Molekularsystematische Studien in der Subtribus Thrinacinae, mit besonderer Berücksichtigung der Gattung Trachycarpus H. Wendl. (Arecaceae) Diplomarbeit im Studienfach Biologie vorgelegt von Chris Stührk Biozentrum Klein Flottbek und Botanischer Garten Hamburg, 2006 Gutachter: Prof. Dr. Hans-Peter Mühlbach Prof. Dr. Jens G. Rohwer I Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis I Abkürzungsverzeichnis III Abbildungsverzeichnis V Tabellenverzeichnis VII 1 Einleitung 1 1.1 Die Familie der Arecaceae 1 1.2 Subtribus Thrinacinae Becc. (1907) 6 1.3 Die Gattung Trachycarpus H. Wendl. (1861) 10 1.4 Fragestellung 18 1.5 ITS Analyse 18 1.6 AFLP, RAPD, ISSR & cpSSR 20 1.7 AFLP Analyse 20 2 Material und Methoden 22 2.1 Material 22 2.1.1 Pflanzenmaterial und Herkunft 22 2.1.2 Chemikalien und Enzyme 22 2.1.3 Behandlung von Geräten und Lösungen 22 2.1.4 DNA-Längenmarker 22 2.1.5 Oligonucleotide (ITS) 23 2.1.6 Oligonucleotide für AFLP Analyse 23 2.2 Methoden 27 2.2.1 Rasterelektronenmikroskopische Untersuchungen 27 2.2.2 Karyologische Untersuchungen 27 2.3 Molekularbiologische Untersuchungen 28 2.3.1 DNA-Isolierung 28 2.3.2 Gelelektrophorese 29 2.3.3 Konzentrationsbestimmungen von DNA-Lösungen 30 2.4.1 Polymerase-Kettenreaktion für die ITS Untersuchungen 30 2.4.2 Aufreinigung der PCR Produkte 32 2.4.3 Sequenzierungsreaktion 32 2.4.4 Fällung der Sequenzreaktion 33 2.4.5 Auftrennung der Sequenzreaktion 33 II 2.4.6 Auswertung der Sequenzen 34 2.4.7 Phylogenetische Analyse 34 2.5.1 AFLP 35 2.5.2 Restriktionsverdau 36 2.5.3 Ligation der Adapter 36 2.5.4 Präamplifikation 37 2.5.5 Selektive Amplifikation 38 2.5.6 Längenstandards für den ALFTMexpress 38 2.5.7 Aufbau des Polyacrylamidgels 40 2.5.8 Probenvorbereitung und Beladung des Gels 40 2.5.9 Gellauf am automatischen Sequenzierer 41 2.5.10 Auswertung der AFLP-Gele am Computer 41 2.5.11 Berechnung der Daten 42 3 Ergebnisse 43 3.1 Morphologische Untersuchungen 43 3.2 Karyologische Untersuchungen 46 3.3 ITS 49 3.3.1 Ergebnisse der ITS Analyse 49 3.4 AFLP 52 3.4.1 Ergebnisse der AFLP Analyse 52 3.4.2 Phylogramme der AFLP Analyse 53 4 Diskussion 70 4.1 Diskussion der morphologischen Untersuchungen 70 4.2 Diskussion der karyologischen Untersuchungen 71 4.3 Diskussion der ITS Analyse 73 4.4 Diskussion der AFLP Analyse 76 4.4.1 Diskussion der AFLP Analyse und ITS Analyse 78 5 Zusammenfassung 86 5.1 Zusammenfassung 86 5.2 Abstract 86 6 Literaturverzeichnise 88 7 Anhang 95 8 Danksagung 128 9 Eidesstattliche Erklärung 129 III Abkürzungsverzeichnis AFLP amplified fragment length polymorphism bp Basenpaar cf. conferre, vergleiche! cpDNA Chloroplasten-DNA cpSSR Chloroplasten simple sequence repeats Cy5 Indodicarbocyanin-Fluorochrom DAPI Diamidino-2-phenylindol DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxynukleotid-5´-Triphosphat EDTA Ethylendiamintetraessigsäure et al. et alteri/et alii (und andere) ISSR inter simple sequence repeats ITS internal transcribed spacer µM mikromolar mA milliAmpere ng Nanogramm NJ Neighbor-joining nm Nanometer PCR polymerase chain reaction pers. Mitt. Persönliche Mitteilung pg Picogramm Primerkombi A Primerkombination Eco ATG + Mse AAT Primerkombi B Primerkombination Eco ATG + Mse AGG RAPD random amplified polymorphic DNA REM Rasterelektronenmikroskop RNA Ribonukleinsäure RNAse Ribonuklease SSR simple sequence repeats TBE Tris-Borat-EDTA Tris Tris-(Hydroxymethyl-)Aminomethan IV UPGMA unweighted pair group method using arithmetic averages Upm Umdrehungen pro Minute UV Ultraviolett µm Mikrometer v/v Volumen pro Volumen w/v Gewicht pro Volumen V Abbildungsverzeichnis Abbildung 1.1: Verbreitung der Arecaceae welweit. 1 Abbildung 1.2: Strict consensus tree der trnL-trnF Analyse von Baker et al. (1999). 4 Abbildung 1.3: Strict consensus tree der kombinierten rps16 und trnL-trnF Analyse von Asmussen et al. (2000). 5 Abbildung 1.4: Typische Blattsegmenteinteilung von Fächerpalmen. 7 Abbildung 1.5: Hastula-Typen verschiedener Fächerpalmen 8 Abbildung 1.6: Prophyll einer Infloreszenz einer Fächerpalme (Schippia). 9 Abbildung 1.7: Eophyll (erstes Sämlingsblatt) von Phoenix. 9 Abbildung 1.8: Verbreitung der Thrinacinae weltweit. 10 Abbildung 1.9: Trachycarpus takil im Habitat, Oktober 2005. 15 Abbildung 1.10: Oval-kaffeebohnenförmige Samen der Trachycarpus sp. ’Nagaland’ 16 Abbildung 1.11: Reniforme Samen der Trachycarpus geminisectus. 16 Abbildung 1.12: Trachycarpus fortunei Typuspflanze in den Royal Botanic Gardens, Kew. 17 Abbildung 1.13: Relative Lage der ETS, ITS- und IGS Abschnitte innerhalb eines rDNA Operons. 19 Abbildung 2.1: Die relative Lage der ITS Primerbinderegionen – schematisch. 23 Abbildung 3.1: Epicuticulare Wachsablagerungen auf der Unterseite eines Blattsegments von Trachycarpus ’NagaHills’ # 43. 43 Abbildung 3.2: Epicuticulare Wachsabsonderung im Querschnitt von Trachycarpus ’NagaHills’ # 43 (REM, Schrägansicht). 44 Abbildung 3.3: Epicuticulare Wachsabsonderung in Aufsicht von Trachycarpus ’NagaHills’ # 43 (REM). 44 Abbildung 3.4: Epicuticulare Wachsabsonderung in Nahansicht von Trachycarpus ’NagaHills’ # 43 (REM). 45 Abbildung 3.5: Trachycarpus princeps # 2 (Typuspflanze) im BG Hamburg 46 Abbildung 3.6: DNA-Histogramm von Trachycarpus nanus # 8. 47 Abbildung 3.7: DNA-Histogramm von Trachycarpus fortunei x takil # 16. 47 Abbildung 3.8: DNA-Histogramm von Trachycarpus takil # 15. 48 Abbildung 3.9: DNA-Histogramm von Trachycarpus takil # 21. 48 Abbildung 3.10: Phylogramm der exhaustive search Analyse (ITS). 50 Abbildung 3.11: ITS Bootstrap 50% majority-rule consensus tree (100 replicates). 51 VI Abbildung 3.12: Phylogramm 5 des Sets 3. 54 Abbildung 3.13: Phylogramm 6 des Sets 3. 55 Abbildung 3.14: Phylogramm 9 des Sets 5. 56 Abbildung 3.15: Phylogramm 10 des Sets 5. 57 Abbildung 3.16: Phylogramm 11 des Sets 6. 59 Abbildung 3.17: Phylogramm 12 des Sets 6. 61 Abbildung 3.18: Gesamtphylogramm 1 der Sets 3, 5 und 6. 63 Abbildung 3.19: Gesamtphylogramm 2 der Sets 3, 5 und 6. 65 Abbildung 3.20: Gesamtphylogramm 3 der Sets 3, 5 und 6. 67 Abbildung 3.21: Gesamtphylogramm 4 der Sets 3, 5 und 6. 69 Abbildung 4.1: Ansichtskarte aus Lugano (1913). 72 Abbildung 4.2: Ansichtskarte aus Lugano (1927). 72 Abbildung 4.3: Die Verteilung der Kontinente vor ca. 135 Millionen Jahren. 74 Abbildung 4.4: Verbreitung der T. princeps entlang des Nujiang (Yunnan, China) 79 Abbildung 4.5: Herbarblatt (Holotyp) der Trachycarpus takil Becc. 80 Abbildung 7.1: Phylogramm 1 des Sets 1. 114 Abbildung 7.2: Phylogramm 2 des Sets 1. 115 Abbildung 7.3: Phylogramm 3 des Sets 2. 116 Abbildung 7.4: Phylogramm 4 des Sets 2. 117 Abbildung 7.5: Phylogramm 7 des Sets 4. 118 Abbildung 7.6: Phylogramm 8 des Sets 4. 119 Abbildung 7.7: Phylogramm 13 des Sets 7. 120 Abbildung 7.8: Phylogramm 14 des Sets 7. 121 Abbildung 7.9: Phylogramm 15 des Sets 7. 122 Abbildung 7.10: Phylogramm 16 des Sets 7. 123 Abbildung 7.11: Phylogramm 17 des Sets 7. 124 Abbildung 7.12: Phylogramm 18 des Sets 7. 125 Abbildung 7.13: Phylogramm 19 des Sets 7. 126 Abbildung 7.14: Phylogramm 20 des Sets 7. 127 VII Tabellenverzeichnis Tabelle 1.1: Klassifikation der Arecaceae nach Dransfield und Uhl. 2 Tabelle 1.2: Subtribus Thrinacinae. 10 Tabelle 1.3: Kurzbeschreibungen der Arten der Gattung Trachycarpus. 11 Tabelle 2.1: Bezeichnung und Sequenz der verwendeten ITS-Primer. 23 Tabelle 2.2: Primer zur Amplifikation des Internen Standards nach Rudolph (2001). 24 Tabelle 2.3: AFLP-Adapter nach Vos et al. (1995). 24 Tabelle 2.4: AFLP-Primer nach Vos et al. (1995). 25 Tabelle 2.5: Primerkombinationen zur Herstellung von PCR-Produkten definierter Länge. 39 Tabelle 3.1: Gesamtzahl detektierter Banden und Anteil monomorpher Banden aus sieben Sets der Primerkombination Eco ATG + Mse AAT. 52 Tabelle 3.2: Gesamtzahl detektierter Banden und Anteil monomorpher Banden aus sieben Sets der Primerkombination Eco ATG + Mse AGG. 52 Tabelle 7.1: Gesamtaufsammlung – nach laufender Labornummer geordnet. 95 Tabelle 7.2: Gesamtaufsammlung – alphabetisch. 98 Tabelle 7.3: Gesamtaufsammlung Thrinacinae – alphabetisch. 102 Tabelle 7.4: Angaben und Koordinaten der Herkünfte. 105 Tabelle 7.5: Händler- und Sammlerverzeichnis. 106 Tabelle 7.6: Taxa der ITS Analyse. 107 Tabelle 7.7: Sets der AFLP Analyse (Primerkombinationen und Taxa). 108 Tabelle 7.8: Chemikalienliste. 112 Einleitung 1 1 Einleitung 1.1 Die Familie der Arecaceae Die Palmen (Arecaceae oder auch Palmae) sind eine Familie der Monokotylen (Liliopsida) und einzige Familie der Ordnung der Palmenartigen (Arecales), die schon vor etwa 70 Millionen Jahren in der Kreidezeit weit verbreitet war. Die Arecaceae zeigen einen pantropischen Verbreitungsschwerpunkt, vor allem im malesischen Raum und in Amazonien. Relativ artenarm an Palmen dagegen ist Afrika, wie die Abbildung 1.1 veranschaulicht. Abbildung 1.1: Verbreitung der Arecaceae weltweit (Lötschert, 1985). Die Angaben über die Anzahl der Palmenarten variieren zwischen 2.500 und 3.500, und über die der Gattungen zwischen 210 und 236 (Jones, 2000). In der Familie der Palmen findet sich das längste Blatt (bei Palmen der Gattung Raphia mit bis zu 25 m Länge), der größte Same (von der Seychellenpalme Lodoicea mit bis zu 22 kg Gewicht), sowie die blütenreichste terminale Infloreszenz (des Pflanzenreichs in der Gattung Corypha mit geschätzten 10 Millionen Blüten pro Infloreszenz). Das Ziel einer allumfassenden Einleitung 2 Klassifikation der Palmen, eines „Genera Palmarum“, verfolgte Harold E. Moore Junior vom L.H. Bailey Hortorium der Cornell University. Moore verstarb 1980, bevor sein Werk vollendet werden konnte. Die Aufzeichnungen wurden jedoch von John Dransfield von den Royal Botanical Gardens Kew und Nathalie Uhl von der Cornell University verwendet, um die erste umfassende Monographie aller bekannten Palmengattungen fertig zu stellen, die unter dem Namen „Genera Palmarum – A classification of palms based on the work of Harold E. Moore, Jr.” erschien (Uhl et al., 1987). Nach dieser Klassifikation werden die Arecaceae in sechs Unterfamilien gegliedert, mit 200 Gattungen und ca. 2.675 Arten. Tabelle 1.1 veranschaulicht dieses Konzept. Tabelle 1.1: Klassifikation der Arecaceae nach Dransfield und Uhl (Uhl et al., 1987).