Tesis Doctoral

Biología reproductiva de los cangrejos ¨Araña¨Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa (Brachyura, majoidea) del norte de Patagonia

González Pisani, Ximena 2011

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Cita tipo APA: González Pisani, Ximena. (2011). Biología reproductiva de los cangrejos ¨Araña¨Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa (Brachyura, majoidea) del norte de Patagonia. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.

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Universidad de Buenos Aires, Argentina

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

BIOLOGÍA REPRODUCTIVA DE LOS CANGREJOS “ARAÑA” LEUROCYCLUS TUBERCULOSUS Y LIBINIA SPINOSA (BRACHYURA, MAJOIDEA) DEL NORTE DE PATAGONIA.

Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área: CIENCIAS BIOLÓGICAS

Ximena González Pisani

Directora de tesis: Dra. Laura S. López Greco

Director Asistente: Dr. Pedro J. Barón

Consejera de estudios: Dra. Laura S. López Greco

Lugar de trabajo: Centro Nacional Patagónico – CONICET y Departamento de Biodiversidad y Biología Experimental, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires.

Buenos Aires, Marzo de 2011

... Se nace y se muere todos los días. Lo sabio es volver a nacer con toda la historia aprendida para crecer todos los días un poquito más.....

Eduardo Galeano

BIOLOGIA REPRODUCTIVA DE LOS CANGREJOS “ARAÑA” LEUROCYCLUS TUBERCULOSUS Y LIBINIA SPINOSA (BRACHYURA, MAJOIDEA)

DEL NORTE DE PATAGONIA

RESUMEN

La presente tesis tiene por objetivo el estudio de la biología reproductiva de dos especies de Majoidea presentes en los golfos norpatagónicos (41°- 43°S, 64°-65° W), Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa. Se describió la estrutura del sistema reproductor femenino y masculino mediante observaciones macroscópicas y bajo microscopía óptica y electrónica de barrido. En las hembras se observó la inserción oviducto-receptáculo seminal del tipo “intermedia” y los receptáculos presentaron diferencias en la zona de transicion mesodermica-ectodermica entre especies. En los machos se observaron diferencias en la formación de los espermatóforos y en la morfología de los gonopodios. Posteriormente se estableció la talla de madurez sexual y se determinaron los estadios de crecimiento. La talla a la cual el 50% de las hembras está madura gonadal, morfométrica y funcionalmente podría corresponder al mismo estadio de crecimiento. En los machos de Leurocyclus tuberculosus se determinó que la madurez gonadal podría ocurrir en un estadio de crecimiento previo a la talla de madurez morfométrica y funcional mientras que en Libinia spinosa la madurez gonadal y morfométrica ocurrirían en el mismo estadio y la madurez funcional en un estadio posterior. Se propone que la muda puberal no sería la muda terminal. La frecuencia de tallas mostró un patrón de crecimiento similar entre sexos en Leurocyclus tuberculosus y diferencias en Libinia spinosa. La proporción de sexos en Leurocyclus tuberculosus fue de 2:1 (hembras: machos) y en Libinia spinosa la proporción varió entre estaciones. La fecundidad estimada fue mayor en Leurocyclus tuberculosus con menor tamaño de huevos. El esfuerzo reproductivo fue menor al de otras especies de Eubrachyura, siendo en Leurocyclus tuberculosus significativamente menor que en Libinia spinosa. Las especies no mostraron una buena correlación entre la fecundidad y la talla lo que sugiere que otros factores modulan la fecundidad. Finalmente se caracterizó el desarrollo embrionario y el efecto de la temperatura sobre el tiempo de desarrollo. Se describieron 5 etapas de desarrollo. El crecimiento embrionario fue mayor en Leurocyclus tuberculosus y la temperatura de incubación tuvo un efecto significativo sobre el tiempo de desarrollo embrionario total en ambas especies. Palabras claves: Majoidea, sistema reproductor, madurez sexual, estructura poblacional, fecundidad y desarrollo embrionario.

REPRODUCTIVE BIOLOGY OF “SPIDER” CRABS LEUROCYCLUS TUBERCULOSUS Y LIBINIA SPINOSA (BRACHYURA, MAJOIDEA) FROM NORTH PATAGONIA

ABSTRACT This thesis is aimed at investigating the reproductive biology of two Majoidea species occurring in the gulfs of northern Patagonia (41°-4 3°S, 64°-65° W), Leurocyclus tuberculosus and Libinia spinosa. The female and male reproductive systems were described based on macroscopic study, light microscopy and scanning electron microscopy. The oviducts connect with the seminal receptacles at the midlength of the mesoderm-derived region, and there are different structures in the transition zone of the seminal receptacles. Males of both species show differences in spermatophore formation and gonopod morphology. In addition, the size at sexual maturity was estimated by combining the concepts of gonadal, morphometric and functional maturity, and growth stages were determined. The size at which 50% of females reach gonad, morphometric and functional maturity would be attained at the same growth stage. Males of Leurocyclus tuberculosus may reach gonad maturity before morphometric and functional maturity, while males of Libinia spinosa may reach gonad and morphometric maturity at the same stage and functional maturity at the next stage. For both species, the pubertal moult may not coincide with the terminal moult. Size frequency distribution of males and females showed a similar and different growth pattern for Leurocyclus tuberculosus and Libinia spinosa, respectively. The sex ratio in Leurocyclus tuberculosus was 2:1 (females: males), while in Libinia spinosa it depended on the season. The fecundity and the reproductive effort were also estimated. Leurocyclus tuberculosus females had higher fecundity and smaller eggs. The reproductive effort of both species was lower than those reported for other Eubrachyura, with the value for Leurocyclus tuberculosus being significantly lower than that for Libinia spinosa. The fecundity did not show a good correlation with size, suggesting that other factors modulate fecundity. Finally, the embryonic development was characterised and the effect of temperature on development was evaluated. Five developmental stages were determined. Embryo volume was greater in Leurocyclus tuberculosus. The effect of incubation temperature on total developmental time was significant for both species.

Key words: Majoidea, reproductive system, sexual maturity, populational structure, fecundity, embryonic development.

Al amor de mis padres...

Quisiera agradecer:

¬ Al Consejo Nacional de Investigaciones de Ciencia y Técnica por el apoyo que he recibido y que brindan a quienes ejercen esta vocación.

¬ Al Consejo Nacional de Ciencia y Técnica por el proyecto PIP- 5835 y a la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica por el proyecto PICT 14700 (dirigidos por el Dr. Pedro Barón) que otorgaron factibilidad a este estudio tanto en lo referido a los muestreos como a la compra de elementos (embarcación, equipamiento de buceo, trampas, GPS, etc) necesarios para el trabajo de campo.

¬ A la Universidad de Buenos Aires por los proyectos UBACYT X143 y X458, a la Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica por los proyectos PICT 953 y 01187 y al Consejo Nacional de Ciencia y Técnica por el proyecto PIP 129 (dirigidos por la Dra. Laura López Greco) que financiaron parcialmente esta tesis.

¬ A mis directores, la Dra. Laura López Greco y el Dr. Pedro Barón por enseñarme a conocer los aspectos más interesantes de la biología, su tenaz paciencia y por todo lo que he aprendido durante la elaboración de esta tesis y el trabajo que ello les ha demandado. Particularmente le agradezco a Laura su vocación para renovar mi entusiasmo y su presencia permanente a pesar de la distancia y a Pedro su enseñanza para enfocar las preguntas desde diferentes aspectos.

¬ A la Universidad de Buenos Aires por recibirme como alumna de doctorado y al Centro Nacional Patagónico por recibirme como integrante de la Institución.

¬ Al jurado, la Dra. Graciela Esnal, el Dr. Cristián Ituarte y al Dr. Tomas Luppi, por su tiempo dedicado y sus interesantes sugerencias.

¬ A los miembros del área náutica del Centro Nacional Patagónico “Hormiga” Díaz, “Bebo” Vera, Néstor Ortiz, “Bocha” Rua y Fabián Quiroga que han estado con su buen humor y apoyo técnico en los días más lindos y en los días más ventosos junto a mí en busca de los cangrejos araña.

¬ A ALUAR por permitir el uso del microscopio electrónico de barrido.

¬ A Jaime Groizard (ALUAR) por su asistencia técnica con el microscopio electrónico de barrido.

¬ Al Dr. José María (Lobo) Orensanz por facilitarme bibliografía y sus valiosas sugerencias.

¬ A Alejandro Pettovello por su ayuda en el análisis de los datos.

¬ A mis compañeros y amigos de la UBA, que han estado conmigo desde el primer día que entré a este inmenso edificio y que se fueron acoplando con el transcurso de los años, Fer (Comemo), Caro, Naty, Lia, Sil, Brenda, Marianita, Dani, Vero y Anouk.

¬ A mis compañeros y amigos del CENPAT, Rodry, Augus, Fer, Juli, Gus, Mauro, Jime y Moni por brindarme atención y consejos siempre que los necesité.

¬ A mis amigos Vero (La Tucu y Santy), Pau, Ro (y Alegra), Yany (y Agus), Fede, Caro, Lau, Gaby, Vero, Sabri, Miriam, Maria Emilia y Elo por estar en los tiempos más difíciles y los más felices de mi carrera.

¬ A mis ahijados que en los momentos más difíciles sus sonrisas son una paz absoluta. Y a las mamás de mis ahijados (Gaby y Tam) que son mis eternas confidentes.

¬ Al Quijote y la Dulcinea, quienes mantienen mi vida dentro de un hermoso cuento.

¬ Y por último a los primeros, al apoyo constante de mamá, a la mirada de Carli, a los abrazos de Sergi, a la sonrisa y consejos de Pabli, a la ternura de Agus, Eze y Santy, al orgullo que siempre sintieron mis abuelos, y al hermoso recuerdo de papá.

INDICE

INTRODUCCIÓN GENERAL ______- 10 -

OBJETIVO GENERAL Y ESPECÍFICOS ______- 7 -

CAPÍTULO I ______- 9 -

Anatomía del Sistema Reproductor ______- 9 - INTRODUCCIÓN ______- 9 - OBJETIVO ______- 15 - MATERIALES Y MÉTODOS ______- 15 - RESULTADOS ______- 17 - El sistema reproductor en las hembras ______- 17 - El sistema reproductor en los machos ______- 34 - DISCUSIÓN ______- 40 -

CAPÍTULO II______- 47 -

Adquisición de la Madurez Sexual ______- 47 - INTRODUCCIÓN ______- 47 - OBJETIVO ______- 50 - MATERIALES Y MÉTODOS ______- 50 - RESULTADOS ______- 55 - Madurez gonadal ______- 55 - Madurez morfométrica ______- 62 - Madurez funcional______- 71 - Estacionalidad de la actividad reproductiva ______- 74 - DISCUSIÓN ______- 86 -

CAPÍTULO III ______- 95 -

Estructura Poblacional ______- 95 - INTRODUCCIÓN ______- 95 - OBJETIVO ______- 97 - MATERIALES Y MÉTODOS ______- 98 - RESULTADOS ______- 102 - Muestras obtenidas______- 102 - Estructura Poblacional ______- 103 - Proporción de sexos ______- 108 - DISCUSIÓN ______- 109 -

CAPÍTULO IV ______- 115 -

Fecundidad y Esfuerzo Reproductivo ______- 115 - INTRODUCCIÓN ______- 115 - OBJETIVO ______- 117 - MATERIALES Y MÉTODOS ______- 118 - RESULTADOS ______- 121 - DISCUSIÓN ______- 125 -

CAPÍTULO V ______- 131 -

Descripción del Desarrollo Embrionario y Modulación Térmica______- 131 - INTRODUCCIÓN ______- 131 - OBJETIVO ______- 133 - MATERIALES Y MÉTODOS ______- 133 - RESULTADOS ______- 136 - Descripción de los estadios embrionarios ______- 136 - Crecimiento embrionario______- 149 - Duración del desarrollo embrionario ______- 151 - DISCUSIÓN ______- 152 -

DISCUSIÓN GENERAL______- 159 -

CONCLUSIONES ______- 165 -

BIBLIOGRAFÍA ______- 169 -

Libinia spinosa

INTRODUCCIÓN GENERAL

Biología Reproductiva de Majoidea Introducción General INTRODUCCIÓN GENERAL

El subplylum Crustacea es uno de los grupos zoológicos con mayor éxito biológico, tanto por el número de especies vivientes como por la diversidad de hábitat que colonizan. La estimación actual del número de especies es de aproximadamente 52.000 (Martin y Dawirs 2001), constituyendo el mayor grupo de artrópodos acuáticos. Habitan el medio marino, salobre y de agua dulce en todas las profundidades y algunos también han colonizado el medio terrestre. Dentro de los crustáceos, se reconocen numerosos recursos pesqueros con un elevado valor comercial en Argentina y otras regiones del mundo (Caddy 1989; Boschi 1997; Gardner 1998), con capturas anuales que superan los seis millones de toneladas (FAO 2008).

La taxonomía de los Crustacea ha cambiado significativamente en los últimos años. Martin y Dawirs (2001) presentaron una clasificación actualizada hasta el nivel de familia, basada en Bowman y Abele (1982), incluyendo nuevas familias y taxones superiores descriptos desde entonces e incorporando otras técnicas para el análisis filogenético como la biología molecular y la morfología espermática. Esta clasificación incluye 849 familias en 42 órdenes y 6 clases.

Entre los cambios más destacados en la taxonomía referida a los cangrejos, se consolida el grupo de los Eubrachyura (Guinot 1977, 1978), que surge de la división de los Brachyura (cangrejos) en dos posibles taxones basándose principalmente en la posición de las aberturas genitales: Eubrachyura y “Podotremata”. Entre otras diferencias, los Eubrachyura se caracterizan por la presencia de vulvas esternales y los Podotremata por poseer la abertura genital femenina en la coxa del quinto par de pereiópodos.

La controversia sobre la validez del taxón “Podotremata” continúa y otras modificaciones en la taxonomía de los Eubrachyura han sido incorporadas más recientemente (Ng et al. 2008; De Grave et al. 2009).

Con respecto a la biología reproductiva, la mayoría de los Decapoda son dioicos aunque se conocen casos de hermafroditismo protándrico (Bauer 2000). Los Pleocyemata presentan típicamente cuidado parental incubando los embriones adheridos a los pleópodos hasta la eclosión. Este último evento da lugar a la liberación de un tipo de larva planctónica, denominada zoea, generalmente planctotrófica y más raramente lecitotrófica (Anger 2001). Luego del estadio zoea, que puede involucrar varias mudas, las larvas metamorfosean al estadio decapodito o megalopa. La siguiente muda transforma la megalopa en el primer juvenil con hábitos generalmente bentónicos (Botsford 1991). Los - 1 - Biología Reproductiva de Majoidea Introducción General juveniles crecen en dimensiones externas a través de un proceso discontínuo de ecdisis o mudas. Durante los procesos de ecdisis, el exoesqueleto viejo es desechado y se produce un rápido crecimiento antes de que el nuevo exoesqueleto vuelva a calcificarse (Hartnoll 1985). Las estrategias de reproducción de los Eubrachyura han sido el foco de numerosos estudios en los últimos años (Lucas 1980; Diesel 1986, 1991; Anilkumar et al. 1999; Dunnington 1999; Hosie 2004). Entre los aspectos de la biología reproductiva usualmente evaluados se destacan: el análisis de los períodos de reproducción, proporción de sexos, desarrollo gonadal, comportamiento de apareamiento, selección sexual, estrategias de transferencia y almacenamiento espermático, competencia espermática, la variabilidad en los períodos de incubación y el análisis de la fecundidad (Wear 1974; Jewett et al. 1985; Comeau y Conan 1992; Hines 1992; Sainte-Marie 1993; Sainte-Marie y Lovrich 1994; Jivoff 1997; Swiney y Shirley 2001; Gardner y Williams 2002; Kendall et al. 2002; Sainte- Marie et al. 2002; Jivoff 2003; Sainte-Marie 2007). Las características reproductivas de las especies y/ó de las poblaciones son el resultado de la interacción entre factores exógenos (temperatura, salinidad, disponibilidad de alimento y fotoperíodo entre otros) y endógenos, que modulan la periodicidad y extensión del periodo reproductivo, la talla de madurez sexual y la fecundidad (Thorson 1950; Jones y Simmons 1983; Conde y Díaz 1989; Burmeister y Sainte-Marie 2010). Una fluctuación menor de estos factores puede causar importantes variaciones en las densidades poblacionales y parámetros reproductivos (Burmeister y Sainte-Marie 2010). El conocimiento detallado de la biología reproductiva de algunas especies de Decapoda es de gran utilidad, dado que numerosas especies son objeto de explotación pesquera tanto costera como de profundidad. El desarrollo de estrategias para la regulación de pesquerías se basa en aspectos reproductivos tales como las tallas de primera madurez, el ciclo reproductivo y las particularidades de los sistemas de apareamiento (Fogarty y Bostford 2007; Dellatorre 2010). Por esta razón son abundantes los estudios sobre la biología, ecología y distribución de decápodos braquiuros y anomuros que habitan la costa Atlántica Argentina (Boschi 1964; Scelzo y Valentini 1974; Melo 1985; Manning y Holthuis 1989; Defeo et al. 1991; Boschi et al. 1992; Carsen et al. 1996; Schoeman y Cockcroft 1996; Spivak 1997; Valero et al. 1999; Morsan 2000; Luppi et al. 2002; Tapella et al. 2002; Delgado y Defeo 2004; Vinuesa 2005, 2007; Pérez-Barros et al. 2008 entre otros). Los Majoidea ó cangrejos “araña” constituyen un grupo de Eubrachyura interesante en relación a las características de su reproducción e interacción con los patrones de

- 2 - Biología Reproductiva de Majoidea Introducción General crecimiento y particularmente en cuanto a sus sistemas de apareamiento (Hartnoll 1963, 1969; Diesel 1991; Jones y Hartnoll 1997; Hartnoll 2006; Sainte-Marie 2007 entre otros). Incluso una de las pesquerías de cangrejos más importantes en el hemisferio norte, se basa en el cangrejo araña Chionoecetes opilio lo que ha aportado significativa información sobre la biología de esta especie, de otra del mismo género, C. bairdii, y ha consolidado el conocimiento de la biología reproductiva y del crecimiento de los Majoidea en general (Hines 1982b; DeGoursey y Auster 1992; Sainte-Marie 1993; Comeau et al. 1999; Sampedro et al. 1999; Rondeau y Sainte Marie 2001; Webb et al. 2007). Fransozo y Hebling (1982) observaron un alto grado de especialización en esta superfamilia en comparación con otros grupos de Brachyura y sugirieron que esta especialización podría ser en parte responsable del gran número de especies (aproximadamente 700) de este grupo taxonómico (Cobo y Okamori 2008). La taxonomía de esta superfamilia se encuentra en constante revisión. En primera instancia fueron propuestas siete subfamilias por Griffin y Tranter (1986), pero la gran diversidad de la antigua familia Majidae llevó a su posterior división en cuatro: Oregoniidae, Macrocheiridae, Majidae e Inachidae en función, principalmente, de la morfología de sus larvas (Pohle y Marques 2000). Actualmente los “Májidos” o cangrejos “araña” constituyen la superfamilia Majoidea que abarca las familias: Epialtidae, Inachidae, Inachoididae, Majidae, Oregoniinae y Hymenosomatidae (Ng et al. 2008, De Grave et al. 2009).

En Argentina (Figura 1) se encuentran nueve especies de Majoidea, pertenecientes a la familia Inachoididae: Collodes rostratus, Piromaia tuberculata y Leurocyclus tuberculosus, a la familia Epialtidae: Rochinia gracilipes, Leucippa pentagona, Libidoclea granaria, Pelia rotunda y Libinia spinosa, a la familia Inachidae: Eurypodius latreillei y a la familia Inachoididae (Boschi et al. 1992; Schejter et al. 2002; Ng et al. 2008). En los golfos norpatagónicos, área de estudio de esta tesis, (Figura 1) se han encontrado cuatro especies de Majoidea: Leurocyclus tuberculosus, Libinia spinosa, Leucippa pentagona y Rochinia gracilipes siendo Leurocyclus tuberculosus (Figura 2) y Libinia spinosa (Figura 2) las especies de mayor talla que coexisten en las aguas de los golfos (observación pers.).

- 3 - Biología Reproductiva de Majoidea Introducción General

N

Figura 1. Mapa del área de estudio y sitios de muestreo. 1: Bahía Creeck; 2: Puerto Lobos; 3: Playa San Román; 4: Playa Fracasso; 5: Puerto Pirámides; 6: Puerto Madryn; 7: Cerro Avanzado; 8: Bahía Cracker. (Modificado de Google earth)

Figura 2. Izquierda- Macho de Leurocyclus tuberculosus. Derecha- Macho de Libinia spinosa. (Escala: 1 cm).

- 4 - Biología Reproductiva de Majoidea Introducción General En Argentina la información sobre Majoidea está principalmente referida a la diversidad, presencia y distribución geográfica (Boschi et al. 1992; Spivak 1997; Bremec et al. 2000; Braga et al. 2002; Vinuesa 2005), descripción de los aspectos anatómicos reproductivos (Sal Moyano et al. 2010a), madurez sexual y fecundidad (Schejter y Spivak 2005; Barón et al. 2009; Sal Moyano et al. 2010b) e información sobre el desarrollo embrionario, distribución y abundancia de las larvas de algunas especies (Boschi y Scelzo 1968; Bacardit 1985; Schejter et al. 2002; Luppi y Spivak 2003). Los miembros de la familia Inachoididae son endémicos de América, se distribuyen en ambas costas del continente y en la actualidad la familia está representada por diez géneros (Ng et al. 2008). Leurocyclus tuberculosus (H. Milne Edwards y Lucas 1842) se distribuye a lo largo de las costas de Sudamérica austral, desde Río de Janeiro (Brasil) hasta Chile (Boschi et al. 1992; Spivak 1997; Braga et al. 2002; Vinuesa 2005) y se la encuentra asociada generalmente a fondos fangosos entre los 10 y 170 m (Melo 1996). La familia Epialtidae está subdividida en 4 subfamilias (Epialtinae, Pisinae, Pliosomatinae y Tychinae) que componen en total 76 géneros. Libinia spinosa (H. Milne Edwards 1834) está presente a lo largo de ambas costas de América, en las costas del océano Pacífico en Baja California, islas Galápagos, Hawaii, Perú y el norte de Chile, y en las costas del océano Atlántico desde Nueva Escocia hasta Chubut (Boschi 2000) y se la encuentra en profundidades de 10 a 130 m en fondos fangosos (Melo 1996). Los estudios realizados en Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa son escasos. Para ambas especies se conoce la morfología externa y la distribución geográfica (Boschi et al. 1992), el desarrollo larval (Boschi y Scelzo 1968; Santana y Marques 2005), la talla de madurez morfológica (Barón et al. 2009) para Leurocyclus tuberculosus y parcialmente la descripción del sistema reproductor (Sal Moyano et al. 2010a) y la madurez morfométrica y gonadal para Libinia spinosa en la zona de Mar del Plata (Sal Moyano et al. 2010b)

Organización de la tesis En función de los aspectos de la biología reproductiva que se desconocen para estas especies de Majoidea, y de su importancia como componentes del bentos y tramas tróficas de los golfos norpatagónicos, se plantea en este trabajo de tesis doctoral la investigación de diferentes aspectos de la biología reproductiva de dos especies de Majoidea que habitan la costa Atlántica de Patagonia.

- 5 - Biología Reproductiva de Majoidea Introducción General La tesis está organizada en cinco capítulos:

• En el capítulo I se caracterizó la morfología del sistema reproductor de ambos sexos en individuos maduros sexualmente y se registraron los cambios morfológicos de los caracteres sexuales a lo largo del crecimiento (estadios inmaduros).

• En el capítulo II se estudió la talla de primera madurez sexual estableciendo la relación entre la madurez morfométrica (talla de cambio en el nivel de alometría de los caracteres sexuales secundarios), gonadal (talla de madurez gonadal) y funcional (talla a que los individuos participan en el evento reproductivo) y su cronología estacional.

• En el capítulo III se caracterizó la distribución de las especies y se estimaron los estadios de crecimiento para juveniles y adultos y su relación con la madurez sexual.

• En el capítulo IV se estimó la fecundidad y el esfuerzo reproductivo.

• En el capítulo V se caracterizó el desarrollo embrionario y la modulación de las etapas de la embriogénesis por efecto de las diferentes temperaturas características de los golfos.

- 6 - Biología Reproductiva de Majoidea Introducción General OBJETIVO GENERAL Y ESPECIFICOS

Objetivo general

El objetivo general de esta tesis es caracterizar la biología reproductiva de las especies Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa (Brachyura; Majoidea) en el litoral norpatagónico y proponer generalizaciones sobre su modo de vida, su ciclo de reproducción, la adquisición de la madurez sexual, la anatomía de las estructuras reproductivas, la distribución espacio-temporal y el desarrollo embrionario y su modulación por la temperatura.

Objetivos específicos

1- Describir y caracterizar la anatomía del sistema reproductor.

2- Establecer los patrones de maduración sexual considerando los cambios morfométricos, gonadales y funcionales, y analizar su cronología estacional.

3- Evaluar la estructura poblacional y la distribución espaciotemporal.

4 – Estudiar la fecundidad y el esfuerzo reproductivo en función de la talla de las hembras y sus posibles variaciones durante el ciclo anual de puestas.

5- Describir la morfología del desarrollo embrionario y caracterizar su duración a diferentes temperaturas representativas de las variaciones térmicas de su hábitat.

- 7 -

Libinia spinosa

Anatomía del Sistema Reproductor

CAPÍTULO I

Biología Reproductiva de Majoidea Anatomía del Sistema Reproductor CAPÍTULO I

Anatomía del sistema reproductor de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa

INTRODUCCIÓN

Los estudios de la morfología reproductiva dentro de un marco filogenético pueden responder preguntas sobre la co-evolución de la anatomía, los comportamientos reproductivos y los mecanismos de fertilización (Wortham-Neal 2002). En varias especies, incluyendo algunos crustáceos, existen cámaras de almacenamiento de espermatozoides en el sistema reproductor femenino cuyo estudio brinda un significativo conocimiento sobre la biología reproductiva dada su estrecha vinculación con el comportamiento reproductivo (Parker 1970; Diesel 1991; Sainte-Marie 2007). Bauer (1986) indicó una posible tendencia filogenética para los crustáceos entre la transferencia de los espermatozoides y las estructuras de almacenamiento espermático de las hembras y propuso que el grado de complejidad de los órganos de transferencia espermática y los de almacenamiento representa una medida de la distancia filogenética al estado ancestral en un taxón. El sistema reproductor está constituido por las gónadas y los conductos que transportan las gametas. Las gónadas maduras presentan variaciones morfológicas e histológicas en función del periodo reproductivo que permiten caracterizarlas desde un punto de vista macroscópico (posición, forma, tamaño relativo y color) y microscópico (posición relativa de las células germinales, tamaño de las gametas y la presencia y localización de las células somáticas acompañantes o células foliculares) (Hartnoll 1963, López-Greco 1997a). Las hembras de los Eubrachyura presentan un sistema reproductor bilateral que abarca desde el ovario hasta la vulva (Hartnoll 1968). El ovario está caracterizado por dos lóbulos que se extienden longitudinalmente a lo largo del cefalotórax y que suelen estar unidos por un puente a la altura del estómago presentando forma de “H” (Adiyodi y Subramonian 1983; Krol et al. 1992). La porción de los lóbulos ováricos anterior al puente de unión se denomina “lóbulos anteriores”, y la porción posterior, “lóbulos posteriores”. Desde el punto de vista histológico el ovario maduro se caracteriza por la presencia de los estadios finales de la oogénesis (oocitos en vitelogénesis secundaria). - 9 - Biología Reproductiva de Majoidea Anatomía del Sistema Reproductor Los conductos reproductores comienzan en los oviductos extendiéndose ventro- lateralmente desde el ovario hacia la región ventral del cefalotórax a la altura del 6º segmento toráxico (Krol et al. 1992). A continuación de los oviductos se encuentran los receptáculos seminales (Figura 3) que son estructuras de origen embrionario mixto, mesodérmico y ectodérmico, (Tavares y Secretan 1993; Guinot y Quenette 2005) especializadas en la recepción y almacenamiento de los espermatóforos/espermatozoides y con elevada actividad secretora relacionada con el mantenimiento de las gametas (Hartnoll 1968, 1969; Diesel 1989; Anilkumar et al. 1996; Jensen 1996; González- Gurriarán et al. 1998; Sainte-Marie y Sainte-Marie 1998; López-Greco et al. 1999, 2009, entre otros). En estas estructuras los espermatozoides/espermatóforos pueden ser almacenados por largos periodos, y consecutivos desoves pueden ser fertilizados sin cópulas previas (Diesel 1988a, 1989, 1991; Hinsch 1991; Jensen 1996; González- Gurriarán et al. 1998; Sampedro et al. 1999; Sainte-Marie 2007). Diesel (1991) clasificó los receptáculos seminales en tipo “dorsal” y tipo “ventral”. En los receptáculos seminales de tipo ventral (Figura 3A) el oviducto y la vagina se abren en la región ventral del receptáculo cerca uno del otro lo cual ha sido observado en cangrejos de la familia Calappidae, Geryonidae, Leucosiidae, Parthenopidae, Parathelphusidae, Corystidae, Ocypodidae y algunas especies de Majoidea (Diesel 1991). Los receptáculos de tipo dorsal (Figura 3B) presentan la apertura del oviducto “más o menos dorsal” (sensu Diesel 1991) al receptáculo y la vagina se encuentra en posición ventral. Este tipo de conexión ha sido observada en cangrejos de la familia Portunidae y Xanthidae (Diesel 1991; Orensanz et al. 1995).

- 10 - Biología Reproductiva de Majoidea Anatomía del Sistema Reproductor

Figura 3. Esquema de los receptáculos seminales modificado a partir de Hartnoll (1968). A- Receptáculo seminal con conexión ventral del oviducto. B- Receptáculo seminal con conexión dorsal del oviducto. O: ovario; Ov: oviducto; RS: receptáculo seminal; V: vagina; Vu: vulva.

Algunos autores han utilizado el término "espermatecas" cuando se refieren a las estructuras de almacenamiento de espermatóforos/espermatozoides (López-Greco et al. 2009 para revisión). En el presente trabajo utilizaremos el término receptáculos seminales basándonos en los trabajos de Tavares y Secretan (1993) y Guinot y Quenette (2005) para Eubrachyura. La última porción del conducto del sistema reproductor femenino es la vagina que es continua con la porción ectodérmica del receptáculo. Hartnoll (1968) describe dos morfologías de vagina: la de tipo simple y la de tipo cóncavo. Una vagina simple es una estructura tubular recta de sección circular con una cutícula de espesor uniforme que rodea la luz, mientras que una vagina cóncava es un conducto que en corte transversal se observa con paredes colapsadas. La parte ventral tiene una pared fina y flexible con una delgada cutícula y la parte dorsal presenta una gruesa cutícula que le da rigidez a la pared y es el sitio de inserción de la musculatura involucrada en la apertura del canal vaginal (Hartnoll 1968). La vagina finaliza en la vulva que se abre al exterior a la altura del 6º segmento toráxico. La vulva puede o no presentar un opérculo y éste puede ser móvil o fijo (Hartnoll 1968; Diesel 1991). La morfología del sistema reproductor femenino en Eubrachyura se relaciona con el comportamiento reproductivo. Se reconocen dos tipos de apareamiento: los que ocurren en intermuda (“hard-shelled mating system”) y los que ocurren en postmuda (“soft-shelled

- 11 - Biología Reproductiva de Majoidea Anatomía del Sistema Reproductor mating system”) definidos en función del estadio de muda de la hembra (Hartnoll 1969; Diesel 1991). Hartnoll (1969) propuso que generalmente las hembras con vagina simple se aparean en postmuda y aquellas con vagina cóncava se aparean en intermuda. Diesel (1992) observó que los receptáculos seminales del tipo dorsal se encuentran con frecuencia en especies que presentan cópula en postmuda, mientras que los receptáculos del tipo ventral se observan en especies que copulan en intermuda. Por otra parte, la disposición topográfica de la conexión entre el oviducto y el receptáculo seminal (dorsal o ventral) tiene implicancias sobre cómo los espermatozoides de diferentes machos se utilizan para la fertilización de los oocitos. En aquellas especies con receptáculos de tipo dorsal, se propone que el primer macho que se aparea con la hembra luego de la ovulación fertilizará sus oocitos, mientras que en las especies con receptáculos de tipo ventral, será el último macho que copula con la hembra antes de la puesta el que fertilizará sus oocitos (Diesel 1991; Urbani et al. 1998; Sainte-Marie 2007). La presencia de estructuras de almacenamiento espermático junto con la condición poliándrica de las hembras de los Eubrachyura posibilita la ocurrencia de competencia espermática (sperm competition) (Parker 1970; Diesel 1991; Wortham-Neal 2002). Los primeros estudios sobre competencia espermática en artrópodos se realizaron en insectos (Parker 1970) y actualmente se conoce que existe este mecanismo en diversas especies de crustáceos (Birkhead y Hunter 1990; Urbani 1998). El proceso se define como la competencia entre el esperma de al menos dos machos por la fertilización de los oocitos de una hembra (Parker 1984; Parker et al. 1990). Este tipo de competencia es un factor determinante de la biología reproductiva de numerosas especies, que nos permite inferir sobre el comportamiento reproductivo y muestra que la competencia entre machos para fertilizar los oocitos continúa después de la cópula dentro de los receptáculos seminales (Parker 1970). Aunque la presencia de receptáculos seminales y la poliandria permitirían a priori la mezcla de espermatozoides de varios machos se ha observado una tendencia a que la paternidad de cada puesta corresponda solo a un macho (Birkhead y Hunter 1990). Se han propuesto dos formas para explicar la paternidad única: la “estratificación de los eyaculados” y la “remoción del esperma” (Birkhead y Hunter 1990) que han sido escasamente estudiados en Eubrachyura (Beninger et al. 1991; Urbani 1998; Rorandelli et al. 2010). Los machos de Eubrachyura presentan un sistema reproductor constituido por un par de testículos que se continúan con los vasos deferentes (Johnson 1980; Krol et al. 1992). Los testículos están localizados en la zona anterior del cefalotórax, tienen por un grado variable de plegamiento y han sido caracterizados como estructuras tubulares

- 12 - Biología Reproductiva de Majoidea Anatomía del Sistema Reproductor consistentes en un conducto seminífero central con lóbulos laterales en diferentes estadios de la espermatogénesis/espermiogénesis y un marcado sincronismo en la maduración de los elementos celulares dentro de cada lóbulo (Johnson 1980; Krol et al. 1992; Simeó et al. 2009). Desde el punto de vista histológico el testículo maduro se caracteriza por la presencia de los estadios finales de la espermatogénesis (espermátides) o de la espermiogénesis (espermatozoides). Los espermatozoides son aflagelados, tienen núcleo descondensado y un número variable de proyecciones o espinas (“spikes’) y se transfieren junto con secreciones en paquetes denominados espermatóforos (Hinsch 1974; Krol et al. 1992; Pochon-Masson 1994) Los vasos deferentes se extienden paralelamente hacia la parte posterior del cefalotórax y su longitud y grado de enrollamiento incrementan el área efectiva de secreción, absorción y almacenamiento (Beninger et al. 1988; Hinsch 1988; Diesel 1989; Talbot y Beach 1989; Krol et al. 1992). Están regionalizados de acuerdo a su forma y función y en relación a su proximidad al testículo se denominan: vaso deferente proximal, medio y distal. En la zona proximal se producen los espermatóforos de forma elíptica o esférica (Bauer 1986; Krol et al. 1992), en la zona media ocurre la acumulación de los espermatóforos y una importante secreción a nivel epitelial y en la zona distal se produce la mayor cantidad de fluído seminal y su transporte hacia los órganos copuladores (Cronin 1947; Johnson 1980; Diesel 1989). Cada vaso deferente distal finaliza en una papila peneana que se abre al exterior a través de un gonoporo ubicado en la coxa del último par de pereiópodos, y se introduce en los gonopodios (Diesel 1989). Los gonopodios son estructuras que utiliza el macho para la transferencia espermática y están formados por los dos primeros pares de pleópodos. El primer par de pleópodos es tubular y en él se introduce la papila peneana que descarga el contenido espermático mientras el segundo pleópodo actúa como pistón durante la transferencia de la masa de espermatóforos a los receptáculos seminales en el momento de la cópula (Hinsch 1991; Krol et al. 1992). Se ha propuesto que la especificidad de la función de los gonopodios contribuye a cierta estabilidad morfológica interespecífica, por lo que dada su naturaleza “conservativa” la morfología de dicha estructura se utiliza como un importante carácter taxonómico (Beninger et al. 1991; Abele 1992). Bauer (1986) ha propuesto que la morfología de los gonopodios se relaciona directamente con la morfología de los receptáculos seminales y que son estructuras que co-evolucionan para lograr maximizar el éxito de la fecundación. Distintos aspectos de la morfología del sistema reproductor de los Majoidea han sido estudiados en Chionoecetes bairdii (Paul y Adams 1984), C. opilio (Beninger et al. 1988;

- 13 - Biología Reproductiva de Majoidea Anatomía del Sistema Reproductor Bryant y Hartnoll 1995; Sainte-Marie y Sainte-Marie 1998; Urbani et al. 1998; Sainte-Marie y Sainte-Marie 1999a,b; Benhalima y Moriyasu 2000; Rondeau y Sainte-Marie 2001), Inachus phalangium (Diesel 1989), Libinia emarginata (Hinsch y Walker 1974; Hinsch 1986; Hinsch 1991), L. spinosa (Sal Moyano et al. 2010a) Maja brachydactyla (García- Flórez y Fernández-Rueda 2000; Rotllant et al. 2007; Simeó et al. 2009), M. squinado (González-Gurriarán et al. 1998), y en las especies de Hymenosomatidae Halicarcinus cookii (Van den Brink 2006), H. ovatus, Amarinus laevis, A. lacustris y A. paralacustris (Lucas 1980). Las hembras de las especies de Majoidea estudiadas hasta el momento comparten los siguientes caracteres: 1) receptáculos seminales del tipo ventral (Diesel 1991), 2) luz de los receptáculos seminales dividida por pliegues (Beninger et al. 1988; Sainte-Marie y Sainte-Marie 1998) o por una estructura denominada “velum” (Diesel 1989), 3) vagina de tipo cóncavo (Hartnoll 1969), 4) pueden almacenar espermatóforos/espermatozoides de varias cópulas en los receptáculos seminales y 5) pueden presentar las dos modalidades de apareamiento (“soft-shelled mating” y “hard-shelled mating”) pudiendo ocurrir la primera cópula de la hembra en postmuda y las posteriores en intermuda (Hartnoll 1969; Sainte-Marie et al. 1997; Jadamec et al. 1999). En relación a los machos, los Majoidea estudiados hasta el momento comparten los siguientes caracteres: 1) testículos de morfología tubular y 2) vasos deferentes donde se distinguen claramente sus partes proximal, media y distal (Hinsch y Walker 1974; Diesel 1989; Moriyasu y Benhalima 1998; Benhalima y Moriyasu 2000). Para “garantizar” la paternidad de un único macho de cada desove de la hembra se han propuesto los dos mecanismos en los Majoidea: la estratificación del esperma (Paul et al. 1983) y el desplazamiento de esperma de machos de cópulas anteriores de los receptáculos seminales, con estructuras como expansiones, espinas y ganchos en los extremos distales de los gonopodios (Beninger et al. 1991; Rorandelli et al. 2010). Dada la importancia del conocimiento de la anatomía del sistema reproductor en el contexto del estudio de la biología reproductiva de las especies, y siendo escasa la información sobre los aspectos anatómicos reproductivos de Leurocyclus tuberculosus (Inachoididae) y Libinia spinosa (Epialtidae) se planteó el siguiente objetivo.

- 14 - Biología Reproductiva de Majoidea Anatomía del Sistema Reproductor OBJETIVO El objetivo del presente capítulo fue describir y caracterizar la anatomía del sistema reproductor de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa.

En el marco de este objetivo se plantearon las siguientes hipótesis:

Hipótesis 1: El sistema reproductor femenino de ambas especies presenta una conexión del oviducto al receptáculo seminal de tipo ventral.

Hipótesis 2: La luz de los receptáculos seminales de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa se encuentra dividida por pliegues o por el “velum”.

Hipótesis 3: El sistema reproductor femenino presenta una vagina de tipo cóncava en ambas especies.

Hipótesis 4: El sistema reproductor masculino en ambas especies presenta estructura tubular con vasos deferentes regionalizados.

Hipótesis 5: Los gonopodios presentan diferencias anatómicas interespecíficas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Los ejemplares de ambos sexos y especies se recolectaron entre los años 2007 y 2009 en aguas del Golfo Nuevo (42º56'S, 64º21'W) a profundidades entre 5 y 40 m. Las muestras se colectaron con buceos y trampas plegables de la manera descripta en el Capítulo III y los ejemplares fueron transportados al Laboratorio de Peces y Mariscos de Interés Comercial en el Centro Nacional Patagónico (CENPAT -CONICET). Para realizar una descripción detallada de las diferentes estructuras que componen el sistema reproductor se utilizaron las siguientes técnicas/metodologías: observación macroscópica del material fresco, observación, tinción e ilustraciones bajo microscopio estereoscópico, observación y fotografía bajo microscopio electrónico de barrido (MEB) y cortes histológicos para microscopía de luz. - 15 - Biología Reproductiva de Majoidea Anatomía del Sistema Reproductor Observaciones macroscópicas De cada ejemplar se realizó una observación macroscópica del sistema reproductor caracterizando los ovarios, oviductos, receptáculos seminales (RS), vaginas, vulvas, y el abdomen en las hembras, y los testículos, vasos deferentes y gonopodios en los machos, de acuerdo a su posición, tamaño relativo, color y consistencia. El sistema reproductor completo fue removido, lavado con agua destilada y algunas estructuras fueron coloreadas con azul de metileno (5%) para mejorar la definición. Se realizaron ilustraciones a través de una cámara clara y se fotografiaron con una cámara digital (Nikon Coolpix).

Observaciones bajo microscopio electrónico de barrido (MEB) Las muestras del sistema reproductor (de cada parte descripta desde el punto de vista macroscópico) utilizadas para microscopía electrónica de barrido fueron disecadas, lavadas con agua destilada, y montadas individualmente sobre un portaobjeto con cinta de doble cara adhesiva. Algunas muestras se recubrieron de oro para obtener una mejor definición con un equipo Cold Sputter Denton Vacuum Desk IV (Huespe et al. 2008). El sistema reproductor femenino y los gonopodios masculinos se observaron y fotografiaron bajo un microscopio electrónico de barrido (MEB) LSM JEOL-6460 LV, con la técnica de bajo vacío (15-20 Pa) (ALUAR SAIC).

Observaciones histológicas bajo microscopio óptico Las muestras del sistema reproductor (de cada parte descripta desde el punto de vista macroscópico) fueron fijadas en solución de Bouin durante 4 horas y luego se preservaron en alcohol 70%. Posteriormente se realizó un procesamiento histológico de rutina para microscopía de luz en el laboratorio de Biología de la Reproducción y el Crecimiento de Crustáceos Decápodos del Departamento de Biodiversidad y Biología Experimental, FCEN, Universidad de Buenos Aires. Cada pieza se deshidrató en una secuencia creciente de alcoholes, luego se incluyó en parafina y se realizaron cortes seriados de 5-6-micrones de espesor con un micrótomo de Carl Zeiss (López-Greco et al. 2007). Las coloraciones utilizadas fueron hematoxilina- eosina, ácido periódico de Schiff y Tricrómico de Masson y las muestras fueron examinadas y fotografiadas con un microscopio Carl Zeiss Axioimager A1. Las secciones histológicas se compararon con observaciones de frotis de los receptáculos seminales y los vasos deferentes, para determinar la presencia/ausencia de

- 16 - Biología Reproductiva de Majoidea Anatomía del Sistema Reproductor espermatozoides/espermatóforos y relacionar su abundancia relativa en estas estructuras con su aspecto macroscópico.

RESULTADOS

El sistema reproductor en las hembras El sistema reproductor femenino de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa es bilateral y está formado por ovarios, oviductos que se expanden en sus respectivos receptáculos seminales que desembocan en vaginas que se abren al exterior en sus vulvas con opérculo (Figura 4). No se observaron diferencias en ninguna región del sistema reproductor entre el lado derecho e izquierdo, ni macroscópica ni microscópicamente.

Análisis macroscópico del sistema reproductor femenino. El ovario de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa consta de dos lóbulos laterales (derecho e izquierdo), conectados por un puente transversal ubicado por detrás del molinillo gástrico en la región pilórica entre el estómago y el corazón (Figura 4A). Los lóbulos anteriores se extienden desde el puente en la región pilórica hasta la región orbital pasando entre los tendones de las mandíbulas y curvándose lateralmente en el borde anterior del cefalotórax (Figura 4A). Los lóbulos posteriores se extienden paralelamente desde el puente de la región pilórica hasta la parte posterior del cefalotórax y su porción más distal se encuentra unida longitudinalmente y enrollada en la parte anterior del abdomen (Figura 4A). Macroscópicamente, se pudieron diferenciar: ovarios de color naranja y delgados (OV1) (Figura 5A), ovarios de color naranja pálido y consistencia medio-turgente (OV2) (Figura 5C), ovarios de color rojo y consistencia turgente (OV3) (Figura 5E) y ovarios de color naranja pálido y consistencia flácida (OV4) (Figura 5G). Los oviductos se extienden desde el lado ventro-lateral del lóbulo posterior del ovario hacia cada receptáculo seminal al nivel del 6º esternito toráxico (Figura 4B, 4C, 4D). Cada receptáculo seminal es una estructura aproximadamente esférica y opalescente (Figura 4B). Macroscópicamente, en función del tamaño y la forma, los receptáculos seminales se diferenciaron en cuatro tipos: colapsados (I), flácidos (II), parcialmente turgentes (III) y turgentes (IV) (Tabla I).

- 17 - Biología Reproductiva de Majoidea Anatomía del Sistema Reproductor Las vaginas de ambas especies son del tipo cóncavo, presentando la concavidad hacia la parte ventral del animal (Figura 6A). La parte dorsal tiene una pared gruesa, rígida y calcificada, mientras que la parte ventral es delgada y flexible. En ambas especies, cada vagina se sujeta al 6º esternito toráxico mediante fibras musculares (Figura 4C, 6B, 6C, 6D) que se insertan a lo largo de la parte flexible de la pared de la vagina hasta la base de la región ectodérmica de los receptáculos seminales (Figura 6B, 6C, 6D). Se ha observado que en la transición de juveniles a adultas, las hembras presentaron vaginas con diferentes morfologías (Figura 7; Capítulo II). En ejemplares morfométricamente inmaduros (Capítulo II), se observaron dos tipos de conformación: a) donde la estructura no se visualizó a simple vista (Figura 7A); y b) la estructura se evidenció macroscópicamente, mostrando una forma tubular con la porción apical (donde más tarde se unirá al receptáculo seminal) expandida (Figura 7B). En contraste, todas las hembras morfométricamente maduras (Capítulo II) presentaron la vagina unida al receptáculo seminal (Figura 4B, 4C, 6A). En ambas especies se observó un cambio en la morfología de la vulva entre juveniles y adultas (Capítulo II). En hembras morfológicamente inmaduras (Capítulo II) de L. tuberculosus esta estructura o no estuvo presente (Figura 8A) o comenzaba a formarse a través del solapamiento de una porción del esternito 5º y su proyección anteromedial sobre el 4º esternito (Figura 8B) o estuvo bien formada pero presentó una apertura parcial (Figura 8B, 8C, 8D). Sólo en ejemplares morfométricamente maduros (Capítulo II) la vulva presentó la apertura elíptica completamente formada e internamente bloqueada por un opérculo formado por la pared flexible de la vagina (Figura 8E, 8F). En las hembras de Libinia spinosa sólo se observaron ejemplares en las dos últimas categorías. El abdomen en ambas especies presentó dos conformaciones diferentes: plana (Figura 9A y 9C) ó cóncava (Figura 9B y 9D).

Análisis histológico del sistema reproductor femenino Los ovarios de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa presentaron diferentes características histológicas que se describen a continuación, en función de las diferencias macroscópicas previamente indicadas: - OV1: numerosas oogonias rodeadas de oocitos en vitelogénesis primaria, con citoplasma de aspecto homogéneo y basófilo (Figura 5B). - OV2: grupos de oogonias rodeadas por oocitos en vitelogénesis primaria, con citoplasma de aspecto homogéneo y basófilo. También se observaron oocitos comenzando la

- 18 - Biología Reproductiva de Majoidea Anatomía del Sistema Reproductor vitelogénesis secundaria con citoplasma fuertemente eosinófilo y numerosas células foliculares de forma redondeadas distribuidas al azar entre las oogonias y los oocitos en vitelogénesis primaria (Figura 5D). - OV3: presencia de una mayor proporción oocitos en vitelogénesis secundaria (tipo celular dominante en esta etapa) rodeados por células foliculares de configuración aplanada. (Figura 5F) - OV 4: presencia de algunos oocitos en vitelogénesis secundaria, oocitos atrésicos, folículos vacíos y oogonias (Figura 5H). Histológicamente los oviductos de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa están revestidos por un epitelio simple cilíndrico no secretor que se continúa con el epitelio mesodérmico de los receptáculos seminales (Figura 10A, 10B). Los receptáculos seminales presentan una región dorsal delimitada por un epitelio derivado del mesodermo y una región ventral delimitada por un epitelio derivado del ectodermo (Figura 10C, 10D). Estas estructuras están completamente rodeadas por una delgada capa externa de tejido conectivo con células musculares (Figura 11B). En ambas especies cada oviducto contacta el receptáculo seminal en la zona media de la región mesodérmica del receptáculo (Figura 10A, 10B). La región mesodérmica se caracteriza por un epitelio estratificado secretor con células cúbicas y cilíndricas fuertemente acidófilas (Figura 11A). En este epitelio estratificado se reconocen desde la parte más externa hacia la luz del receptáculo tres estratos: un estrato externo de anclaje que es continuo con el epitelio del oviducto, un estrato medio donde ocurre la proliferación celular y un estrato interno secretor que se compone de células con núcleos de gran tamaño y secreción holócrina (Figura 11B). La cantidad de capas celulares de los estratos varía considerablemente en grosor de acuerdo al estadio macroscópico del receptáculo seminal. En los receptáculos seminales (RS) categorizados como parcialmente turgentes la cantidad de capas celulares es de 10- 12 en el estrato de anclaje de L. tuberculosus y de 12-14 capas en L. spinosa y de 10 capas de células de espesor en L. tuberculosus y 15 capas en L. spinosa en el estrato medio. El estrato secretor es que el que presenta mayor variación en grosor de acuerdo al estadio macroscópico, siendo mayor en el RS de tipo II y menor en el tipo IV. La región ectodérmica del receptáculo seminal está formada por un epitelio secretor simple de células cilíndricas, con núcleos grandes en la zona basal. La secreción forma la cutícula que es delgada en la zona de transición meso-ectodérmica y se va engrosando hacia la vagina (Figura 12A).

- 19 - Biología Reproductiva de Majoidea Anatomía del Sistema Reproductor La zona de transición (meso-ectodérmica) es abrupta y difiere entre las dos especies. En L. spinosa presenta una estructura formada por células cilíndricas derivadas del epitelio ectodérmico con abundantes fibras musculares (Figura 10C, 13A, 13B), descripta y denominada “velum” por Diesel (1991). Éste se observa en todos los estadios macroscópicos de los receptáculos seminales (Tabla I). En el estadio I el velum se observa de manera relajada y frente a él una serie de pliegues (Figura 14A), en el estadio II se observa largo y firme separando el lumen de la región mesodérmica del de la región ectodérmica limitando el contenido seminal a la región dorsal (Figura 14B) y en los estadios III y IV el velum se acorta y no se observan pliegues en la pared opuesta por lo que el contenido seminal ocupa todo el lumen (Figura 14C, 14D). Por el contrario, L. tuberculosus no presenta velum. En esta especie se observan pliegues radiales de origen ectodérmico proyectándose hacia el lumen del receptáculo seminal en la zona de transición (Figura 10D, 13C, 13D). Los pliegues son numerosos, largos y relajados en el estadio I mientras que en el estadio II están erectos y dividen el lumen en las dos regiones limitando el contenido seminal a la zona dorsal. En los estadios III y IV no se observan los pliegues y las paredes del receptáculo están muy extendidas debido el gran contenido espermático (Tabla I). A partir de las observaciones histológicas y los frotis realizados se determinó la presencia de contenido espermático en los RS de tipo II, III y IV con espermatozoides libres en el estadio II, y espermatóforos/espermatozoides en los estadios III y IV. En todos los tipos de RS se observan dos tipos de material amorfo: uno fuertemente acidófilo, PAS (+) y Tricrómico de Masson (-) que rodea los espermatóforos (Figura 12C) y espermatozoides (Figura 12D), y otro fuertemente basófilo (Figura 13B). Los espermatóforos se localizaron únicamente en la zona ventral, los espermatozoides libres dispersos por todo el lumen y los oocitos maduros en la zona dorsal de los receptáculos seminales (Figura 11C, 11D). En estas especies no se observaron eyaculados discretos o paquetes de espermatozoides/espermatóforos dentro de los RS. La vagina de ambas especies está formada por un epitelio cilíndrico simple que secreta gruesas capas de cutícula que se continúan con la región ectodérmica del receptáculo seminal (Figura 15A, 15B). Histológicamente se pudo corroborar la inserción muscular en la pared flexible de la vagina (Figura 15A, 15B) y la presencia de un opérculo formado por un repliegue de la pared flexible de la vagina (Figura 15C).

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Figura 4. A- Vista dorsal del ovario de Libinia spinosa. La flecha superior indica el puente entre los lóbulos derecho e izquierdo, y la flecha inferior la unión en el plano longitudinal entre los lóbulos posteriores (Escala: 1 cm). B- Vista dorso-lateral del sistema reproductor de Leurocyclus tuberculosus, mostrando el lugar de conexión del oviducto en el receptáculo seminal y la posición relativa de la vagina (Escala: 0,5 cm). C- Vista lateral bajo MEB del receptáculo seminal, la vagina y la vulva de L. tuberculosus (Escala: 1 mm). D- Esquema del oviducto, el receptáculo seminal, la vagina y la vulva en vista medial-lateral para ambas especies. M: musculatura, O: ovario; Ov: oviducto; RE: región ectodérmica; RM: región mesodérmica; RS: receptáculo seminal; S: septos; V: vagina; Vu: vulva.

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Figura 5. Estadios del ovario maduro. A- Ovario delgado (OV1) de Leurocyclus tuberculosus (Escala: 1 cm). B- Histología del ovario delgado (OV1) de L. tuberculosus (Escala: 50 µm). C- Ovario medio turgente (OV2) de Libinia spinosa (Escala: 1 cm). D- Histología del ovario medio turgente (OV2) de L. spinosa (Escala: 50 µm). E- Ovario turgente (OV3) de Leurocyclus tuberculosus (Escala: 1 cm). F- Histología del ovario turgente (OV3) de L. tuberculosus (Escala: 50 µm). G- Ovario flácido (OV4) de L. tuberculosus (Escala: 1 cm). H- Histología del ovario flácido (OV4) de L. tuberculosus (Escala: 50 µm). CF: células foliculares; Og: oogonias; OP: oocito primario; OS: oocito secundario; Ov: ovario; RS: receptáculo seminal; TO: teca ovárica.

Figura 6. A- Microscopía electrónica de barrido del receptáculo seminal y la vagina de Leurocyclus tuberculosus en vista ventral. La flecha indica la cara cóncava de la vagina (Escala: 1 mm). B- Esquema general del receptáculo seminal y la vagina de L. tuberculosus y Libinia spinosa indicando la posición de las fibras musculares (flecha). C- Vista de la cara cóncava de la vagina. La flecha indica la inserción de los músculos (Escala: 1 mm). D- Microscopía electrónica de barrido de la cara cóncava de la vagina de Leurocyclus tuberculosus (Escala: 1 mm). La flecha indica el anclaje de las fibras musculares, ver detalle (Escala del detalle: 0,5 mm). EE: epitelio ectodérmico; O: ovario; RE: región ectodérmica; RM: región mesodérmica; RS: receptáculo seminal; V: vagina; Vu: vulva. - 23 - Biología Reproductiva de Majoidea Anatomía del Sistema Reproductor

Figura 7. Vagina de Leurocyclus tuberculosus. A- Vista interna donde se observa la zona de formación de la vagina. (Escala: 100 µm). B- Vista de la vagina con expansión apical (Escala: 1 mm). La flecha indica la salida al exterior de la vagina (posición de la vulva). V: vagina.

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Figura 8. Formación de la vulva de Leurocyclus tuberculosus. A- Hembra en vista ventral donde no se observa la vulva (Escala: 3 mm). B- Vulva en formación bajo MEB (Escala: 200 µm). C- Hembra en vista ventral donde se observa la formación de la vulva (Escala: 10 mm). D- Vulva formada con apertura parcial (foto al MEB, Escala: 500 µm) E- Hembra en vista ventral con vulva formada (Escala: 10 mm). F- Vulva formada y abierta con la presencia de opérculo (foto al MEB, Escala: 500 µm). Ab: abdomen; Vu: vulva.

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Figura 9. Diferentes morfologías del abdomen. Morfología plana: A- Leurocyclus tuberculosus (Escala: 0,5 cm) y en C- Libinia spinosa (Escala: 0,5 cm). Morfología cóncava: B- Leurocyclus tuberculosus (Escala: 1 cm) y D- Libinia spinosa (Escala: 1 cm).

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Figura 10. A- Histología de la región mesodérmica del receptáculo seminal de Leurocyclus tuberculosus donde se observa la inserción del oviducto (Escala: 1 mm). B- Detalle de la conexión del oviducto con el receptáculo seminal (flecha) (Escala: 0,5 mm). C- Esquema del receptáculo seminal de Libinia spinosa. D- Esquema del receptáculo seminal de Leurocyclus tuberculosus. CS: contenido seminal; EE: epitelio ectodermo; EM: epitelio mesodérmico; L: luz del receptáculo seminal; O: ovario; Ov: oviducto; P: pliegues; S: septo; V: vagina; Ve: velum; Vu: vulva.

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Figura 11. A- Sección longitudinal del receptáculo seminal de Leurocyclus tuberculosus, donde se observa la zona del epitelio mesodérmico y la zona del epitelio ectodérmico (Escala: 100 µm). B- Detalle del epitelio mesodérmico estratificado donde se pueden diferenciar los tres estratos celulares (Escala: 10 µm). C- Sección longitudinal del receptáculo seminal de L. tuberculosus donde se observan secreciones del receptáculo (coloreado en rosa) y las secreciones provenientes del macho (coloreado en azul) (Escala: 500 µm). D- Detalle de los oocitos rodeados por espermatozoides en el receptáculo seminal de L. tuberculosus (Escala: 100 µm). CS: contenido seminal; EA: estrato de anclaje; EE: epitelio ectodérmico; EM: epitelio mesodérmico; EP: estrato proliferativo; ES: estrato secretor; L: luz del receptáculo seminal; O: ovario; Oo: oocito; Se: secreción.

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Figura 12. A- Detalle histológico de la región ectodérmica del receptáculo seminal de Leurocyclus tuberculosus (Escala: 10 µm). B- Detalle de la región ectodérmica donde se puede observar el contenido seminal con espermatóforos y espermatozoides libres (Escala: 300 µm). C- Detalle de los espermatóforos (Escala: 50 µm). D- Microscopía electrónica de los espermatozoides libres en un receptáculo seminal de Leurocyclus tuberculosus (Escala: 10 µm). C: cutícula; EE: epitelio ectodérmico; L: lumen; RS: receptáculo seminal; SPF: espermatóforos; Spz: espermatozoides.

- 29 - Biología Reproductiva de Majoidea Anatomía del Sistema Reproductor

Figura 13. A- Sección histológica del receptáculo seminal de Libinia spinosa. Se puede observar el velum y los pliegues del lado opuesto en la zona de transición entre la región mesodérmica y la región ectodérmica (Escala: 25 µm). B- Detalle del velum (Escala: 15 µm). C- Sección histológica del receptáculo seminal de Leurocyclus tuberculosus. Se pueden observar los pliegues radiales en la zona de transición (Escala: 100 µm). D- Detalle de los pliegues (Escala: 50 µm). EE: epitelio ectodérmico; EM: epitelio mesodérmico; L: luz del receptáculo seminal; P: pliegues; Ve: velum.

- 30 - Biología Reproductiva de Majoidea Anatomía del Sistema Reproductor

Figura 14. Sección histológica del receptáculo seminal de Libinia spinosa mostrando los cuatro estadios macroscópicamente diferenciados. A- Estadio I (colapsado). B- Estadio II (flácido). C- Estadio III (parcialmente turgente). D- Estadio IV (turgente) (Escala en todas las figuras: 500µm). CS: contenido seminal; EE: epitelio ectodérmico; EM: epitelio mesodérmico; O: ovario; Oo: oocito; P: pliegues; Ve: velum.

- 31 - Biología Reproductiva de Majoidea Anatomía del Sistema Reproductor

Figura 15. A- Corte transversal de la vagina en Libinia spinosa (Escala: 100µm). B- Esquema del corte transversal de la vagina de ambas especies donde se indican las inserciones de las fibras musculares. C- Microscopia electrónica de barrido de un corte longitudinal de la vagina en Leurocyclus tuberculosus. La flecha indica las fibras musculares (Escala: 500µm). Cu: cutícula; E: epitelio simple ; L: luz de la vagina; M: fibras musculares; Op: opérculo; PF: pared flexible; PR: pared rígida.

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Tabla I. Descripción de los diferentes estadios de los receptáculos seminales (RS) de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa. (ZT= Zona de transición entre la región ectodérmica y mesodérmica).

Estadio I Estadio II Estadio III Estadio IV

Leurocyclus RS colapsado. Luz del RS con paredes flácidas. Luz del RS redondeado. Luz del RS ovalado. Luz del receptáculo receptáculo reducida sin receptáculo conspicua. Reducido receptáculo amplia, parcialmente completamente llena de tuberculosus contenido seminal. Se contenido espermático compuesto de ocupada con contenido contenido espermático. Se observan largos pliegues espermatozoides, no se observan espermático. Se observan observan espermatóforos y en la ZT relajados. espermatóforos. Alta actividad secretora espermatóforos y espermatozoides espermatozoides libres rodeados del mesodermo. Pliegues de la ZT libres rodeados de secreción. No se de secreción. No se observan extendidos. observan pliegues en la ZT. pliegues en la ZT.

Libinia RS colapsado. Luz del RS con paredes flácidas. Luz conspicua, RS redondeado. Luz amplia RS ovalado. Luz completamente receptáculo reducida, no se con reducido contenido espermático ocupada con contenido llena de contenido espermático, spinosa observa contenido seminal. compuesto de espermatozoides libres. No espermático, se observan se observan espermatoforos y ZT con velum relajado y se observan espermatóforos. Alta espermatóforos y espermatozoides espermatozoides libres rodeados presencia de pliegues en la actividad secretora de la región libres rodeados de secreción. ZT de secreción. ZT con velum corto pared opuesta. mesodérmica. ZT con velum alargado y con velum corto y sin pliegues. y sin pliegues. pliegues.

Biología Reproductiva de Majoidea Anatomía del Sistema Reproductor El sistema reproductor en machos En ambas especies, el sistema reproductor masculino es bilateral, está compuesto por un par de testículos que se continúan en sus respectivos vasos deferentes que desembocan al exterior en la coxa del 5o par de pereiópodos (Figura 16A, 16B). Externamente se observan los gonopodios (Figura 16C). No se observaron diferencias entre el lado derecho e izquierdo del sistema reproductor ni macroscópicamente ni histológicamente, para ambas especies.

Análisis macroscópico del sistema reproductor masculino. En ambas especies, el testículo es una estructura par, de forma tubular y color blanco, altamente enrollado y dorsal al hepatopáncreas (Figura 16A, 16B). Se encuentra en la parte anterior del cefalotórax adherido a la zona dorsal de éste (Figura 16A, 16B). En los vasos deferentes de ambas especies se pueden reconocer tres regiones: (Figura 16A, 16B). -Vaso deferente proximal: La región proximal o anterior es continua al testículo, está enrollada y aumenta su diámetro hacia la región media (Figura 16A, 16B). - Vaso deferente medio: La región media está enrollada en su porción más anterior y es recta hacia la parte distal (Figura 16A, 16B). Esta zona varía macroscópicamente en relación a su textura y diámetro y fue caracterizada como: medio turgente, turgente y flácida (Figura 16A, 16B). - Vaso deferente distal: La región posterior o distal presenta una textura gelatinosa y se ubica a la altura de la coxa del 5o par de pereiópodos terminando en una papila peneana (Figura 16A, 16B, 16C). Los gonopodios están constituidos por el primer y segundo par de pleópodos (Figura 17A, 17B). En ambas especies, el primer par presenta una estructura cilíndrica extendiéndose desde la base del abdomen hasta el 3er segmento toráxico, con una curvatura hacia los laterales (Figura 17C, 17D, 17G). Dentro de él se introduce la papila peneana y el segundo par de pleópodos (Figura 17C, 17D). El segundo par es corto, y se introduce en la parte basal del primer par (Figura 17A, 17B). El primer par de pleópodos presenta diferencias entre especies en su porción apical (Figura 17C, 17D, 17E, 17F). En L. spinosa se observa el extremo apical bifurcado con sus extremos membranosos (Figura 17 E) mientras que en L. tuberculosus el primer pleópodo termina en forma ahusada y rígida con una expansión lateral con espinas en su extremo apical (Figura 17F). Ambas especies presentan sobre el lado externo espínulas en su parte apical ampliamente distribuidas. También se observó que los individuos

- 34 - Biología Reproductiva de Majoidea Anatomía del Sistema Reproductor inmaduros (Figura 18A, 18B; Capítulo II) presentaban gonopodios con setas en toda su longitud, sin prolongaciones ni espinas apicales (Figura 18C, 18D).

Análisis histológico del sistema reproductor masculino. Los testículos de ambas especies presentan tubulos claramente diferenciados (Figura 19A), presentando en su interior algún estadio de la espermatogénesis/espermiogénesis (Figura 19A). También se observa que siempre persiste un núcleo de espermatogonias generalmente en disposición periférica (Figura 19A). Los espermatozoides de ambas especies presentan forma aproximadamente triangular, con un núcleo central rodeado de citoplasma. Histológicamente la región proximal de los vasos deferentes de ambas especies se caracteriza por un epitelio simple cúbico (Figura 19B, 19C). En Leurocyclus tuberculosus no se observan espermatóforos pero si gran cantidad espermatozoides libres (Figura 19B). En Libinia spinosa se observa gran cantidad de secreción acidófila con espermatozoides libres y espermatóforos (Figura 19C). La región media presenta un epitelio simple cilíndrico y secretor (Figura 19D, 19E). En ambas especies se observan espermatóforos rodeados de secreción, sin embargo, en L. tuberculosus se observa secreción basófila (Figura. 19D) y en L. spinosa se observa secreción acidófila (Figura 19E). No se observan espermatozoides libres en esta región. La región distal en ambas especies se caracteriza por un epitelio simple plano (Figura 19F, 19G). En ambas especies, se observan únicamente espermatóforos rodeados de fluido espermático, en mayor o menor proporción en función a la categorización macroscópica de la región media (Figura 19F, 19G). Las diferencias histológicas encontradas en función de la observación macroscópica se relacionaron con la cantidad de contenido espermático (secreciones y espermatóforos). La realización de los frotis de los vasos deferentes corroboró esta observación. En ambas especies, los espermatóforos son estructuras esféricas constituidas por una masa de espermatozoides y secreciones rodeados de una pared acelular (Figura 19F, 19G).

- 35 - Biología Reproductiva de Majoidea Anatomía del Sistema Reproductor

Figura 16. Sistema reproductor masculino. A- Vista dorsal interna de un macho de Leurocyclus tuberculosus con el caparazón desplazado hacia adelante. B- Vista lateral interna de un macho de L. tuberculosus. C- Vista ventral de un macho de Libinia spinosa. Escala de todas las figuras: 1 cm. Gp: gonopodio; PP: papila peneana; Ts: testículo; VDD: vaso deferente distal; VDM: vaso deferente medio; VDP: vaso deferente proximal

- 36 - Biología Reproductiva de Majoidea Anatomía del Sistema Reproductor

Figura 17. Gonopodios. A- Vista ventral de Libinia spinosa con el abdomen rebatido. Se observan el 1er y 2º par de pleópodos (Escala: 5 mm). B- Vista ventral de Leurocyclus tuberculosus con el abdomen rebatido. Se observan el 1er y 2º par de pleópodos (Escala: 5 mm). C- Foto bajo microscopía electrónica del 1er par de pleópodos de L. spinosa. La flecha negra indica la abertura donde se inserta el 2º par. (Escala: 1 mm). D- Foto bajo microscopía electrónica del 1er par de pleópodos de L. tuberculosus. La flecha negra indica la abertura donde se inserta el 2º par (Escala: 1 mm). E- Foto bajo microscopía electrónica de extremo apical del 1er par de pleópodos de L. spinosa (Escala: 200 µm). F- Foto bajo microscopía electrónica de extremo apical del 1er par de pleópodos de L. tuberculosus (Escala: 200 µm). G- Foto bajo microscopía electrónica de un corte transversal del 1er par de pleópodos de L. tuberculosus mostrando su estructura tubular (Escala: 200 µm).

- 37 - Biología Reproductiva de Majoidea Anatomía del Sistema Reproductor

Figura 18. Morfología del gonopodio de Leurocyclus tuberculosus en individuos de tallas menores a la talla de madurez sexual morfométrica (Capítulo II). A- Vista ventral de un ejemplar macho bajo MEB (Escala: 2 mm). B- Primer par del gonopodio derecho e izquierdo (Escala: 100 µm). C- Primer par del gonopodio (Escala: 500 µm). D- Detalle del primer par del gonopodio (Escala: 100 µm).Gp: gonopodio; St: setas.

- 38 - Biología Reproductiva de Majoidea Anatomía del Sistema Reproductor

Figura 19. Histología del sistema reproductor masculino. A- Testículo de Libinia spinosa (Escala: 50 µm). B- Vaso deferente proximal de Leurocyclus tuberculosus (Escala: 50 µm). C- Vaso deferente proximal de Libinia spinosa (Escala: 50 µm). D- Vaso deferente medio de L. tuberculosus (Escala: 50 µm). E- Vaso deferente medio de L. spinosa (Escala: 50 µm). F- Vaso deferente distal de L. tuberculosus (Escala: 50 µm). G- Vaso deferente distal de L. spinosa (Escala: 50µm). Las flechas blancas señalan los espermatozoides y las flechas negras los espermatóforos. Ep: epitelio; LT: tubulos testiculares.

- 39 - Biología Reproductiva de Majoidea Anatomía del Sistema Reproductor DISCUSIÓN

La morfología del sistema reproductor de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa muestra un patrón similar al observado en otros Eubrachyura en general y Majoidea en particular (Ryan 1967; Hartnoll 1968; Johnson 1980; Diesel 1989; Krol et al. 1992; Moriyasu y Benhalima 1998; Sainte-Marie y Sainte-Marie 1998; Benhalima y Moriyasu 2000; Simeó et al. 2009). Sin embargo se observaron algunas diferencias macroscópicas y microscópicas entre las especies analizadas en esta tesis y los Majoidea previamente estudiados. Las hembras de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa presentan gónadas que no tienen la típica forma de “H" descripta por Krol et al. (1992), sino que poseen los lóbulos posteriores fusionados en su parte distal. Esta morfología también ha sido observada en Maja brachydactyla (Rotllant et al. 2007) pero no se la ha asociado a ninguna funcionalidad particular. Se observó para las hembras de ambas especies que en la fase de diferenciación de los oocitos ocurre un incremento considerable del volumen citoplasmático asociado a la vitelogénesis similar a otros Majoidea. También se han observado las células foliculares, que podrían estar implicadas en el proceso de reabsorción oocitaria, producción de vitelo, formación del corion y en la producción de hormonas, como en otras especies de Eubrachyura (Adiyodi y Subramonian 1983; Krol et al. 1992; Pochon-Masson 1994). Considerando que la observación histológica del ovario permite identificar con precisión el grado de madurez ovárica, podemos inferir que una hembra morfométricamente madura presenta luego de la muda puberal (Capítulo II) un ovario delgado iniciando la vitelogénesis primaria, que comienza el proceso de maduración (ovarios medio turgentes de color naranja) hasta llegar a la madurez total donde se observan en mayor proporción oocitos secundarios (ovarios rojos y turgentes). Al desovar, los ovarios se observan flácidos y de color naranja pálido, con oocitos secundarios atrésicos, acúmulos de células foliculares y folículos vacíos. Los receptáculos seminales de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa presentan una estructura similar a la descripta en otros Majoidea. Se diferenció una región derivada del mesodermo con tres estratos celulares y una región de origen ectodérmico con su cutícula. A pesar de las similitudes morfológicas, estas regiones han recibido diferentes nombres de acuerdo a diferentes autores. La región dorsal fue denominada cámara dorsal (o cámara de almacenamiento de esperma) en Inachus phalangium (Diesel 1989) y "espermateca" (o cámara de almacenamiento) en Chionoecetes opilio (Beninger et al. - 40 - Biología Reproductiva de Majoidea Anatomía del Sistema Reproductor 1988; Sainte-Marie 1998) mientras que la región ventral fue denominada cámara ventral (o cámara de inseminación) en I. phalangium (Diesel 1989) y cámara intermedia (o zona limitada por cutícula) en C. opilio (Sainte-Marie 1998). En los receptáculos seminales de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa se encontró un tipo diferente de conexión oviducto-receptáculo. No se observó la conexión típica del tipo ventral descripta en otros Majoidea (Diesel 1991, Sainte-Marie y Sainte- Marie, 1998), ni la típica conexión dorsal de Portunoidea y Xanthoidea (Diesel 1991), sino que ambas especies presentan la conexión oviducto-receptáculo de posición intermedia. Incluso en un trabajo reciente de anatomía de L. spinosa (Sal Moyano et al. 2010a) también se indica la conexión de tipo ventral. A partir de las observaciones derivadas de esta tesis proponemos para Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa la denominación de conexión oviducto-receptáculo seminal de tipo "intermedio" entre las conexiones del ventral y dorsal descriptas originalmente por Diesel (1991). Esta conexión intermedia ha sido recientemente observada en los Majoidea Microphrys bicornutus (Mithracinae) y Macrocoeloma trispinosum (Mithracinae) (López-Greco, obs. pers.). La conexión intermedia podría tener una significativa importancia en cuanto a la paternidad de la progenie. Como fue mencionado en la introducción, la conexión ventral oviducto-receptáculo estaría asociada a una mayor probabilidad de que sea el último macho que copula antes de la puesta el que transfiera su genoma a la descendencia, mientras que la conexión dorsal estaría asociada a que el primer macho que copula antes de la puesta transfiera su genoma. Sobre esta base, se propone que en las especies con conexión oviducto-receptáculo de tipo intermedia, como lo observado en Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa, ni el primero ni el último macho estarían “favorecidos” para la fecundación de los oocitos de una ovulación. Esto nos permite proponer que la competencia espermática en el receptáculo seminal con conexión intermedia podría ser más intensa que en los tipos ventral y dorsal e incluso que una puesta de huevos podría ser fecundada por varios machos. Estudios de ADN de los embriones podrían determinar si este tipo de conexión está vinculado con paternidad múltiple (Urbani et al. 1998). Si realmente la competencia espermática es mayor asociada a este diseño oviducto-receptáculo de tipo intermedio, otros mecanismos (por ejemplo, comportamentales) podrían reducir o minimizar el efecto de una mayor competencia espermática posible desde el punto de vista anatómico. En los receptáculos seminales de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa no se han observado eyaculados discretos o paquetes de espermatóforos/espermatozoides a diferencia de las especies Inachus phalangium, I. communissimus, Pisa tetraodon,

- 41 - Biología Reproductiva de Majoidea Anatomía del Sistema Reproductor Macropodia rostrata, Maja verrucosa (Diesel 1989) y M. squinado (Diesel 1991). Esto podría estar relacionado con diferentes estrategias de apareamiento dentro de los Majoidea y/ó vinculadas a tiempos diferenciales de dehiscencia de los espermatóforos en los receptáculos seminales. Por otra parte las inferencias sobre la funcionalidad de las regiones del receptáculo seminal de las especies estudiadas parecen contradecir lo propuesto hasta el momento. De acuerdo a las publicaciones en el tema, los Majoidea almacenan el contenido seminal en la región mesodérmica del receptáculo, pero la fecundación ocurre en la región ectodérmica (Diesel 1989; Sainte Marie y Sainte Marie 1998), lo cual sería estructuralmente posible dada la ventralidad de la conexión oviducto-receptáculo de las especies estudiadas. Por el contrario, los cortes histológicos de los receptáculos seminales de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa muestran que los espermatozoides libres y los oocitos se encuentran en la región mesodérmica. Esta evidencia podría indicar que en estas especies la fecundación ocurre en la región mesodérmica del receptáculo. Otra diferencia funcional a nivel de los receptáculos seminales de los Majoidea se observa en las estructuras morfológicamente similares ubicadas en la zona de transición entre la región meso y ectodérmica. Se han descripto dos tipos de estructuras en la zona de transición: el “velum” caracterizado por Diesel (1989) en Inachus phalangium, I. communissimmun, Pisa tetraodom y Maja verrucosa, y los “pliegues” caracterizados por Beninger et al. (1993), Lanteigne et al. (1996) y Sainte Marie y Sainte Marie (1998) en Chionoecetes opilio. En esta tesis observamos la presencia del velum en Libinia spinosa y pliegues radiales en Leurocyclus tuberculosus. Diesel (1989) indica que la contracción del velum antes y durante el desove particiona el receptáculo formando una cámara de fertilización. En esta tesis proponemos que la contracción del velum en Libinia spinosa, sería el equivalente funcional de una “válvula” que delimita la región mesodérmica en las hembras con receptáculos en estadio II, preservando así la pérdida del contenido seminal luego del desove. Estructuras similares a los pliegues encontrados en Leurocyclus tuberculosus se han descripto en Chionoecetes opilio (Oregoniidae) por Beninger et al. (1993), Lanteigne et al. (1996) y Sainte-Marie y Sainte-Marie (1998), quienes sugirieron que los pliegues cuticulares móviles y muscularizados podrían ser utilizados para desplazar los eyaculados anteriores. Beninger et al. (1993) y Lanteigne et al. (1996) propusieron que los pliegues jugaría un papel fundamental en la mezcla de los espermatozoides con los oocitos libres

- 42 - Biología Reproductiva de Majoidea Anatomía del Sistema Reproductor para facilitar el encuentro entre gametas y direccionar a los oocitos desde el oviducto hacia la vulva. Considerando los tipos de receptáculos descriptos proponemos que los pliegues en L. tuberculosus podrían estar actuando como un “diafragma” restringiendo el fluido seminal a la región del mesodermo en el estadio II, al igual que el velum en Libinia spinosa. Relacionando lo observado macroscópicamente, histológicamente y la propuesta sobre la funcionalidad del velum y los pliegues de los receptáculos seminales, se propone para las hembras de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa un ciclo reproductivo en el cual las hembras morfométricamente maduras (Capítulo II) que aún no han copulado, poseen un receptáculo seminal con sus paredes colapsadas, el velum o los pliegues relajados y cortos (estadio I) y un ovario delgado con oocitos primarios en desarrollo. Posteriormente, las hembras se aparean (receptáculos seminales de estadio II, III y IV con contenido espermático) y presentan ovarios en maduración, maduros y desovados dependiendo del ciclo ovárico (ver Capítulo II). Sin embargo, en el rango de ejemplares que han copulado, podemos diferenciar a aquellas hembras con receptáculo III y IV, donde los pliegues o el velum se retraen para permitir un mayor almacenamiento dado que los lúmenes de las dos regiones no están separados. Contrariamente, en las hembras con receptáculo flácido (tipo II), el velum o los pliegues están contraídos y erectos separando las regiones del receptáculo, limitando el contenido espermático a la región dorsal, y reteniendo los espermatozoides almacenados para utilizarlos en próximos desoves independientemente de posteriores cópulas. Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa presentan vaginas del tipo cóncavo al igual que otras especies de Majoidea (Hartnoll 1968; Sainte-Marie 1998). Se ha indicado que las hembras con este patrón de vagina, poseen músculos fuertemente adheridos a la parte cóncava de la pared flexible que le permiten a la hembra abrir o cerrar la luz de la vagina por contracción o relajación muscular (Hartnoll 1968). En las especies estudiadas en esta tesis las fibras musculares no sólo se insertan en la parte cóncava de la pared flexible de la vagina, sino que también se extienden hasta el engrosamiento de la pared ventral de la región ectodérmica del receptáculo seminal. Esto probablemente le permite a la hembra abrir más ampliamente el canal para la evacuación de los huevos (oocitos fecundados dentro de los receptáculos) hacia los pleópodos. Las vulvas de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa están internamente bloqueada por una membrana flexible continua con la pared interna de la vagina como fue observado en Hyas araneus (Hartnoll 1968). Respecto a otros Majoidea, en esta tesis se

- 43 - Biología Reproductiva de Majoidea Anatomía del Sistema Reproductor describe por primera vez el tipo de cambios anatómicos asociados a la diferenciación del canal vaginal y vulva. Los machos de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa presentan testículos de estructura tubular con lóbulos laterales que muestran sincronismo en la espermatogénesis y espermiogénesis dentro de ellos pero no entre ellos, como lo descripto para otros Eubrachyura (Johnson 1980; Krol et al. 1992; Simeó et al. 2009). Los vasos deferentes de las especies estudiadas presentan similar regionalización macroscópica que en otros Eubrachyura y Majoidea en particular, como Inachus phalangium y Chionoecetes opilio (Beninger et al. 1988; Hinsch 1988; Diesel 1989; Krol et al. 1992; Talbot y Beach 1989). Usualmente se postula que en los Decapoda el vaso deferente es la estructura responsable del “empaquetamiento” de los espermatozoides y de la formación definitiva de los espermatóforos (Krol et al. 1992). Sin embargo se ha observado una diferencia entre las especies estudiadas en función al sitio de formación de los espermatóforos. En Libinia spinosa se observaron espermatóforos en la parte anterior de la región proximal del vaso deferente, similar a lo descripto por Moriyasu et al. (2002) para Cancer borealis. En Leurocyclus tuberculosus los espermatóforos se observaron en la región media del vaso deferente, similar a lo descripto por Hinsch (1988) quien propone que los espermatóforos se forman en el vaso deferente medio durante el descenso hacia el vaso deferente distal. Asimismo, las especies estudiadas en esta tesis presentan una diferencia en el pH de las secreciones del vaso deferente. Libinia spinosa produce secreción altamente acidófila en el vaso deferente proximal, mientras que en Leurocyclus tuberculosus la secreción es basófila. Por otra parte, es necesario mencionar que con el nivel de resolución de las técnicas empleadas no se han observado diferencias entre ambas especies en la morfología de los espermatozoides y los espermatóforos. Sin embargo como la morfología espermática es especie-específica (Sainte-Marie 1999) es esperable que existan diferencias a nivel de ultraestructura que no fueron evaluadas en la presente tesis. Dado que los espermatozoides de los Eubrachyura son inmóviles (Jamieson et al. 1995) el éxito reproductivo del macho depende de la posición precisa de los espermatozoides dentro de los receptáculos seminales lo que está mediado por las estructuras de transferencia espermática y su “óptima” interacción con la vulva, la vagina y el receptáculo seminal (Türkay 1975; Brandis et al. 1999). En relación a la morfología del 1er pleópodo, se observaron diferencias a nivel apical entre las dos especies estudiadas; Libinia spinosa presentó una morfología similar a la descripta para Maja squinado (Diesel 1991) y L. tuberculosus similar a la descripta

- 44 - Biología Reproductiva de Majoidea Anatomía del Sistema Reproductor para Pisa tetraodon (Diesel 1991). Probablemente estas diferencias morfológicas indiquen una diferencia en la forma en que ocurre la transferencia espermática. La diversidad de forma de los gonopodios en Eubrachyura se propone como una adaptación para transferir los espermatóforos de la manera más favorable que incremente en el macho la probabilidad de fecundar la mayor cantidad de oocitos (Diesel 1991; Rorandelli et al. 2010). En los machos de varias especies de cangrejos del género Uca los segmentos terminales del primer par de pleópodos son especie específicos y muestran un ajuste anatómico a los receptáculos seminales (Lautenschlager et al. 2010). En Inachus phalangium se ha demostrado recientemente que los machos transfieren a las hembras espermatóforos de distintos tamaños y que en el momento de la transferencia espermática el extremo apical dentado del primer par de pleópodos rompe algunos espermatóforos liberando a los espermatozoides contenidos dentro del receptáculo seminal siendo considerado como un mecanismo de desplazamiento espermático (Rorandelli et al. 2010). También se ha descripto para los machos de Majoidea (Rodrigues 1980; Bauer 1986; Beninger et al. 1991; Abele 1992) que con el extremo apical del primer par de pleópodos pueden desplazar el/los eyaculado/s de machos previos permitiéndoles colocar sus propios espermatóforos más próximos a los oocitos aumentando sus posibilidades de fecundar. Para Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa este capítulo de la tesis es la primera caracterización de los gonopodios y aún quedan numerosas preguntas por explorar en relación al rol de estas estructuras y su vinculación con los mecanismos de transferencia y competencia espermática.

En un taxón complejo como los Majoidea (Ng et al. 2008), las diferencias entre especies en relación con los receptáculos seminales (tipo de conexión oviducto- receptáculo, la morfología y la función del velum y los pliegues internos de la zona de transición) y la morfología de los gonopodios podrían estar asociadas con diferentes estrategias de apareamiento y mecanismos de competencia espermática. El estudio morfo-funcional de los componentes del sistema reproductor podría además constituir una herramienta para revisar las propuestas filogenéticas actuales sobre el taxón.

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Leurocyclus tuberculosus

Adquisición de Madurez Sexual

CAPÍTULO II

Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual CAPÍTULO II

Adquisición de la madurez sexual de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa

INTRODUCCIÓN

La reproducción involucra aspectos morfométricos, gonadales, etológicos y ecológicos que comienzan a interactuar en un individuo a partir del momento en que adquiere la madurez sexual, siendo el inicio de la reproducción un parámetro clave de la historia de vida de los organismos (Giese y Pearse 1974; Sastry 1983; Ebert 1994). La maduración sexual en los Eubrachyura abarca: 1) la muda de pubertad que involucra cambios a nivel morfométrico en los órganos relacionados con el apareamiento y la incubación, 2) la maduración gonadal y 3) el comportamiento reproductivo (Pérez 1928; Hartnoll 1965, 1974, 1978, 1982, 1985). Por ende, la adquisición de madurez sexual implica cambios morfométricos, gonadales y funcionales que deben ser considerados para definir la talla de adquisición de la madurez sexual en una especie determinada (López et al. 1997; López Greco y Rodríguez 1999). Según el criterio morfométrico, la madurez sexual ocurre al producirse un cambio en la tasa de incremento de las dimensiones de una o más estructuras corporales con alguna función en la reproducción respecto de una medida estándar de la talla de los individuos. En las hembras, los cambios en la relación entre el ancho máximo del abdomen y el ancho ó largo máximo del caparazón son los más utilizados como indicadores de la adquisición de madurez morfométrica. Este cambio revela un aumento en la capacidad de dicha estructura para dar soporte y proteger los huevos durante la incubación (Hartnoll 1974; Davidson y Mardsen 1987; González-Gurriarán y Freire 1994; Alunno-Bruscia y Sainte-Marie 1998). En los machos, se consideran los cambios en las dimensiones de dos pares de estructuras relevantes para la reproducción: los gonopodios, que funcionan como estructuras de transferencia espermática durante la cópula (Hartnoll 1965; Davidson y Mardsen 1987; González-Gurriarán y Freire 1994; Orensanz et al. 1995; López et al. 1997), y las quelas, que cumplen un rol relevante durante el cortejo, la cópula o el combate entre machos por su acceso a las hembras o a un recurso reproductivo, como pueden ser los refugios (Conan y Comeau 1986; Alunno-Bruscia y Sainte-Marie

- 47 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual 1998; Muiño et al. 1999; Sampedro et al. 1999; López-Greco et al. 2000; Schejter y Spivak 2005). Desde el punto de vista gonadal, la madurez sexual se evalúa a través de la observación de la condición de las gónadas en forma directa (análisis macroscópico) y/ó a través de secciones histológicas (análisis microscópico). En este último caso, se considera que se ha alcanzado la madurez cuando en los ovarios se observan oocitos en vitelogénesis secundaria y en los testículos se evidencia la presencia de espermatozoides (López-Greco 1997a; López-Greco y Rodríguez 1999). Un individuo se considera funcionalmente maduro si tiene la capacidad de participar efectivamente del evento reproductivo (López-Greco y Rodríguez 1999). Hartnoll (1969) define como machos funcionales a aquellos que pueden copular exitosamente y hembras funcionales a aquellas capaces de tener una puesta de huevos. Existen algunos criterios cualitativos generales para establecer la talla a la que se incorporan ejemplares de modo efectivo a la función reproductiva. En las hembras, la condición de ovígeras, la observación de contenido espermático en los receptáculos seminales y la observación de tapones espermáticos (sperm plugs) en vagina u oviductos son algunos de los criterios mayormente utilizados (Hartnoll 1965, 1969; González- Gurriarán y Freire 1994; Orensanz 1995; López-Greco 1997a; López-Greco y Rodríguez 1999). En los machos, la presencia de espermatóforos en el vaso deferente medio o distal son usuales indicadores de madurez funcional (Hartnoll 1969; Du Preez y McLachlan 1984; Jewett et al. 1985; López et al. 1997; Alunno-Bruscia y Sainte-Marie 1998; García- Madrigal y Bastida Zavala 1998; Watters y Hobday 1998; López-Greco y Rodríguez 1999; Sampedro et al. 1999; Schejter y Spivak 2005; Conan et al. 2006; Hall et al. 2006). Para ambos sexos también han sido consideradas las marcas de cópula (Robertson y Kruger 1994) así como la observación de apareamientos en campo o laboratorio (Stevens et al. 1993; Paul y Paul 1996; López-Greco y Rodríguez 1999) como indicadores de madurez funcional. Dependiendo de la especie, los individuos pueden alcanzar la madurez gonadal, morfométrica y funcional a diferentes tallas. En un estudio sobre varias especies de Majoidea, Hartnoll (1963) observó que la talla de madurez morfométrica no coincidía con la de madurez gonadal. En otros estudios también se observó que la talla de madurez morfométrica y gonadal es menor a la de madurez funcional, por lo que aunque los ejemplares son morfométrica y gonadalmente maduros, no pueden copular debido a que son desplazados por otros machos ó hembras más grandes (Krouse 1973; Berril y Arsenault 1982; Zucker 1984; Donaldson y Adams 1989; Mac Diarmid 1989; Robertson y

- 48 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual Kruger 1994; Orensanz et al. 1995; Moriyasu y Comeau 1996; López-Greco y Rodríguez 1999). Asimismo, la talla de adquisición de madurez sexual para una especie puede variar entre poblaciones debido a que tanto el crecimiento como el proceso de maduración están adaptados a los regímenes locales de temperatura, disposición de alimento, salinidad y fotoperíodo (Jones y Simons 1983; Conde y Díaz 1989; Grandjean et al. 1997; López Greco y Rodríguez 1999). Durante la etapa de crecimiento los caracteres sexuales secundarios se desarrollan progresivamente a través de una serie de mudas “pre-puberales” y alcanzan su plena diferenciación en la muda de pubertad o “muda puberal”. Este término fue definido por Pérez (1928) en un estudio realizado sobre Maja squinado en que se distinguieron tres etapas de crecimiento: una etapa que correspondía a los individuos sexualmente indiferenciados, una fase de juvenil o prepuberal y una fase adulta, siendo la muda puberal la que indicaba el inicio de la última fase. Posteriormente se distinguieron las mismas fases en otros Majoidea (Sainte Marie y Hazel 1992; Sainte Marie 1993; Alunno- Bruscia y Sainte Marie 1998; Carmona-Suárez 2003). En varias especies de Majoidea se ha observado que la muda de pubertad coincide con la muda terminal (Yoshida 1941; Watson 1972; Hilsinger 1976; González Gurriarán et al. 1998), lo que los hace particularmente interesantes en cuanto a que sus cambios morfológicos ocurren durante la fase inmadura ya que luego no se producirá ninguna muda. A partir de esta muda, los cangrejos inician su actividad reproductiva y no continúan creciendo. Sin embargo, en Chionoecetes bairdii se observó que sólo en las hembras la muda puberal sería también la terminal, mientras que los machos continuarían creciendo a tasas mucho menores que los juveniles luego de la muda puberal (Donaldson y Adams 1989). También se ha observado en Majoidea que las hembras durante la muda puberal son asistidas por un macho y deben ser fertilizadas en los días inmediatos a esa muda, mientras el exoesqueleto permanece menos calcificado, para producir una progenie viable (Watson 1970, 1972; Paul et al. 1983; Donaldson y Adams 1989; Sainte-Marie y Hazel 1992). Posteriormente las hembras se aparean también con el exoesqueleto rígido en la fase de intermuda (Somerton 1981; Taylor et al. 1985). Las dos especies de Majoidea estudiadas en esta tesis son especies anfioceánicas de amplia distribución latitudinal (Boschi et al. 1992; Spivak 1997; Braga et al. 2002; Vinuesa 2005) sin embargo son escasos los estudios sobre ellas. En Leurocyclus tuberculosus se ha logrado detectar discontinuidades en las relaciones entre algunas dimensiones corporales que distinguen a los ejemplares morfométricamente inmaduros y

- 49 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual maduros en las costas de Brasil (Almeida et al. 2007) y Puerto Madryn (Barón et al. 2009). Aún así faltan por determinar aspectos tales como la talla de madurez de L. tuberculosus desde un punto de vista gonadal y funcional y analizar otros cambios en la morfología de los caracteres asociados a la madurez sexual. En la especie Libinia spinosa falta evaluar la totalidad de los aspectos mencionados en las costas patagónicas y existe un trabajo reciente sobre madurez morfométrica y gonadal en Mar del Plata (Sal Moyano et al. 2010b). En función de la carencia de información sobre los mencionados aspectos, se planteó el siguiente objetivo para este capítulo.

OBJETIVO

Establecer los patrones de maduración sexual de ambas especies considerando los cambios morfométricos, gonadales y funcionales, y analizar su cronología estacional.

En el marco de este objetivo se plantearon las siguientes hipótesis:

Hipótesis 1: En los dos sexos las tallas de madurez sexual morfométrica, gonadal y funcional no son coincidentes para ninguna de las dos especies.

Hipótesis 2: La talla de madurez sexual morfométrica de las hembras es menor que la talla de madurez morfométrica de los machos, en ambas especies.

Hipótesis 3: Para ambos sexos de ambas especies la madurez gonadal es alcanzada sincrónicamente en un periodo acotado del ciclo anual.

MATERIALES Y MÉTODOS

Muestreo Se colectaron mensualmente ejemplares de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa en los golfos Norpatagónicos (41-43ºS; 64-65ºW) y en playa Magagna (43º 17´S; 64º 05´W) (Chubut), Argentina, desde enero del 2006 hasta diciembre del 2009. Las campañas realizadas a playa Magagna se sumaron a los muestreos debido a la falta de ejemplares inmaduros de L. spinosa en las aguas de los golfos Norpatagónicos (Capítulo

- 50 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual III). Los muestreos de cangrejos vivos se realizaron mediante buceo con equipo autónomo y utilizando trampas (como es descripto en el Capítulo III) a profundidades de entre 20 a 40 m. También se obtuvieron ejemplares vivos y muertos por recolección manual en la zona intermareal. Una vez en el laboratorio, los individuos fueron clasificados por especie y sexo. El sexo se determinó por observación directa de la región abdominal (Figura 20). Se capturaron 1640 ejemplares de Leurocyclus tuberculosus (1011 hembras y 539 machos) y 645 ejemplares de Libinia spinosa (283 hembras y 362 machos).

A B

Figura 20. Libinia spinosa. A- Vista ventral de una hembra. B- Vista ventral de un macho. Ab: abdomen. (Escala = 1cm).

Para determinar la talla de adquisición de la madurez sexual, se utilizaron diferentes criterios:

Madurez gonadal Para determinar el estado de madurez gonadal de los individuos de ambas especies se disecó y caracterizó macroscópicamente la condición de partes representativas de los sistemas reproductores de los machos (testículos y vasos deferentes) y hembras (ovario y receptáculos seminales) en función de la forma, coloración y tamaño relativo. Sobre la base de observaciones preliminares y tomando en cuenta escalas desarrolladas para otros Majoidea (Jadamec et al. 1999), se diseñó una escala de madurez gonadal “ad hoc” para Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa y se clasificó la totalidad de los ejemplares de acuerdo a los estadios definidos en la misma.

- 51 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual A fin de establecer si las características gonadales macroscópicas observadas en cada estadio de madurez se ven reflejadas en cambios de la organización tisular asociada, los sistemas reproductores de al menos tres ejemplares por estadio de madurez para cada sexo y especie fueron fijados en líquido de Bouin durante cuatro horas, secuencialmente deshidratados en etanol 70% (15 a 20 minutos), etanol 90% (20 minutos), etanol 96%: butanol (1:1 v/v) durante 30 minutos, butanol (30 minutos) y finalmente incluidos en Paraplast®, seccionados a 5 µm de espesor con micrótomo y coloreados con hematoxilina-eosina, tricrómico de Masson y PAS (López-Greco 1997a). Posteriormente los cortes se observaron bajo microscopio óptico, se realizaron descripciones y se tomaron fotografías con cámara digital. Por otra parte, la talla de primera madurez (TM 50%) se calculó en función de las proporciones de hembras y machos maduros en clases de talla de 6 mm, rango mínimo que permitía observar las diferencias. En ambos sexos se ajustó una curva logística mediante regresión de las proporciones de individuos maduros en las clases de talla utilizando el método de mínimos cuadrados y la fórmula Pi = 1 / 1 + exp (a + b * Li), donde Pi y Li son respectivamente la proporción de individuos maduros y el valor medio (marca) de la clase de talla i, y a y b son las constantes estimadas. La talla de primera madurez fue entonces calculada como TM 50% = a/b.

Madurez morfométrica La talla de madurez morfométrica fue establecida a través de la detección de discontinuidades en las tasas de crecimiento de las dimensiones de órganos involucrados en el cortejo y la reproducción relativas a la dimensión estándar de talla, para ambas especies el ancho máximo de caparazón (AC). En las hembras se consideró el ancho máximo del abdomen y en los machos cuatro dimensiones de las quelas derecha e izquierda (L: largo; Al: el alto; An: el ancho; D: la diagonal entre la inserción del dedo móvil de la quela y la base de la misma) y la longitud de los pleópodos derecho e izquierdo (Figura 21). Las mediciones se realizaron con un calibre electrónico con una precisión del 0,001 mm, excepto para ejemplares de tallas menores a 10 mm de AC, que fueron medidos con una lupa estereoscópica equipada con ocular micrométrico.

- 52 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual

Figura 21. Leurocyclus tuberculosus. A- Vista dorsal: la barra indica el ancho máximo del caparazón. B- Vista ventral de la hembra: la barra indica el ancho máximo del abdomen. C- Vista ventral del macho: las barras indican las cuatro dimensiones de los quelípedos consideradas en el análisis. Escala de todas las figuras: 1 cm. D- Vista ventral del macho, la barra indica longitud del gonopodio. (Ab: abdomen; Al: alto del quelípedo; An: ancho del quelípedo; D: diagonal del quelípedo; Gp: gonopodios; L: largo del quelípedo).

En los Eubrachyura es común observar diferentes tipos de discontinuidades morfométricas asociadas al inicio de la pubertad: 1) a partir una talla dada se produce en los ejemplares un cambio en la tasa de variación de una dimensión respecto de la medida estándar de talla (Somerton 1983) y 2) existe un rango de tallas en el que pueden observarse individuos con dos tipos diferentes de relación morfométrica (Somerton 1980).

- 53 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual Para detectar las discontinuidades morfométricas del primer tipo, se realizó un ajuste por mínimos cuadrados de la función:

ln Y = b + a1 * ln AC + a2 * (ln AC – bkp) * (1 si ln AC ≥ bkp; 0 si ln AC < bkp) donde: ln Y y ln AC son los logaritmos naturales de la dimensión sobre la que se observa la discontinuidad y del ancho del caparazón respectivamente, y b, a1, a2 y bkp son los parámetros del modelo, empleando la rutina “user-specified regression” del Statistica 7.0.

En aquellos casos en los que del a2 es significativamente distinto de 0, se considera que existe un cambio en la relación de las variables de interés en ln AC = bkp. Para analizar las discontinuidades morfométricas del segundo tipo se empleó el método desarrollado por Somerton (1980), implementado a través del programa MATURE I que provee una estimación de la talla a la cual el 50% de los individuos ha alcanzado la madurez morfométrica, basada en la construcción de una ojiva ajustada a la proporción de ejemplares morfométricamente maduros en clases predefinidas dentro del rango de tallas (AC) en que se hallan tanto ejemplares maduros e inmaduros. Por otra parte, se realizaron pruebas de isometría para las relaciones de ln Y sobre ln AC, a fin de establecer el tipo de alometría/isometría en las fases de madurez e inmadurez morfométrica (Hartnoll 1974). Para ello se contrastó la hipótesis de desviación de la isometría utilizando el intervalo de confianza de la pendiente al 95% de probabilidad (IC) bajo las siguientes consideraciones: 1) si 1 está incluido en IC no se rechaza la hipótesis nula de que existe isometría (Ho: b = 1), 2) si cualquier valor entre 0,9-1,1 está incluido en IC la hipótesis de isometría no puede ser rechazada por completo, y se reporta una leve alometría y 3) si el rango de valores incluidos en IC es menor a 0,9 o mayor a 1,1 la relación es considerada alométrica (Voight 1991; Barón y Ré 2002). La información obtenida sobre las tallas de madurez morfométrica en hembras fue complementada con observaciones sobre la condición a la talla de otros caracteres asociados al proceso de maduración observados en la etapa de inmadurez: la ausencia y formación de la vulva y del canal vaginal en las hembras (Capítulo I).

Madurez funcional Para estimar la talla de madurez funcional, se consideraron funcionalmente maduros a: 1) las hembras con contenido espermático en los receptáculos seminales (los clasificados como flácidos, parcialmente turgentes o turgentes, ver Capítulo I) y vulvas

- 54 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual abiertas (ver Capítulo I); 2) los machos con espermatóforos en el vaso deferente medio (los categorizados como medio turgentes, turgentes y flácidos, ver Capítulo I). Para ambos sexos de ambas especies se ajustaron ojivas de madurez a la proporción de ejemplares funcionalmente maduros en clases de talla (AC) predefinidas, siguiendo la metodología explicada en la determinación de la talla de madurez gonadal.

Estacionalidad de la actividad reproductiva A fin de establecer la estacionalidad de los ciclos de madurez gonadal se estableció la frecuencia relativa de individuos de ambos sexos en distintos estadios de maduración gonadal (Capítulo I) en cada estación del año. Para este análisis sólo se utilizaron los ejemplares que alcanzaron la madurez morfométrica. Asimismo, se observó la proporción de individuos funcionalmente maduros e inmaduros durante los mismos periodos.

RESULTADOS

Madurez gonadal En ambas especies las gónadas y los conductos/vasos deferentes se caracterizan por una serie de estadios más o menos discretos a través de su desarrollo, algunos de los cuales ya fueron descriptos en el Capítulo I (Tablas II y III).

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Tabla II. Estadios de desarrollo del ovario de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa.

Estadio Aspecto macroscópico Aspecto a nivel histológico

OV0: No se observa a simple vista Indiferenciado (Figura 22A, 22C, 22E) OV1: Forma tubular delgada, coloración Gran proporción de oogonias con Inmaduro naranja pálido. En este estadio los escaso citoplasma y alta actividad receptáculos seminales pueden mitótica; oocitos en vitelogénesis estar ausentes (Figura 23A, 23C, primaria en distintos grados de 23E) ó presentes (Figura 5A de desarrollo (Figura 5B de Capítulo I) Capítulo I). OV2: Forma tubular voluminosa, aspecto Grupos de oogonias rodeadas por Madurez medianamente turgente y coloración oocitos en vitelogénesis primaria y incipiente naranja intenso. (Figura 5C de oocitos comenzando la vitelogénesis Capítulo I) secundaria. Se observan células foliculares distribuidas al azar entre las oogonias y los oocitos en vitelogénesis primaria (Figura5D de Capítulo I) OV3: Forma tubular, voluminosa, aspecto Gran proporción de oocitos en Máxima madurez turgente y coloración rojo intenso vitelogénesis secundaria rodeados (Figura 5E de Capítulo I) por células foliculares de forma aplanada. (Figura 5F de Capítulo I) OV4: Forma tubular voluminosa, aspecto Baja proporción de oocitos en Desovado flácido y coloración naranja pálido. vitelogénesis secundaria, presencia (Figura 5G de Capítulo I) de oocitos atrésicos, folículos vacíos y oogonias (Figura 5H de Capítulo I).

Tabla III. Estadios de desarrollo del sistema reproductor en machos de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa.

Estadio Aspecto macroscópico Aspecto a nivel histológico

M0: No se observa el testículo a simple Indiferenciado vista (Figura 22B,22D, 22F) M1: Testículo de forma tubular delgada Lóbulos testiculares con Madurez y tamaño pequeño (Figura 23B, espermatogonias, espermatocitos y incipiente 23D); vasos deferentes delgados y espermatozoides (Figura 23E). Los blanquecinos (Figura 23D) vasos deferentes no presentan contenido espermático (Figura 23F). M2: Testículo de forma tubular, Lóbulos testiculares con Maduro voluminosa y altamente enrollado. espermatogonias, espermatocitos y Los vasos deferentes se pueden espermatozoides. Los vasos reconocer claramente por su deferentes contienen fluido seminal, diámetro lo que permite distinguir espermatozoides y espermatóforos tres regiones: anterior, medio y (Figura 19 de Capítulo I) posterior (Figura 16 de Capítulo I).

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Figura 22. Leurocyclus tuberculosus con gónada indiferenciada. A- Hembra en vista ventral (Escala: 1cm). B- Macho en vista ventral (Escala: 1 cm). C- Hembra sin el caparazón (Escala: 0,5 cm). D- Macho sin el caparazón (Escala: 1 cm). E- Vista interna lateral de hembra, la flecha indica donde se va a ubicar el receptáculo seminal en un estado más avanzado de madurez (Escala: 0,5 cm). F- Vista interna del macho sin el caparazón, la flecha indica la posición del vaso deferente medio en un estado más avanzado de madurez (Escala: 1 cm).

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Figura 23. Diferenciación gonadal en Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa. A- Vista interna de hembra (Escala: 0,5 cm). B- Vista interna de macho (Escala: 0,5 cm). C- Detalle del ovario (Escala: 0,5 cm). D- Detalle del testículo (Escala: 0,5 cm). E- Histología de un testículo de madurez incipiente (Escala: 100 µm). F- Histología del vaso deferente medio de un macho inmaduro (Escala: 25 µm). Las flechas blancas señalan la gónada. CV: canal vaginal; Ep: epitelio del vaso deferente; LT: túbulos testiculares; Spz: espermatozoides; VD: vaso deferente.

- 58 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual La hembra más pequeña de L. tuberculosus con gónadas maduras midió 38 mm de AC (Figura 24A) y la estimación del AC en el que el 50% de las hembras presentan gónadas maduras fue de 47 mm (Figura 24B). En el caso de los machos el valor estimado en el que el 50% presentan gónadas maduras fue de 36 mm de AC (Figura 24C) y la mínima talla de madurez gonadal fue de 30 mm de AC (Figura 24D).

A

38

B C

D

30

- 59 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual

Figura 24. Madurez gonadal en hembras y machos de Leurocyclus tuberculosus. A- Representación de los estados de madurez gonadal de las hembras en un diagrama de dispersión del ancho de abdomen (AAb) en función del ancho del caparazón (AC). Círculos verdes: estadio inmaduro indiferenciado; círculos azules: estadio inmaduro con ovario sin RS; círculos verde agua: estadio inmaduro con ovario con RS; círculos rosados: estadio de madurez incipiente; círculos rojos: estadio de máxima madurez; círculos violeta claro: estadio desovado. La flecha indica la mínima talla de madurez gonadal. B- Ojiva de madurez en las hembras ajustada a las proporciones de individuos maduros en clases de AC. C- Ojiva de madurez en los machos ajustada a las proporciones de individuos maduros en clases de AC. D- Representación de los estados de madurez gonadal de los machos en un diagrama de dispersión. Círculos verdes: estadio indiferenciado; círculos azules: estadio de madurez incipiente; círculos rojos: estadio maduro. La flecha indica la mínima talla de madurez gonadal.

En Libinia spinosa, la menor hembra observada con la gónada madura midió 42 mm de AC (Figura 25A) y el valor estimado en el que el 50% de las hembras presentaron gónadas maduras fue de 46 mm de AC (Figura 25B). En los machos, el AC en el que el 50% presentó gónadas maduras fue de 40 mm (Figura 25C) y correspondió también a la talla del macho más pequeño con testículos maduros (Figura 25D).

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A

42

B C

D

40

Figura 25. Madurez gonadal en hembras y machos de Libinia spinosa. A- Representación de los estados de madurez gonadal de las hembras en un diagrama de dispersión del ancho de abdomen (AAb) en función del ancho del caparazón (AC). Círculos verdes: estadio inmaduro indiferenciado; círculos azules: estadio inmaduro con ovario sin RS; círculos verde agua: estadio inmaduro con ovario con RS; círculos rosados: estadio de maduración incipiente; círculos rojos: estadio de máxima madurez; círculos bordo: estadio desovado. La flecha indica la mínima talla de madurez gonadal. B- Ojiva de madurez en hembras ajustada a las proporciones de individuos

- 61 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual maduros en clases de AC. C- Ojiva de madurez en machos ajustada a las proporciones de individuos maduros en clases de AC. D- Representación de los estados de madurez gonadal en machos en un diagrama de dispersión. Círculos verdes: estadio indiferenciado; círculos azules: estadio de maduración incipiente; círculos rojos: estadio maduro. La flecha indica la mínima talla de madurez gonadal.

Madurez morfométrica Para ambas especies se observaron discontinuidades en el crecimiento relativo de alguna dimensión corporal asociada a la reproducción respecto de AC que permitieron diferenciar las etapas de inmadurez y madurez morfométrica. En hembras y machos de Leurocyclus tuberculosus se observó que para las dimensiones corporales utilizadas existe un amplio rango de tallas (AC) en el que se observan tanto ejemplares morfométricamente inmaduros como maduros. En Libinia spinosa se observó el mismo patrón que en Leurocyclus tuberculosus sólo para las hembras, mientras que en los machos a partir de cierto valor de AC se observó un cambio en la tasa de crecimiento de la dimensión analizada respecto de AC, sin solapamiento de individuos con relaciones morfométricas diferentes. En las hembras de Leurocyclus tuberculosus dentro del rango de 37–49 mm de AC se observaron ejemplares con una relación diferente entre el logaritmo natural del ancho máximo del abdomen (ln AAb) y el del ancho máximo del caparazón (ln AC) (Figura 26). El valor estimado de AC en el que el 50% de las hembras son morfométricamente maduras fue de 42 mm de AC (Figura 26). Por otra parte, en el rango de tallas de los organismos morfométricamente inmaduros se detectó un cambio en la relación de ln AAb en función de ln AC aproximadamente a los 17 mm de AC (Figura 26).

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Figura 26. Madurez morfométrica en hembras de Leurocyclus tuberculosus. Diagrama de dispersión del logaritmo natural del ancho de abdomen (ln AAb) y el ancho de caparazón (ln AC). Se presentan los modelos de regresión ajustados mediante análisis de puntos de quiebre (dos modelos ajustados a la fase inmadura) y a través del método de Somerton (1980) (discontinuidad asociada a la maduración morfométrica). Detalle inferior derecho: ojiva de madurez ajustada a las proporciones de individuos maduros en clases de AC. En verde y azul se escriben las ecuaciones correspondientes a los ejemplares inmaduros y en rojo la ecuación de los ejemplares maduros.

Las hembras de Libinia spinosa presentaron ejemplares morfométricamente inmaduros y maduros dentro del rango de 42–53 mm de AC y la talla en el que el 50% de los individuos son morfométricamente maduros fue estimado en 42 mm de AC (Figura27).

Figura 27. Madurez morfométrica en hembras de Libinia spinosa. Diagrama de dispersión del logaritmo natural del ancho de abdomen (ln AAb) y el ancho de caparazón (ln AC). Se presentan los modelos de regresión ajustados siguiendo el método de Somerton (1980). Detalle inferior derecho: ojiva de madurez ajustada a las proporciones de individuos maduros en clases de AC. En azul se escribe la ecuación correspondiente a los ejemplares inmaduros y en rojo la ecuación de los ejemplares maduros.

En los machos de ambas especies se detectaron discontinuidades en las relaciones de las cuatro dimensiones de las quelas analizadas (Figura 28 y 29). Los machos de Leurocyclus tuberculosus, presentaron ejemplares morfométricamente inmaduros y maduros dentro del rango de 58–62 mm de AC y los valores estimados en que el 50% de los machos son morfométricamente maduros

- 63 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual variaron entre 58 y 60 mm de AC para las cuatro dimensiones analizadas (Figura 28). La dimensión que mostró un mayor cambio en la tasa de crecimiento respecto al ancho de caparazón entre los ejemplares inmaduros y maduros fue el ancho de la quela (Figura 28C).

A

B

C

D

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Figura 28. Izquierda: Diagrama de dispersión del logaritmo natural de las dimensiones de las quelas y el ancho de caparazón (ln AC) para Leurocyclus tuberculosus y modelos de regresión ajustados siguiendo el método de Somerton (1980). Derecha: Ojivas de madurez ajustada a las proporciones de individuos maduros en clases de AC. A- Largo de la quela (LQ); B- Diagonal de la quela (DQ); C- Ancho de la quela (An); D- Alto de la quela (Al). En azul se escribe la ecuación correspondiente a los ejemplares inmaduros y en rojo la ecuación de los ejemplares maduros.

En los machos de Libinia spinosa se detectó un cambio en la relación del logaritmo natural de las cuatro dimensiones de la quela respecto de ln AC aproximadamente a los 36mm de ancho de caparazón (Figura 29). Los intervalos de confianza (p = 95%) para la estimación del punto de quiebre (bkp) de las cuatro variables coincidieron dentro de rango 32-38 mm de AC (Tabla N). El largo de la quela fue la dimensión que presentó mayor diferencia de pendiente (Figura 29 A; tabla IV).

A B

C D

Figura 29. Diagrama de dispersión del logaritmo natural de las dimensiones de las quelas y el ln AC para machos de Libinia spinosa y modelos de regresión ajustados. A- Largo de la quela (LQ); B- Diagonal de la quela (DQ); C- Ancho de la quela (An); D- Alto de la quela (Al). En azul se escribe la ecuación correspondiente a los ejemplares inmaduros y en rojo la ecuación de los ejemplares maduros.

- 65 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual

Tabla IV. Ecuaciones de ajuste de las rectas de los organismos inmaduros y maduros para Libinia spinosa. AC: ancho de caparazón; AlQ; alto de la quela; AnQ: ancho de la quela; bkp: punto de quiebre; DQ: diagonal de la quela; LQ: largo de quela; O: ordenada al origen; p: pendiente; Q: quela.

En Leurocyclus tuberculosus el largo del gonopodio derecho crece en forma alométrica negativa respecto de AC, pero sin discontinuidades (Figura 30A). El mismo patrón se observa en Libinia spinosa, pero debido a la dificultad de obtener gonopodios en buenas condiciones a partir de individuos de tallas pequeñas (< 38 mm AC), no se pudo evaluar si la especie presenta discontinuidades en dicha relación (Figura 30B).

A

B

- 66 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual

Figura 30. Diagrama de dispersión del largo del gonopodio derecho y el AC y modelos de regresión ajustados para machos de A- Leurocyclus tuberculosus y B- Libinia spinosa.

En relación a las discontinuidades en el crecimiento relativo de las variables corporales asociadas a la reproducción respecto de AC, se determinó el tipo de alometría/isometría que presentan las fases de inmadura y madura (Tabla V).

Tabla V. Tipo de relación morfométrica (alometría/isometría) de las fases de madurez e inmadurez para los caracteres secundarios estudiados y el ancho de caparazón El valor 0, representa una relación isométrica; el valor 0- representa leve alometría negativa el valor 0+ representa leve alometría positiva; el signo – indica alometría negativa; el signo + indica alometría positiva. AAb: ancho de caparazón; LQ: largo de la quela; DQ: diagonal de la quela; AlQ: alto de la quela; AnQ: ancho de la quela.

En las hembras de ambas especies se observó una correspondencia entre las fases de madurez morfométrica detectadas y los otros caracteres sexuales analizados. En ejemplares morfométricamente inmaduros, se observaron dos tipos de conformación de la vagina (Figura 7, Capítulo I): a) en el rango de tallas de 2-17 mm AC para Leurocyclus tuberculosus y en el rango 19-24 mm de AC en Libinia spinosa la estructura se encontraba ausente (Figura 31) y b) entre los 14-46 mm de AC para Leurocyclus tuberculosus y los 25-53 mm de AC en Libinia spinosa la vagina se observa macroscópicamente mostrando forma tubular con la porción apical expandida (Figura 31). - 67 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual En contraste, todas las hembras mayores a 37 mm de AC en Leurocyclus tuberculosus y las mayores a 42 mm de AC en Libinia spinosa presentaron la vagina unida al receptáculo seminal (Figura 31).

Figura 31. Diagrama de dispersión del ancho del abdomen (Aab) en relación al ancho del caparazón (AC), considerando las diferentes conformaciones de la vagina. Arriba- Leurocyclus tuberculosus y Abajo- Libinia spinosa. Círculos verdes: hembras sin vagina; círculos azules: hembras con vagina sin RS; círculos rojos: hembras con vagina unida al receptáculo seminal.

- 68 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual En ambas especies se observó un cambio en la morfología de la vulva durante el desarrollo de juvenil a adulta (Figura 8, Capítulo I). En hembras morfológicamente inmaduras de Leurocyclus tuberculosus esta estructura: a) no estuvo presente en ejemplares de entre 2-11 mm AC (Figura 32); b) comenzó a formarse en ejemplares de entre 7-16 mm AC (Figura 32); c) estuvo formada pero presentó apertura parcial en ejemplares de entre 14-50 mm AC (Figura 32). Sólo en ejemplares morfométricamente maduros con un AC mayor a 37 mm la vulva presentó la apertura completamente formada (Figura 32). En las hembras de Libinia spinosa sólo se observaron ejemplares en las dos últimas categorías (Figura 32).

- 69 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual

Figura 32. Maduración morfométrica de las hembras de acuerdo a la formación de la vulva. Arriba- Leurocyclus tuberculosus; Abajo- Libinia spinosa. Círculos verdes: hembras sin vulva; círculos turquesas: hembras con vulva en formación; círculos azules: hembras con vulva con apertura apical cerrada; círculos rojos: hembras con vulva con apertura completamente formada.

El abdomen en ambas especies presentó dos morfologías (Figura 9, Capítulo I): plana en los individuos inmaduros y cóncava en los individuos maduros (Figura 33).

Figura 33. Maduración morfométrica de las hembras de acuerdo a la morfología del abdomen. Arriba- Leurocyclus tuberculosus; Abajo- Libinia spinosa. Círculos azules: hembras morfométricamente inmaduras con abdomen plano; círculos rojos: hembras morfométricamente maduras con abdomen cóncavo.

- 70 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual Madurez funcional En Leurocyclus tuberculosus, la hembra más pequeña funcionalmente madura midió 38 mm de AC (Figura 34A) y la talla a la cual el 50% de las hembras se encontraron funcionalmente maduras bajo este criterio fue de 42 mm de AC (Figura 34B). La mínima talla de hembra ovígera fue de 40,3 mm y máxima de 68,79 mm de AC. En el caso de los machos, en Leurocyclus tuberculosus la talla estimada a la cual el 50% de los ejemplares son funcionalmente maduros fue de 53mm de AC (Figura 34C), y coincidió con la talla del ejemplar funcionalmente maduro más pequeño (Figura 34D).

A

38

B C

D

53

- 71 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual

Figura 34. Madurez funcional en hembras y machos de Leurocyclus tuberculosus. A- Representación de los estados de los receptáculos seminales en un diagrama de dispersión del ancho del abdomen (AAb) en función de AC. La flecha indica la talla de hembra funcional más pequeña. Círculos azules: hembras inmaduras sin RS; círculos verde claro: hembras inmaduras con RS colapsado; círculos rosados: hembras maduras con RS medio turgente; círculos rojos: hembras maduras con RS turgente; círculos bordo: hembras maduras con RS flácido. B- Ojiva de madurez funcional en hembras ajustada a las proporciones de individuos maduros en clases de AC. C- Ojiva de madurez funcional en machos ajustada a las proporciones de individuos maduros en clases de AC. D- Representación en los machos de los estados de madurez funcional en un diagrama de dispersión del largo de la quela (LQ) sobre AC. La flecha indica el macho más pequeño con contenido seminal en el vaso deferente medio. Círculos azules: machos sin contenido seminal en el vaso deferente; círculos rojos: machos funcionalmente maduros.

En Libinia spinosa la hembra funcionalmente madura más pequeña midió 42 mm de AC (Figura 35A), y se estimó que el 50% de las hembras alcanza la madurez funcional a los 45 mm de AC (Figura 35B). La mínima talla de hembra ovígera se encontró a los 41,3 mm y la máxima talla de hembra ovígera a los 63 mm de AC. Para los machos, tanto el 50% funcionalmente maduro como el macho más pequeño con espermatóforos en el vaso deferente medio, correspondió a los 45 mm de AC (Figura 35C, 35D).

- 72 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual

A

42

B C

D

45

Figura 35. Madurez funcional en hembras y machos de Libinia spinosa. A- Representación de los estados del receptáculo seminal en un diagrama de dispersión del ancho del abdomen (AAb) y el AC. La flecha indica la talla de hembra funcional más pequeña. Círculos azules: hembras inmaduras sin RS; círculos verde claro: hembras inmaduras con RS colapsado; círculos rosados: hembras maduras con RS medio turgente; círculos rojos: hembras maduras con RS turgente; círculos bordo: hembras maduras con RS flácido. B- Ojiva de madurez funcional en hembras ajustada a las proporciones de individuos maduros en clases de AC. C- Ojiva de madurez

- 73 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual funcional en machos ajustada a las proporciones de individuos maduros en clases de AC. D- Representación de los estados de madurez funcional en un diagrama de dispersión del largo de la quela (LQ) sobre AC. La flecha indica el macho más pequeño con contenido seminal en el vaso deferente medio. Círculos azules: machos sin contenido seminal en el vaso deferente; círculos rojos: machos funcionalmente maduros.

Estacionalidad de la actividad reproductiva Aunque la frecuencia de muestreo fue mensual, debido a la ausencia de ejemplares en varias de las salidas de campo y la limitada cantidad de ejemplares capturados en otras, fue necesario agrupar los datos en periodos trimestrales a fin de facilitar la interpretación de los patrones temporales en la proporción de ejemplares en distintos estadios de maduración y desove. Por otro lado, dada la ausencia de réplicas para todas las estaciones, y tomando en cuenta que un agrupamiento en periodos de tiempo mayores al trimestral proveería información con una resolución temporal de escasa utilidad, la información reportada sobre la estacionalidad de los eventos reproductivos tiene un carácter descriptivo, imposibilitando el contraste exhaustivo de hipótesis mediante pruebas estadísticas.

Leurocyclus tuberculosus Durante los tres años consecutivos de estudio se obtuvieron muestras de hembras de L. tuberculosus durante todas las estaciones excepto las primaveras de 2008 y 2009. Tomando en cuenta los datos de los tres años agrupados por estación, se observó: 1) que las proporciones más altas de individuos en máxima madurez ocurren en los meses del otoño y el invierno, y la más baja en primavera; 2) las hembras inmaduras están ausentes en primavera; 3) las hembras desovadas representan una pequeña fracción de la población en todas las estaciones, pero son más frecuentes en verano (Figura 36). A través de los años muestreados no se observó un patrón claro del ciclo de madurez gonadal, pero podemos destacar la alta frecuencia de hembras en máxima madurez en el invierno de los tres años muestreados y en el otoño del 2007 y 2009. En el otoño del 2008 se observa una alta frecuencia de hembras en maduración incipiente.

- 74 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual

Figura 36. Frecuencia relativa de hembras de Leurocyclus tuberculosus en estadios inmaduro/maduración/desove en las distintas estaciones del año. Arriba: se representan los datos de tres años agrupados por estación; abajo: se presentan la serie de datos discriminada por estación y por año. Los números dentro de las columnas corresponden a la cantidad de individuos.

Por otro lado, considerando la información estacional de todos los años de muestreo, se hallaron hembras ovígeras de L. tuberculosus en todas las estaciones, encontrándose en primavera y verano las mayores frecuencias relativas y en otoño la menor. Al comparar las proporciones relativas entre estaciones de distintos años los patrones más notables fueron: 1) la predominancia de hembras ovígeras en primavera y verano, excepto por el verano y primavera de 2008, en los que la proporción de hembras ovígeras y no ovígeras no pudo considerada debido a la escasa captura; y 2) la predominancia de hembras no ovígeras en todos los otoños. (Figura 37).

- 75 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual

Figura 37. Frecuencia relativa de hembras ovígeras y no ovígeras de Leurocyclus tuberculosus en las distintas estaciones del año. Arriba: se representan los datos de tres años agrupados por estación; abajo: se presentan la serie de datos discriminada por estación y por año. Los números dentro de las columnas corresponden a la cantidad de individuos.

En cuanto a la condición de los receptáculos seminales, en todas las estaciones del año se halló una proporción de hembras de L. tuberculosus con contenido espermático. Al comparar los datos estacionales agregados de los tres años, se observó que: 1) la mayor proporción de RS con carga medio turgente y turgente se encuentra en el verano, seguida por el otoño-invierno, 2) en todas las estaciones del año aparecen ejemplares con RS flácidos, siendo la proporción mínima en verano, incrementando hacia el otoño-invierno y máxima en primavera.

- 76 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual La comparación de las proporciones entre estaciones de diferentes años mostró un patrón contrastante entre veranos (dominancia de receptáculos medio turgentes en 2007 y de colapsados en 2009), proporciones variables pero con representación persistente de receptáculos colapsados, medio turgentes y flácidos en otoño e invierno. La presencia de receptáculos turgentes fue irregular (otoño-invierno de 2007, verano de 2009) (Figura 38).

Figura 38. Frecuencia relativa de hembras de Leurocyclus tuberculosus durante el ciclo anual discriminando las categorizaciones del RS. Arriba: se representan todos los años de muestreo diferenciado por estación; Abajo: se discrimina estacionalmente por año de muestreo. Los números dentro de las columnas corresponden a la cantidad de individuos.

- 77 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual En los machos de L. tuberculosus se observaron testículos maduros y en madurez incipiente en todas las estaciones del año, pero los primeros fueron más frecuentes en invierno y los segundos en verano (las muestras primaverales fueron escasas) (Figura 39). La predominancia de testículos maduros se verificó en los tres años. A diferencia de los otros años, los testículos en maduración no estuvieron representados en verano de 2009.

Figura 39. Frecuencia de machos con gónadas maduras a lo largo del ciclo anual en Leurocyclus tuberculosus. Arriba: se representan todos los años de muestreo diferenciado por estación; Abajo: se discrimina estacionalmente por año de muestreo. Los números dentro de las columnas corresponden a la cantidad de individuos.

- 78 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual En relación a la madurez funcional, en todas las estaciones predominaron los machos inmaduros. Los machos funcionalmente maduros fueron menos frecuentes en primavera y su proporción relativa se incrementó hacia el invierno (Figura 40). En 2007 estos últimos estuvieron más representados en otoño que en invierno.

Figura 40. Frecuencia de machos funcionalmente maduros/inmaduros a lo largo del ciclo anual en Leurocyclus tuberculosus. Arriba: se representan todos los años de muestreo diferenciado por estación; Abajo: se discrimina estacionalmente por año de muestreo.

- 79 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual Libinia spinosa En el caso de L. spinosa sólo se obtuvieron muestras de las cuatro estaciones en 2007 y 2008, mientras que para 2009 sólo se contó con muestras en invierno y verano, esta última de muy baja representatividad. En muestras estacionales agrupadas para todos los años de muestreo, las hembras de L. spinosa mostraron: 1) una baja proporción de gónadas inmaduras, únicamente detectable en otoño; 2) gónadas en maduración incipiente proporcionalmente mejor representadas en verano; 3) gónadas en máxima madurez con mayor frecuencia relativa en primavera y 4) mayor frecuencia de gónadas desovadas en invierno (Figura 41). Los patrones estacionales comparados entre años fueron muy dispares debido al bajo número muestral obtenido.

- 80 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual

Figura 41. Frecuencia de hembras maduras/inmaduras en función de la categorización gonadal a lo largo del ciclo anual en Libinia spinosa. Arriba: se representan todos los años de muestreo diferenciado por estación; Abajo: se discrimina estacionalmente por año de muestreo. Los números dentro de las columnas corresponden a la cantidad de individuos.

Los datos estacionales agregados para todo el periodo de estudio mostraron que en todas las estaciones del año aparecen hembras ovígeras en la población, con mayor frecuencia relativa en verano e invierno (Figura 42). Como excepción, en otoño de 2007 sólo se observaron hembras no ovígeras en las muestras. (Figura 42).

- 81 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual

Figura 42. Frecuencia de hembras ovígeras/no ovígeras a lo largo del ciclo anual en Libinia spinosa. Arriba: se representan todos los años de muestreo diferenciado por estación; abajo: se discrimina estacionalmente por año de muestreo. Los números dentro de las columnas corresponden a la cantidad de individuos.

Los receptáculos seminales de L. spinosa presentaron contenido espermático en todas las estaciones del año. Los datos estacionales agrupados para todo el periodo de muestreo muestran que la mayor proporción relativa de RS con carga media turgente y turgente ocurre en primavera, y que sólo se hallaron hembras inmaduras en otoño. La mayor frecuencia relativa de hembras con RS flácido ocurrió en verano, aunque para esta estación la muestra es poco representativa. La proporción relativa de estadios de los RS comparada entre estaciones de diferentes años presentó patrones poco consistentes debido al escaso número de ejemplares en las muestras. (Figura 43).

- 82 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual

Figura 43. Frecuencia de tallas de hembras de Libinia spinosa funcionalmente maduras/inmaduras a lo largo del ciclo anual categorizando los RS. Arriba: se representan todos los años de muestreo diferenciado por estación; Abajo: se discrimina estacionalmente por año de muestreo. Los números dentro de las columnas corresponden a la cantidad de individuos.

En los machos de L. spinosa se observó para todas las estaciones del año mayor frecuencia relativa de individuos maduros (Figura 44). El mismo patrón se observó al comparar entre estaciones de años sucesivos (Figura 44).

- 83 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual

Figura 44. Frecuencia de machos con gónadas maduras a lo largo del ciclo anual en Libinia spinosa. Arriba: se representan todos los años de muestreo diferenciado por estación; Abajo: se discrimina estacionalmente por año de muestreo.

El patrón anual de madurez funcional de los machos de L. spinosa mostró la misma estacionalidad que las categorías de madurez gonadal (Figura 45).

- 84 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual

Figura 45. Frecuencia de machos funcionalmente maduros/inmaduros durante el ciclo anual en Libinia spinosa. Arriba: se representan todos los años de muestreo diferenciado por estación; abajo: se discrimina estacionalmente por año de muestreo.

- 85 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual DISCUSIÓN

La determinación de la talla a la cual las especies de Decapoda alcanzan la madurez sexual representa una información de suma importancia, dado que es relevante en el marco del estudio de las estrategias de apareamiento (Hartnoll 1963, 1965, 1974, 1982; Sainte Marie y Hazel 1992; Adams y Paul 1993; Jones y Hartnoll 1997), también en estudios sobre la conservación de especies de particular interés ecológico (Hartnoll 1963; Adams y Paul 1993; González-Gurriarán y Freire 1994; Jones y Hartnoll 1997) y es relevante para la administración pesquera de especies de valor comercial (Sainte Marie y Hazel 1992; López-Greco y Rodríguez 1999; Sampedro et al. 1999; Schejter y Spivak 2005; Leal et al. 2008). En el presente capítulo lograron identificarse distintos eventos reproductivos que representan hitos en el ciclo de vida de las hembras de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa. Los ejemplares más pequeños en los que se evidenció macroscópicamente el ovario midieron 20 mm de AC en Leurocyclus tuberculosus y 24 mm de AC en Libinia spinosa, pero sólo en individuos a partir de los 38 mm y 41 mm de AC, respectivamente para cada especie, se observaron ejemplares con RS formados, con contenido espermático y con gónadas maduras. Asimismo, las hembras ovígeras más pequeñas midieron respectivamente 40 mm y 41 mm en Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa. y se estimó que el 50% de las hembras alcanzan la madurez morfométrica, gonadal funcional respectivamente a los 42, 47 y 42 mm de AC en L. tuberculosus y a los 42, 46 y 45 mm de AC en L. spinosa. En varias especies de Decapoda se he observado que la primera maduración del ovario puede ocurrir antes o después de la muda puberal, lo cual puede tener implicancias en relación al comportamiento reproductivo (Jones y Hartnoll 1997). En los Majoidea Inachus phalangium, I. dorsettensis, Chionoecetes opilio, C. bairdii y L. emarginata (Hartnoll 1963; Hinsch 1968; Sainte Marie y Hazel 1992; Adams y Paul 1993; Jones y Hartnoll 1997) la gónada madura luego de la muda puberal, mientras que en Hyas coartatus la gónada madura antes de la muda puberal (Hartnoll 1963; Bryant y Hartnoll 1995). En función de los resultados, la adquisición de la madurez gonadal de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa ocurriría luego de la muda puberal dado que el 100% de las hembras morfométricamente inmaduras presentan ovarios inmaduros. Al ocurrir la muda puberal se diferencia el receptáculo seminal y desde ese momento las hembras pueden

- 86 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual copular (evidencia de receptáculos seminales con contenido espermático) independientemente de estado del ovario (se observan ovarios inmaduros y maduros luego de la muda puberal). En cuanto al patrón de maduración morfométrica, en las hembras de ambas especies se observó que para la relación del ancho del abdomen en función del AC existe un amplio rango en el que se observan tanto ejemplares morfométricamente inmaduros como maduros con similar extensión para ambas especies: 37-49 mm de AC en Leurocyclus tuberculosus y 42–53 mm de AC en Libinia spinosa). En Leurocyclus tuberculosus, dentro del rango de individuos inmaduros se detectó además un cambio en dicha relación morfométrica en los 17 mm de AC que podría estar asociado al desarrollo de la gónada (Sainte Marie y Hazel 1992). En las hembras de Libinia spinosa, en cambio, sólo se observó una discontinuidad morfométrica en la relación entre el ancho de abdomen y el ancho de caparazón. En ambas especies se observó que el crecimiento relativo del ancho del abdomen respecto del AC fue alométrico positivo durante la fase inmadura y alométrico negativo en la fase madura. Este tipo de cambios parece ser la regla general en las hembras de los Eubrachyura, aunque tambien puede observarse una disminucion en el nivel de alometría entre las fases inmadura y madura aún cuando ésta puede continuar siendo positiva (Hartnoll 1965, 1974, 1982). En ambas especies, la adquisición de la madurez morfométrica basada en la relación del ancho del abdomen y el AC, estuvo directamente relacionada con el desarrollo de otros caracteres morfológicos que permiten determinar la madurez en forma cualitativa. Las hembras morfológicamente inmaduras presentaron un abdomen tipo “plano” y vulvas ausentes o en formación pero cerradas, mientras que las maduras presentaron un abdomen de tipo “cóncavo” y vulvas abiertas. La variación de este tipo de caracteres fue utilizada por Sainte Marie y Hazel (1992), quienes reconocieron cuatro tipos de fases de maduración en hembras de Chionoecetes opilio, definidendo como: inmaduras y pubecentes a aquellas que poseen abdomen plano que indica un estado no reproductivo, pero distinguiendo a las últimas por poseer ovarios maduros o en proceso de madurar en la proxima muda, y hembras maduras, con un abdomen voluminoso, primíparas o multíparas (Sainte Marie 1993). Este patrón coincide con lo indicado por Jones y Hartnoll (1997), quienes sostienen que en las hembras de los Majoidea el apareamiento no es posible hasta que se cumple la condición de madurez morfométrica dado que los cambios en los caracteres sexuales secundarios relevantes para el apareamiento y la incubación

- 87 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual (ensanchamiento del abdomen y apertura de la vulva) ocurren solo tras la muda de puebrtad (Hartnoll 1963). En cuanto a los valores de talla de madurez obtenidos es necesario señalar que dada la amplia distribución geográfica en ambas especies, es probable que exista una componente latitudinal importante que determine la talla de madurez sexual para los tres criterios evaluados (Watson 1970; Rufino et al. 1994; López et al., 1997). En el caso particular de Leurocyclus tuberculosus, estimaciones recientes para la población de las costas del estado de San Pablo, Brasil, muestran que las hembras presentan tallas de madurez menores (17,1 a 29,4 mm AC) (Almeida et al. 2007) a las obtenidas para el norte de Patagonia (presente tesis). Por otro lado, la estimación de talla de madurez morfométrica obtenida en el presente capítulo se asemeja a las informadas por Barón et al. (2009) (47,9 mm de AC) en un estudio preliminar sobre la especie basado en muestras obtenidas entre 2002 y 2006 en la misma área de estudio. En los machos se ha observado que la gónada está ausente hasta los 30 mm de AC en Leurocyclus tuberculosus y a los 40 mm de AC en Libinia spinosa. Luego se observa poco desarrollada con espermatozoides en algunos lóbulos testiculares, pero sin espermatozoides ni espermatóforos en los vasos deferentes, registrándose en esta instancia la talla de madurez gonadal. En Leurocyclus tuberculosus la talla a la cual el 50% de los individuos presentan gónadas maduras es 36 mm de AC (6 mm mayor a la talla mínima de macho maduro) y en Libinia spinosa 40 mm de AC, igual a la talla mínima de macho maduro. De acuerdo a estos resultados en los machos no coincidiría la talla de madurez funcional con la talla de madurez gonadal. En los machos de ambas especies los cambios en las relaciones de cuatro dimensiones de la quela sobre AC permitieron diferenciar una fase morfométricamente inmadura y otra madura. Para Leurocyclus tuberculosus se observó la ocurrencia de ejemplares morfométricamente inmaduros y maduros dentro de un rango de tallas. En Libinia spinosa, por el contrario, se observó un cambio en la tasa de crecimiento de la dimensión de la quela analizada en relación a AC sin solapamiento de individuos morfométricamente inmaduros y maduros. En cuanto al crecimieno relativo de los gonopodios, no se encontraron en estas especies discontinuidades morfométricas como ha sido indicado para otros Crustacea (Hartnoll 1965; Davidson y Mardsen 1987; González-Gurriarán y Freire 1994, López et al.1997). Los cambios en el tipo de crecimiento de las quelas respecto de AC (isometría y distintos tipos de alometría) entre las fases inmadura y madura mostraron patrones específicos para cada variable analizada. En Libinia spinosa las cuatro dimensiones de

- 88 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual las quelas de los machos mostraron un crecimiento isométrico en la fase de inmadurez y alométrico positivo en la fase de madurez, al igual que lo indicado para Chionoecetes opilio (Watson 1970). En contraste, estos cambios dependieron de la variable analizada en Leurocyclus tuberculosus (Tabla V). Al comparar estos resultados con otras especies se puede observar que no existe un patrón específico, por ejemplo en Microphrys bicornutus (Majoidea) las dimensiones de las quelas de los machos pasan de una fase alométrica levemente positiva a positiva (López-Greco et al. 2000) y en otras especies de Eubrachyura se han observado cambios de una fase inmadura con crecimiento alométrico positivo a una madura con crecimiento alométrico negativo (Watson 1970; Hartnoll 1974; Davidson y Marsden 1987; Vannini y Gherardi 1988), así como también crecimiento isométrico de las dimensiones de las quelas que no permiten definir la talla en la que ocurre la muda puberal (Hartnoll 1974; Gherardi y Micheli 1989). En base a los resultados obtenidos para las dos especies estudiadas se determinó que las hembras de Leurocyclus tuberculosus maduran morfométricamente a tallas menores (42 mm AC) que los machos (58-60 mm AC), mientras que machos y hembras de Libinia spinosa lo hacen en tallas similares El primer patrón es el más generalizado entre los Eubrachyura en general y Majoidea en particular, dado que la competencia de los machos por las hembras y el dismorfismo de tamaño en favor de los machos en parejas de cópula es común en la reproducción (Watson 1970; Brown y Powell 1972; Taylor et al. 1985; Conan y Comeau 1986; Christy 1987; Ennis et al. 1990; Sainte Marie y Hazel 1992). Por otro lado, resulta interesante la diferencia en cuanto a las dimensiones de las quelas que presentaron mayores cambios en el crecimiento relativo respecto de la talla. Leurocyclus tuberculosus presentó una diferencia en el crecimiento relativo mayor en el ancho de la quela que en cualquier otra variable y Libinia spinosa mostró mayor diferencia en el largo. Dada esta diferencia y considerando que las quelas participan de modo directo en el sistema de apareamiento de las especies, podría inferirse que estas especies presentan diferentes comportamientos reproductivos. Por ejemplo, Leurocyclus tuberculosus al poseer una quela más ancha que larga posiblemente posea más fuerza, lo que le permitiría sostener a la hembra, como fue obsevado en Chionoecetes opilio donde el macho sujeta y levanta a la hembra con la quela ante la presencia de otro macho (Watson 1970). En Libinia spinosa, por el contrario, el largo de la pinza probablemente le otorge mayor capacidad para la lucha agonística con otros machos o para la protección de pre/postcópula. En los machos de Leurocyclus tuberculosus la secuencia de maduración se inicia con la maduración gonadal (presencia de espermatozoides en los testículos, 36 mm AC),

- 89 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual seguida por la maduración funcional (presencia de espermatóforos en los vasos deferentes, 53 mm AC (madurez funcional) y morfométrica (58-60 mm AC), aunque dada la escasa diferencia es probable que estas dos últimas ocurran en el mismo estadio de crecimiento (Figura 46). Esto indica que todos los machos que llegan a la madurez morfométrica están aptos para aparearse. En este capítulo, se observó que para las relaciones entre varias de las dimensiones de la quela de los machos de L. tuberculosus en relación a AC, hubo un rango de tallas en el que coexistieron individuos morfométricamente inmaduros y maduros. Esto es atípico en los machos de la mayoría de especies de Majoidea y otros Eubrachyura, en los que el cambio de relación morfométrica ocurre a partir de una talla dada, sin un rango de solapamiento. En consecuencia, y en contraste con el método utilizado en Libinia spinosa, la determinación de la talla de madurez morfométrica de Leurocyclus tuberculosus se efectuó empleando el método propuesto por Somerton (1980). Los valores de talla de madurez obtenidos (58-60 mm AC) son superiores al determinado por Barón et al. (2009) (48,9 mm AC) empleando el mísmo método que se utilizó en este capítulo para detección de discontinuidades morfométricas de las quelas de los machos de Libinia spinosa. El 50% de los machos de L. spinosa alcanzan la madurez morfométrica a una talla levemente menor (32-38 mm AC) que la gonadal (40 mm AC) y la funcional (45 mm AC). Esto indicaría que no todos los machos maduros morfométricamente serían aptos para copular. (Figura 47). La presencia de individuos maduros desde el punto de vista morfométrico y gonadal que no están aptos para reproducirse, dado que son inmaduros funcionalmente, permitiría inferir en esta especie ocurre como mínimo otra muda más allá de la muda puberal (i.e., la muda de pubertad no coincide con la muda terminal), lo cual fue reportado para otras especies en machos de Majoidea (Donalson y Adams 1989) (ver Capítulo III). Similar observación a la realizada en los machos de Libinia spinosa fue indicada en Chionoecetes bairdii donde la madurez alométrica es requisito para la madurez funcional, vinculada con la capacidad competitiva de copular (Stevens et al. 1993), y en C. opilio donde la madurez morfométrica de los machos se alcanza a los 60 mm y sólo los machos mayores a 96 mm copulan exitosamente (un 60% de diferencia entre ambas tallas de madurez) (Conan y Comeau 1986; Elner y Beninger 1995; Moriyasu y Comeau 1996). Lo mismo se ha observado en especies de Cancridae, donde machos gonadalmente maduros no son capaces de copular, sino que deben mudar dos veces antes de poder acceder a las hembras (Orensanz et al. 1995), lo que también fue observado en Homarus

- 90 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual americanus (Krouse 1973) y Jasus edwardsii (Mc Diarmid 1989). Esto se correspondería con lo observado para especies de Crustacea en que se describieron mecanismos de selección sexual tales que en general son lo machos más grandes los más exitosos en la cópula, produciendo un desplazamiento efectivo de los machos más pequeños (Mac Diarmid 1989; Jormalainen et al. 1992, López et al. 1997).

Figura 46. Esquema de las tallas de madurez sexual en hembras (parte superior) y en machos (parte inferior) de Leurocyclus tuberculosus según los tres criterios de madurez. Los valores que se presentan son las tallas obtenidas por las ojivas de madurez.

- 91 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual

Figura 47. Esquema de las tallas de madurez sexual en hembras (parte superior) y en machos (parte inferior) de Libinia spinosa según los tres criterios de madurez. Los valores que se presentan son las ojivas de madurez, exceptuando la madurez morfométrica de los machos donde se presenta el rango de tallas que se solapa en el intervalos de confianza de las cuatro variables analizadas.

En cuanto al ciclo de reproductivo de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa no se observó un patrón estacional claro en los años de muestreo pero se pudieron determinar ciertas características o tendencias a lo largo de las estaciones. Se observó en ambas especies una baja frecuencia de hembras ovígeras en el otoño. Por otra parte, los machos de ambas especies mostraron sincronismo en la madurez gonadal y funcional. En Leurocyclus tuberculosus el sincronismo en la madurez de los machos se observa en el invierno, y a la vez esta especie presenta un sincronismo en la madurez gonadal entre machos y hembras en el invierno con lo cual se sugiere que existe un pico de eventos de cópula en esta estación.

- 92 - Biología Reproductiva de Majoidea Adquisición de Madurez Sexual En Libinia spinosa los machos se encuentran maduros gonadal y funcionalmente con una elevada frecuencia en todas las estaciones del año. Sin embargo, se observa al igual que en los machos de Leurocyclus tuberculosus, sincronismo en la madurez gonadal y funcional que ocurre en el verano, pero a diferencia de los machos y hembras de Leurocyclus tuberculosus, en Libinia spinosa las hembras presentan mayor frecuencia de gónada en máxima madurez en la estación anterior a los machos, la primavera.

El presente capítulo presenta una aproximación integral sobre la adquisición de la madurez sexual de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa bajo los criterios gonadal, morfométrico y funcional. Se pudo establecer que en el caso de las hembras de ambas especies las tallas estimadas en las que el 50% de las hembras alcanzan la madurez gonadal, morfométrica y funcional se encuentran en un rango acotado de tamaño. Considerando que las estimaciones de talla de madurez del 50% de la población pueden presentar algún grado de variabilidad asociada a la estacionalidad de las proporciones de individuos maduros e inmaduros en las muestras, es razonable asumir que en ambas especies los tres criterios de madurez se cumplen en el mismo estadio de crecimiento. En el caso de los machos, los rangos de adquisición de la madurez sexual abarcan desde los 36 mm a los 60 mm de AC para Leurocyclus tuberculosus y desde los 32 a los 45 mm de AC para Libinia spinosa. En función de estos rangos de talla y conforme a lo indicado en el Capítulo III, en cuanto a que un macho no podría crecer más de un 25% del tamaño corporal al mudar a la pubertad es probable, particularmente para L. tuberculosus, que los machos muden más de una vez para adquirir la madurez sexual completa.

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Libinia spinosa

Estructura Poblacional

CAPÍTULO III

Biología Reproductiva de Majoidea Estructura Poblacional CAPÍTULO III

Estructura poblacional y distribución espacio temporal de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa

INTRODUCCIÓN

El estudio de la estructura poblacional es fundamental para la comprensión de los ciclos de vida de las especies. La información sobre la estructura de tallas, en particular, es frecuentemente utilizada para estimar el crecimiento identificando los estadios inmaduros y maduros, la edad de los individuos en la población, así como también para detectar periodos de reclutamiento (Brown y Powell 1972; Somerton 1980; Donaldson et al. 1981; Du Preez y Mclachlan 1984; Caddy 1986; Lovrich et al. 1995; Orensanz et al. 1995; Begon et al. 1996; Comeau et al. 1999; López-Greco et al. 2000; Carmona-Suárez 2003; Cobo 2006) y brinda información sobre el desplazamiento/migración de las especies (Sainte Marie et al. 1995; Alunno-Bruscia y Sainte-Marie 1998; Dionne et al. 2003). En los crustáceos los movimientos estacionales de las especies sugieren que la distribución espacial está relacionada con el crecimiento y la reproducción (Brêthes et al. 1987; Sainte Marie et al. 1988; Ennis et al. 1990; Comeau et al. 1991; Sainte Marie y Hazel 1992; Hartnoll et al. 1993; González-Gurriarán et al. 1995; Lovrich et al. 1995; Carmona-Suárez 2003). El crecimiento en dimensiones externas es un proceso discontinuo con rápido incremento de tamaño en la postmuda seguido de un periodo de intermuda prolongado donde la talla permanece aproximadamente sin cambios (Somerton 1980; Hartnoll 1982. De este modo, la estructura de tallas está determinada por la frecuencia de mudas y el incremento en el crecimiento de una muda a la siguiente. Se han descripto dos patrones de crecimiento en Crustacea: el crecimiento indeterminado y el determinado (Hartnoll y Briant 2001). Dentro de la segunda categoría se distinguen tres modelos: 1) crecimiento determinado con un número variable de estadios y adquisición de la madurez antes de la última muda; 2) crecimiento determinado con un número variable de estadios y adquisición de la madurez en la última muda; 3) crecimiento determinado con un número fijo de estadios y adquisición de la madurez en la última muda (López-Greco 1997a). Sobre estos modelos de crecimiento se puede

Biología Reproductiva de Majoidea Estructura Poblacional determinar el momento en que ocurre la muda puberal, etapa relevante en la cual las especies alcanzan la madurez sexual morfométrica (Hartnoll 1982, 1985; Sainte Marie y Hazel 1992, Sampedro et al. 1999, Hartnoll y Bryant 2001; Ernst et al. 2005; Schejter y Spivak 2005, Leal et al. 2008). En general, las especies de Majoidea presentan un crecimiento determinado donde se propone que la muda puberal es la muda “terminal” tanto en las hembras como en los machos (Hartnoll 1982, 1985; Conan y Comeau 1986; Bailey y Elner 1989; Hartnoll y Briant 2001). Sin embargo no existe un consenso de que esa característica sea válida para todas las especies del grupo (Sainte Marie et al. 1995; Paul y Paul 1996). Donaldson y Adams (1989) observaron en Chionoecetes bairdii que sólo en las hembras la muda puberal sería también la terminal, mientras que los machos continuarían creciendo a tasas menores que los juveniles luego de la muda puberal. En contraste con la abundante información sobre la madurez sexual de numerosas especies de Majoidea (Hartnoll 1963, 1965, 1974; Orensanz et al. 1995; Alunno-Bruscia y Sainte-Marie 1998; López-Greco et al. 2000; Cobo 2002; Schejter y Spivak 2005; Hartnoll 2006; Barón et al. 2009; Sal Moyano et al. 2010a,b, entre otros) poco se conoce sobre su crecimiento. Miller y Watson (1976) y Moriyasu et al. (1987) establecieron las relaciones de crecimiento por muda en Chionoecetes opilio basados en estudios de laboratorio. Moriyasu et al. (1987) mostraron que el incremento de tamaño es mayor entre estadios de crecimiento de juveniles que el crecimiento que ocurre cuando mudan de un estadio juvenil a un estadio maduro (Donaldson et al. 1981; Comeau et al. 1998; Hartnoll y Bryant 2001). Dado que la temperatura es considerada como el factor más importante en la distribución espacial en Crustacea (Brethes et al. 1987; Gilbert y Pettigrew 1997; Frederich et al. 2000) así como también, en menor orden, la profundidad y el tipo de sustrato (Brêthes et al. 1987; Robichaud et al. 1989; Comeau et al. 1998; Carmona- Suárez 2002), los análisis de la frecuencia de tallas de la población durante el ciclo anual permiten plantear hipótesis sobre la migración de las especies y evaluar la existencia de agregaciones reproductivas estacionales, así como diferencias en el uso de hábitat por cada sexo o estadio de crecimiento (Begon et al. 1996; Dionne et al. 2003; Cobo 2006; Burmeister y Sainte-Marie 2010). En Chionoecetes opilio se ha demostrado que las hembras realizan una migración durante su ontogenia siguiendo gradientes óptimos de temperatura (Dionne et al. 2003; Ernest et al. 2005).

- 96 - Biología Reproductiva de Majoidea Estructura Poblacional Según la teoría de Fisher para las poblaciones naturales se espera una proporción de sexos de 1:1 (hembras:machos) generalmente favorecida por la selección natural (Fisher 1930). Comeau et al. (1998) indicaron que la distribución espacial de machos y hembras en Majoidea se desvía de la proporción esperada y que varía en función de patrones estacionales. Cobo (2006) observó que Mithraculus forceps presenta una proporción de sexos 1:0,76 a favor de los machos mientras que López-Greco et al. 2000 observaron una proporción de sexos 1:1 para Microphrys bicornutus durante todo el ciclo anual. Los Majoidea constituyen un grupo de cangrejos ampliamente distribuídos en una gran variedad de hábitats y presentan diversas estrategias de vida siendo un grupo taxonómico importante para estudios ecológicos (Brêthes et al. 1987; Sampedro et al. 1999; Cobo 2002; Flores et al. 2002; Carmona-Suárez 2003; Mantelatto et al. 2003; Marques et al. 2003). Como fue mencionado en la introducción de la presente tesis, Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa presentan una distribución en un amplio rango de latitudinal por lo que son esperables diferentes estructuras poblacionales a lo largo de su gradiente de distribución. El presente capítulo provee información sobre la estructura poblacional de ambas especies de “cangrejos araña” en los golfos norpatagónicos, focalizada en el análisis de sus frecuencias de tallas y proporción de sexos en función de la profundidad y la estacionalidad.

OBJETIVO

Evaluar la estructura poblacional y la distribución espaciotemporal de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa en los golfos Norpatagónicos.

En el marco de este objetivo las hipótesis planteadas son:

Hipótesis 1: La frecuencia de tallas de ambos sexos de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa permite visualizar más de un estadio de crecimiento luego de la muda puberal con diferencias entre sexos.

- 97 - Biología Reproductiva de Majoidea Estructura Poblacional Hipótesis 2: La proporción de sexos de las especies estudiadas se desvía de la proporción esperada 1:1.

Hipótesis 3: La proporción de sexos para ambas especies difiere entre estaciones anuales y entre rangos de profundidad.

MATERIALES Y MÉTODOS

Para establecer la estructura de tallas y sexos de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa, así como sus variaciones en función de la profundidad y la estacionalidad, se realizaron muestreos mensuales desde 2006 hasta 2010 en varias localidades de los golfos norpatagónicos (Figura 1).

Descripción del sitio de estudio Los denominados golfos norpatagónicos abarcan, de norte a sur, el golfo San Matías, el golfo San José y el golfo Nuevo (Figura 1). El golfo San Matías (40º 42’, 42º 41’ S y 63º 45’, 65º 09’ W) se extiende desde Punta Bermeja, provincia de Río Negro, a Punta Norte, extremo de la península Valdés, Provincia del Chubut. Este golfo es una cuenca semicerrada comunicada parcialmente con el mar abierto a través de una plataforma somera de 60 m de profundidad su superficie es de 19700 km2 y su profundidad máxima alcanza los 180 m (Piola y Rivas 1997). El golfo San José está localizado en la zona norte de Península Valdés (42º 20´ S, 64º 25´ W). La entrada al golfo está en contacto directo con el golfo San Matías, presenta una superficie de 2250 Km2 y una profundidad promedio de 30 m con una máxima de 85 m (Zaixo 1997). El golfo Nuevo es un accidente costero ubicado al noreste de la provincia del Chubut, al sur del Istmo Carlos Ameghino que une a la península Valdés con el continente. El golfo posee 90 Km de largo por 65 Km de ancho, su entrada de 18 Km está flanqueado al noreste por el Morro Nuevo y por Punta Ninfas al suroeste, y constituye un cuerpo de agua semicerrado con características particulares, entre ellas: tamaño relativamente pequeño, costas con pendiente pronunciada, poco intercambio de agua con la plataforma y alcanza 180 m de profundidad (Rivas y Ripa 1989).

- 98 - Biología Reproductiva de Majoidea Estructura Poblacional Los sitios de muestreo del presente capítulo abarcaron la zona norte y sur de cada golfo. El golfo San Matías se muestreó en la zona noreste, Bahía Creeck (41°04´S; 63°56 ′W) y en la zona suroeste, Puerto Lobos (42°03´S; 64°56 ′W). El golfo San José se muestreó en San Román zona norte (42°17´ S; 64° 17 ′ W) y en playa Fracasso zona sureste (42°23´S; 64°13 ′W). El golfo Nuevo se muestreó desde cerca de la desembocadura noreste en Puerto Pirámides (42°40´S; 64°18 ′W), al oeste en Puerto Madryn (42°46´S; 64°59 ′W), al suroeste en la playa de Cerro Avanzado (42°49´S; 64°47 ′ W) y cerca de la desembocadura sureste en Bahía Cracker (42°55´S; 64°21 ′W) (Figura 1).

Técnica de muestreo Los muestreos se llevaron a cabo mediante buceo autónomo y el calado de trampas. Adicionalmente se colectaron individuos en forma manual en el intermareal. Los buceos consistieron en transectas paralelas a la costa entre 2 y 8 m de profundidad. En cada buceo se recolectaron todos los Majoidea presentes sobre el fondo. El muestreo con trampas se efectuó en rangos fijos de profundidad: 5-10, 15-20, 25-30, 35-40, 45-50 m, desde un bote semirígido (LAPEMAR I) de 4,5 m de eslora y motor fuera de borda de 40Hp (Figura 48A). En cada muestreo se caló una línea de trampas por cada rango de profundidad. Cada línea tenía 5 trampas separadas 20 metros entre sí (Figura 48B), que fueron identificadas con los números de 1 a 5 de acuerdo a su posición respecto de la boya ubicada en el extremo de la línea. Las trampas utilizadas fueron de forma cilíndricas y plegables, con un diámetro de 26cm, largo de 50cm y tamaño de malla de 10 mm, las cuales poseen conos de ingreso en los extremos (Figura 48C, 48D). El tiempo de calado fue de 24 horas y para el cebado se utilizó 0,5 kg de espinazos de merluza por trampa, en forma estandarizada durante todo el estudio. El día posterior al calado se retornó al sitio de muestreo y se izaron las líneas identificadas con un número en las boyas. Los animales contenidos en cada trampa fueron colocados en bolsas plásticas etiquetadas con un código considerando la posición de la trampa en la línea y la profundidad de calado.

- 99 - Biología Reproductiva de Majoidea Estructura Poblacional

Figura 48. Método de muestreo con trampas cebadas. A- Embarcación semirígida (LAPEMAR I). B- Línea de trampas, T: trampa; 1,2,3,4,5: la posición de la trampa en la línea; 20 m: es la separación entre trampa y trampa. C- Trampa cilíndrica, se pueden observar dos ejemplares de Leurocyclus tuberculosus. D- Trampa plegada dentro de la embarcación indicada con la flecha negra.

Los animales capturados fueron transportados al Laboratorio del CENPAT. Para cada trampa se registró la cantidad de hembras y machos de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa. Los sexos de los individuos fueron determinados por la morfología del abdomen (Figura 20 del Capítulo II) y a todos los ejemplares capturados se midió el ancho máximo de caparazón (AC) mediante el uso de un calibre electrónico con una precisión del 0,001 mm (Figura 21 del Capítulo II).

Estructura Poblacional Frecuencia de tallas de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa Para identificar los estadios de crecimiento de cada sexo de ambas especies, se diagramaron histogramas de frecuencias de talla (AC) con clases de 1 mm de AC (Barriga et al. 2009). Las distribuciones de frecuencias de talla (DFT) fueron calculadas y en las mismas se identificaron los componentes modales utilizando el método de Bhattacharya (1967) incluido en la subrutina de Análisis de Progresión Modal (MPA) del programa

- 100 - Biología Reproductiva de Majoidea Estructura Poblacional FiSAT (FAO-ICLARM Stock Assessment Tools) (Gayanilo y Pauly 1997; Gayanilo et al., 2003; Barriga et al. 2009). El promedio, el desvío estándar y la proporción de ejemplares de cada uno de las componentes modales fueron utilizados como parámetros iniciales para realizar un ajuste de las componentes teóricas a los datos de frecuencia de tallas observadas mediante la maximización del cociente de verosimilitud utilizando la rutina Solver de Excel 2003 (Barriga et al. 2009). En aquellas tallas donde no se pudieron ajustar los componentes modales se calcularon los estadios de crecimiento por retrocálculo. Para esto, a partir del incremento del menor estadio juvenil obtenido por el método de Bhattacharya (1967) se calculó la media del estadio de crecimiento anterior (Somerton 1980; Barriga et al. 2009).

Proporción de sexos Para analizar las variaciones espaciotemporales en la proporción de sexos de ambas especies, se clasificó a los ejemplares en categorías de madurez morfométrica en base a los resultados obtenidos en el Capítulo II. Para Leurocyclus tuberculosus las hembras inmaduras son aquellas menores a 49 mm de AC con vulva cerrada y las hembras maduras aquellas mayores a 37 mm de AC con vulva abierta. Los machos inmaduros y maduros de L. tuberculosus fueron aquellos de talla (AC) menor o mayor a 59 mm respectivamente. En Libinia spinosa las hembras inmaduras son aquellas menores a 53 mm de AC con vulva cerrada y las maduras aquellas mayores a 42 mm de AC con vulva abierta. Los machos de L. spinosa inmaduros y maduros son aquellos con tallas menores y mayores a 35 mm de AC respectivamente. La proporción de sexos de ambas especies se analizó para: 1) todos ejemplares obtenidos, 2) sólo los individuos inmaduros y 3) sólo los individuos maduros. Se realizaron comparaciones entre las proporciones de sexos por golfo, por estación de año y por profundidad de captura mediante pruebas Chi-cuadrado (Sokal y Rohlf 1995).

- 101 - Biología Reproductiva de Majoidea Estructura Poblacional RESULTADOS

Muestras obtenidas Un total de 1545 ejemplares de Leurocycus tuberculosus (1011 hembras y 534 machos) y 289 ejemplares de Libinia spinosa (138 hembras y 151 machos) fueron capturados en los golfos norpatagónicos en los años 2006 al 2010 (Tabla VI). En total se realizaron 66 campañas en el golfo Nuevo a 4 sitios de muestreo, en las que se colectaron 1347 individuos de L. tuberculosus y 286 ejemplares de L. spinosa (Tabla VI). El sitio en que se obtuvo la mayor cantidad de ejemplares fue Bahía Cracker para L. spinosa y Cerro Avanzado para L. tuberculosus (Tabla VI). Se realizaron 13 campañas al golfo San José, 6 a Playa Fracasso y 7 a Playa San Román. En este golfo no se capturaron ejemplares de L. spinosa en ninguna de las campañas y sólo se capturaron 86 ejemplares de L. tuberculosus (Tabla VI). Se realizaron 2 campañas por sitio de muestreo en el golfo San Matías. No se capturaron ejemplares de ninguna de las dos especies en Bahía Creeck y se capturaron 112 ejemplares de L. tuberculosus y 3 ejemplares de Libinia spinosa en Puerto Lobos (Tabla VI).

Tabla VI. Número de ejemplares de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa obtenidos en los golfos Norpatagónicos. H: hembras; M: machos.

L. spinosa L. tuberculosus Total general Lugar H M Total H M Total Bahía Cracker 134 144 278 79 24 103 381 Cerro Avanzado 0 3 3 465 213 678 681 Nuevo Puerto Madryn 2 3 5 248 183 431 436 Puerto Pirámides 0 0 0 68 67 135 135 Total g. Nuevo 136 150 286 860 487 1347 1633 Playa Fracasso 0 0 0 40 23 63 63 San José Golfo San Román 0 0 0 22 1 23 23 Total g. San José 0 0 0 62 24 86 86 Puerto Lobos 2 1 3 89 23 112 112 San Matías Bahía Creek 0 0 0 0 0 0 0 Total g. San Matías 2 1 3 89 23 112 115 Total general 138 151 289 1011 534 1545 1834

- 102 - Biología Reproductiva de Majoidea Estructura Poblacional Estructura Poblacional Estructura de tallas de Leurocyclus tuberculosus El total de hembras colectadas presentó un rango de tallas de 2,2 a 81,79 mm de AC. La discriminación de los componentes modales en la distribución de frecuencia de tallas de las hembras de L. tuberculosus permitió obtener estimaciones sobre la talla media de cada estadio de crecimiento y el incremento de talla entre estadios sucesivos (Figura 49; Tabla VII). Se observó que a medida que las hembras aumentan de tamaño el incremento de talla es menor (Figura 49; Tabla VII). Dentro del rango de tallas de los ejemplares obtenidos se determinaron 13 estadios de crecimiento. Sin embargo, la determinación fue realizada por métodos diferentes: a partir de los 13 mm de AC pudieron detectarse 8 estadios (numerados VI–XIII) por ajuste de frecuencia de tallas a los componentes modales (Figura 49). En tallas menores a los 13 mm de AC, a pesar de poseer numerosos ejemplares, la escasa resolución de las DFT obtenidas en clases de talla de 1 mm no permitió ajustar distribuciones normales, como tampoco en un ajuste de componentes normales sobre DFT con clases de talla menor (0,3 mm) que resultó en una subdivisión de los datos observados. Por lo tanto, tomando en cuenta el incremento de talla entre estadios juveniles (VI al VII) de un 38% (Tabla VII) y la talla (AC) de la hembra más pequeña obtenida (2,2 mm AC) se estimaron por retrocálculo 5 estadios de crecimiento de tallas menores a 13 mm de AC. Las tallas de una hembra mantenida en acuario, antes y después de la muda de pubertad fueron respectivamente 39,99 mm y 48,93 mm de AC, representando un incremento del 22% de talla entre los estadios IX y X (Figura 49).

Tabla VII. Parámetros de las distribuciones de probabilidad normal correspondientes a componentes modales ajustadas sobre las distribuciones de frecuencia de talla (AC) de hembras de Leurocyclus tuberculosus e incremento porcentual entre estadios de crecimiento consecutivos.

AC Estadio de Promedio crecimiento (mm) Desvío Estándar Incremento de talla (%) VI 16,43 2,19 --- VII 22,79 2,47 38,68 VIII 30,70 2,68 34,70 IX 39,99 3,40 30,27 X 50,75 3,63 26,92 XI 57,06 4,09 12,42 XII 68,28 2,42 19,66 XIII 74,50 1,54 9,11

- 103 - Biología Reproductiva de Majoidea Estructura Poblacional

Figura 49. Distribución de frecuencia de tallas (mm) de hembras de Leurocyclus tuberculosus colectados en los golfos norpatagónicos (Barras) y distribuciones normales de las componentes modales ajustadas (Líneas negras). Barras celestes: hembras morfométricamente inmaduras; barras rosa: hembras morfométricamente maduras (Capítulo II). Los números romanos sobre las componentes modales identifican los estadios de crecimiento establecidos. La línea verde indica la distribución agregada de todas las componentes modales. La flecha indica las tallas de un ejemplar hembra antes y después de la muda puberal registradas en acuario.

El total de machos colectados presentó un rango de tallas de 3,13 a 79,46 mm de AC. En este rango se determinaron 13 estadios de crecimiento. Las componentes modales ajustadas a las DFT de los machos de L. tuberculosus a partir de los 13 mm de AC (Figura 50) fueron 8, correspondiendo a los estadios VI a XIII. Por retrocálculo, en función del incremento de talla (AC) estimado (Tabla VIII) entre los valores medios de las componentes modales juveniles más pequeñas que fueron ajustadas (VI a VII) y de la talla del ejemplar macho más pequeño observado (3,13 mm AC), se estimó la talla media de otros 5 estadios de crecimiento menores a 13 mm de AC. La talla media de las componentes modales ajustadas a las DFT de los machos de L. tuberculosus permitió estimar el crecimiento porcentual de talla entre estadios de crecimiento sucesivos (Figura 50; Tabla VIII), observándose el mismo patrón que para las hembras: una disminución del crecimiento porcentual entre estadios de crecimiento sucesivos mayores (Figura 50; Tabla VIII). Las tallas de un ejemplar macho mantenido en acuario, antes y después de la muda entre dos estadios de crecimiento sucesivos fueron de 21,14 mm y 28,79 mm de

- 104 - Biología Reproductiva de Majoidea Estructura Poblacional AC respectivamente, representando un incremento de un 36% entre los estadios de crecimiento VI a VII ó VII a VIII (Figura 50).

Tabla VIII. Parámetros de las distribuciones de probabilidad normal correspondientes a las componentes modales ajustadas sobre las distribuciones de frecuencia de talla (AC) de machos de Leurocyclus tuberculosus e incremento porcentual entre estadios de crecimiento consecutivos.

Estadios de AC promedio crecimiento (mm) desvío estándar incremento de talla (%) VI 16,41 1,79 --- VII 22,90 2,69 39,57 VIII 30,95 2,43 35,16 IX 38,04 3,12 22,90 X 48,37 3,92 27,18 XI 58,52 3,82 20,98 XII 68,21 2,75 16,56 XIII 74,51 1,42 9,24

Figura 50. Distribución de frecuencia de tallas (mm) de machos de Leurocyclus tuberculosus colectados en los golfos norpatagónicos (barras) y distribuciones normales de las componentes modales ajustadas (líneas negras). Barras celestes: ejemplares morfométricamente inmaduros; barras rosa: ejemplares morfométricamente maduros (Capítulo II). Los números romanos sobre las componentes modales identifican los estadios de crecimiento establecidos. La línea verde indica la distribución agregada de todas las componentes modales. La flecha indica las tallas de un ejemplar macho antes y después de la muda entre estadios de crecimiento juveniles registradas en acuario.

- 105 - Biología Reproductiva de Majoidea Estructura Poblacional Estructura de tallas de Libinia spinosa. Para ambos sexos de L. spinosa sólo se obtuvieron ejemplares maduros en las muestras provenientes de los golfos norpatagónicos. El total de hembras colectadas presentó un rango de tallas de 44,2 a 63 mm de AC y el total de machos un rango de 44,4 a 48 mm de AC por lo tanto, la frecuencia de tallas sólo permitió ajustar componentes modales a DTF representativa de ejemplares que pasaron la muda puberal, hembras mayores a 42 mm de AC y machos mayores a 36 mm de AC (Capítulo II). Sobre las DTF de las hembras de L. spinosa se discriminaron tres componentes modales correspondientes a categorías nominales de estadios de crecimiento adultos denominados A, B y C. A partir de los incrementos de la media de las distribuciones normales ajustadas se estimó el crecimiento porcentual de talla (AC) entre estadios de crecimiento sucesivos (Figura 51; Tabla IX).

Tabla IX. Parámetros de las distribuciones de probabilidad normal correspondiente a componentes modales ajustadas sobre las distribuciones de frecuencia de talla (AC) de hembras de Libinia spinosa e incremento porcentual entre estadios de crecimiento consecutivos.

AC Estadios de Promedio crecimiento (mm) Desvío Estándar Incremento de talla (%) A 49,54 2,12 --- B 54,14 1,51 9,04 C 58,14 1,64 7,39

Figura 51. Distribución de frecuencia de tallas (mm) de hembras de Libinia spinosa colectadas en los golfos norpatagónicos (barras) y distribuciones normales de las componentes modales ajustadas (líneas negras). Las letras sobre las componentes modales identifican los estadios de

- 106 - Biología Reproductiva de Majoidea Estructura Poblacional crecimiento establecidos. La línea verde indica la distribución agregada de todas las componentes modales.

Sobre las DFT de los machos de L. spinosa se discriminaron 6 componentes modales correspondientes a estadios de crecimiento adultos denominados A, B, C, D, E, y F. El incremento porcentual de talla entre estadios de crecimiento decreció en las mudas sucesivas (Tabla X; Figura 52).

Tabla X. Parámetros de las distribuciones de probabilidad normal correspondiente a componentes modales ajustadas sobre las distribuciones de frecuencia de talla (AC) de machos de Libinia spinosa e incremento porcentual entre estadios de crecimiento consecutivos.

Estadios de AC Promedio crecimiento (mm) Desvío Estándar Incremento de talla (%) A 51,10 2,84 --- B 59,31 3,05 16,05 C 67,76 3,59 14,25 D 75,97 1,78 12,11 E 81,27 1,26 6,97 F 88,18 2,92 8,50

Figura 52. Distribución de frecuencia de tallas de machos adultos de Libinia spinosa colectados en los golfos norpatagónicos y distribuciones normales de las componentes modales ajustadas. Las letras sobre las componentes modales identifican los estadios de crecimiento establecidos. La línea verde indica la distribución agregada de todas las componentes modales.

- 107 - Biología Reproductiva de Majoidea Estructura Poblacional Proporción de sexos Leurocyclus tuberculosus De un total de 1545 ejemplares de L. tuberculosus, incluyendo adultos y juveniles se muestrearon 1011 hembras y 534 machos. La proporción de sexos entre machos y hembras resultó significativamente diferente de la proporción 1:1, siendo más abundantes las hembras (X2=12,93; p=0,001). Las proporciones de sexos fueron significativamente diferentes entre las muestras obtenidas de los golfos (X2= 12,93; p= 0,001). En el golfo San Matías la relación fue 3,8:1 (hembras:machos) y en el golfo Nuevo fue de 1,7:1 (hembras: machos). Los muestreos en el golfo Nuevo se realizaron durante todo el ciclo anual, permitiendo realizar el análisis de los datos por estaciones del año. La proporción de sexos de individuos maduros fue significativamente diferente entre estaciones (X2 = 14,83; p=0,001), aunque la proporción de hembras fue mayor que la de machos en todas las estaciones, la proporción de sexos registrada en otoño e invierno fue de 2:1 (hembras:machos) mientras que la de primavera y verano fue de 1,5:1 (hembras:machos). No se hallaron diferencias significativas en las proporciones de machos y hembras maduros entre profundidades (X2 = 4,12; p= 0,38) aunque se mantuvo siempre a favor de las hembras. El análisis de la proporción de hembras inmaduras y hembras maduras a lo largo del año varió significativamente (X2 = 67,44; p<0,05), encontrándose mayor cantidad de ejemplares inmaduros en verano y menor cantidad en invierno. El mismo patrón se observó para los machos (X2 = 14,21; p< 0,05), con la diferencia de que la menor proporción de inmaduros se observó en otoño. La proporción de hembras inmaduras en relación a machos inmaduros no presentó diferencias respecto de la proporción 1:1 (X2 = 0,07; p= 0,69). Tampoco se hallaron diferencias significativas entre dicha proporción entre estaciones del año (X2= 0,39; p = 0,94).

Libinia spinosa Dado que sólo se capturaron cantidades representativas de L. spinosa en el golfo Nuevo (Tabla VI), no se pudieron evaluar las diferencias en la proporción de sexos de la especie entre los golfos. Asimismo, las muestras de L. spinosa recolectadas en el golfo Nuevo sólo incluyeron individuos morfométricamente maduros, por lo cual tampoco se comparan proporciones de sexo entre individuos inmaduros y maduros.

- 108 - Biología Reproductiva de Majoidea Estructura Poblacional En el golfo Nuevo se capturaron un total de 286 ejemplares, 136 hembras y 150 machos. La proporción de sexos no difirió significativamente de 1:1 (hembras:machos) (X2=0,23; p=0,62). Sin embargo, la proporción de individuos maduros difirió significativamente entre estaciones (X2 = 16,02; p = 0,001). En verano fue mayor la proporción de machos, en invierno y otoño no se detectaron diferencias, pero en primavera fue mayor la proporción de hembras. También se detectaron diferencias significativas en la proporción de sexos de L. spinosa entre profundidades (X2 = 13,97; p = 0,002). En el estrato de profundidad nominal de 20 m se observó mayor proporción de machos, y en el de 40 m se observó mayor proporción de hembras.

DISCUSIÓN

En el presente capítulo se describió la estructura poblacional de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa en los golfos norpatagónicos. El muestreo exploratorio sobre la extensa línea costera incluida dentro del rango latitudinal de 41º-43ºS permitió confirmar la presencia de Leurocyclus tuberculosus en los tres golfos, mientras que Libinia spinosa sólo fue detectada en cantidades significativas cerca de la desembocadura del golfo Nuevo (Bahía Cracker). Las capturas de esta última especie en el golfo San Matías fueron escasas y las correspondientes al golfo San José fueron nulas. Tomando en cuenta las abundancias relativas en los sitios de muestreo y la presencia de ejemplares a lo largo del año, los esfuerzos de muestreo fueron incrementados en Bahía Cracker y Cerro Avanzado a fin de garantizar la obtención de información biológica estacional sobre ambas especies. El análisis de la estructura de tallas de las hembras de Leurocyclus tuberculosus permitió identificar 8 estadios de crecimiento y estimar otros 5, completando un total de 13. Las tasas de crecimiento estimadas sobre los componentes modales ajustados variaron de 38 a 30% entre los estadios VI al IX; a partir de éste último, el incremento disminuyó al 26%. Esta última estimación fue validada por la observación directa de la talla pre y postmuda de un ejemplar mantenido en acuario. La disminución marcada en la tasa de crecimiento entre estadios juveniles suele estar relacionada a la ocurrencia de la muda puberal (Somerton 1980). En las hembras de L. tuberculosus la talla en la que se observa el 50% de los individuos maduros (Capítulo II) abarca los estadios IX y X, lo que indica que en la transición entre ambos ocurre la muda de pubertad.

- 109 - Biología Reproductiva de Majoidea Estructura Poblacional Sin embargo se observa también una proporción baja de hembras de pequeña talla pero morfométricamente maduras que podrían pertenecer a los estadios de crecimiento VIII o IX y también de hembras inmaduras grandes que podrían pertenecer al estadios de crecimiento XI, por lo cual no debería descartarse la posibilidad de que unos pocos individuos de la población muden a la pubertad en la transición entre otros estadios de crecimiento además del IX al X. Un patrón como el señalado ha sido reportado en otros Majoidea en los que el estadio de crecimiento de adquisición de madurez varía en función a condiciones externas óptimas para la reproducción. Tal es el caso de Chionoecetes opilio, especie en la que se han observado "pseudo-cohortes" constituídas por hembras que alcanzan la muda puberal a tallas menores en un año determinado, resultando en que la muda de pubertad se detecte entre más de dos estadios de crecimiento consecutivos (Alunno-Bruscia y Sainte-Marie 1998; Ernst et al. 2005; Burmeister y Sainte-Marie 2010). En las DFT de las hembras de L. tuberculosus se detectaron cuatro estadios de crecimiento posteriores la muda de pubertad principal, indicando que la muda pubertad no es la muda terminal. Un patrón similar fue descripto para los machos de otras especies de Majoidea (Dawe et al. 1991; Paul y Paul 1996). Si por el contrario, la muda de pubertad coincidiera con la muda terminal, los ejemplares maduros más grandes deberían incrementar sus tallas (AC) en más de un 60% durante la muda de pubertad. Esto último es improbable si se considera que el incremento de talla en las mudas de los Eubrachyura, incluidos los Majoidea, no excede el 40% tanto para machos como para hembras, y menos aún entre los estadios de crecimiento más avanzados (Tunberg y Creswell 1991; González-Gurriarán et al. 1995; Paul y Paul 1996; Hartnoll y Bryant 2001; Hébert et al. 2002). La discriminación en las componentes modales de las tallas a partir de las DFT de los machos de Leurocyclus tuberculosus permitió detectar 8 estadios de crecimiento en el rango de tallas superiores a 13 mm de AC, y estimar la existencia de otros 5 en tallas menores, totalizando 13 estadios de crecimiento. Este número de estadios de crecimiento es consistente con el obtenido independientemente a partir de las DFT de las hembras de la misma especie, las que además alcanzan tallas máximas similares a las de los machos. Dado que la talla a la cual el 50% de los ejemplares ha alcanzado la madurez morfométrica (Capítulo II) es de aproximadamente 59 mm de AC y que entre 58 y 60 mm de AC se observan individuos inmaduros y maduros (Capítulo II), la muda de pubertad en los machos de esta especie ocurriría en el pasaje de los estadios de crecimiento X a XI, XI a XII o XII a XIII. Esto indica que al igual que las hembras de L. tuberculosus, los machos mudan a la pubertad en el pasaje entre más de dos estadios de crecimiento

- 110 - Biología Reproductiva de Majoidea Estructura Poblacional consecutivos. De acuerdo a las componentes modales detectadas la muda de pubertad de los machos de L. tuberculosus no coincide con la muda terminal. Para Libinia spinosa la DFT de las hembras y machos sólo permitió discriminar componentes modales sobre las clases de talla correspondientes a ejemplares maduros debido a la escasa representación de individuos morfometricamente inmaduros en las muestras. En las DFT de las hembras de L. spinosa se distinguieron tres estadios de crecimiento, con un incremento de tallas (AC) entre estadios de crecimiento de aproximadamente el 10%, similar al observado para Leurocyclus tuberculosus de tallas mayores a la de la muda puberal. Dado que las hembras de Libinia spinosa presentan ejemplares morfométricamente inmaduros y maduros dentro del rango de 42–53 mm (Capítulo II), la muda de pubertad debe ocurrir en el pasaje al estadio de crecimiento A, aunque no puede descartarse que en algunos ejemplares esta ocurra en el pasaje entre los estadios de crecimiento A y B. Aún así, dada la ausencia de hembras inmaduras de L. spinosa en estos sitios de muestreo, la confirmación de una u otra propuesta no puede ser realizada sobre la base de las muestras disponibles. En el caso de los machos de Libinia spinosa la discriminación de seis componentes modales sobre las DFT correspondió exclusivamente a ejemplares morfométricamente maduros (> 36 mm de AC), con una frecuencia de incremento porcentual de talla entre estadios de crecimiento sucesivos del 16 al 9%, similar a las observado sobre las DFT de los machos maduros de Leurocyclus tuberculosus. En relación a la diferencia en el número de estadios de crecimiento entre machos y hembras de Libinia spinosa, cabe mencionar que la especie posee un marcado dimorfismo sexual, con tallas máximas observadas para machos (98 mm de AC) mayores que las observadas en las hembras (63 mm de AC). Este patrón contrasta con el descripto para Leurocyclus, sugiriendo la existencia de estrategias reproductivas diferentes para ambos Majoidea. Por otra parte, las proporciones de sexos de ejemplares maduros de ambas especies en el golfo Nuevo, 2:1 para Leurocyclus tuberculosus y 1:1 para Libinia spinosa, también sugieren comportamientos reproducivos diferentes. La proporción de sexos en las muestras de Leurocyclus tuberculosus maduros respecto de la proporción 1:1 se diferencia de la predicha por la teoría de Fisher. Sin embargo, las desviaciones de la proporción de sexos son comunes en las especies de crustáceos marinos como consecuencia de la acción de varios mecanismos, tales como

- 111 - Biología Reproductiva de Majoidea Estructura Poblacional las diferentes tasas de crecimiento y mortalidad, segregación y competencia por el hábitat, migración y disponibilidad de alimento (Wenner 1972). Este patrón, denominado "anómalo" (Wenner 1972), se caracteriza por la igualdad o casi igual representación de machos y hembras al nacer, seguido de un irregular aumento o disminución de los machos o las hembras en las clases de adultos. Los resultados obtenidos para L. tuberculosus indican mayor proporción de hembras en la etapa adulta, lo cual sugiere que la disponibilidad de los machos podría representar una limitante para el potencial reproductivo de la población. Este mismo patrón diferencial en la etapa madura pero a favor de los machos fue observado en Mithraculus forceps (Cobo 2006). En este sentido, aunque la proporción de ejemplares inmaduros y maduros de L. tuberculosus de ambos sexos varió a lo largo del año, encontrándose mayor proporción de hembras inmaduras en verano y menor proporción en invierno, así como menor proporción de machos en otoño, no se observaron diferencias entre las diferentes profundidades para ninguno de los dos sexos. Sin embargo, si sólo se toman en cuenta los individuos maduros de L. tuberculosus, las proporciones de sexos no variaron entre estaciones anuales o en función a la profundidad, en contraste con lo observado para Libinia spinosa que no presentó diferencias significativas de la proporción 1:1 para la población total pero sí se observaron diferencias de las proporciones de sexos entre estaciones y entre las diferentes profundidades. Aunque estas diferencias se podrían atribuir a migraciones asociadas a la reproducción, no se encontró un ciclo reproductivo estacional definido en la población (Capítulo II) que pueda explicar tales diferencias.

Concluyendo, en Leurocyclus tuberculosus el incremento de tallas es mayor entre los estadios de crecimiento juveniles, tal como ha sido observado en otros Majoidea (Moriyasu et al. 1987), menor entre el último estadio de crecimiento juvenil y el primer maduro, y aún más pequeño entre los estadios de crecimiento maduros (Comeau et al. 1998). Por otra parte, no se pudo hallar evidencia que sugiera que las hembras de L. tuberculosus tengan muda terminal de pubertad en contraste con lo establecido para otras especies de Majoidea (Hartnoll 1963; Alunno-Bruscia y Sainte-Marie 1998; Sampedro et al. 1999). En este sentido, considerando los incrementos porcentuales de tallas reportados en la literatura, como mínimo debe existir una muda posterior a la muda puberal.

- 112 - Biología Reproductiva de Majoidea Estructura Poblacional En relación a las proporciones de sexos, L. tuberculosus presenta mayor proporción de hembras que de machos en la población, pero la proporción de individuos maduros a lo largo del ciclo anual o en función de la profundidad no varía significativamente. Por el contrario Libinia spinosa posee una proporción de sexos general de 1:1 pero muestra variación estacional y espacial (profundidad) en la proporción de sexos lo que podría estar indicando comportamientos reproductivos diferentes entre las especies estudiadas.

- 113 -

Leurocyclus tuberculosus

Fecundidad y Esfuerzo Reproductivo

CAPÍTULO IV

Biología Reproductiva de Majoidea Fecundidad CAPÍTULO IV

Fecundidad y esfuerzo reproductivo de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa

INTRODUCCIÓN

Los estudios sobre la fecundidad y el potencial reproductivo de las especies permiten una mejor comprensión de las estrategias reproductivas y de la dinámica espacio-temporal de una población (García-Montes et al. 1987; Cobo y Okamori 2008). La fecundidad se estima usualmente como el número de huevos por hembra y se describe en función del tamaño corporal (Corey y Reid 1991; Lardies y Wehrtmann 1996; Bas et al. 2007; Diez y Lovrich 2010). Sin embargo algunos autores proponen que es conveniente distinguir las estimaciones de fecundidad según la etapa de producción de huevos (Steachey y Somers 1995; Luppi et al. 1997; López-Greco y Rodríguez 2004) y de acuerdo a esto definieron varios conceptos: 1) la fecundidad potencial como el número de oocitos vitelogénicos en el ovario, 2) la fecundidad realizada como el número de huevos portados por la hembra (equivalente al concepto tradicional de fecundidad) y 3) la fecundidad actual, representada por el número de larvas producidas.

La fecundidad realizada es comúnmente asociada a la inversión o potencial reproductivo definido como la fracción de energía orientada a la reproducción (Hines 1982a, 1991; López-Greco et al. 1997b; Hartnoll 2006). El potencial reproductivo de una hembra es determinado por el número total de descendientes producidos durante su vida, el número de estadios de crecimiento, el número de crías producidas por estadios de madurez y la esperanza de vida de la hembra (Shields 1991). Uno de los estimadores de la inversión reproductiva es el esfuerzo reproductivo (ER) (también denominado “output” reproductivo) definido como el cociente entre el peso seco de la masa de huevos y el peso seco total de la hembra (Hines 1982a, 1991). Para realizar comparaciones interespecíficas o interpoblacionales, otra forma de estimar la fecundidad es la fecundidad relativa que refiere el número de huevos portados por la hembra por unidad de peso o de tamaño de la hembra (López-Greco y Rodríguez 2004).

- 115 - Biología Reproductiva de Majoidea Fecundidad Los Eubrachyura presentan gran variabilidad de estrategias reproductivas involucrando diferencias en los patrones de producción de huevos (Hartnoll y Gould 1988). Los estudios de fecundidad en este grupo han aportado significativo conocimiento sobre las variaciones estacionales en la producción de huevos, el tamaño y volumen de los huevos y su tasa de pérdida durante la incubación (Jones 1980; Reid y Corey 1991; Negreiros-Fransozo et al. 1992; Sudha y Anikumar 1996; Muiño 2002; Silva y Oshiro 2002; López-Greco y Rodríguez 2004; Schejter y Spivak 2005; Bas et al. 2007; Diez y Lovrich 2010). Estos estudios también mostraron una significativa relación entre la fecundidad y el tamaño de la hembra (Hines 1991, 1992; Costa y Negreiros-Fransozo 1996; Lardies y Wehrtmann 1996; López-Greco et al. 1997b, 2000; Carrasco y Zamorano 2000; Cobo y Okamori 2008; Diez y Lovrich 2010) y la relación inversa entre la fecundidad y el tamaño o volumen del huevo (Hines 1982a; Muiño 2002; Bas et al. 2007; Diez y Lovrich 2010). Se ha observado que la masa de huevos puede estar compuesta por pocos huevos grandes o muchos huevos pequeños, lo que produce como resultado que hembras de distintas especies de tamaño equivalente posean una variación significativa en la fecundidad (Hines 1982a; Diez y Lovrich 2010), y por ende una variación en la abundancia de las larvas producidas. Sin embargo, se ha demostrado que algunos factores producen una baja correlación entre el tamaño corporal y la fecundidad, como la propia variación individual en la producción de huevos, la disponibilidad estacional de alimento, la producción de varios desoves durante el período reproductivo y la pérdida natural de los huevos durante el desarrollo (Wear 1974; Hines 1982a; Henmi 1989; Bas et al. 2007; Cobo y Okamori 2008). La variabilidad de los recursos alimentarios asociados a diferente disponibilidad estacional reduce la fecundidad dada la elevada necesidad de proteínas y lípidos para el desarrollo ovárico (Wear 1974; Bas et al. 2007; Dima et al. 2009; Diez y Lovrich 2010). Si estos nutrientes son escasos, las reservas de lípidos del hepatopáncreas y proteínas de los músculos aunque pueden ser “redirigidas” al ovario en desarrollo producen, en general, menor número de oocitos maduros y como resultado menor número de embriones (Wear 1974). La pérdida natural de los huevos puede ocurrir durante cualquier etapa del desarrollo y en los cangrejos Eubrachyura esta pérdida puede ser elevada debido a que llevan sus huevos adheridos a las sedas de los pleópodos quedando parcialmente expuestos (Cobo y Okamori 2008). La mortalidad embrionaria suele ser mayor cuanto más largo es el período de incubación (Talbot 1991) y puede resultar de la abrasión, cambios de temperatura, cambios en los niveles de salinidad, depredadores y parásitos,

- 116 - Biología Reproductiva de Majoidea Fecundidad el canibalismo materno e incluso el aseo o limpieza de los huevos que realizan habitualmente las hembras (Shields 1991; Somers 1991). También puede ocurrir pérdida de huevos durante la oviposición, dada la baja fertilización debido a escasa acumulación de espermatozoides en los receptáculos seminales o por la inadecuada cementación de los huevos a los pleópodos (Somers 1991). Es escasa la información sobre la fecundidad y el esfuerzo reproductivo de las especies de Majoidea Se conoce la fecundidad de algunas especies del género Chionoecetes (Haynes et al. 1976; Sainte Marie 1993), Inachus (Diesel 1988b; Bryant y Hartnoll 1995), Microphrys (López-Greco et al. 2000), Pyromaia (Furota 1996), Libidoclaea (Schejter y Spivak 2005), Halicarcinus (Dunnington 1999; Van den Brink 2006; Diez y Lovrich 2010) y Epialtus (Cobo y Barros 2009). Estas especies presentan en general una tendencia de correlación positiva entre la talla y la fecundidad realizada similar a otros Eubrachyura (Haynes et al. 1976; Hines 1992; Sainte-Marie 1993; López-Greco et al. 2000; Van den Brink 2006; Diez y Lovrich 2010,). Sin embargo se observaron también variaciones de la fecundidad en función a la estacionalidad, a la cantidad de desoves, a la pérdida natural de huevos y a la condición de primíparas (el primer desove luego de la muda puberal) o multíparas (puestas posteriores a la primera) de las hembras (Sainte Marie 1993; Dunnington 1999; Diez y Lovrich 2010). Respecto de las especies Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa hasta el momento no se conocen aspectos sobre la producción de huevos y larvas, y dado que estas especies tendrían un periodo reproductivo continuo (Capítulo II) y una diferencia del 40% y el 30% entre sus respectivas tallas mínimas y máximas de hembras ovígeras (capítulo II), se planteó el siguiente objetivo.

OBJETIVO

Evaluar la fecundidad y el esfuerzo reproductivo de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa en función de la talla de las hembras y sus posibles variaciones durante el ciclo anual de puestas.

- 117 - Biología Reproductiva de Majoidea Fecundidad En el marco de este objetivo las hipótesis planteadas son:

Hipótesis 1: La fecundidad realizada de ambas especies aumenta a medida que aumenta el tamaño corporal.

Hipótesis 2: La fecundidad realizada presenta diferencias entre las especies.

Hipótesis 3: El peso por huevo presenta diferencias entre las especies.

Hipótesis 4: El potencial reproductivo de las especies estudiadas en la presente tesis difiere significativamente.

MATERIALES Y MÉTODOS

Muestreo y mediciones Para el estudio de la fecundidad y el esfuerzo reproductivo de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa se colectaron durante 2007-2008 hembras ovígeras del golfo Nuevo Argentina (42º56´S, 64º22´W) mediante el uso de trampas plegables (Capítulo III). Los ejemplares fueron transportados vivos al laboratorio donde la masa ovígera de cada hembra fue examinada bajo lupa y el estadio de desarrollo de sus embriones fue determinado (Capítulo V). Sólo aquellas hembras que presentaban desarrollo embrionario en el periodo de segmentación (estadio I, Capítulo V) fueron seleccionadas para los análisis de fecundidad. A cada una de ellas se le midió el ancho máximo de caparazón (AC) mediante un calibre Vernier (0,5mm de precisión) y se la pesó obteniendo así el peso fresco de la hembra (PFH) (0,01mg de precisión). Dada la baja proporción de hembras ovígeras en otoño (Capítulo II), para este análisis se compararon las estaciones de invierno, primavera, y verano.

Cálculos de la fecundidad Para determinar la fecundidad, el abdomen de cada una de las hembras con la masa ovígera adherida a los pleópodos fue separado del cefalotórax (Figura 53) y se realizó mediante observación macroscópica una categorización ad hoc referida a la proporción del abdomen ocupada por los huevos. Se establecieron cuatro categorías

- 118 - Biología Reproductiva de Majoidea Fecundidad nominales de acuerdo a la proporción del abdomen ocupado por la masa ovígera: ¼, ½, ¾ y 1 respectivamente y una quinta categoría denominada 2 cuando el gran volumen de la masa ovígera causa que el abdomen no cubra completamente el desove dejándolo parcialmente expuesto (Figura 54). Luego de la categorización del desove, los endopoditos de los pleópodos fueron removidos desde su base (Figura 53D), y a cada uno de ellos se le extrajo la masa de huevos usando una pinza de disección de punta fina. La masa total de huevos de los pleópodos fue pesada para obtener el peso fresco del desove (PFD). Posteriormente todos los huevos fueron colocados en un envase de aluminio y de la masa total de huevos de cada hembra se tomaron 3 submuestras de 300 huevos cada una. Finalmente las hembras, sus desoves y las submuestras de huevos fueron llevados a estufa a 80°C por 48 horas hasta alcanzar peso constante. Los pesos secos de la hembra (PSH), de la masa total de huevos (PSD) y de cada submuestras fueron registrados con una microbalanza analítica Mettler H80.

Figura 53. Hembra de Libinia spinosa. A- Vista dorsal. B- Vista ventral. C- Vista ventral sin el abdomen. D- Abdomen con masa ovígera a la izquierda, y pleópodo con huevos adheridos en el endopodito, a la derecha. (Escala: 1cm). Ab: abdomen; En: endopodito del pleópodo; Ex: exopodito del pleópodo; Mo: masa ovígera; Pl: pleópodo.

- 119 - Biología Reproductiva de Majoidea Fecundidad

Figura 54. Hembra de Leurocyclus tuberculosus. A- Vista ventral con abdomen abierto sin huevos. B- Abdomen con huevos, categoría ¼. C- Abdomen con huevos, categoría ½. D- Abdomen con huevos, categoría ¾. E- Abdomen con huevos, categoría 1. D- Abdomen con huevos, categoría 2. (Escala: 1cm). Ab: abdomen; MO: masa ovígera.

La fecundidad realizada (NH), calculada como la cantidad de huevos que posee la hembra, se estimó extrapolando el peso seco de las submuestras de cantidad de huevos conocida en función del peso seco de la masa total de huevos. La fecundidad relativa (FR) se calculó como el cociente entre la fecundidad realizada y el ancho del caparazón (AC). El esfuerzo reproductivo (ER) se determinó como el cociente entre el peso seco del

- 120 - Biología Reproductiva de Majoidea Fecundidad desove (PSD) y el peso seco de la hembra (PSH): ER= (PSD) /(PSH) * 100. Para cada hembra se calculó el peso seco por huevo (PSPH) como el cociente entre el peso seco de la masa ovígera (PSD) y la fecundidad realizada (NH): PSPH = PSD/NH

Análisis estadísticos. Se analizó la relación entre NH y AC mediante una regresión lineal (Sokal y Rohlf 1995). Las diferencias de NH, FR, ER y PSPH entre especies y las diferencias de fecundidad realizada y relativa entre las estaciones de primavera, verano e invierno para cada especie fueron evaluadas mediante el test no paramétrico de Kruskal Wallis (Sokal y Rohlf 1995) dada la falta de normalidad en los datos. Todos los análisis se realizaron con el software estadístico Infostat versión 2.0.

RESULTADOS

Se utilizaron 85 hembras ovígeras de Leurocyclus tuberculosus de un rango de tallas de 40,30 a 68,79 mm de AC y 95 hembras ovígeras de Libinia spinosa de un rango de tallas de 41,91 a 62,76 mm de AC. Para Leurocyclus tuberculosus la fecundidad realizada promedio estimada fue de 35.199 ± 16.735 huevos por hembra (media ± desvío estándar) y la fecundidad relativa promedio de 661 ± 300 huevos/mm de AC (Tabla XI). La regresión lineal entre la fecundidad realizada y el ancho de caparazón fue significativa (p<0,0001) presentando un R2=0,19 (Figura 55A). Para L. tuberculosus, el valor promedio de ER fue del 4,96% siendo el peso seco por huevo de 29,36 ± 1,21 µg/huevo (Tabla XI).

La fecundidad realizada promedio estimada en hembras de Libinia spinosa fue de 29.164 ± 9.787 huevos, siendo la FR promedio de 547 ± 172 huevos/mm AC (Tabla XI). La regresión entre el ancho de caparazón de la hembra (AC) y la fecundidad realizada (NH) fue significativa (p<0,0001) presentando un R2= 0,16 (Figura 55B). El ER promedio fue del 6,9% siendo el peso seco por huevo de 54,45 ± 6,48 µg/huevo (Tabla XI). Al comparar el ER entre especies se observó que Libinia spinosa presenta un valor significativamente mayor que Leurocyclus tuberculosus (p <0,0001)

- 121 - Biología Reproductiva de Majoidea Fecundidad

Tabla XI. Fecundidad realizada, fecundidad relativa, esfuerzo reproductivo y peso seco por huevo de hembras en estadio I de desarrollo embrionario de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa.

L. tuberculosus L. spinosa Fecundidad realizada (Nº de huevos por hembra) Promedio ± desvío estándar 35.199 ± 16.735 29.164 ± 9.787 Rango 1.175 – 75.922 8.613 – 55.342 N 85 95 Fecundidad relativa (Nº de huevos/mm de AC) Promedio ± desvío estándar 661 ± 300 547 ± 172 Rango 103 – 1.383 188 – 1.098 N 85 95 Esfuerzo reproductivo (%) Promedio ± desvío estándar 4,96 ± 2,25 6,90 ± 2,59 Rango 1,08 - 12,44 2,51 - 18,42 N 85 95 Peso seco del huevo (µg/huevo) Promedio ± desvío estándar 29,36 ± 1,21 54,45 ± 6,48 Rango 19,02 - 29,83 35,21 - 74,25 N 85 95

- 122 - Biología Reproductiva de Majoidea Fecundidad

Figura 55. Fecundidad realizada (NH) en función del ancho máximo de caparazón (AC) de las hembras en estadio I de desarrollo embrionario. Arriba- En Leurocyclus tuberculosus (n=85). Abajo- En Libinia spinosa (n= 95)

Para ambas especies, al analizar la relación entre NH y AC en forma separada para grupos de hembras clasificadas de acuerdo a la proporción de la superficie del

- 123 - Biología Reproductiva de Majoidea Fecundidad abdomen ocupada por la masa ovígera, se pudo observar una relación entre la categorización asignada, la talla y la fecundidad realizada (Figura 56A, 56B).

______Figura 56. Fecundidad realizada (NH) en función del ancho máximo de caparazón (AC) de hembras en estadio I de desarrollo embrionario agrupadas en categorías según la proporción de la superficie del abdomen ocupada por la masa ovígera. Arriba- En Leurocyclus tuberculosus (n=85). Abajo- En Libinia spinosa (n= 95)

En función del ciclo anual Leurocyclus tuberculosus presentó diferencias significativas (p<0,0001) de la NH y FR entre los periodos de invierno, primavera y verano (Figura 57). En los meses de invierno el valor promedio de NH fue de alrededor de 40.000

- 124 - Biología Reproductiva de Majoidea Fecundidad huevos/hembra, en primavera de aproximadamente 50.000 huevos/hembra y en verano de 20.000 huevos/hembra (Fig 57). L. spinosa no presentó diferencias significativas de la NH ni FR entre el invierno, la primavera y el verano (p>0,05) siendo ésta de aproximadamente 30.000 huevos/hembra (Figura 57).

Figura 57. Fecundidad realizada (NH, promedio ± DE) y fecundidad relativa (FR, promedio ± DE) en las estaciones de invierno (I), primavera (P) y verano (V). Arriba: izquierda- Fecundidad realizada, derecha- Fecundidad relativa en Leurocyclus tuberculosus. Abajo: izquierda- Fecundidad realizada, derecha- Fecundidad relativa en Libinia spinosa. Las letras diferentes indican diferencias significativas (p<0,05) entre las estaciones.

DISCUSIÓN

En los cangrejos Eubrachyura se destacan dos medidas indicadoras del potencial reproductivo, una es la cantidad de espermatozoides almacenados en los receptáculos seminales y la otra el número de huevos portados por la hembra estimado como la fecundidad realizada (Orensanz et al. 1998; Sainte-Marie et al. 2002; Bas et al. 2007; Webb 2009; Diez y Lovrich 2010). Las hembras de las especies estudiadas en esta tesis presentaron una fecundidad realizada en la etapa inicial del desarrollo embrionario de aproximadamente de 35.000 (Leurocyclus tuberculosus) y 30.000 huevos (Libinia spinosa), en rangos de tallas de - 125 - Biología Reproductiva de Majoidea Fecundidad 40,30 a 68,79 mm de AC y 41,91 a 62,76 mm de AC, respectivamente. Al relacionar la fecundidad con la talla se obtuvieron valores de fecundidad relativa de 661 huevos/mm para L. tuberculosus y 547 huevos/mm para L. spinosa siendo aproximadamente un 18% mayor en L. tuberculosus que presentó un peso promedio por huevo 45% menor que L. spinosa. En este contexto las dos especies constituirían un ejemplo de la tendencia propuesta para los Eubrachyura de que a mayor fecundidad, menor es el tamaño o peso de los huevos (Hines 1982a; Sainte Marie 1993; Muiño 2002; Diez y Lovrich 2010). Al comparar los valores promedio de fecundidad relativa obtenidos en este estudio con otras especies de Majoidea se observa que las especies estudiadas presentan una fecundidad relativa similar a las especies del género Chionoecetes (Sainte-Marie 1993), superior a las especies de Halicarcinus (Van den Brink 2006; Diez y Lovrich 2010), Libidoclaea granaria (Schejter y Spivak 2005) y Epialtus bituberculatus (Cobo y Barros 2009) e inferior a Microphrys (López-Greco et al. 2000). Fueron señalados diversos factores que pemitirían explicar las diferencias en la fecundidad relativa interespecíficas; uno de ellos es la cantidad de desoves por periodo reproductivo. Por ejemplo, para las especies del género Chionoecetes se registraron 2 y 3 desoves por período reproductivo (Comeau et al. 1999). Por el contrario, para las especies del género Halicarcinus y la especie Microphrys bicornutus que presentan pequeño tamaño se han indicado los niveles más bajos de fecundidad entre los Eubrachyura lo que podría estar asociado al patrón continuo de reproducción (López-Greco et al. 2000; Van den Brink 2006; Diez y Lovrich 2010).

En cuanto al potencial o esfuerzo reproductivo (ER), Hines (1982a) indicó que se encuentran variaciones dentro y entre las especies, pero que en general el valor medio del esfuerzo reproductivo es próximo al 10% para los cangrejos Eubrachyura.

Las hembras de las especies estudiadas en esta tesis presentaron un valor del ER menor al indicado por Hines (1982a), Libinia spinosa presentó un ER= 6,9 % y Leurocyclus tuberculosus un ER= 4,9 %. Sin embargo, según lo indicado por Hartnoll (2006) L. spinosa presenta un ER similar a las especies de Majoidea como: Inachus dorsettensis ER= 8,9; Loxorhynchus crispatus ER= 8,7, Pugettia producta ER= 8,1 y Puggettia richii ER= 8,1. Por otra parte, Leurocyclus tuberculosus presenta un ER cercano a los Majoidea, Libinia emarginata ER= 4,7, Loxorhynchus grandis ER= 5,2 y Mimulus foliatus ER= 5,2. Eso estaría indicando que la esfuerzo reproductivo, al igual que la fecundidad no es propia de cada género, sino que probablente sean factores externos (por ejemplo la temperatura, disponibilidad de alimento) los que modulan su valor.

- 126 - Biología Reproductiva de Majoidea Fecundidad Fue corroborado en varias especies de Eubrachyura que el tamaño corporal de la hembra es el principal factor que influye en la producción reproductiva (Hines 1982a, 1991). Esta tendencia general donde la fecundidad realizada se incrementa con la talla fue observada para Libinia spinosa y Leurocyclus tuberculosus (presente Capítulo) al igual que en otros Majoidea (Sainte-Marie 1993; López-Greco et al. 2000; Van den Brink 2006; Diez y Lovrich 2010). Sin embargo se ha obtenido para L. spinosa y L. tuberculosus, que solo entre un 15 y un 20% aproximadamente de la variación en el número de huevos podría explicarse por el tamaño de la hembra. Esto sugiere que el tamaño de la hembra afecta el tamaño del desove, pero que existen otros factores que también influyen en la fecundidad realizada de estas especies.

Otro factor determinante de la producción de huevos es la disponibilidad de alimento (Wear 1974; Hines 1982a; Henmi 1989; Bas et al. 2007). La variabilidad en la disponibilidad de los recursos alimentarios, por ejemplo causada por la estacionalidad, reduce la fecundidad de las hembras (Hines 1982a, 1992; Bas et al. 2007). Probablemente estos factores se reflejan en Leurocyclus tuberculosus donde se observó una diferencia significativa de la fecundidad realizada y relativa en las estaciones de primavera, verano e invierno. Se pudo observar que en primavera las hembras de la especie presentan mayor fecundidad, y que en el verano la fecundidad es menor. Este mismo patrón fue observado en el Majoidea Halicarcinus planatus (Diez y Lovrich 2010), en el Porcellanidae Pachycheles haigae (leavidactilus) (Pinheiro y Fransozo 1995) y en el Grapsoidea Neohelice granulatus (Bas et al. 2007). Por el contrario, Libinia spinosa no presentó diferencias significativas en su fecundidad realizada y relativa a lo largo de las estaciones analizadas. Una posibilidad por explorar en futuros estudios es evaluar las diferencias alimentarias de ambas especies en los golfos para conocer si hay diferencias de hábitos alimentarios que pudieran explicar las diferencias de fecundidad en L. tuberculosus (y su ausencia en L. spinosa) durante el ciclo anual. Otro factor determinante de la variabilidad que no se tuvo en cuenta en la presente tesis, pero fue indicado para otras especies de Majoidea, es la diferencia encontrada en la fecundidad realizada entre hembras primíparas y multíparas (Dunnington 1999; Diez y Lovrich 2010). Se estimó una fecundidad realizada menor en hembras primíparas que en hembras multíparas para un ancho de caparazón similar. La menor fecundidad en las hembras primíparas se ha observado en Inachus phalangium (Diesel 1988b); Chionoecetes opilio (Sainte-Marie 1993), Inachus dorsettensis (Bryant y Hartnoll 1995), Pyromaia tuberculata (Furota 1996) y Halicarcinus planatus (Diez y Lovrich 2010). Esta diferencia en la fecundidad entre las hembras primíparas y multíparas se ha sugerido que - 127 - Biología Reproductiva de Majoidea Fecundidad se debe a la compartimentación de los recursos entre los procesos competitivos de crecimiento y la reproducción o la limitación de tamaño restringiendo el espacio disponible para el desarrollo del ovario en las hembras primíparas antes de la muda puberal (Calow 1978; Hines 1982a, 1992, Sainte Marie 1993; Somerton y Meyers 1983; Diez y Lovrich 2010). Una caracteristica particular de las especies de Majoidea, es la correlación del contenido espermático en los receptáculos seminales y la producción de huevos. Las hembras de Halicarcinus cookii desovan independientemente de la cantidad de espermatozoides disponibles, ya sean almacenados de cópulas anteriores o de una cópula reciente (Van den Brink 2006), a diferencia de Chionoecetes bairdi donde las hembras no desovan si no hay suficientes espermatozoides en los receptáculos para fertilizar (Paul 1984). En Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa se observó una respuesta similar a la de Halicarcinus cookii ya que las hembras desovan independientemente al almacenamiento de esperma en sus receptáculos seminales (ver en el Capítulo I de la presente tesis la categorización de los receptáculos y el estado reproductivo de las hembras). Por lo cual, podemos inferir que esta independencia entre el desove y la carga espermática en los receptáculos, podría ser unos de los factores que contribuyan a la gran variabilidad observada en la fecundidad para una misma talla, dado que es posible que no todos los oocitos producidos por la hembra puedan ser fecundados.

En cuanto a las estrategias de apareamiento, se ha indicado para varias especies de diversos taxa, incluídos los crustáceos, que los machos “eligen” a las hembas en función de su tamaño. Dada la correlación positiva entre la talla de la hembra y el número de huevos, para los machos sería una “ventaja” aparearse con las hembras de mayor talla (Elwood et al. 1987; Diesel 1988b). En este sentido no podríamos descartar que los machos mayores se apareen con las hembras de mayor talla y que las hembras menores se apareen con aquellos machos más pequeños con menor producción espermática. En ese contexto sería posible que la variabilidad en el número de huevos portados por las hembras pudiera asociarse a la capacidad de transferencia espermática de los machos. El estudio de los mecanismos de apareamiento y de la selección de parejas podría brindar información relevante para el análisis de la fecundidad realizada de ambas especies.

La variación en el número de huevos dentro del mismo rango de tallas podría estar indicando la presencia de más de un desove en el periodo anual de puestas (Capítulo II de la presente tesis; Mantelatto y Franzoso 1997; Mantelatto y García 1999). Una variable

- 128 - Biología Reproductiva de Majoidea Fecundidad que permitió disminuir la gran variabilidad en la fecundidad para una misma talla de hembra, fue el criterio de clasificación dado por la proporción de masa ovígera que ocupa la superficie del abdomen. Con este críterio se pudo establecer para una talla dada y una proporción de masa ovígera sobre el abdomen se puede hacer una mejor estimación de la fecundidad realizada. La variabilidad en la fecundidad para la misma talla también fue observado en Paguristes tortugae, donde los autores establecen que esta diferencia puede ser causada por múltiples desoves en el mismo período reproductivo y a una baja fecundidad observada en hembras primíparas (Goshima et al. 1998; Mantelatto et al. 2002). Los resultados del presente Capítulo presentan un significativo conocimiento sobre el potencial reproductivo de estas dos especies de Majoidea en el golfo Nuevo, Argentina. Se destacan las variaciones de las especies ante una tendencia de los crustáceos en general y sus posibles factores influyentes. Ambas especies muestran una significativa amplitud del número de huevos incubados. Leurocyclus tuberculosus presenta diferencias significativas de fecundidad entre la primavera, el verano y el invierno lo que indicaría que las condiciones para una “óptima” fecundidad van cambiando a lo largo del año. Sin embargo serían necesarios estudios más avanzados para estimar diferencias entre hembras primíparas y multíparas, y el comportamiento de los machos en las cópulas. Asimismo las características mencionadas sumadas al tamaño inicial de los huevos (Capítulo V) podrían ser características moduladoras de la fecundidad o de la inversión reproductiva diferente entre las especies en estudio.

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Leurocyclus tuberculosus

Desarrollo Embrionario de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa

CAPÍTULO V

Biología Reproductiva de Majoidea Desarrollo Embrionario CAPÍTULO V

Descripción del desarrollo embrionario y de su duración a distintas temperaturas en Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa

INTRODUCCIÓN

El estudio de la morfología y la duración del desarrollo embrionario brinda significativa información sobre la biología reproductiva de las especies junto con otras características como la extensión del período reproductivo, el número de huevos, el volumen del desove y el número de larvas eclosionadas (Anderson 1982). Asimismo, la distribución latitudinal y batimétrica está relacionada con la adaptación térmica de las especies en todas las etapas de su ciclo de vida (Anderson 1982; Mallet et al.1993; Stevens 2006; Webb et al. 2007). El desarrollo embrionario de los Decapoda es usualmente subdividido para su estudio en tres etapas: una etapa temprana caracterizada por el proceso de segmentación que da origen a la mórula y posterior gastrulación; una etapa intermedia durante la cual ocurren las principales diferenciaciones morfológicas y aparición de la pigmentación, y una etapa avanzada caracterizada por el inicio del latido cardíaco, movimientos significativos del embrión dentro del huevo y el aumento en el consumo del vitelo, que corresponde a la etapa próxima a la eclosión (Petersen 1995; Moriyasu y Lanteigne 1998; Nagao et al. 1999). Dentro de estas tres etapas encontramos variaciones en el porcentaje de vitelo en el huevo, en la sincronía de aparición de los apéndices y la pigmentación y en la duración relativa de cada etapa dentro del período embrionario total (Anderson 1982; Hines 1982a; De Vries y Forward 1991; Hernáez y Palma 2003; García-Guerrero y Hendrickx 2006a,b). Numerosos estudios en Decapoda revelan que la duración del desarrollo embrionario varía en función de factores externos siendo la temperatura el principal modelador (Wear 1974; Gómez-Díaz 1987; Celada et al. 1988a,b; Dupré et al. 1992; Mallet et al. 1993; Smith et al. 2002; Wehrtmann y López 2003; Brillon y Lambert 2005; Webb et al. 2007). También se ha observado la ocurrencia de períodos de diapausa o suspensión del crecimiento durante el desarrollo, que han sido vinculados a un mecanismo de “garantía” para que la eclosión larval ocurra en momentos de elevada producción primaria y por lo

- 131 - Biología Reproductiva de Majoidea Desarrollo Embrionario tanto un periodo óptimo para la alimentación de las larvas (Wear 1974; Petersen 1995; Petersen y Anger 1997; Moriyasu y Lanteigne. 1998; Stevens 2006; Webb et al. 2007). El desarrollo en los Decapoda puede ser directo o indirecto y está relacionado con el tamaño de los huevos y la duración del desarrollo embrionario (Barnes 1996; Rudolph et al. 2010). En las especies con desarrollo directo eclosiona un organismo pequeño similar al adulto y ocurre generalmente en especies de agua dulce o de profundidad (Lemaitre y Alvarez-León 1992; Quiroga y Soto 1997). En las especies con desarrollo indirecto eclosiona una larva que sufrirá cambios morfológicos y fisiológicos conducentes al primer estadio juvenil y ocurre generalmente en especies marinas y estuariales (Barnes 1996). Existen estudios sobre el desarrollo temprano de especies de Majoidea que involucran descripciones de sus estadios larvales (Boschi y Scelzo 1968; Barcardit y Vera 1983; Barcardit 1985; Taishaku y Konishi 2001; Penha-Lopes et al. 2006) pero son escasos los referidos al desarrollo embrionario. Solo se ha estudiado el desarrollo embrionario de tres especies de la familia Oregoniidae (Ng et al. 2008): Chionoecetes opilio (Mallet et al. 1993; Moriyasu y Lanteigne 1998; Comeau et al. 1999; Webb et al. 2007), Chionoecetes bairdi (Swiney 2008) y Hyas araneus (Petersen 1995; Petersen y Anger 1997). Un aspecto importante de estos estudios, dada la amplitud de distribución de los Majoidea en general y cada especie en particular, es lo indicado por Webb et al. (2007) quien destaca que las migraciones, la fisiología, la vida temprana y el potencial reproductivo de las hembras de C. opilio están afectados por la temperatura. En esta especie se ha demostrado que la duración de la incubación se incrementa un 30% cuando la temperatura decrece de 3ºC a -1ºC. Las especies estudiadas en esta tesis, Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa, presentan un período reproductivo continuo (Capítulo II) y una extensa distribución latitudinal y batimétrica (Boschi et al. 1992; Melo 1996; Spivak 1997; Boschi 2000; Braga et al. 2002; Vinuesa 2005) lo que permite especular que el desarrollo de los embriones ocurre bajo regímenes térmicos diferentes.

- 132 - Biología Reproductiva de Majoidea Desarrollo Embrionario OBJETIVO

Dadas las características de las especies a estudiar, de la temperatura como un factor determinante que modula el desarrollo embrionario y de los regímenes térmicos de los golfos (Dellatorre 2010) se planteó como objetivo describir la morfología del desarrollo embrionario de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa, y caracterizar su duración a diferentes temperaturas representativas de las variaciones térmicas de su hábitat en los golfos norpatagónicos.

En el marco de este objetivo las hipótesis planteadas son:

Hipótesis 1: La morfología embrionaria permite diferenciar las especies estudiadas desde etapas tempranas de su ontogenia.

Hipótesis 2: La temperatura modula la duración del desarrollo embrionario en Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se colectaron hembras ovígeras de ambas especies en bahía Cracker, golfo Nuevo, Argentina (42º56'S, 64º21'W), durante el mes de septiembre de 2008, mediante el uso de trampas plegables (Capítulo III). Las hembras fueron transportadas vivas al laboratorio del CENPAT en conservadoras de 30 litros de capacidad con agua de mar y cubos plásticos fríos para mantener la temperatura. De cada especie se seleccionaron para este estudio treinta y nueve hembras ovígeras de 45 a 55 mm de ancho de caparazón que fueron identificadas a través de una cinta de color en el meropodito del último par de pereiópodos. Los ejemplares fueron mantenidos en acuarios con recirculación de agua de mar, aireación y salinidad de 33 ‰, termo y fotorregulación y se alimentaron diariamente con restos de pescado fresco. Las hembras fueron revisadas diariamente hasta completarse la eclosión, y luego de observarse la nueva puesta se inició el seguimiento de los embriones desde su primer día de desarrollo.

- 133 - Biología Reproductiva de Majoidea Desarrollo Embrionario Diseño experimental El ensayo consistió en incubar las hembras ovígeras de Leurcocylus tuberculosus y Libinia spinosa a distintas temperaturas. Para ello se aplicaron tres regímenes térmicos constantes seleccionados en función del ciclo anual de temperaturas del agua de mar en el golfo Nuevo, Argentina (Dellatorre 2010), y a las profundidades que ellas habitan (Capítulo III). Las temperaturas seleccionadas fueron: 8ºC (menor temperatura anual registrada obtenida en el invierno), 14ºC (temperatura promedio anual) y 18ºC (mayor temperatura anual registrada obtenida en el verano). El mantenimiento constante de las temperaturas en cada acuario se realizó mediante un sistema de control térmico computarizado con la capacidad de mantener y registrar 3 regímenes térmicos diferentes en simultáneo con 0,1ºC de precisión (Cinti et al. 2004). Se asignaron 13 hembras por cada temperatura nominal de ensayo. Diariamente a 10 de las 13 hembras se les extrajeron entre 10 y 20 embriones con una pinza de punta fina para determinar y caracterizar los estadios embrionarios en función de la presencia y morfología de los apéndices. Todos los embriones fueron colectados de un área cercana al centro de la masa ovígera y observados bajo lupa para el reconocimiento de los estadios de desarrollo.

Observaciones y determinaciones de cada estadio embrionario en ambas especies Una vez que fueron caracterizados los estadios de desarrollo, a 20 embriones por estadio se les realizaron disecciones para obtener más detalle de la morfología de sus apéndices y fueron fotografiados bajo microscopio óptico Carl Zeiss equipado con contraste de interferencia diferencial. Otra muestra de 20 embriones por estadio fue fijada en glutaraldehído al 2% en agua destilada. Después de una hora, los embriones se lavaron tres veces con agua destilada y se deshidrataron en una sucesión de alcoholes de gradación creciente desde 20% hasta etanol absoluto (100%) con cambios cada 10 minutos (González-Pisani 2004).

Luego los embriones se llevaron a punto crítico con CO2 líquido, se montaron sobre un portaobjeto con cinta de doble cara adhesiva, y se metalizó la muestra con oro en un equipo Cold Sputter Denton Vacuum Desk IV para obtener una mejor definición. Las observaciones y fotografías se realizaron bajo un microscopio electrónico de barrido (SEM) LSM JEOL-6460 LV, con la técnica de bajo vacío (15-20 Pa) (ALUAR SAIC). La terminología utilizada para definir los apéndices embrionarios fue la utilizada por Clark et al. (1998).

- 134 - Biología Reproductiva de Majoidea Desarrollo Embrionario Para estimar el crecimiento embrionario se tomaron 30 huevos por estadio. A cada huevo se le midieron los tres diámetros mediante un micrómetro ocular de 50X de aumento, y se tomó una medida de referencia de la cantidad de vitelo. Las dimensiones medidas se definieron de la siguiente manera (Figura 58): 1) eje dorso-ventral: entre el polo vegetativo (ocupado por vitelo) y el polo animal (donde se desarrolla el embrión), 2) eje antero-posterior, que se extiende del lado anterior identificado por el globo ocular y el lado posterior, 3) eje izquierda-derecha, perpendicular a los otros dos ejes, y 4) la altura que ocupa el vitelo sobre el eje dorso ventral del embrión.

Figura 58. Dimensiones medidas en los embriones de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa. 1) Embrión en vista lateral, la barra violeta indica el eje dorso-ventral y la barra amarilla la cantidad estimada de vitelo. 2) Embrión en vista ventral, la barra indica el eje antero-posterior. 3) Embrión en vista frontal, la barra indica el eje izquierda-derecha.

A partir de estas medidas se calculó el volumen aproximado del huevo para cada estadio del desarrollo. La ecuación empleada para determinar el volumen fue la fórmula de un elipsoide: V= 4/3 * π * r1 * r2 * r3

Donde V es el volumen del huevo y r1, r2 y r3 son los radios correspondientes a la longitud de: 1) el eje dorso-ventral; 2) el eje antero-posterior y 3) el eje izquierda-derecha (García-Guerrero y Hendrickx 2004).

- 135 - Biología Reproductiva de Majoidea Desarrollo Embrionario Estimación de la duración de cada estadio del desarrollo Para determinar la duración de cada estadio del desarrollo a cada temperatura establecida se extrajeron de 10 a 20 huevos cada dos días de las 10 hembras mantenidas en los acuarios. La duración relativa de cada estadio embrionario para cada temperatura se calculó a partir de la siguiente ecuación: DRE = DE / DT * 100 donde: DRE: Duración relativa de cada estadio de desarrollo, DE es el tiempo de duración en cada estadio (días) y DT es el tiempo de duración total del desarrollo (días) de acuerdo a la metodología aplicada en Chionoecetes opilio (Moriyasu y Lanteigne 1998). La duración total del desarrollo embrionario (DT) se estimó a partir de las 3 hembras de las 13 a las que no se les extrajeron embriones durante todo el desarrollo a fin de descartar posibles variaciones de la duración del tiempo de desarrollo por efecto de la manipulación.

Análisis estadísticos El crecimiento embrionario para ambas especies en función de la longitud de los ejes y el volumen del huevo por estadio, así como también las diferencias de tamaño entre las especies y la duración del desarrollo embrionario, fueron evaluadas mediante el test no paramétrico de Kruskal Wallis (Sokal y Rohlf 1995), dada la falta de normalidad en los datos. Todos los análisis se realizaron con el software estadístico Infostat versión 2.0.

RESULTADOS

Descripción de los estadios embrionarios para ambas especies Durante el desarrollo embrionario los huevos se encuentran sujetos a los pleópodos (Figura 59A, 59B, 59C, 59D). Cada huevo está revestido por una doble envoltura embrionaria, siendo la envoltura externa la formadora del funículo que lo une con las sedas de los pleópodos (Figura 59E, 59D). Se caracterizaron, para ambas especies, cinco estadios embrionarios. Cabe destacar que el desarrollo embrionario es un proceso continuo, pero la división en estadios del desarrollo está basada en los cambios morfológicos de los embriones que se van observando a medida que el desarrollo avanza. Los cinco estadios fueron establecidos en función de: (Figura 60): I) La segmentación II) La presencia de primordio embrionario - 136 - Biología Reproductiva de Majoidea Desarrollo Embrionario III) El tamaño del embrión IV) La pigmentación de los globos oculares V) La aparición de cromatóforos

No se observaron diferencias morfológicas entre los embriones muestreados de una misma hembra ni entre embriones de distintas hembras clasificados en un mismo estadio de desarrollo.

Descripción de los estadios embrionarios para ambas especies Estadio I El estadio I comienza inmediatamente después de la fecundación, cuando se producen las primeras divisiones del huevo (Figura 59E, 61A, 61B). La coloración de los huevos en este estadio es rojo-naranja y está dada por el color del vitelo (Figura 61A, 61B). El huevo comienza a dividirse superficialmente de modo desigual para originar el estado de blástula tipo mórula (Figura 61A, 61B). Durante este estadio no se distinguen formaciones de estructuras embrionarias, el huevo contiene gránulos de vitelo homogéneamente distribuidos (Figura 61C) y las dos envolturas embrionarias permanecen fuertemente unidas (Figura 59E).

Estadio II Este estadio comienza con la diferenciación del primordio embrionario, que se observa como una pequeña zona blanca en el polo animal del huevo. La coloración del resto del huevo se torna naranja (Figura 61D). El embrión está orientado con la región ventral hacia la cara externa del huevo, encontrándose la parte dorsal hacia el interior (Figura 61E). El primordio embrionario consiste en una placa cefalotoráxica-abdominal, en la cual se puede diferenciar sobre la región anterior, que es ancha y redondeada, los contornos de los globos oculares de apariencia plana y lisa proyectados dorso- lateralmente (Figura 61E). Detrás de ellos, se observan cuatro pares de prolongaciones laterales de morfología plana y unirrámea, que darán origen a las anténulas, las antenas y los dos primeros pares de maxilipedios (Figura 61E). Hacia la zona posterior la placa cefalotoráxica presenta una proyección corta y ancha que dará origen al abdomen, con su extremo distal bifurcado en dos grandes lóbulos redondeados que formarán el telson (Figura 61F).

Estadio III

- 137 - Biología Reproductiva de Majoidea Desarrollo Embrionario El inicio de este estadio se define por el crecimiento del embrión que ocupa más espacio que el vitelo (Figura 62A, 62B). El vitelo se mantiene de coloración naranja, siendo la zona embrionaria blanca (Figura 62B). Se observan claramente los 4 pares de apéndices que han crecido en largo y presentan forma tubular (Figura 62C). Se modifica la dirección del crecimiento de los maxilipedios observándose a partir de este estadio paralelos unos a otros hacia la zona anterior, mientras que las anténulas y las antenas permanecen con el mismo sentido de crecimiento, paralelas entre sí hacia la zona posterior del embrión (Figura 62C). En esta etapa se detecta la aparición de los tres pares de apéndices bucales (mandíbula, maxílula y la maxila) de aspecto plano y unirrámeo que se ubican entre la antena y el primer par de maxilipedios (Figura 62C, 62D). Para ambas especies, la anténula permanece unirrámea, presentando un exopodito con una seta corta en la zona terminal y estando ausente el endopodito. Por el contrario, la antena es birrámea, es el apéndice de mayor longitud y presenta un endopodito corto y ancho y un exopodito largo (Figura 62D). La zona abdominal segmentada termina en un telson bilobulado (Figura 62E, 62F). En L. tuberculosus los lóbulos son ahusados y presentan cinco procesos terminales en su margen externo de igual longitud por lóbulo (Figura 62E). En L. spinosa los lóbulos del telson son redondeados y presentan ocho procesos terminales de igual longitud por lóbulo (Figura 62F).

Estadio IV Esta etapa comienza con la aparición de pigmentación en el embrión (Figura 63A, 63B), inicialmente localizada sobre los globos oculares y aparece como una línea oscura posterior y ventral sobre la superficie ocular (Figura 63C - 63D). Durante este estadio los apéndices comienzan a mostrar diferencias entre especies. La anténula (Figura 63E, 63F) es unirrámea y de forma cónica, pero en L. tuberculosus presenta cuatro estetascos, dos largos y dos cortos, y una corta seta terminal (Figura 63E) y en L. spinosa presenta cuatro estetascos de igual tamaño y dos setas cortas terminales (Figura 63F). En ambas especies la antena (Figura 64A) se mantiene birrámea, pero en L. tuberculosus presenta un endopodito corto que no presenta segmentos ni setas, y un exopodito con una larga espina terminal, una subterminal y una corta seta, y una espina que surge de la base del mismo de su misma longitud (Figura 64A) mientras en L. spinosa presenta la misma conformación con la particularidad de que no se observa la seta en el exopodito.

- 138 - Biología Reproductiva de Majoidea Desarrollo Embrionario Los apéndices bucales crecen en ancho y se superponen unos con otros quedando las mandíbulas posicionadas más internamente y solapadas por las maxílulas. Las mandíbulas de ambas especies presentan los procesos molares bien marcados y los procesos de los incisivos en el borde distal externo; las mandíbulas no presentan palpos (Figura 64B). Los maxilipedios de ambas especies se mantienen birrámeos (Figura 64C, 64D) y tanto el primero como el segundo par presentan un endopodito segmentado con setas laterales en sus articulaciones y largas setas plumosas terminales y un exopodito sin segmentación que posee largas setas plumosas terminales (Figura 64C, 64D).

Estadio V Se define a partir de la presencia de cromatóforos de coloración rojiza en el embrión (Figura 65A, 65C). En L. tuberculosus se observa un cromatóforo esférico sobre la base de la antena, un par de cromatóforos esféricos sobre las piezas bucales (Figura 65A), y en el abdomen se observan cromotáforos de morfología estrellada sobre la cara ventral, rodeando al tubo digestivo en la zona de la articulación de los segmentos (Figura 65B). En L. spinosa los cromatóforos presentan forma esférica y su ubican sobre la base de las antenas, las mandíbulas, y en la base y porción terminal de los maxilipedios (Figura 65C, 65D). En esta etapa el embrión está completamente formado y listo para eclosionar. El resto de vitelo no ha modificado su coloración y se limita a la región dorso-medial del cefalotórax (Figura 65A, 65C, 65D). En el abdomen se observan espinas laterales sobre las articulaciones de los segmentos que presentan la misma ubicación en ambas especies, pero distinta morfología. Se ubican en el 3º, 4º y 5º segmento y en L. tuberculosus presentan forma de gancho (Figura 65E) y en L. spinosa presentan forma recta (Figura 65F). En esta etapa en ambas especies, el telson cambia su conformación en relación al estadio III (Figura 66A, 66B). L. tuberculosus presenta un telson con una muesca media, con 6 procesos internos de igual longitud, una furca cuatro veces más larga que los procesos internos y un par de espinas laterales de igual longitud que los procesos internos (Figura 66A). L. spinosa presenta un telson sin muesca media, con 6 procesos internos de igual longitud, entre la furca que es cuatro veces más larga que los procesos internos y un par de espinas laterales pequeñas (1/4 de la longitud de los procesos internos) (Figura 66B).

- 139 - Biología Reproductiva de Majoidea Desarrollo Embrionario En ambas especies al finalizar el desarrollo embrionario los ojos continúan siendo sésiles, con la pigmentación de forma ovalada que cubre aproximadamente el 80% de la superficie de los globos oculares (Figura 66C, 66D). Las omatidias se observan como estructuras hexagonales en la superficie ocular observándose el avance de su pigmentación (Figura 66D). Al finalizar el desarrollo embrionario, se pueden observar esporádicos movimientos de los apéndices y del abdomen que aumentan de frecuencia hacia el momento de la eclosión. Al final de esta etapa los embriones se separan fácilmente de los pleópodos y sus cubiertas exteriores pierden rigidez, pudiéndose inducir la eclosión al tocar la cubierta con una aguja de disección. La larva (zoea I) de ambas especies, eclosiona con un par de anténulas, un par de antenas, un par de mandíbulas, un par de maxilas, un par de maxílulas y los dos primeros pares de maxilipedios, sin presentar pereiópodos, ni pleópodos (Figura 66E, 66F).

- 140 - Biología Reproductiva de Majoidea Desarrollo Embrionario

Figura 59. Hembra ovígera en vista ventral con abdomen abierto de A- Leurocyclus tuberculosus (escala: 1,5 cm) y B- Libnia spinosa (escala: 1,5 cm). A la izquierda, abdomen con los huevos (masa ovígera) sujetos a los pleópodos y a la derecha pleópodo con huevos sujetos en el endopodito de C- L. tuberculosus (escala: 1,5 cm) y D- de L. spinosa (escala: 1,5 cm). Huevos en estadio I de E- L. tuberculosus bajo MEB (escala: 200 µm) y de F- L. spinosa bajo microscopio óptico (escala: 150 µm). Ab: abdomen; EEx: envoltura externa; EIn: envoltura interna; EnP; endopodito del pleópodo; ExP; exopodito del pleópodo; F: funículo; H: huevo; MO: masa ovígera; Pl: pleópodo.

- 141 - Biología Reproductiva de Majoidea Desarrollo Embrionario

Figura 60. Esquema de los estadios embrionarios para ambas especies. A- Estadio I, etapa de segmentación. B- Estadio II, aparición del primordio embrionario. C- Estadio III, momento en que el tejido embrionario ocupa más del 50% del volumen del huevo. D- Estadio IV, pigmentación en los globos oculares. E- Estadio V, aparición de cromatóforos. Ab: abdomen; Annt: anténula; Ant: antena; Bl: blastómero; CrE: cromatóforos esféricos; CrS: cromatóforos con forma de estrella; EEx: envoltura externa; EIn: envoltura interna; F: funículo; GO: globo ocular; MI: maxilipedio I; MII: maxilipedio II; PB: piezas bucales; PE: primordio embrionario; PO: pigmento ocular; V: vitelo.

- 142 - Biología Reproductiva de Majoidea Desarrollo Embrionario

Figura 61. Estadios embrionarios I y II. Huevo en estadio I de A- L. tuberculosus (escala: 100 µm) y B- L. spinosa (escala: 100 µm). C- Huevo de L. tuberculosus bajo MEB donde se observan los gránulos de vitelo (escala: 100 µm). D- Huevo de L. tuberculosus en estadio II inicial donde se observa el primordio embrionario (escala: 200 µm). Detalle: huevos en estadio II de L. tuberculosus (escala: 200 µm). E- Huevo de L. spinosa en estadio II donde se observan los apéndices embrionarios (escala: 50 µm). F- Huevo de L. tuberculosus en estadio II mostrando un corto abdomen con una expansión terminal (escala: 50 µm). Ab: abdomen; Annt: anténula; Ant: antena; Bl: blastómero; GO: globo ocular; GV: gránulos de vitelo; MI: maxilipedio I; MII: maxilipedio II; PE: primordio embrionario; V: vitelo.

- 143 - Biología Reproductiva de Majoidea Desarrollo Embrionario

Figura 62. Estadio embrionario III en: A- L. tuberculosus se observa la sincronización en el desarrollo (escala: 200 µm), B- L. tuberculosus el tejido embrionario supera el 50% del volumen del huevo (escala: 200 µm) y C- L. spinosa se visualizan los apéndices (escala: 150 µm). D- Detalle de la anténula y la antena de L. spinosa (escala: 50 µm). E- Detalle del telson de L. tuberculosus con 5 espinas terminales por lóbulo (escala: 50 µm). F- Detalle del telson de L. spinosa con 8 espinas terminales por lóbulo (escala: 50 µm). Ab: abdomen; Annt: anténula; Ant: antena; ApB: apéndices bucales; E: embrión; GO: globo ocular; MI: maxilipedio I; MII: maxilipedio II; T: telson; V: vitelo.

- 144 - Biología Reproductiva de Majoidea Desarrollo Embrionario

Figura 63. Estadio embrionario IV. Huevos con pigmentación ocular (círculo) de A- L. tuberculosus (escala: 200 µm) y B- L. spinosa (escala: 200 µm). Huevo con pigmentación ocular en la parte ventral del globo ocular de C- L. tuberculosus (escala: 200 µm) y D- L. spinosa (escala: 200 µm). Detalle de la anténula de E- L. tuberculosus (escala 100 µm) y F- L. spinosa (escala 100 µm). Ab: abdomen; Annt: anténula; GO: globo ocular; PO: pigmentación ocular; V: vitelo.

- 145 - Biología Reproductiva de Majoidea Desarrollo Embrionario

Figura 64. Huevos en estadio embrionario IV de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa. A- Detalle de la antena de L. tuberculosus (escala: 100 µm). B- Detalle de la mandíbula de L. spinosa (escala: 50 µm). Detalle de los maxilipedios de C- L. tuberculosus (escala: 100 µm) y D- L. spinosa (escala: 100 µm). End: endopodito; EsExp: espina del exopodito; Exp: exopodito; Mdb: mandíbula.

- 146 - Biología Reproductiva de Majoidea Desarrollo Embrionario

Figura 65 Estadio embrionario V. A- Huevo de L. tuberculosus con cromatóforos sobre los apéndices (escala: 100 µm). B- Detalle del abdomen en L. tuberculosus se observan cromatóforos sobre la articulación (escala: 200 µm). Huevos con cromatóforos de L. spinosa en C- se observan sincronización en el desove (escala: 100 µm) y en D- cromatóforos esféricos (escala: 100 µm). Detalle de la espina lateral sobre las articulaciones del abdomen en E- L. tuberculosus (escala: 200 µm) y F- L. spinosa (escala: 200 µm). Ab: abdomen; Crm: cromatóforo; GO: globo ocular; V: vitelo.

- 147 - Biología Reproductiva de Majoidea Desarrollo Embrionario

Figura 66. Huevos es estadio embrionario V y larva zoea I de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa. A- Detalle del telson de L. tuberculosus (escala: 100 µm). B- Detalle del telson de L. spinosa (escala: 100 µm). C- Detalle del globo ocular de L. spinosa (escala: 50 µm). D- Detalle del globo ocular de L. tuberculosus (escala: 50 µm). E- Larva zoea I de L. tuberculosus (escala: 200 µm). F- Larva zoea I de L. spinosa (escala: 200 µm). Ab: abdomen; Annt: anténula; Ant: antena; GO: globo ocular; Mnd: mandíbula; Mx: maxilipedios; Om: omatidias; PO: pigmentación ocular; T: telson.

- 148 - Biología Reproductiva de Majoidea Desarrollo Embrionario Crecimiento embrionario En ambas especies durante el desarrollo embrionario el huevo cambia de una forma esférica a una elipsoidal. En Leurocyclus tuberculosus las dimensiones del huevo no difieren entre sí (p>0,05) en los estadios I y II, mientras que difieren significativamente en los estadios III, IV y V (p<0,05) siendo el eje ántero-posterior el de mayor longitud (Figura 67). El volumen del huevo estimado en el estadio I es de 0,35 ± 0,02 mm3 y en el estadio V de 0,71±0,03 mm3 aproximadamente, siendo esta diferencia significativa (p<0,05). Sin embargo el incremento no fue constante a lo largo del desarrollo, observándose una etapa estacionaria entre los estadios I y II (p>0,05), una etapa de crecimiento entre estadios II y IV (p<0,05) y nuevamente una etapa estacionaria entre los estadios IV y V (p>0,05) (Figura 67) En Libinia spinosa las dimensiones del huevo no presentan diferencias significativas (p>0,05) en el estadio I pero si en el estadio II, III, IV y V (p<0,05), siendo el eje 2 (antero-posterior) el de mayor longitud y el eje 3 (izquierda-derecha) el de menor longitud (Figura 67). En función del volumen del huevo se puede observar que el crecimiento embrionario puede dividirse en tres etapas, una etapa de crecimiento entre el estadio I y III (p<0,05), una etapa estacionaria entre el estadio III y IV (p>0,05) y una etapa de reinicio de crecimiento entre el estadio IV y V (p<0,05) (Figura 67). Su desarrollo comienza con un volumen promedio aproximado de 0,770±0,003 mm3 y finaliza con un volumen promedio de 1,010 ± 0,003 mm3 siendo significativa esta diferencia (p<0,05) (Figura 67). Para ambas especies se observó una reducción de la cantidad de vitelo a medida que el desarrollo avanza, existiendo una variación significativa de la cantidad de vitelo entre el estadio I y V; en L. tuberculosus se observa aproximadamente un 15%, y en L. spinosa un 26% de vitelo en el estadio V en comparación con el 100% inicial (Figura 67). Los volúmenes del huevo en estadio I entre las especies estudiadas presentaron diferencias significativas (p<0,05), siendo menor el volumen del huevo de L. tuberculosus.

- 149 - Biología Reproductiva de Majoidea Desarrollo Embrionario

Figura 67. Variación de los diámetros del huevo, de la cantidad de vitelo y del volumen durante el desarrollo. (Eje 1, eje dorso-ventral; Eje 2, eje antero-posterior; Eje 3, eje izquierdo-derecho; vitelo, es la cantidad de vitelo sobre el eje dorso-ventral; volumen: 4/3 * π * r1 * r2 * r3 (donde r es la mitad de la longitud de cada eje). Arriba- Leurocyclus tuberculosus y Abajo- Libinia spinosa.

- 150 - Biología Reproductiva de Majoidea Desarrollo Embrionario Duración del desarrollo embrionario Para ambas especies no se observaron diferencias significativas en los tiempos de desarrollo embrionario total entre las hembras control y las hembras a las que se les extrajo embriones periódicamente, en ninguna de las tres temperaturas de incubación (p>0,05). En ambas especies, el tiempo total promedio de incubación decrece a medida que aumenta la temperatura. En Leurocyclus tuberculosus es significativa la diferencia (p<0,05) entre las tres temperaturas de ensayo mientras que en Libinia spinosa es significativa la diferencia (p<0,05) solo entre la temperatura de 8ºC en comparación con 14ºC y 18ºC. El tiempo promedio del desarrollo embrionario para ambas especies a las tres temperaturas de ensayo se indica en la tabla XII.

Tabla XII. Duración total del desarrollo embrionario de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa. Se presentan los valores promedios, máximos y mínimos del tiempo de desarrollo (días) desde el desove hasta la eclosión a las 3 temperaturas ensayadas.

Leurocyclus tuberculosus Temperaturas de ensayo 8ºC 14ºC 18ºC promedio ± desvío estandar (días) 45,5 ± 1,9 36,7 ± 3,1 31,6 ± 3,0 máximo (días) 48 44 36 mínimo (días) 42 32 26 Libinia spinosa Temperaturas de ensayo 8ºC 14ºC 18ºC promedio ± desvío estandar (días) 90,5 ± 13,1 57,4 ± 4,4 51,4 ± 4,2 máximo (días) 112 64 57 mínimo (días) 74 50 45

En ambas especies, los estadios embrionarios presentaron diferentes duraciones. En L. tuberculosus, el estadio II fue el de mayor duración relativa y el estadio V el de menor duración relativa para las tres temperaturas ensayadas (p< 0,05) (Figura 68A). En Libinia spinosa la duración relativa de los estadios varió según la temperatura. Los estadios de mayor duración fueron: para 8ºC el estadio II, para 14ºC el estadio IV y para 18ºC el estadio III siendo los estadios de menor duración el estadio V, I y IV para los 8º, 14º y 18ºC respectivamente (Figura 68B).

- 151 - Biología Reproductiva de Majoidea Desarrollo Embrionario

______Figura 68. Duración del desarrollo embrionario. Se indica el porcentaje del tiempo promedio transcurrido (días) por estadio de desarrollo a las tres temperaturas de ensayo (8ºC, 14ºC y 18ºC) relativo al tiempo total (subrayados los tiempos de mayor duración por temperatura de ensayo). A- Leurocyclus tuberculosus y B- Libinia spinosa.

DISCUSIÓN

Estadios embrionarios El presente trabajo es el primero en describir el desarrollo embrionario de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa. La caracterización embrionaria se basó en el volumen de vitelo, la diferenciación del primordio embrionario y sus apéndices, el crecimiento embrionario, la pigmentación del globo ocular y la aparición de cromatóforos. Sin embargo, las etapas del desarrollo embrionario de los decápodos han sido diferenciadas en función de diferentes criterios. Algunos autores han definido etapas embrionarias basadas en:

- 152 - Biología Reproductiva de Majoidea Desarrollo Embrionario 1) El índice de pigmentación del globo ocular. Este criterio es adecuado para aquellas especies donde la pigmentación se encuentra en más de un 70% de su período total de incubación, como en la langosta Homarus americanus (Perkins 1972). En las especies utilizadas en este estudio, este índice no sería útil dado que en L. tuberculosus el pigmento ocular aparece aproximadamente a partir del 65% del tiempo total transcurrido del desarrollo para las tres temperaturas de incubación y en L. spinosa el pigmento ocular aparece a tiempos muy variables de acuerdo a la temperatura (a 8ºC se observa pigmentación a partir del 74% del tiempo total trascurrido, a 14ºC a partir del 54 % y a 18ºC a partir de el 71% del tiempo total transcurrido), siendo muy avanzado el desarrollo como para caracterizar los estadios con este índice. En otras especies de Majoidea como Chionoecetes opilio, C. bairdi e Hyas araneus (Petersen 1995; Moriyasu y Lanteigne 1998; Swiney 2008), tampoco sería adecuado este criterio dado que la pigmentación aparece luego del 50% del tiempo total de incubación. Es decir que en las 5 especies de Majoidea estudiadas (2 de las cuales corresponden a la presente tesis) el uso de este índice no sería adecuado. 2) Coloración de los embriones a lo largo del desarrollo. Es muy útil para determinar el estadio de desarrollo bajo observación directa y se ha empleado en especies donde la coloración de los huevos cambia durante el transcurso del desarrollo. Este índice ha sido utilizado en diversas especies de Brachyura (Ito 1963; Elner y Gass 1984; Comeau et al. 1991; Sainte-Marie y Hazel 1992; Mallet et al. 1993; Sainte-Marie 1993; Moriyasu y Lanteigne 1998) y en el Majoidea Chionoecetes opilio (Moriyasu y Lanteigne 1998) donde los embriones van adoptando una tonalidad más oscura a medida que el desarrollo avanza. En L. tuberculosus y L. spinosa no sería factible utilizar este criterio dado que el color del huevo se mantiene aproximadamente en la misma tonalidad durante todo el desarrollo. 3) Cambios morfológicos en una estructura a través del desarrollo. Tavonatti (1998) mencionó que un indicador para diferenciar los estadios embrionarios en la langosta marina Jasus frontalis es la morfología de la antena, ya que ésta cambia notablemente su aspecto a lo largo del desarrollo. En los Majoidea estudiados en este trabajo no se encontró alguna estructura que cambie de tal manera que sólo sus modificaciones nos permitan diferenciar los 5 estadios establecidos. Aún así, en ambas especies la morfología y la cantidad y disposición de las espinas terminales del telson permitirían diferenciar los primeros cuatro estadios propuestos. Los estadios I y II, se diferencian en ambas especies por la ausencia de estructuras (estadio I) y por la presencia de un telson pequeño con bifurcación lobular al final del corto abdomen. A partir del estadio III, el

- 153 - Biología Reproductiva de Majoidea Desarrollo Embrionario telson no sólo permite diferenciar el estadio al observarse claramente formado al final del abdomen sino también posibilita diferenciar cada especie. En L. tuberculosus, el telson presenta lóbulos ahusados con cinco procesos terminales y en L. spinosa presenta lóbulos redondeados con ocho procesos terminales. Esta forma se mantiene hasta el comienzo del estadio IV, pero al final de este estadio se observa que en L. tuberculosus el telson es claramente bilobulado con 5 procesos por lóbulo y en L. spinosa no es lobulado y presenta un extremo cóncavo con diez procesos terminales. El estadio V presenta esta última conformación. Por lo tanto, a pesar de que el telson no permite reconocer cada uno de los 5 estadios, podría indicar el grado de avance del desarrollo embrionario. Las dos especies incluidas en este trabajo presentan patrones similares de desarrollo embrionario, particularmente durante los primeros estadios. Los embriones de ambas especies forman sus apéndices durante periodos equivalentes, y la formación y pigmentación de los globos oculares y la aparición de cromatóforos también ocurren de modo similar. En ambas especies no se observan los apéndices toráxicos (pereiópodos) y abdominales (pleópodos) que si fueron hallados en especies de Majoidea estudiadas en otras regiones, tales como Chionoecetes opilio (Moriyasu y Lanteigner 1998) y Hyas araneus (Petersen y Anger 1997). Dos caracteres permiten diferenciar el desarrollo de una y otra especie: 1- la cantidad y disposición de los procesos terminales del telson y 2- la morfología de las espinas terminales laterales sobre las articulaciones del abdomen, que en ambas especies presentan la misma ubicación (en el 3º, 4º y 5º segmento) pero en L. tuberculosus tienen forma de gancho y en L. spinosa forma recta. Como fue indicado en varias especies de decápodos (Saigusa y Kawagoye 1997; Dupré 2003; González-Pisani et al. 2009) las hembras de los Majoidea estudiadas en la presente tesis participan activamente en la inducción a la eclosión, agitando su abdomen y moviendo rítmicamente sus pleópodos. Por otro lado, así como fue caracterizado para otras especies de decápodos, ambas especies presentan en sus maxilípedios gruesas setas terminales que se propone que facilitarían la ruptura de las membranas del huevo durante la eclosión (Tavonatti 1998, Dupré 2003; González-Pisani et al. 2009).

Crecimiento embrionario Durante el desarrollo embrionario de Leurocyclus tuberulous y Libinia spinosa es notoria la diferencia entre el estadio inicial con forma esférica y el estadio final con forma elipsoidal. Por el contrario, se ha indicado que los huevos de las especies de Brachyura mantienen su forma esférica durante todo el desarrollo embrionario (Nagao et al. 1999;

- 154 - Biología Reproductiva de Majoidea Desarrollo Embrionario Pinheiro y Hattori 2003; García-Guerrero y Hendrickx 2004; García-Guerrero y Hendrickx 2006a,b). En algunas especies de Anomura fue observado similar cambio de forma al descripto para L. tuberculosus y L. spinosa en la presente tesis (Tavonatti 1998, Dupré 2003; González-Pisani et al. 2009; Dellatorre y González-Pisani 2010). Se postula que la causa de la morfología oval de los huevos al avanzar el desarrollo se deba al aumento de la longitud de los apéndices en sentido ántero-posterior (Lardies y Wehrtmann 1996; Hernández y Palma 2003; García-Guerrero y Hendrickx 2006a,b). En L. tuberculosus y L. spinosa se observa un crecimiento ántero-posterior mayor a partir del estadio III, cuando los apéndices comienzan a crecer en largo, de anterior a posterior los apéndices cefálicos y de posterior a anterior los apéndices toráxicos. Entre las especies aquí estudiadas los huevos presentaron diferencias significativas de tamaño siendo los huevos de Leurocycus tuberculosus significativamente menores a los de Libinia spinosa. Sin embargo, L. tuberculosus duplica su volumen al finalizar su desarrollo embrionario, y L. spinosa aumenta su volumen aproximadamente un 30%. En Chionoecetes opilio se observó un crecimiento similar al de L. spinosa del 24% entre el estadio inicial y final, siendo los huevos de C. opilio mayores dado que comienzan su desarrollo con un diámetro de 0,64 ± 0,21mm (Moriyasu y Lanteigne 1998). Este incremento en volumen ha sido explicado en varias especies de Natantia, Anomura y Brachyura como un aumento de las tasas de absorción de agua que lleva a un aumento de volumen del embrión hacia los estadios finales del desarrollo (Wear 1974; Valdes et al. 1991; Dupré et al. 1992; Tavonatti y Dupré 2001; Wehrtmann y López 2003; Yávar y Dupré 2005). Esto fue también indicado para el Majoidea Hyas araneus, donde se observó un aumento de la absorción de agua en las etapas III, IV y V durante el proceso de incubación (Petersen y Anger 1997). Es probable que este flujo final de agua facilite la ruptura de la membrana del huevo mediante el aumento de la presión interna en el huevo (Davis 1964; De Vries et al. 1991). Para las especies de Majoidea estudiadas en esta tesis, se puede establecer un patrón de crecimiento del huevo diferenciando tres periodos durante el desarrollo con diferencias particulares entre las especies, en función al volumen. En L. tuberculosus observamos un primer periodo sin crecimiento (estadio I y II), un segundo periodo de crecimiento (estadios II, III y IV) y un tercer periodo donde el crecimiento se detiene (estadio IV y V). Por el contrario, en L. spinosa se observa un periodo de crecimiento desde el inicio del desarrollo, un segundo periodo de estabilidad y un tercer periodo de reinicio del crecimiento.

- 155 - Biología Reproductiva de Majoidea Desarrollo Embrionario El vitelo es durante la embriogénesis la única fuente de energía para la organogénesis. En los Majoidea estudiados el vitelo disminuye significativamente a medida que el desarrollo avanza; en L. tuberculosus cuyos huevos son más pequeños disminuye un 85 % y en L. spinosa un 74 % aproximadamente, superior a otros embriones de crustáceos, donde normalmente la reducción es del 40% al 60% (Petersen y Anger 1997). Lo mismo fue observado en Hyas araneus donde se ha indicado que la degradación de los lípidos es ligeramente superior (69%) (Petersen y Anger 1997) y en Chionoecetes opilio donde se observó una disminución del vitelo del 95% (Moriyasu y Lanteigne 1998). Una explicación propuesta a la gran disminución del vitelo en C. opilio es que la especie presenta entre 1 y 2 años de tiempo de incubación de acuerdo a su distribución. Por otra parte, la presencia de vitelo en el estadio final del huevo implicaría que es posible la lecitotrofia facultativa en los primeros estadios de desarrollo larval, siendo las especies más tolerantes a la inanición, como fue observado en el Majoidea Goniopugettia sagamiensis (Taishaku y Konishi 2001).

Duración del desarrollo embrionario El presente estudio muestra que el desarrollo embrionario de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa está modulado por la temperatura del agua, como se ha observado en otras especies de decápodos (García-Guerrero et al. 2003; Stevens 2006) y Majoidea en particular (Petersen 1995; Moriyasu y Lanteigne 1998). Por ejemplo, en Chionoecetes opilio la duración de incubación se incrementa en 105 días (30%) cuando diminuye la temperatura (Webb et al. 2007). A partir de los resultados obtenidos se puede inferir que el tiempo de desarrollo embrionario en L. tuberculosus y L. spinosa disminuye significativamente entre las temperaturas de primavera-verano y bajas profundidades (14º y 18ºC; profundidades menores a 40 m) y las temperaturas de otoño-invierno y mayores profundidades (8ºC; profundidades mayores a 40 m) de las aguas de los golfos norpatagónicos. Estudios en el golfo Nuevo señalan que el patrón estacional de floración de fitoplancton está caracterizado por dos picos: uno en otoño que se extiende de marzo a mayo y otro en primavera, que se extiende de agosto a octubre (Gayoso y Fulco 2006). De acuerdo a esto se propone que existe una sincronización entre los períodos de eclosión de ambas especies con los períodos de mayor productividad primaria. Dado que las hembras ovígeras observadas (Capítulo II de la presente tesis) en invierno (temperatura del agua de 8ºC) estarían liberando sus larvas a principio de la primavera

- 156 - Biología Reproductiva de Majoidea Desarrollo Embrionario para L. tuberculosus y en primavera para L. spinosa este evento ocurriría en pleno pico de producción primaria en las aguas del golfo Nuevo. Aquellas hembras ovígeras de ambas especies encontradas en la época de primavera-verano con 14º y 18º C estarían liberando sus larvas para el pico de producción primaria de otoño. Otro punto importante, es que la modulación de la duración del desarrollo embrionario para ambas especies afectó en el caso de Leurocyclus tuberculosus de manera similar la duración de los estadios, en las tres temperaturas de ensayo, siendo el estadio de morfogénesis (estadio II) el de mayor duración y el estadio final el de menor duración. Por el contrario, los tiempos relativos de duración del estadio en Libinia spinosa en función de la temperatura variaron, siendo a menor temperatura el estadio de mayor duración el de morfogénesis y el de menor el estadio final, pero a medida que aumenta la temperatura son los estadios de pigmentación embrionario los que demoran su desarrollo y el estadio inicial y final los que ocurren en menor tiempo. Por esta razón se podría inferir que L. spinosa es capaz de modular diferencialmente la duración de las etapas del desarrollo embrionario en función de la temperatura del agua, estableciendo una diferencia entre la morfogénesis y la etapa de pigmentación embrionaria.

Los resultados del presente capítulo presentan información valiosa sobre el desarrollo embrionario de los Decapoda y en particular de los cangrejos Majoidea, siendo el primer trabajo de desarrollo de esta superfamilia en el hemisferio sur. Se destaca el importante rol de la temperatura sobre la duración del desarrollo embrionario y su efecto diferencial sobre los distintos estadios lo que se vincularía con el significativo rango térmico en que ocurre el desarrollo embrionario debido al extenso periodo reproductivo (Capítulo II). Características como el tamaño inicial de los huevos, su incremento relativo de tamaño durante el desarrollo y la tasa de consumo de vitelo podrían ser características moduladas por otros factores como la fecundidad o la inversión reproductiva diferentes entre las especies en estudio.

- 157 -

DISCUSIÓN GENERAL

Biología Reproductiva de Majoidea Discusión General DISCUSIÓN GENERAL

La biología reproductiva de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa en los golfos norpatagónicos fue estudiada desde diferentes aspectos en esta tesis y fueron comparados dentro de cada capítulo con los estudios realizados en otros Majoidea destacándose los presentes resultados integrados como los primeros para especies del hemisferio sur. En relación a su distribución, Leuocyclus tuberculosus fue la especie más abundante y estuvo representada en la mayor parte de su rango de tallas. Libinia spinosa presentó baja frecuencia de ejemplares inmaduros por lo cual es probable que los juveniles de esta especie presenten otra distribución espacial/batimétrica en los golfos estudiados o que migren tempranamente hacia otros ambientes. Para evaluar la adquisición de la madurez sexual se requirió el análisis previo de la morfología del sistema reproductor y de sus caracteres sexuales secundarios destacándose los caracteres generales y las particularidades de estas especies en comparación con otros Majoidea. Estas especies presentan un sistema reproductor con determinadas características particulares que podrían estar asociadas con diferentes estrategias de apareamiento y mecanismos de competencia espermática. Los machos presentan diferencias en el sitio de formación de los espermatóforos y la morfología de los gonopodios. En las hembras se observó un ovario que no posee la típica forma de H, una inserción oviducto-receptáculo seminal de tipo “intermedia” y receptáculos seminales estructuralmente diferentes entre especies. Libinia spinosa posee un velum y Leurocyclus tuberculosus presenta pliegues en la zona de transición meso-ectodérmica del receptáculo seminal, estructuras que se propone que “sostienen” o mantienen el contenido espermático dentro del receptáculo ante el desove. La función propuesta para el velum y los pliegues es acorde con la observación de receptáculos seminales con contenido espermático en hembras ovígeras con ovarios en estado de reciente desove.

En particular, el estudio de la morfología y ciclo anual del contenido de los receptáculos seminales constituyó un abordaje novedoso y comparable con el tipo de estudios realizados en especies de los géneros Inachus (Diesel 1988b, 1989; Rorandelli et al. 2010) y Chionoecetes (Donaldson et al. 1981; Paul 1984; Donaldson y Adams 1989; Sainte Marie 1993; Elner y Beninger 1995; Lanteigne et al. 1996; Sainte-Marie y Sainte- Marie 1998; Jadamec et al. 1999; Rondeau y Sainte-Marie 2001; Sainte-Marie et al. 2002; Sainte-Marie 2007).

- 159 - Biología Reproductiva de Majoidea Discusión General Jones y Hartnoll (1997) proponen para especies del género Inachus y Hinsch (1968) para Libinia emarginata que las especies que desarrollan la gónada luego de la muda puberal se aparean solo en intermuda en contraposición a los autores que proponen que los Majoidea se aparean por primera vez en postmuda y luego en intermuda. Basándonos en los presentes resultados, Leuroyclus tuberculosus y Libinia spinosa se ajustan al modelo expuesto para los Majoidea del género Inachus y Libinia debido a que los receptáculos seminales se desarrollan en la muda puberal en simultáneo o antes de alcanzar la maduración gonadal. Las observaciones estacionales permiten inferir que las mudas puberales podrían estar ocurriendo con mayor frecuencia en otoño e invierno, debido a que son las estaciones donde se observan hembras maduras con receptáculos seminales recién formados (colapsados). Ambas especies fueron analizadas en función de la adquisición de la madurez sexual bajo tres criterios: gonadal, morfométrico y funcional y su relación con los estadios de crecimiento estimados. Como una aproximación novedosa dentro de los estudios del taxón se incluyó la diferenciación del canal vaginal, vulva y gonopodios a lo largo de la ontogenia. Para la especie Leurocyclus tuberculosus se observó que ambos sexos alcanzarían similares tallas máximas con una frecuencia de tallas que permitió ajustar y estimar 13 estadios de crecimiento. Las hembras de Leurocyclus tuberculosus presentaron hasta el estadio de crecimiento designado con el número VII únicamente ejemplares inmaduros y posteriormente, en los estadios de crecimiento VIII al XI se pudieron determinar cuatro posibles estadios donde ocurriría la muda de pubertad en la que alcanzan la madurez morfométrica. Dentro de estos estadios de crecimiento también ocurriría la adquisición de madurez gonadal y funcional, dado que el 50% de las hembras de la población maduran desde el punto de vista gonadal a los 47mm (estadios de crecimiento IX, X, XI) y funcionalmente a los 42 mm (estadio de crecimiento IX). Algo novedoso observado en esta especie es que aunque la madurez gonadal, morfométrica y funcional ocurren en el mismo estadio de crecimiento, la madurez funcional puede ocurrir antes de la madurez gonadal. El concepto utilizado de madurez funcional infiere la cópula, y se independiza de la madurez ovárica. De este modo las hembras pueden copular por primera vez con el ovario inmaduro y completar la maduración ovárica posteriormente a la muda puberal. En los machos de Leurocyclus tuberculosus hasta el estadio de crecimiento número IX se observaron ejemplares inmaduros y en el estadio de crecimiento X

- 160 - Biología Reproductiva de Majoidea Discusión General principalmente, así como en el extremo izquierdo de la distribución de tallas del estadio IX y derecho del estadio X, se pudieron observaron individuos inmaduros y maduros. Se podría entonces estimar que la muda de pubertad que implica cambios a nivel de la tasa de crecimiento de las quelas estaría ocurriendo con mayor frecuencia en el estadio X, al igual que la adquisición de madurez funcional (53 mm de AC). Sin embargo, la talla a la cual el 50% los organismos adquieren la madurez gonadal fue determinada a los 36 mm de AC en estadios de crecimiento anteriores (estadios VIII–IX). De acuerdo a estas observaciones se propone que en los machos de esta especie la muda de pubertad implica madurez funcional, pero es posterior a la muda de adquisición gonadal.

Para la especie Libinia spinosa sólo se pudieron ajustar y estimar los estadios de crecimiento luego de la madurez morfométrica para ambos sexos. A diferencia de Leurcyclus tuberculosus, en Libinia spinosa los machos alcanzarían tallas máximas mayores que las hembras. En las hembras se pudo establecer que las tallas a las cuales el 50% de los ejemplares están maduros gonadal, morfométrica y funcionalmente podrían pertenecer al mismo estadio de crecimiento, al igual que en las hembras de Leurocyclus tuberculosus, y en función al rango de tallas determinado (42 mm a 46 mm de AC) para los tres criterios de madurez se propone que sería en el primer estadio de crecimiento estimado de ejemplares maduros. Sobre la frecuencia de tallas de los machos de Libinia spinosa se estimaron 8 estadios de crecimiento. A diferencia de Leurocyclus tuberculosus la muda puberal (36 mm de AC) involucra la adquisición de la madurez gonadal (40 mm de AC) pero recién en un estadio de crecimiento posterior se adquiere la madurez funcional. En función del análisis de la frecuencia de tallas de ambos sexos y de ambas especies se propone que la muda puberal no sería en principio la muda terminal, debido a la presencia de más de un estadio de crecimiento luego de la muda puberal. Esta inferencia avala la propuesta de Donalson y Adams (1989) para la especie Chionoecetes bardii.

La proporción de sexos de las especies estudiadas no mostró el patrón esperado 1:1. En el caso de Leurocyclus tuberculosus fue de 2:1 a favor de las hembras sin mostrar cambios significativos entre estaciones anuales ni profundidades. Por el contrario, en Libinia spinosa la proporción de sexos presentó mayor la proporción de machos en

- 161 - Biología Reproductiva de Majoidea Discusión General verano, mayor la proporción de hembras en primavera y proporción 1:1 en otoño e invierno. A pesar de que no se observó un patrón estacional claro en los años de muestreo se pudieron determinar ciertas características reproductivas a lo largo de las estaciones anuales. Las hembras de Libinia spinosa así como los machos de ambas especies presentan un sincronismo en la madurez gonadal y funcional, que no fue observado en las hembras de Leuroyclus tuberculosus. Por otra parte, Leurocyclus tuberculosus presenta un sincronismo en la madurez gonadal entre machos y hembras en invierno, lo que permite inferir una época de alta frecuencia de cópulas. Por el contrario, en Libinia spinosa la maduración gonadal entre sexos no es sincrónica, las hembras maduran en primavera cuando la proporción de sexos es a favor de las hembras y los machos en verano cuando dominan la proporción sexual. Respecto de la periodicidad reproductiva, aunque los muestreos mensuales mostraron muy alta variabilidad en la captura, los resultados estacionales obtenidos permitirían proponer un período reproductivo continuo para ambas especies en los golfos Norpatagónicos debido a la presencia de hembras ovígeras durante todo el ciclo anual, sumado a la presencia de ejemplares de ambos sexos funcionalmente maduros durante todo el año. Estos resultados son novedosos para especies de Eubrachyura de estas latitudes donde se esperaría un patrón reproductivo estacional principalmente acotado a la primavera y verano, mientras que la reproducción continua suele observarse en especies tropicales (Hartnoll 2006). La extensión del período de puestas de huevos en ambas especies en los golfos norpatagónicos es consistente con el elevado rango térmico (10°C) en que los embriones pueden desarrollarse exitosamente. Las especies difirieron en la fecundidad realizada, relativa, peso seco por huevo y esfuerzo reproductivo. Estas diferencias interespecíficas no pudieron ser comparadas con otras poblaciones debido a la ausencia de trabajos similares en otras latitudes. Su comparación con otros Majoidea indicó que los valores estimados de fecundidad relativa para ambas especies son acordes a los estudios previos en Chionoecetes (Sainte-Marie 1993), y los de esfuerzo reproductivo varían según la especie: L. spinosa presenta un ER similar a: Inachus dorsettensis ER= 8,9; Loxorhynchus crispatus ER= 8,7, Pugettia producta ER= 8,1 y Puggettia richii ER= 8,1, y Leurocyclus tuberculosus presenta un ER

- 162 - Biología Reproductiva de Majoidea Discusión General similar a: Libinia emarginata ER= 4,7, Loxorhynchus grandis ER= 5,2 y Mimulus foliatus ER= 5,2 (Hartnoll 2006) El efecto global de la temperatura durante el desarrollo embrionario en estas especies (a menor temperatura, mayor tiempo de desarrollo embrionario) muestra la tendencia observada en otros Decapoda (García-Guerrero et al. 2003; Stevens 2006) y los Majoidea estudiados (Petersen 1995; Moriyasu y Lanteigne 1998; Webb et al. 2007). Sin embargo el efecto diferencial de la temperatura sobre cada etapa del desarrollo descripta que difirió entre especies es un aporte novedoso de la presente tesis que por el momento no puede ser comparado con otros Majoidea dada la ausencia de este tipo de trabajos. Un aspecto muy interesante de la dinámica embrionaria y su modulación por la temperatura es que la flexibilidad térmica embrionaria podría estar vinculada con la capacidad de las especies de tener una distribución latitudinal y/ó batimétrica amplia.

Varios aspectos de los resultados obtenidos en la presente tesis generan numerosas nuevas preguntas. Entre ellas:

- Sería interesante determinar experimentalmente las posibles funciones del velum y los pliegues de los receptáculos seminales, y relacionarlas con la morfología de las estructuras de transferencia espermática masculinas.

- Un estudio discriminando entre hembras primíparas y multíparas permitiría esclarecer las diferencias encontradas no solo sobre el potencial reproductivo de las hembras sino en el comportamiento de los machos en las cópulas. De existir la elección en los machos, ¿elegirán los machos a las hembras en función de su condición de primíparas o multíparas?.

- ¿Las diferencias en el crecimiento relativo de las quelas entre especies (cambios más significativos en el ancho de la quela en Leurocyclus tuberculosus y en el largo de la quela en Libinia spinosa al adquirirse la madurez sexual), marcarán una diferencia en el comportamiento reproductivo de precópula, cópula y/ó postcópula?.

-A través de estudios experimentales sería interesante poder determinar con mayor claridad el modelado de la temperatura sobre el incremento de talla de un estadio de crecimiento al siguiente entre juveniles, y su efecto en la determinación del estadio de crecimiento en el que ocurre la madurez puberal.

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CONCLUSIONES

Biología Reproductiva de Majoidea Conclusiones CONCLUSIONES

En función de las hipótesis de cada capítulo las principales conclusiones de esta tesis doctoral son:

1- El sistema reproductor femenino de ambas especies presenta una conexión del oviducto al receptáculo seminal de tipo intermedio entre los tipos dorsal y ventral previamente descriptos para Eubrachyura.

2- La luz de los receptáculos seminales presenta velum en Libinia spinosa y pliegues radiales en Leurocyclus tuberculosus y se propone su rol en la contención de los espermatozoides dentro de la zona dorsal del receptáculo en el momento de la ovulación.

3- Ambas especies presentan vaginas de tipo cóncava.

4- El sistema reproductor masculino de ambas especies presenta estructura tubular con lóbulos testiculares y vasos deferentes regionalizados. Se observan diferencias entre especies en la parte del vaso deferente donde se forman los espermatóforos.

5- Los gonopodios presentan diferencias específicas en su parte apical. La presencia de “ganchos” en el extremo apical de Leurocyclus tuberculosus podría estar involucrada en la ruptura de los espermatóforos durante la transferencia espermática de modo similar a Inachus phalangium.

6- La adquisición de la madurez gonadal, morfométrica y funcional coincide en las hembras de ambas especies. En los machos de Leurocyclus tuberculosus ocurren simultáneamente la madurez morfométrica y funcional posteriormente a la gonadal. En Libinia spinosa ocurren simultáneamente la madurez gonadal y funcional posteriormente a la morfométrica.

7- La talla de madurez sexual morfométrica de las hembras es menor que la de los machos en Leurocyclus tuberculosus. En Libinia spinosa la talla de madurez morfométrica de las hembras es mayor que la de los machos.

- 165 - Biología Reproductiva de Majoidea Conclusiones 8- Leurocyclus tuberculosus presenta sincronismo en la madurez gonadal entre machos y hembras en invierno. En Libinia spinosa la maduración gonadal entre sexos no es sincrónica, las hembras maduran en primavera y los machos en verano.

9- La frecuencia de tallas de ambos sexos de Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa permite visualizar por lo menos más de un estadio de crecimiento luego de la muda puberal para ambos sexos.

10- La proporción de sexos de Leurocyclus tuberculosus es de 2:1 (hembras: machos) y no muestra cambios significativos entre estaciones ni profundidades. En Libinia spinosa la proporción sexual varía según la estación, siendo mayor la proporción de machos en el verano, mayor la proporción de hembras en primavera y 1:1 en otoño e invierno. Respecto a la profundidad, la proporción de machos es mayor en 20m y la de hembras en 40m.

11- La fecundidad realizada de Leurocyclus tuberculosus es 18% mayor que en Libinia spinosa. Las especies no mostraron una buena correlación entre la fecundidad y la talla lo que sugiere que otros factores modulan la fecundidad.

12- El peso por huevo de Leurocyclus tuberculosus es un 45% menor que el de Libinia spinosa.

13- El potencial reproductivo de las especies estudiadas difiere significativamente siendo menor el de Leurocyclus tuberculosus.

14- La morfología embrionaria permite diferenciar las especies estudiadas desde el tercer estadio de desarrollo embrionario en función de la cantidad y disposición de los procesos terminales del telson.

15- La temperatura modula la duración del desarrollo embrionario en Leurocyclus tuberculosus y Libinia spinosa. El tiempo total promedio de incubación decrece a medida que aumenta la temperatura.

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...”En la universidad adquirimos conocimientos, pero lo importante es ver qué úso hacemos de ellos. Los conocimientos son meramente un instrumento, luego hay que ver en que dirección se los usa, por qué, para qué y para quien, esas son las tres preguntas que yo siempre aconsejo hacerse”...

José Saramago

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