UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA FARMACEUTICKÉ BOTANIKY A EKOLOGIE
RIGORÓZNÍ PRÁCE
Biologicky aktivní metabolity rostlin II. Alkaloidy Corydalis cava (L.)
Shweigg. & Körte (Fumariaceae) a screening jejich biologických vlastností.
Biological Active Plant Metabolites II. Alkaloids of Corydalis cava (L.)
Schweigg. & Körte (Fumariaceae) and Screening of Their Biological
Properties.
Školitel: Ing. Lucie Cahlíková, Ph.D.
2010 Mgr. Jan Průša PROHLÁŠENÍ
Prohlašuji, že tato diplomová práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracoval samostatně. Veškerá literatura a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpal, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány.
V Hradci Králové, 15. ledna 2010 Mgr. Jan Průša
1
PODĚKOVÁNÍ
Chtěl bych poděkovat paní Ing. Lucii Cahlíkové, Ph.D. za veškerou pomoc, trpělivost, cenné odborné rady, za změření a interpretaci MS spekter, poznámky k NMR spektrům, veškeré poskytnuté materiály a vedení během vypracovávání mé diplomové práce. Dále bych chtěl poděkovat Prof. RNDr. Janu Schramlovi, DrSc., Ing. Milanovi Kurfürstovi, Ph.D. z Ústavu chemických procesů AV ČR v Praze za změření NMR spekter a také Ing. Kateřině Macákové za stanovení biologických vlastností izolovaných látek. Dále kolektivu katedry farmaceutické botaniky a ekologie za příjemné prostředí a pomoc při řešení technických a teoretických problémů. A také svým rodičům a kamarádům, kteří mi byli vždy oporou.
Mgr. Jan Průša 2
OBSAH
1
Obsah………………………...…………………………………………………………………………1
1. Úvod………………………………………………………………………………………………...4 2. Cíl práce……………………………………………………………………………………...…….7 3. Teoretická část……………………………………………………………………………..………9 3.1. Kritéria výběru rostliny pro fytochemický výzkum………………………………………….10 3.2. Corydalis cava (L.) Schweigg. & Köerte - Dymnivka dutá………………………...... 10 3.2.1. Synonyma…………………………………………………………………..…………..10 3.2.2. Systematické zařazení…………………………………………………………………..11 3.2.3. Botanický popis……………………………………………………………….……..…11 3.2.3.1. Botanický popis čeledi…………………………………………………….....11 3.2.3.2. Botanický popis rostliny……………………………………………………..12 3.2.4. Ekologie………………………………………………………………………….……..13 3.2.5. Areál rozšíření …………………………………………………………………………13 3.2.5.1. Celkové rozšíření…………………………………………………………..…13 3.2.5.2. Rozšíření v České republice………………………………………………….14 3.2.6. Popis drogy………………………………………………………………………..……14 3.3. Obsahové látky Corydalis cava (L.) Schweigg. & Köerte…………………………..………14 3.3.1. Isochinolinové alkaloidy z Corydalis cava (L.) Schweigg. & Köerte……………...... 15 3.3.2. Ostatní sekundární metabolity izolované z Corydalis cava (L.) Schweigg. & Köerte…22 3.4. Alzheimerova choroba její etiopatogeneze a možnosti terapie…………………...………….23 3.4.1. Charekteristika Alzheimerovy choroby…………………………………………………23 3.4.2. Acetylcholinesteráza a butyrylcholinesteráza a jejich inhibice…………………………23 3.4.3. Inhibice AChE a BuChE alkaloidy z Corydalis cava a dalších rostlin rodu Corydalis...25 3.4.4. Ostatní biologické aktivity alkaloidů z Corydalis cava…………………………………27 3.5. Fytochemické a biologické studie dalších druhů rodu Corydalis……………………………28 3.5.1. Corydalis yanhusuo…………………………………………………………………….29 3.5.2. Corydalis solida………………………………………………………………………...32 4. Experimentální část………………………………………………………………………………34 4.1. Všeobecné postupy…………………………………………………………………..……….35 4.1.1. Destilace a odpařování………………………………………………………………….35 4.1.2. Chromatografie…………………………………………………………………….……35 4.1.2.1. Tenkovrstvá chromatografie……………………………...………………….35 4.1.2.2. Sloupcová chromatografie………………………………………………...….35 4.2. Materiál a vybavení……………………………………………………………………….….36 4.2.1. Rozpouštědla…………….……………………………………………………………...36 4.2.2. Chemikálie………………………………………………………………………………36
4.2.3. Chemikálie a materiál ke stanovení účinku AChE a BuChE (IC50)…………………….36 4.2.4. Chemikálie ke stanovení antioxidační a antiprotozoální aktivity……………………….37 4.2.5. Přístroje použité při stanovení biologických účinků izolovaných látek………………...37 4.2.6. Detekční činidla…………………………………………………………………………37 4.2.7. Chromatografické desky a absorbenty………………………………………………….38 4.2.8. Vyvíjecí soustavy pro analytickou tenkovrstvou chromatografii……………………….38 4.2.9. Vyvíjecí soustavy pro preparativní tenkovrstvou chromatografii………………………38 4.3. Zpracování chloroformového výtřepku B z Corydalis cava………………………………..……39
4.3.1. Příprava a čištění výtřepku Corydalis cava/B/CHCl3……………………………..……39
4.3.2. Sloupcová chromatografie výtřepku Corydalis cava/B/CHCl3…………………………40 4.3.3. Zpracování spojených frakcí 7 a 8……………………………………………………....42
2
4.3.4. Čištění a separace minoritních alkaloidů z F1…………………………………………..43
4.3.5. Izolace alkaloidů z podfrakce F1-3……………………………………………………...44 4.4. Určení struktury izolované látky……………………………………………………………..45 4.4.1. Měření hmotnostního spektra……………………………………………………..…….45 4.4.2. Měření NMR spektra……………………………………………………………………45
4.5. Stanovení účinku alkaloidu na lidskou HuAChE a sérovou HuBuChE (IC50)……………….45 4.6. Stanovení antioxidační aktivity……………………………………………………………....46 4.7. Stanovení antiprotozoální aktivity……………………………………………………………46 5. Výsledky...... 47 5.1. Strukturní studie izolované látky 1…………………………………………………………...48 5.1.1. Hmotnostní spektrum izolované látky 1………………………………………………...48 5.1.2. NMR studie izolované látky 1……………………………………………………….….50 5.1.2.1. 1H NMR spektrum izolované látky – 1………………………………………50 5.1.2.2. 13C NMR spektrum izolované látky 1………………………………………..51 5.2. Strukturní studie izolované látky 2…………………………………………………….……..52 5.2.1. Hmotnostní spektrum izolované látky 2………………………………………………...52 5.2.2. NMR studie izolované látky – 2…………………………………………………..…….54 5.2.2.1. 1H NMR spektrum izolované látky 2………………………………………...54 5.2.2.2. 13C NMR spektrum izolované látky 2………………………………………..55 5.3. Antioxidační aktivita alkaloidů ……………………………………………………………...57 5.4. Inhibiční aktivita vůči AChE a BuChE………………………………………………………57 5.5. Antiprotozoální aktivita alkaloidů……………………………………………………………57 6. Diskuze……………………………………………………………………………………………58 7. Literatura………………………………………………………………………………………....60 8. Seznam zkratek…………………………………………………………………………………..66
3
1 ÚVOD
4
V současné době mají přírodní léčiva nezastupitelné místo v medicíně. Moderní výzkum nových léčiv se po určité době opět vrací k rostlinnému materiálu, který je v dnešní době ekonomicky výhodnější a mnohdy levnějším zdrojem biologicky aktivních látek. Velká pozornost je v současnosti věnována rostlinám tradiční čínské medicíny, která využívá asi 5000 léčivých rostlin, u nás nepříliš známých nebo terapeuticky nevyužívaných1,2. Do popředí se také dostávají rostliny dříve považované za okrasné.
Jednou ze skupin látek přírodního původu, které jsou již delší dobu sledovány tvoří alkaloidy. Alkaloidy se vyskytují především ve vyšších rostlinách. Odhaduje se, že 10-20 % všech rostlin obsahují alkaloidy. Biogeneticky jsou tyto látky odvozené od aminokyselin. Podle původní aminokyseliny se dělí na základní strukturní typy (tropanové, isochinolinové, chinolinové atd.), které se dále dělí na podstruktury3.
Jedna z nejvýznamnějších a nejrozšířenějších skupin alkaloidů je skupina isochinolinových alkaloidů. Tyto látky se vyznačují širokým spektrem výskytu, struktur a biologických účinků. Jsou soustředěny především do čeledí Papaveraceae, Berberidaceae,
Ranunculaceae, Fumariaceae a Amarylidaceae4-6.
Isochinolinovým alkaloidům je v současné době věnována velká pozornost pro jejich schopnost inhibovat cholinesterázy, které se podílejí na vzniku neurodegenerativních onemocnění. Mezi tyto nemoci patří především Alzheimerova choroba, která je zodpovědná za cca 50-60 % všech demencí. Tímto onemocněním trpí každý desátý člověk starší 65 let a až každý druhý starší 85 let. Tato choroba se v současné době nedá vyléčit, pouze zmírnit a zpomalit její příznaky. Jednou z terapeutických možností zpomalení progrese Alzheimerovy choroby je podávání inhibitorů acetylcholinesterázy (AChE). Na základě posledních studií bylo zjištěno, že při této chorobě určitou roli hraje i enzym butyrylcholinesteráza (BuChE) a bylo by potřeba blokovat i tento enzym. Jedním z nejrozšířenějších terapeutik používaných při léčbě
Alzheimerovy choroby je isochinolinový alkaloid galanthamin, který specificky inhibuje pouze
AChE a vůči BuChE je prakticky neúčinný7. V současné době se hledají především látky, které
5
budou schopny inhibovat oba typy cholinesteráz. Vzhledem k celosvětovému stárnutí populace se neurodegenerativní choroby a jejich terapie stávají velkým sociálním problémem a hledání nových potencionálních léčiv, jak přírodního tak i syntetického původu, se věnuje řada pracovních skupin po celém světě8,9.
Jedním z rostlinných druhů obsahujících isochinolinové alkaloidy je rod Corydalis, který se v Asii, ale i v Evropě a Americe široce používá nejen v lidovém léčitelství. Z tohoto rodu byla doposud izolována celá řada isochinolinových alkaloidů, ale jejich biologické aktivitě většiny z nich nebyla doposud věnována velká pozornost10,11.
6
2 CÍL PRÁCE
7
Cílem mé rigorózní práce bylo:
1. Provést preparativní tenkovrstvou chromatografii podfrakce F1-3, získané v rámci
diplomové práce12.
2. Získání minimálně jedné látky v čistém stavu, určení jejích základních fyzikálně-
chemických charakteristik.
3. Příprava vzorků na biologické testování.
4. Podílet se na stanovení biologických aktivit (inhibice AChE, BuChE, antioxidační a
antiprotozoální aktivita) izolovaných látek.
8
3 TEORETICKÁ ČÁST
9
3.1 Kritéria výběru rostliny pro fytochemický výzkum
Na základě screeningu biologických vlastností sumárních ethanolových extraktů alkaloidních rostlin provedených v roce 2007 na pracovišti KFBE doc. RNDr. Lubomírem
Opletalem, CSc. a literární rešerše, byla pro fytochemickou studii vybrána rostlina Corydalis cava (L.)13-15.
Corydalis cava (Dymnivka dutá) je vytrvalá bylina, patřící do čeledi Fumariaceae a je bohatým zdrojem isochinolinových alkaloidů. Tato rostlina je široce rozšířena a využívána především v Asii v lidovém léčitelství na zmírnění bolesti hlavy, kloubů, při gastrointestinálních obtížích a při léčbě chorob CNS16,17. Do rodu Corydalis patří celá řada dymnivek, které jsou rozšířené po celém světě. Mnoho z nich bylo podrobeno fytochemickému výzkumu a screeningu biologických vlastností jejich sumárních extraktů isolovaných látek (C. cava, speciosa, nobilis, solida, yanhusuo, sempervirens atd.)18-21.
3.2. Corydalis cava (L.) SCHWEIGG. & KÖERTE - Dymnivka dutá
3.2.1. Synonyma22:
Fumaria bulbosa a cava L., Fumaria cava (L.) Mill., Pistolochia cava (L.) Bernh.,
Corydalis tuberosa DC.
10
Obr. 1. Corydalis cava (L.) Schweigg. & Köerte – celá rostlina23
3.2.2. Systematické zařazení
Tab. I. Systematické zařazení Corydalis cava24
Říše Rostliny Plantae
Podříše vyšší rostliny Cormobionta
Oddělení rostliny krytosemenné Magnoliophyta
Třída vyšší dvouděložné rostliny Rosopsida
Řád pryskyřníkotvaré Ranunculales
Čeleď zemědýmovité Fumariaceae
Rod dymnivka Corydalis
3.2.3. Botanický popis
3.2.3.1. Botanický popis čeledi
Jednoleté až vytrvalé byliny bez mléčnic se střídavými listy. Trojčetné nebo zpeřené listy jsou řapíkaté, bez palistů, vyrůstají střídavě. Oboupohlavné souměrné květy se skládají do hroznů
11
nebo do lat. Kalich je tvořen dvěma malými lístky, které jsou opadavé nebo chybí. Korunu tvoří
čtyři plátky ve dvou kruzích. V květu jsou dvě tyčinky na širokých nitkách, nahoře se dělí na tři
části. Prostřední část tyčinky nese dvoupouzdré prašníky, okrajové části mají prašníky jednopouzdré. Svrchní semeník srůstá ze dvou plodolistů. Plody jsou nažky nebo tobolky, které mají dvě chlopně. Řadí se sem asi 18 rodů se 450 druhy. Oblast rozšíření hlavně v mírném pásmu na severní polokouli. Čeleď Fumariaceae je příbuzná s čeledí mákovitých (Papaveraceae). Od
čeledi Papaveraceae se liší několika znaky. Čeleď Fumariaceae nemá ve svých pletivech mléčnice, ale jen idioblasty obsahující alkaloidy. Semeník u čeledi Papaveraceae může srůstat z většího počtu plodolistů (až z devatenácti)25.
3.2.3.2. Botanický popis rostliny
Vytrvalá bylina dorůstající výšky 10 - 30 cm. Z velké a duté podzemní hlízy vyrůstá lysá, přímá lodyha, která není pokrytá šupinami. Silná lodyha nese pouze dva listy, které mají sivozelenou barvu. Vyrůstají na krátkých řapících, v obrysu mají tvar široce trojboký. Listy jsou
2× trojčetné. Lístky mají v obrysu tvar klínovitě obvejčitý, jsou nepravidelně laločnaté, někdy až dělené do zašpičatělých podlouhlých úkrojků. Oboupohlavné souměrné květy, které vyrůstají v úžlabí celokrajných a vejčitých listenů, se skládají do přímého a bohatého hroznu. Šupinkatý kalich je tvořen dvěma volnými lístky, je prchavý. Koruna je tvořena čtyřmi plátky. Vnější horní plátek se protahuje v ostruhu, ale vnější dolní plátek se na vzniku ostruhy nepodílí. Dva vnitřní plátky mají podlouhlý tvar, v přední části jsou černé. Barva koruny bývá růžová se šedým nádechem nebo žlutavě bílá. Ostruha je dlouhá, na konci dolů ohnutá. Celý květ i s ostruhou pak měří 18 - 28 mm. V květech se nacházejí pouze dvě tyčinky, svrchní semeník srůstá ze dvou plodolistů. Plody jsou tobolky, které se zužují v přímý zobánek a dosahují délky až 25 mm.
Semena jsou lesklá a mají černou barvu. Rostlina kvete od března do května25.
12
Obr. 2. Corydalis cava (L.) Schweigg. & Köerte – květ 26
3.2.4. Ekologie
Dymnivku dutou najdeme v lužních lesích, smíšených listnatých lesích a humózních hájích, někdy i na loukách. Roste na vlhčích, humózních, na minerály bohatších kyprých půdách.
Přednost dává teplejším stanovištím a roste za příznivých podmínek většinou pospolitě27.
3.2.5. Areál rozšíření
3.2.5.1. Celkové rozšíření
ASIE
Západní Asie: Írán, Turecko
Kavkaz: Ázerbájdžán, Georgie, Rusko
EVROPA
Severní Evropa: Dánsko, Švédsko
Střední Evropa: Rakousko, Belgie, Česká Republika, Slovensko, Německo, Maďarsko, Polsko,
Švýcarsko
Východní Evropa: Lotyšsko, Litva, Rusko, Ukrajina
13
Jihovýchodní Evropa: Albánie, Bulharsko, bývalá Jugoslávie, Řecko, Itálie, Rumunsko
Jihozápadní Evropa: Francie, Portugalsko, Španělsko
Rostlina je rozšířená od nížin do podhůří. Vyskytuje se hlavně ve střední Evropě. Na území
České republiky roste hojně. Zavlečena byla i do Anglie28.
3.2.5.2. Rozšíření v České republice
Obr.3. Oblasti výskytu Corydalis cava v České republice29
3.2.6. Popis drogy
Celá droga chutná hořce a je bez zápachu. Hlízy jsou kuželovité až nepravidelně- laločnaté, šedohnědé barvy, v terminální se zbytky stonku, bazální část má dovnitř zahnutou dutinu opatřenou obrubou, hladkou, jakoby zalomenou rovinou zelenožluté barvy30.
3.3 Obsahové látky Corydalis cava (L.) Schweigg. & Köerte
Z fytochemického hlediska byla Corydalis cava intenzivně studována hlavně v minulém století. Z různých částí rostliny (hlízy, kořeny, nadzemní části) bylo izolováno velké množství terciárních a kvartérních isochinolinových alkaloidů patřících do několika strukturních typů17,31.
14
Pomocí moderních analytických metod (GC-MS, HPLC-MS, CE-MS)11 bylo v poslední době identifikováno mnoho minoritních alkaloidů, které nebyly doposud izolovány v čistém stavu. Velice intenzivně se studiu isochinolinových alkaloidů věnoval v 60. až 80.-tých letech minulého století český chemik J. Slavík, který izoloval a strukturně popsal řadu látek z rostlin
řádu Papaverales17,32,33.
3.3.1 Isochinolinové alkaloidy z Corydalis cava (L.) Schweigg. & Köerte
Doposud izolované alkaloidy z Corydalis cava lze rozdělit do několika strukturních typů.
V následující přehledu jsou shrnuty nejvíce zastoupené alkaloidy, izolované z různých částí rostliny Corydalis cava.
1) aporfinové alkaloidy:
(+)-bulbokapnin – isolován z hlíz, kořenů i nadzemních částí rostliny17,31
O O OH MeO
N H Me
(+)-domesticin – isolován z nadzemní části rostliny31
O O OH MeO
N H Me
15
(+)-glaucin – isolován z nadzemní části rostliny17,31
OMe MeO
MeO
MeO N H Me
(+)-isoboldin – isolován z hlíz a nadzemních částí rostliny17,31
OMe HO
MeO
HO N H Me
(+)-korydin - isolován z hlíz16,17
OMe HO OMe MeO
N H Me (+)-korytuberin - izolován z hlíz17
OMe HO OMe MeO
N H Me
16
(+)-magnoflorin – izolován z hlíz17
OMe HO OH MeO
+ N H Me Me
(+)- nantenin – izolován z hlíz a nadzemních částí rostliny17,31,34
OMe MeO
O
O N H Me
(+)-predicentrin – isolován z nadzemních částí rostliny17,31,34
OH MeO
MeO
MeO N H Me
17
2) ftalylisochinolinové alkaloidy:
(-) – kapnoidin – izolován z hlíz a nadzemních částí rostliny31,34
O O O O
H H Me O N O
3) protoberberinové a berberinové alkaloidy: apokavidin – izolován z hlíz31
O O N
Me MeO
OH berberin – izolován z hlíz, kořenů i nadzemních částí rostliny31,33
O O
+ N MeO
OMe
18
(+)-kanadin - izolován z hlíz31 O O H
N MeO
OMe kolumbamin - izolován z hlíz31 OH OMe
+ N MeO
OMe koptisin - - izolován z hlíz a nadzemních částí rostliny17,31
O
O
O + N
O
(+)-korydalin - izolován z hlíz31
OMe OMe Me H
N MeO
OMe
19
(+)-korybulbin - izolován z hlíz17
OMe OH Me H
N MeO OMe
palmatin - izolován z hlíz17
OMe OMe
+ N MeO
OMe
(+)-stylopin - izolován z hlíz a nadzemních částí rostliny17,31
O
O
O N H O tetrahydropalmatin - izolován z hlíz17,31
OMe OMe
N MeO OMe
20
4) protopinové alkaloidy: allokryptopin – izolován z hlíz i nadzemních části rostlin17
Me O O Me
O N
Me korykavin – izolován z hlíz17
O O Me O O
O N
Me
(+)-korykavidin – izolován z hlíz17,31
OMe O O OMe Me O N
Me protopin – izolován z hlíz i nadzemních částí17,34
O O
O O
O N
Me
21
5) morfinanové alkaloidy:
Sinoakutin34
Me N
O
OMe
OH
MeO
6) sekoberinové alkaloidy:
(-)-kanadalin – izolován z hlíz35
O
N O Me H
O OMe
H OMe
3.3.2 Ostatní sekundární metabolity izolované z Corydalis cava (L.) Schweigg.
& Köerte
Další látka izolovaná z Corydalis cava byla kyselina fumarová31. Jiným sekundárním metabolitům přítomným v Corydalis cava nebyla doposud věnována významná pozornost.
COOH HOOC Obr. 4. Kyselina fumarová
22
3.4 Alzheimerova choroba její etiopatogeneze a možnosti terapie
3.4.1 Charekteristika Alzheimerovy choroby
Alzheimerova choroba patří mezi neurodegenerativní onemocnění a tvoří 50-60% veškerých demencí. Porucha paměti a prostorová desorientace, ztráta intelektu i sociálních dovedností a výkyvy emocionálního charakteru jako je agitovanost, deprese, úzkost nebo agresivita, jsou příznaky postihující pacienty s tímto onemocněním. Dochází k ubývání neuronů a celkové atrofii mozkové nervové tkáně. Předpokládá se, že dysfunkce a úbytek neuronů je způsoben zejména narušením metabolické a iontové homeostázy a oxidačním poškozením.
Postižena je zejména cholinergní aktivita. Dochází ke snížení aktivity cholinacetyltransferázy, enzymu který syntetizuje acetylcholin, je omezen vstup prekurzorů
(cholin, acetyl-koenzym A) a zpětné vychytávání acetylcholinu i jeho uvolnění z presynaptického zakončení. Dalším ovlivněným systémem je systém serotoninergní, je snížena hladina somatostatinu. S věkem klesá i syntéza dopaminu a stoupá jeho inaktivace monoaminooxidázami (MAO)36. Významnou roli při Alzheimerově chorobě hrají dva enzymy, a to acetylcholinesteráza a butyrylcholinesteráza37-39.
3.4.2 Acetylcholinesteráza a butyrylcholinesteráza a jejich inhibice
Acetylcholinesteráza (AChE) je vysoce specifický a výkonný enzym vyskytující se především v cholinergních neuronech a v okolí cholinergních synapsí (ve vysokých koncentracích se nachází na nervosvalovém spojení). Hydrolyzuje zejména acetylcholin, uvolněný nervovou stimulací do synaptické štěrbiny a uvnitř nervových zakončení zodpovídá za rozklad cytoplazmatického acetylcholinu na cholin a acetát. Jeho inhibicí, ať už reverzibilní nebo ireverzibilní, dochází k nahromadění ACh na muskarinových respektive nikotinových receptorech a tím k jejich hyperstimulaci40.
23
Je několik různých forem acetylcholinesteráz. V mozku zdravého člověka převládá tetramerní G4 forma a pouze minoritní je forma monomerní G1. U Alzheimerovy choroby vzrůstá podíl formy G1 a klesá podíl G441.
Důležitou částí AChE, která napomáhá při štěpení ACh, je anionické centrum. ACh se váže k anionickému centru enzymu kvartérním dusíkem a poté je rozložen deprotonizovaným hydroxylem aminokyseliny serinu esteratického centra. Strukturně podobné látky obsahující kvartérní dusík, vykazují rovněž zvýšenou afinitu k AChE. Jejich navázáním k enzymu dochází k reverzibilní, nejčastěji kompetitivní inhibici enzymu42.
Inhibitory AChE jsou v současnosti užívány jako pesticidy (parathion, malathion), léčiva
Alzheimerovy choroby (takrin, donepezil, rivastigmin, galanthamin), k léčbě myastenia gravis (neostigmin, pyridostigmin), k premedikaci před otravou nervově paralytickými látkami
(SAD-128) či v oftalmologii.
Butyrylcholinesteráza (též pseudocholinesteráza, BuChE) je substrátově méně specifický enzym, který přednostně rozkládá jiné substráty než acetylcholin (např. butyrylcholin, prokain, suxamethonium apod.). Je přítomna např. v plazmě, játrech a pouze v omezeném rozsahu v neuronech periferního a centrálního nervového systému37. Při vypuknutí Alzheimerovy choroby však její aktivita dramaticky roste a při hledání nových potenciálních terapeutik, je nutno věnovat pozornost i této skutečnosti.
Za posledních několik let znalosti o struktuře, vlastnostech či mechanismu inhibice a reaktivace AChE a BuChE, značně pokročily. Rychlý vývoj výkonných počítačů a nových metod teoretické chemie, umožnil studovat chování látek bez toho, aby se uskutečnil jediný
43 experiment .
V současnosti je dostupné velké množství softwarových systémů, s jejichž pomocí je možné objasnit jednotlivé detaily chemických reakcí, vypočítat vlastnosti látek či studovat interakci potencionálních léčiv s receptory nebo jinými makromolekulami44.
24
3.4.3 Inhibice AChE a BuChE alkaloidy z Corydalis cava a dalších rostlin
rodu Corydalis
V literatuře je dostupná řada prací, týkajících se izolace isochinolinových alkaloidů z Corydalis cava a následné stanovení jejich inhibičních aktivit vůči AChE a BuChE.
Ve studii publikované v roce 2007 byla stanovována in vitro inhibiční aktivita vůči AChE a BuChE tří látek izolovaných z Corydalis cava (bulbokapnin, korydin, korydalin).
Acetylcholinesteráza, která byla použitá pro stanovení inhibice byla původem z elektrického
úhoře (typ VI-S) a zdrojem butyrylcholineterázy bylo koňské sérum16. Výsledky této studie jsou shrnuty společně s hodnotami standartu (galantamin) v následující tabulce (Tab. II.).
Tab. II. In vitro aktivita alkaloidů z Corydalis cava vůči AChE a BuChE
-6 IC50 (10 M) Alkaloid AChE BuChE Bulbokapnin 40 ± 2 83 ± 3 Korydalin 15 ± 3 >100 Korydin >100 52 ± 4
Galantamin (standart) 1,4 ± 0,2 4,0 ± 1,4
Nejvýznamnější inhibiční aktivitu vůči acetylcholinesteráze ze tří testovaných látek vykazoval korydalin a vůči butyrylcholinesteráze korydin. Bulbokapnin byl ale schopen inhibovat obě cholinesterazy v μM množství..
Inhibiční aktivita byla studována také u dalších alkaloidů identifikovaných v Corydalis cava. Pro příslušné testy byly látky izolovány z jiného druhu Corydalis. Zdroje acetylcholinesterázy či butyrylcholinesterázy byly často odlišné v různých studiích. Z tohoto důvodu je nevhodné vzájemně porovnávat zjištěné hodnoty IC50 izolovaných látek. Získané hodnoty lze považovat pouze za předběžné a v dalších testech je nutné pracovat pouze na jednom biologickém modelu, z důvodu vzájemného porovnání a vytipování potenciálně aktivních látek.
25
V práci publikované v roce 2008 bylo z rostliny Corydalis turtschaninovii izolováno 16 isochinolinových alkaloidů protoberberinového a aporfinového typu45. U všech látek byla stanovena hodnota IC50 vůči AChE, která byla získána z myších mozků. Jako pozitivní standart byl použit takrin. Výsledky této studie jsou shrnuty v následující tabulce (Tab.III.). Některé alkaloidy vykázaly zajímavou inhibiční aktivitu, ale ani jedna z testovaných látek se nepřiblížila inhibiční aktivitě pozitivního standartu.
Tab. III. In vitro aktivita alkaloidů z Corydalis turtschaninovii vůči AChE
Alkaloid IC50 (μM) AChE Oxoglaucidalin 27,1 ± 1,8 Oxoglaucin 48,7 ± 1,8 Glaucin ˃ 50 Protopin 14,5 ± 0,5 Korytenchin ˃ 50 Palmatin 10,4 ± 0,4 Berberin 4,7 ± 0,2 Korydalin 30,7 ± 1,5 Xylopinin 38,1 ± 1,8 Stylopin 15,8 ± 1,2 Oxypseudopalmatin ˃ 50 Tetrahydropalmatin 41,3 ± 2,2 Epiberberin 6,5 ± 0,5 Pseudodehydrokorydalin 8,4 ± 0,5 Pseudokoptistin 4,3 ± 0,3 Pseudoberberin 4,5 ± 0,2 Takrin (standart) 0,17 ± 0,02
Protopin, palmatin, berberin a korynoxidin byly v roce 2004 izolovány z Corydalis speciosa a podrobeny studii jejich inhibiční activity vůči acetylcholinesteráze46.
Acetylcholinesteréza pro studii byla získána z mozků myších samců. Jako standart byl opět
26
použit takrin. Získané hodnoty IC50 testovaných látek jsou uvedeny v následující tabulce (Tab.
IV.)
Tab. IV. In vitro aktivita alkaloidů z Corydalis speciosa vůči AChE
Alkaloid IC50 (μM) AChE Protopin 16,1 Korynoxidin 89,0 Palmatin 5,8 Berberin 3,3 Takrin (standart) 0,2
Z tabulky plyne, že nejvyšší inhibiční aktivitu na acetylcholinesterázu z testovaných látek vykázal kvartérní alkaloid berberin, nedosáhl ale aktivity standartu.
Ve studii publikované v roce 2002 byl z Corydalis incisa izolován protoberberinový
47 alkaloid korynolin, pro který byla stanovena hodnota IC50 pro acetylcholinesterázu 30,6 μM .
3.4.4 Ostatní biologické aktivity alkaloidů z Corydalis cava
Protoberberinové alkaloidy hlíz Corydalis cava byly podrobeny studii jejich vlivu na
GABAA receptor. Zatímco terciární protoberberinové alkaloidy isoapokavidin, korydalin, tetrahydropalmatin, skoulerin a isokorypalmin zvyšovaly specifickou afinitu [3H]bikukulin methylchloridu (BMC - GABAA antagonista) ke GABAA receptoru v rozsahu 21-49 %, tak kvarterní protoberberinové alkaloidy zahrnující mimo jiné palmatin, koptisin, dehydroapokavidin
48 a dehydrokorydalin žádný účinek na změnu afinity BMC ke GABAA receptoru neměly .
V odborných publikacích můžeme nalézt také studie, které se zabývají vlivem různých obsahových poměrů extraktů Corydalis cava a Eschscholtzia californica na CNS. První z nich zkoumala vliv na endorfiny a enkefaliny. Endorfiny a enkefaliny jsou látky peptidové povahy, které jsou všeobecně známé jako endogenní peptidy. Tyto látky jsou u lidí považovány za hlavní fyziologické modulátory bolesti. Tyto endogenní látky se vážou na opiátové receptory a tlumí
27
tím vnímání bolesti. Zajímavé je, že právě výtažky z Corydalis cava a Eschscholtzia californica prokazatelně zpomalují procesy degradace těchto endogenních peptidů.. V rámci této studie bylo zjištěno, že extrakt z Corydalis cava má větší vliv na inhibici degradace endogenních peptidů nežli extrakt Eschschotlzia californica49.
Kromě inhibičního efektu na degradaci endogenních peptidů, byl u výše zmíněných rostlin prokázán i aditivní účinek obou bylin na udržení zvýšené hladiny katecholaminů v mozku.
Studie uvádí, že extrakt Corydalis cava spolu s extraktem z Eschscholtzia californica, inhibují oxidativní degradaci katecholaminů. Extrakt z Corydalis cava měl desetkrát větší aktivtu nežli extrakt Eschscholtzia californica. Extrakt z Eschscholtzia californica rovněž inhiboval monoaminooxidázu (MAO-B). Výsledky této studie mohou být interpretovány jako společná součinnost dvou rostlinných preparátů pro udržení a ochránění vysoké hladiny katecholaminů, což vysvětluje jejich sedativní, antidepresivní a hypnotickou aktivitu50.
Další vědecká studie byla zaměřena na zjištění biologické aktivity protopinu, respektive mechanismu jeho antiagregačního působení. Bylo zjištěno, že protopin inhibuje agregaci krevních destiček, která je fyziologicky vyvolávána působením ADP, arachidonové kyseliny,
PAF a kolagenu. Ačkoli je proces agregace krevních destiček ovlivňován hlavně trombinem, který protopinem inhibován nebyl, tak proces agregace byl zčásti potlačen. Bylo to způsobeno inhibiční aktivitou protopinu na účinky tromboxanu B2. Protopin inhiboval taktéž intracelulární uvolňování vápníku způsobeného arachidonovou kyselinou. Studií bylo tedy zjištěno, že antiagregační efekt protopinu je tedy způsobený inhibicí tromboxanu B2 a také následným snížením intracelulární koncentrace vápníku51.
3.5 Fytochemické a biologické studie dalších druhů rodu Corydalis
V literatuře je z fytochemického i biologického hlediska popsána celá řada dalších druhů z rodu Corydalis. V následující části je uvedena stručná charakteristika rostlin Corydalis yanhusuo a Corydalis solida a přehled izolovaných isochinolinových alkaloidů. Kompletní
28
přehled izolovaných látek a jejich biologických vlastností z různých druhů Corydalis by byl velmi rozsáhlý a lze ho nalézt v diplomové práci Kateřiny Salačové (2008)21.
3.5.1 Corydalis yanhusuo
Tato rostlina je velmi dobře známa v tradiční čínské medicíně, kde je používána především pro zlepšení krevního oběhu a tišení bolestí, jako jsou bolesti hlavy, hrudníku, zad atd.
Ukázala se jako účinná při léčení srdečních arytmií, žaludečních a jícnových vředů, menoralgie a má prokazatelné sedativní a hypnotické účinky52.
Obr. 5. Corydalis yanhusuo 53
V různých částech této rostliny bylo doposud identifikováno kolem 20 isochinolinových alkaloidů jak terciárního, tak kvartérního typu. Isolované alkaloidy lze rozdělit do několika strukturních typů. Pro tuto rostlinu jsou charakteristické především isochinolinové alkaloidy protoberberinového typu. Přehled hlavních alkaloidů nalezených v Corydalis yanhusuo je uveden v následující tabulce (Tab. V.)54-56.
29
Tab. V. Hlavní alkaloidy izolované z Corydalis yanhusuo
Strukrurní typ Alkaloid Vzorec Lit.
Protopinový typ protopin 53,54 O O
O O
O N
Me Protoberberinový berberin O 53,54 O
+ N MeO
OMe (-)-kanadin O 53,54 O H
N MeO
OMe (+)-korydalin OMe 53,54 OMe Me H
N MeO
OMe
30
tetrahydrokoptistin OMe 53,54 OMe H
N MeO OMe tetrahydrokolumbamin OH 53,54 OMe H
N MeO OMe palmatin OMe 53,54 OMe
+ N MeO
OMe tetrahydropalmatin OMe 53,54 OMe
N MeO OMe
31
dehydrokorydalin OMe 53,54 OMe Me
N MeO OMe
(-)-stylopin O 53,54
O
O N H O Aporfinový typ (+)-glaucin OMe 53,54 MeO
MeO
MeO N H Me
3.5.2 Corydalis solida
Rostlina Corydalis solida obsahuje (±)-tetrahydrokorysamin, (-)-stylopin, (-)-kanadin,
(±)-sinaktin, nantenin, bulbokapnin, (-)-tetrahydropalmatin, protopin, (+)-isokorydin, domesticin,
(+)-korydin, predicentrin, α-allokryptopin, (+)-isoboldin, berberin a aurotensin 57,58. Celkový obsah alkaloidů v této rostlině je velmi nízký, a to kolem 0,06%. Složením alkaloidů je Corydalis solida velmi podobná rostlině Corydalis ambigua 58.
32
Obr. 6. Corydalis solida59
33
4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST
34
4.1 Všeobecné postupy
4.1.1 Destilace, odpařování a chromatografie
Rozpouštědla byla před použitím destilována, nejprve byl zachycen předek (asi 5 %; většinou s vodným azeotropem), poté bylo vydestilováno zbylých cca 90 % rozpouštědla.
Rozpouštědla byla uchovávána v hnědých nádobách.
Odpařování chromatografických frakcí bylo prováděno na vakuové odparce při 40 ˚C za sníženého tlaku.
4.1.2.1 Tenkovrstvá chromatografie
Chromatografie na tenké vrstvě byla použita v systému normálních komor. Komory byly nasycené mobilní fází (20 minut). V případě použití malých komor (válcových), průměr
10 cm, sycení trvalo asi 30 minut. U klasických komor pak asi hodinu. Chromatografie byla prováděná vzestupně.
4.1.2.2 Sloupcová chromatografie
Sloupcová chromatografie byla prováděna systémem gradientové eluce na silikagelu
L, 0,1-0,2 mm, desaktivovaném 10 % vody. Sloupec byl plněn obvyklým způsobem – nalitím suspenze adsorbentu v rozpouštědle do sloupce. Vzorek byl po vysušení v exsikátoru nanesen na roztěru s malým množstvím silikagelu.
35
4.2 Materiál a vybavení
4.2.1 Rozpouštědla
Rozpouštědla: Benzen, p. a.
Cyklohexan, p.a.
Diethylamin, p. a.
Diethylether, p.a. bez stabilizátoru
Ethanol 95%, denaturovaný methanolem n-Hexan, p. a.
Chloroform, p. a.
Toluen, p. a.
4.2.2 Chemikálie
Chemikálie:
Dusičnan bismutitý zásaditý, p. a.
Hydroxid sodný, p. a.
Kyselina sírová 96%, p. a.
Kyselina vinná, p. a.
Vodný roztok chlorovodíku 36%, p. a.
4.2.3 Chemikálie a materiál ke stanovení účinku AChE a BuChE (IC50)
Chemikálie: 10×10-3 M acetylcholin jodid
10×10-3 M butyrylcholin jodid
5×10-3 M 5,5´-dithiobis-2-nitrobenzoová kyselina
36
DMSO použitý pro ředění vzorků
0,1 M fosfátový pufr pH 7,4 fysostigmin (eserin) galanthamin
Materiál:
Hemolyzát lidských erytrocytů, který sloužil jako zdroj acetylcholinesterasy:
plná krev byla odstředěna po dobu 15 minut při 10000 ot./min, získaná erytrocytarní
masa byla 3× promyta 0,1 M fosfátovým pufrem, pH 7,4 aby byly odstraněny zbytky
plazmy; 10% (v/v) hemolyzát byl připraven ve vodě.
Jako zdroj butyrylcholinesterasy posloužila lidská plazma
Jednorázové semimikro-polystyrenové kyvety 1,5 ml, PLASTIBRAND®
4.2.4 Chemikálie ke stanovení antioxidační a antiprotozoální aktivity
Chemikálie: 2,2´-diphenyl-1-pikrylhydrazyl radikál (DPPH)
(3-[4,5-dimethyl-thiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium-bromide)
4.2.5 Přístroje použité při stanovení biologických účinků izolovaných látek
Centrifuga typ MPW-340 (Mechanika precyzyjna, Polsko) pH metr Ф 72 METER (Beckmann, USA)
Spektrofotometr UV-1601 CE SHIMADZU
FIAlab 3000 analyser (FIAlab Instruments Inc., Bellevue, WA, USA)
USB2000-UV/VIS spektrofotometr se zdrojem světla LS-1 (Ocean Optics, USA)
SMA-Z průtoková cela (1-cm délka)
4.2.6 Detekční činidla
D 1: Dragendorffovo činidlo modifikované podle Muniera 60
37
- pro alkaloidy a ostatní sloučeniny obsahující dusík.
- roztok A: byl připraven rozpuštěním 1,7 g zásaditého dusičnanu bismutitého a 20 g kyseliny vinné v 80 ml vody.
- roztok B: byl připraven rozpuštěním 16 g jodidu draselného ve 40 ml vody.
- zásobní roztok: byl připraven smísením roztoků A a B v poměru 1:1. Ten může být uložený i několik měsíců v lednici.
- činidlo pro analýzu: bylo připravené tak, že se k roztoku 5 ml kyseliny vinné rozpuštěné v 50 ml vody přidalo 5 ml zásobního roztoku.
4.2.7 Chromatografické desky a adsorbenty
A 1: Kieselgel 60 F254, Merck, 5×10 cm
Hliníková deska s vrstvou silikagelu pro tenkovrstvou chromatografii. Silikagel 60
F254, tloušťka vrstvy 0,2 mm.
A 2: Silufol UV 254, Kavalier Votice, 20×10 cm
A 3: Silikagel L, komerčni adsorbent LACHEMA Brno pro chromatografii, zrnitost
0,2-0,4 mm
A 4: Oxid hlinitý neutrální, komerční adsorbent pro chromatografii ACRÓS, zrnitost
0,05-0,2 mm
4.2.8 Vyvíjecí soustavy pro analytickou tenkovrstvou chromatografii
S 1: Toluen+CHCl3+EtOH+Et2NH 70:20:10:3
S 2: Toluen+Et2NH 9:1
S 3: Benzen+Et2NH 9:1
4.2.9 Vyvíjecí soustavy pro preparativní tenkovrstvou chromatografii
S 4: Benzen+Et2NH 95:5
S 5: Cyklohexan+Et2NH 9:1
38
4.3 Zpracování chloroformového výtřepku B z Corydalis cava
Dodavatelem drogy byla firma Megafyt s. r. o., Vrané nad Vltavou, 04/2006, droga
(hlízy) pochází ze sběru v Chorvatsku, dodáno firmou Jugodrvo.
4.3.1 Příprava a čištění výtřepku Corydalis cava/B/CHCl3
Zpracovávaný extrakt „B-chloroform“ byl získán mimo rámec diplomové práce, stejně tak kontrolní TLC.
Příprava extraktu:
Extrakt byl připraven z 11,3 kg suchých hlíz, které byly nejprve extrahovány 95% etanolem, po běžném čištění byly nejprve odstraněny terciární baze při pH 9-10 (extrakt A- diethylether), dále terciární baze při pH 12 (extrakt B-diethylether). Inkriminovaný výtřepek
„B-chloroform“ byl připraven vytřepáním zbylého vodného extraktu; přešly do něho alkaloidy málo rozpustné v diethyletheru (80 g tmavě hnědého, velmi viskózního odparku).
Čištění výtřepku B-chloroform:
80 g odparku bylo rozpuštěno v 800 ml 1% kyseliny sírové, vyloučily se pryskyřičnaté podíly, roztok byl zfiltrován, zalkalizován na pH 12 20% NaOH a vytřepán 11×250 ml chloroformu, organické výtřepky byly spojeny, vysušeny bezvodým síranem sodným a roztok odpařen.Vzniklo 68,6 g hnědého, velmi viskózního odparku.
39
Obr. 8. Detekce výtřepků z Corydalis cava rhizoma (Kieselgel UV 254 Merck, 10 cm (dráha 8,5 cm), To+Chf+EtOH+Et2NH - 70:20:10:3, komora nasycená, vyvíjení 1×, detekce D 1) L - výtřepek éterem z kyselého roztoku alkaloidů - primárního extraktu A - vyčištěný éterový výtřepek (alkalizace 25% amoniakem, pH 9),
B-Et2O - surový výtřepek éterem (alkalizace 50% louhem, pH 12) B-Chf - surový výtřepek chloroformem (po vytřepání éterem, pH 12) J - kvartérní jodidy po vytřepání silných bazí (okyselení HCl, pH 3)
4.3.2 Sloupcová chromatografie výtřepku Corydalis cava/B/CHCl3
68,6 g výtřepku „B-chloroform“ (viz obr. 5, sloupec 4) bylo rozpuštěno v chloroformu a chromatografováno na sloupci silikagelu za účelem získání čistých alkaloidů. (Bližší popis viz tab. 3 a 4)
Tab. VIII. Sloupcová chromatografie výtřepku Corydalis cava/B/CHCl3
Označení vzorku B-Chf, „předčištěný.“ Hmotnost vzorku 68,0 g, temně hnědý, velmi viskózní Druh a množství Silikagel L, 0,2-0,4 mm, 1880 g, desaktivovaný 10 % vody adsorbentu Vrstva s extraktem 7,4×10 cm Dělicí vrstva 7,4×92 cm Frakce (ml)/doba toku 500 ml/35-40 minut
40
Tab. IX. Výsledky sloupcové chromatografie výtřepku Corydalis cava/B/CHCl3
Spoj. Frakce Eluční systém Označení Popis Hmotn. (g) fr. na TLC 1-2 1-2 Chf 1 Hnědý, s náznakem 0,15 krystalů 3-5 3-5 Chf 2 Zelenobělavý, práškovitý 1,88 (drobně kryst.) 6-8 6-8 Chf 3 Zelený, velmi viskózní 0,32 9-12 Chf 9-15 4 Hnědý, krystalický 0,87 13-15 Chf + 2 % EtOH 16-24 Chf + 2 % EtOH 16-25 5 Hnědý, velmi viskózní 1,98 25 Chf + 5 % EtOH 26-29 26-29 Chf + 5 % EtOH 6 Černý, velmi viskózní 6,74 30-33 30-33 Chf + 5 % EtOH 7 Černý, velmi viskózní 0,98 34-37 Chf + 5 % EtOH 34-53 38-51 Chf + 10 % EtOH 8 Černý, velmi viskózní 9,18 52-53 Chf + 25 % EtOH 54-58 54-58 Chf + 25 % EtOH 9 Černý, velmi viskózní 0,52 59-64 59-64 Chf + 25 % EtOH 10 Černý, velmi viskózní 4,4 66-67 Chf + 25 % EtOH 65-80 11 Černý, velmi viskózní 9,02 68-80 Chf + 50 % EtOH
Obr. 9. TLC jednotlivých frakcí z Corydalis cava/B/CHCl3 (popis viz tab. 4) (Pozn. Kieselgel UV 254 Merck, 10 cm (dráha 8,5 cm), Toluen+CHCl3+EtOH+Et2NH-70:20:10:3, komora nasycená, vyvíjení 2×, detekce D1)
41
4.3.3 Zpracování spojených frakcí 7 a 8
Spojené frakce 7 a 8 (viz tab. 4 a obr. 6) byly chromatografovány na sloupci s adsorbentem A 2.
Tab. X. Sloupcová chromatografie odparku Corydalis cava/B/7+8
Označení vzorku Corydalis cava/B/7+8 Hmotnost vzorku 10,16 g, temně černý, velmi viskózní Druh a množství Oxid hlinitý neutrální 0,1-0,2 mm, desaktivovaný 5 % vody, adsorbentu 281 g Vrstva s extraktem 6.2×3,2 cm Dělicí vrstva 54,5×3,2 cm Frakce (ml)/doba toku 100 ml/20 minut
Tab. XI. Výsledky sloupcové chromatografie výtřepku Corydalis cava/B/7+8
Spoj. fr. Frakce Eluční systém Označe Popis Hmotn. ní na (g) TLC 1-12 1-8 Benzin+70%Chf F1 Téměř 4,7 9-12 Benzin+90%Chf černý,nafouklý 13-23 13 Benzin+90%Chf F2 Černý,práškovitý 0,65 14-23 Chf
Obr. 10. Kontrolní vyvíjení F1 a F2 (F1- levá skrvna, F2- pravá skvrna) (Kieselgel UV 254 Merck, 10 cm (dráha 8,5 cm), Toluen+Et2NH-9:1, komora nasycená, vyvíjení 2×, detekce
D 1)
42
4.3.4 Čištění a separace minoritních alkaloidů z F1
Na sloupec o průměru 11 cm byl nanesen roztěr frakce F1 s 25 g Silpearlu. Sloupec byl promývan mobilní fází S 4 a posléze čistým chloroformem. Frakce F1 byla rozdělena na jednotlivé 3 podfrakce (viz. obrázek).
Tab. XII. Výsledky sloupcové chromatografie frakce F1
Hmotn. Hmotn. Složení eluentu Odparek Označeni Vzorku Adsorbe (g) ntu (g) 4.7 315 Toluen+N- 1,765g (červeno- F1-1 hexan+Et2NH=45:45:10 žlutý,olejovitý) (2000ml) 068g (hnědý,velmi F1-2 CHCl3(2000ml) viskózní) 2,58g (hnědožlutý, F1-3 velmi viskózní)
Obr. 11. TLC sloupcové chromatografieodparku F1 (soustava Benzen+Et2NH=9:1, Kieselgel UV 254 Merck, 10 cm (dráha 8,5 cm),detekce Dragendorffovým činidlem podle Muniera).
43
4.3.5 Izolace alkaloidů z podfrakce F1-3
Podfrakce F1-3 (0,8g) byla rozpuštěna v chloroformu a přefiltrována přes vrstvu (5cm,
50g) Al2O3. Vrstva AL2O3 byla promyta 150 ml chloroformu a rozpouštědlo bylo odpařeno.
Na chromatografické desky Silufol 20x10 cm, tloušťka vrstvy 0,1 mm bylo nanášeno 20mg přefiltrované podfrakce F1-3. Desky byly vyvíjeny v mobilní fázi S 4. Každá deska byla vyvinuta čtyřikrát. Pod UV lampou byly detekovány 2 zóny obsahující alkaloidy (Obr. 12.).
Zóny byly označeny a izolovány společně s adsorbentem z chromatografických desek.
Izolované látky byly vymyty z adsorbentu chloroformem a odpařeny. Byly získány dva odparky označené jako M-A (120 mg,) a M-B (160 mg). Odparek M-A byl překrystalizován z ethanolu a bylo získáno 90 mg lehce nažloutlých krystalů označených jako látka 1. Odparek
M-B byl získán ve formě lehce nažloutlé pěny a označen jako látka 2.
Obr. 12. Preparativní TLC podfrakce F1-3 (soustava Benzen+Et2NH=95:5, Silufol 10x20 cm, , (dráha 10 cm).
Izolované látky byly podrobeny studiím (MS, NMR) za účelem stanovení jejich struktury. Poté byl proveden screening biologických vlastností.
44
4.4 Určení struktury izolované látky
4.4.1 Měření hmotnostního spektra
Spektra byla měřena na LC/MS Thermo Finningan LCQDuo iontová past, ionizace elektrosprejem v kladném módu (ESI+). MS/MS spektra byla měřena při kolizní energii
40 eV.
4.4.2 Měření NMR spektra
Spektra byla měřena na spektrometru Varian Inova 500 s pracovní frekvencí
499.9 MHz pro 1H a 125.7 MHz pro 13C jádra. 13C NMR spektra byla měřena v 5mm SW
širokopásmové sondě, 1H a všechna 2D spektra v inverzní 5mm ID PFG sondě s využitím standardních pulsních sekvencí. Experimenty byly měřeny v deuterochloroformu při 25 ˚C.
Hodnoty chemických posunů jsou v ppm a jsou vztaženy k internímu standardu
(hexamethyldisilan, 0,04 ppm, v 1H spektrech) nebo signálu solventu (76,99 ppm, v 13C spektrech) (Dr. M. Kurfürst, Ph.D., Ústav chemických procesů, AV ČR, Praha).
4.5 Stanovení účinku alkaloidu na lidskou HuAChE a sérovou HuBuChE
(IC50)
Pro stanovení inhibiční aktivity látek byla použita Ellmanova spektrofotometrická metoda s použitím 5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoové kyseliny (DTNB). Jako substráty se používají estery thiocholinu, které jsou cholinesterázami štěpeny na thiocholin a příslušnou kyselinu. Stanovuje se SH- skupina thiocholinu, která se naváže na DTNB. Výsledkem je
žlutě zbarvený produkt, který se stanovuje spektrofotometricky při vlnové délce 436 nm.
Sleduje se nárůst absorbance za 1 minutu. Hodnoty IC50 byly vypočítány z naměřených hodnot poklesu aktivity acetylcholinesterasy nebo butyrylcholinesterasy nelineární regresí v programu GraphPaD Prism (verze 3.02 pro Windows; výrobce Graph PaD Software, San
45
Diego, CA, USA). Výsledky byly porovnány s hodnotami IC50 známých inhibitorů cholinesteráz: galathaminem (IC50 AChE = 6,898 μM, BuChE = 156 μM), eserinem (IC50
AChE = 2,168 μM, BuChE = 1,616 μM) a huperzinem A (IC50 AChE = 0,252 μM, BuChE
>1000 μM).
4.6 Stanovení antioxidační aktivity
Antioxidační aktivita byla testována in vitro DPPH testem. Metoda je založena na reakci stabilního 2,2´-diphenyl-1-pikrylhydrazyl (DPPH) se vzorkem. Snížení absorbance
DPPH měřené při 525 nm je závislé na koncentraci antioxidantu ve sledovaném vzorku. Byly použity FIAlab pro Windows software, FIAlab 3000 analyser (FIAlab Instruments Inc.,
Bellevue, WA, USA), 2,5-ml syringe pump, USB2000-UV/VIS spektrofotometr se zdrojem světla LS-1 (Ocean Optics, USA) a SMA-Z průtoková cela (1-cm délka). Antiradikálová aktivita vzorků byla vyjádřena jako 50% účinná koncentrace (EC50), která byla vypočítána pomocí programu GraphPad Prism 3.02, a byla porovnána se známými antioxidanty: kvercetinem EC50 = 25,3μM a troloxem EC50 = 27,8μM.
4.7 Stanovení antiprotozoální aktivity
Pro stanovení antiprotozoální aktivity byla použita spektrofotometrická metoda využívající redukci MTT barviva (3-[4,5-dimethyl-thiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) - ukazatel mitochondriální aktivity a viability prvoků Tetrahymena pyriformis, na fialově zbarvený formazan, který se stanovuje při vlnové délce 562 nm. Hodnoty EC50 byly vypočítány nelineární regresí v programu GraphPaD Prism (verze 3.02 pro Windows; výrobce
Graph PaD Software, San Diego, CA, USA) a porovnány se standardem dichromanem draselným (EC50 = 4,095 μM)
46
5 VÝSLEDKY
47
Na základě MS a NMR studií a porovnání dat s literaturou byly izolované látky identifikovány jako sinoakutin (5,6,8,14-tetradehydro-4-hydroxy-3,6-dimethoxy-17-methyl- morphinan-7-one) a sebiferin (5,6,8,14-tetradehydro-2,3,6-trimethoxy-17-methyl-morphinan-
7-one).
5.1 Strukturní studie izolované látky 1
5.1.1 Hmotnostní spektrum izolované látky 1
+ + + ESI-MS m/z 328,5 [M+H] (100). MS/MS m/z 313 [M-CH3] (10), 297 [M-OCH3] (48), 265
(100), 239 (67).
Obr. 13. MS spektrum izolované látky
48
Obr. 14. MS/MS spektrum izolované látky
49
5.1.2 NMR studie izolované látky 1
18
17 16 N
10 9 1 11 8 15 14 7 2 O 12 13 3 4 5 6
O OH O
6a 3a
Obr. 15. Sinoakutin
5.1.2.1 1H NMR spektrum izolované látky - 1
1 H NMR (CDCl3, 25°C):
1-H 6,67 d; 2-H 6,76 d; 5-H 7,54 s; 8-H 6,33 s; 9-H 3,71 d; 10´-H 3,35 d; 10-H 3,00 dd; 15´-
H 2,37 dd; 15-H 1,78 ddd; 16´-H 2,63 dd; 16-H 2,50 ddd; 18-H 2,46 s; 4a-H (OH) 6,22 s; 3a-
H (OCH3) 3,89 s; 6a-H (OCH3) 3,76 s.
50
Obr. 16. 1H-NMR spektrum sinoakutinu
5.1.2.2 13C NMR spektrum izolované látky 1
13 C NMR (CDCl3, 25°C):
1-C 119,22; 2-C 109,80; 3-C 145,60; 3a-C 56,60; 4-C 143,60; 5-C 120,66; 6-C 151,31; 6a-C
55,12; 7-C 181,54; 8-C 122,59; 9-C 61,31;10-C 33,00; 11-C 129,99; 12-C 124,20; 13-C
43,91; 14-C 161,44; 15-C 37,90; 16-C 47,28; 17a-C 44,94.
51
Obr. 17. 13C-NMR spektrum sinoakutinu
Na základě MS a NMR studií a porovnání dat s literaturou byla izolovaná látka identifikovaná jako sinoakutin (5,6,8,14-tetradehydro-4-hydroxy-3,6-dimethoxy-17-methyl- morphinan-7-one)61.
5.2 Strukturní studie izolované látky 2
5.2.1 Hmotnostní spektrum izolované látky 2
+ + ESI-MS m/z 342.25 [M+H] (100). MS/MS m/z 311 [M-OCH3] (75), 285 (92), 279 (65), 191
(100).
52
Obr. 18. MS spektrum izolované látky
Obr. 19. MS/MS spektrum izolované látky
53
5.2.2 NMR studie izolované látky - 2
18
17 16 N
10 9 2a 1 11 8 15 14 7 2 O O 12 13 3 4 5 6
3a O O
6a
Obr. 20. Sebiferin
5.2.2.1 1H NMR spektrum izolované látky 2
1 H NMR (CDCl3, 25°C):
1 3 1 3 1.67 dt ( JH=12.6 Hz, JH-16=2.4 Hz), 1H, H-15’; 1.95 ddd ( JH=12.6 Hz, JH-16=12.8 Hz,
3 JH-16’=5.8 Hz), 1H, H-15; 2.46 s, 3H, H-18; 2.57 m, 1H, H-16’; 2.59 m, 1H, H-16;
1 3 1 3.04 dd ( JH=17.7 Hz, JH=6.0 Hz), 1H, H-10’; 3.35 d ( JH=17.7 Hz), 1H, H-10; 3.71 d
3 ( JH=6.0Hz), 1H, H-9; 3.80 s, 3H, H-6a; 3.86 s, 3H, H-2a; 3.88 s, 3H, H-3a; 6.33 s, 1H, H-8;
6.35 s, 1H, H-5; 6.63 s, 1H, H-1; 6.81 s, 1H, H-4;
54
Obr. 21. 1H-NMR spektrum sebiferinu
5.2.2.2 13C NMR spektrum izolované látky 2
13 C NMR (CDCl3, 25°C):
32.93, C-10; 41.39, C-15; 44.96, C-18; 42.51, C-13; 45.93, C-16; 55.34, C-6a; 56.13, C-2a;
56.55, C-3a; 61.12, C-9; 108.90, C-4; 110.68, C-1; 119.03, C-5; 122.47, C-8; 129.02, C-11;
130.27, C-12; 148.27, C-3; 148.61, C-2; 151.66, C-6; 161.90, C-14; 181.15, C-7;
55
Obr. 22. 13C-NMR spektrum sebiferinu
Na základě MS a NMR studií a porovnání dat s literaturou byla izolovaná látka identifikovaná jako sebiferin (5,6,8,14-tetradehydro-2,3,6-trimethoxy-17-methyl-morphinan-
7-one)62.
56
5.3 Antioxidační aktivita alkaloidů
Pro sebiferin byla stanovena antioxidační aktivita EC50 > 10 mM (EC50 = 12,78 mM).
Pro sinoakutin byla stanovena antioxidační aktivita EC50 = 0,209 mM.
5.4 Inhibiční aktivita vůči AChE a BuChE
Pro sebiferin byla stanovena inhibiční aktivita vůči AChE a vůči BuChE AChE IC50
> 1 mM a vůči BuChE IC50 > 1 mM.
Pro sinoakutin byla stanovena inhibiční aktivita vůči AChE IC50 > 1 mM a vůči BuChE IC50
> 1 mM.
5.5 Antiprotozoální aktivita alkaloidů
Pro sebiferin byla stanovena antiprotozoální aktivita IC50 71,1 μM.
Experimenty stanovení antiprotozoální aktivity jsou poměrně časově náročné a experiment pro stanovení antiprotozoální aktivity sinoakutinu je ve fázi měření.
57
6 DISKUZE
58
Látky frakce F1-3, izolované z Corydalis cava, byly na základě MS, NMR studií a porovnání dat s literaturou, identifikovány jako sinoakutin (5,6,8,14-tetradehydro-4-hydroxy-
3,6-dimethoxy-17-methyl-morphinan-7-one) a sebiferin (5,6,8,14-tetradehydro-2,3,6- trimethoxy-17-methyl-morphinan-7-one). Jedná se o isochinolinové alkaloidy, které již byly v minulosti popsány a identifikovány v této rostlině. Jelikož u těchto alkaloidů nebylo provedeno testování jejich inhibičních aktivit vůči cholinesterázám, byly tyto látky podrobeny naší studii.
Pro stanovení inhibiční aktivity látek byla použita Ellmanova spektrofotometrická metoda s použitím 5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoové kyseliny (DTNB). Výsledky byly porovnány s hodnotami IC50 známých inhibitorů cholinesteráz: galathaminem, eserinem a huperzinem. Tato měření probíhala na acetylcholinesteráze a butyrylcholinesteráze humánního původu a díky této skutečnosti jsou získané výsledky daleko signifikantnější a směrodatnější, nežli výsledky získávané na nehumánních modelech.
Získané hodnoty IC50 pro inhibici humánní erytrocytární acetylcholinesterázy a humánní sérové butyrylcholinesterázy pro sinoakutin jsou AChE IC50 > 1 mM, BuChE IC50 >
1 mM a pro sebiferin AChE IC50 > 1 mM, BuChE IC50 > 1 mM. Zvýsledků je patrné, že izolované látky neovlivňují zmíněné cholinesterázy. Z tohoto důvodu nejsou využitelné jako potenciální inhibitory cholinesteráz. Jelikož v patogenezi Alzheimerovy choroby hraje určitou roli i vliv volných kyslíkových radikálů, byly u izolovaných látek stanoveny i hodnoty antioxidačních aktivit. Pro sebiferin byla stanovena antioxidační aktivita EC50 > 10 mM (EC50
= 12,78 mM). Pro sinoakutin byla stanovena antioxidační aktivita EC50 = 0,209 mM. Z těchto výsledků je znatelné, že se látky nevyznačují významnou antioxidační aktivitou. Z důvodu neznalosti toxicity těchto látek byly provedeny i testy na antiprotozoální aktivitu. Pro sebiferin byla stanovena antiprotozoální aktivita IC50 71,1 μM. Antiprotozoální aktivita sinoakutinu je stále ve fázi měření.
59
7 LITERATURA
60
1. Tang, W., Eisenbrand, G.: Chinese Drugs of plant origin, Springer-Verlag Berlin
Heidelberg New York, Berlin 1992.
2. Huang, K. Ch.: The pharmacology of Chinese herbs, Second edition, CRC Press Boca
Raton London New York Washington D.C., 1999.
3. Crozier, A., Clifford, M. N., Ashihara, H.: Plant secondary metabolites, Blackwell
Publishing Ltd, 2006.
4. Preininger, V. Chemotaxonomy of the Papaveraceae alkaloids. Chem. Biol. Isoquinoline
Alkaloids, 23-37, 1970.
5. Wildman, W.C. Amaryllidaceae alkaloids. Chem. Alkaloids, 151-171, 1970.
6. Bentley, K. W. β-Phenethylamines and the isoquinoline alkaloids. Nat. Prod. Rep., 21,
395-424, 2004.
7. Greig, N. H., Lahiri, D. K. and Sambamurti, K. Butyrylcholinesterase: an important new
target in Alzheimer´s disease therapy. Int. Psychoger., 14, 77-91 (2002).
8. Berkov, S., Bastida, J., Nikolova, M., Viladomat, F.and Codina, C. Rapid TLC/GC-MS
identification of acetylcholinesterase inhibitors in alkaloid extracts. Phytochem. Anal., 19,
411-419 (2008).
9. Hostettmann, K., Borloz, A., Urbain, A. and Marston, A. Natural product inhibitors of
acetylcholinesterase. Curr. Org. Chem., 10, 825-847 (2006).
10. Kiryakov, K., Daskalova, E., Georgieva, A., Kuzmanov B. and Evstatieva, L. Alkaloids
from Corydalis solida (L.) Schwarz. Fol. Med., 24 (4), 19-22, 1982.
11.Ding, B., Zhou, T., Fan, G., Hong, Z., and Wu, Y. Qualitative and quantitative
determinativ of ten alkaloids in traditional Chinese medicine Corydalis yanhusuo W.T.
Wang by LC-MS/MS and LC-DAD. J. Pharm. Biomed. Anal., 45, 219-226, 2007.
12. Průša, J.: Biologická aktivita obsahových látek rostlin X. Alkaloidy Corydalis cava Schweigg & Körte (Fumariaceae) a jejich účinek na acetylcholinesterasu. UK v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Hr. Králové 2009, 52 s. 13. Sturm, S., Seger, Ch., Stuppner, H. Analysis of central european Corydalis species by
nonaqueous capillary electrophoresis -electrospray ion trap mass spectrometry. J. Chrom.
A, 1159, 42-50, 2007.
61
14. Berkov, S., Bastida, J., Nikolovova, M., Viladomat, F., Codina, C. Rapid TLC/GC-MS
identification of acetylcholinesterase inhibitors in alkaloid extracts. Phytochem. Anal,. 19,
411-419, 2008.
15. Marston, A., Kissling, J., Hostettmann, K., A rapid TLC bioautographic method for the
detection of Acetylcholinesterase and Butyrylcholinesterase inhibitors in plants.
Phytochem. Anal., 13, 51-54, 2002.
16. Adsersen, A., Kjoelbye, A., Dall, Ole., Jaeger, A.-K. Acetylcholinesterase and
butyrylcholinesterase inhibitory compounds from Corydalis cava Schweigg. & Körte.
J.Ethnopharm., 113(1), 179-182, 2007.
17. Slavík, J., Slavíková, L. Alkaloids of the Papaveraceae. LXVII. Alkaloids from Corydalis
cava (L.) Schweigg & Köerte. Coll. Czech.Chem. Comm., 44(7), 2261-2274, 1979.
18. Jha, R.N., Pandey, M.B., Singh, A.K., Singh, S., Singh, V.P. New alkaloids from
Corydalis species. Nat.Prod.Res., 23(3), 250-255, 2009.
19. Wu, Y-R., Zhao, Y-X., Liu, Y-Q., Zhou, J. Isoquinoline alkaloids from Corydalis
taliensis. Z. Natuturforsch. B, 62(9), 1199-1202, 2007.
20. Li, H-L., Zhang, W-D., Han, T., Zhang, Ch., Liu, R-H., Chen, H-S.
Tetrahydroprotoberberine alkaloids from Corydalis saxicola. Chem. Nat. Comp., 43(2),
173-175, 2007.
21. Salačová, K.: Biologická aktivita obsahových látek rostlin XII. Alkaloidy rodu Corydalis
DC. (Fumariaceae) a jejich biologické účinky. UK v Praze, Farmaceutická fakulta
v Hradci Králové, Hr. Králové 2009, 80 s.
22. http://botany.cz/cs/corydalis-cava/, vystaveno 3. 2. 2009
23. http://www.biolib.cz/cz/taxonimage/id15565/?taxonid=3475, vystaveno 3. 2. 2009.
24. http://en.wikipedia.org/wiki/Corydalis, vystaveno 3. 2. 2009.
25. http://rostliny.prirodou.cz/?rostlina=corydalis_cava, vystaveno 3. 2. 2009.
26. http://www.biolib.cz/cz/taxonimage/id19687/?taxonid=3475, vystaveno 3. 2. 2009.
27. Hejný S., Slavík B.: Květena ČSR – 1. Díl, Academia Praha: 497 (1988).
28. Tutin, T. G. et al., eds.: Flora europaea, second edition. (F Eur ed2) 1993.
62
29. http://www.lokality-rostlin.cz/?rostlina=corydalis_cava, vystaveno 3. 2. 2009.
30. HagerROM 2006 − © Springer Medizin Verlag Heidelberg, 2006, Page 1-3.
31. Preininger, V.; Thakur, R. S.; Šantavý, F. Isolation and chemistry of alkaloids from plants
of the family Papaveraceae. LXVII: Corydalis cava (L.) Sch. & K. (C. tuberosa DC). J.
Pharm. Sci., 65(2), 294-296,1976.
32. Slavík, J., Slavíková, L. Alkaloide der Mohngewächse (Papaveraceae) XXXIII. Über die
Alkaloide von drei Arten der Gattung Escholtzia und über die Konstitution des neuen
Alkaloids Escholamin. Coll. Czech.Chem. Comm., 31, 3362-3371, 1966.
33. Slavík, J., Slavíková, L. On alkaloids from the aerial parts of three Escholtzia species.
Coll. Czech.Chem. Comm., 51, 1743-1751, 1986.
34. Ribar, B.: Molecular Structure of Alkaloids Isolated from Corydalis Plants, Bulletin T.
CXXIV de l’Academie serbe des sciences et des arts, Sci. Nat., 40, 95-106, 2003.
35. Kiryakov, H. G., Iskrenova, E. S.: Minor Alkaloids of Corydalis bulbosa, Planta Med.,
50(2), 136-8, 1984.
36. Pydychová, E.: Alzheimerova nemoc. Solutio 2002/2003, 21-28, 2002. 37. Greig, N.-H., Yu, Q.,Brossi, A.,Martin, E., Lahiri, D.-K.,Darvesh, S. :Byutyryl cholinesterase, the Cinderella cholinesterase, as a target for Alzheimer´s disease and related dementias. Med. Chem. Alz. Dis. 79-109, 2008. 38. Stepankova, S., Komers, K., Cholinesterases and cholinesterase inhibitors. Curr. Enzym. Inhib., 4(4), 160-171, 2008. 39. Keowkase, R., Luo, Y., Mechanism of CNS drugs and their combinatons for Alzheimer´s disease.Cen. Nerv. Syst. Ag. Med. Chem., 8(4), 241-248, 2008. 40. Doležal, J.: Biologická aktivita obsahových látek rostlin VIII. Vliv alkaloidů z různých
rostlinných taxonů na acetylcholinesterázu, Diplomová práce, UK v Praze, Farmaceutická
fakulta v Hr. Králové, Hr. Králové 2008, 65 s.
41. Taylor, P.: Anticholinergic agents, v knize: The Pharmacological Basis of Therapeutics
(J.G. Hardman & L.E. Limbird, eds), McGraw Hill, New York 1996.
42. Lullmann, H., Mohr, K., Wehling, M.: Farmakologie und Toxikologie, Georg Thieme
Verlag, Stuttgart 1999.
63
43. Lushington, G. H., Jian-Xin, G., Hurley, M. M.: Acetylcholinesterase – Molecular
modeling with the whole toolkit. Curr. Top. Med. Chem., 6(1), 57 – 63, 2006.
44. Binder, J., Kuča, K., Jun, D., Opletalová, V.: Studium inhibitorů acetylcholinesterasy.
Chem. Listy, 102(S), 2008.
45. Hung, T. M., Na, M., Dat, Ngoc, T. M., Youn, U., Kim, H. J., Min, B., Lee, J., Bae, K.:
Cholinesterase inhibitory and anti-amnesic activity of alkaloids from Corydalis
turtschaninovi. J. Ethnopham., 119, 74-80, 2008.
46. Kim, K. K., Lee, K. T., Baek, N., Kim, S., Park, H. W., Lim, J. P., Shin, T. Y., Eom, D.
O., Yang, J. H., Eun, J. S.: Acetylcholinesterase inhibitors from the aerial parts of
Corydalis speciosa. Arch. Pharm. Res., 11, 1127-1131, 2004.
47. Kim, D. K.: Inhibitory effect of corynoline isolated from the aerial parts of Corydalis
incisa on the acetylcholinesterase. Arch. Pharm. Res., 25 (6), 817-9, 2002.
48. Halbsguth, Ch., Meissner, O., Haberlein, H.: Positive cooperation of protoberberine type 2
alkaloids from Corydalis cava on the GABAA binding site. Planta Med., 69(4), 305 – 309,
2003.
49. Reimeier, C., Schneider, I., Schneider, W., Schafer, H.L., Elstner, E.F.: Effects of
ethanolic extracts from Eschscholtzia californica and Corydalis cava on dimerization and
oxidation of enkephalins. Arzneimittelforschung, 45(2),132 – 6, 1995.
50. Kleber, E., Schneider, W., Schafer, H.L., Elstner, E.F.: Modulation of key reactions of the
catecholamine metabolism by extracts from Eschscholtzia californica and Corydalis cava.
Arzneimittelforschung, 45(2), 127 – 131, 1995.
51. Ko, F.N., Wu, T.S., Lu, S.T., Wu, Y.C., Huang, T.F., Teng, C.M.: Antiplatelet effects of
protopine isolated from Corydalis tubers. Tromb. Res., 56(2), 289 – 298, 1989.
52. Zhong-ze, M., Wei, X., Niels, H.-J., Bryan, L.-R., Lee-yuan, L.-Ch., David, Y.-W.-L. : Isoquinoline alkaloids isolated from Corydalis yanhusuo and their binding affinities at the
dopamine D1 receptor. Molecules, 13, 2303-2312, 2008. 53. http://www.globalherbalsupplies.com/herb_information/images/Corydalis.jpg, vystaveno 10.10.2009
64
54. Shengquiang, T., Jizhong, Y., :Preparative isolation and purification of alkaloids from
Corydalis yanhusuo W.T.Wang by high speed counter-current chromatogramy. J. Liq.
Chrom. & Rel. Tech., 28, 2979-2989, 2005.¨
55. Ding, B., Zhou, T., Fan, G., Hong, Z., Wu, Y.: Qualitative and quantitative determination
of ten alkaloids in traditional Chinese medicine Corydalis yanhusuo W.T. Wang by LC-
MS/MS and LC-DAD. J Pharm. Biomed. Anal., 45, 219-226, 2007.
56. Zhang, J., Jin, Y., Liu., Y., Xiao, Y., Feng, J., Xue, X., Zhang, X., Liang, X., :Purification
of alkaloids from Corydalis yanhusuo W. T. Wang using preparative 2-D HPLC. J. Sep.
Sci., 32(9), 1401-1406, 2009.
57. Kiryakov, K., Daskalova, E., Georgieva, A., Kuzmanov, B., Evstatieva, L., :Alkaloids
from Corydalis solida (L.) Schwarz. Fol. Med., 24(4), 19-22, 1982.
58. Manske, R.-H.-F., The alkaloids of fumariaceous plants. LI. Corydalis solida. Can. J.
Chem., 34, 1-3, 1956.
59. http://magnar.aspaker.no/corydalis_solida.htm, vystaveno 9.12.2010
60. Stahl, E.: Thin-layer Chromatography, A Laboratory Handbook; Springer Verlag Berlin,
Heidelberg, New York, 1969.
61. Hussain, S. F., Siddiqui, M. T., Alkaloidal constituents of Corydalis stewartii. Planta
Med., 58, 108, 1992.
62. Bartley, J. B., Baker, L. T., Carvalho, Ch. F., Alkaloids of Stephania bancroftii.
Phytochem., 36, 1327-1331, 1994.
65
8 SEZNAM ZKRATEK
66
ACh Acetylcholin
AChE Acetylcholinesteráza
ADP Adenosindifosfát
BMC Bikukulin methylchlorid
BuChE Butyrylcholinesteráza
CNS Centrální nervový systém
DTNB kyselina 5,5´-dithiobis-2-nitrobenzoová
GABA Kyselina γ-aminomáselná
IČ Infračervená spektroskopie
MAO Monoaminooxidáza
MS Hmotnostní spektrometrie
NMR Nukleární magnetická rezonance
PAF Destičky aktivující faktor
TLC Tenkovrstevná chromatografie
67
ABSTRAKT
Průša, J.: Biologicky aktivní metabolity rostlin II. Alkaloidy Corydalis cava (L.) Shweigg. &
Körte (Fumariaceae) a screening jejich biologických vlastností. Rigorózní práce, Univerzita
Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta v Hradci Králové, Katedra farmaceutické botaniky a ekologie, Hradec Králové 2010, 69 s.
V rámci screeningu rostlin s obsahem alkaloidů, které inhibují aktivitu lidské erytrocytární acetylcholinesterázy a lidské sérové butyrylcholinesterázy byla studiu podrobena dymnivka dutá (Corydalis cava Schweigg. & Körte, Fumariaceae). Tato práce navazuje na vlastní diplomovou práci (2009).
Cílem práce bylo zpracování podfrakce F1-3 získáné v rámci diplomové práce. Z této směsi byly pomocí preparativní tenkovrstvé chromatografie izolovány dvě látky ve formě volných bází. Na základě MS a NMR studií a porovnání dat s literaturou byly izolované látky identifikovány jako sinoakutin a sebiferin
Byla stanovena inhibiční aktivita sinoakutinu vůči lidské erytrocytární acetylcholinesteráze (IC50 > 1 mM) a lidské sérové butyrylcholinesteráze BuChE (IC50 > 1 mM). Pro sebiferin byla stanovena inhibiční aktivita vůči AChE - IC50 > 1 mM a vůči BuChE
- IC50 > 1 mM. V porovnání s biologickou aktivitou standardních alkaloidních inhibitorů acetylcholinesterázy a butyrylcholinesterázy (galantaminu a eserinu) se jedná o látku, která je nezajímavá z hlediska dalšího možného využití jako inhibitoru cholinesteráz. Jelikož v patogenezi Alzheimerovy choroby hraje významnou roli i vliv volných kyslíkatých radikálů byly u izolovaných látek stanoveny také její antioxidační aktivity. Pro sebiferin byla stanovena antioxidační aktivita EC50 > 10 mM (EC50 = 12,78 mM a pro sinoakutin byla stanovena antioxidační aktivita EC50 = 0,209 mM. Pro sebiferin byla taktéž stanovena antiprotozoální aktivita IC50 71,1 μM.
Klíčová slova: Alzheimerova choroba, alkaloidy, Corydalis cava, acetylcholinesteráza, butyrylcholinesteráza, antioxidační aktivita, antiprotozoální aktivita
68
ABSTRACT
Průša, J.: Biological Active Plant Metabolites II. Alkaloids of Corydalis cava (L.) Schweigg.
& Körte (Fumariaceae) and Screening of Their Biological Properties. Rigorous Thesis,
Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy in Hradec Králové, Department of Pharmaceutical Botany and Ecology, Hradec Králové 2010, 69 p.
Within the screening of plants that contains alkaloids inhibiting the activity of the human erythtocytic acetylcholinesterase and human serum butyrylcholinesterase Corydalis cava (L.) Schweigg. & Körte (Fumariaceae) was studied. This work connect to my diploma thesis (2009).
The task was to separate mixture of alkaloids from extract „B-chloroform“ subfraction
F1-3. This subfraction was prepared within the frame of diploma thesis. From this mixture, using preparative TLC, were isolated two compounds in the form of free bases. On the basis of MS, NMR and comparing data in literature these two substances were identified as sinoacutine and sebiferine.
The isolated compounds inhibited the human erythrocyte acetylcholinesterase and human blood serum butyrylcholinesterase with IC50 for AChE sinoacutine > 1 mM and sebiferine > 1 mM and with IC50 for BuChE sinoacutine> 1 mM and sebiferine > 1 mM.
These compounds showed no inhibition aktivity to AChE and BuChE for the development of potencial drugs against the Alzheimer´s disease. In the patology of Alzheimer disease an important role play free radicals. On this account we determined also antioxidative activity of isolated alkaloids. The radical scavenging activity of sebiferine was EC50 > 10 mM (EC50 =
12,78 mM) and of sinoacutine was EC50 = 0,209 mM. Sebiferine was also tested on antiprotozoal activity (IC50 71,1 μM).
Keywords: Alzheimer disease, alkaloids, Corydalis cava, acetylcholinesterase, butyrylcholinesterase, antioxidative activity, antiprotozoal activity.
69