UNIVERSITÉ DE SHERBROOKE Faculté De Génie Département De Génie Chimique Et Génie Biotechnologique

UNIVERSITÉ DE SHERBROOKE Faculté de génie Département de génie chimique et génie biotechnologique

UTILISATION DU LACTOSÉRUM DANS UN PROCÉDÉ DE CULTURE DE MICROALGUES MIXOTROPHES POUR LA PRODUCTION DE BIODIESEL

Thèse de doctorat Spécialité : génie biotechnologique

Jean-Michel Bergeron Girard

Jury : Michèle Heitz (directrice) Jean-Sébastien Deschênes (co-directeur) Réjean Tremblay (co-directeur) Nathalie Faucheux (co-directrice) J. Peter Jones (rapporteur) Isabelle Marcotte (évaluatrice externe) Joël Sirois (évaluateur interne)

Sherbrooke (Québec) Canada Septembre 2014

À ma mère, à mon père, à ma sœur et à Maud qui cultivent avec moi la légèreté du quotidien

RÉSUMÉ

L‘objectif général du présent travail est la conception et le développement d‘un procédé original de culture de microalgues pour la production à grande échelle d‘huiles végétales à faible coût pour le marché du biodiesel. Une procédure multicritères de sélection de souches a d‘abord été mise au point afin d‘identifier la souche la plus susceptible de répondre favorablement aux paramètres du procédé préalablement déterminés. Cette procédure permet d‘inclure un grand nombre de critères et de considérer l‘importance relative de chacun de ces critères dans le pointage final accordé aux souches présélectionnées. Elle peut aussi être transposée à d‘autres contextes techniques et géographiques pour la sélection de souches destinées à diverses applications commerciales. Par la suite, l‘évaluation de la croissance et de la productivité lipidique de la souche sélectionnée a été effectuée au laboratoire, en mode nutritionnel mixotrophe, en présence d‘un important coproduit de l‘industrie laitière : le perméat de lactosérum. Le profil lipidique de la souche privilégiée, ainsi que sa capacité à hydrolyser le lactose, mise au jour pour la première fois, ont permis de démontrer le potentiel du procédé. Une méthode de suivi de consommation et d‘hydrolyse du lactose contenu dans le perméat de lactosérum a été développée par l‘intermédiaire de la technologie « spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier » couplée à une sonde externe avec « prisme à réflectance totale atténuée » (FT-IR/ATR) ainsi que la conception de modèles univariés et multivariés de type « régression des moindres carrés partiels (PLS) ». Ce type de modèle est plus précis que ceux déjà existants pour le suivi des sucres dissous par la méthode infrarouge car l'utilisation de régressions PLS permet de tenir compte du phénomène d‘additivité des spectres lorsque différents analytes pouvant absorber dans une même région du spectre sont présents dans la solution. De plus la méthode développée permet d‘envisager un suivi in situ de la consommation des sucres dans une culture de microorganismes à l‘échelle industrielle. La méthode des surfaces de réponse (RSM) a ensuite été utilisée afin d‘optimiser les conditions de pH et de densité de biomasse permettant de provoquer une accumulation de lipides à l‘intérieur de cultures de microalgues carencées en azote. Des modèles prédictifs ont été construits pour trois souches différentes et ce en modes nutritifs photoautotrophe et hétérotrophe. Ces travaux ont permis de démontrer l‘existence d‘une interaction entre ces deux facteurs. De plus, certaines différences spécifiques ont pu être mises en évidence en comparant les réponses entre les souches. À la lumière des résultats obtenus, certains paramètres d‘optimisation devront être considérés dans le cadre d‘un procédé de production de biomasse microalgale oléagineuse en deux phases; la première phase permettant d‘obtenir une productivité en biomasse maximale par une stratégie d‘augmentation du taux d‘hydrolyse du lactose; la seconde phase permettant une accumulation de lipides grâce à l‘imposition de conditions environnementales spécifiques. L‘augmentation des connaissances disponibles sur les microalgues ainsi que l‘amélioration et la standardisation des techniques de génie génétique nous permettront d‘aborder ces problématiques d‘un point de vue différent dans le futur.

Mots-clés : Microalgue, lipides, biodiesel, lactosérum, mixotrophie

i ii

REMERCIEMENTS

Je tiens à remercier mes directeurs et directrices de recherche pour ce projet : Jean-Sébastien Deschênes, Réjean Tremblay, Michèle Heitz et Nathalie Faucheux. Les autres personnes qui ont cordialement accepté de s‘impliquer : Jonathan Gagnon, Claude Belzile, Iften Redjah, Jean-Bruno Nadalini, Bertrand Genard, Pierre St-Onge, Alexandre Boudreau, Thomas Poirier- Audet, Mhammed Ben Hafsa, Alain Caron, Andréane Tétrault et Marie-Laine Roy. Le Fond Québécois de Recherche sur la Nature et les Technologies (FQRNT) pour le financement initial du projet, Ressources Aquatiques Québec (RAQ) et le Conseil de Recherche en Sciences Naturelles et en Génie (CRSNG) pour l‘aide financière fournie par l‘intermédiaire du programme de formation orientée vers la nouveauté, la collaboration et l'expérience en recherche (FONCER). Je tiens aussi à remercier tous les membres de ma famille, mes amis et Maud pour le soutien indéfectible tout au long de cette belle aventure.

TABLE DES MATIÈRES

RÉSUMÉ ...... i REMERCIEMENTS ...... ii TABLE DES MATIÈRES ...... iii LISTE DES FIGURES ...... vi LISTE DES TABLEAUX ...... ix LISTE DES ACRONYMES ET ABRÉVIATIONS ...... xi CHAPITRE 1 Introduction ...... 1 1.1 Mise en contexte et problématique ...... 1 1.2 Définition du projet de recherche ...... 3 1.3 Objectifs du projet de recherche ...... 4 1.4 Contributions originales ...... 4 1.5 Plan du document ...... 6 CHAPITRE 2 État de l‘art ...... 9 2.1 Sélection et amélioration de souches de microalgues ...... 9 2.1.1 Sélection sur plusieurs générations...... 10 2.1.2 Modification génétique ...... 10 2.1.3 Biologie synthétique ...... 11 2.2 Systèmes de production de microalgues ...... 11 2.2.1 PBRs tubulaires ...... 13 2.2.2 PBRs colonnes ...... 14 2.2.3 PBRs panneaux plats ...... 15 2.2.4 Autres modèles de PBRs ...... 15 2.3 Modes de nutrition ...... 17 2.3.1 Photoautotrophie ...... 17 2.3.2 Hétérotrophie ...... 17 2.3.3 Mixotrophie ...... 19 2.4 Bioraffinage ...... 20 2.4.1 Lipides ...... 20 2.4.2 Protéines ...... 26 iii iv

2.4.3 Hydrates de carbone ...... 26 2.4.4 Applications commerciales de la biomasse microalgale entière ...... 26 2.5 Biocarburants de troisième génération ...... 28 2.5.1 Bioéthanol et biométhane ...... 28 2.5.2 Biodiesel ...... 28 2.5.3 Propriétés du biodiesel ...... 29 2.6 Valorisation du lactosérum ...... 32 2.6.1 Utilisation du lactose par les microalgues ...... 33 CHAPITRE 3 Une approche multicritères de sélection de souches de microalgues pour la production de biodiesel et autres applications commerciales ...... 35 Avant-propos ...... 35 3.1 Introduction ...... 39 3.2 Materiel and methods ...... 41 3.3 Results and discussion ...... 43 3.4 Conclusion ...... 60 CHAPITRE 4 Culture mixotrophe de l‘algue verte Scenedesmus obliquus en présence de perméat de lactosérum pour la production de biodiesel ...... 61 Avant-propos ...... 61 4.1 Introduction ...... 65 4.2 Materiel and methods ...... 67 4.3 Results and discussion ...... 72 4.4 Conclusion ...... 84 CHAPITRE 5 Modèles d'étalonnage FT-IR/ATR univarié et multivarié pour le suivi in situ des sucres dans un milieu complexe de culture de microalgues ...... 85 Avant-propos ...... 85 5.1 Introduction ...... 89 5.2 Materials and methods ...... 90 5.3 Results and discussion ...... 94 5.4 Conclusion ...... 101 CHAPITRE 6 Optimisation de l‘accumulation de lipides neutres chez trois espèces de microalgues par la méthode des surfaces de réponse ...... 102

Avant-propos ...... 102 6.1 Introduction ...... 106 6.2 Materiel and methods ...... 107 6.3 Results and discussion ...... 109 6.4 Conclusion ...... 120 CHAPITRE 7 Commensalisme dirigé entre Scenedesmus obliquus et Chlorella protothecoïdes : vers la viabilité économique d'un procédé de culture de microalgues mixo/hétérotrophes pour le biodiesel ...... 122 Avant-propos ...... 122 7.1 Introduction ...... 126 7.2 Material and methods ...... 127 7.3 Results and discussion ...... 131 7.4 Conclusion ...... 137 CHAPITRE 8 Conclusion et perspectives ...... 138 LISTE DES RÉFÉRENCES ...... 150 Annexe A ...... 170 Annexe B ...... 182

v vi

LISTE DES FIGURES

Figure 2.1 PBRs tubulaires...... 13 Figure 2.2 PBRs colonnes...... 14 Figure 2.3 PBR panneau plat...... 15 Figure 2.4 A. PBRs sacs verticaux. B. Concept de bio-façade...... 16 Figure 2.5 Paliers de détermination du profil lipidique d‘un extrait lipidique total et exemples de méthodes analytiques de fractionnement...... 22 Figure 2.6 Représentation chimique de la réaction de transestérification ...... 29 Figure 2.7 Structure moléculaire du lactose...... 33

Figure 3.1 Triangular graph showing the proportions (%) of saturated (SFA), monounsaturated (MUFA) and polyunsaturated (PUFA) fatty acids in the total lipid pool of the 10 preselected strains...... 47 Figure 3.2 Triangular graph showing the proportions (%) of lipids, proteins and carbohydrates in the biomass of 7 of the 10 preselected strains after nitrogen starvation...... 49

Figure 4.1 S. obliquus, S. acutus and C. vulgaris cultured in Bold‘s basal medium (BBM), and C. protothecoides cultured in BBM + 1 g L-1 soy protein peptone (BBMP), were supplemented with 5 g L-1 pure lactose under strict heterotrophic conditions (absence of light). Results are presented in cell concentration (x 106) per mL and expressed as the mean±SD (n=3)...... 73 Figure 4.2 (A.) Absorbance at 750 nm and dry weight (DW) of S. obliquus cultures grown in photoautotrophy, mixotrophy or heterotrophy. For mixotrophic and heterotrophic conditions, 40% (v/v) of the Bold‘s basal medium (BBM) was substituted by cheese whey permeate (WP). Results are expressed as the mean±SD (n=3). (B.) Correlation between absorbance at 750 nm and dry weight for cultures ≤ 2 g L-1 or > 2 g L-1. Results are expressed as the mean±SD (n=3)...... 75 Figure 4.3 Lactose, galactose, glucose (A.) and nitrogen (B.) concentrations in S. obliquus cultures grown under mixotrophic or heterotrophic conditions with 40% (v/v) cheese whey permeate (WP) substitution of the culture medium (BBM). Results are expressed as the mean±SD (n=3)...... 78

Figure 4.4 Linear regression relating log neutral lipid (NL) cellular content in mg g-1 DW with log absorbance of cultures g-1 DW at 540 nm (A.), 680 nm (B.), 750 nm (C.) and 680 nm – 750 nm (D.)...... 84

Figure 5.1 Calibration curves of aqueous solutions made from pure lactose, glucose and galactose in the concentration range 5 – 70 g L-1...... 94 Figure 5.2 Mid-infrared absorbance spectra (A) and sugar concentration in the culture media over 7 days (univariate model estimation from spectra acquired in presence (before centrifuge) or in absence (after centrifuge) of the cells) as well as total dissolved solids content and biomass density as measured gravimetrically (B)...... 95 Figure 5.3 Gas chromatogram (A) and proportions of each sugar present in the complex culture medium (B) from days 0 to 13 as measured by the reference procedure (GC-MS)...... 97

Figure 6.1 3D response-surface graphs of the six RSM experiments showing the interactive effect of pH and biomass density on mean cell fluorescence (FL2 mean) for Scenedesmus obliquus (SO), Ankistrodesmus convolutus (AC) and Chlorella protothecoides (CP)...... 116 Figure 6.2 Photoautotrophic (A20) and heterotrophic (H20) cultures of C. protothecoides at the end of the RSM experiments...... 118 Figure 6.3 Nile red coloration of the three mixotrophic strains after the lipid accumulation stage ...... 119

Figure 7.1 Experimental design of the H2O2/catalase and co-culture experiments...... 129 Figure 7.2 Experimental design of the sequential culture experiments...... 130

Figure 7.3 Absorbance at 750 nm of S. obliquus cultures after H2O2/catalase (cat.) treatment vs non-contaminated control cultures. Results are expressed as the mean±SD (n=3). Different letters indicate significant difference (p ˂ 0.001)...... 132 Figure 7.4 Proportion (%) of lactose, glucose and galactose present in the culture medium of S. obliquus cultivated alone (A) or in co-culture with C. protothecoides (B). Results are expressed as the mean±SD (n=3). Different letters indicate significant difference in sugar concentration (p ˂ 0.05)...... 133

vii viii

Figure 7.5 Phase contrast microscopy of homogeneous (S. obliquus) or heterogeneous (S.obliquus + C. protothecoides) microalgal cultures. Red arrows point at C. protothecoides cells characterized by larger and round cells...... 134 Figure 7.6 Residual lactose present in the culture medium at the end of the 5 sequential culture experiments. Results are expressed as the mean±SD (n=3). Different letters indicate significant difference in sugar concentration (p ˂ 0.001)...... 136

Figure 8.1 Schéma du procédé de production de microalgues mixotrophes par l‘utilisation du perméat de lactosérum ...... 140

LISTE DES TABLEAUX

Tableau 2.1 Exemples de produits commerciaux à base de lipides et de pigments de microalgues...... 23 Tableau 2.2 Exemples de compagnies qui travaillent à commercialiser des biocarburants à base de microalgues...... 25

Table 3.1 Upstream determination of critical process parameters ...... 43 Table 3.2 List of pre-selected strains...... 44 Table 3.3 Detailed description of scores attribution for each selected set of indicators of the six selection criteria...... 45 Table 3.4 Experimental determination of culture parameters used to determine lipid and triglycerides (TAG) productivity of the 10 pre-selected strains. (DCW = Dry cells weight) ... 51 Table 3.5 Key morphological and physiological cell characteristics of the preselected strains...... 53 Table 3.6 Diversity of industrial wastewaters and affordable residual matters that can serve as DOC source for growth...... 56 Table 3.7 Scores attributed to each preselected strains for each indicators of the six selection criteria...... 57 Table 3.8 Relative importance of each criterion...... 59 Table 3.9 Final scores and classification...... 59

Table 4.1 Chemical characteristics of solutions used as medium broth. All values are means±SD (n=3)...... 68 Table 4.2 Biomass yields at day 7 and day 13, and lipid productivity at day 13 of S. obliquus cultured in Bold‘s basal medium (BBM), BBM + 40% (v/v) whey permeate (WP) or lake water (LW) + 40% (v/v) whey permeate...... 80 Table 4.3 Total and neutral lipid fatty acid composition at day 7 and day 13 of S. obliquus cultures in BBM, BBM + 40% (v/v) whey permeate and lake water + 40% (v/v) whey permeateA ...... 82

ix x

Table 5.1 Composition of the 46 aqueous solutions used to build the multivariate model. Total sugar concentration was kept constant at 100 g L-1...... 91 Table 5.2 Summary of the main calibration and prediction parameters of the PLS regression developed for the determination of lactose, glucose and galactose. Proportions are expressed in % of total in a solution containing 100 g L-1 sugar...... 98 Table 5.3 Comparative results of the proportion of each sugar present in the culture medium as estimated by the multivariate model and the gas chromatographic method (GC-MS) at days 0, 7 and 13 of the experiment...... 100

Table 6.1 Mixotrophic media and biomass production in PBR...... 110 Table 6.2 Coded levels for independent factors of the Central Composite Design (CCD). S. obliquus (SO), A. convolutus (AC), C. protothecoides (CP)...... 111 Table 6.3 Central Composite Design (CCD) of experiments ...... 111 Table 6.4 Equations and summary of the main ―analysis of variance (ANOVA)‖ results of the six RSM models. Raw data was Log10 transformed. (SO = S. obliquus; AC = A. convolutus; CP = C. protothecoides; Auto = photoautotrophy; Hetero = heterotrophy; Df = degree of freedom; SS = sum of squares)...... 113 Table 6.5 Parameters dictated by each of the RSM models in order to maximize NL accumulation...... 115

Table 7.1 Biomass yields of the sequential experiment. Different letters indicate significant difference in biomass yield (p ˂ 0.05) for each stage and the total. ND = not determined. ... 135 Table 7.2 Analysis of variance (ANOVA) of the biomass yields of the sequential experiment...... 135

LISTE DES ACRONYMES ET ABRÉVIATIONS

Acronyme Définition AA Arachidonic Acid ANOVA Analysis of Variance ASTM American Society for Testing and Materials ATCC American Type Culture Collection BBM Bold‘s Basal Medium BBMP Bold‘s Basal Medium + Pepton CCD Central Composite Design CCMP National Center for Marine Algae and Microbiota CFPP Cold filter plugging point CPCC Canadian Phycological Culture Center DOC Dissolved Organic Carbon DHA Docosahexaenoic Acid DSC Dissolved Solids Content DW Dry Weight EAAI Essential Amino Acid Index EN European Standard EMP Embden-Meyerhof Pathway EPA Eicosapentaenoic Acid FA Fatty Acid FAME Fatty Acid Methyl Ester FT-IR/ATR Fourier Transform Infrared/Attenuated Total Reflectance GC Gas Chromatography HNA High Nucleic Acid HTL Hydrothermal Liquefaction IEA International Energy Agency LC Liquid Chromatography

xi xii

LNA Low Nucleic Acid LW Lake Water MS Mass Spectrometry MSSP microalgae strain selection procedure MUFA Monounsaturated Fatty Acid NL Neutral Lipid PBR Photobioreactor PLS Partial Least Square PPP Pentose Phosphate Pathway PUFA Polyunsaturated Fatty Acid RD Relative Deviation RMSECV Root Mean Square Error of Cross Validation RPD Residual Prediction Deviation RSM Response Surface Methodology ROS Reactive Oxygen Species SFA Saturated Fatty Acid SFE Supercritical Fluid Extraction SNK Student-Newman-Keuls TAG Triglycerides TCA Tricarboxylic acid cycle TL Total Lipids UTEX University of Texas at Austin UTR Untranslated Region VN Vector Normalization. WP Whey Permeate 1

CHAPITRE 1 INTRODUCTION

1.1 Mise en contexte et problématique

La production de biocarburants est en plein essor à travers le monde car elle représente une alternative à la consommation des combustibles fossiles traditionnels, tels le charbon et le pétrole, dans un contexte social où la croissance s‘oriente vers le développement durable de nos ressources. Le biodiesel produit à partir d‘une source biologique est défini comme un carburant renouvelable pouvant être utilisé dans les moteurs à combustion conventionnels et il pourrait représenter plus de 25% des besoins mondiaux en carburants à l‘horizon 2050 (IEA, 2011). Ceci permettrait de réduire de 2,1 milliards de tonnes les

émissions de CO2 reliées au secteur des transports et aussi, de diminuer de façon considérable la dépendance de cette industrie au pétrole (IEA, 2011). Le biodiesel est actuellement principalement produit à partir d‘huiles végétales (soya, canola, etc…) et animales dont la disponibilité est limitée par la productivité des cultures et l‘utilisation de ces huiles dans l‘alimentation humaine. Il s‘avère donc nécessaire de développer d‘autres sources d‘approvisionnement en huiles pour répondre à la demande croissante en biodiesel, tout en considérant les aspects économiques et les impacts sociaux de cette industrie émergente (Serra & Zilberman, 2013).

La forte teneur en lipides neutres de la classe des triglycérides (TAGs) de certaines espèces de microalgues pourrait devenir une source de biodiesel intéressante (Chisti, 2007). Les microalgues sont des organismes unicellulaires photosynthétiques à la base de toute la chaîne alimentaire aquatique qui peuvent dans certaines conditions présenter une productivité de biomasse à l‘hectare 30 fois supérieure à celle des plantes oléagineuses terrestres (Williams & Laurens, 2010). Certaines espèces ont la particularité de pouvoir accumuler de grandes quantités de lipides, particulièrement sous forme de TAG, pouvant parfois représenter 80% de leur masse sèche (Chisti, 2007). Les TAGs peuvent être transformés en biodiesel par une réaction appelée transestérification. La communauté

2 scientifique, encouragée par l‘opinion populaire, les gouvernements et mêmes certaines pétrolières, travaille actuellement à développer un procédé industriel de culture de masse de microalgues pour la production de biodiesel. Le défi consiste à trouver une combinaison entre espèce de microalgues, conditions de culture, valorisation des coproduits et méthode d‘extraction et de transformation des acides gras en biodiesel, qui permettra de rendre ce biocarburant sur le marché à un prix compétitif.

Il existe entre 200 000 et plusieurs millions d‘espèces de microalgues, dont à peine 10% sont connues et caractérisées (Cadoret & Bernard, 2008). Du côté de la sélection d‘espèces marines pour la production de biodiesel, des efforts colossaux ont déjà été réalisés entre autres par le « National Renewable Energy Laboratory » Colorado, États- Unis. Le « Aquatic Species Program » a permis d‘obtenir de l‘information sur plus de 3000 espèces de microalgues et a ouvert la voie à un grand nombre d‘avancées scientifiques sur le plan de la physiologie, la biochimie et les manipulations génétiques. Une des principales conclusions du rapport final était l‘impossibilité de rendre compétitif le prix des carburants fossiles traditionnels de l‘époque (Sheehan et al., 1998). L‘augmentation du prix du baril de pétrole, qui en septembre 2013 dépassait les 110$, et l‘épuisement éventuel et inévitable des ressources mondiales de pétrole, ont récemment fait resurgir l‘idée d‘un biodiesel microalgal. Plusieurs groupes de recherche travaillent actuellement à isoler et caractériser de nouvelles espèces de microalgues possédant les caractéristiques désirées pour la production de biodiesel (Abou-Shanab et al., 2011; Li et al., 2008; Park et al., 2012; Pereira et al., 2011). Les principales caractéristiques recherchées sont principalement une productivité lipidique élevée et un profil lipidique composé majoritairement de TAGs avec des acides gras constitués de 16 à 20 atomes de carbone, saturés ou mono-insaturés. Généralement, les espèces de microalgues marines présentent un profil lipidique composé d‘une plus grande proportion d‘acides gras polyinsaturés à très longues chaînes de carbone (plus de 20 atomes de carbone) que les espèces d‘eau douce.

Le mode de nutrition représente une variable intéressante dans l‘élaboration d‘un procédé de culture de microalgues. En effet, l‘hétérotrophie et la mixotrophie, qui impliquent

3 l‘assimilation d‘une source de carbone organique dissous (DOC), peuvent être exploités par certaines espèces et ont montré des taux de productivité de 10 à 100 fois supérieurs à ceux obtenus en photoautotrophie ainsi qu‘un enrichissement en lipides dans certains cas particuliers (Perez-Garcia et al., 2010). Plusieurs contraintes sont toutefois à considérer lors de la culture de microalgues en modes mixotrophe et hétérotrophe, dont le risque élevé de contamination par d‘autres microorganismes et les coûts engendrés par l‘utilisation d‘une source de carbone organique dissous (DOC). Ces coûts dépendent de la source de DOC choisie justifiant l‘utilisation d‘eaux usées ou de matières résiduelles industrielles sélectionnées (Andrade & Costa, 2006; Barrocal et al., 2010; Bhatnagar et al., 2010; Garci et al., 2000).

1.2 Définition du projet de recherche

Le présent projet s‘inscrit dans un contexte où la recherche dans le domaine du biodiesel microalgal est orientée vers la réduction des coûts de production à l‘échelle industrielle. En ce sens, un nouveau procédé de culture de microalgues exploitant les modes nutritifs mixotrophe et hétérotrophe a été élaboré en tenant compte du contexte géographique, technique et socioéconomique canadien. Divers paramètres du procédé ont d‘abord été testés et optimisés à l‘échelle laboratoire dans des volumes de culture de moins d‘un litre, puis des essais ont été effectués à l‘échelle pilote en photobioréacteurs (PBR) de 27 litres. La culture en PBR présente de nombreux avantages comparativement à la culture en étangs et ce, particulièrement à des latitudes situés au nord du 45ième parallèle. Elle permet généralement un meilleur contrôle des conditions de culture, des échanges gazeux, de la température et des risques de contamination par d‘autres microorganismes (Jorquera et al., 2010).

Le choix d‘une source de DOC pour l‘élaboration du procédé s‘est arrêté sur le lactosérum. Cette matière résiduelle de l‘industrie du fromage, très riche en lactose, est disponible en grande quantité et à faible coût partout à travers le globe. Les travaux ont été orientés plus particulièrement vers la valorisation du perméat de lactosérum, un dérivé déprotéiné du lactosérum brut.

1.3 Objectifs du projet de recherche

Objectif général : Élaborer et développer des stratégies de réduction des coûts de production d‘une biomasse microalgale oléagineuse pour l‘industrie du biodiesel.

Objectif spécifique #1 : Sélectionner, parmi toutes les souches de microalgues disponibles dans les collections de culture canadiennes et américaines, une souche adaptée au procédé de culture ciblé dans le contexte géographique, technique et socioéconomique canadien.

Objectif spécifique #2 : Optimiser les conditions de croissance de la souche de microalgue sélectionnée dans un milieu de culture composé de perméat de lactosérum.

Objectif spécifique #3 : Optimiser la productivité lipidique de la souche de microalgue sélectionnée.

1.4 Contributions originales

Les travaux de recherche présentés dans ce manuscrit apportent des contributions scientifiques originales dans les domaines de la sélection de souches de microorganismes pour une production à visées commerciales, de la culture de microorganisme en mode nutritif mixo/hétérotrophe à portée industrielle, de l‘optimisation des conditions d‘accumulation de lipides neutres dans les microalgues et des avenues de valorisation du lactosérum.

Sur le plan de la sélection de souches de microorganismes pour des applications commerciales, une procédure originale permettant de considérer 6 critères de sélection et 12 indicateurs a été développée. Cette procédure permet également de considérer l‘importance relative de chacun des critères grâce à une adaptation de la méthode d‘Ulrich, une méthode fréquemment utilisée dans le domaine du design industriel pour la sélection de concept.

Sur le plan de la culture de microorganismes mixo/hétérotrophes, l‘intérêt de la culture mixotrophe pour l‘optimisation du taux de croissance et de la productivité de biomasse de l‘algue verte Scenedesmus obliquus a été mis en lumière. Les travaux ont également permis de démontrer la capacité d‘espèces de microalgues appartenant au genre Scenedesmus à utiliser le disaccharide lactose pour croître en hétérotrophie stricte, contrairement à des espèces appartenant au genre Chlorella. De plus, une nouvelle méthode de suivi des sucres dans un milieu de culture de microorganismes a été développée. Cette méthode basée sur le spectre d‘absorbance infrarouge du milieu permet de considérer le phénomène « d‘additivité des spectres », une amélioration considérable comparativement aux modèles existants.

Sur le plan de l‘optimisation des conditions d‘accumulation de lipides neutres cellulaires, la comparaison entre trois espèces de microalgues a permis de tirer des conclusions notables. En effet, la méthode des surfaces de réponse (RSM) a permis d'observer un effet interactif entre le pH et la densité de biomasse sur l‘accumulation de lipides neutres chez les microalgues et des différences spécifiques ont été observées entre l‘espèce Chlorella protothecoïdes appartenant à la classe des Trebouxiophycea et les espèces Scenedesmus obliquus et Ankistrodesmus convolutus appartenant à la classe des Chlorophycea.

Finalement, nous suggérons l‘utilisation d‘un mode de culture commensale pour optimiser la productivité des cultures de microalgues ainsi que l‘utilisation du DOC contenu dans le perméat de lactosérum.

Globalement, ces travaux exposent pour la première fois la possibilité d‘utiliser le perméat de lactosérum comme source de nutriments et de DOC pour la culture de microalgues à l‘échelle industrielle sans hydrolyse artificielle préalable du lactose et ainsi de valoriser cet important coproduit de l‘industrie fromagère par sa conversion directe en biomasse pour le marché du biodiesel et/ou d‘autres produits d‘intérêt commerciaux à base de microalgues.

1.5 Plan du document

Ce manuscrit est présenté sous la forme d‘une thèse par articles composée de cinq articles scientifiques. Il comprend sept chapitres, les conclusions et perspectives des travaux de recherche ainsi qu‘une annexe, dont le détail est donné ci-dessous :

Chapitre 1 : Introduction Ce chapitre présente une mise en contexte et problématique, la définition et les objectifs du projet de recherche, un résumé des contributions originales ainsi que le plan du document.

Chapitre 2 : État de l’art Ce chapitre se veut une revue des connaissances existantes en ce qui a trait à la sélection et l‘amélioration de souches de microalgues, aux systèmes de production, aux modes nutritifs ainsi qu‘aux domaines d‘exploitation et d‘application des microalgues. Nous présentons également des aspects spécifiques au projet et servant de fil conducteur à nos travaux, tels que l‘influence de la qualité des huiles végétales sur les propriétés physicochimiques du biodiesel ainsi que les avenues existantes et potentielles de la valorisation du lactosérum.

Chapitre 3 : Une approche multicritères de sélection de souches de microalgues pour la production de biodiesel et autres applications commerciales Ce chapitre est consacré à la présentation d‘une nouvelle méthode multicritères de sélection de souches de microalgues pour des applications commerciales appliquée aux spécificités de la présente étude. Le choix des souches d‘algues adaptées pour mener à bien nos recherches y est justifié.

Chapitre 4 : Culture mixotrophe de l’algue verte Scenedesmus obliquus en présence de perméat de lactosérum pour la production de biodiesel Ce chapitre présente les résultats obtenus à l‘échelle laboratoire pour la culture de Scenedesmus obliquus en présence de perméat de lactosérum. Plusieurs paramètres

7 d‘optimisation du procédé tenant compte de facteurs de mise à l‘échelle y sont proposés. Les méthodes de suivi de croissance telles que l‘absorbance des cultures à différentes longueurs d‘onde, les mesures de rendement de biomasse sèche et le compte cellulaire, ainsi qu‘une nouvelle méthode d‘estimation du contenu lipidique cellulaire sont également présentées.

Chapitre 5 : Modèles d'étalonnage FT-IR/ATR univarié et multivarié pour le suivi in situ des sucres dans un milieu complexe de culture de microalgues Ce chapitre propose l‘utilisation d‘une nouvelle technologie pour le suivi in situ, quantitatif et qualitatif des sucres présents dans un milieu de culture microbiologique complexe. La méthode a été appliquée à des cultures de microalgues en présence de perméat de lactosérum et fait intervenir des mesures d‘absorbance du milieu à l‘aide d‘un spectrophotomètre infrarouge à transformée de Fourier couplé à une sonde externe avec prisme à réflectance totale atténuée (FT-IR/ATR) ainsi que la conception de modèles multivariés de type « régression des moindres carrés partiels (PLS) »

Chapitre 6 : Optimisation de l’accumulation de lipides neutres chez trois espèces de microalgues par la méthode des surfaces de réponses Ce chapitre introduit une stratégie expérimentale pour l‘optimisation des conditions de cultures permettant une induction rapide et efficace de l‘accumulation de lipides neutres chez les microalgues. L‘utilisation de la méthode des surfaces de réponse (RSM) permet de comparer la réponse de trois espèces de microalgues à différentes conditions de pH, de densité cellulaire et de temps d‘incubation lorsque carencées en azote, et ce, en modes nutritionnels photoautotrophe et hétérotrophe.

Chapitre 7 : Commensalisme dirigé entre Scenedesmus obliquus et Chlorella protothecoides : vers la viabilité économique d’un procédé de culture de microalgues mixo/hétérotrophes pour le biodiesel. Ce chapitre présente une méthode de stérilisation des milieux de culture utilisant le peroxyde d‘hydrogène, ainsi qu‘une stratégie de culture séquentielle des espèces Scenedesmus obliquus et Chlorella protothecoides permettant d‘améliorer le rendement

8 des cultures ainsi que l‘efficacité du procédé de phycoremédiation du perméat de lactosérum présenté précédemment.

Conclusions et perspectives Cette partie permet de tirer un bilan global des différents travaux réalisés dans le cadre de cette thèse. De même, des perspectives de recherche sont proposées dans la continuité des travaux, en particulier au niveau de l'application des stratégies d'optimisation du procédé.

Annexe Ce manuscrit comporte une annexe présentant une liste de plus de 100 espèces de microalgues recensées à partir de la littérature du biodiesel, principalement les articles de revue depuis les cinq dernières années.

CHAPITRE 2 ÉTAT DE L’ART

2.1 Sélection et amélioration de souches de microalgues

La sélection et l‘amélioration de souches est à la base du développement de tout procédé de production de microalgues. Concernant la sélection de souches pour la production de biodiesel et autres métabolites à valeur commerciale, deux principales tendances sont actuellement observées dans la littérature scientifique. L‘une repose sur les travaux d‘isolation et de caractérisation de souches provenant des milieux aquatiques marin et d‘eau douce (Abou-Shanab et al., 2011; Park et al., 2012; Pereira et al., 2011), ou de souches vivant dans des conditions environnementales extrêmes (Bernard, 2010). Ces travaux permettent d‘augmenter notre connaissance sur l‘impressionnante biodiversité des microalgues. Le nombre d‘espèces de microalgues existantes est estimé à entre 200 000 et un million, dont à peine 10% sont caractérisées (Cadoret & Bernard, 2008).

L‘autre tendance implique d‘importants travaux d‘ingénierie génétique afin de sélectionner sur plusieurs générations, d‘améliorer et même créer de nouvelles souches de microalgues à partir de celles déjà connues (Georgianna & Mayfield, 2012). Ces manipulations génétiques ont généralement comme objectif le développement de souches de microalgues performantes utilisées comme manufactures de composés précis tels que des lipides spécialisés, des protéines d‘intérêt biopharmaceutique, ou d‘autres molécules à valeur commerciale. Les méthodes actuellement utilisées pour l‘amélioration génétique des microalgues peuvent être séparées en trois grandes catégories : 1- la sélection sur plusieurs générations d‘individus possédant les traits phénotypiques désirés, 2- les méthodes conventionnelles de modification génétique et 3- la biologie synthétique.

2.1.1 Sélection sur plusieurs générations

Quoique le temps de génération des microalgues soit relativement court comparativement aux végétaux terrestres agricoles, le manque de connaissances des modes de reproduction sexuée de plusieurs espèces limite le potentiel de ce type d‘amélioration génétique. Diverses méthodes permettant d‘accélérer les taux de mutations des microorganismes (traitement physique ou chimique tels les rayons ultraviolets ou la methylnitronitrosoguanidine) peuvent être utilisées afin d‘augmenter l‘incidence d‘individus possédant des phénotypes désirables à l‘intérieur d‘une population de microalgues (Iskandarov et al., 2011). D‘autres méthodes basées sur le tri cellulaire par cytométrie de flux, peuvent ensuite être utilisées afin de sélectionner et d‘isoler efficacement ces individus de la culture initiale (Bougaran et al., 2012).

2.1.2 Modification génétique

La modification génétique de microalgues est de plus en plus courante et pour certaines espèces d‘intérêt commercial telles que Chlamydomonas reinhardtii, Phaeodactylum tricornutum, Chlorella vulgaris, Nannochloropsis gaditana, et Scenedesmus obliquus, des méthodes de transformation optimisées sont disponibles dans la littérature (Cha et al., 2012; Guo et al., 2013; Kindle, 1990; Radakovits et al., 2012; Zaslavskaia et al., 2000). Pour la modification génétique des algues, certains facteurs doivent être obligatoirement considérés tels que la particularité du code génétique microalgal, le choix de séquences promotrices permettant une expression optimale du transgène ainsi que le design de séquences correspondant à des régions non-traduites des ARN messagers qui permettent de tromper les mécanismes cellulaires de régulation négative (Gimpel et al., 2013). Dans la plupart des cas, ces manipulations visent à introduire un gène codant pour une protéine qui présente une activité d‘intérêt biopharmaceutique, ou encore une enzyme intervenant dans la voie de biosynthèse d‘un composé afin de moduler sa productivité ou sa qualité. Les méthodes les plus fréquemment utilisées pour l‘introduction du transgène à l‘intérieur des cellules sont l‘électroporation et la transfection de gènes par l‘intermédiaire de la bactérie Agrobacterium tumefaciens, mais d‘autre techniques, telles

11 que le bombardement particulaire et la méthode des billes de verre, ont aussi montré un certain potentiel (Kirchmayr & Griesbeck, 2012).C

2.1.3 Biologie synthétique

En 2010, avec leurs travaux sur la bactérie Mycoplasma mycoides publiés dans le journal scientifique « Science », l‘équipe de Craig J. Venter a franchi plusieurs obstacles techniques inhérents à l‘avancement de la biologie synthétique (Gibson et al., 2010). Vu par certains comme une extension de la chimie de synthèse, la synthèse et l‘assemblage de novo d‘un génome complet démontre la précision et l‘efficacité des appareils modernes de séquençage et de synthèse d‘ADN. Cette nouvelle méthode d‘ingénierie génétique pave non seulement la voie à la création de microorganismes spécialisés pour la synthèse de composés à valeur commerciale, entre autres dans les domaines bioénergétique et biopharmaceutique, mais soulève également plusieurs questions d‘ordre social, environnemental, philosophique et éthique, entre autres dans les domaines de la propriété intellectuelle et de la brevetabilité du vivant. Déjà, la biologie synthétique se tourne vers de potentielles applications chez les microalgues (Georgianna & Mayfield, 2012; Gimpel et al., 2013).

2.2 Systèmes de production de microalgues

La production de microalgues en étangs de type « raceway » existe depuis les années 1950 et est la plus répandue. Ce type de système est une boucle fermée qui exploite un bassin de forme ovale de 0,2 à 0,5 m de profond avec brassage automatique effectué par une roue agitatrice. Il peut être installé dans des secteurs impropres à l‘agriculture et est parfois considéré comme une méthode plus économique de production de microalgues à grande échelle par rapport aux photobioréacteurs (PBRs) en raison de ses faibles coûts de production et d‘opération. Toutefois, la productivité de biomasse est faible comparativement au PBRs souvent dû à un brassage inefficace (Chisti, 2007). En 2008, le coût de production de Dunaliella salina en étang, une espèce cultivée pour la production de caroténoïdes, était de d‘environ 4 $ / kg de masse sèche (Brennan & Owende, 2010).

De tels systèmes doivent être constamment alimentés en eau en raison de la perte par évaporation et sont soumis à des risques élevés de contamination par d‘autres microorganismes. De plus, un système ouvert est nécessairement soumis aux conditions climatiques locales et ne peut être envisageable dans les régions plus nordiques (Harun et al., 2010).

Les PBRs offrent un contrôle des conditions de culture et des risques de contamination beaucoup plus étroit que les étangs. Ils permettent ainsi une meilleure productivité pouvant atteindre 47 g m-2 jour-1 comparativement à 10 m-2 jour-1 pour les étangs de type « raceway » (Greenwell et al., 2010; Schenk et al., 2008). Les coûts plus élevés de construction de telles structures sont donc compensés par un taux de productivité 5 fois plus élevé (Chisti, 2007). Il existe différents types de PBRs qui peuvent être opérés en mode « batch », continu ou semi-continu, et la recherche se poursuit afin de développer de nouveaux systèmes permettant une production à grande échelle (Chen et al., 2011).

Trois des principaux facteurs à considérer lors du choix d‘un PBR sont les échanges gazeux, le brassage et le pH. En effet, de tels systèmes peuvent voir la concentration en oxygène dissous augmenter dû à la production par les algues en mode autotrophe alors que le pH augmente par la diminution de la concentration de CO2 dissous. De plus, le brassage doit être assuré afin d‘éviter la sédimentation des microalgues. Ces variables peuvent être contrôlées par le bullage d‘un mélange généralement de 20% (V/V) de CO2 et 80% (V/V) d‘air. Un bullage continu permet de brasser les cultures tout en assurant un apport constant en CO2, qui permet de contrôler le pH, et un dégazage de l‘eau, ce qui évite d‘atteindre des concentrations d‘oxygène dissous nocives pour les microalgues. L‘accumulation d‘oxygène dissous à des valeurs supérieures à la saturation par l‘air entraîne une inhibition de la photosynthèse et l‘apparition de dérivés réactifs de l‘oxygène (ROS). Ces ROS ont des effets délétères sur le métabolisme et la survie des cellules. Pour ces raisons, la concentration d‘oxygène dissous ne devrait jamais dépasser 400% de la valeur de saturation par l‘air (Chisti, 2007).

Un système hybride combinant les deux modes de cultures (PBRs et étangs) est aussi envisageable (Schenk et al., 2008). Dans ce type de système, les cultures microalgales entretenues dans des PBRs, dans des conditions axéniques et optimales pour leur croissance, servent à ensemencer des étangs qui eux permettent une production de masse à moindres coûts. Ce procédé est actuellement utilisé par Aquasearch (Hawaii, USA) pour cultiver l‘espèce Haematococcus pluvialis pour la production d‘astaxanthine, un puissant antioxydant pouvant servir de suppléments alimentaires humain et animal.

2.2.1 PBRs tubulaires

Approprié pour la culture extérieure, ce système permet d‘optimiser la surface exposée à la lumière (figure 2.1). Les cultures microalgales sont pompées à travers de longs tubes transparents. Qu‘ils soient horizontaux, verticaux, inclinés ou en hélice, la configuration dépend des spécifications du système et de l‘espèce cultivée. Les systèmes verticaux offrent un meilleur transfert de masse et une économie d‘énergie par rapport aux systèmes horizontaux, qui eux sont plus envisageables à grande échelle mais qui requièrent une plus grande superficie (Harun et al., 2010). L‘usine de 700 m3 de Klötze en Allemagne utilise la technologie des PBRs verticaux.

(photo tirée de Greenwell et al., 2009) Figure 2.1 PBRs tubulaires.

2.2.2 PBRs colonnes

Les PBRs colonnes (figure 2.2) peuvent être brassées mécaniquement mais plus souvent par bullage. Les colonnes sont placées verticalement, aérées par le bas et éclairées à travers leurs parois transparentes. Elles présentent plusieurs avantages dont un contrôle accru des conditions de culture, un brassage efficace et un taux de transfert gazeux supérieur. En effet, la capacité de relargage de l‘oxygène d‘un PBR est gouvernée par son coefficient de transfert de masse gaz-liquide. Ce coefficient est en général plus élevé dans les colonnes que dans les réacteurs tubulaires. Plusieurs PBRs expérimentaux se présentent sous cette forme et ces systèmes peuvent être envisagés pour la culture de masse entre autres à cause de l‘optimisation de l‘utilisation des superficies, qu‘ils offrent (Zittelli et al., 2006).

(photo tirée de Zittelli et al., 2006) Figure 2.2 PBRs colonnes.

2.2.3 PBRs panneaux plats

Ce type de PBR est reconnu pour supporter les meilleures productivités de biomasse microalgales (figure 2.3). Par exemple, Zhang et al, ont obtenu un rendement de productivité de 30 g m-2 jour-1 avec un PBR panneau plat en culture extérieure (Zhang et al., 2001). Comparativement aux autres types de PBRs, ce système présente les avantages d‘une plus faible consommation d‘énergie, une meilleure capacité de transfert de masse, un excellent contrôle de la concentration d‘oxygène dissous et une meilleure efficacité photosynthétique (Harun et al., 2010). Une usine exploitant cette technologie a été construite en 2008 à Hambourg en Allemagne.

(photo prise au laboratoire de la station aquicole de Pointe-aux-Pères, Qc en 2010) Figure 2.3 PBR panneau plat.

2.2.4 Autres modèles de PBRs

Plusieurs autres modèles de PBRs sont également en cours de développement. Notamment, des systèmes exploitant la répétition d‘unités confinées en sacs verticaux

(figure 2.4-A) et des systèmes éclairés de l‘intérieur (Eriksen, 2008; Wijffels & Barbosa, 2010). Aussi, la compagnie française « Ennesys » travaille actuellement au développement de systèmes exploitant le concept des bio-façades ou murs de microalgues (figure 2.4-B).

(photo tirée de Wijffels et Barbosa, 2010) B.

(images tirées de www.ennesys.com) Figure 2.4 A. PBRs sacs verticaux. B. Concept de bio-façade.

2.3 Modes de nutrition

Le mode de nutrition est défini par la façon avec laquelle un organisme se procure le carbone nécessaire à sa survie et sa croissance. Certaines espèces de microalgues ont la capacité d‘assimiler diverses sources de DOC par les mécanismes de la respiration cellulaire en plus du carbone inorganique, présent dans l‘eau sous la forme de CO2, par la photosynthèse. Le DOC assimilé par les microalgues peut être de différentes formes (glucose, glycérol, acétate de sodium, etc…) selon l‘espèce (Ceron-Garcia et al., 2000).

2.3.1 Photoautotrophie

La photoautotrophie est le mode de nutrition par lequel les microalgues assimilent le carbone inorganique sous forme de CO2. L‘énergie nécessaire à cette assimilation est fournie par la lumière, processus appelé photosynthèse (Taiz & Zeiger, 2010). Dans une optique de production de biomasse, dans les cultures traditionnelles photoautotrophes, l‘élément limitant la croissance des populations est souvent la pénétration de la lumière dü à l‘ombrage mutuel (Richmond, 2007). Ce phénomène est provoqué par l‘augmentation de l‘ombrage des cellules les unes sur les autres à mesure que la densité cellulaire devient plus élevée.

2.3.2 Hétérotrophie

L‘hétérotrophie est le mode de nutrition par lequel les microalgues assimilent le DOC. En l‘absence de lumière, l‘énergie requise pour la croissance est fournie par l‘oxydation du substrat organique, phénomène appelé chemo-hétérotrophie. Certaines espèces de microalgues utilisent l‘énergie de la lumière pour assimiler le DOC, processus appelé photo-hétérotrophie (Chen et al., 2011; Chojnacka & Marquez-Rocha, 2004). Plusieurs facteurs sont à considérer lors de la mise en culture de microalgues en mode hétérotrophe pour la production de biomasse : 1- toutes les espèces ne sont pas hétérotrophes

2- l‘augmentation des coûts liés à l‘utilisation d‘un substrat organique et à la stérilisation du matériel 3- les risques de contamination par d‘autres microorganismes 4- l‘inhibition de la croissance par l‘excès de substrat organique 5- l‘incapacité à produire certains métabolites induits uniquement en présence de lumière, tels les pigments photosynthétiques ou autres.

Les cellules microalgales capables de croître en conditions hétérotrophes modifient leur profil d‘expression génique en réponse à la disponibilité de différents substrats carbonés et à la disponibilité de la lumière. En effet, il a été démontré que des gènes codant pour plusieurs enzymes, impliquées entre autres dans le métabolisme du carbone, subissaient des changements de niveaux d‘expression lors de l‘ajout dans le milieu de culture d‘une source de DOC tels le glucose et/ou l‘absence de lumière (Perez-Garcia et al., 2011b). Cette réponse est liée au changement de métabolisme de la photosynthèse vers la respiration cellulaire. Dans un sens large, tous les organismes, incluant les microalgues, utilisent les mêmes voies métaboliques pour la respiration cellulaire. Pendant la respiration, l‘oxygène et le DOC sont consommés et l‘énergie sous forme d‘ATP et de

NADH est produite avec le CO2. Des nombreuses voies utilisées par les microorganismes pour la glycolyse aérobique, seules deux - le Embden-Meyerhof (EMP) et la voie des pentoses-phosphates (PPP) - ont été mises en évidence chez les algues (Perez-Garcia et al., 2011b).

L‘activité relative de ces deux voies d‘assimilation du glucose est un bon exemple de la modification du profil d‘expression génique par la lumière chez les algues. En effet, il a été démontré que chez Chlorella sorokiniana, en l‘absence de lumière, la voie PPP est responsable de 90% de la distribution du flux métabolique du glucose via la glucose-6- phosphate déshydrogénase alors que la réaction catalysée par la glucose-6-phosphate isomérase de la voie EMP est pratiquement absente (Yang et al., 2000 ). Toutefois, en présence de lumière, l‘inverse est observé et la voie EMP est la principale voie glycolytique observée. L‘activité des cycles des acides tricarboxyliques (TCAs) et de la phosphorylation oxydative demeure toutefois élevée, même en présence de lumière chez

19 cette espèce (Yang et al., 2000 ). Ainsi, la présence de lumière pourrait réguler à la baisse l‘activité de l‘enzyme glucose-6-phosphate déshydrogénase, responsable du flux métabolique vers la voie PPP.

Lors de l‘ajout de glucose dans le milieu de culture, les cellules de Chlorella répondent en moins de 5 minutes par une hausse de l‘expression du gène hup1 (Perez-Garcia et al., 2011b). La protéine HUP1 codée par ce gène est responsable du transport actif du glucose à travers la membrane plasmique. Il est intéressant de noter que lors de la translocation du glucose par HUP1, il se produit un mouvement net de protons vers l‘extérieur de la cellule (Perez-Garcia et al., 2011b). Ce relargage de H+ provoque l‘acidification du milieu de culture. L‘abaissement du pH provoqué par cet échange hexose/H+ pourrait être responsable de l‘inhibition de la croissance observée chez certaines espèces en présence d‘une concentration trop élevée de DOC (Lee, 2004b). Une modification génétique a permis de faire passer l‘algue verte Volvox carteri d‘un métabolisme autotrophe strict à un métabolisme hétérotrophe par le simple ajout du gène hup1 (Hallmann & Sumper, 1996).

2.3.3 Mixotrophie

La mixotrophie est une variante de l‘hétérotrophie où le CO2 et d‘autres sources de DOC peuvent être assimilés simultanément (Lee, 2004a). Ceci implique la cohabitation dans la cellule des métabolismes de respiration cellulaire et de photosynthèse qui peuvent opérer en parallèle. Certaines espèces de microalgues ne sont pas de vraies mixotrophes et possèdent la capacité d‘alterner entre les modes autotrophes et hétérotrophes dépendamment des conditions environnementales (Chojnacka & Marquez-Rocha, 2004). Ce mode de nutrition est apparu, ou a été conservé au fil de l‘évolution parce qu‘il représente un important avantage évolutif. En effet la versatilité de ces espèces en regard de leur dépendance à une source de carbone en particulier leur permet dans certains cas de survivre à l‘absence de CO2 ou de dominer des populations autotrophes strictes en présence de DOC. C‘est sans doute pour cette raison qu‘un grand nombre d‘espèces de microalgues responsables des blooms phytoplanctoniques se retrouvent dans cette

20 catégorie (Burkholder et al., 2008). Il a déjà été démontré que la mixotrophie est une bonne stratégie pour la production d‘une grande quantité de biomasse et la production de certains métabolites induits uniquement en présence de lumière (Perez-Garcia et al., 2011b). Plusieurs travaux ont démontré la possibilité d‘utiliser des matières résiduelles industrielles tels des résidus de betterave à sucre ou de mélasse, pour la production d‘espèces de Spirulina en conditions mixotrophes (Alberto Vieira Costa et al., 2004; Andrade & Costa, 2006; Barrocal et al., 2010; Chojnacka & Noworyta, 2004).

2.4 Bioraffinage

La valorisation de la biomasse microalgale par « bioraffinage » est une option qui est actuellement en développement afin de rendre cette industrie plus rentable économiquement (Yen et al., 2013). En effet, le concept de bioraffinage vise l‘optimisation de l‘utilisation de cette biomasse par fractionnement des diverses composantes (lipides, hydrates de carbone et protéines) pour leur valorisation individuelle. L‘idée derrière ce concept est la mise en place d‘une industrie offrant une multitude de produits commerciaux différents tels des produits chimiques spécialisés, des produits alimentaires et des huiles pouvant servir à l‘industrie du biodiesel (Foley et al., 2011). Le concept en est à faire ses preuves à l‘échelle pilote et des études de type « analyse de cycle de vie » sont actuellement en cours afin d‘assurer sa viabilité énergétique et économique (Ibañez & Cifuentes, 2013). D'autre part, la biomasse microalgale peut également être utilisée comme un tout pour la production de nourriture animale ou de carburants renouvelables par liquéfaction hydrothermique (Frank et al., 2013).

2.4.1 Lipides

De tous les produits biosourcés provenant des microalgues, ceux basés sur la fraction lipidique font actuellement, et de loin, l‘objet du plus grand effort de recherche pour leur valorisation industrielle. Différentes expressions existent pour désigner la fraction de la biomasse résiduelle suite à l‘étape d‘extraction des lipides lors du bioraffinage de la

21 biomasse microalgale totale (tourteau, « microalgal cake » ou « lipid extracted algae ») (Lardon et al., 2009). Certaines avenues de valorisation globale, telles que l‘alimentation animale ou la biométhanisation, sont actuellement envisagées pour cette fraction. Les huiles de microalgues pourraient remplacer les huiles végétales traditionnelles et animales dans toutes sortes d‘applications commerciales telles que les surfactants, les lubrifiants, les polymères et les denrées alimentaires (Foley et al., 2011). Le succès d‘un procédé industriel de production d‘huiles microalgales est non seulement basé sur la quantité d‘huile produite, mais aussi sur la qualité de ces huiles. En sélectionnant la bonne espèce de microalgue, en déterminant les conditions de culture optimales et/ou en mettant à profit le génie génétique (voir section 2.1.2), il est donc possible d‘améliorer la productivité globale en huiles des cultures (rendement et taux de croissance ainsi que contenu lipidique cellulaire) et aussi de moduler le profil lipidique de ces huiles (classes de lipide présentes et profil en acides gras), et ce, afin de produire la bonne huile pour le bioproduit d‘intérêt (Guihéneuf et al., 2009; Gupta et al., 2008; Tan & Lin, 2011). La figure 2.5 présente les trois principaux paliers et méthodes de fractionnement de l‘extrait lipidique total permettant de déterminer le profil d‘une huile donnée. L‘intérêt pour les huiles microalgales est en grande partie basé sur la capacité de certains de ces microorganismes de 1- synthétiser certains acides gras polyinsaturés essentiels et 2- d‘accumuler de grandes quantités de TAGs. Ainsi, plusieurs bioproduits à base de lipides de microalgues sont déjà disponibles sur le marché, ou en voie de l‘être (Tableau 2.1) (Spolaore et al., 2006; Yen et al., 2013).

Le groupe des acides gras polyinsaturés (PUFAs) inclut l‘ensemble des acides gras qui possèdent deux insaturations (liaisons double C=C) ou plus. Ils sont généralement retrouvés en majorité dans la fraction lipidique polaire composée en grande partie par des membranes cellulaires (lipides structuraux). Certains de ces acides gras à longues chaînes (> 20 atomes de carbone), tels l‘acide docosahexaénoïque (DHA), l‘acide éicosapentaénoïque (EPA) et l‘acide arachidonique (AA), aussi appelés oméga-3 et oméga-6, sont essentiels à la croissance et la survie des animaux et ont des effets bénéfiques sur la santé humaine (Mimouni et al., 2012). Ces acides gras essentiels sont principalement retrouvés dans les végétaux et sont synthétisés par des voies

22 enzymatiques de désaturases et d‘élongases à partir de deux acides gras précurseurs de 18 carbones, soit l‘acide linoléique et l‘acide linolénique. Les animaux supérieurs, ne possédant pas les enzymes nécessaires pour la synthèse de ces précurseurs, doivent donc se les procurer par l‘intermédiaire de leur nourriture (Glencross, 2009).

Tiré de Bastien A. et al. (2013)

Figure 2.5 Paliers de détermination du profil lipidique d‘un extrait lipidique total et exemples de méthodes analytiques de fractionnement.

Certaines espèces de microalgues, principalement d‘origine marine, sont très riches en PUFA. Par exemple, les DHA, l‘EPA, l‘AA et l‘acide γ-linolénique (GLA) se retrouvent en grande quantité dans des espèces de microalgues telles que Crypthecodinium, Nannochloropsis, Porphyridium et Arthrospira respectivement (Spolaore et al., 2006). La plupart des animaux marins ont par ailleurs complètement perdu leur capacité de

23 biosynthèse des acides gras essentiels et les PUFA contenus dans la chair de poisson sont d‘origine microalgale. L‘entreprise Martek Biosciences cultive depuis une dizaine d‘années une version génétiquement modifiée de l‘espèce Crypthecodinium cohnii en hétérotrophie à l‘échelle industrielle pour la production de DHA destinés à l‘industrie des suppléments alimentaires et des substituts de lait maternel.

Les TAGs sont des lipides non polaires pouvant être accumulés à des fins de réserve énergétique par les cellules eucaryotes. Certaines espèces de microalgues, appartenant principalement aux phyla chlorophyta et heterokonta, peuvent accumuler une grande quantité de TAG lorsque soumises à des conditions de culture particulières (Hu et al., 2008). Par contre, comme ces conditions de culture incluent souvent l‘imposition de certains stress métabolique tels que des carences nutritionnelles, un important compromis doit être fait quant au taux de division cellulaire, et ainsi de productivité en biomasse des cultures.

Tableau 2.1 Exemples de produits commerciaux à base de lipides et de pigments de micro-algues.

Produits Companies Marché Lieu Année

Martek/ EU/ Life’s DHA™ DSM Alimentation 2002 Suisse

Sofiproteol/Ferm en EPA/DHA Alimentation France entalg/Proléalg cours San Sephora/ Algenist™ Cosmétiques Diego, 2013 Solazyme CA Savons et San Unilever/ en produits de Cosmétiques Diego, Solazyme cours soins personnels CA Huile isolante Produits San DOW/ en pour chimiques Diego, Solazyme cours transformateur spécialisés CA

Des recherche faisant intervenir les génies métabolique et génétique sont actuellement en cours afin de déterminer des conditions qui permettraient d‘obtenir des cultures capables de combiner un « contenu élevé en TAG » avec un « taux de croissance élevé » (Klok et al., 2013; Wijffels & Barbosa, 2010). Cette caractéristique des microalgues intéresse particulièrement l‘industrie pour la production de biodiesel et de bio-kérosène actuellement perçus comme la troisième génération de biocarburants. À ce jour aucune entreprise n‘a pu démontrer la rentabilité de cette industrie. Cependant, le potentiel de productivité ainsi que l‘absence de compétition avec l‘industrie alimentaire continuent de susciter un vif intérêt tant du côté des industriels (Tableau 2.2) que des chercheurs en bioprocédés. Par exemple, l‘entreprise Solazyme cultive actuellement plusieurs souches génétiquement modifiées de Chlorella protothecoïdes en hétérotrophie à l‘échelle industrielle pour la production de biocarburants et d‘autres produits à base d‘huile de microalgues.

Les caroténoïdes (β-carotène, astaxanthine, lutéine, zéaxanthine, lycopene et bixine) et les phycobiliprotéines (phycocyanine et phycoérythrine) sont les principaux pigments produits à l‘échelle industrielle à partir de microalgues. Les caroténoïdes sont principalement utilisés comme colorants alimentaires et comme suppléments pour l‘alimentation animale (Goksan et al., 2010). Ils peuvent aussi être utilisés comme ingrédients cosmétiques. En plus de ces applications, plusieurs effets bénéfiques pour la santé humaine ont été démontrés dont l‘apport en provitamine A (Spolaore et al., 2006). Ces produits naturels, en compétition avec les pigments synthétiques, sont toutefois considérés de qualité supérieure. La compagnie Mycrophyt commercialise de la biomasse des espèces Haematococcus pluvialis et Porphyridium cruentum pour leurs contenus élevés en astaxanthine et en zéaxanthine respectivement. D‘autre part, les phycobiliprotéines sont utilisés dans les laboratoires de recherche pour leurs propriétés de coloration et de fluorescence et leur valeur marchande est supérieure à 60$/mg. Aussi, des travaux sont en cours afin de déterminer le mécanisme d‘action antibactérien de la marennine, un pigment bleu produit par l‘espèce Haslea ostrearia (Gastineau et al., 2012; Tardy-Laporte et al., 2013).

Tableau 2.2 Exemples de compagnies qui travaillent à commercialiser des biocarburants à base de microalgues. Compagnie Localisation Site web Algenol Biofuels Bonita Springs, FL, EU www.algenolbiofuels.com Aquaflow Nelson Nelson, New Zealand www.aquaflowgroup.com Aurora Algae, Inc. Hayward, CA, EU www.aurorainc.com Bioalgene Seattle, WA, EU www.bioalgene.com Bionavitas, Inc. Redmond, WA, EU www.bionavitas.com Bodega Algae, LLC Boston, MA, EU www.bodegaalgae.com Cellana LLC Kona, HI, EU www.cellana.com Ennesys Orsay, France www.ennesys.com LiveFuels, Inc. San Carlos, CA, EU www.livefuels.com PetroAlgae Inc. Melbourne, FL, EU www.petroalgae.com Phyco Biosciences Chandler, AZ, EU www.phyco.net Sapphire Energy,Inc. San Diego, CA, EU www.sapphireenergy.com Seambiotic Ltd. Tel Aviv, Israel www.seambiotic.com Solazyme, Inc. South San Francisco, www.solazyme.com Solix Biofuels, Inc. Fort Collins, CO, EU www.solixbiofuels.com Synthetic Genomics Inc. La Jolla, CA, EU www.syntheticgenomics.com Mis à jour et adapté de Chisti and Yan (2011)

Les caroténoïdes sont abordés dans cette section car ils font partie de la famille des terpénoïdes, aussi appelés isoprénoïdes, une importante classe de lipides qui comprend également les phytols comme composants des chlorophylles et des tocophérols (vitamine E), ainsi que les stérols (Lohr et al., 2012). Plus de 150 formes de stérols ont été identifiées chez les plantes (Jäpelt & Jakobsen, 2013). La compagnie espagnole Greenaltech envisage la commercialisation de phytostérols d‘origine microalgale pour les domaines de l‘alimentation humaine, des suppléments diététiques et des cosmétiques. En effet, certaines formes bioactives permettent de réduire le taux de cholestérol sanguin (Plana et al., 2008). De plus, d‘autres formes de stérols isolées à partir de Dunaliella tertiolecta ont montré une activité neuromodulatoire (Francavilla et al., 2012).

2.4.2 Protéines

Les protéines microalgales ainsi que les hydrolysats protéiques sont actuellement étudiés pour leurs propriétés antioxydantes, antihypertensives, anticoagulatives, antitumorales et immunostimulantes (Gerde et al., 2013; Samarakoon & Jeon, 2012; Sari et al., 2013; Vo et al., 2013), ou tout simplement pour leur valeur nutritive et leur contenu en acides aminés essentiels pour l‘alimentation humaine ou animale (Becker, 2007). Dans le but d‘obtenir ces molécules d‘intérêt, deux approches sont étudiées. La première consiste à caractériser les extraits protéiques naturels (endogènes) des souches connues (Yen et al., 2013). L‘autre voie consiste à utiliser le génie génétique pour la production de protéines (exogènes) déjà connues pour leur bioactivité (Cadoret et al., 2012; Lauersen et al., 2013).

2.4.3 Hydrates de carbone

Les microalgues peuvent également représenter une source d‘hydrates de carbone de par la cellulose de leur paroi cellulaire et leurs réserves d‘amidon contenues dans le plaste. Certaines espèces de microalgues, telle Dunaliella tertiolecta, produisent également des polysaccharides extracellulaires (Geun Goo et al., 2013). Ces hydrates de carbone peuvent être utilisés pour la fermentation d‘autres microorganismes et la production de biogaz et de bioéthanol (voir section 2.5.1)(Chen et al., 2013). Par exemple, l‘extraction des sucres à partir de la biomasse microalgale peut être effectuée par ultrasons, suivi d‘une hydrolyse chimique de l‘amidon afin de fournir le glucose nécessaire à la production de bioéthanol par la levure Rhodotorula toruloides (Zhao et al., 2013).

2.4.4 Applications commerciales de la biomasse microalgale entière

La biomasse microalgale peut également être utilisée sans bioraffinage de ses composantes organiques, pour l‘alimentation humaine ou animale, ou pour la production de carburants renouvelables. Plus de 30 % de la production mondiale de microalgues est actuellement destinée à l‘alimentation animale (Spolaore et al., 2006). Pour l‘aquaculture,

27 la production de microalgues sert à nourrir les larves de mollusques, ou indirectement les proies des larves de crustacés et de poissons (Brown et al., 1997; Marchetti et al., 2012). Son usage est bénéfique pour la nutrition, la coloration de la chair des saumons ou pour induire d‘autres activités biologiques chez ces animaux d‘élevage. Les genres les plus fréquemment utilisés pour l‘aquaculture sont : Chlorella, Tetraselmis, Isochrysis, Pavlova, Phaeodactylum, Chaetoceros, Nannochloropsis, Skeletonema et Thalassiosira. Le contenu lipidique des espèces choisies est d‘une importance majeure, car les microalgues sont la source principale d‘PUFAs essentiels des écosystèmes aquatiques. L‘espèce Arthrospira est une excellente source de protéines et est utilisée comme supplément alimentaire pour plusieurs types d‘animaux : chats, chiens, poissons d‘aquarium, oiseaux, chevaux, bétail (Harun et al., 2010). D‘autres entreprises se tournent vers la production de microalgues pour l‘alimentation humaine et des farines à base de microalgues commencent à faire leur apparition sur les marchés.

Le coût énergétique élevé des étapes de séchage de la biomasse microalgale (3,6 MJ / kg d‘eau évaporée) et de lyse cellulaire, nécessaires pour le fractionnement de la biomasse par bioraffinage, a orienté les chercheurs de la filière « biocarburants » vers le développement de méthodes alternatives (Xu et al., 2011). L‘une de ces méthodes, la liquéfaction hydrothermique (HTL), permet la conversion directe d‘une biomasse humide (10-20% m/v) en huile, suite à une exposition d‘environ 15-30 minutes à des températures pouvant varier entre 250-400°C et des pressions de 10-20 MPa en présence d‘un catalyseur. Ce procédé permet d‘accroître la conversion car, en plus des lipides, une partie des protéines et des hydrates de carbone sont aussi convertis en huile-HTL. De plus, l‘huile-HTL peut être directement traitée dans les installations déjà existantes pour le raffinage pétrochimique (Huber & Corma, 2007). Ce procédé permet la production d‘un diesel dit « renouvelable ». Une récente analyse de cycle de vie comparant les deux voies a permis de démontrer le potentiel de la HTL sur le plan du bilan énergétique (Frank et al., 2013). Le contenu élevé en oxygène et en azote de certaines huiles-HTL fait actuellement l‘objet de recherches pour le développement de stratégies permettant d‘améliorer la composition élémentaire de ces huiles (Mørup et al., 2012). La valorisation

28 des protéines et le recyclage des nutriments contenus dans les déchets aqueux de la HTL est aussi étudié (Biller et al., 2013).

2.5 Biocarburants de troisième génération

2.5.1 Bioéthanol et biométhane

Les microalgues peuvent être utilisées comme biomasse dans divers procédés de fermentation par d‘autres microorganismes (bactéries, levures ou autres moisissures) pour la production de bioéthanol et de biométhane. Entre autres, un système de production d‘éthanol par fermentation de microalgues a été récemment breveté (Mohamed et al.,

2011). Ce système propose la récupération du CO2 émis lors de la fermentation, pour la culture des microalgues. Suite au processus de fermentation, la biomasse microalgale restante est digérée en conditions anaérobiques afin de produire du biométhane. Toutefois, ce type de production demeure à l‘échelle expérimentale et aucune technologie n‘a été commercialisée jusqu‘à maintenant (Harun et al., 2010).

2.5.2 Biodiesel

Ce sont présentement les huiles extraites de plantes oléagineuses terrestres telles que le canola, le soya, le tournesol et le palmier à huile qui sont principalement utilisées pour la production de biodiesel. Dans les années 80-90, une vaste étude sur le potentiel de production de biodiesel à partir de microalgues a été menée par le « National Renewable Energy Laboratory » aux États-Unis (Sheehan et al., 1998). Le «Aquatic Species Program » a permis d‘obtenir de l‘information sur plus de 3000 espèces de microalgues et a ouvert la voie à un grand nombre d‘avancées scientifiques sur les plans de la physiologie, la biochimie et les manipulations génétiques. Une des principales conclusions du rapport final est la faisabilité technique d‘une production industrielle de biodiesel algal, mais ceci, à des coûts trop élevés et non compétitifs avec les carburants fossiles traditionnels (Sheehan et al., 1998). Avec l‘avènement de nouvelles préoccupations reliées au réchauffement climatique et à la diminution des stocks

29 mondiaux de pétrole, la communauté internationale cherche actuellement une alternative à la production d‘énergie par les combustibles fossiles et l‘option des algocarburants est à reconsidérer (Chisti, 2007).

Les microalgues représentent une alternative intéressante aux oléagineux terrestres pour différentes raisons. D‘abord, la possibilité d‘utiliser des espaces impropres à la culture de céréales et autres plantes pouvant servir à l‘alimentation humaine rend le projet acceptable socialement dans un contexte où la famine sévit encore dans plusieurs pays. Ensuite, le potentiel de production de litres de biodiesel par hectare par jour pourrait être de loin supérieur. Ceci est dû au contenu élevé en lipides de certaines espèces de microalgues et à leur rythme élevé de division cellulaire et donc, de production de biomasse (Williams & Laurens, 2010). Aussi, la mise en place d‘un procédé industriel est envisageable à l‘année, dans des conditions indépendantes des variations climatiques.

2.5.3 Propriétés du biodiesel

Le biodiesel est produit par une réaction appelée transestérification (figure 2.6). Dans cette réaction, 1 mole de TAG réagit avec 3 moles d‘un alcool, le plus souvent du méthanol, pour former 1 mole de glycérol et 3 moles de méthyl esters d‘acides gras (FAME) (Ramos et al., 2009). Les TAGs sont composés de trois molécules d‘acides gras reliés ensemble par une molécule de glycérol. Ces acides gras peuvent être de trois types : saturés, monoinsaturés ou polyinsaturés. Le degré de saturation dépend du nombre de doubles liaisons présentes dans la molécule.

Figure 2.6 Représentation chimique de la réaction de transestérification

Les propriétés physico-chimiques du biodiesel produit dépendent de la longueur et du degré de saturation des chaînes de carbone des acides gras. Ces propriétés doivent correspondre à certaines normes standards avant que le produit puisse être commercialisé sur un territoire donné (standard américain ASTM D6751, standard européen EN 14214). Certains paramètres (contenu en ester, contenu en méthanol, viscosité cinématique 40°C, valeur acide, point éclair, contenu en monoglycérides, diglycérides et TAGs, glycérol libre et total) dépendent principalement du degré de raffinement des huiles, du procédé de transestérification et de la qualité des étapes de purification de phase. Les propriétés qui sont dépendantes du profil lipidique des huiles utilisées sont l‘indice de cétane, l‘indice d‘iode, la stabilité oxydative et la température limite de filtrabilité (CFPP).

L‘indice de cétane est largement utilisé pour évaluer la qualité d‘un biodiesel et il est le pendant de l‘indice d‘octane de l‘essence. Plus l‘indice de cétane est élevé, meilleure est la combustion et surtout le délai d‘ignition du carburant. Cette propriété est grandement dépendante des caractéristiques des acides gras. Plus les chaînes d‘acides gras sont longues et plus elles sont saturées (ou monoinsaturées), plus l‘indice de cétane sera élevé. Selon le standard EN 12214, l‘indice de cétanes pour un biodiesel d‘origine végétal doit être d‘au moins 51, alors que le standard ASTM D6751 exige un minimum de 47.

L‘indice d‘iode est une mesure du niveau d‘insaturation totale d‘un mélange d‘acides gras. C‘est une mesure de la masse d‘iode (I2) capable de réagir avec 100 g d‘acides gras d‘un échantillon donné. L‘iode interagit exclusivement avec les doubles liaisons des acides gras. Il est intéressant de noter que l‘indice d‘iode d‘une huile végétale ou animale est presque identique à celle de ses esters méthyliques correspondants obtenus à la suite de la réaction de transestérification. La limite maximale de cet indice est de 120 g / 100 g d‘acides gras selon le standard EN 12214 alors que le standard ASTM D6751 ne spécifie aucune valeur. La limitation du degré d‘insaturation est nécessaire, car le chauffage d‘acides gras insaturés résulte en la polymérisation des glycérides, la formation de dépôts et la détérioration des lubrifiants (Ramos et al., 2009).

La stabilité oxydative est une mesure de résistance à l‘oxydation d‘un carburant soumis à un jet d‘air constant à 110°C. La quantité d‘acides volatiles est mesurée en continu au cours de l‘expérience par une mesure de conductivité de l‘air et elle doit être inférieure à un certain seuil pendant 6 heures selon le standard EN 12214 et pendant 3 heures selon le standard ASTM D6751. Il est très difficile de répondre à ce standard sans l‘ajout d‘antioxydants au biodiesel. Cependant, il a été observé que des huiles végétales avec un contenu élevé en acides linoléique et linolénique (C18:2 et C18:3) ont tendance à avoir une faible stabilité oxydative comparativement aux huiles à contenu faible en PUFAs (Agarwal et al., 2010).

La CFPP est la température la plus basse, exprimée en °C, à laquelle un volume donné de diesel passe encore à travers une unité de filtration standardisée. Aucun standard n‘est spécifié par EN 12214 ou ASTM D6751. Les carburants développent typiquement des problèmes de dépôts de cire et de congestion des filtres et des injecteurs à des températures de -10 à -15°C. Lorsque le biodiesel est refroidi, les esters méthyliques des acides palmitique et stéarique (C16:0 et C18:0) sont les premiers à précipiter et représentent une grande partie du matériel qui bouche les filtres des moteurs testés. Des stocks d‘huiles végétales riches en acides gras saturés à longues chaînes (C22:0 et C24:0) produiront donc un biocarburant mal adapté pour des températures inférieures à 0°C (Ramos et al., 2009).

En bref, plusieurs études ont permis de comparer les propriétés de biodiesels produits à partir de différentes huiles d‘origine végétale (Agarwal et al., 2010; Ramos et al., 2009; Stansell et al., 2012). Ces études s‘entendent pour dire que les propriétés recherchées sont des acides gras à longues chaînes, i.e. des acides gras de 12 à 22 atomes de carbone, saturés ou mono-insaturés. Les microalgues marines sont caractérisées par des niveaux de PUFAs nettement supérieurs à ceux observés chez les microalgues d‘eau douce (Lang et al., 2011). Cette caractéristique favorise donc les espèces d‘eau douce pour la production de biodiesel. Dans les régions froides du nord de l‘Amérique, il semble essentiel de considérer la CFPP comme une propriété importante. Dans cette optique, les microalgues

32 produisant des acides gras monoinsaturés avec des chaînes de carbone d‘une longueur inférieure à 22 atomes sont à privilégier (16 :1; C18 :1; C20 :1).

2.6 Valorisation du lactosérum

Le lactosérum, aussi appelé petit lait, est la partie liquide issue de la coagulation du lait. Il est composé à 94% (V/V) d'eau, 4-5% (m/V) de lactose et 0,5-1% (m/V) de protéines laitières, de vitamines et de minéraux (Smithers, 2008). C'est le principal produit secondaire obtenu lors de la fabrication du fromage. Une règlementation stricte existe quant au traitement et au rejet de cet important coproduit industriel car il représente l‘un des rejets industriels les plus polluants (demande biochimique en oxygène > 35 000 ppm; demande chimique en oxygène > 60 000 ppm). Au Canada, 2 100 000 de tonnes de lactosérum sont produites chaque année, dont 1 200 000 tonnes au Québec.

Divers procédés existent actuellement pour récupérer les constituants du lactosérum. L‘un d‘entre eux consiste à concentrer les protéines laitières par filtration. À l‘intérieur de ce procédé, le filtrat, ou concentré de protéines de lactosérum, peut être directement ajouté aux fromages et au yaourt afin d‘en augmenter la valeur nutritive et la qualité des produits, ou encore séché et vendu sous la forme d‘une poudre alimentaire. En effet, les protéines de lactosérum (β-lactoglobuline, α-lactalbumine, immunoglobuline, albumine sérique bovine, lactoferrine, lactoperoxidase et glycomacropeptide) sont des aliments fonctionnels et produits de santé reconnus (Solak & Akin, 2012). Cependant, il est à noter qu‘aucune stratégie de valorisation du lactosérum n‘atteindra cet objectif sans valoriser le lactose car ce dernier représente plus de 75% des solides dissous du lactosérum (Smithers, 2008). Ainsi, d‘autres avenues de valorisation doivent être développées pour le perméat de lactosérum, ou concentré de lactose. Ce coproduit est actuellement utilisé directement dans l‘alimentation porcine, ou plus rarement séché et vendu sous la forme d‘une poudre de lactose. Il représente donc une source de carbone organique abordable et facilement accessible partout dans le monde.

2.6.1 Utilisation du lactose par les microalgues

Jusqu‘à ce jour, les essais de culture de microalgues effectués avec le lactose comme source de DOC se sont avérés peu concluants (Ceron Garcia et al., 2006; Samejima & Myers, 1958; Theriault, 1965; Wang & Peng, 2008 ). En effet, la présence de lactose dans le milieu de culture des algues testées ne semble pas stimuler leur croissance comparativement aux contrôles. Toutefois, certaines espèces de microalgues présentent une activité β-galactosidase (Davies et al., 1994). Cette enzyme est responsable du clivage du disaccharide lactose (figure 2.7) en ses deux constituantes : le glucose et le galactose. La présence d‘une telle activité enzymatique chez ces espèces de microalgues mixotrophes leur permet théoriquement de pouvoir utiliser le lactose pour leur croissance. De plus, la présence de lactosérum dans le milieu de culture a déjà permis de stimuler la croissance des microalgues Anacystis nidulans, Nannochloris sp., Dunaliella tertiolecta et Euglena gracilis (Durmus et al., 1999; Freyssinet & Nigon, 1980) et de la levure Saccharomyces cerevisae (Silva et al., 2010). Cette stimulation pourrait être attribuable à l‘utilisation du lactose et/ou aux autres constituantes du lactosérum. En effet, il a récemment été démontré que l‘ajout d‘une poudre de lactosérum brut au milieu de culture pouvait stimuler la croissance de Chlorella vulgaris (Abreu et al., 2012). Cette stimulation pourrait être due à la présence de certains nutriments tels le phosphore et calcium. Une hydrolyse préalable du lactose a également permis de stimuler significativement les rendements de biomasse et le taux de croissance de culture de cette espèce grâce à l‘utilisation du glucose et du galactose comme source de DOC en conditions mixotrophes (Abreu et al., 2012).

Figure 2.7 Structure moléculaire du lactose.

Le prochain chapitre présente une méthode multicritères de sélection de souche de microalgues pour un procédé de production d‘une biomasse oléagineuse en conditions mixotrophes pour le biodiesel. La détermination des principaux paramètres du procédé tient compte du contexte géographique et technique canadien.

CHAPITRE 3 Une approche multicritères de sélection de souches de microalgues pour la production de biodiesel et autres applications commerciales

Avant-propos Auteurs et affiliation : Jean-Michel Girard : étudiant au doctorat, Université de Sherbrooke, Faculté de génie, Département de génie chimique et de génie biotechnologique. Viviane Bélair : étudiante au doctorat, université McGill. Alexandre Boudreau : étudiant à la maîtrise, Département de mathématiques, informatique et génie, Université du Québec à Rimouski. Nathalie Faucheux : professeure, Université de Sherbrooke, Faculté de génie, Département de génie chimique et de génie biotechnologique. Michèle Heitz : professeure, Université de Sherbrooke, Faculté de génie, Département de génie chimique et de génie biotechnologique. Réjean Tremblay : professeur, Institut des Sciences de la Mer. Jean-Sébastien Deschênes : professeur, Département de mathématiques, informatique et génie, Université du Québec à Rimouski.

Date de soumission : Octobre 2014

Revue : Aquaculture

Titre français : Une approche multicritères de sélection de souches de microalgues pour la production de biodiesel et autres applications commerciales

Contribution au document : Cet article contribue à la thèse en présentant une procédure qui permet de prendre en considération plusieurs critères et indicateurs lors de la sélection d‘une souche de microalgue pour des applications commerciales. La quantité croissante d‘informations pouvant être colligée sur de multiples espèces de microalgues à partir de la littérature justifie le développement et la standardisation d‘un tel système multicritères.

Résumé français : Ce chapitre propose une méthodologie rigoureuse pour la sélection de souches de microalgues pour des applications commerciales. La procédure a été divisée en deux étapes et permet de considérer plusieurs aspects importants du procédé tels que la nature des produits finaux, les systèmes de production, la récolte de la biomasse, les méthodes d'extraction des métabolites d‘intérêt ainsi que les stratégies pour l'amélioration continue du processus. Dans la première étape de sélection, 10 souches de microalgues ont été présélectionnées en fonction de critères de discrimination binaires simples et sans équivoque. Dans la deuxième étape, un total de six critères généraux (avec leurs indicateurs associés) ont été considérés, et une note (0 à 10) par critère a été attribuée à chaque souche présélectionnée. La méthode d‘Ulrich a ensuite été adaptée afin de construire une matrice de sélection de manière à déterminer l'importance relative de chaque critère. Cette approche a été appliquée pour la sélection d'une souche de microalgues dans le but de produire du biodiesel dans le contexte géographique et technique canadien (hiver avec couvert de glace). Cette approche multicritères pourrait facilement être utilisée pour différents contextes et objectifs de production de masse de microalgues.

A multi-criteria approach for microalgae strain selection for biodiesel

production and other commercial applications

Jean-Michel Girard123, Viviane Bélair, Alexandre Boudreau2, Nathalie Faucheux1,

Michèle Heitz1, Réjean Tremblay3, Jean-Sébastien Deschênes2

1 Département de Génie Chimique et Génie Biotechnologique, Université de Sherbrooke 2500, boul. de l‘Université, Sherbrooke (Québec) Canada, J1K 2R1; 2Département de mathématiques, informatique et génie, Université du Québec à Rimouski, 300, allée des Ursulines, Rimouski (Québec) Canada, G5L 3A1; 3Institut des Sciences de la Mer, 310, allée des Ursulines, Rimouski (Québec) Canada, G5L 3A1

Abstract

This paper suggests a rigorous methodology for microalgae strain selection for commercial applications. The procedure was divided in two stages and considered critical aspects of microalgae cultivation including nature of the end products, production systems, harvesting, extraction methods and strategies for continuous improvement of the process. In the first selection stage, 10 microalgae strains were pre-selected according to simple, unequivocal and discriminating criteria. In the second stage, a total of six general criteria (with associated sets of indicators) were determined, and a score (from 0 to 10) was attributed to each pre-selected strain. A selection matrix was then constructed to determine the relative importance (weight) of each criterion using the Ulrich method. This approach was applied for the selection of a microalgae strain for biodiesel production, in the Canadian (winter with ice cover) particular geographical and technical context. We suggest that this multi-criteria approach could be easily used for different contexts and objectives of microalgae mass production.

Keywords: Lipid productivity, fatty acid profile, co-products, mixo/heterotrophy, Ulrich method

3.1 Introduction

Microalgae cultivation offers tremendous potential for the production of a wide diversity of consumer products. In the energy field, while lipids can be used to produce biodiesel, carbohydrates and proteins can be considered for the production of other classes of biofuels, such as alcohols or biogas through fermentation by other microorganisms (Beer et al., 2009; Yi-Xin et al., 2011). In the dietary field, microalga is an important source of functional food such as polyunsaturated fatty acids and antioxidant pigments, and could also become an important source of proteins to serve as human and animal feed (Becker, 2007; Williams & Laurens, 2010). Fractionating the microalgal biomass by ―biorefining‖ to obtain multiple end products from a single biomass feedstock is an option that is currently in development to increase the profitability of this industry (Yen et al., 2013). On the other hand, the microalgal biomass can also be used as a whole for the production of renewable fuels (Frank et al., 2013).

This diversity of actual and potential commercial applications is supported by the important microalgae biodiversity estimated to range between 200 000 and several millions different species (Cadoret & Bernard, 2008). Although this biodiversity remains largely unexplored, numerous strains are already available in culture collections around the world. Moreover, intraspecific biochemical composition, and therefore potential for a given bioproduct, can vary depending on culture conditions and provenance of the particular strain (Gong & Jiang, 2011; Shen et al., 2010). In the elaboration of a microalgae mass production process for a particular commercial application, one of the early critical steps is therefore the selection of a microalgae strain. This is generally realized by theoretical and/or empirical preliminary studies, that consider a definite number of selection criteria (Brown et al., 1998; Mimouni et al., 2012; Park et al., 2012; Rodolfi et al., 2009). In the particular case of microalgal biodiesel production, selection criteria commonly considered are high lipid productivity and adequate fatty acid profile (Gouveia & Oliveira, 2009; Griffiths et al., 2012; Rodolfi et al., 2009). However, several other economical, technical and environmental parameters could greatly influence the outcome of such a selection process. Some of these parameters include adaptation of the

40 strain to the selected production system, susceptibility to the selected lipid extraction method and valorisation potential of the microalgal cake. The work currently available in the literature considers these aspects separately and it will be easier to develop standardized procedures that allows considering all the parameters likely to influence the choice of the strain to be privileged for a particular context, and also to weight their relative importance in the balance of this process.

Some of these parameters are largely dictated by the geographical and technical context of the eventual plant, and certain critical aspects of the production process should therefore be predetermined in order to optimize the selection procedure. For example, at high latitudes (> 45°), the cold temperatures and low solar radiation during winter are too hostile for outdoor cultivation (Williams & Laurens, 2010). For this reason, research must be oriented towards use (and design) of large-scale indoor bioreactors and process development using suitable microalgae strains. Moreover, in contexts of reduced solar radiation during winter, the capacity of a given strain to grow under mixo/heterotrophic conditions can prove a major asset; as such nutrition modes typically allow higher productivities while reducing the light requirements of the culture (Perez-Garcia et al., 2011b).

In the present work, a two stages multi-criteria approach, followed by relative weight determination of each criteria using the Ulrich method (Ulrich & Eppinger, 2007) is proposed to serve as a blueprint for optimal microalgae strain selection for commercial applications. The approach has been applied to our specific geographical and technical context with the objective of selecting a microalgae strain for biodiesel production. Thus, selection criteria were oriented towards: i) suitability of strains for cultivation in bioreactors under photoauto/mixo/heterotrophic conditions, ii) settling potential, iii) susceptibility to lipid extraction technologies, iii) potential for high value co-products and genetic improvements and iv) other environmental considerations.

3.2 Materiel and methods

3.2.1 Selection procedure First stage A short list of simple, unequivocal and discriminating binary criteria was first used to rapidly restrain the list of candidate to approximately 10 strains. Determination of these criteria was done based on the predetermined process parameters. Combined information from laboratory experiments and the literature was then used to further characterize these strains.

Second stage The pre-selected strains were submitted to a second evaluation in order to objectively compare their intrinsic ability to meet the combined expectations from the following six (6) general criteria: 1- productivity and quality of the main product, 2- productivity and quality of the co-products, 3- adaptation to selected cultivation system, 4- susceptibility to harvesting and extraction techniques, 5- expected potential for process improvements and 6- environmental considerations. A number of potential indicators can be used in the evaluation of each criterion, depending on available information. A final score between 0 and 10 is then attributed to each strain (for each criterion), depending on their ability to fulfill the expectations raised by each of the indicators. Methods of point attribution must be clearly defined for each selected indicator.

Category weighting The weight of each individual criterion was determined using the Ulrich method, which is commonly used in design engineering for concept selection (Ulrich & Eppinger, 2007). It involves the distribution of the criteria in a comparison matrix, which allows computing a score based on their relative importance to each other. A resolution ranging from 1 to 5 was used here to determine the relative importance of each criterion, a score of 1 meaning ―much less important‖, 3 meaning ―equally important‖ and 5 meaning ―much more important‖. Note that other resolutions can be used if a more precise comparison is possible.

3.2.2 Experimental procedure The pre-selected strains were ordered from cultures collections in the Canada (Canadian Phycological Culture Center) and the US (National Center for Marine Algae and Microbiota, The Collection Culture of Algae at the University of Texas and American Type Culture Collection) to conduct experimental determination of the ―productivity and quality of the main product‖ criterion (in this case lipids).

Each strain was cultivated in the culture medium recommended by the supplier. All inoculum were brought to exponential growth stage, in 50 mL Erlenmeyer flasks. For each strain, duplicate test cultures (900 mL in 1L Erlenmeyer flasks) were inoculated at an initial cell concentration of 0.5 x 106 cells mL-1, and then kept in a home-made air-lift systems under constant aeration (≈ 0.3 L min-1) and illumination (100 µE m-2 s-1, except Schizochytrium limacinum which was kept in continuous darkness) at 20 °C in a plant growth incubation system (GC-300, MBI Lab Equipment, QC, Canada). Manual agitation was performed daily.

Cultures were sampled (10 mL) every day to perform manual cellular counts by hemacytometer until reaching stationary growth stage (8 to 14 days). At the end of the experiment, cultures were harvested to perform dry weight and lipid analysis. Duplicate of 5 mL of microalgae culture were sampled on 25 mm GF/C filters pre-burned (450°C for 2h) and weighed. One replicate was used for dry mass estimation (70°C for 24h) and the others preserved in 4 mL amber glass vials with 2 mL of dichloromethane:methanol (2:1 v/v) under nitrogen atmosphere at -80ºC until lipids analysis.

Lipids were extracted using a modified Folch procedure described in Parrish (1999). Extracts were spotted on silica gel-coated chromarods (SIII, Iatron Laboratories, Shell USA, Spotsylvania, VA, USA) and lipid classes determined by thin layer chromatography and a flame ionization detection system (Iatroscan MK-6, Iatron Laboratories). Integration software (Peak Simple 3.2, SRI, Torrance, CA, USA) was used

43 to analyze chromatograms of each lipid class. Total lipid was obtained by the summation of all lipid classes. Fatty acid methyl esters (FAMEs) were prepared according to a method described in Lepage and Roy (1984) by direct transesterification and analysed in full scan mode (ionic range: 50–650 m/z) on a Polaris Q ion trap coupled to a Trace GC ultra (Thermo Scientific) equipped with an autosampler model Triplus, a PTV injector and a mass detector model ITQ900 (Thermo Scientific). The separation was performed with an Omegawax 250 (Supelco) capillary column with high purity helium as a carrier gas. Data were treated using Xcalibur v.2.1 software (Thermo Scientific). Methyl nonadecanoate (19:0) was used as an internal standard. FAMEs were identified and quantified by the use of known standards (Supelco 37 Component FAME Mix and menhaden oil; Supelco), and were further confirmed by mass spectrometry (Xcalibur v. 2.1 software).

3.3 Results and discussion

3.3.1 Predetermination of critical aspects of the production process A number of technical criteria can be determined upstream of the microalgae strain selection procedure (MSSP) to get more information about the characteristics sought in the selected species. Table 3.1 presents the choices that were made for the present case study designed to test the MSSP that was developed in our laboratory. We therefore assume that the more information that can be provided on each of these critical process parameters, the more accurate will be the outcome of the procedure. These choices can be dictated by the geographic localization of the eventual plant, the socioeconomic and environmental context or the technologies and knowledge available.

Table 3.1 Upstream determination of critical process parameters Process parameter Location of the plant Quebec – Canada Main product Biodiesel Secondary product Proteins (alimentation) Production system Bioreactors Harvesting method Natural settling Extraction technology Supercritical CO2 Strategy for continuous improvement Genetic engineering – mixo/heterotrophy

3.3.2 First stage of selection: from a 100 to 10 candidates In the first stage of selection, based on three unequivocal selection criteria, 10 microalgae strains were retained for further consideration (Table 3.2) from an initial list of >100 microalgae species (Annexe A) built from citations in the biodiesel oriented scientific literature, mainly the review papers, over the last five years. The three binary criteria used here were: 1- high lipid contents reported in the literature (>30% dry weight biomass), 2- mixo/heterotrophic potential and 3- availability in axenic culture collection in Canada or the U.S.. Determination of these criteria was made using the information presented in Table 3.1. High cellular lipids content is important and determines the proportion of the biomass available for conversion into biodiesel. Also, the selection of mixo/heterotrophic strains is oriented with the continuous improvements strategy. However, in these conditions, the risks of contamination of cultures by other microorganisms are greatly increased due to the presence of a dissolved organic carbon (DOC) source and therefore the need to start with axenic cultures. The ten microalgae strains retained for the second stage of selection were: Ankistrodesmus convolutus, Chlorella protothecoides, Chlorella vulgaris, Nannochloropsis oculata, Navicula pelliculosa, Nitzschia palea, Phaeodactylum tricornutum, Scenedesmus acutus, Scenedesmus obliquus and Schizochytrium limacinum.

Table 3.2 List of pre-selected strains. Specie Abbr Strain number Culture Fresh Marine . medium water Ankistrodesmus convolutus Ac CPCCa 309 BBM X Chlorella protothecoides Cp UTEXb 255 Proteose X Chlorella vulgaris Cv UTEXb 2714 Proteose X Nannochloropsis oculata No CCMPc 525 f/2 X Navicula pelliculosa Na CPCCa 552 CHU-10 X Nitzschia palea Ni CPCCa 160 CHU-10 X Phaeodactylum Pt CCMPc 632 f/2 + Si X tricornutum Scenedesmus acutus Sa CPCCa 10 BBM X Scenedesmus obliquus So CPCCa 5 BBM X Schizochytrium limacinum Sl ATCCd MYA-1381 790 By+ X a Canadian Phycological Culture Center b The Collection Culture of Algae at the University of Texas at Austin c National Center for Marine Algae and Microbiota d American Type Culture Collection

3.3.3 Second stage of selection: scoring the candidates The second stage of selection is defined by six criteria. A score between 0 and 10 was attributed to each strain (for each criteria), depending on their ability to fulfill the expectations raised by two indicators (Table 3.3). Once again, the determination of these criteria/indicators was made using the information presented in Table 3.1.

Table 3.3 Detailed description of scores attribution for each selected set of indicators of the six selection criteria.

Criteria Indicators Methods of points attribution

A. Productivity and 1. TAG productivity Proportional : 100% of points for quality of the main a productivity ≥ 17 mg L-1 d-1 product 2. Fatty acid profile Distance from the « green zone » (biodiesel) (Figure 3.1) B. Productivity and 1. Protein content in lipid Distance from the « green zone » quality of the rich culture (Figure 3.2) secondary product 2. Essential amino acids EAAI ≥ 1 = 5 pt (proteins) content EAAI ≤ 0.5 = 0 pt C. Adaptation to 1. Shear stress tolerance Proportional : 100% of points for cultivation system cells ≤ 10 µm (bioreactors) 2. Biofilm and aggregate Qualitative evaluation (see text production for details) D. Susceptibility to 1. Settling potential Proportional : 100% of points for harvesting and 100% recovery after 24h extraction methods 2. Susceptibility to SFE Composition of the cell wall (settling - SFE) (silicious = 5 pt, cellulose = 0 pt) E. Potential for process 1. Optimized genetic If available = 5 pt improvements transformation protocol If not = 0 pt (genetic engineering 2. Affordable DOC Proportional : 100% of points for - mixo/heterotrophy) sources ≥ 5 known source F. Environmental 1. Indigenous species Isolated in Canada = 5 pt, US = considerations 2.5 pt, others = 0 pt 2. Toxin production 0 points for toxin productive strains, 5 point for the others

3.3.4 Criterion A: Productivity and quality of the main product (Lipids) The data used to score the strains according to their triglycerides (TAG) productivity and suitability of their fatty acid (FA) profile for the production of biodiesel was obtained experimentally (Table 3.4). The TAG productivity was selected as indicator because this

46 class of neutral lipids is the favored biodiesel feedstock (Hu et al., 2008). Indeed, free fatty acids, sterols and phosphate group of the phospholipids makes these classes of lipids respectively uninteresting or problematic (saponification) to the transesterification step leading to biodiesel production (Pruvost et al., 2009). N. oculata presented the highest TAG productivity because it combined high biomass productivity, high lipid content of which a high proportion were TAGs, whereas S. obliquus, although it presented the highest lipid content (61.9% of the dry biomass) presented an average TAG productivity.

The FA profiles are also important lipid-related indicators for the stability of the biodiesel and they are presented in Figure 3.1 according to the triangular graph method of analysis developed by Ramos et al. (2009). According to this method, it is possible to determine if a given vegetable oil will produce a biodiesel that comply with the American (ASTM D6751) and European Standards (EN 14214). This is estimated by the proportions of saturated (SFA), monounsaturated (MUFA) and polyunsaturated (PUFA) fatty acids that compose the total FA pool. Indeed, the degree of saturation greatly affects some important physicochemical properties of biodiesel such as cetane number, oxidation stability and cold flow properties (Ramos et al., 2009). None of the strains presented a FA profile that fitted in the ―green zone‖ of the graph. However the diatoms N. palea and N. pelliculosa were the closest, followed by the two Scenedesmus spp..

Schizochitrium limacinum presented the less interesting lipid profile for biodiesel because of the low MUFA proportion, and this was supported by results obtained from the literature (Johnson & Wen, 2009). High proportion of PUFA make however this strain a good candidate for the production of omega-3 for the dietary supplement market, particularly docosahexaenoic acid (DHA).

Figure 3.1 Triangular graph showing the proportions (%) of saturated (SFA), monounsaturated (MUFA) and polyunsaturated (PUFA) fatty acids in the total lipid pool of the 10 preselected strains.

3.3.5 Criterion B: Productivity and quality of the secondary product (proteins) Williams and Laurens (2010) proposed that combining the production of microalgal biodiesel with proteins destined to human or animal feed would stimulate the profitability of the process. They also outlined the importance of considering two indicators: 1- propensity to accumulate lipids by conversion of carbohydrate instead of proteins and 2- essential amino acids content of the protein fraction of the biomass. Extraction method

48 optimization of these proteins from the defatted biomass is currently under investigation (Gerde et al., 2013).

An important amount of data is actually available in the scientific literature concerning the propensity of certain microalgae strain to accumulate lipids upon nitrogen depletion in the culture medium (Breuer et al., 2012; Griffiths et al., 2012; Illman et al., 2000; Mayers et al., 2013; Shifrin & Chisholm, 1981). During such an accumulation phase, when the lipid proportion of the biomass increases, this is done at the expense of the protein and/or carbohydrate cellular contents. Interestingly, it was observed that one or the other could be preferentially converted into lipids depending on the microalgae strain (Williams & Laurens, 2010). Unfortunately, no general trend related to species from the same phylum could be defined until now, and an evaluation needs to be done for each specie. Information about biochemical composition after a physiological stress induced by nitrogen starvation was therefore collected from the literature and presented in a triangular graph (Figure 3.2). It can be observed that most strain accumulated lipids at the expense of the protein fraction of the biomass. This is mainly related to the decrease in protein and chlorophyll synthesis in the absence of a nitrogen source (Breuer et al., 2012). This phenomenon is responsible for the reduction of the growth rate typically observed during the lipid accumulation stage. Therefore, in a microalgal biodiesel production process where proteins should be the secondary commercial product, the lipid accumulation phase, if necessary, should be triggered by other means than nitrogen starvation. Indeed, various other culture conditions, such as temperature, osmotic pressure, illumination conditions and nutrition mode, are also known to modulate the biochemical composition of microalgae (Li et al., 2010; Li et al., 2011; Liu et al., 2008; Oh et al., 2009; Salama et al., 2013).

Figure 3.2 Triangular graph showing the proportions (%) of lipids, proteins and carbohydrates in the biomass of 7 of the 10 preselected strains after nitrogen starvation.

Evaluation of the essential amino acids content of the protein fraction of the biomass was made using the essential amino acids index (EAAI) (Becker, 1994). This method is based on the assumption that the biological value of a protein is a function of the level of all the essential amino acids in relation to their content in a reference protein (egg). The test performed here considered the nine following essential amino acids: lysine, valine, isoleucine, leucine, threonine, phenylalanine, methionine and cysteine (as one), arginine and histidine. Amino acid profiles were obtained from the available literature (Becker, 1994; Brown, 1991; Daume et al., 2003; Habib et al., 2004; Pyle, 2008; Wei et al., 2011) and EAAI was calculated according to the following equation:

9 EAA = √(lystest/lysref x valtest/valref … x histest/hisref) where ―test‖ is the amount of the particular amino acid, as percentage of total amino acids, found in the literature for each strain, and ―ref‖ is the one of the reference protein. S. limacinum and N. pelliculosa presented the highest EAAI (>0.9) because of fair proportions of methionine and cysteine which are generally not very present in microalgal proteins (Becker, 1994).

3.3.6 Criterion C: Adaptation to cultivation system (bioreactors) Despite their higher initial construction costs, bioreactors offer many advantages over open pond systems such as lower evaporation rates and contamination risks as well as higher productivity rates and better control over various culture parameters and, consequently, over the quality of the end product (Jorquera et al., 2010; Norsker et al., 2011). Microalgae species to be cultivated in bioreactors should have high resistance to shear stress as vigorous agitation is often necessary in order to prevent gas buildup in the culture medium, and ensure homogeneous culturing conditions so the whole process operates at optimal conditions.

Evaluation of this resistance can be made by measuring the photosynthetic activity at different tip speed (Leupold et al., 2012) or determining the effect of shear force on growth and viability of the organism (Chisti & Flickinger, 2009). In all cases, key morphological and physiological cell characteristics greatly influence the tolerance to shear stress and small cell sizes and robust cell walls are normally favored (Table 3.4). However, these parameters can also greatly affect the efficiency of the lipid extraction method (see section 3.3.4). Also, strains forming large colonies are not fit for cultivation in bioreactors as they are more likely to produce biofilms and thus foul the systems. Therefore, benthic strains such as N, pelliculosa an N. palea were not considered good candidates for cultivation in bioreactors, whereas thick walled small N. oculata, Chlorella spp. and Scenedesmus spp. obtained the highest score.

Table 3.4 Experimental determination of culture parameters used to determine lipid and triglycerides (TAG) productivity of the 10 pre-selected strains. (DCW = Dry cells weight)

Duration Final cell Biomass Lipid Lipid TAG content TAG of culture concentration yield content productivity (% lipids) productivity (days) (x106 cells mL-1) (g L-1) (% DCW) (mg L-1 d-1) (mg L-1 d-1)

Ac 9 49 ± 9 0.63 ± 0.16 35 ± 11 25 20 ± 2 5 Cp 8 37 ± 2 0.40 ± 0.08 26 ± 7 13 9 ± 2 1 Cv 14 38 ± 2 0.45 ± 0.02 39 ± 6 12 19 ± 7 2 No 10 138 ± 3 0.44 ± 0.06 48 ± 11 21 79 ± 2 17 Na 9 6 ± 1 0.33 ± 0.08 6 ± 2 2 31 ± 8 ˂ 1 Ni 10 7 ± 1 0.13 ± 0.01 25 ± 3 3 70 ± 1 2 Pt 10 9 ± 1 0.62 ± 0.06 23 ± 2 15 77 ± 4 12 Sa 8 14 ± 1 0.26 ± 0.01 49 ± 6 16 35 ± 12 6 So 14 20 ± 3 0.37 ± 0.05 62 ± 11 16 37 ± 13 6 Sl 10 51 ± 6 0.84 ± 0.17 2 ± 1 2 16 ± 5 ˂ 1

3.3.7 Criterion D: Susceptibility to harvesting and extraction methods (natural settling - critical CO2) For the ―settling potential‖ and the ―susceptibility to supercritical fluid extraction (SFE)‖ indicators, the data used for the classification of strains was collected from the available literature on the subject (Griffiths et al., 2012; Halim et al., 2012; Levine et al., 2010; Mercer & Armenta, 2011; Wiltshire et al., 2000). Small size of the microalgal cells and high density of the aqueous broth can make harvesting of biomass an energy intensive stage (Molina Grima et al., 2003). Microalgae can be harvested by sedimentation, flotation, filtration and centrifugation (Gong & Jiang, 2011). According to the Stokes equation, the velocity (v) of free fall of a particle in an undisturbed gravitational field is given by:

v = 2gr2 Δp / 9η (Myers, 1999)

Thus, the separation efficiency of a system can theoretically be improved by: i) increasing the diameter (r) of the cells, ii) increasing the difference in density (Δp) of the cells vs broth, iii) decreasing the viscosity (η) of the broth and, iv) replacing the force of gravity (g) by a centrifugal force. Therefore, large microalgae cells (Table 3.5) will be generally harvested faster, and with less energy consumption. On the other hand, Griffiths et al. (2012) demonstrated that natural settling potential could be evaluated by measuring the percentage of biomass recovery after 24h of decantation. One important observation is that nitrogen starved cultures with higher lipid content had lower settling potential then their nutrient replete counterparts. S. limacinum and the diatoms N. palea and N. pelliculosa obtained the highest scores because of a large cell size and propensity to form aggregates, respectively.

Table 3.5 Key morphological and physiological cell characteristics of the preselected strains.

Specie Phyllum Class Cell caracteristics Size Shape Wall Ac Chlorophyta Chlorophyceae length: 1 - 2 µm, Elongated Cellulose width: 4 - 5 µm Sa Chlorophyta Chlorophyceae length: 2 - 4 µm, Elongated Cellulose width: 5 - 10 µm So Chlorophyta Chlorophyceae length: 2 - 4 µm, Elongated Cellulose width: 5 - 10 µm Cp Chlorophyta Trebouxiophycaea 2 - 6 µm Spherical Cellulose Cv Chlorophyta Trebouxiophycaea 5 µm Spherical Cellulose Na Heterokonta Bacillariophyceae length: 50 - 70 µm, Narrow linear Silicious width: 5 - 10 µm Ni Heterokonta Bacillariophyceae length: 50 - 70 µm, Narrow linear Silicious width: 5 - 10 µm Pt Heterokonta Bacillariophyceae length: 18 - 26 µm, Narrow linear Silicious width: 2 - 3 µm No Heterokonta Eustigmatophyceae 1 - 2 µm Spherical Cellulose Sl Heterokonta Thraustochytriaceae 7 - 15 um Spherical Theque (Bold & Wynne, 1985; Honda et al., 1998; Pan et al., 1996; Richmond, 2008; Wehr et al., 2002)

Conventional lipid extraction methods using organic solvents involve drying the biomass. This step constitutes the most energy intensive step of an eventual microalgal biodiesel industry in life-cycle analysis (Lardon et al., 2009; Sander & Murthy, 2010). Using solvent method at a large scale also requires additional energy input because the extracted lipids and solvent need to be separated by distillation (Gong & Jiang, 2011). In the present case study, the use of solvents would trigger the necessity for toxicology tests before the proteins could be considered as human or animal feed (Williams & Laurens, 2010).

SFE can operate in an aqueous medium and recuperation of the product could be done by flotation without toxic method associated. Due to its non-polar behaviour, CO2 is a bad solvent for polar compounds. CO2 is highly selective for non-polar lipophilic compounds like neutral lipids (Martinez, 2007). Cells crushing is therefore important as the cell wall is structurally composed of polar molecules which makes difficult the extraction of the internal compounds by supercritical CO2 (Mendes et al., 2003). Lipids recovery efficiency can thus be improved by up to 3-4 times by disrupting the cells. Unfortunately, with the thick cellulosic cell wall (Table 3.5), some of the most promising microalgae for biodiesel production, such as Nannochloropsis spp. and Chlorella spp. are difficult to rupture using industrially relevant cell disruption methods such as high pressure homogenization (Horst et al., 2012). On the other hand, diatom with a fully silicified cell wall might offer a positive resistance to mechanical disruption methods and increase the cellular rupture efficiency of such methods (Lee et al., 2012).

3.3.8 Criterion E: Potential for process improvement (genetic engineering – mixo/heterotrophy) Genetic engineering is becoming more common in microalgae and for some species of commercial interest such as Chlamydomonas reinhardtii, Phaeodactylum tricornutum, Chlorella vulgaris, Nannochloropsis gaditana and Scenedesmus obliquus optimized transformation methods are already available in the literature (Cha et al., 2012; Guo et al., 2013; Kindle, 1990; Radakovits et al., 2012; Zaslavskaia et al., 2000). In most cases, these manipulations aim at introducing a gene encoding for a protein of interest for the biopharmaceutical field; or an enzyme involved in the biosynthetic pathway of a compound to

54 55 modulate its productivity or its quality. The method most frequently used are electroporation and transfection by means of the bacterium Agrobacterium tumefaciens, but other techniques, such as particle bombardment and glass beads, have also shown some potential (Kirchmayr & Griesbeck, 2012). Some critical factors to consider are: 1 - the specificity of the microalgal genetic code, 2 - the choice of promoter sequences for optimal expression of the transgene, and 3 - the design of UTR sequences that evade negative regulatory mechanisms (Gimpel et al., 2013). Moreover, some interesting developments in our capacity to manipulate the microalgal chloroplastic and nuclear genomes may arise from the emerging field of synthetic biology (Georgianna & Mayfield, 2012; Gibson et al., 2010; O'Neill et al., 2012).

Mixo/heterotroph strains present the advantage to use one or many dissolved organic (DOC) carbon source to grow. In many cases, the presence of such DOC source allow increasing growth rate and biomass density, but it also considerably increases the risks of contamination by other microorganisms (Perez-Garcia et al., 2011b). Also, at the industrial scale, the costs associated with the DOC source can limit the potential of profitability of the whole process. Therefore, the potential to grow in mixo/heterotrophy on affordable DOC sources was evaluated according to the ability of a given strain to use a diversity of affordable and largely available DOC sources (Table 3.6). The Scenedesmus spp. and Chlorella spp. are the most studied for their potential for phycoremediation and use of various DOC sources.

3.3.9 Criterion F: Environmental considerations Industrial scale microalgae cultivation imply the evaluation of associated environmental impacts (Mercer & Armenta, 2011). Indigenous strain isolation from a given potential site present advantages such as adaptation of the strain to its environment and lower risk of new (potentially invasive) specie introduction in the ecosystem.

Table 3.6 Diversity of industrial wastewaters and affordable residual matters that can serve as DOC source for growth.

DOC source Reference

Ac Sodium acetate (Chu et al., 1995) Cp Corn powder hydrolysate; (Gao et al., 2010; Heredia-Arroyo et al., 2010; sweet sorghum, glycerol, Xu et al., 2006) sodium acetate Cv Brewery wastewater, Wheat (El-Sheekh et al., 2012; Farooq et al., 2013; bran, dry-grind Heredia-Arroyo et al., 2010; Lee, 2001; Liang ethanol thin stillage, soy et al., 2009; Mitra et al., 2012; Perez-Garcia et whey, sodium acetate, lactate, al., 2011a) glutamate, glycerol No Na Glycerol (Perez-Garcia et al., 2011b) Ni Pt Glycerol Sa Cheese whey, sugarcane (Girard et al., 2014; Shamala et al., 1982) molasses So Cheese whey; wheat bran; (Combres et al., 1994a; El-Sheekh et al., sodium acetate, Olive-oil mill 2012; Girard et al., 2014; Hodaifa et al., 2009; wastewater, poultry litter, fish Mandal & Mallick, 2011) pond discharges, municipal secondary settling tank Sl Glycerol, sweet sorghum (Ethier et al., 2011; Liang et al., 2010)

Table 3.7 Scores attributed to each preselected strains for each indicators of the six selection criteria.

Criteria Indicators Ac Cp Cv No Na Ni Pt Sa So Sl

A. Productivity and quality 1. TAG productivity 1.5 0.3 0.6 5 0 0.6 3.5 1.8 1.8 0 of the main product (biodiesel) 2. Fatty acid profile 1 0 1 1 3 3 1 3 3 0

B. Productivity and quality 1. Protein productivity - 1 0 1 0 0 1 - 0 - of the secondary product (proteins) 2. Essential amino acids content 0 2 3 3.7 4.1 - 3.4 - 3 4.3

C. Adaptation to cultivation 1. Shear stress tolerance 5 5 5 5 0 0 0 5 5 0 system (bioreactors) 2. Biofilm and aggregate production 5 5 5 5 0 0 5 5 5 5

D. Susceptibility to 1. Settling potential 2.7 1.3 1.3 3 5 5 2.1 4.3 4.3 5 harvesting and extraction methods (natural settling 2. Susceptibility to SFE 0 0 0 0 5 5 5 0 0 2.5 - critical CO2) E. Potential for process 1. Potential for genetic engineering 0 5 5 5 0 0 5 5 5 0 improvements (genetic engineering - 2. Affordable DOC source 1 4 5 0 1 0 1 2 5 2 mixo/heterotrophy) F. Environmental 1. Indigenous species 2.5 0 0 0 2.5 2.5 0 5 0 0 considerations 2. Toxin production 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

However, it involves time-consuming lab work (3 – 6 months). Genetic engineering also raises some environmental considerations (Enzing et al., 2012). Provenance of the preselected strains was evaluated according to information provided by the culture collection. Also, some microalgae species can produce toxins. For example, some Pseudo-nitzschia can produce domoic acid, the neurotoxin that causes amnesic shellfish poisoning (Pan et al., 1996). These toxins are high undesirable as they would contaminate the water used as growth medium and thus pose a potential threat to the environment. None of the strains evaluated here are known to produce toxins.

3.3.10 Relative importance of each criteria and final classification The last step of the MSSP consists in determining de relative importance (or weight) of each criterion using the Ulrich method (Ulrich & Eppinger, 2007). This part of the process is somewhat subjective and for a similar set of criteria/indicators, the results might vary from one user to the other. However, it allow the users to consider qualitative, circumstantial or other aspects, which should influence the outcome of the MSSP, and could not be considered otherwise such as: i) the current commercial value of the primary or secondary product; ii) flexibility in the choice of the production system, harvesting method or extraction technology to be used or, iii) short to long term plans for the process improvement strategies. Table 3.8 presents an example of the matrix that was filled by our team for a particular given context. The scores obtained by each strain for each criterion is then proportionated using their respective weight (%). Table 3.9 presents final scores and classification of strains. In our case, S. obliquus ranked first and this result is in line with recent studies showing the high potential of this specie for biodiesel production (Breuer et al., 2012; Griffiths et al., 2012; Mandal & Mallick, 2009).

58 59

Table 3.8 Relative importance of each criterion.

A B C D E F Total Weight % A X 5 4 4 5 3 21 23 B 2 X 3 3 4 3 15 16 C 3 3 X 3 5 3 17 18 D 2 2 3 X 4 3 14 15 E 1 2 2 2 X 3 10 11 F 3 3 3 3 3 X 15 16 Total: 92 100 5 - Much more important 4 - More important 3 - Equal importance 2 - Less important 1 - Much less important

Table 3.9 Final scores and classification.

Strain Final score /60 Final position So 40.0 1 Sa 38.6 2 No 36.6 3 Pt 33.6 4 Cv 32.9 5 Cp 30.0 6 Na 25.4 7 Ac 25.0 8 Sl 23.3 9 Ni 21.2 10

3.4 Conclusion

In conclusion, the multi-criteria MSSP presented here allows including a large number of parameters into the selection process, therefore optimizing the outcome of the procedure while also shedding light on certain aspect of the selected strain and points to be addressed in a particular geographical and technical context. This procedure could easily be used for the selection of microalgae strains for different commercial applications. Users of this MSSP should however keep in mind the incertitude brought in when using data collected from the literature as growth kinetics and biochemical compositions can greatly vary depending on culture conditions and even provenance of the particular strain. Therefore, depending on time and resources available, most critical indicators should be determined empirically.

CHAPITRE 4 Culture mixotrophe de l’algue verte Scenedesmus obliquus en présence de perméat de lactosérum pour la production de biodiesel

Avant-propos Auteurs et affiliation : Jean-Michel Girard : étudiant au doctorat, Université de Sherbrooke, Faculté de génie, Département de génie chimique et de génie biotechnologique. Marie-Laine Roy : étudiante à la maîtrise, Département de biologie, chimie et géographie, Université du Québec à Rimouski Mhammed Ben Hafsa : étudiant à la maîtrise, Département de biologie, chimie et géographie, Université du Québec à Rimouski Jonathan Gagnon : professeur, Département de biologie, chimie et géographie, Université du Québec à Rimouski Nathalie Faucheux : professeure, Université de Sherbrooke, Faculté de génie, Département de génie chimique et de génie biotechnologique. Michèle Heitz : professeure, Université de Sherbrooke, Faculté de génie, Département de génie chimique et de génie biotechnologique. Réjean Tremblay : professeur, Institut des Sciences de la Mer, Rimouski (Qc). Jean-Sébastien Deschênes : professeur, Département de mathématiques, informatique et génie, Université du Québec à Rimouski.

Date d’acceptation : 17 mars 2014

État de l’acceptation : Version finale publiée

Revue : Algal Research, 5(0), 241-248

Référence : (Girard et al., 2014)

Titre français : Culture mixotrophe de l‘algue verte Scenedesmus obliquus en présence de perméat de lactosérum pour la production de biodiesel

Contribution au document : Cet article contribue à la thèse en exposant d‘abord en détail la justification du choix du perméat de lactosérum comme source de DOC pour la culture de microalgues mixo/hétérotrophe à grande échelle. Par la suite, la particularité de deux espèces de microalgues du genre Scenedesmus de pouvoir utiliser le lactose comme source de DOC en conditions hétérotrophes, contrairement à deux espèces du genre Chlorella, est mise en lumière pour la première fois. Différents paramètres de culture et de mise à l‘échelle du procédé, tels que la détermination de la proportion optimale de perméat de lactosérum à intégrer au milieu de culture ainsi que l‘effet du mode nutritif sur la productivité et le profil lipidique de cultures de S. obliquus sont également testés à l‘échelle laboratoire.

Résumé français : L‘élaboration de stratégies de culture de masse de microalgues oléagineuses à faible coût est une étape clé pour le développement de la prochaine génération de biocarburants. Dans le présent travail, nous proposons une stratégie basée sur l‘utilisation du perméat de lactosérum (WP) comme source de carbone organique dissous (DOC) pour la culture mixotrophe de microalgues. D‘abord, nous démontrons que le lactose pur, principal constituant du WP (> 80 % des solides dissouts totaux), peut soutenir la croissance de Scenedesmus spp. dans des conditions de culture hétérotrophe (absence de lumière). La substitution de 40% (v/ v) du milieu de culture avec le WP a permis de stimuler considérablement la croissance de S. -1 - obliquus en mixotrophie (μmax = 1,083 ± 0,030 j ) et en hétérotrophie (μmax = 0,702 ± 0,025 j 1 -1 ) comparativement aux cultures témoins photoautotrophes (μmax = 0,267 ± 0,083 j ). Une réduction significative de la concentration en lactose a été observée au cours de la croissance, tandis que les concentrations de galactose et de glucose ont augmenté dans le milieu de culture. Enfin, des analyses ioniques du milieu de culture ont montré l'épuisement de l'azote extracellulaire (nitrate et ammonium), tandis que les analyses lipidiques ont montré une accumulation de lipides neutres (NL) accompagnée d‘une augmentation du pH (> 9,5) seulement en conditions photoautotrophes. Une méthode simple et rapide pour l‘estimation du contenu cellulaire en NL est également décrite.

Mixotrophic Cultivation of Green Microalgae Scenedesmus obliquus on

Cheese Whey Permeate for Biodiesel Production

Jean-Michel Girard1,3,4, Marie-Laine Roy2, Mhammed Ben Hafsa2, Jonathan Gagnon2,

Nathalie Faucheux1, Michèle Heitz1, Réjean Tremblay3, Jean-Sébastien Deschênes4

1 Département de Génie Chimique et Génie Biotechnologique, Université de Sherbrooke

2500, boul. de l‘Université, Sherbrooke (Québec) Canada, J1K 2R1;

2Département de biologie, chimie et géographie, Université du Québec à Rimouski, 300, allée

des Ursulines, Rimouski (Québec) Canada, G5L 3A1;

3Institut des Sciences de la Mer,

310, allée des Ursulines, Rimouski (Québec) Canada, G5L 3A1;

4Département de mathématiques, informatique et génie, Université du Québec à Rimouski, 300,

allée des Ursulines, Rimouski (Québec) Canada, G5L 3A1;

Abstract Microalgae mass cultivation for biodiesel production might very well become the next marketable biofuel. The main challenge to overcome however is the development of high efficiency strategies for the large-scale production of oleaginous microalgae at low costs. In the present work, the use of cheese whey permeate (WP) in mixotrophic microalgae cultures is proposed. Pure lactose, the main constituent of WP (>80% w/w of the total dissolved solids), can support Scenedesmus growth under heterotrophic culture conditions (absence of light). Substituting 40% (v/v) of the culture medium with WP significantly stimulates Scenedesmus −1 obliquus growth under mixotrophic (μmax= 1.083 ± 0.030 day ) and heterotrophic (μmax= −1 0.702 ± 0.025 day ) conditions, compared to photoautotrophic control cultures (μmax= 0.267 ± 0.083 day−1). As growth occurs in the presence of lactose, a significant reduction of its concentration is observed,while the galactose and glucose concentrations actually increase in the culture medium. Culture medium analyses showed complete exhaustion of extracellular nitrogen (nitrate and ammonium), while intracellular lipid analyses showed neutral lipid (NL) accumulation, particularly under conditions of high pH (>9.5). Photoautotrophic control cultures accumulated more lipids (per dry weight) than WP-supplemented cultures, an aspect which is discussed in the context of lipid enrichment strategies. A fast and simple method for NL cellular content estimation is also described.

Keywords: Microalgae, Mixotrophy, Lactose, Whey permeate, Biodiesel, Neutral lipid content estimation

4.1 Introduction

Microalgae are largely under investigation for their ability to produce oils for a variety of markets (Spolaore et al., 2006). Marine species usually contain large amounts of polyunsaturated fatty acids (PUFA) and are often good candidates for the production of the following -3 fatty acids: arachidonic acid (ARA), eicosapentaenoic acid (EPA) and docosahexaenoic acid (DHA) for the aquaculture and human food supplement industry (Khozin-Goldberg et al., 2011). Freshwater species, on their behalf, mainly accumulate saturated fatty acids (SFA) and monounsaturated fatty acids (MUFA). These can often be transformed into high quality biodiesel or even jet fuel (Mata et al., 2010). In particular, triglycerides (TAG) are a class of neutral lipids (NL) that can be converted into fatty acid methyl esters (FAME) through transesterification, a catalytic reaction that involve alcohols (Peterson et al., 1991; Ramos et al., 2009). FAME is a source of biodiesel compatible with most conventional diesel engines, thus could readily replace fossil diesel sources. However, the high costs of microalgae production still hinder the advent of this product (Wijffels & Barbosa, 2010).

A significant advantage of microalgae-produced biodiesel is that it limits the net amount of carbon dioxide (CO2) emitted into the atmosphere (Williams & Laurens, 2010). This advantage has yet to be supported by more efficient industrial processes allowing the production of large amounts of microalgal biomass at lower costs. Mixotrophic growth, for some microalgae species, can significantly improve biomass productivity (acting on both the maximum cell density and growth rate), thus lowering the production costs (Bhatnagar et al., 2011; Santos et al., 2011). In this nutrition mode, the microalgae may assimilate different dissolved organic carbon (DOC) sources in addition to the inorganic carbon (CO2) fixed through photosynthesis (Chojnacka & Marquez-Rocha, 2004). For example, a 10-fold increase in EPA productivity has been observed under mixotrophic conditions (glycerol as the DOC source) with the marine diatom Phaedactylum tricornutum (Ceron-Garcia et al., 2000). Glucose is also often used as a carbon source for mixotrophic cultivation of various microalgae as it is easy to assimilate: numerous microalgae species including Scenedesmus obliquus and Chlorella protothecoides can grow on this substrate (Abeliovich & Weisman,

1978; Heredia-Arroyo et al., 2010). Although its use is pertinent for research, this DOC source would however be too expensive to depend on for an actual (economically viable) biodiesel production process.

The present work therefore investigates the possibility of integrating microalgae biomass production into an existing industrial production cycle: the dairy products industry. While microalgae can help eliminate phosphorus, nitrogen and sugars from different industrial effluents, the equipment and expertise already available on site (in most dairy product factories) could readily be used for microalgae production. As of fundamental concern, mixo/heterotrophic culture conditions require good control of bacterial populations (Verma et al., 2010), thus it is necessary to pre-process the DOC source. In a cheese factory for example, large amounts of whey are produced and passed through ultrafiltration devices to separate the proteins from other constituents, leaving mainly lactose. The costs of this ultrafiltration step are well compensated by the high-value of the whey proteins on the human food supplement market (~ 30$ kg-1 dry weight). The remaining lactose concentrate (or whey permeate, WP), is likewise free of contamination and could readily be used as a source of carbon (plus other nutrients) for microorganism cultivation. Presently, WP is often used directly for livestock feed without significant profit, or on occasion dried by a rather energy consuming process to produce lactose powder with low market value (Prazeres et al., 2012). As the number of people subject to lactose intolerance increases, the demand for such a product seems an unlikely growth market. Therefore, the hypothesis whether the lactose-rich WP could serve as a DOC source for feeding microalgae in a biodiesel production process merits further investigation, complementarily to the work presented in (Luo et al., 2011; Silva et al., 2010).

To that end, as WP is mainly composed of lactose, the hypothesis whether pure lactose can support and/or stimulate growth of the Scenedesmus and Chlorella microalgae strains is first evaluated. These freshwater species are selected since they are known to exhibit endogenous β-galactosidase activity (Davies et al., 1994). They could also easily be produced as mass cultures and have good lipid profiles for biodiesel (Mandal & Mallick, 2009; Shen et al., 2010). The specific objectives of this the study are thus: 1) to select a microalgae strain capable to use lactose for growth, 2) to quantify the growth and lactose consumption rates by

67 microalgae in the presence of WP for both mixotrophic and heterotrophic conditions and 3) to analyze NL content and the fatty acids profile under culture conditions that emulate a realistic industrial (scaled-up) implementation.

4.2 Materiel and methods

4.2.1 Culture maintenance and medium Scenedesmus obliquus and Scenedesmus acutus strains were obtained from the Canadian Phycological Culture Center in Waterloo, Canada (CPCC 5 and CPCC 10). The Chlorella vulgaris and Chlorella protothecoides strains were obtained from the University of Texas at Austin algae collection (UTEX 2714 and UTEX 255). All cultures were kept in heat sterilized (121°C, 15 min) Bold‘s Basal Medium (BBM), with an adjusted pH of 6.8 (Stein, 1973). For C. protothecoides, 1 g L-1 of soy protein peptone (Sigma-Aldrich) was added to the medium (BBMP). All manipulations were done under sterile conditions in a laminar flow biological hood and axenic culture conditions were confirmed periodically, at least at the beginning and end of each culture as follows: samples were fixed with glutaraldehyde (0.1 % v/v) and analyzed using an Epic Altra flow cytometer (Beckman Coulter Inc., Fullerton, BC, CA) fitted with a 488 nm laser operated at 15 mW under a flow rate of 60 microliters per minute. Data were analyzed with the Expo32 v.1.2b software (Beckman Coulter Inc., Fullerton, CA). Heterotrophic bacteria were quantified in diluted samples stained with SYBR Green I nucleic acid bounder (Molecular Probes Inc., OR, USA), and were separated according to their nucleic acid content (LNA and HNA for low and high nucleic acid, respectively) (Tremblay et al., 2009).

A concentrate of pure D-lactose monohydrate (Sigma-Aldrich) was prepared in BBM medium at 100 g L-1, filtered on 0.2 µm syringe filters, and then diluted to the desired concentration before inoculation. Cheese WP was received from a dairy transformation plant in Quebec, Canada (shipped on ice). Upon reception, the pH of the WP was 6.2 ± 0.1 (Table 4.1).

Neutralisation tests were performed with 1M NaOH and 1M Na2CO3 solutions, which led to the formation of a white precipitate possibly due to calcium phosphate precipitation. To avoid potential problems or influencing the results, no pH adjustments were further made to the WP

68 solution, which was used directly in the cultures while ensuring rigorous pH monitoring during experimentation. Natural lake water (LW) from the Lac-St-Jean (Latitude 48.4666 Longitude -71.8180; QC, Canada) was obtained, sampled on July 1st 2011, 30 m from the lakeside. All these solutions were filtered (0.2 µm filters) and stored at 4°C until further use. Detailed chemical analyses of each solution are provided in Table 4.1.

Table 4.1 Chemical characteristics of solutions used as medium broth. All values are means±SD (n=3). Parameter Cheese whey Bold’s Basal Natural Lake permeate (WP) Medium Water (LW) (BBM) pH 6.2 ± 0.1 6.8 ± 0.1 6.8 ± 0.1

Total sugars (g L-1) 73.8 ± 5.5 - - Lactose (g L-1) 72.4 ± 5.6 - - Galactose (g L-1) 1.00 ± 0.04 - - Glucose (g L-1) 0.40 ± 0.04 - -

Anions (ppm) Chloride (Cl-) 2586 ± 62 43 ± 1 0 - Nitrite (NO2 ) 0 0 0.30 ± 0.42 - Nitrate (NO3 ) 0 204 ± 1 0 3- Phosphate (PO4 ) 2364 ± 66 191 ± 1 0 2- Sulfate (SO4 ) 302 ± 32 41 ± 1 0

Cations (ppm) Sodium (Na+) 1365 ± 141 130 ± 3 0.11 ± 0.15 + Ammonium (NH4 ) 194 ± 22 0 0 Potassium (K+) 2525 ± 172 90 ± 1 1.70 ± 0.22 Magnesium (Mg2+) 266 ± 28 13 ± 1 0.54 ± 0.76 Calcium (Ca2+) 808 ± 56 10 ± 1 1.99 ± 1.87

4.2.2 Experimental design Erlenmeyer flasks were incubated on an orbital shaker at 120 rpm (C1 platform shaker, New Brunswick Scientific, Edison, NJ, USA) under constant temperature (22.5°C) and light intensity of 100 µmol m-2 s-1 (when applicable), measured on the external surface of the flasks using a Q201 quantum radiometer (Macam Photometrics Ltd., Livingston, Scotland). The initial cellular concentration for each experiment was set to 1 x 106 cells mL-1 (day 0), using

69 manual cell counts on a haemocytometer. All experiments were performed in three replicates (n = 3).

4.2.3 Microalgae strain selection for lactose conversion S. obliquus, S. acutus, C. vulgaris and C. protothecoides were grown in triplicate under heterotrophic conditions (continuous darkness) in 20 mL of sterile BBM (or BBMP for C. protothecoides) containing 5 g L-1 D-lactose monohydrate in 50 mL Erlenmeyer flasks. Photoautotrophic control cultures were grown in identical conditions (also in triplicate), except for the absence of lactose in their culture medium. Samples were taken at days 6 and 13 post- inoculation to determine the cellular concentration through manual cell count using a haemocytometer.

4.2.4 WP use and growth optimization Partial substitution of the BBM medium with WP in S. obliquus cultures was tested in various proportions (5, 10, 20, 40, 60 and 80% WP (v/v)) under mixotrophic conditions. Results showed increased growth up to 40% substitution (data not shown). Higher initial WP concentrations prompted a significantly longer lag phase, possibly due to substrate inhibition at low cell concentrations (Chen, 1996). Thus for the mixotrophic and heterotrophic treatments, 80 mL of sterile mixture (60% BBM and 40% WP v/v) were used in 250 mL Erlenmeyer flask for the experiments (13 days duration). Photoautotrophic treatment used 80 mL of sterile BBM only (no DOC source).

The photoautotrophic and mixotrophic cultures were kept under continuous illumination, while the heterotrophic cultures were kept in the dark. All experiments were performed in triplicate. Every day the cultures were sampled to monitor growth. Biomass concentration was estimated by measuring absorbance at 750 nm with a fixed wavelength DU640 UV-visible spectrophotometer (Beckman Coulter Inc., Fullerton, BC, CA) in 1 cm test tubes. Cultures were diluted (1/10) with distilled water to keep readings in the interval 0 to 1.2. Biomass yield was analyzed using dry weight (DW) measurements. Cells were washed 3 times at 4°C with an equivalent volume of distilled water to get rid of excess sugars (centrifuged 5 min at 1500 g between each washing). Culture samples were then filtered on 24 mm glassfiber filter (GF/C,

Whatman Ltd, Maidstone, UK) and dried 24h at 70°C. A good linear regression fit was obtained (R2 value of 0.9953) between the dry weight and absorbance measurements at 750 -1 nm, which was observed for dry weights ≤ 2.0 g L and OD750nm ≤ 0.5767. Specific growth rate (µ d-1) was calculated from the increase in cell density according to the equation µ = ln -1 (X2/X1) / (t2-t1), where X is the biomass yield (g L ) and t is the time in units of days. Cultures were sampled at days 0, 3, 7, 10 and 13 for sugar and ion analyses.

4.2.5 Lipid enrichment Lipid accumulation while growth occurs on WP was tested with different initial nitrogen levels (Table 4.1). S. obliquus was grown in triplicate on 150 mL of sterile BBM, BBM + WP (60% and 40% v/v, respectively) and LW + WP (60% and 40% v/v, respectively) media in 250 mL Erlenmeyer flasks. All cultures were kept in 16h: 8h light-dark regimes with air bubbling at an aeration rate of 0.3 L min-1. Samples were taken at days 7 and 13 for growth and lipid analyses.

4.2.6 Analytical methods Sugar analysis Culture samples were centrifuged (1500 g, 5 min) and the supernatants were transferred in other tubes before freeze-drying. Lyophilized material was analyzed as described in (Girard et al., 2013) by GC-MS.

Ion analysis Culture samples (1 mL) were centrifuged (10 000 g, 15 min) and the supernatant fraction was stored at -20°C until analysis. The analytical procedure was performed with an Ion Chromatography System (ICS-1000, Dionex Corporation, Sunnyvale, CA) equipped with a high-pressure isocratic pump and conductivity detector (DS6) set to 35°C. Volumes of 25 L were injected. Cation analyses were performed with a security guard cartridge (IonPac CG12A 4 × 50 mm) coupled to the analytical column (IonPac CS12A, 4 x 250 mm). The eluent was 20 mM methylsulfonic acid and a flow rate of 1.0 mL min-1 was used throughout the analysis (15 min per run). Suppressor (CSRS Ultra II, 4 mm) current was set to 59 mA. Anion analyses were performed with a pre-column (IonPac AG14A, 4 × 50 mm) coupled to the analytical

column (IonPac AS14A, 4 x 250 mm). An aqueous solution of 8 mM Na2CO3 and 1 mM -1 NaHCO3 was used as eluent at a flow rate of 0.8 mL min . The total run time of each sample was 18 min. Suppressor (ASRS Ultra II, 4 mm) current was set to 45 mA. Calibration curves + + + were used to quantify the major ions: sodium (Na ), potassium (K ), ammonium (NH4 ), 2+ 2+ - - - magnesium (Mg ), calcium (Ca ), chloride (Cl ), nitrite (NO2 ), nitrate (NO3 ), phosphate 3- 2- (PO4 ) and sulfate (SO4 ), and all samples were diluted so their concentration would fall within the boundaries of theses curves. The chromatograms were monitored and integrated by the Chromeleon® software version 6.8.

Intracellular lipid analysis Culture samples were filtered on 24 mm glass-fiber filters (GF/C, Whatman Ltd, Maidstone, UK) and the lipids were extracted using a dichloromethane:methanol (2:1 v/v) solution, following the Folch procedure (Folch et al., 1957). Extracts were subdivided into two subsamples: one for fatty acids profile characterization on total lipids and the other for fatty acids characterization of NL (reserve lipids, mainly TAG) after separation from polar lipids (structural lipids, mainly phospholipids) by column chromatography on silica gel micro- columns (30×5 mm I.D. Kieselgel 70–230 mesh Merck) using chloroform: methanol (98:2, v/v) to elute NL (Marty et al., 1992). Fatty acid profiles were determined on FAME obtained by esterification using sulphuric acid:methanol (2:98, v/v) in toluene. FAME were concentrated in hexane before analysis by GC-MS (Thermo Fisher Scientific Inc., GC model Trace GC Ultra and MS model ITQ900) equipped with a Supelco Omegawax 250 capillary column (30 m × 250 µm × 0.25 µm film thickness). Initial oven temperature was 100oC for 2 min, then 140oC for 1 min and was increased at a rate of 10oC min-1 until it reached 270oC. Injector temperature was 90oC and a constant helium flow of 1.0 mL min-1 was used. Volumes of 1 µL were injected. Fatty acids (FA) were identified by comparing the retention times and mass spectrum with known standards (Supelco 37 Component FAME Mix; Supelco Inc., Belfonte, PA, USA) with the use of Xcalibur v.2.1 software (Thermo Fisher Scientific Inc., Mississauga, ON, CA).

4.2.7 Data analysis For evaluating the ability of the microalgae strains to use lactose (Figure 4.1), the cellular concentrations obtained at day 13 were analyzed using Student‘s t-test. The effects of WP supplementation on S. obliquus growth (Figure 4.2 - A) were evaluated through mixed-model analyses of variance (ANOVA) performed on culture absorbance at 750 nm for all three trophic culture conditions (photoautotrophy, mixotrophy and heterotrophy). The results at two different time conditions (days 6 and 13) were used as repeated measures. Maximum specific -1 growth rates (µmax d ) were evaluated by one way ANOVA with the trophic condition as treatment. Dissolved sugar contents of the culture media were analyzed by mixed-model ANOVA and the results obtained at two different time conditions (days 3 and 13) were used as repeated measures. Mixed-model ANOVA was also performed on the lipid enrichment results to evaluate the temporal variation (between days 7 and 13) in cellular total lipid content (mg g- 1 dry weight), % saturated fatty acids (SFA), % monounsaturated fatty acids (MUFA), % polyunsaturated fatty acids (PUFA) and neutral lipids (NL) ratio to total lipids (TL) for the microalgae grown in three different medium formulations (BBM, BBM + WP, LW + WP). When variations were noted, a posteriori Student-Newman-Keuls (SNK) multiple comparison tests were conducted to determine whether the difference in the results was statistically significant. Normality was verified by a Shapiro-Wilk test. When necessary, data were log+1 or arcsine square-root (for % data) transformed to achieve homogeneity of variances. Analyses were carried out using SAS v.9.2 software (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).

4.3 Results and discussion

4.3.1 Microalgae strain selection Four microalgae strains (Scenedesmus obliquus, Scenedesmus acutus, Chlorella vulgaris and Chlorella protothecoides) were identified as potential candidates for WP conversion (mainly lactose), based on their endogenous β-galactosidase activity (Davies et al., 1994), their ability to accumulate high lipid contents and their well-adapted fatty acid profiles for biodiesel production (Gouveia & Oliveira, 2009; Mata et al., 2010). They were cultivated in the presence of pure D-lactose monohydrate under strict heterotrophic conditions for comparison. Results in Figure 4.1 clearly show that only the Scenedesmus strains were able to grow in the 5

73 g L-1 pure lactose-supplemented medium: both cultures showed significant differences relative to their respective control cultures at day 13 of the experiment (T(4) = -8.66, p < 0.001 and T(4) = -6.24, p = 0.003, respectively). S. obliquus cultures reached the highest cellular concentrations (25 ± 4 x 106 cells mL-1). To our knowledge, it is only the second time that lactose is shown to support Scenedesmus‘s growth (Samejima & Myers, 1958). Similar utilization of lactose was observed in certain plant cell suspensions (Callebaut et al., 1990; Frick & Morley, 1995; Hérouart et al., 1991). Since C. protothecoides cannot assimilate nitrate (Huss et al., 2002), soy protein peptone was added to the BBM medium (BBMP) so it would support its growth in photoautotrophic conditions. In heterotrophic conditions, results showed that lactose did not support the growth of either of the Chlorella spp.: no significant difference has been observed between the controls and the lactose-supplemented cultures.

4.3.2 WP use and growth optimization Substituting 40% (v/v) of BBM with WP led to important growth stimulation in S. obliquus cultures under both mixotrophic and heterotrophic conditions (Figure 4.2 - A). Culture growth was estimated using absorbance (at 750 nm) and dry weight measurements. Under mixo- and heterotrophic conditions, pH remained stable over the whole experiment at an average value of 6.4 ± 0.1. Mixotrophic conditions induced rapid growth stimulation until day 6, after which it considerably slowed down to a somewhat stationary growth phase. Heterotrophic conditions induced moderate though sustained growth stimulation until day 13. At that time, absorbance measurements were 636% and 575% (respectively for the mixotrophic and heterotrophic conditions) that of photoautotrophic cultures. A significant interaction between time and treatments was observed (F(2, 12) = 387.30, p < 0.0001).

Dry weight (DW) measurements were performed for the mixotrophic and heterotrophic WP supplemented cultures throughout the experiment. The highest biomass yield was obtained in mixotrophic conditions, 3.6 ± 0.4 g L-1 DW after 13 days, versus 2.7 ± 0.2 g L-1 DW (also after 13 days) for heterotrophic cultures. A linear regression was performed between DW and absorbance data (Figure 4.2 - B). Different linear relationships were obtained for biomass concentrations above and below 2 g L-1. For this reason, only the values under 2 g L-1 were used for the linear regression equation. The correlation shift coincides with the decrease in growth observed from day 6 in the mixotrophic group. A similar phenomenon was also observed in Haematococcus pluvialis cultures in (Goksan et al., 2010), which was attributed to a change in the cellular state or cell contents due to variations in nutrient availability. These results further enforce the recommendation in (Griffiths et al., 2011) that correlating culture absorbance with dry weight (for standard curve generation) should only be done during the exponential and linear growth phases.

Figure 4.2 (A.) Absorbance at 750 nm and dry weight (DW) of S. obliquus cultures grown in photoautotrophy, mixotrophy or heterotrophy. For mixotrophic and heterotrophic conditions, 40% (v/v) of the Bold‘s basal medium (BBM) was substituted by cheese whey permeate (WP). Results are expressed as the mean±SD (n=3). (B.) Correlation between absorbance at 750 nm and dry weight for cultures ≤ 2 g L-1 or > 2 g L-1. Results are expressed as the mean±SD (n=3).

-1 In photoautotrophic BBM control cultures, the maximum specific growth rate (µmax d ) was reached at day 3 (0.267 ± 0.083), while it occurred at day 4 for both the mixotrophic (1.083 ± 0.030) and the heterotrophic (0.702 ± 0.025) groups. The mixotrophic conditions resulted in a significant increase of the growth rate (F(2, 6) = 179.94, p < 0.0001), which is consistent with other results found on S. obliquus in mixotrophic conditions (and various other DOC sources) (Combres et al., 1994b; Hodaifa et al., 2009; Mandal & Mallick, 2009; Mandal & Mallick,

2011). Another interesting observation in this case is that the maximum growth rate (µmax) obtained in mixotrophic mode corresponds approximately to the sum of the maximum growth rates obtained in the photoautotrophic and heterotrophic modes (µmixo = µphoto + µhetero). Similar observations can be found in the literature with other microalgae species also: Chlorella regularis, Chlorella vulgaris, Euglena gracilis, Haematococcus pluvialis and Spirulina platensis (Ogbonna et al., 2002).

4.3.3 Lactose hydrolysis from WP by S. obliquus Significant differences in the measurement of initial lactose concentration (at day 0) were observed between the two treatments (Figure 4.3 - A) despite an identical medium formulation. This could be due to 1) an incomplete solubilisation in the culture medium at the start of the experiment, 2) adsorption by freshly inoculated cells or 3) another phenomenon. Due to this unexplained difference, statistical significance of results in sugar concentrations was analyzed between days 3 and 13 of the experiment. Significant differences attributable to the trophic conditions and times were observed for each individual sugar (galactose : F(3, 4) = 1133.4, p < 0.0001; glucose : F(3, 4) = 872.6, p < 0.0001; lactose : F(3, 4) = 31.19, p = 0.0031). Heterotrophic conditions however showed no significant differences in lactose concentrations between days 3 and 13 (p = 0.0603). Also in this case, the glucose and galactose concentrations fell below the detection limit of the instrumentation between days 7 and 10 (Figure 4.3 - A), suggesting the monosaccharides were consumed by the microalgae.

Mixotrophic conditions showed a significant decrease in lactose concentration (-54.4%) between days 3 and 13 (p = 0.001). It was accompanied by an accumulation of galactose and glucose in the culture medium, suggesting extracellular hydrolysis of lactose. Such a phenomenon would make more glucose and galactose available to the cells (for growth),

77 though in this case these metabolites were mainly accumulated in the medium (up to 4.2 ± 0.1 g L-1 for galactose and 3.5 ± 0.2 g L-1 for glucose) while the onset of the stationary growth phase occurred (Figure 4.2 - A). Exhaustion of nitrogen (or other nutrient limitation) in the culture media would explain this occurrence (see section 3.2.2).

To assimilate lactose, living organisms have to synthesize a β-galactosidase enzyme to hydrolyze lactose into glucose and galactose and internalize the molecules through the adequate transmembrane proteins. In Escherichia coli, the lac operon is responsible for the expression and regulation of these enzymes as a function of lactose and glucose availability in its environment (Jacob & Monod, 1961). Certain plant and bacterial β-galactosidases can even be secreted outside the cell (Nie et al., 2013; Wen et al., 2008), resulting in a necessary internalization of the glucose and galactose molecules instead. In the microalgae Chlorella kessleri, transmembrane transporters HUP1 and HUP2 allow for this internalization to occur, but with different affinities for glucose and galactose (Stadler et al., 1995). Interestingly, some point mutations in the HUP1 gene (Q298N and N436Q) can modulate this affinity (Will et al., 1998). The ability of S. obliquus to grow on glucose suggests that a similar sugar transport mechanism is present in its genus (Mandal & Mallick, 2009). Although endogenous β- galactosidase activity has already been demonstrated in S. obliquus cultures (Davies et al., 1994), whether this enzyme can be secreted by these cells remains to be investigated.

Differences in lactose consumption rates between the mixo- and heterotrophic conditions may be explained by the different growth rates obtained. In both occasions, glucose and galactose began to accumulate as the biomass reached 2 g L-1 DW (day 7 for mixotrophy and day 13 for heterotrophy) which corresponds to the onset of a stationary phase for the mixotrophic group (Figure 4.2 - A). Also, different patterns of gene expression and metabolic regulation under mixo- and heterotrophic culture conditions could be responsible for this result. For instance, light regulates various cellular metabolisms, such as photosynthesis and glycolytic pathways (Perez-Garcia et al., 2011c). For instance, it was shown that for Chlorella sorokiniana grown in the dark, the metabolic flux of glucose was mainly being routed (90%) through the pentose phosphate pathway (PPP), while only 10% was routed through the Embden-Meyerhof pathway (EMP). In the presence of light, the opposite was actually observed (EMP was the main glycolytic pathway) (Yang et al., 2000 ).

Figure 4.3 Lactose, galactose, glucose (A.) and nitrogen (B.) concentrations in S. obliquus cultures grown under mixotrophic or heterotrophic conditions with 40% (v/v) cheese whey permeate (WP) substitution of the culture medium (BBM). Results are expressed as the mean±SD (n=3).

4.3.4 Nitrogen depletion + + + 2+ 2+ The media was sampled at days 0 to 4, 7, 10 and 13 for major ion (Na , K , NH4 , Mg , Ca , - - - 3- 2- - Cl , NO2 , NO3 , PO4 , SO4 ) analyses by ion chromatography. Nitrate (NO3 ) and ammonium + (NH4 ) concentrations fell below the detection limit of the method (< 1 ppm) from day 7 of the experiment for both the mixotrophic and heterotrophic cultures (Figure 4.3 - B). Under + mixotrophic conditions, NH4 was consumed more rapidly, probably due to a faster growth rate. Since nitrogen depletion coincided with the end of the exponential growth phase, such evidence points toward this nutrient to be the limiting factor. In most microalgae cultures, total consumption of nitrogen from the culture media is necessary before significant lipid accumulation (mainly NL) occurs: thus, the design of an industrial application should carefully consider the biomass yields before introducing nitrogen deficiency conditions (Dean et al., 2010; Gardner et al., 2011; Ho et al., 2012).

4.3.5 Lipid enrichment Several aspects of a realistic industrial implementation were considered in the design of this experiment. First, the culture volume in the shake-flasks was twice the usual volume, and an air bubbling system was added. The idea was to emulate the strategy used in larger tanks (with smaller surface-to-volume ratio) to avoid excessive CO2-O2 accumulation (Chen et al., 2011). A light-dark cycle (16h: 8h) was also imposed to reduce the operation costs versus continuous illumination. Finally, the BBM medium formulation was replaced by natural lake water (LW) composition, sampled from a lake that could serve as water supply for large scale microalgae culturing.

Cultures were sampled during linear (day 7) and early stationary growth phases (day 13) for dry weight and lipid analyses. Table 4.2 presents the global NL and TL productivities (mg L-1 day-1) at day 13 and biomass yields at days 7 and 13 for all three experimental conditions. Despite biomass yields 1.8 to 2.6 times higher, mixotrophic cultures resulted in lower NL productivities even when compared to the photoautotrophic control cultures. This is attributable to lower NL cellular contents at the time of the sampling (Table 4.3).

Table 4.2 Biomass yields at day 7 and day 13, and lipid productivity at day 13 of S. obliquus cultured in Bold‘s basal medium (BBM), BBM + 40% (v/v) whey permeate (WP) or lake water (LW) + 40% (v/v) whey permeate.

Biomass yield (g L-1) Lipid productivity (mg L-1 d-1) Day 7 Day 13 Total lipids Neutral lipids

BBM 0.7 ± 0.1 1.9 ± 0.1 36.9 ± 1.0 31.2 ± 2.1 BBM + WP 2.6 ± 0.1 4.9 ± 0.2 37.8 ± 4.3 19.2 ± 1.8 LW + WP 1.9 ± 0.1 3.5 ± 0.1 28.3 ± 6.0 17.6 ± 4.5

Results are expressed as the mean ±SD (n=3).

Fatty acid profiles (TL and NL fractions) are presented in Table 4.3 for each treatment. At day 7, the presence of PUFA was dominant for all treatment conditions, with stearidonic acid (18:4 n-3) as the main one. The relative proportion of each fatty acid class changed with time and the presence of MUFA, with oleic acid (18:1 n-9) as the main component, became dominant at day 13, again in all three situations. This increase in oleic acid is the result of NL accumulation between days 7 and 13: oleic acid was the prominent fatty acid of the NL fraction and an increase in the NL/TL ratio was observed for all treatments over this time interval. This ratio even reached 0.85 ± 0.08 in the photoautotrophic BBM control cultures at day 13. These cultures also showed the highest TL accumulation (249 ± 10 mg g-1 dry weight).

Differences in DOC and overall nutrient availability, growth stages, osmolality and pH could explain the more important NL accumulation in the photoautotrophic BBM control cultures than in WP supplemented cultures. As in section 3.2, the pH of these cultures remained stable over the whole experiment (6.1 ± 0.3) while in photoautotrophic cultures it raised rapidly to reach 9.7 ± 0.2 (in average) between days 7 and 13 of the experiment. High pH conditions combined with nitrogen deficiency have been known to induce TAG accumulation in Scenedesmus sp. (Gardner et al., 2011). Finally, higher NL accumulation was observed in LW + WP cultures (2.6 fold) compared to BBM + WP cultures (1.4 fold) between days 7 and 13 of the experiment. Lower initial nitrogen availability in LW could explain this difference.

Fatty acids profile analyses revealed good suitability of S. obliquus‘s oil for biodiesel production. The enrichment in SFA and MUFA fractions observed between days 7 and 13 has been favorable to this end, as biodiesel produced from these classes of fatty acids has better physicochemical properties (particularly cetane number and oxidative stability) than when produced from PUFA (Ramos et al., 2009). About the global availability and potential of whey as a DOC source for microalgal biodiesel production, there is currently over 150 M tons of whey produced each year globally, of which 4.9% (w/w) is lactose (Smithers, 2008). According to the results obtained here, these sugars could yield between 3.5 and 7 M tons of microalgal biomass and between 50 and 500 M gallons of microalgal biodiesel annually.

4.3.6 NL cellular content estimation Various methods are available to estimate NL cellular content (often expressed in mg g-1 DW). Nile Red Fluorescence is a widely used method which was proven successful with a good variety of microalgae species (Cooksey et al., 1987; da Silva et al., 2009; de la Jara et al., 2003). However, this method implies significant costs, time and manipulation, thus is not well adapted for industrial implementation. The NL cellular contents (Table 4.3) were therefore correlated with the culture absorbance at 540, 680 and 750 nm (Figure 4.4). The hypothesis is that for a given cell concentration, the difference in composition (lipids vs. proteins vs. carbohydrates) would result in different light absorption patterns, providing information that could be translated into an indication of the NL cellular content. Best correlation results (R2 = 0.82) were obtained with log transformed data at 680 nm wavelength. Differences in cell size, shape and organization may also greatly influence the cell‘s absorption/light scattering patterns, especially at 750 nm where light scattering is predominant. A particularity of S. obliquus cells (which individual size can vary from 4 to 12 µm) is their common organization in groups of four cells (or in pairs) depending on the growth stage. Despite these important changes in physiological patterns, the NL content (in mg g-1 DW) was estimated with relatively good accuracy simply by measuring the absorbance of S. obliquus cultures at 680 nm and 750 nm (R2 = 0.78). This suggests that the NL content is inversely correlated with the chlorophyll content, since chlorophyll a is known to absorb light at 680 nm (Kirk, (1994)). Whether this relation would be useful to estimate NL cellular content in other microalgae species is yet to be demonstrated.

Table 4.3 Total and neutral lipid fatty acid composition at day 7 and day 13 of S. obliquus cultures in BBM, BBM + 40% (v/v) whey permeate and lake water + 40% (v/v) whey permeateA

Day 7 13

BBM BBM + WP LW + WP BBM BBM + WP LW + WP Statistical analysis Total lipids (% molar) 16:0 21.9 ± 0.4 22.1 ± 0.3 22.8 ± 1.1 23.6 ± 0.2 21.7 ± 0.2 23.0 ± 0.2 18:0 1.0 ± 0.3 1.4 ± 0.1 1.0 ± 0.1 2.1 ± 0.1 2.4 ± 0.1 2.2 ± 0.2 16:1 TR 5.0 ± 0.3 5.5 ± 0.7 2.0 ± 0.2 4.5 ± 0.4 5.8 ± 0.4 17:1 2.5 ± 0.2 4.8 ± 0.4 7.1 ± 0.3 1.4 ± 0.1 3.7 ± 0.1 4.6 ± 0.3 18:1 n-9 27.1 ± 5.2 25.2 ± 2.0 22.4 ± 1.6 43.9 ± 1.0 29.3 ± 0.5 28.7 ± 0.4 18:2 n-6 8.8 ± 1.0 15.1 ± 1.5 18.7 ± 0.8 8.4 ± 0.8 17.4 ± 0.7 21.3 ± 0.4 18:3 n-3 2.2 ± 0.2 1.7 ± 0.1 1.3 ± 0.1 1.3 ± 0.1 1.3 ± 0.1 0.5 ± 0.1 18:4 n-3 34.4 ± 4.4 22.8 ± 0.2 19.4 ± 0.7 15.7 ± 0.2 17.7 ± 0.7 12.3 ± 0.5

c bc bc a b a Sum SFAs 24.0 ± 0.5 24.5 ± 0.4 24.9 ± 1.1 26.4 ± 0.2 25.1 ± 0.3 26.1 ± 0.3 t*trt (F(2, 12) = 4.17, p = 0.0421) d c c a bc b Sum MUFAs 30.2 ± 4.9 35.4 ± 1.4 35.3 ± 1.9 48.0 ± 0.9 38.0 ± 0.8 39.5 ± 0.3 t*trt (F(2, 12) = 20.64, p < 0.0001) a b b d bc c Sum PUFAs 45.8 ± 5.3 40.1 ± 1.6 39.7 ± 1.0 25.6 ± 1.1 36.9 ± 1.0 34.4 ± 0.3 t*trt (F(2, 12) = 23.26, p < 0.0001)

82 83

Neutral lipids (% molar) 16:0 20.6 ± 1.6 19.8 ± 0.1 21.6 ± 1.2 19.2 ± 0.5 18.1 ± 0.7 19.1 ± 0.3 18:0 2.1 ± 0.2 3.1 ± 0.1 2.8 ± 0.2 2.2 ± 0.1 3.5 ± 0.1 3.1 ± 0.1 16:1 4.5 ± 2.9 2.4 ± 0.4 2.5 ± 1.4 1.5 ± 0.1 2.8 ± 0.7 4.1 ± 0.2 17:1 0.9 ± 0.1 1.9 ± 0.3 3.6 ± 0.2 0.8 ± 0.1 2.0 ± 0.1 3.3 ± 0.1 18:1 n-9 51.2 ± 2.5 48.1 ± 2.4 34.9 ± 2.2 58.0 ± 1.0 46.5 ± 0.8 36.8 ± 0.1 18:2 n-6 4.8 ± 0.3 11.9 ± 1.8 20.1 ± 2.2 6.8 ± 0.6 16.1 ± 0.6 23.7 ± 0.3 18:3 n-3 1.0 ± 0.2 1.1 ± 0.1 0.8 ± 0.1 0.7 ± 0.1 0.9 ± 0.1 0.4 ± 0.1 18:4 n-3 11.6 ± 0.4 8.9 ± 0.7 10.1 ± 0.2 9.3 ± 0.1 7.9 ± 0.3 7.5 ± 0.3

Sum SFAs 24.1 ± 1.3 24.2 ± 0.6 26.2 ± 1.6 21.9 ± 0.5 22.6 ± 0.8 23.3 ± 0.4 t (F(1, 12) = 26.19, p = 0.0003); trt (F(2, 12) = 6.06, p = 0.0152) b c e a c d Sum MUFAs 58.4 ± 1.2 53.6 ± 0.5 42.3 ± 1.5 61.1 ± 1.0 52.2 ± 0.4 44.7 ± 0.2 t*trt (F(2, 12) = 4.63, p = 0.0323) Sum PUFAs 17.6 ± 0.4 22.2 ± 2.4 31.4 ± 2.3 16.9 ± 0.6 25.3 ± 0.4 31.9 ± 0.5 trt (F(2, 12) = 159.49, p < 0.0001)

Lipids (mg g-1 dry biomass) b bc c a b b Total lipids 109 ± 3 91 ± 7 78 ± 1 249± 10 99 ± 7 105 ± 25 t*trt (F(2, 12) = 54.39, (TL) p < 0.0001) bc c c a bc b Neutral lipids 46 ± 15 36 ± 6 25 ± 4 211 ± 27 50 ± 4 65 ± 18 t*trt (F(2, 12) = 44.52, (NL) p < 0.0001) cd cd d a bc b NL/TL 0.43 ± 0.14 0.40 ± 0.04 0.32 ± 0.05 0.85 ± 0.08 0.51 ± 0.04 0.62 ± 0.06 t*trt (F(2, 12) = 6.25, p = 0.0138) Results are expressed as the mean±SD (n=3). BBM : Bold‘s basal medium; LW : lake water; WP : whey permeate; SFA : saturated fatty acids; MUFA : monounsaturated fatty acids; PUFA : polyunsaturated fatty acids; T : time; trt : treatment; d.f. : degree of freedom A After mixed model repeated two-ways ANOVA, Student-Newman-Keuls (SNK) multiple comparison test results are arranged in decreasing order from left to right : a>b>c>d>e (effect of time (t) and treatment (trt), SNK test, P˂0.05).

Figure 4.4 Linear regression relating log neutral lipid (NL) cellular content in mg g-1 DW with log absorbance of cultures g-1 DW at 540 nm (A.), 680 nm (B.), 750 nm (C.) and 680 nm – 750 nm (D.).

4.4 Conclusion In conclusion, cheese whey permeate has been investigated as a potential DOC source for microalgae cultivation for biodiesel production. Evaluation of microalgae strains with an ability to use lactose for growth showed S. obliquus to be the most promising candidate. Substituting 40% (v/v) of the default culture medium (BBM) with WP resulted in higher specific growth rates and biomass yields under mixotrophic conditions than heterotrophic and photoautotrophic cultures. Mixotrophic growth alowed a 54.4% reduction in lactose concentration while during the stationary growth phase, an accumulation of glucose and galactose was observed in the culture medium, suggesting extracellular lactose hydrolysis by the microalgae. Future work is however necessary to optimize the biomass yields and lactose consumption, and determine the culture conditions that will allow increased NL productivity in S. obliquus WP supplemented cultures.

CHAPITRE 5 Modèles d'étalonnage FT- IR/ATR univarié et multivarié pour le suivi in situ des sucres dans un milieu complexe de culture de microalgues

Avant-propos Auteurs et affiliation : Jean-Michel Girard : étudiant au doctorat, Université de Sherbrooke, Faculté de génie, Département de génie chimique et de génie biotechnologique. Jean-Sébastien Deschênes : professeur, Département de mathématiques, informatique et génie, Université du Québec à Rimouski. Réjean Tremblay : professeur, Institut des Sciences de la Mer, Rimouski (Qc). Jonathan Gagnon : professeur, Département de biologie, chimie et géographie, Université du Québec à Rimouski

Date d’acceptation : 25 juin 2013

État de l’acceptation : Version finale publiée

Revue : Bioresource Technology, 144(0), 664-668

Référence : (Girard et al., 2013)

Titre français : Modèles d'étalonnage FT-IR/ATR univarié et multivarié pour le suivi in situ des sucres dans un milieu complexe de culture de microalgues

Contribution au document : Cet article contribue à la thèse en présentant une méthode innovatrice, simple et rapide pour effectuer le suivi des sucres dans un milieu de culture composé de perméat de lactosérum. Contrairement aux méthodes déjà existantes exploitant la spectrophotométrie infrarouge, la présente méthode permet de tenir compte du phénomène d‘additivité des spectres. Cette méthode pourrait être utilisée dans un procédé de culture de microalgues à l‘échelle industrielle ou encore à l‘échelle laboratoire par exemple dans le cadre de travaux portant sur l‘hydrolyse de polysaccharides par des cultures biologiques ou encore pour étudier la diauxie.

Résumé français : L'objectif de ce travail est de développer une méthode rapide et simple pour le suivi in situ des sucres dans des cultures biologiques. Une nouvelle technologie basée sur la spectrophotométrie infrarouge à transformée de Fourier couplée à une sonde externe composée d‘un câble de fibre optique avec à son extrémité un cristal à réflectance totale atténuée (FT-IR/ATR) a été utilisée, d'abord pour construire des modèles prédictifs à partir de solutions de sucres purs, et ensuite afin d'utiliser ces modèles pour effectuer le suivi des sucres dans un milieu complexe de culture de microalgues mixotrophes. Les résultats de quantification du modèle univarié ont été corrélées avec la teneur en solides dissous totaux (R2 = 0,74). Un modèle multivarié a également été développé après normalisation des données de calibration pour quantifier de manière proportionnelle les différents sucres présents dans le milieu de culture complexe. Ce modèle a montré une précision prédictive supérieure à 90% pour les sucres représentant plus de 20% du total. Ces travaux offrent une alternative aux méthodes de suivi des sucres classiques, et pourrait être utilisée pour un suivi in situ dans des systèmes de production à l'échelle commerciale.

FT-IR/ATR Univariate and Multivariate Calibration Models for in situ

Monitoring of Sugars in Complex Microalgal Culture Media

Jean-Michel Girard1,3,4*, Jean-Sébastien Deschênes3, Réjean Tremblay4, Jonathan

Gagnon2

1 Département de Génie Chimique et Génie Biotechnologique, Université de Sherbrooke 2500, boul. de l‘Université, Sherbrooke (Québec) Canada, J1K 2R1; 2Département de biologie, chimie et géographie; Université du Québec à Rimouski,

300, allée des Ursulines, Rimouski (Québec) Canada, G5L 3A1;

3Département de mathématiques, informatique et génie; Université du Québec à Rimouski,

300, allée des Ursulines, Rimouski (Québec) Canada, G5L 3A1;

4Institut des Sciences de la Mer, 310, allée des Ursulines, Rimouski (Québec) Canada, G5L 3A1

ABSTRACT The objective of this work is to develop a quick and simple method for the in situ monitoring of sugars in biological cultures. A new technology based on Attenuated Total Reflectance – Fourier Transform Infrared (FT-IR/ATR) spectroscopy in combination with an external light guiding fiber probe was tested, first to build predictive models from solutions of pure sugars, and secondly to use those models to monitor the sugars in the complex culture medium of mixotrophic microalgae. Quantification results from the univariate model were correlated with the total dissolved solids content (R2 =0.74). A vector normalized multivariate model was used to proportionally quantify the different sugars present in the complex culture medium and showed a predictive accuracy of > 90% for sugars representing > 20% of the total. This method offers an alternative to conventional sugar monitoring assays and could be used at-line or on-line in commercial scale production systems.

Keywords: FT-IR/ATR technology, microalgae, process monitoring, mixo/heterotrophy,

PLS model

5.1 Introduction

Industrial microalgae cultivation for the production of valuable compounds has tremendous potential and offers many advantages over yeasts and bacteria. In particular, the endogenous ability of these photosynthetic microorganisms to produce high-value chemicals for pharmaceutical and biofuel applications (Spolaore et al., 2006). However, this potential is still largely under study and numerous cultivation processes are actually under development (Bumbak et al., 2011). Some of these processes include a mixo/heterotrophic cultivation stage where a dissolved organic carbon (DOC) source is added to the culture medium, in order to enhance productivity. Such DOC sources may even originate from municipal or industrial waste (phytoremediation) or from low-cost residual matters (Liang et al., 2010; Mitra et al., 2012). As in the case of other microbiological cultures, process operation and optimization are largely dependent on the availability of efficient analytical tools and monitoring methods, ultimately leading to industrial applications.

The methods currently available for the tracking of dissolved sugars during microbial cultivation, such as gas and liquid chromatography (GC and LC) or colorimetric methods are time and energy consuming. Moreover, none of these methods are readily applicable for the on-line monitoring of sugars in biological cultures. Infrared (IR) spectrophotometry presents a simple and quick alternative, particularly in combination with attenuated total reflectance (ATR) technology (Hashimoto & Kameoka, 2000). Until recently, this technology was limited to offline measurements, as the samples were to be taken from the culture and introduced in a compartment of the spectrometer before the quantification would be performed. The recent advent of external probes in combination with optic fibers (1 to 4.5 m in length) now makes it possible to monitor the fate of various analytes in situ during laboratory or industrial scale biological/chemical processes.

In our preliminary work, Scenedesmus obliquus cultures productivity was shown to be highly stimulated by the addition of cheese whey permeate (WP) in the culture medium. 89

WP is an abundant source of saccharides, mainly lactose (> 95%). Monosaccharides like galactose and glucose and other oligosaccharides (3-10 monomers) are also present in small amounts (less than 3% of total sugars) in bovine milk and whey (Barile et al., 2009). Such experimental conditions are thus well adapted to test the potential of FT- IR/ATR technology for sugars monitoring in microalgae cultures (Solis-Oba et al., 2011). Our specific objectives were to 1) determine whether the presence of living cells in the medium influences the readings of the ATR probe and 2) monitor the sugars in a mixotrophic microalgae culture using FT-IR/ATR spectroscopy. We tested the hypothesis that univariate and multivariate calibration models built from the spectra of pure sugar solutions could be used to monitor the sugar composition of a complex culture medium.

5.2 Materials and methods

5.2.1 FT-IR measurements FT-IR absorbance spectra were acquired with a Bruker Matrix MF spectrometer equipped with an ATR diamond probe and a 1.5 m AgX optic fiber. All spectra were measured in the range between 4000-600 cm-1, at resolution of 4 cm-1 and using 32 scans. Distilled water was used as background and to clean the diamond probe between each sample. All measurements were realized at room temperature. The data was treated with the OPUS 6.5 software.

5.2.2 Univariate calibration model The calibration curve was realized using 8 different concentrations of pure D-lactose monohydrate dissolved in distilled water (5, 10, 20, 30, 40, 50, 60 and 70 g L-1). Spectra were the average of three separate replicates (n=3). Quantification of the lactose concentration was done from the integration of the absorption bands 1186-933 cm-1. Integration represents the area above a line drawn between the intensity values of the frequency limits specified.

5.2.3 Multivariate calibration model Duplicate spectra of 46 aqueous standard solutions (Table 5.1) made from various mixtures of pure D-lactose, D-glucose and D-galactose (Sigma-Aldrich) were obtained with proportions varying from 0-100%, 0-50% and 0-50%, respectively. In these samples, the total sugar concentration was kept constant at 100 g L-1. These spectra were used to build the partial least square (PLS-1) regression model (see section 3.2).

Table 5.1 Composition of the 46 aqueous solutions used to build the multivariate model. Total sugar concentration was kept constant at 100 g L-1.

Sample Lac% Glu% Gal% 1 38.00 42.50 19.50 2 67.89 2.66 29.45 3 72.64 11.94 15.42 4 26.50 24.50 49.00 5 42.71 47.24 10.05 6 23.00 38.00 39.00 7 70.77 29.11 0.12 8 46.56 49.06 4.38 9 47.10 9.30 43.60 10 28.00 28.50 43.50 11 73.60 3.37 23.03 12 64.30 4.80 30.90 13 79.91 16.98 3.11 14 16.00 34.50 49.50 15 29.50 46.50 24.00 16 50.50 21.00 28.50 17 30.00 39.00 31.00 18 48.45 9.10 42.45 19 82.98 16.00 1.03 20 27.00 31.50 41.50 21 29.00 42.00 29.00 22 78.39 9.63 11.98 23 57.00 28.00 15.00 24 50.00 37.00 13.00 25 32.50 26.50 41.00 26 86.00 8.01 5.99 27 25.37 47.26 27.36 28 70.15 12.94 16.92 29 39.50 25.00 35.50 30 62.22 0.15 37.63 31 26.63 40.20 33.17 91

32 69.49 24.50 6.01 33 65.55 28.52 5.92 34 74.40 0.13 25.47 35 50.50 13.50 36.00 36 23.50 35.50 41.00 37 26.87 45.77 27.36 38 69.58 20.52 9.89 39 84.47 2.54 12.99 40 50.00 24.50 25.50 41 54.75 4.57 40.68 42 12.00 47.00 41.00 43 14.07 44.22 41.71 44 71.04 22.51 6.44 45 20.00 32.00 48.00 46 100.00 0.00 0.00

5.2.4 Experimental procedure The experiment was conducted in triplicate (n=3) and lasted for 13 days. At day 0, media (74 mL) were inoculated with a green microalga Scenedesmus obliquus (CPCC 5) culture in exponential growth phase (6 mL) for an initial volume of 80 mL at an initial cell concentration of 1 x 106 cell mL-1 in 250 mL culture flasks. Initial composition of the complex culture medium was 60% (v/v) Bold‘s basal medium (BBM) + 40% (v/v) cheese whey permeate (WP). BBM (Stein, 1973) was heat sterilized (121°C, 15 min), while WP was sterilized by filtration (0.2 µm). Cultures were kept on an orbital shaker at 120 rpm (C1 platform shaker, New Brunswick Scientific, Edison, NJ, USA) at 22.5°C under constant illumination and light intensity of 100 µE m-2 s-1, as measured at the surface of the flasks using a Q201 quantum radiometer (Macam Photometrics Ltd., Livingston, Scotland). All manipulations were realized in a laminar flow hood and axenic culture conditions were confirmed by flow cytometry (Epic Altra, Beckman Coulter Inc., Fullerton, BC, CA) at the beginning and end of each experiment.

Medium sugars and total dissolved solids content (DSC) were analyzed daily by sampling 5 mL of culture. Triplicate FT-IR/ATR spectra were acquired directly for each sample, then centrifuged at 1500 g for 5 min and another triplicate FT-IR/ATR spectra was acquired. Fixed volume (4 mL) of this supernatant was taken and weighed. The culture

93 medium sample was then freeze-dried, and proportion of the total DSC determined (mg g-1 of culture medium). The weight average of all 4 mL samples was 4.07 ± 0.04 g for a culture medium density of 1017 ± 11 g L-1. Total DSC (in mg g-1) was converted in g L-1 by multiplication of culture medium density.

5.2.6 Sugar analysis using the GC-MS method Total DSC were silylated prior to gas chromatography. Lyophilized material (3 mg) and arabinose (1 mg) were dissolved in anhydrous pyridine obtained by distillation over calcium hydride (0.3 mL), and were treated with N,O- bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide (0.3 mL) containing 1% (v/v) of chlorotrimethylsilane under nitrogen atmosphere. The solution was heated to 70oC during 4 h. The solution was then allowed to reach room temperature and was evaporated to dryness with a nitrogen flow. The resulting white solid was dissolved in hexane (4 mL) and the solution was filtered before analysis by GC-MS (Agilent Technologies, GC model 6850 series II and MS model 5975B) equipped with a HP-5MS capillary column (30 m x 250 µm x 0.25 µm film thickness) with 5 % phenyl methyl siloxane. Initial oven temperature was 80oC for 5 min and was increased at a rate of 4oC min-1 until it reached 290oC followed by a post run at 300oC. Injector temperature was 250oC and a constant helium flow of 1.2 mL min-1 was used. A volume of 1 µL of sample was injected. Silylated arabinose was utilized as internal standard. Commercial sugars were used for calibration after silylation as described above.

5.2.7 Statistical analysis A repeated measures ANOVA with time between days 0 to 7 as repeated measure was performed to determine differences between sugar concentrations obtained with or without microalgae cells (before and after the centrifugation). The normality was verified by a Shapiro-Wilk test and the variances homoscedasticity through direct observations of residuals using the expected normal probability plot. Analyses were carried out using the software R (version 2.15.1).

5.3 Results and discussion

5.3.1 Sugar concentration monitoring using the univariate model As lactose is the major sugar (> 95%) present in our complex culture medium, the linear regression made from the integration of the region between 1186 and 933 cm-1 obtained from the IR spectra of pure lactose aqueous solution (Figure 5.1) was used as univariate model for the daily monitoring of the sugar concentration during the first 7 days of microalgae cultivation. Relative intensities and wavenumbers of the C-O, C-C and C-OH stretching bands (1186-933 cm-1) were unchanged during this period of time (Figure 5.2- A.).

Figure 5.1 Calibration curves of aqueous solutions made from pure lactose, glucose and galactose in the concentration range 5 – 70 g L-1.

Spectra of the culture media were acquired before and after a centrifugation step (5 min at 1500 g) in order to observe whether the presence of living cells in the medium influences the readings of the ATR probe (Figure 5.2-B.). ANOVA results indicated no significant interaction between presence of microalgae cells and time of culture (F(1) =

1.3, p = 0.25). The presence of cells by itself was not significant (F(1) = 0.7, p = 0.42), but the time of culture was strongly significant (F(1) = 137.7, p < 0.0001). Thus, living cells in the medium do not significantly influence the readings of the ATR probe, but the time of culture was related to a significant decrease of the sugar concentration in the medium. The reduction in sugar concentration between days 1 to 7 was correlated with the reduction in total DSC (R2 = 0.74). This result validates the predictive capacity of the univariate model.

Figure 5.2 Mid-infrared absorbance spectra (A) and sugar concentration in the culture media over 7 days (univariate model estimation from spectra acquired in presence (before centrifuge) or in absence (after centrifuge) of the cells) as well as total dissolved solids content and biomass density as measured gravimetrically (B).

5.3.2 Proportional monitoring of sugars using the multivariate model Culture medium samples from days 0 to 13 of the experiment were freeze dried and silylated before their analysis by gas chromatography coupled to a mass spectrometer (GC-MS) in order to determine sugar contents. This technique allows the characterization of complex saccharides mixtures with high sensitivity (Cerdán-Calero et al., 2012). Upon analysis of the chromatograms, lactose, glucose and galactose peaks were observed (Figure 5.3-A). Quantification was performed using calibration curves made from pure sugars solutions. The proportion of each individual sugar was then calculated and the sum of lactose + glucose + galactose was considered as the ―total sugar‖ fraction. Interestingly the proportion of the two monosaccharides increased over time with concomitant decrease in lactose concentration (Figure 5.3-B).

The PLS algorithm integrates the information contained in an IR spectrum by a simultaneous and mutually dependent factorization of both the spectral and quantitative information contained in the matrices of the calibration data set (Haaland & Thomas, 1988). Table 5.2 presents important calibration and prediction parameters of the PLS regressions developed from the IR spectra of aqueous mixtures of pure lactose, glucose and galactose (multivariate model). Vector Normalization (VN) was selected as data preprocessing method in order to eliminate the influence of the amplitude of the spectra. Indeed, a spectrum contains two parts of information: the amplitude of the band, reflecting the absolute concentration of the analytes, as well as the structure, reflecting the nature of the analytes present in the solution. VN preprocessing consists first in centering the spectra. Then, the sum of all square of all Y – values is calculated, and the respective spectrum is divided by the square root of this sum. The so-called vector norm of the resulting spectrum is thus always 1 (Conzen, 2006). To our knowledge, it is the first time that this type of data preprocessing is used to proportionally quantify the sugars present in a solution.

Figure 5.3 Gas chromatogram (A) and proportions of each sugar present in the complex culture medium (B) from days 0 to 13 as measured by the reference procedure (GC-MS).

Table 5.2 Summary of the main calibration and prediction parameters of the PLS regression developed for the determination of lactose, glucose and galactose. Proportions are expressed in % of total in a solution containing 100 g L-1 sugar.

Analyte Data Ranka RMSECVb Bias RPDc R2 preprocessing (%) (%) Lactose VNd 7 0.468 0.010 48.6 99.96 Glucose VNd 8 0.476 - 0.004 32.2 99.90 Galactose VNd 7 0.414 - 0.005 36.4 99.92 a Rank indicates the number of factors included in the model. b RMSECV stands for root mean square error of cross validation. c RPD stands for residual prediction deviation. d VN stands for vector normalization.

Selecting the appropriate number of factors (rank) to include in the PLS model is important as too few factors leads to insufficient spectra structure recognition (―underfitting‖) and too many leads to deterioration of the analysis by the inclusion of the spectral noise (―overfitting‖). The values of the root-mean-square-errors of cross validation (RMSECV) as well as the coefficient of determination (R2) were used in order to select the appropriate number of factors to include in the model. The selection of an appropriate frequency range is also of crucial importance for the quality of the PLS model. The same region of the spectrum used for total sugar quantification (1186-933 cm-1) was selected. Further optimization of the model by inclusion of different frequency ranges was tested using the OPUS software without improvement of the RMSECV or diminution of the rank.

Cross validation of the model presented strong statistical values with RMSECV ranging between 0.406 and 0.479% and R2 ranging between 99.96 and 99.90 (Table 5.2). The residual prediction deviation (RPD) is a qualitative measure for the assessment of the validation results. The cross validation results for this parameter were high (between 31.2 to 49.2) as a method with a RPD > 8 is already considered an excellent method to perform analytical tasks (Conzen, 2006).

Table 5.3 presents a comparison of the proportion of lactose, glucose and galactose predicted by the multivariate model on microalgae culture media spectra at days 0, 7 and 13 with results obtained from the GC-MS analysis. The percentage of relative deviation (% RD) values for lactose were always less than 9.6. For sugars representing less than 20% of the total sugar concentration, the % RD was between 0.2 and 186.7. The test samples were all considered as ―outlier‖ based on the Mahalanobis distance indicator (limit = 0.15). This indicates that the culture medium spectra may contain structures which do no ―fit‖ the model because it was built from pure sugar samples. The presence of other analytes absorbing in the same region of the spectrum (in the original composition of the BBM or the cheese whey permeate) could explain this phenomenon. However, the relatively low difference observed between the values predicted by the multivariate model and those obtained with the GC-MS reference procedure indicates a prediction capacity of over 90% for sugars representing ≥ 20% of the total.

It is interesting to note that the total sugar concentrations from the test samples were lower than the one used to calibrate the model (~40 vs. 100 g L-1), and that the sum of the values obtained for Lac, Glu and Gal from the model always remains close to 100 (Table 5.3). This confirms that the VN preprocessing method retains only the structural components of the spectral information and that the model predicts the relative proportion of each sugar instead of its absolute concentration in the solution. This type of model could be particularly useful for example to study rates of hydrolysis or diauxie in biological cultures.

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Table 5.3 Comparative results of the proportion of each sugar present in the culture medium as estimated by the multivariate model and the gas chromatographic method (GC-MS) at days 0, 7 and 13 of the experiment. Multivariate GC-MS % Mahalanobis model (%) (%) RDa distance Day 0 Lac 96.8 97.8 -1.0 7.7 Glu 0.5 0.7 -28.6 8.8 Gal 4.3 1.5 186.7 9.1 Sum 101.6 100.0 1.2 Day 7 Lac 89.9 91.6 -1.9 6.4 Glu 2.9 2.5 16.0 6.4 Gal 8.5 5.9 44.1 8.2 Sum 101.3 100.0 -0.1 Day 13 Lac 68.3 62.3 9.6 7.4 Glu 12.1 17.1 -29.2 7.5 Gal 20.9 20.6 1.5 7.6 Sum 101.3 100.0 0.2 a % RD, percentage relative difference ((Multivariate model- Reference method)*100/Reference method)

The saccharide content of a culture medium is subject to high fluctuation due to consumption, hydrolysis or production by the microorganisms. Building quantitative PLS models from the spectra of the culture medium can be difficult due to the production of collinear data sets. On the other hand, the use of pure sugar solutions for the construction of predictive models based on the FT-IR/ATR technology is quick and simple as no complex validation methods, such as chromatographic methods, are necessary. The work presented here demonstrates that this type of models can be useful to estimate quantitative and qualitative variations occurring in complex microbiological culture media during cultivation.

The proposed method, based on the PLS algorithm, compares favourably with what is available in the literature for the determination of sugars in biological culture media using FT-IR/ATR in regards to performance and accuracy. Hashimoto and Kameoka (2000) used the peak wavelength of each sugar present in a given plant-cell culture media formulation to build predictive models that are assuming spectral additivity. The use of PLS regressions improves the accuracy of the model since it includes the variations in

101 absorbance that could be due to interactions between analytes. The intrinsic property of PLS regressions to include the information contained in the whole spectrum, or selected bands, becomes even more advantageous when a large number of analytes are to be included into the model (Hernández-Martínez et al., 2013).

Lastly, it is worth mentioning the importance of model selection as many important parameters such as: choice of representative calibration and validation data sets, selection of spectral bands, data preprocessing methods and choice of the number of factors to be included in the model can greatly influence the prediction capacities of the model. Moreover, specific measures should be considered when it comes to the selection of models built from surrogate mixtures (Krasznai et al., 2012).

5.4 Conclusion

This paper shows that FT-IR/ATR technology in combination with an external light guiding fiber probe is a fast and efficient way to monitor the sugars in a biological cultures and could be used on-line or at-line into automated industrial-scale bioprocesses. Presence of cells did not significantly affect readings by the ATR probe and calibration models made from pure sugar solutions allowed monitoring the sugars in a complex culture medium. The proportion of each sugar present in the complex medium was determined using a PLS regression model built from a vector normalized calibration data set.

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CHAPITRE 6 Optimisation de l’accumulation de lipides neutres chez trois espèces de microalgues par la méthode des surfaces de réponse

Avant-propos Auteurs et affiliation : Jean-Michel Girard : étudiant au doctorat, Université de Sherbrooke, Faculté de génie, Département de génie chimique et de génie biotechnologique. Réjean Tremblay : professeur, Institut des Sciences de la Mer, Rimouski (Qc). Nathalie Faucheux : professeure, Université de Sherbrooke, Faculté de génie, Département de génie chimique et de génie biotechnologique. Michèle Heitz : professeure, Université de Sherbrooke, Faculté de génie, Département de génie chimique et de génie biotechnologique. Jean-Sébastien Deschênes : professeur, Département de mathématiques, informatique et génie, Université du Québec à Rimouski.

Date de soumission : Octobre 2014

Revue : Bioressource Technology

Titre français : Optimisation de l‘accumulation de lipides neutres chez trois espèces de microalgues par la méthode des surfaces de réponses.

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Contribution au document : Cet article contribue à la thèse en présentant les conditions optimales de pH, de densité cellulaire et de temps d‘incubation permettant une accumulation rapide et efficace de lipides neutres chez trois espèces de microalgues mixotrophe (Scenedesmus obliquus, Ankistrodesmus convolutus et Chlorella protothecoïdes). Une utilisation originale de la méthode des surfaces de réponse a permis de construire 6 modèles prédictifs et de comparer les résultats obtenus pour chaque espèce en photoautotrophie et en hétérotrophie en plus de permettre plusieurs observations importantes sur les différences inter-espèce existantes.

Résumé français : Dans le développement d'un procédé de culture de microalgues en deux étapes pour la production de biodiesel, des procédures normalisées doivent être mises au point pour l'induction rapide et efficace de l‘accumulation de lipides neutres (NL) à l‘échelle cellulaire. Dans le présent travail, des conditions de culture mixotrophes ont été fournies à trois souches de microalgues différentes afin d'obtenir une productivité de biomasse optimale au cours de la première étape du procédé. Cette biomasse a ensuite été utilisée dans la seconde étape afin d'optimiser les conditions de pH, la densité de la biomasse et le temps d'incubation conduisant à l'accumulation de NL dans des cultures carencées en azote. Pour ce faire, la méthode des surfaces de réponse a été utilisée et deux modèles ont été construits pour chaque souche (photoautotrophie et hétérotrophie). La comparaison intra- et inter-espèce des résultats a permis de tirer des conclusions importantes sur les effets du pH, du régime de lumière et des modes nutritifs sur l'induction de l'accumulation de NL chez les microalgues. Chlorella protothecoïdes est la seule espèce qui a accumulé une quantité significative de NL en l'absence de lumière, dans des cultures présentant une densité de biomasse > 5 g L-1 et à pH neutre. En revanche, la présence d‘une source lumineuse et un pH élevé (≥ 9,5) étaient nécessaires pour l'accumulation de NL chez Scenedesmus obliquus et Ankistrodesmus convolutus.

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Response-surface methodology to optimize neutral lipid accumulation

in three mixotrophic microalgae species

Jean-Michel Girard1,2,3, Réjean Tremblay2, Nathalie Faucheux1, Michèle Heitz1, Jean-

Sébastien Deschênes3

1 Département de Génie Chimique et Génie Biotechnologique, Université de Sherbrooke

2500, boul. de l‘Université, Sherbrooke (Québec) Canada, J1K 2R1;

2Institut des Sciences de la Mer,

310, allée des Ursulines, Rimouski (Québec) Canada, G5L 3A1 ;

3Département de mathématiques, informatique et génie, Université du Québec à Rimouski,

300, allée des Ursulines, Rimouski (Québec) Canada, G5L 3A1;

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Abstract In the development of a two stages microalgae cultivation process for biodiesel production, standardized procedures must be developed for the rapid and efficient induction of neutral lipid (NL) accumulation at the cellular level. In the present work, mixotrophic culture conditions were provided to three different strains in order to obtain high biomass productivity during the first stage of the process. This biomass was then used in the second stage to build Response-Surface Methodology (RSM) models in order to optimize the conditions of pH, biomass density and time of incubation leading to NL accumulation in nitrogen starved cultures. For each of the three strains, two models were built, one in photoautotrophy and one in heterotrophy. Intra- and inter-strains comparison of the results allowed drawing important conclusions about the effects of pH, light- regime and nutrition modes on the induction of NL accumulation in microalgae. Chlorella protothecoides could accumulate NL in the absence of light at ultrahigh cell density cultures and neutral pH. In contrast, different light-regime threshold, and high pH (≥ 9.5) were necessary for NL accumulation to occur in Scenedesmus obliquus and Ankistrodesmus convolutus.

Keywords: Neutral lipid accumulation, Biodiesel, Microalgae, Nile red, Response- Surface methodology

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6.1 Introduction

Microalgal neutral lipids (NLs) can serve as feedstock for the production of biodiesel (Hu et al., 2008). Research is currently oriented toward the development of industrial scale cultivation processes in order to provide a renewable energy supply for the future (Wijffels & Barbosa, 2010). However, several technical challenges remain before making the microalgal biodiesel industry profitable (Lam & Lee, 2012). At the cellular scale, increasing the NL content of cells could help to reach this objective by increasing the proportion of the biomass that can be converted into biodiesel. A number of eukaryotic microalgae species, mainly from the phyla Chlorophyta and Heterokontophyta, are known to accumulate NL when submitted to particular environmental and nutritional rearing conditions such as nitrogen or silicate starvation (Sheehan et al., 1998).

Using such stresses to rapidly and efficiently induce NL accumulation in microalgae is an important subject of research. This is largely due to the fact that generally the metabolic pathways of cell division must slow down or completely stop to give way to the NL accumulation metabolism (Breuer et al., 2012). While some studies are actually conducted for the development of culture systems stimulating high growth rates and high lipid content simultaneously (Khozin-Goldberg & Cohen, 2011; Klok et al., 2013; Zhou et al., 2013), the two-stage cultivation process (2SCP) offers a simple and promising alternative. In this well-documented concept, the lipid productivity of a microalgal culture can be maximized by adding a ―lipid accumulation‖ stage following the ―biomass production‖ stage (Huntley & Redalje, 2006). During the first stage of a 2SCP, culture conditions must be optimized to obtain the highest biomass productivity possible, while during the second stage, culture conditions must be optimized to efficiently induce NL accumulation, and reach the highest lipid cellular content in the shortest time possible.

Mixotrophy and heterotrophy are nutrition modes generally allowing for higher biomass productivity and density in certain microalgae species compared to strict photoautotrophic cultures (Bumbak et al., 2011), and the induction of the NL accumulation metabolism under these conditions is also actively investigated (Cheirsilp

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& Torpee, 2012; Heredia-Arroyo et al., 2010; Wan et al., 2011). Higher density cultures also means less pumping energy, less storage space and easier harvesting of the biomass. Therefore, the introduction of one or more mixo/heterotrophic stage(s) in the bioprocess could help bringing the industry to profitability (Bumbak et al., 2011). These economies must however compensate for the cost of the dissolved organic (DOC) carbon source used during the mixo/heterotrophic stage. Hence the importance to consider the use of affordable DOC sources, such as wastewaters or industrial residual matters (Bhatnagar et al., 2011; Hodaifa et al., 2013).

Several studies have demonstrated that nitrogen starvation can induce NL accumulation in various microalgae species such as Scenedesmus spp., Chlorella spp. and Ankistrodesmus spp. (Chu et al., 1995; Heredia-Arroyo et al., 2010; Lin & Lin, 2011). More recently, alkaliphilic conditions (pH >9) was also related to NL accumulation in some microalgae strains (Gardner et al., 2011). To optimize the conditions leading to NL accumulation in a 2SCP fashion and assess the effect of nutrition modes, pH, biomass density and time of incubation, and interactions between these factors on this phenomenon, the Response-Surface Methodology (RSM) coupled with Central Composite Design (CCD) was employed. Predictive models were built for three promising microalgae species for the biodiesel industry (Scenedesmus obliquus, Ankistrodesmus convolutus and Chlorella protothecoides) under photoautotrophic and heterotrophic culture conditions.

6.2 Material and methods

6.2.1 Microalgae strains and media Ankistrodesmus convolutus (CPCC309) and Scenedesmus obliquus (CPCC 5) obtained from the Canadian Phycological Culture Center (Waterloo, ON) and Chlorella protothecoides (UTEX 255) from the University of Texas (Austin, TX) were maintained at 22.5°C in Bold‘s basal medium (BBM) (Stein, 1973), at an initial pH of 6.8 with agitation at 120 rpm. For C. protothecoides, 1 g L-1 soy protein peptone (Sigma- Aldrich) was also present in the medium. All media were heat sterilized (121°C for 15 107

108 min). Continuous illumination (100 µE m-2 s-1) as measured at the surface of the flasks using a Q201 quantum radiometer (Macam Photometrics Ltd., Livingston, Scotland) was provided by fluorescent light lamps.

6.2.2 Experimental procedure and Nile Red analysis For each specie, a 7 L photobioreactor (PBR) (Applikon Biotech, Schiedan, Netherlands) containing 3.7 L of mixotrophic medium (Table 6.1) was inoculated with a 0.3 L culture for an initial working volume of 4 L. Inoculum consisted in 10 mL of culture in stationary growth phase transferred into 290 mL of fresh BBM and incubated for 3 days in continuous illumination and 0.3 L min-1 air bubbling. Cultures were kept in the PBR mixotrophic conditions (pH 7.0, aeration rate of 0.7 L min-1, 100 µE m-2 s-1) for 7 days before the 4 L culture was harvested in sterile conditions. The culture was then centrifuged (15 min at 3500 g), the pellet washed once with heat sterilized distilled water, and then resuspended at the desired biomass density (Table 6.2). Aliquots of 15 mL were transferred in sterile tubes. After another centrifugation (5 min at 3500 g), pellets were resuspended in 15 mL of their respective media: BBM without nitrate (BBM-Ni) for the -1 photoautotrophic group, BBM-Ni + 10 g L glucose for the heterotrophic group before being transferred in 50 mL culture flasks. The pH of the media had been fixed to 7, 8.5 or 10 prior to the sterilisation step by using respectively PIPES, bicine and bicarbonate buffers at a concentration of 25 mM and adjusted with a 1 M solution of sodium hydroxide.

At the end of the determined incubation time, a 1 mL culture sample was directly used for intracellular NL content determination (see below) and a 10 mL sample was harvested by centrifugation (3500g for 5 min). A measure of the final pH was taken directly on this supernatant using a bench top pH meter. The pellets were then washed once with distilled water and kept at -80°C until freeze-drying and final yield determination (g dry biomass L-1).

Intracellular NL content was determined by flow cytometry following the method described by de la Jara et al. (2003) and Doan and Obbard (2011). Briefly, fresh cultures

109 were diluted to 1 x 106 cells mL-1 in Tris-buffered Saline (TBS). Cells membranes were permeabilized by adding dimethyl sulfoxide (DMSO) at 15% final concentration. Cells were then stained with NR (Invitrogen) at 0.7 µg mL-1 final concentration, in the dark at room temperature for one hour. Single-cell fluorescence was measured using an Epics Altra flow cytometer (Beckman Coulter Inc., Fullerton, BC, CA) fitted with a 488 nm laser operated at 18 mW. The NR fluorescence of at least 10 000 cells was measured at 575 ± 20 nm. The mean fluorescence of the cells was normalized by the fluorescence of 2 µM microspheres (Fluoresbrite YG, Polysciences) that were added to each sample.

6.2.3 Experimental design and statistical analysis RSM coupled with CCD was used to optimize NL accumulation in three microalgae species for the following parameter: pH, time of incubation and biomass density under photoautotrophic and heterotrophic conditions (Table 6.2). For three-factors, three-levels CCD and ―face centered‖ alpha, statistical theory suggests 20 runs, which includes 14 extra-center points (factorial and axial), and 6 replicates at the center point (Table 6.3). Dry biomass densities were different from one strain to the other as related to the different productivities obtained during the mixotrophic preparation of the biomass (see Table 6.1 and section 6.3.1).

Design Expert software (trail version 8.0.6, Stat-Ease Inc., Mineapolis, MN, USA) was used to design the experiment and realize statistical analysis of the data. The obtained experimental data were fitted to quadratic polynomial equations and factor levels were coded as described elsewhere (Xie et al., 2012).

6.3 Results and discussion

6.3.1 First stage: production of the biomass The first step of the experimental procedure was the production of a biomass to use as raw material for the different conditions to be tested. Table 6.1 presents the results obtained with each species during this first stage. Mixotrophic conditions were used in order to reach higher growth rates and productivity of the cultures (Chu et al., 1995; 109

110

Heredia-Arroyo et al., 2010; Mandal & Mallick, 2009) and to limit the time of adaptation when the cells were to be transferred into strict photoautotrophic or heterotrophic conditions of the experiment (Martínez et al., 1997). Indeed, generally, mixotrophic conditions allow both the photosynthetic and respiration metabolisms to operate simultaneously or alternately inside cells (Lee, 2004a).

For S. obliquus, a particular mixotrophic medium was used (Table 6.1) on the basis of our previous study showing that this strain is able to use the lactose contained in cheese whey permeate (WP) for growth (Girard et al., 2013). The use of such residual matter of the dairy industry could help to limit the costs associated with the DOC source supply and could render the whole process possible on a larger scale. The S. obliquus culture only yielded 28% of the final wet biomass obtained with the C. protothecoides culture, and 62% of the A. convolutus culture. This could be due to a suboptimal growth due to the nature of the carbon source used (lactose vs glucose).

Table 6.1 Mixotrophic media and biomass production in PBR. Specie Medium Incubation Final wet time biomass (days) (g L-1) S. obliquus 80% (v/v) H2Od + 20% (v/v) cheese 7 6.9 ± 0.3 whey permeate + 5 mM NaNO3 + Trace metal mix A. convolutus Glucose (20 g L-1) + peptone (4 g L-1) 7 11.1 ± 0.3 in H2Od

C. protothecoides Glucose (20 g L-1) + peptone (4 g L-1) 7 24.4 ± 0.6 in H2Od

6.3.2 Second stage: induction of NL accumulation The biomass produced under mixotrophic conditions was used to inoculate the samples of the RSM experiment at the initial conditions dictated by the three factors, three levels CCD (Tables 6.2 and 6.3). These samples were incubated for 3, 5 or 7 days in photoautotrophic or in heterotrophic culture conditions. Cells were then permeabilized and intracellular lipids colored using NR staining. Variations in NL cellular contents

111 were estimated by evaluation of the normalized mean cell fluorescence at 575 ± 20 nm by a flow cytometer and the results were used to build the RSM models.

Table 6.2 Coded levels for independent factors of the Central Composite Design (CCD). S. obliquus (SO), A. convolutus (AC), C. protothecoides (CP).

Factors Symbol -1 0 1 Time (days) x1 3 5 7 x (SO) 0.7 3.1 7.2 Dry biomass density 2 y (AC) 2.4 9.2 21.4 (g L-1) 2 z2 (CP) 8.0 27.1 50.0 pH x3 7.0 8.5 10.0

Table 6.3 Central Composite Design (CCD) of experiments

Run Time Biomass density pH x1 x2, y2, z2 x3 1 0 0 -1 2 0 0 0 3 -1 1 1 4 1 -1 1 5 0 1 0 6 0 0 0 7 1 1 1 8 -1 -1 -1 9 0 0 1 10 -1 0 0 11 0 0 0 12 1 -1 -1 13 0 -1 0 14 0 0 0 15 1 0 0 16 -1 1 -1 17 1 1 -1 18 0 0 0 19 -1 -1 1 20 0 0 0

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112

6.3.3 RSM models development and analysis of variance (ANOVA) For each of the three species under study, two different models (photoautotrophic and heterotrophic) were built on the Log10 transformed data for a total of six RSM models. Table 6.4 presents the equations and main ANOVA results for these models. When building the equations of the models, a stepwise selection of terms was performed in order to keep only the terms significantly affecting the output of the response variable (p ˂ 0.10). In all three photoautotrophic models, a significant interaction was found between biomass density and pH as the ―x2x3‖, ―y2x3‖ and ―z2x3‖ terms were included in the SO- Auto, AC-Auto and CP-Auto models, respectively. In all cases, except the A. convolutus heterotrophic model (AC-Hetero), the significant terms were used to build second-order polynomial equations. For the AC-Hetero data set, only the ―x1‖ factor (time of incubation) was shown to have a significant effect on the mean cell fluorescence, therefore a simple linear regression was produced and this model could explain 67% of the variability (R2 = 0.67).

ANOVA results of all the quadratic polynomial models showed strong statistical significance (p ˂ 0.001) and R2 between 0.80 and 0.96. The ―lack of fit‖ was highly significant for the S. obliquus photoautotrophic model (SO-Auto). This indicator provides information on how much the model fits the data and it is recommended that it is not significant (Anderson & Whitcomb, 2005). However, this was not considered problematic for our study as RSM was used to compare species and culture conditions 2 rather than to build highly accurate predictive models. It is also noted that the R pred is also an indicator of the predictive capacity of the model (Anderson & Whitcomb, 2005) 2 and it showed acceptable values (close enough to the R adj values) for all models (Table 6.4). Thus experimental data confirmed predictive results obtained with each model (Annexe B – Tables S1 and S2). Table 6.5 presents the values that should take the factors in order to maximize the NL productivity of the microalgae culture as dictated by the different models for each scenario. In any case, the time of incubation should be maximized.

113

Table 6.4 Equations and summary of the main ―analysis of variance (ANOVA)‖ results of the six RSM models. Raw data was Log10 transformed. (SO = S. obliquus; AC = A. convolutus; CP = C. protothecoides; Auto = photoautotrophy; Hetero = heterotrophy; Df = degree of freedom; SS = sum of squares).

Model Residual Equation R2 R2 R2 (coded factors) F p Lack of fit Adj Pred Df value value (p value) SO-Auto P = -1.67 + 0.13x - 0.35x + 0.25x - 1 2 3 6 41.64 ˂0.001 ˂0.001 0.95 0.93 0.85 0.075x2x3 + 0.48x2 x2 + 0.12x3 x3 SO-Hetero P = -1.05 + 0.11x - 0.26x - 0.66x + 1 2 3 5 74.03 ˂0.001 0.369 0.96 0.95 0.92 0.062x1x2 - 0.11x2 x2 AC-Auto P = -0.71 + 0.1x - 0.15y + 0.14x - 1 2 3 6 26.49 ˂0.001 0.056 0.92 0.89 0.73 0.092y2x3 + 0.21y2 y2 - 0.17x3 x3 AC-Hetero P = -0.89 + 0.14x 1 1 36.88 ˂0.001 0.0383 0.67 0.65 0.58 CP-Auto P = 0.34 + 0.05x + 0.066z - 0.092x + 1 2 3 7 8.72 ˂0.001 0.7365 0.84 0.74 0.56 0.094z2x3 - 0.1x1 x1 - 0.12z2 z2 + 0.15x3 x3 CP-Hetero P = 0.48 + 0.11x - 0.027z - 0.08x + 1 2 3 5 11.55 ˂0.001 0.2536 0.80 0.74 0.61 0.091z2x3 - 0.13z2 z2

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Table 6.5 Parameters dictated by each of the RSM models in order to maximize NL accumulation.

Time Biomass pH (days) density (g L-1) SO-Auto 7 0.7 10

SO-Hetero 7 0.7 9.8

AC-Auto 7 2.4 9.5

AC-Hetero 7 2.4 9.5

CP-Auto 7 26.6 7 CP-Hetero 7 23.1 7

Figure 6.1 presents 3D surface graphs of the interactive effect of biomass density and pH on NL cellular content for each of the six models. Although not significant in S. obliquus and A. convolutus heterotrophic models (Table 6.4, SO-Hetero and AC-Hetero), this interaction is presented to allow an intraspecific (photoautotrophic vs heterotrophic) and interspecific (S. obliquus vs A. convolutus vs C. protothecoides) comparison of the results (discussed below).

6.3.4 Evolution of pH over the course of the RSM experiments Biomass density and pH were analyzed at the time of harvest for every sample, in order to monitor the variations which could have occurred during incubation (Annexe B – Figures S1 and S2). The most important shift in pH was observed for samples with an initial pH of 10 although the culture medium was buffered by 25 mM bicarbonate. Under photoautotrophic conditions, the pH of S. obliquus cultures was increased by 0.8 ± 0.4 units, demonstrating a strong natural tendency to basification of the culture medium under these conditions. This is due at least in part to the assimilation of CO2, nitrate and phosphate by the microalgae culture (Becker, 1994). The same phenomenon was observed for A. convolutus, but not for C. protothecoides. Interestingly, these high pH samples were also the ones showing the highest NR fluorescence, thus supporting the observation made by Gardner et al. (2011) that high pH is associated with NL accumulation in some microalgae species.

115 116

117

On the other hand, for the same initial pH value of 10 under heterotrophic conditions, all three strains induced an average decrease of -1.4 ± 0.6 units of pH. Acidification of the culture medium could be due to the release of H+ during active transport of glucose across the plasma membrane by the HUP1 transporter (Perez-Garcia et al., 2011b). To circumvent this effect, two other biological buffers (25 mM CAPS and 25 mM bicarbonate + 25 mM sodium carbonate) were tested without success (Annexe B – Figure S2). This result suggests that the high pH conditions associated with NL accumulation in some species under photoautotrophic conditions might be difficult to maintain under heterotrophic culture conditions.

6.3.5 Intraspecific comparison of the results In S. obliquus cultures, a significant increase in fluorescence was observed only in the photoautotrophic model, in conditions of high pH (10) and low cell density (0.7 g L-1). Indeed, the maximum value of fluorescence recorded during the photoautotrophic experiment was 3 times higher than in heterotrophy (0.5 vs 0.2). Similar results were obtained with A. convolutus cultures where fluorescence was 4 times higher in photoautrophy (0.8 vs 0.2). These results therefore demonstrate that, under the experimental conditions tested here, illumination was essential to efficiently induce NL accumulation in these species. For C. protothecoides, all the fluorescence values were ranging between 1.0 and 5.0. The terms of the equations retained during the stepwise selection were similar for both the photoautotrophic and heterotrophic models, except for the A2 and C2 terms only present in the photoautotrophic model (Table 6.4). However, presence of light during the NL accumulation phase clearly affected some cellular metabolism and chlorophyll content as demonstrated by light-green color taken by the samples of the photoautotrophic experiment (Figure 6.2). Also, the CP-Auto 3D surface graph presented a ―saddle‖ shape, while the CP-Hetero graph presented a ―rising ridge‖ shape (Figure 6.1). The saddle, or ―mini-max‖ presents major problem for finding a maximum point because one can get stuck in the saddle or push up to the lesser peak at left or right, and thus the true optimum may get lost in the shuffle (Anderson & Whitcomb, 2005).

117

118

Figure 6.2 Photoautotrophic (A20) and heterotrophic (H20) cultures of C. protothecoides at the end of the RSM experiments.

6.3.6 Interspecific comparison of the results Important differences were observed between C. protothecoides and the two other species. Firstly, higher biomass productivity was obtained during the first stage of the process and a change in the color of the culture from green to orange was also observed. This change in color has been associated with NL accumulation (Xu et al., 2006), suggesting a higher initial NL cellular content in C. protothecoides mixotrophic cultures. On the other hand, S. obliquus and A. convolutus cells are known to have a low lipid content (˂ 10% of the dry weight) when cultivated under mixotrophic conditions (Chu et al., 1995; Girard et al., 2014).

Secondly, considering all the samples, the normalized mean cell fluorescence was 2 to 6 times higher in C. protothecoides cultures than the others. This difference could be due to experimental factors (differences in cell permeability to NR staining, difference in biomass density levels, etc…) and/or phylogenetic differences. In support of the latest, observation of NR stained cells by fluorescence microscopy suggested the presence of fewer but bigger lipid droplets in C. protothecoides cells compared to multiple small lipid droplets in S. obliquus and A. convolutus cells (Figure 6.3). It is known that repression of the major lipid droplet protein (MLDP) gene expression lead to an increase in lipid droplets size in Chlamydomonas

119 reinhardtii, without affecting the triacylglycerol cellular content (Moellering & Benning, 2010).

Figure 6.3 Nile red coloration of the three mixotrophic strains after the lipid accumulation stage

Thirdly, C. protothecoides is the only specie which showed important variations in NL cellular content in ultrahigh cell density cultures, i.e. > 10 g dry cell mass L-1 (Richmond, 2007), neutral pH (Table 6.5) and in absence of light (Figure 6.1 - heterotrophic models). The ability to accumulate NL under these conditions would be a major economic asset of the process, while less storage space and energy would be needed during the second stage of the 2SCP and subsequent harvesting of the biomass.

When considering S. obliquus and A. convolutus together, no significant NL accumulation could be obtained in the absence of light, and when light was present, at biomass densities higher than 2.4 g L-1. This could suggest the existence of a threshold dose of light for NL accumulation to occur in both these members of the class Chlorophycea. Indeed, as biomass density increases in a microalgae culture, light availability decreases because of mutual shading (Yen & Chiang, 2012). During the cell division stage, exponential growth occurs until this shading phenomenon reduces the light per cell regimen under a critical threshold, after which specific growth rate is reduced and cell mass continues to accumulate at a constant, linear rate (Richmond, 2007). In batch cultivation, when all nutrients are provided in sufficient 119

120 amount, this linear growth stage lasts until light per cell becomes overly low, or when some inhibitory activity or conditions arrest cell growth. The results obtained here suggest that, for S. obliquus and A. convolutus, the metabolism of NL accumulation could respond to different light-regimes, induced by different biomass density conditions, in a similar manner to the growth model just described. In other words, for an accumulation of intracellular lipid to occur, as for cell division to occur, a minimum dose of light must be provided to each cell. However, unlike for cell division, this light cannot be replaced by the addition of a DOC source in heterotrophic conditions. The frequency of the light-dark cycle, as determined by the length of the optical path and extent of culture turbulence, is also an important ―light related parameter‖ to consider when determining the cell‘s light-regime in high density culture (Richmond, 2007), and could as well play a role in NL accumulation.

Other biotic and abiotic conditions induced by high microalgal biomass densities include: accumulation of O2 and depletion of CO2 (photoautotrophy), depletion of O2 and accumulation of CO2 (heterotrophy) and accumulation of toxic metabolites. These factors could have also had an impact on NL accumulation. However, intra- and interspecific comparison of the results clearly demonstrate that light is a key parameter to consider for NL accumulation to occur in S. obliquus and A. convolutus. However, not all Chlorophycea spp. require light to accumulate lipids. Recently, a strain of Scenedemus (R-16) was isolated which could accumulate high amounts of lipids (52.6% of its dry biomass) when 10 g L-1 glucose was added to the culture medium under strict heterotrophic conditions (Ren et al., 2013). It therefore supports the observation made by others that lipid accumulation by heterotrophic microalgae is strain-dependent (Cheirsilp & Torpee, 2012).

6.4 Conclusion

Our results demonstrate that NL accumulation under heterotrophic conditions is a strain- dependent phenomenon. C. protothecoides showed a good potential for use in the 2SCP proposed here, because of its ability to accumulate lipids in ultrahigh cell density cultures and in absence of light. Conditions of high pH (≥ 9.5) and light were shown to be essential to obtain decent lipid productivity in S. obliquus and A. convolutus nitrogen starved cultures.

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This light-dependent phenomenon should be investigated further by determination of the threshold dose of light, or biomass density, allowing NL accumulation to occur in these strains. Finally, other metabolic stresses or culture conditions, such as temperature and osmotic stresses, or even addition of algaecides in the medium should be tested for their potential to induce NL accumulation in these species under heterotrophic conditions.

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122

CHAPITRE 7 Commensalisme dirigé entre Scenedesmus obliquus et Chlorella protothecoïdes : vers la viabilité économique d'un procédé de culture de microalgues mixo/hétérotrophes pour le biodiesel

Avant-propos Auteurs et affiliation : Jean-Michel Girard : étudiant au doctorat, Université de Sherbrooke, Faculté de génie, Département de génie chimique et de génie biotechnologique. Réjean Tremblay : professeur, Institut des Sciences de la Mer, Rimouski (Qc). Nathalie Faucheux : professeure, Université de Sherbrooke, Faculté de génie, Département de génie chimique et de génie biotechnologique. Michèle Heitz : professeure, Université de Sherbrooke, Faculté de génie, Département de génie chimique et de génie biotechnologique. Jean-Sébastien Deschênes : professeur, Département de mathématiques, informatique et génie, Université du Québec à Rimouski.

Date de soumission : Octobre 2014

Revue : Bioresource Technology

Titre français : Commensalisme dirigé entre Scenedesmus obliquus et Chlorella protothecoïdes : vers la viabilité économique d‘un procédé de culture de microalgues mixo/hétérotrophes pour le biodiesel.

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Contribution au document : Cet article contribue à la thèse de deux façons. Tout d‘abord, la possibilité d‘utiliser le peroxyde d‘hydrogène pour la stérilisation de milieux de culture de microalgues est décrite pour la première fois. Ensuite, une stratégie originale faisant intervenir deux espèces de microalgues différentes (commensalisme dirigé) est testée au laboratoire afin d‘améliorer l‘utilisation des sucres totaux contenus dans le perméat de lactosérum dans une optique de phycorémédiation de ce coproduit industriel. Cette stratégie permettrait également de diversifier la gamme de produits commerciaux pouvant être obtenus par bioraffinage en permettant la production de deux biomasses microalgales de compositions biochimiques différentes.

Résumé français : L‘inclusion d‘une étape de culture mixo/hétérotrophe à l‘intérieur d‘un procédé industriel de production de biomasse microalgale permet d‘augmenter considérablement la productivité des cultures. Toutefois, le contrôle des risques de contamination par d'autres microorganismes et l‘assurance d‘une utilisation efficace d‘une source de carbone organique dissous (DOC) abordable sont des aspects importants à considérer dans ces conditions. Dans le présent travail, un milieu de culture composé de perméat de lactosérum a été volontairement contaminé par la bactérie Escherichia coli, puis stérilisé à l‘aide d‘un système peroxyde d'hydrogène

(H2O2)/catalase avant d'être inoculé avec deux espèces de microalgues en co-culture. Dans une autre expérience, le même milieu a été utilisé pour cultiver séquentiellement Scenedesmus obliquus, dans des conditions mixotrophes, suivi de Chlorella protothecoïdes, dans des conditions hétérotrophes, pour un rendement de conversion du lactose en biomasse de 45 % (m/m), et une consommation de 62% des sucres totaux en 34 jours. Nos résultats démontrent le potentiel du système H2O2/catalase pour la culture de microalgues dans un sous-produit de l'industrie laitière et l'utilisation du commensalisme dirigé pour la production de biomasse microalgale.

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Directed commensalism between Scenedesmus obliquus and Chlorella

protothecoides: towards the economic viability of a mixo/heterotrophic

microalgae cultivation process for biodiesel

Jean-Michel Girard1,2,3, Réjean Tremblay2, Nathalie Faucheux1, Michèle Heitz1, Jean- Sébastien Deschênes3

1 Département de Génie Chimique et Génie Biotechnologique, Université de Sherbrooke 2500, boul. de l‘Université, Sherbrooke (Québec) Canada, J1K 2R1; 2Institut des Sciences de la Mer, 310, allée des Ursulines, Rimouski (Québec) Canada, G5L 3A1 ; 3Département de mathématiques, informatique et génie, Université du Québec à Rimouski,

300, allée des Ursulines, Rimouski (Québec) Canada, G5L 3A1;

125

Abstract Inclusion of a mixo/heterotrophic culture stage in the design of industrial processes of microalgae biomass production can significantly increase crop productivity. However, adequate control of contamination risks by other microorganisms combined with an efficient use of an affordable dissolved organic carbon (DOC) source are important aspects to consider in these conditions. In the present work, a cheese whey permeate supplemented medium was voluntarily contaminated with the bacteria Escherichia coli and successfully decontaminated by a hydrogen peroxide (H2O2)/catalase system, before inoculation with two microalgae strains. In another experiment, the same medium was used to sequentially culture Scenedesmus obliquus, under mixotrophic conditions, followed by Chlorella protothecoides, under heterotrophic conditions, resulting in a 45% (w/w) conversion yield of lactose into microalgae biomass; and 62% consumption of the total lactose content in 34 days. Our results demonstrate the potential of the H2O2/catalase system for microalgae cultivation in a dairy industry byproduct and the use of directed commensalism for microalgae biomass production.

Keywords: Cheese whey permeate, hydrogen peroxide, FT-IR/ATR sugar monitoring, microalgae co-cultivation

125

126

7.1 Introduction

Phycoremediation is the process that converts nutrients and contaminants from industrial and municipal wastewaters into microalgal biomass. It allows the decontamination of these grey waters while producing biomass that has potential for many useful applications including energy and food production (Rawat et al., 2011). The development of such processes and scale-up have however met with mitigated success in the past as low productivity of such cultures can hardly justify for the costs associated with harvesting and dewatering of the biomass (Christenson & Sims, 2011). This low productivity can be attributable to low DOC content typically observed in these effluents, and to the presence of other microorganisms such as bacteria and fungi, which not only competes for available nutrients but also considerably reduces the fields of use of the biomass produced (Prajapati et al., 2013).

. Reactive oxygen species like superoxide (O2 ), hydrogen peroxide (H2O2) and hydroxyl radicals (.OH) can destroy most types of biomolecules unless instantaneously deactivated by suitable reduction mechanisms. Although the use of H2O2 as a preservative agent of milk and derivatives have been greatly reduced or completely eliminated 50 years ago, its bactericide power and ease of use has long been recognized (Lück, 1966). Whey is an important co- product of the cheese industry that possesses a substantial polluting power, with a biochemical oxygen demand (BOD) some 175-fold higher than typical sewage effluent (Smithers, 2008). This is due to its high DOC content which is mainly lactose (> 75% of total solids). Whey proteins represent approximately 10% of total solids and include β-lactoglobulin, α- lactalbumin, the heavy and light chains immunoglobulins, bovine serum albumin, lactoferrin, lactoperoxidase and glycomacropeptide. These proteins are already used as additives in dairies and other food products and are recognized for their nutritive qualities and health benefits (Solak & Akin, 2012). During the process of whey protein isolation, a lactose concentrate is produced (also called ―whey permeate (WP)‖) as a result of an ultrafiltration step. We therefore suggested that WP, with its high DOC content (> 100 g lactose l-1) and very low bacterial load (due to the ultrafiltration step) would be a good candidate for phycoremediation, and Scenedesmus obliquus was identified as a good candidate strain because of its ability to hydrolyse extracellular lactose (Girard et al., 2013).

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Some limitations of the process included incomplete utilization of the DOC by the microalgal culture and necessity of an additional sterilisation step to completely eliminate bacteria before use as a microalgal culture medium. On a large scale, these limitations would translate in high residual lactose content in the sewage effluent and important additional costs of sterilisation of the culture medium. Moreover, the low lipid content observed in the WP grown S. obliquus biomass would greatly limit its use as a feedstock for biodiesel production (Girard et al., 2014). To address these concerns, we tested two hypotheses: 1) the use of a hydrogen peroxide

(H2O2)/catalase decontamination system would be sufficient to eliminate the bacteria from the culture medium, and 2) the co-cultivation or sequential cultivation of S. obliquus and C. protothecoides could improve total lactose consumption and increase lipid productivity of the cultures.

7.2 Material and methods

7.2.1 Culture maintenance and medium Scenedesmus obliquus was obtained from the Canadian Phycological Culture Center in Waterloo, Canada (CPCC 5) and Chlorella protothecoides from the collection of algae at the University of Texas (UTEX 255). Cultures were kept in heat sterilized (121°C, 15 min) Bold‘s Basal Medium (BBM), adjusted to pH 6.8 (Stein, 1973). For C. protothecoides, 1 g L-1 soy protein peptone (Sigma-Aldrich) was added to the medium (BBMP). Cheese whey permeate (WP) was shipped on ice from a dairy transformation plant and filtered (0.2 µm) upon reception.

7.2.2 Experimental procedures

H2O2 decontamination of the culture medium and co-culture experiment A schematic representation of the experimental design is presented in Figure 7.1. All tested conditions were performed in triplicate. The day before inoculation, 8 mL samples of cheese whey permeate (WP) were voluntarily contaminated with 0.01 mL of E. coli bacterial suspension in 50 mL Erlenmeyer flasks. Except for the ―positive contamination control‖,

0.05% (w/v) H2O2 was immediately added in all contaminated samples. After 24h incubation

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128 at room temperature (day 0), different amounts (0, 0.25, 2.5 and 25 U mL-1) of bovine catalase (Sigma-Aldrich) were added, and incubated at room temperature for 30 minutes to neutralize

H2O2 toxicity. Following this treatment, 7 mL of fresh BBM was added to each culture before inoculation with S. obliquus (5 mL of a culture in exponential stage of growth) for an initial volume of 20 mL and initial medium composition of 60% (v/v) BBM and 40% (v/v) WP. The cultures were incubated at 22.5°C with continuous orbital agitation (120 rpm) and continuous illumination (100 µE m-2 s-1). Microalgal growth was monitored by sampling 0.5 mL of culture and subsequent spectrophotometric measure of the absorbance at 750 nm with a fixed wavelength DU640 UV-visible spectrophotometer (Beckman Coulter Inc., Fullerton, BC, CA) in 1 cm cuvets.

At day 4 of the experiment, one culture set was inoculated with C. protothecoides (5 mL of a culture in exponential stage of growth) and supplemented with 2 g L-1 soy protein peptone. In the ―non-contaminated control‖, the C. protothecoides inoculum was replaced by 5 mL of BBMP. The cultures were sampled (0.5 mL) each week during six weeks. Samples were centrifuged (5 min, 10 000 g) and supernatants were kept at -20°C until sugar determination by infrared absorbance spectra acquisition as previously described (Girard et al., 2013). At the end of the experiments, fresh culture samples (0.5 mL) were diluted to 1 x 106 cells mL-1 in Tris-buffered Saline (TBS). These solutions were passed into an Epics Altra flow cytometer (Beckman Coulter Inc., Fullerton, BC, CA) fitted with a 488 nm laser operated at 18 mW. The rest of the biomass was harvested by centrifugation (5 min, 3 500 g). Pellets were washed once with deionized water and then freeze-dried. To eliminate the bias that may have been introduced by variation of volume due to evaporation, the final volume was determined theoretically: 20 mL (initial volume) – 5 mL (sample volume) = 15 mL (final volume). Final yields were determined gravimetrically and expressed in g L-1.

129

Figure 7.1 Experimental design of the H2O2/catalase and co-culture experiments.

Sequential microalgae culture experiment A schematic representation of the experimental design is presented in Figure 7.2. At day 0 of the experiment, five sets of triplicate (#1 to #5) were inoculated with S. obliquus (1.4 mL of a culture in exponential stage of growth) for an initial volume of 10 mL and initial medium composition of 60% (v/v) BBM and 40% (v/v) WP. The cultures were incubated at 22.5°C with continuous orbital agitation (120 rpm) and continuous illumination (100 µE m-2 s-1). At day 0 and each week during four weeks a set of triplicate was harvested by centrifugation (5 min, 3500 g). The supernatants of this centrifugation were transferred aseptically in sterile centrifugation tubes and kept at -20°C until further use. The pellets were used to determine the final S. obliquus dry biomass yields.

All the supernatants from the precedent step were thawed and volumes were readjusted to 10 mL (initial volume) using sterile deionized water to compensate for evaporation. These media were inoculated with C. protothecoides (0.5 mL of a culture in exponential stage of growth) and supplemented with 4 g L-1 soy protein peptone. The cultures were incubated at 22.5°C

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130 with continuous orbital agitation (120 rpm) in continuous darkness (heterotrophy) during 6 days. At the end of this incubation, the biomass was harvested by centrifugation (5 min, 3 500 g). The supernatants were kept frozen at -20°C until acquisition of their infrared absorbance spectra. The pellets were used to determine the final C. protothecoides dry biomass yields.

Figure 7.2 Experimental design of the sequential culture experiments.

7.2.3 Data analysis The differences in final culture yield and residual sugars (g L-1) were analyzed: 1) by Student‘s t-test on biomass yields of the ―co-culture experiment‖, and 2) by an analysis of variance (ANOVA) on biomass yields and on the residual sugars of the ―sequential experiment‖ (n=3). Effect of catalase treatment have been analysed by a two-ways ANOVA with catalase concentrations and culture time as factors. Variation in sugar proportions was

131 also analysed by two-ways ANOVA. Where differences were detected, posteriori Student- Newman-Keuls (SNK) multiple comparison tests were used to determine which means were significantly different. The normality was verified by a Shapiro-Wilk test and the variances homoscedasticity through direct observations of residuals. If necessary, data were log+1 or arcsine square-root (for % data) transformed to achieve homogeneity of variances. Analyses were carried out using SAS v.9.2 software (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA).

7.3 Results and discussion

Our previous work demonstrates the capacity of S. obliquus to hydrolyze extracellular lactose in a WP supplemented culture medium and thus induce the accumulation of glucose and galactose in the medium (Girard et al., 2013). To further characterize this phenomenon, two sets of experiments were conducted by co-cultivating S. obliquus with C. protothecoides, a well-known heterotrophic microalgae specie with high potential for biodiesel production but unable to use lactose for growth (Girard et al., 2014),.

7.3.1 Simultaneous co-cultivation of Scenedesmus obliquus and Chlorella protothecoides in a H2O2 decontaminated culture medium In the first experiment, prior to inoculation with the microalgae, the WP samples were voluntarily contaminated with E. coli, a bacterium well known for its ability to grow on lactose (Jacob & Monod, 1961). In the samples that were not H2O2-treated, significant bacterial growth could be observed by important opacification of the medium (not shown), whereas all the H2O2-treated samples remained clear and unclouded after 24h incubation at room temperature. Four different concentrations of bovine catalase were then added to the

H2O2-treated samples before inoculation with S. obliquus. Microalgal growth occurred only at the two highest catalase concentration tested (2.5 and 25 U mL-1) indicating that the catalase -1 treatment using less than 2.5 U mL was not sufficient to neutralize all the H2O2 and prevent its lethal effect on S. obliquus cells. This result is in agreement with the H2O2 toxicity on this microalgae specie described in the literature (Mallick et al., 2002). Culture growth was monitored by absorbance at 750 nm during the first 4 days. No significant difference was

131

132 found between the treatment using the highest concentration of catalase (25 U mL-1) and the non-contaminated control cultures (F(1) = 0.28, p = 0.61), and only the time of incubation was significant (F(2) = 8684.8, p ˂ 0.001) (Figure 7.3).

S. obliquus was then cultivated either alone, or in co-culture with C. protothecoides, under mixotrophic conditions for six weeks. Figure 7.4 presents the proportions of lactose, glucose and galactose, as % of the total, present in the culture medium over the course of the experiments for the two tested conditions. These proportions were estimated from the infrared absorbance spectra of the solutions and using our previously described FT-IR/ATR multivariate model (Girard et al., 2013). As expected, an important glucose and galactose accumulation was observed in homogenous S. obliquus cultures, concomitant with a decrease in lactose proportion. However, when Chlorella protothecoides was present, the proportion of each individual sugar remained stable during the whole experiment, with lactose representing

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≥ 96% of total sugars at all time. One possible explanation for this phenomenon is that the Chlorella cells have consumed the glucose and galactose resulting from the extracellular hydrolysis of lactose by S. obliquus. In ecology, this type of interaction between two different species is called commensalism.

Figure 7.4 Proportion (%) of lactose, glucose and galactose present in the culture medium of S. obliquus cultivated alone (A) or in co-culture with C. protothecoides (B). Results are expressed as the mean±SD (n=3). Different letters indicate significant difference in sugar concentration (p ˂ 0.05).

Final dry biomass yields were significantly differents at 7.3 ± 0.3 and 10.6 ± 0.6 g L-1 for homogenous S. obliquus cultures and heterogeneous S. obliquus + C. protothecoides cultures respectively (T(1.3) = -7.99, p = 0.045). This increase in yield (45%) can be due to soy protein peptone supplementation and/or presence of C. protothecoides. The presence of both species in the heterogeneous cultures was confirmed by phase contrast microscopy (figure 7.5). However, the two cell populations could not be discerned by passage into a flow cytometer, indicating similar cell granularity, fluorescence and size. An additional technique, such as specific surface markers, should therefore be used in combination with flow cytometry to allow distinguishing the two species if necessary in in subsequent experiments.

133

134

7.3.2 Sequential cultivation of Scenedesmus obliquus and Chlorella protothecoides on cheese whey permeate 1st stage : mixotrophic production of S. obliquus In the second experiment, S. obliquus was first cultivated mixotrophically in the WP supplemented medium for different periods of time (0, 7, 14, 21 and 28 days) and then harvested by centrifugation. Here again, the proportions of lactose, glucose and galactose in the culture medium were estimated using our FT-IR/ATR multivariate model and results were similar to those presented in Figure 7.4-A. The accumulation of monosaccharides in the culture medium resulting from the extracellular hydrolysis of lactose reached 15 ± 1 % for glucose and 33 ± 3 % for galactose at day 28, while biomass yield reached 6.8 ± 0.2 g L-1

135

(Table 7.1). Table 7.2 presents the main statistical results of the analyses of variance performed to detect significant differences in biomass yields.

Table 7.1 Biomass yields of the sequential experiment. Different letters indicate significant difference in biomass yield (p ˂ 0.05) for each stage and the total. ND = not determined.

1st stage 2nd stage Total S. obliquus C. protothecoides Residence Yield Residence Yield Residence Yield time (d) (g L-1) time (d) (g L-1) time (d) (g L-1) Seq. #1 0 0.2 ± 0.1e 6 ND 6 ND Seq. #2 7 3.1 ± 0.1d 6 ND 13 ND Seq. #3 14 4.7 ± 0.1c 6 5.0 ± 0.2b 20 9.7 ± 0.1c Seq. #4 21 6.0 ± 0.1b 6 6.0 ± 0.2a 27 12.0 ± 0.2b Seq. #5 28 6.8 ± 0.2a 6 6.2 ± 0.4a 34 13.0 ± 0.3a

Table 7.2 Analysis of variance (ANOVA) of the biomass yields of the sequential experiment.

Biomass Sum of squares df Mean square F value p value S. obliquus Model 64.65 4 16.16 1390.08 ˂ 0.0001 Error 0.10 9 0.01 Corrected total 64.76 13

C. protothecoides Model 1.85 2 0.92 10.95 0.015 Error 0.42 5 0.08 Corrected total 2.27 7

Total Model 13.11 2 6.56 108.29 ˂ 0.0001 Error 0.30 5 0.06 Corrected total 13.42 7

2nd stage : heterotrophic production of C. protothecoides After harvesting of the S.obliquus biomass by centrifugation, the culture media were transferred aseptically into sterile culture flasks. These media were then inoculated with C. 135

136 protothecoides and cultivated heterotrophically for 6 days. Overall, these experiments produced 5 different sequences of cultivation involving 0 to 28 days of S. obliquus residence time and 6 days of C. protothecoides residence time for a total of 6 to 34 days (Table 7.1). The highest C. protothecoides biomass yields were obtained with culture media with a S.obliquus residence time of 21 and 28 days and highest monosaccharides content.

Estimation of the proportions of lactose, glucose and galactose present in the final culture media showed that the glucose and galactose made available during the first stage had been totally consumed and lactose represented ≥ 98% of total sugars in all cases. A quantitative estimation of the residual lactose was therefore performed using our FT-IR/ATR univariate model (Girard et al., 2013) and showed significant differences between sequences (F(4) = 194.5, p ˂ 0.0001) (Figure 7.6). Sequence #5 presented the highest lactose consumption (62% of total) and highest total biomass yield (13 g L-1), resulting in a 45% ―lactose-to-biomass‖ conversion yield.

Figure 7.6 Residual lactose present in the culture medium at the end of the 5 sequential culture experiments. Results are expressed as the mean±SD (n=3). Different letters indicate significant difference in sugar concentration (p ˂ 0.001).

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Concerning microalgal biodiesel, value added options must be found for the lipid extracted biomass in order to make the whole process viable economically. A number of options implying biorefining the biomass are currently under study to diversify the catalogue of commercial products that can be obtained from a single microalgal biomass feedstock (Yen et al., 2013). This catalogue could include antioxidant pigments, specialized lipids and proteins that could serve as a source of functional food. Therefore, although ―food grade installations and ingredients for food grade products‖ may imply higher initial costs, it could also translate into greater chances to make this industry possible in the short terms.

7.4 Conclusion

The culture strategies tested here demonstrate the possibility to perform phycoremediation of cheese whey permeate for the production of two different microalgal biomass feedstock by sequential culture. The glucose and galactose resulting from the extracellular lactose hydrolysis performed by the S. obliquus culture was completely consumed by the C. protothecoides culture. Also, we demonstrated that hydrogen peroxide could be used to decontaminate the culture media used in the process.

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CHAPITRE 8 Conclusion et perspectives

L‘objectif général du présent travail est le développement d‘un procédé de culture de microalgues à grande échelle pour l‘industrie du biodiesel. La littérature scientifique sur ce sujet n‘a cessé de s‘accumuler à un rythme élevé pendant tout le déroulement du projet (2010- 2014). Ceci est représentatif du vif intérêt de la communauté scientifique et des secteurs privés et institutionnels pour l‘innovation dans le domaine des technologies vertes pour la production de carburants renouvelables, qui permettront éventuellement de palier à l‘épuisement des énergies fossiles utilisées actuellement. Il semble toutefois peu probable que ces énergies puissent être complètement remplacées à courts ou moyens termes, principalement pour des raisons de coûts de production et de volume d‘utilisation à l‘échelle planétaire. Toutefois, les stratégies actuellement déployées par certains gouvernements de légiférer pour le remplacement graduel des combustibles fossiles permettront de réduire les impacts sociaux et économiques suivant l‘avènement du pic pétrolier. Par exemple, depuis le 1er juillet 2011, tout carburant diesel vendu au Canada doit posséder une teneur moyenne annuelle de 2% de biodiesel (Canada, 2010). Ces politiques sont essentielles à la poursuite de la recherche dans le domaine des bioénergies et les cibles devront être constamment mises à jour afin d‘assurer que les infrastructures de production d‘énergies renouvelables alternatives soient adéquates tout au long de la déplétion du pétrole.

Divers paramètres du procédé de culture de microalgues à développer ont été déterminés en amont des essais expérimentaux afin de jeter les bases des travaux à réaliser. Les choix effectués tiennent compte des contextes géographique et technique de l‘emplacement de l‘éventuelle usine de production (Québec, Canada) et sont présentés dans le tableau 3.1. Notamment, l‘utilisation de PBR permet d‘envisager une production continue même en hiver, contrairement aux étangs. Aussi, la sélection d‘espèces de microalgues mixotrophes permet de réduire la dépendance des cultures à la lumière. Sur le plan industriel, les principaux avantages de cultiver des microalgues en mode nutritif mixo/hétérotrophe est l‘augmentation de la productivité des cultures et la phycoremédiation d‘effluents industriels riches en DOC permettant du même coup de réduire les coûts de la source de carbone organique et des nutriments nécessaires. Le principal désavantage est l‘augmentation considérable du risque de

139 contamination des cultures par d‘autres microorganismes hétérotrophes tels les bactéries, les levures et les champignons.

L‘utilisation du perméat de lactosérum comme source de DOC pour la culture de microalgues mixo/hétérotrophes à l‘échelle industrielle présente plusieurs avantages comparativement à d‘autres effluents industriels ou à des eaux usées municipales (Bhatnagar et al., 2011). D‘abord, cette matière résiduelle industrielle contient une haute concentration en sucre (>100 g L-1). Ceci permettrait dans un premier temps, de réduire grandement les coûts de transport, si nécessaire, entre les usines de traitement de lactosérum et l‘emplacement de l‘usine de culture microalgale comparativement à d‘autres rejets liquides possédant une faible concentration en DOC. Il serait toutefois envisageable et potentiellement avantageux d‘intégrer les infrastructures de production de microalgues directement sur les sites de production de perméat de lactosérum (figure 8.1) (Fortier & Sturm, 2012). Dans un deuxième temps, cette haute concentration en DOC permet théoriquement d‘obtenir des cultures possédant une densité de biomasse très élevée (≥ 50 g L-1 ou 5% m/v) (Bumbak et al., 2011). En plus de réduire grandement les coûts reliés à la manutention des liquides (brassage, pompage, etc…) ceci simplifie également la récolte de la biomasse comparativement à des cultures photoautotrophes qui présentent couramment des rendements 100 fois inférieurs (Xu et al., 2011). Certaines technologies de traitement de la biomasse telles le séchage par pulvérisation et la liquéfaction hydrothermique peuvent utiliser comme intrant direct des solutions à 10% m/v de solides dissous. Il suffirait donc de concentrer la biomasse d‘un facteur 2, par centrifugation ou par osmose inverse par exemple, pour rendre possible l‘utilisation de telles technologies en aval du procédé de culture.

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Figure 8.1 Schéma du procédé de production de microalgues mixotrophes par l‘utilisation du perméat de lactosérum

Ensuite, le perméat de lactosérum contient plusieurs autres nutriments essentiels à la croissance des microalgues (Tableau 4.1). La simple présence de ces nutriments a permis d‘améliorer le rendement de cultures de Chlorella vulgaris, une espèce incapable d‘utiliser le lactose comme source de DOC (Abreu et al., 2012). Ce phénomène pourrait également être dû à la présence d‘autres facteurs de croissance dans le lactosérum. Il est toutefois à noter que la + concentration en azote, sous forme d‘ammonium (NH4 ), ne serait pas suffisante pour soutenir les rendements théoriques décrits ci-dessus. Une autre source d‘azote abordable, telle les résidus solubles de la distillation du maïs (Silva et al., 2010), doit donc être envisagée. Dans le cadre d‘un procédé de cultures de microalgues oléagineuses impliquant une phase d‘accumulation lipidique induite par une carence en azote, le fait de pouvoir contrôler la concentration initiale de ce nutriment est cependant un avantage considérable. Aussi, d‘autres avenues de valorisation devront être explorées pour les nutriments présents en excès dans le 3- - perméat de lactosérum, principalement le phosphore (PO4 ), le chlore (Cl ) et le potassium (K+).

Finalement, le perméat de lactosérum est un produit de grade alimentaire débarrassé de la grande majorité de ses contaminants microbiens grâce à l‘étape d‘ultrafiltration nécessaire à la séparation des protéines. En effet, l‘avenue de valorisation actuellement favorisée pour le

141 lactosérum passe d‘abord par la séparation des protéines. Ces protéines de lactosérum sont utilisées comme additif dans des produits destinés à l‘alimentation humaine et possèdent des effets bénéfiques pour la santé (Solak & Akin, 2012). Le perméat de lactosérum est donc le produit secondaire de cette étape de séparation et des avenues de valorisation sont actuellement recherchées pour ce concentré de lactose (Smithers, 2008). Dans l‘optique où un procédé de production de biodiesel microalgal doit nécessairement engendrer un ou des coproduits à haute valeur commerciale pour atteindre la rentabilité (Williams & Laurens, 2010), l‘utilisation d‘une telle matière résiduelle permet d‘envisager des coproduits de grade alimentaire, telles que des protéines microalgales pouvant être utilisées dans l‘alimentation humaine (Becker, 2007).

Les essais effectués à l‘échelle laboratoire ont permis de sélectionner une souche de microalgue pour le procédé et d‘optimiser certains paramètres pour la production de biomasse en mode mixo/hétérotrophe ainsi que pour l‘accumulation de lipides neutres par cette souche. Dans un sens plus large, les travaux ont permis d‘accumuler de l‘information sur dix espèces de microalgues.

L‘étape de la sélection d‘une souche a en effet permis de mettre en lumière plusieurs des forces et des faiblesses de ces dix espèces pour une culture industrielle dans le cadre déterminé par notre procédé. Notamment, il a été démontré que différents facteurs devaient être considérés lors du choix de la souche de microalgue à favoriser. Le processus de sélection présenté au chapitre 3 permet d‘établir une stratégie solide pour le choix de ces facteurs et la détermination de leur importance relative. Cette méthode a entre autres permis de démontrer que la productivité lipidique en TAG, souvent considérée comme le principal critère de sélection de souche pour le biodiesel (Griffiths & Harrison, 2009), n‘était pas le seul facteur à considérer. Par exemple, lors d‘expériences menées en conditions photoautotrophes, la souche Nannochloropsis oculata CCMP-525 a présenté la plus haute productivité en TAG parmi les dix souches testées (17 mg L-1 jour-1). Cependant lors du classement final, cette souche s‘est classée en troisième place principalement à cause du profil lipidique de ses huiles mal adapté à la production de biodiesel, de son faible potentiel de sédimentation naturel et de la méconnaissance de sa capacité à utiliser des sources de DOC d‘origines industrielles pour sa 141

142 croissance comparativement à la souche Scenedesmus obliquus CPCC-5. Il est à noter que ces expériences ont permis d‘enregistrer le plus haut contenu lipidique jamais recensé pour cette dernière espèce (61.9%), la marque précédente étant de 58,3% (Mandal & Mallick, 2009). Cette accumulation lipidique est possiblement due à l‘épuisement des réserves d‘azote contenues dans le milieu de culture par la culture de microalgues. Toutefois, le faible contenu en TAG de l‘extrait lipidique total (37%) a résulté en une productivité de lipides d‘intérêt de seulement 6 mg L-1 jour-1, d‘où l‘importance de pousser les analyses jusqu‘à la détermination des classes lipidiques présentes dans l‘extrait total (voir figure 2.5). À la fin de ce processus de sélection, quatre souches de microalgues d‘eau douce ont été retenues pour les travaux subséquents (Scenedesmus obliquus CPCC-5, Scenedesmus acutus CPCC-10, Chlorella vulgaris UTEX-2714, et Chlorella protothecoïdes UTEX-255). Les souches marines Nannochloropsis oculata CCMP-525 et Phaeodactylum tricornutum CCMP-632 n‘ont pas été retenues pour deux raisons techniques. D‘abord, l‘utilisation d‘eau de mer provoque une usure prématurée des systèmes de production et cette option n‘a pas été considérée viable économiquement dans notre contexte particulier. Ensuite, les espèces marines produisent typiquement des huiles végétales composées d‘une grande proportion d‘PUFA (voir section 2.5.3). Ce profil lipidique a un impact négatif sur plusieurs propriétés physicochimiques du biodiesel résultant, notamment l‘indice de cétane, l‘indice d‘iode et la stabilité oxydative; ce qui ne permet pas d‘obtenir un produit final répondant aux normes américaine et européenne EN 12214 ou ASTM D6751.

Le principal DOC contenu dans le perméat de lactosérum est le lactose (> 80% des solides dissouts). L‘utilisation du lactose par les organismes vivants dépend de leur capacité à synthétiser un transporteur transmembranaire, comme une lactose perméase, ainsi qu‘une enzyme de la famille des β–galactosidase qui permettent respectivement l‘internalisation et l‘hydrolyse de ce disaccharide. Chez la bactérie E. coli, l‘opéron lactose régule l‘expression de ces enzymes qui dépend à la fois de la disponibilité du lactose et de l‘absence de glucose dans le milieu de culture (Jacob & Monod, 1961). D‘autre part, certaines β–galactosidases peuvent être sécrétées à l‘extérieur de la cellule. Dans ces conditions, ce sont les molécules de glucose et de galactose résultant de l‘hydrolyse extracellulaire du lactose qui doivent être internalisées. Chez la microalgue Chlorella kessleri, les transporteurs transmembranaire HUP1 et HUP2

143 permettent cette internalisation mais possèdent des affinités différentes pour le glucose et pour le galactose (Stadler et al., 1995). Certaines mutations ponctuelles sur le gène HUP1 (Q298N et N436Q) permettent toutefois de moduler cette affinité (Will et al., 1998).

Des travaux ont permis de démontrer l‘existence d‘activité β–galactosidase endogène chez plusieurs espèces de plantes et de microalgues marines et d‘eau douce (Davies et al., 1994; Dwevedi & Kayastha, 2010). Trois des quatre souches retenues dans le cadre de nos travaux font partie de ce nombre. Cependant, nos résultats démontrent que seules les souches Scenedesmus obliquus CPCC-5, Scenedesmus acutus CPCC-10 peuvent croître en présence de lactose en conditions hétérotrophes (figure 4.1). Ces résultats s‘accordent tout de même avec ceux de Davies et al. 1994, puisque leurs résultats ont montré une activité β–galactosidase 400 fois supérieure chez Scenedesmus obliquus comparativement à celle observée chez Chlorella vulgaris et Chlorella protothecoïdes. D‘autres expériences ont toutefois démontré que le glucose permet d‘obtenir des résultats 10 fois supérieurs à ceux obtenus avec le lactose en ce qui a trait au rendement des cultures de Scenedesmus (résultats non présentés). À la suite des expériences de croissance menées en présence de lactose pur, seule la souche Scenedesmus obliquus CPCC-5 a été retenue pour la suite des travaux.

Deux des principaux paramètres à considérer pour l‘optimisation des conditions de culture pour la production de biomasse de S. obliquus en mode mixo/hétérotrophe en présence de perméat de lactosérum sont l‘effet de la lumière sur la productivité des cultures et la concentration en sucres permettant une croissance optimale. Ces aspects ont été abordés au chapitre 4 du présent manuscrit. Des expériences menées en conditions mixotrophe vs hétérotrophe ont permis de démontrer un effet positif de la présence de lumière sur le taux de croissance spécifique et le rendement des cultures. Ces résultats ont d‘ailleurs permis d‘ajouter l‘espèce S. obliquus à la liste des espèces pour lesquelles un effet additif des métabolismes photoautotrophe et hétérotrophe est observé. Cette liste compte déjà les espèces Chlorella vulgaris, Chlorella regularis, Haematococcus pluvialis, Spirulina platensis et Euglena gracilis (Ogbonna et al., 2002). Ce phénomène pourrait être dû à divers paramètres. Il a entre autres été observé que chez C. vulgaris, les taux d‘internalisation du glucose et de consommation d‘oxygène étaient les mêmes en présence et en absence de lumière (Martinez & Orus, 1991). 143

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Ceci suggère que les deux métabolismes peuvent fonctionner en parallèle sans être affectés l‘un par l‘autre. De même, en conditions mixotrophes, le CO2 produit par le métabolisme hétérotrophe lors de la respiration cellulaire peut être directement utilisé par le métabolisme photosynthétique (Ogawa & Aiba, 1981). Dans cette optique, la complémentarité des métabolismes de la photosynthèse et de la respiration cellulaire par l‘utilisation de l‘oxygène produit dans l‘un et consommé dans l‘autre, ainsi que le cycle du CO2 suivant la voie inverse, pourrait contribuer à optimiser les taux de production de biomasse ainsi qu‘à stabiliser le pH de cultures à grande échelle. En effet, le pH est un bon indicateur permettant de suivre l‘activité des différents métabolismes. Le métabolisme autotrophe provoque une alcalinisation

à cause de la consommation du CO2 gazeux, tandis qu‘en mode hétérotrophe, c‘est l‘inverse, et le milieu se voit acidifié par le CO2 produit de la respiration. En mixotrophie, le pH de la culture varie selon la constituante dominante du métabolisme, mais dans la plupart des cas, il demeure approximativement constant (Chojnacka & Marquez-Rocha, 2004).

Lorsqu‘une source de DOC exogène est assimilée par une cellule microalgale en conditions mixotrophe, celle-ci vient s‘ajouter au pool de molécules organiques produites par la photosynthèse et disponibles pour la respiration cellulaire. Ainsi, afin qu‘une stimulation de la croissance puisse être observée, la machinerie de respiration doit s‘adapter pour être en mesure d‘utiliser une plus grande quantité de carbone par unité de temps. Chez plusieurs espèces, cette stimulation de la respiration a été observée suite à l‘ajout d‘une source de carbone exogène en présence ou en absence de lumière (Lee, 2004a; Liu et al., 2009). D‘autres souches de Chlorella ont montré un taux de croissance mixotrophe, en présence de glucose, supérieur à la somme des taux de croissance obtenus en autotrophie et en hétérotrophie (Lalucat et al., 1984; Orús et al., 1991). Ceci suggère plutôt une synergie entre les métabolismes. Lalucat et al., au cours d‘une analyse bioénergétique extensive, ont démontré une diminution significative de la fraction d‘énergie lumineuse utilisée pour la fixation de CO2 dans les cellules mixotrophes. L‘énergie lumineuse était plutôt utilisée comme source d‘énergie pour l‘assimilation de carbone organique. En effet, comme le ratio énergie-carbone, exprimé en kcal mol-1, est plus élevé dans la biomasse microalgale que dans le glucose, il n‘y a pas suffisamment d‘énergie dans ce substrat organique pour supporter sa totale conversion en biomasse. Cette utilisation de l‘énergie lumineuse permet donc une efficacité énergétique supérieure en réduisant la

145 quantité d‘énergie perdue par dissipation et en augmentant l‘efficacité photosynthétique. Ces travaux ont permis de conclure que la culture mixotrophe était le procédé le plus efficace de production de biomasse microalgale (Lalucat et al., 1984). En plus de permettre une productivité accrue, l‘ajout d‘une composante énergétique sous forme de lumière à de telles cultures entraîne la production de métabolites d‘intérêt commercial dont l‘expression est dépendante de la présence de lumière, tels que certains pigments photosynthétiques et vitamines (Ogbonna et al., 2002).

Plusieurs formes de DOC peuvent être utilisées par les microalgues. La capacité d‘une espèce de microalgue à pouvoir utiliser une forme donnée dépend de la présence chez cette dernière, des gènes, ainsi que des mécanismes de régulation de leur expression, nécessaires au catabolisme de cette forme. Le glucose est la source de DOC la plus fréquemment utilisée en laboratoire dans les cultures mixotrophes. Il pénètre dans la cellule par transport actif via la protéine transmembranaire HUP1 (Hallmann & Sumper, 1996). L‘ajout de glucose au milieu de culture de Chlorella vulgaris induit plusieurs changements métaboliques tels que : l‘expression du gène hup1 et une diminution du contenu cellulaire en chlorophylle (Perez- Garcia et al., 2011c).

L‘intensité lumineuse joue également un rôle clé dans la stimulation de croissance pouvant être observée à l‘intérieur de cultures mixotrophes. Dans des conditions de saturation lumineuse, le taux de croissance de cultures mixotrophes de Scenedesmus et de Chlorella est égal à celui obtenu en autotrophie (Combres et al., 1994b; Martínez et al., 1997). Dans ce cas, l‘ajout d‘une source de DOC permettrait de stimuler le taux de croissance seulement dans des conditions où la croissance est limitée par la lumière. Ceci pourrait être expliqué, entre autres, par le fait que le mécanisme d‘absorption du glucose peut être inhibé par la lumière, chez certaines souches de Chlorella (Lee, 2004a).

Dans un autre cas d‘étude, à partir d‘une certaine intensité lumineuse, le taux de croissance de cultures mixotrophes était plus bas que le taux de croissance des cultures autotrophes soumises aux mêmes conditions (Ogawa & Aiba, 1981). Ceci pourrait être dû à la diminution du contenu cellulaire en chlorophylle observé dans des cultures mixotrophes de Scenedesmus 145

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acutus et de Phaeodactylum tricornutum, alors que l‘intensité lumineuse optimale (Iopt) est plus basse que celle des cultures photoautotrophes (Bouarab et al., 2004; Liu et al., 2009). De plus, le groupe de Liu et al., est parvenu à démontrer, grâce à des techniques d‘analyse du spectre de fluorescence, que l‘ajout de glucose, d‘acétate ou de glycérol au milieu de culture de P. tricornutum provoque une redistribution de l‘énergie entre les photosystèmes I et II et une diminution de l‘efficacité photochimique du PSII. Cette redistribution est accompagnée d‘une réduction du taux de production d‘oxygène et du taux de transfert d‘électrons, ce qui a permis de conclure à une répression de la photosynthèse chez cette espèce en conditions mixotrophes (Liu et al., 2009).

Les interactions possibles entre les métabolismes d‘absorption d‘une source de DOC, la respiration cellulaire et la photosynthèse sont donc multiples et une grande variabilité dans la réponse cellulaire est observée dépendamment de l‘espèce de microalgue ainsi que de la source de DOC. De plus, la lumière est responsable de la régulation de l‘expression de plusieurs gènes impliqués dans ces métabolismes et pour certaines espèces, l‘intensité lumineuse régule l‘efficacité du métabolisme en mode mixotrophe (Hodaifa et al., 2009). Dans cette optique, il serait intéressant de tester différentes intensités lumineuses afin de déterminer si l‘effet bénéfique de la présence de lumière peut également être observé à des densités de biomasse > 5 g L-1 à l‘intérieur de cultures mixotrophes de S. obliquus.

Diverses proportions du milieu de culture (BBM) ont été substituées par du perméat de lactosérum afin de déterminer la concentration en sucres permettant une croissance optimale de S. obliquus. En effet, des essais effectués avec le glucose ont permis de déterminer qu‘à partir d‘une certaine concentration (1,5% m/v), un effet négatif peut être observé sur la croissance de cette espèce (Mandal & Mallick, 2009). Les résultats ont permis d‘observer une augmentation du taux de croissance des cultures mixotrophes dans un milieu composé jusqu‘à 40% v/v de perméat de lactosérum, correspondant approximativement à 40 g de lactose L-1. Au-delà de ces proportions, une augmentation de la durée de la phase de latence précédant la phase de croissance exponentielle était provoquée (résultats non présentés).

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Aucune accumulation significative de lipides neutres n‘a pu être observée au cours des travaux d‘optimisation de la productivité en biomasse des cultures de S. obliquus mixotrophes (Chapitre 4). Toutefois, les cultures contrôles photoautotrophes ont accumulé jusqu‘à 21,1% de leur biomasse sèche sous la forme de lipides dont 85% étaient des lipides neutres (Tableau 4.3). Quoique cette accumulation puisse être liée à un épuisement des réserves d‘azote, ceci n‘est vraisemblablement pas le seul facteur puisque cet épuisement s‘est également produit à l‘intérieur des cultures mixotrophes (Figure 4.3-B). Le suivi du pH effectué au cours de cette expérience a permis de montrer que l‘accumulation de lipides neutres observée dans les cultures photoautotrophes était accompagnée d‘une importante alcalinisation du milieu de culture (> 9,5) contrairement aux cultures mixotrophes dont le pH légèrement acide (6,1) était demeuré relativement stable tout au long de l‘expérience. Ainsi, ces observations ont inspiré les travaux d‘optimisation présentés au Chapitre 6. Ces travaux ont permis de comparer les effets du mode trophique, du pH, de la densité cellulaire et du temps d‘incubation sur l‘accumulation de lipides neutres pour trois espèces de microalgues carencées en azote, grâce à une méthode statistique d‘optimisation des procédés fréquemment utilisée dans l‘industrie : la méthode des surfaces de réponse (Anderson & Whitcomb, 2005; Cheng et al., 2013).

La souche Chlorella protothecoïdes UTEX-255 a montré plusieurs caractéristiques intéressantes pour les applications visées par le procédé comparativement aux souches Scenedesmus obliquus CPCC-5 et Ankistrodesmus convolutus CPCC-309. Notamment, un rendement supérieur lors de la première étape du procédé, qui consistait à la production de biomasse en mode mixotrophe; un contenu en lipides neutres supérieur, tel qu‘illustré par une fluorescence rouge de Nile des cellules en moyenne 5 fois supérieure; et la capacité d‘accumuler des lipides neutres en l‘absence de lumière (hétérotrophie). Ces résultats sont également appuyés par plusieurs articles scientifiques et brevets portant sur cette souche (Heredia-Arroyo et al., 2010; Mohamed et al., 2011; Santos et al., 2011; Xiong et al., 2008).

L‘absence d‘accumulation lipidique chez S. obliquus et A. convolutus en conditions hétérotrophes observée dans le cadre de nos travaux suggère que la lumière est un facteur essentiel pour que ce phénomène puisse se produire chez ces souches de microalgues. De plus, le fait qu‘une accumulation de lipides ait été observée uniquement à des densités de biomasse 147

148 relativement faibles (< 2,4 g L-1 de masse sèche) en conditions photoautotrophes suggère qu‘une dose de lumière minimale doive nécessairement être fournie à chaque cellule pour rendre le phénomène possible. Une analogie peut d‘ailleurs être faite avec les mécanismes de la croissance des cultures, alors que la lumière est bien connue comme pouvant être le facteur limitant (Richmond, 2007). La capacité d‘accumuler des lipides en mode mixo/hétérotrophe semble donc être spécifique à la souche étudiée.

D‘autres essais à l‘échelle pilote ont été effectués dans des PBR colonnes de 27 litres. Ces essais ont permis de démontrer qu‘un nettoyage exhaustif des systèmes couplé à l‘utilisation de la méthode « peroxyde d‘hydrogène (H2O2) / catalase » présentée au Chapitre 7 n‘était pas suffisant pour assurer l‘absence de contamination par d‘autres microorganismes dans un milieu de culture composé à 40% v/v de perméat de lactosérum. En effet, d‘importantes contamination ont été observées 24h après l‘inoculation de la culture de S. obliquus axénique. Ces contaminations pourraient provenir d‘une stérilisation incomplète du système, d‘erreurs de manipulation lors de l‘inoculation ou d‘une insuffisance des filtres utilisés dans les systèmes de bullage. Il semble donc qu‘une optimisation des systèmes et des procédures d‘utilisation soit nécessaire à la réussite de la mise à l‘échelle du procédé. Ces travaux pourront s‘inspirer des systèmes et procédures déjà existants dans des procédés de fermentation à l‘échelle industrielle, telle que la production de bière, de yaourt ou autres.

Pour conclure, le taux d‘hydrolyse du lactose relativement lent et constant observé chez les cultures de S. obliquus (Figure 7.4) suggère l‘absence d‘un mécanisme régulatoire comparable à celui existant chez E. coli pour l‘expression des gènes intervenant dans le catabolisme du lactose (opéron lac). Il est en effet peu probable que des microorganismes végétaux puissent évoluer pour développer un mécanisme d‘utilisation du lactose comparable à celui développé par Chlorella vulgaris pour l‘utilisation du glucose, en raison de l‘absence de ce disaccharide mammifère dans leur milieu naturel. L‘enzyme responsable de l‘hydrolyse extracellulaire du lactose par cette microalgue pourrait donc avoir une fonction autre telle que la synthèse ou le réarrangement de la paroi. En effet, la paroi cellulaire microalgale est constituée de polysaccharides composés en partie de galactose (Takeda, 1996). Dans le cadre d‘un procédé de production de biomasse microalgale à grande échelle, ce taux d‘hydrolyse pourrait devenir

149 problématique s‘il s‘avérait devenir le facteur limitant la productivité des cultures. De plus la nécessité de fournir une certaine dose de lumière afin de permettre l‘accumulation de lipides neutres chez cette espèce est désavantageuse pour une production à grande échelle particulièrement à cause du fait que la phase d‘accumulation lipidique devrait pouvoir être induite dans des cultures à haute densité (> 50 g L-1) afin de faciliter les étapes subséquentes de récolte de la biomasse et d‘extraction des lipides. Ces limitations, mises en reliefs grâce aux travaux effectués dans le cadre du présent projet de recherche, devront être abordées à l‘aide des méthodes d‘ingénierie métabolique et génétique décrites au Chapitre 2. Dans tous les cas, les méthodes du suivi des sucres exposées au Chapitre 5 et exploitées au Chapitre 7 seront d‘une grande utilité dans la poursuite des travaux d‘optimisation du procédé.

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ANNEXE A

List of >100 microalgae species with potential for biodiesel production and citation in recent literature.

Phyllum Class Specie Citations (review)

Cyanophyta Cyanophyceae Anabaena sp. (Brennan & Owende, 2010) Anabaena (Ghasemi Y., 2012; Griffiths & cylindrical Harrison, 2009; Satyanarayana et al., 2011; Singh & Gu, 2010; Um & Kim, 2009; Verma et al., 2010) Arthrospira sp. (Brennan & Owende, 2010; Greenwell et al., 2010) Arthrospira (Brennan & Owende, 2010; platensis Gong & Jiang, 2011) Microcystis sp. (Lam & Lee, 2012) Microcystis (Brennan & Owende, 2010) aeruginosa Oscillatoria sp. (Griffiths & Harrison, 2009) Spirulina sp. (Brennan & Owende, 2010) Spirulina (Chen et al., 2011; Gouveia & maxima Oliveira, 2009; Griffiths & Harrison, 2009; Halim et al., 2012; Hempel et al., 2012; Mata et al., 2010; Satyanarayana et al., 2011; Sialve et al., 2009; Singh & Gu, 2010; Um & Kim, 2009; Verma et al., 2010) Spirulina (Amaro et al., 2011; Brennan & platensis Owende, 2010; Ghasemi Y., 2012; Gong & Jiang, 2011; Griffiths & Harrison, 2009; Halim et al., 2012; Hempel et al., 2012; Malcata, 2011; Mata et al., 2010; Sialve et al., 2009; Singh & Gu, 2010; Um & Kim, 2009; Varfolomeev & Wasserman, 2011; Verma et al., 2010) Synechococcus (Courchesne et al., 2009; sp. Griffiths & Harrison, 2009; Singh & Gu, 2010; Um & Kim, 2009)

171

Synechocystis sp. (Angermayr et al., 2009) Rhodophyta Rhodophycaea Galdieria (Brennan & Owende, 2010) sulphuraria Porphyridium (Ahmad et al., 2011; Brennan & cruentum Owende, 2010; Chen et al., 2011; Griffiths & Harrison, 2009; Mata et al., 2010; Rodolfi et al., 2009; Satyanarayana et al., 2011; Singh & Gu, 2010; Um & Kim, 2009; Varfolomeev & Wasserman, 2011) Florideophyceae Hypnea (Halim et al., 2012) charoides Cyanidiophyceae Cyanidioschyzon (Courchesne et al., 2009) merolae Chlorophyta Chlorophyceae Ankistrodesmus (Deng et al., 2009; Ghasemi Y., sp. 2012; Mata et al., 2010; Varfolomeev & Wasserman, 2011; Verma et al., 2010) Ankistrodesmus (Griffiths & Harrison, 2009) falcatus Botryococcus sp. (Amaro et al., 2011; Lam & Lee, 2012; Malcata, 2011) Botryococcus (Amaro et al., 2011; Brennan & braunii Owende, 2010; Chen et al., 2011; Chisti, 2007; Deng et al., 2009; Ghasemi Y., 2012; Halim et al., 2012; Huntley & Redalje, 2006; Lam & Lee, 2012; Mata et al., 2010; Satyanarayana et al., 2011; Singh & Gu, 2010; Varfolomeev & Wasserman, 2011; Verma et al., 2010) Chlamydomonas (Ghasemi Y., 2012; Verma et sp. al., 2010) Chlamydomonas (Beer et al., 2009; Courchesne reinhardtii et al., 2009; Deng et al., 2009; Griffiths & Harrison, 2009; Lam & Lee, 2012; Satyanarayana et al., 2011; Sialve et al., 2009; Singh & Gu, 2010; Um & Kim, 2009) Chlamydomonas (Griffiths & Harrison, 2009) applanata Chlorococcum (Ahmad et al., 2011; Amaro et sp. al., 2011; Brennan & Owende, 171

172

2010; Chen et al., 2011; Gong & Jiang, 2011; Halim et al., 2012; Lam & Lee, 2012; Malcata, 2011; Mata et al., 2010; Rodolfi et al., 2009; Singh & Gu, 2010; Varfolomeev & Wasserman, 2011) Chlorococcum (Hempel et al., 2012) ellipsoideum Choricystis (Lam & Lee, 2012) minor Dunaliella sp. (Amaro et al., 2011; Courchesne et al., 2009; Deng et al., 2009; Lam & Lee, 2012; Malcata, 2011; Mata et al., 2010; Varfolomeev & Wasserman, 2011) Dunaliella (Gouveia & Oliveira, 2009; bioculata Singh & Gu, 2010; Um & Kim, 2009; Verma et al., 2010) Dunaliella (Amaro et al., 2011; Brennan & tertiolecta Owende, 2010; Chen et al., 2011; Deng et al., 2009; Ghasemi Y., 2012; Griffiths & Harrison, 2009; Lam & Lee, 2012; Malcata, 2011; Mata et al., 2010; Varfolomeev & Wasserman, 2011; Verma et al., 2010) Dunaliella salina (Amaro et al., 2011; Deng et al., 2009; Ghasemi Y., 2012; Gong & Jiang, 2011; Gouveia & Oliveira, 2009; Greenwell et al., 2010; Griffiths & Harrison, 2009; Huntley & Redalje, 2006; Malcata, 2011; Mata et al., 2010; Satyanarayana et al., 2011; Sialve et al., 2009; Singh & Gu, 2010; Um & Kim, 2009; Varfolomeev & Wasserman, 2011; Verma et al., 2010) Dunaliella (Amaro et al., 2011; Chisti, primolecta 2007; Deng et al., 2009; Ghasemi Y., 2012; Griffiths & Harrison, 2009; Huntley &

173

Redalje, 2006; Malcata, 2011; Mata et al., 2010; Satyanarayana et al., 2011; Singh & Gu, 2010; Varfolomeev & Wasserman, 2011) Haematococcus (Amaro et al., 2011; Brennan & pluvialis Owende, 2010; Deng et al., 2009; Ghasemi Y., 2012; Gong & Jiang, 2011; Greenwell et al., 2010; Huntley & Redalje, 2006; Lam & Lee, 2012; Malcata, 2011; Mata et al., 2010) Nannochloris sp. (Amaro et al., 2011; Chen et al., 2011; Chisti, 2007; Courchesne et al., 2009; Deng et al., 2009; Griffiths & Harrison, 2009; Malcata, 2011; Mata et al., 2010; Satyanarayana et al., 2011; Singh & Gu, 2010; Varfolomeev & Wasserman, 2011) Neochloris sp. (Hempel et al., 2012) Neochloris (Amaro et al., 2011; Chen et al., oleoabundans 2011; Chisti, 2007; Courchesne et al., 2009; Deng et al., 2009; Ghasemi Y., 2012; Gong & Jiang, 2011; Gouveia & Oliveira, 2009; Griffiths & Harrison, 2009; Lam & Lee, 2012; Li et al., 2008; Malcata, 2011; Satyanarayana et al., 2011; Singh & Gu, 2010; Verma et al., 2010) Ourococcus sp. (Griffiths & Harrison, 2009) Parietochloris (Li et al., 2008; Satyanarayana incisa et al., 2011) Pediastrum (Hempel et al., 2012) boryanum Scenedesmus sp. (Ahmad et al., 2011; Amaro et al., 2011; Brennan & Owende, 2010; Chen et al., 2011; Gong & Jiang, 2011; Lam & Lee, 2012; Malcata, 2011; Mata et al., 2010; Rodolfi et al., 2009; Singh & Gu, 2010) 173

174

Scenedesmus (Amaro et al., 2011; Mata et al., acutus 2010) Scenedesmus (Amaro et al., 2011; Brennan & obliquus Owende, 2010; Chen et al., 2011; Deng et al., 2009; Gong & Jiang, 2011; Gouveia & Oliveira, 2009; Griffiths & Harrison, 2009; Malcata, 2011; Mata et al., 2010; Satyanarayana et al., 2011; Sialve et al., 2009; Singh & Gu, 2010; Um & Kim, 2009; Varfolomeev & Wasserman, 2011; Verma et al., 2010) Scenedesmus (Deng et al., 2009; Gouveia & dimorphus Oliveira, 2009; Griffiths & Harrison, 2009; Lam & Lee, 2012; Singh & Gu, 2010; Um & Kim, 2009; Verma et al., 2010) Scenedesmus (Ahmad et al., 2011; Amaro et quadricauda al., 2011; Chen et al., 2011; Griffiths & Harrison, 2009; Malcata, 2011; Mata et al., 2010; Rodolfi et al., 2009; Satyanarayana et al., 2011; Singh & Gu, 2010; Um & Kim, 2009; Varfolomeev & Wasserman, 2011; Verma et al., 2010) Scenedesmus (Hempel et al., 2012) rubescens Selenastrum sp. (Ghasemi Y., 2012; Verma et al., 2010) Selenastrum (Griffiths & Harrison, 2009) gracile Tetraselmis sp. (Ahmad et al., 2011; Brennan & Owende, 2010; Chen et al., 2011; Mata et al., 2010; Rodolfi et al., 2009; Sialve et al., 2009; Singh & Gu, 2010; Varfolomeev & Wasserman, 2011) Tetraselmis (Ahmad et al., 2011; Chen et suecica, al., 2011; Chisti, 2007; Ghasemi Y., 2012; Gong & Jiang, 2011; Griffiths & Harrison, 2009;

175

Huntley & Redalje, 2006; Mata et al., 2010; Rodolfi et al., 2009; Satyanarayana et al., 2011; Singh & Gu, 2010; Verma et al., 2010) Tetraselmis (Singh & Gu, 2010; Um & maculata Kim, 2009; Verma et al., 2010) Volvox carteri (Beer et al., 2009; Courchesne et al., 2009) Trebouxiophycaea Chlorella sp. (Ahmad et al., 2011; Amaro et al., 2011; Brennan & Owende, 2010; Chen et al., 2011; Chisti, 2007; Deng et al., 2009; Gong & Jiang, 2011; Greenwell et al., 2010; Halim et al., 2012; Hempel et al., 2012; Lam & Lee, 2012; Li et al., 2008; Malcata, 2011; Mata et al., 2010; Rodolfi et al., 2009; Satyanarayana et al., 2011; Singh & Gu, 2010; Varfolomeev & Wasserman, 2011; Verma et al., 2010) Chlorella (Ahmad et al., 2011; Amaro et vulgaris al., 2011; Brennan & Owende, 2010; Chen et al., 2011; Courchesne et al., 2009; Deng et al., 2009; Ghasemi Y., 2012; Gouveia & Oliveira, 2009; Griffiths & Harrison, 2009; Halim et al., 2012; Hempel et al., 2012; Huntley & Redalje, 2006; Lam & Lee, 2012; Li et al., 2008; Malcata, 2011; Mata et al., 2010; Rodolfi et al., 2009; Satyanarayana et al., 2011; Sialve et al., 2009; Singh & Gu, 2010; Um & Kim, 2009; Varfolomeev & Wasserman, 2011; Verma et al., 2010) Chlorella (Amaro et al., 2011; Chen et al., emersonii 2011; Courchesne et al., 2009; Deng et al., 2009; Ghasemi Y., 2012; Gouveia & Oliveira, 2009; Griffiths & Harrison, 2009; Huntley & Redalje, 2006; 175

176

Li et al., 2008; Malcata, 2011; Mata et al., 2010; Satyanarayana et al., 2011; Sialve et al., 2009; Varfolomeev & Wasserman, 2011; Verma et al., 2010) Chlorella fusca (Hempel et al., 2012) Chlorella (Chen et al., 2011; Courchesne minutissima et al., 2009; Deng et al., 2009; Ghasemi Y., 2012; Gouveia & Oliveira, 2009; Griffiths & Harrison, 2009; Hempel et al., 2012; Huntley & Redalje, 2006; Li et al., 2008; Satyanarayana et al., 2011; Verma et al., 2010) Chlorella (Amaro et al., 2011; Brennan & protothecoides Owende, 2010; Chen et al., 2011; Deng et al., 2009; Ghasemi Y., 2012; Gong & Jiang, 2011; Gouveia & Oliveira, 2009; Griffiths & Harrison, 2009; Lam & Lee, 2012; Li et al., 2008; Malcata, 2011; Mata et al., 2010; Satyanarayana et al., 2011; Sialve et al., 2009; Varfolomeev & Wasserman, 2011) Chlorella (Amaro et al., 2011; pyrenoidosa Courchesne et al., 2009; Griffiths & Harrison, 2009; Lam & Lee, 2012; Malcata, 2011; Mata et al., 2010; Sialve et al., 2009; Singh & Gu, 2010; Um & Kim, 2009; Varfolomeev & Wasserman, 2011) Chlorella (Hempel et al., 2012) saccharophila Chlorella (Ahmad et al., 2011; Amaro et sorokiniana al., 2011; Brennan & Owende, 2010; Chen et al., 2011; Deng et al., 2009; Ghasemi Y., 2012; Gong & Jiang, 2011; Gouveia & Oliveira, 2009; Griffiths & Harrison, 2009; Li et al., 2008; Malcata, 2011; Mata et al.,

177

2010; Rodolfi et al., 2009; Satyanarayana et al., 2011; Singh & Gu, 2010; Varfolomeev & Wasserman, 2011; Verma et al., 2010) Chlorella (Brennan & Owende, 2010) kessleri Chlorella (Hempel et al., 2012) zofingiensis Oocystis pusilla (Mata et al., 2010) Stichococcus sp. (Ghasemi Y., 2012; Verma et al., 2010) Prasinophycaea Ostreococcus (Courchesne et al., 2009) tauri Zygnematophyceae Cosmarium sp. (Hempel et al., 2012) Spirogyra sp. (Singh & Gu, 2010; Um & Kim, 2009) Euglenophyta Euglenophycaea Euglena gracilis (Deng et al., 2009; Ghasemi Y., 2012; Griffiths & Harrison, 2009; Mata et al., 2010; Sialve et al., 2009; Singh & Gu, 2010; Um & Kim, 2009; Varfolomeev & Wasserman, 2011) Dinophyta Dinophycaea Crypthecodinium (Brennan & Owende, 2010; cohnii Chisti, 2007; Deng et al., 2009; Ghasemi Y., 2012; Griffiths & Harrison, 2009; Mata et al., 2010; Satyanarayana et al., 2011; Singh & Gu, 2010; Varfolomeev & Wasserman, 2011) Heterokonta Bacillariophycaea Amphiprora (Griffiths & Harrison, 2009) hyalina Amphora sp. (Griffiths & Harrison, 2009) Chaetoceros (Ahmad et al., 2011; Amaro et calcitrans al., 2011; Chen et al., 2011; Griffiths & Harrison, 2009; Malcata, 2011; Mata et al., 2010; Rodolfi et al., 2009; Satyanarayana et al., 2011; Singh & Gu, 2010; Varfolomeev & Wasserman, 2011) Chaetoceros (Ahmad et al., 2011; Amaro et muelleri al., 2011; Chen et al., 2011; Deng et al., 2009; Ghasemi Y., 177

178

2012; Griffiths & Harrison, 2009; Halim et al., 2012; Malcata, 2011; Mata et al., 2010; Rodolfi et al., 2009; Satyanarayana et al., 2011; Singh & Gu, 2010; Varfolomeev & Wasserman, 2011; Verma et al., 2010) Cyclotella sp. (Ghasemi Y., 2012) Cyclotella (Courchesne et al., 2009; cryptica Griffiths & Harrison, 2009) Cylindrotheca (Chisti, 2007; Griffiths & sp. Harrison, 2009; Satyanarayana et al., 2011; Singh & Gu, 2010) Hantzschia sp. (Ghasemi Y., 2012; Verma et al., 2010) Monoraphidium (Griffiths & Harrison, 2009; minutum Halim et al., 2012) Navicula (Griffiths & Harrison, 2009) acceptata Navicula (Griffiths & Harrison, 2009) pelliculosa Navicula (Courchesne et al., 2009; saprophila. Griffiths & Harrison, 2009) Nitzschia sp. (Chisti, 2007; Mata et al., 2010; Satyanarayana et al., 2011; Singh & Gu, 2010; Varfolomeev & Wasserman, 2011) Nitzschia (Ghasemi Y., 2012; Huntley & closterium Redalje, 2006; Verma et al., 2010) Nitzschia (Griffiths & Harrison, 2009) communis Nitzschia (Griffiths & Harrison, 2009) dissipata Nitzschia (Ghasemi Y., 2012; Griffiths & frustulum Harrison, 2009; Verma et al., 2010) Nitzschia laevi (Li et al., 2008; Satyanarayana et al., 2011) Nitzschia palea (Griffiths & Harrison, 2009) Phaeodactylum (Ahmad et al., 2011; Amaro et tricornutum al., 2011; Beer et al., 2009; Brennan & Owende, 2010; Chen et al., 2011; Chisti, 2007;

179

Courchesne et al., 2009; Deng et al., 2009; Ghasemi Y., 2012; Gong & Jiang, 2011; Griffiths & Harrison, 2009; Halim et al., 2012; Hempel et al., 2012; Huntley & Redalje, 2006; Malcata, 2011; Mata et al., 2010; Rodolfi et al., 2009; Satyanarayana et al., 2011; Singh & Gu, 2010; Varfolomeev & Wasserman, 2011; Verma et al., 2010) Skeletonema sp. (Chen et al., 2011; Rodolfi et al., 2009; Singh & Gu, 2010; Varfolomeev & Wasserman, 2011) Skeletonema (Ghasemi Y., 2012) dimorphus Skeletonema (Ahmad et al., 2011; Chen et costatum al., 2011; Deng et al., 2009; Ghasemi Y., 2012; Griffiths & Harrison, 2009; Mata et al., 2010; Rodolfi et al., 2009; Singh & Gu, 2010; Varfolomeev & Wasserman, 2011; Verma et al., 2010) Skeletonema (Ghasemi Y., 2012) quadricauda Thalassiosira (Ahmad et al., 2011; Chen et pseudonana al., 2011; Courchesne et al., 2009; Deng et al., 2009; Ghasemi Y., 2012; Griffiths & Harrison, 2009; Mata et al., 2010; Rodolfi et al., 2009; Singh & Gu, 2010; Varfolomeev & Wasserman, 2011) Thalassiosira (Griffiths & Harrison, 2009) weissflogii Xanthophyceae Ellipsoidion sp. (Ahmad et al., 2011; Amaro et al., 2011; Chen et al., 2011; Deng et al., 2009; Ghasemi Y., 2012; Gong & Jiang, 2011; Malcata, 2011; Mata et al., 2010; Rodolfi et al., 2009; Singh & Gu, 2010; 179

180

Varfolomeev & Wasserman, 2011) Monodus (Ahmad et al., 2011; Chen et subterraneus al., 2011; Courchesne et al., 2009; Deng et al., 2009; Griffiths & Harrison, 2009; Li et al., 2008; Mata et al., 2010; Rodolfi et al., 2009; Satyanarayana et al., 2011; Singh & Gu, 2010) Tribonema sp. (Griffiths & Harrison, 2009) Eustigmatophycaea Monallanthus (Chisti, 2007; Deng et al., 2009; salina Ghasemi Y., 2012; Mata et al., 2010; Satyanarayana et al., 2011; Singh & Gu, 2010; Varfolomeev & Wasserman, 2011; Verma et al., 2010) Nannochloropsis (Ahmad et al., 2011; Amaro et sp. al., 2011; Brennan & Owende, 2010; Chen et al., 2011; Chisti, 2007; Deng et al., 2009; Ghasemi Y., 2012; Gong & Jiang, 2011; Griffiths & Harrison, 2009; Halim et al., 2012; Huntley & Redalje, 2006; Lam & Lee, 2012; Malcata, 2011; Mata et al., 2010; Rodolfi et al., 2009; Satyanarayana et al., 2011; Singh & Gu, 2010; Varfolomeev & Wasserman, 2011; Verma et al., 2010) Nannochloropsis (Griffiths & Harrison, 2009; salina Lam & Lee, 2012) Nannochloropsis (Amaro et al., 2011; Chen et al., oculata 2011; Deng et al., 2009; Gong & Jiang, 2011; Lam & Lee, 2012; Malcata, 2011; Mata et al., 2010; Varfolomeev & Wasserman, 2011) Thraustochytriaceae Schizochytrium (Brennan & Owende, 2010; sp. Chisti, 2007; Deng et al., 2009; Ghasemi Y., 2012; Satyanarayana et al., 2011; Singh & Gu, 2010) Haptophyta Prymnesiophycaea Hymenomonas (Griffiths & Harrison, 2009) carterae

181

Isochrysis sp. (Ahmad et al., 2011; Amaro et al., 2011; Chen et al., 2011; Chisti, 2007; Deng et al., 2009; Malcata, 2011; Mata et al., 2010; Rodolfi et al., 2009; Satyanarayana et al., 2011; Singh & Gu, 2010) Isochrysis (Amaro et al., 2011; Deng et al., galbana 2009; Ghasemi Y., 2012; Griffiths & Harrison, 2009; Halim et al., 2012; Huntley & Redalje, 2006; Lam & Lee, 2012; Malcata, 2011; Mata et al., 2010; Satyanarayana et al., 2011; Varfolomeev & Wasserman, 2011; Verma et al., 2010) Pleurochrysis (Mata et al., 2010) carterae Prymnesium (Deng et al., 2009; Ghasemi Y., parvum 2012; Griffiths & Harrison, 2009; Singh & Gu, 2010; Um & Kim, 2009) Pavlovophyceae Pavlova lutheri (Ahmad et al., 2011; Amaro et al., 2011; Chen et al., 2011; Deng et al., 2009; Ghasemi Y., 2012; Gong & Jiang, 2011; Griffiths & Harrison, 2009; Malcata, 2011; Mata et al., 2010; Rodolfi et al., 2009; Singh & Gu, 2010; Varfolomeev & Wasserman, 2011) Pavlova salina (Ahmad et al., 2011; Amaro et al., 2011; Chen et al., 2011; Deng et al., 2009; Gong & Jiang, 2011; Griffiths & Harrison, 2009; Malcata, 2011; Mata et al., 2010; Rodolfi et al., 2009; Singh & Gu, 2010)

181

182

ANNEXE B

Table S1 Experimental results vs values predicted by each model of the photoautotrophic experiment. Data is the normalized mean fluorescence of cells at 575±20 nm (FL2) after Log10 transformation.

Response values (mean FL2) Run SO AC CP Actual Predicted Actual Predicted Actual Predicted value value value value value value 8 -1.27 -1.17 -0.83 -0.85 0.29 0.33 12 -0.72 -0.90 -0.69 -0.64 0.53 0.43 16 -1.66 -1.72 -1.00 -0.96 0.29 0.28 17 -1.43 -1.45 -0.78 -0.76 0.34 0.38 19 -0.57 -0.52 -0.45 -0.39 -0.01 -0.04 4 -0.33 -0.26 -0.10 -0.19 0.06 0.06 3 -1.38 -1.37 -0.79 -0.87 0.27 0.28 7 -1.15 -1.10 -0.77 -0.67 0.34 0.38 10 -1.49 -1.68 -0.80 -0.75 0.19 0.18 15 -1.42 -1.41 -0.51 -0.55 0.25 0.28 13 -0.80 -0.84 -0.35 -0.35 0.07 0.15 5 -1.56 -1.53 -0.57 -0.65 0.35 0.28 1 -1.85 -1.69 -0.90 -0.98 0.54 0.58 9 -0.98 -1.15 -0.67 -0.66 0.40 0.38 20 -1.59 -1.54 -0.67 -0.65 0.32 0.33 18 -1.57 -1.54 -0.70 -0.65 0.41 0.33 14 -1.58 -1.54 -0.63 -0.65 0.35 0.33 11 -1.59 -1.54 -0.61 -0.65 0.39 0.33 6 -1.58 -1.54 -0.69 -0.65 0.37 0.33 2 -1.54 -1.54 -0.65 -0.65 0.18 0.33

183 184

Table S2 Experimental results vs values predicted by each model of the heterotrophic experiment. Data is the normalized mean fluorescence of cells at 575±20 nm (FL2) after Log10 transformation.

Response values (mean FL2) Run SO AC CP Actual Predicted Actual Predicted Actual Predicted value value value value value value 8 -0.92 -0.88 -1.06 -1.03 0.41 0.44 12 -0.84 -0.78 -0.64 -0.75 0.71 0.65 16 -1.49 -1.52 -1.01 -1.03 0.29 0.20 17 -1.16 -1.17 -0.82 -0.75 0.41 0.41 19 -0.95 -1.01 -0.96 -1.03 0.09 0.10 4 -0.88 -0.91 -0.84 -0.75 0.31 0.31 3 -1.65 -1.65 -1.01 -1.03 0.25 0.22 7 -1.31 -1.30 -0.77 -0.75 0.46 0.44 10 -1.11 -1.08 -1.20 -1.03 0.27 0.37 15 -0.83 -0.89 -0.78 -0.75 0.49 0.59 13 -0.90 -0.90 -0.85 -0.89 0.35 0.37 5 -1.44 -1.41 -0.88 -0.89 0.18 0.32 1 -0.86 -0.92 -0.95 -0.89 0.55 0.57 9 -1.14 -1.05 -0.98 -0.89 0.44 0.39 20 -0.94 -0.99 -0.81 -0.89 0.47 0.48 18 -0.95 -0.99 -0.90 -0.89 0.53 0.48 14 -0.95 -0.99 -0.84 -0.89 0.43 0.48 11 -1.06 -0.99 -0.86 -0.89 0.48 0.48 6 -1.02 -0.99 -0.81 -0.89 0.59 0.48 2 -1.01 -0.99 -0.87 -0.89 0.56 0.48

Figure S1. Monitoring of biomass densities of the samples during RSM experiments. (SO: Scenedesmus obliquus; AC:.Ankistrodesmus convolutus; CP: Chlorella protothecoides).

185 186

Figure S2. Monitoring of pH of the samples during RSM experiments. (SO: Scenedesmus obliquus; AC:.Ankistrodesmus convolutus; CP: Chlorella protothecoides).