ОНТОГЕНЕЗ, 2019, том 50, № 4, с. 270–277

БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ РАСТЕНИЙ

УДК 58.085+581.154

МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ И СОМАКЛОНАЛЬНАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ TULIPA SUAVEOLENS () IN VITRO © 2019 г. Т. А. Крицкаяa, *, А. С. Кашинa, М. Ю. Касаткинa aСаратовский национальный исследовательский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского, Астраханская, д. 83, Саратов, 410012 Россия *e-mail: [email protected] Поступила в редакцию 18.12.2018 г. После доработки 08.02.2019 г. Принята к публикации 17.02.2019 г.

Цель работы состояла в получении растений-регенерантов Tulipa suaveolens Roth in vitro, изучении особенностей морфогенеза и в оценке их генетической стабильности с помощью молекулярных ISSR маркеров. Введены в культуру in vitro особи двух генетически контрастных популяций охраня- емого вида T. suaveolens. Исходным материалом для клонального микроразмножения служили про- ростки, полученные из зрелых семян после трех месяцев культивирования при пониженных темпе- ратурах. Выбор протокола клонального микроразмножения был обусловлен литературными данны- ми. Основные этапы морфогенеза in vitro у проростков из обеих популяций T. suaveolens происходили синхронно в полном соответствии с протоколом. Доказано, что формирование микролуковичек про- исходит путем прямого органогенеза. Несмотря на морфологическое соответствие регенерантов ин- тактным растениям, ISSR анализ показал достаточно высокий уровень (13.9–15.8%) сомаклональной изменчивости. В ISSR-спектрах растений-регенерантов были обнаружены уникальные фрагменты, полностью отсутствующие у особей донорной популяции.

Ключевые слова: Tulipa suaveolens, Tulipa schrenkii, сохранение биоразнообразия, морфогенез, сома- клональная изменчивость, ISSR DOI: 10.1134/S0475145019040049

ВВЕДЕНИЕ 1990; The List, 2018). Нарушение естествен- ных степей приводит к сокращению численности Наряду с традиционными способами сохране- его популяций, поэтому вид занесен в Красные ния биоразнообразия растительного мира, таки- книги Российской Федерации, Украины, Казах- ми как создание особо охраняемых природных стана и Азербайджана. территорий, сохранение коллекций растений в Имеющиеся в литературе данные, касающиеся ботанических садах и создание банка семян, в на- клонального микроразмножения , ука- стоящее время широко используются методы T. suaveolens зывают на крайне низкие показатели регенерации биотехнологии растений, а именно поддержание и скорости роста (Moskov et al., 1980). Низ- культур редких видов на питательной среде в ге- in vitro кий регенерационный потенциал тюльпанов в це- нетических банках (IPGRI…, 2003; Белоку- in vitro лом отмечался многими авторами (Wilmink et al., рова и др., 2005; Molkanova et al., 2010). Однако 1995; Podwyszyńska, Marasek, 2003; Ptak, Bach, 2007; прежде чем система может быть приспо- in vitro Maślanka, Bach, 2010). Во всех перечисленных рабо- соблена для сохранения генофонда, она должна тах первичными эксплантами для введения в куль- удовлетворять ряду требований, важнейшими из туру являлись фрагменты луковиц или которых являются введение материала в культуру in vitro цветка. Для редкого вида и тот, и дру- , разработка эффективного способа регене- T. suaveolens in vitro гой вариант не представляется возможным. Изъ- рации растений для каждого закладываемого на ятие достаточного для охвата генетического раз- хранение образца и генетическая стабильность нообразия популяции количества луковиц может полученной культуры (Molkanova et al., 2010, 2018; нанести ей существенный урон. Части цветков Генофонд…, 2012). невозможно доставить до лаборатории в прием- Tulipa suaveolens Roth (=T. schrenkii Regel) явля- лемом виде. К тому же, одна из перечисленных ме- ется высоко декоративным луковичным поликар- тодик получения микролуковичек (Podwyszyńska, пиком семейства Liliaceae и гипотетическим родо- Marasek, 2003) позже была подвергнута критике начальником садового T. × gesneriana L. (Mordak, (Podwyszyńska, 2005). Основаниями для критики

270 МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ И СОМАКЛОНАЛЬНАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ 271

стали обнаруженные в ходе наблюдений за реге- водимыми при выявлении сомаклональной измен- нерантами отклонения от исходных материнских чивости, чем RAPD (Yang et al., 2010). форм, проявляющиеся в изменении цвета и фор- Цель данной работы состояла в получении мы цветка, вариегатности листьев, появлении растений-регенерантов T. suaveolens in vitro, изу- аномальных цветков. чении особенностей морфогенеза и в оценке их Достаточно эффективный протокол клонально- генетической стабильности с помощью молеку- го микроразмножения был разработан Akhmetova лярных ISSR-маркеров. et al. (2007) для гибридных форм тюльпанов. В ка- честве первичных эксплантов авторы использова- МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ли изолированные зародыши. Формирование по- бегов происходило как путем прямой регенерации, Сбор материала и введение в культуру in vitro так и через каллусогенез. Позже методика была мо- Исследования проводили в 2016–2018 гг. с исполь- дифицирована, и в качестве первичных эксплантов зованием общепринятых приемов работы с культура- стали использовать сегменты семядолей и чешуи ми тканей и органов растений (Бутенко, 1999). микролуковиц, полученные из проростков, выра- Руководствуясь правилами сбора редких и ис- щенных из зрелых семян тюльпанов (Ахметова, Ми- чезающих видов растений для ботанических са- ронова, 2008). Путем прямого органогенеза получе- дов (Горбунов и др., 2008), в качестве исходных ны полноценные растения-регенеранты, которые в эксплантов брали зрелые семена растений. Сбор последующем успешно выдержали адаптацию к не- семян T. suaveolens проводили в середине-конце стерильным условиям. При этом на предмет анато- июня из генетически контрастных, согласно ре- мических особенностей и сомаклональной измен- зультатам ISSR анализа (Kritskaya et al., 2018), по- чивости регенеранты не проверяли. пуляций из Хвалынского (2 км южнее с. Черный Похожие результаты получены на культуре затон) и Озинского р-нов (окрестности урочища T. tarda (Maślanka, Bach, 2014). В одном из вари- “Синяя гора”) Саратовской области. антов эксперимента авторы так же использова- Перед началом стерилизации семена погружа- ли проростки. Формирование побегов происхо- ли в мыльный раствор и перемешивали на лабо- дило как путем прямой регенерации, так и че- раторной качалке 30 мин. После этого их много- рез каллусогенез. Анатомическое исследование кратно промывали дистиллированной водой. За- показало, что полученные in vitro микролукович- тем семена обрабатывали 96%-ным этиловым ки имели апикальную меристему, свойственную спиртом в течение 30 с, переносили в 1.25% рас- нормально сформированным луковицам. При твора NaOCl (“Электра”, Волгоград) и переме- этом отсутствовали кроющие чешуи, что объяс- шивали 15 мин на шейкере. На завершающем эта- няется высокой влажностью внутри культураль- пе стерилизации семена трехкратно промывали ных чашек Петри. стерильной дистиллированной водой. Известно, что предпочтительными инициаль- В условиях ламинарного бокса (“Lamsystems”, ными структурами для клонального микрораз- Россия) семена помещали на питательную среду множения являются меристематические ткани Мурасиге и Скуга (Murashige, Skoog, 1962) без растений, так как они, в отличие от каллуса, оста- гормоноподобных регуляторов роста. Пробирки с ются генетически стабильными в течение множе- семенами переносили в фитотрон с температурой ственных субкультивирований (Бутенко, 1999). 5 ± 1°C для холодной стратификации согласно При культивировании растений с целью сохране- справочнику по прорастанию семян (Николаева ния биологического разнообразия этот фактор яв- и др., 1999). ляется ключевым. В этом отношении наиболее оп- Через три месяца сформированные проростки тимальным следует считать протокол Ахметовой и пересаживали в новые пробирки на питательную Мироновой (2008). Однако остается открытым во- среду для микроразмножения согласно протоко- прос об уровне сомаклональной изменчивости. лу Ахметовой и Мироновой (2008). Мощным инструментом при выявлении сома- клональной изменчивости является фрагмент- ный анализ ДНК, например, RAPD (Random Am- Микроразмножение и морфогенез plified Polymorphic DNA) или ISSR (Inter Simple Методика состоит из трех последовательных эта- Sequence Repeats). В данном случае происходит из- пов, на всех этапах базовой является среда Мураси- менение сайта узнавания праймера, – в результате ге и Скуга. На первом этапе проростки тюльпанов чего он не отжигается на ДНК мутантной пробы по помещали на питательную среду с БАП 0.2 мг/л + сравнению с контролем, – либо его делеция, либо + НУК 0.5 мг/л (Var1) или БАП 0.5 мг/л + инсерция, в результате которых изменяется длина + НУК 1.0 мг/л (Var2) и культивировали в усло- амплифицированного фрагмента (Куцев, 2009). На виях 16-часового фотопериода (светодиодные примере Lilium tsingtauense (Liliaceae) было показа- лампы Uniel LED-M80-20W/SP/E27/CL, КНР) и но, что ISSR-маркеры являются более воспроиз- температуры 25 ± 1°C в течение 2.5 мес. На следую-

ОНТОГЕНЕЗ том 50 № 4 2019 272 КРИЦКАЯ и др.

щем этапе полученные побеги длиной 20–30 мм пе- Таблица 1. ISSR-праймеры, выявляющие полимор- ресаживали на среду, содержащую 5% сахарозы, и до- физм ДНК T. suaveolens полненную индолил-3-масляной кислотой 0.5 мг/л. Наличие Название Последова- Пробирки ставили в холодильный шкаф (5 ± 1°C сомаклональной праймера тельность (5′-3′) без освещения) на 10–12 нед. По истечении реко- вариабельности мендованного времени пробирки с регенерантами вновь переносили в стандартные условия (16-часо- UBC810 (GA)8T– вой фотопериод и температура 25 ± 1°C) и культи- UBC811 (GA)8C+ вировали еще 8–10 недель до полного формирова- UBC816 (CA)8T– ния микролуковичек (Ахметова, Миронова, 2008). UBC824 (TC)8G+ Эксперимент выполнялся в трех повторно- UBC827 (AC)8G– стях, на каждую повторность брали не менее 10 UBC836 (AG) YT + проростков. 8 UBC841 (GA) YT + Для изучения особенностей морфогенеза на 8 каждом из этапов фиксировали по 10 культивиру- UBC843 (CT)8RA + емых образцов в смеси формалина, ледяной ук- UBC845 (CT)8RG + сусной кислоты и 50% этилового спирта в объем- UBC851 (GT)8YG – ном соотношении 4 : 1 : 10 (ФУС) в течение 3 ч. Примечание. R = A, G; Y = C, T. Фиксированный материал переносили в раствор глицерин–спирт в соотношении 1 : 1. Подготов- ленные таким образом образцы изучали под сте- ПЦР проводили в объеме 20 мкл. Реакционная реомикроскопом Stemi 2000-CS (Carl Zeiss, Ger- смесь содержала 4 мкл готовой реакционной many). Анатомические срезы готовили при помощи смеси MaGMix (по 200 мкM каждого dNTP, 1.5 мM ротационного микротома согласно общепринятым MgCl2, 1.5 ед. SmarTaqDNA-полимеразы и буфер; методикам (Дженсен, 1965). В качестве контроля ис- Dialat Ltd., Москва, Россия), 15 мкл деионизиро- пользовали проростки, выращенные на питатель- ванной воды, 3.4 пмоль каждого праймера и 1 мкл ной среде без гормоноподобных регуляторов роста. исходной ДНК. ПЦР проводили по следующему алгоритму: изначальная денатурация в течение 5 мин при 95°C, затем 35 циклов по 30 с при 95°C, ISSR анализ 30 с при 44°C и 2 мин при 72°C, с финальной Для тестирования на предмет сомаклональной элонгацией в течение 10 мин при 72°C. изменчивости были выбраны полностью сфор- Разделение продуктов амплификации прово- мированные растения-регенеранты (по 6 шт. от дили электрофоретически в 2%-ном агарозном каждого варианта эксперимента), полученные от геле в 0.5× ТВЕ-буфере. Готовый гель окрашива- образцов донорной популяции из Озинского р-на ли бромистым этидием, фрагменты ДНК анали- Саратовской области, и сами исходные растения зировали с помощью трансиллюминатора (Vilber популяции в качестве контроля (10 особей). Lourmat, Франция) и фотографировали с помо- ДНК выделяли с использованием набора Nu- щью гель-документирующей системы (Doc-print cleoSpin® Plant II (MACHEREY-NAGEL, Герма- VX2, Германия). Фотографии гелей анализирова- ния) согласно протоколу производителя. ПЦР про- ли в программе Corel DRAW X8. Типирование водили в амплификаторе Mastercycler gradient (Ep- ISSR-фрагментов было представлено в виде мат- pendorf, Germany) с 10 ISSR-праймерами (табл. 1), рицы наличия или отсутствия бэндов, закодиро- выбранными нами ранее для T. suaveolens (Кашин ванных как “1” или “0” соответственно. и др., 2016) и синтезированными ЗАО “Синтол” Долю полиморфных фрагментов (P) определя- (Москва). ли по формуле:

Количество полиморфных фрагментов P =× 100 %. Общее количество фрагментов

Анализ полученной матрицы проводили в РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ программе PAST 3 (Hammer et al., 2001) кластери- зацией методом невзвешенного попарно-группо- Введение в культуру in vitro вого среднего (UPGMA) с использованием коэф- Доля семян, свободных от инфекции, при ис- фициента Жаккара и в программе TFPGA 1.3 пользовании изложенной выше методики стери- (Miller, 1997) – с использованием генетических лизации составила 100% для обеих популяций. На- дистанций Нэи (Nei, 1972, 1978). чало прорастания семян наблюдали на 29-е сутки

ОНТОГЕНЕЗ том 50 № 4 2019 МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ И СОМАКЛОНАЛЬНАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ 273

Таблица 2. Усредненные генетические дистанции ше микропобеги, сформированные на внутрен- (ниже диагонали) и идентичность (выше диагонали) ней стороне кроющей чешуи. То есть в обоих ва- Нэи (Nei, 1972, 1978) между экспериментальными вы- риантах развитие происходит на кроющей чешуе борками T. suaveolens путем прямого органогенеза. Ozn Var1 Var2 Среднее число побегов на один проросток соста- вило 4.8 ± 0.8 шт. для варианта питательной среды с Ozn – 0.7170 0.7515 БАП 0.2 мг/л + НУК 0.5 мг/л, и 7.9 ± 0.5 шт. – для Var1 0.3327 – 0.7612 варианта с БАП 0.5 мг/л + НУК 1.0 мг/л. Частота Var2 0.2857 0.2728 – побегообразования = 65.7%. Примечание. Данные получены в программе TFPGA при В течение последующих двух этапов на отса- p ≤ 0.05. женных микропобегах происходило окончатель- ное формирование микролуковиц, состоящих из почки и нескольких чешуй (рис. 1г, 1д), которые стратификации. Через три месяца стратифика- прорастали к концу последнего этапа и не отли- ции проростки приобретали зеленую окраску и чались морфологически от интактных растений формировали собственные корни. Всхожесть се- ювенильного возрастного состояния (рис. 1е). мян составила от 72 до 100%, что согласуется с У контрольной группы на внутренней поверх- предыдущими данными по лабораторной всхоже- ности кроющей чешуи проростка развивалась од- сти семян T. suaveolens (Кашин и др., 2016), полу- на единственная микролуковица, которая так же ченными в результате простого проращивания их по морфологии не отличалась от луковиц интакт- на чашках Петри. ных растений. В целом, апробированный протокол клональ- Микроразмножение и морфогенез ного микроразмножения является эффективным для T. suaveolens и позволяет массово получать по- Основные этапы морфогенеза in vitro у обеих садочный материал данного вида через прямой популяций T. suaveolens выделялись в соответствии органогенез. с вышеизложенным протоколом микроразмноже- ния (Ахметова, Миронова, 2008). На первом этапе наблюдали разрастание кроющей чешуи пророст- ISSR анализ ков, имеющей вид полого мешка, с последующим формированием на ее внутренней поверхности Всего в результате ПЦР образцов ДНК исход- множества адвентивных почек (рис. 1а), которые ной природной популяции T. suaveolens Озинско- затем прорастали и развивали листовые структу- го района Саратовской области (Ozn) и растений- ры длиной 20–30 мм (рис. 1б). Формирующиеся регенерантов, полученных при использовании микропобеги разрывали общую кроющую че- двух вариантов питательных сред (Var1 и Var2), с шую, оставаясь при этом прикрепленными к ней. десятью праймерами получен 101 ISSR-фрагмент В основании микропобегов отмечалось образова- длиной 300–2500 пн. ISSR-спектры растений-до- ние веретеновидного тупо заостренного вздутия, норов и прошедших культуру in vitro растений-ре- представляющего собой новую формирующуюся генерантов сходны, но не идентичны (рис. 2). микролуковицу, включающую в себя на этом эта- В ISSR-спектрах растений-регенерантов были пе органогенеза стенку собственной кроющей че- обнаружены уникальные фрагменты, отсутству- шуи и почку (рис. 1в). В некоторых случаях фор- ющие как у особей донорной популяции, так и у мирование микропобегов происходило на наруж- особей смежных популяций, изученных ранее ной поверхности кроющей чешуи в месте ее (Крицкая и др., 2018). Их доля составила 13.9% у контакта с питательной средой (рис. 1ж). При регенерантов Var1 и 15.8% – у регенерантов Var2. этом ткани контактирующей поверхности сильно Четыре фрагмента (3.9%), напротив, присутство- разрастались и становились рыхлыми по анало- вали во всех донорных генотипах и полностью от- гии с тканями каллусного типа. Однако анатоми- сутствовали у регенерантов. Генетические ди- ческое исследование показало отсутствие каллуса станции Нэи (Nei, 1972, 1978) между исследуемы- внутри таких образцов и на их поверхности. По ми выборками приведены в табл. 2. морфологическим признакам клетки, составляю- Из таблицы видно, что в целом, генетическая щие разросшуюся ткань, сходны с клетками кро- идентичность регенерантов, полученных в раз- ющей чешуи, отличающейся от клеток других ных вариантах эксперимента, между собой выше тканей содержанием в цитоплазме многочислен- этого показателя между ними же и исходными ных крахмальных зерен (рис. 1з). Также в тканях растениями-донорами. Из этого следует, что в были обнаружены проводящие ксилемные эле- культуре in vitro происходит селекция генотипов менты, подходящие к каждому развивающемуся T. suaveolens или они претерпевают сходные изме- микропобегу (рис. 1и). Микропобеги имели такое нения. Это также хорошо видно на UPGMA денд- же анатомическое строение, как и описанные вы- рограмме (рис. 3). Регенеранты образовали отдель-

ОНТОГЕНЕЗ том 50 № 4 2019 274 КРИЦКАЯ и др.

((а)а) 1 см (б)(б) 1 см ((в) в) 1 мм

100 мкм ((г)г) 1 мм (д)((е) е)

((ж)ж) 1 см (з) 20 мкм (и) 10 мкм

Рис. 1. Этапы морфогенеза T. suaveolens in vitro: (а) – формирование адвентивных почек на внутренней стороне крою- щей чешуи проростка; (б) – проросток с микропобегами; (в) – начальная стадия формирования микролуковицы (про- дольный срез основания микропобега); (г) – полностью сформированная микролуковица с почкой (продольный срез); (д) – продольный срез покоящейся почки; (е) – микролуковицы с проросшей почкой и придаточными корнями; (ж) – микропобеги, развивающиеся в месте контакта наружной поверхности кроющей чешуи с питательной средой; (з) – строение клеток кроющей чешуи; (и) – ксилемный элемент в тканях образца.

ОНТОГЕНЕЗ том 50 № 4 2019 МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ И СОМАКЛОНАЛЬНАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ 275

МММММКК 11222333444555666777888999101100 1111 1212 1313 1414 1515 1616 М

2000 1000

500

Рис. 2. ISSR-спектр разных генотипов T. suaveolens, полученный при использовании праймера UBC824. М – маркер молекулярного веса; К – отрицательный контроль; 1–10 – особи донорной популяции Озинского района Саратов- ской области; 11–16 – растения-регенеранты (11–13 – Var1; 14–16 – Var2). Стрелки указывают на отсутствующие у до- норной популяции фрагменты. Var1-1 Var1-2 Var1-3 Var2-1 Var2-2 Var2-3 Var2-4 Var2-5 Var2-6 Var1-4 Var1-5 Var1-6 Ozn-10 Ozn-3 Ozn-9 Ozn-6 Ozn-7 Ozn-1 Ozn-2 Ozn-4 Ozn-5 Ozn-8

0.96 100 100 0.88

0.80

0.72

Similarity 0.64

0.56

0.48

100 0.40

Рис. 3. UPGMA-дендрограмма, построенная на основе ISSR данных для T. suaveolens, с использованием коэффициен- та Жаккара. Бутстреп = 100 реплик, показана только достоверная бутстреп-поддержка – более 70%. Ozn – особи до- норной популяции; Var1 – регенеранты, образованные на питательной среде с БАП 0.2 мг/л + НУК 0.5 мг/л и Var2 – регенеранты, образованные на питательной среде с БАП 0.5 мг/л + НУК 1.0 мг/л.

ный кластер, достоверно различающийся (индекс тате одного полного цикла клонального микро- бутстрепа 100%) от кластера, состоящего из образ- размножения in vitro. Известно, что при увеличе- цов популяции-донора. Природные образцы, не- нии количества циклов микроразмножения доля смотря на внутрипопуляционный полиморфизм, сомаклональной изменчивости, как правило, то- сформировали четкий однородный кластер. же возрастает. Например, было показано, что ре- ISSR анализ показал достаточно высокий уро- генеранты сортовой линии кукурузы, выделен- вень сомаклональной изменчивости растений- ные из каллусов после 8-месячного культивиро- регенерантов T. suaveolens, полученных в резуль- вания, сильнее отличались от исходной линии и

ОНТОГЕНЕЗ том 50 № 4 2019 276 КРИЦКАЯ и др.

между собой по сравнению с регенерантами, по- Работа выполнена при поддержке Российского лученными из 2-месячных каллусных культур Фонда Фундаментальных Исследований (грант (Осипова и др., 2003). У сортовых линий тюльпа- № 16-04-00142). нов “Blue Parrot” и “Prominence”, размножаемых in vitro с использованием тидиазурона, в течение первых трех лет культивирования сомаклональ- СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ная изменчивость не превышала 3.3%, а на чет- Ахметова А.Ш., Миронова Л.Н. Клональное микрораз- вертый год резко возрастала до 100% у сорта “Blue множение тюльпана сорта Lucky Strike // Биотехно- Parrot” и 51.4% – у сорта “Prominence” (Podwyszyńska, логия как инструмент сохранения биоразнообразия 2005). Существует гипотеза, согласно которой есть растительного мира: матер. II Всерос. науч.-практ. определенный “порог” сомаклональной измен- конф. Белгород: Изд-во БелГУ, 2008. С. 148–152. чивости – аналог “бутылочного горлышка” эво- Белокурова В.Б., Листван Е.В., Майстров П.Д. и др. Ис- люции, пройти через который могут только жиз- пользование методов биотехнологии растений для сохранения и изучения биоразнообразия мировой неспособные сомаклоны, в то время как клетки, флоры // Цитология и генетика. 2005. № 1. С. 41–51. содержащие вредоносные мутации, погибают Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro (Wang, Wang, 2012). В итоге такой естественный и биотехнологии на их основе: учеб. пособие. М.: отбор in vitro должен привести к стабилизации ФБК-ПРЕСС, 1999. 160 с. культуры. Это объясняет согласованность гено- Генофонд растений Красной книги Российской Феде- типических изменений, обнаруженную у регене- рации, сохраняемый в коллекциях ботанических рантов в нашем эксперименте. садов и дендрариев / Отв. редактор Демидов А.С. М.: Товарищество научных изданий КМК, 2012. 220 с. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Горбунов Ю.Н., Дзыбов Д.С., Кузьмин З.Е. и др. Методи- ческие рекомендации по реинтродукции редких и Таким образом, при клональном микрораз- исчезающих видов растений (для ботанических са- множении наблюдается селекция и модификация дов). Тула: Гриф и К, 2008. 56 с. генотипов T. suaveolens, что противоречит основ- Дженсен У. Ботаническая гистохимия. М.: Мир, 1965. ной миссии генетических банков. Во-первых, уже 377 с. на уровне проростков происходит отбор геноти- Кашин А.С., Крицкая Т.А., Петрова Н.А. и др. Тюльпан пов, и 34.3% из них не отзываются на воздействие Геснера в Саратовской области и на прилегающей экзогенных регуляторов роста и не дают микропо- территории: распространение, разнообразие, со- бегов. Во-вторых, полученные в результате регене- стояние популяций. Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, рации микролуковички обладают уникальными 2016. 100 с. апликонами, не обнаруженными в ISSR-спектрах Куцев М.Г. Фрагментный анализ ДНК растений: исходной природной популяции и ближайших к RAPD, DAF, ISSR. Барнаул: ARTIKA, 2009. 164 с. ней популяций, изученных ранее. По этим причи- Николаева М.Г., Лянгузова И.В., Поздова Л.М. Биоло- нам создание генетического банка in vitro для со- гия семян. СПб.: РАН., Ботан. ин-т им. В.Л. Кома- хранения генофонда T. suaveolens, по крайней мере, рова, 1999. 232 с. с использование клонального микроразмножения Akhmetova A.Sh., Baiburina R.K., Mironova L.N. In vitro по апробированному в данной работе протоколу propagation of clones of Tulipa L. hybrid forms // Bio- видится нецелесообразным. Учитывая подвержен- technology in . 2007. V. 2. P. 1–7. ность тюльпанов, выращиваемых в коллекциях ex IPGRI Handbooks for Genebanks № 6: A Guide to Effec- tive Management of Germplasm Collections / Eds. situ, вирусным заболеваниям, в качестве основных Engels J.M.M., Visser L. Rome: IPGRI, 2003. 172 p. мероприятий по сохранению генофонда T. suaveo- Hammer O., Harper D.A.T., Ryan P.D. PAST: Palaeontolog- lens следует рекомендовать создание, поддержание ical Statistics software package for education and data и мониторинг особо охраняемых природных тер- analysis // Palaeontologia Electronica. 2001. V. 4. № 1. риторий с восстановлением численности популя- P. 9. ций этого вида. Kritskaya T.A., Kashin A.S., Schanzer I.A. et al. Genetic dif- В целях разработки технологии, позволяющей ferentiation of Tulipa suaveolens (Liliaceae) in the эффективное сохранение генофонда North-East of its range in the European part of Russia // T. suaveolens Botanicheskii Zhurnal. 2018. V. 103. № 2. P. 187–201. в генетическом банке in vitro, необходим поиск новых регуляторов роста растений и их сочета- Maślanka M., Bach A. The effect of abscisic acid, ethylene and inhibitors of their biosynthesis (Fluridone and sali- ний, которые бы не оказывали мутагенного дей- cylic acid) on somatic embryos conversion in // ствия на геном. Тем не менее, вышеизложенный Ecological Chemistry and Engineering. 2010. V. 17. протокол клонального микроразмножения явля- P. 1135–1139. ется высоко эффективным и может быть исполь- Maślanka M., Bach A. Induction of organogenesis in зован для поддержания или получения новых се- in vitro cultures of tarda (Tulipa tarda Stapf.) from лекционных форм с их последующей мультипли- seed-derived explants // In Vitro Cellular & Develop- кацией. mental Biology – Plant. 2014. V. 50. P. 712–721.

ОНТОГЕНЕЗ том 50 № 4 2019 МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ И СОМАКЛОНАЛЬНАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ 277

Miller M.P. Tools for population genetic analyses (TFPGA) Osipova E.S., Koveza O.V., Troitskij A.V. et al. Analysis of 1.3: A Windows program for the analysis of allozyme specific RAPD and ISSR fragments in maize (Zea mays L.) and molecular population genetic data / Computer soft- somaclones and development of SCAR markers on their ware distributed by author, 1997. basis // Russian J. Genetics. 2003. V. 39. № 12. P. 1412– 1419. Molkanova O., Egorova D., Mitrofanova I. Preservation characteristics of valuable plant species in in vitro gene- Podwyszyńska M., Marasek A. Effects of thidiazuron and banks at russian botanical gardens // In Vitro Cellular & paclobutrazol on regeneration potential of tulip flower Developmental Biology – Plant. 2018. V. 54 (Suppl. 1): stalk explants in vitro and subsequent shoot multiplica- S1. P. S46. tion // Acta Societatis Botanicorum Poloniae. 2003. V. 72. P. 181–190. Molkanova O.I., Korotkov O.I., Vetchinkina E.M. et al. The Podwyszyńska M. Somaclonal variation in micropropagated gene banks: problems of formation, preservation and tulips based on phenotype observation // J. Fruit and use // Bulletin of Udmurt University. Series Biology. Ornamental Plant Research. 2005. V. 13. P. 109–122. Earth Science. 2010. V. 3. P. 33–39. Ptak A., Bach A. Somatic embryogenesis in tulip (Tulipa Mordak H. Quid est Tulipa schrenkii Regel et T. heteropetala gesneriana L.) flower stem cultures // In Vitro Cellular & Ledeb. (Liliaceae)? Novosti Sistematiki Vysshikh Ras- Developmental Biology – Plant. 2007. V. 43. P. 35–39. tenij. 1990. V. 27. P. 27–32. . [Интернет-ресурс] URL: http://www.the- Moskov I., Savova I., Boshniakova P. et al. In vitro induction plantlist.org/tpl1./record/kew-290014. Дата публика- of organogenesis and callus in some bulb . I. Hya- ции: 23.03.2012. Дата обращения: 10.12.2018. cinth (Hyacinthus orientalis L.), snowdrop (Galanthus Wang Q.M., Wang L. An evolutionary view of plant tissue nivalis L.) and tulip (Tulipa schrenkii L.) // Fiziologiia culture: somaclonal variation and selection // Plant Cell na rasteniiata (Sofiia). 1980. V. 6. № 1. P. 67–75. Reports. 2012. V. 31. № 9. P. 1535–1547. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth Wilmink A., Van de Ven B.C.E., Custers J.B.M. et al. Adven- and bioassays with tobacco tissue cultures // Plant Phys- titious shoot formation in tulip: histological analysis and iology. 1962. V. 15. № 13. P. 473–497. response to selective agents // Plant Science. 1995. V. 110. P. 155–164. Estimation of average heterozygosity and genetic Nei M. Yang W.R., Zhang Q.X., Pan H.T. et al. In vitro regeneration distance from a small number of individuals // Genetics. of Lilium tsingtauense Gilg. and analysis of genetic vari- 1978. V. 89. P. 583–590. ability in micropropagated plants using RAPD and Nei M. Genetic distance between populations // American ISSR techniques // Propagation of Ornamental Plants. Naturalist. 1972. V. 106. № 949. P. 283–292. 2010. V. 10. № 2. P. 59–66.

Micropropagation and Somaclonal Variation of Tulipa suaveolens (Liliaceae) in vitro T. A. Kritskaya 1, *, A. S. Kashin1, and M. Yu. Kasatkin1 1Chernyshevsky Saratov State University, ul. Astrakhanskaya 83, Saratov, 410012 Russia *e-mail: [email protected] Received December 18, 2018; Revised February 8, 2019; Accepted February 17, 2019

The objective of the research was to regenerate in vitro Tulipa suaveolens Roth plants, examine their morpho- genesis and evaluate the plants’ genetic stability using molecular ISSR markers. Specimens of two genetically contrasting populations of protected T. suaveolens species were introduced in in vitro culture. As donor ma- terial for clonal micropropagation, we used seedlings obtained from rape seeds that had been cultivated under low temperatures for three months. The selection of clonal micropropagation protocol stemmed from the data re- corded in literature. In specimens of both T. suaveolens populations, the major in vitro morphogenenis stages run simultaneously and in accordance with the protocol. It was revealed that bulblets are formed via direct organogen- esis. Despite the morphological correspondence between the regenerated and intact plants, ISSR analysis identi- fied a relatively high degree of somaclonal variability (13.9–15.8%). In regenerated plants’ ISSR patterns, we found unique fragments that were completely lacking in specimens of donor population.

Keywords: Tulipa suaveolens, Tulipa schrenkii, biodiversity conservation, morphogenesis, somaclonal varia- tion, ISSR

ОНТОГЕНЕЗ том 50 № 4 2019