ОНТОГЕНЕЗ, 2019, том 50, № 4, с. 270–277 БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ РАСТЕНИЙ УДК 58.085+581.154 МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ И СОМАКЛОНАЛЬНАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ TULIPA SUAVEOLENS (LILIACEAE) IN VITRO © 2019 г. Т. А. Крицкаяa, *, А. С. Кашинa, М. Ю. Касаткинa aСаратовский национальный исследовательский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского, Астраханская, д. 83, Саратов, 410012 Россия *e-mail: [email protected] Поступила в редакцию 18.12.2018 г. После доработки 08.02.2019 г. Принята к публикации 17.02.2019 г. Цель работы состояла в получении растений-регенерантов Tulipa suaveolens Roth in vitro, изучении особенностей морфогенеза и в оценке их генетической стабильности с помощью молекулярных ISSR маркеров. Введены в культуру in vitro особи двух генетически контрастных популяций охраня- емого вида T. suaveolens. Исходным материалом для клонального микроразмножения служили про- ростки, полученные из зрелых семян после трех месяцев культивирования при пониженных темпе- ратурах. Выбор протокола клонального микроразмножения был обусловлен литературными данны- ми. Основные этапы морфогенеза in vitro у проростков из обеих популяций T. suaveolens происходили синхронно в полном соответствии с протоколом. Доказано, что формирование микролуковичек про- исходит путем прямого органогенеза. Несмотря на морфологическое соответствие регенерантов ин- тактным растениям, ISSR анализ показал достаточно высокий уровень (13.9–15.8%) сомаклональной изменчивости. В ISSR-спектрах растений-регенерантов были обнаружены уникальные фрагменты, полностью отсутствующие у особей донорной популяции. Ключевые слова: Tulipa suaveolens, Tulipa schrenkii, сохранение биоразнообразия, морфогенез, сома- клональная изменчивость, ISSR DOI: 10.1134/S0475145019040049 ВВЕДЕНИЕ 1990; The Plant List, 2018). Нарушение естествен- ных степей приводит к сокращению численности Наряду с традиционными способами сохране- его популяций, поэтому вид занесен в Красные ния биоразнообразия растительного мира, таки- книги Российской Федерации, Украины, Казах- ми как создание особо охраняемых природных стана и Азербайджана. территорий, сохранение коллекций растений в Имеющиеся в литературе данные, касающиеся ботанических садах и создание банка семян, в на- клонального микроразмножения , ука- стоящее время широко используются методы T. suaveolens зывают на крайне низкие показатели регенерации биотехнологии растений, а именно поддержание и скорости роста (Moskov et al., 1980). Низ- культур редких видов на питательной среде в ге- in vitro кий регенерационный потенциал тюльпанов в це- нетических банках (IPGRI…, 2003; Белоку- in vitro лом отмечался многими авторами (Wilmink et al., рова и др., 2005; Molkanova et al., 2010). Однако 1995; Podwyszyńska, Marasek, 2003; Ptak, Bach, 2007; прежде чем система может быть приспо- in vitro Maślanka, Bach, 2010). Во всех перечисленных рабо- соблена для сохранения генофонда, она должна тах первичными эксплантами для введения в куль- удовлетворять ряду требований, важнейшими из туру являлись фрагменты луковиц или которых являются введение материала в культуру in vitro цветка. Для редкого вида и тот, и дру- , разработка эффективного способа регене- T. suaveolens in vitro гой вариант не представляется возможным. Изъ- рации растений для каждого закладываемого на ятие достаточного для охвата генетического раз- хранение образца и генетическая стабильность нообразия популяции количества луковиц может полученной культуры (Molkanova et al., 2010, 2018; нанести ей существенный урон. Части цветков Генофонд…, 2012). невозможно доставить до лаборатории в прием- Tulipa suaveolens Roth (=T. schrenkii Regel) явля- лемом виде. К тому же, одна из перечисленных ме- ется высоко декоративным луковичным поликар- тодик получения микролуковичек (Podwyszyńska, пиком семейства Liliaceae и гипотетическим родо- Marasek, 2003) позже была подвергнута критике начальником садового T. × gesneriana L. (Mordak, (Podwyszyńska, 2005). Основаниями для критики 270 МИКРОРАЗМНОЖЕНИЕ И СОМАКЛОНАЛЬНАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ 271 стали обнаруженные в ходе наблюдений за реге- водимыми при выявлении сомаклональной измен- нерантами отклонения от исходных материнских чивости, чем RAPD (Yang et al., 2010). форм, проявляющиеся в изменении цвета и фор- Цель данной работы состояла в получении мы цветка, вариегатности листьев, появлении растений-регенерантов T. suaveolens in vitro, изу- аномальных цветков. чении особенностей морфогенеза и в оценке их Достаточно эффективный протокол клонально- генетической стабильности с помощью молеку- го микроразмножения был разработан Akhmetova лярных ISSR-маркеров. et al. (2007) для гибридных форм тюльпанов. В ка- честве первичных эксплантов авторы использова- МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ли изолированные зародыши. Формирование по- бегов происходило как путем прямой регенерации, Сбор материала и введение в культуру in vitro так и через каллусогенез. Позже методика была мо- Исследования проводили в 2016–2018 гг. с исполь- дифицирована, и в качестве первичных эксплантов зованием общепринятых приемов работы с культура- стали использовать сегменты семядолей и чешуи ми тканей и органов растений (Бутенко, 1999). микролуковиц, полученные из проростков, выра- Руководствуясь правилами сбора редких и ис- щенных из зрелых семян тюльпанов (Ахметова, Ми- чезающих видов растений для ботанических са- ронова, 2008). Путем прямого органогенеза получе- дов (Горбунов и др., 2008), в качестве исходных ны полноценные растения-регенеранты, которые в эксплантов брали зрелые семена растений. Сбор последующем успешно выдержали адаптацию к не- семян T. suaveolens проводили в середине-конце стерильным условиям. При этом на предмет анато- июня из генетически контрастных, согласно ре- мических особенностей и сомаклональной измен- зультатам ISSR анализа (Kritskaya et al., 2018), по- чивости регенеранты не проверяли. пуляций из Хвалынского (2 км южнее с. Черный Похожие результаты получены на культуре затон) и Озинского р-нов (окрестности урочища T. tarda (Maślanka, Bach, 2014). В одном из вари- “Синяя гора”) Саратовской области. антов эксперимента авторы так же использова- Перед началом стерилизации семена погружа- ли проростки. Формирование побегов происхо- ли в мыльный раствор и перемешивали на лабо- дило как путем прямой регенерации, так и че- раторной качалке 30 мин. После этого их много- рез каллусогенез. Анатомическое исследование кратно промывали дистиллированной водой. За- показало, что полученные in vitro микролукович- тем семена обрабатывали 96%-ным этиловым ки имели апикальную меристему, свойственную спиртом в течение 30 с, переносили в 1.25% рас- нормально сформированным луковицам. При твора NaOCl (“Электра”, Волгоград) и переме- этом отсутствовали кроющие чешуи, что объяс- шивали 15 мин на шейкере. На завершающем эта- няется высокой влажностью внутри культураль- пе стерилизации семена трехкратно промывали ных чашек Петри. стерильной дистиллированной водой. Известно, что предпочтительными инициаль- В условиях ламинарного бокса (“Lamsystems”, ными структурами для клонального микрораз- Россия) семена помещали на питательную среду множения являются меристематические ткани Мурасиге и Скуга (Murashige, Skoog, 1962) без растений, так как они, в отличие от каллуса, оста- гормоноподобных регуляторов роста. Пробирки с ются генетически стабильными в течение множе- семенами переносили в фитотрон с температурой ственных субкультивирований (Бутенко, 1999). 5 ± 1°C для холодной стратификации согласно При культивировании растений с целью сохране- справочнику по прорастанию семян (Николаева ния биологического разнообразия этот фактор яв- и др., 1999). ляется ключевым. В этом отношении наиболее оп- Через три месяца сформированные проростки тимальным следует считать протокол Ахметовой и пересаживали в новые пробирки на питательную Мироновой (2008). Однако остается открытым во- среду для микроразмножения согласно протоко- прос об уровне сомаклональной изменчивости. лу Ахметовой и Мироновой (2008). Мощным инструментом при выявлении сома- клональной изменчивости является фрагмент- ный анализ ДНК, например, RAPD (Random Am- Микроразмножение и морфогенез plified Polymorphic DNA) или ISSR (Inter Simple Методика состоит из трех последовательных эта- Sequence Repeats). В данном случае происходит из- пов, на всех этапах базовой является среда Мураси- менение сайта узнавания праймера, – в результате ге и Скуга. На первом этапе проростки тюльпанов чего он не отжигается на ДНК мутантной пробы по помещали на питательную среду с БАП 0.2 мг/л + сравнению с контролем, – либо его делеция, либо + НУК 0.5 мг/л (Var1) или БАП 0.5 мг/л + инсерция, в результате которых изменяется длина + НУК 1.0 мг/л (Var2) и культивировали в усло- амплифицированного фрагмента (Куцев, 2009). На виях 16-часового фотопериода (светодиодные примере Lilium tsingtauense (Liliaceae) было показа- лампы Uniel LED-M80-20W/SP/E27/CL, КНР) и но, что ISSR-маркеры являются более воспроиз- температуры 25 ± 1°C в течение 2.5 мес. На следую- ОНТОГЕНЕЗ том 50 № 4 2019 272 КРИЦКАЯ и др. щем этапе полученные побеги длиной 20–30 мм пе- Таблица 1. ISSR-праймеры, выявляющие полимор- ресаживали на среду, содержащую 5% сахарозы, и до- физм ДНК T. suaveolens полненную индолил-3-масляной кислотой 0.5 мг/л. Наличие Название Последова- Пробирки ставили в холодильный шкаф (5 ± 1°C сомаклональной праймера тельность (5′-3′) без освещения) на 10–12 нед. По истечении реко- вариабельности мендованного времени пробирки с регенерантами вновь переносили в стандартные условия (16-часо- UBC810 (GA)8T– вой фотопериод и температура 25 ± 1°C) и культи- UBC811 (GA)8C+ вировали еще 8–10 недель до полного формирова-