UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA – UESB PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA, BIODIVERSIDADE E CONSERVAÇÃO
ESTUDOS CITOGENÉTICOS DOS GÊNEROS Phyllodytes E Hypsiboas (AMPHIBIA, ANURA)
MARCELLE AMORIM CARVALHO
PPGGBC
Jequié-BA 2012 MARCELLE AMORIM CARVALHO
ESTUDOS CITOGENÉTICOS DOS GÊNEROS Phyllodytes E Hypsiboas (AMPHIBIA, ANURA)
Dissertação de mestrado apresentada ao programa de Pós-Graduação em Genética, Biodiversidade e Conservação da Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, como requisito para obtenção do título de Mestre em Genética, Biodiversidade e Conservação.
Orientador: Prof. Dr. Sérgio Siqueira Júnior. Co-orientadora: Profa. Dra. Caroline Garcia PPGGBC
Jequié-BA 2012 Jequié, 23 de Março de 2012
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Sérgio Siqueira Júnior (Orientador) – UESB / Jequié ______
Prof. Dr. Marco Antônio Costa – UESC / Ilhéus ______
Prof. Dr. Paulo Roberto Antunes de Mello Affonso – UESB / Jequié ______
SUPLENTE
Profa. Dra. Débora Diniz – UESB / Jequié ______
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Dedico meu trabalho aos professores Dra. Caroline Garcia e Dr. Sérgio Siqueira Jr.; e a minha família amada (Weliton, Jane, Denise, Jamille, Vinícius, Pedrinho...) AGRADECIMENTOS
Agradeço, À UESB e ao Programa de Pós Graduação em Genética, Biodiversidade e Conservação, pela oportunidade; À Fapesb pela concessão da bolsa, muito importante nessa caminhada; Ao prof. Dr. Sérgio Siqueira Jr. pelo convite à orientação, pelas coletas, por me ensinar a buscar, pela confiança, compreensão, paciência, conselhos, incentivo, e por tudo que pôde me ensinar. A profa. Dra. Caroline Garcia, pela incessante ajuda, mesmo antes de se tornar minha co-orientadora; pelo exemplo de professora/orientadora; por ter persistido junto comigo nas técnicas da cito, por se mostrar sempre acessível e feliz por ajudar, por ter tornado possível muito desse trabalho, por ter sido um anjo no meu caminho... faltam palavras pra dizer o quanto foi importante nessa caminhada. Por sua leveza, amizade... por vibrar comigo a cada conquista! Nunca vou conseguir te agradecer o suficiente! Aos meus pais, que sempre me incentivaram, fizeram e fazem tudo o que podem para me proporcionar a melhor educação/formação possível. Por me acudir sempre que precisei, pelas palavras e gestos de força e carinho, por serem responsáveis pela melhor parte do que eu sou; pelo amor incondicional, que me da segurança pra tanto nessa vida; Às minhas irmãs, companheiras, cada uma a sua maneira; sempre torcendo por mim; Ao meu namorido, ou noivorido por me compreender, me fortalecer, incentivar... por sempre ter uma palavra otimista pra me oferecer, por me cuidar nos momentos mais difíceis e me reconhecer como batalhadora no caminho que escolhi. Pelo carinho e amor todos os dias... À Doce, minha princesa linda, por ser tão companheira, e me fazer rir sempre ao chegar em casa, mesmo depois dos dias mais cansativos; Aos meus colegas de laboratório, em especial: Lívia, Isabel, Roque, Oziel, Aline, Jamille, Naiana, Milena por tornarem essa jornada mais alegre, mais leve. E pela ajuda, de uma forma ou outra no decorrer do trabalho; ao colega Paulo Borges, pela ajuda com coletas e fotos; Aos outros professores do programa, em especial aos da Genética, por tudo que me ensinaram, pelos bons exemplos; À Deus, acima de tudo, pois Ele, mais que qualquer pessoa, me permitiu, me fortaleceu, me ajudou a vencerPPGGBC os obstáculos; Enfim, a todos que participaram direta ou indiretamente desse trabalho, muito obrigada! BIOGRAFIA
Marcelle Amorim Carvalho, filha de Weliton Santana Carvalho e Janísia Antunes Amorim Carvalho, nasceu em Itapetinga-Bahia aos 12 dias do mês de Janeiro de 1985. Estudou nas escolas O sossego da Mamãe e na Cooperativa Educacional de Itapetinga, onde concluiu o ensino médio, no ano de 2002, aos 17 anos. Desde criança dizia querer ser cientista, sonho que começou a se realizar aos 20, quando foi aprovada na Faculdade de Ciências Biológicas na Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia. Desde então, passou a morar no município de Jequié-Bahia. Já no ensino superior, participou do Grupo Ecofau, no laboratório de Invertebrados/Ecologia da UESB, onde obteve auxílio para a construção dos primeiros alicerces científicos, e para a realização dos trabalhos e escritos da monografia intitulada: Inventário da Espongiofauna da Baía de Camamu e seu entorno-BA, orientada pelo Prof. Dr. Ulisses Pinheiro. Em 2009 formou-se Bacharel Ciências Biológicas com Ênfase em Ecologia de Águas continentais. No ano seguinte, foi aprovada no Programa de Pós Graduação em Genética, Biodiversidade e Conservação, onde, em conjunto com o Prof. Dr. Sérgio Siqueira e a Profa. Dra. Caroline Garcia, desenvolveu projeto de pesquisa relacionada à citogenética de anuros. Está concluindo, em 2012, o mestrado, aos 27 anos de idade.
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"Bom mesmo é ir a luta com determinação, abraçar a vida e viver com paixão, perder com classe e vencer com ousadia, porque o mundo pertence a quem se atreve" (Charles Chaplin) 1 RESUMO
2 A família Hylidae é constituída por aproximadamente 900 espécies agrupadas em três 3 subfamílias: Phyllomedusinae, Pelodryadinae e Hylinae, sendo a última a maior, 4 compreendendo 37 gêneros, incluindo Hypsiboas e Phyllodytes. Apresentam 2n=18 a 52 5 cromossomos, sendo que, em sua maioria, apresentam número cromossômico 2n=24. O 6 gênero Hypsiboas, possui 84 espécies, distribuídas principalmente em áreas de Mata 7 Atlântica, Cerrado adjacente à Caatinga e formações de Cerrado, ocorrendo também na 8 Floresta Amazônica. Os indivíduos deste gênero variam em tamanho e coloração e são 9 organizados em grupos, tais como H. benitezi, H. punctatus, H. similineatus, H. pellucens, H. 10 albopunctatus, H. faber e H. pulchellus. Destas espécies, apenas 21 foram analisadas 11 citogeneticamente, das quais 7 apresentam apenas dados de número diplóide. O gênero 12 Phyllodytes, composto por animais de pequeno porte e endêmicos da Mata Atlântica, é 13 também dividido em grupos (P. auratus, P. luteolos e P. tuberculosus). Das 11 espécies 14 descritas para o gênero, apenas três foram submetidas a estudos moleculares e nenhuma 15 apresenta dados cromossômicos. De acordo estudos de dados moleculares, morfológicos e 16 número diplóide, as espécies de ambos os gêneros apresentam incertezas em suas relações 17 filogenéticas e encontram-se ameaçadas principalmente pela perda de habitat, pelas mudanças 18 ambientais globais e doenças infecciosas emergentes, estando inseridos em biomas 19 considerados hotspots. Desta forma torna-se importante a sua caracterização genética, tanto 20 para sanar as dúvidas em relação a sua filogenia, quanto para, em conjunto com estudos 21 ecológicos, ser utilizado em programas de manejo e conservação. No presente estudo foram 22 analisados citogeneticamente três espécies do gênero Phyllodytes: P. luteolos, P. 23 melanomystax e P. tuberculosus, e quatro espécies do gênero Hypsiboas: H. atlanticus, H. 24 crepitans, H. semilineatus e H. pombali; todas provenientes de fragmentos de Mata Atlântica, 25 utilizando coloração convencional, bandamento C e impregnação por nitrato de prata. Todas 26 as espécies em questão apresentaram o mesmo número diplóide e número fundamental 27 (2n=24 e NF=48), com pequenas diferenças no que diz respeito à morfologia cromossômica e 28 a quantidade e localização das regiões de heterocromatina constitutiva e das RONs, 29 possibilitando inferências sobre os possíveis rearranjos cromossômicos envolvidos na 30 evolução cariotípicaPPGGBC desses grupos.
31 Palavras-chave: Ag-RONs, bandamento C, cromossomos, evolução cariotípica, inversões 32 pericêntricas. 33 1 ABSTRACT
2 The Hylidae family comprises nearly 900 species grouped into three subfamilies: 3 Phyllomedusinae, Pelodryadinae and Hylinae, the last being the largest, comprising 37 4 genera, including Hypsiboas and Phyllodytes. They present 2n=18 to 52 chromosomes, and, 5 mostly, have a chromosome number 2n=24. The genus Hypsiboas has 84 species, distributed 6 mainly in the Atlantic Forest areas, Cerrado adjacent to the Caatinga, and Cerrado domain, 7 also occurring in the Amazon Rainforest. The individuals of this genus vary in size and color 8 and are organized into groups, such as: H. benitezi, H. punctatus, H. similineatus, H. 9 pellucens, H. albopunctatus, H. faber and H. pulchellus. Among these species, only 21 were 10 analyzed cytogenetically, of which 7 present only diploid number data. The genus 11 Phyllodytes, composed of small animals and endemic of the Atlantic Forest, is also divided 12 into the groups P. auratus, P. luteolos and P. tuberculosus. Among the 11 species described 13 for the genus, only 3 were subjected to molecular studies and none presents chromosomal 14 studies. According to molecular data, morphological, and diploid number studies, the species 15 of both genera present uncertainties in their phylogenetic relationships and also are threatened 16 primarily by habitat loss, the global environmental changes, and emerging infectious diseases, 17 being inserted in biomes considered hotspots. Thus, it becomes important to their genetic 18 characterization, both to address the questions regarding their phylogeny, and for, in 19 conjunction with ecological studies to be used in management and conservation programs. In 20 the present study were analyzed cytogenetically 3 species of the genus Phyllodytes: P. 21 luteolos, P. melanomystax and P. tuberculosus, and four species of the genus Hypsiboas: H. 22 atlanticus, H. crepitans, H. semilineatus, and H. pombali, all from Tropical Forest fragments, 23 using conventional stain, C-banding, and silver nitrate impregnation. All the mentioned 24 species have presented the same diploid number and fundamental number (2n=24 and 25 NF=48), with minor differences regarding chromosome morphology and the amount and 26 location of constitutive heterochromatic regions and the RONs, allowing inferences about 27 possible chromosomal rearrangements involved in the karyotype evolution of these groups.
28 Keywords: Ag-NORs,PPGGBC C-banding, chromosomes, karyotype evolution, pericentric inversions. 29 1 LISTA DE FIGURAS
2 Figura 1. Fotos dos indivíduos de Phyllodytes analisados no presente estudo: a) Phyllodytes 3 luteolos, b) Phyllodytes melanomystax e c) Phyllodytes tuberculosus. 4 Figura 2. Cariótipos submetidos a coloração convencional (1) e bandamento C (2) de: a) 5 Phyllodytes luteolos, b) Phyllodytes melanomystax e c) Phyllodytes tuberculosus. Em 6 destaque os cromossomos nucleolares submetidos à impregnação por nitrato de prata e 7 bandamento C. 8 Figura 3. Fotos dos indivíduos de Hypsiboas analisados no presente estudo: a) Hypsiboas 9 atlanticus, b) Hypsiboas crepitans, c) Hypsiboas pombali, d) Hypsiboas semilineatus. (Fonte: 10 a) Sérgio Siqueira Jr.; b, c, d) Mauro Teixeira Jr.) 11 Figura 4. Cariótipos submetidos a coloração convencional (1) e bandamento C (2) de: a) H. 12 atlanticus; b) H. crepitans; c) H. pombali e d) H. semilineatus. Em destaque os cromossomos 13 nucleolares submetidos à impregnação por nitrato de prata e bandamento C. 14 Figura 5. Idiogramas das espécies de Hypsiboas analisadas citogeneticamente.
15 LISTA DE TABELAS
16 Tabela 1 – Localização dos blocos de heterocromatina e das RONs nas espécies de Phyllodytes 17 analisadas no presente trabalho 18 Tabela 2 – Fórmulas cariotípicas das espécies de Phyllodytes analisadas no presente trabalho 19 Tabela 3 – Fórmulas cariotípicas descritas para espécies de Hypsiboas baseadas em trabalhos 20 previamente publicados. 21 Tabela 4 - Fórmulas cariotípicas descritas para espécies de Hypsiboas baseadas em trabalhos 22 previamente publicados após padronização da medidas cromossômicas segundo Levan (1964). 23 Tabela 5 – ResumoPPGGBC dos dados citogenéticos disponíveis para espécies de Hypsiboas. 24 1 LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS, SÍMBOLOS
2 2n – Número diplóide 3 Ag-RON – Impregnação por nitrato de prata em região organizadora de nucléolo 4 Ba(OH)2 – Hidróxido de bário 5 BI- Banda intersticial 6 BP – Banda pericentromérica 7 BT – Banda terminal 8 DNA – Ácido desoxirribonucléico 9 DNAr – Ácido desoxirribonucléico ribossomal 10 EEWG – Estação Ecológica Wenceslau Guimarães 11 GC – Guanina-Citosina 12 HCl – Ácido clorídrico 13 M - Molaridade 14 m - metacêntrico 15 Mp – Megapixels 16 N – Normalidade 17 NF – Número fundamental 18 p - braço cromossômico curto 19 q - braço cromossômico longo 20 RPMI – Meio de Cultura 21 RNA – Ácido ribonucléico 22 RNAr - Ácido ribonucléico ribossomal 23 RON – Região organizadora de nucléolo 24 sm - submetacêntrico 25 SSC – Solução citratoPPGGBC-salina 26 st - subtelocêntrico 27 - ou * - dado ausente SUMÁRIO RESUMO ...... 1 ABSTRACT ...... 2 LISTA DE FIGURAS ...... 3 LISTA DE TABELAS ...... 3 LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS, SÍMBOLOS ...... 4 1. INTRODUÇÃO ...... 14 1.1 A Mata Atlântica e os Anfíbios ...... 14 1.2 História Natural dos Anfíbios ...... 15 1.3 Citogenética de Anfíbios ...... 15 1.4 A Família Hylidae e os Gêneros Hypsiboas e Phyllodytes ...... 16 2 REVISÃO DE LITERATURA ...... 18 2.1 A Classe Amphibia e a Ordem Anura - Panorama Geral ...... 18 2.1.2 História Natural ...... 18 2.1.3 Sistemática e Taxonomia...... 19 2.2 Citogenética em Anuros ...... 20 2.2.1 Região Organizadora do Nucléolo (RON) ...... 22 2.2.2 Heterocromatina e Bandamento C ...... 24 2.3 A Família Hylidae ...... 25 2.4 Os Gêneros Phyllodytes e Hypsiboas (Hylidae, Hylinae) ...... 26 3. OBJETIVOS ...... 29 3.1 Objetivos Específicos ...... 29 4. MATERIAIS E MÉTODOS ...... 30 4.1 Coletas ...... 30 4.2 Procedimentos Metodológicos ...... 30 4.2.1 Estudos Citogenéticos ...... 30 4.2.2 Preparação de Cromossomos Mitóticos - Intestino (King & Rofe, 1976)...... 30 4.2.3 Detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolo (Ag-RONs) (Howell e Black, 1980) .... 31 4.2.4 DetecçãoPPGGBC da Distribuição da Heterocromatina Constitutiva (Sumner, 1972) ...... 31 4.3 Captura de Imagens ...... 32 4.4 Montagem de Cariótipos e Idiogramas ...... 32 5. REFERÊNCIAS ...... 33 CAPÍTULO I - Estudos citogenéticos no gênero Phyllodytes (Anura, Hylidae) ...... 40 CAPÍTULO II - Dinâmica da Evolução Cromossômica no Gênero Hypsiboas (Anura: Hylidae) ...... 51 6 CONCLUSÕES GERAIS ...... 71 14
1 1. INTRODUÇÃO
2 1.1 A Mata Atlântica e os Anfíbios
3 Classificada como um conjunto de fisionomias e formações florestais, a Mata Atlântica 4 se distribui na faixa litorânea, florestas de baixada, matas interioranas e campos de altitude do 5 Rio Grande do Sul até o Amapá. 6 É considerada um dos principais biomas no que se refere a biodiversidade, pois sua 7 heterogeneidade de hábitats e micro-hábitats, favorece espécies especialistas em determinado 8 tipo de ambiente e, conseqüentemente, o alto número de endemismos. 9 Atualmente, possui menos de 7% de seu tamanho original, e, apresenta-se sob a forma 10 de fragmentos descontínuos, como resultado de processos de uso e ocupação do solo. 11 Levando em conta, portanto, estes dados sobre biodiversidade, endemismo e status de 12 ameaçado, este bioma é considerado um hotspot prioritário para a conservação. 13 Das aproximadamente 400 espécies de anfíbios descritas na Mata Atlântica, cerca de 90 14 são endêmicas e, poucos vertebrados dependem tanto das condições ambientais quanto eles. 15 Sua distribuição, ecologia e comportamento são influenciados especialmente pela vegetação, 16 umidade, espessura de folhiço, variedade de microambientes e disponibilidade de água. 17 Assim, os efeitos do processo de fragmentação têm trazido prejuízos para as espécies de 18 anfíbios, acarretando no empobrecimento dessas comunidades e em riscos de extinção 19 associados às mudanças climáticas, perda de hábitat e introdução patógenos. 20 Na última revisão da lista da fauna brasileira ameaçada de extinção realizada em 2002 21 (Ibama, 2003), constam 15 espécies de anfíbios ameaçados e uma espécie considerada extinta, 22 todas da Mata Atlântica. Recentes estudos indicam que estes números estão subestimados. O 23 rápido declínio das espécies de anfíbios tem mobilizado a comunidade científica em relação à 24 importância da expansãoPPGGBC dos programas de pesquisa de genética e biodiversidade e da prática 25 de estratégias de conservação especialmente em regiões onde existem poucos dados sobre 26 diversidade, abundância e distribuição das espécies, como no Brasil.
27 15
1 1.2 História Natural dos Anfíbios
2 Atualmente na classe Amphibia existem 6771 espécies descritas classificadas em três 3 ordens: Caudata, que reúne as salamandras com aproximadamente 619 espécies, 4 Gymnophiona que representa as cobras-cegas, com 186 espécies descritas, e a ordem Anura, 5 representada pelas rãs, sapos e pererecas, constituída atualmente por 5966 espécies. 6 Os anuros são conhecidos popularmente por serem animais que têm uma parte do seu 7 ciclo de vida na água, sob forma de larvas, e outra parte terrestre, quando transformam-se em 8 adultos. Entretanto, algumas espécies não apresentam a fase larval aquática, possuindo 9 desenvolvimento direto, enquanto outras, mesmo em estágio adulto, vivem em ambientes 10 aquáticos. São vertebrados com pele úmida, permeável e rica em glândulas; apresentam 11 respiração pulmonar, cutânea ou branquial e a temperatura do corpo desses animais varia 12 conforme a temperatura do ambiente (heterotérmicos). Por estes motivos a grande maioria das 13 espécies possui hábitos noturnos e/ou crepusculares, sendo que algumas podem ficar em 14 atividade durante todo o dia se estiverem no interior de matas fechadas, com pouca 15 luminosidade. Este grupo apresenta como importante característica a vocalização, que é 16 distinta para cada espécie e emitida apenas pelo macho para aproximar fêmeas para o 17 acasalamento, e para marcação de território. 18 Os Anura, pertencente à classe dos anfíbios, distribui-se por quase todos os continentes, 19 exceto a Antártica e algumas ilhas oceânicas, estando 77% de suas famílias em regiões 20 tropicais. 21 Os indivíduos dessa ordem são elementos importantes nas cadeias e teias ecológicas, 22 agindo como controladores de insetos e outros vertebrados. São também considerados 23 indicadores biológicos e ambientais, pois necessitam de um ecossistema equilibrado e 24 dependem de microclima para a sua sobrevivência. PPGGBC 25 1.3 Citogenética de Anfíbios
26 Os Anura são relativamente conservados em sua morfologia, o que dificulta resolver 27 questões relativas à sua taxonomia e sistemática através destes caracteres. Dessa forma, 28 principalmente a partir do ano 2000 estudos baseados em análise de quantidades significativas 29 de caracteres, como dados moleculares, passaram a contribuir para o entendimento das 30 relações filogenéticas desse grupo. Da mesma forma dados citogenéticos têm sido utilizados 31 para estudos citotaxonômicos e de evolução cromossômica. 16
1 Até a década de 1980, a citogenética em Anura baseava-se apenas em análises de 2 cariótipos corados convencionalmente com Giemsa, permitindo apenas a caracterização 3 numérica e morfológica dos cromossomos, sendo, ainda assim, possível detectar certa 4 variabilidade no grupo, assim como a possível existência de rearranjos. 5 As primeiras descrições cariotípicas sugeriram que um maior número cromossômico era 6 característico de anuros morfologicamente mais primitivos, e que o número reduzido de 7 cromossomos das famílias mais derivadas teria surgido a partir da redução de um cariótipo de 8 26 cromossomos. 9 A partir do desenvolvimento de técnicas como bandamento C, Ag-RON, colorações 10 com fluorocromos e hibridação in situ, houve uma facilitação do reconhecimento de 11 homologias dos cromossomos, permitido uma melhor compreensão das relações entre gêneros 12 e espécies, através da indicação dos possíveis rearranjos cromossômicos envolvidos na 13 evolução cariotípica e especiação dos Anura.
14 1.4 A Família Hylidae e os Gêneros Hypsiboas e Phyllodytes
15 A família Hylidae, constituída por aproximadamente 901 espécies, é agrupada em três 16 subfamílias: Phyllomedusinae, Pelodryadinae e Hylinae, e em geral, são arborícolas, possuem 17 cabeça e olhos grandes, cintura delgada, mãos e pés longos, discos digitais aumentados e 18 tamanho variável entre 17-140 mm. 19 O cariótipo com 2n=24 cromossomos é o mais comumente encontrado na família 20 Hylidae, com ocorrência de números menores ou maiores, como 2n=18, 20 e 22, e 2n=26, 30, 21 34 e indivíduos triplóides 3n=48 e tetraplóides 4n=52. Para o gênero Hypsiboas foram 22 caracterizadas citogeneticamente 21 das 84 espécies do gênero, das quais 7 tem publicação 23 apenas do número diplóide. Até o momento, não existem dados citogenéticos para 24 Phyllodytes. PPGGBC 25 Até a década de 90, a família Hylidae possuía o maior número de espécies até então 26 cariotipadas (129), sendo que o maior número de espécies analisadas pertence a subfamília 27 Hylinae. Contudo, a maioria das espécies dessa família ainda não possui cariótipo conhecido, 28 e a maior parte das informações citogenéticas existentes baseia-se somente em estudos feitos 29 com coloração convencional. 30 Recentemente, o refinamento das técnicas de marcações cromossômicas permitiu a 31 realização de trabalhos que revelaram a ocorrência de alterações cariotípicas em muitas 32 espécies de Hylidae. Entre estes, a presença de cromossomos sexuais morfologicamente 17
1 diferenciados, cromossomos B, variação na quantidade e distribuição de heterocromatina e 2 diferenças em relação ao número e localização da Ag-RON. 3 Ressalta-se também a importância dos trabalhos que utilizam técnicas mais avançadas, 4 como a coloração com os fluorocromos base-específicos, a hibridação in situ fluorescente em 5 análises cromossômicas de representantes dessa família. Tais estudos vêm fornecendo dados 6 importantes para a compreensão da evolução cariotípica nos Hylidae. 7 O gênero Hypsiboas é organizado em grupos, tais como H. benitezi, H. punctatus, H. 8 similineatus, H. pellucens, H. albopunctatus, H. faber e H. pulchellus; relevantes para a 9 definição de unidades monofiléticas em estudos moleculares. No entanto, algumas espécies 10 têm caracteres que tornam difícil alocá-las em qualquer um dos grupos atualmente 11 reconhecidos. 12 Os Phyllodytes, por sua vez, com base em dados morfológicos possuem três grupos (P. 13 auratus; P.luteolos e P.tuberculosus), e apresentam 11 espécies, sendo que algumas destas 14 não possuem nenhum grupamento. Este é um grupo pouco estudado tanto taxonomicamente 15 quanto a partir de dados moleculares. Além disso, trabalhos recentes divergem quanto a sua 16 filogenia, utilizando dados moleculares de apenas 3 espécies. 17 O presente trabalho, portanto, considerando o escasso conhecimento acerca das espécies 18 de Phyllodytes e Hypsiboas analisadas, e o fato de estarem inseridos em hotspots, tem como 19 objetivo realizar estudos utilizando dados citogenéticos, produzindo uma importante 20 ferramenta para estudos citotaxonômicos e de evolução cromossômica, além de tentar 21 esclarecer as relações filogenéticas destes gêneros. 22 PPGGBC 18
1 2 REVISÃO DE LITERATURA
2 2.1 A Classe Amphibia e a Ordem Anura - Panorama Geral
3 2.1.2 História Natural
4 A classe Amphibia constitui o grupo basal dos vertebrados terrestres, e sua 5 nomenclatura indica que a maioria das espécies que compõe esta classe vive parcialmente na 6 água e parcialmente na terra (Storer et al., 1989; Romer & Parsons, 1985). 7 Para atender as necessidades tanto terrestres quanto aquáticas, apresentam e importantes 8 estruturas adaptativas, como pele úmida e glandular, extremidades para nadar e andar (exceto 9 para Ordem Gymnophiona), respiração pulmonar, cutânea, bucal e branquial, e membros 10 adaptados para o salto em alguns representantes (Romer & Parson, 1985; Pough, 2002). 11 De acordo com Pough (2002) e Frost (2012), os anuros ocorrem em todos os 12 continentes, exceto na Antártida e algumas ilhas oceânicas, apresentando 77% de suas 13 famílias com distribuição tropical e 14% em áreas subtropicais do hemisfério Norte. 14 Aproximadamente 1600 das espécies dessa ordem vivem na América do Sul e, 15 principalmente, na Amazônia e nas florestas tropicais úmidas, não havendo em nenhuma 16 outra parte do mundo tamanha diversidade (Zug, 1993). No Brasil, o número de espécies de 17 anuros é bastante elevado, tendo sido encontradas 20 das 48 famílias existentes (Frost, 2012). 18 São organismos que possuem pele úmida, permeável e com presença de glândulas; 19 apresentam respiração pulmonar, cutânea ou branquial e são heterotérmicos. O que explica os 20 hábitos noturnos e/ou crepusculares da maioria das espécies, sendo que algumas podem ficar 21 em atividade durante todo o dia em locais úmidos e de pouca luminosidade (Pough, 2002). 22 Diferentemente de muitos animais terrestres, os anuros utilizam o som tanto para marcar 23 território, quanto paraPPGGBC identificar possíveis companheiros. De maneira geral, o macho vocaliza 24 com o intuito de atrair a fêmea e, ao mesmo tempo, afastar outros machos da mesma espécie. 25 O canto é bastante diversificado entre as espécies, sendo essa uma das características que 26 auxiliam na identificação da espécie e determinação do sexo do indivíduo (Lutz, 1973). O 27 canto específico das espécies é considerado um caráter evolutivo conservado e, táxons 28 aparentados podem apresentar padrões audioespectográficos similares (Pough, 2002). 29 Os anfíbios anuros apresentam também variados modos de reprodução, como ovos e 30 larvas aquáticas, deposição de ovos fora d’água, ovoviviparidade e viviparidade, sendo a 31 fertilização externa o mais freqüente (Duellman & Rodrigues, 1994). 19
1 Muitas dessas espécies possuem ainda, cuidado parental, desempenhando funções como 2 vigiar os ninhos, ou transportar ovos e girinos para a água. Este papel pode ser maternal, 3 paternal ou biparental (Beck, 1998). A maioria dos representantes dessa ordem não possui 4 órgão copulador introdutório. As fêmeas depositam ovos em local apropriado, ou os armazena 5 em parte do corpo. Até 10.000 ovos podem ser postos em uma única desova (Pough, et al., 6 2002).
7 2.1.3 Sistemática e Taxonomia
8 Atualmente na classe Amphibia existem três ordens e 6771 espécies descritas: ordem 9 Caudata, que reúne as salamandras com 619 espécies, Gymnophiona que representa as 10 cobras-cegas, com 186 espécies, e a ordem Anura, representada pelas rãs, sapos e pererecas, 11 constituída atualmente por 5966 espécies descritas (Frost, 2012). 12 Os Anura são ainda subdivididos em três subordens classificadas com base em 13 características como o número de vértebras, estrutura do cinturão peitoral, e morfologia dos 14 girinos (Frost et al., 2006). Subordem Archaeobatrachia, apresentando quatro famílias de rãs 15 consideradas mais primitivas; Mesobatrachia, que inclui seis famílias de rãs em um nível 16 evolutivo intermediário, e subordem Neobatrachia, o maior grupo, englobando cerca de 95% 17 de todas as espécies de Anura (Ford & Cannatella, 1993). 18 Em um grupo tão diversificado e de morfologia conservada como os Anura, são comuns 19 questões relativas à taxonomia e sistemática (Hillis & Dixon, 1991), o que tem motivado a 20 realização de extensas revisões, utilizando, além dos critérios tradicionais, àqueles obtidos 21 através da análise do seqüenciamento de DNA, reunidos ou não a dados citogenéticos 22 (Faivovich, 2002; Faivovich et al., 2004; Faivovich et al., 2005; Frost et al., 2006, Grant et 23 al., 2006). 24 Os principaisPPGGBC avanços na taxonomia de anuros nos anos 80 e 90 foram baseados na 25 classificação fenotípica. Entretanto, até o fim da década de 90, apenas as relações entre as 26 famílias basais estavam bem estabelecidas (Frost et al., 2006). A partir do ano 2000, estudos 27 baseados em análises de grande quantidade de caracteres, como dados moleculares, tiveram 28 contribuição significativa no entendimento das relações filogenéticas entre os neobatráquios 29 (exemplo, Faivovich, 2002; Faivovich et al., 2004). Uma das mais importantes contribuições 30 foi realizada por Frost et al. (2006) e Grant et al. (2006) que fizeram extensos estudos 31 englobando todas ordens de anfíbios e praticamente todas as famílias de anuros, fornecendo 32 um mapeamento geral dos relacionamentos filogenéticos e embasamentos para estudos 20
1 subsequentes de grupos de anfíbios não amostrados anteriormente por dados moleculares, 2 como é o caso dos trabalhos de Heinicke et al. (2007) e Hedges et al. (2008).
3 2.2 Citogenética em Anuros
4 Os anuros apresentam-se como um grupo de grande interesse para pesquisas sobre 5 mecanismos de evolução cromossômica, por sua abundância, extensa distribuição e 6 diversidade cariotípica. Evidencia-se, assim, a importância da citogenética como ferramenta 7 auxiliar na taxonomia e no esclarecimento das relações filogenéticas entre as espécies de 8 anuros. Esse papel torna-se mais relevante, a medida em que as técnicas empregadas nas 9 análises dos cromossomos se aperfeiçoam ao longo do tempo (Catroli, 2008). 10 A citogenética vem contribuindo enormemente para as investigações em sistemática de 11 vários grupos de organismos. Analisando as variações cromossômicas é possível formular 12 hipóteses sobre a filogenia de diferentes grupos taxonômicos e sobre rearranjos 13 cromossômicos ocorridos durante a evolução desses grupos, possibilitando, inclusive, 14 inferências sobre eventos populacionais (Lourenço, 1996). 15 A filogenia sugerida pelos dados de citogenética muitas vezes coincide com as 16 provenientes de análises morfo-anatômicas, moleculares e bioquímicas, contudo, existem 17 casos de controvérsia entre as relações filogenéticas entre esses tipos de análise. Tal resultado 18 pode decorrer da superficialidade de alguma das análises feitas, levando a interpretações 19 incorretas da ocorrência de convergência durante a evolução de algum desses grupos de 20 caracteres, ou de diferenças de taxas evolutivas nos diferentes conjuntos de caracteres 21 (Futuyma, 1992). 22 A análise conjunta de dados de diferentes naturezas é utilizada para maximizar o 23 entendimento correto da filogenia do grupo de interesse. Assim, estudos citogenéticos 24 fornecem dados PPGGBC que devem ser analisados em conjunto com dados os anatômicos, 25 moleculares e bioquímicos para a escolha da árvore filogenética mais provável (ex. Frost et 26 al., 2006). 27 Até a década de 80 muitos estudos citogenéticos em Anura foram desenvolvidos com 28 base na análise de cariótipos corados convencionalmente com Giemsa onde a maior 29 preocupação dessas investigações era a caracterização numérica e morfológica dos 30 cromossomos. Este dados permitiram detectar a ocorrência de variabilidade cariotípica e 31 possível existência de rearranjos cromossômicos (Bogart, 1973; 1991 Beçak et al., 1970; 32 Morescalchi, 1973; Miura 1995). 21
1 As primeiras descrições cariotípicas sugeriram que anuros morfologicamente mais 2 primitivos possuem cariótipos com maior número cromossômico e que, os cariótipos com 3 poucos cromossomos, das espécies mais derivadas, sejam resultantes de um longo processo 4 evolutivo (Bogart, 1973). Ainda com base em dados citogenéticos, Bogart (1973) inferiu que 5 cariótipos dos indivíduos de famílias mais derivadas (como Dendrobatidae, Hylidae, 6 Leptodactilydae e Ranidae) possam ter surgido a partir de um cariótipo com 26 cromossomos 7 que provavelmente sofreu redução, originando cariótipos com 24 e 22 cromossomos. 8 As reduções do número de cromossomos ocorridas ao longo do processo evolutivo em 9 Anura parecem ser resultantes de fusões cêntricas, ou de fusão “in tandem”, sendo que 10 existem casos em que os dados são insuficientes para apontar a polaridade da transformação 11 cariotípica em análise, sendo impossível determinar se houve redução ou aumento do número 12 cromossômico (Bogart, 1973, 1991; Beçak et al., 1970; e Morescalchi, 1973; Miura et al., 13 1995). 14 Bogart (1973, 1991) e Miura (1995) consideram ainda que translocações, inversões, 15 adições, deleções e amplificações, mesmo não estando envolvidas em mudanças de números 16 cromossômicos, são também prováveis rearranjos ocorridos na evolução cariotípica da 17 Ordem. É possível inferir também que os estudos citogenéticos em Anura auxiliem no 18 esclarecimento dos processos de especiação, fornecendo exemplos em que os rearranjos 19 cromossômicos tenham sido fundamentais para a especiação (White, 1978) ou em que essas 20 alterações tenham ocorrido de forma independente ou subsequente à especiação (como 21 sugerido por Imai, 1983 e Coyne, 1984). 22 Uma melhor compreensão das relações cariotípicas passou a ocorrer após o uso de 23 técnicas citogenéticas mais avançadas, como o bandamento-C, o método de Ag-RON, e as 24 colorações com fluorocromos e hibridação in situ, que facilitaram o reconhecimento de 25 homologias dos cromossomos e possibilitaram uma melhor compreensão das relações entre 26 gêneros e espécies,PPGGBC através da indicação dos rearranjos cromossômicos que podem estar 27 envolvidos na evolução cariotípica dos anuros (exemplos, Bogart 1981; King, 1990; Siqueira 28 et al., 2004). 29 Apesar dessas técnicas evidenciarem vários tipos de rearranjos cromossômicos, estes 30 foram descritos para poucas espécies até agora e evidenciaram rearranjos envolvendo 31 principalmente as RONs (exemplos, Lourenço et al., 1998, Siqueira et al., 2004). Em células 32 meióticas foram observados anéis multivalentes possivelmente resultantes da presença de 33 translocações cromossômicas múltiplas e inversões pericêntricas e paracêntricas (exemplos, 34 Lourenço et al., 2000, Siqueira et al., 2004). 22
1 Com o uso de tais técnicas, foi possível diferenciar espécies morfologicamente 2 semelhantes e que apresentaram mesmo número e morfologia cromossômica, além de mostrar 3 variações intra-específicas de localização e número de RONs e de bandas heterocromáticas 4 (ver em Quinderé, 2007). 5 Cromossomos sexuais heteromórficos são raros em anuros e foram observados em 6 pouco mais de 20 espécies já analisadas citogeneticamente, e apresentaram os sistemas 7 XY/XX, ZZ/ZW, XAAY/XXAA, 00/W0 (ver, entre outros, Schmid et al., 1991, 1992, 1993; 8 Miura, 1994; Lourenço et al., 1998; Ananias et al., 2007; Busin et al., 2007). 9 Apesar de se mostrar como uma ferramenta valiosa no estudo dos anuros, até o 10 momento, aproximadamente 1000 espécies foram estudadas citogeneticamente sendo que, 11 menos de um terço destas foram analisadas com técnicas diferenciais como, bandamento-C, 12 Ag-RON, coloração com fluorocromos base-espécificos e hibridação in situ fluorescente (ver 13 referências, King 1990; Schmid et al., 2003; Siqueira et al., 2004).
14 2.2.1 Região Organizadora do Nucléolo (RON)
15 As RONs são sítios cromossômicos ricos em seqüências GC, formados por numerosas 16 cópias de genes ribossomais que codificam os RNAs ribossomais (RNAr) 18S, 5,8S e 28S, 17 arranjadas in tandem e separadas por seqüências espaçadoras. Esses RNAr tornam-se parte 18 integrante do ribossomo (Galls & Pardue, 1969; Sumner, 1990). Também compõem as RONs, 19 um grupo peculiar das proteínas ácidas altamente argirofílicas, permitindo assim que elas 20 sejam muito clara e rapidamente visualizadas por procedimentos de impregnação por nitrato 21 de prata (Goodpasture & Bloom, 1975). Geralmente são regiões de constrições secundárias, 22 inicialmente observadas por Henderson et al. (1972). No entanto, nem todas as RONs 23 aparecem como constrições secundárias e em alguns casos contêm heterocromatina (Schmid, 24 1982). Em algunsPPGGBC casos ainda, a RON localiza-se adjacente a regiões de heterocromatina 25 (Schmid, 1982). 26 A impregnação pelo íon prata é o método mais usado para a identificação de RONs, 27 embora detecte apenas as RONs que estiveram ativas na última intérfase. Essa técnica foi 28 proposta inicialmente por Howell et al. (1975) Variações da técnica de impregnação pela 29 prata foram oferecidas por outros pesquisadores, como por exemplo, Orlet (1979), que 30 misturou uma solução de prata a 50% com ácido fórmico diluído e incubou a lâmina nesta 31 solução. Este procedimento foi modificado por Howell & Black (1980), que obteve uma 32 solução coloidal misturando ácido fórmico à solução de gelatina diluída e posteriormente este 23
1 revelador coloidal foi misturado com uma solução de nitrato de prata imediatamente antes do 2 uso, sendo então as lâminas incubadas em estufa. 3 A impregnação por prata só é possível de ser observada em RONs que estão ou 4 estiveram associadas à síntese de RNA (Miller et al., 1976a, b), sendo que a especificidade 5 pela prata se dá em razão da reação desta com as proteínas acídicas, associadas ao RNAr 6 recém-transcrito (Schwarzacher & Wachtler, 1993). Portanto, apenas as RONs ativas na 7 intérfase anterior serão evidenciadas pelo método em cromossomos metafásicos. 8 A análise RON e suas características, como número, tamanho e posição no genoma, tem 9 se mostrado importante para o entendimento da evolução cromossômica do grupo em estudo, 10 podendo ser um caráter informativo para a distinção de espécies e populações. 11 Schmid (1982) analisou cromossomos de 260 espécimes de anuros entre 23 diferentes 12 gêneros, e pôde confirmar um alto grau de fixação de heteromorfismo de tamanho de RON 13 entre os espécimes, e também que a maioria dos anuros, tanto de famílias tidas como basais 14 como derivadas, apresenta um par de RONs por genoma diplóide (Schmid, 1982; King et al., 15 1990; Schmid et al., 1990), sugerindo que possivelmente esta seja uma condição 16 plesiomórfica em Anura. De acordo com King et al. (1990), as RONs em Anura tendem a 17 coincidir com bandas C positivas indicando a presença de heterocromatina nesses sítios. 18 Alguns mecanismos de dispersão de RONs, possivelmente envolvidos no surgimento de 19 RONs múltiplas, têm sido considerados por diversos autores (Wiley et al., 1989; King et al., 20 1990; Lourenço et al., 1998; Silva et al., 1999). Estes autores sugerem que essas variações 21 possam ser um resultado de diferenças estruturais das RONs, causadas por rearranjos como 22 transposição e amplificação de genes do DNAr, e erros de reinserção durante a amplificação 23 extra-cromossômica de genes ribossomais na oogênese. 24 A análise das regiões organizadoras de nucléolos (RONs) representa uma importante 25 ferramenta para o estudo de cariótipos em anfíbios (exemplos, Wiley et al., 1989, Lourenço et 26 al., 1998, Silva etPPGGBC al., 1999, Siqueira et al., 2004). Segundo Schmid (1982), o número e a 27 localização das RONs costumam ser características de espécies e populações, que em geral 28 apresentam apenas um par cromossômico portador dessas regiões. A origem da variação intra- 29 específica no número e na localização das RONs, tem sido explicada pela ocorrência de 30 translocações e inversões, transposição de segmentos de DNA por meio de elementos 31 genéticos móveis, amplificações de genes de DNAr fita simples formando RONs 32 identificáveis e funcionais, além de erros de reinserções durante a amplificação do DNAr no 33 curso da oogênese (Schmid et al.,2003).
24
1 2.2.2 Heterocromatina e Bandamento C
2 A heterocromatina foi distinguida da eucromatina pela primeira vez em 1928, por Heitz 3 com base na compactação diferencial na intérfase. A primeira é altamente condensada e 4 possui arranjos nucleossômicos altamente compactados juntamente com a cromatina, 5 enquanto a última apresenta-se menos condensada, mais acessível e geralmente transcreve 6 mais facilmente (Huisinga et al., 2006). As regiões cromossômicas de alta densidade e de 7 elementos repetitivos do DNA tais como seqüências satélites e elementos transponíveis, que 8 são encontrados nos centrômeros e telômeros são os alvos principais da formação de 9 heterocromatina (ver revisão de Grewal & Jia 2007). 10 A heterocromatina pode ser classificada em heterocromatina facultativa e 11 heterocromatina constitutiva; a depender do seu tipo de empacotamento ou condensação. As 12 regiões de heterocromatina constitutiva permanecem condensadas durante todo o ciclo celular 13 em locais específicos do genoma, enquanto a heterocromatina facultativa é encontrada 14 também nos loci de regulação, onde o estado da cromatina pode mudar em resposta aos sinais 15 celulares e às atividades genéticas (ver revisão de Grewal & Jia 2007). 16 Hoje já se conhecem diversas funções adicionais para a heterocromatina. Segundo a 17 recente revisão realizada por Grewal & Jia (2007), a heterocromatina, dentre outras funções 18 que exerce, se porta como uma “plataforma dinâmica” no recrutamento e extensão de 19 proteínas regulatórias ao logo dos seus domínios, facilitando diversos processos, tais como, 20 transcrição, segregação cromossomal e interações cromatínicas. 21 Normalmente, a maior parte do DNA que é compactado em heterocromatina não 22 contém genes, porém os genes que se tornam compactados em heterocromatina são, em geral, 23 resistentes à expressão ou silenciados. Isso não significa que a heterocromatina tenha que ser 24 desprezada, muitoPPGGBC pelo contrário, pois ela é responsável, dentre outros fatores, pelo 25 funcionamento apropriado dos telômeros e centrômeros, auxiliando na proteção do genoma 26 (Alberts et al., 2002). 27 A heterocromatina constitutiva é geralmente detectada citogeneticamente através da 28 técnica de bandamento C (Sumner, 1990), apresentando três etapas básicas: tratamento com 29 ácido com HCl seguido de um tratamento alcalino com solução aquosa de hidróxido de bário 30 [Ba2 (OH)] saturado, e depois com solução salina de cloreto de sódio e citrato de sódio (2x 31 SSC). 25
1 O tratamento com hidróxido de bário resulta na extração de até 50% do DNA dos 2 cromossomos. Esse DNA é mais facilmente extraído das regiões banda C negativas, 3 resultando em uma fraca coloração quando comparada com regiões de heterocromatina 4 constitutiva (banda C positivas) (Schmid, 1990). 5 O bandamento C vem sendo empregado no estudo de um grande número de espécies de 6 anuros, com diversas finalidades, dentre as quais: identificação de espécies parentais com a 7 identificação de padrões em determinadas espécies ou populações, procura de possíveis 8 polimorfismos e homologias, além da caracterização de gêneros e famílias e identificação de 9 pares heteromórficos entre machos e fêmeas (Schmid 1980; Sumner 1990; Siqueira et al., 10 2008). 11 Freqüentemente, o padrão de banda C varia entre as diferentes espécies, podendo ser um 12 importante caráter sistemático, que permite a sugestão de rearranjos genéticos ocorridos 13 durante a evolução do grupo em estudo (Sumner, 1990). Além de variações interespecíficas, 14 variações intra-específicas no padrão de banda C, que embora pouco freqüentes, já foram 15 reportadas em anuros, mostrando principalmente polimorfismo de tamanho dessas regiões. 16 Diferenças nos padrões heterocromáticos entre espécies são encontradas tanto nos anuros 17 tidos como basais quanto nos mais derivados (King, 1991). 18 O padrão de distribuição e quantidade de heterocromatina, detectado pela técnica de 19 bandamento C, assim como a caracterização da composição das bandas heterocromáticas, 20 obtidas a partir do uso de fluorocromos, possibilita também a observação das transformações 21 que ocorreram em grupos de espécies próximas que apresentam cariótipos muito semelhantes 22 (Schmid, 1980; Guerra, 1988). Essas características da heterocromatina banda-C positiva 23 mencionadas acima evidenciam que o seu estudo tem sido um importante caráter citogenético 24 a ser analisado na busca de uma melhor compreensão das questões sistemáticas, bem como da 25 evolução cariotípica nesta Ordem (Schmid, 1980; Odierna et al., 2001; Kasahara et al., 2003). PPGGBC 26 2.3 A Família Hylidae
27 A família Hylidae é constituída por aproximadamente 900 espécies, agrupadas em três 28 subfamílias: Phyllomedusinae, Pelodryadinae e Hylinae, sendo a última a maior, 29 compreendendo 37 gêneros e 646 espécies (Faivovich et al., 2005; Frost, 2012). No Brasil, os 30 representantes dessa família correspondem a cerca de 40% do total de espécies de anuros aqui 31 descritas (SBH, 2007). 26
1 Essa grande diversidade de Hylinae, associada a sua ampla distribuição reflete na 2 existência de conflitos taxonômicos e sistemáticos, o que vem despertando o interesse dos 3 pesquisadores em estudos filogenéticos que buscam testar o monofiletismo e a validade do 4 seu status taxonômico (Faivovich et al., 2005; Salducci et al., 2005; Wiens et al., 2010). 5 Os hilídeos, em geral, são arborícolas, possuem cabeça e olhos grandes, cintura delgada, 6 patas longas, discos digitais aumentados (Pough, et al., 2002) e tamanho variável entre 17- 7 140mm (Duellman & Trueb, 1986). O cariótipo com 2n=24 cromossomos é o mais comum 8 em Hylidae, ocorrendo números menores 2n=18, 20 e 22, ou maiores, 2n=26, 30, 34, 3n=48 9 (triplóide) e 4n=52 (tetraplóide) (Catroli, 2008). É provável que o cariótipo da todas ou quase 10 todas as espécies com número diplóide menor ou igual a que 24 seja derivado de um ancestral 11 com 2n=26 (Bogart, 1973), o que é corroborado nos resultados dos estudos filogenéticos de 12 Faivovich et al., (2005). 13 De acordo com os dados das revisões de King (1990) e Kuramoto (1990), os hilídeos se 14 apresentavam como a família com o maior número de espécies até então cariotipadas, sendo a 15 maior representatividade em espécies analisadas pertencentes a subfamília Hylinae, e ao 16 gênero Hyla. Ainda assim, a maioria das espécies dessa família não tem cariótipo conhecido, 17 restando muitas lacunas quanto à caracterização cromossômica de seus representantes. A 18 maior parte das informações citogenéticas nos hilídeos era baseada somente em estudos feitos 19 com coloração convencional. 20 Com o refinamento das técnicas de bandamento cromossômico puderam ser realizados 21 trabalhos capazes de revelar a ocorrência de alterações cariotípicas em muitas espécies de 22 Hylidae, como a presença de cromossomos sexuais morfologicamente diferenciados, 23 cromossomos B, variação na quantidade e distribuição de heterocromatina, e diferenças em 24 relação ao número e localização da Ag-RON. É importante ressaltar os trabalhos que utilizam 25 técnicas mais avançadas, como a coloração com os fluorocromos base-específicos, a 26 Hibridação in situPPGGBC fluorescente em análises cromossômicas de representantes da família 27 Hylidae. Esses estudos, têm fornecido dados importantes para compreender da evolução 28 cariotípica nos Hylidae (Kasahara et al., 1998; Kasahara et al., 2003; Schmid e Steinlein, 29 2003).
30 2.4 Os Gêneros Phyllodytes e Hypsiboas (Hylidae, Hylinae)
31 O gênero Phyllodytes pertence a família Hylidae, subfamília Hylinae e tribo 32 Lophiohylini (Frost, 2012). Esses animais são popularmente conhecidos como pererecas das 27
1 bromélias (Musso & Lima, 2002), apresentando pequeno porte, onde o adulto pode variar 2 entre 1,7 a 3,5 cm de comprimento, e ventosas nas pontas dos dedos, essenciais para aderência 3 na vegetação (Duellman & Trueb, 1994). 4 Possuem hábito bromelícola e são endêmicos de regiões de Mata Atlântica, um dos 5 biomas mais ameaçados, que vem sofrendo drástica redução devido ação antrópica, restando 6 apenas 7% de sua cobertura original. (Fundação SOS Mata Atlântica, 2012). 7 Apresenta 11 espécies (Frost, 2012), das quais 9 (exceto P. gynaethes e P. maculosus) 8 são pertencentes aos grupos: grupo P. auratus (P. autratus e P. wuchereri), grupo P. luteolos 9 (P. acuminatus, P. brevirostris, P. edelmoi, P. kautskyi, P. luteolos e P. melanomistax) e 10 grupo P. tuberculosus (P. punctatus e P. tuberculosus). 11 Análise de dados moleculares de Faivovich et al. (2005) reconheceram três grupos de 12 espécies e uma espécie não atribuída ao grupo demonstrando o polifiletismo de Phyllodytes. 13 Entretanto a última revisão do gênero, feita por Wiens et al. (2010) indica que Phyllodytes é 14 monofilético e o aloca próximo de grupos como, Trachycephalus, Osteocephalus, 15 Aparasphenodon e Itapotihyla, que morfologicamente são muito distintos deste gênero 16 gênero. 17 Faivovich et al. (2005) baseando-se em análises moleculares de 45 espécies 18 demonstraram o monofiletismo do grupo de Hylas da América do Sul, nesse sentido 19 sinonimizou 15 gênero e alocou as espécies brasileiras no gênero (Hypsiboas). 20 Este gênero constitui-se de 84 espécies distribuídas principalmente em áreas de Mata 21 Atlântica, Cerrado adjacente à Caatinga e formações de Cerrado, ocorrendo também na 22 Floresta Amazônica. O gênero Hypsiboas é organizados em grupos tais como, H. benitezi, H. 23 punctatus, H. similineatus, H. pellucens, H. albopunctatus, H. faber e H. pulchellus; de 24 acordo com suas semelhanças morfológicas. Estes grupos são relevantes para a definição de 25 unidades monofiléticas, no entanto, algumas espécies têm caracteres que tornam difícil alocá- 26 las em qualquer umPPGGBC dos grupos atualmente reconhecidos (Faivovich et al., 2005). 27 Até então, foram caracterizadas citogeneticamente 21 espécies do gênero, das quais 7 28 apresentam somente dados do número cromosssômico (Carvalho et al., 2009; Nunes & 29 Fagundes, 2008; Gruber et al., 2006; Raber et al., 2004; Ananias et al., 2004), Essas 30 caracterizações mostram números diplóides que variam entre 2n=22 a 24 cromossomos 31 (Gruber et al., 2006), sendo 2n=24 o número cromossômico mais comum (Faivovich, 2005). 32 Estudos citogenéticos em anuros, ao contrário do observado em nível morfológico, têm 33 mostrado grande variabilidade em Anura e contribuído bastante em investigações de ordem 34 sistemática e relações filogenéticas de vários grupos (Toledo et al., 2007). Até o momento 28
1 cerca de 1000 espécies de Anura foram estudadas citogeneticamente dentre as 5966 espécies 2 existentes nessa ordem. Apesar da importância dada a estudos citogenéticos ainda não há 3 registro de tais dados para o gênero Phyllodytes, nem para algumas espécies do gênero 4 Hypsiboas, como H. atlanticus e H. pombali. 5
PPGGBC 29
1 3. OBJETIVOS
2 Considerando escasso conhecimento das espécies de Phyllodytes e de algumas espécies 3 de Hypsiboas (Anura, Hylidae), e o fato de esses gêneros estarem inseridos em hotspots, o 4 presente estudo tem como objetivo realizar estudos taxônomicos destes gêneros, utilizando 5 dados citogenéticos, produzindo uma importante ferramenta citotaxonômica que, em conjunto 6 com dados ecológicos, podem auxiliar em programas de manejo e conservação.
7 3.1 Objetivos Específicos
8 A. Coleta e identificação de espécies do gênero Phyllodytes e Hypsiboas, preferencialmente 9 de suas localidades tipo; 10 B. Definição do número diplóide e fórmula cariotípica das populações amostradas a partir de 11 técnicas de coloração convencional; 12 C. Estabelecimento de padrões de distribuição da heterocromatina constitutiva e localização 13 de sítios ativos de NORs, eficientes marcadores cromossômicos, a partir, respectivamente, de 14 técnicas de bandamento-C e impregnação por nitrato de prata nas espécies analisadas; 15 D. Analisar diversidade inter e intraespecífica através de estudos comparativos entre os 16 espécimes; 17 E. Analisar os resultados obtidos comparando com os encontrados na literatura para outros 18 anuros, visando estudos de evolução cromossômica no grupo;
19 PPGGBC 30
1 4. MATERIAIS E MÉTODOS
2 4.1 Coletas
3 Os espécimes do gênero Phyllodytes utilizados provêm de três localidades do estado da 4 Bahia/ Brasil: o Parque Estadual da Serra do Conduru, localizado entre os municípios de 5 Ilhéus, Uruçuca e Itacaré, reserva da Natura, localizada no município de Serra Grande e da 6 cidade de Ilhéus. Os indivíduos do gênero Hypsiboas foram coletados de um fragmento de 7 Mata Atlântica do município de Itacaré-BA e da Estação Ecológica Wenceslau Guimarães, no 8 município que da nome à reserva-BA. As coletas foram realizadas através de busca ativa e 9 vocalização. 10 Foram analisados 13 indivíduos do gênero Phyllodytes, identificados como P. 11 melanomistacs, P. luteolos e P. tuberculosus; e 8 indivíduos do gênero Hypsiboas, 12 identificados como H. atlanticus, H. crepitans, H. pombali e H. semilineatus. 13 Os espécimes vivos coletados foram encaminhados ao Laboratório de Citogenética da 14 Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia – Campus de Jequié onde foram processados, 15 recebendo numeração correspondente ao registro de tombo. Os exemplares foram fixados em 16 formol a 4% e posteriormente mantidos em álcool 70%, identificados e depositados também 17 no Laboratório de Citogenética da Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia – Campus de 18 Jequié.
19 4.2 Procedimentos Metodológicos
20 4.2.1 Estudos Citogenéticos PPGGBC 21 4.2.2 Preparação de Cromossomos Mitóticos - Intestino (King & Rofe, 1976) 22 A. Foi injetado intraperitonealmente uma solução aquosa de colchicina 0,5%, na proporção de 23 0,02 ml por grama de peso do animal; 24 B. Após quatro a seis horas, o animal previamente anestesiado, foi sacrificado sendo 25 removidos coração, fígado, intestino e testículos; 26 C. O coração e os testículos foram acodicionados em eppendorf contendo álcool 100% para 27 posterior análise molecular; 31
1 D. O intestino foi deixado imerso em água destilada por 20 minutos; sendo posteriormente 2 acondicionado em tubo falcon contendo fixador Carnoy (3:1) por 24 horas em geladeira. Após 3 esse período procedeu-se a raspagem da parte interna para obtenção das células a serem 4 analisadas; 5 E. O material obtido do intestino, foi homogeneizado com auxílio de pipetas pasteur e, em 6 seguida, centrifugdo por duas vezes a 950 rpm por dez minutos cada vez; 7 F. Seguiu-se então o armazenamento do material em eppendorfs contendo fixador Carnoy 8 (3:1), em congelador; 9 G. As suspensões obtidas foram pingadas em lâminas, e coradas com uma solução de Giemsa 10 5% em tampão fosfato 0,1M a pH 6,8 por aproximadamente 10 minutos. Após coloração, 11 foram lavadas em água corrente e secas ao ar.
12 4.2.3 Detecção das Regiões Organizadoras de Nucléolo (Ag-RONs) (Howell e Black, 13 1980)
14 A. Foram pingadas sobre uma lamínula, 2 gotas de solução aquosa de gelatina a 2%, acrescida 15 de ácido fórmico na proporção de 2ml/100 ml de solução, e 4 gotas de solução aquosa de 16 nitrato de prata a 50%; 17 B. Cobriu-se lamínula com a lâmina previamente preparada; 18 C. O conjunto lâmina-lamínula foi incubado em estufa ou banho-maria a 60º C até que a 19 lâmina adquirisse coloração de caramelo a marro claro; 20 D. Lavou-se a lâmina em água destilada, com o auxilio de uma piceta, para que a lamínula 21 escorresse naturalmente com a corrente d’água; 22 E. Posterior à retirada da lamínula, a lâmina foi lavada em água corrente (torneira) e seca ao 23 ar; 24 F. Quando se fez PPGGBCnecessário, a lâmina foi corada com Giemsa diluído em tampão fosfato pH 25 6,8 por cerca de 20 segundos.
26 4.2.4 Detecção da Distribuição da Heterocromatina Constitutiva (Sumner, 1972)
27 A. Inicialmente a lâmina foi tratada com HCl 0,2N por 13 minutos em temperatura ambiente; 28 B. Lavou-se a lâmina em água corrente e, depois, seca ao ar; 29 C. Depois de seca, a lâmina foi tratada em solução aquosa e Ba(OH)2 5% a 60ºC durante 60 30 segundos; 32
1 D. Imediatamente após retirada da solução de bário, imergiu-se a lâmina rapidamente em HCl 2 0,2N; 3 E. A lâmina foi então deixada em solução salina 2XSSC a 60ºC por 30 minutos; 4 F. Lavou-se a lâmina em água corrente, deixando secar ao ar. 5 G. Após todo esse procedimento, corou-se a lâmina Giemsa a 5% diluído em tampão fosfato 6 pH 6,8 durante 10 minutos.
7 4.3 Captura de Imagens
8 As preparações foram analisadas em microscópio óptico ou microscópio de epifluorescência e 9 capturadas com 5 Mp de definição através do sistema de análise de imagens CoolSnap Pro, 10 utilizando-se para tal, o programa Image Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics).
11 4.4 Montagem de Cariótipos e Idiogramas
12 Os cariótipos foram montados utilizando Adobe Photoshop 7.0.1, e a morfologia 13 cromossômica foi determinada segundo a razão de braços proposta por Levan, 1964. 14
PPGGBC 33
1 5. REFERÊNCIAS
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1 CAPÍTULO I - Estudos citogenéticos no gênero Phyllodytes (Anura, Hylidae)
2 Marcelle Amorim Carvalho1, Caroline Garcia1 e Sérgio Siqueira1
3 1 Departamento de Ciências Biológicas, Laboratório de Citogenética, Universidade Estadual do Sudoeste da 4 Bahia. Jequié, BA, Brasil.
5 RESUMO
6 Estudos de natureza sistemática e filogenética dentro da ordem Anura foram, em sua 7 maioria, baseados em dados morfológicos, os quais, em muitos grupos, apresentam-se 8 altamente conservados, constituindo caracteres diagnósticos fracos. A partir de 2002, estudos 9 genéticos mostraram-se como ferramentas promissoras na resolução de conflitos taxonômicos 10 e na elucidação de relações evolutivas, sendo uma delas a Citogenética. Dentre as 5966 11 espécies de anfíbios anuros descritas, em torno de 1000 espécies já apresentam algum tipo de 12 informação cariotípica. Estes dados tem se mostrado extremamente úteis em inferências sobre 13 os mecanismos de evolução cromossômica e estudos de taxonomia, e quando associados a 14 dados morfológicos, ecológicos e moleculares permitem um melhor entendimento de suas 15 relações filogenéticas. O gênero Phyllodytes é composto por animais de pequeno porte e 16 endêmicos da Mata Atlântica, e das 11 espécies descritas para o gênero, apenas três destas 17 foram estudadas molecularmente e nenhuma apresenta dados cromossômicos. No presente 18 estudo foram analisados citogeneticamente três espécies deste gênero - Phyllodytes luteolos, 19 P. melanomystax e P. tuberculosus, utilizando coloração convencional, bandamento C e 20 impregnação por nitrato de prata. As três espécies apresentaram o mesmo número diplóide e 21 número fundamental (2n=24 e NF=48), com pequenas diferenças no que diz respeito à 22 morfologia cromossômicaPPGGBC e a quantidade e localização das regiões de heterocromatina 23 constitutiva e das RONs.
24 Palavras-chave: Ag-RONs, bandamento C, cromossomos, evolução cariotípica, inversões 25 pericêntricas 26 41
1 ABSTRACT
2 Cytogenetic studies of genus Phyllodytes (Anura, Hylidae)
3 Phylogenetic and systematics studies within the Anura order were mostly based on 4 morphological data, which in many groups, present themselves as highly conserved, 5 constituting poor diagnostic characters. However, since 2002, genetic studies showed to be 6 promising tools for resolving conflicts regarding taxonomy and in elucidating evolutionary 7 relationships, one of which the Cytogenetics. Among the approximately 5966 species of 8 amphibians described, about 1000 species present some karyotype information. This 9 information has been extremely useful in inferences about the mechanisms of chromosomal 10 evolution and taxonomy studies, and when associated with morphological, ecological and 11 molecular techniques allow a better understanding of their phylogenetic relationships. The 12 genus Phyllodytes consists of small and endemic animals from the Atlantic Forest, and from 13 the 11 species described of the genus, only 3 of these were molecularly studied and they had 14 none chromosomal data presented. In the present study 3 species of the genus Phyllodytes 15 were analyzed cytogenetically; P. luteolos, P. melanomystax and P. tuberculosus, using 16 conventional stain, C-banding, and silver nitrate impregnation. These species have the same 17 diploid and fundamental number (2n=24 and NF=48), with minor differences regarding 18 chromosome morphology, amount and location of constitutive heterochromatic regions and 19 the RONs.
20 Keywods: Ag-NORs, C-banding, chromosomes, karyotype evolution, pericentric inversions 21 PPGGBC 42
1 INTRODUÇÃO
2 O gênero Phyllodytes, composto por 11 espécies, pertence a família Hylidae, subfamília 3 Hylinae e tribo Lophiohylini (Frost, 2012). Esses animais, popularmente conhecidos como 4 pererecas das bromélias (Musso & Lima, 2002), apresentam pequeno porte, onde o indivíduo 5 adulto pode variar entre 1,7 a 3,5 cm de comprimento, apresentando ventosas nas pontas dos 6 dedos, essenciais para aderência na vegetação (Duellman & Trueb, 1994). 7 Esses animais apresentam hábito bromelícola e são exclusivos de ambientes de Mata 8 Atlântica, um dos biomas mais ameaçados e que vem sofrendo drástica redução devido ação 9 antrópica, contando atualmente, com apenas 7% de sua cobertura original. (Fundação SOS 10 Mata Atlântica, 2012). 11 O fato deste bioma marcado por alto grau de endemismo de sua fauna encontrar-se sob 12 severa ameaça, atinge, inevitavelmente, a riqueza de espécies encontradas nessas áreas. 13 Atualmente, reconhece-se a existência de cerca de 340 espécies de anfíbios vivendo em 14 remanescentes de Mata Atlântica, sendo que 90 dessas são consideradas endêmicas (Fundação 15 SOS Mata Atlântica, 2012; Lagos & Muller, 2007). Esses fatos vêm despertando o interesse 16 de pesquisadores em melhor caracterizar os anfíbios desse bioma visando estudos de 17 biodiversidade e projetos de manejo e conservação. Nesse sentido, marcadores 18 cromossômicos e moleculares apresentam grande aplicabilidade em sua caracterização 19 genética, permitindo a identificação de variações intra e interespecífica e o monitoramento da 20 variação genética das populações. 21 O gênero Phyllodytes é um dos menos estudados dentro de Hylinae, tanto do ponto de 22 vista morfológico quanto genético. Os poucos estudos disponíveis sobre as relações 23 filogenéticas dentro da família Hylidae utilizam dados morfológicos e alguns poucos dados 24 moleculares (Wiens,PPGGBC et al., 2010; Faivovich et al., 2005). 25 Faivovich et al. (2005) utilizando dados morfológicos e seqüenciamento de genes 26 mitocondriais (12S, 16S e citocromo b), propõem o monofiletismo do gênero, recuperando-o 27 como grupo mais basal para a tribo Lophiohylini. Wiens et al. (2010) em estudos mais 28 recentes, baseados apenas em dados moleculares (12S e 16S) não confirmou o monofiletismo 29 de Phyllodytes, alocando P. auratus mais próximo filogeneticamente de Itapotihyla do que 30 das demais espécies do gênero. Levando-se em consideração o pequeno número de espécies 31 analisadas no estudo de Wiens (2010) ou Faivovich (2005) (P. auratus, P, luteolos e 32 Phyllodytes sp.) as relações evolutivas dentro do gênero permanecem pouco esclarecidas. 43
1 Em grupos com espécies que apresentam ampla distribuição, ou para aquelas que 2 possuem diversidade críptica, os caracteres morfológicos nem sempre são suficientemente 3 fortes para permitir a correta identificação de espécies. Nesses casos, onde a morfologia 4 mostra-se conservada ou limitada outras ferramentas podem ser utilizadas. Uma dessas 5 ferramentas é a citogenética (Hillis & Dixon, 1991; Toledo et al., 2010). 6 O presente estudo teve por objetivo analisar citogeneticamente três espécies de 7 Phyllodytes gerando informações que possam ser úteis para estudos de evolução 8 cromossômica e citotaxonomia que poderão ser utilizadas também para promover o sucesso 9 de programas de conservação.
10 MATERIAIS E MÉTODOS
11 Foram analisados 11 indivíduos provenientes de três localidades do estado da Bahia/ 12 Brasil: o Parque Estadual da Serra do Conduru, localizado entre os municípios de Ilhéus, 13 Uruçuca e Itacaré; da reserva da Natura, localizada no município de Serra Grande e da cidade 14 de Ilhéus. Os espécimes foram identificados como Phyllodytes luetolos, P. melanomistax e P. 15 tuberculosus e tombados no LAGOA (Laboratório de Genética de Organismos Aquáticos), 16 Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia, Jequié, sob os números 330, 331, 332, 333, 334, 17 431, 432, 434, 435, 444 e 445. (Fig. 1 e Tabela 1). 18 Para a obtenção dos cromossomos, os animais foram tratados com injeção 19 intraperitoneal com uma solução aquosa de colchicina 0,5%, na proporção de 0,02 ml por 20 grama de peso do animal por um período de 4 a 6 horas antes de serem anestesiados e 21 processados. Os cromossomos mitóticos foram obtidos através da raspagem do epitélio 22 intestinal, conforme protocolo descrito por King & Rofe, (1976) com modificações. 23 Para a determinaçãoPPGGBC do número e morfologia dos cromossomos foi utilizada a coloração 24 convencional por Giemsa e a classificação cromossômica seguiu a proposta de Levan et al. 25 (1964). 26 Para o cálculo do número de braços cromossômicos (NF), assumiu-se os cromossomos 27 metacêntricos, submetacêntricos e subtelocêntricos como portadores de dois braços 28 cromossômicos, e cromossomos acrocêntricos como portadores de apenas um braço. As 29 medições cromossômicas foram realizadas com o auxílio de um programa computacional que 30 simula um paquímetro (Bressane e Bressane, em preparação). 44
1 O bandamento C, seguiu o protocolo proposto por Sumner (1972) com modificações; e 2 para a detecção das regiões organizadoras de nucléolo utilizou-se a impregnação por nitrato 3 de prata, com pequenas alterações segundo o Howell & Black (1980).
4 RESULTADOS
5 As três espécies de Phyllodytes apresentaram número diplóide 2n=24 cromossomos e 6 NF=48. Os cariótipos obtidos mostraram-se bastante semelhantes, diferindo quanto a 7 morfologia de alguns pares cromossômicos. Para todas as espécies os pares 1, 9, 10, 11 e 12 8 mostraram-se metacêntricos, e o par 4 subtelocêntrico. Por outro lado, os pares 2, 3, 6 e 8 9 variaram entre metacêntricos e submetacêntricos e os pares 5 e 7 variaram entre 10 submetacêntricos e subtelocêntricos. Pode-se ainda observar a ocorrência de uma constrição 11 secundária em um dos cromossomos do par 7 de Phyllodytes melanomystax, responsável por 12 um heteromorfismo de tamanho entre os homólogos (Fig. 2 A, B, C e Tabela 2). 13 O bandamento C revelou a presença de blocos de heterocromatina constitutiva, 14 localizados pericentromericamente em todos os cromossomos de P. tuberculosus e na maioria 15 dos cromossomos de P. melanomystax e P. luteolos. Blocos banda C positivos também 16 puderam ser observados nas regiões terminais de alguns cromossomos nas três espécies e 17 intersticialmente apenas em P. melanomystax e P. luteolos (Figura 3 D, E, F e Tabela 1). 18 Com relação ao numero e localização das RONs, Phyllodytes melanomystax apresentou 19 uma marcação de Ag-RONs na posição terminal dos braços longos do par 7, coincidente com 20 um bloco de heterocromatina e com a constrição secundária em um dos homólogos do par. 21 Phyllodytes luteolos apresentou RONs terminais localizadas nos braços longos do par 8. Não 22 foi possível obter dados sobre o número e localização das RONS para P. tuberculosus (Fig. 2 23 – boxes). PPGGBC
24 DISCUSSÃO
25 Os cariótipos dos espécimes analisados deste estudo apresentam número diplóide 26 equivalente à 2n=24 cromossomos. Esse número diplóide é uma das características 27 citogenéticas mais marcantes da família Hylidae, apesar de já haverem sido descritas 28 variações neste que vão de 2n=18 cromossomos (ex.: Aplastodiscus leucopygius) até 2n=52 29 cromossomos (ex.: Phyllomedusa tretraploidea) (Catroli, 2008). 45
1 De acordo Bogart (1973) os cariótipos de todas ou quase todas as espécies com 2 número diplóide diferente do número diplóide modal para a família são, provavelmente, 3 derivados de um ancestral comum que apresentava 2n=26 cromossomos. Essa proposta foi 4 corroborada pelos resultados dos estudos de Faivovich et al. (2005), que propõem filogenia 5 para os hilídeos utilizando dados moleculares, porém não deixando de levar em consideração 6 o número cromossômico das espécies. 7 A macroestrutura cromossômica de Phyllodytes apresenta seis pares cromossômicos 8 (1, 4, 9, 10, 11 e 12) com morfologia conservada e outros seis (2, 3, 5, 6, 7 e 8) de morfologia 9 variada. Analisando essas fórmulas cariotípicas, pode-se inferir que as semelhanças entre 10 essas três espécies é resultado de sua ancestralidade comum, já as diferenças na 11 macroestrutura resultantes do posicionamento do centrômero devem-se, provavelmente à 12 inversões pericêntricas como sugerido para espécies de Dendropsohus (Medeiros, 2005), 13 Hypsiboas (Carvalho et al., 2008) e Phyllomedusa (Barth, 2008), as quais possivelmente 14 constituam o principal mecanismo de evolução cariotípica para o grupo. 15 O bandamento C permitiu revelar uma maior diferenciação entre as espécies 16 analisadas, identificando três padrões de distribuição e quantidade dos blocos de 17 heterocromatina. A diminuição do número e do tamanho de blocos heterocromáticos em 18 regiões pericentroméricas, em muitos casos está associada a presença de blocos banda C 19 positiva em regiões intesticiais e/ou terminais, como pode ser observado para P. 20 melanomystax e P. luteolos. Esse fato parece indicar que a ocorrência de heterocromatina 21 intersticial e/ou terminal possivelmente resulta de eventos de inversão pericêntrica 22 envolvendo os blocos proximais à região centromérica, resultando no novo posicionamento 23 (Medeiros, 2005; Carvalho et al., 2008; Barth, 2008). 24 Considerando as RONs, estas são simples e localizadas terminalmente nos braços 25 longos dos pares 7 e 8, em P. melanomystax e P. luteolos, respectivamente. Esses pares 26 cromossômicos apresentamPPGGBC a mesma morfologia nas duas espécies indicando que eles possam 27 ter uma ancestralidade comum e sua localização esteja dependente de rearranjos que tenham 28 ocorrido em outros pares adjacentes durante a evolução cromossômica do grupo. A existência 29 de homeologias entre pares de diferentes espécies pode ser confirmado em estudos dos 30 gêneros Physalaemus (Quinderé, 2007) e Phyllomedusa (Bruschi, 2010). 31 Ainda não foi possível obter resultados de Ag-RON para P. tuberculosus, mas, devido 32 a sua natureza heterocromática e das outras duas espécies estudadas, pode-se supor que, a 33 impregnação pelo nitrato de prata revele a RON coincidente com os blocos heterocromáticos 46
1 existentes na região terminal dos cromossomos do par 8, o qual também mostra-se semelhante 2 em morfologia ao par nucleolar das demais espécies em estudo. 3 Embora translocações/transposições e inversões pericêntricas sejam os eventos mais 4 prováveis de terem ocorrido no grupo em questão, acarretando nas diferenças entre as 5 espécies, não podemos afirmar que estes foram os únicos eventos envolvidos na evolução 6 cromossômica do grupo, pois sabe-se que esses podem ser mais complexos, como observado 7 por Ventura (2009), através de pintura cromossômica, em roedores do gênero Akodon. 8 O presente estudo mostrou que existem importantes diferenças citogenéticas entre as espécies 9 estudadas, o que contribui com os estudos de evolução cariótipica e citotaxonomia, além de 10 poderem ser utilizadas em programas de conservação, visto que, ações bem sucedidas de 11 reintrodução e/ou a permanência das espécies, dependem de uma compatibilidade genética 12 entre elas. Contudo, para auxiliar o entendimento das relações filogenéticas, se faz necessário 13 a coleta e análise de um maior número de espécies utilizando uma maior variedade de técnicas 14 genéticas.
15 AGRADECIMENTOS: 16 Os autores agradecem ao Prof. Dr. Mirco Solé pela identificação dos exemplares 17 Phyllodytes e auxílio nas coletas. Este trabalho contou com o apoio financeiro da Fundação de 18 Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB – processo BOL 1399/2010).
19 REFERÊNCIAS
20 BARTH, A. 2008. Estudos citogenéticos nas espécies do gênero Phyllomedusa (Anura, 21 Hylidae) encontradas na região sul do estado da Bahia. Resumo de Dissertação de 22 Mestrado. 2p. 23 BRESSANE & BRESSANEPPGGBC em preparação. 24 BRUSCHI, D. P. 2010. Relações inter e intraespecíficas no grupo de Phyllomedusa 25 hypochondrialis (Anura, Hylidae): Estudos citogenéticos e de DNA mitocondrial. 26 Campinas: Universidade Estadual de Campinas. Dissertação de Mestrado em Biologia 27 Celular e Estrutural. 28 BOGART, J. P. 1973. Evolution of anuram karyotypes. In Vial, J. L. (ed.). Evolutionary 29 Biology of the Anurans: contemporary research on major problems. University of 30 Missuru Press, Columbia, pp. 337-349. 47
1 CARVALHO, F. K, DE; FERNANDES, A.; BARTH, A. & CUSTÓDIO, R. J. 2008. Tempo 2 ou antropismo como fatores causadores de alterações cromossômicas para uma 3 população de Hypsiboas raniceps (Anura: Hylidae) (Cope, 1862). 4 CATROLI, G. F. 2008. Cariótipo se seis espécies de Bokermannohyla dos grupos de B. 5 circumdata e B. pseudopseudis (Anura, Hylidae). Dissertação apresentada ao Instituto 6 de Biociências da Universidade Estadual Paulista, UNESP, Campus de Rio Claro, para 7 a obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Biologia Celular e Molecular) 8 Rio Claro – SP. 9 DUELLMAN, W. E. & TRUEB, L. 1994. Biology of Amphibians, The John Hopkins Univ 10 Press. Baltimore, 670 pp. 11 FAIVOVICH, J.; HADDAD, C. F. B.; GARCIA, P. C. A.; FROST, D. R.; CAMPBELL, J.A. 12 & WHEELER, W. C. 2005. Systematic review of the frog family Hylidae, with special 13 reference to Hylinae: phylogenetic analysis and taxonomic revision. Bull. Am. Museum 14 Nat. Hist. 294:1-240. 15 FROST, D.R. 2012 Amphibian Species of the World: An Online Reference, version 5.3. 16 Electronic database accessible at http://research.amnh.org/herpetology/amphibia 17 American Museum of Natural History, New York, USA. 18 FUNDAÇÃO SOS MATA ATLÂNTICA. 2012. Mata Atlântica. Portal SOS Mata Atlântica, 19 disponível em: http://www.sosmatatlantica.org.br/index.php?section=info&action=mata 20 . Acessado em 07/01/2012. 21 HILLIS, D. M. & DIXON, M. T. 1991.Ribosomal DNA: molecular evolution and 22 phylogenetic inference. Q Rev Biol, 66, 411 -53. 23 HOWELL, W. M. & BLACK, D. A. 1980.Controlled silver staining of nucleolar organizer 24 regions with a protective colloidal developer; a 1-step method. Experientia 36:1014- 25 1015. 26 KING, M. & ROFE,PPGGBC R. 1976. Karyotype variation in the Australian gekko Phyllodactylus 27 marmoratus (Gray) (Gekkonidae: Reptilia). – Chromosoma 54: 75-87. 28 LAGOS, A. R. & MULLER, B. L. A. 2007. Hotspot brasileiro – Mata Atlântica. Saúde e 29 Ambiente em Revista. Universidade do Grande Rio – UNIGRANRIO 30 LEVAN, A.; FREDGA, K. & SANDBERG, A. A. 1964. Nomenclature for centromeric 31 position on chromosomes. Hereditas 52:201-220. 32 MEDEIROS, L. R. 2005. Citogenética de Dendropsophus (Anura, Hylidae): Caracterizações 33 e comparações cromossômicas. Tese de Doutorado em Biologia Celular e Estrutural 34 110p. 48
1 MUSSO, C. M. & LIMA, R. N. 2002. Diagnóstico Ambiental – Fauna. Zoneamento 2 Ambiental Reserva Ecológica de Jacarenema, Vila Velha – ES. Disponível em: 3 http://www.avidepa.org.br 4 QUINDERÉ, Y. R. S. D. 2007. Citogenética de populações e espécies de Physalaemus do 5 grupo "cuvieri" (Anura, Leiuperidae).” Campinas: Universidade Estadual de Campinas. 6 Dissertação de Mestrado em Biologia Celular e Estrutural. 7 SUMNER, A.T. 1972. A simple technique for demonstrating centromeric heterocromatio. 8 Exp Cell 75:304-306. 9 TOLEDO, L. F., SIQUEIRA, S., DUARTE, T. C., VEIGA-MENONCELLO, A. P. C. & 10 RECCO-PIMETEL, S. M. 2010. Description of a new species of Pseudopaludicola 11 Miranda-Ribeiro, 1926 from the state of São Paulo, Southeastern Brazil (Anura, 12 Leiuperidae). Sou. Am J Herpet 1:185-191. 13 VENTURA, K. 2009. Estudos citogenéticos e filogenia molecular em roedores da tribo 14 Akodontini. Tese apresentada ao Departamento de Genética e Biologia Evolutiva do 15 Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo para a obtenção do título de 16 Doutor em Ciências na área de Biologia/Genética. São Paulo.WIENS, J. J.; 17 KUCZYNSKI, C. A.; HUA, X.; MOEN, D. S .2010. An expanded phylogeny of 18 treefrogs (Hylidae) based on nuclear and mitochondrial sequence data. Molecular 19 Phylogenetics and Evolution 55 871–882.
PPGGBC 49
Tabela 1 – Localização dos blocos de heterocromatina e das RONs nas espécies de Phyllodytes analisadas no presente trabalho Espécie Nº de tombo Localidade Sexo Bandamento C RONs P. luteolos 444 e 4445 Ilhéus/BA 2 Machos BP= maioria B BI=1q, 1p, 5p, T=8q 7q, 10p BT= 1q, 2p, 3q, 4q P. melanomystax 331, 431, 432, PESC/BA e 4 Machos e BP= 1, 4, 6, 7, 8, B 434 e 435 Reserva da 1 Fêmea 9, 10, 11 e 12 T =7q Natura/BA BI=1q BT=1p, 2q, 7q P. tuberculosus 330, 332, 333 e PESC/BA 4 Machos BP=todos os _ 334 cromossomos BT= 8q
Tabela 2 – Morfologia cromossômica das espécies de Phyllodytes analisadas no presente trabalho Espécie 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 P. luteolos m m m st st sm st sm* m m m m P. melanomistacs m m sm st sm m sm* m m m m m P. tuberculosus m sm sm st st sm st sm m m m m * par onde houve marcação das RONs
PPGGBC
50
a) b) c) Fig. 1 - Fotos dos indivíduos de Phyllodytes analisados no presente estudo: a) Phyllodytes luteolos, b) Phyllodytes melanomystax e c) Phyllodytes tuberculosus.
PPGGBC
Fig. 2 - Cariótipos submetidos a coloração convencional (1) e bandamento C (2) de: a) Phyllodytes luteolos, b) Phyllodytes melanomystax e c) Phyllodytes tuberculosus. Em destaque os cromossomos nucleolares submetidos à impregnação por nitrato de prata e bandamento C. 1 51
1 CAPÍTULO II - Dinâmica da Evolução Cromossômica no Gênero Hypsiboas (Anura: 2 Hylidae)
3 Marcelle Amorim Carvalho1, Miguel Trefault Rodrigues2, Caroline Garcia1 e Sérgio Siqueira1
4 1 Departamento de Ciências Biológicas, Laboratório de Citogenética, Universidade Estadual do Sudoeste da 5 Bahia. Jequié, BA, Brasil. 6 2 Departamento de Zoologia, Instituto de Biociências, Universidade de São Paulo. São Paulo, SP, Brasil.
7 RESUMO
8 Hylidae é uma das famílias mais numerosas dos anuros, representando no Brasil 40% da 9 diversidade dessa Ordem. Essa grande diversidade, somada a ampla distribuição desses 10 animais se reflete em conflitos taxonômicos e sistemáticos. Os hilídeos apresentam número 11 diplóide 2n=24 cromossomos, embora já tenham sido relatadas variações. Entre os Hypsiboas, 12 apenas 16% de suas espécies possuem dados citogenéticos, sendo a maioria resultado apenas 13 de coloração convencional. O presente trabalho analisa dados citogenéticos de diferentes 14 espécies e populações de Hypsiboas e discute a dinâmica evolutiva da macro e microestrura 15 cromossômica desses anfíbios. O número diplóide 2n=24 cromossomos é o mesmo nas 16 espécies analisadas, no entanto o grupo apresentou grande variabilidade na morfologia e 17 marcações cromossômicas. A existência de possíveis marcadores cromossômicos com 18 potencial citotaxônomico e a existência de uma possível relação filogeografica dos padrões 19 cromossômicos são discutidos.
20 Palavras-chave: Ag-RONs, bandamento C, cromossomos, evolução cariotípica, inversões 21 pericêntricas PPGGBC
22 ABSTRACT
23 Chromosomal Evolution Dynamics in the genus Hypsiboas (Anura: Hylidae)
24 Hylidae is one of the larger families of the anurans, representing in Brazil 40% of the 25 diversity of this order. This large diversity, added to the wide distribution of these animals is 26 reflected in taxonomic and systematic conflicts. The hylids present the diploid number of 52
1 2n=24 chromosomes, although variations have already been reported. Among the Hypsiboas, 2 only 16% of its species have cytogenetic data, and most only results from conventional 3 staining. This paper analyzes cytogenetic data of different species and Hypsiboas populations 4 and discusses the evolutionary dynamics of both, macro and micro chromosomal structure of 5 these amphibians. The diploid number 2n=24 chromosomes is the same in the analysed 6 species, however the group showed great variability in morphology and chromosomal 7 markers. The presence of possible chromosomal markers with cytotaxonomic potential and 8 the existence of a possible phylogeographic relationship of the chromosomal patterns are 9 discussed.
10 INTRODUÇÃO
11 Hylidae é reconhecida como uma das famílias mais numerosas da ordem Anura. 12 Representantes desse grupo de anfíbios, caracterizados principalmente pela presença de discos 13 adesivos nas bases dos dedos e hábitos arbóreos, podem ser encontrados por todos os 14 continentes do globo, com exceção do continente Antártico, sendo sua maior diversidade 15 relatada para a região Neotropical (Frost, 2012). 16 Os hilídeos totalizam 907 espécies e 47 gêneros (Amphibiaweb, 2012), comumente 17 subdivididos em três subfamílias (Faivovich et al., 2005, Wiens et al., 2010), dentre essas 18 destaca-se a subfamília Hylinae por ser a mais diversa, abrigando cerca de 650 espécies 19 (Frost, 2012). 20 Toda a diversidade de espécies de Hylinae, associada à sua ampla distribuição 21 geográfica refletem na existência de inúmeros conflitos taxonômicos e sistemáticos. Na 22 última década essa subfamília vem sendo foco de estudos filogenéticos que buscaram testar 23 seu monofiletismo e a validade do status taxonômico de seus representantes (Faivovich 24 et al., 2005; SalducciPPGGBC et al., 2005; Wiens et al., 2010). Um dos estudos pioneiros nessa 25 abordagem e que trouxe grandes modificações à taxonomia vigente para Hylinae foi realizado 26 por Faivovich et al. (2005), utilizando o sequenciamento de genes mitocondriais e nucleares 27 associado a dados morfológicos para 226 espécies de hilídeos. Com base neste trabalho 2/3 28 das espécies atribuídas ao gênero Hyla foram alocadas em outros 15 gêneros, sendo um desses 29 o gênero Hypsiboas. 30 Os representantes do gênero Hypsiboas são popularmente conhecidos como pererecas, 31 sapos martelo, sapos ferreiro, entre outros, e são bastante freqüentes nas regiões úmidas da 32 mata atlântica, floresta amazônica, caatinga e formações de cerrado, totalizando 86 espécies 53
1 (Amphibiaweb, 2012). Com base em dados genéticos, morfológicos, alguns dados 2 comportamentais e ecológicos os Hypsiboas estão alocados em sete grupos de espécies: H. 3 albopunctatus, H. benitizi, H. faber, H. pellucens, H. puchellus, H. punctatus e H. 4 semilineatus. 5 Estes grupos não embasados em sinapomorfias morfológicas são relevantes para a 6 definição de unidades monofiléticas, no entanto, algumas espécies têm caracteres que tornam 7 difícil alocá-las em qualquer um dos grupos atualmente reconhecidos (Faivovich et al., 2005). 8 Wiens et al. (2010), através de seqüenciamento gênico também reconheceu a existência 9 destes sete grupos monofiléticos entretanto, infere relações evolutivas entre os grupos, 10 ligeiramente diferentes das propostas por Faivovich et al. (2005). 11 Embora muitos esforços venham sendo empregados no entendimento das relações 12 sistemáticas do grupo, Hylidae permanece pouco estudada do ponto de vista citogenético. 13 Menos de 17% das espécies de Anura apresentam algum dado citogenético disponível, sendo 14 a maioria destes estudos restrita a caracterização da macroestrutura cariotípica utilizando 15 coloração convencional (King, 1990). 16 Durante muito tempo assumiu-se que os anfíbios constituíam um dos poucos grupos de 17 vertebrados que apresentavam cariótipos extremamente conservados. Entretanto, com o 18 emprego de técnicas de coloração diferencial e de citogenética molecular, descobriu-se uma 19 grande variabilidade na microestrutura cromossômica que permite uma melhor identificação 20 de espécies e suas variantes geográficas, constituindo uma importante ferramenta auxiliar em 21 estudos taxonômicos (Kasahara et al., 2003; Siqueira et al., 2004). 22 Os Hylidae, em sua maioria, apresentam número diplóide 2n=24 cromossomos, com 23 cariótipo constituído predominantemente por cromossomos de dois braços, enquanto 24 variações no número cromossômico têm sido consideradas apomorfias para o grupo (King, 25 1990; Catroli, 2008). 26 Com relaçãoPPGGBC ao gênero Hypsiboas, apenas 16% apresentam algum dado citogenético, 27 sendo a maioria dos trabalhos focada apenas na descrição do cariótipo de diferentes espécies e 28 sem importantes inferências sobre evolução cromossômica do grupo com base em marcadores 29 heterocromáticos ou RONs (Raber et al., 2004; Ananias et al., 2004; Gruber et al., 2006; 30 Nunes & Fagundes, 2008 a,b; Carvalho et al., 2009). 31 O presente trabalho teve como objetivo realizar uma análise citogenética de diferentes 32 espécies e/ou populações de Hypsiboas visando identificar possíveis marcadores 33 cromossômicos que auxiliem no melhor entendimento da dinâmica evolutiva da macro e 34 microestrura cromossômica desses anfíbios. 54
1 MATERIAIS E MÉTODOS
2 Foram analisados espécimes de H. crepitans, H. pombali e H. semilineatus provenientes 3 da Estação Ecológica Wenceslau Guimarães - EEWG (Wenceslau Guimarães/BA) e H. 4 atlanticus, proveniente de um fragmento de Mata Atlântica do município de Itacaré-BA (Fig. 5 3). Estes encontram-se depositados no Laboratório de Citogenética da UESB com devidos 6 números de tombo: 438, 439, L115, 22260, 22265, 22266, 22087 e 22088. 7 Para a preparação da suspensão de cromossomos mitóticos, utilizaram-se a raspagem do 8 epitélio intestinal, conforme protocolo descrito por King e Rofe, (1976) com modificações, ou 9 a dissociação do tecido hepático segundo protocolo de Garcia, ainda não publicado. 10 Para a determinação do número e morfologia dos cromossomos foi utilizada a coloração 11 convencional por Giemsa e o número de braços cromossômicos (NF) foi calculado segundo 12 Levan (1964). 13 Na elaboração dos idiogramas foram utilizados tanto os resultados obtidos nesse 14 trabalho, como os disponíveis em artigos da área. As figuras dos cariótipos foram 15 digitalizadas e submetidas à medição cromossômica no programa “Paquimetro” (Bressane e 16 Bressane, em preparação) tendo como base a proposta de Levan et al. (1964). As medidas 17 cromossômicas obtidas foram utilizadas para a construção de idiogramas através do programa 18 para cosntrução de idiogramas “Idiograma” (Bressane e Bressane, em preparação). A 19 padronização da classificação cromossômica se fez necessária para permitir uma melhor 20 comparação das fórmulas cariotípicas e da proporção de tamanho entre os cromossomos, uma 21 vez que muitos autores seguiram padrões de medidas cromossômicas diferenciados. 22 O bandamento C, deu-se segundo protocolo proposto por Sumner (1972) com 23 modificações; e para a detecção das regiões organizadoras de nucléolo utilizou-se a 24 impregnação por nitrato de prata, com pequenas alterações, segundo o Howell & Black 25 (1980). PPGGBC
26 RESULTADOS
27 Todas as espécies de Hypsiboas analisadas neste estudo apresentaram 2n=24 28 cromossomos e NF=48 com diferentes fórmulas cariotípicas (Fig. 4 - Tabela 4). 29 A impregnação por nitrato de prata permitiu evidenciar a ocorrência de RONs simples 30 localizadas intersticialmente nos braços longos do par cromossômico 7 para H. crepitans, H. 31 pombali e H. semilineatus, sendo que para H. pombali e H.semilineatus em todas as metáfases 55
1 analisadas apenas um dos homólogos evidenciou marcações Ag-RONs. Hypsiboas atlanticus, 2 apresentou RONs múltiplas localizadas terminalmente nos braços longos de dois pares de 3 cromossomos (10 e 12) (Fig 5 - boxes). 4 O bandamento C revelou a existência de blocos de heterocromatina constitutiva 5 adjacente aos centrômeros de todos os cromossomos de H. crepitans, H. semilineatus e H. 6 pombali e nos pares 1, 2, 3, 4 e 5 de H. atlanticus. Puderam ainda ser evidenciadas regiões 7 Banda C+ localizadas intersticialmente nos braços longos de seis pares de cromossomos de H. 8 atlanticus (1, 2, 3, 6, 7 e 8) e nos braços curtos do par 3 de H. crepitans. Blocos 9 heterocromáticos terminais foram observados apenas para H. atlanticus e mostraram-se 10 coincidentes com as RONs. Para as demais espécies analisadas não havia heterocromatina 11 associada à RON (Fig 5). 12 A associação dos dados obtidos nesse trabalho com os dados citogenéticos disponíveis 13 na literatura para espécies de Hypsiboas permitiu uma melhor comparação das fórmulas 14 cartiotípicas já evidenciadas para estes animais (Tabela 3). Após a padronização das medidas 15 cromossômicas (Tabela 4) foram identificados oito padrões de composição cromossômica, 16 muitos desses compartilhados por diferentes espécies (Tabela 4 e Figura 6). 17 Com relação à macroestrutura cariotípica, pode-se observar que os pares 18 cromossômicos 1 e 5, são os únicos que mantém morfologia constante (metacêntrico e 19 submetacêntrico, respectivamente) para todas as espécies estudadas. Dentre os demais pares 20 cromossômicos, os pares 2, 10, 11 e 12 mostram-se mais conservados, enquanto os demais 21 pares apresentaram uma maior variação morfológica devido ao posicionamento diferencial da 22 constrição primária (Tabela 4). 23 A comparação entre os padrões de distribuição de heterocromatina constitutiva e das 24 Ag-RONs permitiu evidenciar alguns marcadores cromossômico para H. albomarginatus 25 (RONs interstiticiais nos braços curtos do par 2), H. crepitans (bloco heterocromático 26 interstitical nos PPGGBC braços curtos do par 3) e espécies do grupo H. pulchellus (bloco 27 heterocromático terminal nos braços longos do par 1) (Fig. 5).
28 DISCUSSÃO
29 Dentre as 86 espécies reconhecidas para o gênero Hypsiboas, apenas 13 já foram 30 analisadas até o momento, incluindo os dados do presente trabalho, este número aumenta para 31 15. Todas as espécies apresentaram 2n=24 cromossomos e NF=48, com exceção de H. 32 albopunctatus com 2n=22 cromossomos (Tabela 3). A manutenção do número diplóide em 24 56
1 cromossomos é uma das principais características citogenéticas da família Hylidae, apesar de 2 números diplóides maiores ou menores já terem sido observados (2n=18 em Aplastodiscus 3 leucopygius até 2n=52 em Phyllomedusa tretraploidea) (Catroli, 2008). Acredita-se que o 4 cariótipo de todas, ou quase todas as espécies, com número diplóide menor ou igual a 24 5 cromossomos e pertencentes às famílias de anuros consideradas mais derivadas, como 6 Dendrobatidae, Hylidae, Leptodactilydae e Ranidae, tenham surgido por um evento de 7 redução a partir de um ancestral comum com 2n=26 cromossomos (Bogart, 1973), o que é 8 corroborado pela filogenia proposta por Faivovich et al. (2005), 9 Segundo Gruber et al. (2006) dois possíveis mecanismos poderiam estar envolvidos na 10 redução de número diplóide de H. albopunctatus, fusões em tandem ou translocações 11 envolvendo os pequenos cromossomos do cariótipo, o que poderia ter resultado também na 12 mudança na posição das RONs. Os autores também consideram a possibilidade de que a 13 ocorrência de um cromossomo supranumerário, observada apenas nessa espécie, represente 14 um vestígio de que, no passado, H. albopunctatus também tenha apresentado 2n=24 15 cromossomos. 16 Com relação à morfologia dos cromossomos, observa-se que há predomínio de 17 cromossomos de dois braços no cariótipo e que alguns pares cromossômicos apresentam uma 18 evolução mais dinâmica do que outros. Os pares 1 e 5 mantém morfologia e tamanho 19 conservados para todas as espécies/populações já estudadas, enquanto que os pares 3, 4, 6 e 7 20 variam mais sua morfologia com relação ao posicionamento do centrômero, podendo ser 21 metacêntricos, submetacêntricos ou subtelocêntricos (Tabela 4). Esse fato, associado à 22 manutenção do tamanho dos pares cromossômicos entre os cariótipos são um forte indício de 23 que as inversões pericêntricas seriam o principal mecanismo envolvido na diferenciação da 24 macroesturura cariotípica do grupo. 25 Ainda com relação macroestrurura cromossômica foi possível distribuir as espécies e/ou 26 populações já analisadasPPGGBC em oito grupos de acordo com sua fórmula cariotípica (o que 27 chamaremos de grupos cariotípicos) (Fig. 5 e Tabela 4). Pode-se ainda observar que estes 28 grupos cariotípicos não são compostos necessariamente por populações de uma mesma 29 espécie ou por espécies que pertençam aos mesmos grupos de espécie propostos por 30 Faivovitch et al. (2005) e Wiens et al. (2010). Para o grupo H. faber foram encontradas cinco 31 fórmulas cariotípicas (grupos cariotípicos 1, 2, 3, 5 e 6). O grupo H. semilineatus apresentou 32 dois cariótipos distintos (grupos cariotípicos 4 e 5), assim como o grupo H. pulchellus (grupos 33 cariotípicos 3 e 7). Os grupos H. albopunctatus e H. punctatus apresentaram apenas um 34 padrão cromossômico (grupos cariotípicos 2 e 8, respectivamente). Apesar do 57
1 compartilhamento de um mesmo padrão cariotípico entre as espécies de Hypsiboas, observa- 2 se que a microestrutura cromossômica é muito mais variável permitindo a diferenciação de 3 espécies e suas variantes geográficas. 4 De modo geral, as RONs são tidas como um importante marcador citogenético para o 5 estudo de anfíbios, isso porque, para maioria dos anuros, o número e a localização desses 6 sítios mostram-se conservados dentro das espécies estudadas (Lourenço et al., 1998). 7 Para as espécies e populações de Hypsiboas analisadas, o estudo das RONs demonstrou 8 uma grande variabilidade, onde a maioria das espécies apresentou RONs simples localizadas 9 intersticialmente nos braços longos de cromossomos médio/pequenos (pares 7, 10 e 11) 10 (presente estudo, Ananias et al., 2004; Gruber et al., 2006; Nunes & Fagundes, 2008a). Essa 11 variação não está restrita apenas à espécies diferentes, o que pôde ser observado nas duas 12 populações de H. crepitans (presente estudo; Gruber et al., 2006) e H. faber (Nunes & 13 Fagundes, 2008a; Carvalho et al., 2009) estudadas que diferiram com relação ao par 14 cromossômico nucleolar. Esses dados indicam que as RONs são marcadores cromossômicos 15 fracos para identificar as possíveis espécies do gênero e que outros marcadores devem ser 16 aplicados conjuntamente para que os dados apresentem potencial citotaxonômico. Entretanto, 17 em alguns casos, as RONs terminais e/ou RONs localizadas nos maiores cromossomos do 18 complemento (pares 1 e 2) mostraram-se conservadas e restritas a grupos específicos, 19 podendo ser consideradas, até o momento, marcadores cromossômicos espécie-específico 20 para H. albomarginatus e H. semiguttatus (Ananias et al., 2004; Nunes & Fagundes, 2008a). 21 O primeiro relato de RONs múltiplas para o gênero é descrito no presente estudo para 22 H. atlanticus, que apresentou marcações terminais discretas nos braços longos dos pares 10 e 23 12. De modo geral os anfíbios anuros apresentam RONs simples terminais (King et al., 1990), 24 entretanto para Hypsiboas, quando leva-se em conta as filogenias moleculares disponíveis 25 para o grupo, RONs simples intersticiais (Nunes & Fagundes, 2008a), podem ser 26 consideradas comoPPGGBC uma característica plesiomórfica, e condições variantes como apomorfias. 27 A variação de localização das RONs poderia ser mais facilmente explicada por 28 possíveis eventos de translocação ou transposição cromossômica, uma vez que há manutenção 29 do número e do tamanho cromossômico entre os diferentes cariótipos analisados. Esses 30 mesmos mecanismos também poderiam explicar o surgimento das RONs múltiplas em H. 31 altlanticus. Possivelmente a espécie ancestral possuía RONs terminais localizadas no par 32 cromossômico 10 e por translocação ou transposição, parte dos sítios de rDNA foram 33 transferidos para a região terminal do par 12, resultando no pequeno tamanho das marcações 34 evidenciadas pelo nitrato de prata nessa espécie. Eventos de transposição e/ou translocação 58
1 também são considerados como os possíveis mecanismos de dispersão de sítios ribossomais 2 45S em muitas espécies de anuros que apresentam RONs múltiplas (Schmid et al., 1995). 3 A aplicação da FISH com sondas de rDNA 45S foi realizada apenas para quatro 4 espécies de Hypsiboas (H. albomarginatus, H. faber, H. pardalis e H. semilineatus) 5 confirmando a existência de RONs simples para estas (Nunes & Fagundes, 2008a). 6 Ressaltamos aqui a importância da realização da técnica de FISH com genes ribossomais para 7 confirmar o numero e a localização dos sítios de rDNA 45S nas espécies estudadas nesse 8 trabalho, uma vez que para H. pombalis e H. semilineatus a prata só evidenciou um dos 9 homólogos do par nucleolar, o que poderia indicar uma ativação preferencial dos sítios 10 ribossomais durante a interfase precedente. Além disso, essa técnica também seria útil para 11 verificar a real existência de RONs múltiplas para H. atlanticus, pois existem relatos para 12 outros grupos animais de marcações inespecíficas obtidas pela impregnação por nitrato de 13 prata e que se mostraram coincidentes com blocos heterocromáticos de natureza ácida 14 (Sumner, 1990; Sánchez et al., 1995). 15 O padrão de distribuição de heterocromatina é uma das características mais utilizadas 16 para a diferenciação de espécies/populações dentre os anuros, sendo um dos marcadores 17 cromossômicos mais empregados em estudos citotaxonômicos, como observado por 18 Anderson (1991) em espécies de Hyla, em espécies de Telmatobufo (Formas et al., 2000) e 19 em Colostethus (Veiga-Menoncello et al., 2003). 20 Os poucos dados disponíveis para o gênero Hypsiboas mostram que a maioria das 21 espécies apresenta grande quantidade de heterocromatina pericentromérica distribuída por 22 todo o complemento cromossômico. Blocos BC+ interstiticiais são observados em apenas 23 alguns cromossomos de poucas espécies e blocos terminais são encontrados com menos 24 freqüência (Tabela 3 e Figura 5). Uma melhor comparação do padrão de distribuição da 25 heterocromatina entre populações fica dificultada, pois a maioria dos trabalhos disponível não 26 aplicou esta metodologia.PPGGBC 27 Tendo como base as relações evolutivas entre as espécies estudadas na filogenia 28 molecular de Faivovich et al. (2005) associadas aos dados reunidos na figura 2 e dados 29 disponíveis para espécies próximas, observa-se que cariótipos contendo apenas 30 heterocromatina constitutiva pericentromérica constituem uma característica plesiomórfica 31 para o grupo. Blocos heterocromáticos intersticiais ou terminais consistiriam em variações do 32 padrão ancestral. 33 Pode-se observar que as espécies de Hypsiboas que possuem heterocromatina em 34 posição intersticial/terminal apresentam uma diminuição na quantidade de heterocromatina 59
1 pericentromérica ou no tamanho desses blocos, como pode ser visto para H.albomarginatus, 2 H. albopunctatus, H. crepitans, H. raniceps e H atlanticus (Gruber et al., 2006, Carvalho et 3 al., 2009, presente trabalho). Esse fato poderia ser facilmente explicado como resultado de 4 eventos de inversões cromossômicas que resultariam na transferência dessas regiões ao longo 5 dos braços cromossômicos, reforçando que as inversões seriam o principal mecanismo de 6 evolução cariotípica em Hypsiboas. Essas inversões envolvendo blocos heterocromáticos 7 também poderiam explicar o fato de algumas espécies apresentarem RONs heterocromáticas, 8 enquanto a maioria apresenta RONs eucromáticas, possivelmente estas regiões tornaram-se 9 intercaladas ou associadas à heterocromatina após esses eventos de reorganização estrutural 10 dos cromossomos. 11 Com base nos padrões observados, nota-se que o bloco heterocromático intersticial 12 localizado nos braços curtos do par cromossômico 3 de H. crepitans apresenta um grande 13 potencial para ser considerado um marcador espécie específico, pois está presente apenas nas 14 populações dessa espécie, mesmo que essas apresentem diferenças que as caracterizem como 15 variantes geográficas. O mesmo ocorre para o bloco terminal localizado nos braços longos do 16 par cromossômico 1 das espécies pertencentes ao grupo H. pulchellus e o bloco terminal nos 17 braços curtos do par 6 de H. bischoffi (Fig. 4). 18 Seria de se esperar que populações de uma espécie ou espécies pertencentes a um 19 mesmo grupo taxonômico compartilhassem mais semelhanças com relação ao padrão de 20 distribuição de heterocromatina e/ou número e localização das RONs do que com outras 21 espécies, entretanto, com base nos dados reunidos na figura 2 e no local de origem das 22 populações analisadas pode-se inferir que a evolução da microestrutura cariotípica apresenta- 23 se fortemente associada com a distribuição geográfica desses animais. Por exemplo, as 24 espécies do presente estudo provenientes da Estação Ecológica de Wenceslau Guimarães, 25 apesar de diferirem com relação à fórmula cariotípica, apresentam o mesmo padrão de 26 Bandamento C e PPGGBC RONs, assim como ocorre para H. marginatus, H. semigutattus e H. aff. 27 semigutattus (Ananias et al., 2004) e H. bischoffi e H. guentheri (Ruber et al., 2004). Essa 28 possível relação entre a dinâmica evolutiva da microestrutura cromossômica e a localização 29 geográfica dessas espécies poderia ser resultado de características ambientais únicas que 30 favorecem uma organização cariotípica ótima, situação semelhante é proposta para variantes 31 geográficas de lagartos do gênero Tropidurus (Pellegrino et al., 1996) e para grupos de 32 peixes, como o gênero Leporinos (Galetti et al., 1981, 1984), entretanto, esta hipótese só 33 poderá ser confirmada com o aumento dos estudos citogenéticos no gênero. 60
1 Com base nos dados reunidos, o gênero Hypsiboas mostra-se um interessante material 2 para estudos de evolução cromossômica em anuros, uma vez que, mesmo com os poucos 3 trabalhos já desenvolvidos, nota-se uma acentuada variabilidade cariotípica para o grupo. A 4 presença de marcadores citotaxonômicos e possível relação filogeográfica da microestrutura 5 cariotípica só poderão ser confirmados com o aumento dos estudos de natureza cromossômica 6 para o gênero. Devido a complexidade taxonômica do grupo, estudos moleculares e 7 citogenéticos populacionais também mostram-se necessários para confirmar se há 8 diversidade críptica em algumas espécies, como, por exemplo, H. crepitans e H. faber, como 9 sugerido pelos dados apresentados.
10 AGRADECIMENTOS:
11 Os autores agradecem à equipe do Prof. Dr. Miguel T. Rodrigues pela coleta e 12 identificação dos animais. À Mauro Teixeira Júnior, pelas fotos dos exemplares analisados. 13 Ao Prof. Dr. Mirco Solé pela identificação dos exemplares de H. atlanticus. Aos 14 coordenadores da Estação Ecológica de Wenceslau Guimarães pelo auxílio durante as 15 expedições de campo. Este trabalho contou com o apoio financeiro da Fundação de Amparo à 16 Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB – processo BOL 1399/2010).
17 REFERÊNCIAS
18 AMPHIBIAWEB. 2012. Disponível em
1 CATROLI, G. F. 2008. Cariótipo se seis espécies de Bokermannohyla dos grupos de B. 2 circumdata e B. pseudopseudis (Anura, Hylidae). Dissertação apresentada ao Instituto 3 de Biociências da Universidade Estadual Paulista, UNESP, Campus de Rio Claro, para 4 a obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Biologia Celular e Molecular) 5 Rio Claro – SP. 6 FAIVOVICH, J.; HADDAD, C. F. B.; GARCIA, P. C. A.; FROST, D. R.; CAMPBELL, J.A. 7 & WHEELER, W. C. 2005. Systematic review of the frog family Hylidae, with special 8 reference to Hylinae: phylogenetic analysis and taxonomic revision. Bull. Am. Museum 9 Nat. Hist. 294:1-240. 10 FORMAS, J.R. & CUEVAS, C.C. 2000. Comparative cytogenetic analysis of the Chilean 11 leptodactylid frog genus Telmatobufo, with description of T. venustosus. P. Biol. Soc. 12 Wash. 113:890-899. 13 FROST, D.R. 2012 Amphibian Species of theWorld: An Online Reference, version 5.3. 14 Electronic database accessible at http://research.amnh.org/herpetology/amphibia 15 American Museum of Natural History, New York, USA. 16 GALETTI JUNIOR, P. M.; FORESTI, F.; BERTOLLO, L. A. C. & MOREIRA-FILHO, O. 17 1984. Characterization of eight species of Anostomidae fish on the basis of the 18 Nucleolar Organizing Regions. Caryologia (Firenze), v. 37, n. 4, p. 401-406. 19 GALETTI JUNIOR, P. M.; FORESTI, F.; BERTOLLO, L. A. C. & MOREIRA-FILHO, O. 20 1981. Karyotipic similarity in three genera (Leporinus, Leporellus and Schizodon) of the 21 family Anostomidae (Teleostei). Brazilian Journal of Genetics, v. IV, n. 1, p. 11-15. 22 GARCIA, C. Melhoria na metodologia da obtenção de cromossomos mitóticos em 23 representantes da herpetofauna. Em preparação. 24 GRUBER, S. L.; HADDAD, C. F. B, & KASAHARA, S. 2006. Chromosome banding in 25 three species of Hypsiboas (Hylidae,Hylinae), with special reference to a new case of B- 26 chromosomePPGGBC in anuran frogs and to the reduction of the diploid number of 2n = 24 to 27 2n=22 in the genus. Springer Science+Business Media B.V. 28 HOWELL, W. M. & BLACK, D. A. 1980.Controlled silver staining of nucleolar organizer 29 regions with a protective colloidal developer; a 1-step method. Experientia 36:1014- 30 1015. 31 KASAHARA, S.; ZAMPIERI, A. P. S.; GRUBER S.L. & HADDAD, C.F.B. 2003. 32 Comparative cytogenetic four tree frog species (Anura, Hylidae, Hylinae) from Brazil. 33 Cytogenet. Gen. res. 103:155-167. 62
1 KING, M. 1990. Amphibia. In John B, Gwent C (Eds) Animal Cytogenetics. Amphibia 4 2 Chordata 2. Gebruder Borntraeger, Berlin, pp. 1-241. 3 KING, M. & ROFE, R. 1976. Karyotype variation in the Australian gekko Phyllodactylus 4 marmoratus (Gray) (Gekkonidae: Reptilia). – Chromosoma 54: 75-87. 5 LEVAN, A.; FREDGA, K. & SANDBERG, A. A. 1964. Nomenclature for centromeric 6 position on chromosomes. Hereditas 52:201-220. 7 LOURENÇO, L. B.; RECCO-PIMENTEL, S. M. & CARDOSO, A. J. 1998. Polymorphism 8 of the nucleolus organizer regions (NORs) Physalaemus petersi (Amphibia, Anura, 9 leptodactylidae) detected by silver staining and fluorescent in situ hybridization. Chrom. 10 Res., 6:621-328. 11 NUNES, R. D. R. A. & FAGUNDES, V. 2008. Patterns of ribosomal DNA distribution in 12 hylid frogs from the Hypsiboas faber an H. semilineatus species groups. Genetics and 13 molecular biology, 31, 4, 982-987. 14 PELLEGRINO, K. C. M.; RODRIGUES, M. T. & YASSUDA, Y. Y. 1996. Comparative 15 cytogenetic studies of eleven species of the Tropidurus torquatus group (Sauria, 16 Tropiduridae) with banding patterns. Hereditas (Lund), Suécia, v. 125, p. 37-46. 17 RABER, S.C., CARVALHO, K.A., GARCIA, P.C., VINCIPROVA, G. & RECCO- 18 PIMENTEL, S.M. 2004. Chromosomal characterization of H. bischoffi and Hyla 19 guentheri (Anura, Hylidae). Phyllomedusa, 3: 43-49. 20 SALDUCCI, M. D.; MARTY, C.; FOUQUET, A. & GILLES, A. 2005. Phylogenetic 21 relationships and biodiversity in Hylids (Anura: Hylidae) from French Guiana. C R 22 Biol. 328 (10-11): 1009-1024. 23 SÁNCHEZ, A.; JIMENEZ, R.; BURGOS, M.; STITOU, S.; ZURITA, F. & DIAZ DE LA 24 GUARDIA, R. 1995. Cytogenetic peculiarities in the Algerian hedgehog: silver stains 25 not only NORs but also heterochromatic blocks. Heredity, vol. 75, p. 10-6. 26 SCHMID, M., FEICHTINGER,PPGGBC W., WEIMER, R., MAIS, C., BOLAÑOS, F. & LEÓN, P. 27 Chromosome banding in Amphibia XXI. Inversion polymorphism and multiple 28 nucleolus organizer regions in Agalychnis callidryas (Anura, Hylidae). Cytogenet. Cell 29 Genet. 69: 18-26, 1995. 30 SIQUEIRA, S.; ANANIAS, F. & RECCO-PIMENTEL, S.M. 2004. Cytogenetic analysis of 31 three species of Eleutherodactylus (Anura, Leptodactylidae) from southeastern Brazil. 32 Genet Mol Biol 27:363-372. 33 SUMNER, A.T. 1972. A simple technique for demonstrating centromeric heterocromatin. 34 Exp Cell 75:304-306. 63
1 SUMNER, A. T. 1990. Chromosome banding. Uniwin Hyman, Londres, UK. P.434. 2 WIENS, J. J.; KUCZYNSKI, C. A.; HUA, X. & MOEN, D. S. 2010. An expanded phylogeny 3 of treefrogs (Hylidae) based on nuclear and mitochondrial sequence data. Molecular 4 Phylogenetics and Evolution 55 871–882.
PPGGBC
Tabela 3 – Fórmulas cariotípicas descritas para espécies de Hypsiboas baseadas em trabalhos previamente publicados. Espécie 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Referências H. albomarginatus m m m sm sm sm sm sm sm m m m Nunes e Fagundes (2008) H. albomarginatus m m m sm sm sm m m m m m m Carvalho et al. (2009) H. albopunctatus m sm sm sm sm sm sm m sm m m * Gruber et al. (2006) H. atlanticus m sm st sm st st st sm m sm sm sm Presente trabalho H. bischoffi m m sm st sm st sm m sm sm m m Raber et al. (2004) H. crepitans m sm sm sm sm sm sm m sm m sm sm Gruber et al. (2006) H. crepitans m m sm st sm sm sm m m sm m m Presente trabalho H. faber m m sm sm sm sm sm m m m m m Carvalho et al. (2009) H. faber m m sm st sm st st sm m sm st m Nunes e Fagundes (2008) H. guentheri m m sm st sm st sm m sm sm m m Raber et al. (2004) H. marginatus m m sm st sm st sm m sm sm m m Ananias et al. (2004) H. pardalis m m sm st sm st sm sm m sm m m Nunes e Fagundes (2008) H. pombali m sm sm m sm sm sm m m m m m Presente trabalho H. raniceps m sm sm sm sm sm sm m sm m m sm Gruber et al. (2006) H. semiguttatus m m sm st sm st sm m sm sm m m Ananias et al. (2004) H. semilineatus m m st sm sm st st sm st m m m Nunes e Fagundes (2008) H. semilineatus m m st sm sm sm st st st m m m Presente trabalho H. sp aff semiguttatus m m sm st sm st sm m sm sm m m Ananias et al. (2004) Legenda: m = metacêntrico; sm = submetacêntrico; st = subtelocêtrico; * = dado ausente. PPGGBC
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Tabela 4 – Fórmulas cariotípicas descritas para espécies de Hypsiboas baseadas em trabalhos previamente publicados após padronização da medidas cromossômicas segundo Levan (1964).
Espécie 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Referências Grupo cariotípico 1 H. albomarginatus m m m sm sm sm m m m m m m Carvalho et al. (2009) H. albomarginatus m m m sm sm st m m m m m m Nunes e Fagundes (2008) Grupo cariotípico 2 H. albopunctatus m m sm st sm sm sm m sm m m - Gruber et al. (2006) H. crepitans m m sm st sm sm sm m m sm m m Gruber et al. (2006) H. crepitans m m sm st sm sm sm m sm m m m Presente trabalho H. raniceps m m sm st sm sm sm m sm m m m Gruber et al. (2006) Grupo cariotípico 3 H. bischoffi m m sm st sm st sm m m m m m Raber et al. (2004) H. guentheri m m sm st sm st sm m m m m m Raber et al. (2004) H. marginatus m m sm st sm st sm m m m m m Ananias et al. (2004) H. pardalis m m sm st sm st sm m m m m m Nunes e Fagundes (2008a) H. semiguttatus m m sm st sm st sm m m m m m Ananias et al. (2004) H. sp aff semiguttatus m m sm st sm st sm m m m m m Ananias et al. (2004) Grupo cariotípico 4 H. semilineatus m m st sm sm st sm sm sm m m m Nunes e Fagundes (2008a) H. semilineatus m m st sm sm st sm sm sm m m m Presente trabalho Grupo cariotípico 5 H. pombali m m sm m sm sm sm m m m m m Presente trabalho H. faber m m sm sm sm sm sm m m m m m Carvalho et al. (2009) Grupo cariotípico 6 H. faber m m sm st sm st st sm m m sm m Nunes e Fagundes (2008a) Grupo cariotípico 7 H. polytaenius m sm sm sm sm st sm m m m m m Nunes e Fagundes (2008b) Grupo cariotípico 8 H. atlanticus m m st st sm st m sm m sm sm sm Presente trabalho Legenda: m = metacêntrico; sm = submetacêntrico;PPGGBC st = subtelocêtrico.
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Tabela 5 – Resumo dos dados citogenéticos disponíveis para espécies de Hypsiboas. Espécie Grupo de Espécie Localidade 2n Fórmula Bandamento C Supranumerários RONs Referência cariotípica H. albomarginatus H. faber Anchieta e 24 m = 1, 2, 3, 10, 11, Técnica não empregada * BI 2p Nunes e Fagundes Cariacica/ES 12 (2008) sm = 4, 5, 7, 8, 9 st = 6 H. albomarginatus H. faber Bertioga, Mogi das 24 m = 1, 2, 3, 7, 8, 9, BP = todos os cromossomos * BI 2p Carvalho et al. (2009) Cruzes e 10, 11, 12 BI = 2p e 3p; 5q e 6q Picinguaba/SP sm = 4, 5, 6 RONs = eucromáticas H. albopunctatus H. albopunctatus Rio Claro/SP 22 m = 1, 8, 10, 11 BP = todos os cromossomos (1) m pequeno BT 8p Gruber et al. (2006) sm = 2, 3, 4, 5, 6, BI = 1q, 2q, 3q, 7q RONs = 7, 9 heterocromáticas S = parcialmente heterocromático H. atlanticus H. punctatus 24 m = 1, 9 BT 10q e 12q Presente estudo sm = 2, 4, 8,10,11,12 st = 3, 5, 6, 7 H. bischoffi H. pulchellus S. Francisco de 24 m = 1, 2, 8, 11, 12 BP = todos os cromossomos * BI 10q Raber et al. (2004) Paula/RS sm = 3, 5, 7, 9, 10 BT = 1q Rancho Queimado/RS st = 4, 6 BI = 10q 6 = braços curtos totalmente heterocromáticos RONs eucromáticas H. crepitans H. faber Piranhas/AL 24 m = 1, 8, 10 BP = maioria do complemento * BI 11q Gruber et al. (2006) sm = 2, 3, 4, 5, 6, BI = 3p 7, 9, 11, 12 RONs = heterocromáticas H. crepitans H. faber Estação Ecológica de 24 m = 1, 2, 8, 9, 11, BI 7q Presente estudo Wenceslau 12 Guimarães/BA sm = 3, 5, 6, 7, 10 st = 4 H. faber H. faber Pedra Azul/ ES 24 m = 1, 2, 9, 12 Técnica não empregada * BI 11q Nunes e Fagundes sm = 3, 5, 8, 10 (2008) st = 4, 6, 7, 11 H. faber H. faber Mogi das Cruzes e 24 m = 1, 2, 8, 9, 10 Técnica não empregada * BT 11q Carvalho et al. (2009) Picinguaba/SP 11, 12 sm = 3, 4, 5, 6, 7 H. guentheri H. pulchellus Terra de Areia/SC 24 m = 1, 2, 8, 11, 12 BP = todos os cromossomos * BI 10q Raber et al. (2004) sm = 3, 5, 7, 9, 10 BT = 1q PPGGBCst = 4, 6 BI = 10q RONs eucromáticas
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Espécie Grupo de Espécie Localidade 2n Fórmula Bandamento C Supranumerários RONs Referência cariotípica H. marginatus H. pulchellus S. Francisco de 24 m = 1, 2, 8, 11, 12 BP = todos os cromossomos * BI 10q Ananias et al. (2004) Paula/RS sm = 3, 5, 7, 9, 10 10q = totalmente st = 4, 6 heterocromáticos BT = 1q RONs = heterocromáticas H. p. joaquini H. pulchellus - 24 m = 1, 2, 8, 11, 12 BP = todos os cromossomos * BT 1p Ananias et al. (2004) sm = 3, 5, 7, 9, 10 10q = totalmente st = 4, 6 heterocromáticos BT = 1q RONs = eucromáticas H. pardalis H. faber Cariacica/ES 24 m = 1, 2, 9, 11, 12 Técnica não empregada * BT 11p Nunes e Fagundes sm = 3, 5, 7, 8, 10 (2008) st = 4, 6 H. pombalis H. semilineatus Estação Ecológica de m = 1, 4, 8, 9, 10, BI 7q Presente estudo Wenceslau 24 11, 12 Guimarães/BA sm = 2, 3, 5, 6, 7 H. raniceps H. albopunctatus Brasilândia/MS 24 m = 1, 8, 10, 11 BP = 11q * BT 11q Gruber et al. (2006) sm = 2, 3, 4, 5, 6, BI = 6,p e 7p 7, 9, 12 RONs = heterocromáticas H. semiguttatus H. pulchellus Carambá do Sul/SC 24 m = 1, 2, 8, 11, 12 BP = todos os cromossomos * BT 1 p Ananias et al. (2004) S. Francisco de sm = 3, 5, 7, 9, 10 10q = totalmente Paula/RS st = 4, 6 heterocromáticos Piraquara/PR BT = 1q RONs = eucromáticas H. semilineatus H. semilineatus Sta Teresa/ES 24 m = 1, 2, 10, 11, Técnica não empregada * BI 7q Nunes e Fagundes 12 (2008) sm = 4, 5, 8 st = 3, 6, 7, 9 H. semilineatus H. semilineatus Estação Ecológica de 24 m = BI 7q Presente estudo Wenceslau Guimarães/BA H. sp aff semiguttatus H. pulchellus Misiones/Argentina 24 m = 1, 2, 8, 11, 12 BP = todos os cromossomos * BT 1p Ananias et al. (2004) sm = 3, 5, 7, 9, 10 10q = totalmente st = 4, 6 heterocromáticos BT = 1q RONs = eucromáticas Legenda: m = metacêntrico; sm = submetacêntrico; st = subtelocêtrico; BP = banda pericentromérica; BT = banda terminal; BI = banda intersticial; q = braço longo; p = braço curto; * = dado ausente. PPGGBC
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a) b)
c) d)
Fig.3 Fotos dos indivíduos de Hypsiboas analisados no presente estudo: a) Hypsiboas atlanticus, b) Hypsiboas crepitans, c) Hypsiboas pombali, d) Hypsiboas semilineatus. (Fonte: a) Sérgio Siqueira Jr.; b, c d) Mauro Teixeira Jr.)
PPGGBC
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PPGGBC Fig. 4 Cariótipos submetidos a coloração convencional (1) e bandamento C (2) de: a) H. atlanticus; b) H. crepitans; c) H. pombali e d) H. semilineatus. Em destaque os cromossomos nucleolares submetidos à impregnação por nitrato de prata e bandamento C.
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Figura 5. Idiogramas das espécies de Hypsiboas analisadas citogeneticamente. A) H. albomarginatus (Carvalho, et al., 2009); B) H. albomarginatus (Nunes & Fagundes, 2008); C) H. albopunctatus (Gruber et al., 2006); D) H. crepitans (Gruber I et al., 2006); E) H. crepitans (Presente trabalho); F) H. raniceps (Gruber et al., 2006); G) H. bischoffi (Raber et al., 2004); H) H. guenteri (Raber et al., 2004); I) H. marginatus (Ananias et al., 2004); J) H. pardalis (Nunes & Fagundes 2008a); K) H. semiguttatus (Ananias et al., 2004); L) H. sp. aff semiguttatus (Ananias et al., 2004); M) H. semilineatus (Nunes & Fagundes, 2008a); N) H. semilineatus (Presente trabalho); O) H. pombali (Presente trabalho); P) H. faber PPGGBC(Carvalho et al., 2009); Q) H. faber (Nunes & Fagundes, 2008a); R) H. polytaenius (Nunes & Fagundes, 2008b); S) H. atlanticus (Presente trabalho). 1
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1 6 CONCLUSÕES GERAIS
2 A partir das análises citogenéticas em Phyllodytes, pode-se inferir que:
3 As semelhanças cariotípicas entre as três espécies são provavelmente resultado de uma 4 ancestralidade comum, e que as diferenças são resultantes do posicionamento do 5 centrômero, provavelmente devido à inversões pericêntricas;
6 A diminuição do número e do tamanho de blocos heterocromáticos em regiões 7 pericentroméricas, está possivelmente associada à presença de blocos banda C positiva 8 em regiões intersticiais e/ou terminais, sendo essas bandas resultantes de eventos de 9 inversão pericêntrica envolvendo os blocos proximais à região centromérica;
10 As RONs em P. melanomystax e P. luteolos apareceram no pares 7 e 8 respectivamente, 11 indicando uma provável homeologia desses pares, que apresentam a mesma morfologia 12 nessas duas espécies;
13 Mesmo ainda não tendo obtido resultados de Ag-RONs para P. tuberculosus, pode-se 14 supor que, devido a sua natureza heterocromática e das outras duas espécies estudadas, a 15 impregnação pelo nitrato de prata revele a RON coincidente com os blocos 16 heterocromáticos existentes na região terminal dos cromossomos do par 8, o qual também 17 mostra-se semelhante em morfologia ao par nucleolar das demais espécies em estudo.
18
19 Em se tratando do gênero Hypsiboas, observou-se que:
20 A manutenção do tamanho dos pares cromossômicos entre os cariótipos são um forte 21 indício de que as inversões pericêntricas seriam o principal mecanismo envolvido na 22 diferenciação PPGGBCda macroestrutura cariotípica do grupo; 23 Para espécies estudadas é possível distinguir oito grupos cariotípicos que não são 24 compostos necessariamente por populações de uma mesma espécie ou por espécies que 25 pertençam aos mesmos grupos taxonômicos de espécie;
26 Há a presença de marcadores citotaxonômicos e uma possível relação filogeográfica da 27 microestrutura dos cromossomos – contudo, ainda não se sabe se essa relação é uma 28 constante no gênero. Para confirmar tal fato faz-se necessário o estudo de outras espécies 29 e populações, além do emprego de técnicas moleculares e citogenéticas mais apuradas, 30 como hibridação in situ.
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1 O estudo mostra indícios de que as RONs são marcadores cromossômicos fracos para 2 identificar as espécies do gênero neste estudo, já que as duas populações de H. crepitans 3 e H. faber estudadas diferiram com relação ao par cromossômico nucleolar.
4 Levando-se em conta as filogenias moleculares disponíveis para o grupo, e que, de modo 5 geral os anfíbios anuros apresentam RONs simples terminais, as RONs simples 6 intersticiais em Hypsiboas podem ser consideradas como uma característica 7 plesiomórfica, e condições variantes como apomorfias.
8 A variação de localização das RONs poderia ser explicada por possíveis eventos de 9 translocação ou transposição cromossômica, uma vez que há manutenção do número e do 10 tamanho cromossômico entre os diferentes cariótipos analisados. Esses mesmos 11 mecanismos também poderiam explicar o surgimento das RONs múltiplas em H. 12 atlanticus.
13 Pode-se observar que as espécies de Hypsiboas que possuem heterocromatina em posição 14 intersticial/terminal apresentam uma diminuição na quantidade de heterocromatina 15 pericentromérica ou no tamanho desses blocos, o que poderia ser resultado de eventos de 16 inversões cromossômicas que resultariam na transferência dessas regiões ao longo dos 17 braços cromossômicos.
18 As inversões envolvendo blocos heterocromáticos também poderiam explicar o fato de 19 algumas espécies apresentarem RONs heterocromáticas, enquanto a maioria apresenta 20 RONs eucromáticas, possivelmente estas regiões tornaram-se intercaladas ou associadas 21 à heterocromatina após esses eventos de reorganização estrutural dos cromossomos.
22 Esses dados mostram-se capazes de contribuir para os estudos de evolução cromossômica 23 e citotaxonomia,PPGGBC podendo, inclusive, ser uma ferramenta útil em programas de 24 conservação.