Identifikation humaner Gallensteingene mittels komparativer Genetik

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Dr. med.

an der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig

eingereicht von: Sheila Rathgeber, geb. Mirzakhyl geboren am 08.05.1985 in Wesel angefertigt an der Universität Leipzig, Medizinische Fakultät Klinik und Poliklinik für Gastroenterologie und Rheumatologie Direktor: Prof. Dr. med. J. Mössner

Betreuer: Prof. Dr. rer. med. Peter Kovacs Co-Betreuer: PD Dr. med. Henning Wittenburg

Beschluss über die Verleihung des Doktorgrades vom: 20.11.2018

Bibliographische Beschreibung

Mirzakhyl, Sheila

Identifikation humaner Gallensteingene mittels komparativer Genetik

Universität Leipzig, Dissertation

94 S., 214 Lit., 7 Abb., 28 Tab.

Referat:

Die vorliegende Arbeit untersucht das individuelle Risiko der Entwicklung von Gallensteinen beim Menschen. Die Entstehung von Gallensteinen ist multifaktoriell, und das individuelle Risiko wird durch die Interaktionen von Umweltfaktoren und genetischen Risikofaktoren, so genannten LITH-Genen, bestimmt. Im Inzuchtmausmodell des Cholesterin-Gallensteinleidens wurden zuvor bereits eine Reihe muriner Lith-Gene identifiziert. Für den Menschen wurde jedoch bislang nur die D19H-Variante des ABCG8-Gens als humanes LITH-Gen bestätigt. Um weitere humane LITH-Gene zu identifizieren, führten wir eine genomweite Assoziationsstu- die (GWAS) zur Cholelithiasis in einer sorbischen Population durch. Das Studiendesign hatte zum Ziel, mithilfe der bereits validierten murinen Lith-Loci prädisponierende Genvarianten im humanen Genom zu identifizieren und in einer Kontrollkohorte zu replizieren. Für die komparative Analyse wurden Kandidatengene ausgewählt, die SNPs enthalten, welche in der GWAS eine Assoziation zu Gallensteinen aufweisen und sich in konkordanten murinen Genregionen befinden. Die potentiellen LITH-Gene wurden in einer zweiten unabhängigen Kontrollkohorte mit 184 Gallensteinträgern und 184 Kontrollpersonen weiter untersucht und unter Verwendung von repräsentativen SNPs mittels TaqMan-Methode genotypisiert. Damit konnten wir drei repräsentative SNPs bestätigen und die Gene GAD2 (rs3781117, p = 0,051), KLF3 (rs337623, p = 0,021) und PTPN11 (rs7953150, p = 0,048) als humane LITH-Gene identifizieren. Des Weiteren wurden im Rahmen der GWAS in der sorbischen Population signifikante Assoziationen zu Alter (p < 0,0001), Geschlecht, Body Mass Index (p < 0,0001) und Anzahl der Schwangerschaften (p = 0,001)bestätigt. In der in-silico-Analyse bezüglich einer funktionellen Konsequenz der SNPs konnten zwar keine statistisch signifikanten Zusammenhänge gezogen werden, jedoch wurden Risikoallele identifiziert, die zum individuellen Gesamtrisiko der Entwicklung von Gallensteinen beitragen. Die entsprechenden Schlüsselgene dieser Varianten könnten auf potentielle Moleküle für die innovative Prophylaxe, Diagnostik und Therapie des Gallensteinleidens bei genetisch prädisponierten Patienten hinweisen.

2 1 Einleitung ...... 7

1.1 Das Gallensteinleiden ...... 7 1.2 Pathogenese der Cholelithiasis ...... 8 1.3 Allgemeine Risikofaktoren ...... 9 1.4 Genetische Komponente ...... 10 1.4.1 Gallensteinleiden als oligogene Erkrankung ...... 11 1.4.2 Gallensteinleiden als komplexe polygene Erkrankung ...... 12 1.5 Kopplungsstudien ...... 12 1.5.1 Murine Kopplungsstudien ...... 13 1.5.2 Humane Kopplungsstudien ...... 18 1.6 Genetische Assoziationsstudien ...... 18 1.6.1 SNPs als genetische Variation ...... 18 1.6.2 Studiendesign ...... 19 1.6.3 ABCG5/8 ...... 20 1.7 Humane LITH-Gene ...... 22 1.8 Zielsetzung/Aufgabenstellung ...... 24

2 Material und Methoden...... 25

2.1 Studienaufbau ...... 25 2.1.1 Charakterisierung der Studienkollektive ...... 25 2.2 Genomweite Assoziationsstudie zur Identifizierung humaner LITH-Loci...... 26 2.3 Komparative Analyse ...... 27 2.3.1 Übertragung der Gallensteinkarte der Maus von cM in Mb ...... 27 2.3.2 Identifizierung der konkordanten humanen Regionen mit Ensembl.org ...... 27 2.3.3 Vergleich der konkordanten humanen Regionen mit den Ergebnissen der genomweiten Assoziationsstudie ...... 28 2.4 Selektion und Replikation der Kandidatengene in der Aachener Kohorte...... 28 2.4.1 Bestimmung von Tag-SNPs zur Replikation ...... 28 2.4.2 Genotypisierung der Tag-SNPs ...... 29 2.4.3 Statistische Analyse ...... 31 2.4.4 In-silico Analyse der funktionellen Konsequenzen der SNPs...... 31

3 Ergebnisse ...... 33

3.1 Studienaufbau...... 33 3.2 Studienpopulation ...... 34 3.2.1 Klinische Charakterisierung der Sorben...... 34 3.2.2 Anzahl der Schwangerschaften ...... 35 3.3 Komparative Analyse ...... 36 3.4 Assoziationsanalyse ...... 37 3.4.1 Selektion von Kandidatengenen und ihrer Tag-SNPs zur Replikation...... 37

3 3.4.2 Logistische Regressionsanalyse ...... 38 3.5 Post-hoc Power-Analyse ...... 44

4 Diskussion ...... 46

4.1 Zusammenfassung ...... 46 4.2 Multifaktorielle Genese der Cholelithiasis ...... 47 4.2.1 Geschlecht und Schwangerschaft...... 47 4.2.2 Alter ...... 48 4.2.3 Adipositas ...... 49 4.3 Kandidatengene ...... 50 4.3.1 GAD2 (Glutamat-Decarboxylase 2) ...... 50 4.3.2 KLF-3 (Krüppel-like-factor-3) ...... 51 4.3.3 PTPN11 (Protein-tyrosine phosphatase, non-receptor-type 11) ...... 51 4.4 Funktionelle Konsequenzen der SNPs ...... 53 4.4.1 rs3781117 ...... 53 4.4.2 rs337623...... 54 4.4.3 rs7953150 ...... 56 4.4.4 Zusammenfassung funktionelle Konsequenzen ...... 57 4.5 Limitationen ...... 58 4.6 Perspektive und klinische Relevanz ...... 59

5 Zusammenfassung ...... 62

6 Anlagen ...... 64

7 Literaturverzeichnis ...... 81

8 Selbständigkeitserklärung ...... 94

9 Lebenslauf ...... 96

10 Danksagung ...... 98

4 Abkürzungsverzeichnis

ABCB4 ATP binding cassette transporter subfamily B member 4 ABCB11 ATP binding cassette transporter subfamily B member 11 ABCG8 ATP binding cassette transporter subfamily G member 8 ABCG5 ATP binding cassette transporter subfamily G member 5 APOA1 Apolipoprotein A1 APOB Apolipoprotein B APOC1 Apolipoprotein C1 APOE Apolipoprotein E AR Androgenrezeptor ARDB3 ß3 adrenergic receptor ATP Adenosintriphosphat BMI Body-Mass-Index CA, USA Californien, United States of America CCK1R Cholezystokinin-1-Rezeptor CETP Cholesterinester-Transferprotein Chr Chromosom cM Centimorgan CST8 Cystatin 8 CYP7A1 Cytochrom P450 7A1 dbSNP ID Database-SNP, number of identification DNA Deoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ESR1 Östrogenrezeptor-1 ESR2 Östrogenrezeptor-2 F1 Nachkommen in erster Generation GABA gamma-Aminobuttersäure GAD2 Glutamat-Decarboxylase 2 GAD65 65kDa-Isoform der Glutamat-Decarboxylase GATA3 GATA Binding Protein 3 GBD1 Gallbladder Disease 1 GCKR Glucokinase (Hexokinase4) Regulator GS Gallensteine GWAS Genomweite Assoziationsstudie HapMap Project Haplotype-Map-Project HWE Hardy-Weinberg-Equilibrium HMG-CoA-Reduktase 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzym-A-Reduktase IDH2 Isocitrat Dehydrogenase 2 IL4R Interleukin-4-Rezeptor IZKF Interdisziplinäres Zentrum für Klinische Forschung kDa Kilodalton KLF3 Krüppel-like-Faktor 3 LD Linkage Disequilibrium

5 LOD-Score Logarithm of the Odds-Score LPAC-Syndrom low-phospholipid-associated cholelithiasis-Syndrome LRPAP1 LRP associated protein 1 M, Mb Megabasenpaare MAF Minor-Allel-Frequenz MDR3-Gen Multiple-Drug-Resistance-3-Gen MHz Megahertz Mit-Marker Mikrosatellitenmarker MUC1 Mucin 1 MUC2 Mucin 2 MUPCDH Mucin-like protocadherin N1 erste Rückkreuzungs-Generation NBFs nucleotide-binding-folds NID1 Nidogen 1 Nkx3 nk homeobox 3 NPC1L1 NPC1-Like 1 NR1H4 Farnesoid X Rezeptor OR Odds Ratio p-Wert probability value, Signifikanzniveau PCNXL2 Pecanex Homolog 2 PCR Polymerasekettenreaktion PDE4B Phosphodiesterase 4B PDE8A Phosphodiesterase 8A PPARg Peroxisom-Proliferator aktivierter Rezeptor gamma PTPN11 Protein-tyrosine phosphatase, non-receptor-type 11 QTL Quantitative Trait Locus r2 Korrelationskoeffizient Setd1b SET domain containing 1B Shp2 rezeptorfreie Protein-Tyrosin-Phosphatase 2 SLC10A2 Sodium-dependent bile acid transporter SLCO1B1 Solute carrier organic anion transporter family member 1B1 SNP Single Nucleotide Polymorphism, Einzelnukleotidpolymorphismus SULT2A1 Sulfotransferase family 2A member 1 Tag-SNP Tagging-SNP TAS Trait-associated SNP TLR1 Toll like Rezeptor 1 TM4SF4 Transmembrane 4L six family member 4 TMEM116 Transmembran-Protein 116 TMDs transmembrane domains TPCN2 Two pore segment Channel 2 TTC39B Tetratricopeptide repeat domain 39B UGT1A1 UDP glucuronosyl transferase 1A1 95%-CI 95%-Konfidenzintervall

6 1 Einleitung

1.1 Das Gallensteinleiden

Das Gallensteinleiden stellt mit einer Prävalenz von 15 – 20% eine sehr häufige Erkrankung in Deutschland dar, mit einem Frauenanteil von ca. 60% (AQUA – Institut, 2015). Im Rahmen des natürlichen Verlaufs dieser Erkrankung bleiben ca. 70 – 80% der Patienten beschwerdefrei und werden nur zufällig als Gallensteinträger identifiziert (Barbara, et al., 1987) (Angelico, Del Ben, Barbato, Conti, & Urbinati, 1997). Das jährliche Risiko, eine biliäre Symptomatik zu entwickeln, beträgt in den ersten 5 Jahren nach Diagnosestellung 4 – 6% (Friedmann, Raviola, & Fireman, 1989); ca. 25% der Gallensteinträger werden in den ersten 10 Jahren nach Diagnosestellung symptomatisch (Attili, De Santis, Capri, Repice, & Maselli, 1995). Die jährliche Inzidenz von biliären Komplikationen beträgt ca. 0,3 – 0,65%, und das Risiko, ein Gallenblasenkarzinom zu entwickeln, beträgt bei asymptomatischen Gallensteinträgern ca. 0,015% pro Jahr (Attili, De Santis, Capri, Repice, & Maselli, 1995). Das klinische Erscheinungsbild der Erkrankung ist vielgestaltig und kann sich als unkomplizierte aber schmerzhafte Gallenkolik oder als kompli- ziertes Gallensteinleiden, beispielsweise mit Cholezystitis, Cholangitis, biliärer Pankreatitis oder Gallensteinileus, manifestieren. Über 228.000 Patienten werden jährlich in Deutschland aufgrund von Gallensteinen stationär behandelt, mit steigender Tendenz (Statistisches Bundesamt, 2015). Im Rahmen der Anamnese und klinischen Untersuchung werden beim symptomatischen Gallensteinleiden charakteris- tische Symptome wie Schmerzen im Epigastrium oder rechten Oberbauch, ggf. mit Ausstrahlung in den Rücken oder die rechte Schulter, sowie begleitend oftmals Übelkeit und Erbrechen beschrieben (Lammert, et al., 2007). Die Beschwerdesymptomatik wird häufig durch einen steinbedingten, temporären Verschluss des Ductus cysticus mit daraus resultierendem Gallenstau und – bei Fortbestehen des Verschlusses – Entzündung der Gallenblase verursacht. Bei asymptomatischen Gallensteinen ist in aller Regel ein abwartendes Vorgehen gerechtfertigt. Die symptomatische Cholelithiasis hingegen stellt, den S 3-Leitlinien zur Diagnostik und Therapie von Gallensteinen entsprechend, eine Indikation zur operativen Therapie dar (Lammert, et al., 2007). So wurden allein in Deutschland im Jahr 2014 insgesamt 176.097 Gallenblasen operativ entfernt (AQUA – Institut, 2015). Bei klinischer Beschwerdefreiheit von mehr als 5 Jahren gilt der vormals symptomatische Patient erneut als asymptomatischer Gallensteinträger und eine Cholezystektomie ist nicht mehr indiziert (Lammert, et al., 2007). Trotz Verbesserung der chirurgischen Möglichkeiten durch die Einführung der laparoskopi- schen Cholezystektomie mit resultierender Verkürzung der stationären Verweildauer und Reduktion der postoperativen Komplikationen sind die krankheitsbedingten Kosten für das

7 deutsche Gesundheitssystem hoch. Eine konservative Therapie ist aufgrund der häufigen Therapieresistenz und hohen Rezidivraten langfristig der (laparoskopischen) Cholezystektomie unterlegen. Lediglich die cholesterinreichen und calciumfreien Gallensteine sind prinzipiell einer oralen litholytischen Therapie zugänglich (Portincasa, Di Ciaula , Bonfrate , & Wang, 2012).

1.2 Pathogenese der Cholelithiasis

Bei den Gallenblasensteinen unterscheidet man prinzipiell Cholesteringallensteine von den sehr viel selteneren Bilirubin- oder Pigmentgallensteinen. Die Galle ist eine wässrige Lösung, die Cholesterin, Phospholipide, Gallensalze und den Gallefarbstoff Bilirubin enthält (Mirzakhyl & Wittenburg, 2010). Das hydrophobe Cholesterin bildet mit den Phosholipiden eine Formation von wasserlöslichen Vesikeln und wird in dieser Form von der Leber sezerniert. Durch Hydroxylierung und oxidati- ver Verkürzung einer Seitenkette erfolgt in den Hepatozyten die Synthese von Gallensäuren aus Cholesterin, wobei die primären Gallensäuren Cholsäure und Chenodesoxycholsäure von be- sonderer Bedeutung sind. Die Aufnahme von Gallensäuren während ihres Transports in den Gallenwegen führt zu einer Stabilisierung der Vesikel in Form gemischter Mizellen. (Jüngst & Kullak-Ublick, 2007) Bei einem Überangebot an Cholesterinmolekülen wird die Aufnahmekapazität der gemischten Mizellen überschritten. Es resultiert eine Übersättigung der Galle mit Bildung von cholesterinreichen multilamellären Vesikeln, die in der Gallenblase auskristallisieren können. Diese Cholesterinmonohydratkristalle stellen die obligaten Vorstufen der Choleste- ringallensteine dar. (Jüngst & Kullak-Ublick, 2007) Eine weitere wesentliche Voraussetzung für die Formation von Cholesteringallensteinen ist eine verlängerte Verweildauer der Galle in der Gallenblase aufgrund einer Gallenblasenhypomotilität (Wang, Cohen, & Carey, 2009). Des Weiteren sezernieren die Gallenblasenepithelzellen Muzin- Glykoproteine, die ein Muzin-Gel bilden und somit die Ausfällung von Cholesterinmonohydrat- kristallen sowie deren Formation zu Cholesteringallensteinen fördern (Wang, Cohen, & Carey, 2009) (Jüngst & Kullak-Ublick, 2007). Pigmentsteine resultieren aus einer Störung des Bilirubinstoffwechsels. Durch Hämolyse, dem Abbau größerer Hämatome oder ineffektiver Erythropoese bei Vitamin B12- oder Folsäure- mangel (Aydogdu, Sari, Ulu, & Sevinc, 2001) entsteht Bilirubin als Abbauprodukt der Häm- Proteine (Jüngst & Kullak-Ublick, 2007). Es ist hydrophob und wird an Albumin gebunden zur Leber transportiert (indirektes Bilirubin). In den Hepatozyten wird das aufgenommene Bilirubin durch Konjugation mit Glucuronsäure enzymatisch in wasserlösliches Bilirubinmono- und diglucuronid, direktes Bilirubin, umgebaut (Bosma, Seppen, Goldhoorn, Bakker, Oude Elferink, & Chowdhury, 1994), welches nun aktiv in die Gallengänge sezerniert werden kann (Nies & 8 Keppler, 2007). Infolge Hydrolyse des konjugierten Bilirubins durch endogene β-Glucuronidasen entsteht wiederum unkonjugiertes Bilirubin, das ebenso wie freies Kalzium durch Mizellen in Lösung gehalten werden muss. Bei einem Ungleichgewicht mit Übersättigung der Galle in der Gallenblase fällt das Bilirubin als amorphes Kalziumsalz aus, eine Formation mit Muzingel als Nukleationsmatrix führt dann zur Entstehung von Bilirubingallensteinen. (Ostrow, 1984) Gallensalze werden größtenteils im terminalen Ileum resorbiert und dem enterohepatischen Kreislauf zugeführt. Nach einer Resektion oder bei einer Erkrankung dieses Darmabschnittes kommt es hier zu einer verminderten Aufnahme von Gallensalzen, die nun ins Kolon übertreten. Die Gallensäuren binden Calcium sowie unkonjugiertes Bilirubin und bringen Letzteres in Lösung. Es kann so ein induzierter enterohepatischer Kreislauf von Bilirubin resultieren, durch den vermehrt Bilirubin der Leber zugeführt und entsprechend eine höhere Konzentration von Bilirubin in die Galle sezerniert wird. Dieser Mechanismus erklärt u.a. die erhöhte Gallensteinprävalenz bei z.B. Morbus Crohn des terminalen Ileums. (Brink, et al., 1999) (Wittenburg H. , Gallensteine, 2008) Von den Cholesterin- und Bilirubingallensteinen wird eine dritte Form der Cholelithiasis unterschieden. Die Entstehung von sogenannten braunen Pigmentsteinen wird durch eine Kolonisierung der Gallengänge mit anaeroben Bakterien aufgrund einer biliären Obstruktion und/oder Stase unterschiedlicher Genese begünstigt (Kaufman, Magnuson, Lillemoe, Frasca, & Pitt, 1989). Die Bakterien produzieren ß-Glucuronidase und Phospholipase A1, so dass konjugiertes Bilirubin hydrolysiert und freie Fettsäuren von Phospholipiden abgespalten werden (Maki, 1966) (Siegenthaler & Blum, 2006) (Wu, Uchiyama, & Fan, 2007). Hauptbestand- teile der Pigmentsteine sind Calciumbilirubinat, Calciumsalze von Fettsäuren, Cholesterin und Muzin (Siegenthaler & Blum, 2006). Sie treten in aller Regel in den Gallengängen und nicht in der Gallenblase selbst auf. In den westlichen Ländern beträgt der Anteil der Cholesteringallensteine 90%. Die verbleiben- den 10% entfallen auf Pigmentsteine, die braune und schwarze Steine umfassen (Schafmeyer, et al., 2006).

1.3 Allgemeine Risikofaktoren

Zu wichtigen ursächlichen Faktoren und Determinanten, die das Auftreten einer Gallensteiner- krankung begünstigen, zählen neben dem weiblichen Geschlecht, Alter, einer unausgewogenen, fetthaltigen Ernährung, Schwangerschaft, diversen Erkrankungen, herabgesetzter Gallenblasen- motilität und einigen Medikamenten (Paigen & Carey, 2002) auch ein rascher Gewichtsverlust (Li, Pulido, Fajnwaks, Szomstein, & Rosenthal, 2009) (Liddle, Goldstein, & Saxton, 1989).

9 1.4 Genetische Komponente

Die Theorie von der Existenz einer genetischen Komponente der Cholelithiasis ist Gegenstand zahlreicher aktueller Studien, welche die Interaktionen zwischen Umweltfaktoren und genetischen Variationen untersuchen. Von diesbezüglich eben so großer Bedeutung sind die im Rahmen von Ultraschall-Screeninguntersuchungen beobachteten Unterschiede in der Gallenstein-Prävalenz in verschiedenen geographischen Regionen, die auf eine genetische Komponente hindeuten können (Kratzer, Mason, & Kachele, 1999). Ein potentieller Faktor für das gehäufte Auftreten von Cholesteringallensteinen in den Industrieländern im Vergleich zu Entwicklungsländern ist die so genannte „western diet“, eine Form der Lebens- und Ernährungsgewohnheiten mit chronisch erhöhter Kalorienaufnahme, insbesondere in Form von Fetten, Monosacchariden und/oder Cholesterin mit vermindertem Anteil an Ballaststoffen (Attili, Scafato, Marchioli, Marfisi, Festi, & The MICOL Group, 1998) (Lee, et al., 1985). Durch die u.a. resultierende Adipositas und verzögerte Darmpassage kann diese „lithogene Diät“ die Formation von Gallensteinen, vor allem bei einer Person mit entsprechender genetischer Prädisposition, begünstigen (Kesäniemi, Koskenvuo, Vuoristo, & Miettinen, 1989) (Stokes, Krawczyk, & Lammert, 2011). Auch weltweite Unterschiede in der Prävalenz, die neben der geographischen Variabilität auch auf Unterschiede zwischen ethnischen Gruppen hinweisen, unterstützen die Rolle der genetischen Faktoren. In Südwest-Arizona konnte bereits sehr früh eine Häufung der Cholelithiasis bei indianischen Stämmen festgestellt werden (Sievers & Marquis, 1962) (Carey & Paigen, 2002). Des Weiteren ergab eine umfassende Studie an Pima-Indianern eine stark erhöhte Gallenstein-Prävalenz ab einem Alter von bereits 20 Jahren mit starker Progredienz im Erwachsenenalter und einer maximalen Prävalenz von 80% bei Frauen und 70% bei Männern, unabhängig von den bekannten Risikofaktoren Adipositas, Diabetes mellitus und Zahl der Schwangerschaften (Carey & Paigen, 2002) (Sampliner, Bennett, Comess, Rose, & Burch, 1970). Neben geographischen Unterschieden und hoher Gallensteinprävalenz in speziellen Populationen gab es frühzeitig auch Berichte über die familiäre Häufung der Cholelithiasis (Carey & Paigen, 2002). Da Familienmitglieder aber möglicherweise ähnlichen Umweltfaktoren ausgesetzt sind, können Familienstudien ohne Korrektur hierfür eine genetische Komponente nicht beweisen. Eine Möglichkeit, die familiäre Prädisposition zu belegen, ist der Vergleich des gemeinsamen Auftretens (Konkordanz) von Gallensteinen bei eineiigen (monozygoten) und zweieiigen (dizygoten) Zwillingen. Monozygote Geschwister sind genetisch identisch und Zwillingspaare in der Regel vergleichbaren Umweltfaktoren ausgesetzt. Eine finnische Zwillingsstudie konnte bereits 1989 einen signifikanten Einfluss genetischer Faktoren auf die biliäre Cholesterinkonzentration, Gallensäurenzusammensetzung, Cholesterinsynthese, Cholesterinsättigung der Galle und Gallensteinformation belegen

10 (Kesäniemi, Koskenvuo, Vuoristo, & Miettinen, 1989). Die relative genetische Beteiligung an der Regulation der Serum-Cholesterinkonzentration wurde hierbei auf 25 % berechnet, wobei der Effekt von Umweltfaktoren, insbesondere die diätetische Fettzufuhr, den größten Einfluss auf die Konzentration besitzt (Kesäniemi, Koskenvuo, Vuoristo, & Miettinen, 1989). Eine wahrscheinliche genetische Beteiligung bei der Entwicklung von Gallensteinen wurde vor allem aber dadurch bestärkt, dass die monozygoten Zwillingspaare im Ergebnis eine 40%ige Konkordanz für das Gallensteinleiden und die dizygoten Paare eine komplette Diskordanz aufwiesen, obwohl durch die bewusste Selektion der monozygoten Paare identische Umweltfaktoren eindeutig ausgeschlossen wurden (Kesäniemi, Koskenvuo, Vuoristo, & Miettinen, 1989). Eine große schwedische Zwillingsstudie untersuchte das Zusammenwirken von Umweltfaktoren und genetischen Faktoren zur Entwicklung von symptomatischen Gallensteinen multifaktoriell, wobei 43.141 Zwillingspaare, geboren zwischen 1900 und 1958 und zu vergleichbaren Anteilen mono- und dizygot, in die Untersuchung eingeschlossen wurden. Es zeigte sich eine signifikant höhere Konkordanz für monozygote Zwillingspaare im Vergleich zu dizygoten Paaren mit einer Korrelation von 38 % im Vergleich zu 8 % (Katsika, Grjibovski, Einarsson, Lammert, Lichtenstein, & Marschall, 2005). Entsprechend resultierte eine Heritabilität des symptomati- schen Gallensteinleidens von 25 % (95 % CI, 9-40 %). Identische Umweltfaktoren tragen zu 13 % (95 % CI, 1-25 %) und individuelle Umweltfaktoren sogar zu 62 % (95 % CI, 56-68 %) zur Varianz des Phänotypen bei (Katsika, Grjibovski, Einarsson, Lammert, Lichtenstein, & Marschall, 2005). Eine weitere Assoziationsstudie von Nakeeb et al. mit über 1.000 Studienteilnehmern berechnete die additive genetische Heritabilität auf ca. 29%, mit Alter und Geschlecht als signifikante Kovariaten (Nakeeb, et al., 2002). Diese Daten bestätigen zusammengenommen einen genetischen Anteil am Risiko einer Cholelithiasis von ca. 30%.

1.4.1 Gallensteinleiden als oligogene Erkrankung

Mutationen einzelner Schlüsselgene im Sinne einer „oligogenen“ Erkrankung sind selten für die Cholelithiasis verantwortlich. Zur Pathogenese des Gallensteinleidens als oligogene Erkrankung gibt es entsprechend wenige humane Studien. Die Beschreibung von Rosmorduc et al. zu Mutationen in ABCB4 im Rahmen des LPAC-Syndroms (Low Phospholipid Associated Cholelithiasis Syndrome) ist jedoch wegweisend. Sie ist eine der ersten Untersuchungen, die diesbezüglich einen Gendefekt eindeutig als ursächlich für die Entstehung von Gallensteinen identifiziert hat (Rosmorduc & Poupon, 2007). Die nachgewiese- nen Mutationen in ABCB4 führen zu einer Funktionsstörung der Phosphatidylcholin-Flippase (ABCB4) mit resultierender verminderter Phospholipidkonzentration in der Galle und

11 entsprechend erhöhtem Cholesterin-Phospholipid-Quotienten (Rosmorduc, Hermelin, & Poupon, 2001). Klinisch zeichnet sich das LPAC-Syndrom durch Cholezystitis, Cholangitis und intrahepatische Gallensteine mit oder ohne akute Pankreatitis aus (Rosmorduc & Poupon, 2007). Ein weiteres Beispiel für eine monogene Form der Cholelithiasis ist die benigne rekurrierende intrahepatische Cholestase Typ 2, bei der Mutationen des Gallensäure-Transportergens ABCB11 in einem hohen Prozentsatz zur Ausbildung von Gallensteinen führen (van Mil, et al., 2004).

1.4.2 Gallensteinleiden als komplexe polygene Erkrankung

In der Mehrzahl der Fälle ist die Ätiopathogenese der Erkrankung multifaktoriell, wobei einer Interaktion zwischen Umweltfaktoren und zahlreichen lithogenen Genen mit geringen Effekten eine besondere Bedeutung zuerkannt wird (Lammert & Sauerbruch, 2005). Die potentiell ursächlichen Genvarianten kommen zwar häufig in der Bevölkerung vor, können aber aufgrund des geringen Effektes nur unzureichend identifiziert werden und sind durch unklare Genotyp- Phänotyp-Beziehungen ausgezeichnet. Die „common disease – common variant“ – Hypothese besagt, dass für Erkrankungen mit hoher Prävalenz in der Bevölkerung, wie das Gallensteinleiden, multiple, häufig vorkommende Polymorphismen verantwortlich sind. Trotz ihres eher moderaten Effekts als einzelne Variante können sie durch Interaktion untereinander und in Verbindung mit entsprechenden Umweltfaktoren zur Manifestation einer Erkrankung führen (polygenetische Determination) (Risch & Merikangas, 1996).

1.5 Kopplungsstudien

Sogenannte Kopplungsstudien basieren auf der Analyse von der Wahrscheinlichkeit der gemeinsamen Vererbung eines krankheitsprädisponierenden Gens und eines genetischen Markers in Familien. Sie werden besonders erfolgreich zur Identifizierung von ursächlichen Genen für monogene Krankheiten und wesentlichen Genen mit starken Effektgrößen bei komplexen Krankheiten verwendet. Für die Analyse können zwei verschiedene Ansätze genutzt werden. (Bickeböller & Fischer, 2007) In der genomweiten Analyse wird das komplette Genom im Rahmen eines hypothesenfreien Ansatzes anhand von engmaschig verteilten genetischen Markern auf prädisponierende Gene hin untersucht, ohne dass genauere Informationen über den Pathomechanismus vorliegen. Der zweite Ansatz bezeichnet die Untersuchung von Kandidatengenen. Kann anhand des funktionellen Zusammenhanges ein Gen als prädisponierendes Kandidatengen bestimmt

12 werden, wird das Gen auf seine Beteiligung an der Krankheit und eine Definition des vermuteten Vererbungsmodus untersucht. (Bickeböller & Fischer, 2007) Es besteht eine Kopplung zwischen zwei Genloci, wenn sie häufiger als erwartet gemeinsam vererbt und in der Population auf demselben Haplotypen beobachtet werden (Teare & Barrett, 2005). Die Wahrscheinlichkeit, dass zwei Genloci gemeinsam vererbt werden, korreliert mit ihrer Entfernung auf dem Chromosom. Benachbarte Genloci werden durch Rekombination seltener getrennt und entsprechend häufiger gemeinsam vererbt (Teare & Barrett, 2005). Mittels Kartierung von Genmarkern auf dem kompletten Genom kann durch die Identifizierung eines bereits bekannten Markers auf krankheitsprädisponierende Varianten in der unmittelbaren Nachbarschaft geschlossen werden. Entsprechend kann im Rahmen der Kopplungsanalyse durch Verarbeitung der genetischen Informationen von Verwandten auf eine gemeinsame Vererbung von chromosomalen Regionen und phänotypischen Merkmalen geschlossen werden (Kruglyak, Daly, Reeve-Daly, & Lander, 1996).

1.5.1 Murine Kopplungsstudien

1.5.1.1 Quantitative Trait Locus

Ein quantitatives phänotypisches Merkmal beschreibt eine Eigenschaft, die in Individuen in unterschiedlicher Erscheinung auftreten kann. Der Phänotyp ist häufig das Resultat von multiplen Geninteraktionen, Unterschieden in der Allelverteilung und darauf einfluss- nehmenden Umweltfaktoren bei zwei sich unterscheidenden Individuen. Somit entsteht ein Merkmal, das nicht spezifisch festgelegt ist, sondern ohne Abstufung auf einer kontinuierlichen Skala gemessen werden kann, wie z.B. die Körpergröße. Der Genabschnitt, welcher für die Ausprägung eines quantitativen phänotypischen Merkmals verantwortlich ist, wird als Quantitative Trait Locus (QTL) bezeichnet. Für die Grundlagenforschung und vergleichende Studien auf diesem Gebiet sollten die entsprechenden Umweltfaktoren, wie z. B. Lebensbedingungen und Ernährungsverhalten, komplett normiert und identisch sein, wie es zum Beispiel in einem Experiment in einem Mausmodell möglich ist. Nach derartig erfolgter Eliminierung externer, einflussnehmender Störfaktoren ist davon auszugehen, dass die individuelle Darstellung eines Phänotyps auf genetischer Variation beruht.

13 1.5.1.2 Die Gallensteinkarte der Maus

Anstatt genetische Untersuchungen direkt am Menschen durchzuführen, kann der genetische Hintergrund einer Erkrankung zunächst im Mausmodell untersucht werden, um die Ergebnisse dann basierend auf der engen genetischen Verwandtschaft zwischen Maus und Mensch auf humane Studien zu übertragen (Paigen K. , 1995). Hierfür ist jedoch ein geeignetes murines Modell der Erkrankung erforderlich. Bei einer vergleichenden Studie wurde einer Reihe von Inzuchtmausstämmen eine fettreiche, sog. lithogene Diät verabreicht, woraufhin eindeutige Unterschiede in der Prävalenz von Cholesteringallensteinen zwischen den Mausstämmen als Ausdruck einer differenten phänotypischen Ausprägung beobachtet wurden (Khanuja, et al., 1995). Da alle Tiere sehr ähnlichen Umweltbedingungen ausgesetzt waren, kann von einer genetischen Ursache dieser phänotypischen Unterschiede ausgegangen werden. Um die chromosomalen Regionen, welche die Gene mit den ursächlichen Genvarianten tragen, genauer lokalisieren und identifizieren zu können, wurden genetische Untersuchungen in Kreuzungen von Inzuchtmausstämmen durchgeführt, die sich hinsichtlich ihrer Gallensteinprävalenz unterschieden (Wittenburg H. , Lyons, Paigen, & Carey, 2003). Ein Mausstamm der Elterngeneration wies dabei eine Resistenz bezüglich der Entwicklung von Cholesteringallensteinen auf, der zweite Stamm hingegen eine deutlich höhere Prävalenz. Die Nachkommen (F1) wiederum wurden erneut mit dem gallensteinresistenten Elternstamm gekreuzt, so dass eine Rückkreuzungsgeneration (N1) entstand, welche eine Auswahl an Haplotypblöcken beider Elternstämme enthielt (Wittenburg H. , Lyons, Paigen, & Carey, 2003). Somit wies nur ein Teil der Nachkommen im Rahmen der Rekombination die lithogenen Allele auf (Wittenburg H. , Lyons, Paigen, & Carey, 2003). Nachfolgend wurde der Rückkreuzungsgeneration die lithogene Diät (1% Cholesterin, 0,5% Gallensäuren, 15% Fett) verabreicht, um die Entstehung einer Cholelithiasis zu provozieren. Entsprechend der Allelverteilung entwickelten die Nachkommen Gallensteine oder wiesen eine Resistenz gegenüber der Entwicklung von Gallensteinen unter der fettreichen Diät auf (Wittenburg H. , Lyons, Paigen, & Carey, 2003). Anschließend erfolgte eine systematische Genotypisierung von sogenannten Mit-Markern, die sich über das gesamte Genom der Nachkommen verteilen und zwischen den Elternstämmen aufgrund ihrer unterschiedlichen Suszeptibiliät differieren. Mithilfe von standardisierten Computerprogrammen wurde das individuelle Auftreten von Gallensteinen mit dem Genotyp in Verbindung gebracht und Genregionen identifiziert, welche eine Assoziation zu gesuchten Phänotypen aufwiesen (Wittenburg H. , Lyons, Paigen, & Carey, 2003). Als Indikator für die Assoziation des genetischen Markers zum untersuchten phänotypischen Merkmal wurde der sogenannte LOD-Score (logarithm of the odds) genutzt (Wittenburg H. , Lyons, Paigen, & Carey, 2003). Die erste bestätigte lithogene Region, die Lith 1 genannt wurde, ist auf dem Chromosom 2 des murinen 14 Genoms lokalisiert und wird durch die beiden Mit-Marker D2Mit11 und D2Mit66 definiert (Khanuja, et al., 1995). In der Folge wurden zahlreiche weitere QTL-Kreuzungen zwischen gallensteinempfänglichen und gallensteinresistenten Inzuchtmausstämmen durchgeführt, zunächst weitere Rückkreuzungen, dann F1 x F1 Kreuzungen, um auch rezessive Loci detektieren zu können. Als Resultat entstand die Gallensteinkarte der Maus, die einen Überblick über alle Cholesterin- Cholelithiasis assoziierten Genregionen auf dem murinen Genom gewährt . Die Genregionen mit der stärksten statistischen Signifikanz, sowie bestätigter Assoziation in einem kongenen Mausstamm wurden als Lith-Gene definiert. Bislang konnten 23 murine Lith-Gene auf fast allen Chromosomen identifiziert werden (Abbildung 1) (Lyons & Wittenburg, 2006).

15 Abbildung 1: Gallensteinkarte der Maus (Lyons & Wittenburg, 2006)

16 1.5.1.3 Syntenie

Das Prinzip der konservierten Syntenie beschreibt, dass definierte Bereiche in der DNA zweier verschiedener Arten, Gene in der gleichen Reihenfolge und in Blöcken beinhalten können. Dementsprechend können mehr als 90% des murinen und des humanen Genoms in syntene Bereiche angeordnet und ihre Gensequenzen miteinander verglichen werden. (Alberts, et al., 2012) Die Gendatenbank „The Ensembl Genome Browser“ fokussiert sich auf Vertebraten und umfasst die Informationen über das komplette Genom von ca. 50 verschiedenen Arten, unter anderem des Menschen, der Maus und des Zebrafisches (Herrero, et al., 2016). Durch graphische Darstellung der Chromosomen mit den entsprechenden syntenen Regionen der zu vergleichenden Spezies ist eine komparative Analyse des kompletten Genoms möglich. Im Folgenden (Abbildung 2) ist beispielhaft zentral im Bild das humane Chromosom 1, flankiert von murinen Chromosomen mit den enthaltenen syntenen Gen- regionen, dargestellt.

Humanes Chromosom 1: 933238 – 58547094 M

Mus_musculus Chr 1: 130.4M-174.4M Homo_sapiens Chr 1: 158.5M-207.4M

Abbildung 2: Humanes Chromosom 1 mit den syntenen Genabschnitten verteilt auf den jeweiligen murinen Chromosomen (Ensembl) (Herrero, et al., 2016)

Die farblich gekennzeichneten Genregionen des humanen Chromosoms 1 werden den murinen Chromosomenabschnitten in Blöcken zugeordnet. Auf diese Weise können die entsprechenden syntenen genetischen Abschnitte und ihre chromosomale Lokalisation identifiziert werden. Anhand der Gallensteinkarte der Maus können Kandidatengene in den syntenen humanen Genregionen bestimmt werden, dessen Assoziation zu dem gesuchten Phänotypen im Rahmen von weiterführenden Untersuchungen bestätigt werden muss (Lyons & Wittenburg, 2006). 17 1.5.2 Humane Kopplungsstudien

In der ersten genomweiten Kopplungsstudie zur Identifizierung humaner Gallenstein-Loci von Puppala et al. wurden Untersuchungen mit 715 Studienteilnehmern von insgesamt 39 mexikanisch-amerikanischen Familien durchgeführt. Für die Studie wurden eine Karte von genetischen Markern mit einem Abstand von ca. 10 Centimorgan (cM) und die Daten aus Ultraschalluntersuchungen zur Phänotypisierung der Probanden genutzt. Nach Berücksichti- gung der Kovariaten Geschlecht, Alter und Risikofaktoren des metabolischen Syndroms konnten zwei bedeutende prädisponierende Faktoren auf Chromosom 1p in der Nähe der Mit-Marker D1S1597 und D1S407 identifiziert werden. Diese beiden Loci weisen zudem eine Konkordanz zu dem bestätigten murinen Gallenstein-Gen Lith 8 auf, was entsprechend als weitere Bestätigung der Ergebnisse angesehen wurde. (Puppala, et al., 2006)

1.6 Genetische Assoziationsstudien

1.6.1 SNPs als genetische Variation

Das menschliche Genom enthält ca. 3 Mrd. Basenpaare (Manolio, Brooks, & Collins, 2008). Die phänotypische Vielfalt zwischen einzelnen Individuen resultiert aus genetischen Variationen innerhalb des Genoms, die u.a. durch Sequenzpolymorphismen zustande kommen. Die häufigste Art eines Sequenzpolymorphismus ist der sogenannte SNP („Single Nucleotide Polymorphism“) (Consortium, 2003). Er charakterisiert den Einzelnukleotidaustausch in der Gensequenz des Chromosoms und tritt in der Regel biallel auf. Demzufolge kann ein Individuum homozygot oder heterozygot für diesen Polymorphismus sein. Die SNP-Frequenz beträgt 1 auf 300 Basenpaare, so dass das humane Genom ca. 10 Mio. SNPs beinhaltet (Kruglyak & Nickerson, 2001). Polymorphismen treten mit einer Häufigkeit von ≥ 1% in der Bevölkerung auf und erklären über 90% der genetischen Varianten (Kruglyak & Nickerson, 2001). Jedes neue Allel, das auf der Basis einer Mutation entstanden ist, ist zunächst mit den benachbarten Allelen auf dem Chromosom assoziiert und wird auf dem Genabschnitt als Haplotyp gemeinsam weiter vererbt. Im Rahmen von Rekombination, die einen zufälligen Vorgang darstellt und die genetische Variabilität der entsprechenden Rasse definiert, kommt es nun zu einer Trennung der SNPs. Die Wahrscheinlichkeit, dass zwei SNPs gemeinsam vererbt werden, korreliert negativ zum Abstand auf dem jeweiligen Chromosom auf dem die beiden SNPs lokalisiert sind (Consortium, 2003). Demgegenüber ist die Wahrscheinlichkeit, dass sie durch Rekombination getrennt werden, umso höher, je größer der Abstand zwischen den beiden SNPs ist (Consortium, 2003). Das Kopplungsungleichgewicht (Linkage Disequilibrium, LD)

18 beschreibt hierbei die Wahrscheinlichkeit der gekoppelten Vererbung zweier Allele in einem gemeinsamen Haplotypblock in einer Population (Consortium, 2003). Diese Kopplung wird durch Rekombination im Rahmen der Meiose innerhalb von mehreren aufeinanderfolgenden Generationen schrittweise voneinander getrennt, vorzugsweise in sogenannten Hot-Spot- Regionen des Chromosoms (Manolio, Brooks, & Collins, 2008) (McVean, Myers, Hunt, Deloukas, Bentley, & Donnelly, 2004). Das Maß der Korrelation zwischen zwei SNPs wird durch den Maßstab r² festgelegt. Zwei SNPs stehen in einem perfekten LD zueinander, bei einem r² von 1.0, was bedeutet, dass sie stark miteinander korrelieren und immer zusammen beobachtet werden (Manolio, Brooks, & Collins, 2008). Rückschließend kann somit bei der Genotypisierung von SNP A auf den Genotyp von SNP B geschlossen werden, wenn es in einem hohen LD zum SNP A steht.

1.6.2 Studiendesign

Im Rahmen von Assoziationsstudien wird der Zusammenhang zwischen dem Genotyp einer genetischen Variante und dem Phänotyp einer Erkrankung analysiert (Bickeböller & Fischer, 2007). Eine Assoziation wird vermutet, wenn ein Polymorphismus überdurchschnittlich häufig mit einem phänotypischen Merkmal beobachtet wird. Hierfür bestehen verschiedene Studienansätze: Der sogenannte enge Kandidatengenansatz wird vor allem bei monogenen Krankheiten oder Mendelschen Subformen komplexer Erkrankungen verwendet. Hierbei werden wenige Gene und Marker untersucht, die z.B. zuvor durch Kopplungsanalysen selektioniert wurden oder im Rahmen von vorhergehenden funktionellen Tests oder in Tiermodellen eine Assoziation zu der untersuchten Erkrankung aufweisen. Der erweiterte Kandidatengenansatz überprüft Gene, welche aufgrund ihrer Funktion Einfluss auf die Pathophysiologie der untersuchten Erkrankung haben könnten. Zusätzlich werden genetische Marker in den genregulatorischen Bereichen untersucht, um funktionelle Einflüsse durch genetische Varianten in flankierenden Regionen auf die Kandidatengene zu entdecken. (Bickeböller & Fischer, 2007) Die Kopplungsanalyse weist Einschränkungen für die Untersuchung von komplexen Erkrankungen auf, da disponierende Gene mit geringem Effekt nicht ausreichend identifiziert werden können (Teare & Barrett, 2005). Mithilfe von eng verteilten Markern wird in einer genomweiten Assoziationsstudie (GWAS), ohne gezielte Untersuchung eines zuvor selektierten Gens oder einer Genregion, eine Assoziation mit der Erkrankung untersucht. Entsprechend ist diese Form der Assoziationsanalyse, im Gegensatz zum Kandidatengen-basierten Ansatz, hypothesenfrei und identifiziert ebenfalls Polymorphismen mit geringer Effektstärke. Falls eine statistisch relevante Assoziation zwischen einem Polymorphismus und der Erkrankung gefunden wird, ist entweder die Variante selbst kausal beteiligt, oder sie befindet sich im Kopplungsungleichgewicht mit einer bislang nicht identifizierten, disponierenden Variante.

19 (Bickeböller & Fischer, 2007) Genomweite Assoziationsstudien ermöglichen eine schnelle, kosteneffiziente Analyse und Identifizierung einer hohen Anzahl an genetischen Varianten sowie die Untersuchung ihrer Assoziation mit komplexen Merkmalen oder Erkrankungen. Die Genotypisierung der Probanden, die im Rahmen vorangegangener Untersuchungen exakt phänotypisiert wurden, erfolgt mit Hilfe von speziell entwickelten Gen-Chips. Die DNA-Microarrays bestehen aus tausenden Slots, die jeweils synthetische DNA-Sequenzen mit einem spezifischen SNP enthalten. Nach Hinzufügen der gereinigten humanen DNA, zusammen mit einer Lösung aus Oligonukleotiden und Enzymen, findet eine Hybridisierung auf dem Microarray statt, wobei ein stabiler Hybrid entsteht (Grimm, Blum, & Thimme, 2011). Je nach Homo- oder Heterozygotie des Probanden für den gesuchten SNP entsteht ein spezifisches Fluoreszenzmuster, das automatisiert ausgelesen und dokumentiert wird (Grimm, Blum, & Thimme, 2011). Die Allelfrequenz zwischen den Fällen und Kontrollen wird verglichen, eine signifikante Differenz im Auftreten von SNPs bei der erkrankten Population im Vergleich zur Kontrollkohorte wird als Assoziation mit der untersuchten Erkrankung gewertet (Need & Goldstein, 2010). Schlussfolgernd wird der neu entdeckte Polymorphismus als direkt ursächlich (direkt disponierend) für ein Erkrankungsrisi- ko oder als Marker für eine benachbarte genetische Variation gewertet (indirekt disponierend) (Need & Goldstein, 2010). Abschließend wird die Korrelation zwischen Genotyp und Phänotyp in einem sogenannten Manhattan Plot dargestellt (Grimm, Blum, & Thimme, 2011). Aufgrund der Assoziation zwischen einzelnen SNPs, basierend auf Haplotypblöcken und Kopplungsungleichgewicht, ist es möglich, Kandidatengen-basierte- und genomweite Assoziationsstudien weniger zeit- und kostenintensiv zu gestalten (Manolio, Brooks, & Collins, 2008). Durch die Genotypisierung repräsentativer SNPs (Tag-SNPs) können Informationen über benachbarte SNPs einer Genregion und somit deren spezifischen Haplotypblöcken gewonnen werden (Consortium, 2003). Die Zusammenstellung dieser Tag-SNPs mit präziser Darstellung ihrer Kopplung und die Entwicklung einer Karte mit engmaschig auf dem Genom verteilten Markern war die Zielsetzung des Internationalen HapMap Projektes (Consortium, 2003).

1.6.3 ABCG5/8

Eine der ersten humanen lithogenen Genregionen, die zunächst als Lith-Gen (Lith 9) auf dem Chromosom 17 bei der Maus identifiziert (Wittenburg H. , Lyons, Li, Churchill, Carey, & Paigen, 2003) und im Rahmen einer genomweiten Assoziationsstudie auch beim Menschen bestätigt wurde, ist die Genvariante D19H im Gen ABCG8 (Buch, et al., 2007). Die ATP-binding-cassette-Transporter bilden eine Gruppe von 7 Subfamilien, zu denen auch die ABCG-Familie gehört (Vasiliou, Vasiliou, & Nebert, 2009). Sie sind ein Beispiel für membran- ständige Transporter, die Bindung und Hydrolyse von ATP nutzen, um spezifische Substrate

20 aktiv über die Zellmembran zu transportieren (Rees, Johnson, & Lewinson, 2009). Die ABCG- Subfamilie besteht aus sechs „reverse“-Semi-Transportern, welche typischerweise eine NBF (nucleotide-binding-folds) am Amino-Ende und eine TMD (Transmembran-Domäne) am Carboxyl-Ende aufweisen (Dean, 2002). Die NBFs sind im Zytoplasma lokalisiert und nutzen die durch ATP-Hydrolyse gewonnene Energie, um das Substrat aktiv über die Membran zu transportieren (Dean, 2002). Die kodierenden Gene der beiden Transporter ABCG5 (Sterolin-1) und ABCG8 (Sterolin-2) sind auf dem Chromosom 2p21 in kurzem Abstand voneinander lokalisiert (Yu, Qian, Jiang, Zheng, Cayabyab, & Tang, 2013) und werden überwiegend in Enterozyten des Dünndarmes und Hepatozyten exprimiert (Repa, Berge, Pomajzl, Richardson, Hobbs, & Mangelsdorf, 2002). Beide Proteine fungieren nur als funktionsloser Semi-Transporter, wenn sie separat exprimiert werden. Eine Transportfunktion in der Plasmamembran können sie nur dann ausüben, wenn sie ein funktionstüchtiges Heterodimer bilden, dessen Funktion in der Einschränkung der intestinalen Absorption und Erleichterung der biliären Sekretion von Cholesterin und Phytosterolen besteht (Yu, Qian, Jiang, Zheng, Cayabyab, & Tang, 2013) (Graf, et al., 2002) (von Kampen, et al., 2013). Bei der autosomal-rezessiv vererbbaren Erkrankung Sitosterolämia bewirken Mutationen innerhalb der ABCG5/ABCG8 Gene einen Funktionsverlust des Heterodimers ABCG5/8, wodurch eine erhöhte Absorption und verminderte biliäre Sekretion von Sterolen resultiert (Berge, et al., 2000). Eine massive Resorptionssteigerung von pflanzlichen und neutralen Sterolen sowie Cholesterin mit bis zu 50-fach erhöhten Sitosterol-Plasmaspiegeln sind die Folge (Keller, von Eckardstein, & Hersberger, 2007). Zusätzlich konnte bei Sitosterolämie-Patienten eine verminderte HMG-CoA-Reduktase-Konzentration als Ausdruck einer verminderten Transkription mit entsprechend stark reduzierter Cholesterinsynthese und einer verminderten Cholesterinsekretion in die Galle nachgewiesen werden (Salen, Shefer, Nguyen, Ness, Tint, & Shore, 1992). Patienten mit dieser Erkrankung weisen nur selten Gallensteine auf, was auf die reduzierte biliäre Cholesterinsekretion im Verhältnis zu Gallensäuren und Phospholipiden zurückzuführen ist, und auf eine relative Resistenz hinweisen könnte (Salen, Shefer, Nguyen, Ness, Tint, & Shore, 1992). Nachdem bereits eine Assoziation von Unterschieden im Plasmalipidspiegel von Geschwister- paaren mit Gallensteinen und einer Variante in ABCG5/8 beschrieben wurde (Acalovschi, et al., 2006), konnte letztendlich eine genomweite Assoziationsstudie die Genvariante D19H im ABCG8-Gen als humanen genetischen Risikofaktor für die Entstehung von Gallensteinen identifizieren (Buch, et al., 2007). Zeitgleich wurde diese Schlussfolgerung durch eine Kandidatengen-basierte Linkage- und Assoziationsstudie bestätigt (Grünhage, et al., 2007). Im Rahmen einer umfangreichen Studie mit insgesamt 4381 Gallensteinträgern und 3765 Kontrollen aus Deutschland, Chile, Dänemark, Indien und China konnte eine Assoziation des SNPs rs11887534 (ABCG8-D19H) mit einer allelspezifischen erhöhten Effizienz des 21 Cholesterintransports durch den heterodimeren ABCG5/8-Transporter als Pathomechanismus der Entstehung von Cholesteringallensteinen identifiziert werden (von Kampen, et al., 2013). Damit konnte erstmalig belegt werden, dass die Genvariante zu einer biliären Cholesterinhyper- sekretion und somit zur Cholesterinübersättigung der Galle mit resultierender Prädisposition für eine Gallensteinbildung führt (von Kampen, et al., 2013).

1.7 Humane LITH-Gene

Bis dato wurden Polymorphismen in 25 Genen identifiziert, die eine Assoziation zu Cholesterin- Gallensteinen aufweisen. Ein Großteil davon wurde im Rahmen von Assoziationsstudien identifiziert, wobei einige auch in unabhängigen Studienkollektiven repliziert werden konnten. In der folgenden tabellarischen Zusammenfassung (Tabelle 1) sind die mit den oben genannten Strategien bislang identifizierten Genvarianten aufgeführt.

Poly- Studien- Gen Gensymbol Population Studie morphismus design ATP binding (Rosmorduc, ABCB4 cassette Multiple Frankreich AS Hermelin, & (GBD1) transporter B4 Poupon, 2001) ATB binding (van Mil, et al., cassette ABCB11 Multiple Holland AS 2004) transporter B11 (Buch, et al., rs11887534 GWAS 2007) ATP binding (Wang, et al., cassette ABCG8/ rs4148217 China AS 2007) transporter ABCG5 (Kuo, Shin, Chen, G5/G8 rs6720173 China AS Yang, Yang, & Hsiao, 2008) (Klass, Lauer, Hay, Kratzer, & rs4944 Deutschland AS Fuchs, 2007) ß3 adrenergic ARDB3 receptor (Srivastava, 190 T.C Indien AS Mishra, Singh, Rai, Srivastava, & Mittal, 2013) (Dixit M. , Apolipoprotein Choudhuri, APOA1 -75G>A, RFLP Indien AS A1 Saxena, & Mittal, 2007) c.2488C>T, (Han, Jiang, Suo, Apolipoprotein B APOB China AS c.4154G>A & Zhang, 2000) (Dixit, Apolipoprotein C1 APOC1 RFLP Indien AS Choudhuri, & Mittal, 2006) Apolipoprotein E APOE e4 Spanien AS (Bertomeu, et

22 al., 1996) Androgen- Griechen- (Kitsiou-Tzeli, et AR c.172(CAG)n AS rezeptor land al., 2007) (Srivastava, Cholezystokinin 1 Pandey, Dixit, CCK1R A1A1 Indien AS Rezeptor Choudhuri, & Mittal, 2008) (Juvonen, Savolainen, Kairaluoma, Cholesterin-ester CETP TaqIB Finnland AS Lajunen, Transfer-protein Humphries, & Kesäniemi, 1995) Promotor China AS (Jiang, et al., SNP-204A>C’ 2004) Cytochrom P450 CYP7A1 GWAS- 7A1 rs6471717 Meta- (Joshi, et al., analyse 2016) (Srivastava, IVS1-397C.T Östrogen- Mishra, Singh, ESR1 Indien AS rezeptor 1 IVS1-351A.G Rai, Srivastava, & Mittal, 2013) Östrogen- c.1092+3607 Griechen- (Kitsiou-Tzeli, et ESR2 AS rezeptor 2 (CA)n land al., 2007) Glukokinase Europa, (Rodriguez, et (Hexokinase 4) GCKR rs1260326 AS Frauen al., 2016) Regulator (Dixit, LRP associated LRPAP1 rs11267919 Indien AS Choudhuri, & protein 1 Mittal, 2006) China, (Chuang, et al., Mucin 1 MUC1 rs4072037 AS Männer 2011) China, (Chuang, et al., Mucin 2 MUC2 rs7396030 AS Männer 2011) (Chuang, Hsi, Mucin-like China, MUPCDH rs3758650 AS Wang, Yu, Lee, & protocadherin Männer Juo, 2011) (Lauridsen, rs17655652 Stender, Frikke- Schmidt, NPC1-Like 1 NPC1L1 Dänemark AS Nordestgaard, & rs2072183 Tybjaerg- Hansen, 2015) 20647T>G, Farnesoid X (Kovacs, et al., NR1H4 1G>T und Mexiko AS Rezeptor 2008) IVS7 31A>T Sodium- (Renner, et al., dependent bile SLC10A2 rs9514089 Deutschland AS 2009) acid transporter

23 Solute carrier (Srivastava, organic anion Srivastava, transporter SLCO1B1 rs11045819 Indien AS Srivastava, family, member Choudhuri, & 1B1 Mittal, 2011) Sulfotrans-ferase GWAS- (Joshi, et al., family 2A SULT2A1 rs2547231 Meta- 2016) member 1 analyse Trans-membrane GWAS- (Joshi, et al., 4L six family TM4SF4 rs9843304 Meta- 2016) member 4 analyse Tetratrico- rs686030:C> Europa, (Rodriguez, et peptide repeat TTC39B AS A Frauen al., 2016) domain 39B UDP glucuronosyl (Buch, et al., UGT1A1 rs6742078 Deutschland AS transferase 1A1 2010) Tabelle 1: Auflistung der bislang identifizierten humanen LITH-Gene; (Marschall, Katsika, Rudling, & Einarsson, 2010) (Lammert & Miquel, 2008), AS: Assoziationsstudie

1.8 Zielsetzung/Aufgabenstellung

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung von Prädiktoren und Identifizierung von genetischen Risikofaktoren, die das Gallensteinrisiko des Menschen beeinflussen. Die Gallensteinträger in einer sorbischen Population wurden durch eine Abdomensonographie oder der Anamnese einer Cholezystektomie aufgrund einer Cholezystolithiasis identifiziert. Durch eine genomweite Assoziationsstudie wurden Polymorphismen identifiziert, die eine signifikante Assoziation aufweisen. Basierend auf der Konkordanz zwischen dem murinen und dem menschlichen Genom, wurden die plausibelsten Varianten aus beiden Spezies in einer unabhängigen Kohorte repliziert.

24 2 Material und Methoden

2.1 Studienaufbau

2.1.1 Charakterisierung der Studienkollektive

2.1.1.1 Die Sorben

Zur Identifizierung von SNPs, die mit der Cholelithiasis assoziiert sind, wurde eine genomweite Assoziationsstudie in einer sorbischen Population in der Oberlausitz durchgeführt. Die katholischen Sorben sind eine Bevölkerungsgruppe in Sachsen, die sich eine kulturelle und sprachliche Eigenständigkeit in den umliegenden deutschsprachigen Regionen bewahrt hat. Entsprechend befinden sich ca. 15.000 sorbisch sprechende Einwohner in den Dörfern der Lausitz, die aufgrund ihrer seit ca. 1000 Jahren bestehenden Abgeschiedenheit mit homogenen Umweltfaktoren und weitestgehend fehlender Migration eine eingeschränkte genetische Heterogenität vermuten lassen (Gross, et al., 2011) (Veeramah, et al., 2011). Allerdings ergaben Untersuchungen zu dem Ausmaß der genetischen Isolation der Sorben als Bevölkerungsgruppe nur geringe Unterschiede zu der nicht-isolierten europäischen Bevölkerung, was sie als moderat isoliert gelten lässt (Veeramah, et al., 2011). Dies kann unter anderem auf die jüngst zurückliegende Gründung der Bevölkerungsgruppe (9. Jahrhundert) und eine lediglich relative Abgeschiedenheit aufgrund von sprachlichen und religiösen Unterschieden ohne topographi- sche Isolation zurückgeführt werden (Veeramah, et al., 2011). Insgesamt wurden 932 Sorben in die Studie einbezogen, 176 Gallensteinträger und 756 Kontroll-Probanden ohne Nachweis von Sludge oder Gallensteinen in der Ultraschall- untersuchung. Die Gallensteinträger wurden bei sonographischem Nachweis von Konkrementen in der Gallenblase oder infolge einer anamnestisch angegebenen Cholezystektomie bei symptomatischer Cholezystolithiasis identifiziert. Die abdominelle Ultraschalluntersuchung zur Phänotypisierung des jeweiligen Probanden erfolgte mittels einer 3,5 MHz Ultraschallsonde durch einen erfahrenen Untersucher. Von allen Probanden erfolgte die Entnahme von Vollblut in einem EDTA-Blutröhrchen zur laborchemischen Untersuchung und Extrahierung der DNA. Des Weiteren wurden der Nüchtern- Blutzuckerwert gemessen, u.a. ein oraler Glucosetoleranztest durchgeführt und anthropo- metrische Daten erhoben. Alle Teilnehmer der Studie haben vor Beginn der Untersuchung einen standardisierten Anamnesebogen ausgefüllt und eine schriftliche Einverständniserklärung abgegeben. Die Durchführung der Studie wurde durch die Ethik-Kommission an der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig genehmigt.

25 2.1.1.2 Die Aachener Replikations-Kohorte

Die Replikationskohorte besteht aus 368 Probanden, die in der Klinik für Innere Medizin, Medizinische Klinik III, und der Klinik für Chirurgie am Universitätsklinikum Aachen erfasst und untersucht wurden. Nach stationärer Aufnahme in der gastroenterologischen Abteilung der Klinik für Innere Medizin wurden entsprechende laborchemische Parameter und der Gallensteinstatus bestimmt. Patienten mit Statinen in der täglichen Medikation oder bekannter familiärer Hypercholesterinämie wurden von den weiteren Untersuchungen ausgeschlossen. Drei erfahrene Untersucher führten eine sonographische Untersuchung des Abdomens unter Verwendung eines 3,5 Mhz Schallkopfs bei den Probanden durch. Bei einem Nachweis von Sludge oder Gallensteinen in der Gallenblase oder einer positiven Anamnese auf eine stattgehabte Cholezystektomie aufgrund einer Cholelithiasis wurde der Proband als Gallensteinträger gewertet. Chirurgischerseits wurden Patienten mit elektiver laparoskopischer Cholezystektomie in die Studie aufgenommen. Die Patienten wurden nach Alter, Geschlecht und BMI gematcht und in zwei gleich große Gruppen von Gallensteinträgern und Kontrollen aufgeteilt. Entsprechend beinhaltet die Kohorte 184 Gallensteinträger und 184 Kontroll- probanden, mit einem Altersmedian von 64 Jahren (30 – 89 Jahren), davon 162 männliche und 206 weibliche Teilnehmer. Alle Teilnehmer der Studie haben vor Beginn der Untersuchung eine schriftliche Einverständniserklärung abgegeben. Die Durchführung der Studie wurde durch die zuständige Ethik-Kommission genehmigt. (Mella, et al., 2007)

2.2 Genomweite Assoziationsstudie zur Identifizierung humaner LITH-Loci

Nach erfolgter Blutentnahme der sorbischen Probanden wurde die genomische DNA mittels QIAmp DNA Blood Midi Kit (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA) entsprechend der Herstelleranleitung extrahiert und für die Genotypisierung vorbereitet. Für die Durchführung der Genotypisierung durch die „Core Unit DNA-Technologien“ des Interdisziplinären Zentrums für Klinische Forschung (IZKF, Universität Leipzig) und ATLAS Biolabs GmbH, Berlin, wurden zwei SNP Arrays verwendet: GeneChip Human Mapping 500K Array Set (Affymetrix, Inc.), sowie Genome- Wide Human SNP Array 6.0 (Affymetrix, Inc.). Es wurden eine Qualitätskontrolle durchgeführt und SNPs selektiert, welche folgende Kriterien erfüllten: missing rate per SNP < 5%, Hardy- Weinberg-Equilibrium (HWE) p>0,0001 und minor allele frequency (MAF) > 0,01. Nach erfolgreichem Bestehen der Kontrolle wurden insgesamt 390.619 SNPs der beiden Genchips für die weiteren Untersuchungen ausgewählt. (Tönjes, et al., 2010) Erstellt wurde eine Tabelle mit 417 SNPs, welche eine Assoziation zur Cholelithiasis mit einem p-Wert von < 0.0001 aufwiesen und die entsprechende chromosomale Lokalisation des SNPs einschließlich des dort befindlichen Gens mit entsprechender Genregion zugeordnet.

26 2.3 Komparative Analyse

2.3.1 Übertragung der Gallensteinkarte der Maus von cM in Mb

Um die im Rahmen der genomweiten Assoziationsstudie identifizierten SNPs für weiterführende Untersuchungen einzugrenzen wurden SNPs selektiert, die sich in einer konkordanten Region zu Gallensteinregionen des Mausmodells befanden. Zunächst erfolgte die Auflistung aller validierten murinen Lith-QTLs mithilfe der publizierten von Lyons et al. (Lyons & Wittenburg, 2006). Hierzu erfolgte die tabellarische Erfassung der QTLs sowie Lith-Gene mit dem entsprechenden Chromosom, den gekreuzten elterlichen Mausstämmen mit Hinweis auf den gallensteinempfänglichen Stamm, den Peaks der QTL-Lokalisation und dem jeweiligen Konfidenzintervall der Region. Die murine QTL-Analyse beruht auf einer genetischen Kopplungsanalyse. Entsprechend ist die Lokalisation der Genregionen in der Maßeinheit centiMorgan angegeben, welche die Rekombinationsfrequenzen zweier Genloci bezeichnet. Da die genetische Lokalisation nicht direkt in eine physikalische Entfernung übertragen werden kann, wurden zur Kartierung der Lith-QTLs Mikrosatellitenmarker genutzt, die in ihrer jeweiligen chromosomalen Position genau definiert und entsprechend als genetische Marker geeignet sind. Mithilfe der Mouse Genome Informatics Database (Update 10/9/2008, MGI_4.12) erfolgte die gezielte Identifizierung der Konfidenzintervalle der einzelnen murinen QTLs durch die Lokalisation der Mikrosatelliten- marker (Eppig, Blake, Bult, Kadin, Richardson, & Mouse Genome Database Group, 2015). Somit konnten die Genregionen in Megabasenpaaren übertragen werden, so dass eine vergleichende Untersuchung mit dem humanen Genom möglich wurde.

2.3.2 Identifizierung der konkordanten humanen Regionen mit Ensembl.org

Zur Identifizierung der zu den murinen Lith-QTLs konkordanten humanen Genregionen aus der genomweiten Assoziationsstudie wurde die Multi-Spezies Gendatenbank Ensembl.org herangezogen (Mus musculus Build 37 mouse assembly, (strain C57BL/6J, ensembl release 50)) (Herrero, et al., 2016). Nach Auswahl des zu überprüfenden murinen Chromosoms wird eine Gegenüberstellung mit den jeweiligen konkordanten Genregionen auf den humanen Chromosomen angezeigt. In der Übersicht können die einzelnen Abschnitte des murinen Chromosoms, welche das Konfidenzintervall des zu vergleichenden Lith-QTLs beinhalten, den entsprechenden syntenen chromosomalen Abschnitten blockweise zugeordnet werden. Somit konnten zu allen murinen Gallensteinsuszeptibilitätsregionen korrespondierende humane

Genregionen mit potentiellen LITH-Loci bestimmt werden.

27 2.3.3 Vergleich der konkordanten humanen Regionen mit den Ergebnissen der genomweiten Assoziationsstudie

Nach der Identifizierung der zu murinen Lith-Loci konkordanten humanen Regionen erfolgte der Vergleich mit den Ergebnissen der genomweiten Assoziationsstudie. Eine tabellarische Gegenüberstellung wurde erstellt, indem die SNPs der GWAS, die eine signifikante Assoziation zur Cholelithiasis mit einem Signifikanzniveau von p < 0,0001 aufwiesen, entsprechend ihrer chromosomalen Lokalisation den konkordanten Genregionen zugeordnet wurden. Entsprechend konnte eine Übersicht erstellt werden, aus der Informationen zu murinen Lith- Loci, die zu ihnen entsprechenden konkordanten humanen Regionen und in dieser Region befindlichen Cholelithiasis-assoziierten SNPs aus der GWAS gezogen werden können. Eine Aufstellung der Genregionen ist jeweils für die Chromosomen in Tabellenform erfasst (Siehe Anhang, Tabellen 7-28).

2.4 Selektion und Replikation der Kandidatengene in der Aachener Kohorte

2.4.1 Bestimmung von Tag-SNPs zur Replikation

Die vorliegende Arbeit fokussiert sich auf zehn Gene, die in konkordanten Lith-Regionen liegen und mindestens drei SNPs aus der genomweiten Assoziationsstudie beinhalten. Einzelnuklidpo- lymorphismen und entsprechende Gene, welche sich nicht im Konfidenzintervall einer Genregion konkordant zu einem verifizierten murinen Lith-Lokus befanden, wurden von den folgenden Untersuchungen ausgeschlossen. Nachfolgend wurde eine Replikation der Kandidatengene in der Aachener Kohorte durchgeführt. Um die Anzahl der zu replizierenden SNPs einzuschränken, wurden für jedes Gen Tag-SNPs ausgewählt, welche die genetische Variabilität der Gene abbilden. Hierfür wurde die Datenbank Haploview (Version 4.1) verwendet (Barrett, Fry, Maller, & Daly, 2005). Durch Auswahl der Tag- SNPs können Informationen zu allen SNPs im Gen, entweder durch direkte Analyse oder aufgrund ihres hohen LDs (r² > 0,8) zu analysierten Tag-SNPs, repräsentativ durch eine kleine Gruppe an SNPs gewonnen werden (Carlson, Eberle, Rieder, Yi, Kruglyak, & Nickerson, 2004). Für jedes Kandidatengen wurden entsprechend Tag-SNPs selektiert, die einen hohen LD (r² > 0,8) zu den restlichen SNPs und eine MAF (minor allele frequency) von mind. 5% aufwiesen und somit die LD-Gruppen der potentiellen LITH-Gene repräsentieren. Somit wurde die Anzahl der zu genotypisierenden Genvarianten reduziert.

28 2.4.2 Genotypisierung der Tag-SNPs

2.4.2.1 DNA-Extraktion

Für die Genotypisierung wurden die entnommenen Blutproben der Replikationsprobanden freundlicherweise zur Verfügung gestellt und das Blut bei 4°C in EDTA-Röhrchen gelagert. Nachfolgend wurde die DNA von den insgesamt 368 Vollblutproben mittels QIAGen DNeasy Blood and Tissue Kit® nach Angaben der Herstelleranleitung extrahiert. Die Probenaufberei- tung wurde nach dem angegebenen Protokoll durchgeführt (DNeasy® Blood & Tissue Handbook, July 2006). Die Blutproben werden zunächst auflysiert. Die Pufferbedingungen sind entsprechend angepasst, um optimale Bedingungen für eine DNA-Bindung zu schaffen. Nachfolgend wird das Lysat in eine DNeasy Mini spin column (Teströhrchen) gegeben. Während der Zentrifugation bindet die DNA selektiv an die DNeasy-Membran, und die restlichen Blutbestandteile sedimentieren ungehindert auf den Boden des Teströhrchens. Die verbliebenen kontaminieren- den Bestandteile und Enzyminhibitoren werden im Rahmen von zwei Waschdurchgängen entfernt. Die DNA kann nun in Wasser oder Pufferlösung aufgelöst werden und ist fertig für die Nutzung. (Qiagen)

2.4.2.2 Alleldiskriminierung mittels TaqMan PCR Assay

Die Genotypisierung wurde mittels eines TaqMan PCR Assays durchgeführt. Der verwendete Mastermix ist ein vorgefertigtes und standardisiertes Produkt der Firma Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA, USA). Der Mastermix enthält sequenzspezifische forward- und reverse-Primer, welche sich an die gesuchte DNA-Sequenz anlagern; des Weiteren sind die AmpliTaq-DNA- Polymerase und Basen zur Amplifizierung enthalten. Der wichtigste Bestandteil der Assays sind die vorgefertigten Sonden, welche entsprechend des zu genotypisierenden SNPs auf der Internetseite der Firma Life Technologies GmbH angefordert wurden (ThermoFisher Scientific). Die jeweils farbmarkierten Sonden sind so konstruiert, dass der zu untersuchende Polymorphismus in beiden Allelausführungen von einer kurzen Basensequenz flankiert ist und exakt mit der untersuchten DNA hybridisieren kann. Als Beispiel wird hier der Tag-SNP für das Kandidatengen GAD2 aufgeführt: Eingabe der dbSNP ID rs3781117, Position Chromosom 10: 26512044 Mb, GRCh37 (Genome Reference Consortium, Release March 2009).

GAGGAATCTAGAAGTTAATTAGATA[A/G]GCCTTGCGATGGACTAATCAGTCGA

Die erste Position, beschreibt das Allel 1 (A), welches in der nachfolgenden TaqMan- Genotypisierung mit dem Farbstoff VIC markiert ist. Die zweite Sonde mit dem Allel 2 (G) ist mit dem Farbstoff FAM markiert. Die Sonden werden als Paar mit den beiden Allelvarianten zur 29 Reaktionslösung gegeben, um in jedem Assay die beiden möglichen Varianten genotypisieren zu können. Vorbereitung der Mikrotitrierplatten (96 Wells): - 1 µl DNA pro Well - Platte zentrifugieren - Master Mix für eine Platte (96 Wells) vorbereiten o 250 µl Master Mix (ABI)

o 250 µl H2O (DNase und RNase frei) o 6 µl Sonde (40-fache Konzentration) - 5 µl Master Mix pro Well zur DNA hinzufügen - Matte zum Schutz auf die Platte legen - Platte zentrifugieren Zur Qualitätskontrolle werden folgende Kontrollen durchgeführt: - Reagenzien-Blindwert/Negativ-Kontrolle: In einem Teströhrchen wird lediglich Mastermix mit Wasser versetzt, ohne jegliche DNA hinzuzufügen. Die Probe wird durch sämtliche Extraktionsschritte mitgeführt. Die Auslesung des Teströhrchens muss ein negatives Ergebnis zeigen, da ansonsten von einer Kontaminierung des Mastermix mit DNA auszugehen ist. - Positiv-Kontrolle: Das Teströhrchen enthält den Mastermix und die DNA von einer anderen Platte, die bereits amplifiziert und ausgewertet wurde. Die Auslesung muss eine sichere Amplifikation mit dem gleichen Ergebnis der ursprünglichen Platte haben, ansonsten ist von einem Fehler während der PCR auszugehen. - Falls die Kontrollen nicht das erwartete Ergebnis erzielen, müssen die Resultate der Versuchsreihe verworfen und die Untersuchung wiederholt werden. Durchführung des Cycler-Programms mit ABI 2720 Thermal Cycler (Applied Biosystems Inc.): - AmpliTaq Gold Aktivierung: 10 min bei 95°C à Hold - Denaturierung: 15 Sek bei 92°C 40 Zyklen - Anneal/Extend: 1 min bei 60°C - Temperatur auf 4°C reduzieren Auslesung der Ergebnisse mittels ABI Prism 7500 sequence detector (Applied Biosystems, Inc.) und anschließende Auswertung mit der SDS Software (Abbildung 3):

VIC®-Farbstoff à Homozygotie für Allel 1 FAM™-Farbstoff à Homozygotie für Allel 2 Beide Farbstoffsignale à Heterozygotie für beide Allele

30

Allel 1 Allel 2 Beide Allele NTC

Abbildung 3: Ergebnis der Genotypisierung des SNPs rs3781117 (GAD2)

2.4.3 Statistische Analyse

Zunächst wurden die Genotypverteilungen aller Tag-SNPs auf das Hardy-Weinberg-Equilibrium hin geprüft. Nach erfolgter Genotypisierung wurde jeder SNP einzeln im additiven Modell mittels logistischer Regressionsanalyse auf eine Assoziation mit Cholelithiasis getestet; mit dem SNP als unabhängige und dem Gallensteinstatus als abhängige Variable. Das Signifikanzniveau wurde auf p ≤ 0,05 festgelegt. Eine Adjustierung von prädisponierenden Variablen war nicht erforderlich, da die Fall-Kontroll-Gruppen bereits auf Alter, Geschlecht und BMI gematcht wurden. Im additiven Modell wurden die Genotypen entsprechend ihrer Fluoreszenzmarkierung in folgende numerische Variablen übertragen: homozygote Probanden für das Allel 1 (11) = 0; heterozygote Probanden (12) = 1 und homozygote Probanden für das Allel 2 (22) = 2. Für die Berechnungen wurde die Software SPSS (Version 20) verwendet.

2.4.4 In-silico Analyse der funktionellen Konsequenzen der SNPs

Für die in-silico-Analyse wurden fünf öffentlich zugängliche Internet-Datenbanken ausgewählt, um Informationen anhand des aktuellen Forschungstandes zu den SNPs zusammentragen und nachfolgend interpretieren zu können.

31 Zunächst wurden alle in der genomweiten Assoziationsstudie als signifikant identifizierten SNPs mit der Datenbank für nicht-synonyme SNPs (nsSNPs) abgeglichen. Nicht-synonyme SNPs sind genomische Varianten in kodierenden Sequenzen welche als Resultat einen Aminosäuren- austausch nach sich ziehen und dadurch Veränderungen in der Proteinstruktur induzieren können. Sie können demnach einen direkten Effekt auf die individuelle Empfänglichkeit einer Krankheit oder Medikamentenresponse haben (Karchin, et al., 2005). In der sogenannten „Large Scale annotation data base of coding non-synonymous SNPs“ sind alle annotierten nsSNPs einzusehen (Karchin, et al., 2005). Es erfolgte der Vergleich der SNPs aus der genomweiten Assoziationsstudie mit der Auflistung der annotierten nsSNPs in der o.g. Datenbank, jedoch konnte keiner der Polymorphismen als nsSNP identifiziert werden. Entsprechend ist zunächst nicht von einer strukturellen Veränderung der Kandidatengene durch die SNPs auszugehen. Anhand des „Ensembl Variant Effect Predictors“ wurden des Weiteren die funktionellen Konsequenzen anhand der Lokalisation der einzelnen SNPs evaluiert (McLaren, et al., 2016). Nach Eingabe der replizierten Tag-SNPs in die Suchmaske werden die Transkriptionsfaktoren, die sich im Bereich des zu untersuchenden SNPs befinden, aufgelistet. Ihre Funktion, Lokalisation (ggf. mit Entfernung zum Gen) und weitere Informationen werden angegeben. Entsprechend kann der Effekt der genetischen Variante auf die Transkriptionsfaktoren in der entsprechenden chromosomalen Position beurteilt werden. Die Datenbank RegulomeDB wurde entwickelt, um Varianten im humanen Genom interpretieren zu können. Sie trägt Daten von verschiedenen Quellen zusammen, um regulatorisches Potential oder funktionelle Varianten effektiv und in kurzer Zeit identifizieren und interpretieren zu können. Es wird eine Übersicht mit den Informationen erstellt und ein Score vergeben, der die Wahrscheinlichkeit eines funktionellen Einflusses auf das Genom angibt. (Boyle, et al., 2012) Das Broadinstitute hat zusammen mit dem Massachusetts Institute of Technology (MIT) das Programm HaploReg v4.1 entwickelt, mit dessen Hilfe Informationen, auch aus anderen Gen- Datenbanken, über den zu untersuchenden SNP zusammengetragen werden (Ward & Kellis, 2012). Die Informationen zielen auf den möglichen Einfluss einer nicht-kodierenden genomischen Variante auf den bekannten Phänotypen und enthalten Aussagen zu gewebespezifischen Chromatinzuständen sowie Histonmodifikationen. Das sogenannte GTEx-Portal stellt Zusammenhänge zwischen einem SNP und der Genexpression in verschiedenen humanen Gewebearten her (The GTEx Consortium, 2013). Expressions-QTL, oder Loci mit stark veränderter mRNA-Expression, unterliegen häufig einer ursächlichen genetischen Variante und können durch Untersuchungen gezielt detektiert werden (The GTEx Consortium, 2013). Es können gewebespezifische Effekte von SNPs und somit ggf. bislang unentdeckte pathophysiologische Aspekte identifiziert werden.

32 3 Ergebnisse

3.1 Studienaufbau (Abbildung 4)

Genomweite Assoziationsstudie: 500K Affymetrix GeneChip und Affymetrix Genome-Wide Human SNP Array 6.0

Bestandene Qualitätskontrolle und Assoziation zur Cholelithiasis (p ≤ 0.0001)

417 SNPs

Lokalisation innerhalb der Konfidenzintervalle von humanen Genregionen konkordant zu bestätigten murinen Lith-Regionen

89 potentielle Kandidatengene

Gene, die mindestens drei der assoziierten SNPs aus der GWAS beinhalten

10 Kandidatengene

Selektierung von Tag-SNPs mit den Kriterien: Korrelationskoeffizient r²>0.8 für alle SNPs

22 Tag-SNPs

Replikation in einer unabhängigen Kohorte aus Aachen

Genotypisierung mittels TaqMan und Logistische Regressionsanalyse

3 SNPs (p ≤ 0,05) rs3781117 GAD2 p=0,051

rs337623 KLF3 p=0,021

rs7953150 PTPN11 p=0,048

Abbildung 4: Flussdiagramm des Studienaufbaus

33 3.2 Studienpopulation

3.2.1 Klinische Charakterisierung der Sorben

Die Verteilung der grundlegenden klinischen Charakteristika zwischen Fall- und Kontrollgruppe sind in der Tabelle 2 aufgeführt.

Gallensteinträger Kontrollen Charakteristik p-Wert (n = 189) (n = 833)

Geschlecht (w/m) 144/45 467/366 < 0,0001

BMI (kg/m²) 29,95 ± 0,40 26,21 ± 0,15 0,0001

Alter (Jahre) 60,56 ± 0,84 45,04 ± 0,54 < 0,0001

Tabelle 2: klinische Charakteristika der Sorben, in Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes (SD), sowie Anzahl (n) angegeben; w: weiblich, m: männlich

Von den insgesamt 1022 sorbischen Probanden wurden 189 als Gallensteinträger identifiziert, die weiteren 833 Sorben sind gallensteinfreie Kontroll-Probanden, was einer Gesamtprävalenz von 18,5% in der untersuchten Population entspricht. Bei Frauen konnte ein signifikant erhöhtes Auftreten mit einer Gesamtprävalenz von 23,6% beobachtet werden, im Vergleich zu 11% bei den männlichen Probanden (p < 0,0001, OR (95% CI) = 2,508 (1,747 – 3,601)). Ein signifikanter Unterschied zeigte sich ebenfalls bei der Häufigkeit des Vorkommens von Gallensteinleiden bei adipösen Probanden. So war bei den Gallensteinträgern ein mittlerer BMI von 29,95 kg/m² berechnet worden, im Vergleich zu den Kontrollprobanden mit einem BMI von 26,21 kg/m² (p = 0,0001). Das Alter der Studienpopulation lag zwischen 18 und 88 Jahren mit einem Mittelwert von 47,9 Jahren. Die Analyse zeigt, dass eine Korrelation des Phänotypen zum ansteigenden Alter der Probanden besteht und damit die Prävalenz des Gallensteinleidens zunimmt. Entsprechend weisen die Gallensteinträger mit einem Mittelwert von 60,6 Jahren ein höheres Alter auf als die Kontrollen. Probanden ohne Nachweis von Gallensteinen oder Cholezystektomie in der Anamnese sind signifikant jünger mit 45 Jahren (p < 0,0001). Vergleicht man die Altersgruppen der Gallensteinträger, ist ein Maximum in der Gruppe der 70 – 79- jährigen Probanden zu verzeichnen (Abbildung 5).

34 100 GS-Träger Kontrollen 95 87,2 76,9 61,5 62,5 56,3 43,6 38,5 37,5

Prävalenz in % 23,1 12,8 4,5 0

18 - 29 Jh 30 - 39 Jh 40 - 49 Jh 50 - 59 Jh 60 - 69 Jh 70 - 79 Jh 80 Jh Alter in Jahren

Abbildung 5: Prävalenz (%) der Cholelithiasis in den jeweiligen Altersgruppen; GS: Gallenstein

3.2.2 Anzahl der Schwangerschaften

Weiterhin konnte eine erhöhte Prävalenz in Zusammenhang mit der Anzahl der Schwanger- schaften beobachtet werden, mit einem deutlichen Anstieg bei Multiparität im Vergleich zu Probandinnen mit keiner oder nur einer Schwangerschaft (Abbildung 6).

Gallensteinträgerinnen

95,2 93,1 76,4 70,7 71,4

Prävalenz in % 66,3 66,7 66,7 60 40 33,7 33,3 33,3 23,6 29,3 28,6 4,8 6,9

0 1 2 3 4 5 6 7 8+

Anzahl der Schwangerschaften

Abbildung 6: Vergleich der Prävalenz (%) der Gallensteinträgerinnen und gallensteinfreien Kontrollen in Bezug auf die Anzahl der Schwangerschaften

Zur weiteren Untersuchung der beobachteten Korrelation des Gallensteinleidens mit Multi- parität wurde eine multivariable Analyse mittels logistischer Regression durchgeführt. Nach Adjustierung, jeweils auf das Alter und BMI der Probandinnen, konnte die steigende Anzahl der 35 Schwangerschaften als eigenständiger Risikofaktor mit einem Signifikanzniveau von p = 0,043 und p = 0,001 bestätigt werden (Tabelle 3).

Risikofaktor p-Wert OR (95% CI)

Anzahl der Schwangerschaften p = 0,043 1,171 (1,005 – 1,365) adjustiert auf Alter

Anzahl der Schwangerschaften p = 0,001 1,235 (1,096 – 1,392) adjustiert auf BMI

Tabelle 3: Korrelation des Gallensteinleidens

3.3 Komparative Analyse

Als Beispiel für die komparative Analyse sind in der unten dargestellten Tabelle 4 alle SNPs der genomweiten Assoziationsstudie des humanen Chromosoms 4 mit den jeweiligen konkordanten murinen Lith-Regionen aufgeführt. Die Darstellung erfolgte für jedes humane Chromosom, so dass die Genregionen der assoziierten SNPs mit den murinen Regionen gegenübergestellt werden können (siehe Tabelle 7 – 28).

Human Murin

Lokalisation Chr. Position Lith- Lokalisation SNP Allele Gen Genregion (Chr., Peak, (Mb) Region (Mb) CI in cM) chr4:7666095 rs17368264 C/G SORCS2 Intron

chr4:14467439 rs1389999 A/G Chr 5, 30cM, 95% Lith13 CI 10-45 chr4:17561306 rs6845078 C/T MLR1 Intron

Chr 5, 30cM, 95% chr4:38293153 rs922334 A/G FLJ13197 Intron Gbvq1 CI 20-50cM

chr4:38311539 rs337628 A/T FLJ13197 Intron 35.8 - 73.8M

Chr 5, 60cM, 95% Lith17 chr4:38380129 rs17582575 A/C KLF3 Downstream CI 40-68cM

chr4:38400008 rs17616338 C/T Chr 5, 42cM, 95% QTL CI 20-50cM chr4:38474271 rs4624663 A/G TLR1 Downstream chr4:40734492 rs7674811 A/C APBB2 Intron Chr 5, 30cM, 95% chr4:58396887 rs13134527 A/G Lith13 CI 10-45

chr4:61688491 rs1449622 A/G

Chr 5, 42cM, 95% QTL chr4:85188128 rs17007921 A/G CI 20-50cM

73.9 - 105.0M

chr4:88139044 rs4693155 C/G AFF1 Promoter Chr 5, 30cM, 95% Gbvq1 CI 20-50cM

Chr 5, 60cM, 95% Lith17 CI 40-68cM

36 Chr 8, 69cM, 95% chr4:143042611 rs7677292 A/G QTL CI 31-79cM

77.8 - 86.0M

Chr 8, 58cM, 95% Lith11 CI 48-60cM chr4:169687887 rs4323069 C/T PALLD Intron

chr4:169693682 rs10009813 C/G PALLD Intron Chr 8, 69cM, 95% chr4:169753034 rs13134971 C/T PALLD Intron QTL 42.5 - 69.9M CI 31-79cM chr4:169767441 rs11726512 C/T PALLD Intron

chr4:175707244 rs1365625 G/T

Tabelle 4: Humanes Chromosom 4, Darstellung der komparativen Analyse zwischen den SNPs aus der GWAS und den murinen Lith-Regionen

3.4 Assoziationsanalyse

3.4.1 Selektion von Kandidatengenen und ihrer Tag-SNPs zur Replikation

Die Selektion aus den assoziierten Genen der genomweiten Assoziationsstudie ergab folgende 13 Kandidatengene: PDE4B, PCNXL2, NID1, KLF3, TLR1, PALLD, GAD2, TPCN2, PTPN11, IDH2, CST8, IL4R, PDE8A. Die Gene TLR1, IL4R und PDE8A wurden im Rahmen von anderen Studien des Universitäts- klinikums Leipzig weiter untersucht und sind nicht Gegenstand der vorliegenden Arbeit. Die Tabelle 5 zeigt die zehn selektierten Kandidatengene, ihre jeweilige chromosomale Position und die gewählten repräsentativen Tag-SNPs (insgesamt 22) durch das Programm Haploview, die im weiteren Verlauf genotypisiert wurden.

Chromosomale Position Kandidatengen Tag-SNPs zur Genotypisierung (Chromosom, Mb)

CST8 chr20: 23419766-23424655 rs3004100

IDH2 chr15: 88428218-88446712 rs4553601

PTPN11 chr12: 111319256-111410436 rs7953150, rs7976467

TPCN2 chr11: 68572926-68614648 rs3168115

GAD2 chr10: 26545242-26633497 rs3781117

KLF3 chr4: 38488356-38525695 rs17582575, rs337623, rs17500878

NID1 chr1: 232465182-232554522 rs3738533

37 rs3820118, rs6676202, rs2477857, PCNXL2 chr1: 229426617-229738194 rs10910660

PDE4B chr1: 65970877-66552282 rs11208794, rs12043568, rs507956

rs3109202, rs11726512, rs4323069, PALLD chr4: 169792953-170220958 rs4144994, rs9993632

Tabelle 5: Auflistung der repräsentativen Tag-SNPs der jeweiligen Kandidatengene

3.4.2 Logistische Regressionsanalyse

Nach der Genotypisierung der Tag-SNPs wurde eine logistische Regressionsanalyse durchgeführt, wobei ein additives genetisches Modell bei der Auswertung genutzt wurde. Die folgenden Diagramme (Abbildung 7) stellen die jeweilige Anzahl der Probanden mit oder ohne Gallen-steine aufgeteilt in ihre jeweiligen Genotypen, einschließlich der Minorallelfrequenz (MAF), dem entsprechenden p-Wert, Odds Ratio, sowie 95%-Konfidenzintervall dar.

CST8 rs3004100 (MAF 48,34%) A/A 100 G/A G/G 80 60 94 40 86 p = 0,234 54 20 45 43 40 OR (95% CI) = 0.837 (0,625 - 1,121) 0 Gallensteine keine Gallensteine

IDH2 rs4553601 (MAF 18,9%) G/G 150 T/G T/T 100

123 p = 0,363 50 117 58 OR (95% CI) = 1,188 (0,819 - 1,724) 8 5 54 0 Gallensteine keine Gallensteine

38 PTPN11 rs7953150 (MAF 26,04%) A/A 120 G/A 100 G/G 80 60 106 p = 0,048 40 92 66 72 OR (95% CI) = 0,713 (0,509 - 0,998) 20 8 17 0 Gallensteine keine Gallensteine

PTPN11 rs7976467 (MAF 1,67%) C/C 200 G/C G/G 150

100 178 172 p = 0,150 50 OR (95% CI) = 0,413 (0,124 - 1,375) 0 3 2 5 0 Gallensteine keine Gallensteine

TPCN rs3168115 (MAF 30,69%) T/T 100 T/A A/A 80 60 40 90 83 85 p = 0,436 66 20 OR (95% CI) = 1,132 (0,828 - 1,549) 25 11 0 Gallensteine keine Gallensteine

GAD2 rs3781117 (MAF 10,69%) G/G 200 A/G A/A 150

100 p = 0,051 136 152 50 OR (95% CI) = 1,616 (0,999 - 2,616) 2 43 3 24 0 Gallensteine keine Gallensteine

39

PDE4B rs11208794 (MAF 15,98%) G/G 150 A/G A/A 100 p = 0,162 123 132 50 OR (95% CI) = 1,337 (0,890 - 2,007) 53 6 2 47 0 Gallensteine keine Gallensteine

PDE4B rs12043568 (MAF 1,67%) C/C 200 T/C T/T 150

100 p = 0,527 177 170 50 OR (95% CI) = 0,686 (0,214 - 2,203) 0 5 0 7 0 Gallensteine keine Gallensteine

PDE4B rs507956 (MAF 4,03%) A/A 200 A/G G/G 150

100 166 165 p = 0,605 50 OR (95% CI) = 1,224 (0,570 - 2,625) 0 16 0 13 0 Gallensteine keine Gallensteine

PCNXL rs3820118 (MAF 20,05%) A/A 150 A/G G/G

100 p = 0,570 50 113 117 62 60 OR (95% CI) = 1,114 (0,768 - 1,615) 7 5 0 Gallensteine keine Gallensteine

40

PCNXL rs6676202 (MAF 9,81%) G/G 200 A/G A/A 150

100 p = 0,556 146 147 50 OR (95% CI) = 1,163 (0,703 - 1,923) 2 34 0 33 0 Gallensteine keine Gallensteine

PCNXL rs2477857 (MAF 50,28%) T/T 100 A/T A/A 80 60 p = 0,779 40 80 78 OR (95% CI) = 1,039 (0,790 - 1,368) 20 49 52 52 51

0 Gallensteine keine Gallensteine

PCNXL rs10910660 (MAF 25,14%) C/C 120 T/C T/T 100 80 60 p = 0,863 102 101 40 71 68 OR (95% CI) = 0,971 (0,692 - 1,360) 20 10 12 0 Gallensteine keine Gallensteine

NID1 rs3738533 (MAF 13,56%) C/C 150 T/C T/T

100 p = 0,479 136 139 50 OR (95% CI) = 1,161 (0,767 - 1,757) 6 41 3 40 0

Gallensteine keine Gallensteine

41

KLF3 rs17582575 (MAF 20,17%) A/A 150 C/A C/C 100 p = 0,716 120 50 113 OR (95% CI) = 0,936 (0,655 - 1,337) 51 61 10 7 0 Gallensteine keine Gallensteine

KLF3 rs337623 (MAF 21,75%) A/A 150 G/A G/G

100

p = 0,021 126 50 103 OR (95% CI) = 0,669 (0,476 - 0,941) 62 10 45 15 0

Gallensteine keine Gallensteine

KLF3 rs17500878 (MAF 30,89%) G/G 100 A/G A/A 80 60 89 87 p = 0,851 40 71 76 20 OR (95% CI) = 1,030 (0,756 - 1,403) 21 17 0

Gallensteine keine Gallensteine

PALLD rs3109202 (MAF 11,92%) C/C T/C 150 T/T 100 p = 0,886 141 141 50 OR (95% CI) = 0,967 (0,614 - 1,524)

1 41 3 38 0

Gallensteine keine Gallensteine

42

PALLD rs11726512 (MAF 19,23%) T/T 150 C/T C/C 100 p = 0,462 123 117 50 OR (95% CI) = 0,873 (0,608 - 1,253) 52 56 7 9 0 Gallensteine keine Gallensteine

PALLD rs4323069 (MAF 36,46%) T/T 100 C/T C/C 80 60 p = 0,313 40 83 86 72 68 OR (95% CI) = 0,859 (0,640 - 1,154) 20 27 26 0

Gallensteine keine Gallensteine

PALLD rs4144994 (MAF 38,15%) G/G

100 A/G A/A 80 60 p = 0,128 95 40 80 70 67 OR (95% CI) = 0,789 (0,582- 1,070) 20 17 34 0

Gallensteine keine Gallensteine

PALLD rs9993632 (MAF 31,67%) G/G 100 A/G A/A 80 60 p = 0,213 40 85 85 77 80 OR (95% CI) = 0,815 (0,590 - 1,124) 20 11 22 0 Gallensteine keine Gallensteine

Abbildung 7: Ergebnisse der logistischen Regressionsanalyse der einzelnen Tag -SNPs

43

Bei drei der 22 untersuchten Tag-SNPs (rs3781117 in GAD2, rs337623 in KLF3 und rs7953150 in PTPN11) konnte eine signifikante Assoziation im additiven Modell nachgewiesen werden, wobei der stärkste Effekt im SNP rs337623 des Genes KLF3 (p-Wert 0,021; OR 0,669 [0,476 – 0,941]) beobachtet wurde.

3.5 Post-hoc Power-Analyse

Die statistische Power einer Studie beschreibt die Wahrscheinlichkeit, dass ein durch eine Genvariante ausgelöster Effekt durch die Studie erfasst wird, und sie hängt von mehreren Parametern ab (Bickeböller & Fischer, 2007). Die 22 Tag-SNPs wurden jeweils einzeln mittels der Software Quanto (Version 1.2.4) zur Prüfung der Power untersucht. Hierbei wurde als Signifikanzniveau p = 0,05 festgelegt, ein dichotomes Outcome mit dem Gallensteinleiden als Erkrankung im gematchten Fall-Kontroll- Design gewählt und die Hypothese aufgestellt, dass der jeweils angegebene SNP im additiven Vererbungsmodell die Erkrankung auslösen kann. Die Probandenzahl betrug für jeden SNP ca. 180 je Fall- und Kontrollgruppe. Für jeden SNP wurde die jeweilige Minor-Allel-Frequenz in der Tabelle mit angegeben. Unter Annahme des additiven Modells, mit einem Signifikanzniveau von p=0,05, zeigt die Tabelle 6 die statistische Power für die Detektion des Risikos der Entwicklung von Gallensteinen mit einer Effektgröße von 1,0 bis 2,0 bei den getesteten SNPs. Aus der farblichen Markierung der Tabelle wird ersichtlich, dass ab einer MAF von ca. 16%, Odds Ratios von 1,7 mit einer Power von >80% bei den SNPs identifiziert werden konnten, mit einer Ausnahme. SNPs mit einer größeren MAF konnten bereits bei einer Effektgröße von 1,6 identifiziert werden.

44

Effektgröße (Odds Ratio) SNP, MAF 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 1,9 2,0 rs12043568 5 5 6 8 9 12 15 18 21 25 29 1,67% rs7976467 5 5 6 8 10 12 15 18 21 25 29 1,67% rs507956 5 6 8 11 16 21 28 35 42 49 56 4,03% rs6676202 5 7 12 20 30 41 53 64 74 82 88 9,81% rs3781117 5 7 12 21 32 44 56 67 77 84 90 10,69% rs3109202 5 7 13 22 34 48 60 72 81 87 92 11,92% rs3738533 5 7 14 24 38 52 65 76 84 90 94 13,56% rs11208794 5 8 15 27 41 56 70 80 88 93 96 15,98% rs4553601 5 8 17 30 46 62 75 85 91 95 98 18,9% rs11726512 5 8 17 30 46 62 75 85 92 96 98 19,23% rs3820118 5 7 12 21 32 44 56 67 77 84 90 20,05% rs17582575 5 8 17 31 47 63 76 86 92 96 98 20,17% rs337623 5 8 18 32 49 65 78 87 93 97 98 21,75% rs10910660 5 9 19 35 53 69 82 90 95 98 99 25,14% rs7953150 5 9 19 35 53 70 82 90 95 98 99 26,04% rs3168115 5 9 21 38 56 73 85 92 96 98 99 30,69% rs17500878 5 9 21 38 57 73 85 92 96 98 99 30,89% rs9993632 5 9 21 38 57 73 85 92 96 98 99 31,67% rs4323069 5 9 22 40 59 75 87 93 97 99 99 36,46% rs4144994 5 10 22 41 60 76 87 94 97 99 99 38,15% rs3004100 5 10 23 42 61 77 87 94 97 99 99 48,4% rs2477857 5 10 23 42 61 77 87 94 97 99 99 49,72% Tabelle 6: Post-hoc Powerkalkulation für die Aachener Kohorte (n=368) mittels Quanto v1.2.4. Dargestellt ist die SNP-Annotation mit Minorallelfrequenz (MAF) und die Power (in %) des SNPs entsprechend der Effektgröße

45 4 Diskussion

4.1 Zusammenfassung

In der vorliegenden Arbeit wurden die Hintergründe des Gallensteinleidens mit speziellem Fokus auf die genetische Prädisposition, die Rolle sogenannter LITH-Gene, untersucht. Zur Identifizierung von genetischen Varianten, die eine Assoziation zur Cholelithiasis aufweisen, wurde eine komparative Analyse durchgeführt. Das Studiendesign hatte zum Ziel, mithilfe der bereits validierten murinen Lith-Loci prädisponierende Genvarianten in einer Kohorte aus einer sorbischen Bevölkerungsgruppe zu identifizieren und in einer Kontrollkohorte zu replizieren. Die zugrundeliegende Hypothese der vorliegenden Arbeit basiert auf der Annahme einer Konkordanz muriner Gallenstein-Loci mit bislang nicht identifizierten humanen LITH-Regionen. Durch die akribische Kartierung der lithogenen Loci auf dem murinen Genom („Gallensteinkarte der Maus“) war es möglich, eine Selektion von konkordanten humanen Regionen durchzuführen, die zudem eine Assoziation in unserer genomweiten Analyse aufwiesen. Dies führte zur Bestimmung von potentiellen humanen Kandidatengenen, ein Ansatz, der bis dato für das Gallensteinleiden auf genomweiter Basis noch nicht untersucht wurde. Im ersten Schritt wurden im Rahmen einer genomweiten Assoziationsstudie mit insgesamt 1022 Sorben 390.619 SNPs auf ihre Assoziation mit Cholelithiasis untersucht. Nach Adjustierung auf Alter, Geschlecht und BMI ergab sich für 417 SNPs ein signifikanter Unterschied (p ≤ 0.0001) zwischen der Gallensteinträger- und der Kontrollgruppe. Nach komparativer Analyse der bestätigten murinen Lith-Loci mit den signifikanten SNPs aus der genomweiten Assoziations- studie wurde die Anzahl auf 282 SNPs reduziert, die sich in Regionen von 89 potentiellen Kandidatengenen befinden. Zur weiteren Eingrenzung der zu untersuchenden Gene wurden Kriterien aufgestellt (siehe 2.4 Selektion und Replikation der Kandidatengene in der Aachener Kohorte), nach denen 10 Top-Kandidatengene für die Replikation selektiert wurden. Für diese Kandidatengene wurden insgesamt 22 repräsentative Tag-SNPs in der Kontrollkohorte, den Aachenern, untersucht. Es konnten dabei drei SNPs in drei unterschiedlichen Genen (GAD2, KLF3 und PTPN11) repliziert werden.

46 4.2 Multifaktorielle Genese der Cholelithiasis

4.2.1 Geschlecht und Schwangerschaft

Bei einer Gesamtprävalenz der Cholelithiasis von ca. 18% konnte ein deutlich gehäuftes Auftreten von Gallensteinen bei Frauen (ca. 24%) im Vergleich zu Männern (ca. 11%) beobachtet werden. Das weibliche Geschlecht als prädisponierende Variable zur Entwicklung von Gallensteinen wurde bereits in mehreren Studien bestätigt (Nakeeb, et al., 2002) (Ansari- Moghaddam, Khorram, Miri-Bonjar, Mohammadi, & Ansari, 2016) und wird u.a. auf einen Östrogen-bedingten Einfluss (Scragg, McMichael, & Seamark, 1984) und das gesteigerte Risiko durch Schwangerschaften (Attili, De Santis, Capri, Repice, & Maselli, 1995) zurückgeführt. Diese Korrelation wurde bereits 1979 in der Arbeit von Bennion et al. in einer Studie mit Pima- Indianern beschrieben. Des Weiteren wurden in einer Studie von Uhler et al. die Östrogen- Ersatztherapie bei postmenopausalen Frauen sowie ihre Auswirkung auf biliäre Erkrankungen untersucht und ein erhöhtes Auftreten von Gallensteinen bei weiblichen Probanden in den Gruppen mit transdermaler und oraler Östrogensubstitution beobachtet. Pathophysiologisch wurde dies durch eine signifikant erhöhte Cholesterinsättigung der Galle sowie reduzierter Nukleationszeit zu Cholesterinkristallen durch die Hormontherapie erklärt (Uhler, Marks, Voigt, & Judd, 1998). Auch im Mausmodell der Cholelithiasis wurde der Effekt beschrieben. Untersuchungen von de Bari et al. zu exogener Östrogenzufuhr im Sinne einer Hormonersatz- therapie bestätigten, dass das Gallensteinrisiko bei ovarektomierten Mäusen durch den lithogenen Effekt von 17β-Estradiol durch Aktivierung des ERα-Rezeptors in der Gallenblase induziert wird. Durch eine Erhöhung der hepatischen Synthese und biliären Sekretion von Cholesterin sowie Störung der Gallenblasenentleerung mit resultierender Stase wird die Auskristallisierung von Cholesterinmonohydratkristallen und ihre Nukleation zur Gallensteinen gefördert (de Bari, Wang, Portincasa, Liu, & Wang, 2015). Jedoch ist bei diesem Thema die Studienlage kontrovers. In diesem Zusammenhang erwähnenswert ist, dass ein signifikanter Anstieg der Gesamt- prävalenz an Cholelithiasis in unserer weiblichen Studienpopulation korrelierend mit steigender Anzahl an Schwangerschaften beobachtet wurde. Eine ähnliche Beobachtung wurde auch in der 1988 publizierten GREPCO-Studie beschrieben (GREPCO - The Rome Group for Epidemiology and Prevention of Cholelithiasis, 1988). Studienteilnehmerinnen mit keiner oder nur einer Schwangerschaft waren im Vergleich signifikant weniger häufig von der Cholelithiasis betroffen. Neben dem o.g. pathophysiologischen Aspekt wird des Weiteren ein hormonaler Effekt durch Progesteron vermutet, welches als Relaxans für glatte Muskelzellen fungiert und zu einer verzögerten Gallenblasenentleerung führt (Kern, et al., 1981). In einer Studie über Patientinnen mit subkutaner Langzeit-Progesterontherapie wurde im Rahmen der Hormongabe eine erhöhte

47 biliäre Stase aufgrund einer beeinträchtigten Entleerung der Gallenblase, einerseits durch eine Reduktion der Motilität des Sphinkter Oddi, andererseits durch eine Beeinflussung der Cholezystokinin-induzierten Gallenblasenkontraktilität (Tierney, et al., 1999) beobachtet. Die Beobachtung, dass ca. 1/3 der während der Schwangerschaft diagnostizierten Gallensteine noch vor der Geburt spontan dissolvieren, lässt vermuten, dass die Gallenblase sich von der Progesteronwirkung nach postpartalem Absinken des Serumspiegels erholen kann (Valdivieso, Covarrubias, Siegel, & Cruz, 1993). Bei Progesteronimplantaten wird die lithogene Wirkung trotz niedrigerer Serumspiegel auf eine kontinuierliche und länger andauernde Exposition zurück- geführt (Tierney, et al., 1999). Eine geänderte Gallensäuren-Zusammensetzung soll ebenfalls im Rahmen der Schwangerschaft die Lithogenität der Galle erhöhen (Kern, et al., 1981). Bei genauerer Betrachtung der Probandinnen unserer Studie konnte jedoch auch eine Korrelation zum Alter der Gallensteinträgerinnen nachgewiesen werden. So waren die erkrankten Studienteilnehmerinnen in jeder Gruppe älter als die gesunden Teilnehmerinnen mit der gleichen Anzahl an Schwangerschaften. Zur weiterführenden Untersuchung der Korrelation wurde entsprechend eine multivariable Analyse durchgeführt. Nach Adjustierung auf das Alter und BMI der Probandinnen konnte die Anzahl der Schwangerschaften als eigenständiger Risikofaktor mit signifikanter Assoziation zur Cholelithiasis bestätigt werden.

4.2.2 Alter

In Bezug auf das Alter wurde ein Anstieg der Gesamtprävalenz in den jeweiligen Altersgruppen verzeichnet, mit einem Maximum in der Altersgruppe der 70- bis 79-jährigen Studienteilneh- mern. Auch das Alter wurde bereits als prädisponierende Variable für Gallensteine in mehreren Studien diskutiert und bestätigt (Nakeeb, et al., 2002). Eine steigende Prävalenz in beiden Geschlechtern in Korrelation zum steigenden Alter wurde mehrfach beobachtet. Dieser Effekt ist unabhängig vom ethnischen Hintergrund (Shaffer E. , 2006) (Barbara, et al., 1987). In einer kürzlich veröffentlichten Studie wurde die Konzentration an Gallensäuren im Körper in Abhängigkeit verschiedener Faktoren u.a. von Geschlecht und Alter untersucht (Frommherz, et al., 2016). Dabei wurde festgestellt, dass bei jungen Männern (20 – 35 Jahre) die Plasmakonzent- ration von einigen Gallensäuren am höchsten ist und mit steigendem Alter die Konzentration erneut abfällt (Frommherz, et al., 2016). Dies basiert auf einem alternativen Weg zum klassischen Synthesemechanismus von Gallensäuren und entsprechend höheren Serumkonzent- rationen bei jungen Männern (Frommherz, et al., 2016) und könnte u.a. Einfluss auf die Diskrepanz zwischen der beobachteten Prävalenz von Gallensteinen bei jungen Frauen und Männern sein, welche im steigenden Alter abnimmt (Everhart, Khare, Hill, & Maurer, 1999). Eine weitere Erklärung der erhöhten Gallensteinprävalenz mit steigendem Lebensalter ist, dass es sich bei der Cholelithiasis um einen kumulativen Phänotyp handelt und sich entsprechend

48 gebildete Gallensteine nicht wieder auflösen, abgesehen von Sondersituationen wie der Schwangerschaft. Zusammenfassend kann das erhöhte Gallensteinrisiko im Alter auf eine erhöhte hepatische Cholesterinsekretion in Zusammenhang mit einer erniedrigten Gallensäureproduktion (Einarsson, Nilsell, Leijd, & Angelin, 1985) (Bertolotti, et al., 2007), eine reduzierte Gallenblasen- kontraktilität sowie die Tatsache, dass es sich um einen kumulativen Phänotypen handelt, zurückgeführt werden. Eine Assoziation des Alters zum Gallensteinleiden wurde in der vorliegenden Studie mit einem Signifikanzniveau von p < 0,0001 bestätigt.

4.2.3 Adipositas

Als weiterer Risikofaktor für die Entstehung von Gallensteinen konnte im Rahmen der vorliegenden Studie ein erhöhter BMI bestätigt werden. Mit einem mittleren BMI von 29,95 kg/m² war der BMI bei Gallensteinträgern signifikant höher als bei den Kontrollprobanden mit einem BMI von 26,21 kg/m² (p = 0,0001). Ein erhöhter BMI wurde bereits mehrfach als unabhängiger Risikofaktor beschrieben (Völzke, et al., 2005) und eine lineare Assoziation zwischen BMI und dem Auftreten von Gallensteinen nachgewiesen (Stampfer, Maclure, Colditz, Manson, & Willett, 1992). Untersuchungen zufolge wird vermutet, dass eine erhöhte Aktivität der HMG-Co-A-Reduktase (Novacek, 2006) und entsprechend erhöhte Cholesterinsekretion bei stark übergewichtigen Menschen vorliegt (Shaffer & Small, 1977). Eine Übersättigung der Galle mit Cholesterin führt nicht nur zu einer Auskristallisierung von Cholesterinmonohydratkristallen sondern auch zu einer Beeinträchtigung der Gallenblasenmotilität und somit prolongierter Stase der lithogenen Galle (Portincasa, Di Ciaula, & vanBerge-Henegouwen, 2004). Der BMI berücksichtigt jedoch nicht die Fettverteilung im Körper, sondern gibt lediglich eine Information über das Gewicht im Verhältnis zur Körpergröße an. Der Hüftumfang oder die „Waist-to-Hip-Ratio“ ermöglicht einen genaueren Anhalt auf die Fettverteilung. Aufgrund des bekannten Risikofaktors Adipositas wurden bereits weiterführende Untersuchungen zur Assoziation der körperlichen Fettdistribution und dem Auftreten von biliären Symptomen durchgeführt und ein erhöhtes Risiko für die abdominelle Fettverteilung bei Männern, gemessen durch Hüftumfang und Hüft-Taillen-Index, nachgewiesen (Tsai, Leitzmann, Willett, & Giovannucci, 2004). In einer Studie von Zhang et al. 2014, in welcher MRT-morphologisch das intraabdominelle (sog. viszerale) Fett quantifiziert wurde, konnte eine Korrelation zu einem erhöhten Risiko für die Entwicklung von Cholesteringallensteinen bestätigt werden (Zhang, et al., 2014). Entsprechend wird vor allem die intraabdominelle Fettdistribution als prädispositio- neller Faktor angesehen. Dies sollte in zukünftigen Studiendesigns berücksichtigt werden, sodass vorzugsweise der Hüftumfang und Hüft-Taillen-Index anstatt des BMI als Anhalt für das

49 Ausmaß der Adipositas herangezogen werden, auch wenn dabei nicht zwischen subkutanem und intraabdominellem Fett differenziert wird.

4.3 Kandidatengene

Der kombinierte Ansatz einer humanen GWAS zur Detektion von LITH-Genen mit einer komparativen Analyse aller detektierten murinen Lith-Loci führte in dieser Arbeit zur Identifizierung von 22 repräsentativen SNPs in zehn Genen. Drei dieser Polymorphismen (rs3781117 in GAD2, rs7953150 in PTPN11 und rs337623 in KLF3) wurden erfolgreich in einer unabhängigen Kohorte aus Aachen repliziert.

4.3.1 GAD2 (Glutamat-Decarboxylase)

Das Gen GAD2 ist auf dem Chromosom 10p11-p12 lokalisiert und kodiert die 65-kDa-Isoform der Glutamat-Decarboxylase (GAD65), welche die Formation von Gamma-Amino-Buttersäure (GABA) aus L-Glutamat durch Decarboxylierung katalysiert (Boutin, et al., 2003). GAD2 wird überwiegend in Hirngewebe (insbesondere im Hypothalamus) und in den ß-Zellen im Pankreas exprimiert (Esclapez, Tillakaratne, Tobin, & Houser, 1993) (Okada, Taniguchi, & Schimada, 1976). Diverse Studien haben eine potentielle Assoziation zwischen Einzelnukleotidpolymorphismen in der GAD2-Genregion und Adipositas sowie der Insulinsekretion diskutiert (Boutin, et al., 2003) (Shi Y. , et al., 2000) (Li, et al., 2015). Ein bedeutender SNP ist die -234A>G Variante (rs2236418), als Folge einer Induktion der GAD2-Promoter-Aktivität um den Faktor 6 durch den Risiko-SNP kommt es zu einer vermehrten synaptosomalen GABA-Ausschüttung in der Hypothalamus-Region, was durch eine resultierende erhöhte Nahrungsaufnahme zu Fettleibigkeit führen kann (Boutin, et al., 2003). Die Studie von Prakash et al. beschreibt eine deutliche Korrelation zwischen dem Risiko-SNP und krankhafter Adipositas in der nord- indischen Bevölkerung (Prakash, Mittal, Awasthi, & Srivastava, 2016). Im menschlichen Gewebe wird Glutamatdecarboxylase GAD65 als einzige Isoform in den insulinproduzierenden Beta-Zellen der Langerhans-Inseln des Pankreas exprimiert (Petersen, et al., 1993) (Kim, et al., 1993). Entsprechend der aktuellen Studienlage wird eine Glukose- induzierte Sekretion des Neurotransmitters vermutet (Braun, et al., 2004), mit nachfolgender Aktivierung der GABAa-Rezeptoren der pankreatischen Alpha-Zellen und daraus resultierender Glukagon-Sekretion (Wendt, et al., 2004), wobei der genaue Vorgang auf molekularer Ebene sowie der definitive Einfluss von GABA auf den Insulin-Glukose-Haushalt bislang unklar bleiben.

50 4.3.2 KLF-3 (Krüppel-like-factor-3)

Die Krüppel-like-Faktoren sind eine Familie von Transkriptionsfaktoren, die verschiedene biologische Prozesse wie Proliferation, Differenzierung, Entwicklung und Apoptose durch Bindung an CACCC-Elemente oder GC-reiche DNA-Regionen mittels ihrer drei hoch- konservierten C²H²-Zinkfinger regulieren (Pearson, Fleetwood, Eaton, Crossley, & Bao, 2008). Dieses DNA-Bindungsmotiv befindet sich am Carboxylende und wird mittels der „Krüppel- Links“, kurze Aminosäurensequenzen zwischen den Fingern, miteinander verbunden (Pearson, Fleetwood, Eaton, Crossley, & Bao, 2008) (Dang, Pevsner, & Yang, 2000). Außer der zwei charakteristischen Eigenschaften am Carboxylende des Proteins variieren die Mitglieder der KLF-Familie in der restlichen Gensequenz, wodurch sie unterschiedliche biologische Funktionen ausüben können (Pearson, Fleetwood, Eaton, Crossley, & Bao, 2008). Der Name der Transkriptionsfaktoren wird von einer Homologie der DNA-Bindungsregion zu dem Protein „Krüppel“ im Genom der Drosophila melanogaster abgeleitet (Feinberg, Lin, Fisch, & Jain, 2004). Homozygote Embryos wiesen deformierte thorakale und anteriore abdominale Segmente auf mit letalen Folgen aufgrund der Deformitäten (Feinberg, Lin, Fisch, & Jain, 2004) (Preiss, Rosenberg, Kienlin, Seifert, & Jäckle, 1985). Weitere Funktionen scheinen Einfluss auf den Fettstoffwechsel zu haben. In den Stoffwechselun- tersuchungen von KLF3-knock-out-Mäusen, welche sich durch einen schlanken Phänotyp auszeichneten, wurde eine veränderte Adipogenese beobachtet (Bell-Anderson, et al., 2013). In weiteren Untersuchungen konnte dies auf eine geringere Menge an weißem Fettgewebe mit in Anzahl und Größe verminderten Fettzellen in den Mäusen zurückgeführt werden (Sue, et al., 2008). Der Transkriptionsfaktor KLF3 wurde als ein Regulator des Genes Fam132a identifiziert, welches für den Insulin-Sensitizer-Faktor „Adipolin“ kodiert (Bell-Anderson, et al., 2013). In Studien wurde beobachtet, dass die Fam132a-Genexpression in Mäusen mit dem Genotyp KLF-/- signifikant gesteigert ist, v.a. in Herz-, Lungen-, Darm-, Knochenmark- und Milzgewebe (Bell- Anderson, et al., 2013) (Funnell, et al., 2012). Entsprechend weisen Mäuse mit Mangel an KLF3 einen signifikant erhöhten Plasmalevel an Adipolin auf, unabhängig von der Ernährung (Bell- Anderson, et al., 2013), und zeichnen sich durch einen schlanken Habitus aus. Zudem ist Adipolin als Adipokin in der Lage, Glukose-toleranz und Insulinsensitivität zu verbessern (Wei, et al., 2012).

4.3.3 PTPN11 (Protein-tyrosine phosphatase, non-receptor-type 11)

Das Gen PTPN11 kodiert das Enzym “rezeptorfreie Protein-Tyrosin-Phosphatase (Shp2)”, welches jeweils am N- und am C-Terminus eine Src-Homologie-2-Domäne besitzt (Neel, Gu, & Pao, 2003). Des Weiteren enthält die Phosphatase eine katalytische Domä ne, ein prolinreiches DNA-Bindungsmotiv sowie am Carboxyl-Ende zwei Tyrosin-Phosphorylierungsstellen (Neel, Gu, 51 & Pao, 2003). Die Tyrosinphosphatase übernimmt wichtige Funktionen in der Signaltransdukti- on u.a. von Wachstumsfaktoren, Hormonen und Zytokinen, mit resultierendem Einfluss auf Wachstum, Differenzierung, Migration und Apoptose der Zelle sowie dem Informationsaus- tausch zwischen den Zellen (Feng, 1999). Das autosomal dominant vererbte Noonan-Syndrom wird durch eine Missense-Mutation in PTPN11 verursacht die zu einer Destabilisierung der katalytisch inaktiven Konformation und entsprechend zu einer exzessiven Aktivierung der Funktionsfähigkeit von Shp2 führt (Tartaglia, et al., 2001). Eine Assoziation zwischen der Keimbahnmutation und der Entwicklungsstörung wird in ca. 50% der Fälle beschrieben (Tartaglia, et al., 2001), für das seltenere Leopard- Syndrom (Noonan-Syndrom with multiple lentigines) sogar in ca. 90% der Patienten (Keren, et al., 2004). Charakteristisch für das Noonan-Syndrom sind u.a. eine typische faziale Dysmorphie, Herzfehler, hämatologische Erkrankungen und skeletale Malformationen (Tartaglia & Gelb, 2005). Verschiedene Studien identifizieren Shp2 als Substrat von PTPN11 als Proto-Onkogen im Rahmen von somatischen Mutationen mit resultierenden hämatoonkologischen Erkrankungen (Tartaglia, et al., 2003) (Loh, et al., 2004) (Chan, Kalaitzidis, & Neel, 2008). Des Weiteren wird Shp2 im zentralen Nervensystem mit einer Regulation der Nahrungsaufnah- me, gestörten Energiebilanz und dem Metabolismus in Zusammenhang gebracht, entsprechend wurde bei Mäusen mit einer Neuronen-spezifischen Deletion des Proteins eine erhöhte Kalorienaufnahme mit Fettleibigkeit und resultierendem Diabetes beobachtet (Krajewska, et al., 2008). Als pathophysiologisch ursächlich wird vermutet, dass durch den reduzierten Shp2- Proteinspiegel in homozygoten Mäusen der hypothalamische Leptin-Signalweg alteriert wird, was in erhöhten Leptin-Spiegeln sowie Resistenzen resultiert (Zhang, Chapeau, Hagihara, & Feng, 2004) (Feng, 2006). In einer Studie von Jamshidi et al. 2007 mit 2771 weiblichen Zwillingen wird eine Assoziation von Tag-SNPs in PTPN11, die einen Einfluss auf die Shp2-Aktivität haben, mit erhöhten ApoB- Serumspiegeln beschrieben (Jamshidi, et al., 2007). Bereits in vorhergehenden Studien wurde eine insulininduzierte Beeinflussung des ApoB-Lipoprotein-Metabolismus über zwei bekannte Signalwege diskutiert (Sparks & Sparks, 1990) (Sparks, Phung, Bolognino, & Sparks, 1996). Durch eine gesteigerte Phosphorylierung von IRS-1, scheint Shp2 beide Signalwege zu beeinflussen und damit eine Überexprimierung indirekt zu erhöhten ApoB-Serumspiegeln zu führen (Ugi, Maegawa, Kashiwagi, Adachi, Olefsky, & Kikkawa, 1996) (Noguchi, Matozaki, Horita, Fujioka, & Kasuga, 1994) (Jamshidi, et al., 2007). In der Pathogenese von krankhaftem Übergewicht und Diabetes spielen die Insulin- und Lipoproteinhaushalte wichtige Rollen. Diese Erkrankungen wiederum stellen Risikofaktoren für die Entstehung von Gallensteinen dar. Mutationen in PTPN11 mit resultierender Beeinflussung der Aktivität der Tyrosinphosphatase birgt laut den o.g. Studien ein Potential zur Entwicklung der Erkrankungen. 52 4.4 Funktionelle Konsequenzen der SNPs

Ein Großteil der genetischen Varianten, welche mit komplexen und häufig vorkommenden Erkrankungen assoziiert sind, befinden sich in nicht-codierenden Genregionen (Zerbino, Wilder, Johnson, Juettemann, & Flicek, 2015) (Hindorff, et al., 2009). Diverse epigenetische Marker des Genoms und ihre regulatorischen Elemente nehmen jedoch Einfluss auf die Genexpression und können durch Einzelnuklidpolymorphismen, die sich in den Regionen befinden, in ihrer Funktion alteriert werden. Beispielsweise wurden im genfreien Chromosomenabschnitt 8q24 funktionelle Varianten mit bestätigten Assoziationen zu u.a. Prostata-, Mamma- und kolorektalen Karzinomen durch Einfluss der Polymorphismen auf das sogenannte MYC-Onkogen nachgewiesen (Amundadottir, et al., 2006) (Tomlinson, et al., 2007) (Ghoussaini, et al., 2008) (Wasserman, Aneas, & Nobrega, 2010) (Ward & Kellis, 2012). Zur Prüfung einer eventuellen funktionellen Konsequenz der Einzelnuklidpolymorphismen auf die Entstehung von Gallensteinen wurde eine in-silico-Analyse durchgeführt.

4.4.1 rs3781117

Das Gen GAD2 wurde bereits mit den prädisponierenden Risikofaktoren Adipositas und Diabetes in mehreren Studien in Zusammenhang gebracht. Für den SNP rs3781117 wurde in der vorliegenden Studie ein erhöhtes Risiko für das Gallensteinleiden beobachtet. Die erkrankten Probanden tragen gehäuft das Risiko-Allel G als heterozygoter oder homozygoter Träger. Ein Fehlen des Allels scheint vor der Erkrankung zu schützen. In der Datenbank RegulomeDB Version 1.1. weist der SNP rs3781117 einen relevanten Score von 2b auf. Eine Beeinflussung der regulatorischen Elemente in diesem Bereich durch die Variante wird als wahrscheinlich eingestuft. Die Hypothese der Datenbank stützt sich auf die Zusammenfassung verschiedener Faktoren, die für eine eingegebene Gen-Lokalisation vorliegen. Diesbezüglich angegeben sind: ein Transkriptionsfaktor bindet in diesem Abschnitt an die DNA, es wurde ein Sequenzmotiv nachgewiesen (ob als Bindungsstelle auf der DNA selbst oder als Bestandteil eines Transkriptionsfaktors wurde nicht spezifiziert), und es besteht eine sogenannte Hypersensitivität für das Enzym Desoxyribonuclease I (Boyle, et al., 2012). Im Zelltyp SH-SY5Y (Neuroblastom-Zell-Linie) ist der SNP rs3781117 in der DNA-Bindungsregion des Transkriptionsfaktors GATA3 (GATA binding protein 3) lokalisiert (Boyle, et al., 2012). Studien zufolge ist GATA3 in der Suppression der Adipozytendifferenzierung involviert, u.a. durch eine Hemmung des Enzyms PPARy (Tong, Dalgin, Xu, Ting, Leiden, & Hotamisligil, 2000) (Tong, Tsai, & Hotamisligil, 2003). Weitere Informationen wurden aus der Datenbank Haploreg gewonnen, in welcher die gewebespezifischen Histonmodifikationen sowie funktionelle Chromatin-Zustände aufgelistet wurden. Der SNP befindet sich in einer konservierten Genregion und die chromosomale Position 53 überlappt mit Histon-Markern, die auf eine Chromatinzugänglichkeit u.a. im Hirngewebe und pankreatischen Inselzellen hinweisen. Der stärkste Nachweis von Enhancer- sowie bivalente Promotor-Aktivität wurde jedoch in entodermalen Zellkulturen gefunden. Aus dem Entoderm bildet sich u.a. das Epithelium von Pankreasgewebe. Durch die Lokalisation des SNPs in dem DNA-Abschnitt werden laut der Datenbank 17 verschiedene regulatorische Motive beeinflusst, u.a. von diversen Transkriptionsfaktoren die mittels Homöoboxen an die DNA binden (Ward & Kellis, 2012). Zusammenfassend wird in diesem Genabschnitt eine erhöhte Aktivität von regulatorischen Elementen sowie Chromatin-Zugänglichkeit festgestellt; eine explizite Konsequenz kann hieraus nicht gezogen werden. Die zu GAD2 konkordante murine Lith-Region beinhaltet lediglich einen QTL, über den keine weiteren Informationen vorliegen. Auch die Untersuchung des SNPs anhand des Variant Effect Predictors sowie die Analyse der LD-SNPs ergab keine Konsequenz. Insgesamt ergab die in-silico Untersuchung des SNPs ein möglicherweise relevantes regulatorisches Potential. In weiteren Studien sollten eine Assoziation zum Diabetes und zur Adipozytendifferenzierung als Grundlage einer pathophysiologischen Funktion von rs3781117, die zu einem gesteigerten Risiko einer Cholelithiasis führt, untersucht werden.

4.4.2 rs337623

Der identifizierte SNP rs337623 im Gen KLF3 weißt in der vorliegenden Studie einen protektiven Effekt für das Gallensteinleiden auf. Im Rahmen der Untersuchungen wurden bei hetero- und homozygoten Trägern des Minor-Allels A signifikant weniger häufig Gallensteine beobachtet als bei homozygoten Trägern des Wildtyps (G/G). Obwohl es keine Hinweise auf eine relevante funktionelle Konsequenz in der Datenbank RegulomeDB oder Variant Effect Predictor gab, wird der SNP in der Datenbank HaploReg mit einer aktiven DNA-Region in Zusammenhang gebracht. Der detaillierten Darstellung der Aktivitätszustände des Chromatins in den entsprechenden Gewebegruppen ist zu entnehmen, dass der chromosomale Abschnitt in vielen Geweben u.a. Fett-, Muskel- und Hirngewebe sowie pankreatischen Inselzellen für regulatorische Elemente zugänglich ist und als Enhancer-Region fungiert. Zellspezifisch konnte eine sehr hohe Aktivität u.a. in Hirn-, Darmmukosa- und Fettzellen verzeichnet werden mit Hinweis auf eine transkriptionell aktive Region. Es wird außerdem eine Beeinflussung des DNA-Bindungsmotivs des Transkriptionsfaktors Nkx3 angegeben. Das Synonym „NK3 homeobox 1“ verweist auf die Homöodomäne als DNA- Bindungsmotiv des Transkriptionsfaktors. Nkx3-1 kann als Repressor fungieren und spielt eine Rolle in der regulären Prostata-Entwicklung, eine Mutation ist mit einem Fortschreiten eines bestehenden Prostatakarzinoms assoziiert (Zhang, et al., 2010). Bislang wurde keine Assoziation des Transkriptionsfaktors zu Gallensteinen beschrieben.

54 Die Datenbank HaploReg listet bei Anfrage zur Untersuchung eines SNPs ebenfalls die gekoppelten SNPs mit r2>0,8 auf. Alle SNPs wurden zunächst in der Datenbank RegulomeDb auf ihre Wahrscheinlichkeit für funktionelle Konsequenzen hin untersucht. In dem LD-Block wiesen lediglich rs139880082 (Score 2b) und rs337620 (Score 3b) eine erwähnenswerte Relevanz auf. Im Rahmen der weiterführenden Untersuchung konnte für den SNP rs139880082 lediglich in Darmmukosazellen schwache Enhancer-Aktivitäten sowie die Bindung von mehreren Transkriptionsfaktoren in dem DNA-Abschnitt nachgewiesen werden. Der SNP rs337620 weist u.a. in Darmmukosa-, Fett- und Pankreaszellen aktive Enhancer-Nachweise auf, mit einer aktiven „Transcription-Start-Site“ (TSS) in glatten Muskelzellen des Duodenums sowie Aktivität flankierend zu TSS in Darmmukosazellen. Auch in dieser chromosomalen Region wird die Bindung von Transkriptionsfaktoren beeinflusst, u.a. von GATA2, welcher wie GATA3 Einfluss auf die Adipozytendifferenzierung nimmt (Tong, Dalgin, Xu, Ting, Leiden, & Hotamisligil, 2000) (Tong, Tsai, & Hotamisligil, 2003). Eine nachgewiesene aktive Enhancer-Aktivität in Fettzellkernen in Zusammenhang mit der Beeinflussung der GATA2-Bindung könnte mit dem Hintergrund des protektiven Effektes des SNPs Hinweise über einen bislang unbekannten pathophysiologischen Mechanismus geben. KLF3 liegt in einer chromosomalen Region die laut der komparativen Analyse konkordant zu den murinen Lith-Regionen Lith13, Lith17 und Gbvq1 ist. Im Rahmen der murinen Analysen wurden als potentielle Kandidatengene für diese Lith-Loci u.a. Cckar (Gen kodierend für den Cholezystokinin A-Rezeptor) und Ppargc1a (Peroxisom proliferator-aktivierter Rezeptor Coaktivator 1a) identifiziert. In einer Studie von Bertolotti et al. wurde eine protektive Rolle des Coaktivators basierend auf einer Interaktion mit dem Gallensäurenrezeptor FXR, vermutet (Bertolotti, et al., 2006). GATA2 und GATA3 üben ihren suppressiven Effekt auf die Adipozytendifferenzierung u.a. durch Hemmung von PPARg aus (Tong, Tsai, & Hotamisligil, 2003). CCKAR wurde ebenfalls bereits in humanen Studien mit der Pathogenese des Cholesterin- Gallensteinleidens in Verbindung gebracht (Schneider, Sänger, & Hanisch, 1997) (Srivastava, Pandey, Dixit, Choudhuri, & Mittal, 2008). Gbvq1 ist ein murines QTL welches mit einem erhöhten Gallenblasenvolumen assoziiert ist (Lyons M. , et al., 2003). Die in-silico-Analyse ergab jedoch in Bezug auf die o.g. murinen Loci keine eindeutigen humanen Korrelationen. Wie vorbeschrieben reguliert KLF3 die Kodierung von Adipolin und kann entsprechend zu einer verbesserten Glukosetoleranz und Insulinsensitivität führen, resultierend zu einem verminderten Risiko für Diabetes. In diesem pathophysiologischen Zusammenhang sowie in Bezug auf die Adipozytendifferenzierung durch GATA2 sollten weitere Untersuchungen zur potentiellen Assoziation von KLF3 und dem Gallensteinleiden durchgeführt werden.

55 4.4.3 rs7953150

In der vorliegenden Studie wurde für den SNP rs7953150 im Gen PTPN11 ein protektiver Effekt für das Gallensteinleiden nachgewiesen. Probanden mit einem hetero- und homozygoten Genotyp des Minor-Allels A weisen eine signifikant geringere Häufigkeit für das Auftreten einer Cholelithiasis auf als Probanden mit Homozygotie für den Wildtyp. Der Variant Effect Predictor weist auf eine potentielle regulatorische Funktion des SNPs hin, da er in einer zugänglichen Chromatin-Region lokalisiert ist. Durch eine detaillierte Darstellung in der Datenbank HaploReg wird ersichtlich, dass sich der Abschnitt des Chromatins v.a. in Fett-, Muskel- und Hirnzellen in einem aktiven Zustand mit Hinweis auf Enhancer-Aktivitäten befindet. Die nachgewiesene Motiv-Beeinflussung betrifft die Histon-Lysin-N-Methyltransferase Setdb1 (SET domain bifurcated 1), welche durch die Enzymaktivität resultierenden Histonmodifikationen Einfluss auf die Chromatinstruktur nehmen kann. Das Enzym wird u.a. durch PPARg (Peroxisom-Proliferator-aktivierter Rezeptor g) reguliert und agiert in der Differenzierung von Adipozyten durch Chromatinmodifizierung (Wakabayashi, et al., 2009). Es konnte eine Downregulierung von Setdb1 in adipösen Mäusen im Vergleich zu Kontrollen nachgewiesen werden, mit dem Enzym als entsprechenden Anti- adipogenen Faktor (Wakabayashi, et al., 2009) (Okamura, Inagaki, Tanaka, & Sakai, 2010). Weitere Informationen von HaploReg zu dem SNP weisen auf sogenannte eQTLs u.a. im viszeralen und subkutanen Fettgewebe hin. Wird eine Assoziation von SNPs mit mRNA- Expression des entsprechenden Gens nachgewiesen, besteht die Möglichkeit, dass der SNP einen regulatorischen Einfluss auf die Transkriptionsaktivität des Genes nimmt (Cookson, Liang, Abecasis, Moffatt, & Lathrop, 2009). Die Regulation der Expression könnte im viszeralen Fettgewebe TMEM116 (Transmembran-Protein 116) auf Chromosom 12 in der Nähe zum untersuchten SNP (Aken, et al., 2016) betreffen und weist einen cis-Effekt mit einer Effektgröße von 0,32 bei einem p-Wert von 0.000018 auf (The GTEx Consortium, 2013). Der Transkriptions- faktor GATA-3 bindet in der Promotorregion des Genes (Qiagen, sabiosciences.com). Wie bereits erwähnt, ist GATA-3 in der Adipozytendifferenzierung involviert (Tong, Tsai, & Hotamisligil, 2003). Im subkutanen Fettgewebe wird u.a. HECTD4 (Synonym: C12orf51) auf Chromosom 12 als beeinflusstes Gen erwähnt, mit einer Effektgröße von -0,20 und einem p-Wert von 0.0000099 (The GTEx Consortium, 2013). Laut einer Studie von Go et al. wurde eine Assoziation von C12orf51 mit einem pathologischen 1-Std-Plasmaglukosewert als prädisponierenden Risikofaktor für die Entstehung von Diabetes mellitus Typ 2 identifiziert (Go, et al., 2013). Die Datenbank RegulomeDB misst der potentiell regulatorischen Funktion des SNPs in diesem Chromosomenabschnitt jedoch nur eine geringe Bedeutung (Score 5) zu. Auch den weiteren SNPs im LD-Block konnte keine relevante Konsequenz zugesprochen werden, rs7953150 weist selbst das größte Potential auf. In der komparativen Analyse ist der SNP rs7953150 konkordant

56 zu Lith17, jedoch konnte bislang kein adäquates Kandidatengen für den murinen Locus gefunden werden (Lyons & Wittenburg, 2006). Aufgrund der vor der Genotypsierung der SNPs durchgeführten Adjustierung auf Alter, Geschlecht und BMI der Probanden, wurde ein BMI-unabhängiger Effekt gefunden. Entsprechend ist der nachgewiesene Effekt der Genvariante auf die Gallenstein-Suszeptibilität eher nicht auf den BMI der Probanden zurückzuführen. Die Assoziation zu den eQTLs im viszeralen und subkutanen Fettgewebe mit entsprechender Beeinflussung der Expression der o.g. Gene ist jedoch ein Hinweis für bislang unbekannte zugrundeliegende Pathomechanismen. Eine eindeutige funktionelle Konsequenz für den SNP konnte nicht nachgewiesen werden, weitere Analysen sollten jedoch gezielt den Zusammenhang zu einer reduzierten Adipozyten- differenzierung sowie Diabetes mellitus untersuchen.

4.4.4 Zusammenfassung funktionelle Konsequenzen

Zusammenfassend kann nach der in-silico-Analyse weiterhin keine definitive Aussage über die Kausalität oder funktionellen Konsequenzen der SNPs gemacht werden. Trotz der signifikanten Assoziation sind weitere Untersuchungen zur Interpretation der Kausalität der Tag-SNPs erforderlich mit nachfolgender Expressions- und Funktionsanalysen. Der Polymorphismus rs11887534 im Gen ABCG5/8 ist eine missense-Mutation und führt entsprechend zu einer Aminosäurenveränderung. Durch die Datenbank RegulomeDb wurde dem SNP jedoch nur einen Relevanz-Score von 4 (minimal binding evidence) erteilt, trotz der mehrfach in Studien bestätigten Assoziation zur Cholelithiasis. Der SNP rs3781117 aus der vorliegenden Studie wies einen relevanten Score von 2b auf und wurde bislang in keiner weiteren Untersuchung identifiziert. Entsprechend kann kein eindeutiger Rückschluss des durch die Datenbank errechneten Scores mit der tatsächlichen potentiellen Relevanz des SNPs gezogen werden. Das Gallensteinleiden ist eine komplexe Erkrankung mit selten monogenetischer Ätiologie. Der Einfluss von Umweltfaktoren auf Individuen mit genetischer Prädisposition aufgrund von häufig vorkommenden Polymorphismen mit einem geringen bis moderaten Einfluss auf die Entwicklung der Erkrankung entspricht der aktuellen Vorstellung der Pathophysiologie der „common diseases“, u.a. auch des Gallensteinleidens. Eine Untersuchung der bislang identifizierten „trait-associated SNPs“ (TAS) ergab, dass sie sehr häufig in der Bevölkerung auftreten, mit einer Minorallelfrequenz von durchschnittlich ca. 36% und lediglich einer geringen Effektgröße von OR ~ 1,3 (Hindorff, et al., 2009). Nach Etablierung der Anwendung und Durchführung genomweiter Assoziationsstudien wird das Augenmerk nun verstärkt auf die Interpretation der Ergebnisse gerichtet, um präventive oder therapeutische Konsequenzen aus den Studien ziehen zu können. Eine Identifizierung der

57 assoziierten Genvarianten ist nicht ausreichend, da nur in wenigen Fällen eine funktionelle Konsequenz anhand der Lokalisation des SNP oder der Pathophysiologie der Erkrankung gefunden werden kann. Die Studie von Hindorff et al. ergab, dass sich 45% der TAS in Intron- Regionen und 43% zwischen zwei Genen befinden, lediglich ca. 10% der im Rahmen von GWAS identifizierten Genvarianten befinden sich dementsprechend direkt in kodierenden Sequenzen oder führen zu Aminosäureänderungen (Hindorff, et al., 2009). Die Ergebnisse der Studie bestätigten zwar, dass die intergenen DNA-Regionen den geringsten Quotienten an funktioneller zu totaler DNA besitzen, der Autor wies jedoch darauf hin, dass sich in der Region wichtige regulatorische Komponenten befinden (Hindorff, et al., 2009). Des Weiteren kann durch die systematische Kartierung von Chromatin-Markern des nicht-kodierenden Genoms in verschiedenen Zelltypen durch Ernst et al. ein Rückschluss auf potentielle regulatorische Funktionen der im Rahmen von GWAS identifizierten SNPs gezogen werden (Ernst, et al., 2011). Histonmarker und DNase I-Hypersensitivitäts-Loci weisen auf aktive Chromatinregionen hin mit enthaltenen Promotoren und Enhancern als regulatorische Elemente des nachfolgenden Gens. Durch die Ergänzung von Informationen zu eQTLs wurde die Interpretation zur Funktionalität von SNPs erweitert und weitere Hinweise zum zugrundeliegenden Pathomechanismus der Erkrankung gewonnen. Die gezielte Untersuchung des Chromatinabschnittes, welcher den assoziierten SNP beherbergt, kann entsprechend Hinweise auf zugrundeliegende Pathomechanismen und Funktionalität des SNPs ergeben, wobei die gewebespezifischen Regulationen in der vorliegenden Studie rein spekulativ bleiben.

4.5 Limitationen

Durch die Durchführung der post-hoc Poweranalyse konnte eine Aussage über die Teststärke der vorliegenden Replikationsstudie gemacht werden. Die Ergebnisse der Studie sind jedoch kritisch zu betrachten. Zwar konnten aufgrund der ausreichenden Teststärke Risikos von OR > 1,6 (SNP MAF mind. 15%) zu ca. 70-80% detektiert werden, die Probandenzahlen reichen jedoch nicht aus, um Effekte von geringerer Größe sicher zu detektieren und falsch-negative Ergebnisse sind entsprechend anzunehmen. Zum Vergleich: die mehrfach replizierte Variante p.D19H des Gens ABCG8/5 wurde in der Literatur mit einem Odds Ratio von 2-3 angegeben und trägt laut der Literatur um ca. 10% zur Heritabilität des Gallensteinleidens bei (Buch, et al., 2007) (Grünhage, et al., 2007). Die Teststärke der Studie wäre mit einer Power von über 80% jedoch für diese Effekte von SNPs, mit einer MAF von mind. 15%, ausreichend gewesen. Geringere Effekte und seltenere Varianten sind aufgrund der limitierten Power der Studie nicht detektiert worden. Die Negativ-Ergebnisse

58 sollten jedoch in einer nachfolgenden Replikationsstudie mit einer größeren Kohorte erneut untersucht werden. Zur Vermeidung eines Fehlers erster Ordnung durch multiples Testen wäre eine Bonferroni- Korrektur erforderlich. Entsprechend würde der korrigierte p-Wert bei der Untersuchung von 22 SNPs wie folgt berechnet werden: 0,05 / 22 = 0,002. Das Signifikanzniveau würde p=0,002 entsprechen und die vorliegenden Ergebnisse laut der Bonferroni-Korrektur nicht in den Signifikanzbereich fallen. Nach unserer Interpretation der Ergebnisse, nach erfolgreicher Replikation der SNPs in einer zweiten Kohorte mit ausreichender Teststärke, wären die Ergebnisse jedoch falsch-negativ. Weiterführende Untersuchungen im Sinne einer erneuten Replikation mit a-priori-Poweranalyse sowie nachfolgenden Funktionsuntersuchungen der SNPs sind erforderlich um eine eindeutige Relevanz der Polymorphismen festlegen zu können. Des Weiteren ist zu bedenken, dass populationsspezifische Effekte aufgedeckt sein könnten und eine Replikation der Ergebnisse unserer „Sorben-GWAS“ in anderen genomweiten Unter- suchungen bislang nicht erfolgen konnte. Die vorliegende Studie konnte wiederum aufgrund der heterogenen Studienpopulation und niedrigen Probandenzahlen in der Replikationskohorte mit begrenzter Power die bislang identifizierten LITH-Polymorphismen nicht entdecken. Die fehlende Identifizierung weiterer prädisponierender SNPs könnte evtl. durch die eingegrenzte Auswahl der Kandidatengene zur Replikation begründet sein. Durch die Selektion von Kandidatengenen, die sich in Regionen mit drei oder mehr SNPs (p > 0,001) aus der Assoziationsstudie befinden, ist nicht auszuschließen, dass in der vorliegenden Untersuchung weitere signifikante SNPs unentdeckt geblieben sind. Es wurden durch die Selektion u.a. Gene mit größeren LD-Gruppen bevorzugt untersucht, um die Chance zu erhöhen, eine Assoziation zu identifizieren, ohne dass dies jedoch eine Aussage über die Signifikanz ergibt. Größere Studien sind erforderlich, in welchen diese Gene in die Replikationsanalyse miteinbezogen werden, ohne dass eine Selektion durchgeführt wird, um das Risiko für falsch negative Ergebnisse weiter zu reduzieren.

4.6 Perspektive und klinische Relevanz

Das in der westlichen Gesellschaft häufig vorkommende Gallensteinleiden hat als Erkrankung, verbunden mit teilweise schwerwiegenden Komplikationen, im deutschen Gesundheitswesen einen hohen Stellenwert. Aufgrund der Lebensgewohnheiten in den industrialisierten Ländern mit erhöhter Kalorienaufnahme und mangelnder Bewegung ist das Gallensteinleiden mit einer Prävalenz von ca. 20 % eine der häufigsten Erkrankungen in Deutschland. Derzeit ist die einzige nicht operative Therapie der unkomplizierten Cholelithiasis die medikamentöse Litholyse mit Ursodeoxycholsäure, die aber weitestgehend verlassen ist. Andere

59 Verfahren wie die extracorporale Stoßwellen-Lithotripsie von Gallenblasensteinen werden ebenfalls nicht mehr regulär eingesetzt. Beide Verfahren weisen ein hohes Rezidivrisiko auf, letzteres sogar von über 20%, so dass erneut Komplikationen durch Steinabgänge oder temporäre Gallengangsverschlüsse auftreten können (Muratori, et al., 2017) (Carrilho-Ribeiro, Pinto-Correia, Velosa, & Carneiro De Moura, 2006) (Yamamoto, et al., 2016). Im Rahmen der mittlerweile fortgeschrittenen Möglichkeiten in der genetischen Forschung werden neue molekulare Mechanismen von weit verbreiteten Erkrankungen identifiziert. Durch die Entdeckung krankheitsauslösender oder –verstärkender Polymorphismen ist es möglich, individuelle Risikoprofile von Patienten zu erstellen und durch Behandlung der wiederum beeinflussbaren Risikofaktoren, das Risiko für das Auftreten derartiger Erkrankungen zu limitieren. Durch die sogenannte „Personalisierte Medizin“ können mit gezielten Untersuchungen die genetischen Besonderheiten des Patienten vor dem Beginn einer speziellen medikamentösen Behandlung eingeschätzt werden, ob die Therapie eine Wirksamkeit aufweisen wird, ob relevante Nebenwirkungen auf das Medikament auftreten werden und in welcher Dosierung es appliziert werden sollte (www.vfa.de). Dieses besondere Therapiekonzept findet zum aktuellen Zeitpunkt vor allem in der Behandlung der HIV-infizierten und bei Karzinom-Patienten Anwendung (www.vfa.de). Weitere Untersuchungen zu LITH-Genen sind entsprechend nicht nur erforderlich, um die gesamte Komplexität der Pathophysiologie des Gallensteinleidens zu verstehen, sondern auch um neue Ansatzpunkte für die personalisierte Medizin zu finden und Patienten mit einem hohen Risikoprofil für die Cholelithiasis, einem nichtoperativen und effektiven prophylaktischen Therapiekonzept zuführen zu können. Andererseits könnten Patienten mit einem niedrigen genetischen Risiko aber starken lithogenen Umweltfaktoren, wie Multiparität oder einem raschen Gewichtsverlust, von einer medikamentösen Therapie der Cholelithiasis profitieren. Des Weiteren können durch die sogenannte kombinierte Risikoeinschätzung („combined risk assessment“) individualisierte Risikoprofile erstellt werden. Geninteraktionen und das Geschlecht beeinflussen die Prädisposition für Gallensteine in einem anderen Ausmaß im Vergleich zum alleinigen Effekt einer einzelnen Risiko-Mutation. Diesbezüglich konnte eine Interaktion zwischen den beiden LITH-Genen UGT1A1 und ABCG8 beschrieben werden, die durch den gemeinsamen Nachweis in Kombination mit dem männlichen Geschlecht ein Gallensteinrisiko von ca. 21,1% ergibt (Buch, et al., 2010). Obwohl die in dieser Studie identifizierten Polymorphismen keine direkten Zielmoleküle zur Prävention von Gallensteinen darstellen, konnte unsere systematische Untersuchung jedoch sowohl klinische als auch genetische Risikofaktoren des Gallensteinleidens bestätigen bzw. erstmals detektieren. Weiterführende Studien, basierend auf dem murinen Modell der Cholelithiasis in größeren Populationen, versprechen die Identifizierung von weiteren 60 Zielmolekülen für die innovative Prophylaxe, Diagnostik und Therapie des Gallensteinleidens bei prädisponierten Patienten.

61 5 Zusammenfassung

Dissertation zur Erlangung des akademischen GradesDr. med.

Identifikation humaner Gallensteingene mittels komparativer Genetik

eingereicht von: Sheila Mirzakhyl angefertigt an der: Klinik und Poliklinik für Gastroenterologie und Rheumatologie, Universität Leipzig, Medizinische Fakultät betreut von: Prof. Dr. rer. med. Peter Kovacs PD Dr. med. Henning Wittenburg

Einreichung Dezember 2017

In unserer Gesellschaft stellt das Gallensteinleiden, mit einer Prävalenz von fast 20% und einem vielfältigen klinischen Erscheinungsbild, eine hohe Belastung für das Gesundheitssystem dar. Aus Mangel an vergleichbaren konservativen Methoden kommt bei dem symptomatischen Gallensteinleiden die operative Therapie präferiert zum Einsatz. Die Pathogenese der Cholelithiasis ist ein komplexes Zusammenspiel aus Umweltfaktoren und einer individuellen genetischen Prädisposition, wobei sowohl mono- als auch polygene Formen der Cholelithiasis bereits beschrieben wurden. In der vorliegenden Arbeit wurde auf die Identifizierung sogenannter LITH-Gene fokussiert und als Ansatz eine Analyse basierend auf komparativer Genetik gewählt. Die zugrundeliegende Hypothese basiert auf der Annahme einer Konkordanz muriner Gallenstein-Loci mit bislang nicht identifizierten humanen LITH-Regionen. Ziel des Studiendesigns war es, mithilfe der bereits validierten murinen Lith-Loci prädisponierende Genvarianten in einer Kohorte aus einer sorbischen Bevölkerungsgruppe zu identifizieren und in einer Kontrollkohorte zu replizieren. Durch die „Gallensteinkarte der Maus“ war es möglich, konkordante humane Regionen zu selektieren, die zudem eine Assoziation in unserer genomweiten Analyse aufwiesen.

62 Es wurde eine genomweite Assoziationsstudie für das Gallensteinleiden in einer sorbischen Population durchgeführt. Im Ergebnis wiesen insgesamt 417 SNPs eine Assoziation zur Cholelithiasis mit einem p-Wert von < 0.0001 auf und wurden in den vorliegenden Untersuchungen verwandt. Nach Übertragung der Gallensteinkarte der Maus in die Maßeinheit „Megabasenpaare“ konnte mithilfe der Gendatenbank Ensembl eine gezielte Identifizierung der zu den validierten murinen Lith-Loci konkordanten humanen Genregionen erfolgen. In einer tabellarischen Gegenüberstel- lung wurde ein Vergleich mit den Ergebnissen der genomweiten Assoziationsstudie und den konkordanten humanen Regionen durchgeführt, wobei sich 282 der 417 SNPs innerhalb der zu murinen Lith-Loci konkordanten Genabschnitten befanden und somit 89 Genen als potentielle humane LITH-Gene in Betracht gezogen wurden. Es wurden insgesamt 10 Kandidatengene für die weiteren Untersuchungen ausgewählt (PDE4B, PCNXL2, NID1, KLF3, PALLD, GAD2, TPCN2, PTPN11, IDH2, CST8). Für diese Kandidatengene erfolgte die Bestimmung von insgesamt 22 repräsentativer Tag-SNPs (r²>0.8), welche in den Aachenern als Kontrollkohorte genotypisiert wurden. Die anschließende logistische Regressionsanalyse im additiven Modell ergab für die folgenden SNPs eine signifikante Assoziation: rs3781117 (GAD2, p=0,051), rs337623 (KLF3, p=0,021) und rs7953150 (PTPN11, p=0,048). Des Weiteren konnten die klinischen Risikofaktoren Alter, Geschlecht, BMI und Anzahl der Schwangerschaften mit einer signifikanten Assoziation zur Cholelithiasis bestätigt werden. Im Rahmen einer in-silico-Analyse konnten nur Hinweise auf eine potentiell regulatorische Konsequenz der SNPs gefunden werden, eine spezielle funktionelle Kausalität bleibt spekulativ. Weitere Untersuchungen könnten Aufschluss über die pathophysiologischen Mechanismen und somit therapeutische Konsequenz ergeben. Die vorliegende Untersuchung führte zur Bestimmung von potentiellen humanen Kandidaten- genen, ein Ansatz, der bis dato für das Gallensteinleiden auf genomweiter Basis noch nicht durchgeführt wurde. Im Ergebnis der Arbeit wurde für drei Genvarianten eine bislang nicht beschriebene potentielle Beteiligung an der Risikomodifizierung des Gallensteinleidens nachgewiesen.

63

6 Anlagen

Human Konkordante murine Regionen

Lokalisation Chr. Position (Mb) SNP Allele Gen Genregion Lith-Region Lokalisation (Mb) (Chr., Peak, CI in cM) chr1:19012104 rs12063142 C/T chr1:19026556 rs6684577 C/T chr1:36451197 rs272819 C/T chr1:43199805 rs710218 A/T SLC2A1 Promoter chr1:50748894 rs11581155 G/T FAF1 Intron chr1:53890573 rs11206186 G/T GLIS1 Intron QTL, Chr 4, 46cM, CI ±10cM 103.0 - 155.6M chr1:53892895 rs12733756 A/G GLIS1 Intron Lith8 Chr 4, 62 cM, 95% CI 58-70 cM chr1:58872694 rs11579447 G/T chr1:58877088 rs232905 C/T chr1:58877848 rs232904 A/G chr1:58878741 rs232902 C/T chr1:58899264 rs232779 A/C chr1:58909861 rs513436 C/T chr1:58910760 rs542750 C/T chr1:66302457 rs12043568 C/T PDE4B Intron QTL, Chr 4, 46cM, CI ±10cM chr1:66307819 rs10493394 C/T PDE4B Intron 94.6 - 103.0M Lith8 Chr 4, 62 cM, 95% CI 58-70 cM chr1:66317656 rs12049155 G/T PDE4B Intron chr1:66444438 rs507956 A/G PDE4B Intron chr1:66447591 rs10493399 C/T PDE4B Intron Lith13, Chr 5, 30cM, 95% CI 10-45 chr1:91063601 rs17131213 A/T 105.8 - 108.7M Lith17 Chr 5, 60cM, 95% CI 40-68cM

64

chr1:230204217 rs1754606 A/G DISC1 Intron chr1:230213553 rs866596 C/T DISC1 Intron chr1:230213791 rs821627 A/G DISC1 Intron QTL Chr 8, 69cM, 95% CI 31-79cM 126.3 - 129.5M chr1:230213874 rs821628 A/G DISC1 Intron chr1:231338266 rs2477857 A/T PCNXL2 Intron chr1:234245665 rs16833108 G/T NID1 Intron Intron Lith15 Chr 13, 16cM, 95% CI 0-30cM 9.9 - 14.3M chr1:234253988 rs3738533 C/T NID1 (boundary)

Tabelle 7: Chromosom 1

Human Konkordante murine Regionen

Lokalisation Chr. Position (Mb) SNP Allele Gen Genregion Lith-Region Lokalisation (Mb) (Chr., Peak, CI in cM) chr2:43792583 rs2888881 A/G PLEKHH2 Intron Chr 17, 56cM, 95% CI 50- chr2:48952201 rs6708130 C/T Lith9 71.9 - 92.1M 60cM chr2:48963897 rs10490127 A/T chr2:65950134 rs11890665 A/G FLJ16124 Intron Lith23 Chr 11, 13cM, CI ± 10cM 16.9 - 31.0M Chr 2, 41.8cM/49.6cM, CI 40- chr2:153539181 rs4664635 C/G Lith1 39.4 - 84.3M 60cM

chr2:216429063 rs4076919 A/T QTL, Chr 1, 24cM, 95% CI 0-40cM chr2:217782373 rs13013676 C/G QTL Chr 1, 8cM, 95% CI 0-40cM 53.4 - 96.0M und chr2:228234344 rs2396465 A/G Chr 1, 16cM, 95% CI 10-54cM QTL chr2:239092118 rs752123 C/T

Tabelle 8: Chromosom 2

65 Human Konkordante murine Regionen

Lokalisation Chr. Position (Mb) SNP Allele Gen Genregion Lith-Region Lokalisation (Mb) (Chr., Peak, CI in cM)

chr3:2072897 rs10510226 A/G Lith6 , Chr 6, 54cM, 95% CI 40-70cM 103.2 - 115.9M chr3:2096865 rs12330388 A/T Lith16 chr3:23659405 rs11706670 A/G QTL Chr 14, 10cM, 95% CI 0-25cM 15.3 - 19.8M chr3:32438998 rs17029455 A/C CMTM7 Intron Lith5 Chr 9, 43cM, 95% CI 30-60cM 111.0 - 118.4M

chr3:69429370 rs9863228 C/T Lith6, Chr 6, 54cM, 95% CI 40-70cM chr3:72783259 rs2679211 A/G Lith16 und Chr 6, 56cM, 95% CI 40-70cM 92.2 - 103.3M QTL Chr 6, 31cM, 95% CI 19-39cM

Tabelle 9: Chromosom 3

Human Konkordante murine Regionen

Lokalisation Chr. Position (Mb) SNP Allele Gen Genregion Lith-Region Lokalisation (Mb) (Chr., Peak, CI in cM) chr4:7666095 rs17368264 C/G SORCS2 Intron chr4:14467439 rs1389999 A/G chr4:17561306 rs6845078 C/T MLR1 Intron chr4:38293153 rs922334 A/G FLJ13197 Intron Lith13, Chr 5, 30cM, 95% CI 10-45 Gbvq1, Chr 5, 30cM, 95% CI 20-50cM chr4:38311539 rs337628 A/T FLJ13197 Intron 35.8 - 73.8M Lith17, Chr 5, 60cM, 95% CI 40-68cM chr4:38380129 rs17582575 A/C KLF3 Downstream QTL Chr 5, 42cM, 95% CI 20-50cM chr4:38400008 rs17616338 C/T chr4:38474271 rs4624663 A/G TLR1 Downstream chr4:40734492 rs7674811 A/C APBB2 Intron chr4:58396887 rs13134527 A/G Lith13 , Chr 5, 30cM, 95% CI 10-45 73.9 - 105.0M

66 chr4:61688491 rs1449622 A/G QTL , Chr 5, 42cM, 95% CI 20-50cM chr4:85188128 rs17007921 A/G Gbvq1, Chr 5, 30cM, 95% CI 20-50cM Lith17 Chr 5, 60cM, 95% CI 40-68cM chr4:88139044 rs4693155 C/G AFF1 Promoter

chr4:143042611 rs7677292 A/G QTL , Chr 8, 69cM, 95% CI 31-79cM 77.8 - 86.0M Lith11 Chr 8, 58cM, 95% CI 48-60cM chr4:169687887 rs4323069 C/T PALLD Intron chr4:169693682 rs10009813 C/G PALLD Intron chr4:169753034 rs13134971 C/T PALLD Intron QTL Chr 8, 69cM, 95% CI 31-79cM 42.5 - 69.9M chr4:169767441 rs11726512 C/T PALLD Intron chr4:175707244 rs1365625 G/T

Tabelle 10: Chromosom 4

Human Konkordante murine Regionen

Lith- Lokalisation Chr. Position (Mb) SNP Allele Gen Genregion Lokalisation (Mb) Region (Chr., Peak, CI in cM) chr5:32854314 rs1501850 A/G QTL , Chr 15, 5.5cM, CI ±10cM 3.2 - 32.7M QTL Chr 15, 29cM, 95% CI 0-40cM chr5:121063906 rs9327224 C/T QTL Chr 18, 45cM, 95% CI 31-50cM 44.5 - 60.3M chr5:133058234 rs11242173 A/G Lith23 , Chr 11, 13cM, CI ± 10cM 51.5 - 54.7M QTL Chr 11, 21cM, 95% CI 21-35cM chr5:153544302 rs4958705 C/T GALNT10 Promoter Lith23 , Chr 11, 13cM, CI ± 10cM 54.7 - 58.0M QTL Chr 11, 21cM, 95% CI 21-35cM chr5:165238817 rs13436647 A/T Lith23 , Chr 11, 13cM, CI ± 10cM 32.2 - 48.5M QTL Chr 11, 21cM, 95% CI 21-35cM chr5:178687551 rs4700799 A/G ADAMTS2 Intron Lith23 , Chr 11, 13cM, CI ± 10cM 48.9 - 51.5M

67 QTL Chr 11, 21cM, 95% CI 21-35cM

Tabelle 11: Chromosom 5

Human Konkordante murine Regionen

Lokalisation Chr. Position (Mb) SNP Allele Gen Genregion Lith-Region Lokalisation (Mb) (Chr., Peak, CI in cM) chr6:1653870 rs9405506 C/T GMDS Intron Lith15 Chr 13, 16cM, 95% CI 0-30cM 30.7- 48.6M chr6:3476375 rs9328183 A/G chr6:22406678 rs849877 A/G PRL Promoter chr6:22407025 rs12210179 C/T PRL Promoter Lith15 Chr 13, 16cM, 95% CI 0-30cM 21.4 - 30.4M chr6:24949299 rs9366585 A/G C6orf32 Intron chr6:37710438 rs1776447 C/T MDGA1 3' UTR QTL Chr17, 26cM, 95% CI 10-40cM 27.1 - 31.1M Downstrea chr6:55385126 rs1979875 C/T UNQ9356 m Lith5, Chr 9, 43cM, 95% CI 30-60cM 75.6 - 78.2M chr6:55388261 rs1354204 C/T Lith20 Chr 9, 44cM, 95% CI 33-50cM

chr6:66756421 rs9445639 A/C QTL , Chr 1, 16cM, 95% CI 10-54cM 21.3 - 33.0M QTL Chr 1, 24cM, 95% CI 0-40cM chr6:79001258 rs6911854 C/T Lith5, Chr 9, 43cM, 95% CI 30-60cM chr6:79001613 rs946138 A/G 78.2 - 88.4M Lith20 Chr 9, 44cM, 95% CI 33-50cM

chr6:88489371 rs2787938 C/T QTL, Chr 4, 2.2cM, CI ±10cM chr6:88490584 rs2754273 C/T 21.4 - 34.9M QTL Chr 4, 9cM, 95% CI 3-31cM chr6:98139957 rs7356837 A/G chr6:113810260 rs540391 A/G Lith21 Chr 10,24cM, 95% CI 10-40cM 33.7 - 51.1M chr6:128356297 rs11154433 A/C PTPRK Intron Lith21 Chr 10,24cM, 95% CI 10-40cM 3.0 - 33.4M chr6:152181735 rs3844508 C/T ESR1 Intron

68 Tabelle 12: Chromosom 6

Human Konkordante murine Regionen

Lokalisation Chr. Position (Mb) SNP Allele Gen Genregion Lith-Region Lokalisation (Mb) (Chr., Peak, CI in cM) chr7:36837726 rs2006882 C/T chr7:36893366 rs2041801 A/G ELMO1 Intron chr7:36909839 rs11769038 G/T ELMO1 Intron Lith15 Chr 13, 16cM, 95% CI 0-30cM 14.3 - 21.1M chr7:36922366 rs1882080 A/G ELMO1 Intron chr7:36936199 rs1882082 C/T ELMO1 Intron chr7:36937360 rs10268319 C/T ELMO1 Intron chr7:75845745 rs868269 C/T Lith17 , Chr 5, 60cM, 95% CI 40-68cM 134.6 - 136.5M Lith18 Chr 5, 76cM, 95% CI 70-80cM chr7:77545493 rs4590377 C/T MAGI2 Intron chr7:88833233 rs801873 A/G Lith13 Chr 5, 30cM, 95% CI 10-45 4.2 - 21.0M chr7:88841520 rs10272660 A/G chr7:129749650 rs2306848 C/T CPA4 Coding exon Lith10, Chr 6, 4cM, 95% CI 0-10cM chr7:129752353 rs6955764 C/T CPA4 Downstream 29.2 - 48.5M QTL Chr 6, 31cM, 95% CI 19-39cM chr7:130362315 rs17738298 A/G chr7:150876967 rs1029949 C/G PRKAG2 Downstream chr7:150882696 rs2041634 A/G PRKAG2 Downstream chr7:150883532 rs6952258 A/C PRKAG2 Downstream Lith13 Chr 5, 30cM, 95% CI 10-45 23.8 - 30.1M chr7:150883551 rs4726044 A/C PRKAG2 Downstream

chr7:151119933 rs7796138 A/C PRKAG2 Intron

Tabelle 13: Chromosom 7

69 Human Konkordante murine Regionen

Lokalisation Chr. Position (Mb) SNP Allele Gen Genregion Lith-Region Lokalisation (Mb) (Chr., Peak, CI in cM) chr8:56317603 rs13438934 A/G XKR4 Intron QTL, Chr 1, 8cM, 95% CI 0-40cM 3.1 - 9.4M QTL Chr 1, 24cM, 95% CI 0-40cM chr8:60261552 rs10504287 A/G QTL , Chr 4, 2.2cM, CI ±10cM 3.6 - 9.7M QTL Chr 4, 9cM, 95% CI 3-31cM 3.6 - 9.7M chr8:128672788 rs4247280 C/T QTL , Chr 15, 5.5cM, CI ±10cM chr8:132422917 rs4596632 A/G QTL, Chr 15, 25.5cM, CI ±10cM 32.7 - 76.8M chr8:139892385 rs7838450 C/T COL22A1 Intron QTL Chr 15, 29cM, 95% CI 0-40cM chr8:142110882 rs4961315 C/T

Tabelle 14: Chromosom 8

Human Konkordante murine Regionen

Lokalisation Chr. Position (Mb) SNP Allele Gen Genregion Lith-Region Lokalisation (Mb) (Chr., Peak, CI in cM) chr9:12278602 rs7873941 G/T QTL , Chr 4, 46.4cM, CI ±10cM 74.0 - 94.5M Lith8 Chr 4, 62 cM, 95% CI 58-70 cM 74.0 - 94.5M chr9:73157763 rs11142806 A/G chr9:73160842 rs4289879 A/C chr9:73206593 rs1074670 A/G Lith2 Chr 19, 50cM, 95% CI ±10cM 14.1 - 25.1M chr9:77242670 rs7854515 C/T chr9:77245570 rs1751805 C/T chr9:79996438 rs7037778 A/G chr9:82948468 rs997020 A/G QTL , Chr 4, 46.4cM, CI ±10cM 70.3 - 73.5M

70 Lith8 Chr 4, 62 cM, 95% CI 58-70 cM chr9:85230169 rs4636280 A/C FRMD3 Intron QTL , Chr 4, 46.4cM, CI ±10cM 73.7 - 73.8M Lith8 Chr 4, 62 cM, 95% CI 58-70 cM chr9:102395933 rs1628249 C/T LOC347273 Downstream PALM2- QTL, Chr 4, 9cM, 95% CI 3-31cM chr9:111710183 rs9886729 C/G Intron 45.9 - 70.2M AKAP2 Lith8 Chr 4, 62 cM, 95% CI 58-70 cM chr9:111908142 rs7026192 A/G AKAP2 Intron chr9:136529774 rs11103023 C/T QTL Chr 2, 8 cM, 95% CI 0-20cM 24.5 - 32.1M chr9:136531674 rs11103034 A/G

Tabelle 15: Chromosom 9

Human Konkordante murine Regionen

Lokalisation Chr. Position (Mb) SNP Allele Gen Genregion Lith-Region Lokalisation (Mb) (Chr., Peak, CI in cM) chr10:1821930 rs4457675 C/T Lith15 Chr 13, 16cM, 95% CI 0-30cM 3.5 - 9.8M chr10:4674916 rs17298157 C/T chr10:21106987 rs2765841 G/T NEBL Downstream Intron chr10:21209929 rs16921213 G/T NEBL (boundary) QTL Chr 2, 8 cM, 95% CI 0-20cM 11.9 - 22.9M chr10:26355103 rs11014917 A/T MYO3A Intron chr10:26451099 rs4749092 C/T MYO3A Intron chr10:26552050 rs3781117 C/T GAD2 Intron chr10:34718906 rs2384222 A/T PARD3 Intron QTL Chr 8, 69cM, 95% CI 31-79cM 129.6 - 131.4M chr10:42697172 rs3121323 A/G Lith6 , Chr 6, 54cM, 95% CI 40-70cM 116.2 - 118.4M Lith16 Chr 6, 56cM, 95% CI 40-70cM

71 chr10:53349066 rs1937683 C/T PRKG1 Intron Lith2 Chr 19, 50cM, 95% CI ±10cM 30.3 - 32.5M chr10:58024931 rs17577849 A/C Chr 10, 24cM, 95% CI 10- chr10:58136243 rs1949436 A/G Lith21 58.8 - 74.3M 40cM chr10:72147192 rs7093021 A/G ADAMTS14 Intron chr10:78853158 rs3862501 C/G KCNMA1 Intron QTL Chr 14, 10cM, 95% CI 0-25cM 21.1 - 26.9M chr10:83930772 rs1577624 A/C NRG3 Intron QTL Chr 14, 10cM, 95% CI 0-25cM 35.0 - 41.9M chr10:88100227 rs1078789 C/T GRID1 Intron chr10:90189797 rs10749585 C/T C10orf59 Intron chr10:115320711 rs10885476 A/G HABP2 Intron Lith2 Chr 19, 50cM, 95% CI ±10cM 32.5 - 61.2M chr10:117867783 rs2530348 A/G GFRA1 Intron chr10:126134955 rs908365 A/C LHPP Promoter chr10:126502238 rs7097254 A/C KIAA0157 Intron Lith22 Chr 7, 65cM, CI±10cM 135.5 - 147.5M chr10:126533983 rs2086945 C/T

Tabelle 16: Chromosom 10

Human Konkordante murine Regionen

Lokalisation Chr. Position (Mb) SNP Allele Gen Genregion Lith-Region Lokalisation (Mb) (Chr., Peak, CI in cM) DKFZp686O chr11:17329019 rs7928810 A/C Promoter Lith22 Chr 7, 65cM, CI±10cM 109.2 - 123.7M 24166 chr11:19418229 rs2702648 C/T QTL, Chr 7, 26.5cM, CI ±10cM chr11:21622692 rs11026144 G/T 53.4 - 62.6M Lith22 Chr 7, 65cM, CI±10cM chr11:23958869 rs10834254 C/T chr11:30919924 rs163856 C/G FLJ46154 Intron chr11:31121135 rs7947992 A/G Chr 2, 41.8cM/49.6cM CI 40- Lith1 89.5 - 110.8M chr11:31227920 rs1330719 A/G 60cM chr11:31228161 rs1330714 C/T

72 chr11:31282908 rs3847588 C/T DCDC1 Intron chr11:31606051 rs4922570 C/T ELP4 Intron chr11:31635624 rs964111 A/G ELP4 Intron chr11:31643519 rs4922876 C/T ELP4 Intron chr11:34412551 rs208683 A/G CAT Promoter chr11:36416737 rs7943771 A/G FLJ14213 Intron chr11:36867235 rs4237669 C/G chr11:36908532 rs1480548 C/T chr11:68612530 rs4930265 A/G TPCN2 3' UTR chr11:68614666 rs3168115 A/T TPCN2 Downstream Lith22 Chr 7, 65cM, CI±10cM 151.0 - 152.5M chr11:68617448 rs11228490 C/G TPCN2 Downstream chr11:81622775 rs679370 A/G Lith22 Chr 7, 65cM, CI±10cM 94.3 - 109.2M chr11:97731973 rs11214933 A/G chr11:97737484 rs12288530 A/C QTL Chr 9, 1cM, 95% CI 1-31cM 3.3 - 18.2M chr11:97745273 rs7124636 C/T chr11:97748441 rs1384206 G/T chr11:113027921 rs10891578 A/T QTL, Chr 9, 1cM, 95% CI 1-31cM chr11:113108252 rs10750028 C/T ZW10 Downstream 25.9 - 53.8M Lith5 Chr 9, 43cM, 95% CI 30-60cM chr11:128197130 rs654169 C/T FLI1 Downstream

Tabelle 17: Chromosom 11

Human Konkordante murine Regionen

Lokalisation Chr. Position (Mb) SNP Allele Gen Genregion Lith-Region Lokalisation (Mb) (Chr., Peak, CI in cM) chr12:30594098 rs794174 A/C Lith6 , Chr 6, 54cM, 95% CI 40-70cM 129.2 - 149.5M Lith16 Chr 6, 56cM, 95% CI 40-70cM

73 chr12:32644275 rs10129043 C/G FGD4 Intron QTL, Chr 16, 10cM, 95% CI 0-30cM chr12:32644486 rs10844251 C/T FGD4 Intron 16.2 - 16.6M Lith14 Chr 16,42cM, 95% CI 20-70cM

chr12:88771035 rs2722220 A/C chr12:88779905 rs1946327 G/T chr12:88790762 rs2553110 C/T chr12:88820024 rs4635138 C/T chr12:88921317 rs4453292 C/T Chr 10, 56cM, 95% CI 50- chr12:88948548 rs7313433 A/C Lith7 86.1 - 129.8M 60cM chr12:96966249 rs9669668 A/G chr12:96976282 rs10860276 A/G chr12:96994034 rs7968996 A/G chr12:96999234 rs2160245 C/T chr12:97058928 rs905749 G/T chr12:110607667 rs601663 C/T BRAP Intron chr12:110614582 rs659964 C/G BRAP Promoter chr12:110631347 rs608848 A/G ACAD10 Intron chr12:110674821 rs6490294 A/C ACAD10 Intron chr12:110717401 rs10744777 C/T ALDH2 Intron Lith17 Chr 5, 60cM, 95% CI 40-68cM 115.3 - 123.1M chr12:110947679 rs4767293 A/G ERP29 Downstream chr12:110971201 rs17696736 A/G C12orf30 Intron chr12:111152058 rs1005902 G/T chr12:111425954 rs7953150 A/G PTPN11 Intron chr12:127138524 rs11059501 A/G Lith17 , Chr 5, 60cM, 95% CI 40-68cM 123.1 - 130.1M Lith18 Chr 5, 76cM, 95% CI 70-80cM

Tabelle 18: Chromosom 12

74

Human Konkordante murine Regionen

Lokalisation Chr. Position (Mb) SNP Allele Gen Genregion Lith-Region Lokalisation (Mb) (Chr., Peak, CI in cM) chr13:103076020 rs1331535 A/G chr13:103076872 rs17314747 A/G chr13:106408722 rs9514597 C/T Lith19 Chr 8, 0cM, 95% CI 0-8cM Chr13:102.3 - 114.1M chr13:108755291 rs4134382 A/G chr13:108760580 rs7335249 C/T

Tabelle 19: Chromosom 13

Human Konkordante murine Regionen

Lokalisation Chr. Position (Mb) SNP Allele Gen Genregion Lith-Region Lokalisation (Mb) (Chr., Peak, CI in cM) chr14:28580103 rs2758208 C/G chr14:32438117 rs4246976 A/G chr14:48204811 rs7492685 C/T chr14:71010888 rs36528 G/T chr14:81487024 rs1953408 C/G chr14:86318354 rs1362721 A/G chr14:86790859 rs1682561 A/C chr14:88826249 rs17125613 C/T CHES1 Intron chr14:94412516 rs6575471 A/C

Tabelle 20: Chromosom 14

75

Human Konkordante murine Regionen

Lokalisation Chr. Position (Mb) SNP Allele Gen Genregion Lith- Region Lokalisation (Mb) (Chr., Peak, CI in cM) chr15:29018482 rs565 C/T KIAA1018 Intron QTL , Chr 7, 26.5cM, CI ±10cM 70.1 - 72.8M Lith22 Chr 7, 65cM, CI±10cM chr15:33866710 rs12440810 C/T Chr 2, 41.8cM/49.6cM CI 40- Lith1, chr15:35371235 rs16964884 C/G 60cM 112.1 - 126.9M Lith12 Chr 2, 101cM, CI: 95-110 cM chr15:53862207 rs10851595 A/G chr15:59101888 rs4774381 A/G RORA Intron QTL, Chr 9, 1cM, 95% CI 1-31cM chr15:60074748 rs8034335 A/G VPS13C Intron Lith5, Chr 9, 43cM, 95% CI 30-60cM 56.7 - 75.5M chr15:60074820 rs8034216 C/T VPS13C Intron Lith20 Chr 9, 44cM, 95% CI 33-50cM

chr15:83390002 rs12909971 C/G PDE8A Intron chr15:83407217 rs11632658 A/G PDE8A Intron chr15:83407778 rs11073915 A/G PDE8A Intron chr15:83419048 rs12438909 A/T PDE8A Intron chr15:83419886 rs2304416 A/G PDE8A Intron chr15:83425660 rs2174218 C/G PDE8A Intron chr15:83427392 rs3816104 A/C PDE8A Intron Lith22 Chr 7, 65cM, CI±10cM 88.0 - 91.9M chr15:83436894 rs8032301 C/T PDE8A Intron chr15:83437111 rs734495 C/T PDE8A Intron chr15:83440845 rs12904238 A/T PDE8A Intron chr15:83445463 rs4843019 G/T PDE8A Intron chr15:83462274 rs11073952 C/T PDE8A Intron chr15:83462510 rs10520585 C/G PDE8A Intron

76 chr15:83472759 rs7177110 A/G PDE8A Intron chr15:83479255 rs11633076 C/T PDE8A Intron chr15:87204926 rs9630453 A/G AGC1 Intron QTL, Chr 7, 26.5cM, CI ±10cM chr15:88448992 rs4553601 G/T IDH2 Promoter 82.5 - 87.4M Lith22 Chr 7, 65cM, CI±10cM chr15:88589912 rs3932 A/G LOC390637 Downstream chr15:90571510 rs12440538 A/C QTL, Chr 7, 26.5cM, CI ±10cM chr15:90573772 rs11632145 G/T 72.8 - 82.5M Lith22 Chr 7, 65cM, CI±10cM chr15:93463899 rs1471168 A/T

Tabelle 21: Chromosom 15

Human Konkordante murine Regionen

Lokalisation Chr. Position (Mb) SNP Allele Gen Genregion Lith-Region Lokalisation (Mb) (Chr., Peak, CI in cM) chr16:3807082 rs17199009 A/G CREBBP Intron chr16:7382495 rs17648389 C/T A2BP1 Intron chr16:8110734 rs12929499 A/G QTL Chr 16, 10cM, 95% CI 0-30cM Chr16: 3.2 - 15.1M chr16:8131562 rs12926696 A/G chr16:8132201 rs7202396 C/T chr16:8132309 rs7203304 A/G chr16:26074032 rs8053138 C/T chr16:26085349 rs9938052 A/G Lith22 Chr 7, 65cM, CI±10cM Chr16: 21.5 - 28.2M Intron chr16:27281059 rs3024676 A/C IL4R (boundary) chr16:81194829 rs3865182 A/C QTL, Chr 8, 69cM, 95% CI 31-79cM chr16:86166844 rs6540061 C/G Chr16: 68.7 - 88.6M Lith11 Chr 8, 58cM, 95% CI 48-60cM chr16:86167071 rs17699397 C/T

Tabelle 22: Chromosom 16

77

Human Konkordante murine Regionen

Lokalisation Chr. Position (Mb) SNP Allele Gen Genregion Lith-Region Lokalisation (Mb) (Chr., Peak, CI in cM) chr17:7914904 rs3935950 A/C ALOX12B Downstream Chr 11, 13cM, CI ± 10cM Lith23, chr17:14129518 rs8068798 C/T Chr 11, 21cM, 95% CI 21- 61.9 - 72.2M QTL 35cM chr17:36368165 rs3744389 A/G KA35 Downstream chr17:36380188 rs8072395 C/T KA35 Promoter chr17:36380630 rs1510078 A/G KA35 Promoter Chr 11, 72cM, 95% CI 50- QTL 97.1 - 103.5M chr17:36385766 rs1858209 G/T KA36 Downstream 80cM chr17:36393181 rs7359525 C/T KA36 Intron chr17:36393487 rs6503570 C/T KA36 Intron chr17:41560151 rs2016730 C/T KIAA1267 Intron QTL Chr11, 72cM, 95% CI 50-80cM 103.3 - 104.3M chr17:52051231 rs1003395 C/T QTL Chr11, 72cM, 95% CI 50-80cM 84.7 - 97.2M chr17:61714923 rs9910760 A/T QTL Chr11, 72cM, 95% CI 50-80cM 106.8 - 109.3M

Tabelle 23: Chromosom 17

Human Konkordante murine Regionen

Lokalisation Chr. Position (Mb) SNP Allele Gen Genregion Lith-Region Lokalisation (Mb) (Chr., Peak, CI in cM) chr18:10742237 rs8089336 C/T QTL Chr18, 45cM, 95% CI 31-50cM 62.9 - 63.8M chr18:45905374 rs2469479 G/T chr18:45905535 rs2469478 A/G Chr 18, 45cM, 95% CI 31- QTL 68.7 - 80.2M chr18:51427587 rs10871582 G/T 50cM chr18:51498256 rs1031831 G/T

78 chr18:52586782 rs8097197 A/G WDR7 Intron QTL Chr18, 45cM, 95% CI 31-50cM 63.8 - 67.2M

Tabelle 24: Chromosom 18

Human Konkordante murine Regionen

Lokalisation Chr. Position (Mb) SNP Allele Gen Genregion Lith-Region Lokalisation (Mb) (Chr., Peak, CI in cM) chr19:34620901 rs10423566 C/G QTL , Chr 7, 26.5cM, CI ±10cM 46.9 - 48.2M Lith22 Chr 7, 65cM, CI±10cM chr19:35922510 rs929690 A/G QTL , Chr 7, 26.5cM, CI ±10cM 24.9 - 39.1M Lith22 Chr 7, 65cM, CI±10cM

Tabelle 25: Chromosom 19

Human Konkordante murine Regionen

Lokalisation Chr. Position (Mb) SNP Allele Gen Genregion Lith-Region Lokalisation (Mb) (Chr., Peak, CI in cM) chr20:7208592 rs6085964 A/G chr20:15467047 rs6074913 C/G C20orf133 Intron Chr 2, 41.8cM/49.6cM CI 40- chr20:20792507 rs6082210 A/G Lith1, 60cM 129.1 - 150.9M chr20:23422010 rs3004100 A/G CST8 Intron Lith12 Chr 2, 101cM, CI: 95-110 cM chr20:23430396 rs3004110 C/T CST8 Downstream chr20:23430430 rs3004111 A/G CST8 Downstream chr20:36927175 rs208813 A/G PPP1R16B Intron chr20:46054338 rs11086234 A/G Lith12 Chr 2, 101cM, CI: 95-110 cM 152.4 - 174.7M chr20:46061573 rs6063195 C/T chr20:49536592 rs754285 C/T NFATC2 Intron

79 Tabelle 26: Chromosom 20

Human Konkordante murine Regionen

Lokalisation Chr. Position (Mb) SNP Allele Gen Genregion Lith-Region Lokalisation (Mb) (Chr., Peak, CI in cM) chr21:34726455 rs7279041 A/G Chr 16, 42cM, 95% CI 20- chr21:34734497 rs8129326 A/G KCNE1 Downstream Lith14 75.5 - 98.2M 70cM chr21:39216204 rs8127044 A/G FLJ45139 Intron

Tabelle 27: Chromosom 21

Human Konkordante murine Regionen

Lokalisation Chr. Position SNP Allele Gen Genregion Lith-Region Lokalisation (Mb) (Chr., Peak, CI in cM) chr22:26261552 rs79880 C/T Lith17 Chr 5, 60cM, 95% CI 40-68cM 111.3 - 113.7M chr22:26261842 rs137147 G/T chr22:32383443 rs240343 C/T LARGE Intron chr22:32383620 rs9621748 C/T LARGE Intron chr22:32388812 rs240345 C/G LARGE Intron chr22:32388890 rs240346 A/G LARGE Intron QTL, Chr 8, 69cM, 95% CI 31-79cM 75.3 - 77.8M chr22:32389487 rs240348 A/G LARGE Intron Lith11 Chr 8, 58cM, 95% CI 48-60cM chr22:32389719 rs240350 C/G LARGE Intron chr22:32390303 rs240351 C/T LARGE Intron chr22:32396384 rs240358 A/G LARGE Intron

Tabelle 28: Chromosom 22

80

7 Literaturverzeichnis

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93 8 Selbständigkeitserklärung

Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit

Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig und ohne unzulässige Hilfe oder Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Ich versichere, dass Dritte von mir weder unmittelbar noch mittelbar eine Vergütung oder geldwerte Leistungen für Arbeiten erhalten haben, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen, und dass die vorgelegte Arbeit weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde zum Zweck einer Promotion oder eines anderen Prüfungsverfahrens vorgelegt wurde. Alles aus anderen Quellen und von anderen Personen übernommene Material, das in der Arbeit verwendet wurde oder auf das direkt Bezug genommen wird, wurde als solches kenntlich gemacht. Insbesondere wurden alle Personen genannt, die direkt an der Entstehung der vorliegenden Arbeit beteiligt waren. Die aktuellen gesetzlichen Vorgaben in Bezug auf die Zulassung der klinischen Studien, die Bestimmungen des Tierschutzgesetzes, die Bestimmungen des Gentechnikgesetzes und die allgemeinen Datenschutzbestimmungen wurden eingehalten. Ich versichere, dass ich die Regelungen der Satzung der Universität Leipzig zur Sicherung guter wissenschaftlicher Praxis kenne und eingehalten habe.

Leipzig, den 04.12.2017

Sheila Mirzakhyl

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