Universidade Federal Do Rio Grande Do Norte Centro De Biociências Programa De Pós-Graduação Em Ciências Biológicas Mestrado Em Ciências Biológicas

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS MESTRADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA, MORFOLOGIA E FILOGENIA MOLECULAR DE Coleodactylus natalensis FREIRE, 1999 (SQUAMATA, SPHAERODACTYLIDAE)

BRUNO DE PAIVA RÊGO

NATAL, RN 2019

Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - •Centro de Biociências - CB

Rêgo, Bruno de Paiva. Distribuição geográfica, morfologia e filogenia molecular de Coleodactylus natalensis Freire, 1999 (Squamata, Sphaerodactylidae) / Bruno de Paiva Rêgo. - Natal, 2019. 50 f.: il.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Orientadora: Profa. Dra. Katia Castanho Scortecci. Coorientadora: Profa. Dra. Eliza Maria Xavier Freire.

1. Variabilidade genética - Dissertação. 2. Sphaerodactylinae - Dissertação. 3. Modelagem de distribuição de espécies - Dissertação. 4. Genética de populações - Dissertação. 5. Sequenciamento de DNA - Dissertação. 6. Haplótipos - Dissertação. I. Scortecci, Katia Castanho. II. Freire, Eliza Maria Xavier. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título.

RN/UF/BSECB CDU 575.21

Elaborado por KATIA REJANE DA SILVA - CRB-15/351

BRUNO DE PAIVA RÊGO

DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA, MORFOLOGIA E FILOGENIA MOLECULAR DE Coleodactylus natalensis FREIRE, 1999 (SQUAMATA, SPHAERODACTYLIDAE)

Texto para Defesa submetido ao Programa de Pós- Graduação em Ciências Biológicas, Centro de Biociências, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para obtenção do grau de Mestre em Ciências Biológicas.

Orientadora: Profa. Dra. Katia Castanho Scortecci. Coorientadora: Profa. Dra. Eliza Maria Xavier Freire.

NATAL, RN 2019 ii

DEDICATÓRIA

À minha mãe, Benta Suely de Paiva Rêgo (in memorian), que sempre batalhou enquanto esteve presente para que seus filhos pudessem seguir a passos largos em seus estudos iii

AGRADECIMENTOS

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão da bolsa de Mestrado durante a realização deste trabalho. Ao Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade – ICMBio e ao Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade – SISBIO pela autorização (n° 62539-1). À Universidade Federal do Rio Grande do Norte e ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas pelas infraestruturas e apoios financeiros prestados que deram suporte ao desenvolvimento deste trabalho. Às minhas orientadoras e amigas Katia Castanho Scortecci e Eliza Maria Xavier Freire por todo o conhecimento que me foi ensinado ao longo desses anos de convivência. Vocês colaboraram não só para o meu aprendizado, mas também me transmitiram valores os quais levarei por toda a vida. A todos os gestores das Unidades de Conservação Parque Estadual Dunas do Natal, Parque da Cidade Dom Nivaldo Monte, Parque Estadual Mata da Pipa e Área de Proteção Ambiental Jenipabu, pela autorização das coletas, recepção e apoio na realização das atividades deste trabalho. A todos os companheiros de campo que me ajudaram nas coletas, dedicação, pela logística, paciência e coragem em enfrentar a árdua missão de procurar Coleodactylus natalensis. Este trabalho só foi possível graças a vocês. À Jaqueline Andrade, Raul Sales, Miguel Kolodiuk, Jadna Maria, Jaqueiuto Jorge, Mikaelle Kaline, Ana Quirino, Cristiane Palmeira, Nathália Maíra, Géssica Laize, Verônica Martins, Camila Rayane, Ana Helena Moura e Jaime Souza por toda a ajuda, discussões, cafés científicos, amizade e companheirismo em toda a minha jornada no Laboratório de Herpetologia e no Laboratório de Transformação de Plantas e Análises em Microscopia. Aos meus amigos Matheus Meira pela elaboração do mapa das áreas de estudo e autorização no uso de imagens; A Raul Sales por todo o auxílio e paciência na elaboração do mapa do modelo de distribuição de espécies; À Jaqueline Andrade pelo delicado trabalho com os tecidos biológicos dos animais coletados. À Géssica Laize, Verônica Martins, Camila Rayane, Luciana Melo, Ana Helena Moura e Jaime Souza pela ajuda substancial para a realização dos experimentos deste trabalho. À Nathália Maíra por toda a dedicação, companheirismo e paciência no auxílio das análises em bioinformática. iv

Às agregadas do LabHerpeto Luciana Rocha, Sátiva Villar e Izabelle Medeiros e aos agregados Hugo Amarilha e Ian Rocha pelas amizades e por tornar nossos dias mais felizes. A todos que fazem e fizeram parte da grande família do Laboratório de Herpetologia da UFRN, Miguel Kolodiuk, Raul Sales, Jaqueline Andrade, Jaqueiuto Jorge, Cristiane Palmeira, Jadna Silva, Mikaelle Kaline, Ana Quirino, Ana Cecília, Aguiberto Cândido, Matheus Meira, Kallyne Bonifácio, Vinícius Thawaan, André Santos, Daniel Luiz e Olyana Furtado pela boa convivência e magníficos cafés no fim da tarde. Cada um sabe a significância em minha vida e formação. Sou grato a vocês! A todos que fazem e fizeram parte do Laboratório de Transformação de Plantas e Análises em Microscopia da UFRN, Nathália Maíra, Géssica Laize, Verônica Martins, Camila Rayane, Ana Quirino, Ana Helena, Jaime Souza, Luciana Melo, Saniely Melo, Felipe Almeida, Lucas Felipe, Ana Raquel, Sara Almeida, Emanoelly Morais, Maria Lúcia, Rafaela Alves, Ariana Pereira e Raquel Diniz pelas ótimas companhias e discussões de artigos. Vocês foram fundamentais em minha formação! Aos grandes amigos que fiz ao longo da minha graduação, Everlândja Almeida, Fernanda Fonseca, Sophia Guedes, Ingrid Macedo, Laís Buênia, Clayton Emerson e Ana Carolina pelas ótimas companhias e por todo o apoio e amizade. Amo vocês! A todos os amigos e colegas de turma do Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas que fiz ao longo desses anos. Cada um contribuiu de forma significativa em minha formação pessoal e acadêmica. Em especial, agradeço à minha turma de graduação 2012.2 pelas ótimas amizades conquistadas. Aos amigos e familiares de Riacho da Cruz, Natal e Brasil afora, por todas as vivências nesses anos e apoio na minha estadia. A todos àqueles que fazem e fizeram parte da minha vida. Ao meu namorado Acássio dos Anjos pela ajuda e todo apoio prestado a mim durante esses anos. Você é incrível! Te amo! À minha família, base sólida para minha formação pessoal. Agradeço aos meus irmãos Leandro Rêgo, Thiago Rêgo, Samuel Rêgo e Gilliard Rêgo; às minhas cunhadas e amigas Nathália Gabriella, Itamara Soares, Ana Cristinna e Érika Fabiana; aos meus queridos e amados sobrinhos Benício Rêgo, Bernardo Rêgo, Nícolas Rêgo e Vicente Rêgo; a Suzinária Chagas e aos meus novos irmãos Samuel Lucena e Samyra Lucena; e em especial aos meus pais Manoel Rêgo e Benta Suely (in memorian). Amo a todos! O meu singelo muito obrigado!

RESUMO

Os processos evolutivos são multidimensionais e em áreas isoladas costumam ser mais evidentes, o que podem tornar as espécies simpátricas suscetíveis a uma maior variação intrapopulacional. Nesse contexto, as cinco espécies de lagartos do gênero Coleodactylus ocorrem apenas nas áreas florestadas da América do Sul e, no Brasil, três destas no Nordeste, constituindo o grupo meridionalis. Neste clado, C. natalensis divergiu há 1,9 milhões de anos de C. meridionalis, mantendo alta sobreposição quanto aos caracteres merísticos. Este último habita remanescentes florestais em toda a Região Nordeste, inclusive áreas de Mata Atlântica onde C. natalensis é endêmico no estado do Rio Grande do Norte (RN). Diante da ocorrência restrita e ameaçada de C. natalensis, este trabalho teve como objetivos investigar potenciais áreas de ocorrência desta espécie; analisar e caracterizar os espécimes morfologica e geneticamente; investigar ocorrência em simpatria desta espécie com C. meridionalis e a retenção das respectivas identidades moleculares nessa possível condição. Para tanto, foram coletados espécimes deste gênero no Parque Estadual Dunas do Natal (PEDN), Parque da Cidade Dom Nivaldo Monte (PCNM), Área de Proteção Ambiental Jenipabu (APAJ) e no Parque Estadual Mata da Pipa (PEMP). Nas análises merísticas, também foram incluídos espécimes tombados na Coleção Herpetológica da UFRN. Para a construção dos dados de bioinformática como as redes de haplótipos e as reconstruções filogenéticas, foram sequenciadas regiões dos genes mitocondriais cytb e 16S e os nucleares RAG-1 e c-mos. A modelagem de distribuição de espécies demonstrou ocorrência restrita para C. natalensis, influenciada por uma pequena área de adequação ambiental. As análises merísticas dos 25 exemplares de Coleodactylus spp. coletados, resultaram na formação de dois grupos: um composto pelas populações de espécies da APAJ, PEDN, PCNM e PEMP, e outro apenas com espécimes do PEMP. As análises moleculares corroboraram o encontrado para a morfologia, com os mesmos agrupamentos respondidos principalmente pelas redes de haplótipos do cytb e 16S. Os genes RAG-1 e c-mos mostraram-se bastante conservativos em suas sequências, unindo indivíduos de localidades distantes em suas redes. Nas reconstruções filogenéticas, foi possível identificar duas linhagens de C. natalensis para três áreas amostradas. Os exemplares do PEMP são os mais distintos nas sequências nucleotídicas e grupo-irmão das demais populações; PCNM forma um clado com APAJ e com apenas um indivíduo do PEMP. Enfim, a modelagem gerada confirma que C. natalensis é de ocorrência restrita aos remanescentes de Mata Atlântica do RN, e as análises morfológicas e moleculares sugerem a existência de duas linhagens compondo o referido táxon.

Palavras-chave: Variabilidade genética; Sphaerodactylinae; Mata Atlântica; lagartos; modelagem de distribuição de espécies; genética de populações; sequenciamento de DNA; haplótipos.

ABSTRACT

Evolutionary processes are multidimensional and usually more evident in isolated areas, rendering sympatric species susceptible to greater intrapopulation variation. Following this model, the five lizard species of the genus Coleodactylus occur only in forested areas of South America, and three of these in Northeastern Brazil, forming the meridionalis group. In this clade, C. natalensis diverged 1.9 million years ago from C. meridionalis, maintaining high overlapping in meristic characters. The latter inhabits forest remnants throughout Northeastern Brazil, and it may inhabit Atlantic Forest sites where C. natalensis is endemic in the state of Rio Grande do Norte (RN). In view of the restricted occurrence of C. natalensis, this work investigated potential areas of occupation, through species distribution modeling; in addition, it aimed to characterize the specimens morphologically and genetically, as well as to identify the existence of sympatry in these populations and the retention of molecular identities in this possible condition. For this, the population of the genus were collected in Natal Dune State Park (PEDN), Municipal Park Dom Nivaldo Monte (PCNM), Environmental Protection Area of Jenipabu (APAJ) and Mata da Pipa State Park (PEMP). In the morphological analyzes, individuals deposited in the Herpetological Collection of UFRN were also included. For the construction of bioinformatics data such as haplotype networks and phylogenetic reconstructions, regions of the mitochondrial genes cytb and 16S, and nuclear genes c-mos, RAG-1 were sequenced. The species distribution model showed a restricted occurrence for C. natalensis, influenced by a small area of environmental suitability. Twenty-five specimens of Coleodactylus spp. were collected, which meristically formed two groups: one composed of the populations of APAJ, PEDN, PCNM and PEMP, and another with PEMP specimens only. Molecular analyzes corroborated the results found for morphology, with the same groupings mainly answered by cytb and 16S haplotype networks. The RAG-1 and c-mos genes were very conservative in their sequences, linking individuals from distant locations in their networks. In phylogenetic reconstructions, it is possible to identify two strains of C. natalensis for three sampled areas. PEMP specimens are the most distinct in the nucleotide sequences and sister group of the other populations; PCNM forms a clade with APAJ and with only one PEMP individual. In general, the generated model confirms that C. natalensis is a species with occurrence restricted to the Atlantic Forest remnants of the state of Rio Grande do Norte. Additionally, the analysis of the morphological and molecular results of this study suggests the existence of three subspecies composing the referred taxon.

Key words: Genetic variability; Sphaerodactylinae; Atlantic Forest; lizards; species distribution model; genetics of populations; DNA sequencing; haplotypes.

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LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

% – Por cento mL – Mililitro °C – Graus Celsius mm – Milímetro 16S – Gene 16S rRNA mM – Milimolar AF – Mata Atlântica MMA – Ministério do Meio Ambiente APAJ – Área de Proteção Ambiental mv – Movimento Nucleotídico Jenipabu MVI – Composição de Máxima BLAST – Ferramenta básica de pesquisa Verossimilhança de alinhamento local n – Número Amostral c-mos – Gene Fator de Maturação de N – Número Amostral Total Oócitos Mos pb – Pares de Base CRC – Comprimento Rostro-Cloacal PCNM – Parque da Cidade Dom Nivaldo cytb – Gene Citocromo b Monte DD – Deficiência de Dados PCR – Reações em Cadeia da Polimerase DNA – Ácido Desoxirribonucleico PEDN – Parque Estadual Dunas do Natal dNTP – Desoxirribonucleotídeo Fosfatado “Jornalista Luiz Maria Alves” ENM – Modelagem de Nicho Ecológico PEMP – Parque Estadual Mata da Pipa g – Força G pH – Potencial Hidrogeniônico H – Haplótipo RAG-1 – Gene Ativação de Recombinação

H2O – Fórmula Molecular da Água 1 IUCN – União Internacional para rpm – Rotações por Minuto Conservação da Natureza rRNA – Ácido Ribonucleico Ribossomal Km – Quilômetro SDS – Dodecil Sulfato de Sódio L – Litro spp. – Espécies M – Molar TAE – Tampão Tris-Acetato-EDTA Ma – Milhão de Anos Taq – Thermus aquaticus mA – Miliampere UC – Unidade de Conservação MAXENT – Modelagem de Máxima V – Volts Entropia v – Volume mg – Miligrama μL – Microlitro

SUMÁRIO

RESUMO...... v ABSTRACT...... vi LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS...... vii 1 INTRODUÇÃO GERAL...... 10 2 METODOLOGIA GERAL...... 17 2.1 MODELAGEM DE NICHO ECOLÓGICO...... 17 2.2 ÁREAS DE ESTUDO...... 17 2.3 AMOSTRAGEM DOS TÁXONS...... 17 2.4 MORFOMETRIAS E CARACTERES MERÍSTICOS...... 19 2.5 PROCEDIMENTOS MOLECULARES E FILOGENÉTICOS...... 19 3 CAPÍTULO I GEOGRAPHIC DISTRIBUTION MODEL FOR Coleodactylus natalensis FREIRE, 1999 (SQUAMATA: SPHAERODACTYLIDAE) IN NORTHEASTERN BRAZILIAN ATLANTIC FOREST...... 22 ABSTRACT...... 23 1 INTRODUCTION...... 23 2 MATERIAL AND METHODS...... 25 3 RESULTS...... 26 4 DISCUSSION...... 26 CONCLUSIONS...... 26 ACKNOWLEDGEMENTS...... 26 LITERATURE CITED...... 26 4 CAPÍTULO II VARIABILIDADE MORFOLÓGICA E FILOGENIA MOLECULAR DE Coleodactylus natalensis FREIRE, 1999 (SQUAMATA: SPHAERODACTYLIDAE)...... 31 RESUMO...... 31 1 INTRODUÇÃO...... 32 2 MATERIAL E MÉTODOS...... 34 2.1 Amostragem dos táxons...... 34 2.2 Morfometrias e caracteres merísticos...... 35 2.3 Extração de DNA...... 35 2.4 Verificação em gel de agarose da presença e integridade do DNA extraído...... 36 vii

2.5 Amplificação das regiões gênicas e purificação dos produtos de PCR...... 37 2.6 Sequenciamento e análise dos fragmentos amplificados...... 38 2.7 Testes de neutralidade, construção de redes de haplótipos e análises filogenéticas...... 38 3 RESULTADOS...... 40 3.1 Análises morfométricas e merísticas...... 40 3.2 Amplificação do DNA e testes de neutralidade...... 40 3.3 Rede de haplótipos...... 40 3.3.1 Rede de haplótipos para o marcador citocromo b...... 41 3.3.2 Rede de haplótipos para o marcador c-mos...... 41 3.3.3 Rede de haplótipos para o marcador RAG-1...... 41 3.3.4 Rede de haplótipos para o marcador 16S...... 41 3.4 Cálculo das distâncias genéticas e estimativa de tempo de divergência...... 41 3.5 Reconstrução filogenética...... 41 4 DISCUSSÃO...... 41 CONSIDERAÇÕES FINAIS...... 41 REFERÊNCIAS...... 42 CONSIDERAÇÕES FINAIS DA DISSERTAÇÃO...... 46 REFERÊNCIAS DA PARTE INTRODUTÓRIA DA DISSERTAÇÃO...... 47

1 INTRODUÇÃO GERAL

Os gecos esferodáctilos (Scleroglossa: Sphaerodactylidae) fazem parte do grande grupo dos Gekkota, um táxon bastante rico em espécies de lagartos neotropicais e subtropicais do Velho Mundo, que abrigam os menores vertebrados das florestas tropicais das Américas Central e Sul (Kluge, 1995; Freire, 1999; Gamble et al., 2008, 2011; Geurgas et al., 2008; Geurgas & Rodrigues, 2010; Uetz et al., 2017). Constituem uma família presumidamente monofilética (Kluge, 1995; Geurgas et al., 2008; Geurgas & Rodrigues, 2010; Gamble et al., 2011), distribuída na América Central, ilhas do Caribe, região sul do estado da Flórida, norte da América do Sul, sul da Europa, norte da África e sudoeste da Ásia (Vanzolini, 1957; Vanzolini et al., 1980; Kluge, 1995; Uetz et al., 2017). São reconhecidas atualmente 215 espécies, pertencentes a 12 gêneros: Sphaerodactylus (105 espécies), Gonatodes (31 espécies), Pristurus (25 espécies), Lepidoblepharis (21 espécies), Aristelliger (oito espécies), Pseudogonatodes (sete espécies), Teratoscincus (seis espécies), Coleodactylus (cinco espécies), Saurodactylus (três espécies), Quedenfeldtia (duas espécies), e Chatogekko e Euleptes com uma espécie cada (Vanzolini, 1957; Ávila-Pires, 1995; Kluge, 1995; Freire, 1999; Vitt et al., 2005; Gamble et al., 2011; Gonçalves et al., 2012; Uetz et al., 2017). O monofiletismo da família Sphaerodactylidae é sustentado por sinapomorfias craniais e esqueléticas (Kluge, 1987, 1995). Porém, os caracteres mais notórios são a presença de escamas terminais que recobrem quase inteiramente as unhas, denominadas de estojo ungueal (Figura 1A), e o pequeno tamanho corporal, com algumas espécies de Sphaerodactylus possuindo 16 milímetros de comprimento rostro-cloacal (Hedges & Thomas, 2001), e espécimes maiores como os do gênero Gonatodes com até 65 milímetros de comprimento rostro-cloacal (Rivas & Schargel, 2008; Figura 1B).

Figura 1. Estojo ungueal de Coleodactylus natalensis e espécimes da família Sphaerodactylidae. Vista dorsal e ventral do estojo ungueal de C. natalensis (UFRN5490) formado por um conjunto de cinco escamas assimétricas (A). Em B são mostrados o menor lagarto (Sphaerodactylus ariasae; acima) e maior (Gonatodes infernalis; abaixo) da família Sphaerodactylidae. Fotos: (A) Autor; (B) Daniel Scantlebury: S. ariasae e Rivas & Schargel (2008): G. infernalis.

Acerca do formato dos dígitos e escamação do estojo ungueal, estes caracteres vêm sendo utilizados tanto para delimitar os gêneros como para determinar as relações filogenéticas da família (Vanzolini, 1968; Kluge, 1995; Freire, 1999; Gonçalves et al., 2012). Com ênfase nos gêneros da América do Sul e em decorrência de sua distribuição, o centro primário de diversificação é sugerido ser o Escudo das Guianas, área montanhosa que circunda a Floresta Amazônica das Guianas ao Equador, denominada arco noroeste (Vanzolini, 1968). Esta região em conjunto com os processos evolutivos locais, repercutiram na diferenciação dos esferodáctilos do Novo Mundo, que compartilharam pela última vez um antepassado comum mais recente há 75,5 milhões de anos, no Cretáceo tardio (Geurgas et al., 2008). Na sequência, a divergência de Gonatodes e Lepidoblepharis ocorreu há 68,2 milhões de anos, possivelmente pouco tempo antes da separação de Pseudogonatodes e Sphaerodactylus (Gamble et al., 2008; Geurgas et al., 2008). Na linhagem que deu origem ao gênero Coleodactylus, o evento cladogênico basal ocorreu há 72,6 ± 1,77 milhões de anos, aproximadamente no mesmo tempo em que outros gêneros se diversificavam (Geurgas et al., 2008; Figura 2). Ainda nesse gênero, a divergência entre C. septentrionalis Vanzolini, 1980 e C. brachystoma (Amaral, 1935) + C. meridionalis (Boulenger, 1888) se deu no Eoceno (há 46,4 ± 4,22 milhões de anos), e entre C. brachystoma e C. meridionalis há 29,3 ± 4,33 milhões de anos, no Oligoceno (Geurgas et al., 2008; Figura 2). Enfim, grande parte dos 12

eventos intraespecíficos do gênero Coleodactylus ocorreram do Mioceno ao Plioceno, mas, com base em apenas duas amostras conspecíficas de C. natalensis Freire, 1999 esta é considerada uma diferenciação quaternária (há 1,9 ± 1,3 milhões de anos), a divergência mais recente em relação às suas congenéricas (Geurgas et al., 2008), conforme explicitado na Figura 2.

Figura 2. Árvore baseada na transformação de verossimilhança penalizada para espécies da família Sphaerodactylidae. Estimativas de tempo de divergência (em milhões de anos). Círculos abertos representam eventos de especiação em Coleodactylus. Os números das localidades podem ser consultados no artigo original. Fonte: Geurgas et al. (2008).

Cabe destacar aqui que a especiação é um processo multidimensional constante que age nos indivíduos e os tornam suscetíveis a diversos mecanismos de seleção (Bolnick & Fitzpatrick, 2007; Mallet, 2007; Berner et al., 2009). Assim sendo, nas áreas geograficamente isoladas essas sucessões podem apresentar-se mais acentuadamente que nas regiões contínuas (Vanzolini, 1981; Vanzolini & Williams, 1981), fazendo com que a especiação nesses locais seja mais acentuada. Portanto, as espécies simpátricas além de consistirem em populações variáveis nesses refúgios (Vanzolini & Williams, 1981), podem ser propensas à evolução pelo isolamento reprodutivo (Bolnick & Fitzpatrick, 2007), ou ainda apresentarem divergência recente na escala evolutiva, sendo sintópicas e gerando indivíduos híbridos (Mallet, 2007). Tal mecanismo pode ser aplicado ao grupo dos Gekkota, especialmente ao gênero Coleodactylus, exemplo de um complexo espécies simpátricas distribuídas pela América do 13

Sul e todas ocorrentes no Brasil (Geurgas et al., 2008; Moretti, 2009). Este gênero aloca cinco espécies: C. septentrionalis, C. brachystoma, C. meridionalis, C. natalensis e C. elizae (Vanzolini, 1957; Freire, 1999; Vitt et al., 2005; Geurgas et al., 2008; Moretti, 2009; Sousa, 2010; Gamble et al., 2011; Gonçalves et al., 2012; Correia et al., 2016). Estas compartilham caracteres morfológicos como o estojo ungueal, pequeno comprimento corporal, escamas ventrais lisas e pupila redonda (Vanzolini, 1957; Ávila-Pires, 1995; Freire, 1999), e se distribuem conforme detalhamento a seguir. Coleodactylus septentrionalis ocorre na região dos Cerrados de Roraima, oeste do Suriname, Guiana e Venezuela (Ávila-Pires, 1995; Freire, 1999; Vitt et al., 2005), C. brachystoma na região de Cerrado que abrange os estados de Goiás, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul e Piauí (Ávila-Pires, 1995; Vitt et al., 2005), e três que constituem o grupo meridionalis ocorrem nas áreas florestadas da Mata Atlântica oriental do nordeste brasileiro (Vanzolini, 1957; Freire, 1999; Gonçalves et al., 2012): Coleodactylus meridionalis é a mais antiga delas e possivelmente constitui um complexo de espécies crípticas, o que torna este clado parafilético (Geurgas et al., 2008). As populações desta espécie ampliam suas distribuições em enclaves de mata inseridas no Domínio do Semiárido que se estendem desde o Maranhão até a Bahia (Vanzolini et al., 1980; Colli et al., 2002; Rodrigues, 2003; Ribeiro et al., 2013; Damasceno et al., 2014). Coleodactylus natalensis e C. elizae Gonçalves, Torquato, Skuk & Sena, 2012 são espécies recém descritas do grupo meridionalis e possuem registros apenas em remanescentes da Mata Atlântica setentrional. Em análise molecular, Geurgas et al. (2008) e Correia et al. (2016) observaram que houve deleções de bases no gene RAG-1 e estas ocorreram em diferentes momentos nestas espécies, como representado na árvore apresentada na Figura 3. Além disso, nesta mesma imagem pode-se identificar o gênero Coleodactylus como grupo- irmão do clado composto por Sphaerodactylus e Pseudogonatodes. A espécie C. elizae é endêmica da Serra da Saudinha, município de Maceió, Alagoas, e C. natalensis é, até então, endêmica de remanescentes de Mata Atlântica do Rio Grande do Norte (Freire, 1999; Sousa & Freire, 2010; Gonçalves et al., 2012). Considerando que espécimes de C. meridionalis também foram registrados em alguns remanescentes de Mata Atlântica do Rio Grande do Norte (Sousa, 2010), é possível que esta ocorra em simpatria com C. natalensis. É importante destacar que C. meridionalis pode apresentar sobreposição de caracteres e distribuição geográfica com outras espécies do gênero, como C. brachystoma (Vanzolini et al., 1980; Colli et al., 2002; Ribeiro et al., 2013; Damasceno et al., 2014).

Figura 3. Árvore bayesiana de espécies da família Sphaerodactylidae. Os nomes dos táxons são mostrados à direita, seguido do número de acesso do GenBank dos genes nucleares PTPN12 e RAG-1. RAG-1 possui múltiplos indels únicos e cada um é numerado (#2, #3 e #1) sequencialmente em 5’–3’ seguindo Gamble et al. (2011). Fonte: Correia et al. (2016).

Em adição, C. natalensis e C. meridionalis apresentam alto grau de sobreposição em caracteres merísticos, sendo diferenciadas majoritariamente pelos padrões de coloração (Freire, 1999; Moretti, 2009). Coleodactylus natalensis apresenta dicromatismo sexual, com os machos apresentando manchas brancas na cabeça, ausentes nas fêmeas, sendo estas quase idênticas aos espécimes de C. meridionalis (Figura 4). Coleodactylus natalensis também difere de sua congenérica por apresentar um padrão de estreitas faixas brancas dorsolaterais (Freire, 1999; Figura 4), além de escama rostral dividida e com micro-ornamentações em forma de fossetas profundas de apenas um cílio; nas escamas pós-rostrais estas são em forma de fossetas rasas com variação de três a oito por escamas (Meira-Ribeiro, 2012).

Figura 4. Espécimes de Coleodactylus natalensis e C. meridionalis (Sphaerodactylidae). Coleodactylus natalensis (A: macho; B: fêmea) e Coleodactylus meridionalis (C). Fotos: Carolina Lisboa (A), Matheus Meira-Ribeiro (B) e Melissa Gogliath (C).

O alto grau de sobreposição em caracteres merísticos entre C. meridionalis e C. natalensis, aliada à divergência de C. natalensis ser a mais recente dentro do grupo meridionalis, cerca de 1,9 ± 1,3 milhões de anos (Geurgas et al., 2008), corroboram a afirmação de alguns autores de que a acumulação de mudanças morfológicas nesse clado podem ser tardias (Vanzolini, 1957; Vitt et al., 2005), e que essas alterações podem ser melhor compreendidas com o auxílio de análises moleculares (Geurgas et al., 2008; Gamble 16

et al., 2011; Damasceno et al., 2014; Correia et al., 2016), investigações essas que poderão auxiliar no encontro de morfotipos crípticos no grupo meridionalis. Embora C. natalensis ainda conste na categoria DD (Deficiência de Dados) na Red List of Threatened Species, por se encontrar muito restrita ao estado do Rio Grande do Norte (Nogueira, 2010), onde vive dependente dos remanescentes florestais sombreados e em baixa densidade populacional (Lisboa & Freire, 2012; Lisboa et al., 2012), esta espécie está incluída na categoria Endangered (Em perigo) na Lista Nacional Oficial de Espécies da Fauna Ameaçada de Extinção por mediação da Portaria MMA n° 444/2014 (Brasil, 2014a) e no Livro Vermelho da Fauna Brasileira Ameaçada de Extinção (MMA, 2016). Anteriormente, C. natalensis já havia sido proposta como espécie-bandeira (Sousa, 2011) e decretada, através da Lei Municipal n° 6.438/2014 (Brasil, 2014b), como símbolo dos remanescentes florestais das Unidades de Conservação Parque Estadual Dunas do Natal (sua localidade tipo) e do Parque da Cidade Dom Nivaldo Monte, visando assim alertar os gestores e a população em geral para a importância da participação social na conservação dessas áreas naturais. Dado o isolamento geográfico notável das populações de C. natalensis, a possível ocorrência de sua congenérica, C. meridionalis, em simpatria, além da alta similaridade morfológica que torna difícil distinção entre essas espécies, possivelmente as espécies simpátricas divergem geneticamente. Diante deste cenário e perspectiva, este estudo teve como objetivos, (i) investigar potenciais áreas de ocorrência e distribuição de C. natalensis; (ii) analisar e caracterizar morfologica e geneticamente os espécimes das populações de Coleodactylus em remanescentes florestais do RN com ocorrência registrada de C. natalensis; (iii) investigar ocorrência em simpatria desta espécie com C. meridionalis e a retenção das respectivas identidades moleculares nessa possível condição. Para atendimento aos objetivos, esta Dissertação está composta por dois capítulos, os quais corresponderão a artigos científicos a serem submetidos à publicação. O primeiro, trata da investigação sobre a distribuição potencial de C. natalensis através da modelagem de nicho ecológico, utilizando os registros de ocorrência existentes para a espécie e variáveis ambientais. O segundo, aborda o estudo morfológico e molecular das populações de Coleodactylus obtidas durante este trabalho em remanescentes florestais do Rio Grande do Norte.

2 METODOLOGIA GERAL

Em atendimento aos objetivos propostos, a metodologia geral está subdividida e em conformidade com estes, como detalhado a seguir.

2.1 MODELAGEM DE NICHO ECOLÓGICO

Para esta modelagem, os pontos de ocorrência de C. natalensis foram obtidos do banco de dados da Coleção Herpetológica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) e consultas à literatura especializada. O modelo de distribuição foi gerado usando o

MAXENT 3.3.3k (Phillips et al., 2006). As variáveis ambientais (BIO1-BIO19) foram obtidas do WorldClim (WorldClim.org; Hijmans et al., 2005) na forma de grids gerais com resolução de 30 arc-segundos (~1 km), detalhadas no capítulo I desta dissertação. As variáveis climáticas do Bioclim foram utilizadas para condições atuais (anos ~1950–2000). As camadas bioclimáticas foram selecionadas incluindo toda a Mata Atlântica setentrional, do estado de Sergipe ao Rio Grande do Norte. O modelo foi gerado no pacote dismo no programa R (Hijmans et al., 2017).

2.2 ÁREAS DE ESTUDO

A partir dos dados gerados na modelagem de nicho ecológico, quatro áreas de amostragens dos táxons foram definidas para coletas de espécimes do gênero Coleodactylus na Mata Atlântica potiguar (Figura 5): Área de Proteção Ambiental Jenipabu (APAJ, –5.7055; –35.2093), municípios de Extremoz e Natal; Parque Estadual Dunas do Natal “Jornalista Luiz Maria Alves” (PEDN, –5.8353; –35.1901. Localidade tipo de C. natalensis), município de Natal; Parque da Cidade Dom Nivaldo Monte (PCNM, –5.8463; –35.2310), Natal; e o Parque Estadual Mata da Pipa (PEMP, –6.2302; –35.0646), município de Tibau do Sul, RN. Os métodos apresentados daqui em diante estão detalhados no Capítulo II.

2.3 AMOSTRAGEM DOS TÁXONS

As duas espécies de Coleodactylus de remanescentes florestais do Nordeste brasileiro foram representadas por n ≤ 10 indivíduos de ambas as espécies em cada localidade de ocorrência, contemplando quatro áreas amostrais (SISBIO n° 62539-1). Estas foram 18

selecionadas visando cobrir parte significativa da distribuição de C. natalensis e área de provável simpatria com C. meridionalis. O N amostral por área investigada foi: APAJ (n = 5), PEDN (Coleção Científica, n = 34 e dados do GenBank, n = 2), PCNM (n = 10), e PEMP (n = 10).

Figura 5. Recorte do mapa do Rio Grande do Norte com destaque para áreas de coletas de espécimes de Coleodactylus. Áreas amostradas para coleta de espécimes de Coleodactylus nos remanescentes de Mata Atlântica do Rio Grande do Norte. Unidades amostrais: 1 (APAJ), 2 (PEDN), 3 (PCNM), 4 (PEMP). Fonte: Elaborado por Matheus Meira-Ribeiro.

Em campo, todos os indivíduos foram coletados por método manual, com auxílio de ancinho para remoção do folhiço denso das áreas florestadas das áreas de estudo. Os lagartos coletados foram mantidos em sacos plásticos, identificados com números de campo e acondicionados em caixa térmica de poliestireno expandido (10 a 5 °C); em seguida, foram transferidos para freezer vertical Consul® 231 L (0 a −18 °C) para eutanásia por resfriamento no Laboratório de Herpetologia da UFRN. Por se tratarem de pequenos vertebrados ectotérmicos, o processo de eutanásia segue o protocolo descrito por Shine et al. (2015), o 19

qual estabelece a morte destes animais por resfriamento a baixas temperaturas (10 a 5 °C) antes de expô-lo a temperaturas de congelamento (0 a −18 °C). As considerações fisiológicas e princípios físicos embasados na literatura acerca deste método são concludentes que répteis são incapazes de sofrer dor em temperaturas baixas, quando os cristais de gelo se formam nos tecidos durante o resfriamento do corpo (Lillywhite et al., 2017). Nesse aspecto, a nocicepção é diminuída e extinta em temperaturas muito baixas devido às ações de anestesia do frio nas membranas, ao bloqueio do frio na condução nervosa e à falta de função cerebral em espécies sensíveis ao frio (Shine et al., 2015; Lillywhite et al., 2017).

2.4 MORFOMETRIAS E CARACTERES MERÍSTICOS

Para os lagartos coletados, foram mensuradas medidas do corpo (comprimento rostro- cloacal e comprimento da cauda) com o auxílio de paquímetro digital, fixados em formalina a 10% e mantidos em álcool a 70%. Os caracteres merísticos diagnósticos para as espécies foram identificados sob estereomicroscópio Olympus® SZX7 no Laboratório de Herpetologia da UFRN, utilizando literatura taxonômica especializada, inclusive o trabalho original de descrição da espécie C. natalensis (Freire, 1999), além de alguns dados merísticos utilizados na descrição de C. elizae (Gonçalves et al., 2012). Espécimes de C. meridionalis e C. natalensis tombados na Coleção Herpetológica da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN), coletados em trabalhos anteriores em áreas de Mata Atlântica do Rio Grande do Norte, também foram incluídos nas análises morfométrica e merística. Os lagartos amostrados neste trabalho foram tombados com voucher definitivo na Coleção Herpetológica da UFRN.

2.5 PROCEDIMENTOS MOLECULARES E FILOGENÉTICOS

No Laboratório de Herpetologia, as amostras de tecido (fígado e cauda) foram excisadas dos animais, congelados em nitrogênio líquido e armazenados em Ultrafreezer vertical em −80 °C no Laboratório de Biologia Molecular e Genômica da UFRN. Posteriormente, alíquotas destes tecidos foram tombados na Coleção Herpetológica de Tecidos da UFRN. A extração do DNA foi realizada no Laboratório de Transformação de Plantas e Análises em Microscopia da UFRN, por meio do método com proteinase K (adaptado de Fetzner, 1999). Após a extração de DNA, a integridade e quantificação do DNA genômico foi 20

verificada por meio de espectrofotômetro NanoDrop e gel de agarose em uma corrida eletroforética. As reações em cadeia da polimerase (PCR) foram realizadas em termociclador (Eppendorf – Mastercycler Personal) para quatro regiões parciais de DNA mitocondrial (citocromo b e 16S) e DNA nuclear (RAG-1 e c-mos), utilizando os primers bem estabelecidos na literatura para o estudo de evolução em lagartos (Geurgas et al., 2008; Geurgas & Rodrigues, 2010). Este material amplificado foi separado em gel de agarose 1% em uma corrida eletroforética. Para o sequenciamento, as amostras de produtos amplificados foram purificadas e realizadas as reações para sequenciamento utilizando o BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (código 4337455). Este material foi separado utilizando o sequenciador automatizado ABI 3500 DNA Analyzer. Estas etapas foram realizadas pela Facility NUGEN/Laboratório de Biologia Molecular e Genômica (CB/UFRN). As sequências obtidas foram analisadas pelo software Sequencing Analysis v.6 utilizando o KB Basecaller v1.4. Para cada exemplar, as sequências obtidas foram editadas no programa MEGA-X v10.0.5 (Kumar et al., 2018) e as confirmações das sequências para cada gene aferidas com busca comparativa no GenBank, utilizando o algoritmo Megablast do BLAST. As sequências foram alinhadas utilizando os parâmetros default do programa ClustalW (Thompson et al., 1994) implementado no programa MEGA-X v10.0.5 (Kumar et al., 2018). Foram realizados testes de neutralidade, tais como o teste D de Tajima (1989) e os testes F e o D de Fu & Li (1993), disponíveis no programa DNA Sequence Polymorphism 6.12.01 (Rozas et al., 2017) e no Arlequin v.3.5.2.2 (Excoffier & Lischer, 2010). O primeiro analisou as diferenças entre os números de sítios polimórficos comparados com os números de diferenças nucleotídicas e a partir de seus valores foram inferidos possíveis movimentos populacionais. O segundo teste foi baseado na distribuição haplotípica e seus valores também puderam inferir movimentos populacionais (Fu, 1997). Os haplótipos das populações foram relacionados por meio de redes de haplótipos, construídas a partir do algoritmo de median-joing no software NETWORK 5.1.1 (Fluxus Engineering). As estimativas do número de haplótipos, número de sítios variáveis, diversidade haplotípica e diversidade nucleotídica foram feitas no programa DNA Sequence Polymorphism 6.12.01 (Rozas et al., 2017). Com base em uma matriz, as estimativas de distância genética entre as sequências foram inferidas por meio do MEGA-X v10.0.5 (Kumar et al., 2018). 21

Por meio das sequências, a história evolutiva destes indivíduos foi inferida por meio da construção de uma árvore filogenética concatenada pelo método de inferência bayesiana. Para isso, foi analisado o modelo de substituição adequado a ser aplicado a cada alinhamento, no MEGA-X. Com essa informação, foi possível obter o arquivo com a extensão .XML com as instruções para o início da inferência através do programa BEAUti 2, e a criação das árvores que se efetuou no programa BEAST v2.4.8 (Bouckaert et al., 2014). Embora existam diferenças quanto ao modelo de substituição utilizado e à proporção invariante, há uma constante em todas as análises feitas: o prior utilizado foi “coalescent constant population” e o comprimento da corrente (chain length) foi de 10.000.000 (10 milhões). As árvores foram apresentadas utilizando o programa DensiTtree – Tree Set Visualizer v2.2.6. Foi empregado o TreeAnnotator v2.4.8 para extinguir as árvores iniciais, ou seja, 10%; estas, porém, que são úteis na parte inicial da cadeia do MCMC (Markov chain Monte Carlo – cadeia de Markov de Monte Carlo), onde aproxima-se da distribuição de amostragem a partir do seu início, sendo assim descartadas. A árvore consenso final foi editada e visualizada via programa FigTree v1.4.3.

3 CAPÍTULO I

GEOGRAPHIC DISTRIBUTION MODEL FOR Coleodactylus natalensis FREIRE, 1999 (SQUAMATA: SPHAERODACTYLIDAE) IN NORTHEASTERN BRAZILIAN ATLANTIC FOREST

Este capítulo está formatado de acordo com as normas da Revista Zoologia (Curitiba): An International Journal for Zoology. Foi submetido como Short Communication e retornado com correções que estão sendo realizadas para efetuar nova submissão.

Bruno de Paiva Rêgo1,2, Raul Fernandes Dantas Sales2 and Eliza Maria Xavier Freire2

1Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Campus Universitário Lagoa Nova, 59078-970 Natal, RN, Brazil. Corresponding author: Bruno de Paiva Rêgo ([email protected])

2Laboratório de Herpetologia, Departamento de Botânica e Zoologia, Centro de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Campus Universitário Lagoa Nova, 59078- 970 Natal, RN, Brazil.

ABSTRACT. In this paper, we investigated the potential geographic distribution of the threatened species Coleodactylus natalensis through ecological niche modeling. Occurrence records were obtained from literature and consulting of the Herpetological Collection of the Federal University of Rio Grande do Norte (UFRN). The model was built using Maximum Entropy Modeling (MAXENT), a well-established algorithm that works well with small samples. The model predicted a high environmental suitability to the Atlantic Forest in the east coast of Rio Grande do Norte state, medium suitability to the northeast coast and inland agreste areas of this state, and also to the Atlantic Forest of Paraíba state. The restricted distribution of C. natalensis is influenced by a small area of environmental suitability strongly correlated to precipitation and temperature. Additionally, the occurrence of the congeneric species C. meridionalis may also act as a limiting factor for C. natalensis distribution along the northeastern Atlantic Forest. By being a flagship species, threatened with extinction and symbol of the green areas of Natal municipality, it plays an important role in the conservation of the Atlantic Forest remnants of Rio Grande do Norte state.

KEY WORDS. Biogeography, lizards, niche modelling, potential geographic distribution, remaining forest, sphaerodactyl gecko.

1 INTRODUCTION

In the last decades, the ecological niche modeling (ENM) has broadened the knowledge about the geographic distribution of species, determining by statistical methods their potential extensions along the landscapes (Marmion et al. 2009). ENM techniques use occurrence data of the species and environmental variables of the occurrence points to identify which areas are propitious to the maintenance of the populations (Kaliontzopoulou et al. 2008, Muñoz et al. 2016). With respect to reptiles, especially lizards of the cosmopolitan clade Gekkota, these tools can help to understand the biogeography of the species with restricted distributions (Vanzolini 1957, 1968a, b, Vitt et al. 2005, Rödder et al. 2008), since it has been useful to predict potential distribution of other taxa (Sales et al. 2015). In Brazil, representatives of Gekkota are distributed throughout the range of the most different ecosystems, with considerable representativeness in lizard assemblages (Vanzolini 1957, 1968a, b, Rodrigues 2003, Vitt et al. 2005, Andrade et al. 2013). Among geckos of the Sphaerodactylidae family, the Coleodactylus genus includes five described species distributed throughout South America (Freire 1999, Geurgas et al. 2008, Gamble et al. 2011, Gonçalves 24

et al. 2012, Correia et al. 2016). The monophyly of the genus is supported by both morphological (Vanzolini 1957, Ávila-Pires 1995, Freire 1999) and genetic (Geurgas et al. 2008, Correia et al. 2016) characters. Coleodactylus lizards have the smaller body sizes among South American lizards, and occupy peculiar habitats, such as forest foliage and bromeliad clumps (Vanzolini 1957, Vitt et al. 2005, Geurgas et al. 2008, P.A.G. Sousa unpubl. data, Gonçalves et al. 2012). In the Atlantic Forest of northeastern Brazil, three species are known to occur (Vanzolini 1957, Freire 1999, Gonçalves et al. 2012). Coleodactylus meridionalis (Boulenger, 1888) is the oldest of these (Geurgas et al. 2008, Correia et al. 2016), with a wide distribution in remnants of Atlantic Forest from Bahia to Rio Grande do Norte states, and also in forested habitats throughout the semiarid Caatinga, from Maranhão to Bahia (Vanzolini et al. 1980, Colli et al. 2002, Rodrigues 2003, Damasceno et al. 2014). Coleodactylus natalensis Freire, 1999 (Figure 1) and Coleodactylus elizae Gonçalves, Torquato, Skuk and Sena, 2012 have smaller distributions restricted to the Atlantic Forest of northeastern Brazil: C. elizae is endemic to forest fragments in Alagoas state, and C. natalensis is restricted to forest remnants of Rio Grande do Norte state (Freire 1999, Sousa and Freire 2010, Gonçalves et al. 2012). In Rio Grande do Norte, C. meridionalis seems to occur in sympatry with C. natalensis in some forest fragments on the southern coast of the state (P.A.G. Sousa unpubl. data). Although C. natalensis is still classified in the DD (Data Deficiency) category in the IUCN Red List of Threatened Species (Nogueira 2010), it was included in the Endangered category in the Official National List of Threatened species of Fauna (MMA Ordinance No. 444/2014; Brasil 2014a, MMA 2016), due to a very restricted known distribution, dependency of on shady forest remnants, and low population density (Lisboa and Freire 2012, Lisboa et al. 2012). Efforts to monitor and maintain the populations of C. natalensis have been performed for some areas over the last decade. In this sense, studies have addressed natural history (Lisboa et al. 2008, P.A.G. Sousa unpubl. data, Sousa and Freire 2010), feeding ecology (P.A.G. Sousa unpubl. data, Sousa et al. 2010, Lisboa et al. 2012), habitat use (Capistrano and Freire 2009, P.A.G. Sousa unpubl. data, Lisboa and Freire 2012), thermal ecology (P.A.G. Sousa unpubl. data, Sousa and Freire 2011), and population density (Lisboa and Freire 2012). In addition, C. natalensis was proposed as flagship species of green areas of Natal municipality (its type locality) by DC Sousa (unpubl. data) and decreed by Municipal Law No. 6,438/2014 (Brasil 2014b) as a symbol of the forest remnants of the Conservation Units 25

Parque Estadual Dunas do Natal and Parque da Cidade Dom Nivaldo Monte, aiming at social participation in the conservation of these natural areas. In view of the restricted distribution of C. natalensis and its degree of threat due to habitat loss and fragmentation, this study aimed to investigate the potential distribution of this species through ecological niche modeling using the existing occurrence records for the species and environmental variables.

2 MATERIAL AND METHODS

The occurrence points of C. natalensis used in this study were obtained from the database of the Herpetological Collection of the Federal University of Rio Grande do Norte (UFRN) and published literature records. This search obtained a total of 17 occurrence records for the species (Table 1). The distribution model was generated using MAXENT 3.3.3k (Phillips et al. 2006), an algorithm well established in the literature (Elith et al. 2006) and that works well with small samples (Pearson et al. 2007). MAXENT uses a probabilistic distribution of maximum entropy to predict species distributions from presence data. The environmental variables were obtained from the WorldClim database (Hijmans et al. 2005; www.worldclim.org) in the form of general grids with a resolution of 30 arc-seconds (~1 km). Bioclim climatic variables were used for current conditions (~1950–2000). Bioclimatic layers were cut at latitudes from 11.3°S to 4.4°S and longitudes from 38.5°W to 34.4°W; this area includes the entire northeastern Atlantic Forest to the state of Sergipe, and also includes a portion of the Caatinga of the states of Rio Grande do Norte, Paraíba, Pernambuco, Alagoas and Sergipe. Nine of the 19 original climatic variables were excluded due to high correlations (r > 0.8), to minimize multicollinearity between the layers. The variables used were Bio2 (mean daily amplitude - represents the monthly average of the daily differences between maximum and minimum temperatures), Bio3 (isothermality), Bio7 (annual temperature amplitude), Bio8 (mean temperature of wettest quarter), Bio9 (mean temperature of driest quarter), Bio12 (annual precipitation), Bio13 (precipitation of wettest month), Bio15 (seasonality in precipitation – coefficient of variation), Bio 17 (precipitation of the driest quarter), and Bio18 (precipitation of the warmest quarter). A total of 10 bootstrap replications were performed, with 25% of random test points to evaluate the model, which was generated in the dismo package in R software (Hijmans et al. 2017).

3 RESULTS

A ser publicado em artigo científico.

4 DISCUSSION

A ser publicado em artigo científico.

CONCLUSIONS

A ser publicado em artigo científico.

ACKNOWLEDGEMENTS

This study was financed by research subsidies from the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) to BPR and RFDS, and from Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) to EMXF (process number 309424/2011-9). Adriana M. Almeida for the course on Remote Sensing in Landscape Ecology.

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4 CAPÍTULO II

VARIABILIDADE MORFOLÓGICA E FILOGENIA MOLECULAR DE Coleodactylus natalensis FREIRE, 1999 (SQUAMATA: SPHAERODACTYLIDAE)

RESUMO

Os processos evolutivos são multidimensionais e em áreas isoladas costumam ser mais evidentes, o que podem tornar espécies simpátricas suscetíveis a uma maior variação intrapopulacional. Nesse contexto, as cinco espécies de lagartos do gênero Coleodactylus ocorrem apenas em áreas florestadas, inclusive remanescentes insulares da América do Sul e, no Brasil, três destas no Nordeste, constituindo o grupo meridionalis. Neste clado, C. natalensis divergiu há 1,9 milhões de anos de C. meridionalis, mantendo alta sobreposição quanto aos caracteres merísticos. Este último habita remanescentes florestais em toda a Região Nordeste, inclusive áreas de Mata Atlântica onde C. natalensis é endêmico no estado do Rio Grande do Norte (RN). Diante da ocorrência restrita e ameaçada de C. natalensis, este trabalho teve como objetivos analisar e caracterizar os espécimes morfologica e molecularmente, investigar ocorrência em simpatria desta espécie com C. meridionalis e a retenção das respectivas identidades moleculares nessa possível condição. Para tanto, foram coletados espécimes deste gênero no Parque Estadual Dunas do Natal (PEDN), Parque da Cidade Dom Nivaldo Monte (PCNM), Área de Proteção Ambiental Jenipabu (APAJ) e no Parque Estadual Mata da Pipa (PEMP). Nas análises merísticas, também foram incluídos espécimes tombados na Coleção Herpetológica da UFRN. Para a construção dos dados de bioinformática como as redes de haplótipos e as reconstruções filogenéticas, foram sequenciadas regiões dos genes cytb, c-mos, RAG-1 e 16S. As análises merísticas dos 25 exemplares de Coleodactylus spp. coletados, resultaram na formação de dois grupos de morfotipos. Um composto pelas populações de C. natalensis da APAJ, PEDN, PCNM e PEMP, e outro apenas com C. natalensis do PEMP. As análises moleculares corroboraram o encontrado para a morfologia, com os mesmos agrupamentos respondidos principalmente pelas redes de haplótipos do cytb e 16S. Os genes c-mos e RAG-1 mostraram-se bastante conservativos em suas sequências, unindo indivíduos de localidades distantes em suas redes. Nas reconstruções filogenéticas, é possível identificar duas linhagens de C. natalensis para três áreas amostradas. Os exemplares do PEMP são os mais distintos nas sequências nucleotídicas e grupo-irmão das demais populações; PCNM forma um clado com APAJ e com apenas um indivíduo do PEMP. Portanto, as análises morfológicas e moleculares sugerem a existência de duas linhagens compondo o referido táxon.

Palavras-chave: Variabilidade genética; Sphaerodactylinae; lagartos; genética de populações; sequenciamento de DNA; rede de haplótipos.

1 INTRODUÇÃO

Os processos evolutivos estão propensos a serem contínuos e multidimensionais, comumente difíceis de serem observados na natureza, fatos estes que tornam as espécies suscetíveis aos diversos mecanismos de seleção (Bolnick & Fitzpatrick, 2007; Mallet, 2007; Berner et al., 2009). Em áreas geograficamente isoladas, como ilhas de vegetação ou remanescentes florestais, a especiação costuma ser mais acentuada que nas regiões contínuas e torna mais fácil a identificação das espécies (Vanzolini, 1981). Em simpatria nesses refúgios, os táxons podem consistir em populações variáveis (Vanzolini & Williams, 1981), resultando em evolução pelo isolamento reprodutivo (Bolnick & Fitzpatrick, 2007), ou ainda apresentarem divergência recente em sintopia, podendo gerar indivíduos híbridos (Mallet, 2007). Fatos semelhantes podem estar ocorrendo com espécies de lagartos do grupo Gekkota/Sphaerodactylinae, especificamente no gênero Coleodactylus, que abriga algumas espécies simpátricas sul-americanas distribuídas em áreas florestadas, inclusive remanescentes insulares, do Brasil (Geurgas et al., 2008). Este gênero abriga cinco espécies, com três destas ocorrentes na Mata Atlântica do nordeste (Vanzolini, 1957; Freire, 1999; Gonçalves et al., 2012). Coleodactylus meridionalis é a mais antiga e constitui um complexo de espécies crípticas (Geurgas et al., 2008), com ampliação de sua distribuição em áreas florestadas do Semiárido (Vanzolini et al., 1980; Ribeiro et al., 2013). Coleodactylus natalensis e C. elizae, também do grupo meridionalis; esta última ocorre apenas na região de Maceió, Alagoas (Gonçalves et al., 2012), e C. natalensis é endêmica de remanescentes de Mata Atlântica do Rio Grande do Norte (Freire, 1999; Lisboa & Freire, 2012). Populações de C. meridionalis também foram registradas em alguns remanescentes florestais do Rio Grande do Norte, possivelmente em simpatria com população de C. natalensis (Sousa, 2010). Coleodactylus natalensis e C. meridionalis têm extensa sobreposição em caracteres merísticos, sendo diferenciadas majoritariamente por padrão de coloração (Freire, 1999); em C. natalensis há dicromatismo sexual, com os machos possuindo mancha branca em formato de W no topo da cabeça, ausente nas fêmeas, o que as torna quase que idênticas aos espécimes de C. meridionalis. Coleodactylus natalensis também difere de sua congenérica por apresentar um padrão de estreitas faixas brancas dorsolaterais (Freire, 1999; Figura 4 da Introdução Geral), além de escama rostral dividida e com micro-ornamentações em forma de fossetas profundas de apenas um cílio; nas escamas pós-rostrais estas são em forma de fossetas rasas com variação de três a oito por escamas (Meira-Ribeiro, 2012). 33

A divergência/especiação de C. natalensis é recente, cerca de 1,9 ± 1,3 Ma (Geurgas et al., 2008), fato que confirma a acumulação de mudanças morfológicas nesse clado tardia (Vanzolini, 1957; Vitt et al., 2005); portanto, essas alterações só foram melhor compreendidas após análises moleculares (Geurgas et al., 2008; Gamble et al., 2011; Damasceno et al., 2014; Correia et al., 2016). No âmbito da conservação, embora C. natalensis conste na categoria DD (Deficiência de Dados) na Red List of Threatened Species (Nogueira, 2010), por ser restrita ao estado do Rio Grande do Norte, onde ocupa remanescentes florestais sombreados e em baixa densidade populacional (Lisboa & Freire, 2012; Lisboa et al., 2012), está incluída na categoria Endangered (Em perigo) na Lista Nacional Oficial de Espécies da Fauna Ameaçada de Extinção por mediação da Portaria MMA n° 444/2014 (Brasil, 2014a) e no Livro Vermelho da Fauna Brasileira Ameaçada de Extinção (MMA, 2016). Somado a isso, C. natalensis foi proposta como espécie-bandeira por Sousa (2011) e decretada através da Lei Municipal n° 6.438/2014 (Brasil, 2014b) como símbolo dos remanescentes florestais das Unidades de Conservação Parque Estadual Dunas do Natal e do Parque da Cidade Dom Nivaldo Monte, visando assim, a participação social na conservação dessas áreas naturais. Em estudo anterior, C. natalensis já havia sido proposta como espécie-bandeira (Sousa, 2011) e decretada, através da Lei Municipal n° 6.438/2014 (Brasil, 2014b), como símbolo dos remanescentes florestais das Unidades de Conservação Parque Estadual Dunas do Natal (sua localidade tipo) e do Parque da Cidade Dom Nivaldo Monte, visando assim alertar os gestores e a população em geral para a participação social na conservação dessas áreas naturais. Dado o isolamento geográfico notável das populações de C. natalensis, a possível ocorrência de sua congenérica, C. meridionalis, em simpatria, além da alta similaridade morfológica que torna difícil a distinção entre essas espécies, possivelmente as espécies simpátricas divirjam morfologica e geneticamente. Nessa perspectiva, são imprescindíveis análises merísticas e moleculares que possibilitem a identificação das espécies e populações em remanescentes de Mata Atlântica do Rio Grande do Norte. Portanto, os objetivos que nortearam este trabalho foram, identificar merística e morfologicamente as populações do gênero Coleodactylus ocorrentes nos remanescentes florestais do Rio Grande do Norte, identificar estas populações e suas relações haplotípicas e, por meio de estudos moleculares, identificar e compreender as relações filogenéticas entre as congenéricas, C. natalensis e C. meridionalis, em provável simpatria nestes remanescentes.

2 MATERIAL E MÉTODOS

2.1 Amostragem dos táxons

Os espécimes de Coleodactylus de remanescentes florestais do Rio Grande do Norte foram representadas por n ≤ 10 indivíduos de ambas as espécies em cada localidade de ocorrência, sendo contempladas quatro áreas amostrais (SISBIO n° 62539-1), visando cobrir parte significativa da distribuição de C. natalensis e possível área de simpatria com C. meridionalis (Sousa, 2010). O N amostral por área investigada foi: Área de Proteção Ambiental Jenipabu (APAJ; n = 5), Parque Estadual Dunas do Natal “Jornalista Luiz Maria Alves” (PEDN, localidade tipo de C. natalensis; Coleção Herpetológica da UFRN [n = 34]), Parque da Cidade Dom Nivaldo Monte (PCNM; n = 10), e Parque Estadual Mata da Pipa (PEMP; n = 10). Para a comparação da variabilidade genética entre as populações e entre os indivíduos, foram analisadas sequências de alguns exemplares destas localidades (Tabela 1). Alíquotas de tecidos (caudas e fígados) foram isoladas em papel alumínio dentro de sacos plásticos e encontram-se depositadas em Ultrafreezer vertical em −80°C na Coleção de Tecidos de Répteis e Anfíbios, no Laboratório de Biologia Molecular e Genômica da UFRN, sob curadoria da Dra. Katia Scortecci.

Tabela 1. Localidade, número de tombo, sexo e regiões gênicas amplificadas para 13 exemplares de Coleodactylus natalensis. M: macho; F: fêmea. DNA genômico Espécie Localidade Voucher Sexo c- RAG- 16S cytb mos 1 UFRN5472 M X - X X Parque da Cidade Dom Nivaldo UFRN5473 F X X X X Monte (PCNM) UFRN5475 F X X X X UFRN5477 M X X X X UFRN5482 F X X X X Área de Proteção Ambiental UFRN5483 F X X X X Coleodactylus Jenipabu (APAJ) UFRN5484 F X X X X natalensis UFRN5485 F X X X X UFRN5487 F X X X X UFRN5488 F X X X X Parque Estadual Mata da Pipa UFRN5491 M X X X - (PEMP) UFRN5492 F X X X X UFRN5493 F X X X X

2.2 Morfometrias e caracteres merísticos

Para os 25 espécimes de C. natalensis coletados, foram mensurados os comprimentos rostro-cloacal e da cauda com o auxílio de paquímetro digital; em seguida, foram identificados por sexo e faixa etária (Freire, 1999), retiradas amostras de tecidos do fígado e/ou cauda, fixados em formalina a 10% e mantidos em álcool a 70%. Os caracteres merísticos diagnósticos foram identificados sob estereomicroscópio Olympus® SZX7, no Laboratório de Herpetologia da UFRN, utilizando literatura taxonômica especializada, inclusive os trabalhos originais de descrições das espécies C. natalensis (Freire, 1999) e C. elizae (Gonçalves et al. 2012). Tais caracteres foram: número de escamas pós-rostrais, formato da escama rostral, número de escamas ventrais, número de escamas em volta do meio do corpo, número de lamelas do 4° artelho, número e formato das escamas do estojo ungueal. Espécimes de C. natalensis da Coleção Herpetológica da UFRN, obtidos nas mesmas áreas deste trabalho também foram incluídos nas análises morfométricas e merísticas. Os lagartos coletados durante este estudo foram depositados na Coleção Herpetológica da UFRN, tombados com voucher definitivo.

2.3 Extração de DNA

O DNA genômico total foi extraído a partir das amostras de fígado ou cauda armazenados em ultrafreezer vertical em −80°C na Coleção de Tecidos de Répteis e Anfíbios, no Laboratório de Biologia Molecular e Genômica da UFRN. No Laboratório de Transformação de Plantas e Análises em Microscopia/UFRN, os DNAs genômicos totais foram extraídos pelo método de proteinase K (adaptado de Fetzner, 1999), conforme detalhamento a seguir. Uma pequena amostra de tecido foi colocada em um tubo de 1,5 mL e adicionados 900 μL de tampão de lise celular [Tris-base 10 mM, EDTA 10 mM, 2% de dodecil sulfato de sódio (SDS), pH 8,0] juntamente com 9 μL de proteinase K (20 mg/mL). O tecido foi macerado com um pistilo e toda a solução foi misturada por inversão aproximadamente 20 vezes. A amostra foi incubada a 55 °C em estufa por overnight, com inversões ocasionais durante as primeiras horas. Uma vez digerida, a amostra foi retirada da estufa e colocada em repouso até atingir temperatura ambiente. A amostra foi centrifugada (centrífuga MIKRO 220/220R Hettich) a 11.000 rpm (116.339,08 g) em 4 °C por 5 minutos. Depois, em temperatura ambiente, o sobrenadante 36

contendo o DNA foi transferido para um novo tubo de 1,5 mL. Para a precipitação de proteínas, foram adicionados 300 μL de acetato de amônio 7,5 M, invertida 20 vezes e incubada em −20 °C por 10-15 minutos. Depois, removida do freezer e centrifugada por 5 minutos em velocidade máxima (13.000-14.000 rpm; 162.490,12-188.450,08 g) para precipitação de remanescentes de tecido, proteínas, SDS e outras moléculas, que formaram um pellet. O DNA genômico ficou em suspensão e então foi transferido para um novo tubo de 1,5 mL e centrifugado em velocidade máxima por 2-3 minutos adicionais para a precipitação e formação do pellet dos pequenos fragmentos presentes no sobrenadante. O sobrenadante desta centrifugação foi transferido para um novo tubo de 2 mL contendo agora 900 μL de isopropanol, e este foi invertido gentilmente 20 vezes para a mistura. Em seguida, a amostra foi armazenada em −20 °C em overnight. Posteriormente, a amostra foi retirada do freezer e centrifugada por 5 minutos em velocidade máxima (13.000- 14.000 rpm; 162.490,12-188.450,08 g) para a precipitação do pellet de DNA. Após a centrifugação, o isopropanol foi descartado e o pellet lavado com 500 μL de etanol 70% e o tubo invertido suavemente 20 vezes. A amostra foi centrifugada novamente por mais 5 minutos em 13.000 rpm (162.490,12 g) e o etanol removido. O tubo foi invertido sobre um pedaço de papel toalha e deixado com a tampa aberta, possibilitando a evaporação completa do etanol em temperatura ambiente por cerca de 20 minutos. Depois de seco, o pellet de DNA foi ressuspendido em 50 μL de H2O Milli-Q®. A amostra foi então armazenada em freezer −20 °C até seu uso, e uma alíquota separada para quantificação em espectrofotômetro NanoDrop e verificação do padrão pela separação em gel de agarose 0,7%.

2.4 Verificação em gel de agarose da presença e integridade do DNA extraído

Para a verificação do padrão de extração do DNA genômico, foi feito inicialmente o gel de agarose em 0,7%/ TAE 1×, o qual foi utilizado uma alíquota da amostra de DNA – 3 μL. A esta alíquota foi adicionado 1/10 v de corante Bromphenol e SYBR Green (Invitrogen). Este material foi separado numa corrida eletroforética em 80 V e 150 mA por aproximadamente 40 minutos. A quantificação do DNA foi feita através de fotodocumentação em transluminador sob luz ultravioleta.

2.5 Amplificação das regiões gênicas e purificação dos produtos de PCR

As amplificações pela reação em cadeia da polimerase (PCR) para quatro regiões parciais de DNA mitocondrial (citocromo b e 16S) e DNA nuclear (RAG-1 e c-mos) foram realizadas seguindo as condições detalhadas na Tabela 2.

Tabela 2. Primers utilizados nas reações de amplificação e sequenciamento, e as condições de amplificação do DNA. Região Primer Sequência (5’-3’) Condições de PCR Referência gênica GAA AAA CCA YCG TTG 94°C (5min), [94°C LGL765 Bickham et al. (1995) Citocromo TWA TTC AAC T (40seg), 50°C (40seg), b TGC AGC CCC TCA GAA 72°C (40seg)] 35×, 72°C H15149 Kocher et al. (1989) TGA TAT TTG TCC TCA (10min) CTC TGG KGG CTT TGG 94°C (5min), [94°C LSCH1 Godinho et al. (2005) KKC TGT STA CAA GG (40seg), 50°C (40seg), c-mos GGT GAT GGC AAA RGA 72°C (40seg)] 35×, 72°C LSCH2 Godinho et al. (2005) GTA GAT GTC TGC (10min) TGG AAR TTC AAR CTG 94°C (5min), [94°C F94 Townsend et al. (2004) TTC AAA GT (40seg), 50°C (40seg), RAG-1 GTN TCA TCA TCT ACT 72°C (40seg)] 35×, 72°C R387 Townsend et al. (2004) GGT CCA (10min) TGT TTA CCA AAA ACA 94°C (5min), [94°C 16S F.1 Whiting et al. (2003) TAG CCT TTA GC (40seg), 50°C (40seg), 16S TAG ATA GAA ACC GAC 72°C (40seg)] 35×, 72°C 16S R.0 Whiting et al. (2003) CTG GAT T (10min)

Para cada exemplar e região gênica amplificada pela PCR foi preparado um Mix de 25 μL contendo as seguintes concentrações dos reagentes da reação: dNTPs 0,2 mM, tampão 1×,

MgCl2 1,5 mM, primer F 10 mM, primer R 10 mM, Taq 2,5 U-Polimerase (Sinapse), H2O Milli-Q® e DNA. Em cada um dos tubos foram adicionados 22 μL do Mix e 3 μL de DNA, mantendo-os no gelo. Logo em seguida, as amostras foram colocadas no termociclador (Eppendorf – Mastercycler Personal) para amplificação nas condições apresentadas na Tabela 2. Para a verificação dos produtos amplificados, foi feita uma eletroforese em gel de agarose em 1% em TAE 1× no qual foi adicionado Brometo de Etídio (estoque a 2 mg/mL). Este gel foi separado utilizando 100 V e 190 mA por aproximadamente 30 minutos.

2.6 Sequenciamento e análise dos fragmentos amplificados

Para o sequenciamento, as amostras dos produtos amplificados foram purificadas e a reação de sequenciamento foi realizada utilizando o BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (código 4337455), as amostras foram sequenciadas utilizando o ABI 3500 DNA Analyzer. Os procedimentos foram feitos pela Facility NUGEN/Laboratório de Biologia Molecular e Genômica (CB/UFRN). As sequências obtidas foram analisadas pelo software Sequencing Analysis v.6 utilizando o KB Basecaller v1.4. As sequências analisadas correspondem às quatro regiões parciais dos DNAs genômicos (citocromo b, c-mos, RAG-1 e 16S). Para cada exemplar, as sequências obtidas foram editadas no programa MEGA-X v10.0.5 (Kumar et al., 2018) e as confirmações das sequências para cada gene aferidas por meio de busca comparativa no repositório online do GenBank, utilizando o algoritmo Megablast do BLAST. As sequências foram alinhadas utilizando os parâmetros default do programa ClustalW (Thompson et al., 1994) implementado no programa MEGA-X v10.0.5 (Kumar et al., 2018).

2.7 Testes de neutralidade, construção de redes de haplótipos e análises filogenéticas

Foram realizados testes de neutralidade, tais como o D de Tajima (1989) e o F e o D de Fu & Li (1993), disponíveis no programa DNA Sequence Polymorphism 6.12.01 (Rozas et al., 2017) e no Arlequin v.3.5.2.2 (Excoffier & Lischer, 2010). O primeiro analisa as diferenças entre os números de sítios polimórficos comparados com os números de diferenças nucleotídicas e a partir de seus valores são inferidos possíveis movimentos populacionais. O segundo teste é baseado na distribuição haplotípica e seus valores também podem inferir movimentos populacionais. Obtendo-se valores negativos e significativos nestes índices sugerem-se mecanismos como uma expansão populacional, já valores positivos podem indicar uma seleção estabilizadora ou uma contração populacional (Tajima, 1989; Fu, 1997). Os haplótipos das populações foram relacionados por meio de redes de haplótipos, construídas a partir do algoritmo de median-joing no software NETWORK 5.1.1 (Fluxus Engineering). As estimativas do número de haplótipos, número de sítios variáveis, diversidade haplotípica e diversidade nucleotídica foram feitas no programa DNA Sequence Polymorphism 6.12.01 (Rozas et al., 2017). A partir de uma matriz, as estimativas de distância genética entre as sequências foram inferidas através do MEGA-X v10.0.5 (Kumar et 39

al., 2018). A análise foi conduzida utilizando o modelo de Maximum Composite Likehood (Tamura et al., 2004). Por meio das sequências, a história evolutiva destes indivíduos foi inferida através da construção de uma árvore filogenética concatenada pelo método de inferência bayesiana. As análises envolveram, além das 13 sequências nucleotídicas apresentadas na Tabela 1, mais 15 disponíveis no GenBank e detalhadas na Tabela 3. Para isso, foi analisado o modelo de substituição adequado a ser aplicado a cada alinhamento, no MEGA-X. Com essa informação, foi possível obter o arquivo com a extensão .XML com as instruções para o início da inferência através do programa BEAUti 2, e a criação das árvores que se efetuou no programa BEAST v2.4.8 (Bouckaert et al., 2014). Embora existam diferenças quanto ao modelo de substituição utilizado e à proporção invariante, há uma constante em todas as análises feitas: o prior utilizado foi “coalescent constant population” e o comprimento da corrente (chain length) foi de 10.000.000 (10 milhões). As árvores foram mostradas no programa DensiTtree – Tree Set Visualizer v2.2.6. Foi empregado o TreeAnnotator v2.4.8 para extinguir as árvores iniciais, ou seja, 10%; estas, porém, que são úteis na parte inicial da cadeia do MCMC (Markov chain Monte Carlo – cadeia de Markov de Monte Carlo), onde aproxima-se da distribuição de amostragem a partir do seu início, sendo assim descartadas. A árvore consenso final foi editada e visualizada via programa FigTree v1.4.3.

Tabela 3. Lista de táxons utilizados neste estudo para reconstrução filogenética das espécies de Coleodactylus. As abreviações dos estados brasileiros em “Localidade” seguem: PB, Paraíba; CE, Ceará; MA, Maranhão; AL, Alagoas; BA, Bahia; PA, Pará; AM, Amazonas; TO, Tocantins; RR, Roraima. GenBank Família Espécie Localidade Voucher cytb c-mos RAG-1 16S Sphaerodactylidade Coleodactylus Mamanguape, MTR09762 DQ104150 EU435244 EU435199 DQ104118 meridionalis PB Coleodactylus Mamanguape, MTR09768 DQ110641 EU435245 EU435200 DQ110493 meridionalis PB Coleodactylus Pacoti, CE MTR094 DQ110633 EU435248 EU435203 DQ110491 meridionalis Coleodactylus Pacoti, CE MTR4538 DQ104149 EU435249 EU435204 DQ104117 meridionalis Coleodactylus Carolina, MA ESTR0973 GQ140506 EU435240 EU435195 EU435274 meridionalis Coleodactylus Murici, AL MTR10368 DQ104157 EU435246 EU435201 EU435270 meridionalis Coleodactylus Una, BA MD1721 DQ104153 EU435250 EU435205 DQ104121 meridionalis Chatogekko Altér do MTR09744 DQ110565 EU435221 EU435176 DQ110418 amazonicus Chão, PA Chatogekko Altér do MTR09746 DQ104134 EU435222 EU435177 DQ104102 amazonicus Chão, PA Chatogekko Acajatuba, MTR10278 DQ110602 EU435219 EU435174 DQ110455 amazonicus AM Chatogekko Acajatuba, MTR10280 DQ104141 EU435220 EU435175 DQ104109 amazonicus AM Coleodactylus Paranã, TO MTR4318 DQ104147 EU435236 EU435191 DQ104115 brachystoma Coleodactylus Paranã, TO MTR4129 DQ110711 EU435237 EU435192 DQ110563 brachystoma Coleodactylus Boa Vista, MTR09795 DQ104162 EU435254 EU435209 DQ104131 septentrionalis RR Coleodactylus Ilha de MTR09782 DQ110693 EU435256 EU435211 DQ110542 septentrionalis Maracá, RR

3 RESULTADOS

3.1 Análises morfométricas e merísticas

A ser publicado em artigo científico.

3.2 Amplificação do DNA e testes de neutralidade

A ser publicado em artigo científico.

3.3 Rede de haplótipos

A ser publicado em artigo científico. 41

3.3.1 Rede de haplótipos para o marcador citocromo b

A ser publicado em artigo científico.

3.3.2 Rede de haplótipos para o marcador c-mos

A ser publicado em artigo científico.

3.3.3 Rede de haplótipos para o marcador RAG-1

A ser publicado em artigo científico.

3.3.4 Rede de haplótipos para o marcador 16S

A ser publicado em artigo científico.

3.4 Cálculo das distâncias genéticas e estimativa de tempo de divergência

A ser publicado em artigo científico.

3.5 Reconstrução filogenética

A ser publicado em artigo científico.

4 DISCUSSÃO

A ser publicado em artigo científico.

CONSIDERAÇÕES FINAIS

A ser publicado em artigo científico.

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CONSIDERAÇÕES FINAIS DA DISSERTAÇÃO

Os resultados alcançados reforçam uma distribuição geográfica realmente restrita para C. natalensis, confirmando mais uma vez que o táxon em questão trata-se de uma espécie dependente de áreas de vegetação densa para que possa manter-se no ambiente. Neste aspecto e com visão na conservação destes remanescentes, ela pode estar criticamente em perigo. Sua distribuição torna um fator estratégico para que medidas conservacionistas sejam reforçadas nesses remanescentes. O registro de populações isoladas tanto a nível morfológico quanto molecular, bem como simpatria entre possíveis duas linhagens na área do Parque Estadual Mata da Pipa, são importantes informações para a conservação da espécie. Visto que nas análises moleculares, torna-se possível inferir para a existência de um conjunto de linhagens características para cada localidade estudada. Corroborando com os subsídios acima levantados, os genes como o citocromo b e o 16S, por serem altamente variáveis e bastante utilizados em estudos moleculares em lagartos, dão suporte à essas inferências sobre a história evolutiva dos grupos. Em caracter merístico, são encontradas diferenças principalmente entre as populações do Parque Estadual Mata da Pipa em comparação com às demais e nesta área um exemplar diverge do morfotipo padrão, suportando a hipótese de simpatria entre linhagens de C. natalensis. Já em outras populações, como no Parque Estadual Dunas do Natal, Parque da Cidade Dom Nivaldo Monte e Área de Proteção Ambiental Jenipabu estes dados merísticos são crípticos e as diferenças entre essas populações são melhor visualizadas com arcabouço molecular, pois mudanças nucleotídicas são constantes. Assim, pode-se inferir que mudanças estão ocorrendo nesses remanescentes isolados de Mata Atlântica e distanciando a cada evento de mutação os espécimes de C. natalensis. Portanto, os dados moleculares permitem também inferir um início do processo de especiação nessas linhagens de C. natalensis. Com o tempo, a fragmentação florestal ocorrendo e cada vez mais surgindo barreiras geográficas que impossibilitem o cruzamento entre as populações, é muito provável o surgimento de novas espécies. Os espécimes do Parque Estadual Mata da Pipa por estarem mais distantes da população ancestral (Parque Estadual Dunas do Natal), pode revelar mais rapidamente essa diferenciação, como foi constatado nas redes de haplótipos e na reconstrução filogenética.

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