Genexpressionsanalysen Zur Optimierung Einer Zielgerichteten Therapie Des Glioblastoms Mit Dem EGFR-Inhibitor Erlotinib

Universität Ulm

Universitätsklinik für Neurochirurgie

Geschäftsführender Direktor: Prof. Dr. med. C. R. Wirtz

Genexpressionsanalysen zur Optimierung einer zielgerichteten Therapie des Glioblastoms mit dem EGFR-Inhibitor Erlotinib

Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm

vorgelegt von

Sarah-Maria Löw geboren in Karlsruhe

2014

vorgelegt von

Amtierender Dekan: Prof. Dr. med. Thomas Wirth

1. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Marc-Eric Halatsch 2. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Dietmar Thal

Tag der Promotion: 19.06.2015

vorgelegt von

Inhalt

INHALTSVERZEICHNIS ...... I ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ...... II 1. EINLEITUNG ...... 1 1.1. GLIOBLASTOME ...... 1 1.2. DER EPIDERMALE WACHSTUMSFAKTOR-REZEPTOR (EGFR) ...... 4 1.3. ERLOTINIB ...... 8 1.4. ZIELSETZUNG ...... 11 2. MATERIAL UND METHODEN ...... 12 2.1. MATERIAL ...... 12 2.2. METHODEN ...... 18 3. ERGEBNISSE ...... 37 3.1. KLINISCHE DATEN ...... 37 3.2. PROLIFERATIONSKURVEN DER ZELLLINIE H-199GM ...... 38 3.3. SELEKTION RELEVANTER GENE MITTELS MICROARRAY-ANALYSE...... 40 3.4. FUNKTIONELLE SELEKTION DER KANDIDATENGENE ...... 44 3.5. IN SILICO ANALYSE ...... 47 3.6. KORRELATIONSANALYSE BEKANNTER GENE IN DER PATHOGENESE DES GLIOBLASTOMS ...... 49 3.7. CHROMOSOMALE LOKALISATION DER GENE ...... 50 3.8. QPCR ...... 51 4. DISKUSSION ...... 54 4.1. DISKUSSION DER FRAGESTELLUNG ...... 54 4.2. DISKUSSION DER METHODIK ...... 55 4.3. DISKUSSION DER ERGEBNISSE ...... 57 5. ZUSAMMENFASSUNG ...... 66 6. LITERATURVERZEICHNIS ...... 68 DANKSAGUNG ...... 88 LEBENSLAUF ...... 89

Abkürzungsverzeichnis

18S 18S ribosomale RNS AA Anaplastisches Astrozytom ACTB β-Actin Akt Synonym für Proteinkinase B AP-1 Aktivator Protein 1 B2M β-2-Mikroglobulin BCNU Carmustin BDNF Vom Gehirn stammender neurotropher Faktor CACN Spannungsabhängige Calcium Kanäle CACNG4 Spannungsabhängiger Calcium Kanal, Untereinheit 4 CARD6 Caspase rekrutierendes Protein 6 CASP6 Caspase 6 CCNU Lomustin CDK5 Cyclin-abhängige Kinase CT Zyklusschwellenwert Dhh Desert Hedgehog DKFZ Deutsches Krebsforschungszentrum DMSO DMSO DNS Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat DUSP4 Dualspezifische Phosphatase 4 EGF Epidermaler Wachstumsfaktor EGFR Epidermaler Wachstumsfaktor Rezeptor EGFRvIII Variante III des EGFR EMBL Europäisches Laboratorium für Molekularbiologie ERK Extrazelluläre Signal-regulierte Kinase FDA Amerikanische Bundesbehörde zur Überwachung von Nahrungs- und Arzneimitteln FGF Fibroblastenwachstumsfaktor FGFR4 Fibroblasten Wachstumsfaktor Rezeptor 4 FKS Fetales Kälberserum FOSL1 FOS-artiges Antigen 1

Abkürzungsverzeichnis

G Erdbeschleunigung „g“ GAPDH Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase GFAP Saures Gliafaserprotein GRB2 Humanes Wachstumsfaktorrezeptor gebundenes Protein 2 GUSB beta-Glucuronidase HER Humane epidermale Wachstumsfaktoren HPRT1 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase 1 HSPA1B Hitzeschockprotein 70kDa 1B HSPA9B Hitzeschockprotein 70kDa 9B (Mortalin-2) HSPB1 Hitzeschockprotein 27kDa1 Ihh Indian Hedgehog Protein IVT In vitro Transkription JAK Janus Kinase JNK c-Jun N-terminale Kinasen IDH1 Isocitrat Dehydrogenase 1 KEGG Kyoto Enzyklopädie der Gene und des Genoms M Molar mM Milimolar MAPK Mitogen-aktivierte Proteinkinase MAQC II Microarray Qualitätskontrolle Projekt II MDM2 Murine double Minute 2 MEK 1/2 Mitogen-aktivierte Proteinkinase Kinase 1/2 MRT Magnetresonanztomographie mTOR Ziel des Rapamycins im Säugetier MYC Virales Myelocytomatosis Onkogen NABTC Nordamerikanisches Hirntumor-Konsortium NCBI Nationales Zentrum für biotechnologische Informationen NFATC1 Nukleärer Faktor von aktivierten T-Zellen, Calcineurin- abhängig 1 NGF Nervenwachstumsfaktor NIH Nationales Institut für Gesundheit, USA NF-κB Nukleärer Faktor Kappa beta NSCLC Nicht-kleinzelliges Bronchialkarzinom NT3/4 Neutrophin 3/4

III

Abkürzungsverzeichnis

NTR Neurotrophin Rezeptor NTRK1 Neurotrophin Rezeptor Tyrosinkinase 1 NTRK2 Neurotrophin Rezeptor Tyrosinkinase 2 P53 Tumorsuppressorprotein 53 PBS Phosphatgepufferte Salzlösung PCR Polymerase-Kettenreaktion PCV Procarbazin, Lomustin und Vincristin PDGF Blutplättchen-Wachstumsfaktor PDGFR Blutplättchen-Wachstumsfaktor Rezeptor PFS Progressionsfreies Überleben PI3K Phosphatidylinositol-3-Kinase PKC Proteinkinase C PPIA Peptidylprolyl Isomerase A Ptch Patched Protein PTEN Phosphatase und Tensin Homolog qPCR Quantitative real-time PCR RAC1 Ras-bezogenes C3 Botulinumtoxin Substrat 1 Raf Schnell wachsendes Fibrosarkom Ras Sarkom der Ratte Ras-GRF Ras-spezifischer Guaninnukleotid-freisetzender Faktor Ras-GRP Ras-spezifisches Guaninnukleotid-freisetzendes Protein REST Relative Expressions Software RNS Ribonukleinsäure ROX 5,6-Carboxy-x-Rhodamin RPLP 60S saures ribosomales Protein P RT Reverse Transkriptase Shh Sonic Hedgehog Protein SMO Smoothened Homolog SOS Son-of-sevenless-Protein STAT Signalempfänger und Aktivator von Transkription TBP TATA-Box-Binding Protein TCF7L1 T-Zell-spezifischer Transkriptionsfaktor 7L1 TGFB3 Transformierender Wachstumsfaktor beta 3 TKI Tyrosinkinase-Inhibitor

Abkürzungsverzeichnis

TNFα Transformierender Wachstumsfaktor alpha TSG Tumorsuppressorgen TUBB Klasse I Beta-Tubulin UBC Ubiquitin C YWHAZ Protein Kinase C Inhibitor Protein1

Gene werden im Text kursiv, Proteine nicht kursiv dargestellt.

Einleitung

1. Einleitung 1.1. Glioblastome

1.1.1. Klassifikation, Epidemiologie und bisherige Therapieansätze In der Gruppe der Gliome werden Astrozytome, Oligodendrogliome, Oligo- astrozytome, Ependymome und Tumore des Plexus choroideus zusammengefasst und nach der zuletzt im Jahre 2007 aktualisierten WHO-Klassifikation (Louis et al. 2007) in die Malignitätsgrade I bis IV eingeteilt. Die Klassifikationskriterien der Gliome beruhen nicht wie üblicherweise bei anderen malignen Tumoren auf dem TNM-System, da Tumorgröße (T), Lymphknotenstatus (N) oder auch eine ohnehin seltene Fernmetastasierung (M) eine weniger zentrale prognostische Rolle spielen. Vielmehr von klinischer Bedeutung sind histopathologische Kriterien wie Nekrosenbildung, mitotische Aktivität, Kernatypien, Endothelproliferation und Zell- dichte. Nach dieser Klassifikation entspricht ein Grad I-Tumor einem differenzierten Hirn- tumor mit einer günstigen Prognose bei langsamer Wachstumstendenz, während das Glioblastom einem Grad IV-Astrozytom mit klinisch ungünstiger Prognose entspricht. Histopathologisch zeigt sich beim Glioblastom ein heterogenes Bild mit runden, pleomorphen oder auch fusiformen Zellen. Des Weiteren sind zahlreiche Mitosen, Kernatypien, Pseudopallisadenbildungen, Gefäßproliferationen, flächen- hafte Tumorgewebsnekrosen und diffuse Infiltrationen des angrenzenden Hirn- parenchyms nachweisbar (Louis et al. 2007). Hirntumoren machen etwa 2% aller malignen Neoplasien aus (Deorah et al. 2006, Louis et al. 2007), wobei Gliome mit bis zu 60% zu den am häufigsten vorkom- menden primären Neoplasien des zentralen Nervensystems gehören. 15,6% der intrakraniellen Tumore sind Glioblastome, die damit 54,4% der primären Hirntumore und Gliome ausmachen. Die jährliche Inzidenz beträgt 3,19 Primärfälle pro 100.000 Einwohner (Ostrom et al. 2013). Ein leichter Anstieg der Inzidenz des Glioblastoms wird über die letzten Jahrzehnte beobachtet (Deorah et al. 2006). Ein möglicher Grund hierfür liegt in der verbesserten Diagnosemöglichkeit, z.B. aufgrund einer höheren Verfügbarkeit der Magnetresonanztomographie (MRT). Höheres Alter, männliches Geschlecht und kaukasische Rasse sind mit einer er- höhten Inzidenz von Glioblastomen assoziiert (Deorah et al. 2006). Die 5-Jahres- Überlebensrate hat sich in den letzten zwei Jahrzehnten trotz moderner Therapie- 1

Einleitung formen nur wenig verbessert und beträgt unter leitliniengerechter Therapie 9,8%. Die mediane Überlebenszeit hierbei beträgt 14,6 Monate (Stupp et al. 2009).

Die aktuelle Standardtherapie des Glioblastoms ist eine im Hinblick auf die Scho- nung neurologischer Funktionen größtmögliche Tumorresektion mit anschließender kombinierter Radiochemotherapie und adjuvanter Gabe von Temozolomid, welches zur Substanzklasse der Alkylanzien gehört und in den USA für neu diagnostizierte Glioblastome und refraktäre anaplastische Astrozytome (AA) zugelassen ist. In Europa umfasst die Zulassung die Behandlung von neu diagnostizierten und rezidivierenden Glioblastomen sowie rezidivierenden AA. Phase-III Studien zeigen signifikant erhöhte 2- und 5-Jahresüberlebesrate (27,2% vs. 10,9% und 9,8% vs. 1,9%) sowie ein signifikant verlängertes medianes Gesamtüberleben (14,6 vs. 12,1 Monate), wenn Temozolomid während und nach der Radiotherapie zusätzlich zur alleinigen Strahlentherapie gegeben wird (Stupp et al. 2005, Stupp et al. 2009). In der Vergangenheit wurden weitere Chemotherapeutika wie Carmustin (BCNU), Lomustin (CCNU) oder Procarbazin zusammen mit Lomustin und Vincristin (PCV) oder Carboplatin in der Erstlinien-Therapie eingesetzt. Seit dem Wirkungsnach- weis von Temozolomid werden diese Agenzien jedoch nur noch in der Rezidiv- situation benutzt. Carmustin-Implantate, die in die Tumorresektionshöhle eingelegt werden, zeigten in einer Phase III-Studie therapeutische Wirkung mit einem ver- längerten medianen Überleben von 13,8 Monaten, verglichen mit der Placebo- Gruppe (11,6 Monate) (Westphal et al. 2006). Aktuelle präklinische und klinische Studien fokussieren zunehmend auf den gezielten Angriff eines spezifischen therapeutischen Ziels. Dieses Ziel ist entweder ein spezifisches Molekül auf oder in der Tumorzelle bzw. es spielt bei der Interaktion der Tumorzellen mit ihrer Umgebung oder bei der Neoangiogenese eine Rolle. Der alleinige Einsatz eines unselektiven Zytostatikums tritt zunehmend in den Hintergrund. So wurde in mehreren Studien untersucht, ob und wie der Angiogenesehemmer Bevacizumab (Avastin®, Roche, Basel, Schweiz) zusätzlich zur Standardtherapie das mediane Überleben bei Patienten mit Glioblastomen verändert. Bisher konnte kein eindeutiger Überlebensvorteil festgestellt werden (16,8 Monate in der Bevacizumab + Standardtherapie-Gruppe vs. 16,7 Monate in der Standardtherapiegruppe). Es zeigte sich jedoch eine Verzögerung des

Einleitung

Fortschreitens der Erkrankung (medianes progressionsfreies Überleben in der Bevacizumab + Standardtherapie-Gruppe 8,4 Monate gegenüber 4,3 Monate in der Standardtherapie-Gruppe) (Henriksson et al. 2013). Aktuell befinden sich weit über 800 Studien in klinischer Erprobung, um die Behandlung von Glioblastom- Patienten zu optimieren (NIH Clinical Trials: Glioblastom 2014). Trotz dieser Bemühungen ist bislang kein durschlagender, therapeutischer Erfolg in der Be- handlung von Glioblastomen zu verzeichnen. Weitere Untersuchungen sind daher notwendig, um eine zielgerichtete, tumorspezifische Therapie zu etablieren bzw. zu optimieren.

1.1.2. Molekulare Veränderungen der Glioblastom-Zelle Ähnlich vielen anderen Tumorentitäten entsteht das Glioblastom durch eine An- häufung von genetischen Veränderungen wie Genamplifikation, Genüber- expression, Mutationen oder auch Chromosomenverlusten. Das Glioblastom wird unterteilt in primäre - auch „de novo“ genannt - und sekundäre Glioblastome, welche sich aus niedriggradigen Astrozytomen entwickeln. Die Unterscheidung beider Typen war bisher mit den in der klinischen Routine angewandten, histopathologischen Methoden schwierig. Klinisch jedoch betrifft das primäre Glioblastom mit einem durchschnittlich höheren Erkrankungsalter von 55 Jahren gegenüber 40 Jahren beim sekundären Glioblastom eher ältere Patienten (Kleihues et al. 2002). Das sekundäre Glioblastom tritt mit etwa 5% aller Glioblastome viel seltener auf, als das primäre Glioblastom (Ohgaki et al. 2004). Beide Typen unterscheiden sich hinsichtlich ihrer molekularen Entstehungswege. Beim primären Glioblastom sind neben anderen genetischen Alterationen häufig der epidermale Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) und das murine double minute 2 (MDM2) amplifiziert (36% bzw. ca.10%) und überexprimiert (ca. 60% bzw. 50%). Weiterhin ist in etwa 25% der Fälle das Phosphatase und Tensin Homolog (PTEN) Gen mutiert und in etwa 70% der Fälle kommt es zu einem Verlust der Hetero- zygosität des gesamten Chromosom 10. Sekundäre Glioblastome haben in 60% der Fälle ein mutiertes Tumorsuppressorprotein p53 sowie einen allelischen Ver- lust von Chromosom 19q (Kleihues und Ohgaki 1999, Kleihues et al. 2002, Tso et al. 2006, Ohgaki und Kleihues 2007). Vor kurzem wurden Mutationen in der Iso- zytratdehydrogenase 1 (IDH1) als neue Faktoren zur Unterscheidung zwischen 3

Einleitung primären und sekundären Glioblastomen validiert. Diese Mutationen stellen derzeit das wohl beste, etablierte Unterscheidungsmerkmal zwischen primären und se- kundären Glioblastomen dar, da letztere in mindestens 70% der Fälle einen mutierten IDH1-Status aufweisen (Nobusawa et al. 2009, Ohgaki und Kleihues 2013).

1.2. Der epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) Der EGFR, der auch als HER1 bezeichnet wird, gehört zusammen mit drei anderen Rezeptoren (HER2, HER3 und HER4) zur transmembranösen Rezeptor- familie der humanen, epidermalen Wachstumsfaktoren (HER). Ihnen gemeinsam ist eine extrazelluläre Bindungsdomäne, ein transmembranöses Glykoprotein und eine intrazelluläre Tyrosinkinase (TK), die bei HER3 defekt ist (Yarden und Sliwkowski 2001). In vielen Zelltypen transduzieren die Mitglieder der HER-Familie Signale von der Zelloberfläche zur intrazellulären Domäne, was letztlich durch Aktivierung intrazellulärer Signalwege zur Regulierung von Zellwachstum, Repara- tur und funktioneller Differenzierung führt (Wells 1999). Aktiviert werden die Rezeptoren durch Ligandenbindung im Bereich der extra- zellulären Domäne. Die beiden bedeutendsten Liganden des EGFR sind der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) und der transformierende Wachstumsfaktor  (TGF-) (Jones et al. 1999). Eine Bindung der Liganden führt zur Formierung von homo- oder heterodimeren Komplexen, zur Rezeptor-Autophosphorylierung und letztlich zur Rekrutierung und Aktivierung intrazellulärer Substrate durch Tyrosin- kinase-Aktivität. Die drei wichtigsten Signalwege, die durch den EGFR aktiviert werden, sind (1) der Mitogen-aktivierende Proteinkinase (MAPK)-Signalweg, welcher die Desoxyribonukleinsäure (DNS)-Synthese und das Zellwachstum be- schleunigt, (2) der Phospatidylinositol-3-Kinase (PI3-K)/Akt-Signalweg, der das Zellüberleben sichert (Arteaga 2003, Scagliotti et al. 2004) und (3) der Signalweg über die Janus-Kinase (JAK) und die Signalempfänger und Aktivatoren der Transkription (STAT)-Proteine, welche das Zellwachstum, die Zelldifferenzierung und das Zellüberleben regulieren (Buettner et al. 2002, Citri und Yarden 2006) (Abbildung 1). Fehlregulationen, die den EGFR betreffen, kommen in zahlreichen Tumorentitäten wie dem Glioblastom, dem Mammakarzinom und Ovarialkarzinom sowie dem nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinom (NSCLC) vor. 4

Einleitung

Abbildung 1: Signalwege des EGFR Übersicht über die wichtigsten, durch den EGFR aktivierten Signalwege und den Ansatzpunkt des Tyrosin- kinase-Inhibitors Erlotinib. Die Aktivierung des EGFR führt zu dimeren Komplexen mit anschließender Auto- phosphorylierung und Aktivierung des MAPK-, PI3-K sowie PKC und Jak/STAT-Pfadweges. Letztlich führt dies zu einer vermehrten Angiogenese, Apoptose, Metastasierung und einem vermehrten Zellwachstum. Mittels Erlotinib kann die intrazelluläre Phosphorylierung des EGFR inhibiert werden. Abkürzungen: Akt: Synonym für Proteinkinase B, AP-1: Aktivator Protein 1, EGFR: epidermaler Wachstums- faktor Rezeptor, JAK: Janus Kinase, MAPK: Mitogen-aktivierte Proteinkinase, MEK 1/2: Mitogen-aktivierte Proteinkinase Kinase 1/2, PI3-K: Phosphatidylinositol-3-Kinase, PKC: Proteinkinase C, Raf: schnell wachsendes Fibrosarkom, Ras: Sarkom der Ratte, STAT: Signalempfänger und Aktivator von Transkription (nach Loew et al. 2009).

Einleitung

Diese Fehlregulationen beeinflussen die Gentranskription und Proteintranslation und führen letztlich zu einer erhöhten Zellproliferation, Tumorigenese, Migration, Adhäsion, Angiogenese und Apoptosehemmung (Arteaga 2001). Störungen im EGFR-System können sowohl durch Rezeptoramplifikation/ -überexpression als auch durch auto- oder parakrine Schleifenbildung oder durch Mutationen, die zur konstitutiven Aktivierung des Rezeptors führen, verursacht sein (Arteaga 2003). Das EGFR-Gen ist auf Chromosom 7 lokalisiert (7p12.3-p12.1) und besteht aus 28 Exonen, die sich über 190 Kilobasen erstrecken (Ji et al. 2006). In vielen Tumoren ist der EGFR amplifiziert und/oder überexprimiert; so überexprimieren 43 bis 83% der nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinome (NSCLC) und 40 bis 50% der Glioblastome den EGFR (Volm et al. 1998, Ohsaki et al. 2000). Häufig ist bei einer EGFR-Genamplifikation ebenfalls der EGFR überexprimiert (Frederick et al. 2000). Eine EGFR-Überexpression korreliert mit Krankheitsprogression, schlechter klinischer Prognose und reduzierter Sensitivität gegenüber zyto- statischer Therapie (Nicholson et al. 2001). Die Amplifikation des EGFR-Gens geht häufig mit Mutationen des EGFR einher (Frederick et al. 2000). Beim Glioblastom ist die EGFR-Mutation, die zu einer Verkürzung der extrazellulären Ligandenbindungsdomäne führt, am häufigsten. Diese Variante III des EGFR (EGFRvIII) tritt in etwa der Hälfte aller Glioblastome, die eine Amplifikation des EGFR-Gens aufweisen, auf. Die Mutation kommt durch eine, den Leserahmen erhaltende Deletion von 801 Basenpaaren (Bp; Nukleotidpositionen 275 bis 1075) zu Stande. Die Exone 2 bis 7, die für einen Teil der exrazellulären Domäne kodieren, sind hier eliminiert (Ullrich et al. 1984). Der Rezeptor ist dadurch verkürzt und konstitutiv aktiviert. Weitere Mutationen (EGFRvI, EGFRvII, EGFRvIV und EGFR V) sind beim Glioblastom beschrieben und betreffen sämtlich den ext- razellulären Teil des EGFR, sie treten aber weitaus seltener auf als EGFRvIII. Auffällig im Vergleich zu anderen Neoplasien mit EGFR-Mutationen ist, dass beim Glioblastom mehrere Mutationen im selben amplifizierten EGFR-Gen auftreten können (Frederick et al. 2000).

Amplifikation, Überexpression und/oder konstitutive Aktivierung des EGFR, HER2 oder HER3 werden zusammen mit anderen Dysregulationen dieser Rezeptoren häufig in humanen Malignomen beobachtet und gehen mit einer schlechteren klinischen Prognose einher (Earp et al. 2003). Daher richtet sich der Fokus vieler

Einleitung

Studien auf Mitglieder der HER-Familie als neue Zielmoleküle in der Tumor- therapie (Wells 1999). Ein erfolgreiches Beispiel hierfür ist Trastuzumab (Herceptin®, Roche, Basel, Schweiz), ein monoklonaler Antikörper gegen HER2, der anti-tumorale Aktivität bei Patientinnen mit solchen Mammakarzinome zeigt, die HER2 auf der Zelloberfläche überexprimieren (Slamon et al. 2001, Vogel et al. 2002). Trastuzumab ist mittlerweile bei der Behandlung des metastasierten Mammakarzinoms, aber auch in der kurativen Situation bei entsprechender Indika- tion Teil der leitliniengerechten Therapie und besitzt seit 2006 in Europa, basierend auf der HERA (HER-adjuvant)-Studie, die Zulassung zur adjuvanten Therapie (Piccart-Gebhart et al. 2005). Weitere Antikörper wie z.B. Cetuximab (Erbitux®, Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) – ein Antikörper gegen den EGFR –, der zusammen mit Irinotecan beim kolorektalen Karzinom und auch in Kombination mit einer Radiotherapie bei Kopf-Hals-Tumoren zugelassen ist (Humblet 2004), zeigen die Fortschritte, die mit einer auf die Tumorzelle direkt gerichteten Therapie möglich sind. Auch aktuelle Daten bei Gliompatienten, welche mit einem EGFR-Antikörper (Nimotuzumab, Theraloc®, Oncoscience AG, Wedel, D) in Kombination mit einer Bestrahlung behandelt wurden, zeigen einen klinisch-prognostischen Vorteil mit einer medianen Überlebenszeit von 21,07 Monaten gegenüber der Placebo- Kontrollgruppe (12,63 Monate) (Solomon et al. 2013).

Einleitung

1.3. Erlotinib Das Quinazolin Erlotinib ([6,7-bis(2-methoxy-ethoxy)-quinazolin-4-yl]-[3- ethylphenyl]amin) wird weltweit unter dem Markennamen Tarceva® von einer Allianz aus Genentech (Genentech Inc., San Francisco, CA, USA), OSI Pharmaceuticals (OSI Pharmaceuticals Inc., Melville, NY, USA) und Roche/Hoffmann-La Roche Ltd., Basel, Schweiz) erforscht und vertrieben. Erlotinib ist ein selektiver Tyrosinkinase-Inhibitor (TKI) des EGFR. Die Biover- fügbarkeit nach oraler Gabe beträgt 60%. Erlotinib ist fast vollständig an Albumin gebunden und hat eine Halbwertszeit von 36 Stunden. Die Elimination erfolgt größtenteils über das Cytochrom Cyp3A4 (FDA: Erlotinib 2013). Im November 2004 wurde Erlotinib durch die amerikanische Bundesbehörde zur Überwachung von Nahrungs- und Arzneimitteln (FDA) für die Behandlung des fortgeschrittenen oder metastasierten NSCLC nach erfolgloser vorheriger Chemo- therapie und im April 2010 auch für die Erhaltungstherapie bei progressionsfreiem NSCLC zugelassen. Seit Mai 2013 ist Erlotinib auch in der Primärtherapie beim metastasierten NSCLC mit Deletion des EGFR-Gens in Exon 19 oder Sub- stitutions-Mutationen in Exon 21 (L858R) zugelassen. Weiterhin erhielt Erlotinib im November 2005 die Zulassung für die Therapie des fortgeschrittenen oder metastasierten Pankreaskarzinoms in Kombination mit Gemcitabin (FDA: Erlotinib 2013). In Europa ist Erlotinib seit 2005 bisher zur Behandlung des fortgeschrittenen oder metastasierten NSCLC nach erfolgloser vorheriger Chemotherapie und seit 2007 zur Behandlung des metastasierten Pankreaskarzinoms zugelassen. Die Zulassung für die Primärtherapie bei metastasiertem NSCLC mit EGFR aktivierenden Mutationen (Deletion Exon 19 oder L858R Mutation in Exon 21) besteht seit 2011 und beruht auf einer Phase III-Studie bei der Erlotinib gegenüber einer Standardchemotherapie bei Patienten mit metastasiertem NSCLC mit aktivierenden EGFR-Mutationen ohne vorherige Chemotherapie appliziert wurde. Das progressions-freie Überleben (PFS) betrug in der Erlotinib-Gruppe 9,4 Monate gegenüber 5,2 Monate in der Kontrollgruppe (Rosell et al. 2012). Im Rahmen der Erlotinib-Einnahme wurden das Auftreten von interstitiellen Lungenerkrankungen, der Anstieg der Lebertransaminasen, zerebrovaskuläre Vorkommnisse und hämolytische Anämien mit Thrombozytopenien beschrieben (FDA: Erlotinib 2013). Weiterhin häufig auftretende Nebenwirkungen sind Diarrhoe, Appetitlosigkeit und vor allem Hautreaktionen wie Juckreiz oder 8

Einleitung akneiforme Reaktionen (Eames et al. 2007, Pitarch et al. 2008). Insgesamt zeigte sich aber nach oraler Gabe von Erlotinib eine gute Verträglichkeit (Hidalgo et al. 2001). Im Kaninchen-Modell zeigte sich bei höheren Erlotinib-Dosen eine erhöhte embryonale/fetale Letalität. Daher sollte eine sichere Kontrazeption während der Einnahme durchgeführt werden. Kontrollierte Studien zum Einsatz von Erlotinib bei Schwangeren existieren bisher nicht (FDA: Erlotinib 2013). Erlotinib wird momentan sowohl in Studien bei rezidivierenden Gliomen, als auch bei vielen weiteren Tumorentitäten (Kopf-/Hals-Tumoren, Ependymomen, Mamma-, Lungen- und Pankreaskarzinomen etc.) untersucht (NIH Clinical Trials: Erlotinib 2013). Es werden auch Kombinationen mit herkömmlichen Chemo- therapeutika und Immunsuppressiva, wie zum Beispiel mit mTOR-Inhibitoren, oder auch Kombinationen mit dem Angiogenese-Inhibitor Bevacizumab getestet. Eben- so laufen mehrere Studien, in denen die Kombination von Erlotinib mit einer Radi- otherapie untersucht wird. Eine kürzlich veröffentlichte Phase-II-Studie des nordamerikanischen Hirntumor- Konsortiums (NABTC), in der Erlotinib als Monotherapie beim rezidivierenden Glioblastom bzw. AA oder im Anschluss an eine Bestrahlung bei Glioblastom- Patienten eingesetzt wurde, zeigte keine Wirksamkeit von Erlotinib. Die Autoren argumentieren unter anderem, dass Erlotinib nur bei einigen Subgruppen wirksam sein könnte (Raizer et al. 2010). So wurden beim NSCLC - wie oben bereits beschrieben - mehrere Mutationen identifiziert, die mit erhöhter Sensitivität gegen- über Erlotinib bzw. Gefitinib (Iressa®, AstraZeneca, Wilmington, DE, USA), einem weiteren EGFR-TKI, einhergehen (Lynch et al. 2004, Paez et al. 2004, Pao et al. 2004). Bisher wurden diese speziellen Mutationen beim Glioblastom nicht gefunden. Erlotinib zeigt in vitro Wirkung bei Glioblastom-Zellen, die die am häufigsten vorkommende EGFR-Mutation – EGFRvIII – exprimieren (Iwata et al. 2002, Vogelbaum et al. 2003). In transformierten Zellen führt eine längere Exposition gegenüber Erlotinib zu einer verringerten EGFRvIII-Expression und Inhibition der EGFRvIII-vermittelten Induktion von pro-invasiven Genen (Lal et al. 2002). In einer aktuellen Glioblastom-Studie werden gezielt Patienten mit EGFRvIII- exprimierenden Tumoren mit Erlotinib behandelt (NIH Clinical Trials: Erlotinib EGFRvIII 2013), Daten hierzu stehen noch aus. Neben EGFR-Mutationen scheinen Veränderungen in nachgeordneten Signal- kaskaden zu beeinflussen, wie maligne Zellen auf EGFR-TKIs reagieren. Beim

Einleitung

NSCLC erscheint die Wachstumsinhibition durch Gefitinib größer bei anfänglich erhöhtem phosphorylierten MAPK (pMAPK) oder phosphoryliertem Akt (pAkt) als bei niedrigem pMAPK oder pAkt (Cappuzzo et al. 2004). Eine neuere Studie hingegen konnte die Korrelation zwischen pMAPK-Konzentration und Wachstumsin- hibition durch Gefitinib nicht belegen, zeigte aber eine bessere therapeutische Antwort und Krankheitskontrolle bei Patienten mit pAkt-positiven Tumoren (Cappuzzo et al. 2004). Im Gegensatz dazu zeigte eine andere Studie, dass beim Glioblastom erhöhte EGFR-Konzentrationen kombiniert mit niedrigen Konzentrationen von pAkt signifikant mit einem besseren Ansprechen auf die Behandlung mit Erlotinib und einem verlängerten Zeitraum bis zur Progression assoziiert sind, als eine erniedrigte EGFR-Expression in Kombination mit erhöhten pAkt-Konzentrationen (Haas- Kogan et al. 2005). Nicht nur die direkt an der EGFR-Signalkaskade beteiligten Moleküle scheinen jedoch einen Einfluss auf das Wachstumsverhalten von Glioblastom-Zellen nach Erlotinib-Exposition zu haben. Die Expression des Tumorsuppressorgens PTEN, einem Inhibitor von PI3-K/Akt, ist mit einem klinischen Ansprechen auf EGFR-TKIs assoziiert, wenn eine Ko-Expression mit EGFRvIII vorliegt (Mellinghoff et al. 2005). Darüber hinaus scheint der Verlust von PTEN, der in 40 bis 50% aller Glioblastome auftritt, einen Resistenzfaktor gegen- über EGFR-TKIs darzustellen (Wang et al. 2006). Eindeutige Veränderungen der Glioblastom-Zelle, welche des Wachstumsverhalten nach Erlotinib-Therapie prädiktionieren können, waren jedoch bis zu Beginn dieser Arbeit nicht bekannt.

Einleitung

1.4. Zielsetzung Der EGFR wird in zahlreichen Tumorentitäten überexprimiert und vermittelt eine erhöhte zelluläre Proliferation, Tumorigenität sowie apoptotische Resistenz. Damit stellt dieser Wachstumsfaktorrezeptor ein probates Zielmolekül dar, um aberrantes Wachstum von Tumorzellen zu verhindern. Die durch den EGFR initiierte Signal- kaskade kann durch Blockade der äußeren Rezeptordomäne (z.B. mittels monoklonaler Antiköper oder durch Inhibierung der intrazellulären Tyrosinkinase (TK)), erreicht werden. Erlotinib stellt einen Vertreter von TK-Inhibitoren dar und zeigt in etlichen Tumorentitäten antiproliferative Wirkungen, bleibt aber insgesamt in seiner klinischen Effektivität hinter den Erwartungen zurück. So konnte bislang kein Zusammenhang zwischen EGFR-Amplifikation und/oder -Überexpression und dem Wachstumsverhalten während bzw. nach Erlotinib-Behandlung bei Glioblastomen festgestellt werden. Obwohl bisher schon zahlreiche Einflussfakto- ren auf das Ansprechverhalten gegenüber Erlotinib beim Glioblastom analysiert wurden (siehe Kapitel 1.3), konnte bislang noch kein prädiktiver Faktor für ein po- sitives bzw. negatives Ansprechen festgestellt werden. Im Rahmen dieser Arbeit sollen Kandidatengene determiniert werden, welche mit dem Wachstumsverhalten von Glioblastom-Zellen unter Erlotinib-Gabe korrelieren. Hierdurch sollen Faktoren ermittelt werden, deren Expression mit erhöhter Resis- tenz gegenüber einer Erlotinib-Behandlung einhergeht und die daher potentielle Co-Zielmoleküle in der Glioblastom-Therapie darstellen. Auf der Basis der ermittel- ten Kandidatengen-Listen soll die Grundlage für eine multi targeted therapy bzw. eine zielgerichtete, individuelle Tumortherapie beim Glioblastom diskutiert werden. Die potentiellen Kandidatengene sollen im Rahmen der vorliegenden Arbeit mittels Microarray-Genexpressionsanalyse bei fünf unterschiedlichen Glioblastom- Zelllinien mit bekanntem Wachstumsverhalten nach Erlotinib-Exposition determiniert werden. Die durch die Micorarray-Analyse erhaltenen Expressionsdaten sollen weiterhin durch eine quantitative Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in ihrer Relevanz bestätigt werden. Abschließendes Ziel ist eine Datenbankanalyse der identifizierten Gene, um die erhaltenen Genlisten nach Plausibilität hinsichtlich ihrer bekannten Funktion und ihres Expressionsmusters bei den hier untersuchten Zellen zu prüfen und um so mögliche Therapiestrategien zu diskutieren.

Material und Methoden

2. Material und Methoden 2.1. Material

2.1.1. Zelllinien und Patientenkollektiv Von den in dieser Arbeit verwendeten fünf Zelllinien stammen vier aus Operations- resektaten von Patienten, die in der Klinik und Poliklinik für Neurochirurgie der Georg-August-Universität Göttingen operiert wurden (G-599GM, G-210GM, G-750GM, G-1163GM). Eine Zelllinie wurde aus dem Operationsresektat einer Patientin, die in der Klinik für Neurochirurgie der Ruprecht-Karls-Universität Hei- delberg operiert wurde (H-199GM), gewonnen. Die in Göttingen etablierten Zell- linien wurden schon in vorherigen Arbeiten untersucht und stellen die Grundlage zu der vorliegenden Arbeit dar (Halatsch et al. 2000, Halatsch et al. 2004). Die neuropathologische Diagnose eines Glioblastoms wurde unter anderem durch immunhistochemische Färbung von Vimentin und dem glialen sauren Faserprotein (GFAP) gestellt. Die Zellen wurden adhärent in „Roswell Park Memorial Institute 1640 Zellkultur Medium“ (RPMI 1640) mit 10% fetalem Kälberserum (FKS) kultiviert. Zu Beginn der Zellkulturarbeiten befanden sich alle Zelllinien jenseits der 20. Passage.

2.1.2. Geräte . 7500 Real-Time PCR System Applied Biosystems, Darmstadt, D . Axon GenePix4000 Scanner Molecular Devices, Sillicon Valley, USA . Glasgeräte Schott, Mainz, D . Inkubator CO2-Inkubator MCO-20AIC, Sanyo Biomedical, Chicago, USA . Mikroskop Nikon TM, Tokyo, Japan . Nanometer/Spektrophotometer NanoDrop, Thermo Fisher Scientific, Wilmington, USA . Neubauer-Zählkammer Brand, Wertheim, D . Pipettierhilfe Pipetboy, Integra Bioscience AG, Fernwald, D . Sterilbank Antair BSK Cothech, Berlin, D

Material und Methoden

. Tischzentrifuge Biofuge fresco, Haraeus Instruments, D . Vortex Vortex Genie, Scientific Industries SI, Bohemia, USA . Waage Waage, Sartorius, Göttingen, D . Wärmebad Störk Tronic W12, Stuttgart, D . Zentrifuge Microarray Sigma 4-15c, Qiagen, Hilden, D . Zentrifugen NAPCO 2019R, Advance Scientific & Chemical. Inc, Fort Lauderdale, USA + Eppendorf AG, Hamburg, D

2.1.3. Verbrauchsmaterialien . CodeLink Human Whole Applied Microarray, Tempe, USA Genome Bioarray . Kryoröhrchen Cryogene Vials, Nalgene, Rochester, USA . Pipettenspitzen (1-1000µl) LP Italiana Spa, Safe-seal Tips, Biozym Scientific GmbH . Spritzen BD, Franklin Lakes, USA . Sterile Einmalauslaufpipetten 5,15, 25ml: Costar Stripetten, D 10 ml: Bio-One, Greiner, D . Tubes 1,5ml + 2ml, Sarstedt, Nürmbrech T . Zellkulturflaschen Neolab, Heidelberg, D . Zentrifugenbehältnisse 15+50 ml, Greiner, Frickenhausen, D

2.1.4. Chemikalien und Zellkultivierung . Aqua destillata Apotheke Universität Heidelberg, D . NEN Blocking Reagenz 0,5% PerkinElmer, Waltham, USA . DMSO Hybri Max Sigma, Deisenhofen, D . Erlotinib OSI Pharmaceuticals, Uniondale, USA . Ethanol 99,9% Carl Roth GmbH + Co-KG, Karlsruhe, D . FKS Sigma, Deisenhofen, D . Isopropanol Riedl-de Haën, Seelze, D . NaCl 0,9% B. Braun, Melsungen, D 13

Material und Methoden

. NaCl 5M Gibco, Carlsbad, USA . Nukleasefreies-Wasser Sigma, Deisenhofen, D . Phosphatgepufferte Salzlösung Gibco, Calsbad, USA (PBS) . qPCR Mastermix 2x Invitrogen, Carlsbad, USA . RPMI 1640 BioWhittaker, Walkersville, USA . SCC 20x Puffer Invitrogen, Carlsbad, USA . Streptavidin-Cy5 Applied Microarrays, Tempe, USA . SYBR Green I Molecular Probes, Portland, USA . Tris-HCl, pH 7,6 Promega, Fitchburg, USA . Trypanblau Serva, Heidelberg, D . Trypsin-EDTA Gibco, Carlsbad, USA . Tween 20 (50%) Invitrogen, Calsbad, USA . β-Mercaptoethanol 14.3M Sigma, Deisenhofen, D

2.1.5. Kits . geNorm Houskeeping Selection Kit, PrimerDesign Ltd., Southampton, UK Kitbestandteile: . RNase-freies Wasser . Primer-Paare für 18S, B2M, GUSB, GAPDH, HPRT1, PPIA, RPLP, UBC, TBP, TUBB, YWHAZ

. RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden, D Kitbestandteile: . RLT Puffer . RW1 Puffer . RPE Puffer . RNase-freies Wasser . RNeasy Mini Spin Säulen . Sammel-Tubes 1,5 + 2ml

Material und Methoden

. CodeLink Gene Expression System: Manual Labelled cRNA Target Preparation Kit, GE Healthcare, Chalfont St Giles, UK Kitbestandteile: . T7 Oligo(dT) Primer . 10× Erststrang-Puffer . dNTP-Mix . RNase-Inhibitor . ArrayScript™ . 10× Zweitstrang-Puffer . DNS Polymerase . RNase H . T7 10× Reaktionspuffer . T7 Enzyme Mix . Biotin‐NTP Mix . Nukleasefreies-Wasser . HeLa Kontrol RNS (1 µg/µl) . pTRI‐Xef 1 IVT Kontrolle (0.5 µg/µl) . 5× Fragmentationspuffer . Hybridierungspuffer A und B . Bakterielle mRNS-Kontroll-Set . cDNS-Bindepuffer . cRNS-Bindepuffer . Waschpuffer . Cy5-Streptavidin

. CodeLink Universal Shaker Kit, GE Healthcare, Chalfont St Giles, UK Kitbestandteile: . Universelles Schüttler-Tablett . Flex-Kammer Abstandshalter für das universelle Schüttler-Tablett . New Brunswick Innova 4080 universelle Platform 1 . Schüttler 2 . Versiegelungswerkzeug

Material und Methoden

. CodeLink Expression Bioarray System Kit, GE Healthcare, Chalfont St Giles, UK Kitbestandteile: . 5x Fragmentations Puffer . Hybridisierungs Puffer A und B . Mikrozentrifugen Tubes . Flex-Kammern . Flex-Kammern Herausnehm-Werkzeug . Bioarray Gestell . Bioarray Positionswerkzeug . Reagens Reservoir . Bioarray Herausnehm-Werkzeug

. QuantiTect Reverse Transcription Kit von Qiagen Kitbestandteile: . gDNS-Auswaschpuffer, 7x . Quantiscript® Reverse Transcriptase . Quantiscript RT Puffer, 5x . RT Primer Mix . RNase-freies Wasser

. QuantiTect SYBR Green PCR Kit von Qiagen Kitbestandteile: . 2xSYBR Green Master Mix: . HotStarTaq® DNS Polymerase . QuantiTect SYBR Green RT-PCR Puffer . dNTP Mix . SYBR Green I . ROX™ Referenzfarbstoff . 5 mM MgCl2 . RNase-freies Wasser

Material und Methoden

2.1.6. Software . Codelink Expression Analysis Applied Microarrays, Tempe, USA Software 4.0 . DAVID http://david.abcc.ncifcrf.gov . GenePix 6.0 Moleculare Devices, Silicon Valley, USA . geNorm – qBase Biogazelle, Zwijnaarde, Belgien . Microsoft® Excel 2007 Microsoft, Redmond, USA . Primer 3 http://primer3.sourceforge.net . REST-MCS Version 2 http://www.gene-quantification.de/rest- mcs.html . Software Paket R 2.5.0 http://www.r-project.org . SPSS® Statistics 22.0.0 IBM, Armonk, USA . Universal Probe Library Assay Roche Applied Science, Penzberg, D Design Center . 7500 System SDS Software Applied Biosystems, Darmstadt, D

Material und Methoden

2.2. Methoden

2.2.1. Auswertung der Patientendaten Die klinischen Daten wurden bei den vier aus Göttingen stammenden Patienten (G-599GM, G-210GM, G-750GM, G-1163GM) aus den Vorarbeiten (Halatsch et al. 2000, Halatsch et al. 2004) übernommen. Die Daten der neu hinzugefügten Patientin (H-199GM) wurden retrospektiv aus der Patientenakte entnommen und zusammen mit den bereits vorliegenden Werten in das Tabellenkalkulationspro- gramm EXCEL (Microsoft® Office Excel 2007) importiert. Entsprechende Korrelati- onsanalysen wurden mit dem Korrelationskoeffizient (r) nach Pearson berechnet (s. Kapitel 2.2.13). Der Zeitraum vom Tag der Operation bis zum Todestag galt als Überlebenszeit.

2.2.2. Zellkultur und Zellkulturbedingungen Alle Zellkulturarbeiten erfolgten unter einer sterilen Werkbank der Klasse II. Ebenso wurden alle benötigten Gegenstände vor Benutzung autoklaviert und mit 90%igem Ethanol desinfiziert. Die Arbeiten erfolgten unter größtmöglichen hygie- nischen Kautelen. Alle fünf Zelllinien wurden in flüssigem Stickstoff gelagert und zu Beginn der Versuche im Wasserbad bei 37°C kurz erwärmt. Die Zellen wurden schnellst- möglich in 75 cm2-Zellkulturflaschen transferiert, um das im Gefriermedium enthaltene Dimethylsulfoxid (DMSO) zu verdünnen, da DMSO bei Raum- temperatur zytotoxisch wirkt. Die fünf Glioblastom-Zelllinien wurden adhärent in RPMI-1640-Nährmedium mit 10% hitzeinaktiviertem fetalen Kälberserum (FKS) ohne Antibiotikazusatz in 75 cm2 Zellkulturflaschen kultiviert. Die Kultivierung erfolgte im Begasungsbrut- schrank bei 37°C und wasserdampfgesättigter 5% CO2-Atmosphäre. Zweimal wöchentlich wurde das Nährmedium durch neues, auf 37°C vorge- wärmtes Medium ersetzt. Alle zwei Tage wurde das Zellwachstum licht- mikroskopisch beurteilt und bei 70-80% Konfluenz wurden ca. 10% der Zellen in eine neue Zellkulturflasche passagiert. Dafür wurde zuerst das Medium entnommen, danach mit 10 ml auf 37°C vorgewärmtem PBS gespült. Dann wurden die Zellen mit 1 ml Trypsinlösung für 1-3 Minuten inkubiert. Trypsin gehört

Material und Methoden zu den Endoproteasen und spaltet die Peptidbindungen, die die Adhärenz zwischen Zellen und der Oberfläche des Zellkulturgefäßes bewirken. Das vorherige Spülen mit PBS ist sinnvoll, um die im Nährmedium enthaltenen Proteaseinhibitoren zu entfernen. Nach der Inkubationszeit wurde die Trypsin- Zelllösung mit Nährmedium (10% FKS) auf ein Gesamtvolumen von 10 ml auf- gefüllt. Nach ausreichender Resuspendierung wurden jeweils 1 ml der Zell- suspension in neue, 15 ml Nährmedium mit 10% FKS enthaltende Zellkultur- flaschen transferiert.

2.2.3. Ermittlung der Wachstumskurven Die Wachstumskurven wurden unter drei verschiedenen Bedingungen erstellt. Jeder Ansatz erfolgte als Triplikat. Täglich wurde das Medium gewechselt, um möglichst konstante Wachstumsbedingungen zu schaffen. Die Zellzahl wurde mit der Neubauer-Zählkammer bestimmt. Das Zellkulturmedium wurde mit 0,5% FKS versetzt und eine 1 mM Erlotinib-Stocklösung hergestellt. Das Hydrochloridsalz Erlotinib hat ein Molekulargewicht von 429,9 g und muss in DMSO gelöst werden. Um eine 3 mM Erlotinib-Stocklösung herzustellen, wurden daher 6,448 mg in 5 ml DMSO gelöst. In jede 75 cm2 Zellkulturflasche wurden 4x104 Zellen ausgesät und mit 10 ml Nährmedium mit 10% FKS für 24 Stunden inkubiert. Am nächsten Tag (Tag 0) wurden die unterschiedlichen Versuchsbedingungen angesetzt. Der erste Ansatz enthielt Medium mit 0,5% FKS ohne weiteren Zusatz (Gesamtvolumen 10 ml). An- satz 2 enthielt Medium mit 0,5% FKS und 3 μM Erlotinib (9,99 ml Medium mit 0,5% FKS und 10 μl der 3mM Erlotinib-Stocklösung), Ansatz 3 enthielt 9,99 ml Medium mit 0,5% FKS und 10 μl DMSO als Kontrolle, um einen etwaigen antiproliferativen Effekt von DMSO aufzudecken. Der exakte zytotoxische Mechanismus von DMSO ist bisher noch nicht bekannt, wobei man jedoch von verschiedenen Veränderungen im Zytoskelett und bei Proteinverbindungen ausgeht. Weiterhin wird die Permeabilität der Zellmembran erhöht. Erlotinib zeigte bereits in zahlreichen Publikationen in einer Konzentration von 3 µM eine effektive Wirkung (Chin et al. 2008) und wurde auch in den Vorarbeiten nach entsprechenden Dosisfindungsvorversuchen in dieser Konzentration eingesetzt (Halatsch et al. 2004). 19

Material und Methoden

Täglich – also von Tag 0 bis Tag 10 – wurden pro Ansatz drei Flaschen manuell ausgezählt. Dafür wurde das Medium abgenommen, mit 10 ml auf 37°C vorgewärmtem PBS gespült und mit 1 ml Trypsin unter Sicht bei Raumtemperatur für 3 Minuten inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit PBS gewaschen und bei 300 g für 5 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen und verworfen. Das so gewonnene Zellpellet wurde in 5 ml PBS resuspendiert. Von dieser Zellsuspension wurden jeweils 20 µl abgenommen und mit 80 µl einer 0,5% Trypanblaulösung gemischt. Trypanblau wird nur von toten Zellen aufgenommen und färbt diese dunkelblau. 20 µl der gefärbten Zellsuspension wurden in eine Neubauer-Zählkammer transferiert. Nach kurzer Wartezeit bis sich die Zellen ab- gesetzt haben, wurden die nicht blau-gefärbten, vitalen Zellen unter dem Mikroskop in einer 100fach-Vergrößerung ausgezählt. Der Mittelwert der Zellzahl wurde gebildet, anschließend wurde die Zellzahl mit dem Verdünnungsfaktor (hier 5) und dem Faktor 104 (Umrechnung auf eine Konzentration pro ml) und dem Gesamtvolumen der Zellsuspension (5 ml) multipliziert. Je nach Wachstumsreduktion nach Erlotinib-Exposition - bezogen auf die Kontroll- gruppe an Tag 10 - erfolgte eine Einteilung der Zelllinie in die Gruppe „resistent“ (Wachstumsinhibition <33%), „intermediär“ (Wachstumsinhibition 33%- 67%) oder „sensitiv“ (Wachstumsinhibition von >67%).

2.2.4. Ribonukleinsäure-Isolierung Wir haben für die Gewinnung der RNS bei den Zelllinien G-750GM, G-1163GM, G-599GM und H-199GM drei biologische Replikate gewählt. Es gibt pro Zellreihe zwei Replikate, bei denen die mRNS am gleichen Tag extrahiert wurde, das dritte Replikat wurde maximal zwei Wochen später gewonnen. Bei der Zellreihe G-210GM wurden nicht zwei biologische Replikate, die die am gleichen Tag gewonnene mRNS enthalten, sondern zwei technische Replikate erstellt. Das heißt, von der gleichen Ursprungsprobe wurden zwei mRNS Proben für die weiteren Microarray-Analysen erstellt. Replikate für Expressionsanalysen mittels Microarray sind notwendig, um systemische oder durch Zufall entstandene Messfehler zu verringern (Benes und Muckenthaler 2003). Die Ribonukleinsäure (RNS)-Isolierung erfolgte mit dem RNeasy Kit von Qiagen (Hilden, Germany). Alle Schritte erfolgten mit sterilen und RNase-freien 20

Material und Methoden

Materialien, es wurden den einzelnen Reagenzien keine RNase-Inhibitoren zugesetzt. Bei Subkonfluenz der Zellen wurde das Medium entfernt und mit 10 ml temperiertem PBS gespült. Danach wurden die Zellen mit 1 ml Trypsin unter lichtmikroskopischer Kontrolle bei Raumtemperatur für 3 Minuten inkubiert. Die gelösten Zellen wurden in ein Zentrifugen-Gefäß transferiert und für 5 Minuten bei 300 g zentrifugiert. Nach Abnahme des Trypsinüberstands wurde das Zellpellet in 600 μl eines Guanin-Isothiozyanat (GITC)-haltigen Puffers (RLT-Puffer), dem zuvor 1 Volumenprozent β-Mercaptoethanol hinzugefügt worden war, suspendiert. Der RLT-Puffer führt durch das enthaltene Guanin-Isothiozyanat zur Zelllyse und zur Denaturierung von Proteinen und RNasen. Nach mehrmaligem Auf- und Abpipettieren wurde die Lösung in die QIAshredder- Homogenisierungssäule überführt und für 2 Minuten bei maximaler Geschwindigkeit in einer Eppendorf-Zentrifuge zentrifugiert. Dieser Schritt führt zur Homogenisierung des Lysats, reduziert seine Viskosität und entfernt die DNS ohne jegliche chemische Reaktion, sondern rein mechanisch. Danach wurden 600 μl 70% Ethanol zum Lysat gegeben und durch Auf- und Abpipettieren gemischt. Das Ethanol verbessert die Bindungsfähigkeit der RNS an die im nächsten Schritt eingesetzten Säulen. In zwei Schritten wurden jeweils maximal 700 μl des ethanolversetzten Lysats auf eine RNeasy-Mini-Säule überführt und für 15 Sekunden bei mehr als 8000 g zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen und der Schritt wiederholt, bis sich das gesamte Volumen der Probe auf der RNeasy-Säule befand. Die Membran, die sich in der RNeasy-Säule befindet, können nur solche RNS-Moleküle passieren, die kürzer als 200 Nukleotide sind. Da die mRNS eine Länge von mehr als 200 Nukleotiden hat, ist gewährleistet, dass sich im Endlysat nur mRNS und nicht ribosomale (r)RNS oder transfer (t)RNS befindet, deren Länge typischerweise unterhalb von 200 Nukleotiden liegt.

Die nächsten Schritte sind Waschschritte, um die gewonnene mRNS von möglichen Kontaminationen zu befreien. 700 μl des RW1-Wasch-Puffers wurden auf die Säule gegeben und diese anschließend für 15 Sekunden bei mehr als 8000 g zentrifugiert. Der Durchfluss wurde daraufhin verworfen und die Säulen auf ein Sammelgefäß gesetzt. 500 μl des RPE-Puffer, der vorher mit 4 ml 99,9% Ethanol versetzt worden war, wurden auf die Säule pipettiert und diese dann für 2 Minuten bei mehr als 8000 g zentrifugiert. Die genaue Zusammensetzung und der

Material und Methoden

Wirkungsmechanismus des RPE- und RW1-Puffers werden von der Firma Qiagen nicht genannt. Der Durchfluss wurde verworfen und der Vorgang wiederholt, diesmal aber mit einer Zentrifugationsdauer von einer Minute. Die noch in der Säule gebundene mRNS wurde mit 30 μl RNAse-freiem Wasser versetzt und die Säule für 1 Minute bei mehr als 8000 g zentrifugiert, was zum Auswaschen der RNS aus der Säule führt. Der Vorgang wurde nach erneuter Zugabe von 30 μl RNAse-freiem Wasser wiederholt. Die so gewonnene mRNS in einem Gesamtvolumen von 60 µl wurde sofort in einen –80°C Gefrierschrank überführt, um einen möglichst stabilen Zustand zu gewährleisten. Da häufig nur 2 bis 3 Flaschen die richtige Konfluenz zur RNS-Isolierung hatten, wurden die Lysate nach dem Homogensierungsschritt mit der QIAshredder-Säule bei -80°C eingefroren, um später dann mit allen Proben parallel fortzufahren. So wurden einheitliche Verarbeitungsbedingungen gesichert. Laut dem Hersteller Qiagen ist das Einfrieren der homogenisierten Proben bei -80°C über mehrere Monate bedenkenlos möglich. In unseren Versuchsreihen war dies für längstens zwei Wochen der Fall, bis mit dem nächsten Schritt fortgefahren wurde. Nach Gewinnung der RNS wurde ihre Konzentration mittels Photometer und folgender Formel bestimmt: A=eλ x c x d  c=A/(eλ x d) (c: Konzentration der

RNS in mol/l, A: gemessene Absorption, eλ: molarer Absorptionskoeffizient des absorbierenden Stoffes bei der Wellenlänge λ in M-1 x cm-1, d: Länge des Licht- weges in der absorbierenden Lösung in cm). Umgeformt lässt sich die Formel für RNS-Konzentrationen auch folgendermaßen darstellen: c=A260nm x 40. Die Konzentration wird hier in der Einheit μg/μl angegeben, die Zahl 40 ist ein RNS-spezifischer Faktor, der einer Lösung mit optischer Dichte von 1 entspricht, die eine Konzentration von 40 μg/μl RNS enthält. Um auf die Ausgangskonzentration der Proben zu kommen, muss der

Verdünnungsfaktor D (cUrsprung=cgemessen x D), der in unserem Fall 100 war, rechnerisch berücksichtigt werden. Zur Bestimmung der Reinheit der RNS wurde auch die Extinktion bei 280 nm (Proteinabsorptionsmaximum) bestimmt. Das Verhältnis der Extinktion bei 260 nm (Nukleinsäuren) zur Extinktion bei 280 nm (Proteine) zeigt an, wie stark eine Pro- be verunreinigt ist. Der Quotient lag bei den hier bestimmten Proben immer bei >1,8. Damit liegt eine reine RNS Probe vor. 22

Material und Methoden

2.2.5. Microarray

Microarray ist ein Oberbegriff für molekularbiologische Untersuchungsmethoden, die die integrierte Analyse von mehreren tausend parallelen Expressions- experimenten gleichzeitig erlauben. Es gibt Gewebe-, Protein- und Desoxy- ribonukleinsäure (DNS)-Microarrays. Die Einsatzmöglichkeiten von DNS- Microarrays erstrecken sich von Krankheitsklassifikation und –charakterisierung über die Identifikation neuer Zielmoleküle und die Untersuchung von Gennetzwer- ken bis zur Analyse transkriptioneller Veränderungen der Genexpression bei Tumoren und anderen Erkrankungen. DNS-Microarrays werden seit den 1990er Jahren intensiv entwickelt (Chalifour et al. 1994, Schena et al. 1995, Schena et al. 1996, Shalon et al. 1996) und entstanden aus dem Southern Blot (Southern 1975). Beim Southern Blot werden DNS-Fragemente, die zuvor mittels Gelelektrophorese und anschließend durch Alkalien in Einzelstränge getrennt und auf einer Membran fixiert wurden, mit einer chemisch oder radioaktiv markierten Gensonde bekannter Sequenz hybridisiert. Somit kann festgestellt werden, ob sich die zu den markierten Gensonden komplementäre (c)DNS auf der Membran befindet. Bei den cDNS-Microarrays werden einige hundert bis zehntausende mikroskopisch kleine Sonden auf einer Trägerplatte aus Glas, Plastik oder Silikon an vordefinierten Positionen platziert. Manche cDNS-Microarrays enthalten mehr als 55.000 Sonden auf einem einzigen Träger. Unterschieden wird zwischen cDNS- oder Oligonukleotid-Microarrays, die erstmalig 1996 beschrieben wurden (Lockhart et al. 1996), und zwischen ein- bzw. zweifarbigen Arrays. Bei cDNS-Arrays werden komplette cDNS-Einzelstränge nach der Synthese an vordefinierten Positionen auf der Trägerplatte aufgebracht. Bei Oligonukleotid-Arrays bestehen diese Sonden aus langen (60-70 Bp) oder kurzen (20 Bp) Oligonukleotiden, die direkt auf der Trägerplatte synthetisiert werden. Bei ein- oder zweifarbigen Arrays wird unterschieden, ob eine Referenz- cDNS mit zur Probe gegeben wird. Diese Referenz wird wie die eigentliche cDNS- Probe ebenfalls mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert, meist Cyanine 3 (Cy3) oder Cyanin 5 (Cy5). Danach wird diese Probe auf die Trägerplatte gegeben und die cDNS mit den komplementären Sonden hybridisiert. Da die cDNS mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, kann dieses Fluoreszenzsignal mit einem Laser ausgelesen und in einen Expressionswert umgeschrieben werden. Bei einfarbigen Arrays entspricht das Farbsignal dem Proben-cDNS-Quotienten. Bei zweifarbigen 23

Material und Methoden

Arrays gibt das Farbsignal die Differenz zwischen Referenz-cDNS und Proben- cDNS an. Die so gewonnenen Rohdaten müssen zunächst normalisiert werden, um anschließend weiterverarbeitet und analysiert werden zu können. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der einfarbige CodeLink Human Whole Genome Bioarray (CodeLink Human Whole Genome Bioarray 2013) benutzt. Bei diesem Arrays sind die sehr kurzen, nur 30-mer langen Oligonukleotide an einer 3-D Poly- acrylamid-Gelmatrix gebunden. Der Vorteil der hydrophoben Gelmatrix liegt darin, dass die Matrix die Oligonukleotide abstößt, diese sich dadurch relativ frei bewe- gen können, und somit gut zugänglich für die Hybridisierung sind. Zusammen mit der 3-D Struktur ist die Bindungskinetik zwischen Probe und Oligonukleotid vergleichbar mit der in Flüssigkeiten (Dorris et al. 2003). Auf dem Array befinden sich 57841 Transkripte und expressed sequence tags (ESTs). Unter den Transkripten befinden sich 360 Positiv- und 384 Negativkontrollen sowie 100 nicht regulierte Gene (sogenannte Referenzgene). Die Kontrollen sind für die anschließende Qualitätssicherung notwendig und können im weiteren Verlauf bei der Datenverarbeitung eingesetzt werden. Die nicht regulierten Gene sind Ge- ne, die in jedem Zelltyp und –stadium in gleicher Höhe exprimiert werden. Sie können damit ebenfalls zur weiteren Datenverarbeitung und Normalisierung eingesetzt werden. Mit dem von uns ausgewählten Microarray können weniger als eine Transkript-Kopie pro Zelle detektiert und bei mehr als zwei Basenfehlbindun- gen (mismatch-Bindungen) spezifisch unterschieden werden. Die nächsten Schritte wurden in der Genomics Core Facility des Europäischen Laboratoriums für Molekularbiologie (EMBL, Heidelberg) durchgeführt und sollen nur schematisch dargestellt werden. Für genaue Details der einzelnen Schritte verweisen wir auf die Protokolle von Codelink: CodeLink Gene Expression System: Manual Labelled cRNA Target Preparation und CodeLink Gene Expression System: Single-Assay Bioarray Hybridization and Detection (CodeLink Single-Assay Bioarray - Protokoll 2013). Die Proben-mRNS (20 μl in einer Konzentration von 0,25 μg/μl) wurden zu Beginn mit bakterieller Kontroll-mRNS versetzt, die als Positiv-Kontrolle dient. Da sich auf dem Microarray komplementäre Sequenzen zur bakteriellen Kontroll-mRNS befinden, kann jeder nachfolgende Schritt kontrolliert werden. In einer reversen Transkriptionsreaktion mit DNS-Oligonukleotiden und in Anwesenheit

Material und Methoden

mRNS-Gewinnung aus den Glioblastom-Zellreihen

Qualitätskontrolle der mRNS und Zugabe der bakteriellen Kontroll-mRNS

mRNS (Probe) mRNS (Bakterielle Kontrolle)

Aufeinander folgende Synthese des ersten und komplementären cDNS Strangs. Anschließende Reinigung der cDNS.

cDNS

cRNS Synthese durch in-vitro Transkription mit Biotin-Markierung und mit anschließender cRNS Reinigung

cRNS (Biotin markiert)

Hybridisierung der cRNS mit den cDNS Oligomeren auf dem Array

Hybridisierte cRNS am komplementären Oligonukleotid

Markierung der gebundenen cRNS mit dem Fluo- reszenzfarbstoff Cy5-Streptavidin

Fluoreszenz-markierte gebundene cRNS

Scannen der Arrays

Abbildung 2: Microarray-Ablauf Schematische Darstellung der Arbeitsabläufe bis zum Scannen der Microarrays. Adaptiert aus dem Manual CodeLink Gene Expression System: Single-Assay Bioarray Hybridization and Detection“ (CodeLink Single-Assay Bioarray - Protokoll 2013).

Material und Methoden eines T7oligo(dt) Primers wurden der erste (Inkubation bei 42°C für 2 Stunden) und danach der dazugehörige komplementäre cDNS Strang (Inkubation bei 16°C für 2 Stunden) gebildet. Anschließend wurde photometrisch gemessen, ob die cDNS Synthese erfolgreich war. Die so gewonnene cDNS galt als Matrize für die in vitro Transkription (IVT), um die gewünschte cRNS herzustellen. Dies geschah in Anwesenheit von biotinmarkierten Nukleotiden, die in die cRNS eingebaut werden. Diese Schritte dienen zur 1000- bis 5000-fachen Amplifikation und Biotin- Markierung der cRNS. Die so hergestellte cRNS wurde danach in mehreren Schritten gereinigt und letztlich auf Reinheit und Qualität mittels Nanodrop geprüft. Im nächsten Schritt wurde die gewonnene Biotin-markierte cRNS dem Protokoll entsprechend inkubiert und schließlich auf den Array transferiert. Die Hybridisierung mit den Oligonukleotiden auf dem Array erfolgte unter ständiger Bewegung für 24 Stunden. Nach einem Waschschritt wurden die Arrays mit Cy5-Streptavidin für 30 Minuten inkubiert. Streptavidin ist ein Protein mit hoher Affinität zu Biotin (Zimmermann und Cox 1994), Cy5 gehört zur Gruppe der Cyanine und ist ein Fluoreszenzfarbstoff. Nach anschließender mehrfacher Waschung wurden die Träger- platten zentrifugiert und bis zum Scannen in Dunkelheit gelagert (Abbildung 2). Abgesehen von G-210GM wurden alle Microarray-Experimente als biologische Triplikate wiederholt. Bei G-210GM wurde der Microarray als technisches Duplikat mit ursprünglich zwei mRNS-Proben aus der gleichen Ursprungszellkulturflasche durchgeführt.

2.2.6. Scannen Zum Scannen wurde ein Axon 4000B Scanner benutzt, der eine Auflösung von 5 μm hat. Beim Scannen treffen die Photonen des Lasers auf den Fluoreszenzfarb- stoff der markierten cRNS (hier Cy5) auf. Die Photonen des ausgestrahlten Lichts des Lasers werden absorbiert und Photonen niederer Energie, also mit größerer Wellenlänge werden zurückgesandt. Cy5-Streptavidin wird bei 650 nm angeregt und emittiert Licht einer Wellenlänge von 670 nm. Trifft ein Photon dieser Wellen- länge auf die Photokathode des Photoelektronenvervielfachers des Scanners, wird ein Elektron gebildet. Die so gebildeten Elektronen fließen über einen Sekundär- 26

Material und Methoden elektronen-Vervielfältiger, hier treffen sie auf weitere Elektroden (Dynoden) und schlagen weitere Elektronen heraus. Damit wird ein einzelnes Elektron vervielfäl- tigt. Beim Axon 4000B ist eine Vervielfältigung des Signals bis 107 möglich (Axon 4000B - Benutzerhandbuch 2013), wobei zu berücksichtigen ist, dass bei höherer Verstärkung des Signals auch mehr unspezifische Fluoreszenz verstärkt wird und somit das Hintergrundrauschen zunimmt. Die so multiplizierten Elektronen treffen auf die Anode und erzeugen einen Spannungsabfall, der gemessen wird. Dieser Spannungsabfall ist proportional zu den auf der Photo- kathode aufgetroffenen Photonen. Die minimale Auflösung des Axon 4000B Scanner ist 5 μm, d.h. im Bereich von 5 μm werden die auftretenden Photonen und das daraufhin umgewandelten elektronische Signal zu einem Pixel zusammengefasst. So ergeben sich für jeden einzelnen Spot auf dem Array Signale. Je nachdem wie viel cRNS in der Probe war, die zu einer bestimmten Sonde auf dem Microarray kovalent ist, gibt es auch entsprechend viele Photonen, die vom an die cRNS gebundenen Fluoreszenz- farbstoff emittiert werden. Die Software des Scanners ist GenePix 6.0. Die Bilder wurden jeweils mit einer Auflösung von 5 μm aufgenommen und anschließend im 16 bit Graustufen-Format (TIFF) gespeichert, die Skala der Signalstärken reicht von 0 bis 65536. Nach erfolgter Messung wurden die Daten in die CodeLink Software EXP v4.0 ein- gelesen und die Signalstärken berechnet. Zur Berechnung der Signalstärken werden automatisch die Signalzone und Hintergrundzone ausgewählt. Anhand empirischer Werte sind die unterschiedlichen Formvarianten des Spots bekannt. Der Spot ist das jeweilige Gebiet, auf dem die cRNS mit einer spezifischen Sonde auf dem Array hybridisierte. Durch Datenextraktion und weitere bioinformatische Verarbeitung kann der Radius der Signalzone und die Anzahl der Pixel pro Spot berechnet werden. Damit kann die mittlere Signalintensität berechnet werden, sie ist die Summe aller Pixelintensitäten dividiert durch die Summe aller Pixel. Die eigentliche Signalstärke des Spots wurde mit folgender Formel berechnet: Signal- stärke = 100% x (mittlere Signalintensität - mittlere Signalintensität des Hinter- grunds) / Standardabweichung des Hintergrunds (CodeLink - Image Quantitation 2013).

Material und Methoden

2.2.7. Datenanalyse Vor der weiteren Analyse der Daten wurden alle Positiv- und Negativkontrollen entfernt. Ebenso wurden Gene entfernt, die mehr als zwei fehlende Werte aufwiesen. Bis zu zwei fehlende Werte pro Gene wurden mit Hilfe des k-nächsten- Nachbarn-Algorithmus ersetzt. Anschließend erfolgte eine Normalisierung der Daten mit dem Software Paket R (Version 2.5.0) (Diez et al. 2007). Eine Normalisierung ist nötig, um Unterschiede in den Expressionswerten, die auf Grund technischer Gegebenheiten entstanden sein könnten, wie z.B. durch unterschiedliche Färbung, bei der Hybridisierung oder bei der Messung der Spotsignal- stärke, zu entfernen. Aktuell gibt es für die Normalisierung noch keinen einheitlichen Standard (Wu et al. 2005, Do und Choi 2006). Wie stark die Normalisierung ausfällt, ist von Array zu Array sehr unterschiedlich (Simon et al. 2003). Die meisten Normalisierungsmethoden basieren auf der Annahme, dass der Großteil der Gene nicht unterschiedlich exprimiert wird oder dass die Anzahl der über- und unterexprimierten Gene in etwa gleich hoch ist (Do und Choi 2006). In einer Studie, die die unterschiedlichen Normalisierungsmethoden für CodeLink Bioarrays untersuchte, zeigte sich, dass die häufig verwendete Median- Normalisierung insuffiziente Ergebnisse hervorbringt (Wu et al. 2005). Es wurde daher die von Wu et al. empfohlene CyclicLoess Normalisierung zur weiteren Datenanalyse verwendet.

Zu weiteren Analyse wurde eine Kohorte von 536 Genen (siehe Kapitel 2.2.8.) ausgewählt, die eine Rolle in der Zellproliferation oder Apoptose von Tumorzellen spielt. Diese 536 Gene waren durch 814 Sonden auf dem Codelink Microarray repräsentiert. Die gemessenen Expressionswerte der Gene wurden in unterschiedlichen Phänotyp-Gruppen miteinander verglichen. Dazu wurde der para-meterfreie, unabhängige und zwei-seitige Jonckheere-Terpstra-Test verwendet, der als Teil einer multiplen Testung (van der Laan et al. 2004) in das Soft- ware-Paket R implementiert wurde. Die so erhaltenen p-Werte wurden noch mittels einer p-Wert-Korrektur nach Benjamini und Yekutieli korrigiert (Benjamini 2001). Dies ist notwendig, da bei der Anwendung multipler Tests das „lokale“ Sig- nifikanzniveau von α eingehalten wird, wenn jede individuelle Nullhypothese höchstens mit der Wahrscheinlichkeit α irrtümlich abgelehnt wird. Bei einem Mehr- hypo-thesentest-Problem ist die Irrtumswahrscheinlichkeit jedoch durch eine Feh- 28

Material und Methoden lerrate 1. Art begrenzt, meist die false discovery rate. Das ist die erwartete Anzahl der falsch Positiven innerhalb der abgelehnten Hypothesen. Um diese false discovery rate zu kontrollieren, genügt es nicht alleine, dass alle lokalen Signifikanz- niveaus eingehalten werden. Es muss vielmehr bei einem multiplen Testverfahren ein globales Signifikanzniveau von α eingehalten werden, dies sind die adjustierten p-Werte. Bei einem adjustierten p-Wert <0,05 % wurden die Ergebnisse als signifikant gewertet. Die statistische Auswertung erfolgte in enger Zusammen- arbeit mit Herrn Thomas Hielscher, Abteilung Biostatistik, Deutsches Krebs- forschungszentrum (DKFZ). Schließlich wurde die so erhaltene Genliste noch mittels der Datenbank für „Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID)“ (DAVID Datenbank 2013) (Huang da et al. 2009) auf gemeinsame Signalwege hin untersucht.

2.2.8. Auswahl der Gene Zur Erstellung der Liste mit Genen, die eine Rolle in der Zellproliferation oder Apoptose von Tumorzellen spielen, wurde über die Datenbank Genecards (Genecards Datenbank 2013) bzw. direkt über die „Kyoto Enzyklopädie der Gene und des Genoms“ (KEGG, (KEGG Datenbank 2013)) nach Signalpfaden und den dazugehörigen Genlisten gesucht. Suchbegriffe waren „apoptosis“, „cell proliferation“, „EGFR“, „glioma“ und „glioblastoma“.

2.2.9. Reverse Transkription und qPCR Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist ein durch Kary Mullis 1983 bekannt gewordenes Verfahren, welches den natürlichen Vorgang der DNS-Replikation nachahmt (Holzapfel und Wickert 2007). Mit Hilfe einer Polymerase, Primern und Oligonukleotiden werden spezifische DNS-Abschnitte amplifiziert. Da die Polymerase nur DNS als Matrize nutzen kann, muss die vorher aus der Zellkultur gewonnene RNS in cDNS umgewandelt werden. Dies geschieht mithilfe der reversen Transkriptase. In den frühen 1990ern erfuhr die PCR eine Erweiterung durch Kombination von Fluoreszenzfarbstoffen (z.B. Ethidium-Bromid) mit Videoaufzeichnung zur sogenannten Echtzeit-PCR (Higuchi et al. 1993). Die DNS-Amplifikation konnte 29

Material und Methoden dadurch kontinuierlich gemessen werden, was dazu führte, dass eine quantitative Aussage zur anfänglichen DNS-Konzentration getroffen werden konnte. Dieses Verfahren – die quantitative real-time PCR (qPCR) – wurde im Rahmen dieser Arbeit benutzt, um die durch Microarray-Analyse identifizierten über- oder unterexprimierten Gene mit einem zweiten Verfahren zu bestätigen.

2.2.9.1. Reverse Transkription Die reverse Transkriptase (RT) wurde in den 1970ern von Howard Temin (Temin und Mizutani 1970) und David Baltimore (Baltimore 1992) erstmalig beschrieben. Mittels einer RNS-abhängigen DNS-Polymerase wird ein RNS-DNS-Hybridstrang synthetisiert. Nach Verdauung des RNS-Anteils wird ein komplementärer DNS- Strang gebildet. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das QuantiTect Reverse Transcription Kit von Qiagen benutzt. Die Konzentration der extrahierten RNS wurde mittels eines Spektrophotometers gemessen und mit RNase freiem Wasser auf eine Konzentration von 1 µg/µl ein- gestellt. Um kontaminierende genomische DNS (gDNS) zu eliminieren, wurde die RNS mit einem Waschpuffer (Quantitect gDNS-Waschpuffer) für 2 Minuten bei 42°C gewaschen. Danach wurde eine zweite Lösung hergestellt aus der reversen Transkriptase (RT), einem Primer-Mix und dem Mg2+- und Desoxyribonukleosid- triphosphate (dNTP)-enthaltenden RT-Puffer. Nach Zugabe der RNS wurde die Lösung für 15 Minuten bei 42°C inkubiert und einmalig bei 95°C für 3 Minuten erhitzt, um die reverse Transkriptase zu inaktivieren. Die Konzentration der so gewonnen cDNS wurde erneut photometrisch gemessen und quantifiziert. Die Inhaltsstoffe des Wasch- und RT-Puffers werden von Qiagen nicht genannt.

2.2.9.2. qPCR Die so gewonnene cDNS konnte anschließend für die qPCR weiterverwendet werden. Die Replikation des spezifischen DNS-Abschnittes erfolgt exponentiell, d.h. nach 30 Zyklen liegen etwa 109 Kopien des replizierten DNS-Abschnittes vor. Im ersten Schritt, der Denaturierung werden bei 95°C die DNS-Doppelstränge aufgespalten, im zweiten Schritt – dem Annealing – werden die Primer angelagert. Primer sind synthetische, gegenläufig orientierte, spezifische Oligonukleotide, die 30

Material und Methoden der DNS-Polymerase als Startmolekül zur Verlängerung der Zielsequenz dienen. Die im dritten Schritt (Elongation) erfolgende Verlängerung der DNS-Sequenz erfolgt mittels der rekombinanten, hitzestabilen DNS-Polyermase aus dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus (Taq-Polymerase). Die Taq- Polymerase hat ihr Temperaturoptimum bei 72°C und übersteht die 95°C des De- naturierungsschrittes ohne Aktivitätseinbuße. Dadurch ist ein automatisierter Ablauf von mehreren Zyklen ohne Unterbrechung möglich. Als Fluoreszenzfarbstoff wurde SYBR Green I (Molecular Probes, Portland, Oregon) benutzt. SYBR Green I ist ein fluoreszierender Farbstoff, der sich in die kleinen Furchen doppelsträngiger DNS einlagert. Der Vorteil von SYBR Green I liegt in seiner Unspezifität; es kann damit in jeglicher PCR eingesetzt werden. Gleichwohl stellt dies auch einen Nachteil dar, da SYBR Green I mit jeder doppel- strängigen DNS interkaliert (u.a. auch mit gebildeten Primer-Dimeren) und dadurch ein Fluoreszenzsignal erzeugt. Die Fluoreszenz nimmt proportional zur Menge der PCR-Produkte zu und macht daher eine quantitative Aussage möglich. Wichtig ist, dass man die Quantifizierung am Anfang der exponentiellen Phase durchführt, da zum Schluss der PCR eine Plateauphase eintritt. Hier hybridisieren immer häufiger Produktfragmente miteinander, Primer- und/oder Nukleotidmangel tritt auf und letztlich wird so die PCR gehemmt. Der angegebene Schwellenwert- Zyklus (CT-Wert (cycle threshold)) ist letztlich der Zyklus, bei dem die Fluoreszenz erstmalig signifikant über die Hintergrundfluoreszenz ansteigt. Anfänglich wird nur die Hintergrundfluoreszenz gemessen, da aufgrund der geringen Ausgangskon- zentration der DNS im Reaktionsgefäß die Reporterfluoreszenz nicht detektierbar ist. Um unterscheiden zu können, ob das Fluoreszenzsignal durch das korrekte Produkt und nicht durch ein Artefakt verursacht wurde, ist eine anschließende Schmelzkurvenanalyse nötig. Dabei kommt es durch schrittweisen Temperatur- anstieg zu einer Auftrennung der DNS-Doppelstränge entsprechend ihrer jeweiligen spezifischen Schmelzpunkte. Aufgrund der Abnahme der DNS- Doppelstränge lässt auch die Fluoreszenz nach. Je kleiner die Fragmente sind (Primer-Dimere, Mutationen etc.), desto niedriger sind auch die Schmelzpunkte. Die Schmelzkurven sollten pro gewünschtem Produkt einheitlich sein und einen gemeinsamen Höchstwert haben, um sicher zu gehen, dass keine anderen DNS- Abschnitte oder Primer-Dimere in der Probe gemessen wurden.

Material und Methoden

Für die qPCR dienten 3µl der zuvor hergestellten cDNS-Lösung. Diese 3 µl wurden zu 17 µl MasterMix hinzugegeben. Der MasterMix bestand jeweils aus 0,5 pMol/µl des jeweiligen Primerpaares (vorwärts- und rückwärts-Primer) und des SYBR Green Master Mixes von Qiagen. Der SYBR Green Master Mix hat eine Mg2+-Konzentration von 2,5 mmol/l und enthält SYBR Green I, die HotStarTaq DNS Polymerase und dNTPs. Als passive Referenzfärbung enthält der SYBR Green Master Mix auch das Fluoreszenz 5,6-Carboxy-x-Rhodamin (ROX), welches zur Normalisierung des SYBR Green I Signals dient. Mit diesem Reaktionsansatz erfolgte die qPCR. Anfänglich wurde 15 Minuten bei 95°C inkubiert um die HotStarTaq-Polymerase von Qiagen zu aktivieren. Diese Polymerase ist bei Raumtemperatur funktionslos und verursacht somit keine Primer-Dimerisierung o.ä. während des Versuchsaufbaus. Danach erfolgten 40 Zyklen zu je 15 sec bei 95°C zum Aufspalten der Doppelstränge, 25 sec bei 60°C zur Anlagerung (Annealing) und 20 sec bei 72°C zur Synthese (Extension) des DNS Stranges (QuantiTect SYBR Green PCR Handbook 11/2005, Qiagen). Im Anschluss erfolgten eine visuelle Schmelzkurvenanalyse und die Auswahl des Schwellenwert-Zyklus mittels der 7500 System SDS Software.

2.2.10. Primer Primer wurden für jeden Abschnitt, der repliziert werden sollte, eigens konstruiert und bei der Firma Sigma-Aldrich (Hamburg, D) synthetisiert. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zum einem das Universal ProbeLibrary Assay Design Center von Roche (Roche Applied Science, Penzberg, Germany (Roche - Universal ProbeLibrary Assay Design Center 2013)), als auch das Onlineprogramm „Primer3“ (Primer3 2013) benutzt. Die Primer wurden – wenn möglich – so konstruiert, dass sie über Introns hinaus reichten, um damit möglichst falsch positive Signale durch rückständige genomische DNS-Abschnitte zu verhindern. Die Primer wurden durch Sigma-Aldrich synthetisiert und hatten eine Länge zwischen 18 und 25 Bp. Die amplifizierten PCR Produkte waren zwischen 60 und 131 Basen lang (siehe Tabelle 1).

Material und Methoden

Tabelle 1: Primersequenzen Sequenzen der verwendeten PCR Primer für die qPCR und Sequenzen des Amplikon. Primerlängen betrugen 18 – 25 Bp, Amplikonsequenzen entsprachen 60 bis 131 Bp.

Sequenz Sequenz Gen Amplikonsequenz Vorwärts-Primer Rückwärts-Primer ccgtgaggtttgtgtggaccccgagttccaccaggtgagaagagtgat- BDNF ccgtgaggtttgtgtggac aaaaggatggtcatcactcttctc gaccatcctttt cacgacagctcggagtacctcctccgcatcgtgcgagcctccagcgtctt- CACNG4 cacgacagctcggagtacct ggagcaggatggtgctga ccccatcctcagcaccatcctgctcc cagtcagctgccatttgcggcttaaggcatgaagttttaaaacat- CARD6 cagtcagctgccatttgc ggggcttcaggctgtttta gagaatacagtacctcctcaatctatgggggcaagcagtaattcagaa- gatgctttttctcctggaataaaacagcctgaagcccc tgcatcccagtggaagataaccacaaggccgacatcagctcctggttca- DUSP4 tgcatcccagtggaagataa gcagtccttcacggcatc tggaagccatagagtacatcgatgccgtgaaggactgc ctggagctgggagtgaggcggcggaggagccaggtgaggag- FGFR4 ctggagctgggagtgagg gctggacttcccaccaact gagccaggaaggcagttggtgggaagtccagc aaccggaggaaggaactgaccgacttcctgcaggcggagact- FOSL1 aaccggaggaaggaactgac ctgcagcccagatttctcat gacaaactggaagatgagaaatctgggctgcag gggtcaggccctaccattgaggaggtggattaggggcctttgttctttag- HSPA1B gggtcaggccctaccatt cagtccacctcaaagacaaaca tatgtttgtctttgaggtggactg cgtggcagttatggaaggtaaacaagcaaaggtgctggagaat- HSPA9B cgtggcagttatggaaggtaa actgaaggggtggttctgg gccgaaggtgccagaaccaccccttcagt tccctggatgtcaaccacttcgccccggacgagctgacggtcaagac- HSPB1 tccctggatgtcaaccactt gatgtagccatgctcgtcct caaggatggcgtggtggagatcaccggcaagcacgaggagcggcag- gacgagcatggctacatc caccagcagcgactctgaggaggaacaagaagatgag- MYC caccagcagcgactctga gatccagactctgaccttttgc gaagaaatcgatgttgtttctgtg- gaaaagaggcaggctcctggcaaaaggtcagagtctggatc ggtcttcgggagaggagaaacttt- NFATC1 ggtcttcgggagaggagaaa ttggaggatgcatagccata ggggcccgcgccgcgcgccggcggcaccatgaagtcagcggag- gaagaacactatggctatgcatcctccaa gcgcagagaacctgactgagctctacatcgagaacca- NTRK1 gcgcagagaacctgactga ctcttcacgatggtgaggttt gcagcatctgcagcatctggagctccgtgatctgaggggcctgggg- gagctgagaaacctcaccatcgtgaagag ctgatgcaggccatcaagtgtgtggtggtgggagacggagctgtagg- RAC1 ctgatgcaggccatcaagt caggaaatgcattggttgtg taaaacttgcctactgatcagttacacaaccaatgcatttcctg gcttccgggactatgtgctatgtcaggccaatgtgacca- SMO gcttccgggactatgtgcta agtcagggatgggctgct tcgggctgcccaccaagcagcccatccctgact tgagttgatttctgtgtctgaagttcacccttctagacttcagacca- STAT1 tgagttgatttctgtgtctgaagtt acacctcgtcaaactcctcag cagacaacctgctccccatgtctcctgaggagtttgacgaggtgt ccatgaacgcctcgatgtccagcctggtctccagtcggttctctcctcacat- TCF7L1 ccatgaacgcctcgatgt gagccaccatgtgaggaga ggtggctc aagaagcgggctttggacaccaattactgcttccgcaacttggag- TGFB3 aagaagcgggctttggac cgcacacagcagttctcc gagaactgctgtgtgcg

Material und Methoden

2.2.11. Auswahl der Referenzgene Vor der weiteren Datenanalyse erfolgte eine Normalisierung der CT-Werte. Hierfür werden Gene als Referenz benutzt, die idealerweise leicht zu detektieren sind und deren Expression nicht zwischen Zelltypen, während des Zellzyklus oder bei Än- derungen im Experimentmilieu variiert. Es ist jedoch mittlerweile bekannt, dass bei „Standard“-Referenzgenen signifikante Expressionsunterschiede zwischen unterschiedlichen Geweben bestehen (Tricarico et al. 2002), sodass eine Standard- normalisierung gegen ein einzelnes Referenzgen nicht empfehlenswert ist. Um valide Aussagen machen zu können, sollten möglichst 3 unabhängige Referenz- gene ausgewählt werden (Holzapfel und Wickert 2007). Vandesompele et al. haben die Visual Basic Anwendung „geNorm“ für Microsoft-Excel entwickelt, um Re- ferenzgene mit der stabilsten Expression für jeden Versuchsaufbau bzw. jede Ge- webeart durch einen mathematischen Regressionsalgorithmus festzulegen (Vandesompele, De Preter et al. 2002). Jedes getestete Referenzgen wird hier mit jedem anderen Gen verglichen. Je nach Veränderung des Expressionsquotienten ändert sich die Expressionstabilität „M“, d.h. bei zunehmendem Expressionsquotienten nimmt die Expressionsstabilität „M“ ab. Je kleiner „M“, desto stabiler ist die Expression des Referenzgens in dem untersuchten Ver- suchsaufbau. In dieser Arbeit wurden mittels des geNorm Houskeeping Selection Kit (18S ribosomale RNS (18S), β-Actin (ACTB), β-2-Mikroglobulin (B2M), beta- Glucuronidase (GUSB), Glyceraldehyd-3-Phosphate Dehydrogenase (GAPDH), Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1), Peptidylprolyl Isomerase A (PPIA), 60S saures ribosomales Protein P (RPLP), Ubiquitin C (UBC), TATA- Box-Binding Protein (TBP), Klasse I Beta-Tubulin (TUBB) und Protein Kinase C Inhibitor Protein-1 (YWHAZ)) 12 Gene getestet, um drei Referenzgene für die weitere Normalisierung zu bestimmen. Die PCRs hierfür wurden parallel mit den o.g. PCRs (Kapitel 2.2.9.2) unter gleichen Bedingungen durchgeführt.

2.2.12. Datenanalyse der qPCR-Ergebnisse Die mittleren CT-Werte der qPCR wurden mit dem auf Microsoft-Excel basierenden Programm REST (Relative Expression Software Tool)-MCS (Multiple Condition Solver) Version 2 analysiert (Pfaffl, Horgan et al. 2002). Mit Hilfe dieses Programmes können nicht nur - wie herkömmlich - qPCR-Daten mit einer 34

Material und Methoden

Kontrolle verglichen werden, sondern es können vielmehr mehrere Gene unter- schiedlicher Bedingungen mit einer Referenz-Bedingung in Beziehung gesetzt werden. In unserem Fall wählten wir die intermediäre Gruppe als Referenzbedingung und verglichen, ob und wie die Gene in der sensitiven und resistenten Gruppe über- und unterexprimiert waren. Weiterhin können im Rahmen dieser Analyse mehrere Referenzgene ausgewählt werden. In der vorliegenden Arbeit wählten wir, wie oben beschrieben (Kapitel 2.2.11.), die drei Referenzgene HPRT1, YWHAZ und PPIA aus. Nach der Datenanalyse in REST-MCS wurden die Ergebnisse der absoluten Genregulation in Microsoft-Excel exportiert und entsprechend in Kapitel 3.8. dargestellt.

2.2.13. Statistische Auswertung Im Rahmen der statistischen Auswertung wurden alle patientenbezogenen Daten mittels Microsoft® Excel 2007 tabellarisch erfasst. Die statistische Auswertung erfolgte mit Microsoft® Excel 2007 sowie SPSS® IBM. Korrelationsanalysen von Patientendaten wurden mit Hilfe des Korrelationskoeffizienten nach Pearson durchgeführt (Kapitel 3.1.) Zur weiteren Analyse der Patientendaten bzw. der statistischen Evaluation der beschriebenen zellulären Verdopplungszeiten diente ein zweiseitiger t-test (Kapitel 3.1. und 3.2.). Die Normalisierung der Microarray-Daten erfolgte mit Hilfe der CyclicLoess Nor- malisierung (Kapitel 3.3.). Zur Berechnung eines Trends der Expressionswerte innerhalb der drei Gruppen „resistent, intermediär und sensitiv“ wurde der parame- terfreie, unabhängige und zwei-seitige Jonckheere-Terpstra-Test verwendet, der als Teil einer multiplen Testung in das Software Paket-R (R-Projekt 2014) implementiert wurde. Die adjustierten p-Werte wurden mittels der p-Wert-Korrektur nach Benjamini und Yekutieli berechnet (Benjamini 2001) (Kapitel 3.4.). Zur Berech- nung der Korrelationen bestimmter Gene in der Pathogenese des Glioblastoms wurde der Rangkorrelationskoeffizient nach Spearman eingesetzt (Kapitel 3.6.). Der Jonckheere-Terpstra-Test wurde ebenfalls für die Berechnung der Signifikanzen der qPCR-Daten eingesetzt (Kapitel 3.8.). Die Referenzgene wurden nach Berechnung der Expressionsstabilität „M“ nach Vandesompele (Vandesompele et al. 2002) ausgewählt (Kapitel 3.8.). Bei einem Signifikanz- 35

Material und Methoden niveau von p < 0,05 im jeweils verwendeten Test wurde eine signifikante Korrelation bzw. Unterschied zwischen den jeweils angezeigten Gruppen ange- nommen.

Ergebnisse

3. Ergebnisse 3.1. Klinische Daten Hinsichtlich klinischer Daten wurden das Patientenalter zum Zeitpunkt der Diagnosestellung, das Geschlecht, die Lokalisation des Glioblastoms, das operati- ve Ergebnis (komplette vs. partielle Resektion) sowie das Gesamtüberleben der Patienten untersucht (Tabelle 2).

Tabelle 2: Klinische Daten der fünf Patienten aus denen die 5 Zelllinien gewonnen wurden. * in Jahren ** in Monaten

Über- Prim./sek. Zelllinie Alter* Geschlecht Lokalisation Resektion lebenszeit** Glioblastom H-199GM 60 weiblich rechts frontal partiell 12 sekundär G-210GM 65 männlich links temporo-parietal partiell 9 primär G-599GM 33 männlich links fronto-parietal komplett 16 sekundär G-750GM 70 männlich links parieto-zentral partiell 2 primär G-1163GM 54 männlich links fronto-parietal komplett 4 primär

Bei zwei von fünf Patienten wurde eine vollständige Resektion des Glioblastoms erreicht. Das mittlere Erkrankungsalter der eingeschlossenen Patienten lag bei 56,4 Jahren (33 – 70 Jahre). Bei zwei Glioblastom-Patienten war anamnestisch ein niedriggradiges Astrozytom bekannt. Aus diesem Grund liegt bei diesen Patienten ein sekundäres Glioblastom vor (H-199GM und G-599GM). Die beiden Patienten mit sekundärem Glioblastom haben mit 46,5 Jahren ein jüngeres mittle- res Erkrankungsalter im Vergleich zu den Patienten mit primärem Glioblastom (63 Jahre; n.s.; t-test; p=0,255). Die mittlere Überlebensdauer nach Diagnosestellung betrug 8,6 Monate (2-16 Monate). Hierbei konnte statistisch bei einer Gesamt- kohorte von n=5 keine signifikante Korrelation zu den anderen untersuchten, klinischen Parametern nachgewiesen werden. Die zellulären Verdopplungszeiten für die vier aus Göttingen stammenden Zell- linien (G-210GM, G-599GM, G-750GM, G-1163GM) wurden aus Vorarbeiten entnommen (Halatsch et al. 2000, Halatsch et al. 2004). Für die Zelllinie H-199GM wurden neue Wachstumskurven unter analogen Bedingungen erstellt. Hierbei zeigte sich eine Verdopplungszeit von 1,71 Tagen in Standardzellmedium (10% FKS) bzw. von 6,43 Tagen unter Serummangel- bedingungen (0,5% FKS) (Abbildung 3). Für die Berechnung der Verdopplungs- zeiten wurden die Zellzahlen an Tag 2 und an Tag 10 einbezogen. Eine

Ergebnisse

Korrelation zwischen Verdopplungszeit unter Standardzellkulturbedingungen und Überlebenszeit bzw. zwischen Verdopplungszeit unter Serummangelbedingungen und Überlebenszeit ließ sich statistisch in der Gesamtkohorte (n=5) nicht nachweisen.

3.2. Proliferationskurven der Zelllinie H-199GM Wie bereits oben beschrieben, wurden die Wachstumskurven der Zelllinien G-210GM, G-599GM, G-750GM, G-1163GM unter Standard- und Serummangel- bedingungen schon in Vorarbeiten erstellt und veröffentlich (Halatsch et al. 2000, Halatsch et al. 2004). In diesem Zusammenhang wurde gleichzeitig die Wachstumshemmung nach Zusatz des TKI Erlotinib untersucht. Hierbei zeigte sich eine stark unterschiedliche Wachstumsinhibition durch Erlotinib. Diese Analyse wurde unter analogen Bedingungen auch an der Zelllinie H-199GM im Rahmen der vorliegenden Arbeit durchgeführt (Abbildung 3). Hierbei zeigte sich die oben beschriebene Verdopplungszeit von 6,43 Tagen unter Serummangel- bedingungen (0,5% FKS). Eine ähnliche Verdopplungszeit von 6,02 Tagen wurde unter Ko-Kultivierung mit dem Kontrollmedium (DMSO/0,5% FKS) beobachtet. Dies ist in Übereinstimmung mit den bereits publizierten Daten ((Halatsch et al. 2000, Halatsch et al. 2004), wo ebenfalls kein signifikanter, zusätzlich inhibieren- der Effekt durch DMSO nachweisbar war (t-test; Tag 10; n.s.). Nach Zugabe von Erlotinib in 0,5% FKS stieg die Verdopplungsrate auf 49,1 Tage an, was einer signifikanten Hemmung durch Erlotinib im Vergleich zu den Kontrollen entspricht (t-test; Tag 10; p = 0,049). Die relative Zellzahl der Zelllinie H-199GM nach Zugabe von Erlotinib betrug an Tag 10 27,7% bezogen auf die Zellzahl unter Serummangelbedingungen mit äquivalenter Menge DMSO. Dies entspricht einer Wachstumsinhibition von 72,3%. In den Vorarbeiten (Halatsch et al. 2000, Halatsch et al. 2004) wurden die Zell- linien G-210GM, G-599GM, G-750GM, G-1163GM entsprechend ihrer relativen Zellzahl unter Erlotinib bezogen auf die Kontrollgruppe an Tag 10 in 3 Gruppen eingeteilt. Eine maximale Wachstumsinhibition nach Erlotinib-Zusatz von > 67% wurde als Ansprechen gewertet. Diese Gruppe wurde „sensitiv“ genannt.

Ergebnisse

1,00E+07

1,00E+06

1,00E+05 Zellzahl

1,00E+04

1,00E+03 Tag 0 Tag 2 Tag 4 Tag 6 Tag 8 Tag 10

0,5% FKS mit Erlotinib 0,5% FKS und DMSO 0,5% FKS 10% FKS

Abbildung 3: Proliferationskurve von H-199GM Proliferationskurve der Zelllinie H-119GM unter Standardbedingungen (10% FKS Medium), unter Serumman- gelbedingungen (0,5% FKS) und nach Zugabe von Erlotinib (3 µM + 0,5% FKS) bzw. nach Zugabe einer äquivalenten Menge DMSO (+0,5% FKS). Die Gabe von Erlotinib führt an Tag 10 zu einer Zellzahlreduktion von 72,3% verglichen mit der Zellzahl unter Serummangelbedingungen mit äquivalenter Dosis DMSO. Abkürzungen: FKS: Fetales Kälberserum, DMSO: Dimethylsulfoxid.

Analog wurden eine „intermediäre“ Gruppe (maximale Wachstumsinhibition 33 -67%) sowie eine „resistente“ Gruppe (maximale Wachstumsinhibition < 33%) definiert. Somit kann man auch bei der Zelllinie H-199GM von einer Wachstums- hemmung durch Erlotinib ausgehen. Die neue Zelllinie H-199GM wurde daher in die Gruppe „sensitiv“ eingeteilt (Tabelle 3).

Tabelle 3: Einteilung der Zelllinien nach Wachstumsverhalten nach Erlotinib-Gabe In der Gruppe sensitiv* führte die Behandlung mit Erlotinib zu einer Wachstumsinhibition von >67%, in der intermediären**-Gruppe betrug die Wachstumsinhibition durch Erlotinib 33%-67%, bei der Gruppe resistent*** führte Erlotinib zu einer Wachstumsinhibition von weniger als 33%.

Sensitiv* Intermediär** Resistent***

H-199GM G-210GM G-1163GM G-599GM G-750GM

Ergebnisse

3.3. Selektion relevanter Gene mittels Microarray-Analyse

Wie bereits in Material und Methoden beschrieben, erfolgte zur Erstellung einer inhaltlich relevanten Genliste eine Datenbankanalyse. Hierfür wurden die Daten- bank Genecards (Genecards Datenbank 2013) bzw. die „Kyoto Enzyoklopädie der Gene und des Genoms“ (KEGG Datenbank 2013) verwendet. Es wurden Gene eingeschlossen, die unter den Suchbegriffen „apoptosis“, „cell proliferation“, „EGFR“, „glioma“ und „glioblastoma“ verzeichnet waren. So konnten insgesamt 536 relevante Gene ausgewählt werden, welche durch insgesamt 814 Spots auf dem Microarray repräsentiert waren. Mittels einer Jonckheere-Terpstra-Analyse wurden die Gene auf einen statistisch signifikanten Trend innerhalb der oben eingeführten Gruppen getestet (resistent < intermediär < sensitiv bzw. sensitiv < intermediär < resistent). Insgesamt 19 Gene erbrachten mit einem adjustierten p-Wert von p < 0,05 ein signifikantes Ergebnis und korrelierten mit dem Ansprech- verhalten auf Erlotinib (Tabelle 4).

Tabelle 4: Gesamtgenliste und Kandidatengene Auswahl der 536 relevanten Gene mittels Genecards und „Kyoto Enzyklopädie der Gene und des Genoms“ (KEGG) mit tabellarischer Darstellung der medianen Signalstärken der unterschiedlichen Zellgruppen „resistent, intermediär und sensitiv“ je nach Wachstumsinhibition nach Erlotinib-Behandlung (>67%, 33%-67%, <33%). In grau sind die 19 Kandidatengene hervorgehoben, die einen signifikanten adjustieren p-Wert (p<0,05; Jonckheere-Terpstra Test im Rahmen eines multiplen Testverfahren; adjustierte p-Werte gemäß Benjamini & Yekutieli) aus der Microarray-Analyse erreichten.

Adj. Adj. Adj. Median Median Median Median Median Median Median Median Median Gen p- Gen p- Gen p- Res. Int. Sens. Res. Int. Sens. Res. Int. Sens. Werte Werte Werte ABCA1 82,95 91,32 172,58 0,2257 ATP8B1 73,60 67,75 139,35 1,0000 CACNA2D4 51,34 58,90 157,06 0,9979

ABL1 246,51 210,59 259,72 1,0000 ATR 112,02 79,45 98,67 1,0000 CACNB1 10,93 25,66 16,50 1,0000

ABLIM3 108,09 196,59 502,13 0,3859 BAD 59,01 53,67 30,81 0,6331 CACNB2 19,60 22,29 9,56 0,9892

ACVR1B 307,93 299,08 337,64 0,9725 BAX 1.062,52 1.008,90 1.300,19 0,9983 CACNB3 177,60 157,62 68,53 0,0733

ACVR1C 7,47 7,79 7,03 1,0000 BCAR1 548,93 618,12 727,45 1,0000 CACNB4 0,57 9,07 7,71 1,0000

AIP1 54,37 52,13 12,58 0,1639 BCL10 364,34 428,90 368,26 1,0000 CACNG1 15,17 15,34 10,65 0,9979

AKT1 460,55 660,85 328,69 0,9979 BCL2 13,49 19,35 9,39 0,9995 CACNG2 23,49 21,22 18,59 1,0000

AKT2 72,96 81,06 83,21 1,0000 BDNF 190,33 277,85 809,22 0,0443 CACNG3 96,34 93,31 88,06 1,0000

AKT3 19,37 26,63 34,69 0,7027 BRAF 74,29 67,19 61,20 0,5596 CACNG4 222,16 182,59 121,63 0,0007

ANAPC1 148,88 108,15 139,48 1,0000 BRCA1 165,62 142,18 196,29 0,9756 CACNG5 41,42 62,59 60,92 1,0000

ANAPC2 408,60 258,97 292,91 0,9983 BUB1 111,29 67,47 84,86 1,0000 CACNG6 335,60 240,78 250,66 0,9756

ANAPC4 64,24 46,91 47,23 0,9932 BUB1B 36,15 30,98 27,92 0,9983 CACNG7 123,95 128,69 129,11 1,0000

ANAPC5 160,53 122,67 112,78 0,9995 BUB3 344,84 323,90 472,93 0,3859 CACNG8 4,01 9,83 4,29 1,0000

ANAPC7 418,55 271,35 313,53 0,9983 CACNA1B 21,66 11,67 12,13 1,0000 CAMK2A 58,64 GE58785 62,83 0,9983

APAF1 114,76 141,52 133,89 1,0000 CACNA1C 288,44 271,57 341,07 0,9983 CARD10 381,21 349,93 330,40 0,9756

APC10 138,47 159,03 191,49 0,9653 CACNA1D 8,15 4,10 9,85 1,0000 CARD11 10,43 28,79 29,78 1,0000

ARHA 1.687,73 1.935,04 1.752,49 1,0000 CACNA1E 26,39 17,64 33,69 0,9979 CARD14 16,93 28,96 25,95 1,0000

ARNT 58,88 62,51 50,64 0,7027 CACNA1F 51,67 20,42 13,94 0,2257 CARD15 16,73 11,17 6,26 0,9725

ARRB1 50,13 88,57 45,36 1,0000 CACNA1G 8,59 13,02 2,03 0,9756 CARD4 80,31 86,98 57,28 0,5596

ARRB2 75,35 87,01 132,45 0,9979 CACNA1H 15,92 5,14 49,47 0,9247 CARD6 42,66 74,06 152,62 0,0007

ASC 7,04 162,59 32,68 1,0000 CACNA1I 50,06 61,18 47,86 0,9995 CARD8 27,97 25,94 36,60 0,9892

ASK 1.234,41 437,20 568,31 1,0000 CACNA1S 7,36 4,38 9,18 0,9979 CARD9 10,60 10,67 16,92 1,0000

ATF2 376,87 332,03 274,38 0,8372 CACNA2D1 46,09 33,04 43,47 1,0000 CASP14 16,77 5,95 10,08 1,0000

ATF4 816,57 1.173,40 2.041,89 0,0733 CACNA2D2 220,87 263,39 204,96 0,9932 CASP2 185,59 121,30 131,30 0,9756

ATM 75,68 117,14 104,68 1,0000 CACNA2D3 12,34 7,81 9,17 1,0000 CASP3 204,59 153,88 121,20 0,7768

Ergebnisse

Adj. Adj. Adj. Median Median Median Median Median Median Median Median Median Gen p- Gen p- Gen p- Res. Int. Sens. Res. Int. Sens. Res. Int. Sens. Werte Werte Werte CASP4 10,84 14,22 12,74 1,0000 CSNK2A1 225,05 191,10 339,12 0,7768 FGFR1 422,19 643,11 517,54 1,0000

CASP5 43,30 30,04 27,33 0,9932 CTNNB1 42,48 39,36 44,42 1,0000 FGFR2 19,50 35,08 7,20 0,9653

CASP6 472,86 357,10 224,70 0,0007 CUBN 21,64 6,99 9,75 0,9979 FGFR3 5,99 17,46 11,68 1,0000

CASP7 271,19 291,81 309,88 1,0000 CUL1 443,57 204,90 183,68 0,8372 FGFR4 49,55 37,13 24,95 0,0097

CASP8 131,94 130,01 235,05 0,9979 DAXX 75,77 116,02 74,73 1,0000 FGR 8,96 4,59 3,82 0,9653

CASP9 427,50 621,01 356,11 0,9725 DCC 8,82 9,47 8,07 1,0000 FLJ13479 318,25 232,59 261,29 1,0000

CBL 17,63 10,21 14,14 1,0000 DHFR 496,04 1.434,50 1.503,42 0,9247 FLJ14124 33,16 31,92 29,85 0,9983

CCNA1 27,13 45,64 41,50 0,9756 DMBT1 1,54 3,46 10,53 0,8888 FLNA 3.865,72 6.988,10 4.568,00 1,0000

CCNB1 1.152,26 1.364,44 1.637,90 1,0000 DPM2 1.425,18 764,21 1.166,77 1,0000 FLNB 309,60 446,89 266,72 0,9653

CCNB2 1.372,16 1.231,41 1.240,31 1,0000 DUSP1 124,12 165,97 385,53 0,9247 FLNC 196,78 1.221,19 2.258,33 0,9247

CCNB3 9,94 12,47 21,94 0,9983 DUSP10 465,06 206,20 408,73 1,0000 FLT1 81,37 89,98 146,10 0,9510

CCND1 17,53 9,91 13,76 1,0000 DUSP14 763,92 819,02 811,07 1,0000 FOS 78,74 296,27 81,18 1,0000

CCND2 34,56 31,56 26,68 0,9979 DUSP16 196,05 242,45 214,84 1,0000 FOSL1 126,79 217,17 718,15 0,0443

CCND3 1.352,44 864,76 861,28 0,9983 DUSP2 131,45 129,64 42,25 0,3025 FOXO1A 168,28 168,14 117,51 0,9892

CCNE1 324,82 228,22 153,20 0,9892 DUSP3 105,12 156,73 155,60 0,9979 FRAP1 218,83 252,00 268,59 0,9979

CCNE2 136,24 120,80 112,21 1,0000 DUSP4 112,55 422,05 927,78 0,0218 FZR1 242,27 166,78 212,17 1,0000

CCNH 250,96 252,42 533,02 0,4755 DUSP5 22,78 63,52 258,56 0,0733 GADD45A 2.750,59 2.108,44 5.150,78 0,9932

CD14 450,44 539,11 617,03 0,5596 DUSP6 32,59 28,70 18,73 0,5596 GADD45B 30,92 26,98 46,84 0,8372

CDC14A 24,89 40,22 48,66 0,9247 DUSP7 134,85 77,92 97,50 0,9983 GADD45G 11,94 21,12 10,54 1,0000

CDC14B 69,33 36,34 50,57 1,0000 DUSP8 47,92 45,17 33,85 0,3025 GAS41 794,43 767,43 863,21 1,0000

CDC16 87,42 100,67 85,30 1,0000 DUSP9 23,88 24,88 27,82 0,9983 GH1 1,86 12,09 8,66 1,0000

CDC2 1.183,82 786,32 1.433,19 0,9247 DYRK1A 132,45 145,48 125,47 1,0000 GHR 7,70 10,11 10,29 1,0000

CDC20 572,98 530,72 400,91 0,8888 DYRK1B 41,65 34,84 34,35 0,9725 GLI 127,60 139,91 151,10 0,7027

CDC23 214,03 237,14 354,95 0,3025 E2F1 226,38 127,39 191,10 1,0000 GLI2 57,06 42,37 47,35 1,0000

CDC25A 38,71 29,12 36,63 1,0000 E2F4 1.498,03 975,46 1.891,73 0,9725 GLI3 501,15 147,06 137,77 0,4755

CDC25B 1.017,48 879,57 689,37 0,9979 E2F5 224,30 433,71 773,33 0,9653 GNA12 1.358,37 938,05 709,40 0,7768

CDC25C 292,99 324,28 430,07 0,9995 EGF 1.344,58 2.151,83 1.479,74 1,0000 GNAS 29,65 12,53 8,75 0,9892

CDC27 451,19 697,75 432,12 0,9979 EGFL6 5,95 6,58 8,56 0,9995 GNG12 2.097,65 1.964,73 1.912,57 1,0000

CDC42 3.648,28 4.392,96 2.899,42 0,8372 EGFR 116,44 97,53 85,42 0,9725 GRB2 124,76 156,35 170,01 0,8372

CDC45L 37,60 17,16 28,28 1,0000 EGR1 4.413,95 4.335,37 3.254,93 0,7027 GSK3B 68,07 74,27 79,97 0,9995

CDC6 467,23 318,33 564,13 1,0000 EHD2 159,98 172,77 79,27 0,7027 HDAC1 153,42 175,77 164,27 1,0000

CDC7 183,60 138,97 161,57 1,0000 EIF4EBP1 1.988,22 3.704,49 4.926,41 0,2257 HDAC2 1.035,49 824,21 1.153,58 0,8888

CDK2 654,59 650,57 502,45 0,9756 ELK1 2.131,79 2.104,23 1.807,40 1,0000 HIF1A 1.984,97 2.203,32 1.651,81 1,0000

CDK5 2.180,34 1.017,27 763,44 0,0443 ELK4 51,88 53,90 56,74 1,0000 HIF-1beta 17,16 27,35 28,36 1,0000

CDK6 48,13 15,28 34,84 1,0000 EP300 192,58 206,57 223,53 1,0000 HRAS 103,87 108,84 136,45 0,2257

CDK7 199,78 248,41 544,66 0,7027 EPHA3 1.096,95 63,65 71,32 0,9069 HSPA1A 941,34 889,22 1.638,91 0,9995

CDKN1A 666,54 1.188,78 1.855,86 0,3859 EPHB6 5,06 10,29 6,44 1,0000 HSPA1B 1749,98 1326,11 746,28 0.0097

CDKN1B 103,41 66,56 156,19 0,7027 ESPL1 161,60 129,46 115,44 0,9653 HSPA1L 72,36 32,15 54,39 1,0000

CDKN1C 741,43 655,84 519,39 1,0000 ESR1 16,90 35,56 15,98 0,9995 HSPA5 27,10 34,57 49,71 1,0000

CDKN2A 39,10 104,96 42,97 1,0000 EVI1 330,91 352,10 330,70 1,0000 HSPA8 1.185,46 941,94 652,53 0,9932

CDKN2B 62,61 225,32 314,05 0,9510 FGF1 9,60 10,35 7,48 1,0000 HSPA9B 1.932,19 2.771,90 6.014,64 0,0218

CDKN2C 1.383,18 1.062,46 327,85 0,7027 FGF10 24,64 21,30 19,34 1,0000 HSPB1 27370,07 19445,46 9320,32 0,0035

CDKN2D 252,14 130,38 137,32 0,9247 FGF11 19,34 66,64 41,01 1,0000 HSPB2 72,93 539,83 4,75 0,7009

CEBPA 9,13 41,95 44,04 1,0000 FGF12 18,33 36,46 64,04 0,5596 HSPCA 3.481,32 3.586,66 2.762,53 1,0000

CEBPB 604,28 723,93 1.032,16 0,5596 FGF13 60,20 10,90 55,80 1,0000 ICEBERG 2,89 1,94 7,22 0,8372

CEBPG 246,49 261,09 493,27 0,9892 FGF14 16,46 12,12 8,22 0,9983 IGF1 38,35 13,60 12,06 0,7768

CHEK1 546,84 473,37 399,11 1,0000 FGF16 4,13 7,85 4,15 1,0000 IGF1R 197,49 231,32 197,22 1,0000

CHEK2 224,02 202,57 354,79 0,7768 FGF17 22,18 23,53 41,95 0,6331 IKBKAP 261,61 182,78 261,60 1,0000

CHP 2.702,70 2.768,17 2.132,97 0,9247 FGF18 37,33 50,46 24,98 0,9756 IKBKB 32,98 53,44 61,62 0,8372

CHUK 229,96 180,65 336,54 0,8372 FGF19 9,44 8,18 6,22 1,0000 IKBKG 1.384,91 1.029,88 769,63 0,9247

CREB1 741,98 737,86 768,30 0,9983 FGF2 150,01 118,56 483,09 0,7768 IL1A 10,92 19,19 84,66 0,9892

CREBBP 16,51 7,57 9,75 1,0000 FGF20 47,75 51,79 55,51 0,9979 IL1B 32,78 34,76 1.559,89 0,6951

CRK 288,81 285,72 391,57 0,3025 FGF21 10,41 16,93 18,70 1,0000 IL1R1 13,39 17,62 9,34 1,0000

CRKL 282,79 287,58 448,33 0,2257 FGF22 14,80 13,79 7,86 0,6331 IL1R2 227,23 202,49 235,38 1,0000

CSE1L 2.649,97 2.396,94 3.309,19 1,0000 FGF23 33,03 20,26 25,05 1,0000 ILK 352,51 367,27 288,59 0,9932

CSNK1A1 815,14 1.192,41 1.762,67 0,1107 FGF4 35,10 20,29 22,62 0,8372 IRS1 75,63 51,35 112,40 0,9892

CSNK1D 1.015,64 3.461,98 2.101,93 1,0000 FGF5 65,85 168,12 149,11 0,9995 ITGA5 1.026,12 913,51 589,88 0,0733

CSNK1E 2.385,10 2.153,92 2.883,97 0,9979 FGF6 98,98 105,50 143,64 0,6331 JAK1 156,60 165,98 196,98 0,9892

CSNK1G1 21,47 8,80 11,32 0,9979 FGF7 34,29 30,76 36,38 1,0000 JUN 266,30 231,82 371,83 1,0000

CSNK1G2 334,44 237,93 196,22 0,9725 FGF8 41,23 30,66 36,35 1,0000 JUNB 430,85 432,35 304,23 0,9510

CSNK1G3 93,64 134,48 164,41 0,9756 FGF9 5,51 7,35 7,71 1,0000 KDR 4,44 8,93 7,49 0,9995 41

Ergebnisse

Adj. Adj. Adj. Median Median Median Median Median Median Median Median Median Gen p- Gen p- Gen p- Res. Int. Sens. Res. Int. Sens. Res. Int. Sens. Werte Werte Werte KIAA0934 10,77 9,74 8,98 1,0000 MCM5 511,79 417,03 544,78 1,0000 PDGFRA 64,42 54,57 30,59 0,9247

KIAA1233 5,79 6,24 51,19 0,9979 MCM6 338,48 294,91 428,23 1,0000 PDGFRB 189,48 191,80 178,64 1,0000

KLK2 39,49 41,61 36,36 0,9995 MCM7 2.306,66 1.633,82 2.082,17 1,0000 PDK2 215,84 142,07 140,51 0,9756

KRAS2 373,21 274,61 272,99 0,9756 MDM2 13,74 4,71 5,22 0,9892 PDPK1 61,33 31,17 42,17 1,0000

LAMC2 99,95 82,26 120,71 0,9653 MDR1 3,40 8,36 7,40 1,0000 PIK3CA 199,17 216,83 188,46 1,0000

LEF1 493,79 763,22 21,60 0,3025 MEF2C 52,90 30,44 37,38 1,0000 PIK3CB 159,80 148,32 133,60 0,9653

LGI1 11,03 7,42 5,61 0,9995 MGC26484 2,41 13,17 3,49 1,0000 PIK3CD 79,58 150,76 143,85 0,9995

LOC144363 38,02 19,73 18,37 0,9892 MGMT 521,11 18,18 495,41 1,0000 PIK3R1 177,79 103,90 56,46 0,5596

LOC163688 6,64 5,89 11,88 0,9983 MINK 423,85 430,60 333,20 0,6331 PIK3R2 196,10 440,63 196,88 1,0000

MACF1 646,21 757,31 838,97 0,7027 MKNK1 127,19 171,40 117,97 0,9979 PIK3R3 120,11 122,97 104,24 0,9247

MAD1L1 197,26 164,83 118,20 0,3025 MKNK2 356,96 476,00 495,92 1,0000 PKHD1 2,97 7,91 7,44 1,0000

MAD2L1 695,97 619,63 884,82 0,9725 MLL2 36,42 43,80 22,10 0,9247 PKMYT1 173,05 117,19 178,37 1,0000

MAD2L2 1.197,48 1.378,41 1.246,32 1,0000 MLL3 13,86 27,91 21,88 1,0000 PLA2G10 31,87 36,61 25,64 0,8372

MADH2 286,97 349,71 325,67 0,9983 MLLT7 10,13 9,42 8,93 1,0000 PLA2G12A 613,59 775,74 457,12 0,8888

MADH3 68,12 80,78 54,56 0,9983 MOS 4,18 4,04 4,60 1,0000 PLA2G12B 6,16 13,73 9,38 1,0000

MADH4 226,82 207,17 213,51 1,0000 MRAS 89,51 82,27 33,18 0,2257 PLA2G1B 8,96 6,99 6,36 0,9983

MAGI-3 6,45 7,79 9,52 1,0000 MRE11A 116,95 144,95 153,62 0,9756 PLA2G2A 14,86 21,02 14,72 1,0000

MALT1 515,28 351,16 134,65 0,3025 MXI1 26,20 85,57 107,95 0,7768 PLA2G2D 25,56 27,71 23,21 1,0000

MAP2K1 580,93 823,48 597,75 1,0000 MYC 226,39 630,93 1.598,31 0,0097 PLA2G2E 8,49 5,01 8,57 1,0000

MAP2K1IP1 199,06 245,78 262,52 0,9892 MYCN 9,64 9,91 2,37 0,9653 PLA2G2F 119,17 111,02 112,65 1,0000

MAP2K2 1.444,20 1.443,27 1.126,04 0,8372 MYT1 5,90 8,28 8,62 1,0000 PLA2G3 14,89 13,39 12,23 1,0000

MAP2K3 321,43 345,93 774,16 0,5596 NALP1 106,36 130,94 175,63 0,9756 PLA2G4A 11,51 24,10 40,92 0,9725

MAP2K4 173,88 227,06 207,48 0,9995 NBS1 585,67 493,00 656,44 0,9995 PLA2G5 6,95 29,75 11,46 1,0000

MAP2K6 58,38 49,17 56,02 1,0000 NCK1 241,74 232,32 242,45 1,0000 PLA2G6 13,17 32,86 26,45 0,9932

MAP2K7 32,97 31,27 23,96 0,9932 NEURL 1,13 15,38 8,14 1,0000 PLCG1 94,92 61,14 69,41 1,0000

MAP3K1 62,40 69,70 63,06 1,0000 NF1 170,15 401,36 316,47 1,0000 PLK1 121,88 68,96 86,61 0,9995

MAP3K10 42,24 36,21 46,05 1,0000 NF2 93,71 60,97 64,33 0,9979 PPM1A 199,93 210,90 246,90 0,8888

MAP3K12 309,16 311,14 242,67 0,9756 NFAT5 1.146,41 794,87 1.526,28 0,9725 PPM1B 403,88 342,34 445,89 1,0000

MAP3K13 21,75 41,05 33,45 0,9983 NFATC1 147,36 90,73 51,78 0,0007 PPP2CA 31,35 31,00 13,99 0,5596

MAP3K14 78,02 102,61 136,28 0,9653 NFATC2 18,48 11,51 3,93 0,5596 PPP3CA 314,66 330,13 190,50 0,7768

MAP3K2 177,05 149,94 148,15 0,9756 NFATC3 245,52 165,40 202,22 1,0000 PPP3CB 52,32 52,35 107,12 0,8888

MAP3K3 248,56 192,07 168,03 0,9983 NFATC4 36,00 31,27 19,26 0,9892 PPP3CC 493,40 490,04 664,85 0,6331

MAP3K4 407,76 230,04 227,41 0,9725 NFKB1 1.012,88 754,34 789,24 0,9983 PPP5C 356,31 396,73 573,58 0,9247

MAP3K5 78,21 30,32 50,36 1,0000 NFKB2 58,03 71,91 162,07 0,9510 PRKACA 36,16 24,10 36,86 1,0000

MAP3K6 184,78 233,47 117,95 0,7768 NFKBIA 1.242,87 1.061,22 1.070,64 1,0000 PRKACB 146,79 133,06 128,31 0,9892

MAP3K7IP1 85,48 84,36 100,11 0,9756 NGFB 121,84 476,91 164,65 1,0000 PRKACG 183,90 217,96 232,36 0,9932

MAP3K7IP2 144,77 104,01 82,84 0,9725 NGFR 37,74 37,43 32,41 0,9979 PRKAR1A 541,30 769,82 534,35 1,0000

MAP3K8 7,49 20,14 16,33 1,0000 NLK 6,34 9,22 11,28 1,0000 PRKAR1B 6,20 5,65 3,62 1,0000

MAP4K1 26,27 14,59 18,72 1,0000 NOL3 176,92 227,77 183,76 1,0000 PRKAR2A 177,08 146,82 183,70 1,0000

MAP4K3 79,63 62,25 84,18 1,0000 NOVA2 49,00 39,28 31,49 0,8372 PRKAR2B 85,48 55,87 12,37 0,7027

MAP4K4 105,61 110,51 79,53 0,9653 NR4A1 160,72 228,16 152,42 1,0000 PRKCA 87,74 70,46 129,62 0,9979

MAPK1 7,32 9,24 12,04 1,0000 NRAS 147,80 177,17 234,13 0,6331 PRKCB1 16,88 10,39 14,89 1,0000

MAPK10 6,23 6,14 11,17 0,9932 NTF3 27,12 200,67 60,63 1,0000 PRKCG 8,76 11,04 8,18 1,0000

MAPK11 272,25 324,02 241,03 0,9247 NTF5 300,86 330,21 310,74 1,0000 PRKDC 476,56 942,68 979,09 0,1639

MAPK12 345,52 272,71 240,12 0,9247 NTN1 14,61 15,28 18,94 0,9995 PRKX 62,34 96,52 45,27 0,9247

MAPK13 72,37 84,44 116,80 0,9247 NTRK1 52,01 28,90 12,57 0,0443 PRKY 22,51 29,05 14,96 0,8888

MAPK14 261,51 339,37 236,98 1,0000 NTRK2 15,65 9,06 15,94 1,0000 PTCH 47,56 39,47 27,26 0,9653

MAPK3 243,19 248,40 177,34 0,9932 ORC1L 132,74 98,93 87,48 0,9932 PTEN 52,51 95,83 89,90 0,9995

MAPK7 110,34 163,60 114,35 1,0000 ORC2L 158,76 179,89 203,11 0,9756 PTK2 177,52 223,23 288,61 0,4755

MAPK8 39,79 54,83 83,33 0,7768 ORC3L 475,24 340,21 576,71 1,0000 PTPN5 5,31 6,37 4,21 1,0000

MAPK8IP1 147,71 128,27 189,07 0,9725 ORC4L 122,99 127,01 145,88 0,9892 PTPN7 8,47 2,84 13,94 0,9510

MAPK8IP2 91,66 98,12 74,39 0,8372 ORC5L 36,96 12,42 27,46 1,0000 PTPRR 28,54 18,72 12,46 0,9979

MAPK8IP3 181,40 186,19 187,36 1,0000 ORC6L 212,96 114,20 284,71 0,9892 PTTG1 2.271,43 2.353,15 2.655,00 1,0000

MAPK9 745,22 769,53 882,22 1,0000 P101-PI3K 6,74 11,44 12,72 0,9983 PXN 180,27 247,41 253,82 0,9247

MAPKAPK3 360,58 353,28 438,93 1,0000 PAK1 194,16 236,75 212,82 1,0000 RAC1 973,12 612,19 450,69 0,0443

MAPKAPK5 218,87 150,87 219,92 0,9983 PAK2 25,27 20,37 21,53 1,0000 RAC2 15,38 119,49 64,35 1,0000

MAPT 13,54 20,55 9,85 0,9756 PBP 3.269,22 3.103,47 1.907,15 0,3025 RAC3 104,16 263,75 374,48 0,7027

MAX 154,54 144,11 246,30 0,9653 PCNA 142,49 100,10 115,23 1,0000 RAD50 100,29 90,35 172,75 0,9892

MCM2 2.002,91 1.192,21 1.859,15 1,0000 PDAP1 2.126,01 1.280,97 1.178,72 0,7768 RAD51 122,61 63,13 97,89 1,0000

MCM3 17,27 13,22 14,57 1,0000 PDGFA 410,78 167,15 239,31 1,0000 RAF1 223,94 207,83 223,66 1,0000

MCM4 545,44 768,23 889,71 0,4755 PDGFB 51,96 45,42 35,18 0,9756 RAP1A 205,45 135,70 112,80 0,3025 42

Ergebnisse

Adj. Adj. Adj. Median Median Median Median Median Median Median Median Median Gen p- Gen p- Gen p- Res. Int. Sens. Res. Int. Sens. Res. Int. Sens. Werte Werte Werte RASA1 6,66 14,67 12,88 0,9983 SITPEC 696,80 647,95 738,35 1,0000 TFDP1 606,74 721,06 552,55 0,9892

RASA2 40,34 37,26 33,03 0,9983 SKP1A 2.480,67 3.428,23 3.424,11 0,9510 TGFA 204,21 180,88 187,94 1,0000

RASGRF1 6,88 14,91 9,50 1,0000 SKP2 74,47 98,80 109,48 0,9725 TGFB1 857,27 867,85 717,42 0,9932

RASGRF2 37,40 36,92 73,81 0,6331 SLC2A1 317,78 881,12 753,54 0,9979 TGFB2 411,96 288,50 369,10 0,9995

RASGRP1 12,61 6,48 9,60 0,9983 SLI 89,83 50,72 54,39 1,0000 TGFB3 462,79 118,87 11,47 0,0097

RASGRP2 10,26 10,66 12,56 1,0000 SMC1L1 106,49 82,51 48,18 0,1107 TGFBR1 403,31 337,93 467,97 0,9892

RASGRP3 12,09 4,64 8,48 1,0000 SMC1L2 87,23 87,63 81,70 1,0000 TGFBR2 372,88 152,54 330,26 1,0000

RASGRP4 9,66 3,70 11,30 0,9653 SMO 376,62 257,59 54,91 0,0035 TIMP1 8,44 11,66 9,45 1,0000

RB1 178,63 46,50 139,80 1,0000 SOCS1 153,93 93,64 78,29 0,9247 TIMP3 124,20 163,85 181,60 1,0000

RBBP8 1.018,46 888,05 1.108,75 1,0000 SOCS2 265,14 279,70 212,52 0,9510 TNF 104,10 135,67 119,77 0,9892

RBL1 24,55 23,58 30,33 0,9995 SOS1 97,65 84,20 77,68 0,9725 TNFAIP2 335,86 358,51 117,05 0,4755

RBL2 555,94 541,57 567,46 1,0000 SOS2 183,80 230,88 244,95 0,9892 TNFRSF1A 760,11 928,13 882,07 1,0000

RBX1 741,23 883,68 779,99 1,0000 SP1 44,99 47,97 34,57 0,9979 TNFRSF6 57,32 67,95 24,14 0,4755

REL 95,06 73,38 94,80 1,0000 SPTAN1 1.238,85 1.328,14 1.057,97 0,9725 TNFSF6 0,23 5,32 9,18 0,9756

RELA 508,80 657,56 588,06 0,9979 SRC 962,22 870,33 688,50 0,7768 TP53 465,11 712,22 571,55 1,0000

RELB 126,51 112,55 360,00 1,0000 SRC 55,78 42,52 49,05 1,0000 TP73 12,90 8,14 7,65 1,0000

RHEB 6,90 9,76 7,17 1,0000 SRF 38,16 27,31 36,17 1,0000 TRAF1 364,83 181,65 206,38 0,9932

RIPK2 419,01 544,85 610,39 0,8372 STAT1 314,25 449,49 1.294,73 0,0218 TRAF2 173,86 136,33 164,19 1,0000

ROCK1 454,01 391,57 340,66 0,3859 STAT3 538,12 660,06 395,02 0,9510 TRAF5 161,34 204,06 189,14 1,0000

RPS6KA1 53,05 114,82 30,92 0,9653 STAT5A 122,80 66,35 33,82 0,8372 TRAF6 65,35 71,05 76,49 0,9725

RPS6KA2 13,10 30,61 41,02 0,4755 STAT6 162,58 28,36 180,85 1,0000 TSC2 281,19 346,50 339,53 0,9995

RPS6KA3 152,59 136,18 105,78 0,9756 STK3 28,53 55,24 32,23 1,0000 TTN 4,63 8,41 9,26 0,9932

RPS6KA4 253,87 346,96 270,67 1,0000 STK4 18,11 18,20 27,47 0,9653 VEGF 331,27 789,42 408,06 1,0000

RPS6KA5 87,39 108,28 139,73 0,9983 STMN1 345,90 404,15 246,18 0,9756 WEE1 510,52 664,58 893,57 0,1107

RPS6KA6 6,83 17,38 11,67 1,0000 SUFU 103,59 102,11 96,74 0,9653 YWHAB 579,74 427,63 505,39 1,0000

RRAS 427,22 1.752,03 594,27 1,0000 SYNE1 33,33 36,24 36,95 1,0000 YWHAE 1.730,67 1.788,15 2.138,67 0,9725

RRAS2 649,44 1.053,53 1.447,57 0,9979 TAO1 112,12 98,15 103,29 1,0000 YWHAG 548,28 292,49 296,70 0,9510

SAS 5.300,63 4.627,95 4.706,41 1,0000 TCF7 372,70 486,68 292,18 0,9932 YWHAH 435,32 347,17 449,42 0,9979

SF1 156,94 240,12 148,12 1,0000 TCF7L1 146,83 61,70 30,09 0,0097 YWHAQ 8.845,58 9.494,09 7.685,07 0,9510

SFN 13,55 22,15 8,50 1,0000 TCF7L2 66,06 46,70 84,76 1,0000 YWHAZ 2.937,94 4.889,73 3.919,52 1,0000

SHC1 10,89 10,43 10,05 1,0000 TECTA 20,39 19,24 20,94 1,0000 ZAK 66,40 54,39 72,20 1,0000 SHH 57,33 48,94 47,86 0,8888 TFAP2A 131,53 238,72 47,84 0,4755

Ergebnisse

3.4. Funktionelle Selektion der Kandidatengene Im nächsten Schritt wurden die 19 Gene (Tabelle 4), welche in der Microarray- Analyse signifikant mit dem Ansprechverhalten auf Erlotinib korrelierten, hinsichtlich ihres Trendverhaltens mittels des Jonckheere-Terpstra-Tests analysiert.

Abbildung 4: Relative Überexpression der Gene mit erhöhter Sensitivität gegenüber Erlotinib in der Microarray-Analyse. Dargestellt sind die Mittelwerte der relativen Geneexpression von bis zu zwei Zelllinien pro Phänotyp und pro drei biologischer Replikate pro Zelllinie in Bezug auf ihr Wachstumsverhalten (resistent, intermediär, sensitiv) nach Erlotinib-Behandlung. Die hier aufgeführten 7 Gene sind in der Gruppe mit erhöhter Sensitivität gegen- über Erlotinib überexprimiert. Das Signifikanzniveau betrug p<0,05 und wurde mittels der Jonckheere- Teststatistik im Rahmen einer Multiplen-Test-Prozedur mit adjustierten p-Werten nach Benjamini & Yekutieli berechnet.

Abbildung 5: Relative Überexpression der Gene mit erhöhter Resistenz gegenüber Erlotinib in der Microarray-Analyse. Dargestellt sind die Mittelwerte der relativen Geneexpression von bis zu zwei Zelllinien pro Phänotyp und pro drei biologischer Replikate pro Zelllinie in Bezug auf ihr Wachstumsverhalten (resistent, intermediär, sensitiv) nach Erlotinib-Behandlung. Alle 12 Gene sind überexprimiert in der Gruppe der Zelllinien mit erhöhter Resis- tenz gegenüber einer Erlotinib-Behandlung. Das Signifikanzniveau betrug p<0,05 und wurde mittels der Jon- ckheere-Teststatistik im Rahmen einer Multiplen-Test-Prozedur mit adjustierten p-Werten nach Benjamini & Yekutieli berechnet. 44

Ergebnisse

Die Expression von 7 Kandidatengenen steigt signifikant mit zunehmender Sensitivität der Zellen gegenüber Erlotinib an (DUSP4, MYC, CARD6, FOSL1,

BDNF, HSPA9B, STAT1; Abbildung 4). Gegenteiliges gilt für 12 weitere Gene, hier steigt die Expressionshöhe statistisch signifikant mit zunehmender Resistenz gegenüber Erlotinib (CACNG4, CASP6, CDK5, FGFR4, HSPA1B, HSPB1, NFATC1, NTRK1, RAC1, SMO, TCF7L1, TGFB3; Abbildung 5).

Als nächstes erfolgte die systematische Selektion plausibler Kandidatengene anhand der erwarteten zellulären Funktion. Die Ergebnisse dieser Analyse sind in Tabelle 5 dargestellt.

Tabelle 5: Charakteristika der Gene, welche eine statistisch signifikante Korrelation zwischen ihrer quantitativen Expression und dem Wachstumsverhalten von Glioblastom-Zelllinien nach Erlotinib- Behandlung aufweisen. Tabellarische Darstellung der Funktion, chromosomalen Lokalisation und Signalweg-Beteiligung der Kandida- tengene. *CASP6 und *CDK5 wurden wegen Inkongruenz bezüglich ihrer proapoptotischen Funktion, jedoch erhöhter Expression in der resistenten Gruppe der Zelllinien nach Erlotinib-Behandlung aus den weiteren Analysen ausgeschlossen. Abkürzungen: EKR: extrazelluläre regulierte MAP Kinase; JAK: Janus Kinase; JNK: JUN N-terminale Kinase; MAPK: Mitogen-aktivierte Proteinkinase; NF-κB: Nukleärer Faktor Kappa beta; PI3K: Phosphatidylinositol-3-Kinase; TSG: Tumorsuppressorgen.

Gen Name Funktion Signalweg Lokalisation BDNF Vom Gehirn stammender neurotropher Faktor Apoptose-Inhibition MAPK 11p13 Spannungsabhängiger Calcium Kanal, Un- Calciumionen-Transport; Aktivie- CACNG4 MAPK 17q24 tereinheit 4 rung von PI3K Apoptose-Inhibition; Aktivierung CARD6 Caspase rekrutierendes Protein 6 NF-κB 5p13.1 von NF-κB CASP6* Caspase 6 Apoptose Apoptose 4q25 CDK5* Cyclin-abhängige Kinase Apoptose Apoptose 7q36 Blockade der ERK Aktivierung, DUSP4 Dualspezifische Phosphatase 4 MAPK 8p12 mögliches TSG FGFR4 Fibroblasten Wachstumsfaktor Rezeptor 4 Proliferation + Angiogenese MAPK 5q35.1 FOSL1 FOS-artiges Antigen 1 Proliferation; Transkriptionsfaktor WNT 11q13 HSPA1B Hitzeschockprotein 70kDa 1B Apoptose-Inhibition (JNK) 6p21.3 HSPA9B Hitzeschockprotein 70kDa 9B (Mortalin-2) Apoptose-Inhibition (JNK) 5q31.1 Apoptose-Inhibition; Aktivierung

HSPB1 Hitzeschockprotein 27kDa1 JNK 7q11.23 von NF-κB JAK-STAT, JNK,

MYC Virales Myelocytomatosis Onkogen Apoptose-Inhibition 8q24.21 MAPK, WNT Proliferation; Transkriptionsfaktor, NFATC1 Nukleärer Faktor von aktivierten T-Zellen JNK, WNT 18q23 aktiviert MYC

NTRK1 Neurotrophin Rezeptor Tyrosinkinase 1 Apoptose-Inhibition MAPK 1q21-q22 MAPK, RAC1 Ras-bezogenes C3 Botulinumtoxin Substrat 1 Apoptose-Inhibition 7p22 WNT

SMO Smoothened Homolog Proliferation + Apoptose-Inhibition Hedgehog 7q32.3 Signalempfänger und Aktivator von JAK-STAT,

STAT1 Apoptose, Proliferations-Inhibition 2q32.2 Transkription 1 JNK

TCF7L1 T-Zell-spezifischer Transkriptionsfaktor 7L1 Proliferation; Transkriptionsfaktor WNT 2p11.2 Autokrine Wachstumsstimulation

TGFB3 Transformierender Wachstumsfaktor beta 3 MAPK 14q24 in einigen Neoplasien

Ergebnisse

Zehn Gene (CACNG4, FGFR4, HSPA1B, HSPB1, NFATC1, NTRKI1, RAC1, SMO, TCF7L1 und TGFB3), die bei den Erlotinib-resistenten Zellen überexprimiert sind, gehen hierbei mit ihrer erwarteten zellulären Funktion einher (siehe Abbildung 6) und können somit als plausible Kandidatengene gewertet werden.

Abbildung 6: Plausibilitätsübersicht der 19 Kandidatengene bezüglich ihrer zellulären Funktion und dem Wachstumsverhalten der Zelllinien nach Erlotinib-Behandlung. In der linken Graphik („pausibel“) sind die Gene aufgeführt, deren Funktion kongruent mit dem Wachstums- verhalten der Zelllinien gegenüber Erlotinib (resistent, intermediär, sensitiv) einhergeht. CACNG4, HSPA1b, HSPB1, NFATC1, NTRK1, RAC1, SMO, TCF7L1 und TGFB3 spielen eine Rolle in antiapoptotischen Signal- wegen, FGFR4 ist bei Proliferation und Angiogenese von Relevanz. Diese Gene sind in den gegenüber einer Erlotinib-Behandlung resistenten Zelllinien überexprimiert. DUSP4 und STAT1 hingegen haben proapoptotische Funktionen und sind in den Zelllinien mit erhöhter Sensitivität gegenüber Erlotinib überexprimiert. Nicht plausibel (rechte Graphik) sind zum einen CASP6 und CDK5, welche eine proapoptotische Funktion in der Zelle haben, jedoch in den Erlotinib-resistenten Zelllinien überexprimiert waren. Sie wurden daher für weitere Analysen ausgeschlossen. BDNF, CARD6, FOSL1, HSPA9B und MYC waren in den gegenüber einer Erloti- nib-Behandlung sensitiven Zelllinien überexprimiert, haben jedoch eine antiapoptotische Funktion (nach Halatsch et al. 2009).

DUSP4 und STAT1 spielen eine bekannte Rolle bei der Apoptose und sind pas- send hierzu bei den Erlotinib-sensitiven Zellen überexprimiert. Bei den gegenüber Erlotinib sensitiven bzw. resistenten Zellen sind jedoch nicht alle überexprimierten Gene kongruent zu ihrer bisher beschriebenen Funktion. So sind 5 Gene (BDNF, CARD6, FOSL1, HSPA9B und MYC), denen antiapoptotische Funktionen zugeschrieben werden, in den Erlotinib-sensitiven Zellen überexprimiert. CASP6 und CDK5 wurden aus der Kandidatenliste aufgrund offensichtlicher Inkongruenz zwischen ihrer vorbeschriebenen proapoptotischen Funktion (Weishaupt et al. 2003, Bodey et al. 2004) und der ansteigenden Expressionshöhe bei denjenigen Zell- linien mit erhöhter Resistenz gegenüber Erlotinib (Abbildung 6) ausgeschlossen.

Ergebnisse

3.5. In Silico-Analyse

Abbildung 7: Ausschnitt aus dem MAPK-Signalweg Vier der acht am MAPK-Kinase-Signalweg beteiligten Gene (BDNF, CACNG4, DUSP4, FGFR4, MYC, NTRK1, RAC1 und TGFB3) liegen in direkter Nachbarschaft zueinander, hier mit rotem x markiert. FGFR4, CACNG4 und NTRK1 führen alle – wie der EGFR auch – zu einer Aktivierung des MAPK- Signalwegs. Alle drei Gene waren in den Zelllinien mit erhöhter Resistenz gegenüber Erlotinib überexpri- miert. BDNF ist einer der Liganden für NTRK2 und war in der Gruppe der Erlotinib-sensitiven Zelllinien überexprimiert Abkürzungen: BDNF: vom Gehirn stammender neurotropher Faktor, CACN: spannungsabhängige Calci- um Kanäle, EGF: epidermaler Wachstumsfaktor, EGFR: epidermaler Wachstumsfaktor Rezeptor, FGF: Fibroblastenwachstumsfaktor, FGFR: Fibroblastenwachstumsfaktor Rezeptor, GRB2: Humanes Wachs- tumsfaktorrezeptor gebundenes Protein 2, NGF: Nervenwachstumsfaktor, NT3/4: Neutrophin 3/4, NTRK: Neurotrophin Rezeptor Tyrosinkinase, PDGF: Blutplättchen-Wachstumsfaktor, PDGFR: Blutplättchen- Wachstumsfaktor Rezeptor, Ras: Sarkom der Ratte, Ras-GRF: Ras-spezifischer Guaninnukleotid- freisetzender Faktor, Ras-GRP:Ras-spezifisches Guaninnukleotid-freisetzendes Protein (nach Halatsch et al. 2009).

Ergebnisse

Von der erhaltenen Genliste wurde mittels der DAVID-Datenbank (DAVID Datenbank 2013) analysiert, ob es gemeinsame Vertreter in einem Signalweg gibt. Acht Gene sind Teil des MAPK-Signalwegs (BDNF, CACNG4, DUSP4, FGFR4, MYC, NTRK1, RAC1 und TGFB3), wovon vier (BDNF, CACNG4, FGFR4 und NTRK1) wiederum in direkter funktioneller Nachbarschaft zueinander stehen (siehe Abbildung 7). CACNG4, FGFR4 und NTRK1 spielen eine ähnliche Rolle bei der Aktivierung des MAPK-Signalpfades. Alle drei Gene sind überexprimiert in den Erlotinib-resistenten Zellen und führen ebenso wie der EGFR letztlich zu einer Ak- tivierung von RAS, welches eine zentrale Rolle in der Pathobiologie der Glioblastome spielt (Lopez-Gines, Gil-Benso et al. 2008). BDNF, welches einer der Liganden für den Neurotrophic Tyrosine Kinase 2 (NTRK2) ist und dem primär eine antiapoptotische Funktion zugesagt wird, war unerwarteter Weise über- exprimiert in den Erlotinib-sensitiven Zellen und ist auch Teil des MAPK- Signalweges. Neben dem MAPK-Signalweg enthält die Kandidatenliste fünf Gene (FOSL1, MYC, NFATC1, RAC1 und TCF7L1), die im WNT Signalweg und weitere drei (HSPB1, MYC und STAT1), welche im Janus-Kinasen-Signalweg (JNK) eine Rolle spielen.

Ergebnisse

3.6. Korrelationsanalyse bekannter Gene in der Pathogenese des Glioblastoms

Im nächsten Schritt wurden im Rahmen dieser Arbeit Gene betrachtet, die eine bedeutende Rolle in der Pathogenese des Glioblastoms spielen. Hierzu zählen insbesondere EGFR, PTEN und AKT1.

Abbildung 8: Darstellung der Korrelation der Genexpressionen innerhalb der drei Gruppen mit un- terschiedlichem Wachstumsverhalten nach Erlotinib-Behandlung. Signifikante Korrelationen nach Spearman (p<0,05) sind in blau, nicht signifikante in grau dargestellt. In schwarz sind Gene mit zentraler Rolle in der Pathogenese des Glioblastoms hervorgehoben. Fett: Dar- stellung dreier Gene (AKT, PTEN und EGFR) mit in der Literatur beschriebenem Zusammenhang bezüg- lich des Ansprechverhaltens nach Erlotinib-Behandlung in vitro. Links: Aufführung der Rangkorrelationskoeffizienten nach Spearman der gesamten Gengruppe der 541 Gene in Bezug auf ihr Wachstumsverhalten nach Erlotinib-Behandlung (resistent, intermediär, sensitiv). Rechts: Darstellung von Genen mit zentraler Rolle in der Pathogenese des Glioblastoms (schwarz) und Darstellung der 19 Kandidatengene (blau) - nach Anwendung der Jonckheere-Terpstra-Teststatistik aus der Ursprungsliste der 541 Genen (nach Halatsch et al. 2009).

Ergebnisse

In der Literatur wird ein Zusammenhang dieser Gene mit dem Ansprechverhalten der Glioblastom-Zellen gegenüber Erlotinib-Exposition beschrieben (Haas-Kogan et al. 2005, Mellinghoff et al. 2005). In Rahmen dieser Arbeit konnte kein Zusam- menhang zwischen der Genexpression des EGFR, PTEN und AKT1 und dem Ansprechverhalten der Zelllinien gegenüber Erlotinib festgestellt werden (Abbildung 8). Vier der Kandidatengene (FGFR4, FOSL1, MYC und RAC1) spielen eine bekannte Rolle in der Pathogenese, Erhaltung und Progression von malignen Gliomen. FGFR4 und RAC1 waren in den Erlotinib-resistenten Zellen überexprimiert, FOSL1 und MYC waren trotz zugeschriebener proliferativer bzw. antiapoptotischer Funktion in den Erlotinib-sensitiven Zellen überexprimiert.

3.7. Chromosomale Lokalisation der Gene Zur Untersuchung, inwiefern sich die in der gegenüber Erlotinib-resistenten oder sensitiven Gruppe überexprimierten Gene in chromosomaler Nähe befinden, wurden die chromosomalen Lokalisationen verglichen (Tabelle 6). Keine der Gene befanden sich in direkter chromosomaler Nachbarschaft untereinander oder zum EGFR (Chromosom 7p12). Eine gemeinsame Amplifikation ist daher nicht nachweisbar. Die Lokalisationen wurde aus der Datenbank des nationalen Cen- ters für biotechnologische Informationen (NCBI) entnommen (NCBI Gendatenbank 2014).

Tabelle 6: Chromosomale Lokalisation der Gene *in der Erlotinib-resistenten Gruppe überexprimierte Gene; **in der Erlotinib-sensitiven Gruppe überexprimier- te Gene. Es konnte keine Nachbarschaft und damit keine potentielle gemeinsame Amplifikation nachgewiesen werden.

Gen Chromosomale Lokalisation Spalte1 Gen Chromosomale Lokalisation CACNG4* 17q24 TCF7L1* 2p11.2 CASP6* 4q25 TGFB3* 14q24 CDK5* 7q36 CARD6** 5p13.1 FGFR4* 5q35.2 BDNF** 11p13 HSPA1B* 6p21.3 DUSP4** 8p12 HSPB1* 7q11.23 FOSL1** 11q13 NFATC1* 18q23 HSPA9B** 5q31.1 NTRK1* 1q21-q22 MYC** 8q24.21 RAC1* 7p22 STAT1** 2q32.2 SMO* 7q32.3

Ergebnisse

3.8. qPCR

Zur methodischen Bestätigung der Microarray-Ergebnisse wurden qPCRs durchgeführt. Hierfür wurden zunächst mittels einer geNorm Analyse aus den Ergebnissen der qPCRs unserer 12 Referenzgenen (18S, ACTB, B2M, GUSB, GAPDH, HPRT1, PPIA, RPLP, UBC, TBP, TUBB und YWHAZ) die 3 stabilsten Referenzgene berechnet (Abbildung 9). Je kleiner der Expressionsstabilitätswert „M“, desto stabiler werden die Gene exprimiert.

1,3

1,2 1,1 1 0,9 0,8 0,7 0,6 Expressionsstabilität Expressionsstabilität M 0,5 0,4

weniger stabile Gene stabilere Gene

Abbildung 9: Stabilitätsanalyse der Genexpression von 12 Referenzgenen Detektion der Gene mit der höchsten Expressionsstabilität im Rahmen unseres Testystems mittels der geNorm-Analyse aus einem Panel von Referenzgenen. Von links nach rechts Darstellung der Gene mit zunehmender Expressionstabilität über alle Zelllinien hinweg. HPRT1, YWHAZ und PPIA waren die Gene mit der höchsten Expressionstabilität.

Drei Referenzgene konnten dadurch für die weiteren PCR-Analysen selektioniert werden: HPRT1, YWHAZ und PPIA. Diese 3 Gene wurden in den weiteren Analy- sen zur Normalisierung verwendet. Nach Durchführung der qPCR wurden die erhaltenen CT-Werte in das auf Micro- soft-Excel® basierende Programm REST importiert und analysiert. In diesem Zusammenhang wurde die absolute Regulation der intermediären Gruppe auf 1 normalisiert, um eine besser Vergleichbarkeit zu ermöglichen. Je nachdem, ob die Gene in der sensitiven oder resistenten Gruppe im Vergleich zur intermediären Gruppe hoch- oder runterreguliert waren, ergaben sich Werte > bzw. < 1. Abgesehen von zwei Genen (HSPA9B und STAT1), konnte bei allen Genen die Microarray-Datenanalyse bestätigt werden. CASP6 und CDK5 wurden, wie bereits 51

Ergebnisse oben beschrieben, nach der Microarray-Analyse von weiteren Analysen ausgeschlossen.

Abbildung 10: Absolute Genregulation entsprechend der qPCR Auswertung Darstellung der Mittelwerte der absoluten Gen-Regulation von 7 Genen deren Expression mit zunehmender Sensitivität gegenüber einer Erlotinib-Behandlung ansteigt. Bestätigung der Microarray-Ergebnisse bei DUSP4, MYC, CARD6, FOSL1 und BDNF. Bei HSPA9B und STAT1 konnte der Trend der Microarray-Analyse bestätigt werden. Die Daten wurden auf die intermediäre Gruppe als Referenzgruppe (absolute Gen- Regulation = 1) bezogen. Berechnung der statistischen Signifikanz (p < 0,05) mittels des Jonckheere- Terpstra-Tests.

Abbildung 11: Absolute Genregulation entsprechend der qPCR-Auswertung Darstellung der Mittelwerte der absoluten Genregulation von 10 Genen mit ansteigender Expression in der Gruppe mit erhöhter Resistenz gegenüber Erlotinib. Bis auf HSAP1B waren alle Werte signifikant und bestäti- gen die Microarray-Daten. Die Daten wurden auf die intermediäre Gruppe als Referenzgruppe (absolute Gen- Regulation = 1) bezogen. Berechnung der statistischen Signifikanz (p < 0,05) mittels des Jonckheere- Terpstra-Tests.

Ergebnisse

Die Expression von fünf Genen stieg mit zunehmender Sensitivität gegenüber Erlotinib kongruent zur Microarray-Analyse an (BDNF, CARD6, DUSP4, FOSL1, MYC) (Abbildung 10). In der Microarray-Analyse zeigte sich auch bei HSPA9B und STAT1 ein statistisch signifikanter Trend mit positiver Korrelation (p=0,02; p=0,021), dies konnte mit der qPCR nicht eindeutig bestätigt werden. HSPA9B und STAT1 waren in der sensitiven Gruppe 4,84 bzw. 8,61-fach höher exprimiert als in der intermediären Gruppe und in der intermediären Gruppe 1,03 bzw. 1,36- fach niedriger exprimiert als in der resistenten Gruppe. In der Jonckheere-Terpstra Analyse zeigte sich jedoch ein signifikanter Trend, sodass beide Gene in der Kan- didatenliste beibehalten werden konnten.

Die in der Microarray-Analyse beschriebenen 10 Gene, bei denen die Expression mit zunehmender Resistenz gegenüber Erlotinib anstieg (CACNG4, FGFR4, HSPA1B, HSPB1, NFATC1, NTRK1, RAC1, SMO, TCF7L1 und TGFB3) konnten alle in der qPCR Analyse bestätigt werden (siehe Abbildung 11). Bei HSPA1B konnte bei intaktem Trend das Signifikanz-Niveau (p<0,05) nicht erreicht werden.

Diskussion

4. Diskussion 4.1. Diskussion der Fragestellung Trotz einiger vielversprechender präklinischer Daten verfehlte der TKI Erlotinib bisher seine Erwartungen in der Klinik (van den Bent et al. 2009, Raizer et al. 2010). Bisherige Analysen zeigten, dass die Expressionshöhe des EGFR im Tumor keinen Einfluss auf das Antwortsprechverhalten gegenüber Erlotinib hat, sondern dass zahlreiche andere Einflussfaktoren eine Rolle spielen (Halatsch et al. 2004, Haas-Kogan et al. 2005, Mellinghoff et al. 2005). Die von Wadlow et al. publizierten Daten (Wadlow und Ramaswamy 2005) zeigen, dass das Ansprechverhalten auf eine Antitumorsubstanz mit dem Genexpressionsprofil des Tumors in Zusammenhang steht. So konnten bei 30 Tumorzelllinien individuelle Genprofile für 11 Antitumorsubstanzen (5-Fluoruracil, Cisplatin, Cyclophosphamid, Doxorubicin, Etoposid, Methotrexat, Mitomycin C, Mitoxantron, Paclitaxel, Topote- can, Vinblastin) erstellt werden, welche mit einer Resistenz gegenüber dem jeweiligen Agens korrelierten (Gyoerffy et al. 2006). Weiterhin detektierten Penzvalto et al. einzelne Gene, die bei erhöhter Resistenz gegenüber einer Behandlung mit fünf unterschiedlichen TKI bei insgesamt 45 Tumorzelllinien (Lunge, Mamma, Niere und Leber) überexprimiert sind (Penzvalto et al. 2013). In NSCLC Zellen konnten Coldren et al. bereits zeigen, dass mittels Expressionsanalysen eine Vor- hersage auf das Ansprechverhalten gegenüber dem TKI Gefitinib möglich ist (Coldren et al. 2006). Ziel dieser Arbeit war, spezifische Genexpressionsprofile zu erstellen, die mit er- höhter oder verminderter Sensitivität gegenüber einer Behandlung mit Erlotinib einhergehen und somit potentielle, weitere Co-Zielmoleküle zu definieren. In Kongruenz zu oben beschriebenen Daten, spielt auch in unseren Zelllinien die Expressionshöhe des EGFR keine Rolle im Hinblick auf ein Erlotinib-spezifisches Ansprechverhalten. Insgesamt bleibt zu beachten, dass im Rahmen der Fragestellung der Arbeit Zell- linien eingesetzt wurden und es bekannt ist, dass sich das Genexpressionsprofil nach längerer Kultivierungszeit in vitro verändern kann. Außerdem wird in Zellkul- turarbeiten die individuelle Pharmakokinetik und –dynamik sowie das lokale Tu- mormilieu nicht berücksichtigt. Weitere Untersuchungen zur Testung unsere gewonnenen Ergebnisse an Primärkulturen oder direkt an Primärgewebe bzw. in vivo sind daher notwendig. 54

Diskussion

4.2. Diskussion der Methodik Als Microarray wählten wir den einfarbigen Human Whole Genome Bioarray von CodeLink (CodeLink Human Whole Genome Bioarray 2013). Das vom FDA initiierte Microarray Qualitätskontroll Projekt II (MAQC-II) konnte eine gleich gute Ergebnisqualität von ein- oder zweifarbigen Arrays bestätigen (Oberthuer et al. 2010). Der Vorteil dieses Arrays mit Oligonukleotidlängen von 30-mer ist seine höhere Spezifität im Vergleich zu cDNS Arrays, da die Möglichkeit von Kreuz- hybridisierungen auf Grund der kürzeren Sequenzen verringert ist. Die Sequenz- längen sind einheitlich und durch die unterschiedlich gewählten Sequenzen können auch Splicevarianten detektiert werden (Ramaswamy und Golub 2002). Ein weitere Vorteil des Arrays ist, dass die hydrophobe 3-D Polyacrylamid Gel- matrix die Oligonukleotide abstößt und daher die Bindungskinetik zwischen Probe und Oligonukleotid vergleichbar mit der in Flüssigkeiten ist (Dorris et al. 2003). Abgesehen von Probe G-210M wurden im Rahmen dieser Arbeit sowohl bei der Microarray-Analyse, als auch bei der qPCR Test-Triplikate eingesetzt. Bei G-210GM wurden aufgrund geringer mRNS-Mengen nur Duplikate verwendet. Replikate sind notwendig, um systemische oder durch Zufall entstanden Mess- fehler im Versuchsaufbau zu verringern (Benes und Muckenthaler 2003). Unabhängig von der verwendeten Microarray Plattform, muss bei jeder Analyse von einem „Hintergrundrauschen“ ausgegangen werden. (Wu et al. 2005). Dieses „Hintergrundrauschen“ kann durch die unterschiedlichen Prozessschritte wie Pro- benpräparation, cRNS Markierung oder bei der Hybridisierung entstehen. Es kann biologisch wichtige Signale verdecken und somit die Datenanalyse verfälschen. Da sich das „Hintergrundrauschen“ bei jedem Array unterscheidet, verhindert es darüber hinaus auch eine Vergleichbarkeit der Daten. Mit Hilfe von Normalisie- rungsprozessen lassen sich Teile des „Hintergrundrauschen“ herausfiltern, wobei jedoch gleichzeitig das eigentlich Signal bestmöglich erhalten bleiben muss (Wu et al. 2005). Es gibt verschiedene Normalisierungsmethoden, die sich bei den jeweiligen Arrays funktionell als unterschiedlich gut geeignet erwiesen haben. Bislang wurde noch kein internationaler Konsens gefunden, welche Methodik dem Gold- standard entspricht. Wir haben uns für die CyclicLoess Normalisierung ent- schieden, da die häufig verwendete Median-Normalisierung vermehrt insuffiziente Ergebnisse hervorbringt (Wu et al. 2005). 55

Diskussion

Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine auf die Behandlung mit Erlotinib intermediär reagierende Gruppe (maximale Wachstumsinhibition 33 - 67%) eingeführt, um so die analytische Genauigkeit zu erhöhen. Zur Überprüfung der hier gewonnenen Daten bietet sich in weiteren Schritten eine Transfektions- bzw. Knock-Down- Analyse an, da so eine Kausalität zwischen Genexpression und Wachstums- verhalten unter Erlotinib-Exposition spezifischer untersucht werden kann.

Diskussion

4.3. Diskussion der Ergebnisse Im Rahmen dieser Arbeit wurden Genexpressionsprofile von Glioblastom- Zelllinien, deren Wachstumsverhalten unter Erlotinib-Exposition bekannt ist, untersucht. Insgesamt wurden in der vorliegenden Arbeit 19 Kandidatengene identifiziert, die einen Einfluss auf das Wachstumsverhalten der Glioblastom- Zelllinien nach Erlotinib-Zugabe haben. Keines der Gene befindet sich in chromosomaler Nachbarschaft, so dass nicht von einer gemeinsamen Amplifikation als Ursache für die Überexpression ausgegangen werden kann. Da- runter sind zehn Gene, die in der Erlotinib-resistenten Gruppe überexprimiert sind und hinsichtlich ihrer Funktion plausibel zu interpretieren sind (CACNG4, CASP6, CDK5, FGFR4, HSPA1B, HSPB1, NFATC1, NTRK1, RAC1, SMO, TCF7L1 und TGFB3). Bei einigen Genen (FGFR4, HSPA1B, NFATC1, NTRK1, RAC1, SMO und TGFB3) konnte bereits gezeigt werden, dass in normalen Gliazellen keine Überexpression oder konstitutive Aktivierung vorliegt und diese Gene daher als mögliche Co-Zielmoleküle in Fragen kommen (De Groot et al. 1999, Fuhrmann et al. 1999, Charytoniuk et al. 2002, Senger et al. 2002, Aronica et al. 2004, Arion et al. 2007, Perez-Ortiz et al. 2008, Villapol et al. 2008). TGFB3 z.B. ist ein Zytokin, welches über die Bindung an den TGFB-Rezeptor eine bedeutende Rolle bei der Angiogenese, Invasion und Immunsuppression bei Gliomen spielt (Platten et al. 2001). Eine Überexpression von TGFB3 geht mit erhöhter Malignität von Gliomen einher (Kawataki et al. 2000). Mehrere klinische Studien untersuchen aktuell den therapeutischen Nutzen einer Inhibierung des TGFB-Rezeptors bei Gliomen (NIH Clinical Trials: TGFB 2013). In einer 2012 ver- öffentlichten Studie konnten beim duktalen Adenokarzinom des Pankreas präklinisch durch eine kombinierte EGFR- und TGFB-Inhibition erste Erfolge verzeichnet werden (Deharvengt et al. 2012). Eine kombinierte Therapie von Erlotinib mit einem TGFB-Inhibitor erscheint daher als möglicher Therapie- ansatz bei Glioblastomen vielversprechend, v.a. da TGFB3 die größte Spannweite der Expressionswerte innerhalb unserer drei Gruppen innehält. Ein weiteres Gen, welches in der Gruppe mit vermehrter Resistenz gegenüber einer Erlotinib-Behandlung überexprimiert ist, ist FGFR4. Auch dies ist ein Gen, welches mit dem histopathologischen Grad von Astrozytomen korreliert (Yamada et al. 2002). Aktuelle Studien beschäftigen sich mit der Suche eines spezifischen FGFR4-Inhibitors (Liang et al. 2012, Ho et al. 2013), da FGFR in vielen Tumor- 57

Diskussion entitäten eine Rolle bei der Proliferation, Angiogenese und Migration spielt und eine Inhibierung in präklinischen Versuchen vielversprechende Ergebnisse erbrachte. Fenton et al. konnten kürzlich zeigen, dass FGFR in Glioblastom-Zellen zu einer Phosphorylierung von PTEN führt (Fenton et al. 2012). Eine Phosphorylierung, Verlust oder Mutation von PTEN führten letztlich zu einer erhöhten Resistenz gegenüber EGFR-TKIs (Bianco et al. 2003). Daher erscheint eine Kombination von Erlotinib mit einem FGFR4-Inhibitor ebenfalls sehr sinnvoll. Als weiteres Zielmolekül in der Gruppe mit erhöhter Resistenz gegenüber Erlotinib sticht RAC1 ins Auge. RAC1 gehört zur Gruppe der Rho-Familie und ist eine GTPase; es spielt bei der Invasion, Migration und dem Überleben von Gliomzellen eine bedeutende Rolle (Senger, Tudan et al. 2002; (Chan et al. 2005). Eine Inhibierung von RAC1 in Glioblastom-Zelllinien induziert Apoptose und vermindert das Zellüberleben (Senger et al. 2002). Eine Depletion von RAC1 mittles RNS Interferenz führte zu einer verminderten Zellmigration und –invasion in Glioblastom-Zellen (Chan et al. 2005). Basierend auf den Ergebnissen unserer Arbeit, bei der RAC1 in den Erlotinib-resistenten Zellen überexprimiert war, untersuchten Karpel-Massler et al. den spezifischen RAC1 Inhibitor NSC23766 (Gao et al. 2004) in Kombination mit Erlotinib (Karpel-Massler et al. 2013). Die Kombination beider Agenzien führte zu einem synergistischen, antiproliferativen Effekt bei allen drei untersuchten Glioblastom-Zelllinien und bei zwei primären Glioblastom-Zellkulturen. Weiterhin führte eine kombinierte Behandlung zu einer verminderten Migration der Glioblastom-Zellen im Vergleich zu Kontroll- bedingungen oder einer Mono-Behandlung mit einem der beiden Inhibitoren. In einem Xenograft Maus-Modell überlebten die Tiere mit einer Kombinationsbe- handlung aus Erlotinib und NSC23766 länger im Vergleich zur Kontroll- oder Mo- notherapiegruppe. Ein ebenfalls in der Erlotinib-resistenten Gruppe überexprimiertes Gen ist NFATC1. NFATC1 ist ein Trankskriptionsfaktor, der u.a. die T-Zell-Entwicklung und Makrophagenfunktion reguliert. Neuere Daten legen nahe, dass eine NFATC1 Überexpression zur Tumorprogression von Karzinomzellen beiträgt (Oikawa et al. 2013). Aktuell konnte gezeigt werden, dass Pankreaskarzinom-Zellen, welche NFATC1 überexprimieren, weniger auf eine Behandlung mit Phospho-Sulindac, einem Derivat des Antirheumatikums Sulindac, ansprechen (Murray et al. 2014). Im Gegensatz dazu reagierten Zellen, bei denen die Expression von NFATC1

Diskussion mittels RNS-Interferenz aufgehoben wurde, besser auf eine Behandlung mit Phospho-Sulindac. Murray et al. bezeichnen daher NFATC1 als ein potentielles Kandidatengen für Pharmakoresistenz - eine Beobachtung, die in dieser Arbeit auch gemacht wurde, da NFATC1 bei den Erlotinib-resistenten Zellen über- exprimiert ist. Cyclosporin A und FK506 (Tacrolimus) sind unspezifische Inhibitoren von NFATC1 und werden als Immunsuppressiva nach Organ- transplantation oder in der Behandlung von Autoimmunerkrankungen eingesetzt. Obwohl Cyclosporin A und FK506 (Tacrolimus) in in vitro Untersuchungen nicht zu verminderter Proliferation von Glioblastom-Zellen führte, konnte doch eine reduzierte Invasion beobachtet werden (Tie et al. 2013). Da Cyclosporin A und FK506 (Tacrolimus) zusätzlich zu NFAT die Phosphorylierung weiterer Substrate hemmen, haben sie weitreichende Nebenwirkungen, weshalb aktuell nach spezifischeren NFATC-Inhibitoren gesucht wird (Mancini und Toker 2009). Das Protein VIVIT, welches spezifischer die NFAT Phosphorylierung und damit Aktivierung hemmt, verzögert die Invasion von Mammakarzinom-Zellen in vitro (Jauliac et al. 2002). Weitere ausführliche Untersuchungen zu Gliomen mit diesem Inhibitor stehen aktuell aus. TCF7L1 wird ebenfalls in der Erlotinib-resistenten Gruppe überexprimiert. Es gehört zur Gruppe von Transkriptionsfaktoren mit zentraler Bedeutung bei der Stammzellregulierung (Slyper et al. 2012) und ist Teil des WNT-Pfadweges, welcher bei der Differenzierung und Proliferationen von Tumorzellen eine entscheidende Rolle spielt. Durch die Bindung an WNT-Rezeptoren wird die Phosphorylierung von beta-Catenin und damit dessen Degradation verhindert. Nicht-phosphoryliertes beta-Catenin wandert in den Nukleus, wo es unter anderem an TCF7L1 bindet und es dadurch aktiviert (Nager et al. 2012). Eine aberrante Aktivierung des WNT-Signalweges ist ein Kennzeichen von Tumoren (Polakis 2012). TCF7L1 wird in gering differenzierten Mammakarzinom-Zellen überexprimiert und spielt hier eine tragende Rolle bei der Tumorinitiierung und dem Tumorwachstum (Slyper et al. 2012). In Gliomzellen supprimiert eine Herun- terregulierung von WNT2 mittels siRNS das Wachstum in vitro (Pu et al. 2009). Eine Antagonisierung des WNT-Pfadweges führt zu einer erhöhten Chemo- sensitivität von Gliomzellen gegenüber Doxorubicin oder Cisplatin (Warrier et al. 2014). Die Blockierung des bei den Erlotinib-resistenten Zellen überexprimierten TCF7L1 erscheint daher eine sinnvolle Rationale.

Diskussion

Ein weiteres Gen, welches in der Erlotinib-resistenten Gruppe überexprimiert wird, ist das G-Protein-gekoppelte Rezeptor Protein SMO. Dieses Gen ist im Hedge- hog-Signalweg bei der Aktivierung von Bedeutung. In in vitro Untersuchungen konnten Hu et al. zeigen, dass das Sonic Hedgehog Protein (Shh) ebenso wie SMO und der EGFR in Pankreaskarzinom-Zellen überexprimiert ist (Hu et al. 2007). Shh gehört ebenso wie Indian Hedgehog (Ihh) und Desert Hedgehog (Dhh) zu den Hedgehog Proteinen. Wenn diese Proteine an ihren Liganden Patched (Ptch) binden, welcher normalerweise SMO inhibiert, wird die Inaktivierung von SMO aufgehoben. Dadurch werden intrazelluläre Transkriptionsfaktoren (wie z.B. Gli) aktiviert, welche eine Rolle bei der Zellproliferation, Invasion und Angiogenese bei Tumoren spielen. Hu et al. konnten zeigten, dass eine kombinierte Blockade des EGFR und des Shh mittels des spezifischen Inhibitor Cyclopamin den antiproliferativen Effekt des TKI Gefitinib (Iressa®, AstraZeneca, London, GB) bei Pankreaskarzinomen in vitro verstärkt (Hu et al. 2007). Aktuell wird in mehreren Phase 1 - Studien der SMO- Inhibitor LY2940680 (Eli Lilly and Company, Indianapolis, USA) (NIH Clinical Trials: LY2940680 2014) unter anderem auch beim kleinzelligen Bronchialkarzi- nom und anderen soliden Tumoren untersucht. In vitro konnten Ferruzzi et al. bereits antiproliferative Effekte eines weiteren SMO-Inhibitors, SEN450, für Glioblastom-Zellen zeigen (Ferruzzi et al. 2012). Aktuell wird ein weiterer spezifischer SMO-Inhibitor (Vismodegib, Erivedge®, Roche, Basel, Schweiz) bei pädiatri- schen Patienten mit pontinem Gliom untersucht (NIH Clinical Trials: Vismodegib 2014). Aufgrund der weit fortgeschrittenen, klinischen Erprobung von SMO Inhibi- toren erscheint dieses Gen als ebenso wichtiges Zielmolekül in einer Kombinati- onstherapie mit Erlotinib. Ebenfalls in der Erlotinib-resistenten Gruppe überexprimiert wird CACNG4. CACNG4 ist eine Untereinheit von spannungsabhängigen Calcium-Kanälen und wird in Mammakarzinom-Zelllinien überexprimiert. Ein Knockdown von CACNG4 führte in Mammakarzinom-Zellen zu einer verminderten Migration und Invasion (Kanwar et al. 2013). Weitere Daten zur Bedeutung von CACNG4 bei anderen Karzinomen stehen aktuell noch aus. Ein weiterer Vertreter in der Erlotinib-resistenten Gruppe ist NTRK1. NTRK1 gehört zur Gruppe der Neutrophin Tyroskin-Kinase Rezeptoren, aktiviert in phosphoryliertem Zustand den MAPK-Signalweg und spielt damit bei Zell-

Diskussion wachstum, Differenzierung und Apoptose eine wichtige Rolle. In Astrozytomen wird NTRK1 unabhängig vom Tumorgrad exprimiert (Assimakopoulou et al. 2007). In Prostatakarzinom-Zellen führte eine Inaktivierung von NTRK1 mittels des Pan-Tyrosinkinase-Inhibitors CEP-701 (Lestaurtinib, Cephalon, Frazer, Pennsylvania, USA) zu einer verminderten Migration und Invasion (Festuccia et al. 2007). In einer Phase I – Studie mit CEP-701, bei der Patienten mit weit fortgeschrittenem Tumorleiden eingeschlossen wurden, zeigte sich eine gute Verträglichkeit (Marshall et al. 2005). Mehrere Studien untersuchen aktuell die Wirkung von CEP-701 v.a. bei hämatologischen Neoplasien (NIH Clinical Trials: CEP-701 2014). Weitere in der Erlotinib-resistenten Gruppe überexprimierte Gene sind die Hitze- schockproteine HSPB1 und HSPA1B. Sie gehören zur Gruppe der Chaperone und werden in zahlreichen Tumorentitäten überexprimiert. HSPB1 reguliert die Zellkon- traktion, die Aktin-Polymerisierung und Migration und geht mit einer schlechteren Prognose in Gliomen einher (Graner und Bigner 2005). HSPA1B fördert das Über- leben von Gliomzellen (Li et al. 2011). Aktuell wird der Nutzen einer Inhibition von Hitzeschockproteinen in Gliomen untersucht (Liu et al. 2012). Im Hinblick auf das Konzept der oncogene addiction (Weinstein und Joe 2008) stellen diese zehn überexprimierten Gene einen potentiellen Mechanismus dar, um eine für die Tumorzelle suppressive EGFR Inhibierung zu umgehen und für die Zelle überlebenswichtige Signalpfade zu erhalten. Eine parallele Blockierung des EGFR und der oben aufgeführten Gene erscheint daher sinnvoll, um die Effektivi- tät einer Erlotinib-Therapie zu erhöhen. Als proof of concept zeigt die Arbeit von Karpel-Massler et al., dass eine kombinierte Behandlung von Erlotinib mit dem RAC1 Inhibitor NSC23766 sowohl in vitro als auch in vivo zu einem synergistischen, antiproliferativen Effekt beim Glioblastom führte (Karpel-Massler et al. 2013). Wie bereits oben aufgeführt, existieren weitere, teilweise spezifische Inhibitoren für mehrere der genannten Gene (u.a. NFATC1, SMO, NTRK1), bzw. deren Proteine. Hier erscheint vor allem SMO als ein optimaler Kandidat für weitere Untersuchungen, da bereits mehrere spezifische Antagonisten in klinischer Erprobung sind und bisher ein tolerables Nebenwirkungsprofil zeigten.

Neben diesen zehn Genen, die potentielle Co-Ziele in der Behandlung von Erlotinib-resistenten Tumoren darstellen, waren fünf Gene in der Erlotinib-

Diskussion sensitiven Gruppe überexprimiert, denen eine antiapoptotische Funktion zugeschrieben wird (BDNF, CARD6, FOSL1, HSPA9B, MYC) und die daher bereits im Ergebnisteil als nicht plausibel interpretiert wurden. FOSL1 bildet mit weiteren Proteinen das Transkriptions Aktivator Protein 1 (Faktor AP-1) und spielt eine Rolle in der Erhaltung und Progression von Gliomen (Debinski und Gibo 2005). In Mammakarzinomen geht eine Überexprimierung von FOSL1 mit einer vermehrten Zellproliferation und Invasion einher (Belguise et al. 2005). Gleichzeitig führt eine Inhibierung von FOSL1 mittels siRNS zu einer Wachstumsreduktion bei Mammakarzinom-Zellen in vitro (Pennanen et al. 2011). Ein weiteres Gen mit antiapoptotischer Funktion, welches in der Erlotinib- sensitiven Gruppe überexprimiert wird, ist CARD6. CARD6 aktiviert den Transkriptionsfaktor Nuclear Factor-kappaB (NF-B) und wird u.a. im Magen- und Ösophaguskarzinom sowie im kolorektalen Karzinom überexprimiert (Kim et al. 2010). Die NF-B Proteine sind Transkriptionsfaktoren, welche bei der angebore- nen und erworbenen Immunantwort sowie bei der Zellproliferation und Inhibierung der Apoptose von Bedeutung sind (Naugler und Karin 2008). NF-B wird unter anderem auch in Gliom-Gewebe überexprimiert (Hayashi et al. 2001). Eine In- aktivierung zeigte bereits bei mehreren Tumorarten eine Wachstumsinhibition (Fernandez-Majada et al. 2007, Rahman et al. 2007, Yang et al. 2007). BDNF tritt in zwei Formen auf, als proBDNF und als matureBDNF. ProBDNF bindet an den p75-Neurotrophin Rezeptor (NTR) und wird in höhergradigen Gliomen überexprimiert. Es führt jedoch zu einer Wachstums- und Migrations- inhibition und vermehrter Apoptose in vitro (Xiong et al. 2013). Im Verlauf wird proBDNF aber zu matureBDNF umgebaut. Xiong et al. postulieren, dass damit ein Gleichgewicht in der Tumorzellen zwischen Wachstum, Migration und Apoptose hergestellt wird, da über matureBDNF der NTRK2 und damit der MAPK-Signalweg aktiviert wird. Bei Mammakarzinom-Patienten wird BDNF vermehrt im Tumorge- webe gebildet und eine erhöhte BDFN-Expression geht mit einer schlechteren Prognose einher (Patani et al. 2011). Im Gegensatz zu den in dieser Arbeit gewonnenen Daten, bei denen BDNF in den Erlotinib-sensitiven Zelllinien über- exprimiert ist, scheint rekombinantes BDNF in Kolonkarzinom-Zelllinien ein Resistenzfaktor gegenüber dem EGFR-Inhibitor Cetuximab zu sein. Bei Inhibierung von BDNF durch den nicht-spezifischen Inhibitor K252a war der antiproliferative Effekt von Cetuximab synergistisch verstärkt (de Farias et al. 2012). 62

Diskussion

Eine Ursache könnte sein, dass in unseren Zelllinien vermehrt proBDNF gebildet wurde, welches wie oben beschrieben, zu einer Migrationsinhibition und vermehrten Apoptose führt. Weitere Untersuchungen bzgl. der Form von BDNF (proBDNF vs. matureBDNF) in unseren Gliomblastom-Zellen sind hier notwendig, um die jeweilige Expression plausibel erklären zu können. Ein weiteres, in der Erlotinib-sensitiven Gruppe überexprimiertes Gen ist das Hitzeschockprotein HSPA9B. HSPA9B gehört wie die zwei oben aufgeführten Gene HSPB1 und HSPA1B zur Gruppe der Chaperone und wird in Gliomen über- exprimiert (Takano et al. 1997). HSPA9B ist co-lokalisiert mit p53 und inhibiert dieses Tumorsuppressorgen. Wird die Funktion von HSPA9B mittels des Inhibitors MKT-077 blockiert, führt dies zu einer Reaktivierung von p53 und damit zur Wachstumsinhibition (Wadhwa et al. 2000). Das letzte in der Erlotinib-sensitiven Gruppe überexprimierte Gen ist MYC. MYC spielt eine zentrale Rolle in der Proliferation von Gliomzellen (Barnett et al. 1998), (Broaddus et al. 1997). Im Maus-Modell führte eine Inhibierung von MYC zu einer verminderten Zellproliferation und Zunahme der Apoptose (Annibali et al. 2013). Aktuell wird die Wirkung eines MYC-Inhibitors, dem Benzodiazepin-Derivat JQ1, der durch Inhibierung der BET Bromodomäne letztlich zu einer verminderten MYC-Transkription führt, in Tumoren untersucht. Präklinische Daten mit Medulloblastom-Zellen zeigten eine Abnahme des Zellüberlebens nach Behand- lung mit JQ1 (Bandopadhayay et al. 2014). In Gliomen konnte in einem orthotopen Maus-Modell ebenfalls ein vermindertes Tumorwachstum gezeigt werden (Cheng et al. 2013). Ein weiterer MYC-Inhibitor, OTX015 (Oncoethix, Lausanne, Schweiz) befindet sich aktuell bei der Behandlung hämatologischer Neoplasien in klinischer Erprobung (NIH Clinical Trials: OTX015 2014). Diese fünf Gene mit antiapoptotischer Funktion waren erstaunlicherweise in der Erlotinib-sensitiven Gruppe überexprimiert und wurden daher bereits im Ergebnisteil als nicht plausibel interpretiert. Zu untersuchen wäre hier, ob diese Gene als prädiktiver Marker für ein Ansprechen auf eine Erlotinib-Behandlung dienen können oder eventuell Co-Ziele von Erlotinib darstellen. Für MYC befinden sich, wie oben beschrieben, bereits Inhibitoren in klinischer Erprobung. Es wäre zu untersuchen, ob eine gleichzeitige Inhibierung von MYC den antiproliferativen Effekt von Erlotinib noch synergistisch verstärken kann.

Diskussion

Weiteren zwei Genen der Erlotinib-sensitiven Gruppe (DUSP4 und STAT1) wird eine antiproliferative und somit plausible Funktion zugeschrieben. DUSP4 gehört zur Gruppe der Dual-spezifischen Phosphatasen, welche eine bedeutende Rolle in der Inaktivierung von verschiedenen Isoformen des MAPK-Signalwegs sowie bei der Tumorsuppression spielen (Prabhakar et al. 2013). DUSP4 dephosphoryliert und inaktiviert MAP-Kinasen und wird daher als Tumorsuppressorgen gehandelt. Eine Überexpression führt zur Wachstumsinhibierung von Gliomzellen (Waha et al. 2010). Somit wird potentiell in unserem Versuchsaufbau die Erlotinib-bedingte Inhibierung des MAPK-Signalwegs durch die Überexpression von DUSP4 und der damit ebenfalls verbundenen MAPK-Signalweg-Inhibierung unterstützt, sodass die Zellen damit sensitiv auf eine Erlotinib-Behandlung reagieren. Ebenfalls von antiproliferativer Wirkung und in der Erlotinib-sensitiven Gruppe überexprimiert, war das Gen STAT1. STAT1 gehört zur Gruppe der Signal- empfänger und Aktivatoren der Transkription und wird u.a. durch Interferone aktiviert. In humanen Glioblastom-Zellen findet man eine verminderte Expression von STAT1. Eine Transfektion von Gliomzellen mit STAT1 führte zu einer signifikanten Inhibierung des Tumorwachstums in vitro (Ju et al. 2013). Beide Gene (DUSP4 und STAT1) stellen damit ebenfalls potentielle, prädiktive Marker für den Therapieerfolg einer Erlotinib Behandlung dar. Weiterhin erscheint es möglich, dass die intrinsische Überexpression von STAT1 und DUSP4 alleine nicht ausreicht, um einen antiproliferativen Effekt zu erzielen, sondern eine Blockierung eines weiteren Pfadweges, wie z.B. des EGFR, notwendig ist. Es bedarf dies- bezüglich weiterer Untersuchungen zur Beurteilung dieser Hypothese.

Zwei Gene wurden wegen Inkongruenz aufgrund ihrer proapoptotischen Funktion und Überexpression in der Erlotinib-resistenten Gruppe von den weiteren Analysen ausgeschlossen: (1) CASP6, welches für das Protein Caspase 6 codiert und auch in Gliomen eine proapoptotische Funktion hat (Komata et al. 2001) und (2) CDK5, welches ebenfalls bei der Apoptose von Gliomzellen eine Rolle spielen kann (Catania et al. 2001).

Neben der Analyse der einzelnen Funktionen der Gene, wurde im nächsten Schritt untersucht, ob bestimmte Pfadwege durch die Kandidatengene vermehrt repräsentiert sind. Hierbei fiel vor allem der MAPK-Signalweg auf. Acht der

Diskussion

Kandidatengene sind daran beteiligt (BDNF, CACNG4, DUSP4, FGFR4, MYC, NTRK1, RAC1 und TGFB3). Jimeno et al. konnten bereits zeigen, dass bei Gal- len- und Pankreastumoren, die resistent gegenüber einer Behandlung mit EGFR- TKIs waren, ebenfalls mehrere Gene des MAPK-Signalwegs überexprimiert waren (Jimeno et al. 2007). Eine gleichzeitige Blockade des EGFR mittels Gefitinib (Iressa®, AstraZeneca, Wilmington, DE, USA) und des MAPK-Signalweges durch PD184352 zeigte in vitro und in vivo bereits antitumorale Effekte (Jimeno et al. 2007). Drei der hier aufgeführten Gene (FGFR4, CACNG4 und NTRK1) befinden sich in direkter Nachbarschaft und aktivieren den MAPK-Signalweg ebenso wie der EGFR. Alle drei Gene sind in der Erlotinib-resistenten Gruppe überexprimiert. Dieser funktionelle Cluster lässt daher vermuten, dass eine alleinige Aktivitätsblo- ckierung des MAPK-Signalwegs durch Erlotinib nicht ausreichend und eine kombinierte Inhibierung sinnvoll ist. Neben dem MAPK-Signalweg war in der vorliegenden Analyse auch der WNT- Signalweg mit fünf Genen deutlich überrepräsentiert (FOSL1, MYC, NFATC1, RAC1 und TCF7L1). Neuere Daten legen einen crosstalk zwischen dem EGFR- und dem WNT-Signalweg in Gliomen nahe (Paul et al. 2013). Die oben beschriebenen und kürzlich veröffentlichten Daten von Karpel-Massler et al. zeigen ein- drucksvoll die synergistischen und antiproliferativen Effekte einer kombinierten Behandlung mit Erlotinib und dem RAC1-Inhibitor NSC23766 sowohl in vitro als auch in vivo und unterstreichen so diese Feststellung (Karpel-Massler et al. 2013).

Zusammenfassung

5. Zusammenfassung In der vorliegenden Arbeit wurden Genexpressionsanalysen von fünf unterschiedlichen Glioblastom-Zelllinien mit bekanntem Wachstumsverhalten nach Erlotinib- Exposition – einem Tyrosinkinase-Inhibitor (TKI) des epidermalen Wachstums- faktors (EGFR) – mittels Microarray durchgeführt. Die Glioblastom-Zelllinien wurden hinsichtlich ihres Wachstumsverhaltens nach Erlotinib-Gabe in drei Gruppen eingeteilt: resistent – intermediär – sensitiv. Obwohl der EGFR in etwa der Hälfte von Glioblastomen überexprimiert wird, konnte bisher kein Einfluss der EGFR-Expressionshöhe auf das Ansprechverhal- ten gegenüber Erlotinib festgestellt werden. Dies wurde in unserer Analyse ebenfalls bestätigt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten jedoch 19 Kandidaten- gene identifiziert werden, die mit einer erhöhten oder verminderten Resistenz gegenüber Erlotinib einhergehen und damit potentielle Co-Zielmoleküle in der Therapie des Glioblastoms darstellen. Zwei Gene (CDK5 und CASP6) wurden wegen Inkongruenz zwischen ihrer proapoptischen Funktion und ihrer erhöhten Expression in der gegenüber Erlotinib-resistenten Gruppe von der weiteren Analyse ausgeschlossen. Von den verbliebenen 17 Genen, welche hinsichtlich ihrer Expression mittels qPCR bestätigt werden konnten, waren zehn Gene (CACNG4, CASP6, CDK5, FGFR4, HSPA1B, HSPB1, NFATC1, NTRK1, RAC1, SMO, TCF7L1 und TGFB3) mit bekannter antiapoptotischer bzw. proliferationsför- dernder Funktion in der resistenten Gruppe überexprimiert und stellen damit potentielle Kombinationsziele zusammen mit Erlotinib in der Behandlung von Glioblastomen dar. Bei einigen der zehn Gene existieren schon jetzt spezifische Inhibitoren, die sich zum Teil auch bereits in klinischer Erprobung befinden. Neben diesen zehn Genen waren weitere fünf Gene (BDNF, CARD6, FOSL1, HSPA9B und MYC) in der Erlotinib-sensitiven Gruppe überexprimiert, die auch eine antiapoptotische oder antiproliferative Wirkung in der Glioblastom-Zelle haben. Diese fünf Gene könnten Co-Ziele von Erlotinib darstellen oder auch als potentielle prädiktive Marker hinsichtlich des Ansprechens auf Erlotinib dienen. Weitere Untersuchungen sind hierzu notwendig. Abschließend waren zwei Gene (DUSP4 und STAT1) mit tumorsuppressiver Funktion in der Erlotinib-sensitiven Gruppe überexprimiert. Hier bleibt zu klären, ob es sich bei diesen zwei Genen auch um prädiktive Marker für das Ansprechen auf Erlotinib handelt und/oder ob

Zusammenfassung die beschriebene antiproliferative Wirkung der Gene erst in Kombination mit einer EGFR-Inhibierung zur vollen Geltung kommt. Weiterhin wurde in der vorliegenden Arbeit eine Signalpfadanalyse durchgeführt, in welcher sich v.a. eine Überrepräsentation der Kandidatengene im Mitogen- aktivierten Proteinkinase (MAPK)- und Wnt-Signalweg zeigte. Drei der Kandidatengene (FGFR4, CACNG4 und NTRK1) befinden sich in direkter Nachbarschaft und aktivieren ebenso wie der EGFR den MAPK-Signalweg. Dieser funktionelle Cluster lässt daher vermuten, dass eine alleinige Aktivitätsblockierung des MAPK-Signalwegs durch Erlotinib nicht ausreichend und eine kombinierte Inhibierung sinnvoll ist. Fünf der Kandidatengene (FOSL1, MYC, NFATC1, RAC1 und TCF7L1) sind Teil des Wnt-Signalwegs, welcher entsprechend neuerer Daten in enger Beziehung zum EGFR-Signalweg steht. Auch hier bietet die duale Blockierung beider Signalwege mittels Erlotinib und eines Wnt-Inhibitors eine vielversprechende Rationale.

Im Rahmen dieser Arbeit konnten somit mehrere Gene identifiziert werden, die mit dem Ansprechverhalten von Glioblastom-Zellen gegenüber einer Erlotinib- Behandlung korrelieren. Bei mehreren Genen, bzw. ihren dazugehörigen Proteinen, existieren bereits spezifische Inhibitoren in klinischer Erprobung. Eine duale Behandlung in Kombination mit Erlotinib bedarf weiterer präklinischer und klinischer Untersuchung. Weiterhin bieten die determinierten Gene perspektivisch mögliche Ansatzpunkte zur Prädiktion des Ansprechverhaltens von Glioblastom- Zellen gegenüber Erlotinib.

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Danksagung

Danksagung aus Gründen des Datenschutzes entfernt.

Lebenslauf

Lebenslauf aus Gründen des Datenschutzes entfernt.

Lebenslauf

Teile dieser Dissertation wurden bereits in folgenden Fachartikeln veröffentlicht:

S. Löw, V. I. Vougioukas, T. Hielscher, U. Schmidt, A. Unterberg, and M. E. Halatsch, 'Pathogenetic Pathways Leading to Glioblastoma Multiforme: Associa- tion between Gene Expressions and Resistance to Erlotinib', Anticancer Res, 28 (2008), 3729-32.

M. E. Halatsch, S. Löw, T. Hielscher, U. Schmidt, A. Unterberg, and V. I. Vougioukas, 'Epidermal Growth Factor Receptor Pathway Gene Expressions and Biological Response of Glioblastoma Multiforme Cell Lines to Erlotinib', Anticancer Res, 28 (2008), 3725-8.

M. E. Halatsch, S. Löw, K. Mursch, T. Hielscher, U. Schmidt, A. Unterberg, V. I. Vougioukas, and F. Feuerhake, 'Candidate Genes for Sensitivity and Resistance of Human Glioblastoma Multiforme Cell Lines to Erlotinib. Laboratory Investiga- tion', J Neurosurg, 111 (2009), 211-8.

S. Löw, U. Schmidt, A. Unterberg, and M. E. Halatsch, 'The Epidermal Growth Factor Receptor as a Therapeutic Target in Glioblastoma Multiforme and Other Malignant Neoplasms', Anticancer Agents Med Chem, 9 (2009), 703-15.