Bárbara Bort Biazotti Caracteres Estruturais

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE BIOLOGIA

BÁRBARA BORT BIAZOTTI

CARACTERES ESTRUTURAIS DIAGNÓSTICOS E TENDÊNCIAS EVOLUTIVAS EM SEMENTES DAS SUBTRIBOS DE TABERNAEMONTANEAE (APOCYNACEAE, RAUVOLFIOIDEAE)

CAMPINAS 2015

Campinas, 12 de agosto de 2015.

Profa. Dra. Sandra Maria Carmello-Guerreiro

Profa. Dra. Denise Maria Trombert de Oliveira

Prof. Dr. Diego Demarco

Profa. Dra. Luiza Sumiko Kinoshita

Profa. Dra. Ingrid Koch

AGRADECIMENTOS

Ao Programa de Pós-Graduação de Biologia Vegetal e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo aceite do Projeto de Mestrado (830513/1999-0) e pela concessão de bolsa de estudos. À Universidade Estadual de Campinas e ao Departamento de Biologia Vegetal, principalmente, ao Laboratório de Anatomia Vegetal, que me ofereceram infraestrutura e conhecimentos científicos necessários para a realização deste trabalho. À minha orientadora, Profa. Dra. Sandra Maria Carmello-Guerreiro, pelos ensinamentos, conselhos, paciência, confiança e carinho. Ao meu coorientador Prof. Dr. André Olmos Simões, pela sua importante colaboração para o meu crescimento científico. Aos professores, Profa. Dra. Denise Maria Trombert de Oliveira, Prof. Dr. Diego Demarco, Profa. Dra. Luiza Sumiko Kinoshita e Profa. Dra. Ingrid Koch, que aceitaram serem membros da banca examinadora desta dissertação. Aos membros da banca de qualificação e da pré-banca, Profa. Dra. Denise Maria Trombert de Oliveira, Prof. Dr. Diego Demarco e Profa. Dra. Luiza Sumiko Kinoshita, pelas excelentes sugestões, que foram fundamentais para a evolução desta dissertação. Aos funcionários do Departamento de Biologia Vegetal e da Coordenadoria da Pós-Graduação, pela prestatividade e ajuda durante anos de execução deste trabalho. Aos colegas do Departamento de Botânica, especialmente, aos do Laboratório de Anatomia Vegetal, pela colaboração científica, companhia e amizade. À minha família, ao meu marido e aos meus amigos, pelo constante incentivo e pela admiração. E a Deus, pela proteção, saúde e coragem. A conclusão deste trabalho foi possível graças a fundamental colaboração de todas essas pessoas e dos conhecimentos e da infraestrutura que a Unicamp nos oferece. Muito obrigada!

RESUMO

Apocynaceae é uma das maiores famílias dentre as angiospermas e apresenta notável variedade morfológica de caracteres reprodutivos. A classificação tribal de Rauvolfioideae tem sido tradicionalmente baseada em caracteres de frutos e sementes. Tabernaemontaneae é a maior tribo de Rauvolfioideae e foi recentemente dividida em duas subtribos, Ambelaniinae e Tabernaemontaninae. Trabalhos de caracterização de frutos e sementes, em conjunto com estudos florais, são fundamentais para auxiliar na compreensão da evolução de caracteres em Apocynaceae. O estudo objetivou caracterizar as sementes de onze espécies de Tabernaemontaneae, quatro de Ambelaniinae e sete de Tabernaemontaninae, visando a identificar caracteres estruturais taxonomicamente úteis, em sementes maduras, e a origem da excrescência carnosa, das dobras do tegumento e da ruminação do endosperma, em sementes jovens. As sementes foram coletadas e processadas conforme técnicas usuais de microscopia de luz e eletrônica de varredura. Os caracteres estruturais diagnósticos de Ambelaniinae são sementes nuas com exotesta formada por células em paliçada, mesotesta parcialmente comprimida, hilo elíptico/circular subterminal ventral, endosperma não ruminado e embrião linear. As espécies de Tabernaemontaninae possuem sementes recobertas por excrescência carnosa, tegumento reduzido à exotesta sinuosa e homogênea, com células que variam na dimensão radial, hilo alongado e localizado em um sulco longitudinal na face rafeal, endosperma ruminado e embrião espatulado. A testa sinuosa está presente em sementes de Ambelaniinae e de Tabernaemontaninae e se origina de forma semelhante, respectivamente, nas sementes dos gêneros Tabernaemontana e Spongiosperma. O desenvolvimento do endosperma é tardio em ambos os gêneros e torna-se ruminado apenas em Tabernaemontana. A excrescência carnosa que envolve as sementes de Tabernaemontana tem origem placentária e não funicular, como registrado na literatura. O estrato gelatinoso e translúcido que recobre a semente de Macoubea guianensis é uma parede celular com mucilagem e não um arilo. Essa evidência auxilia no entendimento da evolução dos caracteres em Tabernaemontaneae, pois sugere o aparecimento do arilo apenas no ancestral comum mais recente (ACMR) de Tabernaemontaninae. Nossos dados também sugerem que sementes com mucilagem podem ter dado origem a sementes nuas e estas, por sua vez, terem originado sementes com excrescência carnosa de origem placentária no ACMR do clado Tabernaemontaneae s. str. (clado Tabernaemontaninae). ABSTRACT

Apocynaceae is one of the largest families of angiosperms, with a remarkable variation in morphological traits. The tribal classification of one of its subfamilies, Rauvolfioideae, has been traditionally based on fruit and seed characters. Tabernaemontaneae is the largest tribe of Rauvolfioideae and is currently divided in two subtribes, Ambelaniinae and Tabernaemontaninae. Studies focused on the characterization of fruits and seeds, together with floral studies, are critical to help in understanding the evolution of characters in Apocynaceae. This study aims to characterize the seed morphology and anatomy of eleven species of Tabernaemontaneae, four from subtribe Ambelaniinae and seven from subtribe Tabernaemontaninae, in order to detect characters with taxonomic significance in mature seeds and to study the origin of fleshy excrescence, the folds of the seed coat, and endosperm rumination in young seeds. Seeds were collected, prepared and analyzed with usual techniques in light microscopy and SEM. All species of Ambelaniinae have naked seeds with a circular or elliptic hilum, exotesta formed by the palisade cells, mesotesta partially crushed, non-ruminate endosperm, and linear embryo. In species of Tabernaemontaninae, seeds are covered by placental outgrowths, with seed coat reduced to the tortuous and homogeneous exotesta having cells ranging in radial length, an elongated hilum in a longitudinal groove in the raphe side, ruminate endosperm and spatulate embryo. The infoldings and furrows of the seed surface develop in the same way in Spongiosperma spp. (Ambelaniinae) and Tabernaemontana spp. (Tabernaemontaninae). The endosperm develops late in both, but does not acquire a ruminate configuration in Tabernaemontana. In Tabernaemontana, the pulpy structure has placental origin, not funicular, as registered in the literature. Our results show that the viscous, translucent stratum covering the seeds of Macoubea guianensis is not an aril, but a cell wall with mucilage. This interpretation helps understanding the character evolution in the tribe by the suggestion that the aril arose only once in the most recent common ancestor (MRCA) of the Tabernaemontaninae. Our data also suggest that mucilaginous seed may give raise to naked seeds and these ones to the fleshy placental outgrowth in the MRCA Tabernaemontaneae s. str. clade (Tabernaemontaninae clade).

SUMÁRIO

INTRODUÇÃO ...... 9

BREVE HISTÓRICO TAXONÔMICO DA FAMÍLIA ...... 9 RAUVOLFIOIDEAE E TABERNAEMONTANEAE ...... 10 OBJETIVOS GERAIS ...... 12

OBJETIVOS ESPECÍFICOS...... 13 MATERIAIS E MÉTODOS ...... 13 RESULTADOS ...... 16

CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DAS SEMENTES MADURAS ...... 16 Caracteres comuns às espécies ...... 16 Caracteres úteis à distinção das espécies ...... 17 ORIGEM DAS DOBRAS DO TEGUMENTO, RUMINAÇÃO DO ENDOSPERMA E DA EXCRÊSCENCIA CARNOSA NOS GÊNEROS SPONGIOSPERMA E TABERNAEMONTANA ...... 20 Dobras do Tegumento ...... 20 Ruminação do Endosperma ...... 21 Excrescência Carnosa ...... 21 DISCUSSÃO ...... 22 CONCLUSÕES ...... 32 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 33 APÊNDICE ...... 38

QUADROS 1 E 2 ...... 38 FIGURAS DE 1 A 19...... 39 ANEXOS ...... 54

INTRODUÇÃO

BREVE HISTÓRICO TAXONÔMICO DA FAMÍLIA Adanson, em 1768, agrupou os táxons, tradicionalmente, pertencentes a Apocynaceae e à Asclepiadaceae em uma única família, sob o nome de Apocyna. A partir disso, o estudo da evolução floral foi ponto de partida para muitos taxonomistas do grupo no estabelecimento de novas classificações, alterando muitas vezes suas circunscrições, especialmente, em relação à Asclepiadaceae e Periplocaceae. Brown (1810) propôs a separação do grupo em duas ordens distintas, Asclepiadeae (Asclepiadaceae) e Apocineae (Apocynaceae), principalmente, pela presença ou ausência, respectivamente, de grãos de pólen formando massas ligadas a um translador. No entanto, informações moleculares asseguram que a tradicional Asclepiadaceae (atual Asclepiadoideae) é um subclado de Apocynaceae (Endress et al., 1996; Sennblad & Bremer, 1996; Potgieter & Albert, 2001; Livshultz et al., 2007; Livshultz, 2010). Endress & Bruyns (2000) combinaram, pela primeira vez, grande conjunto de caracteres morfológicos a evidências moleculares e propuseram a reunificação das tradicionais Apocynaceae s. str., Asclepiadaceae e Periplocaceae numa ampla circunscrição, sendo dividida em cinco subfamílias: Rauvolfioideae, Apocynoideae, Periplocoideae, Secamonoideae e Asclepiadoideae. As subfamílias Rauvolfioideae e Apocynoideae correspondem à tradicional Apocynaceae s. str. e as subfamílias Secamonoideae e Asclepiadoideae, à tradicional Asclepiadaceae. Essa delimitação de Apocynaceae s.l. enquadrou a família num clado claramente monofilético e foi aprimorada por Endress et al. (2007) e, recentemente, por Endress et al. (2014) por incluírem novas tribos e subtribos. No entanto, a divisão em subfamílias ainda é imperfeita devido aos parafiletismos de Rauvolfioideae e Apocynoideae e do posicionamento fracamente sustentado de Periplocoideae (Potgieter & Albert, 2001; Sennblad & Bremer, 2002; Livshultz et al., 2007; Ionta & Judd, 2007; Simões et al., 2007; Livshultz, 2010) necessitando, portanto, de mais estudos morfológicos e moleculares para aprimorar a circunscrição de níveis infrafamiliares.

Atualmente, Apocynaceae é uma das maiores famílias das angiospermas e a segunda mais representativa da ordem Gentianales com 375 gêneros e mais de 5000 espécies encontradas, principalmente, em regiões tropicais e subtropicais (Endress et al., 2007). Alguns membros possuem uma das mais complexas flores dentre as angiospermas devido a suas elaboradas estruturas, como a corona (auxilia na polinização), ginostégio (formado pela fusionamento dos estames ao gineceu) e polínias (massas rígidas de grãos de pólen coesos) providas de transladores (conecta polínias de anteras adjacentes e funciona como um dispositivo de transporte) (Endress & Bruyns, 2000; Judd et al., 2009).

RAUVOLFIOIDEAE E TABERNAEMONTANEAE

Rauvolfioideae forma um grado basal com o restante da família e possui 11 tribos, com Amsonieae recentemente descrita, e 79 gêneros (Endress et al., 2014). Essa subfamília apresenta flores morfologicamente mais simples do que as encontradas nas demais subfamílias e, dessa forma, as flores apresentam menos caracteres taxonomicamente úteis para a diferenciação de suas tribos, quando comparada com as outras quatro subfamílias de Apocynaceae. Por outro lado, Rauvolfioideae é considerada um grupo heterogêneo devido aos frutos que variam de apocárpicos a sincárpicos, deiscentes ou indeiscentes, do tipo baga, drupa, folículo, cápsula ou, raramente sâmara, com pericarpo carnoso ou seco e com sementes nuas, aladas, ariladas ou, raramente, comosas (Endress & Bruyns, 2000). Nas demais subfamílias, os frutos são, comumente, folículos secos portando sementes comosas. Sendo assim, a construção das classificações tribais tradicionais de Rauvolfioideae foi baseada, principalmente, nos caracteres de frutos e sementes (Pichon, 1948; Boiteau & Sastre, 1975; Boiteau et al., 1978; Leeuwenberg, 1994). Dentre as tribos de Rauvolfioideae, Tabernaemontaneae é a maior com 16 gêneros e 170 espécies (Simões et al., 2010) com frutos apocárpicos ou sincárpicos, deiscentes ou indeiscentes, do tipo baga ou folicular carnoso com sementes ariladas, recobertas por polpa ou nuas, podendo apresentar um sulco hilar profundo (Corner, 1976; Endress & Bruyns, 2000). Apesar desse conjunto

11 distintivo de caracteres de frutos e de sementes em Tabernaemontaneae, há controvérsias quanto a sua evolução, principalmente, em relação às tribos irmãs Willughbeieae e Vinceae (Simões et al., 2007; 2010). Uma das mais abrangentes classificações tradicionais de Rauvolfioideae foi a de Pichon (1948a; b) que baseou a classificação supragenérica na morfologia do fruto e da semente. Pichon (1948b) dividiu os gêneros em duas tribos, Tabernaemontaneae composta por frutos apocárpicos e deiscentes com sementes ariladas e Ambelanieae com gêneros neotropicais com frutos sincárpicos, indeiscentes e com sementes não ariladas. O autor dividiu ainda Ambelanieae em duas subtribos, Ambelaniinae com os gêneros Ambelania, Mologum, Neocouma e Rhigospira, e Macoubeinae, somente com Macoubea. Com o advento da cladística e do uso de dados moleculares para reconstrução de filogenias, diversos caracteres de frutos e sementes mostraram-se convergentes, provavelmente, em resposta a pressões seletivas exercidas por fatores ecológicos e por diferentes agentes dispersores (Potgieter & Albert, 2001; Simões et al., 2007; 2010). Frutos bacoides indeiscentes estão presentes em Vinceae, Tabernaemontaneae, Willughbeieae e em Hunteriaeae, assim como sementes aladas, em Aspidospermeae, Vinceae, Hunteriaeae, Melodineae e em Plumerieae (Simões et al., 2010). Essas evidências de paralelismo invalidaram, portanto, muitos dos agrupamentos propostos por Pichon (1948a; b). Posteriormente, Endress & Bruyns (2000) circunscreveram Tabernaemontaneae incluindo todos os gêneros de Rauvolfioideae que possuem anteras lignificadas dorsalmente, formando a fenda estaminal que guia a probóscide de insetos durante a polinização (Fallen, 1986). Nesta delimitação, Tabernaemontaneae engloba todos os táxons das tribos Ambelanieae e Tabernaemontaneae sensu Pichon (1948b). Simões et al. (2010) manteve essa circunscrição e propôs a divisão da tribo em duas subtribos, Ambelaniinae com espécies restritas, principalmente, à planície da Floresta Tropical Amazônica, com frutos sincárpicos indeiscentes e sementes sem arilo, incluindo o gênero Macoubea, e Tabernaemontaninae com espécies pantropicais com frutos apocárpicos, geralmente, deiscentes e sementes ariladas.

De fato, os estudos filogenéticos de Potgieter et al. (2001), Simões et al. (2007) e de Simões et al. (2010) contribuíram para avaliar a utilidade de caracteres morfológicos nas classificações de Rauvolfioideae, inclusive para identificar evidências de repetida evolução de alguns caracteres de frutos e sementes. No entanto, em categorias infrafamiliares, as sementes podem fornecer conjuntos de caracteres relativamente estáveis que atuam como diagnósticos para Tabernaemontaneae e, especialmente, para suas subtribos que podem indicar tendências evolutivas na tribo. Embora a diversidade de caracteres das sementes de Tabernaemontaneae esteja morfologicamente bem documentada em trabalhos taxonômicos, ainda há controvérsias quanto ao formato, sulco longitudinal na face rafeal, endosperma, dobras no tegumento, arilo e a natureza da cobertura da semente de Macoubea, especialmente, porque os dados anatômicos são escassos. Para investigar a utilidade taxonômica de caracteres das sementes de Tabernaemontaneae, conforme as classificações propostas por Pichon (1948a; b) e por Simões et al. (2010), há três grupos morfológicos importantes: Ambelaniinae (Ambelaninae sensu Pichon (1948b)) com sementes nuas e sem arilo; Tabernaemontaninae, com sementes ariladas e sulco hilar profundo, e Macoubea (Macoubeinae sensu Pichon (1948b)), com sementes envoltas por uma cobertura gelatinosa de natureza desconhecida. A morfoanatomia detalhada e comparada desses grupos pode fornecer caracteres com valor taxonômico diagnóstico para atuarem como ferramenta de identificação, para auxiliarem no entendimento da evolução de caracteres na tribo e até mesmo para reforçarem o posicionamento de Tabernaemontaneae em relação a tribos irmãs, Willughbeieae e Vinceae.

OBJETIVOS GERAIS

Caracterizar as sementes de onze espécies de Tabernaemontaneae, quatro de Ambelaniinae e sete de Tabernaemontaninae, visando a identificar caracteres estruturais diagnósticos e tendências evolutivas.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Identificar caracteres estruturais diagnósticos para Tabernaemontaneae e para cada subtribo, nas sementes maduras de Ambelaniinae (Ambelania acida, Macoubea guianensis, Rhigospira quadrangularis, Spongiosperma grandiflorum) e de Tabernaemontaninae (Tabernaemontana alba, T. crassa, T. elegans, T. laeta, T. sananho e Stemmadenia donnell-smithii (sinonimizada a Tabernaemontana donnell-smithii por Simões et al., 2010));  Revelar a origem da excrescência carnosa, quando presente, das dobras do tegumento e da ruminação do endosperma, nas sementes jovens de Spongiosperma grandiflorum (subtribo Ambelaniinae) e de Tabernaemontana alba, T. catharinensis e T. sananho (subtribo Tabernaemontaninae);  Identificar os principais compostos de reserva presentes no endosperma das sementes maduras;  Caracterizar a natureza da cobertura viscosa da semente madura de Macoubea guianensis;  Indicar possível série evolutiva dos caracteres das sementes na tribo de acordo com filogenia atualmente reconhecida (Figura 1).

MATERIAIS E MÉTODOS

Os materiais de estudo foram obtidos de uma coleção de amostras reprodutivas de Apocynaceae coletadas na Costa Rica e no Brasil, na Reserva Ducke (AM), Reserva Biológica de Uatumã (AM), Reserva de Utinga (PA), Rio de Janeiro (RJ), Ubatuba (SP) e Campinas (SP), e mantidas no Laboratório de Anatomia Vegetal do Departamento de Biologia Vegetal da Unicamp. Os materiais foram fixados em FAA - formaldeído, ácido acético e álcool etílico 50%, 1:1:18 (v/v) (Johansen, 1940) - armazenados em álcool etílico 70%. Os materiais testemunhas destes espécimes estão depositados em herbários (Tabela 1):

Tabela 1: Espécies estudadas de cada subtribo, números de coletor e herbários onde foram depositados os materiais testemunhas. Espécies Coletor (Herbário) Ambelania acida Aubl. S.S. Viana 87 (MG) Macoubea guianensis (Müll.Arg.) Markgr. S.S. Viana 53 (MG) Rhigospira quadrangularis (Müll.Arg.) Miers A.O. Simões et al. 03/2008 (INPA, UEC)

Ambelaniinae Spongiosperma grandiflorum (Huber) S.S. Viana 17 (MG) Tabernaemontana alba Mill. A.O. Simões 1039 (UEC) Tabernaemontana catharinensis A. DC. A.O. Simões 1039 (UEC) Tabernaemontana crassa Benth. R. Morokawa s.n. (RB) Tabernaemontana elegans Stapf. A.O. Simões 1039 (UEC) Tabernaemontana laeta Mart. I. Koch 890 (UEC) Tabernaemontana sananho Ruiz & Pav. A.O. Simões et al. s.n. (INPA, UEC)

Tabernaemontaninae Stemmadenia donnell-smithii (Rose) Woodson J.F. Morales s.n. (INB, UEC)

1. Microscopia de luz: i. Inclusão em resina plástica (Historesin Leica) conforme o terceiro tratamento proposto por Paiva et al. (2011), que foi otimizado aumentando o tempo nos passos de pré-infiltração e infiltração, movimentando as soluções em agitador de tubos para potencializar a penetração da resina no material e mantendo em vácuo por 24h. Aumentou-se 50% do volume do endurecedor, como sugerido por Paiva et al. (2011). Foram realizadas secções transversais e longitudinais de 4-8 µm de espessura em micrótomo rotativo manual com navalha de aço, coloração com Azul de Toluidina a 0,05% em tampão acetato 0,1M (pH 4,7) (O’Brien et al., 1964 modificado) por 5 min e montagem das lâminas em água para observação e documentação em fotomicroscópio Olympus BX51 com câmera digital (modelo DP71) no Laboratório de Anatomia Vegetal do Departamento de Biologia Vegetal (UNICAMP); ii. Macerado do tegumento das sementes maduras conforme o método de Franklin modificado (Franklin, 1945), para a construção de ilustrações dos espessamentos secundários das células da testa. Fragmentos do tegumento permaneceram de 24h a 72h, a 60ºC, de acordo com a rigidez espécie-específica, em tubo de ensaio contendo água oxigenada 30

volumes e ácido acético (1:1), tampado com rolha e vedado com esparadrapo. Após o tempo adequado, o material foi agitado para dissociação das células, lavado com água destilada (5 vezes), retirando o líquido sobrenadante após aguardar decantação, lavado com etanol 50% e corado com Safranina 1% (em etanol 50%) por 24h. Após a coloração, foram realizadas lavagens em etanol 30% (3 vezes) e uma pequena quantidade do macerado foi espalhado sobre algumas gotas de gelatina glicerinada em lâmina, posteriormente, montada com lamínula, para observação e documentação em fotomicroscópio Olympus BX51 com câmera digital (modelo DP71) no Laboratório de Anatomia Vegetal do Departamento de Biologia Vegetal (UNICAMP); 2. Microscopia eletrônica de varredura (MEV): desidratação das amostras, em série, até acetona pura, secagem em ponto crítico no aparelho Bal Tec CPD 030, fixação em suportes metálicos com fita de carbono, cobertura condutora com ouro em aparelho Bal Tec SCD 050, análise em microscópio JEOL JSM 5200 e documentação fotográfica em câmera JEOL MP no Laboratório de Microscopia Eletrônica do Instituto de Biologia (UNICAMP). 3. Histoquímica: os testes histoquímicos foram escolhidos para detectar os principais compostos orgânicos de reserva do endosperma (carboidratos, lipídeos e proteínas) e confirmar a natureza de compostos já evidenciados nas células da exotesta (mucilagem, pectina e compostos fenólicos) pela coloração de Azul de Toluidina (Ramalingam & Ravindranath, 1970; Briggs et al., 2005; Sridharan & Shankar, 2012). Testes com Lugol para amido (Johansen, 1940), Xylidine Ponceau para proteínas (Mello & Vidal, 1980), Sudan IV glicerinado e Sudan Black B (Pearse, 1972 modificado) para lipídeos totais, Ácido tânico/ Cloreto férrico para mucilagem (Pizzolato & Lillie, 1973), Cloreto Férrico para compostos fenólicos (Johansen, 1940), Vermelho de Rutênio para pectinas (Johansen, 1940), Floroglucina ácida para lignina (Johansen, 1940) e Calcofluor White para celulose (Hughes & McCully, 1975). Estes testes foram realizados no Laboratório de Anatomia Vegetal do Departamento de Biologia Vegetal (UNICAMP).

4. Análise dos dados morfológicos e anatômicos: construção de uma matriz utilizando 17 caracteres e seus estados de caráter que receberam (0) quando ausente e de (1) a (6) para os diferentes tipos. Esses números foram organizados numa tabela comparativa, relacionando-os com as espécies e às subtribos as quais pertencem, a fim de destacar aqueles que se repetem, exclusivamente, em cada subtribo. As terminologias adotadas foram a de Martin (1946) para a morfologia do embrião, de Radford et al. (1974) para a classificação de figuras planas e sólidas simétricas, de Bayer & Appel (1996) para endosperma ruminado e a de Corner (1976) para arilo, sarcotesta e classificação da semente.

RESULTADOS

CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DAS SEMENTES MADURAS

Caracteres comuns às espécies

As sementes maduras estudadas (Figura 2A-I) são hemianátropas e unitegumentadas formadas apenas pela testa, diferenciada em exotesta, mesotesta e endotesta indistinta, devido a sua compressão em conjunto com camadas da mesotesta (Figura 3A-H). A rafe é curta e os embriões exibem um eixo reto, espesso e posicionado no centro do amplo endosperma (Figuras 3A, C, E e G). Todas as espécies de Tabernaemontana possuem excrescência carnosa formada sobre o hilo (Figuras 3G e H). A exotesta constitui a camada mecânica do tegumento (sementes exotestais) (Figuras 4A-D e 5A-F), sendo formada por uma única camada de células alongadas radialmente e com paredes irregularmente espessadas e lignificadas (Figuras 6A-D e 7A-G). A mesotesta é multiestratificada, parenquimática e com camadas celulares comprimidas (Figuras 6A-D e 7A-G), restando maior número de camadas intactas nas sementes de Macoubea guianensis (Figura 6A) e Spongiosperma grandiflorum (Figura 6B). A excrescência carnosa presente nas sementes das seis espécies de Tabernaemontana é vascularizada (Figuras 5A-C e 7B e G).

Caracteres úteis à distinção das espécies As sementes das espécies estudadas apresentaram diferenças histoquímicas (Quadro 1), morfológicas e anatômicas, possibilitando a descrição de 17 caracteres e seus estados (Quadro 2):

1. Tamanho (comprimento x largura x espessura) – (1) Pequena (7-8,0 x 3,5-5,0 x 2,5- 3,5 mm, Figura 8A) - Ambelania acida e Tabernaemontana alba; (2) Média (9,0-13,0 x 3,5- 8,0 x 3-6,0 mm, Figuras 8B e C) - Rhigospira quadrangularis, Spongiosperma grandiflorum, Tabernaemontana crassa, T. donnell-smithii, T. elegans, T. laeta e T. sananho; (3) Grande (16,0-18,5 x 6-7,0 x 5,0 mm, Figura 8D) - Macoubea guianensis;

2. Formato - (1) Obovoide (Figuras 8A e B) – Ambelania acida, Rhigospira quadrangularis e Spongiosperma grandiflorum; (2) Obpiramidal (Figura 8C) – Tabernaemontana alba, T. crassa, T. donnell-smithii, T. elegans, T. laeta e T. sananho (3) Elipsoide/ Obovoide (Figura 8D) – Macoubea guianensis;

3. Contorno da secção transversal - (1) Triangular (Figura 3B) - Ambelania acida; (2) Ovado-achatado (Figura 3D) – Macoubea guianensis e Rhigospira quadrangularis; (3) Losangular (Figura 3F) - Spongiosperma grandiflorum; (4) Reniforme (Figura 3H) - Tabernaemontana alba, T. crassa, T. donnell-smithii, T. elegans, T. laeta e T. sananho;

4. Topografia da superfície antirrafeal - (1) Lisa (Figura 9A) – Ambelania acida e Rhigospira quadrangularis; (2) Foveolada e com dobras (Figuras 9B e C) – Macoubea guianensis; (3) Com dobramentos paralelamente orientados com/sem ramificações formando sulcos longitudinais (Figuras 9D e E) – Tabernaemontana alba, T. crassa, T. donnell-smitii, T. laeta, e T. sananho; (4) Com dobramentos sem orientação definida e ramificados (Figura 9F) – Spongiosperma grandiflorum e Tabernaemontana elegans;

5. Hilo - (1) Contorno elíptico/circular e localizado na região subterminal da face rafeal (Figuras 10A e C) - Ambelania acida, Macoubea guianensis, Rhigospira quadrangularis e Spongiosperma grandiflorum; (2) Alongado, em relação ao maior eixo de comprimento da semente, e localizado em um sulco longitudinal formado na face rafeal (Figuras 3G e 10B) - Tabernaemontana alba, T. crassa, T. donnell-smithii, T. elegans, T. laeta e T. sananho;

6. Micrópila - (0) Não observada devido à impossibilidade de remoção da excrescência carnosa/ camada mucilaginosa ou pela dificuldade de sua distinção em relação aos sulcos

18 formados pela exotesta – Macoubea guianensis, Tabernaemontana crassa, T. donnell- smithii, T. elegans, T. laeta e T. sananho; (1) Visível, terminal e em fenda (Figuras 10D e E) – Ambelania acida, Rhigospira quadrangularis, Spongiosperma grandiflorum e Tabernaemontana alba;

7. Embrião - (1) Linear, cotilédones pequenos e com a mesma largura do eixo hipocótilo- radícula (Figura 11A) – Ambelania acida, Macoubea guianensis, Rhigospira quadrangularis e Spongiosperma grandiflorum; (2) Espatulado, cotilédones expandidos e mais largos que o eixo hipocótilo-radícula, sem que o envolvam (Figura 11B) – Tabernaemontana alba, T. crassa, T. donnell-smithii, T. elegans, T. laeta e T. sananho;

8. Padrão da exotesta em secção transversal – (0) Exotesta não sinuosa (Figuras 3A e B, 4C e D) - Ambelania acida e Rhigospira quadrangularis; (1) Exotesta sinuosa heterogênea, com cristas de diferentes larguras e reentrâncias de diferentes profundidades (Figuras 3C-F e 4A e B) - Macoubea guianensis, Spongiosperma grandiflorum; (2) Exotesta sinuosa homogênea, cristas semelhantes em largura e reentrâncias semelhantes em profundidade, principalmente, na face antirrafeal (Figuras 3H e 5A-F) - Tabernaemontana alba, T. crassa, T. donnell-smithii, T. elegans, T. laeta e T. sananho;

9. Alongamento radial das células da exotesta - (1) Uniforme, células em paliçada (Figura 6A-D) – Ambelania acida, Macoubea guianensis, Rhigospira quadrangularis e Spongiosperma grandiflorum; (2) Células com alongamento radial variado e gradual, as mais alongadas na região das cristas e as menos alongadas nas reentrâncias (Figuras 7A e B) – Tabernaemontana alba, T. crassa, T. donnell-smithii, T. elegans, T. laeta e T. sananho;

10. Mesotesta – (0) Mesotesta comprimida reduzindo o tegumento à exotesta (Figuras 5A- F e 7B, F e G), eventualmente, com algumas camadas celulares remanescentes no interior das cristas (Figuras 7A e C) - Tabernaemontana alba, T. crassa, T. donnell-smithii, T. elegans, T. laeta e T. sananho; (1) Mesotesta parcialmente comprimida, restando de 1-12 camadas celulares (Figuras 6A-D) - Ambelania acida, Macoubea guianensis, Rhigospira quadrangularis e Spongiosperma grandiflorum;

11. Endosperma - (0) Não ruminado (Figuras 3B, D e F e Figuras 4A-D) - Ambelania acida, Macoubea guianensis, Rhigospira quadrangularis e Spongiosperma grandiflorum; (1) Ruminado (Figuras 3H e 5A-F) – Tabernaemontana alba, T. crassa, T. donnell-smithii, T. elegans, T. laeta e T. sananho;

12. Excrescência carnosa - (0) Ausente (Figuras 4A-D) – Ambelania acida, Macoubea guianensis, Rhigospira quadrangularis e Spongiosperma grandiflorum; (1) Presente e vascularizada (Figuras 7B e G) - Tabernaemontana alba, T. crassa, T. donnell-smithii, T. elegans, T. laeta e T. sananho;

13. Espessamento secundário das células da exotesta - A parede secundária lignificada é depositada, preferencialmente, nas faces periclinal interna e anticlinais. Nas faces anticlinais, esse espessamento é heterogêneo, sendo didaticamente dividido em porções externa, mediana e interna. Em corte longitudinal da célula, nas faces anticlinais das células da exotesta de todas as espécies estudadas, é possível observar uma maior deposição em direção ao lúmen, apresentando um aspecto abaulado (Figuras 12A-F): (1) Porção externa com espessamento espiralado, porção mediana com variação de reticulado a pontoado e porção interna com espessamento total. Face periclinal interna com espessamento pontoado (Figura 12A) – Ambelania acida; (2) Espessamento espiralado na porção externa, reticulado na mediana e pontuado na interna. Face periclinal interna com espessamento pontuado (Figura 12B) – Spongiosperma grandiflorum; (3) Porção externa com espessamento espiralado/reticulado, porção mediana com longas projeções, porção interna com espessamento pontoado. Face periclinal interna com espessamento pontoado (Figura 12C) – Rhigospira quadrangularis; (4) Porção externa com espessamento total, assemelhando-se a um capuz, mediana pontoada e interna total, com faces anticlinais tortuosas. Espessamento ausente na face periclinal interna (Figura 12D) – Tabernaemontana elegans; (5) Porção externa reticulada, porção mediana com espessamento pontoado e porção interna com espessamento total. Face periclinal interna com espessamento pontoado (Figura 12E) – Macoubea guianensis, Tabernaemontana alba, T. donnell-smithii, T. sananho – ou ausente – T. crassa; (6) Porção externa com longas projeções, porção mediana pontoada e porção interna com espessamento total. Espessamento ausente na face periclinal interna (Figura 12F) – Tabernaemontana laeta;

14. Exotesta com mucilagem - as faces periclinais externas e anticlinais da porção externa da parede celular das células da exotesta são ricas em pectina e contínuas a uma porção gelatinosa também rica em pectina, de aspecto lamelar (Figuras 13A e B) e com filamentos de celulose (Figura 13E): (0) Ausente (Figura 13F) – Rhigospira quadrangularis, Spongiosperma grandiflorum, Tabernaemontana alba, T. crassa, T. donnell-smithii, T. elegans, T. laeta e T. sananho; (1) Espessa, de 0,5 a 1,0 mm de espessura (Figuras 13A, C

20 e E) – Macoubea guianensis; (2) Delgada, de 10 a 70 µm de espessura (Figura 13B) – Ambelania acida;

15. Face periclinal externa das células da exotesta - (1) Frouxa (Figuras 13A-D e 13F) – Ambelania acida, Macoubea guianensis, Rhigospira quadrangularis; (2) Não frouxa (Figuras 6B e 7A-G) - Spongiosperma grandiflorum, Tabernaemontana alba, T. crassa, T. donnell- smithii, T. elegans, T. laeta, e T. sananho;

16. Conteúdo da célula da exotesta: (1) Lúmen da célula preenchido por compostos fenólicos (Figura 14A) – Ambelania acida, Macoubea guianensis, Rhigospira quadrangularis, Spongiosperma grandiflorum, Tabernaemontana crassa, T. elegans e T. laeta; (1) Lúmen da célula com distribuição esparsa de traços de compostos fenólicos (Figura 14B) - Tabernaemontana alba, T. donnell-smithii e T. sananho;

17. Compostos de reserva do endosperma – (1) Proteínas e lipídeos totais (Figuras 15A e B) – Rhigospira quadrangularis, Tabernaemontana crassa e T. laeta; (2) Somente proteínas (Figuras 15C e D) – Ambelania acida, Spongiosperma grandiflorum, Macoubea guianensis, Tabernaemontana alba, T. donnell-smithii, T. sananho. Somente em Macoubea guianensis as proteínas tem aspecto poliédrico (Figura 15D).

ORIGEM DAS DOBRAS DO TEGUMENTO, RUMINAÇÃO DO ENDOSPERMA E DA EXCRÊSCENCIA CARNOSA NOS GÊNEROS SPONGIOSPERMA E TABERNAEMONTANA

Dobras do Tegumento

Nas sementes dos gêneros Spongiosperma (Figuras 16A e B) e Tabernaemontana (Figuras 16C e D), em regiões específicas da mesotesta adjacente à exotesta, cerca de 3 a 4 camadas internas, alguns grupos de células apresentam intensa atividade de divisão celular em vários planos (Figuras 16B e D). Especialmente em Tabernemontana, foi possível observar divisões oblíquas que originam células de contorno triangular, em corte transversal da semente jovem, no ápice da formação da crista (Figura 16A). O resultado, em ambos os gêneros, é a formação de saliências que promovem a sinuosidade da exotesta, formando sulcos e cristas, com divisões, exclusivamente, anticlinais de suas

21 células (Figuras 16B e D). Nas regiões mais internas da mesotesta prevalecem divisões periclinais (Figura 16B).

Ruminação do Endosperma

O desenvolvimento do endosperma se inicia após a exotesta já ter adquirido sua configuração sinuosa. O endosperma cresce de forma centrífuga, comprimindo, primeiramente, a endotesta e as camadas mais internas da mesotesta (Figura 17A) até atingir a base dos sulcos da exotesta (Figura 17B). Posteriormente, o endosperma em Tabernaemontana continua a crescer comprimindo o restante da mesotesta, projetando-se para o interior das cristas. (Figura 17C). Consequentemente, o endosperma adquire contorno irregular de acordo com a sinuosidade da exotesta e o tegumento torna-se restrito à exotesta, na maioria das sementes analisadas (Figura 17D). Em Spongiosperma grandiflorum, o endosperma cresce até a base dos sulcos formados pelas células da exotesta ou cessa o seu desenvolvimento antes de atingi-la, mantendo-se com contorno regular (Figura 4B).

Excrescência Carnosa

A excrescência carnosa das sementes de Tabernaemontana origina-se do tecido placentário que se prolifera e torna-se bem desenvolvido e carnoso na maturidade. A formação dessa excrescência inicia-se com o desenvolvimento de projeções da placenta que já é expandida no óvulo (Figuras 18A e B). Após a fecundação, ela continua a crescer (Figuras 18C e 19A-B), durante o desenvolvimento da semente, de forma a envolvê-la e tornar-se carnosa na maturidade, inclusive, com a mudança de coloração esbranquiçada para alaranjada, especialmente, em Tabernaemontana catharinensis (Figura 19C). O funículo permanece curto e não se observa qualquer novo apêndice formando-se a partir dessa região (Figuras 18A e B).

DISCUSSÃO

Revelamos nove caracteres com valor taxonômico diagnóstico para diferenciação das sementes das subtribos Ambelaniinae e Tabernaemontaninae que são: formato, contorno da secção transversal, hilo, padrão da exotesta, alongamento radial das células da exotesta, mesotesta, endosperma, embrião e excrescência carnosa. Dessa forma, somente as espécies de Ambelaniinae apresentam hilo elíptico/circular subterminal ventral, exotesta composta por células em paliçada, mesotesta parcialmente comprimida, endosperma não ruminado e embrião linear. Por outro lado, as sementes de Tabernaemontaninae possuem, exclusivamente, formato obpiramidal, contorno da secção transversal reniforme, hilo alongado localizado num sulco longitudinal na face rafeal, exotesta sinuosa homogênea com variação no comprimento radial das suas células, mesotesta comprimida reduzindo, na maioria dos casos, o tegumento à exotesta, endosperma ruminado, embrião espatulado e presença de excrescência carnosa. O reconhecimento desses caracteres estruturais diagnósticos para cada subtribo, Ambelaniinae e Tabernaemontaninae, corrobora a divisão de Tabernaemontaneae em dois subclados proposta por Simões et al. (2010) utilizando, especialmente, de estudos moleculares. Pichon (1948b) foi a primeiro a sugerir a separação em dois grupos de acordo com dados morfológicos de fruto e semente, sendo, todavia, categorizados como duas tribos de Rauvolfioideae, Ambelanieae e Tabernaemontaneae, e não como duas subtribos de uma única tribo, a atual Tabernaemontaneae (Simões et al., 2010). Especialmente nas sementes de duas espécies de Ambelaniinae, Ambelania acida e Macoubea guianensis, identificamos um revestimento com mucilagem, mais espesso em Macoubea guianensis. E somente as sementes de Tabernaemontaninae possuem excrescência carnosa que recobre parcial ou completamente a semente. Nas sementes de Tabernaemontana, esta excrescência carnosa foi descrito por Corner (1976), como um arilo vermelho ou alaranjado, e por Leeuwenberg (1994), também como um arilo, podendo ser branco, alaranjado ou vermelho, envolvendo toda a semente, na maioria dos casos.

A interpretação de estruturas carnosas nas sementes das Angiospermas gera, muitas vezes, controvérsia entre os autores (Pijl, 1969; Endress, 1973; Corner, 1976; Kapil et al., 1980). Arilo, ariloide, arilódio, estrofíolo e carúncula foram utilizados para descrever excrescências carnosas que envolvem as sementes das angiospermas. Pijl (1969) denominou ariloides as excrescências que se formam sobre a rafe, próximas à micrópila e ao redor da exóstoma, ou como arilo verdadeiro, somente a partir do funículo. Endress (1973) descreveu arilo como um tecido que emerge da superfície das sementes sem definição do local de sua origem. Corner (1976) também recusou essas subdivisões e propôs o termo arilo de forma generalista para qualquer estrutura pulposa que se desenvolve de partes do óvulo ou do funículo, recobrindo parcial ou totalmente a semente. Kapil et al. (1980), por sua vez, também rejeitaram as antigas terminologias específicas, contudo mantiveram os termos carúncula (da exóstoma) e estrofíolo (da rafe) e propuseram a diferenciação de arilo funicular (do funículo) e arilos complexos (origens mistas). Nosso trabalho revela que a excrescência carnosa que envolve as sementes de Tabernaemontana tem origem placentária e não há formação de outra excrescência a partir do funículo, como indicaram estudos prévios de Endress & Bruyns (2000), Simões et al. (2007) e Simões et al. (2010). O funículo de Tabernaemontana é tão curto que Corner (1976) considerou os óvulos como sésseis, o que reforça o nosso argumento de não formação de excrescência a partir dessa região. Por outro lado, a sua descrição para as sementes de Tabernaemontana é ambígua, pois o autor se refere a um arilo chamado de “arilo placentário”, originado de uma “placenta lobulada”. Isso é contraditório com sua própria definição de arilo, já que o autor considerou, exclusivamente, porções do óvulo ou do funículo como regiões de origem. Já Periasamy (1963) sugeriu a formação de um arilo funicular para Ervatamia heyneana (atual Tabernaemontana heyneana) e uma massa carnosa proveniente do crescimento de carpelos para Voacanga grandifolia, ambas atualmente inseridas em Tabernaemonataninae. No entanto, para espécies de Tabernaemontana, não identificadas em seu trabalho, ele negou a existência de

24 alguma cobertura carnosa para as sementes. Pijl (1966) também não reconheceu a formação de arilo em Tabernaemontana sp. e descreveu uma polpa de origem placentária, mas que recobre o grupo de sementes como um todo, e não individualmente cada semente, como observado em nossos estudos. Diante dessas evidências, a excrescência carnosa das sementes de Tabernaemontana não se enquadra em nenhuma das terminologias referidas como estrofíolo, carúncula, arilódio ou ariloide, citadas por Kapil et al. (1980), pois esses conceitos foram baseados no local de origem a partir de regiões da semente, como rafe, micrópila, exóstoma e funículo, e não da placenta (ovário). Dessa forma, adotamos o termo genérico excrescência placentária para excrescências carnosas que se formam de regiões do endocarpo e/ou da placenta. Essa decisão também foi sustentada por evidências anatômicas de excrescências carnosas de origem placentária em sementes de outras famílias. Em Myrsinaceae, Källersjö et al. (2000) descreveram, para o gênero Ardisiandra, sementes envolvidas por um tecido esponjoso que cresce da placenta. Sementes de Rafflesiaceae também são recobertas por tecido placentário nos gêneros Pilostyles, Apodanthes e Cytinus (Bouman & Müjer, 1994). Excrescências placentárias formam câmaras no fruto de Solanum tuberosum que circundam as sementes próximas ao endocarpo (Dave et al., 1980). Rubiaceae apresenta exemplos bastante significativos e chama a atenção o fato de também pertencer à ordem Gentianales. Periasamy (1964) faz referência à “placenta expandida” que cresce de acordo com o desenvolvimento das sementes, envolvendo-as. Corner (1976) citou sementes com excrescências placentárias para os gêneros Gardenia e Tarenna. Sonké et al. (2012) descreveram sementes parcialmente recobertas por tecido placentário denominado para Sericanthe gabonenses. Alguns dos estados de caráter que identificamos como diagnósticos para Tabernaemontaninae, como sementes recobertas por excrescência carnosa, com sulco longitudinal na região do hilo e a presença de endosperma ruminado, foram testados filogenicamente por Simões et al. (2010). Este estudo demonstrou que as sementes do ancestral comum mais recente (ACMR) do clado Tabernaemontaneae

25 s. str. (Tabernaemontaniinae) possuem estas características. No entanto, a lacuna que impossibilitava o entendimento da evolução de caracteres em Tabernaemontaneae era, especialmente, a presença ou não de um arilo em Macoubea, o gênero que primeiramente divergiu no grupo (Simões et al., 2010). Os revestimentos das sementes de Macoubea guianensis e Ambelania acida foram identificados em nossos estudos como parede celular com mucilagem, ou seja, a mucilagem ocorre na face periclinal externa da parede celular das células da exotesta. O seu aspecto gelatinoso é decorrente da sua natureza rica em pectinas, pois as pectinas são polissacarídeos ácidos conhecidos por formarem gel ao sofrerem processos de metil esterificação (Western et al., 2000; Albersheim et al., 2011). Bredenkamp & Van Wyk (1999) propuseram semelhante origem para a mucilagem da epiderme da folha de Passerina (Thymelaeaceae), em que ocorre a transformação da parede celular em mucilagem, através de processos de distensão, aumento da hidratação e desorganização das microfibrilas de celulose, restando um estrato gelatinoso amorfo. No entanto, para Macoubea guianensis e Ambelania acida, a camada gelatinosa das suas sementes mantém sua característica estrutural com composição celulósica, permanecendo aderida à semente. Por outro lado, nas sementes de Macoubea guianensis, possivelmente, o líquido viscoso formado a partir da sua espessa cobertura gelatinosa, com o avanço da maturidade (Boiteau & Sastre,1975), é somente mucilagem. Envelopes gelatinosos com estrutura lamelar e composição semelhantes foram descritos para frutos e sementes de outras famílias. Mühlethaler (1949) relatou sementes recobertas com mucilagem celulósica em Cyndonia vulgaris Pers. (Rosaceae), devido à semelhança dos filamentos presentes na mucilagem com as microfibrilas de celulose. Tal processo é similar ao observado no tegumento das sementes de Carrichtera annua e Anastatica hierochuntica (Brassicaceae), que é composto por duas camadas celulares externas que, quando hidratadas, aumentam em comprimento desenvolvendo uma densa porção mucilaginosa contendo microfibrilas de parede celular (Gutterman & Shen-Tov, 1997). A partir da comparação dos conceitos de Boesewinkel & Bouman (1984) para sementes sarcotestais e para sementes mucilaginosas, descartamos a

26 possibilidade do revestimento viscoso de Macoubea guianensis ser uma sarcotesta, pois apresentam diferentes formações e constituições. O conceito de sarcotesta de Boesewinkel & Bouman (1984) é sustentado pelo de Corner (1976), aplicando o termo para a testa ou qualquer parte dela que seja pulposa, segundo Corner, “simulando um arilo”. Todavia, esta explicação é desprovida de detalhes anatômicos. Em Carica papaya (Caricaceae), a sarcotesta é formada por células epidérmicas e hipodérmicas, que aumentam consideravelmente seu tamanho e tornam-se transparentes e gelatinosas (Stephens, 1910; Foster, 1943). Corner (1948) descreveu a sarcotesta das sementes de Xylopia fusca, X. caudata e X. malayana (Annonaceae) como uma película externa de aspecto ceroso formada por uma camada paquenquimatosa espessa e carnosa. Xylopia aromatica possui sarcotesta formada por uma exotesta pulposa também composta por células de paredes celulares finas e preenchidas por grãos de amido (Svoma, 1998). Em Vitaceae, Chen & Manchester (2014) caracterizaram as sementes pela presença de exotesta com células parenquimatosas, podendo conter mucilagem e cristais. De fato, não há homologia entre a parede com mucilagem observada em Macoubea guianensis e em Ambelania acida com as excrescências carnosas de Tabernaemontana, como sugerido por Simões et al. (2010). Em Tabernaemontana spp., o apêndice carnoso é de origem placentária e envolve individualmente cada semente como um tecido não associado ao tegumento, e nas sementes de Macoubea guianensis, sua cobertura viscosa é uma porção da parede das células da exotesta. Sendo assim, podemos inferir que a excrescência carnosa surgiu apenas no ACMR de Tabernaemontaninae (Tabernaemontaneae s. str.). Esta interpretação está de acordo com a terceira das três hipóteses evolutivas propostas por Simões et al. (2010) para o surgimento de excrescência carnosa em Tabernaemontaneae: no ACMR do clado Tabernaemontaneae s.l. e perdido em Ambelaniinae, no ACMR de Tabernaemontaneae s. str. e paralelamente em Macoubea, ou apenas no ACMR do clado Tabernaemontaneae s. str. De forma inédita, nossos estudos sugerem uma categorização mais específica para o formato das sementes e novos termos para o contorno das sementes em secção transversal. Na literatura, encontram-se apenas termos como

27 sementes oblongas para Tabernaemontana (Corner, 1976) e outros, como elipsoides, ovoides ou oblongas, também para Tabernaemontana e para outros gêneros da tribo (Leeuwenberg, 1994). No entanto, acrescentamos os formatos obovoide e elipsoide com contorno em corte transversal triangular, losangular ou obovado-achatado, para as espécies de Ambelaniinae, e formato obpiramidal com contorno reniforme em corte transversal, para as sementes de Tabernaemontana. Além disso, o sulco ao longo do maior comprimento da semente na região da rafe foi denominado em nosso trabalho apenas como “sulco longitudinal” da semente e não como “sulco rafeal” (Corner, 1976) ou “sulco hilar” (Simões et al., 2010), pois o comprimento desse sulco, geralmente, ultrapassa o da rafe e/ou do hilo. As sementes de Spongiosperma e de Tabernaemontana possuem diferentes padrões de organização das dobras do tegumento da superfície antirrafeal que, no entanto, originam-se igualmente do crescimento de saliências em regiões específicas da mesotesta. Periasamy (1963; 1964) identificou semelhantes atividades de divisão celular em espécies de Rubiaceae (Periasamy, 1963) e de Apocynaceae (Periasamy, 1964), ressaltando, nos dois casos, que a exotesta, nomeada por ele de “epiderme”, divide-se apenas anticlinalmente. Em Apocynaceae (Periasamy, 1964), o autor descreveu, detalhadamente, essas dobras originando-se por divisões anticlinais e periclinais de “camadas hipodérmicas” em sementes de Voacanga grandifolia e de Ervatamia heyneana, enquanto que em Rubiaceae (Periasamy, 1963), ele apenas faz referência a uma atividade de divisão celular de “camadas mais internas”. A configuração da testa homogênea é peculiar das sementes de Tabernaemontana, o que corresponde à descrição de Ervatamia heyneana feita por Periasamy (1964). Já em Spongiosperma, a exotesta exibe sinuosidades irregulares, muito parecido com que Periasamy (1964) afirmou, contraditoriamente, para Tabernaemontana sp. Em Rubiaceae, semelhantes origens também podem determinar diferentes configurações dos tegumentos, formando sulcos conectados uns aos outros, compondo uma rede em Psychotria congesta, P. dalzellii e P. elongata, ou sulcos longitudinais em P. reevesi e P. serpens (Periasamy, 1963).

O desenvolvimento do endosperma é tardio nas sementes jovens estudadas de Tabernaemontana e Spongiosperma, mas se torna ruminado apenas em Tabernaemontana e não em Spongiosperma. A diferença ocorre porque o endosperma em Tabernaemontana continua crescendo para o interior das cristas da exotesta, comprimindo o restante da mesotesta. Portanto, a origem da ruminação é condição sinuosa pré-determinada pela exotesta, como afirmou Periasamy (1963) para Voacanga grandifolia e para Ervatamia heyneana, ambas atualmente inseridas em Tabernaemontaninae. Assim sendo, apesar da ruminação do endosperma ser determinada previamente pela exotesta sinuosa, ainda é necessário um evento de crescimento contínuo do endosperma, comprimindo as camadas celulares da mesotesta, projetando-se para o interior das cristas da exotesta. Esse evento ocorre, exclusivamente, em Tabernaemontana (nossos resultados) e Voacanga (Periasamy,1963). Por outro lado, sementes de Spongiosperma e Macoubea apresentam exotesta sinuosa, mas o endosperma mantém seu contorno regular. Estas observações validam o nosso argumento do endosperma ruminado ser um caráter diagnóstico para Tabernaemontaninae (Tabernaemontaneae s. str.). Essa relação entre tegumento com dobras e endosperma ruminado foi visualizada também em Rubiaceae (Periasamy, 1964) nas espécies Psychotria congesta, P. dalzellii, P. reevesii e P. serpens, já referidas anteriormente por possuírem sementes com dobras e sulcos. Por outro lado, em P. bisulcata, o tegumento não apresenta dobras e o endosperma apresenta contorno regular, o que é uma condição semelhante às sementes de Ambelania acida e Rhigospira quadrangularis aqui estudadas. No entanto, novamente, Periasamy (1963) relatou as sementes de Tabernaemontana sp. com características equivalentes às de Spongiosperma, ou seja, endosperma não ruminado. Em geral, a descrição e as imagens de espécies não definidas de Tabernaemontana sp. propostas pelo autor assemelham-se com os nossos dados para Spongiosperma, especialmente, em relação à ausência de excrescência carnosa, endosperma não ruminado e exotesta sinuosa heterogênea. Portanto, sugerimos que descrição do autor não pode ser estendida,

29 exclusivamente, para o gênero, pois o autor não elucidou quais espécies foram estudadas. Em termos evolutivos, Corner (1976) defendeu o primitivismo do arilo. Endress (1973), por outro lado, explicou que estruturas similares originaram-se repetidas vezes, inclusive, em grupos não relacionados filogeneticamente, principalmente, quando essas estruturas conferem valor adaptativo, como nos mecanismos de polinização e dispersão. Este é o caso das excrescências carnosas, pois atribuem vantagens potenciais à dispersão de sementes. Bayer & Appel (1996) relataram que o endosperma ruminado evoluiu independentemente várias vezes dentro das angiospermas, sendo a variedade de formas de ruminação uma das possíveis evidências. Esses autores discutiram seis tipos diferentes de formação de endosperma ruminado que ocorrem em 58 famílias de angiospermas, incluindo Apocynaceae, Loganiaceae e Rubiaceae, da ordem Gentianales. Nossos resultados sugerem uma tendência evolutiva em Tabernaemontaneae, relacionada às características da exotesta e da excrescência carnosa das sementes, conforme a posição filogenética atualmente reconhecida para as espécies (Simões et al., 2010). A face periclinal externa da parede celular da exotesta apresenta-se com aspecto frouxo (Ambelania acida, Macoubea guianensis e Rhigospira quadrangularis) ou sem afrouxamento (Spongiosperma grandiflorum e as Tabernaemontana). As sementes estudadas são nuas, com mucilagem ou com excrescência carnosa. Portanto, uma possível série evolutiva pode ser notada, a partir de Macoubea, que é o primeiro gênero a divergir na subtribo Ambelaniinae, até os que divergiram posteriormente, Tabernaemontana spp (subtribo Tabernaemontaninae): face periclinal externa da parede celular da exotesta de aspecto frouxo com mucilagem e espessa (Macoubea guianensis) → aspecto frouxo com mucilagem e delgada (Ambelania acida) → aspecto frouxo e sem revestimento (sementes nuas, Rhigospira quadrangularis) → sem afrouxamento e sem revestimento (sementes nuas, Spongiosperma grandiflorum) → sem afrouxamento e com excrescência carnosa (todas as de Tabernaemontana).

Hipóteses moleculares indicaram que sementes nuas representam a condição plesiomórfica da tribo, a partir da qual surgiram as sementes ariladas, provavelmente no ancestral do clado Tabernaemontaneae s. str. (Simões et al., 2010). No entanto, nosso trabalho sugere que sementes com mucilagem podem ter dado origem a sementes nuas e estas, por sua vez, terem originado sementes com excrescência carnosa de origem placentária no ACMR do clado Tabernaemontaneae s. str. Esta interpretação procede porque todas as espécies estudadas de Tabernaemontana possuem excrescência carnosa envolvendo individualmente cada semente, o que não foi encontrado nos representantes de Ambelaniinae. Dentre os 17 caracteres analisados, nenhum se mostrou exclusivo para Tabernaemontaneae, pois sementes unitegumentadas e exotestais também foram registradas nas tribos Willughbeieae (Mello, 2012) e Vinceae (Khan, 1970) de Rauvolfioideae, assim como nas tribos Echiteae (Apocynoideae) (Aguiar, 2003) e em Asclepiadeae (Asclepiadoideae) (Souza et al., 2004). Exemplos de sementes albuminosas também ocorrem em Apocynoideae, nas tribos Malouetieae e Mesechiteae, e em Rauvolfioideae, na tribo Plumerieae (Aguiar, 2009). Endosperma com reservas proteicas e lipídicas também estão presentes em Willughbeieae (Rauvolfioideae) (Mello, 2012). E, assim como em Macoubea guianensis, proteínas de reserva com aspecto poliédrico também foram observadas em Asclepias curassavica (Asclepiadoideae) (Souza et al., 2004), em Malouetia arborea e Mandevilla pohliana (Apocynoideae) (Aguiar, 2009) e em Lacmellea panamensis (Willughbeieae) (Rauvolfioideae) (Mello, 2012). Com relação a grupos vizinhos, nossos resultados corroboram a proximidade filogenética entre Willughbeieae e Tabernaemontaneae proposta por Endress & Bruyns (2000) e relatada por Simões et al. (2007). Afinal, as sementes de Willughbeieae também possuem testa composta por saliências e reentrâncias com células alongadas radialmente e preenchidas por compostos fenólicos, mesotesta-endotesta comprimidas e endosperma com reserva lipídica e proteica, podendo ocorrer proteínas com aspecto poliédrico (Lacmellea panamensis) (Mello, 2012). Além disso, há registro da presença de mucilagem nas células da exotesta

31 de Parahancornia fasciculata (Willughbeieae) (Mello, 2012), semelhante ao da semente estudada de Macoubea guinanensis. Esses caracteres que se repetem tanto em Rauvolfioideae quanto, em geral, para Apocynaceae, sustentam o argumento de evolução convergente de alguns estados de caráter para as sementes na família, já demonstrado por Potgieter & Albert (2001) e Simões et al. (2007), principalmente, em relação à excrescência da semente. No entanto, ao considerarmos apenas Tabernaemontaneae, nossos dados identificaram apomorfias que auxiliam no reconhecimento de dois subclados na tribo, como as subtribos propostas por Simões et al. (2010). Apesar da maioria dos caracteres seminais apresentar fraco valor taxonômico para distinção da família Apocynaceae e da subfamília Rauvolfioideae, alguns estados de caráter mostraram-se altamente valiosos dentro de Tabernaemontanae, pois revelaram afinidade entre gêneros de uma mesma subtribo, corroborando, assim, a divisão nas subtribos Ambelaniinae e Tabernaemontanineae. Além disso, eles evidenciam uma especificidade genérica para as espécies de Tabernaemontana por exibir uma combinação única de caracteres. Isso reforça o valor dos caracteres morfoanatômicos de sementes para estudar um táxon, principalmente, referente ao entendimento da evolução desses caracteres em Tabernaemontaneae. E que, em conjunto com informações moleculares e com dados morfológicos de flores e frutos, poderão ser úteis como ferramenta de identificação de grupos. Isso se concretizará, principalmente, se estudos morfoanatômicos de frutos e sementes forem expandidos para outras tribos e subfamílidas de Apocynaceae, a começar por Willughbeieae (Mello, 2012) e Vinceae.

CONCLUSÕES

Não há homologia entre a cobertura viscosa observada em Macoubea guianensis e em Ambelania acida com as excrescências carnosas de Tabernaemontana. Sendo assim, nenhuma delas pode ser nomeada de arilo, dado que as sementes de Macoubea guianensis possuem exotesta com mucilagem na parede celular e as sementes de Tabernaemontana têm excrescência carnosa de origem placentária e não funicular, que nomeada, neste trabalho, de excrescência placentária. Portanto, podemos inferir que a excrescência carnosa surgiu apenas no ancestral comum mais recente de Tabernaemontanineae (Tabernaemontaneae s.str.). E pode-se deduzir uma tendência evolutiva dentro de Tabernaemontaneae: sementes com mucilagem (no representante mais basal, Macoubea, e em Ambelania) → sementes nuas (Spongiosperma e Rhigospira) → sementes com excrescência carnosa (Tabernaemontana). A testa sinuosa ocorre em Ambelaniinae e em Tabernaemontaninae, originando-se de forma semelhante em Tabernaemontana e Spongiosperma, mas somente nas sementes de Tabernaemontana, as dobras são homogêneas. O desenvolvimento do endosperma é tardio em ambos os gêneros, porém se torna ruminado apenas em Tabernaemontana. A ruminação do endosperma é resultado de uma condição pré-determinada pela sinuosidade da exotesta e pelo crescimento contínuo do endosperma, adentrando o interior das cristas da exotesta. Não se verificam caracteres exclusivos para Tabernaemontaneae, pois muitos deles se repetem em outras tribos e subfamílias. Entretanto, foram identificados nove caracteres estruturais diagnósticos, que sustentam a separação da tribo em Ambelaniinae e Tabernaemontaninae. Além disso, os caracteres estudados auxiliam o entendimento da evolução da cobertura das sementes, quando presente, e da relação entre grupos vizinhos, confirmando o estreito relacionamento entre Tabernaemontaneae e Willughbeieae.

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APÊNDICE

QUADROS 1 e 2

Quadro 1: Testes histoquímicos para a detecção dos principais compostos presentes nas sementes. Os sinais (-) e (+) indicam, respectivamente, ausência ou presença do composto químico no tecido, enquanto que (++) e (+++) são estados comparativos, indicativos de maiores intensidades entre as espécies. Composto Lipídeos Espécies Mucilagem Pectina Lignina Proteínas Amido fenólico totais M. guianensis +++ +++ +++ + - + - A. acida ++ +++ + + - + - R. quadrangularis - +++ - + + + -

Ambelaniinae S. grandiflorum - +++ - + - + - T. alba - + - + - + -

Exotesta T. crassa - +++ - + + + -

Endosperma T. donnel-smithii - + - + - + - T. elegans - +++ - + - + - T. laeta - +++ - + + + -

Tabernaemontaninae T. sananho - + - + - + -

Quadro 2: Relação de caracteres das sementes e seus estados de caráter conforme as espécies e subtribos. As fileiras em destaque representam o compartilhamento do mesmo estado numa mesma tribo. Espécies 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17.

A. acida 1 1 1 1 1 1 1 0 1 1 0 0 1 2 1 1 2

M. guianensis 3 3 2 2 1 0 1 1 1 1 0 0 5 1 1 1 2

R. quadrangularis 2 1 2 1 1 1 1 0 1 1 0 0 3 0 1 1 1

Ambelaniinae S. grandiflorum 2 1 3 4 1 1 1 1 1 1 0 0 2 0 2 1 2

T. alba 1 2 4 3 2 1 2 2 2 0 1 1 5 0 2 2 2

T. crassa 2 2 4 3 2 0 2 2 2 0 1 1 5 0 2 1 1

T. donnell-smithii 2 2 4 3 2 0 2 2 2 0 1 1 5 0 2 2 2

T. elegans 2 2 4 4 2 0 2 2 2 0 1 1 4 0 2 1 2

T. laeta 2 2 4 3 2 0 2 2 2 0 1 1 6 0 2 1 1

Tabernaemontaninae 2 2 4 3 2 0 2 2 2 0 1 1 5 0 2 1 2 T. sanaho 1. = Tamanho; 2. = Formato, 3. = Contorno da seção transversal; 4. = Topografia da superfície antirrafeal; 5. = Hilo; 6. = Micrópila; 7. = Embrião; 8. = Padrão da exotesta em secção transversal; 9. = Alongamento radial das células da exotesta; 10. = Mesotesta; 11. = Endosperma; 12. = Excrescência carnosa; 13. = Espessamento secundário das células da exotesta; 14. = Exotesta com mucilagem; 15. = Face periclinal externa das células da exotesta; 16. = Conteúdo das células da exotesta; 17. = Compostos de reserva do endosperma.

FIGURAS de 1 A 19

Figura 1: Filogenia resumida e adaptada de Simões et al. (2010), apresentando a posição na tribo das espécies estudadas e posição de Tabernaemontaneae em relação às tribos Vinceae e Willughbeieae. Amb = Clado Ambelanieae (subtribo Ambelaniinae); Cal = Clado Callichilia; Tab = Clado Tabernaemontana; Tsl = Clado Tabernaemontaneae s.l.; Tss = Clado Tabernaemontaneae s. str.(subtribo Tabernaemontaninae). Traços espessos indicam ramos fortemente sustentados por dados moleculares com probabilidade posterior (PP) ≥ 0,95 e os traços finos, ramos com PP < 0,95.

Figura 2. Fotos dos frutos maduros e abertos, natural ou manualmente, expondo as sementes. A. Ambelania acida. B. Macoubea guianensis. C. Rhigospira quadrangularis. D. Spongiosperma grandiflorum. E. Tabernaemontana alba. F. Tabernaemontana crassa. G. Tabernaemontana donnell-smithii. H. Tabernaemontana laeta. I. Tabernaemontana sananho.

Figura 3: Ilustrações de sementes maduras em secções longitudinais, na coluna da esquerda, e em secções transversais, na coluna da direita. Endotesta indistinta em todos os exemplos. A e B. Ambelania acida. C e D. Macoubea guianensis. E e F. Spongiosperma grandiflorum. G e H. Tabernaemontana alba. Presença de excrescência carnosa.

Figura 4: Sementes maduras de Ambelaniinae. Secções transversais passando pelos cotilédones. A. Macoubea guianensis. B. Spongiosperma grandiflorum. C. Rhigospira quadrangularis. D. Ambelania acida. A e B. Exotesta sinuosa heterogênea. C e D. Exotesta não sinuosa.

Figura 5: Sementes maduras de Tabernaemontaninae. Secções transversais passando pelos cotilédones. Notar o sulco longitudinal (setas) e excrescências carnosas (cabeças de setas). A. Tabernaemontana donnell-smithii. B. Tabernaemontana alba. C. Tabernaemontana crassa. D. Tabernaemontana sananho. E. Tabernaemontana elegans. F. Tabernaemontana laeta.

Figura 6: Sementes maduras de Ambelaniinae, secções transversais. As chaves indicam a mesotesta parcialmente comprimida. A. Macoubea guianensis. B. Spongiosperma grandiflorum. C. Ambelania acida. D. Rhigospira quadrangularis.

Figura 7: Sementes maduras de Tabernaemontaninae, secções transversais. A. Tabernaemontana sananho. B. Tabernaemontana alba. C. Tabernaemontana laeta. D. Tabernaemontana donnell-smithii. E. Tabernaemontana elegans. F. Tabernaemontana crassa. A e B. Células da exotesta com alongamento radial variado e gradual, das maiores na crista às menores no sulco (seta). B e G. Notar feixe vascular presente na excrescência carnosa (linhas tracejadas). ec: excrescência carnosa; en: endosperma.

Figura 8: Sementes maduras. Face antirafeal. A. Ambelania acida. Semente pequena com formato elipsoide B. Rhigospira quadrangularis. Semente de médio tamanho e obovoide. C. Tabernaemontana donnell-smithii. Semente de médio tamanho e obpiramidal. D. Macoubea guianensis. Semente grande com formato elipsoide.

Figura 9: Topografia da superfície antirafeal de sementes maduras. A e C-F. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). B. Estereomicroscopia. A. Ambelania acida. Lisa. B e C. Maboubea guianensis. B. Fóveas e dobras. C. Notar fóveas em MEV. D. Tabernaemontana donnell-smithii. Dobramentos paralelamente orientados e sem ramificações. E. Tabernaemontana alba. Dobramentos paralelamente orientados com ramificações F. Spongiosperma grandiflorum. Dobramentos sem orientação definida e ramificados.

Figura 10: Hilo e micrópila. A. Ambelania acida, hilo subterminal com contorno elíptico (seta). B. Tabernaemontana alba. Face rafeal. Sulco longitudinal com restos de excrescência carnosa (imagem colorida artificialmente). C. Spongiosperma grandiflorum, hilo subterminal com contorno circular. D e E. Micrópilas visíveis e em fenda. D. Spongiosperma grandiflorum. E. Tabernaemontana sananho.

Figura 11. Tipos de embrião. A. Linear. B. Espatulado. (seta: cotilédone).

Figura 12: Ilustrações do espessamento secundário das células da exotesta. A. Ambelania acida. B. Spongiosperma grandiflorum. C. Rhigospira quadrangularis. D. Tabernaemontana elegans. E. Tabernaemontana sananho. F. Tabernaemonatna laeta (linhas tracejadas: espessamentos das faces anticlinais e periclinais internas em direção ao lúmen).

Figura 13: Testa das sementes maduras evidenciadas por testes histoquímicos. A e B. Ácido tânico/ Cloreto férrico. A. Macoubea guianensis, espessa porção de parede com mucilagem. B. Ambelania acida. Delgada porção de parede com mucilagem. Aspecto lamelar da face periclinal externa da parede da célula exotesta (linha pontilhada). C e D. Vermelho de Rutênio. C. Macoubea guianensis. D. Ambelania acida. E. Macoubea guianensis. Branco Calcofluor. Filamentos de celulose na porção mucilaginosa da parede da exotesta (linhas tracejadas). F. Rhigospira quadrangularis. Azul de Toluidina. Porção externa das células da exotesta com face periclinal externa frouxa. ex: exotesta; mu: mucilagem.

Figura 14: Teste com Cloreto Férrico nas células da exotesta. A. Lúmen celular preenchido por compostos fenólicos em Rhigospira quadrangularis. B. Lúmen com distribuição esparsa de traços de compostos fenólicos (pontas de setas) em Tabernaemontana donnell-smithii.

Figura 15: Endosperma das sementes maduras. Testes histoquímicos. A e B. Células ricas em lipídeos totais. A. Negro de Sudão. Rhigospira quadrangularis. B. Sudan IV. Tabernaemontana laeta. C e D. Xylidine Ponceau. Células ricas em proteínas. C. Tabernaemontana alba. D. Macoubea guianensis. Corpos proteicos com aspecto poliédrico (em destaque).

Figura 16: Sementes jovens. Início da formação da sinuosidade da exotesta. A e B. Tabernaemontana sananho. A. Vista panorâmica. Células com contorno triangular no ápice da região de formação da crista (em destaque). B. Detalhe do tegumento da semente. Regiões com divisões celulares que iniciam a formação das cristas (linhas pontilhadas). C e D. Spongiosperma grandiflorum. C. Vista panorâmica. D. Exotesta e camadas celulares da mesotesta adjacente. Regiões com divisões celulares que iniciam a formação das cristas (linhas pontilhadas). ms: mesotesta; pl: placenta.

Figura 17: Sementes jovens. Formação do endosperma ruminado. As setas indicam a direção de crescimento do endosperma. A. Tabernaemontana catharinensis. Endotesta e as primeiras camadas da mesotesta comprimidas. B. Tabernaemontana laeta. O endosperma atingiu a base dos sulcos formados pela exotesta. C e D. Tabernaemontana sananho. C. Endosperma no interior das cristas. D. Completa compressão das camadas celulares da mesotesta, tornando-se o tegumento restrito à exotesta. en: endosperma; ms: mesotesta.

Figura 18: Óvulos e sementes jovens de Tabernaemontana. Fases de formação da excrescência carnosa. A. Tabernaemontana sananho. Óvulos conectados à placenta expandida. B. Detalhe do óvulo evidenciando uma projeção da placenta próxima à micrópila e ao funículo de curto comprimento. Tabernaemontana sananho. C. Tabernaemontana catharinensis. Semente jovem conectada ao tecido placentário em crescimento. Início da formação de projeções que darão origem à excrescência carnosa, individualmente, para cada semente, na maturidade (setas). ec: excrescência carnosa; pl: placenta.

Figura 19: Sementes jovens de Tabernaemontana catharinensis. Fases de formação da excrescência carnosa. A. Projeções da placenta em crescimento ao redor de cada semente (setas). B. Cada semente é envolvida individualmente por excrescência de origem placentária. C. Semente próxima da maturidade e com excrescência carnosa de coloração alaranjada. ec: excrescência carnosa; pl: placenta.

ANEXOS