UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE BIOLOGIA

NATALÍ GOMES BORDON

DELIMITAÇÃO DE ESPÉCIES DE L. (, , TABERNAEMONTANEAE)

CAMPINAS

2020 NATALÍ GOMES BORDON

DELIMITAÇÃO DE ESPÉCIES DE TABERNAEMONTANA L. (APOCYNACEAE, RAUVOLFIOIDEAE, TABERNAEMONTANEAE)

Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Doutora em Biologia Vegetal.

Orientador: ANDRÉ OLMOS SIMÕES

ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA NATALÍ GOMES BORDON E ORIENTADA PELO PROF. DR. ANDRÉ OLMOS SIMÕES.

CAMPINAS

2020 Ficha catalográfica Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Biologia Gustavo Lebre de Marco - CRB 8/7977

Bordon, Natalí Gomes, 1984- B64d BorDelimitação de espécies de Tabernaemontana L. (Apocynaceae, Rauvolfioideae, Tabernaemontaneae) / Natalí Gomes Bordon. – Campinas, SP : [s.n.], 2020.

BorOrientador: André Olmos Simões. BorTese (doutorado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia.

Bor1. Taxonomia vegetal. 2. Morfologia vegetal. 3. Filogenia. 4. Botânica. I. Simões, André Olmos. II. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. III. Título.

Informações para Biblioteca Digital

Título em outro idioma: Delimitation of of Tabernaemontana L. (Apocynaceae, Rauvolfioideae, Tabernaemontaneae) Palavras-chave em inglês: taxonomists Plant morphology Phylogeny Botany Área de concentração: Biologia Vegetal Titulação: Doutora em Biologia Vegetal Banca examinadora: André Olmos Simões [Orientador] Marcelo Reginato Michael John Gilbert Hopkins Ingrid Koch Elis Marina Damasceno Silva Data de defesa: 12-08-2020 Programa de Pós-Graduação: Biologia Vegetal

Identificação e informações acadêmicas do(a) aluno(a) - ORCID do autor: https://orcid.org/0000-0001-7011-1126 - Currículo Lattes do autor: http://lattes.cnpq.br/3734762514065142

Powered by TCPDF (www.tcpdf.org) Campinas, 12 de agosto de 2020.

COMISSÃO EXAMINADORA

Prof. Dr. André Olmos Simões

Dr. Marcelo Reginato

Dr. Michael John Gilbert Hopkins

Profa. Dra. Ingrid Koch

Dra. Elis Marina Damasceno Silva

Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.

A Ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa de Biologia Vegetal do Instituto de Biologia.

DEDICATÓRIA

Dedico aos meus queridos pais: Alice e Célio pelo carinho, amor, apoio e incentivo. AGRADECIMENTOS

Em primeiro lugar gostaria de agradecer a Universidade Estadual de Campinas, em especial ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Vegetal, pelo apoio, participação, atenção, excelência de ensino e acima de tudo pela formação construtivista e participativa. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001 e do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ) - 142320/2015-3, pela bolsa de doutorado. Ao meu orientador Prof. Dr. André Olmos Simões pela imensa orientação, paciência e auxílio incondicional ao longo desses anos, e acima de tudo pelo exemplo, amizade, respeito e possibilidade de trabalho. Agradeço aos professores Dra. Samantha Koehler, Dra. Ingrid Koch e Dr. Fabio Pinheiro. Ao técnico do laboratório da Taxonomia Vegetal João Carlos Galvão que sempre me auxiliou durante a execução da minha tese. À Kamila Pinheiro de Lima e Livia Cordi do Herbário da Universidade Estadual de Campinas (UEC) pelo auxílio, orientação e ajuda no processamento e inclusão das exsicatas e à Thainá Aparecida Lazaro pela montagem das exsicatas e processamento das imagens. Aos integrantes do laboratório de Taxonomia Vegetal e Biologia Molecular da UNICAMP, Edersin Torres, Gustavo Shimizu, Rafael Pinto, Marcelo Freire, André Vito, João do Carmo, Andreza Pereira, Marcelo Monge, Rebeca Romanini, Helder Vechi, Emília Kotovski, Alexandre Zuntinii, Fernanda Cabral, Rosemeri Morokawa, Nállarett Dávila e Elisa Cândido por terem me acolhido e compartilhado o espaço, materiais de laboratório e conhecimento durante todo o período da tese. Ao meu querido pai Célio Bordon, que além de tudo me ajudou, acompanhou e trabalhou muito ao longo de 15 dias de coletas pelos estados de Minas Gerais, Espírito Santo, Bahia, Rio de Janeiro com mais de 4.000 km rodados. À Camila Lucas Chaves pela companhia e ajuda nas coletas de Londrina, PR e nos estados de Pernambuco, Paraíba e Ceará. À Ana Carolina Devides Castello por me ajudar, me aturar e compartilhar as viagens de campo para Minas Gerais, Paraná, Santa Catarina, Distrito Federal, Ceará e Piauí em busca das Aspidospermas e Tabernaemontana. Aos coordenadores e trabalhadores do Parque Estadual da Serra Mar Picinguaba, Parque Estadual da Ilha de Anchieta, Parque Estadual da Serra dos Órgãos, Reserva Biológica de Poço das Antas, Tayra EcoParque, Mata Paraíso da Universidade Federal de Viçosa, Parque Nacional do Monte Pascoal, Parque Nacional do Descobrimento, Mata do Sr. Ademir, Reserva Natural da Vale do Rio Doce, Reserva Biológica de Comboios, Parque Nacional de Saint-Hilarie Lange, Parque Nacional de Brasília, Reserva Natural Serra das Almas, Parque Nacional de Ubajara, Floresta do Curió, Parque Municipal Arthur Thomas. A todos que me ajudaram e me auxiliaram na coleta, foram tantas pessoas que me receberam com tanto carinho e atenção. À Sueli Gomes que me recebeu carinhosamente em Brasília. Ao Thiago Roberto Soares Vieira, gerente, e a todos os funcionários da RPPN Serra das Almas, pela hospitalidade e auxílio durante as coletas. Ao Leonardo Jales Leitão pelo auxílio durante as coletas no Ceará. Ao Projeto Lontra Ekko Brasil, em especial ao Marcelo Tosatti, pela hospedagem durante a coleta em Florianópolis. Ao senhor Claudio Vargas do Tayra EcoParque. Ao Geovane Siqueira da Reserva Natural da Vale do Rio Doce. Ao Vando Moraes pelo auxílio e amizade ao longo das minhas coletas em Picinguaba. Ao Gilson Luiz Souto Mota chefe do Parque Nacional de Ubajara. Ao Geraldo Machado Pereira chefe do Parque Nacional do Descobrimento e Marcelo Ramos pela valiosa ajuda na coleta. Ao Rogério Florenzano Júnior chefe do Parque Nacional de Saint-Hilarie Lange e todos do parque que me ajudaram na coleta. A Yve Cólica Canaveze e Gabriel Piassa pelo auxílio e ajuda nas coletas em Botucatu, SP. A Luciana Silva Cordeiro que além da amizade, me ajudou na logística e me concedeu material de coleta para as coletas no Nordeste e além de tudo me levou para passear na sua cidade linda. À querida Jéssica Nayara que além da amizade coletou Tabernaemontanas na Amazônia, juntamente com a Beatriz Machado, que além de coletar me recebeu carinhosamente em São Paulo. Ao André Rodrigues e Camila Dias, pela ajuda com a organização do material de coleta e do material de morfometria, pelo auxílio nas imagens. Em especial a Camila Dias pelo tempo que passou ao meu lado e por me apresentar o mundo vegano. À Patricia Zampieri da CBMEG (Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética da Universidade Estadual de Campinas), pela atenção e excelente serviço prestado. Agradeço imensamente à Elis Damasceno, Chris Klingenberg, Leonardo Lôbo e Aldo Caccavo que compartilharam os seus conhecimentos de morfometria geométrica. Em especial a Elis Damasceno sem a sua orientação a morfometria geométrica não teria saído do papel. E ao Chris Klingenberg pela atenção, carinho e paixão pela morfometria. Aos meus amigos de bagunça, que me auxiliaram nos momentos de dificuldade e compartilharam muitas alegrias ao longo desses anos, Fabio, Carol, Lauana, Laura, Júlia, Camila, Eder, Sara e Clarinha. A todos os meus amigos da 12ª turma do GEAE e a todos do GEAE, que me auxiliaram nos momentos de dificuldade e trouxeram paz e alegria ao meu coração. E não menos aos meus queridos pais Célio Bordon e Alice Gomes Bordon, que além de me conceder a vida, o exemplo, amor e carinho, me auxiliaram incondicionalmente ao longo da minha trajetória acadêmica. Todas as palavras ainda é pouco para agradecer tudo o que eles fizeram por mim. Aos meus queridos irmãos, que sempre estiveram ao meu lado, Julia Bordon, Giovani, Saulo, Karla e Daniel e aos meus queridos sobrinhos Lucas, Isadora, Melissa e Diego. A tese de longe é um trabalho individual, muitas pessoas contribuíram para execução e andamento da tese e agradeço imensamente a ajuda de todos. E acima de tudo, a essa natureza linda e maravilhosa que me faz apaixonar cada vez mais, perante a beleza, impotência, inteligência e harmonia, perante a ela somos nada e a única coisa que resta, além de admirar, é passar anos tentando compreendê-la “Em que ciência há conhecimento senão no estudo da Natureza”. O que me faz pensar sempre na presença de uma inteligência superior, no qual compreendemos muito pouco.

RESUMO

O gênero Tabernaemontana (Apocynaceae, Rauvolfioideae, Tabernaemontaneae) é composto por aproximadamente 115 espécies. Das sete seções previamente reconhecidas, somente T. seção Pagiantha, T. seção Peschiera e T. seção Rejoua são monofiléticas. Em um estudo filogenético prévio (Simões et al. 2010), T. aurantiaca se posicionou no clado Callichilia e não no clado Tabernaemontana, apesar da semelhança morfológica com as espécies desse clado, principalmente com as espécies que ocorrem na Ásia e Bacia do Pacífico. Em Tabernaemontana seção Peschiera, T. laeta, T. catharinensis, T. hystrix e T. salzmannii, apresentam ampla variação morfológica o que ocasiona problemas de identificação dos espécimes. As variações nessas espécies não se enquadram nas variações descritas aos nomes associados. Com o intuito de elucidar o posicionamento de T. aurantiaca, inferir as relações interespecíficas de T. seção Peschiera, e contribuir para o reconhecimento das espécies com problemas de delimitação, a tese está dividida em quatro capítulos. Os capítulos têm como objetivos: elucidar o posicionamento de T. aurantica (capítulo 1), inferir as relações interespecíficas das espécies de T. seção Peschiera (capítulo 2) e verificar se as morfoespécies estabelecidas a priori correspondem a agrupamentos morfológicos distintos nos complexos taxonômicos T. catharinensis (capítulo 3) e T. laeta e T. hystrix (capítulo 4). Para os capítulos 1 e 2 foram geradas sequências de DNA e utilizadas sequências disponíveis em bancos de dados públicos, e para os demais capítulos utilizamos a morfologia tradicional aliada a morfometria geométrica dos botões florais e morfometria linear dos caracteres florais e foliares. Os agrupamentos taxonômicos foram divididos previamente em morfoespécies, com base nos caracteres morfológicos dos materiais coletados, assim como das revisões taxonômicas, exsicatas depositadas nos herbários e bancos de dados digitais. O complexo taxonômico T. catharinensis foi subdividido em quatro morfoespécies (1 a 4), e os complexos T. laeta e T. hystrix foram subdivididos em seis morfoespécies (6 a 11) já T. salzmannii dividida em três morfoespécies (12 a 14). Baseado no posicionamento filogenético e caracteres morfológicos, T. aurantica foi recuperada como uma linhagem distinta, sendo proposto o restabelecimento do gênero monotípico Rejoua (capítulo 1). No capítulo 2 os marcadores moleculares utilizados tiveram baixo sinal filogenético, com incongruência entre os marcadores com diferentes tipos de heranças parentais. Pela análise do ITS T. arborea, T. heterophylla e as morfoespécies 2, 12 e 14 foram recuperadas como monofiléticas, os demais táxons como parafiléticos. As espécies T. arborea, T. vanheurckii, T. cymosa e T. heterophylla correspondem aos táxons derivados das primeiras linhagens a se divergirem e são espécies irmãs dos demais táxons de T. seção Peschiera. A análise dos caracteres vegetativos e florais possibilitou o reconhecimento de quatro espécies dentro do complexo taxonômico T. catharinensis (capítulo 3), essas correspondem a T. hilariana, T. catharinensis, T. caatingae (espécie nova) e T. solanifolia. Nos complexos taxonômicos T. laeta e T. hystrix foi possível o reconhecimento de três espécies distintas, essas corresponderam a T. laeta e morfoespécies 2 e 3 (capítulo 4).

ABSTRACT

The genus Tabernaemontana (Apocynaceae, Rauvolfioideae, Tabernaemontaneae) has around 115 species. Of the seven sections previously recognized, only Tabernaemontana section Pagiantha, T. section Peschiera and T. section Rejoua are monophyletic. In a previous phylogenetic study (Simões et al. 2010), T. aurantiaca was positioned in the clade Callichilia and not in the Tabernaemontana clade, despite the morphological similarity with the species of that clade, mainly the species that occur in Asia and the Pacific Basin. In Tabernaemontana section Peschiera, T. laeta, T. catharinensis, T. hystrix, and T. salzmannii have great morphological variation, which causes problems of identification of specimens. The variations in these species do not fit the variations described in the associated names. To elucidate the positioning T. aurantiaca, infer the interspecific relationships of T. section Peschiera, and contribute to the recognition of species with problems of delimitation, the thesis is divided into four chapters. The chapters aim to: elucidate the positioning of T. aurantica (chapter 1), infer the interspecific relationships of the species of T. section Peschiera (chapter 2), and verify whether the morphospecies established a priori correspond to distinct morphological groupings in the taxonomic complexes T. catharinensis (chapter 3), T. laeta and T. hystrix (chapter 4). For chapters 1 and 2, DNA sequences were generated and sequences available in public databases were used, and for the other chapters, we used traditional morphology combined with geometric morphometrics of flower buds, linear morphometry of floral and leaf characters. These taxonomic groupings were previously divided into morphospecies, based on the morphological characters of the collected materials and observations in the field, as well as the taxonomic revisions, exsiccates deposited in the herbariums and digital databases. Tabernaemontana catharinensis was subdivided into four morphospecies (1 to 4), T. laeta and T. hystrix were subdivided into six morphospecies (6 to 11), and T. salzmannii in three morphospecies (12 to 14). Based on phylogenetic positioning and morphological characters, T. aurantica was recovered as a distinct lineage, being proposing the reestablishment of the monotypic genus Rejoua (chapter 1). In chapter 2, the molecular markers used had a low phylogenetic signal and incongruence between markers with different types of parental inheritance. By analyzing the ITS T. arborea, T. heterophylla and morphospecies 2, 12, and 14 were recovered as monophyletic, the other taxa as paraphyletic. The species T. arborea, T. vanheurckii, T. cymosa, and T. heterophylla correspond to taxa derived from the first lineages to diverge and are sister species to the other taxa of T. section Peschiera. Based on the vegetative and floral characters analyzed, it enabled the recognition of four species within the taxonomic complex T. catharinensis (chapter 3), these correspond to T. hilariana, T. catharinensis, T. caatingae (new species), and T. solanifolia. In taxonomic complexes T. laeta and T. hystrix made it possible to recognize three distinct species, these corresponded to the taxa T. laeta and morphospecies 2 and 3 (chapter 4).

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO GERAL...... 15 1.1. Tabernaemontana L...... 16 1.2. Delimitação de espécies...... 17 1.3. Morfometria...... 20 2. ESTRUTURA E OBJETIVOS DA TESE...... 21 3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...... 23 CAPÍTULO 1 - Reestablishment of Rejoua aurantiaca (Apocynaceae, Rauvolfioideae) based on morphological and molecular data Abstract………………………...... …………………………...... ……32 Introduction…………………………...... …………………………...... ……………33 Material and methods…………………………...... …………………………...... …………35 Results………………………………………………………………...... …………...... …...37 Discussion…….……………………………………………………………...... …………...38 Taxonomic treatment……………………………………………………..………...... …….40 References………………………………..………………………………………….…...... 41 APPENDIX…………………………………………………………………..………...... 50 CAPÍTULO 2 - Filogenia de Tabernaemontana L. seção Peschiera (Apocynaceae, Rauvolfioideae, Tabernaemontaneae) RESUMO…………………………………………………………………...... ………..53 ABSTRACT………………………………………………………………...... …………55 1. INTRODUÇÃO………………………………………………………...... …………57 2. MATERIAL E MÉTODOS……………………………………...... ………………..59 2.1. Táxons amostrados………………………………………...... ………………….…59 2.2. Extração, amplificação e sequenciamento...... 59 2.3. Alinhamento e análise filogenética…………………………...... …………………60 3. RESULTADOS………………………………………………………...... ………….61 4. DISCUSSÃO…………………………………………………...... …………………67 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS…..……………...... …………………………70 6. APÊNDICES……………………...... ……………………………………………….…76 CAPÍTULO 3 - Análise morfológica e morfométrica do complexo taxonômico Tabernaemontana catharinensis A. DC. (Apocynaceae, Rauvolfioideae, Tabernaemontaneae) RESUMO……………………………………...... …………………………………..88 ABSTRACT………………………………………………...... ……………..90 1. INTRODUÇÃO………………………………...... …………………91 2. MATERIAL E MÉTODOS……………...... ………………………..92 2.1. Amostragem dos espécimes...... ……………………………………………...... 92 2.2. Morfometria geométrica, linear e caracteres discretos...... 95 2.3. Análise estatística…………...... ……………………………...... 96 3. RESULTADOS…………………………….………...... ………………97 3.1. Morfometria geométrica dos botões florais...... …………………..……………97 3.2. Caracteres florais e foliares contínuos e discretos...... ………………………101 4. DISCUSSÃO……………………………………...... ………….……….109 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...... 113 6. APÊNDICES...... 117 CAPÍTULO 4 - Análise morfológica e morfométrica dos complexos taxonômicos Tabernaemontana laeta Mart. e T. hystrix Steud. (Apocynaceae, Rauvolfioideae, Tabernaemontaneae) RESUMO………………………...... ………………………………………133 ABSTRACT…………………………...... ……………………………135 1. INTRODUÇÃO…………………………...... ………………………..………136 2. MATERIAL E MÉTODOS……………...... …………………………………………138 2.1. Amostragem dos espécimes ……………...... …………………………...... …138 2.2. Morfometria geométrica, linear e caracteres discretos...... ……………...... 140 2.3. Análise estatística ………………………………...... …...... ………………….140 3. RESULTADOS………………………………………………………………...... 144 3.1. Morfometria geométrica.…………………………………...... ……………….....144 3.2. Caracteres florais e foliares contínuos e discretos...... 149 4. Discussão…………………………………………………...... 158 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS……………………………...... ……………162 6. APÊNDICES...... 165 7. CONSIDERAÇÕES FINAIS...... 181 8. ANEXOS...... 184

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1. INTRODUÇÃO GERAL Apocynaceae está entre as famílias mais diversas de angiospermas, com cerca de 366 gêneros e aproximadamente 5.000 espécies (Endress et al., 2014; Nazar et al., 2013). A família pertence à ordem e é subdividida em cinco subfamílias: Asclepiadoideae, Secamonoideae, Periplocoideae, Apocynoideae e Rauvolfioideae (Endress e Bruyns, 2000). Apesar dos grandes avanços no estabelecimento das relações filogenéticas de seus táxons, diversos estudos apontam o parafiletismo de Rauvolfioideae e Apocynoideae (Fishbein et al., 2018; Livshultz et al., 2007; Nazar et al., 2013; Simões et al., 2007a, 2010), sendo denominados de grados rauvolfioid e apocynoid por Simões et al. (2016). Alguns táxons de Apocynaceae apresentam alto grau de sinorganização floral, o que permitiu a formação de estruturas singulares, tais como o ginostégio (ausentes em Rauvolfioideae), polinário (ausente em Rauvolfioideae e Apocynoideae), trilhos guias nas anteras (“guide rails”, ausente em Periplocoideae e Rauvolfioideae, exceto em Tabernaemontaneae) e presença de cabeça estilar secundariamente pentâmera e subdividida em regiões especializadas para deposição e recepção do pólen e secreção de viscina (Endress et al., 1983; Simões et al., 2007b). O grado Rauvolfioid é composto pelas primeiras linhagens a se divergirem em Apocynaceae, sendo caracterizados por flores com morfologia relativamente simples, sem ginostégio e polinário, e em alguns táxons sem diferenciação evidente da cabeça estilar (Endress, 2004; Endress e Bruyns, 2000; Simões et al., 2007b). Em sua circunscrição atual, Rauvolfioideae é subdividida em 11 tribos: Aspidospermateae, Alstonieae, Vinceae, Willughbeieae, Tabernaemontaneae, Melodineae, Amsonieae, Alyxieae, Hunterieae, Plumerieae e Carisseae (Endress et al., 2014; Simões et al., 2007a). Espécies da tribo Tabernaemontaneae apresentam flores relativamente elaboradas. Com a região dorsal das anteras lignificadas, essa região lignificada se estende além das tecas formando alas que são adjuntas com as anteras adjacentes (“lignified guide rails”) (Endress e Bruyns, 2000). Cada antera auxilia no direcionamento da probóscide do polinizador (Endress e Bruyns, 2000; Kunze e Wanntorp, 2008) e, juntamente com o ápice da cabeça estilar com projeções lobuladas (de 5 a 10 lóbulos) e base da cabeça estilar espessada e expandida, auxiliam na compartimentalização floral (Endress, 1994; Simões et al., 2007b). A maioria das espécies da tribo Tabernaemontaneae possuem frutos foliculares com sementes ariladas e superfície interna do cálice com numerosos coléteres, dispostos em uma a várias linhas (Simões et al., 2007a). A tribo Tabernaemontaneae é subdividida em duas subtribos, Ambelaniinae e Tabernaemontaninae. Ambelaniinae é caracterizada pelos frutos bacóides, com sementes geralmente envoltas por polpa (Simões et al., 2010) e é composta por 16

sete gêneros restritos aos neotrópicos ( Aubl., Aubl., (Monach.) Pichon, Mucoa Zarucchi, Zarucchi, Miers e Zarucchi). Já Tabernaemontaninae é a mais diversa dentro da tribo e as espécies apresentam como sinapomorfias os frutos do tipo folicular, sementes com endosperma ruminado e sulco hilar profundo, com arilo de cores variadas revestindo total ou parcialmente a semente (Simões et al., 2010; Endress et al., 2014). A subtribo Tabernaemontaninae é subdividida em dois clados, Callichilia e Tabernaemontana (Simões et al., 2010; Endress et al., 2014). Callichilia é composto por sete gêneros (Callichilia Stapf, Calocrater K. Schum. & Prantl., K. Schum. & Prantl., Crioceras Pierre, , Baill. Tabernaemontana L., Baill. e Thouars) mais Tabernaemontana aurantiaca Gaudich., enquanto o clado Tabernaemontana é composto exclusivamente por espécies do gênero Tabernaemontana (Leeuwenberg, 1991, 1994).

1.1. Tabernaemontana L. O gênero Tabernaemontana foi estabelecido por Linnaeus em 1753, o qual reconheceu três espécies, posteriormente teve sua circunscrição ampliada por Candolle em 1844, o qual adicionou 61 espécies. A partir de Candolle (1844), o gênero foi desmembrado em 32 gêneros distintos por diversos autores (Baillon, 1889; Boiteau e Allorge, 1976; Candolle, 1844; Don George, 1837; Du Petit-Thouars, 1806; Gaudichaud, 1829; Markgraft, 1935, 1937, 1938, 1941, 1972; Miers, 1878; Pichon, 1948; Stapf, 1902; Schumann, 1902; Woodson, 1941, 1960). A última revisão taxonômica completa para o gênero foi feita por Leeuwenberg em 1991 e 1994, sendo composta por dois volumes, essa revisão foi baseada principalmente em materiais de herbário. O primeiro volume abordou as 55 espécies de Tabernaemontana do Velho Mundo (África continental, Madagascar, Ásia tropical e Australásia) e o segundo volume 53 espécies do Novo Mundo. Nesta revisão, o autor aceitou uma ampla circunscrição do gênero, sendo que apenas Stemmadenia foi mantido como um gênero distinto, posteriormente sinonimizado em Tabernaemontana por Simões et al. (2010). Tabernaemontana em sua circunscrição atual, tem em torno de 115 espécies distribuídas na África, Madagascar, Ilhas Mascarenhas, Ásia, Oceania, Austrália e América tropical (Leeuwenberg, 1991). O gênero apresenta como sinapomorfias os lobos da corola inflexos no botão e frutos sempre foliculares (Simões et al., 2010). Leeuwenberg (1990, 1991, 1994) separou o gênero em sete seções: Bonafousia, Ervamatia, Pagiantha, Pandaca, Rejoua, Peschiera e Tabernaemontana. Essa separação baseava-se em um conjunto de características vegetativas e reprodutivas, como textura das folhas, características da inflorescência, 17

proporção entre a inflorescência e as folhas subtendidas, forma do tubo da corola, inserção dos estames, presença de lignificação nas anteras, morfologia da cabeça estilar e morfologia dos mericarpos. As relações filogenéticas de Tabernaemontaneae foram elucidadas por Simões et al. (2010), com a utilização de sequências de cinco marcadores plastidiais. Das 115 espécies de Tabernaemontana atualmente reconhecidas, 70 foram incluídas na filogenia, e dessas 32 são neotropicais. Apesar da ampla amostragem e grandes avanços no reconhecimento das relações filogenéticas do grupo, alguns clados tiveram baixa resolução, dentre esses T. aurantiaca teve posicionamento incerto no clado Callichilia (Simões et al., 2010). O posicionamento de T. aurantiaca foi inesperado devido à grande semelhança morfológica com as espécies de Tabernaemontana que ocorrem na Ásia e Bacia do Pacífico, com ausência de região dorsal lignificada nas anteras e cabeça estilar indiferenciada (Leeuwenberg, 1991; Simões et al., 2010). Tabernaemontana aurantiaca ocorre na Micronésia (em Palau), Indonésia, Papua Nova Guiné, Ilhas de Salomão e Vanuatu (Leeuwenberg, 1991). Na filogenia gerada por Simões e colaboradores (2010) não foram incluídas espécies que ocorrem na mesma região geográfica que T. aurantiaca, como T. salomonensis (Markgr.) Leeuwenb. e T. remota Leeuwenb., o que pode ter ocasionado o posicionamento dessa espécie no clado Callichilia. Das sete seções previamente estabelecidas por Leeuwenberg (1990, 1991) somente T. seção Pagiantha, T. seção Peschiera e T. seção Rejoua foram recuperadas como monofiléticas (Simões et al., 2010). Tabernaemontana seção Peschiera tem 12 espécies distribuídas na região Neotropical (Leeuwenberg, 1994). Apesar da extensa revisão taxonômica para o gênero, T. seção Peschiera possui muitas espécies que necessitam ser revistas. Nessa seção, T. laeta Mart., T. catharinensis A.DC., T. hystrix Steud. e T. salzmannii A.DC. têm grande variação morfológica nos caracteres vegetativos e reprodutivos, os quais ocasionam problemas de delimitação das espécies e consequentemente identificação dos espécimes.

1.2. Delimitação de espécies As espécies compõem a unidade fundamental utilizadas nas diferentes áreas do conhecimento, como biogeografia, ecologia, evolução, fisiologia, biologia da conservação, sistemática filogenética, microevolução e macroevolução (Freudenstein et al., 2017; Zachos, 2016). Há uma extensa literatura a respeito dos diferentes conceitos de espécies, os quais utilizam os diferentes atributos biológicos, como por exemplo, diferenças fenotípicas, genéticas, comportamentais, ecológicas e isolamento reprodutivo (Hausdorf, 2011; Hendry, 2009; Hey, 2006). Atualmente, há uma tendência em conceituar as espécies como linhagens 18

metapopulacionais evoluindo separadamente (Queiroz, 2007; Pante et al., 2015). Esse conceito de espécie difere dos critérios operacionais, ou atributos biológicos, ou linhas de evidência, que são utilizados para identificar e delimitar as espécies (Queiroz, 1998, 2007). Os critérios operacionais correspondem aos caracteres morfológicos, filogenéticos, ecológicos e isolamento reprodutivo, os quais enquadram-se nos diferentes conceitos de espécies prévios (Queiroz, 1998, 2007). A separação entre conceito e critérios operacionais e a identificação dos elementos comuns entre os diversos conceitos de espécies estabeleceu o conceito unificado de espécies (Queiroz, 1998, 2007). Nesta nova abordagem o conceito de espécies é definido como um problema filosófico, o qual é separado do problema metodológico de inferir os limites e número de espécies (Queiroz, 1998, 2007). No geral, a dificuldade em delimitar as espécies se deve ao processo de especiação, no qual é um processo contínuo e gradual de divergência entre as linhagens, e esse se estende ao longo do tempo (Queiroz, 1998, 2007). A especiação pode ocorrer em simpatria, alopatria e parapatria. A divergência na especiação simpátrica ocorre sem isolamento geográfico, enquanto a especiação alopátrica requer isolamento geográfico (Turelli et al., 2001; Zeng et al., 2011). A especiação parapátrica ocorre em uma área geográfica contínua e as espécies divergentes têm distribuições adjacentes e não há barreira geográfica ao fluxo gênico (Turelli et al., 2001; Zeng et al., 2011). No processo de especiação as taxas de mudanças nos caracteres podem ser heterogêneas, o quais ocasionam incongruências entre os caracteres ou poucos caracteres divergentes, o que dificulta a delimitação dos grupos com diversificação recente (Queiroz, 2007; Shaffer e Thomson, 2007; Lenormand et al., 2008). Ao longo do processo de divergência, as linhagens adquirem as diferentes propriedades ou critérios operacionais, que podem ser utilizadas para testar hipóteses de delimitação de espécies (Queiroz, 1998, 2007). Entretanto, cada espécie apresenta uma história única de mudanças nos atributos biológicos, assim como sua interação com fatores bióticos e abióticos e eventos estocásticos (Queiroz, 2007; Lenormand et al., 2008; Rundell e Price, 2009). Entre os critérios operacionais usualmente utilizados na delimitação de espécies estão os padrões de variações morfológicos descontínuos e não sobrepostos nos caracteres quantitativos contínuos, assim como caracteres qualitativos fixos ou invariantes (Davis e Nixon, 1992; Stuessy, 2009; Wiens e Servedio, 2000). Essa descontinuidade resulta da diferenciação parcial do genoma, o qual impede a homogeneização das linhagens, sendo resultado dos processos de deriva, seleção, adaptação e especialização ecológica (Alcázar et al., 2012; Forest et al., 2014; Givnish, 2010; Macnair et al., 1989; Sobel et al., 2010). Geralmente grupos taxonômicos problemáticos exibem padrões complexos de variação 19

morfológica e ausência na descontinuidade morfológica, o que pode refletir uma história evolutiva complexa, comumente observada em grupos com alta diversidade e de origem recente (Leliaert et al., 2014; Neustupa et al., 2010; Pinheiro et al., 2018; Segatto et al., 2017; Turchetto et al., 2014a, b). A sobreposição morfológica também pode ocorrer devido à alta plasticidade fenotípica, seleção estabilizadora, evolução convergente e hibridização (Conesa et al., 2012; Leliaert et al., 2014; Minelli e Fusco, 2012; Neustupa et al., 2010; Renner et al., 2013; Segatto et al., 2017) A taxonomia tradicional utilizava majoritariamente os dados morfológicos e mais recentemente dados filogenéticos, para identificar os grupos morfológicos discretos e descontínuos (Stuessy, 2009). Esta abordagem geralmente se mostra eficaz em grupos de origem e divergência mais antigos e com descontinuidade observável nos caracteres, entretanto em grupos de divergência recente, com sobreposição e incongruência entre os caracteres essa abordagem é insuficiente (Briggs e Walters, 1997; Davis e Nixon, 1992; Henderson, 2006, Gurevitch et al., 2006). A utilização de múltiplas linhas de evidência para descobrir e delimitar as espécies é denominada de taxonomia integrativa (Dayrat, 2005; Will et al., 2005; Yeates et al., 2011). Esta abordagem surgiu em decorrência da necessidade de uma melhor metodologia e padronização na delimitação das espécies (Padial et al., 2010). A taxonomia integrativa tem sido amplamente utilizada em estudos com vertebrados (Olave et al., 2017; Ramírez-Reyes et al., 2017; Salvi et al., 2018), invertebrados (Álvarez-Campos et al., 2017; Eyer et al., 2017; Sun et al., 2017) e plantas (Alvarado-Sizzo et al., 2018; Flores- Rentería et al., 2017; Smet et al., 2017; Yang et al., 2019). Na literatura há uma discussão sobre quais e quantos caracteres devem ser levados em consideração no processo de identificação e delimitação das linhagens, assim como a congruência e incongruência entre os caracteres (Padial et al., 2010; Sites e Marshall, 2003). Dentro desse contexto é reconhecida a integração por congruência ou por acumulação (Padial et al., 2010; Pante et al., 2015). Na integração por congruência é necessário a concordância entre diferentes caracteres, para indicar a separação completa da linhagem, já na integração por acumulação a divergência em qualquer um dos atributos fornece evidência para o reconhecimento de uma espécie distinta (Padial et al., 2010). Na prática, na integração por acumulação, a concordância e discordância entre os atributos biológicos são explicados sob a perspectiva evolutiva da população em estudo, sendo que o reconhecimento de uma espécie com base em um único atributo biológico pode ser feito, caso esse seja considerado um bom indicador de divergência (Padial et al., 2010). Yeates e colaboradores (2011) propuseram uma diferenciação entre os termos iterativo e integrativo, o termo integrativo refere-se a um 20

método quantitativo que possibilita que diferentes partições de dados (morfológicos, genéticos ou ecológicos) contribuam para delimitação dos limites das espécies. A abordagem iterativa baseia-se em uma análise qualitativa dos caracteres correlacionando ou corroborando os diferentes conjuntos de dados, sendo essa a mais utilizada nos trabalhos de delimitação de espécies (Yeates et al., 2011).

1.3. Morfometria A análise dos caracteres morfológicos é de grande importância na delimitação das espécies, sendo necessário analisar a variação morfológica de indivíduos e populações nas diferentes regiões geográficas de ocorrência das espécies, assim como incluir populações simpátricas e alopátricas para identificação dos possíveis híbridos (Conesa et al., 2012; Doḿinguez et al., 1998; Rosquist e Prentice, 2001; Sobel et al., 2010; Viscosi et al., 2009). A variação fenotípica pode refletir grupos taxonômicos distintos, entretanto fatores físicos e bióticos influenciam no fenótipo das plantas (Klingenberg et al., 2012; Pfennig et al., 2010; Rosquist e Prentice, 2001). Entretanto, mudanças na morfologia floral e estruturas reprodutivas como cor, odor, comprimento do tubo floral, número e altura das flores são relacionados com o isolamento reprodutivo (Byers et al., 2014; Castellanos et al., 2004; Forest et al., 2014; Givnish, 2010; Gomez et al., 2008, 2015, 2016; Lázaro e Totland, 2014; Schemske e Bradshaw, 1999). A morfometria é uma ferramenta amplamente utilizada na análise da variação morfológica e essa pode ser definida como a análise quantitativa da forma biológica (Zelditch et al., 2004, 2012). Ela difere da morfologia descritiva por permitir a quantificação dos caracteres e posterior análise estatística, sendo possível analisar a variação morfológica entre indivíduos, população e espécies (Henderson, 2006; Zelditch et al., 2004, 2012). A morfometria tem sido amplamente utilizada em estudos com complexos de espécies e identificação dos híbridos (ex., Conesa et al., 2012; Henderson, 2006; Jensen et al., 1993; Peñaloza-Ramírez et al., 2010; Shipunov e Bateman, 2005; Viscosi et al., 2009). A morfometria pode ser separada em morfometria tradicional e geométrica (Zelditch et al., 2004, 2012). A morfometria tradicional utiliza distância ou ângulos entre as estruturas morfológicas homólogas (Zelditch et al., 2004, 2012). A morfometria geométrica tem se mostrado uma ferramenta útil, com aplicações em diversos ramos do conhecimento (Benitez-Vieyra et al., 2009; Gómez et al., 2008, 2009; Klingenberg et al., 2012; Savriama e Klingenberg, 2011; Savriama et al., 2012). Essa metodologia também permite separar espécies relacionadas como os híbridos, tal como em 21

espécies de Dactylorhiza (Orchidaceae) (Shipunov e Bateman, 2005) e Quercus (Fagaceae) (Jensen et al., 1993; Viscosi et al., 2009). Além disso, possibilita analisar a variação intraespecífica das populações, como relatado em Montrichardia linifera (Araceae) (Silva et al., 2012). O nível de resolução da morfometria geométrica é superior a linear, pois essa analisa somente a forma e desconsidera as informações de tamanho, posição e orientação (Klingenberg, 2010, 2016; Klingenberg et al., 2012; Zelditch et al., 2012). Enquanto a linear utiliza somente distâncias (ou ângulos) entre estruturas homólogas, sendo que esse método não é o mais adequado para detectar diferenças em complexos de espécies, ou mesmo para comparar grupos distintos (Wiens e Servedio, 2000; Zapata e Jiménez et al., 2012). Em alguns grupos é necessário a análise de um conjunto maior de caracteres, como em Quercus (Fagaceae), no qual a discriminação dos grupos morfológicos só foi possível utilizando a morfometria geométrica foliar, ou com a inclusão de um número maior de caracteres foliares (macro e micromorfológicos), conjuntamente com as medidas lineares (Bruschi et al., 2000; Viscosi et al., 2009). Já em espécies de Dactylorhiza (Orchidaceae) não foi possível discriminar as espécies por meio da morfometria geométrica do lábio floral, somente com a inclusão de outros caracteres advindos da morfometria linear e da sistemática filogenética (Shipunov e Bateman, 2005). A forma de uma estrutura floral é representada por um conjunto de pontos de coordenadas, referidos como landmarks, ao longo do contorno da estrutura floral (Adams et al., 2004; Klingenberg, 2010). Com os landmarks a forma é definida, quantificada e visualizada estatisticamente, o qual permite uma análise mais detalhada da variação da forma na estrutura em questão (Zelditch et al., 2004, 2012). Entretanto, o estabelecimento dos landmarks requer pontos anatômicos homólogos (Zelditch et al., 2012). O estabelecimento dos landmarks em grupos distintos e em estruturas florais complexas é particularmente difícil, tal como no tubo da corola e em flores com simetria zigomorfa, sendo necessário o uso de técnicas de obtenção de imagens de maior custo (Van der Niet et al., 2010; Wang et al., 2015), ou a decomposição da estrutura floral (Hsu et al., 2015). Até o momento a sua aplicabilidade em estruturas florais ainda é pouco utilizada na delimitação de espécies.

2. ESTRUTURA E OBJETIVOS DA TESE A tese está dividida em quatro capítulos. O primeiro capítulo aborda o posicionamento filogenético de Tabernaemontana aurantiaca. No capítulo 2 geramos uma filogenia para Tabernaemontana seção Peschiera. Os capítulos 3 e 4 abordam a análise morfométrica e morfológica dos complexos taxonômicos T. catharinensis, T. laeta e T. hystrix. 22

Para os capítulos 1 e 2 foram utilizadas sequências de DNA, geradas para este estudo e obtidas de banco de dados públicos, e para os demais capítulos empregamos as técnicas de morfometria linear e geométrica dos caracteres florais e foliares, assim como a análise qualitativa desses caracteres. Segue abaixo os títulos dos capítulos e os seus respectivos objetivos. Capítulo 1, “Reestablishment of Rejoua aurantiaca (Apocynaceae, Rauvolfioideae) based on morphological and molecular data”, tem como objetivo inferir o posicionamento de Tabernaemontana aurantiaca, com a inclusão de espécies que ocorrem na mesma região geográfica que T. aurantiaca. Capítulo 2, “Filogenia de Tabernaemontana seção Peschiera (Apocynaceae, Rauvolfioideae, Tabernaemontaneae)”, têm como objetivos, (1) inferir as relações interespecíficas das espécies que compõem a T. seção Peschiera, (2) inferir o posicionamento filogenético das morfoespécies pertencentes aos complexos taxonômicos T. catharinensis, T. hystrix, T. laeta e T. salzmannii. Capítulo 3, “Análise morfológica e morfométrica do complexo taxonômico Tabernaemontana catharinensis A. DC. (Apocynaceae, Rauvolfioideae, Tabernaemontaneae)”, o qual tem como objetivo avaliar se as morfoespécies previamente estabelecidas correspondem a agrupamentos morfológicos distintos. O capítulo 4, “Análise morfológica e morfométrica dos complexos taxonômicos Tabernaemontana laeta Mart. e T. hystrix Steud. (Apocynaceae, Rauvolfioideae, Tabernaemontaneae)” o qual tem como objetivo avaliar se as morfoespécies previamente estabelecidas correspondem a agrupamentos morfológicos distintos.

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Reestablishment of Rejoua aurantiaca (Apocynaceae, Rauvolfioideae) based on

morphological and molecular data

NATALÍ GOMES BORDON1*, MARY E. ENDRESS & ANDRÉ OLMOS SIMÕES3

1Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Programa de Pós-Graduação em Biologia Vegetal, Rua Monteiro Lobato, 255, CEP 13083-862, Cidade Universitária Zeferino Vaz, Campinas, SP, Brazil 2Institute of Systematic Botany, University of Zurich, Zollikerstrasse 107, 8008 Zürich, Switzerland 3Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Departamento de Biologia Vegetal, Rua Monteiro Lobato, 255, CEP 13083-862, Cidade Universitária Zeferino Vaz, Campinas, SP, Brazil *Corresponding author: Bordon, N.G. E-mail: [email protected]

O manuscrito será submetido à Phytotaxa

Abstract The placement of Tabernaemontana aurantiaca as more related to other genera from tribe Tabernaemontaneae than other species of Tabernaemontana in a previous phylogenetic study was unexpected. This species has been included by some authors in Tabernaemontana due to floral and vegetative characters, and segregated by others on a monotypic genus, Rejoua, mainly due to its fruits and seed morphology in the tribe. Our work aimed to test the phylogenetic placement of T. aurantiaca by adding species of Tabernaemontana unsampled in previous studies, two of which (T. remota and T. salomonensis) from the same geographic region and three from nearby areas (T. bovina, T. corymbosa and T. thurstonii). Our results show the phylogenetic placement of T. aurantiaca within Tabernaemontaneae is still uncertain but distantly related to the species of Tabernaemontana from the same geographic region and morphological alike. The Asian Tabernaemontana clade is divided into two strongly supported sister clades, one comprising most species that occur in the continental portion of Asia (East, South, and Southeast Asia) and Malesia, and the other for the great majority of the island species (Malesia and Melanesia). Our morphological analyses find more resemblance of T. aurantiaca to the species of Tabernaemontana than to the species from other genera of Tabernaemontaneae, and that its fruits have distinctive features within the tribe. In conclusion, our results showed that Tabernaemontana aurantiaca is a distinct lineage within the tribe, possibly phylogenetically closer to the genera from the Callichilia clade but morphologically similar to Tabernaemontana species. Tabernaemontana aurantiaca occurs in 33

the easternmost portion of the Pacific Islands and the presence of a spongy mesocarp which is correlated to hydrochoric dispersion, suggesting a specialization of this taxa to the island habitat. We, therefore, propose the reestablishment of genus Rejoua with a single species, R. aurantiaca distributed in Malesia, Melanesia, and Micronesia.

Keywords: Callichilia, monotypic genus, Tabernaemontana, Tabernaemontaneae, Tabernaemontaninae.

Introduction The rauvolfioid grade (sensu Simões et al. 2016) is composed of 11 tribes and 79 genera and represents the first lineages of the Apocynaceae to diverge (Endress et al. 2014). Of the 11 tribes, Tabernaemontaneae is the most diversified with 15 genera and about 150 species (Endress et al. 2014, Fishbein et al. 2018). Most Tabernaemontaneae species have flowers with lignified anthers forming lateral rails to guide the pollinator (guide rails) and a differentiated style head with a 5 to 10 lobed apex and a thickened and expanded base (Endress & Bruyns 2000, Simões et al. 2010). Tabernaemontaneae is divided into two subtribes: (i) Ambelaniinae, with species having baccate fruits and naked seeds with non- ruminant endosperm and no discernible hilar groove, and (ii) Tabernaemontaninae, with species having mostly follicular, more rarely baccate fruits and arillated seeds with ruminant endosperm and a deep hilar groove. Tabernaemontanineae is further divided into two major lineages, named Tabernaemontana and Callichilia clades (Simões et al. 2010, Endress et al. 2014). The Callichilia clade is formed by species from seven paleotropical genera: Callichilia Stapf (1902: 130), Calocrater Schumann (1895: 175), Carvalhoa Schumann (1895: 189), Crioceras Pierre (1897: 1311), Schizozygia Baillon (1888: 752), Tabernanthe Baillon (1888: 783) and Voacanga Thouars (1806: 10) and Tabernaemontana aurantiaca Gaudichaud (1826: 451). Species of the Callichilia clade are mainly distributed in continental Africa and Madagascar, with some species of Voacanga occurring in Malesia. The Tabernaemontana clade, on the other hand, is composed exclusively by species from the genus Tabernaemontana Linnaeus (1753: 210) (Leeuwenberg 1991, 1994) and has as potential synapomorphy the corolla lobes inflexed in the bud (Simões et al. 2010). Phylogenetic relationships within Tabernaemontana clade have a strong geographic correspondence, with main clades formed by species distributed in the same continental and insular areas (Table 1). Callichilia grade is morphologically heterogeneous, and the diagnostic feature is a conspicuous nectariferous disk around the base of the ovary (absent in T. aurantiaca) (Simões 34

et al. 2010). Even though the genera from this clade are well defined in morphological terms, uncertainties on their phylogenetic placement remain, especially for T. aurantiaca (Simões et al. 2010). Tabernaemontana aurantiaca was initially described in a monotypic genus, Rejoua by Gaudichaud (1829: 450) based on the consistency, colour, shape, and opening of the fruit (Gaudichaud, 1826). The generic status of Rejoua was accepted by some taxonomists (Miers 1878, Markgraf 1935-1972, Pichon 1948, Boiteau & Allorge 1978) but others (Candolle 1844, Schumann 1895) have placed the species in Tabernaemontana. The latest classification proposed for the genus (Leeuwenberg 1994) maintained this taxon in Tabernaemontana, reducing Rejoua to a sectional status. This taxonomic disagreement is due to the morphological resemblance of the taxa to other species of Tabernaemontana. Tabernaemontana aurantiaca has corolla lobes inflected in the bud, the main diagnostic feature of the genus according to Simões et al. (2010). In addition, it shares with species of Tabernaemontana from Asia, Australia, and Pacific Islands the flowers with undifferentiated style head and anthers without lignified guide rails, and with the other species the anthers sagittated at the base (Leeuwenberg 1990, 1991). The diagnostic characteristic of T. aurantiaca is the fruit with indehiscent mericarps, spongy mesocarp, and an inconspicuous aril, in contrast to the usually dehiscent mericarps with a leathery to woody mesocarp and conspicuous arils from most species of Tabernaemontana (Pichon 1948, Leeuwenberg 1991, 1994). Within the Callichilia clade, species morphologically alike to T. aurantiaca belong to the genus Voacanga. From the species of Voacanga that occur in the same geographic region of T. aurantiaca only V. grandifolia Rolfe (1883: 202) is usually confused with T. aurantiaca due to similar leaves in dried specimens but the two species differ in flowers and fruits morphology. Voacanga grandifolia has a calyx 10-20 mm long, fruits light yellow or dark green with numerous small warts (light gray-brown), dehiscent with a mesocarp leathery to fleshy but never spongy, and seeds surrounded by a conspicuous aril which separates easily from the wall, while T. aurantiaca has the calyx 2 mm long, fruit bright orange, smooth, mostly subglobose or pear-shaped, indehiscent and with a spongy pulp not separable from the very thin wall and seeds with reduced aril (Leeuwenberg 1985a, 1991). The placement of T. aurantiaca in the Callichia clade does not rule out the hypothesis that the observed positioning is an artifact of the low sampling of species of Tabernaemontana from the same geographic region by Simões et al. (2010). Of the 20 species of the genus distributed in Asia and Pacific Islands, only nine were sampled by these authors which correspond to the species previously recognized in T. section Ervatamia 35

Candolle (1844: 373) and T. section Pagiantha Leeuwenberg (1990: 73-81), except T. inconspicua Staf (1894: 120) and T. sessifolia Baker (1883a: 205) which occur in Africa and Madagascar, respectively. Among the species not included in that study, stand out T. remota Leeuwenberg (1991: 191) and T. salomonensis (Markgraf (1967: 28)) Leeuwenberg (1991: 193) which occur in the same locality that T. aurantiaca, and nearby areas such as T. bovina Loureiro (1790: 118), T. corymbosa Roxburgh ex Wallich (1829: 1274) and T. thurstonii Horne ex Baker (1883b: 368). We tested the phylogenetic placement of T. aurantiaca by expanding the phylogenetic study of Simões et al. (2010), with the inclusion of species of Tabernaemontana morphologically and geographically related, and to determine whether the species should be kept in Tabernaemantana or placed into a separated genus.

Material and methods Taxon sampling:—To elucidate the placement of T. aurantiaca, we included sequences from the five cpDNA markers of all the species sampled by Simões et al. (2010). In addition, we generated new sequences from these five markers for nine species of Tabernaemontana not sampled by Simões et al. (2010). Of these, five occur in Southeast Asia, Malesia and Melanesia (T. bovina, T. corymbosa, T. remota, T. salomonensis and T. thurstonii), and four in the neotropics (T. albiflora Miquel (1851: 165) Pulle (1906: 382), T. angulata Martius ex Müller Argoviensis (1860: 72), T. oppositifolia Sprengel (1822: 33) Urban (1910: 493) and T. wullschlaegelii Grisebach (1864: 409) (Appendix 1). DNA extraction, amplification, and sequencing:—To obtain the total DNA, we used 20 mg of leaves from herbarium or silica-dried samples for each specimen. The DNA extraction was done with the DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN Sample and Assay Technologies), following protocol specifications. The DNA fragments to be amplified correspond to the regions of the introns rpl16, rps16 and trnK, intergenic spacer trnS-G, and the matK gene from the cpDNA. The primers used and their annealing temperatures used are listed in Appendix 2. For the PCR reactions, we used the Platinum® Taq DNA Polymerase kit (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Corporation, Massachusetts, USA) and GoTaq® Green Master Mix (Promega Corporation), according to the manufacturers’ specifications, with small changes. In addition, we added BSA (Bovine Serum Albumin) at 10 mg/mL, Betaine 1 M, and DMSO (Dimethyl sulfoxide) at 5% (Franckman et al. 1998). The steps of the PCR reaction in the thermal cycler were: (1) initial denaturation at 94 ºC, for 3 min; (2) denaturation and separation of the double DNA helix at 94 ºC, for 30 s; (3) annealing of primers to DNA for 1 min at primer-specific temperature (Appendix 2); (4) extension and synthesis at 72 ºC, for 1 m 30 s; (5) final step at 36

72 ºC, for 5 min, in 35 cycles. Changes in the number of cycles and annealing temperature were made according to the necessity of each marker and genomic DNA quality (Roux 2008). After amplification, the samples were purified using the purification kits (Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System, Promega Corporation, Madison, USA, and QIAquick PCR Purification Kit QIAGEN Sample and Assay Technologies) and purification enzymes (ExoSAP-IT® of USB®, Affymetrix, Thermo Fisher Scientific), and then sent for sequencing. The sequencing was done in the CBMEG (Center for Molecular Biology and Genetic Engineering of the University of Campinas) using the sequencer Applied Biosystems® 3500xL Genetic Analyzers (Life Technologies Corporation, Thermo Fisher Scientific Corporation, Massachusetts, USA). Sequence alignment and phylogenetic analyses:—The contigs and sequence editions were done in the Geneious v9.1.8 program (Kearse et al. 2012). The sequences were aligned using the MAFFT program (Katoh et al. 2017). Nucleotide substitution models were determined for each cpDNA region using jModelTest 2.1.7 (Darriba et al. 2012), and the best fit model was selected by the Akaike Information Criterion (AIC; Akaike 1974). We analyzed six different datasets: the five matrices for each dataset (rpl16, rps16, trnS-G, trnK, and matK), and a combined matrix for all five plastid markers. Phylogenetic analysis was made on Bayesian inference (BI) approach in MrBayes 3.2 program (Ronquist et al. 2012) at the CIPRES platform (via the CIPRES Science Gateway) (Miller et al. 2010). Two independent and simultaneous analyses with 20.000.000 generations were performed by the Markov Chain Monte Carlo algorithm (Larget & Simon 1999, Atchadé et al. 2011), with four chains each. The trees of highest posterior probability were sampled at intervals of 2000 generations, in which 25% of the initial trees were later discarded as burn-in. The convergence of chains and effective sample size were observed in the parameters Tracer v1.6 (Rambaut et al. 2014). The posterior probabilities (PP) of the branches were calculated from a tree of maximum credibility, obtained in TreeAnnotator v.1.10 (Rambut & Drummond 2017). The trees of maximum credibility were edited and analyzed in FigTree v1.4.3 (Rambaut 2016). Morphological studies:—We performed a morphological analysis of species belonging to all genera from Callichilia and Tabernaemontana clades, by examination of vouchers deposited in the herbaria Z, WAG, L, K, and BR. In addition, we analyzed digitized images of herbaria collection available at the JSTOR and Aut websites, as well as by consulting specialized literature (Pichon 1948, Halle 1965, 1971, Beentje 1978, Barink 1984, Bisset 1989, Vonk & Leeuwenberg 1989, Leeuwenberg 1985a, 1985b, 1991, 1994). 37

Results Most clades retrieved in our analysis have high posterior probability (PP), with the taxa comprising the Callichilia clade (PP = 0.26), sensu Simões et al. (2010). Due to its low support, this group will be named Callichilia grade hereafter. This grade was divided into five clades formed by: (1) species of Carvalhoa, Schizozygia and Tabernanthe (PP = 1.0), (2) the three sampled specimens of T. aurantiaca (PP = 1.0), (3) species of Calocrater and Crioceras (PP = 1.0), (4) species of Voacanga (PP = 1.0) and (5) all species of Callichilia (PP = 0.74) (Figure 1). All Tabernaemontana species were recovered in a single clade with a high posterior probability (PP = 1.0). The relationships between the Carvalhoa-Schizozygia- Tabernanthe and T. aurantiaca clades with the other genus from Callichilia grade and Tabernaemontana still uncertain. The Tabernaemontana clade is divided into four major lineages, Asian (PP = 1.0), African (PP = 0.97), Malagasy (PP = 1.0) and Neotropical clades (PP = 1.0) (Figure 1). The four new sampled species from the neotropics (T. albiflora, T. angulata, T. oppositifolia, and T. wullschaegelii) are highly supported as a component of the Neotropical clade. Within the Asian clade, two supported clades were obtained. The first comprises most species that occur in the continental portion of Asia (East, South, and Southeast Asia) and Malesia (PP = 0.93), and the other for the great majority of the island species, from Malesia and Melanesia (PP = 0.98). These clades comprise species belonging to T. section Pagiantha, which have mericarps mostly subglobose (in some cases obliquely ellipsoid or oblong or ovoid, pod-like, fusiform and reniform) and dehiscent. Tabernaemotana divaricata and T. peduncularis are the first lineages to diverge in the Asian clade. From the sampled species of T. section Pagiantha, T. macrocarpa is distributed in the continental portion in Thailand and Malesia (Philippines, Malaysia, Brunei, and Indonesia) (Figure 2). Tabernaemontana sphaerocarpa distributes further south of Malesia (Indonesia: Bali, Flores, Java, Lombok, Seram, Sulawesi, Sula Islands, Sumba and Sumbawa). The species that occur further east of Melanesia are T.thurstonii and T. cerifera which are endemic in Fiji Islands and New Caledonia, respectively. Tabernaemontana remota has a more restricted distribution in Malesia, occurring in Sulawesi and Rossel Island, as T. salomonensis at Bougainville Island and the Solomon Islands. Tabernaemontana aurantiaca is distributed to eastern Malesia, at Melanesia and Micronesia in Palau, this occurs with the island species of T. sphaerocarpa, T. salomonensis, and T. remota all belonging to the subclade Malesia and Melanesia. In Callichilia grade all genera occur in Africa except some species for Voacanga. Of the 14 species currently recognized in Voacanga five occur only in Malesia and no species 38

occur in continental Southeast Asia only in the insular portion. Our morphological analysis reveals that T. aurantiaca is more similar to species from the Tabernaemontana clade than to species from the Callichilia grade (Table 1). Tabernaemontana aurantiaca shares with all species of Tabernaemontana the corolla lobes inflexed in the bud and with species of Asian clade the undifferentiated style head and absence of guide rails. With taxa from Callichilia grade, it shares the funnelform corolla with the monospecific Calocrater and Crioceras, and with some Callichilia and Voacanga, and indehiscent fruits with Calocrater, Tabernanthe and some Callichilia, but differs in the absence of a nectariferous disk and guide rails, and by the undifferentiated style head and corolla lobes inflexed in the bud (Table 1).

Discussion Our results corroborate the phylogenetic placement of Tabernaemontana aurantiaca previously reported by Simões et al. (2010). Specimens from this taxa were not nested within Tabernaemontana clade, even with the inclusion of morphologically alike species from the same geographic region in our study. The hypothesis of a sister relationship of T. aurantiaca to the remaining species of Tabernaemontana cannot be ruled out, due to the low statistical support of the Callichilia grade. Nevertheless, we assume that our study brings both morphological and phylogenetic evidence that justifies the reestablishment of a monospecific genus, Rejoua, to name a lineage morphologically alike but segregated from Tabernaemontana. As here defined, Rejoua aurantiaca shares with all other species of Tabernaemontana the corolla lobes inflexed in bud, a synapomorphy of the genus. It also shares with species of Tabernaemontana from Southeastern Asia the loss of anther guide rails and undifferentiated style head without apical and basal modifications (Leeuwenberg 1990, 1991). This simplified flower morphology of the androecium and gynoecium found in R. aurantiaca is also present in T. inconspicua, T. coffeoides Bojer ex Candole (1844: 370) and T. sessifolia (Leeuwenberg, 1991) which occur in continental Africa, Madagascar, Comoro Islands and Seychelles, suggesting a convergent evolution of these traits in these taxa. In addition, the pollen of R. aurantiaca resembles other paleotropical species of Tabernaemontana as T. elegans Staf (1894: 24), T. inconspicua, and T. odoratissima Staf (1906: 526) Leeuwenberg (1991: 50) (Van der Weide & Van der Ham 2012). In these species, pollen is densely perforated with relatively long colpi, characteristic that may be considered a putative synapomorphy for the Paleotabernaemontana clade (Van der Weide & Van der Ham 2012). 39

Our morphological analysis did not reveal shared and exclusive morphological characters between R. aurantiaca and species from the Callichilia grade. All taxa of this grade have anthers with guide rails and some degree of style head specialization, which has a lobed apex (5-10 lobes) in all species and a thickened basal ring, however absent in species of Callichilia, Calocrater, and Crioceras (Table 1). The fruit morphology of R. aurantiaca has caused its placement on a separate rank by previous taxonomists, either as a monospecific genus or as a section of Tabernaemontana. Its fruit has a spongy mesocarp, a characteristic known to be correlated to hydrochoric dispersion in several plant groups (Barroso et al. 1999). The most common fruit type in that subtribe Tabernamontaninae is a dry to fleshy follicle with arillate seeds and usually dehiscent (Endress & Bruyns 2000, Simões et al. 2010). In Tabernaemontana, some species occurring in the Neotropics, Africa, and Asia, the fruits lose the ability to open and functionally can be considered baccate, although they still form an arilloid structure around the seed and a discernible dehiscence line (Leeuwenberg 1991, 1994). This pattern was observed in T. sananho Ruiz & Pavón (1799: 22), an Amazonian species in which the dehiscence line was lignified by the thickening of adjacent cell walls (Leeuwenberg 1994) and in T. africana Hooker (1825: 389), T. brachyantha Stapf (1894: 22), T. contorta Stapf (1894: 23) and T. pachysiphon Stapf (1894: 22) in which a dehiscence line is discernible but no longer functional (Leeuwenberg 1991). These exceptions to the typical follicular fruit of Tabernaemontana, however, appear to have evolved in a convergent way and differ significantly from the fruits of R. aurantiaca, especially in the composition of the mesocarp and aril. The island distribution pattern of R. aurantiaca and part of the species of Voacanga, in a similar way to the phylogenetic geographical structure of major clades in Tabernaemontana, may depict the complex interaction between speciation, with geotectonic, climatological and dispersal events. However, a dated phylogeny and amplification of the sampled taxons from subtribe Tabernaemontaninae are needed to achieve a better understanding of biogeographic patterns in that group. In Tabernaemontana the African clade is sister of the Asian clade and this was subdivided in species most common in a continental portion of South Asia and the other for the great majority of the island species which corresponds to Malesia and Melanesia. Similar results were found for Begonia (Begoniaceae), in which the Asian species were divided into two clades (except three species) one composed by species distributed in continental Asia and the other by species distributed in Malesian (Thomas et al. 2012). In addition, Begonia masoniana and B. morsei form a sister clade with species distributed in Malesian; however, they are distributed in the continental portion of Asia (Thomas et al. 40

2012). In the Asian clade few species occur in Melanesia and none in Polynesia, only, T. padancaqui occurs in Australia and Micronesia (Leeuwenberg 1991), its current distribution does not represent the naturally occurring area of the species, as it is widely used in landscaping. The Pacific islands have a unique and complex geographical history with great differences in the age of formation, size, elevation, isolation, and connection between the different areas (Bird et al. 2005, Keppel et al. 2009, UNG et al. 2016). The diversity of some taxon generally decreases eastwards, depending on the size of the archipelago, as well as the age of formation and isolation (Keppel et al. 2009). Some studies have indicated that continental Asia and Malesia are important sources of taxon for the Pacific islands region, with multiple and independent dispersion events as well as subsequent interisland dispersals (Cronk et al. 2005, Thomas et al. 2012, Grudinski et al. 2014). However, recent dispersal events from east to west have been reported for some plant groups, such as Aglaia (Meliaceae) (Grudinski et al. 2014). In other lineages, Australia (Harbaugh & Baldwin 2007, Birch & Keeley 2013) and New Zealand (Keppel et al. 2009, Birch & Keeley 2013, Cantley et al. 2016) are also important source regions for the Pacific flora. Rejoua aurantiaca occurs in the easternmost portion of the Pacific Islands and the presence of a spongy mesocarp is possibly associated with hydrochoric dispersion (Barroso et al. 1999), suggesting a specialization of this taxa to the insular habitat. In conclusion, the fruit traits (indehiscence, spongy mesocarp, and reduced arils), floral morphology together with the phylogenetic placement of Rejoua aurantiaca give strong evidence that this species forms a separate lineage within tribe Tabernaemontaneae. For these reasons, we propose here the reestablishment of genus Rejoua, with a single species, R. aurantiaca, occurring in Palau, Indonesia, Papua New Guinea, Solomon Islands, and Vanuatu.

Taxonomic treatment Rejoua Gaudichaud (1829: 450). Tabernaemontana section Rejoua (Gaudich.) Leeuwenberg (1994: xvi), syn. nov. Rejoua aurantiaca (Gaud. 1826: 50) Gaudichaud (1829: 451). Tabernaemontana aurantiaca Gaudichaud (1826: 50), syn. nov. Type:—Indonesia, Rawak, Gaudichaud 123. Holotype: P00495908 (digital image in Jstor).

Trees or shrubs, up to 15m high. Leaves of a pair of equal to unequal, petiolate; leaves elliptic to obovate or narrowly, apex apiculate or acuminate at the apex, base cuneate or decurrent, 41

glabrous. Inflorescence few-flowered, lax, axillary or subterminal, branches covered by many scale-like bracts and pedicel scars. Flowers sweet-scented. Calyx greenish, lobes are suborbicular to broadly ovate, rounded or obtuse at the apex, glabrous, with opposite colleters adaxially. Corolla thin, tube narrowly funnelform, white or limb white and tube creamy or greenish with yellow or orange throat, in bud creamy. Mature bud with an ovoid head with a blunt or acute apex. Anthers oblong, apex acuminate ou apiculate, sagittate at the base, not sclerified, glabrous; pilose pubescent belt around the stamens inside the corolla or only with pubescent stripes among the anthers. Gynoecium 2-carpellate, ovary apocarpous, style-head non-differentiated, often with 5 shallow longitudinal grooves at the base. Fruit of 2 separate, indehiscent mericarps, usually only one reaching full development by abortion, mericarps orange or red, subglobose, obliquely pear-shaped, curled pod-like or an intermediate shape, smooth, 10-20 seeded, mesocarp spongy, whitish, pulp not separable from the wall; aril reduced white. Distribution and habitat:—The species occurs in Micronesia, Indonesia, Papua New Guinea, Solomon Islands, and Vanuatu, in riverine and swamp forests, less often in limestones (description and additional data adapted from Leeuwenberg, 1991).

Acknowledgments This work was part of the thesis of the first author, which was developed at the University of Campinas (UNICAMP) by the Graduate Program in Plant Biology, with a grant from the Coordination for the Improvement of Higher Education Personnel (CAPES) (PROEX0228087) and National Council for Scientific and Technological Development (CNPq) (142320/2015-3). I would like to thank all the members of the Laboratory of Molecular Biology of UNICAMP for assistance and support. References Akaike, H. (1974) A new look at the statistical model identification. IEEE Transactions on Automatic Control 19: 716-723. Atchadé, Y.F., Roberts, G.O. & Rosenthal, J.S. (2011) Towards Optimal Scaling of Metropolis Coupled Markov Chain Monte Carlo. Stat. and Comput. 21: 555-568. Baillon, H.E. (1888) nº 94. Bull. Mens. Soc. Linn. Paris 1: 745-752. Baker, J.G. (1883a) Contributions to the Flora of Madagascar-Part II Monopetalae. Journal of the Linnean Society, Botany 20: 159-236. Baker, J.G. (1883b) Recent Additions to our Knowledge of the Flora of Fiji. Journal of the Linnean Society, Botany 20: 358-373. 42

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47

TABLE 1. Comparison of selected morphological characters of taxa from the Tabernaemontana and Clallichilia clades.

Callichilia Genus Callichilia Voacanga Calocrater Crioceras Carvalhoa Schizoygia Tabernanthe Area of occurence African Africa and African African African African and African Malesia Comoro island

Number of species 6 14 1 1 1 1 2

Corolla shape salverform and Salverform and funnelform funnelform campanulate salverform salverform funnelform funnelform

Corolla lobe inflexed not inflexed not inflexed not inflexed not inflexed not inflexed not inflexed not inflexed in the bud

Lignified guide rails present present present present present present present

Style-head body apex lobed lobed lobed lobed lobed lobed lobed

Style-head body base not basal ring not not basal ring basal ring basal ring differentiated Nectariferous disk present present present present present present present

Fruit dehiscent and dehiscent dehiscent dehiscent dehiscent dehiscent indehiscent indehiscent

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Table 1. Continuation

Callichilia Tabernaemontana Genus T. aurantiaca Tabernaemontana Area of occurence Malesia, Melanesia African Southeast Asia, Malesia Madagascar1 Neotropics and Micronesia and Melanesia

Number of species 1 18 20 16 ≥ 61

Corolla shape funnelform salveform and salverform and tubular salverform and salveform, funnelform tubular tubular and tubular Corolla lobe inflexed in inflexed inflexed inflexed inflexed inflexed the bud Lignified guide rails absent mostly present2 absent mostly present3 present

Style-head body apex not lobed mostly lobed2 not lobed mostly lobed3 lobed

Style-head body base not mostly basal ring2 not mostly basal ring3 basal ring differentiated Nectariferous disk absent mostly absent4 absent absent absent and present

Fruit indehiscent dehiscent and dehiscent dehiscent dehiscent and indehiscent indehiscent

1: Species occurring in Madagascar and the other African islands east of the continent (Comoro Islands, Seychelles, Reunion, and Mauritius); 2: Tabernaeontana inconspicua is only that have undifferentiated style-head and absence of lignified guide rails; 3: T. coffeoides e T. sessifolia have undifferentiated style-head and absence of lignified guide rails; 4: T. elegans have disk-like thickening and T africana have sometimes at the base with an obscure disk-like thickening; 49

FIGURE 1. Maximum credibility trees based on the Bayesian analysis of the combined molecular dataset (rpl16, rps16, trnS-G, trnK and matK). Posterior probabilities are indicated in the branches.

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APPENDIX 1. Species, locality, vouchers, and GenBank accession numbers used in this study.

Tabernaemontana bovina, Vietnam, Quang Tri, Dong Che Massif, Polaine 10599, (L): Tabernaemontana thurstonii, Fiji, Tailevu, Ndakuivuna, A.C.Smith 7190, (L): Tabernaemontana albiflora, Suriname, Sipaliwini, Bakhuys Mountains, B.G. Bordenave et al. 8395, (L): Tabernaemontana albiflora, Suriname, Sipaliwini, Bakhuys Mountains, B.G. Bordenave et al. 8182, (L): Tabernaemontana angulata, Brazil, Pará, Salvaterra, S.S.Viana, and A.O.Simões, (MG): Tabernaemontana corymbosa, Thailand, D. Middleton 3948, (E): Tabernaemontana oppositifolia, Puerto Rico, Yabucoa, R.J.Wagner 1312, (L): Tabernaemontana remota, Indonesia, South Sulawesi, De Vogel 6121a, (L): Tabernaemontana salomonensis, Papua New Guinea, Bougainville Island, Buin, L.A.Craven and R.Schodee 244, (L): Tabernaemontana salomonensis, Solomon Islands, Guadalcanal, Duidui, R. Mauriasi et al. 2044, (L): Tabernaemontana wullschlaegelii, Jamaica, G. R. Proctor 35674 (L):

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APPENDIX 2. Primer sequence of the plastid regions used in this study.

cpDNA region Annealing Sequence Reference rpl16_ F71 52-60 GCTATGCTTAGTGTGTGACTCGTTG Baum et al. 1998 rpl16_ R1516 52-60 CCCTTCATTCTTCCTCTATGTTG Baum et al. 1998 rpl16 _513F 59-60 GGGAACGATGGAAGCTGTGAATGC Simões et al. 2004 rpl16 _542R 57-60 CGCGGGCGAATATTTACTCTTC Simões et al. 2004 rps16_F 52-55 GTGGTAGAAAGCAACGTGCGACTT Oxelman et al. 1997 rps16_R2 52-55 TCGGGATCGAACATCAATTGCAAC Oxelman et al. 1997 rps16_387Fa 52 CMSCGAAGTAATGCCTAAACC This project rps16_497Ra 52-55 AGATTCTTAAGTYRGCCCAG This project

trnS 52-60 GCCGCTTTAGTCCACTCAGC Hamilton 1999 trnG 52-58 GAACGAATCACACTTTTACCAC Hamilton 1999 trnSG_R675 58-60 CCCGCTACAATGCGATTATGT This project

matK_8F 52-55 AATTTCAAATGGAAGAAATC Civeyrel & Rowe 2001 matK _67R 49 CTGAAAGATAAGTGGATA This Project matK _503F 55-58 TCGCTATTGGGTAAAAGATGC Civeyrel & Rowe 2001 matK _565R 52-55 TTGTAGCAATAAGATTATTMC This project matK _842F 55 TCAGGCYAACTTAGGCTT This project matK _1040R 55 AATGATTGGACAATTGCT This project matK _1309F 49-52 GACTTTCTTGTGCTAGAACT Civeyrel & Rowe 2001 matK_1628R 55 CATGCTACATCAACATTTCAG Civeyrel & Rowe 2001 trnK _437F 49 TTCTCGATTTTTTCAATGAAT This Project trnK_590R 49-52 TCAACCYAATCGCTCTTTTGA This Project trnK_3914F 49-52 GGGGTTGCTAACTCAACGG Civeyrel & Rowe 2001 trnK_2R 49-58 AACTAGTCGGATGGAGTAG Civeyrel & Rowe 2001

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CAPÍTULO 2

Filogenia de Tabernaemontana L. seção Peschiera (Apocynaceae, Rauvolfioideae, Tabernaemontaneae)

RESUMO O gênero Tabernaemontana tem em torno de 115 espécies e foi previamente desmembrado em 32 gêneros por diversos autores, desde o século XIX, o qual dificultou a taxonomia do grupo. Das sete seções previamente reconhecidas no gênero, somente Pagiantha, Rejoua, e Peschiera foram recuperadas como monofiléticas. Apesar de extensa revisão taxonômica feita por Leeuwenberg (1991, 1994) e avanços no conhecimento sobre as relações filogenéticas do gênero (Simões et al., 2010). Tabernaemontana seção Peschiera tem muitas espécies com problemas de delimitação, os quais ocasionam problemas de identificação dos espécimes. Dentre essas T. laeta, T. catharinensis, T. hystrix e T. salzmannii apresentam ampla variação morfológica, os quais não se enquadram aos nomes associados. Além disso as relações interespecíficas das espécies que compõem T. seção Peschiera não são estabelecidas. O capítulo tem como objetivos, (1) inferir as relações interespecíficas das espécies de T. seção Peschiera e (2) inferir o posicionamento filogenético dos complexos taxonômicos T. catharinensis, T. hystrix, T. laeta e T. salzmannii. Os agrupamentos taxonômicos foram previamente separados em morfoespécies; para maiores detalhes consultar os capítulos 3 e 4. Tabernaemontana catharinensis foi separada em quatro morfoespécies (morfoespécies 1 a 4). A variação encontrada em T. laeta e T. hystrix foram divididas em sete táxons (T. hystrix e morfoespécies 6 a 10) e T. salzmannii em três morfoespécies (12 a 14). No total, incluímos 82 terminais na filogenia de T. seção Peschiera, dos quais oito são grupo externo. Das 12 espécies da seção, somente T. apoda não foi incluída na filogenia e para os táxons T. vanheurckii, T. cymosa, T. lagenaria e morfoespécie10 foi possível incluir somente um terminal na filogenia, e para morfoespécie13 até o momento não foi possível incluir nenhum terminal. Os fragmentos de DNA amplificadas correspondem às regiões dos espaçadores intergênicos trnS-trnG e psbA-trnH do cloroplasto e dos espaçadores internos transcritos (ITS1 e ITS2) do DNA ribossomal. Tabernaemontana seção Peschiera foi recuperada como monofilética. Os marcadores plastidiais e nuclear apresentaram baixo sinal filogenético, com poucas espécies monofiléticas e com incongruência entre os marcadores plastidiais e nuclear. Devido à incongruência entre os marcadores com diferentes tipos de heranças parentais a concatenação não é recomendada e optou-se por utilizar a filogenia obtida pelo marcador nuclear, pelo maior nível de resolução filogenética e concordância com a taxonomia do grupo. 54

Tabernaemontana arborea, T. heterophylla e as morfoespécies 2, 12 e 14 foram recuperadas como monofiléticas, e os táxons T. hystrix, T. lagenaria, T. linkii, morfoespécies 1, 3 a 11 foram recuperadas como parafiléticas pela filogenia gerada pelo ITS. As espécies T. arborea, T. vanheurckii, T. cymosa e T. heterophylla correspondem a linhagens pertencentes aos primeiros táxons a se divergirem e são espécies irmãs dos demais táxons de T. seção Peschiera. O baixo sinal filogenético observado na filogenia de T. seção Peschiera pode ser devido à diversificação recente do grupo, somado aos processos de hibridização e sorteamento incompleto das linhagens, sendo necessário a inclusão de um maior número de marcadores nucleares para elucidar a história evolutiva do grupo.

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ABSTRACT The genus Tabernaemontana has around 115 species and has been previously dismembered into 32 genera by several authors since the nineteenth century, which hindered the taxonomy of the group. Of the seven sections previously recognized in the genus, only Pagiantha, Rejoua, and Peschiera were recovered as monophyletic. Despite an extensive taxonomic review by Leeuwenberg (1991, 1994) and advances in knowledge about phylogenetic relationships of the genus (Simões et al., 2010). Tabernaemontana section Peschiera has many species with problems of delimitation, which causes problems of specimen identification. Among these T. catharinensis, T. hystrix, T. laeta, and T. salzmannii have a wide variation, which do not fit the associated names. Furthermore, the interspecific relationships of the species that make up T. section Peschiera are not established. The chapter aims, (1) to infer the interspecific relations of the species of T. section Peschiera and (2) to infer the phylogenetic positioning of the taxonomic complexes, T. catharinensis, T. hystrix, T. laeta, and T. salzmannii. Taxonomic groups were previously separated into morphospecies for more details see chapters 3 and 4. Tabernaemontana catharinensis was separated into four morphospecies (morphospecies 1 to 4). The variation found in T. laeta and T. hystrix was divided into seven taxa (T. hystrix, and morphospecies 6 to 10) and T. salzmannii divided into three morphospecies (morphospecies 12 to 14). We included 82 terminals in the phylogeny of the T. section Peschiera, eight of which corresponded to the outgroup. Of the 12 species in the section, only T. apoda was not included in the phylogeny and for taxons T. vanheurckii, T. cymosa, T. lagenaria, and morphospecies10 it was possible to include only one terminal in the phylogeny and for morphospecies13 until the moment it has not yet been possible to include any terminal in the phylogeny. The amplified DNA fragments corresponding to the regions of the intergenic spacers trnS-trnG and psbA-trnH of the chloroplast and the internal transcribed spacers (ITS1 and ITS2) of the nuclear ribosomal DNA. Tabernaemontana section Peschiera was recovered as monophyletic. Plastid and nuclear markers had a low phylogenetic signal, with few monophyletic species and with incongruence between plastid and nuclear markers with different types of parental inheritance. Due to the incongruence between the markers with different types of parental inheritance, concatenation is not recommended and it was decided to use the phylogeny obtained by the nuclear marker, due to the higher level of phylogenetic resolution and agreement with the taxonomic group. Tabernaemontana arborea, T. heterophylla, and morphospecies 2, 12, and 14 were recovered as monophyletic, and the taxa T. hystrix, T. lagenaria, T. linkii, and morphospecies 1, 3 to 11 were recovered as paraphyletic, by the phylogeny generated by the ITS. The species T. 56

arborea, T. vanheurckii, T. cymosa, and T. heterophylla correspond to lineages belonging to the first taxa to diverge and are sister species to the other taxa of T. section Peschiera. The low phylogenetic signal observed in the phylogeny of T. section Peschiera may be due to the recent diversification of the group, added to hybridization processes and incomplete lineages sorting, requiring the inclusion of a greater number of nuclear markers to elucidate the evolutionary history of the group.

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1. INTRODUÇÃO O gênero Tabernaemontana L. (Apocynaceae, Rauvolfioideae, Tabernaemontaneae) apresenta um extenso histórico taxonômico, no qual foi sucessivamente desmembrado em 32 gêneros distintos, por diversos autores desde o século XIX (Baillon, 1889; Boiteau e Allorge, 1976; Candolle, 1844; Don George, 1837; Du Petit-Thouars, 1806; Gaudichaud, 1829; Markgraft, 1935, 1937, 1938, 1941, 1972; Miers, 1878; Pichon, 1948; Stapf, 1902; Schumann, 1902; Woodson, 1941, 1960). Essa separação dificultou a taxonomia do grupo, devido ao estabelecimento de gêneros morfologicamente similares. A última revisão taxonômica para o gênero foi feita por Leeuwenberg (1991, 1994), o qual seguiu em grande parte a proposição sensu latu de Tabernaemontana de Pichon (1948), reconhecendo apenas Stemmadenia Benth. como gênero distinto. Além disso, propôs uma classificação de Tabernaemontana em sete seções, Bonafousia, Ervamatia, Pagiantha, Pandaca, Rejoua, Peschiera e Tabernaemontana (Leeuwenberg, 1990, 1991, 1994). As seções foram definidas com base na morfologia da inflorescência, formato da cabeça estilar, textura das folhas e corola, nível de inserção e formato das anteras e mericarpos (Leeuwenberg, 1990). Em sua circunscrição atual, Tabernaemontana apresenta como sinapomorfias os lobos da corola inflexos no botão e frutos sempre foliculares (Simões et al., 2010). As relações filogenéticas em Tabernaemontaneae foram elucidadas por Simões et al. (2010), com a utilização de cinco marcadores plastidiais. Das 115 espécies de Tabernaemontana atualmente reconhecidas, 70 foram incluídas na filogenia, e destas, 32 são neotropicais. Das sete seções previamente estabelecidas por Leeuwenberg (1990, 1991, 1994) somente T. seção Pagiantha, T. seção Peschiera e T. seção Rejoua foram recuperadas como monofiléticas (Simões et al., 2010). Das 12 espécies de T. seção Peschiera, nove espécies (T. arborea J.D. Sm., T. catharinensis A. DC., T. cymosa Jacq., T. heterophylla Vahl, T. hystrix Steud., T. laeta Mart., T. salzmannii A. DC., T. solanifolia A. DC. e T. vanheurkii Mull.Arg.) foram incluídas na filogenia do gênero (Simões et al., 2010). As espécies de T. seção Peschiera se distribuem nos Neotrópicos, das quais apenas T. apoda C. Wright e T. arborea não ocorrem no Brasil. As espécies de Tabernaemontana seção Peschiera são comuns em ambientes florestais, com grande número de espécies na Floresta Amazônica e posteriormente na Mata Atlântica, sendo que T. solanifolia é a única espécie da seção que ocorre no Cerrado (Leeuwenberg, 1991, 1994). As espécies de T. seção Peschiera têm inflorescências em geral laxas, maiores que as folhas subtendidas; corolas delicadas, com o tubo da corola mais largo na base (balão invertido), ou mais raramente quase cilíndrico; estames inseridos na metade 58

inferior do tubo, anteras sagitadas na base; cabeça estilar variável, frequentemente com 10 projeções basais agudas, suberetos ou ausentes e geralmente com 5 lóbulos ao redor do ápice estigmoide da cabeça estilar; mericarpos deiscentes, obliquamente elipsoides, com paredes grossas, muricados ou verrucosos (Leeuwenberg, 1990, 1994). Em Tabernaemontana seção Peschiera T. laeta, T. catharinensis, T. hystrix e T. salzmannii apresentam alta variação morfológica, os quais ocasionam problemas de identificação dos espécimes. Essa variação é ocasionada por problemas de circunscrição, onde a variação morfológica não se enquadra ao nome associado, ou em alguns casos a variação morfológica excede a variação inicialmente descrita para a espécie. Apesar da extensa revisão para o gênero e chaves de identificação disponíveis na literatura (Koch e Kinoshita, 2005; Leeuwenberg, 1994), as chaves de identificação, revisão e descrição dos nomes e sinônimos foram baseados na análise descritiva da variação morfológica, sem a inclusão de análises filogenéticas ou morfométricas para separar e identificar as espécies. Tabernaemontana catharinensis se distribui amplamente pelo Brasil, também ocorre na Argentina, Bolívia e Paraguai. Tabernaemontana hystrix e T. laeta têm uma área de distribuição sobreposta na região sudeste, entretanto T. laeta também ocorre na região nordeste do Brasil. Tabernaemontana salzmannii ocorre na região nordeste do Brasil, assim como no estado do Espírito Santo. Com base nas informações disponíveis na literatura (Koch e Kinoshita, 2005; Leeuwenberg, 1994) T. catharinensis difere de T. hystrix pela proporção do tubo em relação aos lobos da corola, número de flores por inflorescência, distância do ápice das anteras a fauce do tubo da corola e forma do ápice do botão floral. Já Tabernaemontana laeta difere das espécies citadas acima, pelas lacínias do cálice ovadas e patentes. Tabernaemontana catharinensis apresenta formas distintas, com variações no formato das folhas, comprimento da corola e indumento. Tabernaemontana hystrix também tem grande variação nos caracteres vegetativos e reprodutivos, sendo necessário a reavaliação da espécie e caracterização morfológica. Tabernaemontana salzmannii é distinta das demais pelas folhas coriáceas a subcoriáceas brilhantes, ápice foliar obtuso a obtuso-acuminado e venação terciária inconspícua. O presente capítulo tem como objetivos, inferir as relações interespecíficas das espécies que compõem Tabernaemontana seção Peschiera, assim como inferir o posicionamento filogenético das morfoespécies pertencentes aos complexos taxonômicos T. catharinensis, T. hystrix, T. laeta e T. salzmannii

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2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. Táxons amostrados Os espécimes incluídos na filogenia de Tabernaemontana seção Peschiera se encontram listadas no Apêndice A. No total foram incluídos oito terminais como grupo externo (T. amygdalifolia Jacq., T. angulata Müll. Arg. T. flavicans Roem. & Schult., T. sananho Ruiz & Pav. e Tabernaemontana sp.). Das 12 espécies de T. seção Peschiera, somente T. apoda não foi incluída na filogenia e para as espécies T. vanheurckii, T. cymosa, T. lagenaria Leeuwenb. e morfoespécie10 foi possível incluir somente um terminal na filogenia. O complexo T. catharinensis foi dividido em quatro morfoespécies sendo incluídos 16 terminais na filogenia (morfoespécie1 N = 7; morfoespécie2 N = 4; morfoespécie3 N = 4; morfoespécie4 N = 4), para maiores detalhes sobre as morfoespécies consultar o capítulo 3. Os complexos taxonômicos T. laeta e T. hystrix foram divididos em seis morfoespécies sendo incluídos 34 terminais na filogenia (morfoespécie6 N = 10; morfoespécie7 N = 5; morfoespécie8 N = 9; morfoespécie9 N = 2; morfoespécie10 N = 1; morfoespécie11 N = 3), para maiores detalhes sobre as morfoespécies consultar o capítulo 4. Além disso, incluímos quatro terminais de T. hystrix, essa variação morfológica é comumente identificada como T. hystrix nos herbários por especialistas da família. Para o complexo taxonômico T. salzmannii foram incluídos cinco terminais na filogenia, esse foi dividido em três morfoespécies (morfoespécie12 N = 2; morfoespécie14 N = 3), para a morfoespécie13 não foi possível incluir nenhum terminal, para maiores detalhes sobre as morfoespécies consultar o Apêndice B. 2.2. Extração, amplificação e sequenciamento Para obtenção do DNA total foram utilizados 20 mg de folhas provenientes de amostras de herbário e de sílica. A extração do DNA foi realizada com os kits de extração da DNeasy Plant Mini (QIAGEN Sample and Assay Technologies), NucleoSpin® Plant II (Macherey-Nagel), seguindo as especificações do protocolo, com pequenas alterações. Para algumas amostras o DNA total foi extraído por meio do protocolo de extração de CTAB (Doyle e Doyle, 1987), com modificações. Os fragmentos de DNA amplificados correspondem às regiões dos espaçadores intergênicos trnS-trnG e psbA-trnH do cloroplasto e do espaçadores internos transcritos (ITS 1 e ITS 2) do DNA ribossomal. Os primers utilizados e respectivas temperaturas de anelamento utilizadas se encontram descritas no Apêndice C. Para as reações de PCR utilizou-se o kit Platinum® Taq DNA Polymerase (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Corporation, Massachusetts, USA) e GoTaq® Green Master Mix 60

(Promega Corporation), conforme as especificações dos fabricantes, com pequenas alterações. Adicionalmente, foram acrescentados BSA (Albumina Sérica Bovina) a 10 mg/mL, Betaína a 1 M e DMSO (Dimetilsulfóxido) a 5% (Franckman et al., 1998). As etapas da reação da PCR no termociclador foram: (1) denaturação inicial a 94 ºC, por 3 min; (2) denaturação e separação da dupla hélice de DNA a 94 ºC, por 30 s; (3) anelamento dos primers ao DNA por 1 min em temperatura primer-específica; (4) extensão e síntese a 72 ºC, por 1 m 30 s; (5) etapa final a 72 ºC, por 5 min, em 35 ciclos. Alterações no número de ciclos e temperaturas de anelamento foram feitas de acordo com as necessidades específicas de cada marcador e a qualidade do DNA (Roux, 2008). Após a amplificação, as amostras foram purificadas utilizando-se os kits de purificação (Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System, da Promega Corporation, Madison, USA e QIAquick PCR Purification Kit da QIAGEN Sample and Assay Technologies) e enzimas de purificação (ExoSAP-IT® da USB® da Affymetrix, Thermo Fisher Scientific), e posteriormente enviadas para o sequenciamento. O sequenciamento foi feito no CBMEG (Centro de Biologia Molecular e Engenharia Genética da Universidade Estadual de Campinas) utilizando o sequenciador Applied Biosystems® 3500xL Genetic Analyzers (Life Technologies Corporation, Thermo Fisher Scientific Corporation, Massachusetts, USA). 2.3. Alinhamento e análise filogenética Os contigs e as edições das sequências foram feitos no programa Geneious v 9.1.8 (Kearse et al., 2012). As sequências foram alinhadas utilizando o programa MAFFT (Katoh et al., 2017). As análises foram realizadas individualmente para cada marcador (trnS-trnG, psbA-trnH, ITS1 e ITS2) e de forma concatenada para as diferentes regiões genômicas (cpDNA e nrDNA). A análise de máxima parcimônia (MP) foi feita no programa PAUP version 5.0 (Swofford e Bell, 2017), seguindo o critério de Fitch (1971). Todos os caracteres utilizados foram não ordenados e igualmente ponderados. Foram realizadas duas buscas heurísticas das árvores mais parcimoniosas. A primeira consistiu em buscas de árvores com 1000 réplicas aleatórias de adição aleatória das sequências (RASR), mantendo 10 árvores em cada etapa, usando o algoritmo TBR (Tree-Bissection-Reconnection) para rearranjo dos ramos, com as opções MULTTREES e Steepest Descent ativadas, com 100 árvores salva em cada réplica. Todas as árvores mais curtas foram salvas e utilizadas em uma segunda busca heurística, na qual envolve buscas exaustivas pelo algoritmo TBR (Tree Bisection-Reconnection). O suporte relativo de cada nó foi estimado usando o procedimento de reamostragem de bootstrap (Felsenstein, 1985), no qual foi utilizada uma busca heurística de 1000 réplicas, 250 RASR, 61

com três árvores mantidas em cada etapa, com as opções MULTTREES e Steepest Descent e 10 árvores salvas em cada RASR. A inferência Bayesiana (BI) foi feita no programa MrBayes 3.2 (Ronquist et al., 2012) pela plataforma CIPRES (via the CIPRES Science Gateway) (Miller et al., 2010). Os modelos de substituição de nucleotídeos foram determinados para cada marcador utilizando o programa jModelTest 2.1.7 (Darriba et al., 2012), sendo que o melhor modelo foi selecionado pelo Critério de Informação de Akaike (AIC; Akaike, 1974). Para a inferência Bayesiana foram executadas duas análises independentes e simultâneas, com 80.000.000 gerações pelo algoritmo Markov Chain Monte Carlo (Atchadé et al., 2011; Larget e Simon, 1999), com quatro cadeias cada, sendo três quentes e uma fria. As árvores de maior probabilidade posterior foram amostradas a intervalos de 8000 gerações, sendo que 25% das árvores iniciais foram posteriormente descartadas como burn-in. A convergência das cadeias e o tamanho efetivo das amostras dos parâmetros foram verificados no programa Tracer v 1.6 (Rambaut et al., 2014). As probabilidades posteriores (PP) dos ramos foram calculadas a partir de uma árvore de máxima credibilidade (maximum clade credibility), obtida no programa TreeAnnotator v.1.10 (Rambut e Drummond, 2017). As árvores de máxima credibilidade foram editadas e analisadas no programa FigTree v1.4.3 (Rambaut, 2016).

3. RESULTADOS As características das sequências dos marcadores moleculares utilizados se encontram descritas na Tabela 1. A matriz do ITS1 e ITS2 consistiu em 539 caracteres, dos quais 126 (23%) são variáveis, e desses 96 (18%) são parcimoniosamente informativos. O ITS1 consistiu em 295 caracteres, dos quais 75 (25%) são variáveis e 58 (20%) são parcimoniosamente informativos. O nível de variação no ITS2 foi menor, este apresentou 246 caracteres, dos quais 52 (21%) são variáveis e 39 (16%) são parcimoniosamente informativos. A matriz combinada dos marcadores plastidiais consistiu em 1523 caracteres, dos quais 267 (18%) são variáveis e 147 (10%) são parcimoniosamente informativos. Os marcadores plastidiais apresentaram um grande número de indels, devido a presença de dois microssatélites no espaçador psbA-trnH e um no espaçador trnS-trnG, sendo que o psbA-trnH teve um maior número de caracteres informativos (Tabela 1). Tabernaemontana seção Peschiera foi recuperada como monofilética para todos os marcadores, com alto valor de sustentação (Figuras 1 e 2), exceto para o ITS2 com baixo valor de probabilidade posterior e alto valor de bootstrap (PP = 0,67; BS = 87) (Apêndice D, Figuras 2). Para o marcador psbA-trnH não foi possível enraizar a árvore com todos os táxons 62

pertencentes ao grupo externo (Apêndice D, Figuras 4). Os marcadores plastidiais e nuclear apresentaram baixo sinal filogenético, com incongruência entre os marcadores com diferentes tipos de heranças parentais (Tabela 2, Figuras 1 e 2). As relações e clados recuperados pelos marcadores plastidiais foram coerentes entre si (Apêndice D, Figuras 3 e 4), assim como para o marcador molecular (Apêndice D, Figuras 1 e 2).

Tabela 1. Características das sequências dos marcadores do cpDNA (psbA-trnH e trnS-trnG) e nrDNA (ITS1 e ITS2) e informações das árvores individuais e combinadas. c: concatenado.

psbA-trnH trnS-trnG cpDNAc ITS1 ITS2 nrDNAc Comprimento das sequências 298-735 483-573 829 -1108 279-283 229-239 508-522 Número total de caracteres 863 660 1523 295 246 539 Caracteres constantes 659 587 1256 220 194 413 Número de caracteres 107 48 147 58 39 96 parcimoniosamente informativos Comprimento da árvore 427 89 508 107 71 179 Índice de consistência (CI) 0,59 0,91 0,63 0,85 0,80 0,823 Índice de retenção (RI) 0,67 0,97 0.74 0,95 0,90 0,93 Índice de homoplasia (HI) 0,41 0,09 0,37 0,15 0,20 0,18 Modelo evolutivo (critério BIC) TVM+G TVM+I c GTR+G HKY+G c

Tabela 2. Posição dos táxons nos clados nas filogenias recuperadas pelos marcadores plastidiais e nuclear. Táxons em branco não se posicionaram em nenhum dos dois clados.

Nuclear Plastidial Clado1 Clado2 Clado1 Clado2 T. arborea X T. cymosa X T. heterophylla X T. hystrix X X X T. linkii X X T. vanheurckii X Morfoespécie1 X X Morfoespécie2 X X Morfoespécie3 X X Morfoespécie4 X X Morfoespécie5 X X Morfoespécie6 X X X Morfoespécie7 X X Morfoespécie8 X X Morfoespécie9 X X Morfoespécie10 X X Morfoespécie11 X X Morfoespécie12 X X Morfoespécie13 X 63

Pela filogenia gerada pelo ITS Tabernaemontana seção Peschiera foi dividida em dois grandes clados. O primeiro (c1, PP = 1; BS = 100) (Tabela 2, Figura 1) composto por T. hystrix, T. linkii e as morfoespécies 1, 2, 9 e 10. Este clado um foi ainda subdividido em três subclados, o primeiro (sc1.1) composto pelos terminais das morfoespécies 9 e 10 (PP = 1; BS=90), o segundo (sc1.2) pelos espécimes da morfoespécie2 (PP = 1; BS = 100), e o terceiro (sc1.3) pelos táxons T. linkii e morfoespécie1 (PP = 0,99; BS = 100) (Figura 1). Na análise de MP, parte dos terminais identificados como T. linkii (exceto NB29 e NB39) formaram um clado com alto valor de sustentação (BS = 82), entretanto com baixo valor de probabilidade posterior (PP = 0,5) (Figura 1). O segundo clado recuperado pela ITS (c2, PP = 1; BS = 100) foi composto pelos táxons T. lagenaria e morfoespécies 3, 8, 12 e 14 (Figura 1). Esse segundo clado apresentou baixa resolução interna (Figura 1), sendo possível identificar somente dois subclados, um composto pela morfoespécie12 (sc2.1, PP = 0,99; BS = 100) e o outro pela morfoespécie14 (sc2.2; PP = 0,96; BS = 100). A análise de MP ainda recuperou mais três subclados, um formado pelos dois espécimes amostrados da morfoespécie5 e três espécimes da morfoespécie6 (TEO1, AL8 e ITA1), juntamente com o terminal TEO6_morfo4 (PP = 0,61; BS = 86) (Figura 1). O segundo subclado recuperado foi composto pela RO205_morfo7 e SJ17_morfo11 (BS = 98), sem sustentação na análise bayesiana (Figura 1). O terceiro subclado é formado pelos terminais da morfoespécie6 (UB59, RO195, VIC21 e TER1) e pelo terminal RO203_morfo7 (PP = 0,73; BS = 90) (Figura 1). Pela análise do ITS, T. arborea, T. vanheurckii, T. cymosa e T. heterophylla são os táxons resultantes das primeiras linhagens a se divergirem e são espécies irmãs dos demais táxons de Tabernaemontana seção Peschiera. Tabernaemontana arborea, T. heterophylla e as morfoespécies 2, 12 e 14 foram recuperados como monofiléticos pelo ITS, e T. hystrix, T. lagenaria, T. linkii e as morfoespécies 1, 3, 4 e 11 foram recuperadas como parafiléticas (Figura 1). A análise concatenada dos marcadores plastidiais recuperaram relações diferentes do marcador nuclear não sendo indicado a concatenação. Os marcadores plastidiais dividiram as espécies da seção em dois grandes clados, o primeiro (c1, PP = 0,94; BS = 83) (Figura 2) composto pelos táxons T. arborea, T. vanheurckii, T. heterophylla e morfoespécies 6 a 11 e parte dos espécimes identificados como T. hytrix. O clado um ainda foi divido em dois subclados (Figura 2), um composto pelos espécimes amostrados (sc1.1) de T. heterophylla, T. arborea e T. vanheurckii (PP = 97), e outro (sc1.2, PP = 1; BS = 100) composto por parte dos espécimes amostrados da morfoespécie6 (UB15, UB52, UB59, TER1 e RO195), T. hystrix (NB46 e NB47, PP = 1; BS = 94) e pela morfoespécie9 (PP = 1; BS = 94) e morfoespécie10 64

Figura 1. Árvore de máxima credibilidade para táxons pertencentes à Tabernaemontana seção Peschiera, obtida pela análise bayesiana para as regiões dos espaçadores internos transcritos 1 e 2 do nrDNA. Os valores de probabilidade posterior (PP) encontram-se abaixo dos ramos, seguido do valor de bootstrap (BS). Valores de probabilidade posterior ≤ 0,09 foram omitidos. -: terminal ausente na análise de MP. 65

(Figura 2). A análise de MP separou os espécimes PRA12_ morfo8 a PA175_morfo11 em um subclado distinto (BS = 83), além de recuperar as relações entre IPI5_morfo6 e RO205_morfo7 (BS = 83) (Figura 2). O segundo clado (c2) (PP = 98) recuperado pela análise concatenada dos marcadores plastidiais foi formado pela morfoespécie12 (DES13) e todos os terminais amostrados das morfoespécies pertencentes ao complexo taxonômico T. catharinensis (morfoespécies 1 a 4), T. linkii e morfoespécie5 e parte dos espécimes identificados como T. hystrix e morfoespécie6. O clado 2 foi subdividiu em dois subclados, o primeiro (sc2.1) separou DES13_morfo12, SJ12_morfo2, NB7_T. cymosa das demais (PP = 0,99) (Figura 2). O subclado 2.1 foi ainda subdividido em dois subclados o primeiro (sc2.1.1) composto pelos espécimes da morfoespécie3 e parte dos terminais da morfoespécie1 (NB50, LON1 e LON9) (PP = 0,94), com algum grau de resolução interna (Figura 2). O segundo subclado (sc2.1.2) foi composto pelos espécimes de T. linkii (PP = 0,91; BS = 94, exceto pela NB39). A análise de MP recuperou a relação NB55_morfo1, DF1_morfo5 e parte dos terminais identificados como morfoespécie4 (exceto TEO5) (BS = 82), assim como da CAMP152_morfo1 e FLO7_ morfo2 (PP = 0,82; BS = 89) (Figura 2). Pela análise concatenada dos marcadores plastidiais somente a morfoespécie9 foi recuperada com monofilética e os demais táxons como parafiléticos (Figura 2). As morfoespécies identificadas como T. catharinensis foram divididos em dois clados distintos no ITS, e somente a morfoespécie2 foi recuperada como monofilética. A morfoespécie1, apesar de ser recuperada como parafilética, formou com clado com T. linkii, com alto valor de sustentação (PP = 0,99; BS = 100) e distinta das demais morfoespécies pertencentes ao complexo taxonômico T. catharinensis (Figura 1). As morfoespécies 3 e 4 foram recuperadas em um segundo clado, sem resolução interna, entretanto os terminais identificados como morfoespécie3 foram separados dos demais terminais desse clado (PP = 0,85; BS = 100), apesar do seu parafiletismo (Figura 1). Na análise concatenada dos marcadores plastidiais os espécimes previamente classificados como T. catharinensis foram recuperados no mesmo clado, sem resolução interna. As morfoespécies 6, 7, 8 e 11 pertencentes aos complexos taxonômicos T. laeta e T. hystrix foram recuperadas no mesmo clado no ITS, juntamente com as morfoespécies 3, 4 e 5, sem resolução interna (Figura 1). As morfoespécies 9 e 10 formaram um clado no ITS, com alto valor de sustentação (PP = 1, BS = 90) (Figura 1), esse clado foi recuperado somente no ITS2 (PP = 0,99, BS = 91) (Apêndice D, Figura 2), e para o ITS1 a morfoespécie10 formou um clado com alto valor de sustentação com o terminal VIC10_T. hystrix (PP = 1, BS = 100) (Apêndice D, Figura 1). Na análise concatenada dos marcadores plastidiais a morfoespécie9 66

Figura 2. Árvore de máxima credibilidade para táxons pertencentes à Tabernaemontana seção Peschiera, obtida pela análise bayesiana da matriz concatenada das regiões do trnS-trnG e psbA-trnH do cpDNA. Os valores de probabilidade posterior (PP) encontram-se abaixo dos ramos, seguido do valor de bootstrap (BS). Valores de probabilidade posterior ≤ 0,09 foram omitidos. -: terminal ou clado não recuperado pela análise de MP; estrela: indica relações divergentes entre BI e MP; a MP dividiu as espécies pertencentes a morfoespécie7, morfoespécie8 e morfoespécie11 em um clado (BS=72), tendo a IPI5 como táxon irmão (BS=83). 67

foi recuperada como monofilética, assim como na análise separada para cada marcador plastidial. Na análise concatenada dos marcadores plastidiais os espécimes previamente classificados como morfoespécie6 se posicionaram ao longo dos dois clados, assim como T. hystrix (Figura 2). As morfoespécies 7, 8 e 11 foram recuperadas no mesmo clado, sem resolução interna.

4. DISCUSSÃO Na filogenia recuperada pelo ITS Tabernaemontana arborea, T. heterophylla e as morfoespécies 2, 12 e 14 foram recuperados como monofiléticas, entretanto os táxons T. hystrix, T. lagenaria, T. linkii e as morfoespécies 1, 3 a 11 foram recuperadas como parafiléticas. Pelo baixo sinal filogenético e incongruência entre os marcadores com diferentes tipos de heranças parentais, Tabernaemontana seção Peschiera é um grupo de diversificação recente, sendo necessário a inclusão de um maior número de marcadores nucleares para elucidar a história evolutiva do grupo e obter um melhor sinal filogenético. Os marcadores plastidiais e nuclear apresentaram baixo sinal filogenético, entretanto o nuclear teve maior número de caracteres variáveis e parcimoniosamente informativos. A taxa de evolução do genoma plastidial nas plantas é geralmente mais lenta do que o genoma nuclear (Greiner et al., 2011; Small et al., 2004). Em níveis taxonômicos mais baixos as regiões dos íntrons e espaçadores intergênicos plastidiais são utilizados nas inferências filogenéticas (Bailey et al., 2003; Small et al., 2004). No entanto, devido à baixa taxa de evolução do DNA plastidial, mesmo as regiões não codificantes podem fornecem baixo sinal filogenético, em grupos com divergência recente (Bailey et al., 2003; Small et al., 2004). O ITS (internal transcribed spacer) em comparação com os marcadores plastidiais não codificantes fornece uma melhor resolução filogenética, em níveis taxonômicos mais baixos (Álvarez e Wendel, 2003; Kuzoff et al., 1998; Mort et al., 2007). A incongruência entre os marcadores plastidiais e ITS já foram relatados em outros grupos de plantas (Albach e Chase, 2004; Degtjareva et al., 2012; Fehrer et al., 2007; Galbany-Casals et al., 2014; Lihová et al., 2006; Nishimoto et al., 2003; Pelser et al., 2010; Smith et al., 2017; Sun et al., 2015; Xu et al., 2012; Yang et al., 2016; Yu et al., 2013). A incongruência pode ser resultado de fenômenos biológicos, assim como de artefatos analíticos, entre esses, sequências parálogas, atração de ramos longos e baixo número de caracteres informativos (Degtjareva et al., 2012; Doyle, 1992; Pelser et al., 2010; Van der Niet e Linder, 2008). A incongruência também pode indicar diferenças na história evolutiva das regiões utilizadas de DNA, e entre os principais eventos comumente observados são a 68

hibridização e separação incompleta das linhagens, ambos geram padrões topológicos similares (Degnan e Rosenberg, 2009; Fujita et al., 2012; Maddison, 1997; Rosenberg e Nordborg, 2002; Szöllosi et al., 2015). A discriminação de um ou outro fenômeno biológico que gera incongruência entre as topologias requer um maior número de marcadores nucleares de regiões distintas, assim como de informações adicionais como nível de ploidia, idade do clado e área de ocorrência das espécies, os quais ajudam a compreender a história evolutiva do grupo (Alvarado-Sizzo et al., 2018; Pelser et al., 2010; Yang et al., 2019; Yu et al., 2013). Apesar de não ser possível inferir quais eventos estão ocasionando a incongruência entre os marcadores plastidiais e nuclear do presente estudo, a partir do conjunto de dados analisados, optamos por utilizar a topologia fornecida pelo marcador nuclear, por apresentar um maior número de caracteres informativos, por ser um marcador de herança biparental, além de refletir melhor a taxonomia do grupo. A filogenia inferida pelo ITS foi preferida por alguns autores, quando esta refletia a taxonomia do grupo (Albaladejo et al., 2005; Fehrer et al., 2007; Zhang et al., 2015). As espécies T. lagenaria e T. linkii são espécies bem definidas morfologicamente e com ecologias distintas. Tabernaemontana lagenaria e T. linkii ocorrem na Bacia Amazônica, sendo que T. lagenaria tem uma distribuição mais restrita (Brasil: Amazonas, Acre; Guiana Francesa e Peru), enquanto T. linkii tem uma distribuição mais ampla (Brasil: Amazonas, Acre, Pará, Amapá, Maranhão, Rondônia; Suriname; Guiana Francesa; Peru e Bolívia) (Leeuwenberg, 1994). As sépalas de T. lageraria são puberúlas em ambas as faces; as folhas são glabras e pecioladas, elípticas a estreito-elípticas, ápice foliar acuminado e base foliar cuneada (Leeuwenberg, 1994). Já em T. linkii o tubo da corola é estreito e lobos da corola curtos, no entanto são observadas variações nesses caracteres; a corola é amarela ou alaranjada, raramente branca; as folhas são pecioladas, elípticas a estreito-elípticas, ápice foliar acuminado e base foliar cuneada, os pecíolos podem ser glabros ou com pubescência esparsa e as folhas podem ser glabras ou pubescentes na face abaxial (Leeuwenberg, 1994). A morfoespécie2 será elevada à categoria de espécie, essa se enquadra na descrição da espécie tipo de T. catharinensis A. DC. (Candolle, 1844) (maiores detalhes consultar o capítulo 3). As morfoespécies 12 e 14 foram reconhecidos como linhagens distintas, sendo necessária uma reavaliação dos nomes associados à T. salzmannii e sinônimos descritos em outros nomes taxonômicos. Um grande número de táxons de T. seção Peschiera foram recuperados como parafiléticos. A ausência de monofiletismo pode ser devido ao número insuficiente de marcadores moleculares, o que reflete a especiação recente do grupo. Apesar do parafiletismo, alguns táxons têm caracteres morfológicos constantes, diferenças na 69

ecologia e área de ocorrência, sendo essas as morfoespécies 1, 3 e 6. A morfoespécie1 será reconhecida pelo nome T. hilariana Müll.Arg., para a morfoespécie3 é proposto um novo nome, T. caatingae (para maiores detalhes consultar o capítulo 3). A morfoespécie6 será reconhecida como T. laeta, apesar de ser recuperada como parafilética propomos uma delimitação mais restrito desse táxon (para maiores detalhes consultar o capítulo 4). Já para os táxons, T. hystrix e morfoespécies 7 a 11 é necessário à inclusão de um maior número de marcadores moleculares, assim como uma análise mais detalhada dos caracteres morfológicos para um posicionamento mais adequado.

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6. APÊNDICES

Apêndice A. Vouchers utilizados na extração de DNA e respectivas regiões amplificadas para os espécimes pertencentes à Tabernaemontana

seção Peschiera (Apocynaceae, Rauvolfioideae).

ID Seção Espécie Localidade Voucher trnH

-

ITS2 trnSG psbA ITS1 NB13 Tabernaemontana T. amygdalifolia Jacq. Brasil J.F. Morales et al. (INB) s s s

NB23 Bonafousia T. angulata Müll. Arg. Belém, PA, Brasil A.O. Simões (MG) s s s

NB24 Bonafousia T. angulata Presidente Figueiredo, AM, Brasil Sakagawa, S. & Ferreira, J.R.M. 510 (INPA) s s s NB22 Bonafousia T. flavicans Linhares, ES, Brasil N.G. Bordon & Bordon, C. 6 (UEC) s s s s NB21 Bonafousia T. flavicans Roem. & Schult. Itamaraju, BA, Brasil N.G. Bordon & Bordon, C. 8 (UEC) s s s s NB12 Bonafousia T. sananho Ruiz & Pav. Presidente Figueiredo, AM, Brasil Sakagawa, S. & Ferreira, J.R.M. 506 (INPA, UEC) s s s s

NB10 grupo externo Tabernaemontana sp. Brasil J.F. Morales et al. (INB) s s s NB8 grupo externo Tabernaemontana sp. Brasil Revilla, J. 2611 (INB, MO) s s s s NB41 Peschiera T. vanheurckii Müll. Arg. La Paz, Bolívia Fuentes, A. F. 4365 (BOLV, LPB, MA, MO, USZ) s s s s NB9 Peschiera T. arborea J. D. Sm. Brasil J.F. Morales et al. (INB) s s s s NB42 Peschiera T. arborea Nicaragua Stevens, W.D. & Montiel, O.M. 31459 (MO) s s s s NB7 Peschiera T. cymosa Jacq. Madre de Díos, Manu Province, Maceda, A.P. 1038 (BRIT-SMU-VDB) s s s s Peru NB11 Peschiera T. heterophylla Vahl Costa Rica J.F. Morales et al. (INB) s s s s

NB16 Peschiera T. heterophylla Presidente Figueiredo, AM, Brasil Silva, J.A.C. et al. 257465 (UEC, INPA) s s s NB30 Peschiera T. lagenaria Leeuwenb. Cruzeiro do Sul, AC, Brasil Ferreira, C.A.C. 5131 (UEC) s s s s NB20 Peschiera T. linkii A. DC Ariquemes, RO, Brasil Vieira, G. et al. 333 (MO, NY, INPA) s s s s NB25 Peschiera T. linkii Belém, PA, Brasil Simões, A.O. (MG) s s s s NB29 Peschiera T. linkii Belterra, PA, Brasil Francisco, J.N.C. et al. 87 (SPF) s s s s

77

Apêndice A. Continuação

trnH

-

ID Seção Espécie Localidade Voucher

ITS1 ITS2 trnSG psbA NB35 Peschiera T. linkii Rondônia, AC, Brasil Simão, M.R.V.C. et al. 233 (RB) s s s s NB38 Peschiera T. linkii Acrelândia, AC, Brasil Forzza, R.C. et al. 6200 (RB) s s s s NB39 Peschiera T. linkii Capixaba, AC, Brasil Daly, D.C. et al. 12024 (NY, RB) s s s s DF1 Peschiera Morfoespécie5 Brasília, DF, Brasil Bordon, N.G. & Castello, A.C.D DF1 (UEC) s s s s NB17 Peschiera Morfoespécie5 Brasília, DF, Brasil Silva; G.P. 6682 (UEC) s s s s CAMP86 Peschiera Morfoespécie1 Campinas, SP, Brasil Bordon, N.G. & Galvão, J.C. CAMP86A (UEC) s s s s CAMP152 Peschiera Morfoespécie1 Campinas, SP, Brasil N.G. Bordon s s s s LON1 Peschiera Morfoespécie1 Londrina, PR, Brasil Bordon, N.G. & Chaves, C.L. LON1 (UEC) s s s s LON9 Peschiera Morfoespécie1 Londrina, PR, Brasil N.G. Bordon s s s s NB50 Peschiera Morfoespécie1 Corrientes, Argentina Xifreda, C.C. & Maldonado, S. 563 (BAA, RB) s s s s

NB52 Peschiera Morfoespécie1 Bela Vista, MS, Brasil Hatschbach, G. et al. 76519 (RUSU, RB) s

NB55 Peschiera Morfoespécie1 Cacequi, RS, Brasil Záchia, R. et al. 6740 (FUEL) s FLO7 Peschiera Morfoespécie2 Florianópolis, SC, Brasil N.G. Bordon, A.C.D. Castello s s s s GUA5 Peschiera Morfoespécie2 Guaratuba, PR, Brasil N.G. Bordon s s s s

NB58 Peschiera Morfoespécie2 Porto Alegre, RS, Brasil A.O. Simões s s s SJ12 Peschiera Morfoespécie2 Silva Jardim, RJ, Brasil N.G. Bordon s s s s DOM17 Peschiera Morfoespécie3 Piripiri, PI, Brasil Bordon, N.G. & Castello, A.C.D. DOM17 (UEC) s s s s FOR2 Peschiera Morfoespécie3 Fortaleza, CE, Brasil Bordon, N.G. & Castello, A.C.D. FOR2 (UEC) s s s s SA18 Peschiera Morfoespécie3 Buriti dos Montes, PI, Brasil Bordon, N.G. & Castello, A.C.D. SA18 (UEC) s s s s TIA8 Peschiera Morfoespécie3 Tianguá, CE, Brasil Bordon, N.G. & Castello, A.C.D. TIA8 (UEC) s s s s TEO5 Peschiera Morfoespécie4 Itambacuri, MG, Brasil Bordon, N.G. & Bordon, C. TEO5 (UEC) s s s s TEO6 Peschiera Morfoespécie4 Itambacuri, MG, Brasil Bordon, N.G. & Bordon, C. TEO6 (UEC) s s s s TEO7 Peschiera Morfoespécie4 Itambacuri, MG, Brasil Bordon, N.G. & Bordon, C. TEO7 (UEC) s s s s 78

Apêndice A. Continuação

trnH

-

ID Seção Espécie Localidade Voucher

S1

IT ITS2 trnSG psbA TEO8 Peschiera Morfoespécie4 Itambacuri, MG, Brasil Bordon, N.G. & Bordon, C. TEO8 (UEC) s s NB44 Peschiera T. hystrix Resende, RJ, Brasil Marquete, R. et al. 3417 (IBGE, HRB, RB) s s s s NB46 Peschiera T. hystrix Rio de Janeiro, RJ, Brasil Braga, J.M.A. et al. 7259 (K, NY, RB) s s s s NB47 Peschiera T. hystrix Rio de Janeiro, RJ, Brasil Fraga, C.N. et al 3141 (UEC, SPF, K, NY, RB) s s s s VIC10 Peschiera T. hystrix Viçosa, MG, Brasil Bordon, N.G. & Castello, A.C.D. VIC10 (UEC) s s s s AL8 Peschiera Morfoespécie6 Alagoa Nova, PB, Brasil Bordon, N.G. & Chaves, C.L. AL8 (UEC) s s s s IPI5 Peschiera Morfoespécie6 Linhares, ES, Brasil Bordon, N.G. & Bordon, C. IPI5 (UEC) s s s s ITA1 Peschiera Morfoespécie6 Bom Jesus do Amparo, MG, Brasil Bordon, N.G. & Bordon, C. ITA1 (UEC) s s s s RO195 Peschiera Morfoespécie6 Rio das Ostras, RJ, Brasil N.G. Bordon s s s s TEO1 Peschiera Morfoespécie6 Campanário, MG, Brasil Bordon, N.G. & Bordon, C. TEO1 (UEC) s s s s TER1 Peschiera Morfoespécie6 Teresópolis, RJ, Brasil N.G. Bordon s s s s UB15 Peschiera Morfoespécie6 Ubatuba, SP, Brasil Bordon, N.G. & Simões, A.O. UB15 (UEC) s s s s UB52 Peschiera Morfoespécie6 Parati, RJ, Brasil Bordon, N.G. UB52 (UEC) s s s s UB59 Peschiera Morfoespécie6 Ubatuba, SP, Brasil Bordon, N.G. UB59 (UEC) s s s s VIC21 Peschiera Morfoespécie6 Viçosa, MG, Brasil N.G. Bordon s s s s COMB10 Peschiera Morfoespécie7 Linhares, ES, Brasil N.G. Bordon s s s s PRA1 Peschiera Morfoespécie7 Prado, BA, Brasil Bordon, N.G. & Bordon, C. PRA1 (UEC) s s s s RO203 Peschiera Morfoespécie7 Rio das Ostras, RJ, Brasil Bordon, N.G. & Bordon, C. RO203 (UEC) s s s s RO205 Peschiera Morfoespécie7 Rio das Ostras, RJ, Brasil Bordon, N.G. & Bordon, C. RO205 (UEC) s s s s TAY15 Peschiera Morfoespécie7 Rio das Ostras, RJ, Brasil Bordon, N.G. & Bordon, C. TAY15 (UEC) s s s s

COMB1 Peschiera Morfoespécie8 Aracruz, ES, Brasil Bordon, N.G. & Bordon, C. COMB1 (UEC) s s s

COMB8 Peschiera Morfoespécie8 Linhares, ES, Brasil Bordon, N.G. & Bordon, C. COMB8 (UEC) s s s DES2 Peschiera Morfoespécie8 Prado, BA, Brasil Bordon, N.G. & Bordon, C. DES2 (UEC) s s s s 79

Apêndice A. Continuação

nH

tr

-

ID Seção Espécie Localidade Voucher

ITS1 ITS2 trnSG psbA DES7 Peschiera Morfoespécie8 Prado, BA, Brasil N.G. Bordon s s s s IPI2 Peschiera Morfoespécie8 Linhares, ES, Brasil Bordon, N.G. & Bordon, C. IPI2 (UEC) s s s s PAS8 Peschiera Morfoespécie8 Prado, BA, Brasil N.G. Bordon s s s s PRA2 Peschiera Morfoespécie8 Prado, BA, Brasil Bordon, N.G. & Bordon, C. PRA2 (UEC) s s s s PRA6 Peschiera Morfoespécie8 Prado, BA, Brasil N.G. Bordon s s s s PRA12 Peschiera Morfoespécie8 Prado, BA, Brasil N.G. Bordon s s s s UB29 Peschiera Morfoespécie9 Ubatuba, SP, Brasil Bordon, N.G. & Simões, A.O. UB29 (UEC) s s s s UB70 Peschiera Morfoespécie9 Ubatuba, SP, Brasil N.G. Bordon s s s s TAY3 Peschiera Morfoespécie10 Rio das Ostras, RJ, Brasil Bordon, N.G. & Bordon, C. TAY3 (UEC) s s s s PA175 Peschiera Morfoespécie11 Silva Jardim, RJ, Brasil N.G. Bordon s s s s SJ1 Peschiera Morfoespécie11 Silva Jardim, RJ, Brasil Bordon, N.G. & Bordon, C. SJ1 (UEC) s s s s SJ17 Peschiera Morfoespécie11 Silva Jardim, RJ, Brasil N.G. Bordon s s s s DES13 Peschiera Morfoespécie12 Prado, BA, Brasil Bordon, N.G. & Bordon, C. DES13 (UEC) s s s s

PRA3 Peschiera Morfoespécie12 Prado, BA, Brasil Bordon, N.G. & Bordon, C. PRA3 (UEC) s s s NB14 Peschiera Morfoespécie13 Ilhéus, BA, Brasil J.W. Thomas et al. (CPEQ) s s s s NB18 Peschiera Morfoespécie13 Caravelas, BA, Brasil Folli, D.A. 6228 (CVRD, HUEFS) s s s s

NB48 Peschiera Morfoespécie13 Recife, PE, Brasil Silva, L.A. & Chagas, M.A. 118 (UFP) s s

VAL3 Peschiera Tabernaemontana sp. Linhares, ES, Brasil Bordon, N.G. & Bordon, C. VAL3 (UEC) s s s

80

APÊNDICE B. Descrição do complexo taxonômico Tabernaemontana salzmannii

Uma análise mais detalhada dos espécimes T. salzmannii coletados no município de Prado, Bahia revelou que esses tinham variações significativas nos caracteres florais, folhas e inflorescências (Figura 1A-H), os quais foram divididos em duas morfoespécies, morfoespécie12 (Figura 1A-D) e morfoespécie13 (Figura 1E-H). Outra possível morfoespécie foi incluída somente na análise filogenética e corresponde a morfoespécie14 (Figura 1I-L). Durante o período de coleta do presente estudo não encontramos nenhum indivíduo no campo, no entanto, a morfoespécie14 foi coletada por outros coletores nos estados de Bahia, Alagoas e Pernambuco. As morfoespécies 12 e 13 têm diferenças na forma dos botões florais de acordo com as análises iniciais da morfometria geométrica dos botões florais, assim como diferenças no comprimento da inflorescência, número de flores por inflorescência, comprimento e largura máxima da sépala, distância da fauce ao ápice das anteras, comprimento do tubo da corola e largura da lâmina foliar (Figura 2). A morfoespécie14 difere das demais pelo comprimento da inflorescência e sépalas, sendo essa última reflexa. 81

Apêndice B. Continuação

A B C D Figura 1. Inflorescências, flores, botões florais e folhas de: A-D) morfoespécie12, Prado, BA; E-H) morfoespécie13, Prado, BA; I-L) morfoespécie14, Ilhéus, BA.

E F G H

I J K L

82

Apêndice B. Continuação

Figura 2. Boxplot de 12 caracteres quantitativos de 7 espécimes para os caracteres florais e 9 espécimes para os caracteres foliares, pertencentes ao complexo morfológico Tabernaemontana salzmannii. Os retângulos são definidos 25 e 75 percentis; linhas horizontais dentro dos retângulos representam à média; círculos representam os valores extremos; os valores mínimo e máximo são representados por linhas horizontas curtas (“whiskers”). A: morfoespécie12; B: morfoespécie13. Letras em minúsculo representam o resultado do teste de post-hoc de Dunn, com base no valor de P corrigido de Bonferroni. Letras iguais são associadas ao P ≥ 0,05; letras diferentes são associadas a valores de P ≤ 0,05. 83

Apêndice C. Primers utilizados na filogenia de Tabernaemontana seção Peschiera (Rauvolfioideae, Apocynaceae) e respectivas temperaturas de anelamento.

Região do Temperatura Sequência Referência DNA de anelamento trnS 52 GCCGCTTTAGTCCACTCAGC Hamilton 1999 trnG 52 GAACGAATCACACTTTTACCAC Hamilton 1999 psbA 48 GTTATGCATGAACGTAATGCTC Shaw et al, 2005 trnHGUC 48 CGCGCATGGTGGATTCACAATCC Shaw et al, 2005

ITS_17SE ACGAATTCATGGTCCGGTGAAGTGTTCG 52 a 61 Sun et al, 1994 ITS_5.8I2 GCCTGGGCGTCACGC 52 a 61 Sun et al, 1994 ITS_5.8I1 52 a 61 GTTGCCGAGAGTCGT Sun et al, 1994 ITS_26SE 52 a 61 TAGAATTCCCCGGTTCGCTCGCCGTTAC Sun et al, 1994

ITS26S_21R 61 TGCTTAAACTCAGCGGGTAGT Presente estudo

ITS18S_25F 61 AAGTCGTAACAAGGTTTCCGT Presente estudo

ITS5.8_58R Seq. AAACTCGATGGTTCACGGGA Presente estudo

ITS5.8_50F Seq. GCAAACTGCGATACTTGGTGTG Presente estudo

Seq.: primers utilizado somente no sequenciamento. Referências Bibliográficas HAMILTON, M. B. Four primer pairs for the amplification of chloroplast intergenic regions with intraspecific variation. Molecular Ecology, v. 8, p. 513-525, 1999. SHAW, J. et al. The tortoise and the hare II: Relative utility of 21 noncoding chloroplast DNA sequences for phylogenetic analysis. American Journal of Botany, v. 92, p. 142-166, 2005. SUN, Y. et al. Phylogenetic analysis of Sorghum and related taxa using internal transcribed spacers of nuclear ribosomal DNA. Theor Appl Genet., v. 89, 26–32, 1994. 84

Apêndice D. Árvores de máxima credibilidade para os táxons pertencentes à Tabernaemontana seção Peschiera, obtida pela análise bayesiana.

Figura 1. Árvore de máxima credibilidade obtida pela inferência bayesiana para o ITS1 do nrDNA. Os valores de probabilidade posterior (PP) encontram-se abaixo dos ramos, seguido do valor de bootstrap (BS), Valores de probabilidade posterior ≤ 0,09 foram omitidos, -: terminal ausente na análise de MP; estrela: indica relações divergentes entre BI e MP, a relação entre os táxons NB11 e NB16 com os clados de NB46 a LON1 e com o clado DOM17 a RO194 foi sustentada somente pela análise MP com BS = 99. 85

Apêndice D. Continuação

Figura 2. Árvore de máxima credibilidade obtida pela inferência bayesiana para o ITS2 do nrDNA. Os valores de probabilidade posterior (PP) encontram-se abaixo dos ramos, seguido do valor de bootstrap (BS), Valores de probabilidade posterior ≤ 0,09 foram omitidos, -: terminal ausente na análise de MP (IPI2 sequência não foi obtida para esse marcador); estrela: indica relações divergentes entre BI e MP, para a MP está recuperou o clado da NB18 a COMB1 com BS = 87. 86

Apêndice D. Continuação

Figura 3. Árvore de máxima credibilidade obtida pela inferência bayesiana para o trnS-trnG (cpDNA). Os valores de probabilidade posterior (PP) encontram-se abaixo dos ramos, seguido do valor de bootstrap (BS). Valores de probabilidade posterior ≤ 0,09 foram omitidos, -: terminal ou clado não recuperado pela análise de MP. 87

Apêndice D. Continuação

Figura 4. Árvore de máxima credibilidade obtida pela inferência bayesiana para o psbA-trnH do cpDNA. Os valores de probabilidade posterior (PP) encontram-se abaixo dos ramos, seguido do valor de bootstrap (BS). Valores de probabilidade posterior ≤ 0,09 foram omitidos, -: terminal ou clado não recuperado pela análise de MP; estrela: indica relações divergentes entre BI e MP, a análise de MP recuperou a relação CAMP86, NB41, NB41 com NB13 com BS = 51; a MP recuperou o táxon NB17 como grupo irmão da TEO5 a TEO6 com BS = 54. 88

CAPÍTULO 3

Análise morfológica e morfométrica do complexo taxonômico Tabernaemontana catharinensis A. DC. (Apocynaceae, Rauvolfioideae, Tabernaemontaneae)

RESUMO Tabernaemontana catharinensis ocorre na Argentina, Bolívia, Paraguai e nas regiões nordeste, sul, sudeste e centro-oeste do Brasil. A espécie tem ampla variação nos caracteres florais, foliares e pubescência e foi previamente reconhecida em sete sinônimos e três variedades, por diversos autores. As informações disponíveis nas coleções herborizadas e chaves de identificação de T. catharinensis não permitem inferir se a variação morfológica corresponde a categorias taxonômicas distintas, ou se a espécie apresenta ampla variação morfológica. Nesse estudo analisamos a variação morfológica de T. catharinensis, com o objetivo de avaliar se as morfoespécies previamente estabelecidas correspondem a agrupamentos morfológicos distintos, utilizando a morfometria geométrica dos botões florais, morfometria linear e análise qualitativa dos caracteres florais e foliares. Tabernaemontana catharinensis foi dividida em quatro morfoespécies (morfoespécies 1, 2, 3 e 4), com base nos caracteres florais e foliares. Para os estudos morfológicos e morfométricos foram amostrados 156 espécimes de T. catharinensis (morfoespécie1 N = 49; morfoespécie2 N = 44; morfoespécie3 N = 59 e morfoespécie4 N = 4) distribuídos nas regiões sul, sudeste e nordeste do Brasil. Para a morfoespécie5 foram amostrados 25 espécimes, essa foi incluída, como base de comparação nas análises morfométricas, sendo essa morfologicamente e ecologicamente distinta de T. catharinensis. Para testar os agrupamentos morfológicos utilizamos a morfometria geométrica dos botões florais, nove caracteres florais quantitativos e dois foliares, assim como 15 caracteres qualitativos vegetativos e florais. Com base na forma dos botões florais, caracteres florais, foliares e vegetativos analisados foi possível reconhecer quatro espécies dentro do complexo taxonômico T. catharinensis. A morfoespécie1 formou um agrupamento morfológico distinto, com base na morfologia dos botões florais, caracteres florais e foliares analisados, essa variação morfológica será reconhecida como T. hilariana. A variação floral e vegetativa dos espécimes da morfoespécie2 se sobrepuseram com a morfoespécie3, entretanto, a morfoespécie3 foi à única que não apresentou projeções basais na cabeça estilar e distribuição geográfica disjunta, essa ocorre na Caatinga nos estados do Piauí e Ceará. A morfoespécie2 irá manter o nome de T. catharinensis e para a morfoespécie3 propomos um novo nome, T. caatingae, dado a singularidade e ocorrência restrita dessa 89

espécie. Propomos o reconhecimento da morfoespécie4, como T. solanifolia, e da morfoespécie5 como T. nervosa.

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ABSTRACT Tabernaemontana catharinensis occurs in Argentina, Bolivia, Paraguay, and in the northeast, south, southeast, and central-west regions of Brazil. The species has great variation in floral, foliar, and pubescence characters and was previously recognized in seven synonyms and three varieties, by several authors. The information available in the herborized collections and identification keys of T. catharinensis does not allow us to infer if the morphological variation corresponds to distinct taxonomic categories, or if the species presents a wide morphological variation. In this study we analyzed the morphological variation of T. catharinensis, to evaluate if the morphotypes previously established in the present study correspond to different morphological groups, using the geometric morphometry of floral buds, linear morphometry, and qualitative analysis of floral and foliar characters. Tabernaemontana catharinensis was divided into four morphospecies (T. catharinensis 1, 2, 3, and 4), based on floral and leaf morphological differences, and field observations. For morphological and morphometric studies were sampled 156 specimens of T. catharinensis (T. catharinensis1 N = 49; T. catharinensis2 N = 44; T. catharinensis3 N = 59; T. catharinensis4 N = 4), distributed in the south, southeast, and northeast regions of Brazil. For T. solanifolia, 25 specimens were sampled, which was included in the morphometric analysis, to serve as a basis for comparison, being this morphologically and ecologically distinct from the taxonomic complex T. catharinensis. To test the morphological groups the geometric morphometry of the floral buds was used, nine quantitative floral characters, and two foliar characters, as well as 15 qualitative vegetative and floral characters. Based on the shape of the floral buds, floral, foliar, and vegetative characters analyzed, it was possible to recognize four species within the taxonomic complex T. catharinensis. The specimens of T. catharinensis1 formed a distinct morphological grouping, based on the morphology of the flower buds, floral and foliar characters analyzed, this morphological variation will be recognized as T. hilariana. The floral and vegetative variation of T. catharinensis2 specimens overlapped with T. catharinensis3, however, T. catharinensis3 is the only species that does not have basal projections in the style head and disjunct geographic distribution, this occurs in the Caatinga in the states of Piauí and Ceará. The morphotype T. catharinensis2 will keep the name of T. catharinensis and for T. catharinensis3 we propose a new name, T. caatingae, given the singularity and restricted occurrence of this species. We propose the recognition of T. catharinensis4, as T. solanifolia, and the species used as an external group in the present study should be recognized as T. nervosa. 91

1. INTRODUÇÃO Tabernaemontana catharinensis conhecida popularmente como leiteiro-de-vaca, leiteiro e mata-pasto, é uma espécie de ampla distribuição nos neotrópicos, ocorre na Argentina, Bolívia, Paraguai e nas regiões nordeste, sul, sudeste e centro-oeste do Brasil (Koch e Kinoshita, 2005; Leeuwenberg, 1994). Na região sudeste do Brasil a espécie é considerada invasora e praga de pastagens, com alta densidade no sub-bosque de plantações de eucalipto, matas secundárias e áreas urbanas, a alta regeneração possivelmente se dá a partir da rebrota de raízes (Koch e Kinoshita, 2005). Na revisão elaborada por Leeuwenberg (1994) o autor destaca que a espécie apresenta alta variação na forma das folhas, indumento e comprimento da corola. Tabernaemontana catharinensis foi previamente descrita em diferentes nomes, na sua circunscrição atual, engloba sete sinônimos (Peschiera albidiflora Miers, T. acuminata Müll. Arg, T. affinis Müll. Arg., T. australis Müll. Arg., T. hilariana Müll. Arg., T. hybrida Hand.-Mazz., T. salicifolia Hand.-Mazz) e três variedades (P. affinis var. acuminata L. Allorge, P. affinis var. campestris Rizzini, T. affinis var lanceolata Müll. Arg., P. australis var. hilariana (Müll. Arg.) L. Allorge). A última revisão do gênero foi feita por Leeuwenberg (1994), essa se baseou na análise de exsicatas depositadas nos herbários, e abordou um tratamento taxonômico tradicional, sem incluir análises morfométricas ou filogenéticas. Na filogenia prévia do gênero foram incluídos poucos terminais de T. catharinensis (Simões et al. 2010). Além disso, Leeuwenberg (1994) destacou que os espécimes procedentes dos estados do Maranhão e Ceará podem ser considerados como uma forma distinta, devido a presença de tricomas no tubo da corola, porém não reconheceu essa variação como uma espécie distinta. As espécies de Tabernaemontana seção Peschieira têm flores e folhas similares, as flores são brancas a amareladas, com poucos caracteres divergentes. As espécies de T. seção Peschiera usualmente são separadas pelo formato e comprimento do tubo da corola, proporção do tubo da corola em relação aos lobos, distância do ápice das anteras a fauce ou da base do tubo da corola, forma do botão floral e ápice, curvatura das sépalas, tricomas nas estruturas florais e vegetativas, e em alguns casos pelas características foliares (Koch e Kinoshita, 2005; Leeuwenberg, 1994). Tabernaemontana catharinensis tem grande variação na forma das folhas, comprimento da corola e indumento, e as informações disponíveis nas coleções herborizadas, chaves de identificação e revisões (Koch e Kinoshita, 2005; Leeuwenberg, 1994) não permitem inferir se essa variação morfológica corresponde a categorias taxonômicas distintas ou se a espécie apresenta ampla variação morfológica. É necessária uma análise mais detalhada da variação morfológica floral e foliar, com a inclusão 92

de espécimes de diferentes populações e utilização de técnicas morfométricas, já que a taxonomia tradicional é limitada para separar a variação morfológica observada nessa espécie. Desta forma, é necessária uma análise populacional da variação morfológica encontrada nessa espécie afim de determinar se essa variação forma agrupamentos distintos e se esses correspondem a unidades taxonômicas distintas. Nesse estudo analisamos a variação morfológica de Tabernaemontana catharinensis, com o objetivo de avaliar se as morfoespécies aqui estabelecidas correspondem a agrupamentos morfológicos distintos, e se esses agrupamentos podem ser reconhecidos como espécies distintas. Para tal, utilizamos a morfologia tradicional aliada a morfometria geométrica dos botões florais, morfometria linear dos caracteres florais e foliares.

2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. Amostragem dos espécimes Amostramos 156 espécimes do complexo T. catharinensis. Os espécimes foram coletados em 16 localidades, distribuídas nas regiões sul (Paraná e Santa Catarina), sudeste (São Paulo, Rio de Janeiro e Minas Gerais) e nordeste (Ceará e Piauí) do Brasil (Figura 1). Essas localidades foram escolhidas pelo grande número de espécimes previamente coletados, de acordo com os dados extraídos do speciesLink e revisão do Leeuwenberg (1994), assim como da localidade do espécime tipo. As localidades e espécimes amostradas se encontram descritas no Apêndice A. Os materiais coletados de T. catharinensis foram separados em quatro morfoespécies (Figura 2). As morfoespécies foram separadas com base nos caracteres florais, foliares e hábito de vida (Figura 2). Para confirmar a separação e identificações das morfoespécies, as coleções de alguns herbários (RB, R, CVRD, FUEL, HCDAL, HERBAM, UFP, UFPB, UB, UEC e VIC), base de dados digitais (JSTOR, speciesLink, Reflora, Tropicos, NYBG e MNHN) e a revisão de Leeuwenberg (1994) foram consultados. Após a separação da variação morfológica encontrada no complexo taxonômico T. catharinensis em morfoespécies, essas foram submetidos às análises morfométricas iniciais para validação, e caso necessário foi feita a reavaliação das morfoespécies. No total coletamos 49 espécimes da morfoespécie1 (Figura 2 A-B, Apêndice A) coletados nos municípios de Campinas (SP) e Londrina (PR) (Figura 1). Para a morfoespécie2 amostramos 44 espécimes (Figura 2 C-D, Apêndice A) coletados nos municípios de Silva Jardim (RJ), Matinhos, Guaratuba (PR), Itajaí e Florianópolis (SC) (Figura 1). Para a morfoespécie3 amostramos 59 espécimes (Figura 2 G-I, Apêndice A) nos municípios de 93

Crateús, Viçosa do Ceará, Fortaleza, Ubajara (CE) e Piripiri (PI) (Figura 1), já para morfoespécie4 (Figura 2 E-F, Apêndice A) somente 4 espécimes foram coletados no município de Itambacuri (MG) (Figura 1). Para auxiliar na interpretação dos resultados incluímos 25 espécimes da morfoespécie5 como “grupo externo” (Figura 2 J-L, Apêndice A). Essa morfoespécie tem morfologia e ecologia distinta das demais morfoespécies de T. catharinensis. Essa mesma abordagem foi feita por outros autores (Palmquist et al., 2015; Püschel et al., 2014; Shipunov e Bateman, 2005).

Figura 1. Mapa de distribuição das populações pertencentes ao complexo taxonômico Tabernaemontana catharinensis. Triângulo: morfoespécie1; quadrado: morfoespécie2 círculo: morfoespécie3; pentágono: morfoespécie4; CAMP: Campinas, São Paulo; LON: Londrina, Paraná, FLO: Florianópolis, Santa Catarina; GUA: Guaratuba, Paraná; IJA: Itajaí, Santa Catarina; MAT: Matinhos, Paraná; SJ: Silva Jardim, Rio de Janeiro; DOM: Piripiri, Piauí; FOR: Fortaleza, Ceará; SA: Crateús, Ceará e Buriti dos Montes, Piauí; TIA: Tianguá, Ubajara e Viçosa do Ceará, Ceará; TEO: Itambacuri, Minas Gerais.

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Figura 2. Inflorescência, flores, botões A B C D florais e forma de vida das morfoespécies pertencentes ao complexo taxonômico T. catharinensis: A-B) morfoespécie1, Londrina, PR; C- D) morfoespécie2, Itajaí e Florianópolis, SC; E-F) morfoespécie4, Itambacuri, MG; G-I) morfoespécie3, Fortaleza, CE; J-L) morfoespécie5, E F G H Brasília, DF.

I J K L 95

2.2. Morfometria geométrica, linear e caracteres discretos

Para todos os espécimes coletados, os botões florais, flores e inflorescências foram fixados em álcool 70%, para obtenção das imagens dos botões florais, medidas lineares dos caracteres florais, comprimento da inflorescência e número de flores por inflorescência. O material fixado em álcool 70% também foi utilizado para a análise qualitativa dos caracteres florais. Para todos os espécimes coletados foram montadas exsicatas e essas foram utilizadas para análise qualitativa dos caracteres vegetativos e para a obtenção das medidas foliares. Para obtenção da forma dos botões florais utilizamos cinco botões florais por espécime, no mesmo estágio de desenvolvimento. As imagens foram feitas com uma câmera digital Nikon D80 e lente Nikon AF-S Micro Nikkor 105 mm 1: 2.8 GED, acoplados a um tripé para padronização das imagens (Zelditch et al., 2012). Para cada botão floral foram colocados nove landmarks e seis semilandmarks (ponto médio entre dois landmarks) (descritos no Apêndice B) distribuídos na base do tubo floral, estreitamento do tubo floral e cabeça do botão floral, os quais foram digitalizados utilizando o programa tpsDig2 ver. 2.26 (Rohlf, 2016). Para quantificar o erro nas etapas de obtenção das imagens e colocação dos landmarks, foram tomadas duas imagens para cada botão floral (Cardini e Elton, 2007; Zelditch et al., 2012). Para as medidas lineares dos caracteres florais utilizamos em média cinco flores por espécime. Mensuramos o comprimento do lobo da corola (CL), comprimento da sépala (CS), comprimento do tubo da corola (CTC), assim como a largura da base do lobo da corola (LBL), largura máxima do lobo da corola (LML), largura máxima da sépala (LS) e distância da fauce ao ápice das anteras (DFA). Para medir o comprimento total da inflorescência (CI) e quantificar o número total de flores por inflorescência (TF), utilizamos em média cinco inflorescências por espécime. Para aferir o comprimento (C) e largura (L) da lâmina foliar utilizamos em média oito folhas por espécime. As medidas florais e foliares foram aferidas por meio de um paquímetro digital. Para os caracteres discretos utilizamos 15 caracteres florais e vegetativos, esses se encontram descritos na Tabela 1. Para a morfoespécie4 não foi possível incluir as medidas foliares e caracteres discretos pela insuficiência de material coletado.

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Tabela 1. Caracteres vegetativos e florais discretos analisados nos espécimes pertencentes ao complexo taxonômico T. catharinensis e grupo externo (morfoespécie5).

Caracteres qualitativos Estado de Caráter Curvatura da sépala (0) inflexa; (1) reflexa Margem da sépala ciliada (0) ausente; (1) presente Pubescência na face abaxial da sépala (0) ausente; (1) presente Pubescência na face adaxial da sépala (0) ausente; (1) presente Pubescência na face externa do tudo da corola (0) ausente; (1) presente Pubescência na face interna do tubo da corola (0) ausente; (1) presente Pubescência no ovário (0) ausente; (1) presente Projeções basais na cabeça estilar (0) ausente; (1) presente Lobos apicais na cabeça estilar (0) ausente; (1) presente Porção mediana da cabeça estilar com sulcos longitudinais (0) ausente; (1) presente Pubescência no pecíolo foliar (0) ausente; (1) presente Pubescência na face abaxial da lâmina foliar (0) ausente; (1) presente Pubescência na face adaxial da lâmina foliar (0) ausente; (1) presente Pubescência no pedúnculo e pedicelo da inflorescência (0) ausente; (1) presente Pubescência nas brácteas da inflorescência (0) ausente; (1) presente

2.3. Análise estatística Devido à baixa disponibilidade de botões florais, flores ou folhas para alguns espécimes, cada conjunto de dados foram analisados separadamente: morfometria geométrica dos botões florais (dataset1), medidas lineares dos caracteres florais (dataset2), medidas lineares do comprimento e largura da lâmina foliar (dataset3). Posteriormente uma análise conjunto das medidas lineares florais e foliares (dataset4), no entanto, com um número reduzido de espécimes. Uma segunda análise conjunta global foi feita com as medidas lineares dos caracteres florais e foliares, caracteres discretos e resultados da ordenação da forma dos botões florais (dataset5). Para o dataset5 além dos caracteres contínuos incluímos a razão da largura pelo comprimento da sépala (L/C sep), razão entre comprimento do lobo da corola pelo comprimento do tubo da corola (CL/CTC), razão entre distância da fauce ao ápice das anteras pelo comprimento do tubo da corola (DFA/CTC) e razão entre largura pelo comprimento da lâmina foliar (L/C). Os dados de morfometria geométrica dos botões florais foram tratados em duas dimensões com simetria e as informações da forma foram extraídas das coordenadas dos landmarks e semilandmarks por meio do ajuste de Procustes (Generalized Least-Squares Procrustes Fit), onde as diferenças residuais medem as variações na forma (Zelditch et al., 97

2012). A partir da matriz de covariância do dataset1 foi feita a análise de componentes principais (PCA) somente para o componente simétrico, para determinar se algum agrupamento morfológico era detectável, sem nenhuma designação a priori. Para as análises a posteriori utilizou-se a análise de variáveis canônicas (CVA) e a análise de função discriminante (DFA). Para a CVA e DFA utilizou-se o teste de permutação para as distâncias de Mahalanobis e de Procustes, com 10.000 iterações e corridas, para testar as diferenças entre os grupamentos morfológicos estabelecidos a posteriori. As análises foram feitas no programa MorphoJ (Klingenberg, 2011). Para os datasets 2, 3 e 4 as medidas lineares foram padronizadas utilizando o escore-Z, onde para cada observação foi subtraída a média geral para cada caráter e dividido pelo desvio-padrão (Gotelli e Ellison, 2011; Legendre e Legendre, 1998). Aplicamos a análise de componentes principais (PCA) e análise de discriminantes (LDA). A significância dos escores dos componentes principais foram testados pelo teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, utilizando os valores de P corrigidos por Bonferroni. A análise de discriminantes também fornece uma tabela das flores e folhas classificadas corretamente e incorretamente (Gotelli e Ellison, 2011; Legendre e Legendre, 1998). Para os datasets 2 e 3 aplicamos a análise univariada dos caracteres quantitativos, no qual utilizamos o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis, utilizando o teste de post-hoc de Dunn, com os valores de P corrigidos por Bonferroni. As análises foram executadas no programa Past versão 3.20 (Hammer et al., 2001). Para o dataset5 aplicamos a análise de coordenadas principais (PCoA), nessa análise utilizamos os escores do PC1 e PC2 da ordenação da forma dos botões florais e tamanho do centroide, ambos fornecidos pelo MorphoJ, sendo esses calculados somente para a repetição um. O tamanho do centroide é uma medida de tamanho do botão floral que é matematicamente independente da forma (Zelditch et al., 2012). Para a PCoA utilizou-se a distância de Gower indicada para dados mistos, e com a normalização de amplitude. Todas as análises foram executadas no programa Past versão 3.20 (Hammer et al., 2001).

3. RESULTADOS 3.1. Morfometria geométrica dos botões florais (dataset1) O primeiro componente principal capturou 59% e segundo 19% da variação na forma dos botões florais (Figura 3). O PC1 indicou mudanças nas cabeças dos botões florais, com mudanças nos landmarks 5 e 6 (correspondentes 10 e 11) e semilandmark 7 (correspondente 9), tanto nos posicionamentos como nos distanciamentos (Figura 4). No PC1 observamos 98

mudanças de uma forma largo-elíptica, com transições para uma forma mais trulada das cabeças dos botões florais, com aumento progressivo do tamanho da cabeça do botão floral e diminuição do comprimento do tubo floral, os quais corresponderam aos landmarks e semilandmarks 1 ao 5 (correspondentes 11 ao 15), também houve um encurtamento do estreitamento do tudo floral, os quais corresponderam aos landmanks e semilandmarks 3 a 5 (correspondentes 11 a 13) (Figura 4). O PC1 separou as morfoespécies 2, 3 e 4 das demais, onde houve uma diminuição da cabeça do botão floral e aumento do tubo floral, já na morfoespécie1 houve uma diminuição do tubo floral e aumento da cabeça do botão floral, sendo essa trulada (Figura 4). Na morfoespécie5 houve um aumento da cabeça do botão floral sendo essa triangular e diminuição do tubo floral (Figura 4). No PC2 houve mudanças na espessura da base e estreitamento do tubo floral, no qual se referem aos landmarks e semilandmarks 1 ao 5 (correspondentes 11 a 15) (Figura 4). Também foram observadas mudanças no posicionamento e distanciamento entre os landmarks 5 e 6 (correspondentes 10 e 11) da cabeça dos botões florais (Figura 4). Uma mudança menos acentuada foi observada no distanciamento entre o landmark 6 (correspondente 10) com o semilandmark 7 (correspondente 9), com mudança progressiva de uma cabeça dos botões florais mais triangulares para elípticas (Figura 4).

Figura 3. Análise de componentes principais (PC) da forma dos botões florais (dataset1) das morfoespécies pertencentes ao complexo taxonômico T. catharinensis e grupo externo (morfoespécie5). 99

Figura 4. Análise de componentes principais (PC) da forma dos botões florais (dataset1) das morfoespécies pertencentes ao complexo taxonômico T. catharinensis e grupo externo (morfoespécie5). O wireframe em preto representa a forma média geral para os fatores de escalas do PC1 e wireframe em azul para o PC2.

O CV1 capturou 52% da variação na forma dos botões florais e o CV2 39% (Figura 5). As formas dos botões florais das morfoespécies 1 e 5 se diferenciaram pelos CVs 1 e 2 (Figura 5), com sobreposição parcial entre as morfoespécies 2, 3 e 4. Apesar dessa sobreposição entre as morfoespécies 2, 3 e 4 o teste de permutação indicaram diferenças, tanto para a distância de Mahalanobis como Procustes (Tabela 2). Na análise de variáveis canônicas somente para essas três morfoespécies houve uma maior sobreposição entre as morfoespécies 2 e 3, posteriormente com a morfoespécie4 (Figura 6). Essa sobreposição foi indicada pelo número de botões florais classificados incorretamente pela análise de discriminante (DFA) entre as morfoespécies 2 e 3 que foi de 15%, e entre a morfoespécie 3 com a morfoespécie 2 de 9%, as demais comparações pareadas não ultrapassaram os 5%.

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Tabela 2. Distâncias de Mahalanobis e Procustes e respectivas probabilidades obtidas pelo teste de permutação da diferença na forma dos botões florais (dataset1) das morfoespécies pertencentes ao complexo taxonômico T. catharinensis e grupo externo (morfoespécie5). Valores de P significativos se encontram em negrito. morfo1: morfoespécie1; morfo2: morfoespécie2; morfo3: morfoespécie3; morfo4: morfoespécie4; morfo5: morfoespécie5.

morfo1 morfo2 morfo3 morfo4 morfo5 Distância de Mahalanobis: triangulo superior é os P-valor do teste de permutação; triangulo inferior são as distâncias entre espécies Morfoespécie1 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 Morfoespécie2 5,29 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 Morfoespécie3 5,67 2,51 Morfoespécie4 4,72 2,83 3,90 < 0,01 Morfoespécie5 6,84 5,47 6,81 6,83 Distância de Procrustes: triangulo superior é os P-valor do teste de permutação; triangulo inferior são as distâncias entre espécies

Morfoespécie1 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 Morfoespécie2 0,09 < 0,01 < 0,01 < 0,01

Morfoespécie3 0,11 0,03 < 0,01 < 0,01 Morfoespécie4 0,09 0,04 0,05 < 0,01

Morfoespécie5 0,11 0,13 0,16 0,15

Figura 5. Análise de variáveis canônicas (CVA) da forma dos botões florais (dataset1) das morfoespécies pertencentes ao complexo taxonômico T. catharinensis e grupo externo (morfoespécie5). 101

Figura 6. Análise de variáveis canônicas (CVA) da forma dos botões florais (dataset1) das morfoespécies 2, 3 e 4 pertencentes ao complexo taxonômico T. catharinensis.

3.2. Caracteres florais e foliares contínuos e discretos Caracteres florais contínuos (dataset2): o primeiro e segundo componentes principais contabilizaram 58% da variação na morfologia floral (Apêndice C, Tabela 1). O gráfico dos escores do componente 1 e 2 indicaram sobreposição nos caracteres florais para algumas morfoespécies (Apêndice C, Figura 1), entretanto com diferenças nos escores dos componentes principais testados (Apêndice C, Tabela 1), assim como na comparação pareada entre as morfoespécies (Apêndice C, Tabela 2). O eixo um da análise de discriminante explicou 61% da variação nos dados florais, o segundo e terceiro explicaram 25% e 9%, respectivamente. O gráfico de dispersão dos caracteres pela análise de discriminante indicou alta sobreposição entre as morfoespécies 2 e 3, e para as demais morfoespécies sobreposição marginal (Figura 7). No total 85% das flores foram corretamente classificadas, os maiores números de classificações incorretas ocorreram nas morfoespécies 2 (20,67%), 3 (21,54%) e 4 (15%) e os menores números nas morfoespécies 1 (4%) e 5 (9%). Caracteres foliares contínuos (dataset3): o primeiro componente principal contabilizou 79% na variação do comprimento e largura foliar e o segundo 21% (Apêndice C, Tabela 1) e indicaram sobreposição parcial entre as morfoespécies, exceto para a 102

morfoespécie3 e morfoespécie5, as quais apresentaram variação foliar sobreposta (Apêndice C, Figura 2), sem diferenças na comparação pareada dos escores dos componentes principais entre as duas morfoespécies (Apêndice D, Tabela 2). O gráfico de dispersão da análise de discriminante (Figura 8) foi semelhante à PCA. No total 72% das folhas foram corretamente classificadas, os maiores números classificações incorretas ocorreram nas morfoespécies 2 (36%), 3 (54%) e 5 (48%) e os menores valores na morfoespécie1 (3%).

Figure 7. Gráficos de dispersão dos eixos 1 e 2 da análise de discriminantes de 116 espécimes pertencentes ao completo taxonômico T. catharinensis e grupo externo (morfoespécie5) baseado em nove caracteres florais contínuos (dataset2).

Figura 8. Gráficos de dispersão dos eixos 1 e 2 da análise de discriminantes de 127 espécimes pertencentes ao complexo taxonômico T. catharinensis e grupo externo (morfoespécie5) baseado no comprimento e largura da lâmina foliar (dataset3). 103

Análise conjunta dos caracteres florais e foliares (dataset4): o gráfico gerado pela análise de discriminante indicou sobreposição entre as morfoespécies 2 e 3 (Figura 9), com menor sobreposição no eixo 3 (gráfico não apresentado). Na comparação pareada dos escores dos componentes principais os dois táxons diferiram nos PCs 1, 2, 4 e 5 (Apêndice C, Tabela 2). Nenhuma sobreposição foi observada nas morfoespécies 1 e 5 (Figura 9). No total 96% dos dados foram corretamente classificados e o maior número de classificações incorretas ocorreram na morfoespécie2 (11%), menores nas morfoespécies 1 (1%) e 3 (1%).

Figure 9. Gráficos de dispersão dos eixos 1 e 2 da análise de discriminantes de 76 espécimes pertencentes ao complexo taxonômico T. catharinensis e grupo externo (morfoespécie5), baseado em 11 caracteres florais e foliares contínuos (dataset4).

Caracteres qualitativos: as descrições detalhadas dos caracteres vegetativos e florais analisados encontram-se descritos no Apêndice E e resumidos na Tabela 3. Todos os espécimes do complexo taxonômico T. catharinensis tem sépalas reflexas, pubescência interna na corola (tricomas infra e supraestaminal), lobos da corola deflexos, com algum grau de torção, ápice da cabeça estilar com 5 lóbulos e pubescência nos verticilos florais e vegetativos variáveis entre populações, indivíduos e dentre os indivíduos para todas as morfoespécies de T. catharinensis. As projeções na base da cabeça estilar estavam ausentes na maioria das flores analisadas da morfoespécie3. Análise conjunta global (dataset5): o eixo um e dois da análise de coordenadas principais (PCoA) capturaram 55% na variação dos dados, com sobreposição entre as morfoespécies (Figura 10). Devido à alta variação entre e dentre os espécimes na presença e ausência de pubescência nos caracteres florais e vegetativos da morfoespécie1 (Apêndice E), 104

parte dos espécimes (LON16, CAMP152 e CAMP92) foram separados dos demais, sendo que o mesmo ocorreu para a morfoespécie2 (FLO2, FLO8 e FLO11). Para a morfoespécie3, apesar da variação na pubescência, essa variação foi melhor distribuída entre os espécimes. Com a retirada desses espécimes (LON16, CAMP152, CAMP92, FLO2, FLO8 e FLO11) a sobreposição entre as morfoespécies foi menor (Figura 11). As morfoespécies 1 e 5 se separaram nas coordenadas 3 e 4 (gráfico não apresentado). A sobreposição entre as morfoespécies 2 e 3 foi devido à presença e ausência de projeções basais na cabeça estilar, em alguns espécimes da morfoespécie2 provenientes de Silva Jardim. Na Tabela 3 se encontram descritos os resultados das análises qualitativas e quantitativas dos caracteres florais e vegetativos, assim como da análise filogenética (capítulo 2) do complexo taxonômico T. catharinensis e grupo externo (morfoespécie5).

Figure 10. Gráficos de dispersão das coordenadas 1 e 2 da análise de coordenadas principais (PCoA) de 81 espécimes pertencentes ao complexo taxonômico T. catharinensis e grupo externo (morfoespécie5) baseado em 33 caracteres florais e vegetativos contínuos e discretos (dataset5). DOM: Piripiri, Piauí; FOR: Fortaleza, Ceará (FOR); SA: Crateús, Ceará e Buriti dos Montes, Piauí; TIA: Tianguá, Ubajara e Viçosa do Ceará, Ceará; FLO: Florianópolis, Santa Catarina; GUA: Guaratuba, Paraná; IJA: Itajaí, Santa Catarina; SJ: Silva Jardim, Rio de Janeiro; CAMP: Campinas, São Paulo; LON: Londrina, Paraná; DF e PNB: Brasília, Distrito Federal.

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Figure 11. Gráficos de dispersão das coordenadas 1 e 2 da análise de coordenadas principais (PCoA) de 59 espécimes pertencentes ao complexo taxonômico T. catharinensis e grupo externo (morfoespécie5), baseado em 33 caracteres florais e vegetativos contínuos e discretos (dataset5). Nessa análise foram retirados os outliers: LON16, CAMP152, CAMP92, FLO2, FLO8 e FLO11. DOM: Piripiri, Piauí; FOR: Fortaleza, Ceará (FOR); SA: Crateús, Ceará e Buriti dos Montes, Piauí; TIA: Tianguá, Ubajara e Viçosa do Ceará, Ceará; FLO: Florianópolis, Santa Catarina; GUA: Guaratuba, Paraná; IJA: Itajaí, Santa Catarina; SJ: Silva Jardim, Rio de Janeiro; CAMP: Campinas, São Paulo; LON: Londrina, Paraná; DF e PNB: Brasília, Distrito Federal.

Análise univariada dos caracteres florais e foliares contínuos (datasets 2 e 3): o comprimento do lobo da corola (CL), comprimento da lâmina foliar (C), largura da lâmina foliar (L) e razão entre largura pelo comprimento da lâmina foliar (L/C) foram os caracteres que mais diferiram entre as morfoespécies pertencentes ao complexo taxonomico T. catharinensis (Figura 12). A morfoespécie1 se diferenciou das demais morfoespécies, pela largura máxima do lobo da corola (LML) e da sépala (LS), distância da fauce ao ápice das anteras (DFA) e comprimento do tubo da corola (CTC) (Figura 12). A morfoespécie2 diferenciou das demais pelo comprimento da sépala (CS), e a morfoespécie4 pelo comprimento total da inflorescência (CI) e número total de flores por inflorescência (TF). A morfoespécie5 diferenciou dos demais táxons pela largura máxima da sépala (LS) e distância da fauce ao ápice das anteras (DFA) (Figura 12). A estatística sumária dos caracteres quantitativos aferidos se encontra descrita no Apêndice D, Tabela 1.

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Figura 12. Boxplot de 12 caracteres contínuos de 116 espécimes para os caracteres contínuos florais e 127 espécimes para os caracteres contínuos foliares (datasets 2 e 3), pertencentes ao complexo taxonômico T. catharinensis e grupo externo (morfoespécie5). Os retângulos são definidos 25 e 75 percentis; linhas horizontais dentro dos retângulos representam à média; círculos representam os valores extremos; os valores mínimo e máximo são representados por linhas horizontas curtas (“whiskers”). A: morfoespécie1; B: morfoespécie2; C: morfoespécie3; D: morfoespécie4; E: morfoespécie5. Letras em minúsculo representam o resultado do teste de post-hoc de Dunn, com base no valor de P corrigido de Bonferroni. Letras iguais são associadas ao P ≥ 0,05; letras diferentes são associadas a valores de P ≤ 0,05.

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Tabela 3. Resumo dos caracteres morfológicos analisados e posicionamento filogenético das morfoespécies pertencentes ao complexo taxonômico T. catharinensis e grupo externo (morfoespécie5). MG: morfometria geométrica dos botões florais; ML: morfometria linear dos caracteres florais e foliares; caracteres em negrito pela análise univariada apresentaram sobreposição com a morfoespécie5. Morfos: morfoespécies; morfo1: morfoespécie1; morfo2: morfoespécie2; morfo3: morfoespécie3; morfo4: morfoespécie4; morfo5: morfoespécie5; CI: comprimento da inflorescência; TF: total de flores por inflorescência; CL: comprimento máximo do lobo da corola; LBL: largura da base do lobo da corola; LML: largura máxima do lobo da corola; CS: comprimento da sépala; LS: largura máxima da sépala; DFA: distância da fauce da corola ao ápice das anteras; C: comprimento máximo da lâmina foliar; L: largura máxima da lâmina foliar; L/C: Razão entre largura pelo comprimento da lâmina foliar; Id: identificação prévia feita por especialistas da família

Caracteres Morfoespécie1 Morfoespécie2 Morfoespécie3 Morfoespécie4 Morfoespécie5 ITS Parafilética Monofilética Parafilética Sem resolução Sem resolução

Plastidial Parafilética Parafilética Parafilética Sem resolução Sem resolução MG dataset1 Grupo separado Sobreposição parcial com as Sobreposição parcial com as Sobreposição parcial com Grupo separado morfos 3 e 4 morfos 2 e 4 as morfos 2 e 3 ML florais Sobreposição parcial com Sobreposta com morfo3 e Sobreposta com a morfo2 e Sobreposição parcial com Sobreposição parcial dataset2 as morfos 2, 3 e 5 sobreposição parcial com as sobreposição parcial com a a morfo2 com as morfos 1 e 2 morfos 1, 4 e 5 morfo1 ML foliares Sobreposição parcial com Sobreposição parcial com as Sobreposta com a morfo5, Sem dados Sobreposta com a dataset3 as morfos 2, 3 e 5 morfos 1, 3 e 5 sobreposição parcial com as morfo3, sobreposição morfos 1 e 2 parcial com as morfos Análise conjunta Grupo separado Sobreposição parcial com a Sobreposição parcial com a Sem dados Grupo1 e 2 separado florais e foliares morfo3 morfo2 dataset4 Caracteres Folhas, inflorescências, Folhas, inflorescências, Folhas, inflorescências, Sépalas pubescentes e Folhas, inflorescências, qualitativos sépalas, brácteas e face brácteas, sépalas e face brácteas, sépalas, face externa face externa da corola brácteas, sépalas, face externa da corola externa da corola usualmente da corola e ovário usualmente usualmente pubescente; externa da corola e usualmente glabra; ovário pubescentes; ovário pubescentes; usualmente sem ovário glabro e ovários glabros, com glabro; usualmente com usualmente glabro; as projeções basais pubescente; com projeções basais. projeções basais usualmente com projeções projeções basais basais 108

Tabela 3. Continuação

Caracteres Morfoespécie1 Morfoespécie2 Morfoespécie3 Morfoespécie4 Morfoespécie5

Análise conjunta Grupo separado Sobreposição parcial com Sobreposição parcial com Sem dados Grupo separado dataset5 morfo3 devido à população de morfo2 devido à população de SJ (morfo2) SJ (morfo2) Caracteres CL, LML, LS, DFA, CTC, CL, CS, C, L e L/C CL, C, L e L/C CI, TF e CL CI e CL (iguais diferentes na C, L e L/C morfo4), LML e CTC análise (iguais morfo1), C, L e univariada L/C (iguais morfo3), datasets 2 e 3 LS e DFA

Hábito de vida Árvore de pequeno porte Árvore de pequeno a médio Arbusto a arvoreta Árvore de pequeno porte Arvoretas de pequeno porte porte (até 1m de altura) “indivíduos” agregados Habitat Áreas alteradas e urbanas Mata Atlântica, borda e mata Caatinga, PI e CE Caatinga, norte de MG e Cerrado sul da BA Id. prévia T. catharinensis T. catharinensis T. catharinensis T. solanifolia T. solanifolia Nome proposto T. hilariana T. catharinensis T. caatingae T. solanifolia T. nervosa

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4. DISCUSSÃO Com base nos caracteres florais e foliares analisados identificamos quatro espécies dentro do complexo taxonômico T. catharinensis, três dessas com maior sustentação. A morfoespécie1 formou um agrupamento morfológico distinto, com base na morfologia dos botões florais, caracteres florais e foliares analisados. A variação floral e vegetativa da morfoespécie2 se sobrepôs com morfoespécie3, entretanto a morfoespécie2 foi recuperada como monofilética e distinta da morfoespécie3, com base nos dados moleculares (capítulo 2). Adicionalmente, a morfoespécie3 foi o único táxon que não apresentou projeções basais na cabeça estilar. Apesar do baixo número de espécies coletados para a morfoespécie4 essa tem morfologia distinta, com base nas análises morfométricas iniciais e análise dos espécimes depositados nos herbários, essa se distingue das demais pela base foliar decorrente e a inflorescência mais longa, maior número de flores por inflorescência e comprimento do lobo da corola. As variações na forma dos botões florais das morfoespécies 1 e 5 não se sobrepuseram com as demais morfoespécies. Para as morfoespécies 2, 3 e 4 a sobreposição foi marginal e a análise de discriminantes indicou baixas porcentagens de classificações incorretas, abaixo de 14%, a qual é considerada suficiente para discriminar as três morfoespécies. Valores superiores a 15% de classificações incorretas são interpretados como indicativo de baixo poder discriminante, em estudos taxonômicos com morfometria linear (Fernández et al., 2017; Laphitz et al., 2015; Lehnebach, 2011). Na ordenação dos caracteres florais e foliares as morfoespécie 1 e 5 formaram agrupamentos morfológicos não sobrepostos e as morfoespécies 2 e 3 com sobreposição parcial. Nos estudos de delimitação de espécies entre os critérios comumente utilizados são a descontinuidade morfológica dos caracteres quantitativos contínuos e a presença de caracteres qualitativos fixos, os quais sugerem a ausência de fluxo gênico (Davis e Nixon, 1992; Niklas, 1997; Sites e Marshall, 2003; Wiens e Servedio, 2000; Zapata e Jiménez et al., 2012). Entretanto, a evolução morfológica convergente, a estase morfológica, plasticidade fenotípica e o polimorfismo morfológico neutro são fenômenos comuns em alguns grupos de plantas e podem obscurecer a correspondência entre descontinuidade morfológica e limite entre as espécies (Davis e Gilmartin, 1985; Leliaert et al., 2014; Minelli e Fusco, 2012; Pérez et al., 2003; Sherry e Lord, 1996; Sobel et al., 2010). Adicionalmente, o tipo de método empregado para o estudo das estruturas morfológicas pode não ser o mais adequado para detectar diferenças em complexos de espécies, ou mesmo para comparar grupos distintos (Wiens e Servedio, 2000; Zapata e Jiménez et al., 2012), muitas vezes sendo necessário a análise de um 110

conjunto maior de caracteres (Bruschi et al., 2000; Shipunov e Bateman, 2005; Viscosi et al., 2009). Apesar da descontinuidade morfológica observada nas análises conjuntas dos caracteres vegetativos e florais das morfoespécies 1 e 5, essas foram recuperadas como parafiléticas (capítulo 2). Vale ressaltar que utilizamos um conjunto limitado de marcadores moleculares. Para muitos grupos de plantas é necessário incluir um maior número de marcadores moleculares, principalmente em grupos recentes (Krak et al., 2013; Levin et al., 2009; Nowak et al., 2012; Russell et al., 2010; Stern e Bohs, 2016; Whittall et al., 2006; Yuan e Olmstead, 2008). Em uma revisão sobre a utilização de marcadores moleculares e morfológicos na delimitação de espécies vegetais, alguns estudos tiveram congruência entre os diferentes marcadores, em outros os marcadores genéticos discriminaram um maior número de agrupamentos dos que os morfológicos, o oposto também ocorreu (Duminil e Michele, 2009). No entanto, os caracteres morfológicos estão sobre o controle de vários genes e mudanças nos padrões de expressão gênica estão relacionados com a evolução morfológica e diversificação de alguns grupos (Ferris et al., 2015; Paun et al., 2010; Specht e Howarth, 2015), e a ausência de monofiletismo nas análises filogenéticas não invalida a discriminação das espécies, com base nos caracteres morfológicos. A pubescência foi utilizada como um caráter taxonômico importante para separar as diferentes espécies e variedades previamente reconhecidas na sinonímia de T. catharinensis, por diferentes autores (ex., Leeuwenberg, 1994; Miers, 1878; Müller Argoviensis, 1860). A análise de um maior número de espécimes permitiu evidenciar que esse caráter é variável entre os espécimes do mesmo agrupamento morfológico, assim como entre folhas e flores do mesmo espécime, portanto, não deve ser utilizado para discriminar as morfoespécies. Todavia, essa variação pode auxiliar na identificação da morfoespécie3, no qual as folhas são velutinas, ovários usualmente pubescentes e as flores usualmente com grande quantidade de tricomas. Já, na morfoespécie1 as folhas, flores e inflorescência e brácteas da inflorescência são usualmente glabras. A morfoespécie5 foi incluída nas análises morfométricas para servir como base de comparação, sendo essa morfologicamente distinta do complexo taxonômico T. catharinensis, e com área de ocorrência disjunta e com ecologia distinta. Apesar de ser uma espécie bem definida foi recuperada como parafilética e somente na análise individual dos caracteres florais e foliares essa se sobrepôs com algumas morfoespécies. A inclusão dessa espécie indica que a ausência de monofiletismo e a formação de agrupamentos morfológicos não sobrepostos devem ser interpretadas com cautela. Isso pode ser devido a não inclusão de 111

regiões moleculares com um nível de resolução filogenética satisfatória, assim como o número de caracteres morfológicos utilizados. A morfoespécie 1 diferenciou-se das demais morfoespécies pela forma do botão floral, comprimento do lobo da corola (CL), largura máxima do lobo da corola, (LML), largura da sépala (LS), distância da fauce ao ápice das anteras (DFA), comprimento do tubo da corola (CTC) e medidas foliares (comprimento, largura e razão entre largura e comprimento da lâmina foliar). A variação observada nessa morfoespécie já foi descrita por outros autores em diferentes nomes, T. acuminata Müll. Arg. (Müller Argoviensis, 1860), T. affinis var. lanceolata Müll. Arg. (Müller Argoviensis, 1860), T. australis Müll. Arg. (Müller Argoviensis, 1860), T. hilariana Müll. Arg. (Müller Argoviensis, 1860), T. hybrida Hand.- Mazz. (Handel-Mazzetti, 1910) e T. salicifolia Hand-Mazz. (Handel-Mazzetti, 1910). Os nomes T. acuminata, T. affinis var. lanceolata, T. australis e T. hilariana foram publicados na mesma obra e ano e apresentam igual prioridade. Optamos pelo nome de Tabernaemontana hilariana com base no tipo Saint-Hilaire 1069 (P), pela melhor qualidade do espécime tipo e pela maior quantidade de exsicatas depositados em diferentes herbários. A morfoespécie2 diferenciou-se das demais pela forma do botão floral, comprimento do lobo da corola (CL), comprimento da sépala (CS) e medidas foliares (comprimento, largura e razão entre largura e comprimento da lâmina foliar) e foi recuperada como monofilética pelo ITS. A morfoespécie2 enquadra-se na descrição da espécie tipo de T. catharinensis A. DC. (Candolle, 1844), com base no tipo de Gaudichaud 186 (FI, F, P, W e WAG), coletado em Santa Catarina. Essa morfoespécie manterá o nome de T. catharinensis. A morfoespécie3 diferenciou das demais pela forma do botão floral, comprimento do lobo da corola (CL), ausência de projeções basais na cabeça estilar, medidas foliares (comprimento, largura e razão entre largura e comprimento da lâmina foliar), distribuição geográfica e ecologia distinta. Essa morfoespécie tem uma distribuição restrita a Caatinga nos estados do Piauí e Ceará. Durante as coletas analisamos as coleções de alguns herbários (HCDAL, UFP, UFPB e JPB), juntamente com as informações obtidas de base de dados digitais (speciesLink e Reflora), no qual foi possível confirmar a distribuição disjunta. Essa morfoespécie é arbustiva, ocasionalmente arvoreta ou árvore de pequeno porte. A variação morfológica dessa morfoespécie não se enquadra na descrição de nenhum nome publicado previamente. Apesar da citação do Leeuwenberg (1994) a respeito de uma forma distinta dos espécimes analisados do Maranhão e Ceará, nenhum nome foi descrito por este autor, ou autores subsequentes com base em coletas da região nordeste. Dado a singularidade da espécie e ocorrência restrita propomos o nome Tabernaemontana caatingae. 112

A morfoespécie4 se diferenciou das demais pela forma dos botões florais, comprimento da inflorescência (CI), total de flores por inflorescência (TF), comprimento lobo corola (CL) e folhas com base decorrente. Essa morfoespécie tem sido incorretamente identificada como T. solanifolia. O tipo de T. solanifolia (Candolle, 1844) descrito com base na coleta de Blanchet 2724 (W, G, HAL, BM, P, F, FI, BR) coletado em Jacobina na Bahia, se refere à variação morfológica observada na morfoespécie4, assim como o sinônimo T. accedens Müll. Arg. (Müller Argoviensis, 1869, (C)). Propomos o reconhecimento da morfoespécie4 como T. solanifolia. A morfoespécie5 é uma espécie típica do Cerrado, e tem morfologia distinta das demais morfoespécies de T. catharinensis, essa se distingue pelas folhas sésseis a subsésseis, venação terciária conspícua e reticulada, e são arvoretas de pequeno porte (até 1m de altura). Essa morfoespécie tem sido identificada como T. solanifolia, no entanto o tipo de T. solanifolia (Candolle, 1844) descrito com base na coleta de Blanchet 2724 (W, G, HAL, BM, P, F, FI, BR) coletado em Jacobina na Bahia, se refere à variação morfológica observada na morfoespécie4 e não na morfoespécie5. Os nomes T. affinis var. campestris Rizzini (Rizzini, 1963) T. fallax Müll. Arg. (Müller Argoviensis, 1860), T. nervosa Desf. ex Poir (Poiret, 1817) e T. warmingii Müll. Arg. (Müller Argoviensis, 1869) se referem à variação morfológica observada na morfoespécie5, sendo que o nome T. nervosa tem prioridade. Os sinônimos de Peschiera albidiflora Miers (Miers, 1878) com base no tipo Bowie & Cunningham s.n. (BM) do Rio de Janeiro e T. affinis Müll. Arg. (Müller Argoviensis, 1860) com base no tipo Pohl 1842 (W, BR, F, GH, K, M e P) do Rio de Janeiro correspondem à variação observada no complexo morfológico T. hystrix, pelo formato e tamanho das folhas, forma do botão floral, dimensões florais e ausência de tricomas, e devem ser retirados da sinonímia de T. catharinensis.

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6. APÊNDICES Apêndice A. Número de identificação das morfoespécies, localidade de coleta dos espécimes, vouchers depositados no herbário da Universidade Estadual de Campinas (UEC) e espécimes utilizados nos estudos de morfometria linear da lâmina foliar (Folha), morfometria geométrica de botões florais (Botão), morfometria linear da flor (Flor) e análise qualitativa dos caracteres florais e vegetativos (Qual.).

ID Espécie Localidade Voucher (Herbário) Folha Botão Flor Qual. CAMP86 Morfoespécie1 Campinas, SP Bordon, N.G & Galvão, J.C. CAMP86A (UEC) s s CAMP87 Morfoespécie1 Campinas, SP s s CAMP88 Morfoespécie1 Campinas, SP Bordon, N.G & Simões, A.O. CAMP88 (UEC) s s CAMP89 Morfoespécie1 Campinas, SP s s CAMP91 Morfoespécie1 Campinas, SP s s CAMP92 Morfoespécie1 Campinas, SP Bordon, N.G & Galvão, J.C. CAMP92A (UEC) s s s s CAMP93 Morfoespécie1 Campinas, SP s s s s CAMP94 Morfoespécie1 Campinas, SP s s s s CAMP95 Morfoespécie1 Campinas, SP s s s s CAMP98 Morfoespécie1 Campinas, SP s s s CAMP99 Morfoespécie1 Campinas, SP s s CAMP100 Morfoespécie1 Campinas, SP s s CAMP101 Morfoespécie1 Campinas, SP s s CAMP102 Morfoespécie1 Campinas, SP s s CAMP103 Morfoespécie1 Campinas, SP Bordon, N.G & Galvão, J.C. CAMP13A (UEC) s s CAMP104 Morfoespécie1 Campinas, SP Bordon, N.G & Simões, A.O. CAMP104 (UEC) s s CAMP105 Morfoespécie1 Campinas, SP s s CAMP106 Morfoespécie1 Campinas, SP s s CAMP107 Morfoespécie1 Campinas, SP s s s s CAMP108 Morfoespécie1 Campinas, SP s s CAMP109 Morfoespécie1 Campinas, SP Bordon, N.G & Galvão, J.C. CAMP109A (UEC) s s s s CAMP110 Morfoespécie1 Campinas, SP Bordon, N.G & Galvão, J.C. CAMP110A (UEC) s s CAMP111 Morfoespécie1 Campinas, SP s s CAMP142 Morfoespécie1 Campinas, SP Bordon, N.G & Galvão, J.C. CAMP142A (UEC) s s s s CAMP143 Morfoespécie1 Campinas, SP Bordon, N.G & Galvão, J.C. CAMP143A (UEC) s s s s 118

Apêndice A. Continuação

ID Espécie Localidade Voucher (Herbário) Folha Botão Flor Qual. CAMP144 Morfoespécie1 Campinas, SP s s CAMP145 Morfoespécie1 Campinas, SP s s s s CAMP146 Morfoespécie1 Campinas, SP Bordon, N.G & Simões, A.O. CAMP146 (UEC) s s CAMP147 Morfoespécie1 Campinas, SP s s s s CAMP148 Morfoespécie1 Campinas, SP s s CAMP149 Morfoespécie1 Campinas, SP s s s s CAMP151 Morfoespécie1 Campinas, SP s s CAMP152 Morfoespécie1 Campinas, SP s s s s LON1 Morfoespécie1 Londrina, PR Bordon, N.G & Chaves, C.L. LON1 (UEC) s s s s LON2 Morfoespécie1 Londrina, PR s s s LON3 Morfoespécie1 Londrina, PR s s s s LON4 Morfoespécie1 Londrina, PR Bordon, N.G & Chaves, C.L. LON4 (UEC) s s s s LON5 Morfoespécie1 Londrina, PR s s s s LON6 Morfoespécie1 Londrina, PR Bordon, N.G & Chaves, C.L. LON6A (UEC) s s s s LON7 Morfoespécie1 Londrina, PR s s LON8 Morfoespécie1 Londrina, PR Bordon, N.G & Chaves, C.L. LON8 (UEC) s s s LON9 Morfoespécie1 Londrina, PR s s LON10 Morfoespécie1 Londrina, PR s s s s LON11 Morfoespécie1 Londrina, PR Bordon, N.G & Chaves, C.L. LON11 (UEC) s s s LON12 Morfoespécie1 Londrina, PR Bordon, N.G & Chaves, C.L. LON12 (UEC) s s s s LON13 Morfoespécie1 Londrina, PR Bordon, N.G & Chaves, C.L. LON13 (UEC) s s LON14 Morfoespécie1 Londrina, PR s s s s LON15 Morfoespécie1 Londrina, PR Bordon, N.G & Chaves, C.L. LON15 (UEC) s s s s LON16 Morfoespécie1 Londrina, PR Bordon, N.G & Chaves, C.L. LON16 (UEC) s s s s LON17 Morfoespécie1 Londrina, PR s s s s PA157 Morfoespécie2 Silva Jardim, RJ s s PA173 Morfoespécie2 Silva Jardim, RJ Bordon, N.G & Bordon, C. PA173 (UEC) s s s s PA174 Morfoespécie2 Silva Jardim, RJ s s SJ2 Morfoespécie2 Silva Jardim, RJ Bordon, N.G & Bordon, C. SJ1 (UEC) s s s s SJ8 Morfoespécie2 Silva Jardim, RJ Bordon, N.G & Bordon, C. SJ8 (UEC) s s 119

Apêndice A. Continuação

ID Espécie Localidade Voucher (Herbário) Folha Botão Flor Qual. SJ9 Morfoespécie2 Silva Jardim, RJ Bordon, N.G & Bordon, C. SJ9 (UEC) s s s s SJ10 Morfoespécie2 Silva Jardim, RJ Bordon, N.G & Bordon, C. SJ10 (UEC) s s s s SJ11 Morfoespécie2 Silva Jardim, RJ s s s s SJ12 Morfoespécie2 Silva Jardim, RJ s s s s SJ13 Morfoespécie2 Silva Jardim, RJ Bordon, N.G & Bordon, C. SJ13 (UEC) s s s s SJ14 Morfoespécie2 Silva Jardim, RJ s s s SJ15 Morfoespécie2 Silva Jardim, RJ Bordon, N.G & Bordon, C. SJ15 (UEC) s s s s MAT1 Morfoespécie2 Matinhos, PR Bordon, N.G & Castello, A.C.D. MAT1 (UEC) s s MAT2 Morfoespécie2 Matinhos, PR Bordon, N.G & Castello, A.C.D. MAT2 (UEC) s s s MAT3 Morfoespécie2 Matinhos, PR s s MAT4 Morfoespécie2 Matinhos, PR Bordon, N.G & Castello, A.C.D. MAT4 (UEC) s s s MAT5 Morfoespécie2 Matinhos, PR s s MAT6 Morfoespécie2 Matinhos, PR s s s MAT7 Morfoespécie2 Matinhos, PR s GUA1 Morfoespécie2 Guaratuba, PR Bordon, N.G & Castello, A.C.D. GUA1 (UEC) s s s s GUA2 Morfoespécie2 Guaratuba, PR s s s s GUA3 Morfoespécie2 Guaratuba, PR Bordon, N.G & Castello, A.C.D. GUA3 (UEC) s s s s GUA4 Morfoespécie2 Guaratuba, PR Bordon, N.G & Castello, A.C.D. GUA4 (UEC) s s s s GUA5 Morfoespécie2 Guaratuba, PR s s s s GUA6 Morfoespécie2 Guaratuba, PR Bordon, N.G & Castello, A.C.D. GUA6 (UEC) s s s s GUA7 Morfoespécie2 Guaratuba, PR Bordon, N.G & Castello, A.C.D. GUA7 (UEC) s s s s GUA8 Morfoespécie2 Guaratuba, PR Bordon, N.G & Castello, A.C.D. GUA8 (UEC) s s s s IJA1 Morfoespécie2 Itajaí, SC Bordon, N.G & Castello, A.C.D. IJA1 (UEC) s s s s IJA2 Morfoespécie2 Itajaí, SC Bordon, N.G & Castello, A.C.D. IJA2 (UEC) s s s IJA3 Morfoespécie2 Itajaí, SC s s IJA4 Morfoespécie2 Itajaí, SC s s IJA5 Morfoespécie2 Itajaí, SC s s FLO1 Morfoespécie2 Florianópolis, SC s s FLO2 Morfoespécie2 Florianópolis, SC Bordon, N.G & Castello, A.C.D. FLO2 (UEC) s s s s FLO3 Morfoespécie2 Florianópolis, SC Bordon, N.G & Castello, A.C.D. FLO3 (UEC) s s 120

Apêndice A. Continuação

ID Espécie Localidade Voucher (Herbário) Folha Botão Flor Qual. FLO4 Morfoespécie2 Florianópolis, SC Bordon, N.G & Castello, A.C.D. FLO4 (UEC) s s s FLO5 Morfoespécie2 Florianópolis, SC Bordon, N.G & Castello, A.C.D. FLO5 (UEC) s s FLO6 Morfoespécie2 Florianópolis, SC s FLO7 Morfoespécie2 Florianópolis, SC s s FLO8 Morfoespécie2 Florianópolis, SC s s s s FLO9 Morfoespécie2 Florianópolis, SC s s FLO10 Morfoespécie2 Florianópolis, SC Bordon, N.G & Castello, A.C.D. FLO10 (UEC) s s s s FLO11 Morfoespécie2 Florianópolis, SC Bordon, N.G & Castello, A.C.D. FLO11 (UEC) s s s s FLO12 Morfoespécie2 Florianópolis, SC Bordon, N.G & Castello, A.C.D. FLO12 (UEC) s s SA1 Morfoespécie3 Crateús, CE Bordon, N.G & Castello, A.C.D. SA1 (UEC) s s s SA2 Morfoespécie3 Crateús, CE s SA3 Morfoespécie3 Crateús, CE s SA5 Morfoespécie3 Crateús, CE s SA6 Morfoespécie3 Crateús, CE s s s s SA8 Morfoespécie3 Crateús, CE s s SA9 Morfoespécie3 Crateús, CE s s SA10 Morfoespécie3 Crateús, CE s s SA11 Morfoespécie3 Crateús, CE Bordon, N.G & Castello, A.C.D. SA11 (UEC) s s s s SA12 Morfoespécie3 Crateús, CE s SA13 Morfoespécie3 Crateús, CE Bordon, N.G & Castello, A.C.D. SA13 (UEC) s s s s SA14 Morfoespécie3 Crateús, CE s s s s SA17 Morfoespécie3 Buriti dos Montes, PI s s s SA18 Morfoespécie3 Buriti dos Montes, PI Bordon, N.G & Castello, A.C.D. SA18 (UEC) s s s s SA19 Morfoespécie3 Buriti dos Montes, PI Bordon, N.G & Castello, A.C.D. SA19 (UEC) s s s PI1 Morfoespécie3 Castelo do Piauí, PI s PI2 Morfoespécie3 Castelo do Piauí, PI Bordon, N.G & Castello, A.C.D. PI2 (UEC) s DOM1 Morfoespécie3 Piripiri, PI Bordon, N.G & Castello, A.C.D. DOM1 (UEC) DOM2 Morfoespécie3 Piripiri, PI s s DOM3 Morfoespécie3 Piripiri, PI s s DOM4 Morfoespécie3 Piripiri, PI Bordon, N.G & Castello, A.C.D. DOM4 (UEC) s s 121

Apêndice A. Continuação

ID Espécie Localidade Voucher (Herbário) Folha Botão Flor Qual. DOM5 Morfoespécie3 Piripiri, PI s s DOM7 Morfoespécie3 Piripiri, PI s s DOM8 Morfoespécie3 Piripiri, PI s s s DOM9 Morfoespécie3 Piripiri, PI s s DOM10 Morfoespécie3 Piripiri, PI s DOM11 Morfoespécie3 Piripiri, PI Bordon, N.G & Castello, A.C.D. DOM11 (UEC) s s s s DOM12 Morfoespécie3 Piripiri, PI s s DOM13 Morfoespécie3 Piripiri, PI Bordon, N.G & Castello, A.C.D. DOM13 (UEC) s DOM14 Morfoespécie3 Piripiri, PI s s DOM15 Morfoespécie3 Piripiri, PI s s DOM16 Morfoespécie3 Piripiri, PI s s DOM17 Morfoespécie3 Piripiri, PI Bordon, N.G & Castello, A.C.D. DOM17 (UEC) s s DOM18 Morfoespécie3 Piripiri, PI Bordon, N.G & Castello, A.C.D. DOM18 (UEC) s s s DOM19 Morfoespécie3 Piripiri, PI Bordon, N.G & Castello, A.C.D. DOM19 (UEC) s s DOM20 Morfoespécie3 Piripiri, PI s s TIA1 Morfoespécie3 Tianguá, CE Bordon, N.G & Castello, A.C.D. TIA1 (UEC) s s s s TIA2 Morfoespécie3 Tianguá, CE Bordon, N.G & Castello, A.C.D. TIA2 (UEC) s s s TIA3 Morfoespécie3 Tianguá, CE Bordon, N.G & Castello, A.C.D. TIA3 (UEC) s s s s TIA4 Morfoespécie3 Tianguá, CE Bordon, N.G & Castello, A.C.D. TIA4 (UEC) s s s s TIA5 Morfoespécie3 Tianguá, CE Bordon, N.G & Castello, A.C.D. TIA5 (UEC) s TIA6 Morfoespécie3 Tianguá, CE Bordon, N.G & Castello, A.C.D. TIA6 (UEC) s s TIA8 Morfoespécie3 Tianguá, CE Bordon, N.G & Castello, A.C.D. TIA8 (UEC) s s TIA10 Morfoespécie3 Ubajara, CE s s TIA11 Morfoespécie3 Ubajara, CE Bordon, N.G & Castello, A.C.D. TIA11 (UEC) s s s s TIA12 Morfoespécie3 Ubajara, CE Bordon, N.G & Castello, A.C.D. TIA12 (UEC) s s TIA13 Morfoespécie3 Ubajara, CE Bordon, N.G & Castello, A.C.D. TIA13 (UEC) s s s TIA14 Morfoespécie3 Ubajara, CE s s s s TIA15 Morfoespécie3 Tianguá, CE s s s s TIA16 Morfoespécie3 Ubajara, CE Bordon, N.G & Castello, A.C.D. TIA16A (UEC) s s TIA17 Morfoespécie3 Ubajara, CE Bordon, N.G & Castello, A.C.D. TIA17A (UEC) s s s s 122

Apêndice A. Continuação

ID Espécie Localidade Voucher (Herbário) Folha Botão Flor Qual. TIA18 Morfoespécie3 Ubajara, CE s s s s TIA19 Morfoespécie3 Ubajara, CE s s s TIA20 Morfoespécie3 Viçosa do Ceará, CE Bordon, N.G & Castello, A.C.D. TIA20 (UEC) s s TIA21 Morfoespécie3 Viçosa do Ceará, CE s FOR1 Morfoespécie3 Fortaleza, CE Bordon, N.G & Castello, A.C.D. FOR1 (UEC) s s s s FOR2 Morfoespécie3 Fortaleza, CE Bordon, N.G & Castello, A.C.D. FOR2 (UEC) s s s FOR3 Morfoespécie3 Fortaleza, CE s s FOR4 Morfoespécie3 Fortaleza, CE s s FOR5 Morfoespécie3 Fortaleza, CE Bordon, N.G & Castello, A.C.D. FOR5 (UEC) s s s s TEO5 Morfoespécie4 Itambacuri, MG Bordon, N.G & Bordon, C. TEO5 (UEC) s s TEO6 Morfoespécie4 Itambacuri, MG Bordon, N.G & Bordon, C. TEO6 (UEC) s s TEO7 Morfoespécie4 Itambacuri, MG Bordon, N.G & Bordon, C. TEO7 (UEC) s s TEO8 Morfoespécie4 Itambacuri, MG Bordon, N.G & Bordon, C. TEO8 (UEC) s s DF1 Morfoespécie5 Brasília, DF Bordon, N.G & Castello, A.C.D. DF1 (UEC) s s s s DF2_2 Morfoespécie5 Brasília, DF s DF2_4 Morfoespécie5 Brasília, DF s DF3_1 Morfoespécie5 Brasília, DF s s s DF3_2 Morfoespécie5 Brasília, DF s s s s DF3_3 Morfoespécie5 Brasília, DF Bordon, N.G & Castello, A.C.D. DF33 (UEC) s DF3_4 Morfoespécie5 Brasília, DF s s DF4_1 Morfoespécie5 Brasília, DF s DF4_2 Morfoespécie5 Brasília, DF s s s DF5 Morfoespécie5 Brasília, DF s DF7 Morfoespécie5 Brasília, DF Bordon, N.G & Castello, A.C.D. DF7 (UEC) s s s DF8 Morfoespécie5 Brasília, DF Bordon, N.G & Castello, A.C.D. DF8A (UEC) s s s DF9 Morfoespécie5 Brasília, DF s s PNB1_1 Morfoespécie5 Brasília, DF s PNB1_2 Morfoespécie5 Brasília, DF s PNB1_3 Morfoespécie5 Brasília, DF s PNB1_4 Morfoespécie5 Brasília, DF Bordon, N.G & Castello, A.C.D. PNB14 (UEC) s s 123

Apêndice A. Continuação

ID Espécie Localidade Voucher (Herbário) Folha Botão Flor Qual. PNB3_1 Morfoespécie5 Brasília, DF s s s PNB3_2 Morfoespécie5 Brasília, DF s s PNB4_2 Morfoespécie5 Brasília, DF s s PNB5_1 Morfoespécie5 Brasília, DF s s s s PNB6_1 Morfoespécie5 Brasília, DF s s s s PNB6_2 Morfoespécie5 Brasília, DF Bordon, N.G & Castello, A.C.D. PNB62 (UEC) s s s s PNB7_1 Morfoespécie5 Brasília, DF s s PNB7_2 Morfoespécie5 Brasília, DF Bordon, N.G & Castello, A.C.D. PNB72 (UEC) s s

124

Apêndice B. Posicionamento e descrição dos landmarks e semilandmarks nos botões florais.

1: junção entre cálice e pedicelo. 2: ponto médio entre os landmarks 1 e 3. 3: ponto onde termina a base e começa o estreitamento do tubo floral. 4: ponto médio entre os landmarks 3 e 4. 5: ponto onde termina o estreitamento do tubo floral e inicia a cabeça do botão floral. 6: parte distal do cabeça do botão floral. 7: ponto médio entre os landmarks entre 6 e 8. 8: ápice da cabeça, sendo visualizado pela junção dos lobos da corola. 9: ponto médio entre os landmarks entre 8 e 10. 10: parte distal da cabeça do botão floral. 11: ponto onde termina a cabeça do botão floral e inicia o estreitamento do tubo floral. 12: ponto meio entre os landmarks 11 e 13. 13: ponto onde termina o estreitamento do tubo floral e começa a base do botão floral. 14: ponto médio entre os landmarks 13 e 15. 15: junção entre cálice e pedicelo. Para delimitar os semilandmarks 2, 4, 7, 9, 12, 14, utilizou-se a ferramenta draw background curves, selecionamos a curva (resample curve) e está foi dividida em 3 pontos pelo comprimento (numbers of points 3, by lenght), que fornece o ponto médio da curva, pelo programa tpsDig2 ver. 2.26 (Rohlf, 2016), posteriormente o ponto médio da curva foi transformado em semilandmarks. 125

Apêndice C. Resultados das análises de ordenação dos caracteres florais e foliares de espécimes pertencentes ao complexo taxonômico T. catharinensis e grupo externo (morfoespécie5).

Tabela 1. Autovalores, variância, significância dos escores dos componentes principais e loadings da ordenação de 11 caracteres contínuos florais e foliares de 116 espécimes para os caracteres florais e 127 espécimes para os caracteres foliares das morfoespécies pertencentes ao complexo taxonômico T. catharinensis e grupo externo (morfoespécie5). Valores de P significativos se encontram em negrito. Os valores de loadings ≥ 0,6 em negritos representam os caracteres que mais contribuíram para os respectivos eixos.

Caracteres Sigla PC1 PC2 PC3 PC4 PC5 Caracteres florais (dataset2) Autovalor 3,017 2,119 1,385 0,787 0,544

Variância (%) 33,992 23,953 15,563 8,899 6,148

Kruskal-Wallis (H) 134 419 199 10,4 72,12 P < 0,001 < 0,001 < 0,001 0,034 < 0,001

Comprimento inflorescência CI 0,218 0,232 0,570 -0,258 -0,260

Totais flores por inflorescência TF 0,043 0,118 0,714 0,174 0,270

Comprimento lobo corola CL 0,317 0,503 0,021 -0,062 0,027

Largura da base do lobo corola LBL 0,423 0,045 -0,158 0,338 0,707

Largura máxima lobo corola LML 0,375 0,411 -0,238 -0,080 -0,089

Comprimento sépala CS 0,456 0,030 -0,213 0,014 -0,425

Largura máxima da sépala LS 0,262 -0,309 0,157 0,733 -0,388

Distância da fauce corola ao ápice DFA 0,326 -0,467 0,109 -0,385 0,122

Comprimento tubo corola CTC 0,384 -0,440 0,037 -0,305 0,070 das anteras

Caracteres foliares (dataset3) Autovalor 1,472 0,382

Variância (%) 79,396 20,604

Kruskal-Wallis (H) 298 720 P < 0,001 < 0,001 Comprimento lâmina foliar C 0,753 -0,658

Largura lâmina foliar L 0,658 0,753

126

Apêndice C. Continuação

Tabela 2. Valores de P corrigido de Bonferroni da comparação pareado pelo teste de post-hoc de Dunn dos escores dos componentes principais da ordenação dos caracteres florais de 116 espécimes, caracteres foliares de 127 espécimes e análise conjunta dos caracteres florais e foliares de 76 espécimes pertencentes ao complexo taxonômico T. catharinensis e grupo externo (morfoespécie5). Valores de P significativos se encontram em negrito. morfo1: morfoespécie1; morfo2: morfoespécie2; morfo3: morfoespécie3; morfo4: morfoespécie4; morfo5: morfoespécie5.

Caracteres florais (dataset2) Triangulo superior são os valores de p de Bonferroni corrigido para o PC1; triangulo inferior são os valores de p para o PC2 morfo1 morfo2 morfo3 morfo4 morfo5 morfo1 - < 0,01 0,99 < 0,01 < 0,01 morfo2 < 0,01 - < 0,01 1,00 0,07 morfo3 < 0,01 < 0,01 - < 0,01 < 0,01 morfo4 1,00 < 0,01 < 0,01 - 0,04 morfo5 0,14 < 0,01 < 0,01 0,05 - Triangulo superior são os valores de p de Bonferroni corrigido para o PC3; triangulo inferior são os valores de p para o PC4 morfo1 - 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 morfo2 1,00 - < 0,01 < 0,01 < 0,01 morfo3 1,00 1,00 - < 0,01 1,00 morfo4 1,00 1,00 1,00 - < 0,01 morfo5 0,27 0,02 0,18 0,89 - Triangulo superior são os valores de p de Bonferroni corrigido para o PC5 morfo1 - 1 0,60 0,01 < 0,01 morfo2 - - 0,01 0,07 < 0,01 morfo3 - - - < 0,01 < 0,01 morfo4 - - - - < 0,01 Caracteres foliares (dataset3) Triangulo superior são os valores de p de Bonferroni corrigido para o PC1; triangulo inferior são os valores de p para o PC2 morfo1 - < 0,01 0,02 0,21 - morfo2 < 0,01 - < 0,01 < 0,01 - morfo3 < 0,01 < 0,01 - 1,00 - morfo5 < 0,01 < 0,01 1,00 - - Caracteres florais e foliares (dataset4) Triangulo superior são os valores de p de Bonferroni corrigido para o PC1; triangulo inferior são os valores de p para o PC2

morfo1 - < 0,01 0,02 < 0,01 - morfo2 < 0,01 < 0,01 < 0,01 - - morfo3 < 0,01 < 0,01 - < 0,01 - morfo5 1,00 - 1,00 0,04 - Triangulo superior são os valores de p de Bonferroni corrigido para o PC3; triangulo inferior são os valores de p para o PC4

morfo1 - < 0,01 < 0,01 0,03 - morfo2 0,13 < 0,01 < 0,01 - - morfo3 < 0,01 1,00 - 0,66 - morfo5 < 0,01 - < 0,01 < 0,01 - Triangulo superior são os valores de p de Bonferroni corrigido para o PC5 morfo1 - < 0,01 0,75 1,00 - morfo3 - - - 0,04 - morfo5 - - 0,09 < 0,01 -

127

Apêndice C. Continuação

Figure 1. Biplot da análise de componentes principais (PCA) de 116 espécimes pertencentes a T. catharinensis e grupo externo (morfoespécie5), baseado em nove caracteres florais (dataset2). CI: comprimento da inflorescência; TF: total de flores por inflorescência; CL: comprimento máximo do lobo da corola; LBL: largura da base do lobo da corola; LML: largura máxima do lobo da corola; CS: comprimento da sépala; LS: largura máxima da sépala; DFA: distância da fauce da corola ao ápice das anteras; CTC: comprimento do tubo da corola.

Figure 2. Biplot da análise de componentes principais (PCA) de 127 espécimes pertencentes a T. catharinensis e grupo externo (morfoespécie5), baseado no comprimento e largura da lâmina foliar (dataset3). C: comprimento máximo da lâmina foliar; L: largura máxima da lâmina foliar. 128

Apêndice C. Continuação

Figure 3. Biplot da análise de componentes principais (PCA) de 76 espécimes pertencentes a T. catharinensis e grupo externo (morfoespécie5), baseado em 11 caracteres florais e vegetativos (dataset4). CI: comprimento da inflorescência; TF: total de flores por inflorescência; CL: comprimento máximo do lobo da corola; LBL: largura da base do lobo da corola; LML: largura máxima do lobo da corola; CS: comprimento da sépala; LS: largura máxima da sépala; DFA: distância da fauce da corola ao ápice das anteras; CTC: comprimento do tubo da corola; C: comprimento máximo da lâmina foliar; L: largura máxima da lâmina foliar.

129

Apêndice D. Estatística sumária dos caracteres quantitativos florais e foliares aferidos em espécimes do complexo taxonômico T. catharinensis e grupo externo (morfoespécie5).

Tabela 1. Estatística sumária dos caracteres morfométricos florais e foliares de espécimes pertencentes ao complexo taxonômicos T. catharinensis e grupo externo (morfoespécie5) (datasets 2 e 3). N: número amostral; CV: coeficiente de variação; CI: comprimento da inflorescência; TF: total de flores por inflorescência; CL: comprimento máximo do lobo da corola; LBL: largura da base do lobo da corola; LML: largura máxima do lobo da corola; CS: comprimento da sépala; LS: largura máxima da sépala; DFA: distância da fauce da corola ao ápice das anteras; C: comprimento máximo da lâmina foliar; L: largura máxima da lâmina foliar.

Morfoespécie1 CI TF CL LBL LML CS LS DFA CTC C L N 135 135 135 135 135 135 135 135 135 426 426 Mínimo 20,75 6,00 7,03 1,64 4,94 2,53 0,87 0,87 7,89 29,27 10,36 Máximo 54,75 45,00 14,80 3,27 12,52 6,48 1,79 2,67 11,62 190,00 37,16 Média 33,95 19,21 11,29 2,35 8,92 4,18 1,37 1,57 9,33 90,86 20,68 Erro padrão 0,55 0,65 0,14 0,02 0,12 0,08 0,02 0,03 0,06 1,34 0,25 Variância 41,11 56,87 2,67 0,08 1,98 0,83 0,04 0,13 0,54 766,22 26,30 Desvio Padrão 6,41 7,54 1,63 0,28 1,41 0,91 0,20 0,35 0,73 27,68 5,13 Mediana 33,33 18,00 11,39 2,35 8,98 4,13 1,38 1,57 9,22 88,81 20,27 CV 18,88 39,25 14,48 12,11 15,75 21,81 14,36 22,48 7,87 30,47 24,79 Morfoespécie2 CI TF CL LBL LML CS LS DFA CTC C L N 139 139 148 148 148 148 148 148 148 272 272 Mínimo 20,92 4,00 6,62 1,79 4,53 2,38 1,14 1,19 7,63 49,10 16,53 Máximo 59,49 44,00 19,73 3,74 15,48 9,10 2,34 6,29 15,84 238,00 70,89 Média 36,67 19,35 10,60 2,76 8,32 5,24 1,71 3,35 12,05 110,37 35,37 Erro padrão 0,66 0,63 0,19 0,03 0,18 0,11 0,02 0,10 0,19 1,89 0,54 Variância 60,38 55,50 5,56 0,13 4,58 1,84 0,06 1,40 5,41 974,46 79,42 Desvio Padrão 7,77 7,45 2,36 0,36 2,14 1,36 0,25 1,18 2,33 31,22 8,91 Mediana 35,89 18,00 10,22 2,77 8,19 5,24 1,70 3,42 13,06 108,82 34,12 CV 21,19 38,51 22,24 13,14 25,71 25,90 14,54 35,34 19,30 28,28 25,20 Morfoespécie3 CI TF CL LBL LML CS LS DFA CTC C L N 182 182 195 195 195 195 195 195 195 239 239 Mínimo 20,07 7,00 4,38 1,13 3,26 2,19 1,17 1,26 9,40 30,92 15,34 Máximo 50,12 89,00 12,43 3,22 10,95 7,03 2,50 5,65 14,24 106,46 53,48 Média 35,45 22,81 8,19 2,26 6,64 3,92 1,69 3,07 11,55 60,11 28,01 Erro padrão 0,47 0,79 0,10 0,03 0,11 0,07 0,02 0,05 0,07 1,05 0,47 Variância 39,65 114,55 2,07 0,16 2,51 0,94 0,07 0,58 0,89 264,26 51,72 Desvio Padrão 6,30 10,70 1,44 0,40 1,58 0,97 0,27 0,76 0,94 16,26 7,19 Mediana 35,46 21,00 8,17 2,29 6,53 3,80 1,68 3,09 11,52 58,01 27,59 CV 17,76 46,92 17,56 17,83 23,86 24,78 15,86 24,87 8,15 27,04 25,68

130

Apêndice D. Tabela 1. Continuação

Morfoespécie4 CI TF CL LBL LML CS LS DFA CTC C L N 18 18 20 20 20 20 20 20 20 - - Mínimo 35,51 27,00 11,84 2,23 5,72 3,25 1,50 2,10 8,81 - - Máximo 90,10 124,00 16,23 3,08 8,75 4,83 1,93 4,47 12,96 - - Média 61,54 72,89 14,06 2,61 7,30 4,04 1,72 3,38 11,50 - - Erro padrão 3,80 7,05 0,31 0,06 0,21 0,09 0,03 0,16 0,25 - - Variância 259,91 895,16 1,92 0,06 0,89 0,18 0,01 0,48 1,23 - - Desvio Padrão 16,12 29,92 1,39 0,25 0,95 0,42 0,11 0,69 1,11 - - Mediana 58,02 73,50 13,76 2,60 7,30 3,98 1,72 3,46 11,55 - - CV 26,20 41,05 9,86 9,61 12,95 10,37 6,60 20,56 9,66 - - Morfoespécie5 CI TF CL LBL LML CS LS DFA CTC C L N 68 68 80 80 80 80 80 80 80 104 104 Mínimo 29,27 6,00 9,44 1,66 6,40 3,13 1,02 1,08 7,97 27,19 13,05 Máximo 94,25 68,00 18,26 3,27 13,85 6,46 1,93 3,26 12,01 106,47 48,75 Média 52,12 27,34 13,80 2,27 9,63 4,47 1,52 2,12 9,42 60,10 27,99 Erro padrão 1,72 1,59 0,19 0,03 0,20 0,09 0,02 0,06 0,08 1,63 0,81 Variância 201,19 171,06 3,02 0,08 3,18 0,66 0,03 0,24 0,57 275,75 67,64 Desvio Padrão 14,18 13,08 1,74 0,29 1,78 0,81 0,18 0,49 0,75 16,61 8,22 Mediana 49,13 25,50 13,94 2,22 9,25 4,48 1,54 2,15 9,36 58,27 27,16 CV 27,22 47,84 12,58 12,78 18,51 18,20 11,82 23,21 7,98 27,63 29,38 131

Apêndice E. Descrição da análise qualitativa dos caracteres florais e vegetativos do complexo taxonômico T. catharinensis e grupo externo (morfoespécie5).

Todas as morfoespécies de T. catharinensis apresentaram sépalas reflexas; pubescência interna na corola (tricomas infra e supraestaminal); lobos da corola deflexos e com algum grau de torção. Todos os espécimes analisados apresentaram o ápice da cabeça estilar com 5 lóbulos. A pubescência nos verticilos florais e vegetativos (exceto a pubescência interna da corola) teve grande variação entre e dentre os espécimes. A maioria dos espécimes analisados da morfoespécie1 tem as sépalas glabras, entretanto alguns espécimes com sépalas pubescentes, ou pubescência limitada a face adaxial, sendo que um único espécime possuía tricomas na borda das sépalas. Para todos os espécimes analisados das morfoespécies 2, 3 e 4 as sépalas eram pubescentes. A face externa do tubo da corola nos espécimes da morfoespécie1 eram glabros (exceto um único espécime com pubescência). Entretanto, a morfoespécie2 tem pubescência na face externa do tubo da corola e os tricomas estavam presentes até a base dos lobos, os lobos geralmente são glabros ou ocasionalmente com tricomas na borda. Um único espécime apresentou flores sem tricomas e outro flores com e sem tricomas na face externa do tubo da corola. Para morfoespécie3 as flores analisadas eram pubescentes na face externa do tubo da corola e a base do tubo glabro. Para a morfoespécie4 dos quatro espécimes analisados três tinham flores pubescentes na face externa do tubo, com pubescência até a base dos lobos e um único espécime com flores glabras. O ovário é glabro nas morfoespécies 1 e 2 (exceto um único espécime), para a morfoespécie3 o ovário é pubescente para maioria dos espécimes analisados, entretanto alguns tinham ovários glabros e outros com ambas às condições. Para a morfoespécie4 alguns ovários tinham pubescência e outros não. O número de projeções basais na base da cabeça estilar é variável entre os espécimes para todos as morfoespécies analisadas, variando de 0 a 18, podendo ser estes bem delimitados ou não. Para a morfoespécie1 encontramos um único espécime sem as projeções basais evidentes, e para a morfoespécie2 encontramos três sem e três com projeções basais e outras flores sem. Para a morfoespécie3 todas as flores analisadas não tinham as projeções basais na base da cabeça estilar, exceto para um único espécime que apresentou de 8 a 10. Para a morfoespécie4 todos os quatro espécimes tinham 10 projeções basais na cabeça estilar. A maioria dos espécimes analisados da morfoespécie1 tinham folhas glabras, no entanto seis espécimes com folhas e pecíolos com tricomas, e no geral esses espécimes com 132

Apêndice E. Continuação folhas pubescentes, os tricomas também estavam presentes na inflorescência e nas brácteas da inflorescência. Nos espécimes da morfoespécie2 as folhas eram pubescentes, assim como pecíolos, inflorescências e brácteas da inflorescência, entretanto três eram glabros. Os espécimes analisados da morfoespécie3 tinham folhas pubescentes, assim como pecíolos, inflorescências e brácteas da inflorescência, no entanto quatro tinham folhas glabras e três tinham pubescência somente na face abaxial da lâmina foliar e um único espécime com folhas glabras ou pubescente somente na face abaxial. As flores da morfoespécie5 apresentaram sépalas reflexas e glabras, face externa do tubo da corola e ovários glabros, as flores tinham de 9 a 12 projeções basais na base da cabeça estilar e ápice da cabeça estilar com 5 lóbulos. As folhas, inflorescências e brácteas da inflorescência são glabras e as folhas com pecíolo curto a subséssil.

133

CAPÍTULO 4

Análise morfológica e morfométrica dos complexos taxonômicos Tabernaemontana laeta Mart. e T. hystrix Steud. (Apocynaceae, Rauvolfioideae, Tabernaemontaneae)

RESUMO As espécies de T. laeta e T. hystrix apresentam grande variação nos caracteres florais e foliares e as informações disponíveis na literatura e coleções herborizadas não permitem inferir se a variação morfológica correspondem a unidades taxonômicas distintas, ou se são espécies com ampla variação morfológica. Tabernaemontana laeta engloba dois sinônimos e três variedades, e se distribui nas regiões nordeste e sudeste do Brasil, já T. hystrix engloba nove sinônimos e se distribui na região sudeste do Brasil, e no estado da Bahia. Nesse estudo dividimos as variações morfológicas encontradas em T. hystrix e T. laeta em seis morfoespécies (morfoespécies 6 a 11), com base nos caracteres florais e vegetativos. Utilizamos a morfometria geométrica dos botões florais, morfometria linear e análise qualitativa dos caracteres florais e vegetativos, a fim de testar se as morfoespécies previamente estabelecidas correspondem a grupamentos morfológicos distintos. Para os estudos morfométricos e morfológicos foram amostrados 208 espécimes (morfoespécie6 N = 100; morfoespécie7 N = 20; morfoespécie8 N = 35; morfoespécie9 N = 29; morfoespécie10 N = 8; morfoespécie11 N = 16) distribuídos nas regiões nordeste e sudeste do Brasil. Para o grupo externo (morfoespécie5) amostrados 24 espécimes, como base de comparação para os estudos morfométricos, a qual é distinta morfologicamente das demais morfoespécies. Para avaliar os possíveis agrupamentos morfológicos utilizou-se a morfometria geométrica dos botões florais, nove caracteres florais quantitativos e dois foliares, assim como 15 caracteres qualitativos vegetativos e florais. Com base na forma dos botões florais, caracteres florais, foliares e vegetativos analisados permitiram o reconhecimento de três espécies distintas dentro do complexo taxonômico T. laeta e T. hystrix, as quais corresponderam às morfoespécies 6, 9 e 10. As morfoespécies 7, 8 e 11 apresentaram sobreposição nos caracteres analisados, entretanto a morfoespécie11 apresentou-se distinta na forma dos botões florais e parte dos caracteres florais analisados. A variação morfológica da morfoespécie6 se sobrepôs parcialmente com as morfoespécies 7 e 8, somado a ausência de resolução filogenética (capítulo 2), coocorrência em algumas localidades e floração no mesmo período podem indicar algum nível de fluxo gênico e hibridização. A variação morfológica da morfoespécie6 se enquadra na descrição do nome T. laeta, e a forma típica de T. laeta é separada das demais pela forma e tamanho dos botões florais e caracteres florais e foliares. Para as morfoespécies 134

9 e 10 até o momento não foi possível relacionar com nenhum nome taxonômico previamente publicado. É necessária uma revisão mais detalhada dos sinônimos e nomes descritos em T. hystrix e táxons próximos, para confirmar se as morfoespécies 9 e 10 não foram previamente descritas.

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ABSTRACT The species of T.laeta and T. hystrix have great variation in the floral and foliar characters and information available in the literature and herborized collections does not allow us to infer if the morphological variation corresponds to distinct taxonomic units, or if they are species with a wide morphological variation. Tabernaemontana laeta comprises two synonyms and three varieties and is distributed in northeastern and southeastern Brazil, already T. hystrix encompasses nine synonyms and is distributed in southeastern Brazil, with records in the state of Bahia. In this study, we divided the morphological variation found in T. hystrix and T. laeta into six morphospecies (morphospecies 6 to 11), based on floral and vegetative characters. We used the geometric morphometrics of floral buds, linear morphometry, and qualitative analysis of the floral and vegetative characters to test whether the previously established morphospecies corresponds to distinct morphological groups. For morphometric and morphological studies 208 specimens were sampled (morphospecies6 N = 100; morphospecies7 N = 20; morphospecies8 N = 35; morphospecies9 N = 29; morphospecies10 N = 8; morphospecies11 N = 16) distributed in the northeastern and southeastern regions of Brazil. For the external group (morphospecies5) 24 specimens were sampled, to serve as a basis for comparison for morphometric studies, which is morphologically distinct from the other morphospecies. To evaluate the possible morphological groupings, the geometric morphometry of floral buds, nine quantitative floral characters, and two foliar characters, as well as 15 qualitative vegetative and floral characters were used. Based on the shape of the floral buds, floral, foliar, and vegetative characters analyzed allowed the recognition of three distinct species within the taxonomic complex T. laeta and T. hystrix, which corresponded to morphospecies 6, 9, and 10. Morphospecies 7, 8, and 11 had overlapping in the characters analyzed, however, the morphospecie11 were distinct in the form of floral buds and part of the floral characters analyzed. The morphological variation of morphospecies6 partially overlapped with morphospecies 7 and 8, added to the absence of phylogenetic resolution (chapter 2), co-occurrence in some localities, and flowering in the same period may indicate some level of gene flow and hybridization. The morphological variation of the morphospecies6 fits the description of T. laeta, and the typical shape of T. laeta is separated from the others by the shape and size of the flower buds and floral and leaf characters. For morphospecies 9 and 10 so far, it has not been possible to relate to any previously published taxonomic name. A more detailed review of the synonyms and names described in T. hystrix and nearby taxa is necessary to confirm that morphospecies 9 and 10 have not been previously described. 136

1. INTRODUÇÃO Tabernaemontana laeta Mart., em sua circunscrição atual (Leeuwenberg, 1994) engloba dois sinônimos (T. breviflora Müll. Arg. e T. spixiana Martius ex Müll. Arg.) e três variedades (T. laeta var densa Müll. Arg., T. laeta var minor Müll. Arg. e T. laeta var. pubiflora Müll. Arg.). Com base nas informações da literatura, ocorre em florestas secundárias nos estados de Pernambuco, Paraíba, Bahia, Minas Gerais, Espírito Santo, Rio de Janeiro e São Paulo (Leeuwenberg, 1994). Tabernaemontana laeta foi descrita por Martius em 1837, sendo caracterizada pela ausência de tricomas nos verticilos vegetativos e florais; folhas membranáceas, oblongas, ápice foliar agudo ou acuminado e base foliar aguda; inflorescência terminal do tipo corimbo, achatadas lateralmente e com multiflores, inflorescência composta por cimeiras penduculadas, brácteas da inflorescência decíduas; lacínias do cálice triangulares, ligeiramente agudas; lacínias da corola obliquamente estreita- obovada; lobos da corola quase do mesmo tamanho que o tubo floral, parte superior do tubo floral constricto e fauce com tricomas (Martius, 1837). Na chave fornecida por Leeuwenberg (1994) a espécie apresenta a face interna dos lobos da corola pilosos por 0,1 a 0,35 mm do seu comprimento, frutos densamente cobertos com excrescências bruscas e verdes. Tabernaemontana hystrix em sua circunscrição atual (Leeuwenberg, 1994) engloba nove sinônimos (Peschiera granulosa Miers, P. solandri Miers, T. bracteolaris Mart. ex. Müll. Arg. T. collina Gardner, T. echinata Vell., T. fuchsiifolia A. DC., T. gaudichaudii A. DC., T. gracilis Müll. Arg. e T. lundii A. DC). Com base nas informações da literatura, ocorre somente em ambientes abertos nos estados da Bahia, Minas Gerais, Espírito Santo, Rio de Janeiro e São Paulo (Leeuwenberg, 1994). Leeuwenberg (1994) cita que os espécimes por ele analisados, incluindo o tipo do nome e sinônimos, são similares em quase todos os caracteres morfológicos. Além disso, ressalta que a espécie é muito próxima de T. catharinensis pelas folhas, sépalas recurvadas, frutos e ecologia similar, sendo separadas pela proporção do comprimento do tudo da corola em relação aos lobos da corola e proporção do cálice em relação aos lobos da corola (Leeuwenberg, 1994). No entanto, Koch e Kinoshita (2005), em estudo do gênero para a Flora de São Paulo, ressalta a existência de polimorfismo entre os materiais analisados de T. hystrix, no qual é necessário a reavaliação da espécie, designação de um epítipo, uma vez que o lectótipo é baseado em uma prancha ilustrativa de Velloso (1829). Dessa forma, as informações fornecidas por esse lectótipo, são insuficientes para caracterizá-lo adequadamente e descrever a variação morfológica associada a esse nome (Koch e Kinoshita, 2005). Tabernaemontana hystrix foi descrita com base na prancha ilustrativa de Velloso (1829) (Figura 1), essa prancha não permite evidenciar os caracteres 137

diagnósticos e é acompanhada de uma breve descrição, sendo caracterizada por folhas opostas, flores agrupadas e terminais. Nas observações o autor acrescentou que a espécie apresenta flores odoríferas e contortas, os nectários são ausentes e a corola é alba. Já os folículos são em número de dois e horizontais, e a parte superior côncavo e inferior convexo e equinado; a polpa de cor vermelha viva que envolve as sementes; caules sub-arbóreos e latescentes (Velloso, 1829). A espécie é conhecida pelo nome popular de pão de colher, e ocorre em áreas de mata próximo ao ambiente marinho (Velloso, 1829).

Figura 1. Tipo de Tabernaemontana hystrix, baseada na prancha de Vellozo, Florae Fluminensis 3: t. 17 (1829).

Com base nas informações disponíveis na literatura, não é possível inferir se a variação morfológica de T. laeta e T. hystrix correspondem a unidades taxonômicas distintas ou se são espécies com ampla variação morfológica. Apesar das coleções herborizadas, revisão taxonômica e chaves de identificação é necessário incluir a variação morfológica entre espécimes e populações para melhor determinar a variação em cada táxon. Os complexos taxonômicos T. laeta e hystrix apresentam flores similares com poucos caracteres divergentes, sendo necessário incluir análises de morfometria dos caracteres florais e vegetativos e uma análise mais ampla dos caracteres qualitativos. Com o objetivo de avaliar se as morfoespécies previamente estabelecidas nesse estudo, correspondem a agrupamentos morfológicos distintos 138

utilizamos a morfologia tradicional aliada a morfometria geométrica dos botões florais, morfometria linear dos caracteres florais e foliares.

2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1. Amostragem dos espécimes No total amostramos 208 espécimes pertencentes aos complexos taxonômicos T. laeta e T. hystrix. Os espécimes foram coletados em 15 localidades, distribuídas nas regiões sudeste (São Paulo, Rio de Janeiro, Espírito Santo e Minas Gerais) e nordeste (Bahia, Pernanbuco e Paraíba) do Brasil (Figura 2). Essas localidades foram escolhidas pelo grande número de espécimes previamente coletados, com base nos dados extraídos do speciesLink e revisão do Leeuwenberg (1994), assim como das localidades dos espécimes tipos. As localidades e espécimes amostrados por cada morfoespécie se encontram descritas no Apêndice A. Os materiais coletados de T. laeta e T. hystrix foram separados em seis morfoespécies (Figuras 3 a 5). As morfoespécies foram separadas com base nos caracteres florais, foliares e hábito de vida. Para confirmar a separação e identificações das morfoespécies, as coleções de alguns herbários (RB, R, CVRD, FUEL, HCDAL, HERBAM, UFP, UFPB, UB, UEC e VIC), base de dados digitais (JSTOR, speciesLink, Reflora, Tropicos, NYBG e MNHN) e a revisão de Leeuwenberg (1994) foram consultados. Após a separação das variações morfológicas encontradas nos espécimes pertencentes aos complexos taxonômicos T. laeta e T. hystrix em morfoespécies, essas foram submetidos às análises morfométricas iniciais para validação, e caso necessário foi feita a reavaliação dos espécimes e morfoespécies. No total coletamos 100 espécimes da morfoespécie6 (Figura 3, Apêndice A) esses foram coletados nos municípios Ubatuba (SP), Rio das Ostras (RJ), Viçosa, Bom Jesus do Amparo, Campanário, Itabira (MG), Linhares (ES), Goiana, Condado (PE), Areia e Alagoa Nova (PB) (Figura 2). Essa morfoespécie tem sido identificada como T. laeta, com base nas identificações feitas nos herbários, por especialista da família. A maioria dos espécimes coletados da morfoespécie6 têm morfologia constante (Figura 3 A-E), no entanto alguns com variações no formato e dimensões dos botões florais, tamanho dos lobos da corola e tubo floral, forma foliar, comprimento da inflorescência e número de flores por inflorescência (Figura 3 F-J). Para a morfoespécie7 amostramos 20 espécimes (Figura 4 A-E, Apêndice A) coletados nos municípios de Rio das Ostras (RJ), Prado (BA), Linhares e Aracruz (ES) (Figura 2) e para a morfoespécie8 (Figura 4 F-J, Apêndice A) amostramos 35 espécimes nos municípios de Prado (BA), Linhares e Aracruz (ES) (Figura 2). Os espécimes associados a variação 139

morfológica observada na morfoespécie7 tem sido identificada como T. hystrix, com base nas identificações feitas nos herbários, por especialista da família, já a morfoespécie8 tem sido identificada como T. laeta. As duas morfoespécies são de difícil posicionamento, com caracteres florais sobrepostos, entretanto com diferenças na morfologia foliar, ápice do botão floral e diferenças na arquitetura da copa (Figura 4). As duas morfoespécies coocorrem em algumas localidades (Prado e Linhares) (Figura 2), embora a morfoespécie7 tenha preferência por locais abertos, e a morfoespécie8 por ambientes de mata ou borda.

Figura 2. Mapa de distribuição das populações amostradas pertencentes aos complexos taxonômicos Tabernaemontana laeta e T. hystrix. Triângulo: morfoespécie6; losango: morfoespécie8; quadrado: morfoespécie11; círculo: duas morfoespécies amostradas; asterisco: populações mistas (IPI: morfoespécie 6 a 8; PRA: morfoespécies 7 e 8; RO: morfoespécies 6, 7, 10 e 11). Preto: morfo6; amarelo: morfo8; cinza: morfo11; roxo: morfo7; rosa: morfo9. AL: Areia e Alagoa Nova, Paraíba; ITA: Itabira e Bom Jesus do Amparo, Minas Gerais; JP: Goiana e Condado, Pernambuco; TEO: Campanário, Minas Gerais; VIC: Viçosa, Minas Gerais; PAS: Prado, Bahia; SJ: Silva Jardim, Rio de Janeiro; COMB: Aracruz e Linhares, Espírito Santo, DES: Prado, Bahia; UB: Ubatuba, São Paulo; IPI: Linhares, Espírito Santo; PRA: Prado, Bahia; RO: Rio das Ostras, Rio de Janeiro. 140

Coletamos 29 espécimes para a morfoespécie9 (Figura 5 A-E, Apêndice A), esses foram coletados somente no município de Ubatuba (SP) (Figura 2). Para a morfoespécie10 coletamos somente 8 espécimes (Figura 5 F-J, Apêndice A) somente no município de Rio das Ostras (RJ) (Figura 2). As morfoespécies 9 e 10 tem sido identificadas como T. hystrix, com base nas identificações feitas nos herbários por especialista da família. As morfoespécies 9 e 10 são similares (Figura 5 A-J), no entanto, com diferenças nos caracteres florais e foliares. Para a morfoespécie11 coletamos 16 espécimes (Figura 5 K-O, Apêndice A) no município de Silva Jardim (RJ) (Figura 2). A morfoespécie11 tem sido identificada como T. hystrix, com base nas identificações feitas nos herbários por especialista da família. Para auxiliar na interpretação dos resultados incluímos 25 espécimes da morfoespécie5 como “grupo externo” (Apêndice A). Essa morfoespécie tem morfologia e ecologia distinta das demais morfoespécies pertencentes aos complexos taxonômicos T. laeta e T. hystrix. Essa mesma abordagem foi feita por outros autores (Palmquist et al., 2015; Püschel et al., 2014; Shipunov e Bateman, 2005). 2.2. Morfometria geométrica e linear e caracteres discretos Mesma metodologia utilizada no subitem 2.2. do capítulo 3, página 95.

2.3. Análise estatística Mesma metodologia utilizada no subitem 2.2. do capítulo 3, página 96.

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A B C D Figura 3. Inflorescências, flores, botões florais e folhas da morfoespécie6 com morfologia constante A-E) coletadas em Rio das Ostras, RJ (A-C), Ubatuba, SP (D) e Itabira, MG (E); espécimes com morfologia atípicas F-J) coletadas em Ubatuba, SP (F), Itabira, MG (G), Campanário, MG (H), Viçosa, MG (I) e Alagoa Nova, PB (J). E F G

H I J

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A B C D E

F G H I J

Figura 4. Inflorescências, flores, botões florais e folhas de: A-E) morfoespécie7, Prado, BA (A, B), Rio das Ostras, RJ (C) e Linhares, ES (D); F-J) morfoespécie8, Itamaraju, BA e Linhares, ES;

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A B C D E Figura 5. Inflorescências, flores, botões florais e folhas de: A-E) morfoespécie9, Ubatuba, SP; F- J) F G H I J morfoespécie10, Rio das Ostras, RJ; K-O) morfoespécie11, Silva Jardim, RJ.

K L M N O 144

3. RESULTADOS 3.1. Morfometria geométrica O primeiro componente principal capturou 59% da variação na forma dos botões florais e o segundo 19 % (Figura 6), com sobreposição entre as morfoespécies 7, 8 e 9. O gráfico da ordenação somente para essas três morfoespécies indicou que a forma dos botões florais da morfoespécie6 se sobrepôs parcialmente com as morfoespécies 7 e 8, e a morfoespécie7 é sobreposta com a morfoespécie8 (Figura 7).

Figura 6. Análise de componentes principais (PC) da forma dos botões florais (dataset1) de espécies pertencentes aos complexos taxonômicos T. laeta e T. hystrix e grupo externo (morfoespécie5).

O PC1 indicou mudanças na base, estreitamento do tubo floral e cabeça dos botões florais (Figura 8). No PC1 observamos mudanças de uma forma largo-elíptica, com transições para uma forma mais trulada das cabeças dos botões florais, com mudanças nos landmarks 5 e 6 (correspondentes 10 e 11) e semilandmark 7 (correspondente 9), tanto nos posicionamentos como nos distanciamentos (Figura 8). Assim como, diminuição do tubo floral, os quais correspondem aos landmanks e semilandmarks 1 ao 5 (correspondente 11 ao 15) e aumento da curvatura da base dos botões florais, os quais correspondem aos landmanks e semilandmarks 1 ao 3 (correspondentes 13 ao 15) (Figura 8). O PC1 separou a morfoespécies 5 e 10 das demais, e parcialmente a morfoespécie6. A morfoespécie10 pode ser caracterizada pelo tubo floral estreito e longo e cabeça do botão floral elíptico. A morfoespécie5 tem a base 145

do botão floral mais espessada e estreitamento do tubo floral menor, com aumento da cabeça dos botões florais sendo essa mais trulada (Figura 8).

Figura 7. Análise de componentes principais (PC) da forma dos botões florais (dataset1) das morfoespécies 6, 7 e 8 pertencentes aos complexos taxonômicos T. laeta e T. hystrix.

No PC2 houve uma diminuição progressiva da espessura da base e estreitamento do tubo floral, os quais se referem aos landmarks e semilandmarks 1 ao 5 (correspondentes 11 a 15) (Figura 8). Também foram observadas mudanças no posicionamento e distanciamento entre os landmarks 5 e 6 (correspondentes 10 e 11) da cabeça dos botões florais (Figura 8). Uma mudança menos acentuada foi observada no distanciamento entre o landmark 6 (correspondente 10) com o semilandmark 7 (correspondente 9), o que resultou numa mudança progressiva largo-elíptica para estreito-elíptica das cabeças dos botões florais (Figura 8). O PC2 separou a morfoespécie9 das demais morfoespécies, somente com a retirada do grupo externo (morfoespécie5), gráfico não apresentado.

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Figura 8. Análise de componentes principais (PC) da forma dos botões florais (dataset1) das morfoespécies pertencentes aos complexos taxonômicos T. laeta e T. hystrix e grupo externo (morfoespécie5). O wireframe em preto representa a forma média geral para os fatores de escalas do PC1 e wireframe em azul para o PC2.

Os CVs 1 e 2 capturaram 91% da variação (Figura 9). Somente a morfoespécie5 não se sobrepôs com as demais morfoespécies, sendo separada pelo CV1 (Figura 9). A morfoespécie6 se sobrepôs parcialmente com as morfoespécies 7 e 8, e para as morfoespécies 9, 10 e 11 a sobreposição foi marginal (Figura 9), apesar dessas sobreposições o teste de permutação indicaram diferenças, tanto para a distância de Mahalanobis como Procustes (Tabela 1), para todas as morfoespécies. A CVA gerada somente com as morfoespécies 6, 7 e 8 ainda se observa sobreposição marginal da morfoespécie6 com as morfoespécies 7 e 8, no entanto entre essas duas observa-se maior sobreposição (Figura 10). Pela análise da função de discriminante (DFA) 10% dos botões florais da morfoespécie6 foram incorretamente classificados como pertencentes as morfoespécies 7 e 8, e para a morfoespécie7 3% dos botões florais foram classificados como a morfoespécie6, e para a morfoespécie8 8%. Maior número de botões classificados incorretamente ocorreu entre as morfoespécies 7 (24%) e 8 147

(21%). Apesar das morfoespécies 9, 10 e 11 formarem agrupamentos distintos, a separação entre essas morfoespécies foram melhores visualizadas na CVA separada (Figura 11). O CV1 separou a morfoespécie9 das morfoespécies 10 e 11, e essas últimas foram separadas pelo CV2, respectivamente (Figura 11), o mesmo padrão de agrupamento foi observado na PCA (gráfico não apresentado). O número de botões classificados incorretamente pela análise de discriminante (DFA) não ultrapassaram os 5% entre as morfoespécies 10 e 11 e para as morfoespécies 9 e 11 foi de 1%, e entre as morfoespécies 9 e 10 nenhum botão floral foi incorretamente classificado.

Figura 9. Análise de Análise de variáveis canônicas (CVA) da forma dos botões florais (dataset1) das morfoespécies pertencentes aos complexos taxonômicos T. laeta e T. hystrix e grupo externo (morfoespécie5). 148

Figura 10. Análise de Análise de variáveis canônicas (CVA) da forma dos botões florais (dataset1) das morfoespécies 6, 7 e 8 pertencentes aos complexos taxonômicos T. laeta e T. hystrix.

Figura 11. Análise de Análise de variáveis canônicas (CVA) da forma dos botões florais (dataset1) das morfoespécies 9, 10 e 11 pertencentes aos complexos taxonômicos T. laeta, T. hystrix. 149

Tabela 1. Distâncias de Mahalanobis e Procustes e respectivas probabilidades obtidas pelo teste de permutação da diferença na forma dos botões florais (dataset1) das morfoespécies pertencentes aos complexos taxonômicos T. laeta e T. hystrix e grupo externo (morfoespécie5). Valores de P significativos se encontram em negrito.

morfo6 mo rfo5 morfo7 morfo8 morfo9 morfo10 morfo11 Distância de Mahalanobis: triangulo superior é os P-valor do teste de permutação; triangulo inferior são as distâncias entre espécies morfoespécie6 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 morfoespécie5 6,68 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 morfoespécie7 3,01 8,30 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 morfoespécie8 2,87 8,08 1,52 < 0,01 < 0,01 < 0,01 morfoespécie9 5,59 8,37 5,46 5,58 < 0,01 < 0,01 morfoespécie10 6,56 10,51 5,22 5,45 4,25 < 0,01 morfoespécie11 4,55 8,83 3,40 3,53 3,99 2,46 Distância de Procrustes: triangulo superior é os P-valor do teste de permutação; triangulo inferior são as distâncias entre espécies morfoespécie6 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 morfoespécie5 0,15 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 morfoespécie7 0,08 0,22 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 morfoespécie8 0,06 0,20 0,03 < 0,01 < 0,01 < 0,01 morfoespécie9 0,09 0,18 0,12 0,11 < 0,01 < 0,01 morfoespécie10 0,17 0,28 0,13 0,14 0,11 < 0,01 morfoespécie11 0,11 0,23 0,08 0,08 0,07 0,07

3.2. Caracteres florais e foliares contínuos e discretos

Caracteres florais contínuos (dataset2): o primeiro e segundo componentes principais contabilizaram 62% da variação na morfologia floral (Apêndice B, Tabela 1) . O gráfico dos escores dos componentes 1 e 2 indicaram sobreposição entre alguns pares de morfoespécies (Apêndice B, Figura 1). Com diferenças para as morfoespécies 5 e 6 em todos os eixos testados (Apêndice B, Tabela 2), no entanto sem diferenças entre as morfoespécies 7 e 8 e entre as morfoespécies 9 e 10 para todos os eixos testados (Apêndice B, Tabela 2). A ausência de diferenças entre as morfoespécies 9 e 10, possivelmente é devido ao baixo número de espécimes incluídos nas análises. As diferenças entre as morfoespécies 9 e 11 e entre as morfoespécies 10 e 11 foram observadas somente no PC3 (Apêndice B, Tabela 2). O eixo um da análise de discriminante capturou 54% da variação nos dados florais, e o segundo 4% (Figura 10). O gráfico de dispersão da análise de discriminante indicou grande sobreposição dos caracteres florais entre as morfoespécies 7, 8 e 11 e baixa sobreposição com as morfoespécies 6 e 9, e nenhuma sobreposição para as morfoespécies 5 e 10 (Figura 10). A sobreposição parcial ou total dos caracteres florais entre as morfoespécies foram evidenciadas pelos números de classificações incorretas. No total 84% dos caracteres florais foram 150

corretamente classificados e os maiores números de classificações incorretas ocorreram nas morfoespécies 7 (39%), 8 (36%) e 11 (16%) e menores nas morfoespécies 6 (9%) e 9 (5%).

Figure 10. Gráficos de dispersão dos eixos 1 e 2 da análise de discriminantes de 145 espécimes pertencentes aos complexos taxonômicos T. laeta e T. hystrix e grupo externo (morfoespécie5), baseado em nove caracteres florais (dataset2). Caracteres foliares contínuos (dataset3): o primeiro componente principal capturou 91% da variação do comprimento e largura foliar e o segundo 9% (Apêndice B, Tabela 1), com alta sobreposição entre os táxons (Apêndice B, Figura 2). Apesar da alta sobreposição, a

Figura 11. Gráficos de dispersão dos eixos 1 e 2 da análise de discriminantes de 192 espécimes pertencentes aos complexos taxonômicos T. laeta e T. hystrix e grupo externo (morfoespécie5), baseado no comprimento e largura da lâmina foliar (dataset3). 151

comparação pareada dos escores indicaram diferenças entre todos os táxons, exceto entre as morfoespécies 6 e 8 (Apêndice B, Tabela 2). O eixo um da análise de discriminante capturou 65% da variação nos dados dos caracteres foliares, e o segundo explicou 35% (Figura 11), com alta sobreposição entre as morfoespécies. No total somente 35% das folhas foram corretamente classificadas. Os maiores números de classificações incorretas ocorreram nas morfoespécies 6 (72%), 8 (82%), 9 (68%) e 11 (70%), posteriormente nas morfoespécies 7 (42%), 10 (26%) e 5 (24%). Análise conjunta dos caracteres florais e foliares contínuos (dataset4): o gráfico de dispersão da análise de discriminante indicou sobreposição entre as morfoespécies 6 a 9 e 11 (Figura 14). A comparação pareada dos escores dos componentes principais indicaram diferenças entre as morfoespécies. No entanto essas diferenças ocorreram somente no PC3 para as morfoespécies 9 e 10, nos PCs 2 e 3 para as morfoespécies 8 e 9, e PCs 4 e 5 para as morfoespécies 9 e 11 (Apêndice B, Tabela 2). No total 86% dos caracteres florais e foliares foram corretamente classificados e os maiores números de classificações incorretas ocorreram nas morfoespécies 1 (27%), 8 (25%), 11 (24%) e (8%).

Figure 14. Gráficos de dispersão dos eixos 1 e 2 da análise de discriminantes de 115 espécimes pertencentes aos complexos taxonômicos T. laeta e T. hystrix e grupo externo (morfoespécie5), baseado em 11 caracteres florais e vegetativos (dataset4).

Caracteres qualitativos: todos as morfoespécies analisadas têm pubescência interna no tubo da corola (tricomas infra e supraestaminais), lobos da corola deflexos, com algum grau de torção, e ápice da cabeça estilar com 5 lóbulos. Nas morfoespécies 6, 7, 8 e 11 as sépalas são inflexas e as folhas, flores e inflorescência são glabros, e as flores com projeções 152

basais na cabeça estilar. Nas morfoespécies 9 e 10 as sépalas são reflexas, pubescentes na face adaxial da morfoespécie9 e em ambas as faces na morfoespécie10. A morfoespécie10 foi a única com tricomas na face externa do tubo da corola, ovário e folhas. Os espécimes analisados da morfoespécie9 não apresentaram projeções basais na cabeça estilar, enquanto na morfoespécie10 dos três indivíduos analisados dois não tinham projeções basais e um apresentou 10. A descrição da análise qualitativa dos caracteres florais e foliares se encontram descritos no Apêndice D e resumidos na Tabela 2. Análise conjunta global (dataset5): o eixo 1 e 2 da análise de coordenadas principais (PCoA) capturaram 40% na variação dos dados, com sobreposição entre as morfoespécies 7, 8 e 6 (Figura 15) em todos os eixos analisados. Os caracteres florais e vegetativos das morfoespécies 9 e 10 não se sobreporam com nenhum táxon (Figura 15). A morfoespécie5 se separou dos demais táxons na coordenada 3 (gráfico não apresentado). Na Tabela 3 se encontram descritos os resultados das análises qualitativas e quantitativas dos caracteres florais e vegetativos, assim como da análise filogenética (capítulo 2) dos complexos taxonômicos T. laeta e T. hystrix e grupo externo (morfoespécie5).

Figure 15. Gráficos de dispersão das coordenadas 1 e 2 da análise de coordenadas principais (PCoA) de 117 espécimes pertencentes aos complexos taxonômicos T. laeta e T. hystrix e grupo externo (morfoespécie5) baseado em 33 caracteres florais e vegetativos qualitativos e quantitativos (dataset5), com a retirada outlier RO203_morfoespécie7. AL: Areia e Alagoa Nova, Paraíba; COMB: Aracruz e Linhares, Espírito Santo; DES: Prado, Bahia; IPI: Linhares, Espírito Santo; ITA: Itabira e Bom Jesus do Amparo, Minas Gerais; JP: Goiana e Condado, Pernambuco; PAS: Prado, Bahia; PRA: Prado, Bahia; RO: Rio das Ostras, Rio de Janeiro; SJ: Silva Jardim, Rio de Janeiro; TEO: Campanário, Minas Gerais; UB: Ubatuba, São Paulo; VIC: Viçosa, Minas Gerais. 153

Análise univariada dos caracteres florais e foliares contínuos (datasets 1 e 2): a morfoespécie6 diferenciou-se das demais pelo comprimento total da inflorescência (CI), total de flores por inflorescencia (TF), comprimento do lobo da corola (CL), largura máxima do lobo da corola (LML) e largura máxima da sépala (LS) (exceto para a morfoespécie5 no CI, TF e CL) (Figura 12). As morfoespécies 7 e 8 diferiram na largura máxima do lobo da corola (LML), comprimento da lâmina foliar (C), largura máxima da lâmina foliar (L) e razão entre largura e comprimento da lâmina foliar (L/C) (Figura 12). A morfoespécies 9, 10 e 11 diferiram das morfoespécies 7 e 8 pelo total de flores por inflorescência (TF) e distância da fauce ao ápice das anteras (DFA), sendo o DFA maior nas morfoespécies 9, 10 e 11 e o número de flores menores. A morfoespécies 9 e 10 diferiram da morfoespécie11 com base no comprimento da sépala (CS), comprimento do tubo da corola (CTC) e comprimento da lâmina foliar (C), sendo todos menores na morfoespécie11. A morfoespécie9 diferiu das morfoespécies 10 e 11, com base na largura máxima da lâmina foliar (L) sendo essa maior na morfoespécie9, e a morfoespécie10 diferiu das morfoespécies 9 e 11 pela razão entre largura e comprimento da lâmina foliar (L/C), sendo menor na morfoespécie10 (Figura 12). Na análise dos caracteres florais e foliares entre as morfoespécies 9 e 10 essas diferiram pelo comprimento do lobo da corola (CL), largura máxima do lobo da corola (LML), comprimento da sépala (CS), distância da fauce ao ápice das anteras (DFA), comprimento do tubo da corola (CTC), largura máxima da lâmina foliar (L) e razão entre largura e comprimento da lâmina foliar (L/C) (Figura 13). Morfoespécie5 diferenciou dos demais táxons na largura máxima do lobo da corola (LML), distância da fauce ao ápice das anteras (DFA) e razão entre largura e comprimento da lâmina foliar (L/C) (Figura 12). A estatística sumária dos caracteres quantitativos aferidos se encontra descrita no Apêndice C, Tabela 1. 154

Figura 12. Boxplot de 12 caracteres quantitativos de 145 espécimes para os caracteres florais e 192 espécimes para os caracteres foliares (datasets 1 e 2), pertencentes aos complexos taxonômicos T. laeta e T. hystrix e grupo externo (morfoespécie5). Os retângulos são definidos 25 e 75 percentis; linhas horizontais dentro dos retângulos representam à média; círculos representam os valores extremos; os valores mínimo e máximo são representados por linhas horizontas curtas (“whiskers”). A: morfoespécie6; B: morfoespécie7; C: morfoespécie8; D: morfoespécie9; E: morfoespécie10; F: morfoespécie11; G: morfoespécie5 (grupo externo). Letras em minúsculo representam o resultado do teste de post-hoc de Dunn, com base no valor de P corrigido de Bonferroni. Letras iguais são associadas ao P ≥ 0,05; letras diferentes são associadas a valores de P ≤ 0,05.

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Figura 13. Boxplot de 12 caracteres quantitativos de 11 espécimes para os caracteres florais e 32 espécimes para os caracteres foliares, pertencentes às morfoespécies 9 e 10. Os retângulos são definidos 25 e 75 percentis; linhas horizontais dentro dos retângulos representam à média; círculos representam os valores extremos; os valores mínimo e máximo são representados por linhas horizontas curtas (“whiskers”). A: morfoespécie9; B: morfoespécie10. Letras em minúsculo representam o resultado do teste de post-hoc de Dunn, com base no valor de P corrigido de Bonferroni. Letras iguais são associadas ao P ≥ 0,05; letras diferentes são associadas a valores de P ≤ 0,05. 156

Tabela 2. Resumo dos caracteres morfológicos analisados e posicionamento filogenético dos complexos taxonômicos T. laeta e T. hystrix e grupo externo (morfoespécie5). MG: morfometria geométrica; ML: morfometria linear; CI: comprimento da inflorescência; TF: total de flores por inflorescência; CL: comprimento máximo do lobo da corola; LBL: largura da base do lobo da corola; LML: largura máxima do lobo da corola; LS: largura máxima da sépala; CTC: comprimento do tubo da corola; DFA: distância da fauce da corola ao ápice das anteras; C: comprimento máximo da lâmina foliar; L/C: Razão entre largura pelo comprimento da lâmina foliar; Id: identificação prévia; nd: não determinado; morfos: morfoespécies. Caracteres em negrito pela análise univariada apresentaram sobreposição com o grupo externo (morfoespécie5). Caracteres Morfoespécie6 Morfoespécie7 Morfoespécie8 Morfoespécie9 Morfoespécie10 Morfoespécie11 Morfoespécie5

ITS Sem resolução Sem resolução Sem resolução Parafilética, clado Parafilética, clado Sem resolução Sem resolução composto pelas morfos composto pelas 9 e 10 morfos 9 e 10 Plastidial Parafilética Sem resolução Sem resolução Monofilética Sem resolução Sem resolução Sem resolução MG dataset1 Sobreposição Sobreposta com Sobreposta com Grupo separado Grupo separado Grupo separado Grupo separado parcial com as a morfo8, baixa morfo7, morfos 7 e 8 sobreposição sobreposição com a morfo6 parcial com a morfo6 ML florais Sobreposição Sobreposta com Sobreposta com Sobreposição parcial Grupo separado Sobreposta morfo7 Grupo separado dataset2 parcial com as morfos 8 e 11, morfo7 e com as morfos 7 e 11 e sobreposição morfos 7 e 8 sobreposição sobreposição parcial com as parcial com as parcial com as morfos 8 e 9 morfos 9 e 6 morfos 11 e 6 ML foliares Sobreposta com Sobreposta com Sobreposta com Sobreposta com as Sobreposta com as Sobreposta com as Sobreposta com dataset3 as demais as demais as demais demais demais demais as demais Análise conjunta Parcialmente Sobreposta com Sobreposta com Sobreposição parcial Grupo separado Sobreposta com as Grupo separado florais e foliares sobreposto com a morfo8 e as morfos 7 e com as morfos 7, 8 e morfos 7, 8 e 9 dataset4 as morfos 7 e 8 sobreposição sobreposição 11 parcial com as parcial com as

morfos 6, 9 e 11 morfos 6, 9 e 11

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Tabela 2. Continuação

Caracteres Morfoespécie6 Morfoespécie7 Morfoespécie8 Morfoespécie9 Morfoespécie10 Morfoespécie11 Morfoespécie5

Caracteres Folhas, Folhas, Folhas, Folhas glabras; Face abaxial das Folhas, Folhas, qualitativos inflorescências, inflorescências, inflorescências, inflorescências e folhas pubescentes; inflorescências, inflorescências, brácteas, sépalas, brácteas, brácteas, brácteas usualmente inflorescências, brácteas, sépalas, brácteas, face face externa do sépalas, face sépalas, face pubescentes; sépalas brácteas, sépalas, face face externa do tubo externa da corola tubo da corola e externa do tubo externa do tubo usualmente externa da corola e da corola e ovários e ovários glabros; ovários glabros; da corola e da corola e pubescentes na face ovários pubescentes; glabros; sépalas sépalas reflexas; sépalas inflexas; ovários glabros; ovários glabros; interna; ovários e face sépalas reflexas; com inflexas, com com projeções com projeções sépalas inflexas; sépalas inflexas; externa do tubo da e sem projeções projeções basais basais basais com projeções com projeções corola glabro; sépalas basais basais basais reflexas; sem projeções basais

Análise conjunta Sobreposição Sobreposta com Sobreposta com Grupo separado Grupo separado Sobreposição Grupo separado

dataset5 parcial com as morfo8, morfo7, parcial com as morfos 7 e 8 sobreposição sobreposição morfos 7 e 8 parcial com as parcial com as morfos 11 e 6 morfos 11 e 6 Caracteres CI, TF, CL, C L/C L/C CTC, C CI e CL (igual diferentes na LBL, LML e LS morfo6), LBL análise (igual morfo10), univariada C (igual morfo7), datasets 1 e 2 LML, DFA, L/C Hábito de vida Arbórea Arbustivo, Arbórea a Arbustivo a arvoreta Arbustivo a arvoreta Arvoreta Arbustivo a arbórea a arvoreta arvoreta,

arvoreta “indivíduos” agregados Habitat Borda de mata e Áreas alteradas Mata e borda de Mata Mata Mata e borda de Cerrado áreas alteradas mata mata Id. prévia T. laeta T. hystrix T. laeta T. hystrix T. hystrix T. hystrix T. solanifolia

Nome proposto T. laeta Não Não Espécie nd. Espécie nd. Não determinado T. nervosa determinado determinado 158

4. DISCUSSÃO Com base nos caracteres florais e vegetativos analisados foi possível reconhecer três espécies dentro dos complexos taxonômicos T. laeta e T. hystrix, essas corresponderam as morfoespécies 6, 9 e 10. As análises morfométricas indicaram sobreposição nos caracteres analisados para as morfoespécies 7, 8 e 11. No entanto, a morfoespécie11 apresentou-se distinta na forma do botão floral e parte dos caracteres florais, apesar dessas diferenças optamos por não reconhecer essa morfoespécie como uma espécie distinta, até que novas análises e caracteres sejam incluídos. A variação morfológica da morfoespécie6 se sobrepôs parcialmente com as morfoespécies 7 e 8, somado a ausência de resolução filogenética (capítulo 2), coocorrência em algumas localidades e floração no mesmo período podem indicar algum nível de fluxo gênico e hibridização. A forma dos botões florais variou entre as morfoespécies nos complexos taxonômicos T. laeta e T. hystrix. No entanto, pelo alto número de botões florais classificados incorretamente entre as morfoespécies 7 e 8, optamos por não considerar essas duas distintas. Apesar da sobreposição parcial da morfoespécie6 com as morfoespécies 7 e 8, a análise de discriminantes indicou baixa proporção de classificações incorretas (menos de 8%), diferença essa suficiente para reconhecer a morfoespécie6 pela forma do botão floral. A sobreposição na forma dos botões florais entre as morfoespécies 6 a 8 podem ser resultados do fluxo do gênico ou hibridização nas populações simpátricas, como observado em outros caracteres e grupos de plantas (Conesa et al., 2012; Peñaloza-Ramírez et al., 2010; Shipunov e Bateman, 2005; Viscosi et al., 2009). O alto nível de variação foliar e sobreposição parcial de duas espécies simpátricas de Helichrysum (Asteraceae), somado a ausência de barreiras reprodutivas, permitiu inferir que parte da plasticidade é resultado dos processos de hibridização históricos e contínuos (Conesa et al., 2012). Os níveis de sobreposição intermediários nos caracteres morfológicos, por meio da morfometria geométrica indicaram a origem híbrida em outros grupos de plantas (Dactylorhiza (Orchidaceae), Shipunov e Bateman, 2005; Quercus (Fagaceae), Peñaloza-Ramírez et al., 2010; Viscosi et al., 2009). As morfoespécies analisadas florescem no mesmo período e algumas ocorrem em simpatria, e principalmente nessas localidades (Rio das Ostras, RJ, Linhares e Aracruz ES e em Prado, BA, Figura 2) a separação entre as morfoespécies é problemática, com alguns indivíduos com morfologias intermediárias. O padrão intermediário na variação morfológica dos híbridos já foi relatado em alguns táxons, e a presença de híbridos ocasionais dentro das populações naturais dificultam a delimitação, identificação e limites entre as espécies (Bateman et al., 2008; Conceição et al., 2008a, b; Fernandez-Manjarres et al., 2006; Surina et 159

al., 2009). A análise da variação morfológica dos caracteres florais, foliares e estrutura anatômica foliar dentro do complexo Edraianthus graminifolius (L.) A.DC. (Campanulaceae) não evidenciaram a formação de agrupamentos discretos, sendo sugerido que os fenômenos de hibridização interespecífica e introgressão acompanhados de extensa homoplasia morfológica podem estar ocorrendo dentro do complexo (Rakić et al., 2012). As variações morfológicas nos caracteres florais e foliares foram intermediárias nos híbridos naturais de Edraianthus x lakusicii Stevan. & D.Lakušić (Campanulaceae) (Lakušić et al., 2009). A morfometria linear dos caracteres foliares não permitiu evidenciar nenhum agrupamento morfológico, no entanto as morfoespécies inicialmente propostas têm diferenças na forma foliar, inclusive entre as morfoespécies 7 e 8. As variáveis contínuas se sobrepõem e podem apresentar uma distribuição contínua, e em alguns casos com pouca utilidade para diagnosticar os grupos (Adams et al., 2004; Zelditch et al., 2012). Como nas folhas de Quercus (Fagaceae), no qual a discriminação dos agrupamentos morfológicos só foi possível por meio da morfometria geométrica (Viscosi et al., 2009), ou com a utilização de caracteres macro e microfoliares, em combinação com as medidas lineares (Bruschi et al., 2000). As morfoespécies 9 e 10 diferiram dos demais táxons na forma do botão floral e parte dos caracteres florais e foliares. As duas morfoespécies são espécies relacionadas, como evidenciado pela filogenia recuperada pelo marcador nuclear (maiores detalhes consultar o capítulo 2), no entanto a filogenia dos marcados plastidiais recuperaram relações distintas e somente a morfoespécie9 foi recuperada como monofilética. Apesar da incongruência entre os marcadores com diferentes tipos de heranças parentais e parafiletismo na filogenia recuperada pelo marcador nuclear, as diferenças morfológicas são suficientes para o reconhecimento das duas espécies. As duas morfoespécies apresentaram diferenças na forma dos botões florais, sendo o comprimento do lobo da corola, largura da lâmina foliar e razão entre largura e comprimento da lâmina foliar maiores na morfoespécie9, enquanto a morfoespécie10 a largura máxima do lobo da corola, comprimento da sépala, distância da fauce ao ápice das anteras e comprimento do tubo da corola são maiores. Além disso, a morfoespécie10 foi à única que apresentou a face externa do tubo da corola e ovários pubescentes, assim como ausência de projeções basais na cabeça estilar. As folhas da morfoespécie9 são glabras, enquanto na morfoespécie10 as folhas são pubescentes na face abaxial. As sépalas são pubescentes na morfoespécie10, já na morfoespécie9 a pubescência ocorre usualmente na face interna da sépala. Até o momento não foi possível relacionar essas morfoespécies com nenhum nome taxonômico previamente publicado. É necessária uma revisão mais detalhada dos sinônimos e nomes descritos em T. hystrix e táxons próximos, para confirmar se essas 160

foram previamente descritas. Apesar da possibilidade de hibridização e fluxo gênico entre a morfoespécie6 com as demais morfoespécies que ocorrem em simpatria, a forma típica da morfoespécie6 é distinta das demais pela forma e tamanho do botão floral, pelo comprimento da inflorescência, número total de flores por inflorescência, comprimento máximo do lobo da corola, largura máxima do lobo da corola, largura da base do lobo da corola e largura máxima da sépala. Entretanto, alguns indivíduos tinham morfologias atípicas, sendo esperado essa alta plasticidade fenotípica, já que a morfoespécie tem ampla distribuição, ocorre no nordeste e sudeste do Brasil e coocorre com outras morfoespécies. A variação morfológica da morfoespécie6 se enquadra na descrição de T. laeta (Martius, 1837). Sendo necessário uma circunscrição mais restrita de T. laeta, com a exclusão dos sinônimos T. spixiana Martius ex Müll. Arg e T. laeta var densa Müll. Arg. Tabernaemontana spixiana representa a variação morfológica encontrada no complexo taxonômico T. salzmannii e T. laeta var densa corresponde a morfoespécie8 do presente estudo. A variação típica da espécie corresponde aos sinônimos de T. breviflora Müll. Arg., T. laeta var minor Müll. Arg. e T. laeta var. pubiflora Müll. Arg. O presente estudo não englobou toda a variação morfológica observada em T. hystrix. O tipo morfológico comumente identificado como T. hystrix nos herbários e por especialistas da família corresponde a um único indivíduo coletado em Viçosa (MG), do presente estudo e devido a insuficiência de espécimes coletados essa variação morfológica não foi incluída nas análises morfométricas, somente na filogenia. Os marcadores moleculares utilizados foram insuficientes para inferir o posicionamento filogenético dos táxons de T. hystrix, assim como as análises morfométricas utilizadas foram ineficientes. Além disso, a descrição original de T. hystrix é incompleta e não permite avaliar o tipo morfológico associado ao nome T. hystrix, somado a muitos sinônimos relacionados a nomes incorretos nessa e em outras espécies de T. seção Peschieira. Uma alternativa para tentar esclarecer esse complexo taxonômico seria incluir à análise de forma foliar das exsicatas depositadas nos herbários e identificadas como T. hystrix, assim como dos sinônimos associados a variação morfológica dessa espécie, na tentativa de esclarecer a variação morfológica nesse complexo taxonômico. Aparentemente esse complexo taxonômico, as quais foram parcialmente abordados nesse capítulo apresentam homogeneidade floral, entretanto as possíveis espécies têm diferenças na forma foliar. Os padrões de variação morfológica e diferenciação em alguns grupos de plantas apresentam histórias evolutivas complexas (Liu et al., 2015; Turchetto et al., 2014a, b), e para compreender o padrão de diferenciação entre as espécies e a história evolutiva desses grupos 161

são necessários estudos mais detalhados, focados em aspectos de sua ecologia e biologia. Apesar dos resultados iniciais, alguns pontos puderam ser esclarecidos e abre possibilidade para estudos futuros mais detalhados.

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5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ADAMS, D. C.; ROHLF, F. J.; SLICE, D. E. Geometric morphometrics: ten years of progress following the ‘revolution’. Italian Journal of Zoology, v. 71, n. 1, p. 5–16, 2004. BATEMAN, R. M.; SMITH, R. J.; FAY, M. F. Morphometric and population genetic analyses elucidate the origin, evolutionary significance and conservation implications of Orchis xangusticruris (O.purpurea X O. simia), a hybrid orchid new to Britain.. Botanical Journal of the Linnean Society, v. 157, n. 4, p. 687–711, 2008. BRUSCHI, P. et al. Morphological and molecular differentiation between Quercus petraea (Matt.) Liebl. and Quercus pubescens Willd. (Fagaceae) in Northern and Central Italy. Annals of Botany, v. 85, n. 3, p. 325–333, 2000. CONCEIÇÃO, A. S. et al. Biosystematics of Chamaecrista sect. Absus subsect. Baseophyllum (Leguminosae-Caesalpinioideae) based on allozyme and morphometric analyses. Plant Systematics and Evolution, v. 270, n. 3–4, p. 183–207, 2008a. CONCEIÇÃO, A. S.; QUEIROZ, L. P.; BORBA, E. L. Natural hybrids in Chamaecrista sect. Absus subsect. Baseophyllum (Leguminosae-Caesalpinioideae): Genetic and morphological evidence. Plant Systematics and Evolution, v. 271, n. 1–2, p. 19–27, 2008b. CONESA, M. À.; MUS, M.; ROSSELLÓ, J. A. Leaf shape variation and taxonomic boundaries in two sympatric rupicolous species of Helichrysum (Asteraceae: Gnaphalieae), assessed by linear measurements and geometric morphometry. Biological Journal of the Linnean Society, v. 106, n. 3, p. 498–513, 2012. FERNANDEZ-MANJARRES, J. F. et al. Differential patterns of morphological and molecular hybridization between Fraxinus excelsior L. and Fraxinus angustifolia Vahl (Oleaceae) in eastern and western France. Molecular Ecology, v. 15, n. 11, p. 3245 3257, 2006. KOCH, I.; KINOSHITA, L.S. Tabernaemontana L.. In: WANDERLEY, M.G.L.; SHEPHERD, T. S.; MELHEM, T. S.; GIULIETTI, A. M. (Eds.). Flora Fanerogâmica do Estado de São Paulo.vol. 4. São Paulo: FAPESP: RiMa, 2005. p. 83-91. LAKUŠIĆ, D. et al. Edraianthus × lakusicii (Campanulaceae) a new intersectional natural hybrid: Morphological and molecular evidence. Plant Systematics and Evolution, v. 280, n. 1–2, p. 77–88, 2009. LEEUWENBERG, A. J. M. A revision of Tabernaemontana II: the new world species and Stemmadenia. London: Royal Botanic Gardens, Kew, 1994. 163

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6. APÊNDICES Apêndice A. Número de identificação das morfoespécies, localidade de coleta dos espécimes, vouchers depositados no herbário da Universidade Estadual de Campinas (UEC) e espécimes utilizados nos estudos de morfometria linear da lâmina foliar (Folha), morfometria geométrica de botões florais (Botão), morfometria linear da flor (Flor) e análise qualitativa dos caracteres florais e vegetativos (Qual.). ID Espécie Localidade Voucher (Herbário) Folha Botão Flor Qual. UB1 Morfoespécie6 Ubatuba, SP s s s s UB2 Morfoespécie6 Ubatuba, SP Bordon, N.G & Simões, A.O. UB2 (UEC) s s s UB3 Morfoespécie6 Ubatuba, SP s UB4 Morfoespécie6 Ubatuba, SP Bordon, N.G & Simões, A.O. UB4 (UEC) s UB6 Morfoespécie6 Ubatuba, SP Bordon, N.G & Simões, A.O. UB6 (UEC) s s s UB10 Morfoespécie6 Ubatuba, SP Bordon, N.G & Simões, A.O. UB10 (UEC) s s s s UB11 Morfoespécie6 Ubatuba, SP Bordon, N.G & Simões, A.O. UB11 (UEC) s s UB12 Morfoespécie6 Ubatuba, SP Bordon, N.G & Simões, A.O. UB12 (UEC) s UB13 Morfoespécie6 Ubatuba, SP s s UB14 Morfoespécie6 Ubatuba, SP Bordon, N.G & Simões, A.O. UB14 (UEC) s s UB15 Morfoespécie6 Ubatuba, SP Bordon, N.G & Simões, A.O. UB15 (UEC) UB16 Morfoespécie6 Ubatuba, SP Bordon, N.G & Simões, A.O. UB16 (UEC) UB17 Morfoespécie6 Ubatuba, SP s s UB45 Morfoespécie6 Ubatuba, SP s s UB46 Morfoespécie6 Ubatuba, SP s s s s UB48 Morfoespécie6 Ubatuba, SP s s s s UB49 Morfoespécie6 Ubatuba, SP s s UB50 Morfoespécie6 Ubatuba, SP s s UB51 Morfoespécie6 Paraty, RJ Bordon, N.G UB51 (UEC) UB52 Morfoespécie6 Paraty, RJ Bordon, N.G UB52 (UEC) s s s s UB56.2 Morfoespécie6 Ubatuba, SP s s UB58 Morfoespécie6 Ubatuba, SP s s UB59 Morfoespécie6 Ubatuba, SP Bordon, N.G UB59 (UEC) s s s s UB61 Morfoespécie6 Ubatuba, SP s s RO177 Morfoespécie6 Rio das Ostras, RJ s s s 166

Apêndice A. Continuação

ID Espécie Localidade Voucher (Herbário) Folha Botão Flor Qual. RO178 Morfoespécie6 Rio das Ostras, RJ Bordon, N.G & Bordon, C. RO178 (UEC) s s s RO179 Morfoespécie6 Rio das Ostras, RJ s s RO180 Morfoespécie6 Rio das Ostras, RJ Bordon, N.G & Bordon, C. RO180 (UEC) s s RO181 Morfoespécie6 Rio das Ostras, RJ s s s RO182 Morfoespécie6 Rio das Ostras, RJ Bordon, N.G & Bordon, C. RO182 (UEC) s s s s RO183 Morfoespécie6 Rio das Ostras, RJ Bordon, N.G & Bordon, C. RO183 (UEC) s s RO184 Morfoespécie6 Rio das Ostras, RJ s s s RO185 Morfoespécie6 Rio das Ostras, RJ s s s s RO186 Morfoespécie6 Rio das Ostras, RJ Bordon, N.G & Bordon, C. RO186 (UEC) s s s RO187 Morfoespécie6 Rio das Ostras, RJ Bordon, N.G & Bordon, C. RO187 (UEC) s s s RO188 Morfoespécie6 Rio das Ostras, RJ s s RO190 Morfoespécie6 Rio das Ostras, RJ Bordon, N.G & Bordon, C. RO190 (UEC) RO193 Morfoespécie6 Rio das Ostras, RJ Bordon, N.G & Bordon, C. RO193 (UEC) s s s s RO194 Morfoespécie6 Rio das Ostras, RJ Bordon, N.G & Bordon, C. RO194 (UEC) RO198 Morfoespécie6 Rio das Ostras, RJ Bordon, N.G & Bordon, C. RO198 (UEC) s s s s RO199 Morfoespécie6 Rio das Ostras, RJ Bordon, N.G & Bordon, C. RO199 (UEC) s s s s RO200 Morfoespécie6 Rio das Ostras, RJ Bordon, N.G & Bordon, C. RO200 (UEC) RO206 Morfoespécie6 Rio das Ostras, RJ s s RO207 Morfoespécie6 Rio das Ostras, RJ Bordon, N.G & Bordon, C. RO207 (UEC) s s s RO208 Morfoespécie6 Rio das Ostras, RJ Bordon, N.G & Bordon, C. RO208 (UEC) s s TAY1 Morfoespécie6 Rio das Ostras, RJ s s s s TAY4 Morfoespécie6 Rio das Ostras, RJ s s s s TAY6 Morfoespécie6 Rio das Ostras, RJ s s s TAY7 Morfoespécie6 Rio das Ostras, RJ s s s s TAY8 Morfoespécie6 Rio das Ostras, RJ Bordon, N.G & Bordon, C. TAY8 (UEC) s s s s TAY16 Morfoespécie6 Rio das Ostras, RJ Bordon, N.G & Bordon, C. TAY16 (UEC) s s s s VIC1 Morfoespécie6 Viçosa, MG s s VIC3 Morfoespécie6 Viçosa, MG s s s s VIC4 Morfoespécie6 Viçosa, MG s s VIC5 Morfoespécie6 Viçosa, MG s 167

Apêndice A. Continuação

ID Espécie Localidade Voucher (Herbário) Folha Botão Flor Qual. VIC6 Morfoespécie6 Viçosa, MG s s s s VIC7 Morfoespécie6 Viçosa, MG Bordon, N.G & Castello, A.C.D. VIC7 (UEC) s s s VIC8 Morfoespécie6 Viçosa, MG Bordon, N.G & Castello, A.C.D. VIC8 (UEC) s s s s VIC9 Morfoespécie6 Viçosa, MG s s s s VIC11 Morfoespécie6 Viçosa, MG s s VIC12 Morfoespécie6 Viçosa, MG s s VIC13 Morfoespécie6 Viçosa, MG s s VIC14 Morfoespécie6 Viçosa, MG s s VIC15 Morfoespécie6 Viçosa, MG s s VIC16 Morfoespécie6 Viçosa, MG s s s VIC17 Morfoespécie6 Viçosa, MG s s s VIC18 Morfoespécie6 Viçosa, MG s s VIC19 Morfoespécie6 Viçosa, MG s s s VIC20 Morfoespécie6 Viçosa, MG s s s s VIC21 Morfoespécie6 Viçosa, MG s s s VIC22 Morfoespécie6 Viçosa, MG s s s VIC23 Morfoespécie6 Viçosa, MG Bordon, N.G & Castello, A.C.D. VIC23 (UEC) s VIC25 Morfoespécie6 Viçosa, MG s s s s VIC26 Morfoespécie6 Viçosa, MG Bordon, N.G & Castello, A.C.D. VIC26 (UEC) s s s s ITA1 Morfoespécie6 Bom Jesus do Amparo, MG Bordon, N.G & Bordon, C. ITA1 (UEC) s s s s ITA2 Morfoespécie6 Itabira, MG s s ITA3 Morfoespécie6 Itabira, MG s s s s ITA4 Morfoespécie6 Itabira, MG Bordon, N.G & Bordon, C. ITA4 (UEC) s s s s ITA5 Morfoespécie6 Itabira, MG s s s s ITA6 Morfoespécie6 Itabira, MG Bordon, N.G & Bordon, C. ITA6 (UEC) s s s s ITA7 Morfoespécie6 Bom Jesus do Amparo, MG Bordon, N.G & Bordon, C. ITA7 (UEC) s s s s ITA8 Morfoespécie6 Bom Jesus do Amparo, MG Bordon, N.G & Bordon, C. ITA8 (UEC) s s s s ITA9 Morfoespécie6 Bom Jesus do Amparo, MG s s s s TEO1 Morfoespécie6 Campanário, MG Bordon, N.G & Bordon, C. TEO1 (UEC) s s s s TEO2 Morfoespécie6 Campanário, MG Bordon, N.G & Bordon, C. TEO2 (UEC) s s s s 168

Apêndice A. Continuação

ID Espécie Localidade Voucher (Herbário) Folha Botão Flor Qual. TEO3 Morfoespécie6 Campanário, MG Bordon, N.G & Bordon, C. TEO3 (UEC) s s s TEO4 Morfoespécie6 Campanário, MG Bordon, N.G & Bordon, C. TEO4 (UEC) s s s s IPI1 Morfoespécie6 Linhares, ES s s IPI4 Morfoespécie6 Linhares, ES Bordon, N.G & Bordon, C. IPI4 (UEC) s s s s IPI5 Morfoespécie6 Linhares, ES Bordon, N.G & Bordon, C. IPI5 (UEC) s s s s IPI5.1 Morfoespécie6 Linhares, ES s s IPI6 Morfoespécie6 Linhares, ES s s s JP1 Morfoespécie6 Goiana, PE Bordon, N.G & Chaves, C.L. JP1 (UEC) s s s s JP2 Morfoespécie6 Goiana, PE Bordon, N.G & Chaves, C.L. JP2 (UEC) s s s s JP3 Morfoespécie6 Goiana, PE Bordon, N.G & Chaves, C.L. JP3 (UEC) s s s s JP4 Morfoespécie6 Goiana, PE Bordon, N.G & Chaves, C.L. JP4 (UEC) s s s s JP5 Morfoespécie6 Condado, PE Bordon, N.G & Chaves, C.L. JP5 (UEC) s s s s JP6 Morfoespécie6 Condado, PE Bordon, N.G & Chaves, C.L. JP6 (UEC) s s s s AL1 Morfoespécie6 Areia, PB s s AL2 Morfoespécie6 Areia, PB s s AL3 Morfoespécie6 Alagoa Nova, PB Bordon, N.G & Chaves, C.L. AL3 (UEC) s s s s AL4 Morfoespécie6 Alagoa Nova, PB Bordon, N.G & Chaves, C.L. AL4 (UEC) s s s s AL5 Morfoespécie6 Alagoa Nova, PB Bordon, N.G & Chaves, C.L. AL5 (UEC) s s s s AL6 Morfoespécie6 Alagoa Nova, PB Bordon, N.G & Chaves, C.L. AL6 (UEC) s s s s AL7 Morfoespécie6 Alagoa Nova, PB Bordon, N.G & Chaves, C.L. AL7 (UEC) s s s s AL8 Morfoespécie6 Alagoa Nova, PB Bordon, N.G & Chaves, C.L. AL8 (UEC) s s s s RO201 Morfoespécie7 Rio das Ostras, RJ Bordon, N.G & Bordon, C. RO201 (UEC) s s s RO203 Morfoespécie7 Rio das Ostras, RJ Bordon, N.G & Bordon, C. RO203 (UEC) s s s RO205 Morfoespécie7 Rio das Ostras, RJ Bordon, N.G & Bordon, C. RO205 (UEC) s s s s TAY14 Morfoespécie7 Rio das Ostras, RJ Bordon, N.G & Bordon, C. TAY14 (UEC) s s s s TAY15 Morfoespécie7 Rio das Ostras, RJ Bordon, N.G & Bordon, C. TAY15 (UEC) s s s TAY17 Morfoespécie7 Rio das Ostras, RJ Bordon, N.G & Bordon, C. TAY17 (UEC) s s s s TAY18 Morfoespécie7 Rio das Ostras, RJ Bordon, N.G & Bordon, C. TAY18 (UEC) s s s TAY19 Morfoespécie7 Rio das Ostras, RJ Bordon, N.G & Bordon, C. TAY19 (UEC) s s s PRA1 Morfoespécie7 Prado, BA Bordon, N.G & Bordon, C. PRA1 (UEC) s s s s 169

Apêndice A. Continuação

ID Espécie Localidade Voucher (Herbário) Folha Botão Flor Qual. PRA6 Morfoespécie7 Prado, BA s s s s PRA12 Morfoespécie7 Prado, BA s s s s PRA13 Morfoespécie7 Prado, BA Bordon, N.G & Bordon, C. PRA13A (UEC) s IPI9 Morfoespécie7 Linhares, ES s s s s COMB1 Morfoespécie7 Aracruz, ES Bordon, N.G & Bordon, C. COMB1 (UEC) s s s s COMB3 Morfoespécie7 Aracruz, ES s s COMB4 Morfoespécie7 Aracruz, ES s s s s COMB5 Morfoespécie7 Aracruz, ES Bordon, N.G & Bordon, C. COMB5 (UEC) s s s s COMB5.1 Morfoespécie7 Aracruz, ES s s s s COMB10 Morfoespécie7 Linhares, ES s s s s COMB13 Morfoespécie7 Linhares, ES Bordon, N.G & Bordon, C. COMB13 (UEC) s s s s PAS1 Morfoespécie8 Prado, BA Bordon, N.G & Bordon, C. PAS1 (UEC) s s s s PAS2 Morfoespécie8 Prado, BA s s PAS3 Morfoespécie8 Prado, BA s s PAS4 Morfoespécie8 Prado, BA Bordon, N.G & Bordon, C. PAS4 (UEC) s s s s PAS5 Morfoespécie8 Prado, BA s s PAS6 Morfoespécie8 Prado, BA s s PAS7 Morfoespécie8 Prado, BA Bordon, N.G & Bordon, C. PAS7 (UEC) s s s s PAS8 Morfoespécie8 Prado, BA s s PAS9 Morfoespécie8 Prado, BA Bordon, N.G & Bordon, C. PAS9 (UEC) s s s s PAS10 Morfoespécie8 Prado, BA s s DES1 Morfoespécie8 Prado, BA s s DES2 Morfoespécie8 Prado, BA Bordon, N.G & Bordon, C. DES2 (UEC) s s s s DES3 Morfoespécie8 Prado, BA s s s s DES4 Morfoespécie8 Prado, BA Bordon, N.G & Bordon, C. DES4 (UEC) s s s s DES5 Morfoespécie8 Prado, BA s s s s DES6 Morfoespécie8 Prado, BA s s DES7 Morfoespécie8 Prado, BA s s DES8 Morfoespécie8 Prado, BA s s DES9 Morfoespécie8 Prado, BA Bordon, N.G & Bordon, C. DES9 (UEC) s s 170

Apêndice A. Continuação

ID Espécie Localidade Voucher (Herbário) Folha Botão Flor Qual. DES10 Morfoespécie8 Prado, BA Bordon, N.G & Bordon, C. DES10 (UEC) s s s s DES11 Morfoespécie8 Prado, BA Bordon, N.G & Bordon, C. DES11 (UEC) s s PRA2 Morfoespécie8 Prado, BA Bordon, N.G & Bordon, C. PRA2 (UEC) s s s s PRA9 Morfoespécie8 Prado, BA Bordon, N.G & Bordon, C. PRA9 (UEC) s s s s PRA11 Morfoespécie8 Prado, BA s s s s PRA15 Morfoespécie8 Prado, BA Bordon, N.G & Bordon, C. PRA15 (UEC) s s s s IPI2 Morfoespécie8 Linhares, ES Bordon, N.G & Bordon, C. IPI2 (UEC) s s s s IPI7 Morfoespécie8 Linhares, ES s s s s COMB2 Morfoespécie8 Aracruz, ES Bordon, N.G & Bordon, C. COMB2 (UEC) s s s s COMB6 Morfoespécie8 Linhares, ES Bordon, N.G & Bordon, C. COMB6 (UEC) s s COMB7 Morfoespécie8 Linhares, ES s s COMB8 Morfoespécie8 Linhares, ES Bordon, N.G & Bordon, C. COMB8 (UEC) s s s s COMB9 Morfoespécie8 Linhares, ES s s s s COMB11 Morfoespécie8 Linhares, ES s s COMB12 Morfoespécie8 Linhares, ES Bordon, N.G & Bordon, C. COMB12 (UEC) s s s s COMB14 Morfoespécie8 Linhares, ES Bordon, N.G & Bordon, C. COMB14 (UEC) s s s UB7 Morfoespécie9 Ubatuba, SP s s s UB18 Morfoespécie9 Ubatuba, SP s s UB19 Morfoespécie9 Ubatuba, SP s s UB25 Morfoespécie9 Ubatuba, SP s s UB29 Morfoespécie9 Ubatuba, SP Bordon, N.G & Simões, A.O. UB29 (UEC) s s s s UB30 Morfoespécie9 Ubatuba, SP Bordon, N.G & Simões, A.O. UB30 (UEC) s s s UB31 Morfoespécie9 Ubatuba, SP s s UB32 Morfoespécie9 Ubatuba, SP Bordon, N.G & Simões, A.O. UB32 (UEC) s s UB37 Morfoespécie9 Ubatuba, SP Bordon, N.G & Simões, A.O. UB37 (UEC) s s UB39 Morfoespécie9 Ubatuba, SP Bordon, N.G & Simões, A.O. UB39 (UEC) s s s s UB41 Morfoespécie9 Ubatuba, SP s s UB63 Morfoespécie9 Ubatuba, SP s s s s UB64 Morfoespécie9 Ubatuba, SP s s UB65 Morfoespécie9 Ubatuba, SP s s 171

Apêndice A. Continuação

ID Espécie Localidade Voucher (Herbário) Folha Botão Flor Qual. UB66 Morfoespécie9 Ubatuba, SP s s s s UB67 Morfoespécie9 Ubatuba, SP s s UB68 Morfoespécie9 Ubatuba, SP s s UB69 Morfoespécie9 Ubatuba, SP s s UB70 Morfoespécie9 Ubatuba, SP s UB71 Morfoespécie9 Ubatuba, SP s s UB72 Morfoespécie9 Ubatuba, SP s s UB73 Morfoespécie9 Ubatuba, SP s s UB75 Morfoespécie9 Ubatuba, SP s s UB78 Morfoespécie9 Ubatuba, SP s UB81 Morfoespécie9 Ubatuba, SP s s UB83 Morfoespécie9 Ubatuba, SP s s UBB2 Morfoespécie9 Ubatuba, SP s UBB3 Morfoespécie9 Ubatuba, SP s UBB4 Morfoespécie9 Ubatuba, SP s TAY2 Morfoespécie10 Rio das Ostras, RJ Bordon, N.G & Bordon, C. TAY2 (UEC) s s s s TAY3 Morfoespécie10 Rio das Ostras, RJ Bordon, N.G & Bordon, C. TAY3 (UEC) s s s s TAY5 Morfoespécie10 Rio das Ostras, RJ s s TAY9 Morfoespécie10 Rio das Ostras, RJ s s TAY10 Morfoespécie10 Rio das Ostras, RJ s s TAY11 Morfoespécie10 Rio das Ostras, RJ s s TAY12 Morfoespécie10 Rio das Ostras, RJ s s TAY13 Morfoespécie10 Rio das Ostras, RJ Bordon, N.G & Bordon, C. TAY13A (UEC) s s PA158 Morfoespécie11 Silva Jardim, RJ s s s s PA159 Morfoespécie11 Silva Jardim, RJ s s PA160 Morfoespécie11 Silva Jardim, RJ s s PA162 Morfoespécie11 Silva Jardim, RJ s s s s PA164 Morfoespécie11 Silva Jardim, RJ s s s s PA171 Morfoespécie11 Silva Jardim, RJ s s PA172 Morfoespécie11 Silva Jardim, RJ s s 172

Apêndice A. Continuação

ID Espécie Localidade Voucher (Herbário) Folha Botão Flor Qual. PA175 Morfoespécie11 Silva Jardim, RJ s s s SJ1 Morfoespécie11 Silva Jardim, RJ Bordon, N.G & Bordon, C. SJ1 (UEC) s s s s SJ3 Morfoespécie11 Silva Jardim, RJ s s s s SJ4 Morfoespécie11 Silva Jardim, RJ Bordon, N.G & Bordon, C. SJ4 (UEC) s s s s SJ5 Morfoespécie11 Silva Jardim, RJ Bordon, N.G & Bordon, C. SJ5 (UEC) s s SJ6 Morfoespécie11 Silva Jardim, RJ Bordon, N.G & Bordon, C. SJ6 (UEC) s s s s SJ7 Morfoespécie11 Silva Jardim, RJ Bordon, N.G & Bordon, C. SJ7 (UEC) s s s s SJ16 Morfoespécie11 Silva Jardim, RJ s s s s SJ17 Morfoespécie11 Silva Jardim, RJ s s s DF1 Morfoespécie5 Brasília, DF Bordon, N.G & Castello, A.C.D. DF1 (UEC) s s s s DF2_2 Morfoespécie5 Brasília, DF s DF2_4 Morfoespécie5 Brasília, DF s DF3_1 Morfoespécie5 Brasília, DF s s s DF3_2 Morfoespécie5 Brasília, DF s s s s DF3_3 Morfoespécie5 Brasília, DF Bordon, N.G & Castello, A.C.D. DF33 (UEC) s DF3_4 Morfoespécie5 Brasília, DF s s DF4_1 Morfoespécie5 Brasília, DF s DF4_2 Morfoespécie5 Brasília, DF s s s DF5 Morfoespécie5 Brasília, DF s DF7 Morfoespécie5 Brasília, DF Bordon, N.G & Castello, A.C.D. DF7 (UEC) s s s DF8 Morfoespécie5 Brasília, DF Bordon, N.G & Castello, A.C.D. DF8A (UEC) s s s DF9 Morfoespécie5 Brasília, DF s s PNB1_1 Morfoespécie5 Brasília, DF s PNB1_2 Morfoespécie5 Brasília, DF s PNB1_3 Morfoespécie5 Brasília, DF s PNB1_4 Morfoespécie5 Brasília, DF Bordon, N.G & Castello, A.C.D. PNB14 (UEC) s s PNB3_1 Morfoespécie5 Brasília, DF s s s PNB3_2 Morfoespécie5 Brasília, DF s s PNB4_2 Morfoespécie5 Brasília, DF s s PNB5_1 Morfoespécie5 Brasília, DF s s s s 173

Apêndice A. Continuação

ID Espécie Localidade Voucher (Herbário) Folha Botão Flor Qual. PNB6_1 Morfoespécie5 Brasília, DF s s s s PNB6_2 Morfoespécie5 Brasília, DF Bordon, N.G & Castello, A.C.D. PNB62 (UEC) s s s s PNB7_1 Morfoespécie5 Brasília, DF s s PNB7_2 Morfoespécie5 Brasília, DF Bordon, N.G & Castello, A.C.D. PNB72 (UEC) s s 174

Apêndice B. Resultados das análises de ordenação dos caracteres florais e foliares de espécimes pertencentes aos complexos taxonômicos T. laeta e T. hystrix e grupo externo (morfoespécie5)

Tabela 1. Autovalores, variância, significância dos escores dos componentes principais e loadings da ordenação de 11 caracteres quantitativos florais e foliares da ordenação de 145 espécimes para os caracteres florais e 192 espécimes para os caracteres foliares das morfoespécies pertencentes aos complexos taxonômicos T. laeta e T. hystrix e grupo externo (morfoespécie5). Valores de P significativos se encontram em negrito. Os valores de loadings ≥ 0,6 em negritos representam os caracteres que mais contribuíram para os respectivos eixos.

Caracteres Sigla PC1 PC2 PC3 PC4 PC5 Caracteres florais (dataset2) Autovalor 3,824 1,615 1,096 0,828 0,556 Variância (%) 43,531 18,382 12,478 9,432 6,334 Kruskal-Wallis (H) 495,200 266,900 356,700 40,280 66,960 P < 0,001 < 0,001 < 0,001 < 0,001 < 0,001 Comprimento inflorescência CI 0,390 0,026 0,101 0,385 -0,298 Totais flores por inflorescência TF 0,304 -0,076 -0,062 0,754 -0,097 Comprimento lobo corola CL 0,458 -0,084 -0,022 -0,276 -0,159 Largura da base do lobo corola LBL 0,388 -0,062 -0,319 -0,344 -0,221 Largura máxima lobo corola LML 0,412 -0,172 0,323 -0,287 -0,105 Comprimento sépala CS 0,201 0,196 0,782 -0,017 0,328 Largura máxima da sépala LS 0,344 -0,090 -0,333 0,049 0,841 Distância da fauce corola ao ápice das anteras DFA -0,023 0,738 -0,016 -0,006 -0,019 Comprimento tubo corola CTC 0,257 0,602 -0,241 -0,057 -0,032 Caracteres foliares (dataset3) Autovalor 1,827 0,173 Variância (%) 91,365 8,635 Kruskal-Wallis (H) 374,600 387,400 P < 0,001 < 0,001 Comprimento lâmina foliar C 0,707 0,707 Largura lâmina foliar L 0,707 -0,707

175

Apêndice B. Continuação

Tabela 2. Valores de P corrigido de Bonferroni da comparação pareado pelo teste de post-hoc de Dunn dos escores dos componentes principais da ordenação de 145 espécimes para os caracteres florais e de 192 espécimes para os caracteres foliares, e 115 espécimes para a análise conjunta dos caracteres florais e foliares das morfoespécies pertencentes aos complexos taxonômicos T. laeta e T. hystrix e grupo externo (morfoespécie5). Valores de P significativos se encontram em negrito.

Caracteres florais (dataset2) Triangulo superior são os valores de p de Bonferroni corrigido para o PC1; triangulo inferior são os valores de p para o PC2 morfo6 morfo7 morfo8 morfo9 morfo10 morfo11 morfo5 morfoespécie6 - < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 1,00 morfoespécie7 < 0,01 - 1,00 1,00 1,00 1,00 < 0,01 morfoespécie8 < 0,01 1,00 - 1,00 1,00 1,00 < 0,01 morfoespécie9 < 0,01 < 0,01 < 0,01 - 1,00 1,00 < 0,01 morfoespécie10 < 0,01 < 0,01 < 0,01 1,00 - 1,00 < 0,01 morfoespécie11 < 0,01 < 0,01 < 0,01 0,20 0,37 - < 0,01 morfoespécie5 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 - Triangulo superior são os valores de p de Bonferroni corrigido para o PC3; triangulo inferior são os valores de p para o PC4 morfoespécie6 - 0,04 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 morfoespécie7 < 0,01 - 0,19 < 0,01 < 0,01 1,00 < 0,01 morfoespécie8 0,33 0,49 - < 0,01 < 0,01 1,00 < 0,01 morfoespécie9 1,00 < 0,01 0,47 - 1,00 < 0,01 0,23 morfoespécie10 1,00 0,01 0,30 1,00 - < 0,01 1,00 morfoespécie11 1,00 0,01 1,00 1,00 1,00 - < 0,01 morfoespécie5 1,00 < 0,01 0,32 1,00 1,00 1,00 - Triangulo superior são os valores de p de Bonferroni corrigido para o PC5 morfoespécie6 0,20 < 0,01 0,22 1,00 1,00 0,01 morfoespécie7 - 0,77 < 0,01 1,00 1,00 < 0,01 morfoespécie8 - - < 0,01 1,00 0,03 < 0,01 morfoespécie9 - - - 0,38 0,56 1,00 morfoespécie10 - - - - 1,00 0,23 morfoespécie11 - - - - - 0,15 Caracteres foliares (dataset3) Triangulo superior são os valores de p de Bonferroni corrigido para o PC1; triangulo inferior são os valores de p para o PC2 morfoespécie6 - < 0,01 1,00 < 0,01 1,00 < 0,01 < 0,01 morfoespécie7 < 0,01 - < 0,01 < 0,01 < 0,01 0,01 1,00 morfoespécie8 1,00 < 0,01 - < 0,01 1,00 < 0,01 < 0,01 morfoespécie9 < 0,01 0,01 < 0,01 - 0,01 < 0,01 < 0,01 morfoespécie10 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 - < 0,01 < 0,01 morfoespécie11 < 0,01 0,12 < 0,01 1,00 < 0,01 - < 0,01 morfoespécie5 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01

176

Apêndice B. Tabela 2. Continuação

Caracteres florais e foliares (dataset4) Triangulo superior são os valores de p de Bonferroni corrigido para o PC1; triangulo inferior são os valores de p para o PC2 morfoespécie6 - < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 0,25 morfoespécie7 1,00 - 0,03 1,00 1,00 1,00 < 0,01 morfoespécie8 0,05 0,01 - 1,00 1,00 0,39 < 0,01 morfoespécie9 < 0,01 < 0,01 < 0,01 - 1,00 1,00 < 0,01 morfoespécie10 < 0,01 < 0,01 < 0,01 1,00 - 1,00 0,31 morfoespécie11 < 0,01 < 0,01 < 0,01 0,29 0,60 - < 0,01 morfoespécie5 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 < 0,01 - Triangulo superior são os valores de p de Bonferroni corrigido para o PC3; triangulo inferior são os valores de p para o PC4 morfoespécie6 - 1,00 < 0,01 0,21 < 0,01 < 0,01 < 0,01 morfoespécie7 1,00 - 0,01 0,85 < 0,01 0,01 < 0,01 morfoespécie8 < 0,01 < 0,01 - 0,00 < 0,01 < 0,01 < 0,01 morfoespécie9 < 0,01 < 0,01 1,00 - 0,02 1,00 0,01 morfoespécie10 1,00 1,00 1,00 1,00 - 0,02 1,00 morfoespécie11 1,00 1,00 < 0,01 < 0,01 1,00 - < 0,01 morfoespécie5 < 0,01 < 0,01 < 0,01 0,31 0,01 < 0,01 - Triangulo superior são os valores de p de Bonferroni corrigido para o PC5 morfoespécie6 - < 0,01 1,00 0,00 0,24 1,00 < 0,01 morfoespécie7 - - < 0,01 < 0,01 < 0,01 0,04 < 0,01 morfoespécie8 - - - 0,12 1,00 1,00 < 0,01 morfoespécie9 - - - - 1,00 0,03 1,00 morfoespécie10 - - - - - 0,47 1,00 morfoespécie11 ------< 0,01

177

Apêndice B. Continuação

Figure 1. Biplot da análise de componentes principais (PCA) de 145 espécimes pertencentes aos complexos taxonômicos T. laeta e T. hystrix e grupo externo (morfoespécie5), baseado em nove caracteres florais (dataset2). CI: comprimento da inflorescência; TF: total de flores por inflorescência; CL: comprimento máximo do lobo da corola; LBL: largura da base do lobo da corola; LML: largura máxima do lobo da corola; CS: comprimento da sépala; LS: largura máxima da sépala; DFA: distância da fauce da corola ao ápice das anteras; CTC: comprimento do tubo da corola.

Figure 2. Biplot da análise de componentes principais (PCA) de 192 espécimes pertencentes aos complexos taxonômicos T. laeta e T. hystrix e grupo externo (morfoespécie5), baseado no comprimento e largura da lâmina foliar (dataset3). C: comprimento máximo da lâmina foliar; L: largura máxima da lâmina foliar. 178

Apêndice C. Estatística sumária dos caracteres quantitativos florais e foliares aferidos em espécimes dos complexos taxonômicos T. laeta e T. hystrix e grupo externo (morfoespécie5).

Tabela 1. Estatística sumária dos caracteres morfométricos lineares florais e foliares de espécimes pertencentes aos complexos taxonômicos T. laeta e T. hystrix e grupo externo (morfoespécie5) (datasets 2 e 3). N: número amostral; CV: coeficiente de variação; CI: comprimento da inflorescência; TF: total de flores por inflorescência; CL: comprimento máximo do lobo da corola; LBL: largura da base do lobo da corola; LML: largura máxima do lobo da corola; CS: comprimento da sépala; LS: largura máxima da sépala; DFA: distância da fauce da corola ao ápice das anteras; C: comprimento máximo da lâmina foliar; L: largura máxima da lâmina foliar.

Morfoespécie6 CI TF CL LBL LML CS LS DFA CTC C L N 319 317 333 334 334 335 335 333 335 656 656 Mínimo 21,99 3,00 6,21 1,57 3,61 1,10 0,83 0,85 8,67 40,12 17,02 Máximo 100,50 122,00 19,82 3,59 12,31 5,34 2,93 5,80 15,03 208,00 87,68 Média 47,77 30,38 13,51 2,65 7,09 2,74 1,92 3,01 11,81 102,45 39,64 Erro padrão 0,70 1,00 0,14 0,02 0,08 0,05 0,02 0,05 0,07 1,14 0,42 Variância 157,67 319,77 6,45 0,16 2,34 0,72 0,10 0,76 1,65 848,84 115,47 Desvio Padrão 12,56 17,88 2,54 0,40 1,53 0,85 0,31 0,87 1,28 29,13 10,75 Mediana 48,34 27,00 13,54 2,66 6,92 2,70 1,93 2,93 11,78 99,52 38,76 CV 26,28 58,86 18,80 14,90 21,56 30,94 16,24 28,98 10,88 28,44 27,11 Morfoespécie7 CI TF CL LBL LML CS LS DFA CTC C L N 95 95 100 100 100 99 100 100 100 119 119 Mínimo 16,07 7,00 3,90 0,98 2,48 1,44 0,94 0,83 6,62 34,88 11,6 Máximo 48,77 40,00 12,87 2,83 5,44 3,42 2,24 4,67 13,13 148,23 48,28 Média 29,33 18,36 7,03 2,03 4,00 2,31 1,56 2,61 9,75 71,30 26,41 Erro padrão 0,67 0,76 0,19 0,04 0,07 0,05 0,03 0,08 0,13 2 0,70 Variância 43,18 55,53 3,45 0,14 0,44 0,23 0,07 0,65 1,65 442,77 57,51 Desvio Padrão 6,57 7,45 1,86 0,37 0,67 0,48 0,27 0,80 1,28 21,04 7,58 Mediana 28,72 17,00 6,93 2,07 3,97 2,27 1,58 2,72 9,78 66,37 25,14 CV 22,40 40,59 26,43 18,15 16,64 20,65 17,48 30,81 13,17 29,51 28,72 Morfoespécie8 CI TF CL LBL LML CS LS DFA CTC C L N 100 100 105 105 105 105 102 105 105 272 272 Mínimo 19,24 6,00 3,32 1,43 2,90 1,32 1,12 1,59 7,24 43,95 18,97 Máximo 50,02 40,00 11,17 2,66 7,56 3,86 2,62 4,71 12,14 171,00 63,55 Média 29,57 17,63 7,74 2,11 4,78 2,60 1,66 2,84 9,65 97,50 37,77 Erro padrão 0,49 0,73 0,15 0,03 0,08 0,05 0,02 0,07 0,08 1,49 0,53 Variância 24,33 53,71 2,48 0,07 0,64 0,24 0,06 0,49 0,71 602,42 75,96 Desvio Padrão 4,93 7,33 1,57 0,26 0,80 0,49 0,25 0,70 0,84 24,54 8,72 Mediana 29,77 16,50 7,73 2,12 4,81 2,66 1,65 2,74 9,66 96,79 37,71 CV 16,68 41,57 20,33 12,32 16,79 18,73 15,06 24,69 8,75 25,17 23,08 179

Apêndice C. Tabela 1. Continuação

Morfoespécie9 CI TF CL LBL LML CS LS DFA CTC C L N 41 41 42 42 42 42 42 42 42 188 188 Mínimo 22,23 4,00 5,83 1,51 2,06 2,45 0,78 3,06 8,49 70,48 17,05 Máximo 50,37 20,00 8,69 2,55 5,12 5,13 1,62 6,94 13,85 193,00 73,63 Média 30,25 8,07 7,20 1,95 3,66 3,48 1,19 5,07 11,87 120,99 40,63 Erro padrão 0,94 0,46 0,13 0,04 0,11 0,09 0,03 0,16 0,18 1,95 0,78 Variância 36,19 8,67 0,70 0,06 0,49 0,32 0,03 1,10 1,31 717,07 114,22 Desvio Padrão 6,02 2,94 0,83 0,25 0,70 0,56 0,18 1,05 1,15 26,78 10,69 Mediana 28,98 8,00 7,22 1,94 3,51 3,54 1,19 5,37 12,07 115,86 39,93 CV 19,89 36,47 11,59 12,56 19,16 16,16 15,49 20,70 9,66 22,13 26,31 Morfoespécie10 CI TF CL LBL LML CS LS DFA CTC C L N 10 10 10 10 10 10 10 10 10 64 64 Mínimo 22,01 3,00 4,34 1,68 3,57 4,00 0,96 4,36 12,82 53,51 16,36 Máximo 38,07 10,00 5,98 2,17 4,88 6,80 1,50 9,25 15,22 169,00 45,15 Média 27,22 6,00 5,30 1,91 4,13 5,36 1,18 6,93 14,33 114,62 30,88 Erro padrão 1,54 0,70 0,15 0,06 0,12 0,26 0,07 0,46 0,27 2,93 0,92 Variância 23,77 4,89 0,24 0,03 0,14 0,68 0,05 2,12 0,74 550,67 54,50 Desvio Padrão 4,88 2,21 0,49 0,18 0,38 0,82 0,22 1,46 0,86 23,47 7,38 Mediana 25,89 5,50 5,20 1,86 4,06 5,22 1,10 6,90 14,50 115,66 30,46 CV 17,91 36,85 9,18 9,24 9,20 15,37 18,69 21,02 6,00 20,47 23,91 Morfoespécie11 CI TF CL LBL LML CS LS DFA CTC C L N 48 48 50 50 50 50 50 50 50 128 128 Mínimo 19,66 3,00 4,13 1,18 3,03 1,33 0,94 2,64 8,68 50,81 13,43 Máximo 44,47 17,00 9,40 2,69 6,47 3,51 2,04 5,30 12,71 140,91 43,50 Média 28,80 9,77 6,79 1,94 4,56 2,45 1,45 4,05 10,87 87,42 29,83 Erro padrão 0,72 0,52 0,16 0,05 0,09 0,07 0,03 0,10 0,15 1,62 0,56 Variância 24,73 12,73 1,24 0,11 0,43 0,25 0,06 0,53 1,17 337,21 40,46 Desvio Padrão 4,97 3,57 1,11 0,33 0,66 0,50 0,24 0,73 1,08 18,36 6,36 Mediana 28,43 10,00 6,58 1,94 4,61 2,47 1,47 4,09 11,01 86,84 29,49 CV 17,26 36,52 16,38 17,17 14,42 20,36 16,62 18,02 9,97 21,01 21,32 Morfoespécie5 CI TF CL LBL LML CS LS DFA CTC C L N 68 68 80 80 80 80 80 80 80 104 104 Mínimo 29,27 6,00 9,44 1,66 6,40 3,13 1,02 1,08 7,97 27,19 13,05 Máximo 94,25 68,00 18,26 3,27 13,85 6,46 1,93 3,26 12,01 106,47 48,75 Média 52,12 27,34 13,80 2,27 9,63 4,47 1,52 2,12 9,42 60,10 27,99 Erro padrão 1,72 1,59 0,19 0,03 0,20 0,09 0,02 0,06 0,08 1,63 0,81 Variância 201,19 171,06 3,02 0,08 3,18 0,66 0,03 0,24 0,57 275,75 67,64 Desvio Padrão 14,18 13,08 1,74 0,29 1,78 0,81 0,18 0,49 0,75 16,61 8,22 Mediana 49,13 25,50 13,94 2,22 9,25 4,48 1,54 2,15 9,36 58,27 27,16 CV 27,22 47,84 12,58 12,78 18,51 18,20 11,82 23,21 7,98 27,63 29,38 180

Apêndice D. Descrição da análise qualtitativa dos caracteres florais e vegetativos dos complexos taxonômicos T. laeta e T.hystrix.

As morfoespécies 6, 7, 8 e 11 (exceto um único indivíduo da morfoespécie7) apresentaram as sépalas inflexas e as morfoespécies 9 e 10 apresentaram as sépalas reflexas. Todas as morfoespécies apresentaram pubescência interna no tubo da corola (tricomas infra e supraestaminais), lobos da corola deflexos a ocasionalmente patentes (um único indivíduo da morfoespécie6 e três indivíduos da morfoespécie7), com algum grau de torção, e ápice da cabeça estilar com 5 lóbulos. Os espécimes analisados das morfoespécies 6, 7, 8 e 11 (exceto um único indivíduo da morfoespécie7) apresentaram sépalas totalmente glabras. A morfoespécie9 apresentou pubescência somente na face adaxial das sépalas (exceto um único indivíduo, com pubescência em ambas as faces) e na morfoespécie10 as sépalas eram pubescentes em ambas às faces. A morfoespécie10 foi a única espécie que apresentou pubescência na face externa do tubo da corola e no ovário (exceto um único individuo da morfoespécie7). O número de projeções basais na cabeça estilar é variável entre e dentre os espécimes; para a morfoespécie6 este variou de 9 a 12 (uma única flor sem as projeções basais), para morfoespécie7 este variou de 7 a 11 (um único indivíduo variou de 0 a 9), para morfoespécie8 variou de 8 a 11 (um indivíduo não apresentou e outros dois apresentaram flores com e sem os as projeções basais), a morfoespécie11 houve constância em 10 projeções basais (um único indivíduo variou de 0 a 10). Os espécimes analisados da morfoespécie9 não apresentaram projeções basais e para a morfoespécie10 dos três indivíduos analisados dois não apresentavam e um apresentou 10 projeções basais na cabeça estilar. A maioria dos espécimes analisados das morfoespécies 6, 7, 8, 9 e 11 (exceto um único indivíduo da morfoespécie7) apresentaram folhas glabras, assim como o pecíolo. As morfoespécies 6, 7, 8 e 11 (exceto um único indivíduo morfoespécie7) apresentaram inflorescências e brácteas glabras; para a morfoespécie9, no entanto, os espécimes analisados tinham pubescência na inflorescência e brácteas da inflorescência, no entanto alguns indivíduos eram glabros e outros podiam ser pubescentes ou glabros. Os espécimes da morfoespécie10 apresentaram pecíolos pubescentes e lâmina foliar pubescente na face abaxial e glabra ou pubescente ao longo da nervura central na face adaxial, além de pubescência nas inflorescências, brácteas e ovários. Um único indivíduo da morfoespécie7 apresentou pubescência no ovário.

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7. CONSIDERAÇÕES FINAIS Com a inclusão de espécies de ocorrência geográfica próxima a T. aurantiaca, essa se posicionou como provável táxon irmão dos demais táxons do clado Callichilia, apesar da semelhança morfológica com as espécies de Tabernaemontana, principalmente com as espécies que ocorrem na Ásia e Bacia do Pacífico. O posicionamento filogenético de T. aurantiaca, em conjunto com os caracteres morfológicos analisados permitiu o reconhecimento dessa espécie como uma linhagem distinta, sendo proposto o restabelecimento do gênero monotípico Rejoua. Com base no posicionamento filogenético, forma dos botões florais, caracteres florais, foliares e vegetativos analisados permitiu o reconhecimento de quatro espécies dentro do complexo taxonômico T. catharinensis. As morfoespécies identificadas no presente estudo correspondem às descrições prévias feitas por diversos autores, sendo proposto a conservação do nome T. hilariana Müll. Arg. para a morfoespécie1. A morfoespécie2 se enquadra na descrição da espécie tipo de T. catharinensis A. DC.. A variação morfológica encontrada na morfoespécie3 não se enquadra em nenhum nome prévio e será proposto o nome T. caatingae, dado a sua ocorrência restrita a esse bioma e singularidade da espécie. Propomos o reconhecimento da morfoespécie4 como T. solanifolia, e a morfoespécie5 utilizada como grupo externo no presente estudo deverá ser reconhecida como T. nervosa. De acordo com o posicionamento filogenético, forma dos botões florais, caracteres florais e vegetativos analisados reconhecemos três espécies dentro dos complexos taxonômicos T. laeta e T. hystrix, que corresponderam às morfoespécies 6, 9 e 10. As morfoespécies 7, 8 e 11 apresentaram sobreposição nos caracteres analisados. A morfoespécie6 teve sobreposição morfológica parcial com as morfoespécies 7 e 8, somado a ausência de resolução, coocorrência em algumas localidades e floração no mesmo período podem indicar uma história evolutiva complexa, com possível fluxo gênico e hibridização. Apesar da possibilidade de hibridização e fluxo gênico entre a morfoespécie6 com as demais morfoespécies que ocorrem em simpatria, a forma típica da morfoespécie6 se enquadra na descrição do nome T. laeta e essa é separada das demais pela morfologia foliar, pela forma e tamanho dos botões florais e pelos caracteres florais analisados. A espécie T. salzmannii foi incluída no trabalho com o propósito de servir como um grupo externo nos estudos de morfometria, pois a princípio se tratava de uma espécie bem definida. Entretanto uma análise mais detalhada do material coletado e dos espécimes depositados nos herbários permitiu o reconhecimento de três morfoespécies. Dessas, as morfoespécies 12 e 14 foram recuperadas como monofiléticas. As análises morfométricas 182

iniciais indicaram diferenças entre as morfoespécies 12 e 13. Os resultados são iniciais, sendo necessário uma análise mais detalhada dos espécimes depositados nos herbários e bases de dados digitais, assim como incluir mais terminais na filogenia, para melhor delimitar as possíveis espécies. Para publicação da filogenia de Tabernaemontana seção Peschiera pretendemos incluir um maior número de terminais das morfoespécies 9, 10, 12, 13 e 14. Inicialmente a tese tinha como objetivo utilizar sequências para marcadores nucleares de baixa cópia. Foram testados sete primers de COSII (single-copy orthologous genes), desenvolvidos para outros grupos de Apocynaceae. No entanto, após o sequenciamento das regiões amplificadas estas se apresentaram duplicadas, sendo necessário maior tempo laboratorial para clonar e amplificar as regiões. A inclusão desses marcadores moleculares na filogenia da seção não está prevista, por questões de tempo e logística, no entanto abre possibilidade para estudos futuros. Para publicação do artigo referente ao complexo taxonômico T. catharinensis ainda serão incluídos dados referentes às análises da forma foliar por meio da análise de Fourier. As imagens das folhas já estão digitalizadas e parcialmente editadas. Para a morfoespécie4 não foi possível incluir dados foliares, devido a qualidade das exsicatas. Pretendemos utilizar imagens das exsicatas de banco digitais desse táxon nas análises dos caracteres foliares. Para o capítulo 4, o qual abordou os complexos taxonômicos T. laeta e T. hystrix as morfoespécies 9 e 10 serão publicadas em um artigo a parte, por serem dois táxons próximos e com morfologias distintas dos demais táxons. No entanto, é necessária uma revisão detalhada dos nomes e sinônimos publicados previamente em T. laeta e T. hystrix, para verificar se essas já não foram previamente publicadas. Também será feita uma consulta às bases de dados digitais e espécimes depositados nos herbários, para confirmar as áreas de distribuição dessas duas espécies. Para os demais táxons pertencentes aos complexos taxonômicos T. laeta e T. hystrix ainda serão adicionados dados referentes às análises da forma foliar por meio da análise de Fourier. As imagens das folhas já estão digitalizadas, sendo necessário somente editá-las e incluir algumas imagens de exsicatas coletadas posteriormente. A princípio as morfoespécies definidas a piori têm diferenças na forma foliar e aparentemente apresentam homogeneidade floral. O complexo taxonômico T. hystrix tem um extenso histórico taxonômico e a variação morfológica nesse táxon é alta, com as possíveis espécies de difícil identificação e delimitação, possivelmente devido à homogeneidade floral. Uma alternativa para os estudos futuros seria incluir dados foliares das exsicatas depositadas nos herbários e identificadas como T. hystrix, assim como dos sinônimos. Apesar da extensa coleta realizada no presente 183

estudo a variação morfológica nesse complexo foi parcialmente abordado. O completo taxonômico T. catharinensis é um grupo interessante para estudar os processos envolvidos na especiação. Acredito que o grupo apresente hibridização antiga, seguida de recolonização e expansão das áreas de ocorrência, seguido de adaptação local a diferentes condições ecológicas. Tabernaemontana seção Peschiera como um todo pode ser um bom modelo de estudo para compreender a diversificação das espécies nas regiões de Mata Atlântica, Amazônia, Cerrado e Caatinga, levando em consideração que o gênero apresenta um fóssil bem datado e identificado, o qual poderia ser utilizado para datar a filogenia em estudo futuros. Para os estudos futuros nos complexos T. laeta e T. hystrix seria interessante incluir informações sobre a biologia reprodutiva dos táxons nas populações onde essas coocorrem. É importante levar em consideração que as espécies florescem no mesmo período, e nessas populações foi observada a constância morfológica em alguns espécimes, entretanto, alguns tinham morfologia intermediária. Essas populações seriam um bom modelo para entender o processo de especiação, com possível fluxo gênico e hibridização, assim como testar se a separação entre os possíveis táxons está sendo mantidos por conjuntos distintos de polinizadores e se existe sobreposição entre os polinizadores, o qual explicaria o possível fluxo gênico. Outro ponto importante é realizar um número maior de coletas nos estados de Rio de Janeiro, Espírito Santo e na porção de Mata Atlântica do estado da Bahia, pelos materiais depositados nos herbários e pelas coletas realizadas nesses estados existe a possibilidade de um número maior de espécies pertencentes à Tabernaemontana seção Peschiera. A coleta de novos espécimes no campo é necessária, dado que alguns caracteres morfológicos úteis na delimitação e identificação das espécies se perdem durante o processo de secagem.

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8. ANEXOS

Anexo A. Declaração de bioética e biossegurança

DECLARAÇÃO

Em observância ao §5º do Artigo 1º da Informação CCPG-UNICAMP/001/15, referente a Bioética e Biossegurança, declaro que o conteúdo de minha Tese de Doutorado, intitulada “Delimitação de espécies de Tabernaemontana L. (Apocynaceae, Rauvolfioideae, Tabernaemontana)”, desenvolvida no Programa de Pós-Graduação em Biologia Vegetal do Instituto de Biologia da Unicamp, não versa sobre pesquisa envolvendo seres humanos, animais ou temas afetos a Biossegurança.

Assinatura: Nome do(a) aluno(a): Natalí Gomes Bordon

Assinatura: Nome do(a) orientador(a): André Olmos Simões

Data: 30/10/2020 185

Anexo B. Declaração de direito autoral

Declaração

As cópias de artigos de minha autoria ou de minha co-autoria, já publicados ou submetidos para publicação em revistas científicas ou anais de congressos sujeitos a arbitragem, que constam da minha Dissertação/Tese de Mestrado/Doutorado, intitulada Delimitação de espécies de Tabernaemontana L. (Apocynaceae, Rauvolfioideae, Tabernaemontana), não infringem os dispositivos da Lei n.° 9.610/98, nem o direito autoral de qualquer editora.

Campinas, 30 de outubro de 2020.

Assinatura :

Nome do(a) autor(a): Natalí Gomes Bordon

RG n.° 42.202.359-0

Assinatura :

Nome do(a) orientador(a): André Olmos Simões

RG n.°