Atividade Antimicrobiana E Estudo Químico Bioguiado De Espécies De Aspidosperma
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALAGOAS INSTITUTO DE QUIMICA E BIOTECNOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA E BIOTECNOLOGIA GREISIELE LORENA PESSINI ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E ESTUDO QUÍMICO BIOGUIADO DE ESPÉCIES DE ASPIDOSPERMA Maceió 2015 GREISIELE LORENA PESSINI ATIVIDADE ANTIMICROBIANA E ESTUDO QUÍMICO BIOGUIADO DE ESPÉCIES DE ASPIDOSPERMA Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Química e Biotecnologia da Universidade Federal de Alagoas como requisito parcial para a obtenção do grau de Doutora em Ciências. Orientador: Prof. Dr. João Xavier de Araújo Júnior Co-orientador: Prof. Dr. Celso Vataru Nakamura Maceió 2015 Catalogação na fonte Universidade Federal de Alagoas Biblioteca Central Divisão de Tratamento Técnico Bibliotecário Responsável: Valter dos Santos Andrade P475a Pessini, Greisiele Lorena. Atividade antimicrobiana e estudo químico bioguiado de espécies de Aspidosperma / Greisiele Lorena Pessini. – 2015. [251]f. : il. tabs., grafs. Orientador: João Xavier de Araújo Júnior. Coorientador: Celso Vataru Nakamura. Tese (doutorado em Química e Biotecnologia) – Universidade Federal de Alagoas. Instituto de Química e Biotecnologia. Maceió, 2015. Bibliografia: f. 208-233. Anexos: f. [234]-[251]. 1. Aspidosperma macrocarpon. 2. Aspidosperma tomentosum. 3. Aspidosperma pyrifolium. 4. Atividade antimicrobiana. I. Título. CDU: 543.645:615.28 Este trabalho é dedicado com amor aos meus pais Luiz e Josefa e ao meu esposo Willian pela paciência, companheirismo, carinho e estímulo constante. AGRADECIMENTOS “Em meio à tribulação, invoquei o Senhor, e o Senhor me ouviu e me deu folga. O Senhor está comigo entre os que me ajudam;... Render-te-ei graças porque me acudiste e foste a minha salvação.” Salmo 118.5, 7, 21. Ao Prof. Dr. João Xavier de Araújo Júnior pela orientação, confiança, pelas cobranças, incentivo, por todo auxílio prestado e compreensão durante todo este tempo, muito obrigada. Ao Prof. Dr. Celso Vataru Nakamura pela co-orientação, confiança, por ter permitido fazer parte da sua equipe mais uma vez, pelos ensinamentos, amizade, por sua grandiosa contribuição, não tenho palavras para agradecer tantos anos de apoio, muito obrigada. A profa. Drª. Tânia Ueda-Nakamura pela parceria nos experimentos antivirais, por ter aberto as portas do seu laboratório, por toda ajuda em todos os momentos que solicitei, pela amizade e por todo o cuidado que tens em cada detalhe do trabalho que realiza. Ao prof. Dr. Antônio Euzébio Goulart Sant’Ana por ter aberto as portas do seu laboratório no início do meu doutoramento, e pela dica que alimentei durante todo o processo “... com Aspidosperma o estudo deve ser bioguiado...” Ao prof. Dr. João Palazzo de Mello por mais uma vez me estender à mão, por ter aberto as portas do seu laboratório nos momentos que precisei, pela confiança, pelas dicas durante a execução dos experimentos e preocupação comigo. Ao prof. Dr. Arildo José Braz de Oliveira meus sinceros agradecimentos por aceitar supervisionar os estudos fitoquímicos com dicas e ensinamentos que foram imprescindíveis para o direcionamento dos estudos. A minha família, meus pais Luiz e Josefa, meu irmão Alan, e meu esposo Willian, pelo amor incondicional, apoio constante e por me ajudarem a seguir em frente, agradeço a Deus por tê- los na minha vida, obrigada Senhor porque permitiu que eles continuassem comigo. A Josélia que cuidou da minha casa durante todo o tempo que estive ausente, assim como dos meus amores Bud (in memoriam) Mel e Bob – três cockers. As novas amizades, presente de Deus, Amanda, Débora, Francielle e Elizandra pelos ensinamentos, paciência, pela ajuda durante e após os experimentos, na leitura dos meus textos, pelo apoio nos momentos difíceis, agradeço por terem tornado esta fase da minha vida muito mais fácil, e por continuarem a fazer parte dela, mesmo distante. Aos amigos que acompanharam tudo de longe, que sempre torceram a favor, que oraram, compartilharam e compartilham vários momentos da minha vida, Sirlene, Jose, Fabíola, Éverson, Liliana e Tânia, muito obrigada. Aos amigos e colegas do laboratório de Inovação Tecnológica no Desenvolvimento de Fármacos e Cosméticos da Universidade Estadual de Maringá - PR, Débora, Fran Garcia, Amanda Louzano, Elizandra, Nilma, Gean, Juliana Cogo, Vanessa, Hélito, Alex, Vânia, Solange, Jean, Nathiele, Fabianne, Danielle, Priscila, Karen, Jéssica, Érica, Renata, Carol, Larissa, Talitha, Eliana, Lígia, Ângelo, Mychelle, Samara, para descrever como cada um foi importante na minha vida pessoal e profissional, eu usaria mais páginas do que há nesta tese, sou imensamente grata a Deus por ter colocado cada um de vocês na minha vida, o aprendizado foi enorme, as alegrias e as lembranças serão eternas. Aos colegas e amigos do laboratório Palafito, da Universidade Estadual de Maringá - PR: Letícia, Maísa, Vanessa, Fernanda, André, Bruna, Raquel, Admir, Leila, Adrielli pelos momentos de descontração, as ajudas oportunas e pelo companheirismo que deram suporte para a realização dos experimentos de fitoquímica. A Malinda pelos ensinamentos de inglês, pela amizade e sabedoria transmitida com tanto carinho. A Fernanda Leve pela parceria nos experimentos relacionados aos ensaios antitumorais com os alcaloides. Aos técnicos do Complexo de Centrais de Apoio à Pesquisa (COMCAP) da Universidade Estadual de Maringá - PR, Fábio pela disponibilização de nitrogênio líquido, Edson pela ajuda sempre que necessário e a Kátia pelo auxílio na utilização dos microscópios eletrônicos. À Ivania e Ulisses pela amizade e valiosa ajuda na obtenção dos espectros de RMN. À Gabriela parceira durante as disciplinas do doutorado, tornando esta fase mais fácil e divertida. Ao Pedro e Aldy pela ajuda oportuna e a Erlan pelo companheirismo nos momentos de descontração. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo auxílio financeiro. E a todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho, muito obrigada. “Não que por nós mesmos, sejamos capazes de pensar alguma coisa, como se partisse de nós; mas a suficiência vem de Deus.” 2 Coríntios 3.5 RESUMO As espécies do gênero Aspidosperma pertencentes à família Apocynaceae são restritas às Américas. Estudos etnofarmacológicos revelaram a utilização destas espécies como agente potencial contra a malária e tripanosomatídeos, como antimicrobianos, anti-inflamatórios e antitumorais. A pesquisa em busca de novas entidades químicas com ação antimicrobiana apresenta significativa importância devido à versatilidade dos micro-organismos em adquirir resistência ao arsenal terapêutico, e devido à prevalência de doenças consideradas negligenciadas, como as leishmanioses. Estas são endêmicas nos países em desenvolvimento e possuem poucas opções terapêuticas, sendo estas tóxicas e de eficácia limitada. O objetivo do estudo consistiu em avaliar os extratos brutos e frações de diferentes partes das espécies de A. macrocarpon, A. tomentosum e A. pyrifolium, quanto à ação antimicrobiana e realizar o estudo químico bioguiado da espécie mais ativa sobre os micro-organismos testados e menos tóxica para células de mamíferos. Sobre a atividade antibacteriana a fração alcaloídica da casca de A. pyrifolium apresentou concentração inibitória mínima (CIM) moderada de 125 e 250 µg/mL para Staphylococcus aureus e Bacillus subtilis, respectivamente. A fração acetato de etila do caule de A. macrocarpon apresentou CIM fraca de 250 µg/mL sobre Candida parapsilosis. A atividade do extrato da casca do caule de A. macrocapon contra formas promastigotas de Leishmania amazonensis apresentou concentração inibitória (CI50) de 151,5 g/mL e índice de seletividade (IS) de 6,52 sobre células LLCMK2, sendo a espécie mais promissora para a realização do estudo químico bioguiado. As frações de clorofórmio e acetato de etila obtidas da casca do caule de A. macrocarpon demonstraram CI50 de 29,00 1,65 e 29,50 0,95 g/mL respectivamente, sobre as formas promastigotas de L. amazonensis. O estudo bioguiado do fracionamento da fração clorofórmio conduziu à obtenção da subfração com monoacilglicerois (MAG) como a mais ativa sobre as formas evolutivas de L. amazonensis, com CI50 2,31 0,08 e 2,29 0,14 g/mL sobre promastigotas e amastigotas intracelulares, respectivamente e IS sobre macrófagos J774-A1 de 42, para ambas as formas evolutivas. Estudos relacionados ao mecanismo de ação da fração MAG avaliados por microscopia óptica, eletrônica de varredura (MEV), e transmissão (MET) evidenciaram alterações como inchaço mitocondrial, membranas concêntricas dentro da mitocôndria, presença de perfurações na superfície celular do parasito e vacúolos autofágicos. Estes dados quando analisados em conjunto com resultados da citometria de fluxo indicaram a autofagia e necrose como provável mecanismo de morte celular. Após o fracionamento da fração acetato de etila foi identificada a quercetina como substância ativa sobre as formas evolutivas de L. amazonensis, com CI50 de 61,93 1,36 e 63,86 3,25 M/mL sobre promastigotas e amastigotas intracelulares, respectivamente. A quercetina foi avaliada em combinação com anfotericina B (Q+A) e miltefosina (Q+M), o efeito combinatório de ambas foi considerado sinérgico sobre as formas evolutivas de L. amazonensis. As combinações Q+A e Q+M demonstraram ação antagônica sobre macrófagos e eritrócitos humanos. A avaliação da combinação por MEV e MET associada aos dados da literatura indicaram provável morte celular por apoptose de ambas as combinações. Estes achados nos ensaios