ANKARA ÜN ĐVERS ĐTES Đ FEN B ĐLĐMLER Đ ENST ĐTÜSÜ
DOKTORA TEZ Đ
GENTIANA OLIVIERI GRISEB.’DE KALLUS VE SÜSPANS ĐYON KÜLTÜRLER ĐNDE BULUNAN BAZI SEKONDER METABOL ĐTLER
Canan YA ĞCI TÜZÜN
BĐYOLOJ Đ ANAB ĐLĐM DALI
2011 ANKARA
Her hakkı saklıdır TEZ ONAYI
Canan YA ĞCI TÜZÜN tarafından hazırlanan “ Gentiana olivieri Griseb.’de Kallus ve Süspansiyon Kültürlerinde Bulunan Bazı Sekonder Metabolitler” adlı tez çalı ması 02/12/2011 tarihinde a ağıdaki jüri tarafından oy birli ği ile Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı’nda DOKTORA TEZ Đ olarak kabul edilmi tir.
Danı man : Prof. Dr. M. Cihat TOKER E danı man : -
Jüri Üyeleri : Ba kan: Prof. Dr. Rukiye TIPIRDAMAZ Hacettepe Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü
Üye: Prof. Dr. M. Cihat TOKER Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü
Üye: Doç. Dr. Gül Nilhan TU Ğ Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü
Üye: Yrd. Doç. Dr. H. Nurhan BÜYÜKKARTAL Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü
Üye: Yrd. Doç. Dr. Hatice ÇÖLGEÇEN Zonguldak Karaelmas Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü
Yukarıdaki sonucu onaylarım
Prof. Dr. Özer KOLSARICI Enstitü Müdürü
2 ÖZET
Doktora Tezi
GENTIANA OLIVIERI GRISEB.’DE KALLUS VE SÜSPANS ĐYON KÜLTÜRLER ĐNDE BULUNAN BAZI SEKONDER METABOL ĐTLER
Canan YA ĞCI TÜZÜN
Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı
Danı man: Prof. Dr. M. Cihat TOKER
Flavonoit, iridoit ve alkaloit içeren Gentiana olivieri Griseb. (Gentianaceae), antidiyabetik, antidepresan ve sindirime yardımcı olarak kullanılmaktadır. Flavonoit (izoorientin ile izoviteksin) ve iridoitlerin (gentiopikrozit ile svertiamarin) varlı ğı G. olivieri kallus ve süspansiyon kültürlerinde ara tırıldı. G. olivieri tohumları 0.1 mM GA 3 içeren Woody Plant Medium (WPM)’da çimlendirildi. Kallus üretmek için ilk deneme için yaprak ve kök eksplantları, ikincisi için sadece yaprak eksplantı kullanıldı. Her iki denemede de eksplantlar 60 günlük aseptik fidelerden alındı. Eksplantlar 1 mg/l Naftalen Asetik Asit (NAA) ile 0.5 mg/l Benzil Amino Purin (BAP) veya 0.2-0.5 mg/l Kinetin içeren Murashige ve Skoog (MS) ile WPM ortamlarına ekildi. Kültürler ilk denemede karanlıkta; ikincide ise 16/8 aydınlık/karanlık fotoperiyotta 3000 lux ı ık iddetinde inkübe edildi. Đkinci denemeden elde edilen kalluslardan süspansiyon kültürleri kuruldu. Kallus kültürlerinden 3 alt kültür ve süspansiyon hücrelerinden 25 gün boyunca üretilen sekonder metabolitler; kalitatif ve kantitatif olarak ara tırıldı.
Sekonder metabolit üretiminde süspansiyon kültürü, kallus kültürüne göre daha verimli bulundu. 1 mg/l NAA ve 0.5 mg/l BAP içeren WPM ortamında 20. günde süspansiyon kültüründe geli en hücrelerde izoviteksin miktarı G. olivieri ekstresinden 10 kat fazla bulundu (0.408 mg/g). 1 mg/l NAA ve 0.5 mg/l Kinetin içeren WPM ortamında 1. alt kültürde geli en kallus hücreleri izoorientin üretimi için en iyi sonucu verdi (0.492 mg/g). Đridoit yapıda oldu ğu dü ünülen fakat gentiopikrozit ve svertiamarin ile e le meyen maddeler üretildi.
Aralık 2011, 124 sayfa
Anahtar Kelimeler: Gentiana olivieri , kallus kültürü, hücre süspansiyon kültürü, bitki sekonder metabolitlerinin üretimi
i ABSTRACT
Ph. D. Thesis
SOME SECONDARY METABOLITES OF CALLUS AND SUSPENSION CULTURES OF GENTIANA OLIVIERI GRISEB.
Canan YA ĞCI TÜZÜN
Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology
Supervisor : Prof. Dr. M. Cihat TOKER
Gentiana olivieri Griseb. (Gentianaceae), which contains flavonoid, iridoid and alkaloid, has been used as antidiabetic, antidepressant and digestive aid. Existence of flavonoids (isoorientin and isovitexin) and iridoids (gentiopicroside and swertiamarin) were investigated in callus and suspension culture of G. olivieri . Seeds of G. olivieri were germinated in Woody Plant Medium (WPM) with 0.1 mM GA 3. Leaf and root explants were used for the first experiment while only leaf explant was used for the second to produce callus. In both experiments, explants were obtained from 60 days old aseptic plantlets. Explants were sown onto Murashige & Skoog Medium (MS) and WPM including 1 mg/l Naphtalane Acetic Acid (NAA) with 0.5 mg/l Benzyl Amino Purine (BAP) or 0.2-0.5 mg/l Kinetin. Cultures were incubated in the dark in the first experiment while the second was in 3000 lux at 16/8h light/dark photoperiod. Suspension cultures were established from calli which obtained from the second experiment. Secondary metabolites, which were produced from callus cultures during 3 sub-culture and from suspension cultures during 25 days, were investigated qualitatively and quantitatively.
Suspension cultures were found more productive than callus cultures in terms of secondary metabolite production. Quantity of isovitexin, grown in WPM suspension cultures containing 1 mg/l NAA and 0.5 mg/l BAP in the 20th day, was found ten times more from G. olivieri extract (0.408 mg/g). Callus cells which grown in WPM containing 1 mg/l NAA and 0.5 mg/l Kinetin in the first sub-culture were found to be more succesful for isoorientin production (0.492 mg/g). Substances, which were considered to have iridoidal structure but had no match with gentiopicroside and swertiamarin, were produced.
December 2011, 124 pages
Key Words: Gentiana olivieri , callus culture, cell suspension culture, production of plant secondary metabolites
ii TE EKKÜR
Bu tez, Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü tarafından desteklenen “ Gentiana olivieri Griseb.’de kallus olu umu ve kallusta izoorientin miktarının tayini (2001-K- 120-240)” ile TÜB ĐTAK tarafından desteklenen “Bitkisel Kaynaklı Đlaç Etken Maddelerinin Biyoteknolojik Yöntemlerle Üretilmesi Üzerine Çalı malar (1055343)” adlı projeler kapsamında yürütülmü tür.
Bu çalı mayı yürütmemi sa ğlayan, fikirleriyle beni yönlendiren, ara tırmalarımda ilgi, bilgi ve deste ğini esirgemeyen danı man hocam Sayın Prof. Dr. M. Cihat TOKER ve çalı malarımda her zaman deste ğini gördü ğüm ve Gazi Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmakognozi Ana Bilim Dalı’nda bulunan laboratuarında tüm imkanları sunan Sayın Hocam Prof. Dr. Gülnur TOKER’e sonsuz te ekkürlerimi sunarım.
Kantitatif analizleri yürüttü ğüm Hacettepe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmakognozi Ana Bilim Dalı’nda görev yapan Sayın Hocalarım Prof. Dr. Đhsan ÇALI , Prof. Dr. Tayfun ERSÖZ, Doç. Dr. Funda Nuray YALÇIN ba ta olmak üzere tüm personele güleryüzlerinden, verdikleri destek ve yardımlarından dolayı ükranlarımı sunarım.
Hayatım boyunca attı ğım her adımda bana destek olan babam Emin Ali YA ĞCI, annem Ay e YA ĞCI, abim Ayhan YA ĞCI’ya tüm kalbimle te ekkür ederim. Tezimi bitirmemde sonsuz manevi deste ğini gördü ğüm e im Mehmet Murat TÜZÜN’e sonsuz te ekkür ederim.
Canan YA ĞCI TÜZÜN Ankara, Aralık 2011
iii ĐÇĐNDEK ĐLER
ÖZET ...... i ABSTRACT ...... ii TE EKKÜR ...... iii SĐMGELER D ĐZĐNĐ ...... vii EK ĐLLER D ĐZĐNĐ ...... viii ÇĐZELGELER D ĐZĐNĐ ...... x 1. G ĐRĐ ...... 1 2. KAYNAK ÖZETLER Đ ...... 5 2.1 Gentianaceae Familyası ve G. olivieri ile Đlgili Sistematik Bilgiler ...... 5 2.1.1 Gentianaceae familyası ...... 5 2.1.2 Gentiana L. cinsi ...... 5 2.1.3 Türkiye’de yayılı gösteren Gentiana türlerinin te his anahtarı (Davis 1978) ...... 6 2.1.4 Gentiana olivieri Grisebach ...... 7 2.1.4.1 Sistematik bilgileri ...... 7 2.1.4.2 Genel özellikleri ve habitatı ...... 7 2.1.4.3 Türkiye’deki yayılı ı ...... 8 2.1.4.4 Sinonim ve yerel isimleri ...... 9 2.2 Gentiana L.’nin Kullanım Alanları ...... 9 2.2.1 Gentiana olivieri ’nin kullanım alanları ...... 11 2.3 Gentiana L.’de Bulunan Biyoaktif Özellikteki Bile ikler ...... 11 2.3.1 Flavon C-heterozitler (C- Glikozil flavonoitler) ...... 13 2.3.1.1 Flavon C-heterozitlerin genel özellikleri ve biyosentez yolları ...... 13 2.3.1.2 Flavon C-heterozitlerin biyolojik aktivite ve kullanım alanları ...... 15 2.3.2 Đridoit ve sekoiridoit glikozitler ...... 16 2.3.2.1 Đridoit ve sekoiridoit glikozitlerin genel özellikleri ve biyosentez yolları ...... 16 2.3.2.2 Đridoit ve sekoiridoit glikozitlerin biyolojik aktivite ve kullanım alanları ...... 18 2.4 Doku Kültürü ile Đlgili Genel Bilgiler ...... 18 2.4.1 Bitki doku kültürünün uygulama alanları...... 19 2.4.2 Bitki doku kültürü yöntemleri ...... 20 2.4.2.1 Kallus kültürü ...... 20 2.4.2.2 Süspansiyon kültürü ...... 20 2.4.2.3 Organ kültürü ...... 21 2.4.2.4 Somatik embriyogenez ...... 21 2.4.2.5 Mikroço ğaltım ...... 21 2.4.2.6 Transgenik bitki üretimi ...... 22 2.4.3 Bitki doku ve hücre kültürü teknikleri kullanılarak sekonder metabolit üretiminin ticari önemi, avantaj ve dezavantajları ...... 22 2.4.4 Bitki Doku Kültürlerinde Sekonder Metabolit Üretimini Artırmak Đçin Stratejiler ...... 23 2.4.4.1 Üretici gücü yüksek hücre hatlarının taranması ve seçilmesi ...... 23 2.4.4.2 Ortam miktarlarının ve bile enlerinin de ği tirilmesi ...... 24 2.4.4.2.1 eker miktarı ...... 24 2.4.4.2.2 Nitrat miktarı ...... 25 2.4.4.2.3 Fosfat miktarı ...... 25 2.4.4.2.4 Büyüme düzenleyiciler ...... 25 2.4.4.2.5 Öncü molekül beslemesi ...... 26 2.4.4.3 Kültür artlarının optimizasyonu ...... 26 2.4.4.3.1 Sıcaklık ...... 26 2.4.4.3.2 Aydınlatma ...... 26 2.4.4.3.3 Çalkalama ...... 27 2.4.4.4 Uyarma (Elisidasyon) ...... 27 2.4.4.5 Permeabilizasyon ...... 27 2.4.5 Bitki doku kültüründe kullanılan besin ortamları ...... 28 2.5 Gentiana L. Üzerine Yapılan Çalı malar ...... 30 2.5.1 Fitokimyasal çalı malar ...... 30
iv 2.5.1.1 Flavonoitlerle ilgili fitokimyasal çalı malar ...... 30 2.5.1.2 Đridoit ve sekoiridoitlerle ilgili fitokimyasal çalı malar ...... 31 2.5.2 Biyoaktivite çalı maları ...... 32 2.5.2.1 Flavonoitlerle ilgili biyoaktivite çalı maları ...... 32 2.5.2.2 Đridoit ve sekoiridoitlerle ilgili biyoaktivite çalı maları ...... 33 2.5.3 Doku kültürü çalı maları ...... 34 2.5.3.1 Gentiana türleri ile yapılan doku kültürü çalı maları ...... 34 2.5.3.2 Gentiana türlerinde ve Gentianaceae familyasına dahil bitkilerde yapılan sekonder metabolit üretimi çalı maları ...... 38 2.6 Gentiana olivieri Griseb. üzerine yapılan çalı malar ...... 41 2.6.1 Fitokimyasal çalı malar ...... 41 2.6.2 Biyoaktivite çalı maları ...... 42 2.6.3 Doku kültürü çalı maları ...... 43 3. MATERYAL ve YÖNTEM ...... 45 3.1 Materyal ...... 45 3.2 Yöntem ...... 45 3.2.1 Besin ortamının hazırlanması ...... 46 3.2.1.1 Stok çözeltiler ...... 46 3.2.1.1.1 Major tuz stok çözeltilerinin hazırlanması ...... 46 3.2.1.1.2. Minor tuz stok çözeltilerinin hazırlanması ...... 47 3.2.1.1.3 MS ortamı için demir stok çözeltisinin hazırlanması ...... 48 3.2.1.1.4 Vitamin stok çözeltisinin hazırlanması ...... 48 3.2.1.2 Bitki büyüme düzenleyicileri ...... 49 3.2.1.2.1 Naftalen Asetik Asit (NAA) stok çözeltisi (1 mg/ ml) ...... 49 3.2.1.2.2 Benzil Amino Purin (BAP) stok çözeltisi (1 mg/ ml) ...... 49 3.2.1.2.3 Kinetin stok çözeltisi (1 mg/ ml) ...... 50 3.2.1.3 Besin ortamlarının hazırlanması ...... 50 3.2.1.4 pH ayarı...... 51 3.2.1.5 Sterilizasyon ...... 51 3.2.1.5.1 Besin ortamının sterilizasyonu ...... 51 3.2.1.5.2 Di ğer malzemelerin sterilizasyonu ...... 52 3.2.1.5.3 Ekim odasının sterilizasyonu ...... 52 3.2.1.5.4 Tohum için yüzey sterilizasyonunun basamakları ...... 53 3.2.1.5.5 Eksplantların yüzey sterilizasyonu ...... 53 3.2.1.6 Ortamların petrilere dökülmesi ...... 53 3.2.1.7 Ortamlara yapılan ekimler ...... 54 3.2.1.7.1 Tohum çimlendirilmesi ...... 54 3.2.1.7.2. Kallus kültürü ...... 55 3.2.1.7.3 Süspansiyon kültürü ...... 57 3.2.2 G. olivieri , kallus ve süspansiyon ekstrelerinin hazırlanması ...... 58 3.2.3 Standart maddelerin hazırlanması ...... 59 3.2.4 Kallus ve süspansiyon kültürlerinde sekonder metabolit analizi ...... 59 3.2.4.1 Đnce tabaka kromatografisi ( ĐTK) ...... 59 3.2.4.2 Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC) ...... 60 3.2.5 HPLC sonuçlarının de ğerlendirilmesi ...... 61 3.2.5.1 Piklerin do ğrulu ğunun belirlenmesi ...... 61 3.2.5.2 Kalibrasyon e ğrisinin çizilmesi ...... 62 4. ARA TIRMA BULGULARI ...... 63 4.1 In vitro Çimlendirme ...... 63 4.2 Kallus Üretimi ...... 63 4.2.1 Kallusların karanlıkta inkübasyonu ...... 63 4.2.2 Kallusların aydınlıkta inkübasyonu ...... 64 4.2.3 Kütle büyüme indeksleri (KB Đ) ...... 64 4.2.3.1 Karanlık inkübasyon için KB Đ bulguları ...... 64 4.2.3.2 Aydınlık inkübasyon için KB Đ bulguları ...... 68 4.3 Süspansiyon kültürü ...... 71 4.3.1 Kütle büyüme indeksi (KB Đ), ortam ve pH miktarındaki de ği imler ...... 71 4.4 Kallus ve süspansiyon kültürlerinde sekonder metabolitlerin ara tırılması ...... 74
v 4.4.1 Kalitatif analiz ( ĐTK) ...... 74 4.4.1.1 Karanlık inkübasyonda geli en kallus kültürlerinin ĐTK’sı ...... 74 4.4.1.2. Aydınlık inkübasyonda geli en kallus kültürlerinin ĐTK’sı ...... 74 4.4.1.3 Süspansiyon kültürlerinin ĐTK’sı ...... 79 4.4.2 Kantitatif analiz (HPLC) ...... 79 4.4.2.1 Kalibrasyon e ğrisinin çizilmesi ...... 85 4.4.2.2 Kallus ekstreleri için HPLC analizi ...... 86 4.4.2.3 Süspansiyon kültüründen elde edilen hücre ekstreleri için HPLC analizi ...... 87 5. TARTI MA ve SONUÇ ...... 101 KAYNAKLAR ...... 109 ÖZGEÇM Đ ...... 122
vi KISALTMALAR DĐZĐNĐ
AEF Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Herbaryumu ANK Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Herbaryumu B5 Gamborg besin ortamı BAP Benzil Amino Purin CPPU N-(2-kloro-4-piridil)N'-fenil üre Dicamba 3,6-dikloro-o-anisik asit
GA 3 Gibberellik Asit GÜEF Gazi Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Herbaryumu 1H-NMR Proton Nükleer Manyetik Rezonans HPLC Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi HUB Hacettepe Üniversitesi Fen Fakültesi Herbaryumu HÜEF Hacettepe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Herbaryumu IAA Đndol-3- Asetik Asit ĐTK Đnce Tabaka Kromatografisi Kinetin 6-furfurilamino purin (N 6-furfuriladenin)
LD 50 Letal Doz MS (M) Murashige ve Skoog besin ortamı ½ MS Makro ve mikro tuzları yarı yarıya azaltılmı MS ortamı MS Kütle Spektrometresi MY Murashige ve Skoog ortamında yaprak eksplantından kallus kültürü NAA Naftalen-3 Asetik Asit NaOCl Sodyum hipoklorit (Çama ır suyu) NMR Nükleer Manyetik Rezonans
PCR Polimeraz Zincir Reaksiyonu Ri Agrobacterium rhizogenes bakterisinin kök olu umuna neden olan Ri plazmidi RT-PCR Ters Transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu Agrobacterium rhizogenes bakterinin tümör olu turan Ri plazmidinin bitki T-DNA hücresine aktardı ğı DNA parçası TDZ N-fenil-N'-1,2,3 tiyadiazol-5-il üre UV Ultraviyole WPM (W) Woody Plant Medium besin ortamı Zeatin 6-(4-Hidroksi-3-metilbu-2-enilamino) purin
vii EK ĐLLER D ĐZĐNĐ
ekil 2.1. a. Gentiana olivieri Griseb. (Afat) b. G. olivieri habitatı ...... 8 ekil 2.2 G. olivieri ’nin Türkiye’deki yayılı ı ...... 9 ekil 2.3. a. G. sinoornata , b. Gentian desenli tabak ve fincan, c. Đngiltere’de basılmı pul ...... 11 ekil 2.4. Ba lıca flavonoit tipleri ...... 14 ekil 2.5. Flavonoit biyosentez yolu ...... 14 ekil 2.6. Gentianaceae’de en sık rastlanan flavonoitler ...... 15 ekil 2.7. Đridoit ve sekoiridoit glikozitlerin biyosentez yolu ...... 17 ekil 2.8. Gentianaceae familyasında en çok bulunan sekoiridoit glikozitler ...... 17 ekil 2.9. Bitki hücre kültürlerinden sekonder metabolit üretiminde hücre hattı seçimi ...... 24 ekil 3.1. Gaziantep’ten aktardan satın alınmı G. olivieri herbası ...... 45 ekil 3.2. a. Gentiana olivieri Griseb. tohumları, b. Ekilen tohumların petrideki durumu ...... 55 ekil 3.3. a. Ekilen kök, b. yaprak eksplantlarının petrideki konumları ...... 56 ekil 4.1. 60 gün inkübasyon sonunda çimlenen G. olivieri fideleri ...... 63 ekil 4.2. 1.alt kültür sonunda karanlık inkübasyonla kök eksplantından olu an kalluslar ...... 65 ekil 4.3. 1.alt kültür sonunda karanlık inkübasyonla yaprak eksplantından olu an kalluslar...... 66 ekil 4.4. 1.alt kültür sonunda aydınlık inkübasyonla yaprak eksplantından olu an kalluslar...... 67 ekil 4.5. Karanlık inkübasyon yapılan kallus kültürlerinde yaprak (a) ve kök (b) eksplantlarına göre KB Đ de ğerlerindeki de ği iklikleri gösteren grafikler ...... 70 ekil 4.6. Aydınlık inkübasyon yapılan kallus kültürlerinde yaprak eksplantına göre KB Đ de ğerlerindeki de ği iklikleri gösteren grafikler ...... 71 ekil 4.7. Süspansiyon kültüründe geli en hücreler ...... 72 ekil 4.8. Süspansiyon kültüründe 25 günlük inkübasyon süresince hücre ağırlıklarındaki de ği imler ... 72 ekil 4.9. Süspansiyon kültüründe 25 günlük inkübasyon süresince ortam miktarındaki de ği imler ...... 73 ekil 4.10. Süspansiyon kültüründe 25 günlük inkübasyon süresince ortam pH’sındaki de ği imler ...... 73 ekil 4.11. WY ve WK serisinde karanlıkta inkübe edilen 3 alt kültürde üretilen sekonder metabolitlerin solvan sistemi I’de, %5’lik H2SO 4’le görünümleri ...... 76 ekil 4.12. MY ve MK serisinde karanlıkta inkübe edilen 3 alt kültürde üretilen sekonder metabolitlerin solvan sistemi I’de, %5’lik H2SO 4’le görünümleri ...... 77 ekil 4.13. a. WY, WK ve b. MY, MK serilerinde karanlıkta inkübe edilen 3 alt kültürde üretilen sekonder metabolitlerin solvan sistemi II’de, NA ile UV 366 ’da görünümleri...... 78 ekil 4.14. a. WY ve b. MY serisinde aydınlıkta inkübe edilen 3 alt kültürde üretilen sekonder metabolitlerin solvan sistemi II’de NA ile görünümleri...... 80 ekil 4.15. Süspansiyon kültüründe aydınlıkta inkübe edilerek ilk 25 günde üretilen sekonder metabolitlerin solvan sistemi II’de NA ile görünümleri...... 81 ekil 4.16. Đzoorientin’in a. program I’de ve b. program II’de verdi ği pikler ...... 82 ekil 4.17. Đzoviteksin’in a. program I’de ve b. program II’de verdi ği pikler ...... 83 ekil 4.18. G. olivieri ekstresinin a. program I’de ve b. program II’de verdi ği pikler ...... 84 ekil 4.19. Program I’de: a. Gentiopikrozit, b. Svertiamarinin verdi ği pikler ...... 85 ekil 4.20. Đzoorientin için elde edilen kalibrasyon grafi ği ve do ğru denklemi ...... 86 ekil 4.21. Đzoviteksin için elde edilen kalibrasyon grafi ği ve do ğru denklemi ...... 86 ekil 4.22. W1Y1 ortamında geli en kallus hücrelerinde a. izoorientinin ve b. izoviteksinin pik ve spektrumlarını gösteren kromatogram ...... 88 ekil 4.23. W1Y3 ortamında geli en kallus hücrelerinde a. izoorientinin ve b. izoviteksinin pik ve spektrumlarını gösteren kromatogram ...... 89 ekil 4.24. W2Y1 ortamında geli en kallus hücrelerinde a. izoorientinin ve b. izoviteksinin pik ve spektrumlarını gösteren kromatogram ...... 90 ekil 4.25. a. W3Y1 ve b. W3Y2 ortamlarında geli en kallus hücrelerinde izoviteksinin pik ve spektrumlarını gösteren kromatogram ...... 91 ekil 4.26. W2S15 ortamında geli en süspansiyon hücrelerinde a. izoorientin ve b. izoviteksinin pik ve spektrumlarını gösteren kromatogram ...... 92 ekil 4.27. W2S20 ortamında geli en süspansiyon hücrelerinde a. izoorientin ve b. izoviteksinin pik ve spektrumlarını gösteren kromatogram ...... 93 ekil 4.28. W3S10 ortamında geli en süspansiyon hücrelerinde a. izoorientin ve b. izoviteksinin pik ve spektrumlarını gösteren kromatogram ...... 94
viii ekil 4.29. W3S15 ortamında geli en süspansiyon hücrelerinde a. izoorientin ve b. izoviteksinin pik ve spektrumlarını gösteren kromatogram ...... 95 ekil 4.30. W3S20 ortamında geli en süspansiyon hücrelerinde a. izoorientin ve b. izoviteksinin pik ve spektrumlarını gösteren kromatogram ...... 96 ekil 4.31. a. W1S5 ve b. W1S10 ortamlarında geli en süspansiyon hücrelerinde izoviteksinin pik ve spektrumlarını gösteren kromatogram ...... 98 ekil 4.32. a. W1S15, b. W1S20 ortamlarında geli en süspansiyon hücrelerinde izoviteksinin pik ve spektrumlarını gösteren kromatogram ...... 99 ekil 4.33. a. W2S5, b. W2S10 ortamlarında geli en süspansiyon hücrelerinde izoviteksinin pik ve spektrumlarını gösteren kromatogram ...... 100
ix ÇĐZELGELER D ĐZĐNĐ
Çizelge 2.1. Bitki doku kültüründe en çok kullanılan temel besin ortamları ...... 29 Çizelge 2.2. Ara tırmacıların iridoit ve flavonoit yapılı bile ikleri HPLC ile kantitatif ...... 32 olarak belirlemek için kullandıkları kolon, solvan sistemi ve dedektörün dalga boyu...... 32 Çizelge 3.1. WPM ve MS ortamları için major tuz stok çözeltisi ...... 47 Çizelge 3.2. WPM ve MS ortamları için minor tuz stok çözeltisi ...... 47 Çizelge 3.3. MS ortamı için demir stok çözeltisi ...... 48 Çizelge 3.4. WPM ve MS ortamları için minor tuz stok çözeltisi ...... 48 Çizelge 3.5. Kallus ve süspansiyon kültürü için ortamlarda kullanılan büyüme düzenleyicileri ve konsantrasyonları ...... 49 Çizelge 3.6. Đzoorientin ve izoviteksin standart maddelerinin kalibrasyonu için kullanılan konsantrasyonlar ...... 62 Çizelge 4.1. Karanlık ve aydınlık inkübasyon ile üretilen kallusların kütle büyüme indeksleri-KB Đ ...... 69 Çizelge 4.2. HPLC analizi sonucunda G. olivieri ile kallus ve süspansiyon hücrelerinde bulunan Io ve Iv standart maddelerin miktarları ve yüzdeleri...... 97
x 1 . GĐRĐ
Türkiye Florası’nda kayıtlı 12 Gentiana L. (Gentianaceae) türünden birisi olan Gentiana olivieri Griseb., 10-30 cm. boyunda gövdeye sahip, çok yıllık, otsu bir bitkidir (Davis 1978). Ülkemizde Đç Anadolu, Orta Karadeniz, Do ğu ve Güneydo ğu Anadolu bölgelerinde sınırlı alanlarda yeti en bu bitki Gaziantep civarında, halk arasında “Afat” olarak bilinmektedir.
Gentianaceae’ye dahil birçok bitki, özellikle Uzak Do ğu ülkelerinde eski zamanlardan beri halk arasında çe itli hastalıkları tedavi etmek için kullanılmaktadır. Çin halk tıbbında G. macrophylla, G. tibetica, G. crassicaulis, G. dahurica ’dan elde edilen preparatlar günümüzde de hazırlanıp pazarlanmaktadır. Bu preparatlar hepatit, konstipasyon (peklik), romatizma, a ğrı, hipertansiyon ve mikrobiyal enfeksiyonların tedavisinde oldukça sık kullanılmaktadır (Tan vd. 1998). G. scabra kökleri ise ensefalitis B, i tahsızlık, mantar enfeksiyonu ve enflamasyonda kullanılmaktadır (Edis 2003, Yang 2001). Yurdumuzda do ğal olarak yeti en G. lutea (sarı centiyan, centiyane)’nın i tah açıcı ve sindirime yardımcı etkisi bilinmektedir. Đçerdi ği acı sekoiridoit glikozitlerden dolayı bu bitki, sinir uçlarını uyararak salgıları artırır ve i tahı açar. Antipiretik (ate dü ürücü) ve yara iyile tirici etkisinin yanında antianemik etkisinin oldu ğu da tespit edilmi tir (Edis 2003).
Gaziantep yöresinde G. olivieri ’nin ise çiçekli toprak üstü kısımları kan ekerini düzenleyici (Ba er vd. 1986, Aslan 2000), ate dü ürücü, i tah açıcı ve sakinle tirici olarak kullanılmaktadır (Baytop 1984, Ersöz ve Çalı 1991). Özbekistan’da da diyare, so ğuk algınlı ğı, mide a ğrısı tedavisinde ve yara iyile tirici olarak kullanıldı ğı bildirilmi tir (Honda 1999). Ayrıca alyuvar sayısını artırıcı özelli ğinden dolayı kansızlık (anemi) tedavisinde de kullanılmaktadır (Ba er vd. 1986). G. olivieri ’nin sulu ekstresiyle yapılan bir çalı mada, sekoiridoit fraksiyonunun antikonvülsan ve antidepresan oldu ğu tespit edilmi tir (Ersöz ve Çalı 1991). Ayrıca G. olivieri ’nin çiçekleri Pakistan’da “Bangero” olarak bilinmekte ve çe itli medikal problemler için kullanılmaktadır (Edis 2003).
1 Gentiana türleri üzerinde yapılan çalı malarla sekoiridoit, iridoit, flavonoit, terpenoit, ksanton, alkaloit gibi bile iklerin bulundu ğu belirlenmi tir (Ersöz 1988, Jensen ve Schripsema 2002). Ersöz (1988) yaptı ğı çalı mada G. olivieri ’de ksantonların bulunmadı ğını buna kar ın sekoiridoit glikozit olan triflorozit, sverozit, svertiamarin ve gentiopikrozitin; iridoit heteroziti olan loganik asitin; flavon C-heteroziti olan izoorientin ve orientin türevlerinin varlı ğını tespit etmi tir. Bu bile iklerden bitkiye acı tadını veren iridoit ve sekoiridoitlerin i tah açıcı oldu ğu bilinmektedir. Ayrıca yüksek ate i dü ürmede, antikolinerjik ve antihepatotoksik olarak sıklıkla kullanılmaktadır ( ener ve Toker 1986, Bilalo ğlu ve Harmandar 1999, Aslan 2000, Deliorman Orhan vd. 2003).
Günümüzde insan sa ğlı ğı açısından flavonoitlerin oldukça önemli oldu ğu yapılan çalı malarda kanıtlanmı tır. Flavonoitlerin düz kaslar, gastrointestinal ve ürogenital sistem üzerinde spazmolitik aktiviteye sahip oldu ğu bunların yanında diüretik, antimutajenik, antitümoral, antimikrobiyal, antidepresan, antianemik ve östrajenik aktivitelerinin var oldu ğu belirlenmi tir ( ener ve Toker 1986, Bilalo ğlu ve Harmandar 1999). G. oliveri ’nin metanollü ekstresinin yüksek antidiyabetik aktivite gösterdi ği tespit edilmi , aktiviteden sorumlu olan maddenin bir flavon C- heteroziti olan izoorientin oldu ğu belirlenmi tir (Aslan 2000). Ayrıca Aktay vd. (2000)’nin yaptıkları çalı mada G. olivieri ekstraktının hepatoprotektif oldu ğunu kanıtlamı lardır.
Birçok Gentiana türü dünyanın çe itli yerlerinde kesme ve saksı çiçe ği olarak satılmaktadır. Gösteri li çiçeklere sahip olan bu bitkilerin soyları, süs bitkisi ve ilaç olarak do ğadan a ırı toplanma nedeniyle, tükenme tehlikesiyle kar ı kar ıyadır. Bu nedenle de bazı Gentiana türlerinin birçok Avrupa ülkesinde do ğadan toplanması ve satılması yasaklanmı tır. Ülkemizde de G. lutea , ihracatı yasaklanan 18 bitki türünden birisidir (http://www.tarim.gov.tr/mevzuat/teblig/dogal_ciceksoganlarinin_2006_yiliihracat_listesihakkinda_teblig.doc). Ayrıca bu bitki Türkiye Bitkileri Kırmızı Kitabı’nda da EN kategorisindedir (Ekim vd. 2000).
2 Gentianaceae familyasına ait bitkilerde, bitki biyoteknolojisini kullanarak yapılan çalı ma sayısı oldukça fazladır. Yapılan çalı malar daha çok, nesli tehlike altında olan bu türlerin ço ğaltılması üzerinedir. Momcilovic vd. (1997), G. lutea, G. cruciata, G. purpurea ve G. acaulis ’te, Morgan vd. (1997) G. cerina ve G. corymbifera ’da kallustan; Bach and Pawlowska (2003), G. pneumonanthe ’de somatik embriyogenezle; Takahata and Jomori (1989), G. scabra ’nın mezofil protoplastlarından protoplast kültürüyle; Hosokawa vd. (1998), G. triflora X G. scabra hibridinde süspansiyon kültürüyle mikroço ğaltım çalı malarını ba armı lardır.
Bitkide bulunan biyoaktif bile iklerin ara tırılmasıyla ilgili çok fazla sayıda çalı ma vardır. Bu çalı malarda, do ğadan toplanan bitkiler çe itli yöntemlerle ekstre edilip, standart maddeler varlı ğında kar ıla tırmalı olarak kimyasal analizler yapılmı ve miktarları bulunmu tur. Arino vd. (1997) G. lutea köklerinden; Takeda vd. (1999) G. olivieri ’den; Liang vd. (2007) G. scabra ’dan çe itli sekonder metabolitleri izole edip, miktarlarını belirlemi lerdir. Bu tip çalı malar sayesinde yeni biyoaktif sekonder metabolitler ke fedilmektedir.
Yapılan çalı malardan birisi de bitki doku kültürü teknikleriyle biyoaktif bile iklerin üretilmesidir. Bitkilerde sekonder metabolit olarak üretilen bu bile ikler kallus, hücre süspansiyon kültürleriyle ve geni çapta biyoreaktörlerle üretilebilmektedir. Gentiana türleri için bu tip çalı malar çok yaygın de ğildir fakat sekonder metabolitlerin öneminin anla ılmasıyla günümüzde hız kazanmı tır. Bu yolla üretimi en çok yapılan grup iridoitlerdir. Hosokawa vd. (1998), süspansiyon kültüründe, Menkovic vd. (2000a) ve Tiwari vd. (2007) ise gen aktarılarak elde edilen saçak köklerde iridoitleri analiz etmi ler ve sonuçlara göre doku kültürü yönteminin iridoit üretimi için avantajlı oldu ğunu vurgulamı lardır.
Đçerdi ği sekonder metabolitlerden dolayı G. olivieri ’nin ilaç sanayiinde kullanım potansiyeli yüksektir. Tıbbi bir bitki olması nedeniyle ekonomik öneme sahip olan bu bitki, Türkiye’nin ilaç sanayiine katkısı bakımından de ğerlendirilmesi gereken bir bitkidir. Yüksek lisans çalı mamızda biyoaktif sekonder metabolitler açısından zengin
3 oldu ğu bilinen G. olivieri bitkisinde doku kültürü ile kallus elde edilmi tir (Ya ğcı 2005). Bu çalı mada ise G. olivieri tohumları in vitro çimlendirildi; elde edilen bitkiciklerden eksplantlar alınarak farklı bitki büyüme düzenleyicileri içeren besin ortamları kullanıldı ve kallus dokusu üretildi. Devamında ise kallus veriminin artırılması, kalluslardan süspansiyon kültürleri kurulması ve bu yolla üretilen kallus ile süspansiyon kültürlerindeki bazı biyoaktif özellikteki sekonder metabolitlerin varlı ğının standart maddelerle kar ıla tırılarak tespit edilmesi amaçlandı.
4 2 . KAYNAK ÖZETLER Đ
2.1 Gentianaceae Familyası ve G. olivieri ile Đlgili Sistematik Bilgiler
2.1.1 Gentianaceae familyası
Ço ğu ılıman bölgelerde yeti en, genellikle tüysüz, bir veya çok yıllık otsu bitkilerdir. Yaprakları tam, kar ılıklı veya alternat dizili li, sapsızdır. Çiçekler erdi i, aktinomorftur. Kaliks 4-5 parçalı, gamosepaldir. Korolla 4-5 parçalı, gamopetaldir. Stamen sayısı petal adedi kadar ve korolla loplarının önündedir. Ovaryum üst durumlu, 2 karpelli, bir gözlü, çok ovüllü, plasentalanma paryetal-marginaldir. Stilus tek veya yoktur. Stigma genellikle 2 lopludur. Meyve 2 gözlü septisit kapsüldür. Dünyada hemen her bölgeye yayılmı 70 cins, 800 kadar türü; Türkiye’de ise 7 cinsi, 80’e yakın türü bulunmaktadır (Davis 1978).
2.1.2 Gentiana L. cinsi
Çok yıllık (nadiren tek yıllık) otsu, bazen az çok dallanmı ve yere yatık, bazen etli bir rizomdan çıkmı bir veya birkaç dal ta ıyan bitkilerdir. Çiçekler 4-5 (-9)- parçalıdır. Kaliks az çok derin parçalı, loplar kısmen bir iç zar ile birle mi tir. Korolla fazla derin olmayan bir ekilden huni ekline kadar de ği en biçimlerde; soluk ve menek e-mavi, sarı veya krem rengindedir (nadiren beyaz). Genellikle ana loplar ile alternat durumda küçük loplar vardır. Korolla bo ğazı içte, tüysüzdür. Anterler bazifikstir. Ovaryum üste gittikçe incelen kısa bir stilus ile sonlanır veya stilus hiç yoktur. Stigma 2, kalıcıdır. Ovaryum tabanında nektaryum bulunur. Meyve kapsül, eliptikten oblonga kadar de ği en ekillerde, saplı veya sapsızdır (Davis 1978).
Gentiana cinsinin Türkiye Florası’nda kayıtlı 12 türü vardır: G. lutea L. , G. asclepiadea L. , G. cruciata L. , G. olivieri Griseb. , G. aquatica L. , G. pyrenaica L. , G. septemfida Pallas , G. boissieri Schott & Kotschy ex Boiss ., G. gelida Bieb. , G. verna L., G. brachyphylla Vill. , G. nivalis L. (Davis 1978).
5 2.1.3 Türkiye’de yayılı gösteren Gentiana türlerinin te his anahtarı (Davis 1978)
1. Taban yaprakları çok büyük (40x25 cm): korolla yarısından fazla bölünmü , açık sarı...... lutea 1. Taban yaprakları 15x3 cm (ço ğunlukla daha küçük): korolla ½’ den daha az bölünmü ; beyaz, soluk sarı, mavi veya menek e. 2. Dallar uzun, genellikle 30 cm’den uzun, çiçekler yaprakların koltuklarında. 3. Yapraklar akut, çiçekler 5 parçalı, anterler tabanda birle mi ...... asclepideae 3. Yapraklar obtus, çiçekler 4 parçalı, anterler serbest ...... cruciata 2. Dallar kısa, genellikle 30 cm’den daha kısa, çiçekler terminal veya terminal ve lateral. 4. Tek yıllık bitkiler. 5. Korolla soluk mavi, loplar obtus, meyve kapsula, saplı ...... aquatica 5. Korolla parlak mavi, loplar akut, meyve kapsula, sapsız ...... nivalis 4. Çok yıllık bitkiler. 6. Rizomun üst kısmı lifli bir kılıfla kaplı, gövde dik,10-40 cm ...... olivieri 6. Rizomun üst kısmı lifli bir kılıfla kaplı de ğil, gövde genellikle yere yatık veya 10 cm’den kısa 7. Korolla soluk sarı...... gelida 7. Korolla mavi (nadiren beyaz), 8. Çiçekler 3 veya daha fazla sayıda, terminal durumda; gövde basit bir yapıda...... septemfida 8. Çiçekler genellikle tek tek; gövde basit veya dallı 9. Çiçekli gövde 11 veya daha fazla sayıda internodyuma sahip, gövde basit, yere yatık...... boissieri 9. Çiçekli gövde 11’den az sayıda internodyuma sahip, gövde genellikle tabanda çok dallanmı .
6 10. Korollanın 2. lopları yakla ık ana loplar kadar, korolla 10- parçalı; internodyumlar hemen hemen e it uzunlukta...... pyreniaca 10. Đkincil loplar ufak, genellikle ana lopların yarısı kadar, nodusların arası çiçeklenmeden sonra açılır. 11. Rozet yaprakların en uzun olanları gövdedeki yapraklardan çok daha uzun, korolla 20-28 mm veya daha uzun...... verna 11. Rozet yapraklar yakla ık gövde yaprakları kadar, korollanın boyu 20 mm’den kısa...... brachyphylla
2.1.4 Gentiana olivieri Grisebach
2.1.4.1 Sistematik bilgileri
Gentiana cinsine ait olan G. olivieri Griseb., Gentianaceae familyasındadır. Bu familya ise Asteridae subclasisine dahil olan Gentianales ordosunda bulunmaktadır (http://plants.usda.gov/java/ClassificationServlet?source=display&classid=GENTI).
2.1.4.2 Genel özellikleri ve habitatı
10-30 (-40) cm boyunda, 1-3 dik çiçekli gövdeli, yaprakları tabandaki rozetten çıkan, çok yıllık, otsu bir bitkidir. Rizomun üst kısmı tüylü bir koruyucu kılıf ile örtülmü tür. Đnternodyum sayısı azdır, en yukarıdaki gövde yapraklarını geçer. Rozet yapraklar, 15 cm uzunlukta, oblanseolat, obtus veya subakuttur. Gövde üzerindeki yapraklar 6 cm’ye kadar, lanseolat, perfoliat ve gövdeyi bir kılıf gibi sarmı ekildedir. Çiçekler (-1) 3-10 arasında olup, terminal, 5 parçalıdır. Kaliks 12-15 mm, yarısına kadar bölünmü tür. Korolla mavi, iç kısmı 20-30 mm, beyazımsı, 1/3’üne kadar bölünmü , ikincil loplar birincil lopların yarısı kadardır. Meyve kapsül, stilusa do ğru gittikçe incelir, kısa saplıdır. Çiçeklenme devresi Nisan-Temmuz ayları arasıdır ve kireçli topraklardaki çimenliklerde bulunur ( ekil 2.1). 350-2300 m arasındaki yüksekliklerde yeti ir (Davis 1978).
7
ekil 2.1. a. Gentiana olivieri Griseb. (Afat) b. G. olivieri habitatı (Foto ğraf, Prof. Dr. A. Selçuk Ertekin tarafından çekilmi tir)
2.1.4.3 Türkiye’deki yayılı ı
Gentianaceae familyasının Gentiana cinsine dahil bir tür olan Gentiana olivieri Griseb. Türkiye, Kuzey Irak, Đran (güneyi hariç), Afganistan, Orta Asya’da Tian Shan’a kadar yayılım gösteren bir bitkidir (Davis 1978). Türkiye’deki yayılı alanları:
A4: Çankırı: Ilgaz Da ğı, 1800 m, W. Kotte (ANK 1934), Çankırı: Ilgaz Da ğı, 1800 m (Davis 1978) A6: Tokat: Almus- Niksar arası, 700 m (Davis 1978) A9: Kars: Sarıkamı - Karakurt arası, sarıçam ormanı, Kelkit Deresi mevkii, 1800-1900 m, O. Güne (HUB 1240) B6: Sivas: Hafik- Zara arası, 1120 m (Davis 1978), Sivas: Zara-Đmranlı yolu, 5-8. km, yamaçlarda, 1400 m, M. Koyuncu (AEF) B8: Erzurum: Erzurum-A kale arası, 1500 m (Davis 1978) B9: Bitlis: Pelli, 2200 m (Davis 1978), Bitlis: 7 km güneyi, Seyitova Köyü çevresi, 1500 m, A. Engin (ANK 2707), Van: Tatvan- Sorgun, Van Gölü üstü, Quercus infectoria çalılı ğı, volkanik taban, 1650-1750 m, H. Pe men (HUB)
8 C6: Gaziantep: Birecik yakınları (Davis 1978), Gaziantep: Nizip’ten 36 km, 600 m, Davis- Hedge (ANK 1957), Gaziantep: Kertü e Köyü, T. Ersöz, Đ. Çalı (HÜEF 87- 1231), Gaziantep: Araban Yolu, 15. km, M. Aslan (GÜEF 99G001). C7: anlıurfa: anlıurfa’nın 5 km batısı, 800 m (Davis 1978) C8: Siirt: Siirt’ten Eruh’a do ğru, 500 m (Davis 1978) C9: Mardin: Cizre’den 9 km ileride, 350 m (Davis 1978), Mardin: 19. km, kalker kayaları, 930 m, Huber-Morath (ANK 86) C10: Hakkari: Sat Da ğları, Yüksekova’dan Varagöz’e do ğru, 2150 m (Davis 1978) ( ekil 2.2).
ekil 2.2 G. olivieri ’nin Türkiye’deki yayılı ı (Davis 1978)
2.1.4.4 Sinonim ve yerel isimleri
Gentiana regeliana Gandoger., G. weschniakowii Regel., Tretorhiza olivieri (Griseb.) Sojak. G. olivieri, Türkiye’de Gaziantep yöresinde “Afat”, Çin’de ise “xie wan que qin jiao” (http://www.efloras.org/florataxon.aspx?flora_id=2&taxon_id=113422 ), Pakistan’da ise “Bangero” ismi ile tanınmaktadır (Edis 2003).
2.2 Gentiana L.’nin Kullanım Alanları
Đçerdikleri flavon C-heterozitler ve sekoiridoit glikozitler nedeniyle Gentiana cinsi, halk tıbbında sıklıkla kullanılmaktadır. Gentiana cinsine ait türlerden bazıları Uzak Do ğu ba ta olmak üzere birçok ülkede yüzyıllardan beri bilinmekte ve çe itli bitkisel
9 preparatların içeri ğinde bulunmaktadır. Çin halk tıbbında G. macrophylla kökleri ve di ğer Gentiana türlerinden ( G. tibetica, G. crassicaulis, G. dahurica ) elde edilen ve “Qinjiao (Chin-chiu)” olarak adlandırılan ilaç, hepatit, konstipasyon (peklik), romatizma, a ğrı, hipertansiyon, fungal ve bakteriyal enfeksiyonların tedavisinde oldukça sık kullanılmaktadır (Tan vd. 1998). G. scabra kökleri de “Longdan (Long- Dan-Cao)” olarak bilinmekte ve geleneksel Çin ilacı olarak sıklıkla ensefalitis B, i tahsızlık, mantar enfeksiyonu ve inflamasyonda kullanılmaktadır (Edis 2003, Yang 2001).
Yurdumuzda halk arasında i tah açıcı ve sindirime yardımcı karı ımların içeri ğinde kullanılan ve aktarlarda satılan Gentian türü G. lutea (sarı centiyan, centiyane)’dır. Bu bitkinin sonbaharda toplanıp güne te kurutulmu kök ve rizomları, içerdi ği acı sekoiridoit glikozitlerden dolayı halk tıbbında çok eskiden beri kullanılmaktadır. Bu acı ilaç, sinir uçlarını uyararak salgıları artırır ve i tahı açar. Eskiden ate dü ürücü olarak da kullanılmı , haricen yara iyile tirici olarak da kullanılmaktadır. Bunların yanında alyuvarları artırıcı etkisi oldu ğu da tespit edilmi tir (Edis 2003).
Gösteri li çiçeklere sahip olan Gentian’lar, tıbbi kullanımlarının dı ında özellikle Uzakdo ğu, Avrupa ve Amerika’da kesme ve saksı çiçe ği olarak satılmaktadır. Ayrıca içeceklere acı aromanın verilmesinde kullanılmasının yanı sıra parfüm ve tonik gibi kozmetik malzemelerinin içinde de yer almaktadır. Çiçeklerinin güzelli ği nedeniyle birçok air ve yazar için ilham kayna ğı olmu , birçok kurulu un isim ve logosunda kullanılmı ve birçok e yaya da (pul, nakı i lemesi gibi) tema olu turmu lardır (http://gentian.rutgers.edu/ethno.htm) ( ekil 2.3).
10
ekil 2.3. a. G. sinoornata , b. Gentian desenli tabak ve fincan, c. Đngiltere’de basılmı pul (http://alpineenthusiast.blogspot.com/, http://www.gimex.de/www_site/produktgrafx/enzian_detail1.jpg, http://gentian.rutgers.edu/ethno_stamps.htm#GENTIANA%20stamps)
2.2.1 Gentiana olivieri ’nin kullanım alanları
Türkiye’de Do ğu ve Güneydo ğu Anadolu’da “Afat” isimiyle bilinen G. olivieri ’nin çiçekli toprak üstü kısımları halk arasında kan ekerini düzenleyici (Ba er vd. 1986, Aslan 2000), ate dü ürücü, i tah açıcı ve sakinle tirici olarak kullanılmaktadır (Baytop 1984, Ersöz ve Çalı 1991). Özbekistan’da da diyare, so ğuk algınlı ğı, mide a ğrısı tedavisinde ve yara iyile tirici olarak kullanıldı ğı bildirilmektedir (Honda 1999). Ayrıca alyuvar sayısını artırıcı özelli ğinden dolayı kansızlık (anemi) tedavisinde de kullanılmaktadır (Ba er vd. 1986). G. olivieri ’nin sulu ekstresiyle yapılan bir çalı mada, sekoiridoit fraksiyonunun anti konvülsan (kas gev etici, sakinle tirici) ve antidepresan (sakinle tirici) oldu ğu tespit edilmi tir (Ersöz ve Çalı 1991).
Sekoiridoit glikozitlerin tümör nekrozis faktör üretimini inhibe ederek hepatite kar ı koruyucu oldu ğu bilinmektedir. Ayrıca tatlarının acı olması nedeniyle sinir uçlarını uyararak mide salgısını artırırlar. Bu etkisinden dolayı sindirim güçlü ğü, mide ek imesi ve peklik tedavisinde kullanılır. Yani sekoiridoit glikozitler gastrointestinal sistemde sindirime yardımcı olan maddelerdir (Tan vd. 1998, Takeda vd. 1999).
2.3 Gentiana L.’de Bulunan Biyoaktif Özellikteki Bile ikler
Gentiana türlerinde major olarak bulunan iridoit ve sekoiridoit yapısındaki bile iklerin bitkinin toprak altı (Arino vd. 1997, Carnat vd. 2005, Jiang vd. 2010), toprak üstü
11 kısımlarından (Ersöz ve Çalı 1991) veya tüm bitkiden (Takeda vd. 1999) izole edildi ği bilinmektedir. Gentiana türlerinden en çok izole edilen sekoiridoit yapılı bile ikler gentiopikrozit, svertiamarin, sverozit ve bunların türevleridir.
Geçmi yıllarda Gentiana türlerinde C-glikozil flavonların (flavon C-heterozitler) varlı ğı da yapılan birçok çalı mayla gösterilmi tir (Ersöz 1988, Kuo vd. 1996, Lin vd. 1997, Ko vd. 1998). Günümüzde yeni flavonoitler bulunmakta ve bunların biyoaktif özellikleri ara tırılmaktadır (Sezik vd. 2005, Petrovic vd. 2008). Gentiana türlerinde flavonoit yapılı bile ikler çe itlilik göstermektedir. Flavon C-heterozitlerinin yanında O- heterozitleri de bulunabilmektedir (Ersöz 1988). Bulunan bile ikler genellikle luteolinden türevlenen bile iklerdir. Ersöz (1988) ve Aslan (2000)’ın yaptıkları tez çalı malarında G. olivieri ’deki flavonoitlerin izoorientin (homoorientin) ile izoviteksin ve bunların türevleri oldu ğunu bulmu lardır.
Jensen ve Schripsema (2002) çalı malarında iridoit ve sekoiridoitlerin familyada ortak bile ik oldu ğunu buna kar ın ksantonların seksiyonlar arasında farklılıklar gösterdi ğini bildirmi lerdir. Szücs vd. (2002) yaptıkları çalı mada bunu desteklemi ve Pneumonanthe seksiyonuna dahil G. pneumonanthe ve G. asclepiadea ile Gentiana seksiyonunda olan G. lutea ’da ksanton yapısındaki gentisin ve gentiozit izomerlerini tespit ederlerken, Cruciata seksiyonunda bulunan G. cruciata ’da ksanton yapılı bile iklere rastlamamı lardır. G. olivieri ’de de ksanton bulunmadı ğı Ersöz (1988) tarafından belirtilmi tir.
Gentiana türlerinde yapılan çalı malarda alkaloitlerin varlı ğı da gösterilmi tir (Samatov vd. 1967, Rakhmatullaev ve Yunusov 1972). Popov vd. (1988) ise yaptıkları çalı mada alkaloitlerin gentiopikrozit ve svertiamarinden olu tu ğunu göstermi lerdir. Mansoor (1996) doktora tez çalı masında G. olivieri ’deki alkaloitleri izole etmi tir. Tezindeki yöntemle izole etti ği alkaloitlerin antibakteriyal ve antifungal aktiviteleri (Mansoor vd. 1999) ile antihipertansif etkisini ara tırmı tır (Mansoor vd. 2004).
12 G. olivieri , major olarak iridoit, sekoiridoit glikozitleri ve flavonoitleri içerdi ği için (Jensen ve Schripsema 2002, Edis 2003) bu tez çalı masında bu gruplar üzerinde ara tırma yapıldı.
2.3.1 Flavon C-heterozitler (C- Glikozil flavonoitler)
2.3.1.1 Flavon C-heterozitlerin genel özellikleri ve biyosentez yolları
Flavonoitler ikimat-asetat yolu ile fenilalaninden olu an fenolik yapıda bile iklerdir. Fenilalanin, sinnamik asite ve daha sonra okside olarak p-kumarik asite dönü ür. p- kumarik asit, 3 asetat ünitesiyle kondensasyona u ğrayarak A halkasını olu turup, tetrahidrokalkona dönü ecek olan ilk ara ürünün olu masını sa ğlar. Di ğer kapalı halka yapısı (C halkası) olu tu ğunda bir flavonon olan naringenin meydana gelir. Bundan sonra flavonlar arasında de ği ik formlar olu ur; flavon (viteksin, izoviteksin, orientin, izoorientin); izoflavon (daidzein, genistein); flavonol (kemferol), dihidroflavonol (dihidrokemferol) (Crozier vd. 2000) ( ekil 2.4-2.5). Jensen ve Schripsema (2002) yaptıkları derlemede, Fujita ve Inoue (1979)’nun radyoaktif etiketleme yöntemi kullanarak izoviteksinin, içlerinde izoorientinin de bulundu ğu flavonoitlerden bir grubun öncü maddesi oldu ğunu gösterdiklerinden bahsetmi tir.
13
ekil 2.4. Ba lıca flavonoit tipleri (Crozier vd. 2000)
ekil 2.5. Flavonoit biyosentez yolu (Jensen ve Schripsema (2002)’den Türkçele tirilerek alınmı tır)
Gentiana türlerinden çok sayıda flavonoit bile iği izole edilmi tir. Bu bile iklerden büyük bir kısmı flavon C-heteroziti yapısındadır (Ersöz 1988, Edis 2003). Bunlar, flavonoitlerin 6 veya 8. C atomuna veya her ikisine C-C ba ğı ile eker ba ğlanması ile olu ur. Bu bile iklere en fazla Leguminosae, Gramineae, Gentianaceae, Compositae ve Labitae familyalarında rastlanır. Flavon C-heterozitler, bitkinin kökü dı ında bütün kısımlarında, yaprak, çiçek, gövde, kabuk, odununda ve genellikle uygun O-heterozitleri ile beraber bulunurlar (Edis 2003). Gentianaceae’de en sık rastlanan orientin, viteksin, izoorientin ve izoviteksinin formülleri ekil 2.6’daki gibidir.
14
ekil 2.6. Gentianaceae’de en sık rastlanan flavonoitler
2.3.1.2 Flavon C-heterozitlerin biyolojik aktivite ve kullanım alanları
Flavonoitler, bitkilerde, özellikle çiçeklerdeki renklenmeyi sağlayan sekonder bile iklerdir. Çe itli flavonoitlerin polar oksin ta ınmasını negatif yönde etkiledi ği, ayrıca Arabidopsis polenlerinde yapılan çalı malarda polen çimlenmesini artırıcı etkiye sahip oldukları kanıtlanmı tır. Bunlara ek olarak flavonoitlerin mikroorganizma ve böcek saldırılarına kar ı koruyucu etkiye sahip oldu ğu da belirtilmi tir. Genellikle yaprak, çiçek ve tomurcuklarında bulunan flavonoitlerin bitkide oksidasyon-redüksiyon olaylarına katıldı ğı ve büyümede rol oynadıkları bilinmektedir ( ener ve Toker 1986, Taylor ve Grotewold 2005).
Flavonoitlerin, süperoksit ve hidroksil radikallerini ortadan kaldırarak antioksidan etki gösterdi ği bilinmektedir. Flavonoitlerin düz kaslar, gastrointestinal ve ürogenital sistem üzerinde spazmolitik aktiviteye sahip oldu ğu, aynı zamanda damar geni letici etkileri nedeniyle de kardiyovasküler sistem üzerinde etkili oldukları bildirilmi tir. Flavonoitlerin antibakteriyal, antitümoral, antiviral; izoflavonoitlerin ise fitoöstrojenik aktivitelerinin oldu ğu bildirilmi tir ( ener ve Toker 1986, Bilalo ğlu ve Harmandar 1999).
15 Flavonoitlerin epinefrin metabolizması üzerine etki etti ği ve C vitamininin etkisini uzatarak kapiller çeperinin direncini artırdı ğı ve permeabiliteyi azalttı ğı da bulunmu tur. Flavonoitlerin diüretik etkiye sahip oldu ğu uzun yıllardır bilinmekte ve bu etkinin permeabiliteyi azaltmak suretiyle oldu ğu ileri sürülmektedir ( ener ve Toker 1986).
2.3.2 Đridoit ve sekoiridoit glikozitler
2.3.2.1 Đridoit ve sekoiridoit glikozitlerin genel özellikleri ve biyosentez yolları
Siklopentanoid monoterpen türevi olan ve mevalonik asitten (MVA) bir dizi biyosentetik mekanizma ile olu an iridoitler; iridoit glikozitler, basit iridoitler (non- glikozidik iridoitler), sekoiridoitler ve bisiridoitler olarak dört gruba ayrılabilir (Bianco 1994, Jensen ve Schripsema 2002) ( ekil 2.7). Đridoitlerin yapısındaki siklopentan halkanın bozulmasıyla sekoiridoitler, piran halkasının bozulmasıyla iridoit türevleri olu ur (Dinda vd. 2007). Đridoitler bitkilerde genellikle suda çözünebilen glikozitler eklinde bulunur. Bu familya için karbosiklik iridoitlerin neredeyse tümü sekoiridiotlerin öncü molekülü loganinden türevlenmi tir.
Iridomirmex cinsi karıncaların savunma mekanizmalarında yer alan iridoidal, iridomirmesin gibi bile iklerin izolasyonu ile isim kazanmı tır. Đridoitler, böcekler dı ında bitkiler aleminde Angiospermlerde tespit edilmi tir. Angiospermlere dahil her türlü bitkide bulunabilen yaygın bile iklerdendir (Seigler 1999). Gentianaceae familyasında en çok bulunan sekoiridoit glikozitler; gentiopikrozit, svertiamarin ve sverozittir (Ersöz 1988, Jensen ve Schripsema 2002), ( ekil 2.8).
16
ekil 2.7. Đridoit ve sekoiridoit glikozitlerin biyosentez yolu (MVA-Mevalonik asit) (Jensen ve Schripsema (2002)’den Türkçele tirilerek alınmı tır)
ekil 2.8. Gentianaceae familyasında en çok bulunan sekoiridoit glikozitler
17 2.3.2.2 Đridoit ve sekoiridoit glikozitlerin biyolojik aktivite ve kullanım alanları
Gentianaceae familyasındaki bitkiler içerdikleri iridoit ve sekoiridoit yapısındaki bile ikler nedeniyle “acı” olarak bilinmektedirler. Acı tadlarından dolayı tükrük ve mide salgıları ba ta olmak üzere vücuttaki salgıları artırırlar. Bu nedenle özellikle Uzakdo ğu ülkelerinde toniklerin içine katılarak i tah açıcı, mide rahatsızlıklarını giderici ve konstipasyon (peklik) tedavisine yardımcı olarak kullanılırlar (Tan vd. 1998, Jensen ve Schripsema 2002). Đridoidal bile ikler acı içeceklerin yapımında da kullanılmaktadırlar (Carnat vd. 2005). Yine acı tadlarından dolayı, do ğada birçok canlının, bitkiyi yiyememesi nedeniyle antifidant (normal yeme davranı ını engelleyen) etkiye de sahiplerdir (Seigler 1999).
Tundis vd. (2008) yaptıkları mini-derlemede, iridoit ve sekoiridoit yapısındaki bile iklerin serbest radikallerin olu umunu inhibe ederek nöroprotektif ve antioksidan etkiye sahip olduklarını belirtmi ler; antikanser, anti-enflamatuvar 1, kardiyovasküler 2, antihepatotoksik 3, koleretik 4, hipoglisemik, hipolipidemik, antispasmodik (spazmolitik) 5, antiviral, antimikrobiyal, immünomodulatör, antialerjik, anti-lejmanyal 6 ve mollussisidal 7 özellikleri oldu ğuna dair yapılan çalı maları irdelemi lerdir.
2.4 Doku Kültürü ile Đlgili Genel Bilgiler
Bitki doku kültürü, apikal meristem ve mezofil gibi dokuların; kök, gövde ve yaprak gibi organların; meristematik hücreler, kallus hücreleri gibi hücre ve hücre kısımlarının bitkiden ayrılarak steril ko ullarda (aseptik) yapay besin ortamları üstünde in vitro olarak yeti tirilmesi ve bunlardan olu an de ği ime açık hücre ve dokulardan (kallus)
1 Enflamasyon yani iltihaplanmayı azaltarak a ğrıyı azaltıcı yapıdaki maddeler 2 Kan dola ımını kolayla tırıcı etkiye sahip olan maddeler 3 Karaci ğerde toksik etki yaratabilecek maddeleri önleyen maddeler 4 Safra uyarıcı maddeler 5 Spazm baskılayıcı maddeler 6 Lejyoner hastalı ğını önleyici maddeler 7 Mollusk (deniz omurgasızları) öldüren ajanlar
18 yeni bitkilerin yani klonların ya da bitkisel ürünlerin (primer ve sekonder metabolitler) elde edilmesidir.
Bitki doku kültürü çalı malarında bitkiden ayrılarak ortama koyulan parçaya eksplant denir. Eksplant, küçük bir bitki olabilece ği gibi organ, embriyo, tek hücre ve hatta çeperi kaldırılmı hücre (çıplak hücre, protoplast) kadar küçük olabilir. Önemli olan eksplanttaki hücrelerde totipotensi yetene ğinin bulunmasıdır. Totipotensi ise zigotta görülen ve mitoz bölünmelerle somatik hücrelere geçen tam bir bitki olu turma özelli ğidir.
2.4.1 Bitki doku kültürünün uygulama alanları
Bitki doku kültürü, bitki biyoteknolojisi ve bitki genetik mühendisli ğinde kullanılan temel ara tırma metotları arasında yer alır (Kyte 1987, Babao ğlu vd. 2001). Bitki doku ve hücre kültürünün bitki ıslahında, (türler arası melezlemelerden sonra) embriyo kültürü, haploid bitki üretiminde anter (polen) ve yumurtalık (ovül) kültürü, somaklonal varyasyon, in vitro seleksiyon, in vitro döllenme, in vitro germplazm muhafazası, somatik hücre melezlemesi (protoplast füzyonu), gen transferi gibi uygulama alanları vardır. Bitki ıslahı dı ında ise hastalıksız bitki elde edilmesinde meristem kültürü, mikroço ğaltım, sentetik tohum üretimi (somatik embriyolar), sekonder metabolit üretimi (kallus-hücre süspansiyonları) gibi alanlarda uygulanmaktadır (Babao ğlu vd. 2001).
Günümüzde küresel ısınma nedeniyle toprak veriminin azalması ve dünya nüfusunun hızla ço ğalması nedeniyle ba ta tahıllar olmak üzere sebze ve meyve yeti tirmek için tarım alanlarının kısıtlı olması, bilim insanlarını sorunu çözme yolunda ara tırma yapmaya te vik etmi tir. Tarımsal sorunların çözülmesi için mikroço ğaltım, gen aktarımı ile bitkilere çe itli özellikler (kuraklı ğa, pestisitlerde dayanıklı veya vitamin içeri ği zenginle tirilmi tahıllar vb.) kazandırarak verimi artırmak gibi biyoteknolojik yollar kullanılması çözüm yolunda atılan de ğerli adımlar arasındadır.
19 Tıbbi ve aromatik bitkilerin ilaç ve kozmetik sanayinde kullanımı da çok yaygındır. Tıbbi bitkilerin ilaç sanayinde hammadde olarak kullanılması bu bitkilerin do ğadan a ırı miktarda toplanmasına neden olmakta ve türlerin nesilleri tehlike altına girebilmektedir. Bilim insanları bu soruna da biyoteknolojik yöntemlerle çözüm önerileri sunmu ve ba arılı uygulamalarla ilaç etken maddesi olan sekonder metabolitler bitki doku veya hücrelerine adeta bir fabrika gibi ürettirilmi tir (Zenk vd. 1977, Curtin vd. 1983).
2.4.2 Bitki doku kültürü yöntemleri
Bitki biyoteknolojisinde genel bir terim olarak kullanılan doku ve hücre kültürü aslında birbirine ba ğlı birçok yöntemi kapsar. Kullanılacak yöntemler denemenin amacına göre de ği ir. Mikroço ğaltımda, do ğrudan eksplanttan rejenerasyonla bitki ço ğaltılabilirken, dolaylı yolla, önce kallus olu turulur bundan da organogenez ve somatik embriyogeneze yönelerek de bitki elde edilebilir. En çok kullanılan kültür yöntemlerine a ağıda kısaca de ğinilmi tir:
2.4.2.1 Kallus kültürü
Kök, gövde, apikal meristem, kotiledon, yaprak gibi organlardan alınan küçük parçaların (eksplant), kallus (bitki yara dokusu) olu turmak için besin ortamlarına ekilmesiyle yapılan yöntemdir. Kallus olu umu inkübasyon süresine, ortam sıcaklı ğına, fotoperiyoda, bitkinin kallus olu turabilme yetene ğine göre de ği ir. Elde edilen kalluslardan sekonder metabolit üretimi, süspansiyon kültürü, protoplast kültürü ve füzyonu, mikroço ğaltım yapılabilir (Ya ğcı vd. 2008).
2.4.2.2 Süspansiyon kültürü
Üretilen kalluslar sıvı besin ortamına ekilip çalkalamalı inkübasyon yapılırsa süspansiyon kültürü kurulmu olur. Hücreler sıvı ortamda serbest ekilde geli ir. Bu yöntem özellikle ekstrasellüler bile iklerin üretiminde kullanılır. Đstenen madde
20 ekstraselüler de ğilse üreyen ve inkübasyon sonunda geli en hücreler mekanik, kimyasal veya enzimatik olarak parçalanır ve madde elde edilir (Yağcı vd. 2008).
2.4.2.3 Organ kültürü
Üretilen kalluslardan veya do ğrudan alınan eksplant üzerinden organ olu turmaya yönelik yöntemdir. Organ kültürüyle sadece istenen organın geli mesi sa ğlanabilir örne ğin köksüz bitkicik veya sadece kök olu umu gibi. Ayrıca bu kültür tipi organa özel sekonder metabolitlerin üretiminde oldukça avantajlıdır (Ya ğcı vd. 2008).
2.4.2.4 Somatik embriyogenez
Embriyo geli iminin somatik hücrelerle gerçekle tirilmesidir. Bu yöntemde besin ortamına büyüme düzenleyiciler eklenerek kalluslarda embriyo olu umu sa ğlanır. Bu yöntem özellikle bitki ço ğaltımında kullanılır. Günümüzde birçok bitkide sentetik tohum yapımında somatik embriyogenez yöntemi kullanılmaktadır (Ya ğcı vd. 2008).
2.4.2.5 Mikroço ğaltım
Bu yöntem kalluslardan (dolaylı organogenez) veya eksplant üzerinden (do ğrudan organogenez) organ geli imini sa ğlar. Bu yöntemde temel, totipotensi özellikleri kullanılarak hücrelerin bitki olu turmaya te vik edilmesidir. Bu hücrelerin orijinleri küçük bir eksplanttır ve bu eksplant çe itli büyüme düzenleyicilerle organ olu turmaya yönlendirilirler. Sonuçta tek bir hücreden bir bitkicik olu ur. Dolayısıyla teorik olarak eksplant üzerindeki totipotent hücre sayısı kadar bitki elde edilecektir. Gerçek artlarda ba arı beklenen kadar olmasa da küçük bir yaprak parçasından veya yaprak sapından alınan bir parçadan çok sayıda bitki elde edilmektedir (Ya ğcı vd. 2008).
21 2.4.2.6 Transgenik bitki üretimi
Tür içi, türler arası ve organizmalar arası gen aktarımı anlamına gelen transgenik kavramı, bitkilerde elit türler elde etmek, pestisitlere direnç sa ğlamak, verimi artırmak, besin içeri ğini zenginle tirmek ve temel ara tırmalara ı ık tutmak için yapılan bir i lemdir. Günümüzde biyoteknoloji alanındaki hızlı geli me sayesinde transgenik bitki elde etmenin birçok yolu vardır. Bunlardan en çok kullanılanları dikotil bitkilerde Agrobacterium tumefaciens ve A. rhizogenes , çe itli virus ve fajlar gibi biyolojik ajanlar yoluyla; mikroenjeksiyon, mikroprojektil bombardıman ve elektroporasyon gibi fiziksel yollarla gen aktarımıdır (Ya ğcı vd. 2008).
2.4.3 Bitki doku ve hücre kültürü teknikleri kullanılarak sekonder metabolit üretiminin ticari önemi, avantaj ve dezavantajları
Bitki doku kültürü yöntemleri ile sekonder metabolit üretiminin avantajları unlardır (Ramachandra-Rao ve Ravishankar 2002, Razdan 2003, Lila 2005, Ya ğcı vd. 2008):
1. Üretim daha güvenilir, basit ve tahmin edilebilirdir. 2. Normalde ana bitkide bulunmayan bile iklerin üretilebilmesine olanak sa ğlar. 3. Politik, co ğrafik ve mevsimsel engellerden ba ğımsız üretim yapılabilir. 4. Karma ık bitki ekstraksiyonlarıyla kar ıla tırıldığında fitokimyasalların izolasyonu daha çabuk ve etkili yapılabilir. 5. In vitro olarak üretilen bile ikler tüm bitkideki bile ikler ile do ğrudan paraleldir. 6. Tarlada yeti en bitkide istenmeyen bile ikler hücre kültüründe elimine edilebilir. 7. Hücre kültürleriyle bitkinin kendisinden elde edilen fitokimyasalların miktarı kar ıla tırıldı ğında hücre kültürlerinden çok daha fazla miktarda ürün elde edilebilir hatta üretim endüstriyel boyuta ta ınabilir. 8. Hücre kültürleri deney kurmak için mükemmel bir modeldir. 9. Hücre kültüründe genetik uygulamalara yönelik i aretlemeler ve de ği imler yapılabilir. 10. Temel ara tırmalara (örne ğin metabolik ve biyokimyasal yolların anla ılmasında) yol gösterici tayinler yapılabilir.
22 11. Ucuz öncü moleküller kullanılarak, yeni bile iklerin tekli veya çoklu enzim sistemleriyle biyotransformasyonu gerçekle tirilebilir.
Sekonder metabolit üretiminde stabil olmayan hücre hatları, dü ük verim, yava geli me ve üretimi artırmada ya anan sorunlar gibi geli tirilmesi gereken konular vardır (Ramachandra-Rao ve Ravishankar 2002).
2.4.4 Bitki Doku Kültürlerinde Sekonder Metabolit Üretimini Artırmak Đçin Stratejiler
2.4.4.1 Üretici gücü yüksek hücre hatlarının taranması ve seçilmesi
Hücre hattı geli tirmek, istenen ürünün yüksek miktarda elde edilebildi ği ana bitkinin seçimiyle, kallus artırma ile ve yüksek verimli hücrelerin gözlenmesiyle ba lar. Sonra karı ık populasyon arasından istenen ürünü en çok üreten hücre hatları taranır ve bu hücrelerle çalı ılır. Genetik yapıdan kaynaklanan çe itlilik, yüksek verimli hücrelerin var olmasını sa ğlayabilir. E ğer istenen ürün pigment içeriyorsa seçim kolaylıkla yapılabilir. Örne ğin Lithospermum erythrorhizon kültüründe ikonin üretiminde, taranan hücrelerden kırmızı renklilerin seçilmesiyle 13-20 kat fazla verim alınmı tır (Fujita vd. 1984, Ya ğcı vd. 2008) ( ekil 2.9).
23
ekil 2.9. Bitki hücre kültürlerinden sekonder metabolit üretiminde hücre hattı seçimi (Bourgaud vd. 2001)
2.4.4.2 Ortam miktarlarının ve bile enlerinin de ği tirilmesi
Birçok sekonder metabolitin olu umu besin ortamındaki maddelerin miktarı, stres faktörleri, ı ık ve büyüme düzenleyicileri gibi dı faktörlerden kolaylıkla etkilenebilmektedir (Ya ğcı vd. 2008).
2.4.4.2.1 eker miktarı
Bitki hücre kültürleri genellikle heterotrofik olarak, karbonu basit ekerlerden (sakaroz), inorganik maddeleri de di ğer bile enlerden kar ılayarak geli irler. Sakaroz seviyesi sekonder metabolit birikimi yapan kültürlerin üretkenliklerini etkilemektedir. Aralia cordata hücre süspansiyonunda %5 sakaroz ile antosiyanin üretimi dü mü , %3’te ise artmı tır (Sakamoto vd. 1993).
24 2.4.4.2.2 Nitrat miktarı
Azot konsantrasyonunun hücre süspansiyon kültürlerinde, protein veya aminoasit ürünlerinin miktarında etkili oldu ğu bulunmu tur. Bitki doku kültürü ortamları olan MS (Murashige ve Skoog 1962), LS (Linsmaier ve Skoog 1965), B5’te (Gamborg vd. 1968) azot kayna ğı olarak nitrat ve amonyum tuzları vardır. Toplam azot miktarının artması Vitis türlerinde antosiyanin üretimini artırmı tır (Yamakawa vd. 1983).
2.4.4.2.3 Fosfat miktarı
Fosfat konsantrasyonu bitki hücre kültürlerinde sekonder metabolit üretimi üzerinde etkili olmaktadır. Yüksek konsantrasyondaki fosfatın hücre geli imini hızlandırdı ğı fakat fosfatça sınırlandırılmı ortamlarda sekonder ürünlerin birikiminin olumsuz etkilendi ği bulunmu tur. Sasse vd. (1982), azalan fosfat miktarının Catharanthus roseus ’ta fenolik bile iklerin üretiminin artmasına neden oldu ğunu bulmu lardır.
2.4.4.2.4 Büyüme düzenleyiciler
Büyüme düzenleyiciler ve konsantrasyonları sekonder ürün birikiminde oldukça karma ık role sahiptirler (Deus ve Zenk 1982, DiCosmo ve Towers 1984). Oksin veya sitokininin çe idi ve konsantrasyonu veya oksin/sitokinin oranı, kültüre alınmı bitki hücrelerinde geli me ve ürün biçiminde dikkat çekici de ği ikliklere neden olur (Mantell ve Smith 1984). 2,4 Diklorofenoksi asetik asitin (2,4 D) birçok durumda sekonder metabolit üretimini inhibe etti ği görülmü tür. 2,4 D’nin ortamdan eliminasyonu veya Naftalen Asetik Asit (NAA) veya Đndol Asetik Asit (IAA) ile de ği tirilmesiyle Populus ve Daucus carota süspansiyonlarında antosiyanin üretiminin arttı ğı gözlenmi tir (Seitz ve Hinderer 1988, Rajendran vd. 1992). Buna kar ılık D. carota süspansiyonlarında karotenoit biyosentezinde (Mok vd. 1976) ve Oxalis linearis kallus kültürlerinde antosiyanin üretiminde (Meyer ve van Staden 1995) 2,4 D’nin stimüle edici etkisi gözlenmi tir. Sitokininlerin etkisi metabolitin tipine ve incelenen türlere göre çe itlilik gösterir. 6-furfurilamino purin (Kinetin), Haplopappus gracilus ’ta antosiyanin üretimini
25 artırırken Populus hücre kültürlerinde antosiyanin üretimini inhibe etmektedir (Mok vd.
1976, Seitz ve Hinderer 1988). Gibberellik Asit (GA 3) ve Absisik Asitin (ABA) birçok hücre kültüründe antosiyanin üretimini engelledi ği bildirilmi tir (Seitz ve Hinderer 1988).
2.4.4.2.5 Öncü molekül beslemesi
Bu yöntem, üretilmek istenen sekonder metabolitin biyosentez yolunun ba langıç veya ana ürünlerinden olan, yeni ürünün öncüsü niteli ğindeki bile iğin ortama eklenmesi mantı ğına dayanır. Bu sayede ürün miktarı artırılabilir. Scutellaria baicalensis ’te yapılan bir çalı mada saçak kök kültürlerinde öncü molekül olarak L-fenilalanin kullanılmı ve flavonoit üretiminin artması sa ğlanmı tır (Kuzovkina vd. 2001).
2.4.4.3 Kültür artlarının optimizasyonu
2.4.4.3.1 Sıcaklık
Kültür hücrelerinin geli tirilmesi ve kallus dokularının artırılması için genellikle 17- 25ºC arasındaki sıcaklık de ğerleri uygulanır. Fakat her bitki türünün sıcaklık ihtiyacı farklı olabilir (Ya ğcı vd. 2008). Seo vd. (1993), Scutellaria baicalensis hücre hatlarında, baikalin adlı flavonoitin üretiminin 30ºC’de 2.9 g/l iken sıcaklık 25ºC’ye dü ürüldü ğünde 72 saat sonra 4.2 g/l’ye yükseldi ğini bulmu lardır.
2.4.4.3.2 Aydınlatma
Yüksek iddette aydınlatma sa ğlandı ğında antosiyanin ve türevlerinin üretiminin dikkate de ğer biçimde arttı ğı birçok çalı mada vurgulanmı tır. Zhang vd. (2002), yaptıkları çalı mada 8000-8300 lüks de ğerinde ı ık iddeti uyguladıkları Vitis vinifera süspansiyon kültürlerinde antosiyanin üretiminin kontrole göre 4.8 kat arttı ğını göstermi lerdir. Fedoreyev vd. (2000), Maackia amurensis ’in kallus kültürlerinde izoflavonoitlerin üretimini artırmak için inkübasyonu karanlıkta gerçekle tirmi lerdir.
26 Aynı ekilde Kuzovkina vd. (2001) vogonin, baikalein ve baikalin üretimi için Scutellaria baicalensis süspansiyon kültürlerini karanlıkta inkübe etmi lerdir.
2.4.4.3.3 Çalkalama
Bu faktör genellikle süspansiyon kültürlerinde ve üretimi büyütülmekte olan kültürlerde önemlidir. Sıvı kültür içinde homojen da ğılımı sa ğlamak amacıyla orbital çalkalama yapılır. Çalkalamada önemli olan nokta, hassas olan hücrelerin çalkalama direncine kar ı koyabilece ği bir de ğerin bulunmasıdır. Bu de ğer genellikle 90-100 rpm arasında olmaktadır (Bourgaud vd. 1999, Kuzovkina vd. 2001, Shibasaki-Kitakawa vd. 2003).
2.4.4.4 Uyarma (Elisidasyon)
Bitkiler do ğal ya amlarında patojen ataklarına kar ı savunma amaçlı olarak sekonder metabolit üretirler. Bitkilerin patojenin kendisine verdi ği yanıt ile bazı patojen orijinli bile iklere yani elisitörlere kar ı verdi ği yanıtın aynı oldu ğu bulunmu tur. Elisitörler sekonder metabolitlerin üretilmesine neden olan bir tür sinyaldir. Sekonder metabolit yolu, strese bir cevap olarak geli ir. Bitki hücre kültürlerinde sekonder metabolit üretimini artırmak, aynı zamanda yüksek konsantrasyonlarda üretimi kısa sürede sa ğlamak amacıyla biyotik ve abiyotik elisitörler kullanılır (DiCosmo ve Tallevi 1985, Eilert 1987, Barz vd. 1988). Fungal, bakteriyel ve maya kaynaklı biyotik elisitörler ile polisakkaritler, glikoproteinler, inaktif enzimler, safla tırılmı kurdlan (bir tür polimer), ksantan ve kitosan, a ğır metal tuzları gibi abiyotik elisitörler, çe itli sekonder metabolitlerin üretiminde kullanılmı tır (DiCosmo vd. 1987, Furze vd. 1991, Guo vd. 1992, Rajendran vd. 1994, Ramachandra-Rao vd. 1996b).
2.4.4.5 Permeabilizasyon
Genelde bitki hücre kültürlerinde üretilen metabolitler hücre içinde ve vakuollerde depolanırlar (Keller 1986). Ürünün vakuolden bitki hücresinin dı ına salınması için tonoplast, plazma membranından olu an iki membran bariyerinin ve hücre çeperinin
27 a ılması gereklidir. Hücre geçirgenli ği bitki hücresinin membran sistemindeki çe itli moleküllerin hücre içine giri çıkı ını sa ğlayan por olu umlarına ba ğlıdır. Hücrenin geçirgenli ği hekzokinaz, glukoz 6-fosfat dehidrojenaz, izositrat dehidrojenaz, malik ve sitrat sentetaz gibi primer metabolizmada i gören aktif enzimlerin ölçülmesiyle izlenebilir (Brodelius vd. 1988). Geçirgenlik sa ğlayan ajanlar, enzimlerin giri ini hızlandırmak veya hücre içinde depolanmı ürünlerin salınmasını sa ğlamak amacıyla kullanılırlar (Felix 1982, Parr vd. 1984, Knorr vd. 1985, Berlin vd. 1989). Đzopropanol, dimetil sülfoksit (DMSO) ve kitosan benzeri polisakkaritler permeabilize ajanlar olarak kullanılırlar (Knorr ve Teutonico 1986, Beaumont ve Knorr 1987, Van Uden vd. 1990). Ultrasonikasyon, elektroporasyon ve iyonoforetik salınım gibi dü ük akım kaynaklı araçlar, di ğer permeabilize edici ajanlar olarak kullanılmı tır (Brodelius vd. 1988). Ayrıca yüksek akımlı elektrik alanları ve çok yüksek basınç sekonder metabolit salınımı için kullanılmı tır (Dornenburg ve Knorr 1993).
2.4.5 Bitki doku kültüründe kullanılan besin ortamları
Doku kültüründe i lemlere ba larken verilecek öncelikli kararlardan biri kullanılacak besin ortamlarının seçimidir. Çe itli ara tırmacılar tarafından bildirilen bir çok besin ortamı formülasyonu mevcuttur (Çizelge 2.1). Besin ortamlarında yer alan komponentler kullanım sıklı ğına göre sırasıyla; su, makro elementler (majör tuzlar, makronutrientler), mikro elementler (minör tuzlar, mikronutrientler), vitaminler, ekerler, yarı katıla tırıcılar, bitki büyüme düzenleyicileri, tamponlar, amino asitler ve kimyasal olarak tanımlanamayan bazı maddelerdir (Babao ğlu vd. 2001).
28 Çizelge 2.1. Bitki doku kültüründe en çok kullanılan temel besin ortamları (Babao ğlu vd. 2001)
Kültür ortamındaki konsantrasyon (mg/l) Komponentler White’s Nitsch’s MS B5 SH LS NN KM LM SI S-3 H
KNO 3 1900 2500 2500 1900 80.0 950 950 1900 1900 -
NH 4NO 3 1650 - - 1650 - 720 720 600 1650 -
NH 4H2PO 4 - - 300 ------
(NH 4)2SO 4 - 134 ------
MgSO 4.7H 2O 370 250 400 370 720 185 185 300 1850 370
CaCl 2.2H 2O 440 150 200 440 - 220 166 600 22 440
Ca(NO 3)2.4H 2O - - - - 300 - - - - - KCl - - - - 65 - - 300 - 1400
KH 2PO 4 170 - - 170 68 68 68 170 340 170
NaH 2PO 4.H 2O - 150 ------
NaH 2PO 4 - - - - 16,5 - - - - -
Na 2SO 4 - - - - 200 - - - - -
MnSO 4.H 2O - 10 10 16,89 - - - 10 21 -
MnSO 4.4H 2O 22,3 - - - 7 25 25 - - 22,3 KI 0,83 0,75 1 0,83 0,75 - - 0,75 4,15 0,83
H3BO 3 6,2 3 8 6,2 1,5 10 10 3 31 6,2
ZnSO 4.7H 2O 8,6 2 1 10,58 3 10 10 2 43 8,6
CuSO 4.5H 2O 0,025 0,025 0,2 0,025 - 0,025 0,025 0,025 0,5 0,025
Na 2MoO 4.2H 2O 0,25 0,25 0,1 0,25 - 0,25 0,25 0,25 1,25 0,25
CoCl 2.6H 2O 0,025 0,025 0,1 0,025 - - - 0,025 0,125 0,025
FeSO 4.7H 2O 27,8 27,8 15 27,85 - 27,8 - - 27,8 27,8
Fe 2(SO 4)3 - - - - 2,5 - - - - - Sequestren ------28 - - 330Fe
Na 2EDTA 37,3 37,3 20 - - 37,3 - - 37,3 37,3 Nikotinik asit 0,5 1 5 - - 5 - - 0,5 0,5 Piridoksin HCl 0,5 1 0,5 - - 0,5 - 1 0,1 0,5 Tiyamin HCl 0,1 10 5 0,4 - 0,5 - 1 0,1 0,1 Biotin - - - - - 0,05 - 0,01 - - Folik asit - - - - - 0,5 - 0,4 - - myo- inositol 100 100 1000 - - 100 - 100 100 100 L-inositol - - - 100 ------Glisin 2 - - - - 2 - 0,1 - 2 Glutamin ------1462 Sakkaroz 30000 20000 30000 - - 20000 - 20000 30000 10000
29 2.5 Gentiana L. Üzerine Yapılan Çalı malar
2.5.1 Fitokimyasal çalı malar
2.5.1.1 Flavonoitlerle ilgili fitokimyasal çalı malar
Pureb vd. (1991) G. barbata ’da bulunan ksanton ve flavonoitleri ara tırmı lardır. Etil alkol ile yapılan ekstraksiyon sonucunda ksanton türevlerinin yanı sıra bir flavonoit olan luteolini bulmu lardır. Analizler spektroskopik yöntemlerle gerçekle tirilmi tir.
Butayarov vd. (1993) yaptıkları çalı mada G. karelinii ’nin toprak üstü kısımlarını metanol ile ekstre etmi ler ve UV, spektral yöntemler ve fizikokimyasal kar ıla tırmalar sonucunda ksanton yapılı bile iklerle birlikte bir flavon C-heteroziti olan izoorientinin (homoorientin) varlı ğını göstermi lerdir.
Chulia vd. (1996) G. depressa ’nın toprak üstü kısımlarında flavonoit ve iridoit yapılı bile ikleri ara tırmı lardır. Metanol ekstresinin n-butanolde çözülen kısmı ile yapılan çalı mada flavonoit yapıda izoskoparin ile izoviteksin ve izoorientin 2''-glikoziti, iridoit yapıda ise loganin, depresterozit, depressin metabolitleri spektroskopik ve kimyasal dönü üm deneyleriyle tespit edilmi tir.
Kuo vd. (1996) G. arisanensis ve G. formosana ’da flavon C-heteroziti ve aromatik glikoziti ara tırmı lardır. Tüm bitkinin metil alkol ve kloroform ile ektraksiyonu sonucunda G. arisanensis ’te izoorientin türevleri; yine tüm bitkinin metil alkol ile ekstre edilmesiyle G. formosana ’da 2-hidroksi-3-metoksibenzoik asit glukoz esteri adında yeni bir aromatik glikozit, spektral yöntemler ve kimyasal reaksiyonlar sonucunda bulunmu tur.
30 2.5.1.2 Đridoit ve sekoiridoitlerle ilgili fitokimyasal çalı malar
Çalı vd. (1990), G. gelida ’da bulunan sekoiridoit glikozitleri ara tırmı lardır. Metil alkol ile ekstre edilen G. gelida herbasının (toprak üstü kısımları) gelidozit, gentomozit, triflorozit, gentiopikrozit, svertiamarin, östomozit ve östomoruzzit içerdi ği spektroskopik yöntemlerle tespit edilmi tir.
Menkovic vd. (2000b) G. lutea yaprak ve çiçeklerinde mevsimsel farklılıkların sekonder metabolit miktarını etkileyip etkilemedi ğini ara tırmı lardır. Çalı malarında iki er senelik üç periyotta (1993, 1995 ve 1997) marttan ekime kadar toplanan G. lutea bitkisinin yaprak ve kökleri metil alkol ile ekstre edilmi tir. HPLC kullanarak yapılan analizler sonucunda bir flavon C-heteroziti olan izoorientin ve bir ksanton türevi olan mangiferinin çiçeklenme periyodu olan haziran ve temmuz aylarında maksimum miktara ula tı ğı buna kar ın gentiopikrozitin kök ve rizomda, nisan ve ekim aylarında iki defa maksimum miktara ula tı ğı bulunmu tur.
Carnat vd. (2005), 6 farklı bölgeden topladıkları G. lutea köklerindeki acı iridoitlerin miktarlarını taze köklerde, do ğal artlarda ve etüvde kurutulan köklerde HPLC kullanarak ara tırmı lardır. Analiz sonucunda kurutma yönteminin iridoit miktarı üzerine fark edilir derecede etkili oldu ğunu bulmu lar; en yüksek iridoit miktarını taze köklerde daha sonra etüvde ve en az da do ğal artlarda kurutulanlarda oldu ğunu göstermi lerdir.
Aberham vd. (2007) yaptıkları çalı mada Almanya ve Avusturya’da farklı bölgelerden toplanan G. lutea köklerindeki iridoit grubu maddelerin kantitatif analizlerini, ters fazlı HPLC ve LC-MS kullanarak ara tırmı lardır. Analiz sonuçlarına göre dominant bile ik gentiopikrozit (% 4.46-9.53) olarak bulunurken sırasıyla loganik asit (% 0.1-0.76), svertiamarin (% 0.21-0.45), ksanton yapılı bile iklerden gentisin (% 0.02) ve izogentisin (% 0.11) tespit edilmi tir.
31 Yapılan literatür taramasıyla ara tırıcıların iridoit ve flavonoit yapılı bile ikleri HPLC ile kantitatif olarak belirlemek için kullandıkları kolon, solvan sistemi ve dedektörün dalga boyu çizelge 2.2’de özetlenmi tir.
Çizelge 2.2. Ara tırmacıların iridoit ve flavonoit yapılı bile ikleri HPLC ile kantitatif olarak belirlemek için kullandıkları kolon, solvan sistemi ve dedektörün dalga boyu
Ara tırıcılar Kolon Solvan Dalga boyu (nm) Aberham vd. Zorbax Eclipse XDB-C18 A: Su %0.025 232 (2007) (150 mm x 4.6 mm x 5 µm) Trifloroasetik asit (TFA) B: Asetonitril: n- propanol (1:1) Jiang vd. C18 A: Su 200-400 (2005) (250 mm x 4.6 mm x 5 µm) B: Asetonitril Carnat vd. Lichrocart125-4 A: Su: 85% Fosforik asit 239 (2005) Supersher RP8-E, 5 µm (100:0.3 v/v) B: Asetonitril: Su: 85% Fosforik asit (80:20:0.3 v/v/v) Edis (2003) Lichrospher RP-18e Su: MeOH: Glasiyel asetik 354 (250 mm x 4 mm x 5 µm) asit (65:35:5) (izokratik) Chueh vd. Intersil ODS-3- 5 µm ve MeOH: Su (30:70) Belirtilmemi (2000) Guard-Pak ön kolon (izokratik) (45 dk) Menkovic Hypersil ODS C18 A: Asetonitril Belirtilmemi vd. (2000a) (250 mm x 4.6 mm x 5 µm) B: %3 asetik asitli su Menkovic Lichrospher RP-18 A: Asetonitril Belirtilmemi
vd. (2000b) (250 mm x 4 mm x 5 µm) B: %1 H 3PO 4 (1 N) su
2.5.2 Biyoaktivite çalı maları
2.5.2.1 Flavonoitlerle ilgili biyoaktivite çalı maları
G. arisanensis bitkisi üzerinde yapılan fitokimyasal ve biyoaktivite çalı masında Lin vd. (1997), bitkiyi etil asetat ile ekstre etmi ve izoviteksin türevi yeni bir flavon C- heteroziti ile kersetin, izoorientin, izoviteksin, luteolin ve luteolin türevi bir flavonoitin
32 varlı ğını, spektral yöntemler ve kimyasal reaksiyonlar kullanarak tespit etmi lerdir. Luteolinin ara idonik asit ile uyarılmı platelet çökelmesinde potansiyel olarak antiplatelet etki gösterdi ği bulunmu tur. Đzoorientin, luteolin 7-O-β-D-glikozit ve luteolinin aort kontraksiyonu üzerine etkisi de çalı ılmı ve yine luteolinin kontraksiyonu baskıladı ğı gözlenmi tir.
Odontuya vd. (2005) içlerinde G. azurea ve G. tenella ’nın da bulundu ğu 5 bitkiden izole ettikleri flavonoit yapılı bile iklerin tromboksan B 2 ve lökotrien B 4’in sentezini sa ğlayan enzimleri inhibe etme yetene ği ile hidrojen peroksiti temizleme (scavenging) aktivitesini incelemi lerdir. Luteolinin tromboksan ve lökotrien sentezi üzerine dikkate de ğer bir inhibitör aktivite gösterdi ğini bulmu lardır. Bunun yanında tüm flavonoitler hidrojen peroksit kar ısında mükemmel temizleyici etki göstermi lerdir.
Wu vd. (2006) G. piasezkii ’den 2 yeni ve 4 bilinen flavonoiti izole etmi ve yeni bulunan flavonoitlerin yapısını NMR ile ortaya koymu lardır. Đzole ettikleri 6 flavonoitin antioksidan aktivitesini ara tırmı lar ve yeni bulunan 7-O-feruloilorientin ile luteolinin, pozitif kontrolden daha iyi sonuç verdi ğini bulmu lardır.
2.5.2.2 Đridoit ve sekoiridoitlerle ilgili biyoaktivite çalı maları
Öztürk vd. (2002) yaptıkları metanolik ekstraksiyon ile G. lutea ssp. symphyandra köklerinde svertiamarin, gentiopikrozit ve sverozit iridoitlerinin varlı ğını göstermi lerdir. Elde ettikleri ekstreyi fareler üzerinde deneyerek merkezi sinir sistemine pozitif etkilerinin oldu ğunu bulmu lardır. Buna göre ekstre, doza ba ğlı olmadan, yüzme performansını artırmı , az da olsa analjezik aktivite göstermi tir. Bu etkilerin yanında letal etki gözlenmemi tir. Ara tırıcılar, bu bitkinin köklerinden elde edilen metanolik ekstrenin fareler üzerinde adaptojenik etkisi oldu ğunu belirtmi lerdir.
Niiho vd. (2006) G. lutea köklerinden elde ettikleri metanolik ekstrenin gastroprotektif etkisini farklı gastrik lezyon modelleri üzerinde çalı mı lardır. Ekstrenin oral veya duodenuma uygulanmasıyla akut gastrik ülser, stres kaynaklı ülser ve gastrik mukozal
33 yaraya kar ı koruma sa ğlandı ğı belirlenmi tir. Ayrıca G. lutea kök ve Swertia japonica bitkisinden elde ettikleri amarogentin, gentiopikrozit, amarosverin ve svertiamarin adlı dört sekoiridoit glikozitin de benzer etkiler gösterdi ği bulunmu tur. Bu sonuçlarla, Gentian kökünün gastrik yaralar üzerindeki terapötik etkilerinin, hücre membranında prostaglandin yolu ile mukozal savunmanın artırılmasıyla ili kili oldu ğu belirlenmi tir. Bu aktiviteden sekoiridoit glikozitlerin sorumlu oldu ğu belirtilmi tir.
Wang vd. (2010) yaptıkları çalı mada, G. manshurica köklerinden elde ettikleri ve gentiopikrozit varlı ğını HPLC ile gösterdikleri metanolik ekstrenin, asetaminofen (APAP) kullanılarak karaci ğer yarası olu turulan fareler üzerindeki hepatoprotektif etkisini ara tırmı lardır. Sonuçta ekstrenin hepatik glutatyon seviyesini artırarak, serum alanin aminotransferaz (ALT), aspartat aminotransferaz (AST) ve malondialdehit (MDA) de ğerlerini dü ürerek ve glutatyon peroksidaz ve süperoksit dismutaz aktivitesini koruyarak APAP kaynaklı oksidatif stresi hafifletti ği belirlenmi tir.
2.5.3 Doku kültürü çalı maları
2.5.3.1 Gentiana türleri ile yapılan doku kültürü çalı maları
Bu kısımda Gentiana türlerinde yapılan protoplast kültürü, mikroço ğaltım, rejenerasyon, somatik embriyogenez teknikleriyle ço ğaltma çalı malarına yer verilmi tir. Ayrıca doku kültürü yöntemleri kullanılarak yapılan genetik ve histolojik ara tırmalara da de ğinilmi tir.
Takahata ve Jomori (1989), G. scabra ’nın mezofil protoplastlarından bitkicik geli tirmi lerdir. Protoplastlar, in vitro ço ğaltılmı G. scabra yapraklarından enzimatik yollarla izole edilmi tir. Hücre bölünmesi, modifiye edilmi MS veya B5 sıvı kültürde 4-5 günden sonra ba lamı tır ve 6-8 hafta sonra küçük kalluslar taze ortama aktarılmı tır. Sürgünler 1.0 mg/l IAA ve 6.0 mg/l BA içeren MS katı ortamında, protoplast kaynaklı kalluslardan farklıla mı tır. Bitkicikler hormon içermeyen MS ortamında köklendirilmi lerdir.
34 Momcilovic vd. (1997), G. lutea, G. cruciata, G. purpurea ve G. acaulis ile yaptıkları çalı mada, mikroço ğaltımı hedeflemi lerdir. 4 türün tohumları in vitro olarak çimlendirilmi ve olu an fideler eksplant kayna ğı olarak kullanılmı tır. G. lutea, G. purpurea ve G. acaulis tohumları 0.2 mM (0,069 g/l) GA 3 içeren MS ortamına, G. cruciata ’nın tohumları ise 10 mM (1,01 g/l) KNO 3 içeren MS ortamına ekilmi tir. Çimlenmeden 30 gün sonra 2-3 internod geli tiren bitkilerden eksplantlar alınmı tır. Sürgün olu umu ve ço ğaltım için G. cruciata ve G. lutea ’da MS; G. acaulis ve G. purpurea ’da ise sadece makro tuzları WPM’dan olu an MS ortamı kullanılmı tır. Sürgün olu umunu uyarmak amacıyla IAA ve BAP çe itli konsantrasyonlarda kullanılmı tır. 0.2 mg/l IAA varlı ğında BAP konsantrasyonunun artırılmasıyla sürgün olu umunun arttı ğı gözlenmi tir. Dört bitkide de 0.2 mg/l IAA ve 4 mg/l BAP’ın en çok sürgün verdi ği belirlenmi tir. Bunun yanında 2 mg/l BAP varlı ğında de ği ik IAA konsantrasyonları denendi ğinde sürgün sayısının bitkilerde de ği ik sonuçlar verdi ği görülmü tür. Köklendirme için NAA’in de ği ik konsantrasyonları [0.67- 10.74 M (0,12- 2 mg/l)] denenmi ve ilk adventif kök olu umu 14. günde gerçekle mi tir. Köklenen bitkicikler hormonsuz MS ve WPM’ye aktarılmı tır. Yalnız G. cruciata ’nın kök geli imine NAA’lı ortamda devam edilmi tir.
Morgan vd. (1997) ise G. cerina ve G. corymbifera ’nın in vitro ço ğaltımı üzerine bir
çalı ma yapmı lardır. G. corymbifera ’nın tohumları 100 mg/l GA 3 içeren MS ortamında çimlendirilmi ve 70 gün sonra % 54 çimlenme gözlenmi tir. Seradan toplanan G. cerina ve in vitro çimlendirilen G. corymbifera fidelerinden alınan sürgünler, BAP içeren MS ortamlarında ço ğaltılmı tır. G. cerina için 0.05 ve 0.5 mg/l BAP konsantrasyonları arasında sürgün ço ğalma oranında önemli bir fark gözlenmemi tir. En yüksek sürgün ço ğalması, G. corymbifera ’da 0.2 mg/l BAP’da olmu tur. Ortama 1 mg/l
GA 3 eklenmesi, ço ğalmanın artmasına neden olmu tur. En iyi uygulama G. cerina için 50 gün sonra sürgün olu umunu 7 kat artırırken G. corymbifera için artı 3 kattan fazla olmu tur. Kök olu umu IBA ile MS ortamında gerçekle tirilmi tir. Sonuçta 0.3 mg/l IBA her iki türde de kök olu umu için tavsiye edilmi tir.
Hosokawa vd. (2000) partikül bombardımanı tekni ğiyle transgenik bitkiler elde etmek için G. triflora ve G. scabra ’nın yaprak eksplantlarının hücre süspansiyon kültürlerini
35 yapmı lardır. Bu çalı mada, bir partikül tabancası kullanılarak Caulimovirüs (CaMV) 35S promotoruna ba ğlanan β-Glukuronidaz geni, süspansiyon kültür hücrelerine aktarılmı tır. Transformasyona u ğradı ğı dü ünülen hücreler önce 30 mg/l higromisin, 10 mg/l N-fenil-N'-1,2,3 tiyadiazol-5-il üre (TDZ), 1 mg/l NAA ve 30 g/l sakaroz içeren sıvı ortamda geli tirilmi tir. Sonra içeri ği aynı ortama, 2 g/l jellan gum katılmı ve katı ortam elde edilmi tir. 12 hafta sonra bu ortamdaki higromisine dirençli olan yani β- Glukuronidaz genini alan hücrelerden geli en kalluslar seçilmi tir. Seçilen kallusların analizi PCR ve Southern blotting teknikleri kullanılarak yapılmı ve β-Glukuronidaz genini aldıkları tespit edilmi tir.
Pawlowska ve Bach (2003) nesli tükenme tehlikesi altında oldu ğundan korunmakta olan G. pneumonanthe ’nin, süs bitkisi olarak mikroço ğaltımı üzerine bir çalı ma yapmı lardır. Bunun için olgun ve olgun olmayan tohumlar in vitro çimlendirilmi daha sonra elde edilen fidelerden sürgün uçları ile bir nod içeren fideler eksplant olarak kullanılmı tır. BAP, kinetin, TDZ ve 2iP olmak üzere dört sitokinin ile IAA ve GA 3 kullanılmı tır. En yüksek ço ğalma bir nodlu fideden 10 µM BAP içeren ortamda elde edilmi tir. Aksillar sürgünler 0.5 ve 1 µM IAA, NAA ve IBA içeren ortamlarda köklendirilmi ve en iyi etki IAA’da görülmü tür. Köklenme, hormon içermeyen ortamlarda da gözlenmi tir. Köklendirilmi bitkicikler, %65 hayatta kalma oranıyla topra ğa geçirilmi ve serada akklimatize edildikten sonra dı ve iç mekan ko ullarında geli tirilmi tir. Klon bitkilerin çiçek ve gövde sayısının do ğal ortamda ya ayan bitkilere göre daha fazla oldu ğu gözlenmi tir.
Bach ve Pawlowska (2003), G. pneumonanthe ’de somatik embriyogenezi gerçekle tirmi lerdir. Bir önceki çalı malarında (Pawlowska ve Bach 2003) elde edilen in vitro rejenere olmu bitkilerin yaprak ve apikal meristemlerinden alınan eksplantlar kullanılmı tır. Kallus olu umu için BAP ve Pikloram veya 2,4 D içeren ½ MS ortamı kullanılmı tır. 3-4 hafta sonra kültürlerde ilk somatik proembriyolar elde edilmi tir. En çok embriyojenik kallus 2,4 D içeren ve karanlıkta inkübe edilenlerde olmu tur. Embriyolar, oksin miktarı azaltılan ortamlarda olgunla mı ve hormon içermeyen ortamda çimlendirilmi tir. Kallus ve somatik embriyolardan elde edilen bitkilerin
36 sitometrik analizleri, DNA içeriklerinin ana bitkiden farklı oldu ğunu göstermi tir. Fakat akklimatize olan bitkilerin, verici (ana) bitkidekiyle aynı miktarda DNA içerdikleri tespit edilmi tir.
Butiuc-Keul vd. (2005) G. punctata ’nın in vitro organogenezi için ½ MS ortamında in vitro çimlenen fidelerden alınan eksplantları kombineli ekilde 2iP, zeatin, IBA ve mısır ekstresi içeren MS ortamına aktarmı lardır. 2iP, zeatin ve IBA içeren ortamlarda ço ğalma az olmu tur. Bitki ço ğalması ortama mısır ekstresinin eklenmesiyle az miktarda da olsa artmı tır. Rizogenez (kök olu umu) sadece 1 mg/l NAA, 1 mg/l 2iP ve 1 mg/l mısır ekstresi içeren ortamda gözlenmemi tir. Đn vitro bitkicikler kültürün 6. haftasından sonra topra ğa alınmı lar ve akklimatize edilmi lerdir.
Takashi vd. (2005) G. scabra ’nın çiçek renginin kendili ğinden mutasyona u ğrayarak pembeden eflatuna dönü tü ğünü moleküler ara tırmalarla kanıtlamı lardır. Mutasyonun delfinidin adlı antosiyanin türevinin olu umunu sa ğlayan flavonon 3′,5 ′-hidroksilaz (F3′5′H) adlı enzimde oldu ğunu kanıtlamı lardır. Flavonon 3′,5 ′-hidroksilaz (F3′5′H) enziminin genine yerle tirilen iki farklı transpozon elementiyle bu enzimin aktivasyonu bozulmu ve bu yolun katalizlenmesi önlenmi tir. Sonuç olarak delfinidinin üretilmedi ği, buna kar ılık pembe rengi veren siyanidinin üretildi ği gösterilmi tir.
Fiuk ve Rybczynski (2008), G. cruciata , G. kurroo , G. lutea , G. pannonica ve G. tibetica ’nın embriyojenik potansiyellerini belirlemek amacıyla bir çalı ma yapmı lardır.
Bu bitkilerin tohumları önceklikle 0.5 mg/l GA 3 içeren MS ortamında in vitro çimlendirilmi daha sonra ise sürgün olu umunu uyarmak amacıyla fideler, 2.0 mg/l BAP ve 0.2 mg/l NAA içeren MS ortamına aktarılmı lardır. Buradan elde edilen sürgün eksplantları, bitki büyüme düzenleyici içermeyen ortama aktarılarak aksenik sürgün kültürü yapılmı tır. Daha sonra aksenik sürgünlerden geli en yapraklardan alınan eksplantlar, NAA, 2,4-D ve dicamba olmak üzere üç oksinin ve zeatin, kinetin, TDZ, N- (2-kloro-4-piridil) N' -fenil üre (CPPU) ve BAP olmak üzere be sitokinin varlı ğında kültüre alınmı tır. Đki aylık kültür sonunda en yüksek embriyogenez frekansı G. kurroo ’da bulunmu tur (%54.7). Bu bitki, uygulanan tüm büyüme düzenleyicilerini
37 içeren ortamlarda morfojenik kapasite göstermi , buna kar ılık G. lutea’da hiçbir uygulamada somatik embriyo olu umu gözlenmemi tir. Somatik embriyo olu umu eksplant ba ına ortalama G. tibetica ve G. cruciata ’da 6.6, G. pannonica ’da 15.7, G. kurroo ’da 14.2 olarak bulunmu tur. Optimum rejenerasyon NAA’nın BAP veya TDZ ile kombinasyonunda ba arılı olmu tur. NAA rizogenezi de çok miktarda artırmı tır. Ayrıca G. kurroo, G. cruciata ve G. pannonica adventif köklerinden somatik embriyolar elde edilmi tir. Somatic embriyolar ½ MS ortamında bitkici ğe dönü türülmü tür.
2.5.3.2 Gentiana türlerinde ve Gentianaceae familyasına dahil bitkilerde yapılan sekonder metabolit üretimi çalı maları
Gentianaceae familyasındaki türler üzerinde doku kültürü yöntemleri kullanılarak genellikle sekoiridoitler üretilmektedir. Son yıllarda ksanton türevi bile iklerin üretimi konusunda çalı malar vardır. Yapılan literatür taramasında Gentianlarda doku kültürü yöntemleriyle flavonoitlerin varlı ğı tespit edilmesine kar ın üretilmelerine yönelik bir çalı maya rastlanmamı tır. Bu kısımda kallus ve süspansiyon kültürleriyle elde edilen hücrelerde ve in vitro rejenerasyon yöntemleriyle elde edilen bitkiciklerde sekonder metabolit üretimi ile ilgili yapılan çalı malara de ğinilmi tir.
Menkovic vd. (2000a), in vitro kültür ile elde edilen G. lutea ’nın gövde, kök ve saçak köklerindeki sekoiridoit ve γ-piron bile iklerin kantitatif belirlenmesi için çalı ma yapmı lardır. Buna göre in vitro elde edilen gövdede, sekoiridoit ve γ-piron bile iklerin miktarı, do ğadan toplanan G. lutea ’nın topraküstü kısmındaki miktarla yakla ık bulunmu tur. En fazla miktarda bulunan sekoiridoit, gentiopikrozit iken ksanton grubundan mangiferin ba lıca γ-piron bile iklerinden olmu tur. Agrobacterium ile infekte edilen dokuz saçak kökte ise çe itli miktarlarda sekonder metabolit bulunmu tur.
Chueh vd. (2000) Çin halk tıbbında G. davidii var. formosana ’dan elde edilen ve Long- Dan adıyla kullanılan ilacın etken maddeleri olan gentiopikrozit ve svertiamarinin büyük ölçülerde üretilebilmesi, bu sayede bitkinin do ğal ya amının korunması amacıyla
38 süspansiyon kültürü yapmı lardır. Kallus, G. davidii var. formosana ’nın gövde eksplantından, 0.2 mg/l kinetin ve 1.0 mg/l NAA içeren MS ortamında elde edilmi tir. Hızlı geli en hücre süspansiyon kültürleri, 0.2 mg/l kinetin, %3 sakkaroz içeren MS ortamında (pH 4.2-5.2) alt kültüre alınmı tır. Çalı manın sonucunda svertiamarin için en yüksek konsantrasyona 12 günlük, gentiopikrozit için en yüksek konsantrasyona ise 24 günlük inkübasyon sürecinden sonra ula ılaca ğı bulunmu tur.
Piatczak vd. (2005a) Centaurium erythrea sürgün uçlarından aldıkları eksplantlarla 0.1 mg/l IAA ve 1.0 mg/l BAP içeren sıvı MS ortamında mikroçoğaltım yapmı lardır. Kültüre alınan her eksplanttan dört haftada yakla ık 60 mikrosürgün elde edilmi tir. Bu sonuç, katı (agar içeren) ortamda yapılan kültüre göre 3 kat daha fazladır. Sürgünler hormon içermeyen MS ortamında altı haftada %85 ve yine hormon içermeyen ½ MS ortamında dört haftada %77 oranında köklendirilmi tir. Köklenen sürgünler %90 ba arı ile topra ğa aktarılmı tır. 10 haftalık mikroço ğaltılan sürgünlerde, 149 mg/l miktarda toplam sekoiridoit glikozit birikimi oldu ğu bulunmu tur. Bu miktar, sürgün kültürü ve yaban tip bitkinin toprak üstü kısmı ile kar ıla tırıldı ğında çok fazladır.
Piatczak vd. (2005b) bir önceki çalı madan elde ettikleri C. erythrea sürgünlerini yaptıkları bir di ğer çalı ma ile biyoreaktöre aktarmı lar ve çok miktarda sürgün elde ederken sürgünlerdeki sekoiridoit miktarlarını da artırmayı ba armı lardır. 21 veya 28 gün sonra hasat edilen sürgünler kurutularak metanol ile ekstre edilmi ve HPLC’de içerdikleri sekoiridiotlerin miktarı ara tırılmı tır. Toplam sekoiridoit miktarının (gentiopikrozit, svertiamarin, sverozit ve di ğer glikozitlerin toplamı) 21 günlük kültür sonunda 303 mg/l’ye ula tı ğı belirlenmi tir. Böylece biyoreaktörle, erlende yapılan daha önceki denemelere göre (Piatczak vd. 2005a) 6 kat fazla sekoiridoit üretimi daha kısa sürede (3-4 haftada) yapılmı tır.
Sabovljevic vd. (2006) MS ortamında çimlendirdikleri Blackstonia perfoliata (Gentianaceae) sürgün ve kök kültürlerindeki sekoiridoit miktarını in vitro ve in vivo olarak de ğerlendirmi lerdir. Bitkinin vejetatif ço ğaltımını 0.5 µM IBA ve BAP’ın de ği ik konsantrasyonlarıyla (0-20 µM) MS ortamında sa ğlarken IBA’nın kökteki
39 sekoiridoit miktarına etkisini ara tırmak için de 1, 3 ve 10 µM konsantrasyonda IBA kullanmı lardır. Sekoiridoit miktarının artırılması için bitkinin ikinci noduna A. rhizogenez (A4M70GLS su u) süspansiyonu enjekte edilerek genetik transformasyon amaçlanmı tır. Hem in vitro hem de in vivo geli en B. perfoliata kök ve sürgünlerinde gentiopikrozit, svertiamarin ve sverozit tespit edilirken gentiopikrozit major bile ik olarak bulunmu tur. IAA bulunmayan ortamda geli en bitkilerde gentiopikrozit miktarının daha yüksek oldu ğu, BAP’ın ise sekoiridoit üretimini engelledi ği bulunmu tur.
Devic vd. (2006), yaptıkları çalı mada G. asclepiadea ’nın in vitro ço ğaltımı için geli tirdikleri protokolde en iyi ço ğalmayı 8.9 µM BAP ve 1.1 µM IAA içeren WPM’da gözlemi lerdir. 8.9 µM BAP ve 1.1 µM IAA ile GA 3 birarada kullanıldı ğında, ço ğalma miktarı de ği memesine ra ğmen sürgün uzaması uyarılmı tır. Hormon kullanılmayan ortamda köklenme kendili ğinden geli mesine ra ğmen oksinlerin köklenme yetene ğini artırdı ğı gözlenmi tir. IAA ile uygulama kök uzunlu ğunu artırırken IBA ile uygulama olu an kök miktarını artırmı tır. Đn vitro geli en G. asclepiadea ’da mangiferin ve gentiopikrin birikimi köklerde gövdedekinden az olmu tur. Kültüre alınan bitkilerde sitokininlerin varlı ğında (BAP) mangiferin ve gentiopikrin birikimi do ğal geli en bitkilere göre dikkate de ğer biçimde uyarılmı tır.
Tiwari vd. (2007), Qinjiao olarak bilinen G. macrophylla ’dan aldıkları 2 haftalık genç yaprak, 2 aylık olgun yaprak ve gövde eksplantlarını dört Agrobacterium su u ile muamele ederek genetik olarak de ği tirip saçak kök olu turmu lardır. Saçak kök olu umu için R1000 Agrobacterium su unu ve ½ MS+B5 ortamını, süspansiyon kültürü için kullanmı lardır. Çalı mada saçak kök klonları, toplam kök uzaması, yan köklerin yo ğunlu ğu ve katı ortamdaki biyomas birikimi olmak üzere üç kategoriye ayrılmı tır. PCR ve Southern hibridizasyon analizleri, kök klonlarında hem sol hem de sa ğ T- DNA’ların birle ti ğini (integrasyon) ortaya koymu ve RT-PCR analizi de indüklenen saçak kök genlerinin ifade edildi ğini göstermi tir. Köke özgü sekoiridoit glikozitlerden gentiopikrozitin GM1 ve GM2 tipi klonlarda çok miktarda, GM3 kallus tipi klonda çok daha az oldu ğu gözlenmi tir. Kök kültürlerinin kurulmasında kök:ortam oranının büyük
40 ölçüde etkili olduğu bulunmu tur. Maksimum geli me 1:50 kök:ortam ile kaydedilmi tir. Ya a ğırlıkta maksimum biyomas 33 kat ile ½ MS+B5 ortam kompozisyonunda 35 gün sonra elde edilmi tir. Bu oran kontrolden 6 kat fazladır.
2.6 Gentiana olivieri Griseb. üzerine yapılan çalı malar
2.6.1 Fitokimyasal çalı malar
G. olivieri ’nin genellikle toprak üstü kısımlarında bulunan ve çe itli hastalıkların iyile tirilmesinde kullanılan acı sekoiridoit glikozitler ve flavonoitlerin izolasyonu üzerine çalı malar yapılmı tır.
Ersöz ve Çalı ’ın (1991) yaptı ğı çalı mada, G. olivieri ’de bulunan flavon C-heterozitler ekstre edilmi , ince tabaka kromatografisi ve daha sonra da 1H-NMR teknikleri ile 4 farklı yapı bulunmu tur. Bunların yapıları izoorientin, izoorientin-4'-O-glikozit, izoorientin-7-O-glikozit ve orientin-2''-O-glikozit olarak belirlenmi tir. Đzoorientin-7-O- glikozit ve orientin-2''-O-glikozit Gentiana ’lardan ilk defa bu çalı mayla elde edilmi tir.
Takeda vd. (1999), G. olivieri ’nin tamamından üç yeni acı sekoiridoit glikozit (olivierozit A, B ve C) izole etmi lerdir. Bu üç acı sekoiridoit glikozit yanında gentiopikrozit, sverozit, 6'-O-β-D-glukozilgentiopikrozit, svertiapunimarin, eustomozit, eustomorussit ve septemfidozit izole edilmi tir. Yeni bulunan bile enlerin yapıları spektroskopik ve kimyasal olarak tespit edilmi tir.
Aslan (2000) doktora tez çalı masında halk arasında eker hastalı ğına kar ı kullanılan bitkileri ara tırmı tır. G. olivieri ’nin metanollü ekstresinin glikoz-hiperglisemik sıçanlarda %36.5, metanollü ekstrenin fraksiyonlanmasıyla elde edilen etil asetat ekstresinin ise diyabetik sıçanlarda %48 oranında antidiyabetik aktivite gösterdi ğini bulmu tur. Ayrıca sulu ekstrenin hipoglisemik aktivitenin tersine hiperglisemik aktivite gösterdi ğini de tespit etmi tir.
41 Edis (2003), yüksek lisans çalı masında Türkiye’de yeti en be Gentiana türünün (G. olivieri , G. asclepiadea , G. cruciata , G. gelida ve G. septemfida ) içerdi ği izoorientin miktarını ara tırmı tır. Bunun için bitkilerin çiçek, yaprak ve gövdelerinin kulanmı metanolle ekstre etti ği materyalleri HPLC’de analiz etmi tir. Buna göre yaprak, çiçek ve gövdelerde bulunan izoorientin miktarları sırasıyla G. olivieri ’de %3.70, 3.28, 1.36; G. asclepiadea ’da % 3.07, 1.84. 0.10; G. cruciata ’da % 2.27, 1.79, 0.24; G. gelida ’da %0.88, 3.51, 0.26; G. septemfida ’da ise %1.51, 0.88, 0.11 olarak bulunmu tur.
2.6.2 Biyoaktivite çalı maları
Aktay vd. (2000), Türk halk tıbbında karaci ğer hastalıklarında kullanılan, G. olivieri ’nin de içinde bulundu ğu bitkiler üzerine yaptıkları çalı mada, bitkilerden etanol ile elde ettikleri ekstraktları kullanmı lardır. Sıçanlarda CCl 4 ile hepatotoksisite sa ğlanmı tır. G. olivieri ekstraktının, enzim (aspartat transferaz ve alanin transferaz) seviyesinin oldu ğu kadar, plazma ve hepatik malondialdehit artı ını da önemli ölçüde önlenmi oldu ğu tespit edilmi ve G. olivieri ’nin hepatoprotektif oldu ğu kanıtlanmı tır.
Deliorman Orhan vd. (2003) yaptıkları çalı mada, G. olivieri ’nin çiçeklenmi toprak
üstü kısımlarından elde edilen ekstrelerin, sıçanlar üzerinde CCl4 ile olu turulan karaci ğer harabiyeti üzerindeki hepatoprotektif etkisini ara tırmı lardır. Biyolojik aktivite ile yönlendirilen fraksiyonlama yöntemiyle etil asetat fraksiyonunda aktif antihepatotoksik etki gösteren madde izole edilmi ve bunun bir C-glikozilflavonoit olan izoorientin oldu ğu belirlenmi tir. Vücut a ğırlı ğına göre 15 mg/kg dozda izoorientinin güçlü hepatoprotektif aktivite gösterdi ği bulunmu tur. Bu aktivitenin antioksidan etkisine ba ğlı olabilece ği belirtilmi tir.
Mansoor (2003), G. olivieri ’nin sulu ekstresi ve etil alkol ekstraksiyonu ile elde etti ği saf gentianinin sıçanlar üzerindeki toksikolojik de ğerlendirmesini ara tırmı tır. Gentianin ve sulu ekstrenin farklı dozlarda verildi ği sıçanlarda 7 gün sonunda hiçbir ölüm olayı gözlenmemi tir. Ayrıca yüksek dozda gentianin ve sulu ekstraktının verildi ği sıçanlarda 3. günde yo ğun ürinasyon ve bunun sonucunda da kan basıncında dü meler
42 (antihipertansif etki) gözlenmi tir. Bu konuda daha sonra çalı ma yapılması gerekti ği bildirilmi tir. Çalı manın sonuçlarına göre ekstraktın öldürücü olmadı ğı ve omurgalılarda emniyetle kullanılabilece ği ileri sürülmü tür.
Küpeli vd. (2004) G. olivieri ’den izole ettikleri izoorientinin, fare ve sıçanlar üzerinde herhangi bir akut toksisite göstermeden antinosiseptif (a ğrı olu umuna neden olan elektrokimyasal olayları engelleyen) ve antienflamatuvar etkiye sahip oldu ğunu buna kar ın dikkate de ğer bir gastroprotektif etkiye sahip olmadı ğını göstermi lerdir.
Mansoor vd. (2004), G. olivieri ’nin antihipertansif özelli ğini klinik deneylerle ara tırmı lardır. Deneyler sonucunda bu bitkinin insanlarda da antihipertansif özelli ğinin oldu ğu ve her durumda hipotansif etki yarattı ğı, buna ek olarak da hiçbir yan etkisinin gözlenmedi ği vurgulanmı tır.
G. olivieri ’nin hipoglisemik etkisi in vivo modellerde çalı ılmı tır (Sezik vd. 2005). Bunun için normal, glukoz hipoglisemik ve streptozotosin kaynaklı diyabetik sıçanlar kullanılmı tır. Etken madde olarak izoorientin, G. olivieri ’den etanol ekstraksiyonu ile izole edilmi tir. Đzoorientinin, 15 mg/kg dozda antihiperlipidemik etki gösterdi ği bulunmu tur. Ekstraktların ve fraksiyonların izoorientin konsantrasyonu, hipoglisemik aktivite ile korelasyon gösterdi ği HPLC ile tespit edilmi tir.
2.6.3 Doku kültürü çalı maları
Ya ğcı (2005) yüksek lisans tez çalı masında G. olivieri bitkisinin tohumlarını in vitro çimlendirmi ve elde etti ği fidelerden aldı ğı eksplantlar ile bitkinin doku kültürüne cevabını ara tırmı tır. Đn vitro çimlendirme ve kallus kültürü için MS ve makro tuzları WPM’dan olu an modifiye MS ortamları kullanılmı tır. Çimlenmeyi uyarmak için ortamlara 0, 0.1, 0.2 ve 0.4 mM GA 3 eklenmi ve inkübasyon karanlık, 1500 ve 3000 lux ı ık iddetinde gerçekle tirilmi tir. En çok çimlenmenin 3000 lux ı ık iddetinde,
0.2 mM GA 3 içeren modifiye MS ortamında oldu ğu bulunmu tur. Kallus olu umunu uyarmak için ise ortamlara 2.0-4.0 mg/l BAP ve 0.2-0.4 mg/l IAA eklenmi ve yaprak,
43 kotiledon, hipokotil, kök ve apikal meristem eksplantları kullanılmı tır. Sonuçta her iki ortamda ve bütün büyüme düzenleyicilerde yaprak ve kotiledon eksplantları doku kültürüne cevap vermemi fakat hipokotil ve kök eksplantları modifiye MS ortamında, tüm büyüme düzenleyicilerde kallus dokusu olu turmu tur.
44 3. MATERYAL ve YÖNTEM
Bu çalı ma, 2005-2011 yılları arasında Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Bitki Doku Kültürü Laboratuvarı, Gazi Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmakognozi Ana Bilim Dalı ve Hacettepe Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmakognozi Ana Bilim Dalı laboratuvarlarında gerçekle tirildi.
3.1 Materyal
Halk arasında toprak üstü (çiçekli herba) kısmı demlenerek kullanıldı ğından, G. olivieri Gaziantep yöresindeki aktarlarda kurutulmu olarak satılmaktadır. Doku kültürü deneyleri için Gaziantep’ten kurutulmu bitki demetleri satın alındı ( ekil 3.1) ve bunlardan elde edilen tohumlar in vitro çimlendirildi. Elde edilen aseptik fidelerden eksplantlar alınarak kallus kültürü kuruldu. Satın alınan bitki örneklerinin te hisi Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Herbaryumu’nda (ANK) yapıldı.
ekil 3.1. Gaziantep’ten aktardan satın alınmı G. olivieri herbası
3.2 Yöntem
Tez çalı ması, G. olivieri tohumlarının in vitro çimlendirilmesi, elde edilen fidelerden eksplant alınarak kallus kültürü yapılması, ardından sekonder metabolit içeri ği daha çok
45 olabilecek kallusların seçilerek bunlardan süspansiyon kültürünün kurulması ve kallus ile süspansiyon kültürlerindeki sekonder metabolitlerin ara tırılması olmak üzere dört basamakta yapıldı. Đn vitro çimlendirmede WPM (Woody Plant Medium) (Lloyd ve McCown 1980); kallus kültürü için WPM ve MS (Murashige ve Skoog) (1962) ve süspansiyon kültürü için yine WPM besin ortamları kullanıldı.
3.2.1 Besin ortamının hazırlanması
3.2.1.1 Stok çözeltiler
Besin ortamı hazırlanırken ortamın içerdi ği maddeler hassas terazi kullanılarak tartıldı. Makro elementler için 10x’lik; mikro elementler, vitaminler ve demir tuzları için 100x’lik stok çözeltiler hazırlandı. Stok çözeltiler renkli cam i elere konup etiketlenerek +4 °C’de buzdolabında saklandı. Besin ortamı hazırlanırken stok çözeltilerden alınacak miktarlar a ağıdaki formüle göre belirlendi (Slack ve Tufford 1995).
istenilen konsantrasyon × ortam hacmi Đstenilen stok hacmi = stok çözeltinin konsantrasyon
Çalı malar sırasında hazırlanan 1 litre besin ortamına WPM için % 2 (20 g/l), MS ortamı için % 3 (30 g/l) sakaroz ve kallus kültürlerinde % 0.8 (8 g/l) agar ilave edildi.
3.2.1.1.1 Major tuz stok çözeltilerinin hazırlanması
1 litrelik balonjoje içine yakla ık 700 ml distile su konuldu. Çizelge 3.1’deki maddeler sırasıyla tartılıp balonjojedeki suya eklendi. Homojen da ğılımı sa ğlamak amacıyla balonjojenin içindeki sıvı devamlı karı tırıldı ve ölçü çizgisine kadar distile su ile 1 litreye tamamlandı. Besin ortamından 1 litre hazırlanaca ğında, bu major tuz sto ğundan 100 ml alındı.
46 Çizelge 3.1. WPM ve MS ortamları için major tuz stok çözeltisi (10x), (g/l)
Major tuzlar WPM MS
Amonyum nitrat (NH NO ) 4 16.5 4 3 Potasyum nitrat (KNO ) - 19 3 Magnezyum sülfat (MgSO 4.7H 2O) 3.7 3.7
Kalsiyum nitrat [Ca(NO 3)2.4H 2O] 5.56 -
Potasyum dihidrojen fosfat (KH 2PO 4) 1.7 1.7
Kalsiyum klorür (CaCl 2.2H 2O) 0.96 4.4
Potasyum sülfat (K 2SO 4) 9.9 -
3.2.1.1.2. Minor tuz stok çözeltilerinin hazırlanması
Minör tuz stokları da majör tuz stoklarına benzer ekilde 1 litrelik balonjojelerde hazırlandı. Çizelge 3.2’deki maddeler sırasıyla tartıldı. WPM için demir stok çözeltisi ayrıca hazırlanmadı ve minor stokla birlikte ve aynı konsantrasyonda hazırlandı. Kobalt klorür ve bakır sülfatın MS ortamındaki miktarları dü ük oldu ğundan ayrı bir stok olarak hazırlandıktan sonra minör stok çözeltisine ilave edildi. Bunun için 25 mg kobalt klorür ve 25 mg bakır sülfat tartılıp, 100 ml distile suda çözüldü. Bu çözeltiden 10 ml alınıp önceden hazırlanan minör stok çözeltisine ilave edildi (Bu sto ğun 10 ml’sinde 2.5 mg kobalt klorür ve 2.5 mg bakır sülfat vardır). Minör tuz sto ğu bu ekilde hazırlandıktan sonra distile su ile 1 litreye tamamlandı. Besin ortamından 1 litre hazırlanaca ğı zaman, bu minör tuz sto ğundan 10 ml alındı.
Çizelge 3.2. WPM ve MS ortamları için minor tuz stok çözeltisi (100x), (mg/l)
Minor tuzlar WPM MS
Borik asit (H 3BO 3) 620 620
Sodyum EDTA (Na 2EDTA .2H 2O) 3720 -
Demir sülfat (Fe 2SO 4.7H 2O) 2780 -
Mangan sülfat (MnSO 4.4H 2O) 2230 2230
Sodyum molibdat (Na 2MoO 4.2H 2O) 25 25
Çinko sülfat (ZnSO 4.7H 2O) 860 860
Kobalt klorür (CoCl 2.6H 2O) - 2.5
Bakır sülfat (CuSO 4.5H 2O) 25 2.5 Potasyum iyodür (KI) - 83
47 3.2.1.1.3 MS ortamı için demir stok çözeltisinin hazırlanması
1 litrelik balonjojeye 700 ml distile su koyulduktan sonra balonjoje manyetik karı tırıcı üstüne koyuldu. Çizelge 3.3’teki maddeler tartılıp balonjoje içine katıldı ve çözünmeleri sa ğlandı. Daha sonra karı ım distile su ile 1 litreye tamamlandı. Besin ortamından 1 litre hazırlanaca ğı zaman, demir sto ğundan 10 ml alındı. Hazırlanan demir sto ğu buzdolabında ve renkli i ede saklandı. I ık kar ısında dayanıksız olması nedeni ile demir sto ğunun karanlıkta kalmasına dikkat edildi.
Çizelge 3.3. MS ortamı için demir stok çözeltisi (100x), (g/l)
Demir sülfat (Fe 2SO 4.7H 2O) 2.78
Sodyum EDTA (Na 2EDTA) 3.72
3.2.1.1.4 Vitamin stok çözeltisinin hazırlanması
Çizelge 3.4’teki maddeler sırayla tartıldı. 1 litrelik balonjoje içine 700 ml distile su koyularak manyetik karı tırıcı üstüne yerle tirildi. Karı tırıcı yardımıyla maddeler eritildi. Karı ım distile su ile 1 litreye tamamlandı. 1 litrelik besin ortamlarının hazırlanmasında bu vitamin sto ğundan 10 ml alındı.
Çizelge 3.4. WPM ve MS ortamları için minor tuz stok çözeltisi (100x), (g/l)
Vitaminler WPM MS Myo - inositol 10 10 Piridoksin HCl 0.05 0.05 Tiyamin HCl 0.1 0.01 Nikotinik asit 0.05 0.05 Glisin 0.2 0.2
48 3.2.1.2 Bitki büyüme düzenleyicileri
Ortamlara, çimlenmeyi uyarmak için 0.1 mM (0.0345 g/l) GA 3, kallus olu umunu uyarmak ve süspansiyon kültüründeki hücrelerin geli imini devam ettirmek için 1 mg/l NAA ile de ği ik konsantrasyonlarda BAP veya Kin uyarıcıları eklendi (Çizelge 3.5). Đn vitro çimlendirme ortamında kullanılan GA 3, tartılıp 1 M NaOH ile çözülerek ortama eklendi. Di ğer büyüme düzenleyiciler için ise stok çözeltiler hazırlandı.
Çizelge 3.5. Kallus ve süspansiyon kültürü için ortamlarda kullanılan büyüme düzenleyicileri ve konsantrasyonları
Ortam NAA (mg/l) BAP (mg/l) Kinetin (mg/l) M1 1 0.5 - M2 1 - 0.5 M3 1 - 0.2 W1 1 0.5 - W2 1 - 0.5 W3 1 - 0.2
3.2.1.2.1 Naftalen Asetik Asit (NAA) stok çözeltisi (1 mg/ ml)
100 mg NAA hassas terazide tartıldı. 100 ml’lik balonjojeye birkaç ml distile su koyuldu ve tartılan madde eklendi. Maddenin çözünmesini sa ğlamak amacıyla, çözünene kadar 1M NaOH, karı ımın üstüne damla damla ilave edildi. Maddenin tamamı çözündükten sonra distile su ile 100 ml’ye tamamlandı. Çizelge 3.5’teki miktarlarda olacak ekilde besin ortamlarına katıldı.
3.2.1.2.2 Benzil Amino Purin (BAP) stok çözeltisi (1 mg/ ml)
100 mg BAP hassas terazide tartıldı. 100 ml’lik balonjojeye birkaç ml distile su koyuldu ve tartılan madde eklendi. Maddenin çözünmesini sa ğlamak amacıyla, çözünene kadar 1M HCl, karı ımın üstüne damla damla ilave edildi. Maddenin tamamı çözündükten
49 sonra distile su ile 100 ml’ye tamamlandı. Çizelge 3.5’teki miktarlarda olacak ekilde besin ortamlarına katıldı.
3.2.1.2.3 Kinetin stok çözeltisi (1 mg/ ml)
100 mg Kinetin hassas terazide tartıldı. 100 ml’lik balonjojeye birkaç ml distile su koyuldu ve tartılan madde eklendi. Maddenin çözünmesini sa ğlamak amacıyla, çözünene kadar 1M HCl, karı ımın üstüne damla damla ilave edildi. Maddenin tamamı çözündükten sonra distile su ile 100 ml’ye tamamlandı. Çizelge 3.5’teki miktarlarda olacak ekilde besin ortamlarına katıldı.
3.2.1.3 Besin ortamlarının hazırlanması
Deneylerde kullanılacak olan 1 litre besin ortamı, 1000 ml hacimli balon jojelerde hazırlandı. Balon joje, manyetik karı tırıcı üstüne yerle tirildi ve içine yakla ık 250 ml distile su ile magnetik balık koyuldu. Hassas terazide WPM için 20g/l, MS için 30 g/l sakaroz tartıldı balon jojede bulunan su içine katılarak çözülmesi sa ğlandı. Daha sonra ortam formülüne göre stoklar her iki ortam için de a ağıdaki sırayla katılıp homojen olarak karı ması sa ğlandı:
Major tuz sto ğundan 100 ml Minör tuz sto ğundan 10 ml Demir sto ğundan (MS için) 10 ml Vitamin sto ğundan 10 ml
Đn vitro çimlendirme için hazırlanan besin ortamına yukarıda anlatıldı ğı ekilde GA 3 eklendi. Kallus ve süspansiyon kültürü için kullanılan besin ortamlarına ise çizelge 3.5’de gösterilen konsantrasyonlarda büyüme düzenleyicileri stoklardan gerekli miktarlar hesaplanarak eklendi ve balonjojenin boynundaki çizgiye kadar distile su eklenerek ortam hazırlandı. Hazırlanan ortamlar, pH ölçümünün daha rahat yapılaca ğı
50 ağzı geni erlenmayerlere aktarıldı. Erlenlerin üzerine cam kalemi ile hangi ortam oldu ğu yazıldı. Deneylerde kolaylık sa ğlamak amacıyla WPM ortamı W, MS ortamı ise M harfiyle temsil edildi. Ortamlar içindeki büyüme düzenleyicilerin türü ve miktarı ise W veya M harflerinden sonra gelen 1, 2 veya 3 sayılarıyla gösterildi.
Büyüme düzenleyiciler ilave edildikten sonra ortamların pH’ları 5.8’e ayarlandı. Kallus kültürü için ortamlara jelle tirici ajan olarak her litre çözelti için 8 g agar tartılıp eklendi. Süspansiyon kültüründe kullanılan ortamlar sıvı oldu ğundan agar eklenmedi. Erlenmayerlerin a ğızları pamuk tıkaçla kapatıldı ve üstleri alüminyum folyo ile sarıldı. Böylece ortamlar sterilizasyona hazırlandı.
3.2.1.4 pH ayarı
Ortamların pH ayarları agar ilave edilmeden önce yapıldı. Önceden hazırlanmı olan ve geni a ğızlı erlenmayerlere koyulan besin ortamları, manyetik karı tırıcı üstüne koyuldu ve pH’ı ölçüldü. Tez çalı masında kullanılan tüm besin ortamlarının pH de ğerleri 1 M HCl ya da 1 M NaOH kullanılarak 5.8±0.02’e ayarlandı.
3.2.1.5 Sterilizasyon
Denemeler öncesinde çalı ma yapılacak laboratuvarın alet ve ekipmanların sterilizasyonu yapıldı. Materyal olarak kullanılan bitkinin tohumlarının yüzey sterilizasyonu ve ekim yapılacak olan kabinin bulundu ğu ekim odasının da sterilizasyonu yapıldı.
3.2.1.5.1 Besin ortamının sterilizasyonu
Sterilizasyona hazırlanmı olan besin ortamları otoklavda 1.2 bar basınç altında, 121 ° C’de 15 dakika steril edildi.
51 3.2.1.5.2 Di ğer malzemelerin sterilizasyonu
Çalı maların ekim safhasında, tohumları süzmek amacıyla kullanılacak olan kaba filtre ka ğıdı (kare eklinde kesilip dörde katlanmı ) ve bir adet küçük cam huni, 1000 ml’lik bo beher içine koyuldu. Eksplant ekimi sırasında üstünde trimleme (fazla parçaların ayıklanıp temizlenmesi) yapılacak olan kaba filtre ka ğıtları petri içine sı ğacak ekilde kesildikten sonra bir petriye yerle tirildi. Yüzey sterilizasyonu için kullanılacak olan distile su, ihtiyaç duyuldu ğu miktarda erlenmayerlere koyuldu, a ğızları pamuk tıkaçla kapatıldı. Metal malzemeler (bisturi, pens gibi) alüminyum folyo ile sarıldı. Tüm bu malzemeler ile birlikte çimlendirme ve yüzey sterilizasyonu için kullanılan metal kapaklı cam kavanozlar da otoklavda steril edildi. Petriler ise alüminyum folyo ile sarıldıktan sonra etüvde 180 °C’de 2 saat bekletilerek steril edildi.
3.2.1.5.3 Ekim odasının sterilizasyonu
Ekim i leminin yapılaca ğı kabinin bulundu ğu oda, odadaki ekipmanlar (masa, tabure vs.) ve laminar kabin antiseptik bir çözelti olan %1’lik zefiranla veya % 10’luk NaOCl (çama ır suyu) ile silindi. Bu i lemden sonra ekim odasında bulunan laminar kabinin tüm yüzeyleri % 70’lik etanol ile dezenfekte edildi. Dezenfeksiyon i lemi sırasında, ekimde kullanılacak steril metal ve cam malzemeler kabine yerle tirildi. Đleri sterilizasyon için kabin içindeki UV-C lambası 24 saat açık bırakıldı.
Ekim odasına girilmeden önce önlük giyildi, galo ve maske takıldı, eller alkolle silindikten sonra steril cerrahi eldiven giyildi. Ellerin sterilizasyonu, ekim i lemi boyunca aralıklarla % 70’lik etanol püskürtülerek yapıldı.
Ekim odasında yapılan tüm sterilizasyon i lemlerinin yanı sıra ekim anında kullanılan bisturi, pens gibi metal malzemeler her kullanı ta % 96’lık alkole batırılıp bek alevinden geçirildi.
52 3.2.1.5.4 Tohum için yüzey sterilizasyonunun basamakları
1. Sonraki a amada kullanılmak üzere 200 ml, % 5’lik sodyum hipoklorit (NaOCl) hazırlanıp steril cam kavanoza koyuldu. 2. Tohumlar, cam kavanozlara konan 1 damla Tween 20 damlatılmı % 70’lik etil alkolde 1 dakika bekletildi. Tohumların alkolden zarar görmemesi için sürenin 1 dakikadan fazla olmamasına dikkat edildi. 3. Tween 20 içeren etil alkol içerisindeki tohumlar süzüldü ve steril kabin içinde % 5’lik NaOCl ile 10 dakika steril edildi. 4. 10 dakika sonunda NaOCl süzüldü ve steril distile su ile 3 defa 5’er dakika çalkalamak suretiyle durulama yapıldı. 5. Beher içine koyulup steril edilen kaba filtre ka ğıdı, cam huniye yerle tirildi ve durulama bitiminde tohumlar kaba filtre ka ğıdından süzüldü. 6. Süzme i leminden sonra tohumlar ekime hazır hale geldi.
3.2.1.5.5 Eksplantların yüzey sterilizasyonu
Kallus olu umu için kullanılacak olan eksplantlar in vitro çimlendirilen ve steril geli en fidelerden alındı ğından herhangi bir sterilizasyon i lemi yapılmadı (Ya ğcı 2005). Yapılan ekimlerde kontaminasyon miktarının çok az olması eksplant sterilizasyonunun gerekli olmadı ğını do ğruladı.
3.2.1.6 Ortamların petrilere dökülmesi
Çimlendirme deneylerinde 10 cm çapında cam petriler ile metal kapaklı cam kavanozlar kullanıldı. Otoklavda 121 °C’de 15 dakika steril edilen besin ortamları otoklavdan çıkarıldı ve katıla masına izin verilmeyecek ekilde sıcaklı ğı dü ene kadar bekletildi. Böylece ortam katıla ırken meydana gelen buharla ma ile ortaya çıkacak olan serbest suyun olu ması önlendi.
53 Ortamlar, petriler ve cam kavanozlar, sterilizasyonun devamlılı ğına özen göstermek suretiyle ekim odasına alındı. Ortamlar, steril laminar kabin içinde, steril petri ve kavanozlara döküldü. Bu i lem sırasında ortamların bulundu ğu erlenmayerlerin a ğız kısımları her açı ta bek alevinden geçirildi. Ortamların petrilere döküm i lemleri tamamlandıktan sonra petri ve kavanozların üstüne ortamın adı ve varsa önemli özellikleri çıkmayacak bir biçimde yazıldı. Petrilere dökülen besin ortamlarının iyice katıla ması ve olası kontaminasyonların ekim yapılmadan önce görülebilmesi için 24 saat beklendi.
3.2.1.7 Ortamlara yapılan ekimler
3.2.1.7.1 Tohum çimlendirilmesi
Ekime hazır bulunan tohumlar, önce alkol sonra alevden geçirilen steril pens yardımıyla her petri/kavanozda 25 tohum olacak ekilde ekildi ( ekil 3.2). Deneylerde 10 cm çapında cam petriler ve kavanozlar kullanıldı. Ekim yapılırken tohumların birbirine çok yakın olmamasına, besiyerine batırılmamasına ve dengeli da ğılmalarına dikkat edildi. Ekim i lemi bittikten sonra kapakları kapatılan petrilerin kenarları streç filmle sarıldı ve 60 gün inkübe edildi.
Çimlenmede inkübasyon 3000 lux ı ık iddetine sahip bitki yeti tirme odasında yapıldı. Aydınlatma, so ğuk beyaz floresan lambalarla yapıldı ve fotoperiyot, 16 saat aydınlık / 8 saat karanlık olacak ekilde ayarlandı. Ortam sıcaklı ğı tüm aydınlatma artlarında (karanlık ve 3000 lux ı ık iddeti) 24±1 °C’de sabit tutuldu (Ya ğcı 2005).
54
ekil 3.2. a. Gentiana olivieri Griseb. tohumları, b. Ekilen tohumların petrideki durumu
3.2.1.7.2. Kallus kültürü
Tohumların ortamlara ekilmesinden 60 gün sonra elde edilen fidelerden alınan kök ve yaprak eksplantları çizelge 3.5’te gösterildi ği ekilde hazırlanan ortamlara ekildi. Fidelerin aseptik (steril) olması nedeniyle ekim yapılırken eksplant sterilizasyonu yapılmadı. Kök eksplantları yakla ık 1 cm uzunlu ğunda parçalar olacak ekilde trimlenerek hazırlandı. Yapraklar zayıf yapılı olması nedeniyle çok hırpalamadan yine yakla ık 1 cm olacak ekilde trimlenerek veya direkt ortama aktarıldı. Kallus kültürünün ilk denemesinde her petriye, kökten 5, yapraktan büyüklü ğüne göre de ği mekle birlikte 5-6 adet eksplant ekildi ( ekil 3.3). Ekim yapılırken eksplantların birbirine çok yakın olmamasına, besiyerine batırılmamasına ve dengeli da ğılmalarına dikkat edildi. Ekim i lemi bittikten sonra petrilerin kapakları kapatılarak kenarları streç filmle sarıldı. Denemeler 3 kere tekrarlandı.
55
ekil 3.3. a. Ekilen kök, b. yaprak eksplantlarının petrideki konumları
Kallus kültürü için yapılan ilk denemede kök ve yaprak eksplantları çizelge 3.5’te gösterilen ortamlara ekildi ve karanlıkta inkübe edildi. Yaprak eksplantlarının kullanıldı ğı ikinci denemede ise petriler, 3000 lux ı ık iddetindeki bitki yeti tirme odasında inkübe edildi. Aydınlatmada fotoperiyot, 16 saat aydınlık / 8 saat karanlık olacak ekilde ayarlandı. Ortam sıcaklı ğı tüm aydınlatma artlarında 24±1 °C’de sabit tutuldu.
Eksplant ekimini takiben ilk 30 gün kallus olu umu a aması olarak adlandırıldı. Bu a amadan sonra geli imlerine devam eden kalluslar her 30 günde bir aynı içeri ğe sahip taze ortamlara aktarılarak alt kültürleri yapıldı. Bu ekilde ilk kallus kültürü denemesinde kök ve yaprak eksplantından olu an kalluslar 3 alt kültür boyunca izlendi. Her alt kültüre aktarım a amasında aktarılan kallusların a ğırlıkları tartıldı ve bir miktar kallus tartılıp analiz yapılabilmesi için derin dondurucuya alındı. Kallusların ya ağırlıklarına göre geli iminin izlenmesi için kallus büyüme indeksi (KB Đ) hesaplandı (Memi oğlu 2005).
Son hücre a ğırlı ğı (g) Kütle Büyüme Đndeksi (KB Đ) = Đlk hücre a ğırlı ğı (g)
Bu denemelerde alınan sonuçlara göre yaprak eksplantının kallus olu turma yetene ğinin ve içerdi ği sekonder metabolitlerin fazla oldu ğu belirlendi. Bu nedenle ikinci denemede
56 sadece yaprak eksplantı kullanıldı ve inkübasyon 3000 lux ı ık iddetinde yapıldı. Kallus geli imi, ilk denemede oldu ğu gibi 3. alt kültür sonuna kadar izlendi, analiz için bir miktar kallus derin dondurucuya alındı ve aynı ekilde KB Đ de ğerleri hesaplandı.
3.2.1.7.3 Süspansiyon kültürü
ĐTK ile yapılan analizler sonucunda leke sayısının ve lekelerin yo ğunlu ğunun (miktar olarak fazla olanlar) en çok WPM ortamında geli en, yaprak eksplantından olu an kalluslarda oldu ğu gözlendi. Bu nedenle süspansiyon kültürü için de WPM ortamında (W1, W2 ve W3) geli en kallusların yine aynı içeri ğe sahip sıvı ortamda süspansiyon kültürlerine geçirilmesine karar verildi.
Süspansiyon kültürü için içerikleri kallus kültürüyle aynı olan W1, W2 ve W3 ortamları hazırlandı. Ortamlara katıla tırıcı ajan olan agar eklenmedi. Süspansiyon kültürleri 100 ml’lik cam erlenlerde kuruldu ve her erlende 25’er ml ortam payla tırıldı. Đnokülasyon (a ılama) için en uygun zaman, kallus kültüründe büyümenin fazla oldu ğu 15. gün olarak belirlendi (Gürel vd. 2002). 15. günde alınan kalluslar steril kabin içinde, her erlene 0.75 g olacak ekilde tartılarak süspansiyon kültürü kuruldu. Süspansiyon kültürleri için kullanılan erlenler 100-110 rpm hızda çalı an orbital çalkalayıcıda (Chueh vd. 2000, Gürel vd. 2002), 24±1°C’de, 3000 lux ı ık iddetinde ve 16 saat aydınlık / 8 saat karanlık fotoperiyotta 25 gün inkübe edildi.
Her be günde bir, her ortamdan üçer erlen, naylon ve sık gözenekli bir kuma tan (por çapı yakla ık 3.2-3.3 µm), Buchner hunisi yardımıyla süzüldü. Süzülen hücreler tartılarak hücrelerin ya a ğırlıkları ölçüldü ve hücre artı ı (KB Đ) hesaplandı. Hücreler süzüldükten sonra geriye kalan ortamın hacmi ve pH’ı ölçülerek ba langıç miktarıyla farkları belirlendi.
57 3.2.2 G. olivieri , kallus ve süspansiyon ekstrelerinin hazırlanması
Elde edilen kallus hücrelerinin içerdi ği sekonder metabolitlerin ara tırılması için alt kültüre alınma esnasında tartılarak ayrılan kalluslar kullanıldı. Đçerdikleri maddelerin bozulmasını minimum seviyede tutmak için derin dondurucuda (-20°C) dondurulan hücreler daha sonra liyofilizatörde kurutuldu ve analiz yapılana kadar desikatörde korundu. Yapılan literatür taramasıyla flavonoit ve iridoit yapılı bile iklerin metanolle ekstre edilebilece ği belirlendi (Ersöz 1988, Menkovic vd. 2000a ve Menkovic vd. 2000b).
Đlk denemede karanlıkta inkübe edilerek elde edilen kalluslar ezilerek toz haline getirildi. Toz halindeki hücrelerden 100 mg tartılarak ekstraksiyon için hazırlandı, 50 ml’lik cam erlenlere alındı ve etiketlendi. Bu hücrelerin üzerine 7 ml %80’lik metanol eklenerek 10 dk ultrasonik su banyosunda tutularak hücre çeperlerinin parçalanıp hücre içinde üretilen maddelerin metanol içine geçmesi sağlandı. Ardından erlenler, 50°C’lik su banyosunda 1 saat tutuldu. Bu süre sonunda hücreler tekrar ultrasonik su banyosunda 10 dk bekletildi ve 10 ml hacimli balonjojelere filtre ka ğıtlarından süzüldü. %80’lik metanol ile hacimleri 10 ml’ye tamamlandı.
Đkinci denemede ise aydınlıkta inkübe edilen kallus ve süspansiyon kültüründen elde edilip kurutulan hücreler kullanıldı. HPLC’de analizlenecek olan bu örneklerin ekstraksiyonu için yapılan literatür taraması sonucunda, örneklerin miktarları da göz önünde bulundurularak, daha önceki ekstraksiyon yönteminde de ği iklikler yapıldı (Jiang vd. 2005, Aberham vd. 2007). Toz halindeki hücrelerden 80 mg tartılarak ekstraksiyon için hazırlandı, 50 ml’lik cam erlenlere alındı ve etiketlendi. Bu hücrelerin üzerine 7 ml metanol eklenerek 10 dk ultrasonik su banyosunda tutuldu. Ardından erlenler, oda sıcaklı ğında 1 gece bekletildi. Bu süre sonunda hücreler tekrar ultrasonik su banyosunda 10 dk bekletildi ve 10 ml hacimli balonjojelere filtre ka ğıtlarından süzüldü. Metanol ile hacimleri 10 ml’ye tamamlanarak ekstreler hazırlandı. G. olivieri yaprak ve çiçeklerinden 80 mg tartılarak örneklerle aynı ekilde hazırlanan metanolik ekstre ise hem ĐTK hem de HPLC’de pozitif kör olarak kullanıldı. ĐTK’da plaklara
58 yapılan tatbik sayısını azaltmak ve HPLC’de elde edilecek piklerin daha net belirlenebilmesini sa ğlamak amacıyla, hazırlanan ekstrelerin konsantre edilmesinin daha uygun olaca ğı dü ünüldü. Ekstreler azot gazı varlı ğında kurulu ğa kadar uçuruldu ve plaklara tatbik edilmeden önce her birine 2 ml metanol eklenerek yine ultrasonik su banyosunda birkaç dakika tutuldu (ekstrelerin son konsantrasyonu 32 mg/ml).
3.2.3 Standart maddelerin hazırlanması
Flavonoit yapılı Đzoviteksin (Iv) (Fluka, Germany), Viteksin (Vi) (Fluka, Germany) ve Đzoorientin (Homoorientin) (Io) (Chromodex, USA) ile iridoit yapılı Svertiamarin (Sw) (Chromodex, USA) ve Gentiopikrozit (Gp) (Sigma Aldrich, Germany) satın alındı. Her birinden 1’er mg tartılarak üzerine 10 ml metanol eklendi ve daha iyi çözünmesini sa ğlamak amacıyla birkaç dakika ultrasonik su banyosunda tutuldu (son konsantrasyon 0.1 mg/ml= 100 ppm).
3.2.4 Kallus ve süspansiyon kültürlerinde sekonder metabolit analizi
3.2.4.1 Đnce tabaka kromatografisi ( ĐTK)
Kallusların içerdi ği sekonder metabolitler hakkında bilgi edinebilmek amacıyla ince tabaka kromatografisi ( ĐTK) yapıldı. Tatbikler Merck marka silika jel plaklara
(Kieselgel 60 F 254) yapıldı. Yapılan literatür taramasında iridoit ve flavonoit yapılı maddelerin aynı solvan sistemlerinde ayrılabildikleri belirlendi (Ersöz 1988). Karanlık inkübasyon sonucunda elde edilen kallusların içerdiği sekonder metabolitler hakkında bilgi edinebilmek amacıyla iki solvan sistemi (Sistem I ve Sistem II) kullanıldı. Plaklara revelatör olarak %5’lik H2SO 4 ve Naturstoff reaktifi (NA) püskürtüldü. Lekeler UV 366 ve günı ığında gözlenerek de ğerlendirildi.
Sistem I. Etil asetat : Formik asit : Asetik Asit : Su (100:11:11:27) Sistem II. Kloroform : Metanol : Su (61:32:7)
59 Aydınlık inkübasyon sonucunda elde edilen kallusların ve süspansiyon kültürlerinin içerdi ği sekonder metabolitleri ara tırırken ise daha iyi ayrım yaptı ğı gözlenen solvan sistemi II kullanıldı. Revelatör olarak plaklara, flavonoitleri belirgin hale getiren NA püskürtüldü. Lekeler UV 366 ve günı ığında gözlenerek de ğerlendirildi.
3.2.4.2 Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (HPLC)
Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi ile yapılan çalı mada tüm örnekler cihaza verilmeden önce 0.22 µm por çapındaki naylon filtrelerden geçirildi. Aynı ekilde solvanlar da Sartorius marka süzme kitinden 0.45 µm por çapına sahip naylon filtreden geçirildi. Kullanılan cihaz, kolon ve solvanlar a ağıdaki gibidir:
Cihaz: Dionex Thermostatted Column Compartment TCC-100 (California, USA) Pompa: P860 HPLC Pump Örnek Tablası: ASI-100 Automated Sample Injector Kolon yuvası: Thermostatted Column Compartment TCC-100 Dedektör: UVD340U Dalga boyu: 230, 254, 270 ve 300 nm Pik görüntüleme programı: Chromeleon ver. 6.50 Kolon: Supelco Lichrosphere RP 18, 5 µm (250 mm x 4.6 mm)
A: pH 2.7 HPLC kalitesinde su (pH deri ik H2SO 4 ile ayarlandı) B: HPLC kalitesinde asetonitril (Carlo Erba marka) Kolon sıcaklı ğı: 27 °C Akı hızı: 1 ml/dk
Sekonder metabolitlerin ayrımını en iyi ekilde yapabilmek için iki program denendi. Đlk olarak Jiang vd. (2005)’un kullandı ğı program düzenlenerek kullanıldı (Program I). Daha sonra ise bu program tekrar düzenlenerek olu turulan Program II denendi.
60 Program I 0-22.5 dk %10 B (izokratik), 22.5-25 dk %10-20 B (lineer), 25-32.5 dk %20 B (izokratik), 32.5-40 dk %20-90 B (lineer), 40-45 dk %90 B (izokratik), 45-50 dk %90- 10 B (lineer). Bu programda enjeksiyon hacmi 20 µl olarak ayarlanmı tır.
Program II 0-15 dk %10-15 B (lineer), 15-20 dk %15-20 B (lineer), 20-30 dk %20 B (izokratik), 30-35 dk %20-25 B (lineer), 35-40 dk %25 B (izokratik), 40-45 dk %25-75 B (lineer), 45-50 dk %75-10 B (lineer). Bu programda enjeksiyon hacmi 10 µl olarak ayarlanmı tır.
3.2.5 HPLC sonuçlarının de ğerlendirilmesi
3.2.5.1 Piklerin do ğrulu ğunun belirlenmesi
Cihaza öncelikle standart maddeler verildi ve alıkonma (tutulma) zamanları (Rt- retention time) ile üç dalga boyunda verdikleri spektrumlar belirlendi. Daha sonra cihaza G. olivieri ekstresi verildi ve elde edilen kromatogramda standart maddelerin varlı ğı ara tırıldı. Örneklerin cihazda analizlenmesinden sonra alıkonma zamanları standart maddelere yakın olan pikler belirlendi. Piklerin aranan standart maddeye ait olup olmadı ğını belirlemek için örne ğin spektrumu ile standart maddenin spektrumu kar ıla tırıldı. E le en spektrumlar, örnekteki pikin standart madde olduğunu do ğruladı.
Alıkonma zamanları ve spektrumları birbirine yakın olan pikleri ayırt etmek için ise problem ya anan örneklere, standart flavonoitlerden birisi (izoorientin veya izoviteksin) eklenerek tekrar analizlendi. Pik alanının artı ı ile hangi flavonoit oldu ğuna karar verildi.
61 3.2.5.2 Kalibrasyon e ğrisinin çizilmesi
Đzoorientin ve izoviteksin standart maddelerinden hazırlanan seri dilüsyonların (çizelge 3.6) HPLC kolonuna uygulanması ile elde edilen piklerin alanlarının (y), konsantrasyon de ğerine (x) kar ı grafi ğe geçirilmesiyle her iki standart maddenin kalibrasyon e ğrileri elde edildi. Ekstrelerdeki madde miktarları hesaplanmadan önce her ekstre için elde edilen pik alanlarının ortalaması Microsoft Office Excel 2003 programı kullanılarak alındı ve standart hataları hesaplandı.
Çizelge 3.6. Đzoorientin ve izoviteksin standart maddelerinin kalibrasyonu için kullanılan konsantrasyonlar
Dilüsyon Konsantrasyon (ppm) Konsantrasyon (mg/ml) 1 10 0.01 2 25 0.025 3 50 0.05 4 100 0.1
62 4. ARA TIRMA BULGULARI
4.1 In vitro Çimlendirme
Tohumların in vitro çimlendirilmesi için 0.1 mM GA 3 içeren WPM ortamı kullanıldı. Đlk 15 gün içinde tohumlarda çimlenmeler gözlendi ( ekil 4.1). Aseptik fidelerin geli imi için 60 gün inkübasyon yapıldı. Kallus olu umu için karanlıkta yapılan ilk çalı mada yaprak ve kökler eksplant olarak kullanıldı. Kallus olu umu için aydınlıkta yapılan ikinci çalı mada da çimlenme artları aynı ekilde ayarlandı ve sadece yapraklar kullanıldı.
ekil 4.1. 60 gün inkübasyon sonunda çimlenen G. olivieri fideleri
4.2 Kallus Üretimi
4.2.1 Kallusların karanlıkta inkübasyonu
Yüksek lisans tez çalı masında eksplantların karanlıkta inkübe edilmesiyle daha fazla miktarda kallus elde edildi ği bulunmu tur (Ya ğcı 2005). Bu nedenle doktora tez çalı masında kallus olu turmak için in vitro çimlenen fidelerden alınan yaprak ve kök eksplantları ilk olarak karanlıkta inkübe edildi.
63 Eksplantların kallus olu turma ortamlarına aktarılmasının ardından ilk 30 gün içinde kallus olu umu gözlendi. Eksplant ekimini takip eden ay kallus olu um a aması, sonraki ay ise 1. alt kültür olarak adlandırıldı. Kallus kültürüne 3. alt kültür sonuna kadar devam edildi. 1. alt kültür sonunda MS ve WPM ortamlarında kök ve yaprak eksplantlarından olu an kalluslar ekil 4.2 ve 4.3’te görülmektedir.
4.2.2 Kallusların aydınlıkta inkübasyonu
Tez çalı masının ikinci denemesinde sekonder metabolitlerden flavonoitlerin topraküstü kısımda daha çok bulundu ğu göz önüne alınarak (Edis 2003) kallus olu umu için sadece yaprak eksplantları kullanıldı ve inkübasyon 3000 lux ı ık iddetinde gerçekle tirildi. Đlk denemedeki gibi ilk 30 günde kallus olu umu gözlendi. Deneme 3 alt kültür boyunca devam etti. 1. alt kültür sonunda MS ve WPM ortamlarında yaprak eksplantından olu an kalluslar ekil 4.4’teki gibidir.
4.2.3 Kütle büyüme indeksleri (KB Đ)
4.2.3.1 Karanlık inkübasyon için KB Đ bulguları
Kallusların bir önceki a amaya göre ne kadar arttı ğını gösteren çizelge 4.1’deki KB Đ sonuçlarına göre karanlık inkübasyonda yaprak eksplantlarının kallus olu umu a amasında daha iyi yanıt verdi ği gözlendi (KB Đ-1). Kök eksplantları ile kar ıla tırıldı ğında KB Đ-2 ve di ğerlerinde aynı çıkı ın devam etmedi ği görüldü. Bunun yanında kök eksplantlarının 1. alt kültürde KB Đ-2 de ğerinde fark edilir bir çıkı gözlendi. KB Đ-2 de ğeri için MS ortamının daha ba arılı oldu ğu belirlendi.
KB Đ-1 sonuçlarına göre her iki ortamda da yaprak eksplantları kök eksplantlarına göre daha iyi geli im gösterdi. WPM ortamı MS ortamına göre kallus geli iminde daha ba arılı bulundu (Çizelge 4.1).
64
ekil 4.2. 1.alt kültür sonunda karanlık inkübasyonla kök eksplantından olu an kalluslar a. M1K1, b. M2K1, c. M3K1, d. W1K1, e. W2K1, f. W3K1
65
ekil 4.3. 1.alt kültür sonunda karanlık inkübasyonla yaprak eksplantından olu an kalluslar. a. M1Y1, b. M2Y1, c. M3Y1, d. W1Y1, e. W2Y1, f. W3Y1
66
ekil 4.4. 1.alt kültür sonunda aydınlık inkübasyonla yaprak eksplantından olu an kalluslar. a. M1Y1, b. M2Y1, c. M3Y1, d. W1Y1, e. W2Y1, f. W3Y1
67 Buna göre 3. alt kültür sonunda karanlık inkübasyonla kök ve yaprak eksplantlarından elde edilen kallusların büyüme indeksleri çizelge 4.1 ve ekil 4.5’teki gibidir.
4.2.3.2 Aydınlık inkübasyon için KB Đ bulguları
Kallus olu umu için yapılan ikinci denemede yaprak eksplantı kullanılarak 3000 lux ı ık iddetindeki aydınlıkta kallus üretildi. 3. alt kültür sonuna kadar gözlenen kallus artı ını gösteren KB Đ de ğerleri çizelge 4.1 ve ekil 4.6’daki gibidir. Buna göre kallus olu umunda en çok artı KB Đ-1 de ğerinde görüldü. Aydınlıkta en iyi KB Đ-1 de ğeri 26.4 ile W2Y ortamında elde edildi.
68 Çizelge 4.1. Karanlık ve aydınlık inkübasyon ile üretilen kallusların kütle büyüme indeksleri-KB Đ (ak, alt kültür)
Büyüme Kallus Büyüme Đndeksi (KB Đ) Ortamlar Düzenleyiciler (mg/l) Karanlık Đnkübasyon Aydınlık Đnkübasyon (3000 lux)
NAA BAP Kin KB Đ-11 KB Đ-22 KB Đ-33 KB Đ-44 KB Đ-1 KB Đ-2 KB Đ-3 KB Đ-4
M1Y 1 0.5 - 38,63 3,09 1,88 2,38 12,27 8,93 8,14 2,26 M2Y 1 - 0.5 39,58 3,86 2,06 2,4 14,4 4,28 8,54 2,66 M3Y 1 - 0.2 46,25 3,22 2,33 2,49 20,8 3,25 6,98 2,76 W1Y 1 0.5 - 59,52 11,9 1,73 1,71 12,27 7,33 12,07 2,18
69 W2Y 1 - 0.5 48,51 5,67 2,18 2,34 26,4 4,87 8,36 1,11
W3Y 1 - 0.2 48,21 3,27 1,81 2,27 20,27 5,15 7,89 1,54 M1K 1 0.5 - 7,7 14,78 2,58 1,82 M2K 1 - 0.5 4,15 16,17 3,23 2,2 M3K 1 - 0.2 8,51 17 2,41 2,67 W1K 1 0.5 - 6,14 4,36 3,37 3,77 W2K 1 - 0.5 7,35 4,09 2,24 1,94 W3K 1 - 0.2 6,89 8,71 3,28 2,36
1KB Đ-1, kallus olu um a aması / eksplant a ğırlı ğı
2KB Đ-2, 1. Alt kültür / kallus olu um a aması
3KB Đ-3, 2. Alt kültür / 1. Alt kültür
4KB Đ-4, 3. Alt kültür / 2. Alt kültür
ekil 4.5. Karanlık inkübasyon yapılan kallus kültürlerinde yaprak (a) ve kök (b) eksplantlarına göre KB Đ de ğerlerindeki de ği iklikleri
70 gösteren grafikler
ekil 4.6. Aydınlık inkübasyon yapılan kallus kültürlerinde yaprak eksplantına göre KB Đ de ğerlerindeki de ği iklikleri gösteren grafikler
4.3 Süspansiyon kültürü
4.3.1 Kütle büyüme indeksi (KB Đ), ortam ve pH miktarındaki de ği imler
Süspansiyon kültüründe ço ğalan hücreler 25. güne kadar her be günde bir süzüldü ( ekil 4.7). Süzülen hücrelerin ya a ğırlıklarının tartılması sonucunda hücre artı ı belirlendi. Hücre artı ının en iyi gözlendi ği kültür ortamı, W3 olarak tespit edildi ( ekil 4.8). Hücre geli imine kar ılık ortam miktarında azalma ve pH’da dü me görüldü ( ekil 4.9-4.10).
71
ekil 4.7. Süspansiyon kültüründe geli en hücreler a. 5.gün b. 25.gün
ekil 4.8. Süspansiyon kültüründe 25 günlük inkübasyon süresince hücre ağırlıklarındaki de ği imler
72
ekil 4.9. Süspansiyon kültüründe 25 günlük inkübasyon süresince ortam miktarındaki de ği imler
ekil 4.10. Süspansiyon kültüründe 25 günlük inkübasyon süresince ortam pH’sındaki de ği imler
73 4.4 Kallus ve süspansiyon kültürlerinde sekonder metabolitlerin ara tırılması
4.4.1 Kalitatif analiz ( ĐTK)
4.4.1.1 Karanlık inkübasyonda geli en kallus kültürlerinin ĐTK’sı
Karanlık inkübasyon ile MS ve WPM ortamları kullanılarak yaprak ve kök eksplantlarından elde edilen kallus hücrelerinde üretilen sekonder metabolitler, solvan sistemi I ve II kullanılarak kalitatif olarak incelendi. Plaklara, lekeleri belirgin hale getirmek için solvan sistemi I’de %5’lik H 2SO 4, solvan sistemi II’de ise NA püskürtüldü. Plaklar gün ı ığı ve UV 366 ’da görüntülendi. ĐTK sonuçlarına göre hem WPM hem de MS ortamlarında karanlıkta geli en kalluslarda sekonder metabolitlerin üretildi ği gözlendi. Fakat referans olarak kullanılan G. olivieri ekstresiyle kar ıla tırıldı ğında lekelerin sayı ve miktarlarının daha az oldu ğu görüldü. Kalluslardan elde edilen ekstrelerde referans olarak kullanılan flavonoitlere rastlanmadı ( ekil 4.11, 4.12, 4.13. a ve 4.13. b). ĐTK pla ğında, özellikle kök eksplantından elde edilen ekstrelerde, iridoit yapılı bile iklerden svertiamarin ve gentiopikrozit ile aynı hizada lekeler gözlendi.
Yapılan literatür taramasına göre flavonoit ve iridoit grubu bile iklerin toprak üstü yani güne gören organlarda bir arada bulabildi ği tespit edildi (Çalı vd. 1992, Krstic vd. 2004). Bu nedenle bundan sonraki analizlere yaprak eksplantından elde edilen kalluslar
üzerinden gidilmesine ve inkübasyonunun ı ık altında yapılmasına karar verildi.
4.4.1.2. Aydınlık inkübasyonda geli en kallus kültürlerinin ĐTK’sı
Aydınlıkta MS ve WPM ortamlarında yaprak eksplantından elde edilen kalluslardaki sekonder metabolitler, solvan sistemi II kullanılarak kalitatif olarak incelendi. Plaklara, flavonoitleri belirgin hale getirmek için NA püskürtüldü. Plaklar gün ı ığı ve UV 366 ’da görüntülendi. WPM ortamında geli en hücrelerde üretilen sekonder metabolitlerin
74 (lekelerin) sayısının MS ortamındakilere göre daha çok oldu ğu gözlendi ( ekil 4.14). Ayrıca karanlık inkübasyonla kar ıla tırıldı ğında da üretilen metabolitlerin sayı ve yo ğunlu ğunun daha fazla oldu ğu bulundu. Bu nedenle süspansiyon kültürü için WPM ortamında geli en kalluslar kullanıldı. Flavonoitler için NA belirtecinin kullanılmasıyla kallus ekstrelerinde flavonoit yapıda olabilecek sarı renkli maddeler üretildi ği gözlendi. Đridoit grubu bile iklerle aynı hizada birçok leke gözlendi.
75 76
ekil 4.11. WY ve WK serisinde karanlıkta inkübe edilen 3 alt kültürde üretilen sekonder metabolitlerin solvan sistemi I’de, %5’lik H2SO 4’le görünümleri (a. günı ığında b. UV 366 ’da)
77
ekil 4.12. MY ve MK serisinde karanlıkta inkübe edilen 3 alt kültürde üretilen sekonder metabolitlerin solvan sistemi I’de, %5’lik H2SO 4’le görünümleri (a. günı ığında b. UV 366 ’da)
78
ekil 4.13. a. WY, WK ve b. MY, MK serilerinde karanlıkta inkübe edilen 3 alt kültürde üretilen sekonder metabolitlerin solvan sistemi II’de, NA ile UV 366 ’da görünümleri
4.4.1.3 Süspansiyon kültürlerinin ĐTK’sı
WPM ortamında geli en kalluslardan kurulan ve aydınlıkta inkübe edilen süspansiyon kültürlerinde üretilen sekonder metabolitlerin varlı ğı, solvan sistemi II kullanılarak ara tırıldı. Plaklara, flavonoitleri belirginle tiren NA reaktifi püskürtüldü. Plaklar gün
ı ığı ve UV 366 ’da görüntülendi. 10. günden sonra geli en hücrelerde metabolit yo ğunlu ğunun arttı ğı belirlendi ( ekil 4.15). Ekstrelerde, izoorientin ve izoviteksin flavonoitleriyle aynı hizaya denk gelen sarı renkli lekeler gözlendi.
4.4.2 Kantitatif analiz (HPLC)
WY serisinden elde edilen kallus ve yine WPM ortamı kullanılarak kurulan süspansiyon kültürlerinden elde edilen hücrelerdeki sekonder metabolitlerin varlı ğının ve miktarlarının G. olivieri ekstresi ve standart maddeler ile kar ıla tırılarak ara tırılması için HPLC yapıldı. HPLC’de madde ayrımının iyi olması için saf oldukları bilinen standart maddeler ( ekil 4.16. -4.17. a) ve G. olivieri ekstresi kullanılarak program I denendi. Daha iyi ayrım yapılabilece ği dü üncesiyle program I tekrar düzenlenerek program II olu turuldu. Standart maddeler saf olduklarından pikler net bir ekilde gözlense de ( ekil 4.16. b-4.17. b) yapılan kar ıla tırma sonucunda program II’de G. olivieri ekstresinde ayrımın tam gerçekle medi ği gözlendi ( ekil 4.18. b). Bu nedenle tüm standartlar ve ekstreler program I’deki gibi analizlendi. Program I’deki ayrım ba arılı bulundu; G. olivieri ekstresinde major olarak bulunan izoorientin ile izoviteksin, net bir ekilde ayrıldı ( ekil 4.18. a). Đridoit grubu standart maddelerin verdi ği pikler de ayrımın iyi yapıldı ğını gösterdi ( ekil 4.19. a,b).
79 80
ekil 4.14. a. WY ve b. MY serisinde aydınlıkta inkübe edilen 3 alt kültürde üretilen sekonder metabolitlerin solvan sistemi II’de NA ile görünümleri (soldaki ekiller günı ığı, sa ğdakiler ise UV 366 ’da).
81
ekil 4.15. Süspansiyon kültüründe aydınlıkta inkübe edilerek ilk 25 günde üretilen sekonder metabolitlerin solvan sistemi II’de NA ile görünümleri (a. günı ığında b. UV 366 ’da)
82
ekil 4.16. Đzoorientin’in a. program I’de ve b. program II’de verdi ği pikler
83
ekil 4.17. Đzoviteksin’in a. program I’de ve b. program II’de verdi ği pikler
84
ekil 4.18. G. olivieri ekstresinin a. program I’de ve b. program II’de verdi ği pikler
ekil 4.19. Program I’de: a. Gentiopikrozit, b. Svertiamarinin verdi ği pikler
4.4.2.1 Kalibrasyon e ğrisinin çizilmesi
Đzoorientin ve izoviteksin standart maddelerinden hazırlanan seri dilüsyonların (Çizelge 3.6) HPLC kolonuna uygulanması ile elde edilen piklerin alanlarının (y), konsantrasyon de ğerine (x) kar ı grafi ğe geçirilmesiyle kalibrasyon e ğrileri elde edildi. Đzoorientin ve izoviteksin için kalibrasyon e ğrileri ve elde edilen denklemler sırasıyla ekil 4.20- 4.21’daki gibidir.
85
ekil 4.20. Đzoorientin için elde edilen kalibrasyon grafi ği ve do ğru denklemi
ekil 4.21. Đzoviteksin için elde edilen kalibrasyon grafi ği ve do ğru denklemi
4.4.2.2 Kallus ekstreleri için HPLC analizi
WY serisinde yaprak eksplantından geli en kalluslardaki sekonder metabolitlerin üç alt kültür boyunca varlı ğı HPLC ile ara tırıldı. Kallus kültüründe WIY1, W1Y3 ve W2Y1
86 ortamlarında izoorientine rastlandı ( ekil 4.22.a, 4.23.a ve 4.24.a). En yüksek izoorientin 0.492 mg/g miktarıyla W2Y1’de bulundu (çizelge 4.2).
W1Y3 ( ekil 4.23.b), W2Y1 ( ekil 4.24.b), W3Y1 ( ekil 4.25.a) ve W3Y2 ( ekil 4.25.b) ortamlarında geli en kalluslarda izoviteksine rastlanırken W3Y1 ve W3Y2’de sadece izoviteksin üretildi ği tespit edildi. En yüksek izoviteksin miktarına 0.337 mg/g miktarıyla W3Y2 ile ula ıldı. W1Y1 ( ekil 4.22.b) ve W2Y2 ortamlarında geli en kalluslarda izoviteksin varlı ğı gözlense de hesaplanamayacak kadar az oldu ğu bulundu. (Çizelge 4.2). W1Y3 ve W2Y1’de hem izoorientine hem de izoviteksine rastlandı ( ekil 4.23-4.24). Yapılan analizler sonucunda örneklere ait kromatogramlarda referans olarak kullanılan iridoitlere rastlanmadı.
4.4.2.3 Süspansiyon kültüründen elde edilen hücre ekstreleri için HPLC analizi
WY serisinden (W1Y, W2Y ve W3Y) geli en kalluslardan kurulan süspansiyon kültürlerinde 5., 10, 15. ve 20. günlerde üretilen sekonder metabolitlerin varlı ğı HPLC ile ara tırıldı. Örnek sayısını azaltmak için 25. gün süspansiyon örneklerinin analizi yapılmadı. Çok az miktarlarda da olsa W2S15, W2S20, W3S10, W3S15 ve W3S20 ekstrelerinde izoorientine rastlandı ( ekil 4.26.a, 4.27.a, 4.28.a 4.29.a ve 4.30.a). Süspansiyon kültürlerinde en fazla miktarda izoorientin 0.217 mg/g ile W2S15’ten elde edildi (Çizelge 4.2).
Buna kar ılık W3S5 dı ında tüm ekstrelerde izoviteksine rastlandı ( ekil 4.26.b, 4.27.b, 4.28.b 4.29.b, 4.30.b, 4.31.a,b, 4.32.a,b ve 4.33.a,b). W1S20 ve W3S10 ekstrelerindeki izoviteksin miktarı, sırasıyla, 0.408 ve 0.389 mg /g olarak bulundu. Bu miktarlar G. olivieri ekstresindeki izoviteksin miktarına göre yakla ık 10 kat fazladır (Çizelge 4.2).
87 88
ekil 4.22. W1Y1 ortamında geli en kallus hücrelerinde a. izoorientinin ve b. izoviteksinin pik ve spektrumlarını gösteren kromatogram
89
ekil 4.23. W1Y3 ortamında geli en kallus hücrelerinde a. izoorientinin ve b. izoviteksinin pik ve spektrumlarını gösteren kromatogram
90
ekil 4.24. W2Y1 ortamında geli en kallus hücrelerinde a. izoorientinin ve b. izoviteksinin pik ve spektrumlarını gösteren kromatogram
91
ekil 4.25. a. W3Y1 ve b. W3Y2 ortamlarında geli en kallus hücrelerinde izoviteksinin pik ve spektrumlarını gösteren kromatogram
92
ekil 4.26. W2S15 ortamında geli en süspansiyon hücrelerinde a. izoorientin ve b. izoviteksinin pik ve spektrumlarını gösteren kromatogram
93
ekil 4.27. W2S20 ortamında geli en süspansiyon hücrelerinde a. izoorientin ve b. izoviteksinin pik ve spektrumlarını gösteren kromatogram
94
ekil 4.28. W3S10 ortamında geli en süspansiyon hücrelerinde a. izoorientin ve b. izoviteksinin pik ve spektrumlarını gösteren kromatogram
95
ekil 4.29. W3S15 ortamında geli en süspansiyon hücrelerinde a. izoorientin ve b. izoviteksinin pik ve spektrumlarını gösteren kromatogram
96
ekil 4.30. W3S20 ortamında geli en süspansiyon hücrelerinde a. izoorientin ve b. izoviteksinin pik ve spektrumlarını gösteren kromatogram
Çizelge 4.2. HPLC analizi sonucunda G. olivieri ile kallus ve süspansiyon hücrelerinde bulunan Io ve Iv standart maddelerin miktarları ve yüzdeleri
Đzoorientin % SH c Đzoviteksin % SH c Ortam (mg/g) a miktar b (mg/g) a miktar b G. olivieri yaprak ve 2.863 0.286 0.2360 0.04 0.004 0.0653 çiçek ekstresi W1Y1 0.051 0.005 0.0317 ND d - W1Y2 - - - - W1Y3 0.02 0.002 0.0074 0.177 0.018 0.1493 W2Y1 0.492 0.049 0.2832 0.181 0.018 0.1530 W2Y2 - - ND d - W2Y3 - - - - W3Y1 - - 0.033 0.003 0.0685 W3Y2 - - 0.337 0.034 0.3720 W3Y3 - - - - W1S5 - - 0.012 0.001 0.0694 W1S10 - - 0.058 0.006 0.0542 W1S15 - - 0.071 0.007 0.1269 W1S20 - - 0.408 0.041 0.0554 W2S5 - - 0.011 0.001 0.0478 W2S10 - - 0.028 0.003 0.0538 W2S15 0.217 0.022 0.0992 0.210 0.021 0.2368 W2S20 0.127 0.013 0.0618 0.154 0.015 0.1573 W3S5 - - - - W3S10 0.049 0.005 0.0225 0.389 0.039 0.3200 W3S15 0.157 0.016 0.0697 0.042 0.004 0.0556 W3S20 0.066 0.007 0.0168 0.185 0.019 0.0562 a mg/g- 1 g bitkide veya hücrede bulunan madde miktarı (mg) b% miktar - 100 g bitkide veya hücrede bulunan madde miktarı (g) cSH- HPLC analizi sonucunda her bir ekstre için elde edilen ortalama pik alanlarının standart hatası dND- Miktar çok az oldu ğundan hesaplanamadı
97 98
ekil 4.31. a. W1S5 ve b. W1S10 ortamlarında geli en süspansiyon hücrelerinde izoviteksinin pik ve spektrumlarını gösteren kromatogram
99
ekil 4.32. a. W1S15, b. W1S20 ortamlarında geli en süspansiyon hücrelerinde izoviteksinin pik ve spektrumlarını gösteren kromatogram
100
ekil 4.33. a. W2S5, b. W2S10 ortamlarında geli en süspansiyon hücrelerinde izoviteksinin pik ve spektrumlarını gösteren kromatogram
5. TARTI MA ve SONUÇ
Gentianaceae familyasındaki bitkilerin tıbbi amaçla kullanıldı ğı ve biyoaktif metabolitlerin ba lıca iridoit, sekoiridoit, flavonoit, bazı türlerde ksanton ve alkaloitler oldu ğu bilinmektedir (Jensen ve Schripsema 2002). Gentianların içerdikleri acı sekoiridoit glikozitler nedeniyle kardiyovasküler, antihepatotoksik, koleretik, hipoglisemik, hipolipidemik, antienflamatuvar, antispazmodik, antitumor, antiviral, immunmodülator aktiviteye sahip oldukları bilinmektedir (Rodriguez vd. 1998). Tıbbi olarak en çok kullanılan Gentianlar G. lutea , G. macrophylla ve G. scabra ’dır.
Gaziantep yöresinde halk arasında “korkanlara” içirildi ği bilinen Gentiana olivieri, içerdi ği metabolitler nedeniyle antidepresan, antidiyabetik, antihepatotoksik, antianemik, yara iyile tirici, sindirime yardımcı olarak kullanılmaktadır (Ba er vd. 1986, Takeda vd. 1999, Sezik vd. 2005). Yapılan çalı malarla G. olivieri ’de biyoaktif metabolitlerin ba lıca iridoit, sekoiridoit ve flavonoitlerden kaynaklandı ğı bulunmu tur (Ersöz 1988, Aslan 2000, Deliorman-Orhan vd. 2003).
Günümüzde hastalıkların tedavisinde geleneksel tedavilere yönelim artmaktadır. Bunun nedeni sentetik olarak üretilen ilaçlar veya tedavi yöntemlerinin yan etkilerinin oldukça fazla ve olumsuz olması, do ğal yeti en ürünlerden elde edilen ekstre ve ilaçların insan sa ğlı ğı üzerinde daha az olumsuz etki olu turabilece ği dü üncesidir. Bu dü ünce beraberinde de do ğal yeti en bitkilerin do ğadan toplanmasını getirmektedir. Do ğal yeti en bitkiler bilinçsizce habitatlarından çok fazla miktarlarda toplanabilmekte ve do ğal denge bozulmaktadır. A ırı toplama nedeniyle türünün nesli tükenme tehlikesiyle kar ı kar ıya olan bitkiler için koruyucu bazı kanun ve yasalar dünya çapında konulmu sa da hepsi için koruma mümkün olamamaktadır. G. lutea , Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanlı ğı, 2006, 2008, 2010 ve 2011 yılları için Resmi Gazete’de yayınladı ğı “Do ğal Çiçek So ğanlarının Đhracat Listesi Hakkında Tebli ğ”de “Do ğadan Toplanarak Đhracatı Yasak Olan Çiçek So ğanları” listesinde yer almaktadır (http://www.resmigazete.gov.tr/default.aspx, 2011).
101 Bitkilerin do ğal ya amlarını engellemeden tıbbi amaçlı kullanılmalarını sa ğlayacak alternatif bir yöntem geli tirme çabasında olan bilim insanları doku kültürü tekniklerini kullanarak Bitki Biyoteknolojisi adında yeni bir bilim dalı yaratmı tır. Amaca göre de ği en tekniklerle çok az bitkisel materyal kullanılarak endüstriyel boyutlara varabilen üretimler gerçekle tirilebilmektedir (Ramachandra Rao ve Ravishankar 2002). Fakat üretim a amasına geçilmeden model olabilecek ara tırılmalar yapılması gerekmektedir. Öncelikle bitkinin doku kültürü tekniklerine cevap verip vermedi ği belirlenmeli daha sonra verimi artırmaya yönelik çalı malar yapılmalıdır. En son a amada ise optimizasyon tam olarak sa ğlanıp a amalı olarak biyoreaktörlerde üretime geçilmelidir. Çalı mamız bu amaca yöneliktir.
Gentiana cinsine ait birçok türde mikroço ğaltım (Morgan vd. 1997, Zhang ve Leung 2002, Bach ve Pawlowska 2003), protoplast kültürü (Takahata ve Jomori 1989), somatik embriyogenez (Bach ve Pawlowska 2003), hücre süspansiyon kültürü (Chueh vd. (2000) çalı maları bulunmaktadır. Sekonder metabolit üretimi ile ilgili çalı malar iridoitler üzerine yo ğunla mı tır (Chueh vd. 2000, Menkovic vd. 2000a, Devic vd. 2006, Cai vd. 2009). Yapılan literatür taraması sonucunda G. olivieri ile ilgili yapılan tek doku kültürü çalı masının Yüksek Lisans tezi oldu ğu görülmü tür (Ya ğcı 2005). Bu çalı mada, in vitro çimlendirilmi G. olivieri fidelerinden alınan eksplantlardan kurulan kallus ve süspansiyon kültürlerinde bazı biyoaktif özellikteki sekonder metabolitlerin varlı ğının ara tırılması amaçlanmı tır.
Kallus üretimi a amasında iki deneme yapıldı. Đlk denemede kök ve yaprak eksplantları kullanıldı ve inkübasyon karanlıkta gerçekle tirildi. Đkinci denemede ise sadece yaprak eksplantı kullanıldı ve inkübasyon 3000 lux ı ık iddetinde aydınlıkta gerçekle tirildi. Her iki deneme için de kallus üretimi ilk 30 günde gözlendi. Kallus olu um a aması sonunda elde edilen kallusların miktarları analiz için yeterli olmadı. Bu nedenle kallus geli imini artırmak için her 4 haftada bir alt kültür yapıldı. Böylece hem kallus miktarlarındaki artı belirlenerek en çok hücre artı ının oldu ğu ortam belirlendi, hem de analiz için yeterli miktarda kallus elde edildi. Ayrıca sekonder metabolit içeri ğindeki de ği imler aylık izlenebildi. Sekonder metabolit üretimi için en fazla materyalin (kallus veya süspansiyon hücreleri) hangi ortamdan elde edilebilece ğini belirlemek için KB Đ
102 de ğerleri hesaplandı. Böylece KB Đ de ğerleri ile eksplantların doku kültürüne verdikleri cevap belirlendi. Karanlıkta inkübe edilen yaprak eksplantlarının köklere göre çok daha fazla hücre artı ına sahip oldu ğu gözlendi. Yaprak eksplantlarında KB Đ-2 ve KB Đ-3 sonuçlarının KB Đ-1’e göre dü ük olması, kallus artı ının en hızlı eksplant ekimi a amasında gerçekle ti ğini gösterdi. Karanlıkta geli en kallusların miktarları aydınlıktakilerden yüksek bulundu (Çizelge 4.1). Đnkübasyon ve eksplant türü kallus renklerinde farklılık yaratmadı ve kalluslar sarı renkli, çok gevrek olmayan fakat kolay da ğılabilen yapıda üredi. Karanlık inkübasyonda en fazla hücre artı ı yaprak eksplantında, 1 mg/l NAA ve 0.5 mg/l BAP içeren W1 ortamında olurken (59.52 kat); aydınlık inkübasyonda en fazla hücre artı ı 1 mg/l NAA ve 0.5 mg/l Kinetin içeren W2 ortamında (26.4 kat) gözlendi (Çizelge 4.1). Edis (2003) yaptı ğı çalı mada G. olivieri herbasından elde etti ği ekstrede çok miktarda izoorientin bulundu ğunu göstermi tir. Bunun yanında Çalı vd. (1992) G. septemfida ’da ve Krstic vd. (2004) G. dinarica ’da herbada yaptıkları çalı mada iridoitlere rastlamı lardır. Sekonder metabolitlerden flavonoitler bitkinin herbasında bulunmaktadır. Bu nedenle ikinci denemede aydınlık inkübasyon yapılmasına karar verildi.
G. olivieri ’de süspansiyon kültürü ise yaprak eksplantından aydınlık inkübasyon ile 1. alt kültür sonunda geli en kallus hücrelerinden kuruldu. 25. günün sonuna kadar her 5 günde bir hücre miktarındaki de ği im izlendi. En fazla hücre artı ı ise 1 mg/l NAA ve 0.2 mg/l Kinetin içeren W3 ortamında (4 kat) gözlendi ( ekil 4.8). Chueh vd. (2000) G. davidii var. formosana ’da yaptıkları süspansiyon kültürü çalı masında gövdeden aldıkları eksplantları 1 mg/l NAA ve 0.2 mg/l kinetin içeren MS ortamında kallus kültürüne almı lardır. Elde ettikleri hücrelerden 0.2 mg/l Kinetin sabit kalmak ko uluyla 0, 0.5, 1, 2 ve 4 mg/l 2,4 D, NAA veya IAA içeren MS ortamında süspansiyon kültürü kurmu lardır. 36. günün sonuna dek her 4 günde bir hücre artı ını izlemi lerdir. Buna göre en çok hücre artı ının sadece 0.2 mg/l Kinetin içeren ortamda oldu ğunu belirlemi lerdir. Daha sonra 0, 0.2, 0.5, 1 ve 2 mg/l konsantrasyonlarda Kinetin deneyerek hücre artı ını izlemi ler ve yine en iyi sonucu 0.2 mg/l Kinetinin verdi ğini bulmu lardır. Çalı mamızda da 0.2 mg/l Kinetinin (W3 ortamı) daha iyi sonuç verdi ği gözlendi.
103 Đn vitro çimlendirilmi G. olivieri fidelerinden alınan kök ve yaprak eksplantlarından üretilen kallus hücrelerinde iridoit ve flavonoit grubu bile ikler önce ĐTK ile kalitatif olarak ara tırıldı. Karanlıkta geli en hücrelerde iridoit grubu standart bile iklerle aynı hizada lekeler görüldü. Karanlık ve aydınlık inkübasyonun Gentiana türlerinde in vitro sekonder metabolit üretimi üzerine etkisi ile ilgili bir makaleye rastlanmasa da iridoit ve sekoiridoitlerin in vivo ’da köklerde daha fazla bulundu ğu bilinmektedir (Vanisree vd. 2004). Bu nedenle karanlık inkübasyon iridoit üretimini sa ğlamı olabilir. Buna kar ın topraküstü kısımda fazla miktarda oldu ğu bilinen flavonoitler karanlıkta inkübe edilen hücre ekstrelerinde gözlenmedi ( ekil 4.11-4.13). Aydınlıkta inkübe edilen kallus hücrelerinde ise ilk denemenin aksine flavonoit grubu standart bile iklerle aynı hizada lekeler görüldü. Elimizdeki referans iridoitlerden farklı, iridoit olabilecek maddelere rastlandı (Wagner vd. 2001). Bu ekstrelerdeki leke sayısı ve yo ğunlu ğu ilk denemedekilere göre daha fazla oldu ( ekil 4.14). Do ğal ortamında yeti en Gentiana türlerinde genel olarak topraküstü kısımlarda flavonoitler (Deliorman Orhan vd. 2003), toprakaltı kısımlarında ise iridoitler (Chulia vd. 1996) yo ğundur. Elde edilen sonuçlar bu bulgular ile örtü mektedir; ilk denemede (karanlık inkübasyonda) iridoitler gözlenirken ikinci denemede (aydınlık inkübasyon) flavonoit ve iridoitler gözlendi. Fakat doku kültürü çalı malarında bitkide çok miktarda bulunan bile iklerin in vitro ’da üretilmedi ği veya aksine bitkide bulunmayan bile iklerin üretilebilece ği de unutulmamalıdır (Ramachandra Rao ve Ravishankar 2002).
Üretilen sekonder metabolitler sayı ve yo ğunluk olarak de ğerlendirildi ğinde süspansiyon kültüründe üretilenlerin WY ortamlarında aydınlıkta üretilen kalluslardakilerden fazla oldu ğu gözlendi. Svertiamarin ve gentiopikrozit ile e le en maddeler bulunmazken ĐTK’da tespit edilen, Rf de ğerleri ve renkleriyle iridoit grubu bile iklerden oldu ğu dü ünülen (Wagner vd. 2001) fakat referansları olmadı ğından ne oldu ğu belirlenemeyen maddeler üretildi (alıkonma zamanı 2 ve 38. dak) ( ekil 4.26- 4.33).
Aydınlıkta inkübe edilen kalluslarda üretilen sekonder metabolitlerin varlı ğını daha net ortaya çıkarmak ve miktarlarını belirleyebilmek için HPLC kullanıldı. En fazla izoorientin miktarı 0.492 mg/g (kuru a ğırlık-ka) [% 0.049] ile 1 mg/l NAA ve 0.5 mg/l
104 Kinetin içeren W2 ortamında 1. alt kültür sonunda yaprak eksplantından elde edilen hücrelerde bulundu. Bu miktar, G. olivieri ’de izoorientinin en fazla bulundu ğu yaprak ve çiçeklerden hazırlanan ekstre ile kar ıla tırıldı ğında 5.8 kat daha azdır. Bunu yanında di ğer bir flavonoit olan ve G. olivieri ’de daha az miktarda bulunan izoviteksin, en fazla 1 mg/l NAA ve 0.2 mg/l Kinetin içeren W3 ortamında yaprak eksplantından 2. alt kültür sonunda üretilmi tir (0.337 mg/g) [% 0.034]. Bu miktar bitkide bulunandan 8.43 kat daha fazladır. Bu sonuçlar, kallus kültürünün G. olivieri ’den izoviteksin üretimi için daha ba arılı oldu ğunu göstermektedir. Gentiana türlerinde kallus kültürü ve rejenere olan bitkiler ile sekonder metabolit üretimi daha çok iridoitler üzerinedir. Elde etti ğimiz sonuçlarla, daha önce yapılan çalı malar kar ıla tırıldı ğında sekonder metabolitlerin miktarları de ği kenlik göstermektedir. Menkovic vd. (2000a) G. lutea ’dan in vitro üretilen sürgün ve köklerde sekoiridoit, γ-piron ile izoorientin ve izogentisin bile iklerini tespit etmi lerdir. Hormonsuz MS ortamında geli en sürgünlerde % 1.48 (ka), köklerde ise % 0.71 oranında gentiopikrozit elde etmi lerdir. Bu miktarlar sürgünde do ğal yeti en bitkiden alınan yapraktakine oranla yakla ık 1.8 kat fazla iken in vitro elde edilen kökte do ğadan alınan köke göre 9 kat daha azdır. Svertiamarin in vitro sürgünde yapraktakiyle aynı oranda bulunurken in vitro kökte üretilememi tir. Đzoorientin ise yaprakta % 0.93 oranında bulunurken in vitro kökte % 0.11 oranında üretilebilmi tir. Ayrıca çe itli büyüme düzenleyiciler kullanarak elde ettikleri sürgünlerde de sekonder metabolitlerin varlı ğını ara tırmı lardır. 0.25 mg/l BAP ve 0.2 mg/l IAA içeren ortamda geli en sürgünlerde gentiopikrozit miktarı % 3.59, svertiamarin miktarı % 0.73 ve izoorientin miktarı % 0.1 oranında üretilebilmi tir. Cai vd. (2009) G. straminea ’da yaptıkları kapsamlı kallus kültüründe kallusların büyük ço ğunlu ğu sonradan somatik embriyogeneze u ğramı lardır. 11.42 µM IAA içeren MB ortamında (MS tuzları, B5 vitaminleri ve kazein hidrolizat içeren besin ortamı) geli en sarı-ye il proembriyojenik hücrelerde % 0.031 (ka), ye il proembriyojenik hücrelerde ise % 0.53 oranında gentiopikrozit bulmu lardır. Sabovljevic vd. (2006), farklı lokalitelerden topladıkları Blackstonia perfoliata (Gentianaceae)’de yaptıkları çalı mada, in vitro çimlendirdikleri fideleri ve kökleri kültüre almı lardır. Do ğadan toplanan bitkilerde gentiopikrozit miktarı % 5.75-7.35 arasında iken svertiamarin % 0.66-1.28 arasında bulunmu tur. 0.5 M IBA içeren MS ortamında geli en fidelerde gentiopikrozit miktarı % 5.52, svertiamarin miktarı ise % 0.38 olarak bulunmu tur. Kök
105 kültüründe ise 10 M IBA ile gentiopikrozit miktarını % 3.21, svertiamarin miktarını ise % 0.21 olarak tespit etmi lerdir. Çalı mamızda yaprak eksplantından aydınlıkta elde edilen hücrelerde izoorientin miktarı en fazla % 0.049, izoviteksin ise % 0.034 olarak bulunmu ; svertiamarin ve gentiopikrozite rastlanmamı tır. Svertiamarin ve gentiopikrozitler daha ziyade köklerde bulunan maddelerdir.
G. olivieri ’de aydınlık inkübasyonda yaprak eksplantından geli en kalluslardan kurulan süspansiyon kültürlerinde, ortam ve büyüme düzenleyiciler kallus kültüründekilerle aynı olacak ekilde hazırlandı. 25 gün süren inkübasyon aydınlıkta gerçekle tirildi. Her 5 günde bir alınan hücreler ekstre edildi ve sekonder metabolit varlı ğı önce ĐTK ile kalitatif olarak gözlendi. Đridoit yapıda oldu ğu dü ünülen fakat elimizdeki referanslardan farklı maddeler üretildi (Wagner vd. 2001). Plaklarda, flavonoitlerin karakteristik rengi olan sarı lekeler tespit edildi. Lekelerin yo ğunlu ğunun genel olarak inkübasyon boyunca arttı ğı gözlendi ( ekil 4.15). HPLC sonuçlarına göre süspansiyon kültürü kallus kültürüne göre sekonder metabolit üretiminde daha ba arılı bulundu (çizelge 4.2). Yapılan HPLC analizi sonucunda süspansiyon kültürlerinde W1 serisinde izoorientin görülmezken, W2 ve W3 ortamlarında 10. günden sonra az miktarda görüldü. Süspansiyon kültüründe en fazla miktarda izoorientin 0.217 mg/g (% 0.022) olarak W2S15’de rastlandı. Elimizdeki referans iridoitlere rastlanmadı. Buna kar ın W3S5 dı ında tüm ortamlarda üreyen hücrelerde izoviteksin üretildi. En yüksek izoviteksin miktarları, G.olivieri ekstresine oranla 10.2 kat fazla olan W1S10’da (0.408 mg/g) [% 0.041] ve 9.73 kat fazla olan W3S10’da (0.389 mg/g) [% 0.039] elde edildi. Đzoviteksin, doku kültürü yoluyla ilk defa bu çalı mayla üretildi. Chueh vd. (2000) G. davidii var. formosana ’da yaptıkları süspansiyon kültürü çalı masında, kültür artlarının optimizasyonu üzerine bir çalı ma yapmı lardır. 0.2 mg/l Kinetin içeren sıvı MS ortamında geli tirdikleri hücrelerin sekoiridoit içeriklerini ara tırmı lar ve gentiopikrozit için en yüksek miktara 24. günde 1.6 mg/g (süspansiyon hücrelerinin kuru a ğırlı ğı) ile ula ırken svertiamarin için bu sonuç 12 günde 2.24 mg/g olarak gerçekle mi tir. Piatczak vd. (2005a) Centaurium erythraea (Gentianaceae)’de sürgün artı ını ve sekoiridoit üretimini amaçladıkları çalı malarında kallus ve süspansiyon kültürü yapmı lardır. Sürgünlerden aldıkları eksplantları 0.1 mg/l IAA ve 1 mg/l BAP içeren MS ortamında 1 yıldan fazla süre alt kültürde geli tirmi ler, daha sonra yine aynı
106 konsantrasyonlarda büyüme düzenleyicileri içeren sıvı ve katı ortamlarda kültüre almı lardır. Do ğal yeti en bitkide 4.78 mg/g gentiopikrozit ve 35.45 mg/g svertiamarin bulunurken, 10 haftalık mikroço ğalan fidelerden geli en sürgünlerde gentiopikrozit 48 mg/g, svertiamarin ise 86.5 mg/g’a kadar yükselmi tir. Çalı ma sonucuna göre katı ve sıvı kültürlerde üretilen sekonder metabolitlerin miktarları hemen hemen aynı olmu tur.
Jensen ve Schripsema (2002)’nin bildirdi ğine göre Fujita ve Inoue (1979), radyoaktif etiketleme yöntemi kullanmı lar ve izoviteksinin, içlerinde izoorientinin de bulundu ğu flavonoitlerden bir grubun öncü maddesi oldu ğunu kanıtlamı lardır. Bu çalı ma, öncü molekül olarak kabul edilen izoviteksinin kallus kültürlerinde 1. alt kültürde, süspansiyon kültürlerinde ise 5. günden itibaren üretilmesini açıklar niteliktedir. Gerçekle tirilen kallus ve süspansiyon kültürlerinde izoviteksinin izoorientine dönü ümü için gerekli biyokimyasal sürecin tam olarak gerçekle medi ği dü ünülebilir. Bununla beraber çizelge 4.2’de, W1Y1 hariç, izoorientin üretimi olan tüm ortamlarda izoviteksinin de üretildi ği gözlenmektedir.
Literatür taramasında Gentiana türlerinden izoviteksinin izole edildi ği bildirilmesine ra ğmen (Lin vd. 1997, Bergeron vd. 1997, Xu vd. 2009) izoviteksinin varlı ğı G. olivieri bitkisinde ara tırılmamı tır. Bu çalı mayla çiçek ve yapraklarından yapılan metanolik ekstraksiyon ile G. olivieri ’de izoviteksinin varlı ğı gösterildi.
Đzoviteksinin antiradikal etkisi Masteikova vd. (2008) tarafından bildirilmi tir. Lin vd. (2002), izoviteksinin antioksidan aktivitesi üzerine yaptıkları ayrıntılı çalı mada, izoviteksinin, analogları olan di ğer flavonoitlere göre oldukça kuvvetli antioksidan aktiviteye sahip oldu ğunu, bunun yanında DNA’yı korudu ğunu, reaktif oksijen türlerinin insan promiyelositik lösemi hücreleri üzerindeki etkilerini kaldırdı ğını, bunu da en dü ük sitotoksik etki göstererek yaptı ğını bulmu lardır. Peng vd. (2008) yaptıkları çalı mada viteksin ve izoviteksinin fazla birikti ğinde sinir, böbrek, retina hastalıklarına ve katarakta neden olabilen glikasyon son ürünlerinin olu umunu engelledi ğini bulmu lardır. Oksidatif stresle çok iyi ba a çıkan izoviteksin günlük hayatta kullanılan bir metabolittir. Aspalathus linearis (Rooibos) (Rabe vd. 1994),
107 Passiflora sp. (Pereira vd. 2005), Euterpe oleracea (Akai meyvesi) (Schauss vd. 2006) ve Vitex agnus-castus ’ta (hayıt meyvesi) (Jarry vd. 2006) izoorientin ile beraber bulunan izoviteksin, bu bitkilerden hazırlanan çaylarla detoks kürü ve sakinle tirici olarak kullanılmaktadır. Bununla beraber izoviteksin, kozmetik ürünlerinde de ciltten serbest radikalleri uzakla tırıcı ajan olarak kullanılmaktadır (http://www.coreana.com/eng/Brand/GoodsView.asp?CateID=389, 2010). Ciltteki serbest radikallerin ortadan kalkmasıyla cilt, yumu ak, esnek ve daha canlı olmakta dolayısıyla ya lanma etkilerini de hafifletmektedir.
Çalı mamızda biyolojik etkileri kanıtlanmı olan izoorientin ve izoviteksin, Gentiana olivieri Griseb. bitkisinde ilk kez doku kültürü yöntemleriyle üretildi. Đzoorientin miktarının bitkideki miktara göre az olması bu metabolitin üretimi üzerinde daha ayrıntılı çalı malar yapılması gerekti ğini göstermektedir. Đzoorientin üretimini artırmak için farklı büyüme düzenleyiciler kullanılabilir, öncül molekül eklemesi yapılabilir, elisitörler kullanılabilir, metabolizma mühendisli ği teknikleri kullanılarak biyokimyasal ara tırmalar yapılabilir veya gen aktarımı yoluyla metabolitin miktarı artırılmaya çalı ılabilir.
Đzoviteksinin çalı mamızda 10 kat fazla üretilmesi ise doku kültürü tekni ğinin (özellikle süspansiyon kültürünün) bu metabolitin büyük miktarlarda üretilmesi için kullanılabilece ğini göstermektedir. Bu çalı ma öncü niteliktedir, üretimin büyük miktarlara ta ınabilmesi için bu yöntemin optimizasyonu tam olarak yapılmalıdır. Yine izoorientin üretimini artırmaya yönelik denenebilecek yöntemler kullanılarak izoviteksinin in vitro hücrelerdeki miktarı daha da artırılabilir. Bu çalı mada G. olivieri ’de referans olarak kullanılan svertiamarin ve gentiopikrozit karanlık inkübasyon ile üretilebilmesine ( ekil 4.11-4.13) kar ın aydınlık inkübasyon ile üretilememi tir. Đridoit yapılı bile ikleri üretmek için karanlık inkübasyonla kök eksplantından elde edilen kalluslar ile süspansiyon kültürü kurulabilir.
108 KAYNAKLAR
Aberham, A., Schwaiger, S., Stuppner, H. and Ganzera, M. 2007. Quantitative analysis of iridoids, secoiridoids, xanthones and xanthone glycosides in Gentiana lutea L. roots by RP-HPLC and LC-MS. J. Pharm. Biomed. Anal. 45 (3); 437-442. Aktay, G., Deliorman, D., Ergun, E., Ergun, F., Ye ilada, E. and Çevik, C. 2000. Hepatoprotective effects of Turkish folk remedies on experimental liver injury. J. Ethnopharmacol., 73 (1-2); 121-129. Anonim. 2006. Sayı: 2005/45, 26326, 26678, Web Sitesi: http://www.resmigazete.gov.tr/default.aspx#, Eri im Tarihi: 01.08.2011. Anonim. 2009. Web Sitesi: http://www.tarim.gov.tr/Files/Mevzuat/teblig/dogal_ciceksoganlarinin_2006_yili ihracat_listesihakkinda_teblig.doc, Eri im Tarihi: 14.05.2009. Anonymous. 2002-2008. Web Sitesi: http://gentian.rutgers.edu/ethno.htm, Eri im Tarihi: 14.05.2009. Anonymous. 2002-2008. Web Sitesi: http://gentian.rutgers.edu/ethno_stamps.htm#GENTIANA%20stamps, Eri im Tarihi: 14.05.2009. Anonymous. 2009. Web Sitesi: http://alpineenthusiast.blogspot.com, Eri im Tarihi: 14.05.2009. Anonymous. 2009. Web Sitesi: http://www.gimex.de/www_site/produktgrafx/enzian_detail1.jpg, Eri im Tarihi: 14.05.2009. Anonymous. 2010. Web Sitesi: http://www.efloras.org/florataxon.aspx?flora_id=2&taxon_id=113422, Eri im Tarihi: 10.10.2011. Anonymous. 2011. Web Sitesi: http://www.coreana.com/eng/Brand/GoodsView.asp?CateID=389, Eri im Tarihi: 05.01.2011. Anonymous. 2011. Web Sitesi: http://plants.usda.gov/java/ClassificationServlet?source=display&classid=GENTI , Eri im Tarihi: 20.12.2011. Arino, A., Arberas, I., Jesus Leiton, M., Renobales, M. and Dominguez, J. B. 1997. The
109 Extraction of Yellow Gentian Root ( Gentiana lutea L.). Z. Lebensm. Unters. Forsch. A, 205; 295-299. Aslan, M. 2000. eker Hastalı ğına Kar ı Halk Đlacı Olarak Kullanılan Bitkiler Üzerinde Farmakognozik Ara tırmalar, Doktora Tezi, Ankara. Babao ğlu, M., Gürel, E. and Özcan, S. 2001. Bitki Bitoteknolojisi -1- Doku Kültürü ve Uygulamaları. Selçuk Üniversitesi Vakfı Yayınları. Bach, A. and Pawlowska, B. 2003. Somatic Embryogenesis in Gentiana pneumonanthe L. Acta Biologica Cracoviensia, 45 (2); 79-86. Barz, W., Daniel, S., Hinderer, W., Jaques, U., Kessmann, H., Koster, J. and Tiemann, K. 1988. Elicitation and metabolism of phytoalexins in plant cell cultures. In: Plant cell biotechnology. Pais, M., Mavituna, F. and Novais, J. (eds), NATO ASI Series, Springer-Verlag, pp. 211–230, Berlin. Ba er, K. H. C., Honda, G. and Miki, W. 1986. Herb Drugs and Herbalists in Turkey, Studia Culturae Đslamicae 27, Tokyo. Baytop, T. 1984. Türkiyede Bitkiler ile Tedavi. Đstanbul Üniversitesi Yayınları No: 3255, 194-195 p., Đstanbul. Beaumont, M.D. and Knorr, D. 1987. Effects of immobilizing agents and procedures on viability of cultured celery ( Apium graveolens ) cells. Biotechnol Lett, 9; 377– 382. Bergeron, C., Marston, A., Gauthier, R. and Hostettmann, K. 1997. Iridoids and secoiridoids from Gentiana linearis . Phytochemistry , 44(4); 633 637. Berlin, J., Martin, B., Nowak, J., Witte, L., Wray, V. and Strack, D. 1989. Effects of permeabilization on the biotransformation of phenylalanine by immobilized tobacco cell cultures. Z Naturforsch 44c; 249–254. Bianco, A. 1994. Recent Developments in Iridoids Chemistry. Pure & Appl. Chem., 66 (10/11); 2335-2338. Bilalo ğlu, G. V. ve Harmandar, M. 1999. Flavonoidler. Aktif Yayınevi, Đstanbul. Bourgaud, F., Bouque, V. and Guckert, A. 1999. Production of flavonoids by Psoralea hairy root cultures. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 56; 97–104. Bourgaud, F., Gravot, A. Milesi, S. and Gontier, E. 2001. Production of plant secondary metabolites: a historical perspective. Plant Science, 161; 839-851. Brodelius, P. 1988. Permeabilization of plant cells for release of intracellularly stored
110 products: viability studies. Appl Microbiol Biotechnol, 27; 561–566. Butayarov, A. V., Batirov, E. Kh., Tadzhibaev, M. M. and Malikov, V. M. 1993. Xanthones and Flavonoids of Gentiana karelinii . Chemistry of Natural Compounds, 29(3); 408-409. Butiuc-Keul, A., uteu, A. and Deliu, C. 2005. In vitro Organogenesis of Gentiana punctata . Not. Bot. Hort. Agrobot., 33 (1); 38-41. Cai, Y., Liu, Y., Liu, Z. Zhang, F., Xiang, F. and Xia, G. 2009. High-frequency embryogenesis and regeneration of plants with high content of gentiopicroside from the Chinese medicinal plant Gentiana straminea Maxim. In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant, 45; 730-739. Carnat, A., Fraisse, D., Carnat, A., Felgines, C., Chaud, D. and Lamaison, J. 2005. Influence of Drying Mode on Iridoid Bitter Constituent Levels in Gentian Root. Journal of the Science of Food and Agriculture, 85; 598-602. Chueh, F., Chen, C. and Tsay, H. 2000. Studies on Factors Affecting the Establisment of Gentiana davidii var. formosana (Hayata) T.N. Ho Cell Suspension Cultures. Journal of Food and Drug Analysis, 8 (4); 297-303. Chulia, A. J., Vercauteren, J. and Mariotte, A. M. 1996. Iridoids and Flavones from Gentiana depressa . Phytochemistry, 42(1); 139-143. Crozier, A.,Burns, J., Aziz, A. A., Steward, A. J., Rabiasz A. S., Jenkins, G. I., Edwards, C. A. and Lean, M. E. J. 2000. Antioxidant Flavonols from Fruits, Vegetables and Beverages: Measurements and Bioavailability. Biological Research, 33(2); 79-88. Curtin, M. E. 1983. Harvesting Profitable Products from Plant Tissue Culture. Biotech., 1; 644-657. Çalı , Đ., Rüegger, H., Chun, Z. and Sticher, O. 1990. Secoiridoids Glucosides Isolated from Gentiana gelida . Planta Medica, 56; 406-409. Çalı , Đ., Ersöz, T., Chulia, A.J. and Rüedi, P. 1992. Septemfidoside: A New Bis-Iridoid Diglucoside from Gentiana septemfida. Journal of Natural Products, 55(3); 385- 388. Davis, P. H. 1978. Flora of Turkey and East Eagean Islands. V 6. S. 311. Edinburg University Press, Edinburgh. Deliorman Orhan, D., Aslan, M., Aktay, G., Ergun, E., Yesilada, E. and Ergun, F. 2003.
111 Evaluation of Hepatoprotective Effect of Gentiana olivieri Herbs on Subacute Administration and Isolation of Active Principle. Life Sciences, 72; 2273-2283. Deus, N. B. S. and Zenk, M. H. 1982. Exploitation of plant cells for the production of alkaloids in Catharanthus roseus cell suspension cultures. Planta Med, 50;427– 431. Devic, M., Momcilovic, I., Krstic, D., Maksimovic, V. and Konjevic, R. 2006. In vitro Multiplication of Willow Gentian ( Gentiana asclepiadea L.) and the Production of Gentiopicrine and Mangiferin. Phyton, 46(1); 45-54. DiCosmo, F. and Towers, G. H. N. 1984. Stress and secondary metabolism in cultured plant cells. In: Recent advances in phytochemistry, vol. 18. Timmerman, B. N., Steelink, F. A. and Loewus, F. A. (eds), Plenum, pp. 97–175, New York. DiCosmo, F. and Tallevi, S. G. 1985. Plant cell cultures and microbial insult: interactions with biotechnological potential. Trends Biotechnol, 3;110–111. DiCosmo, F., Quesne, A., Misawa, M. and Tallevi, S.G. 1987. Increased synthesis of ajmalicine and catharanthine by cell suspension cultures of Catharanthus roseus in response to fungal culture filtrates. Appl Microbiol Biotechnol, 14;101–106. Dinda, B., Debnath, S. and Harigaya, Y. 2007. Naturally Occurring Iridoids. A Review, Part 1. Chem. Pharm. Bull., 55(2); 159-222. Dornenburg, H. and Knorr, D. 1993. Cellular permeabilization of cultured tissues by high electric field pulses or ultra high pressure for the recovery of secondary metabolites. Food Biotechnol, 7; 35–48. Edis, M. 2003. Türkiye’de Yeti en Bazı Gentiana L. Türlerinin Đzoorientin Yönünden De ğerlendirilmesi. Yüksek Lisans Tezi, Ankara. Ekim, T., Koyuncu, M., Vural, M., Duman, H., Aytaç, Z. ve Adıgüzel, N. 2000. Türkiye Bitkileri Kırmızı Kitabı (E ğrelti ve Tohumlu Bitkiler). Türkiye Tabiatını Koruma Derne ği ve Van Yüzüncüyıl Üniversitesi, Barı can Ofset, 166 s., Ankara Eilert, U. 1987. Elicitation: methodology and aspects of application. In: Cell culture and somatic cell genetics of plants, vol. 4. Constabel, F. and Vasil, I. (eds), Academic Press, pp. 153–196, San Diego. Ersöz, T. 1988. Gentiana olivieri Griseb. Üzerinde Farmakognozik Ara tırmalar. Doktora Tezi, Ankara.
112 Ersöz, T. and Çalı , Đ. 1991. C-Glucosylflavones from Gentiana olivieri . Journal of Faculty of Pharmacy, Hacettepe University, 11 (1); 29-36. Fedoreyev, S. A., Pokushalova, T. V., Veselova, M. V., Glebko, L. I., Kulesh, N. I., Muzarok, T. I., Seletskaya, L. D., Bulgakov, V. P. and Zhuravlev, Yu. N. 2000. Isoflavonoid production by callus cultures of Maackia amurensis. Fitoterapia, 71(4); 365-372. Felix, H. R. 1982. Permeabilized cells. Anal Biochem, 120; 211–234. Fiuk, A. and Rybczynski, J. J. 2008. Genotype and Plant Growth Regulator-dependent Response of Somatic Embryogenesis from Gentiana spp. Leaf Explants. In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant, 44; 90-99. Fujita, M. and Inoue, T. 1979. Biosynthesis of C-glucosylflavones in Swertia japonica . Yakugaku Zasshi, 99; 165–171. Fujita, Y., Takahashi, S. and Yamada, Y. 1984. Selection of cell lines with high productivity of shikonin derivatives through protoplasts of Lithospermum erythrorhizon . Proc Euro Congr Biotechnol (3rd), 1;161–166. Furze, J. M., Rhodes, M. J. C., Parr, A. J., Robins, R. J., Whithehead, I. M. and Threlfall, D. R. 1991. Abiotic factors elicit sesquiterpenoid phytoalexin production but not alkaloid production in transformed root cultures of Datura stramonium . Plant Cell Rep, 10;111–114. Gamborg, O.L., Miller, R.A. and Ojima, K. 1968. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Experimental Cell Research 50 (1); 151-158. Guo, Y. G., Li, H. J., Cai, Y. X., Zhong, Y. and Peng, Z. Y. 1992. Studies on the production of secondary metabolites in plant cell cultures. In: Biochemical engineering for 2001. Furusaki, S., Endo, I. and Matsuno, R. (eds), Springer- Verlag, pp. 242–245, Tokyo. Gürel, S., Gürel, E. and Kaya, Z. 2002. Establishment of Cell Suspension Cultures and Plant Regeneration in Sugar Beet ( Beta vulgaris L.). Turkish Journal Botany, 26; 197-205. Honda, G. 1999. A Report on Traditional Medicine of Turkish People (1997, 1998), Kyoto University, Kyoto. 43, 53, 74. pp Hosokawa, K., Oikawa, Y. and Yamamura, S. 1998. Mass Propagation of Ornamental
113 Gentian in Liquid Medium. Plant Cell Reports, 17; 747-751. Hosokawa, K., Matsuki, R., Oikawa, Y. and Yamamura, S. 2000. Production of Transgenic Gentian Plants by Particle Bombardment of Suspension-culture Cells. Plant Cell Reports, 19; 454-458. Jarry, H., Spengler, B., Wuttke, W. and Christoffel, V. 2006. In vitro assays for bioactivity-guided isolation of endocrine active compounds in Vitex agnus- castus. Maturitas, 55S; S26–S36. Jensen, S. R. and Schripsema, J. 2002. Chemotaxonomy and pharmacology of Gentianaceae. Gentianaceae- Systematics and Natural History, Struwe, L. & Albert, V. (Eds.), Cambridge University Press. Jiang, R., Wong, K., Chan, Y., Xu, H., But, P. P. and Shaw, P. 2005. Isolation of iridoid and secoiridoid glycosides and comparative study on Radix gentianae and related adulterants by HPLC analysis. Phytochemistry, 66(22); 2674-2680. Jiang, Z., Liu, H., Liu, X., Shang, J., Zhao, J. and Yuan, C. 2010. Chemical composition of Gentiana pneumonanthe Pall. Natural Product Research 24(14); 1365-1369. Keller, F. 1986. Gentiopicroside is Located in the Vacuoles of Root Protoplasts of Gentiana lutea . J. Plant Physiol., 122; 473-476. Knorr, D., Miazga, S. M. and Teutonica, R. A. 1985. Immobilization and permeabilization of cultured plant cells. Food Technol, 39;139–142. Knorr, D. and Teutonico, R. A. 1986. Chitosan immobilization and permeabilization of Amaranthus tricolor cells. J Agric Food Chem, 34;582–585. Ko, F. N., Chu, C. C., Lin, C. N., Chang, C. C. and Teng, C. 1998. Isoorientin- 6''-O- glucoside, A Water-Soluble Antioxidant Isolated from Gentiana arisanensis . Biochimica et Biophysica Acta, 1389; 89-90. Krstic, D., Jankovic, T., Aljancic, I., Savikin-Fodulovic, K., Menkovic, N. and Milosavljevic, S. 2004. Phytochemical investigation of Gentiana dinarica . Biochemical Systematics and Ecology, 32; 937–941. Kuo, S., Yen, M., Chung, M. and Lin, C. 1996. A Flavone C-Glycoside and an Aromatic Glucoside from Gentiana Species . Phytochemistry, 41(1); 309-312. Kuzovkina, I. N., Guseva, A. V. , Alterman, I. E. and Karnachuk, R. A. 2001. Flavonoid Production in Transformed Scutellaria baicalensis Roots and Ways of Its Regulation. Russian Journal of Plant Physiology, 48(4); 448–452.
114 Küpeli, E., Aslan, M., Gürbüz, Đ. and Yesilada, E. 2004. Evaluation of in vivo Biological Activity Profile of Isoorientin. Z. Naturforsch. 59c, 787-790. Kyte, L. 1987. Plants from test tubes. An Inroduction to Micropropagation, Timber Press, Portland, Oregon. Liang, Y., Hu, J., Chen, H, Zhang, T. and Ito, Y. 2007. Preparative Isolation and Purification of Four Compounds from Chinese Medicinal Herb Gentiana scabra Bunge by High-Speed Countercurrent Chromatography. Journal of Liquid Chromatography and Related Technologies, 30; 509-520. Lila , M. A. 2005. Valuable secondary products from in vitro culture, In: Plant Development and Biotechnology. Trigiano, R.N. and Gray, D. (eds), CRC Press, pp. 285-289, Oxford, U.K. Lin, C., Kuo, S. and Chung, M. 1997. A New Flavone C-Clycoside and Antiplatelet and Vasorelaxing Flavones from Gentiana arisanensis . J. Nat. Prod., 60; 851-853. Lin, C., Chen, C., Lee, H. and Lin, J. 2002. Prevention of cellular ROS damage by isovitexin and related flavonoids. Planta Medica, 68(4): 365-367. Linsmaier, E. M. and Skoog, F. 1965. Organic Growth Factor Requirements of Tobacco Tissue Cultures. Physiologia Plantarum, 18 (1); 100-127. Lloyd, G. and McCown, B. H. 1980. Commercially Feasible Micropropagation of the Mountain Laurel, Kalmia latifolia Linn. by Using Shoot-tip Culture. Comb. Proc. Intl. Plant Prop. Soc., 30; 421–427. Mansoor, A. 1996. Entomological and biochemical studies on the etiology of malaria, malaria studies-I, PhD Thesis, Balochistan. Mansoor, A., Zaidi, M.I. and Malghani, M.A.K. 1999. Biological efficacy of the extracts and pure compounds of G. olivieri . Pakistan journal of Biological Sciences, 32: 105-109. Mansoor, A. 2003. Toxicological Evaluation of the Extracts and Pure Compound of Gentiana olivieri . Pakistan Journal of Biological Sciences, 6 (23); 1949-1950. Mansoor, A., Zaidi, M. I., Hyder, M. and Rasheed, R. 2004. Antihypertensive Effect of Gentiana olivieri . J. Med. Sci., 4 (3); 176-178. Mantell, S. H. and Smith, H. 1984. Cultural factors that influence secondary metabolite accumulation in plant cell and tissue cultures, In: Plant Biotechnology. Mantell, S. H. and Smith, H. (eds), Cambridge Univ. Press, pp. 75–108, Cambridge.
115 Masteikova, R., Bernatoniene, J., Bernatoniene, R. and Velziene, S. 2008. Antiradical activities of the extract of Passiflora incarnata . Acta Poloniae Pharmaceutica- Drug Research, 65(5); 577- 583. Memi oğlu, M. 2005. Ecballium elaterium Bitkisinde Hücre Süspansiyon Kültürü Tekni ği ile Sekonder Metabolit (Kukurbitasin B) Üretimi, Doktora Tezi, Ankara. Menkovic, N., Savikin-Fodulovic, K. Momcilovic, I. and Grubisic, D. 2000a. Quantitative Determination of Secoiridoid and γ-Pyrone Compounds in Gentiana lutea Cultured in vitro . Planta Med., 66; 96-98. Menkovic, N., Savikin-Fodulovic, K. and Savin, K. 2000b. Chemical Composition ans Seasonal Variation in the Amount of Secondary Compounds in Gentiana lutea Leaves and Flowers. Planta Medica, 66; 178-180. Meyer, H. J. and van Staden, J. 1995. The in vitro production of an anthocyanin from callus cultures of Oxalis linearis . Plant Cell Tissue Org Cult, 40;55–58. Mok, M. C., Gabelman, W. H. and Skoog, F. 1976. Carotenoid synthesis in tissue cultures of Daucus carota . J Am Soc Hortic Sci, 101;442–449. Momcilovic, I., Grubisic, D. and Neskovic, M. 1997. Micropropagation of Four Gentiana species ( G. lutea, G. cruciata, G. purpurea and G. acaulis ). Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 49; 141-144. Morgan, E. R., Butler, R. M. and Bicknell, R. A. 1997. In vitro Propagation of Gentiana cerina and Gentiana corymbifera . New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science, 25; 1-8. Murashige, T. and Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant., 15; 473-497. Niiho, Y., Yamazaki, T., Nakajima, Y., Yamamoto, T., Ando, H., Hirai, Y., Toriizuka, K. and Ida, Y. 2006. Gastroprotective effects of bitter principles isolated from Gentian root and Swertia herb on experimentally-induced gastric lesions in rats. Journal od Natural Medicine, 60: 82–88. Odontuya, G., Hoult, J. R. S. and Houghton, P. J. 2005. Structure-activity relationship for antiinflammatory effect of luteolin antiinflammatory effect of luteolin. Phytothreapy Research, 19; 782-786. Öztürk, N., Ba er, K. H. C., Aydın, S., Öztürk, Y. and Çalı , Đ. 2002. Effects of
116 Gentiana lutea ssp. symphyandra on the central nervous system in mice. Phytother Res., 16(7); 627-631. Parr, A. J., Robins, R. J. and Rhodes, M. J. C. 1984. Permeabilization of Cinchona ledgeriana cells by dimethyl sulfoxide: Effect on alkaloid release and long term membrane integrity. Plant Cell Rep, 3;262–265. Pawlowska, B. and Bach, A. 2003. In vitro Propagation of Protected Species Gentiana pneumonanthe L. for Ornamental Horticultural Use. Folia Horticulturae, 15(1); 113-122. Peng, X., Zheng, Z., Cheng, K.-W, Shan, F., Ren, G.-X., Chen, F. and Wang, M. 2008. Inhibitory effect of mung bean exract and its constituents vitexin and isovitexin on the formation of advanced glycation endproducts. Food Chemistry, 106; 475- 481. Pereira, C. A. M., Yariwake, J. H. and McCullagh, M. 2005. Distinction of the C- Glycosylflavone Isomer Pairs Orientin/Isoorientin and Vitexin/Isovitexin Using HPLC-MS Exact Mass Measurement and In-source CID. Phytochemical Analysis, 16; 295-301. Petrovic, S., Leskovac, A. and Joksic, G. 2008. Radioprotective properties of Gentiana dinarica polyphenols on human lymphocytes in vitro . Current Science, 95(8); 1035-1041. Piatczak E., Wielanek, M. and Wysokinska, H. 2005a. Liquid Culture System for Shoot Multiplication and Secoiridoid Production in Micropropagated Plants of Centaurium erythrea Rafn. Plant Science, 168; 431-437. Piatczak E., Chimel, A. and Wysokinska, H. 2005b. Mist Trickling Bioreactor for Centaurium erythrea Rafn Growth of Shoots and Production of Secoiridoids. Biotechnology Letters, 27; 721-724. Popov, S.S., Marekov, N.L. and Do, T.N. 1988. In vitro transformations of gentiopicroside and swertiamarin. Journal of Natural Products, 51(4); 765-768. Pureb, O., Zhim’vansan, Ya. and Oyun, Kh. 1991. Xanthones and flavonoids of Gentiana barbata . Chemistry of Natural Compounds, 27(2); 245-246. Rabe, C., Steenkamp, J.A., Joubert, E., Burger, J.F.W. and Ferreira, D. 1994. Phenolic metabolites from Rooibos tea ( Aspalathus linearis ). Phytochemistry, 35(6); 1559-1565.
117 Rajendran, L., Ravishankar, G. A., Venkataraman, L. V. and Prathiba, K. R. 1992. Anthocyanin production in callus cultures of Daucus carota L. as influenced by nutrient stress and osmoticum. Biotechnol Lett, 14;707–714. Rajendran, L., Suvarnalatha, G., Ravishankar, G. A. and Venkataraman, L. V. 1994. Enhancement of anthocyanin production in callus cultures of Daucus carota L. under influence of fungal elicitors. Appl Microbiol Biotechnol, 42;227–231. Rakhmatullaev, T.U. and Yunusov, Yu. 1972. Alkaloids of Gentiana olivieri . Khimiya Prirodnykh Soedineii, 3; 350-353. Ramachandra Rao, S., Sarada, R. and Ravishankar, G. A. 1996b. Phycocyanin, a new elicitor of capsaicin and anthocyanin accumulation in plant cell cultures. Appl Microbiol Biotechnol, 46;619–621. Ramachandra Rao, S. and Ravishankar, G. A. 2002. Plant cell cultures: Chemical factories of secondary metabolites. Biotechnol. Adv, 20;101–153. Razdan, M. K. 2003. Introduction to Plant Tissue Culture. Science Publishers, India. Rodriguez, S., Marston, A., Wolfender, J. L. and Hostettmann, K. 1998. Iridoids and secoiridoids in the Gentianaceae. Current Organic Chemistry, 2; 627-648. Sabovljevic, A., Rosic, N., Jankovic, T. and Grubisic, D. 2006. Secoiridoid Content of Blackstonia perfoliata in vivo and in vitro . In vitro Cellular and Developmental Biology- Plant, 42; 427-431. Sakamoto, K., Iida, K., Sawamura, K., Hajiro, K., Asada, Y., Yoshikawa, T. and Furuya, T. 1993. Effects of nutrients on anthocyanin production in cultured cells of Aralia cordata . Phytochemicals, 33;357–360. Samatov, A, Akramov, S.T. and Yunusov, Yu. 1967. Alkaloids of Gentiana. Structure of gentianadine and gentianamine. Khimiya Prirodnykh Soedineii, 3(2); 182- 187. Sasse, F., Knobloch, K. and Berlin, J. 1982. Induction of secondary metabolism in cell suspension cultures of Catharanthus roseus , Nicotiana tabacum and Peganum harmala . In: Proceedings of the 5th International Congress of Plant Tissue and Cell Culture. Fujiwara, A. (ed), Abe Photo Printing, pp. 343–344, Tokyo. Schauss, A. G., Wu, X., Prior, R. L., Ou, B., Patel, D., Huang, D. and Kababick, J. P.
118 2006. Phytochemical and Nutrient Composition of the Freeze-Dried Amazonian Palm Berry, Euterpe oleracea Mart. (Acai) . J. Agric. Food Chem., 54(22); 8598–8603. Seigler, D. S. 1999. Plant Secondary Metabolism. Springer-Verlag, Berlin. Seitz, H. U. and Hinderer, W. 1988. Anthocyanins. In: Cell culture and somatic cell genetics of plants vol. 5. Constabel, F. and Vasil, I. (ed), Academic Press, pp. 49–76, San Diego. Seo, W. T., Park, Y. H. and Choe, T. B. 1993. Identification and production of flavonoids in a cell suspension culture of Scutellaria baicalensis G. Plant Cell Reports, 12(7-8);414-417. Sezik, E., Aslan, M., Yesilada, E. and Ito, S. 2005. Hypogylcaemic Activity of Gentiana olivieri and Isolation of the Active Constituent through Bioassay- directed Fractionation Techniques. Life Sciences, 76; 1223-1238. Shibasaki-Kitakawa, N., Takeishi, J. and Yonemoto, T. 2003. Improvement of catechin productivity in suspension cultures of tea callus cells. Biotechnol. Prog., 19:655– 668. Slack, S. A. and Tufford, L. A. 1995. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Fundamental Methods. In: O.L. Gamborg and G.C. Phillips (eds), Springer- Verlag, Berlin. Szücs, Z, Danos, B. and Nyiredy, Sz. 2002. Comparative Analysis of the Underground Parts of Gentiana Species by HPLC with Diode-Array and Mass Spectrometric Detection. Chromatographia 56(Supplement); 19-23. ener, B. ve Toker, G. 1986. Flavonoitlerin Eczacılık Yönünden Önemi. Mar. Ünv. Ecz. Der., 2(2);169-183. Takahata, Y. and Jomori, H. 1989. Plant Regeneration from Mesophyll Protoplasts of Gentiana (Gentiana scabra Bungei). Plant Tissue Culture Letters, 6 (1); 19-21. Takashi, N., Masahiro, N., Keiichiro, M., Hiroshi, H. and Saburo,Y. 2005. Two different transposable elements inserted in flavonoid 3 ′,5 ′-hydroxylase gene contribute to pink flower coloration in Gentiana scabra . Molecular Genetics and Genomics, 275; 231–241. Takeda, Y., Masuda, T., Honda, G., Takaishi, Y., Ito, M., Ozodebek A. A., Khodzhimatov O. K. and Otsuka, H. 1999. Secoiridoid Glycosides from
119 Gentiana olivieri . Chem. Pharm. Bull., 47 (9); 1338-1340. Tan, R. X., Kong, L. D. and Wei, H. X. 1998. Secoiridoid Glycosides and An Antifungal Anthranilate Derivative from Gentiana tibetica . Phytochemistry, 47; 1223-1226. Taylor, L. P. and Grotewold, E. 2005. Flavonoids as developmental regulators. Current Opinion in Plant Biology, 8; 317-323. Tiwari, R. K., Trivedi, M., Guang, Z. C., Guo, G. and Zheng, G. 2007. Genetic Transformation of Gentiana macrophylla with Agrobacterium rhizogenes : Growth and Production of Secoiridoid Glucoside Gentiopicroside in Transformed Hairy Root Cultures. Plant Cell Reports, 26; 199-210. Tundis, R., Loizzo, M. R., Menichini, F., Statti, G. A. and Menichini, F. 2008. Biological and Pharmacological Activities of Iridoids: Recent Developments. Mini-Review in Medicinal Chemistry, 8; 399-420. Van Uden, W., Pras, N. and Malingre, T. H. M. 1990. On the improvement of the podophyllotoxin production by phenylpropanoid precursor feeding to cell cultures of Podophyllum hexandrum Royle. Plant Cell Tissue Org Cult, 23; 217– 224. Vanisree, M., Lee, C., Lo, S., Nalawade, S. M., Lin, C. Y. and Tsay, H. 2004. Studies on the production of some important secondary metabolites from medicinal plants by plant tissue culture. Bot. Bull. Acad. Sin., 45; 1-22. Wagner, H., Bladt, S. and Rickl, V. 2001. Plant Drug Analysis: A Thin Layer Chromatography Atlas. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, New York. Wang, A., Lian, L., Jiang, Y. and Nan, J. 2010. Gentiana manshurica Kitagawa prevents acetaminophen-induced acute hepatic injury in mice via inhibiting JNK/ERK MAPK pathway. World Journal of Gastroenterology, 16(3): 384-391. Wu, Q.-X, Li, Y. and Shi, Y. –P. 2006. Antioxidant phenolic glucosides from Gentiana piasezkii . Journal of Asian Natural Products Research, 8(5): 391–396. Xu, M., Zhang, M., Zhang, Y.-J. and Yang, C.-R. 2009. New Acylated Secoiridoid Glucosides from Gentiana straminea (Gentianaceae). Helvetica Chimica Acta, 92; 321-327. Ya ğcı, C. 2005. Gentiana olivieri Griseb. (Afat)’nin Bitki Doku Kültürüne Cevabı. Yüksek Lisans Tezi, Ankara.
120 Ya ğcı, C., Toker, M.C. and Toker, G. 2008. Bitki doku kültürü yoluyla üretilen flavonoitler. Türk Bilimsel Derlemeler Dergisi, 1(1): 47-58. Yamakawa, T., Kato, S., Ishida, K., Kodama, T. and Minoda, Y. 1983. Production of anthocyanins by Vitis cells in suspension culture. Agric Biol Chem, 47; 2185– 2191. Yang, Y. 2001. Chinese Herbal Medicines Comparisons and Characteristics. Redwing Book Co., ISBN: 0-4430-7166-7, 41-63 pp. Zenk, M., El-Shagi, H. and Ulbrich, B. 1977. Production of Rosmarinic acid by Cell Suspension Cultures of Coleus blumei . Naturwissenschaften, 64; 585-586. Zhang, Z. and Leung, D. W. M. 2002. Factors Influencing the Growth of Micropropagated Shoots and in vitro Flowering of Gentian. Plant Growth Regulation, 36; 245-251. Zhang, W., Curtin, C., Kikuchi, M. and Franco, C. 2002. Integration of jasmonic acid and light irradiation for enhancement of anthocyanin biosynthesis in Vitis vinifera suspension cultures. Plant Science, 162; 459–468.
121 ÖZGEÇM Đ
Adı Soyadı: Canan YA ĞCI TÜZÜN Do ğum Yeri: 12.03.1980 Do ğum Tarihi: Ankara Medeni Hali: Evli Yabancı Dil: Đngilizce (Mart 2005 UDS 73.75, Mayıs 2009 KPDS 69)
Eğitim Durumu
Lise : Kanuni Lisesi (Ankara), 1994-1997 Hazırlık Okulu: Ankara Üniversitesi TÖMER Hazırlık Okulu, 1997 -1998 Lisans: Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi, Biyoloji Bölümü (Moleküler Biyoloji ve Biyoteknoloji Bran ı), 1998-2002 Yüksek Lisans: Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Tezli Yüksek Lisans (Gentiana olivieri Griseb. (Afat)’in bitki doku kültürüne cevabı), 2002-2005
Çalı tı ğı Kurumlar Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Moleküler Biyoloji ABD’de Ara tırma Görevlisi, Kasım 2002-Haziran 2011
T.C. Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanlı ğı, Tarımsal Ara tırmalar ve Politikalar Genel Müdürlü ğü, Tarla Bitkileri Merkez Ara tırma Enstitüsü, Türkiye Tohum Gen Bankası’nda Uzman Biyolog, Haziran 2011-
Yayınlar
Ulusal ve Uluslararası Hakemli Dergilerde yayınlanan makaleler
Canan YA ĞCI , M. Cihat TOKER ve Gülnur TOKER. 2008. “Bitki Doku Kültürü Yoluyla Üretilen Flavonoitler” Türk Bilimsel Derlemeler Dergisi, 1(1); 47-58.
122 Canan YA ĞCI TÜZÜN , Mehmet Cihat TOKER and Gülnur TOKER. 2011. “Anatomical Investigations on Root, Stem and Leaf of Gentiana olivieri Griseb.” Pharmacognosy Magazine, 7(25); 9-13.
Canan YA ĞCI TÜZÜN , Mehmet Cihat TOKER ve Gülnur TOKER. “Gentiana olivieri Griseb.’in Kallus Kültürlerinin Kurulması ve Sekonder Metabolitlerin Ara tırılması” Tarım Bilimleri Dergisi (ID 160) (SCI-Expanded kapsamında) (hakem de ğerlendirmesi bekleniyor)
Canan YA ĞCI TÜZÜN , Mehmet Cihat TOKER ve Gülnur TOKER. “ In vitro seed germination of Gentiana olivieri Griseb.” Seed Science and Technology (SST 1682) (SCI-Expanded kapsamında) (hakem düzeltmeleri yapılıyor)
enol, Fatma Sezer; Yagci Tuzun, Canan ; Toker, Gulnur; Erdogan Orhan, Ilkay. “An in vitro perspective to cholinesterase inhibitory and antioxidant activity of five Gentiana species and Gentianella caucasea ”. International Journal of Food Sciences and Nutrition (CIJF-2011-0573) (SCI-Expanded kapsamında) (hakem de ğerlendirmesi bekleniyor)
Sözlü ve Yazılı Bildiriler
“In vitro Germination of Gentiana olivieri Griseb. Seeds”, Yagci C. , Toker M.C. and Toker G., XVII. International Botanical Congress (17 - 23 July 2005, Vienna- Austria) (Poster)
“Callus Production in Centaurea tchihatcheffii (Yanardöner)”, H. Çölgeçen, C. Ya ğcı , M.C. Toker, G. Toker, 8th International Symposium on Pharmaceutical Sciences, 13-16 June 2006, Ankara, Turkey (Poster)
“Gentiana olivieri Griseb (Afat)’in Kök, Gövde ve Yaprak Anatomisi”, Canan YA ĞCI , Hatice ÇÖLGEÇEN, Nurhan BÜYÜKKARTAL, Gülnur TOKER, M. Cihat TOKER, 18. Ulusal Biyoloji Kongresi, 26-30 Haziran 2006, Ku adası-Aydın (Poster)
123 “Ultrastructure of seed coat in Gentiana olivieri (Afat)”, H. Nurhan BÜYÜKKARTAL, Canan YA ĞCI , Hatice ÇÖLGEÇEN, XV Congress of the Federation of European Societies of Plant Biology, 17- 21 July 2006, Lyon, France (Poster)
“Gentiana olivieri Griseb. (Afat) Kallus Kültürü ve Kallustaki Sekonder Metabolitler”, C. Ya ğcı , M.C. Toker, G. Toker, XV. Ulusal Biyoteknoloji Kongresi, 28- 31 Ekim 2007, Antalya (Sözlü Bildiri)
“Gentiana L. (Fam:Gentianaceae) Cinsinin Pneumonanthe ve Cruciata Seksiyonlarına Ait Bazı Türlerin Polen Morfolojileri” Canan Ya ğcı ve enol Alan, 19. Ulusal Biyoloji Kongresi, Karadeniz Teknik Üniversitesi, 23-27 Haziran 2008, Trabzon (Poster)
Yürütülen çalı malar
A.Ü. Biyoteknoloji Enstitüsü tarafından desteklenen projeler Gentiana olivieri Griseb.’de kallus olu umu ve kallusta izoorientin miktarının tayini. Proje no 136, Nisan 2004- Nisan 2007 (tamamlandı)
Arnebia densiflora (Nordm.) Ledeb. hücre süspansiyon kültürlerinde ikonin miktarı ve artırılması. Proje no 131, Nisan 2004-Nisan 2007 (tamamlandı)
TÜB ĐTAK tarafından desteklenen projeler
Centaurea tchihatcheffii (Yanardöner)’de Kallus Üretimi ve Fitokimyasal Đçeri ğinin Belirlenmesi. TÜB ĐTAK (106T205)(TBAG-HD/140), Mayıs 2006-Mayıs 2007 (tamamlandı)
Bitkisel Kaynaklı Đlaç Etken Maddelerinin Biyoteknolojik Yöntemlerle Üretilmesi Üzerine Çalı malar. TÜB ĐTAK (1055343), Mayıs 2006-Mayıs 2010 (tamamlandı).
124