Ribes Uva Crispa L.) Und Jostabeeren (Ribes X Nidigrolaria Bauer

TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN Lehrstuhl für Allgemeine Lebensmitteltechnologie

Kapillargaschromatographische und sensorische Untersuchungen flüchtiger Verbindungen in Stachelbeeren (Ribes uva crispa L.) und Jostabeeren (Ribes x nidigrolaria Bauer)

Katrin S. Schrade

Vollständiger Abdruck der von der Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für Ernährung, Landnutzung und Umwelt der Technischen Universität München zur Erlangung des akademischen Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften genehmigten Dissertation.

Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. W. Schwab Prüfer der Dissertation: 1. Univ.-Prof. Dr. K.-H. Engel 2. Univ.-Prof. Dr. P. Schieberle

Die Dissertation wurde am 05.12.2013 bei der Technischen Universität München eingereicht und durch die Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für Ernährung, Landnutzung und Umwelt am 07.04.2014 angenommen.

DANKSAGUNG

Meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. K.-H. Engel danke ich sehr herzlich für die Überlassung des Themas und für die vielen anregenden Diskussionen. Insbesondere bedanke ich mich für die jederzeit offen stehende Tür, durch welche die Diskussionen fachlicher Fragestellungen stak erleichtert wurden.

Weiterhin bedanke ich mich bei meinen ehemaligen Kolleginnen und Kollegen des Lehrstuhls für Allgemeine Lebensmitteltechnologie. Mir wurde eine außergewöhnliche Hilfsbereitschaft und Unterstützung entgegengebracht. Der starke Zusammenhalt in unserem Team führte zu einem wunderbaren Arbeitsklima, welches jeden meiner Arbeitstage verschönerte. Diese tolle Erfahrung werde ich nicht vergessen! Mein besonderer Dank gilt außerdem Oxana Fastowski, die mich bei den praktischen Arbeiten im Labor sowie durch ihr ruhiges Gemüt stets unterstützte, und an Anne-Marie Orth und Dr. Bastian Reichardt, die mich als Freunde und Kollegen in der Aromagruppe während fast der gesamten Zeit am Lehrstuhl unterstützten. Mit ihnen führte ich zahlreiche Diskussionen, die mich in meiner Arbeit weiterbrachten und ohne welche eine vielseitige Betrachtung von Fragestellungen und Problemen oft nicht möglich gewesen wäre.

Für die erfolgreiche Mitarbeit im Rahmen ihrer Bachelor-, Abschluss- und Masterarbeiten, sowie Praktika bedanke ich mich sehr herzlich bei Svenja Nörenberg, Jennifer Gatzemeier, Johannes Dechau, Martina Lechner, Christan Hones, Melanie Marx, Marianna Ziegltrum, Johanna Celic und Markus Kopp.

Außerdem danke ich allen Teilnehmern der zahlreichen Sensorik-Panels, die durch ihre tatkräftige Unterstützung entscheidend zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben.

Herzlichen bedanke ich mich auch bei Herrn Schilling und Herrn Wiesinger (Hochschule Weihenstephan-Triesdorf, Freising), Herrn Göding (Lehr- und Beispielbetrieb Deutenkofen), Herrn Dr. Pour Nikfardjam und Frau Richter (Staatliche Lehr- und Versuchsanstalt für Wein- und Obstbau Weinsberg) sowie bei Herrn Schwaiger und Herrn Schimmelpfeng, ohne deren hilfsbereites Überlassen von Beeren diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre.

Mein größter Dank gilt allerdings meiner Familie, die mich während der gesamten Zeit unterstützte und mich in schwierigen Zeiten motivierte. Im Besonderen bedanke ich mich bei meinem Bruder Christian für dessen entgegengebrachtes Vertrauen und seine Unterstützung sowie bei meinem Mann Andri, der mir die Energie gab, diese Arbeit fertigzustellen.

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung und Zielsetzung ...... 1

2 Kenntnisstand und Grundlagen ...... 3

2.1 Stachelbeeren und Jostabeeren ...... 3 2.1.1 Botanik und Verwendung ...... 3 2.1.2 Inhaltsstoffe ...... 5 2.1.2.1 Stachelbeeren ...... 5 2.1.2.2 Jostabeeren ...... 8

2.2 Enzymatische Bildung von Aromastoffen aus ungesättigten Fettsäuren ...... 9

2.2.1 Enzymatische Bildung von C6-Komponenten ...... 9 2.2.2 Enzymatische Bildung weiterer kurzkettiger Aldehyde und Alkohole ...... 10

2.2.3 Aromaeigenschaften von C6-Komponenten ...... 11

2.2.4 Pflanzenphysiologische Wirkung der C6-Komponenten ...... 11

2.3 Sensorische Analyse ...... 12 2.3.1 Geruchswahrnehmung ...... 12 2.3.2 Methoden zur sensorischen Bewertung ...... 14 2.3.2.1 Verschiedene Anwendungen der Gaschromatographie-Olfaktometrie (GC-O) ...... 14 2.3.2.2 Aromawertkonzept ...... 16 2.3.3 Rekombinationen und Weglassversuche ...... 16

3 Material und Methoden ...... 17

3.1 Material ...... 17 3.1.1 Untersuchungsmaterial ...... 17 3.1.2 Chemikalien ...... 19 3.1.3 Synthese von Referenzsubstanzen ...... 20

3.2 Methoden ...... 21 3.2.1 Isolierung und Konzentrierung flüchtiger Verbindungen ...... 21 3.2.1.1 Vakuum Headspace Technik (VHS) ...... 21 3.2.1.2 Flüssig-Flüssig-Extraktion (LLE) ...... 22 3.2.1.3 Headspace HRGC-MS (HS) ...... 22

3.2.2 Identifizierung flüchtiger Verbindungen (VHS und LLE) ...... 24 3.2.2.1 Bestimmung der Retentionsindices ...... 24 3.2.2.2 Kapillargaschromatographie-Massenspektrometrie (HRGC-MS) ...... 24 3.2.3 Quantifizierung flüchtiger Verbindungen (VHS und LLE) ...... 25 3.2.3.1 Kapillargaschromatographie (HRGC-FID) ...... 25 3.2.3.2 Bestimmung der FID-Response-Faktoren ...... 26 3.2.3.3 Bestimmung der absoluten Wiederfindung von Heptan-2-ol ...... 26 3.2.3.4 Bestimmung der relativen Wiederfindungsraten ...... 26 3.2.3.5 Ermittlung der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen ...... 28

2 3.2.3.6 Quantifizierung mit dem deuterierten Standard [ H2]-(Z)-Hex-3-enal ...... 29 3.2.4 Untersuchung chiraler Aromastoffe ...... 30 3.2.5 Sensorische Bewertung flüchtiger Verbindungen ...... 31 3.2.5.1 Kapillargaschromatographie-Olfaktometrie (GC-O) ...... 31 3.2.5.2 Bestimmung der Geruchsschwellenwerte von Aromastoffen ...... 32 3.2.5.3 Berechnung von Aromawerten ...... 33 3.2.5.4 Aromaprofilanalyse ...... 33 3.2.6 Rekombination des Aromas frischer Beeren ...... 34 3.2.7 NMR-Spektroskopie ...... 35

4 Ergebnisse und Diskussion ...... 37

4.1 Analyse der flüchtigen Verbindungen in Stachelbeeren ...... 37 4.1.1 Identifizierung und Quantifizierung der flüchtigen Verbindungen mittels VHS ..37 4.1.1.1 Einleitung ...... 37 4.1.1.2 Zusammensetzung des flüchtigen Profils der frischen Beeren ...... 37 4.1.1.3 Einfluss der enzymkatalysierten Reaktionen auf das Spektrum von

C6-Verbindungen ...... 52 4.1.1.4 Chirale Verbindungen in Stachelbeeren ...... 53 4.1.1.5 Einfluss der Reife ...... 56 4.1.1.6 Einfluss der Tiefkühllagerung ...... 58 4.1.2 Einfluss anderer Isolierungsverfahren ...... 61 4.1.2.1 Einleitung ...... 61 4.1.2.2 Isolierung der flüchtigen Verbindungen mittels LLE ...... 62 4.1.2.3 Isolierung der flüchtigen Verbindungen mittels Headspace HRGC-MS .....69 4.1.3 Sensorische Analyse ...... 73 4.1.3.1 Einleitung ...... 73

4.1.3.2 Analyse der aromaaktiven Komponenten ...... 73 4.1.4 Analyse des flüchtigen Profils eines Stachelbeerproduktes ...... 79 4.1.4.1 Einleitung ...... 79 4.1.4.2 Ergebnisse und Diskussion ...... 80 4.1.5 Zusammenfassung ...... 83

4.2 Analyse der flüchtigen Verbindungen in Jostabeeren ...... 85 4.2.1 Identifizierung und Quantifizierung der flüchtigen Verbindungen mittels VHS ..85 4.2.1.1 Einleitung ...... 85 4.2.1.2 Zusammensetzung des flüchtigen Profils der frischen Beeren ...... 85 4.2.1.3 Einfluss der enzymkatalysierten Reaktionen auf das Spektrum von

C6-Verbindungen ...... 96 4.2.1.4 Chirale Verbindungen in Jostabeeren ...... 97 4.2.1.5 Einfluss der Reife ...... 99 4.2.1.6 Einfluss der Tiefkühllagerung ...... 102 4.2.2 Einfluss der Flüssig-Flüssig-Extraktion auf das Aromaprofil von Jostabeeren 104 4.2.2.1 Einleitung ...... 104 4.2.2.2 Ergebnisse und Diskussion ...... 104 4.2.3 Sensorische Analyse ...... 111 4.2.3.1 Einleitung ...... 111 4.2.3.2 Analyse der aromaaktiven Komponenten ...... 112 4.2.3.3 Rekombination des Aromas frischer Jostabeeren ...... 113 4.2.4 Analyse des flüchtigen Profils eines Jostabeerenproduktes ...... 116 4.2.4.1 Einleitung ...... 116 4.2.4.2 Ergebnisse und Diskussion ...... 116 4.2.5 Zusammenfassung ...... 119

4.3 Vergleich des flüchtigen Profils verschiedener Beeren der Gattung Ribes ...... 120 4.3.1 Einleitung ...... 120 4.3.2 Ergebnisse und Diskussion ...... 120

5 Zusammenfassung ...... 123

6 Literatur ...... 125

7 Anhang ...... 137

7.1 Absolute Wiederfindungsraten von Heptan-2-ol bei VHS und LLE ...... 137

7.2 Vergleich der Wiederfindungsraten bei VHS und LLE aus Beerenmatrix-Imitat und Wasser ...... 137

7.3 Wiederfindungsraten von (Z)-Hex-3-enal, (E)-Hex-3-enal und (E)-Hex-2-enal mit 10-fach höheren und 10-fach niedrigeren Konzentrationen ...... 138

7.4 Zur Quantifizierung verwendete Wiederfindungsraten ...... 138

7.5 NMR-spektroskopische Daten des synthetisierten 2-Hydroxy-1,8-cineols ...... 140

7.6 Identifizierung und Quantifizierung flüchtiger Verbindungen in Goldjohannis- beeren (Ribes aureum L.) ...... 141

TRIVIALNAMEN

Acetophenon 1-Phenylethan-1-on

Acetoin 3-Hydroxybutan-2-on

Anethol 1-(4-Methoxyphenyl)prop-1-en

Borneol Endo-1,7,7-Trimethylbicyclo[2,2,1]heptan-2-ol

Camphen 2,2-Dimethyl-3-methylenbicyclo[2,2,1]heptan

Campher 1,7,7-Trimethylbicyclo[2,2,1]heptan-2-on

∆-3-Caren 3,7,7-Trimethylbicyclo[4,1,0]hept-3-en

Chrysanthenylacetat 2,7,7-Trimethylbicyclo[3,1,1]hept-2-en-6-ylacetat

1,8-Cineol 1,3,3-Trimethyl-2-oxabicyclo[2,2,2]octan

(Z)-Cineron (Z)-But-2-en-2-yl-3-methylcyclopent-2-en-1-on

Citronellol 3,7-Dimethyloct-6-en-1-ol

β-Cyclocitral 2,6,6-Trimethylcyclohex-1-en-1-carboxaldehyd p-Cymen p-Isopropyltoluol p-Cymen-7-ol 4-(1-Methylethyl)benzenmethanol p-Cymen-8-ol α,α,4-Trimethylbenzenmethanol

β-Damascenon (2,6,6-Trimethylcyclohexa-1,3-dien-1-yl)but-2-en-1-on

Diethylmalonat 1,3-Diethylpropandisäure

α-Dihydroionon 4-(2,6,6-Trimethylcyclohex-2-en-1-yl)butan-2-on

β-Dihydroionon 4-(2,6,6-Trimethylcyclohex-1-en-1-yl)butan-2-on p-α-Dimethylstyrol 1-Methyl-4-(1-methylethenyl)-benzen

Furfural 2-Furancarboxaldehyd

Geraniol (E)-3,7-Dimethylocta-2,6-dien-1-ol

(Z)-Geranylaceton (Z)-6,10-Dimethylundeca-5,9-dien-2-on

2-Hydroxy-1,8-cineol 1,3,3-Trimethyl-2-oxabicyclo[2,2,2]octan-6-ol

α-Ionon (E)-4-(2,6,6-Trimethylcyclohex-2-en-1-yl)but-3-en-2-on

β-Ionon (E)-4-(2,6,6-Trimethylcyclohex-1-en-1-yl)but-3-en-2-on

α-Iron 4-(2,5,6,6-Tetramethylcyclohex-2-enyl)but-3-en-2-on

Isoeugenol 2-Methoxy-4-(prop-1-en-1-yl)phenol

Limonen 4-Isopropenyl-1-methylcylohexen

β-Linalool 3,7-Dimethylocta-1,6-dien-3-ol

(E)-Linalooloxid 5-Ethenyltetrahydro-α,α,5-trimethyl-2-furanmethanol

Menthon 5-Methyl-2-(1-methylethyl)-cyclohexan-1-on

Mesifuran 4-Methoxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanon

Myrcen 7-Methyl-3-methylen-1,6-octadien

α-Pinen 2,6,6-Trimethylbicyclo[3,1,1]hept-2-en

β-Pinen 6,6-Dimethyl-2-methylenbicyclo[3,1,1]heptan

α-Terpinen 1-Methyl-4-(1-methylethyl)cyclohexa-1,3-dien

γ-Terpinen 1-Methyl-4-(1-methylethyl)cyclohexa-1,4-dien

Terpinen-4-ol 4-Methyl-1-(1-methylethyl)cyclohex-3-en-1-ol

α-Terpineol α,α,4-Trimethylcyclohex-3-en-1-methanol

Terpinolen 1-Methyl-4-(1-methylethyliden)cyclohexen

Theaspiran 2,6,10,10-Tetramethyl-1-Oxaspiro[4,5]dec-6-en

Methylisoeugenol 1,2-Dimethoxy-4-(prop-1-en-1-yl)benzen

Menthol 5-Methyl-2-(1-methylethyl)cyclohexan-1-ol

γ-Octalacton 5-Butyldihydro-2(3H)-furanon

Propylenglykol Propan-1,2-diol

Rosenoxid Tetrahydro-4-methyl-2-(2-methylprop-1-en-1-yl)-2H-pyran

Sabinen 4-Methylen-1-(1-methylethyl)-bicyclo[3,1,0]hexan

Zimtsäure (E)-3-Phenylpropensäure

ABKÜRZUNGEN

AEVA Aromaextraktverdünnungsanalyse

BG Bestimmungsgrenze

BHT 3,5-di-tert-Butyl-4-hydroxytoluol

DE Diethylether

EG Erfassungsgrenze

EI Elektronenstoßionisation

FD-Faktor Flavor Dilution-Faktor

FID Flammenionisationsdetektor

GC Gaschromatographie

GC-O Gaschromatographie-Olfaktometrie

HRGC Kapillargaschromatographie (High Resolution Gas Chromatography)

HS Headspace

RI Retentions Index

LLE Flüssig-Flüssig-Extraktion

MDGC Multidimensionale Gaschromatographie

MS Massenspektrometrie

NG Nachweisgrenze

NMR Kernresonanzspektroskopie

Pe n-Pentan

SDE Simultane Destillation-Extraktion

VHS Vakuum Headspace Technik

Einleitung und Zielsetzung

1 Einleitung und Zielsetzung

Stachelbeere (Ribes uva crispa L.) und Jostabeere (Ribes x nidigrolaria Bauer) gehören zur Gattung der Johannisbeeren (Ribes L.) in der Familie der Stachelbeergewächse (Grossulariaceae). Stachelbeeren (Ribes uva crispa L.) werden seit Beginn des 17. Jahrhunderts in Europa angebaut. Sie erlangten in Europa große Beliebtheit und obwohl die Nachfrage in den vergangenen Jahren leicht gesunken ist, stellen Stachelbeeren immer noch eine weit verbreitete Beerenobstart dar, die vor allem zum frischen Verzehr, aber auch zur Herstellung von Konfitüren, Desserts und Säften verwendet wird. Bis heute sind über 4800 verschiedene Stachelbeer-Sorten bekannt (Barney und Hummer 2005). Über die Inhaltsstoffe von Stachelbeeren gibt es jedoch nur wenige Informationen. Erste Studien ergaben, dass Äpfel- und Zitronensäure die dominierenden organischen Säuren in Stachelbeeren darstellen (Whiting 1958). Weitere Forschungsarbeiten beschäftigten sich mit Ernteparametern (Mäge 2002) und dem Einfluss von Lagerungsbedingungen auf die Qualität der Früchte (Shelaputin und Saatchan 1953, Harb und Streif 2004). In den Forschungsarbeiten der letzten Jahre wurden vor allem die phenolischen Inhaltsstoffe sowie die antioxidativen Eigenschaften der Beere untersucht (Stöhr und Herrmann 1975, Nowak und Zgorka 1997, Haekkinen et al. 1999, Kaehkoenen et al. 2001, Moyer et al. 2002b, Wu et al. 2004, Mattivi und Vrhovsek 2005, Mattila et al. 2006, Jordheim et al. 2007, Pantelidis et al. 2007, Woodrow et al. 2007, Da Silva Pinto et al. 2008, Russell et al. 2009, Krisch et al. 2009, Filipiak-Szok et al. 2012). Das Wissen bezüglich der flüchtigen Verbindungen in Stachelbeeren ist auf die Identifizierung der natürlichen Vorstufen der Vitispirane in Stachelbeerblättern (Humpf et al. 1992) und auf die Bestimmung der Enantiomerenverhältnisse von Theaspiranen sowie auf die Identifizierung von freier und gebundener Ameisen- und Essigsäure in Stachelbeeren begrenzt (Werkhoff et al. 1991, Mehlitz und Matzik 1956). Die Jostabeere (Ribes x nidigrolaria Bauer) ist das Kreuzungsprodukt aus Schwarzer Johannisbeere (Ribes nigrum L.) und Stachelbeere (Ribes uva crispa L.). Erste Hybridisierungsexperimente wurden bereits 1929 durchgeführt (Lorenz 1929, Bauer 1978). Das Ziel dieser Experimente war die Züchtung einer neuen Beerenobstart, welche eine stärkere Resistenz gegenüber ertrags- und qualitätsmindernden Krankheiten aufweist, da sowohl die Stachelbeere als auch die Schwarze Johannisbeere an Mehltau- (Sphaerotheca mors uvae) bzw. Blattfallkrankheiten wie Säulchenrost (Cronartium ribicola) leiden. Trotz der Züchtung einer maschinell erntbaren Sorte ist ihr kommerzieller Anbau begrenzt, sodass Jostabeeren bis heute ein Nischenprodukt darstellen (Bauer et al. 2000). Aufgrund ihres interessanten und außergewöhnlichen Aromas finden Jostabeeren nicht nur zum frischen

Einleitung und Zielsetzung

Verzehr Verwendung, sondern sind ebenso für die Herstellung von Gelee und Getränken geeignet (Bauer 1978). Das Hauptaugenmerk analytischer Untersuchungen von Jostabeeren liegt auf ihren antioxidativen Wirkstoffen. Erste Studien wurden bereits 1985 veröffentlicht (Schuster und Herrmann 1985), aber besonders während des letzten Jahrzehnts verstärkte sich das Interesse an den Beeren (Moyer et al. 2002a, Moyer et al. 2002b, Jordheim et al. 2007, Krisch et al. 2009). Der Phenolgehalt, die antioxidative Kapazität sowie die Konzentration an Anthocyanen in Jostabeeren liegen zwischen den in Stachelbeeren und Schwarzen Johannisbeeren bestimmten Gehalten. Außerdem decken sich die Hauptanthocyane der Jostabeeren mit jenen beider Eltern (Jordheim et al. 2007). Obwohl Bauer bereits 1978 schrieb, dass der Geschmack der Jostabeeren neuartig sei, nämlich eine Kombination aus dem erfrischenden, hochfeinen Aroma der Stachelbeeren und dem typischen Aroma der Schwarzen Johannisbeeren, gab es bisher diesbezüglich keine Untersuchungen. Ziel der vorliegenden Untersuchungen war es daher, die flüchtigen Inhaltsstoffe der Josta- und Stachelbeeren zu identifizieren und zu quantifizieren sowie die Variabilität der Zusammensetzungen der flüchtigen Profile und die sensorischen Beiträge einzelner Komponenten zum Gesamtaroma der Beeren zu bestimmen.

Kenntnisstand und Grundlagen

2 Kenntnisstand und Grundlagen

2.1 Stachelbeeren und Jostabeeren 2.1.1 Botanik und Verwendung Stachelbeeren und Jostabeeren gehören zur Gattung der Johannisbeeren (Ribes L.) in der Familie der Stachelbeergewächse (Grossulariaceae). Die genaue Taxonomie der Beeren ist seit Jahrhunderten konfus. Man findet immer wieder Unterteilungen der Gattung Ribes L. in Untergattungen, Sektionen oder Serien, wie beispielsweise Coreosma (Schwarze Johannisbeeren), Ribesia (Rote Johannisbeeren) und Grossularia (Stachelbeeren) (Barney und Hummer 2005). Die laut Erhardt et al. (2008) korrekte Systematik für Schwarze Johannisbeeren, Stachelbeeren und Jostabeeren, nach welcher die Beeren unterschiedliche Arten innerhalb der Gattung Ribes L. darstellen, ist in Tabelle 1 aufgeführt.

Tabelle 1: Systematik der Schwarzen Johannisbeeren, Stachelbeeren und Jostabeeren nach Erhardt et al. (2008) Schwarze Kultur- Jostabeere Johannisbeere Stachelbeere Klasse: Dikotyledoneae Unterklasse: Rosidae Ordnung: Saxifragales Familie: Grossulariaceae Gattung: Ribes L. Art: nigrum L. uva-crispa L. x nidigrolaria Sorte: var. sativum

Die Kulturstachelbeeren Ribes uva crispa var. sativum, welche von den gewöhnlichen Stachelbeeren Ribes uva crispa var. uva crispa unterschieden werden, umfassen eine große Anzahl unterschiedlicher Sorten, wie beispielsweise Xenia, Bekay oder Achilles (Erhardt et al. 2008). Die Anzahl der während der letzten Jahrhunderts gezüchteten Stachelbeeren wird auf weltweit 3004 rote, 675 gelbe, 925 grüne und 280 weiße Sorten geschätzt. Diese umfassen sowohl zum Verzehr gedachte Beeren als auch Ziersträucher, wie beispielsweise Ribes aureum oder Ribes odoratum (Galletta und Himelrick 1990). Der Anbau von Stachelbeeren begann in Europa ungefähr 1700. Nur 200 Jahre später wurden Stachelbeeren und Johannisbeeren auch in Nordamerika in großen Mengen angebaut. Aufgrund der durch die Stachelbeeren in Amerika eingeschleppten Krankheit Säulchenrost (Cronartium ribicola, engl. white pine blister rust), welche nennenswerte Waldbestände zerstörte, ergaben sich jedoch große Probleme für die Holzindustrie. Dies führte zu Verboten durch die US-Regierung, welche den Stachel- und Johannisbeeranbau in

Kenntnisstand und Grundlagen

Nordamerika untersagte und um 1920 nahezu gänzlich ausrottete. Nach der Züchtung resistenter Sorten wurden 1966 die Verbote zum Anbau von Ribes-Arten in den USA wieder aufgehoben (Barney und Hummer 2005, Herrmann 2001). Mit einer Produktion von weltweit ca. 120000 t für das Jahr 2010 stellen Stachelbeeren dennoch bis heute ein Nischenprodukt dar (FAOSTAT). Verwendung finden die Beeren aufgrund ihres vergleichsweise hohen Zuckergehaltes hauptsächlich zum frischen Verzehr oder zur Herstellung von Konfitüren und Säften. Stachelbeeren und Schwarze Johannisbeeren leiden an unterschiedlichen qualitäts- und ertragsmindernden Krankheiten: Während Stachelbeeren (Ribes uva crispa L.) von Mehltaukrankheiten befallen sind, mindern Blattfallkrankheiten bei Schwarzen Johannisbeeren (Ribes nigrum L.) den Ertrag. Bereits seit 1926 gab es Versuche ein Kreuzungsprodukt aus Stachelbeere und Schwarzer Johannisbeere zu züchten, welches die Resistenzen der Eltern vereinigte (Lorenz 1929, Bauer 1978). Tatsächlich gelang in den 50er Jahren die Züchtung einer neuen Beerenobstart, die eine stärkere Resistenz gegenüber den genannten Krankheiten aufweist. Zur Charakterisierung der Abstammung dieser neuen Beerenobstart von Schwarzer Johannisbeere und Stachelbeere wurde ihr der Name Jostabeere (Ribes x nidigrolaria Bauer) gegeben. Die Früchte dieser Beerenobstart sind im vollreifen Zustand fast schwarz und ihre Größe liegt zwischen jenen der Eltern. Die Jostabeere vereinigt viele der positiven Eigenschaften ihrer Eltern. So übertrifft sie beispielweise deren Wüchsigkeit und ist in der Ertragsleistung den verwandten Sorten überlegen. Außerdem ist die Jostabeere winterhart wie die Stachelbeere, aber dennoch stachellos und der Gehalt an Vitamin C in den Früchten erreicht fast jenen in Schwarzen Johannisbeeren (Bauer 1978). Verwendung finden Jostabeeren hauptsächlich zum frischen Verzehr, sowie verarbeitet zu Getränken oder Konfitüren (Lim 2012). Bis heute stellt allerdings auch die Jostabeere ein Nischenprodukt dar. Aktuelle Anbaudaten lassen sich auf Seiten nationaler und internationaler Institutionen der Agrarwirtschaft nicht finden (beispielsweise Food and Agriculture Organization of the United Nations und Statistisches Bundesamt).

Kenntnisstand und Grundlagen

2.1.2 Inhaltsstoffe

2.1.2.1 Stachelbeeren Stachelbeeren bestehen im Mittel aus 87,2 % Wasser, 7,06 % Kohlenhydraten, 2,95 % Ballaststoffen, 1,44 % Fruchtsäuren 0,80 % Protein, 0,45 % Mineralstoffen und 0,15 % Fett (Souci et al. 2013). Die Gehalte an verschiedenen Vitaminen variieren recht stark. Für Nikotinsäure wurden Konzentrationen im Bereich von 130-389 µg/100 g, für Pantothensäure von 64-302 µg/100 g und für Biotin von 0,35-2,63 µg/100 g nachgewiesen (James 1952). Der Gehalt an Vitamin C liegt in reifen Stachelbeeren bei durchschnittlich 45 mg/100 mL Saft (Mäge 2002). Berechnet auf die ganze Frucht wurden in roten Stachelbeeren 25,4 mg/100g und in gelben Stachelbeeren 20,3 mg/100 g Vitamin C nachgewiesen (Pantelidis et al. 2007). Die Konzentrationen an Vitamin C sind in unreifen Beeren höher und nehmen bis zur Reife der Frucht ab (Koch 1954). Einen genauen Überblick über die weitere Zusammensetzung der Vitamine, Mineralstoffe und Spurenelemente geben Herrmann (2001), Magee (1952) und Souci et al. (2013). Der Zuckergehalt ist in reifen Stachelbeeren recht hoch, wobei der Gehalt an Fructose meist etwas höher liegt als der Gehalt an Glucose. Saccharose liegt in deutlich geringeren Konzentrationen vor. Die bei Herrmann (2001) aufgeführten Werte liegen durchschnittlich bei 3,58 % Glucose, 3,83 % Fructose und 1,41 % Saccharose. Auch die von Mäge (2002), Viljakainen et al. (2002) und Mikulic-Petkovsek et al. (2012a) bestimmten Konzentrationen bestätigen diese Verhältnisse, wobei die absoluten Konzentrationen leicht abweichen. Die Gehalte an Fructose, Glucose und Saccharose sind in unreifen Stachelbeeren geringer und nehmen während der Fruchtreife zu (Mäge 2002, Famiani et al. 2009). Im Widerspruch zu anderen Untersuchungen wiesen Famiani et al. (2009) Saccharose als dominierenden Zucker in reifen Stachelbeeren nach. Auch die in Stachelbeeren enthaltenen organischen Säuren zeigen reifeabhängige Änderungen. Als Hauptvertreter wurden bereits 1958 Zitronensäure und Äpfelsäure identifiziert (Whiting 1958). Zusätzlich wurden Shikimisäure und Chinasäure nachgewiesen, jedoch in deutlich niedrigeren Konzentrationen. Mit zunehmender Reife der Früchte kommt es zu einer Zunahme an Zitronensäure. Auch die Gehalte an Äpfelsäure zeigten am Anfang der Reifung einen leichten Anstieg, nahmen dann jedoch wieder ab, während für Shikimisäure eine leichte Abnahme verzeichnet wurde. Aufgrund dieser reifeabhängigen Veränderungen stellt Shikimisäure in der unreifen Frucht eine der Hauptsäuren dar. In der reifen Frucht sind die Konzentrationen an Äpfelsäure und Zitronensäure jedoch deutlich höher (Whiting 1958). Widersprüchliche Ergebnisse zeigte Mäge (2002), der eine leichte Abnahme von Äpfelsäure und eine konstante Zitronensäure-Konzentration im Zuge der Reifung feststellte. Famiani et al. (2009) verzeichneten im Verlauf der Reifung sowohl für Zitronen- als auch für Äpfelsäure anfangs leichte Zunahmen und später Abnahmen. Die bei 5

Kenntnisstand und Grundlagen

Herrmann (2001) angegebenen Konzentrationen liegen bei 0,72 g Äpfelsäure, 0,72 g Zitronensäure, 0,12 g Shikimisäure und 19 mg Gesamtoxalsäure pro 100 g frischer Stachelbeeren. Für französische und kanadische Früchte wurden folgende Konzentrationen angegeben: 1,05 g Zitronensäure, 0,66 g Äpfelsäure und 0,105 g Shikimisäure pro 100 g Beeren französischer Herkunft und 1,06 g Äpfelsäure, 0,99 g Zitronensäure und 0,031 g Chinasäure pro 100 g Beeren kanadischer Herkunft. (Herrmann 2001) Ähnliche Werte ergaben die Untersuchungen von Mäge (2002) und Viljakainen et al. (2002). Mikulic- Petkovsek et al. (2012a) wiesen zusätzlich 0,137-0,245 g/kg Weinsäure in Stachelbeeren nach. Dieser recht hohe Gehalt an Säuren führt in Stachelbeeren zu einem pH von ungefähr 2,9-3,2 (Mehlitz und Matzik 1956, Viljakainen et al. 2002). Großes Interesse bestand in den vergangenen Jahren an den phenolischen Inhaltsstoffen von Stachelbeeren. Dies zeigen zahlreiche Veröffentlichungen, wie Woodrow et al. (2007) und Mattivi und Vrhovsek (2005). Polyphenole und phenolische Verbindungen stellen natürliche Pflanzeninhaltsstoffe mit antioxidativer Kapazität dar. Kleine Früchte, wie Johannisbeeren und Stachelbeeren, sind bekannt für ihren hohen Gehalt an antioxidativ wirksamen Verbindungen und stellen gute Quellen phenolischer Verbindungen in der menschlichen Ernährung dar (Woodrow et al. 2007, Mattivi und Vrhovsek 2005, Pantelidis et al. 2007). Zu diesen biologisch aktiven Verbindungen zählen vor allem Hydroxybenzoesäure- und Zimtsäurederivate, Anthocyane, Flavonole, Flavanole und Tannine. Ihnen werden unter anderem antioxidative, antimikrobielle, antiinflammatorische und gefäßerweiternde Aktivitäten zugeschrieben (Kaehkoenen et al. 2001). Bereits 1975 wurden Hydroxyzimtsäuren (v.a. Kaffeesäure und p-Cumarsäure) in höheren Konzentrationen in Stachelbeeren nachgewiesen. Als niedriger konzentrierte Inhaltsstoffe einzelner Stachelbeersorten wurden Salicylsäure, Gentisinsäure, Vanillinsäure und Syringasäure identifiziert. Zusätzlich wurden bis zu 30 mg/kg Catechine sowie nach Hydrolyse freigesetzte Protocatechussäure in Stachelbeeren bestimmt (Stöhr und Herrmann 1975). Laut Schuster und Herrmann (1985) enthalten sowohl Stachelbeeren als auch Jostabeeren und Schwarze Johannisbeeren jeweils zwischen 2 und 10 ppm der Phenolsäureglucoside aus p-Cumarsäure, p-Hydroxybenzoesäure und Protocatechussäure. Es wurden zahlreiche Phenolsäuren in sehr unterschiedlichen Konzentrationen (0,03- 213,95 µg/g) in Stachelbeeren nachgewiesen (Nowak und Zgorka 1997), wobei unterschiedliche Verbindungen als Hauptkomponenten identifiziert wurden. Laut Nowak und Zgorka (1997) stellt Protocatechussäure die Hauptkomponente dar (bis 213,92 µg/kg). Russell et al. (2009) identifizierten p-Cumarsäure und Filipiak-Szok et al. (2012) Gallussäure als dominierende Phenolsäure. Mattila et al. (2006) wiesen die höchsten Konzentrationen für p-Cumarsäure in gelben Stachelbeeren und für Kaffeesäure und in roten Früchten nach, was mit der Analyse von Russell et al. (2009) übereinstimmt. Allgemein sind die in Stachelbeeren

Kenntnisstand und Grundlagen enthaltenen Phenolsäuren größtenteils hydroxyliert, wobei über 82 % der Verbindungen verestert vorliegen (Russell et al. 2009). Der Gehalt an Flavonolen ist in Stachelbeeren im Vergleich zu anderen Früchten recht gering. Als dominierende Verbindungen wurden Quercetin- und Kämpferolglykoside bzw. Quercetin (18-22 mg/kg) und Kämpferol (16-19 mg/kg) nach Hydrolyse identifiziert (Haekkinen et al. 1999, Mikulic-Petkovsek et al. 2012b). Innerhalb der phenolischen Inhaltsstoffe überwiegen die Anthocyane. In finnischen Stachelbeeren wurden beispielsweise 83 mg/100 g Anthocyane, 51 mg/100g Flavonole, 39 mg/100 g Hydroxyzimtsäure und 6 mg/100 g Hydroxybenzoesäure nachgewiesen (Kaehkoenen et al. 2001). Durch die Untersuchung verschiedener Sorten konnten insgesamt 11 Anthocyane in Stachelbeeren identifiziert werden: Cyanidin-3-rutinosid, Cyanidin-3- glucosid, Cyanidin-3-xylosid, Cyanidin-3-galactosid, Cyanidin-3-O-β-(6´´-E-caffeoylglucopyranosid), Cyanidin-3-O-β-(6´´-E-p-cumaroylglucopyranosid), Cyanidin-3-(6´´-Z-p- cumaroylglucosid), Peonidin-3-glucosid, Peoniodin-3-rutinosid, Delphinidin-3-rutinosid und Delphinidin-3-glucosid. In zwei der untersuchten Sorten waren jedoch keine Anthocyane nachweisbar (Wu et al. 2004, Jordheim et al. 2007). Anthocyane stellen Farbpigmente dar und sind hauptsächlich in der Schale der Stachelbeeren lokalisiert. Die positive Abhängigkeit der Rotfärbung von der Anthocyanmenge in den Beeren wurde von Pour Nikfardjam et al. (2013) gezeigt. Dies stimmt auch mit den Untersuchungen von Pantelidis et al. (2007) überein, die in gelben Stachelbeeren (2,4 mg/100 g) einen deutlich niedrigeren Gehalt an Anthocyanen feststellten als in roten (43,3 mg/100 g). Bemerkenswert ist der hohe Anteil an mit aromatischen Säuren acylierten Anthocyanen in Stachelbeeren. Diese stellen stabilere Verbindungen dar als die nicht acylierten Anthocyane (Jordheim et al. 2007). Neben Anthocyanen wurden auch Proanthocyane in Stachelbeeren nachgewiesen (Wu et al. 2004).

Das Wissen bezüglich der flüchtigen Verbindungen in Stachelbeere ist begrenzt. Neben der Identifizierung der natürlichen Vorstufen der Vitispirane in Stachelbeerblättern und der Bestimmung der Enantiomerenverhältnisse von Theaspiranen in Stachelbeeren wurden die flüchtigen Säuren untersucht (Humpf et al. 1992, Werkhoff et al. 1991, Mehlitz und Matzik 1956). Der als Essigsäure berechnete Gehalt an flüchtigen Säuren lag bei 64-90 mg/L und der Gehalt an flüchtigen Estern bei 0-10,4 mL 0,1 n-NaOH/L (Bestimmung durch Rücktitration mit Schwefelsäure nach Umesterung mit NaOH). Im Rahmen dieser Untersuchungen wurden Ameisensäure und Essigsäure sowohl frei als auch gebunden nachgewiesen, wobei die Menge an Ameisensäure deutlich dominierte (Mehlitz und Matzik 1956). Versuche zur Lagerung von Stachelbeeren ergaben, dass Stachelbeeren bei 1 °C, 12-18 % Kohlendioxid und 18 % Sauerstoff bis zu 7,5 Wochen gelagert werden können.

Kenntnisstand und Grundlagen

Organoleptische Tests bestätigten die Eignung dieser Bedingungen, auch wenn es zu geringen sensorischen Veränderungen kam (Harb und Streif 2004). Außerdem wurde das Samenöl der Stachelbeeren untersucht. Dieses besteht zu 8 % aus γ-Linolensäure, welche eine für den Menschen essentielle Fettsäure darstellt (Goffman und Galletti 2001). Sie dient als Prekursor zur Bildung von Prostaglandinen, Prostacyclinen und Tromboxanen. Zusätzlich wurden antiinflammatorische und antitumorale Wirkungen der Verbindung nachgewiesen. Als weitere natürliche Antioxidantien sind ca. 790 mg Tocopherole pro Kilogramm im Öl enthalten. Das Muster der Tocopherole zeigte keine sortenabhängigen Schwankungen und bestand zu 70 % aus γ-Tocopherol, zu 23,5 % aus α-Tocopherol und zu 6,5 % aus δ-Tocopherol (Goffman und Galletti 2001).

2.1.2.2 Jostabeeren Ebenso wie in Stachelbeeren und in Schwarzen Johannisbeeren liegen auch in Jostabeeren Glucose und Fructose als dominierende Zucker vor, wobei Fructose meist in leicht höheren Konzentrationen in den Früchten enthalten ist. In reifen Jostabeeren wurden 38,9 g/kg Glucose, 49,4 g/kg Fructose und 7,74 g/kg Saccharose nachgewiesen. Für die organischen Säuren lagen die Gehalte bei 15,3 g/kg für Zitronensäure, 12,1 g/kg für Äpfelsäure, 0,232 g/kg für Weinsäure, 131 mg/kg für Fumarsäure und 844 mg/kg für Shikimisäure (Mikulic-Petkovsek et al. 2012a). Die Konzentration an Vitamin C liegt in Jostabeeren im gleichen Bereich wie in Schwarzen Johannisbeeren und übertrifft mit 96,8 mg/100 g weit den Gehalt in Stachelbeeren (Jurikova et al. 2012). Der Anthocyangehalt in Jostabeeren übertrifft die in Stachelbeeren bestimmten Konzentrationen. Als dominierende Anthocyane in Jostabeeren wurden ausschließlich Verbindungen nachgewiesen, die ebenfalls Hauptanthocyane in Stachelbeeren und/oder Schwarzen Johannisbeeren darstellen. In Jostabeeren wurden folgende neun Anthocyane identifiziert: Cyanidin-3-rutinosid, Cyanidin-3-glucosid, Cyanidin-3-xylosid, Cyanidin-3-O-β- (6´´-E-caffeoylglucopyranosid), Cyanidin-3-O-β-(6´´-E-p-cumaroylglucopyranosid), Cyanidin- 3-(6´´-Z-p-cumaroylglucosid), Peoniodin-3-rutinosid, Delphinidin-3-rutinosid und Delphinidin- 3-glucosid (Jordheim et al. 2007, Lim 2012). Sowohl der Anthocyangehalt (39,0- 91,4 mg/100 g) als auch der Gesamtphenolgehalt (280-350 mg/100g) und die antioxidative Aktivität (22,0-34,3 µmol TE/g; ORAC) frischer Jostabeeren liegen zwischen den für Stachelbeeren und Schwarzen Johannisbeeren ermittelten Werten (Moyer et al. 2002a, Lim 2012). Neben Anthocyanen wurden in Jostabeeren zahlreiche Flavonol-Glykoside nachgewiesen. Als Hauptkomponente stellte sich Quercetinrutinosid heraus (Mikulic- Petkovsek et al. 2012b). Zusätzlich wurde die antimikrobielle Wirksamkeit von aus Jostabeeren, Stachelbeeren und anderen Ribes-Arten gewonnenen Säften und Extrakten verglichen. Stachelbeeren zeigten 8

Kenntnisstand und Grundlagen einen niedrigeren Phenolgehalt sowie eine geringere antimikrobielle Wirksamkeit als Jostabeeren (Krisch et al. 2009).

2.2 Enzymatische Bildung von Aromastoffen aus ungesättigten Fettsäuren Pflanzliche Aromastoffe werden nach der Art ihrer Bildung in primäre und sekundäre Aromastoffe unterteilt. Die erste Gruppe beinhalten jene Substanzen, die aufgrund des Stoffwechsels der lebenden Pflanze bereits im intakten Gewebe vorliegen. Im Gegensatz dazu entstehen sekundäre Aromastoffe durch enzymatische, oxidative oder thermische Prozesse aus nicht flüchtigen Vorstufen (Matheis 1991). Die enzymatische Bildung flüchtiger Verbindungen aus Linol- und Linolensäure bei der Zerstörung des Pflanzengewebes stellt z.B. einen wichtigen Weg für die Entstehung sekundärer Aromastoffe in Früchten und Gemüsen dar.

2.2.1 Enzymatische Bildung von C6-Komponenten Bereits 1966 stellten Drawert et al. fest, dass bestimmte Aromastoffe erst nach der Zerstörung des pflanzlichen Gewebes entstehen. Zu diesen sekundären Aromastoffen zählen die C6-Komponenten, wie Hexanal, (Z)-Hex-3-enal und (E)-Hex-2-enal sowie deren korrespondierende Alkohole. Diese Verbindungen wurden in Homogenaten aus Äpfeln, Trauben und Tomaten in hohen Konzentrationen nachgewiesen (Drawert et al. 1966, Drawert et al. 1973 und Schreier und Lorenz 1981). Parallel zu Drawert et al. (1973) beschäftigten sich Hatanaka und Harada (1973) mit der Bildung von C6-Aldehyden und

C6-Alkoholen in grünen Teeblättern. Ihre Untersuchungen zeigten analog zu jenen von Drawert et al. (1973) eine enzym- und sauerstoffabhängige Bildung von (E)-Hex-2-enal aus Linolensäure sowie einen mit zunehmender Mazerationszeit korrelierenden Anstieg von Hexanal, (E)-Hex-2-enal und (Z)-Hex-3-en-1-ol. Außerdem wurde von der Isomerisierung von (Z)-Hex-3-enal zu (E)-Hex-2-enal mit anschließender Reduktion zum korrespondierenden Alkohol berichtet (Hatanaka und Harada 1973, Hatanaka et al. 1978). In späteren Arbeiten wurde die Bildung der C6-Komponenten in grünen Blättern weitgehend aufgeklärt (Hatanaka 1993, Hatanaka 1999). Der Biosyntheseweg von C6-Komponenten aus Linol- und Linolensäure ist in Abbildung 1 schematisch dargestellt.

Kenntnisstand und Grundlagen

O α-Linolensäure OH

OH Lipoxygenase Linolsäure O HOO Lipoxygenase OH O 13-(S)-Hydroperoxylinolensäure HOO Hydroperoxidlyase OH O 13-(S)-Hydroperoxylinolsäure ADH Hydroperoxidlyase OH H (Z)-Hex-3-en-1-ol (Z)-Hex-3-enal O Isomerisierung H O Hexanal ADH OH H

ADH (E) -Hex-3-en-1-ol (E)-Hex-3-enal

Isomerisierung OH Hexanol O ADH OH H (E)-Hex-2-en-1-ol (E)-Hex-2-enal

Abbildung 1: Vereinfachtes Schema der Biosynthese von Grünnoten aus Linol- und Linolensäure (nach Hatanaka 1999); ADH: Alkoholdehydrogenase.

Durch die Zerstörung von Membranen und Zellorganellen beim Verzehr einer Frucht oder bei der Probenaufarbeitung im Rahmen analytischer Untersuchungen werden gebundene Enzyme freigesetzt. Lipid-Acylhydrolasen katalysieren die Hydrolyse von Fettsäuren aus Triglyceridstrukturen. Freie Fettsäuren mit (Z,Z)-1,4-Pentadienstruktur können anschließend durch Lipoxygenasen unter der Beteiligung von Luftsauerstoff zu Fettsäurehydroperoxiden katalysiert werden. Von diesem Zwischenschritt aus sind mehrere Folgereaktionen möglich. Für die Aromabildung ist die durch Hydroperoxidlyase katalysierte Kettenspaltung der Fettsäurehydroperoxide von besonderer Bedeutung. Hierbei entstehen neben nichtflüchtigen

Oxofettsäuren flüchtige, aromaintensive C6-Aldehyde sowie C6-Alkohole (Schreier 1987). Die Reduktion bzw. Isomerisierung des primär gebildeten (Z)-Hex-3-enals wird durch Alkoholdehydrogenasen und Isomerasen katalysiert. Zahlreiche Analysen und Inkubationsversuche zeigten, dass das für die Aromastoffbildung verantwortliche Enzymsystem in Pflanzen weit verbreitet ist. So wurden enzymatisch gebildete C6-Komponenten unter anderem in Äpfeln (Drawert et al. 1966, Drawert et al. 1973), Tomaten (Kazeniac und Hall 1970, Buttery et al. 1987) und Bananen (Drawert et al. 1966) nachgewiesen.

2.2.2 Enzymatische Bildung weiterer kurzkettiger Aldehyde und Alkohole

Neben der enzymatischen Bildung von C6-Komponenten ist auch die Entstehung von C8- und

C9-Körpern, wie beispielsweise in Pilzen (Wurzenberger und Grosch 1984) und Gurken

(Grosch und Schwarz 1971, Galliard et al. 1976) bekannt. Die Bildung von C6-, C8- bzw.

C9-Komponenten ist von der Selektivität der Lipoxygenase sowie der Hydroperoxidlyase der 10

Kenntnisstand und Grundlagen jeweiligen Pflanze abhängig. Lipoxygenasen zeigen beispielsweise häufig eine 9- oder 13-Regiospezifität und bilden dementsprechend 9-(S)-Hydroperoxysäuren (Prekursoren für

C9-Verbindungen) oder 13-(S)-Hydroperoxysäuren (Prekursoren für C6-Verbindungen) (Hatanaka 1999, Galliard et al. 1976). Lipoxygenasen des erst genannten Types sind aus Kartoffelknollen bekannt, Lipoxygenasen des zweiten Types wurden in Sojabohnen und Teeblättern nachgewiesen (Hatanaka 1993). Für die in Stachelbeeren enthaltene Lipoxygenase konnte keine Peroxydierungsspezifität nachgewiesen werden (Kim und

Grosch 1978). Die Bildung von C8-Komponenten, wie beispielsweise Oct-1-en-3-ol in Pilzen, läuft über 10-(S)-Hydroperoxysäure ab und ist im Kapitel 4.1.1.4 detailliert erläutert. Zusätzlich spielt aber auch die Substratspezifität der Hydroperoxidlyase eine entscheidende Rolle bei der Bildung flüchtiger Verbindungen aus ungesättigten Fettsäuren. Es existieren zwei unterschiedliche Typen von Hydroperoxidlyasen, welche entweder die Spaltung von 9-(S)-Hydroperoxiden (Typ 1) oder von 13-(S)-Hydroperoxiden (Typ 2) bevorzugen.

Hydroperoxidlyase Typ 1 führt zur Bildung von zwei C9-Fragmenten. Hydroperoxidlyase Typ

2, welche zur Bildung eines C6- und eines C12-Fragments führt, ist aus Teeblättern und Tomaten bekannt (Hatanaka 1999). In Gurken wurde die Aktivität beider Hydroperoxidlyase- Typen nachgewiesen (Galliard et al. 1976, Matsui et al. 1989).

2.2.3 Aromaeigenschaften von C6-Komponenten Die durch die im Kapitel 2.2.2 beschriebenen biochemischen Umsetzungen entstehenden

Komponenten stellen potente Aromastoffe dar. Besonders C6-Verbindungen, die sich durch ein allgemein grünes, frisches Aroma auszeichnen, finden sehr häufig Anwendung in der Aromaindustrie (Matsui 2006, Stumpe und Feussner 2006). Hatanaka (1993) untersuchte die

Abhängigkeit der Aromaeigenschaften und der Geruchsschwellen der einzelnen C6-Aldehyde und C6-Alkohole in Abhängigkeit von ihren Strukturen. Es wurde festgestellt, dass die Geruchsschwelle weniger durch die Geometrie der Struktur ((E) bzw. (Z)) als durch die Position der Doppelbindung beeinflusst wird. Außerdem lagen die Schwellen der Hexenole stets deutlich höher als die Schwellenwerte der korrespondierenden Hexenale (10- bis 1000- fach). Hexenole und Hexenale mit gleicher Geometrie und gleicher Doppelbindung zeigten ähnliche Aromanoten. So riechen Hex-2-enole und Hex-2-enale beispielsweise fruchtig, frisch und süß. Charakteristische Unterschiede der Aromaqualität in Abhängigkeit von der Doppelbindungsposition oder der Geometrie konnten nicht eindeutig festgestellt werden.

2.2.4 Pflanzenphysiologische Wirkung der C6-Komponenten

Pflanzenphysiologisch dient die Bildung von C6-Komponenten dem Schutz vor Mikroorganismen (Urbasch 1984). Ihre Entstehung nach Verletzung einer Pflanze wurde

Kenntnisstand und Grundlagen unter anderem am Beispiel von Espenblättern, Buchenblättern und Klee gezeigt (Fall et al.

1999). C6-Komponenten haben antibiotische Wirkung und verhindern die Bakterieninvasion sowie die Invasion anderer Mikroorganismen (Slusarenko et al. 1993). Weiterhin spielt (Z)-Hex-3-en-1-ol eine wichtige Rolle bei der direkten und indirekten Pflanzenabwehr. Es wird beim Angriff der Pflanzen durch Herbivore freigesetzt und beeinflusst sowohl das Verhalten der Herbivore als auch das ihrer natürlichen Feinde. Die Pflanzen-Pflanzen- Kommunikation mittels (Z)-Hex-3-en-1-ol hilft außerdem dem Angriff benachbarter, noch unbeschadeter Pflanzen vorzubeugen (Wei und Kang 2011).

2.3 Sensorische Analyse

Der Gesamtsinneseindruck aus Geruchs- und Geschmacksempfindung, der beim Verzehr eines Lebensmittels entsteht, wird als Aroma bezeichnet (Schreier 1987). Das Aroma stellt ein maßgebliches Qualitätskriterium unserer Nahrung dar und trägt daher primär zur Anziehungskraft eines Lebensmittels und zur damit verbundenen Verbraucherakzeptanz bei. Die für das Aroma verantwortlichen chemischen Verbindungen werden üblicherweise in Geschmacks- und Geruchsstoffe (Aromastoffe) unterteilt, wobei es auch Verbindungen gibt, die sowohl auf den Geschmacks- als auch auf den Geruchssinn wirken. Ein klassisches Beispiel ist (-)-Menthol in Pfefferminze, welches neben dem typischen Pfefferminzgeruch einen kühlenden Effekt hat (Emberger und Hopp 1987). Geschmacksstoffe sind im Allgemeinen nicht flüchtige, gelöste Ionen oder Moleküle, die eine der fünf Hauptgeschmacksrichtungen auslösen: sauer, süß, salzig, bitter oder umami. Der Geruch ermöglicht hingegen die Wahrnehmung von bis zu 10.000 verschiedenen Eindrücken und wird durch das Zusammenwirken einer Vielzahl flüchtiger Verbindungen (Aromastoffe, Geruchsstoffe) verursacht (Schreier 1987, Muecke und Lemmen 2011).

2.3.1 Geruchswahrnehmung

Die Geruchswahrnehmung findet durch ein chemosensorisches System in der Riechregion (Regio olfactoria) der Nasenhöhle statt. Hier liegen etwa 10 Millionen Rezeptorzellen (bipolare Nervenzellen), welche niedermolekulare, flüchtige Substanzen mit hoher Spezifität und Empfindlichkeit erkennen und fähig sind, chemische Reize in eine Abfolge elektrischer Nervenimpulse als elektrisch kodierte Information zum Gehirn weiterzuleiten (Muecke und Lemmen 2011). Das Binden eines Aromastoffes an eine Rezeptorzelle löst eine intrazelluläre G-Protein (heptahelikales Transmembranprotein) gesteuerte Reaktionskaskade aus. Durch die Aktivierung der Adenylcyclase (AC), einem Enzym, das in die Plasmamembran der Cilien eingebettet ist, erfolgt die katalytische Umwandlung von Adenosin-5´-triphosphat (ATP) zu 12

Kenntnisstand und Grundlagen cyclischem Adenosin-3´,5´-monophosphat (cAMP), einem Second Messenger. Durch cAMP erfolgt die Öffnung kationenselektiver Kanäle, wodurch positiv geladen Ionen in die Zelle einströmen, welche zu einer Änderung des elektrischen Potentials führen. Diese Depolarisierung führt zur Aussendung einer Sequenz von Aktionspotentialen, die über die Axone des Geruchsnervs zum Hirn geleitet werden. Im Riechkolben (Bulbus olfctorius) werden die Signale der einzelnen Axone in Riechknötchen (Glomeruli) gebündelt und an höhere Hirnregionen weitergeleitet, unter anderem zum limbischen System. Hier erfolgen die Auswertung ankommender Aktionspotentiale und das Zusammenfügen zum Geruchseindruck. Bei der Verarbeitung der Geruchsinformationen wird zwei Organen des Limbischen Systems Bedeutung zugesprochen, der Amygdala und dem Hippokampus. Dies sind Hirnregionen, welche Emotionen kontrollieren und das Gedächtnis mitformen (Herman 2002, Buglass 2011, Muecke und Lemmen 2011, Hatt 2009). Die verschiedenen Geruchsrezeptoren des Menschen sind durch ungefähr 1000 Gene kodiert, von welchen allerdings nur weniger als 40 % aktiv sind. Die Wahrnehmung der bis zu 10.000 verschiedenen Gerüche wird erst durch eine kombinatorische Vielfalt möglich, welche sich aus der Bindung verschiedener Aromastoffe am gleichen Rezeptortyp sowie der Wechselwirkung jedes Aromastoffes mit mehreren verschiedenen Rezeptortypen ergibt (Herman 2002, Muecke und Lemmen 2011). Neben der orthonasalen Geruchswahrnehmung direkt durch die Nase vor dem Verzehr eines Lebensmittels spielt auch die retronasale Wahrnehmung über den Mund-Rachen-Raum eine entscheidende Rolle: Die durch den Verzehr (Kauen, Schlucken) im Mundraum frei werdenden Aromastoffe können über den Rachenraum die Riechregion in der Nasenhöhle erreichen und eine Geruchswahrnehmung auslösen. Die Aromafreisetzung während des Verzehrs eines Lebensmittels wird durch unterschiedliche Faktoren beeinflusst (Burdach und Doty 1987) und kann in vivo mittels massenspektrometrische Methoden untersucht werden (API-MS, PTR-MS) (Büttner und Schieberle 2000b, Büttner et al. 2001). Durch Videofluoroskopie kann außerdem während des Verzehrs eines Lebensmittels der Ablauf des Aromatransfers vom Mund- in den Nasenraum beobachtet werden (Büttner et al. 2001). Es wurde gezeigt, dass die retronasale Wahrnehmung von physiologischen Barrieren beeinflusst wird, die nur zu bestimmten Zeiten den Übergang der Aromastoffe in den Nasenraum erlauben und sowohl von der Konsistenz als auch von der Menge des Lebensmittels im Mund abhängen. Zusätzlich wirkt sich die Adsorption von Geruchsstoffen an die Mundschleimhaut auf die retronasale Geruchswahrnehmung aus (Büttner und Schieberle 2000a, Büttner et al. 2008). Weitere Untersuchungen führten zu der Annahme, dass ein intranasaler Gradient der Aromastoffkonzentration in Abhängigkeit von der chemischen Struktur des Aromastoffes entsteht (Büttner et al. 2008).

Kenntnisstand und Grundlagen

Bezüglich der Interaktion zwischen Aromastoff und Rezeptor im olfaktorischen Epithel wurden in den 50er Jahren zwei unterschiedliche Theorien entwickelt. Nach der Theorie von Amoore (1970) werden Aromastoffe aufgrund eines „Schlüssel-Schloss-Prinzips“ zwischen Geruchsstoff und Rezeptor wahrgenommen. Hierbei sollen vor allem die Molekülform sowie die elektrische Ladung wichtig sein. Nach der Schwingungstheorie von Wright und Serenius (1954), welche von Turin (1996) avanciert wird, wird die Wechselwirkung zwischen Geruchsstoff und Rezeptor durch das Energieniveau innerhalb des Aromastoffes erklärt. Die Grundlage dieses Modells ist der starre Elektronen-Tunneleffekt. Der Geruchssinn wäre demnach neben dem Sehen und Hören ein weiterer spektraler Sinn, und kein chemischer Sinn (Turin 1996, Herman 2002). Bis heute bleibt unklar, welcher der beiden Mechanismen zur Aktivierung des Geruchrezeptors führt, oder ob eventuell beide Mechanismen zusammenspielen. Auch Versuche mit deuterierten Aromastoffen, die auf Basis der Theorie von Amoore (1970) kaum oder nicht und auf Basis der Theorie von Turin (1996) deutlich vom nicht deuterierten Aromastoff zu unterscheiden wären, führten zu keinem eindeutigen Ergebnis (Gane et al. 2013).

2.3.2 Methoden zur sensorischen Bewertung

Der Fortschritt der Analytik in den vergangenen Jahren ermöglicht die Detektion einer Unmenge an flüchtigen Verbindungen in Lebensmitteln. Zum Aroma eines Lebensmittels tragen jedoch tatsächlich nur einige wenige dieser Substanzen bei. Zur Analyse dieser Aromastoffe dient die Gaschromatographie-Olfaktometrie (GC-O), die bereits 1964 entwickelt wurde und sich bis heute bewährt hat (Fuller et al. 1964). Sie stellt eine Kombination aus instrumentell-analytischer und sensorischer Methode dar. Die einzelnen Aromakomponenten werden nach ihrer kapillargaschromatographischen Trennung am Ende der Kapillarsäule am sogenannten Sniffing-Port sensorisch beurteilt.

2.3.2.1 Verschiedene Anwendungen der Gaschromatographie-Olfaktometrie (GC-O)

Die GC-O dient der Identifizierung einzelner aromaaktiver Komponenten aus einem komplexen Stoffgemisch. Um den sensorischen Beitrag der einzelnen Aromastoffe besser abschätzen zu können, wurden verschiedene Methoden entwickelt, die sich laut Acree und Barnard (1994) und van Ruth (2001) in fünf Kategorien unterteilen lassen: (I) „dilution analyses“, (II) „detection frequency methods“, (III) „posterior intensity methods“, (IV) „time- intensity methods” und (V) „response interval methods“. Zu den „dilution analyses“ zählen die Aromaextrakt-Verdünnungsanalyse (AEVA) (Schmid und Grosch 1986, Ullrich und Grosch 1987) sowie die Charm-Analyse (Acree et al. 1984). Zur sensorischen Bewertung der Aromastoffe wird sowohl bei der AEVA als auch bei der 14

Kenntnisstand und Grundlagen

Charm-Analyse (combined hedonic response measurement) eine schrittweise Verdünnung des Aromastoffgemisches mit Lösungsmittel vorgenommen. Zur AEVA werden die so erhaltenen Verdünnungen mittels GC-O sensorisch analysiert, bis kein Geruch mehr wahrgenommen wird. Die Intensität der einzelnen Aromastoffe wird in sogenannten Flavor Dilution-Faktoren angegeben. Diese werden anhand der Verdünnungsstufe berechnet, bei der ein Geruch gerade noch wahrgenommen wird. Bei der Charm-Analyse werden die Verdünnungen in einer willkürlichen Anordnung mittels GC-O analysiert. Hierbei wird jeweils die Dauer der Geruchswahrnehmung einer Verbindung festgehalten. Zur Angabe der Intensitäten der Substanzen werden sogenannte Charm-Faktoren berechnet. Bei den „detection frequency methods“ wird das Aromastoffgemisch durch mindestens zehn Personen mittels GC-O analysiert und anschließend die Detektionshäufigkeit einer Substanz verwendet, um deren Intensität zu bewerten (Linssen et al. 1993). Üblicherweise werden Gaschromatographen verwendet, deren Eluentenstrom dreigeteilt wird, wobei neben einem Flammenionisationsdetektor zwei Sniffing-Ports installiert sind. Bei der „posterior intensity method“ wird die Geruchsintensität nach der Elution des Peaks auf einer Skala bewertet und anhand dessen die Aromaintensität der Verbindung abgeschätzt (Casimir und Whitfield 1978). Im Gegensatz zur „posterior intensity method“ findet bei der „time-intensity-method“ die Bewertung der Intensität parallel zur Elution des Substanzpeaks statt (Sanchez et al. 1992). Da Silva und Kollegen entwickelten 1994 eine „time-intensity-Methode“ namens OSME. Hierbei werden die Intensität und die Dauer der Wahrnehmung jedes Aromastoffes am Sniffing-Port auf einer 16 Punkte Skala bewertet. Eine parallele Übertragung der Daten in eine computergesteuerte Graphik erleichtert die Bewertung und ermöglicht Korrekturen. Die „response interval methods“ setzten die Annahme voraus, dass die Dauer der Aromawahrnehmung einer Substanz am Sniffing-Port der GC-O zu der Intensität proportional ist. Dies wäre allerdings nur erfüllt, wenn alle Komponenten in gleichem Maße tailen würden, was nicht immer der Fall ist. Letztere Methoden fanden in den vergangenen Jahren vergleichsweise selten Anwendung. Vorherrschend werden die Techniken der Verdünnungsanalyse zur Aromaanalyse eingesetzt.

Kenntnisstand und Grundlagen

2.3.2.2 Aromawertkonzept

Der Aromawert ist eine Messgröße zur Charakterisierung der sensorischen Bedeutung einzelner Komponenten in einem komplexen Aroma (Rothe und Thomas 1963). Er ist definiert als das Verhältnis der Konzentration eines Aromastoffes zu seinem Geruchsschwellenwert. Nach dem Aromawertkonzept von Rothe und Thomas sind alle Substanzen aromaaktiv, deren Aromawert im Lebensmittel ≥ 1 ist, da deren Konzentration somit oberhalb ihrer Geruchsschwelle liegt. Je größer der Aromawert ist, desto größer wird der Beitrag der Verbindung zum Gesamtaroma eingeschätzt. Als Geruchsschwelle wird diejenige Konzentration einer Verbindung bezeichnet, die gerade noch zur Erkennung ihres Geruchs ausreicht. Die Geruchsschwelle eines Aromastoffes wird von vielen Faktoren beeinflusst (verwendetes Medium, äußere Bedingungen wie Temperatur, Empfindlichkeit der Prüfperson). Daher ist es nachvollziehbar, dass die in der Literatur von unterschiedlichen Autoren bestimmten Schwellenwerte für gleiche Verbindungen eine breite Spanne umfassen können. Dies wird in der Zusammenstellung von Rychlik et al. (1998) deutlich.

2.3.3 Rekombinationen und Weglassversuche

Die vorgestellten Methoden zur sensorischen Analyse des Aromas eines Lebensmittels (GC-O-basierte Analysen sowie das Aromawertkonzept) berücksichtigen keine Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Aromastoffen oder zwischen Aromastoff und anderen im Lebensmittel enthaltenen Substanzen (synergistische oder antagonistische Effekte). Die Rekombination der Aromastoffe in einer Lebensmittelmatrix oder einer dem Lebensmittel ähnlichen Matrix und die anschließende sensorische Bewertung sind daher zur Überprüfung der Ergebnisse unerlässlich. Gibt ein auf diese Weise erhaltenes Aromarekombinat die sensorischen Eigenschaften des untersuchten Lebensmittels wieder, so kann durch anschließende Weglassversuche die Aromarelevanz der einzelnen Komponenten überprüft werden. Hierbei wird eine im Vergleich zum Vollrekombinat um einzelne Verbindungen reduzierte Lösungen (Teilrekombinate) mit dem Vollrekombinat in einer sensorischen Unterschiedsprüfung verglichen. Auf diese Weise kann die Notwendigkeit einzelner Verbindungen für das Gesamtaroma untersucht werden (Grosch 2001).

Material und Methoden

3 Material und Methoden

3.1 Material 3.1.1 Untersuchungsmaterial

Die für die Untersuchungen verwendeten Stachelbeeren, Jostabeeren und Schwarzen Johannisbeeren wurden entweder von einem Händler (örtlicher Großmarkt bzw. Obst- und Gemüsevertrieb Südbaden GmbH) erworben oder direkt von den Anbauern erhalten. In Tabelle 2, Tabelle 3 und Tabelle 4 ist die Herkunft aller Chargen mit jeweiligem Ernte- bzw. Kaufdatum aufgeführt.

Tabelle 2: Auflistung der untersuchten Stachelbeeren-Chargen

Jahr Sorte (Reifegrad) Erntedatum Kaufdatum Erworben von

2010 Unbekannt (reif) a / 05.07.10 Großmarkt Achilles (reif) / 12.07.10 Großmarkt Unbekannt (reif) a / 13.07.10 Großmarkt Achilles (reif) a / 05.08.10 Großmarkt Unbekannt (reif) / 13.08.10 Großmarkt Unbekannt (reif) / 19.08.10 Großmarkt Achilles (reif) / 25.08.10 Großmarkt 2011 Invicta (reif) a / 09.06.11 Obst- und Gemüsevertrieb Südbaden GmbH Xenia (reif) / 15.06.11 Obst- und Gemüsevertrieb

Südbaden GmbH Achilles (reif) / 20.07.11 Großmarkt Achilles (reif) / 25.07.11 Großmarkt Achilles (unreif) / 26.07.11 Großmarkt Achilles (reif) a / 26.07.11 Großmarkt Achilles (überreif) / 26.07.11 Großmarkt 2012 Invicta (reif) 14.06.12 / Staatliches Obstgut Heuchlingen (Bad Friedrichshall) Xenia (unreif) 18.06.12 / Staatliches Obstgut Heuchlingen

(Bad Friedrichshall) Xenia (reif) 18.06.12 / Staatliches Obstgut Heuchlingen

(Bad Friedrichshall) Xenia (überreif) 25.06.12 / Staatliches Obstgut Heuchlingen

(Bad Friedrichshall) Tixia (reif) 18.06.12 / Staatliches Obstgut Heuchlingen

(Bad Friedrichshall) Frühe Rote (reif) 18.06.12 / Staatliches Obstgut Heuchlingen

(Bad Friedrichshall) Bekay (unreif) 25.06.12 / Staatliches Obstgut Heuchlingen

(Bad Friedrichshall) Bekay (reif) 25.06.12 / Staatliches Obstgut Heuchlingen

(Bad Friedrichshall) Bekay (überreif) 10.07.12 / Staatliches Obstgut Heuchlingen

(Bad Friedrichshall) Späte Spitze (reif) 25.06.12 / Staatliches Obstgut Heuchlingen

(Bad Friedrichshall) 17

Material und Methoden

Jahr Sorte (Reifegrad) Erntedatum Kaufdatum Erworben von

Rote Eva (reif) 02.07.12 / Staatliches Obstgut Heuchlingen

(Bad Friedrichshall) Achilles (reif) / 16.07.12 Händler a: Teile dieser Chargen wurden nach dem Einwiegen (je 500 g für die späteren Analysen) bei -20°C gelagert.

Tabelle 3: Auflistung der untersuchten Jostabeeren-Chargen

Jahr Reifegrad Erntedatum Erworben von

2010 reif 19.07.10 Staudengarten der Hochschule Weihenstephan- Triesdorf (Freising) 2011 reif a 30.06.11 Obst- und Gemüsevertrieb Südbaden GmbH (Oberrotweil) reif 03.07.11 Privater Anbauer (Lindau) reif 04.07.11 Lehr- und Beispielbetrieb Deutenkofen reif 04.07.11 Privater Anbauer (Hangenham) reif 13.07.11 Staudengarten der Hochschule Weihenstephan-

Triesdorf (Freising) 2012 unreif 02.07.12 Lehr- und Beispielbetrieb Deutenkofen reif 02.07.12 Lehr- und Beispielbetrieb Deutenkofen reif 09.07.12 Privater Anbauer (Hangenham) reif 11.07.12 Lehr- und Beispielbetrieb Deutenkofen reif 16.07.12 Staudengarten der Hochschule Weihenstephan-

Triesdorf (Freising) reif 30.07.12 Lehr- und Beispielbetrieb Deutenkofen a: Ein Teil dieser Charge wurde nach dem Einwiegen (je 500 g für die späteren Analysen) bei -20°C gelagert.

Tabelle 4: Weitere untersuchte Beeren

Jahr Reifegrad Erntedatum Kaufdatum Erworben von

Schwarze 2011 reif / 20.06.11 Händler Johannisbeeren

Goldjohannisbeeren Privater Anbauer 2011 reif 03.08.11 / (Hangenham)

Die Früchte wurden bei 5°C gelagert (maximal zwei Tage) und vor der Aufarbeitung auf Raumtemperatur temperiert. Ein Teil der in Tabelle 2 und Tabelle 3 markierten Chargen wurde bei -20°C tiefgefroren und nach acht Monaten tiefgekühlter Lagerung analysiert. Vor der Aufarbeitung wurden diese Beeren für 14 Stunden aufgetaut. Der untersuchte Stachelbeerenlikör (20 Volumenprozent Alkohol) sowie der Jostabeerenlikör (15 Volumenprozent Alkohol) waren kommerziell erhältlich.

Material und Methoden

3.1.2 Chemikalien

Die verwendeten Referenzsubstanzen wurden von Fluka (Steinheim), Sigma-Aldrich (Steinheim) und Merck (Darmstadt) bezogen bzw. von der Firma Frey&Lau GmbH (Henstedt-Ulzburg) zur Verfügung gestellt. Der Standard Heptan-2-ol wurde von Fluka 2 (Steinheim) und [ H2]-(Z)-Hex-3-enal (Lösung in n-Pentan) von der aromaLab AG (Freising) erworben.

Die folgenden Reagenzien wurden verwendet:

Aceton (p.a.) Honeywell Burdick und Jackson, Seelze Ascorbinsäure (p.a.) Sigma-Aldrich, Steinheim Äpfelsäure (for synthesis) Merck, Hohenbrunn Calciumchlorid Dihydrat (p.a.) Carl Roth GmbH, Karlsruhe deuteriertes Chloroform (≥ 99,8 %) Merck, Darmstadt m-Chloroperbenzoesäure (purum; > 99,0 %) Fluka, Steinheim Zitronensäure-Monohydrat (p.a.) Sigma-Aldrich, Steinheim Dichlormethan (p.a.; ≥ 99,9 % GC) Sigma-Aldrich, Steinheim Diethylether (p.a.) Honeywell Burdick und Jackson, Seelze Ethanol (p.a.) Carl Roth GmbH, Karlsruhe Fructose (Ph.Eur.6) Euro OTC Pharma GmbH, Bönen Glucose-Monohydrat (Ph.Eur.6) Euro OTC Pharma GmbH, Bönen Hexan (AnalR Normapure) VWR, Darmstadt Natriumacetat (p.a.) Sigma-Aldrich, Steinheim Natriumhydrogencarbonat (p.a., ≥ 99,0 %) Fluka, Steinheim Natriumhydrogensulfat (p.a.) Fluka, Steinheim Natriumsulfat, wasserfrei (p.a.) Merck, Darmstadt Oxalsäure-Dihydrat (p.a.) Merck, Darmstadt n-Pentan (p.a.) AppliChem GmbH, Darmstadt Salzsäure, 25% (puriss) Sigma-Aldrich, Steinheim Sorbit (puriss.) Caesar-Loretz GmbH, Hilden p-Toluolsulfonsäure (puriss.) Fluka, Neu-Ulm Zitronensäure-Anhydrat (Ph.Eur. 6.0) Sigma-Aldrich, Steinheim

Die zur Extraktion verwendeten Lösungsmittel Diethylether und n-Pentan wurden vor Gebrauch über Füllkörperkolonnen destilliert.

Material und Methoden

3.1.3 Synthese von Referenzsubstanzen

2-Hydroxy-1,8-cineol

2-Hydroxy-1,8-cineol wurde in Anlehnung an Horst und Rychlik (2010) aus α-Terpineol synthetisiert. Hierzu wurden 200 mg α-Terpineol in 5 mL Dichlormethan gelöst und bei 0°C tropfenweise zu einer Lösung aus 320 mg m-Chloroperbenzoesäure in 5 mL Dichlormethan gegeben. Anschließend wurde für zwei Stunden unter Stickstoff gerührt. Nach der Filtration wurde mit Natriumhydrogensulfat-Lösung (5 %ig), Natriumhydrogencarbonat-Lösung (5 %ig) und Wasser gewaschen und mit Dichlormethan auf 15 mL aufgefüllt. Nach der Zugabe von 60 mg p-Toluolsulfonsäure wurde für 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, mit Natriumhydrogencarbonat-Lösung (10 %ig) gewaschen und anschließend am Rotationsverdampfer getrocknet. Das erhaltene Produkt wurde in Hexan/Ether (2+1; v+v) gelöst und durch Säulenchromatographie (Kieselgel 60; 0,063-0,200mm) gereinigt. Als Fließmittel wurde n-Hexan/Ether (2+1; v+v) verwendet. Die anschließende Identifizierung erfolgte durch GC-MS-Analyse (für Geräteangaben siehe 3.2.2.2) und NMR-Analyse (Kapitel 3.2.7) sowie durch den Vergleich der Daten mit Horst und Rychlik (2010).

Pentylnonanoat

1,5 mL Pentanol und 0,3 mL Nonansäure wurden in 3 mL Dichlormethan gelöst. Nach Zugabe weniger Tropfen Salzsäure (konz.) wurde für fünf Stunden bei 40°C gerührt. Anschließend wurde mit Natriumhydroxid-Lösung neutralisiert, über Natriumsulfat (Anhydrat) getrocknet, filtriert und das Lösemittel am Rotationsverdampfer abgezogen.

1-Phenylethyl-2-methylpropanoat

Die Synthese erfolgte analog der von Pentylnonanoat, jedoch unter Einsatz von 0,3 mL 1-Phenylethanol und 1,5 mL 2-Methylpropansäure.

3-Methylbutylnonanoat

Die Synthese erfolgte analog der von Pentylnonanoat, jedoch unter Einsatz von 1,5 mL 3-Methylbutanol und 0,3 mL Nonansäure.

Material und Methoden

3.2 Methoden

3.2.1 Isolierung flüchtiger Verbindungen Vor der Isolierung der flüchtigen Verbindungen aus frischen Beeren wurden diese auf Raumtemperatur gebracht (ca. zwei Stunden) und alle Stiele entfernt. Das tiefgefrorene Material wurde für 14 Stunden bei Raumtemperatur aufgetaut.

3.2.1.1 Vakuum Headspace Technik (VHS) Zur Isolierung der flüchtigen Verbindungen wurden 500 g Beeren in einem Mixer (Moulinex Turbo blender) mit 400 mL Wasser nach der Zugabe des internen Standards (Heptan-2-ol, 150 µg) für 30 Sekunden homogenisiert. Das Homogenat wurde in einen 2 L Rundkolben überführt und der Mixer mit 150 mL Wasser nachgespült. Nach Anschluss des Kolbens an eine VHS-Apparatur nach Werkhoff et al. (1998), wurde dieser mittels eines Wasserbades auf 35°C temperiert und es erfolgte die Isolierung der Aromastoffe bei 1-10 mbar (Leybold- Hereus Vakuumpumpe, Typ D4A) für 2 Stunden. Das wässrige Destillat wurde in drei Kühlfallen kondensiert. Die ersten beiden waren mit einem Wasser-Eis-Gemisch gekühlt, die dritte mit flüssigem Stickstoff. Nach Ablauf des Vorgangs und Auftauen der Destillate wurden diese vereinigt und mit 3 x 50 mL n-Pentan/Diethylether (1:1; v/v) ausgeschüttelt. Die vereinigte organische Phase wurde über Natriumsulfat (wasserfrei) getrocknet und an einer Vigreux-Kolonne bei einer Wassertemperatur von ca. 40°C schonend auf ein Volumen von 1 mL eingeengt. Die Reduzierung auf ein Endvolumen von 0,5 mL erfolgte vorsichtig unter Stickstoff-Strom.

Die Isolierung der flüchtigen Verbindungen aus Stachelbeeren- und Jostabeerenlikör erfolgte unter Einsatz von je 1 L Likör nach der oben beschriebenen Vorgehensweise. Aufgrund des Alkoholgehalts von 15 bzw. 20 Volumenprozent war eine analoge Volumenreduzierung im Wasserbad auf 1 mL nicht möglich. Die Einengung erfolgte deshalb an der Vigreux-Kolonne auf 5 mL. Eine weitere Volumenreduzierung auf 2 mL wurde unter Stickstoff-Strom durchgeführt.

Material und Methoden

3.2.1.2 Flüssig-Flüssig-Extraktion (LLE) Die Flüssig-Flüssig-Extraktion erfolgte in einem Kutscher-Steudel Extraktor (Wieland und Sucrow 1982). Zur Isolierung wurden 500 g Beeren nach Zugabe des internen Standards (Heptan-2-ol, 150 µg) und 400 mL destilliertem Wasser für 30 Sekunden in einem Mixer (Moulinex Turbo blender) zerkleinert. Das erhaltene Homogenat wurde unter Nachspülen mit 100 mL Wasser zentrifugiert (5 min., 3000 Umdrehungen/min) und der Überstand in den Extraktor gegeben. Der Rückstand wurde mit 150 mL Wasser aufgeschlämmt. Nach erneuter Zentrifugation wurde auch der zweite Überstand dem Extraktor zugeführt und die Flüssigkeit mit Wasser auf 1 L aufgefüllt. Es folgte eine 24-stündige Extraktion unter Verwendung von 150 mL n-Pentan/ Diethylether (1:1, v/v). Der erhaltene Extrakt wurde über Natriumsulfat (wasserfrei) getrocknet und an einer Vigreux-Kolonne bei einer Wassertemperatur von ca. 40 °C schonend auf ein Volumen von 1 mL eingeengt. Die Reduzierung auf ein Endvolumen von 0,5 mL erfolgte vorsichtig unter Stickstoff-Strom.

Um den Einfluss der enzymkatalysierten Reaktionen auf das Spektrum der C6-Verbindungen zu untersuchen, erfolgte die Zugabe gesättigter Calciumchloridlösung an Stelle von Wasser 30, 60, 90 und 180 Sekunden nach Homogenisierung der Beeren. Die anschließende Analyse wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Die mittels VHS und LLE erhaltenen Extrakte wurden bis zur kapillargaschromatographischen Analyse (maximal 10 Tage nach Extraktion; Bedingungen siehe 3.2.2 und 3.2.3) bei -18°C aufbewahrt.

3.2.1.3 Headspace HRGC-MS (HS) Die statische Headspace-Analyse wurde an einem Clarus 600 GC in Kombination mit einem Turbo Matrix 40 Trap HS Sampler der Firma Perkin Elmer durchgeführt. Zur Bestimmung der flüchtigen Verbindungen wurden 100 g Stachelbeeren mit einem Stabmixer für 2,5 min zerkleinert. Von dieser Masse wurden 7 g in ein Headspace Vial (neoLab Migge, 20 mL) eingewogen und mit einem PTFE/Butyl-Septum (ND20 walzblank, neoLab Migge) verschlossen. Die Temperierung der Probe (37 °C für 60 min, 25 psi, Adsorptionsmaterial Tenax TA 60/80 mesh) im Headspace Sampler des GC-MS fand 10 min nach Beginn des Zerkleinerungsprozesses statt. Die Elution erfolgte thermisch bei 40-180 °C. Die Trennung der Aromastoffe erfolgte an einer Zebron ZB-624-Säule (30 m; 0,25 mm I.D.; 1,4 μm F.; Phenomenex, Aschaffenburg). Als Trägergas diente Helium (BIP-Qualität, Tyczka) mit einem Druck von 20 psi. Das Temperaturprogramm lautete wie folgt: 40 °C/5 min //20 °C/ min// 220 °C /5 min. Das Massenspektrometer zeichnete im EI+-Modus (70eV) Massen zwischen 40 und 200 m/z über

Material und Methoden einen Zeitraum von 19 min auf (Temperatur von Transferline und Interface: 180 °C). Zur Auswertung wurde die Software Turbo Mass, Version 5.4.2 (Perkin Elmer) verwendet. Die Identifizierung der Substanzen erfolgte über den Vergleich der Retentionszeiten und der jeweiligen Massenspektren mit authentischen Referenzsubstanzen, die Quantifizierung über eine externe Standardisierung. Der Kalibrierbereich war den Konzentrationsbereichen der einzelnen Verbindungen in den untersuchten Stachelbeeren angepasst. Die verwendeten Standardlösungen wurden mit o-Phosphorsäure auf pH 3,2 eingestellt. Die Konzentrationen der zur Kalibrierung verwendeten Lösungen sowie die resultierenden Gleichungen und deren Bestimmtheitsmaß sind in Tabelle 5 zusammengefasst. Die Quantifizierung erfolgte aus analytischen Gründen ab einer Signalfläche von 10.000.

Tabelle 5: Headspace HRGC-MS: Konzentrationen der zur Kalibrierung verwendeten Standardlösungen sowie Kalibriergleichung mit Bestimmtheitsmaß

Stammlösung Verdünnungen in Wasser Gleichung, Verbindung [mg/L] (pH = 3,2) Bestimmtheitsmaß

Methylacetat 73,814 1+9; 1+49; 1+99 y = 20+06x; 0,99

Ethylacetat 26,925 1+49; 1+99 y = 50+06x; 1,00

Methylbutanoat 17,673 1+49; 1+99 y = 40+06x; 1,00

(E)-Methylbut-2-enoat 0,187 1+1; 1+9; 1+49; 1+99 y = 30+06x; 0,99

Ethylbutanoat 8,741 1+49; 1+99 y = 60+06x; 1,00

Hexanal 0,160 1+1; 1+9; 1+49; 1+99 y = 50+06x; 0,99

(E)-Ethylbut-2-enoat 0,547 1+1; 1+9; 1+49; 1+99 y = 70+06x; 1,00

Methylhexanoat 0,525 1+1; 1+9; 1+49; 1+99 y = 20+07x; 1,00

Ethylhexanoat 0,173 1+1; 1+9; 1+49; 1+99 y = 10+07x; 0,99

Pentan-2-on 8,009 1+1; 1+9; 1+49; 1+99 y = 50+06x; 1,00

(E)-Pent-2-enal 0,328 1+1; 1+9; 1+49; 1+99 y = 35+05x; 0,99

(E)-Hex-2-enal 16,412 1+1; 1+9; 1+49; 1+99 y = 55+05x; 1,00

Heptan-2-on 0,163 1+1; 1+9; 1+49; 1+99 y = 70+06x; 1,00

(E,E)-Hexa-2,4-dienal 0,331 1+1; 1+9; y = 23+05x; 1,00

(R)-Oct-1-en-3-ol 0,661 1+1; 1+9; 1+49; y = 10+06x; 0,99

(Z)-Hex-3-en-1-ol 25,033 1+1; 1+9; 1+49; 1+99 y = 71+04x; 0,99

(Z)-Hex-3-enal 153,978 1+1; 1+5; 1+10 y = 17+05x; 0,91

Material und Methoden

3.2.2 Identifizierung flüchtiger Verbindungen (VHS und LLE) Die flüchtigen Verbindungen der mittels VHS und LLE gewonnenen Extrakte wurden mittels Kapillargaschromatographie (siehe 3.2.3.1) und Kapillargaschromatographie- Massenspektrometrie (siehe 3.2.2.2) analysiert. Die Identifizierung der Verbindungen erfolgte durch Vergleich der massenspektrometrischen und kapillargaschromatographischen (Retentionsindices) Daten mit authentischen Referenzsubstanzen.

3.2.2.1 Bestimmung der Retentionsindices Zur Bestimmung der Retentions-Indices (RI) wurden n-Alkane als Standardsubstanzen verwendet. Die Retentionszeiten der zu identifizierenden Verbindungen wurden auf die Retentionszeiten der Serie der n-Alkane bezogen (Kovats 1958).

RT RTn RI=100× C+ RT RT n+1− n � � −

RI Retentions-Index RT Retentionszeit der unbekannten Verbindung

RTn Retentionszeit des n-Alkans

RTn+1 Retentionszeit des n+1-Alkans C Anzahl der Kohlenstoffatome des n-Alkans

Die Bestimmung der Retentionsindices erfolgte an dem Gerät Carlo Erba Mega II 8575 (siehe 3.2.3.1).

3.2.2.2 Kapillargaschromatographie-Massenspektrometrie (HRGC-MS)

HRGC-MS Bedingungen: Gerät: GC 8000Top-Voyager (ThermoFinnigan) Kapillarsäule: DB-WAX-ETR (30 m; 0,25 mm I.D.; 0,5 µm F.); J&W Scientific Temperaturprogramm: 40 °C/5 min//4 °C/ min/ 240 °C/25 min Trägergas: He (75 kPa)

Material und Methoden

Injektor: Splitinjektion (220 °C); Splitfluss 30 mL/min; Splitverhältnis ca. 1:50 Quadrupol-Massenfilter in EI-Modus Ionisationsenergie: 70 eV MS- Source Temperatur: 200 °C MS- Interface Temperatur: 240 °C

Zur Auswertung der Massenspektren wurde die Software Xcalibur, Version 1.4 (Thermo Electron) verwendet.

3.2.3 Quantifizierung flüchtiger Verbindungen (VHS und LLE) Die Quantifizierung der flüchtigen Verbindungen erfolgte über die Peakflächen der Substanzen und des zugesetzten internen Standards Heptan-2-ol am Gerät Carlo Erba Mega II 8575 (siehe 3.2.3.1). Vorversuche hatten gezeigt, dass Heptan-2-ol nicht natürlich in Stachelbeeren, Jostabeeren oder Schwarzen Johannisbeeren sowie nicht in den untersuchten Likören vorkommt. Die Quantifizierung fand unter Berücksichtigung der FID- Response-Faktoren und der bestimmten Wiederfindungsraten (siehe 7.4) statt. Zeigte eine Substanz eine relative Wiederfindung < 25 %, wurde keine Quantifizierung mit der jeweiligen Methode durchgeführt.

Px×Rfx×Ms cx= Ps×M×W

cx Konzentration der Verbindung: [µg/kg] für Beeren und [µg/L] für Likör

Px Peakfläche der zu quantifizierenden Komponente

Rfx FID-Response Faktor der Verbindung

MS zugesetzte Menge des internen Standards [µg]

PS Peakfläche des internen Standards M eingesetzte Menge Beeren [kg] bzw. Likör [L] W relativer Wiederfindungsfaktor der zu quantifizierenden Verbindung

3.2.3.1 Kapillargaschromatographie (HRGC-FID) HRGC-FID Bedingungen: Gerät: Carlo Erba Mega II 8575 (C.E. Instruments) Kapillarsäule: DB Wax (60 m; 0,32 mm I.D.; 0,25 µm F.); J&W Scientific Temperaturprogramm: 40 °C/ 5 min// 4 °C/ min/ 240 °C/ 25 min 25

Material und Methoden

Trägergas: H2 (110 kPa) Injektor: Splitinjektion (215°C); Splitfluss 30 mL/min; Splitverhältnis ca. 1:10 Detektoren: FID (235 °C) und FPD (235 °C) Eluentensplit via press-fit T-Stück 1:1

3.2.3.2 Bestimmung der FID-Response-Faktoren Die FID-Response-Faktoren wurden mit Hilfe von Lösungen der Referenzsubstanzen im Vergleich zum internen Standard Heptan-2-ol (je 0,1 µg/µL in Diethylether) bestimmt.

Ps Rfx= Px

Rfx Response-Faktor der Verbindung

Px Peakfläche der Verbindung

PS Peakfläche des internen Standards (Heptan-2-ol)

3.2.3.3 Bestimmung der absoluten Wiederfindung von Heptan-2-ol Zur Bestimmung der absoluten Wiederfindung des internen Standards Heptan-2-ol wurden die mittels VHS und LLE extrahierten Stachelbeeren-Chargen aus den Jahren 2010 bis 2012 herangezogen. Außerdem erfolgte die 5-fache Injektion einer Lösung Heptan-2-ol in Diethylether, deren Konzentration einer 100 % -igen Wiederfindung nach VHS bzw. LLE entsprach. Die hierbei durchschnittlich ermittelte Fläche wurde mit der durchschnittlich in den Beerenextrakten für Heptan-2-ol bestimmten Fläche verglichen.

3.2.3.4 Bestimmung der relativen Wiederfindungsraten Die Bestimmung der Wiederfindungsfaktoren erfolgte durch dreifache Extraktion der jeweiligen Referenzsubstanz mittels VHS bzw. LLE aus einer wässrigen Vorlage. Hierzu wurden zunächst Stammlösungen der Referenzsubstanzen zusammen mit dem internen Standard Heptan-2-ol (jeweils 3,0 mg/mL in Ethanol) hergestellt. Um eventuelle

Umlagerungen der C6-Komponenten während der Extraktion zu bemerken, wurden die Wiederfindungsraten der einzelnen Komponenten in mehreren Ansätzen aus unterschiedlichen Stammlösungen bestimmt. Zur Bestimmung der Wiederfindungsraten wurde jeweils ein Aliquot der Stammlösungen 1+9 in Diethylether verdünnt und direkt

Material und Methoden kapillargaschromatographisch analysiert. Gleichzeitig wurden 100 µL der jeweiligen Stammlösung (3,0 mg/mL in Ethanol) sowie 1 L Wasser zur VHS bzw. LLE eingesetzt. Bei den Bestimmungen mittels LLE wurde nach dem Pipettieren der Substanzen in die wässrige Vorlage 30 Minuten vor Zugabe des Lösungsmittels und Beginn der Extraktion abgewartet, um die Dauer der Zentrifugation bei Beeren nachzustellen. Die relativen Wiederfindungen der Substanzen wurden über den Vergleich der Peakflächen der jeweiligen Referenz und denen des internen Standards vor und nach der Aufarbeitung ermittelt. Dabei wurde folgende Formel verwendet:

PXI×PSO W= PXO×PSI

W Relativer Wiederfindungsfaktor der Verbindung

PXi Peakflächen der Verbindung nach Isolierung

PX0 Peakfläche der Verbindung vor Isolierung

PSi Peakfläche des IS nach Isolierung

PSO Peakfläche des IS vor Isolierung

Die Wiederfindungsraten der Säuren wurden aus einer Natriumcitrat/Salzsäure-Pufferlösung (pH 3,5) bestimmt, um mögliche Dissoziationen zu verhindern. Außerdem erfolgte für einige Substanzen zusätzlich die Bestimmung der Wiederfindungsraten aus einem Beerenmatrix- Imitat.

Beerenmatrix-Imitat zur Wiederfindungsbestimmung

Zur Herstellung einer Beerenmatrix-ähnlichen Lösung wurden organische Säuren und Zucker in den für Stachelbeeren publizierten Konzentrationen (Viljakainen et al. 2002; Herrmann 2001; Whiting 1958) in Wasser gelöst: Oxalsäure (100 mg), Äpfelsäure (10 g), Glucose (40 g), Fructose (40 g), Ascorbinsäure (350 mg), Zitronensäure (10 g), Saccharose (10 g) und Sorbit (4 g) pro 1 L Wasser.

Herstellen des Natriumcitrat/Salzsäure-Puffers

Die Pufferlösung (pH 3,5) wurde nach Rauscher et al. (1977) hergestellt: Lösung A: 21,008 g Zitronensäure-Monohydrat wurden in 200 mL 0,1 N Natrium- hydroxidlösung gelöst und auf 1 L mit Wasser aufgefüllt. Lösung B: 0,1 N Salzsäure Lösung A und Lösung B wurden im Verhältnis 46,8 + 53,2 (v+v) gemischt. 27

Material und Methoden

3.2.3.5 Ermittlung der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen Die Bestimmung der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen erfolgte stellvertretend für die Verbindungen Octanal, (E)-Oct-2-enal, Ethylhexanoat, Methyl-3-hydroxybutanoat und Pent- 1-en-3-ol nach der von Vogelgesang und Hädrich (1998) beschriebenen Methode. Es wurden jeweils vier unterschiedliche Konzentrationen im Bereich von 625 ng/mL bis 6250 ng/mL (in Diethylether) dreifach kapillargaschromatographisch analysiert. Aus den daraus erstellten Kalibriergeraden wurden die Nachweis- und die Bestimmungsgrenzen nach folgenden Formeln berechnet.

Aus der Kalibriergeraden (y=bx+a) errechnete sich die Reststandardabweichung (sy):

n 2 (y -(bxi+a) S = i=1 i y n-2 ∑ �

a y-Achsenabschnitt b Steigung

yi Peakfläche der Probe i

xi Konzentration der Probe i n Anzahl der Messwerte

Hieraus ergeben sich die Nachweisgrenze (NG)

2 Sy 1 n NG= ∙t ∙ 1+ + b f;α n n 2 i=1 (x�i x) � ∑ − � und die Bestimmungsgrenze (BG)

1 (EG-x)2 BG= y+b(EG-x)+s ∙t ∙ 1+ + -a /b y f;α n n 2 i=1 (xi � x) �� ∑ − �

tg;α 1,860 (Quantil der t-Verteilung für F=n-2 Freiheitsgrade und 95 % Wahrscheinlichkeit) x Arithmethisches Mittel aller zugesetzten Konzentrationen

y� Arithmethisches Mittel aller erhaltenen Peakflächen EG� 2∙NG

Material und Methoden

Es ergaben sich leicht unterschiedliche Grenzen für die fünf eingesetzten Verbindungen. Den folgenden Auswertungen wurde die höchste ermittelte Nachweisgrenze (0,6 µg/kg) und Bestimmungsgrenze (1,7 µg/kg) zugrunde gelegt.

2 3.2.3.6 Quantifizierung mit dem deuterierten Standard [ H2]-(Z)-Hex-3-enal

2 Bestimmen der Konzentration des Standards [ H2]-(Z)-Hex-3-enal 2 Die Bestimmung der Konzentration der erworbenen Standardlösung ([ H2]-(Z)-Hex-3-enal in n-Pentan) wurde nach der folgenden Methode durchgeführt: Durch die kapillargaschromatographische Analyse (GC-FID) einer Lösung, die definierte Mengen an (Z)-Hex-3-enal und Heptan-2-ol als Standard enthielt, wurde ein FID- Responsefaktor für (Z)-Hex-3-enal bestimmt. Danach wurde eine bestimmte Menge Heptan- 2 2-ol zu einem definierten Volumen der Standardlösung ([ H2]-(Z)-Hex-3-enal in n-Pentan) gegeben. Die Mischung wurde mittels GC-FID analysiert und die Konzentration von 2 [ H2]-(Z)-Hex-3-enal über die Peakflächen der Substanz und des Standards, unter Berücksichtigung des vorher für das nicht markierte (Z)-Hex-3-enal bestimmten Responsefaktors, berechnet. Die Bestimmung der Konzentration erfolgte zweifach.

Quantifizierung von (Z)-Hex-3-enal in Stachel- und Jostabeeren Die Quantifizierung von (Z)-Hex-3-enal in Stachel- und Jostabeeren unter Verwendung des deuterierten Standards erfolgte mittels GC-MS im Selective Ion Monitoring-Modus (stabilisotopenmarkierter Standard: m/z 85; nicht markierte Verbindung: m/z 83) nach folgender Gleichung:

((P(83) 0,146·P(85))∙Kf c= m(85) P(85)∙m − Beeren

c Konzentration (Z)-Hex-3-enal (µg/kg) P(83) Peakfläche m/z 83 P(85) Peakfläche m/z 85 0,146 Korrekturfaktor (der in der Standardlösung vorkommenden Fläche m/z 83) Kf Kalibrierfaktor 2 m(85) eingesetzte Menge [ H2]-(Z)-Hex-3-enal (µg) mBeeren eingesetzte Menge Beeren (kg)

Material und Methoden

Die Bestimmung des Kalibrierfaktors erfolgte durch die Analyse von Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen an markiertem und nicht markiertem (Z)-Hex-3-enal (1:3 bis 3:1). Der Konzentrationsbereich der Lösungen erstreckte sich von 0,4 bis 4 mg/mL Extrakt, was etwa einer Konzentration von etwa 1300 bis 13.000 µg/kg in der Frucht entspricht. Das Verhältnis der Peakflächen (A) der markierten und der nicht markierten Verbindung wurde gegen ihr Konzentrationsverhältnis (c) aufgetragen (Abbildung 2). Der so ermittelte Graph zeigt Linearität in dem gemessenen Bereich.

4 y = 1,9649x + 0,2333 R² = 0,9855 3

A (85) / A (83) / A (85) A 2

0 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 c (85) / c (83)

Abbildung 2: Kalibriergerade und Bestimmtheitsmaß zur Bestimmung des Kalibrierfaktors Kf; A: Fläche; c: Konzentration

3.2.4 Untersuchung chiraler Aromastoffe Für die Bestimmung der Enantiomerenzusammensetzungen der chiralen Aromastoffe wurde ein multidimensionales Gaschromatographiesystem (MDGC) verwendet, welches aus zwei via beheizter Transferline gekoppelten Gaschromatographen (GC 8000 Series) bestand und mit einem Moving Column Stream Switching System (MCSS) ausgestattet war (Schmarr et al. 2007; Sulzbach 1996).

MDGC Bedingungen:

Säulenofen 1 Vorsäule: DB-WAX (60 m; 0,32 mm I.D.; 0,25 µm F.); J&W Scientific Temperaturprogramm: 40 °C/5 min //4 °C/ min//240 °C/25 min

Trägergas: H2 (165 kPa)

Material und Methoden

Injektor: Splitinjektion (215 °C) Splitfluss 30 mL/min; Splitverhältnis ca. 1:15 Detektor: FID (230 °C)

Säulenofen 2 Hauptsäule: (I) 2,3-di-O-acetyl-6-O-tert-butyldimethylsilyl-β-cyclodextrin OV-1701-vi (30 m; 0,25 mm I.D.; F 0,25 µm) (II) 2,3-di-O-methyl-β-cyclodextrin in SE 54 (30 m; 0,25 mm I.D.; F 0,25 µm) (III) 2,3-di-O-ethyl-6-O-tert-butyldimethylsilyl-β-cyclodextrin in PS-086 (30 m; 0,25 mm I.D.; F 0,25 µm) (IV) 2,3-MOM-γ-cyclodextrin in OV 1701-vi (30 m; 0,25 mm I.D.; F 0,25 µm) Temperaturprogramm: 37 °C/10 min//2 °C/min//200 °C/15 min

Trägergas: H2 (100 kPa) Detektor: FID (200 °C)

Die Cyclodextrinderivate (I) bis (III) wurden nach Schmarr (1992) synthethisiert und charakterisiert, das Derivat (IV) nach Takahisa und Engel (2005). Die Auswertung der Daten erfolgte mit Hilfe der Software Chromcard (Thermo Fisher Scientific).

3.2.5 Sensorische Bewertung flüchtiger Verbindungen

3.2.5.1 Kapillargaschromatographie-Olfaktometrie (GC-O) Zur sensorischen Bewertung der Aromastoffe wurde die Aromaextraktverdünnungsanalyse angewandt (Ullrich und Grosch 1987). Hierzu wurden die konzentrierten VHS-Extrakte aus Stachelbeeren (4,5 kg; 1 mL) bzw. Jostabeeren (1,5 kg; 0,5 mL) schrittweise 1+1 mit Lösungsmittel (Diethylether/n-Pentan; 1:1; v/v) verdünnt. Die so erhaltenen Verdünnungen wurden mittels Kapillargaschromatographie-Olfaktometrie sensorisch analysiert. Es erfolgte die Ermittlung der Aromaqualität sowie der Verdünnungsstufe n, bei der ein Geruch gerade noch wahrnehmbar war. Aus dieser Verdünnungsstufe n wurde der Flavour Dilution-Faktor (FD) berechnet: FD=2n

HRGC-O Bedingungen:

Gerät: Carlo Erba Strumentazione Fractovap 4200 (E.C. Instruments)

Material und Methoden

Kapillarsäule: DB Wax (60 m, 0,32 mm I.D., F. 0,25 µm); J&W Scientific Temperaturprogramm: 55 °C/ 10 min// 4 °C/min/ 240 °C/ 25 min

Trägergas: H2 (110 kPa) Injektor: Splitinjektion (220 °C); Splitfluss 30 mL/min; Splitverhältnis ca. 1:10 Detektor: FID (230°C) Sniffingport: Passiv geheizte Verlängerung der Detektorbasis (230 °C) Eluentensplit via press-fit T-Stück 1:1

3.2.5.2 Bestimmung der Geruchsschwellenwerte von Aromastoffen Die Bestimmung der Geruchsschwellen ausgewählter Verbindungen erfolgte durch ein Panel (mindestens zehn Teilnehmer) im Triangeltest. Es wurde die „Forced-Choice“-Technik angewandt, wonach die Prüfpersonen auch bei Nicht-Wahrnehmung eines Unterschieds eine Angabe machen mussten. Um Zufallstreffer auszuschließen, wurde bei der Auswertung diejenige Probe als erste richtig gewertet, ab der jede weitere in der Verdünnungsreihe richtig erkannt wurde. Die Berechnung der Geruchsschwellenwerte der einzelnen Teilnehmer erfolgte nach dem von Meilgaard et al. (2007) beschriebenen Verfahren.

G= Ce×Ce-1

� G Geruchsschwelle der einzelnen Prüfpersonen

Ce Konzentration [mg/L] der ersten erkannten Probe

Ce-1 Konzentration [mg/L] der vorangegangenen Probe

Für die Ermittlung der Geruchsschwelle der Prüfgruppe wurde das geometrische Mittel herangezogen.

n n G= Gi i=1 � ��

G Geruchsschwelle der Prüfgruppe n� Anzahl der Prüfpersonen

Gi Geruchsschwelle der einzelnen Prüfperson ∏ Produkte der Geruchsschwellen der einzelnen Prüfer

Material und Methoden

Die Bestimmung der Geruchsschwellenwerte wurde in Wasser und für einige Verbindungen zusätzlich in einem Beerenmatrix-Imitat durchgeführt. Die Herstellung der unterschiedlichen Verdünnungsstufen der Verbindungen erfolgte jeweils aus einer Stammlösung.

Herstellen des Beerenmatrix-Imitates für die Bestimmung der Geruchsschwellenwerte

Als Beerenmatrix-Imitat wurde eine wässrige Lösung der in Stachelbeeren enthaltenen organischen Säuren und Zucker in deren natürlichen Konzentrationen verwendet (Herrmann 2001, Viljakainen et al. 2002, Whiting 1958, Iversen et al. 1998, Milivojevic et al. 2012, Zheng et al. 2009). Hierzu wurden Oxalsäure (100 mg), Äpfelsäure (10 g), Ascorbinsäure (350 mg), Zitronensäure (10 g), Glucose (40 g), Fructose (40 g), Saccharose (10 g) und Sorbit (4 g) in 1 L Wasser gelöst.

3.2.5.3 Berechnung von Aromawerten Zur Beurteilung der Aromarelevanz von flüchtigen Verbindungen eignet sich das Prinzip des Aromawertes nach Rothe und Thomas (1963). Die Berechnung der Aromawerte erfolgte nach folgender Formel:

c A= G

A Aromawert der Verbindung in einem bestimmten Lebensmittel c Konzentration der Verbindung im Lebensmittel G Geruchsschwellenwert der Verbindung

3.2.5.4 Aromaprofilanalyse Die bei der Aromaprofilanalyse verwendeten Deskriptoren sowie deren sensorische Beschreibungen sind in Tabelle 6 aufgeführt. Für die Aromaprofilanalyse wurden Lösungen der jeweiligen Substanzen in Wasser hergestellt, wobei deren Konzentration 100fach oberhalb der jeweiligen Geruchsschwelle lag. Anhand dieser Deskriptorlösungen erfolgte die Aromaprofilanalyse der Beeren, Liköre und Rekombinate auf einer Bewertungsskala von 0 (nicht wahrnehmbar) bis 3 (stark wahrnehmbar) in 0,5-Schritten.

Material und Methoden

Tabelle 6: Für Stachelbeeren/Stachelbeerenlikör (STB) und Jostabeeren/Jostabeerenlikör (JO) verwendete Deskriptoren, deren Geruchsbeschreibungen und Geruchsschwellen

Geruchsschwelle in Wasser Substanz Geruch [µg/L] Ethylbutanoat STB, JO Ananas 3 a Methylbutanoat STB grün-fruchtig 63 a Methylbenzoat JO süß 4 a (E)-Methylbut-2-enoat STB muffig 124 a (E)-Hex-2-enal STB, JO Apfel 77 a (Z)-Hex-3-enal STB, JO grasig 0,6 a Hexanal JO fettig-grün 4 a 1,8-Cineol JO Eukalyptus 2 a (R)-Oct-1-en-3-ol STB Pilz-artig 0,9 a Essigsäure STB, JO sauer 70 b Acetophenon STB süß-blumig 26 a Pent-1-en-3-on JO scharf-modrig 0,9 a a: Die Geruchsschwellen wurden im Rahmen dieser Arbeit bestimmt. b: Geruchsschwelle nach Yang et al. 2010.

Die Säfte wurden direkt zur Bewertung eingesetzt. Die Früchte wurden unmittelbar vor der Bewertung mit einem Messer halbiert und dann die orthonasale Bewertung innerhalb von 30 Sekunden durchgeführt. Für jeden Deskriptor wurde eine neue Frucht angeschnitten.

3.2.6 Rekombination des Aromas frischer Beeren Die Rekonstitution des Aromas frischer Stachelbeeren erfolgte auf Basis der Aromastoffkonzentrationen in der Charge Achilles vom 05.08.2010 (Tabelle 16) in Wasser. Es wurden alle Substanzen einbezogen, deren durchschnittlicher Aromawert als > 1 berechnet wurde (Tabelle 18): (Z)-Hex-3-enal, (E)-Hex-2-enal, (R)-Oct-1-en-3-ol, Ethylbutanoat, Methylbutanoat, (Z)-Hex-3-en-1-ol, Acetophenon, Ethylhexanoat, (E)-Methylbut-2-enoat und Methyldecanoat. Die Rekonstitutionen des Aromas frischer Jostabeeren erfolgten auf Basis der Aromastoffkonzentrationen in Jostabeeren vom 30.06.11 (Tabelle 28). Dazu wurden Stammlösungen der einzelnen Verbindungen hergestellt und in einer Lösung, bestehend aus organischen Säuren und Zuckern (Beerenmatrix-Imitat) verdünnt. Die Herstellung dieses Beerenmatrix-Imitats erfolgte auf Basis der natürlich vorkommenden Konzentrationen der Substanzen in Schwarzen Johannisbeeren, da zu diesem Zeitpunkt keine Daten für Jostabeeren vorlagen: Oxalsäure (40 mg/L), Äpfelsäure (3,5 g/L), Ascorbinsäure (1,5 g/L), Zitronensäure (25 g/L), Glucose (30 g/L), Fructose (35 g/L) und Saccharose (20 g/L).

Material und Methoden

Tabelle 7: Vollrekombinat und Teilrekombinat des Jostabeerenaromas

Substanz Konzentration Vollrekombinat Teilrekombinat [µg/L]

(E)-Methylbut-2-enoat 74 × (E)-Hex-3-en-1-ol 45 × Pent-1-en-3-on 18 × × (E)-Pent-2-enal 18 × α-Terpineol 17 × Ethylhexanoat 10 × × 2-Methylpropanol 10 × 3-Methylbut-2-enylacetat 1 × Propanal 1 × Oct-1-en-3-on 0,01 × × 2-Methylpropansäure 1 × Linalylacetat 1 × 2-Methylpropylacetat 1 × Nonanal 1,5 × Linalooloxid 1 × Propan-2-thiol 1 × (Z)-Octa-1,5-dien-3-ol 0,2 × a Ethylbutanoat 712 × × (Z)-Hex-3-enal 955 × × 1,8-Cineol 447 × × Hexanal 134 × × (E)-Hex-3-enal 23 × b Hexanol 105 × Ethylacetat 8465 × (E)-Hex-2-enal 4836 × × Methylbutanoat 2725 × × a: Diese Substanz wurde in Form eines Extraktes aus Pilzen nach Zugabe von Linolensäure zugegeben (Tressl et al. 1982). b: In Referenz von (Z)-Hex-3-enal zu 2,4 % enthalten.

Das Teilrekombinat wurde gegen das Vollrekombinat im Triangeltest bewertet. Die statistische Auswertung erfolgte nach Quad et al. (2011) mit einem Signifikanzniveau von α=0,05.

3.2.7 NMR-Spektroskopie Zur Identifizierung der Substanz mit einem Retentions-Index von 1859 (Tabelle 22, Tabelle 23 und Tabelle 28) wurde 2-Hydroxy-1,8-cineol nach der Methode von Horst und Rychlik (2010) synthethisiert (siehe 3.1.3). Es folgten NMR-spektroskopische Untersuchungen der synthetisierten Substanz (1H-NMR bei 500,1 MHz, 13C-NMR bei 125,6 MHz, H,H-Cosy, HSQC, HMBC) und ein Abgleich mit den Literaturdaten (Horst und Rychlik 2010).

Material und Methoden

Die chemischen Verschiebungen (1H und 13C NMR) wurden in ppm angegeben und alle 13C NMR-Spektren wurden im Protonen-entkoppelten Modus aufgezeichnet. Die Auswertung erfolgte mit Hilfe der Software MestreNova.

NMR Spektrometer: Avance500C Spektrometer (Bruker Instruments, Deutschland) Lösungsmittel: deuteriertes Chloroform Probentemperatur: 25 °C

Ergebnisse und Diskussion

4 Ergebnisse und Diskussion

4.1 Analyse der flüchtigen Verbindungen in Stachelbeeren

4.1.1 Identifizierung und Quantifizierung der flüchtigen Verbindungen mittels VHS

4.1.1.1 Einleitung

Stachelbeeren (Ribes uva crispa L.) werden in Europa seit Beginn des 17. Jahrhunderts angebaut. Ihre Wildformen sind zwar in den gemäßigten Klimazonen (Italien, Griechenland) zu finden, allerdings wachsen sie nur in bergigen Gebieten, was ihre Kultivierung als Nutzpflanze erschwert (Barney und Hummer 2005). Bisher waren keine Daten über das flüchtige Profil von Stachelbeeren bekannt. Ziel der vorliegenden Untersuchungen war es daher, die flüchtigen Inhaltsstoffe der Beeren zu identifizieren und zu quantifizieren sowie einen Überblick über die Variabilität der flüchtigen Profile zu erhalten. Außerdem wurden Untersuchungen zum Einfluss verschiedener Parameter, wie der Tiefkühllagerung und der Fruchtreife, auf das flüchtige Spektrum durchgeführt. Zur Isolierung der flüchtigen Komponenten wurde die Vakuum Headspace Technik (VHS) angewandt. Dies ist eine schonende Methode, welche die Bildung thermisch bedingter Reaktionsprodukte verhindert. In mehreren Arbeiten erwies sich die VHS als sehr gut geeignet für die Isolierung flüchtiger Inhaltsstoffe aus frischem Pflanzenmaterial (Dregus und Engel 2003, Werkhoff et al. 1998).

4.1.1.2 Zusammensetzung des flüchtigen Profils der frischen Beeren

Die mittels VHS gewonnenen Extrakte wurden mit Hilfe von kapillargaschromatographischen Methoden (HRGC-FID/FPD und HRGC-MS) untersucht. Die quantitativen Bestimmungen beruhen auf der Verwendung eines internen Standards (Heptan-2-ol), der nicht natürlich in den Beeren vorkommt und vor der Isolierung der Komponenten zugegeben wurde. Unter Berücksichtigung des gaschromatographischen Verhaltens (Response) und der Wiederfindung erfolgte die Quantifizierung der Komponenten. Durch die Anwendung der VHS wurden insgesamt 127 Verbindungen in den 26 untersuchten Chargen frischer Stachelbeeren identifiziert. Diese sind in Tabelle 8 aufgeführt. Ein beispielhaftes Chromatogramm ist in Abbildung 3 dargestellt.

Ergebnisse und Diskussion

Tabelle 8: In frischen Stachelbeeren identifizierte Verbindungen

Nr.a Verbindung RIb nc Identifizierung

1 Propanal 796 11 d 2 Ethylformiat 822 22 d 3 Methylacetat 824 2 d 4 Prop-2-enal 863 14 d 5 Ethylacetat 886 25 d 6 Methylpropionat 905 1 d 7 3-Methylbutan-2-on 923 1 d 8 Propan-2-ol 926 1 d 9 Ethanol 931 18 d 10 Ethylpropionat 946 3 d 11 2-Methylpent-3‑en-1-ol 962 1 e 12 Pentanal 963 7 d 13 Pentan-3-on 963 1 e 14 Pentan-2-on 963 25 d 15 Methylbutanoat 981 26 d 16 2‑Methylpropylacetat 1011 1 d 17 Methyl-2‑methylbutanoat 1015 1 d 18 Pent-1-en-3-on 1015 25 d 19 Ethylbutanoat 1033 26 d 20 (E)-But-2-enal 1035 1 d 21 2‑Methylbut-3‑en-2‑ol 1041 4 d 22 Ethyl-2‑methylbutanoat 1041 1 d 23 Hexan-3‑on 1045 1 e 24 2,3,5‑Trimethylfuran 1050 20 e 25 Ethyl-3‑methylbutanoat 1057 1 d 26 Butylacetat 1061 1 d 27 Hexanal 1076 26 d 28 2‑Methylpent-3‑en-1‑ol 1086 1 e 29 2‑Methylpropan-1-ol 1090 11 d 30 (E)-Methylbut-2-enoat 1101 21 d 31 (Z)-Pent-2-enal 1101 4 e 32 Propylbutanoat 1107 1 e 33 Pentan-3‑ol 1110 6 d 34 3‑Methylbutylacetat 1110 1 d 35 Pent-3‑en-2‑on 1117 1 d 36 (E)-Pent-2-enal 1121 24 d 37 Pentan-2-ol 1123 21 d 38 (E)-Hex-3-enal 1133 26 d 39 (Z)-Hex-3-enal 1139 26 d 40 Butan-1-ol 1142 8 d 41 (E)-Ethylbut-2-enoat 1158 23 d 42 Pent-1-en-3-ol 1161 26 d 43 Heptan-2‑on 1174 10 d 44 Methyl-2‑methylbut-2‑enoat 1180 2 e 45 Methylhexanoat 1184 26 d 46 (Z)-Hex-2-enal 1194 25 f 47 1,8-Cineol 1200 1 d 48 (E)-Hex-2-enal 1209 26 d 49 2‑Methylbutan-1-ol 1214 2 d 50 3‑Methylbutan-1-ol 1214 4 d 51 Ethyl-2‑methylbut-2‑enoat 1226 3 d 52 Ethylhexanoat 1232 24 d 53 Pentan-1-ol 1252 25 d 54 Acetoin 1265 26 d 38

Ergebnisse und Diskussion

Nr.a Verbindung RIb nc Identifizierung

55 Octanal 1276 2 d 56 (E)‑Pent-2‑en-1‑ol 1313 6 d 57 (E)-Hept-2-enal 1318 15 d 58 (Z)‑Pent-2‑en-1‑ol 1321 24 d 59 (E)‑Hex-2‑enylacetat 1331 1 d 60 6‑Methylhept‑5-en‑2-on 1332 3 d 61 Ethyl-(E)‑hex-2‑enoat 1340 1 d 62 4‑Hydroxy-4‑methylpentan-2‑on 1344 1 d 63 Hexan-1-ol 1355 23 d 64 (E)-Hex-3-en-1-ol 1363 17 d 65 (Z)-Hex-3-en-1-ol 1384 26 d 66 Methyloctanoat 1388 26 d 67 Nonanal 1389 18 d 68 (E,E)‑Hexa-2,4‑dienal 1400 2 d 69 (E)-Hex-2-en-1-ol 1407 26 d 70 (E)-Oct-2-enal 1422 2 d 71 Ethyloctanoat 1434 11 d 72 4‑Hydroxypentan-2‑on 1436 1 e 73 Essigsäure 1440 24 d 74 (R)-Oct-1-en-3-ol 1452 26 d, g 75 Heptadienal-Isomer 1458 12 e 76 (E,E)-Hepta-2,4-dienal 1483 9 d 77 3‑Ethylpentan-2,4‑dion 1486 1 e 78 2-Ethylhexan-1-ol 1491 14 d 79 2‑Ethylhexylprop-2‑enoat 1493 1 e 80 Theaspiran I 1495 5 f 81 Ethyl-3‑hydroxybutanoat 1498 2 d 82 Benzaldehyd 1512 8 d 83 Propansäure 1533 12 d 84 Theaspiran II 1535 5 f 85 Butan-2,3‑diol (ersteluierendes Stereoisomer) 1538 1 d 86 Linalool 1548 4 d 87 Octan-1-ol 1560 6 d 88 2‑Methylpropansäure 1560 1 d 89 Butan-2,3‑diol (zweiteluierendes Stereoisomer) 1576 6 d 90 Mesifuran 1587 5 d 91 Propylenglycol 1588 11 d 92 Methyldecanoat 1590 23 d 93 4-Hydroxy-5-methylhexan-2-on 1612 1 e 94 Methylbenzoat 1613 11 d 95 β‑Cyclocitral 1614 7 d 96 Buttersäure 1624 17 d 97 Ethyldecanoat 1638 2 d 98 Acetophenon 1641 26 d 99 Ethylbenzoat 1661 11 d 100 2‑Methylbuttersäure 1667 3 d 101 α‑Terpineol 1686 2 d 102 Verbenon 1703 1 d 103 Benzylacetat 1723 2 d 104 Pentansäure 1734 1 d 105 (E)‑But-2‑ensäure 1768 1 d 106 Isopropyllaurat 1795 19 e 107 1‑Phenylethan-1-ol 1810 2 d 108 α‑Dihydroionon 1812 1 d 109 Anethol 1821 2 d 110 β‑Dihydroioinon 1828 2 d 39

Ergebnisse und Diskussion

Nr.a Verbindung RIb nc Identifizierung

111 Hexansäure 1844 24 d 112 Geraniol 1849 6 d 113 Benzylbutanoat 1871 1 d 114 Benzylalkohol 1874 16 d 115 2-Phenylethanol 1899 1 d 116 3,5-di-tert-Butyl-4-hydroxytoluol 1908 5 e 117 β‑Ionon 1936 4 d 118 (E)-Hex-3-ensäure 1951 17 d 119 (E)-Hex-2-ensäure 1961 1 d 120 Octansäure 2057 14 d 121 1‑Hydroxy-1‑phenylpropan-2‑on 2098 1 e 122 Nonansäure 2164 6 d 123 Isopropylpalmitat 2239 5 e 124 Decansäure 2245 2 d 125 Hexadecan-1-ol 2380 2 d 126 Phthalat 2540 5 e,h 127 Kohlenwasserstoff C 29 2901 1 d a: Die Nummern entsprechen den Verbindungen in Abbildung 3 und Tabelle 9. b: Retentionsindices. c: Identifiziert in n von 26 Chargen. d: Die Identifizierung der Verbindungen erfolgte durch Abgleich massenspektrometrischer und kapillargaschromatographischer Daten mit Referenzsubstanzen. e: Die Identifizierung erfolgte durch Abgleich massenspektrometrischer Daten mit Literaturangaben. f: Die Identifizierung erfolgte durch Abgleich massenspektrometrischer und kapillargaschromatographischer Daten mit Literaturangaben. g: Identifizierung des Enantiomers durch den Vergleich kapillargaschromatographischer Daten mit einer Referenzsubstanz auf einer 2,3-di-O-acetyl-6-O-tert-butyldimethylsilyl-β-cyclodextrin-Säule. h: nicht eindeutig identifizierbarer Phthalsäureester.

Ergebnisse und Diskussion

20 5 15 39 48 IS 65

69 30 15

98 10 74 [mV] 19 116

41 5 96 111 2 123 45 73 127 14 63 4 9 38 66 27 54 37 46 53 83 95 125 126 18 42 52 64 78 92 114 118 55 87 103 104 119 120 122 124 0 0 20 40 60 80 Zeit [min]

Abbildung 3: Kapillargaschromatographische Trennung (DB-WAX) der mittels Vakuum Headspace Technik aus Stachelbeeren (Achilles vom 05.08.10; Konzentrationen siehe Tabelle 9) isolierten flüchtigen Verbindungen (die angegebenen Nummern entsprechen den Verbindungen in Tabelle 8 und Tabelle 9; Bedingungen siehe Material und Methoden 3.2.3.1; IS: interner Standard Heptan-2-ol)

Ergebnisse und Diskussion

In allen analysierten Chargen waren stets die gleichen Hauptkomponenten zu finden, die durch eine große Anzahl geringer konzentrierter Verbindungen begleitet wurden. Die Konzentrationen der einzelnen Verbindungen sind in Tabelle 9 für die drei kommerziell wichtigsten Sorten Achilles, Bekay und Xenia exemplarisch für je eine Charge gezeigt. Durch die angewandte VHS werden bevorzugt flüchtige Verbindungen isoliert. Die bestimmten Wiederfindungsraten zeigen die Diskriminierung nicht-flüchtiger sowie sehr polarer Substanzen (Anhang, Tabelle 34). Organische Säuren, wie Äpfel- oder Zitronensäure, werden durch VHS beispielweise nicht isoliert. Dies wurde bereits in einer früheren Arbeit gezeigt (Dregus und Engel 2003). Die relativen Wiederfindungen (zum internen Standard Heptan-2-ol) der flüchtigen Verbindungen bei VHS wurden für ausgewählte Verbindungen aus Wasser sowie aus einem Beerenmatriximitat bestimmt (Anhang, Tabelle 32). Hierbei zeigte sich kein Einfluss durch die Matrix.

Tabelle 9: Konzentrationen der nach VHS quantifizierten Verbindungen in den drei kommerziell wichtigsten Stachelbeersorten Achilles, Xenia und Bekay

Nr.a Substanz RIb Achilles Xenia Bekay

[µg/kg]c

C6-Komponenten 39 (Z)-Hex-3-enal 1139 1279 ± 410 21014 ± 2127 11188 ± 2541 d 48 (E)-Hex-2-enal 1209 1046 ± 360 1247 ± 152 1441 ± 299 d 65 (Z)-Hex-3-en-1-ol 1384 167 ± 89 398 ± 59 862 ± 30 d 38 (E)-Hex-3-enal 1133 46 ± 21 301 ± 91 269 ± 79 d 69 (E)-Hex-2-en-1-ol 1407 179 ± 105 29 ± 10 133 ± 50 d 27 Hexanal 1076 21 ± 6 166 ± 7 123 ± 20 d 63 Hexan-1-ol 1355 7 ± 4 7 ± 2 33 ± 8 d 46 (Z)-Hex-2-enal 1194 4 ± 2 26 ± 5 14 ± 4 f 64 (E)-Hex-3-en-1-ol 1363 7 ± 4 n.q.h 27 ± 7 e

Ester 15 Methylbutanoat 981 858 ± 414 4609 ± 642 2984 ± 323 d 19 Ethylbutanoat 1033 136 ± 55 651 ± 31 1557 ± 312 d 30 (E)-Methylbut-2-enoat 1101 293 ± 18 79 ± 4 191 ± 50 d 41 (E)-Ethylbut-2-enoat 1158 120 ± 60 44 ± 9 175 ± 75 d 45 Methylhexanoat 1184 31 ± 6 61 ± 7 36 ± 7 d 66 Methyloctanoat 1388 12 ± 4 22 ± 2 8 ± 3 e 123 Isopropylpalmitat 2239 41 ± 10 n.d.i n.q. f 94 Methylbenzoat 1613 4 ± 2 24 ± 12 n.d. d 52 Ethylhexanoat 1232 4 ± 4 6 ± 1 11 ± 2 e 126 Phthalat 2540 17 ± 11 n.d. n.d. f,k 92 Methyldecanoat 1590 3 ± 1 4 ± 0 n.q. e 99 Ethylbenzoat 1661 n.d. 4 ± 1 n.d. e 106 Isopropyllaurat 1795 n.d. n.d. 3 ± 1 f 71 Ethyloctanoat 1434 n.q. n.d. n.q. e 103 Benzylacetat 1723 n.q. n.d. n.d. e 2 Ethylformiat 822 n.k. n.k. n.k. g 5 Ethylacetat 886 n.k. n.k. n.k. g

Ketone 14 Pentan-2-on 970 121 ± 57 10 ± 2 74 ± 4 d 98 Acetophenon 1641 121 ± 39 6 ± 2 10 ± 2 d 42

Ergebnisse und Diskussion

Nr.a Substanz RIb Achilles Xenia Bekay

[µg/kg]c

18 Pent-1-en-3-on 1015 3 ± 1 25 ± 2 21 ± 2 e 54 Acetoin 1265 n.k. n.k. n.k. g 90 Mesifuran 1587 n.d. n.d. n.c. g

Alkohole 74 (R)-Oct-1-en-3-ol 1452 61 ± 21 159 ± 34 157 ± 27 d 42 Pent-1-en-3-ol 1161 3 ± 1 16 ± 0 12 ± 2 e 58 (Z)-Pent-2-en-1-ol 1321 n.d. 18 ± 2 13 ± 1 e 37 Pentan-2-ol 1123 21 ± 21 n.d. 8 ± 5 e 9 Ethanol 931 5 ± 1 6 ± 1 9 ± 2 e 125 Hexadecan-1-ol 2380 10 ± 3 n.d. n.q. e 114 Benzylalkohol 1874 4 ± 2 n.d. n.q. e 29 2-Methylpropan-1-ol 1090 n.d. n.q. 4 ± 1 e 53 Pentan-1-ol 1252 3 ± 1 n.q. 4 ± 1 e 78 2-Ethylhexan-1-ol 1491 n.q. n.d. n.q. e 87 Octan-1-ol 1560 n.q. n.d. n.d. e 21 2-Methylbut-3-en-2-ol 1041 n.d. n.q. n.d. d

Aldehyde 36 (E)-Pent-2-enal 1121 n.q. 8 ± 0 9 ± 0 e 4 Prop-2-enal 863 4 ± 1 n.d. n.d. e 67 Nonanal 1389 3 ± 0 n.q. n.q. e 57 (E)-Hept-2-enal 1318 n.d. n.q. n.q. d 55 Octanal 1276 n.q. n.d. n.d. e 70 (E)-Oct-2-enal 1422 n.q. n.d. n.d. e 82 Benzaldehyd 1512 n.q. n.d. n.d. e

Säuren 73 Essigsäure 1440 n.k. n.k. n.k. g 83 Propansäure 1533 n.k. n.k. n.k. g 96 Buttersäure 1624 n.k. n.d. n.k. g 104 Pentansäure 1734 n.k. n.d. n.d. g 100 2-Methylbuttersäure 1667 n.d. n.d. n.k. g 111 Hexansäure 1844 n.k. n.k. n.k. g 118 (E)-Hex-3-ensäure 1951 n.k. n.k. n.d. g 119 (E)-Hex-2-ensäure 1961 n.k. n.d. n.d. g 120 Octansäure 2057 n.k. n.d. n.k. g 122 Nonansäure 2164 n.k. n.k. n.k. g 124 Decansäure 2245 n.k. n.d. n.k. g g Sonstige 3,5-di-tert-Butyl-4- 116 1908 126 ± 51 n.d. n.d. hydroxytoluol 127 Kohlenwasserstoff C 29 2901 16 ± 9 n.d. n.d. f 91 Propylenglykol 1588 n.d. 10 ± 6 n.q. 75 Heptadienal-Isomer 1458 n.d. 5 ± 2 n.q. f 95 β-Cyclocitral 1598 2 ± 1 n.d. n.d. e 76 (E,E)-Hepta-2,4-dienal 1483 n.q. n.q. n.d. 24 2,3,5-Trimethylfuran 1050 n.d. n.q. n.q. f 86 Linalool 1548 n.d. n.q. n.d. e 112 Geraniol 1849 n.d. n.q. n.d. e a: Die Nummern entsprechen den Verbindungen in Abbildung 3 und Tabelle 8. b: Retentionsindices. c: Mittelwert und Standardabweichung einer Dreifachbestimmung. d: Die Quantifizierung erfolgte unter Berücksichtigung des gaschromatographischen Verhaltens (Response) und der Wiederfindung (siehe Anhang, Tabelle 34). e: Die Quantifizierung erfolgte unter Berücksichtigung des gaschromatographischen Verhaltens (Response). f: Für die

Ergebnisse und Diskussion

Quantifizierung wurde der Response-Faktor 1 angenommen. g: Nicht kalkulierbar (n.k.), da die Wiederfindung unter 25 % lag. h: Nicht quantifizierbar (n.q.), da die Konzentration unterhalb der Bestimmungsgrenze (1,7 µg/kg) lag. i: Nicht identifizierbar (n.d.), da die Konzentration unterhalb der Nachweisgrenze (0,6 g/kg) lag. k: nicht eindeutig identifizierbarer Phthalsäureester.

Das flüchtige Profil von Stachelbeeren wird hauptsächlich durch drei Verbindungen geprägt, die in hohen Konzentrationen vorlagen: (Z)-Hex-3-enal, (E)-Hex-2-enal und Methylbutanoat repräsentierten mindestens 70 % der Summe an flüchtigen Verbindungen in allen analysierten Chargen. Alle weiteren Verbindungen lagen nur in vergleichsweise geringen Konzentrationen vor. Das flüchtige Profil von Stachelbeeren war folglich zum größten Teil durch die Substanzklassen der C6-Komponenten und Ester geprägt, welche mindestens 88 % der Gesamtmenge an flüchtigen Verbindungen in reifen Stachelbeeren darstellen und die im Folgenden weiter betrachtet werden.

C6-Komponenten

C6-Komponenten kommen in zahlreichen Früchten vor und spielen eine wichtige Rolle für die Verteidigungsmechanismen und die Schädlingsbekämpfung der Pflanze. Sie werden nach der Zerstörung des Zellgewebes enzymatisch aus ungesättigten Fettsäuren gebildet und stellen somit sekundäre Aromastoffe dar (siehe 2.2). Hohe Konzentrationen an

C6-Verbindungen sind beispielsweise bereits für Rhabarber, Nektarinen und Kiwis bekannt

(Dregus und Engel 2003, Engel et al. 1988, Young et al. 1995). Das C6-Profil der Stachelbeeren zeigte besonders hohe Konzentrationen an (Z)-Hex-3-enal, gefolgt von dessen Isomerisierungsprodukt (E)-Hex-2-enal und den korrespondierenden Alkoholen (Z)-Hex-3-en-1-ol und (E)-Hex-2-en-1-ol. Die starke Dominanz von (Z)-Hex-3-enal, die durchgängig in allen Chargen zu beobachten war, ist eine Besonderheit der Stachelbeere, die bisher kaum in anderen Früchten gefunden wurde. Das C6-Profil der meisten bisher analysierten Früchte wird durch (E)-Hex-2-enal oder (E)-Hex-2-en-1-ol dominiert (Dregus und Engel 2003, Engel et al. 1988, Young et al. 1995, Schreier 1980). Neben Stachelbeeren ist für Tomaten und Pinke Guave bekannt, dass (Z)-Hex-3-enal den dominierenden

C6-Körper darstellt (Buttery et al. 1987, Steinhaus et al. 2009).

Quantifizierung von (Z)-Hex-3-enal

Aufgrund der bekannten Instabilität von (Z)-Hex-3-enal (Buttery et al. 1990, Steinhaus und Schieberle 2000, Büttner und Schieberle 2001) wurde dessen Quantifizierung durch eine zweite Methode überprüft. Hierzu erfolgten parallele Aufarbeitungen einer Charge Stachelbeeren (I) nach Zugabe des internen Standards Heptan-2-ol und (II) nach Zugabe der

2 stabilisotopenmarkierten Verbindung [ H2]-(Z)-Hex-3-enal.

Ergebnisse und Diskussion

2 Heptan-2-ol bzw. [ H2]-(Z)-Hex-3-enal wurde direkt bei Beginn der Homogenisierung zu den Beeren gegeben. Die Extraktion (VHS bzw. LLE) wurde wie üblich durchgeführt. Die Bestimmung der Konzentrationen an (Z)-Hex-3-enal erfolgte mit Hilfe von GC-FID und mittels HRGC-MS. Die ermittelten Konzentrationen an (Z)-Hex-3-enal in Stachelbeeren sind in Tabelle 10 aufgeführt.

2 Tabelle 10: Mittels Heptan-2-ol und [ H2]-(Z)-Hex-3-enal bestimmte Konzentrationen an (Z)-Hex-3-enal sowie der Summe aller C6-Verbindungen in Stachelbeeren bei Standardzugabe zu Beginn der Homogenisierung

2 Verwendeter Standard: Heptan-2-ol [ H2]-(Z)-Hex-3-enal

Quantifizierte Komponente(n): (Z)-Hex-3-enal Summe (Z)-Hex-3-enal

[µg/kg]

VHS 1783 ± 449 4342 5662 ± 464

LLE 1889 ± 623 3407 4512 ± 1360

Ein Vergleich der durch beide Methoden ermittelten Konzentrationen an (Z)-Hex-3-enal 2 zeigte sowohl nach VHS als auch nach LLE große Differenzen. Die mittels [ H2]-(Z)-Hex-3- enal berechneten Werte lagen mehr als zweifach über den mittels Heptan-2-ol bestimmten Konzentrationen. Der Grund für die unterschiedlichen Konzentrationen ist die enzymatische Entstehung der

C6-Komponenten. Durch den deuterierten Standard wurde exakt zu dem Zeitpunkt der Standardzugabe – also direkt zu Beginn der Homogenisierung – quantifiziert. Da aus

(Z)-Hex-3-enal alle weiteren C6-Komponenten durch Isomerisierung und Reduzierung entstehen und mittels Heptan-2-ol die Quantifizierung von (Z)-Hex-3-enal aufgrund der Bestimmung der Wiederfindung zum Zeitpunkt des Starts der Extraktion (also bei VHS ca. 10 min und bei LLE ca. 30 min nach Homogenisierung) durchgeführt wurde, ergaben sich die 2 unterschiedlichen Konzentrationen in obiger Tabelle. Das zugegebene [ H2]-(Z)-Hex-3-enal wurde analog zum endogen entstehenden (Z)-Hex-3-enal isomerisiert und reduziert. Diese Vermutung konnte auf folgende Weise bestätigt werden:

(I) Die Summen aller mittels Heptan-2-ol berechneten C6-Komponten lagen im Bereich 2 der durch [ H2]-(Z)-Hex-3-enal ermittelten (Z)-Hex-3-enal-Konzentration. 2 (II) In den nach Zugabe von [ H2]-(Z)-Hex-3-enal erhaltenen VHS- und LLE-Extrakten aus Jostabeeren und Stachelbeeren, deren (Z)-Hex-3-enal-Konzentrationen in obiger Tabelle aufgeführt sind, konnten deuteriertes (E)-Hex-2-enal sowie (Z)-Hex-3-en-1-ol nachgewiesen werden. Die deuterierten Verbindungen wurden anhand charakteristischer Massen identifiziert, wie Abbildung 4 am Beispiel (E)-Hex-2-enal zeigt.

Ergebnisse und Diskussion

D O

H D

2 2 Abbildung 4: Massenspektren von (E)-Hex-2-enal und [ H2]-(E)-Hex-2-enal in einem nach Zugabe von [ H2]-(Z)- Hex-3-enal erhaltenen Extrakt (GC-MS-Bedingungen siehe Material und Methoden)

(III) Werden die Enzyme der Beeren 90 Sekunden nach Homogenisierung durch die

Zugabe von gesättigter CaCl2-Lösung inhibiert (siehe 4.1.1.3) und der Standard 2 (Heptan-2-ol bzw. [ H2]-(Z)-Hex-3-enal) erst anschließend zugegeben, so sind die bestimmten Konzentrationen nahezu gleich, wie Tabelle 11 zeigt.

2 Tabelle 11: Mittels Heptan-2-ol und [ H2]-(Z)-Hex-3-enal ermittelte Konzentrationen an (Z)-Hex-3-enal in Stachel- und Jostabeeren bei Enzyminhibierung mittels gesättigter CaCl2-Lösung nach 90 Sekunden (VHS-Isolierung)

Stachelbeere Jostabeere

(Z)-Hex-3-enal [µg/kg]

2 2 Verwendeter Standard: Heptan-2-ol [ H2]-(Z)-Hex-3-enal Heptan-2-ol [ H2]-(Z)-Hex-3-enal

Durchführung 1 2042 1960 8056 9934

Durchführung 2 1701 1941 ∕ ∕

Ergebnisse und Diskussion

Durch die Versuche mit Hilfe eines stabilisotopenmarkierten Standards wurde die Quantifizierung von (Z)-Hex-3-enal mittels Heptan-2-ol bestätigt. Trotz der Instabilität der Komponente im wässrigen Medium sind die über Heptan-2-ol bestimmten Konzentrationen zuverlässig. Es ist jedoch zu bedenken, dass die über Heptan-2-ol bestimmten Konzentrationen die Menge an Substanzen in der jeweiligen Beerenmatrix ohne Inhibierung zum Zeitpunkt des Extraktionsbeginns angeben. Um auch Aufschluss über die Konzentrationen direkt nach Zerstörung des Zellgewebes zu erhalten, wurden zusätzlich Inhibierungsversuche durchgeführt (siehe 4.1.1.3). Zur zusätzlichen Absicherung der Quantifizierung wurde die relative Wiederfindungsrate für (Z)-Hex-3-enal (bezogen auf Heptan-2-ol) durch Versuche mit 10-fach erhöhten und 10-fach erniedrigten Substanzmengen bestätigt (Anhang, Tabelle 33). Die aus frischen Stachelbeeren gewonnenen Extrakte wurden jeweils innerhalb einer Woche der kapillargaschromatographischen Analyse unterzogen. Um auch in dieser Zeit unter den gegebenen Bedingungen die Stabilität von (Z)-Hex-3-enal zu gewährleisten, wurden zwei weitere Versuche durchgeführt. Einerseits wurde eine definierte Menge (Z)-Hex-3-enal in Lösemittel (Diethylether/n-Pentan; 1/1)) über 100 Tage regelmäßig kapillargaschromatographisch analysiert. Andererseits wurden zwei mittels VHS aus Stachelbeeren gewonnene Extrakte innerhalb von 15 Tagen mehrfach analysiert. In beiden Fällen lag die relative Standardabweichung der Konzentration an (Z)-Hex-3-enal unter 6 %. Die Stabilität von (Z)-Hex-3-enal in dem verwendeten Lösemittel sowie die Stabilität der Extrakte unter den gegebenen Bedingungen war somit innerhalb des Zeitraums der Analysen gewährleistet.

Ester

Ester sind primäre Aromastoffe und existieren aufgrund von biogenetischen Prozessen bereits im intakten Gewebe der Pflanze. In den Stachelbeeren-Extrakten dominierten vor allem kurzkettige Ester, hauptsächlich gesättigte und ungesättigte Buttersäureester. Methyl- und Ethylester sind weit verbreitet und wurden in zahlreichen Früchten nachgewiesen (Werkhoff et al. 1998, Young et al. 1995, Schreier 1980, Hakala et al. 2002). Das Konzentrationsverhältnis von Methyl- und Ethylestern liegt jedoch in den meisten Früchten auf der Seite der Ethylester oder es existiert kein nennenswerter Konzentrationsunterschied. Das dominierende Vorkommen von Methylestern, wie es in Stachelbeeren nachgewiesen wurde, war bisher nur für wenige Früchte, wie beispielsweise Ananas (Takeoka et al. 1989), bekannt.

Ergebnisse und Diskussion

Variabilität der Zusammensetzung des flüchtigen Profils

Durch die Analyse zahlreicher Chargen wurde ein umfangreiches Bild der natürlichen Variabilität der Zusammensetzung des flüchtigen Profils frischer Stachelbeeren erhalten. Das hierzu verwendete Probenmaterial ließ sich in zwei Gruppen teilen. Einerseits wurden sieben unterschiedliche Sorten Stachelbeeren analysiert: Ribes uva crispa var. sativum Invicta (grün), Frühe Rote (orange), Rote Eva (rot), Tixia (rot), Xenia (rot), Späte Spitze (grün) und Bekay (rot). Die Beeren wurden im genussreifen Zustand geerntet, der durch eine Mitarbeiterin der LVWO Weinsberg anhand einer visuellen und sensorischen Beurteilung sowie eines Drucktests festgestellt wurde. Das Erntedatum dieser Beeren war bekannt und sie wurden innerhalb von zwei Tagen nach der Ernte extrahiert. Zusätzlich erfolgte die Extraktion von sieben Chargen der gleichen Sorte (Achilles). Da diese Beeren aus dem kommerziellen Handel bezogen wurden, war das Erntedatum nicht bekannt. Die Aufarbeitung dieser Früchte erfolgte innerhalb von zwei Tagen nach Kauf der Ware. Abbildung 5 zeigt die prozentuale Zusammensetzung der Stoffklassen in den 14 Chargen Stachelbeeren.

C6-Komponenten und Ester dominieren in allen untersuchten Chargen, ihre Verteilung variiert jedoch drastisch. Innerhalb der sieben unterschiedlichen Sorten, die alle im genussreifen Zustand geerntet wurden, erstreckt sich der Anteil an Estern von 1 % (Invicta) bis 26 % (Bekay) und der Anteil der C6-Komponenten von 73 % (Bekay) bis 98 % (Invicta). Diese Variationen sind innerhalb der Sorte Achilles mit einem Esteranteil von 5 % bis 56 % und einem Anteil an C6-Komponenten von 40 % bis 93 % sogar noch größer.

Ergebnisse und Diskussion

A) Invicta Frühe Rote Rote Eva Tixia

Summe: 17.9 mg/kg Summe: 22.9 mg/kg Summe: 13.1 mg/kg Summe: 24.4 mg/kg Xenia Späte Spitze Bekay

Ester

C6-KomponentenC6- Summe: 28.9 mg/kg Summe: 15.4 mg/kg Summe: 19.3 mg/kg

Ketone B) 25.07.11 12.07.10 20.07.11 1 Alkohole

Aldehyde

Summe: 13.0 mg/kg Summe: 5.8 mg/kg Summe: 7.9 mg/kg 26.07.11 05.08.10 25.08.10 16.07.12

Summe: 10.6 mg/kg Summe: 4.6 mg/kg Summe: 3.8 mg/kg Summe: 10.9 mg/kg

Abbildung 5: Verteilung der Stoffgruppen A) in sieben unterschiedlichen Stachelbeeren-Sorten zum Zeitpunkt der Reife und B) in sieben Chargen der Sorte Achilles (Kaufdatum angegeben)

Als nicht klimakterische Früchte können Stachelbeeren nicht vor dem Erreichen der optimalen Reife geerntet werden, um die Reifung anschließend im Lager durchzuführen. Da Stachelbeeren aber sehr druckempfindlich sind, werden sie dennoch häufig vor dem Zeitpunkt der Vollreife geerntet, um unbeschadet im Handel angeboten werden zu können. Die im Rahmen dieser Arbeit analysierten Stachelbeeren der roten Sorte Achilles, die im Handel erworben wurden, waren stets unterschiedlich stark gerötet und wiesen häufig noch grüne Stellen auf. Da Änderungen des flüchtigen Profils in Abhängigkeit von der Reife für viele Früchte bekannt sind, wird dieser Einfluss in einem späteren Kapitel detailliert behandelt (siehe 4.1.1.5). Aber auch die unterschiedlich lange Lagerung der Beeren vor dem Erwerb kann zu den Differenzen beigetragen haben. Neben der Stoffklassenverteilung spiegelt sich die Variabilität des flüchtigen Profils auch auf der Ebene der einzelnen Verbindungen wider. Dies ist in Tabelle 13 und Tabelle 12 dargestellt.

Ergebnisse und Diskussion

Tabelle 12: Konzentrationen der C6-Komponenten und Ester in sieben unterschiedlichen Stachelbeersorten nach VHS-Isolierung

Bekay Späte Spitze Xenia Tixia Rote Eva Frühe Rote Invicta

C6-Komponenten [µg/kg] (Z)-Hex-3-enal 11188 ± 2541 8192 ± 1595 21014 ± 2127 16868 ± 1177 8010 ± 1559 20559 ± 2530 14436 ± 1689 (E)-Hex-2-enal 1441 ± 299 3431 ± 273 1247 ± 152 1666 ± 65 2952 ± 222 982 ± 34 1845 ± 175 (Z)-Hex-3-en-1-ol 862 ± 30 496 ± 74 398 ± 59 460 ± 35 507 ± 98 282 ± 27 761 ± 178 Hexanal 123 ± 20 105 ± 19 166 ± 7 207 ± 18 156 ± 29 174 ± 16 219 ± 42 (E)-Hex-2-en-1-ol 133 ± 50 202 ± 112 29 ± 10 64 ± 7 601 ± 166 26 ± 2 133 ± 17 (E)-Hex-3-enal 269 ± 79 41 ± 4 301 ± 91 719 ± 57 324 ± 49 111 ± 13 43 ± 2 (Z)-Hex-2-enal 14 ± 4 18 ± 1 26 ± 5 24 ± 3 16 ± 2 21 ± 1 24 ± 2 Hexan-1-ol 33 ± 8 15 ± 2 7 ± 2 15 ± 3 39 ± 10 6 ± 6 23 ± 5 (E)-Hex-3-en-1-ol 27 ± 7 n.d.a n.q.b 11 ± 5 22 ± 8 n.q. n.q. ∑ 14090 12500 23189 20035 12628 22160 17486 Ester Methylbutanoat 2984 ± 323 1811 ± 350 4609 ± 642 3740 ± 418 45 ± 9 347 ± 118 48 ± 21 Ethylbutanoat 1557 ± 312 475 ± 163 651 ± 31 195 ± 66 62 ± 29 3 ± 4 10 ± 11 Methyl-(E)-but-2-enoat 191 ± 50 85 ± 23 79 ± 4 47 ± 6 11 ± 1 n.d. n.d. Ethyl-(E)-but-2-enoat 175 ± 75 51 ± 21 44 ± 9 13 ± 8 17 ± 10 n.d. n.d. Methylhexanoat 36 ± 7 28 ± 2 61 ± 7 56 ± 3 n.q. 39 ± 13 3 ± 3 Ethylhexanoat 11 ± 2 2 ± 2 6 ± 1 n.q. n.q. n.d. n.q. Methyloctanoat 8 ± 3 18 ± 4 22 ± 2 19 ± 1 14 ± 7 62 ± 20 6 ± 3 Benzylacetat n.d. n.d. n.d. n.d. 36 ± 7 n.d. n.d. Methylbenzoat n.d. 7 ± 0 24 ± 12 13 ± 2 11 ± 7 4 ± 1 13 ± 3 Methyldecanoat n.q. n.q. 4 ± 0 6 ± 0 4 ± 1 8 ± 2 2 ± 3 Ethylbenzoat n.d. n.q. 4 ± 1 n.d. n.q. n.d. n.d. Ethyloctanoat n.q. n.d. n.d. n.d. n.q. n.d. 4 ± 1 ∑ 4960 2495 5504 4088 211 463 86 a: Nicht identifizierbar (n.d.), da die Konzentration unterhalb der Bestimmungsgrenze (0,6 g/kg) lag. b: Nicht quantifizierbar (n.q.), da die Konzentration unterhalb der Nachweisgrenze (1,7 µg/kg) lag.

Ergebnisse und Diskussion

Tabelle 13: Konzentrationen der C6-Komponenten und Ester in sieben Chargen Stachelbeeren der Sorte Achilles nach VHS-Isolierung

Kaufdatum: 16.07.12 26.07.11 25.07.11 20.07.11 25.08.10 05.08.10 12.07.10

C6-Komponenten [µg/kg] (Z)-Hex-3-enal 1783 ± 449 5578 ± 785 11045 ± 358 4919 ± 1285 1128 ± 81 1279 ± 410 2712 ± 335 (E)-Hex-2-enal 2302 ± 292 891 ± 88 728 ± 117 1401 ± 502 509 ± 157 1046 ± 360 1818 ± 29 (Z)-Hex-3-en-1-ol 113 ± 20 127 ± 52 195 ± 45 177 ± 14 71 ± 11 167 ± 89 327 ± 64 (E)-Hex-3-enal 50 ± 13 60 ± 8 62 ± 23 91 ± 36 25 ± 7 46 ± 21 62 ± 4 (E)-Hex-2-en-1-ol 92 ± 25 25 ± 3 15 ± 4 71 ± 30 66 ± 8 179 ± 105 362 ± 70 Hexanal 38 ± 7 32 ± 4 52 ± 4 46 ± 11 12 ± 1 21 ± 6 35 ± 6 (Z)-Hex-2-enal 7 ± 2 7 ± 1 12 ± 1 9 ± 1 n.q. 4 ± 2 14 ± 3 Hexan-1-ol 6 ± 5 n.q. n.q. 6 ± 2 n.d. 7 ± 4 15 ± 4 (E)-Hex-3-en-1-ol n.q.a n.d.b n.d. 6 ± 0 n.d. 7 ± 4 14 ± 5 ∑ 4392 6765 12108 6726 1811 2755 5359 Ester Methylbutanoat 3810 ± 551 2523 ± 846 387 ± 129 628 ± 132 1276 ± 137 858 ± 414 166 ± 50 Methyl-(E)-but-2-enoat 889 ± 145 232 ± 45 28 ± 3 68 ± 31 267 ± 34 293 ± 18 17 ± 4 Ethylbutanoat 846 ± 104 707 ± 151 112 ± 12 73 ± 19 47 ± 35 136 ± 55 48 ± 31 Ethyl-(E)-but-2-enoat 514 ± 100 126 ± 35 12 ± 4 17 ± 7 22 ± 17 120 ± 60 8 ± 6 Methylhexanoat 54 ± 9 48 ± 9 20 ± 2 22 ± 5 26 ± 5 31 ± 6 13 ± 3 Ethylhexanoat 8 ± 0 7 ± 2 n.q. n.q. n.d. 4 ± 4 3 ± 0 Methyloctanoat 7 ± 1 7 ± 2 21 ± 1 24 ± 1 10 ± 1 12 ± 4 11 ± 2 Methylbenzoat 4 ± 1 n.d. n.d. 2 ± 4 n.d. 4 ± 2 5 ± 1 Benzylacetat 3 ± 3 n.d. n.d. 4 ± 0 n.d. n.q. n.d. Ethyloctanoat n.d. n.d. n.q. n.d. n.d. n.q. n.d. Methyldecanoat n.d. n.d. 4 ± 1 4 ± 1 n.q. 3 ± 1 3 ± 0 Ethylbenzoat n.q. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. ∑ 6135 3650 584 842 1648 1461 274 a: Nicht quantifizierbar (n.q.), da die Konzentration unterhalb der Bestimmungsgrenze (1,7 µg/kg) lag. b: Nicht identifizierbar (n.d.), da die Konzentration unterhalb der Nachweisgrenze (0,6 g/kg) lag.

Ergebnisse und Diskussion

In allen untersuchten Chargen wurden (Z)-Hex-3-enal, (E)-Hex-2-enal und Methylbutanoat als Hauptkomponenten bestätigt, die Konzentrationen der einzelnen Verbindungen sowie der Summe an flüchtigen Komponenten variierten jedoch stark. Die Konzentrationen für (Z)-Hex- 3-enal erstrecken sich beispielsweise von 8010 µg/kg (Rote Eva) bis 21014 µg/kg (Xenia) und die von Methylbutanoat von 45 µg/kg (Rote Eva) bis 4609 µg/kg (Xenia). Aber abgesehen von je einer Ausnahme (Achilles vom 16.07.12 bzw. Rote Eva) blieb das Muster innerhalb der Gruppen der Ester und der C6-Komponenten konstant: (I) Methylester dominierten über Ethylester und (II) (Z)-Hex-3-enal stellte die Haupt-C6-Komponente dar, gefolgt von (E)-Hex-2-enal sowie den korrespondierenden Alkoholen (Z)-Hex-3-en-1-ol und (E)-Hex-2-en-1-ol. Die direkt nach der Ernte erhaltenen Stachelbeeren zeigten außerdem eine generell höhere Konzentration an (Z)-Hex-3-enal im Vergleich zu den aus dem Handel erworbenen Beeren (8010 – 21014 µg/kg für verschiedene Sorten bzw. 1128 – 11045 µg/kg für Achilles). Dies ist vermutlich auf die unterschiedliche Lagerdauer der Früchte zurückzuführen. Die bereits früher untersuchten Theaspirane I und II (Humpf et al. 1992) wurden nur in Beeren der Sorte Invicta, Tixia und Späte Spitze, sowie in zwei weiteren Chargen unbekannter Sorte, nachgewiesen.

4.1.1.3 Einfluss der enzymkatalysierten Reaktionen auf das Spektrum von

C6-Verbindungen

C6-Komponenten werden nach der Zerstörung von pflanzlichem Gewebe durch enzymkatalysierte Reaktionen aus ungesättigten Fettsäuren gebildet. Das originär entstehende Spektrum kann jedoch sehr schnell durch nachfolgende Reaktionen verändert werden.

Da die Gruppe der C6-Verbindungen einen großen Teil des flüchtigen Spektrums von frischen Stachelbeeren ausmacht, sollte untersucht werden, inwiefern das nach Zerkleinern freigesetzte Spektrum an C6-Verbindungen nachfolgenden Modifikationen unterliegt. Um die Dynamik der Bildung innerhalb eines bestimmten Zeitfensters zu verfolgen, wurde die Isolierung mittels VHS zusätzlich unter enzyminhibierenden Bedingungen durchgeführt. Die Inhibierung erfolgte zu unterschiedlichen Zeitpunkten (30, 60, 90 und 180 Sekunden) nach der Homogenisierung und die Resultate wurden mit dem C6-Spektrum unter nicht inhibierten Bedingungen derselben Charge verglichen. Verschiedene Varianten der Enzyminhibierung wurden bereits erfolgreich bei Früchten und Gemüsen eingesetzt (Iwaoka et al. 1994, Girard und Kopp 1998, Bartley und Schwede

1989). Calciumchloridlösung (CaCl2-Lösung) zeigte sich für Tomaten am besten geeignet, da im Gegensatz zu Natriumchloridlösung keine Isomerisierung von (Z)-Hex-3-enal zu (E)-Hex- 2-enal für eine Extraktionszeit von bis zu drei Stunden beobachtet wurde (Buttery et al. 52

Ergebnisse und Diskussion

1987). In Anlehnung daran wurde gesättigte CaCl2-Lösung als Inhibitor für die Untersuchung der Stachelbeeren gewählt. Für einen zweiten Ansatz des gleichen Versuchs wurde die Flüssig-Flüssig-Extraktion (LLE) als Extraktionsmethode gewählt. Beide Versuche lieferten ein fast identisches Bild. Die Ergebnisse sind in Abbildung 6 dargestellt:

VHS LLE

16 3

(Z)-Hex-2-enal (Z)-Hex-2-enal 12

(E)-Hex-2-en-1-ol2 (E)-Hex-2-en-1-ol 10 (E)-Hex-3-enal (E)-Hex-3-enal 8

[mg/kg] (Z)-Hex-3-en-1-ol[mg/kg] (Z)-Hex-3-en-1-ol 6 (E)-Hex-2-enal1 (E)-Hex-2-enal 4 (Z)-Hex-3-enal (Z)-Hex-3-enal 2

0 0 30 60 90 180 2 30 60 90 180 24 Sek Std Sek Std

Abbildung 6: Durch Vakuum Headspace Extraktion und Flüssig-Flüssig-Extraktion ermittelte Konzentrationen der C6-Komponenten in Stachelbeeren: Enzyminhibierung nach unterschiedlichen Zeitintervallen (30, 60, 90 und 180 Sekunden) sowie ohne Inhibierung (2 bzw. 24 Stunden Extraktionszeit)

Erwartungsgemäß nahm die Summe an C6-Komponenten mit längerer Enzymaktivität zu. Außerdem konnte ein konsistentes Übergewicht an (Z)-Hex-3-enal und (E)-Hex-2-enal festgestellt werden. Sogar nach zwei (VHS) bzw. 24 (LLE) Stunden Extraktionszeit ohne Inhibierung der Enzyme wurden keine starken Veränderungen in der prozentualen Verteilung der einzelnen C6-Komponenten beobachtet. Das Profil blieb über den gesamten Zeitraum nahezu konstant. Allgemein war nach LLE-Extraktion aber ein etwas größerer Anteil an (E)-Hex-2-enal festzustellen. Dieser ist vermutlich entweder durch die längere Extraktionsdauer oder durch die längere Zeitspanne zwischen Homogenisierung und Start der Extraktion bei LLE (ca. 30 Minuten vs. 10 Minuten bei VHS) bedingt. Ursache für die unterschiedlichen Summenkonzentrationen an C6-Verbindungen nach VHS- bzw. LLE- Isolierung ist die Verwendung verschiedener Chargen Stachelbeeren.

4.1.1.4 Chirale Verbindungen in Stachelbeeren

Oct-1-en-3-ol stellt die einzige chirale Verbindung dar, die in Stachelbeeren in höheren Konzentrationen (> 50 µg/kg) vorkommt (Tabelle 9). In natürlichen Matrices liegen chirale Verbindungen meist mit hoher optischer Reinheit vor. Eine hohe optische Reinheit zugunsten 53

Ergebnisse und Diskussion des (R)-Enantiomers wurde für Oct-1-en-3-ol bereits in verschiedenen Speisepilzen (Freytag und Ney 1968, Zawirska-Wojtasiak 2004) sowie in Kornelkirschen und im Feuerdorn (Dolezal et al. 2003) nachgewiesen. Als Ursache der hohen optischen Reinheit ist der enzymatische Bildungsweg der Verbindung zu sehen, der in Champignons (Psalliota bispora) weitgehend aufgeklärt ist: (R)-Oct-1-en-3- ol wird nach der Zerstörung des Pilzgewebes aus Linolsäure, der Hauptfettsäure der Champignonlipide (Holtz und Schisler 1971), gebildet (Tressl et al. 1982). Nach dem von Wurzenberger und Grosch (1984) postulierten Bildungsweg findet die Spaltung von Linolsäure zu (R)-Oct-1-en-3-ol und 10-oxo-trans-8-Decensäure über das Zwischenprodukt 10-Hydroperoxylinolsäure statt. In einer weiteren Arbeit (Grosch und Wurzenberger 1985) wurde deren absolute Konfiguration als (S)-10-Hydroperoxylinolsäure bestimmt. Dies wurde auch von Matsui et al. (2003) und von Akakabe et al. (2005) bestätigt. Der vorgeschlagene Bildungsweg ist in Abbildung 7 schematisch dargestellt.

COOH (1)

Lipoxygenase

HOO COOH (2)

Hydroperoxidlyase

OH COOH + OHC (3) (4)

Abbildung 7: Postulierter Bildungsweg für (R)-Oct-1-en-3-ol in Pilzen: (1) Linolsäure; (2) (S)-10-Hydroperoxylinolsäure; (3) (R)-Oct-1-en-3-ol; (4) 10- Oxo-8-decensäure (nach Akakabe et al. (2005))

Ziel dieser Untersuchung war es, die in Stachelbeeren vorliegende Enantiomerenverteilung von Oct-1-en-3-ol zu bestimmen, um auf eine enzymatische oder autoxidative Bildung der Substanz schließen zu können. Durch Autoxidation entstandenes Oct-1-en-3-ol liegt in nahezu racemischem Verhältnis der beiden Enantiomere vor, wie am Beispiel von autoxidiertem und gelagertem Sojaöl gezeigt wurde (Freytag und Ney 1968). Die Untersuchung der Enantiomerenverhältnisse von Oct-1-en-3-ol aus Stachelbeeren erfolgte mit Hilfe der Multidimensionalen Gaschromatographie (MDGC). Diese Methode ermöglicht eine direkte Untersuchung von chiralen Verbindungen, wobei die Trennung der flüchtigen

Ergebnisse und Diskussion

Fraktion der Stachelbeeren an einer achiralen Phase und die nachfolgende Stereodifferenzierung ausgewählter Substanzen an einer chiralen Phase durchgeführt wurden (Bedingungen siehe 3.2.4). Wie aus Abbildung 8 ersichtlich ist, konnten unter Verwendung von 2,3-di-O-acetyl-6-O-tert- butyldimethylsilyl-β-cyclodextrin als chiraler stationärer Phase die Enantiomere von Oct-1-en- 3-ol getrennt werden. Die Bestimmung der Elutionsreihenfolge erfolgte mit Hilfe eines aus Champignons gewonnen VHS-Extraktes.

[mV] [mV] (S) (R) (S) (R)

(a) (b) (R) (R)

36 44 39 44 [min] [min]

Abbildung 8: Enantioselektive MDGC-Analyse von Oct-1-en-3-ol (MD-GC-Bedingungen siehe Material und Methoden): a) einer Referenz (oben) und eines VHS-Extraktes frischer Stachelbeeren (unten); b) einer Referenz (oben) und eines VHS-Extraktes tiefkühlgelagerter Stachelbeeren (unten)

Es wurden die Enantiomerenverhältnisse in mittels VHS gewonnenen Extrakten aus unterschiedlichen Stachelbeersorten, in unterschiedlichen Reifestadien sowie vor bzw. nach Tiefkühllagerung untersucht. Wie die in Tabelle 14 dargestellten Ergebnisse zeigen, lag stets das (R)-Enantiomer in hoher optischer Reinheit vor. Lediglich nach achtmonatiger Gefrierlagerung zeigte sich eine leichte Erhöhung des Anteils des (S)-Enantiomers (bis 5 %), welche auf eine autoxidative Bildung zurückzuführen ist.

Ergebnisse und Diskussion

Tabelle 14: Enantiomerenzusammensetzungen von Oct-1-en-3-ol in VHS-Extrakten aus Stachelbeeren

Enantiomerenzusammensetzung [%] (S) (R) (S) (R)

Frischen Stachelbeeren: Verschiedene Reifestadien: Achilles <1 > 99 Bekay unreif <1 > 99 Xenia <1 > 99 Bekay reif <1 > 99 Tixia <1 > 99 Bekay überreif <1 > 99 Bekay <1 > 99 Xenia unreif <1 > 99 Späte Spitze <1 > 99 Xenia reif <1 > 99 Rote Eva <1 > 99 Xenia überreif <1 > 99 Unbekannt 1 <1 > 99 Unbekannt 2 <1 > 99 Nach Tiefkühllagerung (acht Monate): Frühe Rote <1 > 99 Achilles 5 95 Mucurines <1 > 99 Unbekannt 1 <1 > 99 Invicta <1 > 99 Invicta 1 99

4.1.1.5 Einfluss der Reife

Aufgrund der Tatsache, dass nicht nur die flüchtigen Profile verschiedener Stachelbeersorten stark variierten, sondern auch innerhalb der Sorte Achilles starke Unterschiede festgestellt wurden und reifeabhängige Änderungen des flüchtigen Profils für verschiedene Früchte bereits bekannt sind (Wan et al. 1999, Wyllie et al. 1996, Paterson et al. 1991, Serradilla et al. 2010, Mehinagic et al. 2006, Blekas et al. 1994, Zhang et al. 2010, Sinuco et al. 2010, Buttery 1993), wurden drei unterschiedliche Sorten Stachelbeeren zu drei unterschiedlichen Reifezeitpunkten untersucht: unreif, (genuss-) reif und überreif. Die Farbe aller untersuchten Beeren änderte sich von grün (unreif) über hellrot (reif) zu dunkelrot (überreif), wie in Abbildung 9 beispielhaft für die Sorte Bekay gezeigt ist.

unreif reif überreif

Abbildung 9: Stachelbeeren der Sorte Bekay in unterschiedlichen Reifestadien

Während der Reifung der Früchte traten zwei auffällige Veränderungen ein: (I) Die Menge der sekundär gebildeten C6-Komponenten sank: Bei Xenia von 97 auf 52 %, bei Bekay von 94 auf 31 % und bei Achilles von 93 auf 63 %. (II) Die Menge der primär gebildeten Ester

Ergebnisse und Diskussion nahm hingegen stark zu: Bei Xenia von 1 auf 47 %, bei Bekay von 3 auf 65 % und bei Achilles von 4 auf 34 %. Die Konzentrationsänderungen der einzelnen Komponenten der beiden Stoffgruppen sind in Abbildung 10 dargestellt.

Xenia Bekay Achilles Xenia Bekay Achilles

25 Ester C6-Komponenten [mg/kg] (Z)-Hex-3-enal Ethylbutanoat 20 (E)-Hex-2-enal Methylbutanoat (Z)-Hex-3-en-1-ol (E)-2-Ethylbut-2-enaot 15 Hexanal (E)-Methylbut-2-enoat (E)-Hex-3-enal 10 Ethylpropionat (E)-Hex-2-en-1-ol

(Z)-Hex-2-enal Methylhexanoat 5 Hexan-1-ol Ethylhexanaot

(E)-Hex-3-en-1-ol 0 A B C A B C A B C A B C A B C A B C

Abbildung 10: Konzentrationen der C6-Komponenten und Ester in drei Stachelbeersorten zu unterschiedlichen Reifezeitpunkten: A: unreif, B: reif, C: überreif.

Die Abnahme der Summe an C6-Komponenten wurde hauptsächlich durch die starke Abnahme von (Z)-Hex-3-enal verursacht. Die Konzentrationen der meisten anderen

C6-Komponenten nahmen sogar leicht zu. Auch Änderungen innerhalb der prozentualen

Verteilung der C6-Komponenten lassen vermuten, dass es mit zunehmender Reife der Frucht zu Änderungen der Aktivität der an der Bildung der C6-Komponenten beteiligten Enzyme kommt: Die Aktivität der Isomerasen und Alkoholdehydrogenasen scheint zuzunehmen, woraus höhere prozentuale Anteile von (E)-Hex-2-enal, (E)-Hex-3-enal, (Z)-Hex-3-en-1-ol und (E)-Hex-2-en-1-ol resultieren. Die Ursachen für reifeabhängige Änderungen des flüchtigen Profils einer Frucht können sowohl veränderte Enzymaktivitäten als auch eine veränderte Substratverfügbarkeit sein (Wyllie et al. 1996, Leone et al. 2006, Riley et al. 1996). Die verminderte Bildung von (Z)-Hex-3-enal könnte also einerseits durch geringere Konzentrationen des Substrates Linolensäure, andererseits durch eine verminderte Aktivität der an der Bildung beteiligten Lipoxygenase oder Hydroperoxidlyase verursacht werden. Reifeabhängige Änderungen der Lipoxygenase- und Hydroperoxidlyaseaktivität wurden bereits in Erdbeeren festgestellt (Pérez et al. 1998).

Ergebnisse und Diskussion

Innerhalb der Gruppe der Ester gibt es kaum reifeabhängige Änderungen in der prozentualen Verteilung. Der Anteil an Methylbutanoat erreicht im reifen Zustand ein Maximum und nimmt im überreifen Zustand wieder leicht ab. Zusätzlich wurden reifeabhängige Abnahmen der Konzentrationen der ebenfalls enzymatisch gebildeten Verbindungen Pent-1-en-3-ol und (R)-Oct-1-en-3-ol sowie Zunahmen für Pentan-2-on, Acetophenon und 2-Methylpropanol festgestellt. Mit der Reife zunehmende Esterkonzentrationen wurden bereits für viele andere Früchte gezeigt (Wan et al. 1999, Fellman und Mattheis 1995, Mehinagic et al. 2006). Es steigt der katabole Stoffwechsel der Frucht und durch verstärkte Glykolyse oder auch β-Oxidation steht vermehrt Substrat zur Estersynthese bereit. Bezüglich reifeabhängiger Änderungen des

C6-Profils wurden für verschiedene Früchte unterschiedliche Verläufe beobachtet: Während in Pfirsichen, Äpfeln und kolumbianischer Guave mit zunehmender Reife Abnahmen für die meisten C6-Komponenten festgestellt wurden, wurden in Kiwis keine signifikanten Änderungen, in Tomaten und Süßkirschen aber sogar Zunahmen detektiert (Wan et al. 1999, Serradilla et al. 2010, Mehinagic et al. 2006, Blekas et al. 1994, Zhang et al. 2010, Sinuco et al. 2010, Buttery 1993).

4.1.1.6 Einfluss der Tiefkühllagerung

Aufgrund der bekannten Tatsache, dass sich der Geruch von Lebensmitteln durch die Zubereitung oder Lagerung stark verändern kann (Siegmund et al. 2001, Perez-Cacho und Rouseff 2008, Kumazawa und Masuda 2001), wurden zusätzlich zur Analyse der frischen Früchte fünf Chargen Stachelbeeren nach Tiefkühllagerung untersucht. Das Aroma der aufgetauten Stachelbeeren unterschied sich stark vom dem der frischen Früchte. Die frische, grüne Note war nahezu komplett verschwunden und stark fruchtig-butterige sowie muffig- ranzige Noten überwogen. Durch die Analyse von zwei Chargen Achilles, zwei Chargen einer unbekannten, roten Sorte und einer Charge Invicta vor und nach einer Gefrierlagerung von acht Monaten wurden die Änderungen im flüchtigen Profil analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 15 zusammengefasst.

Ergebnisse und Diskussion

Tabelle 15: Nach VHS bestimmte Konzentrationen der flüchtigen Verbindungen aus frischen und tiefkühlgelagerten (acht Monate) Stachelbeeren unterschiedlicher Sorten

Unbekannt, rot Unbekannt, rot Achilles Achilles Invicta Frisch Gefroren Frisch Gefroren Frisch Gefroren Frisch Gefroren Frisch Gefroren [µg/kg]a C6-Komponenten: (Z)-Hex-3-enal 7511 ± 2302 20 ± 6 2169 ± 675 8 ± 1 1279 ± 410 8 ± 2 5578 ± 785 n.d.b 5134 ± 873 n.d. (E)-Hex-2-enal 1853 ± 600 29 ± 11 1856 ± 424 15 ± 4 1046 ± 360 12 ± 2 891 ± 88 29 ± 2 2167 ± 201 64 ± 14 (Z)-Hex-3-en-1-ol 376 ± 89 18 ± 5 230 ± 61 6 ± 3 167 ± 89 5 ± 1 172 ± 52 14 ± 2 273 ± 44 43 ± 1 (E)-Hex-2-en-1-ol 164 ± 135 13 ± 3 249 ± 121 7 ± 2 179 ± 105 7 ± 2 25 ± 3 11 ± 2 227 ± 46 34 ± 4 (E)-Hex-3-enal 112 ± 49 n.d. 59 ± 24 n.d. 46 ± 21 n.d. 60 ± 8 n.d. 27 ± 3 n.d. Hexanal 93 ± 31 125 ± 27 38 ± 7 82 ± 7 21 ± 6 82 ± 18 32 ± 4 123 ± 3 99 ± 2 200 ± 56 (Z)-Hex-2-enal 14 ± 2 n.d. 14 ± 3 n.d. 4 ± 2 n.d. 7 ± 1 n.d. 12 ± 1 n.d. Hexan-1-ol 11 ± 4 17 ± 3 11 ± 5 12 ± 3 7 ± 4 12 ± 4 n.q.c 15 ± 4 14 ± 1 24 ± 7 (E)-Hex-3-en-1-ol 10 ± 8 n.d. n.d. n.d. 7 ± 4 n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.

Ester: Methylbutanoat 3804 ± 1433 3027 ± 1272 213 ± 69 80 ± 11 858 ± 414 349 ± 53 2523 ± 846 418 ± 68 1241 ± 848 804 ± 2 Ethylbutanoat 831 ± 440 210 ± 104 78 ± 6 41 ± 8 136 ± 55 41 ± 11 707 ± 151 228 ± 50 349 ± 214 438 ± 80 (E)-2-Methylbut-2-enoat 192 ± 131 109 ± 63 36 ± 12 5 ± 2 100 ± 18 217 ± 58 232 ± 45 46 ± 8 21 ± 7 20 ± 2 (E)-2-Ethylbut-2-enoat 138 ± 81 21 ± 14 29 ± 1 4 ± 1 120 ± 60 22 ± 8 126 ± 35 35 ± 8 15 ± 2 31 ± 8 Methylhexanoat 76 ± 11 1 ± 1 10 ± 2 3 ± 0 31 ± 6 3 ± 0 48 ± 9 4 ± 3 22 ± 6 8 ± 2 Methyloctanoat 17 ± 3 n.d. 3 ± 2 n.d. 12 ± 4 n.d. 7 ± 2 n.d. 11 ± 2 2 ± 2 Ethylhexanoat 10 ± 2 n.d. n.q. n.d. 4 ± 4 n.d. 7 ± 2 n.d. 4 ± 1 n.d.

Aldehyde: Prop-2-enal 13 ± 0 n.d. 5 ± 3 n.d. 4 ± 1 n.d. n.q. n.d. n.d. n.d. Nonanal 3 ± 1 7 ± 1 4 ± 2 7 ± 0 3 ± 0 9 ± 2 n.q. 8 ± 2 4 ± 1 10 ± 1 (E)-Hept-2-enal n.d. 6 ± 1 n.d. 10 ± 3 n.d. 6 ± 3 n.q. 34 ± 13 n.q. 83 ± 61

Alkohole: (R)-Oct-1-en-3-ol 85 ± 16 131 ± 14 76 ± 8 88 ± 11 61 ± 21 50 ± 4 32 ± 6 113 ± 17 122 ± 11 270 ± 13 Pentanol 5 ± 2 93 ± 14 9 ± 3 93 ± 31 3 ± 1 69 ± 42 3 ± 3 80 ± 38 5 ± 1 113 ± 28 (Z)-2-Pent-2-en-1-ol 12 ± 2 n.d. n.d. n.d. n.d. 4 ± 3 9 ± 1 n.d. 12 ± 1 7 ± 3 Pentan-2-ol 6 ± 1 3 ± 1 4 ± 1 1 ± 0 21 ± 21 13 ± 3 30 ± 23 5 ± 4 n.d. n.q. Pent-1-en-3-ol 5 ± 2 3 ± 0 3 ± 1 3 ± 1 3 ± 1 3 ± 1 10 ± 2 4 ± 1 13 ± 5 6 ± 3

Ergebnisse und Diskussion

Unbekannt, rot Unbekannt, rot Achilles Achilles Invicta Frisch Gefroren Frisch Gefroren Frisch Gefroren Frisch Gefroren Frisch Gefroren [µg/kg]a Ketone: Acetophenon 32 ± 11 22 ± 5 49 ± 7 22 ± 1 121 ± 39 97 ± 22 10 ± 3 5 ± 1 31 ± 5 64 ± 10 Heptan-2-on n.d. 25 ± 4 n.d. 17 ± 11 n.d. 11 ± 1 6 ± 2 n.q. n.d. n.q. Oct-1-en-3-on n.d. 4 ± 1 n.d. 3 ± 0 n.d. 4 ± 1 n.d. 9 ± 3 n.d. 25 ± 18 6-Methylhept-5-en-2-on n.d. 3 ± 2 n.d. 7 ± 5 n.d. 5 ± 3 n.d. 17 ± 7 n.d. 17 ± 8 a: Mittelwert ± Standardabweichung. b: nicht identifizierbar (n.d.), da die Konzentration unterhalb der Bestimmungsgrenze (0,6 g/kg) lag. c: nicht quantifizierbar (n.q.), da die Konzentration unterhalb der Nachweisgrenze (1,7 µg/kg) lag.

Ergebnisse und Diskussion

Den stärksten Einfluss hatte das Tiefkühlen auf die aus Linolensäure gebildeten

C6-Komponenten. Nach Gefrierlagerung waren in den Stachelbeeren nur sehr geringe Mengen an ungesättigten Alkoholen und Aldehyden nachweisbar. Die Konzentrationen der aus Linolsäure entstehenden Verbindungen Hexanol, Hexanal und (R)-Oct-1-en-3-ol waren hingegen sogar erhöht. Aufgrund der optischen Reinheit (siehe 4.1.1.4) kann eine autoxidative Bildung von (R)-Oct-1-en-3-ol ausgeschlossen werden. In Bezug auf die Ester wurde in den roten Stachelbeeren eine Abnahme der höher konzentrierten Verbindungen Methyl-, Ethylbutanoat, (E)-Methyl-, (E)-Ethylbut-2-enoat und Methyl-, Ethylhexanoat festgestellt. Diese Änderungen wurden von einem leichten Konzentrationsanstieg der Autoxidationsprodukte ungesättigter Fettsäuren, wie Nonanal, (E)-2-Hept-2-enal, Heptan-2-on, 6-Methylhept-5-en-2-on und Oct-1-en-3-on, begleitet. Außerdem kam es in allen untersuchten Chargen zu einem starken Anstieg der Konzentration von Pentanol, welches ein Nebenprodukt der alkoholischen Gärung darstellt. Die Esterkonzentrationen der frischen, grünen Stachelbeeren der Sorte Invicta zeigten starke Unterschiede. Nach Tiefkühllagerung wurde im Gegensatz zu den roten Früchten ein Anstieg der Konzentrationen von Ethylbutanoat, (E)-Methyl- und (E)-Ethylbut-2-enoat festgestellt. Ähnliche Gefrierexperimente wurden in den vergangenen Jahren für verschiedene Früchte durchgeführt. Bereits 1988 stellte Pfannhauser Unterschiede in der Zusammensetzung der flüchtigen Verbindungen frischer und tiefgekühlter Kiwis fest. Die Abnahme der

C6-Komponenten und Buttersäureester korrelierte mit einer Veränderung des Geruchseindruckes der Früchte (Pfannhauser 1988). Auch Douillard und Guichard (1990) sowie Schreier (1980) beobachteten eine Abnahme der Konzentrationen der

C6-Komponenten und kurzkettigen Ester bereits nach einmonatiger Gefrierlagerung von Erdbeeren.

4.1.2 Einfluss anderer Isolierungsverfahren

4.1.2.1 Einleitung

Die Isolierung der flüchtigen Verbindungen stellt einen kritischen Schritt in der Aromaanalyse dar. Dies führte zur Entwicklung vieler unterschiedlicher Methoden, deren Vor- und Nachteile bereits in zahlreichen Arbeiten diskutiert wurden (Guadayol et al. 1997, Werkhoff et al. 1998, Pennarun et al. 2002, Caldeira et al. 2007). Die eingesetzten Methoden können in unterschiedlichem Maße zu qualitativen und quantitativen Veränderungen des originären flüchtigen Spektrums des Ausgangsmaterials führen. Vergleichende Untersuchungen flüchtiger Inhaltsstoffe unter Einsatz verschiedener Isolierungstechniken wurden an verschiedenen Beispielen, wie Paprika (Guadayol et al. 1997), Passionsfrucht (Werkhoff et

Ergebnisse und Diskussion al. 1998) und der Rinde einer süd- und mittelamerikanischen Baumart (Tabebuia impetiginosa Martius ex DC, bekannt als „Taheebo“) (Park et al. 2004) durchgeführt. Sie zeigten, dass die Techniken hinsichtlich der Zusammensetzung der Extrakte signifikante Unterschiede aufwiesen. Bei der Wahl des Isolierungsverfahrens ist es wichtig die Methode dem Zweck der Analyse anzupassen (Caldeira et al. 2007). Zur Aromaanalyse eines Lebensmittels empfiehlt sich beispielsweise die Anwendung der schonenden Vakuum Headspace Analyse (VHS). Unter anderem am Beispiel von Passionsfrucht (Werkhoff et al. 1998), Rhabarber (Dregus und Engel 2003) und Austern (Pennarun et al. 2002) wurde gezeigt, dass mittels VHS erhaltene Extrakte den originären Geruch der Frucht bzw. des Lebensmittels wiedergeben. Eine weitere etablierte Technik zur Extraktion flüchtiger Verbindungen aus komplexen Lebensmitteln stellt die „Solvent assisted flavour evaporation“ (SAFE) dar (Engel et al. 1999). Unter Anwendung dieser Isolierungstechnik gelang es beispielsweise authenthische Extrakte aus Pinker Guave und Aprikose zu erhalten. Nach sensorischer und quantitativer Analyse der Extrakte konnten die typischen Aromanoten beider Früchte rekombiniert werden (Steinhaus et al. 2009, Greger und Schieberle 2007). Zur möglichst umfangreichen Charakterisierung der flüchtigen Bestandteile eines Lebensmittels sollten parallel mehrere Methoden eingesetzt und miteinander verglichen werden. Zur Isolierung der flüchtigen Komponenten aus Stachelbeeren sollten daher neben der bereits diskutierten VHS-Technik zwei weitere Methoden zum Einsatz kommen: die Flüssig-Flüssig-Extraktion (LLE) nach Kutscher Steudel (Wieland und Sucrow 1982) und die Headspace-Analyse (HS). Die beiden genannten Methoden stellen ebenfalls schonende Verfahren dar, da die Isolierung der flüchtigen Verbindungen ohne thermische Belastung des Untersuchungsmaterials abläuft. Es war folglich nicht mit der Bildung thermischer Artefakte zu rechnen, wie beispielsweise bei der Anwendung der Simultanen Destillation-Extraktion (SDE) unter atmosphärischem Druck.

4.1.2.2 Isolierung der flüchtigen Verbindungen mittels LLE

Während die Aufarbeitung mittels VHS zu Isolaten mit typisch grünem, an frische Stachelbeeren erinnernden Geruch führte, wiesen die durch LLE erhaltenen Extrakte neben einem grünen Charakter ein stärker stechendes und saures Aroma auf. Da sowohl flüchtige als auch weniger flüchtige Verbindungen mittels LLE extrahiert werden, konnten neben den bereits mittels VHS analysierten Verbindungen 19 weitere identifiziert bzw. zugeordnet werden: Ethyl-2-hydroxy-2-phenylacetat, ein weiterer Phthalsäureester*, Isopentyllaurat*, Linalylacetat, Dodecanol, Phenol*, 2-Phenylethylalkohol, α-Methylbenzylalkohol*, (Z)-Cineron*, β-Damscenon, Benzoesäure, Dodecansäure, 2-Ethylhexansäure, Hexadecansäure, 3-Hydroxybuttersäure, Pentansäure, Zimtsäure, Isobuttersäureanhydrid*

Ergebnisse und Diskussion und Dehydrodihydroionon* (*keine Referenz vorhanden; Zuordnung durch Abgleich des Massenspektrums mit Literaturdaten). Insgesamt wurden sechs Chargen Stachelbeeren parallel mittels VHS und LLE aufgearbeitet. Wie das beispielhafte Chromatogramm zeigt (Abbildung 11), waren in den LLE-Extrakten aus Stachelbeeren außerdem höherkettige Kohlenwasserstoffe enthalten. Aliphatische Kohlenwasserstoffe sind auch aus anderen Früchten, wie Aprikose (Takeoka et al. 1990), Sanddorn (Cakir 2004) und Kürbis (Kale und Laddha 2012) bekannt. Sie stellen biologisch stabile, weit verbreitete Komponenten dar, die endogen durch Decarboxylierung aus Fettsäuren gebildet werden (Iyer et al. 1998). Sie dienen vermutlich unter anderem dem Schutz der Pflanze vor Austrocknung und stellen eine Barriere gegen das Eindringen von Mikroorganismen dar (Kale und Laddha 2012). Ein anderer Ursprung der Kohlenwasserstoffe könnte aber auch in der Fruchtbehandlung der Stachelbeeren liegen, denn Paraffine (Gemische aus gereinigten, gesättigten aliphatischen Kohlenwasserstoffen) finden auch als Überzugsmittel bei Obst und Gemüse Anwendung (Eisenbrand et al. 2006).

Ergebnisse und Diskussion

20 5 15 30 39 48 IS 96

19 73 41 111

10 98 [mV]

85 69 83 90 A G I N 5 74 F H 24 E K 14 89 C 2 38 45 37 114 M O 105 46 118 D P 9 86 107 120 B Q 27 35 42 5253 58 63 66 82 87 116 55 103 106 119 124 0 0 20 40 60 80 Zeit [min]

Abbildung 11: Kapillargaschromatographische Trennung (DB-WAX) der mittels Flüssig-Flüssig-Extraktion aus Stachelbeeren (Achilles vom 05.08.10, Konzentrationen siehe Tabelle 16) isolierten flüchtigen Verbindungen (die angegebenen Nummern und Buchstaben entsprechen den Verbindungen in Tabelle 16; Bedingungen siehe Material und Methoden; IS: interner Standard Heptan-2-ol)

Ergebnisse und Diskussion

Die durch VHS- und LLE-Extraktion ermittelten Konzentrationen sind in Tabelle 16 für zwei beispielhafte Chargen gegenübergestellt. Die Quantifizierung mittels LLE erfolgte analog zur VHS-Analyse unter Verwendung eines internen Standards und unter Berücksichtigung von FID-Responsefaktoren sowie Wiederfindungsraten.

Tabelle 16: Konzentrationen der nach VHS und LLE quantifizierten Verbindungen aus zwei Chargen Stachelbeeren der Sorte Achilles

Nr.a Substanz RIb 05.08.10 20.07.11 VHS LLE VHS LLE [µg/kg]c

C6-Komponenten 39 (Z)-Hex-3-enal 1139 1279 ± 410 1201 ± 275 4919 ± 1285 3387 ± 2055 d 48 (E)-Hex-2-enal 1209 1046 ± 360 1128 ± 133 1401 ± 502 1206 ± 239 d 69 (E)-Hex-2-en-1-ol 1407 179 ± 105 64 ± 9 71 ± 30 29 ± 9 d 65 (Z)-Hex-3-en-1-ol 1384 167 ± 89 92 ± 8 177 ± 14 113 ± 8 d 38 (E)-Hex-3-enal 1133 46 ± 21 135 ± 26 91 ± 36 193 ± 102 d 27 Hexanal 1076 21 ± 6 25 ± 4 46 ± 11 39 ± 8 d 63 Hexan-1-ol 1355 7 ± 4 3 ± 1 6 ± 2 n.q.h d 64 (E)-Hex-3-en-1-ol 1363 7 ± 4 n.d.i 6 ± 0 n.q. e 46 (Z)-Hex-2-enal 1194 4 ± 2 12 ± 1 9 ± 1 18 ± 2 f

Ester 15 Methylbutanoat 981 858 ± 414 1042 ± 436 628 ± 632 440 ± 174 d 30 (E)-Methylbut-2-enoat 1101 293 ± 18 342 ± 102 68 ± 71 48 ± 23 d 19 Ethylbutanoat 1033 136 ± 55 212 ± 109 73 ± 99 39 ± 20 d 41 (E)-Ethylbut-2-enoat 1158 120 ± 60 193 ± 19 17 ± 25 10 ± 4 d 45 Methylhexanoat 1184 31 ± 6 28 ± 6 22 ± 5 30 ± 19 d 126 Phthalat 2540 17 ± 11 n.d. n.d. n.d. f,k 66 Methyloctanoat 1388 12 ± 4 7 ± 1 24 ± 1 10 ± 2 e 94 Methylbenzoat 1613 4 ± 2 n.d. 2 ± 4 n.q. d 52 Ethylhexanoat 1232 4 ± 4 3 ± 1 n.q. n.d. e 92 Methyldecanoat 1590 3 ± 1 n.d. 4 ± 1 n.q. e 71 Ethyloctanoat 1434 n.q. n.d. n.d. n.d. e 103 Benzylacetat 1723 n.q. 5 ± 4 4 ± 0 n.d. e 2 Ethylformiat 822 n.k.g n.k. n.k. n.k. e 5 Ethylacetat 886 n.k. n.k. n.k. n.k. e F Phthalat 2490 n.d. 23 n.k. n.d. f,k 106 Isopropyllaurat 1795 n.d. 14 ± 5 3 ± 1 5 ± 1 f

Ketone 14 Pentan-2-on 970 121 ± 57 207 ± 132 49 ± 46 60 ± 30 d 98 Acetophenon 1641 121 ± 39 98 ± 16 43 ± 28 16 ± 8 d 18 Pent-1-en-3-on 1015 3 ± 1 n.d. 13 ± 3 4 ± 4 e 72 4-Hydroxypentan-2-on 1436 n.d. 28 ± 22 n.d. n.d. f 35 Pent-3-en-2-on 1117 n.d. 9 ± 3 n.d. 4 ± 4 e 2-(Z)-But-2-enyl-3-methyl A 1847 n.d. 5 ± 1 n.d. n.d. f -cyclopent-2-en-1-on 43 Heptan-2-on 1174 n.d. n.q. n.d. n.d. e 90 Mesifuran 1587 n.k. n.k. n.k. n.k. d 54 Acetoin 1265 n.k. n.k. n.k. n.k. d

Alkohole 74 (R)-Oct-1-en-3-ol 1452 61 ± 21 38 ± 6 230 ± 54 158 ± 1 d 37 Pentan-2-ol 1123 21 ± 21 44 ± 27 5 ± 1 15 ± 8 e 65

Ergebnisse und Diskussion

Nr.a Substanz RIb 05.08.10 20.07.11 VHS LLE VHS LLE [µg/kg]c

125 Hexadecan-1-ol 2380 10 ± 3 n.d. n.d. n.d. e 9 Ethanol 931 5 ± 1 11 ± 2 4 ± 1 14 ± 4 e 114 Benzylalkohol 1874 4 ± 2 20 ± 8 3 ± 0 n.d. e 53 Pentan-1-ol 1252 3 ± 1 4 ± 0 n.q. n.q. e 42 Pent-1-en-3-ol 1161 3 ± 1 7 ± 0 6 ± 1 7 ± 7 e 87 Octan-1-ol 1560 n.q. 6 ± 1 n.q. 2 ± 2 e 78 2-Ethylhexan-1-ol 1491 n.q. n.d. n.q. n.d. e 21 2-Methylbut-3-en-2-ol 1041 n.d. 5 ± 1 n.d. n.d. d 107 1-Phenylethan-1-ol 1810 n.d. 6 ± 4 n.d. n.d. e 58 (Z)-Pent-2-en-1-ol 1321 n.d. 6 ± 1 7 ± 2 12 ± 2 e 56 (E)-Pent-2-en-1-ol 1313 n.d. n.d. n.q. 10 ± 8 f 115 2-Phenylethylalkohol 1899 n.d. n.d. n.d. 3 ± 0 e 33 Pentan-3-ol 1110 n.d. n.d. n.q. n.q. e

Aldehyde 67 Nonanal 1389 3 ± 0 8 ± 2 n.d. n.q. e 4 Prop-2-enal 863 4 ± 1 7 ± 4 n.q. 33 ± 33 e 36 (E)-Pent-2-enal 1121 n.q. 4 ± 0 5 ± 5 16 ± 8 e 82 Benzaldehyd 1512 n.q. 4 ± 2 3 ± 0 5 ± 1 e 55 Octanal 1276 n.q. n.q. n.d. n.d. e 70 (E)-Oct-2-enal 1422 n.q. n.d. n.d. n.d. e 1 Propanal 796 n.d. n.d. n.q. 11 ± 10 e 57 (E)-Hept-2-enal 1318 n.d. n.d. n.q. n.d. d

Säuren 96 Buttersäure 1624 n.k. 986 ± 356 n.k. 103 ± 75 d 83 Propansäure 1533 n.k. 284 ± 102 n.k. 16 ± 16 d 111 Hexansäure 1844 n.k. 167 ± 38 n.k. 60 ± 42 d M Zimtsäure 2849 n.k. 86 ± 39 n.k. n.d. d 118 (E)-Hex-3-ensäure 1951 n.k. 30 ± 3 n.k. 49 ± 40 d 105 (E)-But-2-ensäure 1768 n.d. 25 ± 8 n.k. n.d. e 120 Octansäure 2057 n.k. 15 ± 3 n.k. 11 ± 10 e 119 (E)-Hex-2-ensäure 1961 n.k. 10 ± 3 n.k. n.d. d 124 Decansäure 2245 n.k. 8 ± 4 n.k. n.d. e 100 2-Methylbuttersäure 1667 n.k. n.d. n.k. 2 ± 2 e 73 Essigsäure 1440 n.k. n.k. n.k. n.k. d

Sonstige 3,5-di-tert-Butyl-4- 116 1908 126 ± 51 7 53 ± 46 89 ± 47 f hydroxytoluol 95 β-Cyclocitral 1598 2 ± 1 n.d. n.d. n.d. e 76 (E,E)-Hepta-2,4-dienal 1483 n.q. n.d. n.q. n.d. e 24 2,3,5-Trimethlyfuran 1050 n.d. 27 ± 17 32 ± 20 30 ± 20 f 86 Linalool 1548 n.d. 6 ± 5 n.d. 4 ± 3 e 91 Propylenglykol 1588 n.d. n.d. n.d. 34 ± 8 e 85 Butan-2,3-diol 1538 n.d. n.k. n.k. n.k. d 89 Butan-2,3-diol 1576 n.k. n.k. n.k. n.k. d I Kohlenwasserstoff C 27 2700 n.d. 28 ± 5 n.d. n.d. f N Kohlenwasserstoff C 29 2905 16 ± 9 27 ± 7 n.d. n.d. f K Kohlenwasserstoff C 28 2799 n.d. 24 ± 2 n.d. n.d. f G Kohlenwasserstoff C 25 2500 n.d. 21 ± 5 n.d. n.d. f C Kohlenwasserstoff C 22 2196 n.d. 20 ± 4 n.d. n.d. f E Kohlenwasserstoff C 24 2399 n.d. 20 ± 2 n.d. n.d. f H Kohlenwasserstoff C 26 2600 n.d. 19 ± 3 n.d. n.d. f D Kohlenwasserstoff C 23 2300 n.d. 12 ± 5 n.d. n.d. f 66

Ergebnisse und Diskussion

Nr.a Substanz RIb 05.08.10 20.07.11 VHS LLE VHS LLE [µg/kg]c

O Kohlenwasserstoff C 30 2999 n.d. 12 ± 4 n.d. n.d. f P Kohlenwasserstoff C 31 3099 n.d. 9 ± 4 n.d. n.d. f B Kohlenwasserstoff C 21 2098 n.d. 8 ± 3 n.d. n.d. f Q Kohlenwasserstoff C 32 3199 n.d. 5 ± 3 n.d. n.d. f a: Die Nummern und Buchstaben entsprechen den Verbindungen in Abbildung 11, Tabelle 8 und Tabelle 9. b: Retentionsindex (DB-WAX). c: Mittelwert und Standardabweichung einer Dreifachbestimmung. d: Die Quantifizierung erfolgte unter Berücksichtigung des gaschromatographischen Verhaltens (Response) und der Wiederfindung (siehe Anhang). e: Die Quantifizierung erfolgte unter Berücksichtigung des gaschromatographischen Verhaltens (Response). f: Für die Quantifizierung wurde der Response-Faktor 1 angenommen. g: Nicht kalkulierbar (n.k.), da die Wiederfindung unter 25 % lag (siehe Anhang). h: Nicht quantifizierbar (n.q.), da die Fläche unterhalb der Bestimmungsgrenze (1,7 µg/kg) lag. i: Nicht identifizierbar (n.d.), da die Fläche unterhalb der Nachweisgrenze (0,6 g/kg) lag. k: nicht eindeutig identifizierbare Phthalsäureester. A-Q: nicht nach VHS, nur nach LLE nachgewiesen.

Da der Kutscher-Steudel-Extraktor nur die Untersuchung flüssiger Probenmatrices ermöglicht, wurde lediglich der nach Zentrifugation erhaltene Überstand des Stachelbeerenhomogenats zur Isolierung eingesetzt. Die Absolutmengen an flüchtigen Komponenten nach VHS- und LLE-Extraktion waren daher nicht direkt miteinander vergleichbar. Die prozentuale Verteilung der Stoffgruppen (ohne Berücksichtigung der in Tabelle 16 aufgeführten Säuren und sonstigen Verbindungen) war in den analysierten Chargen zwar stets ähnlich, jedoch nicht identisch (Abbildung 12). Diese Schwankungen sind vermutlich auf die Inhomogenität der Früchte zurückzuführen.

100% 90% 80% 70% 60% Ketone 50% 40% AlkholeAlkohole 30% Aldehyde 20% Ester 10%

0% C6-KomponentenC6-

Abbildung 12: Prozentuale Verteilung der Stoffgruppen verschiedener Chargen Stachelbeeren nach VHS- (1. Balken) und LLE-Extraktion (2. Balken)

Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 13 und Abbildung 14 zeigen die Verteilung der einzelnen Komponenten innerhalb der beiden Hauptstoffgruppen. Die Profile der primär gebildeten Ester zeigten nach VHS- und LLE-Isolierung ein sehr ähnliches Bild. Die Verteilung der erst nach Zerstörung des

Zellverbandes enzymatisch gebildeten C6-Komponenten wurde jedoch durch die Isolierungstechnik beeinflusst. Mit Ausnahme der Charge vom 16.07.12 ging nach LLE- Isolierung der sinkende Anteil an (Z)-Hex-3-enal mit einer prozentualen Zunahme von (E)-Hex-2-enal und (E)-Hex-3-enal einher. Die Isomerisierung des primär gebildeten (Z)-Hex- 3-enals scheint entweder durch die längere Zeitspanne zwischen Homogenisierung und Beginn der Extraktion bei LLE oder durch längere Extraktionsdauer bei LLE (24 h) im Vergleich zur VHS (2 h) verstärkt stattzufinden. Die gleiche Beeinflussung wurde bereits bei den Inhibierungsversuchen (4.1.1.3) beobachtet.

100% 90% 80% Benzylacetat 70% Methylbenoat 60% Methyloctanoat 50% 40% Ethylhexanoat 30% Methylhexanoat 20% (E)-Ethylbut-2-enoat 10% 0% Ethylbutanoat (E)-Methylbut-2-enaot Methylbutanoat

Abbildung 13: Prozentuale Verteilung der einzelnen Komponenten innerhalb der Stoffgruppe der Ester nach VHS- (1. Balken) bzw. LLE-Extraktion (2. Balken)

Ergebnisse und Diskussion

100% 90% 80% (E)-3-Hexenol 70% Hexanol 60% (Z)-Hex-2-enal 50% 40% Hexanal 30% (E)-Hex-3-enal 20% (E)-Hex-2-enol 10% 0% (Z)-Hex-3-en-1-ol (Z)-Hex-3-enal (E)-Hex-2-enal

Abbildung 14: Prozentuale Verteilung der einzelnen Komponenten innerhalb der C6-Gruppe nach VHS- (1. Balken) bzw. LLE-Extraktion (2. Balken)

4.1.2.3 Isolierung der flüchtigen Verbindungen mittels Headspace HRGC-MS VHS-Extrakte zeigen eine ausgewogene Zusammensetzung der Aromastoffe niedrigeren und höheren Molekulargewichtes und geben das Aroma der verwendeten Früchte wieder (Pennarun et al. 2002, Werkhoff et al. 1998). Nichtsdestotrotz werden hoch flüchtige Komponenten durch eine VHS-Isolierung nicht ausreichend extrahiert. Durch die Schritte der Probenaufarbeitung gehen große Teile der stark flüchtigen Verbindungen verloren (Güntert et al. 1998). Durch Headspace-Analytik ist es möglich, stark flüchtige Verbindungen quantitativ zu analysieren. Ein weiterer großer Vorteil dieser Technik ist das Arbeiten ohne Lösemittel, sodass es nicht zur Überlagerung von Lösemittel- und Substanzpeaks kommen kann, wie beispielsweise bei LLE oder VHS. Des Weiteren können die Proben im Headspace Sampler auf 37°C temperiert werden, so dass die Verdampfungsvorgänge im menschlichen Mundraum nachgestellt werden können. Aus diesen Gründen wurden sieben Chargen Stachelbeeren zusätzlich zur VHS-Isolierung parallel mittels einer statischen Headspace-Methode (HS) untersucht. Hierbei wurden 17 Verbindungen quantifiziert. Die für die Hauptkomponenten ermittelten Konzentrationen sind in Abbildung 15 dargestellt.

Ergebnisse und Diskussion

(Z)-Hex-3-enal (E)-Hex-2-enal (Z)-Hex-3-en-1-ol 30 5 1,0

25 4 0,8 20 3 0,6 15 [mg/kg] [mg/kg] 2 [mg/kg] 0,4 10 5 1 0,2 0 0 0,0

Methylbutanoat Ethylacetat Methylacetat

10 30 12 8 25 10 8 6 20 15 6 [mg/kg] [mg/kg] 4 [mg/kg] 10 4 2 5 2 0 0 0

HS VHS

Abbildung 15: Konzentrationen der Hauptverbindungen nach HS-Analyse und VHS-Extraktion

Die durch VHS bzw. HS bestimmten Konzentrationen für die Hauptverbindungen (Z)-Hex-3- enal, (E)-Hex-2-enal, (Z)-Hex-3-en-1-ol und Methylbutanoat lagen trotz der unterschiedlichen Isolierungstechniken jeweils im gleichen Bereich. Aufgrund der begrenzten Menge an Stachelbeer-Material konnte die Headspace-Analytik jedoch nur in Einfachbestimmungen durchgeführt werden. Die aufgetretenen Abweichungen sind aufgrund der geringeren Probeneinwaage bei HS-Analyse vermutlich auf die Inhomogenität der Beeren zurückzuführen. Durch HS konnte das flüchtige Profil von Stachelbeeren um die stark flüchtigen Verbindungen Ethylacetat und Methylacetat ergänzt werden. Diese waren mittels VHS nur begrenzt nachweisbar und nicht quantifizierbar. Durch HS stellten sich die beiden Komponenten jedoch als Hauptkomponenten mit Konzentrationen bis zu 25681 µg/kg (Ethylacetat) bzw. 10286 µg/kg (Methylacetat) heraus. Die ermittelten Konzentrationen aller quantifizierten Verbindungen sind in Tabelle 17 zusammengefasst.

Ergebnisse und Diskussion

Tabelle 17: Konzentrationen flüchtiger Verbindungen in sieben Chargen Stachelbeeren nach VHS- und HS-Analyse

Bekay Späte Spitze Xenia Tixia HS VHS HS VHS HS VHS HS VHS [µg/kg] (Z)-Hex-3-enal 14915 11188 ± 2541 9014 8192 ± 1595 18500 21014 ± 2127 13144 16868 ± 1177 Methylacetat 10286 n.k.b 9797 n.k. 5136 n.k. 6968 n.k. Methylbutanoat 2391 2984 ± 323 1111 1811 ± 35 4274 4609 ± 642 8230 3740 ± 418 (E)-Hex-2-enal 1570 1441 ± 299 4048 3431 ± 273 1963 1247 ± 152 3122 982 ± 34 (Z)-Hex-3-en-1-ol 530 862 ± 30 803 338 ± 43 765 398 ± 59 424 185 ± 29 Aceton 353 n.d. 43 n.d. 130 n.q. 139 n.d. (E)-Methylbut-2-enoat 266 191 ± 50 139 85 ± 23 199 79 ± 4 280 47 ± 6 (E,E)-Hexa-2,4-dienal 111 n.d. 69 n.d. 164 n.d. 85 n.d. Ethylacetat 99 n.k. 2399 n.k. 3196 n.k. 4947 n.k. (R)-Oct-1-en-3-ol 63 157 ± 27 376 338 ± 43 83 159 ± 34 50 185 ± 29 (E)-Pent-2-enal 44 9 ± 0 n.d. n.q.c 63 8 ± 0 n.d. 15 ± 1 Hexanal 28 123 ± 20 n.d. 105 ± 19 n.d. 166 ± 7 n.d. 207 ± 18 Methylhexanoat 16 36 ± 7 18 28 ± 2 20 61 ± 7 33 56 ± 3 Ethylbutanoat 9 1557 ± 312 97 475 ± 163 1253 651 ± 31 1525 195 ± 66 Methyloctanoat 6 8 ± 3 11 18 ± 4 9 22 ± 2 n.d. 19 ± 1 (E)-Ethylbut-2-enoat n.d.a 175 ± 75 30 51 ± 21 77 44 ± 9 127 13 ± 8 Ethylhexanoat n.d. 11 ± 2 n.d. 2 ± 2 5 6 ± 1 5 n.d. Propan-2-ol n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d. n.d.

Ergebnisse und Diskussion

Rote Eva Frühe Rote Invicta HS VHS HS VHS HS VHS [µg/kg] (Z)-Hex-3-enal 1441 8010 ± 1559 22699 20559 ± 2530 25226 14436 ± 1689 Methylacetat 10197 n.k. 7467 n.k. 271 n.k. Methylbutanoat 74 45 ± 9 1588 347 ± 118 188 48 ± 21 (E)-Hex-2-enal 1834 2952 ± 222 2436 1666 ± 65 2803 1845 ± 175 (Z)-Hex-3-en-1-ol 205 50 ± 13 523 190 ± 15 575 199 ± 37 Aceton n.d. n.q. 62 n.q. 279 7 ± 5 (E)-Methylbut-2-enoat 22 11 ± 1 38 n.d. n.d. n.d. (E,E)-Hexa-2,4-dienal n.d. n.d. 150 n.d. 154 n.d. Ethylacetat 25681 n.k. 292 n.k. n.d. n.k. (R)-Oct-1-en-3-ol n.d. 50 ± 13 117 190 ± 15 117 199 ± 37 (E)-Pent-2-enal n.d. 11 ± 3 n.d. 10 ± 1 n.d. 10 ± 1 Hexanal n.d. 156 ± 29 n.d. 174 ± 16 n.d. 219 ± 42 Methylhexanoat 3 n.q. 23 39 ± 13 3 3 ± 3 Ethylbutanoat 115 62 ± 29 n.d. 3 ± 4 n.d. 10 ± 11 Methyloctanoat n.d. 14 ± 7 23 62 ± 20 n.d. 6 ± 3 (E)-Ethylbut-2-enoat 60 17 ± 10 n.d. n.d. n.d. n.d. Ethylhexanoat 3 8 ± 0 n.d. n.q. n.d. n.q. Propan-2-ol 1531 n.d. n.d. n.d. 434 n.d. a: Nicht identifizierbar, VHS: Konzentration unterhalb der Nachweisgrenze (0,6 µg/kg), HS: Peakfläche < 10.000. b: Nicht kalkulierbar, da Wiederfindung < 25 %. c: Nicht quantifizierbar (n.q.), da die Konzentration unterhalb der Bestimmungsgrenze (1,7 µg/kg) lag.

Ergebnisse und Diskussion

4.1.3 Sensorische Analyse

4.1.3.1 Einleitung

Wie in den vorhergehenden Kapiteln gezeigt wurde, enthalten Stachelbeeren eine Vielzahl an flüchtigen Verbindungen. Einen Beitrag zum Aroma einer Frucht leisten jedoch in vielen Fällen nur eine recht geringe Anzahl ausgewählter Aromastoffe. So wurden beispielweise in Aprikosen über 200 und in Pinker Guave über 400 flüchtige Verbindungen identifizert (Greger und Schieberle 2007, Steinhaus et al. 2008). Durch die Analyse der aromarelevanten Verbindungen gelang es jedoch das typische Aroma der Früchte unter Verwendung von nur 18 bzw. 13 Verbindungen zu imitieren (Greger und Schieberle 2007, Steinhaus et al. 2009). Ziel dieser Arbeit war es, unter den insgesamt 127 in VHS-Extrakten aus frischen Stachelbeeren nachgewiesenen Verbindungen die entscheidenden Aromastoffe zu identifizieren und deren Beitrag zum Gesamtaroma der Frucht abzuschätzen. Hierzu wurde ein via VHS gewonnener Extrakt mittels Aromaextraktverdünnungsanalyse (AEVA) (Schmid und Grosch 1986, Ullrich und Grosch 1987) analysiert. Durch Anwendung des Aromawertkonzeptes von Rothe und Thomas (1963) erfolgte anschließend eine Bewertung der Aromarelevanz der einzelnen Verbindungen.

4.1.3.2 Analyse der aromaaktiven Komponenten

Zur Analyse der aromaaktiven Komponenten in Stachelbeeren wurde ein mittels VHS gewonnener Extrakt durch Aromaextraktverdünnungsanalyse (AEVA) untersucht (Schmid und Grosch 1986, Ullrich und Grosch 1987). Die aus Stachelbeeren mittels VHS gewonnen wässrigen Destillate zeichneten sich durch eine fruchtig-grüne Note aus, welche an die frischen Beeren erinnerte. Zur AEVA wurde ein konzentrierter VHS-Extrakt verwendet, der aus 4,5 kg roten Stachelbeeren gewonnen wurde. Durch schrittweise Verdünnung des Extraktes mit Lösemittel (Diethylether/n-Pentan; 1/1;v/v)) und gaschromatographisch- olfaktometrische Analyse jeder der Verdünnungsstufen wurden die Flavor Dilution-Faktoren (FD) der geruchsaktiven Komponenten bestimmt. Es wurden 21 aromaaktive Verbindungen detektiert, von welchen 18 identifiziert wurden. Die wahrgenommenen Gerüche wurden überwiegend durch grüne und fruchtige Aromanoten dominiert. Die höchsten FD-Faktoren wurden für (Z)-Hex-3-enal (4096), (E)-Hex-2-enal (4096) und Methylbutanoat (2048) bestimmt, gefolgt von weiteren Lipidoxidationsprodukten und kurzkettigen Estern. In Tabelle 18 sind die Geruchsqualitäten der einzelnen aromaaktiven Komponenten aufgeführt. Zur Beurteilung der Aromarelevanz der einzelnen Verbindungen wurden durch Division der Konzentrationen der einzelnen Verbindungen durch deren Geruchsschwellen die Aromawerte (A) berechnet (Rothe und Thomas 1963, Grosch 1993). Da Stachelbeeren zu 73

Ergebnisse und Diskussion

über 87 % aus Wasser (Herrmann 2001) bestehen, wurden in Wasser bestimmte Geruchsschwellen verwendet. Derartige Schwellen wurden für verschiedene Substanzen bereits in zahlreichen Arbeiten veröffentlicht. Aufgrund der starken Schwankungen zwischen verschiedenen Autoren wurden die Schwellen der laut der FD-Werte wichtigsten Aromastoffe jedoch im Rahmen dieser Arbeit erneut bestimmt. Dies erfolgte mit Hilfe eines Panels im Dreieckstest. Die bestimmten Geruchsschwellen sowie die daraus resultierenden Aromawerte der aromaaktiven Komponenten in Stachelbeeren sind in Tabelle 18 aufgeführt. Der bei Weitem höchste Aromawert wurde für (Z)-Hex-3-enal berechnet. Diese Komponente zeichnete sich durch ein grünes, grasiges Aroma aus. Zusätzlich lagen die Konzentrationen neun weiterer Substanzen oberhalb ihrer Geruchsschwellen (A > 1), wobei sich in Analogie zu den FD-Werten vor allem Lipidoxidationsprodukte und kurzkettige Ester als aromaaktive Verbindungen herausstellten. Den sensorisch dominierenden Ester in Stachelbeeren stellt Ethylbutanoat dar, dessen Aromawert aufgrund seiner sehr niedrigen Geruchsschwelle weit oberhalb jenem des quantitativ dominierenden Methylbutanoates lag.

Ergebnisse und Diskussion

Tabelle 18: Konzentrationen und sensorische Bewertung von Schlüsselaromastoffen in Stachelbeerena

Geruchsschwelle Verbindung RIb Geruchc FD-Faktor [µg/kg]d Ae (µg/L in Wasser)

(Z)-Hex-3-enal 1139 Grasig 4096 0,6 4063 6772 (R)-Oct-1-en-3-ol 1452 Pilzig 64 0,9 112 124 Ethylbutanoat 1033 Ananas 2048 2,5 281 112 Methylbutanoat 981 fruchtig, käsig, grün 512 63 1378 22 (E)-Hex-2-enal 1209 grün, Apfel 4096 77 1242 16 (Z)-Hex-3-en-1-ol 1384 Geranie 32 28 175 6 Acetophenon 1641 süß, blumig 256 26 67 3 Ethylhexanoat 1232 grün, Melone 32 1,4 3 2 (E)-Methylbut-2-enoat 1101 modrig, fruchtig 512 124 256 2 Methyldecanoat 1590 grün, Gurke 16 2,1 2 1 Methylhexanoat 1184 Ananas 16 63 31 <1 (E)-Ethylbut-2-enoat 1158 Apfel 8 253 117 <1 (E)-Hex-3-en-1-ol 1363 modrig, grün 16 1000f 4 <1 Essigsäure 1440 fruchtig-sauer 8 70g n.k.h Hexansäure 1844 beerig 8 290i n.k. (E)-Hex-3-ensäure 1951 metallisch 32 171 n.k. 6-Methylhept-5-en-2-on 1333 Zitrus-artig, grün 8 50k n.d.l Benzylacetat 1723 Orange 8 2m n.q.n Unbekannto 1712 beerig, fruchtig 128 Unbekannto 1979 Melone 16 Unbekannto 2002 grün, fruchtig 16 a: Material von 2010; GC-O und AEVA wurden mit einem konzentrierten VHS-Extrakt durchgeführt, welcher 4,5 kg frischer, roter Stachelbeeren entsprach. b: Retentions-Indices (DB-WAX). c: Bestimmung der Geruchsqualität im unverdünnten Extrakt am Sniffing-Port. d: Bestimmung der durchschnittlichen Konzentrationen aus sieben Chargen Stachelbeeren der Sorte Achilles. e: Aromawerte. f: Zea et al. 2001. g: Yang et al. 2010. h: nicht kalkulierbar: Wiederfindung < 25 %. i: Rychlik und Schieberle 1998. k: Leffingwell & Associates 2011. l: Nicht identifizierbar, da die Konzentration unterhalb der Nachweisgrenze (0,6 µg/kg) lag. m: Burdock 2005. n: Nicht quantifizierbar (n.q.), da die Konzentration unterhalb der Bestimmungsgrenze (1,7 µg/kg) lag. o: nicht identifiziert, Detektion nur am Sniffing-Port.

Ergebnisse und Diskussion

Um den Einfluss der starken Variabilität des flüchtigen Profils von Stachelbeeren auch bei der Berechnung der Aromawerte zu berücksichtigen, wurden zusätzlich die Aromawerte für drei unterschiedliche Chargen Achilles sowie zwei weitere Sorten berechnet (Tabelle 19).

Tabelle 19: Aromawerte ausgewählter Chargen Stachelbeeren Aromawert Achilles Invicta Bekay 16.07.12 25.07.11 26.07.11 14.06.12 25.06.12 (Z)-Hex-3-enal 2972 9297 18408 24060 18647 (R)-Oct-1-en-3-ol 67 36 186 222 175 Ethylbutanoat 282 236 37 3 519 Methylbutanoat 60 40 6 1 47 (E)-Hex-2-enal 30 12 9 24 19 (Z)-Hex-3-en-1-ol 4 6 7 27 31 Ethylhexanoat 8 7 n.k.a n.k. 11 Acetophenon 6 <1 n.k. <1 <1 Methyldecanoat n.k. n.k. 2 1 n.k. (E)-Methylbut-2-enoat 7 2 <1 <1 2 Methylhexanoat <1 <1 <1 <1 <1 (E)-Ethylut-2-enoat 2 <1 <1 <1 <1 (E)-Hex-3-en-1-ol n.k. <1 n.k. n.k. <1

a nicht kalkulierbar, da Konzentration unterhalb der Bestimmungsgrenze (1,7 µg/kg)

In allen Chargen erwies sich (Z)-Hex-3-enal als deutlich dominierender Aromastoff. Weiterhin zeigten (R)-Oct-1-en-3-ol, Ethylbutanoat, Methylbutanoat, (E)-Hex-2-enal und (Z)-Hex-3-en-1-ol in allen Chargen Aromawerte über eins. Zusätzlich wurde je nach Charge der Einfluss von Ethylhexanoat, Acetophenon, Methyldecanoat und (E)-Methyl- und (Z)-Ethylbut-2-enoat auf das Gesamtaroma von Stachelbeeren festgestellt. Auf den starken Einfluss der C6-Komponenten und kurzkettigen Ester auf das Aroma frischer Stachelbeeren und die deutliche Abnahme der Konzentrationen dieser Verbindungen nach Gefrierlagerung ist das veränderte Aroma von Stachelbeeren nach tiefgekühlter Lagerung zurückzuführen (4.1.1.6). Als weiterer Einflussfaktor auf das Aroma von Stachelbeeren wurde die natürliche Beerenmatrix untersucht, indem für die Komponenten mit den höchsten FD-Faktoren zusätzlich zur Bestimmung der Geruchsschwellenwerte in Wasser eine Bestimmung in einer Beerenmatrix-ähnlichen Lösung durchgeführt wurde. Diese Lösung bestand aus verschiedenen Zuckern und organischen Säuren in deren natürlich vorkommenden Konzentrationen (siehe 3.2.5.2). In Tabelle 20 sind die bestimmten Geruchsschwellen gegenübergestellt.

Ergebnisse und Diskussion

Tabelle 20: Geruchsschwellen ausgewählter Verbindungen in Wasser und einer Beerenmatrix-ähnlichen Lösung

Verbindung Geruchsschwelle [µg/L] Wasser Beerenmatrix-ähnliche Lösunga (Z)-Hex-3-enal 0,6 0,1 Oct-1-en-3-ol 0,9 6,2 Ethylbutanoat 2,5 17 Methylbutanoat 63 62 (E)-Hex-2-enal 77 37 (Z)-Hex-3-en-1-ol 28 39 Acetophenon 26 153 Ethylhexanoat 1,4 2,8 (E)-Methylbut-2-enoat 124 54 a: Zusammensetzung: siehe Material und Methoden

Deutliche Differenzen der Schwellenwerte in Wasser und Beerenmatrix-ähnlicher Lösung, die mehr als zwei Verdünnungsstufen betrugen, ergaben sich für (Z)-Hex-3-enal, Oct-1- en-3-ol, Ethylbutanoat und Acetophenon. Während die grüne Aromanote des (Z)-Hex-3- enals in der Beere anscheinend noch intensiver wahrgenommen wird, treten die Intensitäten von Oct-1-en-3-ol (pilzig), Ethylbutanoat (fruchtig) und Acetophenon (süß) zurück. Alle anderen untersuchten Substanzen zeigten keine eindeutige Beeinflussung durch die Anwesenheit von Zuckern und Säuren. Durch die zusätzlich durchgeführte Headspace-Analyse (HS) stellte sich das stark flüchtige Ethylacetat als eine weitere aromaaktive Komponente (A>1) heraus. Die HS- Analyse von Stachelbeeren der Sorte Achilles, Bekay und Xenia zu sechs unterschiedlichen Reifezeitpunkten ergab eine Abhängigkeit des Aromas der reifen Frucht vom Verhältnis der beiden Verbindungen Ethylacetat und (Z)-Hex-3-enal, denn die Aromawerte beider Verbindungen änderten sich drastisch während der Reifung (Abbildung 16). Das frische, grüne (Z)-Hex-3-enal stellt eine entscheidende Charakteristik des frischen Stachelbeeraromas dar. Die Konzentration dieser Verbindung nimmt mit fortschreitender Reife ab, während die Konzentration des Esters immer stärker dominiert. Sobald das Verhältnis der Aromawerte von (Z)-Hex-3-enal und Ethylacetat den Wert 1 unterschritt, war ein Klebstoff-artiger Aromafehlton der Beeren feststellbar. Während in den Sorten Bekay und Xenia das Verhältnis der beiden Verbindungen auch nach dem optimalen Reifezeitpunkt ausgeglichen war, trat bei der Sorte Achilles ab dem Zeitpunkt der starken Überreife ein Klebstoff-artiger Aromafehlton auf, der durch die Dominanz des Ethylacetats hervorgerufen wurde.

Ergebnisse und Diskussion

Achilles Bekay Xenia 100000

10000

1000

(Z)-hex-3-enal(Z)-Hex-3-enal 100 Aromawert ethylEthylacetat acetate

1 R R R Zeitlicher Verlauf der Reifung

Abbildung 16: Mittels HS berechnete Aromawerte für Ethylacetat und (Z)-Hex-3-enal zu sechs unterschiedlichen Reifezeitpunkten von unreif bis überreif (R: reif)

Die starken, Reife-abhängigen Konzentrationsänderungen von einflussreichen Aromastoffen stellen also eine weitere Herausforderung für die Nachahmung natürlichen Stachelbeeraromas dar. Erste Rekombinationsversuche, die auf Basis der in der Charge Achilles vom 05.08.2010 bestimmten Konzentrationen durchgeführt wurden, bestätigten die Wichtigkeit der genannten Komponenten für das Aroma von Stachelbeeren. Dennoch zeigt der Vergleich der Aromaprofile von frischen Stachelbeeren und dem Rekombinat (Abbildung 17), dass das Aroma von Stachelbeeren nicht vollständig nachgeahmt werden konnte. Die dynamische Bildung der C6-Komponenten, welche das Aroma von Stachelbeeren entscheidend prägen, sowie der Einfluss stark flüchtiger Verbindungen wie Ethylacetat, scheint eine große Herausforderung für die Nachahmung von Stachelbeeraroma darzustellen.

Ergebnisse und Diskussion

Ananas 2

muffig grün-fruchtig 1

Rekombinat Pilz-artig 0 Apfel Stachelbeeren var. Achilles

süß-blumig grasig

sauer

Abbildung 17: Aromaprofile frischer Stachelbeeren var. Achilles (schwarze Linie) und eines Rekombinates (graue Linie) auf Basis der Aromastoff-Konzentrationen in Stachelbeeren var. Achilles (05.08.2010)

4.1.4 Analyse des flüchtigen Profils eines Stachelbeerproduktes

4.1.4.1 Einleitung

Die Herstellung von Likören geht bereits auf das 13. Jahrhundert zurück. Als Heilmittel gegen Krankheiten erfreute sich die Spirituose vor allem in Italien schnell immer größerer Beliebtheit. Kaum 200 Jahre später galt Italien als weltweit führender Likörhersteller. Obwohl der medizinische Hintergrund nie in Vergessenheit geriet, wurden Liköre zunehmend als Genussmittel verzehrt. Auch heute sind Liköre noch sehr beliebt, was das Angebot einer enorm großen Produktpalette von Likören unter anderem aus Obst, Gemüse, Nüssen, und Gewürzen zeigt. Den größten Anteil dieser Palette repräsentieren die Fruchtliköre. Neben Kernobst, Steinobst, Beeren und Wildfrüchten finden ebenso Zitrus- sowie exotische Früchte Einsatz (Buglass 2011). Liköre stellen eine Spirituose mit definiertem Mindestzucker- und Alkoholgehalt dar. Zur Aromatisierung dürfen sowohl natürliche Aromen (Aromastoffe und Aromaextrakte) als auch Aromen verwendet werden. Einzelne Sorten unterliegen jedoch weiteren gesetzlichen Bestimmungen. So ist der Zusatz von nicht natürlichen Aromen beispielsweise bei der Herstellung von Likör aus Schwarzen Johannisbeeren, Kirschen und Himbeeren verboten (VO(EG)110/ 2008, Kolb und Fauth 2002). Im Rahmen der Untersuchungen wurde das flüchtige Spektrum eines kommerziell bezogenen Stachelbeerlikörs untersucht und mit dem der frischen Stachelbeeren

Ergebnisse und Diskussion verglichen. Der Geruch des Stachelbeerlikörs unterschied sich bereits im ersten Eindruck deutlich von dem frischer Stachelbeeren und wirkte sehr künstlich.

4.1.4.2 Ergebnisse und Diskussion

Die Isolierung der flüchtigen Verbindungen aus der Likörmatrix erfolgte mittels VHS analog zur Extraktion der frischen Beeren. Zuvor wurde sichergestellt, dass der interne Standard Heptan-2-ol nicht im Stachelbeerlikör enthalten war. Ein Unterschied ergab sich bei der Einengung des Extrakts an der Vigreux-Kolonne. Während der Extrakt aus frischen Stachelbeeren auf 0,5 mL eingeengt wurde, war dies bei dem Likör nicht möglich. Aufgrund des Siedepunktes von Ethanol (78 °C) verhinderte der Alkoholgehalt von 15 Volumenprozent eine analoge Volumenreduzierung im Wasserbad bei ca. 38 °C. Die Einengung erfolgte deshalb an der Vigreux-Kolonne nur auf 5 mL. Eine weitere Volumenreduzierung auf 2 mL wurde unter Stickstoffstrom durchgeführt. Die im Likör identifizierten und quantifizierten Komponenten sind in Tabelle 21 dargestellt. Die für die Hauptsubstanzen des Likörs bestimmten Wiederfindungen sind im Anhang (Tabelle 34) aufgeführt.

Tabelle 21: Konzentrationen der nach VHS identifizierten und quantifizierten Verbindungen in kommerziell erhältlichem Stachelbeerlikör

Substanz RIa Konzentration [µg/L]b

Ester: 1-Phenylethylacetat 1709 7808 ± 667 c,e 1-Phenylethyl-2-methylpropanoat 1750 6296 ± 646 c,e (Z)-Hex-3-enylacetat 1318 4603 ± 515 c,e Ethylbutanoat 1048 4001 ± 954 c,e Diethylmalonat 1578 1986 ± 222 c,e 3-Methylbutylacetat 1127 1151 ± 196 c,e 2-Phenylethylacetat 1816 1019 ± 117 c,f 2-Methylpropylacetat 1029 796 ± 207 c,e Ethylhexanoat 1214 177 ± 13 c,g (E)-Hex-2-enylacetat 1335 81 ± 8 c,f Ethyloctanoat 1436 57 ± 7 c,g Ethylbenzoat 1662 30 ± 24 c,g (E)-Hex-3-enylacetat 1309 26 ± 3 d,g Diethylethylidenmalonat 1775 24 ± 5 d,g 1-Phenylethylpropanoat 1757 22 ± 7 c,f (E,Z)-Ethyldeca-2,4-dienoat 1852 20 ± 4 c,f (Z)-Oct-3-enylacetat 1501 20 ± 9 c,g 1-Phenylethylbutanoat 1836 16 ± 2 c,f Ethylphenylacetat 1786 11 ± 2 c,f (E,Z)-Methyldeca-2,4-dienoat 1801 7 ± 6 c,f Hexylacetat 1264 6 ± 0 c,f Ethyl-2-methylbutanoat 1061 n.q.h c,f Ethyl-3-methylbutanoat 1075 n.q. c,f Butylacetat 1079 n.q. c,f Ethylheptanoat 1332 n.q. c,f

Ergebnisse und Diskussion

Substanz RIa Konzentration [µg/L]b

Ethyldecanoat 1632 n.q. c,e

Terpene/Terpenalkohole: α-Terpineol 1709 3904 ± 340 c,e β-Ionon 1943 251 ± 44 c,e Terpinen-4-ol 1601 59 ± 22 c,e α-Ionon 1856 22 ± 28 c,f Citronellol 1761 21 ± 6 c,e Linalool 1551 17 ± 1 c,e Geraniol 1844 9 ± 1 c,f Borneol 1713 n.q. c,f

C6-Komponenten: (E)-Hex-2-en-1-ol 1409 2246 ± 84 c,e Hexan-1-ol 1359 2066 ± 69 c,e (Z)-Hex-3-en-1-ol 1386 237 ± 10 c,e (E)-Hex-3-en-1-ol 1367 22 ± 3 c,g Hexanal 1086 18 ± 2 c,e (Z)-Hex-2-en-1-ol 1418 11 ± 1 c,f (E)-Hex-2-enal 1204 n.q. c,e

Alkohole: Heptan-1-ol 1460 843 ± 41 c,e 3-Methylbutan-1-ol 1196 289 ± 139 c,e 2-Methylpropan-1-ol 1104 160 ± 9 c,e 2-Phenylethan-1-ol 1915 105 ± 40 c,f Propan-1-ol 1054 37 ± 7 c,f 1-Phenylethan-1-ol 1790 35 ± 10 c,f 2-Ethylhexan-1-ol 1493 29 ± 2 c,f Nonan-1-ol 1643 19 ± 4 c,f Butan-2-ol 1042 9 ± 8 c,f Octan-3-ol 1399 8 ± 1 c,f 2-Ethylbutan-1-ol 1313 7 ± 0 c,f 6-Methylhept-5-en-2-ol 1471 5 ± 1 c,f Octan-1-ol 1562 5 ± 0 c,f Butan-1-ol 1152 n.q. c,f

Aldehyde: Heptanal 1185 561 ± 45 c,e Benzaldehyd 1514 30 ± 2 c,f

Sonstige: Heptanaldiethylacetal 1351 119 ± 13 c,e Propan-1,2-diol 1592 70 ± 11 c,f Rosenoxid 1365 61 ± 7 c,f Methylisoeugenol 2184 58 ± 13 c,f (E)-Linalooloxid 1442 36 ± 7 c,f β-Damascenon 1823 32 ± 4 c,f Heptanalpropylenglykolacetal 1449 29 ± 3 d,g 2,4-Dimethylhepta-2,4-dienal 1538 18 ± 2 d,g Heptanalpropylenglykolacteal 1426 12 ± 2 d,g γ-Octalacton 1919 10 ± 4 c,f Furfural 1458 n.q. c,f

Ketone: Acetophenon 1646 78 ± 0 c,e Acetoin 1280 n.k.i c,e

Ergebnisse und Diskussion

Substanz RIa Konzentration [µg/L]b

Säuren: 2-Methylpropansäure 1569 n.k. c,f Buttersäure 1630 n.k. c,e a: Retentionsindices (DB-WAX). b: Mittelwert und Standardabweichung einer Dreifachbestimmung. c: Die Identifizierung der Verbindung erfolgte mit Hilfe einer Referenzsubstanz. d: Die Identifizierung erfolgte durch Abgleich massenspektrometrischer Daten mit Literaturangaben. e: Die Quantifizierung erfolgte unter Berücksichtigung des gaschromatographischen Verhaltens (Response) und der Wiederfindung (siehe Anhang). f: Die Quantifizierung erfolgte unter Berücksichtigung des gaschromatographischen Verhaltens (Response). g: Für die Quantifizierung wurde der Response-Faktor 1 angenommen. h: Nicht quantifizierbar, da die Fläche unterhalb der Bestimmungsgrenze (1,7 µg/L) lag. i: nicht kalkulierbar, da die Wiederfindung unter 25 % lag (siehe Anhang).

Im Likör wurden 72 Substanzen identifiziert. Im Vergleich zum flüchtigen Spektrum frischer Stachelbeeren ergaben sich große Unterschiede. Während das Profil der frischen

Beeren hauptsächlich durch C6-Aldehyde (v.a. (Z)-Hex-3-enal und (E)-Hex-2-enal) und kurzkettige Buttersäureester geprägt war, dominierten im Likör C6-Alkohole (v.a. (E)-Hex- 2-en-1-ol und Hexan-1-ol) und Essigsäureester. Als weitere Hauptverbindungen traten α-Terpineol, Heptan-1-ol und Heptanal auf. Ein sensorischer Vergleich des Likörs und der frischen Beeren bestätigte die stark unterschiedlichen Zusammensetzungen der flüchtigen Komponenten. Es wurden Aromaprofile von frischen Stachelbeeren und vom Likör erstellt und miteinander verglichen (Abbildung 18). Die Unterschiedlichkeit der Profile spiegelt den ersten Eindruck des Likörs wider, dessen Geruch nicht an Stachelbeeren erinnerte.

Ananas 2 grün- muffig fruchtig 1

Stachelbeerenlikör

pilzig 0 Apfel frische Stachelbeeren (Achilles)

süß-blumig grasig

sauer

Abbildung 18: Vergleich der Aromaprofile von frischen Stachelbeeren und vom Stachelbeerenlikör

Ergebnisse und Diskussion

4.1.5 Zusammenfassung Durch die Isolierung der flüchtigen Verbindungen aus frischen Stachelbeeren mittels VHS und kapillargaschromatographisch-massenspektrometrische Untersuchung der Extrakte wurden 127 Verbindungen identifiziert. Das flüchtige Profil der Beeren wurde durch

C6-Komponenten und Ester dominiert. Die drei Hauptkomponenten (Z)-Hex-3-enal, (E)-Hex-2-enal und Methylbutanoat repräsentierten in allen untersuchten Chargen mindestens 70 % der Summe an flüchtigen Verbindungen. Durch die Analyse von sieben Chargen Stachelbeeren der Sorte Achilles sowie durch den Vergleich der flüchtigen Spektren von sieben unterschiedlichen Stachelbeersorten wurde gezeigt, dass die Verhältnisse der Stoffgruppen zueinander sowie die Konzentrationen der einzelnen Verbindungen stark variieren. Innerhalb der Stoffgruppen waren die Verhältnisse der Komponenten zueinander allerdings vergleichbar: Methylester lagen stets höher konzentriert vor als ihre korrespondierenden Ethylester, und (Z)-Hex-3-enal repräsentierte durchgängig die Hauptverbindung des C6-Spektrums. Durch Inhibierungsversuche wurde gezeigt, dass das primär gebildete Profil an

C6-Komponenten durch nachfolgende Reduktionen und Isomerisierungen kaum verändert wird. Die Tiefkühlung von Stachelbeeren führte jedoch zu einer stark verminderten

Bildung der C6-Komponenten. Die Analyse unreifer und überreifer Stachelbeeren zeigte starke reifungsabhängige Veränderungen der Zusammensetzung des flüchtigen Spektrums. Das in unreifen Beeren fast ausschließlich durch C6-Komponenten geprägte Profil wird im Zuge der Reifung immer stärker durch Ester dominiert. Weiterhin erfolgte die Analyse von Stachelbeeren durch zwei weitere schonende Extraktionsmethoden. Die durch VHS ermittelte prozentuale Verteilung der Stoffgruppen sowie die der einzelnen Komponenten innerhalb der Ester und C6-Gruppe konnte mittels LLE bestätigt werden. Außerdem wurden 19 weitere Verbindungen nach LLE identifiziert. Aufgrund der unterschiedlichen Probenvorbereitung konnten die mittels VHS und LLE erhaltenen absoluten Konzentrationen jedoch nicht direkt miteinander verglichen werden. Durch die Anwendung der HS wurden die zwei stark flüchtigen Ester Methylacetat und Ethylacetat als weitere Hauptverbindungen des flüchtigen Spektrums von Stachelbeeren identifiziert und quantifiziert. Die mittels VHS gewonnenen wässrigen Destillate wiesen den typischen Geruch von Stachelbeeren auf. Mittels sensorischer Analyse der Extrakte (AEVA) und Berechnung der Aromawerte wurden vor allem Lipidoxidationsprodukte ((Z)-Hex-3-enal, (R)-Oct-1-en- 3-ol, und (Z)-Hex-3-en-ol) und kurzkettige Ester (Ethylbutanoat, Methylbutanoat) als aromaaktive Komponenten identifiziert. Rekombinationsversuche bestätigten die

Ergebnisse und Diskussion

Bedeutung dieser Komponenten für das Aroma von Stachelbeeren; das natürliche Aroma konnte jedoch nicht vollständig nachgeahmt werden. Die Untersuchung der flüchtigen Verbindungen im Zuge der Reifung von Stachelbeeren ergab drastische Konzentrationsänderungen für (Z)-Hex-3-enal und Ethylacetat. Die fortschreitende Reifung führte zu einer verminderten Bildung des C6-Aldehydes und zu einer verstärkten Generierung des Esters. Wurde das Verhältnis der Aromawerte dieser beiden Komponenten von 1:1 (Ethylacetat: (Z)-Hex-3-enal) überschritten, führte die Dominanz von Ethylacetat zu einem deutlichen, Klebstoff-artigen Aromafehlton. Das flüchtige Spektrum und das Aromaprofil eines im Handel erhältlichen Stachelbeerlikörs zeigten kaum Ähnlichkeiten mit denen der frischen Beere.

Ergebnisse und Diskussion

4.2 Analyse der flüchtigen Verbindungen in Jostabeeren

4.2.1 Identifizierung und Quantifizierung der flüchtigen Verbindungen mittels VHS

4.2.1.1 Einleitung

Die Züchtung der Jostabeere (Ribes x nidigrolaria Bauer) erfolgte um 1950. Sie stellt ein Kreuzungsprodukt aus Stachelbeere (Ribes uva crispa L.) und Schwarzer Johannisbeere (Ribes nigrum L.) dar. Ihre Früchte werden hauptsächlich zum frischen Verzehr oder nach Verarbeitung zu Konfitüren und Getränken verwendet (Bauer 1978). Bisher waren keine Daten über das flüchtige Profil von Jostabeeren bekannt. Ziel der vorliegenden Untersuchungen war es daher, die flüchtigen Inhaltsstoffe von Jostabeeren zu identifizieren und zu quantifizieren sowie einen Überblick über die Variabilität des flüchtigen Profils zu erhalten. Durch die Anwendung der VHS wurde nicht nur das flüchtige Profil reifer Jostabeeren untersucht, es wurden zusätzlich Untersuchungen zum Einfluss verschiedener Parameter, wie der Tiefkühllagerung und der Fruchtreife, auf das flüchtige Spektrum vorgenommen.

4.2.1.2 Zusammensetzung des flüchtigen Profils der frischen Beeren

Die in frischen Jostabeeren enthaltenen flüchtigen Verbindungen wurden mittels VHS isoliert. Die Vorteile dieser Technik wurden bereits unter Kapitel 4.1.1.1 diskutiert. Durch die kapillargaschromatographische Analyse der erhaltenen Isolate wurden insgesamt 131 Verbindungen identifiziert. Diese sind in Tabelle 22 aufgelistet. Ein beispielhaftes Chromatogramm zeigt Abbildung 19.

Tabelle 22: In VHS-Extrakten frischer Jostabeeren identifizierte Verbindungen

Nr.a Verbindung RIb nc Identifizierung

1 Propanal 801 4 d 2 Ethylformiat 822 10 e 3 Methylacetat 824 4 d 4 Prop-2-enal 843 2 d 5 Ethylacetat 886 10 d 6 2-Methylbutanal 909 1 d 7 3-Methylbutanal 912 1 d 8 Ethanol 931 5 d 9 Ethylpropanoat 945 3 d 10 Pentanal 963 7 d 11 Pentan-3-on 963 8 e 12 Pentan-2-on 963 2 d 13 Propylacetat 963 5 d 14 Methylbutanoat 975 10 d 15 2-Methylpropylacetat 1005 1 d 85

Ergebnisse und Diskussion

Nr.a Verbindung RIb nc Identifizierung

16 Pent-1-en-3-on 1009 10 d 17 α-Pinen 1013 2 d 18 Ethylbutanoat 1034 10 d 19 2-Methylbut-3-en-2-ol 1041 10 d 20 Camphen 1051 4 d 21 Butylacetat 1061 5 d 22 Hexanal 1075 10 d 23 2-Methylpropan-1-ol 1084 10 d 24 β-Pinen 1093 6 d 25 (E)-Methylbut-2-enoat 1096 9 d 26 (Z)-Pent-2-enal 1101 3 e 27 Sabinen 1106 7 d 28 3-Methylbutylacetat 1110 4 d 29 (E)-Pent-2-enal 1120 10 d 30 Pentan-2-ol 1123 5 d 31 Hex-5-enal 1127 8 e 32 (E)-Hex-3-enal 1133 10 d 33 (Z)-Hex-3-enal 1138 10 d 34 Butan-1-ol 1142 6 d 35 (E)-Ethylbut-2-enoat 1158 9 d 36 Pent-1-en-3-ol 1160 10 d 37 Myrcen 1165 1 d 38 Heptan-2-on 1176 1 d 39 Methylhexanoat 1184 10 d 40 (Z)-Hex-2-enal 1194 10 d 41 Limonen 1196 3 d 42 1,8-Cineol 1200 10 d 43 (E)-Hex-2-enal 1211 10 d 44 Ethyl-2-methylbut-2-enoat 1223 1 e 45 Ethylhexanoat 1232 9 d 46 γ-Terpinen 1238 9 d 47 3-Methylbut-2-enylacetat 1251 5 d 48 Pentan-1-ol 1252 6 d 49 Octan-3-on 1254 4 d 50 p-Cymen 1255 2 d 51 Acetoin 1259 6 d 52 Hexylacetat 1263 8 d 53 Terpinolen 1272 7 d 54 Oct-1-en-3-on 1296 3 d 55 (E)-Pent-2-en-1-ol 1315 9 e 56 (E)-Hept-2-enal 1317 1 d 58 (Z)-Pent-2-en-1-ol 1322 10 d 57 2-Methylbut-3-en-1-ol 1325 1 d 59 (E)-Hex-2-enylacetat 1332 10 d 60 Hexan-1-ol 1355 10 d 61 (E)-Hex-3-en-1-ol 1364 10 d 62 Methyl-2-hydroxybutanoat 1374 1 f 63 (Z)-Hex-3-en-1-ol 1384 10 d 64 Methyloctanoat 1387 10 d 65 Nonanal 1391 8 d 66 (E)-Hex-2-en-1-ol 1406 10 d 67 (Z)-Hex-2-en-1-ol 1417 8 d 68 (E)-Oct-2-enal 1424 2 d 69 (E)-Linalooloxid 1428 1 e 70 Ethyloctanoat 1436 7 d 71 Essigsäure 1443 10 d 72 (R)-Oct-1-en-3-ol 1452 10 d,h 73 Menthon 1457 2 d 86

Ergebnisse und Diskussion

Nr.a Verbindung RIb nc Identifizierung

74 Heptadienal-Isomer 1459 4 e 75 Octylacetat 1463 1 d 76 (E,E)-Hepta-2,4-dienal 1475 4 d 77 2-Ethylhexan-1-ol 1492 3 d 78 Decanal 1495 2 d 79 Campher 1499 1 d 80 (E)-Hexa-3,5-dien-1-ol 1504 1 e 81 (Z)-Hexa-3,5-dien-1-ol 1507 2 e 82 Benzaldehyd 1516 5 d 83 Propionsäure 1536 7 d 84 Linalool 1548 1 d 85 Linalylacetat 1552 2 d 86 Octan-1-ol 1560 9 d 87 2-Methylpropansäure 1562 1 d 88 Propylenglykol 1590 3 d 89 Terpinen-4-ol 1592 10 d 90 Methyldecanoat 1594 7 d 91 Kohlenwasserstoff C 16 1600 2 d 92 Methylbenzoat 1613 10 d 93 Buttersäure 1623 7 d 94 Ethyldecanoat 1635 7 d 95 Acetophenon 1640 2 d 96 Menthol 1644 2 d 97 Nonan-1-ol 1646 3 d 98 Ethylbenzoat 1659 5 d 99 2- und 3-Methylbuttersäure 1672 3 d 100 α-Terpineol 1685 10 d 101 Borneol 1688 3 d 102 Kohlenwasserstoff C 17 1700 3 d 103 2-Hydroxy-1,8-cineol 1721 9 e 104 Benzylacetat 1725 8 d 105 Methylsalicylat 1769 10 d 106 Ethylsalicylat 1783 5 d 107 Isopropyllaurat 1794 7 e 108 Kohlenwasserstoff C 18 1800 1 d 109 Chrysanthenylacetat 1802 2 e 110 Hexansäure 1841 8 d 111 2-Hydroxy-1,8-cineol 1859 5 g 112 Benzylalkohol 1871 8 d 113 (Z)-Geranylaceton 1876 1 d 114 2-Phenylethan-1-ol 1906 3 d 115 Kohlenwasserstoff C 19 1903 2 d 116 3,5-di-tert-Butyl-4-hydroxytoluol (BHT) 1912 8 e 117 Heptansäure 1943 1 d 118 (E)-Hex-3-ensäure 1951 6 d 119 (E)-Hex-2-ensäure 1961 7 d 120 Kohlenwasserstoff C 20 1999 3 d 121 p-Mentha-1.4-dien-7-ol 2053 1 e 122 Octansäure 2057 5 d 123 Kohlenwasserstoff C 21 2098 2 d 124 Nonansäure 2164 2 d 125 Kohlenwasserstoff C 22 2203 2 d 126 Isopropylpalmitat 2241 5 e 127 Kohlenwasserstoff C 23 2299 4 d 128 Isoeugenol 2315 1 d 129 Kohlenwasserstoff C 24 2399 3 d 130 Phthalat 2539 6 e,i

Ergebnisse und Diskussion

Nr.a Verbindung RIb nc Identifizierung

131 Phthalat 2697 3 d,i a: Die Nummern entsprechen den Verbindungen in Abbildung 19 und Tabelle 23. b: Retentionsindices (DB-WAX). c: Identifiziert in n von 10 Chargen. d: Die Identifizierung der Verbindungen erfolgte mit Hilfe von Referenzsubstanzen. e: Die Identifizierung erfolge durch Abgleich massenspektrometrischer Daten mit Literaturangaben. f: Die Identifizierung erfolgte durch Abgleich massenspektrometrischer und gaschromatographischer Daten mit Literaturangaben. g: Die Identifizierung erfolgte durch Synthese der Substanz nach 3.1.3. h: Identifizierung des Enantiomers durch den Vergleich kapillargaschromatographischer Daten mit einer Referenzsubstanz auf einer 2,3-di-O-acetyl-6-O-tert-butyldimethylsilyl-β-cyclodextrin-Säule. i: nicht eindeutig identifizierbare Phthalsäureester.

Ergebnisse und Diskussion

18 19 60 63 20 5 14 42 43 IS 66

33 10 [mV]

5 22 89 92 2 130 39 51 23 61 71 100 10-13 35 40 72 32 5258 98 16 36 45 93 110 116 131 1 29 64 81 105 112 8 47 55 59 86 104 128 67 118 122 124 0 0 20 40 60 80 Zeit [min]

Abbildung 19: Kapillargaschromatographische Trennung (DB-WAX) der mittels Vakuum Headspace Technik aus Jostabeeren (03.07.11; Konzentrationen siehe Tabelle 23) isolierten flüchtigen Verbindungen (die angegebenen Nummern entsprechen den Verbindungen in Tabelle 22 und Tabelle 23; Bedingungen siehe Material und Methoden; IS: interner Standard Heptan-2-ol)

Ergebnisse und Diskussion

In Tabelle 23 sind die Konzentrationen der nachgewiesenen Verbindungen beispielhaft für drei Chargen Jostabeeren aus dem Jahr 2011 von unterschiedlichen Standorten in Süddeutschland aufgeführt. Die höchsten Konzentrationen wurden in allen analysierten Chargen für (E)-Hex-2-enal, (E)-Hex-2-en-1-ol, (Z)-Hex-3-enal, (Z)-Hex-3-en-1-ol, Methylbutanoat, Ethylbutanoat, 2-Methylbut-3-en-2-ol und 1,8-Cineol erhalten. Diese Verbindungen machten stets über 91 % der Summe an flüchtigen Verbindungen in

Jostabeeren aus. Als Hauptstoffgruppen dominierten C6-Komponenten und Ester.

Tabelle 23: Konzentrationen der nach VHS quantifizierten Verbindungen in drei Chargen Jostabeeren

Nr.a Verbindungen RIb Lindau Deutenkofen Hangenham

(03.07.11) (04.07.11) (04.07.11)

[µg/kg]c

C6-Komponenten 43 (E)-Hex-2-enal 1211 6027 ± 439 5793 ± 857 5176 ± 507 d 66 (E)-Hex-2-en-1-ol 1406 1663 ± 159 1745 ± 920 1547 ± 634 d 33 (Z)-Hex-3-enal 1138 798 ± 125 2299 ± 426 1454 ± 916 d 63 (Z)-Hex-3-en-1-ol 1384 712 ± 143 491 ± 93 502 ± 185 d 32 (E)-Hex-3-enal 1133 164 ± 48 275 ± 80 246 ± 20 d 22 Hexanal 1075 144 ± 23 128 ± 81 140 ± 21 d 60 Hexan-1-ol 1355 170 ± 53 48 ± 18 118 ± 47 d 61 (E)-Hex-3-en-1-ol 1364 78 ± 7 52 ± 20 57 ± 17 e 40 (Z)-Hex-2-enal 1194 45 ± 10 66 ± 25 39 ± 7 f 67 (Z)-Hex-2-en-1-ol 1417 5 ± 1 5 ± 2 7 ± 4 e 31 Hex-5-enal 1127 n.q.i 4 ± 1 4 ± 1 f

Ester 14 Methylbutanoat 975 3664 ± 905 1851 ± 448 5409 ± 621 d 18 Ethylbutanoat 1034 633 ± 112 445 ± 86 1698 ± 176 d 25 (E)-Methylbut-2-enoat 1096 139 ± 27 92 ± 16 108 ± 6 d 35 (E)-Ethylbut-2-enoat 1158 24 ± 5 24 ± 4 77 ± 9 d 39 Methylhexanoat 1184 63 ± 4 19 ± 2 74 ± 10 d 92 Methylbenzoat 1613 48 ± 5 62 ± 5 48 ± 9 d 45 Ethylhexanoat 1232 13 ± 5 n.q. 26 ± 8 e 98 Ethylbenzoat 1659 13 ± 11 22 ± 1 24 ± 4 e 52 Hexylacetat 1263 3 ± 2 4 ± 1 23 ± 5 e 64 Methyloctanoat 1387 20 ± 6 11 ± 2 23 ± 0 e 130 Phthalat 2539 24 ± 14 5 ± 5 2 ± 2 f,p 131 Phthalat 2697 5 ± 4 n.q. n.q. e,p 104 Benzylacetat 1725 9 ± 1 10 ± 4 14 ± 4 e 21 Butylacetat 1061 5 ± 1 4 ± 3 11 ± 3 e 70 Ethyloctanoat 1436 3 ± 2 2 ± 2 11 ± 2 e 59 (E)-Hex-2-enylacetat 1332 8 ± 2 16 ± 8 9 ± 4 e 47 3-Methylbut-2-enylacetat 1251 n.d.k 7 ± 3 8 ± 3 e 105 Methylsalicylat 1769 13 ± 5 12 ± 1 8 ± 2 e 90 Methyldecanoat 1594 n.q. n.q. 6 ± 2 e 15 2-Methylpropylacetat 968 n.d. n.d. 5 ± 1 e 106 Ethylsalicylat 1783 n.q. 2 ± 1 3 ± 1 e 9 Ethylpropanoat 945 n.q. n.q. n.q. e 28 3-Methylbutylacetat 1110 n.d. n.q. n.q. e 75 Octylacetat 1463 n.d. n.d. n.q. e 109 Chrysanthenylacetat 1802 n.d. n.q. n.d. e 90

Ergebnisse und Diskussion

Nr.a Verbindungen RIb Lindau Deutenkofen Hangenham

(03.07.11) (04.07.11) (04.07.11)

[µg/kg]c

85 Linalylacetat 1552 n.q. n.d. n.q. e 94 Ethyldecanoat 1635 n.q. n.d. n.q. e 2 Ethylformiat 822 n.k. n.k. n.k. g 5 Ethylacetat 886 n.k. n.k. n.k. g 3 Methylacetat 824 n.k. n.k. n.k. g

Alkohole 19 2-Methylbut-3-en-2-ol 1041 1182 ± 197 1051 ± 287 1995 ± 144 d 23 2-Methylpropan-1-ol 1084 33 ± 7 26 ± 6 117 ± 32 e 58 (Z)-Pent-2-en-1-ol 1322 30 ± 2 37 ± 5 39 ± 3 e 34 Butan-1-ol 1042 15 ± 2 8 ± 3 38 ± 10 e 72 (R)-Oct-1-en-3-ol 1452 35 ± 9 134 ± 27 25 ± 4 d 36 Pent-1-en-3-ol 1160 24 ± 3 23 ± 3 24 ± 3 e 86 Octan-1-ol 1560 9 ± 4 12 ± 3 14 ± 2 e 81 (Z)-Hexa-3,5-dien-1-ol 1507 12 ± 3 n.d. 10 ± 2 f 48 Pentan-1-ol 1252 n.q. 6 ± 1 9 ± 2 e 112 Benzylalkohol 1871 4 ± 1 5 ± 0 7 ± 1 e 55 (E)-Pent-2-en-1-ol 1315 n.q. 16 ± 6 7 ± 1 f 8 Ethanol 931 7 ± 2 12 ± 5 n.d. e 30 Pentan-2-ol 1123 3 ± 3 n.q. 3 ± 3 e 121 p-Mentha-1,4-dien-7-ol 2053 n.d. 3 ± 0 n.d. f 97 Nonan-1-ol 1646 n.q. n.q. n.q. e 77 2-Ethylhexan-1-ol 1492 n.d. n.q. n.q. e 114 2-Phenylethan-1-ol 1906 n.d. n.q. n.q. e 80 (E)-Hexa-3,5-dien-1-ol 1504 n.q. n.d. n.d. f

Terpene/Terpenalkohole 42 1,8-Cineol 1200 647 ± 115 536 ± 50 557 ± 84 d 89 Terpinen-4-ol 1592 101 ± 39 47 ± 6 34 ± 4 d 100 α-Terpineol 1685 26 ± 12 22 ± 3 15 ± 3 e 24 β-Pinen 1093 6 ± 3 7 ± 2 8 ± 2 e 103 2-Hydroxy-1,8-cineol 1721 3 ± 1 4 ± 0 4 ± 1 f 46 γ-Terpinen 1238 4 ± 2 6 ± 1 4 ± 1 e 27 Sabinen 1106 n.d. 4 ± 1 2 ± 2 e 111 2-Hydroxy-1,8-cineol 1859 4 ± 0 2 ± 2 n.q. f 53 Terpinolen 1272 n.q. 13 ± 2 n.q. d 128 Isoeugenol 2315 4 ± 4 n.d. n.d. e 41 Limonen 1196 n.q. 3 ± 1 n.d. d 20 Camphen 1051 n.q. n.q. n.q. e 50 p-Cymen 1255 n.d. 3 ± 0 n.q. e 17 α-Pinen 1013 n.d. n.q. n.q. d 37 Myrcen 1165 n.d. n.d. n.q. d 96 Menthol 1644 n.d. n.q. n.q. e 79 Camphor 1499 n.d. n.d. n.q. e 101 Borneol 1688 n.q. n.d. n.d. e

Aldehyde 29 (E)-Pent-2-enal 1120 22 ± 4 36 ± 10 25 ± 4 e 65 Nonanal 1391 n.q. 9 ± 3 5 ± 0 e 4 Prop-2-enal 843 n.q. 14 ± 7 n.d. e 1 Propanal 801 n.q. 7 ± 3 n.d. e 82 Benzaldehyd 1516 n.q. n.q. n.q. e 76 (E,E)-Hepta-2.4-dienal 1475 n.d. n.q. n.q. e 6 2-Methylbutanal 909 n.q. n.d. n.d. e 91

Ergebnisse und Diskussion

Nr.a Verbindungen RIb Lindau Deutenkofen Hangenham

(03.07.11) (04.07.11) (04.07.11)

[µg/kg]c

7 3-Methylbutanal 912 n.q. n.d. n.d. e 56 (E)-Hept-2-enal 1317 n.d. n.q. n.d. d

Ketone 16 Pent-1-en-3-on 1009 20 ± 4 62 ± 6 49 ± 9 e 49 Octan-3-on 1254 n.q. 2 ± 2 2 ± 2 e 95 Acetophenon 1640 n.d. n.q. n.q. d 54 Oct-1-en-3-on 1296 n.d. n.q. n.d. e 73 Menthon 1457 n.d. n.d. n.q. e 113 (Z)-Geranylaceton 1876 n.q. n.d. n.d. e 51 Acetoin 1259 n.k. n.k. n.k. g

Säuren 71 Essigsäure 1443 n.k. n.k. n.k. g 83 Propionsäure 1536 n.k. n.k. n.k. g 87 2-Methylpropansäure 1562 n.k. n.k. n.k. g 93 Buttersäure 1623 n.k. n.k. n.k. g 99 2- und 3-Methylbuttersäure 1672 n.k. n.k. n.k. g 110 Hexansäure 1841 n.k. n.k. n.k. g 117 Heptansäure 1943 n.k. n.k. n.k. g 118 (E)-Hex-3-ensäure 1951 n.k. n.k. n.k. g 119 (E)-Hex-2-ensäure 1961 n.k. n.k. n.k. g 122 Octansäure 2057 n.k. n.k. n.k. g 124 Nonansäure 2164 n.k. n.k. n.k. g

Sonstige 10-13 C5-Komponenten 963 32 ± 4 27 ± 10 36 ± 6 e 3,5-di-tert-Butyl-4- 116 1912 28 ± 11 33 ± 1 30 ± 3 f hydroxytoluol 69 (E)-Linalooloxid 1428 n.d. n.d. n.k. f a: Die Nummern entsprechen den Verbindungen in Abbildung 19 und Tabelle 22. b: Retentionsindices. c: Mittelwert und Standardabweichung einer Dreifachbestimmung. d: Die Quantifizierung erfolgte unter Berücksichtigung des gaschromatographischen Verhaltens (Response) und der Wiederfindung (siehe Anhang). e: Die Quantifizierung erfolgte unter Berücksichtigung des gaschromatographischen Verhaltens. f: Für die Quantifizierung wurde der Responsefaktor 1 angenommen. g: nicht kalkulierbar, da die Wiederfindung unterhalb 25 % lag (siehe Anhang). h: Nicht quantifizierbar, da die Konzentration unterhalb der Bestimmungsgrenze (1,7 µg/kg) lag. i: Nicht identifizierbar, da die Konzentration unterhalb der Nachweisgrenze (0,6 µg/kg) lag. k: Koelution von Propylacetat, Pentan-2-on, Pentan-3-on und Pentanal. m: Identifizierung des Enantiomers durch den Vergleich der Retentionszeit mit einer authentischen Referenzsubstanz auf einer (2.3-di-O-acetyl-6-O-tert- butyldimethylsilyl)-β-cyclodextrin-Säule (siehe 4.2.1.4). n: Die Enantiomere konnten mit den verwendeten chiralen Phasen nicht ausreichend getrennt werden (siehe 4.2.1.4). o: Bestimmung der Enantiomerenverhältnisse durch Abgleich der Retentionszeiten mit einer authentischen Referenzsubstanz auf einer 2,3-di-O-acetyl-6-O-tert- butyldimethylsilyl-β-cyclodextrin-Säule und Vergleich mit Literaturangaben: 65 % (S) : 35 % (R) (siehe 4.2.1.4). p: nicht eindeutig identifizierbare Phthalsäureester.

Ergebnisse und Diskussion

C6-Komponenten

Das C6-Profil von Jostabeeren wurde quantitativ von (E)-Hex-2-enal dominiert. Diese

Verbindung ist bereits als Haupt-C6-Verbindung aus anderen Früchten wie Kiwis und Nektarinen bekannt (Young et al. 1995, Engel et al. 1988). In Jostabeeren lagen zusätzlich der korrespondierende Alkohol (E)-Hex-2-en-1-ol sowie (Z)-Hex-3-enal und (Z)-Hex-3-en-1- ol in recht hohen Konzentrationen vor.

Ester

Das Esterprofil frischer Jostabeeren wird hauptsächlich durch den kurzkettigen Ester Methylbutanoat geprägt. Allein dieser Ester stellte bis zu 27 % des flüchtigen Profils und bis zu 87 % der Esterfraktion dar. Auch bei den niedriger konzentrierten Estern, wie beispielsweise Methyl- und Ethylhexanoat und Methyl- und Ethyloctanoat dominierte stets die Methylverbindung. Wie bereits unter 4.1.1.2 diskutiert, ist diese Dominanz bisher nicht häufig in Früchten nachgewiesen worden.

Weitere flüchtige Verbindungen

Neben den C6-Verbindungen und Estern zählen 1,8-Cineol und 2-Methylbut-3-en-2-ol zu den flüchtigen Hauptkomponenten in Jostabeeren. 1,8-Cineol, oder auch Eukalyptol, ist als Hauptkomponente des ätherischen Öls aus Eukalyptus bekannt. Ätherisches Eukalyptusöl der Art Eukalyptus globulus besteht aus bis zu 89 % 1,8-Cineol und findet zahlreiche Anwendungen zur Aromatisierung von Lebensmitteln, Getränken, Kosmetika oder auch in der Duftindustrie (Vilela et al. 2009, Harborne und Baxter 1993). Zusätzlich wurde 1,8-Cineol auch in den Ölen aus Rosmarin, Salbei, Basilikum und Lorbeer nachgewiesen (da Silveira et al. 2012, Ehrnhöfer-Ressler et al. 2013). 1,8-Cineol zeichnet sich durch ein charakteristisches, frisches, kampferartiges Eukalyptus-Aroma aus. Außerdem wurde eine biologische Aktivität der Verbindung gegen Pflanzen, Mikroorganismen und Insekten nachgewiesen (García et al. 2009). 2-Methylbut-3-en-2-ol wurde unter anderem als flüchtige Verbindung des Kreosotbusches (Jardine et al. 2010) sowie in Honig (Soria et al. 2008) und im Matsutake-Pilz (Cho et al. 2007) nachgewiesen. Es zeichnet sich durch ein krautiges Aroma aus und fungiert als Pheromon (Cho et al. 2007, Veith et al. 1984). Zeidler und Lichtenthaler untersuchten die enzymatische Bildung von 2-Methylbut-3-en-2-ol aus Dimethylallylpyrophosphat in den Nadeln der Gelb-Kiefer (Zeidler und Lichtenthaler 2001).

Ergebnisse und Diskussion

Variabilität des flüchtigen Profils frischer Jostabeeren

Die in Tabelle 23 gezeigten drei Chargen Jostabeeren stammten alle aus dem gleichen Erntejahr (2011). Trotz der unterschiedlichen Anbauorte sind die flüchtigen Profile der drei Chargen sehr ähnlich. Die einzelnen Verbindungen liegen in drei Chargen in nahezu gleichen Konzentrationen vor. Der auffälligste Unterschied sind die leicht erhöhten Konzentrationen von Methyl- und Ethylbutanoat in der Charge vom 04.07.11 aus Hangenham. In einer weiteren Untersuchung sollte der Einfluss des Jahres auf die Zusammensetzung des flüchtigen Profils der Jostabeeren untersucht werden. Hierzu wurden Beeren in zwei (Lehr- und Beispielbetrieb Deutenkofen) bzw. drei (Staudengarten der Hochschule Weihenstephan- Triesdorf, Freising) aufeinanderfolgenden Jahren am gleichen Standort geerntet. Da Jostabeeren nicht einheitlich reifen, sondern zur gleichen Zeit reife sowie unreife Beeren am selben Strauch zu finden sind, können in einem Jahr mehrfach - zu unterschiedlichen Zeitpunkten - reife Beeren desselben Strauchs geerntet werden. Dieses Phänomen wurde im Jahr 2012 am Standort Deutenkofen ausgenutzt und der Einfluss auf die Zusammensetzung der flüchtigen Verbindungen betrachtet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 24 dargestellt. Es wurden alle Verbindungen berücksichtigt, die in einer der Chargen in einer Konzentration ≥ 20 µg/kg nachgewiesen wurden.

Tabelle 24: Konzentrationen der Verbindungen nach VHS-Isolierung aus Jostabeeren desselben Standortes (Freising bzw. Deutenkofen) in verschiedenen Jahren

Freising Deutenkofen

2010 2011 2012 2011 2012 2012 19. Juli 13. Juli 16. Juli 04. Juli 02. Juli 11. Juli Substanz [µg/kg]

Methylbutanoat 695 ± 225 2330 ± 291 2000 ± 287 1851 ± 448 2019 ± 527 2045 ± 161 Ethylbutanoat 46 ± 20 348 ± 66 596 ± 149 445 ± 86 123 ± 34 254 ± 100 (E)-Methylbut-2-enoat 90 ± 4 125 ± 15 151 ± 31 92 ± 16 110 ± 18 165 ± 14 Methylbenzoat 160 ± 16 13 ± 3 34 ± 10 62 ± 5 109 ± 23 28 ± 5 Methylhexanoat 23 ± 5 40 ± 3 24 ± 1 19 ± 2 28 ± 9 49 ± 6 (E)-Ethylbut-2-enoat 4 ± 1 22 ± 4 62 ± 9 24 ± 4 7 ± 1 24 ± 6 Ethylbenzoat n.d.a n.d. n.d. 22 ± 1 n.d. n.d. Summe: 1018 2879 2867 2515 2395 2566

(E)-Hex-2-enal 8066 ± 109 9613 ± 819 11473 ± 2730 5793 ± 857 13583 ± 1393 8686 ± 1230 (Z)-Hex-3-enal 652 ± 142 565 ± 226 322 ± 198 2299 ± 2426 6006 ± 852 237 ± 24 (E)-Hex-2-en-1-ol 862 ± 325 525 ± 180 438 ± 151 1745 ± 920 381 ± 31 1108 ± 232 Hexanal 158 ± 33 365 ± 75 330 ± 114 128 ± 81 486 ± 36 183 ± 22 (Z)-Hex-3-en-1-ol 223 ± 19 186 ± 11 127 ± 13 491 ± 93 264 ± 20 259 ± 29 (E)-Hex-3-enal 149 ± 74 233 ± 22 160 ± 30 275 ± 80 318 ± 34 197 ± 27 (Z)-Hex-2-enal 68 ± 16 45 ± 4 30 ± 3 66 ± 25 44 ± 10 49 ± 7 Hexan-1-ol 45 ± 10 43 ± 10 35 ± 3 48 ± 18 25 ± 4 82 ± 16 (E)-Hex-3-en-1-ol 34 ± 14 25 ± 3 8 ± 7 52 ± 20 10 ± 1 34 ± 5 Summe: 10256 11601 12921 10897 21117 10835 94

Ergebnisse und Diskussion

Freising Deutenkofen

2010 2011 2012 2011 2012 2012 19. Juli 13. Juli 16. Juli 04. Juli 02. Juli 11. Juli Substanz [µg/kg]

2-Methylbut-3-en-2-ol 586 ± 74 1670 ± 548 1378 ± 197 1051 ± 287 1011 ± 328 1076 ± 89 1,8-Cineol 453 ± 97 308 ± 51 484 ± 80 536 ± 50 430 ± 7 631 ± 63 Pent-1-en-3-on 28 ± 2 57 ± 10 49 ± 12 62 ± 6 69 ± 13 49 ± 8 Oct-1-en-3-ol 5 ± 1 68 ± 16 10 ± 3 134 ± 27 32 ± 7 17 ± 6 (E)-Pent-2-enal 29 ± 3 30 ± 7 22 ± 3 36 ± 10 27 ± 5 32 ± 7 (Z)-Pent-2-en-1-ol 22 ± 1 27 ± 3 18 ± 1 37 ± 5 28 ± 1 23 ± 2 Pent-1-en-3-ol 8 ± 2 21 ± 3 17 ± 1 23 ± 3 28 ± 2 20 ± 1 Terpinen-4-ol 22 ± 6 14 ± 5 10 ± 2 47 ± 6 7 ± 1 5 ± 1 2-Methylpropan-1-ol 18 ± 9 4 ± 0 7 ± 9 26 ± 6 9 ± 9 15 ± 20 α-Terpineol 14 ± 6 5 ± 3 3 ± 3 22 ± 3 3 ± 0 7 ± 2 Summe: 1186 2205 1998 1976 1645 1875

Gesamt: 12459 16685 17787 15387 25157 15276 a: Nicht identifizierbar, da die Konzentration unterhalb der Nachweisgrenze (0,6 µg/kg) lag.

Wie bereits im Jahr 2011 für die unterschiedlichen Anbauorte festgestellt wurde, stellte sich auch in den Jahren 2010 bis 2012 die Reife der Beeren im gleichen, sehr engen Zeitraum ein (Tabelle 23 und Tabelle 24). Die Konzentrationen der einzelnen sowie die Summen aller flüchtigen Komponenten der in Freising geernteten Jostabeeren waren in den Jahren 2011 und 2012 sehr ähnlich. Auch die Konzentrationen der meisten C6-Komponenten und Alkohole der Charge aus dem Jahr 2010 stimmen gut mit jenen der anderen Jahre überein. Die Esterkonzentrationen sowie die Menge an 2-Methylbut-3-en-2-ol liegen jedoch deutlich niedriger. Der Vergleich der zweifachen Ernte innerhalb des Jahres 2012 (Deutenkofen) zeigte, dass sich die flüchtige Zusammensetzung der Jostabeeren je nach Reifezeitpunkt innerhalb eines Jahres verändert. Während die Konzentrationen der Ester, Alkohole, Terpenalkohle,

Aldehyde und Ketone nahezu unbeeinflusst blieben, nahm die Menge an C6-Verbindungen zum späteren Erntezeitpunkt deutlich ab. Sie sank von 21117 µg/kg auf 10835 µg/kg. Das

Verhältnis der C6-Aldehyde und C6-Alkohole verschob sich zum späteren Erntezeitpunkt auf die Seite der Alkohole. Die stärkste Abnahme wurde für den C6-Aldehyd (Z)-Hex-3-enal festgestellt. Der Vergleich der 2011 und 2012 geernteten Beeren aus Deutenkofen zeigte, dass sich die flüchtigen Profile der schwarz gefärbten, als reif geltenden Früchte unabhängig von früherer oder späterer Reifung bis auf die C6-Komponenten kaum unterschieden. Das flüchtige Profil reifer Jostabeeren ist folglich recht stabil. Trotz unterschiedlicher Anbauorte und Anbaujahre waren sowohl die Verteilung als auch die Summen der flüchtigen

Verbindungen in unterschiedlichen Chargen nahezu identisch. Die C6-Profile der früh und

Ergebnisse und Diskussion spät reifenden Jostabeeren am selben Strauch innerhalb einer Saison unterschieden sich jedoch in ihrer Zusammensetzung.

4.2.1.3 Einfluss der enzymkatalysierten Reaktionen auf das Spektrum von

C6-Verbindungen

Um analog zu den Versuchen mit Stachelbeeren (siehe 4.1.1.3) auch in Jostabeeren die

Dynamik der Bildung der C6-Komponenten verfolgen zu können, wurden Inhibierungsversuche mit Jostabeeren auf gleiche Weise durchgeführt. Die Ergebnisse der Enzyminhibierung zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Homogenisierung von Jostabeeren ist in Abbildung 20 dargestellt.

Hexanal 10

(E)-Hex-2-en-1-ol 8

(E)-Hex-3-enal 6 [mg/kg] (Z)-Hex-3-en-1-ol 4

(E)-Hex-2-enal

(Z)-Hex-3-enal

0 30 60 90 180 2 Sek Std

Abbildung 20: Durch VHS ermittelte Konzentrationen der C6-Komponenten in Jostabeeren: Enzyminhibierung nach unterschiedlichen Zeitintervallen (30, 60, 90 und 180 Sekunden) sowie ohne Inhibierung (2 Stunden Extraktionszeit)

Wie erwartet führte die längere Aktivität der Enzyme zu einer Zunahme der Summe an

C6-Komponenten. Bei der Durchführung ohne Inhibierung kam es allerdings zu einem leichten Rückgang der Summe an C6-Komponenten. Da die Inhibierungsversuche aus zeitlichen Gründen nur in Einfachbestimmungen durchgeführt wurden, könnte die natürliche 96

Ergebnisse und Diskussion

Inhomogenität der Früchte die Ursache der Abnahme darstellen. Nichtsdestotrotz konnte die

Dynamik der Bildung des für Jostabeeren typischen C6-Profils beobachtet werden: Während der ersten drei Minuten nach Zerstörung des Zellverbandes blieben die Verhältnisse der Komponenten ungefähr gleich, wobei (Z)-Hex-3-enal die Hauptverbindung darstellte, gefolgt von dessen Isomerisierungsprodukt (E)-Hex-2-enal. Fand aber keine Inhibierung der Enzyme statt, so veränderte sich das Profil drastisch: Nach zwei Stunden Isolierung mittels

VHS lag nur noch ein vergleichsweise geringer Anteil an (Z)-Hex-3-enal vor. Die Haupt-C6- Komponente stellte dann (E)-Hex-2-enal dar, was auch bereits für die anderen analysierten Chargen (Tabelle 23) gezeigt wurde. Demzufolge spielt die Aktivität der Isomerasen und

Alkoholdehydrogenasen für das C6-Profil in Jostabeeren eine entscheidende Rolle. Das primär gebildete (Z)-Hex-3-enal wird in nachfolgenden Reaktionen zum größten Teil in (E)-Hex-2-enal sowie in die Alkohole (Z)-Hex-3-en-1-ol und (E)-Hex-2-en-1-ol überführt.

Ähnliche Veränderungen wurden bereits für das C6-Profil in Rhabarber beobachtet (Dregus und Engel 2003).

4.2.1.4 Chirale Verbindungen in Jostabeeren

In Jostabeeren wurden die chiralen Verbindungen Oct-1-en-3-ol, Terpinen-4-ol, und α-Terpineol in Konzentrationen > 50 µg/kg nachgewiesen. Ziel war es, die in Jostabeeren vorliegenden Enantiomerenverteilungen dieser Verbindungen zu bestimmen. Die Untersuchung der Enantiomerenverhältnisse erfolgte mit Hilfe der Multidimensionalen Gaschromatographie. Wie aus Abbildung 21 ersichtlich ist, konnten unter Verwendung von 2,3-di-O-acetyl-6-O-tert- butyldimethylsilyl-β-cyclodextrin als chiraler stationärer Phase die Enantiomere von Oct-1-en- 3-ol sowie von α-Terpineol getrennt werden. Eine Basislinientrennung der Enantiomere von Terpinen-4-ol konnte mit keiner der verwendeten stationären Phasen (2,3-di-O-acetyl-6-O- tert-butyldimethylsilyl-β-cyclodextrin-Säule; 2,3-di-O-methyl-β-cyclodextrin-Säule; 2,3-di-O- ethyl-6-O-tert-butyldimethylsilyl-β-cyclodextrin-Säule; 2,3-MOM-γ-cyclodextrin-Säule) erzielt werden. In Abbildung 22 ist eine Antrennung zu erkennen, auf Basis derer die in Jostabeeren vorkommenden Enantiomerenverhältnisse abgeschätzt wurden. Für eine exakte Bestimmung der optischen Reinheit müsste jedoch eine andere stationäre Phase gefunden werden. Die Bestimmung der Elutionsreihenfolgen der Komponenten erfolgte für Oct-1-en-3- ol mit Hilfe eines aus Champignons gewonnen VHS-Extraktes und für α-Terpineol durch den Abgleich der Elutionsreihenfolge einer authentischen Referenzsubstanz und dem Vergleich mit Literaturdaten (Dugo et al. 2001). Für die Enantiomere von Terpinen-4-ol erfolgte keine Zuordnung.

Ergebnisse und Diskussion

[mV] (S) (R)

(a)

(S) (R)

(b)

(R)

(c)

(S) (R)

33 [min] 55

Abbildung 21: Enantioselektive MDGC-Analyse (a) einer racemischen Referenzsubstanz Oct-1-en-3-ol, (b) einer racemischen Referenzsubstanz α-Terpineol und (c) eines VHS-Extraktes aus Jostabeeren (GC-Bedingungen siehe Material und Methoden)

[mV]

(a)

(b)

24 [min] 48

Abbildung 22: Enantioselektive MDGC-Analyse (a) einer racemischen Referenzsubstanz Terpinen-4-ol und (b) eines VHS-Extraktes aus Jostabeeren (GC-Bedingungen siehe Material und Methoden)

Ergebnisse und Diskussion

Es wurden die Enantiomerenverhältnisse in mittels VHS und LLE (4.2.2) gewonnenen Extrakten aus reifen, frischen bzw. aus tiefgekühlten Jostabeeren untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 25 zusammengestellt.

Tabelle 25: Enantiomerenzusammensetzungen von Oct-1-en-3-ol, α-Terpineol und Terpinen-4-ol in Jostabeeren

Enantiomerenzusammensetzung [%] Oct-1-en-3-ola α-Terpineola Terpinen-4-olb (S) (R) (S) (R) ersteluierendes zweiteluierendes Enantiomer Frische, reife Beeren VHS-Extrakt <1 > 99 65 35 41 59 LLE-Extrakt <1 > 99 66 34 47 53

Reife Beeren nach Tiefkühllagerung LLE-Extrakt 11 89 64 36 36 64 a: Trennung der Enantiomere auf einer 2,3-di-O-acetyl-6-O-tert-butyldimethylsilyl-β-cyclodextrin-Säule mittels MDGC. b: lediglich Abschätzung, da nur Antrennung der Enantiomere auf einer 2,3-di-O-methyl-β-cyclodextrin- Säule mittels MDGC.

In den frischen Beeren lag stets das (R)-Enantiomer von Oct-1-en-3-ol in hoher optischer Reinheit vor. In den tiefgekühlt gelagerten Beeren stieg der Anteil an (S)-Oct-1-en-3-ol auf bis zu 11 %. Die Enantiomerenverteilung von α-Terpineol zeigte keine Beeinflussung durch die Tiefkühlung der Früchte. Das Verhältnis lag im Mittel bei 65 % (S) zu 35 % (R). Die Enantiomerenverteilung des Terpinen-4-ols konnte aufgrund der schlechten Trennung nur abgeschätzt werden. Es ergab sich eine leicht höhere Konzentration des zweiteluierenden Enantiomers. Bisher lagen keine Untersuchungen zu den Enantiomerenverteilungen von Oct-1-en-3-ol, α-Terpineol und Terpinen-4-ol in Jostabeeren vor. Untersuchungen der Enantiomerenverhältnisse chiraler Terpene und Terpenalkohole in Schwarzen Johannisbeeren zeigten ein Verhältnis von 62,8 (S) / 37,2 (R) für α-Terpineol und von 41,2 (S) / 58,8 (R) für Terpinen-4-ol (Orav et al. 2002). Diese in Schwarzen Johannisbeeren bestimmten Verhältnisse für α-Terpineol sind jenen in Jostabeeren sehr ähnlich.

4.2.1.5 Einfluss der Reife

Zusätzlich zu frischen Jostabeeren wurden unreife Beeren untersucht, und es folgte der Vergleich der flüchtigen Profile. Wie in Abbildung 23 zu sehen ist, zeigten die unreifen Jostabeeren eine grüne bis leicht rote Farbe, während die reifen Beeren eine fast schwarze Färbung aufwiesen. Die unreifen und reifen Beeren wurden zum gleichen Zeitpunkt von demselben Strauch geerntet, sodass die beobachteten Veränderungen nicht durch andere Faktoren, wie beispielsweise der Bodenbeschaffenheit oder der Sonneneinstrahlung,

Ergebnisse und Diskussion beeinflusst wurden. Die mittels VHS-Isolierung erhaltenen quantitativen Ergebnisse sind in Tabelle 26 dargestellt.

Abbildung 23: Unreife (links) und reife (rechts) Jostabeeren

Tabelle 26: Konzentrationen der flüchtigen Verbindungen in unreifen und reifen Jostabeeren

Verbindungen unreif reif [µg/kg]a

C6-Komponenten (E)-Hex-2-enal 2133 ± 1282 13583 ± 1393 (Z)-Hex-3-enal 17891 ± 2653 6006 ± 852 Hexanal 211 ± 13 486 ± 36 (E)-Hex-2-en-1-ol 260 ± 34 381 ± 31 (E)-Hex-3-enal 621 ± 105 318 ± 34 (Z)-Hex-3-en-1-ol 1042 ± 112 264 ± 20 (Z)-Hex-2-enal 22 ± 12 44 ± 10 Hexan-1-ol 28 ± 3 25 ± 4 (E)-Hex-3-en-1-ol 27 ± 6 10 ± 1 Summe 22237 21117 Ester Methylbutanoat 398 ± 92 2019 ± 527 Ethylbutanoat 9 ± 5 123 ± 34 (E)-Methylbut-2-enoat n.d.b 110 ± 18 Methylbenzoat 15 ± 2 109 ± 23 Methylhexanoat 10 ± 9 28 ± 9 Methyloctanoat 25 ± 6 17 ± 3 Ethyldecanoat n.d. 10 ± 2 Methyldecanoat n.d. 9 ± 2 Benzylacetat n.d. 7 ± 0 (E)-Ethylbut-2-enoat n.d. 7 ± 1 Methylsalicylat 4 ± 1 5 ± 1 (E)-Hex-2-enylacetat 4 ± 3 3 ± 3 Hexylacetat n.q. n.q. Ethylhexanoat n.d. n.q. 3-Methylbut-2-enylacetat n.q. n.d. Summe 466 2447 Alkohole 2-Methylbut-3-en-2-ol 94 ± 23 1011 ± 328 100

Ergebnisse und Diskussion

Verbindungen unreif reif [µg/kg]a

(R)-Oct-1-en-3-ol 148 ± 47 32 ± 7 (Z)-Pent-2-en-1-ol 30 ± 0 28 ± 1 Pent-1-en-3-ol 29 ± 3 28 ± 2 2-Methylpropan-1-ol n.q.c 9 ± 9 (E)-Pent-2-en-1-ol 4 ± 0 4 ± 0 Ethan-1-ol n.d. 4 ± 3 Benzylalkohol n.d. n.q. Pentan-2-ol n.q. n.d. Octan-1-ol 14 ± 4 n.d. Summe 319 1116 Terpene/Terpenalkohole 1,8-Cineol 342 ± 269 430 ± 7 Terpinen-4-ol 8 ± 1 7 ± 1 Sabinen 6 ± 2 5 ± 1 α-Terpineol 2 ± 2 3 ± 0 β-Pinen 2 ± 2 n.d. Terpinolen n.d. n.q. γ-Terpinen n.q. n.d. Summe 378 454 Ketone Pent-1-en-3-on 64 ± 4 69 ± 13 Oct-1-en-3-on 20 ± 9 n.d. Summe 84 69 Aldehyde (E)-Pent-2-enal 31 ± 5 27 ± 5 Nonanal 5 ± 2 n.q. (Z)-Pent-2-enal 21 ± 1 n.d. Summe 38 27 Sonstige d C5-Komponenten 12 ± 2 10 ± 2 Heptadienal-Isomer 6 ± 0 6 ± 1 1,2-Propandiol 6 ± 1 5 ± 3 Summe 24 21 a: Mittelwert und Standardabweichung aus einer Dreifachbestimmung. Ernte der unreifen und der reifen Beeren am 02.07.12 in Deutenkofen. b: Nicht identifizierbar (n.d.), da die Peakfläche unterhalb der Nachweisgrenze (0,6 µg/kg) lag. c: Nicht quantifizierbar (n.q.), da die Peakfläche unterhalb der Bestimmungsgrenze (1,7 µg/kg) lag. d: Koelution von Propylacetat, Pentan-2-on, Pentan-3-on und Pentanal.

Mit zunehmender Reife der Jostabeeren wurden steigende Gesamtkonzentrationen der Ester (von 466 µg/kg auf 2447 µg/kg) und Alkohole (von 315 µg/kg auf 1112 µg/kg) festgestellt. Der höhere Gehalt an Estern wurde vor allem durch die stark steigende Konzentration von Methylbutanoat von 398 µg/kg in den unreifen Beeren auf 2019 µg/kg in den reifen Beeren verursacht. Innerhalb der Stoffgruppe der Alkohole wurden unterschiedliche Einflüsse der Reife beobachtet. Während die Konzentrationen von (Z)-Pent- 2-en-1-ol und Pent-1-en-3-ol konstant blieben und der Gehalt an (R)-Oct-1-en-3-ol mit zunehmender Reife abnahm, stieg die Konzentration an 2-Methylbut-3-en-2-ol beträchtlich

101

Ergebnisse und Diskussion von 94 µg/kg auf 1011 µg/kg. Eine starke Zunahme dieser Komponenten mit der Reifung wurde auch in Schwarzen Johannisbeeren festgestellt (Andersson und von Sydow 1966a). Neben den starken Konzentrationsänderungen der Ester und Alkohole blieb die Summe der

C6-Verbindungen in den unreifen und reifen Früchten nahezu konstant. Innerhalb der Stoffgruppe änderte sich die Verteilung der einzelnen Komponenten jedoch drastisch.

Während in unreifen Jostabeeren (Z)-Hex-3-enal ca. 80 % der C6-Verbindungen darstellte, sank dieser Anteil in den reifen Früchten auf ca. 28 %. Es fand eine verstärkte Isomerisierung des primär gebildeten (Z)-Hex-3-enals zu (E)-Hex-2-enal statt. Generell nahmen die Konzentrationen aller Hex-3-enale/-ole mit der Reife ab, während die Konzentrationen der Hex-2-enale/-ole einheitlich zunahmen. Zusätzlich wurden abnehmende Konzentrationen für β-Pinen und Oct-1-en-3-on festgestellt. Die Abnahme des Ketons passt zu der ebenfalls detektierten sinkenden Konzentration des Alkohols Oct-1-en-3-ol, da beide Verbindungen aus dem gleichen Bildungsweg stammen.

4.2.1.6 Einfluss der Tiefkühllagerung

Um die Eignung von Jostabeeren zur Tiefkühlung zu bewerten, wurden die flüchtigen Profile und die Aromaprofile von frischen Jostabeeren und von Beeren nach achtmonatiger Tiefkühlung analysiert und miteinander verglichen. In Tabelle 27 sind die mittels VHS erhaltenen Konzentrationen flüchtiger Verbindungen frischer und tiefgekühlt gelagerter Jostabeeren aufgelistet. Substanzen, deren Konzentrationen in beiden Chargen unterhalb der Bestimmungsgrenze lagen, sind in der Tabelle nicht aufgeführt.

Tabelle 27: Konzentrationen der mittels VHS isolierten flüchtigen Verbindungen in frischen und tiefgekühlt gelagerten (acht Monate) Jostabeeren

Verbindungen frisch tiefgekühlt [µg/kg]a

C6-Komponenten (E)-Hex-2-enal 4836 ± 696 37 ± 3 (E)-Hex-2-en-1-ol 1249 ± 462 54 ± 4 (Z)-Hex-3-enal 955 ± 605 n.d.b (Z)-Hex-3-en-1-ol 238 ± 79 11 ± 3 (E)-Hex-3-enal 116 ± 71 n.d. (E)-Hex-3-en-1-ol 45 ± 6 n.d. (Z)-Hex-2-enal 29 ± 8 n.d. (Z)-Hex-2-en-1-ol 3 ± 1 n.d. Hexanal 134 ± 55 123 ± 21 Hexan-1-ol 105 ± 73 54 ± 5

Ester Methylbutanoat 2725 ± 374 1494 ± 200 Ethylbutanoat 712 ± 240 377 ± 27 (E)-Methylbut-2-enoat 74 ± 14 44 ± 6 102

Ergebnisse und Diskussion

Verbindungen frisch tiefgekühlt [µg/kg]a

Methylhexanoat 48 ± 7 16 ± 2 (E)-Ethylbut-2-enoat 23 ± 3 22 ± 1 Methylbenzoat 17 ± 2 17 ± 2 Ethylhexanoat 10 ± 3 4 ± 0 Benzylacetat 9 ± 1 13 ± 0 Ethylbenzoat 8 ± 1 9 ± 1 Methyloctanoat 8 ± 0 n.d. Ethyloctanoat 5 ± 1 n.d. Ethyl-2-hydroxybutanoat n.d. 7 ± 4

Alkohole 2-Methylbut-3-en-2-ol 902 ± 132 976 ± 85 1,8-Cineol 447 ± 58 429 ± 19 Terpinen-4-ol 60 ± 11 40 ± 5 (R)-Oct-1-en-3-ol 26 ± 18 30 ± 12 α-Terpineol 17 ± 2 5 ± 1 Butan-1-ol 11 ± 1 19 ± 5 2-Methylpropan-1-ol 10 ± 5 18 ± 8 Pentan-1-ol 7 ± 1 59 ± 19 Benzylalkohol 3 ± 3 8 ± 1 Butan-2-ol n.d. 13 ± 1

Ketone Pent-1-en-3-on 18 ± 3 5 ± 1 a: Mittelwert und Standardabweichung je einer Dreifachbestimmung; gleiche Charge Beeren (30.06.11) vor und nach Tiefkühllagerung für 8 Monate. b: Nicht identifizierbar (n.d.), da die Konzentration unterhalb der Nachweisgrenze (0,6 µg/kg) lag.

Das flüchtige Profil von Jostabeeren wurde durch das Gefrieren stark beeinflusst. Die

Konzentrationen der meisten Ester und der aus Linolensäure gebildeten C6-Komponenten waren stark verringert, wie analog bereits unter 4.1.1.6 für Stachelbeeren festgestellt wurde.

Am deutlichsten zeigte sich die Abnahme der aus Linolensäure gebildeten C6-Komponenten, die nach Lagerung bei -20°C kaum mehr nachweisbar waren. Die Gehalte an 2-Methylbut-3-en-2-ol, 1,8-Cineol sowie die der anderen Terpene und Terpenalkohole wurden nicht beeinflusst. Diese Konzentrationsänderungen der flüchtigen Verbindungen wirkten sich auch auf das Aroma der Beeren aus. Abbildung 24 zeigt einen Vergleich der Aromaprofile frischer und für einen Zeitraum von acht Monaten tiefgekühlt gelagerter Jostabeeren.

103

Ergebnisse und Diskussion

Abbildung 24: Aromaprofil von frischen Jostabeeren und Jostabeeren nach achtmonatiger Tiefkühllagerung.

Ananas 2 scharf- Apfel modrig 1

Jostabeeren nach Tiefkühllagerung süß 0 grasig frische Jostabeeren

Eukalypt sauer us

fettig- grün

Das Gefrieren der Jostabeeren führte zu einem weniger frischen und weniger fruchtigen Aroma. Wie Abbildung 24 zeigt, wurden die Intensitäten der Geruchseindrücke süß, modrig- stechend und Eukalyptus in frischen und aufgetauten Jostabeeren gleich stark bewertet. Die Intensitäten der grünen (Apfel, grasig, fettig-grün) und fruchtigen (Ananas) Aromanoten wurden bei den aufgetauten Beeren jedoch deutlich schwächer bewertet.

4.2.2 Einfluss der Flüssig-Flüssig-Extraktion auf das Aromaprofil von Jostabeeren

4.2.2.1 Einleitung

Wie bereits unter 4.1.2.1 diskutiert wurde, empfiehlt sich für die umfangreiche Charakterisierung der flüchtigen Bestandteile eines Lebensmittels die parallele Anwendung mehrerer Methoden. Zur Isolierung der flüchtigen Komponenten aus Jostabeeren wurde daher neben der bereits diskutierten VHS-Technik die Flüssig-Flüssig-Extraktion (LLE) nach Kutscher Steudel (Wieland und Sucrow 1982) angewandt.

4.2.2.2 Ergebnisse und Diskussion

Neben der VHS-Isolierung wurden sieben Chargen Jostabeeren parallel zusätzlich mittels LLE aufgearbeitet. Durch die Anwendung dieser zweiten Extraktionsmethode wurden 33 weitere Inhaltsstoffe in Jostabeeren nachgewiesen bzw. zugeordnet: Butanal, Neral, Furfural, Acetaldehyd-2,3-butandiolacetal*, Hex-2-enalpropylenglycolacetal*, Vanillin, Methyl-3- hydroxybutanoat, Ethyl-3-hydroxybutanoat, (Z)-Hex-3-enylacetat, Pentan-3-ol, Dodecanol, Zimtalkohol, 2-Phenoxyethanol, 2,3-Dehydro-1,8-cineol*, p-Cymen-8-ol, p-Cymen-7-ol*,

104

Ergebnisse und Diskussion p-Mentha-1,5-dien-8-ol*, Terpineol-Isomer*, Lilac-Alkohol* (2 Stereoisomere), Butan-2,3-diol (2 Stereoisomere), Pent-3-en-2-on, 2-Oxabicyclo(2,2,2)octan-6-on*, p-Menthahex-3-en-2- on*, But-3-en-2-on*, Benzoesäure, Hexensäure-Isomer*, Phenylessigsäure, α-Terpinen, γ-Hexalacton, p-α-Dimethylstyrol und (Z)-Linalooloxid* (* keine Referenzsubstanz vorhanden; Zuordnung durch Abgleich des Massenspektrums mit Literaturdaten). Wie das beispielhafte Chromatogramm zeigt (Abbildung 25), waren auch in den LLE- Extrakten aus Jostabeeren, wie bereits unter 4.1.2.2 für Stachelbeeren dargestellt, zusätzlich höherkettige Kohlenwasserstoffe enthalten. Da im Gegensatz zu den analysierten Stachelbeeren eine Fruchtbehandlung der Jostabeeren ausgeschlossen werden kann, sind die detektierten aliphatischen Kohlenwasserstoffe folglich auf einen endogenen Ursprung zurückzuführen. Die mittels VHS und LLE bestimmten Konzentrationen der einzelnen Komponenten sind in Tabelle 28 für zwei beispielhafte Chargen gegenübergestellt.

105

Ergebnisse und Diskussion

20 5 14 19 33 43 IS 103 111 42 18 32

93 15

10 66

[mV] 71 63 51

25 22 110 5 40 122 X 39 104 119 U W 35 62 M 130 T 92 100 112 V 16 36 I N 129 S Y 2 29 60 H 89 118 Z 10-13 23 48 J87 R 46 52 59 72 K 99 114 120 0 0 20 40 60 80 Zeit [min]

Abbildung 25: Kapillargaschromatographische Trennung (DB-WAX) der mittels Flüssig-Flüssig-Extraktion aus Jostabeeren (16.07.12, Konzentrationen siehe Tabelle 28) isolierten flüchtigen Verbindungen (die angegebenen Nummern entsprechen den Verbindungen in Tabelle 28; Bedingungen siehe Material und Methoden; IS: interner Standard Heptan-2-ol)

106

Ergebnisse und Diskussion

Tabelle 28: Konzentrationen der nach VHS und LLE quantifizierten Verbindungen aus zwei Chargen Jostabeeren

Nr.a Substanz RIb 30.06.11 16.07.12 VHS LLE VHS LLE c [µg/kg]

C6-Komponenten 43 (E)-Hex-2-enal 1211 4836 ± 696 4870 ± 2275 11473 ± 2730 8361 ± 471 d 66 (E)-Hex-2-en-1-ol 1406 1249 ± 462 181 ± 66 438 ± 151 123 ± 13 d 33 (Z)-Hex-3-enal 1138 955 ± 605 1032 ± 364 322 ± 198 3535 ± 329 d 63 (Z)-Hex-3-en-1-ol 1384 238 ± 79 146 ± 45 127 ± 13 110 ± 6 d 22 Hexanal 1075 134 ± 55 113 ± 97 330 ± 114 294 ± 33 d 32 (E)-Hex-3-enal 1133 116 ± 71 365 ± 47 160 ± 30 748 ± 43 d 60 Hexan-1-ol 1355 105 ± 73 14 ± 5 35 ± 3 10 ± 1 d 61 (E)-Hex-3-en-1-ol 1364 45 ± 6 n.q. 8 ± 7 n.d. e 40 (Z)-Hex-2-enal 1194 29 ± 8 49 ± 14 30 ± 3 54 ± 1 f 67 (Z)-Hex-2-en-1-ol 1417 3 ± 1 n.d.i n.q. n.d. e 31 Hex-5-enal 1127 n.q.h n.d. 5 ± 2 3 ± 3 f

Ester 14 Methylbutanoat 975 2725 ± 374 2556 ± 933 2000 ± 287 1978 ± 358 d 18 Ethylbutanoat 1034 712 ± 240 555 ± 28 596 ± 149 376 ± 79 d 25 (E)-Methylbut-2-enoat 1096 74 ± 14 85 ± 27 151 ± 31 128 ± 3 d 39 Methylhexanoat 1184 48 ± 7 35 ± 17 24 ± 1 35 ± 6 d 35 (E)-Ethylbut-2-enoat 1158 23 ± 3 22 ± 4 62 ± 9 38 ± 7 d 92 Methylbenzoat 1613 17 ± 2 16 ± 3 34 ± 10 23 ± 6 d 59 (E)-Hex-2-enylacetat 1332 12 ± 7 22 ± 8 n.q. n.q. e 45 Ethylhexanoat 1232 10 ± 3 7 ± 3 7 ± 3 n.q. e 130 Phthalat 2539 9 ± 4 n.d. 10 ± 2 13 ± 4 f,k 104 Benzylacetat 1725 9 ± 1 6 ± 4 4 ± 4 16 ± 2 e 98 Ethylbenzoat 1659 8 ± 1 6 ± 1 n.d. n.d. e 105 Methylsalicylat 1769 8 ± 1 8 ± 1 n.q. n.d. e 64 Methyloctanoat 1387 8 ± 0 15 ± 3 7 ± 2 9 ± 0 e 70 Ethyloctanoat 1436 5 ± 1 6 ± 1 n.q. n.d. e 21 Butylacetat 1061 3 ± 3 2 ± 2 n.d. n.d. e 90 Methyldecanoat 1594 2 ± 2 n.d. n.d. n.d. e 94 Ethyldecanoat 1635 2 ± 2 n.d. 15 ± 3 8 ± 2 e 52 Hexylacetat 1263 2 ± 2 n.q. n.d. n.q. e 106 Ethylsalicylat 1783 2 ± 2 n.d. n.d. n.d. e 28 3-Methylbutylacetat 1110 n.q. n.q. n.d. n.d. e O Isopropyllaurat 1805 n.q. 4 ± 1 n.d. n.d. f 126 Isopropylpalmitat 2241 n.q. n.d. n.q. n.d. f 44 Ethyl-2-methylbut-2-enoat 1223 n.q. n.d. n.d. n.d. f 5 Ethylacetat 886 n.k.g n.k. n.k. n.k. e 2 Ethylformiat 826 n.k. n.k. n.k. n.k. f D (Z)-Hex-3-enylacetat 1304 n.d. 29 ± 14 n.d. n.d. e 62 Methyl-2-hydroxybutanoat 1374 n.d. n.d. n.d. 18 ± 5 f 131 Phthalat 2697 n.d. n.d. n.d. n.d. e,k 47 3-Methylbut-2-enylacetat 1251 n.d. n.d. n.q. n.d. e H Methyl-3-hydroxybutanoat 1458 n.d. n.q. n.d. 25 ± 6 e I Ethyl-3-hdroxybutanoat 1499 n.d. n.q. n.d. 14 ± 2 e 3 Methylacetat 824 n.d. n.d. n.k. n.k. f

Alkohole 19 2-Methylbut-3-en-2-ol 1041 902 ± 132 1483 ± 99 1378 ± 197 1906 ± 282 d 72 (R)-Oct-1-en-3-ol 1452 26 ± 18 29 ± 7 10 ± 3 8 ± 3 d 58 (Z)-Pent-2-en-1-ol 1322 24 ± 1 56 ± 5 18 ± 1 n.d. e 36 Pent-1-en-3-ol 1160 19 ± 1 15 ± 2 17 ± 1 15 ± 1 e 55 (E)-Pent-2-en-1-ol 1315 12 ± 10 n.d. 3 ± 0 n.d. f 34 Butan-1-ol 1042 11 ± 1 14 ± 3 n.d. n.d. e 107

Ergebnisse und Diskussion

Nr.a Substanz RIb 30.06.11 16.07.12 VHS LLE VHS LLE c [µg/kg]

23 2-Methylpropan-1-ol 1084 10 ± 5 n.d. 7 ± 9 4 ± 4 e 48 Pentan-1-ol 1252 7 ± 1 7 ± 1 n.d. 11 ± 9 e 86 Octan-1-ol 1560 4 ± 1 n.q. n.q. n.q. e 30 Pentan-2-ol 1123 3 ± 2 9 ± 4 n.d. n.q. e 112 Benzylalkohol 1871 3 ± 3 n.q. n.d. 13 ± 3 e 8 Ethanol 931 n.d. 11 ± 10 n.d. n.d. e N p-Mentha-1,5-dien-8-ol 1779 n.d. n.d. n.d. 14 ± 4 f 121 p-Mentha-1,4-dien-7-ol 2053 n.d. n.d. n.d. 6 ± 6 f 114 2-Phenylethan-1-ol 1906 n.d. 2 ± 2 n.d. 3 ± 3 e C 3-Methylbutan-1-ol 1203 n.d. n.d. n.q. n.q. e 81 (Z)-Hexa-3,5-dien-1-ol 1507 n.d. n.q. n.d. n.d. f

Terpene/Terpenalkohole 42 1,8-Cineol 1200 447 ± 58 339 ± 17 484 ± 80 287 ± 38 d 103 2-Hydroxy-1,8-cineol 1721 n.q. 145 ± 12 n.q. 330 ± 44 f 111 2-Hydroxy-1,8-cineol 1859 n.d. 105 ± 11 n.d. 229 ± 18 f 89 Terpinen-4-ol 1592 60 ± 11 44 ± 1 10 ± 2 12 ± 1 d 100 α-Terpineol 1685 17 ± 2 30 ± 7 3 ± 3 17 ± 1 e P p-Cymen-8-ol 1831 n.d. n.d. n.d. 5 ± 5 e B α-Terpinen 1167 n.d. n.d. n.d. 2 ± 1 e 46 γ-Terpinen 1238 2 ± 1 n.q. n.q. 2 ± 2 e 24 β-Pinen 1093 4 ± 1 n.d. n.d. n.d. e 84 Linalool 1548 n.d. n.d. n.d. n.q. e 27 Sabinen 1106 n.q. n.d. n.q. n.d. e 41 Limonen 1196 n.d. n.q. n.d. n.d. d Q p-Cymen-7-ol 2072 n.d. n.q. n.d. n.d. f 53 Terpinolen 1272 n.d. n.d. n.q. n.k. d

Ketone 16 Pent-1-en-3-on 1009 18 ± 3 64 ± 44 49 ± 12 26 ± 3 e M 5-Methylhex-3-en-2-on 1772 n.d. n.d. n.d. 26 ± 1 f 51 Acetoin 1259 n.k. n.k. n.k. n.k. d 2-Oxabicyclo(2,2,2)octan- L 1685 n.d. n.d. n.d. n.q. f 6-on A Pent-3-en-2-on 1109 n.d. n.q. n.d. n.d. e

Aldehyde 29 (E)-Pent-2-enal 1120 18 ± 2 24 ± 8 22 ± 3 17 ± 1 e 4 Prop-2-enal 843 n.d. 23 ± 25 n.d. n.d. e 1 Propanal 801 n.d. 16 ± 10 n.d. n.d. e G Furfural 1457 n.d. n.d. n.d. 6 ± 1 e 56 (E)-Hept-2-enal 1317 n.d. n.d. n.d. n.d. d 65 Nonanal 1391 n.q. n.d. n.d. n.d. e 26 (Z)-Pent-2-enal 1101 n.d. n.d. n.q. n.d. f

Säuren 93 Buttersäure 1623 n.k. 92 ± 9 n.k. 259 ± 203 d 119 (E)-Hex-2-ensäure 1961 n.d. 11 ± 2 n.k. 49 ± 2 d 110 Hexansäure 1841 n.k. 17 ± 7 n.k. 38 ± 29 d W Zimtsäure 2852 n.d. n.d. n.d. 52 ± 37 d 118 (E)-Hex-3-ensäure 1951 n.k. 52 ± 28 n.d. 31 ± 1 d 122 Octansäure 2057 n.k. n.q. n.d. 23 ± 27 e R Benzoesäure 2427 n.d. n.d. n.d. 15 ± 4 e 99 2- und 3-Methylbuttersäure 1672 n.d. 4 ± 4 n.d. 7 ± 1 e 87 2-Methylpropansäure 1562 n.d. n.d. n.d. n.q. e 108

Ergebnisse und Diskussion

Nr.a Substanz RIb 30.06.11 16.07.12 VHS LLE VHS LLE c [µg/kg]

71 Essigsäure 1443 n.k. n.k. n.k. n.k. d 124 Nonansäure 2164 n.d. n.d. n.q. n.d. e

Sonstige 10-13 C5-Komponenten 963 27 ± 6 71 ± 18 29 ± 2 8 ± 1 f X Kohlenwasserstoff C 29 2904 n.d. n.d. n.d. 36 ± 6 f U Kohlenwasserstoff C 27 2704 n.d. n.d. n.d. 27 ± 8 f T Kohlenwasserstoff C 26 2603 n.d. n.d. n.q. 22 ± 8 f V Kohlenwasserstoff C 28 2803 n.d. n.d. n.q. 21 ± 8 f 129 Kohlenwasserstoff C 24 2399 n.d. n.d. 4 ± 3 16 ± 6 f Y Kohlenwasserstoff C 30 3004 n.d. n.d. n.d. 16 ± 5 f 102 Kohlenwasserstoff C 17 1700 n.d. n.d. n.q. 15 ± 7 f S Kohlenwasserstoff C 25 2501 n.d. n.d. n.q. 11 ± 9 f Z Kohlenwasserstoff C 31 3104 n.d. n.d. n.d. 11 ± 4 f 123 Kohlenwasserstoff C 21 2098 n.d. n.d. 12 ± 7 n.d. f 74 Heptadienal-Isomer 1459 n.d. n.d. 5 ± 1 n.d. f F p,α-Dimethylstyrol 1419 n.d. 4 ± 3 n.d. n.d. e E Kohlenwasserstoff C 14 1400 n.d. n.d. n.d. 5 ± 0 f 3,5-di-tert-Butyl- 116 1912 36 ± 9 194 ± 111 n.d. n.d. f 4-hydroxytoluol 88 Propylenglykol 1590 n.d. n.q. n.d. n.d. e 125 Kohlenwasserstoff C 22 2203 n.d. n.d. n.q. n.d. f 127 Kohlenwasserstoff C 23 2299 n.d. n.d. n.q. n.d. f J Butan-2,3-diol 1522 n.d. n.k. n.d. n.k. d K Butan-2,3-diol 1568 n.d. n.d. n.d. n.k. d 120 Kohlenwasserstoff C 20 1999 n.d. n.d. n.d. n.q. f 115 Kohlenwasserstoff C 19 1903 n.d. n.d. n.q. n.q. f a: Die Nummern und Buchstaben entsprechen den Verbindungen in Abbildung 25, Tabelle 22 und Tabelle 23. b: Retentionsindex (DB-WAX). c: Mittelwert und Standardabweichung einer Dreifachbestimmung. d: Die Quantifizierung erfolgte unter Berücksichtigung des gaschromatographischen Verhaltens (Response) und der Wiederfindung (siehe Anhang). e: Die Quantifizierung erfolgte unter Berücksichtigung des gaschromatographischen Verhaltens (Response). f: Für die Quantifizierung wurde der Response-Faktor 1 angenommen. g: Nicht kalkulierbar (n.k.), da die Wiederfindung unter 25 % lag (siehe Anhang). h: Nicht quantifizierbar (n.q.), da die Fläche unterhalb der Bestimmungsgrenze (1,7 µg/kg) lag. i: Nicht identifizierbar (n.d.), da die Fläche unterhalb der Nachweisgrenze (0,6 g/kg) lag. k: nicht eindeutig identifizierbare Phthalsäureester. A-Z: nicht nach VHS, nur mittels LLE nachgewiesen.

Die prozentuale Verteilung der Stoffgruppen (ohne Berücksichtigung der in Tabelle 28 aufgeführten Säuren und sonstigen Verbindungen) aller analysierten Chargen ist in Abbildung 26 dargestellt. Der Vergleich der beiden Extraktionsmethoden für sieben Chargen Jostabeeren zeigte kaum Einfluss auf die prozentuale Verteilung der Stoffgruppen. Die leichte Zunahme der Alkohole bzw. der Gruppe der Terpene und Terpenalkohole ist hauptsächlich auf die Verbindungen 2-Methylbut-3-en-2-ol sowie die beiden Stereosiomere des 2-Hydroxy-1,8-cineols zurückzuführen. Letztere waren in den VHS-Extrakten nicht oder nur in vergleichsweise geringen Konzentrationen nachweisbar.

109

Ergebnisse und Diskussion

C6-

Abbildung 26: Prozentuale Verteilung der Stoffgruppen nach VHS- (1. Balken) und LLE-Extraktion (2.Balken) verschiedener Chargen Jostabeeren

Abbildung 27 und Abbildung 28 zeigen die Verteilung der einzelnen Komponenten innerhalb der beiden Hauptstoffgruppen. Die Profile der primär gebildeten Ester zeigten nach VHS- und LLE-Isolierung ein sehr ähnliches Bild. Es wurden zwar Unterschiede festgestellt, jedoch gab es keine einheitlichen Zu- oder Abnahmen bestimmter Verbindungen, die auf einen Einfluss der Isolierungsmethode schließen ließen.

100% Sonstige 90% Ethylhexanoat 80% Ethylbenzoat 70%

60% Methyloctanoat

50% Methyl-3-hydroxybutanoat 40% (E)-Ethylbut-2-enoate 30% Methylhexanoat 20%

10% Methylbenzoat

0% (E)-Methylbut-2-enoat

Ethylbutanoat

Methylbutanoat

Abbildung 27: Prozentuale Verteilung der einzelnen Komponenten innerhalb der Stoffgruppe der Ester nach VHS- (1. Balken) bzw. LLE-Extraktion (2. Balken) 110

Ergebnisse und Diskussion

Die Profile der enzymatisch gebildeten C6-Verbindungen wurden jedoch durch die Isolierungsmethode beeinflusst. Nach LLE-Isolierung sanken die prozentualen Anteile der aus Linolensäure gebildeten C6-Alkohole, während die Anteile der C6-Aldehyde anstiegen. Eine Ausnahme stellen die beiden im Jahr 2012 analysierten Chargen dar. Hier nahm durch LLE-Isolierung der Anteil an (E)-Hex-2-enal deutlich ab. Auch nach LLE-Isolierung von Stachelbeeren zeigte sich im Vergleich zur VHS-Isolierung eine Abnahme des Anteils der ungesättigten C6-Alkohole, während die Anteile an ungesättigten C6-Aldehyden zunahmen. Hier wurde jedoch zusätzlich eine Abnahme des prozentualen Anteils von (Z)-Hex-3-enal festgestellt. Dies war bei der Analyse der Jostabeeren nicht der Fall.

100% (E)-Hex-3-en-1-ol 90% 80% (Z)-Hex-2-enal

70% Hexan-1-ol 60% Hexanal 50% 40% (Z)-Hex-3-en-1-ol 30% (E)-Hex-3-enal 20% 10% (E)-Hex-2-en-1-ol 0% (Z)-Hex-3-enal

(E)-Hex-2-enal

Abbildung 28: Prozentuale Verteilung der einzelnen Komponenten innerhalb der C6-Gruppe nach VHS- (1. Balken) bzw. LLE-Extraktion (2. Balken)

4.2.3 Sensorische Analyse

4.2.3.1 Einleitung

Der Geruch von Jostabeeren wurde von Bauer (1978) als etwas „Neuartiges“ beschrieben; er charakterisierte ihn als eine Kombination des erfrischenden, grünen Aromas von Stachelbeeren und des typischen, terpen-artigen Aromas Schwarzer Johannisbeeren. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung der aromarelevanten Verbindungen in Jostabeeren und das Abschätzen der Aromabeiträge einzelner Verbindungen. Durch anschließende Rekombinationsversuche sollte die Relevanz der identifizierten Aromastoffe überprüft werden.

111

Ergebnisse und Diskussion

4.2.3.2 Analyse der aromaaktiven Komponenten

Die mittels VHS aus Jostabeeren gewonnenen Extrakte kennzeichnete ein frisches, grünes, Schwarzen Johannisbeeren ähnliches Aroma, welches an frische Jostabeeren erinnerte. Ein konzentrierter, aus 1,5 kg Jostabeeren hergestellter Extrakt wurde zur Aromaextraktverdünnungsanalyse herangezogen. Hierbei wurden 58 geruchsaktive Komponenten wahrgenommen, von denen 49 identifiziert werden konnten. Wie Tabelle 29 zeigt, hatten 25 Substanzen einen FD-Faktor ≥ 16. Vor allem Lipidoxidationsprodukte, wie beispielsweise Hexanal (FD: 256, Geruch: fettig-grün) und (Z)-Octa-1,5-dien-3-ol (FD: 256, Geruch: pilzig), kurzkettige Ester wie Ethylbutanoat (FD: 4096, Geruch: fruchtig) sowie 1,8-Cineol (FD: 512, Geruch: Eukalyptus) trugen zum Aroma der Jostabeeren bei.

Tabelle 29: Konzentrationen und sensorische Daten von Schlüsselaromastoffen frischer Jostabeeren

Verbindung a b FD Geruchsschwelle d e RI Geruch [µg/kg] A Faktorc (µg/L in Wasser)

(Z)-Hex-3-enal 1138 grasig 32 0,6 f 1476 2460 1,8-Cineol 1200 Eukalyptus 512 2 f 499 250 Ethylbutanoat 1034 Ananas 4096 2,5 f 539 216 (E)-Hex-2-enal 1211 Apfel 32 77 f 8139 106 Hexanal 1075 fettig, grün 256 4 f 230 58 Pent-1-en-3-on 1009 modrig, stechend 16 1 f 45 45 Methylbutanoat 975 fruchtig, käsig 128 63 f 2526 40 Ethylhexanoat 1232 grün, fruchtig 32 1,4 f 8 6 (E)-Hex-3-enal 1133 grün 32 160 g 206 1 Nonanal 1391 fettig 16 1 h n.q.i ∕ 3-Methylbut-2- 1251 modrig, grün 64 ∕ 2 ∕ enylacetat (Z)-Octa-1,5-dien-3-olk 1490 pilzig 256 0,1 l n.d.m ∕ Propan-2-thiol 801 schwefelig 64 0,001 n n.d. ∕ Oct-1-en-3-on 1296 pilzig 64 0,005 o n.d. ∕ Ethylacetat 886 fruchtig 32 5 p n.k.q ∕ (E)-Methylbut-2-enoat 1096 fruchtig, stechend 2048 124 f 117 <1 (E)-Pent-2-enal 1120 grün, stechend 128 1500 r 27 <1 Hexan-1-ol 1355 grün, stechend 1024 500 s 75 <1 (E)-Hex-3-en-1-ol 1364 Geranie 64 1000 t 39 <1 2-Methylpropansäure 1562 modrig 64 10 u n.q. <1 Linalylacetat 1552 süß, kräuter-artig 32 24 f n.q. <1 2-Methylpropylacetat 968 grün, frisch 16 441 v n.q. <1 2-Methylpropan-1-ol 1084 käsig, alkoholisch 16 75000 t 27 <1 (E)-Linalooloxid 1428 erdig, modrig 16 100 w n.q. <1 α-Terpineol 1683 nussig, Mandel 16 182 f 13 <1 a: Retentionsindices (DB-WAX). b: Bestimmung der Geruchsqualität im unverdünnten Extrakt am Sniffing-Port. c: Zur AEVA wurde ein aus 1,5 kg Jostabeeren mittels VHS gewonnener Extrakt verwendet. d: durchschnittliche Konzentrationen aus 9 Chargen Jostabeeren. e: Aromawert. f: Bestimmung siehe Material und Methoden. g: Tamura et al. 2001; h: Guadagni et al. 1972; i: nicht quantifizierbar: Konzentration unterhalb der Bestimmungsgrenze (1.7 µg/kg). k: Die Identifizierung erfolgte durch Vergleich der massenspektrometrischen Daten und des Geruchs mit Literaturdaten (Tressl et al. 1982) sowie durch Vergleich der Retentionsindices, wozu ein aus Pilzen gewonnener Extrakt (Zugabe von Linolensäure bei Pilzhomogenisierung analog Tressl et al. 1982) und die Quelle Piveteau et al. (2000) herangezogen wurden. l: Whitfield et al. 1982. m: Nicht identifizierbar, da die Konzentration unterhalb der Nachweisgrenze (0,6 µg/kg) lag. n: Clanton und Schmidt 2000. o: Buttery et al. 1978. p: Burdock 2005. q: nicht kalkulierbar: Wiederfindung < 25 %. r: Buttery 1993. s: Flath et al. 1967. t: Zea et al. 2001. U: Larsen und Poll 1992. v: Schnabel et al. 1988. w: Liu et al. 2012. 112

Ergebnisse und Diskussion

Es sind jedoch auch begrenzende Faktoren der AEVA bekannt (Grosch 1993). Hierzu zählt beispielsweise, dass während der Extraktion auftretenden Verluste der Substanzen nicht berücksichtigt werden können und, dass eine Verdampfung der sensorischen Bewertung der Komponenten am Sniffing-Port vorausgeht. Im Lebensmittel hingegen hängt die Flüchtigkeit der Substanzen von ihrer Löslichkeit bzw. ihren Wechselwirkungen mit anderen, auch nicht flüchtigen Bestandteilen des Lebensmittels, ab. Um den Beitrag der einzelnen Aromastoffe besser beurteilen zu können, erfolgte die Berechnung der Aromawerte, dem Quotient aus der Aromastoffkonzentration in der Frucht und der jeweiligen Geruchsschwelle. Da Jostabeeren zu fast 90 % aus Wasser bestehen, dienten in Wasser bestimmte Geruchsschwellenwerte als Basis für die Berechnung. Es wiesen insgesamt neun Verbindungen einen Aromawert ≥ 1 auf (Tabelle 29). Diese waren (Z)-Hex-3-enal, 1,8-Cineol, Ethylbutanoat, (E)-Hex-2-enal, (E)-Hex-3-enal, Hexanal, Pent-1-en-3-on, Methylbutanoat und Ethylhexanoat.

4.2.3.3 Rekombination des Aromas frischer Jostabeeren

Neben der Komposition der Aromastoffe kann aufgrund von Wechselwirkungen zwischen Aromastoffen und anderen Matrixbestandteilen auch die Lebensmittelmatrix einen entscheidenden Einfluss auf das Gesamtaroma der Jostabeeren ausüben. Jostabeeren bestehen zu fast 90 % aus Wasser und enthalten relativ hohe Konzentrationen an organischen Säuren und Zuckern. Um diese natürliche Matrix nachzuahmen, wurde eine wässrige Lösung der in Schwarzen Johannisbeeren enthaltenen Zucker und Säuren (siehe 3.2.6) hergestellt, da zum damaligen Zeitpunkt keine Daten über die Gehalte der Substanzen in Jostabeeren veröffentlicht waren. Diese beerenähnliche Matrix wurde anschließend für die Rekonstitutionsversuche verwendet. Für erste Simulationsversuche wurde ein Vollrekombinat unter Verwendung der in Tabelle 29 aufgeführten 24 Aromastoffe hergestellt. Ein Vergleich der Konzentrationen im mittels AEVA analysierten VHS-Extrakt und der Mittelwerte aller bis zu diesem Zeitpunkt untersuchten sechs Chargen Jostabeeren zeigte keine großen Unterschiede (Abbildung 29). Deshalb erfolgten die Rekombinationen auf Grundlage der Konzentrationen der Charge vom 30.06.11 (siehe Tabelle 28). Für die Substanzen, deren Konzentrationen im Extrakt unterhalb der Quantifizierungs- oder Nachweisgrenze lagen, wurde folgendes Vorgehen angewandt: Lag die Konzentration unterhalb der Nachweisgrenze, so wurde entweder die doppelte Konzentration der Geruchsschwelle oder maximal 1 µg/kg Frucht veranschlagt. Lag die Konzentration der Substanz zwischen Nachweis- (0,6 µg/kg) und Bestimmungsgrenze (1,7 µg/kg), so wurde eine Konzentration von 1,5 µg/kg angenommen.

113

Ergebnisse und Diskussion

100000

10000

1000

Mittelwert der Charge vom 100 30.06.11

log Konzentration [µg/kg] log Konzentration Mittelwert aller Chargen (n=6) 10

1 Hexanal Nonanal Propanal Terpineol - Hexan-1-ol Ethylacetat α Eucalyoptol Prenylacetat Ethylbutanoat Ethylhexanoat (Z)-Hex-3-enal (E)-Hex-2-enal (E)-Hex-3-enal Pent-1-en-3-on (E)-Pent-2-enal Methylbutanoat (E)-Hex-3-en-1-ol 2-Methylpropan-1-ol (E)-Methylbut-2-enoat

Abbildung 29: Mittelwerte und Standardabweichungen der aromaaktiven Verbindungen im zur AEVA verwendeten Extrakt (Charge vom 30.06.11) sowie aller bis zu diesem Zeitpunkt analysierten sechs Chargen

Das Vollrekombinat wurde von einem Panel sensorisch untersucht und das Aromaprofil mit dem der frischen Jostabeeren verglichen. Wie Abbildung 30 zeigt, stimmten die Aromaprofile der frischen Frucht und des Vollrekombinates gut überein. Laut der Panelisten erinnerte der Geruch des Rekombinates an Jostabeeren. Der Extrakt hatte ein Aroma, das mild nach Schwarzer Johannisbeere roch und durch eine zusätzliche grüne Note gekennzeichnet war.

Ananas 2 muffig- Apfel scharf 1

frische Jostabeeren süß 0 grasig Vollrekombinat

sauer Eukalyptus

fettig-grün Abbildung 30: Aromaprofile frischer Jostabeeren und des Vollrekombinates 114

Ergebnisse und Diskussion

Um festzustellen, welche der 24 verwendeten Substanzen tatsächlich einen Einfluss auf das Aroma von Jostabeeren haben, wurde anschließend ein Weglassversuch durchgeführt. Hierzu wurde ein Teilrekombinat hergestellt, welches im Vergleich zum Vollrekombinat um mehrere Verbindungen reduziert war. Nur diejenigen Aromastoffe, die laut dem Aromawertkonzept von Rothe und Thomas (1963) zum Aroma beitrugen, wurden für das Teilrekombinat verwendet. Da sowohl Oct-1-en-3-on als auch (Z)-Octa-1,5-dien-3-ol mit ihrem pilzigen Charakter sehr niedrige Geruchsschwellen aufweisen, die Berechnung der Aromawerte aber aufgrund ihrer geringen Konzentrationen im Extrakt nicht möglich war, wurde Oct-1-en-3-on in das Teilrekombinat einbezogen. Dieses Teilrekombinat, welches aus 10 Komponenten bestand, wurde mit dem ersten Modell (24 Komponenten) in einer Unterschiedsprüfung (Triangeltest) verglichen. Es zeigte sich, dass in Einklang mit dem Aromawertkonzept die Verbindungen, deren Aromawert <1 war, nicht zum Aroma beitrugen. Es konnten die Verbindungen Nonanal, 3-Methylbut-2- enylacetat, (Z)-Octa-1,5-dien-3-ol, Propan-2-thiol, Ethylacetat, (E)-Methylbut-2-enoat, (E)-Pent-2-enal, Hexan-1-ol, (E)-Hex-3-en-1-ol, 2-Methylpropansäure, Linalylacetat, 2-Methylpropylacetat, 2-Methylpropan-1-ol und (E)-Linalooloxid weggelassen werden, ohne dass ein signifikanter Unterschied bemerkt wurde (Signifikanzniveau 0,05, nach Quad et al. 2011). Auch das Aromaprofil des Teilrekombinates zeigte eine sehr gute Übereinstimmung mit dem von frischen Jostabeeren (Abbildung 31). Das Aroma von frischen Jostabeeren lässt sich folglich durch Pent-1-en-3-on, Ethylhexanoat, Oct-1-en-3-on, Ethylbutanoat, (Z)-Hex-3-enal, (E)-Hex-3-enal, Eukalyptol, Hexanal, (E)-Hex-2-enal und Methylbutanoat nachahmen.

Ananas 2 muffig- Apfel scharf 1

süß 0 grasig Teilrekombinat frische Jostabeeren

sauer Eukalyptus

fettig-grün

Abbildung 31: Aromaprofil von frischen Jostabeeren und dem Teilrekombinat

115

Ergebnisse und Diskussion

4.2.4 Analyse des flüchtigen Profils eines Jostabeerenproduktes 4.2.4.1 Einleitung

Analog zu den Versuchen mit Stachelbeerlikör wurde auch ein kommerziell erhältlicher Jostabeerenlikör untersucht. Die Isolierung der flüchtigen Verbindungen aus der Likörmatrix erfolgte wie unter 3.2.1.1 beschrieben mittels VHS. Der so erhaltene Extrakt wurde kapillargaschromatographisch untersucht und es erfolgten die Identifizierung und Quantifizierung der flüchtigen Verbindungen. Im Vorhinein wurde sichergestellt, dass der interne Standard Heptan-2-ol nicht im Jostabeerenlikör enthalten war.

4.2.4.2 Ergebnisse und Diskussion

In den Extrakten aus dem Jostabeerenlikör wurden 70 flüchtige Substanzen identifiziert. Eine Auflistung dieser Komponenten gibt Tabelle 30 wieder.

Tabelle 30: Konzentrationen der mittels VHS aus Jostabeerenlikör isolierten flüchtigen Verbindungen

Substanz RIa [µg/L]b

Ester Ethylbutanoat 1038 990 ± 133 e,g Prop-2-enylhexanoat 1357 694 ± 62 e,g Pentylpentanoat 1401 669 ± 74 e,g Ethylnonanoat 1524 486 ± 40 e,g Ethylhexanoat 1224 479 ± 25 e,g 3-Methylbutylnonanoat 1749 243 ± 24 k,m Ethylbenzoat 1633 230 ± 17 e,g 3-Methylbutylacetat 1116 199 ± 41 e,g 1-Phenylethyl-2-methylpropanoat 1718 143 ± 9 l,m Ethyldecanoat 1622 128 ± 45 e,g 2-Methylpropylacetat 1021 126 ± 31 e,g Butylbutanoat 1208 85 ± 12 e,g Ethylcinnamat 2127 74 ± 8 e,g Ethyldodecanoat 1826 52 ± 18 e,h Benzylacetat 1694 46 ± 28 e,h Ethyloctanoat 1422 46 ± 24 e,h Methylbenzoat 1599 37 ± 14 e,g Ethyltetradecanoat 2026 20 ± 1 e,h Ethylphenylacetat 1791 14 ± 4 e,h Diethylsuccinat 1651 13 ± 5 e,h Ethylpentanoat 1128 9 ± 3 e,h Ethyl-2-methyloctanoat 1414 7 ± 0 f,i Ethyllactat 1321 n.k.d e,g

Alkohole 3-Methylbutan-1-ol 1199 487 ± 54 e,g 2-Methylpropan-1-ol 1089 263 ± 60 e,g Pentan-1-ol 1240 46 ± 17 e,h Propan-1-ol 1041 22 ± 1 e,h Butan-2-ol 1033 10 ± 3 e,h (E)-Prop-2-en-1-ol 1105 5 ± 4 e,h 2-Propoxyethan-1-ol 1229 5 ± 0 f,i 116

Ergebnisse und Diskussion

Substanz RIa [µg/L]b

Butan-1-ol 1138 5 ± 4 e,h Hexan-1-ol 1341 3 ± 2 e,g

Aldehyde: Phenylacetaldehyd 1585 298 ± 17 e,g Hexanal 1074 88 ± 8 e,g Benzaldehyd 1484 45 ± 9 e,h Furfural 1428 22 ± 11 e,h 2-Butyloct-2-enal 1649 9 ± 1 f,i

Terpene/Terpenalkohole ∆-3-Caren 1136 160 ± 16 e,g Limonen 1180 95 ± 14 e,g Menthol 1626 95 ± 11 e,g β-Linalool 1533 78 ± 14 e,g Geraniol 1830 40 ± 6 e,g α-Terpineol 1676 41 ± 18 e,h Terpinen-4-ol 1581 37 ± 5 e,g Terpinolen 1264 25 ± 8 e,g Citronellol 1753 21 ± 10 e,g Caryophyllenalkohol 2031 19 ± 11 f,i p-Cymen 1249 16 ± 2 e,h p-Cymen-8-ol 1820 15 ± 3 e,h 1,8-Cineol 1194 14 ± 4 e,g Eugenol 2132 10 ± 1 e,h α-Terpinen 1164 3 ± 2 e,h γ-Terpinen 1231 n.q.c e,h

Ketone α-Iron 1954 25 ± 14 e,h Pent-3-en-2-on 1111 11 ± 1 e,h

Säuren Nonansäure 2137 n.q. e,g Essigsäure 1426 n.k. e,g Buttersäure 1607 n.k. e,g Hexansäure 1816 n.k. e,g Decansäure 2244 n.k. e,h Octansäure 2036 n.k. e,h 2- und 3-Methylbuttersäure 1644 n.k. e,i

Sonstige 3.5-di-tert-Butyl-4-hydroxytoluol 1887 60 ± 16 f,i Kohlenwasserstoff C 17 1698 97 ± 84 e,i Kohlenwasserstoff C 18 1798 170 ± 148 e,i Kohlenwasserstoff C 19 1902 75 ± 80 e,i Kohlenwasserstoff C 20 1993 60 ± 65 e,i Kohlenwasserstoff C 21 2096 38 ± 41 e,i a: Retentions Retentionsindices. b: Mittelwert und Standardabweichung einer Dreifachbestimmung. c: Nicht quantifizierbar, da die Konzentration unterhalb der Bestimmungsgrenze (1,7 µg/kg) lag; d: Nicht kalkulierbar: Wiederfindung kleiner 10 %. e: Die Identifizierung erfolgte durch eine Referenzsubstanz. f: Die Identifizierung erfolgte durch Abgleich massenspektrometrischer Daten mit Literaturangaben. g: Die Quantifizierung erfolgte unter Berücksichtigung des gaschromatographischen Verhaltens (Response) und der Wiederfindung (siehe Anhang). h: Die Quantifizierung erfolgte unter Berücksichtigung des gaschromatographischen Verhaltens (Response). i: Für die Quantifizierung wurde der Response-Faktor 1 angenommen. k: Berücksichtigung des Mittelwertes der Wiederfindungen der aliphatischen Ester. l: Berücksichtigung der Wiederfindung von Ethylbenzoat. m: Identifizierung durch Synthese des Esters (siehe Material und Methoden).

117

Ergebnisse und Diskussion

Das flüchtige Spektrum des im Handel erworbenen Jostabeerenlikörs bestand zu über 60 % aus Estern. Die höchsten Konzentrationen wurden für Ethylbutanoat (990 µg/L) und Prop- 2-enylhexanoat (694 µg/L) erhalten. Außerdem wurden im Likör zahlreiche Alkohole, Aldehyde, Terpene und Terpenalkohole identifiziert, deren Hauptvertreter 3-Methylbutanol, 2-Methylpropanol bzw. Phenylacetaldehyd sowie ∆-3-Caren, Limonen und Menthol darstellten. Die flüchtigen Hauptkomponenten der frischen Jostabeere wiesen hingegen sehr viele

C6-Verbindungen, einige Ester sowie 1,8-Cineol und 2-Methyl-3-buten-2-ol in hohen Konzentrationen auf. Eine anschließende sensorische Untersuchung des Jostabeerenlikörs bestätigte die Unterschiede. Das Aromaprofil des Likörs, welches anhand der für frische Jostabeeren ausgewählten Deskriptoren erstellt wurde, zeigt enorme Unterschiede zu dem Profil frischer Beeren (Abbildung 32). Lediglich die fruchtige Ananas-Note wurde sowohl in den Beeren als auch im Likör einheitlich bewertet. Neben dieser dominierte ein süßer Geruch das Liköraroma. Die in frischen Beeren intensiv wahrgenommenen Grünnoten wurden im Likör nur sehr niedrig bewertet.

Ananas 2 scharf- Apfel modrig 1 Jostabeerenlikör süß 0 grasig frische Jostabeeren

sauer Eukalyptus

fettig-grün

Abbildung 32: Aromaprofile von Jostabeerenlikör und frischen Jostabeeren

118

Ergebnisse und Diskussion

4.2.5 Zusammenfassung Durch die Isolierung der flüchtigen Verbindungen aus frischen Jostabeeren mittels VHS und die anschließende kapillargaschromatographisch-massenspektrometrische Analyse wurden

131 Verbindungen identifiziert. C6-Komponenten und Ester erwiesen sich als die dominierenden Stoffgruppen. Die acht Hauptkomponenten (E)-Hex-2-enal, (E)-Hex-2-en- 1-ol, (Z)-Hex-3-enal, (Z)-Hex-3-en-1-ol, Methylbutanoat, Ethylbutanoat, 2-Methylbut-3-en-2-ol und 1,8-Cineol machten stets über 91 % der flüchtigen Verbindungen in Jostabeeren aus. Durch die Untersuchung mehrerer Chargen Jostabeeren, die an unterschiedlichen Standorten in Süddeutschland angebaut und/oder in verschiedenen Jahren geerntet und analysiert wurden, zeigte sich ein recht stabiles flüchtiges Profil für reife Jostabeeren. Das flüchtige Spektrum unreifer Jostabeeren unterschied sich allerdings deutlich von dem reifer Früchte.

Enzyminhibierende Versuche zeigten, dass das primär gebildete C6-Spektrum durch nachfolgende Reduktionen und Isomerisierungsreaktionen stark verändert wurde. Während zu Beginn der Homogenisierung (Z)-Hex-3-enal die Hauptkomponente darstellte, wurde das ohne Inhibierung erhaltenen C6-Profil von (E)-Hex-2-enal dominiert. Nach tiefgekühlter Lagerung der Jostabeeren für acht Monate wurden nur deutlich geringere Konzentrationen der Grünnoten nachgewiesen und auch die Gehalte der Ester waren verringert. Für 1,8-Cineol und 2-Methylbut-3-en-2-ol wurde hingegen kein Einfluss durch das Gefrieren festgestellt. Durch Anwendung von LLE als zweite Extraktionstechnik wurde das flüchtige Profil von Jostabeeren um 33 weitere Verbindungen ergänzt. Die prozentuale Verteilung der

Stoffgruppen sowie die Verteilung innerhalb der Gruppe der Ester und C6-Verbindungen zeigten nach VHS- und LLE-Isolierung gleiche Profile. Nach Identifizierung der aromaaktiven Verbindungen durch Anwendung der AEVA und Berechnung der Aromawerte dieser Verbindungen konnte das Aroma frischer Jostabeeren erfolgreich nachgeahmt werden. Das Aromaprofil eines Rekombinantes aus Pent-1-en-3-on, Ethylhexanoat, Oct-1-en-3-on, Ethylbutanoat, (Z)-Hex-3-enal, (E)-Hex-3-enal, Eukalyptol, Hexanal, (E)-Hex-2-enal und Methylbutanoat zeigte sehr gute Übereinstimmung mit dem Aromaprofil frischer Beeren. Sowohl das Aroma als auch das flüchtige Spektrum eines im Handel erhältlichen Jostabeerenlikörs zeigten kaum Ähnlichkeit mit den frischen Beeren.

119

Ergebnisse und Diskussion

4.3 Vergleich der flüchtigen Profile verschiedener Beeren der Gattung Ribes

4.3.1 Einleitung

Zur Gattung der Johannisbeeren (Ribes) gehören zahlreiche unterschiedliche Arten (Erhardt et al. 2008). In diesem abschließenden Kapitel soll die Zusammensetzung des flüchtigen Profils von Jostabeeren mit den Profilen der Früchte der Eltern, also Stachelbeeren und Schwarzen Johannisbeeren, verglichen werden. Da sich das flüchtige Profil von Schwarzen Johannisbeeren laut zahlreicher Untersuchungen (Andersson und von Sydow 1966a, Andersson und von Sydow 1966b, von Sydow und Karlsson 1971, Kampuss et al. 2008) stark von dem für Stachelbeeren ermittelten Profil unterscheidet, war die Einordnung des Profils ihres Kreuzungsproduktes von besonderem Interesse. Außerdem wurden Goldene Johannisbeeren, eine weitere Ribes-Art, analysiert.

4.3.2 Ergebnisse und Diskussion

Um die flüchtigen Profile frischer Jostabeeren, Stachelbeeren und Schwarzer Johannisbeeren miteinander vergleichen zu können, erfolgte die Verwendung von Daten, die durch Aufarbeitung auf identische Weise mittels VHS erhalten wurden. Aufgrund der starken Variabilität des flüchtigen Profils von Stachelbeeren wurde eine Charge ausgewählt, deren flüchtige Verbindungen die durchschnittliche Verteilung in Stachelbeeren repräsentieren (var. Achilles, 25.08.2010, siehe Abbildung 5). Die Stoffklassenverteilungen der drei verschiedenen Ribes-Arten sind in Abbildung 33 dargestellt.

C6-Komponenten Stachelbeeren C6- Ester Jostabeeren Alkohole Aldehyde schwarze Ketone Johannisbeeren Terpene/-alkohole 0% 20% 40% 60% 80% 100%

Abbildung 33: Verteilung der Stoffklassen in unterschiedlichen Arten der Gattung Ribes. Alle Daten wurden in einer Dreifachbestimmung (VHS) aus frischen Früchten bestimmt.

Die flüchtigen Profile von Jostabeeren, Stachelbeeren und Schwarzen Johannisbeeren waren durch hohe prozentuale Anteile von C6-Komponenten und Estern geprägt. Für Jostabeeren wurde zusätzlich ein recht hoher Alkohol-Anteil (ca. 11 %) festgestellt. Terpene und Terpenalkohle, welche in Schwarzen Johannisbeeren deutlich dominierten, stellten in Jostabeeren nur ca. 2 % des flüchtigen Profils dar. Höhere Konzentrationen an Ketonen 120

Ergebnisse und Diskussion wurden nur in Stachelbeeren nachgewiesen. Diese waren hauptsächlich auf Acetophenon zurückzuführen. Die durchschnittlich höchsten Konzentrationen wurden in Jostabeeren für (E)-Hex-2-enal, (E)-Hex-2-en-1-ol, (Z)-Hex-3-enal, (Z)-Hex-3-en-1-ol, Methylbutanoat, Ethylbutanoat, 2-Methylbut-3-en-2-ol und 1,8-Cineol bestimmt. Einen Vergleich der Gehalte dieser Substanzen in den drei unterschiedlichen Ribes-Arten zeigt Tabelle 31. Es wurden weitere

C6-Komponenten und Ester integriert, um ein umfangreicheres Bild zu erhalten.

Tabelle 31: Vergleich der Konzentrationen der flüchtigen Hauptkomponenten aus Jostabeeren mit den Konzentrationen in Stachelbeeren und Schwarzen Johannisbeeren

a b Schwarze Stachelbeeren Jostabeeren c Johannisbeeren

[µg/kg]d

C6-Komponenten (E)-Hex-2-enal 509 ± 157 9613 ± 819 2227 ± 404 (Z)-Hex-3-enal 1128 ± 81 565 ± 226 461 ± 99 (E)-Hex-2-en-1-ol 66 ± 8 525 ± 180 257 ± 1 Hexanal 12 ± 1 365 ± 75 159 ± 22 (E)-Hex-3-enal 25 ± 7 233 ± 22 48 ± 9 (Z)-Hex-3-en-1-ol 71 ± 11 186 ± 11 152 ± 35 (Z)-Hex-2-enal n.q.e 45 ± 4 n.d. Hexan-1-ol n.d.f 43 ± 10 33 ± 2 (E)-Hex-3-en-1-ol n.d. 25 ± 3 18 ± 7 Summe 1811 11600 3355

Terpen-/Alkohole 2-Methylbut-3-en-2-ol n.d. 1670 ± 548 238 ± 124 1,8-Cineol n.d. 308 ± 51 71 ± 20 Summe n.d. 1978 309

Ester Methylbutanoat 1276 ± 137 2330 ± 291 1774 ± 1090 Ethylbutanoat 47 ± 35 348 ± 66 1773 ± 1523 (E)-Methylbut-2-enoat 267 ± 34 125 ± 15 6 ± 1 (E)-Ethylbut-2-enoat 22 ± 17 22 ± 4 n.d. Methylhexanoat 26 ± 5 40 ± 3 141 ± 71 Summe 1638 2865 3694 a: Stachelbeeren var. Achilles (25. August 2010). b: Ernte: 13. Juli 2011 in Freising. c: Kauf: 20. Juni 2011 im örtlichen Handel. d: Mittelwert und Standardabweichung je einer Dreifachbestimmung. e: Nicht quantifizierbar (n.q.), da die Konzentration unterhalb der Bestimmungsgrenze (1,7 µg/kg) lag. f: Nicht nachweisbar (n.d.), da die Konzentration unterhalb der Nachweisgrenze (0,6 µg/kg).

Das C6-Profil von Jostabeeren gleicht mit (E)-Hex-2-enal als Hauptkomponente, gefolgt von (Z)-Hex-3-enal und (E)-Hex-2-enol, dem der Schwarzen Johannisbeeren. Auch 2-Methylbut- 3-en-2-ol und 1,8-Cineol, die in Jostabeeren in hohen Konzentrationen vorlagen, waren ebenfalls in frischen Schwarzen Johannisbeeren nachweisbar. Das Spektrum der Ester in Jostabeeren gleicht hingegen dem von Stachelbeeren. Kurzkettige Ester dominierten das

121

Ergebnisse und Diskussion

Spektrum, wobei Methylester stets höher konzentriert waren als die korrespondierenden Ethylverbindungen. Bis auf 15 Spurenkomponenten wurden alle Verbindungen, die im Rahmen dieser Arbeit in Jostabeeren identifiziert wurden, auch in den Beeren mindestens eines der Eltern nachgewiesen. Die Konzentrationsverhältnisse in Stachelbeeren, Schwarzen Johannisbeeren und Jostabeeren zeigten mitunter aber große Differenzen. Einige der in Stachel- oder Schwarzen Johannisbeeren nachgewiesenen, hoch konzentrierten Verbindungen, wie beispielsweise Δ-3-Caren, β-Phellandren oder (E)/(Z)-β-Ocimen wurden im Hybrid jedoch nicht wiedergefunden. Eine weitere, stark konsumierte Ribes-Art stellen Rote Johannisbeeren (Ribes rubrum L.) dar. Ihr C6-Profil unterscheidet sich abermals von den bisher diskutierten Beeren. Im frischen Saft roter Johannisbeeren dominiert (E)-Hex-2-en-1-ol, gefolgt von Hexanol und (Z)-Hex-3- en-1-ol, die in deutlich niedrigeren Konzentrationen vorliegen. (E)-Hex-2-enal und (Z)-Hex-3- enal wurden nur in sehr geringen Konzentrationen (< 10 µg/L) nachgewiesen (Schreier et al. 1977). Die Analyse von Goldjohannisbeeren (Ribes aureum L.) ergab ein den Jostabeeren

ähnliches C6-Profil. Als weitere Hauptkomponenten wurden Ester und Terpen-/Alkohole nachgewiesen, die alle bereits aus den verwandten Arten bekannt waren (siehe Tabelle 35).

Das Aroma von Jostabeeren wurde bereits 1978 von Bauer als eine Kombination aus den Aromen von Stachelbeeren und Schwarzen Johannisbeeren beschrieben. Die im Rahmen dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse unterstützen diese Aussage. Wie die sensorische Analyse von Jostabeeren (4.2.3) zeigt, wird das Aroma dieser Beeren primär durch Esternoten (Ethylbutanoat, Methlybutanoat und Ethylexanoat), Grünnoten ((Z)-Hex-3-enal, (E)-Hex-2-enal, (E)-Hex-3-enal und Hexanal) und durch den kampherartigen Geruch von 1,8-Cineol (Eukalyptus) geprägt. Diese Aromen sind auch aus Schwarzen Johannisbeeren und Stachelbeeren bekannt: Die geruchsaktivsten Komponenten in Schwarzen Johannisbeeren wurden als Methylbutanoat, Ethylbutanoat, 1,8-Cineol, Diacetyl und eine unbekannte Verbindung mit einem Geruch nach Katzenurin charakterisiert (Latrasse et al. 1982). Diese Unbekannte wurde von Mikkelsen und Poll (2002) als 4-Methoxy-2-methyl-2-mercaptobutan identifiziert, welches bereits aus den Blüten Schwarzer Johannisbeersträucher bekannt war (Latrasse et al. 1982)); sie wurde jedoch im Rahmen dieser Arbeit nicht in den aus Jostabeeren erhaltenen Extrakten detektiert. Die in Jostabeeren detektierten Grün- und Esternoten wurden ebenfalls als wichtige Aromanoten von Stachelbeeren identifiziert (siehe 4.1.3).

122

Zusammenfassung

5 Zusammenfassung

Die flüchtigen Inhaltsstoffe von Stachelbeeren (Ribes uva crispa L.) und Jostabeeren (Ribes x nidigrolaria Bauer) wurden mittels Vakuum Headspace Technik isoliert und mittels kapillargaschromatographisch-massenspektrometrischer Methoden untersucht.

Das Spektrum flüchtiger Verbindungen von Stachelbeeren war vor allem durch

C6-Verbindungen und Ester geprägt. Die drei Hauptkomponenten (Z)-Hex-3-enal, (E)-Hex-2- enal und Methylbutanoat machten in allen untersuchten Chargen mindestens 70 % aus. Durch die Untersuchung verschiedener Stachelbeer-Sorten sowie durch Analyse mehrerer Chargen Stachelbeeren derselben Sorte wurde gezeigt, dass das flüchtige Profil von Stachelbeeren in der prozentualen Zusammensetzung der Stoffgruppen sowie in den absoluten Konzentrationen einzelner Verbindungen stark variiert. Innerhalb der einzelnen Stoffgruppen blieben die Verteilungen der Komponenten aber nahezu konstant.

Im Spektrum flüchtiger Verbindungen aus Jostabeeren überwogen ebenfalls

C6-Komponenten und Ester. Als zwei weitere quantitativ dominierende Verbindungen wurden 1,8-Cineol und 2-Methylbut-3-en-2-ol nachgewiesen. Im Gegensatz zum flüchtigen Profil aus Stachelbeeren, welches primär durch (Z)-Hex-3-enal geprägt wurde, bestimmt (E)-Hex-2- enal das C6-Profil in Jostabeeren. Durch die Analyse von Beeren, die an verschiedenen Anbauorten in Süddeutschland geerntet wurden, und durch die Untersuchung von Beeren desselben Anbauortes in verschiedenen Jahren wurde gezeigt, dass die qualitative und quantitative Zusammensetzung des flüchtigen Jostabeeren-Profils sehr konstant ist.

Starke Änderungen im Spektrum flüchtiger Verbindungen wurden sowohl für Stachelbeeren als auch für Jostabeeren im Zuge der Fruchtreifung festgestellt. In den Beeren beider

Beerenobstarten nahmen die Menge an C6-Komponenten im Verlauf der Reifung ab, während die Summe an Estern zunahm. Zusätzlich traten Änderungen innerhalb des

C6-Profils von Jostabeeren auf: Während in unreifen Früchten (Z)-Hex-3-enal dominiert, stellt in der reifen Frucht (E)-Hex-2-enal die Haupt-C6-Verbindung dar.

Untersuchungen zum Einfluss enzymkatalysierter Reaktionen zeigten, dass das direkt nach der Zerkleinerung freigesetzte C6-Spektrum in Stachelbeeren durch Folgereaktionen kaum verändert wurde. Bei Jostabeeren wurden jedoch starke Änderungen festgestellt: Aus dem primär gebildeten (Z)-Hex-3-enal werden durch anschließende Reduktionen und Isomerisierungen schnell der korrespondierende Aldehyd (E)-Hex-2-enal sowie (E)-Hex-2- en-1-ol gebildet. Nach der Tiefkühllagerung der Beeren für acht Monate war vor allem die

Bildung dieser ungesättigten C6-Komponenten stark reduziert. 123

Zusammenfassung

Als zusätzliche Methode zur Isolierung flüchtiger Verbindungen wurde die Flüssig-Flüssig- Extraktion eingesetzt. Die Verteilung der Hauptstoffgruppen von Stachelbeeren und Jostabeeren stimmte mit den in den VHS-Extrakten beobachteten Verteilungen überein. Die LLE-Extrakte zeigten jedoch höhere Mengen an Säuren und aliphatischen Kohlenwasserstoffen. Durch statische Headspace Analyse wurden in Stachelbeeren zusätzlich die stark flüchtigen Verbindungen Methylacetat und Ethylacetat als weitere Hauptkomponenten des flüchtigen Profils identifiziert.

Die VHS-Extrakte aus Stachelbeeren und Jostabeeren wiesen den für die jeweilige Frucht charakteristischen Geruch auf. Die geruchsaktiven Komponenten wurden mit Hilfe von Kapillargaschromatographie-Olfaktometrie und unter Einsatz der Aromaextrakt- verdünnungsanalyse ermittelt. Zusätzlich wurde der Beitrag einzelner Komponenten zum Gesamtaroma durch die Berechnung von Aromawerten abgeschätzt. In Stachelbeeren wurden vor allem Lipidoxidationsprodukte und kurzkettige Ester als aromaaktive Verbindungen identifiziert. (Z)-Hex-3-enal erwies sich als deutlich dominierender Aromastoff. Diese Komponente zeichnet sich durch ein grünes, grasiges Aroma aus. Weiterhin zeigten (R)-Oct-1-en-3-ol, Ethylbutanoat, Methylbutanoat, (E)-Hex- 2-enal, (Z)-Hex-3-en-1-ol und Ethylacetat einen Einfluss auf das Aroma. Auch in Jostabeeren tragen vor allem Lipidoxidationsprodukte und kurzkettige Ester zum typischen Aroma bei. Zusätzlich wurde 1,8-Cineol als wichtiger Aromastoff identifiziert. Das Aroma von frischen Jostabeeren konnte unter Verwendung von Pent-1-en-3-on, Ethylhexanoat, Oct-1-en-3-on, Ethylbutanoat, (Z)-Hex-3-enal, (E)-Hex-3-enal, 1,8-Cineol, Hexanal, (E)-Hex-2-enal und Methylbutanoat in den natürlich in Jostabeeren enthaltenen Konzentrationen nachgeahmt werden.

Die flüchtigen Profile eines im Handel erhältlichen Stachelbeerenlikörs und eines im Handel erhältlichen Jostabeerenlikörs zeigten starke Unterschiede zu den Profilen der jeweils frischen Früchte.

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136

Anhang

7 Anhang

7.1 Absolute Wiederfindungsraten von Heptan-2-ol bei VHS und LLE Die absolute Wiederfindung des internen Standards Heptan-2-ol wurde wie unter 3.2.3.3 beschrieben ermittelt. Sie betrug bei VHS 79 ± 9 % und bei LLE 77 ± 8 %.

7.2 Vergleich der Wiederfindungsraten bei VHS aus Beerenmatrix-Imitat und Wasser

Tabelle 32: Für Isolierungen mittels VHS bestimmte Wiederfindungen aus Wasser und einem Beerenmatrix-Imitat

Wiederfindung [%]a Wasser BMb Substanz VHSc

Aldehyde (E)-Hex-2-enal 85 ± 6 90 ± 5 (E)-Hex-3-enal 23 ± 1 26 ± 7 (Z)-Hex-3-enal 21 ± 1 27 ± 7

Ester Ethylbutanoat 76 ± 8 64 ± 2 (E)-Ethylbut-2-enoat 87 ± 3 80 ± 4 Methylbutanoat 63 ± 18 58 ± 2 (E)-Methylbut-2-enoat 82 ± 5 76 ± 4 Methylhexanoat 76 ± 6 63 ± 4

Alkohole (E)-Hex-2-en-1-ol 77 ± 7 88 ± 2 (Z)-Hex-3-en-1-ol 76 ± 5 79 ± 1 Oct-1-en-3-ol 101 ± 0 101 ± 1

Ketone Acetophenon 92 ± 4 94 ± 3 Pentan-2-on 51 ± 3 55 ± 3

Terpene / Terpenalkohole ∆-3-Caren 47 ± 3 34 ± 6 Limonen 30 ± 10 32 ± 5 Terpinolen 48 ± 4 40 ± 6 Eukalyptol 86 ± 14 91 ± 10 Terpinen-4-ol 83 ± 8 87 ± 8 a: Mittelwert und Standardabweichung jeweils einer Dreifachbestimmung. b: Beerenmatrix-Imitat (siehe 3.2.5.2). c: Vakuum Headspace Technik.

137

Anhang

7.3 Wiederfindungsraten von (Z)-Hex-3-enal, (E)-Hex-3-enal und (E)-Hex- 2-enal mit 10-fach höheren und 10-fach niedrigeren Konzentrationen

Tabelle 33: Für (Z)-/(E)-Hex-3-enal und (E)-Hex-2-enal bestimmte Wiederfindungen bei um Faktor 100 unterschiedlichen Konzentrationen

(Z)-Hex-3-enal VHSa LLEb [%] normalc 33 ± 13 42 ± 4 normalc 27 ± 7 50 ± 3 10fachd 40 ± 10 52 ± 11 1/10e 32 ± 3 35 ± 2

(E)-Hex-3-enal VHS LLE [%] normalc 32 ± 13 43 ± 5 normalc 27 ± 7 48 ± 2 10fachd 43 ± 9 64 ± 12 1/10e 37 ± 2 50 ± 1

(E)-Hex-2-enal VHS LLE [%] normalf 85 ± 6 84 ± 2 10fachg 108 ± 3 93 ± 2 1/10h 88 ± 15 110 ± 28 a: Vakuum Headspace Extraktion. b: Flüssig-Flüssig-Extraktion. c: 706 µg (Z)-Hex-3-enal, 43 µg (E)-Hex-3-enal und 299 µg Heptan-2-ol zur Extraktion eingesetzt. d: 10fach höhere Mengen an (Z)-Hex-3-enal und (E)-Hex-3- enal zur Extraktion eingesetzt. e: 10fach niedrigere Mengen an (Z)-Hex-3-enal und (E)-Hex-3-enal zur Extraktion eingesetzt. f: 284 µg (E)-Hex-2-enal und 299 µg Heptan-2-ol zur Extraktion eingesetzt. g: 10fach höhere Mengen an (E)-Hex-2-enal zur Extraktion eingesetzt. h: 10fach niedrigere Mengen an (E)-Hex-2-enal zur Extraktion eingesetzt.

7.4 Zur Quantifizierung verwendete Wiederfindungsraten

Tabelle 34: Zur Quantifizierung verwendete Wiederfindungsraten

Wiederfindung [%]a Substanz VHSb LLEc

Aldehyde (E)-Hept-2-enal 92 ± 7 96 ± 2 Hexanal 86 ± 4 69 ± 10 (E)-Hex-2-enal 85 ± 6 84 ± 2 (Z)-Hex-3-enald 30 ± 10 46 ± 6 (E)-Hex-3-enald 29 ± 7 46 ± 2 Heptanal 85 ± 2 Phenylacetaldehyd 40 ± 2

138

Anhang

Wiederfindung [%]a Substanz VHSb LLEc

Ester Methylbenzoat 87 ± 13 102 ± 4 (E)-Ethylbut-2-enoat 87 ± 3 106 ± 4 (E)-Methylbut-2-enoat 82 ± 5 82 ± 2 Ethylbutanoat 76 ± 8 88 ± 2 Methylhexanoat 76 ± 6 92 ± 2 Methylbutanoat 63 ± 18 61 ± 4 Ethylbenzoat 99 ± 4 1-Phenylethyl 2-methylpropanoat 99 ± 5 (Z)-Hex-3-enylacetat 93 ± 5 Ethylcinnamat 89 ± 8 Phenylethylacetat 83 ± 5 Ethylnonanoat 79 ± 5 2-Propenylhexanoat 79 ± 7 3-Methylbutylacetat 79 ± 6 Ethylhexanoat 77 ± 6 Butylbutanoat 77 ± 6 Pentylpentanoat 75 ± 7 2-Methylpropylacetat 73 ± 5 Ethyldecanoat 71 ± 7 Dimethylmalonat 39 ± 5 Ethylformiat 5 ± 9 Ethyllactat 4 ± 0 Ethylacetat 1 ± 1

Alkohole Oct-1-en-3-ol 101 ± 0 100 ± 1 Hexan-1-ol 82 ± 2 89 ± 1 (E)-Hex-2-en-1-ol 77 ± 7 95 ± 1 3-Methylbutanol 77 ± 4 87 ± 3 (Z)-Hex-3-en-1-ol 76 ± 5 83 ± 10 2-Methylbut-3-en-2-ol 40 ± 15 29 ± 3 3-Methylbut-2-en-1-ol 35 ± 9 77 ± 4 Menthol 91 ± 1 Heptan-1-ol 64 ± 4 2-Methylpropanol 36 ± 2

Terpene / Terpenalkohole Citronellol 93 ± 10 109 ± 4 1,8-Cineol 86 ± 14 98 ± 3 Terpinen-4-ol 83 ± 8 107 ± 5 Terpinolen 48 ± 4 19 ± 1 β-(E)-Ocimen 48 ± 4 16 ± 2 β-(Z)-Ocimen 48 ± 4 15 ± 2 ∆-3-Caren 47 ± 3 12 ± 2 Myrcen 45 ± 4 12 ± 2 α-Pinen 40 ± 2 6 ± 2 Limonen 30 ± 10 21 ± 10 β-Phellandren 30 ± 10 21 ± 10 Linalool 101 ± 2 β-Ionon 94 ± 8 α-Terpineol 90 ± 14

Säurene Dimethylmalonsäure n.q.f 9 ± 1 Zimtsäure n.d.g 78 ± 7 Hexansäure 31 ± 8 101 ± 3 139

Anhang

Wiederfindung [%]a Substanz VHSb LLEc

Buttersäure 13 ± 0 62 ± 12 (E)-Hex-2-ensäure 13 ± 3 98 ± 9 (E)-Hex-3-ensäure 12 ± 1 95 ± 3 Propansäure 4 ± 0 28 ± 8 Essigsäure 2 ± 0 17 ± 6 Nonansäure 2 ± 1 2-Methylpropansäure n.d.

Ketone Acetophenon 92 ± 4 102 ± 1 Pentan-2-on 51 ± 3 40 ± 4 Mesifuran 7 ± 1 66 ± 13 Acetoin n.d. 4 ± 0 Furaneol n.d. 11 ± 2

Sonstige Butan-2,3-diol (ersteluierendes n.d. 2 ± 1 Diastereomer) Butan-2,3-diol (zweiteluierendes n.d. n.d. Diastereomer) Heptanal-Diethylacetal 117 ± 2 a: Mittelwert ± Standardabweichung einer Dreifachbestimmung aus Wasser. b: Vakuum Headspace Technik. c: Flüssig-Flüssig-Extraktion. d: Mittelwert einer Sechsfachbestimmung aus Beerenmatrix-Imitat (Anhang, Tabelle 33). e: Bestimmungen aus Natriumcitrat/Salzsäure-Pufferlösung (pH 3,5). f: Nicht quantifizierbar, da die Konzentration unterhalb der Bestimmungsgrenze (1,7 g/kg) lag. g: Nicht identifizierbar (n.d.), da die Konzentration unterhalb der Nachweisgrenze (0,6 µg/kg) lag.

Für Substanzen, deren Wiederfindungsrate < 25 % war, wurde keine Quantifizierung durchgeführt. Bei VHS-Isolierung wurde aufgrund der niedrigen Wiederfindungen aller analysierten Säuren generell keine Quantifizierung für Säuren durchgeführt.

7.5 NMR-spektroskopische Daten des synthetisierten 2-Hydroxy-1,8- cineols

1 NMR-Spektrum (500 mHz; H in CD3Cl): 3,6 ppm (m, 1H, H-2); 2,5 ppm (m, 1H, H-3a); 1,98 ppm (m, 1H, H-5a); 1,90 ppm (m, 1H, H- 6a); 1,57 ppm (m, 1H, H-6b); 1,52 ppm (m, 1H, H-4); 1,48 ppm (m, 1H, H-5b); 1,34 ppm (m, 1H, H-3b); 1,27 ppm (s, 3H, H-9/10); 1,20 ppm (s, 3H, H-9/10); 1,05 ppm (s, 3H, H-7). 13 NMR-Spektrum (126 mHz; C in CD3Cl): 73,2 ppm (C8); 74,6 ppm (C1); 71,4 (C2); 34,5 ppm (C4); 35,2 ppm (C3); 29,3 ppm (C9/C10); 28,9 ppm (C9/C10); 26,1 ppm (C6); 24,9 ppm (C7); 22,2 ppm (C5).

140

Anhang

7.6 Identifizierung und Quantifizierung flüchtiger Verbindungen in Goldjohannisbeeren (Ribes aureum L.)

Tabelle 35: Mittels Vakuum Headspace Technik in Goldjohannisbeeren identifizierte und quantifizierte Verbindungen (Doppelbestimmung)

Substanz RIa 1 2 [µg/kg]

Ester Ethylbutanoat 1028 867 1397 e,g Methylbutanoat 976 50 56 e,g (E)-Ethylbut-2-enoat 1158 22 19 e,g Ethyl-2-hydroxybutanoat 1387 12 25 f,i Methylsalicylat 1769 15 17 e,h Isopropylpalmitat 2239 13 13 f,i Ethylhexanoat 1232 14 12 e,h Methylhexanoat 1184 5 8 e,g Ethyloctanoat 1434 7 5 e,h Ethyl-3-hydroxybutanoat 1498 4 7 e,h Ethylbenzoat 1661 2 4 e,h Ethylacetat 884 n.q.b n.q. e,h Isopropyllaurat 1795 2 n.q. f,i Propylbutanoat 1107 n.q. n.q. f,i 2-Methylpropylbutanoat 1117 n.q. n.q. e,h Methylbenzoat 1613 n.q. n.d.c e,g

C6-Komponenten (E)-Hex-2-enal 1209 767 950 e,g (E)-Hex-2-en-1-ol 1407 153 199 e,g (Z)-Hex-3-enal 1139 85 69 e,g Hexanal 1176 22 21 e,g (Z)-Hex-3-en-1-ol 1384 18 22 e,g Hexan-1-ol 1355 11 11 e,g (E)-Hex-3-enal 1133 14 n.q. e,g

Alkohole (R)-Oct-1-en-3-ol 1452 133 145 e,g 2-Methylpropan-1-ol 1090 71 195 e,g Butan-1-ol 1142 63 132 e,h 2-Methylbut-3-en-2-ol 1035 26 45 e,g Butan-2-ol 1042 9 13 e,h 3-Methylbut-2-en-1-ol 1308 10 11 e,g Ethanol 931 7 10 e,h (Z)-Pent-2-en-1-ol 1321 5 10 e,h Pent-1-en-3-ol 1161 5 9 e,h 2-Phenylethan-1-ol 1899 5 8 e,h Octan-1-ol 1560 6 6 e,h Pentan-1-ol 1252 6 5 e,h 2-Ethylbutan-1-ol 1295 7 3 e,h 2-Ethylhexan-1-ol 1491 4 5 e,h Benzylalkohol 1874 2 n.q. e,h

Terpene/Terpenalkohole 1,8-Cineol 1200 69 67 e,g α-Terpineol 1686 18 11 e,h Limonen 1196 6 7 e,g Terpinen-4-ol 1601 4 n.q. e,g Borneol 1713 3 n.q. e,h 141

Anhang

Substanz RIa 1 2 [µg/kg]

Anethol 1821 2 n.q. e,h a-Pinen 1013 n.q. n.q. e,g β-Pinen 1093 n.q. n.q. e,h Carvon 1710 n.q. n.d. e,h Eugenol 2132 n.q. n.d. e,h Camphen 1051 n.q. n.d. e,h Campher 1499 n.q. n.d. e,h

Ketone Pentan-2-on 963 8 10 e,g Menthon 1457 9 5 e,h Octan-3-on 1254 4 6 e,h Acetoin 1265 n.k.d n.k. e,g

Aldehyde Nonanal 1389 3 5 e,h Octanal 1276 n.q. n.d. e,h (E)-Hept-2-enal 1318 n.q. n.d. e,g Benzaldehyd 1512 n.q. n.d. e,h

Säuren 2-Methylbuttersäure 1667 n.k. n.k. e,h Essigsäure 1440 n.k. n.k. e,g Pentansäure 1734 n.k. n.k. e,h Hexansäure 1844 n.k. n.k. e,g Buttersäure 1624 n.k. n.k. e,g a: Retentionsindices. b: Nicht quantifizierbar (n.q.), da die Konzentration unterhalb der Bestimmungsgrenze (1,7 µg/kg) lag. c: Nicht identifizierbar, da die Konzentration unterhalb der Nachweisgrenze (0,6 µg/kg) lag. d: Nicht kalkulierbar: Wiederfindung kleiner 25 %. e: Die Identifizierung erfolgte durch eine Referenzsubstanz. f: Die Identifizierung erfolgte durch Abgleich massenspektrometrischer Daten mit Literaturangaben. g: Die Quantifizierung erfolgte unter Berücksichtigung des gaschromatographischen Verhaltens (Response) und der Wiederfindung. h: Die Quantifizierung erfolgte unter Berücksichtigung des gaschromatographischen Verhaltens (Response). i: Für die Quantifizierung wurde der Response-Faktor 1 angenommen.

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Anhang

LEBENSLAUF

Persönliche Angaben: Name Katrin Sigrid Schrade, geborene Hempfling Geboren am 08. August 1984 in Kronach Familienstand ledig Staatsangehörigkeit deutsch Adresse Dittenbergerstr. 4 in 06114 Halle Telefon +49 345 44595837 Mobil +49 170 8232005 Email [email protected]

Schulbildung: 1991 – 1995 Grund- und Hauptschule Mitwitz 1995 – 2004 Frankenwald-Gymnasium Kronach Abschluss: allgemeine Hochschulreife

Hochschulbildung: 09/2004 – 09/2008 Studium der Lebensmittelchemie (Staatsexamen) an der Julius- Maximilians-Universität Würzburg

Vorprüfung im Oktober 2006 Erste Staatsprüfung im Oktober 2008

Berufserfahrung: 02/2005 – 03/2005 Praktikum bei der Danone GmbH im Bereich Qualitätssicherung

10/2008 – 04/2009 Praktikum bei der Nestlé Deutschland AG im Bereich Qualitätssicherung

04/2009 – 12/2012 Wissenschaftliche Mitarbeiterin am Lehrstuhl für Allgemeine Lebensmitteltechnologie an der Technischen Universität München

01/2012 – 04/2012 Schriftliche Ausarbeitung der Doktorarbeit

04/2013 – heute Laborleiterin der Rohstoffanalytik bei der Scil Proteins Production GmbH

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Anhang

Auszüge dieser Dissertation wurden bereits veröffentlicht oder als Manuskript eingereicht:

PUBLIKATIONEN

Hempfling, K.; Fastovskaya, O.; Engel, K.-H. (2011): Untersuchung flüchiger Verbindungen in Stachelbeeren (Ribes uva crispa L.). Lebensmittelchemie 65 (5), S. 130.

Hempfling, K.; Engel, K.-H. (im Druck): Analysis and sensory evaluation of gooseberry (Ribes uva crispa L.) volatiles. Weurman Symposium Series.

Hempfling, K.; Fastowski, O.; Kopp, M.; Pour Nikfardjam, M.; Engel, K.-H. (2013): Analysis and sensory evaluation of gooseberry (Ribes uva crispa L.) volatiles. J. Agric. Food Chem. 61 (26), S. 6240–6249.

Hempfling, K; Fastowski, O.; Celik, J.; Engel, K.-H. (2013): Analysis and sensory evaluation of jostaberry (Ribes x nidigrolaria Bauer) volatiles. J. Agric. Food Chem. 61 (38), S. 9067- 9075.

Pour Nikfardjam, M.; Echle, A.; Kopp, M.; Hempfling, K.; Engel, K.-H. (2013): Stachelbeeren. Eigenschaften verschiedener Sorten und wertgebender Inhaltsstoffe. Obstbau 6, S- 351-356.

Pour Nikfardjam, M.; Kopp, M.; Hempfling, K.; Engel, K.-H. (eingereicht): Analyse von Aromastoffen in frischen Stachelbeeren (Ribes uva-crispa L.) mittels Headspace HRGC-MS. Mitteilungen Klosterneuburg.

VORTRÄGE oder POSTER

Hempfling, K.; Fastovskaya, O.; Engel, K.-H. (2011): Untersuchung flüchiger Verbindungen in Stachelbeeren (Ribes uva crispa L.). Arbeitstagung des Regionalverbandes Bayern der Lebensmittelchemischen Gesellschaft (GDCh), Freising, 15.02.2011.

Hempfling, K.; Engel, K.-H. (2011): Analysis and sensory evaluation of gooseberry (Ribes uva crispa L.) volatiles. 13. Weurman Flavour Research Symposium, Zaragoza, Spanien, 27.-30.09.2011.

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