LỜI CẢM ƠN
Sau thời gian nghiên cứu, với tinh thần nghiêm túc, tích cực đến nay khóa luận đã hoàn thành, để có đƣợc kết quả này trƣớc hết tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện CNSH Lâm nghiệp đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi để tôi thực hiện đề tài:“Nghiên cứu nhân giống in vitro Đàn hương trắng (Santalum album L.)”. Trong quá trình thực hiện đề tài, ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi còn nhận đƣợc sự hƣớng dẫn tận tâm, chỉ bảo và truyền đạt kiến thức của các thầy, cô giáo trong trƣờng Đại học Lâm nghiệp, các cán bộ viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp. Nhân dịp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới : Các thầy cô trong Bộ môn Chọn tạo giống - Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp – Trƣờng Đại học Lâm nghiệp. Giáo viên hƣớng dẫn TS. Khuất Thị Hải Ninh. Cán bộ và thầy cô trong viện Công Nghệ Sinh học Lâm nghiệp. Mặc dù đã cố gắng để hoàn thành đề tài khóa luận song thời gian có hạn, kinh nghiệm bản thân còn hạn chế nên đề tài không thể tránh khỏi những thiếu sót. Chúng tôi rất mong nhận đƣợc những lời nhận xét, đóng góp ý kiến của các Thầy, Cô giáo để đề tài đƣợc hoàn thiện hơn. Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 27 tháng 05 năm 2019 Sinh viên thực hiện
Kiều Thị Dung
i
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN ...... i
MỤC LỤC ...... ii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG ...... v
DANH MỤC HÌNH ...... vi
DANH MỤC BIỂU ĐỒ ...... vii
ĐẶT VẤN ĐỀ ...... 1
PHẦN 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU ...... 3
1.1. Giới thiệu chung về cây Đàn hƣơng trắng ...... 3
1.1.1. Đặc điểm hình thái ...... 3
1.1.2. Đặc điểm sinh thái ...... 5
1.1.3. Đặc điểm phân bố ...... 6
1.1.4. Giá trị kinh tế ...... 7
1.1.5. Thực trạng Đàn hƣơng trắng ...... 10
1.2. Một số nghiên cứu về Đàn hƣơng trắng ...... 11
1.3. Một số kết quả về nhân giống in vitro Đàn hƣơng trắng ...... 12
PHẦN 2. MỤC TIÊU, NỘI DUNG, vẬt liỆu và ...... 15
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...... 15
2.1. Mục tiêu nghiên cứu ...... 15
2.2. Nội dung nghiên cứu ...... 15
2.3. Đối tƣợng, vật liệu và địa điểm nghiên cứu ...... 15
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ...... 15
2.4.1. Phƣơng pháp luận ...... 15
2.4.2. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm và thu thập số liệu ...... 16
2.4.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu ...... 20
PHẦN 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ...... 23
3.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian khử trùng mẫu bằng HgCl2 0,1% đến khả năng tạo mẫu sạch ...... 23
...... 24 3.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất điều hoà sinh trƣởng và hàm lƣợng các loại
đƣờng đến khả năng nhân nhanh chồi Đàn hƣơng trắng ...... 26 ii
3.2.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất điều hoà sinh trƣởng đến khả năng nhân nhanh chồi ...... 26 3.2.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng hàm lƣợng các loại đƣờng đến khả năng nhân nhanh chồi
Đàn hƣơng trắng...... 29
3.3. Ảnh hƣởng của chất điều hoà sinh trƣởng đến khả năng ra rễ của chồi in vitro .... 32
PHẦN 4. KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KHUYẾN NGHỊ ...... 36
4.1. Kết luận...... 36
4.2. Tồn tại ...... 36
5.3. Khuyến nghị ...... 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ BIỂU
iii
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
STT Ký hiệu Giải thích
1 BAP 6 - Benzyl amino purin
2 CTTN Công thức thí nghiệm
3 ĐHST Điều hòa sinh trƣởng
4 MS Murashigee Skoog, 1962
5 NAA A-Naphthalene acetic acid
6 IBA Indole-3-butyric acid
7 K Kinetine
8 GA3 Gibberellic axit 9 Sig Mức ý nghĩa ( Significant) 10 TB Trung bình 11 G Glucose 12 S Sucrose 13 CoM Nƣớc cốt dừa 14 TDZ Thidiazuron 15 IPA Iso propyl alcohol 16 2,4D Axit 2,4-Dichlorophenoxyacetic
iv
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. So sánh giá trị kinh tế giữa Đàn hƣơng trắng và Đàn hƣơng đỏ...... 9
Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm về ảnh hƣởng thời gian khử trùng mẫu bằng HgCl2 0,1% đến khả năng tạo mẫu sạch ...... 17 Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng nhân nhanh chồi ...... 18 Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm về sự ảnh hƣởng của hàm lƣợng các loại đƣờng đến khả năng nhân nhanh chồi ...... 19 Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm về sự ảnh hƣởng của IBA, NAA đến khả năng ...... 20 ra rễ ...... 20
Bảng 3.1. Tỷ lệ mẫu sạch nảy chồi khi khử trùng chồi Đàn hƣơng trắng bằng HgCl2 0,1% ...... 24 Bảng 3.2. Kết quả nhân nhanh chồi Đàn hƣơng trắng trên môi trƣờng MS có bổ sung BAP, K và NAA ...... 26 Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng các loại đƣờng đến khả năng nhân nhanh chồi Đàn hƣơng trắng ...... 30 Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của IBA, NAA đến khả năng ra rễ của chồi in vitro Đàn hƣơng trắng ...... 33
v
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cây Đàn hƣơng trắng ...... 3 Hình 1.2. Hình thái hoa và quả Đàn hƣơng trắng...... 4 Hình 1.3. Một số sản phẩm làm từ cây Đàn hƣơng trắng ...... 10 Hình 3.1. Kết quả tạo mẫu sạch Đàn hƣơng trắng sau 4 tuần nuôi cấy...... 25 Hình 3.2. Chồi Đàn hƣơng trắng môi trƣờng ...... 29 MS + 0,2 mg/l BAP + 0,3 mg/l K + 0,15 mg/l NAA (sau 6 tuần nuôi cấy) ...... 29 Hình 3.3. Cụm chồi Đàn hƣơng trắng trên môi trƣờng bổ sung ...... 32 MS + 0,2 mg/l BAP + 0,3 mg/l K + 0,15 mg/l NAA + 30 g/l Glucose ...... 32 (sau 6 tuần nuôi cấy) ...... 32 Hình 3.4. Rễ Đàn hƣơng trắng sau 8 tuần cấy chuyển sang môi trƣờng rễ MS + 0,25 mg/l NAA + 0,5 mg/l IBA sử dụng 30 g/l Glucose ...... 35 Hình 3.5. Rễ Đàn hƣơng trắng sau 8 tuần cấy chuyển sang môi trƣờng rễ MS + 0,5 mg/l IBA sử dụng 30 g/l Glucose ...... 35
vi
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1. Tỷ lệ (%) mẫu sạch nảy chồi khi khử trùng mẫu bằng HgCl2 0,1% với thời gian khác nhau...... 24 Biều đồ 3.2. Chiều cao chồi Đàn hƣơng trắng trên môi trƣờng MS có bổ sung BAP, K và NAA ở các nồng độ khác nhau ...... 27 Biều đồ 3.3. Hệ số nhân chồi Đàn hƣơng trắng trên môi trƣờng MS có bổ sung BAP, K và NAA ở các nồng độ khác nhau ...... 27 Biểu đồ 3.4. Hệ số nhân chồi Đàn hƣơng trắng trong môi trƣờng bổ sung hàm lƣợng các loại đƣờng khác nhau ...... 30 Biểu đồ 3.5. Chiều cao chồi Đàn hƣơng trắng trong môi trƣờng MS + 0,2 mg/l BAP + 0,3 mg/l K + 0,15 mg/l NAA với hàm lƣợng các loại đƣờng khác nhau ...... 31 Biểu đồ 3.6. Tỷ lệ chồi in vitro ra rễ trên môi trƣờng bổ sung các chất ĐHST ở nồng độ khác nhau ...... 33 Biểu đồ 3.7. Chiều dài TB/rễ trên môi trƣờng bổ sung các chất ĐHST ở nồng độ khác nhau ...... 34
vii
ĐẶT VẤN ĐỀ
Đàn hƣơng trắng có tên khoa học là Santalum album L., còn gọi là Bạch đàn hƣơng hay Bạch đƣờng, là một loài thực vật có hoa trong họ Santalaceae. Loài này đƣợc miêu tả khoa học đầu tiên năm 1753 [31].
Cây Đàn hƣơng trắng mang lại giá trị sử dụng cao, gần nhƣ tất cả các bộ phận của cây nhƣ: thân, gốc, cành, lá, giác gỗ... Gỗ Đàn hƣơng trắng thƣờng đƣợc dùng để sản xuất ra các mặt hàng có giá trị cao nhƣ hàng đồ gỗ mỹ nghệ, đồ gia dụng cao cấp, trang trí nội thất, dùng chiết suất tinh dầu, chất dẫn xuất nƣớc hoa, sử dụng trong ngành mỹ phẩm để làm đẹp, chăm sóc da.
Đàn hƣơng trắng là cây gỗ quý, có trong danh mục sách đỏ Ấn Độ, mang lại giá trị sử dụng và giá trị kinh tế cao hơn so với các giống đàn hƣơng khác, đƣợc thế giới đánh giá là cây hƣơng liệu siêu hạng [4]. Trung Quốc đánh giá Đàn hƣơng trắng là cây có thu nhập vào loại cao nhất trên một đơn vị diện tích, là cây “hoàng kim” giá đắt nhƣ vàng [4]. Năm 2014, bình quân doanh thu khi trồng Đàn hƣơng trắng là gần 1,5 triệu USD/ha/năm, tƣơng đƣơng 27 tỷ đồng/ha/năm, cao gấp hàng trăm lần các cây rừng khác. Giá bán mỗi kg gỗ Đàn hƣơng trắng hiện vào khoảng 500 USD [4]. Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn ngày 22/4/2019 đã ban hành Quyết định số 1305/QĐ-BNN-TCLN về việc công nhân giống cây trồng cây lâm nghiệp mới đối với giống cây Đàn hƣơng trắng có xuất xứ Karnataka - Ấn Độ. Giống do Viện Nghiên cứu cây Đàn hƣơng và Thực vật quý hiếm nhập nội và sản xuất thử nghiệm đã đƣợc trồng tại một số địa phƣơng nhƣ: huyện Buôn Đôn, TP. Buôn Mê Thuật (Đắk Lắk); Huyện Lục Ngạn, TP. Bắc Giang (Bắc Giang); Huyện Thạch Thất, TX Sơn Tây (Hà Nội) và một số vùng sinh thái tƣơng tự [2], [3],[10]. Từ kết quả nghiên cứu này, Viện đã chọn lọc ra các cây trội có sinh trƣởng nhanh, hàm lƣợng tinh dầu cao làm cơ sở cho các bƣớc chọn giống tiếp theo.
Do loài cây này mới đƣợc du nhập về Việt Nam, nguồn hạt giống phải nhập từ nƣớc ngoài, đặc biệt là từ Ấn Độ, hạt tỷ lệ nảy mầm thấp (chỉ từ 20 - 60%, nếu dùng GA3 để kích thích nảy mầm sẽ ảnh hƣởng đến việc phát triển lõi gỗ và hàm lƣợng tinh dầu do GA3 làm dãn tế bào), những nguyên nhân trên đã làm cho giá
1 cây giống rất cao (80.000 – 100.000 đồng/cây, cao từ 25 – 30 cm). Mặt khác, nhu cầu cây giống trong nƣớc ngày càng lớn, vì vậy, việc nghiên cứu nhân giống tại chỗ nhằm giảm giá thành cây giống là rất cần thiết [4], [8], [24]. Trong đó, nhân giống in vitro là một phƣơng pháp nhân giống với nhiều ƣu điểm nhƣ: hệ số nhân giống cao, đáp ứng đủ và kịp thời cho việc sử dụng một lƣợng lớn cây giống trên qui mô lớn, không phụ thuộc vào thời vụ. Xuất phát từ những vấn đề thực tế trên với hy vọng đóng góp một phần vào phát triển loài Đàn hƣơng trắng ở Việt Nam, tôi đã lựa chọn đề tài:“Nghiên cứu nhân giống in vitro Đàn hương trắng (Santalum album L.)”.
2
PHẦN 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU
1.1. Giới thiệu chung về cây Đàn hƣơng trắng 1.1.1. Đặc điểm hình thái - Tên khoa học: Santalum album L. - Tên Việt Nam: Đàn hƣơng trắng, Bạch đàn hƣơng hoặc Bạch đƣờng. - Họ: Thuộc họ Đàn hƣơng Santalaceae.
Hình 1.1. Cây Đàn hƣơng trắng (Nguồn: Viện nghiên cứu đàn hƣơng và thực vật quý hiếm) a. Đặc điểm thân cây
Đàn hƣơng trắng là cây gỗ cao 10 – 15 m, khi trồng ở Ấn Độ lên tới 20 m. Thân cây hình trụ có thể đạt chu vi hơn 1,5 m. Đôi khi nó cũng phát triển nhƣ một cây bụi thẳng đứng hoặc hiếm khi leo lên, đạt đến tầm cao tới 4 m. Ở những cây non, vỏ cây nhẵn và có màu từ nâu đến nâu sẫm, xám đen. Gỗ màu vàng nhạt, mùi thơm ngát, dùng dƣới dạng khúc gỗ hoặc gỗ bào [7]. b. Đặc điểm rễ
Đặc tính sinh học quan trọng nhất là có rễ cái ký sinh trên cây chủ, rễ con bám chặt vào rễ cái cây chủ bằng các giác mút, hút dinh dƣỡng từ cây ký chủ để sinh trƣởng và phát triển nên còn gọi Đàn hƣơng trắng là cây gỗ bán ký sinh. Đàn hƣơng trắng vừa có thể tự dƣỡng bằng quang hợp nhƣng rễ cây cũng có thể ký sinh vào thân hay rễ của cây khác để hấp thụ nƣớc hoặc muối khoáng [23], [30]. Có ba loại cây ký chủ cho từng giai đoạn cho cây Đàn hƣơng trắng nhƣ sau: + Cây ký chủ cho giai đoạn ƣơm giống: Cấy trong bịch giống khi cây đạt từ 4 – 6 lá cho tới khi trồng ra vƣờn.
3
+ Cây ký chủ chuyển tiếp: Cây nhỏ hoặc cây bụi lớn, thƣờng tồn tại mấy năm (khoảng 4 - 5 năm) họ đậu, cố định đạm đƣợc trồng gần với cây gỗ Đàn hƣơng trắng. + Cây ký chủ dài ngày: cây dài hạn giúp Đàn hƣơng trắng hấp thu chất dinh dƣỡng cung cấp cho toàn bộ quá trình phát triển của cây, nó đƣợc trồng với mật độ thấp hơn cây Đàn hƣơng trắng và ít nhất 3 m từ cây Đàn hƣơng trắng gần nhất [23].
Bộ rễ cây Đàn hƣơng trắng chủ yếu phân bổ ở tầng sâu từ 20 - 30 cm, có rễ cái ăn sâu trên 1 m. Vì vậy, yêu cầu đất trồng đàn hƣơng trắng phải có tầng đất sâu trên 1 m [3]. c) Đặc điểm lá Lá đơn, dầy, mọc đối, hình trứng hoặc hình mũi mác. Mép lá nguyên. Mặt trên của lá sáng bóng và mặt dƣới có màu xanh nhạt [12]. d) Hình thái hoa và quả Hoa mẫu 4, cụm hoa mọc thành chùm, lúc đầu màu vàng, sau màu đỏ thẫm. Quả hạch hình cầu, khi chín màu đen, thịt quả nhiều nhựa. Ra hoa vào tháng 5 - 6, đậu quả vào tháng 7 – 9 [10].
Hình 1.2. Hình thái hoa và quả Đàn hƣơng trắng
( Nguồn: Viện nghiên cứu đàn hƣơng và thực vật quý hiếm )
4
1.1.2. Đặc điểm sinh thái Đàn hƣơng trắng là cây dễ tính, phổ thích nghi rộng, yêu cầu điều kiện sinh thái không quá khắt khe. Đàn hƣơng trắng nên trồng ở vùng đồi núi, thoát nƣớc tốt. Là cây nhạy cảm với ánh sáng, nên phải trồng ở vùng nhiều nắng hoặc ở quanh bờ rào, ven kênh mƣơng, có điều kiện lập địa tốt. Ở những vùng đồi có cây gỗ bụi phát triển, nên trồng xen cây Đàn hƣơng trắng vừa không tốn đất lại vừa tiện chăm sóc. a. Điều kiện khí hậu Nhiệt độ: Đàn hƣơng trắng là cây nhiệt đới, á nhiệt đới, phổ nhiệt độ thích hợp từ 23 - 35°C. Nhiệt độ thấp hơn 13°C cây tạm ngừng sinh trƣởng, chồi ngọn chuyển sang ngủ nghỉ. Ở những nơi không có sƣơng giá mùa đông, Đàn hƣơng trắng có thể tạm thời chịu đƣợc nhiệt 0°C, nhƣng khi nhiệt độ xuống dƣới 0°C lá bị rét hại, thời gian lạnh giá càng kéo dài rét hại càng lớn. Nếu nhiệt độ xuống - 3°C đến - 5°C, Đàn hƣơng trắng có thể chƣa chết, có thể do thời gian giá rét ngắn và nhờ cây ký sinh bảo vệ giúp cành lá không bị rét hại. Nhiệt độ cực trị dƣới - 10°C và thời gian rét liên tục là hai yếu tố chủ yếu hạn chế sinh trƣởng của Đàn hƣơng trắng. Vì vậy, vùng thích nghi phát triển Đàn hƣơng trắng là vùng có nhiệt độ tối thấp, bình quân nhiều năm không thấp hơn 0°C, tích ôn nhiệt độ bình quân ngày ≥ 10°C, đảm bảo thỏa mãn điều kiện nhiệt độ trồng Đàn hƣơng trắng. Trong vùng thích hợp ở độ cao 1.800 m so với mặt nƣớc biển, Đàn hƣơng trắng vẫn phát triển tốt. Nói chung, ở những vùng trồng đƣợc chuối tiêu, đu đủ, vải, mít, xoài… đều có thể trồng đƣợc Đàn hƣơng trắng. Lƣợng mƣa: Lƣợng mƣa hàng năm phù hợp với nhu cầu của Đàn hƣơng trắng từ 600 - 1.600 mm/năm [31]. b. Điều kiện lập địa Địa hình: Đàn hƣơng trắng không thể trồng đƣợc ở đất lúa vì đất trồng lúa lâu ngày có tầng đế cày không lợi cho bộ rễ phát triển.
5
Đàn hƣơng trắng nên trồng ở vùng đồi núi, thoát nƣớc tốt. Đây là cây nhạy cảm với ánh sáng, nên phải trồng ở vùng nhiều nắng hoặc ở quanh bờ rào, ven kênh mƣơng, có điều kiện lập địa tốt. Ở những vùng đồi có cây gỗ bụi phát triển, nên trồng xen cây Đàn hƣơng trắng vừa không tốn đất, vừa tiện chăm sóc [5]. Thổ nhƣỡng: Đất trồng Đàn hƣơng trắng phải thoát nƣớc tốt, tơi xốp, giàu Fe, P, K, độ pH từ 5 - 6, kỵ đất xốp, tầng đất dày, đảm bảo điều kiện phát triển bộ rễ Đàn hƣơng trắng và rễ cây ký chủ, đồng thời nâng cao đƣợc khả năng giữ nƣớc, giữ phân. Trồng trên đất có tầng canh tác mỏng, Đàn hƣơng trắng phát triển không tốt, rất khó phát triển thành rừng, không những vậy, cây ký chủ cũng sinh trƣởng không tốt, có thể làm cho cây chết. Bộ rễ cây Đàn hƣơng trắng chủ yếu phân bổ ở tầng sâu từ 20 - 30 cm, có rễ cái ăn sâu trên 1 m. Vì vậy, yêu cầu đất trồng Đàn hƣơng trắng phải có tầng đất sâu trên 1m [3]. Mực nƣớc ngầm: Rễ Đàn hƣơng trắng kỵ đọng nƣớc. Nếu đất đọng nƣớc rễ Đàn hƣơng trắng thối làm cho cây chết. Vì vậy, đất trồng Đàn hƣơng trắng phải có mực nƣớc ngầm dƣới 1 m, đồng thời mặt đất không bị đọng nƣớc vào mùa mƣa [3]. Cây Đàn hƣơng trắng tuy đòi hỏi kỹ thuật trồng không phức tạp, nhƣng có yêu cầu đặc thù về cây ký chủ, cần bố trí phù hợp. Đây cũng là cây trồng dài ngày sau khoảng 6 - 7 năm trở lên, giá rất đắt, phải đƣợc bảo vệ rất nghiêm ngặt. Vì vậy, nên trồng Đàn hƣơng trắng phân tán trong các hộ gia đình, mỗi hộ trồng vài chục cây, để thuận tiện cho việc chăm sóc và bảo vệ, làm giàu cho từng gia đình [4]. 1.1.3. Đặc điểm phân bố Đàn hƣơng trắng có nguồn gốc ở Đông Timor, phân bố ở Ấn Độ, Trung Quốc (Quảng Đông, Quảng Tây, Vân Nam), Indonesia. Ở Việt Nam cây đƣợc trồng tại một số vùng núi Nghệ An, Hà Tĩnh, Thanh Hóa [23]. Tại Việt Nam, cây Đàn hƣơng trắng đƣợc các nhà khoa học nghiên cứu từ năm 2005, nhƣng phải đến năm 2014 mới thu đƣợc những thành công bƣớc đầu. Sau hơn 4 năm trồng khảo nghiệm trên hơn 43 tỉnh thành trên cả nƣớc, tốc độ sinh
6 trƣởng và phát triển của cây Đàn hƣơng trắng cho thấy sự thích nghi tốt với khí hậu, thổ nhƣỡng tại Việt Nam [3]. 1.1.4. Giá trị kinh tế Cây Đàn hƣơng trắng mang lại giá trị sử dụng và kinh tế cao hơn so với các giống Đàn hƣơng khác. Khi thu hoạch cây Đàn hƣơng trắng ngƣời ta sử dụng gần nhƣ tất cả các bộ phận của cây nhƣ: thân, gốc, cành, lá, giác gỗ đem về chế biến và sử dụng. Giá bán mỗi kg gỗ Đàn hƣơng trắng hiện vào khoảng 500 USD [4]. Chính bởi vậy, một số nhà khoa học tại Việt Nam đã mạnh dạn nghiên cứu, thử nghiệm trồng cây này tại Việt Nam. Lõi gỗ: đƣợc dùng để sản xuất ra các mặt hàng có giá trị cao, nhƣ hàng đồ gỗ mỹ nghệ, đồ gia dụng cao cấp, trang trí nội thất, dùng chiết xuất tinh dầu, chất dẫn suất nƣớc hoa [15]. Rễ cây: một số nghiên cứu cho rằng rễ cây Đàn hƣơng trắng là thành phần chứa 60 - 70% lƣợng tinh dầu trên cây, chính vì vậy rễ Đàn hƣơng trắng ngƣời ta sử dụng chủ yếu làm chế xuất tinh dầu, hoặc nghiền lấy bột sử dụng trong ngành mỹ phẩm để làm đẹp, chăm sóc da [16]. Giác gỗ: đƣợc nghiền lấy bột để sử dụng trong ngành mỹ phẩm, làm đẹp, chăm sóc da. Lá cây: ngoài những tác dụng làm đẹp, chăm sóc da, chế xuất nƣớc hoa ngƣời ta còn biết đến lá cây Đàn hƣơng trắng dùng để sản xuất trà sạch chất lƣợng cao. Hạt: có tác dụng để nhân giống, chiết xuất tinh dầu, sản xuất rƣợu … Gỗ Đàn hƣơng trắng – loại sản phẩm từ vùng nhiệt đới của Ấn Độ là một trong những sản phẩm đa dạng của thiên nhiên và rất hiệu quả cho việc chăm sóc da. Ở Ấn Độ, gỗ Đàn hƣơng trắng đƣợc chế biến thành kem dƣỡng, thuốc điều trị da và mỹ phẩm cao cấp. Với thành phần chính là Beta-santalol (chiết xuất đến 90%) có chức năng diệt khuẩn, giữ ẩm tốt nên gỗ Đàn hƣơng trắng là phƣơng thuốc của rất nhiều vấn đề về da, đƣợc sử dụng trong mỹ phẩm làm đẹp, giúp làm sạch, dƣỡng da, đem lại làn da mịn màng, xóa sẹo lồi lõm, và bảo vệ da khỏi tia tử ngoại. Gỗ Đàn hƣơng trắng đƣợc dùng ở dạng bột, tinh dầu, kem, và trở thành một sự lựa chọn hoàn hảo để chăm sóc da mặt. Đƣợc sử dụng cùng với dầu để
7 massage chống mỏi cơ và hồi phục sức khỏe. Bột gỗ Đàn hƣơng trắng đƣợc trộn làm mặt nạ đắp để tẩy mụn đầu đen và mụn đầu trắng. Ngoài ra còn đƣợc dùng để chữa các chứng đau bụng vùng dạ dày, bụng dƣới, đái buốt do viêm đƣờng tiết niệu, thổ huyết, nấc, ho có đờm lâu khỏi, chữa phong thấp đau nhức xƣơng, thuốc điều khí chữa đau tim [8], [13]. Theo tây y, gỗ Đàn hƣơng trắng có tác dụng sinh lý chủ yếu là sát trùng đƣờng niệu - sinh dục. Y học cổ truyền Ấn Độ dùng lõi gỗ Đàn hƣơng trắng chống viêm, sát trùng, hạ nhiệt, làm săn da, chữa viêm bàng quang (Cystitis), ỉa chảy, lậu mãn tính, xuất huyết, nấc, khí hƣ, loét và rối loạn đƣờng tiết niệu [21]. Tinh dầu Đàn hƣơng trắng đƣợc ví nhƣ là “nƣớc vàng”. Có tác dụng kích thích và cân bằng cảm xúc, xua tan mọi căng thẳng, giúp trấn tĩnh, tỉnh táo, dễ chịu và sảng khoái hơn cho tinh thần và sức khỏe là những công dụng tuyệt vời mà tinh dầu Đàn hƣơng trắng mang lại cho con ngƣời. Ngoài ra, tinh dầu Đàn hƣơng trắng còn giúp thanh lọc không khí, khử mùi hôi ẩm mốc, khử mùi thuốc lá, giúp không khí trong lành và tinh khiết [20]. Ngoài ra, ngày càng có nhiều ngƣời rất ƣa chuộng dùng gỗ Đàn hƣơng trắng để thỏa mãn nhu cầu phong phú về vật chất của cá nhân và nhu cầu sản phẩm tâm linh, đƣợc coi là biểu hiện của nhu cầu hƣởng thụ mang tính quý tộc.
8
Bảng 1.1. So sánh giá trị kinh tế giữa Đàn hƣơng trắng và Đàn hƣơng đỏ (Viện nghiên cứu Đàn hƣơng và thực vật quý hiếm năm 2015) [4].
Đàn hƣơng trắng Đàn hƣơng đỏ Tên khoa học Santalum album Pterocarpus santalius Đàn hƣơng trắng Ấn Độ (Santalum Đàn hƣơng đỏ lá nhỏ (Loburlar Red album) Một số loài Sandalwood) Đàn hƣơng trắng Úc (Santalum Đàn hƣơng đỏ lá to (Rosewood) spicatum) Thời gian thu hoạch Sau 12 - 15 năm nếu có ký chủ tốt. Sau 22 năm Hình thành lõi sau 5 năm, tỷ lệ lõi Lõi hình thành sau 9 năm, tỷ lệ lõi Hình thành lõi cây kém thấp (<15%). kém từ 30-40%. Đồ mỹ nghệ, đồ gia dụng cao cấp, đồ Lõi gỗ dùng trong xe hơi, máy bay, chiết tinh Đồ mỹ nghệ, đồ gia dụng cao cấp. dầu. Chiết tinh dầu, nghiền thành bột làm Rễ cây Đồ mỹ nghệ, đồ gia dụng cao cấp. mỹ phẩm, xà phòng. Cách sử Nghiền thành bột làm mỹ phẩm, xà dụng Giác gỗ Bỏ phòng. Nghiền thành bột làm mỹ phẩm, xà Cành nhỏ Bỏ phòng. Lá Trà cao cấp. Bỏ Chiết tinh dầu, sản xuất rƣợu, nhân Hạt Nhân giống giống. Lõi gỗ 350 USD/kg 65 USD/kg Giá bán Rễ cây 250 USD/kg 35 USD/kg (tại Ấn Độ Giác gỗ 50 USD/kg Không có giá trị năm 2015) Cành nhỏ 50 USD/kg Không có giá trị Lá 4 USD/kg Không có giá trị Hạt 150 USD/kg (hạt giống) 25 USD/kg Ít rủi ro hơn, có thể thu đƣợc lợi từ Hình thành lõi kém hơn Đàn hƣơng Rủi ro khi trồng cây trồng xen canh trong thời gian đợi trắng. thu hoạch Đàn hƣơng trắng.
9
Hình 1.3. Một số sản phẩm làm từ cây Đàn hƣơng trắng ( Nguồn: Viện nghiên cứu Đàn hƣơng và thực vật quý hiếm). 1.1.5. Thực trạng Đàn hương trắng 1.1.5.1. Trên thế giới Đàn hƣơng trắng là loài bị đe dọa ở Nam Ấn Độ và phát triển ở Western Ghats và một vài dãy núi khác nhƣ Kalrayan và Shevaroy Hills. Mặc dù cây gỗ Đàn hƣơng trắng ở Ấn Độ, Pakistan và Nepal thuộc sở hữu của chính phủ và việc thu hoạch của họ bị kiểm soát, tuy nhiên vẫn có nhiều cây bị chặt hạ trái phép. Giá tinh dầu gỗ Đàn hƣơng trắng đã tăng lên 2.000 đô la mỗi kg gần đây. Các đồn điền mới đƣợc tạo ra với sự viện trợ quốc tế ở Tamil Nadu để khai thác kinh tế. Ở Kununurra, Tây Úc, gỗ Đàn hƣơng trắng Ấn Độ đƣợc trồng trên quy mô lớn. Loài này là nguồn gỗ Đàn hƣơng trắng chính đƣợc sử dụng trong sản xuất dầu thƣơng mại và không nên nhầm lẫn với gỗ Đàn hƣơng Tây Ấn, Amyris Balsamifera [7], [31].
10
1.1.5.2. Ở Việt Nam Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn ngày 22/4/2019 đã ban hành Quyết định số 1305/QĐ-BNN-TCLN về việc công nhận giống cây trồng cây Lâm nghiệp mới đối với giống cây Đàn hƣơng trắng có xuất xứ Karnataka - Ấn Độ. Giống do Viện Nghiên cứu cây Đàn hƣơng và Thực vật quý hiếm nhập nội và sản xuất thử nghiệm đã đƣợc trồng tại một số địa phƣơng nhƣ: Huyện Buôn Đôn, TP. Buôn Mê Thuật (Đắk Lắk); Huyện Lục Ngạn, TP. Bắc Giang (Bắc Giang); Huyện Thạch Thất, TX Sơn Tây (Hà Nội) và một số vùng sinh thái tƣơng tự [2], [3],[10]. 1.2. Một số nghiên cứu về Đàn hƣơng trắng Năm 2014, Shamsi và cộng sự đã nghiên cứu về khả năng kháng khuẩn và chống oxy hóa của Đàn hƣơng trắng trong ống nghiệm, cho thấy loài này có khả năng kháng lại S.aureus (MTCC 902) đến 87%, nhƣng lại không có khả năng kháng lại vi khuẩn E.coli (ATCC 25922) và B.subilis (MTC 736). Đồng thời Đàn hƣơng trắng cũng có khả năng chống oxy hóa đến 87% [27]. Năm 2014, Vũ Thoại và các đồng nghiệp đã nghiên cứu phƣơng pháp kích thích hạt cây Đàn hƣơng trắng nảy mầm tự nhiên, tạo ra giống cây đạt tiêu chuẩn hoàn toàn theo phƣơng pháp hữu cơ tại Việt Nam [2]. Năm 2014, Vũ Thoại đã nghiên cứu thành công đề tài “Làm chủ quy trình chọn tạo cây Đàn hƣơng trắng”. Sau gần ba năm triển khai nghiên cứu và hợp tác thử nghiệm với các đối tác công nghệ trong nƣớc và quốc tế, Viện Nghiên cứu cây đàn hƣơng và thực vật quý hiếm (ISAF) đã hoàn toàn làm chủ quy trình công nghệ chọn tạo cây giống Đàn hƣơng trắng chất lƣợng cao và cung cấp cây giống cho các tổ chức, lâm hộ tại nhiều tỉnh, thành phố trên cả nƣớc [3]. Năm 2014, Phạm Đức Tuấn và Vũ Văn Định đã nghiên cứu về giá trị sử dụng và thị trƣờng tiêu thụ Đàn hƣơng trắng ở Việt Nam và trên thế giới. Đề tài cho thấy thị trƣờng tiêu thụ gỗ Đàn hƣơng trắng ngày càng lớn, cung không đủ cầu, giá bán trên thế giới từ chỗ chỉ có vài chục USD/kg, nay đã nâng lên trên 1.000 USD/kg. Hiện nay, Indonesia giá bán khoảng 500 USD/kg, ở Ấn Độ khoảng 1.000 USD/kg [4].
11
1.3. Một số kết quả về nhân giống in vitro Đàn hƣơng trắng Năm 1998, Rugkhla và Jones đã nghiên cứu nhân giống in vitro Đàn hƣơng trắng cho thấy tạo phôi soma trong môi trƣờng MS+ 2 mg/l TDZ sau 8 tuần. Phôi hình cầu màu trắng, đƣợc chuyển sang môi trƣờng MS + 1,15 mg/l IAA + 0,2 mg/l K để tăng trƣởng, nhân lên và duy trì phôi. Phôi soma trƣởng thành, các lá mầm phát triển tốt đƣợc tách ra và cấy vào môi trƣờng kích thích nảy mầm có chứa 1,5 mg/l GA3. Sau khi nảy mầm, phôi soma đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng
MS bổ sung 1,5 mg/l GA3. Việc bổ sung nƣớc cốt dừa là cần thiết cho sự phát triển của cây con từ phôi soma [24]. Năm 2005, Abdul Mujib đã nghiên cứu kỹ thuật nhân giống in vitro Đàn hƣơng trắng từ lá trên môi trƣờng WPM + 0,5 mg/l BAP cho hệ số nhân chồi đạt 15 chồi/cụm sau 45 ngày nuôi cấy [6]. Năm 2008, Mo Xiao-lu và cộng sự đã nghiên cứu sự hình thành phôi soma và tái sinh Đàn hƣơng trắng. Kết quả cho thấy tỉ lệ hình thành phôi soma tốt nhất (đạt 91,2%) khi nuôi cấy trong môi trƣờng MS + 1 mg/l TDZ. Chồi Đàn hƣơng trắng tăng trƣởng nhanh, khả năng nảy mầm cao (100%) khi đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng MS + 1,5 mg/l GA3 + 4% Sucrose [18]. Năm 2011, Janarthanam và Sumathi đã nghiên cứu tái sinh chồi Đàn hƣơng trắng từ hạt. Từ kết quả nghiên cứu cho thấy nhiều chồi Đàn hƣơng trắng đã đƣợc tái sinh trên môi trƣờng MS + 1 mg/l IPA+ 10% nƣớc cốt dừa , chồi tăng trƣởng tốt với chiều cao trung bình 2,9 cm sau 45 ngày nuôi cấy. Môi trƣờng tạo rễ thích hợp ½ MS bổ sung 0,5 mg/l IBA + 0,25 mg/l NAA với chiều dài rễ trung bình 4,8 cm, sau 6 tuần nuôi cấy. Cây con đƣợc trồng ra ngoài vƣờn ƣơm với thành phần ruột bầu gồm đất, phân trùn quế và phân chuồng trại theo tỉ lệ 1: 1: 1, tỉ lệ cây sống đạt 70% [14]. Năm 2013, Parveen và Shahzad đã nghiên cứu tạo mô sẹo và tái sinh chồi từ lá mầm Đàn hƣơng trắng kết quả cho thấy sử dụng MS + 2,2 mg/l 2,4D + 0,22 mg/l BAP cho 22,8 phôi tạo mô sẹo trên mỗi mẫu cấy, với tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo là 35,3% sau 6 tuần nuôi cấy [21].
12
Năm 2011, Singh và cộng sự đã nghiên cứu tái sinh cây Đàn hƣơng trắng từ lá cây trƣởng thành. Kết quả cho thấy môi trƣờng tạo phôi tốt nhất khi sử dụng WPM + 0,8 mg/l TDZ với 100% mẫu tạo phôi. Công thức tái sinh cụm chồi tốt nhất là WPM + 2,5 mg/l BAP + 0,4 mg/l NAA với hệ số chồi/mô sẹo là 24,6 chồi. Tăng trƣởng chồi tốt nhất khi chuyển sang môi trƣờng WPM + 5 mg/l BAP + 3 mg/l K, với chiều cao chồi đạt 5,17 cm sau 8 tuần nuôi cấy. Các chồi sinh trƣởng tốt, đạt tiêu chuẩn đƣợc chuyển sang môi trƣờng rễ WPM + 1,5 mg/l IBA với tỷ lệ ra rễ đạt 91,67% [28]. Năm 2014, Toni Herawan và cộng sự đã nghiên cứu tạo mô sẹo cây Đàn hƣơng trắng Ấn Độ. Kết quả cho thấy, mô sẹo đƣợc tạo ra từ lá trong môi trƣờng MS + 3 mg/l 2,4 D + 0,15 mg/l K với 40 g/l Sucrose và 2,5 g/l Gelritevới 80% mẫu tạo mô sẹo (Toni Herawan và cs. 2014) [32]. Năm 2015, Sweekruti Barpanda và cộng sự đã nghiên cứu tái sinh chồi Đàn hƣơng trắng từ lá của cây trƣởng thành. Kết quả cho thấy mẫu lá đƣợc khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 6 phút với tỉ lệ mẫu sạch cao nhất đạt 86,67%. Tạo mô sẹo trên môi trƣờng MS + 1,5 mg/l BAP +0,5 mg/l NAA +0,5 mg/l IAA [30]. Năm 2015, Peeris và cộng sự đã nghiên cứu tái sinh cây Đàn hƣơng trắng qua phôi soma để tạo ra một số lƣợng lớn cây phục vụ cho mục đích thƣơng mại. Mẫu tạo mô sẹo tốt nhất khi sử dụng MS bổ sung 2,5 mg/l 2,4D + 3 mg/l K tạo phôi có đƣờng kính trung bình là 3,22 cm sau 8 tuần nuôi cấy. Phôi soma nảy mầm tốt nhất trong môi trƣờng MS bổ sung 2mg/l GA3, tỷ lệ mô sẹo tái sinh thành cây con cao nhất khi đƣợc chuyển vào môi trƣờng MS có bổ sung 0,4 mg/l BAP và 0,2 mg/l IAA [22]. Năm 2016, Hartini Realista và cộng sự đã nghiên cứu nhân giống in vitro Đàn hƣơng trắng kết quả cho thấy hạt đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng ½ MS + 2 mg/l BAP cho tỷ lệ hạt nảy mầm là 11,67%, trong môi trƣờng WPM + 1 mg/l NAA cho tỷ lệ nảy mầm của hạt giống là 8,13% [12]. Năm 2016, Khande và Bhagyashri Prabhakar đã tiến hành nhân giống in vitro Đàn hƣơng trắng. Kết quả nghiên cứu cho thấy khi mẫu chồi đƣợc khử trùng bằng
Tween 20 (2%) với thời gian 20 phút và HgCl2 2% trong 10 phút cho tỷ lệ mẫu sạch
13 cao nhất (đạt 81,66%). Môi trƣờng tạo mô sẹo tốt nhất là MS + 0,5 mg/l 2,4D + 0,5 mg/l NAA + 0,5 mg/l BAP với tỷ lệ mẫu tạo mô sẹo là 66,67% [16]. Năm 2016, Supatmi và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu nhân giống in vitro Đàn hƣơng trắng qua sự hình thành phôi soma từ lá. Phôi soma đƣợc hình thành và phát triển tốt nhất trong môi trƣờng MS + 1 mg/l IAA và MS + 1 mg/l IAA + 0,2 mg/l K cho tỷ lệ mẫu sống sót cao (98%). Cây mô sinh trƣởng tốt khi đƣợc cấy vào giá thể gồm đất, cát, compos theo tỷ lệ 1:1:1 [29]. Từ các kết quả nghiên cứu tổng quan cho thấy, nghiên cứu nhân giống in vitro Đàn hƣơng trắng đã đƣợc nhiều tác giả ngoài nƣớc thực hiện. Tuy nhiên, các nghiên cứu về nhân giống in vitro ở trong nƣớc còn rất hạn chế. Để chủ động nguồn cây giống trong nƣớc và hạ giá thành cây con thì các nghiên cứu trong nƣớc là rất cần thiết. Do đó, các nghiên cứu trên đây là cơ sở để đề tài tiến hành các nội dung nghiên cứu giống in vitro loài Đàn hƣơng trắng.
14
PHẦN 2. MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Mục tiêu nghiên cứu - Xác định đƣợc kỹ thuật tạo mẫu sạch từ chồi cây Đàn hƣơng trắng. - Xác định đƣợc các chất điều hoà sinh trƣởng và hàm lƣợng các loại đƣờng để nhân nhanh chồi Đàn hƣơng trắng. - Xác định đƣợc chất điều hòa sinh trƣởng thích hợp để tạo cây hoàn chỉnh. 2.2. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian khử trùng mẫu bằng HgCl2 0,1% đến khả năng tạo mẫu sạch từ chồi. - Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất điều hoà sinh trƣởng và hàm lƣợng các loại đƣờng đến khả năng nhân nhanh chồi. - Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng tạo rễ của chồi in vitro. 2.3. Đối tƣợng, vật liệu và địa điểm nghiên cứu - Đối tượng nghiên cứu: Loài Đàn hƣơng trắng (Santalum album L.) - Vật liệu nghiên cứu: : Mẫu đƣợc sử dụng là chồi non đƣợc lấy từ cây trội 2 năm tuổi đã đƣợc trẻ hóa trƣớc thời điểm nuôi cấy 3 tháng do Viện nghiên cứu Đàn hƣơng và thực vật quý hiếm (ISAF) cung cấp. - Địa điểm n hi n cứu: Đề tài tiến hành nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Viện Công nghệ sinh học Lâm nghiệp – Trƣờng Đại học Lâm nghiệp. - Điều kiện trong phòng thí nghiệm: + Thời gian chiếu sáng 10 h/ngày. + Cƣờng độ chiếu sáng 2000-3000 lux, nhiệt độ phòng nuôi 25 ± 20C, các môi trƣờng nuôi cấy đƣợc điều chỉnh ở độ pH = 5,6 - 5,8. 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp luận - Các nhân tố là chỉ tiêu nghiên cứu: Phải chia thành các công thức thí nghiệm khác nhau.
15
- Các nhân tố không phải chỉ tiêu nghiên cứu: Phải đảm bảo tính đồng nhất giữa các công thức thí nghiệm. - Số mẫu của mỗi công thức thí nghiệm phải đủ lớn (n ≥ 30). - Thí nghiệm đƣợc bố trí đủ số lần lặp (n ≥ 3). 2.4.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm và thu thập số liệu - Các bƣớc đƣợc tiến hành theo nhƣ sau:
Tạo mẫu sạch
( Xác định thời ian khử trùn mẫu bằn HgCl2 0,1% )
Nhân nhanh chồi (Xác định chất điều hoà sinh trưởn và hàm lượn các loại đườn )
Tạo rễ in vitro Xác định nồn độ IBA, NAA phù hợp cho quá trình tạo rễ của loài Đàn hươn trắn .
Sơ đồ nghiên cứu nuôi cấy in vitro Đàn hương trắng 2.4.2.1. Thí nghiệm tạo mẫu sạch từ chồi (thí nghiệm 1) - Chọn mẫu cấy: Mẫu đƣợc sử dụng là chồi non đƣợc lấy từ cây trội 2 năm tuổi đã đƣợc trẻ hóa trƣớc thời điểm nuôi cấy 3 tháng. - Làm sạch mẫu cấy: Mẫu cấy đƣợc cắt bỏ toàn bộ lá, để lại cuống lá, rồi rửa mẫu dƣới vòi nƣớc chảy. Sau đó, lắc mẫu trong nƣớc xà phòng loãng 3 - 4 phút và rửa lại bằng nƣớc sạch. Tiếp tục, cho mẫu vào khay (trong khay có nƣớc
16 xà phòng loãng), dùng chổi lông để chải mẫu, sau đó rửa lại mẫu cho sạch dƣới vòi nƣớc chảy và tráng lại mẫu bằng nƣớc cất trƣớc khi mang mẫu vào box cấy. - Khử trùng mẫu trong box cấy: Đầu tiên mẫu đƣợc rửa bằng nƣớc cất vô trùng 2 - 3 lần, mỗi lần rửa khoảng 2 - 3 phút. Mẫu cấy đƣợc khử trùng bằng
HgCl2 0,1% với thời gian khác nhau 2; 4; 6 và 8 phút (Bảng 2.1). Sau khi khử trùng bằng HgCl2 0,1%, mẫu đƣợc rửa lại bằng nƣớc cất vô trùng và cấy vào môi trƣờng MS + đƣờng Sucrose 30 g/l+ agar 5,5 g/l. Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm về ảnh hƣởng thời gian khử trùng mẫu bằng HgCl2 0,1% đến khả năng tạo mẫu sạch
Ký hiệu CTTN HgCl2 0,1 % (phút) Số mẫu TN H1 2 90 H2 4 90
H3 6 90
H4 8 90
Thu thập số liệu sau 4 tuần: Số mẫu sạch nảy chồi. + Tỷ lệ mẫu sạch nảy chồi (%). 2.4.2.2. Thí n hiệm nhân nhanh chồi a) Ảnh hưởn của chất điều hoà sinh trưởn đến khả năn nhân nhanh chồi (thí n hiệm 2) Sau 4 tuần nuôi cấy, những mẫu sạch, không nhiễm nấm và khuẩn ở thí nghiệm 1 đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng nhân nhanh chồi MS + 30 g/l Sucrose + 5,5 g/l agar có bổ sung BAP, K kết hợp NAA nồng độ khác nhau (Bảng 2.2)
17
Bảng 2.2. Bố trí thí nghiệm ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng nhân nhanh chồi Ký hiệu CTTN Chất điều hòa sinh trƣởng (mg/l) Số mẫu cấy TN BAP K NAA ĐH1 0,2 90 ĐH2 0,3 90 0,2 0,15 ĐH3 0,4 90 ĐH4 0,5 90 ĐH5 0,1 90 ĐH6 0,15 0,2 0,15 90 ĐH7 0,25 90
Thu thập số liệu sau 6 tuần nuôi cấy
+ Số mẫu tạo cụm chồi
+ Chiều cao chồi (cm).
+ Số chồi/cụm
+ Chất lƣợng chồi (Chồi tốt: màu xanh non và mập khỏe, Chồi trung bình: màu vàng và mập, Chồi xấu: màu vàng nhạt và nhỏ). b) Ảnh hưởn của hàm lượn các loại đườn đến khả năn nhân nhanh chồi (thí n hiệm 3) Sử dụng môi trƣờng nhân nhanh chồi với nồng độ các chất ĐHST tốt nhất ở thí nghiệm 2, để cấy chuyển những mẫu sống khoẻ mạnh, không nhiễm nấm và khuẩn sang môi trƣờng nhân nhanh chồi MS + 5,5 g/l agar có bổ sung Glucose và Sucrose với hàm lƣợng khác nhau (Bảng 2.3).
18
Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm về sự ảnh hƣởng của hàm lƣợng các loại đƣờng đến khả năng nhân nhanh chồi
Đƣờng Ký hiệu CTTN Số mẫu thí nghiệm (g/l) N1 40g G 90 N2 30g G 90 N3 20g G+ 10g S 90 N4 10g G + 20g S 90 N5 40g S 90 Thu thập số liệu sau 6 tuần nuôi cấy
+ Số mẫu tạo cụm chồi
+ Chiều cao chồi (cm).
+ Số chồi/cụm + Chất lƣợng chồi (Chồi tốt: màu xanh non và mập khỏe, Chồi trung bình: màu vàng và mập, Chồi xấu: màu vàng nhạt và nhỏ). 2.4.2.3. Thí nghiệm tạo cây con hoàn chỉnh Các chồi Đàn hƣơng trắng khỏe mạnh, chiều cao từ 2,5 - 3,0 cm thu đƣợc từ giai đoạn nhân nhanh đƣợc cắt và cấy chuyển sang môi trƣờng tạo rễ. Trong giai đoạn này, tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của hàm lƣợng chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng ra rễ của chồi. Thành phần môi trƣờng là MS có bổ sung 5,5 g/l agar + 30 g/l G, bổ sung IBA riêng rẽ và kết hợp với NAA ở các nồng độ khác nhau (Bảng 2.4)
19
Bảng 2.4. Bố trí thí nghiệm về sự ảnh hƣởng của IBA, NAA đến khả năng ra rễ
Ký hiệu NAA IBA Số mẫu thí nghiệm CTTN (mg/l) (mg/l) R5 0,3 90 R6 0 0,5 90 R7 0,7 90 R8 1,2 90 R1 0,3 90 R2 0,25 0,5 90 R3 0,7 90 R4 1,2 90
Thu thập số liệu sau 8 tuần nuôi cấy
+ Số chồi ra rễ
+ Chiều dài rễ (cm), số rễ/cây
+ Chất lƣợng rễ (Rễ tốt: Màu trắng, mập, Rễ trung bình: Màu trắng và nhỏ. Rễ xấu: Màu đen và nhỏ) 2.4.3. Phương pháp xử lý số liệu * Tính toán các đặc trƣng mẫu bằng công thức sau: 1 n +Số trung bình mẫu: X Xi n i1
+ Tỷ lệ ra rễ (%) =
+ Hệ số nhân chồi (lần) = X 100
Số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm SPSS và phần mềm Excel. * So sánh giữa các công thức thí nghiệm về tỉ lệ mẫu tạo cụm chồi, tỷ lệ chồi ra rễ bằng tiêu chuẩn khi bình phƣơng (2) Kxr m 2ij 2 1) n = N( trong đó: i, j tj * ni
20
K: Số công thức, r: Số cấp chất lƣợng 2 m ij: là tần số quan sát thực nghiệm ở công thức thứ i và đặc trƣng định tính thứ j t j : tổng tần số quan sát của các công thức đối với cấp j ni: dung lƣợng mẫu của công thức thứ i N là tổng số các quan sát : N = n1 + n2 + … + nk = t1 + t2 + …+ tr Số liệu đƣợc sử lý bằng phần mềm SPSS (20.0), kết quả kiểm tra sai dị đƣợc thể hiện bằng trị số sig : + Nếu sig (xác suất của 2) nhỏ hơn 0,05 các chỉ tiêu nghiên cứu có sự sai khác giữa các công thức thí nghiệm. + Nếu sig (xác suất của 2) lớn hơn 0,05 các chỉ tiêu nghiên cứu không có sự sai khác giữa các công thức thí nghiệm. * So sánh giữa các công thức thí nghiệm về chiều dài rễ và số lƣợng rễ/chồi, chiều cao chồi, chiều cao cây bằng phân tích phƣơng sai một nhân tố. Cụ thể:
+ Gọi VT là biến động toàn bộ của n trị số quan sát, biến động này đƣợc định nghĩa bằng công thức:
2 a ni xij a ni 2 i1 j1 VT = xij c Với C = i1 j1 n Do tính chất cộng đƣợc của biến động mà loại biến động này bao gồm 2 loại biến động sau: + Biến động giữa các trị số quan sát trong cùng một mẫu. Biến động này
đƣợc kí hiệu là VN . a ni a 2 2 VN = X ij ni x i i1 j1 j1 + Biến động giữa các trị số quan sát ở các mẫu mà đại biểu là các biến động giữa các số trung bình mẫu ( trung bình các cấp của nhân tố A ).
Ta gọi biến động này là VA và do tính chất cộng của biến động nên: a 2 VA = VT - VN = ni x .i c i1
+ Ngƣời ta đã chứng minh rằng nếu giả thuyết H0: 1 2 .... a o là đúng thì: (n a)V F = A (1) (a 1)VN
21
Có phân bố F với K1 = a-1 và K2 = n-a bậc tự do. Giả thuyết H0 sẽ bị bác bỏ nếu F tính theo (1) lớn hơn F05 tra bảng với bậc tự do nhƣ trên. Số liệu đƣợc sử lý bằng phần mềm SPSS (20.0), kết quả kiểm tra sai dị đƣợc thể hiện bằng trị số sig: Nếu Sig (xác suất của ) 0,05 chỉ ti u phân tích c sự sai khác giữa các công thức thí nghiệm. Nếu Sig (xác suất của ) 0,05 thì chỉ ti u phân tích kh n c sự sai khác giữa các công thức thí nghiệm.
22
PHẦN 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian khử trùng mẫu bằng HgCl2 0,1% đến khả năng tạo mẫu sạch Mục tiêu của nuôi cấy mô tế bào thực vật là tạo ra đƣợc số lƣợng lớn cây con cung cấp đủ nhu cầu cho sản xuất. Trƣớc hết, để có đƣợc nguồn mẫu nuôi cấy mô, công việc đầu tiên là phải tạo ra đƣợc nguồn mẫu sạch trong ống nghiệm. Vì vậy, việc xác định phƣơng pháp khử trùng thích hợp là yếu tố đầu tiên có ý nghĩa rất lớn đối với thành công của quá trình nhân giống. Đây là công việc rất khó khăn và phức tạp đòi hỏi ngƣời làm phải thực hiện hết sức nghiêm túc và cẩn thận. Mức độ nhiễm trùng của các mô nuôi cấy là rất khác nhau và thay đổi liên tục, nên ngoài việc sử dụng hoá chất, nồng độ hoá chất, vấn đề thời gian xử lý cũng đòi hỏi phải có độ chính xác. Tuy nhiên, hiệu lực diệt nấm khuẩn của hoá chất cũng phụ thuộc vào đặc điểm và tình trạng của mẫu cấy. Vì vậy, việc thiết lập các kỹ thuật khử trùng nhằm tìm ra cách tối ƣu để tạo ra đƣợc nhiều mẫu sạch và mẫu cấy có khả năng nảy mầm tốt nhất là việc làm rất cần thiết. Hiện nay, phƣơng pháp hóa học đƣợc sử dụng phổ biến để khử trùng mẫu cấy. Những hóa chất có tác dụng diệt khuẩn hay đƣợc sử dụng trong nuôi cấy mô - tế bào thực vật nhƣ: NaClO, Ca(OCl)2, HgCl2, H2O2, AgNO3, các chất kháng sinh… Nhìn chung, một loại hóa chất đƣợc lựa chọn cho quá trình vô trùng mẫu cấy phải đảm bảo 2 thuộc tính: có khả năng diệt vi sinh vật cao, không hoặc có mức độ độc tính thấp đối với mẫu cấy.
Nghiên cứu tạo mẫu sạch, HgCl2 0,1% đã đƣợc sử dụng với thời gian 2; 4; 6 và 8 phút để khử trùng mẫu chồi. Kết quả thu đƣợc sau 4 tuần nuôi cấy đƣợc thể hiện ở bảng 3.1.
23
Bảng 3.1. Tỷ lệ mẫu sạch nảy chồi khi khử trùng chồi Đàn hƣơng trắng bằng HgCl2 0,1% (sau 4 tuần nuôi cấy)
Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm Số liệu thu thập sau 4 tuần Thời gian khử Mẫu sạch nảy chồi Ký hiệu trùng bằng HgCl2 Số mẫu TN Số mẫu Tỷ lệ CTTN 0,1% (phút) (N) (%) H1 2 90 45 50,00 H2 4 90 61 66,67 H3 6 90 52 57,78 H4 8 90 41 45,56 Sig 0,009
80
70 66.67
57.78 60 50 50 45.56
40
30
20
10 Tỷ lệ mẫu (%) chồi nảy sạch Tỷmẫu lệ
0 2 Phút 4 Phút 6 Phút 8 Phút
Thời gian xử lý mẫu bằng HgCl2 0,1% (phút)
Biểu đồ 3.1. Tỷ lệ (%) mẫu sạch nảy chồi khi khử trùng mẫu bằng HgCl2 0,1% với thời gian khác nhau.
24
Từ bảng 3.1. và biểu đồ 3.1. cho thấy khi sử dụng HgCl2 0,1% để khử trùng mẫu với thời gian khử trùng khác nhau đã có ảnh hƣởng rõ rệt đến khả năng tạo mẫu sạch (sig <0,05).
Trong đó, khi khử trùng mẫu bằng HgCl2 0,1% trong thời gian 4 phút cho tỉ lệ mẫu sạch cao nhất (66,67%), nhƣng khi xử lý mẫu trong thời gian 8 phút cho tỉ lệ mẫu sạch nảy chồi là thấp nhất (45,56%). Khi khử trùng mẫu ở thời gian ngắn trong 2 phút không đủ thời gian khử nấm, khuẩn nên mẫu dễ bị nhiễm và chết
(50%). Nhƣ vậy, khi tăng thời gian khử trùng mẫu cấy bằng HgCl2 0,1% thì tỷ lệ mẫu sạch tăng lên, tuy nhiên thời gian quá lâu làm cho mẫu chồi bị gây độc từ chất khử trùng dẫn đến làm chết mẫu. Công thức khử trùng đạt hiệu quả nhất đối với
Đàn hƣơng trắng khi sử dụng HgCl2 0,1% trong 4 phút. Khi so sánh kết quả nghiên cứu trên với các nghiên cứu trƣớc đó có sự khác biệt. Khande và Bhagyashri Prabhakar (2016) [16] sử dụng Tween 20 (2%) trong
20 phút và HgCl2 2% trong 10 phút để khử trùng chồi Đàn hƣơng trắng với tỉ lệ mẫu sạch đạt 81,66%. Một nghiên cứu khác của Sweekruti Barpanda và cộng sự
(2015) cũng sử dụng HgCl2 0,1% trong 6 phút để khử trùng chồi cho tỉ lệ mẫu sạch đạt 86,67%. Sự khác biệt này có thể do mức độ hóa gỗ và độ nhiễm nấm khuẩn của chồi khi lấy trên cây mẹ có điều kiện sống khác nhau.
Hình 3.1. Kết quả tạo mẫu sạch Đàn hƣơng trắng sau 4 tuần nuôi cấy
25
3.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của chất điều hoà sinh trƣởng và hàm lƣợng các loại đƣờng đến khả năng nhân nhanh chồi Đàn hƣơng trắng 3.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hoà sinh trưởng đến khả năng nhân nhanh chồi Từ các nghiên cứu của Mo Xiao-lu và cộng sự (2008) [17], Bele và cộng sự (2012) [10], Muthan và cộng sự (2006) [19], Mo và cộng sự (2008) [18]về nhân giống in vitro Đàn hƣơng trắng cho thấy các tác giả đểu sử dụng môi trƣờng cơ bản MS để nghiên cứu giai đoạn nhân chồi. Kế thừa các nghiên cứu này, môi trƣờng cơ bản MS đã đƣợc sử dụng để tiếp tục nghiên cứu ảnh hƣởng của chất điều hòa sinh trƣởng đến khả năng nhân nhanh chồi. Những mẫu Đàn hƣơng trắng sạch, khoẻ mạnh, không nhiễm nấm và vi khuẩn đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng kích thích nhân nhanh chồi. Kết quả thu đƣợc sau 6 tuần cấy chuyển đƣợc thể hiện ở bảng 3.2. Bảng 3.2. Kết quả nhân nhanh chồi Đàn hƣơng trắng trên môi trƣờng MS có bổ sung BAP, K và NAA (sau 6 tuần nuôi cấy) Ký hiệu Chất điều hòa sinh Số Tỷ lệ Chiều Hệ số Chất CTTN trƣởng mẫu mẫu tạo cao chồi nhân chồi lƣợng (mg/l) cấy cụm chồi TB TB chồi (N) (%) (cm) (lần) BAP K NAA
ĐH1 0,2 90 100 1,79 9,10 TB ĐH2 0,3 90 100 1,92 10,17 Xấu
ĐH3 TB 0,2 0,4 0,15 90 100 1,87 9,33 ĐH4 0,5 90 100 1,81 8,47 TB ĐH5 0,1 90 100 1,65 8,13 Xấu
ĐH6 0,15 90 100 1,77 8,84 TB 0,2 0,15 ĐH7 0,25 90 100 1,70 8,74 TB Sig 0,001 0,0001
26
1.95 1.92 1.9 1.87 1.85
1.81 1.79 1.8 1.77 1.75 1.7 1.7 1.65 1.65
Chiều cao chồicao Chiều 1.6
1.55
1.5 ĐH1 ĐH2 ĐH3 ĐH4 ĐH5 ĐH6 ĐH7 Công thức thí nghiệm
Biều đồ 3.2. Chiều cao chồi Đàn hƣơng trắng trên môi trƣờng MS có bổ sung BAP, K và NAA ở các nồng độ khác nhau
12
10.17 10 9.33 9.1 8.84 8.74 8.47 8.13 8
6 Hệ số nhân nhân chồi Hệ số
4
2
0 ĐH1 ĐH2 ĐH3 ĐH4 ĐH5 ĐH6 ĐH7 Công thức thí nghiệm
Biều đồ 3.3. Hệ số nhân chồi Đàn hƣơng trắng trên môi trƣờng MS có bổ sung BAP, K và NAA ở các nồng độ khác nhau Số liệu ở bảng 3.2, biểu đồ 3.2 và biểu đồ 3.3 cho thấy, các công thức thí nghiệm khác nhau đều cho 100% mẫu nảy chồi, điều này chứng tỏ Đàn hƣơng trắng có năng lực tái sinh chồi rất tốt. Mặc dù vậy, khi sử dụng các chất điều hoà sinh trƣởng riêng rẽ hay kết hợp ở các nồng độ khác nhau đã có ảnh hƣởng rõ rệt đến hệ số nhân chồi, chiều cao chồi (sig < 0,05) và chất lƣợng chồi.
27
Môi trƣờng nuôi cấy cố định BAP và NAA, chỉ thay đổi nồng độ của K (từ 0,2 – 0,5 mg/l), công thức ĐH2 cho kết quả tốt nhất với hệ số nhân chồi 10,17 chồi/cụm, chiều cao chồi trung bình là 1,92 cm. Trong khi đó, khi tăng nồng độ K lên 0,5 mg/l làm giảm hệ số nhân chồi (8,47 chồi/cụm), chiều cao chồi (1,81 cm) và chất lƣợng chồi cũng bị ảnh hƣởng. Nhƣ vậy, có thể thấy, K trong môi trƣờng giúp thúc đẩy sự phân chia tế bào và hoạt động trong các quá trình tăng trƣởng, tăng hệ số nhân chồi, đồng thời làm giảm quá trình thoái hóa của cây.
Khi cố định K, NAA chỉ thay đổi nồng độ của BAP (0,1 - 0,25 mg/l) kết quả cho thấy công thức ĐH5 (MS + 0,1 mg/l BAP + 0,2 mg/l K + 0,15 mg/l NAA) hệ số chồi (8,13 chồi/cụm), chiều cao chồi trung bình (1,65 cm) thấp nhất, chất lƣợng chồi kém. Khi tăng nồng độ BAP (0,15 mg/l) hệ số nhân chồi (8,84 chồi/cụm), chiều cao chồi (1,77 cm) đều tăng lên, chất lƣợng chồi khá hơn song chỉ ở mức độ trung bình. Tuy nhiên khi tăng nồng độ BAP lên (0,25 mg/l) chiều cao chồi (1,70 cm), hệ số nhân (8,74 chồi/cụm) lại giảm, đồng thời chất lƣợng chồi xấu, rụng lá và hơi ngả vàng. Có thể thấy, khi sử dụng BAP ở nồng độ phù hợp (0,15 mg/l) giúp thúc đẩy sự sinh trƣởng chồi nách, tăng trƣởng chồi. Khi cố định K và NAA, chỉ thay đổi nồng độ của BAP ( từ 0,2 – 0,5 mg/l) thì chồi có chất lƣợng tốt (xanh, mập) và có hệ số nhân chồi (từ 8,47 - 10,17 chồi) cao hơn so với việc kết hợp thay đổi nồng độ BAP (từ 0,1 - 0,25 mg/l) và cố định K, NAA (8,13 – 9,10 chồi). So sánh với nghiên cứu của Sanjaya (2006) [26] môi trƣờng tạo cụm chồi tối ƣu nhất là MS + 0,1 mg/l NAA + 2,5 mg/l BAP (60% chồi tạo cụm, tăng trƣởng chồi từ 0,5 – 2 cm, hệ số nhân chồi là 10 lần sau 90 ngày nuôi cấy). Còn theo nghiên cứu của Janarthanam và Sumathi (2011) [14] thì môi trƣờng MS + 1 mg/l IPA + CoM 10% tạo cụm chồi tốt nhất, 71,6% chồi tạo cụm, chiều cao chồi là 2,9 cm sau 45 ngày nuôi cấy. Nhƣ vậy, có thể thấy các nghiên cứu trên cho tỉ lệ mẫu tạo cụm chồi chỉ 60 - 70%. Trong khi kết quả nghiên cứu của chúng tôi đều cho tỉ lệ mẫu tạo cụm chồi đạt 100%. Có thể thấy việc bổ sung thêm K trong môi trƣờng nuôi cấy đã có hiệu quả rõ rệt. Nhƣ vậy, môi trƣờng MS bổ sung MS + 0,2 mg/l BAP + 0,3 mg/l K + 0,15 mg/l NAA là phù hợp để nhân nhanh chồi Đàn hƣơng trắng.
28
Tuy nhiên sau 1 thời gian nuôi cấy chồi bắt đầu hơi ngả sang màu vàng và rụng lá. Nguyên nhân có thể do Đàn hƣơng trắng là cây bán ký sinh, phải hút dinh dƣỡng từ cây ký chủ để sinh trƣởng và phát triển, do vậy khả năng tự tổng hợp các chất dinh dƣỡng kém. Để khắc phục hiện tƣợng này, đề tài tiến tiếp tục sử dụng công thức nhân nhanh chồi sử dụng nồng độ chất ĐHST tốt nhất trên đây, thay đổi nồng độ các loại đƣờng với hy vọng khắc phục đƣợc hiện tƣợng trên.
H nh 3.2. Chồi Đàn hƣơng trắng môi trƣờng MS + 0,2 mg/l BAP + 0,3 mg/l K + 0,15 mg/l NAA (sau 6 tuần nuôi cấy) 3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng các loại đường đến khả năng nhân nhanh chồi Đàn hương trắng. Để khắc phục hiện tƣợng chồi rụng lá, ngả vàng, môi trƣờng MS + 0,2 mg/l BAP + 0,3 mg/l K + 0,15 mg/l NAA bổ sung nồng độ các loại đƣờng khác nhau đã đƣợc sử dụng để nghiên cứu khả năng nhân nhanh chồi. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.3.
29
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng các loại đƣờng đến khả năng nhân nhanh chồi Đàn hƣơng trắng (sau 6 tuần nuôi cấy) Ký hiệu Nồng độ các loại Số Tỷ lệ mẫu Hệ số Chiều Chất CTTN đƣờng mẫu tạo cụm nhân cao lƣợng (g/l) TN chồi (%) TB chồi chồi Sucrose Glucose (lần) TB (cm)
N1 - 40 90 100 13,01 2,53 Tốt N2 - 30 90 100 17,01 2,72 Tốt N3 10 20 90 100 12,37 2,32 TB N4 20 10 90 100 11,16 2,01 TB N5 30 - 90 100 10,17 1,92 Xấu TB 12,34 2,3 Sig 0,0001 0,0001
18 17.01
16
14 13.01 12.37 12 11.16 10.17 10
8
6
Hệ số nhân chồi (lần) chồi nhân số Hệ 4
2
0 N1 N2 N3 N4 N5 Công thức thí nghiệm
Biểu đồ 3.4. Hệ số nhân chồi Đàn hƣơng trắng trong môi trƣờng bổ sung hàm lƣợng các loại đƣờng khác nhau
30
3 2.72 2.53 2.5 2.32 2.01 2 1.92
1.5
1 Chiều cao chồi (cm) chồi Chiềucao 0.5
0 N1 N2 N3 N4 N5 Công thức thí nghiệm
Biểu đồ 3.5. Chiều cao chồi Đàn hƣơng trắng trong môi trƣờng MS + 0,2 mg/l BAP + 0,3 mg/l K + 0,15 mg/l NAA với hàm lƣợng các loại đƣờng khác nhau
Số liệu bảng 3.3, biểu đồ 3.4. và biểu đồ 3.5 cho thấy hàm lƣợng các loại đƣờng có ảnh hƣởng rõ rệt đến hệ số nhân nhanh chồi, chiều cao chồi, đồng thời chất lƣợng chồi tăng lên đáng kể. Khi sử dụng đƣờng đơn (Glucose), cây hút trực tiếp đƣợc dinh dƣỡng ngay từ giai đoạn ban đầu giúp cho chồi xanh, mập, phát triển tốt. Khi bổ sung kết hợp đƣờng Glucose và Sucrose (công thức N3 và N4) vào môi trƣờng nuôi cấy cho hiệu quả tốt hơn so với chỉ sử dụng đƣờng Sucrose (công thức N5). Mặc dù vậy, các công thức N3, N4 và N5 (sử dụng riêng rẽ đƣờng Sucrose hoặc kết hợp với Glucose) sau 3 - 4 tuần nuôi cấy thì chồi vẫn còn hiện tƣợng rụng lá và hơi ngả vàng. Tuy nhiên, khi môi trƣờng nuôi cấy chỉ bổ sung 30 g/l Glucosethì chất lƣợng lƣợng chồi xanh, mập, khỏe, phát triển tốt, không còn hiện tƣợng rụng lá và ngả vàng, hệ số nhân chồi đạt 17,01 lần, chiều cao chồi trung bình đạt 2,72 cm. Khi tăng hàm lƣợng đƣờng lên 40 g/l Glucose, hệ số nhân chồi và chiều cao chồi lại có xu hƣớng giảm (tƣơng ứng đạt 13,01 lần và 2,53 cm).
31
Nhƣ vậy môi trƣờng MS bổ sung 0,2 mg/l BAP + 0,3 mg/l K + 0,15 mg/l NAA và 30 g/l Glucose là phù hợp để tăng khả năng tạo cụm chồi Đàn hƣơng trắng.
H nh 3.3. Cụm chồi Đàn hƣơng trắng trên môi trƣờng bổ sung MS + 0,2 mg/l BAP + 0,3 mg/l K + 0,15 mg/l NAA + 30 g/l Glucose (sau 6 tuần nuôi cấy) 3.3. Ảnh hƣởng của chất điều hoà sinh trƣởng đến khả năng ra rễ của chồi in vitro
Giai đoạn tạo cây con hoàn chỉnh (cây có đầy đủ thân, lá và rễ) là một giai đoạn quan trọng trong quy trình nhân giống in vitro. Cây con có bộ rễ khoẻ mạnh sẽ có khả năng sống và sinh trƣởng tốt khi đƣa từ điều kiện phòng thí nghiệm ra trồng ở nhà lƣới. Nhiều quy trình nhân giống các loài cây lâm nghiệp đã không thành công do chồi nuôi cấy in vitro không có khả năng ra rễ hoặc tỷ lệ ra rễ rất thấp (cây Dó trầm, Bách xanh, Pơmu, Trẩu...). Trong quá trình nuôi cấy, các chồi hình thành có thể phát sinh rễ tự nhiên, nhƣng thông thƣờng các chồi này cần phải đƣợc cấy chuyển sang một môi trƣờng khác để kích thích tạo rễ. Kết quả thu thập đƣợc tổng hợp ở bảng 3.4.
32
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của IBA, NAA đến khả năng ra rễ của chồi in vitro Đàn hƣơng trắng (sau 8 tuần nuôi cấy)
IBA Số mẫu Tỷ lệ Số lƣợng Chiều Ký hiệu NAA Chất (mg/l) thí chồi ra rễ dài rễ CTTN (mg/l) lƣợng rễ nghiệm rễ (%) TB/Chồi (cm) R5 0,3 90 65,67 1 1,42 TB
R6 0,5 90 71,12 1 1,93 Tốt 0 R7 0,7 90 61,12 1 1,51 TB
R8 1,2 90 50,01 1 0,94 Xấu
R1 0,3 90 50,00 1 1,26 TB
R2 0,5 90 68.89 1 1,47 TB
R3 0,7 0,25 90 58,89 1 0,83 TB
R4 1,2 90 45,56 1 0,72 Xấu
Sig 0,002 0,0001
80 71.12 68.89 70 65.67 61.12 58.89 60 50.01 50 50 45.56 40 30
Tỷ lệ chồi tạo rễ rễ tạo Tỷchồi lệ 20 10 0 R5 R6 R7 R8 R1 R2 R3 R4 Công thức thí nghiệm
Biểu đồ 3.6. Tỷ lệ chồi in vitro ra rễ trên môi trƣờng bổ sung các chất ĐHST ở nồng độ khác nhau
33
2.5
2 1.93
1.42 1.51 1.47 1.5 1.26 0.94 1 0.83
0.72 Chiều dài rễ/chồi Chiềudài 0.5
0 R5 R6 R7 R8 R1 R2 R3 R4 Công thức thí nghiệm
Biểu đồ 3.7. Chiều dài TB/rễ trên môi trƣờng bổ sung các chất ĐHST ở nồng độ khác nhau
Nghiên cứu khả năng ra rễ in vitro Đàn hƣơng trắng bằng cách sử dụng môi trƣờng MS có bổ sung chất IBA riêng rẽ và kết hợp với NAA ở các nồng độ khác nhau đã có ảnh hƣởng rõ rệt đến chiều dài rễ, tỷ lệ chồi tạo rễ (sig < 0,05) và chất lƣợng rễ. Khi sử dụng riêng rẽ IBA để nghiên cứu khả năng ra rễ của chồi in vitro Đàn hƣơng trắng, ở nồng độ 0,3 mg/l IBA cho kết quả tỷ lệ ra rễ (65,67%), chiều dài rễ (1,42 cm) và chất lƣợng rễ trung bình. Khi tăng nồng độ IBA lên 0,5 mg/l, cho hiệu quả tốt hơn, tỷ lệ chồi tạo rễ (71,12%), chiều dài rễ (1,93 cm) và chất lƣợng rễ tốt nhất. Tuy nhiên khi tăng nồng độ IBA (1,2 mg/l) lên quá cao làm giảm tỷ lệ chồi ra rễ (50,01%), giảm chiều dài rễ (0,94 cm) và rễ chất lƣợng kém. Khi sử dụng kết hợp NAA với IBA, công thức thí nghiệm R2 (0,25 mg/l NAA +0,5 mg/l IBA) là tốt nhất với tỉ lệ chồi tạo rễ là 68,89%, chiều dài rễ đạt 1,47 cm. Tuy nhiên, vẫn kém hơn so với công thức R6 (chỉ sử dụng riêng rẽ IBA nồng độ 0,5 mg/l). So sánh kết quả nghiên của Janarthanam và Sumathi (2011) [14] môi trƣờng tạo rễ thích hợp là ½ MS có bổ sung 0,5 mg/l IBA + 0,25 mg/l NAA + CoM 10% với chiều dài rễ trung bình 4,8 cm sau 6 tuần nuôi cấy. Mặc dù sử dụng nƣớc cốt dừa 10% (CoM) cho kết quả tỷ lệ chồi ra rễ và và số lƣợng rễ cao hơn,
34 tuy nhiên, khi sản xuất cây giống trên qui mô lớn thì việc sử dụng nƣớc cốt dừa làm tăng giá thành cây con. Nhƣ vậy, khi sử dụng IBA ở nồng độ phù hợp (0,5 mg/l) giúp thúc đẩy việc kích thích quá trình tạo rễ in vitro Đàn hƣơng trắng, đồng thời chất lƣợng rễ đƣợc cải thiện rõ rệt.
H nh 3.4. Rễ Đàn hƣơng trắng sau 8 tuần cấy chuyển sang môi trƣờng rễ MS + 0,25 mg/l NAA + 0,5 mg/l IBA sử dụng 30 g/l Glucose
H nh 3.5. Rễ Đàn hƣơng trắng sau 8 tuần cấy chuyển sang môi trƣờng rễ MS + 0,5 mg/l IBA sử dụng 30 g/l Glucose
35
PHẦN 4. KẾT LUẬN, TỒN TẠI VÀ KHUYẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Qua quá trình nghiên cứu nhân giống Đàn hƣơng trắng bằng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro đề tài rút ra một số kết luận sau: * ạo m u sạch Công thức khử trùng hiệu quả nhất để tạo mẫu sạch Đàn hƣơng trắng sử dụng HgCl2 0,1%, trong vòng 4 phút cho 66,67 % mẫu sạch nảy chồi. * Nhân nhanh chồi Môi trƣờng thích hợp để nhân nhanh chồi MS + 0,2 mg/l BAP + 0,3 mg/l K + 0,15 mg/l NAA + 30 g/l Glucose để tăng hệ số nhân chồi (17,01 lần và chiều cao chồi 2,72 cm). * Tạo rễ in vitro Môi trƣờng MS bổ sung 0,5 mg/l IBA là phù hợp để tạo rễ cây Đàn hƣơng trắng cho tỷ lệ chồi tạo rễ cao nhất (71,12%), chiều dài rễ đạt 1,93 cm, chất lƣợng rễ tốt. 4.2. Tồn tại Các thí nghiệm về môi trƣờng dinh dƣỡng và phối hợp các chất điều hòa sinh trƣởng đến sự tạo rễ và số lƣợng rễ chƣa nhiều, cần có những nghiên cứu thêm các công thức khác để nâng cao hơn nữa tỉ lệ ra rễ và số lƣợng rễ. Đề tài chƣa có điều kiện để nghiên cứu tiếp kỹ thuật huấn luyện và chăm sóc cây con ở giai đoạn vƣờn ƣơm. 5.3. Khuyến nghị - Tiếp tục nghiên cứu để tìm ra công thức phù hợp nhất để cải thiện số lƣợng, chất lƣợng rễ cho loài Đàn hƣơng trắng. - Tiếp tục có những nghiên cứu ở giai đoạn huấn luyện cây con, chăm sóc cây con ở giai đoạn vƣờn ƣơm.
36
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT NAM: 1. Bộ NN-PTNT 22/4/2019 ban hành Quyết định số 1305/QĐ-BNN-TCLN. 2. Vũ Thoại, 2014. “Phƣơng pháp kích thích hạt cây đàn hƣơng nảy mầm tự nhiên”, Viện nghiên cứu đàn hƣơng và thực vật quý hiếm (ISAF) website:viennghiencuudanhuong.com.vn 3. Vũ Thoại, 2014. “Làm chủ quy trình chọn tạo cây giống đàn hƣơng”. Viện nghiên cứu đàn hƣơng và thực vật quý hiếm (ISAF) website:viennghiencuudanhuong.com.vn 4. Phạm Đức Tuấn - Vũ Văn Định, 2014: “Đàn hƣơng "hoàng kim" thu 27 tỷ/năm” Đất- Thổ Nhƣỡng.” Đăng trên Báo Nông nghiệp Việt Nam ngày 27/06/2014. 5. Viện nghiên cứu đàn hƣơng và thực vật quý hiếm (ISAF) 2014. “Đàn hƣơng trắng Ấn Độ Santalum album L.” website:viennghiencuudanhuong.com.vn TIẾNG NƢỚC NGOÀI: 6. Abdul Mujib, 2004. “In vitro Regeneration of Sandal (Santalum album L.) from Leaves”. Department of Botany, Hamdard University, New Delhi India: 1- 10. 7. Asian Regional Workshop, 1998. “Santalum album L.”. IUCN 2006. 8. Agroforestry Database 4.0 (Orwa et al.2009) “Sandalwood, East Indian sandalwood”: pp 2-16. 9. Bapat & Rao, 1988. Sandalwood plantlets form “synthetic seeds”. Plant Cell Reports: pp 434–436. 10. Bele, Tripathi, Tiwari, Baghel, & Tiwari ,2012. “Microcloning of sandalwood (Santalum album Linn.) from cultured leaf discs”. Journal of Agricultural Technology: pp 571-583. 11. Flora of Tamil Nadu, VOL. II, 1987: pp 456- 462 12. Hartini Realista Lydia Solle and Endang Semiarti, 2016. “Micropropagation of Sandalwood (Santalum album L.) Endemic Plant from East Nusa Tenggara, Indonesia” Faculty of Biology, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, Jl. Teknika Selatan, Sekip Utara, Yogyakarta, Indonesia: pp 552 -582. 13. India biodiversity Portal, 2018. “Santalum album L. – World agroforestry centre”: pp 345- 357.
14. Janarthanam and Sumathi, 2011. “High Frequency Shoot Regeneration from Internodal Explants of Santalum album L.” International Journal of Botany: pp 249-254. 15. Ken Fern, Tropical Plants Database, 2018. “Santalum Album L.- Useful tropical plants”: 256-278 16. Khande and Bhagyashri Prabhakar, 2016. “Micropropagation studies in Indian Sandalwood (Santalum album (L.)” 321 - 334 17. Mo Xiao-lu, Zeng Qing-qian, Qiu Wei-fen, Chen Yu-zhen (Guangdong Research Institute of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou, China), 2008. “Study on Somatic Embryogenesis from Sandalwood and Plantlet Regeneration” pp 475 - 486. 18. Mo, Qiu, & Chen, 2008. “Study on somatic embryogenesis from sandalwood and plantlet regeneration”. Food Drug, pp 35-37. 19. Muthan, Rathore, & Rai, 2006. “Factors influencing in vivo and in vitro micrografting of sandalwood (Santalum album L.): an endangered tree species”. Journal of Forest Research pp 147-151. 20. Noordwijk, Wawo, Lusiana, Roshetko, 2000. Sandalwood as a component of agroforestry: exploration of parasitism and competition with the WaNuLCAS model: “Proceedings of seminar Kajian Terhadap Cendana Santalum album L. Sebagai Komoditi Utama Perekonomian Propinsi NTT Menuju Otonomisasi”. 26 June 2000, Jakarta. Jakarta: Indonesian Institute of Science pp 124 -135 21. Parveen and Shahzad, 2013. “Somatic embryogenesis and plantlet regeneration of Cassia angustifolia from immature cotyledon-derived callus” pp 112 - 119 22. Peeris and Senarath, 2015. “In vitro propagation of Santalum albumL.”. Department of Botany, Faculty of Applied Science, University of Sri Jayewardenepura, Gangodawila, Nugegoda pp 89 – 95. 23. Rai,1990. Status and cultivation of sandalwood in India. USDA Forest Service General Technical Report. USDA Forest Service, Pacific Southwest Research Station, Albany, USA pp 66 -71. 24. Rao, Chrungoo & Sinha, 1996. Characterization of somatic embryogenesis in Sandalwood (Santalum album L.). In vitro Cellular and Developmental Biology – Plant pp 78 – 92. 25. Rugkhla, A., & Jones, M. G. K. 1998. “Somatic embryogenesis and plantlet formation in Santalum album L.”. Journal of experimental botany 563 - 571.
26. Sanjaya; Muthan, Bagyalakshmi; Rathore, Thrilok Singh; Rai, Vittal Ravishankar, 2006. “Micropropagation of an endangered Indian sandalwood (Santalum album L.)” pp 320 – 326. 27. Shamsi, Parveen, Afreen, Azam, Fatma, Haque and Fatima, 2014. “In-vitro Antibacterial and Antioxidant Activities of Sandalwood (Santalum Album L.)” pp 110 -123 28. Singh, Sandeep Raj, Patil, Jaiswal & Subhash, 2013. Plant regeneration from leaf explants of mature sandalwood (Santalum album L.) trees under in vitro conditions” pp 423 - 429. 29. Supatmi, Nurdiya Ardiyant, Nurhamidar Rahman and Enny Sudarmonowati, 2016. “Massive in vitroPropagation of Sandalwood Through Friable Embryogenic Callus Research Center for Biotechnology, Indonesian Institutes of Sciences (LIPI), Cibinong Science Center, Jl. Raya Bogor KM, Cibinong pp 321 - 332. 30. Sweekruti Barpanda, Sashikala Beura, Sandeep Rout, and Prema Narayan Jagadev, 2015. “Studies on in vitro regeneration of Sandalwood (Santalum album Linn) from Leaf disc explant “ pp 115 – 123 . 31. The Plant List, 2010. “Santalum album L.” pp 356 - 371. 32. Toni Herawan, Mohammad Na’iem, Sapto Indriokoand Ari Indrianto 2014 “Somatic embryogenesis of Sandalwood (Santalum album L.)” pp 151 – 156.
PHỤ BIỂU
Phụ biểu 01. Tỉ lệ mẫu sạch nảy chồi, mẫu sạch chết và mẫu nhiễm ở các công thức xử lý HgCl20,1% với thời gian khác nhau
CTTN * TAOMAUSACH Crosstabulation TAOMAUSACH Total MAUSACH MAUNHIEM Count 45 45 90 H1 % within 50.0% 50.0% 100.0% CTTN Count 62 28 90 H2 % within 68.89% 31.11% 100.0% CTTN CTTN Count 53 37 90 H3 % within 58.89% 41.11% 100.0% CTTN Count 41 49 90 H4 % within 45.56% 54.44% 100.0% CTTN Count 201 159 360 Total % within 55.8% 44.2% 100.0% CTTN
Phụ biểu 02.Kết quả kiểm tra tỷ lệ mẫu sạch nảy chồi, mẫu sạch chết, mẫu nhiễm của Đàn hƣơng trắng Chi-Square Tests
Value df Asymp. Sig. (2-sided) Pearson Chi-Square 11.659a 3 .009 Likelihood Ratio 11.829 3 .008 Linear-by-Linear Association .991 1 .320 N of Valid Cases 360 a. 0 cells (0.0%) have expected count less than 5. The minimum expected count is 39.75.
Phụ biểu 03. Kiểm tra sự ảnh hƣởng của nồng độ chất ĐHST đến chiều cao chồi Đàn hƣơng trắng
ANOVA CHIEUCAOCHOI Sum of df Mean Square F Sig. Squares Between Groups .143 7 .020 341.991 .000 Within Groups .002 35 .000 Total .145 42
Phụ biểu 04. Kiểm tra sự ảnh hƣởng của nồng độ chất ĐHST đến hệ số nhân chồi Đàn hƣơng trắng
ANOVA HESONHANCHOI Sum of df Mean Square F Sig. Squares Between Groups 14.779 7 2.111 120086.925 .000 Within Groups .001 35 .000 Total 14.779 42
Phụ biểu 05. Kiểm tra sự ảnh hƣởng của hàm lƣợng các loại đƣờng đến hệ số nhân chồi Đàn hƣơng trắng
ANOVA HESONHANCHOI Sum of df Mean Square F Sig. Squares Between Groups 200.608 4 50.152 2277252.266 .000 Within Groups .001 29 .000 Total 200.608 33
Phụ biểu 06. Kiểm tra sự ảnh hƣởng của hàm lƣợng các loại đƣờng đến chiều cao chồi Đàn hƣơng trắng
ANOVA CHIEUCAOCHOI Sum of df Mean Square F Sig. Squares Between Groups 3.117 4 .779 69894.273 .000 Within Groups .000 29 .000 Total 3.117 33
Phụ biểu 07. Kiểm tra sự ảnh hƣởng của chất đến chiều dài rễ Đàn hƣơng trắng
ANOVA CHIEUDAIRE Sum of df Mean Square F Sig. Squares Between Groups 1.164 3 .388 10842.091 .000 Within Groups .000 8 .000 Total 1.164 11
Phụ biểu 08. Kiểm tra sự ảnh hƣởng của IBA và NAA đến tỷ lệ chồi tạo rễ Đàn hƣơng trắng
CTTN * TYLERARE Crosstabulation TYLERARE Total TAORE KHONGTAORE Count 59 31 90 R5 % within 65.6% 34.4% 100.0% CTTN Count 64 26 90 R6 % within 71.1% 28.9% 100.0% CTTN CTTN Count 55 35 90 R7 % within 61.1% 38.9% 100.0% CTTN Count 45 45 90 R8 % within 50.0% 50.0% 100.0% CTTN
R1 45 45 90 Count % within 50.0% 50.0% 100.0% CTTN R2 Count 59 31 90 % within 65.6% 34.4% 100.0% CTTN R3 Count 51 39 90 % within 56.7% 43.3% 100.0% CTTN R4 Count 40 50 90 % within 44.4% 55.6% 100.0% CTTN Count 418 302 720 Total % within 61.9% 38.1% 100.0% CTTN
Phụ biểu 09. Kết quả kiểm tra sự ảnh hƣởng của chất ĐHST đến tỷ lệ chồi tạo rễ Đàn hƣơng trắng
Chi-Square Tests Value df Asymp. Sig. (2-sided) Pearson Chi-Square 8.985a 3 .002 Likelihood Ratio 9.073 3 .028 Linear-by-Linear 1.180 1 .277 Association N of Valid Cases 360 a. 0 cells (0.0%) have expected count less than 5. The minimum expected count is 41.25.