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Identificacion Y Cuantificación Por Hplc

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Identificacion Y Cuantificación Por Hplc IDENTIFICACI ON Y CUANTIFICACIÓN POR HPLC - DAD - MS DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS DE QUINUA GERMINADA VARIEDAD CHULPI SILVIA PILCO QUESADA 1,2 ; RITVA ANN - MARY REPO CARRASCO VALENCIA 1 ; JUKKA PEKKA SOUMELA 3 ; YE - TIAN 3 ; JOEL JERSON COAQUIRA QUISPE 2 1 U niversidad Nacional Agraria La Molina – Lima – Perú, 2 U niversidad Peruana Unión - Lima y Juliaca - Perú . 3 University of Turku - Turku – Finlandia. Correo electrónico: ( [email protected] , [email protected] , [email protected] , [email protected] , [email protected] ). RESUMEN La Quinua ( Chenopodium quinoa Willd ) en un grano alimenticio de origen andino de América del Sur, apreciado por ser un alimento altamente nutritivo por su composición. Su crecimiento se puede dar en diferentes pisos altitudinales. Estudios demuestran la presencia de compuestos fenólicos (CF) tales como los flavonoides y ácidos fenólicos, demostrando así la actividad antioxidante y anticancerígena . Por otro lado, l os germinados son excelentes ejemplos de "alimentos funcionales", que se definen como la disminución del r iesgo de diversas enfermedades ejerciendo efectos favorables en la salud. Existen variedades de quinua que han sido poco investigadas, tal es el caso de la variedad chulpi, originaria del departamento de Puno - Perú . El objetivo de la investigación fue ide ntificar y cuantificar los compuestos fenólicos generados d urante el proceso de germinación de la quinua chulpi . Los granos de quinua fueron germinados en un germinador (bioSnacky®, A.Vogel ) por periodo de 1 a 3 días a 22°C con 95% HR. Para la extracción d e los CF se usó 5g de muestra con 15 ml de metanol ácido al 70% (ácido acético al 0,1%), posteriormente homogenizado y centrifugado. El proceso se repite por 2 veces más. Se concentró y se redisolvió en metanol y se filtró para ser inyectado al HPLC. Para la identificación y cuantificación de los compuestos fenólicos se usó un sistema de Cromatografía líquida de Alta Eficiencia (HPLC) con detector de arreglo de diodos ( DA D ) y acoplado a un espectrómetro de masas (MS) . Se uti lizó una columna XB - C18 (3.6 μm, 150 × 4.60 mm ) a 25 ºC. La fase móvil fue de elución con gradiente binario con ácido fórmico / agua (0,1: 99,9, v / v) como disolvente A y ácido fórmico / acetonitrilo (0,1: 99,9, v / v) como disolvente B. El volumen de inye cción fue de 10 μL para cada muestra. Para el ácido vanílico se controló a 280 nm, para Ácidos fenólicos a 320 nm y para Flavonoides a 360nm. Todo el flujo de 0.5 ml / min fue conducido al espectrómetro de masas. El espectrómetro de masas se hizo funcionar en modo de ión positivo. Los resultados mostraron que e l proceso de germinación favorece el incremento de compuestos fenólicos totales, en los granos crudos fue de 2.31 mg/g y en el tercer día de germinación fue de 4.18 mg/g. Los CF identificados fueron: Acacetina/Questina, Acido valínico 4 - glucósido, Acido coumárico – hexosido, Acido ferúlico – glucósido, Acido coumárico, Quercetina - deoxihexosido - deoxihexosido - hexosido, Quercetina - deoxihexosido - pentosido - hexosido, Kaempferol - deoxihexosido - deoxihexosido - he xosido, Kaempferol - deoxihexosido - pentosido - hexosido, Quercetina 3 - O - glucuronide, Kaempferol - pentosido - hexosido, Kaempferol - deoxihexosido - hexosido, Kaempferol - pentosido - glucuronido, Kaempferol 3 - O - glucuronide, además, de un compuesto que no se logró identif icar utilizando la librería de espectrómetro de masas . Se identificó un total de 15 CF durante la germinación presentando un impacto positivamente (p<0.05) en la composición fitoquímica de la quinua. Palabras Clave: Quinua , Compuestos fenólicos, HPLC - DA D - MS , germinados. INTRODUCCIÓN Es considerado el Perú como centro de domesticación de plantas alimenticias, por sus microclimas y diferencias altitudinales originando una diversidad de zonas agroecológicas, favoreciendo al cultivo de granos andinos (quinua, cañihua y kiwicha) (IICA 2015) (Instituto Interamericano de Cooperación para la Agricultura (IICA), 2015). La quinua es grano protegido y conservado por los pueblos indígenas andinos de la región andina de América del Sur; cultivado ampliamente en América del Sur y México (Repo - Carrasco - Valencia et al. 2010 y 2009). Estos granos tienen una gran variabilidad genética, y los cultivares se adaptan al crecimiento en diferentes altitudes y climas ya sean sub - tropicales o fríos. Estos pseudocereales tien en altos valores nutricionales y funcionales que están asociados con la calidad y c antidad de sus proteínas , como es en la quinua de 9 - 18 % , grasas (4 a 6 %) y alto potencial antioxidante (Gorinstein et al., 2002; Gorinstein et al., 2007; Pas'ko, Barton', Fołta, & Gwizdz, 2007, Nowak et al. 2016; Vidueiros et al. 2015; Repo - Carrasco - Valencia et al. 2009; Kent y Evers 1994), además los aminoácidos esenciales son de alto valor biológico (Koziol 1992; Repo - Carrasco - Valencia et al. 2003 y 2001). Estudios demues tran la presencia de una diversidad de compuestos bioactivos en la quinua, de entre ellos se pueden mencionar a los flavonoides, principalmente de los glucósidos: flavonoles, kaempferol y quercetina (Dini et al. 2004). Otro grupo resaltante son los compues tos fenólicos, que han sido ampliamente estudiados, identificando a los principales como el ácido cafeico, ácido p - hydroxybenzoico y ácido ferulico, además de comprobar su actividad antioxidante y anticancerígena (Repo - Carrasco - Valencia et al. 2009; Alvare z - Jubete et al. 2010; Klimczak et al. 2002; Pasko et al. 2009; Gawlik - Dziki et al. 2013). Una nueva forma en la nutrición, en los últimos años, es el consumo de germinados, los vegetales atípicos, que han recibido atención como alimentos funcionales, debid o a su valor nutritivo, que incluye aminoácidos, fibra, oligoelementos y vitaminas, así como flavonoides y fenólicos ácidos (Pas'ko, Sajewicz, Gorinstein y Zachwieja, 2008). El consumo de semillas y germinados se ha vuelto cada vez más popular entre las pe rsonas interesadas en mejorar y mantener su estado de salud cambiando los hábitos alimentarios. Los germinados son excelentes ejemplos de "alimentos funcionales", que se definen como la disminución del riesgo de diversas enfermedades y / o que ejercen efec tos de promoción de la salud, además de su valor nutritivo. OBJETIVO DEL ESTUDIO El objetivo de la investigación fue identificar y cuantificar los compuestos fenólicos generados durante el proceso de germinación de la quinua ( Chenopodium quinoa variedad chulpi ) . MATERIALES Y MÉTODOS Muestras Las semillas de quinua ( Chenopodium quinoa variedad Chul pi) fueron adquiridas del distrito de Ayaviri en el departamento de Puno, Perú. Las semillas fueron almacenadas en bolsas de polietileno a 4°C. Antes de la extracción las muestras fueron molidas utilizando una moledora de granos (Kenwood Chef Titanium XL KVL8300S Stand Mixer, Reino Unido) y tamizado (0.5mm). La harina fue almacenada a 4°C en oscuridad hasta su posterior uso. Reactivos Agua desionizada 18M Ω cm obtenida del sistema PURELAB Ultra (Evoqua Water Technologies). Metanol (grado HPLC y MS), Acetonitrilo (grado HPLC y MS), adquiridos de VWR International Oy (Espoo, Finlandia), Ácido acético (grado HPLC), Ácido fórmico (grado HPLC y MS) comprados de J. T . Baker (Deventer, Holanda). Quercetina - 3 - Rutinósido, Ácido clorogénico, Kaempferol - 3 - O - Rutinósido, Kaempferol - 3 - O - glucuronide, Ácido p - Cumárico, Ácido Trans - ferúlico, Ácido Vanilico. Proceso de Germinación Para germinación de las semillas se utilizó un ge rminador (bioSnacky®, A.Vogel, Canadá), por tres días a temperatura de 22°C y humedad relativa de 95% monitoreadas por un higrómetro (TR300, Amprobe, China) Preparación de muestra para el análisis por HPLC y HPLC/MS Se pesó 5g de la muestra en polvo y se le añadió 15 ml de metanol ácido al 70% (ácido acético al 0,1%) en un ultraturrax durante 3 minutos, seguido de centrifugación (18000 rpm) durante 30 minutos. El sobrenadante fue recolectado. Después de la centrifugación, del residuo se extrajo dos veces m ás, y los sobrenadantes de las tres extracciones se combinaron y se concentraron hasta la evaporación total del solvente con un evaporador rotatorio a vacío a 40°C. El extracto se redisolvió en 5 ml de metanol y se filtró a través de un filtro de 0,45 μm y 0.2 μm (VWR International, LLC, PA) para el análisis en Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia - detección de arreglo de diodos (HPLC - DAD) para la cuantificación de los compuestos fenólicos (CF) y Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia acoplada a Espect rometría de masas en tándem por ionización por electrospray (HPLC - DAD - ESI - MS / MS) para la identificación de los CF. Para el análisis de los CF, los extractos concentrados se filtraron a través de un filtro de 0,45 μm o 0,2 μm antes del an álisis de HPLC - DA D y HPLC - DAD - ESI - MS respectivamente. Para el análisis de CF todas las muestras analíticas fueron extraídas y analizadas en triplicado. Identificación de Compuestos fenólicos utilizando HPLC/MS El análisis se llevó a cabo con un sistema de Cromatografía l íquida de Alta Eficiencia Waters Acquity (Waters Corp., Milford, MA) que consta con un gestor de muestras, sistema binario de suministro de di solvente, detector Waters 2996 DA D y espectrómetro de masas cuadrupolo Tandem Premier Tandem Waters Quattro (Water s Corp., Milford, MA) con ionización por electrospray (ESI). El cromatógrafo y el espectrómetro de masas se operaron utilizando el software MassLynx 4.1. Análisis cualitativo de los compuestos fenólicos Se utilizó una columna Phenomenex Aeris peptide XB - C1 8 (3.6 μm, 150 × 4.60 mm, Torrance, CA) combinada con un kit de cartucho de seguridad Phenomenex (Torrance, CA) para el análisis de muestras a una temperatura del horno de 25 ºC. La fase móvil consistió en un sistema de elución con gradiente binario (Hsu e t al., 2017). Los análisis se llevaron a cabo mediante una elución en gradiente con ácido fórmico / agua (0,1: 99,9, v / v) como disolvente A y ácido fórmico / acetonitrilo (0,1: 99,9, v / v) como disolvente B.
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