Adaptation de l’Archaea halophile halobacterium salinarum aux stress environnementaux : mécanismes de survie et rôle de la protéolyse intracellulaire Vincent Marty

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Vincent Marty. Adaptation de l’Archaea halophile halobacterium salinarum aux stress environnemen- taux : mécanismes de survie et rôle de la protéolyse intracellulaire. Biologie structurale [q-bio.BM]. Université de Grenoble, 2011. Français. ￿NNT : 2011GRENV087￿. ￿tel-01328136￿

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Arretˆ e´ minist erial´ : du 7 ao utˆ 2006

Pr esent´ ee´ par Vincent Marty

Th ese` dirig ee´ par Bruno Franzetti pr epar´ ee´ au sein de l’Institut de Biologie Structurale et de l’Ecole Doctorale Chimie et Sciences du Vivant

Adaptation de l’Archaea halophile Ha- lobacterium salinarum aux stress en- vironnementaux : mecanismes´ de sur- vie et r oleˆ de la prot eolyse´ intracellu- laire.

Th ese` soutenue publiquement le 9 D ecembre´ 2011 , devant le jury compos e´ de :

M. Mohamed Jebbar Professeur universitaire, CNRS-Ifremer-UBO, Rapporteur Mme. V eronique´ Baldin Chercheur CR1, CNRS, Rapporteur M. C edric´ Norais Maitre de conf erence,´ Ecole Polytechnique, Examinateur M. Giuseppe Zaccai Directeur de Recherche, ILL, Examinateur M. Bruno Franzetti Directeur de Recherche, CNRS, Directeur de th ese` Table des mati`eres

I Introduction 16

1 Les Archaea 17 1.1 Habitatsetg´en´eralit´es ...... 17 1.2 Classifications...... 18

2 Les arch´ees halophiles 20 2.1 Habitatsetg´en´eralit´es ...... 20 2.2 Classification ...... 22 2.3 Strat´egies d’adaptations aux conditions salines extrˆemes ...... 22 2.3.1 L’adaptation cellulaire au sel des arch´ees halophiles ...... 23 2.3.2 Adaptation mol´eculaire des prot´eines halophiles ...... 25

3 L’organisme mod`ele Halobacterium salinarum 31 3.1 Conditions de croissance, tol´erances aux conditions environnementales et r´eponse aux stress chez Halobacterium salinarum ...... 34 3.1.1 D´efinitiondustress ...... 34 3.1.2 Les conditions de culture normales pour H.s. : ...... 35 3.1.3 LestypesdestressquepeutrencontrerH.s...... 35

4 L’organisme Haloferax volcanii (Hv) 37

5 La prot´eolyse intracellulaire 38 5.1 Lesfonctions ...... 38

1 5.1.1 Rˆoleg´en´eraldelaprot´eolyse ...... 38 5.1.2 Rˆole de la prot´eolyse dans l’extrˆemophilie des halophiles . . . . 41 5.2 Lesacteurs ...... 41 5.2.1 Les Principaux acteurs eucaryotes pour la d´egradation des prot´eines solubles ...... 41 5.2.2 Lesprincipauxacteursbact´eriens ...... 47 5.2.3 Lesprincipauxacteursarch´eens ...... 48

6 L’aminopeptidase TET 51 6.1 Lesaminopeptidases ...... 51 6.2 Laprot´eineTET ...... 52

7 Objectifs de la th`ese 59

II D´etermination des m´ecanismes mol´eculaires permettant la survie de l’arch´ee halophile Halobacterium salinarum dans des conditions de basse salinit´e 62

8 Effet du sel sur la dynamique in vivo du prot´eome de Halobacterium salinarum 63 8.1 Mesure de la dynamique mol´eculaire des prot´eines par diffusion de neu- tronsinvivo...... 65 8.1.1 La dynamique mol´eculaire des prot´eines ...... 65 8.1.2 La technique de diffusion de neutrons pour des analyses de dy- namiques mol´eculaires d’´echantillons biologiques ...... 69 8.1.3 Interpr´etation des donn´ees de diffusion neutronique ...... 75 8.2 R´esultats...... 77 8.2.1 Choix de la gamme de Q utilis´ee pour le traitement des donn´ees de H.salinarum : ´etude de l’influence du choix de la gamme de Q sur les donn´ees de diffusion neutronique sur E.coli ...... 77

2 8.2.2 Mesure de la r´esilience mol´eculaire du prot´eome Halobacterium salinarum ...... 86 8.2.3 Modification de la dynamique mol´eculaire du prot´eome de H.salinarum dans des conditions exp´erimentales hyposalines ...... 89 8.2.4 Modification de la dynamique mol´eculaire lors des stress thermiques 96 8.2.5 Etude de l’induction du complexe chaperon TF55 lors des stress 99 8.2.6 Influence de l’int´egrit´ecellulaire sur la dynamique du prot´eome d’un organisme m´esophile( E.coli ) et halophile( H.salinarum ) . . 100 8.3 Discussion ...... 102

9 Mise en ´evidence d’un m´ecanisme de survie `ala basse salinit´echez Halobacterium salinarum 104 9.1 R´esultats...... 107 9.1.1 Halobacterium salinarum peut survivre `ades conditions hypo- salinesextracellulaires ...... 107 9.1.2 Mesure de la concentration intracellulaire en K + au cours de stresshypo-salinsprogressifs...... 112 9.1.3 La survie des cellules en condition de basse salinit´e s’accompagne dechangementmorphologiques ...... 115 9.1.4 Mise en ´evidence d’une nouvelle forme d’adaptation au stress. . 122 9.2 Discussion ...... 126

III Contribution `ala compr´ehension du rˆole du syst`eme prot´eolytique PAN-prot´easome chez l’Archaea halophile extrˆeme Halobacterium salinarum 129

10 R´esume de l’article 1 voir annexe 16 : R´egulation du syst`eme prot´eolytique PAN-prot´easome au cours de stress thermiques et hypo-salin chez Halobacterium salinarum . 130 10.1Introduction...... 131

3 10.2R´esultats...... 131 10.2.1 R´egulation de l’activit´eendopeptidasique et de la transcription du syst`eme PAN-prot´easome pendant la croissance cellulaire. . . 131 10.2.2 R´egulation de l’activit´eendopeptidasique et de la transcription du syst`eme PAN-prot´easome au cours de la r´eponse aux stress. . 135 10.2.3 Etat d’oligom´erisation et interactions physiques des prot´eines PANA et PANB chez Halobacterium ...... 138 10.2.4 Les cellules Halobacterium peuvent maintenir leur croissance cel- lulaire dans des conditions normales et de stress malgr´eune d´eficienceduprot´easome...... 140 10.3 Donn´ees suppl´ementaires `al’article 16 : Etude de l’effet de diff´erentes drogues sur l’activit´edu prot´easome de Halobacterium salinarum in vitro etinvivo ...... 143 10.3.1 Effetdesdroguessurlacroissance...... 144 10.3.2 Effet des drogues sur l’activit´edu prot´easome ...... 145 10.4Discussion ...... 151

IV Etude du rˆole de l’aminopeptidase TET dans la prot´eolyse intracellulaire chez les arch´ees halophiles in vivo 152

11 Etude du rˆole de TET chez l’arch´ee halophile Haloferax volcanii par la d´etermination du ph´enotype d’un mutant d´el´et´ed’un des g`enes codant pour la prot´eine TET 154 11.1R´esultats...... 155 11.1.1 Influence de la pr´esence de la prot´ease TET au cours de la crois- sance...... 155 11.1.2 Influence de la pr´esence de la prot´ease TET au cours d’un stress Hypo-salin...... 157

4 11.1.3 Influence de la pr´esence de la prot´ease TET au cours de stress nutritionnel ...... 158 11.1.4 Mesure de l’activit´eamino-peptidasique totale et importance de lapeptidaseTET ...... 161 11.2Discussion ...... 166

12 Etude du rˆole de TET chez l’arch´ee halophile Halobacterium salina- rum 170 12.1R´esultats...... 170 12.1.1 Les diff´erentes formes de TET dans le cytoplasme ...... 170 12.1.2 Contribution de la prot´ease TET dans l’activit´eamino-peptidasique totale ...... 172 12.1.3 Accumulation et recrutement de la forme 12 sous-unit´es de la prot´ease TET au d´ebut de la phase stationnaire ...... 175 12.1.4 Essai de dosage de l’activit´eenzymatique de la peptidase TET apr`es d’immuno-pr´ecipitation `ahaut sel ...... 179 12.1.5 Disparition de la prot´ease TET lors de stress ...... 180 12.1.6 Accumulation et recrutement de la forme 12 sous-unit´es de la prot´ease TET au cours de carences nutritionnelles ...... 184 12.2Discussion ...... 188

V Conclusion g´en´erale et perspectives 191

VI Mat´erielsetm´ethodes 194

13 Croissance et manipulation du mat´eriel vivant utilis´e 195 13.1Milieuxdeculture...... 195 13.1.1 Milieu et conditions de croissance optimum d’ Halobacterium sa- linarum ...... 195

5 13.1.2 Milieu et conditions de croissance optimum d’ Haloferax volcanii 196 13.1.3 Milieux de croissance pour stress nutritionnels d’ Halobacterium salinarum ...... 196 13.1.4 Milieux de croissance pour stress nutritionnels d’ Haloferax volcanii 197 13.1.5 Milieux pour le stress bas sel d’ Halobacterium salinarum . . . . 199 13.2 Suividelacroissance ...... 199 13.2.1 Densit´eoptique ...... 199 13.2.2 Comptagesurboite...... 200 13.2.3 Comptageparmicroscopie ...... 201 13.2.4 Mesure de la viabilit´e(technique Live/Dead) ...... 202 13.3Stressphysiques...... 203 13.3.1 Stressbassalinit´e...... 203 13.3.2 Stresshautetemp´erature...... 204

14 Biochimie des prot´eines 205 14.1 Extractionset´echantillonnage ...... 205 14.2 Pr´ecipitation `al’acide trichlorac´etique (TCA) ...... 206 14.3Dosage...... 206 14.4S´eparation...... 207 14.4.1 S´eparation par ´electrophor`ese et d´etection des prot´eines (Co- omassie,Argent,Western-Blot ...... 207 14.4.2 S´eparationpargradientdesucrose ...... 210 14.4.3 Immuno-pr´ecipitation `ahaut sel de la prot´ease TET ...... 210 14.5 Mesure de l’activit´eamino-peptidasique ...... 211

15 Technique de biophysique 213 15.1 Microscopie : visualisation des changements morphologiques ...... 213 15.1.1 Microscopie par fluorescence pour visualisation des membranes . 213 15.1.2 Microscopie ´electronique coloration n´egative ...... 214 15.1.3 Microscopie ´electronique par balayage ...... 214

6 15.1.4 Microscopie´electronique par coupe ...... 214 15.2 Dosagedesionsintracellulaires ...... 215 15.3 Dynamique mol´eculaire par diffusion de neutron ...... 216 15.3.1 Pr´eparationdes´echantillons ...... 216 15.3.2 Analysedesdonn´ees ...... 217

VII Annexes 218

16 Thermal and salt stress regulation of the PAN-proteasome system in the extreme halophilic Archaeon Halobacterium. 219

VIII Bibliographie 221

7 Table des figures

1.1 Arbre phylog´en´etique hypoth´etique de tous les organismes vivants. . . . 19

2.1 Repr´esentation sch´ematique des transporteurs membranaires de Halo- bacterium salinarum permettant le contrˆole de l’osmolarit´eintracellulaire 25 2.2 Structuret´etram´eriquedelaHMDH ...... 29 2.3 Comparaison de la surface ´electrostatique r´esultant de la composition en acide amin´es acido-basique de la surface d’une malate d´eshydrog´enase acidophileetethalophile...... 30

5.1 Sch´ema r´ecapitulatif des diff´erents rˆoles de la prot´eolyse cytoplasmique chez les arch´ees et position du syst`eme PAN-prot´easome...... 50

6.1 Structure de l’enveloppe du complexe TET de l’arch´eehalophile H.marismortui 53 6.2 Microscopie´electroniquedePhTET1 ...... 55 6.3 Structure du dim`ere dans les deux complexes (12ss et 24ss) de PhTET1 56 6.4 Structures internes du complexe de PhTET1 `a12 sous-unit´es...... 57

8.1 Les ´echelles de temps des mouvements fondamentaux de dynamique mol´eculairedesprot´eines ...... 66 8.2 Repr´esentation du degr´ed’encombrement dans le cytoplasme d’ E.coli . 67 8.3 Porte ´echantillon et culot de Halobact´erium pour les ´etudes de diffusion deneutrons ...... 70 8.4 Photodel’instrumentIN13del’ILL...... 71 8.5 Principe du spectrom`etre `ar´etrodiffusion IN13 de l’ILL...... 72

8 8.6 Processusdediffusiond’unneutron ...... 72 8.7 Exemple d’une mesure de diffusion de neutrons de l’organisme e.coli .. 74 8.8 Courbe < u 2 > en fonction de la temp´erature de l’organisme e.coli ... 76 8.9 Comparaison de la dynamique mol´eculaire d’un ´echantillon d’ E.coli et de son tampon `adiff´erentes temp´eratures...... 79 8.10 Comparaison de la dynamique mol´eculaire entre deux ´echantillons diff´erents de E.coli et choix de la gamme de Q 2 pour le fit permettant d’obtenir la valeur de < u 2 > ...... 81 8.11 Comparaison des < u 2 > obtenues pour les donn´ees mai et juillet 2011 pour l’organisme E.coli en fonction du choix de la gamme en Q 2. ... 83 8.12 Comparaison des valeurs des < k ′ > obtenues pour les diff´erentes gammes de Q 2 pour les donn´ees de E.coli mesur´ees en Mai et en Juillet. . . . . 85 8.13 Comparaison de la flexibilit´eet de la r´esilience macromol´eculaire moyenne < k ′ > (rigidit´e) d’Halobacterium et d’une m´esophile ( E.coli )...... 88 8.14 Comparaison de la dynamique mol´eculaire entre un prot´eome intact de H.salinarum et des cellules lys´ees de H.salinarum par choc osmotique . 90 8.15 Suivi de la croissance de cultures d’ H.salinarum en conditions optimales (4,2M, 37˚C) et de cultures soumises `at=0 `adiff´erents stress environ- nementaux...... 92 8.16 Tableau r´esumant les r´esultats de viabilit´ede l’organismes H.salinarum soumis aux diff´erentes conditions de stress ...... 93 8.17 Tableau r´esumant les r´esultats de dosage de la concentration en K +intracellulaire de l’organismes H.salinarum soumis aux diff´erentes conditions de stress hypo-salins...... 94 8.18 Effets des conditions environnementales hypo-salines sur la dynamique mol´eculaire du prot´eome de H.salinarum ...... 95 8.19 Comparaison de la dynamique mol´eculaire entre un prot´eome intact de H.salinarum et des cellules lys´ees de H.salinarum par choc thermique . 97

9 8.20 Effets du stress thermique sur la dynamique mol´eculaire du prot´eome de H.salinarum ...... 98 8.21 Accumulation de la sous-unit´e α du Thermosome chez H.salinarum en fonction des stress environnementaux thermiques et hypo-salins . . . . 99 8.22 Effets de l’int´egrit´ede la membrane et des petits solut´esur la dynamique totale du prot´eome de H.salinarum ...... 100 8.23 Effets de l’int´egrit´ede la membrane et des petits solut´es sur la dyna- mique totale du prot´eome de H.salinarum ...... 102

9.1 Effet d’une dilution avec un tampon sans sel sur une culture de H.salinarum 105 9.2 Syst`eme exp´erimental permettant une dilution progressive ...... 106 9.3 Micrographies de cellules d’H.salinarum en condition de croissance nor- male (4,2M) et soumis en fin d’un stress progressif de 5 jours (concen- trationextracellulaireenNaCL=0,5M) ...... 108 9.4 Viabilit´ede H.salinarum lors du passage de 4.2M `a0.5M en fonction de la vitesse de dilution des cultures avec un tampon sans sel ...... 109 9.5 Syst`eme de milieu solide pour ´etaler des cellules adapt´ees ...... 111 9.6 Suivi de la concentration en K+ `al’int´erieur du cytoplasme au cours d’unstressbassel...... 113 9.7 Comparaison de la forme des cellules d’ Halobacterium salinarum `adiff´erentes concentrationsextracellulairesdeNaCl ...... 115 9.8 Changement morphologique au cours d’un stress bas sel ...... 117 9.9 Comparaison des cellules en conditions normales et apr`es un stress bas selparmicroscopie ...... 120 9.10 Comparaison de la surface de la membrane et du volume de la cellule en conditions normales et en conditions de stress bas sel ...... 122 9.11 Etat du prot´eome lors d’un stress salin progressif ...... 124

10 10.1 Modifications de l’activit´edu prot´easome 20S et de l’expression des sous- unit´es du complexe PAN-prot´easome lors de la croissance cellulaire chez Halobacterium ...... 133 10.2 Induction de l’activit´edu prot´easome 20S et quantification de l’accu- mulation de transcript des quatre g`enes codant pour les sous-unit´es du syst`eme PAN-prot´easome lors d’une r´eponse `aun stress thermique chez Halobacterium ...... 136 10.3 Induction de l’activit´edu prot´easome 20S et quantification de l’accu- mulation de transcript des quatre g`enes codant pour les sous-unit´es du syst`eme PAN-prot´easome lors d’une r´eponse `aun stress hypo-salin chez Halobacterium ...... 137 10.4 D´etection par co-immunopr´ecipitation des interactions physiques entre les sous-unit´es ATPasiques r´egulatrices du prot´easome PANA et PANB . 139 10.5 Effets de l’inhibition du prot´easome dans des conditions normales de croissance ainsi que dans des conditions de choc thermique ...... 141 10.6 Suivi de la croissance cellulaire d’Halobacterium trait´eavec les diff´erentes drogues ...... 144 10.7 Mesure de l’activit´eendo-peptidasique apr`es inhibition ou non du prot´easome invivoparlesdiff´erentesdrogues...... 146 10.8 Mesure de l’activit´eendopeptidasique sur les fractions de bas poids mol´eculaire et de haut poids mol´eculaire au cours de la croissance cellulaire147 10.9 Mesure de l’activit´eendo-peptidasique apr`es inhibition ou non du prot´easome invitroparlesdiff´erentesdrogues...... 149

11.1 Comparaison morphologique des deux souches ...... 155 11.2 Suivit et comparaison de la croissance en condition optimale de l’orga- nisme H.volcanii etdumutantCN5...... 156 11.3 Comparaison de la croissance des deux souches lors de choc hypo-salin. 158

11 11.4 Comparaison de la croissance de H.volcanii WT et CN5 en fonction de diff´erentsmilieuxnutritionnels ...... 160 11.5 D´etermination d’un profil d’activit´eamino-peptidasique en condition de carencenutritionnelle...... 163 11.6 Mesure de l’activit´eamino-peptidasique en milieu normal HvYPC. En pr´esence de Cobalt. En blue Hv WT en rouge Hv CN5...... 165 11.7 Figure hypoth´etique tra¸cant le rˆole de TET en pr´esence de peptone commeuniquesourcedenutriment...... 168 11.8 Figure hypoth´etique tra¸cant le rˆole de TET en pr´esence d’acides amin´es commeuniquesourcedenutriment...... 169

12.1 Calibrage du gradient de sucrose, les trois formes de TET de H.salinarum invivo...... 171 12.2 Mesure de l’activit´eamino-peptidasique totale chez l’organisme H.salinarum 173 12.3 Correspondance entre la localisation de l’activit´eamino-peptidasique danslegradientetlaplacedelaprot´easeTET ...... 174 12.4 Tableau r´ecapitulatif des m´etallo-prot´eases r´ef´erenc´ees chez H.salinarum 175 12.5 Quantification de l’accumulation de la prot´ease TET et de l’activit´e amino-peptidasique totale au cours des diff´erentes phases de la croissance cellulaire chez H.salinarum ...... 176 12.6 Comparaison de la localisation lors d’un gradient de sucrose 5-20% de l’activit´eamino-peptidasique et de la prot´ease TET au cours de la crois- sance...... 177 12.7 V´erification de l’immuno-pr´ecipitation de TET H.salinarum `ahaut sel. 180 12.8 Profil d’accumulation de la prot´ease TET au cours du temps en pr´esence d’un stress hypo-salin et haute temp´erature...... 181 12.9 Mise en ´evidence du lien entre l’intensit´edu stress hypo-salin et la vitesse dedisparitiondelaprot´easeTET ...... 182

12 12.10R´ev´elation par immuno-d´etection des formes de TET pr´esentes lors d’un stresshypo-salinetthermique ...... 183 12.11Comparaison de la concentration de la prot´ease TET accumul´ee dans le cytoplasmeaucoursdestressnutritionnels ...... 185 12.12Immuno-r´ev´elation par Western-blot de la prot´ease TET pour les cultures soumises`aunstressnutritionnel...... 186 12.13Comparaison de la quantit´edes diff´erentes formes de TET accumul´ees lorsdestressnutritionnels...... 187

13.1 Repr´esentation sch´ematique d’une lame de num´erotation Neubauer . . 201

13 Liste des abr´eviations

BPM fractions de bas poids mol´eculaire cL βL b´eta-lactone

DO Densit´eoptique hMDH malate d´eshydrog´enase d’ Haloarcula marismortui

HPM fractions haut poids mol´eculaire

Hs Halobacterium salinarum

Hv Haloferax volcanii

Hv-MDH malate d´eshydrog´enase d’ Haloferax volcanii

IBS Institut de Biologie Structurale de Grenoble

KCL Chlorure de potassium

LDH lactate d´eshydrog´enase

M Molarit´e

MDH malate d´eshydrog´enase

NaCl Chlorure de sodium

NLVS NIP-Leu3-vinylsulfone ou 4-hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylacetyl-Leu-Leu-leucinal- vinyl sulfone p/v poids/volume

14 PhTET1 peptidase TET1 de Pyrococcus horikoshii

PI1 Protease 1 Inhibitor

Pt-MDH malate d´eshydrog´enase d’ Picrophilus torridus

TET Aminopeptidase t´etra´edriques

TRI prot´ease Tricorne

15 Premi`ere partie

Introduction

16 Chapitre 1

Les Archaea

1.1 Habitats et g´en´eralit´es

Les ”Archaea” ou ”arch´ees” sont pr´esentes dans des environnements extrˆemement diversifi´es. En effet certains groupe d’arch´ees se singularisent par leur capacit´e`ase d´evelopper dans les environnements les plus extrˆemes connus sur terre : temp´erature (jusqu’`aplus de 100˚C), hautes pressions (fond des oc´eans, jusqu’`a1000Bar), hyper- salinit´e(jusqu’`a6M de sel), haute acidit´e(jusqu’`apH proche de 0), UV,... ([1] [2]). Ces organismes capables de vivre dans ces niches ´ecologiques aux conditions extrˆemes sont souvent les seules `ales occuper. A ce titre, ces organismes repr´esentent de bons mod`eles pour comprendre les adaptations cellulaires aux milieux extrˆemes ([3]). Toutefois, il existe aussi beaucoup d’arch´ees vivant dans des biotopes plus courants comme le sol, les lacs, la mer ou l’intestin des animaux. Il n’y a pas d’exemple clairement reconnu d’arch´ees pathog`enes ou parasites, mais il existe des esp`eces mutualistes ou commensales. Par exemple, les arch´ees m´ethanog`enes du tractus intestinal de l’Homme et des ruminants participent `ala digestion des ali- ments. Elles contribueraient jusqu’`a20% du total de la biomasse de la terre.

17 1.2 Classifications

Des analyses g´en´etiques de ce groupe de procaryote ont montr´eque les arch´ees se diff´erenciaient grandement des autres microorganismes. En 1977, Carl Woese ´elaborent un arbre phylog´en´etique bas´esur la s´equence du g`ene de l’ARN ribosomique 16S. En 1990, la g´enomique comparative vient valider l’affectation des arch´ees `aun troisi`eme domaine diff´erent de celui des bact´eries et des eucaryotes (arbre universel bas´esur l’ARN 16S et sur les prot´eines ribosomiques)[4]. Les arch´ees sont remarquablement similaires aux bact´eries `abien des ´egards, en par- ticulier pour la taille et l’organisation de leurs chromosomes, la pr´esence des unit´es de transcription polycistronique et l’utilisation de s´equences de Shine-Dalgarno pour l’initiation de la traduction (mais pas exclusivement; [5]). Les analyses faites sur les g´enomes complets d’arch´ees publi´es `ace jour (www.tigr.com) montrent que les prot´eines du m´etabolisme sont essentiellement de nature bact´erienne. Toutefois malgr´eleurs ressemblances avec les bact´eries, les arch´ees pr´esentent aussi de nombreuses caract´eristiques eucaryotes [6]. Ainsi, les prot´eines class´ees dans le groupe de fonction ”processus cellulaires” (r´eplication, transcription, traduction, d´egradation des ARNm, prot´eolyse...) sont essentiellement de nature eucaryote [7]. Par exemple l’appareil de r´eplication de l’ADN : les primases, les h´elicases et les polym´erases des arch´ees et des eucaryotes, sont totalement ´etrangers `aleurs homologues bact´eriens [8]. Toutefois les syst`emes mol´eculaires d´ecrits chez les arch´ees pr´esentent une simpli- cit´een terme de nombre de composants, compar´es `aleurs homologues eucaryotes. En r´esum´eon pourrait voir les arch´ees comme des organismes qui utilisent des complexes de prot´eines simplifi´es de type eucaryote dans un contexte de type bact´erien [9] [10] [11].

Malgr´eles similitudes `ala fois bact´eriennes et eucaryotes, les arch´ees poss`edent des caract´eristiques uniques qui les distinguent radicalement des deux autres domaines, comme la st´er´eochimie de leur mol´ecule du glyc´erol et de leurs phospholipides. Tous les phospholipides membranaires des arch´ees sont des ´ethers isopr´eno¨ıdes construits sur

18 Figure 1.1 – Arbre phylog´en´etique hypoth´etique de tous les organismes vi- vants. L’arbre est bas´esur des s´equences de l’ARNr 16S. A` l’origine propos´epar Carl Woese, il montre l’histoire ´evolutive des trois domaines du vivant (bact´eries, arch´ees et eucaryotes). le glyc´erol-1-phosphate (G1P), tandis que les membranes bact´eriennes et eucaryotes contiennent des esters d’acides gras li´es au st´er´eo-isom`ere du glyc´erol-3-phosphate (G3P) [12].

19 Chapitre 2

Les arch´ees halophiles

2.1 Habitats et g´en´eralit´es

Les arch´ees halophiles peuvent ˆetre class´ees en trois cat´egories : les l´eg`erement ha- lophiles (optimum de croissance entre 2 et 5% P/V de NaCl); les halophiles mod´er´ees (optimum de croissance entre 5 et 20% p/v de NaCl ); et les halophiles extrˆemes (op- timum de croissance entre 20 et 30% p/v de NaCl). Les organismes halophiles ont ´et´eisol´es dans des lacs, des ´etangs sal´es, dans des marais salants ou dans des s´ediments marins. Ils peuvent ˆetre par exemple rencontr´es dans le Grand Lac Sal´een Utah, le Lac Owens en Californie, la Mer Morte, les estuaires de la Baie de San Francisco, le Lac Magadi au Kenya, la lagune de Venise en Italie. Parmi les exemples d’arch´ees halophiles, l’ordre des Halobacteriales comprend les genres Halobacterium, Halococcus, Haloarcula, Haloferax, Natronococcus.

La concentration saline dans les environnements hyper-sal´es (comme la mer morte ou les grands lacs sal´es) est proche du niveau de saturation pour le chlorure de sodium [13]. L’´evaporation `ala surface de l’eau provoque un rapprochement des mol´ecules de sel entre elles, ce qui provoque la formation de petits cristaux de sel qui flottent `ala surface de la saumure. Ces petits cristaux croissent ensuite par l’ajout de nou- velles mol´ecules de sel sur leurs bords. Comme le cristal devient plus lourd, il ne flotte

20 plus et s’enfonce progressivement plus bas dans la saumure. Ce ph´enom`ene entraˆıne la formation de grosses pyramides cristallines. Enfin, ces pyramides continuent de croitre jusqu’`ala surface. Quand ces pyramides de cristaux salins se forment, de petites poches de saumure sont pi´eg´ees dans la structure. Comme le taux de croissance du cristal aug- mente, la quantit´edes inclusions fluidiques augmente ´egalement. De plus la quantit´e d’inclusions fluidiques est plus importante dans le centre du cristal [14]. Dans ces inclu- sions sont parfois pi´eg´es des arch´ees halophiles, qui restent viable du fait de la pr´esence d’eau libre, pendant de nombreuses ann´ees [15] [16]. Diverses esp`eces d’arch´ees halophiles ont ´et´eremises en culture `apartir de cristaux de sel anciens [15] [16]. La quantit´ede cristaux anciens qui abritent les halophiles viables est toutefois faible. Dans une ´etude de 52 cristaux de sel vieux de 250 millions ann´ees, seulement 2 cristaux ´etudi´es contenaient des arch´ees ayant surv´ecues `ala ”dormance” [16]. Les effets de l’´epuisement des ressources peuvent ´egalement ˆetre observ´es dans les cristaux de sel r´ecemment form´es. En effet, il a ´et´econstat´eque certaines arch´ees halophiles ayant une forme de bˆatonnet en conditions normales de croissance, de- viennent sph´eriques dans les deux ou trois semaines apr`es la formation des cristaux. Ce pl´eomorphisme est typique des arch´ees halophiles en forme de bˆatonnet dans des ´etats de carence [17]. En plus d’un milieu riche en sel, ces organismes sont soumis `a d’autres types de stress, comme les UV. La plus part des arch´ees halophiles sont color´ees en rouge orang´e. Cette couleur est due `al’incorporation de carot´eno¨ıdes dans leur membrane cellulaire. Ces mol´ecules (anti- oxydante) contribuent `ala photoprotection, permettant aux cellules de vivre dans un environnement avec d’intenses radiations d’UV. Les autres moyens de protection contre les UV utilis´es par ces organismes sont un syst`eme de r´eparation de l’ADN efficace et un faible nombre de ”cibles” UV dans leurs g´enomes (thymines). Certaines esp`eces ont aussi une couleur pourpre, dans ces cas l`ala membrane in- corpore de la bact´eriorhodopsine (chromo prot´eine pourpre) ou d’autres rhodopsine-

21 chromo-prot´eines [18]. L’exposition `ala lumi`ere UV est n´ecessaire pour l’activation de la bact´eriorhodopsine. Le rˆole de cette prot´eine est de cr´eer un gradient de proton entre le cytoplasme et le milieu extracellulaire afin de synth´etiser de l’ATP. Certaines esp`eces d’arch´ees comme Halobacterium , pour utiliser au mieux la quantit´e d’UV du milieu produisent aussi des v´esicules de gaz. Cette technique leur permet de flotter `ala surface de la colonne d’eau o`ula lumi`ere (UV) et l’oxyg`ene sont facilement accessibles afin d’activer au mieux leur syst`eme de production d’´energie.

2.2 Classification

Les arch´ees halophiles ´etudi´ees au laboratoire proviennent de la Mer Morte, de lacs hypersalins, de marais salants ou de poissons sal´es contamin´es. Ces organismes ont une forte pigmentation rouge orang´ee ou pourpre. Nous avons ´etudi´eet utilis´eau cours de ma th`ese deux organismes halophiles diff´erents : Halobacterium salinarum (Hs) et Haloferax volcanii (Hv). Ces deux organismes seront pr´esent´es dans le chapitre 3 pour Hs et dans le chapitre 4 pour Hv.

2.3 Strat´egies d’adaptations aux conditions salines extrˆemes

En g´en´eral, les organismes non halophiles tol`erent des niveaux de NaCl `a0,2 mol/L. Les effets d’une forte concentration en sel sur ces organismes non adapt´es sont :

– la pr´ecipitation des biomol´ecules,

– une forte pression osmotique,

22 – une d´eshydratation cellulaire et donc une dessiccation.

Les arch´ees halophiles se d´eveloppent cependant dans des niveaux de NaCl `aplus de 3,5 mol/L. Quels sont les m´ecanismes mis en jeux par les organismes pour vivre dans un environnement hyper sal´e?

2.3.1 L’adaptation cellulaire au sel des arch´ees halophiles

Osmoprotectants

L’exclusion du sodium et la synth`ese ou l’accumulation de solut´es compatibles sont des r´eponses au stress hyper-osmotique adopt´es par de nombreux microorganismes eucaryotes et bact´eriens, mais aussi par des arch´ees halophiles m´ethanog`enes [18]. Les solut´es compatibles peuvent ˆetre des sucres (saccharose, tr´ehalose), des d´eriv´es de sucres (sulfotr´ehalose, glucosylglyc´erol), certains acides amin´es et d´eriv´es (proline, acide glutamique, glutamine, glycine b´eta¨ıne), ´ecto¨ıne (et d´eriv´es) ou des polyalcools (glyc´erol, arabitol, mannitol). L’osmoprotecteur le plus fr´equemment observ´eest la glycine b´eta¨ıne [19]. Il est utilis´epar de nombreux microorganismes halophiles et halo- tol´erants tels que les cyanobact´eries, les bact´eries a´erobies h´et´erotrophes et les arch´ees m´ethanog`enes. Les arch´ees halophiles qui utilisent cette strat´egie ont des pompes transmembranaires ions-s´electives efficaces ainsi que des voies sp´ecifiques pour la synth`ese d’osmolytes. Les voies de biosynth`ese des solut´es organiques, `al’exception de celle de la glycine b´eta¨ıne, d´erivent de la synth`ese du glutamate et de l’aspartate. Le mode d’action des osmoprotecteurs est loin d’ˆetre clair. Ils pourraient n’ˆetre que des solut´es compatibles permettant de maintenir l’osmolarit´ede la cellule vis `avis de l’environnement ou ils pourraient aussi jouer un rˆole protecteur actif en interagissant avec les prot´eines et les prot´egeant [20], de tel sorte que leur pr´esence dans le cytoplasme n’exige pas une adaptation particuli`ere des prot´eines cellulaires.

23 Accumulation de sel

La seconde strat´egie, adopt´ee par la plus part des arch´ees halophiles, est l’accumu- lation intracellulaire de KCl [21] [22] [23]. Une concentration en ion K+ de 5,0 M a ´et´emesur´ee chez Hs lorsque la croissance a lieu `a4,0 M en ion Na + [21]. L’exclusion du Na + du cytoplasme se fait grˆace `aun antiport Na +/H+ (nomm´enhaC chez Hs) (voir sch´ema 2.1) , localis´eau niveau de la membrane cytoplasmique. G´en´eralement, les ions K+ entrent passivement via un syst`eme uniport (nomm´es trkAH chez Hs ) sous l’impulsion du potentiel de membrane. Ce syst`eme revient `a remplacer une partie du sodium cellulaire par du potassium. De multiples syst`emes de transport actif des ions K+( nomm´es kdpABC chez Hs ) ont ´egalement ´et´ed´etect´es dans le g´enome de Halo- bacterium sp. NRC-1 [24] (voir sch´ema 2.1).

La source principale d’´energie, pour l’expulsion du Na + et l’accumulation de K+ dans les cellules d’arch´ees, est la diff´erence de potentiel ´electrochimique des protons. Le potentiel de repos (pour Hs environ de -100 `a-125 mV) est la polarisation ´electrique en situation physiologique de repos d’une membrane plasmique. En introduisant une ´electrode de mesure `al’int´erieur de la cellule (m´ethode de patch-clamp), il a ´et´econstat´e une diff´erence de potentiel : l’int´erieur de la cellule est n´egatif et l’ext´erieur est positif [25] [26]. Cette diff´erence de potentiel est due `ala fois au transport des ´electrons dans la chaˆıne respiratoire, ainsi que par le gradient de protons form´elors de la synth`ese de l’ATP par les ATPase membranaires et les antiporteurs de K+ (KdpABC).

L’afflux de cations doit ˆetre compens´epar un nombre ´equivalent d’anions. Le mouvement d’anions tel que le chlorure est coupl´e`al’´energie du potentiel de mem- brane. Il p´en`etre grˆace `aun symport Na +/Cl −. L’illumination des membranes ac- tionne ´egalement une pompe qui fait entrer les ions Cl − dans la cellule. Cette derni`ere fonction revient `aune prot´eine contenant du r´etinal appel´ehalorhodopsine chez Hs [27].

24 Figure 2.1 – Repr´esentation sch´ematique des transporteurs membranaires de Halobacterium salinarum permettant le contrˆole de l’osmolarit´eintracel- lulaire. En haut `adroite, repr´esentation sch´ematique de la localisation intracellulaires et extracellulaires des ions Na +, K + et Cl −. En haut `agauche, transporteurs dont l’ac- tion d´epend de la pression osmotique et du potentiel de membrane. En bas `agauche, transporteurs dont l’action d´epend d’une source d’´energie chimique de type ATP. En bas `adroite, transporteurs dont l’action d´epend d’une source d’´energie physique de type UV.

2.3.2 Adaptation mol´eculaire des prot´eines halophiles

Les organismes, accumulant dans leur cytoplasme de fortes quantit´es de sel (prin- cipalement du KCl), se soumettent `aun nouveau stress cellulaire : le stress salin. Une force ionique ´elev´ee peut avoir deux effets sur la solubilit´edes prot´eines d’organismes non adapt´es aux conditions hyper-saline : la forte concentration en ion salin va neu- traliser certaines charges ioniques requises en surface pour le maintien de la solubilit´e des prot´eines et rentrer en comp´etition avec les prot´eines pour les mol´ecules d’eau dis-

25 ponibles en solution. Quand la concentration en sel est assez ´elev´ee pour priver une prot´eine des mol´ecules d’eau qui l’hydratent, celle-ci pr´ecipite. Cependant, les organismes halophiles ne semblent pas connaˆıtre ce stress, leurs prot´eines sont non seulement solubles et fonctionnelles (stables, actives et flexibles) `ade telles salinit´es, mais en plus elles se d´enaturent d`es que la concentration en KCl diminue en dessous de 1,0 `a2,0 M. Elles sont en ce sens qualifi´ees de prot´eines halophiles [28] [29] [30].

Le travail r´ealis´esur les syst`emes prot´eiques au cours des 15 derni`eres ann´ees a mis en ´evidence plusieurs caract´eristiques g´en´erales de l’adaptation mol´eculaire halophile via la strat´egie de l’accumulation de KCl. Du fait de la pr´esence d’une forte concentration en sel dans le cytoplasme, les prot´eines halophiles ont n´ecessairement d´evelopp´edes m´ecanismes sp´ecifiques pour la r´etention de leur conformation native et de leur activit´es en milieu satur´een sel. Tout d’abord, l’analyse statistique de 26 s´equences de prot´eines halophiles a montr´e que la plupart des prot´eines halophiles (24 sur 26) sont tr`es acides (exc`es de r´esidus acide par rapport au basique) par rapport aux non-halophiles [31], avec un potentiel iso´electrique moyen (pI) pour le prot´eome halophiles proche de 5. Les structures cristallines de plusieurs prot´eines halophiles ont montr´edes surfaces riches en r´esidus acides. L’utilisation de r´esidus d’acides amin´es charg´es n´egativement conduit `aune organisation des ions salins en r´eseau `ala surface des prot´eines, qui ren- force `ala fois les interactions faibles particules-particules (r´epulsion) et les interactions prot´eine-solvant. La s´election d’une surface acide est donc n´ecessaire pour maintenir la solubilit´edes prot´eines dans un environnement en sel ´elev´e. De plus, de nombreuses prot´eines halophiles ont des sites de liaison aux ions, souvent `al’interface de sous-unit´e. La formation de ponts salins avec d’autres r´esidus va per- mettre d’augmenter la stabilit´edes prot´eines. Il a aussi ´et´ed´emontr´equ’une hydrophobicit´erelativement faible `ala surface des prot´eines ainsi que dans les parties enfouies (cœur de la prot´eine) ´etait une autre forme

26 d’adaptation aux conditions salines. En r´eduisant l’hydrophobicit´ede la surface externe de la prot´eine, l’attraction hydrophobe prot´eine-prot´eine est ´egalement diminu´ee [32]. Ainsi la r´eduction des r´esidus charg´es positivement (principalement la lysine) permet d’am´eliorer la solubilit´edes prot´eines en augmentant la charge n´egative de la surface (d´ej`aforte grˆace aux r´esidus acides). La diminution de la surface hydrophobe enfouie entre les monom`eres est de plus susceptible de favoriser une plus grande flexibilit´e des sous unit´es. Pour l’enzyme malate d´eshydrog´enase halophile, cette derni`ere ca- ract´eristique augmente la flexibilit´edes sous unit´es actives, lui permettant de garder une activit´eenzymatique correcte. Pour la composition des prot´eines halophiles en particulier pour la composition de la surface des prot´eines, il y a donc une forte utilisation des r´esidus Asp, Glu (r´esidus charg´es n´egativement), Thr (r´esidus hydrophiles) et une diminution de l’utilisation des r´esidus Lys, Met, Leu, Ile, et Cys. Dans ce type d’environnement hyper-salin, les r´esidus hydrophobes des prot´eines nouvellement synth´etis´ees sont expos´es `ades concentrations ´elev´ees de sel, ce qui pourraient conduire `ades interactions non-sp´ecifiques inter-ou in- tramol´eculaires des chaˆınes lat´erales, ce qui engendreraient de forte perturbation pour le repliement final de la prot´eine. Afin de minimiser ces possibilit´es, toutes les prot´eines halophiles solubles ont un nombre inf´erieur de r´esidus hydrophobes, de plus l’augmenta- tion de la charge n´egative sur la surface des prot´eines halophiles contrecarre la constante di´electrique (qui se trouve ˆetre basse `ala salinit´e´elev´ee) et permet donc d’am´eliorer la solubilit´edes prot´eines. Une ´etude r´ecente de mutag´en`ese dirig´ee a soulign´equ’une diminution de la surface accessible au solvant d’une prot´eine ´et´eaussi une caract´eristique de l’adaptation halo- phile [33]. Enfin, au niveau structure secondaire des prot´eines halophiles (par rapport aux prot´eines non halophiles), il y a une plus grande tendance `ala formation de structure de type pelote statique (random coil) et une plus faible tendance `a la forme de structure de type h´elico¨ıdales (h´elices et feuillets). Un pourcentage plus ´elev´ede la structure de type h´elice, permet une augmentation globale de la rigidit´ede la prot´eine, par cons´equence

27 une diminution du pourcentage de structure de type h´elice chez les prot´eines halophiles rend probablement plus souples ces prot´eines.

La malate d´eshydrog´enase , une prot´eine mod`ele pour ´etudi´ele caract`ere halophile des prot´eines : La malate d´eshydrog´enase (MDH) est une enzyme cl´e qui catalyse la conversion de la malate en oxaloac´etate (et inversement) dans le cycle de l’acide citrique. Pr´esente dans la plupart des organismes, la malate d´eshydrog´enase existe comme une mol´ecule homot´etram´erique ( la sous unit´eposs`ede un poids mol´eculaire aux alentour de 30 KDa) avec une structure proche de celle de la lactate d´eshydrog´enase (LDH). Il est int´eressant de noter que la s´equence en acides-amin´e de MDH d’arch´ees est plus proche de celle de la lactate d´eshydrog´enase LDH que celle de MDH d’autres orga- nismes(cela indique qu’il existe un lien possible entre l’´evolution de la LDH et MDH). Il sera donc plus int´eressant de comparer les structures des MDH d’arch´ee `ades LDH des autres organismes. La MDH d’arch´ees halophile la plus ´etudi´ee `ace jour, est la MDH d’ Haloarcula ma- rismortui (hMDH) . La structure homot´etram´erique de la hMDH est repr´esent´ee par la figure 2.2, cette structure `a´et´eobtenue par cristallographie au rayon X avec une r´esolution de 3,2 Apar˚ dym et all en 1995 [34].

Depuis, plusieurs structures de cette prot´eine ont ´et´er´ealis´ees avec une meilleur r´esolution. La comparaison des r´esidus de surface des diff´erentes MDH (et LDH) pro- venant d’organismes halophile, thermophile, acidophile et m´esophile, permet de visua- liser la forte proportion de r´esidus acide de la prot´eine halophile en contact avec le solvant(sauf dans les r´egions o`ula pr´esence d’acide amin´epositif est n´ecessaire pour les fonction biologique) et donc le fort potentiel iso´electrique n´egatif. Sont repr´esent´e sur la figure 2.3 la surface ´electrostatique de la MDH de l’arch´ee acidophile Picrophilus torridus (Pt-MDH) qui croit `aun pH=0 et celle de l’arch´ee halophile Haloferax vol-

28 Figure 2.2 – Structure t´etram´erique de la HMDH : les acides amin´es acides sont repr´esent´es en rouge et les basiques en bleu. Les nombres 1 `a4 d´esigne les diff´erentes sous-unit´ede la prot´eine. Source Dym et al 1995 [34] canii (Hv-MDH). Il est suppos´eque cette surface charg´ee n´egativement va permettre de recruter un grand nombre de mol´ecules de solvant, cr´eant une couche d’hydratation car les ions salins sont hydrat´es.

A partir des donn´ees structurales de la hMDH, il a ´et´epossible de d´eterminer d’autres particularit´es structurales, en particulier la pr´esence de sites sp´ecifiques de ponts ioniques `al’interface des sous-unit´es. Cette incorporation d’ions `al’int´erieur de la structure va permettre de cr´eer un tr`es grand nombre de ponts et de r´eseaux salins entre les sous-unit´es (cette fonctionnalit´eest aussi utilis´ee pour la thermostabilit´edes prot´eines). Depuis, ces donn´ees structurales ont ´et´econfirm´ees sur d’autres prot´eines halophiles, provenant aussi d’autres organismes halophiles.

29 Figure 2.3 – Comparaison de la surface ´electrostatique r´esultant de la composition en acide amin´es acido-basique de la surface d’une malate d´eshydrog´enase acidophile et halophile. Structure t´etram´erique de la Pt-MDH (`a gauche) et de la Hv-MDH (`adroite), la surface ´electrostatique n´egative est repr´esent´ee en rouge et positive en bleu. Structure et image r´ealis´ees par Romain Talon, groupe ELMA IBS.

Des organismes optimis´es : Les organismes halophiles qui utilisent la strat´egie d’accumulation de sel dans leur cytoplasmes sont optimis´es pour des concentrations salines extracellulaires tr`es ´elev´ees o`ul’eau libre est rare. De ce fait l’absence de sel devient une condition l´etale et la diminution de la concentration en sel devient une source de stress tr`es importante pour ces organismes. L’impact d’une diminution en sel du milieu extracellulaire provoque dans un premier temps une entr´ee massive d’eau dans le cytoplasme (due `ala forte pression osmotique engendr´ee par l’accumulation de K+ dans le cytoplasme). Cette entr´ee massive va provoquer une destruction de la membrane et donc la lyse des cellules. De plus l’effet d’une forte proportion d’eau libre va provoquer une d´enaturation des prot´eines, car comme vu dans le paragraphe pr´ec´edent, le sel stabilise et est n´ecessaire `ala conformation spatiale des prot´eines halophiles.[29][35]

30 Chapitre 3

L’organisme mod`ele Halobacterium salinarum

Halobacterium salinarum (Hs) est une esp`ece repr´esentative d’un vaste groupe, la famille des halobact´eriac´ees (Phylum Euryarchaeota, Classe Halobacteria, Ordre Ha- lobacteriales, Famille Halobacteriaceae). Cet organisme a ´et´eisol´esur des poissons ou des viandes sal´es, dans les lacs et mers hypersalins (comme la mer morte ou le lac de Magadi au Kenya) et dans certains marais salants (comme au Madagascar). Cet organisme a ´et´ed´ecouvert par Elazari-Volcani en 1957.

G´en´eralit´e Les cellules Hs ont une forme de bˆatonnet de 2 `a10 µm de long et de 0,4 `a0,7 µm de diam`etre, munis de flagelles `aune ou deux extr´emit´es (5 `a10 filaments sur une extr´emit´een conditions de croissance optimum et 5 `a10 filaments sur chaque extr´emit´een conditions de carence). Ces flagelles leur permettent de se mouvoir afin de rechercher des conditions favorables pour leur croissance : pr´esence de nutriments et d’oxyg`ene. Les cellules poss`edent une membrane form´ee de prot´eines et de lipides, typiques des arch´ees (2.1). Elles n’ont pas de paroi mais sont envelopp´ees par une pel- licule extra-membranaire, appel´ee couche S, form´ee de glycoprot´eines reli´ees par des + ions Mg 2 . Ces arch´ees se d´eveloppent dans des milieux contenant une concentration

31 extrˆemement ´elev´ee en chlorure de sodium (entre 170 et 300g/L), pr`es de dix fois celle de l’eau de mer (optimum de croissance `a4,2Mol/L, soit 250 g/L de NaCl), donc proche de la saturation (qui intervient vers 5,2 Mol/L, environ 300 g/L de NaCl). En conditions de croissance optimum, on peut trouver jusqu’`a 100 millions de cellules par millilitre.

Limites par rapport au sel Hs a un besoin absolu d’une concentration ´elev´ee en sel, en particulier pour maintenir la structure de sa membrane et ne peut plus se mul- tiplier si la concentration en sel (NaCl) devient inf´erieure `a2,5 Mol/L. Lorsque les cellules sont expos´ees `aun milieu dont la concentration est inf´erieure `a1,5 Mol/L, les cellules ´eclatent du fait de la pression osmotique. La r´esistance de cet organisme `aune concentration ´elev´ee en sel s’explique par leur capacit´e`a´equilibrer la pression osmotique du milieu intracellulaire par rapport `acelle du milieu extracellulaire par une concentration interne en cations ( K+) particuli`erement ´elev´ee. Grˆace `adivers syst`emes de pompe, elles accumulent les ions potassium ( K+) dans leur milieu intracellulaire `a des concentrations d’environ 4 `a5 Mol/L et expulse les ions sodium `al’ext´erieur de la cellule (il en reste n´eanmoins une concentration proche de 1 Mol/L dans le cy- toplasme). Elles accumulent aussi activement les ions chlorures. Cette accumulation d´epend de prot´eines transmembranaires dont l’une est une pompe `achlorures activ´ee par la lumi`ere, appel´ee halorhodopsine [36].

M´etabolisme Hs pr´esente un m´etabolisme ´energ´etique lui permettant d’utiliser des sources d’´energie vari´ees. Fondamentalement, c’est un chimio-organotrophe a´erobique : cet organisme peut d´egrader des substrats organiques en produisant de l’ATP par respiration a´erobie, c’est-`a-dire avec le di-oxyg`ene (comme accepteur final du pouvoir r´educteur ( H+ + ´electrons)) arrach´eaux substrats au cours du cycle de Krebs. La chaˆıne de transport des ´electrons, situ´ee dans la membrane plasmique, est constitu´ee

32 d’enzymes qui sont proches sur le plan phylog´en´etique de celles des eubact´eries a´erobies. Les g`enes qui les codent pour ces enzymes pourraient avoir ´et´eacquis par transfert ho- rizontal `apartir d’eubact´eries. Dans la nature, les substrats organiques que ces arch´ees utilisent comme source d’´energie : peptides, acides amin´es, acides organiques, etc . pro- viennent g´en´eralement de la d´egradation d’organismes moins halophiles qui meurent lorsque la salinit´eaugmente excessivement. C’est pourquoi, on les cultive au labora- toire sur un milieu enrichi en substances organiques par de l’extrait de levure et de la peptone [24]. Hs a aussi une capacit´ede respiration ana´erobie facultative. Dans ce cas, l’accepteur final des ´electrons est le DMSO (dim´ethylsulfoxide) ou la TMAO (trim´ethylamine N- oxyde).

Enfin, lorsque la concentration en oxyg`ene mol´eculaire est faible, Hs peut aussi de- venir phototrophe, c’est-`a-dire capable de produire de l’ATP en utilisant l’´energie lu- mineuse. Mais ce m´ecanisme n’a rien `avoir avec la photosynth`ese puisqu’il ne n´ecessite ni chlorophylle, ni bact´eriochlorophylle. La phototrophie de Hs d´epend d’une prot´eine membranaire, appel´ee bact´eriorhodopsine, dont le maximum d’absorption se situe dans le visible `a560 nm, c’est-`a-dire dans le vert, contrairement aux chlorophylles qui n’ab- sorbent pas dans cette r´egion du spectre lumineux. A` la lumi`ere, en l’absence d’oxyg`ene dissout, les voies m´etaboliques conduisant `ala synth`ese de la bact´eriorhodopsine sont stimul´ees [24]. Les mol´ecules de bact´eriorhodopsine sont organis´ees en trim`eres qui forment dans la membrane un arrangement para-cristallin bidimensionnel de forme hexagonale et lui conf`erent une couleur pourpre. Le reste de la membrane, si`ege de la respiration, est rouge en raison de la pr´esence de carot´eno¨ıdes. En pompant activement les protons in- tracellulaires vers l’ext´erieur `atravers la membrane sous l’action de l’´energie lumineuse, la bact´eriorhodopsine rend le milieu intracellulaire plus alcalin que le milieu extracellu- laire. Le gradient chimio-osmotique ainsi produit `ala lumi`ere est utilis´epar une ATP synthase membranaire pour synth´etiser l’ATP `apartir de l’ADP et du phosphate. Il a

33 ´et´ecalcul´eque la synth`ese d’une mol´ecule d’ATP n´ecessite l’absorption d’environ 22 photons [24].

3.1 Conditions de croissance, tol´erances aux condi- tions environnementales et r´eponse aux stress chez Halobacterium salinarum

3.1.1 D´efinition du stress

Un stress est une perturbation de l’environnement qui soumet l’organisme `ades contraintes (ou des pressions). Ces perturbations peuvent ˆetre de natures physiques (pression, radiation, temp´erature, dessiccation), environnementales (pr´edation, agres- sion, comp´etition, libert´ede mouvement), chimiques (toxine, m´etaux, oxyg`ene, pH) ou nutritionnelle (carence). Mˆeme si d’un point de vue d’un observateur ext´erieur, l’organisme ”supporte” ces contraintes, d’un point de vue interne, de nombreux processus de survie rentre en jeu pour permettre cette tol´erance aux stress. Ces contraintes vont donc g´en´erer des stimuli qui vont provoquer une r´eponse de l’organisme. Chaque organisme a une capacit´ed’adaptation propre `achaque type de perturbation, on parlera donc de limite de tol´erance aux stress. La limite de tol´erance est l’intensit´e maximum de stimuli que peut supporter un organisme. Une fois que l’intensit´edu sti- mulus passe cette limite de tol´erance, le stress devient l´etal. De plus, il est int´eressant de voir qu’un organisme ayant d´ej`a´et´esoumis `aun type de stress devient lui et ses descendants plus tol´erants aux stress suivants du mˆeme type. Il existe donc une forme d’adaptation aux stress ou de s´election des processus de survie chez des organismes contraints `ade nombreux stimuli. Par comparaison aux milieux g´en´erant des conditions de stress, on parlera donc de milieu environnemental normal

34 ou optimal, pour caract´eriser un environnement qui g´en`ere un minimum de sources de stress pour l’organisme (milieu Normal) ou mˆeme qui favorise son expansion (milieu Optimal).

3.1.2 Les conditions de culture normales pour H.s. :

H.salinarum poss`ede une croissance optimale `a37˚C, `apression atmosph´erique, avec une concentration de NaCl extracellulaire de 4.2M, `apH 7.2, en pr´esence d’oxyg`ene, de luminosit´eet dont la composition en nutriments est un m´elange d’extrait de levure et de peptone [36][24][37].

3.1.3 Les types de stress que peut rencontrer H.s.

Les types de stress que peut rencontrer H.s. dans la nature : – Dessiccation extrˆeme (´evaporation, internalisation dans des cristaux) ou dilution (pluie). – Baisse ou hausse des temp´eratures. – Radiation UV excessive ou obscurit´etotale. – Anoxie. – Pr´esence de m´etaux en abondance ou autre toxine. – Carence nutritionnelle.

Cet organisme est r´esistant `ade nombreux types de stress [38][39], sa limite de tol´erance `achaque type de stress [36][24][37] est : – Dessiccation : pr´esence de ces organismes dans des cristaux de sel (5.2M). – Dilution : peut supporter une chute brutale jusqu’`a2.5M de NaCl extracellulaire, en dessous de 1.5M toute les cellules sont lys´ees. – Limite basse en temp´erature : les cellules entrent en latence `apartir de 15˚C, une exposition prolong´ee `ades temp´eratures de l’ordre de 4˚C d´estabilise le g´enome.

35 – Limite haute en temp´erature : peut supporter une temp´erature de 50˚C, au dessus de 80˚C les cellules meurent en moins d’une heure. – UV : Tol´erance tr`es ´elev´ee : viabilit´ede 100% `a100 J/m 2 pendant 1 heure (intensit´esuffissante pour tuer un organisme tel que E.coli ). La viabilit´echute `a 80% pour une exposition `a200 J/m 2 pendant 1 heure. – Obscurit´e: totale pendant plusieurs jours. – Anoxie : totale. – Tol´erance `ala carence nutritionnelle : les phases stationnaires durent plusieurs semaines. Cet organisme est parfait pour ´etudier la r´eponse aux stress, du fait de sa grande gamme de tol´erance aux stress. Nous utilisons au laboratoire la souche NRC-1.

36 Chapitre 4

L’organisme Haloferax volcanii (Hv)

Haloferax volcanii (Hv), tout comme H.salinarum (Hs) est une arch´ee de la famille des Halobacteriaceae (Phylum Euryarchaeota, Classe Halobacteria, Ordre Halobacte- riales, Famille Halobacteriaceae). Son habitat d’origine est la mer morte mais on la retrouve aussi dans les grands lacs sal´es. Cet organisme a ´et´ed´ecouvert par Mulla- khanbhai et Larsen en 1975 [40]. Les cellules Hv sont extrˆemement pl´eomorphes, de couleur rouge orang´eclair, souvent en forme de disque de 0,4-3 x 2-3 microm`etre (les cellules peuvent avoir une forme ronde, carr´ee, ovale, rectangulaire ou en forme de ”corn flakes”). Cet organisme est non mobile. Cette arch´ee se d´eveloppe dans des milieux contenant une concentration en chlorure de sodium comprise entre 60 et 260g/L (optimum `aenviron 110g/L). Tout comme Hs, cet organisme se lyse dans l’eau distill´ee. Sa couleur orange est due `ala production et `al’accumulation de carot´eno¨ıdes pour la protection contre les UV. Nous utilisons la souche DS2 au laboratoire (que nous nommerons ”souche sauvage”) et le mutant CN5 issue de la souche H53 (CN5 = H53∆ tet : :trpA ) elle-mˆeme issue de la souche DS2 (H53 = DS2 pHV2 − ∆pyrE2 ∆trpA ).

37 Chapitre 5

La prot´eolyse intracellulaire

Une partie du travail effectu´ependant la th`ese s’est port´e sur l’´etude de la prot´eolyse intracellulaire chez les arch´ees halophiles et en particulier sur le rˆole invivo de la prot´eases TET. Les cellules poss`edent `ala fois des voies de d´egradation des prot´eines extracellulaires et intracellulaires. La principale voie extracellulaire est un syst`eme de prot´eases digestives (endoprot´eases, exopeptidases et peptidases) qui dig`erent les prot´eines en oligopep- tides, qui pourront passer la membrane des cellules par le biais de transporteurs, afin de g´en´erer un pool de petits peptides pour le m´etabolisme cellulaire. La cellule poss`ede ´egalement plusieurs voies prot´eolytiques intracellulaires pour d´egrader les prot´eines. Ces voies prot´eolytiques peuvent ˆetre class´ees en deux grands syst`emes : les lysosomes et les voies cytosoliques dont la principale est la voie ubiquitine/prot´easome.

5.1 Les fonctions

5.1.1 Rˆole g´en´eral de la prot´eolyse

La prot´eolyse cytosolique ou d´egradation des prot´eines est l’un des processus les plus essentiels `ala survie de la cellule. Elle assure l’´elimination des prot´eines d´efectueuses,

38 des prot´eines mal repli´ees [41], mais aussi contrˆole la demi-vie de certaines prot´eines et joue donc un rˆole dans les processus m´etaboliques. Les acteurs de la prot´eolyse sont des prot´eines appel´ees ”prot´eases” dont le rˆole est de d´egrader en acides amin´es les prot´eines cibl´ees.

Les prot´eases ne d´egradent pas n’importe quelles prot´eines. La d´egradation est sp´ecifique et cette sp´ecificit´eest assur´ee par les signaux de d´egradation. Les signaux de d´egradation se classent en deux cat´egories : les signaux de d´egradation primaires qui sont essentiellement situ´es au sein de la structure elle-mˆeme. Ce sont g´en´eralement des r´egions hydrophobes non structur´ees ou des motifs de quelques acides amin´es localis´es en N-terminal ou en C-terminal ou dans des localisations variables `al’int´erieur de la s´equence [42]. Les signaux de d´egradation secondaires sont apport´es en trans sur les prot´eines. Ce sont des modifications post-traductionnelles qui peuvent ˆetre des phosphorylations ou l’addition co-traductionnelle de signaux peptidiques. Ces modifications permettent la r´egulation fine et sp´ecifique de l’activit´ede la prot´eolyse (ex. syst`eme ubiquitine voir la suite).

On peut d´efinir quatre grandes fonctions prot´eolytiques.

1. La prot´eolyse joue un rˆole important dans la r´egulation des processus cellulaires [43] [44] en contrˆolant pr´ecis´ement la demi-vie de nombreux facteurs de r´egulation [41]. Le processus est hautement s´electif et finement r´egul´eet la demi-vie d’une prot´eine donn´ee varie selon sa fonction, de quelques minutes `aquelques jours. En contrˆolant le niveau de prot´eines-clefs dans la cellule, la prot´eolyse intervient dans la r´egulation du cycle cellulaire; de l’oncogen`ese; de la transcription; du d´eveloppement et la croissance; de l’atrophie des muscles et de la pr´esentation de peptides antig´eniques [45] [46] [47].

39 2. Il existe un syst`eme de contrˆole de la qualit´edes prot´eines [41] dont le but est de pr´evenir l’accumulation des prot´eines d´efectueuses dans la cellule [48] [49]. Des prot´eines d´efectueuses peuvent provenir de diverses origines : – d’erreurs de la machinerie de la traduction, qui produisent des prot´eines d´efectueuses appel´ees ´egalement DRiPs (pour Deficient Ribosomal Products). – de mutations, qui g´en`erent des prot´eines incapables de se replier correctement. – de d´et´erioration lors de stress environnementaux.

Ce dernier facteur de d´et´erioration est particuli`erement pr´esent pour les orga- nismes extrˆemophiles.

3. La prot´eolyse permet `ala cellule d’´eliminer les prot´eines et les peptides superflus afin de g´en´erer un pool d’acides amin´es pour la synth`ese de nouvelles prot´eines.

4. Enfin, la d´egradation de peptides cytosoliques, `adeux fins : pour la r´egulation des peptides cellulaires et extracellulaires comme par exemple par l’activation du complexe majeur d’histocompatibilit´e; ou pour le m´etabolisme en d´egradant des peptides cellulaires (autophagie) et extracellulaires, afin de g´en´erer des acides amin´es pour le fonctionnement du m´etabolisme cellulaire lors de carences nutri- tionnelles.

Les prot´eases sont largement repr´esent´ees dans la cellule (3 `a10% des prot´eines de la cellule) et se r´epartissent en deux groupes selon leurs besoins ´energ´etiques. On distingue les prot´eases ATP-d´ependantes et les prot´eases ATP-ind´ependantes. Les prot´eases ATP-d´ependantes interviennent essentiellement dans la d´egradation des prot´eines dites r´egulatrices et dans l’´elimination des prot´eines d´efectueuses. L’inhibition ou l’inactivation de la majorit´edes prot´eases ATP-d´ependantes entraˆıne une sensibilit´e aux stress et l’accumulation des prot´eines d´efectueuses dans le cytoplasme. La majorit´e de ces prot´eases sont induites en conditions de stress [41]. Les prot´eases ATP-ind´ependantes interviennent notamment dans les fonctions dites de

40 ”m´enage”. Leur rˆole est notamment de r´ealiser l’´etape finale de la prot´eolyse in vivo, en ce sens elles sont charg´ees de d´egrader les petits oligopeptides, issus de la prot´eolyse d´ependante de l’´energie, en acides amin´es r´eutilisables.

5.1.2 Rˆole de la prot´eolyse dans l’extrˆemophilie des halophiles

Les extrˆemophiles sont constamment soumis `ade multiples stress environnemen- taux, ce qui engendre de nombreuses d´et´eriorations des prot´eines et de l’ADN. L’ac- cumulation de prot´eines d´efectueuses dans le cytoplasme est un facteur de toxicit´e important pour les cellules. Une des r´eponses cellulaires au stress est l’induction rapide et temporaire de la machinerie prot´eolytique. Il faut donc une machinerie efficace et compl`ete pour r´eagir face `ades prot´eines `ad´egrader en masse. La prot´eolyse cellulaire joue donc un rˆole cl´edans la survie de ces organismes extrˆemophiles, en ´eliminant le surplus de prot´eines non fonctionnelles et ainsi en ´evitant une n´ecrose due `aune trop grande concentration de prot´eines toxiques.

5.2 Les acteurs

5.2.1 Les Principaux acteurs eucaryotes pour la d´egradation des prot´eines solubles

Les prot´eines solubles intracellulaires sont en g´en´eral d´egrad´ees par des prot´eases solubles class´ees en quatre types majeurs, bas´es sur la nature du ou des acides amin´es du site actif impliqu´edans la catalyse et leurs m´ecanismes d’action :

– Les prot´eases `as´erine qui poss`edent une triade catalytique caract´eristique com- prennent une s´erine, une histidine et un aspartate. Le groupement hydroxyle de la s´erine joue le rˆole de nucl´eophile et attaque le carbonyle de la liaison peptidique.

41 Exemples : la thrombine qui clive le fibrinog`ene en fibrine lors de la coagulation sanguine, mais aussi la trypsine et la chymotrypsine qui sont des enzymes diges- tives du suc pancr´eatique.

– Les prot´eases `athiol qui poss`edent une cyst´eine dans leur site actif. Dans ces prot´eases, le rˆole du nucl´eophile est jou´epar le soufre de la cyst´eine, sous forme de thiolate d´eproton´e. Exemples : les caspases qui jouent un rˆole essentiel dans les ph´enom`enes d’apoptose, de n´ecrose et d’inflammation.

– Les prot´eases acides agissant `apH acide et poss´edant un acide aspartique sur leur site actif. Exemple : la pepsine endoprot´ease digestive du suc gastrique.

– Les m´etalloprot´eases qui poss`edent un ou plusieurs cations m´etalliques, en g´en´eral un atome de zinc, fix´efortement `ala prot´eine par les chaˆınes lat´erales de plu- sieurs acides amin´es. Le cation m´etallique intervient directement pour activer une mol´ecule d’eau qui clive la chaˆıne peptidique. Exemple : les prot´eases de la matrice extracellulaire comme les collag´enases.

– Les prot´eines solubles intracellulaires peuvent ˆetre ´egalement d´egrad´ees par la voie ubiquitine/prot´easome si elles sont reconnues comme incorrectement repli´ees ou non assembl´ees par le syst`eme de contrˆole de qualit´e. Ce syst`eme ayant un rˆole majeur, sa description fait l’objet du chapitre suivant.

La voie ubiquitine/prot´easome est responsable de la d´egradation de la grande majo- rit´edes prot´eines en particulier les prot´eines anormales, r´esultant de d´efauts de synth`ese ou de modifications perturbant leur repliement tridimensionnel et par cons´equent leur fonctionnement. Le ciblage des prot´eines incorrectement repli´ees vers la voie ubiqui- tine/prot´easome depuis le R´eticulum Endoplasmique (RE) se fait par deux syst`emes successifs : un syst`eme de contrˆole de qualit´eet un syst`eme de d´egradation. Ces

42 m´ecanismes font intervenir de nombreuses prot´eines chaperonnes et enzymes. Le syst`eme contrˆole qualit´edu r´eticulum endoplasmique (Endoplasmic Reticulum Qua- lity Control = ERQC) joue un rˆole essentiel dans le repliement et la maturation des prot´eines nouvellement synth´etis´ees. Il fournit un environnement optimal pour le re- pliement, l’oxydation et l’assemblage des oligom`eres des prot´eines transloqu´ees dans la lumi`ere du RE ou ins´er´ees dans la membrane. Le repliement dans le RE se fait par l’action combin´ee de nombreuses enzymes de repliement, de chaperonnes mol´eculaires et de senseurs de repliement [50]. Ces derni`eres s’associent pour la plupart `ala chaˆıne polypeptidique naissante et aident au repliement tant que la prot´eine n’a pas acquis son ´etat natif. Afin d’assurer un processus de maturation correct, la sortie du RE est r´egul´ee par le syst`eme de contrˆole qualit´edu RE qui pr´evient la s´ecr´etion des prot´eines mal repli´ees [51]. Les prot´eines de conformations incorrectes produites dans le RE sont pas transport´ees le long de la voie s´ecr´etrice, mais sont retenues dans le RE o`uelles sont soit prises en charge par les chaperonnes pour acqu´erir une conformation correcte, soit dirig´ees vers l’ERAD (Endoplasmic Reticulum Associated Protein Degradation) [51]. Les prot´eines mal repli´ees ou non assembl´ees sont reconnues par ces chaperonnes. Elles sont en- suite retransloqu´ees dans le cytoplasme, d´eglycosyl´ees et polyubiquitinyl´ees avant d’ˆetre d´egrad´ees par le prot´easome. Il arrive qu’un certain nombre de prot´eines d´eficientes arrivent `apasser tous les contrˆoles pr´ec´edents et se retrouvent au niveau de la membrane plasmique. A ce niveau l`a, ces prot´eines (ainsi que les autres prot´eines devenues d´eficientes ou obsol`etes) sont d´egrad´ees majoritairement par la voie lysosomale. Il existe quatre diff´erents types d’acheminement, vers les lysosomes, des mol´ecules `ad´egrader : l’endocytose, la pi- nocytose, la phagocytose et l’autophagie.

Le terme lysosome (du grec lusis ”s´eparer” et soma ”corps”) ´evoque la grande quan- tit´ed’enzymes de lyse contenues dans cet organite. Les lysosomes sont des organites cellulaires de 0,2 `a0,5 microns form´es dans l’appareil de Golgi et pr´esents dans le cy-

43 tosol. L’activit´edu lysosome a un rˆole majeur lors de l’h´et´erophagique (d´ecomposition des corps ´etrangers), lors de l’autophagique (d´egradation d’une partie du cytoplasme par ses propres lysosomes), lors des remaniements tissulaires (activit´eprincipale au niveau des reins avec la suppression progressive des ´ebauches), lors de la d´etoxication (activit´eprincipale au niveau du foie avec le stockage des sels biliaires nocifs pour la cellule) et enfin lors de la r´egulation de la s´ecr´etion hormonale de la cellule. Cet organite ne contient pas seulement des prot´eases, il pr´esente aussi abondamment des lipases, des glycolipases, des nucl´eases, des phosphatases, des sulphatases, des phospholipases, c’est un v´eritable organite de digestion de macromol´ecules endog`enes ou exog`enes. Les enzymes lysosomales (cathepsines, ...) sont d´ependantes de l’acidit´edu milieu car elles sont actives `apH5 (lysosome), mais inactives `apH7,2 (cytosol). L’acidit´edes lyso- somes est due `ala pr´esence d’une pompe `aproton (H+/ATPase), qui cr´ee un gradient de protons entre les lysosomes et le cytosol.

La voie ubiquitine-prot´easome

Le syst`eme prot´easome est utilis´eaussi bien par les arch´ees, que par les levures, les plantes ou les animaux. Le syst`eme principal d’adressage des prot´eines au prot´easome est appel´e”syst`eme ubiquitine”. Ce type d’adressage n’est utilis´eque par les eucaryotes [52]. La voie prot´eolytique utilisant l’ubiquitine et le prot´easome fonctionne en deux grandes ´etapes : dans un premier temps, le substrat `ad´egrader est marqu´epar addition d’une chaˆıne de polyubiquitine; dans un deuxi`eme temps, le substrat polyubiquitinyl´eest reconnu et d´egrad´epar le prot´easome 26S. Il est `anoter que d’autres voies de signali- sation comme les signaux N-Ter ou des voies de signalisation ubiquitine-ind´ependante existent et permettent l’adressage des prot´eines `ad´egrader.

L’ubiquitination : Cette voie de d´egradation utilise l’ubiquitine, un polypeptide de 76 amino-acides (poids

44 mol´eculaire 8,4kDa), pour marquer les prot´eines `ad´egrader [53]. Ce marquage se fait par l’attachement covalent de l’ubiquitine `aun r´esidu lysine du substrat, par une cas- cade enzymatique n´ecessitant l’action de trois enzymes, appel´ees E1, E2 et E3. A ce jour chez l’Homme un seul g`ene a ´et´eidentifi´epour E1 (ubiquitin activating enzyme), plusieurs pour E2 (ubiquitin-carrier protein) et `apeu pr`es 300 pour E3 (ubiquitin- protein ligase). Dans la plupart des cas, E3 se comporte comme un r´ecepteur, qui s´electionne et pr´esente `aE2 la prot´eine `ad´etruire. Les nombreuses formes d’E3 ont chacune une affinit´esp´ecifique pour une gamme de prot´eines. La proc´edure d’ubiquiti- nation est la suivante : d’abord, en pr´esence d’ATP l’ubiquitine r´eagit avec E1, formant ainsi un thiolester entre sa glycine C-terminale et un r´esidu cyst´eine d’E1. L’ubiquitine est ensuite transf´er´ee sur E2, r´ealisant une liaison instable avec une cyst´eine. Enfin, l’ubiquitine est transf´er´ee sur une lysine du substrat par E3. Cette r´eaction de conju- gaison de l’ubiquitine a lieu plusieurs fois, l’ubiquitine ´etant conjugu´ee `aelle-mˆeme (au niveau de la lysine 48), ce qui se traduit par l’addition sur le substrat d’une chaˆıne d’ubiquitines qui sert de signal de d´egradation (une chaine doit ˆetre compos´ee d’au moins quatre mol´ecules pour ˆetre reconnue comme un signal).

Le prot´easome 26S : Les prot´eines ubiquitin´ees sont ensuite reconnues par le prot´easome, grand complexe qui poss`ede une activit´eendopeptidasique. Le terme ”prot´easome” a ´et´eforg´epar analogie avec le terme ribosome qui est l’organite responsable de la fonction inverse (production de prot´eine), avec lequel il rivalise en taille. Ce complexe, vital pour les cellules, est form´epar le prot´easome 20S qui constitue son cœur prot´eolytique et deux mol´ecules de PA700 (ou complexe r´egulateur 19S), qui s’associent aux extr´emit´es du prot´easome 20S [54]. Cette association est ATP d´ependante. Le prot´easome 26S d´egrade les prot´eines ubiquitinyl´ees en petits peptides de 3 `a24 r´esidus.

Le prot´easome 20S : Le prot´easome 20S compose le cœur peptidasique du prot´easome, c’est un cylindre

45 creux form´ede 4 anneaux heptam´eriques. Chaque anneau est constitu´ede sous-unit´es de petite taille alpha ou beta (20 `a35kDa). Le complexe mol´eculaire est compos´ede 28 sous-unit´es : chacun des deux anneaux externes ´etant constitu´epar sept sous-unit´es ”alpha” et chacun des deux anneaux internes par sept sous-unit´es ”beta” [55]. Chez les eucaryotes les sept unit´es alpha et beta sont diff´erentes. Plusieurs activit´es pepti- dasiques ont ´et´eidentifi´ees `al’aide de substrats peptidiques pour le prot´easome 20S [55]. Avec une activit´epeptidasique ciblant un site pr´ecis de coupure apr`es des r´esidus acides pour beta 1 (caspase-like [ ?], apr`es des r´esidus basiques pour beta 2 (trypsin- like [ ?] et apr`es des r´esidus hydrophobes pour beta 5 (chymotrypsin-like [ ?], l’ensemble permet la d´egradation d’une large gamme de prot´eines.

Le complexe 19S (PA700) : PA700 comprend 20 composants prot´eiques au minimum [56], appel´es Rpn’s et Rpt’s (Rpt est l’acronyme de Regulatory Particle ATPase, Rpn est l’acronyme de Regulatory Particle Non-ATPase )[57][58]. Il est divis´een deux parties : – La base qui s’associe `ala particule 20S et qui est constitu´ee de triple A ATPases (ATPase Associated with various Cellular Activities ou AAA+ [59][60]) et de non-ATPases. – Le couvercle qui est compos´ede non-ATPases. Ce ”chapeau” plus flexible sert de couvercle `al’entr´ee dans le site catalytique [61]. L’unit´er´egulatrice PA700 a quatre rˆoles : dans un premier temps, elle fixe le substrat ubiquitin´e(r´ecepteur) ; puis elle d´e-ubiquitine la prot´eine par l’action d’une isopepti- dase (les ubiquitines sont recycl´ees); ensuite elle facilite le d´epliage et la translocation vers le cœur du prot´easome de la chaˆıne polypeptidique par son activit´eATPasique ; et enfin elle active le prot´easome par ouverture du pore form´e par les sept sous-unit´es alpha. Ainsi la fixation d’une unit´er´egulatrice au complexe 20S permet l’acc`es `ala chambre catalytique. Par ce m´ecanisme, la cellule est capable de limiter la d´egradation prot´eique non s´elective.

46 5.2.2 Les principaux acteurs bact´eriens

Chez les bact´eries, il existe plusieurs classes de prot´eases ATP-d´ependantes. Ces prot´eases incluent : le syst`eme ClpAP, le syst`eme ClpXP, la prot´ease ClpYQ qui s’ap- parente au syst`eme prot´easome par son mode de clivage [62]. Le syst`eme Clp est form´epar l’agencement de deux anneaux heptam´eriques (ClpP), similaire au prot´easome 20S. Le complexe prot´eolytique par lui-mˆeme a une activit´e peptidasique limit´ee et a besoin pour d´egrader des prot´eines natives d’interagir avec une autre machinerie capable de reconnaˆıtre les prot´eines, de les d´eplier afin qu’elles soient accessibles aux sites catalytiques. Ces machines se pr´esentent sous forme de complexes ATPasiques (ClpA, ClpX) qui s’associent aux complexes prot´eolytiques afin de r´eguler leur activit´e(comparable au prot´easome 19S). Les domaines ou sous-unit´es ATPasiques sont les r´egulateurs de l’activit´eprot´eolytique portant des activit´es de type chaperonne mol´eculaire. Elles appartiennent `ala famille de triple A ATPases (AAA+) qui utilisent l’´energie de l’ATP pour r´ealiser des fonctions de d´epliement et de d´esassemblage ([63]. Tout comme le prot´easome, le syst`eme Clp doit ˆetre conjugu´e `aun syst`eme d’adressage des prot´eines. Chez les bact´eries, il en existe de plusieurs sortes, l’un d’eux est le syst`eme ssrA qui cible les polypeptides issus d’une traduction d´efectueuse. Les prot´eines d´efectueuses au niveau des ribosomes sont reconnues par les prot´eases grˆace `aune s´equence peptide ”AAANDENYALAA” dans leur r´egion C- terminale. Certains substrats n´ecessitent, pour leurs interactions avec les complexes AAA+, la pr´esence d’autres prot´eines nomm´ees prot´eines adaptatrices/chaperonnes [64]. Les prot´eines adaptatrices forment une nouvelle classe de prot´eines qui ont pour fonction de moduler la liaison du substrat `ala prot´eine AAA+, mais elles sont capables aussi de moduler l’activit´edes prot´eines AAA+. Les mieux caract´eris´es sont les prot´eines adaptatrices du syst`eme Clp : ClpS, RssB, SspB, UmuD, MecA. Les prot´eines adaptatrices sont des prot´eines de faible poids mol´eculaire, qui interagissent directement avec le domaine N-terminal des AAA+. La plupart des substrats du syst`eme Clp (par comparaison au syst`eme prot´easome)

47 sont des prot´eines clefs impliqu´ees dans les processus r´egulateurs dans la cellule. Le rˆole du syst`eme prot´eolytique Clp est de r´eajuster la composition du prot´eome [55].

5.2.3 Les principaux acteurs arch´eens

Les arch´ees poss`edent un syst`eme prot´easome [ ?] similaire `acelui eucaryote, mais simplifi´e[65]. Ils sont de structure similaire : 4 anneaux form´es de sous-unit´es α et β. La diff´erence de complexit´ese trouve dans la vari´et´ede ces sous-unit´es. Comme vu pr´ec´edemment, le prot´easome eucaryote poss`ede 7 types de sous-unit´es α et 7 de type β. Par contre, la majorit´edes arch´ees dispose d’un prot´easome 20S form´ede seulement 2 sous-unit´es diff´erentes (une de type α et une de type β). Quelques arch´ees poss`edent 3 `a4 sous-unit´es diff´erentes. Par exemple, Haloferax volcanii poss`ede 2 sous- unit´es α diff´erentes et 1 β ; Haloarcula marismortui poss`ede 2 α et 2 β ; Pyrococcus horikoshii poss`ede 1 α et 2 β. Tout comme le syst`eme eucaryote, le syst`eme prot´easome arch´een n´ecessite un syst`eme d’adressage et de ciblage. Le Rˆole du complexe 19S est rempli par le syst`eme PAN (Proteasome Activating Nucleotidase)[66]. Cette prot´eine pr´esente de fortes homologies (autour de 40%) avec les sous-unit´es AT- Pasiques du prot´easome eucaryote (rpt). PAN forme un complexe oligom´erique de haut poids mol´eculaire (550 - 650Kda) sous forme d’anneaux hexam´eriques.[66]. On peut no- ter que seules les arch´ees halophiles et les m´ethanosarcinac´ees poss`edent deux PANs et que certaines arch´ees comme les familles thermoplasmales et les ferroplasmales ne poss`edent pas de s´equences codant pour la prot´eine PAN (ce syst`eme n’est donc pas uni- versel dans le monde des arch´ees et est remplac´epar une prot´eine homologue nomm´ee VAT)[67]. PAN peut jouer diff´erents rˆoles [68] : un rˆole de chaperonne mol´eculaire (permet le repliement de certaines prot´eines), un rˆole d’adressage des prot´eines au prot´easome (d´epliement des prot´eines `ad´egrader) et un rˆole de r´egulation de l’activit´edu prot´easome (contrˆole de l’ouverture / fermeture du pore d’entr´ee) [69] [68] [70]. Pour l’instant au- cune interaction stable entre PAN est le prot´easome n’a ´et´e d´emontr´ee. Il a par contre

48 ´et´epropos´e, via des ´etudes biochimiques, que le complexe PAN lie le prot´easome via son domaine C-terminal [71].

L’ubiquitination n’existe pas chez les arch´ees et aucun m´ecanisme ´equivalent n’a ´et´e d´emontr´e`ace jour. Des prot´eines homologues `al’ubiquitine existent chez les arch´ees, mais celles-ci sont peu conserv´ees et sont encore mal comprises. Le rˆole d’adressage chez les arch´ees pourrait ˆetre endoss´epar le syst`eme SAMP (Pour Small Archaeal Modifier Proteins) [72]. R´ecemment, il a ´et´emontr´ein vivo chez Haloferax volcanii que deux homologues de l’ubiquitine, SAMP1 et SAMP2, forment des complexes avec des prot´eines susceptibles d’ˆetre `ad´egrader [72]. Ces SAMPs sont de petites prot´eines (autour de 20kDA) qui pr´esentent peu d’homologie de s´equence avec l’ubiquitine, sauf un motif C-terminal conserv´e(le motif est : glycine-glycine). Ces 2 SAMPs peuvent faire une liaison isopep- tidique (liaison peptidique qui ne se trouve pas dans la chaine principale de la prot´eine) avec les r´esidus lysine d’une prot´eine cible. On parle alors de SAMPylation. Ce produit final (prot´eine cible +SAMP) pourrait ˆetre une voie d’adressage `ala prot´eolyse ana- logue `al’ubiquitination. Toutefois, un lien direct entre la d´egradation par le prot´easome et la SAMPylation n’a pas encore ´et´e´etabli. Un r´ecapitulatif des rˆoles de la prot´eolyse cytoplasmique, ainsi que la position des acteurs principaux de cette prot´eolyse est repr´esent´esut la figure 5.1.

49 Figure 5.1 – Sch´ema r´ecapitulatif des diff´erents rˆoles de la prot´eolyse cyto- plasmique chez les arch´ees et position du syst`eme PAN-prot´easome. Apr`es leurs productions par l’appareil traductionnel, certaines prot´eines anormales (due `a des mutations ou a des erreurs de traduction) Vont ˆetre prise en charge par le syst`eme contrˆole qualit´e(en rouge) afin d’ˆetre d´egrad´ees ou r´epar´ees. Le contrˆole qualit´ein- tervient aussi sur des prot´eines native ayant subit des d´egradations lors de stress. Les deux autres rˆole de la prot´eolyse sont la r´egulation de la demi-vie des prot´eines(en bleu) et la destruction de prot´eines inutiles par autophagie pour le m´etabolisme (en vert). Le syst`eme principal et le syst`eme prot´easome compos´ed’un complexe AAA ATPase (PAN ou VAT chez les arch´ees) et du complexe endo-peptidasique (prot´easome 20S). Ce syst`eme d´egrade les prot´eines qui lui sont adress´ees en petits peptides qui vont ˆetre `aleur tour d´egrad´een acide amin´epar des peptidases.

50 Chapitre 6

L’aminopeptidase TET

6.1 Les aminopeptidases

En plus du syst`eme prot´easome, il existe de nombreuses voies alternatives de d´egradation des prot´eines, telle que la prot´ease Lon, qui se trouve dans les bact´eries, les arch´ees [73] [74] et les mitochondries. Il est important de noter que toutes ces machines prot´eolytiques ne sont pas en mesure d’achever le processus de d´egradation, c’est-`a-dire de d´egrader des prot´eines en acides amin´es simples. Ils g´en`erent tous un pool d’oligopeptides de longueurs diff´erentes qui ont besoin d’un traitement ult´erieur par des peptidases, afin de g´en´erer des acides amin´es.

Les substrats des aminopeptidases sont des peptides qui proviennent de l’environ- nement extracellulaire ou qui sont produits par la d´egradation des prot´eines par des machineries ATP d´ependantes telles que le prot´easome. De plus, l’´elimination des r´esidus terminaux des chaˆınes polypeptidiques par les ami- nopeptidases est n´ecessaire pour r´ealiser une large gamme de fonctions biologiques [75]. Dans certains cas, les prot´eines peuvent ˆetre soumises `ades modifications N- terminale ou C-terminale. Ces modifications vont permettre la maturation ou l’activa- tion la prot´eine ou de contrˆoler la demi-vie de la prot´eine dans les cellules. Les aminopeptidases peuvent donc jouer un rˆole essentiel pour les fonctions d’en-

51 tretien et de m´enage tels que le renouvellement des prot´eines ou l’hom´eostasie des acides amin´es, ainsi que pour le contrˆole de processus cellulaires telle que la prot´eolyse sp´ecifique.

Une large gamme de s´equences d’aminopeptidase est pr´esente dans le g´enome des arch´ees [76], dont la majorit´esont m´etallo-d´ependantes. On les classe en deux sous- types, chacun ayant ses sp´ecificit´es : – Les amino-peptidases de type N : exopeptidases capable de d´egrader les oligo- peptides (de 2 `a20 acides amin´es, avec une activit´epr´ef´erentielle pour la lysine, la leucine et l’arginine). – Les amino-peptidases de type C : exopeptidases qui ont une activit´eoptimum pour des peptides d’une taille inf´erieure `a4 acides amin´es.

Le premier complexe peptidasique, identifi´epour r´ealiser la d´egradation en acides amin´es des oligopeptides produits par le prot´easome, est le complexe Tricorne. La prot´ease Tricorne (TRI) est un complexe hexam´erique de 720 kDa d´ecouvert chez Thermoplasma acidophilum. TRI est capable de dig´erer les peptides produits par le prot´easome en tri- ou dipeptides, qui sont `aleur tour d´egrad´es de fa¸con s´equentielle par de petites aminopeptidases associ´ees `aTRI, nomm´ees Tricorn Interacting Factors F1, F2 et F3 [77]. Le complexe TRI est seulement pr´esent dans les g´enomes de certains procaryotes et l’alignement des s´equences primaires ne r´ev`ele aucun homologue dans le r`egne eucaryote. Il existe donc surement d’autres grands complexes capables de r´ealiser cette fonction.

6.2 La prot´eine TET

En plus du complexe TRI, un autre complexe peptidasique d’arch´ee a ´et´ed´ecrit. Ce complexe oligom´erique de type inconnu a ´et´ed´ecouvert chez l’arch´ee Haloarcula

52 marismortui (d´ecouverte r´ealis´edans notre laboratoire) [78]. Cette prot´ease appartient `ala famille peptidase M42 (classification MEROPS) et a ´et´e nomm´eAminopeptidase t´etra´edriques (TET) , en r´ef´erence `ala peptidase TRI et en raison de sa structure tridimensionnelle particuli`ere en forme de t´etra`edre. Le complexe prot´eique a donc une forme de t´etra`edre (voir figures 6.1) dont l’arrˆete fait 150 A˚ environ. Cette prot´ease g´eante est un complexe prot´eique auto-compartiment´e de 12 sous-unit´es identiques, avec une activit´eaminopeptidase `alarge sp´ecificit´ede substrat et pouvant traiter des peptides d’une longueur de 20 acides amin´es[78].

Figure 6.1 – Structure de l’enveloppe du complexe TET de l’arch´ee halo- phile H.marismortui , l’enveloppe a ´et´ed´etermin´ee par microscopie ´electronique, la particule est vue sous ses 3 axes de sym´etrie (d’apr`es Franzetti et al 2002 [78]).

L’alignement de s´equences primaires a r´ev´el´ela pr´esence de TET chez la majorit´e des arch´ees et chez diff´erentes esp`eces bact´eriennes. Notre ´equipe a d´etermin´eles struc- tures et l’enzymologie de 3 diff´erentes prot´eines TET de l’arch´ee hyper-thermophile Py- rococcus horikoshii . Ce travail montre que ces complexes poss`edent des activit´es amino- peptidases compl´ementaires avec une sp´ecificit´ede substrats diff´erentes, qui leur per- mettent de d´egrader compl`etement tout type de polypeptide `apartir de leur extr´emit´e N-terminale. La peptidase TET1 de Pyrococcus horikoshii (nomm´ePhTET1) a ´et´e particuli`erement bien d´ecrite [79] [80] [81]. Cette peptidase d’organisme hyper-thermophile a une activit´eamino-peptidasique optimale `a90˚C, avec un pH autour de 7,4 et en pr´esence du cofacteur m´etallique co- balt. La structure de la peptidase PhTET1 a ´et´er´ealis´ee par cristallographie au rayon X et a permis d’observer deux ions cobalt par site catalytique (ce m´etal ´etait pr´esent `aforte

53 proportion dans les solutions de cristallisation). Le monom`ere PhTET1 contient 332 r´esidus et a un poids mol´eculaire d’environ 37 kDa. Les dim`eres de PhTET1 peuvent s’assembler en deux diff´erentes structures quaternaires : un t´etra`edre dod´ecam´erique et un octa`edre t´etracosam´erique, ces deux formes ont pu ˆetre observ´ees par microscopie ´electronique (voir figure 6.2) [79]. Il est `anoter que ces deux types de formes n’ont ´et´eobserv´ees que pour PhTET1 et non pour la TET de Haloarcula marismortui et les autres TET de Pyrococcus horikoshii , en effet pour ces autres TET seule la forme `a12 sous-unit´es a ´et´eobserv´ee.

Cette capacit´ed’assemblage sous deux formes quaternaires avait d´ej`a´et´eidentifi´ee auparavant pour des capsides virales et est rendu possible grˆace `ades interactions quasi-´equivalentes entre les sous-unit´es prot´eiques(voir figure 6.3) [79]. Pour passer de la structure du dim`ere de la forme 12ss `acelle de la forme 24ss, une simple inclinaison de 14˚entre les deux monom`ere est n´ecessaire. Ces rotations ont des cons´equences sur les structures quaternaires des complexes. Cette modification change la g´eom´etrie de la particule, pour le complexe quaternaire `a12ss chaque sommet du t´etra`edre est constitu´ede 3 sous-unit´es, pour le complexe quaternaire `a24ss chaque ”pointe” du octa`edre est constitu´ede 4 sous-unit´es. A cause des g´eom´etries particuli`eres adapt´ees par ces deux types de complexes quaternaires, les r´eseaux de cavit´es internes ont des tailles diff´erentes, ´etant de taille plus importante pour les complexes `a24ss [79]. Le complexe `a24 sous-unit´es ´etant pr´esent que pour une des TET de Pyrococcus horikoshii, nous ne focaliseront pas sur sa description.

L’organisation interne des particules PhTET1 `a12ss r´ev`ele une auto-compartimentation permettant la formation de r´eseaux de canaux amenant `ade vastes chambres cataly- tiques (voir figure 6.4).

L’examen du r´eseau interne du complexe 12ss r´ev`ele une compartimentation com- plexe de PhTET1. Les quatre grandes ouvertures situ´ees dans chaque face du t´etra`edre

54 Figure 6.2 – Microscopie ´electronique de PhTET1. A. Image obtenue par mi- croscopie ´electronique `acoloration n´egative de PhTET1 montrant les deux structures de phTET1. [79] B. Vues sch´ematiques d’un t´etra`edre et d’un octa`edre inscrits dans un cube. C. A gauche, reconstruction tridimensionnelle de la structure de PhTET1 de 12 sous-unit´es `a14 Ade˚ r´esolution. A droite, reconstruction tridimensionnelle de la structure de PhTET1 24 sous-unit´es `a15 Ade˚ r´esolution. donnent acc`es `aquatre larges canaux qui se croisent au milieu de la particule. La di- mension des canaux est comparable `acelles trouv´ees dans d’autres grandes peptidases

55 Figure 6.3 – Structure du dim`ere dans les deux complexes (12ss et 24ss) de PhTET1 [79]. Une repr´esentation du dim`ere extrait du mod`ele t´etra´edrique de PhTET1 en bleu superpos´e`aun dim`ere extrait du mod`ele octa´edrique de PhTET1 en rouge. Les ions cobalt sont pr´esent´es comme des sph`eres. Pour visualiser le changement de forme permettant d’int´egrer les dim`eres dans chaque structure, les monom`eres en bas de chaque dim`ere ont ´et´esuperpos´es, afin de visualiser les d´eformations n´ecessaires du dim`ere pour passer d’une structure de 12ss `a24ss. B. Int´egration des deux structures dim´eriques de A. dans les deux complexes possible de PhTET1. cytosoliques. Le potentiel de surface ´electrostatique pr´esent dans les canaux sugg`ere que ces derniers sont impliqu´es dans la navigation et l’orientation du substrat pepti- dique vers les chambres catalytiques [79]. Quatre sous-compartiments en forme d’entonnoir sont ensuite pr´esents dans les som- mets du complexe, c’est `ace niveau que sont situ´ees les chambres catalytiques conte- nant chacune trois sites actifs. Dans le cas de PhTET1, les chambres catalytiques sont charg´ees positivement `al’exception des sites actifs. En raison de la r´epulsion

56 Figure 6.4 – Structures internes du complexe de PhTET1 `a12 sous-unit´es. [79] En haut , coupe de la structure quasi-atomique du complexe PhTET1 sous deux orientation diff´erentes. En bas , moulage des cavit´es du complexe `a12 sous-unit´es, l’orientation des structures correspond `ala mˆeme que celle des images d’en-dessus. Les fl`eches indiquent la position des sites catalytiques.

´electrostatique, une fois que le polypeptide p´en`etre dans la chambre catalytique, leurs r´esidus N-ter doivent ˆetre d´etourn´ees vers l’un des trois sites actifs [79]. Enfin, `al’extr´emit´ede ces quatre chambres catalytiques est pr´esente une ouverture vers l’ext´erieur, plus ´etroite que les ouvertures des faces du t´etra`edre. Ces pores pr´esents dans les sommets du t´etra´edre ne sont pas assez larges pour permettre le passage ais´e d’un peptide ´etendu. En cons´equence, ces orifices paraissent plus adapt´es pour l’expul-

57 sion des acides amin´es libres g´en´er´es par la r´eaction aminopeptidase [79]. Il en ressort un m´ecanisme pr´esomptif. Entr´ee et guidage de la chaine polypeptidique par un des 4 pores (20 Ade˚ diam`etre) situ´es dans une des faces du t´etra`edre. Puis, l’adressage par une boucle mobile de l’extr´emit´eN-ter vers une des 4 poches cata- lytiques est r´ealis´ee au niveau du croisement des 4 syst`emes de guidage. Entr´ee du peptide dans la chambre catalytique, puis clivage des acides amin´es N-ter par un des 3 sites actif de la poche. Enfin, l’expulsion des acides amin´es est r´ealis´ee par l’orifice situ´eaux pointes du t´etra`edre [79].

La place des complexes TET dans la prot´eolyse intracellulaire n’est pas encore connue. Le syst`eme TET pourrait jouer un rˆole homologue `acelui propos´epour la prot´ease Tricorne, c’est-`a-dire que TET pourrait fonctionner en aval du prot´easome pour ache- ver le travail de d´egradation des prot´eines. Mais ce n’est pas le seul rˆole potentiel pour cette prot´ease : de par son activit´epeptidase `alarge spectre, TET pourrait aussi jouer un rˆole important dans le m´etabolisme en permettant l’hydrolyse de peptides extracel- lulaires import´es par des transporteurs. De plus, l’activit´eamino-peptidase de TET pourrait ´egalement participer `ala maturation post-traductionnelle et `al’adressage de certaines classes de prot´eines. Enfin, l’analyse structurale des complexes TET ainsi que des exp´eriences de co-purification (r´ealis´ees au laboratoire) indiquent que TET pourrait interagir avec d’autres grands complexes r´egulateurs (complexe prot´easome, complexes de prot´eines chaperonnes, polysomes, ...) et ainsi constituer un nouveau syst`eme de d´egradation, destin´e`aremplir des fonctions similaires `acelles du prot´easome ou plus sp´ecialis´ees. Il est `anoter que l’organisme H.salinarum poss`ede seulement 1 g`ene pour la prot´eine TET et l’organisme H.volcanii en poss`ede quant `alui 2 diff´erents.

58 Chapitre 7

Objectifs de la th`ese

Les syst`emes mol´eculaires d´ecrits chez les arch´ees mettent en ´evidence une sim- plicit´e, comparativement `aleurs homologues eucaryotes. Par ailleurs, leur caract`ere extrˆemophile a pour cons´equence une hyper-robustesse qui rend leur manipulation in vitro et les ´etudes structurales beaucoup plus ais´ees. Ainsi les arch´ees repr´esentent de bons mod`eles pour comprendre les fonctions cellulaires complexes, particuli`erement celles qui mettent en jeu de grandes machineries mol´eculaires, comme celles impliqu´ees dans la prot´eolyse.

Mon premier objectif de travail de th`ese a ´et´ede comprendre les m´ecanismes de r´esistance dans l’adaptation des arch´ees halophiles aux stress environnementaux Les arch´ees halophiles accumulent des concentrations multi-molaires de KCl/NaCl dans leur cytosol (3.4M KCl / 1.1M NaCl chez Halobacterium salinarum ). Cette situation suppose une biochimie tr`es particuli`ere qui autorise un fonctionnement dans des sol- vants o`ul’eau libre est rare. Ainsi, les prot´eines de ces organismes sont elles-mˆemes halophiles et ne sont solubles et repli´ees que dans des conditions de salinit´eextrˆemes (de 2 `a5M sel). Cette biochimie particuli`ere expliquerait en partie l’extraordinaire capacit´edes arch´ees halophiles `ar´esister aux stress physico-chimiques (temp´erature, radiations, d´eshydratation). Le mat´eriel d’´etude utilis´eest l’arch´ee halophile stricte Halobacterium salinarum .

59 Nous voulions ´etudier la r´eponse de cet organisme `ades stress de basse salinit´e. En effet, au-del`adu choc osmotique, la chute de la concentration saline dans le milieu provoque une baisse de la concentration en KCl intracellulaire (ref), ce qui doit avoir un effet direct sur l’´etat de repliement des prot´eines intracellulaires, comme lors d’un stress thermique. Tr`es peu de donn´ees sur la r´eponse des cellules halophiles extrˆemes `aune baisse de salinit´edans l’environnement ´etaient connues. Dans la premi`ere partie de cette th`ese, j’ai r´ealis´eune ´etude visant `ad´eterminer les limites de viabilit´eet les modifications cytosoliques associ´ees `aune baisse de sali- nit´e. Pour analyser le ph´enom`ene nous avons doser les modification de concentra- tion/accumulation du sel intracellulaire conjointement `a des mesures de viabilit´e. Nous avons avons aussi quantifier l’induction de prot´eines chaperonnes li´ees `ala r´eponse au stress. Enfin nous avons r´ealiser une ´etude importante de biophysique neutronique afin d’´evaluer l’effet du stress sur le repliement des prot´eines in vivo. Au cours de ce travail, il a ´et´emis en ´evidence un ph´enom`ene de survie `ala basse salinit´eassoci´e`ades modifications morphologiques. Pour d’´ecrire ce ph´enom`ene, une seconde ´etude `a´et´er´ealis´een prenant en compte les changement morphologique des cellules des cellules en survie, mais aussi les fluctuations de salinit´eintracellulaire , ainsi que une ´etude de la composition globale du prot´eome au cours de ces stress en condition de basse salinit´e. Il a ´et´emis en ´evidence lors d’un stress de basse salinit´e ”progressive” en plus de la survie d’une grande quantit´ede cellules, des changements morphologiques importants associ´es `aune chute de la concentration intracellulaire en K+, ainsi qu’une modification du prot´eome.

Le deuxi`eme objectif de mon travail de th`ese a consist´emettre en ´evidence l’impor- tance des syst`emes de prot´eolyse dans l’adaptation des arch´ees halophiles aux stress environnementaux. L’effet d’une faible concentration en sel provoque la d´enaturation des prot´eines halophiles, l’accumulation de prot´eines mal repli´ees dans le cytoplasme met `acontribution les syst`emes chaperons et la machinerie de prot´eolyse intracellu- laire. Dans ce contexte, une partie de mon travail de th`ese a ´et´ede contribuer `ala

60 compr´ehension du rˆole dans la prot´eolyse in vivo du syst`eme PAN-prot´easome, avec un accent sur la croissance, la r´eponse au stress et l’adaptation halophilique. L’autre partie de mon travail de th`ese sur la prot´eolyse `aconsist´e`aplacer le rˆole du complexe prot´easique TET d´ecouvert au laboratoire dans la physiologie des cellules procaryotes. Cette ´etude c’est d´eroul´esur deux arch´ees halophiles diff´erentes : Halobacterium salina- rum et Haloferax volcanii . Nous avons choisit de travailler sur ce deuxi`eme organisme car nous disposions pour celui-ci une souche mutante CN5 d´el´et´ed’un des g`enes TET. Ainsi nous avons ´etudi´es l’accumulation de la prot´eine TET lors de la croissance et lors de diff´erents stress (thermique/salin/nutritifs) chez Halobacterium salinarum et les diff´erences de ph´enotype entre la souche sauvage et la souche mutante CN5 chez Haloferax volcanii lors des diff´erents stress.

61 Deuxi`eme partie

D´etermination des m´ecanismes mol´eculaires permettant la survie de l’arch´ee halophile Halobacterium salinarum dans des conditions de basse salinit´e

62 Chapitre 8

Effet du sel sur la dynamique in vivo du prot´eome de Halobacterium salinarum

La capacit´ede d´eveloppement des micro-organismes dans leur environnement na- turel d´epend surtout de leurs capacit´es `asurmonter les effets d´el´et`eres de l’instabilit´e du repliement des prot´eines due aux facteurs physico-chimiques extrˆemes. A cette fin, les cellules emploient trois strat´egies diff´erentes `adivers degr´es : l’accumu- lation de solut´es compatibles pour stabiliser les diff´erents composants du cytoplasme (tr´ehalose, glutamate, b´eta¨ınes, ...) ; l’induction de machines mol´eculaires sp´ecialis´ees dans le contrˆole qualit´edes prot´eines (prot´eines chaperonnes et prot´eases); et la mo- dification structurelle de la prot´eine elle-mˆeme. Le dernier trait se fait par l’´evolution adaptative et est souvent favoris´ee chez les organismes extrˆemophiles, une classe de microorganisme qui n´ecessite des temp´eratures extrˆemes ou des conditions de sel pour vivre. Tous les processus adaptatifs ont en commun le fait qu’ils modifient le paysage ´energ´etique de dynamique mol´eculaire des prot´eines.

Dans ce projet, nous souhaitons voir l’influence des perturbations thermiques et salines de l’environnement sur la dynamique du prot´eome in vivo. Ces exp´eriences sont

63 r´ealis´ees sur l’organisme Halobacterium salinarum en conditions de stress mod´er´edirect (2,5M et 2,0M de NaCl extracellulaire), que nous comparons `a des stress thermiques. Nous avons choisis des conditions de stress thermiques qui ont un impact similaire sur la croissance des cellules que ceux observ´es lors des stress hyposalins `a2,5 et 2,0M ( soit respectivement 55˚C et 60˚C). Halobacterium salinarum (poussant dans des conditions salines optimales proches de 4.2M de NaCl) a adopt´eune strat´egie d’accumulation de sel pour contrebalancer la pression osmotique ´elev´ee, impos´ee par le milieu o`uil prosp`ere. En effet des mesures de spectrom´etrie de flamme (par ICP voir chapitre 15.2) nous ont permis de confirmer et de v´erifier dans nos conditions exp´erimentales la teneur en ions salins du cytoplasme : nous avons mesur´eune concentration en ion K + de 3,7M et en ion Na + de 1,1M Na + en condition de croissance optimale et en d´ebut de phase exponentielle. Pour mesurer la concentration en sel intracellulaire, des fractions de 1mL de culture sont culott´ees. Il est important de compter le nombre de cellules pr´esentes dans 1mL de culture, pour remonter `ala fin `ala concentration intracellulaire d’une cellule. Les cellules culott´ees sont lav´ees avec un tampon sans KCl, puis `anouveau culott´ees sur un coussin de dim´ethylphtalate. Ces deux ´etapes de lavage sont r´ealis´ees pour ´eviter de mesurer le sel du milieu environnant et ainsi ne mesurer que le sel intracellulaire. Le culot obtenu est ensuite transf´er´edans 10mL d’H 20 distill´ee, le choc osmotique devrait provoquer la lyse des cellules, mais nous effectuons quand mˆeme une s´erie de sonications pour achever compl`etement la lyse. Les ´echantillons sont ensuite utilis´es pour mesurer la concentration en sel grˆace `aun spectrom`etre de flamme, pr´ealablement calibr´eavec une gamme de solution en K + et Na +. Une fois la valeur de la concentration en sel obtenue, il est n´ecessaire de remonter les dilutions et ainsi obtenir une concentration en sel par cellule (mol/cellule). Pour obtenir la concentration molaire, une ´etude du volume moyen des cellules est n´ecessaire (en moyenne dans cette condition v = 2 , 5µm 3 , soit v = 2 , 5x10 −15 L).

Du fait de la forte concentration en sel intracellulaire, il est n´ecessaire que les

64 prot´eines cytosoliques soient adapt´ees pour rester solubles, stables et fonctionnelles lorsque l’activit´ede l’eau est faible et dans des milieux extrˆemement riches en ions qui normalement entravent les processus biologiques (voir chapitre 2.3). Dans ce contexte, il int´eressant d’utiliser la spectroscopie de neutrons afin d’´evaluer comment l’adaptation mol´eculaire des prot´eines halophiles, ainsi que la fluctuation de l’hypersalinit´edu milieu, affectent les propri´et´es de dynamique mol´eculaire du prot´eome halophile dans le contexte cellulaire.

8.1 Mesure de la dynamique mol´eculaire des prot´eines par diffusion de neutrons in vivo

8.1.1 La dynamique mol´eculaire des prot´eines

La dynamique mol´eculaire est la mesure des mouvements atomiques au cours du temps. Chaque atome d’une mol´ecule est consid´er´ecomme une masse ponctuelle dont le mou- vement est d´etermin´epar l’ensemble des forces exerc´ees sur lui par les autres atomes en fonction du temps. Une grande vari´et´ede mouvements peuvent animer les macromol´ecules biologiques, ren- dant ces syst`emes dynamiques [82]. Ces mouvements s’´etalent sur des gammes de temps allant de la femto-seconde `ala seconde. Les mouvements possibles sont repr´esent´es sur la figure 8.1. En plus de ces mouvements mol´eculaires, il y a l’ensemble des liaisons faibles : les liaisons hydrog`enes, les interactions de Van der Waals, les interactions hydrophobes ou encore les interactions ´electrostatiques. Ce sont ces forces qui maintiennent la structure des prot´eines et qui conditionnent les mouvements mol´eculaires fondamentaux.

65 Figure 8.1 – Les ´echelles de temps des mouvements fondamentaux de dy- namique mol´eculaire des prot´eines. Image provenant de l’article de Zhong, D. 2007[82]

Notre int´erˆet se porte plus particuli`erement sur la dynamique mesur´ee dans des temps allant de la ps `ala ns, avec des amplitudes de fluctuation de l’ordre de l’Ang- str¨om. Cette gamme correspond `al’´etude des forces de coh´esion de la structure des prot´eines et permet ainsi de d´eterminer si la prot´eine est plutˆot ”dure” ou plutˆot ”mol- le”.

Au cours de cette th`ese, nous ne nous sommes pas int´eress´e`a l’´etude de la dyna- mique d’une prot´eine isol´ee, mais de l’ensemble du prot´eome d’Halobact´erium. En effet dans les ´etudes in vivo, nous pouvons voir l’influence de l’environnement cellulaire sur le fonctionnement des macromol´ecules (cet environnement est souvent n´eglig´e`atort dans les ´etudes biochimiques et biophysiques des macromol´ecules). La dynamique mol´eculaire d’une prot´eine est aussi sensible `al’environnement de la prot´eine qu’`asa structure. En effet, une prot´eine peut ˆetre inactive dans un environ- nement dans lequel elle est parfaitement stable. Donc la dynamique mol´eculaire d’une prot´eine dans le cytosol pourrait ˆetre tr`es diff´erente de celle mesur´ee dans des conditions

66 in vitro [83]. De plus, par la nature mˆeme des forces de stabilisation de sa structure tertiaire, la dynamique des prot´eines ne peut pas ˆetre ´etudi´ee sans prendre en compte l’influence du solvant physiologique et du cytosol [84]. A savoir le cytosol est un envi- ronnement encombr´e, avec des compartiments sub-cellulaire (o`uil y a co-localisation des prot´eines impliqu´ees dans la mˆeme fonction). Cet environnement va compl`etement influencer la stabilisation des prot´eines, par les interactions avec leurs partenaires, des substrats, co-facteurs, ainsi que par les actions de solut´es compatibles ou de mol´ecules chaperonnes. En effet, les macromol´ecules biologiques sont fonctionnelles `al’int´erieur des cellules o`u l’environnement est fortement encombr´epar d’autres macromol´ecules et constituants cellulaires [85] (avec une concentration en macromol´ecules comprise entre 300 et 600 mg/ml [86] [87]). Le tout formant de grands complexes et r´eseaux ayant des interactions sp´ecifiques et non sp´ecifiques entre eux (figure 8.2).

Figure 8.2 – Repr´esentation du degr´ed’encombrement dans le cytoplasme d’ E.coli . Source : Goodsell 1993. La membrane en vert est accompagn´ee d’un flagelle, le cytoplasme est repr´esent´ee en bleu violet et la partie g´enomique en jaune orang´e

67 L’influence de l’encombrement mol´eculaire provoquant des interactions non sp´ecifiques peut ˆetre mim´e, in vitro, par l’ajout d’agent d’encombrement `aune solution de prot´eines purifi´ees, par contre l’encombrement mol´eculaire provoquant des interactions sp´ecifiques ne peut pas ˆetre reproduit et est pour l’instant peu ´etudi´e. Cet encombrement mol´eculaire sp´ecifique donne lieu `adeux effets contraires : d’un cot´e, il favorise l’association des macromol´ecules entre elles (permettant d’augmenter d’un facteur 2 ou 3 certaines constantes d’´equilibre de r´eaction chimique, en diminuant l’´energie libre du milieu) et d’un autre cot´e, il r´eduit les coefficients de diffusion des mol´ecules (d’un facteur pouvant allez jusqu’`a10 pour certaines mol´ecules)[85] [88]. Ces perturbations ne doivent pas ˆetre n´eglig´ees dans l’´etude des processus biochimiques et dynamiques des macromol´ecules. La pr´esence des solut´es compatibles peut influencer la stabilit´eet la solubilit´edes prot´eines. En effet, l’ajout d’osmolytes in vitro, peut pr´evenir de la perte d’activit´e des enzymes. De plus pour de nombreuses prot´eines, ces compos´es peuvent inhiber l’agr´egation et la d´enaturation thermique et chimique des prot´eines. De plus, les os- molytes peuvent induire la formation de structures secondaires, stabilisant des formes pr´e-repli´ees qui permettraient ensuite une acc´el´eration du processus de repliement. Cela sugg`ere que les osmolytes n’ont pas un rˆole uniquement dans le m´etabolisme, mais exercent ´egalement d’importantes fonctions physiologiques in vivo, en maintenant l’activit´eenzymatique et en stabilisant les structures des prot´eines [89]. Des ´etudes de dynamique mol´eculaire sur des prot´eines en pr´esence de solut´es compatibles a ´et´er´ealis´e par RMN et ont montr´eque l’interaction d’une prot´eine avec des solut´es compatibles permettait d’augmenter la stabilit´ede la prot´eine, jusqu’`aun retour `asa stabilit´enor- male, en pr´esence d’agent d´enaturant [90].

Acc´eder aux param`etres de dynamique mol´eculaire moyens de l’ensemble du prot´eome cellulaire dans un micro-organisme vivant devient un atout majeur pour comprendre la dynamique r´eelle des prot´eines dans un contexte biologique. Aujourd’hui, l’´etude de la dynamique mol´eculaire au sein de cellules vivantes, appel´ee

68 par la suite ”dynamique intracellulaire”, constitue une ´etape clef dans la compr´ehension du fonctionnement des syst`emes vivants. La spectrom´etrie neutronique est bien adapt´ee `al’´etude de la dynamique du prot´eome, par le fait que la longueur d’onde et l’´energie du neutron correspond parfaitement aux ´echelles des fluctuations ( de l’ordre de l’ A)˚ et de temps (de l’ordre de la pico- `ala nano-seconde) de la dynamique des macromol´ecules.

8.1.2 La technique de diffusion de neutrons pour des analyses de dynamiques mol´eculaires d’´echantillons biologiques

La diffusion incoh´erente de neutrons est une technique exp´erimentale de choix, non l´etale, pour ´etudier la dynamique mol´eculaire au sein de syst`emes biologiques [91]. La technique est sensible aux mouvements des atomes d’hydrog`ene, qui repr´esentent pr`es de la moiti´edes atomes pr´esents dans les structures biologiques et qui sont r´epartis uniform´ement au sein des structures. Les gammes de temps et d’´echelles de longueur utilis´ees, accessibles par la diffusion de neutrons, retracent les mouvements des atomes d’hydrog`ene qui sont corr´el´es aux mouvements des groupements chimiques auxquels ils sont li´es, comme par exemple les chaˆınes lat´erales des acides amin´es.

Les cultures cellulaires d’ H.salinarum sont culott´ees, lav´ees, puis transf´er´ees dans un porte ´echantillon en aluminium plaqu´eor (figure 8.3). L’aluminium ne diffuse et n’absorbe quasiment pas en pr´esence de neutrons et l’or permet d’´eviter d’avoir des interactions ou des r´eactions chimiques entre l’´echantillon et l’aluminium.

69 Figure 8.3 – Porte ´echantillon et culot de Halobact´erium pour les ´etudes de diffusion de neutrons : le culot d’arch´ees de couleur rouge du fait de la pr´esence de pigment carot´eno¨ıde est plac´eau centre du porte ´echantillon (le couvercle n’apparait pas sur la photo), un joint d’indium (position pr´esent´ee par la fl`eche noire) permet de rendre le porte ´echantillon ´etanche apr`es vissage du couvercle qui permet de fixer un volume et une ´epaisseur fixe (0,3mm) `al’´echantillon.

Nous d´eposons le mat´eriel cellulaire de telle sorte que tout le volume, entre la base du porte ´echantillon et le couvercle, soit rempli par 0.540 mg de culot pour un couvercle laissant 0.3mm d’´epaisseur possible pour l’´echantillon. Ensuite le porte ´echantillon est ferm´e(l’indium sert de joint) et sell´e(avec des vis en aluminium). Le porte ´echantillon doit ˆetre compl`etement ´etanche, car lors de la mesure (qui dure en moyenne 20h) il sera dans une chambre de mesure sous vide. Nous v´erifions la viabilit´ede nos cellules avant et apr`es la mesure sur l’instrument afin de v´erifier qu’aucun biais n’a affect´el’int´egrit´e de nos cellules, comme par exemple la pr´esence du vide dans le porte ´echantillon (du fait d’un mauvais montage ou d’une mauvaise ´etanch´eit´edu joint). Nous r´ealisons les mesures de diffusion, `al’Institut Laue-Langevin (ILL) de Grenoble, sur la ligne IN13 (photo de l’appareil de mesure 8.4).

70 Figure 8.4 – Photo de l’instrument IN13 de l’ILL

L’´echantillon est expos´eau faisceau de neutrons pendant 20h (3h de mesure pour chaque temp´erature au minimum). Les neutrons sont diffus´es par les noyaux atomiques de l’´echantillon et la mesure de cette diffusion fournit des informations sur la vitesse et l’´energie des mouvements de ces atomes. Le principe de mesure de l’instrument IN13 est d´ecrit par la figure 8.5. En r´esum´e, les exp´eriences de spectroscopie neutronique de l’instrument IN13 reposent sur la mesure de changement de direction des neutrons du faisceau, suite `aleur interaction avec les hydrog`enes de l’´echantillon. Des d´etecteurs sont plac´es autour de l’´echantillon et permettent de compter les neutrons en fonction de leur angle de diffusion (voir figure 8.6).

71 Figure 8.5 – Principe du spectrom`etre `ar´etrodiffusion IN13 de l’ILL. (Image et texte tir´es de ”Bioneutronique : la diffusion de neutrons pour l’´etude de la dynamique des prot´eines.” Par Marion JASNIN [91])Dans le cas d’une exp´erience de diffusion ´elastique, le faisceau de neutron est envoy´esur un monochromateur qui s´electionne la longueur d’onde incidente. Un d´eflecteur en graphite focalise ensuite le faisceau monochromatique sur l’´echantillon. Les neutrons diffus´es par l’´echantillon sont analys´es par des cristaux analyseurs. Ceux-ci s´electionnent ceux qui ont conserv´eleur ´energie et les r´etrodiffusent avec des angles de diffraction de 90˚. Les neutrons sont finalement d´etect´es par un jeu de 32 d´etecteurs `a3He.

Figure 8.6 – Sch´ema simplifi´edu processus de diffusion d’un neutron. Image provenant du site web de la soci´et´efran¸caise de neutron

La gamme de vecteur de diffusion ( Q) ainsi que la r´esolution en ´energie de l’exp´erience vont d´efinir les ´echelles de temps et de longueur des mouvements atomiques obser-

72 vables. La r´esolution en ´energie d´ependante de l’instrument d´efinit la limite inf´erieure des transferts d’´energie associ´es aux mouvements pouvant ˆetre observ´es. En choisis- sant convenablement ces valeurs, il est possible d’observer la dynamique interne d’une population de prot´eines in vivo. La r´esolution en ´energie utilis´ee sur cet instrument est de 8 µeV dans une gamme de vecteur de diffusion comprise entre 0.8 A˚−1 < Q <1.7 A˚−1. Cette gamme correspond aux mouvements atomiques dans des temps de l’ordre de 0.1 ns. Les exp´eriences sont bas´ees sur des ”scans de temp´erature ´elastique”, dans lesquels les neutrons sont diffus´es dans une fenˆetre d’´energie tr`es ´etroite, autour de l’´energie du faisceau incident. Cette diffusion est observ´ee en fonction de la temp´erature appliqu´ee `al’´echantillon. Ces mesures des donn´ees, une fois corrig´ees par les donn´ees d’intensit´e du porte-´echantillon vide, de diffusion du tampon (nous estimons que dans notre culot il y a environ 60% de tampon `asoustraire) et normalis´ees par la diffusion du vana- dium (contrˆole positif), permettent d’obtenir les valeurs de l’intensit´e´elastique totale I(Q, 0 ± ∆ω). Un exemple de donn´ees, d’un ´echantillon `adiff´erentes temp´eratures lnI (Q, 0 ± ∆ω) en fonction de Q 2 obtenue par de diffusion de neutrons, est pr´esent´edans la figure 8.7. La pente du logarithme n´ep´erien, mesur´epour les courbes lnI (Q, 0±∆ω) en fonction de Q 2 de chaque temp´erature sur la gamme 0.8 A˚−1 < Q <1.7 A˚−1, correspond au d´eplacement atomique carr´emoyen < u 2 > (MSD = Mean Square Displacement) [92]. L’´equation qui relie < u 2 > `a I est :

< u 2 > I(Q, 0 ± ∆ω) = cte.exp (− Q2) −−−−−−−−−−− (EQ 1) 6

La courbe ln I en fonction de Q 2 doit ˆetre une droite, ce n’est pas le cas exp´erimentalement sur toute la gamme de Q (voir figure 8.7), car ces donn´ees repr´esentent un syst`eme com- plexe et la moyenne < u 2 > est sur plusieurs populations de mouvement. L’´equation EQ1 est valable seulement pour des petites valeurs de Q par rapport `ala fluctuation

73 Figure 8.7 – Exemple d’une mesure de diffusion de neutrons `adiff´erentes temp´eratures de l’organisme e.coli . Les pointill´es d´elimites la zone o`ul’´equation EQ1 est valide. La zone ”a” correspond `ades mouvements lents de grandes amplitudes associ´es essentiellement `aune population d’hydrog`ene de l’eau. La zone ”b” correspond `ades mouvements plus rapides de plus petites amplitudes associ´es essentiellement `a une population d’hydrog`ene de macromol´ecule. La zone entre ”a” et ”b” peut ˆetre consid´er´ecomme un m´elange de ces populations, plus on se dirigera vers la zone ”a” plus on prendra en compte les mouvements des hydrog`enes de l’eau, plus on se diri- gera vers la zone ”b” plus on prendra en compte les mouvements des hydrog`enes des macromol´ecules. mesur´ee, on consid`ere que les donn´ees sont valables lorsque l’´equation : Q 2u2≤ 2 [92]. On consid`ere que toute les donn´ees `adroite de Q 2 = 5 ne correspondent pas `aune diffusion exprim´epar l’´equation EQ1 et sont donc ignor´ees. De plus tous les mouve- ments mesur´ees et dont les donn´ees figures `agauche de Q 2 = 5 ne sont pas que des mouvements d’hydrog`ene des macromol´ecules. En effet dans cette zone de Q, il y a les mouvements des hydrog`enes des macromol´ecules, mais aussi les mouvements des

74 hydrog`enes de l’eau. Il sera donc n´ecessaire de d´elimit´e une gamme dans dans cette zone de Q pour effectuer l’interpr´etation des r´esultats. Une ´etude de l’impact du choix de la gamme de Q a ´et´er´ealis´eet est pr´esent´edans le chapitre 8.2.1. En choisissant une gamme ad´equate, la valeur du < u 2 > nous renseignera donc sur l’amplitude des mouvements des atomes d’hydrog`ene des prot´eines (c’est une mesure de distance, en A˚2).

8.1.3 Interpr´etation des donn´ees de diffusion neutronique

J.Zaccai a propos´eune analyse du MSF en fonction de la temp´erature, en terme de constante de force [92]. L’analyse a permis de relier la flexibilit´edes prot´eines `aleur resilience. d A partir de la courbe dT (exemple figure 8.8), nous pouvons extraire la r´esilience < k ′ > qui correspond `ala duret´e(force, en N/m ) des mouvements des atomes.

Par comparaison `aun syst`eme dans lequel les liaisons hydrog`enes peuvent ˆetre assi- mil´ees `ades ressorts, < u 2 > correspond `ala capacit´ed’´elongation du ressort et < k ′ > la rigidit´eeffective du ressort. < k ′ > ou r´esilience correspond `aune constante de force effective qui prend en compte les fluctuations entropiques, mais aussi enthalpiques du syst`eme [92]. L’´equation qui relie < k ′ > `a < u 2 > est :

′ 2kb 0.00276 < k >= d = d −−−−−−−−−−− (EQ 2) dT dT

−23 (kb correspond `ala constante de Boltzmann : kb = 1 .38 × 10 J/K ) La r´esilience est donc inversement proportionnelle `ala pente du MSD en fonction de la temp´erature. Plus la pente du MSD en fonction de la temp´erature est grande, plus

75 Figure 8.8 – Courbe < u 2 > en fonction de la temp´erature de l’organisme e.coli : Les valeurs ont ´et´ecalcul´ees `apartir des donn´ees de la figure 8.7, la pente est repr´esent´ee en rouge. Nous obtenons < k ′ >=0.16 N/m

< k ′ > est petit et donc plus le syst`eme est mou (par rapport aux liaisons hydrog`enes).

76 8.2 R´esultats

8.2.1 Choix de la gamme de Q utilis´ee pour le traitement des donn´ees de H.salinarum : ´etude de l’influence du choix de la gamme de Q sur les donn´ees de diffusion neutronique sur E.coli

Des ´etudes ont ´et´er´ealis´ees en 2004 (Tehei et al. [93]), sur l’organisme t´emoin E.coli et sur des organismes psychrophiles, m´esophiles, thermophiles et hyperthermophiles et en 2008 (Jasnin et al. [94]) sur E.coli en pr´esence de diff´erents solvants. Ces ´etudes, r´ealis´ees au LBM et `al’ILL, ont constitu´el’amorce d’une r´eflexion sur les possibilit´es offertes par la diffusion de neutrons pour ´etudier la dynamique macromol´eculaire in vivo chez les arch´ees halophiles. Lors des ´etudes neutroniques pr´ec´edentes sur des organismes vivants, des gamme de Q diff´erentes ont ´et´eutilis´ees. Ainsi l’´etude portant sur les organismes extrˆemophiles utilisait g´en´eralement la gamme en Q 1.2 A˚−1 < Q < 2.2 A˚−1 (nomm´e”range 0”),et les ´etudes sur l’influence du tampon sur la dynamique mol´eculaire de l’organisme E.coli utilisait la gamme en Q 1.27 A˚−1 < Q < 1.87 A˚−1 (nomm´erange 1). Ce choix de gamme de Q est justifi´epour visualiser le moins possible les mouvements li´es aux atomes d’hydrog`ene de l’eau. Il ´etait donc n´ecessaire tester ces gammes et ainsi de choisir une gamme de Q adapt´ee `anos donn´ees. Nous souhaitons avoir une gamme de Q prenant en compte les mouvements des macromol´ecules, mais aussi les mouvements des hy- drog`enes de l’eau ”associ´es” a ces macromol´ecules. Pour cela, nous avons donc mesur´edeux ´echantillon de cellule de E.coli , les donn´ees ont ´et´etrait´es en collaboration avec Elisa Fabiani (post-doctorante du groupe ELMA `al’IBS) et les r´esultats sont pr´esent´es dans ce chapitre. Les cellules E.coli en phase exponentielle de croissance ont ´et´eculott´ees, lav´ees puis en- ferm´ees dans le porte ´echantillon et la dynamique mol´eculaire des cellules a ´et´emesur´ee environ 20 heures par diffusion neutronique. Une fois les fichiers de ”data” obtenue,

77 les donn´ees sont trait´ees avec le logiciel ”lamp” jusqu’a l’obtention des valeurs de ”I ” en fonction de ” Q”, pour les ´echantillons et le tampon. La soustraction et le reste des calculs sont fait ind´ependamment sur le logiciel ”origine” (homologue du logiciel ”Ex- cel” mais plus performant) afin de limiter les ´etapes de calculs dans le logiciel ”lamp” et ainsi contrˆoler et v´erifier chaque ´etape du calcul.

Le choix d’une gamme en Q commen¸cant `a1,2 A˚−1 avait ´et´efait, car l’intensit´e pr´esente dans les Q plus petit est compos´ee de l’intensit´edes prot´eines, mais surtout de l’intensit´ede l’eau libre du solvant (voir figure 8.9). Une ´etude de la prise en compte des intensit´edes Q plus petit que 1,2 A˚−1 est donc n´ecessaire, pour pouvoir effectuer notre choix de gamme de Q, en sachant que nous voulons prendre en compte les mouve- ments des hydrog`enes des mol´ecules d’eau li´ees aux macromol´ecules et que les intensit´es de diffusion neutronique de l’eau du solvant ne nous int´eresse pas.

78 Figure 8.9 – Comparaison de la dynamique mol´eculaire d’un ´echantillon d’ E.coli et de son tampon `adiff´erentes temp´eratures. L’intensit´e”I” et trac´e en fonction de l’angle ” Q”.

Pour ne pas prendre en compte l’intensit´edes mol´ecules d’eau du solvant, dans les ´etudes pr´ec´edentes, l’intensit´edu tampon ´etait soustrait quelques soit la gamme de Q utilis´ee. Il est donc n´ecessaire de soustraire l’intensit´edu tampon de fa¸con la plus juste possible, en prenant en compte la quantit´ede tampon pr´esent dans le culot cellulaire. Pour estimer la quantit´ede tampon pr´esent il est n´ecessaire de comparer la masse du culot avant et apr`es ´evaporation de l’eau (mis dans une ´etuve `a80˚c). Le r´esultat obtenu est qu’il faut pour corrig´el’intensit´ede l’´echantillon soustraire environ 60-70% de l’intensit´edu tampon. Hors en regardant les valeurs des intensit´edu tampon et de l’´echantillon, on remarque deux choses : – Dans la gamme de Q range 0 et range 1, l’intensit´edu tampon est proche de 0,

79 donc il n’est pas n´ecessaire de soustraire le tampon. – Pour les Q inf´erieur `a1.2 A˚−1 il est clair, que l’eau diffuse plus dans ces ”petits Q”. Mais dans cette portion l’intensit´edes prot´eines est bien plus forte que dans la gamme aux alentour de 1,5 A˚−1 (environ 3 fois plus intense). On peut estimer que l’intensit´edu tampon (et donc de l’eau) compar´e`al’intensit´ede l’´echantillon est inf´erieure `a12%, donc si on consid`ere que l’intensit´edu tampon pr´esent dans l’´echantillon correspond `a70% de l’intensit´edu tampon seul, la diff´erence entre les deux n’est pas de 12% mais de8%, donc finalement l’intensit´ede l’eau dans cette gamme de Q semble assez n´egligeable. Donc si la soustraction est estimer correcte, il est possible de travailler avec ces ”petit Q”.

Nous n’avons pas consid´er´ele dernier point de la gamme ”range 0” car ce point pr´esente une grande barre d’erreur essentiellement due au fait qu’`acet angle on observe de fortes fluctuations de l’intensit´epar la contamination d’intensit´es li´ees `al’aluminium. La suite de ce chapitre va expliquer quels sont les crit`eres que nous avons pris en compte pour choisir une nouvelle gamme de Q. Cette ´etude est bas´ee sur les donn´ees de l’organisme E.coli uniquement, mais il est a savoir qu’elle a ´et´eaussi r´ealis´esur les donn´ees de H.salinarum (donn´ees non montr´ees). A partir des donn´ees obtenues pour les deux ´echantillons E.coli les courbes Ln (I)en fonction de Q 2 ont ´et´etrac´ees (voir figure 8.10).

80 Figure 8.10 – Comparaison de la dynamique mol´eculaire entre deux ´echantillons diff´erents de E.coli et choix de la gamme de Q 2 pour le fit permettant d’obtenir la valeur de < u 2 >. Nuage de points du Ln(I) en fonction de Q 2 pour chaque temp´eratures exp´erimentales. En haut, donn´ee obtenue en mai 2011, en bas donn´ee obtenues en juillet 2011, pour l’organsime E.coli DH5 α. Pour les gammes de Q 2, R1 correspond `ala gamme 1,6 < Q 2 <3,49; R2 `ala gamme 0,27 < Q 2 <1,6 ; R3 `ala gamme 0,27 < Q 2 <2,16; R4 `ala gamme 0,27 < Q 2 <2,79; R5 `ala gamme 0,27 < Q 2 <3,49.

81 Sur cette figure sont repr´esent´ees les autres gammes de Q test´ees pour traiter les donn´ees (”R” correspond `a”Range”). Comme il est possible de voir les deux jeux de donn´ees ne sont pas exactement identiques, cela peut ˆetre due a de nombreux facteurs ´etant donn´ee que nous travaillons sur des ´echantillons biologiques vivants complexes. Pour chaque gamme (de R1 `aR5) les < u 2> ont ´et´ecalcul´e(voir figure 8.11), puis les < k ′ > (voir 8.12).

82 Figure 8.11 – Comparaison des < u 2 > obtenues pour les donn´ees mai et juillet 2011 pour l’organisme E.coli en fonction du choix de la gamme en Q 2. En haut, donn´ees obtenues en Mai 2011. En bas, donn´ees obtenues en Juillet 2011.

En observant les deux jeux de donn´ees sur la figure 8.11, il est int´eressant de no-

83 ter que le choix de la gamme de Q interf`ere sur la valeur moyenne des < u 2 >, plus la gamme utilise des Q ”grand” plus la valeur moyenne des < u 2 > est basse. Par contre, il est aussi visible que pour les gammes range 2 `arange 5 les pentes obtenues sont parall`eles entre elles (donc devrait donner une mˆeme information au niveau de la r´esilience de l’´echantillon) et que ce n’est pas le cas pour la gamme range 1 (les points en noirs sur la figure). La gamme ”range 1” ne semble donc pas adapt´ees pour visualis´eune moyenne des r´esiliences de l’eau en interaction avec les macromol´ecules et des macromol´ecules elles-mˆeme. En comparant les valeurs de < k ′ > r´esultants des deux jeux de donn´ees (voir 8.12), il est clairement visible que les gammes R2 `aR5 donnent des valeurs de < k ′ > tr`es similaires avec une faible barre d’erreur.

84 85 Figure 8.12 – Comparaison des valeurs des < k ′ > obtenues pour les diff´erentes gammes de Q 2 pour les donn´ees de E.coli mesur´ees en Mai et en Juillet. Les fl`eches d´esignent la gamme choisie pour traiter les donn´ees au cours de l’´etude r´ealis´ee sur le prot´eome de H.salinarum . Nous avons finalement choisi la gamme range 3 (0,27 < Q 2 <2,16), bien que toutes les gammes test´ees (sauf range 1) donnent une valeur de < k ′ > presque ´equivalente. Nous avons choisi la gamme range 3, car la gamme range 1 poss`ede peu de point pour avoir une bonne statistique lors des r´egressions lin´eaires; les points des gammes range 4 et 5 du graphique 8.10 montrent que leur alignement n’est pas lin´eaire et donc que leur utilisation pour calculer une pente est peu justifiable math´ematiquement.

Cette petite ´etude ma permit aussi de r´ealiser, que le traitement des donn´ees est tr`es sensible et que la ”mani`ere ” d’effectuer les corrections peut influencer les r´esultats finaux. De ce fait, il me semble que cet outil (la diffusion de neutron) permet d’obtenir de bonnes informations de dynamique mol´eculaire entre les diff´erents ´echantillons, qu’il ne faut pas se focaliser sur les ”nombres” des valeurs obtenues, mais sur les ”comparai- sons” des valeurs ( < u 2 > et < k ′ >) obtenues pour des ´echantillons trait´es exactement de la mˆeme fa¸con et si possible mesur´es en mˆeme temps.

8.2.2 Mesure de la r´esilience mol´eculaire du prot´eome Halo- bacterium salinarum

Les exp´eriences ont ´et´er´ealis´ees sur le spectrom`etre IN13 `al’Institut Laue Lange- vin. Les cellules d’Halobacterium ont ´et´ecultiv´ees [95] et culott´ees au cours de leurs phases exponentielles de croissance (DO entre 0.8 et 1.0). Une partie du pr´el`evement est utilis´epour obtenir des informations compl´ementaires en plus de la DO `a600nm : le nombre de cellules (compt´esur lame de Neubaueur par microscopie par contraste de phase), la viabilit´e(les cellules sont incub´ees avec les r´eactifs kit live/dead d’Invitrog`ene permettant de discriminer les cellules mortes des cellules vivantes par microscopie fluo- rescence), la concentration de sel intracellulaire (par ICP). Pour les exp´eriences de diffusion de neutrons, les culots de cellules sont lav´es avec un tampon contenant une concentration saline ´equivalente au milieu de culture (voir M&M). Le culot r´esultant a

86 ´et´echarg´edans le porte-´echantillon dor´ede 0.3mm d’´epaisseur. Une mesure pr´ealable de la transmission aux neutrons est effectu´ee sur les ´echantillons, ces mesures montrent une transmission d’environ 90% pour le faisceau de neutrons 2,23 A.˚ Des contrˆoles ont ´et´eeffectu´es pour s’assurer que les cellules restent en vie et en bon ´etat physiologique au cours des exp´eriences de diffusion. Pour cela les mˆemes contrˆoles sont r´ealis´es en fin d’exp´erience : le nombre de cellules, la viabilit´e, la concentration de sel intracellulaire. De plus, lors des comptages, une ´etude des changements morpho- logiques cellulaires a ´et´er´ealis´ee. L’ensemble des protocoles utilis´eest d´ecrit dans le chapitre VI. Dans toutes les figures pr´esent´ees, les points `a”t=0” correspondent `aun point contrˆole r´ealis´esur des cultures en d´ebut d’exp´erience. Les points ”t=1h” correspondent quand `aeux `al’´etape o`ules cultures sont culott´ees afin de les d´eposer dans le porte ´echantillon, c’est `adire `ades cultures apr`es 1 heure d’incubation (nous avons respect´ece d´elais affin de pourvoir comparer plus tard ces r´esultats `ades r´esultats de cultures soumis `a un stress pendant 1 heure. Les points ”t=24” correspondenta ` la fin de l’exp´erience de diffusion de neutrons, apr`es ouverture du porte-´echantillon. Pour les cellules d’ E.coli , le protocole de pr´eparation des cellules est le mˆeme que celui utilis´edans l’article de ”Tehei et al , 2004”.

Les valeurs r´esiduelles de la viabilit´ecellulaire sont de l’ordre de 98% apr`es 24 heures d’enfermement des cellules dans le porte ´echantillon, dont 20 heures soumis au passage du faisceau de neutrons. Aucune modification morphologique ou modification dans la composition du K + intracellulaire n’a pu ˆetre d´etect´ee (donc la concentration en K + reste autour de 3.6M et les cellules ont une forme en batonnet).

Les donn´ees de la diffusion ´elastique incoh´erente ont ´et´e recueillies avec une r´esolution en ´energie de 8 µ eV dans un vecteur de diffusion des 0.8 A˚−1< Q < 1,7 A˚−1. Les donn´ees d’intensit´eobtenues ont ´et´enormalis´ees par la diffusion du vanadium, puis corrig´ees par la diffusion du porte-´echantillon et du tampon, pour obtenir l’intensit´eI en fonc-

87 tion du vecteur de diffusion Q pour chaque temp´erature de chaque ´echantillon. Pour chaque ´echantillon et pour chaque point de temp´erature, il a ´et´er´ealis´eun graphique de ln[ I(Q, ´elastique)] en fonction de Q 2. Le d´eplacement atomique carr´emoyen (MSD) < u 2> est calcul´e`apartir de la pente obtenue. Les mesures de MSD sont ensuite trac´ees en fonction de la temp´erature pour d´eterminer la constante de force < k ′ >, aussi appel´ee ”r´esilience”, `apartir de la pente des donn´ees. Pour plus d’information voir chapitre 8.1.2

Figure 8.13 – Comparaison de la flexibilit´e et de la r´esilience macro- mol´eculaire moyenne < k ′ > (rigidit´e) du prot´eome d’Halobacterium et d’une m´esophile ( E.coli ). A. D´eplacement carr´emoyen < u 2 > de l’organisme H.salinarum et E.coli en fonction des temp´eratures exp´erimentales, dans la gamme de 0.8 A˚−1< Q < 1,7 A˚−1. En triangle, donn´ees du prot´eome de H.salinarum et en ´etoile celles de E.coli . B. Histogramme des constantes de force moyennes, d´ecrivant la r´esilience macromol´eculaires, calcul´ees `apartir des pentes du d´eplacement carr´emoyen de la figure A (les barres d’erreur sont obtenues par la r´ep´etition des mesures).

La figure 8.13 montre la comparaison entre les < u 2> `adiff´erentes temp´eratures et les < k ′ > d’ Halobacterium salinarum et celle de l’organisme m´esophile E.coli , dans la gamme de Q ”range 3”. Etant donn´ee que n’utilisons une gamme de Q diff´erentes de celles utilis´ees dans les articles ref [94] et [93], il est normal que nous n’obtenions pas les mˆemes valeurs de < u 2> et < k ′ > que celles pr´esent´ees dans ces articles (voir chapitre 8.2.1 pour plus de d´etail quand au choix de la gamme de Q). Pour toutes les temp´eratures utilis´ees pour les mesures de diffusion, il est int´eressant de voir que la valeur des < u 2 > du prot´eome m´esophile est sup´erieure `acelle de l’halophile,

88 on peut donc en conclure que les prot´eines composant le prot´eome halophile sont moins flexibles que celles de l’organisme m´esophile mesur´ees dans cette ´etude. De plus, les mesures ont montr´eque la r´esilience ( < k ′ >) du prot´eome Halobacterium salinarum est nettement sup´erieure (plus de 4 fois) `acelle de E.coli et t´emoigne d’une r´esilience du prot´eome halophile plus ´elev´ee que celle de la m´esophile. Des travaux ant´erieurs sur des malates d´eshydrog´enases halophiles purifi´ees sugg´eraient que la grande r´esilience des prot´eines adapt´ees aux concentration en sel ´elev´eest due `ala contribution enthalpique de l’´energie libre (plus grande ”rigidit´e”) [96]. Nous ne pouvons pas exclure, cependant, que d’autres facteurs cytoplasmiques d’ Halobacterium salinarum contribuent ´egalement `al’obtention d’une r´esilience ´elev´ee.

8.2.3 Modification de la dynamique mol´eculaire du prot´eome de H.salinarum dans des conditions exp´erimentales hy- posalines

Afin d’examiner l’influence de la variation de la concentration en sel sur la dyna- mique du prot´eome Halobacterium salinarum dans un contexte cellulaire, nous avons ´etudi´el’effet d’une baisse de salinit´ede l’environnement extracellulaire (milieu de culture) sur la concentration en K + du cytoplasme. Pour r´ealiser cette baisse de concen- tration externe en NaCL, des dilutions avec un milieu de culture sans NaCl (milieu Hs 0M) sont r´ealis´ees. Nous avons dans un premier temps observ´e l’effet de diff´erentes di- lutions avec du milieu Hs 0M sur la croissance des cellules afin de choisir des conditions g´en´erant un stress non l´etal pour les cellules (voir figure 8.15). Puis dans un second temps, une quantification de la modification de la concentration du sel intracellulaire (K +) par l’abaissement de la concentration externe en NaCl du milieu de culture a ´et´er´ealis´e(voir figure 8.16). Il a ´et´echoisi deux conditions de stress hypo-salin : une conditions en NaCl extracellulaire de 2,5M et une de 2,0M.

Une exp´erience contrˆole a aussi ´et´er´ealis´ee, elle correspond `aun ´echantillon tota-

89 lement lys´epar un choc osmotique important : une culture cellulaire en phase expo- nentielle a ´et´eculott´ee, lav´ee, transf´er´ee dans un boudin de dialyse et une dialyse a ´et´e r´ealis´ee pendant toute une nuit contre un tampon sans NaCl dont les autres composants sont identiques au tampon de lavage normal. A la fin de la dialyse, il est possible de voir l’aspect glaireux du culot, signifiant une lise des cellules et une large d´enaturation des composants cellulaires. Ce culot est homog´en´eis´epar agitation et d´epos´esur un porte-´echantillon puis la mesure de diffusion de neutrons est r´ealis´ee (voir figure 8.14).

Figure 8.14 – Comparaison de la dynamique mol´eculaire entre un prot´eome intact de H.salinarum et des cellules lys´ees de H.salinarum par choc osmo- tique ; A. Comparaison de la flexibilit´edu prot´eome entre H.salinarum en conditions normales (triangle) et lys´epar choc osmotique (une culture culott´ee de H.salinarum dia- lys´ee pendant une nuit contre un tampon sans NaCl). B. Comparaison de la r´esilience du prot´eome entre H.salinarum en conditions normales (4,2M) et lys´epar choc osmo- tique (0M)

La dynamique mol´eculaire du prot´eome d´enatur´een conditions de basse salinit´ede H.salinarum (figure 8.14) est tr`es ´eloign´ede l’´echantillon intact. La flexibilit´eest large- ment sup´erieure quelques soient les temp´eratures de mesure utilis´ees et la r´esilience est plus de 5 fois inf´erieure `ala condition normale. Il existe un biais dans cette exp´erience : lors de la dialyse, il est possible de perdre les petits solut´es, cette perte pourrait engen- drer une baisse du signal et donc des fluctuations de la flexibilit´eet de la rigidit´e. Pour enlever ce biais, une ´etude sur la dynamique du prot´eome de cellules lys´ees puis dia- lys´ees, compar´ees au prot´eome de cellules seulement lys´ees a ´et´er´ealis´ee et est trait´ee

90 au chapitre 8.2.6. Ce r´esultat important peut servir de ”limite” n´egative, pour les me- sures de flexibilit´eet de rigidit´edu prot´eome lors de chocs/stress osmotiques.

Pour les stress `a2,5M et 2,0M NaCl extracellulaire, les cultures cellulaires stress´ees sont cultiv´ees pendant 1 heure, puis culott´ees, lav´ees, d´epos´ees sur le porte-´echantillon et mesur´ees par diffusion de neutrons. Comme pour l’´etude pr´ec´edente le nombre de cellules, la viabilit´e, les changements morphologiques et la concentration de sel in- tracellulaire sont mesur´es avant le stress (t=0), avant de d´eposer les cellules dans le porte-´echantillon (t=1h) et apr`es les mesures de diffusion (t=24h). Comme d´ej`asignal´e, le taux de croissance de Halobacterium salinarum est affect´een dessous de 3M NaCl et une baisse drastique de la viabilit´ecellulaire est observ´ee lorsque la concentration en sel chute en dessous de 2M (voir r´esultats figure 8.15).

91 Figure 8.15 – Suivi de la croissance de cultures d’ H.salinarum en conditions optimales (4,2M, 37˚C) et de cultures soumises `at=0 `adiff´erents stress en- vironnementaux ; voir encadr´epour la l´egende des stress. Compar´eaux conditions optimales (4,2M 37˚C), il est possible de s´eparer l’intensit´eper¸cue du stress par l’or- ganisme H.salinarum en deux cat´egories : les conditions de stress `a2,5M/37˚C et un stress `a4,2M/55˚C ne permettent plus une croissance optimale, mais n’arrˆetant pas la croissance; les conditions de stress 2,0M/37˚C et 4,2M/60˚C quand `aelles arrˆetent rapidement la croissance cellulaire. Il est `anot´eque des stress plus intenses sont l´etaux pour ces organismes.

Toutefois, nous avons constat´eque, entre 2.5-2M, les cellules d’Halobacterium sur- vivent en majorit´eavec un taux de viabilit´ede 90% et cela pendant de longues p´eriodes (8.16). A 2.5M les cultures cellulaires concervent une l´eg`eres croissance et une viabilit´e maximale, mais entre plus tˆot en phase stationnaires; par contre les cultures cessent de croˆıtre aux alentour de 2M. Des taux de viabilit´e´elev´es (sup´erieur `a80%) ont ´et´e trouv´es apr`es 24 heures d’enfermemant dans le porte-´echantillon soumis au faisceau de neutrons (voir tableau 8.16).

92 Figure 8.16 – Tableau r´esumant les r´esultats de viabilit´ede l’organismes H.salinarum soumis aux diff´erentes conditions de stress. La viabilit´ea ´et´e quantifi´ee par comptage des cellules sur lame de num´eration ”Neubauer” au microscope confocal et par coloration des cellules mortes et vivantes par les composants du kit ’Live/dead d’Invitrogen (voir Mat´eriel et M´ethodes).

Nous avons aussi mesur´eaux cours des diff´erentes ´etapes de l’exp´erience, les varia- tions de la concentration intracellulaire en K + dans les deux conditions hypo-salines. Ces exp´eriences ont r´ev´el´eque dans les cellules vivantes intactes la concentration intra- cellulaire en K + diminue en fonction de la concentration de NaCl externe (voir tableau 8.17). L’´equilibre a ´et´eatteint apr`es 1 heure et est rest´estable apr`es 24 heures. Dans ces conditions, la concentration intracellulaire en K + a ´et´eabaiss´e`a2.2 M et 1.6 M pour les concentrations extracellulaires en NaCl respectivement de 2.5 et 2M.

93 Figure 8.17 – Tableau r´esumant les r´esultats de dosage de la concentration en K+intracellulaire de l’organismes H.salinarum soumis aux diff´erentes condi- tions de stress hypo-salins. Les mesures de concentration en K + ont ´et´er´ealis´ees par spectrom´etrie de flamme (voir Mat´eriel et M´ethodes pour plus de pr´ecisions sur la technique utilis´ee)

Nous avons mesur´ele MSD des cellules expos´ees `ade telles conditions hypo-saline (8.18 A). Nous pouvons observer qu’`atoutes les temp´eratures exp´erimentales, les va- leurs des MSD sont d´eplac´ee vers le haut par rapport au t´emoin non stress´e. Ces valeurs indiquent que l’amplitude des mouvements mol´eculaires est accrue. Les va- leurs de r´esilience correspondantes ( < k ′ >) ont ´et´ecalcul´ees `apartir des pentes de la temp´erature (8.18 B). Nous pouvons observer que plus la concentration en sel extracel- lulaire diminue, plus la concentration en K + intracellulaire diminue, cela impacte sur le prot´eome par un MSD qui augmente (donc la flexibilit´edu prot´eome augmente), ainsi que par une r´esilience en diminution (donc une rigidit´emoindre). Or, des mesures de prot´eines d´epli´ees ont ´et´er´ealis´ees et ont montr´e de plus grandes fluctuations du MSD et de faibles r´esiliences par rapport `al’´etat repli´e[97] [98]. Ainsi, on peut en d´eduire que le d´epliement des prot´eines a d´ej`acommenc´edans le cytosol Halobacterium sali- narum pour ces conditions hypo-salines ”douces”. Par contre ces valeurs sont encore loin du contrˆole 0M dans lequel des cellules sont compl`etement lys´ees et pour lequel les valeurs mesur´ees traduisent probablement un ´etat avanc´e de d´epliement de la plupart des prot´eines.

94 Figure 8.18 – Effets des conditions environnementales hypo-salines sur la dynamique mol´eculaire du prot´eome de H.salinarum . A. D´eplacement carr´e moyen < u 2 > de l’organisme H.salinarum soumis `ades conditions environnemen- tales hypo-salines en fonction des temp´eratures exp´erimentales, dans la gamme de 0.8 A˚−1< Q < 1,7 A˚−1. En triangles, H.salinarum cultiv´een conditions normales (4,2M NaCl); en croix H.salinarum soumis `aun stress hypo-salin de 2,5M NaCl; en lo- sanges, H.salinarum soumis `aun stress hypo-salin de 2,0M NaCl. B. Histogramme des constantes de force moyennes, d´ecrivant la r´esilience macromol´eculaire, calcul´ees `a partir des pentes du d´eplacement carr´emoyen de la figure A (les barres d’erreur sont obtenues par la r´ep´etition des mesures).

Inversement, bien qu’il soit possible d’observer une perturbation importante de la flexibilit´eet de la rigidit´edes prot´eines au cours des stress `a2,5M et 2,0M NaCl extracel- lulaire, les valeurs de dynamique mol´eculaire du prot´eome sont encore loin des valeurs du profil de d´enaturation totale des prot´eines de H.salinarum . Mais il est int´eressant de remarquer que dans cette gamme de Q, la r´esilience de l’organisme H.salinarum soumis `aun stress salin et proche de la r´esilience de l’organisme E.coli dans des conditions physiologiques normales. En conclusion les prot´eines repli´ees du prot´eome de E.coli sont moins r´esilientes que celles de prot´eome de H.salinarum et aussi ”molles” que celles de H.salinarum partiellement d´epli´ees.

95 8.2.4 Modification de la dynamique mol´eculaire lors des stress thermiques

Nous avons voulu explorer l’hypoth`ese que la faible r´esilience et l’augmentation du MSD observ´ees au cours des stress hypo-salins correspond au d´epliement des prot´eines, pour cela nous avons effectu´edes mesures de dynamique mol´eculaire du prot´eome Ha- lobacterium salinarum in vivo sous contrainte thermique. Les halophiles extrˆemes repr´esentent d’excellents mod`eles pour ´etudier l’effet du stress thermique, puisque, par rapport aux m´esophiles, ils peuvent r´esister `ades plages de temp´erature plus large. De mˆeme que pour les mesures de faible stress salin, des exp´eriences pilotes ont ´et´eeffectu´ees pour explorer les limites de viabilit´ed’ Halobacterium salinarum lors d’exposition `adiff´erentes temp´eratures pour choisir des conditions neu- troniques exp´erimentales stressantes mais non l´etales. Il en ressort, en comparant la croissance et la viabilit´equ’un stress de 55˚C pendant 1 heure impacte la croissance cellulaire de mani`ere quasi-´equivalente `aun stress hypo-salin de 2.5M; et qu’un stress de 60˚C impacte quand `alui d’un niveau ´equivalent `aun stress hypo-salin de 2.0M. Comme pour l’´etude de la dynamique mol´eculaire de H.salinarum lors de stress hypo- salin, un contrˆole `ahaute temp´erature a ´et´er´ealis´e. Pour r´ealiser ce contrˆole, une culture cellulaire de H.salinarum en phase exponentielle (DO 0.9) a ´et´eculott´ee, lav´ee et d´epos´ee sur le porte-´echantillon. Une fois le porte ´echantillon scell´e, il est d´epos´e pendant 1 heure dans une ´etuve `a80˚C, puis l’´echantillon est mesur´epar diffusion neutronique (voir r´esultats figure 8.19). La cuisson des cellules va engendrer une lyse et une d´enaturation des prot´eines, donc un r´esultat sur la dynamique mol´eculaire, si- milaire `acelui obtenu pour l’´echantillon 0M, ´etait envisageable. Il est `anot´eque cette exp´erience avait d´ej`a´et´er´ealis´ee sur l’organisme m´esophile E.coli [93] et avait montr´e une augmentation du MSD et une diminution de la r´esilience lorsque les cellules ´etaient cuites.

96 Figure 8.19 – Comparaison de la dynamique mol´eculaire entre un prot´eome intact de H.salinarum et des cellules lys´ees de H.salinarum par choc ther- mique. A. Comparaison de la flexibilit´edu prot´eome entre H.salinarum en conditions normales (triangle) et cellules cuites `a80˚C pendant 1 heure (croix). B. Comparai- son de la r´esilience du prot´eome entre H.salinarum en conditions normales (4,2M) et H.salinarum ”cuit” (80˚C)

Il est possible de voir que le r´esultat attendu pour un ´echantillon cuit n’est pas du tout comparable au contrˆole 0M, en effet non seulement la flexibilit´eest inf´erieur `a l’´echantillon normal, mais la rigidit´eest aussi sup´erieure aux autres ´echantillons. Lors de l’ouverture du porte-´echantillon dans lequel la cuisson et les mesures de dynamique des cellules ont ´et´er´ealis´ees, la v´erification de l’aspect du culot (aspect non liquide mais ”sec”, dont la consistance est comparable `aun blanc d’oeuf trop cuit) a permis de conclure que la pr´esence de fortes quantit´es de sel lors de la cuisson a entrain´e l’agr´egation de tous les composants des cellules, cr´eant un objet dense et rigide. Cette exp´erience contrˆole ne peut donc servir `ala calibration de la dynamique mol´eculaire du prot´eome de H.salinarum au cours de stress thermique.

Pour l’exp´erience de diffusion neutronique en pr´esence de stress thermique, les cultures cellulaires ont ´et´etransf´er´ees `a37˚C (contrˆole), 55˚C ou 60˚C pendant 1 heure sous agitation; puis culott´ees, lav´ees dans un tampon de hyper-salin et plac´ees dans le faisceau de neutrons (voir r´esultats figure 8.20 ). Notez que, contrairement aux exp´eriences de stress hypo-salin, le stress thermique ne peut pas ˆetre maintenu pen-

97 dant les mesures de diffusion de neutrons, en partie dˆu`al’utilisation lors de l’exp´erience de diffusion d’une plage de temp´eratures pour le calcul de la r´esilience.

Figure 8.20 – Effets du stress thermique sur la dynamique mol´eculaire du prot´eome de H.salinarum . A. D´eplacement carr´emoyen < u 2 > en fonction des temp´eratures exp´erimentales, dans la gamme de 0.8 A˚−1< Q < 1,7 A˚−1 obtenue pour le prot´eome de l’organisme H.salinarum soumis `ades conditions de culture en pr´esence d’un stress thermique pendant 1 heure. En triangles H.salinarum cultiv´een conditions normales (37˚C) ; en croix H.salinarum soumis `aun stress thermique de 55˚C pendant 1 heure; en losanges H.salinarum soumis `aun stress thermique de 60˚C pendant 1 heure. B. Histogramme des constantes de force moyennes, d´ecrivant la r´esilience ma- cromol´eculaires, calcul´ees `apartir des pentes du d´eplacement carr´emoyen de la figure A (les barres d’erreur sont obtenues par la r´ep´etition des mesures).

N´eanmoins, une nette augmentation de la flexibilit´emacromol´eculaire ainsi qu’une baisse de la rigidit´eont ´et´ed´etect´ees pour les deux ´echantillons stress´es (8.20). En effet plus le stress thermique est important, plus la dynamique mol´eculaire du prot´eome est perturb´ee par rapport `al’´echantillon contrˆole non stress´e. Il est int´eressant de constater que malgr´eces perturbations importantes, les cellules sont n´eanmoins tou- jours vivantes (voir les valeurs de viabilit´esur le tableau 8.16). Ceci laisse supposer que des m´ecanismes mis en jeu au cours de ces stress permettent de compenser les ef- fets d´el´et`eres d’un stress physique et en particulier pour prot´eger des effets d´enaturant d’un stress thermique prolong´esur le repliement des prot´eines. L’´etude pr´esent´ee dans le chapitre suivant est en faveur de cette hypoth`ese.

98 8.2.5 Etude de l’induction du complexe chaperon TF55 lors des stress

Cette conclusion a ´et´ecorrobor´ee par l’analyse montrant l’accumulation de la sous- unit´ealpha thermosome dans les deux types de stress (thermique et hypo-salin) dans la cellule (8.21).

Figure 8.21 – Accumulation de la sous-unit´e α du Thermosome chez H.salinarum en fonction des stress environnementaux thermiques (en haut) et hypo-salins (en bas) , une fraction de chaque culture soumise ou non aux stress est culott´ee, les prot´eines sont extraites et d´epos´ee sur un gel SDS, puis transf´er´ee sur membrane et r´ev´el´ee avec un anticorps ciblant la sous-unit´e α du Thermosome

Le thermosome est, chez les arch´ees, l’´equivalent de la prot´eine de choc thermique Hsp60 bact´erienne, qui est un complexe chaperon [99]. Cette accumulation est pro- portionnelle `al’intensit´edu stress et est pr´esente mˆeme pour un stress non ther- mique comme le stress hypo-salin. Donc les perturbations de la dynamique mol´eculaire d´etect´ees dans les cellules vivantes ont co¨ıncid´eavec l’accumulation des prot´eines de la machinerie du contrˆole de la qualit´edes prot´eines (prot´eines chaperonnes). Cette observation pourrait expliquer en partie pourquoi, en d´epit d’une perturbation signifi- cative du prot´eome, Halobacterium salinarum peut maintenir un taux de viabilit´e´elev´e

99 sur de longues p´eriodes, durant et apr`es l’exposition au stress. Une ´etude plus pouss´ee, sur les machineries de protection et de d´egradation lors de stress, est pr´esent´ee dans le chapitre III

8.2.6 Influence de l’int´egrit´ecellulaire sur la dynamique du prot´eome d’un organisme m´esophile( E.coli ) et halophile( H.salinarum

Comme signal´edans le chapitre 8.2.3, il est important de quantifier l’apport des petits solut´es `ala dynamique mol´eculaire totale du prot´eome. Pour cela une culture en conditions normales a ´et´eculott´ee, lav´ee, puis lys´ee de fa¸con douce par sonication jusqu’`alyse totale des cellules (observ´ee au microscope). L’´echantillon r´esultant a ´et´e divis´een deux, la premi`ere partie a directement ´et´eintroduite dans le porte-´echantillon puis la dynamique mol´eculaire a ´et´emesur´ee ; la seconde partie a ´et´eintroduite dans un boudin de dialyse et dialys´ee pendant la nuit contre un tampon de lavage avec 3,4M KCl de sel, puis la dynamique mol´eculaire a ´et´emesur´ee (r´esultats figure 8.22).

Figure 8.22 – Effets de l’int´egrit´e de la membrane et des petits solut´e sur la dynamique totale du prot´eome de H.salinarum . A. D´eplacement carr´e moyen < u 2 > en fonction des temp´eratures exp´erimentales, dans la gamme de 0.8 A˚−1< Q < 1,7 A˚−1 obtenue pour le prot´eome de l’organisme H.salinarum en conditions normales (triangles), pour des cellules lys´ees (´etoiles) et pour des cellules lys´ese puis dialys´ees pendant une nuit contre un tampon `a3,4M KCl (losanges). B. Histogramme des constantes de force moyennes, d´ecrivant la r´esilience macromol´eculaire, calcul´ees `a partir des pentes du d´eplacement carr´emoyen de la figure A (les barres d’erreur sont obtenues par la r´ep´etition des mesures).

100 L’int´egrit´ede la membrane semble importante pour la dynamique mol´eculaire totale du prot´eome, en effet les donn´ees obtenues sont tr`es diff´erentes de l’´echantillon contrˆole et les valeurs sont tr`es proches de celles obtenues pour l’´echantillon H.salinarum stress´e `a2,5M. Ce r´esultat montre aussi l’importance des mesures de dynamique mol´eculaire r´ealis´ees in vivo et montre que l’encombrement mol´eculaire provoquant des interactions non sp´ecifiques entre les diff´erents composants joue un rˆole important dans la dyna- mique mol´eculaire du prot´eome. Le fait de dialyser l’´echantillon fait baisser la flexibilit´edu prot´eome assez significa- tivement, par contre la rigidit´ene change presque pas. Cette diff´erence de flexibilit´e peut ˆetre due seulement `aune ”perte” de signal, si beaucoup de petits solut´es ont ´et´edialys´es alors que l’on met toujours la mˆeme quantit´ede mat´eriel cellulaire dans le porte-´echantillon. En conclusion les grands changements de flexibilit´eet de rigi- dit´eobserv´es pour l’´echantillon contrˆole n´egatif `a 0M NaCl (voir figure 8.14) ne sont pas dus `ala perte de composants lors de la dialyse mais `ala d´enaturation des prot´eines.

Enfin, lors de la comparaison des r´esultats obtenus pour des ´echantillons normaux et des ´echantillons lys´es, nous nous sommes demand´esi l’influence de l’int´egrit´ede la membrane est aussi importante chez l’organisme m´esophile t´emoin E.coli pour la dy- namique mol´eculaire du prot´eome. Pour cela, des mesures de dynamique mol´eculaire de cellules E.coli intactes et lys´ees ont ´et´er´ealis´ees (voir r´esultats figure 8.23). Que ce soit pour les valeurs obtenues pour la flexibilit´eet la rigidit´edu prot´eome, peu de diff´erences sont visibles, que les cellules d’ E.coli soient lys´ees ou pas. Cette derni`ere information renforce les observations faites sur la comparaison des r´esultats obtenus pour des prot´eomes intacts de H.salinarum et E.coli (voir figure 8.13 et laisse aussi penser qu’une partie non n´egligeable de l’adaptation halophile est due `al’encombre- ment cellulaire.

101 Figure 8.23 – Effets de l’int´egrit´ede la membrane et des petits solut´es sur la dynamique totale du prot´eome de H.salinarum . A. D´eplacement carr´e moyen < u 2 > en fonction des temp´eratures exp´erimentales, dans la gamme de 0.8 A˚−1< Q < 1,7 A˚−1 obtenue pour le prot´eome de l’organisme H.salinarum en conditions normales (triangles), pour des cellules lys´ees (´etoiles) et pour des cellules lys´ees puis dialys´ees pendant une nuit contre un tampon `a3,4M KCl (losanges). B. Histogramme des constantes de force moyennes, d´ecrivant la r´esilience macromol´eculaires, calcul´ees `apartir des pentes du d´eplacement carr´emoyen de la figure A (les barres d’erreur sont obtenues par la r´ep´etition des mesures).

8.3 Discussion

Notre travail montre que pour les organismes halophiles extrˆemes comme Halobac- terium salinarum , une baisse mod´er´ee de la concentration en sel de l’environnement a un effet similaire `aun stress thermique sur l’´etat de repliement des prot´eines in vivo. Il ´etait d´ej`aconnu que, chez les halophiles, une diminution de la concentration en sel de l’environnement induit la transcription et l’accumulation des prot´eines de r´eponse au stress comme les chaperons et prot´eases, certaines d’entre elles ´etant sp´ecifiques `ala r´eponse au stress salin [100] [101]. Cependant, il est surprenant de d´etecter des pertur- bations significatives de la dynamique mol´eculaire au sein des cellules lorsque les ions K+ chutent `a2,2M, car c’est encore une forte concentration de sel dans lequel de nom- breuses prot´eines halophiles (comme la malate d´eshydrog´enase) sont stables in vitro pendant de longues p´eriodes dans une solution dilu´ee [101] [102] [78]. Il est `aconstater qu’une partie du prot´eome de l’arch´ees halophile extrˆeme Halobacterium salinarum est

102 d´ependante d’une concentration ´elev´ee en sel afin de maintenir les prot´eines dans une bonne forme et cela mˆeme dans un contexte cytosolique encombr´e. Cela a des importantes implications pour la compr´ehension du mode de vie microbien halophile. Dans la nature, dans des conditions de pluie ou des inondations, ces orga- nismes doivent souvent faire face aux variations brutales de la concentration en sel de l’environnement. Nos r´esultats ont montr´eque dans de telles conditions, des effets d´el´et`eres se produisent d´ej`asur le prot´eome Halobacterium salinarum mˆeme lorsque la concentration en sel externe est encore relativement ´elev´e. Cette constatation tend `alaisser penser que ces organismes doivent avoir d´evelopp´edes syst`emes efficaces de survie cellulaire pour maintenir un niveau prot´eome minimal d’int´egrit´e, dans des condi- tions cellulaires de faibles concentrations en sel. Dans ce travail, nous avons montr´eque la spectroscopie de neutrons peut d´etecter des alt´erations de l’´etat moyen de la dynamique mol´eculaire du prot´eome au sein d’une cellule vivante en r´eponse aux changements des conditions ext´erieures. Ces ´etudes pour- raient ˆetre utiles pour ´evaluer la robustesse de cellules dans des conditions de stress et pourraient aussi ˆetre un outil pour ´etudier les processus biologiques qui alt`erent le repliement des prot´eines in vivo. La m´ethode de diffusion des neutrons utilis´ee pourrait ˆetre utile, par exemple dans des applications m´edicales, pour ´evaluer l’´etat de dynamique mol´eculaire du prot´eome comme lors d’effets d´el´et`eres de maladies d´eg´en´eratives, du vieillissement, sur les cel- lules cultiv´ees ou des ´echantillons de tissus.

103 Chapitre 9

Mise en ´evidence d’un m´ecanisme de survie `ala basse salinit´echez Halobacterium salinarum

Halobacterium salinarum est un organisme hyper-halophile. Dans le chapitre pr´ec´edent, il a ´et´epossible de voir une ”r´esistance” du prot´eome vis-`a-vis d’une chute drastique de la concentration en sel intracellulaire, due elle-mˆeme `a une chute de la concentration en sel extracellulaire. Il est fort probable que de nombreux m´ecanismes soient mis en jeu au cours de ces stress pour prot´eger le prot´eome et donc la cellule. Dans cette optique, nous avons voulu ´etudier les limites de tol´erance de l’organisme H.salinarum aux stress hypo-salins. Il est connu que lors d’une diminution rapide de la concentration en sel extracellulaire, cet organisme est lys´edu fait de la pression osmo- tique engendr´ee par la diff´erence des concentrations extracellulaire et intracellulaire en sel [103]. Ainsi, lors d’une chute brutale de la concentration en sel, en dessous de 1.5M, toutes les cellules ”explosent”. La pression osmotique va engendrer une entr´ee massive et rapide d’eau `al’int´erieur de la cellule, provoquant un gonflement de la cellule et une rupture de la membrane. Cette propri´et´eest largement utilis´ee pour lyser ces cellules par de nombreux groupes de recherche [103] . La figure 9.1 montre les courbes de croissance de cultures de Hs soumises `adiff´erentes

104 concentrations salines extracellulaires par dilution avec un milieu sans NaCl (le nombre de cellules a ´et´enormalis´epar les facteurs de dilution). Il est possible de voir qu’en dessous de 2.5M NaCl extracellulaire les cultures s’arrˆete de croitre et qu’en dessous de 2.0M la DO chute fortement (r´esultat d’une disparition des cellules due `aleur lyse).

Figure 9.1 – Effet d’une dilution avec un tampon sans sel sur une culture de H.salinarum : Une culture `a4.2M `at=0 est fractionn´ee puis chaque fraction est dilu´ee avec du milieu de croissance sans NaCl afin d’obtenir des cultures dans un milieu `a4.2M NaCl extracellulaire (losanges noirs); `a3.5M NaCl extracellulaire (losanges blancs); `a3.0M NaCl extracellulaire (ronds noirs); `a2.5M NaCl extracellulaire (ronds blancs); `a2.0M NaCl extracellulaire (triangles noirs); `a 1.5M NaCl extracellulaire (triangles blancs); `a1.0M NaCl extracellulaire (croix);a ` 0.5M NaCl extracellulaire (´etoiles)

Il est int´eressant d’´etudier ces m´ecanismes d’adaptation `ala basse salinit´ecar dans son milieu naturel, l’environnement salin de cet organisme peut compl`etement chan- ger, comme par exemple lors de fortes pluies. Par ailleurs, des ´etudes font ´etat de la pr´esence d’organismes halophiles dans des milieux non hyper-salins, comme dans le sol, l’intestin d’animaux [104], le d´esert, ... ainsi que dans des cristaux de sel [105] sur des poissons [106] ou dans des mines [107]. Cet organisme, pour survivre dans de telles situations, utilise-t-il des techniques d’´evitement ou a-t-il des propri´et´es d’adaptation permettant sa survie? De plus, la limitation d’une concentration ext´erieure, sup´erieure `a1.5M pour sa survie, ne permet pas `acet orga-

105 nisme de ce diss´eminer facilement et ne devrait pas permettre de retrouver cet orga- nisme dans des milieux non hyper-salins. Pour r´epondre `aces questions, nous avons test´ediff´erentes techniques de dilution, afin de voir si l’application de stress hypo-salins ”moins rapides” mais ayant une ”inten- sit´e” sup´erieure `acelle de 1,5M permettait d’augmenter la limite de tol´erance au stress hypo-salin et donc une survie dans des conditions non hyper-salines. Pour cela, nous avons mis au point un syst`eme exp´erimental, d´ecrit sur la figure9.2, permettant de contrˆoler la vitesse de l’ajout de solution non sal´ee aux cultures. Ainsi nous pouvons effectuer une dilution tr`es progressive pour laisser le temps `al’organisme de mettre en œuvre ses syst`emes de protection.

Figure 9.2 – Syst`eme exp´erimental permettant une dilution progressive : Syst`eme exp´erimental permettant de r´eguler la vitesse de dilution par le biais d’une pompe p´eristaltique d’une culture avec un milieu de culture sans NaCl et donc d’obtenir un stress dont la progressivit´eest contrˆol´ee.

106 9.1 R´esultats

9.1.1 Halobacterium salinarum peut survivre `ades condi- tions hypo-salines extracellulaires

Grˆace au syst`eme d´ecrit dans le chapitre pr´ec´edent (figure 9.2), il a ´et´epossible de contrˆoler la vitesse de dilution des cultures et donc la progressivit´edu stress. Nous avons essay´eplusieurs vitesses de dilution pour passer de 4.2M `a0.5M : 2 jours / 5 jours que nous avons compar´e`aune dilution par ajout en 10 ´etapes de forts volumes de milieu sans sel, le tout, fait en 1 heure ou en 2 jours. Le dispositif exp´erimental ne permet pas de r´ealiser en mˆeme temps toutes ces techniques de dilution et donc il n’est pas possible de r´ealiser ces exp´eriences sur une mˆeme culture. De ce fait il est important d’essayer de travailler avec des cultures aux propri´et´esimilaires (mˆeme DO, mˆeme vitesse de division, mˆeme aspect des cellules). Aux cours des stress, un comptage du nombre de cellules (par microscopie sur lame de Neubaueur, voir 13.2.3)), ainsi qu’une mesure du taux de mortalit´e(coloration des cellules vivantes et des cellules mortes par les composant du kit Live/Dead d’Invitrogen et r´ev´el´ees par microscopie fluorescence, voir 13.2.4) a ´et´eeffectu´ee `achaque diminution de 0.5M de la concentration totale en NaCl de la culture (figure 9.4). Au cours des mesures de viabilit´eavec le kit Live/Dead, qui colore en vert les cellules vivantes et en rouge les cellules mortes, tr`es peu de cellules mortes ont ´et´eobserv´ees (moins de 5%) quelque soit l’intensit´edu stress (exemple de r´esultats obtenue par la coloration live dead voir figure 9.3).

107 Figure 9.3 – Micrographies de cellules d’H.salinarum en condition de crois- sance normale (4,2M) et soumis en fin d’un stress progressif de 5 jours (concentration extracellulaire en NaCL = 0,5M.) Les cellules ont ´et´eincub´ees avec le kit Live/dead d’Invitrog`ene pendant 15 minutes dans l’obscurit´e, la coloration ”verte” marque toute les cellules, la coloration ”rouge” marque uniquement les cellules mortes. La barre blanche correspond `aune ´echelle de 10 µm .

Le kit Live/Dead d’Invitrog`ene est compos´ed’intercalants fluorog´eniques de l’ADN, qui vont p´en´etrer de diff´erentes fa¸cons dans la cellule : le colorant vert passe les mem- branes librement et va donc s’intercaler et color´etoutes les cellules; le colorant rouge ne peut passer que les membranes non intactes (signe de mortalit´ecellulaire) et donc ne colore que des cellules aux parois endommag´ees (pour plus de pr´ecisions, voir le chapitre Mat´eriel et M´ethodes). Cette valeur de mortalit´emesur´ee par le biais du kit Invitrog`ene ne correspond pas `ala viabilit´er´eelle des cellules stress´ees, en effet les cel- lules qui ne r´esistent pas au choc osmotique vont exploser pour la plupart, ne seront pas visibles en microscopie et donc par coloration Live/Dead. Pour visualiser la quantit´ede cellules survivantes, il vaut donc mieux regarder la fluctuation du nombre de cellules totales dans chaque culture et normaliser ce r´esultat par les mesures de viabilit´eavec le test Live/Dead. Enfin il est `anot´eque la ”viabilit´e” mesur´ee ne correspond pas `a la survie dans la gamme de concentration en sel extracellulaire comprise entre 4.2M

108 et 2.0M, car il faut plus d’1 jour (sauf pour la descente en ´etape en 1 heure) pour arriver `aune concentration en sel du milieu proche de 2.0M et pendant cette p´eriode il y a encore une croissance cellulaire et/ou un turn-over sup´erieur `a1. En dessous de 2.0M nous pouvons estimer que nous observons bien directement la viabilit´edes cel- lules survivantes au stress, vu que normalement la croissance est compl`etement stopp´ee.

Figure 9.4 – Viabilit´ede H.salinarum lors du passage de 4.2M `a0.5M en fonction de la vitesse de dilution des cultures avec un tampon sans sel : cette mesure de viabilit´emet en jeu le nombre de cellule compt´epar microscopie, ainsi que les r´esultats obtenus par le test Live/Dead sur les cellules. Les courbes correspondent `aune dilution en 1 heure par ajout de 10 volumes de milieu 0M NaCl (ronds) ; `aune dilution en 2 jours par ajout de 10 volumes de milieu 0M NaCl (triangles) ; `aune dilution progressive en 2 jours avec la pompe p´eristaltique (losanges) ; `aune dilution progressive en 5 jours avec la pompe p´eristaltique (croix)

Nous pouvons ainsi voir que le taux de survie des cellules d´epend du temps qui leur est laiss´epour s’adapter et non de l’intensit´efinale du stress (voir figure 9.4). Pour des

109 dilution par 10 ajout successif de volume de tampon sans sel, il est possible de voir une tr`es forte mortalit´equand la concentration en NaCl du milieu passe en dessous de 2.0M, par contre il est possible d’observer que plus la vitesse de dilution est lente plus le nombre de ”survivant” augmente. Ainsi, il est possible d’obtenir une ”viabilit´e” finale proche de 100% `aune concentration de 0.5M, pour une dilution tr`es progressive de 5 jours. En prenant en compte le fait que lors des premiers jours il y a eu des divisions cellulaires (la croissance ne s’arrˆete pas et le turn over est superieur `a1), la valeur de ”viabilit´e” obtenue proche de 100% n’est pas r´eelle si on en se fie uniquement au nombre de cel- lules, il serait plus exact d’estimer que la survie au stress est de l’ordre de 80% en fin d’exp´erience.

Des ´etudes de ”red´emarrage” ont ´et´er´ealis´ees en milieu liquide et en milieu solide. L’´etude n’´etant pas compl`ete et peu r´ep´et´ee, aucune figure de r´esultats n’est montr´ee dans ce document. En milieu liquide, nous ajoutons progressivement du sel au mi- lieu jusqu’`aune concentration en NaCl extracellulaire de 4,2M. Nous avons test´ede ”red´emarrer” des cellules stress´ees aux diff´erentes ”concentrations ´etapes”, soit 3,5M- 3,0M-2,5M-2,0M-1,5M-1,0M-0,5M. Il est `anot´eque dans tous les cas, nous avons ob- serv´eun red´emarrage de la croissance cellulaire, mais que plus le stress ´etait intense (plus la concentration en sel ´etait basse), plus le red´emarrage ´etait lent, avec un temps de latence de quelques jours pour un red´emarrage `a1,0M et de plusieurs semaines pour un red´emarrage `a0,5M. Pour ´etudier le red´emarrage en milieu solide, il a fallu contourner le probl`eme du choc osmotique dˆu`al’´etalement sur un milieu solide riche en sel. Pour cela un syst`eme d’augmentation de la concentration en sel progressif en milieu solide a ´et´etest´e:

110 Figure 9.5 – Syst`eme de milieu solide pour ´etaler des cellules adapt´ees : `agauche et au centre, explication des diff´erentes couches du milieu solide; `adroite, colonies de cultures d’ H.salinarum pr´ealablement soumises `aun stress basse salinit´e de 0,5M NaCl extracellulaire.

Avec ce genre de milieu solide form´ede couches de diff´erentes concentrations en sel, il est possible d’´etaler des cellules stress´ees sur un environnement similaire en sel `aleur milieu environnant. Les milieux solides ne sont pas fig´es : il va y avoir un ´equilibrage progressif en sel entre les diff´erentes couches au cours du temps, laissant ainsi le temps aux cellules de ”s’adapter” aux nouvelles conditions environnementales et en limitant ainsi le choc osmotique. Pour l’instant, seule cette exp´erience, de red´emarrage de culture `a0,5M a ´et´er´ealis´ee et doit ˆetre reproduite; de plus il est `anoter que les premi`eres colonies sont apparues 4 semaines apr`es ´etalement.

Jusqu’a pr´esent, il ´etait de notori´et´epublique que l’organisme H.salinarum , ne pou- vait survivre dans des conditions salines extracellulaires inf´erieures `a2,0M [103] [37] [108]. Nous d´emontrons, ici que cet organisme `ala capacit´e de survivre en pr´esence de faibles concentrations salines et qu’il est ”capable” de recommencer `acroitre si la concentration saline du milieux redevient optimale pour lui. Dans le chapitre pr´ec´edent (voir figure 8.16), nous avons pu observ´eune chute de la

111 concentration intracellulaire en K + lors de baisses des concentrations extracelluaires en NaCl, qui engendraient une perturbation de la dynamique du prot´eome. Il devient int´eressant de mesurer la concentration intracellulaire en K + dans ces conditions hypo- salines ”extrˆemes”.

9.1.2 Mesure de la concentration intracellulaire en K + au cours de stress hypo-salins progressifs.

Nous avons mesur´ela concentration en K+ dans nos cellules au cours du ph´enom`ene d’adaptation morphologique au stress hypo-salin. Pour cela, des fractions de cellules ont ´et´epr´elev´ees au cours du stress progressif de 5 jours par pallier de 0,5M NaCl du milieu de culture (soit 4,2M-3,5M-3,0M-2,5M-2,0M- 1,5M-1,0M-0,5M), ainsi que pour une culture soumise `aun stress par ajout successif de milieu non sal´ependant 1 heure. Les ´echantillons pr´elev´es sont ensuite fractionn´es en fractions de 1mL, culott´es, lav´es avec un tampon sans KCl, puis transf´er´es dans 10mL + d’H 2O distill´e, soniqu´eet le K est mesur´epar spectrophotometrie de flamme (ICP) (r´esultat figure 9.6).

112 Figure 9.6 – Suivi de la concentration en K+ `al’int´erieur du cytoplasme au cours d’un stress bas sel : au cours d’un stress progressif (carr´es + trait gras) et au cours d’un stress par ´etape en 1 heure (´etoiles + trait fin). Mesure effectu´ee par spectrom´etrie de flamme.

Bien que nous ne soyons pas dans les mˆemes conditions de stress hypo-salin, il est `anoter que nos mesures d’K + intracellulaires sont proches de celles de la litt´erature [37].Nous pouvons voir que jusqu’`a2,5M d’NaCl extracellulaire (concentration o`ul’or- ganisme arrive encore `acroˆıtre), il y a une l´eg`ere r´etention de la concentration en K+, l’effet de r´etention est encore plus visible sur les mesures de concentration pour le stress par ´etape (trait fin figure 9.6). Cette diff´erence de r´etention du K + entre les deux exp´eriences pourrais s’expliquer par le fait que nous avons laiss´etr`es peu de temps de latence pour le stress par ”´etape” entre la dilution (donc le d´ebut du stress) et

113 l’´echantillonnage (fin du stress). Il est `anoter que dans cette gamme de concentration, c’est `adire sup´erieure `a2,5M la majorit´edes prot´eines restent encore stables [29] [31]. Par contre en dessous de 2M de NaCl extracellulaire la concentration en K+ chute pour les deux syst`emes exp´erimentaux, de plus il est `arappeler que ces conditions sont susceptibles de perturber l’int´egrit´edu prot´eome. Dans ce cas, les cellules n’arrivent pas `amaintenir une concentration optimale en K+ interne en dessous de 2M NaCl extracellulaire. On peut supposer que l’activit´edes pompes `a K+ n’est pas suffisante pour contrer les effets de la pression osmotique engendr´ee par ce type de stress ou que la faible concentration en K + provoque des d´enaturations de nombreuses prot´eines qui empˆeche la cellule de fonctionner normalement et donc de maintenir le sel dans son cytoplasme. Une autre option serait pour ces cellules d’´evacuer le K + interne afin d’´eviter la destruction de leur paroi par la pression osmotique. Cette derni`ere hypoth`ese pourrais ˆetre en accord avec l’observation suivante : pour le stress par ´etape en 1 heure `apartir de 1,5M NaCl du milieu, la majorit´edes cellules sont lys´es et on obtient donc une mesure du K + proche de 0. Etant donn´ela forte baisse de salinit´eintracellulaire, l’ensemble du prot´eome doit ˆetre soumis `ade fortes perturbations (voir le chapitre 8). Ces basses concentrations en sel intracellulaire devraient provoquer la d´enaturation de la majorit´edes prot´eines halo- philes, ce qui entrainerais une grande toxicit´ecytoplasmique et qui devrait donc ˆetre l´etal pour l’organisme. Or, comme vu pr´ec´edemment par les mesures de viabilit´ece n’est pas le cas : une majorit´ede cellules ”survive” et recommence `acroitre lorsque la concentration en sel redevient favorable. Des m´ecanismes de protections du prot´eome doivent donc ˆetre mis en jeux pour contrer cette baisse de salinit´eintracellulaire et permettre la survie des cellules.

114 9.1.3 La survie des cellules en condition de basse salinit´es’ac- compagne de changement morphologiques

Au cours des diff´erents comptages de cellules et de tests de viabilit´e, il a ´et´epossible observ´eque les cellules d’ Halobacterium salinarum , ayant normalement une forme de bˆatonnet, se transformaient en cellules sph´eriques lors de stress basse salinit´e(figure 9.7). Il est a not´eque cette transformation avait d´ej`a´et´eobserv´ee [103], mais pas ana- lys´ee et mis en rapport avec une survie en conditions hypo-salines.

Figure 9.7 – Comparaison de la forme des cellules d’ Halobacterium sali- narum `adiff´erentes concentrations extracellulaires de NaCl. Les stress sont appliqu´es par dilutions progressives avec un milieu sans sel pendant un total de 5 jours (pour passe de 4,2M `a0,5M) `al’aide d’une pompe p´eristaltique. Micrographies par contraste de phase.

115 Les cellules ont une forme de bˆatonnet en condition normale (4,2M de NaCl ex- tracellulaire) et cela jusqu’`aenviron 2,5M. Puis il est possible de voir qu’`apartir de 2,5M , un changement drastique de forme des cellules s’effectue : les cellules r´etr´ecissent et deviennent globulaires. Il est `anoter que nous avons pu observer que des cellules `a3,0M conserve leur forme de bˆatonnet et cela pendant plus de 3 jours (nous n’avons pas observ´eleur forme apr`es ce laps de temps).

Le changement morphologique observ´edes cellules de la forme en bˆatonnet vers une forme sph´erique ”r´esistante `ala basse salinit´e”, pouvait s’apparenter `aune forme de sporulation. La sporulation est un m´ecanisme utilis´epar certaines bact´eries pour ”survivre” (conser- ver une ou plusieurs copies de l’ADN) lors d’un stress l´etal pour l’organisme [109], la forme spore ´etant une forme de latence capable de r´esister `ade nombreux stress. La formation de la pr´e-spore commence par le d´edoublement du chromosome, puis par l’arrangement du mat´eriel nucl´eaire en forme de bˆatonnet axial. Ensuite, un septum (cloison membranaire) transversal asym´etrique se forme `a partir de la membrane plas- mique [109]. Pour identifier, si notre ph´enom`ene de transformation est une sporulation ou non, la coloration des membranes cellulaires (colorant FM 4-64, voir 15.1.1 ) va permettre d’observer l’apparition du septum lors du ph´enom`ene. Pour visualiser cela, il est possible de suivre en temps r´eel l’application du stress bas sel sur une cellules et ainsi ”assister” `ason changement de forme, par microscopie par contraste de phase et par fluorescence. Pour cela, un ´echantillon de culture cellulaire est d´epos´eentre lame et lamelle de microscopie et est observ´eau microscope. Pendant l’observation, il est possible d’injecter du milieu sans sel entre la lame et la lamelle, provoquant ainsi une diminution rapide de la concentration en sel. Le changement de forme d´ependant de la concentration en sel extracellulaire, il est possible d’observer en direct et en quelques minutes le changement de forme des cellules d’ H.salinarum pr´ealablement incub´ees avec du colorant FM4-64 (r´esultat figure 9.8). Il est `anoter que

116 ce genre d’exp´erience ne permet pas de contrˆoler exactement la concentration en sel du milieu et le r´esultats pr´esent´ecorrespond donc `aune simulation de chocs hypo-salins. Si l’ajout de tampon sans sel est trop important, cela peut provoquer la lyse imm´ediate de toutes les cellules.

Figure 9.8 – Changement morphologique au cours d’un stress bas sel visua- lis´een temps r´eel. En haut : photographies des ´etapes de transformation d’une cellule d’ Halobact´erium salinarum au microscope photonique, le colorant orange FM 4-64 a ´et´eutilis´epour colorer la membrane. En bas : micrographie r´ealis´ee par mi- croscopie ´electronique par balayage de cellule d’ Halobact´erium salinarum en cours de transformation, dont la forme est comparable `acelle observ´ee en ”temps r´eel” au mi- croscope photonique.

117 Le fait de ne pas voir le septum par le changement morphologique en temps r´eel permet d’exclure le m´ecanisme de sporulation. Il s’agit d’un ph´enom`ene dynamique d´ependant de la concentration en sel. En compa- rant l’observation du changement morphologique en temps r´eel et la forme des cellules ”adapt´ees” aux diff´erentes concentrations extracellulaires en NaCl, il est possible de d´ecrire ce ph´enom`ene : A 3,0M NaCl extracellulaires, on distingue nettement la forme d’une coque `aune extr´emit´edu bˆatonnet. Puis, plus on baisse la concentration extracellulaire en sel, plus la partie bˆatonnet de la cellule se raccourcit et la zone sph´erique augmente. A` 1,5M NaCl extracellulaire, 80% des cellules ont une forme ovo¨ıdale. A partir de 1,0M NaCl extracellulaire, les cellules sont toutes rondes. De plus, si nous r´e-incubons ces cellules en forme de ”spore” dans un milieu optimum, la croissance recommence au bout de 3 semaines environ (exp´erience r´ealis´ee en milieu liquide et en milieu solide voir figure 9.5). Nous sommes en pr´esence d’un nouveau ph´enom`ene de survie cellulaire.

Pour analyser ces changements de forme plus en d´etail, l’utilisation d’un micro- scope par contraste de phase n’est pas suffisant. Avec le collaboration de D.Phenel et G.Schoehn du laboratoire de Microscopie Electronique et M´ethodes de l’IBS , il a ´et´e possible de visualiser les diff´erentes formes des cellules soumises au stress bas sel, par microscopie ´electronique par coloration n´egative, par coupe et par balayage. Remarque : toutes les exp´eriences de microscopie ´electronique ont ´et´er´ealis´ees sur des cultures adapt´ees `aune concentration en sel extracellulaire de 1M au minimum. L’obtention de cellules stables `a0.5M pour la microscopie (pouvant subir des centrifu- gations, ainsi que tous les traitements pour fixer les cellules) a ´et´eun aspect du sujet de stage de Camille Cibot (´etudiante en Master 2), des probl`emes de cristallisation (formation de cristaux autour des membranes) sont apparus et ont rendu ses obser- vations peut fiables. Ces observations doivent ˆetre encore reproduites et ne sont donc pas trait´ees dans cette th`ese. Nous comparons ici uniquement des cellules en conditions

118 normales avec des cellules en conditions de stress bas sel `a 1M. Donc pour compl´eter les observations faites en microscopie par contraste de phase, les cellules ont aussi ´et´eobserv´ees en microscopie `atransmission afin d’obtenir une meilleure r´esolution de l’observation. En effet cette technique permet d’obtenir un grossissement d’observation 500 fois sup´erieur `acelui de la microscopie par contraste de phase. L’observation des cellules par la microscopie `abalayage va quand `aelle permettre une analyse plus fine des cellules en trois dimensions, pour une meilleure visualisation de leurs surfaces. L’observation des coupes de Halobacterium salinarum par Microscopie ´electronique en transmission, permet d’obtenir des informations sur l’´epaisseur des parois cellulaires et des informations sur la densit´edu cytosol. Pour r´ealiser les exp´eriences de microscopie ´electronique par coloration n´egative, des cellules cultiv´ees en conditions normales ou soumises `aun stress hypo-salin (1M NaCl extracellulaire) sont fix´ees avec du formald´ehyde (4%) et du glutarald´ehyde (2,5%), pendant une nuit, sous agitation `a4˚C. Une partie des cellules fix´ees sont d´epos´es sur une grille de mica recouverte de carbone, puis l’´echantillon est color´en´egativement avec de l’ac´etate d’uranyle. L’´echantillon peut ensuite ˆetre visualis´een microscopie ´electronique avec le ”Microscope Philips CM12”(voir r´esultats figure 9.9).

119 Figure 9.9 – Comparaison des cellules en conditions normales et apr`es un stress bas sel (1M) par microscopie : par microscopie par contraste de phase (A et A’), microscopie ´electronique `acoloration n´egative (B et B’), microscopie ´electronique en coupe de r´esine (C et C’) et microscopie ´electronique `a balayage (D1/D2/D3 et D’1/D’2/D’3). La microscopie ´electronique a ´et´er´ealis´ee par Daphna Fenel du labora- toire de Microscopie Electronique et M´ethodes de l’IBS.

120 Pour r´ealiser les exp´eriences de microscopie ´electronique par transmission de coupe, les cellules cultiv´ees en conditions normales ou soumisesa ` un stress hypo-salin (1M NaCl extracellulaire) sont fix´ees cette fois-ci avec du paraformald´ehyde (1%) et du glutarald´ehyde (1,25%), pendant 4h `atemp´erature ambiante. Puis une autre s´erie de fixation est r´ealis´ee avec du tetroxide d’osmium, puis avec de l’acide uranyle. Enfin l’´echantillon est d´eshydrat´e`al’´ethanol, puis incub´eavec de la r´esine pendant 48h. En- suite des coupes ultra-fines des cellules prisonni`eres de la r´esine sont r´ealis´ees `al’aide d’un microtome. Enfin une coloration `al’ac´etate d’uranyle est r´ealis´ee afin de visuali- ser les coupes cellulaires par le biais d’un microscope ´electronique (voir r´esultats figure 9.9). Pour r´ealiser les exp´eriences de microscopie ´electronique balayage, on s`eche directe- ment les culots cellulaires sur une plaque de silicium. Puis on m´etallise l’´echantillon par l’ajout d’une couche de platine, avant de pouvoir le visualiser (voir r´esultats figure 9.9).

Ces exp´eriences de microscopie ´electronique permette d’estimer plus pr´ecis´ement les diff´erentes formes des cellules d’ H.salinarum . En condition normale la majorit´edes cellules ont une forme de bˆatonnet (9.9 D1) de 3 et 10 µm de long et environ 0.45 `a0.65 µm de large (9.9 B, D2 et D3). Le cytosol de ces cellules apparait dense aux ´electrons (9.9 C). En conditions de stress, la majorit´edes cellules ((9.9 D’1) ont une forme ovo¨ıdale, d’en- viron 1 µm de diam`etre (9.9 B’, D’2 et D’3), nous pouvons remarquer que ces formes adapt´ees n’ont pas une forme cylindrique parfaite. Nous pouvons ainsi voir que dans ces conditions de stress, le cytosol reste dense aux ´electrons(9.9 C’), mais aussi qu’il n’y a pas d’´epaississement de la membrane.

121 9.1.4 Mise en ´evidence d’une nouvelle forme d’adaptation au stress.

Comparaison du volume cellulaire et de la surface de la membrane des diff´erentes formes morphologiques de H.salinarum .

En analysant des photographies de microscopie par contraste de phase et en utili- sant le logiciel ImageJ il est possible de comparer le volume et la surface moyenne des cellules normales et stress´ees (figure 9.10). Pour les cellules en forme de bˆatonnet, nous estimons que leur forme est proche du cylindre et pour les cellules ovo¨ıde, proche de la sph`ere.

Figure 9.10 – Comparaison de la surface de la membrane et du volume de la cellule en forme bˆatonnet (gris fonc´e) et en forme de sph`ere (gris clair). Pour le calcul des cellules, 200 cellules en conditions normales et stress´ees ont ´et´emesur´ees `al’aide du logiciel ImageJ sur des micrographies par contraste de phase. Il a ´et´eestim´e pour simplifier les calculs que la forme de bˆatonnet correspondait `aun cylindre et la forme ovo¨ıde `aune sph`ere.

Il est possible d’observer lors de ce changement morphologique, qu’il n’y a pas de gonflement de la cellule (le volume change peu) et mˆeme que la surface totale de la cellule est r´eduite. Il n’est pas ´etonnant de voir aucun gonflement des cellules, car ces organismes pr´esente une structure particuli`ere monolipidique de leur membrane qui

122 pourrait empˆecher la dilatation des membranes. Si la pression osmotique est trop im- portante les cellules ne gonflent pas et ´eclatent directement lorsque la force engendrait par la pression devient trop importante.

A la vue de ces observations, il est possible d’´emettre deux hypoth`eses : – Hypoth`ese 1 : les cellules essaie de maintenir leur concentration en sel intra- cellulaire en bloquant tous les ´echanges avec le milieu extracellulaire ( et ainsi conserver le potassium intracellulaire), elles prot`egent ainsi leur prot´eome de la baisse de salinit´e. Dans cette hypoth`ese les cellules doivent subir une pression osmotique ´enorme. Pour pallier cette contrainte physique, les cellules changent de forme pour diminuer la surface d’´echange et prendre une forme sph´erique plus optimale. D’apr`es les mesures de sel intracellulaire effectu´ees, cette hypoth`ese pourrait ˆetre valable pour une concentration en sel extracellulaire sup´erieure `a 2,5M, en-dessous de cette concentration, nous observons une diminution drastique de la concentration en sel intracellulaire. – Hypoth`ese 2 : les cellules expulsent ou laissent sortir le sel `al’ext´erieur de leur cytoplasme, ainsi la diff´erence de pression osmotique ne fait pas rentrer de l’eau en masse. Par contre, dans ces conditions, les prot´eines halophiles vont probable- ment ˆetre d´enatur´ees en masse du fait de leur repliement sel d´ependant. Il faudrait donc une induction des syst`emes de protection des prot´eines (solut´ecompatible, induction de chaperonne, ...) et de d´egradation (prot´eases) pour r´ecup´erer ou ´eliminer toutes les prot´eines superflues et d´enatur´ees. Le changement morpholo- gique est dˆu`ala d´egradation de nombreux composants de la cellule et peut-ˆetre d’un cyto-squelette primitif ou de l’exo-squelette(S-layer).

Etude de la composition globale du prot´eome au cours du stress progressif.

Pour voir si ces changements morphologiques et la chute importante de la concen- tration saline intracellulaire s’accompagnent de changements dans la composition du prot´eome (d´egradations, accumulation,..), nous avons amorc´es des analyses sur la com-

123 position des extraits prot´eiques de nos cellules au cours du stress progressif. Pour cela nous avons d´epos´eles extraits prot´eiques cytoplasmiques (S30) sur un gel de s´eparation des prot´eines (SDS/PAGE 12% voir chapitre 14.4.1 (r´esultats figure 9.11).

Figure 9.11 – Etat du prot´eome lors d’un stress salin progressif : analyse par gel SDS/PAGE 12% d´enaturant color´eau bleu de Coomassie, des prot´eines des extraits cytoplasmiques d’ H.salinarum soumissent `aun stress basse salinit´eprogressive. La l´egende du haut correspond `ala concentration extracellulaire en NaCl.

Nous pouvons voir que de 4,2M `a2,5M NaCl extracellulaire, aucune modification du prot´eome intracellulaire n’est d´etectable avec ce type d’analyse. A` partir de 2,0M NaCl, on observe une ´epuration progressive du prot´eome. Pour r´ealiser cette figure, une quantit´esimilaire de prot´eines a ´et´ed´epos´ee dans chaque puits. L’augmentation de l’intensit´edes bandes (pour des concentrations en-dessous de 2M NaCl extracellulaire) pour une mˆeme prot´eine n’est donc pas directement assimi- lable `aune induction ou `aune accumulation, mais peut seulement refl´eter la conser- vation de cette prot´eine. Si nous sommes en pr´esence du dernier cas (”conservation de cette prot´eine”), il est mis en ´evidence un effondrement de la diversit´edes prot´eines

124 sauf pour une dizaine d’entre elles. Ce dernier travail a ´et´er´ealis´epar Camille Cibot au cours de son stage de Master 2 et doit ˆetre reproduit. De plus une analyse compl`ete des diff´erentes prot´eines conserv´ees lors du stress devient une voie de recherche int´eressante pour mieux comprendre l’adap- tation au stress et les processus mis en jeu pour permettre non seulement la survie mais aussi le re-d´emarrage de la croissance lorsque ces cellules sont remises dans des condi- tions favorables. Une ´etude r´ealis´een 2008 fait ´etat d’une ”up-r´egulation” d’une poign´ee de prot´eines (dont les fonctions sont inconnues) au cours d’un choc bas sel `a2,6M et d’une ”down-r´egulation” du reste du prot´eome [110].

125 9.2 Discussion

Il est admis par la communaut´escientifique s’int´eressant aux microorganismes halo- philes extrˆemes, que les faibles conditions de salinit´ede leur environnement constituent des conditions ioniques inappropri´ees pour ces organismes [108] [37]. La plupart des prot´eines de ces organismes ne sont solubles et fonctionnelles que dans des concentra- tions de K + multimolaires dues `aune association forte du sel avec la structure des prot´eines halophiles [29]. Cette association permet une solubilit´eet une stabilit´eopti- male dans des cytoplasmes satur´es en sel. De plus, l’int´egrit´ede la membrane cellulaire d´epend de la forte concentration en cations intracellulaires, permettant de contreba- lancer la pression osmotique [37] [103]. La lyse survient donc `ades concentrations en NaCl inf´erieures ou ´egale `a1.5M [24]. Cependant, le travail effectu´eau cours de ma th`ese a permis de montrer que cette lyse n’a lieu que lors d’une baisse brutale de la salinit´eextracellulaire. Un stress ap- pliqu´ede mani`ere tr`es progressive, par dilution du milieu extracellulaire (par exemple avec une pompe p´eristaltique) permet au cellules de survivre `ade faibles concentra- tions salines extracellulaires. Cette technique permet de mimer ce que ces organismes pourraient subir dans leur environnement naturel lors de pluies ou inondations. Bien qu’elles ne soient plus capables de se diviser (forme de latence ou turn over proche de 1), ces cellules se maintiennent pendant plusieurs semaines, `aune concentration saline ´equivalente `acelle de l’eau de mer (0.5M NaCl). La caract´erisation par microscopie photonique et ´electronique du m´ecanisme de trans- formation morphologique associ´e`ace type de stress a permis de d´ecrire le processus de r´etractation de la forme de bˆatonnet d’ H. salinarum menant vers une forme ovo¨ıdale. Ce m´ecanisme qui n’est pas une sporulation, est dynamique et d´ependant de la concen- tration en sel extracellulaire. L’observation de la diminution de la surface des cellules sans changement drastique du volume limiterait les interactions de H. salinarum avec l’ext´erieur et les risques de chocs osmotiques. Aucun ´epaississement de la paroi n’est observ´e. Ceci sugg`ere qu’une

126 r´eduction ou un r´earrangement de la membrane a eu lieu. Ces donn´ees soutiennent l’hypoth`ese de la protection des cellules par le changement de forme et par la r´etention du sel `al’int´erieur du cytoplasme, dans le sens o`udans une premi`ere ´etape (jusqu’`aune concentration extracellulaire en NaCl sup´erieure `a2,0M), cette r´eponse va permettre de gagner du temps pour la cellule, afin que celle-ci puisse cr´eer suffisamment de prot´eines ou de compos´es ”protecteurs” (prot´eines chaperonnes ou solut´es compatibles) dans des conditions favorables `a leur repliement (maintien d’une concentration en K + intracellulaire sup´erieur `a2M) ou bien que la machinerie cellulaire soit encore capable de produire certaines prot´eines peu halophile composant une sorte de kit de survie `ala basse salinit´eet pouvant permettre le red´emarrage des cellules lorsque les conditions saline extracellulaire redeviennent favorables.

Mais cette r´eponse n’est que transitoire et non suffisante en cas de stress de forte intensit´eo`ule syst`eme de r´etention en sel (pompes sodium potassium) n’est plus ca- pable de maintenir le gradient de cation. En dessous de la concentration critique de 2M d’NaCl extracellulaire et si le stress est tr`es progressif, laissant ainsi le temps `ala cellule de prot´eger certains de ses composants (dont une dizaine de prot´eines), les r´esultats soutiennent plutˆot une deuxi`eme hypoth`ese qui est que les cellules ne retiennent plus le sel en leur cytoplasme et utilisent d’autres syst`emes de protection comme les prot´eines chaperonnes, des osmoportectants,... En effet, lors de cette adaptation progressive `ala basse salinit´e, nous pouvons observer une clarification massive du prot´eome ou une ”super” induction de quelques prot´eines. Cette modification du prot´eome des cellules en-dessous de 2,5M NaCl peut ˆetre mis en relation avec l’incapacit´edes cellules `ase diviser en-dessous de cette concentra- tion, gardant ainsi le maximum d’´energie pour activer les syst`emes de protections. Les m´ecanismes cellulaires responsables, `asavoir la modification du transcriptome, la destruction et/ou la stabilisation de prot´eines sont encore `aidentifier [110]. La clari- fication du prot´eome serait une strat´egie indispensable pour limiter la production de prot´eines et ainsi ´eviter la forte toxicit´ed’une agr´egation massive des prot´eines dans

127 le cytoplasme. Il serait ´egalement int´eressant de savoir si les prot´eines conserv´ees dans ces conditions sont celles qui ont des propri´et´es non halophiles leur permettant de rester fonctionnelles dans de telles conditions. On peut aussi penser que les prot´eines maintenues ont une fonction indispensable pour le maintien de l’int´egrit´ecellulaire (synth`ese d’osmoprotectants [111]) ou qu’elles repr´esentent le kit minimum de survie indispensable pour maintenir une activit´em´etabolique basale. Il est aussi possible que cet organisme ne conserve que des prot´eines destin´ees `aassurer le red´emarrage du m´etabolisme apr`es la phase de latence. Ce m´ecanisme de latence permettrait d’expliquer la colonisation d’espaces hyper-salins favorables `aces organismes, par le passage dans des zones hypo-salines telles que la mer et la pr´esence de nombreux halophiles dans les sols et d’autres environnements hypo-salins [104].

Dans cette perspective, il faudrait explorer l’induction des prot´eines chaperonnes, des prot´eases et des solut´es compatibles au cours du stress hypo-salin. Une ´etude a ´et´e amorc´ee, o`uil est question du rˆole du complexe prot´easome et d’une prot´eine chape- ronne, dans des conditions de stress (hypo-salin et thermique), les r´esultats sont trait´es dans le chapitre suivant (voir chapitre III).

Le dosage des solut´es compatibles sera r´ealis´edans un futur proche par RMN. De plus, une mesure de l’ADN 16s par marquage (technique Fish) pourrait ˆetre n´ecessaire pour ”prouver ” que toutes nos cellules adapt´ees sont bien en r´ealit´edes Halobacterium salinarum et non un contaminant ext´erieur viable `a0.5M. Cette hypoth`ese semble peu probable car nous avons bien identifi´ele changement morphologique des cellules et nous ne voyons pas de croissance `a0.5M (car si nous avions un contaminant, cela voudrait dire qu’il poss`ede un turn-over (division/mort cellulaire) ´egal `a1). De plus, mˆeme si le red´emarrage apr`es un stress intense est long (autour de 3 semaines), nous l’avons confirm´een milieu liquide et en milieu solide.

128 Troisi`eme partie

Contribution `ala compr´ehension du rˆole du syst`eme prot´eolytique PAN-prot´easome chez l’Archaea halophile extrˆeme Halobacterium salinarum

129 Chapitre 10

R´esume de l’article 1 voir annexe 16 : R´egulation du syst`eme prot´eolytique PAN-prot´easome au cours de stress thermiques et hypo-salin chez Halobacterium salinarum.

Ce travail a ´et´epubli´edans le journal Extremophiles en Janvier 2012 ?? , il sera pr´esent´esous forme de r´esum´ed’article. L’article est joint en annexe 16. Ma contribu- tion `acet article se trouve dans l’identification et le choix des conditions de stress, ainsi que dans la r´ep´etition des exp´eriences de croissance et des tests d’activit´es en pr´esence de drogues qui inhibent l’activit´edu prot´easome.

130 10.1 Introduction

L’activit´edu prot´easome r´egule diff´erents processus cellulaires requ´erant la des- truction de prot´eine. La r´egulation du prot´easome pour le contrˆole des processus phy- siologiques cellulaires reste encore mal d´efini. Chez les Eucaryotes, la difficult´epour comprendre les processus de r´egulation est dˆuau nombre ´elev´ede sous-unit´es diff´erentes du complexe prot´easome, ainsi qu’`ala distinction de l’activit´edu prot´easome par rap- port aux autres activit´es cellulaires endopeptidasiques et enfin au cloisonnement des diff´erentes activit´es prot´eolytiques dans des organites et des v´esicules. Ce travail vise `afournir des informations sur le rˆole du syst`eme prot´easome dans la physiologie des cellules procaryotes, avec un accent sur la croissance, la r´eponse au stress et l’adap- tation halophilique. Nous avons ´etudi´ela r´egulation du syst`eme PAN-prot´easome de l’arch´ee halophile Halobacterium salinarum au cours de stress thermiques et hypo- salins. Comme vu dans les chapitre pr´ec´edents, les condition hypo-saline repr´esentent pour ce type d’organisme un stress naturel d’un genre unique, qui ce traduit par la synth`ese de nombreuses prot´eines de r´eponse au stress [112] [101] [113]. De plus cet organisme poss`ede un syst`eme prot´eolytique plus simple que celui des Eucaryotes, ce syst`eme ne comprend que deux types de sous-unit´es formant le noyau peptidase 20S et deux ATPases, PANA et PANB, formant la particule activatrice du prot´easome [114].

10.2 R´esultats

10.2.1 R´egulation de l’activit´eendopeptidasique et de la trans- cription du syst`eme PAN-prot´easome pendant la crois- sance cellulaire.

Pour montrer l’importance de la r´egulation du prot´easome pendant la croissance des arch´ees, l’activit´epeptidase du complexe 20S a ´et´e mesur´ee, ainsi que l’expression

131 des g`enes codants pour des sous-unit´es du syst`eme PAN-prot´easome. Pour cela les prot´easomes natifs ont ´et´epartiellement purifi´es au cours de la croissance cellulaire de culture d’ Halobacterium salinarum par ultracentrifugation en gradient de densit´e. Pour la visualisation de la r´egulation de l’activit´etranscriptionnelle, des exp´eriences de Northern-Blot sur les deux sous-unit´es du prot´easome ainsi que sur les deux PAN ont ´et´er´ealis´ees (pour plus de pr´ecision sur les techniques et la m´ethode utilis´ees, se r´ef´erer `al’article 16). Les profils cin´etiques de l’activit´eendopeptidasique ont montr´eque l’accumulation du prot´easome 20S est modifi´ee en fonction de l’´etat physiologique des cellules (voir r´esultats figure 10.1 et figure 10.8 du chapitre 10.3.1).

132 Figure 10.1 – Modifications de l’activit´edu prot´easome 20S et de l’ex- pression des sous-unit´es du complexe PAN-prot´easome lors de la crois- sance cellulaire chez Halobacterium . A. Mesure de l’activit´es endopeptidasique du prot´easome 20S en utilisant le substrat peptidique fluorog´enique Suc-LLVY-AMC. L’activit´epeptidasique est trac´ee en fonction de la densit´ecellulaire (DO 600nm). B. Courbe de croissance d’ Halobacterium : les chiffres en dessus des fl`eches correspondent aux diff´erents temps d’´echantillonnage utilis´es pour l’extraction des ARNs totaux. C. Analyse de l’expression des sous-unit´es du complexe PAN-prot´easome par Northern- Blot. Pour plus d’information sur les techniques exp´erimentales voir l’article en annexe

133 Un maximum d’activit´es endopeptidasiques ainsi qu’un maximum d’accumulation de transcrits des sous-unit´es du prot´easome ont ´et´emesur´es dans les extraits cellulaires en d´ebut de phase exponentielle (autour d’une DO de 0,6). Puis, pendant la phase de croissance exponentielle, une r´eduction drastique est observable pour `ala fois l’activit´e endopeptidasique (divis´ee par 3 par rapport `al’activit´e maximum mesur´ee `ala DO 0,6) et l’accumulation des ARNm. Un l´eger regain arrive en phase stationnaire (apr`es la DO 1,2). Une r´egulation transcriptionnelle semblable a ´egalement ´et´eobserv´ee pour les deux sous-unit´es activatrices PAN.

Un changement de l’activit´edu prot´easome avait d´ej`a´et´eobserv´ee au cours de la croissance chez la levure o`ul’assemblage du prot´easome 20S est n´ecessaire pour la sur- vie durant la phase stationnaire [115]. Chez les arch´ees, une accumulation du niveau des transcripts du prot´easome avait aussi ´et´ed´etect´ee chez Haloferax volcanii au cours de la phase stationnaire [116]. Prises ensembles, ces observations sugg`erent que la r´egulation transcriptionnelle intervient sur tous les composants du syst`eme Pan-prot´easome et que cette r´egulation est importante pour le contrˆole de l’activit´eprot´eolytique intracel- lulaire en fonction de la phase de croissance. L’augmentation observ´ee dans l’activit´e prot´eolytiques combin´ee avec l’accumulation cellulaire du complexe prot´eolytique PAN- prot´easome pourrait ˆetre n´ecessaire pour ´eliminer les produits d´efectueux r´esultants de la traduction ribosomale en d´ebut de croissance c’est-`a-dire lorsque les cellules sont en train de traduire activement de nouvelles prot´eines, mais aussi pour l’´elimination de prot´eines ind´esirables `ades fins m´etaboliques ou de r´egulations au cours de la phase stationnaire.

134 10.2.2 R´egulation de l’activit´eendopeptidasique et de la trans- cription du syst`eme PAN-prot´easome au cours de la r´eponse aux stress.

Chez les micro-organismes, les stress de nature physique provoquent des chan- gements de conformation des prot´eines intracellulaires. S’il est bien connu que les prot´eines chaperonnes sont induites dans ces conditions chez les arch´ees, la r´egulation du syst`eme prot´easome n’est pas encore totalement d´efini. De pr´ec´edentes ´etudes de transcriptomie ont montr´e, chez les arch´ees hyperthermo- philes, que la quantit´ed’ARNm d’une des deux sous-unit´es b´eta du prot´easome ´etait augment´ee lors de stress thermiques, tandis que la quantit´ed’ARNm de la sous-unit´e alpha est en baisse [117].

Pour ´etudier la r´eponse aux stress, nous avons choisi dans ce travail, le stress ther- mique, mais aussi des conditions de stress hypo-salin pour lesquelles les prot´eines mal- repli´ees s’accumulent (voir r´esultats figures 10.2 pour le stress thermique et 10.3 pour le stress hypo-salin).

135 Figure 10.2 – Mesure de l’activit´edu prot´easome 20S et quantification de l’accumulation de transcript des quatre g`enes codant pour les sous-unit´es du syst`eme PAN-prot´easome lors d’une r´eponse `aun stress thermique chez Halobacterium .A. Activit´es endo-peptidases intracellulaires du complexe 20S. Une culture est divis´ee en deux, une partie est mise `a37˚C(triangles blancs) l’autre `a55˚C (triangles noirs). B. Analyse du nombre d’ARNm par Northern-blot des diff´erentes sous-unit´es du complexe PAN-prot´easome lors de l’application sur les cultures d’un stress thermique `a55˚C, mesures effectu´ees dans les premiers temps de la r´eponse au stress.

136 Figure 10.3 – Induction de l’activit´edu prot´easome 20S et quantification de l’accumulation de transcript des quatre g`enes codant pour les sous-unit´es du syst`eme PAN-prot´easome lors d’une r´eponse `aun stress hypo-salin chez Halobacterium .A. Activit´es endo-peptidases intracellulaires du complexe 20S. Une culture est divis´ee en deux, une partie est dilu´ee avec du milieu normal (triangles blancs) l’autre avec un milieu sans sel (triangles noirs) les volumes `aajouter sont ajust´eafin d’avoir une concentration extracellulaire en NaCl de 4,2M et 2,5M respectivement. B. Analyse du nombre d’ARNm par Northern-blot des diff´erentes sous-unit´edu complexe PAN-prot´easome lors de l’application sur les cultures d’un stress hypo-salin `a2,5M NaCl extracellulaire, mesures effectu´ees dans les premiers temps de la r´eponse au stress.

137 Apr`es l’exposition au stress, que se soit pour le stress thermique ou hypo-salin, nous avons mesur´eune augmentation significative de l’activit´e du prot´easome ainsi qu’une forte accumulation de transcripts des sous-unit´es alpha et bˆeta du prot´easome, ainsi que des deux sous-unit´es du complexe PAN.

Chez T.acidophilum, il a ´et´emontr´equ’une inhibition chimique partielle de l’acti- vit´epeptidasique 20S r´eduit consid´erablement la capacit´edes cellules `asurmonter le choc thermique [118]. En outre, les complexes du prot´easome 20S de T.acidophilum et de H.marismortui restent stables, in vitro, dans des conditions de stress thermique et de stress hypo-salin et conservent dans ces conditions une activit´eendo-peptidasique permettant la destruction des prot´eines mal repli´ees [119] [120]. Nos observations sugg`erent que, chez les arch´ees halophiles, la r´egulation transcription- nelle coordonn´ee de toutes les sous-unit´es du complexe PAN-prot´easome joue un rˆole important dans la r´eponse cellulaire aux stress environnementaux et donc dans l’adap- tation extrˆemophile pour compenser l’effet d´el´et`ere des variations de temp´erature et de sel sur la stabilit´edes prot´eines.

10.2.3 Etat d’oligom´erisation et interactions physiques des prot´eines PANA et PANB chez Halobacterium .

Les sous-unit´es activatrice AAA ATPase (donc d´ependante d’´energie) du prot´easome stimulent la d´egradation des prot´eines. Chez la levure, des ´etudes de mutagen`ese ont r´ev´el´eque les 6 diff´erentes Rpt ATPasz du prot´easome avait une grande diversit´enon- redondance de fonction [121]. Dans tous les AAA ATPases, le domaine N-terminal est indispensable pour la reconnaissance du substrat. Il a ´et´e propos´eque les motifs coiled coil (faisceau d’h´elices) pr´esents dans les r´egions N-terminales des AAA ATPases sont impliqu´es dans l’interaction des substrats prot´eiques avec le complexe, leurs interac- tions g´en´erant le processus d’oligom´erisation [122]. Chez Halobacterium , la pr´esence

138 de deux prot´eines PAN avec diff´erentes r´egions N-terminale pourrait ˆetre le signe qu’il existe, dans la physiologie cellulaire, des rˆoles et des sp´ecificit´es de substrats diff´erents pour ces deux prot´eines. Nos ´etudes par Northern-blot ont montr´eque, chez Halobacterium , que les deux sous- unit´es de PAN n’affichent pas des profils d’expression diff´erents au cours de la croissance cellulaire et lors de la r´eponse au stress. Ces donn´ees sont en faveur d’un rˆole similaire des prot´eines PANA et PANB dans la physiologie cellulaire (voir figure 10.1,10.2 et 10.3 ). Les exp´eriences de co-immunopr´ecipitations (voir r´esultats figure 10.4 ) indiquent que les deux prot´eines PAN interagissent l’une avec l’autre au sein d’extraits cellulaires d’ Halobacterium .

Figure 10.4 – D´etection par co-immunopr´ecipitation des interactions phy- siques entre les sous-unit´es ATPasiques r´egulatrices du prot´easome PANA et PANB . Des extraits prot´eiques Halobacterium ont ´et´eincub´ees avec des anticorps anti-PANA ou anti-PANB. Les complexes immuns ont ´et´epr´ecipit´es en utilisant des billes de prot´eine A s´epharose et analys´es par Western-Blot avec les anticorps anti- PANA ou anti-APNB.

Cette constatation sugg`ere que les deux sous-unit´es PAN forme des complexes h´et´ero-oligom´eriques sous forme d’anneaux au sein des cellules. Ces donn´ees s’accordent avec l’hypoth`ese que les prot´eines PANA et PANB ne sont pas sp´ecialis´ees dans des fonctions de d´egradations cellulaires diff´erentes. Cette conclusion est compatible avec un rapport sur les composants du prot´easome chez Haloferax volcanii qui montrait qu’il fallait d´el´eter les deux prot´eines PAN pour donner un ph´enotype l´etal, ce qui implique que ces deux prot´eines sont impliqu´ees dans des fonctions similaires [123]. Toutefois, il reste possible que la composition en sous-unit´es du complexe oligom´erique PAN per-

139 mette de modifier l’affinit´edu complexe pour des substrats de natures diff´erentes, ce qui pourrait ainsi permettre des r´eglages plus pr´ecis dans les profils de d´egradation des prot´eines.

10.2.4 Les cellules Halobacterium peuvent maintenir leur crois- sance cellulaire dans des conditions normales et de stress malgr´eune d´eficience du prot´easome.

Des ´etudes g´en´etiques sur la fonction du prot´easome chez Haloferax volcanii ont montr´equ’une d´el´etion des sous-unit´es b´eta du prot´easome est l´etale [123]. Par cons´equence, l’inhibition partielle du prot´easome par des inhibiteurs chimiques sp´ecifiques comme le NLVS (NIP-Leu3-vinylsulfone ou 4-hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylacetyl-Leu-Leu-leucinal- vinyl sulfone) repr´esente un outil pour ´etudier la contribution du prot´easome in vivo chez Halobacterium pendant diff´erentes fonctions cellulaires comme la croissance et la r´eponse au stress. Dans cette ´etude, nous avons utilis´ele NLVS, qui est un inhibiteur sp´ecifique du prot´easome, son action a ´et´ed´emontr´echez les eucaryotes et les arch´ees, il g´en`ere des modifications irr´eversibles sur les sous-unit´es β du prot´easome [124]. Chez les eucaryotes, l’utilisation de cet inhibiteur affecte g´en´eralement la prolif´eration cellu- laire. Dans nos exp´eriences, le taux de croissance des cellules Halobacterium n’a pas ´et´e significativement affect´emalgr´eune perte spectaculaire de l’activit´eendo-peptidasique du prot´easome 20S (voir r´esultats figures 10.5.

140 Figure 10.5 – Effets de l’inhibition du prot´easome dans des conditions nor- males de croissance ainsi que dans des conditions de choc thermique. A. Evaluation´ de l’inhibition de l’activit´edu prot´easome 20S chez Halobacterium par l’in- hibiteur sp´ecifique du prot´easome NLVS. Apr`es 8 heures de traitement des cultures cellulaires avec 30 µM de NLVS, les prot´eines ont ´et´eextraites et des quantit´es ´egales de celle-ci ont ´et´es´epar´ees sur gradient de sucrose 5-25%. L’activit´epeptidase 20S a ´et´e mesur´ee dans les diff´erentes fractions (voir article pour plus de d´etail). Les ´echantillons de cultures cellaires non trait´es sont repr´esent´es en cercles blancs ; les ´echantillons de cultures cellualires trait´es avec le NLVS sont repr´esent´es en triangles noirs; les cercles noirs correspondent `aun contrˆole n´egatif, c’est `adire un ´echantillon de culture cel- lulaire non trait´eauquel on ajoute avant le fractionnement sur gradient de sucrose 5 µM de NLVS. B. Les courbes de croissance des cultures d’ Halobacterium en pr´esence d’inhibiteur du prot´easome(30 µM de NLVS). Les cercles blancs et carr´es blancs corres- pondent aux cultures cellulaires non trait´ees cultiv´ees respectivement `a37˚C et 55˚C. Les cercles noirs et les carr´es noirs correspondent aux cultures cellulaires trait´ees et cultiv´ees respectivement `a37˚C et 55˚C.

141 Ces r´esultats impliquent qu’un niveau ´elev´ede particules 20S actives n’est pas n´ecessaire pour la croissance. Ces r´esultats sont surprenants,en effet les ´etudes enzy- matiques et d’expression g´enique rapport´ees dans ce document indiquent que l’activit´e endopeptidasique et l’expression des g`enes codants pour les sous-unit´es du complexe prot´easome sont modifi´ees lors de la croissance. Cette th´eorie peut s’expliquer par le fait qu’il est possible que d’autres prot´eases cytosoliques ou membranaires telles que Lon prennent le relais et assurent des fonctions de prot´eolyse en fonctionnant sur les mˆemes substrats que le prot´easome 20S et permettant de compenser l’activit´e”man- quante” du prot´easome dans ces conditions de croissance. Chez les eucaryotes, il a ´et´emesur´eune augmentation des activit´es peptidasiques dans le cytosol des cellules d´eficientes en prot´easome [124]. Ce r´esultat est ´egalement compatible avec l’observa- tion que, chez Haloferax volcanii , le taux de d´egradation du substrat GFP sp´ecifique du prot´easome n’a ´et´eque l´eg`erement r´eduit en pr´esence de l’inhibiteur du prot´easome clastro lactacystine [125].

L’absence de modifications significatives dans le taux de croissance et de viabilit´e des cellules d’ Halobacterium , trait´ees avec le NLVS, lors d’un choc thermique est plus surprenante. Comme indiqu´epar la forte induction de la sous-unit´edu thermosome TF55, les conditions que nous avons utilis´ees devraient provoquer une accumulation d´el´et`ere de prot´eines mal-repli´ees dans le cytosol. Avec une d´et´erioration importante de l’activit´eenzymatique du prot´easome, on devrait s’attendre `aun effet drastique sur la capacit´edes cellules `asurmonter les conditions de stress environnementaux. Comme mentionn´eplus haut, le fait de ne pas avoir de profil diff´erent lors de la croissance des cultures soumises ou non `ala drogue, pourrait ˆetre dˆu `al’activation ou la sur- expression d’autres syst`emes prot´eolytiques compensatoires. Mais chez Thermoplasma acidophilum, des exp´eriences similaires de stress utilisant aussi l’inhibiteur NLVS, ont montr´edes effets graves sur la croissance cellulaire [118]. Les halophiles ont ´evolu´e pour r´esister aux multiples stress extrˆemes de leur environnement hyper-salin comme la temp´erature, le sel, le rayonnement, les m´etaux lourds ; il est possible que ces orga-

142 nismes aient d´evelopp´eune limite de tol´erance sup´erieure envers le stress par rapport `ad’autres arch´ees, par le biais de syst`emes de protection comme les chaperonnes, mais aussi par le biais de syst`emes prot´eolytique compensatoire ou plus efficaces.

10.3 Donn´ees suppl´ementaires `al’article 16 : Etude de l’effet de diff´erentes drogues sur l’activit´e du prot´easome de Halobacterium salinarum in vitro et in vivo

Dans le cadre de l’article 16, la drogue inhibitrice du prot´easome NLVS a ´et´eutilis´ee. Au cours de cette pr´ec´edente ´etude,une activit´eendopeptidasique fut observ´ee dans les fractions de bas poids mol´eculaire. En r´eponse au blocage du prot´easome par le NLVS, l’activit´edans ces fractions de bas poids mol´eculaire augmentait de fa¸con significative et pouvait donc venir compenser la perte d’activit´eli´eau prot´easome bloqu´e(tous ces r´esultats ne sont pas montr´es dans l’article 16). Nous avons entam´ecette ´etude sur d’autres drogues inhibitrices du prot´easome car la drogue NLVS n’est plus commercialis´ee `ace jour. Les r´esultats de cette nouvelle ´etude ont ´et´eobtenus lors du stage de Master 2 de Camille Cibot que j’ai encadr´e. Nous souhaitons donc trouver une drogue ayant la mˆeme sp´ecificit´e, une action similaire sur l’activit´edu prot´easome et sur les cellules d’ Halobacterium que le NLVS, ainsi qu’une induction similaire de l’activit´e”compen- satoire” observ´ee dans les fractions de bas poids mol´eculaire. L’´etude s’est port´ee sur quatre drogues not´ees comme inhibitrice du prot´easome : le b´eta-lactone (not´ecL βL ), Epoxomycine, MG132 et Protease 1 Inhibitor (not´ePI1 )).

143 10.3.1 Effet des drogues sur la croissance

Pour tester les diff´erentes drogues sur l’organisme H.salinarum , les diff´erents inhibi- teurs du prot´easome 20S sont ajout´es `ades cultures en d´ebut de phase exponentielle de croissance (DO 0,2-0,4) (voir r´esultats figure 10.6). Il a ´et´ed´ecid´epour d´emarrer cette ´etude d’utiliser la mˆeme concentration d’inhibiteur que le NLVS, soit 5 µM. Pour deux de ces drogues (MG132 et Prot´ease I inhibitor), aucun effet n’a ´et´evisible que ce soit sur la croissance et sur l’activit´edu prot´easome 20S, il a donc ´et´ed´ecid´ed’augmenter leur concentration `a15 µM lors de l’ajout aux cultures.

Figure 10.6 – Suivi de la croissance cellulaire d’Halobacterium trait´eavec les diff´erentes drogues la quantit´ede drogue ajout´ee aux cultures est not´ee `adroite du nom des drogues

Contrairement `al’action du NLVS sur la croissance cellulaire d’ H.salinarum (voir r´esultats figure 10.5) il est possible d’observer que l’impact de ces diff´erentes drogues inhibitrices sur la croissance cellulaire n’est pas nul (voir r´esultats figure 10.6). Ces drogues ne sont pas l´etales `aces concentration mais elles ont toutes un impact sur la vitesse de croissance cellulaire. Ces r´esultats laissent penser que la sp´ecificit´ede ces drogues n’est pas la mˆeme que celle du NLVS. Ces quatre inhibiteurs sont de courts peptides qui interagissent avec un ou plusieurs sites catalytiques du prot´easome.

144 Le MG132 est un peptides ald´ehyde synth´etique. Il inhibe r´eversiblement l’activit´e chymotrypsin-like au sein du prot´easome. Dans la litt´erature le MG132 est le plus uti- lis´epour inhiber le prot´easome car il est cens´eˆetre le plus actif, le plus sp´ecifique et qu’il est perm´eable aux membranes. Le b´eta-lactone est un d´eriv´ede la lactacystine, il inhibe irr´eversiblement l’activit´echymotrypsin-like du prot´easome (mais plus faible- ment que le MG132) et est perm´eable aux membranes des cellules de mammif`ere et de levure. Par contre ce compos´eest le moins stable parmi les inhibiteurs du prot´easome : mˆeme s’il est consid´er´ecomme un inhibiteur irr´eversible, il peut ˆetre hydrolys´e`apH neutre, mˆeme lors de son interaction avec le prot´easome, cette r´eaction permet au prot´easome d’ˆetre de nouveau actif. L’´epoxomycine est aussi un inhibiteur d’origine naturelle faisant partie de la famille des expoxyk´etones. Il est connu comme un inhibi- teur irr´eversible et tr`es sp´ecifique du prot´easome. Il inhibe l’activit´echymotrypsin-like seule ou coupl´ee `al’activit´epost-acide glutamyl. Le Proteasome Inhibitor 1 est not´e comme un inhibiteur r´eversible de l’activit´echymotrypsine-like du prot´easome dans les cellules HT4. Peu de ces compos´eont ´et´etest´es sur des Archaea, ces premi`eres donn´ees nous montre qu’ils sont stables dans le temps `ahaute concentration saline (4,2M NaCl extracellulaire) et qu’ils sont capables de traverser la membrane des Archaea.

10.3.2 Effet des drogues sur l’activit´edu prot´easome

Les cultures trait´ees ou non avec les 4 drogues ont ´et´eculott´ees, lys´ees et le prot´eome a ´et´efractionn´esur gradient de sucrose 5-20%. Ensuite, tout comme dans l’´etude sur le prot´easome avec l’inhibiteur NLVS, des tests d’activit´e endopeptidasique utilisant le substrat Succ-L-L-V-Y-AMC (voir Mat´eriels et M´ethodes) on ´et´er´ealis´es sur chaque fraction (voir r´esultat figure 10.7).

145 Figure 10.7 – Mesure de l’activit´eendo-peptidasique apr`es inhibition ou non du prot´easome Halobacterium in vivo par les diff´erentes drogues. Mesure de l’activit´e endo-peptidase utilisant le substrat Succ-L-L-V-Y-AMC en fonction de chaque fraction obtenue `apartir d’un gradient de sucrose r´ealis´esur le S30 de cellules Halobacterium trait´ees ou non (exp´erience contrˆole) pendant 72h avec les quatre diff´erents inhibiteurs du prot´easome aux concentrations indiqu´ees entre parenth`eses.

L’exp´erience contrˆole correspondant aux fractions cytosoliques de cellules n’ayant pas ´et´ecultiv´ees en pr´esence d’inhibiteur du prot´easome, montre un profil caract´eristique, constitu´ede deux pics d’activit´eendopeptidasique. L’un est situ´edans les fractions 3-4- 5 (appel´ees fractions de bas poids mol´eculaire BPM ) et l’autre dans les fractions 8-9-10 (appel´ees fractions haut poids mol´eculaire HPM ). L’activit´esur les fractions de bas poids mol´eculaire correspond `al’activit´ede prot´eases intracellulaires inconnues, tandis que l’activit´ede fractions de haut poids mol´eculaire correspond `acelle du prot´easome 20S (voir la correspondance entre les fractions du gradient de sucrose et la position du prot´easome dans le gradient dans l’article 16. Ces pools de fractions sont int´eressants car les fractions HPM correspondent `aun pool o`ul’on retrouve l’activit´eendopepti- dasique du prot´easome et les fractions BPM correspondenta ` un pool o`ul’on retrouve

146 des activit´eendo-peptidasiques pouvant compenser un blocage du prot´easome et dont l’activit´en’est pas sensible au NLVS. Il est possible de remarquer que les profils observ´es sur la figure pr´ec´edente ne cor- respondent pas exactement `acelui de la figure 10.5, cela s’explique par le fait que les profils d’activit´es endopeptidasiques des fractions BPM et HPM d´ependent de l’´etat de croissance des cellule(voir figure 10.8, `apartir de ces r´esultats il est possible de voir que d’une part l’activit´edu prot´easome fluctue au cours de la croissance (r´esultats similaires `ala figure 10.1 A) et que d’autre part l’activit´e endopeptidasique des autres prot´eases cytosoliques fluctue presque de fa¸con identique pendant la croissance. En ef- fet une forte activit´eendo-peptidasique est d´etect´ee en d´ebut de croissance (donc apr`es dilution d’une culture m`ere), puis l’activit´echute `ason minimum pour des cultures en d´ebut de phase exponentielle (activit´edivis´epar 5), ensuite l’activit´eaugmente pro- gressivement pour atteindre son maximum en d´ebut de phase stationnaire.

Figure 10.8 – Mesure de l’activit´eendopeptidasique sur les fractions de bas poids mol´eculaire et de haut poids mol´eculaire au cours de la croissance cel- lulaire. En rouge et en bleu, respectivement l’activit´eendopeptidasique des fractions de haut poids mol´eculaires (HPM) et de bas poids mol´eculaire (BPM) obtenues par fractionnement sur gradient de sucrose d’une culture au cours de la croissance.

147 Lors de la mesure de l’activit´edu prot´easome dans les extraits de cellules trait´ees par les diff´erents inhibiteurs (fractions HPM de la figure 10.7) , il a ´et´epossible de remarquer diff´erents effets des drogues sur le profil d’activit´eendopeptidasique. Ainsi le traite- ment avec le PI1 semble inefficace, tandis que les autres inhibiteurs du prot´easome pro- voquent une diminution de cette activit´e. Ainsi, le traitement avec la clasto-lactacystin β-lactone (cL βL) entraine une chute d’environ 50% de l’activit´edu prot´easome, tan- dis que celle provoqu´ee par le MG-132 est presque totale. Enfin, l’inhibition compl`ete du prot´easome est observ´ee lorsque les cellules sont trait´ees avec l’epoxomycine qui constitue donc l’inhibiteur le plus efficace. Nous pouvons donc conclure que, mˆeme avec un prot´easome fortement inhib´epar ces drogues, les Archaea restent vivantes et parviennent `ase diviser. Par contre en regardant l’activit´edes fractions de BPM nous pouvons observer que la sp´ecificit´ede ces drogues vis-`a-vis du prot´easome n’est pas optimal pour les drogues MG132 et Epoxomycine, car en effet ces drogues abaissent ´egalement l’activit´ed´etect´ee dans les fractions BPM. Par contre, le traitement des cel- lules par la cL βL provoque, parall`element `ala baisse d’activit´edu prot´easome, une augmentation de l’activit´eendopeptidasique dans les fractions BPM, cette observation avait aussi ´et´efaite pour la drogue NLVS (donn´ees non montr´ee dans l’article).

Afin de v´erifier l’action et la sp´ecificit´ein vitro de ces inhibiteurs sur le prot´easome 20S, les fractions d’int´erˆets (de BPM : fractions 3-4-5 et HPM : fractions 8-9-10) d’une culture en conditions normales ont ´et´etrait´ees pendant 1 heure avec les diff´erentes drogues inhibitrices. Puis l’activit´eendopeptidasique a ´et´emesur´ee (10.9A et B). Pour visualiser un effet optimal des inhibiteurs au bout d’une heure, nous avons choisi d’uti- liser des concentrations sup´erieures `acelle de l’exp´erience in vivo.

148 Figure 10.9 – Mesure de l’activit´eendo-peptidasique apr`es inhibition ou non du prot´easome in vitro par les diff´erentes drogues. Mesure de l’action des drogues in vitro sur l’activit´eendopeptidasique en utilisant le substrat Succ-L- L-V-Y-AMC. Les prot´eines d’une culture en conditions normales ont ´et´efractionn´ees sur un gradient de sucrose 5-20%, les fractions num´eros 8-9-10 et 3-4-5 sont r´ecup´ees ensembles pour former un pool d’´echantillon de haut poids mol´eculaire (HPM) et de bas poids mol´eculaire (BPM). On mesure sur chaque pool de fractions l’effet de l’ajout des drogues lors du test de l’activit´eendo-peptidasique (les ´echantillons sont incub´es 1h avec les droques). Les histogrammes correspondent aux pourcentages d’activit´eendo- peptidasique par rapport `al’exp´erience sans inhibiteur (contrˆole). A. correspond aux fractions BPM 3-4-5 et ( B. correspond aux149 fractions HPM 8-9-10. Dans les fractions de HPM (r´esultats figure 10.9 B ), nous pouvons voir une diminu- tion de l’activit´eendopeptidasique du prot´easome pour tous les inhibiteurs test´es. Ces drogues affecte donc bien le prot´easome in vitro d’une fa¸con beaucoup plus importante que dans l’exp´erience in vivo : 90% de l’activit´eest inhib´ee au minimum. L’augmen- tation de l’inhibition du prot´easome in vitro par rapport au in vivo peut s’expliquer par : – Les concentrations des drogues inhibitrices utilis´ees. – Le fait que les inhibiteurs peuvent agir directement sur le prot´easome, sans devoir passer la membrane cellulaire. – Un temps d’incubation ”rapide”, qui va limiter la d´egradation des inhibiteurs. On peut remarquer que l’´epoxomycine est l’inhibiteur le plus efficace `ala concentration de 50 µM. Dans les fractions BPM (r´esultats figure 10.9 ) il est possible d’observer la sp´ecificit´e de ces inhibiteurs. A l’exception de l’´epoxomycine qui inhibe tr`es fortement l’activit´e endopeptidasique des fractions BPM, les inhibiteurs ne diminuent que l´eg`erement (au- tour de 20%) l’activit´eendopeptidasique totale des autres prot´eases cytosoliques et cela mˆeme `aforte concentration.

En conclusion, le meilleur candidat pour remplacer la drogue inhibitrice du prot´easome NLVS semble ˆetre la CL βL : elle permet d’inhiber tr`es fortement le prot´easome in vi- tro, elle inhibe tr`es l´eg`erement l’activit´eendopeptidasique pr´esente dans les fractions BPM, elle est capable de p´en´etrer les cellules d’arch´ees et ainsi atteindre le prot´easome in vivo, elle permet d’observer une activit´ecompensatoire in vivo dans les fractions BPM. Il faut cependant optimiser sa concentration `autiliser in vivo pour avoir un effet d’inhibition du prot´easome comparable `acelui de la drogue inhibitrice NLVS.

150 10.4 Discussion

Chez les arch´ees, l’importance du rˆole du syst`eme prot´easome dans les processus biologiques fondamentaux est encore mal d´efini. Des prot´easomes natifs ont ´et´epar- tiellement purifi´ee `apartir de Halobacterium par ultracentrifugation en gradient de densit´e. Les profils d’activit´epeptidasiques ont montr´e que l’accumulation de la par- ticule 20S du syst`eme prot´easome est modifi´ee en fonction de l’´etat physiologique des cellules. La quantit´ede particules 20S actifs dans des cellules augmente, chez Ha- lobacterium, en r´eponse `ades stress thermiques et de basse salinit´e. Dans les mˆemes conditions exp´erimentales, des exp´eriences de Northern-Blot ont montr´eune r´egulation positive de la transcription de la sous-unit´es alpha et bˆeta du prot´easome, ainsi que des deux ATPases r´egulatrices du prot´easome, PANA et PANB. De plus des exp´eriences de co-immunopr´ecipitation ont d´emontr´el’existence d’une interaction physique entre les deux types de PAN dans des extraits cellulaires. Ainsi, une r´eglementation directe se produit sur les composants PAN-prot´easome pour ajuster l’activit´ede d´egradation de prot´eines lors de la croissance et en r´eponse `ades stress environnementaux. Ces r´esultats indiquent ´egalement que, dans chez les halophiles extrˆemes, la prot´eolyse ef- fectu´epar le syst`eme prot´easome constitue une r´eponse importante de ces organisme face a un stress hypo-salin. L’utilisation du NLVS (inhibiteurs du port´easome) ainsi que quatre autres drogues(marqu´ees comme inhibitrices du prot´easome) sur des cultures cellulaires `apermit d’´etudier la fonction cellulaire in vivo du prot´easome chez Halobacterium . Ces drogues n’ont pas un effet important sur la croissance et sur la mortalit´edes cellules dans des conditions normales de croissance, mais aussi dans des conditions de choc thermique, bien que l’inhibition chimique de prot´easomes est ´et´emesur´ee dans les extraits cellulaires. Ces r´esultats sugg`erent que les activateurs de PAN ou autres prot´eases compensent la perte de l’activit´edu prot´easome dans des conditions de stress et lors de la croissance.

151 Quatri`eme partie

Etude du rˆole de l’aminopeptidase TET dans la prot´eolyse intracellulaire chez les arch´ees halophiles in vivo

152 L’´etude du rˆole de TET chez les halophile a ´et´er´ealis´e sur deux organismes halo- philes H.salinarum et H.volcanii . Nous avons choisit de travailler aussi sur l’organisme H.volcanii , car nous disposions pour cet organisme un mutant d´el´et´ede la s´equence d’une des deux TET. Ainsi, pour r´ealiser cette ´etude, nous avons utilis´ela souche sauvage DS2 de H.volcanii , mais aussi un mutant d´el´et´ed’une des deux prot´eases TET (souche CN5 de H.volcanii ). La d´el´etion du g`ene ” tet ” a ´et´er´ealis´ee par C´edric Norais et est d´ecrite dans son manuscrit de th`ese. La technique pop-in/pop-out a ´et´eutilis´ee pour cr´eer cette souche mutante. La technique pop-in/pop-out consiste `aint´egrer un plasmide non r´eplicatif au niveau du locus cibl´epar recombinaison (pop-in) puis la suppression du g`ene d’int´erˆet s’effectue apr`es une recombinaison homologue du plasmide au niveau de l’int´egration (pop-out)[126]. Lorsque cette ´etudes a ´et´einiti´ees, le s´equen¸cage du g´enome d’ H.volcanii n’´etait pas achev´e, celui ci a ´et´epubli´een 2010 [127]. Une analyse r´ecente par ”blastp” a ´et´er´ealis´e par Fr´ed´eric FROTTIN au cours de ¸ca th`ese et a permis de trouver un g`ene codant pour une s´equence prot´eique ayant plus de 30% d’identit´eavec la s´equence de la pep- tidase TET connue d’ H.volcanii . Cette s´equence est annot´ee sur le serveur UniProtKB comme ´etant homologue `ala s´equence de la peptidase TET. Deplus il a r´ealis´eun alignement de cette ”nouvelle” s´equence avec les peptidases TET d´ej`acaract´eris´ees et il montre clairement l’origine commune de toutes ces prot´eases. Pour diff´erencier ces deux TET pr´esente chez H.volcanii , nous nommerons la peptidase TET venant d’ˆetre d´ecouverte TET2 et ”l’ancienne” TET (d´ej`aconnu et donc celle dont nous disposons un mutant) nous la nommerons par la suite seulement TET. Enfin, il est a not´eque des test on ´et´er´ealis´eau laboratoire pour d´el´et´eou cloner la s´equence de TET de l’organisme H.salinarum , mais aucun de ces tests n’a ´et´e concluant. C’est pour ces raisons que nous avons choisit de changer d’organisme et d’´etudi´een partie le rˆole de TET chez H.volcanii par le biais de cette souche d´el´et´e d’un des g`enes TET.

153 Chapitre 11

Etude du rˆole de TET chez l’arch´ee halophile Haloferax volcanii par la d´etermination du ph´enotype d’un mutant d´el´et´ed’un des g`enes codant pour la prot´eine TET

Le but de cette ´etude est de pouvoir trouver, par la comparaison ph´enotypique de la souche sauvage (not´eWT pour ”wild-type”) et d’un mutant d´el´et´ed’un des deux g`enes de la prot´ease TET (not´eCN5 ou parfois ∆ TET) de H.volcanii , des informations sur le rˆole ou l’action de TET dans la physiologie des arch´ees.

154 11.1 R´esultats

11.1.1 Influence de la pr´esence de la prot´ease TET au cours de la croissance

Notre laboratoire dispose d’une souche sauvage et d’une souche mutante avec un des deux g`enes de TET d´el´et´ede l’organisme H.volcanii . Les deux souches sont cultiv´ees en parall`eles, un ´echantillonnage est effectu´esur les deux culture `aDO 0,9. Les cellules sont ensuite regard´eau microscope par contraste de phase (voir figure 11.1) afin d’observer des diff´erences morphologique entre les deux souches. Ces deux souches pl´eomorphes, ne semble pas avoir de diff´erences morpholo- giques drastiques.

Figure 11.1 – Comparaison morphologique des deux souches. Micrographie par contraste de phase de la souche sauvage H.volcanii (WT) `agauche et de la souche mutante d´el´et´ed’un g`ene TET d’ H.volcanii (CN5) `adroite.

155 La vitesse de croissance dans leur milieu optimal (milieu Hv-YPC voir Mat´eriel et M´ethodes pour ¸ca composition)a aussi ´et´ecompar´ee entre la souche sauvage et la souche mutante (voir r´esultats figure 11.2).

Figure 11.2 – Suivit et comparaison de la croissance en condition optimale de l’organisme H.volcanii et du mutant CN5. En blue Hv WT en rouge Hv CN5, la croissance dans le milieu HvYPC (voir Mat´eriels et M´ethodes) est suivit par mesure de la densit´eoptique `a600nm. L’exp´erience a ´et´e r´ep´et´ede multiple fois et l’apparition du d´ecrochage en fin de phase exponentiel est r´ep´etitif.

Nous pouvons voir une croissance similaire tout au long de la phase exponentielle de croissance, puis une entr´ee en phase stationnaire plus pr´ecoce et `aDO plus faible (environ 10%) pour la souche mutante. Il s’av`ere donc que la pr´esence de la prot´ease TET n’est pas indispensable lors de la croissance cellulaire, except´elors de l’entr´ee en phase stationnaire. Il est donc possible que cet prot´ease n’est pas un rˆole primordial `ajouer au cours de la croissance, ou bien le fait que seulement une des 2 prot´eases TET de cet organisme soit d´el´et´ee laisse `al’organismes des possibilit´es de compensa- tions, pour pallier l’activit´emanquante. Il est possible par contre, que l’activit´ede cette

156 prot´ease intervient en d´ebut de phase stationnaire ( Do maximum toujours inf´erieur de 10% pour la souche mutante). L’entr`ee en phase stationnaire est due `aun apauvrissement du milieu en nutriments. Les cellules pour ”continuer” `ase multiplier vont r´eg´en´er´eles prot´eines inutiles de leurs cytoplasme afin de fournir `aleur m´etabolisme des acides-amin´es. Il devient donc int´eressant de tester diff´erentes compositions nutritionnelles du milieu de croissance ( voir chapitre 11.1.4) afin de voir si un ph´enotype diff´erent entre la souche mutante et la souche sauvage se d´egage. En effet cette entr´ee l´eg`erement plus basse (en Do) en phase stationniare laisse penser que cette peptidase pourrait jouer un rˆole dans le m´etabolisme.

11.1.2 Influence de la pr´esence de la prot´ease TET au cours d’un stress Hypo-salin

Il est possible que les amino-peptidases joue un rˆole de contrˆole qualit´een asso- ciation avec le prot´easome pour la d´egradation des prot´eines d´efectueuse g´en´er´ees par exemple lors de stress. Nous avons vu pr´ec´edemment que le prot´easome, ainsi que les prot´eines activatrice du complexe prot´easome (syst`eme PAN) ´etaient induites lors de stress salins (voir figure 10.3). L’absence d’une des prot´ease TET pourrait ainsi rendre la r´eponse de l’organisme face au stress moins performante, ralentissant la croissance ou compromettant sa survie. Les deux souches (WT et CN5) ayant une division cellulaire et une croissance proche avec une mˆeme DO de d´epart, sont soumises `aun stress hypo-salin par dilution. Plu- sieurs concentration finale en NaCl extracellulaire apr`es dilution ont ´et´etest´ees (1,5M et 0,9M). La vitesse de croissance cellulaire des deux souches est ensuite compar´ee apr DO ( voir r´esultats figures 11.3).

157 Figure 11.3 – Comparaison de la croissance des deux souches lors de choc hypo-salin. En bleu Hv WT en rouge Hv CN5, la croissance est suivit par densit´e optique `a600nm. A gauche et `adroite les cultures sont respectivement soumises a un stress hypo-salin par dilution de culture en phase de croissance exponentielle avec du milieu sans NaCl `aune concentration finale en NaCl extracellulaire de 1,5M et 0,9M respectivement.

Quel que soit l’intensit´edu stress, les souches WT et CN5 croient de mani`ere iden- tique. Donc l’absence d’une seule de ces prot´eines TET n’impacte pas la croissance et la survie de l’organisme en pr´esence de stress hypo-salins (il est a not´equ’exactement le mˆeme r´esultats a ´et´eobtenu en pr´esence d’un choc thermique, mais ces donn´ees ne figure pas dans cette th`ese car elles n’ont pas ´et´er´ep´et´ees). En conclusion, son action ne semble pas n´ecessaire `ala r´eponse `aces types de stress environnementaux.

11.1.3 Influence de la pr´esence de la prot´ease TET au cours de stress nutritionnel

Il a ´et´epossible de voir une l´eg`ere d´egradation de la capacit´ede croissance lors de l’entr´ee en phase stationnaire du mutant dans des conditions de croissance optimales ( voir r´esultats en rappel sur figure 11.4.). Il est int´eressant d’´etudier la capacit´edu mutant CN5 `asurmonter un d´eficit nutritionnel , par sa culture dans des milieux ”mi- nimums” ou des milieux d´efinis.

158 Pour cette exp´erience, trois types de milieu avec diff´erents ´el´ements nutritionnels ont ´et´eutilis´es : le milieu Hv-YPC est le milieu optimal et est compos´ede nutriment de type peptone et extrait de levure; le milieu Hv-Peptone ne sera compos´eque de nu- triment de type peptone et donc d´epourvu d’extrait de levure, le milieu Hv-aa, est un milieu minimum dont les nutriments sont des acide amin´eet la source d’´energie est du glyc´erol et du sodium succinate (pour plus de pr´ecision sur la composition des milieux se r´ef´erer au Mat´eriels et M´ethodes). Des cultures de chaque souche (WT et CN5), ayant la mˆeme DO de d´epart sont cu- lott´ees, puis les cellules sont re-suspendues avec les diff´erents milieu nutritionnel. La croissance des diff´erentes souches est suivit par DO `a600nm et les r´esultats obtenus sont pr´esent´es sur la figure 11.4.

159 Figure 11.4 – Comparaison de la croissance de H.volcanii WT et CN5 en fonction de diff´erents milieux nutritionnels . En blue Hv WT en rouge Hv CN5. A. Courbe de croissances des deux souches en conditions nutritionnelles normales (milieu HvYPC). B. en pr´esence d’un milieu de cultures Hv-Peptone. C. en pr´esence d’un milieu Hv-AA. D. en pr´esence d’un milieu Hv-AA sans ´energie (sans le glycerol et le sodium succinate). Pour r´ealis´ecette exp´erience, une culture de H.volcanii WT et une de H.volcanii CN5 sont culott´ees et divis´ees en 4, les diff´erents culots sont ensuite re-suspendus dans les diff´erents milieux nutritionnels.

En pr´esence de source de nutriment compos´ee seulement de ”peptone” ( le milieu normale est compos´ed’un m´elange de peptone et d’extrait de levure), il est possible de voir que le mutant n’arrive pas `aobtenir une DO ´equivalente `acelle de la souche WT en d´ebut de la phase stationnaire, comme lors d’une croissance en milieu ”normal” (Hv-YPC). En effet la phase stationnaire d´ebute `aune DO 20% plus faible chez le mutant que chez la souche sauvage. Il semblerais donc que cette peptidase TET joue un l´eger rˆole en condition de carrence (due `ala phase stationnaire o`ules nutriments

160 deviennent rares) et plus particuliairement en pr´esence de petit peptides et d’acide amin´edans le milieu nutritionnel (milieu Hv-peptone). La pr´esence d’acide amin´ecomme seule source de nutriment r´ev`ele un ph´enotype to- talement diff´erent entre les deux souches. Que se soit avec ou sans apport d’´energie (voir r´esultats figure 11.4 C et D) , il est possible de voir que la pr´esence de cette prot´ease TET est essentielle pour maintenir la croissance cellulaire. Il semble tout de mˆeme qu’un apport ´energ´etique ( glyc´erol + sodium succinate )permette pendant un laps de temps assez court de maintenir une l´eg`ere croissance. Ce r´esultat va `al’encontre de se que nous attendions : TET ´etant une amino-peptidase dont le rˆole est de d´egrader des peptides en acides-amin´es (donc g´en´erer des acides- amin´es) est paradoxalement indispensable pour la croissance cellulaire lorsqu’il n’y a que des acides-amin´es comme source de nutriment. Cette prot´ease pourrait donc jouer un autre rˆole permettant aux cellules d’utiliser ces acides amin´es pr´esents dans le milieu extracellulaire.

11.1.4 Mesure de l’activit´eamino-peptidasique totale et im- portance de la peptidase TET

Nos ´etudes pr´ec´edentes montrent que nous disposons d’un ph´enotype diff´erents qui distingue la souche WT de la souche ∆TET. Ce ph´enotype apparait lorsque les deux souches sont en pr´esence d’acides-amin´es comme source de nutriment dans le milieu extracellulaire. En cons´equence, cette condition de culture a ´et´echoisit pour d´eterminer les profils d’activit´es enzymatiques, car dans ces conditions la pr´esence de TET semble primordiale. Donc normalement dans ces conditions l’induction, l’accumulation ou l’ac- tivit´edes prot´eases TET doit ˆetre favoris´echez la souche sauvage, ce qui pourrait nous permettre de mettre en ´evidence en l`acomparant avec l’activit´eamino-peptidasique totale du mutant, une augmentation d’activit´eamino-peptidasique due `al’activit´ede TET.

161 Pour cela les deux souches on ´et´ecultiv´ees en conditions normales, puis culott´ees, re-suspendues dans un milieu Hv-YPC AA et cultiv´ees pendant 24 heures `a45˚c (temp´erature optimum). Les cultures sont `anouveau culott´ees, puis lys´ees et l’acti- vit´eenzymatique totale est mesur´ee apr`es avoir normaliser les ´echantillons en fonction de la concentration prot´eique totale (par test Bradford et dilution). Ne connaissant pas la sp´ecificit´ede la TET de H.volcanii , tout les substrats disponibles coupl´es `al’AMC ont ´et´etest´es. De plus une combinaison avec diff´erents cofacteurs m´etalliques (calcium, cuivre, cobalt, magn´esium, fer, zinc) a ´et´er´ealis´e. Parmi tout ces cofacteurs, seul le cobalt permet d’obtenir une activit´eenzymatique diff´erente de celle de l’´echantillon contrˆole sans cofacteur (r´esultats non montr´es), une s´election des r´esultats percutant est pr´esent´efigure 11.5.

162 Figure 11.5 – D´etermination d’un profil d’activit´eamino-peptidasique en condition de carence nutritionnelle. En blue Hv WT en rouge Hv CN5. En clair (bleu clair et rouge clair) test d’activit´esans cofacteur m´etallique ; en fonc´e, test d’ac- tivit´een pr´esence de cobalt (Co). Le test d’activit´eavec le substrat Suc-L-L-V-Y est un contrˆole positif sur l’activit´eendopeptidasique totale. Les autres substrats sont de gauche `adroite des substrats fluorog`eniques (coupl´e`al’AMC) permettant de doser l’activit´eamino-peptidasique : Trp = Tryptophane-AMC ; Ser = Serine-AMC ; AAF = Alanine-Alanine-Ph´enylalanine-AMC. Voir chapitre 14.5 pour la m´ethode de mesure de l’activit´e. Sont entour´es en rouge les substrats utilis´es dans la suite de l’´etude.

Il est possible de voir que l’activit´eendo-peptidasique ( substrat Suc-L-L-V-Y) est quasiment la mˆeme pour les deux souches et qu’elle n’est pas sensible au cobalt. Ce test nous sert de contrˆole positif. Quelques soit le substrat utilis´epour mesurer l’activit´e amino-peptidasique, en pr´esence ou non de cobalt, ils est possible de voir dans ces conditions que l’activit´eamino- peptidasique totale des ´echantillons prot´eiques provenant de la souche mutante est largement inf´erieure `acelle de la souche sauvage.

Il est possible grˆace `ace test d’identifier trois diff´erent profil d’activit´eamino-

163 peptidasique, pouvant ˆetre associ´e`aune ou plusieurs peptidases. Dans le chapitre 12.1.2, il sera d´emontr´eque l’activit´eamino-peptidasique mesur´ee dans les extrait cel- lulaire ne correspond pas `al’activit´ede la peptidase TET. L’activit´eamino-peptidasique mesur´ee pour le substrat Trp-AMC, montre que les pep- tidases qui entre en jeu pour le d´egrader ne sont pas sensible au cobalt; pour le substrat Ser-AMC, l’activit´eest multipli´epar deux en pr´esence du cobalt ; pour le substrat AAF- AMC, compos´ede trois acides-amin´es et permettant de visualis´eune activit´eamino- peptidasique sur une ”chaine d’acide amin´es”, la pr´esence du cobalt est n´ecessaire. Mˆeme si trois profil d’activit´een fonction du cobalt apparaissent, il se peut que se soit la mˆeme prot´ease qui poss`ede une affinit´ediff´erentes en fonctions du substrat et de la pr´esence de cofacteur. Il est `anot´eque ces trois substrats en pr´esence de cobalt seront utilis´es par la suite pour toutes les exp´eriences d’activit´eenzymatique.

Il est ainsi possible de voir une forte diff´erence d’activit´eamino-peptidasique entre les deux souches lors de ce stress nutritionnel. Cette diff´erence d’activit´esemble ˆetre due `al’absence d’activit´ede la peptidase TET (bien que nous verrons par la suite au chapitre 12.1.2 que cette activit´emesur´en’est surement pas due `ala peptidase TET). Pour valid´ecette hypoth`ese, la mesure de l’activit´eamino-peptidasique dans les frac- tions prot´eiques en condition optimale de croissance (milieu Hv-YPC), l`ao`uTET n’est pas n´ecessaire, a ´et´er´ealis´eet devrait permettre de d´efinir si c’est bien l’absence (ou la pr´esence de TET) qui favorise cette diff´erence de profil d’activit´e(voir r´esultats figure 11.6).

164 Figure 11.6 – Mesure de l’activit´eamino-peptidasique en milieu normal HvYPC. En pr´esence de Cobalt. En blue Hv WT en rouge Hv CN5. Le test d’activit´eavec le substrat Suc-L-L-V-Y est un contrˆole positif sur l’activit´eendopepti- dasique totale. Les autres substrats sont de gauche `adroite des substrats fluorog`eniques (coupl´e`al’AMC) permettant de doser l’activit´eamino-peptidasique : AAF = Alanine- Alanine-Ph´enylalanine-AMC ; Trp = Tryptophane-AMC ; Ser = Serine-AMC. Voir cha- pitre 14.5 pour la m´ethode de mesure de l’activit´e.

En condition nutritionnelle ”optimale” contrairement `ala condition de carence nu- tritionnelle en pr´esence uniquement d’acides-amin´es vue pr´ec´edemment, il est possible de voir que l’activit´eamino-peptidasique de la souche sauvage et de la souche mutante sont du mˆeme ordre de grandeur et mˆeme que l’activit´eamino-peptidasique du mutant est l´eg`erement sup´erieure `acelle de la souche sauvage et cela quelque soit le substrat utilis´e. Ces r´esultats ne permette pas de confirmer l’hypoth`ese avanc´edans le paragraphe pr´ec´edent, qui stipulait que la diff´erence d’activit´emesur´eentre les diff´erentes souches en conditions de carence nutritionnelle, ´etaient due `ala pr´esence du g`ene TET. Car en effet, un profil d’activit´esimilaire `acelui observ´esur la figure 11.5 aurait pu prouv´e que l’absence de TET ”amput´e” l’activit´eamino-peptidasique totale des cellules. C’est le cas en conditions de carences nutritionnelles, mais ce n’est pas le cas en condi- tions de croissances optimales. Ainsi, il est possible que ce profil d’activit´eamino-

165 peptidasique ”amoindrit” chez la souche mutante en conditions de croissance dans un milieu d´efini compos´euniquement d’acides amin´es soient due au fait que les cellules rentre dans une sorte de phase de latence. Pendant cette phase de latence la plupart des amino-peptidases cytosolique pourraient ˆetre d´er´egul´ees ou d´esactiv´ees afin de stopper le m´etabolisme (que se soit au niveau de la production et de la dextruction).

11.2 Discussion

Il avait ´et´emontr´eque la prot´ease TET de H.marismortui , avait une forte affi- nit´epour les substrats Glutamine, Lysine, Leucine, M´ethionine, S´erine et Arginine. Dans notre ´etude sur les extraits prot´eiques seuls les substrat Ser-AMC et Trp-AMC permettent d’obtenir un profil d’activit´esans cobalt [78]. Par contre la pr´esence de ce cofacteur m´etallique, permet d’obtenir une activit´eamino-peptidasique sur presque l’ensemble des substrats et en particulier sur le substrats AAF-AMC, mimant un pep- tide plus long. L’int´erˆet de choisir un peptide plus long est de cibler des peptidases pouvant dig´erer des poly-peptides, comme la peptidase TET. Lors de stress nutritionnel, o`ules cultures n’ont que des acide-amin´ecomme source de nutriment, il est clair le g`ene TET d´el´et´eest essentiel pour le maintient de la croissance. Il est a not´equ’il ne semble pas y avoir de redondance fonctionnelle entre les deux TET. Si cette peptidase est essentielle dans ce type de stress nutritionnel, elle devrait ˆetre produite en forte quantit´e, accumul´e, activ´eou voir son rendement optimis´e. En condition de croissance normale, cette prot´ease n’´etant pas primordiale et il est int´eressant de trouver un profil d’activit´eamino-peptidasique totale proche pour les deux souches. Il semble fort probable qu’en condition optimale, cette peptidase n’ai pas un rˆole cl´e`ajouer, ou que d’autre peptidase prennent le relais et compense l’acti- vit´emanquante. Le profil de croissance et d’activit´eaminopeptidasique obtenue en condition de carence nutritives d´efinie en pr´esence d’acide amin´e, et plutˆot paradoxal pour une amino-

166 peptidase. En effet comment expliquer que l’absence d’une peptidase permettant de g´en´erer des acides amin´es, ne permet pas aux cellules de croitre dans un environnement o`uil y a d´ej`a´enorm´ement d’acide amin´eet donc dans une condition environnementale o`usa pr´esence n’est pas suppos´en´ecessaire ? Une des explications pourrait ˆetre, qu’en pr´esence d’acide amin´e, l’appareil traduction- nel s’emballe, g´en`ere de nombreuses prot´eines d´efectueuses et que le syst`eme contrˆole qualit´eincomplet (syst`eme PAN-prot´easome + TET en aval) n’arrive plus `acompenser l’absence de TET et laisse s’accumuler dans le cytoplasme des prot´eines d´efectueuses et ”toxique”. Cette th´eorie est en d´esaccord avec les ´etudes de croissance qui montre seulement un arrˆet de la croissance et non une forte mortalit´edue `ala toxicit´ede l’ac- cumulation des prot´eines d´efectueuses dans le cytoplasme. De plus, cette explication, n’indique pas pourquoi il y a un l´eger d´ecrochage en d´ebut de phase stationnaire en conditions normales et en milieu ne fournissant que de la peptone. Une deuxi`eme explication est pr´esent´ee dans les figures 11.7 et 11.8. TET pourrait jouer un rˆole en aval du prot´easome pour ”finir” la d´egradation des prot´eines en acides amin´es. Mais aussi TET pourrait avoir un rˆole dans le transport de nutriment et en particulier pour les petits peptides et les acides amin´es. En effet certains transporteurs sont activ´epar la pr´esence de prot´ease cytosolique [128],il est possible aussi que leur production soit contrˆol´ee ou r´egul´ee `aun certain niveau uniquement par la prot´ease TET et donc stopp´ee en cas e d´el´etion (mutant CN5). Ainsi l’absence de l’activit´ede la prot´ease TET est compensable dans un milieu fournissant peu de petits peptides et d’acide amin´es comme le milieu Hv-YPC, mais plus le rapport en acide amin´eet petit peptide augmente compar´eau reste des nutriments (exemple pour le milieu peptone) plus la quantit´ede nutriment ”utilisable” diminue (ils ne peuvent plus entrer car les transporteurs ne sont pas activ´edu fait de l’absence de cette prot´ease) et donc plus vite la croissance s’arrˆete. L’effet est particuli`erement visible dans un environnement ne fournissant que des acides amin´es, o`uaucun nutriment n’est capable de passer la membrane. Dans ce cas les cellules s’arrˆete de croitre directement, se mette en ´etat de latence en attendant l’arriv´ede nouveau nutriment.

167 Figure 11.7 – Figure hypoth´etique tra¸cant le rˆole de TET en pr´esence de peptone comme unique source de nutriment. A gauche et `adroite respective- ment : m´ecanisme hypoth´etique du rˆole de la peptidase TET chez la souche sauvage et la souche mutante ∆TET de H.volcanii . Trois types de transporteurs membranaires sont pr´esent chez les arch´ees, un type pour les prot´eine, un type pour les oligopeptides et un type pour les acides amin´es. Nous faisons l’hypoth`ese qu’un syst`eme contrˆole soit en association avec ces transporteurs, permettant de les produire ou de les activer et de contrˆoler ou d´egrader les substrats transport´es. Pour la souche d´el´et´edu g`ene TET, dans un milieu nutritionnel compos´ede m´elange de gros et de petits peptides, les gros peptides peuvent ˆetre transport´es librement et ˆetre d´egrad´es dans le cytoplasme par le prot´easome (par exemple) et fournir des acides amin´es au m´etabolisme, par contre pour les petits peptides sans la pr´esence de TET le transporteur n’est pas activ´eet ne peuvent donc pas ˆetre assimil´epar les cellules. La l´eg`ere diff´erence de croissance s’explique donc par le fait que la souche sauvage a acc`es `aplus de nutriment que la souche mutante.

168 Figure 11.8 – Figure hypoth´etique tra¸cant le rˆole de TET en pr´esence d’acides amin´es comme unique source de nutriment. Comme pr´ec´edemment, trois types de transporteurs membranaires sont pr´esent chez les arch´ees, un type pour les prot´eine, un type pour les oligopeptides et un type pour les acides amin´es. Nous faisons l’hypoth`ese qu’un syst`eme contrˆole soit en association avec ces transporteurs, permettant de les produire ou de les activer et de contrˆoler ou d´egrader les substrats transport´es. Pour la souche d´el´et´edu g`ene TET, dans un milieu nutritionnel compos´e de m´elange d’acides amin´es, sans la pr´esence de TET le transporteur n’est pas activ´eet les cellules ne peuvent donc pas ˆetre assimil´eles acides amin´es pour leur m´etabolisme. Sans source de nutriment les cellules s’arrˆetent de croitre et entre dans une phase de dormance (arrˆet des processus cellulaire et donc arrˆet des acteurs de la prot´eolyse).

Nous ne disposons pas d’un double mutant KO des deux g`enes TET diff´erents chez H.volcanii , ni un KO du g`ene TET2. Nous n’avons pas non plus d’anticorps ciblant les TET de H.volcanii . Par contre nous savons que l’organisme H.salinarum ne dispose que d’une seule TET, et nous avons pour cette prot´eine un anticorps sp´ecifique. Il devient donc int´eressant de passer chez cet organisme pour continuer l’´etude du rˆole de l’amino-peptidase TET.

169 Chapitre 12

Etude du rˆole de TET chez l’arch´ee halophile Halobacterium salinarum

L’organisme H.salinarum est un organisme plus adapt´e`al’´etude du rˆole de TET, en effet cet organisme, contrairement `a H.volcanii , ne poss`ede qu’un seul g`ene de TET. De plus, nous connaissons et maitrisons plus pr´ecis´ement les conditions d’application de stress pour cet organisme et en particulier les conditions de stress hypo-salins et thermiques (voir premi`ere partie de cette th`ese). Enfin nous poss´edons des anticorps sp´ecifiques de cette prot´ease, ainsi que des outils d’analyses de prot´eines calibr´epour cet organisme comme le gradient de sucrose. Par contre nous ne disposions pas d’un mutant KO du g`ene TET chez cet organisme.

12.1 R´esultats

12.1.1 Les diff´erentes formes de TET dans le cytoplasme

Dans la litt´erature, la prot´ease TET est d´ecrite comme une particule `a12ss form´ee d’assemblages de dim`eres [81] [80], qu’en est-il in vivo chez les arch´ees halophiles ? Pour ´etudier l’´etat d’assemblage de TET, il a ´et´er´ealis´eau laboratoire une calibration

170 de gradient de sucrose 5-20% au sel (3,4M KCl) avec diff´erents complexes prot´eiques de poids mol´eculaires connus comme la malate d´ehydrog´enase ou le prot´easome 20S. Des cultures de H.salinarumm en phase exponentielle de croissance sont culott´ees, re- suspendues dans du tampon de lyse `a3,4M KCl, puis lys´ees par sonication. L’ADN est ensuite d´egrad´epar l’action d’une DNAse pendant 1 heure `atemp´erature ambiante, puis une centrifugation de 45 minutes `a30 000g permet l’obtention d’un surnageant prot´eique(appel´eS30) ”purifi´e” de l’ADN et des membranes. Enfn une partie du sur- nageant est d´epos´esur un gradient de sucrose 5-20% (5-20% de sucrose m´elang´eau tampon de lyse) et la s´eparation se fait pendant 20 heures `a 160 000g. Enfin le gradient est s´epar´een 15 fractions, dont la fraction contenant les mol´ecules les plus l´eg`eres est la fraction 1 et celle contenant les mol´ecules les plus lourdes la fraction 15 (voir r´esultats figure (voir figure 12.1).

Figure 12.1 – Calibrage du gradient de sucrose, les trois formes de TET de H.salinarum in vivo . En haut , exemple de complexes prot´eiques s´epar´es par gradient de sucrose et r´ev´el´es par Western-blot. En bas , la position suppos´ee dans le gradient des diff´erentes formes de TET : fractions 1-5 TET dim´erique, 7-10 TET 12ss, 15 forme de TET inconnue surement associ´ee `ades complexes de haut poids mol´eculaire.

171 Dans ces conditions exp´erimentales la figure montre que la forme majoritaire de TET pr´esente dans le cytoplasme est une forme de bas poids mol´eculaire dans les fractions 1 `a6, pouvant correspondre `ala forme dim´erique. Une forme de plus haut poids mol´eculaire se situe autour des fractions 7 `a10 pouvant correspondre `ala forme ”active” `a12ss. Enfin dans la fraction 15, une forme de type inconnu surement associ´ee `ades complexes de haut poids mol´eculaire est d´etect´ee. Il est int´eressant de voir que la forme suppos´ee active n’est pas repr´esent´ee de fa¸con majoritaire dans la cellule. Il devient donc int´eressant pour comprendre le rˆole de cette prot´ease, de trouver les conditions qui permettent le recrutement de cette forme dite ”active”.

12.1.2 Contribution de la prot´ease TET dans l’activit´eamino- peptidasique totale

L’activit´eamino-peptidasique totale a ´et´etest´ee sur une culture en d´ebut de phase exponentielle (DO `a600nm de 0.6) avec la mˆeme s´election de substrats de type AMC que lors de l’´etude effectu´ee chez H.volcanii (voir chapitre 11.1.4). Pour cela des cultures en phase exponentielle de croissance ont ´et´eculott´ees, lys´ees et l’activit´eaminopep- tidasique a ´et´emesur´ee sur les extraits prot´eiques. Les r´esultats sont pr´esent´es sur la figure 12.2.

172 Figure 12.2 – Mesure de l’activit´eamino-peptidasique totale chez l’orga- nisme H.salinarum . En bleu mesure sans cofacteur, en rouge mesure avec du Cobalt. Des cultures en phase exponentielle de croissance (DO 0.6 `a 600nm) ont ´et´eculott´ees, lys´ees et l’activit´eaminopeptidasique a ´et´emesur´ee sur les extraits prot´eiques avec les substrats AAF, Trp, Ser et Suc-L-L-V-Y coupl´es `al’AMC en pr´esence ou non du cofacteur m´etallique cobalt.

Comme pour les exp´eriences r´ealis´ees chez H.volcanii , l’activit´eamino-peptidasique sur les substrats Ser et Trp est activ´ee par la pr´esence du cofacteur m´etallique (Cobalt). Le substrat avec lequel l’activit´eaminopeptidasique est la plus importante et qui sera choisi pour le reste de l’´etude est le substrat Ser-AMC.

Une partie des extraits prot´eiques a ensuite ´et´es´epar´ee par gradient de sucrose 5-20%. Le gradient est ensuite fractionn´een 15 fractions. Apr`es fractionnement sur gra- dient de sucrose, chaque fraction peut ˆetre divis´ee, une partie va servir `ala d´etermination de la localisation de la prot´ease TET par immuno-r´ev´elation et l’autre partie sera uti- lis´ee afin de mesurer l’activit´eamino-peptidasique. L’objectif est de tenter de corr´eler la pr´esence de la prot´ease TET dans les fractions avec le profil d’activit´eamino- peptidasique (r´esultats figure 12.3).

173 Figure 12.3 – Correspondance entre la localisation de l’activit´e amino- peptidasique dans le gradient et la place de la prot´ease TET de H.salinarum au cours de la phase exponentielle. En haut , activit´eSer-AMC r´ealis´ee sur un des extraits prot´eiques de H.salinarum apr`es s´eparation par gradient de sucrose 5-20%, en bleu, activit´esans cofacteur, en rouge avec du Cobalt. En bas , r´ev´elation par western blot de la localisation de TET dans le gradient.

La figure 12.3 montre que toute l’activit´eamino-peptidasique semble ˆetre cobalt- d´ependante, en effet la pr´esence de cobalt augmente de mani`ere significative l’activit´e amino-peptidasique dans chaque fraction o`uelle ´etait pr´esente. Par contre en comparant la localisation de TET et la localisation de l’activit´eamino- peptidasique dans le gradient, il est clair que l’on ne les retrouve pas dans les mˆemes fractions, en effet le pic d’activit´ese trouve aux alentours des fractions 5-6 et s’´etale de la fraction 3 `ala fraction 10. De plus les prot´eases misent en jeu pour cette activit´esont sensibles aux drogues in- hibitrices de metallo-prot´ease ”amastatine” et ”bestatine” (donn´ees non montr´ees) ; la prot´ease TET est sensible `aces drogues, mais une autre prot´ease non assign´ee de

174 la famille M29 l’est aussi (voir tableau 12.4. Il est donc fort probable, que l’activit´e amino-peptidasique mesur´ee corresponde `al’activit´ede cette prot´ease et non due `a l’activit´ede la prot´ease TET.

Figure 12.4 – Tableau r´ecapitulatif des m´etallo-prot´eases r´ef´erenc´ees chez H.salinarum .

12.1.3 Accumulation et recrutement de la forme 12 sous-unit´es de la prot´ease TET au d´ebut de la phase stationnaire

Lors de l’´etude ph´enotypique du mutant CN5 chez H.volcanii , il a ´et´epossible de voir une l´eg`ere diff´erence de capacit´ede croissance, avec une DO plus faible de 10% de la souche mutante lors de l’entr´ee en phase stationnaire. Une ´etude de l’accumula- tion de cette prot´ease en cours de croissance a donc ´et´er´ealis´ee (voir figure 12.5), afin

175 d’oserver l’´evolution des diff´erents profils de la prot´ease TET au cours de la croissance.

Figure 12.5 – Quantification de l’accumulation de la prot´ease TET et de l’activit´eamino-peptidasique totale au cours des diff´erentes phases de la croissance cellulaire chez H.salinarum . A gauche , en bleu : courbe retra¸cant la croissance d’une culture de H.salinarum ; en rouge : mesure de l’activit´eamino- peptidasique totale sur des extraits prot´eiques, normalis´ee par rapport `ala quantit´e totale de prot´eines (par Bradford). A droite Immuno-r´ev´elation par la technique de Western-blot de la prot´ease TET et des contrˆoles MDH(malate d´ehydrog´enase) et TF55 (thermosome) des fractions prot´eiques normalis´ees et pr´elev´ees au cours des diff´erents temps de la croissance.

Il est possible de voir que l’activit´eamino-peptidasique augmente au cours de la croissance, atteint son maximum en d´ebut de phase stationnaire, puis chute en phase stationnaire prolong´ee (courbe rouge de la figure 12.5). Il est aussi possible de voir une l´eg`ere accumulation de la prot´ease TET lors de l’entr´ee en phase stationnaire (Western- blot de la figure 12.5).

Pour compl´eter l’´etude nous avons pris les fractions prot´eiques d’ H.salinarum au cours des diff´erentes phases de croissance et nous les avons s´epar´es sur gradient de sucrose 5-20%, puis l’activit´eamino-peptidasique a ´et´e mesur´ee dans chaque fraction et une immunor´evalation de la prot´ease TET par Western-blot a ´et´er´ealis´ee (voir r´esultats figure 12.6.

176 Figure 12.6 – Comparaison de la localisation lors d’un gradient de sucrose 5-20% de l’activit´eamino-peptidasique et de la prot´ease TET au cours de la croissance chez H.salinarum .En haut , activit´eSer-AMC r´ealis´ee sur un des extraits prot´eiques de H.salinarum apr`es s´eparation par gradient de sucrose 5-20%, en bleu : culture en phase stationnaire, en rouge, culture en fin de phase exponentielle, en vert, culture en d´ebut de phase exponentielle. En bas , r´ev´elation par Western blot de la localisation de TET dans le gradient au cours de la croissance.

L’activit´eaminopeptidasique augmente clairement enfin de croissance cellulaire des

177 cultures, cette augmentation est homog`ene dans toute les fractions du gradient. Ainsi il est possible de voir que l’activit´eamino-peptidasique se retrouve toujours dans les mˆemes fractions (entre la 4 et la 11, avec un pic aux alentours des fractions 5-6). Sur les diff´erentes courbes de croissance en phase ”avanc´ee” un l´eger ´epaulement apparait autour de la fraction 8. Du fait de son emplacement, il serait possible de croire que cette activit´edans les fractions 8-9 serait due `al’activit´ede la prot´ease TET. En visualisant l’immuno-r´ev´elation de la prot´ease TET sur le gradient et en comparant les r´esultats obtenus des DO de 0.4 et 0.9, il est possible de voir une accumulation de prot´eases dans les fractions 8 `a11. Mais cela semble n’ˆetre qu’une co¨ıncidence. En effet, sur le gradient de la culture `aDO 1.5, il est possible de voir que, bien que l’accumulation de la forme suppos´ee `a12ss soit encore sup´erieure `acelle obtenue en fin de phase ex- ponentielle (DO 0.9), la prot´ease se trouve majoritairement dans les fractions 10-11. Or, dans ces fractions l’activit´eamino-peptidasique mesur´ee est proche de 0. Donc ces activit´es amino-peptidasique mesur´ees ne correspondent donc pas `al’activit´ede la prot´ease TET. Cette co-localisation de l’activit´eet de la prot´ease TET dans certaines conditions de croissance ne semble ˆetre qu’un artefact de manipulation. N´eanmoins, mˆeme si nous ne pouvons observer l’activit´ede la prot´ease TET, le fait d’avoir un changement d’oligom´erisation de la prot´ease dans diff´erentes phases de crois- sance est un ´el´ement important, surtout si l’activit´ede la prot´ease est d´ependante de son ´etat d’oligom´erisation. En effet son ´etat d’oligom´erisation semble ˆetre r´egul´een fonction de l’´etat de croissance, avec un fort recrutement dans les fractions de HPM en fin de phase exponentielle. Il est donc fort probable que l’activit´ede cette prot´ease joue un rˆole important lors de l’entr´ee en phase stationnaire et donc lors de carences nutritionnelles.

178 12.1.4 Essai de dosage de l’activit´eenzymatique de la pepti- dase TET apr`es d’immuno-pr´ecipitation `ahaut sel

N’arrivant pas `amesurer directement l’activit´ede la prot´ease TET dans les frac- tions prot´eiques et mˆeme apr`es s´eparation sur gradient de sucrose, une ”purification” par immuno-pr´ecipitation a ´et´etest´ee sur des cultures en d´ebut de phase stationnaire. Le probl`eme pour la mise en place de cette exp´erience ´etait la salinit´e, en effet il est n´ecessaire de trouver des conditions qui permettent de conserver des prot´eines intactes (il est donc n´ecessaire d’avoir une forte salinit´e), mais aussi des conditions o`ula r´eaction antig`ene-anticorps-billes soit favorable (`atrop haute concentration saline les anticorps pr´ecipitent). Finalement la condition saline optimale pour cette immuno-pr´ecipitation `ahaut sel est de 2M KCl. Par contre mˆeme apr`es immuno-pr´ecipitation (voir r´esultat figure 12.7), aucune activit´eamino-peptidasique n’a ´et´emesur´ee. Les raisons de ces mesures d’activit´e”n´egatives” peuvent ˆetre dues `aune trop faible concentration de la prot´ease ”active” (en effet une large partie des prot´eases TET sont sous forme dim`erique), `aun blocage de l’activit´epar la pr´esence de la liaison aux anticorps (nous n’avons pu trouver de conditions permettant de s´eparer l’anticorps de TET) ou encore `aune d´esoligom´erisation des formes `a12ss lors de l’exp´erience.

179 Figure 12.7 – V´erification de l’immuno-pr´ecipitation de TET H.salinarum `ahaut sel (2M KCl). A. Immuno-r´ev´elation par Western-blot de la prot´eine TET. B. et C. R´ev´elation des prot´eines par la coloration au Bleu de coomassie et au nitrate d’argent respectivement. Composition des puits : 1 : Marqueur de poids mol´eculaire ; 2 : Extrait total de H.salinarum ; 3 : S30 (surnageant contenant l’extrait prot´eique d´ebarrass´ede l’ADN et des membranes) de H.salinarum ; 4 : surnageant apr`es immuno- pr´ecipitation TET ; 5 : fractions immuno-pr´ecipit´ees ; 6 : contrˆole anti-corps+billes ; 7 : contrˆole billes incub´eavec S30 sans anticorps.

12.1.5 Disparition de la prot´ease TET lors de stress

Un rˆole possible pour la prot´ease TET est la d´egradations de peptides en aval du prot´easome. Le prot´easome ´etant induit lors de stress environnementaux, bien qu’au-

180 cune diff´erence de croissance n’ait ´et´eobserv´ee chez le mutant CN5 de H.volcanii , il est possible que cette prot´ease ait un rˆole `ajouer dans la r´eponse au stress. Des cultures de H.salinarum ont ´et´esoumises `aun stress hypo-salin `a2,5M ou `aun stress ther- mique `a55˚C. Des pr´el`evements de cellules ont ´et´er´ealis´es au cours du stress et les prot´eases TET ont ensuite ´et´eimmuno-r´ev´el´ees par Western-blot, ainsi que la malate d´ehydrog´enase (MDH) servant de contrˆole n´egatif (accumulation peu modifi´ee au cours du stress) et d’une sous-unit´edu thermosome (TF55) qui est une prot´eine chaperonne de r´eponse au stress thermique (voir r´esultats figure 12.8).

Figure 12.8 – Profil d’accumulation de la prot´ease TET d’ H.salinarum au cours du temps en pr´esence d’un stress hypo-salin et haute temp´erature. Des cultures de H.salinarum ont ´et´esoumises `aun stress hypo-salin mod´er´e(2,5M NaCl extracellulaire) et thermique (55˚C), des ´echantillonnages de chaque culture ont ´et´er´ealis´es au cours du temps, les prot´eines en ont ´et´eextraites est d´epos´ees sur gel SDS puis r´ev´el´ees par immuno-d´etection (Western-blot), les prot´eines vis´ees sont TET et les contrˆoles MDH et TF55.

181 Comme attendu, l’accumulation de la MDH change peu au cours des stress, la prot´eine TF55 est accumul´ee rapidement en r´eponse `aun stress thermique (moins de 4 heures apr`es) et un peu plus tardivement pour un stress hypo-salin (environ 8 heures apr`es). Par contre, pour les deux stress il est possible de voir la prot´ease TET dispa- raitre des fractions prot´eiques. Cette prot´ease serait sensible aux stress. Pour confirmer cela, une ´etude de la vitesse de disparition de cette prot´ease en fonction de l’intensit´e du stress a ´et´er´ealis´ee (voir r´esultats figure 12.9).

Figure 12.9 – Mise en ´evidence du lien entre l’intensit´edu stress hypo-salin et la vitesse de disparition de la prot´ease TET. Immuno-r´ev´elation d’extraits prot´eiques de culture de H.salinarum soumis a diff´erentes intensit´es de stress hypo- salin (3,5 - 3,0 - 2,5 - 2,0 - 1,5M NaCl extracellulaire) au cours du temps. Des contrˆoles sur la fluctuation de la MDH ont ´et´eaussi r´ealis´es mais ne figurent pas sur la figure.

Il est en effet possible de voir que la vitesse de disparition de la prot´ease TET est d´ependante de l’intensit´edu stress. Plus la condition saline extracellulaire est basse (donc plus le stress est intense) plus la prot´ease TET disparait rapidement des frac- tions cellulaires. Cette sensibilit´ene veut pas forc´ement dire que cette prot´ease ne joue pas un rˆole au cours de ces types de stress. EN effet, bien que l’accumulation de cette prot´ease soit sensible aux stress, il est possible que se ne soit que la forme dim´erique qui disparaissent (et/ou qui n’est pas renouvel´ee) et que la cellules conserve un ”pool” de prot´eases TET fonctionnelles sous formes actives (particule `a12 sous-unit´es). Pour v´erifier cela, une culture a ´et´edivis´een trois, la premi`ere partie est cultiv´ee en condi-

182 tions normales, la seconde subit un stress hypo-salin `a2,5M NaCl extracellulaire et la derni`ere un stress thermique `a55˚C pendant environ 20 heures. Les cultures sont ensuite culott´ees, les prot´eines extraites et s´epar´ees par gradient de sucrose 5-20% et finalement la prot´ease TET est r´ev´el´ee dans chaque fraction par immuno-d´etection (voir r´esultats figure 12.10).

Figure 12.10 – R´ev´elation par immuno-d´etection des formes de TET pr´esentes lors d’un stress hypo-salin et thermique, apr`es s´eparation sur gradient de sucrose 5-20% . Sur la figure en haut, immuno-d´etection de la prot´ease TET en conditions de culture normales. Au milieu, en conditions de stress thermique (55˚C) pendant 20 heures. En bas, en conditions de stress hypo-salin (2,5M nACl) pendant 20 heures.

Il est nettement visible, que toute les formes de TET cytoplasmiques sauf celles pr´esentes dans la fraction 15 semblent ˆetre sensibles aux stress et disparaissent pour les deux types de stress. Il semble donc que cette prot´ease ne soit donc pas n´ecessaire lors de la r´eponse aux stress physiques environnementaux et est mˆeme rapidement d´egrad´ee lors d’un stress mod´er´e. Cette d´egradation peut ˆetre due au fait que la prot´ease ne joue pas un rˆole primordial dans ces conditions ou que la stabilit´ede cette prot´ease est sensible aux stress et que sa d´egradation/disparition est due `asa d´enaturation. Mais aussi, il est possible que l’activit´e(le rˆole cellulaire) de cette prot´ease soit ”n´efaste” lors de ces types de stress et donc les cellules d´egrade rapidement (et en priorit´ela forme active) la prot´ease TET, mˆeme dans de conditions de stress mod´er´e.

183 12.1.6 Accumulation et recrutement de la forme 12 sous-unit´es de la prot´ease TET au cours de carences nutritionnelles

Lors de l’´etude port´ee sur le mutant CN5 TET de H.volcanii en conditions de carences nutritionnelles (fin de phase exponentielle en milieu ”Hv-YPC”, mais aussi en milieu carenc´ecomme le ”Hv-peptone” ou les milieux ”Hv-AA”), un ph´enotype diff´erent de celui de la souche sauvage a ´et´eclairement visible. Etant donn´el’impor- tant recrutement de la forme dod´ecam´erique de la prot´ease TET de H.salinarum en fin de phase exponentielle, il semble possible que ce recrutement de la forme `a12 sous- unit´es soit effectif dans ces mˆemes conditions nutritionnelles chez H.salinarum . Pour visualiser cela, une culture en phase exponentielle a ´et´edivis´ee en quatre, les cellules ont ´et´eculott´ees. La premi`ere partie a ´et´ere-suspendue dans un milieu de croissance optimal (Hs 4.2M); la deuxi`eme avec un milieu ”Hs peptone” (c’est `adire sans extrait de levure); les troisi`eme et quatri`eme avec un milieu ”Hs a.a.” avec ou sans source d’´energie (Glycerol, Sodium Succinate). Les cellules sont mises en culture pendant 20 heures `a37˚C. Les prot´eines des cellules apr`es culottage sont ensuite ex- traites, une partie est directement d´epos´ee sur gel SDS-page pour r´ealiser une immuno- r´ev´elation de la prot´ease TET et ainsi comparer les diff´erences d’accumulation de la prot´ease entre les diff´erentes conditions nutritionnelles (l’intensit´edes spots a ´et´eme- sur´ee `al’aide du logiciel de capture Kodak et les r´esultats sont pr´esent´es sur la figure 12.11); l’autre partie est utilis´ee pour r´ealiser une s´eparation sur gradient de sucrose et ainsi visualiser les proportions des diff´erentes forme de TET pr´esentes dans le cy- toplasme par le biais d’une immuno-r´ev´elation par Western-blot (voir r´esultats figure 12.12).

184 Figure 12.11 – Comparaison de la concentration de la prot´ease TET ac- cumul´ee dans le cytoplasme au cours de stress nutritionnels. L’intensit´edes bandes obtenues apr`es Western-blot a ´et´emesur´ee grˆace au logiciel de capture Kodak, l’intensit´ede la bande de l’´echantillon contrˆole c’esta ` dire celui cultiv´edans des condi- tions nutritionnelles optimales/normales (milieu Hs 4,2M) a ´et´erapport´e`ala valeur ”1” et sert de r´ef´erence.

Il est possible de voir une nette accumulation de la prot´ease TET d`es la pr´esence de modifications nutritionnelles, avec un effet plus important lors de la pr´esence de petits peptides (tryptone) qui multiplient la concentration cytoplasmique de la prot´ease TET par 3. L’accumulation est aussi visible en milieu d´efinit compos´ed’acides amin´es (ac- cumulation x1,5) et est amplifi´ee lorsque le milieu ”Hs a.a.” n’apporte plus de source d’´energie (accumulation x2,5). En visualisant la pr´esence des diff´erentes formes cytoplasmiques de TET lors de la mise sous carence, il est aussi possible de voir un net recrutement de TET dans les fractions HPM lorsque les cellules sont mises en pr´esence uniquement de petits peptides, ce re- crutement n’apparait pas dans les milieux compos´es uniquement d’acides-amin´es.

185 Figure 12.12 – Immuno-r´ev´elation de la prot´ease TET pour les cultures soumises `aun stress nutritionnel. Les les fractions prot´eiques ont ´et´es´epar´ees par gradient de sucrose 5-20% puis r´ev´el´ees par Western-blot.

Les r´esultats pr´esent´es dans les deux figures pr´ec´edentes ont ´et´eregroup´es et sont pr´esent´es sur la figure 12.13. Cela permet ainsi de comparer l’accumulation des diff´erentes formes cytoplasmiques de TET entre les diff´erents milieux de carences. Il est ainsi possible de voir une importante augmentation de la prot´ease TET dod´ecam´erique dans le cytoplasme pour le milieu peptone par rapport `ala condition normale/optimale de croissance (la concentration est 7 fois sup´erieure), que la concentration de la forme dim´erique augmente l´eg`erement (x1.5) et que la forme pr´esente dans la fraction 15 augmente de 3 fois. Pour les deux milieux ”Hs a.a.”, on mesure la mˆeme quantit´ede la forme dod´ecam´erique (environ 2 fois moins concentr´ee que pour l’´echantillon normal) et de la forme pr´esente dans la fraction 15 (environ 4 fois plus concentr´ee que pour l’´echantillon normal). Par contre il est possible d’observer dans ces derni`eres conditions de croissance, une nette augmentation de la concentration de la forme dim´erique, avec une augmentation de 1.5 fois pour un milieu ”Hs a.a.” et d’environ 4 fois pour un milieu ”Hs a.a. sans apport d’´energie”.

186 Figure 12.13 – Comparaison de la quantit´edes diff´erentes formes de TET accumul´ees lors de stress nutritionnels. Les valeurs ont ´et´erapport´ees `ala valeur du contrˆole ”normal”. Pour obtenir la hauteur des barres de l’histogramme, une quan- tification de l’intensit´edes bandes de Western-bolt a ´et´e utilis´ee sur des ´echantillons prot´eiques de chaque culture. Pour obtenir la composition de chaque barre de l’histo- gramme, une quantification de l’intensit´edes bandes de chaque fraction des gradients de sucrose immuno-r´ev´el´es par Western-bolt a ´et´eutilis´ee.

En r´eponse `aun stress nutritionnel, o`ule milieu de culture n’est compos´eque de petits peptides comme source de nutriments, la pr´esence de la forme `a12 sous-unit´es de la prot´ease TET semble primordiale. En effet cette forme devient non seulement la forme cytoplasmique majoritaire, mais la concentration de cette forme seule ´equivaut presque `a2 fois la concentration de toutes les formes cytoplasmiques de TET en condi- tions nutritionnelles normales. Par contre en milieu d´efinit o`ul’apport nutritionnel n’est compos´eque d’acides-amin´es, on peut observer une disparition (ou un non recrutement) de la forme `a12 sous-unit´es au profit des deux autres formes. Malgr´ecela il semble, du fait de l’augmentation de

187 l’accumulation totale de la prot´ease TET par rapport `ala condition nutritionnelle nor- male, que cette prot´ease joue un rˆole dans la r´eponse `ace type de stress nutritionnel par le biais de sa forme dim´erique et de sa forme ”inconnue” associ´ees `ades complexes de haut poids mol´eculaire (fraction 15). Il semble donc que la forme `a12 sous-unit´es de la prot´ease TET intervienne pour la prise en charge et/ou la d´egradation des peptides extracellulaires, mais n’intervient pas pour la prise en charge des acides amin´es extracellulaires et que la forme dim´erique n’est pas essentielle pour la prise en charge et/ou la d´egradation des peptides extracellu- laires, mais semble importante pour la prise en charge des acides amin´es extracellulaires.

12.2 Discussion

Il en ressort qu’in vivo la particule dod´ecam`erique ne semble pas ˆetre la seule forme pr´esente utile et donc ”active”. En effet une forme de bas poids mol´eculaire (surement la particule dim`erique) et une forme inconnue de tr`es haut poids mol´eculaire semblent essentielles pour la prise en charge des acides-amin´es comme nutriments pour la cellule. La pr´esence de ces diff´erentes formes cytoplasmiques peut s’expliquer de plusieurs fa¸cons qui peuvent se combiner entre elles : – La cellule g´en`ere un pool de particules dim`eriques de TET non actives (sans activit´eamino-peptidasique), qui vont aller interagir avec des cibles `ad´egrader, une fois fix´ees `ala cible, il y a recrutement de la forme dod´ecam`erique pour activer l’activit´ede prot´eolyse. Une fois le complexe activ´e, il le reste d’o`ul’augmentation de l’accumulation des formes dod´ecam`eriques. La cellule essaie de plus de toujours garder un ”pool” constant de prot´eases dim`eriques. – Comme pr´ec´edemment, la cellule g´en`ere un pool de particules dim`eriques de TET non actives en pr´evision d’un recrutement rapide de prot´eases dod´ecam`eriques actives lorsque cela devient n´ecessaire, en pr´esence d’un signal de nature inconnu. – Les diff´erentes formes de la prot´ease TET pr´esentes dans le cytoplasme sont toutes

188 actives, la prot´ease TET joue des rˆoles et poss`ede des activit´es peptidasiques diff´erentes en fonction de son ´etat d’oligom´erisation. – La forme dod´ecam`erique est une forme active de la prot´ease TET, son inter- vention est n´ecessaire pour l’utilisation des peptides extracellulaires assez longs (chaine de plusieurs acides amin´es) comme source de nutriments, par l’activation des transporteurs de peptides et/ou par la d´egradation des peptides entrant dans la cellule. – La forme dim`erique peut poss´eder une activit´eamino-peptidasique propre ou non, cette forme est essentielle pour l’utilisation de nutriments extracellulaires de type acide amin´e, par exemple en activant les transporteurs d’acides amin´es ou les transporteurs de di-peptides tout en contrˆolant les acides amin´es entrant et en contrˆolant/d´egradants les di-peptides entrant pour g´en´erer un pool d’acides amin´es dans le cytoplasme. Le fait de ne pouvoir mesurer l’activit´eamino-peptidasique in vivo de cette prot´ease TET, que ce soit de la forme dim`erique ou dod´ecam`erique, ne permet pas de conclure sur le rˆole exact de TET. Une ´etude r´ecente non publi´ee sur l’activit´eamino-peptidasique, r´ealis´ee au laboratoire par Alexandre Appolaire sur des mutants de la prot´ease TET2 de Pyrococcus horikoshii permettant de stabiliser in vitro la forme dim`erique et dod´ecam`erique, montre claire- ment que la particule dim`erique poss`ede une activit´eamino-peptidasique ´equivalente `a la forme dod´ecam`erique pour des peptides de tr`es petite taille (dipeptide) ; par contre la forme dod´ecam`erique est la forme optimis´ee pour d´egrader des peptides longs (par exemple elle est 2,5 fois plus performante que la forme dim`erique pour un peptide com- pos´ede 11 r´esidus). Il est donc fort probable que tout comme la prot´ease TET2 d’ H.horikoshii , la forme dim`erique majoritairement pr´esente dans des conditions de croissances normales poss`ede une activit´eamino-peptidasique permettant de d´egrader de petits peptides en acides amin´es. Par contre lorsque la d´egradation d’un nombre important de peptides plus longs devient n´ecessaire, un recrutement de la forme dod´ecam`erique s’effectue.

189 Au vu des r´esultats obtenus sur les TET de H.salinarum et H.volcanii , il semble ´evident que cette prot´ease ne joue pas juste un rˆole en aval du prot´easome pour la d´egradation de peptides en acides amin´es, mais que cette prot´ease semble essentielle dans le trans- port/prise en charge/d´egradation de nutriments, en particulier pour des nutriments de type petits peptides et d’acides amin´es. En conclusion il semble que cette prot´ease TET joue plusieurs rˆoles cl´es dans la cellule. De plus, bien que son activit´eamino-peptidasique semble compl´ementaire avec le com- plexe prot´easome, il semble peu probable que ces prot´eines soient associ´ees, en effet la prot´ease TET est d´egrad´ee en conditions de stress hypo-salin et thermique, alors que le complexe prot´easome est induit. Cette prot´ease TET pourrait donc appartenir `aun syst`eme de prot´eolyse annexe, diff´erent du syst`eme prot´easome, avec des rˆoles dans la cellules diff´erents et compl´ementaires aux rˆoles du syst`eme prot´easome. Son implication semble en particulier primordiale lorsque la cellule ne poss`ede que des petits peptides et des acides amin´es comme source de nutriments et lors de l’entr´ee des cellules en phase stationnaire.

190 Cinqui`eme partie

Conclusion g´en´erale et perspectives

191 Cette th`ese a permit de confirmer que la diffusion de neutron est un outil permet- tant de mesurer in vivo l’effet d’un stress sur la dynamique des prot´eines. En effet nous avons pu mettre en ´evidence, in vivo , l’effet d’un stress sur la dynamique mol´eculaire du prot´eome d’ Halobacterium salinarum pour des stress de diff´erents intensit´es et de diff´erentes natures (stress thermique et stress hypo-salin). De ce fait cette technique pourrait donc ˆetre int´eressante pour tester l’action de drogues, de m´edicaments ou de pathologies sur diff´erents types cellulaires ou organismes.

Du point de vue halophilisme, j’ai montr´eque dans un contexte intracellulaire, le prot´eome d’ Halobacterium salinarum conserve des caract´eristiques halophiles marqu´ees. De plus la dynamique mol´eculaire du prot´eome halophile est perturb´epour des chan- gements mod´er´es de salinit´edans l’environnement (2,5M NaCl extracellulaire). En r´epondant `ala question : ” quelles sont les limites d’adaptation au stress hypo-salin de cet organisme ? ”, j’ai d´ecouvert l’existence d’un m´ecanisme qui permet la survie des arch´ees hyper-halophiles `abasse salinit´epar des changements de morphologie et une modification de la composition du prot´eome. Ainsi en contrˆolant l’intensit´edu stress, l’organisme hyper halophile H.salinarum peut survivre `aun environnement hypo-salin (jusqu’`a0,5M NaCl extracellulaire). Cette survie s’accompagne de changements mor- phologiques importants, d’une forme en bˆatonnet les cellules prennent `apartir de 2,5M NaCl extracellulaire une forme ovo¨ıde. Au cours de ce ph´enom`ene de survie, j’ai pu montrer que ces cellules ne conservent pas leur potassium intracellulaire. Etant en pr´esence d’organisme hyper-halophile dont le prot´eome est adapt´ea de forte concen- tration en sel, le fait de ne pas conserver le potassium intracellulaire doit engendrer des contraintes ´enormes pour le prot´eome car celui si est sel d´ependant. Ainsi nous avons pu observer des changements important de la composition du prot´eome avec une accumulation de prot´eines sp´ecifiques et la disparition de la majorit´edes prot´eines cytoplasmiques. En perspective, il serait int´eressant d’identifier ces prot´eines pr´esentes `abasse salinit´e. Puis de les caract´eriser fonctionnellement et structuralement. Mais aussi d’´etudier les

192 modifications du prot´eome et du transcriptome lors de la survie au stress. Enfin une analyse de l’accumulation des solut´es compatibles pouvant jouer un rˆole osmoprotec- tant lors de ce ph´enom`ene pourrait ˆetre d´eterminante pour comprendre les m´ecanismes mis en place lors de la survie `abasse salinit´e. Du point de vue prot´eolyse intracellulaire, mon travail de th`ese `apermit d’orienter la recherche du rˆole de l’aminopeptidase TET, in vivo , plutˆot vers une voie m´etabolique alors qu’on lui pr´edisait uniquement un rˆole de partenaire du prot´easome. J’ai pu mon- trer que cette prot´eine ´etait sensible/r´egul´een condition de stress physique (basse salinit´eou temp´erature) et que son ´etat d’oligom´erisation ´et´econtrˆol´epar les condi- tions nutritionnel et de phase de croissance. Enfin, d’apr`es l’´etude r´ealis´ee, il en ressort une possibilit´ed’avoir des rˆole diff´erents pour chaque type d’association de TET. En perspective, il serait int´eressant de r´ealiser une ´etude in cellulo de la prot´ease TET, en se focalisant sur la localisation (par imagerie), l’association (compartimentation cel- lulaire) et les partenaires ( pull down , co-immuno-pr´ecipitation) des diff´erentes formes de cette prot´ease. De plus, une ´etude g´en´etique plus pouss´ee pourrait permettre de mieux d´efinir le ph´enotype d’organisme priv´ede la prot´ease TET, soit en r´ealisant un double mu- tant TET chez H.volcanii , soit en r´ealisant un simple mutant chez H.salinarum .

193 Sixi`eme partie

Mat´eriels et m´ethodes

194 Chapitre 13

Croissance et manipulation du mat´eriel vivant utilis´e

13.1 Milieux de culture

13.1.1 Milieu et conditions de croissance optimum d’ Halobacterium salinarum

• Milieu Hs 4.2M L’organisme Halobacterium salinarum R1 est cultiv´e`a37˚C, dans un milieu hyper- salin standard `a4,2M de NaCl et sous agitation mod´er´ee pour une culture en milieu liquide (110 rpm (rotations par minute)). Pour composer 1 litre de milieu de culture liquide (nomm´e”Milieu Hs 4.2M”), dis- soudre dans 500ml d’H 2O distill´ee : 250g NaCl , 20g MgSO 4, 3g extrait de levure, 5g tryptone, 3g KCl, 3g Trisodium Citrate. Puis compl´eter `a1L qsp avec H 2O distill´ee. Autoclaver. Ajuster `apH=7,5 avec du NaOH concentr´e. Pour composer 1 litre de milieu de culture solide (nomm´e”Milieu Hs 4.2M solide”), dissoudre 14g d’agar dans 1 litre de ”Milieu Hs 4.2M”. Autoclaver.

195 13.1.2 Milieu et conditions de croissance optimum d’ Haloferax volcanii

• Milieu Hv-YPC L’organisme Haloferax volcanii est cultiv´e`a45˚C, dans un milieu hyper-salin `a 2,4M de NaCl et sous agitation `a130 rpm. Pour composer 1 litre de milieu de culture liquide (nomm´e”Hv-YPC”) dissoudre dans

500ml d’eau chaude : 144g NaCl, 18g MgCl 2.6H 2O, 22g MGSO 4.7H 2O, 4g KCl, 12ml Tris-HCl 1M pH=7,5. Dissoudre, `apart, dans 20ml d’eau : 1g peptone (marque Oxoid), 5,2g extrait de levure, 1g Casamino acide et rajouter 2ml KOH 1M. M´elanger les deux solutions et compl´eter `a1 litre avec H 2O distill´ee. Autoclaver. Laisser refroidir et ajou- ter 3ml CaCl2 1M st´erile. Pour composer 1 litre de milieu culture solide (nomm´e”Hv-YPC solide”), dissoudre 14g d’agar dans 1 litre de ”Milieu Hv-YPC”. Autoclaver.

13.1.3 Milieux de croissance pour stress nutritionnels d’ Halobacterium salinarum

• Milieu Hs peptone Dans ce milieu la source de nutriment ”extrait de levure” est supprim´ee et est rem- plac´ee par un apport sup´erieur en ”tryptone”. Pour composer 1 litre de milieu de culture liquide (nomm´e”Milieu Hs tryptone”), dis- soudre dans 500ml d’H 2O distill´ee : 250g NaCl, 20g MgSO 4, 8g tryptone, 3g KCl, 3g

Trisodium Citrate. Puis compl´eter `a1L qsp avec H 2O distill´ee. Autoclaver. Ajuster `apH=7,5 avec du NaOH concentr´e.

• Milieu Hs levure

196 Dans ce milieu la source de nutriment ”tryptone” est supprim´ee et est remplac´ee par un apport sup´erieur en ”extrait de levure”. Pour composer 1 litre de milieu de culture liquide (nomm´e”Milieu Hs levure”), dis- soudre dans 500ml d’H 2O distill´ee : 250g NaCl, 20g MgSO 4, 8g extrait de levure, 3g

KCl, 3g Trisodium Citrate. Puis compl´eter `a1L qsp avec H 2O distill´ee. Autoclaver. Ajuster `apH=7,5 avec du NaOH concentr´e.

• Milieu Hs a.a. Ce milieu est un milieu minimum dont la source en nutriments est compos´ee d’acides amin´es. Pour composer 1 litre de milieu de culture liquide (nomm´e”Milieu Hs a.a.”), dissoudre dans 500ml d’H 2O distill´ee : 250g NaCl, 20g MgSO 4, 2g KCl, 0.2g KNO 3,

0.3g CaCl 2.2H 2O, 0.15g KH 2PO 4, 0.15g K 2HPO 4, 0.5g Sodium citrate.2H 2O, 0.005mg

CuSO 4.5H 2O, 2.3mg FeCl 2.4H 2O, 0.44mg ZnSO 4.7H 2O, 1.0g Glycerol et les acides amin´es suivants : 0.43g L-alanine, 0.40g L-arginine, 0.05g L-cysteine hydrochloride mo- nohydrate, 1.3g L-glutamic acid, 0.06g glycine, 0.44g L-isoleucine, 0.8g L-leucine, 0.85g L-lysine, 0.37g L-methionine, 0.26g L-phenylalanine, 0.5g L-proline, 0.6g L-s´erine, 0.5g L-thr´eonine, 0.2g L-tyrosine, 1.0g L-valine. Autoclaver. Ajuster `apH=7,5.

13.1.4 Milieux de croissance pour stress nutritionnels d’ Haloferax volcanii

• Milieu HV-YPC peptone Dans ce milieu la source de nutriment ”extrait de levure” est supprim´ee et est rem- plac´ee par un apport sup´erieur en ”peptone”. Pour composer 1 litre de milieu de culture liquide (nomm´e”Hv-YPC peptone”) dis- soudre dans 500ml eau chaude : 144g NaCl, 18g MgCl 2.6H 2O, 22g MGSO 4.7H 2O, 4g KCl, 12ml Tris-HCl 1M pH=7,5. Dissoudre `apart dans 20ml d’eau : 7g peptone

197 (marque Oxoid) et rajouter 2ml KOH 1M. M´elanger les deux solutions et compl´eter `a

1 litre avec H 2O distill´ee. Autoclaver. Laisser refroidir et ajouter 3ml CaCl2 1M st´erile. Pour composer 1 litre de milieu culture solide (nomm´e”Hv-YPC solide”), dissoudre 14g d’agar dans 1 litre de ”Milieu Hv-YPC”. Autoclaver.

• Milieu HV-levure Dans ce milieu la source de nutriment ”peptone” est supprim´ee et est remplac´ee par un apport sup´erieur en ”extrait de levure”. Pour composer 1 litre de milieu de culture liquide (nomm´e”Hv-YPC levure”) dis- soudre dans 500ml eau chaude : 144g NaCl, 18g MgCl 2.6H 2O, 22g MGSO 4.7H 2O, 4g KCl, 12ml Tris-HCl 1M pH=7,5. Dissoudre `apart dans 20ml d’eau : 7g d’extrait de levure et rajouter 2ml KOH 1M. M´elanger les deux solutions et compl´eter `a1 litre avec

H2O distill´ee. Autoclaver. Laisser refroidir et ajouter 3ml CaCl2 1M st´erile. Pour composer 1 litre de milieu culture solide (nomm´e”Hv-YPC solide”), dissoudre 14g d’agar dans 1 litre de ”Milieu Hv-YPC”. Autoclaver.

• Milieu HV-AA Ce milieu est un milieu minimum pour H.volcanii dont la source en nutriments est compos´ee d’acides amin´es. Pour composer 1 litre de milieu de culture liquide (nomm´e”Milieu Hv-YPC a.a.”), dis- soudre dans 500ml d’H 2O distill´ee : 144g NaCl, 18g MgCl 2.6H 2O, 22g MgSO 4, 4g KCl,

0.2g KNO 3,0.3g CaCl 2.2H 2O, 0.3g NH 4Cl, 0.15g KH 2PO 4, 0.15g K 2HPO 4, 0.005mg

CuSO 4.5H 2O, 2.3mg FeCl 2.4H 2O, 0.44mg ZnSO 4.7H 2O, 0.36mg MnCl 2, 2.0g Glycerol, 2.0g (2mL) Sodium Succinate (acide succinique) et les acides amin´es : 0.43g L-alanine, 0.40g L-arginine, 0.05g L-cysteine hydrochloride monohydrate, 1.3g L-glutamic acid, 0.06g glycine, 0.44g L-isoleucine, 0.8g L-leucine, 0.85g L-lysine, 0.37g L-methionine, 0.26g L-phenylalanine, 0.5g L-proline, 0.6g L-s´erine, 0.5g L-thr´eonine, 0.2g L-tyrosine,

198 1.0g L-valine, 12ml Tris-HCl 1M pH=7,5. Autoclaver. Ajuster `apH=7,5.

Il est possible de compl´ementer ce milieu avec les acides amin´es manquant (milieu nomm´e”Milieu Hv-YPC a.a. compl´ement´e”) : 0.4g Acide aspartique, 0.45g Acide glu- tamique, 0.25g Histidine, 0.4g Asparagine, 0.3g Tryptophane.

13.1.5 Milieux pour le stress bas sel d’ Halobacterium salina- rum

Les milieux utilis´es pour diluer et soumettre un stress bas sel aux cultures est identique au milieu optimum dans sa conception, le seul ´el´ement changeant est la quantit´ede NaCl. Exemple pour le milieu optimum : 250g/L, pour le milieu OM.

13.2 Suivi de la croissance

Dans les conditions optimum, ces organismes ont un temps de g´en´eration long et non lin´eaire (en moyenne la DO `a600nm (voir chapitre suivant) augmente de 0.3 toutes les 24h). La croissance cellulaire est suivie par des mesures de l’absorbance `a600nm, par comptage de colonies sur boite, par comptage de cellules en microscopie et par dosage des prot´eines totales par la m´ethode de Bradford (voir chapitre 14.3 pour cette technique).

13.2.1 Densit´eoptique

La mesure de la turbidit´eou densit´eoptique (DO) se fait grˆace `aun spectropho- tom`etre. La DO d´esigne le logarithme d´ecimal de l’opacit´e, c’est-`a-dire l’inverse de la transmission (transparence) `aune longueur d’onde d´efinie. La longueur d’onde utilis´ee pour mesurer la quantit´ede cellules est de λ = 600 nm .

199 Le nombre de cellules pr´esentes en solution dans des conditions normales est propor- tionnelle `al’opacit´ede la solution (dans une gamme de DO allant de 0.2 `a1.2). Pour chaque incr´ementation de DO de 0.1 `apartir de DO=0.2, il y a environ 10 8 cellules/mL en plus, soit pour DO=0.2, il y a 2 ∗ 10 8 cellules/mL, pour DO=0.8, il y a 8 ∗ 10 8 cel- lules/mL et pour une DO=1.2, il y a 1 .2 ∗ 10 9 cellules/mL. Cette technique est une technique de routine en laboratoire pour suivre la croissance des cultures, par contre cette technique n’est pas totalement fiable lors du suivi de cultures en stress, car le stress peut g´en´erer de grande quantit´ede d´ebris (dus `ades d´egradations ou une forte mortalit´e) qui vont ˆetre ”d´etect´es”,tout comme les cellules intactes, par la mesure de la DO. Il se peut mˆeme que la DO augmente plus vite lors de la lyse des cellules.

13.2.2 Comptage sur boite

Le comptage de colonies sur boite est une technique de d´enombrement mais aussi de viabilit´edes cellules procaryotes. Le principe est d’´etaler une culture sur un milieu de culture solidifi´e(pour la composition de ces milieux de culture voir chapitre 13.1.1) et de laisser pousser les cellules dans une ´etuve (pour nos cellules `a37˚C), pour que chaque cellule forme une colonie visible `al’œil nu. Il faut diluer l’´echantillon `amesurer de telle sorte qu’il y ait entre 5 et 50 cellules par boite. Le probl`eme de cette technique pour notre sujet d’´etude (qui a un temps de d´edoublement peu rapide) est que cette mesure n’est pas directe : il faut environ 2 `a3 semaines pour des cultures non stress´ees pour avoir les premiers r´esultats. De plus cette technique n’est pas fiable pour des cultures subissant un stress bas sel, car le fait de les ´etaler sur un milieu riche en sel va provoquer un autre choc osmotique souvent l´etal.

La combinaison du comptage par microscopie et de la mesure de la viabilit´epar la technique Life/Dead est une m´ethode de choix pour contourner ce probl`eme de temps

200 et de ”sur-stress”.

13.2.3 Comptage par microscopie

On compte les cellules par d´epˆot de 10 µL de culture dilu´ee au 1/10 sur une lame de cellules `anum´eration Neubauer, avec un microscope par contraste de phase Olympus BX61-UCB coupl´e`aune cam´era CCD Retiga-SRV ´equip´ee d’un objectif UPFLN x100. La lame Neubauer a en son centre une grille de num´eration compos´ee d’un quadrillage carr´evisible uniquement au microscope (voir figure 13.1).

Figure 13.1 – Repr´esentation sch´ematique d’une lame de num´erotation Neu- bauer : en rouge exemple de zone de comptage

On compte en moyenne les cellules pr´esentes sur 4 lignes de 20 carr´es. Les cellules sont compt´ees selon la r`egle en L, qui consiste `aconsid´erer les ´el´ements qui se trouvent

201 `al’int´erieur des carr´es, ainsi que ceux qui sont en contact avec la ligne de gauche d´elimitant le premier carr´eet toute la ligne inf´erieure. Chaque petit carr´e`aune aire de 0,0025 mm 2 et l’´epaisseur entre la lame et la lamelle est de 0.1 mm. Pour remonter au nombre de cellules il faut utiliser la formule suivante :

(nombre de cellules compt´ees ∗ facteur de dilution ∗ facteur de conversion) Nombre de cellules finales = (nombre de carr´es ∗ volume d’un carr´e)

– Le facteur de dilution correspond `ala dilution effectu´ee avant le d´epˆot(pour nous 1/10). – Le facteur de conversion correspond `al’unit´evoulue pour exprimer le nombre de cellules finales (x1 pour exprimer en µ L, x10 3 pour exprimer en mL et x10 6 pour exprimer en litres. – Le nombre de carr´es correspond au nombre de carr´es de 0,0025 mm 2 utilis´es pour compter les cellules. – Le volume d’un carr´e= 0.00025mm 3.

13.2.4 Mesure de la viabilit´e(technique Live/Dead)

La viabilit´edes cellules est analys´ee grˆace au kit Live/Dead BacLight Bacterial Viability pour microscopie (L7012, Invitrogen) et grˆace au microscope par contraste de phase Olympus BX61-UCB. 100 µL de culture (plus ou moins dilu´ee) est incub´e`al’abri de la lumi`ere pendant 15 min avec 5 µL du m´elange d’iodure de propidium(1.2 mM) et de SYTO 9 (0.2 mM). 15 µL de la culture est d´epos´esur lame pour microscopie. On utilise une lampe `a fluorescence X-Cite 120 (EXFO) coupl´ee au microscope, avec les filtres CY3 et DAPI, pour observer le marquage au SYTO9 et `al’iodure de propidium respectivement. Le traitement des images est r´ealis´egrˆace au logiciel Volocity 5 Ces deux compos´es sont des intercalants fluorescents d’acides nucl´eiques. Le SYTO9 est un compos´equi passe facilement la barri`ere form´ee par la membrane de la cellule. Ce compos´eva donc s’intercaler dans tout les ”morceaux” d’ADN pr´esents dans la culture, donc dans les cellules vivantes, mais aussi dans les cellules mortes. Avec le filtre utilis´e(DAPI) les cellules apparaissent color´ees en vert fluo du fait de la pr´esence de ce compos´e.

202 L’iodure de propidium n’est pas ”capable” de traverser une membrane cellulaire intacte, il va donc s’ins´erer que dans les cellules mortes, o`ula membrane est d´esorganis´ee. Avec le filtre CY3 les cellules mortes apparaissent color´ees en rouge. En superposant les cellules rouges aux vertes, il est possible de d´eterminer un pour- centage de viabilit´e.

13.3 Stress physiques

13.3.1 Stress bas salinit´e

• Pour un stress direct Les cellules sont dilu´ees de 4.2M NaCl `ala concentration finale en NaCl extracel- lulaire voulue en une seule ´etape avec du milieu de culture `a 0M (13.1.5).

• Pour un stress par ´etape Les cellules sont dilu´ees de 4.2M NaCl `ala concentration finale en NaCl extracellu- laire voulue en intervalles r´eguliers avec du milieu de culture `a0M en laissant un temps de repos `a37˚C et sous agitation entre chaque ´etape de dilution. Par exemple, pour le stress par ´etape en 1 heure, il y a 12 ´etapes de dilution de 5 minutes.

• Pour un stress progressif Les cellules sont dilu´ees de 4.2M NaCl `a1.5M NaCl, pour cela on dilue avec un volume 2,8 fois sup´erieur au volume initial avec un milieu de culture `aune concen- tration de 0M NaCl. Cette dilution est r´ealis´ee progressivement grˆace `aune pompe p´eristaltique (voir 9.2). La culture reste pendant toute la dilution `a37˚C et sous agita- tion. Le volume de culture obtenue est alors centrifug´e`a2500 rpm pendant 1h et repris dans un volume du mˆeme milieu de culture 1.5M NaCl de fa¸con `a obtenir la mˆeme valeur initiale de densit´eoptique `a600 nm. Puis les cellules sont `anouveau dilu´ees de

203 la mˆeme fa¸con, de 1.5M NaCl `a0.5M NaCl, par ajout de 3 volumes au volume initial d’un milieu de culture `a0M NaCl.

13.3.2 Stress haute temp´erature

Pour appliquer un stress thermique, nous pla¸cons nos cultures sous agitation dans un incubateur r´egl´e`ala temp´erature voulue pendant 1 `a 2 heures. Le temps d’appli- cation du stress est d´ependant du volume de la culture, plus le volume sera important, plus le temps pour que toute la culture arrive `ala temp´erature voulue est grand.

204 Chapitre 14

Biochimie des prot´eines

14.1 Extractions et ´echantillonnage

Ce protocole est utilis´epour extraire des prot´eines halophiles intactes et fonction- nelles. 300 mL de culture est centrifug´ee `a4500 rpm (45 min, 4˚C). Les cellules sont lys´ees en deux ´etapes : on provoque un choc osmotique doux par re-suspension dans 1mL de tampon de lyse A (3,2 M KCl, 60mM MgOAc, 50mM Tris-HCl, pH 7,6). Ce tampon de lyse ”haut sel” permet de conserver les membranes cellulaires intactes et empˆeche la d´enaturation des prot´eines halophiles. La solution est homog´en´eis´ee avec l’utilisation d’un Potter (si le culot est petit on utilise une seringue de 1mL et une ai- guille st´erile (0.6mm de diam`etre) pour homog´en´eiser). Puis les cellules sont soniqu´ees 6 fois pendant dix secondes, entre chaque ´etape on incube le lysat dans la glace du- rant 1 minute. Ce lysat cellulaire est ensuite trait´eavec 20U de DNase 1 (Ambion) pendant 30 minutes `atemp´erature ambiante, afin de d´egrader les acides nucl´eiques. Apr`es centrifugation `a13 000 rpm (45 minutes, 4˚C), le surnageant (nomm´eS30) est pr´elev´e. Il contient les prot´eines cytosoliques totales. Le culot (nomm´eC30) contient les membranes et les prot´eines associ´ees aux membranes. Remarque : s’il n’y a pas la n´ecessit´ede grader des prot´eines intactes, il est possible de provoquer une lyse par choc osmotique intense en rajoutant seulement au culot un fort volume d’eau distill´ee et de re-suspendre ce culot avec la technique de la seringue.

205 Cette solution ´evite l’´etape de la pr´ecipitation en TCA n´ecessaire pour enlever le sel.

14.2 Pr´ecipitation `al’acide trichlorac´etique (TCA)

La s´eparation par gel SDS-Page et donc l’analyse par immuno-d´etection n´ecessite un ´echantillon avec une concentration en sel faible. Pour extraire les prot´eines d’un mi- lieu tampon riche en sel, la pr´ecipitation au TCA est une technique rapide et efficace. Pour 100 µL d’´echantillon, ajouter 1 mL de TCA 15 %, vortexer. Centrifuger 15 mi- nutes `atemp´erature ambiante avec une centrifugeuse de paillasse r´egl´ee `a13200 rpm. Jeter le surnageant et reprendre le culot avec 1 mL d’ac´etone glaciale (stock´ee `a-20˚c). Centrifuger 10 min `a13200 rpm. Enlever le surnageant et laisser le culot s´echer `al’air. Reprendre le culot avec du tampon Tris 20mM. Remarque : pour utiliser l’´echanitllon directement pour un SDS-Page, il suffit d’ajouter `ala derni`ere ´etape un volume ´equivalent `acelui du tampon Tris 20mM de Sample Buf- fer (SB : 50mM Tris, 8M Ur´ee, 2M Thiour´ee, 3 % SDS, 0.05 % bleu de Bromoph´enol, 75mM DTT).

14.3 Dosage

A partir des cultures, 500 µL est pr´elev´eet transf´er´edans des Eppendorf 1.5mL et centrifug´e`a13000 r.p.m. pendant 5 minutes. Les culots sont re-suspendu dans 1mL d’

H2O `al’aide d’une seringue 0.6mm (lyse cellulaire). Puis 100 µL de cette solution est m´elang´ee avec 700 µL d’ H 2O et 200 µL de r´eactif de Bradford 5x. Apr`es 5 min et la D.O. est prise `a595nm. Une courbe ´etalon est r´ealis´ee en suivant le mˆeme protocole. La solution prot´eique est remplac´ee par des solutions de BSA (Bovine Serum Albumine) de concentrations connues : de 0.001`a1.0 mg.mL-1.

206 14.4 S´eparation

14.4.1 S´eparation par ´electrophor`ese et d´etection des prot´eines (Coomassie, Argent, Western-Blot

• S´eparation par SDS-PAGE Cette technique permet de s´eparer les prot´eines en fonction de leur masse appa- rente.

Pour l’analyse sur gel SDS-PAGE, les culots des cellules sont repris dans 400 µL d’ H 2O, puis 400 µL de tampon de d´epˆot SB (50mM Tris, 8M Ur´ee, 2M Thiour´ee, 3 % SDS, 0.05 % bleu de Bromoph´enol, 75mM DTT). On d´epose une quantit´e´egale de prot´eines dans tous les puits (environ 15 µg). Les ´echantillons dans le tampon de d´epˆot sont chauff´es 5min `a95 ˚C puis centrifug´es quelques secondes. Les ´echantillons prot´eiques `as´eparer sont d´epos´es sur un gel de poly-acrylamide 12 % Sodium Dod´ecyl Sulfate d´enaturant. De plus, on d´epose un marqueur de poids mol´eculaire afin de faciliter l’identification des prot´eines recherch´ees (5 µL de Page- Ruler Prestained Protein Ladder SM0671 (Fermentas)). Ce gel est constitu´een deux parties : un gel de concentration (acrylamide/ bis-acrylamide 5 %, Tris 125 mM, SDS 0,1 %, glyc´erol pH 6,8) permet de concentrer les prot´eines sur un mˆeme front de mi- gration afin qu’elles d´ebutent leur s´eparation en mˆeme temps. Puis la s´eparation des prot´eines a lieu sur un gel de s´eparation (acrylamide/ bis-acrylamide 12%, Tris 375 mM pH 8,8, SDS 0,1%, glyc´erol 6%). La migration des prot´eines se fait dans le tampon de migration (25mM Tris, 250mM glycine, 0.1% SDS) `a15mA-300V, jusqu’`ace que le front de migration repr´esent´epar le bleu de bromoph´enol atteigne le bas du gel. Pour visualiser globalement les prot´eines, le gel est soit color´epar coloration au bleu de Coomassie, soit par coloration au nitrate d’argent. Pour la visualisation sp´ecifique d’une seule prot´eine, la technique d’immunodetection par Western-Blot est utilis´ee.

207 • Coloration au bleu de Coomassie La coloration au bleu de Coomassie est r´ealis´ee `al’aide d’une solution de coloration contenant du bleu de Coomassie R250 (0,15% de Bleu de Coomassie, 46% H 20 , 45% Ethanol pur, 9% acide ac´etique) par incubation du gel pendant au moins 15 min sous agitation constante puis par d´ecoloration (7,5% d’acide ac´etique glacial, 5% d’´ethanol, 87,5% H20).

• Coloration `al’argent La coloration au Coomassie a un seuil de sensibilit´esitu´ee aux alentours de 0.1 µg de prot´eines par d´epˆot. Lorsque la concentration est inf´erieure, on doit utiliser une colo- ration plus performante. L’argent permet une sensibilit´e3 fois plus importante. Tout d’abord le gel est compl`etement d´ecolor´edans 50% m´ethanol, 10% acide ac´etique pen- dant quelques heures. Ensuite on plonge le gel dans une solution avec du dichromate de potassium (3.4mM de potassium dichromate, 1/5000`eme d’acide nitrique, H 2O), pendant 5 min. Cette solution va mettre le gel en conditions oxydatives et va ainsi permettre au nitrate d’argent de se fixer. On nettoie le gel `al’eau 4 fois pendant 30s pour enlever l’exc`es de r´eactif puis on met notre solution de nitrate d’argent (12mM nitrate d’argent, H 2O) pendant 30 min. On place ensuite le gel dans 150 ml de car- bonate de sodium (283mM), formald´ehyde (1/5000`eme) et H 2O pendant 2 min, ceci afin d’´eliminer l’exc`es d’argent. Puis on ajoute 250ml de cette mˆeme solution. Pendant environ 10 min on agite. Cette solution va r´eduire l’argent Ag+ en Ag˚. L’Ag˚devient noir et ”solide” et marque plus fortement les prot´eines. Une fois l’intensit´ede coloration voulue obtenue, on place le gel dans une solution d’acide ac´etique (5%), glyc´erol (5%) et

H2O arrˆeter la r´eduction de l’argent. La conservation du gel se fait `al’abri de la lumi`ere.

• Immunod´etection par Western blot Cette technique permet d’identifier les prot´eines par immunomarquage sp´ecifique avec un anticorps. Apr`es l’´electrophor`ese sur gel de polyacrylamide, les prot´eines sont ”´electro-transf´er´ees”

208 sur une membrane hydrophobe de Fluorure de polyvinylid`ene (Amersham Hybond-P, pr´ealablement perm´eabilis´ee avec du m´ethanol 100%, rinc´ee dans de l’eau et ´equilibr´ee dans le tampon de transfert (25 mM Tris pH8.3, 150mM Glycine, 20% m´ethanol)). Apr`es transfert sous l’action d’un champ ´electrique de 30mA-300V pendant 1h (appa- reil `atransfert liquide Amersham), les sites asp´ecifiques de la membrane sont satur´es par les prot´eines du lait (solution de TBS-Tween20 (20mMTris pH 7,6 ; 150mM NaCl ; Tween20 0,05%) compl´ement´ee `a5% en lait ´ecr´em´e) pendant 1 heure sous agitation `a temp´erature ambiante. La membrane est ensuite lav´ee trois fois toutes les 10 minutes avec la solution de TBS-Tween20. La membrane est ensuite incub´ee avec l’anticorps primaire de lapin dirig´econtre la prot´eine d’int´erˆet (dilu´ee au 1/10 000`eme dans le tampon TBS-Tween) pendant une heure. La membrane est ensuite lav´ee trois fois (comme pr´ec´edemment) puis incub´ee pendant 30 minutes avec l’anticorps secondaire sp´ecifique anti lapin (dilu´ee au 1/5000`eme dans du TBS-tween20). Cet anticorps est de plus coupl´e`ala peroxydase. Une nouvelle ´etape de lavage est ensuite n´ecessaire avant de r´ev´eler la membrane grˆace au kit ECL (Enhanced Chemiluminescence, Amersham). Le kit ECL contient du peracide qui va oxyder la peroxydase coupl´ee `al’anticorps se- condaire qui `ason tour va oxyder le luminol pr´esent dans le kit. Un signal chimolumi- nescent est alors ´emis par le luminol, d´etect´ee grˆace `a une cam´era Kodak 4000MM (ou sur film photographique). Les prot´eines cibl´ees vont apparaitre sous forme de bandes lumineuses.

Diff´erents anticorps dirig´es contre des prot´eines issues de H.salinarium ont ´et´euti- lis´es. L’anticorps anti-Malate d´eshydrog´enase, qui est dirig´econtre la prot´eine enti`ere. L’anticorps anti-TF55 qui est dirig´econtre un peptide immunog`ene interne `ala s´equence. Les anticorps anti-TET qui sont dirig´es, soit contre deux peptides internes `ala s´equence (nomm´eantiTET2x, utilis´epour les Westerns-Blot), soit contre les 14 premiers r´esidus, expos´es en surface dans la forme native de la prot´eine (nomm´eantiTETnter, utilis´e pour les immunopr´ecipitations).

209 14.4.2 S´eparation par gradient de sucrose

On d´epose 500 µL du surnageant prot´eique (nomm´e: S30) au sommet d’un gradient lin´eaire de sucrose 5-20% de 10mL r´ealis´edans du tampon A `al’aide d’un dispositif `a deux compartiments coupl´e`aune pompe p´eristaltique. Apr`es 20h d’ultracentrifugation `a160 000g et 10˚Cdans un rotor Beckman SW41, on fractionne le gradient en 15 frac- tions de 700 µL. Le culot est re-suspendu avec la derni`ere fraction. Ces conditions ont ´et´ed´etermin´ees au laboratoire pour permettre une r´esolution optimale de complexes de prot´eines halophiles de tailles comprises entre 100kDa et 1MDa (Franzetti 2008). Ces fractions peuvent ˆetre utilis´ees pour des tests d’activit´eenzymatique ou pour une s´eparation et analyse par gel SDS-PAGE ou Western-Blot).

14.4.3 Immuno-pr´ecipitation `ahaut sel de la prot´ease TET

La technique d’immunopr´ecipitation de TET a ´et´emise au point dans le cadre de cette th`ese. Elle peut ˆetre appliqu´ee sur des extraits totaux de prot´eines halophiles et sur les fractions de gradients de sucrose. L’´echantillon est dilu´epour avoir une concentration finale en sel de 2,5M KCl dans un tampon Tris-HCl 50mM pH 7,6; 60mM MgOAc (tampon A). On ajoute 1/10`eme de volume de s´erum ou d’anticorps anti-peptide N-ter pr´ealablement purifi´epar chroma- tographie d’affinit´e. Apr`es une heure sous agitation on ajoute 1/10`eme du volume de suspension de billes de prot´eine G-S´epharose (Amersham). Apr`es une nuit d’incubation sous agitation `a4˚C, on effectue 2 lavages avec du tampon A. Pour culotter les billes, on utilise une centrifugeuse de paillasse `a2000rpm pendant 10 min. Pour analyser la qualit´eet la sp´ecificit´ede la pr´ecipitation, une partie des culots est re-suspendue dans du tampon de d´epˆot SDS-PAGE. Les prot´eines immunopr´ecipit´ees sont s´epar´ees sur gel 12% et r´ev´el´ees par coloration au bleu de cCoomassie, au nitrate d’argent ou par immunod´etection apr`es transfert sur membrane.

210 Afin de tenter de stabiliser les interactions entre TET et ses partenaires pour r´ealiser des co-immunopr´ecipitations, deux types d’agents pontant ont ´et´etest´e, le glutarald´ehyde et le DTSSP, ajout´es directement au m´elange r´eactionnel `aune concen- tration finale 0.1%. Le glutarald´ehyde cr´ee des liaisons covalentes stables, le DTSSP cr´ee des ponts disulfures qui peuvent ˆetre d´etruits par le DTT du tampon de d´epˆot SDS-PAGE. Apr`es une heure d’incubation, l’exc`es de DTSSP ou de glutarald´ehyde est ensuite ´elimin´epar ultracentrifugation de l’extrait cellulaire sur un coussin de sucrose 10% dans du tampon A (une heure, 100 000g, 10˚C dans un rotor Beckman TL100 A). Le culot est repris dans du tampon A et on effectue l’immunopr´ecipitation comme d´ecrit pr´ec´edemment.

14.5 Mesure de l’activit´eamino-peptidasique

Les substrats pour visualiser une activit´eamino-peptidasique sont des acides amin´es coupl´es soit `ala PNA (paranitroaniline) qui est un substrat chromog`ene, soit `al’AMC (7-amino-4-methylcoumarine) qui est un substrat fluorog`ene. L’absorbance de la lib´eration du substrat PNA lors de l’activit´eenzymatique est ob- serv´e`a405 nm par un spectrophotom`etre. L’AMC ´emet de la fluorescence (excitation `a330nm) s’il est lib´er´e, c’est-`a-dire si le substrat est hydrolys´epar une amino-peptidase. Cette fluorescence est alors mesur´ee `a 465 nm grˆace `aun spectrofluorim`etre (lecteur de plaque Fluostar Optima), `a40˚C et pendant 200 cycles (1min/cycle).

Pour tester l’activit´eamino-peptidasique dans les gradients de sucrose, 115 µL de chaque fraction est mix´ee `a81 µL de tampon de lyse A sans sel (0M KCl, 60mM MgOAc, 50mM Tris-HCl, pH 7,6). Cette dilution est n´ecessaire pour baisser la concen- tration en sel de la solution `a2M environ (2.13M) et ainsi ´eviter la pr´ecipitation du substrat.

211 Pour tester l’activit´eamino-peptidasique dans des S30, 20 µL de S30 est mix´eavec 176 µL de tampon de lyse A (2.0M NaCl,60mM MgOAc, 50mM Tris-HCl, pH 7,6) pour obtenir une concentration finale en KCl proche de 2M (2.13M). On ajoute ensuite 2 µL de substrat (dont sa concentration initiale est `a40mM) et 2 µL de cofacteurs m´etalliques (dont la concentration initiale est `a100mM). On effectue les mesures sur une plaque Greiner de 96 puits et trois contrˆoles sont r´ealis´es : eau, tampon 2M KCl et substrat en pr´esence du tampon 2M KCl. Les donn´ees sont ensuite trait´ees avec le logiciel Microsoft Excel Viewer 2007. On calcule les coefficients directeurs de la droite de r´egression pour les valeurs situ´ees dans la partie lin´eaire des courbes d’activit´e, auxquelles on soustrait les valeurs de coefficients directeurs de droite de r´egression obtenues pour la mˆeme fenˆetre de temps pour le contrˆole n´egatif du substrat en pr´esence du tampon 2M KCl.

212 Chapitre 15

Technique de biophysique

15.1 Microscopie : visualisation des changements morphologiques

Les exp´eriences de microscopie ´electronique ont ´et´er´ealis´ees avec Daphna FENNEL de la plateforme de microscopie de l’IBS sous la responsabilit´ede Guy SCHOEHN.

15.1.1 Microscopie par fluorescence pour visualisation des mem- branes

Pour les observations morphologiques, 15 µL de la culture est d´epos´esur lame. Le microscope `acontraste de phase (Olympus Bx UCB coupl´e`ala cam´era Retigo SRV, voir chapitre 13.2.3) est utilis´e, pour observer les diff´erences morphologiques des cel- lules au cours des stress. Pour la visualisation des membranes, on utilise le compos´efluorescent ”FM 4-64” d’In- vitrogen (ou N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino) phenyl) hexatrie- nyl) pyridinium dibromide ) qui s’ins`ere dans la membrane o`uil devient intens´ement orange fluorescent (visualisation avec le filtre CY5). 100 µL de culture plus ou moins dilu´ee sont incub´es pendant quelques minutes avec 5

213 µL du compos´eFM 4-64, avant d’en d´eposer 15 µL sur lame.

15.1.2 Microscopie ´electronique coloration n´egative

Pour l’observation en microscopie `atransmission, 250mg de cellules lav´ees ont ´et´e fix´ees avec 1mL d’une solution de fixation `ala concentration en NaCl correspondante `a celle du milieu de culture (4,2 M NaCl ou 0,5 MNaCl, 0,1 M MgSO 4,7 H20, 0,04 M KCl,

0,01 M Tri sodium Citrate. 2H 20 (pH 7,5), 4% formald´ehyde et 2,5 % glutarald´ehyde), en agitation `a4˚C pendant la nuit. 8 µL de l’´echantillon est d´epos´esur une grille de mica recouverte de carbone de 5 mm 2. Les cellules sont color´ees n´egativement avec 2% (poids/volume) d’ac´etate d’uranyle. L’analyse est ensuite effectu´ee par un microscope ´electronique Philips CM12 ´equip´ed’un filament LaB6, `a120kV. Les micrographies sont enregistr´ees `aun agrandissement de 5000x.

15.1.3 Microscopie ´electronique par balayage

Pour l’observation au microscope `abalayage, On s`eche 10 µg de l’´echantillon sur une plaque de silicium. On m´etalise l’´echantillon par l’ajout d’une couche de 10 nm de platine avec le m´etaliseur Biorad2 SC500. On pourra ainsi r´ecolter les ´electrons secondaires lors de l’observation au microscopique `al’aide d’un microscope S-4000, `a 4,9 kV.

15.1.4 Microscopie ´electronique par coupe

Pour la micrsocopie `atransmission de coupes d’ H. salinarum , l’´echantillon est lav´edans un tampon 4,2 M NaCl ou 0,5 M NaCl, puis fix´edans 1% paraformal- dehyde et 1,25% glutaraldehyde pendant 4h `atemp´erature ambiante. Une premi`ere fixation est r´ealis´ee avec du tetroxide d’osmium, puis une seconde avec de l’acide ura- nyle. L’´echantillon est ensuite d´eshydrat´een utilisant des concentrations croissantes d’´ethanol. Puis on l’incube dans des concentrations croissantes en epon afin de rempla-

214 cer l’ethanol par cette r´esine. La prise de l’´echantillon dans la r´esine a lieu pendant 48h `a60˚C. On r´ealise ensuite des coupes ultra-fines `al’aide d’un microtome et on r´ealise une coloration `acontraste `al’aide de deux colorants : l’ac´etate d’uranyle qui colore la chromatine et le citrate de plomb.

15.2 Dosage des ions intracellulaires

Apr`es une heure de stress et d´etermination du nombre de cellules dans chaque ´echantillon par microscopie, trois aliquotes de 1mL de cellules en culture sont culott´es par centrifugation (13200 rpm centrifugeuse de paillasse). Chaque culot est lav´edeux fois avec un tampon de lavage sans KCl (Tris 50mM pH7.5,100mM MgCl 2, ”X” M NaCl, ”X” ´etant identique `ala concentration initiale de l’´echantillon et donc d´ependant de la condition de stress). Les culots cellulaires sont ensuite lys´es par sonication dans 10mL d’H 2O. Nous effectuons ensuite une gamme de dilution (x1, x1/5, x1/10, x1/20) de l’´echantillon avec de l’H 2O, pour ˆetre sur de ren- trer dans la gamme ´etalon de l’appareil. La mesure de la concentration intracellulaire en k + est ensuite r´ealis´ee par spectrophotometrie de flamme (ICP-AES Perkin Elmer OPTIMA 3300 DV). Une ´etude du volume moyen des cellules est n´ecessaire pour ”remonter” `ala concen- tration intracellulaire, cette ´etude a ´et´er´ealis´ee par microscopie par contraste de phase sur un ´echantillon de 100 cellules (volume moyenne = 4 ∗ 10 −19 m3)(de plus la mesure a ´et´ev´erifi´ee par microscopie ´electronique).

215 15.3 Dynamique mol´eculaire par diffusion de neu- tron

15.3.1 Pr´eparation des ´echantillons

Apr`es 1 heure de stress (pour les stress salins) et 2 heures de stress (pour le stress thermique), les cellules sont culott´ees par centrifugation `a4000 rpm dans une centri- fugeuse Beckman (rotor JLA10500) pendant 30 minutes `atemp´erature ambiante. Le surnageant est ´ecart´eet le culot est lav´eavec 200mL de tampon de lavage adapt´e au stress, c’est `adire : – pour la condition dite normale et pour les conditions de stress thermique : 4.2M

NaCl,70mM KCl, 80mM MgSO 4, 50mM Tris- HCl pH 7.6 – pour les stress bas sel 2.5M et 2.0M respectivement : 2.5M ou 2.0MNaCl,70mM

KCl, 80mM MgSO 4, 50mM Tris- HCl pH 7.6 540mg du culot lav´eest ensuite transf´er´edans un porte ´echantillon plat en aluminium plaqu´eor pour analyse au neutron dont le couvercle laisse 0.3mm d’´epaisseur, un fil d’indium de 1.5mm d’´epaisseur sert de joint et des vis en aluminium sont n´ecessaires pour sceller le porte ´echantillon. Un scan ´elastique (angle de l’´echantillon `a135˚par rapport au faisceau) de 4h est en- suite r´ealis´epour les temp´eratures : 280k ; 287k ; 294k ; 302k ; 310k. En fin d’exp´erience, une petite fraction du culot utilis´eest re-suspendu dans du tampon de lavage afin de v´erifier la viabilit´epar microscopie par fluorescence (Live/dead), cet ´echantillon est nomm´et=24h. Le nombre de cellule ainsi que la viabilit´esont compar´es aux r´esultats obtenus avant l’application du stress (nomm´et=0) et apr`es l’application du stress ( nomm´et=1h). Pour pouvoir normaliser les intensit´es obtenues pour l’´echantillon, il est n´ecessaire de mesurer un scan ´elastique du tampon de lavage pendant 2h pour chaque temp´erature ; du porte ´echantillon vide (2h `a300k) ; du vanadium 2mm d’´epaisseur pendant une quin- zaine d’heure `aune temp´erature (300k) ; ainsi que la transmission (angle de l’´echantillon

216 `a90˚par rapport au faisceau), de chaque ´echantillon et ´el´ement de contrˆole pendant 5min.

15.3.2 Analyse des donn´ees

Pour l’analyse des donn´ees, nous utilisons dans un premier temps le logiciel LAMP (Large Array Manipulation Program neutron data analysis) pour normaliser les ´echantillon par rapport au vanadium et `ala cellule vide. La suite des calculs est r´ealis´ee `al’aide du logiciel d’analyse Origin.

217 Septi`eme partie

Annexes

218 Chapitre 16

Thermal and salt stress regulation of the PAN-proteasome system in the extreme halophilic Archaeon Halobacterium.

219 Extremophiles DOI 10.1007/s00792-011-0421-0

ORIGINAL PAPER

Stress regulation of the PAN–proteasome system in the extreme halophilic archaeon Halobacterium

H. Chamieh • V. Marty • D. Guetta • A. Perollier • B. Franzetti

Received: 14 July 2011 / Accepted: 13 December 2011 Ó Springer 2012

Abstract In Archaea, the importance of the proteasome function of proteasome in Halobacterium. The chemical system for basic biological processes is only poorly inhibition of proteasomes was measured in the cellular understood. Proteasomes were partially purified from extracts. It has no effect on cell growth and mortality under Halobacterium by native gradient density ultracentrifuga- normal growth conditions as well as under heat shock tion. The peptidase activity profiles showed that the 20S conditions. These results suggest that the PAN activators or proteasome accumulation is altered depending on the other proteases compensate for loss of proteasome activity physiological state of the cells. The amount of active 20S in stress conditions. particles increases in Halobacterium cells as a response to thermal and low salt stresses. In the same conditions, Keywords Archaea Á Proteasome Á AAA-ATPase Á Northern experiments showed a positive transcriptional Salt stress Á Halophiles regulation of the alpha and beta proteasome subunits as well as of the two proteasome regulatory ATPases, PANA and PANB. Co-immunoprecipitation experiments demon- Introduction strated the existence of a physical interaction between the two Proteasome Activating Nucleotidase (PAN) proteins in Protein degradation is a controlled process that eliminates cell extracts. Thus, a direct regulation occurs on the PAN– the damaged or the misfolded protein that could not be proteasome components to adjust the protein degradation rescued by the chaperone system in order to prevent their activity to growth and environmental constraints. These intracellular aggregation (Sherman and Goldberg 2001). results also indicate that, in extreme halophiles, proteasome Protein hydrolysis therefore represents an important aspect mediated proteolysis is an important aspect of low salt of the environmental stress response as well as of the protein stress response. The tri-peptide vinyl sulfone inhibitor quality control (Goldberg 2003). A selective proteolysis also NLVS was used in cell cultures to study the in vivo occurs in order to provide an irreversible way of inactivat- ing, at the appropriate times, the regulatory molecules involved in cell cycle progression or in metabolic switches Communicated by S. Albers. (Coux et al. 1996). In eukaryotes, the ATP-dependent H. Chamieh Á V. Marty Á D. Guetta Á A. Perollier Á ubiquitin/26S proteasome system is the main proteolytic B. Franzetti ( &) machinery (Lee and Goldberg 1996). The 26S proteasome Extremophiles and Large Molecular Assemblies Group, can be separated in two subparticles: the 20S self-compart- UMR5075, CNRS, Institut de Biologie Structurale, mentalized peptidase core and the 19S dependent regulatory 41 rue J. Horowitz, 38027 Grenoble Cedex 1, France e-mail: [email protected] particle (RP) (Zwickl and Baumeister 1999). Six regulatory subunits (Rpt) form the base of the RP (Patel and Latterich H. Chamieh Á V. Marty Á D. Guetta Á A. Perollier Á B. Franzetti 1998; Rubin et al. 1998). These proteins belong to a large CEA, 38054 Grenoble, France family of proteins known as the AAA ATPases (Atpases H. Chamieh Á V. Marty Á D. Guetta Á A. Perollier Á B. Franzetti Associated with a variety of cellular Activities) (Patel and Universite´ Joseph Fourier, 38000 Grenoble, France Latterich 1998). They recognize specific proteins as targets

123 Huiti`eme partie

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