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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL FACULDADE DE AGRONOMIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA AGRÍCOLA E DO AMBIENTE
IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ISOLADOS DE Paenibacillus spp PROVENIENTES DE AMOSTRAS DE ACUA E DE SOLO
Anelise Beneduzi da Silveira Bióloga UFRGS
Dissertação apresentada como um dos requisitos para a obtenção do Grau de Mestre em Microbiologia Agrícola e do Ambiente
Porto Alegre (RS) Fevereiro de 2003 ANELISE BENEDUZI DA SILVEIRA Bacharel em Ciências Biológicas - UFRGS
DISSERTAÇÃO
Submetida como parte dos requisitos para obtenção do Grau de
MESTRE EM MICROBIOLOGIA AGRÍCOLA E DO AMBIENTE
Programa de Pós-Graduação em Microbiologia Agrícola e do Ambiente Faculdade de Agronomia Universidade Federal do Rio Grande do Sul Porto Alegre (RS), Brasil
Aprovada em: 21.03.2003 Homologado em:29/04/2003 Pela Banca Examinadora Por
4111111, GERTRUDES CORÇÃO J• É CA OS GERMANI Orientadora-PPG-Microbiologia Coordenador do Programa de Agrícola e do Ambiente Pós-Graduação em Microbiologia Agrícola e do Ambiente
ló";L:4 Imo. Rokkc, çtsl vxNDREIA MARA ROTTA DE ONÉjfà j LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA - MIRCEN/FEPAGRO
CLÁUDIO WAGEK NAL DEP. DE MEDICINA ANIMAL - UFRGS
cOk L-71 J-CkuL dez, d SUELI TERESINHA VAN DER SAND GIL PR ARDUINO BETTIO MARODIN DEP. MICROBIOLOGIA - UFRGS Diretor da Faculdade de Agronomia UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL FACULDADE DE AGRONOMIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA AGRÍCOLA E DO AMBIENTE
IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ISOLADOS DE Paenibacillus spp PROVENIENTES DE AMOSTRAS DE ÁGUA E DE SOLO
Anelise Beneduzi da Silveira Bióloga — UFRGS
Fevereiro de 2003 AGRADECIMENTOS
À Dra. Gertrudes Corção pela orientação, paciência, apoio e amizade.
Aos professores do Curso de Pós-Graduação em Microbiologia Agrícola
e do Ambiente, Dra. Sueli T. Van Der Sand, Dra. Marisa da Costa, Dr. Amauri
Simonetti e Dr. José Carlos Germani pelas sugestões e amizade.
Aos colegas de curso, de laboratório e amigos Patrícia Bender,
Margaroni F. de Oliveira, Neida Macedo e Luiz Gustavo A. Borges pelas
sugestões, amizade e apoio.
Aos colegas de curso e amigos Adriana Giongo, Cézar Crispim, Marcos
Marquardt e Roberta Bandeira pelo apoio e amizade.
Aos colegas de laboratório e também amigos Cláudio, Emanuele Kuhn e
Sabrina pela amizade.
Aos funcionários do Departamento de Microbiologia.
Ao meu namorado Heraldo, pelo amor, carinho, dedicação, compreensão e paciência.
Aos meus pais, Venilda e José, pelo apoio, amor e carinho de sempre.
À todos que contribuíram de alguma maneira para a realização deste trabalho.
À CAPES pelo apoio financeiro.
111 IDENTIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE ISOLADOS DE Paenibacillus spp PROVENIENTES DE AMOSTRAS DE ÁGUA E DE SOLO 1/
Autora: Anelise Beneduzi da Silveira Orientadora: Dra. Gertrudes Corção.
RESUMO
O gênero Paenibacillus, anteriormente pertencente ao gênero Bacillus, tem como representantes bastonetes produtores de esporos que se diferenciam destes pelos padrões encontrados através da amplificação e seqüenciamento de um fragmento da subunidade 16S rDNA. Esse gênero é extremamente diverso sendo encontrado tanto em ambientes aquáticos como em ambientes terrestres, e seus representantes podendo ser desde patógenos de animais a fixadores de nitrogênio (associados ou não a plantas). Dos oitenta bastonetes Gram positivos esporulados isolados dos balneários de Ipanema, Belém Novo e Lami (Porto Alegre/RS), trinta e cinco foram identificados através de PCR como sendo do gênero Paenibacillus e dos sessenta isolados de solo provenientes de Belém Novo (Porto Alegre/RS) e Osório (RS), vinte e nove são pertencentes a este gênero. Nos isolados provenientes da água foram encontrados representantes de P. validus (8), P. azotofixans (6), P. illinoisensis (3), P. chibensis (3), P. glucanolyticus (3), P. borealis (2), P. koreensís (2), P. brasiliensis (2), P. odorífer (1), P. apiarius (1), P. graminís (1), P. macerans (1), P. pabuli (1) e P. thiaminolyticus (1). Entre os indivíduos provenientes de amostras de solo foram identificados P. alginolyticus (7), P. pabuli (5), P. azotofixans (3), P. validus (4), P. thiaminolyticus (2), P. chibensis (2), P. apiarius (2), P. glucanolyticus (2), P. macquariensis (1) e P. peoriae (1). A caracterização genética através de BOX-PCR produziu fragmentos de 4365 a 445bp e revelou vinte e oito grupamentos em um nível de similaridade de 73% nos isolados provenientes da água, e dezoito grupamentos a 70% nos isolados do solo. Pelas análises foi possível identificar um elevado grau de polimorfismo, com diferenças inter e intraespecíficas entre os isolados de Paenibacillus, isso sendo evidenciado pelo alto número de grupamentos encontrados. Os isolados de Paenibacillus provenientes da água e do solo puderam ser separados em grupamentos distintos através do BOX-PCR, sugerindo que populações distintas estejam estabelecendo-se nestes ambientes.
1/ Dissertação de Mestrado em Microbiologia Agrícola e do Ambiente- Biologia Molecular de Microrganismos, Faculdade de Agronomia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil. (139 p.) Fevereiro, 2003
iv IDENTIFICATION AND CHARACTERIZATION OF Paenibacillus spp ISOLATED FROM WATER AND SOIL SAMPLES 1/
Autor: Anelise Beneduzi da Silveira Adviser: Gertrudes Corção, Ph. D.
ABSTRACT
Paenibacillus genus, formerly Bacillus genus, are spore producer rod-shape that differ from Bacillus for the patterns found through 16S rDNA subunit amplification and sequencing. This genus is extremely diverse, being found both on aquatic and land environment, and it can be from animal pathogens to nitrogen fixer (associated or not to piants). From the eighty sporulated Gram positive rod-shape isolated from Ipanema, Belém Novo and Lami (Porto Alegre/RS), tirthy-five were identified through PCR as being Paenibacillus genus and, from the sixty isolated soul samples collected in Belém Novo (Porto Alegre/RS) and Osório (RS), twenty-nine belonged to this genus. Isolates of P. validus (8), P. azotofixans (6), P. iffinoisensis (3), P. chibensis (3), P. glucanolyticus (3), P. borealis (2), P. koreensis (2), P. brasiliensis (2), P. odorifer (1), P. apiarius (1), P. graminis (1), P. macerans (1), P. pabuli (1) and P. thiaminolyticus (1) were found on the isolated coming from water. Among the isolates coming from soil samples, it was identified P. alginolyticus (7), P. pabuli (5), P. azotofixans (3), P. validus (4), P. thiaminolyticus (2), P. chibensis (2), P. apiarius (2), P. glucanolyticus (2), P. macquariensis (1) and P. peoriae (1). The genetic characterization through BOX-PCR produced fragments from 4365 to 445bp and revealed twenty-eight groups with 73% similarity levei on water isolates, and eighteen groups with 70% levei on soil isolates. Through the ran out analysis a high degree of polymorphism were identified, with inter and intraspecific differences between the Paenibacillus isolates, what was observed with the high amount of groups found. The Paenibacillus isolates from water and soil could be separated in distinct groups through BOX-PCR, what suggests that different populations are being established in this environments.
1/ Master of Science Dissertation in Environmentai and Agricultura) Microbiology, Faculdade de Agronomia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil. (139 p.) February of 2003. SUMÁRIO
Página
1. INTRODUÇÃO 01
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 03 2.1. O gênero Bacillus e sua heterogeneidade filogenética 03 2.2. O gênero Paenibacillus 12 2.3. Seqüências repetitivas 17 2.3.1. Seqüências repetitivas BOX 20 2.4. Fixação Biológica de Nitrogênio 27
3. MATERIAIS E MÉTODOS 32 3.1. Meios de cultura e soluções 32 3.2. Obtenção dos isolados bacterianos 32 3.3. Isolamento das amostras provenientes do solo 32 3.4. Identificação dos isolados bacterianos 34 3.5. Manutenção das culturas bacterianas 34 3.6. Preparo dos isolados bacterianos para a extração de DNA total 34 3.7. Protocolo para extração de DNA total 35 3.8. Quantificação do DNA total 36 3.9. Identificação do gênero Paenibacillus pela amplificação do gene 16S rRNA 36 3.10. Análise do fragmento amplificado de Paenibacillus 37 3.11. Identificação das espécies de Paenibacillus 37 3.12. Análise das seqüências repetitivas BOX 38 3.13. Análise dos fragmentos amplificados através do BOX-PCR 39 3.14. Análise dos resultados do BOX-PCR 39 3.15. Amplificação do gene nifH 40 3.16. Análise do fragmento amplificado do gene nifH 41 3.17. Marcadores moleculares 41 3.18. Teste de especificidade 41
4. RESULTADOS 43 4.1. Identificação dos isolados provenientes da água e do solo 43 4.1.1. Identificação do gênero Paenibacillus 43 4.1.2. Identificação das espécies de Paenibacillus 44 4.2. Padronização das condições do BOX-PCR 64 4.2.1. Concentração de cloreto de magnésio 64 4.2.2. Concentração de DNA molde 65 4.2.3. Concentração do oligonucleotídeo iniciador BOXA1R 66 4.2.4. Concentração de BSA 66 4.2.5. Temperatura e número de ciclos 66 4.3. Perfil de BOX-PCR 67
vi 4.4. Análises dos dendrogramas de BOX-PCR 69 4.4.1. Análise do dendrograma dos isolados provenientes da água 69 4.4.2. Análise do dendrograma dos isolados provenientes do solo. 72 4.4.3. Análise do dendrograma dos isolados provenientes da água e do solo 74 4.5. Amplificação do gene nifH 77 5. DISCUSSÃO 79 5.1. Identificação do gênero Paenibacillus 79 5.2. Caracterização genética dos isolados de Paenibacillus 82 5.3. Confirmação das espécies fixadoras de nitrogênio 94 6. CONCLUSÕES 97 7. CONSIDERAÇÕES FINAIS 98
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 99
9. APÊNDICE 111 9.1. Meios de cultura para crescimento, isolamento e identificação 112 9.2. Soluções utilizadas na extração de DNA total 111 9.3. Soluções utilizadas para corrida em gel de agarose 120 9.4. Soluções para PCR 122 9.5. Matriz dos coeficientes de similaridade obtidos entre os isolados de Paenibacillus provenientes de amostras de água 123 9.6. Matriz dos coeficientes de similaridade obtidos entre os isolados de Paenibacillus provenientes de amostras de solo 128 9.7. Matriz dos coeficientes de similaridade obtidos entre os isolados de Paenibacillus provenientes de amostras de água e de solo 132
vil RELAÇÃO DE TABELAS
Página
1 Linhagens padrão utilizadas como controles nos testes bioquímicos 38
2. Linhagens padrão utilizadas como controles nos ensaios de especificidade 42
3. Características fenotípicas das espécies e subespécies do gênero Paenibacillus 48
4. Identificação das espécies de Paenibacillus isoladas de amostras de água e de solo 63
5. Porcentagem de isolados provenientes do solo que amplificaram determinados fragmentos no BOX-PCR 69
6. Porcentagem de isolados provenientes da água que amplificaram determinados fragmentos no BOX-PCR 69
viii RELAÇÃO DE FIGURAS
Página
1. Árvore filogenética construída a partir da matriz de distância da análise de seqüências do 16S rRNAs de bacilos, enterococos, lactobacilos e leuconostocos 6
2. Árvore de distância evolutiva mostrando a heterogeneidade do gênero Bacilius 8
3. Árvore de distância evolutiva mostrando as inter-relações do novo gênero Paenibacillus e outras espécies de Bacillus 11
4. Organização do elemento BOX em relação a alguns genes 21
5. Estrutura "stem-loop" da seqüência BOX 22
6. Amplificação do fragmento de 800bp de Paenibacillus 44
7. Chave de Identificação das espécies de Paenibacillus 58
8. Teste de concentração de cloreto de magnésio 64
9. Teste de concentração de DNA 65
10. Perfis de BOX-PCR 68
11. Dendrograma baseado em análises de BOX-PCR dos isolados provenientes da água 71
12. Dendrograma baseado em análises de BOX-PCR dos isolados provenientes do solo 73
13. Dendrograma baseado em análises de BOX-PCR dos isolados provenientes da água e do solo 76
14. Amplificação do gene nifH 77
ix 1. INTRODUÇÃO
O gênero Paenibacillus, anteriormente pertencente ao gênero
Bacillus, tem como representantes bastonetes produtores de esporos que se diferenciaram destes pelos padrões encontrados através da amplificação e seqüenciamento de um fragmento da subunidade 16S rDNA e também por alguns representantes do gênero apresentarem o gene nifH (gene que codifica a proteína ferro do complexo da enzima nitrogenase). Esse gênero é extremamente diverso sendo encontrado tanto em ambientes aquáticos como em ambientes terrestres, e o seus representantes podendo ser desde patógenos de animais à fixadores de nitrogênio no solo (associados ou não a plantas).
A caracterização genética baseada no padrão de fragmentos gerada por "Polymerase Chain Reaction" (PCR) está sendo usada para o estudo de comunidades microbianas de diversos ambientes. Famílias de sequências repetitivas de DNA (REP, ERIC e BOX) estão espalhados por todo o genoma e são utilizados para produzir um padrão de fragmentos de DNA típico de diversas espécies bacterianas e podem revelar diferenças entre linhagens. Em particular, o elemento BOX que consiste de diferentes subsequências conservadas (BOX A, BOX B e BOX C) e que se encontra disperso por todo o genoma. 2
Devido a grande diversidade do gênero Paenibacillus, a identificação
do gênero através do 16S rDNA aliada a caracterização molecular dos isolados
através do elemento repetitivo BOX, pode ser uma ferramenta de rápida
detecção de uma determinada espécie de Paenibacillus, já que somente os
testes bioquímicos clássicos são insuficientes para a identificação deste
gênero.
A parte experimental deste trabalho foi desenvolvida no
Departamento de Microbiologia no Instituto de Ciências Básicas da Saúde da
Universidade Federal do Rio Grande do Sul e teve como objetivos:
• identificar através da amplificação por PCR os isolados provenientes da
água e do solo (rizosfera de milho) como pertencentes ao gênero
Paenibacillus sp;
• caracterizar os isolados em nível de espécie através de provas bioquímicas
clássicas;
• caracterizar molecularmente os isolados através da amplificação por PCR
utilizando oligonucleotídeos BOX ;
• analisar e comparar os isolados da água e do solo em relação a suas
características moleculares;
• comprovar a presença do gene nifH nos isolados identificados previamente
como espécies fixadoras de nitrogênio. 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 O gênero Bacillus e sua heterogeneidade filogenética
Bactérias em forma de bastonetes, aeróbias ou anaeróbias facultativas e formadoras de esporos têm sido geralmente classificadas como sendo do gênero Bacillus, um taxon sistematicamente diverso (Claus &
Berkeley, 1986). Os indivíduos pertencentes a este gênero estão entre os microrganismos mais largamente distribuídos e possuem papéis significantes nas comunidades microbianas (Reva et al., 1995).
Embora representantes de Bacillus tenham sido extensivamente estudados, é conhecido que sua taxonomia é insatisfatória. O gênero Bacillus é fenotipicamente heterogêneo, com membros exibindo uma grande diversidade de requerimentos nutricionais, condições de crescimento, metabolismo e composição de DNA (32 a 69%mol G+C). Como exemplo dessa diversidade estão os organismos estritamente aeróbios, os anaeróbios facultativos e até mesmo acidófilos, alcalófilos, quimiolitotróficos, halófilos, psicrófilos e termófilos.
Em adição a isto, há também uma forte evidência de heterogeneidade filogenética (Ash et ai., 1993).
A primeira tentativa em nível molecular usada para separar este gênero foram análises comparativas da subunidade 16S do RNA ribossomai
(16S rRNA). Estes estudos revelaram um único grupo diverso contendo a 4
maioria das espécies examinadas. Havia, entretanto, um número de espécies
individuais (Bacillus alvei, B. polymyxa, B. brevis, B. acidocaldarius e B.
cycloheptanicus) que foram até mais diversos e não pareceram pertencer
àquele único grupo citado anteriormente. Dentro do grupo principal de Bacillus,
as análises do 16S rRNA revelaram pelo menos dois grupos moderadamente
relacionados: o primeiro consiste de organismos com esporos elípticos que
estão localizados centralmente (B. subtilis, B. pumilus, B. megaterium e B.
cereus) e o segundo subgrupo inclui organismos que formam esporos esféricos
(B. minovorans, B. globisporus, B. insolitus, B. pasteurii, B. sphaericus e
Sporosarcina ureae, bem como três organismos não formadores de esporas:
Planococcus citreus, Filibater limicola e Caryophanon !atum). Outros membros
do grupo principal de Bacillus que têm sido examinados pelo 16S rRNA são B. stearothermophilus e Thermoactinomyces vulgaris. Embora estes resultados tenham um bom fundamento, estava claro que esse exame inicial era insuficiente para definir o grande número de relações dentro do gênero que seriam necessárias antes que revisões taxonômicas pudessem ser feitas.
Também há uma interligação entre organismos não esporulados com esporulados, como citado acima, que necessita de trabalhos adicionais para o entendimento da relação das espécies de Bacillus com outros gêneros (Rôssler et al., 1991).
No estudo de Rõssler et al. (1991) foram introduzidos os primeiros resultados de uma análise do gênero Bacillus utilizando seqüências do 16S rRNA produzidas por sequenciamento direto com transcriptase reversa ou pela amplificação do DNA ribossomal. Novas seqüências do 16S rRNA foram 5
obtidas por este estudo (mais de 1300 nucleotídeos sequenciados). A análise
comparativa revelou pelo menos quatro grupos de espécies de Bacillus: o grupo
do B. subtilis que inclui também o B. stearothermophilus; o grupo do B. brevis
que inclui B. laterosporus e o grupo do B. alveí que inclui o B. polymyxa, B.
macquariensis e B. macerans. Também houve uma ramificação representada
somente pelo B. cycloheptanicus. Esta análise mais completa não somente
confirmou a diversidade entre três destes grupos estudados previamente pelo
16S rRNA, mas também encontrou um fundamento seguro para identificar um
segundo membro do "grupo B. brevis" e dois novos membros do "grupo B.
alvei". Dentro de cada um destes grupos existe uma similaridade de seqüências
superior a 90% e entre os grupos a similaridade encontrada é menor que 90%.
A distinção entre eles é ainda maior pelo fato que certas bactérias Gram
positivas não formadoras de esporos, tais como os enterococos, lactobacilos e leuconostocos mostrarem uma similaridade de seqüências maior com B. subtilis e B. stearothermophilus do que estes com os grupos do B. brevis e do B. alvei.
De acordo com estes resultados, está claro que os organismos comumente colocados dentro do gênero Bacillus exibem grandes diferenças genotípicas que justificam a criação de novos gêneros. Dados fenotípicos também demonstram que diversidade e similaridades dos bacilos têm sido encontradas no grupo do B. alveí, todavia não existem as mesmas similaridades fenotípicas para os outros grupos definidos em nível genotípico (Figura 1). 6
Enterococci Lactobacilli Leuconostoca B.stearothermophilus B.subtilis B.polymyxa B.mace.rans B.macquariensis B.alvei B.laterosporus B.brevis
B.cycloheptanicus Escherichia Holiobacterium
Streptomyces
Figura 1. Árvore filogenética construída a partir da matriz de distância da análise de sequências do 16S rRNAs de bacilos, enterococos, lactobacilos e leuconostocos. Fonte: ROssler et al., 1991
Os estudos relativos ao 16S rRNA haviam sido restritos as nove espécies citadas acima, consequentemente não era possível traçar conclusões seguras sobre a estrutura filogenética do gênero (Ash et al., 1991).
Nos estudos de Ash et al. (1991) foram determinadas quase todas as seqüências da estrutura do 16S rRNA (95% da molécula total, 1450 a 1490 nucieotídeos) de mais de cinqüenta espécies de Bacillus usando-se a transcriptase reversa. Uma considerável diversidade filogenética dentro do gênero foi evidenciada através dos cinco grupos distintos produzidos pela análise da matriz de distância. O grupo maior ou grupo 1 compreende vinte e oito espécies de bacilos: B. anthracis, B. cereus, B. medusa, B. mycoides e B. 7
thuringiensis formam um subgrupo; B. atrophaeus, B. amyloliquifaciens, B. lautus, B. lentimorbus, B. licheniformis, B. popilliae, B. pumilus e B. subtilis formam outro subgrupo; e B. maroccanus, B. simplex e B. psychrosaccharolyticus outro subgrupo. Muitos outros bacilos formaram ramificações distintas e não possuem relações específicas com outras espécies dentro do grupo. O grupo 2 é formado pelas espécies: B. fusiformís, B. globisporus, B. insolitus, B. pasteurii, B. psychrophilus e B. sphaericus.
Sporosarcina ureae também foi colocada neste grupo. O grupo 3 consiste de B. macerans e nove outras espécies (B. amylolyticus, B. macquariensis, B. pabuli,
B. azotofixans, B. polymyxa, B. pulvifaciens, B. larvae, B. gordonae e B. alver).
Este grupo exibe uma baixa homologia de seqüências com os outros Bacillus e pelo modelo de ramificação da árvore constitui um agrupamento distinto. O grupo 4 consiste de duas espécies: B. brevis e B. laterosporus e formam uma linha distinta de origem exibindo um baixo nível de relação com todos os outros bacilos examinados. B. stearotherrnophilus, B. kaustophilus e B. thermoglucosidasius formam o grupo 5. O acidófilo e termofílico, B. cycloheptanicus, exibiu a menor similaridade de seqüências com todas as outras espécies examinadas e claramente representa um taxon separado. Das outras espécies formadoras de esporos estudadas, B. alcalophilus e B. aneurinolyticus permaneceram fora dos grupos, assim como Sporolactobacillus inulinus que também formou uma linha separada de origem (Figura 2). 8
Group 2 a pas:eutu B. psycIlroplus glatrisportiS B. fuséforms B osohtt,ss 8'. carrpestns B. sphaericus 1 E ouras 8 sutiNis 1 8 anryo:óriuttacns ureére 8 • 4enbrror-pus• pcy.miNie 1 8. xraphactis e pumdus 8. ccrees 8. artntiscis pray; •a tNinng,ensfts- 8. nvictusa L. rrialocyrogenes B. myco,des • 5, ccjaw,i4n.s E. faecalis 8 aorfoterregrfts a tastrivsus 8: fnegateraon E cortirxrbRe psyrmasacrfrwric.;yricfrs. trIerrnocéacosiciasies • G. rnanaccavis Group 5 .6, 8 slearathermerahrlus Group 1
3. terrus.. s3;nha B kaustophfius E. 14'Ais Inutinus aicalopus e .c.arytom,rptre,5
8. aneurrnolyzicus
t3, amolytrcus
Group 3 8 ..eterosporus
\ 8. rnacauariensts a. maceram
8 cycloheptal!:cus 8. puivilacens B. azotatocans B. iarvae a. gotricrae a POiymyxa
Figura 2. Árvore de distância evolutiva mostrando a heterogeneidade do gênero Bacillus. Fonte: Ash et al., 1991 9
Os resultados do estudo de Ash et ai. (1991) com a análise da
seqüência do 16S rRNA reafirmaram a inadequação de definir gêneros
baseados em critérios fenotípicos. Está claro que o gênero Bacillus é
filogeneticamente muito heterogêneo e requer revisões taxonômicas extensivas.
Os cinco grupos genéticos criados a partir da análise da matriz de distância claramente representam gêneros distintos.
A base da sistemática bacteriana está sofrendo mudanças fundamentais, características fenotípicas clássicas estão sendo substituídas por critérios moleculares e genéticos. A classificação microbiana no futuro será baseada nestes critérios (seqüências e estruturas). As seqüências de nucleotídeos podem revelar relações evolucionárias, enquanto que caracteres fenotípicos podem não revelar (Heyndrickx et al., 1995).
Em 1992, o Comitê Internacional de Sistemática Bacteriana, mais especificamente o Subcomitê da Taxonomia do gênero Bacillus decidiu realizar um estudo taxonômico polifásico deste gênero com o objetivo de estabelecer procedimentos padrões para a descrição de espécies e revisão da nomenclatura (Heyndrickx et ai., 1995).
Recentemente a reorganização do gênero Bacillus foi iniciada com a introdução do novo gênero Alicyclobacillus, para as espécies termofílicas e acidófilas que contém os ácidos graxos co-ciclohexano ou o-cicloheptano (B. cycloheptanicus) (Ash et ai., 1993).
Estudos taxonômicos mostraram que linhagens pertencentes às espécies B. brevis deveriam ser transformadas em nove novas espécies e a espécie B. aneurinolyticus também foi revista. Essas duas espécies foram 10
renomeadas como sendo os novos gêneros Brevibacillus e Aneurinibacillus respectivamente (Shida et al., 1996).
Subseqüentemente os outros grupos filogenéticos também foram
renomeados como novos gêneros: Halobacillus (Spring et al., 1996),
Virgibacillus (Heyndrickx et al., 1998), Gracillbacillus, Salibacillus (Waino et al.,
1999 apud Yoon et al. 2002), Coprobacillus (Aguilera et al., 2001),
Amphibacillus (Nimura et ai. ,1990 apud Xu & Côté não publicado), Filobacillus
(Schlesner et al., 2001 apud Xu & Côté não publicado), Geobacillus (Nazina et
al., 2001 apud Xu & Côté não publicado), Ureibacilius (Fortina et al., 2001 apud
Xu & Côté não publicado), Jeotgalibacillus e Marinibacillus (Yoon et al., 2001
apud Xu & Côté não publicrdo).
Ash et al. (1993) propôs que vários membros deste gênero deveriam
ser reclassificados no novo gênero Paenibacillus. Nesses estudos, uma sonda
altamente específica baseada em características do 16S rRNA foi descrita e
com isso foi encontrado um mecanismo seguro de diferenciar membros do novo gênero de outros bacilos produtores de esporos. Essa análise revelou a presença de uma seqüência potencialmente característica para o grupo três de
Bacillus, na região variável V5 do 16S rDNA. Todas as espécies do grupo três testadas (B. alvei, B. amylolyticus, B. azotofiXans, B. gordonae, B. larvae, B. macerans, B. macquariensis, B. pabuli, B. polymyxa, B. pulvifaciens e B. validus) reagiram positivamente com a sonda enquanto outros bacilos e
Alicyclobacillus acidocaldanus não hibridizaram. Com os resultados de Ash et al. e este trabalho de 1993, foi possível concluir que o grupo três representa um grupo filogenetic,amente distinto. Membros deste grupo exibem alta homologia 11
dessas seqüências e são remotamente relacionados com B. subtilis que é a
espécie padrão do gênero Bacillus (Figura 3).
Figura 3. Árvore filogenética mostrando as inter relações do novo gênero Paenibacillus e outras espécies de Bacillus. Grupos 1 a 5 como definidos por Ash et al. (1991). Grupo 1 (a) B. anthracis, B. cereus, B. mycoides e B. thuringiensis; (b) B. amyloliquefaciens, B. atrophaeus, B. lautus, B. lentimorbus, B. popílliae, B. licheniformis, B. pumilus e B. subtilis; (c) B. maroccanus, B. psychrosaccharolyticus e B. simplex. Fonte: Ash et al., 1993. 12
Um oligonucleotídeo iniciador altamente específico denominado
PAEN515F foi desenhado baseado numa seqüência de DNA encontrada no
gene 16S rRNA das espécies de Paenibacillus. Assim como a hibridização
usada por Ash et al. (1991) e a amplificação usando oligonucleotídeos
específicos para o gênero Brevibacillus e Aneurinibacillus usada por Shida et al.
(1996), o gênero Paenibacillus foi diferenciado com sucesso de outros Bacillus usando PAEN515F (Shida et al., 1997a).
Estudos anteriores têm mostrado que amplificações pela Reação em
Cadeia da Polimerase (PCR) de fragmentos do gene 16S rRNA usando oligonucleotídeos iniciadores específicos é muito útil para a identificação de bactérias, como exemplo este procedimento é rápido e específico para identificar membros de Francisella em nível de gênero, espécie e subespécie.
Oligonucleotídeos iniciadores foram usados para identificar o gênero
Aneurinibacillus e Brevibacillus e foram altamente específicos. Somente o uso de características fenotípicas para a diferenciação e identificação de
Bacillaceae são inadequadas e o uso de sondas e oligonucleotídeos iniciadores de detecção específica deveriam ser amplamente usados para a diferenciação destes (Shida et al., 1996).
2.2. O gênero Paenibacillus
Os membros do gênero Paenibacillus são organismos em forma de bastonetes, aeróbios ou anaeróbios facultativos que produzem esporos elípticos. Fenotipicamente as espécies deste grupo reagem fracamente com a coloração de Gram e até mesmo colônias jovens podem aparecer Gram 13
negativas, apesar de terem a estrutura Gram positiva. O DNA é composto de
G+C (moi%) entre 40 e 54 (Shida et al., 1996). São organismos móveis por mecanismos de flagelos peritríquios e não produzem pigmentos (Ash et ai.,
1993). Também podem excretar uma variedade de enzimas extracelulares de hidrólise de polissacarídeos complexos como alginato, condroitina, quitina, curdlano e outros (Shida et al., 1997a). Alguns membros são conhecidos por produzirem polissacarídeos (Yoon et al., 2002) e compostos antimicrobianos tais como poiimixina, octopitina, bacifelacina e antifúngicos (Chung et al., 2000).
Espécies de Paenibacillus têm sido isoladas de uma grande variedade de fontes, incluindo solo, água, rizosferas de plantas, raízes de
árvores, materiais vegetais, alimentos, forragem, fezes e larvas de insetos
(Daane et al., 2002). Isolados bacterianos pertencentes a esse gênero também têm sido encontrados no lago Vostok na Antártida (Christner et al., 2001), na cobertura de gelo de montanhas na China (Christner et ai., 2000), em pinturas biodeterioradas (Heyrman & Swings, 2001), em águas marinhas (Siefert et al.,
2000), em biofilmes redutores de mercúrio (Wagner-Dõbler et al., 2000) e em sedimentos estuarinos contaminados com petróleo (Daane et al., 2002). Esse gênero também foi abundantemente encontrado em empresas que produzem papéis para a indústria alimentícia (Raaska et ai., 2002).
O gênero Paenibacillus como proposto por Ash et ai. (1993), representa um novo filo que consiste das seguintes espécies: P. polymyxa, P. alvei, P. azotofáans, P. pabuli, P. macerans, P. macquariensis e P. amylolyticus (Ash et ai., 1993); P. alginolyticus, P. chondroitinus, P. glucanolyticus, P. curdlanolyticus, P. kobensis e P. thiaminolyticus (Shida et ai., 14
1997a); P. larvae subsp. larvae e P. larvae subsp. pulvifaciens (Heyndrickx et al., 1996a); P. lautus e P. peoriae (Heyndrickx et al., 1996b); P. gordonae e seu sinônimo P. validus (Heyndrickx et al., 1995), P. durum como sinônimo de P. azotofixans (Rosado et al., 1997); P. illinoisensis e P. chibensis (Shida et al.,
1997b); P. dendritiformis (Tcherpakov et ai., 1999); P. jamilae (Aguilera et al.,
2001); P. graminis e P. odorifer (Berge et al., 2002); P. lentimorbus e P. popilliae (Pettersson et al., 1999); P. koreensis (Chung et al., 2000); P. apiarius
(Nakamura, 1996); P. azoreducens (Meehan et ai., 2001); P. naphthalenovorans
(Daane et ai., 2002); P. campinasensis (Yoon et al., 1998); P. borealis (Elo et al., 2001); P. chinjuensis (Yoon et al., 2002); P. granivorans (van der Maarel et al., 2000); P. brasilensis (von der Weid et al., 2002); P. koleovorans (Takeda et al., 2002); P. turicensis (Bosshard et al., 2002); P. glycanilyticus (Dasman et al.,
2002) e P. daejeonensis (Lee et al., 2002).
Várias espécies descritas como bacilos fixadores de nitrogênio pertencem a esse gênero tais como: P. polymyxa, P. macerans e P. azotofixans
(Rosado et al., 1998), P. peoriae (Shida et al., 1997a), P. borealis (Elo et ai.,
2001), P. graminis e P. odorifer (Berge et al., 2002) e P. brasilensis (von der
Weid et al., 2002).
Atualmente, o interesse em microrganismos do solo tem aumentado significativamente na medida que eles têm um importante papel na manutenção da fertilidade do solo. A maior mudança para o desenvolvimento da agricultura sustentável é o uso de bactérias fixadoras de nitrogênio, hábeis em assimilá-lo da atmosfera (Seldin et al., 1998). 15
Além da fixação de nitrogênio, P. polymyxa solubiliza o fósforo no
solo, produz antibióticos, quitinase e outras enzimas hidrolíticas, acentua a
porosidade do solo e produz compostos promotores de crescimento em plantas
similares em atividade ao ácido indol acético (AIA) (Timmusk et al., 1999).
Ainda aumenta a captação de nutrientes pela planta e age como biocontrolador
de microrganismos patógenos nativos (Chanway, 1995). Esta espécie também
tem sido usada em controles biológicos contra Fusarium e Pythium (Guenouri-
Athmani et al., 2000).
O P. azotofixans é o principal representante de Paenibacillus isolado de solos e raízes de cana-de-açúcar, trigo e outras gramíneas. A característica interessante dessa espécie está relacionada com a sua capacidade de fixação biológica de nitrogênio, mesmo em presença de altos níveis de nitrato e com a produção de substâncias antimicrobianas (Neves & Rumjanek, 1998). P. azotofixans apresenta uma capacidade in vitro de fixar nitrogênio superior às outras espécies, e por não ser afetada pela presença de nitrato, a fixação em
áreas com fertilizantes é possível (Rosado et al., 1996).
Outros representantes são patógenos, tais como P. larvae subsp. larvae e subsp. pulvifaciens, que causam a mais séria doença americana de origem bacteriana em abelhas produtoras de mel (Apis mellifera) afetando seus estágios !arvais e pupais (Allipi & Aguilar, 1998, Heyndrickx et al., 1996a).
A espécie P. alvei produz sintomas em larvas similares às produzidas por P. larvae, causando a mais séria doença européia em abelhas. Ao contrário de P. larvae que se encontra apenas associado à abelhas, P. alvei ocupa muitos nichos ambientais incluindo o solo, leite, larvas de mosquito e seres 16
humanos. Esta espécie produz alveolisina, uma toxina que é altamente homóloga a listeriolisina O, perfringolisina O, pneumolisina e estreptolisina O
(Djordjevic et al., 2000).
O P. apiarius é outra espécie isolada de ambientes com abelhas juntamente com P. thiaminolyticus, mas está distantemente relacionado a outros Paenibacillus associados a abelhas (Nakamura, 1996, Shida et al.,
1997).
A maioria das espécies do gênero Paenibacillus secretam uma variedade de enzimas extracelulares. P. azoreducens degrada corantes têxteis de efluentes de indústrias (Meehan et al., 2001), P. validus e P. naphthalenovorans degradam hidrocarbonetos poliaromáticos (Daane et al.,
2002), P. jamilae degrada aipequina (resíduo aquoso tóxico produzido na extração do óleo de oliva) (Aguilera et al., 2001), P. glucanolytícus degrada uma variedade de p-glucanos como celulose, laminarina e pustulano (Alexander
& Priest, 1989), P. lautus, P. curdlanolyticus e P. kobensís degradam curdlano,
P. alginolyticus e P. chondroitinus degradam alginato (Shida et al., 1997a).
Há ainda os que produzem exopolissacarídeos como P. chinjuensís
(Yoon et al., 2002) e P. jamilae (Aguilera et al., 2001). P. campinasensis produz ciclodextrina de amido, sendo a única espécie alcalófila e ocupando uma posição filogenética distinta dentro desse gênero (Yoon et al., 1998).
P. koreensis produz compostos antifúngicos (tipo iturin) que inibem o crescimento de vários patógenos de plantas e animais tais como Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum, Candida albicans entre outros. Esta espécie é usada como controlador biológico desses patógenos por causa de sua 17
habilidade em degradar quitina, o maior componente da parede celular dos fungos (Chung et al., 2000).
Algumas outras espécies formam modelos complexos e diferentes de colônias durante o seu desenvolvimento como o P. dendritiformis (Tcherpakov et al., 1999).
No estudo de Ash et al. (1993), as espécies P. lentimorbus e P. popilliae foram colocadas no grupo 1 de Bacillus onde a espécie padrão é o B. subtilis. Entretanto, P. lentimorbus e P. popilliae têm várias características fisiológicas e ecológicas em comum com várias espécies de Paenibacillus incluindo a reação de Gram variável e a perda da catalase (em comum com P. larvae). Adicionalmente, uma análise de características fenotípicas os colocou no grupo de outros Paenibacillus associados com insetos, por causarem doenças nestes. Estas observações sugeriram que eles foram mal classificados no grupo 1 de Ash et ai. (1993) e através de novos estudo das seqüências do gene 16S rRNA eles foram incluídos no gênero Paenibacillus (Pettersson et al.,
1999).
2.3 Seqüências repetitivas
As seqüências repetitivas estão presentes nos genomas de todos os
organismos. Embora a função precisa dessas seqüências em genomas de
procariotos seja obscura, sua presença pode ser explorada para várias
aplicações e manipulações moleculares. Estas seqüências estão começando a
prover novas metodologias para a identificação e análise genética de 18
microrganismos e provavelmente possuem um importante papel nos estudos de microrganismos futuramente (Lupski & Weinstock, 1992).
O DNA cromossomal dos procariotos contém uma variedade de seqüências repetitivas com baixo número de cópias, tais como elementos de inserção, operons de RNA ribossomal, genes de RNA transportador e outros.
Estas seqüências podem contribuir para a evolução da estrutura cromossomal através de rearranjos do DNA tais como deleções cromossomais, duplicações e inversões. Genes repetitivos também fornecem mecanismos para aumentar a virulência bacteriana (Lupski & Weinstock, 1992).
A seqüência repetitiva que foi primeiro descrita e mais estudada é o
"repetitive extragenic palindrome" (REP) ou "palindromic unit sequence" (PU), inicialmente identificado em Salmoneila typhimurium e Escherichia coli (Lupski
& Weinstock, 1992).
A estrutura do REP consiste em uma seqüência consenso de 38 nucleotídeos em forma de palíndromo que pode formar uma estrutura "stem- loop" estável. As funções atribuídas para a seqüência REP ou PU incluem regulação gênica por tradução diferencial dentro de operons policistrônicos e retrorregulação por estabilização do RNA mensageiro. O fato de que os elementos REP não estão sempre presentes nas mesmas regiões intergênicas, em diferentes espécies, indica que eles não são um elemento essencial no mecanismo da expressão gênica. Entretanto, quando presentes eles podem influenciar a quantidade ou regulação da expressão de um gene ou de um operon. Adicionalmente outras funções têm sido atribuídas: como a ligação a
DNA girase e a DNA polimerase. Estes estudos têm levado a propor que o PU 19
ou REP está envolvido no empacotamento do DNA cromossomo bacteriano dentro de domínios independentes superenovelados (Lupski & Weinstock,
1992).
Outro elemento repetitivo interespaçado em genomas de procariotos foi identificado em Escherichia colí, Salmonella typhimurium e outros membros da família Enterobacteriaceae. Este foi denominado "intergenic repeat unir
(IRU) ou "enterobacterial repetitive intergenic consensus" (ERIC). O ERIC ou
IRU é uma seqüência de aproximadamente 126bp de comprimento e como a seqüência REP, está localizado em regiões transcritas e não codificantes do cromossomo e incluí uma repetição invertida conservada (Lupski & Weinstock,
1992). A seqüência ERIC foi descrita em detalhes em 1990 e 1991 (van Belkum et al. ,1998) e foi utilizada com sucesso por Guemouri-Athmani et al. (2000) para diferenciar isolados de Paenibacillus polymyxa de acordo com a sua origem (solos cultivados com trigo a 5, 26, 70 e 2000 anos), sendo a estrututra genética afetada quanto maior o tempo de cultivo.
Os protocolos correspondentes são referidos como REP-PCR, ERIC-
PCR e BOX-PCR e rep-PCR coletivamente. Os fragmentos amplificados podem ser resolvidos em um gel, produzindo um perfil referido como padrões genômicos rep-PCR. Uma das grandes vantagens destes padrões é que estes podem ser gerados não somente de DNA genômico purificado, mas também diretamente de lisados, células de culturas líquidas ou colônias em placas e de tecidos infectados tais como nódulos de raízes ou lesões de plantas. O padrão genômico de rep-PCR gerado de isolados bacterianos permite a diferenciação das bactérias em espécies, subespécies e linhagens, e pode representar o mais 20
discriminatório e reproduzível método de padrão genômico disponível para a rápida análise de amostras (Rademaker et al., 1997).
2.3.1 Seqüências Repetitivas BOX
Uma terceira seqüência repetitiva descoberta no genoma de
Streptococcus pneumoniae foi denominada BOX. Este elemento repetitivo foi descoberto nos estudos de Martin et ai. (1992) onde um fragmento clonado carregando o gene mmsA de S. pneumoniae (envolvido no reparo e recombinação do DNA), hibridizou com um número de fragmentos de uma clivagem total cromossomal além de hibridizar com os fragmentos do gene mmsA. A região responsável por estas múltiplas hibridizações foi mapeada e um fragmento de 340bp conseguido pela clivagem com Hpal e Pvull foi localizado a 1,5kb após o gene mmsA. Quando usado como sonda, este fragmento de 340bp hibridizou com 25 fragmentos cromossomais diferentes.
O sequenciamento do DNA deste fragmento de 340bp revelou a presença de quatro repetições diretas de um segmento de 45bp (boxB). Uma seqüência similar foi também identificada no centro de uma região de 150bp de alta homologia entre as regiões dos genes hexB e comA. Comparações das seqüências envolvendo as repetições de 45bp do fragmento mmsA com aquele em hexB e comA revelaram que ambas regiões flanqueadoras 5' (boxA, 59bp) e
3' (boxC, 50bp) foram também altamente conservadas. O elemento total
(incluindo alguma combinação de boxA, boxB e/ou boxC) foi denominada BOX.
A região do fragmento comA hibridizou com 6 a 10 diferentes fragmentos do cromossomo de S. pneumoniae. As seqüências de 45 bp (boxB) também foram 21
identificadas antes do fragmento do gene lytA de S. pneumoniae e no gene neuA e após o gene ply que codifica pneumolisina, também foram identificadas em um fragmento clonado possivelmente contendo um determinante de resistência a penicilina, aspS (Figura 4).
Figura 4. Organização do elemento BOX em relação a alguns genes. Box A, box B e box C estão indicados pelos retângulos preto, branco e pela linha sombreada. Fonte: Martin et ai., 1992
A existência dos elementos BOX contendo um único boxB (locus
IytA) ou um número variável de repetições adjacentes deste (fragmentos mmsA e aspS) sugere que o boxB é o elemento básico ao redor do qual a estrutura modular do BOX está organizado. O alinhamento de todas as seqüências BOX obtidas dos fragmentos de genes citados acima revelou um alto grau de similaridade para cada subunidade (acima de 90% para todo o elemento BOX).
O elemento BOX consenso é constituído, de 5' para 3', de três subunidades: boxA (59bp), boxB (45bp) e boxC (50bp) e seu comprimento total é de 154bp
(Martin et al., 1992). 22
Um exame do elemento BOX de 154bp revelou várias seqüências
invertidas e repetidas que poderiam levar a formação de um grampo no DNA ou
uma "stem-loop" estável em um transcrito de RNA desta molécula (Figura 5).
Uma estrutura proposta seria um "stem-loop" que poderia ser formada entre
boxA e boxC para todos os elementos BOX. Em vários casos onde os BOXs diferem do consenso, uma mudança de base compensatória é vista no braço complementar da "stem-loop", sugerindo que a manutenção da estrutura secundária é importante (Martin et al., 1992).
4 c., 4 0 boxB VI O P. 4 O C TA
T A T C G C , A T AA'"<",
1 VI / A TC- -C C C ; AA
MITUSA: T G C C O V _CT C G T 0 C , O C T c_ 9 A IV cornA : C —CACC GAT A r A T III A T T TCGC T boxA boxC C TC GT:7 7 A A T A T A T II rexB : AT A T C GC— A TC GT T A C G A T T A A T COMA ply T T • -> A A 7 A
Figura 5. Estrutura "stem-loop" da sequência BOX. As flechas indicam a localização das mudanças de bases compensatórias que ainda mantém a estrutura. Fonte: Martin et ai., 1992. 23
Sondas com oligonucleotídeos complementares às seqüências das subunidades revelaram que somente a subunidade boxA aparece altamente conservada entre diversas bactérias. Seqüências similares às subunidades boxB e boxC foram somente encontradas em S. pneumoniae. Todavia, o modelo de conservação de um elemento repetitivo pode não estar correlacionado com a filogenia estabelecida. A subunidade boxA estava dispersa e presente em um alto número de cópias em S. pneumoniae, mas não estava presente em outros estreptococos tais como S. pyogenes e S. agalactiae. Entretanto, organismos Gram negativos não relacionados tais como
E. coli e S. typhímurium continham múltiplas cópias de seqüências boxA dispersas em seu genoma (Versalovic et ai., 1994).
Na procura por uma função específica dos elementos BOX, foi observado que vários destes elementos estão localizados nas vizinhanças de genes cujas funções são relacionadas ao processo de transformação gênica.
Estes incluem os genes comA, hexB e possivelmente mmsA. O gene comA controla a competência para a transformação genica. O gene hexB codifica um componente essencial do sistema de reparo Hex, na qual elimina os maus pareamentos de bases que surgem no DNA durante a transformação (Martin et al., 1992).
Muitos dos outros elementos BOX identificados estão localizados próximos à genes possivelmente envolvidos na virulência de S. pneumoniae.
Estes incluem o gene neuA que codifica neuraminidase, um fator de virulência de pneumococos e o gene ply que codifica pneumolisina, outro fator de
virulência. Finalmente, a função do gene lytA está relacionada a transformação 24
e virulência. A localização dos elementos BOX nas vizinhanças dos genes envolvidos na competência ou virulência acentua a possibilidade de uma conecção regulatória entre estes. O desenvolvimento da competência para transformação gênica pode ser modulado por mudanças nas condições de crescimento tais como temperatura, pH inicial da cultura e concentrações de cálcio e magnésio. Embora a possível regulação da virulência de S. pneumoniae não foi ainda documentada, a expressão por parte de várias bactérias patogênicas, é conhecida por ser controlada por esses sinais ambientais. Isto leva-nos a especular que os elementos BOX poderiam estar envolvidos na expressão coordenada de genes de competência específicos e virulentos. Ambas transformação e virulência poderiam ser vistas como uma resposta global do S. pneumoniae a mudanças das condições ambientais
(Martin et al., 1992).
As seqüências BOX são o primeiro grupo de elementos de DNA repetitivos altamente conservados encontrados em uma bactéria Gram positiva.
Embora a seqüência de nucleotídeos seja inteiramente diferente, várias características de BOX são similares a estas de ERIC e de REP. Com respeito ao seu tamanho e número estimado de cópias, as seqüências BOX são mais similares ao ERIC do que ao REP, entretanto, diferente de ERIC, ele tem uma estrutura modular. O DNA não codificante e repetitivo é provavelmente mantido em um nível mínimo em S. pneumoniae, dado o pequeno tamanho de seu genoma quando comparado ao de E. coli (2270kb e 4700kb, respectivamente).
A menos que as seqüências BOX sejam mantidas como um DNA "egoísta", um pape! funcional como elemento regulatório deveria explicar sua persistência e 25
conservação de seqüências em S. pneumoniae. Pode-se especular que o BOX representa um caso de evolução de um elemento de DNA repetitivo recrutado para uma função específica (Martin et al., 1992).
A utilização das seqüências BOX ou a técnica de BOX-PCR é muito mais sensível para detectar diferenças entre linhagens quando comparada, por exemplo, à técnica de "Restriction Fragment Lenght Polimorfism" (RFLP) do
16S rRNA, tendo várias vantagens sobre esta: o 16S rDNA é somente uma pequena fração do genoma e os elementos BOX estão espalhados por todo o cromossomo; algumas partes do 16S rDNA são variáveis enquanto que as subunidades do BOX são altamente conservadas; digestões do 16S rDNA geram menos de oito bandas e o BOX PCR pode gerar até mais de doze bandas; mutações pontuais podem acabar ou modificar os sítios de restrição para o RFLP do 16S rDNA mas não afetam o perfil do BOX PCR (Jarvis et al.,
2001).
Existem também algumas diferenças cruciais comparando-se o rep-
PCR e a técnica de RAPD ("Random Amplified Polymorphic"). A maior diferença
é o tamanho dos oligonucleotídeos iniciadores e as condições usadas no PCR.
O RAPD usa oligonucleotídeos curtos com seqüências arbitrárias e o rep-PCR usa oligonucleotídeos maiores e com alta homologia a seqüências repetitivas. O rep-PCR usa condições mais definidas, o qual reduz a variação experimental e os artefatos de PCR (Louws et al., 1994).
Van Belkum et al. (1996) testaram vários tipos de oligonucleotídeos
BOX em S. pneumoniae: BOX A, BOX B, BR-1 e BR-2A. Somente o oligonucleotídeo BOX A gerou quantidades satisfatórias de amplificações em 26
números e tamanhos altamente variáveis e com isso foi concluído que o BOX-
PCR possui excelente capacidade discriminatória. Os oligonucleotídeos BR-1 e
BR-2 não geraram amplificações e o BOX C só gerou uma amplificação de 2kb.
Também foi observado que certas espécies de Streptococcus, tais como S. intermedius não amplificam fragmentos, indicando que os elementos BOX podem ser restritos somente a certas espécies.
O BOX-PCR foi usado com sucesso para determinar as relações genéticas e diversidade de B. anthracis e espécies relacionadas (Kim et al.,
2001).
Um alto grau de diversidade também foi observado entre linhagens de P. polymyxa através de BOX-PCR quando comparado a resultados fenotípicos e homologia pelo gene nif (von der Weid et al., 2000). A mesma observação foi descrita entre linhagens de P. azotofixans isolados de milho
(Seldin et al., 1998).
Entre isolados de P. larvae subsp. lanme, o BOX-PCR foi utilizado
para fazer uma correlação entre os isolados provenientes da Argentina e de outros países, para se tentar descobrir a origem da doença provocada por esta
espécie. Através da análise dos padrões de fragmentos foi sugerido que a
doença na Argentina pode ter se originado de mais de uma fonte (Alippi &
Aguilar, 1998).
O BOX-PCR também diferenciou com sucesso patovares de
Xanthomonas e Pseudomonas (Louws et al., 1994), linhagens de
Bradyrhizobium (Vinuesa et al., 1998), isolados de Burkholderia solanacearum 27
(Smith et al. 1995) e isolados de E. coli provenientes de humanos e animais
(Dombek et al. 2000).
2.4 Fixação Biológica de Nitrogênio
O nitrogênio é um dos principais constituintes das biomoléculas e, em sua forma molecular (N2), compõe quase 80% da atmosfera. Apesar de abundante, o nitrogênio do ar é quimicamente inerte e poucos são os organismos capazes de utilizá-lo. Determinadas bactérias utilizam como fonte de nitrogênio para o seu metabolismo, o enorme reservatório gasoso da atmosfera e estas possuem a capacidade de catalisar a redução do nitrogênio molecular à amônia e incorporar esse nitrogênio em suas moléculas orgânicas
(aminoácidos e proteínas), processo denominado Fixação Biológica do
Nitrogênio (Newton, 2000).
Essa capacidade é determinada pelo complexo enzimático da nitrogenase e as bactérias que a possuem são chamadas diazotróficas
(fixadoras de nitrogênio). Até o homem conseguir realizar a fixação do nitrogênio industrialmente, as bactérias diazotróficas eram responsáveis pela fixação de cerca de 90% do nitrogênio do planeta, enriquecendo os oceanos e os solos com formas de nitrogênio assimiláveis pelas algas e plantas e, desta forma, sustentando toda a biosfera. Com o aumento explosivo da população humana no último século (passando de 1,6 bilhão, em 1990, para 6,1 bilhões de pessoas, em 2000) o homem passou a interferir significativamente nesta equação, colocando fertilizantes nitrogenados na lavoura para suprir a 28
crescente demanda de alimentos, de modo que hoje contribuímos com cerca de
25% do nitrogênio fixado no planeta (Newton, 2000).
O nitrogênio, por ser essencial, é freqüentemente limitante na produção agrícola. São muitos os processos envolvidos na ciclagem desse importante elemento: desnitrificação, volatilização da amônia, queimadas
(processos que retornam o nitrogênio à forma gasosa) e lixiviação de nitratos para as camadas profundas do solo, conduzindo à perda do nitrogênio nos ecossistemas. Para repor o nitrogênio perdido são usados fertilizantes nitrogenados ou a Fixação Biológica de Nitrogênio (Neves & Rumjanek, 1998).
No entanto, o uso extensivo de fertilizantes nitrogenados na agricultura representa um problema econômico, social, ambiental e de saúde pública. Grande parte dos fertilizantes nitrogenados adicionados ao solo é consumida por bactérias (que voltam a oxidar o nitrogênio, liberando óxido nitroso e óxido nítrico na atmosfera) ou lixiviados, ou seja, não se aderem ao solo e acabam sendo levados pela água até o lençol freático. Contaminando o lençol freático, esse excesso de nitrogênio pode chegar em rios e lagoas e causar a eutroficação destes ambientes (Lewis et al., 1984).
Os microrganismos fixadores de nitrogênio são muito diversos, com representantes cultiváveis em todos os grupos filogenéticos de procariotos
(Gram positivos, Gram negativos, Archea e Cianobactérias). Os genes de fixação de nitrogênio não são distribuídos entre todos os representantes relacionados filogeneticamente, isto é, os genes de fixação de nitrogênio são encontrados em diversos grupos filogenéticos, mas gêneros fixadores e não 29
fixadores podem estar em grupos fortemente relacionados (Affourtit et ai.,
2001).
Apesar da variedade de organismos capazes de fixar nitrogênio, o complexo da nitrogenase é muito similar na maioria destes. A nitrogenase é formada de duas proteínas sensíveis ao oxigênio. O componente 1 ou dinitrogenase é uma proteína ferro-molibdênio formada por duas subunidades.
O componente 11 ou dinitrogenase redutase é uma proteína ferro-enxofre que transfere os elétrons para a dinitrogenase. Estas proteínas, juntamente com
ATP, Mg+2, e uma fonte de elétrons são essenciais para a atividade de fixação de nitrogênio (Moat & Foster, 1995).
Um ambiente anaeróbio é exigido para a atividade da nitrogenase devido à sensibilidade desta ao oxigênio, então uma hidrogenase acoplada a uma rota bioquímica que consome oxigênio ajuda a manter a anaerobiose do sistema. A fixação de nitrogênio é energeticamente muito dispendiosa e é inibida pela presença de nitrogênio fixado, principalmente amônia (Zehr et ai.,
2000).
O complexo da enzima nitrogenase, como visto anteriormente, é composto de duas proteínas conservadas: a proteína ferro-molibdênio, composta de subunidades codificadas pelos genes nifD e nifk e a proteína ferro codificada pelo gene nifH. O gene da proteína ferro, nifH, é um dos mais antigos genes funcionais da história da evolução e as relações entre as bactérias baseadas nas divergências de seqüências deste gene tem estado de acordo com a filogenia inferida pelas seqüências do gene 16S rRNA. Esta característica do gene nifH tem possibilitado o estudo da diversidade dos genes 30
de fixação de nitrogênio em bactérias de interesse bem como a caracterização de tais genes em comunidades microbianas do solo (Rosado et al., 1998).
Os genes nifH, nifD e nifK são normalmente encontrados juntos em um único operon e são fisicamente adjacentes a outros genes nif fazendo parte de um grande regulon. Freqüentemente encontrados anteriores ao nifK, em um outro operon, estão os genes nifE, nifN e nifX. Os genes nifE e nifN codificam uma proteína cofator essencial para que o complexo da nitrogenase seja reunido. A função do nifX ainda não está clara, mas ele pode ter um papel na biossíntese de cofatores ou na regulação (Kessler et al., 1998). A expressão do gene nif exige o produto do gene nifA, um ativador transcricional deste regulon
(Rudnick et al., 1997).
Recentemente, as seqüências do gene nifH têm sido amplificadas e sequenciadas de um grande número de ambientes, incluindo raízes de arroz, solos, oceanos e invertebrados (Zani et ai., 2000). A amplificação do nifH pode fornecer informações sobre quais tipos de organismos podem estar envolvidos na fixação de N2, confirmando a presença dos genes em um determinado organismo que se espera ser fixador ou identificar a presença de organismos que são suspeitos de serem pequenos contribuidores na fixação de N2 (Zehr et al., 1996).
Apesar do gene nifH ser evolutivamente conservado a nível de aminoácidos, ele pode não ser homólogo a nível de DNA devido a degeneração do código genético. Foi observado que em regiões de seqüências conservadas de aminoácidos, oligonucleotídeos iniciadores podem ser desenhados para amplificar uma seqüência de DNA alvo com alta especificidade. A 31
especificidade resulta da amplificação entre os oligonucleotídeos, devido à degeneração, não é aconselhável seu uso separadamente como sondas específicas. Este método possibilita clonar e sequenciar um gene de interesse sem a construção de uma biblioteca de DNA, produção de um anticorpo ou conhecimento prévio da seqüência de DNA (Zehr & McReynolds, 1989).
A reação em cadeia da polimerase é uma poderosa ferramenta para a investigação dos tipos e abundância de organismos fixadores de nitrogênio, e os fatores que limitam a sua distribuição e atividade. Se organismos fixadores de nitrogênio são detectados, o tipo de microrganismo pode ser identificado pelo sequenciamento dos fragmentos do gene nifH amplificados pelo PCR. A amplificação do nifH de culturas mistas de bactérias é possível através de oligonucleotídeos degenerados desenhados a partir de seqüências do nifH que codificam seqüências de aminoácidos altamente conservadas. Assim a amplificação é quase universal, e os resultados indicam que os sítios de anelamento não são seletivos para amostras específicas de nifH mesmo se eles variam no conteúdo de GC. Até mesmo seqüências nifH de arqueobactérias são amplificadas usando esses oligonucleotídeos, embora sejam somente distantemente relacionadas as seqüências nifH bacterianas. Estes oligonucleotídeos amplificam genes de organismos fixadores de nitrogênio associados com vários ambientes como oceanos, sedimentos, no picoplâncton e zooplâncton. A diversidade dos genes nifH no ambiente marinho é muito grande e com o desenvolvimento de novas ferramentas para a avaliação da expressão específica de genes nifH, haverá um melhor entendimento dos fatores controladores da fixação de nitrogênio (Zehr et al., 1996). oppai.suag opnai.uoo o a woo L ap apeprpuni.wd ewn we oppasu! enb OAd
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3.8 Quantificação do DNA total (Sambrook et ai., 1989)
Foi utilizada uma técnica rápida para estimar a que. klade de DNA em amostras: a fluorescência emitida pelo brometo de etídeo complexado com o DNA e vista sob luz ultravioleta. A quantidade de fluorescência é proporcional a massa total do DNA e por isso a quantidade de DNA na amostra pode ser estimada comparando a fluorescência produzida na amostra com aquela de uma série de padrões. Os padrões utilizados foram DNA lambda diluído nas seguintes concentrações: 50Ong/g1, 250 ngigl, 100 ng/g1 e 50 ng/gl.
3.9 Identificação do gênero Paenibacillus pela amplificação do gene 16S rRNA
Linhagens pertencentes ao gênero Paenibacillus foram identificadas pela reação em cadeia da polimerase (PCR) pelo uso dos oligonucleotídeos iniciadores PAEN515F (5'-TCGGAGAGTGACGGTACCTGA-3') (Shida et al.,
1997a) e 1377R (5'- CATGCTGATCCGCGATTACTA-3') (Shida et ai., 1996).
As reações de amplificação foram realizadas com uma concentração de DNA de aproximadamente 25ng num volume total de 20g1 por reação contendo 1U de Taq DNA polimerase (invitrogen), lx de tampão de reação da
Taq DNA polimerase (invitrogen), 3,5mM de uma solução de MgCl2
(lnvitrogen), 0,125mM de uma solução de dNTPs (Amersham Biosciences) e
1,2511M de uma solução contendo os oligonucleotídeos iniciadores PAEN515 E
1377R (Gibco BRL).
A reação de amplificação foi realizada em um aparelho termociclador
Progene (Techne) em um total de 27 ciclos nas seguintes condições: 1 ciclo 37
inicial de desnaturação a 94°C por 1 minuto, 25 ciclos de desnaturação a 94°C por um minuto, anelamento a 58°C por 1,5 minuto, extensão a 72°C por 1,5 minuto e 1 ciclo de extensão final a 72°C por 5 minutos.
3.10 Análise do fragmento amplificado de Paenibacillus
o fragmento amplificado que identifica o gênero Paenibacillus tem
800bp e foi submetido a eletroforese com uma corrente de 75V por 20 minutos em um gel de agarose 0,8% (9.3.1) com tampão TAE 1X (9.3.3) corado com brometo de etídeo (9.3.2). O gel foi analisado sob luz ultravioleta e fotografado com câmera digital Kodak.
3.11 Identificação das espécies de Paenibacillus
A identificação das espécies de Paenibacillus foi realizada através de provas bioquímicas clássicas seguindo a tabela e a chave de identificação construídas a partir de dados bibliográficos especialmente para este trabalho
(Tabela 3 e Figura 7).
As provas bioquímicas utilizadas neste trabalho foram: crescimento em anaerobiose, redução de nitrato, oxidase, produção de indo!, produção de gás sulfídrico, produção de urease, fenilalanina desaminase, catalase, amilase e gelatinase; hidrólise de caseína e esculina; utilização do citrato, crescimento em 5% de cloreto de sódio, crescimento a 50°C, crescimento em pH 10,5, produção de gás a partir da glicose, fermentação de L- arabinose, D- frutose, galactose, D- glicose, lactose, manitol, maltose, D- rafinose, ramnose, D- ribose, salicina, sorbitol, D- trealose e D- xilose.
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P. er kau os o + Pr -o E es + H Vog 3 p ão aç icus t ly fic i no t la d r Iden cu P. de e Chav 'd 0)1 o )S"- ia-3- O O OA001 -----: o CD o• (I ) cD ce) Q. SURI a,) c:,c (D 'ca o uep g cD Seou oe *osaJo 17 %3 eN d 10 ai u +- owg smp CD o e 5np 'd .."0 o) oe Cn a- CD O oze N N ap O cis) oj O Ij 4:3" 2)) eJpiN ex (,) CD o} Su Cf) a- o CD— C"13- C1) CD CD (t) C C R C- CD- (i) (i) -P -9 O CD c). cD Da Cp CD o) rn c cr -oo) 63 De acordo com a Tabela 4, as espécies mais freqüentemente encontradas nas amostras provenientes da água foram: P. validus, P. azotofixans, P. chibensis, P. glucanolyticus e P. illinoisensis. Nas amostras provenientes de solo as espécies mais encontradas foram: P. alginolyticus, P. pabuli e P. validus. Cerca de 37% dos isolados de água foram identificados como espécies fixadoras de nitrogênio (P. azotofixans, P. brasilensis, P. borealis, P. odorifer, P. gramínis e P. macerans) contra 14% dos isolados do solo (P. azotofixans e P. peoriae). Tabela 4. Identificação das espécies de Paenibacillus isoladas de amostras de água e de solo Espécie Isolados de água Isolados de solo P. validus 8 4 P. alginolyticus o 7 P. azotofixans 6 3 P. chibensis 3 2 P. glucanolyticus 3 2 P. illinoisensis 3 O P. koreensis 2 O P. brasilensis 2 O P. borealis 2 O P. thiaminolyticus 1 2 P. odorifer 1 O P. graminis 1 O P. macerans 1 O P. pabuli 1 5 P. apárius 1 2 P. macquariensis O 1 P. peoriae O 1 Total 35 29 64 4.2 Padronização das condições do BOX-PCR A técnica de BOX-PCR precisa ser muito bem padronizada quanto aos reagentes utilizados e suas concentrações devido ao seu alto poder discriminatório e alta sensibilidade. 4.21 Concentração de Cloreto de Magnésio (MgC12) o cloreto de magnésio é necessário para a atividade da enzima Taq •DNA potimerase. Para a determinação da concentração ideal para a realização do BOX-PCR foram testadas as concentrações de 2, 2,5, 3, 35 e 4mM de MgC12. A concentração escolhida foi de 3.5 mM de MgC12, a qual produziu um padrão de fragmentos, ideai para posterior análise e construção dos dendrogramas (Figura 8), 3 4 6 7 8 bp 2000 600 Figura 8. Teste de concentração de Nig:12. Canaletas: M, Marcador Molecular DNA i clivado com Hind111; 1-4, Paenibacillus polymyxa nas seguintes concentrações 2, 2,5, 3 .5 e 4mM; 5-8 Paenibarillus alvei nas seguintes concentrações 2, 2,5, 3,5 e 4mM, 65 •41.2 Concentração de DNA molde Foram testadas as concentrações de 200, 150, 100 e 5Ongil de DNA molde para o BOX-PCR. A concentração de 10Ongigi foi a que se mostrou mais eficiente para a produção e reprodutibilidade do perfil de fragmentos nos isolados de Paenibacillus (Figura 9). 2 3 4 5 6 7 8 9 10 M 11 bp 2030. 1380. 940.. 5S0— Figurá 9 Teste de concentração de DNA. Canaletas: M, Marcador Molecular DNA 2, clivado com EcoR1 e Hindill; 1-2 P. validus nas concentrações de 150 e 10Ongigi de DNA; 3-4 P. validus nas concentrações de 50 e 10Ongigi de DNA; ; 5-7 P. chibensis nas concentrações de 200, 150 e 10Ongipti de DNA; 8-10 P. chibensis nas concentrações de 200, 150 e 10Ongigi de DNA; 11, Controle Negativo da reação. 66 4.2.3 Concentração do oligonucleotídeo iniciador BOXA1R A concentração inicial recomendada pelo protocolo de Alippi & Aguilar (1998) para as reações de amplificação é de 2,5gM de BOXA1R. Foram testadas as concentrações de 2,5 e 51AM do oligonucleotídeo iniciador. Foi feita a padronização da concentração levando-se em consideração o número de bandas obtidas bem como a intensidade das mesmas. A concentração de 5gIVI apresentou bandas mais fortes e definidas e mostrou ser a mais eficiente para os isolados de Paenibacillus, quando comparada com a de 2,501. 4.2.4 Concentração de BSA o BSA ("Bovine Serum Albumin") foi utilizado para reduzir os efeitos inibitórios de contaminantes tais como ácido húmico, FeCl3, ácido fúlvico, etc... Utilizou-se a concentração de 8ng/g1 de BSA no preparo das amostras para as reações de amplificação (Wintzingerode et ai., 1997). 4.2.5 Temperatura e número de ciclos o protocolo definido por Alippi & Aguilar (1998) recomenda 1 ciclo de desnaturação inicial a 95°C por 7 minutos, 30 ciclos de desnaturação a 94°C por 1 minuto, anelamento a 53°C por 1 minuto, extensão a 65°C por 8 minutos e uma extensão final a 65°C por 15 minutos. Neste trabalho obteve-se um melhor resultado ajustando-se o tempo e a temperatura de anelamento e de desnaturação inicial e diminuindo-se o tempo de extensão. Com isso obteve-se uma maior exposição da fita molde de DNA ao oligonucleotídeo iniciador. Portanto, foram utilizados 1 ciclo inicial de desnaturação a 94°C por 2 minutos, 67 30 ciclos de desnaturação a 94°C por 1 minuto, anelamento a 50°C por 1,5 minuto, extensão a 65°C por 5 minutos e um ciclo de extensão final a 65°C por 15 minutos. 4.3 Perfil de BOX-PCR Foram encontrados 28 perfis entre as diferentes espécies isoladas da água enquanto que no solo foram encontrados 18 perfis de BOX-PCR (Figura 10). Para as análises foram selecionados quarenta e três fragmentos com tamanho molecular variando de 4365 a 445bp. Os isolados de água amplificaram de 5-13 fragmentos com uma média de 9,3 fragmentos por isolado, enquanto que os do solo amplificaram de 5-16 fragmentos com uma média de 9,5 fragmentos por isolado. Observou-se fragmentos de 1230, 841, 715 e 618bp comuns a maioria dos isolados de água que foram amplificados. Entre os isolados de solo foram encontrados fragmentos comuns de 2378, 1645, 1457, 1359, 1259, 1122, 1087 e 954bp. Não foi observada a ocorrência de um mesmo fragmento para todos os isolados. Os fragmentos de 3956, 3364, 2270, 1856, 1772, 1314, 1230 e 445bp foram amplificados somente com os isolados provenientes da água, enquanto que fragmentos de 2660, 2201, 1268 e 646bp foram gerados apenas em isolados provenientes do solo. •68 M 3 7 8 9 10 M bp 3530. 2030. 1380 . 940. Figura 10. Perfis de BOX-PCR. Canaistas: M, Marcador Molecular DNA A, clivado com EroRI e Hindi 1, Controle Positivo P. alvei; 2, Controle Positivo P. polymyxa; 3-6, Isolados provenientes de solo: 3- P. azoto fixans, 4-5 P, aiginolytirus, 6- P. pabuff, 7-10 isolados provenientes de água: 7- P. borealis, 8-10 P. validus; 11, Controle Negativo da reação. Dentro das espédes que tiveram um maior número de isolados, tais como P. a/gino!yticus, P. pabuii e P. validus no solo e P. validus e P. azotofixans na água, foram encontrados fragmentos em comum para estas espécies nos diferentes ambientes analisados e estes são apresentados nas tabelas 5 e 6. 69 Tabela 5. Isolados de Paenibacillus provenientes do solo que amplificaram determinados fragmentos no BOX-PCR P. alginolyticus P. pabuli P. validus n= 7 n= 5 n= 4 1645 6 3 3 ) 1573 1 4 O bp ( 1457 1 3 4 tos 1359 6 4 2 n 1259 7 1 3 me 1122 3 3 4 1087 5 4 O Frag 954 2 3 4 841 1 1 4 Tabela 6. Isolados de Paenibacillus provenientes da água que amplificaram determinados fragmentos no BOX-PCR validus P. azotofixans n= 8 n= 6 1856 5 ) 1230 5 4 bp ( 1122 O tos 954 6 1 n 841 me 715 7 2 Frag 618 7 2 4.4 Análises dos dendrogramas de BOX-PCR 4.4.1 Análise do dendrograma dos isolados provenientes da água De acordo com o dendrograma obtido através da análise dos isolados da água (Figura 11), foram observados cinco grandes grupos com um nível de similaridade de 35%. Um destes grupos pertence aos isolados controles, P. alvei e P. polymyxa. Os isolados de água com maior nível de 70 similaridade foram P. borealis (isolados 37 e 125) e P. validus (isolados 112 e 172) com similaridade de 100%. Em 73% de similaridade foram encontrados 9 grupos. Alguns isolados de P. validus agruparam-se com níveis de similaridade diferentes e o isolado 111 tendeu a agrupar-se com P. chibensis (isolado 23) a 73%. Em um grupo diferenciado encontra-se apenas um isolado de P. chibensis (isolado 171) apresentando o menor nível de similaridade (35%), ou seja, maior diversidade em relação aos demais. Alguns P. azotofixans, isolados 189-39Mar e 6-26, agruparam-se com similaridades diferentes, 64% e 51% respectivamente. Os isolados de P. glucanolyticus (isolados 18 e 19) agruparam-se em uma similaridade de 68%. No dendrograma também podemos observar 13 grupos únicos, tais como, P. azotofixans (isolado 26) juntando-se ao grupamento em 51°/0, P. macerans (isolado 29M) a 45% e P. chibensis (isolado 171) já citado anteriormente. 71 Nível de Similaridade (%) 100 90 80 70 60 50 40 0 20 1 P. borealís 37 P. borealis 125 P. thiaminolyticus AC P. graminis 8 P. valídus 191 P. azotofíxans 189 P. azotofixans 39Mar P. odorifer 5N P. brasilensis 21 P. valídus 41N P. azotofíxans 6 P. azotofíxans 26 P. aplarius 28 P. koreensís 5 P. illinoisensis 29 P. glucanolytícus 11 P. macerans 29M P. glucanolytícus 18 P. glucanolyticus 19 P. azotofíxans 204 P. azotofixans 32 P. pabuli 24Mar P. validus 10M P. brasilensis 16 P. validus 169 P. illinoisensis 23M P. koreensis 32M P. chíbensis 17b P. validus 112 P. valídus 172 P. validus 168 P. illinoisensis 79 P. validus 111 P. chibensis 23 P. chibensis 171 P. alveí ATCC6344 P. polymyxa ATCC842 Figura 11. Dendrograma baseado em análises de BOX-PCR dos isolados provenientes da água. 72 4.4.2 Análise do dendrograma dos isolados proveniente do solo No dendrograma da análise de agrupamento dos isolados do ;do apresentado na figura 12, foram observados quatro grandes grpos polimórficos em um nível de similaridade de 36%. Os controles, P. alvei P. polymyxa, estão em grupos separados sendo que P. alvei está próximoaos isolados do solo. Os isolados mais próximos foram P. azotofixans (iscado 43solo) com P. alginolyticus (isolado 8solo) e P. validus (isolados 4 e 2so)) a 92%. Em um nível de similaridade de 70% observaram-se 8 grupos. Os isolados de P. validus (2, 4 e 44solo) mostraram-se semelhantes ente si agrupando-se a 92% e 83%, somente um dos isolados (40solo) agrupa-se com P. alginolyticus (22solo) a 83%. No grupo de P. validus observaran-se dois isolados de P. chibensis (isolados 12 e 18solo) em um níve de similaridade de 75 e 61c/o, respectivamente. Dois isolados de P. pabuli (.6 e 50solo) agruparam-se com similaridade de 73%. Isolados de P. alginoly'cus (39, 37 e 35solo) agruparam-se em um nível de similaridade de 75% Os grupamentos únicos observados foram oito, entre estes P. pabuli (41solo, em uma similaridade de 50%, P. glucanolyticus (isolado 38solo) a 48% e P. periae (isolado 57solo) a 44%. 73 Nível de Similaridade (%) 95 90 80 70 60 50 40 20 P. azotofixans 43 P. algíno1yticus 8 1 P. azotofixans 34 P. glucanolytícus 32 P. pabuli 41 P. alginolytícus 22 P. valídus 40 P. validus 4 P. valídus 2 P. validus 44 P. chlbensis 12 P. chibensis 18 P. alveí ATCC6344 P. thíaminolytícus 23 P. pabuli 42 P. aplarlus 19 P. azotofixans 45 P. macquariensis 21 P. thiaminolytícus 3 P. pabuli 46 P. pabuli 50 P. alginolyticus 35 P. alginolyticus 37 P. alginolyticus 39 P. pabuli 28 P. alginolyticus 33 P. glucanolyticus 38 P. alginolytícus 7 P. apíasrius 1 P. peoriae 57 P. polymyxa ATCC842 Figura 12. Dendrograma baseado em análises de BOX-PCR do; isolados provenientes do solo. anb ovos op °pelos! (oiosg3) linged wn "%L9 e (JelA16£ e 691- sopelos!) suenojoze -d woo nau000 owsaw () % 2. 9 ep aPeppeigims ewn woo as -weJednffie en6e ep sopelos! (61- e 91.) snollAioueoni5 -d .SOSJGAIP apeppepw!s ap s!aniu we °los op sopelos! s!suacfitio -d a snpllen -d so amua as-weJednffie (H. ain6u) en6e ap se4sowe sep ewefficupuap ou weJedru6e as ocu anb (1,2.1, a q2.1,) sisuecllgo -d a “61.) snpfien 'd ap sopelosl -%91. GP apeppepw!s ewn wa es-weJedm6e waqwe `ovos op sopelos! `(olos31,) s/suagNo a (olos”. °pelos!) snpllen "d .%£8 e %36 tolos ap SeASOWC sep eweffloJpuep op owsew o nonu!woo apeppel!w!s ap leniu o a c(olostrfr a t, sopelos!) ops op °pelos! snpllen -d woo nau000 owsew p -% ep GPePpeums ewn woo (t. 1. °pelos!) snpllen d woo as-JednJoe e noTion (w °pelos!) s!suacutio d "%001- ep aPePpegins ap leniu ou sopednffle weJenu!woo (H, ain6W) en6e ap Se4SOWB sep ewei6offluep ou as-walednffie anb (3z I, a 311, sopelos!) snpy en -d ap sopelos! sowsaw -sowewednJ6 0I sopeiwooua WEJ0j. %02. ap apeppeigms ap leniu wn w3 "ovos op sawa!uanoid sopelos! woo seuade opeiwo4 g:4 odru6 oo!ur3 wn a en6e ep sawagianaid sopelos! Jod awawos sopeauo4 walol sodrufi sapue.16 se sep spa •sopelos! soAno sop sepepueisp e sepednffie weJenuRuoo alaiwoo sua6equll se am6g. eu awawaopewe ois!n owoo -0/0017 ep GPePPel!w!s ap leniu wn wa sodru6 sepueJ6 alas sopeiTuooue weJoj ain64 eu opewasaide eweffioffluep oN •sawa!qwe so soqwe we sepeowwep! sapadsa se al.uawos sepeiap!suoo as!Rue essa eJed ovos op e en6ç ep saluawanoid sopelos! sop ewei6oipuep op asg?uy t7L *%09 ep elDeppeuw!s ewn we (010S147 opelos!) fincled -d a %0P e (010s l. °Pelos!) snueide 'd `0/0EP e (olosn oPelos!) sno/PC/oueon/5 "d ``)/c29 e (olos£ opeios!) sno/pfiowweiLll -d Muawenpadsai %Og e %917 ep elpePPeuw!s ap fanju wn wa (9z a .froz sopelos!) suexijo,ioze *d salsa alWe Massazap weJoj sopeiwoj. soo!un sodni6 so -% t.2 ep GPeppeums ewn woo as-nodnffie anb (ops£17 e PE sopeioso sueno.ioze 'd woo nau000 owsaw o •%L9 ep aPeppepans ewn we apacIse ewsaw ap so woo alueweTunf opednffie !O ewei6oipuep assau `(z. e.in6u) oios ap seiTsowe sep ewei6oipuep ou sepacIsa se4no woo as-nodnffie SL, 76 Nível de Similaridade ( 96) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 valius 112 valius 172 1 • valius 169 vai bus 111 chi3nsis 23 valius 168 gluanolytícus 18 • gluanolyticus 19 • azo)fixans 204 azo)fixans 189 azo)fíxans 39Mar valius 4IN azo)fixans 6 • azo)fixans 26 pabLi * 50 pabLi * 46 pabLi * 28 pabLi * 42 thitzínolytícus * 23 azo)fixans * 45 • apídus * 19 • thiaínolytícus * 3 gluanolytícus * 38 apídus * 1 • azo)fíxans 32 pabí 24Mar • valdus 10M api:ius 28 • gluanolytícus 11 • thitzinolytícus AC * 41 • azo)fixans * 34 azo)fixans * 43 • gluanolytícus * 32 valius * 2 valius * 4 valius * 44 • chi..?nsis * 12 chi3nsis 17b valius 191 • chi2nsís * 18 i chi2nsis 171 • valius * 40 ATCC634 • pol:zyxa ATCC842 77 4%5 Amplificação do gene niffi Todos os isolados, tanto os provenientes da água como os do solo, •ram submetidos a amplificação por PCR para a obtenção do fragmento do çne MN. Somente os isolados previamente identificados como fixadores de rrogênio produziram um único fragmento amplificado de aproximadamente 50bp, enquanto o controle positivo (Rhizobium leguminosarum bv. trifain) Eip•ificou um fragmento de 360bp (Figura 14). Os outros controles positivos tzados, Bradyrhizobium sp. e Paenibacillus polymyxa não apresentaram nnhum amplificado. 1 3 4 5 230 •0 *****11 50 Figura 14. Amplificação do gene nifff. Canaletas: M, Marcador Molecular DNA Ã. clivado com EcoR1 e Hindi 1 Controle Positivo DNA de Rhízobium leguminosarum bv. írifolli na concentração de 5Ong4l; 2, amostra de solo com concentração de 10Ongip,1 de DNA molde; 3, amostra de solo com concentração de 5Ong411 de DNA molde; 4 Controle Negativo da reação; 5, Controle Negativo Paenibarillus alvei. "(17[. am6u) seowoadsau! sao5eowidwe ap opelinsai 'BOB4 apepsualui ap sepueq sep?A n!znpoJd ¡ri16u001, ap e anb owenbua `Ir1/6u09 ap e !ol awapg.a siew nansow as anb oe5anuaouoo v 'oe5eai iod ap¡ow VNG ap 111/6u0S a 00 i ap sao5aqueouoo se sepesai. weJol waciwei .dciot76 ap a dqogc ap owaw6eii. o opuei.uasaide oeu Jeinoelow oquewel. o4je ap seog.joadsau! sepueq 81.119WOS weJeowidwe sals3 sod oe soplawqns weioj waqwe o!ue6orpu ap salopexy. oeu sopejosi so 8L ap oe5eowivap! e aied min oi!nw a soog.joadse saJopep!u! soaplioalonuo6mo opuesn VNJJ sgi, aue6 op soluaw6e4 ap (dod) aselawnod ep e!apeo wa oe5ead elad seoôeoLpldwe anb opeAsow w9 SalOpei.U8 sopnis3 'S0Jodse ap seJoinpaid a aTauoiseq ap eunol we sepaioeq sei ?A aflua snypecllueed wau96 op oe5eowivap! e aied opezmin !O Jopep!u! oapfloaionuoNo essa `opnisa aluasaid oN .saisap oe5epualeAp e aied sopesn aivaweidwe Jes wepanap enoadsa oT3oeiap ap saiopepw soapj4oalonuo6Ho a sepuos ep osn o a sepenbapeul o?s aeaoeiipeg ap oe5eoli!ivap! a ow3epualapp e aied seo!djioual seo!ispaioaleo ap osn o aivawos anb waiew.ie (9660 "le ;e ePNS "wau96 assap oeoeowivap! e aied oe5ez!ppqN ap eopo91. e weiezwin (L661,) le ia gsv •391,9N3vd opuesn snilloeg salino ap ossaons woo opepualapp !ol snypewueed aieu96 o anb waieleiai (xe1.661.) -te ia ep!Lis -snipewueed ep sepadse sep vivd., sgi, aua6 ou epailuooue e epemasuoo vNa ap epuanbas ewnu opeaseq opequasap !ol dg 1,9N3vd opeu!wouep ootjjoadsa 81.119WMIC Jopep!ui oapjioalonuoNo wn "snilloeg apuas owoo opeog.!sseio 9 wau96 assa `soominbo!q so!esua ap oe5ezwin ep sanaliv -seo!dnoue; seo!ispaioaleo Jod soJau96 mino ap opepueJapp e oeu srylloeweed snypecllueed oiaup,6 op oeSeowluapi vg ovssnosia -s `suexgojoze -d eJed '9661. "le Te uplas `exifwkod *d ap oe5eow4uap e eJed `0003 "le piam Jap uon :soidwaxe sun61e) HOOSIdV ewals!s o ezifiln saloi.ne sop epo!ew e sapadsa sep oeaeog.g.uap! e ated .snypegrueed eJed ienjuodsp eirmeiain eu sepeAuooue oes oeu anb e oyieqaq. assa eJed aluawiepadsa sepingsuoo seo!dnouaj. seoRspeloaleo woo seiagel a saAeqo as-opuez!pn sepepuatapp a sepaledwoo WeJC selsa soo!winbom salsa]. ap saneJTV .sapadsa sep oe5eowi.uap! e emoli `oJeua6 o opeowluap! ap spdaa .souepajoeq saleua6 soilno no stypeweed ap sapadse seAno noToal.ap oeu a suexijojoze d eJed oog.joadsa loa oe5oaap ap ewas!s a4s3 .oeffial eTse eied oowoadsa oapiloalonuo6qo wn woo oçoez!ppqN ewn ap ep!n6as vr\p:p aua6 op jn e Ln spn?pen saoffiai sep o4uaw6e4 wn ap ow3eowidwe eu eg.s!suoo anb suenopze ap oe5oalep e eJed Jeinoelow opoTaw wn walanionuesap (966 0 .ie 4a opesoj .sue6equu sens e (sepoiajoeg) efiejonaid oJeua6 o J!n6u4s!p eJed oowoadsa Jopepu! oapnoalonuo6Ho owoo epez!pn io4 anb yNcji s91- ou epeaseq epuanbas ewn weieouiTuep! (17660 .1e 4a uRsn6Av -soo!Ajo sw4 ap seJo4npoJd saiom wa se5uaop enesneo anb eppequoosap ai,e («iapeqoJaq!!„ ap aluawe!naid epeu!wouap) en!4e6au weJe eue4oeq ewn ap epagoosap e eJed VNJJ 891. 91186 op oTuew6e4 wn weiezfi.n (t766 fe 4a x!ano6er .soowoadsa a4uawe4e "01 salsa a stypequieig a stypecllupneuv oiaua6 o Jeowi.uap! eJed salopepp! soaplioalonuoNo ossaons woo weJezffiln (966 0 le 4a epp4s .apadseqns a apadsa `oJeua6 ap leniu wa ellaspueid ap soxiwaw Jeowi.uap! eJed oowoadsa a op!cf?., a oimampeowd asa anb "84819.1 (t766 le Ta uewsJod .sepapeq 08 ep o anb opeowsJamp s!ew o;!nw e opo4osuall a cn6e ep aTuamwe o waJod .ovos ou o!ua6o4u ap seJopen. sapadsa seT!nw wels!xe anb ?f copeJadsa o !oi. oeu opel.insai aTs3 .(073t71,) ovos ou anb (%a) opaBo.mu ap saJopcxg. sepalocq ap wa6eluaaiod Jo!ew ewn epemesqo en6e eN .oxeldwoo ewals!ssooa wn !nssod oeu anb awamwe `ognw ap sainTinoouow wa sepelepo WaJC4 ovos op sawa!uanald Se4SOWe se anb oluenbu3 .opeowsian!p ewels!ssooa wn woo (onoN walag a ewauedi lwei) sai.ualciwe ap oJewou Jo!ew wn ap sepelos! a sepeTeloo Wal01 sagsowe sessa anb ap oe op!Aap Jes apod apep!sJamp Jo!ew essa 'en6e eu sapadsa ap apep!sJamp Jopw ewn JeleTsuoo es-apod (17 eleger ovos a en6e ap salue!qwe sou sepeowluap! sepadsa se ai4u3 •oc-58opuep! ep!d?J ewn aled sco!jaid wassol anb selaqc saneio ap oc5n4suoo e aied a ses!fflue selse aied sopjniou! soo!wjnbo!q sa;sal o4enb a owao e apadsaqns ewn a sapadsa olp a ei.upl ap !elo]. wn -snypecllueed waua6 oe sajueoua4ad sepadsa sep co!dnoual oc5co4.u.uap! ap epeowidw!s ai!aucw ewn ewasaide °pisa ai.s3 lanjuodsp einTaiem e as-opuez!!!).n oyieqail assa aied aTuawlepadsa sepinAsuoo WC.104 selsa `ewelqad assa e op!nea - wanssod souepapeq swaua6 a sapadse soAno owoo w!sse sco!diToue4 scoRspepaleo wa sopeaseq Selposep ?!* sapadsa se sepol wcpueadwoo anb oc5Bou.n.uap! ap sanewo no selaqc wanssod oeu snypeweed oJeua6 op sepadsa sv *(syealoq -d ap ocbcog.g.uap! e aied '1,003 "le 4e 09 a exifwiciod d eied '0003 "le Ta !Liewylv-pnowan 18 cassa alCd "Bo!uoal ep apepigmnpaidal e JaTawadwoo a Jel.ale wepod aweuiwewoo VNa ap sewiujw sapepiluenb ap e5uasad e e dod ap oedwel op oe5isodwoo ep `ePlow VNG op `Jopepiui oappoaionuo6iio op 0C5C.11.UGOU00 CU S905CUCA :owoo `siewewpadxa seo5epen e oliains esse Sod wa sepeaseq seopoal seAno owoo wisse Sod-dai ap ol000Taid .snlipeqiueed ap sapadsa sawaiej.ip ap ewoua6 op oT5ezpaloweo e aled xog sowewaia sop sapepiwixad seu eoilaue6 apepiliqepeA awaiede e epesn io `opinsa alseN .saimne sosJanup Jod soue sow!TIn sou sepeprnsa ai.uawenisuawe oP!s we (dOci-XOS a 2:10c1-01d3 SOd-d3d Gi.UGWCA1).8100 opewego á owoo) od Jod sepela6 sepueq ap saaiped '(966 "le uen) eowoadsa epuaTadwoo ewnfile e no epuaiwin e sopeuopeiai saue6 ap sopc4ein6ai somwop Jei.ueseiciai wepod saia Sowawaia sal.sa aled e;sodad opis equal aleio oe5un4 ewnqueu aloqw3 .X09 ap sopeuiwouep a sopeognuapi weJoi. aeitiowneud -s ap ewoue6 op aiwap sopemasuoo awaweile a son!madat soi.uawaia ap copo asseio ewn -ewoue6 ou sosJadsip sopeJ4uooue sonimadai sowawaia ap sanai4e Jeinoalow oe5ezpaloareo ewn e sepilawqns sepoi. Wal0j. 9419W.10pei.UC sepeopuepi sapadsa sv stillpeclluaed ap sopeioss sop e3Raue6 oe5ezpapele3 z•s •sennip sep sanage en6e e ated ovos op sope6aueo oes sowsiue6Japiw soue a `awaw.iopai.ue opelp owoo 'Nua' ap annoouow Z8 ez!Nn (9661-) Jel!n6V !dd!IV ap oloomad o anb °puas `suexyaioze d GP 0e5epuala4w e ated (9660 "le Ta ulpies owoo ITI/6u 09 ap BOJe0 nozfin sopooloJd sop epotew e `appw vNa ap oC3E11.11G0U00 e oweno .snoieozv ap sepadsa ap oeoetouataltp e aled (2,661,) i.e lainH Jod epezfin lAiwg`L GTe 'ovos op saped sawaiapp ap sopelost suenojoze .d ap oe5epuaialtp e eied (9660 ie utplas Jod epezfin VJWt7 `seowal6oe6 sue6uo ap aEvuei *dsqns *d Jetouatapp aled (9660 Jeitn6v 9 tdmiv Jod epezfin vyw£ `aeruowneud snopoocnclaijs ap sue6equti ap oe5eowdu. e eJed (9660 *te Ta wmileg uen Jod epezfin Ifywn, apsap oen ami.walti eu sepaiwooue otsau6ew ap maiolo ap sao5eiwaouoo sv .ogieqat4 awasaid ou dod-xos op oe5eztleai e ated epenala oi.tnw epatap!suoo oeaalwaouoo els3 .otaw op owewtosan ap sot6?".se oiTenb so awainp exAwkod d ap apeptsJantp ep oeSetiene e eied (0003) P!eM Jap uon Jod epezuRn waqwel. a seuowopnesd G seuowapuex ap StJe6eqUlj e satenoled ap oeaetouatej.tp e eied (P661.) *te Ta sAnnoi ap oloocnaid ou epezfin vyw2:9 ap oeJatwaouoo ep awaiejta •astpue Jopalsod eied sowaw6a4 ap oJawou woq a oeóniosa, eoq ewn neoewo dod ap oe5eat e epeuototpe lAjwg`E ap oe5alwaouoo ewn -sepueq ap alawou JOLJeW wn wat!znpaid sexieq stew sao5atweouoo sv 'oeaniosai ep eped a SO4SeJ ap owawne woo sew Sowaw6ati. ap wawcw Jo!ew wn ap oe5eowidwe e WeJBAel Seile ei.uawemelat sao5aiweouoo sv •sepueq ap saffed sop apeweldwoo eu oltaj.a opunp.id wn anal. z+BiAi ap oe5eAueouoo v .2:10d-X09 ap opoolald op oe5eztualped e a oe5eztlutTo e ated sateutwtiaid SGTS8T we sopesn weJoi. saiatwoo Sewapaid £8 ep apepsseoeu e ?Li oeu `sonoadsa-apadse sealped aoauJoi. Jopep!u! oapjpaionuo6no wn awawos ap oe5ez!pn e (0002) le 1.a em6enez woo opooe Ga *ewoue6 ou epq enu! oe5ewapo ewn wa sao5!Tedai sep oeopqpTsllp e op!Aap sepueq ap saalped J!znpaid aled awapg.ns á oapnoatonuo6Ho oo!un ass3 "d0d-X08 ap ol000lad o eied op?sseoeu a Jopep!u! oapnoapnuo6Ho wn awawos `dod o wezmi.n anb seo!uoai. se4no ap awaiama .sepueq ap oiewnu ouanbed wn es-anaAo sawlo wa a sopeios! sun6te wa sopeo!JiIdwe ap oe5npad e annow oeu vsEi ap oe5!pe e wes sopezNea, sowawpadxa soN •ii1i6u99`0 ap oeõeJTueouoo ewn epezffii.n `(t7661,) -te 1.9 OIAORSJGA Jod opezfin reu!6po ol000laid oN .asoie6e ap ia6 ou sepezmens!A opuenb sesuaw! s!ew sepueq nota sepueq ap Jo!ew wawou wn ap owawpaiede ou noi.insa, anb o Lopeowidwe Jes e vNa o woo Jope!o!u! oaplloapfluoNo op owawelaue ap sao5puoo se JeJOIfieW ap on!larqo o woo (L661, "ie i.a apaia6up.um) ap oe5alwaouoo eu oeaeowidwe ap Se0589J se ared saiTsowe sep asedad ou vs9 as-noz!im sepueq ap saaiped sou sagoewini waznpad saindwi sao5eJedad a apiow vNa ap sawappsu! sao5eJ4uaouoo (g660 .ie Ta o!noiesJaA opun6as .ex/fulifiod -d ap oe5epuatajw e eied o?.5eAueouoo essa weJezwm anb (000E) .te Te p!eM Jap uon aw_ioluoo waqwel. e dod-dai ap ol000l.ad o weianionuasep anb (17660 .ie Te 0!AOICSJeA Jod opesn pj owsaw o (sinoq sn000pojdans ap sopelos! ap oeoepueJapp e aled leap! sepueq ap oewed wn weiang.qo waqweT anb (1.002) 'te s!mer woo opooe ap ?Isa anb o ziri/6u001. ap e g4 soi.uaw6e4 ap jped woq wn n!znpad anb oe5e.iwaouoo e oyieqe4 alseN -Geme/ -dsqns agyvei -d ated i8 oquewei orle ap sowaw6ay. sop oeaeoglidwe e naoaJonej oeu a aswue Jopalsod aied sopeowidwe ap awapiins wawou wn woo s!anipipaidai sawped neoewo4 0005 ap einTaladwaT e opeJwoo ov •(00£9) epezfin s!ew amlaiedwaT e opuenb sop!znpaid waiol sowew6e4 soonod no wnqueN *sipad sou topai.° nas Jod sepemene waloi. 0025 e OS ap owaweiaue ap saimaiadwal `ot.fieqe4 asaN -afeio s!ew asseoeied soTuew6eJ4 ap oalped o aloqwe 0009 ap einTejadwaT e woo nowawne oeu oe5niosai ap Japod o e!nepol !saio!ew sowaw6all ap oe5eowidwe e naoalonej. DoOS ap e '0009 e 0005 LaeRiownaud snopopojdatis aP VNCI o aied sawaiejm) owawelaue ap sannaiadwai senp sopese Wa194. opuenb `(9660 .ie wnliag UCA ap oN -„sewein.4A ellielLICOCA.„ e „sel.uainiv■awawelle„ eyeeydso.ide7 ap sepadsa ap Jeinoalow oe5ezpapeJeo e aied Jopepu! oapjloatonuo6No ep waiez!pn (6661-) ie 4e elzeiruPer suenojoze wa ap oe5a4uaouoo e waiesn (9661,) .18 u!PleS -exkuifiod ap oe5ezpaTomeo e eled lowdog `ex!eq oe5eAueouoo ewn noz!I!Tn waqwe4 (0002) "le Te paAA Jap u0A `Sty/Peg ap sapadse ap oeoepuaial!P e aied (lowdu) ex!eq oTpw oe5a4uaouoo ewn weJezNn (1,0w) -le w!N `anneJapi eN -sewsaw sep apepsuaw! e owoo waq sepueq ap wawou op owawne awanbasuoo woo (nrig) epeo!idnp apepuenb e `oss! e op!Aaa .ogieqe4 a4sa eJed openbape sepueq ap upad wn n!znpaid oeu `seoup6oe6 sue6uo sepen ap aeniel .dsqns amues snypeweed ap oe5epualapp e aled uvrigL3 ap opues owoo (9661.) Jepn6v !clOiv Jod eiposap Jopepu! oapiloalonuo6mo op oeàaiwaouoo v •s!aniznpaidai oes sopeTinsai so seppg.ap oes oeoeowidwe ap sao5puoo se opuenb a ewoue6 op o!naid owawpaquoo ç8 ap owewpaiede o weiThoej. anb oeoea, ap san.aw?Jed so `(2661.) -te ira o!nolesJaA opunhas -Jelnoalow oquewel (me ap sowaw6ag. ap seo5eowidwe ai) oe5!q!ui e aied opinu!wp oesuaixa ap odwai. o sod op oeoezneal e aied seiniao ap sanno ap eleiND o?5ez!Nn e ?(.1 opuenb op?ssaoau a oe5earneusap ap odwa; Jo!ew wn -Jopep!ui oapjloalonuo6mo oe vima ap appw eis ep oe5!sodxa Jo!ew ewn as-analqo oss! woo -oesuapce ap odwal o as -opu!nu!wp a lep!ui oe5am4eusap ap e owawelaue ap ainTaiedwal e a odwal o as-opuelsnie opewsai Joyiew wn as-anaTqo coglecleil esaN *(2661-) Jel!n6y !cfOlv ap sopeowpow W8J01 sopp ap wawou o a aimeJadwa V -oe5eowidwe ap sopodsa sol.npaid soonod wamznpaid Jod a sepueq ap setalped sop apep!!!q!lnpaidai e WeJCIUGWne iod s!an?fasap oes owaweieue ap sanneiadwal seTle t(t7661.) 18 1.9 OIAOICSJOA WOO opiooe 9(] -01J9TeelB oapfloalonuo6mo wn owoo nffie no sen!madai sepuambas e noieue Jopepui oapnoalonuo6no o as OJCIO Jex!ap oeu Jod sewanoid weJa6 sex!eq oTinw saimaiadwal, `oss!p Jesede `selAi -ds wnyejoeqopwg ap sopepsi ossaons woo nopueJapp essa a 0o017 ap eanTeaadweT e epeziIiTn '(0003) -1e e!!6enez ap (negai], oN .2:10d-X08 o eJed sepeoude waqwel oes sex!eq ol!nw sepaiap!suoo owawelaue ap seonaladwal sy -ex/CwAlod -d ap oe5e!ouaiapp e eied (0003) -18 Ta p!aAA Jap uon Jod epezwin !c4 ewsaw v -seou.?ffloa6 sua6po saTuaiapp ap agyvel "dsqns ae/uel -d JCZpei3OBJEO aled 00E5 ap ainTaladwa4 e waiezup (966 1,) Jem6y !ddfly -sooffluo,t!Tue soTsodwoo ap saloTnpaid seuowopriesd ap apep!sJamp e i!usap aied 000s ap annaledwal. e walez!sn anb (0003) '18 Ta Jeuepee woo opooe ap ?se opeTinsai a4s3 -Jelnoelow 98 bei ep oesualxa ap al!wn op sowixpid oeTse a dod ap solei.ape oes Jeinoalow oquewe ap soTuew6e4 so anb waialap!suoo (9660 -ie Ta 6unieus *(11g ap s!ew woo sopeowidwe sowaw8e4 seweffiaipuep sop oeánAsuoo a asn?ue aled sopalepsuoo "01. oeu coqieqaq awasaid oN "opnlsa ou sopesneue ias waiapnd oeu anb so4uaw6e4 ap OAISSGOX9 oJewou wn n!znpad eazim ap oios ap sopeios! suexijojoze .d ap dod -xos o anb weJe4eial ,g660 •18 43 unDies •sopeowidwe oc-01, woo soo!6urwwe so4sodwoo ap sami.npaid seuowopnesd ap apepsiamp e waleprnsa (0002) "le JeuePe0 e dad-X08 ap soi.uawBag. z1.-17 ap oe5npoid ep _n4ed e snigoeg ap sapadsa seAno ap spen.nue sruipeg waiepuaJapp (1,00z) - te 43 `s!ew!ue ap sopeiosi sop euewnq wa6po ap 00 weialedas anb sopeowidwe 0p-ç3 ap Walall.U091/9 (0003) le 4a )iaqwoa `seuowopnesd a seuowor.nuex ap sua6equn a saienowd ap oe5epuala4Ip e eied SO4uGW6al4 ap waiRnpaid (17660 le smnoi -sepeTinsuoo s8nneJa4n sawaiapp se amua nopen eTsa a 91,-S ap epaiwooue so4uew6e4 ap apeppenb e (negai; alsaN ap eiras asn?ue e aied dod-X08 ap so4uaw6e4 ap leap! apeNuenb e `(t7661,) .18 43 o!noiesJaA woo ormooe Ga .(966l.) "Ie 4a wnlin uen opunhas (so4uaw6e4 sop oe5niosai eu oeo!nu!wnp no sopezRaw !S suoo!ldwe s!ew) dOd X09 op elDePPIIPedse ep oeoaialie e .18Ael W9C1We4. wepod Se05eal seu epesn asaiawnod vNa bei ep eoiew e no owaweuodwe4 ap sao5npuoo sep oe5eJaTie Ng, .dod ap opp epeo e so6uoi oesuaTxa ap sodwal a apiow vNa ap apeNuenb apueJ6 (salopepu! soapi4oalonuo6no 913 OSS80Xe 'sdINP ap ossaoxa :oes Jeinoeiow oquewe4 ofle ap sopeouldwe L8 epeu!wJalap ewn ap oe5ezpa4oeJeo eu s!ap3 J9S wapod sopeowidwe salsa sew cepuanbas ewsaw e waT apadsa ewsaw ep sope¡os! so sopoT wa sepaii.uooue sepueq selsa as Jaqes owoo ?t4 oeN "sopelosi ap oJewou apue.16 wn wa oeu sew `awaw.iopalue sopeuopuew sopeowidwe so waieluasaide waqwel sapadse se4no sv "dqi,t7g ap o4uaw6eil o sopeios! sop %001, wa noowidwe `en6? ep °pelos! suexyojoze .d .sala sopa; wa sopen.iesqo Jes weJapnd dqi,vg e 17;6 `m, :sowew6e4 agenb oios op sopeios! snpllen .d ap sopeios! sou anb owenbue Sopelos! sop %ou wa dq6gu ap owaw6e4 ooiun wn anal snogiflouffile "wnwoo wa soi.uaw6e.4. sopeiwooue weJoi. sopeowTuap! sopeios! ap oJewou Jo!ew wn "GMT anb sapadse sep 041180 - dqgv.t7 e gg£17 ap sopeowidwe sowew6e4 sopeAmooue weJol `opnlsa awasaid oN "souanbad opnw sopeowidwe ap oe5niosal e eJed ep!weipoeuod ap s!96 wa6p(a J3d ap sop(49w sagno sun6ie oiuenbue LasoJe6e ap 1a6 wn we sopniosei Jes wapod a ozit, e duo', 94118 sowaw6e4 ap soTsodwoo oes sipad so anb a dod-dai op wa6ei.uen ewn `(9661,) •je 4a 6uffiaus opun6as e id003 woo OPeAHO VNG ap oeJped op sanalle sepueq sep Jeinoalow oquewel op oinoiço o eied -g-c"A a I, Nvao5i ewefflaid o opezffiln `ossi e op!naci 'nu no e asq?ue e aled soxeldwoo awaweile ap s!pad znpoid a smsnqai saffed eia6 dod-xos o "oapn.a ap olawalq woo sopeio° ap spdap SfGAISlA aidwas oes oeu no eppew ewsaw eu sopeowidwe adwas oes ogu sooe.4. sowaw6e4 e (q)ig e g) sapueJ6 soi.uaw6e4 anb weJeTelsuoo (t,651.) "ie smnoi "sipad ap sao5eJedwo3 seu sopinpui Jas wanap o?u olueliod a s!aniznpoJdai adwas oes oeu anb saio!ew sopeowidwe so -aseJamiod 88 sopeias! wa apep!sJanup apueJ6 ewn walei.elsuoo (9660 "te 1.a esanu!A -%96 ap apeppel!wis ewn wa soTuewednj6 g waliznpoid sopeias! ;g anb apuas .d wa apep!siamp apuBJ6 ewn WeleAU0OUG (0003) 'te le PPM Jap uon opmsa aq.no wn w3 "sowawedru6 j7 sopailuooue suexijo,ioze .d ap sua6equu 9p we anb Wele].ejeJ (966 "le Ta u!PleS •%99 ap aPePPel!Ms ewn wa "ds eplueid ap sowawedm6 g weiepualajw anb 0,003) pIo*Aj 19 6uoar woo nau000 owsew o "sauoio walas ap soiladsns WeJ9 anb eullio!ued sawals!sai ae!uowneud snowooideijs ap sopeias! Lc ap 18301 wn wa sodru6 g WeJall.U0OUG (6661.) 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(oiosg opeios0 snorgiou./5/e -d e (oios£17 °pelos!) suenopze .d ‘ogleciail awasaid oN sod-dal Jod sopaia6 sopeowidwe solnpaid sop apeppcaldwoo e op!Aap sepepualajw awawipe4 ias wepod eôueop no ai!apadsoy owsaw o woo sepe!oosse sepai.oeq anb e sawa6Jamp sipad Jel wepod 'vima ap oe5ez!ppq!Li owoo s!ei.uawpadxa soloomaid salino Jod ois!A owoo `sepeuopelai awaweile seueToeq (17661,) sAnnoi opunhas -didd Jod opeowwap! epfueid ap VN12:1-1 S91- ap 0?-1Ped wn seuade sodni6 g. wa nopuaiapP 2:10d-da, o anb (1-00Z) plaucn 6uoar -wafied!ToJos eied soo!wap! weia anb wnoruodel wrnozgpAperg ap sua6equu ap eo!Taue6oill oe5elei e nou!wJai.ap eo!uoal e4s3 -wa6equu apadse ap lanw we sowawedm6 ap oe5epualapp Jo!ew ewn al!wJed dod-dai o '(9661,) .le 4a esanuv\ opunhas -snypecpeed ap sopelos! sou eowoadsaalw! a iam apep!sJamp apueJ6 ewn ?i4 `e!nepoi. -sepadsa se4no woo no sexpq sapeppeuw!s Limo weiedni6e anb snollkoueoni5 "d `snyeide -d `suexgo;oze -d 'llnqed -d `snorpflow5ie "d ap sopelos! sun6le oeisa ovos ap sopelos! so ailuj 'awaweowoadsaiew! a eJw! as-weJedni6e srsuallsen "d a suexyaioze "d `srsueado)1 -d Lsnpercle -d `sisuespuo -d `srsuntio -d `snplleA -d enes? ep sopelos! so effuea .sowRsma apeppei!w!s ap s!aniu wa sopedni6e waio4 sawalapp sepadsa ap a apadse ewsaw ap sopelos! 'oprnsa aTsaN .0/0g9 ap apeppel!ms ap tanw wn we sopelos! eJ4lJe so3uewedm6 p. sopeiwooue weJoi. apuo `wnolliodef wrNozgpApeig ap 06 91 agupamento P. alginolyticus com P. validus está em concordância com a filogenia baseada no 16S rRNA. Nos isolados de água, P. brasilensis (isolado 16) e P. validus (isolado 169) agruparam-se a 85%, e P. illinoísensis (isolado 23M) com P. koreensis (isolado 32M) a 84%. Na literatura, através do BOX- PCR, outras bactérias de espécies diferentes também não puderam ser discriminadas e foram agrupadas. Nos estudos de Kim et al. (2001), B. cereus e B. thuringiensis tiveram um nível de similaridade de 98%, assim como B. pumilus e B. subtílis (96%) e B. licheniformis agrupou-se com B. megaterium a 60%. Zavaglia et ai. (2000) relataram que Bifidobacterium dentium e Bifidobacterium animalis agruparam-se em uma similaridade de 82%. As espécies, neste estudo, mais semelhantes entre si e que tenderam agrupar-se foram os isolados de P. validus, tanto da água quanto do solo, e os de P. alginolyticus no solo. Como estas duas espécies possuíam um maior número de isolados, foi possível uma análise mais completa o que resultou nesses grupamentos de mesma espécie. P. chibensis em ambos os ambientes tenderam a agrupar-se a P. validus. Analisando a chave de identificação e as tabelas de testes bioquímicos foi possível constatar que fenotipicamente estas espécies estão próximas, de 43 testes bioquímicos, eles diferem em apenas 10. O agrupamento de isolados de mesma espécie foi mais visualizado no dendograma da água e do solo juntos (Figura 13), onde isolados que não se agruparam nos dendogramas anteriores juntaram-se neste. Como exemplos disso estão P. azotofbcans (43solo e 34solo), P. pabuli (28solo) e alguns isolados de P. validus (isolado 191 e 169), e P. chibensis (isolados 17b, 171 e 92 12 solo) que estavam separados nos dendogramas das figuras 11 e 12. O P. pabuli (isolado 28solo) que estava agrupado com P. alginolyticus (isolado 33solo) no dendograma do solo (Figura 12) se agrupou com os de mesma espécie no dendograma da água e solo (figura 13). Esses agrupamentos foram facilitados pelo fato de que nesta análise foram consideradas somente as espécies identificadas em ambos os ambientes. Quando os isolados de água e solo foram considerados, observaram-se sete grandes grupamentos em um nível de similaridade de 42% (Figura 13). Estes grupamentos foram bem distintos, separando, na sua maioria, os isolados da água dos isolados do solo, sugerindo que populações distintas estejam estabelecendo-se nestes ambientes. Dombek et ai. (2000) usando o BOX-PCR também diferenciou com sucesso isolados de E. colí provenientes de seres humanos, gado, porcos, ovelhas, galinhas, patos e gansos, colocando-os desse modo dentro dos corretos grupos de origem. Já Smith et al. (1995) agruparam isolados de Burkholdería solanacearum provenientes da América do Sul (exceto do Brasil) separando-os de isolados de várias partes do mundo, sendo os da América do Sul os que possuíam maior diversidade genética. Seldin et al. (1998) encontraram diferenças significativas entre as amostras de P. azotofixans isolados de diferentes partes do solo (rizoplano, rizosfera e de solo não pertencente a rizosfera), sugerindo que as plantas selecionam uma determinada subpopulação de bactérias. Neste mesmo estudo também foram encontradas diferenças significativas entre os isolados de P. azotofixans durante os quatro estágios do crescimento do milho (10, 30, 60 e 90 dias). Alippi & Aguilar (1998) tentaram encontrar a origem de 93 larvae subsp. larvae, causador de doenças em abelhas na Argentina, través do BOX-PCR. Os isolados da Argentina apresentaram os perfis A, B e , enquanto que P. larvae subsp. larvae de outros países apresentaram )mente os perfis A e B. As linhagens dos Estados Unidos e Alemanha foram ênticos e relacionados ao perfil A, enquanto que os isolados da República heca e da Inglaterra pertenciam ao perfil B. Linhagens da França, Polônia, ália, Suécia e Nova Zelândia apresentaram os dois perfis (A e B). Estes sultados sugeriram que P. larvae subsp. larvae na Argentina pode ser -oveniente de múltiplas fontes. Guemouri-Athmani et ai. (2000), utilizando RIC-PCR, conseguiram avaliar a estrutura genética de P. polymyxa de acordo )m a sua origem (solos cultivados com trigo a 5, 26, 70 e 2000 anos), e esta strutura tem sido afetada pelo longo tempo de cultivo do solo, quanto mais ngo o cultivo maior a predominância de um genótipo. Os controles utilizados neste estudo, P. alvei e P. polymyxa .ermaneceram bem separados dos demais isolados de Paenibacillus. Este fato lmbém foi observado por Jeong & Myrold (2001) onde os padrões de bandas e duas linhagens controles de Frankia foram completamente diferentes dos 9.drOes apresentados por outras amostras. Através dos procedimentos utilizados no presente estudo, o BOX- CR foi altamente discriminatório, pois revelou um grande número de çupamentos distintos. Os resultados apresentados aqui claramente emonstram que a sequência BOX está presente no genoma de Paenibacillus, Int() em isolados de água como de solo. Estes resultados também emonstram que o BOX-PCR é uma ferramenta útil para a análise genética de 94 actéris e para a taxonomia bacteriana, devido ao fato de permitir a produção e pert; de bandas de gêneros, espécies, linhagens, patovares e wrovares e, Dm iso, auxiliar na determinação de relações filogenéticas, como Di visto por iverso autores citados anteriormente. 5.3 Confirmação das espécies fixadoras de nitrogênio Os oligonucleotídeos iniciadores degenerados selecionachs por Zehr McFeynolds (1989) são amplamente usados para amplificação de um agmeto de 359bp do gene niffl de vários microrganismos, rendo uma )cnicamuito utilizada para a análise destes no ambiente. No presente trabalho, um fragmento de aproximadamente 360bp foi mplificado do controle positivo Rhizobium leguminosarum bv. trifoM O mesmo o ocorreu com os outros controles positivos utilizados, Bradyrhizthium sp. e aenibcillus polymyxa, que não apresentaram nenhum amplificado. Achouak t al. (1)99) relataram um amplificado muito fraco de Paenibacillus ficadores de trogê io. Diferente do fragmento esperado de 359bp, os isolados icentificados )mo f(adores de nitrogênio produziram um amplificado de aproxinadamente 4Obp. Estes fragmentos poderiam ser artefatos de PCR, mas essa hipótese desartada já que nos controles negativos utilizados essa bada não foi otida. Usando esses mesmos oligonucleotídeos degenerados, :ani et ai. 000) ambém encontraram uma variação no tamanho e amplitaram um agmeto de 460bp em amostras do Lago George em Nova York, sendo que seqências obtidas não foram similares a nenhuma de estudos anteriores. 95 Ohkuma et al. (1999) encontraram um amplificado de 470bp na comunidade microbiana simbiótica do intestino de cupins. Rosado et al. (1998) utilizaram oligonucleotídeos degenerados juntamente com específicos para a obtenção de um fragmento de 360bp em P. azotofkans. Outra hipótese para a ocorrência do amplificado de 940bp seria a presença de múltiplas cópias do gene nifH no genoma. Os oligonucleotídeos poderiam estar anelando em cópias diferentes e isto produziria um fragmento de tamanho maior que o esperado. Segundo Rosado et ai. (1998), a ocorrência de múltiplas cópias de genes nifH e/ou sistemas alternativos de nitrogenase têm sido encontradas para várias espécies bacterianas. Neste mesmo estudo, os autores encontraram múltiplas regiões homólogas ao nifH com divergência nas seqüências em P. azotofixans. Zehr et al. (1995) relataram que Clostridium pasteurianum possui seis cópias do gene nifH, sendo uma cópia de nitrogenase alternativa (sistema de nitrogenase que contém vanádio) e Azotobacter também possui várias cópias. Kirshtein et al. (1991) constataram a presença de múltiplas cópias do gene nifH em Anabaena oscillarioídes. Kessler et al. (1998) usando sondas específicas para cada gene nif detectaram múltiplos RNAs mensageiros em Methanococcus maripaludis, sendo que o nifH produziu dois transcritos, um de 930bp e outro de 1,7kb. Este transcrito de 930bp está de acordo com o tamanho do amplificado encontrado neste trabalho de aproximadamente 940bp. No presente trabalho alguns isolados não fixadores de nitrogênio amplificaram bandas de alto tamanho molecular. Affourtit et ai. (2001) relataram 96 o aparecimento de bandas inespecíficas em controles negativos no estudo com microrganismos do estuário do rio Neuse na Carolina do Norte. Segundo Achouak et ai. (1999) a obtenção de um amplificado com oligonucleotídeos nif não é o bastante para inferir a presença do gene nif e a confirmação por hibridização ou sequenciamento é assim necessária. Ben-Porath & Zehr (1994), usando esse conjunto de oligonucleotídeos, confirmaram que a seqüência do produto de 359bp é suficientemente variável para distinguir seqüências do gene nifH de cianobactérias, de arqueobactérias e eubactérias, bem como de genes nifH de heterocistos dos de não heterocistos. Rosado et al. (1998) usando oligonucleotídeos degenerados demonstraram que há variação suficiente em nível de DNA para distinguir partes da seqüência do gene nifH de P. azotofixans dos genes de espécies relacionadas (P.polymyxa e P.macerans). 8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ACHOUAK, W.; NORMAND, P.; HEULIN, T. Comparative phylogeny of rrs and nifH genes in the Bacillaceae. International Journal of Systematic Bacteriology, Spencers Wood, v.49, p.961-967, 1999. AFFOURTIT, J.; ZEHR, J. P.; PAERL, H. W. Distribution of nitrogen-fixing microorganisms along the Neuse river estuary, North Carolina. Microbial Ecology, New York, v.41, n.2, p.114-123, 2001. 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APÊNDICES 112 9.1 Meios de cultura para crescimento, isolamento e identificação 9.1.1 Água Peptonada Tamponada (Merck) Peptona 10,0g Cloreto de Sódio 5,0g Tampão Fosfato 10,5g Água destilada 1000m1 9.1.2 Ágar Tiamina-Biotina (TB) D(+) glicose 5,0g MgSO4.7H20 0,2g FeC13.6H20 0,04g Na2MoO4.2H20 0,005g CaC12.2H20 0,15g Tiamina 0,001g Biotina 0,001g Tioglicolato de sódio 0,5g K2HPO4 0,8g Solução Micronutriente de Jurgensen lml H3B03 2,86g MnC12.4H20 1,81g ZnSO4.7H20 0,22g CuSO4.5H20 0,08g 113 Água destilada 1000m1 Ágar 15,0g Água destilada 1000m1 9.1.3 Ágar Tripticaseína de Soja (TSA) (Merck) Peptona de caseína 15,0g Peptona de farinha de soja 5,0g Cloreto de sódio 5,0g Ágar 15,0g Água destilada 1000m1 9.1.4 Caldo Lactosado Peptona lOg Lactose 10g Água destilada 1000m1 9.1.5 Ágar Vermelho Neutro Peptona bacteriológica (Biobrás) 10,0g Amido 10,0g Vermelho neutro 0,05g Ágar 12,0g Água destilada 1000m1 114 9.1.6 Caldo Tripticaseína de Soja (TSB) (Merck) Peptona de caseína 17,0g Peptona de farinha de soja 3,0g D(+) glicose 2,5g Cloreto de sódio 5,0g Fosfato de hidrogênio dipotássico 2,5g Água destilada 1000m1 9.1.7 Meio Tioglicolato (Merck) Peptona de caseína 15,0g Extrato de levedura 5,0g D(+) glicose 5,5g L(+) cisteína 0,5g Cloreto de sódio 2,5g Tioglicolato de sódio 0,5g Sódio resazurin 0,001 g Ágar 0,75g Água destilada 1000m1 9.1.8 Reativo de Kovac's para Oxidase N, N, N, N Tetrametil p-fenilenediamina 1% 9.1.9 Caldo Nitrato (Difco) Extrato de carne 3,0g 115 Peptona 5,0g Nitrato de potássio 1,0g Água destilada 1000m1 9.1.10 Meio SIM Caseína digerida por enzimas pancreáticas 20,0g Tecido animal digerido por enzimas pépticas 6,1g Sulfato ferroso de amônio 0,2g Ágar 3,5g Água destilada 1000m1 9.1.11 Ágar Caseína Solução A: Leite em pó desnatado 10,0g Água destilada 100m1 Solução B: Ágar 2,0g Água destilada 100m1 9.1.12 Ágar Amido Amido solúvel 10,0g Peptona 5,0g Extrato de carne 3,0g Cloreto de sódio 5,0g 116 Ágar 20,0g Água destilada 1000m1 9.1.13 Caldo Uréia (Difco) Extrato de levedura O, lg Fosfato monobásico de potássio 9,1g Fosfato dibásico de potássio 9,5g Uréia 20,0g Vermelho de fenol 0,01g Água destilada 1000m1 9.1.14 Ágar Citrato seg. Simmons (Merck) Amônio di-hidrogenofosfato 1,0g Di-potássio hidrogenofosfato 1,0g Cloreto de sódio 5,0g Citrato de sódio 2,0g Sulfato de magnésio 0,2g Azul de bromotimol 0,08g Ágar 12,0g Água destilada 1000m1 9.1.15 Caldo TSB (Merck) com 5% NaCI Peptona de caseína 17,0g Peptona de farinha de soja 3,0g 117 D(+) glicose 2,5g Cloreto de sódio 50,0g Fosfato de hidrogênio dipotássico 2,5g Água destilada 1000m1 9.1.16 Gelatina Nutriente Extrato de carne 3, 0g Peptona 5,0g Gelatina 120,0g Água destilada 1000m1 9.1.17 Meio Base para Carboidratos Peptona 10,0g Cloreto de sódio 5,0g Carboidrato 10,0g(salicina 5,0g) Vermelho de fenol 0,018g Água destilada 1000m1 9.1.18 Ágar Fenilalanina D-L Fenilalanina 2,0g Extrato de levedura 3,0g Cloreto de sódio 5,0g Fosfato de sódio 1,0g Ágar 12,0g 118 Água destilada 1000m1 9.1.19 Ágar Esculina Extrato de levedura 5,0g Caldo TSB 5,0g Esculina 1,0g Citrato férrico amoniacal 0,5g Ágar 15,0g Água destilada 1000m1 9.1.20 Meio TY Triptona 5,0g Extrato de levedura 3,0g Cloreto de cálcio 0,87g Água destilada 1000m1 9.2 Soluções utilizadas na extração de DNA total 9.2.1 Tampão de Extração de DNA TES Tris 10mM EDTA 25mM NaCI 150mM 9.2.2 Tampão TE Tris 10mM 119 EDTA 25mM 9.2.3 Lisozima (Sigma) Solução estoque 50mg/m1 em água Milli-Q estéril Solução de uso 20mg/m1 em água Milli-Q estéril Aliquotar e conservar a —20°C. 9.2.4 RNAse (Gibco-BRL) Dissolver em uma solução de Tris/HCI 10mM e NaCI 15mM (pH7,5) na concentração de 10mg/ml. Aquecer à 100°C por 15 minutos e deixar atingir lentamente a temperatura ambiente. 9.2.5 Dodecilsulfato de sódio (SDS) (Synth) Dodecilsulfato de sódio 20g Água destilada 100m1 9.2.6 Proteinase K (Gibco-BRL) Solução de uso 20mg/m1 em água Milli-Q estéril 9.2.7 Fenol (Invitrogen) Fenol tamponado para pH7,8 com os seguintes reagentes: Fenol 250m1 Água destilada 50m1 Tris/HC11M (pH8) 6m1 120 8-Hidroxiquinolona 0,25g m-cresol 12,5m1 13-mercaptoetanol 0,5ml NaOH IN 7,5ml NaOH em pastilhas para o ajuste de pH 9.2.8 Fenol + Clorofórmio/Álcool Isoamílico Volume de 1:1 9.2.9 Clorofórmio/Álcool Isoamílico Volume de 24:1 9.2.10 Tampão TE2 Tris 10mM EDTA 1mM 9.3 Soluções utilizadas para corrida em gel de agarose 9.3.1 Gel de agarose Agarose 0,8g (gel 0.8%) ou lg (gel I%) Tampão TAE ou TBE 100m1 9.3.2 Solução de brometo de etídeo Brometo de etídeo 0,50mg Álcool etílico 1000m1 121 Concentração de estoque: 10mg/m1 Concentração de uso: 0,54/m1 9.3.3 Tampão TAE 50X Tris 242g Ácido Acético Glacial 57, 1m1 EDTA 0,5M (pH8) 100m1 Água destilada 1000m1 Concentração de uso: 1X. 9.3.4 Tampão TBE 5X Tris 54g Ácido Bórico 27,5g EDTA 0,5M (pH8) 20m1 Água destilada 1000m1 Concentração de uso: 0,5X. 9.3.5 Tampão de Amostra Azul de bromofenol 0,25% Gllicerol em água 30% 122 9.4 Soluções para PCR 9.4.1 Dideoxinucleotídeos Trifosfatados (dNTPs 100mM) (Amersham Biosciences) dGTP 5g1 dCTP 51,11 dATP 5g1 dTTP 5g1 Água Milli-Q estéril 180µI Concentração de uso: 2,5mM 9.4.2 Tampão de reação da Taq DNA polimerase 10X (Invitrogen) Tris/HCI (pH8,4) 200mM KCI 500mM Concentração de uso:1X 9.4.3 Soro albumina bovina (BSA) (Amersham Biosciences) Soro albumina bovina 4g1 Água Milli-Q estéril 96111 Concentração de uso: 8ng/g1 123 9.5 Matriz dos coeficientes de similaridade obtidos entre os isolados de Paenibacillus provenientes de amostras de água Isolados 204 32 28 29 29M 5 AC 8 204 1 32 0,625 1 28 0,222 0,364 1 29 0,235 0,19 0,696 1 29M O 0,25 0,556 0,235 1 5 0,25 0,4 0,727 0,667 0,625 1 AC 0,222 0,364 0,667 0,522 0,333 0,545 1 8 0,222 0,364 0,5 0,522 0,333 0,455 0,667 1 111 0,182 0,4 0,235 0,25 O 0,267 0,353 0,235 17b 0,444 0,545 0,417 0,435 0,222 0,455 0,417 0,417 11 0,333 0,455 0,667 0,435 0,444 0,636 0,583 0,333 24/Mar 0,4 0,737 0,476 0,4 0,267 0,421 0,571 0,476 168 0,462 0,471 0,316 0,333 O 0,353 0,316 0,105 112 0,429 0,444 0,4 0,211 0,143 0,222 0,4 0,3 10M 0,316 0,609 0,48 0,25 0,211 0,435 0,48 0,32 172 0,429 0,444 0,4 0,211 0,143 0,222 0,4 0,3 16 0,353 0,476 0,522 0,455 0,235 0,476 0,435 0,609 189 0,211 0,348 0,48 0,417 0,316 0,435 0,56 0,48 23M 0,4 0,526 0,381 0,4 0,267 0,526 0,476 0,381 79 0,167 0,25 0,444 0,471 0,167 0,5 0,444 0,111 18 0,5 0,5 0,545 0,476 0,125 0,5 0,364 0,364 19 0,429 0,333 0,4 0,421 0,143 0,222 0,3 0,5 23 0,333 0,375 0,444 0,353 0,167 0,375 0,556 0,333 169 0,375 0,5 0,636 0,476 0,25 0,4 0,545 0,636 39Mar 0,222 0,545 0,417 0,261 0,333 0,455 0,583 0,417 37 0,308 0,353 0,421 0,333 0,308 0,353 0,632 0,632 125 0,308 0,353 0,421 0,333 0,308 0,353 0,632 0,632 32M 0,25 0,6 0,545 0,381 0,5 0,7 0,545 0,455 191 0,222 0,455 0,5 0,522 0,222 0,545 0,583 0,667 171 0,267 0,421 0,095 0,2 0,133 0,211 0,19 0,381 5N 0,267 0,316 0,381 0,3 0,133 0,211 0,381 0,476 21 0,5 0,5 0,455 0,381 0,125 0,4 0,364 0,364 4IN 0,308 0,471 0,211 0,333 0,154 0,353 0,421 0,316 6 0,333 0,375 0,222 0,235 O 0,125 0,556 0,444 26 0,353 0,286 0,435 0,364 0,353 0,381 0,348 0,435 ATCC 6344 0,2 0,333 0,385 0,4 0,1 0,167 0,231 0,385 ATCC 842 O O 0,19 0,4 0,133 0,105 0,286 0,381 124 9.5 Matriz dos coeficientes de similaridade obtidos entre os isolados de Paenibacillus provenientes de amostras de água (continuação) Isolados 111 17b 11 24/Mar 168 112 10M 172 204 32 28 29 29M 5 AC 8 111 1 17b 0,588 1 11 0,235 0,333 1 24/Mar 0,429 0,571 0,476 1 168 0,667 0,526 0,211 0,375 1 112 0,615 0,5 0,3 0,353 0,667 1 10M 0,444 0,48 0,48 0,545 0,4 0,476 1 172 0,615 0,5 0,3 0,353 0,667 1 0,476 1 16 0,5 0,609 0,348 0,5 0,444 0,526 0,5 0,526 189 0,333 0,48 0,32 0,364 0,4 0,286 0,385 0,286 23M 0,714 0,762 0,381 0,556 0,625 0,588 0,455 0,588 79 0,727 0,556 0,333 0,4 0,769 0,429 0,316 0,429 18 0,4 0,364 0,545 0,316 0,471 0,556 0,522 0,556 19 0,308 0,2 0,2 0,353 0,4 0,5 0,19 0,5 23 0,727 0,556 0,333 0,4 0,615 0,571 0,421 0,571 169 0,533 0,545 0,364 0,526 0,471 0,667 0,435 0,667 39Mar 0,235 0,417 0,583 0,381 0,211 0,2 0,48 0,2 37 0,333 0,421 0,316 0,5 0,286 0,267 0,3 0,267 125 0,333 0,421 0,316 0,5 0,286 0,267 0,3 0,267 32M 0,667 0,727 0,545 0,632 0,471 0,444 0,609 0,444 191 0,471 0,583 0,417 0,476 0,316 0,3 0,56 0,3 171 0,429 0,571 0,095 0,333 0,25 0,235 0,455 0,235 5N O 0,381 0,381 0,333 O 0,118 0,273 0,118 21 0,267 0,545 0,455 0,316 0,353 0,444 0,348 0,444 41N 0,167 0,211 0,211 0,25 0,286 0,133 0,3 0,133 6 0,182 0,222 0,222 0,4 0,308 0,143 0,211 0,143 26 0,125 0,261 0,261 0,2 0,333 0,316 0,167 0,316 ATCC 6344 0,211 0,385 0,154 0,435 0,286 0,364 0,222 0,364 ATCC 842 O O O 0,111 O 0,118 0,091 0,118 125 9.5 Matriz dos coeficientes de similaridade obtidos entre os isolados de Paenibacillus provenientes de amostras de água (continuação) Isolados 16 189 23M 79 18 19 23 169 204 32 28 29 29M 5 AC 8 111 17b 11 24/Mar 168 112 10M 172 16 1 189 0,5 1 23M 0,7 0,455 1 79 0,353 0,421 0,667 1 18 0,476 0,261 0,526 0,375 1 19 0,421 0,286 0,353 0,286 0,667 1 23 0,471 0,526 0,667 0,667 0,375 0,286 1 169 0,857 0,522 0,632 0,375 0,5 0,556 0,625 1 39Mar 0,348 0,64 0,381 0,222 0,364 O 0,333 0,273 37 0,444 0,6 0,5 0,308 0,235 0,4 0,615 0,471 125 0,444 0,6 0,5 0,308 0,235 0,4 0,615 0,471 32M 0,667 0,522 0,842 0,625 0,5 0,222 0,625 0,6 191 0,696 0,48 0,571 0,333 0,455 0,3 0,444 0,545 171 0,5 0,545 0,556 0,267 0,316 0,235 0,4 0,316 5N 0,5 0,455 0,222 O 0,211 0,118 0,133 0,316 21 0,571 0,348 0,526 0,25 0,5 0,222 0,375 0,5 41N 0,222 0,3 0,375 0,154 0,353 0,133 0,308 0,235 6 0,353 0,421 0,4 0,167 0,25 0,286 0,333 0,375 26 0,455 0,583 0,4 0,235 0,476 0,526 0,353 0,476 ATCC 6344 0,4 0,444 0,261 0,2 0,25 0,364 0,3 0,5 ATCC 842 0,1 0,273 O O 0,105 0,353 0,133 0,211 126 9.5 Matriz dos coeficientes de similaridade obtidos entre os isolados de Paenibacillus provenientes de amostras de água (continuação) Isolados 39Mar 37 125 32M 191 171 5N 21 204 32 28 29 29M 5 AC 8 111 17b 11 24/Mar 168 112 10M 172 16 189 23M 79 18 19 23 169 39Mar 1 37 0,421 1 125 0,421 1 1 32M 0,545 0,471 0,471 1 191 0,5 0,632 0,632 0,636 1 171 0,381 0,375 0,375 0,526 0,476 1 5N 0,571 0,5 0,5 0,211 0,571 0,444 1 21 0,545 0,353 0,353 0,4 0,455 0,316 0,632 1 4IN 0,526 0,286 0,286 0,353 0,421 0,25 0,125 0,235 6 0,444 0,615 0,615 0,25 0,444 0,267 0,4 0,25 26 0,435 0,444 0,444 0,381 0,348 0,3 0,3 0,286 ATCC 6344 0,231 0,286 0,286 0,25 0,308 0,261 0,348 0,25 ATCC 842 0,095 0,25 0,25 O 0,19 0,111 0,111 O 127 9.5 Matriz dos coeficientes de similaridade obtidos entre os isolados de Paenibacillus provenientes de amostras de água (continuação) Isolados 41N 6 26 ATCC 6344 ATCC 842 204 32 28 29 29M 5 AC 8 111 17b 11 24/Mar 168 112 10M 172 16 189 23M 79 18 19 23 169 39Mar 37 125 32M 191 171 5N 21 4IN 1 6 0,615 1 26 0,556 0,471 1 ATCC 6344 0,19 0,2 0,48 1 ATCC 842 0,25 0,133 0,3 0,348 1 128 9.6 Matriz dos coeficientes de similaridades obtidos entre os isolados de Paenibacillus provenientes de amostras de solo Isolados 57SOLO V44SOLO 3SOLO 46SOLO 28SOLO 39SOLO 22SOLO 40SOLO 57SOLO 1 44SOLO 0,5 1 3SOLO 0,143 0,5 1 46SOLO 0,222 0,417 0,444 1 28SOLO 0,348 0,483 0,435 0,444 1 39SOLO 0,235 0,435 0,588 0,381 0,615 1 22SOLO 0,154 0,526 0,308 0,471 0,273 0,25 1 40SOLO 0,154 0,421 0,154 0,471 0,273 0,25 0,833 1 35SOLO 0,5 0,364 0,375 0,4 0,64 0,737 0,133 0,267 37SOLO 0,333 0,5 0,444 0,545 0,667 0,762 0,235 0,235 21SOLO 0,2 0,385 0,3 0,417 0,483 0,348 0,316 0,421 34SOLO 0,4 0,476 0,133 0,421 0,333 0,222 0,429 0,429 43SOLO 0,286 0,5 0,286 0,222 0,261 0,353 0,462 0,462 4SOLO 0,4 0,846 0,5 0,5 0,483 0,435 0,526 0,526 7SOLO 0,571 0,4 0,286 0,222 0,348 0,353 O O 19SOLO 0,571 0,593 0,571 0,64 0,533 0,417 0,3 0,3 23SOLO 0,4 0,381 0,667 0,316 0,417 0,556 0,143 0,286 42SOLO 0,5 0,545 0,5 0,3 0,4 0,421 0,4 0,4 33SOLO 0,421 0,56 0,421 0,348 0,714 0,545 0,111 0,111 45SOLO 0,421 0,48 0,421 0,348 0,571 0,364 0,333 0,333 2SOLO 0,3 0,769 0,4 0,5 0,483 0,435 0,526 0,526 12SOLO 0,333 0,667 0,111 0,364 0,37 0,286 0,588 0,588 18SOLO 0,133 0,476 0,267 0,211 0,417 0,333 0,429 0,429 1 SOLO 0,308 0,316 0,308 0,353 0,364 0,125 O O 41SOLO 0,167 0,333 0,167 0,375 0,095 O 0,364 0,364 8SOLO 0,308 0,526 0,308 0,235 0,273 0,375 0,5 0,5 32SOLO 0,571 0,6 0,286 0,333 0,348 0,353 0,462 0,462 38SOLO 0,462 0,316 0,462 0,471 0,455 0,375 0,333 0,333 50SOLO 0,222 0,417 0,556 0,727 0,667 0,571 0,353 0,353 ATCC 6344 0,095 0,37 0,286 0,48 0,4 0,333 0,4 0,4 ATCC 842 0,25 0,182 O 0,3 0,16 0,211 0,133 0,133 129 9.6 Matriz dos coeficientes de similaridades obtidos entre os isolados de Paenibacillus provenientes de amostras de solo (continuação) Isolados 35SOLO 37SOLO 21SOLO 34SOLO 43SOLO 4SOLO 7SOLO 19SOLO 57SOLO 44SOLO 3SOLO 46SOLO 28SOLO 39SOLO 22SOLO 40SOLO 35SOLO 1 37SOLO 0,8 1 21SOLO 0,364 0,333 1 34SOLO 0,471 0,316 0,476 1 43SOLO 0,375 0,222 0,5 0,8 1 4SOLO 0,455 0,5 0,462 0,476 0,5 1 7SOLO 0,5 0,444 0,3 0,4 0,429 0,5 1 19SOLO 0,522 0,48 0,444 0,455 0,381 0,741 0,571 1 23SOLO 0,588 0,421 0,571 0,25 0,4 0,476 0,533 0,636 42SOLO 0,444 0,3 0,636 0,471 0,625 0,636 0,625 0,609 33SOLO 0,571 0,609 0,56 0,4 0,421 0,64 0,632 0,692 45SOLO 0,476 0,348 0,56 0,5 0,421 0,56 0,421 0,692 2SOLO 0,455 0,5 0,462 0,476 0,5 0,923 0,4 0,667 12SOLO 0,3 0,364 0,417 0,421 0,444 0,75 0,333 0,48 18SOLO 0,235 0,211 0,476 0,25 0,4 0,571 0,267 0,273 1 SOLO 0,267 0,235 0,316 0,286 0,154 0,421 0,615 0,6 41SOLO 0,143 0,125 0,444 0,462 0,5 0,333 0,333 0,316 8SOLO 0,4 0,235 0,526 0,714 0,923 0,526 0,308 0,4 32SOLO 0,625 0,444 0,4 0,8 0,714 0,6 0,429 0,476 38SOLO 0,667 0,471 0,211 0,429 0,308 0,526 0,462 0,6 50S O LO 0,6 0,636 0,5 0,421 0,333 0,417 0,333 0,64 ATCC 6344 0,348 0,4 0,444 0,455 0,286 0,519 0,095 0,429 ATCC 842 0,222 0,2 0,364 0,353 0,25 0,182 0,125 0,261 130 9.6 Matriz dos coeficientes de similaridades obtidos entre os isolados de Paenibacillus provenientes de amostras de solo (continuação) Isolados 23SOLO 42SOLO 33SOLO 45SOLO 2SOLO 12SOLO 18SOLO 1 SOLO 57SOLO 44SOLO 3SOLO 46SOLO 28SOLO 39SOLO 22SOLO 40SOLO 35SOLO 37SOLO 21SOLO 34SOLO 43SOLO 4SOLO 7SOLO 19SOLO 23SOLO 1 42SOLO 0,706 1 33SOLO 0,5 0,571 1 45SOLO 0,6 0,667 0,583 1 2SOLO 0,381 0,545 0,64 0,64 1 12SOLO 0,211 0,5 0,522 0,522 0,833 1 18SOLO 0,25 0,588 0,5 0,5 0,667 0,737 1 1 SOLO 0,429 0,4 0,556 0,556 0,421 0,235 0,286 1 41SOLO 0,308 0,571 0,235 0,353 0,333 0,375 0,308 0,364 8SOLO 0,429 0,667 0,444 0,444 0,526 0,471 0,429 0,167 32SOLO 0,4 0,625 0,421 0,421 0,5 0,444 0,267 0,154 38SOLO 0,429 0,4 0,444 0,333 0,421 0,235 0,143 0,333 50SOLO 0,526 0,4 0,522 0,522 0,417 0,273 0,211 0,471 ATCC 6344 0,182 0,261 0,308 0,385 0,519 0,32 0,273 0,3 ATCC 842 0,118 0,222 0,19 0,19 0,182 0,2 0,118 0,133 9t7E`0 O 9J`0 L9J`0 Et7 I. `0 2179 331V tP`O .17'0 E`O t-z`o t7t7£9 001V 1.2.f7`0 EEC`O £9£`0 9L£`0 010S09 ECC`O J91:0 010S9 69L'O 010SJC 9179'0 010S9 I. 010S 010S1. 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