UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FACULTAD DE CIENCIAS

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

DIVERSIDAD DE Bacillus sphaericus EN DIFERENTES HABITAT y REGIONES GEOGRÁFICAS

JENNY DUSSÁN GARZÓN

TESIS DOCTORAL

BOGOTÁ, JULIO 2006

DIVERSIDAD DE Bacillus sphaericus EN DIFERENTES HABITAT y REGIONES GEOGRAFICAS

DISERTACIÓN SOMETIDA A LA ESCUELA DE POSTGRADO DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS , FACULTAD DE CIENCIAS COMO REQUISITO PARA OBTENER EL GRADO DE

DOCTORA EN

CIENCIAS BIOLÓGICAS

Biología Molecular

JENNY DUSSÁN GARZÓN

FACULTAD DE CIENCIAS UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

BOGOTÁ, JULIO 2006

PALABRAS CLAVES: Bacillus sphaericus, Quercus humboldtii, Quercus robur Colombia, España, Proteinas, Proteina-S, Peptidoglicano, RAPDs, RFLPs, 16S rDNA secuencia.

A la memoria de mis padres quienes me enseñaron la constancia por el saber y hacer A la memoria de la doctora Grose quien me dio la libertad de dar vuelo a mi imaginación Amis hijitas Camilita y Juanita fuentes de alegria y amor eterno

TABLA DE CONTENIDO

RESUMEN ...... iv

ABSTRACT…………………………………………………………………………viii

AGRADECIMIENTOS ……………………………………………………………xii

LISTA DE TABLA ………………………………………………………………..xiii

LISTA DE FIGURAS ………………………………………………………………xiv.

INTRODUCCIÓN ………………………………………………………………...... 1

I . REVISION LITERATURA

Bacillus generalidades contexto organismo modelo ……………...... 3

Clasificación y Filogénia ………………………………………...... 4

Pared celular y Proteínas capa-S …………………………………………………9

Ecología del Género Bacillus ………………………………………………………...11

II. MATERIALES Y METODOS

Localización de sitios de muestreo y cepas de estudio……………………….14

Aislamiento de bacterias y análisis agrológico de suelo ……………………...18

Sincronización de cultivos : Célula vegetativa y Espora………………………..20

Preparación de peptidoglicano de célula vegetativa y asociado a esporas………………...………………………………………………….……..21

Extracción de proteinas y fracciones celulares …………………………………23

Electroblot y secuencia N-terminal de proteina de la capa - S y toxina 41KD ...... ……………………………………………………25

Preparación de DNA total………………………………...... 25

Polimorfismo intraespecifico RAPD´s………….. ……………………...... 26

Polimorfismo intraespecifico gen r16S rRNA…...... ……….....……………....27

Análisis de datos...... 27

Número Acceso Genbank …………………………………………………...... 28

III RESULTADOS Y DISCUSION

PROTEINAS TOTALES Y FRACCIONES CELULARES EN CELULA VEGETATIVA Y ESPORAS ………………………………………………….29

PROTEINA ENTOMOTOXIGÉNICA DE 41KD Y DE LA CAPA-S…………38

PEPTIDOGLICANO DE CELULA VEGETATIVA Y ESPORA ……………..41

POLIMORFISMO INTRAESPECIFICO : RAPD`s ...... 48

POLIMORFISMO INTRAESPECIFICO GEN 16S rRNA RFLPs...... 57

SECUENCIACION de GEN 16S rRNA ……………………………………….59

Bacillus sphaericus ASOCIADO A Quercus humboldtii y Quercus robur Linneo…………………………………………………………………………….62

DISCUSIÓN 65

CONCLUSIONES 70

BIBLIOGRAFIA 73

RESUMEN

DIVERSIDAD DE Bacillus sphaericus EN DIFERENTES HABITAT Y REGIONES GEOGRAFICAS

JENNY DUSSAN GARZON1

JUAN AYALA, DIRECTOR2

Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad de los Andes. Bogotá, Colombia1.

Consejo Superior de Investigaciones Científicas. Universidad Autónoma de Madrid, España2

RESUMEN

Bacillus sphaericus ha sido reconocido en cinco grupos de homología con base a la hibridización DNA-DNA. Fundamentalmente, las cepas patógenas se han asociado al grupo IIA y las no patógenas a los grupos I, IIB, III, IV y V. Treinta y dos aislamientos de este taxón de diferentes habitat y regiones geográficas en Colombia y España, fueron evaluados a nivel fenotípico por patrones de perfil de peptidoglicano, perfiles proteicos de fracciones celulares y a nivel molecular por polimorfismos por RAPDs, RFLPs, y secuenciación del gen 16S rRNA

Dos clados fueron determinados por secuenciación parcial de 16S DNA en relación a su carácter patógeno y ubicación geográfica con una divergencia superior al 4% Los aislamientos patógenos (6/9) se ubicaron en el clado I relacionados con los grupos de referencia I, IIA y IV. Los aislamientos de España asociados a Quercus robur Linneo (6/9) mostraron una agrupación en el clado II sin relación con grupos de homología.

iv

Los aislamientos no patógenos de Colombia asociados a Quercus humboldtii se relacionaron tanto en el clado I como el II igualmente sin relación con grupos de homología

El perfil de muropeptidos de peptidoglicano tanto en célula vegetativa como en espora revelo un patrón similar entre todos los aislamientos. Una tendencia diferenciar se determino en el peptidoglicano de la célula vegetativa por la ausencia de mas de 10 picos de muropeptidos y un patrón más homogéneo en esporas (ausencia de 3 picos). El fenograma comparativo revelo dos grupos claramente definidos en aislamientos patógenos relacionados con las cepas I, IIA y IV y no patógenos tanto de Colombia como de España relacionados con los grupos IIB y V de homología a un nivel de similitud entre el 20% y 50%.

El perfil de proteínas en etapas logarítmica, estacionaria y en los extractos de esporas mostraron tres grupos: Patógenas, no patógenos asociadas a Quercus humboldtii (Colombia) y no patógenos asociados a Quercus robur ( España). Se determino que los aislamientos de Colombia se encuentran asociados al grupo IV de homología y los aislamientos de España al grupo V. Los aislamientos patógenos se asociaron al grupo IIA de homología.

De igual forma un perfil homogéneo en todos los aislamientos en relación con las fracciones de membrana y citoplasma fue el patrón establecido en las fracciones individuales. En 36 (de 39 total) cepas, el N-terminal de la proteína de 125 KD dio una identidad del 91% y 100% con la proteína de la capa – S de B. sphaericus. Diferencias en la posición 10 del aminoácido serina por cisteina se determino en las cepas de España con respecto a las de Colombia.

v

Tres oligonucleotidos de 37 probados fueron seleccionados para el análisis de los patrones de RAPDs. Los productos de amplificación revelaron un patrón de bandas heterogéneo (bandas entre 250 pb y las 1500 pb) en los aislamientos no patógenos tanto de Colombia como de España. En contraste para las cepas patógenas, se evidencio un bandeo homogéneo (bandas entre l00 pb y 900 pb) El Dendograma mostró dos grupo, uno relacionado con el grupo V de homología correspondiente a cepas no patógenas de España y Colombia y un segundo agrupamiento de los patógenos relacionado con el grupo IIA y IV de homología con una disimilitud mayor al 70%

Se evidencio por análisis comparativo de los parámetros fenotipicos y genotípicos dos grupos claramente definidos: En el grupo I los aislamientos patógenos relacionados con los grupos de homología I, IIA y IV y en el grupo II, los aislamientos no patógenos de Colombia (subgrupo IIa) y España (subgrupo IIb), estos relacionados con el grupo V de homología

El polimorfismo por RFLPs revelo para los 32 aislamientos y los grupos de homología pertenecientes a B.sphaericus patrones homogéneos de restricción correspondientes a lo establecido en el genero Bacillus. Los fragmentos generados por la enzima EcoR1 revelaron bandas fuertes de 850, 450 y 300 pb. Para la enzima Ddel1 se obtuvieron dos productos de digestión de 900 pb y 600 pb. Para la enzima Pst1 no se encontraron puntos de digestión en ninguna de las cepas analizadas En B. globisporus (outgroup) con la enzima Ddel1 no hubo restricción en la secuencia 16S rDNA

Una relación ecofisiológica fue establecida en asociación con Quercus humboldtii y Quercus robur Linneo. Se determino un numero alto de bacterias del genero Bacillus y específicamente del taxón B. sphaericus en la rizosfera de los cuatro bosques analizados del genero Quercus. Las concentraciones de iones divalentes de Ca, Mn y Fe mostraron una relación directa con el alto porcentaje de esporas (> 70%).

vi

La inducción de la esporulación en medio suelo sitio especifico con concentraciones de 0.06% de Ca, 0.01% de Fe y 0.015% de Mn para el pool de Bacillus formulado de cada bosque fue superior al 70% en relación a los grupos de homología seleccionados (I, IIA, IV), no obstante la cepa IV dio valores cercanos a los determinados en los aislamientos nativos de cada bosque. Bacillus globisporus outgroup mostró el menor porcentaje de esporulación en las condiciones establecidas para los tres iones divalentes probados.

Los resultados obtenidos soportan la gran heterogeneidad fenotípica y genotípica del complejo taxón de Bacillus sphaericus, sin embargo tanto los grupos de homología como los 32 de estudio se agruparon en relación con su carácter no patógenos separadamente de los patógenos independiente del hábitat y región geográfica. Este es el primer reporte de asociación de Bacillus sphaericus con el genero Quercus robur Linneo.

vii

ABSTRACT

Bacillus sphaericus Diversity in Different Habitats and Geographic Regions.

JENNY DUSSAN GARZON1

JUAN AYALA, DIRECTOR2

Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad de los Andes. Bogotá, Colombia1.

Consejo Superior de Investigaciones Científicas. Universidad Autónoma de Madrid, España2

Bacillus sphaericus has been recognized in five groups of homology based on DNA- DNA hybridization patterns. Mainly, the pathogen strains have been associated with the IIA- group and the non-pathogen strains with the groups I, IIB, III, IV and V. Thirty two isolations of this taxon from different habitats and geographical regions of Colombia and Spain were evaluated at the phenotypical level by peptidoglycane patterns, protein patterns of cellular fractions, and at the molecular level by RAPDs and RFLPs polymorphisms and 16S rRNA gene sequence.

Using partial sequence of 16S DNA were determined two clades in relation with pathogen character and geographical location with a divergence greater than 4%. The pathogens isolations (6/9) were located in the clade I in relation with the reference groups I, IIA and IV.

viii

The Bacillus sphaericus isolations from Spain Quercus rubor Linneo (6/9) show a cluster in the clade II without relations with other homology groups. The non-pathogen isolations from Colombia associated to Quercus humboldtii were related with the I and II clades without relations with homology groups.

The muropeptides pattern of peptidoglycane made in spore and vegetative cells was similar for all the isolations. A difference tendency was determined in vegetative cell peptidoglycane not having more than ten peaks of muropeptides in contrast with a more homogeneous pattern in spores (without three peaks). The comparative phenogram revealed two groups clearly defined: pathogen isolations related with the strains I, IIA and IV and non-pathogen isolations from Colombia and Spain related with homology groups IIB and V with similarities between 20% and 50%.

The protein pattern in stationary and logarithmic stages as well as in the spore extracts showed three groups: pathogens, non pathogens related to Quercus humboldtii (Colombia) and non pathogens related to Quercus robur Linneo (Spain). The isolations from Colombia are related with the homology group IV and those from Spain with the group V. The pathogen isolations are related with the homology group IIA.

A homogeneous pattern was found in all the isolations in relation with the membrane and cytoplasm fractions. In 36 strains (from a total of 39) the N-end of the 125KD protein give an identity of 91% and for the layer-S protein of Bacillus sphaericus the identity was 100%. The strains from Colombia and Spain have a difference in position 10 aminoacid (serine by cisteine).

Three of thirty seven oligonucleotides were selected for RAPDs analyses. The amplification products revealed a heterogeneous band pattern (from 250 pb to 1500 pb) in the non-pathogen isolations from Colombia and Spain.

ix

In contrast, for the pathogen strains a homogeneous pattern was founded (band from 100 pb to 900 pb). The dendogram showed two groups: one related with the homology group V and the non- pathogen strains from Colombia and Spain and the pathogen second one related with the homology group IIA and IV with dissimilarities greater than 70%.

Using phenotype and genotype comparative analyses two clearly defined groups were identified: In the first on e the pathogens isolations related with the homology groups I, IIA and IV and in the second group the non-pathogens isolations from Colombia (subgroup IIa) and Spain (subgroup IIb) related with the homology group V.

The RFLPs polymorphisms for the thirty two isolations and the homology groups of Bacillus sphaericus showed homogeneous restriction patterns in correspondence with the established for the genera Bacillus. The fragments generated by the EcoR1 enzyme showed strong bands of 850, 450 and 300 pb. Two digestive products of 900 pb and 600 pb were obtained with the Ddel1 Enzyme. For all the strains analyzed no digestive products were found using the Pst1 enzyme. For B. globisporus (out group) no restriction in the 16S rDNA sequence was found using the Ddel1 enzyme.

An ecophysiological relationship was established between Bacillus sphaericus, Quercus humboldtii and Quercus robur Linneo. It was founded a high bacteria number of the genera Bacillus and mainly of the Bacillus sphaericus taxon in the rhizosphera (Root soil) of the four Quercus forest analyzed. The amounts of Ca, Mn and Fe divalent ions showed a direct relationship with the high percent of spores (higher than 70%).

x

The induction of sporulation in soil specific site medium with amounts of 0.06% Ca, 0.01% Fe and 0.015% Mn for the prepared pool of Bacillus from each forest was 70% higher than the found in the homology groups selected (I, IIA, IV) although to the IV strain were founded values near to the native strains of each forest. Bacillus globisporus showed the smaller percent of sporulation in the established conditions.

These results support the high phenotypic and genotypic heterogeneity of the complex Bacillus sphaericus taxon and also show that the homology reference strains as well as the thirty two strains isolated were clustered in relationship with the pathogen and non- pathogen character independent of the habitat and the geographical region. It is showed the first report of association between Bacillus sphaericus and Quercus robur Linneo.

xi

AGRADECIMIENTOS :

Juan Alfonso Ayala Serrano : Director red ALFA y director de mi trabajo doctoral. Gracias Juan no tengo palabras, el apoyo en mi tesis, a mi familia en fin a TODO

Gabriel Gutkink : Gestor de la Red ALFA-Biología Molecular. Jurado crítico de mi trabajo doctoral

Helena Groot : El apoyo incondicional al doctorado en Ciencias Biológicas

Silvia Restrepo : Jurado valioso en el momento decisivo

Lucia Lozano : Mil gracias por pertenecer al grupo de Bacillus, de esporulados y por todo su colaboración en diferentes campo del saber en microbiología

Martha Vives : Por nuestras disertaciones en ciencia y en otros aspectos

CIMIC : Todo un equipo de colaboración : Oscar Bedoya en análisis filogenético, Marcela Castillo en edición clave de diagramas, Carolina Barriga en deposito de secuencias en Genbank

Jose Rafael Toro : Su impulso en iniciar el doctorado durante su decanatura en Ciencias

Nohra de Sanchez, Carlos Jaramillo y Mauricio Linares : Por su estimulo en mi gestión de desempeño anual del departamento

A mi familia : César por la revisión final del documento y a mis hijitas Camilita y Juanita por su colaboración en revision bibliografica y edición de diagramas y se el motor de mi vida

Esporas de Bacillus por se mi inspiración en ciencia

xii

LISTA DE TABLA

Tabla 1. Aislamientos de Bacillus sphaericus analizados en este estudio y grupos referencia

Tabla 2. Análisis Agrológico de rizosfera de Quercus humboldtii y Quercus rubur Linneo….

Tabla 3. Proteínas de 125 KD y 41 KD de las cepas aisladas y relacionadas con B.sphaericus.

xiii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Mapa de Colombia y localización de la Reserva Parque Natural Chicaque y Bosque Las Mercedes

Figura 2. Mapa de España y localización de Bosque en Tres Cantos y Canto Blanco

Figura 3. Quercus humboldtii y Quercus rubur Linneo

Figura 4. Bacillus sphaericus sincronizado microscopia luz y electrónica

Figura 5. Electroforesis SDS-PAGE de Proteínas fase logarítmica

Figura 6. Fenograma de Proteínas fase logarítmica

Figura 7. Electroforesis SDS-PAGE de Proteínas fase estacionaria

Figura 8. Fenograma de Proteínas fase estacionaria.

Figura 9. Electroforesis SDS-PAGE de Proteínas espora madura

Figura 10. Fenograma de Proteínas esporas madura

Figura 11. Fenograma comparativo de proteínas totales

Figura 12. Electroforesis de fracciones de membrana

xiv

Figura 13. Electroforesis de fracciones de citoplasmáticas

Figura 14. Cromotograma de peptidoglicano de célula vegetativa

Figura 15. Cromotograma de peptidoglicano de esporas madura

Figura 16. Fenograma de peptidoglicano de célula vegetativa

Figura 17. Fenograma de peptidoglicano de espora madura

Figura 18. Fenograma comparativo de peptidoglicano de célula vegetativa y espora madura

Figura 19. Electroforesis productos de amplificación de los oligonucleotido AD-11, AA-15 y AF-17 en los aislamientos no patógenos

Figura 20. Electroforesis productos de amplificación de los oligonucleotido AD-11, AA-15 y AF-17 en los aislamientos patógenos

Figura 21. Dendograma productos de amplificación oligonucleotido AD-11

Figura 22. Dendograma productos de amplificación oligonucleotido AA-15

Figura 23. Dendograma productos de amplificación oligonucleotido AF-17

Figura 24. Dendograma comparativo oligonucleotidos AD-11, AA-15 y AF-17

Figura 25. Fenograma - Dendograma comparativo Fenotípico – Genotípico

xv

Figura 26. Amplificación del gen 16S rRNA de Bacillus sphaericus

Figura 27. Electroforesis de productos de restricción con EcoR1 y Ddel1

Figura 28. Arbol filogenético grupo I de Bacillus sphaericus

Figura 29. Árbol filogenético grupo II de Bacillus sphaericus

Figura 30. Población de Bacillus en la rizosfera de Quercus humboldtii, Colombia y Quercus rubur Linneo, España.

Figura 31. Esporulación de Bacillus sphaericus en iones divalentes

xvi

CAPITULO I

INTRODUCCION

Bacillus sphaericus es una bacteria estrictamente aerobia formadora de endosporas, metaboliza una variedad de aminoácidos pero no utiliza azúcares como fuente de carbono, fenotipo tradicional en el género Bacillus para la clasificación por test bioquímicos de la ubicación taxonómica, motivo por el cual los estudios en esta especie de bacteria fueron muy escasos.

Sin embargo con el descubrimiento en 1965 de la actividad larvicida de algunas cepas pertenecientes a este taxón y el desarrollo de técnicas a nivel molecular para el diagnóstico de bacterias entomopatógenas, el interés en este microorganismos fue marcado.

La clasificación numérica de B.sphaericus mostró una heterogeneidad en todos los parámetros medidos, concepto reforzado por la variabilidad de actividad insecticida entre los diferentes aislamientos a partir de larvas de mosquitos.

Usando técnicas de hibridización de DNA, en B.sphaericus se demostraron cinco grupos de homología con una asociación entre el 45% al 75% entre los grupos no patógenos y del 80% en los grupos patógenos para mosquitos. Estudios basados en polimorfismos azarosos como (RAPDs) y polimorfismos de fragmentos de restricción (RFLPs) de DNA total han confirmado algunos de los grupos de homología reportados.

1

La distribución cosmopolita del género Bacillus ha mostrado que se encuentra presente en un alto porcentaje en todo tipo se suelos, asociado este porcentaje a la característica de formar endosporas. En Colombia, a partir de diversos hábitats se ha aislado B.sphaericus patógeno para larvas de mosquitos con una variabilidad en su toxicidad . De otra parte, diferentes especies de Bacillus fueron la población dominante en bosques de vegetación heterogénea en la Reserva Parque Natural Chicaque. Fundamentalmente, la especie correspondiente a B. sphaericus fue el grupo dominante encontrado asociado a la rizosfera de bosques de vegetación homogénea de robledales en esta reserva natural. Los aislamientos no presentaron toxicidad para larvas de mosquitos del género Culex.

De tal forma que el taxón correspondiente a Bacillus sphaericus es un grupo complejo asociado a diferentes hábitat con características fisiológicas y moleculares fundamentalmente heterogéneas que lo colocan como el taxón modelo de estudio del genero Bacillus en diferentes ecosistemas y particularmente en asociación con el género Quercus.

2

I REVISION LITERATURA

Bacillus generalidades y contexto de organismo modelo

En 1872, Ferdinand Cohn, un estudiante de Robert Koch, describió y dio el nombre a la bacteria Bacillus subtilis. Este microorganismo es considerado la bacteria modelo del género grande y diverso, Bacillus, género que se encuentra clasificado en la familia Bacillaceae. La característica distintiva de esta familia es la producción de endosporas, las cuales son cuerpos altamente refráctiles formados en las células vegetativas como proceso de diferenciación celular. Desde la descripción de Cohn, todos los miembros del género Bacillus han sido caracterizados como bacilos Gram- positivos, aeróbicos o facultativos y formadores de endosporas (Bowditch Ron .D., 2001, Gordon, R. E et al 1973).

La ubicuidad de las especies en la naturaleza, la inusual resistencia de sus endosporas a agentes químicos y físicos, el desarrollo del ciclo de formación de endosporas, la producción de antibióticos, la toxicidad de las esporas y del cristal paraesporal para varios insectos, y la patogenicidad de ciertas especies como Bacillus anthracis, han despertado desde los tiempos de Koch el interés por este genero. (Cano, R. J. et al 1995).

Hay una gran diversidad fisiológica entre los miembros del género, dado que características colectivas que incluyen degradación de casi todos los sustratos derivados de plantas y animales , como la celulosa, almidón, pectina, proteínas, agar, hidrocarburos; producción de antibióticos; nitrificación; desnitrificación; fijación de nitrógeno; litotrofia facultativa; autotrofía; acidofilia; alcalifilia; sicrofilia; termofilia; y parasitismo (Boivin Boivin-Jahns V et al 1995).

3

La formación de esporas universalmente encontrada en este género, es considerada una estrategia de sobreviviencia en diferentes ecosistemas donde la bacteria predomina. La distribución y volatilización de las esporas en estado dormante probablemente explican la ocurrencia de las especies de Bacillus aerial en la mayoría de los hábitat examinados (Donovan, W. 1987, Gest, H. et al. 1987)

Clasificación y Filogenia

Los intentos por clasificar las especies de Bacillus se basaron en un principio en dos características: crecimiento aeróbico y formación de endosporas. El resultado reunió varias bacterias con diferentes características fisiológicas y diferentes habitats en un mismo grupo (Priest F.G., et al 1988). Por consiguiente la heterogeneidad fisiológica, ecológica y genética ha dificultado la categorización del género Bacillus así como la generalización del mismo.

En el Manual de Clasificación Sistemática de Bacterias Bergey's (1nd ed. 1986), el contenido G+C de las especies conocidas de Bacillus se encuentra en un rango entre el 32 al 69%. Esta observación, realizada por técnicas de hibridización, reveló la heterogeneidad genética del género. No solamente esta variación fue encontrada de especie a especie, sino también diferencias marcadas en el contenido G+C entre cepas de la misma especie. Por ejemplo, el contenido G+C del grupo de B. megaterium se encuentra en un rango del 36 al 45%. (Claus D. et al. 1986, Riva O.N. et al 2001)

En el Manual de Clasificación Sistemática de Bacterias Bergey's (2nd ed. 2001), basado en clasificación filogenética determinó que la organización de este género en dos tipos de grupos predominantes de las bacterias formadoras de endosporas, clostridia y

4

bacilli, en dos diferentes "clases" de Gram-positivos, "clostridia" y "bacilli". "Clostridia" incluye el Orden Clostridiales and Familia Clostridiaceae con 11 géneros incluyendo a, Clostridium. "Bacilli" incluye el Orden Bacillales y la Familia Bacillaceae. En esta familia hay varios nuevos géneros en el nivel con los Bacillus. Esto explica la heterogeneidad en el contenido G+C observado en 1986 en el "genus" Bacillus. (Claus D. et al 2001)

El acercamiento filogenético a la taxonomía de Bacillus ha sido acompañado por extensos análisis de las moléculas 16S rRNA. Esta técnica además de revelar relaciones filogenéticas ente las diferentes especies de Bacillus, sorprendentemente mostró un parentesco con ciertas especies de bacilos no formadoras de esporas como son los géneros Planococcus, Lactobacillus y Staphylococcus (Woese .C 1978., Ursing, J. B et al 1995).

En estos primeros estudios, el análisis por secuenciación de oligonucleotidos de 16S rRNA categóricamente mostró que B. subtilis y otras especies de formadores de esporas elipsoidales, como B. cereus, B. megaterium, and B. pumilus, formaban un cluster coherente, pero especies formadoras de endosporas redondas como, B. sphaericus, B. globisporus y B. aminovorans, no entraban en ese cluster

En otros estudios de secuenciación de 16S rRNA, tres grupos de cluster taxonómicos mayores de Bacillus fueron definidos determinando la secuencia parcial o completa de 16S RNA (mas de 1,100 nucleótidos secuenciados) en 35 cepas reconocidas de referencia. Estos tres grupos de cluster fueron marcadamente diferentes a los reportados previamente.

5

Los análisis comparativos de la secuencia del operon rrnB ribosomal de E.coli y B.subtilis ha mostrado una similiaridad mayor al 70%, sin embargo se han demostrado características diferenciales como la perdida de sitios de restricción de la enzimas BalI , BglI , BglII , HaeI , MstI , NaeI , Ncoi , SalI y XbaI. Un sitio único para BamHI y Hind III en el 23 rRNA y para SphI y PstI en el gen 16S rRNA (Brosiur.G., et al 1978, Green.C.J. 1985).

Las secuencias determinadas también demuestran por estructuras hipotéticas de estructura secundaria codificantes para tRNA al final del policistrónico, contrario a lo reportado en E.coli codificación para tRNA en el espacio intercistronico de 16S y 23S

Bacillus sphaericus este taxón incluye aislamientos patógenos para varias especies de larvas de mosquitos así como aislamientos saprofititos que tiene la característica de no usar glucosa como fuente de carbón para su crecimiento Ha sido aislado de diferentes tipos de suelo, de aguas ( marina y dulce) y sedimentos polucionados (Cokmus C, et al .1993, Mercan. N et al 2003).

Las primeras cepas patógenas para mosquitos fueron reportadas en 1965 (Kellen et al., 1965, Myers P, et al 1978, Stahly, D. P et al 1992). Desde entonces un número elevado de aislamientos han sido descritos pero no relacionadas con su potencial entomopatógeno (Rippere, K. E et al 2000 , 1997) Por lo tanto ha sido una necesidad de diferenciar entre las diferentes cepas Consecuentemente diferentes métodos se han desarrollados para la clasificación Los primeros fueron basados en características morfológicas y bioquímicas, Un avance en la clasificación e identificación lo dio Yousten (Yousten et al., 1984, 1980) desarrollando una combinación de bacteriófagos y usando antigenos para la serotipificación de las cepas (Thanabalu, T. et al .1996).

6

Posteriormente los diferentes aislamiento fueron diferenciados por técnicas que incluyeron homologia de DNA-DNA (Krych et al., 1980, Stackebrandt E et al 1994, 1987), análisis de ácidos grasos y actividad bacteriocina (Cokmus et al 1993, Priest. F.G. et al 1994).

En el estudio de Krych , las especies fueron ubicadas en al menos cinco grupos distintos de homologia cada uno lo suficientemente separado para ser considerado un taxón independiente .Todos los aislamientos patógenos pertenecen al grupo IIA, sin embargo se han encontrado aislamientos no patógenos cuya estabilidad de asociación DNA-DNA se comparten con el grupo IIA (Alexander. et al 1990., Jahnz, U et al 1996., Johnson, J. L. 1994, 1973)

Las cepas representantes de cada grupo han sido examinadas también por análisis del polimorfismos de los fragmentos de restricción del gene rRNA confirmando que B.sphaericus es un grupo complejo distinguible en grupos (Aquino de Muro M et al.1992a; Aquino de Muro et al 1992b) .Posteriores análisis empleando la técnica de RAPDs para polimorfismos azarosos han distinguido claramente grupos de patógenos y no patógenos ( Miteva V, et al 1998, Woodburn, M. A et al 1995).

No obstante lo anterior no han sido separados los cinco grupos a status de especie cada uno. El grupo IIA se ha dividido en dos subgrupos en base al nivel de similaridad del hereroduplex y de la estabilidad de los mismos. Por lo tanto ha sido interesante determinar que todos los aislamientos patógenos pertenecientes al grupo IIA es toxico para larvas de mosquitos. Por el contrario los aislamientos no patógenos fueron encontrados de pertenecer a cualquier grupo de homologia sin una particularidad. Las bacterias son patógenas porque producen una o mas toxinas .La toxina binaria es característica de las cepas altamente patógenas (Dussán.G.J, et al 2002, Nakamura L.K. 2000).

7

Un método para diferenciar bacterias del género Bacillus a nivel de diferenciación de cepas de la misma especie es la técnica conocida como random amplified polymorphic DNA (RAPD) ( Aquino de Muro M et al .1994).

El uso de genoma total como templado y oligonucleotidos arbitrarios cortos (10 pares de bases) determina polimorfismos entre las cepas como resultado de la adición o perdida del sitio de unión del oligonucleotido y por lo tanto la falta de presencia o ausencia de una banda particular. El patrón de bandeo produce una huella que comparada con otras cepas, cada banda es considerada una caracteriza de la cepa (Dussán et al 1997, Lozano et al 2000)

La técnica del RAPD ha sido usada extensivamente para distinguir bacterias, hongo, plantas, y animales y ha resultado ser una técnica mas sensible que la tipificación de proteínas enzimáticas multilocus En algunos casos los RAPD se han correlacionado con los análisis de enzimas de restricción de la subunidad pequeña que codifica para el rRNA (Genilloud et al 1994)

El RAPD se ha usado para la diferenciación de aislamientos clínicos de Streptococcus uberis, Klebsiella pneumoniae y Escherichia coli de vacas con mastitis clínica . En control biológico se ha aplicado para diferenciar cepas patógenas y no patógenas de Bacillus sphaericus y para distinguir las cepas comerciales de Bacillus thuringiensis y diferenciarlas de cepas filogenéticamente cercanas y comprometidas en contaminación de alimentos y enfermedades humanas, como Bacillus cereus y Bacillus anthracis.

También el RAPD ha sido una alternativa para obtener polimorfismos cuando la utilización de RFLP no produce patrones diferenciales (Yousten. A.A 1984a ). Se han podido crear grupos de patogenicidad en bacterias fitopatógenas, analizando los

8

patrones de bandeo obtenidos por RAPD , así como diferenciar cepas de bacilos esporo formadores imposibles de distinguir por análisis bioquímico, de fagotipificación o de ácidos grasos (Yousten. A.A 1994b).

Los análisis filogenéticos han demostrado variabilidades en la secuencia 16S y 23S del gen rRNA, así como regiones espaciadoras entre 16S y 23S. Los trabajos de Nakamura revelaron la agrupación del género Bacillus y organismos relacionados en más de siete grupos de homologia (Nakamura L.K. 2000.; Xu D. et al .2003., Yousten. A.A, 1997).

Pared celular y proteínas de la capa –S

La variabilidad de la estructura de la pared celular que comúnmente se presenta en la mayoría de bacterias Gram-positivas no ocurre en el género Bacillus. La pared celular de la célula vegetativa de casi todas las especies de Bacillus esta constituida de peptidoglicano que contiene acido meso-diaminopimélico (DAP). Las excepciones son B. sphaericus y especies relacionadas, como B. pasteurii y B. globisporus, que presentan lisina en vez de DAP (Guinand M. et al 1979. Popham D. L.2002.).

Esta es la típica estructura de pared universal de las bacterias Gram-negativa, i.e., contienen DAP como diamino acido. En algunos casos, DAP es ligado directamente a la D-alanine, como en las Enterobacteriaceae; en otros casos, dos cadenas de tetrapeptidos de peptidoglicano son unidos por un puente anclador interpeptídico entre DAP y D-alanina, el cual es característico de la mayoría de bacterias Gram-positivas (MJ Vacheron et al. 1999).

9

En muchos especies de Bacillus, el puente interpeptídico que conecta la D-alanine al meso-diaminopimelic acid (DAP) esta ausente. El peptidoglicano de B. sphaericus y B. pasteurii contiene L-lisina en lugar de DAP, pero todas las esporas de estas especies de Bacillus tienen el mismo tipo de subunidades de acido murámico en la corteza de la espora (Farrow J.E, et al 1994, Linnett P E et al. 1976. Massie J et al 1985).

Típico de la mayoría de especies de Gram-positivos, la superficie de Bacillus es compleja y esta asociada con propiedades de adherencia, resistencia y respuesta quimio táctica. La superficie de la célula es una estructura laminar que consiste de una capsula, una capa superficial protéica (S-layer), varias capas de peptidoglicano y proteínas de la superficie externa de la membrana citoplasmática (Bowditch Ron D et al 2005; Ilk, N., et al 2002, 1999., Mercan N et al. 2004).

Capas superficiales cristalinas o subunidades glicoprotéicas, denominadas S-layers, son encontradas en miembros del género Bacillus. Como se ha determinado en otras proteínas de la capa S, su función es desconocida .Sin embargo, se ha demostrado que las S-layers pueden físicamente enmascarar la carga negativa del peptidoglicano y evitar la auto aglutinación en B. stearothermophilus, además se ha propuesto que esta capa juega algún papel en la interacción de la bacteria con metales como uranio (Beveridge, T. J et al 1997, Egelseer, E., et al 2001, 1994., Pollmann , K et al 2005).

Proteínas especificas como las toxinas binarias presentes en los aislamientos patógenos y típicas de formación de flagelos , son algunas que se han usado en determinaciones por electroforesis de proteínas en sistemática microbial principalmente como una técnica sensible para la separación y comparación de proteínas celulares de cepas que pertenecen a una misma especie o subespecie (Cokmus. C. et al 1994, Liu, J et al 1996).

10

Ecofisiología de Bacillus

Las especies de Bacillus son cosmopolita y en su mayoría, saprofitas; están ampliamente distribuidas en el suelo y se han aislado especies capaces de crecer en condiciones extremas de temperatura, pH o salinidad, que inhibirían a la mayoría de organismos. Además, poseen esporas que les permite sobrevivir a condiciones adversas para su crecimiento (Driks, A. 1999, Francis, C. A., 2001, 2000, 1999).

Los bacilos poseen un rango amplio de características fisiológicas, como producción de antibióticos y de enzimas hidrolíticas que les permiten degradar proteínas, péptidos, aminoácidos, lípidos y polisacáridos como celulosa y lignina. Participan en el ciclo del nitrógeno en procesos de nitrificación, desnitrificación y fijación de este (Hem, J. D. 1978).

Han sido ampliamente utilizados en control biológico de insectos: algunas cepas de B. thuringiensis (para lepidópteros, moscas negras, mosquitos y coleópteros), B. sphaericus (para mosquitos) y B. popilliae (para coleópteros) (Lacey L .A. et al 1986. Porter, A 1993. Stahly, D. P et al 1992b). Los bacilos también se han reportado y usado exitosamente como promotores de crecimiento en plantas (Brian B. et al in press, Da Silva, J. J.et al 1991. Klein, M. G. 1988).

Debido a la resistencia de las esporas en ambientes bajo condiciones de stress como sobrevivencia por tiempos prolongados en otro tipo de condiciones adversas, la mayoría de las especies del género Bacillus son ubicuas y pueden ser aisladas de una amplia variedad de fuentes (Nicholson, W. L et al 2000, Nieto, J. J et al 1989).

11

La prevalencia de las bacterias espoformados en ciertos hábitat no necesariamente es indicador de su hábitat, sin embargo es generalmente aceptado que los habitantes primarios de los suelos son los bacilos formadores de endosporas aerobios, lo que comúnmente el gran microbiólogo ruso Winogradsky considero con el termino "flora " del suelo (Clement B.G.1998, Nealson, K. H et al 1980, Potts, M. 1994)

En el ambiente suelo las bacterias se encuentran metabolicámente activas cuando hay una disponibilidad de sustratos y teóricamente forman esporas cuando los nutrientes bajan. Esta estrategia es usada por otros microorganismos que incluyen los hongos filamentosos y los actinomicetes que son predominantes en un hábitat aerobio.

Esto puede ser un ejemplo de convergencia evolutiva para estos grupos de microorganismos que viven en el suelo, forman esporas y producen antibióticos (Vreeland, R. H et al 2000) Además muchas de las especies de Bacillus pueden efectivamente degradar una serie de biopolímeros (proteínas, almidón, pectina, etc.), ello se asume de tener un papel significativo en los ciclos geobiológicos del carbono y nitrógeno (De Vrind, J. P et al .1998, 1986).

Cohn demostró la resistencia al calor de las endosporas en B. subtilis, y Koch describió el desarrollo del ciclo de esporulación en B. anthracis. Endosporas derivan su nombre porque son formadas intracelularmente, no obstante, ellas son liberadas de la célula madre o esporangio como esporas libres. Las endosporas es la estructura más duradera encontrada en la naturaleza por su característico estado criptobiotico en la fase de dormancia, lleva a que permanezca por tiempos prolongados o millones de años en la naturaleza (Chin, K. J 1999, van Waasbergen, L et al 1996).

12

Ni las características morfológicas ni los criterios moleculares han permitido adecuadamente distinguir los miembros del género Bacillus. Una forma artificial pero conveniente para organizar los miembros de este género es localizarlo en grupos ecofisiologicos como son: fijadores de nitrógeno, denitrificantes, patógenos de insectos, patógenos de animales, termofilos, productores de antibióticos entre otros. Esta agrupación permite especular acerca de la historia natural y la ecología de este importante grupo de bacterias (Caspi. A.G 1997, Dong YH et al 2002, Felske, A., A et al 1998, Gurtner, C et al 2000).

13

CAPITULO II

II. MATERIALES Y METODOS

Localización de sitios de muestreo y cepas de estudio

Las cepas objeto de este trabajo se obtuvieron de la colección del Centro de Investigaciones Microbiológicas, CIMIC, Universidad de los Andes, evaluadas en anteriores estudios (Andrade et al 1996, Dussán et al 1997, Lozano et al 2002) por su carácter patógeno para mosquitos y como grupo indicador en bosques nativos de Quercus humboldtii ubicado en el Parque Reserva Natural Chicaque vía SAN ANTONIO DE TEQUENDAMA (N 4°36´ W 74°15´), municipio de Cundinamarca, Colombia, (Fig. 1).

Adicionalmente se seleccionaron tres sitios para nuevos aislamientos: Un bosque de Quercus humboldtii en el bosque Natural Las Mercedes vía La MESA (N 4°36´ W 74°26´) , municipio de Cundinamarca , Colombia (Fig. 1 , 3) y dos bosques de Quercus robur Linneo en la localidad de Tres Cantos (N 40°36´ W3°42´) y de Canto Blanco (N 40°32´ W4°42´) al Norte de la Comunidad de Madrid, España ( Fig. 2 , 3 ) . Todas las cepas se relacionan en la Tabla 1

14

1a 1b

Fig. 1. 1a: Mapa de Colombia. 1b: Localización del Parque Natural Chicaque (N4°36´ W 74°15´) y Parque las Mercedes (N4°36´ W 74°26´) vía la Mesa, Cundinamarca, Colombia

2a 2b

Fig. 2. 2a: Mapa de España. 2b: Localización de Bosque de Quercus robur Linneo en la localidad de Tres Cantos (N 40°36´ W3°42´) y Canto Blanco (N 40°36´ W4°42´). Norte Madrid, España

15

3a

3b

Fig. 3. 3a: Quercus humboldtii (Colombia). 3b: Quercus robur Linneo (España)

16

Idenificacion Lugar Características Genbank

Bs1-I B.s grupo homologia I (biótipo I) Kryac et al Bs 2a-IIA B.s grupo homologia IIA - (biótipo IIA) Kellen et al Bs 3a-IIA B.s grupo homologia IIA - (biótipo IIA) Kellen et al Bs 4a-IIB B.s grupo homologia IIB - (biotipo IIB) Kryac et al Bs 11b-III B.s grupo homologia III - (biotipo III) Kryac et al Bs 6a-IV B.s grupo homologia IV - (biotipo IV) Kryac et al Bs 10a-V B.s grupo homologia V - (biotipo V) Kryac et al Bs 10aa Bacillus globisporus outgroup Andrade et al DQ860141 Bs 12- 17a Chiza Sabana Bogotá Andrade et al DQ860130 Bs 15-15a Chiza Sabana Bogotá Andrade et al DQ860129 Bs 17-17b Tierra Sabana Bogotá Dussán et al DG860131 Bs 19-2b Tierra Valle , Choco Dussán et al DQ860113 Bs 9-4b Tierra Valle , Choco Dussán et al DQ860119 Bs 14- 13a Tierra Sabana Bogotá Dussán et al DQ860127 Bs 20-3b Tierra Sabana Bogotá Dussán et al DQ860116 Bs 21-21a Chiza Sabana Bogotá Dussán et al DQ860132 Bs 13-13b Tierra Sabana Bogotá Dussán et al DQ860128 Bs 18-10b Rizosfera Q. humboldtii Chicaque Lozano et al DQ860125 Bs 10-10a Rizosfera Q. humboldtii Chicaque Lozano et al DQ860124 Bs 11-11a Rizosfera Q. humboldtii Chicaque Lozano et al DQ860126 Bs 16-29a Rizosfera Q. humboldtii Chicaque Lozano et al DQ860143 Bs 22-22a Rizosfera Q. humboldtii Chicaque Lozano et al DQ860133 Bs 23-22b Rizosfera Q. humboldtii Chicaque Lozano et al DQ860134 Bs 24-24a Rizosfera Q. humboldtii Chicaque Lozano et al DQ860135 Bs 25-257a Rizosfera Q. humboldtii Mercedes En este estudio DQ860144 Bs 26-27a Rizosfera Q. humboldtii Mercedes En este estudio DQ860136 Bs 27-27b Rizosfera Q. humboldtii Mercedes En este estudio DQ860137 Bs 28-28a Rizosfera Q. humboldtii Mercedes En este estudio DQ860142 Bs 29-29b Rizosfera Q. humboldtii Mercedes En este estudio DQ860138 Bs 30-30b Rizosfera Q. humboldtii Mercedes En este estudio DQ860139 Bs 2E-2ea Rizosfera Q. robur Linneo Tres Cantos En este estudio DQ860114 Bs 3E-3ea Rizosfera Q. robur Linneo Tres Cantos En este estudio DQ860117 Bs 4E-4ea Rizosfera Q. robur Linneo Tres Cantos En este estudio DQ860120 Bs 5E-5eb Rizosfera Q. robur Linneo Tres Cantos En este estudio DQ860123 Bs 8Eg-2eb Rizosfera Q. robur Linneo Tres Cantos En este estudio DQ860115 Bs 8Ep-3eb Rizosfera Q. robur Linneo Canto Blanco En este estudio DQ860118 Bs 10E-4eb Rizosfera Q. robur Linneo Canto Blanco En este estudio DQ860121 Bs 11E-5ea Rizosfera Q. robur Linneo Canto Blanco En este estudio DQ860122 Bs14E-30a Rizosfera Q. robur Linneo Canto Blanco En este estudio DQ860140

Table 1. Aislamientos de Bacillus sphaericus analizados en este estudio y grupos Referencia

17

Aislamiento de bacterias y análisis agrológico de suelo

Cuadrantes de 10 X 10 m y subcuadrantes de 1 X 1 m fueron demarcados para el muestreo en los bosques de Las Mercedes (La Mesa, Colombia), Tres Cantos y Canto Blanco (Madrid, España). Muestras de 500 grs. tomadas a una profundidad de 30 cm. alrededor de la rizosfera de cada uno de los 20 árboles seleccionados en cada sitio fueron depositadas en bolsas y refrigeradas por 4 h.

Se homogenizó y se mezcló 50g de cada suelo con 50 mL de agua destilada estéril, se agitó a 150 r.p.m por 30 min. y decantó igualmente por 30 minutos. 10 mL del sobrenadante fueron llevados a choque térmico ( 90°C X 20´) y diluciones seriadas fueron preparadas para siembras en superficie en Agar nutritivo e incubadas a 30°C por 48 h. El material restante fue utilizado para la determinación agrológica del suelo.

Los aislamientos seleccionados por observación macroscópica, microscópica y por un análisis discriminatorio de formación de espora terminal deformante de esporangio y bioquímicas selectivas para género y especie. fueron conservados a -80°C (Rosson, R. A.et al 1982.) .

El análisis agrológico del suelo se baso en características de concentración de iones bivalentes de Ca, Mn, Fe, determinación de pH y capacidad de intercambio cationico – CEC (tabla 2).

18

Análisis Parque Parque Las Bosque Tres Bosque Canto Chicaque Mercedes Cantos Blanco pH 5.5 5.2 5.0 5.3 Textura Franco arenoso Franco arenoso Arenoso Arenoso % carbono 14,79 10,05 13,92 15,42 % nitrógeno 1,34 1,07 1,20 1,34 Calcio (ppm) 642 604 825 747 Manganeso(ppm) 124 146 148 129 Potasio (ppm) 220 193 210 242 Fósforo ( ppm) 5.5 5.6 6.0 5.0 CEC 66,07 62,23 62,00 65,04 %saturación Ca 70,5 67,7 89,8 81,2 %saturación Mn 35,8 43,9 44,2 38,6 Relación Ca/Mn 5,17 4,38 5,57 5,79

Tabla 2. Análisis agrológico de rizosfera de Quercus humboldtii y Quercus robur Linneo

19

Sincronización de cultivos: célula vegetativa y espora

Un total de 39 morfotipos agrupados como Bacillus sphaericus fueron sincronizados por rondas de temperatura selectiva para célula vegetativa y estados de esporulación en medio agar-suelo y caldo-suelo De un cultivo crecido ON en placa se seleccionó una colonia y se resuspendió en caldo LB , dejando crecer 15 h a 30°C. Erlermeyer con medio base suelo (suelo estéril 1%) fueron inoculados con 1% del cultivo anterior, este se incubó a 30°C durante 72 h. Se repitió cinco veces el mismo procedimiento y se determinó la formación de esporas por 99% de refringencia de los cultivos. Se indujo la germinación por choque térmico a 90°C por 20´ (Fig. 4)

4a 4b 4c

Fig. 4. (a) Bacillus sphaericus, microscopia de luz. (b) Estado IV de esporulación . (c) Espora madura , microscopia electrónica

20

Preparación de peptidoglicano de célula vegetativa.

Cultivos celulares vegetativos fueron herviendo durante 15 min. y centrifugados a 14.000 rpm durante 8 min. a 4°C. Se resuspendió el pellet por adición de SDS al 5% caliente (w/v) y otra vez hervido por 25 min. El material insoluble fue recuperado por centrifugación (14.000 rpm, 8 min., 20°C), resuspendido en SDS al 4% (w/v) y hervido otra vez por 15 min. La preparación de peptidoglicano insoluble fue lavado varias veces con agua destilada caliente (60°C) hasta obtener la solución libre de SDS. Las proteínas asociadas fueron retiradas con pronasa (2mg/mL) incubando a 60°C por 1h. La pared celular obtenida se centrifugó (14.000 rpm, 8 min., 20°C) y se lavó una vez mas con agua destilada caliente, el pellet celular se resuspendió en acido tricloacético (400 µl de una solución 5% v/v) de tal forma que la mezcla fue incubada a 2°C por 24 h. El material insoluble fue centrifugado (14.000 rpm, 8 min., 4°C) y lavado varias veces y resuspendido en buffer Tris-HCL (50mM pH 7). Finalmente fue lavado varias veces con agua destilada fría hasta obtener una solución pH neutro. El material fue conservado a -20°C (Abdelmadjid. A et al. 1999)

Preparación de peptidoglicano asociado a esporas maduras.

Cultivos esporulados (99% refringencia) fueron centrifugados (14.000 rpm, 8 min., 4°C) y el pellet celular de esporas obtenido fue secado ON a 37°C. 800 mg del material secado se resuspendieron en buffer Tris-HCL-dithiotreitol (50mM pH 8.0, SDS 4%, EDTA 2mM, dithiotreitol 30mM) y hervidos durante 16 min. . La mezcla se dejo reposar a 37°C por 40 min.

21

La preparación insoluble fue lavado varias veces con agua destilada caliente (60°C) hasta obtener la solución libre de SDS. Las proteínas asociadas fueron retiradas con pronasa (2mg/ml) incubando a 60°C por 1h y 30 min. La pared celular obtenida se centrifugo (14.000 rpm, 8 min., 20°C) y resuspendido en buffer Tris-HCL-SDS ( Tris 50mM pH 7, SDS 4%, EDTA 2mM) y se calentó de nuevo la mezcla a 100°C por 16 min.

Se repitió varios lavados y centrifugados en agua caliente hasta obtener solución libre de SDS. Finalmente se lavó varias veces con agua destilada fría hasta obtener una solución de pH neutro. El material fue conservado a -20°C (Abdelmadjid A et al 1996)

Hidrólisis enzimática del Peptidoglicano y separación por RP-HPLC de los muropeptidos solubles.

Las muestras que contenían los muropeptidios solubles conservadas a -20°C fueron digeridas con 250 µg de Cellusyl en buffer fosfato de sodio pH 5.6 por 15 horas . La reacción fue detenida calentando la mezcla ( 100°C , 3 min.). Los muropeptidos solubles fueron reducidos con Borohidruro de Sodio al 10% ( 0.5 M ,pH 8.0) concentración final 1.7 mg en la muestra . La reacción fue detenida después de 15 min. bajando el pH 3.0 con acido fosfórico al 10%. Todas las muestras fueron filtradas por millipore 0.45 µ para retirar el material insoluble y conservadas a – 20°C hasta su uso.

Los muropeptidos reducidos fueron separados por HPLC de fase reversa empleado una columna de Hipersil octadecilsilane (Sigma) Los buffer de elusión fueron:

22

Buffers A : 40 mM fosfato de sódio ( pH 4.25 a 20°C) , Buffers B : 40 mM fosfato de sódio ( pH 4.21 a 20°C) – 20% ( v/v) metanol. La columna fue equilibrada con buffer A (0.60 ml min.-1) a 40°C. Las muestras que contenían los muropeptidos (50 µL) fueron corridos en un gradiente lineal 0 a 100 de buffer B durante 180 min. Los compuestos eluidos fueron monitoreados a A 202 (Abdelmadjid A et al 1998)

Extracción de proteínas totales: fase logarítmica y estacionaria.

1% de Cultivos ON (30°C) de las cepas de estudio crecidas en medio LB, se inoculó en erlermeyers con 100 ml de medio LB. Se continuo el crecimiento 3h en las mismas condiciones hasta alcanzar una absorbancia de 0.6 – 0.8 (fase logarítmica) y de 1.0 (fase estacionaria). Luego 1% de los cultivos crecidos hasta fase estacionaria fue transferido a 100 ml de medio inductor de esporulación. Se incubó por 5 días a 30°C o hasta observar un 99% de refringencia. Todos los cultivos se centrifugaron a 14.000 r.p.m a 20ºC por 10 min y se conservó el pellet celular a – 20°C en buffer de conservación de proteínas (Kämpfer P. 1995)

Extracción de fracciones: membrana, citoplasma y periplasma.

Se sembraron cultivos ON de la cepas de estudio en 30 ml de LB, se centrifugó (14.000 r.p.m. 20ºC .15min) y el botón celular se resuspendió en 1 mL de solución de Tris- Sacarosa, adicionando 10 µL de EDTA pH 8,0 0,5M, 100 µL de lisozima de una solución fresca de 2,5 mg/ml y se dejo en hielo por 1 hora. Transcurrido este tiempo se adicionó 20 µL de CaCl2 de una solución stock 1 M, 20 µL de NaCl de una solución stock de 5 M y se centrifugó a 12.000 r.p.m por 20 minutos a 4ºC.

23

El sobrenadante se transfirió a otro eppendorf y se marcó como fracción periplasmática (P), a este se le adicionaron inhibidores de proteasas (leupeptina a 0.5 g/mL, phenyl- methyl-sulfonil-fluoride (PMSF) a 170 µg/mL), agentes reductores (dithiothreitol (DTT) a 1mM), glicerol al 10% y se conservó a -20°C.

El pellet se resuspendió en 0,5 mL de la solución A (30mM Tris HCl pH 8.0, 5 mM

MgCl2) y se centrifugó a 12.000 r.p.m por 20 minutos a 4ºC. Se recuperó el sobrenadante y se marco como fracción citoplasmática (C), a este se le adicionaron inhibidores de proteasas y agentes reductores como se describe anteriormente, glicerol (al 10%) y se conservó a -20°C.

El pellet resultante se resuspendió en 50 µL de la solución B (30mM Tris HCl pH 8.0, 1mM EDTA pH 8.0) y se marcó como fracción de membrana (M), adicionándole inhibidores de proteasas y agentes reductores como se describe arriba, Tritón 100X (concentración final de 1.5%), KCl (concentración final de 0.15M), glicerol (concentración final 10%) y se conservó a -20°C.

Electroforesis de proteínas en SDS – PAGE.

. A 20 µL de cada muestra ( extractos totales y fracciones celulares) se adicionó 10 µL de buffer de corrida (Laemmli UK. 1970). Todas las muestras fueron sometidas a denaturalización por calentamiento a 94°C por 5 min y separadas en geles de poliacrilamida- Dodecil sulfato de Sodio (SDS – PAGE) al 10 % (110 voltios.1h. 45min) con buffers Tris-Glicina .El marcador de peso molecular empleado fosforilasaB 97,400; Albúmina sérica 66,200; Ovoalbumina 45,000; Anhidrasa carbónica 31,000, inhibidor de tripsina 21,500; Lisozima 14,400. Los geles se tiñeron con Azul de Coomasie (15 min.) en agitación y se decoloraron con acido acético al 10 % por 24h ( Çökmüş C. et al 1994).

24

Electroblot y Secuencia N-Terminal de Proteína Capa – S y Toxina de 41 KDa

Las proteínas corridas en gel de poliacrilamida al 10% fueron transferidas a una membrana de PVDF. La transferencia se realizó en sistema semiseco a 250 mA por 1h. Posteriormente, la membrana fue revelada con Rojo Congo para visualizar el marcador de peso molecular y las proteína de alrededor de 100kDa y 30 KDa que se determinó en los extractos en fase estacionaria como en fracciones de membrana y la proteína de 41 KDa en los cultivos esporulados de los aislamientos patógenos. Las proteínas fueron secuenciadas en su N-terminal en el Laboratorio de Secuencia de proteínas del Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Universidad Autónoma de Madrid, España La identidad de la proteina fue analizada por el programa Fast 3.t. European Bioinformatics Institute

Preparación de DNA total

Células crecidas en 100 mL de caldo LB fueron resuspendidas en 10 mL de buffer E ( Tris-HCL pH 8.0 -1 mM EDTA) con 1 mg/ ml de lisozima (sigma) e incubada a 37°C hasta que la solución se torno viscosa. Luego 0.5 mL de una solución de SDS al 10% (w/v) y 1.0 mg de proteinasa K (sigma) fueron adicionada y la mezcla fue incubada por 3h a 50°C. 10 mL de una solución fenol-cloroformo-iso-amil-alcohol (25:24:1) se adicionó, se mezcló y centrifugó. La fase acuosa fue transferida a un tubo y se adicionó isopropanol frío dos veces el volumen original. El DNA total concentrado y secado fue resuspendido en agua milliQ estéril y conservado a – 20°C.

25

RAPDs

Oligonucleotidos obtenidos de Isogen Bioscience BV fueron resuspendidos en agua milliQ estéril a una concentración de 0.1 ug/ul. Un total de 37 oligonucleotidos fueron probados y 3 escogidos por la reproducibilidad de patrones de bandeo en tres repeticiones AD-11 (CAATCGGGTC), AA-15 (ACGGAAGCCC) y AF- 17(AACCCGGGAA). Los siguiente reactivos fueron adicionados a cada uno de 25 µL de reacción: 5 µL de buffer 10X, dNTPs a 100 µM, 3 mM de MgCl2, 1.25 µM de cada oligonucleotido, 1.5 µL Taq polimerasa, 20 ng de DNA templado y se completó a 25 µL con agua milliQ estéril.

Las condiciones de la amplificación fueron las siguiente: 94°C por 10 min., 65 ciclos de 94°C por 1 min, 36°C por 1 min, 72°C por 2 min. y una extensión final de 72°C por 10 min. Los productos de PCR fueron corridos en gel de agarosa al 1.5% en buffer TAE 1X con bromuro de etidio (0.5 µg/ µL). Los geles fueron analizados en sistema de documentación ChemiDoc.

Amplificación del gen 16S rRNA y secuenciación.

La amplificación del gen 16s rRNA fue realizada en 25 µL de reacción que contenían 100 ng de DNA, 10 µL de 10X de buffer, 200 µL de cada dNTPs , 1 µL de cada oligonucleotido y 5 unidades de Taq polimerasa de Boeheringer. Los oligonucleotidos de amplificación fueron 5´ GAGTTTGATCCTGGCTCAG (E.coli posición 9 -27) y 5´ AGAAAGGAGGTGATCCAGCC 3´ (Posición 1525 -1544).

26

Las condiciones de amplificación de PCR incluyeron un paso de denaturación inicial a 94°C por 10 min. seguido por 30 ciclos de 94°C por 1 min., 58°C por 2.5 min. luego 72°C por 2.0 min. y una extensión final de 72°C por 10 min. . Los fragmentos amplificados fueron purificados por electroforesis en agarosa al 0.8% y la secuencia del DNA obtenido con el oligonucleotido interno 5´TACGGCTACCTTGTTACGACT3´ (posición 1109 a 1130 )

RFLPs.

Las enzimas de restricción EcoR1, Ddel1 y Pst 1 fueron usados en un reacción de 20 µl. Cada enzima fue trabajada con el buffer recomendado por la casa manufacturera, 3U de la enzima y aproximadamente 200 ng del producto de PCR se incubaron a la temperatura optima durante 4h.

Los fragmentos de restricción fueron revelados por electroforesis en agarosa al 1% en buffer TAE 1X (110 V 75 mA) .Para la coloración, el gel fue colocado en una solución de bromuro de etidio (0.5ug/ml) durante 20 min. Los geles fueron visualizados y la imagen analizada en un sistema de documentación Chemi doc

Agrupamiento taxonómico fenotípico: Fenogramas

Las bandas del perfil de proteínas se transformaron en un perfil utilizando el programa TINA 2.3 (Esen, A.A. 1978). Posteriormente este perfil así como los picos obtenidos en los cromatogramas de muropeptidos del peptidoglicano analizado, se transformaron a datos binarios (1/0) con el fin de realizar una matriz, la cual se analizó por el coeficiente de similitud de Sokal y el método de agrupación de características entre parejas con promedios aritméticos (UPGMA), utilizando el programa SYN-TAX-pc 2000. (Rohlf, F. J. 1994).

27

Agrupamiento taxonómico genotípico: Dendogramas

Con los productos de amplificación obtenidos con cada uno de los oligonucleotidos evaluados, se realizó una matriz indicando presencia o ausencia de las bandas para cada una de las cepas (1/0), la cual se analizó por el coeficiente de similitud de Jaccard y el método de agrupación de características entre parejas con promedios aritméticos (UPGMA), utilizando el programa SYN-TAX-pc 2000.

Análisis filogenético.

Las secuencias del gen 16S rRNA fueron alineadas manualmente usando Sequencher y comparado los alineamientos con CLUSTAL W y el programa de alineamientos Mac Clade y Ribosomal Database Project Sequence Aligner program. Los árboles filogenéticos fueron generados por máxima verosimilitud o por máxima parsimonia con PAUP (versión 4.0b3). La base de datos en GenBank, EMBL y DDBJ de los Bacillus sphaericus se usaron como referencia para el alineamiento

Número de acceso de secuencia de nucleótidos y N-Terminal de proteínas

Las secuencias del gen 16S RNA de las 32 cepas determinadas en este estudio fueron depositadas en GenBank bajo los números de acceso DQ860113 al DQ860144

28

CAPITULO III

RESULTADOS

PROTEINAS TOTALES Y FRACCIONES CELULARES EN CELULA VEGETATIVA Y ESPORAS.

Las Fig. 5, 7 y 9, presentan el patrón de bandeo de los perfiles protéicos de los cultivos vegetativos y espora madura en gel de poliacrilamida al 10%.

Para todos los aislamientos se observa un patrón heterogéneo en el perfil de proteínas en fase logarítmica así como para las cepas controles (fig. 5). El Fenograma del perfil de proteínas mostró dos grupos separados con un nivel de disimilitud de 0.37 en fase logarítmica y tres subgrupos (fig. 6). En el subgrupo III se agruparon la mayoría de las cepas patógenas con los biotipos de referencia I y IIA (2362). En los subgrupo IV y V los aislamientos no patógenos asociados a la rizosfera del género Quercus con similitudes del 100% independiente de la región geográfica de aislamiento y relacionados con los biotipos IIB, III, IV y V

Un patrón mas homogéneo de bandeo de los cultivos en fase estacionaria se observo (fig. 7). Para el análisis del perfil de proteínas se determinaron dos grupos con 0.65 de disimilitud y entre un 0.3 y un 0.5 en los cuatro subgrupos en fase estacionaria (fig. 8). Varios aislamientos independientes del carácter patógeno y de la región geográfica presentaron un 100% de similitud. No se relacionaron los aislamientos con biotipos de referencia en particular

29

Para el perfil de proteínas de espora madura (fig. 9) se determinó la presencia de bandas especificas en aislamientos patógenos (carril 9, B.s 19-19a) y una homogeneidad de bandas en los no patógenos.

El fenograma revelo una disimilitud del 0.8 para los grupos I y II (fig. 10) y un 0.25 - 0.5 de disimilitud entre los tres subgrupos. La mayoría de los aislamientos no patógenos incluidos todos los de la rizosfera de Quercus robur Linneo de España y el biotipo IV de referencia mostraron un 100% de similitud (subgrupo III). Los aislamientos patógenos y los biotipos de referencia IIA no presentaron una agrupación especifica , sin embargo es fundamental resaltar que se ve una tendencia de agrupaciones entre los patógenos de alta, media o baja patogenecidad y el biotipo IIA de referencia (B.s 2a,3a) .

El agrupamiento comparativo de las proteínas sintetizadas por Bacillus sphaericus durante su ciclo de vida (vegetativa y espora) mostró : 1. Dos grupos con una similitud del 0.45 y cuatro subgrupos distribuidos así : 2 El III relacionado casi todos aislamientos patógenos y relacionados con los biotipos I , IIA y IV de referencia 3. El IV y V relacionó a la mayoría de los aislamientos de la rizosfera de Quercus humboldtii 4. El grupo VI el agrupamiento de los aislamiento de la rizosfera de Quercus robur Linneo (fig. 11). Se determinó similitud del 100% en las cepas de España para los extractos de esporas y fase estacionaria

30

A

B

Fig. 5. Electroforesis de Proteínas de Fase logarítmica de cultivos sincronizados de B.sphaericus .A. lineas: 1. marcador de peso molecular. 2- 8: Biotipos de referencia, 9- 16 .Aislamientos patógenos. B. 1. Marcador de peso molecular. 2-6: Aislamientos no patógenos de bosques de Colombia, 7-9 aislamientos no patógenos de bosques España. 10 .Bacillus globisporus (outgroup)

31

Fig. 6 Fenograma de Proteínas Fase Logarítmica de Bacillus sphaericus basado en el coeficiente de similitud de Sneath y Sokal y en UPGMA. 1 (1-I); 2 (3a-IIA); 3 (2a- IIA) ; 4 (4a-IIB ) ; 5 (11b-III ) ; 6 (29-29b). 7(10a-V ) ; 8 (6a-IV ) ; 9. (12- 17a ) ; 10. (15-15a) ; 11. (17-17b) ; 12. (19-2b ) ; 13. (20-3b ) ; 14. (9-4b) ; 15. (13-13a) ; 16. (21- 21a) ; 17. (14- 13a) ; 18. (18-10b) ; 19. (10-10a) ; 20. (11-11a) ; 21. (16-29a) ; 22. (22- 22a) ; 23. (23-22b) ; 24. (24-24a) ; 25. (25-257a) ; 26. (26-27a) ; 27. B globisporus(10aa) ; 28. (28-28a); 29. (27-27b) ; 30. (30-30b) ; 31. (2E-2ea) ;32. (3E- 3ea); 33 (4E-4ea ); 34 (5E-5eb) ; 35(8Eg-2eb) ;36 (8Ep-3eb); 37(10E-4eb); 38 (11E- 5ea); 39 (14E-30a) : Azul :biotipos referencia; rojo : patógenos; verde : no patógenos Colombia, Negro : No patógenos España 32

A

B

Fig. 7. Electroforesis de Proteínas de Fase Estacionaria de cultivos sincronizados de B.sphaericus. A.Lineas 1: Marcador de peso molecular. 2-5 no patógenos de Parque Chicaque; 6-10 no patógenos Bosque Las Mercedes, Colombia. B.1.marcador de peso molecular; 2-3 no patógenos biotipos de referencia, 4-5 patógenos; 6- 9 no patógenos Bosque Canto Blanco, España. 10. B.globisporus outgroup

33

Fig. 8. Fenograma de Proteínas Fase Estacionaria de Bacillus sphaericus basado en el coeficiente de similitud de Sneath y Sokal y en UPGMA. 1 (1-I); 2 (3a-IIA); 3 (2a- IIA) ; 4 (4a-IIB ) ; 5 (11b-III ) ; 6 (29-29b). 7(10a-V ) ; 8 (6a-IV ) ; 9. (12- 17a ) ; 10. (15-15a) ; 11. (17-17b) ; 12. (19-2b ) ; 13. (20-3b ) ; 14. (9-4b) ; 15. (13-13a) ; 16. (21- 21a) ; 17. (14- 13a) ; 18. (18-10b) ; 19. (10-10a) ; 20. (11-11a) ; 21. (16-29a) ; 22. (22- 22a) ; 23. (23-22b) ; 24. (24-24a) ; 25. (25-257a) ; 26. (26-27a) ; 27. B globisporus(10aa) ; 28. (28-28a); 29. (27-27b) ; 30. (30-30b) ; 31. (2E-2ea) ;32. (3E- 3ea); 33 (4E-4ea ); 34 (5E-5eb) ; 35(8Eg-2eb) ;36 (8Ep-3eb); 37(10E-4eb); 38 (11E- 5ea); 39 (14E-30a) .Azul :biotipos referencia; rojo : patógenos; verde : no patogenos Colombia, Negro : No patógenos España

34

A

B

Fig. 9. Electroforesis de Proteínas de Espora Madura en gel de poliacrilamida al 10% de cultivos sincronizados de Bacillus sphaericus. A. líneas: 1. Marcador de peso molecular; 2-6 Cepas referencia, 7-10 patógenas. B líneas: 1. marcodor de peso molecular 2- 6 no patógenas de Colombia, 7 -10 no patógenos de España

35

Fig. 10. Fenograma de Proteínas de Espora madura de cultivos sincronizados de Bacillus sphaericus basado en el coeficiente de similitud de Sneath y Sokal y en UPGMA. 1 (1-I); 2 (3a-IIA); 3 (2a-IIA) ; 4 (4a-IIB ) ; 5 (11b-III ) ; 6 (29-29b). 7(10a-V ) ; 8 (6a-IV ) ; 9. (12- 17a ) ; 10. (15-15a) ; 11. (17-17b) ; 12. (19-2b ) ; 13. (20-3b ) ; 14. (9-4b) ; 15. (13-13a) ; 16. (21-21a) ; 17. (14- 13a) ; 18. (18-10b) ; 19. (10-10a) ; 20. (11- 11a) ; 21. (16-29a) ; 22. (22-22a) ; 23. (23-22b) ; 24. (24-24a) ; 25. (25-257a) ; 26. (26- 27a) ; 27. B globisporus(10aa) ; 28. (28-28a); 29. (27-27b) ; 30. (30-30b) ; 31. (2E- 2ea) ;32. (3E-3ea); 33 (4E-4ea ); 34 (5E-5eb) ; 35(8Eg-2eb) ;36 (8Ep-3eb); 37(10E- 4eb); 38 (11E-5ea); 39 (14E-30a) Azul :biotipos referencia; rojo : patógenos; verde : no patogenos Colombia, Negro : No patógenos Espana

36

Fig. 11. Fenograma Comparativo de Proteinas Totales en Celula Vegetativa y Espora maduras de cultivos sincronizados de Bacillus sphaericus basado en el coeficiente de similitud de Sneath y Sokal y en UPGMA. 1 (1-I); 2 (3a-IIA); 3 (2a-IIA) ; 4 (4a-IIB ) ; 5 (11b-III ) ; 6 (29-29b). 7(10a-V ) ; 8 (6a-IV ) ; 9. (12- 17a ) ; 10. (15-15a) ; 11. (17- 17b) ; 12. (19-2b ) ; 13. (20-3b ) ; 14. (9-4b) ; 15. (13-13a) ; 16. (21-21a) ; 17. (14- 13a) ; 18. (18-10b) ; 19. (10-10a) ; 20. (11-11a) ; 21. (16-29a) ; 22. (22-22a) ; 23. (23- 22b) ; 24. (24-24a) ; 25. (25-257a) ; 26. (26-27a) ; 27. B globisporus(10aa) ; 28. (28- 28a); 29. (27-27b) ; 30. (30-30b) ; 31. (2E-2ea) ;32. (3E-3ea); 33 (4E-4ea ); 34 (5E- 5eb) ; 35(8Eg-2eb) ;36 (8Ep-3eb); 37(10E-4eb); 38 (11E-5ea); 39 (14E-30a) Azul :biotipos referencia; rojo : patógenos; verde : no patógenos Colombia, Negro : No patógenos España 37

PROTEINA ENTOMOTOXIGENICA de 41KDa y DE LA CAPA – S EN FRACCIONES DE MEMBRANA Y EXTRACTOS CELULAR

Para las fracciones citoplasmáticas y de membrana se determinaron patrones uniformes de bandeo en todos los aislamientos evaluados (Fig. 12,13). Proteínas de 100 KDa en las fracciones de membrana y en extractos totales fueron analizadas por la presencia en 36 aislamientos y proteína de 41kDa por su alta concentración en los aislamientos patógenos (Fig. 9A).

La secuencia N-Terminal de la proteína de 100 KDa reveló una diferencia puntual en el aminoácido serina (S) por cisterna ( C) en 9 de los 36 aislamientos evaluados: AQLNDFNKISGY , AQLNDFNKICGY Una identidad del 100% y del 91% en el alineamiento de la secuencia fue obtenido con la proteína completa de 125 KDa de la capa S ( S-layer) especifica de B.sphaericus. (Tabla 3)

Las proteínas de 41KDa y 52 KDa se evidenciaron en los aislamientos patógenos correspondientes a la toxina binaria de las cepas patógenos (Fig. 9) .Para la proteína de 41 KDa , presente en algunos de los aislamientos patógenos se obtuvo igualmente una identidad del 100% en el N-terminal. La secuencia N-terminal mostró una homologia con la proteína de los biotipos IIA B.sphaericus 2362 y B.sphaericus 1593 (tabla 3). No se obtuvo homología para la banda de 30 KDa presente en varios aislamientos

38

Fig. 12. Electroforesis de Proteínas de Fracciones de Membrana de cultivos sincronizados de Bacillus sphaericus. Líneas: 1. Marcador de peso molecular; 2-3 biotipos de referencia. 4-5 patógenas de Colombia, 6-9 no patógenas de Colombia. 10 no patógenas de España

100

32

Fig. 13. Electroforesis de Proteínas de Fracciones de Citoplasma de cultivos sincronizados de Bacillus sphaericus. Líneas: 1. Marcador de peso molecular; 2-4 Biotipos de Referencia. 5-6 patógenas de Colombia, 7-10 no patógenas de Colombia

39

Péptido AQLNDFNKISGY AQLNDFNKICGY MRNLDFIDNF MRNLDFIDNT

Peso 125 KD 125 KD 41 KD 41 KD Molecular

Identidad 12/12 (100%) 11/12 (91%) 12/12(100%) 11/12 (91%)

Positivos 12/12 (100%) 11/12 (91%) 12/12 (100%) 11/12 (91%)

Gaps 0/12 (0%) 0/12 (0%) 0/12 (0%) 0/12 (0%)

Proteína Precursor Precursor Toxina BinA4 Toxina BinA4 Capa-S Capa-S

Bacteria B.sphaericus B.sphaericus B.sphaericus B.sphaericus

N° Acceso P38537 P38537 AJ000743.1 AJ000743.1 GenBank

Tabla 3. Proteínas de 125 KDa y 41 KDa de las cepas aisladas y relacionadas con B.sphaericus. Alineamiento por programa fase 3.t. European Bioinformatics Institute

40

PEPTIDOGLICANO DE CELULA VEGETATIVA Y ESPORA

Los muropeptidos solubles producidos por la digestión con Cellusyl fueron separados por RP- HPLC. Las condiciones de la cromatografía diferenciaron alrededor de 20 picos distintos de muropeptidos en célula vegetativa (Fig. 14) y más de 30 en extractos de espora (Fig. 15).

No obstante los cromatogramas muestran un perfil similar de muropeptidos entre los diferentes aislamientos, la ausencia de picos en célula vegetativa y espora reveló diferencias puntuales entre los aislamientos de estudio.

En la Fig. 14A se presenta un cromotograma ejemplo de los corridos para todos los aislamientos. De manera que se evidencia picos prominentes como 1,3,16 y 19 en la cepa 2362 de biotipo de referencia IIA en contraste de la ausencia de picos en el aislamiento patógeno 12-12a (Fig. 14B). En el cromatograma de espora madura (Fig. 15) de la misma forma se evidencia un perfil similar, sin embargo picos como el 5, 17,28 y 29 no se presentan en el aislamiento patógeno 12-12A en comparación con la cepa 2362 referencia IIA.

El tamaño pequeño de los muropeptidos obtenidos a partir de extractos de esporas determina una estructura sencilla de peptidoglicano. En contraste con algunos picos prominentes en célula vegetativa. La menor intensidad determina una estructura más homogénea

El fenograma del análisis del perfil de peptidoglicano de célula vegetativa (Fig. 16) muestra cuatro grupos:

41

1. En el grupo I se determinó agrupación de todos los patógenos y estos agrupados nuevamente a los biotipos I y IIA de referencia. 2 En el grupo II se encuentra el 50% de los aislamientos no patógenos de Colombia. 3 Los aislamientos de España tienden agruparse con el biotipo III y 4. Los biotipos de referencia 3A-IIA, III, IV y V se organizaron en el grupo IV. En los aislamientos de la rizosfera de Quercus robur (España) se determinó un grupo con una similitud del 0.6 con respecto a todos los aislamientos de Colombia (patógenos y no patógenos).

Los muropeptidos analizados de las esporas maduras mostraron dos grupos definidos: Uno relacionado con aislamientos de Colombia y España (II) y el otro claramente definido pertenecientes a patógenas de Colombia (I). 100% de similitud entre la mayoría de las cepas analizadas se reveló excepto para el grupo de aislamientos de Quercus robur (fig. 17).

Los perfiles de peptidoglicano comparativo entre célula vegetativa y espora agrupa nuevamente los aislamientos de Colombia patógenos con los biotipos I y IIA de referencia y las cepas no patógenas de Colombia y de España más relacionadas con los biotipos IIB y V (fig. 18).

42

B

Fig. 14. Análisis de muropeptidos del peptidoglicano de células vegetativas de cultivos sincronizados de B.sphaericus por RP-HPLC. (A). Biotipo IIA -2362; (B) Aislamiento patógeno 12-17a

43

B

Fig. 15. Análisis de muropeptidos del peptidoglicano de Espora Madura de cultivos sincronizados de B.sphaericus por RP-HPLC. (A). Biotipo IIA -2362; (B) Aislamiento patógeno 12-17a

44

Fig. 16. Fenograma de Peptidoglicano de célula vegetativa de Bacillus sphaericus basado en el coeficiente de similitud de Sneath y Sokal y en UPGMA. 1 (1-I); 2 (3a- IIA); 3 (2a-IIA) ; 4 (4a-IIB ) ; 5 (11b-III ) ; 6 (29-29b). 7(10a-V ) ; 8 (6a-IV ) ; 9. (12- 17a ) ; 10. (15-15a) ; 11. (17-17b) ; 12. (19-2b ) ; 13. (20-3b ) ; 14. (9-4b) ; 15. (13- 13a) ; 16. (21-21a) ; 17. (14- 13a) ; 18. (18-10b) ; 19. (10-10a) ; 20. (11-11a) ; 21. (16- 29a) ; 22. (22-22a) ; 23. (23-22b) ; 24. (24-24a) ; 25. (25-257a) ; 26. (26-27a) ; 27. B globisporus(10aa) ; 28. (28-28a); 29. (27-27b) ; 30. (30-30b) ; 31. (2E-2ea) ;32. (3E- 3ea); 33 (4E-4ea ); 34 (5E-5eb) ; 35(8Eg-2eb) ;36 (8Ep-3eb); 37(10E-4eb); 38 (11E- 5ea); 39 (14E-30a) Azul :biotipos referencia; rojo : patógenos; verde : no patogenos Colombia, Negro : No patógenos Espana

45

Fig. 17. Fenograma de peptidoglicano de espora madura de cultivos sincronizados de Bacillus sphaericus basado en el coeficiente de similitud de Sneath y Sokal y en UPGMA. 1 (1-I); 2 (3a-IIA); 3 (2a-IIA) ; 4 (4a-IIB ) ; 5 (11b-III ) ; 6 (29-29b). 7(10a-V ) ; 8 (6a-IV ) ; 9. (12- 17a ) ; 10. (15-15a) ; 11. (17-17b) ; 12. (19-2b ) ; 13. (20-3b ) ; 14. (9-4b) ; 15. (13-13a) ; 16. (21-21a) ; 17. (14- 13a) ; 18. (18-10b) ; 19. (10-10a) ; 20. (11- 11a) ; 21. (16-29a) ; 22. (22-22a) ; 23. (23-22b) ; 24. (24-24a) ; 25. (25-257a) ; 26. (26- 27a) ; 27. B globisporus(10aa) ; 28. (28-28a); 29. (27-27b) ; 30. (30-30b) ; 31. (2E- 2ea) ;32. (3E-3ea); 33 (4E-4ea ); 34 (5E-5eb) ; 35(8Eg-2eb) ;36 (8Ep-3eb); 37(10E- 4eb); 38 (11E-5ea); 39 (14E-30a) Azul :biotipos referencia; rojo : patógenos; verde : no patogenos Colombia, Negro : No patógenos Espana

46

Fig. 18. Fenograma comparativo de peptidoglicano de célula vegetativa y espora madura de cultivos sincronizados de Bacillus sphaericus basado en el coeficiente de similitud de Sneath y Sokal y en UPGMA. 1 (1-I); 2 (3a-IIA); 3 (2a-IIA) ; 4 (4a-IIB ) ; 5 (11b-III ) ; 6 (29-29b). 7(10a-V ) ; 8 (6a-IV ) ; 9. (12- 17a ) ; 10. (15-15a) ; 11. (17- 17b) ; 12. (19-2b ) ; 13. (20-3b ) ; 14. (9-4b) ; 15. (13-13a) ; 16. (21-21a) ; 17. (14- 13a) ; 18. (18-10b) ; 19. (10-10a) ; 20. (11-11a) ; 21. (16-29a) ; 22. (22-22a) ; 23. (23- 22b) ; 24. (24-24a) ; 25. (25-257a) ; 26. (26-27a) ; 27. B globisporus(10aa) ; 28. (28- 28a); 29. (27-27b) ; 30. (30-30b) ; 31. (2E-2ea) ;32. (3E-3ea); 33 (4E-4ea ); 34 (5E- 5eb) ; 35(8Eg-2eb) ;36 (8Ep-3eb); 37(10E-4eb); 38 (11E-5ea); 39 (14E-30a) Azul :biotipos referencia; rojo : patógenos; verde : no patogenos Colombia, Negro : No patógenos España

47

ANALISIS DE RAPDs

El DNA total de las 12 cepas patógenas y 20 no patógenas y de los cinco grupos de homología de Bacillus sphaericus fue amplificado con tres oligonucleotidos de 10 pb generando bandas discretas por PCR.

Los productos de amplificación con los oligonucleotido AD-11, AA-15 y AF-17 mostraron un patrón de bandas heterogéneo entre las 0.25Kb y las 1.5 Kb en los aislamientos no patógenos tanto de Colombia como de España (fig. 19). Para las cepas patógenas los productos de amplificación con los tres oligonucleotidos reveló bandas homogéneas entre los 100 y las 900 pb, a diferencia de lo determinado con los aislamientos no patógenos (fig. 20)

El dendograma de los productos de amplificación reveló dos grupos y tres subgrupos a un nivel alto de disimilitud (.90) para el oligonucleotido AD-11 (Fig. 21). Así en el grupo I se relacionan la mayoría de los aislamientos patógenos con casi todos los biotipos de referencia, adicionalmente se encuentra en este grupo dos aislamientos de España. En el grupo II se determino agrupamiento entre las no patógenas con una tendencia de agrupamiento de las colombianas (IV).

Para el oligonucleotido AA-15, (fig. 22) se determinó cinco grupos con una disimilitud del 0.55 al 0.25. De nuevo las cepas patógenas se agruparon en dos cluster con una disimilitud del 0.85 con respecto a los grupos no patógenos, de otra parte se determinó similitudes del 100% entre las patógenas y con el biotipo de referencia I (III). Los aislamientos no patógenos no mostraron una tendencia de los aislamientos a relacionarse con algún biotipo de referencia en particular

48

Con el oligonucleotido AF-17 se decidió agrupar en cinco grupos, sin embargo no se revelo ningún patrón característico por carácter patógeno ni por localización geográfica (Fig. 23)

El análisis comparativo de los tres oligonucleotidos estableció nuevamente dos grupos y dos subgrupos con el siguiente patrón (fig. 24). 1. Grupo I: todos los aislamientos no patógenos independiente de localización geográfica 2. Grupo II: todos los patógenos y relacionados con los biotipos referencia internacional patógenas 2A- IIA y 3a-IIA y no patógena IV. 3. grupos III aislamientos no patógenos de la rizosfera de Quercus humboldtii en parque Natural Chicaque y grupo. 4 grupos IV relacionando la mayoría de aislamientos del Bosque las Mercedes. Los aislamientos de la rizosfera de Quercus robur tanto del bosque de tres Cantos como de Canto Blanco no mostraron una tendencia de agrupamiento especifica.

En la Fig. 25 se presentan los resultados del análisis comparativo Fenotípico – Genotípico (proteínas-peptidoglicano-RAPDs). El fenograma muestra un patrón similar al revelado para cada uno de las variables estudiadas individualmente, es decir , las 39 cepas de estudio se agrupan en dos cluster con una disimilitud de 0.4, distribuidos en el grupo I la mayoría de biotipos referencia y aislamientos patógenos y grupo II los aislamientos no patógenos. Además tres subgrupos que reúnen con una similitud del 50% los aislamientos no patógenos de España (subgrupo II ) , los no patógenos de Colombia ( subgrupo II y III ) relacionados con el biotipo V y el subgrupo I relacionando los biotipos I.IIA,IIB y IV con los patógenos .

49

A

B C

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

4.3

1.9

Fig. 19. Patrones de bandas por RAPD en los aislamientos de B.sphaericus. (A) Oligonucleotido AD-11 Líneas: 1,5: biotipos de referencia; 2-4 : no patógenas de Colombia 6: marcador de peso molecular; 7-11 cepas no patógenas de España. (B) oligonucleotido AA-15 Líneas 1-6 grupos referencia 7-12cepas no patógenas de Colombia; (C) oligonucleotido AF-17 Líneas 13-18 cepas no patógenas de España. 11 Marcador de peso molecular : fago O 29 digerido con HindIII (pb: 4.370; 2.899; 2.498; 2.201; 1.933;1.331; 1.150; 759; 549; 453; 273; 156. )

50

A

B C

Fig. 20. Patrones de bandas por RAPD en los aislamientos patógenos de B.sphaericus. (A) oligonucleotido AD-11 Líneas 1. Marcador de peso molecular.2. grupo IIA referencia patógeno. 3-11 cepas patógenas de Colombia y España. (B) oligonucleotido AA-15 Líneas 1-2 grupos referencia IIA .3-10 aislamientos patógenos. 11 Marcador de peso molecular (C) oligonucleotido AF-17 Líneas 12, 13, 16, 17, 18,19 cepas patógenas .14,15: grupos referencia IIA. 20 B.globisporus outgroup

51

Fig. 21.Dendograma de los productos de amplificación del Oligonucleotido AD-11 de Bacillus sphaericus basado en el coeficiente de similitud de Jacard y en UPGMA. 1 (1- I); 2 (3a-IIA); 3 (2a-IIA) ; 4 (4a-IIB ) ; 5 (11b-III ) ; 6 (29-29b). 7(10a-V ) ; 8 (6a-IV ) ; 9. (12- 17a ) ; 10. (15-15a) ; 11. (17-17b) ; 12. (19-2b ) ; 13. (20-3b ) ; 14. (9-4b) ; 15. (13-13a) ; 16. (21-21a) ; 17. (14- 13a) ; 18. (18-10b) ; 19. (10-10a) ; 20. (11-11a) ; 21. (16-29a) ; 22. (22-22a) ; 23. (23-22b) ; 24. (24-24a) ; 25. (25-257a) ; 26. (26-27a) ; 27. B globisporus(10aa) ; 28. (28-28a); 29. (27-27b) ; 30. (30-30b) ; 31. (2E-2ea) ;32. (3E- 3ea); 33 (4E-4ea ); 34 (5E-5eb) ; 35(8Eg-2eb) ;36 (8Ep-3eb); 37(10E-4eb); 38 (11E- 5ea); 39 (14E-30a) Azul :biotipos referencia; rojo : patógenos; verde : no patogenos Colombia, Negro : No patógenos Espana

52

Fig. 22. Dendograma de los productos de amplificación del Oligonucleotido AA-15 de Bacillus sphaericus basado en el coeficiente de similitud de Jacard y en UPGMA. 1 (1-I); 2 (3a-IIA); 3 (2a-IIA) ; 4 (4a-IIB ) ; 5 (11b-III ) ; 6 (29-29b). 7(10a-V ) ; 8 (6a-IV ) ; 9. (12- 17a ) ; 10. (15-15a) ; 11. (17-17b) ; 12. (19-2b ) ; 13. (20-3b ) ; 14. (9-4b) ; 15. (13-13a) ; 16. (21-21a) ; 17. (14- 13a) ; 18. (18-10b) ; 19. (10-10a) ; 20. (11-11a) ; 21. (16-29a) ; 22. (22-22a) ; 23. (23-22b) ; 24. (24-24a) ; 25. (25-257a) ; 26. (26-27a) ; 27. B globisporus(10aa) ; 28. (28-28a); 29. (27-27b) ; 30. (30-30b) ; 31. (2E-2ea) ;32. (3E- 3ea); 33 (4E-4ea ); 34 (5E-5eb) ; 35(8Eg-2eb) ;36 (8Ep-3eb); 37(10E-4eb); 38 (11E- 5ea); 39 (14E-30a) Azul :biotipos referencia; rojo : patógenos; verde : no patogenos Colombia, Negro : No patógenos España

53

Fig. 23. Dendograma de los productos de amplificación del Oligonucleotido AF-17 de Bacillus sphaericus basado en el coeficiente de similitud de Jacard y en UPGMA. 1 (1-I); 2 (3a-IIA); 3 (2a-IIA) ; 4 (4a-IIB ) ; 5 (11b-III ) ; 6 (29-29b). 7(10a-V ) ; 8 (6a-IV ) ; 9. (12- 17a ) ; 10. (15-15a) ; 11. (17-17b) ; 12. (19-2b ) ; 13. (20-3b ) ; 14. (9-4b) ; 15. (13-13a) ; 16. (21-21a) ; 17. (14- 13a) ; 18. (18-10b) ; 19. (10-10a) ; 20. (11- 11a) ; 21. (16-29a) ; 22. (22-22a) ; 23. (23-22b) ; 24. (24-24a) ; 25. (25-257a) ; 26. (26- 27a) ; 27. B globisporus(10aa) ; 28. (28-28a); 29. (27-27b) ; 30. (30-30b) ; 31. (2E- 2ea) ;32. (3E-3ea); 33 (4E-4ea ); 34 (5E-5eb) ; 35(8Eg-2eb) ;36 (8Ep-3eb); 37(10E- 4eb); 38 (11E-5ea); 39 (14E-30a) Azul :biotipos referencia; rojo : patógenos; verde : no patogenos Colombia, Negro : No patógenos Espana

54

Fig. 24. Dendograma comparativo de los productos de amplificación de los oligonucleotido AD-11, AA-15, AF-17 de Bacillus sphaericus basado en el coeficiente de similitud de Jacard y en UPGMA. 1 (1-I); 2 (3a-IIA); 3 (2a-IIA) ; 4 (4a-IIB ) ; 5 (11b-III ) ; 6 (29-29b). 7(10a-V ) ; 8 (6a-IV ) ; 9. (12- 17a ) ; 10. (15-15a) ; 11. (17- 17b) ; 12. (19-2b ) ; 13. (20-3b ) ; 14. (9-4b) ; 15. (13-13a) ; 16. (21-21a) ; 17. (14- 13a) ; 18. (18-10b) ; 19. (10-10a) ; 20. (11-11a) ; 21. (16-29a) ; 22. (22-22a) ; 23. (23- 22b) ; 24. (24-24a) ; 25. (25-257a) ; 26. (26-27a) ; 27. B globisporus(10aa) ; 28. (28- 28a); 29. (27-27b) ; 30. (30-30b) ; 31. (2E-2ea) ;32. (3E-3ea); 33 (4E-4ea ); 34 (5E- 5eb) ; 35(8Eg-2eb) ;36 (8Ep-3eb); 37(10E-4eb); 38 (11E-5ea); 39 (14E-30a) Azul :biotipos referencia; rojo : patógenos; verde : no patogenos Colombia, Negro : No patógenos Espana

55

Fig. 25 Dendograma comparativo de proteinas, peptidoglicano y RAPD de celula vegetativa y espora de Bacillus sphaericus basado en el coeficiente de similitud de Jacard y en UPGMA. 1 (1-I); 2 (3a-IIA); 3 (2a-IIA) ; 4 (4a-IIB ) ; 5 (11b-III ) ; 6 (29- 29b). 7(10a-V ) ; 8 (6a-IV ) ; 9. (12- 17a ) ; 10. (15-15a) ; 11. (17-17b) ; 12. (19-2b ) ; 13. (20-3b ) ; 14. (9-4b) ; 15. (13-13a) ; 16. (21-21a) ; 17. (14- 13a) ; 18. (18-10b) ; 19. (10-10a) ; 20. (11-11a) ; 21. (16-29a) ; 22. (22-22a) ; 23. (23-22b) ; 24. (24-24a) ; 25. (25-257a) ; 26. (26-27a) ; 27. B globisporus(10aa) ; 28. (28-28a); 29. (27-27b) ; 30. (30- 30b) ; 31. (2E-2ea) ;32. (3E-3ea); 33 (4E-4ea ); 34 (5E-5eb) ; 35(8Eg-2eb) ;36 (8Ep- 3eb); 37(10E-4eb); 38 (11E-5ea); 39 (14E-30a) Azul :biotipos referencia; rojo : patógenos; verde : no patogenos Colombia, Negro : No patógenos España

56

RFLPDs

De los 32 aislamientos de estudio y las 7 cepas referencia se obtuvo un producto de amplificación de 1500 pb correspondiente al gen 16S rRNA de Bacillus sphaericus (fig. 26). La digestión con las enzima EcoR1 (fig. 27A) reveló un patrón homogéneo de bandeo en todos los aislamientos y cepas de referencia. Una banda fuerte de 850 pb y dos bandas correspondiente a digestiones parciales entre 350 y 450 pb.

La fig. 27B muestra dos productos de digestión de 900 pb y 600 pb con la enzima DdelI. En la cepa outgroup B.globisporus no se determinó digestión con DdelI (fig. 27C, carril 18). Para la enzima Pst1 no se determinó ningún producto de digestión para los biotipos de referencia como para las 32 de estudio y para la cepa outgroup

Fig. 26. Amplificación del gen 16S rRNA de Bacillus sphaericus .Marcador de peso molecular fago O 29 digerido con HindIII (pb: 4.370; 2.899; 2.498; 2.201; 1.933;1.331; 1.150; 759; 549; 453; 273; 156. )

57

A

4.370

2.899 2.498 2.201 4.370 1.933

1.331 2.899 1.150 2.498 2.201 759 1.933 549 453 1.331 1.150 273 759 549 453

23

B

C

Fig. 27. Electroforesis en geles de agarosa al 10% de los productos de digestión del gen 16S rRNA de Bacillus sphaericus. (A).digestión con EcoR1, (B-C) digestión con Ddel1 .Marcador de peso molecular Fago O 29 digerido con HindIII

58

SECUENCIACION DEL GEN 16S rRNA

Las cepas de estudio de Krych fueron utilizadas como referencia para el análisis del gen 16S rRNA. 32 aislamientos patógeno y no patógeno de una variedad de hábitat y diversas regiones geográficas de Colombia y España fueron incluidos en este estudio.

El complejo grupo de los 32 aislamientos y las siete cepas referencias fueron divididos filogenéticamente en dos clados de descendencia comparando las secuencias parciales del gen 16S rRNA con secuencias reportadas para B.sphaericus en la base de datos de Genbank. Se determino una divergencia superior al 4%

El clado I agrupo biotipos, I, IIA y IV y 14 aislamientos correspondientes a 6 patógenos, 5 no patógenos de Colombia y 3 de España. Los aislamientos patógenos de nuevo se encontraron relacionados con el biotipo IIA correspondiente a B.s 2362 de alta patogenicidad.

El clado II determinó un agrupamiento de 3 biotipos de referencia: 3-IIA (1593), III, V, B.globisporus (outgroup) y 18 aislamientos, entre ellos 3 patógenos, 7 no patógenos de Colombia y 6 de España. Los biotipos de referencia no se encontraron dentro de este clado excepto 1593-IIA, quien se encontró relacionado con los aislamientos patógenos

59

Figura 28. Árbol filogenético del taxón de Bacillus sphaericus grupo I basado en alineamiento de la secuencia parcial de 16S rDNA, incluidos diferentes especies de Bacillus como outgroup. Azul :biotipos referencia; rojo : patógenos; verde : no patógenos Colombia, Negro : No patógenos España

60

Figura 29. Árbol filogenético del taxón de Bacillus sphaericus grupo II basado en alineamiento de la secuencia parcial de 16S rDNA, incluidos diferentes especies de Bacillus como outgroup Azul :biotipos referencia; rojo : patógenos; verde : no patogenos Colombia, Negro : No patógenos España

61

B.sphaericus Asociado a Quercus humboldtii y Quercus robur Linneo

El análisis agrológico de la rizosfera del género Quercus de Colombia y España mostró una alta concentración de iones divalentes de Ca (642 ppm - 825 ppm) y de Mn (124 ppm – 148 ppm). La capacidad de intercambio catiónico (CEC) correspondiente alrededor del 65% determina la inmovilización de iones divalentes en la rizosfera en relación a los microorganismos asociados y por lo tanto su alta concentración en el suelo rizosférico analizado (tabla 2).

El recuento total de microorganismos del género Bacillus revelo una contribución alta al número total de microorganismos presentes en la rizosfera superior al 50% y específicamente B.sphaericus represento un porcentaje mayor al 70% del total de Bacillus rizosfericos. Estos valores altos corresponden al elevado recuento de esporas cuyos valores se encontraron por encima del 70% excepto en el bosque de las Mercedes (Fig. 30).

La alta capacidad de intercambio cationico presente en los cuatro bosques analizados asociados al género Quercus fue determinada con la inducción de esporulación en iones divalentes de Ca, Fe y Mn en concentraciones presentes en la rizosfera (Krumbein, W. et al 1973, Rosson et al . 1982.). El pool de Bacillus conformado de cada uno de los cuatro bosques evaluados mostró porcentajes de esporulación > del 85% en iones de Ca y > del 75% en iones de Fe y Mn en comparación con los grupos controles I, IIA seleccionados de las siete cepas de referencia empleadas en este trabajo (fig 31).

62

El biotipo IV presentó los valores más cercanos de inducción con los iones divalentes al pool de bacilos conformado. En Bacillus globisporus como outgroup se evidencio la baja inducción de esporulación (25%) en las concentraciones de iones analizadas

Recuento de Bacillus sphaericus en la rizosfera de Quercus humboldtii y Quecus robur Linneo

100 80 % crecimiento 60 y esporulación 40 20 0 col-ch col-me esp-tr esp-cb total 62 57 68 67 B.s 75 83 65 70 80 70 85 90 espo Sitios de muestreo

Fig. 30. Población de Bacillus en la rizosfera de Quercus humboldtii, Colombia y Quercus robur Linneo, España. Los valores mostrados corresponden al porcentaje total de microorganismos y morfotipos analizados

63

Esporulación de Bacillus sphaericus en iones divalentes

100

% de Esporulación 50

0 col- col- esp- esp- I IIA IV B.g 0.06% Ca 95 95 85 90 65 35 75 25 0.01% Fe 75 80 75 75 50 30 65 30 0015%Mn 80 75 75 95 60 35 70 25 Pool de Bacillus sphaericus de sitio de muestreo

Fig. 31. Esporulación de Bacillus sphaericus en iones divalentes. Los grupos I, IIA y IV de referencia y Bacillus outgroup fueron utilizados como bacterias controles.

64

DISCUSIÓN

Treinta y dos aislamientos del taxón complejo de Bacillus sphaericus de diferentes hábitat y regiones geográficas en Colombia y España, fueron evaluados a nivel fenotípico por patrones de perfil de peptidoglicano, perfiles protéicos de fracciones celulares y a nivel molecular por polimorfismos por RAPDs, RFLPs, y secuenciación del gen 16S rRNA

Los resultados comparativos a nivel fenotípico y molecular soportan la gran heterogeneidad fenotípica y genotípica del taxón de estudio. El perfil de proteínas de las diferentes fase de crecimiento mostró claramente que cuando el microorganismo sale de la fase logarítmica donde se presenta una alta versatilidad metabólica y entra en la fase estacionaria, los perfiles proteicos son mas homogéneos entre las cepas patógenas y no patógenas (similitud 45%) dando identidad del 100% en varios de los aislamientos que permiten agrupar con biotipos de referencia definidos como I, IIA y IV.

Por lo tanto para el perfil de proteínas totales el fenograma presentado en la Fig. 11 evidencio cuatro grupos definidos y dos subgrupos claramente separados: patógenos de Colombia y no patógenos de España. De igual forma el análisis del N-terminal de la proteína de 125KDa correspondiente a la capa –S mostró que los aislamientos de España difieren puntualmente en un aminoácido con respecto a los aislamientos de Colombia (sustitución de Serina por Cisteina), y el N-terminal de la proteína de 41KDa mostró una identidad del 100% de los aislamientos patógenos.

65

Extractos de espora madura e inducidos a proceso de germinación han sido estudiados en previos reportes revelando diferencias en el número de muropeptidos y en el tipo de aminoácidos que componen esta estructura. El proceso de esporulación y germinación lleva a cambios enzimáticos marcados que se acentúan en la biosíntesis de proteínas de ensamblaje de membranas y maduración de la corteza, así como en la biosíntesis de muropeptidos específicos en célula vegetativa y espora (Abdelmadjid A et al 1999).

El peptidoglicano de la espora ha sido reportado como un muropeptido sencillo a diferencia del que constituye la célula vegetativa de B.sphaericus (Abdelmadjid A et al 1998). El análisis de los cromatogramas del peptidoglicano de los diferentes aislamientos similar a lo reportado en estudios anteriores , muestra un peptidoglicano mas complejo en célula vegetativa que en espora ( >numero de picos ) y por lo tanto mayor similitud en el perfil de extractos de espora que en vegetativa (Fig. 14-18)

Los patrones determinados a nivel molecular por polimorfismo intraespecifico azaroso (RAPDs) mostraron un alto número de bandas con los tres oligonucleotidos lo cual permitió realizar un análisis discriminatorio específico entre los aislamientos patógenos y no patógenos. Con todos los oligonucleotidos, las cepas patógenas mostraron perfiles cercanos y algunas veces idénticos.

Es interesante resaltar dos aspectos: 1. Los tres oligonucleotidos diferenciaron igualmente los aislamientos patógenos de los no patógenos y 2. No obstante la similitud del grupo IIA con los patógenos, se presentaron similaridades con aislamientos no patógenos soportando estos resultados los datos de previos estudios que muestran una agrupación no única de patógenos en un solo cluster.

66

Del análisis comparativo fenotípico – genotípico (proteínas-peptidoglicano-RAPDs) se ve claramente que las 39 cepas de estudio se agrupan en dos cluster con una disimilitud de 0.4, distribuidos en el grupo I la mayoría de biotipos referencia y aislamientos patógenos y grupo II los aislamientos no patógenos. Además tres subgrupos que reúnen con una similitud del 50% los aislamientos no patógenos de España (subgrupo II ) , los no patógenos de Colombia ( subgrupo II y III ) relacionados con el biotipo V y el subgrupo I relacionando los biotipos I.IIA,IIB y IV con los patógenos .

Los patrones de restricción no dieron resultados discriminatorios en la secuencia del gen 16 rRNA, dado que las digestiones con EcoR1 y Ddel1 revelaron productos de digestión similar a lo reportado para el gen 16S rRNA del género Bacillus: dos sitios de corte para EcoR1 (bandas fuertes de 850, 450 y 300 pb) y un sitio de corte para Ddel1 (900 pb y 600 pb )y ausencia de restricción para Pst1 (Green.C.J. 1985)

La secuencia parcial de 16S DNA determinó dos clados bien definidos en relación a su carácter patógeno y ubicación geográfica con una divergencia superior al 4% Los aislamientos patógenos (6/9) se ubicaron en el clado I relacionados con los biotipos de referencia I, IIA y IV.

Los aislamientos de España asociados a Quercus robur Linneo (6/9) mostraron una agrupación en el clado II sin relación con biotipos de referencia. Los aislamientos no patógenos de Colombia asociados a Quercus humboldtii se relacionaron tanto en el clado I como el II igualmente sin relación con biotipos de referencia.

67

Una relación ecofisiologica fue establecida en asociación con Quercus humboldtii y Quercus robur Linneo. Se determino un número alto de bacterias del género Bacillus y específicamente del taxón B. sphaericus en la rizosfera de los cuatro bosques analizados del género Quercus. Las concentraciones de iones divalentes de Ca, Mn y Fe mostraron una relación directa con el alto porcentaje de esporas ( > 70% ) . Relaciones fundamentales reportadas por Francis, C. A. (1999, 2000 y 2001, Hastings, D.et al 1986.).

La inducción de la esporulación en medio suelo sitio especifico con concentraciones de 0.06% de Ca , 0.01% de Fe y 0.015% de Mn para el pool de Bacillus formulado de cada bosque fue superior al 70% en relación a los biotipos de referencia seleccionados ( I, IIA, IV). Datos similares reportados por Francis Chris A. et al (2002).

No obstante la cepa IV dio valores cercanos a los determinados en los aislamientos nativos de cada bosque . Bacillus globisporus outgroup mostró el menor porcentaje de esporulación en las condiciones establecidas para los tres iones divalentes evaluados.

Se evidencio por análisis comparativo de los parámetros fenotípicos y genotípicos dos grupos claramente definidos: En el grupo I los aislamientos patógenos relacionados con los grupos de homologia I, IIA y IV y en el grupo II, los aislamientos no patógenos de Colombia (subgrupo IIA) y España (subgrupo IIB), estos relacionados con el biotipo V de referencia.

Finalmente el complejo taxón de Bacillus sphaericus sigue siendo cuestionado en relación a la sistemática de los grupos patógenos y no patógenos para ser elevados cada uno a categoría de especies separadas.

68

El operon del 16S del gen rRNA con más de 10 copias debe ser cuestionado para los análisis filogenéticos y en lo posible implementar la secuenciación con el gen rpoB, hasta el momento reportado en una copia por celular, como ha sido cuestionado por Fox G.E. et al desde 1992. No obstante los microorganismos pertenecientes al género Bacillus tiene una característica complejo adicional, el proceso de diferenciación o esporulación, lo cual los hace aun más difíciles de elucidar en su filogenia.

En este estudio se presenta el primer reporte de Bacillus sphaericus asociado a Quercus robur Linneo

69

CONCLUSIONES

Treinta y dos aislamientos de diferentes hábitat y regiones geográficas en Colombia y España, fueron ubicados con el taxón complejo Bacillus sphaericus

Dos clados fueron determinados por secuenciación parcial de 16S DNA en relación a su carácter patógeno y ubicación geográfica con una divergencia superior al 4%

Los aislamientos patógenos se ubicaron en el clado I relacionados con los grupos de referencia I, IIA y IV. Los aislamientos de España asociados a Quercus robur Linneo (6/9) mostraron una agrupación en el clado II sin relación con grupos de homología.

Los aislamientos no patógenos de Colombia asociados a Quercus humboldtii se relacionaron tanto en el clado I como el II igualmente sin relación con grupos de homología

El N-terminal de la proteína de 125 KDa dio una identidad del 91% y 100% con la proteína de la capa – S de B. sphaericus. Diferencias en la posición 10 del aminoácido Serina por Cisteina se determinó en las cepas de España con respecto a las de Colombia. El N-terminal de la proteína 41 KDa dio una identidad del 100% con respecto al biotipo control internacional 2362 -IIA

Los patrones determinados a nivel molecular por polimorfismo intraespecifico azaroso ( RAPDs) mostraron un alto número de bandas con los tres oligonucleotidos lo cual permitió realizar un análisis discriminatorio específico entre los aislamientos patógenos y no patógenos.

70

No obstante la similitud del grupo IIA con los patógenos, se presentaron similaridades con aislamientos no patógenos soportando estos resultados los datos de previos estudios que muestran una agrupación no única de patógenos en un solo cluster.

Los productos de restricción no dieron resultados discriminatorios en la secuencia del gen 16 rRNA, dado que las digestiones con EcoR1 y Ddel1 revelaron productos de digestión similar a lo reportado para el gen 16S rRNA del género Bacillus: dos sitios de corte para EcoR1, un sitio de corte para Ddel1 y ausencia de restricción para Pst1.

Los parámetros fenotípicos y genotípicos determinaron dos grupos claramente definidos: En el grupo I los aislamientos patógenos relacionados con los grupos de homología I, IIA y IV y en el grupo II, los aislamientos no patógenos de Colombia (subgrupo IIA) y España (subgrupo IIB), estos relacionados con el biotipo V de referencia.

Una relación ecofisiologica fue establecida en asociación con Quercus humboldtii y Quercus robur Linneo. Se determinó un número alto de bacterias del género Bacillus y específicamente del taxón B. sphaericus en la rizosfera de los cuatro bosques analizados del género Quercus.

Las concentraciones de iones divalentes de Ca, Mn y Fe mostraron una relación directa con la inducción de la esporulación superior al 70% en medio suelo sitio especifico evidenciando la alta proporción de esporas en la rizosfera del género Quercus en los cuatro bosques evaluados

Los resultados comparativos a nivel fenotípico y molecular soportan la gran heterogeneidad fenotípica y genotípica del taxón de estudio.

71

El complejo taxón de Bacillus sphaericus sigue siendo cuestionado en relación a la sistemática de los grupos patógenos y no patógenos para ser elevados cada uno a categoría de especies separadas.

En este estudio se presenta el primer reporte de Bacillus sphaericus asociado a Quercus robur Linneo

.

72

BIBLIOGRAFÍA

Abdelmadjid. A and Foster. S. J. 1999. The Role of Peptidoglycan Structure and Structural Dynamics during Endospore Dormancy and Germination Antonie van Leeuwenhoek. 75: 299–307.

Abdelmadjid. Atrih., Gerold. Bacher., Gunter Allmaier., Michael P. Williamson, and Simon J. Foster. 1999 Analysis of Peptidoglycan Structure from Vegetative Cell of Bacillus subtilis 168 and Role of PBP 5 in Peptidoglycan Maturation. J. Bacteriol. 181 : 3956–3966.

Abdelmadjid. A., Zollner. P., Allmaier. G., Williamson. M. P. and Foster. S. J. 1998. Peptidoglycan Structural Dynamics during Germination of Bacillus subtilis 168 Endospores. J. Bacteriol. 180 : 4603–4612.

Abdelmadjid. A., Zollner. P., Allmaier G., Williamson. M. P. and Foster. S. J. 1996.Structural Analysis of Bacillus subtilis 168 Endospores Peptidoglycan and Its role during Germination . J. Bacteriol. 178 : 6173–6183.

Alexander. B. and Priest. F. G .1990. Numerical Classification and Identification of Bacillus sphaericus including some strains pathogenic for mosquito larvae. J. Gen. Microbiol. 136: 367-376.

Aquino de Muro. M., and F. Priest. 1994. A colony hybridization procedure for the identification of mosquitocidal strains of Bacillus sphaericus on isolation plates. J.Invertebr. Pathol. 63 : 310-313.

Aquino de Muro. M., Mitchell. W.J., and Priest. F.G.1992. Differentiation of mosquito-pathogenic strains of Bacillus sphaericus from non-toxic varieties by ribosomal RNA gene restriction patterns. J. Gen. Microbiol. 138 : 1159-1166.

Andrade. D. R., Lozano. L. C. and Dussán. J. 1996. Caracterización de ADN Plasmídico de Bacterias Utiles en el Control Biológico de Mosquitos Transmisores de Malaria. Rev Col. Entomol. 22 :131-135.

Beveridge, T. J., Pouwels, P. H., Sara, M., Kotiranta, A., Lounatmaa, K., Kari, K., Kerosuo, E., Haapasalo, M., Egelseer, E. M., and Schocher, I. 1997: Functions of S- layers.. FEMS Microbiol. Reviews. 20 : 99-149.

73

Boivin Boivin-Jahns. V., Bianchi. A., Ruimy. R., Garcin. J., Daumas. S. and Christen R. 1995. Comparison of phenotypical and molecular methods for the identification of bacterial strains isolated from a deep subsurface environment. Appl Environ Microbiol. 61: 3400–3406

Bowditch . Ron. D., Paul Baumann, and Allan A. Yousten .2005. Sequencing of the Gene Encoding a 125-Kilodalton Surface-Layer Protein from Bacillus sphaericus 2362 and of a Related Cryptic . Gene. 171 : 302-304

Bowditch. Ron .D . 2001. Simplified technique for identification of the aerobic spore- forming bacteria by phenotype. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51: 1361-1371.

Brian. B. and McSpadden. . Systems The Nature and Application of Biocontrol Microbes: Bacillus spp. Ecology of Bacillus and Paenibacillus spp. in Agricultural PHYTOPATHOLOGY. In press

Brosiur.G., Palmer.M.L., Kennedy.P.J and Noller.H.F. 1978. Complete nucleotide sequence of a 16S ribosomal RNA gene from Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. 75 :4801-4805

Cano. R. J., and M. K. Borucki. 1995. Revival and identification of bacterial spores in 25- to 40-million-year-old Dominican amber. Science 268:1060– 1064.

Caspi. A.G. 1997. Bacterially-mediated mineral formation: insights into manganese( II) oxidation from molecular genetic and biochemical studies. Rev. Mineral. 35:225– 266.

Chin. K. J., D. Hahn, U. Hengstmann, W. Liesack, and P. H. Janssen. 1999. Characterization and identification of numerically abundant culturable bacteria from the anoxic bulk soil of rice paddy microcosms. Appl. Environ. Microbiol. 65:5042–5049.

Claus. D., and Berkeley. R.C.W.1986 : Genus Bacillus Cohn, 174AL. In: P.H.A. SNEATH, N.S. MAIR, M.E. SHARPE and J.G. HOLT (ed.) Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, vol. 2, The Williams & Wilkins Co., Baltimore. 1105-1139.

Clement. B.G., Kehl. L.E., DeBord. K.L., and Kitts. C. 1998. Terminal Restriction Fragment Patterns (TRFs), a rapid PCR-based method for the comparison of complex bacterial communities. J. Microbiol. Methods. 31:135–142

74

Cokmus. C., and Yousten. A.A .1994. Characterization of Bacilus sphaericus strains by SDS-PAGE. J. Invertebr. Pathol. 64: 267-268.

Cokmus. C., and Yousten. A.A .1993. Bacteriocin production by Bacillus sphaericus. J. Invertebr. Pathol. 61: 323-325.

Da Silva. J. J., and R. J. P. Williams. 1991. The biological chemistry of the elements. Clarendon Press, Oxford, United Kingdom.

De Vrind. J. P. ., G. J. Brouwers, P. L. A. M. CORSTJENS. J. den Dulk., and E. W. de Vrind-de Jong. 1998. The cytochrome c maturation operon is involved in manganese oxidation in Pseudomonas putida GB-1. Appl. Environ. Microbiol. 64:3556–3562.

De Vrind, J. P. M., E. W. de Vrind-de Jong, J.-W. H. de Voogt, P. Westbroek, F. C. Boogerd, and R. A. Rosson. 1986. Manganese oxidation by spores and spore coats of a marine Bacillus species. Appl. Environ. Microbiol. 52:1096– 1100.

Dong .Y.H., Gusti. A.R., Zhang. Q, Xu. J.L., and Zhang. L.H. 2002 Identification of quorum-quenching N-acyl homoserine lactonases from Bacillus species. Appl Environ Microbiol. 68:1754-1759.

Donovan. W., L. B. Zheng., K. Sandman., and R. Losick. 1987. Genes encoding spore coat polypeptides from Bacillus subtilis. J. Mol. Biol. 196:1–10.

Driks. A. 1999. Bacillus subtilis spore coat. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63:1– 20.

Dussán. J., Andrade. D.R., Lozano. L. C and Vanegas. S. 2002.Caracterizacion fisiologica y genetica de cepas nativas de Bacillus sphaericus. Rev Col Biotecnol. 4 : 89-99

Dussán. J., Andrade. D. R. and Lozano. L. C. 1997 Relación de ADN Plasmídico y Actividad Larvicida en Cepas Nativas de Bacillus sphaericus. Rev. Col. Entomol. 23: 103-106.

Egelseer. E.M., Danhorn, T., Pleschberger, M., Hotzy, C., Sleytr, U.B., and Sára, M. 2001: Characterization of an S-layer glycoprotein produced in the course of S-layer variation of Bacillus stearothermophilus ATCC 12980 and sequencing and cloning of the sbsD gene encoding the protein moiety.. Arch. Microbiol., 177: 70-80.

75

Egelseer. E., Schocher. I., Sara. M., and Sleytr, U. B. 1994: S-layers from Bacillus strains as molecular sieves and adhesion sites for exoenzymes.. Proc. 7th Int. Congr. Bacteriol. Appl. Microbiol., Prag, BS-4/15.

Esen. A. A. 1978. Simple method for quantitative, semiquantitative, and qualitative assay of protein. Anal. Biochem. 89: 264-273.

Farrow. J ., Wallbanks. S., and Collins. M..D. 1994 Phylogenetic interrelationships of round-spore-forming bacilli containing cell walls based on lysine and the non-spore- forming genera Caryophanon, Exiguobacterium, Kurthia, and Planococcus. Int J Syst Bacteriol 44:74–82

Felske. A., A. Wolterink, R. Van Lis., and A. D. Akkermans. 1998. Phylogeny of the main bacterial 16S rRNA sequences in Drentse A grassland soils (TheNetherlands). Appl. Environ. Microbiol. 64 : 871–879.

Fox. G. E., Wisotzkey., J. D. and Jurtshuk. Jr. P. 1992. : How close is close: 16S rRNA sequence identity may not be sufficient to guarantee species identity. Int. J. Syst. Bacteriol, 42, 166-170.

Francis . Chris A. and Bradley M. Tebo . 2002. Enzymatic Manganese(II) Oxidation by Metabolically Dormant Spores of Diverse Bacillus Species App Environ Microbiol 68 : 874–880 .

Francis. C. A. 2000. Diversity and molecular mechanisms of manganese(II)- oxidizing bacteria. Ph.D. thesis. University of California, San Diego.

Francis. C. A., and B. M. Tebo. 1999. Marine Bacillus spores as catalysts for oxidative precipitation and sorption of metals. J. Mol. Microbiol. Biotechnol.1:71–78.

Francis. C. A., E.-M. Co, and B. M. Tebo. 2001. Enzymatic manganese(II) oxidation by a marine _-proteobacterium. Appl. Environ. Microbiol. 67: 4024–4029.

Genilloud .O.E., Pelaez. F., Gonzalez. I., and Diez. M.T. 1994. Diversity of actinomycetes and fungi on seaweeds from the Iberian coasts. Microbiologia 10 : 413– 422

Gest. H., and J. Mandelstam. 1987. Longevity of microorganisms in natural environments. Microbiol. Sci. 4: 69–71.

Gordon. R. E., W. C. Haynes, and C. H.-P. Pang. 1973. The Genus Bacillus, vol. 427. U. S. Department of Agriculture, Washington, D. C.

76

Green. C. J., Stewart.G.C., Hollis. M. A., Vold. B .S., and Bott. F.1985.Nucleotide sequence of Bacillus subtilis ribosomal RNA operon rrnB. Gene.37: 261-266

Guinand. M., Vacheron. M.J., and Michel. G. 1979. Location of peptidoglycan lytic enzymes in Bacillus sphaericus. J Bacteriol. 138 : 126-32.

Gurtner. C., J. Heyrman, G. Pinar, W. Lubitz, J. Swings, and S. Roelleke. 2000. Comparative analyses of the bacterial diversity on two different biodeteriorated wall paintings by DGGE and 16S rDNA sequence analysis. Int. Biodeterior Biodegradation 46:229–239.

Hastings. D., and S. Emerson. 1986. Oxidation of manganese by spores of a marine bacillus: kinetic and thermodynamic considerations. Geochim. Cosmochim. Acta 50:1819–1824.

Hem. J. D. 1978. Redox processes at surfaces of manganese oxide and their effects on aqueous metal ions. Chem. Geol. 21:199–218.

Ilk. N., Völlenkle. C., Egelseer. E.M., Breitwieser. A., Sleytr. U.B., and Sára, M. 2002: Molecular characterization of the S-layer gene sbpA of Bacillus sphaericus CCM 2177 and production of a functional S-layer fusion protein with the ability to recrystallize in a defined orientation while presenting the fused allergen.. Appl. Environ. Microbiol. 68: 3251-3260.

Ilk. N., Kosma. P., Puchberger. M., Egelseer. E. M., Mayer. H. F., Sleytr. U. B., Sara, M. 1999: Structural and functional analyses of the secondary cell wall polymer of Bacillus sphaericus CCM 2177 that serves as an S-layer specific anchor.. J. Bacteriol. 181: 7643-7646.

Jahnz. U., A. Fitch, and F. Priest. 1996. Evaluation of an rRNA-targeted oligonucleotide probe for the detection of mosquitocidal strains of Bacillus sphaericus in soils; characterization of novel strains lacking toxin genes. FEMS Microbiol. Ecol. 20:91-99.

Johnson. J. L. 1973. Use of nucleic-acid homologies in the taxonomy of anaerobic bacteria. Int. J. Syst.Bacteriol. 23:308-315.

77

Johnson. J. L. 1994. Similarity analysis of DNAs, p. 655-682. In P. Gerhardt, R. G. E. Murray, W. A. Wood, and N. R.Krieg (ed.), Methods for general and molecular bacteriology.ASM Press, Washington, D. C.

Kämpfer. P. 1995. An efficient method for preparation of extracts from gram-positive bacteria for comparison of cellular protein patterns. J. Microbiol. Methods 21: 55-60.

Kellen. W.R., Clark T.B., Lindegren. J.E., Ho. B..C., Rogoff. M., and H.Singer. 1965. Bacillus sphaericus Neide as a pathogen of mosquitoes. J. Invertebr. Pathol. 7: 442-448.

Kennedy. M. J., S. L. Reader, and L. M. Swiercznski. 1994. Preservation records of micro-organisms: evidence of the tenacity of life. Microbiology. 140 : 2513–2519.

Klein. M. G. 1988. Pest management of soil-inhabiting insects with microorganisms. Agric. Ecosyst. Environ. 24:337-349.

Krumbein. W. E., and H. J. Altman. 1973. A new method for detection and enumeration of manganese-oxidizing and -reducing microorganisms. Helgol. Wiss. Meeresunters. 25:347–356.

Krych. V. A., Johnson J. L. and Yousten A. A. 1980. Deoxyribonucleic acid homologies among strains of Bacillus sphaericus. Int. J. Syst. Bacteriol. 30 : 476-484.

Lacey. L.A., Undeen. A..H., 1986. Microbial control of black flies and mosquitos. Annu. Rev. Entomol. 31: 265-296.

Laemmli .U. K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assambly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.

Linnett. P..E and Tipper. D. J. 1976. Transcriptional control of peptidoglycan precursor synthesis during sporulation in Bacillus sphaericus. J Bacteriol. 125:565-74..

Liu. J. W., A. Porter, B. Y. Wee, and T. Thanabalu. 1996. New gene from nine Bacillus sphaericus strains encoding highly conserved 35.8 kilodalton mosquitocidal toxins. Appl. Environ. Microbiol. 62 :2174-2176.

78

Lozano. L. C and Dussán. J. 2002. Diferenciación de aislamientos colombianos de Bacillus sphaericus patogenos y no patogenos para larvas de mosquitos por amplificación azarosa del ADN. Actual Biológ, 24 : 23-31

Massie. J., Roberts. G., and White. P.J. 1985 Cell wall polymers of Bacillus sphaericus 9602. I. Structture of the vegetative cell wall peptidoglycan. Biochemistry. 8:3577-3587

Mercan. N., Çağlar. A. and Aslım. B. Beyatlı. 2003. Classification of Strains of Bacillus sphaericus by Different statistical methods. Turk J. Biol. 27: 171-179.

Mercan. Nazime., and Cumhur. Cokmus. 2004 Discrimination of Bacillus sphaericus strains by filtrate protein profiles. African J Biotechnol 3 : 281-283.

Miteva. V., Gancheva. A., Mitev. V., and Ljubenov. M.1998.Comparative genome aalysis of Bacillus sphaericus by ribotyping, M13 hybridization, and M13 polymerase chain Reaction fingerprinting. Can J Microbiol.; 44: 175-80 . Myers. P., and Yousten. A.A 1978. Toxic activity of Bacillus sphaericus SSII- 1 for mosquito larvae. Infect. Immun. 19: 1047-1053.

Nakamura. L.K. 2000. Phylogeny of Bacillus sphaericus-like organisms. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50: 1715-1722.

Nealson. K. H., and J. Ford. 1980. Surface enhancement of bacterial manganese oxidation: implications for aquatic environments. Geomicrobiol. J. 2:21–37.

Nicholson. W. L., N. Munakata. G., Horneck. H., J. Melosh., and P. Setlow. 2000. Resistance of Bacillus endospores to extreme terrestrial and extraterrestrial environments. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64:548–572.

Nieto. J. J., R. Fernandez-Castillo. M., C. Márquez., A. Ventosa., E. Quesada., and F. Ruiz-Berraquero. 1989. Survey of metal tolerance in moderately halophilic eubacteria. Appl. Environ. Microbiol. 55:2385–2390.

Pollmann. Katrin., Johannes. Raff., Michaela. Schnorpfeil., Galina. Radeva., and Sonja. Selenska-Pobell. 2005. Novel surface layer protein genes in Bacillus sphaericus associated with unusual insertion elements Microbiology. 151 : 2961-2973

79

Popham. D. L.2002. Specialized peptidoglycan of the bacterial endospore: the inner wall of the lockbox Cell. Mol. Life. Sciences 59 : 426 – 433

Porter. A., E. Davidson., and J.-W. Liu. 1993. Mosquito toxins of bacilli and their genetic manipulation for effective biological control of mosquitoes. Microbiol. Rev. 57 :838-861.

Potts. M. 1994. Desiccation tolerance of prokaryotes. Microbiol. Rev. 58: 755–805

Priest. F..G., Goodfellow. M., and Todd. C. 1988: A numerical classification of the genus Bacillus. J. Gen. Microbiol. 134: 1847-1882.

Priest. F. G., Aquino de Muro. M., and Kaji. D. A. 1994. Systematics of insect pathogenic bacilli: uses in strain identification and isolation of novel pathogens. In : F.G. PRIEST, A. RAMOS-CORMENZANA et B.J. TINDALL: Bacterial diversity and systematics, Plenum Press, New york, pp. 275-295.

Rippere. K. E., J. L. Johnson., and A. A. Yousten. 1997. DNA Similarities among Mosquito-pathogenic and Nonpathogenic Strains of Bacillus sphaericus. Int. J. Syst. Bacteriol. 47:214-216.

Rippere. K. E., M. T. Tran., A.A. Yousten., K. H. Hilu., and M. G. Klein. 2002.Molecular Systematics of Bacillus popilliae and Bacillus lentimorbus, Bacteria causing Milky Disease in Japanese Beetles and Related Scarab Larvae. Int. J. Syst. Bacteriol. 48:395-402.

Riva. O.N., Sorokulova. I..B., and Smirnov. V.V. 2001. Simplified technique for identification of the aerobic spore-forming bacteria by phenotype. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51: 1361-1371.

Rohlf. F. J. 1994. NTSYS-pc numerical taxonomy and multi-variate analysis system version 1.80. Exeter Publishing, Setauket, NY.

Rosson. R. A., and K. H. Nealson. 1982. Manganese binding and oxidation by spores of a marine bacillus. J. Bacteriol. 174:575–585.

Russell. B. L., Jelley. S.A., Yousten. A. A. 1989. Carbohydrate metabolism in the mosquito pathogen Bacillus sphaericus 2362. Appl. Environ. Microbiol. 55: 294-297.

80

Stackebrandt. E., Ludwig. W., Weizenegger. M., Dorn. S., McGill. T.J., Fox. G.E., Woese. C.R., Schubert. W., Schleifer. K.H.1987. Comparative 16S rRNA oligonucleotide analyses and murein types of round-spore-forming bacilli and non- spore-forming relatives. J Gen Microbiol.133 : 2523-2529.

Stackebrandt. E., and B. M. Goebel. 1994. Taxonomic Note: A Place for DNA-DNA Reassociation and 16S rRNA Sequence Analysis in the Present Species Definition in Bacteriology. Int. J. Syst. Bacteriol. 44: 846-849.

Stahly. D. P., R. E. Andrews, and A. A. Yousten. 1992a. The genus Bacillus-Insect pathogens, p. 1029-2140. In A.Balows, H. G. Truper, M. Dworkin, W. Harder, and K.- H. Schleifer (ed.), The Prokaryotes, 2 ed, vol. 2. Springer- Verlag, New York.

Stahly. D. P., D. M. Takefman. C., A. Livasy., and D. W. Dingman. 1992b. Bacillus popilliae in soil and in commercial spore powders. Appl. Environ. Microbiol. 58:740- 743.

Thanabalu. T., and A. Porter.1996. A Bacillus sphaericus gene encoding a novel type of mosquitocidal toxin of 31.8 kDa. Gene 170:85-89.

Ursing. J. B., R. A. Rossello-Mora., E. Garcia-Valdes., and J. Lalucat. 1995. Taxonomic note: A pragmatic approach to the nomenclature of phenotypically similar genomic groups. Int. J. Syst. Bacteriol. 45: 604.

Vacheron. V.J., M. Guinand., A. Francon., and G. Michel. 1999. Characterisation of a new endopeptidase from sporulating Bacillus sphaericus which is specific for the gamma-D-glutamyl-L-lysine and gamma-D-glutamyl-(L)meso-diaminopimelate linkages of peptidoglycan substrates Eur .J. Biochemistry.100: 189-196

van Waasbergen- L. G., M. Hildebrand., and B. M. Tebo. 1996. Identification and characterization of a gene cluster involved in manganese oxidation by spores of the marine Bacillus sp. strain SG-1. J. Bacteriol. 12:3517–3530.

Vreeland. R. H., W. D. Rosenzweig., and D. W. Powers. 2000. Isolation of a 250 million-year-old halotolerant bacterium from a primary salt crystal. Nature 407:897–900.

Woese. C. R. 1987. Bacterial Evolution. Microbiol Review.. 51:221-271

81

Woodburn. M. A., A. A. Yousten, and K. H. Hilu. 1995. Random amplified polymorphic DNA fingerprinting of mosquito pathogenic and nonpathogenic strains of Bacillus sphaericus. Int. J. Syst. Bacteriol. 45:212-217.

Xu .D., and Cote. J..C..2003. Phylogenetic relationships between Bacillus species and related genera inferred from comparison of 3' end 16S rDNA and 5' end 16S-23S ITS nucleotide sequences. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 53: 695-704.

Yousten. A. A., and K. E. Rippere. 1997. DNA Similarity Analysis of a Putative Ancient Bacterial Isolate Obtained From Amber. FEMS Lett. 152:345-347.

Yousten. A..A., de Barjac. H., Hedrick. J., Cosmao-Dumonair V., and Myers. P. 1980. Comparison between bacteriophage typing and serotyping for the differentiation of Bacillus sphaericus strains. Ann. Microbiol. 131B: 297-308.

Yousten. A. A. 1984a. Bacillus sphaericus: Microbiological factors related to its potential as a mosquito larvicide. Adv. Biotechnol. Processes 3: 315-343.

Yousten. A. A. 1984b. Bacteriophage typing of mosquito pathogenic strains of Bacillus sphaericus. J. Invertebr. Pathol. 43:124-125.

82