Entschlüsselung Des Genoms Von Gluconobacter Oxydans 621H – Einem Bakterium Von Industriellem Interesse
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Entschlüsselung des Genoms von Gluconobacter oxydans 621H – einem Bakterium von industriellem Interesse Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Georg-August-Universität zu Göttingen vorgelegt von Christina Prust aus Göttingen Göttingen, 2004 D7 Referent: Prof. Dr. G. Gottschalk Korreferent: Prof. Dr. U. Deppenmeier Tag der mündlichen Prüfung: 29. Juni 2004 für meinen Mann Jörg Inhaltsverzeichnis I INHALTSVERZEICHNIS ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG 1 2 MATERIAL UND METHODEN 5 2.1 Organismen und Plasmide 5 2.2 Nährmedien, Puffer und Stammlösungen 6 2.2.1 Komplexmedien 6 2.2.2 Antibiotika und Medienzusätze 7 2.3 Kultivierung und Stammhaltung von Mikroorganismen 7 2.3.1 Zellanzucht 7 2.3.2 Stammhaltung 7 2.3.3 Reinheitskontrolle 8 2.4 Messung der optischen Dichte 8 2.5 Standardtechniken für das Arbeiten mit Nukleinsäuren 8 2.5.1 Behandlung von Geräten und Lösungen 8 2.5.2 Reinigung und Konzentrierung von Nukleinsäuren 9 2.5.2.1 Phenol/Chloroform-Extraktion 9 2.5.2.2 Fällung von Nukleinsäuren 9 2.5.3 Konzentrationsbestimmung und Reinheitskontrolle von DNA 9 2.5.4 Standard-Agarosegelelektrophorese 10 2.5.5 Größenbestimmung von Nukleinsäuren 11 2.6 Isolierung von Nukleinsäuren 12 2.6.1 Isolierung genomischer DNA mit dem AquaPure GenomicDNA Kit 12 Inhaltsverzeichnis II 2.6.2 Isolierung genomischer DNA mit CTAB 13 2.6.3 Isolierung von Plasmid-DNA 14 2.6.4 Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen 14 2.6.5 Aufreinigung von PCR-Produkten 15 2.6.6 Phenol-Chloroform-Extraktion 15 2.7 Enzymatische Modifikation von DNA 16 2.7.1 Spaltung von DNA durch Restiktionsendonukleasen 16 2.7.2 Dephosphorylierung von DNA-Fragmenten 16 2.7.3 Herstellung von stumpfen Enden 17 2.7.4 Ligation von DNA Fragmenten 17 2.8 Übertragung von DNA in E. coli und Selektion rekombinanter Klone 17 2.8.1 Herstellung von transformationskompetenten E. coli-Zellen (INOUE et al., 1990) 17 2.8.2 Transformation von E. coli DH5α durch Hitzeschock 18 2.8.3 Transformation von E. coli durch Elektroporation 18 2.8.4 Selektion rekombinanter Klone durch den Blau-Weiß-Test 19 2.9 In vitro-Amplifikation von DNA durch Polymerasekettenreaktion (PCR) 20 2.10 Sequenzierung von DNA 21 2.11 Die Prozessierung von Rohsequenzen 22 2.11.1 Einführund in das Staden Package 22 2.11.2. Das Pregap4 Interface 22 2.11.3 Gap4 23 2.11.3.1 Der Contig Editor 24 2.11.3.2 Das Template Display 24 2.12 Methoden zur Überwindung von Sequenzlücken in einem Genomsequenzierungsprojekt 25 Inhaltsverzeichnis III 2.12.1. Identifikation von Contigüberlappungen mittels Gap4 oder BLASTN 26 2.12.2 Lückenschluss durch Walkings auf Plasmiden 26 2.12.3 Lückenschluss mit Hilfe von PCR 27 2.12.3.1 Auf der Cosmid-Genbank basierende PCR 27 2.12.3.2 Kombinatorische PCR 27 2.13 Auffinden repetiver Sequenzen 28 2.13.1 Identifikation repetiver Sequenzen mit Hilfe von und Gap4 28 2.13.2 Auffinden repetitiver Sequenzen mit Hilfe von RepVis und BLASTN 29 2.14 Sequenzanalyse 29 2.14.1 ORF-Vorhersage 30 2.14.2 Genomweite Annotation mit ERGO 31 2.15 Bezugsquellen für Biochemikalien und Enzyme 33 3 EXPERIMENTE UND ERGEBNISSE 35 3.1 Vorarbeiten und Überblick über die Strategie des Sequenzierungsprojekts 35 3.2 Editieren der Rohsequenzen 37 3.3 Lückenschluss 41 3.3.1 Lückenschluss durch Walkings und BLASTN 42 3.3.2 Erstellen eines „Supercontigs“ 43 3.3.3 Kombinatorische Ansätze 46 3.3.4 Abschluss der Sequenzierung 47 3.4 Identifizierung von Plasmiden 50 3.4.1 Auffinden der Plasmide mit Hilfe von Gap4 50 3.4.2 Isolierung der identifizierten Plasmide 51 Inhaltsverzeichnis IV 3.4.3 Analyse der Plasmide 54 3.4.3.1 Analyse von pGOX1 54 3.4.3.2 Analyse von pGOX2 57 3.4.3.3 Analyse von pGOX3 58 3.4.3.4 Analyse von pGOX4 59 3.4.3.5 Analyse von pGOX5 59 3.5. Analyse des Chromosoms von G. oxydans 60 3.5.1 Allgemeine Merkmale des Chromosoms 60 3.5.1.1 ORF-Vorhersage und Übersicht über die Annotation 62 3.5.2 Identifizierung des Replikationsursprungs 64 3.6 Rekonstruktion des Stoffwechsels 66 3.6.1 Transportsysteme in G. oxydans 67 3.6.1.1 Erleichterte Diffusion 68 3.6.1.2 ABC-Transporter 68 3.6.1.3 Symporter und Antiporter 69 3.6.1.4 Permeasen 70 3.6.2 Substratverwertung 71 3.6.2.1 Glykolyse und Gluconeogenese 72 3.6.2.2 Pentosephosphat-Weg 74 3.6.2.3 Entner-Doudoroff-Weg (KDPG-Weg) 77 3.6.2.4 Zitratzyklus 79 3.6.3 Biosynthese der Aminosäuren 81 3.6.3.1 Biosynthese von Histidin 81 3.6.3.2 Biosynthese der aromatischen Aminosäuren Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan 84 3.6.3.3 Biosynthese von Serin, Glycin und Cystein 86 3.6.3.4 Biosynthese von Alanin, Leucin, Isoleucin und Valin 87 3.6.3.5 Biosynthese von Aspartat, Asparagin, Lysin, Threonin und Methionin in G. oxydans 89 3.6.3.6 Biosynthese von Glutamin, Glutamat, Prolin und Arginin in G. oxydans 91 3.6.4 Transhydrogenasen 92 Inhaltsverzeichnis V 3.6.4.1 Analyse der Transhydrogenase aus G. oxydans 93 3.6.5 Membrangebundene Prozesse 97 3.6.5.1 Rekonstruktion der Atmungskette 97 3.6.5.2 Die ATP-Synthase 101 3.6.6 Dehydrogenasen 102 3.6.6.1 Pyrrolochinolin Chinon (PQQ) 107 3.7 Abschließende Bemerkungen 108 4 DISKUSSION 110 4.1 Mobile Elemente 110 4.2 Betrachtungen zur Energiekonservierung 114 4.3 Chinoproteine 119 4.3.1 Allgemeine Merkmale von Chinoproteinen 120 4.3.2 PQQ-abhängige Proteine aus G. oxydans 123 4.3.2.1 Die membrangebundene Alkohol-Dehydrogenase aus G. oxydans 124 4.3.2.2 Chinat-Dehydrogenase 126 4.3.3 Der Cofaktor PQQ 128 4.4 G. oxydans im Dienst der Biotechnologie 129 4.4.1 Essigsäureproduktion 130 4.4.2 Produktion von Vitamin C 131 4.4.3 Miglitol und 1-Deoxynojirimycin 136 4.4.4 Produktion von Dihydroxyaceton 138 4.4.5 Produktion von Xylitol 139 4.4.6 Produktion von Gluconat und Ketogluconaten durch G. oxydans 142 4.4.6.1 Membrangebundene Produktion von Ketogluconaten 142 4.4.6.2 Cytoplasmatische Produktion von Ketogluconaten 144 4.5 Ausblick 148 Inhaltsverzeichnis VI 5 ZUSAMMENFASSUNG 149 6 LITERATURVERZEICHNIS 152 Abkürzungsverzeichnis VII Abkürzungsverzeichnis A. Acinetobacter °C Grad Celsius A Adenin Abb. Abbildung ABC ATP-bindende Kassette, ATP-binding cassette AICAR 5’-Phospho-Ribosyl-5-Amino-4-Imidazol-Carboxamid Amp Ampicillin ATP Adenosintriphosphat BLAST Basic Local Alignment Search Tool BLASTN BLAST auf Nukleotidebene BLASTP BLAST auf Proteinebene bp Basenpaar bzw. beziehungsweise C Cytosin C- Carboxy ca. circa cm Zentimeter CoA Coenzym A Da Dalton DH Dehydrogenase DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure dNTP Desoxyribonukleotid-5’-triphosphat E. Escherichia ed(s). Herausgeber EDTA Etylendiamintetraessigsäure einschl. einschließlich et al. et alteri (und andere) Fa. Firma FAD Flavinadenindinukleotid G Guanin g Gramm Abkürzungsverzeichnis VIII G. Gluconobacter Gap Genomassemblierungsprogramm, genome assembly program H2Odest. destilliertes Wasser Hrsg. Herausgeber IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid IS Insertionssequenz(en) k Kilo kb Kilobasenpaare l Liter µ Mikro (106) M Molar (Mol pro Liter) Mb Megabasenpaare min Minute mod. modifiziert N- Amino- NAD(P) Nicotinadenindinukleotid(phosphat) NCBI National Center for Biotechnology Information OD Optische Dichte ORF “open reading frame”, offener Leserahmen P. Pseudomonas PCR Polymerasekettenreaktion pH negativer dekadischer Logarithmus der Protonenkonzentration PQQ Pyrrolochinolinchinon PRPP 5-Phosphoribosyl-1-Pyrophosphat R. Rhizobium RNA Ribonukleinsäure rRNA Ribosomale Ribonukleinsäure RT Raumtemperatur s. siehe S. Sinorhizobium SDS Natriumdodecylsulfat sp. Spezies TAE Tris-Acetat-EDTA TE Tris-EDTA Abkürzungsverzeichnis IX Tm Schmelztemperatur U Unit (Einheit der Enzymaktivität) u.a. unter anderem u.s.w. und so weiter v/v Volumen pro Volumen vgl. vergleiche w/v Masse pro Volumen X-Gal 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-galactosid z. B. zum Beispiel Aminosäuren A Ala Alanin M Met Methionin C Cys Cystein N Asn Asparagin D Asp Aspartat P Pro Prolin E Glu Glutamat Q Gln Glutamin F Phe Phenylalanin R Arg Arginin G Gly Glycin S Ser Serin H His Histidin T Thr Threonin I Ile Isoleucin V Val Valin K Lys Lysin W Trp Tryptophan L Leu Leucin Y Tyr Tyrosin Einleitung 1 1 EINLEITUNG Gluconobacter-Arten gehören, zusammen mit Vertretern der Gattungen Acetobacter und Gluconacetobacter, zu der Familie der Acetobacteriaceae. Sie unterscheiden sich von denen der Gattung Acetobacter dadurch, dass sie Acetat und Lactat nicht zu Kohlendioxid und Wasser oxidieren können (DE LEY et al., 1984). Während die Produktion von Essigsäure aus Ethanol vor allem durch Organismen der Gattung Acetobacter besonders effizient ist, dominieren Gluconobacter Spezies bei der Oxidation verschiedener Zucker. Essigsäurebakterien sind strikt aerobe, Gram-negative, stäbchenförmige Bakterien, welche der α-Subklasse der Proteobakterien zugeordnet werden. Gluconobacter-Arten sind durch polar angeordnete Flagellen schwach beweglich. Im Gegensatz dazu sind Vertreter der Gattung Acetobacter peritrich begeißelt (LEISINGER, 1965). In der Natur findet man Gluconobacter Spezies vor allem auf Früchten und in alkoholischen Getränken wie Bier und Wein. Dabei tragen sie durch die Säureproduktion auch zum Verderben der Getränke und Früchte bei. Die optimale Wachstumstemperatur beträgt 25-30 °C bei einem pH-Wert von 5,5-6. Viele Gluconobacter-Stämme sind jedoch auch in der Lage, in einem Komplexmedium bei einem konstanten pH-Wert von 2,5 zu wachsen (DEPPENMEIER et al., 2002; MACAULEY et al., 2001; GUPTA et al., 2001). In der Regel oxidieren aerobe Mikroorganismen ihre Kohlenstoffquelle vollständig zu Kohlendioxid und Wasser. Bei diesem Abbauprozess werden sowohl Energie als auch Intermediärprodukte für die Biosynthese von Zellbestandteilen generiert. Nur unter ungünstigen Wachstumsbedingungen (Substratüberangebot, Spurenelementlimitierung oder in Anwesenheit von toxischen Verbindungen bzw. von Inhibitoren) werden die Substrate von einigen Bakteriengruppen unvollständig oxidiert.