Monogenea Sladkovodních a Brakických Ryb Čeledi Tetraodontidae: Prostorová Distribuce Na Úrovni Mikrohabitatu Hostitele

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BOTANIKY A ZOOLOGIE

MONOGENEA SLADKOVODNÍCH A BRAKICKÝCH

RYB ČELEDI TETRAODONTIDAE: PROSTOROVÁ

DISTRIBUCE NA ÚROVNI MIKROHABITATU

HOSTITELE

Diplomová práce

Bc. Jana Kneysová

Vedoucí práce: Mgr. Eva Řehulková, Ph.D. Brno 2017

Bibliografický záznam

Autor: Bc. Jana Kneysová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav botaniky a zoologie

Název práce: Monogenea sladkovodních a brakických ryb čeledi Tetraodontidae: prostorová distribuce na úrovni mikrohabitatu hostitele

Studijní program: Ekologická a evoluční biologie

Studijní obor: Zoologie

Vedoucí práce: Mgr. Eva Řehulková, Ph.D.

Akademický rok: 2016/2017

Počet stran: 67

Klíčová slova: Monogenea, Dactylogyridae, Thylacicleidus, Tetraodontidae, Dichotomyctere, prostorová distribuce, post-larvální vývoj, ekologická nika, mikrohabitat, žaberní aparát, segregace nik, vnitrodruhová interakce, mezidruhová kompetice

Bibliographic Entry

Author: Bc. Jana Kneysová Faculty of Science, Masaryk University Department of Botany and Zoology

Title of Thesis: Monogeneans of fresh and brakish water fishes of the Tetraodontidae: spatial distribution and microhabitat host specifity

Degree programme: Ecological and Evolutionary Biology

Field of Study: Zoology

Supervisor: Mgr. Eva Řehulková, Ph.D.

Academic Year: 2016/2017

Number of Pages: 67

Keywords: Monogenea, Dactylogyridae, Thylacicleidus, Tetraodontidae, Dichotomyctere, spatial distribution, post-larval development, ecological niche, microhabitat, gill aparatus, niche segregation, intraspecific interaction, interspecific competition

Abstrakt

V této diplomové práci byla studována prostorová distribuce dvou druhů monogeneí, Thylacicleidus latus a Thylacicleidus serendipitus (Dactylogyridae), parazitujících na čtverzubci zeleném Dichotomyctere nigroviridis (Tetraodontidae). Druhy rodu Thylacicleidus jsou charakteristické příchytným aparátem (tzv. haptorem), který nese tyto sklerotizované struktury: dva páry středních háčků spojené destičkami a sedm párů marginálních háčků. Vzhledem k tomu, že se tyto struktury během ontogeneze objevují postupně, lze předpokládat, že strategie přichycení těchto parazitů se bude v závislosti na stupni vývoje měnit. Jedním z cílů této práce proto bylo charakterizovat změny ve struktuře haptoru během ontogenetického vývoje studovaných monogeneí. Byla rozlišena celkem čtyři post-larvální stadia (J1 – J4) charakterizovaná objevením těchto struktur: J1, pouze 14 okrajových háčků; J2, základy středních háčků (dorzální a ventrální); J3, základy ventrální destičky; J4, základy dorzální destičky. Ve druhé části práce byla analyzována prostorová distribuce post-larválních a adultních stadií v rámci žaberního aparátu. Byla zjištěna preference proximálních částí žaber ranými vývojovými stadii (J1) a preference 1. žaberního oblouku téměř dospělými jedinci (J4). Adultní monogenea žádnou zvláštní preferenci mezi jednotlivými oblouky nevykazovala. U druhu T. serendipitus byla pozorována silná preference distálních částí žaber a intraspecifická agregovanost. Naopak druh T. latus byl více abundantní ve středních částech žaberních oblouků, ze statistického hlediska ale nepreferoval žádný mikrohabitat. Šířka niky byla podstatně menší u druhu T. serendipitus. Pozitivní vztah mezi šířkou niky a abundancí u obou druhů a stupeň agregovanosti druhu T. serendipitus potvrzují hypotézu, že na prostorovou distribuci monogeneí mají vliv především intraspecifické faktory, které narůstají v důsledku segregace nik.

Abstract

This thesis deals with the spatial distribution of two monogenean species, Thylacicleidus latus and Thylacicleidus serendipitus (Dactylogyridae), parasitizing green spotted puffer Dichotomyctere nigroviridis (Tetraodontidae). Species of Thylacicleidus are characterised by an attachment apparatus (haptor) possessing the following sclerotised structures: two pairs of anchors joined by medial bars and seven pairs of marginal hooks. These haptoral structures appear gradually during parasite ontogeny and, therefore, attachment strategies vary depending on developmental age. One of the main aims of this thesis was to study the developmental changes of the above mentioned species of Thylacicleidus. Throughout the gradual development of the sclerotised structures, four post-larval phases (J1 - J4) were distinguished: J1, with only 14 marginal hooks; J2, with anchors (ventral and dorsal) formed; J3, with ventral bar formed; and J4, with dorsal bar formed. The second aim of this study was to investigate monogenean distribution patterns to account for potential differences in post-larval stages and adult parasite distribution on the gills. The early post-larval stages (J1) exhibited a preference for proximal parts of the gills and the first gill arch was preferred by almost adult stages (J4). No preferences in the distribution of adults were found among gill arches. Adults of Thylacicleidus serendipitus showed significant site preference for distal parts of gills and also highly aggregated distribution over microhabitats. There were no significant microhabitat preferences by adults of T. latus although they were expected based on observed higher abundances in the middle parts of the gills. The niche breadth was narrower for specimens of T. serendipitus than for those of T. latus, and in both species it increased with abundances. This correlation between niche breadth and abundances along with aggregated distribution confirm the hypothesis that the site selection is influenced by intraspecific factors which resulted from niche segregation.

Poděkování

Na tomto místě bych chtěla poděkovat vedoucí mé práce Mgr. Evě Řehulkové, Ph.D. za její pozitivní přístup, odborné vedení a výběr velice sympatického tématu. Dále bych chtěla poděkovat všem z oddělení parazitologie PřF MU, kteří mi během vypracování této diplomové práce byli nápomocni, zvláště pak Mgr. Nikol Kmentové za profesionální rady, poskytnuté zázemí, Mgr. Jiřímu Vorlovi za pomoc s řešením technických problémů a psychickou oporu a doc. RNDr. Andree Vetešníkové Šimkové, Ph.D. za produktivní konzultace. V neposlední řadě děkuji své rodině a přátelům za podporu a víru, kterou ve mně vložili, a sdílené pevné nervy v krizových situacích.

Prohlášení

Prohlašuji, že jsem svoji diplomovou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.

Brno 2. května 2017 ……………………………… Jméno Příjmení

ÚVOD A CÍLE PRÁCE ...... 11

LITERÁRNÍ PŘEHLED ...... 13

1 Tetraodontidae (čtverzubcovití) ...... 13

1.1 Základní charakteristika ...... 14

1.2 Sladkovodní a brakické druhy využívané v současné akvaristice...... 16

2 Monogenea (žábrohlísti) ...... 17

2.1 Biologie a parazito-hostitelské vztahy ...... 18

3 Monogenea parazitující na rybách čeledi Tetraodontidae ...... 24

3.1 Check-list PARAZIT – HOSTITEL ...... 24

3.2 Check-list HOSTITEL – PARAZIT ...... 28

MATERIÁL A METODIKA ...... 30

1 Parazitologické vyšetření ryb ...... 30

2 Sběr a fixace monogeneí...... 32

3 Stanovení lokalizace monogeneí ...... 32

4 Determinace monogeneí ...... 33

4.1 Determinace post-larválních (juvenilních) stadií ...... 33

5 Zpracování výsledků a hodnocení dat ...... 34

VÝSLEDKY ...... 36

1 Morfologicko-taxonomické vyhodnocení nalezených monogeneí...... 36

1.1 Post-larvální vývoj přichycovacích struktur haptoru monogeneí rodu Thylacicleidus ...... 36

2 Prostorová distribuce monogeneí rodu Thylacicleidus ...... 41

2.1 Prostorová distribuce adultů a juvenilů na úrovni orgánů...... 41

2.2 Prostorová distribuce post-larválních stadií na žaberním aparátu ...... 42

2.3 Prostorová distribuce druhů Thylacicleidus serendipitus a Thylacicleidus latus… ...... 45

9 2.4 Ekologická nika druhu T. serendipitus a T. latus ...... 50

DISKUZE ...... 52

1 Prostorová distribuce monogeneí rodu Thylacicleidus ...... 53

1.1 Preference mikrohabitatu post-larválních (juvenilních) stadií ...... 53

1.2 Prostorová distribuce adultních stadií ...... 55

SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY ...... 58

10 ÚVOD A CÍLE PRÁCE

Monogenea představují jednu ze tří skupin výhradně parazitických neodermálních ploštěnců. Převážná část těchto parazitů cizopasí na kůži, ploutvích a žábrách ryb. Díky přímému vývojovému cyklu bez účasti mezihostitele a krátké době při přeměně larválního stadia v dospělce je jejich generační perioda poměrně krátká. Dochází tak k rychlému namnožení, zejména pak v podmínkách intenzivních chovů. Tato schopnost je v literatuře často popisována u živorodých monogeneí (Bakke et al. 2007), masivní invaze v chovech ryb však nejsou výjimkou ani u vejcorodých monogeneí, například těch parazitujících na rybách čeledi Tetraodontidae (Okamoto 1963; Ogawa & Inouye 1997; Řehulková & Gelnar 2005). Monogenea jsou obecně považována za cizopasníky s úzkou specifitou, a to nejen na druh hostitele, ale také na místo (mikrohabitat) svého přichycení na daném hostiteli či orgánu. Preference určitého mikrohabitatu může být ovlivněna celou řadou biotických (vnitrodruhové a mezidruhové interakce monogeneí, stáří a imunita hostitele) a abiotických faktorů (např. intenzita proudění a teplota vody). Zcela zásadní vliv na výběr a udržení se na daném mikrohabitatu mají morfologické vlastnosti jednotlivých druhů, zejména pak stavba přichycovacího aparátu, tzv. haptoru. Vzhledem k tomu, že struktura haptoru (resp. jeho sklerotizovaných částí) se během ontogenetického vývoje mění, lze předpokládat, že rovněž jednotlivá vývojová stadia monogeneí budou preferovat odlišné mikrohabitaty.

Předkládaná diplomová práce se zaměřuje na studium prostorové distribuce cizopasníků na úrovni mikrohabitatu hostitele, a to ve vztahu k druhové příslušnosti a stupni ontogenetického vývoje monogeneí parazitujících na rybách čeledi Tetraodontidae. Modelovým druhem hostitele byl Dichotomyctere nigroviridis, který je v rámci českého, i evropského, trhu s akvarijními rybami nejčastěji nabízeným a poměrně snadno dostupným čtverzubcem.

11 Hlavní cíle diplomové práce: 1. Sestavit check-list monogeneí parazitujících na rybách čeledi Tetraodontidae ve formě parazit-hostitel a hostitel-parazit. 2. Provést morfologicko-taxonomické zhodnocení monogeneí nalezených na čtverzubcích dostupných na území ČR. 3. Charakterizovat změny ve struktuře haptoru během post-larválního vývoje monogeneí rodu Thylacicleidus. 4. Analyzovat prostorovou distribuci monogeneí rodu Thylacicleidus na úrovni mikrohabitatu hostitele.

12 LITERÁRNÍ PŘEHLED

1 Tetraodontidae (čtverzubcovití)

Čeleď Tetraodontidae je jednou z 9 čeledí řádu Tetraodontiformes (Teleostei, Actinopterygii), přičemž za její sesterskou skupinu je považována čeleď Diodontidae (Nelson 2006; Yamanoue et al. 2011). Její zástupci jsou rozšířeni v tropickém a subtropickém pásmu, ojediněle se vyskytují i v mírném pásmu, ale nikdy ve studených vodách (Obr. 1). Z celkového počtu dosud popsaných 200 druhů (29 rodů) se pouze 81 druhů vyskytuje i mimo slané vody (Froese & Pauly 2016). Některé mořské druhy se totiž mohou během života pohybovat v brakických vodách nebo mohou mít dokonce sladkovodní juvenilní stadia (Ebert 2001). Za čistě sladkovodní je pak považováno asi 34 druhů (viz Obr. 1; Froese & Pauly 2016), z nichž některé představují významný artikl obchodu s exotickými akvarijními rybami (Burgess et al. 1988; Baensch & Fischer 1998). Kromě akvaristiky jsou však tyto ryby objektem zájmu i ve vědě.

Obr. 1 Světové rozšíření mořských/brakických (vyznačeno černobíle) a sladkovodních (vyznačeno barevně) zástupců čeledi Tetraodontidae: sladkovodní rody jsou uvedeny s počtem zastoupených druhů v závorce - nejsou mezi ně zahrnuty druhy s diadromní migrací (Yamanoue et al. 2011; Froese & Pauly 2016), upraveno.

13 Díky malému genomu představují vhodné modelové organismy při výzkumu evolučních procesů (např. druhy Takifugu rubripes, Dichotomyctere nigroviridis) (Yamanoue et al. 2011). Z ekologického hlediska jsou pak některé druhy využívány v biologickém boji proti invazivním druhům plžů (např. D. nigroviridis v Číně k redukci plže Pomacea canaliculata; Guo et al. 2016).

1.1 Základní charakteristika

I když se zástupci čtverzubcovitých řadí spíše mezi menší ryby a často nepřesahují velikost 20 cm (Froese & Pauly 2016), mohou se mezi nimi vyskytovat i druhy dosahující až 90 cm. Tělo má torpédovitý tvar a je kryto velmi elastickou kůží, která je buď zcela holá, nebo se zanořenými šupinami ve formě trnů v oblasti břicha. Charakteristickou vlastností těchto ryb je schopnost enormního zvětšení objemu těla (Nelson 2006). V rámci obranné reakce začne jedinec polykat vodu (nebo vzduch na souši), která postupně vyplňuje žaludek a ten se rozpíná. Tento proces je umožněn nejen elasticitou kůže a žaludku, ale také velmi flexibilní páteří a absencí dolních žeber a kostry pánevních končetin (Obr. 2). V anglické literatuře jsou čtverzubci díky této vlastnosti označováni jako „puffers“ (Ebert 2001). Zvětšení těla a případné vztyčení trnovitých šupin predátora zastraší nebo mu znemožní spolknutí potenciální kořisti. K odrazení predátora čtverzubci používají i opačný proces – náhlé vypuzení vody proti útočníkovi (Wainwright & Turingan 1997). Kromě tohoto chování vydávají také při obranné reakci zvuky třením čelistí či požerákových zubů, nebo chvěním plynového měchýře. Typickým morfologickým znakem čtverzubcovitých je dopředu vybíhající čelist zobákovitého tvaru, která nese nepravé zuby srostlé v jakési desky. Dojem 4 zubů pak vytváří pouze mediální švy na těchto deskách – jeden na horní a jeden na dolní čelisti (Burgess et al. 1988; Nelson 2006). Hlavními orgány pohybu jsou, na rozdíl od většiny ryb, ploutve hřbetní a řitní se 7-18 měkkými paprsky (Nelson 2006), zatímco ocasní ploutev slouží jako kormidlo a břišní ploutve chybí (Baensch & Fischer 1998). Celý systém koordinace je velmi přesný a umožňuje například i pohyb dozadu či do stran. Nemají skřele a žaberní dutiny vyúsťují těsně před prsními ploutvemi v podobě úzkých štěrbin. Každá žaberní dutina obsahuje pouze 3 žaberní oblouky. (Tyler 1980; Abumandour & Gewaily 2016). Čichový orgán je uložen na temeni hlavy, je velmi nápadný a často druhově specifický. Jeho přesunutí vně těla je vysvětlováno silně vyvinutou svalovinou čelistí, která tak nenechává prostor v ústní dutině smyslovým orgánům. Většina čtverzubců se totiž živí měkkýši a jejich silné čelisti s mohutnou svalovinou umožňují rozkousávání tvrdých

14 schránek. Oči jsou velké, posazené daleko od sebe a pohybují se nezávisle na sobě (Ebert 2001).

Obr. 2 Lagocephalus laevigatus: kostra celého těla (A) (Tyler 1980), jedinec při zvětšení vlastního objemu během obranné reakce (B) (Goode 1884).

Některé druhy této čeledi mají v těle uložený tetrodotoxin (TTX), jeden z nejstarších známých jedů. První zmínky o tomto alkaloidu pocházejí z doby kolem 2700 př. n. l. z Čínské literatury, která hovoří o otravách způsobených konzumací ryb této čeledi – odtud také název tetrodotoxin. Pozdější výzkum ale zaznamenal výskyt tohoto jedu napříč dalšími živočišnými skupinami (od mořských bezobratlých po vodní i suchozemské obratlovce). Dnes se původ TTX přisuzuje spíše bakteriím, zejména zástupcům rodů Vibrio, Shewanella nebo Pseudomonas (Noguchi et al. 1986; Yasumoto et al. 1986; Simidu et al. 1990), přičemž se v tělech ostatních organismů akumuluje pravděpodobně díky potravnímu řetězci (Yoshikawa-Ebesu et al. 2000). Podíl na šíření TTX se přikládá také symbiotickým či parazitickým vztahům (Chulanetra et al. 2011). Teorii o šíření toxinu potravním řetězcem potvrzují i studie, které dokazují postupnou ztrátu toxičnosti mladých ryb a její zpětnou obnovu z potravy během života. Jedinci držení v zajetí, kteří nemají přístup ke své přirozené potravě, toxičtí nebývají. Tetrodotoxin selektivně blokuje přenos nervových signálů (váže se na napěťově řízené sodíkové kanály) a způsobuje tak paralýzy dýchacích cest. Největším

15 problémem je tento jed v Japonsku, kde bývá příčinou několika úmrtí ročně. Japonská kuchyně totiž pokrm z masa čtverzubce (tzv. „fugu“) považuje za delikatesu, a protože jed nelze odstranit tepelnou úpravou, jsou přípravou těchto pokrmů pověření jen zkušení kuchaři (Silva et al. 2012). Toxin je u mořských druhů obsažen především v játrech a vaječnících, u sladkovodních druhů hlavně v kůži. Hromadění této látky je ovlivněno také sezónou. V době rozmnožování je nejvíce koncentrován v gonádách. Toxicita vajíček a plůdku je nejspíš prostředkem obrany, který může vyvolat vyvrácení kořisti predátorem. Některé studie ukazují na schopnost čtverzubců vnímat TTX čichovým orgánem jakožto atraktant pro juvenilní jedince (patrně kvůli zdroji obranného mechanismu) a dospělé samce v době páření (funkce feromonu) (Okita et al. 2013).

1.2 Sladkovodní a brakické druhy využívané v současné akvaristice

I když se v posledních letech zájem o chov mořských druhů výrazně zvýšil, sladkovodní akvaristika má na trhu stále svou výsostnou pozici. Důvodem jsou ekonomické výhody. Převážná část (90 %) mořských druhů pochází z divokých populací, zatímco mnoho sladkovodních druhů je dnes chováno v umělých akvakulturách zřízených nejen v zemích jejich přirozeného výskytu (především Thajsko, Indonésie, Malajsie), ale také v zemích bližších evropským zákazníkům (např. Česká republika, Španělsko, Belgie, Nizozemsko). To podstatně snižuje náklady na transport (Livengood & Chapman 2007). Není proto divu, že většina dnes v akvaristice využívaných čtverzubcovitých pochází ze sladkých vod. Jedná se hlavně o rody Tetraodon (dnes je část druhů nově přeřazena do rodů Dichotomyctere a Pao), Carinotetraodon a Colomesus. Naopak populárními mořskými druhy jsou zástupci rodu Arothron (Froese & Pauly 2016). Čtverzubcovití pocházejí původně z moří. K invazi sladkovodních biotopů došlo nezávisle na sobě minimálně třikrát, a to v Jižní Americe, jihovýchodní Asii a střední Africe. Proto je pro ně typická vysoká tolerance k salinitě (Yamanoue et al. 2011). Tato vlastnost je výhodou při léčbě mykóz či ektoparazitických infekcí, kdy krátkodobým zvýšením salinity vody v akváriu nedochází ani u čistě sladkovodních druhů k nepříznivým reakcím na změnu prostředí. U mnoha mořských druhů žijících v pobřežních zónách je pozorována migrace do brakických až sladkých vod z důvodu páření (Takifugu obscurus, Takifugu ocellatus) nebo se zde vyskytují jejich juvenilní stadia (Chelonodon sp., Arothron sp.). Bohužel, většina čtverzubců je v rámci dnešního akvarijního obchodu nabízena jako druhy sladkovodní, přestože jejich ekologické nároky je řadí mezi čtverzubce brakických vod, tzn. vyžadujících

16 alespoň minimální úroveň salinity. Nejčastěji se jedná o druhy Dichotomyctere nigroviridis (syn. Tetraodon nigroviridis) a Dichotomyctere ocellatus (syn. Tetraodon biocellatus) (Ebert 2001; Yamanoue et al. 2011). Amatérští chovatelé tak často tyto druhy/jedince drží v nevhodných životních podmínkách, což bývá fatální. Míra odolnosti ale záleží i na tom, jak dlouho a v jakém typu přírodního habitatu se konkrétní jedinec vyskytoval, než byl odloven a exportován. Například jedinci žijící v mangrovových oblastech jsou k chovu ve sladkovodním akváriu méně vhodní než jedinci vyskytující se více ve vnitrozemí, daleko od ústí řeky. Typickým brakickým druhem s vysokou variabilitou v odolnosti vůči nevhodným podmínkám je Dichotomyctere nigroviridis, který se dnes do Evropy dováží v masivním množství a jedinci pochází z nejrůznějších lokalit (Ebert 2001). Chov v akvaristických podmínkách sebou nese i další problémy. Čtverzubcovití jsou silně teritoriální a agresivní vůči vlastnímu i ostatním druhům, což je umocněno právě limitovaným prostorem. Další problém souvisí s dostupností vhodné potravy, kterou jsou v přirozeném prostředí měkkýši. Pokud taková potrava chybí, mohou silné zobákovité čelisti, uzpůsobené ke zpracování silných schránek, přerůstat a znemožňovat další příjem potravy. V neposlední řadě je v literatuře zmiňována nesprávná manipulace s těmito rybami. Jestliže je jedinec vytažen z akvária, začne se bránit polykáním vzduchu místo vody. Ten může v žaludku zůstat a jedinec je pak vynášen na hladinu, kde mu hrozí riziko infekce a následné smrti (Ebert 2001).

2 Monogenea (žábrohlísti)

Monogenea (Neodermata, Plathyleminthes) představují jednu ze tří skupin výhradně parazitických neodermálních ploštěnců. Převážná část těchto parazitů (95%) cizopasí na povrchu těla (kůže, ploutve a žábry) sladkovodních a mořských druhů ryb (Euzet & Combes 1998). K přichycení na těle hostitele slouží především zadní část těla, která se nazývá haptor (opisthaptor). Tento orgán je obvykle vybaven sklerotizovanými strukturami, kterými jsou háčky, destičky nebo svorky (Whittington & Chisholm 2008). Obrovská variabilita ve stavbě haptoru a tvaru skleritů je výsledkem úzké adaptace monogeneí na své hostitele, a to nejen na úrovni hostitelské specifity, ale také hostitelského mikrohabitatu. Právě díky těmto vlastnostem jsou monogenea považována za velmi zajímavou skupinu z hlediska studia koevolučních vztahů a adaptačních mechanismů mezi hostiteli a jejich parazity (Poulin 1992a; Kearn 1994; Desdevises & Morand 2002).

17 2.1 Biologie a parazito-hostitelské vztahy

2.1.1 Rozmnožování a ontogeneze monogeneí

Monogenea jsou hermafroditi schopní samooplození (self-fertilization), většinou je ale k produkci životaschopných vajíček potřeba dvou jedinců (cross-fertilization). Samčí reprodukční soustava dozrává dřív a mluvíme tak o hermafroditismu protandrickém (Whittington & Chisholm 2008). Sklerotizované orgány distální části pohlavní soustavy, tedy obvykle vagína a samčí kopulační orgán složený z kopulační trubky (penis, cirrus) a přídatného (podpůrného) aparátu, jsou hodnotnými znaky pro klasifikaci (Pugachev et al. 2009). Vývoj je přímý, tedy bez mezihostitele. Většina zástupců je oviparní a vajíčka jsou uvolňována do vodního prostředí, kde probíhá vývoj embrya po dobu 2 dnů až 3 týdnů. Z vajíčka se uvolní onkomiracidium (obrvená larva), které pomocí smyslových receptorů a cilií aktivně vyhledá hostitele. K přichycení na tělo hostitele slouží sekrety žláz a základ haptoru. Po přisednutí larva odvrhuje povrchové cilie a začne přeměna v dospělce, během které se parazit přesouvá nejčastěji do žaberní dutiny (Whittington & Chisholm 2008; Pugachev et al. 2009). U viviparních zástupců (Gyrodactylus) se v děloze formují dceřiní jedinci až do podoby dospělce, který infikuje přítomného hostitele a nemá tak potřebu aktivně vyhledávat hostitele jiného. Během vývoje v mateřském jedinci se mohou tito potomci již ve stadiu juvenilním asexuálně rozmnožovat a obsahovat vlastní embryo, v některých případech dokonce více embryí několika generací (progenetická polyembryonie). Na rozdíl od ostatních monogeneí dozrává samičí soustava živorodých gyrodaktylů dřív než samčí (protogynie) (Bakke et al. 2007). Velmi vzácně mohou být monogenea i ovoviviparní (Whittington & Chisholm 2008). Díky přímému vývojovému cyklu a krátké době při přeměně onkomiracidia v dospělce je generační doba často velmi krátká. Dochází tak k rychlému namnožení, zejména pak v podmínkách intenzivního chovu. Zástupci podtřídy Polyonchoinea (Monopisthocotylea), jejichž přichycovací orgány obsahují převážně sklerotizované háčky větších rozměrů, jsou obecně považováni za více patogenní. V místě přichycení dochází k poraněním a následné sekundární infekci. Naopak u skupiny Heteronchoinea (Polyopisthocotylea) se parazit přichytí svorkami na žaberní lamely bez mechanického poškození tkáně, ale výrazně ji podráždí. Obranná reakce hostitele vyvolá nadměrnou produkci žaberního hlenu, který tak zamezí dostatečnému přísunu kyslíku (Boeger & Vianna 2006; Whittington & Chisholm 2008).

18 2.1.2 Morfologické změny haptoru během post-larválního vývoje

Jak bylo uvedeno výše, jednohostitelský životní cyklus monogeneí zahrnuje několik vývojových stadií: vajíčko, larvu zvanou onkomiracidium a dospělce. Vývoj z larvy do dospělého jedince (post-larvální vývoj) je ale postupný a kritický pro vytváření příchytného orgánu - haptoru. U nižších monogeneí (Polyonchoinea nebo Monopisthocotylea), je haptor vybaven háčky (střední a okrajové) a často přídatnými strukturami (destičky, squamodisky, lamellodisky). Díky nim jsou monogenea schopná udržet se jak na žábrách, tak na kůži a ploutvích (Kearn 1968). Prost (1963) zjistila, že čerstvě vylíhlé larvy druhu Dactylogyrus anchoratus před migrací do žaber nejprve přichází do styku s kůží hostitele. Krátce po přichycení odhazují svou ciliární epidermis a do žaberní dutiny se následně přemisťují přes skřele. Juvenilní jedinci některých druhů byly dokonce nalezeny v ústní dutině. Vzhledem k tomu, že ta je rovněž lemována epidermis, je možné, že larvy nasáté během dýchání ústní dutinou reagují na tento povrch stejně jako v případě vnějšího povrchu (kůže) a přichytí se. Naopak Sanchez- Garcia et al. (2015) v rámci své studie u druhu Lamellodiscus theroni žádná stadia mimo žaberní aparát nepozorovali. I zde se ale jedinci různých vývojových fází obvykle vyskytovali na specifických částech žaber. Zatímco haptor onkomiracidií slouží k primárnímu „hrubému“ přichycení a umožňuje snazší aktivní pohyb k cílovému orgánu/mikrohabitatu, další post-larvální vývoj směřuje ke zdokonalování haptoru ve smyslu udržet se na hostiteli při působení tlaků prostředí nebo během růstu a rozmnožování. Obývání rozdílných mikrohabitatů a měnící se požadavky na funkci haptoru nutně vedou ke změnám ve strategii (mechanismu) přichycení, a to v závislosti na stupni vývinu jednotlivých skleritů (Sanchez-Garcia et al. 2015). U čerstvě vylíhlých larev jsou vytvořeny jen okrajové háčky (6 párů po okrajích a 7. pár ve středu haptoru), které jsou orientovány ventrálně. Ventrální orientace je ideální k přichycení se k rovnému povrchu, jako je právě kůže nebo báze žaberního oblouku a primární lamely. Spíše výjimečně Kearn (1968) zaznamenal u takto mladých larev i přichycení mezi 2 sekundárními lamelami, přičemž některé háčky byly orientovány na dorzální stranu. V dalších fázích vývoje jsou jedinci přichyceni zpravidla mezi 2 sekundárními lamelami. K udržení se mezi nimi již okrajové háčky samy o sobě nestačí a dominantními strukturami haptoru se stávají střední háčky orientované částečně ventrálně a částečně dorzálně. Tím je zajištěno přitahování sousedních lamel k sobě a redukování jejich odporu, který by

19 znesnadňoval okrajovým háčkům ukotvit haptor na daném místě (Sanchez-Garcia et al. 2015). Kearn (1968) porovnává přichycovací orgány zástupců čeledí Diplectanidae, Tetraonchidae a Dactylogyridae (konkrétně druhy rodu Dactylogyrus; viz Obr. 3 – 7). Na rozdíl od prvních dvou skupin, kde okrajové háčky během post-larválního vývoje téměř nemění svou velikost a nejdůležitějším orgánem přichycení se stávají střední háčky, velikost okrajových háčků daktylogyrů se v průběhu vývoje až zdvojnásobí. Zástupci rodu Dactylogyrus totiž nemají dostatečně vyvinuté ventrální střední háčky a jejich funkci musí přebrat právě háčky okrajové. Jejich důležitost naznačuje také vazba 1. a 2. páru na ventrální destičku, která slouží jako základna pro mohutnější svaly tyto háčky ovládající. U rodů

Obr. 3 – 7 Vývoj příchytného orgánu druhu Dactylogyrus crucifer (syn. Neodactylogyrus crucifer). 3. Volně plovoucí larva – onkomiracidium. 4. Larva bez cilií na kůži hostitele (laterální pohled). 5, 6. Postupné fáze vývoje sklerotizovaných částí haptoru juvenilního jedince. 7. Haptor dospělého jedince. A - ventrální pohled; B - laterální pohled; C - dorzální pohled. Zkratky: c – cilie; d.d. – dorzální destička; d.h. – dorzální střední háček; v.d. – ventrální destička; v.h. – ventrální střední háček; o. – oční skvrna; I – VII – okrajové háčky (Kearn 1968), upraveno.

20 monogeneí s dobře vyvinutými dvěma páry středních háčků je ventrální destička asociovaná právě s párem ventrálním. Pokud jde o rychlost růstu těla juvenilních jedinců, tak ten se nápadněji zvyšuje po vytvoření všech skleritů. Je to dáno tím, že v raných fázích vývoje je nejvyšší prioritou parazita udržet se na hostiteli. Až po dosažení stabilního přichycení může jedinec investovat do růstu a reprodukce s jistotou, že ho haptor na hostiteli udrží (Sanchez-Garcia et al. 2015).

2.1.3 Distribuce monogeneí na úrovni hostitelské specifity a mikrohabitatu hostitele

Monogenea lze rozdělit do dvou hlavních skupin, a to na specialisty (= druhy omezené pouze na jeden hostitelský druh) a generalisty (= druhy parazitující na dvou a více druzích hostitelů). Pro jednohostitelské parazitické druhy Euzet & Combes (1980) zavedli termín “striktní specialista”. Druhy parazitující na dvou či více kongenerických druzích hostitelů jsou potom označovány za specialisty (Šimková et al. 2006). Převážná část monogeneí parazitujících na žábrách patří mezi specialisty. Monogenea parazitující na povrchu těla (Gyrodactylus) jsou častěji schopna napadnout širší spektrum druhů (polyxenní specifičnost; generalisti) (Buchmann & Uldal 1997; Whittington et al. 2000). Kromě hostitelské specifity se monogenea vyznačují i specifitou orgánovou, a to do té míry, že některé druhy se specializují dokonce na konkrétní mikrohabitaty na daném orgánu (Smyth & Halton 1983; Turgut et al. 2006; Whittington & Chisholm 2008).

2.1.3.1 Prostorová distribuce monogeneí na žaberním aparátu hostitele

Existuje celá řada prací, z nichž vyplývá, že monogenea preferují určitou oblast žaberního aparátu hostitele a jejich lokalizace tedy není náhodná (Gutierrez & Martorelli 1999; Šimková et al. 2000; Rubio-Godoy & Tinsley 2002; Kadlec et al. 2003; Soler-Jiménez & Fajer-Ávila 2012). Avšak není zcela jednoznačné, jaká je příčina této preference. Zásadní roli mohou hrát různé biotické a abiotické faktory (Soler-Jiménez & Fajer-Ávila 2012). Nejčastěji zmiňovaným abiotickým faktorem je průtok vody jednotlivými žaberními oblouky. Nejsilnější proud a tedy i nejefektivnější okysličování bylo pozorováno na prostředních obloucích (II a III), kde zároveň někteří autoři zaznamenali vysoké abundance monogeneí (Rubio-Godoy & Tinsley 2002; Soler-Jiménez & Fajer-Ávila 2012). Mnozí z nich se domnívají, že variabilita v objemu vody proudícím přes jednotlivé žaberní oblouky může ovlivňovat počet příležitostí monogeneí k jejich přichycení na žaberním aparátu (Llewellyn 1956). Rubio-Godoy & Tinsley (2002) zaznamenali rozdílné preference

21 v lokalizaci dospělých jedinců a larválních stadií. Domnívají se, že obrvené larvy osídlující žaberní aparát právě prostřednictvím proudění vody (Llewellyn 1963) se vyskytují na určitých obloucích nezávisle na vlastnostech druhu a až po vytvoření esenciálních částí haptoru migrují mezi oblouky do míst preferovaných adulty. Kromě síly průtoku a objemu vody je zvažován také význam rozdílné velikosti jednotlivých oblouků (Wootten 1974; Gutierrez & Martorelli 1999), přičemž největší plochu mají opět střední části žaberního aparátu (Soler-Jiménez & Fajer-Ávila 2012). Mezi těmito faktory existuje zřejmá souvislost (oba definují příležitosti k přichycení) a distribuci monogeneí ovlivňují společně (Gutierrez & Martorelli 1999). Rozdílná prostorová distribuce může být způsobena také sezónní variabilitou (Turgut et al. 2006). Při vyšších teplotách je urychlena reprodukce a vývoj, což má vliv na abundanci druhu a nepřímo i na preferovaný mikrohabitat tím, že se zvyšuje vnitrodruhová, případně mezidruhová kompetice (Rubio-Godoy & Tinsley 2002). Velká část autorů se zaměřuje na vnitrodruhové a mezidruhové interakce ovlivňující prostorovou distribuci monogeneí. Koexistence druhů využívajících podobné zdroje je umožněna jen v případě, že dojde k rozrůznění a specializaci nik, včetně morfologické diferenciace kongenerických druhů nebo prostorové segregace (Šimková et al. 2002). Rohde & Hobbs (1986 in Kadlec et al. 2003) poukázali na fakt, že druhy sdílející jak stejného hostitele tak stejný mikrohabitat se výrazně liší morfologií samčího kopulačního orgánu, a naopak druhy s oddělenými mikrohabitaty měly tyto orgány téměř identické. Z toho lze odvozovat, že cílem prostorové segregace je posílení reprodukčních bariér, tedy reprodukční izolace druhů jako prostředek zamezující hybridizaci a snižování mezidruhové kompetice (Šimková et al. 2002; Kadlec et al. 2003; Turgut et al. 2006; Soler-Jiménez & Fajer-Ávila 2012). Mnoho potenciálních nik rybích ektoparazitů je ale pravděpodobně prázdných a mezidruhová kompetice by neměla mít na jejich segregaci takový vliv (Rohde 1979). Většina současných prací se proto zabývá vnitrodruhovými faktory jako je intraspecifická agregace v souvislosti se zvyšováním příležitostí k páření (Kadlec et al. 2003; Rubio-Godoy & Tinsley 2002; Soler-Jiménez & Fajer-Ávila 2012). Příčina segregace druhů na úrovni mikrohabitatu je často zkoumána ve vztahu k abundanci parazitického druhu. Například Kadlec et al. (2003) uvádí, že v případě nízkých abundancí je důvodem vymezení mikrohabitatu intraspecifická agregovanost, zatímco v případě vysokých abundancí je to interspecifická segregace. Při středních abundancích se jeví distribuce monogeneí jako náhodná (Šimková et al. 2000).

22 Vliv na lokalizaci monogeneí mají také odlišné ekologické nároky a morfologické vlastnosti jednotlivých druhů, například stavba přichycovacího aparátu (Rohde 1991; Šimková et al. 2000; Soler-Jiménez & Fajer-Ávila 2012). Druhy žijící v překrývajících se nikách mají totiž podobné přichycovací orgány, což souvisí s teorií o podobnosti druhů s obdobnými ekologickými nároky (Šimková et al. 2002). Kromě toho působí na prostorovou distribuci i biologie samotného hostitele. Některé práce zmiňují migraci parazitů indukovanou imunitními reakcemi hostitele (Rubio-Godoy & Tinsley 2002; Buchmann & Bresciani 1998) nebo pozitivní vztah mezi abundancí a velikostí/stářím hostitele (Gonzalez-Lanza & Alvarez-Pellitero 1982). Je také důležité si uvědomit, že preferenci mikrohabitatu nikdy neovlivňuje jen jeden faktor a většina jich působí synergicky (Gutierrez & Martorelli 1999). Žaberní aparát ryb je komplexem mikrohabitatů na několika úrovních. Je možné analyzovat preferenci mezi žaberními oblouky nebo dokonce mezi jednotlivými sektory v rámci každého oblouku zvlášť (Gelnar 1990). Výjimečně lze sledovat rozdíl mezi žaberním aparátem pravé a levé strany těla hostitele. Příkladem jsou druhy Dactylogyrus amphibothrium (Wootten 1974) a Microcotyle mugilis preferující pravou stranu a Metamicrocotyle cephalus preferující levou stranu (El Hafidi et al. 1998).

23 3 Monogenea parazitující na rybách čeledi Tetraodontidae

Dosud bylo na 17-ti druzích ryb čeledi Tetraodontidae popsáno 21 druhů monogeneí zařazených do 6 rodů: Ancyrocephalus (1 druh), Diclidophora (1 druh), Haliotrema (2 druhy), Heterobothrium (13 druhů), Neobenedenia (1 druh) a Thylacicleidus (3 druhy).

Třída Monogenea Bychowsky, 1937 Podtřída Polyonchoinea Bychowsky, 1937 Řád Dactylogyridea Bychowsky, 1937 Čeleď Dactylogyridae Bychowsky, 1933 Rod Ancyrocephalus Creplin, 1839 Rod Haliotrema Johnston & Tiegs, 1922 Rod Thylacicleidus Wheeler & Klassen, 1988 Řád Capsalidea Lebedev, 1988 Čeleď Capsalidae Baird, 1853 Rod Neobenedenia Yamaguti, 1963 Podtřída Heteronchoinea Boeger & Kritsky, 2001 Řád Mazocraeidea Bychowsky, 1937 Čeleď Diclidophoridae Cerfrontaine, 1895 Rod Diclidophora Diesing, 1850 Rod Heterobothrium Cerfontaine, 1895

Vzhledem k počtu dnes známých druhů těchto ryb (tj. 200) a předpokladu, že na každý hostitelský druh připadá minimálně jeden odlišný druh monogeneí (Whittington 1998), je zcela zřejmé, že naše současné znalosti týkající se fauny monogeneí parazitujících na rybách čeledi Tetraodontidae jsou značně omezené.

3.1 Check-list PARAZIT – HOSTITEL

V následujícím checklistu jsou zástupci monogeneí řazeny abecedně, a to bez zařazení do klasifikačního systému z důvodu snazší orientace. Systematický přehled monogeneí podle Boeger & Kritsky (1993; 2001) je uveden výše.

1. Ancyrocephalus ornatus Yamaguti, 1968 Hostitel a lokalita: Arothron hispidus, Havaj

24 Lokalizace: žábry Zdroje: (Yamaguti 1968)

2. Diclidophora indica Tripathi, 1959 Hostitel a lokalita: Tetraodon oblongus (= Takifugu oblongus), Indie Lokalizace: žábry Zdroje: (Tripathi 1959)

3. Haliotrema kusafugu Klassen, 1993 Hostitel a lokalita: Takifugu niphobles, Japonsko Lokalizace: žábry Zdroje: (Klassen 1993)

4. Haliotrema obesa (Caballero, Bravo-Hollis & Grocott, 1955) Young, 1968 Synonymum: Tetrancistrum obesum Caballero, Bravo-Hollis & Grocott, 1955 Hostitel a lokalita: Tetraodon hispidus (= Arothron hispidus), Panama1, Austrálie2 Lokalizace: žábry Zdroje: 1(Caballero et al. 1955); 2(Young 1968)

5. Heterobothrium bychowskyi Ogawa, 1991 Synonymum: Heterobothrium tetrodonis sensu Bychowsky et al. (1976) Hostitel a lokalita: Spheroides alboplumbeus (= Takifugu alboplumbeus), Čína Spheroides sp. (= Takifugu sp.), Čína Lokalizace: žábry Zdroje: (Bychowsky et al. 1976)

6. Heterobothrium ecuadori Meserve, 1938 Synonymum: Tagia ecuadori (Meserve, 1938) Sproston, 1946 Hostitel a lokalita: Cheilichthys annulatus (= Sphoeroides annulatus), Ekvádor1, Mexiko4, 7, Panama2 Spheroides formosus (= Guentheridia formosa), Brazílie5 Spheroides sp. (= Sphoeroides sp.), Kostarika3 Lokalizace: žábry Zdroje: 1(Meserve 1938); 2(Caballero et al. 1953); 3(Caballero & Brenes 1957); 4(Lamothe-Argumedo 1967); 5(Buhrnheim 1972); 7(Fajer-Ávila et al. 2004)

7. Heterobothrium elongatum Williams, 1986 Hostitel a lokalita: Torquigener pleurogramma, Austrálie Lokalizace: žábry Zdroje: (Williams 1986)

25 8. Heterobothrium fluviatilis Euzet & Birgi, 1975 Hostitel a lokalita: Tetraodon fahaka (= Tetraodon lineatus), Čad Lokalizace: žábry Zdroje: (Euzet & Birgi 1975)

9. Heterobothrium lamothei Vidal-Martínez & Mendoza-Franco, 2008 Hostitel a lokalita: Sphoeroides testudineus, Mexiko Lokalizace: žábry Zdroje: (Vidal-Martinez & Mendoza-Franco 2008)

10. Heterobothrium lineatus Morsy, Saady, Abdel-Ghaffar, Bashtar, Mehlhorn, Al Quraishy & Adel 2012 Hostitel a lokalita: Tetraodon lineatus, Egypt Lokalizace: žábry, stěna žaberní dutiny Zdroje: (Morsy et al. 2012)

11. Heterobothrium okamotoi Ogawa, 1991 Synonymum: Heterobothrium tetrodonis sensu Okamoto (1963) Hostitel a lokalita: Takifugu rubripes, Japonsko Lokalizace: žábry, stěna žaberní dutiny Zdroje: (Okamoto 1963); (Ogawa 1991)

12. Heterobothrium praeorchis Bychowsky, Mamaev & Nagibina, 1976 Hostitel a lokalita: Spheroides alboplumbeus (= Takifugu alboplumbeus), Čína1 Spheroides vermicularis (= Takifugu vermicularis), Čína1, Japonsko2 Spheroides sp. (= Takifugu sp.), Čína1 Takifugu poecilonotus, Japonsko2 žábry Zdroje: 1(Bychowsky et al. 1976); 2(Ogawa 1991)

13. Heterobothrium shinagawai Ogawa, 1991 Hostitel a lokalita: Takifugu xanthopterus, Japonsko Lokalizace: žábry Zdroje: (Ogawa 1991)

14. Heterobothrium tetrodonis (Goto, 1894) Cerfontaine, 1895 Synonymum: Diclidophora tetrodonis Goto, 1894 Hostitel a lokalita: Tetrodon sp. (Kōyosé-fugu) (=Takifugu pardalis), Japonsko1, 2 Tetrodon sp. (Kogomé-fugu), Japonsko1 Lokalizace: žábry

26 Zdroje: 1(Goto 1894); 2(Ogawa 1991)

15. Heterobothrium tonkinensis Bychowsky, Mamaev & Nagibina, 1976 Hostitel a lokalita: Lagocephalus sceleratus, Čína Spheroides vermicularis (= Takifugu vermicularis), Čína Spheroides sp. (= Takifugu sp.), Čína Lokalizace: žábry Zdroje: (Bychowsky et al. 1976)

16. Heterobothrium torquigeneri Williams, 1986 Hostitel a lokalita: Torquigener pleurogramma, Austrálie Lokalizace: žábry Zdroje: (Williams 1986)

17. Heterobothrium yamagutii Ogawa, 1991 Synonymum: Heterobothrium tetrodonis sensu Yamaguti (1958) Heterobothrium sp. sensu Bychowsky et al. (1976) Hostitel a lokalita: Takifugu xanthopterus, Japonsko Lokalizace: žábry Zdroje: (Yamaguti 1958); (Bychowsky et al. 1976); (Ogawa 1991)

18. Neobenedenia melleni (Mac Callum, 1927) Yamaguti, 1963 Synonymum: Epibdella melleni Mac Callum, 1927 Hostitel a lokalita: Sphoeroides annulatus, Mexiko Lokalizace: kůže Zdroje: (Fajer-Ávila et al. 2004)

19. Thylacicleidus brunensis Řehulková & Gelnar, 2005 Hostitel a lokalita: Tetraodon biocellatus (= Dichotomyctere ocellatus), Thajsko Lokalizace: žábry Zdroje: (Řehulková & Gelnar 2005)

20. Thylacicleidus latus Řehulková & Gelnar, 2005 Hostitel a lokalita: Tetraodon nigroviridis (= Dichotomyctere nigroviridis), Thajsko Lokalizace: žábry Zdroje: (Řehulková & Gelnar 2005)

21. Thylacicleidus serendipitus Wheeler & Klassen, 1988 Hostitel a lokalita: Tetraodon fluviatilis (= Dichotomyctere nigroviridis), Indonésie1 Tetraodon nigroviridis(= Dichotomyctere nigroviridis), Thajsko2

27 Lokalizace: žábry Zdroje: 1(Wheeler & Klassen 1988); 2(Řehulková & Gelnar 2005)

3.2 Check-list HOSTITEL – PARAZIT

Arothron hispidus (Linnaeus, 1758) Ancyrocephalus ornatus Haliotrema obesa Dichotomyctere nigroviridis (Marion de Procé, 1822) Thylacicleidus latus Thylacicleidus serendipitus Dichotomyctere ocellatus (Steindachner, 1870) Thylacicleidus brunensis Guentheridia formosa (Günther, 1870) Heterobothrium ecuadori Lagocephalus sceleratus (Gmelin, 1789) Heterobothrium tonkinensis Sphoeroides annulatus (Jenyns, 1842) Heterobothrium ecuadori Neobenedenia melleni Sphoeroides testudineus (Linnaeus, 1758) Heterobothrium lamothei Takifugu alboplumbeus (Richardson, 1845) Heterobothrium bychowskyi Heterobothrium praeorchis Takifugu niphobles (Jordan & Snyder, 1901) Haliotrema kusafugu Takifugu oblongus (Bloch, 1786) Diclidophora indica Takifugu pardalis (Temminck & Schlegel, 1850) Heterobothrium tetrodonis

28 Takifugu poecilonotus (Temminck & Schlegel, 1850) Heterobothrium pra eorchis Takifugu rubripes (Temminck & Schlegel, 1850) Heterobothrium okamotoi Takifugu vermicularis (Temminck & Schlegel, 1850) Heterobothrium praeorchis Heterobothrium tonkinensis Takifugu xanthopterus (Temminck & Schlegel, 1850) Heterobothrium shinagawai Heterobothrium yamagutii Tetraodon lineatus (Linnaeus, 1758) Heterobothrium fluviatilis Heterobothrium lineatus Torquigener pleurogramma (Regan, 1903) Heterobothrium elongatum Heterobothrium torquigeneri

29 MATERIÁL A METODIKA

1 Parazitologické vyšetření ryb

Hostitelské ryby podrobené parazitologickému vyšetření pocházely ze sortimentu čtverzubců nabízených importními firmami dlouhodobě působícími na českém akvarijním trhu (Aquarimex s.r.o., Akvarijní ryby – Macenauer.eu, Profi-aquarium – Roman Papík). Převážná část těchto ryb byla odchována na rybích farmách v jihovýchodní Asii (Malajsie, Thajsko, Singapur). Celkem bylo vyšetřeno 5 druhů (51 ks) čtverzubců náležejících do 4 rodů: Carinotetraodon travancoricus (Hora & Nair, 1941), Colomesus asellus (Müller & Troschel, 1849), Dichotomyctere ocellatus (Steindachner, 1870) (syn. Tetraodon biocellatus), Dichotomyctere nigroviridis (Marion de Procé, 1822) (syn. Tetraodon nigroviridis) a Pao cochinchinensis (Steindachner, 1866) (syn. Tetraodon cochinchinensis). Validní vědecká jména ryb byla čerpána z databáze FishBase (Froese & Pauly 2017). Nejčastěji nabízenými druhy ve zverimexech a zejména pak ve velkoobchodních řetězcích (např. Hornbach) byly Dichotomyctere nigroviridis a D. ocellatus. Fotografický přehled druhů, včetně počtu vyšetřených jedinců, je prezentován níže.

Přehled hostitelských druhů čtverzubců vyšetřených parazitologickou pitvou

Hostitel: Carinotetraodon travancoricus Synonymum: Tetraodon travancoricus Lokalita: Indie (import) Počet infikovaných/vyšetřených jedinců: 0/10

http://www.deviantart.com/

Hostitel: Colomesus asellus Synonymum: Chelichthys asellus Lokalita: Jižní Amerika (import) Počet infikovaných/vyšetřených jedinců: 0/10 http://www.fishbase.org/search.php (Foto: Holm)

Hostitel: Dichotomyctere ocellatus Synonymum: Tetraodon biocellatus Lokalita: JV Asie (import) Počet infikovaných/vyšetřených jedinců: 0/5 http://www.fishbase.org/search.php (Foto: Dikic)

Hostitel: Dichotomyctere nigroviridis Synonymum: Tetraodon nigroviridis Lokalita: JV Asie (import) Počet infikovaných/vyšetřených jedinců: 20/21 http://www.alamy.com/stockphoto/tetraodon.html

Hostitel: Pao cochinchinensis Synonymum: Tetraodon cochinchinensis Lokalita: JV Asie (import) Počet infikovaných/vyšetřených jedinců: 0/5

http://www.fishbase.org/search.php (Foto: Jensen) Čtverzubci byli ihned po získání podrobeni parazitologické pitvě nebo krátkodobě drženi (nejdéle 14 dní) v akváriu. Teplota vody byla udržována na 23-24 °C a mírně brakického prostředí bylo dosaženo přidáním alespoň 13g/l chloridu sodného, jak doporučuje Monk (2007). Potrava byla poskytována každý druhý den a jednalo se o mražené nitěnky (Tubifex tubifex) či kril. Před parazitologickou pitvou byly ryby nejprve omráčeny a usmrceny přerušením páteře za hlavou. Následně byla změřena délka jejich těla. Jako první byl proveden stěr slizu z povrchu těla. Následovalo odstřižení ploutví, vyjmutí žaberní aparátu a otevření dutinou ústní podle postupu navrženého Malmbergem (1970). Všechny orgány byly vyšetřeny jednotlivě (tj. v samostatných Petriho miskách s vodou) pod preparačním mikroskopem. Z předchozích studií (Rubio-Godoy & Tinsley 2002; Turgut et al. 2006) vyplývá, že rozdíl v prostorové distribuci monogeneí mezi levým a pravým žaberním aparátem nebyl statisticky významný. Proto byly z časových důvodů vyšetřeny pouze žaberní oblouky levé

31 strany těla. Žaberní aparát pravé strany byl uložen do čistého alkoholu (96%) pro případné budoucí molekulární analýzy. Mimo vlastní data získaná s primárním cílem analýzy prostorové distribuce byly použity také preparáty monogeneí ze sbírek parazitologie MU. Ty byly nashromážděny během let 1996-2005 doktorkou Evou Řehulkovou z hostitelů Dichotomyctere nigroviridis a Dichotomyctere ocellatus. Tato data byla použita pro studium larválního vývoje.

2 Sběr a fixace monogeneí

Monogenea byla izolována od hostitelské tkáně pomocí preparačních jehel při mírném zvětšení (20x) stereomikroskopu. Preparáty byly zhotoveny rozmáčknutím červů pod tlakem krycího sklíčka, jehož rohy byly následně přichyceny k podložnímu sklu pomocí laku na nehty, jak navrhl Ergens (1956). K fixaci monogeneí byla použita směs glycerinu a nasyceného vodného roztoku pikranu amonného v poměru 1:1 (=GAP; Malmberg 1957).

3 Stanovení lokalizace monogeneí

V rámci této práce byla převážná část monogeneí zachycena na žábrách, méně na ploutvích vyšetřených ryb. Žaberní aparát čtverzubců je tvořen pouze třemi páry žaberních oblouků. Ty jsou uloženy v žaberních dutinách, které nejsou kryté skřelemi, ale s vnějším prostředím jsou propojeny pouze úzkými štěrbinami otevírajícími se před prsními ploutvemi. Každý oblouk je složen ze dvou řad žaberních lístků, tzv. půlžaber (hemibranchů). Povrch těchto žaberních lístků (= primárních žaberních lamel) je dále zvětšen příčnými řasami (= sekundárními žaberními lamelami). Pro stanovení lokalizace monogeneí na žábrách bylo nutné definovat jednotlivé mikrohabitaty (viz Obr. 8). Žaberní oblouky byly číslovány v předozadním směru 1 – 3. Dále byl rozlišen přední Obr. 8 Členění žaberního oblouku (A – anterior) a zadní (P – posterior) hemibranch. podle Gelnar et al. (1990), upraveno

32 Každý oblouk byl rozdělen na 9 pomyslných sektorů charakterizovaných jedním ze 3 segmentů (D – dorzální, M – mediální, V – ventrální) a jednou ze 3 ploch (p – proximální, c –centrální, d – distální). Všechny výše zmíněné údaje byly zahrnuty ve výsledném zápisu lokalizace parazita, a to v tomto pořadí: oblouk, hemibranch, segment a plocha (např. 2AVc). Během sběru vzorků bylo zjištěno, že jedinci námi pozorovaných druhů nevykazují vazbu na vnější nebo vnitřní stranu žaber, jak píše Gelnar et al. (1990), ale všichni byli přichyceni haptorem mezi 2 sekundárními lamelami (tzn. laterálně). Proto nebyl tento paramter podrobněji hodnocen.

4 Determinace monogeneí

Preparáty monogeneí zařazených do rodu Thylacicleidus Wheeler & Klassen, 1988 (Dactylogyridae) byly studovány za použití světelného mikroskopu Olympus BX 50 vybaveným fázovým kontrastem. Kresby sklerotizovaných struktur byly zhotoveny pomocí kreslícího zařízení a do grafické (vektorové) podoby převedeny pomocí tabletu Wacom Intuos 5 touch ve spolupráci s programy Adobe Illustrator CS6 a Adobe Photoshop CS5 Extended. Měření studovaných struktur za účelem determinace bylo provedeno v programu Digital Image Analysis (Verze 4.0 pro Windows 95/NT/98) podle schématu převzatého z práce (Řehulková & Gelnar 2005). Pro počítání okrajových háčků bylo použito schéma z práce (Mizelle 1936). V první fázi taxonomického průzkumu nasbíraného materiálu bylo vzhledem k různorodosti ontogenetického stupně vývoje monogeneí nutné oddělit larvální/juvenilní stadia od adultních. Jedincům juvenilních stadií byla v dalším kroku přiřazena příslušnost k dané vývojové fázi J1-J4 (viz níže), dospělým jedincům pak příslušnost druhová.

4.1 Determinace post-larválních (juvenilních) stadií

Ačkoli je růst sklerotizovaných částí v oblasti haptoru kontinuální, lze na základě dokončení vývoje jednotlivých skleritů stanovit několik fází. Sanchez-Garcia et al. (2015) ve své práci zaměřené na post-larvální vývoj druhu Lamellodiscus theroni (Diplectanidae) rozlišují 5 vývojových fází, přičemž každá je definována objevením určité (plně vyvinuté) sklerotizované struktury. U jednotlivých fází se tak postupně objevují zcela vyvinuté: 1. okrajové háčky, 2. střední háčky (dorzální i ventrální), 3. ventrální destička, 4. dorzální

33 destička, 5. ventrální i dorzální lamellodisky. Stadium s vytvořeným samčím kopulačním orgánem je pak označováno za adultní. Přestože námi nalezená monogenea rodu Thylacicleidus patří do čeledi Dactylogyridae, diferenciace jednotlivých vývojových fází víceméně odpovídá schématu zaznamenanému autory Sanchez-Garcia et al. (2015). Výjimkou je fáze 5, která chybí, jelikož daktylogyridi daný typ skleritů (tj. lamellodisky) nemají. 1. fáze (J1): stavba haptoru i těla je velmi podobná onkomiracidiu (Obr. 10 (A)), avšak liší se ztrátou obrvení. Vytvořeno je pouze 14 okrajových háčků, přičemž 6 párů leží na okraji haptoru a 1 pár v jeho středu. 2. fáze (J2): haptor je vybaven 14 okrajovými háčky a 2 páry jehlicovitých základů středních háčků. Pro rod Thylacicleidus je charakteristická přítomnost dvou párů středních háčků (tj. dorzální a ventrální), ty však ještě nejsou v tomto stadiu příslušně orientovány. 3. fáze (J3): objevují se základy ventrální destičky, a to jako dva oddělené sklerity (bilaterální konce destičky) ležící naproti sobě, které postupným růstem srůstají. 4. fáze (J4): jsou vytvořeny minimálně základy všech sklerotizovaných struktur, které můžeme pozorovat u dospělců (14 okrajových háčků, 4 střední háčky, 2 destičky). Zároveň se jeden pár středních háčků začíná orientovat ventrálně a druhý dorzálně, což umožňuje lepší ukotvení těchto stadií v žaberní tkáni hostitele. Báze středních háčků již mají náznaky výrůstků (vnitřní a vnější). Ventrální destička tvoří zpočátku slabou, ale již kompaktní jednu strukturu. Dorzální destička se vytváří obdobně jako v předchozí fázi destička ventrální, tzn. základy bilaterálních konců postupně ke středu srůstají.

5 Zpracování výsledků a hodnocení dat

Data vhodná pro stanovení epidemiologických charakteristik a posouzení prostorové distribuce na orgánové úrovni byla získána z 21 jedinců hostitele D. nigroviridis. Pouze u 16 z nich byla pro každého červa nalezeného na žaberním aparátu zaznamenána přesná lokalizace v rámci mikrohabitatu. Epidemiologické charakteristiky (prevalence, intenzita infekce a abundance) byly spočítány podle Bush et al. (1997). Prostorová distribuce byla uvažována v rámci 4 environmentálních proměnných (oblouky, hemibranchy, segmenty a plochy), kterými bylo definováno celkem 54 mikrohabitatů. Vliv proměnných na celkovou variabilitu byl testován pomocí diskriminační analýzy (DA) a k porovnání sledovaných skupin v tomto

34 mnohorozměrném prostoru byla použita metoda PERMANOVA. Rozdíl v abundanci jednotlivých druhů/post-larválních stadií mezi hemibranchy byl ověřen pomocí Mann- Whitney testu. Abundance mezi ostatními proměnnými (oblouky, segmenty, plochy) pak byla porovnána pomocí Kruskal-Wallis testu, po kterém následoval vždy Dunnův post-hoc test s Bonferroniho korekcí. 2 Pro každou infrapopulaci byl spočítán Levinsonův index šířky niky B =1/pj , kde pj je podíl jedinců daného druhu v mikrohabitatu j, a následně standardizován podle Krebse (1999). Podobně byl pro výpočet překryvu niky použit Renkonenův index

R =1 - ½Ʃǀpia - pjaǀ, kde pia je podíl jedinců druhu i v mikrohabitatu a, a pja je podíl jedinců druhu j v mikrohabitatu a. Pro zjištění závislosti mezi šířkou niky a abundancí byl použit Spearmanův korelační koeficient. Jako ukazatel agregované distribuce uvažované v rámci 54 mikrohabitatů byl použit předpolad koeficientu disperze (CD), že s2/m >0, kde s2 je rozptyl a m je průměr, a d >1,96

(d =√2(s2(n-1)/m) - √2v -1, kde v je počet stupňů volnost) (Geets et al. 1997) Analýza byla provedena v programech MS Excel 2013, XLSTAT 2017 a R 3.4.0, dodatečné grafické zpracování pak v programu MS Word 2013.

35 VÝSLEDKY

1 Morfologicko-taxonomické vyhodnocení nalezených monogeneí

Parazitologické vyšetření 5 druhů čtverzubců odhalilo přítomnost monogeneí pouze na čtverzubci zeleném (Dichotomyctere nigroviridis). Nalezená monogenea byla zařazena do rodu Thylacicleidus Wheeler & Klassen, 1988 na základě přítomnosti níže uvedených znaků. Haptor je vybaven sedmi páry okrajových háčků, dvěma páry středních háčků (dorzální a ventrální) a dvěma (spojovacími) destičkami (dorzální a ventrální). Okrajové háčky nemají rukojeť rozdělenou na dvě části, všechny páry jsou podobného tvaru a velikosti. Oba páry středních háčků jsou charakteristické zkráceným dříkem; ventrální háčky mají dobře diferencované oba výrůstky (vnější a vnitřní); vnější výrůstky dorzálních háčků jsou redukované. Samčí kopulační orgán je tvořen pouze jednoduchou kopulační trubkou, bez přídatného aparátu. Vagina není sklerotizovaná (Řehulková & Gelnar 2005). Hostitel byl parazitován dvěma druhy monogeneí, a to druhem Thylacicleidus serendipitus Wheeler & Klassen, 1988 (Obr. 9 (1)) a Thylacicleidus. latus Řehulková & Gelnar, 2005 (Obr. 9 (2)).

1.1 Post-larvální vývoj přichycovacích struktur haptoru monogeneí rodu Thylacicleidus

Pro 2 druhy rodu Thylacicleidus (T. serendipitus a T. latus) byla vypracována morfologická studie haptoru post-larválních stadií (J1-J4) se snahou zmapovat jeho postupný vývoj (Tab. 1 a 2). V prvních fázích růstu obsahuje haptor pouze okrajové háčky (J1, Obr. 10 (B)), načež se objevují základy obou párů středních háčků, které se kontinuálně zvětšují (J2, Obr. 10 (C)). Později se mezi nimi začne vytvářet ventrální destička ve formě dvou oddělených skleritů, které se postupným růstem přibližují a nakonec spojují v jednu kompaktní strukturu (J3, Obr. 10 (D)). Zároveň se prodlužují/rozšiřují oba páry středních háčků v proximálním směru a začíná se formovat báze. V poslední post-larvální fázi (J4, Obr. 10 (E)) se obdobným způsobem jako ventrální destička začne vytvářet i destička dorzální, tzn. základy bilaterálních konců postupně ke středu srůstají. Báze středních háčků již mají náznaky výrůstků (vnitřní a vnější), což podstatně ulehčuje taxonomickou determinaci.

Obr. 9 Sklerotizované struktury haptoru (A) a samčí kopulační orgán (B) druhů Thylcicleidus serendipitus (1) a Thylacicleidus latus (2): d.h. – dorzální střední háček; v.h. – ventrální střední háček; d.d. – dorzální destička; v.d. – ventrální destička; o.h. – okrajový háček. Mikrofotografie, fázový kontrast.

Jedním z hlavních problémů bylo určování dorzálních a ventrálních středních háčků. V počátcích vývoje (J2) se totiž nepodílejí na přichycení k hostiteli a jsou uloženy ve tkáni bez orientace ventrálním či dorzálním směrem. Navíc nejsou vytvořeny základy ani jedné z destiček, podle kterých by bylo možné odvodit příslušný pár středních háčků. Podle práce Řehulková & Gelnar (2005) byly převzaty údaje o velikostech a proporcích jednotlivých háčků a na jejich základě byly sklerity přiřazeny k ventrálnímu nebo dorzálnímu páru podle předpokladu, že větší celkovou délku a menší míru zakřivení mají háčky dorzální.

Obr. 10 Jednotlivá stadia ontogenetického vývoje monogeneí rodu Thylacicleidus: (A) onkomiradicium, (B – E) juvenilové J1 – J4; v.d. – ventrální destička, d.d. – dorzální destička. Mikrofotografie, fázový kontrast.

Jedince bylo možné spolehlivě druhově určit podle tvaru středních háčků a destiček až ve fázi J4, výjimečně ve fázi J3. Jediným znakem, který bylo možné použít pro determinaci ranějších stadií (tj. J1, J2), byla délka okrajových háčků. Ty totiž neměnní během vývoje svou velikost. V této studii byl pro určení druhové příslušnosti vybrán 5. pár okrajových háčků, protože byl u všech preparátů nejlépe zachovaný (patrně to souvisí s jeho uložením mezi středními háčky a menší náchylností k poškození při stlačování červa). Podle Řehulková a Gelnar (2005) jsou rozměry okrajových háčků u druhu T. latus 13-16 µm

38 a u druhu T. serendipitus 14-19 µm. Všichni jedinci s háčky většími než 16 µm proto byli označeni jako druh T. serendipitus (tento typ kategorizace je samozřejmě subjektivní a byl použit pouze pro orientační sledování vývoje post-larválních stadií). Pro přesnější a objektivnější taxonomickou determinaci by byla nutná rozsáhlá geomorfologická analýza, nejlépe podložená molekulárními daty.

Tab. 1 Ontogenetický vývoj sklerotizovaných struktur haptoru u druhu T. latus (J1 – J4)

39 Tab. 2 Ontogenetický vývoj sklerotizovaných struktur haptoru u druhu T. serendipitus (J1 – J4)

40 2 Prostorová distribuce monogeneí rodu Thylacicleidus

Statistické vyhodnocení prostorové distribuce na žaberním aparátu bylo provedeno na základě dat získaných z hostitele Dichotomyctere nigroviridis. Průměrná velikost hostitele byla 4,28 ± 0,47 cm. Bylo nalezeno 713 monogeneí na 20 z celkem 21 vyšetřených ryb. Tento soubor hostitelů byl použit k vyhodnocení epidemiologických charakteristik (Tab. 3). Pouze u 16 z výše zmíněných ryb byla pro každého parazita stanovena příslušnost k jednomu z 54 mikrohabitatů. Analýza prostorové distribuce monogeneí tudíž zahrnovala 16 hostitelů, na kterých byli nalezeni dospělí jedinci druhu T. serendipitus (125 ks) a druhu T. latus (221 ks) a také druhově blíže neurčení juvenilové (135 ks). Dvacet tři červů bylo nalezeno volně a všichni byli určeni jako adultní stadia druhu T. latus. Jedná se o jedince odpadlé během manipulace s žábrami, kteří byli z vlastní analýzy vyloučeni.

2.1 Prostorová distribuce adultů a juvenilů na úrovni orgánů

Z celkového počtu 481 byli pouze 4 jedinci nalezeni mimo žaberní aparát a to konkrétně na prsních ploutvích (Graf 1). Jednalo se o dva jedince post-larválního stadia J1 a dva jedince stadia J2.

Graf 1 Procentuální rozložení jednotlivých stadií (J1 – dospělci) mezi žábrami, ploutvemi a kůží hostitele D. nigroviridis.

Dichotomyctere nigroviridis

J1 J2 J3 J4 D

100% 100% 100%

93%

89%

11%

0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0%

ŽÁBRY PLOUTVE KŮŽE

41 Tab. 3 Epidemiologická tabulka

Prevalence Průměrná Průměrná Počet infikovaných/ (%) intenzita infekce ± SD abundance ± SD vyšetřených ryb T. serendipitus 71,4 14,6 ± 13,9 10,4 ± 13,5 15/21 T. latus 76,2 18,8 ± 23,9 14,3 ± 22,0 16/21 juvenilové 95,2 9,7 ± 8,6 9,2 ± 8,6 20/21

2.2 Prostorová distribuce post-larválních stadií na žaberním aparátu

Prostorová distribuce v rámci žaberního aparátu byla analyzována na souboru 131 juvenilních jedinců. U žádného vývojového stupně nebyl zjištěn významný rozdíl mezi abundancemi na anteriorním a posteriorním hemibranchu (Mann-Whitney test, p>0,05) ani mezi oblouky 1 – 3 (Kruskal-Wallis test, p>0,05). Do dalších výpočtů nejsou výše zmíněné proměnné zahrnuty odděleně, ale pouze jako jedna proměnná (dále jen jako „oblouky“) o 6 kategoriích. Distribuci tedy sledujeme v rámci 9 mikrohabitatů na 6 obloucích. Zda se distribuce jednotlivých post-larválních stadií v mnohorozměrném prostoru definovaném 3 proměnnými (oblouky, segmenty, plochy) liší bylo analyzováno metodou PERMANOVA. Signifikantní rozdíl byl pozorován mezi dvojicemi juvenilních stadií J1-J4 (PERMANOVA, p=0,032), J2-J3 (PERMANOVA, p=0,01) a J3-J4 (PERMANOVA, p=0,009). Výsledky mohou být nicméně zkreslené kvůli malému počtu jedinců v případě stadií J1 – J3. V dalším kroku byly testovány rozdíly mezi jednotlivými kategoriemi uvnitř každé proměnné. U juvenilů J4 byla prokázána rozdílná distribuce mezi obloukem 2 a 6 (Kruskal-Wallis test, p=0,002) a obloukem 3 a 6 (Kruskal-Wallis, p=0,001), přičemž vyšší abundance byla pozorována na obloucích 2 a 3 (Graf 6). U stadií J4 byla rovněž zjištěna vyšší abundace na mediálním segmentu oproti segmentu dorzálnímu (Kruskal- Wallis, p=0,003) (Graf 2). Stadia J1 se vyskytovala v mikrohabitatech proximálních částí oblouků mnohem častěji než v částech centrálních (Kruskal-Wallis test, p=0,041) a distálních (Kruskal-Wallis, p=0,025) (Graf 2 a 3). Abundance jednotlivých post- larválních stadií v rámci 9 mikrohabitatů na každém z 6 oblouků viz Grafy 3 – 6.

Graf 2 Rozmístění post-larválních stadií (J1-J4) na žaberních obloucích: prostor je rozdělen na 9 sektorů (mikrohabitatů), kde osa x představuje segmenty dorzální (-1), mediální (0) a ventrální (+1) a osa y plochy proximální (-1), centrální (0) a distální (+1).

J1 J2 J3 J4 proximální centrální distální

ventrální mediální dorzální

Graf 3 Abundance juvenilů J1 v rámci 9 mikrohabitatů na každém z 6 oblouků. Mikrohabitaty jsou popsány kombinací 2 písmen: segment (D – dorzální, M – mediální, V – ventrální), plocha (p – proximální, c –centrální, d – distální). J1

3 2,5 2 Vp Mp 1,5 Dp Vc 1 Mc abundance Dc 0,5 Vd

Md mikrohabitat 0 Dd 1 2 3 4 5 6 oblouk

Graf 4 Abundance juvenilů J2 v rámci 9 mikrohabitatů na každém z 6 oblouků. Mikrohabitaty jsou popsány kombinací 2 písmen: segment (D – dorzální, M – mediální, V – ventrální), plocha (p – proximální, c –centrální, d – distální). J2

3 Vp Mp 2 Dp Vc

abundance Mc 1 Dc Vd

Md mikrohabitat 0 Dd 1 2 3 4 5 6 oblouk

Graf 5 Abundance juvenilů J3 v rámci 9 mikrohabitatů na každém z 6 oblouků. Mikrohabitaty jsou popsány kombinací 2 písmen: segment (D – dorzální, M – mediální, V – ventrální), plocha (p – proximální, c –centrální, d – distální). J3

3 2,5 2 Vp Mp 1,5 Dp Vc abundance 1 Mc Dc 0,5 Vd

Md mikrohabitat 0 Dd 1 2 3 4 5 6 oblouk

Graf 6 Abundance juvenilů J4 v rámci 9 mikrohabitatů na každém z 6 oblouků. Mikrohabitaty jsou popsány kombinací 2 písmen: segment (D – dorzální, M – mediální, V – ventrální), plocha (p – proximální, c –centrální, d – distální). J4

4 Vp 3 Mp Dp 2 Vc abundance Mc Dc 1 Vd

Md mikrohabitat 0 Dd 1 2 3 4 5 6 oblouk

2.3 Prostorová distribuce druhů Thylacicleidus serendipitus a Thylacicleidus latus

Prostorová distribuce dvou druhů monogeneí (T. serendipitus a T. latus) a jejich juvenilů byla analyzována podobně jako distribuce jednotlivých post-larválních stadií. U žádného druhu ani juvenilů nebyl pozorován rozdíl v abundanci mezi hemibranchy (Mann-Whitney test, p>0,05) ani mezi oblouky (Kruskal-Wallis test, p>0,05). V dalších analýzách byly „oblouky“ a „hemibranchy“ sloučeny v jednu proměnnou o 6 kategoriích. Vizualizace podílu 3 proměnných na celkové variabilitě byla provedena pomocí diskriminační analýzy (Grafy 7 a 8). Bylo zjištěno, že největší vliv na celkovou variabilitu má distribuce v rámci ploch (distální, centrální, proximální) (DA, p<0,0001). Tato proměnná výrazně koreluje s první faktorovou osou (F1, r=0,977), která vysvětluje 99,5 % variability. Korelace proměnných s faktorovými osami a „eigenvalues“ jednotlivých os jsou uvedeny v Tab. 4. Množství srpávně/nesprávně zařazených jedinců do skupin je uvedeno v Tab. 5. Ta nám ve své podstatě říká, že podle typu obývaného mikrohabitatu lze jedince přiřadit ke druhu T. serendipitus s 82,4% pravděpodobností správnosti. U druhu T. latus a juvenilů je tato pravděpodobnost podstatně nižší. Vzhledem k tomu, že jsme jedince determinovali na základě morfologie a jejich správné zařazení do druhu je téměř jisté, můžeme z výsledků DA předpokládat, že distribuce těchto skupin se přirozeně překrývá (Graf 8).

Grafy 7 a 8 Diagramy DA. 7. vliv 3 proměnných (oblouky, segmenty, plochy) na celkovou variabilitu; 8. jedinci promítnutí do prostoru DA podle obývaného mikrohabitatu: (A) všechny skupiny dohromady, (B) T. serendipitus, (C) T. latus, (D) juvenilové.

Graf 8 (A) Graf 7 4 oblouky 1 latus 3 larvy

0,75 2 0,5 segmenty 1 0,25

0 0 F2 (0,49 %) F2 -0,25 plochy -1

-0,5 F2 (0,49 %) F2 -2 -0,75 -3 -1 -1 -0,75 -0,5 -0,25 0 0,25 0,5 0,75 1 serendipitus F1 (99,51 %) -4 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 F1 (99,51 %) larvy latus serendipitus

(B) (C) (D)

4 4 4 3 3 3 2 2 2 1 1 1 0 0 0

F2 (0,49 %) F2 -1 -1 -1 -2 -2 -2 -3 -3 -3 -4 -4 -4 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 2 3 F1 (99,51 %)

Tab. 4 Korelace proměnných s faktorovými osami F1 a F2 a „eigenvalues“ faktorových os.

F1 F2 oblouk 0,251 0,927 segment 0,209 0,212 oblast 0,977 -0,192 eigenvalue 0,446 0,002

Tab. 5 Matice záměn DA: ukazuje počet jedinců, u kterých bylo diskriminační analýzou navrženo přeřazení z apriorní skupiny do jiné Správnost juvenilové T. latus T. serendipitus celkem z \ do zařazení (%) juvenilové 45 52 34 131 34,35% T. latus 18 150 53 221 67,87% T. serendipitus 0 22 103 125 82,40% celkem 63 224 190 477 62,47%

Statistická významnost rozdílů mezi druhy a juvenily byla testována metodou PERMANOVA. Bylo pozorováno, že druh T. serendipitus se signifikantně liší od druhu T. latus (PERMANOVA, p<0,001) i juvenilů (PERMANOVA, p<0,001) a mezi T. latus a juvenily byl významný rozdíl pouze se zanedbáním Bonfferoniho korekce (PERMANOVA, p=0,018). Dále byly testovány rozdíly mezi jednotlivými kategoriemi uvnitř každé proměnné. Výsledky potvrzují předchozí předpoklad z DA o vlivu ploch. Jediný statisticky významný rozdíl byl zaznamenán v distribuci druhu T. serendipitus mezi distálními a centrálními plochami (Kruskal-Wallis, p=0,001) a především mezi distálními a proximálními plochami (Kruskal-Wallis, p<0,0001), přičemž vyšší abundance byla pozorována vždy v distálních částech žaber (Graf 9). Jedinci druhu T. latus se naopak viditelně více vyskytovali v mirkohabitatech centrálních ploch (Graf 9), to ale nebylo statisticky prokázáno (Kruskal-Wallis test, p>0,05). Abundance obou druhů a juvenilů v rámci 9 mikrohabitatů na každém z 6 oblouků viz Grafy 10 – 12.

Graf 9 Rozmístění druhu T. serendipitus, druhu T. latus a juvenilů na žaberních obloucích: prostor je rozdělen na 9 sektorů (mikrohabitatů), kde osa x představuje segmenty dorzální, mediální a ventrální a osa y plochy proximální, centrální a distální.

larvy T. latus T. serendipitus 1,5

0,5

0 -1,5 -1 -0,5 0 0,5 1 1,5 -0,5

-1 proximál centrální distální -1,5 ventrální mediální dorzální

Graf 10 Abundance druhu T. serendipitus v rámci 9 mikrohabitatů na každém z 6 oblouků. Mikrohabitaty jsou popsány kombinací 2 písmen: segment (D – dorzální, M – mediální, V – ventrální), plocha (p – proximální, c –centrální, d – distální).

T. serendipitus

15 Vp Mp 10 Dp Mc Vc abundance 5 Dc Md

Vd mikrohabitat 0 Dd 1 2 3 4 5 6 oblouk

Graf 11 Abundance druhu T. latus v rámci 9 mikrohabitatů na každém z 6 oblouků. Mikrohabitaty jsou popsány kombinací 2 písmen: segment (D – dorzální, M – mediální, V – ventrální), plocha (p – proximální, c –centrální, d – distální).

T. latus

12 10 8 Vp Mp 6 Dp Mc 4 abundance Vc Dc 2 Md

Vd mikrohabitat 0 Dd 1 2 3 4 5 6 oblouk

Graf 12 Abundance juvenilů v rámci 9 mikrohabitatů na každém z 6 oblouků. Mikrohabitaty jsou popsány kombinací 2 písmen: segment (D – dorzální, M – mediální, V – ventrální), plocha (p – proximální, c –centrální, d – distální) juvenilové

6 Vp Mp 4 Dp Mc Vc abundance 2 Dc Md

Vd mikrohabitat 0 Dd 1 2 3 4 5 6 oblouk

2.4 Ekologická nika druhu T. serendipitus a T. latus

Pro každou infrapopulaci druhu T. serendipitus, druhu T. latus a juvenilů byl spočítán Levinsonův index šířky niky, který byl následně standardizován pro interval 0-1, a Renkonenův index překryvu niky. Graf 13 zobrazuje průměrnou niku všech tří skupin a v Grafu 14 jsou vyneseny překryvy nik mezi jednotlivými dvojicemi těchto skupin. Bylo pozorováno, že nejužší niku má druh T. serendipitus a naopak nejširší druh T. latus. Překryvy nik jsou pak největší mezi T. latus a juvenilními stadii a naopak nejmenší mezi dospělci obou druhů. Odlehlá hodnota u druhu T. serendipitus je způsobena přítomností silně invadovaného hostitelského jedince a tedy i větší šířkou niky parazitického druhu. Průměrné hodnoty Levinsonova a Renkonenova indexu všech skupin jsou uvedeny v Tab. 6. U všech skupin byl potvrzen pozitivní vztah mezi abundancí a šířkou niky (Spearmanův korelační koeficient, rser=0,950 , rlat=0,914 , rjuv=0,874, p<0,0001). Naopak nebyla pozorována závislost mezi šířkou niky jednoho druhu a abundancí druhého druhu/juvenilů (Spearmanův korelační koeficient, p>0,05). Tento výsledek naznačuje, že na prostorovou distribuci nemá interspecifická kompetice velký vliv. Byla prokázána agregovanost jedinců druhu T. serendipitus (CD, s2/m>1) viz Tab. 7.

Graf 13 Levinsonův index pro druhy Graf 14 Renkonenův index pro dvojice T. T. serendipitus (S), T. latus (L) a juvenily serendipitus-T. latus (S-L), T. serendipitus- (J). juvenilové (S-J) a T. latus-juvenilové (L-J).

0,45 0,4

0,4 L 0,35 S-J

0,35 0,3

0,3 0,25 0,25 0,2 0,2 0,15 0,15

0,1 0,1

0,05 0,05

0 0

S J S-L L-J

Tab. 6 Průměrné hodnoty Levinsonova a Renkonenova indexu

LI RI

T. serendipitus 5,230 T. latus 9,475 jvenilové 6,694

T.s.-T.l. 0,075 T.s.-juvenilové 0,079 T.l.-juvenilové 0,142

Tab. 7 Hodnoty ryzptylu a průměru pro výpočet koeficientu disperze (CD) a d-hodnota (agregace je potvrzena při d >1,96)

T. serendipitus T. latus juvenilové s2 5,757 3,142 1,566 m 2,315 4,092 2,426 d 5,990 -1,225 -7,821

DISKUZE

Čeleď Tetraodontidae je z hlediska výzkumu fauny monogeneí poměrně málo probádanou skupinou. Whittington (1998) popisuje monogenea jako parazity s velmi úzkou hostitelskou specifitou a odhaduje, že na každý hostitelský druh připadá alespoň jeden odlišný druh monogeneí. Lim (1998) vypracovala studii zaměřenou na monogenea jihovýchodní Asie, odkud pochází většina sladkovodních a brakických druhů čtverzubcovitých, a odhaduje dokonce až 3 druhy monogeneí připadající na jeden hostitelský druh. V této studii byl vypracován checklist, podle kterého bylo dosud popsáno/zachyceno pouze 21 druhů monogeneí na 17 druzích ryb čeledi Tetraodontidae. Vzhledem k celkovému počtu druhů této hostitelské skupiny (tj. 200 druhů) tedy můžeme předpokládat, že naše znalost fauny monogeneí parazitujících na čtverzubcovitých dnes odpovídá maximálně 10,5 % skutečné diverzity. V této práci bylo parazitologickému vyšetření podrobeno celkem 51 ryb náležejících do 5 druhů: Carinotetraodon travancoricus, Colomesus asellus, Dichotomyctere nigroviridis, Dichotomyctere ocellatus a Pao cochinchinensis. Všichni jedinci pocházeli z importů realizovaných v rámci obchodu s akvarijními rybami. Pozitivní nález byl zaznamenán pouze u hostitelského druhu Dichotomyctere nigroviridis (čtverzubce zeleného). Jednalo se infekci druhy Thylacicleidus serendipitus a Thylacicleidus latus (Dactylogyridae), které na stejném hostiteli již dříve zaznamenali Wheeler a Klassen (1988) a Řehulková a Gelnar (2005). U obou druhů byla dlouhodobě pozorována vysoká míra patogenity, čímž se naskytla jedinečná příležitost ke studiu prostorové distribuce těchto cizopasníků na těle/mikrohabitatu hostitele. Studií řešících otázku biologie a ekologie monogeneí parazitujících na čtverzubcích není mnoho. Výzkumy sledující vývojový cyklus, prostorovou distribuci nebo faktory ovlivňující přežívání monogeneí byly provedeny například na druhu Heterobothrium okamotoi z hostitele Takifugu rubripes (Ogawa 1997; Ogawa & Inouye 1997; Yoshinaga et al. 2006) nebo na druhu H. ecuadori z hostitele Sphoeroides annulatus (Grano-Maldonado et al. 2011). Dosud ale nebyla pro čeleď Tetraodontidae vypracována studie zabývající se post- larválním vývojem nebo prostorovou distribucí monogeneí skupiny Polyonchoinea, do které řadíme i rod Thylacicleidus. Zástupci rodu Heterobothrium patří mezi tzv. vyšší monogenea (Heteronchoinea), která převážnou část života tráví přisedle na jednom místě a jejich haptor

je tvořen často asymetricky uspořádaným velkým počtem svorek. Naproti tomu tzv. nižší monogenea (Polyonchoinea), mezi něž patří i druhy rodu Thylacicleidus, jsou pohyblivější, obývají různorodější mikrohabitaty a jejich haptor je vyzbrojen háčky (Hayward 2005). Preference určitého místa/míst a způsob přichycení na těle hostitele se tak bude mezi těmito skupinami monogeneí pravděpodobně lišit.

1 Prostorová distribuce monogeneí rodu Thylacicleidus

Stejně jako ostatní organismy, i parazité mají vymezené ekologické niky (Holmes 1973). Nika je n-rozměrný prostor definovaný souborem podmínek, kterými je omezená distribuce organismu (Hutchinson 1957). Podle Gausseho principu kompetičního vyloučení se druhy se stejnou nikou buď kompetičně vyloučí, nebo divergují a dochází k rozrůznění nik a vzniku nových druhů (Holmes 1990). Segregace nik je nejjednodušším vysvětlením koexistence více druhů a může k ní docházet v důsledku: . specializace na různé zdroje (např. morfologické adaptace), . časové proměnlivosti prostředí . nebo právě v důsledku vzniku prostorových nik.

V této práci jsme se zabývali otázkou prostorového uspořádání dvou druhů monogeneí, a to jak dospělých jedinců tak jejich juvenilních stadií.

1.1 Preference mikrohabitatu post-larválních (juvenilních) stadií

V rámci post-larválního vývoje byly definovány 4 skupiny juvenilů (J1-J4). Příslušnost k dané vývojové fázi byla stanovena u 135 jedinců, kteří byli následně podrobeni analýze prostorové distribuce. Kearn (1968) sledoval vývoj druhu Dactylogyrus crucifer (Dactylogyridae) a zjistil, že juvenilové raných fází vývoje (J1, J2), jejichž haptor obsahuje pouze okrajové háčky, případně zatím nevyužívané základy středních háčků, jsou ideálně přizpůsobeni k přichycení se na rovném povrchu (kůži, ploutvích, stěnách žaberní dutiny, bázích žaberních oblouků nebo primárních lamelách). V této práci bylo zjištěno, že juvenilové J1 vykazují mírnou preferenci proximálních částí žaberního aparátu, což je v souladu s názorem Kearna (1968). Většinou se vyskytovali buď na bázi oblouku, nebo na primárních lamelách proximálních ploch. U juvenilů J2 a J3 nebyla prokázána preference žádného mikrohabitatu, což může být vysvětleno nedostatečným počtem vzorků.

Významný rozdíl byl zaznamenán také v distribuci juvenilů J4 mezi jednotlivými oblouky a jejich segmenty. Zatímco nejvyšších abundancí dosahovalo toto stadium na posteriorním hemibranchu oblouku 1 a anteriorním hemibranchu oblouku 2, signifikantně menší počet jedinců byl na posteriorním hemibranchu posledního oblouku. Co se týče segmentů, stadium J4 viditelně preferovalo mediální části a naopak méně často se jedinci vyskytovali v dorzální části. Obě pozorování by mohla souviset s preferováním těch částí žaberního aparátu, které mají větší plochu a přes které proudí větší objem vody, jak uvádí Gutierrez & Martorelli (1999). Toto vysvětlení by bylo vyhovující za předpokladu, že jsou vajíčka uvolňována do vnějšího prostředí, z něhož jsou volně plovoucí larvy (onkomiracidia) následně nasáty do žaberní dutiny nového hostitele. Na žábrách se pak uchytí jedinci hlavně tam, kde proudí největší množství vody (Llewellyn 1963). V souladu s jinými autory (Kearn 1968; Sanchez-Garcia et al. 2015) ale bylo v rámci této studie pozorováno, že během ontogeneze dochází ke změnám v morfologii a konfiguraci přichycovacích struktur haptoru. Tyto změny mají zřejmě přímou souvislost se schopností monogeneí měnit v průběhu ontogeneze svou lokalizaci. U raných stadií monogeneí (J1, J2) jsou dobře vyvinuty pouze ventrálně orientované marginální háčky, což umožňuje jejich aktivnější pohyb na rovném povrchu (kůže, ploutve, chrupavčité báze oblouků a primární žaberní lamely). Teprve později se některé struktury haptoru orientují dorzálním směrem (dorzální pár středních háčků a 2 páry háčků marginálních). Proto se lze domnívat, že vyšší abundance posledních post-larválních stadií na mediálních segmentech oblouků odpovídá morfologické fázi vývoje haptoru na cestě do místa konečné lokalizace.

1.1.1 Lokalizace na povrchu hostitele

Prost (1963) pozorovala masivní infekci kůže a ploutví čerstvě vylíhnutými juvenilními jedinci druhu Dactylogyrus anchoratus (Dujardin, 1845). Domnívá se, že na kůži probíhá iniciální kontakt s hostitelem a teprve následně dochází díky slabě vyvinutému haptoru, který umožňuje rychlý pohyb, k migraci do žaberní dutiny. V rámci této práce, se pouze 4 jedinci ze 135 vyskytovali mimo žaberní aparát, konkrétně na prsních ploutvích. Jednalo se o vývojová stadia J1 a J2. Masivní výskyt post-larválních stadií na kůži a ploutvích ryb by mohl souviset s namnožením (zvýšením početnosti) těchto parazitů v daném (uzavřeném) prostředí v důsledku působení různých biotických a abiotických faktorů. Je známo, že vyšší abundance cizopasníků může být způsobena stresem hostitelských ryb držených v nevyhovujících podmínkách prostředí, a tím i nižší imunitní odpovědí hostitele (Poulin 54

1992b) . Na abundanci parazitů mají rovněž vliv rozdílné nároky na prostředí během životního cyklu. Při optimální teplotě se larvy D. anchoratus líhnou a dospívají rychleji (Chubb 1977). V souvislosti se specifickou morfologií žaberního aparátu čtverzubců se naskýtá také jiný pohled. Čtverzubci nemají skřele, ale pouze úzký otvor před prsními ploutvemi. Je tedy možné, že vajíčka opatřená dlouhým filamentem (osobní pozorování školitelky) zůstávají zapletena do žaberních lístků a do vnějšího prostředí se uvolňují jen obtížně. Čerstvě uvolněná onkomiracidia tak zůstávají v žaberní dutině a nemusí ztrácet energii při hledání nového hostitele. Sporadické nálezy raných juvenilních stadií na prsních ploutvích pak mohou být důsledkem vnitro- a mezidruhových interakcí při vysokých intenzitách infekce, kdy jedinci opouštějí „mateřskou“ žaberní dutinu ve snaze najít si nového hostitele.

1.2 Prostorová distribuce adultních stadií

Specifické anatomické vlastnosti (absence skřelí, redukovaný počet žaberních oblouků) ryb čeledi Tetraodontidae mohou ovlivňovat interpretaci vlivu faktorů, které jsou běžně dávány do souvislosti s prostorovou distribucí monogeneí na žábrách svých hostitelů. Například Gutierrez & Martorelli (1999) pozorovali vyšší abundance druhů rodu Demidospermus Suriano, 1983 (Dactylogyridae) ve středních částech žaberního aparátu. Tento jev dávají do souvislosti s proudem vody, který je podle Palinga (1968) nejsilnější právě na 2. a 3. žaberním oblouku. Výsledky naší práce ale preferenci konkrétních žaberních oblouků dospělými jedinci nepotvrdily, což může být dáno právě výše zmíněným uspořádáním žaberního aparátu. Výsledky získané analýzou prostorové distribuce naznačují, že dospělí jedinci preferují mikrohabitat na základě vlastní ekologické niky a jejich distribuce zřejmě není prouděním vody ovlivněna. Velmi zřetelná byla preference distálních částí žaberních oblouků druhem T. serendipitus. Ramasamy et al. (1985) pozorovali, že paraziti žijící na distálních částech žaber jsou často lépe uzpůsobení k přichycení na hostiteli, ať už se jedná o přítomnost přídatných struktur haptoru, větších háčků nebo jiných morfologických adaptací. Tyto části žaber jsou totiž částečně obnaženy a je tedy nutné stabilnější ukotvení v tkáni hostitele. To potvrzuje i morfologie druhu T. serendipitus, který má menší haptor vhodný k hlubšímu zanoření do tkáně hostitele a zároveň větší okrajové háčky, které haptor v tkáni trvale ukotvují. Naopak druh T. latus, který se vyskytuje více „skrytě“, využívá především větší střední háčky. Ty zřejmě fungují jako vzpěra mezi sekundárními žaberními lamelami, což 55

umožňuje větší pohyb. Podobný princip přichycení byl pozorován u druhu Haliotrema balisticus (Dactylogyridae) parazitujícím na druhu Balistes capriscus (Balistidae, Tetraodontiformes) (Kearn 1971). Při parazitologickém vyšetření jsme tuto schopnost relativně rychlého přemisťování pozorovaly a všichni jedinci nalezení volně mimo žaberní aparát, tedy jedinci, kteří nebyli během manipulace schopní udržet se na žábrách, byli později určeni právě jako zástupci druhu T. latus. Na rozdíl od druhu T. serendipitus, který preferuje distální části žaber, se T. latus vyskytuje především v centrálních oblastech. Prostorové ddělení nik vysvětluje, proč mají oba druhy podobné samčí kopulační orgány, ale zároveň odlišnou stavbu haptoru. Šimková et al. (2002) sledovali rozdíly ve stavbě haptoru a reprodukčních orgánů 9 kongenerických druhů rodu Dactylogyrus a zjistili, že druhy s podobnou stavbou haptoru a naopak odlišnými samčími kopulačními orgány sdílejí určitou ekologickou niku. Je to dáno tím, že druhy s podobnou ekologickou nikou využívají podobné zdroje, a proto mají i podobné morfologické adaptace, a zároveň se kvůli sdílenému habitatu a riziku hybridizaci potřebují reprodukčně izolovat, v tomto případě odlišnou morfologií samčích kopulačních orgánů. Druhy, které ekologickou niku nesdílejí, pak vykazují přesně opačné charakteristiky. Zatímco v heterogenním prostředí je prostorová proměnlivost dána biotickými i abiotickými faktory, v homogenním prostředí jsou nejdůležitejšími mechanismy diferenciace nik intraspecifická agregace a interspecifická segregace (Chesson 2000). Naše pozorování prokázala velmi těsný vztah mezi šířkou niky a abundancí druhu, což je vysvětlováno právě vlivem vnitrodruhových faktorů na prostorovou distribuci. Naopak nebyla potvrzena závislost šířky niky jednoho druhu na abundanci druhého druhu, a tím pádem nebylo prokázáno, že by niky druhů ovlivňovala mezidruhová kompetice. Oba výsledky jsou v souladu s tím, co předpokládá Rohde (1979), tedy že mnoho potencionálních nik rybích ektoparazitů je prázdných a tudíž nemůže být mezidruhová kompetice hlavním faktorem ovlivňujícím segregaci nik. Naopak hlavní vliv přisuzuje vnitrodruhovým faktorům a tvrdí, že prostorová segregace není výsledkem selekce pro stabilní oddělení kompetičních druhů, ale je adaptací pro udržení vnitrodruhového kontaktu při nízkých populačních hustotách parazita. Nutnost vnitrodruhového kontaktu z důvodu zvyšování příležitostí k páření dokazuje i námi pozorovaná agregovanost jedinců druhu T. serendipitus, kteří jsou z podstaty své morfologie dosti imobilní a nemohou tak aktivně vyhledávat partnery.

Ačkoli soubor post-larválních stadií obsahuje jedince obou výše zmíněných druhů, vypočítali jsme pro něj jako pro samostatnou jednotku stejné charakteristiky a srovnali je s druhy T. serendipitus a T. latus. Bylo zjištěno, že juvenilové mají nejširší niku a nejvíce se překrývají s nikou druhu T. latus. Velká šířka niky juvenilů je patrně dána tím, že hlavním úkolem raných stadií, nehledě na druhovou příslušnost, je co nejefektivněji osídlit žaberní aparát. Dospělci, kteří mají různé druhově specifické adaptace, pak mohou obsazovat konkrétní mikrohabitaty v souladu s jejich ekologickou nikou a původně široká nika juvenilů se tak v dospělosti zúží.

Díky malé ploše žaberního aparátu jsou monogenea ideálními modelovými organismy pro sledování a měření prostorové distribuce a segregace nik. Stejně jako v mnoha publikovaných pracích, výsledky potvrdily druhově specifické preference určitých žaberních oblastí a jejich souvislost s morfologickými adaptacemi příchytného ústrojí na daný mikrohabitat. Pozorována byla rovněž prostorová segregace druhů s morfologicky velmi podobnými samčími kopulačními orgány, což podporuje hypotézu o prostorové izolaci druhů k posílení reprodukčních bariér a tím zabránění hybridizace. Poměrně unikátní jsou pak získané informace týkající se morfologických změn sklerotizovaných struktur haptoru během ontogenetického vývoje, a to ve vztahu k lokalizaci jednotlivých post- larválních stadií na těle hostitele. Bohužel se u raných stadií nepodařila určit druhová příslušnost, a to kvůli nevyvinutým skleritům. Tyto jedince by bylo možné spolehlivě identifikovat pouze na základě molekulárních znaků. Vzhledem k nepříliš velkému vzorku dat představuje tato diplomová práce spíše pilotní studii o prostorové distribuci monogeneí na hostitelském těle ryb. Přesto však otevírá celou řadu otázek, k jejichž uspokojivému vyřešení bude nutný nejen větší soubor dat, ale také komplexnější přístup využívající různé metody studia (např. molekulární, histologické, elektronové mikroskopie).

SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY

Abumandour, M.M.A. & Gewaily, M.S. 2016: Morphological studies on the gills of puffer fish (Lagocephalus sceleratus, Gmelin, 1789). Int. J. Morphol 34(3): 817–829.

Baensch, H.A. & Fischer, G.W. 1998: Aquarienatlas: foto-index 1-5. Mergus Verlag GmbH, Melle, Germany,

Bakke, T.A., Cable, J. & Harris, P.D. 2007: The biology of gyrodactylid monogeneans: The ‘Russian-Doll Killers’. In Advances in Parasitology (eds. J. R. Baker, R. Muller, & D. Rollinson), pp. 161–376. , Elsevier Science, London, UK.

Boeger, W.A. & Kritsky, D.C. 1993: Phylogeny and a revised classification of the Monogenoidea Bychowsky, 1937 (Platyhelminthes). Systematic Parasitology 26: 1– 32.

Boeger, W.A. & Kritsky, D.C. 2001: Phylogenetic relationships of the Monogenoidea. In Interrelationships of the Platyhelminthes (eds. D. T. J. Littlewood & R. A. Bray), pp. 92–102. , Taylor & Francis, London.

Boeger, W.A. & Vianna, R.T. 2006: Monogenoidea. In Amazon fish parasites (ed. V. E. Thatcher), pp. 42–116. , Pensoft, Sofia, Bulgaria.

Buhrnheim, U. 1972: Monogenetic trematodes from South-Atlantic coast. 1. Loimos scitulus sp. n. (Loimoidae) and Tagia ecuadori (Meserve, 1938) Sproston, 1946 (Diclidophoridae). Memorias Do Instituto Oswaldo Cruz 70(1): 29–35.

Buchmann, K. & Uldal, A. 1997: Gyrodactylus derjavini infections in four salmonids:comparative host susceptibility and site selection of parasites. Diseases of Aquatic Organisms 28(3): 201–209.

Buchmann, K. & Bresciani, J. 1998: Microenvironment of Gyrodactylus derjavini on rainbow trout Oncorhynchus mykiss: association between mucous cell density in skin and site selection. Parasitology research 84(1): 17–24.

Burgess, W.Axelrod, H.R.& Hunziker, R.E. 1988: Dr. Burgess’s atlas of marine aquarium fishes 3rd ed. T.F.H. Publications, New York,

Bush, A., Lafferty, K., Lotz, J. & Shostak, A. 1997: Parasitology meets ecology on its

own terms: Margolis et al. revisited. The Journal of parasitology.

Bychowsky, B.E., Mamaev, Y.L. & Nagibina, L.F. 1976: Revision of the genus Heterobothrium Cerfontaine, 1895 (Diclidophoridae). Trudy Biologo-Pochvennogo Instituta, Novaya Seriya 34: 29–40.

Caballero, C.E. & Brenes, M. 1957: Helmintos de la Republica de Costa Rica VI. Algunos tremátodos de peces, reptiles y mamiferos. Anales del Instituto de Biología, Universidad Nacional Autónoma de México, Serie Zoología 28(1–2): 215–240.

Caballero, C.E., Bravo-Hollis, M. & Grocott, R.G. 1953: Helmintos de la Republica de Panamá. VII. Descripcion de algunos trematodos de peces marinos. Anales del Instituto de Biologia 24: 97–136.

Caballero, C.E., Bravo-Hollis, M. & Grocott, R.G. 1955: Helmintos de la Republica de Panamá. XIV. Trematodos monogeneos y digeneos de peces marinos del Oceano Pacifico del Norte, con descripcion de nuevas formas. Annales del Instituto Biologico del Universidad Nacional Autonom de Mexico, Series Zoologica 26: 117–147.

Desdevises, Y. & Morand, S. 2002: Evolution and determinants of host specificity in the genus Lamellodiscus (Monogenea). Biological Journal of the.

Ebert, K. 2001: The puffers of fresh and brackish waters. Aqualog Verlag GmbH, Mӧrfelden-Walldorf, Germany,

Ergens, R. 1956: Výsledky výzkumu monogenetických motolic rodu Dactylogyrus Diesing, 1850. Práce Brněnské Základny Československé Akademie Věd. 28(7): 346–376.

Euzet, L. & Birgi, E. 1975: Heterobothrium fluviatilis n.sp. (Monogenea, Diclidophoridae) - branchial parasite of Tetraodon fahaka Bennett 1834 (Teleostei) of Tchad. Bulletin De La Societe Zoologique De France-Evolution Et Zoologie 100(4): 411–420.

Euzet, L. & Combes, C. 1980: Les problèmes de l’espèce chez les animaux parasites. Bull Soc Zool Fr.

Euzet, L. & Combes, C. 1998: The selection of habitats among the monogenea. Int J Parasitol 28(10): 1645–1652.

Fajer-Ávila, E., Roque, A., Aguilar, G. & Duncan, N. 2004: Patterns of occurrence of the platyhelminth parasites of the wild bullseye puffer (Sphoeroides annulatus) off Sinaloa,

Mexico. Journal of Parasitology 90(2): 415–418.

Geets, A., Coene, H.& Ollevier, F. 1997: Ectoparasites of the whitespotted rabbitfish, Siganus sutor (Valenciennes, 1835) off the Kenyan Coast: distribution within the host population and site selection on the. Parasitology 115(1): 69–79.

Gelnar, M., Svobodova, Z .& Vykusova, B. 1990: Eudiplozoon nipponicum (Goto, 1891)– acclimatization of parasite in Czech ponds. Czech Fishery Bulletin.

Gonzalez-Lanza, M.C. & Alvarez-Pellitero, M.P. 1982: Description and population dynamics of Dactylogyrus legionensis n.sp. from Barbus barbus bocagei Steind. Journal of Helminthology 56(3): 263.

Goode, G.B. 1884: The fisheries and fishery industries of the United States. Government Printing Office, Washington,

Goto, S. 1894: Studies on the ectoparasitic trematodes of Japan. J. Coll. Sci. Imp. Univ. Tokyo,

Grano-Maldonado, M., Roque, A., Aguirre, H. & Fajer-Ávila, E. 2011: Egg morphology, larval development and description of the oncomiracidium of Heterobothrium ecuadori (Monogenea: Diclidophoridae) parasitising the bullseye pufferfish, Sphoeroides annulatus. Helminthologia 48(1): 51–55.

Guo, J.Zhang, J., Zhao, B., Luo, M. & Zhang, C. 2016: The role of spotted green pufferfish Tetraodon nigroviridis in controlling golden apple snail Pomacea canaliculata : an effective biological control approach involving a new agent. Biocontrol Science and Technology 26(8): 1100–1112.

Gutierrez, P.A. & Martorelli, S.R. 1999: Hemibranch preference by freshwater monogeneans a function of gill area, water current, or both? Folia Parasitologica 46(4): 263–266.

El Hafidi, F., Berrada-Rkhami, O., Benazzou, T. & Gabrion, C. 1998: Microhabitat distribution and coexistence of Microcotylidae (Monogenea) on the gills of the striped mullet Mugil cephalus : chance or competition? Parasitology Research 84(4): 315–320.

Hayward, C. 2005: Monogenea Polyopisthocotylea (ectoparasitic flukes). In Marine Parasitology (ed. K. Rohde), pp. 55–63. , CSIRO, Collingwood, Australia & CABI.

Holmes, J.C. 1973: Site selection by parasitic helminths: interspecific interactions, site segregation, and their importance to the development of helminth communities. Canadian Journal of Zoology 51(3): 333–347.

Holmes, J.C. 1990: Competition, contacts, and other factors restricting niches of parasitic helminths. Annales de Parasitologie Humaine et Comparée 65: 69–72.

Hutchinson, G.E. 1957: Concluding Remarks. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 22(0): 415–427.

Chesson, P. 2000: Mechanisms of maintenance of species diversity. Annual Review of Ecology and Systematics 31(1): 343–366.

Chubb, J.C. 1977: Seasonal occurrence of helminths in freshwater fishes part I. Monogenea. In , pp. 133–199.

Chulanetra, M., Sookrung, N., Srimanote, P., Indrawattana, N., Thanongsaksrikul, J., Sakolvaree, Y., Chongsa-Nguan, M., Kurazono, H. & Chaicumpa, W. 2011: Toxic marine puffer fish in Thailand seas and tetrodotoxin they contained. Toxins 3(10): 1249–1262.

Kadlec, D., Šimková, A. & Gelnar, M. 2003: The microhabitat distribution of two Dactylogyrus species parasitizing the gills of the barbel, Barbus barbus. Journal of Helminthology 77(4): 317–325.

Kearn, G. 1971: The attachment of the ancyrocephalid monogenean Haliotrema balisticus to the gills of the trigger fish, Balistes capriscus (= carolinensis). Parasitology 63(1): 157–162.

Kearn, G.C. 1968: Development of adhesive organs of some diplectanid, tetraonchid and dactylogyrid gill parasites (Monogenea). Parasitology 58: 149–163.

Kearn, G.C. 1994: Evolutionary expansion of the Monogenea. International Journal for Parasitology 24(8): 1227–1271.

Klassen, G.J. 1993: A new species of Haliotrema (Monogenea, Ancyrocephalidae) from a Japanese puffer fish Takifugu niphobles (Tetraodontiformes, Tetraodontidae). Int J Parasitol 23(6): 777–783.

Krebs, C.J. 1999: Ecological methodology. Benjamin/Cummings,

Lamothe-Argumedo, R. 1967: Monogeneos de peces. V. Redescripción de Tagia ecuadori (Meserve, 1938) Sproston, 1946. In Anales del Instituto de Biología, Universidad Nacional Autónoma de México, Serie Zoología, pp. 35–46.

Lim, L.H.. 1998: Diversity of monogeneans in Southeast Asia. International Journal for Parasitology 28(10): 1495–1515.

Livengood, E.J. & Chapman, F.A. 2007: The ornamental fish trade: an introduction with perspectives for responsible aquarium fish ownership. University of Florida IFAS Extension.

Llewellyn, J. 1956: The host-specificity, micro-ecology, adhesive attitudes, and comparative morphology of some trematode gill parasites. Journal of the Marine Biological Association of.

Llewellyn, J. 1963: Larvae and larval development of monogeneans. In Advances in Parasitology (ed. B. Dawes), pp. 287–326. , Academic Press, UK, London.

Malmberg, G. 1957: On the occurrence of Gyrodactylus on Swedish fishes. Skrifter utgivna av Sodra Sveriges Fiskeriforening (1956): 19–76.

Malmberg, G. 1970: The excretory systems and the marginal hooks as a basis for the systematics of Gyrodactylus (Trematoda, Monogenea). Arkiv for Zoologi 23(1/2): 1– 235.

Meserve, F.G.C. 1938: Some monogenetic trematodes from the Galapagos Islands and the neighbouring Pacific. Allan Hancock Pacific Expedition 2(5): 31–89.

Mizelle, J. 1936: New species of trematodes from the gills of Illinois fishes. American Midland Naturalist.

Monks, N. 2007: In Search of the Peaceful Puffer. TFH Magazine 56(4): 86–90.

Morsy, K., Saady, H., Abdel-Ghaffar, F., Bashtar, A.R., Mehlhorn, H., Al Quraishy, S. & Adel, A. 2012: A new species of the genus Heterobothrium (Monogenea: Diclidophoridae) parasitizing the gills of tiger puffer fish Tetraodon lineatus (Tetraodontidae). A light and scanning electron microscopic study. Parasitology Research 110(3): 1119–1124.

Nelson, J.S. 2006: Fishes of the world 4th ed. John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New

Jersey,

Noguchi, T., Joong-Kyun, J., Arakawa, O., Sugita, H., Deguchi, Y., Shida, Y. & Hashimoto, K. 1986: Occurrence of tetrodotoxin and anhydrotetrodotoxin in Vibrio sp. isolated from the intestines of a xanthid crab, Atergatis floridus. The Journal of Biochemistry 99(1): 311–314.

Ogawa, K. 1991: Redescription of Heterobothrium tetrodonis (Goto, 1894) (Monogenea: Diclidophoridae) and other related new species from puffers of the genus Takifugu (Teleostei: Tetraodontidae). Japanese journal of parasitology 40(4): 388–396.

Ogawa, K. 1997: Copulation and egg production of the Monogenean Heterobothrium okamotoi, a gill parasite of cultured tiger puffer(Takifugu rubripes). Fish Pathology 32(4): 219–223.

Ogawa, K. & Inouye, K. 1997: Heterobothrium infection of cultured tiger puffer, Takifugu rubripes. A field observation. Fish Pathology 32(1): 15–20.

Okamoto, T. 1963: On the problems of monogenetic trematode infection of puffers from inland sea of Japan. Suisan Zoshoku 3: 17–29.

Okita, K., Yamazaki, H., Sakiyama, K., Yamane, H., Niina, S., Takatani, T., Arakawa, O. & Sakakura, Y. 2013: Puffer smells tetrodotoxin. Ichthyological Research 60(4): 386–389.

Paling, J.E. 1968: A method of estimating the relative volumes of water flowing over the different gills of a freshwater fish. Journal of Experimental Biology 48(3).

Poulin, R. 1992a: Determinants of host-specificity in parasites of freshwater fishes. International Journal for Parasitology 22(6): 753–758.

Poulin, R. 1992b: Toxic pollution and parasitism in freshwater fish. Parasitology Today 8(2): 58–61.

Prost, M. 1963: Investigations on the development and pathogenicity of Dactylogyrus anchoratus (Duj., 1845) and D. extensus Mueller et v. Cleave, 1932 for breeding carps. Acta Parasitologica Polonica 11(1/4): 17–47.

Pugachev, O.N., Gerasev, P.I., Gussev, A. V., Ergens, R., Khotenowsky, I., Galli, P. & Kristsky, D. 2009: Guide to Monogenoidea of freshwater fish of palaeartic and amur

regions. Ledizioni-LediPublishing, Milano, Italy,

Ramasamy, P., Ramalingam, K., Hanna, R.E.B. & Halton, D.W. 1985: Microhabitats of gill parasites (Monogenea and copepoda) of teleosts (Scomberoides spp.). International Journal for Parasitology 15(4): 385–397.

Rohde, K. 1979: A critical evaluation of intrinsic and extrinsic factors responsible for niche restriction in parasites. The American Naturalist 114(5): 648–671.

Rohde, K. 1991: Intraspecific and interspecific interactions in low density populations in resource-rich habitats. Oikos 60(1): 91–104.

Rubio-Godoy, M. & Tinsley, R. 2002: Trickle and single infection with Discocotyle sagittata (Monogenea: Polyopisthocotylea): effect of exposure mode on parasite abundance and development. Folia parasitologica 49(4): 269–278.

Řehulková, E. & Gelnar, M. 2005: A revised diagnosis of Thylacicleidus (Monogenea : Dactylogyridae) with a redescription of the type species, Thylacicleidus serendipitus, and descriptions of two new species from southeast Asian pufferfishes (Tetraodontiformes : Tetraodontid. Journal of Parasitology 91(4): 794–807.

Sanchez-Garcia, N., Raga, J.A. & Montero, F.E. 2015: Morphological and attachment changes of Lamellodiscus theroni (Monogenea: Diplectanidae) during its post-larval development on fish. Folia Parasitologica 62: 8.

Silva, M.Azevedo, J., Rodriguez, P., Alfonso, A., Botana, L.M. & Vasconcelos, V. 2012: New gastropod vectors and tetrodotoxin potential expansion in temperate waters of the atlantic ocean. Marine Drugs 10(12): 712–726.

Simidu, U.Kita-Tsukamoto, K., Yasumoto, T. & Yotsu, M. 1990: Taxonomy of four marine bacterial strains that produce tetrodotoxin. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 40(4): 331–336.

Smyth, J.D. & Halton, D.W. 1983: The Physiology of Trematodes 2nd ed. Cambridge University Press, Cambridge, UK,

Soler-Jiménez, L. & Fajer-Ávila, E. 2012: The microecology of dactylogyrids (Monogenea: Dactylogyridae) on the gills of wild spotted rose snapper Lutjanus guttatus (Lutjanidae) from Mazatlan Bay, Mexico. Folia parasitologica.

Šimková, A., Desdevises, Y., Gelnar, M. & Morand, S. 2000: Co-existence of nine gill ectoparasites (Dactylogyrus: Monogenea) parasitising the roach (Rutilus rutilus L.): history and present ecology. International Journal for Parasitology 30(10): 1077– 1088.

Šimková, A., Ondráčková, M., Gelnar, M. & Morand, S. 2002: Morphology and coexistence of congeneric ectoparasite species: reinforcement of reproductive isolation? Biological Journal of 76: 125–135.

Šimková, A., Verneau, O., Gelnar, M. & Morand, S. 2006: Specifity and specialization of congeneric monogeneans parasitizing cyprinid fish. Evolution 60(5): 1023.

Tripathi, Y.R. 1959: Monogenetic trematodes from fishes of India. Indian Journal of Helminthology 9(1/2): 1–149.

Turgut, E., Shinn, A. & Wootten, R. 2006: Spatial distribution of Dactylogyrus (Monogenan) on the gills of the host fish. Turkish Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 6: 93–98.

Tyler, J.C. 1980: Osteology, phylogeny, and higher classification of the fishes of the order Plectognathi (Tetraodontiformes). U.S. Dept. of Commerce, National Oceanic and Atmospheric Administration, National Marine Fisheries Service, [Seattle, Wash.] :,

Vidal-Martinez, V.M. & Mendoza-Franco, E.F. 2008: Heterobothrium lamothei n. sp (Monogenea: Diclidophoridae) from the gills of Sphoeroides testudineus (Pisces: Tetraodontidae) from the coast of Yucatan, Mexico. Revista Mexicana De Biodiversidad 79: 89S–93S.

Wainwright, P.C. & Turingan, R.G. 1997: Evolution of pufferfish inflation behavior. Evolution 51(2): 506.

Wheeler, T.A. & Klassen, G.J. 1988: Thylacicleidus serendipitus n. gen., n. sp. (Monogenea: Ancyrocephalidae) from the Indonesian freshwater puffer Tetraodon fluviatilis (Tetraodontiformes: Tetraodontidae). Canadian Journal of Zoology-Revue Canadienne De Zoologie 66(9): 1928–1930.

Whittington, I.D. 1998: Diversity ‘down under’: monogeneans in the Antipodes (Australia) with a prediction of monogenean biodiversity worldwide. Int J Parasitol 28: 1481– 1493. 65

Whittington, I.D. & Chisholm, L.A. 2008: Diseases caused by Monogenea. In Fish diseases (eds. J. C. Eiras, H. Segner, T. Wahli, & B. G. Kapoor), pp. 683–816. , Science Publishers, Enfield, New Hampshire, USA.

Whittington, I.D., Cribb, B.W., Hamwood, T.E. & Halliday, J.A. 2000: Host-specificity of monogenean (platyhelminth) parasites: a role for anterior adhesive areas? Int J Parasitol 30(3): 305–320.

Williams, A. 1986: Taxonomy of 2 new species of Heterobothrium (Monogenea, Diclidophoridae) from Torquigener pleurogramma (Pisces, Tetraodontidae) from western Australia. Australian Journal of Zoology 34(5): 707–715.

Wootten, R. 1974: The spatial distribution of Dactylogyrus amphibothrium on the gills of ruffe Gymnocephalus cernua and its relation to the relative amounts of water passing over the parts of the gills. Journal of Helminthology 48(3): 167–174.

Yamaguti, S. 1958: Studies on the helminth fauna of Japan. Part 53. Trematodes of fishes, XII. Publications of the Seto marine biological Laboratory 7(1): 53–88.

Yamaguti, S. 1968: Monogenetic trematodes of Hawaiian fishes. University of Hawaii Press, Honolulu, Hawaii,

Yamanoue, Y., Miya, M., Doi, H., Mabuchi, K., Sakai, H. & Nishida, M. 2011: Multiple invasions into freshwater by pufferfishes (Teleostei: Tetraodontidae): amitogenomic perspective. Plos One 6(2): 1–13.

Yasumoto, T., Yasumura, D., Yotsu, M., Michishita, T., Endo, A. & Kotaki, Y. 1986: Bacterial production of tetrodotoxin and anhydrotetrodotoxin. Agricultural and Biological Chemistry 50(3): 793–795.

Yoshikawa-Ebesu, J.S.M., Hokama, Y. & Noguchi, T. 2000: Tetrodotoxin. In Foodborne disease handbook. Volume 4: seafood and environmental toxins (eds. Y. H. Hui, D. Kitts, & P. S. Stanfield), pp. 253–284. , Marcel Dekker, Inc., NY.

Yoshinaga, T., Yasuzaki, M. & Ogawa, K. 2006: Fate of oncomiracidia of Heterobothrium okamotoi (Monogenea) attaching to the body surface of tiger puffer Takifugu rubripes. Fish Pathology 41(3): 113–115.

Young, P.C. 1968: Ten new species of Haliotrema (Monogenoidea-Dactylogyridae) from

Australian fish and a revision of genus. Journal of Zoology 154: 41–75.

Elektronické zdroje

Froese R. & Pauly D. (ed.) 2016: FishBase. World Wide Web electronic publication. Dostupné z www.fishbase.org. Verze (10/2016).