N° D’ORDRE : 16/2009-M/S.N RÉPUBLIQUE ALGÉRIENNE DÉMOCRATIQUE ET POPULAIRE Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique Université des Sciences et de la Technologie Houari Boumediène Faculté des Sciences Biologiques

MEMOIRE

Présenté en vue de l’obtention du diplôme de MAGISTER

EN SCIENCES DE LA NATURE Spécialité : Écobiologie et Amélioration Végétales Présenté par DJOUADI Samir

le thème

Caractérisation phénotypique et génotypique des Rhizobia associés aux d’Algérie

Soutenu publiquement le 02 Décembre 2009 devant le jury composé de:

Mme BOUGUEDOURA N. Professeur (FSB-USTHB) Présidente

Mme AID F. Professeur (FSB-USTHB) Directrice de thèse Mr. HANIFI N. Maître de Conférences (FSB-USTHB) Examinateur

Mr. KACI Y. Maître de Conférences (FSB-USTHB) Examinateur

Mr. AMRANI S. Chargé de Cours (FSB- USTHB) Examinateur

1 Résumé

Cette étude porte sur la prévalence de la symbiose et la diversité des Rhizobia associés chez les légumineuses de la tribu des Loteae en Algérie. L’examen de 101 , représente 44 taxons et 8 genres, prélevés de différentes régions ont permis d’établir que la symbiose à Rhizobia est courante chez ce groupe de plantes. La caractérisation symbiotique (Spectre d’hôte), phénotypique et génotypique (PCR-RFLP et séquençage du gène de l’ARN 16S) de 93 souches de Rhizobia associées à permis de montrer que les Loteae d’Algérie sont nodulés par au moins 8 espèces représentant 5 lignées phylogénétiques de BNL. Parmi ces BNL associées aux Loteae en Algérie, nous avons mis en évidence des souches de Burkholderia qui est associée aux Mimosoîdés d’Amérique centrale.

Mots clé : Symbiose, Loteae Algérie, Rhizobia associées, caractérisation phénotypique et genotypique (PCR-RFLP et séquençage du gène de l’ARN 16S), Burkholderia.

2 Je dédie spécialement cette thèse à mes parents pour

leur soutien inébranlable et sans qui je ne serais pas là aujourd'hui.

Je la dédie également à mes sœurs et frères

qui m’ont toujours donné le sourire dans les moments difficiles,

qui ont toujours su raviver en moi cette flamme de l'espoir pour

qu'elle ne s'éteigne jamais.

Je voudrais simplement leur dire que je les aime de tout mon cœur.

Et à tous ceux qui comptent pour moi

3 Remerciements

Je souhaite tout d’abord adresser mes sincères remerciements à ma directrice de thèse, Mme Aïd F. Professeur à la Faculté des Sciences Biologiques (FSB) USTHB pour le grand honneur qu’elle m’a fait en acceptant de diriger ce travail, pour les connaissances et le savoir-faire qu’elle m’a apporté qui sont et resteront précieux pour moi.Je tiens à remercier aussi Mr Amrani S. MAA à la Faculté des Sciences Biologiques (FSB) USTHB qui a accepté de juger ce travail pour ses recommandations, ses discussions perspicaces ainsi que pour ses conseils qui ont beaucoup enrichi non seulement ma recherche au sein du laboratoire mais également différents aspects de ma vie.

Mes remerciements s'adressent aussi à Mme BOUGUEDOURA N. Professeur à l’USTHB, pour l'honneur qu'elle me fait en acceptant de présider le jury de soutenance.

Je remercie également Mr HANIFI N. Maître de Conférences à l’USTHB et Mr KACI Y. Maître de Conférences à l’USTHB qui m’ont fait l’honneur de juger ce travail.

Je tiens à remercier également Mlle Noureddine N.E MAA à la (FSB) USTHB pour ses encouragements, pour son implication et les conseils scientifiques qu’elle m’a accordés.

Je remercie également tous les membres des laboratoires ou ce travail a été réalisé :

Le laboratoire de Biologie des Sols de la Faculté des Sciences Biologiques de l'USTHB.

Le laboratoire de physiologie végétale de la Faculté des Sciences Biologiques de l'USTHB.

Et à tous ceux qui ont participé de prés ou de loin à la réalisation de ce travail. Merci pour tout

4 Liste des abréviations

% : Pourcentage ° : Degré °C : Degré Celsius CV : Cultivar µg mL-1 : Microgramme par millilitre µL : Micro litre µm : Micromètre 16S rDNA : Ribosomal Deoxyribonucleic acid BNL : Bactéries nodulant les légumineuses DNA : Deoxyribonucleic acid EPS : Exopolysaccharides Fig : Figure J :Jours h : Heure ILDIS : International Legume Database and Information Service. M.V.S.P : Multi-Variate Statistical Package LCO : Lipo-oligosaccharides mL : Millilitre mL.L-1 : Millilitre par litre mM :Millimolaire mn : Minute ncbi : National Center for Biotechnology Information OTU : Unité Taxonomique Opérationnelle PCR : Polymerase Chain Reaction PEG : Polyéthylène Glycol pH : Potentiel hydrogène RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism rpm : Revolutions per minute s : Seconde Tab : Tableau TBE : Tris Borate EDTA tr/mn : Tours par minute TY : Yeast Tryptone UV : Ultra Violet YEMA : Tryptone Yeast Extract Agar YEMA-RC : Yeast Extract Mannitol Agar – Rouge Congo YEMB : Tryptone Yeast Extract Broth

5 Liste des tableaux

Tableau 1 : Liste des organismes fixateurs d’azote. Tableau 2 : Principaux remaniements taxonomiques à la tribu des Loteae d’Algérie. Tableau 3 : Caractéristiques principales des différents genres de la tribu des Loteae. Tableau 4 : Les Rhizobia capables de noduler les légumineuses et exceptionnellement des non-légumineuses. Tableau 5 : Liste des genres de Rhizobia nodulant les Loteae. Tableau 6: Amorces utilisées pour l’amplification et la détermination de la séquence nucléotidique du 16S rDNA. Tableau 7 : Différentes espèces de Loteae recueillis au cours de nos campagnes de prospection. Tableau 8 : Nombre de taxons par genre. Tableau 9 : Statut symbiotique (nodulation et fixation d’azote), type nodulaire et localisation des nodules chez les 44 taxons de Loteae examinées. Tableau 10 : Authentification des isolats bactériens extraits à partir des nodosités des 96 Plants de Loteae recueillis. Tableau 11 : Spectre d’hôte des différentes souches de Rhizobia associées aux Loteae d’Algérie Tableau 12: Profils phénotypiques des trois groupes d’isolats associés aux Loteae d’Algérie. Tableau 13. : Profils de restriction du 16S rDNA des souches de Rhizobia associées aux Loteae. Tableau 14 : Profils de restriction du gène de l’ARN 16S des 93 souches de Rhizobia associées au Loteae d’Algérie.

6 Liste des figures

Figure 1 : Représentation schématique du fonctionnement du complexe nitrogénasique. Figure 2 : Les différents systèmes de fixation biologique de l’azote moléculaire et leur potentiel de fixation d’azote en kg/ha de sol. Figure 3 : Etapes du processus de nodulation lors de la symbiose Légumineuses – Rhizobium. Figure 4 : Schéma général de la structure du nodule chez les légumineuses. Figure 5 : Fixation de l’azote et transport de l’ammonium dans le symbiosome. Figure 6 :Localités de prélèvement des Loteae utilisées pour la constitution d’une collection de souches de Rhizobia associées Figure 7 : Nodules de plants de Loteae provenant de différentes localités d’Algérie. Figure 8 : Photos de nodules obtenus pour les tests d’authentification des isolats bactériens. Figure 9 : Phénogramme représentant la subdivision des souches de Rhizobia associées aux Loteae d’Algérie en fonction de leur spectre d’hôte. Figure 10 : Phénogramme représentant le traitement numérique simultané du spectre d’hôte et de l’efficience symbiotique des souches de Loteae associées. Figure 11 : Phénogramme représentant les caractères phénotypiques des souches de Rhizobia associées aux Loteae d’Algérie. Figure 12 : électrophorèse des amplifiats obtenus par PCR-RFLP de l’ADNr 16s.de quelques souches nodulant les Loteae. Figure 13 : Profils éléctrophorétique de la restriction par RFLP de l’ADNr 16S obtenu pour quelques souches après digestion par l’endonucléase Hinf1. Figure 14 : Arbre phylogénétique des souches associées aux Loteae d’Algérie.

7 Sommaire

Liste des abréviations Liste des figures Liste des tableaux Introduction 1

Synthèse bibliographique 1-La fixation biologique de l’azote moléculaire 3 1-1- La nitrogénase 5 1-1-1 - Structure – Constitution 5 1-1-2 - Fonctionnement de la nitrogénase 6 1-2-Les différents systèmes de fixation biologique de l’azote 7 2-La symbiose Rhizobia légumineuses 10 2-1- Le macrosymbionte : les légumineuses 10 2-1-1 - Les Cesalpinoidées 10 2-1-2 - Les Mimosoïdées 11 2-1-3 - Les Papilionoïdées 12 2-1-4 - La tribu des Loteae 13 2-2- Le microsymbionte : Les Rhizobia 17 2-2-1 - Les bactéries nodulant les légumineuses 17 2-2-2 - Les Rhizobia associés aux Loteae 20 2-3- Etablissement de la symbiose 21 2-3-1 - La formation des nodules racinaires 21 2-3-2 - Fonctionnement du nodule 24 2-4- Utilisation de la symbiose Rhizobia légumineuses 25 Matériels et méthodes 1-Matériel 27 1-1-Matériel végétal 27 1-2-Semences 28 1-3-Milieux de culture 28 2-Méthodes 29 2-1- Evaluation de la prévalence de la nodulation et de la fixation d’azote chez les Loteae 29 2-1-1– Extraction 29 2-1-2- Isolement et purification 29 2-1-3-Conservation des souches 30 2-2-Détermination des caractéristiques symbiotiques des souches 30 2-2-1-Stérilisation superficielle des semences 30 2-2-2 -Substrat utilisé pour la culture des au laboratoire 30 2-2-3- Préparation de l’inoculum 31 2-2-4 -Conditions de culture 31 2-3-Caractérisation phénotypique des souches 32 2-3-1-Préparation des milieux tests 32 2-3-2-Lecture des résultats 32 2-3-3- Analyse numérique 33 2-3-3-1- La taxonomie numérique 33 2-3-3-2- Indice de similitude 33

8 2-3-3-3 - Logiciel utilisé 33 2-4- Caractérisation génotypique 33 2-4-1- Extraction de L’ADN 33 2-4-2 - Amplification du 16S rDNA 34 2-4-3- Analyse des fragments de restriction 35 2-4-4 - Séquençage du 16S rDNA 36 2-4-5- Traitement des séquences 36 2-4-6 - Interrogation des bases de données de séquences génétiques (BLAST) 36 2-4-7 - Alignement des séquences 37 2-4-8 - Dépôt des séquences auprès de NCBI-GenBank 37 Résultats et discussions I - Prévalence de la symbiose à Rhizobia chez les Loteae d’Algérie 38 1-1 - Loteae recueillies au cours de nos prospections 38 1-2 -Statut symbiotique des Loteae d’Algérie 43 1-3 - Les Rhizobia associés aux Loteae d’Algérie 50 1-3-1 - Extraction des souches et authentification des isolats 50 1-3-2 - Spectre d’hôte des BNL associées aux Loteae d’Algérie 52 1-3-3 – Nodulation 59 1-3-4 - Fixation d’azote 63 2-Caractérisation phénotypique 65 2-1- Caractéristiques coloniales 65 2-2- Etude phénotypique 66 3-Caractéristique génotypiques 71 3-1 Profils de restriction du 16S rDNA 71 3-2 Identification des souches par séquençage du gène de l’ARN 16S 78 4 - L’arbre phylogénétique obtenu 79 Conclusion générale 82 Références bibliographiques 85 Annexe

9 Introduction

10 Introduction

Les légumineuses de la tribu des Loteae sensu Polhill (1994), qui regroupe aujourd’hui les représentants de la tribu des Loteae et des Coronilleae sensu Polhill (1981) est l’une des plus grandes tribus de légumineuses-papillionacées de la zone tempérée (Polhill 1981, 1994). Cette tribu est représentée presque exclusivement par des espèces herbacées et comporte, à l’échelle mondiale, près de 273 taxons distribués sur 21 genres. Les représentants des Loteae, initialement considérés comme des Genisteae (Polhill 1981, 1994) sont aujourd’hui, et à la lumière des données moléculaires, rapprochés du clade des Robinoidées qui englobe en plus des Loteae sensu lato, les représentants du genre Sesbania et les Robinieae (Kass et Wink, 1997).

Les Loteae constituent un groupe important de la flore des légumineuses d’Algérie au niveau de laquelle elle est représentée par au moins 75 taxons répartis sur 12 genres (Quezel et Santa, 1962 ; ILDIS, 2002) ce qui en fait une des plus importante de la famille des légumineuses d’Algérie puisqu’elle représente à elle seule près d’un sixième de la biodiversité de ce groupe de plantes.

Les Loteae d’Algérie sont représentées essentiellement par des espèces herbacées et arbustives des genres Lotus, , Anthyllis, Ornithopus, Hippocrepis, Dorycnium, Scorpiurus, Hymenocarpos, chez qui prédominent les formes herbacées annuelles. Les représentants de ces taxons sont essentiellement présents et abondants au nord du pays sous régime sub-humide et humide mais quelques espèces sont présentes au sud du pays en zone semi-aride, aride ou désertique. Elles se rencontrent essentiellement au niveau des pâturages humides et désertiques, dans les zones montagneuses, forêts claires, sables maritimes, et broussailles.

En raison de leur capacité de fixer l’azote atmosphérique et de leur abondance dans les milieux naturels elles jouent un rôle important pour le maintien et/ou l’augmentation du niveau de fertilité azotée des sols, dans la succession écologique et présentent un grand intérêt agropastoral (Abdelguerfi et Abdelguerfi-Laouar, 2004) du fait de leur teneur élevée en protéines.

11 Introduction

Malgré l’importance qualitative, quantitative et écologique de ce groupe de légumineuses, aucune étude portant sur leur capacité de contracter une symbiose fixatrice d’azote et sur la nature des Rhizobia qui leurs sont associées n’a été menée, à notre connaissance, en Algérie.

C’est en raison de l’importance des Loteae en tant que composante importante de la flore des légumineuses d’Algérie et de l’absence d’informations concernant la prévalence de la symbiose et la nature des Rhizobia associés à ce groupe de plantes que nous avons jugé intéressant de réaliser cette étude.

Nous nous sommes fixé comme objectifs dans le cadre de celle-ci

- D’évaluer la prévalence de la symbiose à Rhizobia et de la fixation symbiotique de l’azote chez les Loteae d’Algérie en procédant à des prospections en milieu naturel. - De procéder à l’extraction, l’isolement et l’authentification des souches de Rhizobia associées. - De caractériser ces souches sur le plan symbiotique (spectre d’hôte) et phénotypique (caractéristiques physiologiques, utilisation des substrats carbonées, résistance aux agents antibactériens…). - D’évaluer la diversité de ces souches par PCR-RFLP du gène de l’ARN 16S. - D’appréhender leur phylogénie par comparaison de la séquence de leur gène de l’ARN 16S avec les souches types des espèces de Rhizobia jusqu’ici reconnues.

Cette étude devrait permettre de révéler la nature des Rhizobia associés aux Loteae en Algérie, d’évaluer leur diversité et de vérifier si celles-ci sont similaires à celles mises en évidence dans d’autres régions du monde (Sprent et Parsons, 2000 ; Sprent, 2001). Elle peut aussi aboutir à la mise en évidence de souches originales propres au contexte biogéographique algérien.

12 Synthèse bibliographique

13 Synthèse bibliographique

1 - La fixation biologique de l’azote moléculaire

On désigne par fixation biologique de l’azote moléculaire (N2) sa réduction par un complexe enzymatique : la nitrogénase ou complexe nitrogénasique. Ce complexe métallo-enzymatique qui n’existe que chez les procaryotes est capable de catalyser l’hydrolyse de la triple liaison N≡N et de réduire N2 en NH3 selon la réaction ci- dessous.

- + + N2 + 8e + 8H 2NH4 + H2 16 ATP-Mg++ 16ADP + 16Pi

Les organismes capables d’effectuer cette réaction, sont très diversifiés puisqu’ils appartiennent aussi bien à l’empire des archaébactéries qu’à celui des eubactéries (Tab 1). Cependant, la grande majorité des organismes capables de réduire l’azote moléculaire fait partie de l’empire des eubactéries où ils occupent des classes très dissemblables (Firmicutes, Protéobactéries, Cyanobactéries).

Tableau 1 : Liste des organismes fixateurs d’azote

Subdivision Genres et ou espèces Observations fixatrices d’azote en Archaebactéries Methanosarcini barkeri anaérobiose Eubactéries

Firmicutes (Gram +) Bacillus Photosynthétiques

Protéobactéries (Gram -) Rhizobium Fixateurs symbiotiques Libres ou associés aux Cyanobactéries Nostoc sp. lichens

Ces bactéries, désignées par les termes de fixateurs d’azote ou diazotrophes, constituent une infime minorité par rapport au nombre de genres et d’espèces d’archaébactéries et d’eubactéries décrites à ce jour.

14 Synthèse bibliographique

L’activité des fixateurs d’azote est responsable de la réduction de près de 200 millions de tonnes d’azote par an au niveau de la biosphère soit près du double de la quantité d’azote fixée durant la même période par l’industrie mondiale des engrais azotés (environ 130M de tonnes). (Bakemeier et al., 1997) La fixation biologique de l’azote moléculaire, s’apparente au plan du fonctionnement de la biosphère à la photosynthèse. C’est la voie fondamentale d’enrichissement de la biosphère en azote combiné. C’est également par son biais que l’azote moléculaire

(N2) résultant de la dénitrification, c'est-à-dire du retour de l’azote combiné à l’état moléculaire, est recyclé au niveau de la biosphère. Il est intéressant de faire ici le parallèle entre la réduction biologique de l’azote et son équivalent technologique, le procédé Haber-Bosch de réduction industrielle de l’azote moléculaire. (Smil, 2001) Le procédé Haber-Bosch consiste tout comme la réduction biologique de l’azote atmosphérique à réduire l’azote moléculaire en ammoniac selon la réaction ci- dessous :

200 atm N2 + 3H2 2NH3 350 à 500°C

Cette réaction catalysée par du fer nécessite cependant une dépense considérable d’énergie pour assurer les conditions de pression (de 150 à 200 atmosphères) et de températures (350 à 500°C) nécessaires à la réaction. C’est pour ces raisons que l’industrie des engrais azotés est l’une de celles qui consomment le plus d’énergie puisqu’il faut pas moins de 2 tonnes de pétrole ou d’équivalent pétrole pour fixer 1 tonne d’azote, ce qui rend les engrais azotés particulièrement onéreux. En plus de la dépense énergétique considérable nécessaire à la production des engrais azotés, l’impact environnemental de leur production et de leur utilisation présente de nombreux inconvénients

15 Synthèse bibliographique

 consommation effrénée d’énergies fossiles (gaz, pétrole).  génération de gaz a effet de serre.  utilisation dispendieuse.  pollution, eutrophisation des lacs et des cours d’eaux (manque d’oxygène).  réduction de la biodiversité (la présence d’azote favorise le développement des plantes peu compétitive pour l’azote). La fixation biologique réalise quant à elle la même réaction à température ambiante et sous une atmosphère normale en faisant intervenir l’enzyme de la fixation d’azote : la nitrogénase ou complexe nitrogénasique (Postgate, 1998). Cette réduction biologique de l’azote moléculaire est de plus non polluante, durable, économiquement et écologiquement plus intéressante pour la gestion de la fertilité azotée des agrosystèmes. C’est pour ces raisons que l’on s’intéresse de plus en plus à la fixation biologique de l’azote comme moyen pour maintenir ou améliorer le niveau de fertilité azotée des sols et se passer de l’utilisation massive des engrais azotés. A titre d’exemple, l’Union Européenne s’est fixée de réduire de 50% sa consommation d’engrais azotés d’ici 2010, en particulier en faisant appel à la fixation biologique de l’azote moléculaire pour maintenir les rendements agricoles à un niveau acceptable.

1-1 - La nitrogénase 1-1-1 - Structure - Constitution La nitrogénase, enzyme qui permet aux organismes diazotrophes de réduire l’azote moléculaire, est en fait un complexe enzymatique constitué de deux métallo-enzymes dont le fonctionnement en tandem s’apparente à celui d’une oxydoréductase. Le complexe nitrogénasique comprend deux composantes (Fig 1)  La protéine I qui est une ferroprotéine (protéine Fe) appelée aussi nitrogénase réductase, est un homodimère de 64 kDa codé par le gène nifH. (Newton, 1993; Elmerich, 1997)  La protéine II qui est une ferro-molybdoprotéine (protéine FeMo), appelé aussi nitrogénase ou Mo-nitrogénase est un tétramère de 220 Kda constituée de 4

16 Synthèse bibliographique

sous unités, deux sous unité de 51 Kda et deux de 59 Kda. (Eady, 1986; Newton, 1993; Dommergues et al., 1999). Des variantes de protéine II ont été mises en évidence chez Azotobacter, où le molybdène est remplacé par du vanadium et chez Rhodobacter chez qui la protéine II ne comporte que du fer. Les gènes codant pour les deux composantes de la nitrogénase sont portés par un opéron appelé Nif (pour Nitrogen fixation). Les plus importants d’entre eux sont les gènes nifK et nifD qui codent pour la protéine II et le gène nifH qui code pour la protéine I. 1-1-2 - Fonctionnement de la nitrogénase

Le cycle réactionnel commence avec la liaison d'une molécule d'ATP à la protéine I réduite, ce qui provoque un changement conformationnel de cette protéine I et permet le transfert d'un électron de la protéine I à la protéine II. Le complexe ainsi formé se dissocie ensuite et la protéine I est alors réduite par un donneur d'électrons représenté par une ferrédoxine ou une flavodoxine. Le cycle est répété jusqu'à ce que 8 électrons soient transmis à la protéine II qui les transfère à son tour à une molécule d’azote moléculaire qui est réduite en ammoniac (Halbleib et al., 2000).

Fe Protéine MoFe Protéine

Ferredoxine ox Produits 2 NH3. H2

Substrats Ferredoxine red N2. 8H

Figure 1 : Représentation schématique du fonctionnement du complexe nitrogénasique d’après Dixon et Wheeler 1986, et Buchanan et al., 2000

17 Synthèse bibliographique

1-2 - Les différents systèmes de fixation biologique de l’azote

La réduction biologique de l’azote moléculaire, est une activité qui nécessite une dépense énergétique importante puisque pour réduire une molécule d’azote moléculaire, la bactérie doit utiliser 16 ATP (Postgate, 1982 ; Streeter, 1993). Le métabolisme énergétique des diazotrophes ne permet pas d’assurer à lui seul la fourniture de suffisamment d’énergie pour leur permettre de fixer l’azote durant de longues périodes. C’est en raison de leur incapacité a assurer seuls la couverture de la dépense énergétique nécessaire au fonctionnement de la nitrogénase que les diazotrophes ont tendance à s’associer plus ou moins intimement avec d’autres organismes (plantes, champignons, insectes) pour pouvoir fixer l’azote moléculaire. En fonction de l’étroitesse des relations qu’ils entretiennent avec les plantes les diazotrophes sont communément divisés en 3 groupes :  Les fixateurs libres : Ce premier groupe de fixateurs d’azote n’entretient pas de lien direct avec les plantes. Ils vivent librement dans le sol et ont tendance comme tous les microorganismes telluriques à coloniser préférentiellement la rhizosphère des plantes, qu’elles soient légumineuses ou pas. Dans cette niche écologique particulière, ils peuvent utiliser les exsudats racinaires (sucres, acides organiques…) excrétés par la plante pour assurer plus efficacement la couverture des besoins énergétiques nécessaires à la réduction de l’azote. Les fixateurs libres sont représentés essentiellement par les genres Azotobacter, Clostridium et Klebsiella (Hill, 1992). Le niveau de fixation d’azote de ce

premier groupe de diazotrophes est estimé tout au plus à 10 kg N2/ha/an en raison de la faiblesse du potentiel énergétique de la rhizosphère et de la compétition qui existe entre tous les microorganismes du milieu pour l’utilisation des exsudats racinaires.  Les fixateurs d’azote associatifs ou semi-symbiotiques : Ce deuxième groupe de fixateurs d’azote est plus intimement lié aux plantes puisqu’ils colonisent plus particulièrement le rhizoplan (la surface des racines) voire même les tissus superficiels des racines. Ils peuvent profiter d’un plus grand potentiel énergétique, ce qui leur permet d’atteindre des niveaux de fixation de l’ordre de

18 Synthèse bibliographique

50 à 100 kg N2/ha/an soit 5 à 10 fois plus que le groupe précédent. Les fixateurs d’azote associatifs sont représentés essentiellement par le genre Azospirillum et Acetobacter. Le premier genre est utilisé au Brésil pour l’inoculation de la canne à sucre et du maïs.  Les fixateurs d’azote symbiotiques : Le dernier groupe de diazotrophes est celui qui entretient les relations les plus étroites avec les plantes. En effet, ses représentants développent des relations mutualistes ou symbioses, c’est à dire des associations à bénéfices réciproques avec certaines plantes. Ces symbioses sont nombreuses et diversifiées. Elles peuvent être exocellulaires comme c’est le cas des symbioses à cyanobactéries rencontrées chez certains bryophytes et lichens, chez qui l’organisme fixateur d’azote est hébergé simplement à la surface des feuilles ou à l’intérieur de structures simples (poches). La forme la plus évolué des symbioses fixatrices d’azote est endocellulaires, c'est-à-dire que les cellules du fixateur d’azote pénètrent à l’intérieur des cellules de la plante ou elles sont hébergées dans un organe spécialisé bien intégré à la plante, le nodule ou nodosité. Ces endosymbioses à nodules sont rencontrées essentiellement chez les plantes actinorhiziennes associées à certaines bactéries du groupe des actinomycétes (Casuarinacés, Betulacées, Myricacées …) (en particulier le genre Frankia) et les légumineuses associées aux Rhizobia. De ces deux endosymbioses fixatrices d’azote, la plus étudiée est la mieux connue est la symbiose Rhizobia-légumineuse puisqu’elle concerne un groupe de plantes renfermant un grand nombre d’espèces utiles à l’homme dont certaines sont d’une importance économique considérable (soja, arachide, haricot…). Elle est également plus importante pour la dynamique de l’azote dans la biosphère puisqu’on estime qu’elle serait responsable à elle seule de la fixation de 180 des 200 millions de tonnes d’azote fixées biologiquement chaque année.

19 Synthèse bibliographique

Figure 2 : Les différents systèmes de fixation biologique de l’azote moléculaire et leur potentiel de fixation d’azote en kg/ha de sol. (D’après Marschner 1995)

20 Synthèse bibliographique

2 - La symbiose Rhizobia légumineuses

Avant de détailler la symbiose Rhizobia-légumineuses, son établissement et son fonctionnement, nous allons commencer par la présentation des deux partenaires : le macrosymbiote représenté par les légumineuses et le microsymbiote représenté par un groupe diversifié d’eubactérie : les Rhizobia. 2-1 - Le macrosymbionte : les légumineuses

La famille des légumineuses ou Faboïdeae est en nombre d’espèces l’une des plus importantes des angiospermes ; avec environ 720 genres et 20 000 espèces (Crok et al., 2006), elle vient juste après celle des Poacées. La caractéristique la mieux partagée par les représentants de cette famille est la structure de leur qui est un légume ou gousse, c'est-à-dire fruit sec à deux valves, garnies chacune d'une rangée de graines. Cette double suture permet de distinguer les gousses des légumineuses des ressemblant, comme les urnes et les enveloppes. Elle renferme des espèces ligneuses et herbacées très diversifiées sur le plan de leur habitat, de la structure de leurs feuilles et de leurs fleurs. La famille des légumineuses est celle qui fournit le plus d’espèces cultivées parmi lesquelles certaines présentent une importance économique ou alimentaire considérable comme par exemple le soja, l’arachide, le haricot, le pois chiche, la fève… Elles occupent en raison de leur richesse en protéines, qui résulte de leur pouvoir de fixer l’azote de l’air, une place importante dans l’alimentation animale et humaine. Le dernier cas est particulièrement crucial dans les pays en voie de développement où les légumineuses constituent la source principale de protéines des populations pour qui les protéines animales sont inaccessibles. La famille des Fabacées est subdivisée classiquement en trois sous familles (Lewis et al., 2005) : 2-1-1 - Les Césalpinoidées Cette sous-famille est la plus primitive des trois. Elle renferme près de 150 genres et 2200 espèces essentiellement ligneuses (arbres, arbustes et lianes) des régions tropicales (Yong et al., 2003).

21 Synthèse bibliographique

Elles se distinguent des deux autres sous famille par une légère zygomorphie de leurs fleurs (Marbbesley, 1998).

Fleur de Bauhinia corymbosa Bauhinia corymbosa

Les Césalpinoîdées sont rarement nodulées ; seulement 20% d’entres elles seraient nodulées. (Sprent et al., 1987). Les représentants les plus caractéristiques et les mieux connus de cette sous-famille en Algérie sont le caroubier (Ceratonia siliqua) et l’arbre de Judée (Cercis siliquastrum). 2-1-2 - Les Mimosoïdées : La sous-famille des Mimosoïdées est plus évoluée que la précédente puisqu’on estime qu’elle serait apparue au quaternaire. Elle est représentée par 62 genres et 2500 espèces essentiellement ligneuses des régions tropicales. La caractéristique qui permet de les distinguer des autres sous famille est la structure actinomorphe de leur fleur. En effet chez les Mimosoidées, la fleur est actinomorphe c'est-à-dire à symétrie radiale (Watson et Dallwitz, 2000).

Fleur d’Acacia nilotica Arbre d’Acacia tortilis Gousse d’Acacia pycnantha

22 Synthèse bibliographique

Les représentants les plus caractéristiques de la sous-famille présents et communs en Algérie sont les Acacias improprement appelés mimosas dans le langage courant. Contrairement aux césalpinoïdées, les Mimosoïdées sont généralement nodulées puisqu’on estime qu’environ 80% des représentants de cette sous famille sont capables d’établir une symbiose fixatrice d’azote avec les Rhizobia. (Sprent et al., 1987) 2-1-3 - Les Papilionoïdées : La sous-famille des papilionacés est la plus grande des trois sous familles de légumineuses puisqu’elle renferme près de 429 genres et 12.000 espèces, soit plus du double des deux autres sous familles réunies. Cette sous-famille, qui est la plus évoluée puisqu’elle ne serait apparue qu’au dévonien est essentiellement représentée par des espèces herbacées des régions tempérées. Les papilionacées se caractérisent par la zygomorphie poussée de leurs fleurs. En effet ces dernières subissent les transformations suivantes : Les fleurs hermaphrodites sont cyclisées et rendues fortement zygomorphes au niveau de la corolle.

Fleur de Lotus ornithopodioïdes Lotus ornithopodioïdes Gousse de Lotus ornithopodioïdes

La quasi-totalité des espèces de légumineuses cultivées appartient à cette sous famille. Chez les papillionacées, la nodulation est de règle ; les seuls exceptions connues sont celle de certains cultivars réfractaires à la nodulation comme par exemple le cultivar cv Afghanistan chez le petit pois (Hogg et al., 2002) Les représentants les plus caractéristiques de la sous famille, présents en Algérie sont la fève, le pois chiche ou encore les trèfles et les luzernes.

23 Synthèse bibliographique

La sous-famille des papilionacés est subdivisée en 30 tribus parmi lesquelles les plus importantes sont les tribus des Loteae, Galegae, Cytiseae, Crotalarieae, Phaseoleae, Millettieae,... Les légumineuses de la tribu des Loteae qui font l’objet de cette étude font partie de cette sous famille où elle occupe le 13ème rang en nombre d’espèces décrites dans le monde. 2-1-4 - La tribu des Loteae

Ce sont des fines herbes ou de petit arbustes, leurs feuilles sont pluvinées, pennées, ayant 3-5 folioles, souvent sessiles.On trouve une paire de stipules à la base des folioles, les feuilles sont rarement simples, les stipules sont membraneux ou foliacés, souvent accompagnés ou remplacés par des glandes stipuliformes. Les fleurs sont habituellement en position axillaires généralement pédonculés, avec ou sans petites bractées. Le calice est campanulé ou tubulaire, avec un hypanthe (Réceptacle floral) de longueur variable. Les anthères sont similaires, avec un long connectif. Les graines sont oblongues (bien plus longues que larges et arrondies aux deux bouts) réniformes. Les cotylédons sont souvent longs et étroits, l’éophylle (1ère feuille qui sort de la plantule) est alterné, la plumule est parfois absente. Le nombre chromosomique est variable et compris entre 2n=10 et 2n=28. On trouve les Loteae en Australie, en Amérique du sud et en Afrique, mais la majorité des espèces sont trouvé autour du bassin méditerranéen qui constituerait leur centre d’origine et de diversité (Polhill et Raven, 1981) La tribu des Loteae comporte à l’échelle mondiale 330 espèces et sous espèces réparties sur 21 genres d’inégales importances. A l’échelle mondiale, cette tribu est dominée par le genre Lotus qui représente 37.6 % de la diversité de la tribu. D’autres genres sont bien représentés au sein de cette tribu comme les genres Anthyllis avec 57 taxons et Hippocrepis avec 36 taxons. A l’opposé, les genres Hammatolobium et Tripodion sont très faiblement représentés et renferment moins de 2 taxons chacun. Sur les 21 genres que comporte la tribu des Loteae, seulement 12 sont représentés en Algérie. Ces derniers regroupent 75 espèces ou sous espèces (taxons) soit 22.72% de

24 Synthèse bibliographique la diversité de la tribu a l’échelle mondiale et 15,33% de la biodiversité des légumineuses en Algérie. La classification et la nomenclature des Loteae ont évoluée au cours de ces dernières années. La tribu a connu des remaniements importants par rapport à la Flore « officielle » d’Algérie qui date des années 60. Parmi ces remaniements taxonomiques, on peut citer le transfert du genre Tetragonolobus au genre Lotus avec conservation du nom d’espèce sauf pour Tetragonolobus purpureus qui a été renommé en Lotus tetragonolobus (ILDIS, 2009). Les remaniements apportés à la tribu des Loteae et concernant des taxons présents en Algérie sont signalés au niveau du tableau 2 :

Tableau 2 : Principaux remaniements taxonomiques apportés à la tribu des Loteae d’Algérie (Quezel et Santa 1962 et ILDIS 2009).

Nomenclature Quezel et Santa Nomenclature ILDIS

Anthyllis tetraphyla Tripodion tetraphyllum

Hippocrepis atlantica Securigera atlantica

Lotus roudairei Kebirita roudarei

Tetragonolobus maritimus Lotus maritimus Tetragonolobus biflorus Lotus biflorus Tetragonolobus gussonei Lotus conjugatus Tetragonolobus purpureus Lotus tetragonolobus Tetragonolobus requienii Lotus conjugatus L. subsp. requienii

25 Synthèse bibliographique

Tableau 3 : Caractéristiques principales des différents genres de la tribu des Loteae (Compilation et synthèse réalisées sur la base de Polhill, 1994).

Genre Caractéristiques spécifiques Photos

Plantes annuelles ou vivaces, ou petits arbrisseaux à tige cylindrique avec des feuilles imparipennées, rarement Coronilla simples ou trifoliées. L’ est en couronne, les fleurs sont de couleur jaune. La gousse est lomentacée, non rétrécie entre les graines

Ce sont des arbustes ou herbes à feuilles rarement simples ou trifoliées. Les fleurs sont souvent en têtes denses rarement en petits glomérules ou solitaires. La Anthyllis corolle est de couleur très variable, jaunes blanchâtre, roses purpurine etc. Leurs gousses sont soit sessiles ou stipitées Ce sont des plantes herbacées vivaces ou de petits arbustes. Les feuilles comprennent cinq folioles, les 2 Dorycnium folioles inférieures simulent des stipules. La fleur se présente en glomérules axillaires, la corolle est blanche ou rose et la gousse est oblongue ou ovoïde.

Ce sont des plantes annuelles herbacées qui présentent des feuilles simples ou imparipennées, à petits stipules membraneuses, avec des fleurs en tête, leurs corolles est Hymenocarpos de couleur jaune qui et terminés en bec. La gousse est indéhiscente tordue et enroulée en spirale dans un plan, à marge membraneuse et ailée.

Ce sont des plantes annuelles ou vivaces, herbacées et parfois ligneuses à la base. Les feuilles sont imparipennées à 5 folioles, les deux inférieurs Lotus ressemblant à des stipules. Les fleurs sont soit solitaires ou en petits glomérules. La carène est munie d’un bec, la gousse est cylindrique parfois un peu comprimée.

Ce sont des plantes annuelles herbacées à feuilles imparipennées, les stipules sont petites, libres et linéaires. Ornithopus Les fleurs sont en tête axillaires, la Gousse est lomentacée, cylindrique ou comprimée, en général rétréci entre les graines et à nervation réticulée.

26 Synthèse bibliographique

Se sont des plantes thérophytes à feuilles soit simples ou imparipennées, la corolle se caractérise par des ailes Tripodion soudées à la carène. Ces plantes présentes des gousses à déhiscence bivalve, avec des étranglements entre les graines.

Se sont des plantes annuelles à feuilles simples, leurs nervures sont parallèles, on observe la présence de stipules à leurs niveaux qui sont libres et linéaires. Les Scorpiurus fleurs sont soit solitaires ou en petits groupes axillaires. La corolle est de couleur jaune ou purpurine. leurs gousses sont soit lomentacées ou indéhiscentes plus ou moins courbées ou contournées.

Se sont des plantes annuelles ou vivaces plus au moins rampantes, leurs feuilles sont à pétioles bien développés. Les fleurs sont isolées à l’aisselle des feuilles sur un Kebirita pédoncule très court.

Se sont des plantes annuelles ou vivaces, les feuilles sont imparipennées à stipules herbacées, soudées au pétiole. Hippocrepis La fleur est de couleur jaune, qui peut être en glomérules axillaires ou rarement solitaires. La gousse est étranglée entre les graines, en forme de fer à cheval.

Se sont des plantes vivaces entièrement revêtues de poils, les feuilles sont sessiles à 3 folioles lancéolées, on Hammatolobium observe la présence de 2 stipules semblables aux folioles. Les fleurs sont de 2 à 3 au sommet des tiges et de couleur jaune, les gousses sont articulées hispides.

Se sont des plantes annuelles ou vivaces, à tige anguleuse, les feuilles sont imparipennées, les stipules Securigera sont oblancéolées, non soudées au pétiole. Les fleurs sont en ombelle, munie chacune d’une petite bractée. La corolle est de couleur jaune ou rose.

27 Synthèse bibliographique

2-2 - Le microsymbionte 2-2-1 - Les bactéries nodulant les légumineuses

Les partenaires bactériens de la symbiose Rhizobium-légumineuses sont aujourd’hui regroupés sous le terme supragénérique et commun de Rhizobia. Ils présentent comme seule caractéristique spécifique, la capacité de former une symbiose fixatrice d’azote avec les plantes de la famille des légumineuses. Cette symbiose qui fait suite à la pénétration des Rhizobia dans les cellules racinaires de la plante se traduit par la formation d’un organe spécifique : le nodule ou nodosité. Il s’agit d’eubactéries aérobies communes du sol, appartenant au Phylum des protéobactéries. Ce phylum regroupe l’ensemble des bactéries qui présentent une membrane externe riche en lipopolysaccharides (LPS) mais pauvre en peptidoglycane et qui présentent par conséquent une réaction négative au test de Gram. Pendant longtemps la capacité d’induire la nodulation chez les légumineuses était restreinte aux seuls  protéobactéries des familles Rhizobiaceae, Bradyrhizobiaceae et Phylobacteriaceae. Des travaux relativement récents ont montré que la capacité de contracter une symbiose fixatrice d’azote avec les légumineuses est en fait beaucoup plus répandue. En effet, cette propriété a été mise en évidence chez d’autres familles d'alpha protéobactéries comme les Hyphomicrobiaceae avec Devosia neptunians (Rivas et al., 2003) et les Methylobacteriaceae avec Methylobacterium nodulans (Jourand et al., 2004). Cette caractéristique a été retrouvée également chez les représentants d’une autre classe de protéobactéries, celle des  protéobactéries dont au moins trois genres (Burkholderia, Cupriavidus, Herbaspirillum) renferment une ou plusieurs espèces nodulant les légumineuses. Certains auteurs (Benhizia et al., 2004) ont montré que des représentants d’une troisième classe de protéobactéries, à savoir celle des protéobactéries, étaient présents dans les nodules de légumineuses du genre Hedysarum. Cependant, en l’absence de tests de nodulation et d’une confirmation par d’autres auteurs, il est vraisemblable que les souches de protéobactéries (Pantoea sp., Enterobacter sp., Pseudomonas sp.…) mises en évidence par Benhizia et al., (2004) dans les nodules d’Hedysarum spp.

28 Synthèse bibliographique ne seraient que des endophytes nodulaires, c’est à dire des souches ayant pénétré dans le nodule sans qu’elles soient impliquées dans sa formation. Les Rhizobia tels que définis ici forment un groupe paraphylétique où l'on trouve aussi bien des α-Proteobactéries appartenant aux genres Azorhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium, Allorhizobium, Sinorhizobium , Rhizobium (ex-Rhizobium) (Wang et Martinez-Romero, 2000) et Methylobacterium (Sy et al., 2001 ; Jourand et al., 2004) , des ß-Protéobactéries appartenant aux genres Burkholderia (Moulin et al., 2001), Ralstonia (Chen et al., 2001). Les ex-Rhizobium sont regroupés dans la famille des Rhizobiacées, mais des analyses phylogénétiques récentes basées sur l'ARN 16S révèlent que cette famille a des origines multiples et constitue aussi un groupe paraphylétique (Wang et Martinez-Romero, 2000). Les genres Azorhizobium et Bradyrhizobium par exemple sont assez éloignés des autres et devraient être placés dans une autre famille (Wang et Martinez-Romero, 2000). Les genres Allorhizobium et Sinorhizobium sont très proches du genre Agrobacterium qui a été classé en dehors des Rhizobiacées en raison de ses caractéristiques pathogènes. En plus des espèces nodulantes, les Rhizobia sont également représentés par quelques espèces incapables de noduler les légumineuses, vraisemblablement en raison de la perte des gènes de la nodulation. Les principales espèces non nodulantes décrites à ce jour font partie des genres Mesorhizobium (Mesorhizobium thiogangeticum) et Rhizobium (Rhizobium selenitireducens, Rhizobium cellulosilyticum). La classification des Rhizobia est en constante modification en raison de l’extension des études à des espèces de légumineuses des régions jusqu’ici inexplorées (Chine, Afrique, Amérique du Sud…) et la classification des Rhizobia est vraisemblablement appelée à connaître d’autres remaniements importants à la lumière de nouvelles découvertes (Sahgal et Johri, 2003 ; Benhizia et al., 2004). Les Rhizobia capables de noduler les légumineuses et exceptionnellement des non- légumineuses sont représentés par près de 40 espèces appartenant à 12 genres.

29 Synthèse bibliographique

Tableau 4 : Les Rhizobia capables de noduler les légumineuses et exceptionnellement des non-légumineuses. s e s e

i

e s p r t s e e y é e t e s ô t d t r

c e n h c

b e è r a s a s s l p n e s e b m s u e c t a o o e è l d n ’ é G N p o t a C d s l o n r P E p Cicerum arietinum, Vicia Rhizobium Rhizobium leguminosarum 18 faba, Phaseolus vulgari.... Mesorhizobium loti Mesorhizobium Jarvis et Lotus corniculatus Jarvis et al., 1982 11 al. 1997, gen. Nov. Acacia, Jarvis et al., 1997 Bradyrhizobium Jordan Bradyrhizobium japonicum 5 Glycine max, Vigna sp, 1982, gen. Nov. Jordan, 1982 Acacia sp Sinorhizobium fredii medicago.Melilotus, Sinorhizobium Chen et Scholla et Elkan,1984 5 Trigonella Acacia sp, e

i al. 1988, gen. Nov. r Chen et al., 1988 Sesbania,… é t c

a Ochrobactrum Holmes Ochrobactrum anthropi Cytisus scoparius,

b 2

o et al. 1988, gen. Nov. Holmes et al., 1988 Lupinus albus é t

o Phyllobacterium r p

a myrsinacearum

h 2 Astragalus algerianus, p

l Phyllobacterium ex Knösel, 1962

A Lathyrus numidicus,. Knösel, 1984 emend. Mergaert et al., 2002 Azorhizobium Dreyfus Azorhizobium caulinodans Sesbania rostrata, 2 et al. 1988, gen. nov. Dreyfus et al., 1988. Sesbania virgata. Devosia Devosia riboflavina Nakagawa et al. 1996, ex Foster, 1944 1 Neptunia natans gen. nov. Nakagawa et al., 1996. Methylobacterium Methylobacterium Patt organophilum Patt et al., 1 Crotalaria podocarpa et al. 1976, 1976 Burkholderia cepacia Acacia spp

e Burkholderia Yabuuchi i

r Palleroni et Holmes, 1981 5 Acacia bimucronata

é et al. 1993, gen. nov. t

c Yabuuchi et al., 1993 a

b Cupriavidus o

é Cupriavidus necator t Makkar et Casida 1987, 1 Mimosa sp o

r Makkar et Casida, 1987

p gen. nov. a t

e Herbaspirillum Baldani Herbaspirillum lusitanum B 1 Phaseolus vulgaris et al. 1986, gen. nov. Valverde et al., 2003.

30 Synthèse bibliographique

2-2-2 - Les Rhizobia associés aux Loteae

Durant toute la période ou les études étaient réduites à quelques espèces uniquement des régions tempérées, les Loteae en général et les lotus en particulier étaient nodulés par un seul groupe de Rhizobia longtemps désigné par « Lotus Rhizobia » et qui a été élevé au rang d’espèce, Rhizobium loti par Jarvis et al. (1982) Cette espèce a été ensuite intégrée au genre Mesorhizobium qui a été créé pour désigner les espèces de Rhizobia dont la vitesse de croissance est intermédiaire entre les Rhizobia à croissance rapide des genres Rhizobium et Sinorhizobium et des Rhizobia à croissance lente du genre Bradyrhizobium (Lindstrom et al., 1995 ; Jarvis et al., 1997). Avec l’expansion des études à un plus grand nombre de Loteae, y compris celles des zones géographiques jusqu’ici sous explorées, les Rhizobia capables de noduler ce groupe de plante se sont révélés plus diversifiés qu’on ne le croyait à l’origine puisqu’ils incluent des Rhizobia appartenant au moins à 2 genres : Mesorhizobium et Bradyrhizobium Tableau 5 : Liste des genres de Rhizobia nodulant les Loteae.

Genres Rhizobia associées Zone géographique Mesorhizobium Monde Bradyrhizobium Monde Lotus Sinorhizobium Iles Canaries Rhizobium Kebirita (Lotus) - - Mesorhizobium Monde Anthyllis Sinorhizobium Maroc Rhizobium Tunisie Hammatolobium - - Hippocrepis - - Dorycnium - - Tripodion - - (Anthyllis) Secirugera - - (Coronilla) Scorpiurus Mesorhizobium Italie Coronilla - - Hymenocarpos - - Ornithopus Bradyrhizobium -

31 Synthèse bibliographique

2-3 - Etablissement de la symbiose

La symbiose Rhizobia-légumineuses se traduit par la formation d’une structure spécialisée, siège des interactions symbiotiques entre la bactérie et la plante. Cette structure désignée, par nodule ou nodosité n’est pas une simple excroissance ou une tumeur. Il s’agit d’un véritable organe bien intégré à la plante. L’induction de l’organogénèse de cet organe est un processus complexe et spécifique qui fait suite à un véritable dialogue moléculaire entre la bactérie et la plante. 2-3-1 - La formation des nodules racinaires

Pour obtenir un nodule fixateur, quatre mécanismes sont mis en place sous le contrôle de la plante :  Attraction et amplification des Rhizobia via les exsudats racinaires des légumineuses L’infection du système racinaire débute par une attraction chimiotactique et la multiplication des Rhizobia dans la spermosphère et la rhizosphère de la légumineuse via l’exsudation par la graine et la plantule de substrats énergétiques (Denarié et al., 1996 ; Oldryod, 2001)  Reconnaissance spécifique entre les deux symbiotes Il existe un système de signalisation et de reconnaissance moléculaire entre les deux symbiotes. La plante exsude dans la rhizosphère les isoflavonoïdes (Fig 3) (Siqueira et al., 1991; Oldryod, 2001) qui diffèrent d’une légumineuse à une autre (Barbour et al., 1991 ; Truchet et al., 1993; Dakora, 2000; Phillips, 2000) et qui jouent un rôle important dans l’attraction des Rhizobia (Aguilar et al., 1988; Kape et al., 1991; Caetano-Anollés et al., 1992). Les flavonoïdes excrétés par la plante induisent l’expression des gênes de nodulation ou gène nod au niveau des Rhizobia compatibles (Schlaman et al. 1992 ; Lawson et al., 1996; Phillips, 2000; Bergum et al., 2001). Ces gènes sont responsable de la synthèse des facteurs Nod de nature lipo-chito-oligosaccharidique (LCO) spécifiques à chaque espèce de Rhizobia (Lerouge et al., 1990; Dénarié et al., 1996; Gresshoff, 2003). Ces facteurs Nod sont perçus par la plante hôte et induisent des modifications morphologiques au niveau de la racine. L’adhésion des Rhizobia aux poils absorbants

32 Synthèse bibliographique se fait par la présence au niveau de la plante d’une lectine, substance de nature glycoproteique qui diffère d’une plante à une autre (Viprey et al., 2000) et du coté Rhizobia, par les exoploysaccarides qui diffèrent également d’une espèce à une autre (Van de Sande et al.,1997; Viprey et al., 2000).  Infection du système racinaire Les Rhizobia pénètrent dans les cellules des racines de la plante hôte via les poils absorbant, qui se recourbent en crosse de berger (Viprey et al., 2000; Patriarca et al., 2004) ce qui conduit à une fragilisation de la paroi du poil absorbant.par des enzymes hydrolytiques végétales (Ridge, 1992; Parniske, 2000; Mateos et al., 2001). Les bactéries progressent le long du poil absorbant grâce au cordon d’infection jusqu’au cortex racinaire ou les bactéries sont libérées à l’intérieur des cellules corticales (Brewin, 1991; Franssen et al., 1992; Maetos et al., .2001). Ce cordon d’infection est le point d’entrée et de colonisation des Rhizobia, contrôlée par les cellules de la plante. (Fig 3).  Nodulation proprement dite Les cellules de la plante se dédifférencient en un méristème nodulaire (Geurts et al., 1996) en donnant naissance au primordium nodulaire (Wood et al., 1989). Le cordon d’infection va l’atteindre et libère les bactéries qui infectent les cellules végétales (Losick et al., 1997; Gage, 2004). Chaque bactérie est séquestrée dans une vacuole formé par une membrane péribactéroidale et l’ensemble constitue le symbiosome (Parniske, 2000; Gualtieri et al., 2000). A l’intérieur du symbiosome, les bactéries se différencient en bacteroïdes (Gage, 2004). A ce stade, les Rhizobia synthétisent la nitrogénase (Oke et al., 1999; Gage, 2004), enzyme qui permet la réduction de l'azote moléculaire.

33 Synthèse bibliographique

Figure 3 : Etapes du processus de nodulation lors de la symbiose Légumineuses – Rhizobium (D’après Perret et al , 2000)

A. Les Rhizobia (rh) colonisent la rhizosphère et s’attachent aux poils absorbants (r) Etape 1 B. Les bactéries induisent la déformation du poil en crosse de berger et initient un cordon d'infection (it) au centre de la courbure à partir d’un centre infectieux (ci). C. Le cordon s’allonge et atteint la base de la cellule épidermique. Etape 3 D. Le cordon se ramifie (rit) à l’approche du primordiat nodulaire formé suite à la division des cellules du cortex (c). E. Les bactéries sont relâchées dans les cellules du nodule et forment des symbiosomes où elles se différencient en bactéroïdes fixateurs. Des granules de PHB s’accumulent dans les bactéroïdes entourés d’une membrane péribacéroïdienne. r, poil absorbant ; rh, rhizobium ; ep, épiderme ; c, cortex ; it, cordon d’infection ; n, noyau ; ci, centre infectieux ; rit, ramification du cordon d’infection ; ed, endoderme ; b, bactéroïdes ; pb, membrane péribactéroïdienne ; s, symbiosome ; d, vacuole ; phb, poly β-hydroxybutarate ;

34 Synthèse bibliographique

Cortexe racinaire Zone sénescente (capacité Tissu vasculaire fixatrice d’azote faible) (Phloème, Xylème) Zone mature (capacité fixatrice d’azote élevée) Endoderme Nouvelle région infectée (capacité fixatrice d’azote faible)

Zone de division cellulaire (capacité fixatrice d’azote nulle)

Figure 4 : Schéma général de la structure du nodule chez les légumineuses.

2-3-2 - Fonctionnement du nodule

L'association Rhizobia-légumineuse est un exemple de syntrophie. Les acides organiques fournis par la plante sont une source d'énergie permettant au Rhizobia d'obtenir son énergie (réduction d’O2 en H2O) et de fixer l'azote (réduction N2 en

NH3). L'ammoniac produit est cédé à la plante qui le convertit en acides aminés, une partie étant rétrocédée aux bactéroïdes. La léghémoglobine, une chromoprotéine renfermant du fer, permet de maintenir au sein du nodule une faible pression partielle en oxygène en le fixant. L’oxygène fixé par la léghémoglobine n’est libéré qu’au niveau de certains sites permettant ainsi d'éviter la dénaturation irréversible de la nitrogénase qui est très sensible à l'oxygène tout en assurant l'apport d'O2 indispensable aux bactéroïdes qui sont aérobies. La léghémoglobine est synthétisée conjointement par la plante-hôte qui assure la synthèse de la partie protéique (globine) et par les bactéroïdes qui assurent la synthèse du groupement prosthétique (hème) lié à la globine.

35 Synthèse bibliographique

Figure 5 : Fixation de l’azote et transport de l’ammonium dans le symbiosome.

La léghémoglobine maintient une pression partielle basse en oxygène permettant le fonctionnement de la nitrogénase qui transforme l’azote en ammoniac dans le bactéroïde. L’ammoniac diffuse dans l’espace péribactéroïdien où il est transformé en ammonium qui est ensuite exporté dans le cytoplasme végétal via un canal et assimilé sous forme de glutamine par la plante. L’ammoniac peut aussi être assimilé au niveau du bactéroïde par incorporation dans les acides aminés qui sont ensuite exportés vers le cytoplasme végétal. (Day et al., 2001).

ETC, Electron transport chain, PBS, espace péribactéoïdien.

2-4 - Utilisation de la symbiose Rhizobia légumineuses

En raison de l’importance de l’azote pour la productivité végétale et de l’ampleur de sa fixation par la symbiose Rhizobia-légumineuse, on se dirige vers une utilisation de plus en plus grande de ce phénomène biologique pour la gestion de la fertilité des sols en particulier au niveau de ces agrosystèmes.

36 Synthèse bibliographique

Les utilisations de la symbiose Rhizobia légumineuses sont nombreuses, certaines d’entre elles ont été utilisées empiriquement depuis l’antiquité (rotation des cultures) (Shipley et al., 1992; Corre et al., 1997). D’autres comme les cultures mixtes, la pratique de l’inoculation des légumineuses par des inoculants rhizobiens sont plus raisonnées et se sont développées pour la plupart au cours du vingtième siècle.

Parmi les avantages de l’utilisation de la symbiose Rhizobia-légumineuses, on peut citer les points suivants :

. Un bilan énergétique très favorable Il faut plus de 2 litres de fuel pour produire, transporter et épandre une unité d’azote de synthèse, alors que les légumineuses utilisent tout simplement l’énergie solaire pour faire fonctionner leur fixation symbiotique locale, discrète et non polluante.

. Impact sur l’environnement des légumineuses fourragères Au-delà de l’intérêt bien connu des légumineuses comme fournisseur d’azote, elles peuvent avoir aussi un impact sur l’environnement, englobant non seulement la gestion de l’azote et les risques de pollution, mais aussi les économies d’énergie et notamment d’énergie fossile.

Cependant, on peut utiliser les légumineuses comme plantes de couverture, qui sont susceptibles de couvrir le sol en permanence pour le protéger de l’érosion, augmenter le taux de matière organique et jouer un rôle à long terme sur la fertilité du sol.(Roose, 1994).

37 Matériel et- méthodes

38 Matériel et méthodes

1 - Matériel

1-1- Matériel végétal

Les plants nécessaires à la détermination du statut symbiotique des Loteae et la constitution d’une collection de souches de Rhizobia associées ont été recueillis de diverses localités (Fig. 6) au cours de la période printemps-été 2007- 2008. L’identification des plants a été réalisée au stade phénologique de floraison- fructification à l’aide des flores de Quezel et Santa (1962), d’Ozenda (1983) et accessoirement celles de Tunisie (Pottier-Alapetite, 1979) et de France (Guinochet et Vilmorin, 1984).

Boumerdes Bouira Tipaza Tizi Ouzzou

Djelfa

El Golea

Bechar

Essendilene

Djanet

Tamenrasset

Figure 6 : Position des localités de prélèvement des échantillons de Loteae utilisés pour la collection des souches

39 Matériel et méthodes

1-2 - Semences

Les graines nécessaires aux tests de nodulation requis pour l’authentification des isolats et la détermination du spectre d’hôte des souches de Rhizobia ont été recueillies à partir de plants d’une des espèces de chacun des genre de la tribu des Loteae représentés en Algérie au cours de l’été 2007 ou obtenues auprès d’une coopérative de production de semences dans le cas de Lotus corniculatus, Vigna radiata, Medicago sativa, Trifolium alexandrinum. Ces semences ont été triées sur la base de la couleur, de la forme et de la taille et la classe la plus représentative a été retenue pour chacune des espèces. 1-3 - Milieux de culture

Pour la culture et la purification de nos souches de Rhizobia, nous avons utilisé le milieu Yeast Extract Mannitol (YEM) (Vincent, 1970) (Annexe 1).

Lorsque la version solide ou semi-solide de ce milieu est requise, nous ajoutons à la composition de base respectivement 15 et 7g d’Agar-Agar. Nous désignerons la version liquide par “Milieu YEMB” les versions solides par “Milieu YEMA”. Le milieu YEM est additionné de 9 mL d’une solution de rouge Congo à 0,25%, ce qui permet de détecter d’éventuelles contaminations. En effet, en présence de rouge Congo, les colonies de Rhizobia n’absorbant généralement pas ce colorant, forment des colonies blanchâtres, rosées ou orangées ; alors que les contaminants forment des colonies rouges en raison de la forte absorption de rouge Congo (Vincent, 1970).

En plus des milieux YEMA et YEMB, nous avons utilisés le milieu Tryptone Yeast Extract (TYE), dont la composition figure au niveau de l’annexe 2, pour la culture ainsi que la conservation à court terme des souches de Rhizobium.

La composition du milieu utilisé pour la conservation à long terme des souches de Rhizobia est en (Annexe 3).

Pour la caractérisation phénotypique des souches de Rhizobia, nous avons adopté le milieu de culture préconisé par Amarger (1997) (Annexe 4).

40 Matériel et méthodes

2 - Méthodes

2-1 - Evaluation de la prévalence de la nodulation et de la fixation d’azote chez les Loteae

Pour l’évaluation de la prévalence de la symbiose à Rhizobia chez les Loteae d’Algérie nous avons vérifiés la présence de nodules sur le système racinaire des plants prélevés ainsi leurs efficience, c'est-à-dire leur capacité à réduire l’azote moléculaire en réalisant une coupe transversale du nodule afin de déterminer si celui-ci présente une coloration rose ou rouge qui indique la présence de léghémoglobine, une hémoprotéine qui n’est produite que par les nodules fixateurs d’azote (Dommergues, 1999).

2-1-1 - Extraction L’extraction est réalisée dans des conditions d’asepsie à partir d’un nodule dont la surface a été préalablement stérilisée par immersion dans de l’éthanol à 95° pendant 30 secondes puis dans une solution de chlorure mercurique (HgCl2 à 0.1%) pendant 3 mn suivie d’un rinçage dans 6 bains successifs d’eau distillée afin d’éliminer les traces d’

HgCl2 très toxique. Le nodule ainsi traité est écrasé à l’aide d’une tige en verre dans 0,5 mL d’eau physiologique stérile (NaCl 8,5‰), pour libérer les bactéroïdes qu’il renferme.

2-1-2 - Isolement et purification Des aliquotes du broyat ainsi obtenu sont ensemencées sur milieu YMA en boîte de Pétri. Après trois à huit jours d’incubation à 25°C, les colonies bactériennes présumées appartenir aux Rhizobia, sont reconnaissables par leur prédominance, leur non absorption du rouge Congo ainsi que par leur aspect gommeux et translucide. Nous avons sélectionné le type colonial le plus représentatif pour procéder à la purification des souches par repiquages successifs sur milieu YMA. La pureté des isolats est vérifiée par observation microscopique des cellules à l’état frais et sur des frottis colorés selon la technique de Gram (Vincent, 1970).

41 Matériel et méthodes

Une fois purifiées, les souches isolées sont conservées à 4°C en tubes à essai sur milieu YMA incliné. 2-1-3 - Conservation des souches Deux méthodes de conservation des souches bactériennes ont été utilisées : - Conservation à court terme à 4°C en tubes à essai contenant le milieu YEM solide incliné. Cette méthode est utilisée dans le cas des sous collections de travail ; les souches sont remises en circulation au moins une fois par an à partir de cryoconservats.

-Conservation à long terme (4 à 10 ans) par congélation des souches à –20°C dans des cryotubes contenant un milieu de cryoconservation à base de glycérol qui est un bon cryoprotecteur.

2-2 - Détermination des caractéristiques symbiotiques des souches L’authentification et la détermination du spectre d’hôte des isolats bactériens, extraits à partir des nodosités des Lotus ont été réalisées au laboratoire par réinoculation des souches à des plantules axéniques des plants.

2-2-1 - Stérilisation superficielle des semences Pour éviter l’apport de Rhizobia par le biais des graines, nous procédons systématiquement à la stérilisation de leur surface avant leur utilisation. Cette stérilisation est assurée par immersion des graines dans de l’éthanol à 90° durant 30s puis dans une solution d’hypochlorite de sodium à 5,25% durant 5mn. Les semences ainsi traitées sont rincées dans 6 bains d’eau distillée stérile, mises à imbiber dans de l’eau distillée stérile durant 12h et mises à germer en boîte de Petri sur couche d’agar (agar à 0,75%). Après 2 à 3jours d’incubation à 25°C et à l’obscurité, les graines dont la radicule a pointé sont transférées en pots.

2-2-2 - Substrat utilisé pour la culture des Loteae au laboratoire Nous avons utilisé pour la production de plantules de Lotus au laboratoire, un substrat constitué d’un mélange de deux volumes de tourbe brune (Marque Kekkila – Turquie) et d’un volume de sable de rivière.

42 Matériel et méthodes

Le mélange est tamisé à 2mm et stérilisé par autoclave pendant une heure à 120°C, trois fois de suite entrecoupées par un séjour de 48h à 25°C. Ce traitement est destiné à éliminer la microflore endogène, en particulier les champignons et d’éventuels Rhizobia qui peuvent fausser les résultats. Ce substrat est réparti à raison de 200 ml par pot dans des petits pots en plastique (250 ml) dont le fond comporte des perforations pour assurer l’aération ainsi que le drainage d’un éventuel excès d’eau. Nous plaçons dans chaque pot 3 germinations et procédons immédiatement à un arrosage avec de l’eau distillée stérile en quantité suffisante pour atteindre 80% du potentiel de rétention en eau du mélange sable tourbe. Les pots ainsi préparés sont alors inoculés à l’aide de suspensions bactériennes renfermant des cellules de chacune des souches testées.

2-2-3 - Préparation de l’inoculum L’inoculation des pots a été réalisée par aspersion à la surface du substrat de 5ml de culture âgée de 72h obtenues en milieu TY en agitateur thermostaté réglé à 25°C et à 100 tr/mn. Dans ces conditions, les cultures atteignent une densité cellulaire de l’ordre de 107-108 cellules/ml, largement suffisante pour assurer la nodulation des plantules si la souche est bien un Rhizobia et qu’elle est compétente vis-à-vis de la plante cible (Antoun et Prévost, 2007) L’inoculation a été réalisée pour l’ensemble des espèces 3 jours après le transfert des germinations en pots en utilisant une seringue munie d’une aiguille pour canaliser l’aspersion à la base des plantules.

2-2-4 - Conditions de culture Les pots contenant les germinations sont placées à température ambiante sous un éclairement additionnel de 8000 lux avec une photopériode de 16 heures de jour et 8 heures de nuit. Les pertes en eau résultant de l’évaporation et de l’évapotranspiration sont déterminées toutes les 48 heures par pesée des pots et compensées par l’addition d’une quantité équivalente d’eau distillée stérile.

43 Matériel et méthodes

Après 45 jours de végétation, les plants sont dépotés en prenant soin de ne pas endommager leur système racinaire. Les racines sont lavées à l’eau courante et examinées pour la présence de nodules. S’ils sont présents.

2-3 - Caractérisation phénotypique des souches 2-3-1 - Préparation des milieux tests

Les tests de caractérisation ont été menés en microgaleries préparées par nos soins au laboratoire. Les milieux test ont été préparés sur la base du milieu YEMB sur lequel nous avons apporté les modifications suivantes :  Les milieux de métabolisation des substrats carbonés : Le mannitol a été remplacé par différentes sources de carbone, stérilisées par microfiltration.  Les milieux de métabolisation des substrats azotés : Le sulfate d’ammonium a été remplacé par différentes sources d’azote, stérilisées par microfiltration.  Les tests de résistance aux antibiotiques (Spiromycine, Kanamycine et

Streptomycine sulfate) et aux métaux lourds (MgCl2, ZnSO4 et CuSO4). Les substances testées ont été rajoutées au milieu après stérilisation par microfiltration (à 0.5mL aux concentrations de milieu 100 (µg mL-1).  L’évaluation de la résistance des souches aux stress. Différentes concentrations de PEG 6000 de 0% à 16%(stress osmotique), de NaCl de 0M à 1.5M (stress salin), de niveau de pH et de température (4°C, 10°C, 15°C, 20°C, 25°C, 30°C, 35°C 40°C et 45°C) ont été testées.

En ce qui concerne les modalités de préparation des milieux, la modification apportée consiste en une stérilisation par microfiltration à 0,25µm, en conditions stériles, de la majorité des substances, à l’exception du PEG 6000, ou l’autoclavage est obligatoire, à cause de la consistance visqueuse de ce produit.

2-3-2 - Lecture des résultats La croissance des souches qui se traduit presque toujours par une acidification ou une alcalinisation du milieu est signalée par un virage du bleu de bromothymol vers le jaune ou vers le bleu. Lorsque ce virage n’est pas obtenu, les puits sont observés à l’œil nu, en vue de rechercher un trouble bactérien révélateur de croissance.

44 Matériel et méthodes

2-3-3 - Analyse numérique 2-3-3 1- La taxonomie numérique La taxonomie numérique est basée sur l’évaluation du degré de similitude globale, d’organismes par rapport à un grand nombre de caractères. C’est une méthode de classification qui tient compte des relations phénétiques entre les organismes étudiés (Sneath, 1974 ; Pesenko, 1982).

2-3-3-2 - Indice de similitude

Le résultat primaire d’une analyse numérique des profils phénotypiques est la construction d’une matrice basée sur une formule permettant le calcul d’un coefficient de similitude entre les souches à classer. Il est appelé « indice de similitude ». L’indice le plus couramment utilisé en biologie est l’indice de Jaccard.

Formule de Jaccard : IJl=(A)/ (A+B+C) IJl = cœfficient de Jaccard A,B,C…= valeur de l’OTU chez chaque individu (0 ou 1) Le dendrogramme n’est qu’une représentation graphique de cette matrice. Il permet une visualisation simple pour une interprétation aisée des résultats obtenus.

2-3-3-3 - Logiciel utilisé

Nous avons utilisé pour nos analyses statistiques le logiciel M.V.S.P. (Multi-Variate Statistical Package) version 3.12 de Kovach computing services.

2-4 - Caractérisation génotypique 2-4-1 - Extraction de L’ADN L’ADN génomique total est extrait à partir de 1,5mL de culture bactérienne obtenue en milieu TY à l’aide de kits d’extraction-purification (Spinclean Genomic DNA Purification Kit) selon le protocole suivant :  1,5mL de culture cellulaire obtenue en milieu TY sont soumis à une centrifugation à 8000 tr/mn pendant 5mn. Le culot est récupéré.

45 Matériel et méthodes

 Il est lavé deux fois dans 200 µL de tampon de resuspension cellulaire. Au culot obtenu à l’issue des deux lavages nous rajoutons 200µL de tampon de resuspension et homogénéisons le mélange par agitation au vortex.  400µL de tampon de lyse (DNA Lysis Buffer) et 20µL de Proteinase K sont ajoutés à la suspension cellulaire et le mélange obtenu est incubé 15mn à 65°C après agitation vigoureuse au vortex  L’échantillon est transféré dans les colonnes d’extraction) purification (Spinclean Genomic DNA Purification Kit) placées dans des tubes Eppendorf en présence de 500µL d’une solution tampon de lavage (Wash Buffer MARQUE).  Les tubes Eppendorf contenant les colonnes sont centrifugés pendant 1mn à 13000 rpm. Après élimination de l’éluat nous procédons à une deuxième centrifugation durant 2mn.  Les colonnes d’extraction et purification sont transférées dans de nouveaux tubes Eppendorf stériles dans lesquels nous ajoutons 100µL d’eau distillée stérile.  Après 5mn de contact, nous procédons à une centrifugation de 1mn à 13000 rpm et récupérons l’ADN dans l’éluat obtenu.

2-4-2 - Amplification du 16S rDNA Les amorces spécifiques procaryotiques que nous avons utilisées pour l’amplification du 16S rDNA par PCR, une technique de réplication ciblée qui permet l’amplification avec des amorces spécifiques. Les amorces que nous avons utilisées pour l’amplification de 16S rDNA figurent au tableau 6.

46 Matériel et méthodes

Tableau 6 : Amorces utilisées pour l’amplification et la détermination de la séquence nucléotidique du 16S rDNA.

Séquence cible Fournisseur

16F27 5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC. AG-3' 16S rDNA MWG Biotech

16R343 5’ ACTGCTGCCTCCCGTA 3’ 16S rDNA MWG Biotech

16F530 5’ TTCGTGCCAGCAGCCGCGG 3‘ 16S rDNA MWG Biotech

La PCR des segments d’ADN ciblés a été réalisée sur 1µL d’échantillon d’ADN en présence de 5µL de tampon 10x (10 fois concentré) (Invitrogen), 5µL (25mM) de

MgCl2, 8µL (1,25mM) dNTP (oligonucléotides), 2,5µL (12µm) de chaque amorce et 0.5µL (1,25U) de la taq DNA polymérase. Le cycle de température retenu pour la réalisation de la PCR a consisté en 94°C pendant 3mn, 35 cycles de réactions à 95°C pendant 1mn, 50°C pendant 1mn, 72°C pendant 1mn et une étape finale d’extension qui se déroule à 72°C pendant 3mn.

2-4-3 - Analyse des fragments de restriction Des aliquotes de 10 µL du produit de la PCR ont été digérées avec des endonucléases de restriction dans un volume total de 30µl. La digestion a été exécutée par quatre enzymes AluI, HhaI, HinfI et MspI pour les 16S rDNA. Ces endonucléases ont été appliquées individuellement à des aliquotes différentes des amplifiats.

Les fragments de restriction obtenus sont séparés par électrophorèse horizontale sur gel d’agarose à 2,5% (migration de 3h sous une tension de 80V en présence d’un tampon Tris Borate EDTA (TBE) à pH 8,0). Le gel d’agarose utilisé renferme 1mgmL-1 de bromure d’éthidium pour visualiser les bandes sous lumière ultraviolette.

2-4-4 - Séquençage du 16S rDNA Nous avons fait procéder au séquençage total des produits d’amplification du gène de l’ARN 16S (16S rDNA) de nos souches par la firme NBT (New Biotechnic – Seville –

47 Matériel et méthodes

Espagne). Les quatre amorces utilisées pour réaliser le séquençage sont 16F27, 16R1488, 16R343 et 16F530 et le séquenceur utilisé est un séquenceur modèle 310, d’Applied Biosystems.

2-4-5 - Traitement des séquences Le séquençage automatique de l’ADN comporte un certain degré d’erreurs qui se traduisent sur la séquence brute fournie par le prestataire par la présence de caractères équivoques autres que ceux utilisés pour le codage des bases azotés A G T C par exemple des N, des S, des V…. Nous utilisons pour procéder au nettoyage de ces caractères équivoques le logiciel ChromaPro qui permet de visualiser simultanément les spectres d’absorption obtenus lors de l’analyse et leur transcription littérale.

2-4-6 - Interrogation des bases de données de séquences génétiques (BLAST) Après nettoyage des séquences brutes, nous avons procédé à la comparaison de nos séquences avec celles présentes dans les bases de données spécialisées comme NCBI- GenBank ou EBI. Cette comparaison permet de déterminer rapidement à quel groupe, genre ou espèce est apparentée une souche donnée et de récupérer par conséquent les séquences des souches types les plus pertinentes pour l’analyse de similitude des séquences et la construction de l’arbre phylogénétique. Dans le cas de NCBI- GenBank, cette fonctionnalité a été nommée BLAST et génère un tableau listant les souches dont la séquence est la plus proche de celle introduite par l’utilisateur.

2-4-7 - Alignement des séquences Les séquences obtenues auprès du prestataire de service ne sont presque jamais complètes et sont généralement tronquées à leurs extrémités et il est évidemment impossible de les comparer avec d’autres séquences sans procéder au préalable à leur alignement, c'est-à-dire de les positionner en faisant coïncider leur plus grande zone chevauchante. Pour régler ce problème, il a été mis au point des algorithmes dits d’alignement multiples dont le plus utilisé est CLUSTALW.

48 Matériel et méthodes

Pour procéder à l’alignement des séquences de nos souches et de celles des souches types récupérées de NCBI-GenBank, nous avons utilisés le logiciel MEGA qui en plus de procéder aux alignements de séquences par la méthode CLUSTALW permet également le calcul des indices de similitudes entre les séquences et la construction d’arbres phylogénétiques par diverses méthodes de reconstruction. La reconstruction phylogénétique permet sur la base des divergences sur la séquence du 16s de classer les souches selon un ordre de succession dans le temps.

2-4-8 - Dépôt des séquences auprès de NCBI-GenBank Les séquences du 16S rDNA des souches retenues pour le séquençage ont été déposées auprès NCBI-GenBank et ont été dotées d’un numéro d’accession.

49 Résultats et discussion

50 Résultats et discussion

1 - Prévalence de la symbiose à Rhizobia chez les Loteae d’Algérie :

1-1 - Loteae recueillies au cours de nos prospections

Les Loteae d’Algérie constituent un groupe important de la flore des légumineuses d’Algérie. Elles regroupent au sens que l’on donne aujourd’hui à cette tribu (ILDIS, 2009) 75 taxons répartis en 12 genres qui sont essentiellement présentes dans le Nord du pays. Pour la constitution d’une collection de souches de Rhizobia associées à ces légumineuses, nous avons menés des campagnes de prospection à travers le territoire national. Ces campagnes ont permis de recueillir 101 plants au niveau de différentes localités et zones climatiques du pays (Tab 7). Ces plants appartiennent à 44 taxons répartis en 8 genres, parmi lesquels 4 genres (Anthyllis, Hymenocarpos, Lotus, Dorycnium) font partie de l’ex-tribu des Loteae et les 4 autres (Coronilla, Hippocrepis, Scorpiurus, Ornithopus) font partie de l’ex-tribu des Coronilleae. Parmi tous les genres de la tribu des Loteae référencés par Quezel et Santa (1962) et le réseau ILDIS (2002) le seul genre pour lequel nous n’avons pas pu recueillir des plants est le genre Hammatolobium, représenté en Algérie par une seule espèce très rare Hammatolobium. kremerianum (Quezel et Santa, 1962). Les 44 taxons pour lesquels nous avons pu recueillir des plants représentent par rapport aux 75 taxons de Loteae qui existent en Algérie près de 2/3 (59%) de la biodiversité de ce groupe de légumineuses. Ces taxons, sont représentés par ordre d’importance croissant, par les représentants des genres Lotus (15 taxons), Anthylis (8 taxons), Coronilla, Hippocrepis et Ornithopus représentés chacun par 5 taxons, Dorycnium (3 taxons), Scorpiurus (2 taxons), Hymenocarpos (1 taxon). Ces proportions sont en accord avec la représentativité relative de ces genres au niveau de la flore d’Algérie (Quezel et Santa, 1962), ce qui devrait nous permettre d’appréhender de manière assez précise la nature des Rhizobia associés à ce groupe de légumineuses ainsi que leur diversité.

51 Résultats et discussion

Tableau 7 : Différentes espèces de Loteae recueillis au cours de nos campagnes de prospection.

N° Genre Espèces ou sous Localisation Bioclimat espèces 1 A.barba-jovis Tipaza Humide 2 A.cytisoides Ben Aknoun Sub-humide 3 A. cytisoides Tipaza Humide 4 A.montana Ouadhias Sub-humide 5 A.polycephala Ténés Sub-humide 6 A tetraphyla Ouadhias Sub-humide 7 A. tetraphyla Baïnem Sub-humide 8 Anthyllis A.vulneraria. maura Tipaza Humide 9 A. vulneraria. maura Ténés Humide 10 A.vulneraria. maura Cherchell Humide 11 A.vulneraria. maura Gouraya Humide 12 A.vulneraria. saharae El Goléa Aride 13 A.vulneraria. saharae Béni Abbes Aride 14 A.vulneraria. saharae Bechar Aride 15 A.henonia El Goléa Aride 16 D.pentaphyllum gracile B El Bahri Sub-humide 17 D.pentaphyllum suffruticosum Djelfa Aride Dorycnium 18 D.rectum Cherchell Humide 19 D. rectum Corso Humid 20 H.circinatus Tipaza Humide Hymenocarpos 21 H.circinatus Chenoua Humide 22 L. arabicus Tamanrasset Aride 23 L.arabicus Djanet Aride 24 L. biflorus Beni Douala Sub-humide 25 L. biflorus Baba Hassan Sub-humide 26 L.biflorus Ouadhias Sub-humide 27 L.biflorus Ouled fayet Sub-humide 28 L.conimbricensis Tipaza Humide 29 L.corniculatus Ben Aknoun Sub-humide 30 L.corniculatus Béni douala Sub-humide 31 L.corniculatus Baïnem Sub-humide 32 L.corniculatus B el bahri Sub-humide 33 L.creticus Plage Kaddous Humide 34 L.creticus Tipaza Humide 35 L.creticus Tamenfoust Humide 36 L.creticus Corso Humide Lotus 37 L.edulis Bab Ezzouar Sub-humide 38 L.edulis Ben Aknoun Sub-humide 39 L.edulis Béni Douala Sub-humide 40 L.edulis Bab Ezzouar Sub-humide 41 L.glinoîdes Ben Aknoun Sub-humide 42 L.hispidus Tipaza Humide 43 L.hispidus Ouled fayet Sub-humide 44 L.jolyi Djanet Aride 45 L.ornithopodioides Ben Aknoun Sub-humide 46 L.ornithopodioides Ouadhias Sub-humide 47 L.ornithopodioides Tipaza Humide 48 L.ornithopodioides USTHB Sub-humide 49 L.palustris Corso Humide 50 L.parviflorus Boumerdès Sub-humide 51 L.parviflorus Bouira Sub-humide

52 Résultats et discussion

N° Genre Espèces ou Localisation Bioclimat sous espèces 52 L.pedunculatus Ben Aknoun Sub-humide 53 L.pedunculatus Tipaza CET Sub-humide 54 L.purpureus Ouled Fayet Sub-humide 55 L.purpureus Douira Sub-humide 56 L.purpureus Baba Hassan Sub-humide 57 L.purpureus Ouled Fayet Sub-humide 58 L.roudairei Baînem Sub-humide 59 L.roudairei Boumerdes Sub-humide 60 L.roudairei Boudouaou Sub-humide 61 C. juncea Ouadhias Sub-humide 62 C. juncea Béni douala Sub-humide 63 C. juncea Baïnem Sub-humide 64 C. juncea Ben aknoun Sub-humide 65 C. minima Ouadhias Sub-humide 66 C. minima Beni douala Sub-humide 67 C. minima Baïnem Sub-humid 68 C. minima Ben Aknoun Sub-humide 69 Coronilla C. repanda Tipaza Humide 70 C. repanda Chénoua Humide 71 C. repanda Ben Aknoun Sub-humide 72 C. repanda Baïnem Sub-humide 73 C.scorpioides Tipaza Humide 74 C.scorpioides Ouadhias Sub-humide 75 C.scorpioides Béni douala Sub-humide 76 C. valentina Ouadhias Sub-humide pentaphylla 77 H.areolata Boudouaou Sub-humide 78 H.atlantica B el bahri Sub-humide 79 Hippocrepis H.biflora Baba Hassan Sub-humide 80 H. minor Tipaza Humide 81 H. multisiliquosa Baïnem Sub-humide 82 H.multisiliquosa Tipaza Humide 83 Hippocrepis H. multisiliquosa Cherchell Humide 84 H. multisiliquosa Chenoua Humide 85 O.compressus Baïnem Sub-humide 86 O.compressus Béni douala Sub-humide 87 O.isthmocarpus Ouadhias Sub-humide 88 O.isthmocarpus Ben Aknoun Sub-humide 89 Ornithopus O.perpusillus Boudouaou Sub-humide 90 O.pinatus Baïnem Sub-humide 91 O.pinatus Ben Aknoun Sub-humide 92 o.sativus B el Bahri Sub-humide 93 o.sativus Boudouaou Sub-humide 94 Sc.muricatus Bab Ezzouar Sub-humide 95 Sc.muricatus Ben Aknoun Sub-humide 96 Sc.muricatus Baïnem Sub-humide 97 Sc.muricatus Douira Sub-humide Scorpiurus 98 Sc.vermiculatus Baïnem Sub-humide 99 Sc.vermiculatus Tipaza Humide 100 Sc.vermiculatus Ouadhias Sub-humide 101 Sc.vermiculatus Bab Ezzouar Sub-humide

53 Résultats et discussion

Tableau 8 : Nombre de taxons de Loteae par genre.

A – Selon ILDIS et Quezel et Santa 1962

Genre Nbr taxons Nombre de taxons par genre selon Ildis & Quezel et Santa Anthyllis 12

Coronilla 12 Anthyllis Dorycnium 6 Coronilla Hippocrepis 9 Dorycnium Hammatolobium 1 Hippocrepis Hymenocarpos 1 Hammatolobium Hymenocarpos Lotus 24 Lotus Ornithopus 5 Ornithopus Scorpiurus 2 Scorpiurus Kebirita 1 Kebirita Securigera 1 Securigera Tripodion 1 Tripodion

B – Echantillonés au cours de nos compagnes de prospections.

Genre Nbr taxons Nombre de taxons par genre echantillonés au cours de nos Anthyllis 8 compagnes de prospections Coronilla 5 Dorycnium 3 Anthyllis Coronilla Hippocrepis 5 Dorycnium Hymenocarpos 1 Hippocrepis Hymenocarpos Lotus 15 Lotus Ornithopus 5 Ornithopus Scorpiurus 2 Scorpiurus Hammatolobium Hammatolobium 0

54 Résultats et discussion

1-2 -Statut symbiotique des Loteae d’Algérie

Les 44 taxons examinés se sont révélés tous nodulés et efficients (Tab 9), c'est-à-dire capables de réduire l’azote moléculaire (N2) en ammoniaque, ce qui indique que les sols renferment une microflore rhizobienne suffisamment abondante, diversifiée et compétente pour assurer la nodulation de ces légumineuses. Cette prévalence élevée de la nodulation chez les différents taxons des Loteae d’Algérie indique que la nodulation de ce groupe de légumineuses ne pose vraisemblablement pas de problème. Ce résultat est en accord avec Allen et Allen (1981) et Sprent (2000) qui ne signalent pas chez les représentants des Loteae, que ce soient ceux de l’ancien monde (Europe, Asie et Afrique) ou ceux du nouveau monde (Amériques et Océanie), de taxons réfractaires à la nodulation comme cela existe par exemple chez les acacias (Harrier et al., 1997). Seuls cinq plants appartenant aux taxons Anthyllis vulneraria subsp. saharae (E12), Coronilla scorpioides (E73), Coronilla repanda (E69), Hippocrepis multisiliquosa (E81), Lotus arabicus (E22), se sont révélés non nodulés au niveau de certains sites de prélèvement. L’absence de nodulation, au niveau de certains sites de prélèvements, chez ces taxons trouverait son explication par l’effet inhibiteur des facteurs édaphiques prévalant au niveau de ces sites (Température, pH, Humidité, sécheresse …) sur la microflore rhizobienne et/ou les mécanismes menant à l’établissement de la symbiose (Zahran, 1999 ; Zahran, 2001 ; Graham, 2008). La forte prévalence des symbioses à Rhizobia et leur efficience chez les Loteae d’Algérie indique que ce groupe de plante joue vraisemblablement un rôle important dans la dynamique de l’azote au niveau des milieux qu’elles colonisent. En effet, en enrichissant le sol en azote par le biais de leur exsudation racinaire ou par leur litière, elles interviennent dans la succession écologique en permettant l’installation de plantes non fixatrices et relativement exigeantes en azote comme les graminées. De plus, en raison de leur teneur élevée en protéines, elles constituent à l’instar des autres légumineuses, un potentiel non négligeable sur le agropastoral comme ressources fourragères riches en protéines, ce qui explique le succès de la luzerne, du trèfle ou encore du lotier corniculé comme espèces fourragères dans les pays à agriculture intensive, grand producteurs de lait ou de viande

55 Résultats et discussion

L’examen des données relatives au type nodulaire (Tab 9), c'est-à-dire à la morphologie des nodosités présentes sur le système racinaire, indique que les taxons examinés se subdivisent en deux groupes.

0,4 Cm 0,4 Cm

Nodule de Lotus creticus provenant Nodule de Lotus corniculatus de la plage du Kadous. provenant de la forêt de Baïnem.

0,4 Cm 0,4 Cm

Nodule de Coronilla juncea Nodule de Ornithopus compressus provenant de la région de Beni provenant de la région de Beni Douala Douala.

Figure 7 : Nodules de plants de Loteae provenant de différentes localités d’Algérie.

56 Résultats et discussion

Tableau 9 : Statut symbiotique (nodulation et fixation d’azote), type nodulaire (Déterminé ou Indéterminé) et localisation des nodules chez les 44 taxons de Loteae examinées.

Nod : Présence de nodule. Fix : Nodule fixateur d’azote. Locnod : Localisation nodule.

N° s

e n n e u l e o o c u l o i i l d t è t e d s e o a r p a d o x e c v n s s i n i o n r c i t c

e l F e N e

è n e o a s s G p e p L c u b s L y o E o O T L s

E1 A.barba-jovis Tipaza + + D C E2 A.cytisoides Ben Aknoun + + D C E3 A. cytisoides Tipaza + + D C E4 A.montana Ouadhias + + D C E5 A.polycephala Ténés + + D C E6 A tetraphyla Ouadhias + + D RII E7 A. tetraphyla Baïnem + + D RII E8 Anthyllis A.vulneraria. maura Tipaza + + D C E9 A. vulneraria. maura Tenes + + D C E10 A.vulneraria. maura Cherchell + + D C E11 A.vulneraria. maura Gouraia + + D C E12 A.vulneraria. saharae Bechar - - - - E13 A.vulneraria. saharae Beni abbas + + D c E14 A.vulneraria. saharae El golea + + D c E15 A.henonia Golea + + D C E16 D.pentaphyllum gracile B El Bahri + + D C E17 D.pentaphyllum suffruticosum Djelfa + + D C Dorycnium E18 D.rectum Cherchell + + D C E19 D. rectum Corso + + D C E20 H.circinatus Tipaza + + D C Hymenocarpos E21 H.circinatus Chenoua + + D C E22 L. arabicus Essendilene - - - - E23 L.arabicus Djanet + + D c E24 L. biflorus Beni Douala + + D C + E25 L. biflorus Baba Hassan + + D C + E26 L.biflorus Ouadhias + + D C + E27 L.biflorus Ouled fayets + + D C + E28 L.conimbricensis Tipaza + + D C E29 L.corniculatus Ben Aknoun + + D C E30 L.corniculatus Beni douala + + D C E31 L.corniculatus Baïnem + + D C E32 L.corniculatus B el bahri + + D C Lotus E33 L.creticus Plage Kadous + + D RII E34 L.creticus Necropol Tipaza + + D RII Nodules verdatres E35 L.creticus Tamenfoust + + D RII E36 L.creticus Corso + + D RII E37 L.edulis Bab Ezzouar – + + D C E38 L.edulis Ben Aknoun + + D C E39 L.edulis Benidouala + + D C E40 L.edulis Bab Ezzouar + + D C E41 L.glinoîdes Ben Aknoun + + D C E42 L.hispidus Tipaza + + D C E43 L.hispidus Ouled fatet + + D C

57 Résultats et discussion s

N° e n n e u l e o o c u l o i i l

t è d t e d s e a r o p a d o e c x v s s n n i i o n r c i t f

e l c e n e

è n e a o s s G l p e p c u b s L y o E o O T L s E44 L.jolyi Djanet + + D C E45 L.ornithopodioides Ben Aknoune + + D C E46 L.ornithopodioides Ouadhias + + D C E47 L.ornithopodioides Tipaza + + D C E48 L.ornithopodioides Bab ezzouar + + D C E49 L.palustris Corso + + D C E50 L.parviflorus Boumerdes + + D C E51 L.parviflorus Bouira + + D C E52 L.pedunculatus Ben Aknoun + + D C E53 L.pedunculatus Tipaza CET + + D C E54 L.purpureus Ouled Fayet + + D C E55 L.purpureus Douira + + D C + E56 L.purpureus Baba Hassan + + D C + E57 L.purpureus Ouled Fayet + + D C + E58 L.roudairei Baînem + + D C + E59 L.roudairei Boumerdes + + D C E60 L.roudairei Boudouaou + + D C E61 C. juncea Ouadhias + + I RII E62 C. juncea Beni douala + + I RII E63 C. juncea Baïnem + + I RII E64 C. juncea Ben aknoun + + I RII E65 C. minima Ouadhias + + I RII E66 C. minima Beni douala + + I RII E67 C. minima Baïnem + + I RII E68 C. minima Ben aknoun + + I RII Coronilla E69 C. repanda Tipaza - - - - E70 C. repanda Chenoua + + I RII E71 C. repanda Ben Aknoun + + I RII E72 C. repanda Baïnem + + I RII E73 C.scorpioides Tipaza - - - - E74 C.scorpioides Ouadhias + + I RII E75 C.scorpioides Beni douala + + I RII E76 C. valentina pentaphylla Ouadhias + + I RII E77 H.areolata Boudouaou + + I C E78 H.atlantica B el bahri + + I C E79 H.biflora Baba Hassan + + I C E80 H. minor Tipaza + + I C Hippocrepis E81 H. multisiliquosa Baïnem - - - - E82 H.multisiliquosa Tipaza + + I C E83 H. multisiliquosa Cherchell + + I C E84 H. multisiliquosa Chenoua + + I C E85 O.compressus Baïnem + + I RII E86 O.compressus Beni douala + + I RII E87 O.isthmocarpus Ouadhias + + I RII E88 O.isthmocarpus Ben aknoun + + I RII E89 Ornithopus O.perpusillus Boudouaou + + I RII E90 O.pinatus Baïnem + + I RII E91 O.pinatus Ben aknoun + + I RII E92 o.sativus B el bahri + + I RII E93 o.sativus Boudouaou + + I RII

58 Résultats et discussion

N° s

e n n e u l e o o c u l o i i l

t è d t e d s e a r o p a d o e c x v s s n n i i o n r c i t f

e l c e n e

è n e a o s s G l p e p c u b s L y o E o O T L s

E94 Sc.muricatus Bab Ezzouar + + I RII E95 Sc.muricatus Ben Aknoun + + I RII E96 Sc.muricatus Baïnem + + I RII E97 Sc.muricatus Douira + + I RII Scorpiurus E98 Sc.vermiculatus Baïnem + + I RII E99 Sc.vermiculatus Tipaza + + I RII E100 Sc.vermiculatus Ouadhias + + I RII E101 Sc.vermiculatus Bab ezzouar + + I RII

59 Résultats et discussion

 Les genres provenant des taxons ex-Loteae (Anthyllis, Hymenocarpos, Lotus, Dorycnium) possèdent tous des nodules déterminés, c'est-à-dire des nodules de forme sphérique dont le méristème a une activité limitée dans le temps, ces nodules se rencontrent généralement chez les légumineuses tropicales ou subtropicales, comme par exemple chez l’haricot commun (tribu des Phaseoleae) (Sprent 2001, 2008). Ce type de nodule est considéré par Sprent (2008) comme la forme la plus évoluée de la nodosité. Ces nodules sont presque toujours isolés et lorsqu’ils sont regroupés ils forment des amas tubéreux. Bien qu’ils soient similaires à ceux des légumineuses tropicales, comme les représentants de la tribu des Phaseoleae, ils s’en distinguent par certains traits comme le fait d’exporter des amides et non des uréides.

 A l’opposé, les genres provenant des taxons ex-Coronilleae (Coronilla, Hippocrepis, Ornithopus, Scorpiurus) portent eux des nodules indéterminés, c'est-à-dire des nodules qui se développent en longueur du fait qu’ils possèdent un méristème nodulaire persistant au niveau de l’apex et à partir duquel les cellules sont ajoutées continuellement au tissu cortical et central du nodule. L’activité continue du méristème nodulaire est à l’origine de la forme allongée du nodule indéterminé que l’on rencontre généralement chez les légumineuses tempérées comme par exemple chez les Trifolieae, les Vicieae... Ces nodules sont souvent branchés, c'est-à-dire qu’ils présentent des ramifications.

Le type nodulaire est un caractère botanique consistant (Corby, 1981 ; Corby, 1988 ; Sprent et Parsons, 2000 ; Sprent, 2001) ; un groupe de légumineuses donné présente à l’échelle de la tribu et du genre le même type nodulaire (Corby, 1981 ; Allan et Allan, 1981 ; Sprent, 2008). La présence des deux types nodulaires au sein des Loteae examinées et exceptionnel et laisse indiquer qu’elles ne constituent pas un groupe taxonomique homogène. (Sprent et Parsons, 2000 ; Sprent, 2001).

Cette observation rejoint celle de Sprent qui signale aussi que la tribu des Loteae telle que définie par Polhill (1994), est la seule tribu des papilionacées chez qui on rencontre cette dualité de type nodulaire.

60 Résultats et discussion

Cette incongruence du type nodulaire chez les Loteae - Coronilleae (Anthyllis, Hymenocarpos, Lotus, Dorycnium, Coronilla, Hippocrepis, Ornithopus, Scorpiurus) laisse indiquer que cette division taxonomique est hétérogène. Nous nous sommes donc intéressés de plus près à l’historique de cette unité taxonomique.

En fait, les Loteae - Coronilleae (Anthyllis, Hymenocarpos, Lotus, Dorycnium, Coronilla, Hippocrepis, Ornithopus, Scorpiurus) regroupent aujourd’hui des représentants de deux ex-tribus distinctes, à savoir celle des Loteae et celles des Coronilleae. En effet, Polhill (1994), qui fait autorité en matière de systématique des légumineuses, a considéré que la principale différence qui existe entre ces deux taxons et qui porte sur la soudure du fruit (Allan et Porter, 2000) n’était pas assez consistante pour maintenir ces deux tribus comme des entités séparées et a proposé de les regrouper au sein d’une tribu unique celle des Loteae - Coronilleae.

L’analyse de la distribution des types nodulaires au sein des Loteae étudiés indique justement que les Loteae présentant des nodules déterminés font tous partie de l’ex tribu des Loteae (Anthyllis, Hymenocarpos, Lotus, Dorycnium) et que celles portant des nodules indéterminés font pour leurs parts parties de l’ex-tribu des Coronilleae (Coronilla, Hippocrepis, Ornithopus, Scorpiurus).

En ce qui concerne la localisation des nodules sur le système racinaire des plants, deux tendances se distinguent au sein des différentes Loteae examinées. Dans le cas des genres Anthyllis, Hymenocarpos, Lotus, Dorycnium, Hammatolobium c'est-à-dire des ex Loteae, l’essentiel des nodules est situé au niveau du collet à l’exception de Anthyllis tetraphylla des deux localités respectives Ouaibes, Baïnem et Lotus creticus qui ont présentés des nodules sur les racines secondaires. Ces nodules sont uniformément répartis tout le long de celles-ci, tandis que dans le cas des genres de l’ex tribu des Coronilleae (Coronilla, Hippocrepis, Ornithopus, Scorpiurus) ils se situes généralement sur la partie médiane ou distale des racines secondaires, à l’exception du genre Hippocrepis ou les nodules se situe au niveau du collet.

61 Résultats et discussion

1-3 - Les Rhizobia associés aux Loteae d’Algérie 1-3-1 - Extraction des souches et authentification des isolats

A partir des 96 plants nodulés, nous avons pu extraire et purifier 96 isolats bactériens. La réinoculation au laboratoire, de ces isolats à des plantules de leur plante hôte d’origine (Tab 10) nous as permis d’authentifier 93 souches comme étant des Rhizobia. En effet, ces isolats se sont révélés capables de renoduler au laboratoire et en conditions bactériologiques contrôlées, leur plante hôte d’origine ou une plante taxonomiquement voisine. Ils peuvent donc être considérés comme des souches de Rhizobia ou de BNL. En effet, malgré les avancées de la biologie moléculaire et parce que le concept de Rhizobia ou de BNL est fonctionnel (Bactérie Nodulant les Légumineuses), le test de nodulation reste le critère absolu pour authentifier les Rhizobia (Vincent, 1970 ; Sprent, 2008).

Seuls 3 isolats, les isolats : Lot-rou3, Orn-ist1, Orn-sat1 se sont révélées incapables de renoduler au laboratoire des plantules de leur plante hôte d’origine ou d’une légumineuse du même genre. Ces isolats correspondraient à des :

 souches contaminantes (non-Rhizobiennes) provenant de la surface des nodules et qui auraient échappés à la procédure de stérilisation superficielle du nodule. A l’isolement, ces souches peuvent produire des colonies dont l’aspect est similaire à celle des souches de Rhizobia (non-absorption du rouge Congo et aspect mucoïde) et être considérées à tort comme telle. C’est souvent le cas par exemple des souches de Pseudomonas, Pantoea, Agrobacterieum… bien représentées dans la rhizosphère des légumineuses et résistantes aux procédures de stérilisation de la surface nodulaire (Beauchamp, 1993).

 souches de Rhizobia ayant perdu leurs capacités symbiotiques. En effet, les gènes intervenant dans l’établissement de la symbiose chez les légumineuses sont portés par des plasmides (Zeze et al., 2001). Cette localisation prédispose les souches de Rhizobium a une perte fréquente de leur pouvoir infectif à la suite de délétions ou encore transfert de plasmides entre souches (Fenton, 1994).

62 Résultats et discussion

 souches rhizobiennes ou non rhizobiennes qui seraient des endophytes, c'est-à-dire des souches naturellement présentes au sein du nodule, échappant au système de reconnaissance Rhizobia-légumineuse. Ces souches empruntent généralement le cordon d’infection lors de la pénétration dans la racine de la plante hôte d’une souche de Rhizobia compétente. Lors de l’isolement des bactéries présentes dans le nodule, ces souches non-compétentes ou non symbiotiques ne peuvent pas induire la nodulation lorsqu’elles sont réinoculées à la plante hôte d’origine, soit parce qu’elles ne sont pas spécifiques (cas des endophytes rhizobiens) soit parce qu’elles ne possèdent pas le système génétique requis pour la symbiose (cas des endophytes non rhizobiens). Les endophytes des nodosités de légumineuses sont très diversifiés (Sadowsky, 2005)

 souches non rhizobiennes ayant acquis temporairement les gènes requis pour la nodulation par transfert vertical et qui les auraient perdus lors de la procédure d’isolement et de purification. C’est souvent le cas des représentants du genre Agrobacterium qui sont très fréquemment isolés de nodosités de légumineuses (Young, 1994 ; Martinez-Romero, 1994). Cependant, aucune souches d’Agrobacterium isolées à partir de nodules de légumineuses n’as pu provoquer la formation de nodules en laboratoire et les gènes de la nodulation n’ont pu être mis en évidence chez ces souches d’Agrobacterium (Mhamdi et al., 2005 ; Mrabet et al., 2006). Par ailleurs, les tests de nodulation ayant été mené sur un substrat stérilisé, on ne peut pas exclure que la non nodulation observée dans le cas de certains isolats soit due à l’absence de groupes bactériens connus pour faciliter la nodulation. En effet, le sol renferme des bactéries dont la présence au niveau de la rhizosphère est de nature à favoriser la nodulation par les Rhizobia. En absence de ces groupes bactériens facilitant l’infection des racines, la nodulation des légumineuses peut être fortement réduite ou totalement inhibée (Triplet et Sadowsky, 1992).

63 Résultats et discussion

Les plants nodulés au laboratoire ont présenté dans l’ensemble des nodosités de forme, de type et de localisation similaires à celles observées dans la nature (Tab 10). La seule exception observée est celle de Lotus creticus qui a montré en pots avec les souches extraites de ses nodosités des transformations dans la localisation et la couleur extérieure des nodules. En effet, les nodules qui se sont formées, au laboratoire, sur le système racinaire de Lotus creticus sont essentiellement localisés au collet comme cela a été observé pour toutes les espèces de l’ex tribu des Loteae.

1-3-2 - Spectre d’hôte des BNL associées aux Loteae d’Algérie

Pour caractériser sur le plan symbiotique les souches de Rhizobia associées aux Loteae d’Algérie, nous avons déterminé leur spectre d’hôte c’est-à-dire la gamme de légumineuses avec lesquelles elles sont capables de former une symbiose fixatrice d’azote. Pour ce faire, nous avons réinoculés nos souches à des plantules d’un représentant de chacun des genres des Loteae d’Algérie ainsi qu’à celles d’un représentant des genres Medicago (M. sativa), Trifolium (Triifolium alexandrinum), deux représentants de la tribu des Trifolieae et à celles d’un représentant de la tribu tropicale des Phaseoleae : Vigna radiata.

64 Résultats et discussion

0,4 Cm 0,4 Cm 0,4 Cm

Racine de Scorpiurus muricatus Racine de Hippocrepis multisiliquosa Racine de Coronilla minima inoculé inoculé par Sco-mur4. inoculé par Hip-mul1 par Cor-min4.

0,4 Cm 0,4 Cm 0,4 Cm

Racine de Dorycnium rectum inoculé Racine de Hymenocarpos circinatus Racine de Lotus creticus inoculé par par Dor-rec1. inoculé par Hym-cir2. Lot-cre1.

Figure 8 : Photos de nodules obtenus par le test d’authentification.

65 Résultats et discussion

Tableau 10 : Authentification des isolats bactériens extraits à partir des nodosités des 96 plants.

Nod : Présence de nodule. Fix : Nodule fixateur d’azote. Locnod : Localisation nodule. e l

l

d é s s s e s t o e e e i c e e u l

l c i h N c r e e o t è u a c è s n d d c p c n p d u x p e o o s o y o e i o u s o G E o e C s L N F T n L L 1 Anthyllis barba-jovis Ant-bar Tipaza + + D C 2 Anthyllis cytisoides Ant-cyt1 Ben Aknoun + + D C 3 Anthyllis cytisoides Ant-cyt2 Tipaza + + D C 4 Anthyllis montana Ant-mon1 Ouaibes + + D C 5 Anthyllis polycephala Ant-pol1 Ténés + + D C 6 Anthyllis tetraphyla Ant-tet1 Ohadhias + + D RII 7 Anthyllis tetraphyla Ant-tet2 Baïnem + + D RII Anthyllis 8 Anthyllis vulneraria subsp. maura Ant-vma1 Tipaza + + D C 9 Anthyllis vulneraria subsp. maura Ant-vma2 Ténés + + D C 10 Anthyllis vulneraria subsp. maura Ant-vma3 Cherchell + + D C 11 Anthyllis vulneraria subsp. maura Ant-vma4 Gouraia + + D C 12 Anthyllis vulneraria subsp. saharae Ant-vsa1 El Golea + + D C 13 Anthyllis vulneraria subsp. saharae Ant-vsa2 Beni abbes + + D C 14 Antyillis henonia Ant-hen1 El Golea + + D C 15 Dorycnium pentaphyllum gracile Dor-pgr1 B El Bahri + + D C Dorycnium pentaphyllum Dor-psu1 16 Djelfa + + D C Dorycnium suffruticosum 17 Dorycnium rectum Dor-rec1 Cherchell + + D C 18 Dorycnium rectum Dor-rec2 Corso + + D C 19 Hymenocarpos circinatus Hym-cir1 Tipaza + + D C Hymenocarpos 20 Hymenocarpos circinatus Hym-cir2 Chenoua + + D C 21 Lotus arabicus Lot-ara1 Tamenrasset + + D C 22 Lotus biflorus Lot-bif1 Beni Douala + + D C + 23 Lotus biflorus Lot-bif2 Baba Hassen + + D C + 24 Lotus biflorus Lot-bif3 Ouadhias + + D C + 25 Lotus biflorus Lot-bif4 Ouled fayet + + D C + 26 Lotus conimbricensis Lot-con1 Tipaza + + D C 27 Lotus corniculatus Lot-cor1 Ben Aknoun + + D C 28 Lotus corniculatus Lot-cor2 Beni douala + + D C 29 Lotus corniculatus Lot-cor3 Baïnem + + D C Lotus 30 Lotus corniculatus Lot-cor4 B el Bahri + + D C 31 Lotus creticus Lot-cre1 Plage Kadous + + D RII 32 Lotus creticus Lot-cre2 Necropol Tipaza + + D RII 33 Lotus creticus Lot-cre3 Tamenfoust + + D RII 34 Lotus creticus Lot-cre4 Corso + + D RII 35 Lotus edulis Lot-edu1 Bab Ezzouar + + D C 36 Lotus edulis Lot-edu2 Ben Aknoun + + D C 37 Lotus edulis Lot-edu3 Benidouala + + D C 38 Lotus edulis Lot-edu4 Baïnem + + D C

66 Résultats et discussion

e

l é s d s s s

l e t e e e o l e e i e e u r c l d c h c x u o d p N è i i n a è o c

s o d t y

e c p c F p u N o n s o u T s C o o G e n e o s E L L L 39 Lotus glinoîdes Lot-gli Ben Aknoun + + D C 40 Lotus hispidus Lot-his1 Tipaza + + D C 41 Lotus hispidus Lot-his2 Ouled fatet + + D C 42 Lotus jolyi Lot-jol Djanet + + D C 43 Lotus ornithopodioides Lot-orn1 Ben Aknoune + + D C 44 Lotus ornithopodioides Lot-orn2 Ouadhias + + D C 45 Lotus ornithopodioides Lot-orn3 Tipaza + + D C 46 Lotus ornithopodioides Lot-orn4 Bab ezzouar + + D C 47 Lotus palustris Lot-pal Corso + + D C 48 Lotus parviflorus Lot-pa1r Boumerdes + + D C Lotus 49 Lotus parviflorus Lot-par2 Bouira + + D C 50 Lotus pedunculatus Lot-ped1 Ben Aknoun + + D C 51 Lotus pedunculatus Lot-ped2 Tipaza CET + + D C 52 Lotus purpureus Lot-pur1 Ouled Fayet + + D C 53 Lotus purpureus Lot-pur2 Douira + + D C + 54 Lotus purpureus Lot-pur3 BABA Hassan + + D C + 55 Lotus purpureus Lot-pur4 Ouled Fayet + + D C + 56 Lotus roudairei Lot-rou1 Baïnem + + D C + 57 Lotus roudairei Lot-rou2 Boumerdes + + D C 58 Lotus roudairei Lot-rou3 Boudouaou - - - - 59 Coronilla juncea Cor-jun1 Ouadhias + + I RII 60 Coronilla juncea Cor-jun2 Benidouala + + I RII 61 Coronilla juncea Cor-jun3 Baïnem + + I RII 62 Coronilla juncea Cor-jun4 Ben Aknoun + + I RII 63 Coronilla minima Cor-min1 Ouadhias + + I RII 64 Coronilla minima Cor-min2 Benidouala + + I RII 65 Coronilla minima Cor-min3 Baïnem + + I RII Coronilla 66 Coronilla minima Cor-min4 Ben Aknoun + + I RII 67 Coronilla repanda Cor-rep1 Tipaza + + I RII 68 Coronilla repanda Cor-rep2 Chenoua + + I RII 69 Coronilla repanda Cor-rep3 Ben Aknoun + + I RII 70 Coronilla scorpioides Cor-sco1 Tipaza + + I RII 71 Coronilla scorpioides Cor-sco2 Ouadhias + + I RII 72 Coronilla valentina pentaphylla Cor-vpe Ouadhias + + I RII 73 Hippocrepis areolata Hip-are Boudouaou + + I C 74 Hippocrepis atlantica Hip-atl B el Bahri + + I C 75 Hippocrepis biflora Hip-bif Baba Hassen + + I C 76 Hippocrepis Hippocrepis minor Hip-min Tipaza + + I C 77 Hippocrepis multisiliquosa Hip-mul1 Baïnem + + I C 78 Hippocrepis multisiliquosa Hip-mul2 Tipaza + + I C 79 Hippocrepis multisiliquosa Hip-mul3 Cherchell + + I C

67 Résultats et discussion s

e s

e l u e e e e h u l c c é o d d l c

t e è

d o n i e s u r e l d p o a c x e s N o s i i n a s o

n c s s t

e s e c c

è F

e i N e n o e t s o p o G i e p s d u L r L y L V o c o E s T C

80 Ornithopus compressus Orn-com1 Baïnem + + D C 81 Ornithopus compressus Orn-com2 Benidouala + + I RII 82 Ornithopus isthmocarpus Orn-ist1 Ouadhias - - - - 83 Ornithopus isthmocarpus Orn-ist Ben Aknoun + + I RII 84 Ornithopus ornithopus perpusillus Orn-per Boudouaou + + I RII 85 Ornithopus pinatus Orn-pin1 Baïnem + + I RII 86 Ornithopus pinatus Orn-pin2 Ben Aknoun + + I RII 87 ornithopus sativus Orn-sat1 B el Bahri - - - - 88 ornithopus sativus Orn-sat2 Boudouaou + + I RII 89 Scorpiurus muricatus Sco-mur1 Bab Ezzouar + + I RII 90 Scorpiurus muricatus Sco-mur2 Ben Aknoun + + I RII 91 Scorpiurus muricatus Sco-mur3 Baïnem + + I RII 92 Scorpiurus muricatus Sco-mur4 Douira + + I RII Scorpiurus 93 Scorpiurus vermiculatus Sco-ver1 Baïnem + + I RII 94 Scorpiurus vermiculatus Sco-ver2 Tipaza + + I RII 95 Scorpiurus vermiculatus Sco-ver3 Ouadhias + + I RII 96 Scorpiurus vermiculatus Sco-ver4 Baïnem + + I RII

68 Résultats et discussion

Tableau 11 : Spectre d’hôte des différentes souches de Loteae isolées. ++ : Nodulation et efficience +- : Nodulation et pas d’efficience P : pseudonodule -- : Pas de nodulation et pas d’efficience

e l e m i s t u c u ô e a n a i r s h s s o v r h a

s i g u s u t u t d s e c e t t a r s a u

a e t n i a d t a m e s o u l i s a m n d u c a

u n r i u e n o u i x l i o a a r c o l n è b o i l s c c r e n i i i i p r l y g s r m t r p P i

e n a a u a h

m

e y m r

T

i C s c n e p c o i m c o G e . m H g

a e l . C c i d d c t y

è u

S e i u A V n l o H L O p e d M o f C s p o i

r E N T D Ant-bar1 A. barba-jovis L ++ ++ -- ++ -- +- ++ ------+- Ant-cyt1 A. cytisoides L ++ ++ -- ++ -- ++ ++ ------Ant-cyt2 A. cytisoides L ++ ++ -- ++ -- ++ ++ ------+- Ant-mon1 A. montana L ++ ++ -- ++ -- +------Ant-pol1 A. polycephala L ++ ++ -- ++ -- ++ ++ ------Ant-tet1 A. tetraphyla L ++ ++ -- ++ -- ++ ++ ------Ant-tet2 A. tetraphyla L ++ ++ -- ++ -- ++ ++ P ------++ Ant-vma1 A. vulneraria subsp. maura L ++ ++ -- ++ -- ++ ++ ------Ant-vma2 Anthyllis A. vulneraria subsp. maura L ++ ++ -- ++ -- ++ ++ ------+- -- Ant-vma3 A. vulneraria subsp. maura L ++ ++ -- ++ -- ++ ++ ------+- Ant-vma4 A. vulneraria subsp. maura L ++ ++ -- +- -- ++ ++ ------Ant-vsa1 A. vulneraria subsp. Saharae L ++ ++ -- ++ -- ++ ++ ------+- Ant-vsa2 A. vulneraria subsp. Saharae L ++ ++ ------++ ++ ------+- +- Ant-hen1 Antyillis henonia L ++ +- -- ++ -- ++ ++ ------Dor-pgr1 D.pent.gracile L ++ ++ -- ++ -- ++ ++ ------Dor-psu1 D.pent.suffruticosum L ++ +- -- ++ -- ++ ++ ------Dorycnium Dor-rec1 D.rectum L ++ ++ -- ++ -- ++ ++ ------Dor-rec2 D.rectum L ++ ++ -- ++ -- -- ++ ------Hym-cir1 Hy.circinatus L ++ -- ++ -- ++ ++ -- ++ +- -- ++ -- Hymenocarpos Hym-cir2 Hy.circinatus L ++ ++ -- ++ -- ++ ++ ------Lot-ara1 L.arabicus L ++ ++ -- ++ -- ++ ++ -- -- ++ -- -- Lot-bif1 L.biflorus L ++ ++ P ++ -- ++ ++ ------Lot-bif2 L.biflorus L ++ ++ -- ++ -- +- ++ ------Lot-bif3 L.biflorus L ++ ++ -- ++ -- ++ ++ ------Lot-bif4 L.biflorus L ++ ++ -- ++ -- ++ ++ ------+- Lot-con1 L.conimbricensis L ++ ++ -- +- -- ++ ++ ------Lot-cor1 L.corniculatus L ++ ++ -- ++ -- ++ ++ ------Lot-cor2 L.corniculatus L ++ ++ -- ++ -- ++ ++ ------Lot-cor3 L.corniculatus L ++ ++ -- ++ -- ++ ++ ------Lot-cor4 L.corniculatus L ++ ++ -- ++ -- ++ ++ ------Lot-cre1 L.creticus L ++ ++ -- ++ -- ++ ++ ------++ Lot-cre2 Lotus L.creticus L ++ ++ -- ++ -- ++ ++ ------+- Lot-cre3 L.creticus L ++ ++ -- ++ -- ++ ++ ------+- Lot-cre4 L.creticus L ++ +- -- ++ -- ++ ++ ------Lot-edu1 L.edulis L ++ ++ -- ++ -- ++ ++ ------+- Lot-edu2 L.edulis L ++ ++ -- ++ -- ++ ++ ------Lot-edu3 L.edulis L ++ ++ P ++ -- ++ ++ ------P Lot-edu4 L.edulis L ++ ++ -- ++ P ++ ++ ------Lot-gli1 L.glinoîdes L ++ -- -- ++ -- ++ ++ ------Lot-his1 L.hispidus L ++ ++ -- ++ -- ++ ++ ------Lot-his2 L.hispidus L ++ ++ -- ++ -- ++ +------P Lot-jol1 L.jolyi L ++ ++ -- ++ -- ++ ++ -- -- P -- -- Lot-orn1 L.ornithopodioides 1 L ++ ++ -- ++ -- ++ ++ ------

69 Résultats et discussion

e l e m i s t u c u ô e a n a i r s h s s o v r h a

s i g u s u t u t d s e c e t t a r s a u

a e t n i a d t a m e s o u l i s a m n d u c a

u n r i u e n o u i x l i o a a r c o l n è b o i l s c c r e n i i i i p r l y g s r m t r p P i

e n a a u a h

m

e y m r

T

i C s c n e p c o i m c o G e . m H g

a e l . C c i d d c t y

è u

S e i u A V n l o H L O p e d M o f C s p o i

r E N T D Lot-orn2 L.ornithopodioides L ++ ++ -- ++ -- ++ ++ ------Lot-orn3 L.ornithopodioides L ++ ++ -- ++ -- ++ ++ ------+- Lot-orn4 L.ornithopodioides L ++ ++ -- ++ -- ++ ++ ------Lot-pal1 L.palustris L ++ ++ -- ++ -- ++ ++ ------Lot-par1 L.parviflorus L ++ ++ -- ++ -- ++ +------P Lot-par2 L.parviflorus L ++ ++ -- ++ -- ++ ++ ------Lot-ped1 L.pedunculatus L ++ ++ -- ++ -- ++ ++ ------++ Lot-ped2 L.pedunculatus L ++ ++ -- ++ P ++ ++ ------Lot-pur1 L.purpureus L ++ ++ -- ++ -- ++ ++ ------Lot-pur2 L.purpureus L ++ ++ -- ++ -- ++ ++ ------+- +- Lot-pur3 L.purpureus L ++ ++ -- ++ -- ++ ++ ------Lot-pur4 L.purpureus L ++ ++ -- ++ -- ++ ++ -- -- P -- P Lot-rou1 L.roudairei L ++ -- P ------++ ------Lot-rou2 L.roudairei L ++ +------+- ++ ------Cor-jun1 C. juncea C ++ -- ++ -- ++ ------Cor-jun2 C. juncea C ++ -- ++ -- ++ -- -- ++ ++ -- -- P Cor-jun3 C. juncea C ++ -- ++ -- ++ -- -- ++ ++ -- ++ +- Cor-jun4 C. juncea C ++ -- ++ -- ++ -- -- ++ ------Cor-min1 C. minima C ++ -- ++ -- ++ -- -- ++ ++ ++ -- -- Cor-min2 C. minima C ++ -- ++ -- ++ -- -- ++ ++ -- ++ -- Cor-min3 C. minima C ++ -- ++ -- ++ -- -- ++ ++ -- ++ -- Coronilla Cor-min4 C. minima C ++ -- ++ -- ++ -- -- ++ ++ ------Cor-rep1 C.repanda C ++ -- ++ -- ++ -- -- ++ +------Cor-rep2 C. repanda C ++ -- ++ -- +- -- -- ++ ++ -- -- P Cor-rep3 C. repanda C ++ -- ++ ------+- -- Cor-sco1 C. scorpioides C ++ -- ++ -- ++ -- -- ++ ------Cor-sco2 C.scorpioides C ++ -- ++ P ++ -- -- ++ ++ ++ -- -- Cor-vpe1 C.val.pentaphylla C ++ -- ++ -- ++ -- -- ++ ++ -- ++ -- Hip-are1 H.areolata C ++ -- ++ -- ++ -- -- ++ +- -- ++ -- Hip-atl1 H.atlantica C ++ -- ++ -- ++ -- -- ++ ++ ------Hip-bif1 H.biflora C ++ -- ++ -- ++ -- -- ++ +------Hip-min1 Hippocrepis H.minor C ++ -- ++ -- ++ -- -- ++ +------Hip-mul1 H.multisiliquosa C ++ -- ++ -- ++ -- -- ++ ++ ++ -- -- Hip-mul2 H.multisiliquosa C ++ -- ++ -- ++ -- -- ++ ++ -- +- -- Hip-mul3 H. multisiliquosa C ++ -- ++ -- ++ -- -- ++ ++ ------Orn-com1 O.compressus C ++ ++ -- ++ -- ++ ++ ++ ------++ Orn-com2 O.compressus C ++ ++ -- ++ -- ++ ++ ++ ------++ Orn-ist1 O.isthmocarpus C ++ ++ -- +- -- ++ ++ ++ ------++ Orn-per1 Ornithopus o.perpusillus C ++ ++ -- ++ -- ++ ++ ++ ------Orn-pin1 O.pinatus C ++ ++ -- ++ -- ++ ++ ++ ------+- Orn-pin2 O.pinatus C ++ ++ -- ++ -- ++ ++ ++ ------++ Orn-sat1 o.sativus C ++ -- ++ ------++ ++ -- -- +- Sco-mur1 S.muricatus C ++ -- ++ -- ++ -- -- ++ ++ ------Sco-mur2 S.muricatus C ++ -- ++ -- ++ -- -- ++ ++ ------Sco-mur3 S.muricatus C ++ -- ++ -- ++ -- -- ++ ++ -- ++ -- Sco-mur4 S.muricatus C ++ -- ++ -- ++ -- P ++ ++ ------Scorpiurus Sco-ver1 S.vermiculatus C ++ -- ++ P ++ -- -- ++ ++ -- ++ -- Sco-ver2 S.vermiculatus C ++ -- ++ -- ++ -- -- ++ ++ ------Sco-ver3 S.vermiculatus C ++ -- ++ -- ++ -- -- ++ ++ -- ++ P Sco-ver4 S.vermiculatus C ++ -- ++ -- ++ -- -- ++ ++ ------

70 Résultats et discussion

1-3-3 - Nodulation

Sur les 1023 combinaisons souche/plante cible examinées, 403 combinaisons soit 39,39% ont montré sur leur système racinaire les nodosités caractéristiques de la symbiose Rhizobium-légumineuses. Ce résultat indique que le souchier constitué n’est pas très spécifique au panel de plantes cibles retenues, ce qui est tout à fait justifié puisque ce panel représente en tout 11 genres répartis sur 3 tribus parfois très divergentes.

Lorsqu’on ne tient pas compte des résultas obtenus pour les deux non Loteae incluse dans la détermination du spectre d’hôte (Medicago sativa, Trifolium alexandrinum et Vigna radiata) cette proportion monte à 48,65 %.

Les résultats des tests d’inoculation croisée indiquent que les souches examinées se subdivisent globalement en deux lots.

 Le premier est constitué de souches issues de plants de l’ex tribu des Loteae et qui se sont révélées capable de noduler la plupart les plants des genres Anthyllis, Hymenocarpos, Lotus, Dorycnium

 Le deuxième lot est constitué quant à lui de souches extraites des plants des genres Coronilla, Hippocrepis, Scorpiurus, Ornithopus et qui se sont révélées pour leurs parts capables de noduler surtout les plantes des genres appartenant à l’ex tribu des Coronilleae.

La seule exception à cette règle réside dans le cas des souches issues de la majorité des plants du genre Ornithopus (Ornithopus compressus, Ornithopus isthmocarpus, Ornithopus perpusillus, Ornithopus pinatus) qui se sont révélées capables de noduler en dehors d’Ornithopus compressus, la plante cible retenue pour l’authentification des isolats provenant de plants d’Ornithopus sp, uniquement les plantes cibles appartenant à l’ex tribu des Loteae (Anthyllis cytisoides, Dorycnium pentaphyllum, Hymenocarpos circinatus, Lotus corniculatus).

59 Résultats et discussion

On peut noter également comme autre exception, la souche Hym-cir1, qui nodule en dehors de la plante cible retenu pour authentification Hymenocarpos circinatus uniquement les plantes appartenant a l’ex tribu des Coronilleae.

Le spectre d’hôte des 93 souches examinées est variable puisque celles-ci se sont révélées capables de noduler entre 1 (minimum) et 6 (maximum) des 11 plantes cibles prises en considération.

L’amplitude du spectre d’hôte permet de définir 3 groupes de souches :

 Souches à spectre large capables de noduler cinq ou six plantes des 11 plantes cibles, comme par exemple les souches Ant-bar, Hym-cir1.

 Souches à spectre moyen, capables de noduler trois ou quatre des 11 plantes cibles retenues, comme c’est par exemple le cas pour les souches Ant-pol1, Ant-mon1.

 Souches à spectre étroit qui ne nodulent qu’une ou deux des 11 plantes cibles comme par c’est le cas par exemple des souches Lot-rou1, Cor-jun1.

Si l’on se place du point de vue des plantes cibles autres que celles appartenant à la tribu des Loteae on peut remarquer que Vigna radiata est l’espèce qui est la plus susceptible au souchier testé puisqu’elle est nodulée par 20 des 93 souches testées soit 21 % très nettement supérieur aux 15 % et 4 % enregistrés respectivement pour Trifolium alexandrinum et Medicago sativa.

Nous remarquerons, à ce niveau, que les souches qui ont été capables de noduler Medicago sativa, Trifolium alexandrinum ou Vigna radiata sont majoritairement (56%) extraites de plants de l’ex tribu des Coronilleae (ex-Coronilleae) ce qui laisse indiquer que ce groupe de légumineuses est nodulé par des Rhizobia relativement peu spécifiques. Par contre sur les 57 souches extraites des plants de l’ex tribu des Loteae, seules quelques unes (33%) provenant essentiellement de plants d’Anthyllis et Lotus se sont montrées capables de noduler Medicago sativa, Trifolium alexandrinum ou Vigna radiata. Ce

60 Résultats et discussion résultat nous amène à conclure que les Rhizobia associés aux ex Loteae seraient beaucoup plus spécifiques que ceux associés aux ex Coronilleae.

C’est par exemple le cas des souches Lot-cre1, Lot-edu1, Orn-ist qui nodulent Vigna radiata espèce surtout susceptible a Bradyrhizobium, des souches Hip-mul3, Hip-mul1, Lot-ara, Cor-sco2, qui nodulent Medicago sativa surtout susceptibles aux Sinorhizobium des espèces Meliloti et Medicae ou encore des souchesCor-min2, Cor-min3, Cor-rep3, Cor-vpe, Hip-mul2, Hym-cir1, Sco-mur3, Sco-ver1, Sco-ver3, qui nodulent Trifolium alexandrinum connu pour être susceptibles presque exclusivement à Rhizobium leguminosarum, en particulier ceux du biovar trifolii.

Pour mieux illustrer la subdivision des souches de Rhizobia associées aux Loteae d’Algérie en fonction de leur spectre d’hôte, nous avons procédé au traitement numérique de leur spectre d’hôte en utilisant l’algorithme UPGMA et l’indice de similitude de Jaccard.

61 Résultats et discussion

UPGMAUPGMA

C. repanda3 o.sativus1 Hy.circinatus1 H.areolata1 S.vermiculatus3 S.vermiculatus1 S.muricatus3 C.val.pentaphylla1 C. minima3 C. minima2 C. juncea3 C. scorpioides1 C. juncea4 H.multisiliquosa1 C.scorpioides2 A C. minima1 C. repanda2 H.minor1 H.biflora1 C.repanda1 H.multisiliquosa2 S.vermiculatus4 S.vermiculatus2 S.muricatus4 S.muricatus2 S.muricatus1 H. multisiliquosa3 H.atlantica1 C. minima4 C. juncea2 C. juncea1 L.roudairei2 L.roudairei1 A. montana 1 A. vulneraria. Saharae2 O.pinatus1 o.perpusillus1 O.isthmocarpus1 C O.pinatus2 O.compressus2 O.compressus1 L.glinoîdes1 L.arabicus1 L.purpureus2 A. vulneraria. Maura 2 L.pedunculatus1 L.creticus1 A. tetraphyla 2 L.ornithopodioides3 L.edulis1 L.creticus3 L.creticus2 L.biflorus4 A. vulneraria. Saharae 1 A. vulneraria. Maura 3 A. cytisoides 2 L.creticus4 D.pent.suffruticosum1 Antyillis henonia1 L.parviflorus1 L.hispidus2 L.conimbricensis1 A. vulneraria. Maura 4 L.purpureus4 L.purpureus3 L.purpureus1 L.pedunculatus2 B L.parviflorus2 L.palustris1 L.ornithopodioides4 L.ornithopodioides2 L.ornithopodioides1 L.jolyi1 L.hispidus1 L.edulis4 L.edulis3 L.edulis2 L.corniculatus4 L.corniculatus3 L.corniculatus2 L.corniculatus1 L.biflorus3 L.biflorus1 Hy.circinatus2 D.rectum1 D.pent.gracile1 A. vulneraria.maura 1 A. tetraphyla 1 A. polycephala 1 A. cytisoides 1 D.rectum2 L.biflorus2 A. barba-jovis 1 -0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

Jaccard's Coefficient

Figure 9: Phénogramme représentant la subdivision des souches de Rhizobia associées aux Loteae d’Algérie en fonction de leur spectre d’hôte

Le dendrogramme obtenu (Fig 9) met bien en évidence les deux groupes de souches précédemment définies et souligne leurs différences sur le plan de leur spectre d’hôte. Le souchier se subdivise sur cette base en deux grand phénons A et B. Le phénon A est composé uniquement de souches ex-Coronilleae à l’exception de la souche : Hym-cir1 qui nodule les plants d’ex Coronilleae et non les Loteae ; le phénon B est composé quand à lui de souches ex-Loteae. On notera cependant, la présence d’un phénon intermédiaire entre les deux grands phénon, le phénon C, qui est composé pour sa part d’un mélange de souches appartenant à la fois à l’ex tribus des Loteae et ex Coronilleae.

62 Résultats et discussion

Ces résultats indiquent que les souches de Rhizobia associées aux Loteae d’Algérie sont contrastées et diversifiées. Contrastées car les souches issues des ex Coronillae et des ex Loteae ne présentent pas un recoupement, un chevauchement de leur spectre d’hôte. Les souches de l’ex tribu des ex Coronillae ne nodules généralement pas les plants de l’ex tribu des ex Loteae et inversement.

Diversifiées car parmi les deux groupes de souches, certaines d’entre elles ont un spectre d’hôte qui laisse suggérer leur appartenance à des genres et espèces de Rhizobia non conventionnelles pour les Loteae.

Quelques souches parmi les 93 examinées ont induit la formation de structures blanchâtres et cotonneuses chez les plantes cibles, en particulier chez Vigna radiata. Les pseudonodules sont des structures qui ressemblent à des nodules mais qui ne montrent pas de zones infectées par les Rhizobia comme c’est le cas chez véritables nodules qu’ils soient efficients ou pas.

1-3-4 - Fixation d’azote

Les nodules des 403 couples symbiotiques obtenus pour les tests d’inoculation croisée ne se sont pas révélés tous fixateurs d’azote. En effet, 37 couples symbiotiques ont abouti à la formation de nodosités non-efficientes vraisemblablement en raison de la faible compétence des deux symbiotes, alors que 366 couples symbiotiques soit une proportion de 36% ont montré la présence d’une zone centrale rose, rouge ou brunâtre qui est due à la présence de léghémoglobine, une hémoprotéine qui n’est produite que par les couples symbiotiques fixateurs d’azote. En effet, la symbiose Rhizobia légumineuses est un processus a spécificité d’étape et une souche de Rhizobia peut être assez spécifique pour induire la nodulation mais pas assez pour fixer l’azote au sein du nodule.

Le traitement numérique simultané du spectre d’hôte et de l’efficience symbiotique des souches a permis de construire le dendrogramme représenté par la figure 10.

63 Résultats et discussion

UPGMAUPGMA

o.sativus1 C. repanda3 Hy.circinatus1 S.vermiculatus4 S.muricatus2 S.muricatus1 S.muricatus4 S.vermiculatus2 H.multisiliquosa2 H.atlantica1 C.repanda1 H. multisiliquosa3 H.multisiliquosa1 C. minima1 C. juncea4 A C. minima4 C.val.pentaphylla1 C. minima2 C. scorpioides1 S.vermiculatus3 S.vermiculatus1 S.muricatus3 H.areolata1 C. juncea3 C.scorpioides2 C. repanda2 H.minor1 H.biflora1 C. minima3 C. juncea2 C. juncea1 L.creticus4 L.ornithopodioides3 L.creticus2 O.pinatus1 O.compressus1 L.purpureus2 L.pedunculatus1 L.edulis1 L.creticus3 O.compressus2 O.pinatus2 O.isthmocarpus1 L.creticus1 L.arabicus1 A. vulneraria. Saharae2 L.roudairei1 o.perpusillus1 Antyillis henonia1 L.corniculatus2 D.pent.gracile1 L.glinoîdes1 A. vulneraria. Saharae 1 L.purpureus1 A. cytisoides 1 L.roudairei2 L.palustris1 A. vulneraria. Maura 4 L.ornithopodioides1 L.conimbricensis1 D.pent.suffruticosum1 L.corniculatus3 Hy.circinatus2 A. tetraphyla 2 B L.biflorus3 L.pedunculatus2 L.ornithopodioides4 L.edulis2 L.edulis3 L.corniculatus1 L.corniculatus4 D.rectum2 L.biflorus4 A. cytisoides 2 L.edulis4 A. vulneraria. Maura 2 L.purpureus4 L.parviflorus2 A. vulneraria.maura 1 L.ornithopodioides2 L.hispidus1 L.jolyi1 A. tetraphyla 1 D.rectum1 L.purpureus3 A. polycephala 1 L.biflorus2 A. montana 1 L.parviflorus1 A. vulneraria. Maura 3 L.hispidus2 L.biflorus1 A. barba-jovis 1 0,04 0,2 0,36 0,52 0,68 0,84 1

Jaccard's Coefficient

Figure 10 : Phénogramme représentant le traitement numérique simultané du spectre d’hôte et de l’efficience symbiotique des souches de Loteae associées.

Ce dernier reproduit en affinant les limites des différents phénons les différentes subdivisions définies sur la base du spectre d’hôte seul. En effet, on y distingue deux grand phénons A et B, le phénon A porte 31 souches, tandis que le phénons B porte quant à lui les 62 souches restantes.

L’analyse de la composition des 2 clusters indique que le premier est constitué majoritairement des souches de Coronilleae, ou on peut trouver l’exception de

64 Résultats et discussion

Hymenocarpos circinatus1 qui nodule les Coronilleae et non les Loteae, par contre le deuxième est constitué des souches de Loteae avec comme particularité la présence des souches de Ornithopus (Ornithopus compressus1, Ornithopus compressus2 Ornithopus isthmocarpus1, Ornithopus perpusillus1, Ornithopus pinatus1, Ornithopus pinatus2).

2 - Caractérisation phénotypique 2-1 - Caractéristiques coloniales

Ces isolats forment en milieu YMA-RC des colonies visibles à l’œil nu après 2 à 9 jours d’incubation à 28°C, ce qui laisse indiquer que leur taux de croissance est très variable.

Les colonies formées par nos souches sont circulaires, à bord régulier et à élévation convexe. Elles sont toutes de texture homogène et de couleur blanche, crème ou rosâtre. Aucune d’entre-elles n’a montré de pigmentation ou de fluorescence naturelle.

Elles présentent un aspect translucide et brillant. Ces derniers caractères étant en relation avec l'excrétion de polysaccharides extracellulaires (exopolysaccharides ou EPS) responsable de l’aspect mucoïde des colonies de Rhizobia.

La taille des colonies formées par nos souches sur milieu YEMA après 7 jours d’incubation à 28°C est très variable. Elle s'échelonne entre environ 10-12mm pour les souches formant les plus grands clones et entre 2-4 mm pour les souches formant les plus petits clones. La taille moyenne des colonies est pour l'ensemble du souchier de l'ordre de 7,31 mm (Tab 12). Des observations au microscope réalisées sur des cellules vivantes colorées au bleu de méthylène et sur des cellules fixées colorées par la technique de Gram (Vincent, 1970) nous ont permis de vérifier que tous les isolats se présentent sous la forme de bacilles relativement courts et arrondis aux extrémités, tous mobiles et présentant une réaction Gram négatif.

Dans l’ensemble, le souchier que nous avons constitué a présenté des caractéristiques coloniales et cellulaires homogènes, en accord avec les descriptions communément admises pour les Rhizobia dans la littérature. La seule différence consistante observée lors

65 Résultats et discussion de la procédure d’extraction et de purification des souches réside dans la vitesse de croissance. En effet, 80 des 93 souches étudiées se sont révélées capables de former des colonies visibles à l’œil nu après seulement 2 à 3 jours d’incubation en milieu YMA tandis que 13 autres ne le font qu’après 7 à 9 jours d’incubation. Cette observation laisse indiquer que notre souchier comporterait des Rhizobia à croissance rapide c’est à dire des représentants des genres Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium et Azorhizobium et des Rhizobia à croissance lente c'est-à-dire des représentants du genre Bradyrhizobium.

2-2 - Etude phénotypique

Pour la caractérisation phénotypique des 93 souches de Rhizobia associées aux Loteae d’Algérie, nous avons retenus 82 caractères incluant l’utilisation de différentes sources de carbone et d’azote, la tolérance à la salinité (NaCl), à la dessiccation (PEG 6000), la croissance à différentes températures et pH, la résistance à des agents antibactériens antibiotiques et métaux lourds.

L’analyse par simple comparaison des profils phénotypiques ne permet pas de faire de distinction entre les souches examinées. Cependant, la vitesse de croissance évaluée par la durée d’incubation nécessaire à la formation de colonies visibles à l’œil permet de subdiviser les souches en trois groupes

 27 souches à croissance rapide qui forment des colonies visibles après seulement 2 à 3 jours d’incubation à 28°C en milieu YEMA-RC.

 53 souches à croissance intermédiaire dont les colonies sont visibles à l’œil nu après 4 à 5 jours d’incubation.

 13 souches à croissance lente dont les colonies ne sont visibles qu’après 7 à 9 jours d’incubation.

Les souches de ce dernier groupe se distinguent des souches des deux autres en plus de leur vitesse de croissance également par :

 Un spectre d’utilisation réduit vis-à-vis des substrats carbonés

66 Résultats et discussion

 Une tendance alcalinisatrice vis-à-vis du milieu de culture en présence de la plupart des substrats carbonés testés.

67 Résultats et discussion

Tableau 12 : Profils phénotypique des trois groupes d’isolats.

Groupe I Groupe II Groupe III Croissance rapide Croissance intermédiaire Croissance lente Durée d’incubation moyenne nécessaire à la formation de 2-3 4-6 7-9 colonies visibles à l’œil nu en jours Taille moyenne des colonies après 7 jours d’incubation à 28°C sur 8,7mm 5,7mm 3,3mm milieu YMA-RC Acidification du milieu YMA-BB 91% 61% 10% Alcalinisation du milieu YMA-BB 5% 28% 87% Sans réaction sur milieu YMA-BB 4% 11% 3% Croissance à 4°C 0% 0% 0% Croissance à 10°C 5% 9% 0% Croissance à 15°C 19% 17% 9.8% Croissance à 20 41.3% 44.2% 25.3% Croissance à 25°C 100% 100% 100% Croissance à 30°C 100% 100% 100% Croissance à 35°C 81.6% 81.1% 61.8% Croissance à 40°C 39.7% 33.8% 32..5% Croissance à 45°C 11% 7% 0% Croissance à 50°C 0% 0% 0% 0.5M 100% 100 88.3% Croissance en 1M 68.1% 46,7 39.6% présence de NaCl 1.5M 9% 3 0% Croissance en 4% 100% 100 88.5% présence de PEG 8% 93.9% 81.5 50% 6000 12% 66.1% 41,2 10.5% 16% 17.3% 7,1 0% Croissance à pH pH3 0% 0% 0% pH5 11% 9% 3% pH7 100 100% 100% pH8 64.9% 71.2% 83.4% pH9 14.1% 15.4 17.8% Spectre d’utilisation des substrats 87.7% 79.8% 52.5% carbonés (b) Spectre d’utilisation des substrats 81.7% 84.8% 76% azotés (b) Résistance aux métaux lourds © 48.4% 31.4% 25% Résistance aux antibiotiques © 33.3% 24.2% 25% a- Colonies visibles à l’œil nu après un maximum de 7 jours b- pourcentage moyen de substrats carbonés et azotés métabolisés par les souches du groupe considéré c- pourcentage moyen de métaux lourds ou d’antibiotiques vis-à-vis desquels les souches du groupe considéré sont résistantes

68 Résultats et discussion

Ces 3 groupes de souches correspondraient respectivement aux genres Rhizobium- Sinorhizobium-Allorhizobium-Agrobacterium dans le cas des souches à croissance rapide, au genre Mesorhizobium dans le cas des souches à croissance intermédiaire et enfin à des représentants du genre Bradyrhizobiumm dans le cas des souches à croissance lente.

Les souches du groupe III, caractérisées par un spectre d’hôte étroit vis-à-vis des différentes espèces de Loteae étudiées, se distinguent des souches des groupes I et II par les caractères essentiels suivants :

 Une vitesse de croissance nettement plus lente. La durée d’incubation moyenne des souches du groupe III est de 7,9 j alors que celle des groupes I et II sont respectivement : 2-3 j, 4-6 j.

 Un spectre d’utilisation des substrats carbonés est plus important

En raison du nombre élevé de caractères pris en considération nous avons soumis les profils phénotypiques des souches à une analyse numérique afin de résumer graphiquement les nombreux points de similitude ou de différence qui existent entre elles. L’analyse numérique des profils phénotypiques des souches à l’aide de l’algorithme UPGMA (Unweighted Pair Group Méthode with Arithmetic Mean, une méthode de regroupement où tous les caractères ont le même poids) et le coefficient de similitude de Jaccard a permis la construction du dendrogramme représentés par la figure 11.

69 Résultats et discussion

UPGMAUPGMA A1

O.compressus1 L.purpureus2 L.pedunculatus1 O.pinatus1 L.edulis1 L.creticus3 A A2 O.compressus2 L.creticus2 O.pinatus2 o.sativus1 O.isthmocarpus1 L.creticus4 L.creticus1 L.ornithopodioides3 S.muricatus1 L.edulis3 L.ornithopodioides1 L.conimbricensis1 L.roudairei2 L.corniculatus1 L.biflorus4 L.ornithopodioides4 L.edulis2 L.corniculatus4 D.rectum2 B1 L.pedunculatus2 L.glinoîdes1 A. vulneraria. Saharae 1 L.biflorus3 A. tetraphyla 2 L.corniculatus2 D.pent.gracile1 S.vermiculatus4 S.muricatus2 L.purpureus1 A. cytisoides 1 Hy.circinatus1 H.atlantica1 C.repanda1 B2 C.scorpioides2 C. juncea1 L.arabicus1 H. multisiliquosa3 H.multisiliquosa1 C. minima1 C. juncea4 C. minima4 H.biflora1 S.muricatus3 S.vermiculatus3 C. scorpioides1 S.vermiculatus1 H.areolata1 C. juncea3 o.perpusillus1 B L.corniculatus3 Hy.circinatus2 H.minor1 C. minima3 C. juncea2 Antyillis henonia1 C.val.pentaphylla1 C. repanda3 C. repanda2 A. vulneraria. Saharae2 L.purpureus4 L.parviflorus2 D.pent.suffruticosum1 L.edulis4 A. vulneraria. Maura 2 L.roudairei1 L.biflorus2 C. minima2 A. vulneraria.maura 1 L.ornithopodioides2 L.jolyi1 A. tetraphyla 1 L.hispidus1 A. montana 1 S.muricatus4 L.palustris1 A. vulneraria. Maura 4 L.purpureus3 D.rectum1 A. polycephala 1 A. cytisoides 2 S.vermiculatus2 H.multisiliquosa2 L.parviflorus1 A. vulneraria. Maura 3 L.hispidus2 L.biflorus1 A. barba-jovis 1 0,2 0,36 0,52 0,68 0,84 1

Jaccard's Coefficient

Figure 11 : Phénogramme représentant les caractères phénotypiques des souches des Rhizobia associées aux Loteae d’Algérie.

Le dendrogramme qui résume les caractères phénotypiques (fig. 11), indique que le souchier constitué est très diversifié puisque les souches divergent en clusters à un niveau de similitude de 0.25% (soit 0.75% de dissimilitude) ce qui indique que le souchier constitué est représenté par des bactéries ayant des caractéristiques très différentes.

L’analyse numérique as permis de définir 2 grands phénons A et B ce qui indique que ces derniers renferme des souches très dissemblables sur le plan phénotypique.

70 Résultats et discussion

Le cluster A porte 13 souches tandis que le cluster B porte quant à lui les 80 souches restantes. L’analyse de la composition de ces deux clusters indique que le premier est constitué à la fois de souches ex Loteae 7 et 6 souches ex Coronilleae, tandis que le cluster B renferme l’ensemble des autres souches des ex Loteae et des ex Coronilleae.

Le cluster A diverge à 0.30% de similitude en deux clusters, le cluster A1 et le cluster A2.

Le cluster A1 porte une seule souche : Ornithopus compresus 1, et le cluster A2 renferme quant à lui les 12 souches restantes,

Le cluster B diverge à 0.36% de similitude en deux clusters, le cluster B1 et le cluster B2. Le cluster B1 renferme essentiellement des souches ex Loteae et 3 souches ex Coronilleae, et le cluster B2 renferme quant à lui 57 souches parmi lesquelles 30 Loteae et 27 Coronilleae.

3-Caractéristique génotypiques 3-1 Profils de restriction du 16S rDNA

Le gène de l’ARN 16S qui est un gène bien conservé et abondant dans les cellules est utilisé pour identifier les Rhizobia au niveau générique ou spécifique. En 1983, Kimura a émis le concept d'horloge "évolutionnaire", la vitesse de l'évolution est constante, les mutations qui surviennent dans le génome n'ont pas nécessairement de conséquences phénotypiques, mais elles sont étroitement corrélées avec le temps. Pour ces raisons Woese (1987) a proposé l’horloge moléculaire comme un moyen de dater la divergence entre les organismes. Cette relative stabilité de l’évolution a pour conséquence que la PCR-RFLP du 16S rDNA de différentes espèces donne le même profil et dans le pire des cas le même profil et obtenu pour le même genre.

Généralement, la PCR-RFLP du 16S rDNA présente une résolution au niveau spécifique. Cependant, lorsqu’on utilise un nombre réduit d’enzymes de restriction, il est courant de trouver des espèces différentes présentant le même profil de restriction. En effet la différence entre les séquences 16S de certaines espèces très apparentées n’est pas assez importante pour produire des fragments de restriction différents. C’est

71 Résultats et discussion le cas par exemple pour Sinorhizobium meliloti et Sinorhizobium medicae, des biovars de l’espèce Rhizobium léguminusarum ou pour les représentants du genre Bradyrhizobium.

Toutefois, en utilisant un grand nombre de restictases, la PCR-RFLP du 16S permet de distinguer les différentes espèces au niveau d’un genre et même les différents biovars au sein de la même espèce. (Amarger et al., 1997; Laguerre et al., 1994).

L’électrophorèse des amplifiats du 16S rDNA des souches associées aux différentes espèces de Loteae étudiées indique que sa taille est de l’ordre de 1500 pb pour toutes les souches. En effet, la taille du gène de l’ARN 16S est de 1500 pb pour tous les procaryotes (Laguerre et al., 1994).

L’établissement des profils de restriction du 16S rDNA vis-à-vis de 4 enzymes de restriction (AluI, HhaI, HinfI et MspI) appliquées isolément sur le produit d’amplification du 16S rDNA des 93 souches, nous a permis de mettre en évidence 19 électromorphes différents pour les 4 enzymes de restrictions utilisées (Fig. 13). (Tab 13) Les plus grand nombre d’électromorphes ont été obtenus pour HinfI(6 électromorphes) et MspI (6 électromorphes) et les plus petits avec AluI (4 électromorphes) et HhaI (3 électromorphes).

Les enzymes HhaI et MspI se révèlent ainsi les plus discriminantes et AluI et HinfI, les enzymes les moins discriminantes.

72 Résultats et discussion 2 1 1 1 1 1 1 2 4 1 1 2 r r 1 1 n m e r 1 n i n n a u i o t e f u o a e p s c i s c u u r d B i c - H m v j s j b v h b m c e - - J ------C F t t m t n n r r r r r J t t t o r r y n n o o n o o o A C o o o F c M A L S A L L O O C C H A C C C D C F

Figure 12 : Electrophorèse des amplifiats obtenus par PCR-RFLP de l’ADNr 16s.de quelques souches nodulant les Loteae.

Figure 13 : Profils électrophorétique de la restriction par RFLP de l’ADNr 16S obtenue pour quelques souches après la digestion par endonuclease Hinf1.

73 Résultats et discussion

Tableau 13. : Profils de restriction du 16S rDNA des souches de Rhizobia associées aux Loteae. Assignation Code Espèce ou Profil en fonction Genre AluI HhaI HinfI MspI souche sous espèce RFLP du profil RFLP Ant-bar 1 A. barba-jovis C A H F CAHF M.loti Ant-cyt 1 A. cytisoides C A H F CAHF M.loti Ant-cyt 2 A. cytisoides C A H F CAHF M.loti Ant-mon 1 A. montana C A H F CAHF M.loti Ant-pol 1 A. polycephala C A H F CAHF M.loti Ant-tet 1 A. tetraphyla C A H F CAHF M.loti Ant-tet 2 A. tetraphyla B C F E BCFE S.fredii Anthyllis Ant-vma 1 A. vulneraria. maura C A H F CAHF M.loti Ant-vma 2 A. vulneraria. maura C A H F CAHF M.loti Ant-vma 3 A. vulneraria. maura C A H F CAHF M.loti Ant-vma 4 A. vulneraria. maura C A H F CAHF M.loti Ant-vsa 1 A. vulneraria. saharae C A F F CAFF M.ciceri Ant-vsa 2 A. vulneraria. saharae D A C B DACB Non identifiée Ant-hen 1 A. henonia B C C B BCCB R. gallicum. Cor-jun 1 C. juncea D A C B DACB Non identifiée Cor-jun 2 C. juncea C C D D CCDD R.giardinii Cor-jun 3 C. juncea D A C B DACB Non identifiée Cor-jun 4 C. juncea B C F E BCFE S.fredii Cor-min 1 C. minima C A D B CADB R.leguminosarum Cor-min 2 C. minima C A D B CADB R.leguminosarum Cor-min 3 C. minima C A D B CADB R.leguminosarum Coronilla Cor-min 4 C. minima B C C B BCCB R.gallicum Cor-rep 1 C. repanda B C C B BCCB R.gallicum Cor-rep 2 C. repanda F F J J FFJJ Non identifiée Cor-rep 3 C. repanda C A D B CADB R.leguminosarum Cor-sco 1 C. scorpioides C C F H CCFH Non identifiée Cor-sco 2 C. scorpioides B C F D BCFD S.meliloti/medicae Cor-vpe 1 C. val.pentaphylla C A D B CADB R.leguminosarum Dor-pgr 1 D. pent.gracile C A H F CAHF M.loti Dor-psu 1 D. pent.suffruticosum C A H F CAHF M.loti Dorycnium Dor-rec 1 D. rectum C A H F CAHF M.loti Dor-rec 2 D. rectum C A H F CAHF M.loti Hip-are 1 H. areolata C A D B CADB R.leguminosarum Hip-atl 1 H. atlantica B C C B BCCB R.gallicum Hip-bif 1 H. biflora B C C B BCCB R.gallicum Hip-min 1 Hippocrepis H. minor C C D D CCDD R.giardinii Hip-mul 1 H. multisiliquosa B C F D BCFD S.meliloti/medicae Hip-mul 2 H. multisiliquosa C A D B CADB R.leguminosarum Hip-mul 3 H. multisiliquosa B C F D BCFD S.medicae/meliloti Hym-cir 1 Hy. circinatus C A D B CADB R.leguminosarum Hymenocarpos Hym-cir 2 Hy. circinatus D A C B DACB Non identifiée Sco-mur 1 S. muricatus C A H F CAHF M.loti Sco-mur 2 S. muricatus C A H F CAHF M.loti Sco-mur 3 S. muricatus C A D B CADB R.leguminosarum Sco-mur 4 S. muricatus C A H F CAHF M.loti Scorpiurus Sco-ver 1 S. vermiculatus C A D B CADB R.leguminosarum Sco-ver 2 S. vermiculatus C A H F CAHF M.loti Sco-ver 3 S. vermiculatus D A C B DACB Non identifiée Sco-ver 4 S .vermiculatus C A H F CAHF M.loti

74 Résultats et discussion

Assignation en Espèce ou Profil Code Genre AluI HhaI HinfI MspI fonction du profil sous espèce RFLP souche RFLP Lot-ara 1 L. arabicus B C F E BCFE S.fredii Lot-bif 1 L. biflorus C A H F CAHF M.loti Lot-bif 2 L. biflorus C A H F CAHF M.loti Lot-bif 3 L. biflorus C A H F CAHF M.loti Lot-bif 4 L. biflorus C A H F CAHF M.loti Lot-con 1 L. conimbricensis C A H F CAHF M.loti Lot-cor 1 L. corniculatus C A H F CAHF M.loti Lot-cor 2 L. corniculatus C A H F CAHF M.loti Lot-cor 3 L. corniculatus C A H F CAHF M.loti Lot-cor 4 L. corniculatus C A H F CAHF M.loti Lot-cre 1 L. creticus B B B A BBBA B.japonicum Lot-cre 2 L. creticus B B B A BBBA B.japonicum Lot-cre 3 L. creticus B B B A BBBA B.japonicum Lot-cre 4 L. creticus B B B A BBBA B.japonicum Lot-edu 1 L. edulis B B B A BBBA B.japonicum Lot-edu 2 L. edulis C A H F CAHF M.loti Lot-edu 3 L. edulis C A H F CAHF M.loti Lot-edu 4 Lotus L. edulis C A H F CAHF M.loti Lot-gli 1 L. glinoîdes C A H F CAHF M.loti Lot-his1 L. hispidus C A H F CAHF M.loti Lot-his2 L. hispidus C A H F CAHF M.loti Lot-jol L. jolyi C A H F CAHF M.loti Lot-orn 1 L. ornithopodioides C A H F CAHF M.loti Lot-orn 2 L. ornithopodioides C A H F CAHF M.loti Lot-orn 3 L. ornithopodioides C A H F CAHF M.loti Lot-orn 4 L. ornithopodioides C A H F CAHF M.loti Lot-pal 1 L. palustris C A H F CAHF M.loti Lot-par 1 L. parviflorus C A H F CAHF M.loti Lot-par2 L. parviflorus C A H F CAHF M.loti Lot-ped1 L. pedunculatus B B B A BBBA B.japonicum Lot-ped2 L. pedunculatus C A H F CAHF M.loti Lot-pur 1 L. purpureus C A H F CAHF M.loti Lot-pur 2 L. purpureus B B B A BBBA B.japonicum Lot-pur 3 L. purpureus C A H F CAHF M.loti Lot-pur 4 L. purpureus C A H F CAHF M.loti Lot-rou 1 L. roudairei C A H F CAHF M.loti Lot-rou 2 L. roudairei C A H F CAHF M.loti Orn-com 1 O.compressus B B B A BBBA B.japonicum Orn-com 2 O.compressus A A A A AAAA B.elkanii Orn-ist 1 O.isthmocarpus B B B A BBBA B.japonicum Orn-per 1 Ornithopus O.perpusillus D A C B DACB Non identifiée Orn-pin 1 O.pinatus B B B A BBBA B.japonicum Orn-pin 2 O.pinatus B B B A BBBA B.japonicum Orn-sat 1 O.sativus A A A A AAAA B.elkanii Profils de restriction des différentes souches de référence utilisées dans le cadre de cette étude Mesorhizobium loti (USDA 3471) C A H F CAHF Sinorhizobium fredii (USDA 205) B C F E BCFE Rhizobium gallicum (USDA 291)8 B C C B BCCB Rhizobium giardinii (USDA 2914) C C D D CCDD Rhizobium leguminosarum (USDA 2370) C A D B CADB Sinorhizobium meliloti (USDA 1002) B C F D BCFD Sinorhizobium medicae (USDA 1037) B C F D BCFD Bradyrhizobium japonicum (USDA 110) B B B A BBBA Bradyrhizobium elkani (USDA 76) A A A A AAAA Mesorhizobium ciceri (USDA 3383) C A F F CAFF

75 Résultats et discussion

L’action séparée des 4 enzymes de restrictions AluI, HhaI, HinfI et MspI, a permis de définir 12 profils de restriction chez les 93 souches de BNL associées aux Loteae d’Algérie (Tab 13). Ces profils électromorphiques sont qualifiés de génotypes PCR- RFLP dans la littérature et nous conviendrons d’utiliser ce terme pour les désigner.

Les souches examinées ont présenté 12 génotypes PCR-RFLP. Le génotype le plus fréquent est CAHF commun à 48 souches (52%), suivi du génotype BBBA présenté par 11 souches (12%). Les 9 autres génotypes CADB (10 souches), et BCFD et BCFE (3 souches), CCDD (2 souches), BCCB (5 souches), DACB (6 souches) et AAAA (2 souches), CAFF, FFJJ et CCFH (1 souche) étant beaucoup moins fréquents puisqu’ils ne concernent tous réunis que 35% des souches examinées.

Parmi ces profils, certains sont similaires à celui de l’une des souches de référence incluses dans cette partie de l’étude. C’est le cas par exemple des souches dont le génotype BBBA est similaire à celui de Bradyrhizobium japonicum ou encore des souches Hip-mul3, Hip-mul1 et Cor-Sco2 dont le génotype BCFD est identique à celui de Sinorhizobium meliloti.

Les profils de restrictions qui ont pu être rapprochés de ceux des souches de référence indiquent que les Loteae sont nodulées par au moins 8 espèces de Rhizobia : Mesorhizobium loti, Mesorhizobium ciceri, Rhizobium gallicum, Rhizobium giardinii, Rhizobium leguminosarum, Sinorhizobium fredii, Sinorhizobium meliloti/medicae, Bradyrhizobium japonicum et Bradyrhizobium elkani. Cependant l’identité de certaines souches nodulantes n’a pu être établie par PCR-RFLP puisque leurs profils de restriction ne correspondent à aucune des 10 souches de référence prises en considération. C’est le cas par exemple des souches Orn-per1, Sco-ver3, Hym-cir2, Ant-vsa2, Cor-jun1, Cor-jun3, Cor-rep2, Cor-sco1 qui ont présenté le ribotype DACB, FFJJ, CCFH qui ne correspond à aucun de ceux obtenus pour les 10 souches de référence.

76 Résultats et discussion

Tableau 14 : Profils de restriction du gène de l’ARN 16S des 93 souches de Rhizobia associées au Loteae d’Algérie. e

n u e e e q

e

i d d s s

t e n p e e e é r n o y h h r i t n o b c t c i b é o r t a u u g i a b c m o l ’ i o o i l n l s o S f R o f y N f h A p Ant-bar, Ant-cyt1, Ant-mon, Ant-pol, Ant-tet1, Ant- vma1, Ant-vma2, Ant-vma3, Ant-vma4, Dor-pgr, Dor- psu, Dor-rec1, Dor-rec2, Lot-bif1, Lot-bif2, Lot-bif3, Lot-bif4, Lot-con, Lot-cor1, Lot-cor2, Lot-cor3, Lot- cor4, Lot-edu2, Lot-edu3, Lot-edu4, Lot-gli, Lot-his1, 48 (52%) CAHF Mesorhizobium loti. Lot-his2, Lot-jol, Lot-orn1, Lot-orn2, Lot-orn3, Lot- orn4, Lot-pal, Lot-par1, Lot-par2, Lot-ped2, Lot-pur1, Lot-pur3, Lot-pur4, Lot-rou1, Lot-rou2, Sco-mur1, Sco- mur2, Sco-mur4, Sco-ver2, Sco-ver4, Ant-cyt2.

Ant-tet2, Cor-jun4, Lot-ara 3 (3%) BCFE Sinorhizobium fredii

Ant-vsa1 1 (1%) CAFF Mesorhizobium ciceri.

Ant-vsa2, Orn-per, Cor-jun1, Cor-jun3, Hym-cir2, Sco- 6 (6%) DACB Rhizobium etli ver3

5 (5%) BCCB Rhizobium gallicum. Ant-hen, Cor-min4, Cor-rep1, Hip-atl, Hip-bif

10 Rhizobium Cor-min1, Cor-min2, Cor-min3, Cor-rep3, Cor-vpe, Hip- CADB (10,75%) are, Hip-mul2, Hym-cir1, Sco-mur3, Sco-ver1 leguminosarum.

1 (1%) FFJJ Burkholderia tuberum Cor-rep2 Mesorhizobium 1 (1%) CCFH Cor-sco1 mediterraneum

Sinorhizobium 3 (3%) BCFD Cor-sco2, Hip-mul1, Hip-mul3 meliloti/medicae.

Bradyrhizobium Lot-cre1, Lot-cre2, Lot-cre3, Lot-cre4, Lot-edu1, Lot- 11(12%) BBBA ped1, Lot-pur2, Orn-com1, Orn-is, Orn-pin1, Orn-pin2 japonicum.

2 (2%) Bradyrhizobium elkani. Orn-com2, Orn-sat AAAA 2 (2%) Cor-jun2, Hip-min CCDD Rhizobium giardinii.

77 Résultats et discussion

3-2 Identification des souches par séquençage du gène de l’ARN 16S

Pour confirmer la nature des souches qui ont été rapprochées sur la base du profil de restriction du gène de leur ARN 16S à certaines espèces de Rhizobia et révéler la nature exacte de celles qui n’ont pas pu être identifiées, nous avons procédé au séquençage du gène de l’ARN 16S d’un représentant de chacun des génotypes RFLP obtenus.

Les souches retenues sont :

 Ant-vsa2, Cor-jun1, Orn-per1, Cor-jun3, Hym-cir2, Sco-ver3, Cor-rep2, Cor-sco1, ces souches ont présentés des profils PCR-RFLP différents de ceux des souches de référence

 les souches : Sco-mur3, Ant-hen1, Hip-mul1, Ant-tet2, Ant-vsa1, Dor-rec1, Orn-sat1, Lot-cre3 qui ont été prisent pour confirmer leur identité

4 - L’arbre phylogénétique obtenu

La reconstruction phylogénétique effectuée à l’aide du logiciel MEGA et en prenant en compte les séquences du gène de l’ARN 16S des 13 souches associées aux Loteae d’Algérie et 61 souches types de Rhizobia obtenus auprès de NCBI-Genbank, nous a permis d’obtenir l’arbre phylogénétique représenté par la figure 14.

78 Résultats et discussion

100 R. etli CFN 42 (U28916).seq

68 Cor-jun3.seq R. leguminosarum LMG 14904 (AM181757)...

100 76 Sco-mur3.seq

99 R. hainanense I66 (U71078).seq R. tropici CIAT 899 (U89832).seq

95 100 R. lusitanum p1-7 (AY738130).seq

94 Ag. rhizogenes ATCC 11325 (AY945955).seq

R. indigoferae CCBAU 71042 (AF364068)...

R. sullae IS 123T (Y10170).seq 96 loessense CCBAU 7190B (AF364069).seq 51 96 R. gallicum R602sp (U86343).seq 97 51 Ant-hen1.seq

56 R. yanglingense SH22623 (AF003375).seq

56 R. mongolense USDA 1844 (U89817).seq 99 Orn-per1.seq

100 R. giardinii H152 (U86344).seq Hip-min1.seq

R. daejeonense L61 (AY341343).seq 75 100 R. galegae ATCC 43677 (D11343).seq

86 99 R. huautlense SO2 (AF025852).seq 69 R. cellulosilyticum ALA10B2 (DQ855276...

76 Al. undicola LMG 11875 ( Y17047).seq 51 Ag. vitis NCPPB3554 (D14502).seq

56 R. larrymoorei 3-10 (Z30542).seq

100 Ag. radiobacter LMG 140 (AM181758).seq 66 Ag. rubi LMG 156 (X67228).seq

S. morelense LMG 21331 (AM181737).seq

S. terangae LMG 7834 (X68388).seq

91 S. kostiense LMG 19227 (AM181748).seq

71 S. americanum CFNEI 156 (AF506513).seq

93 Ant-tet2.seq 100 S. xinjiangense LMG 17930 (AM181732).seq 66 S. freddi ATCC 35423 (D14516).seq

S. saheli LMG 7837 (X68390).seq

S. arboris LMG 14919 (AM181744).seq

S. medicae LMG 19921 (AM181754).seq 99 Hip-mul1.seq 54

91 S. kummerowiae CCBAU 71714 (AF364067)... 85 S. meliloti LMG 6133 (X67222).seq

M. thiogangeticum SJTT (AJ864462).seq

83 M. ciceri UPM-Ca7 (U07934).seq

82 Ant-vsa1.seq 100 Dor-rec1.seq

98 M. loti ATCC 33669 (D14514).seq

M. albiziae CCBAU 61158 (DQ100066).seq

M. chacoense PR5 (AJ278249).seq

87 M. amorphae ACCC 19665 (AF041442).seq 72 68 M. septentrionale SDW 014 (AF508207).seq 87 M. plurifarium LMG 15298 (AJ295079).seq

M. huakuii IFO 15243 (D13431).seq

M. tianshanense A-1BS (AF041447).seq

M. temperatum SDW 018 (AF508208).seq 75

99 M. mediterraneum UPM-Ca36 (L38825).seq Cor-sco1.seq

Az. caulinodans ORS 571 (D11342).seq

100 B. elkanii USDA 76 (U35000) 55 Orn-sat1.seq

100 B. iriomotense EK05 (AB300992) B. betae PL7HG1 (AY372184) 89 B. yuanmingense CCABU 33109 (EF394152) 86 B. canariense BTA-1 (AJ558025) 78 B. liaoningense LMG 18230 (AJ250813)

Lot-cre3.seq

55 B. lupini DSM 30140 (X87273) 53 B. japonicum LMG 6138 (X66024)

99 Bur. caribensis TJ182 (AJ505301).seq Bur. phymatum STM815 (AJ302312).seq

100 Bur. tuberum STM678 (AJ302311).seq 100 Cor-rep2.seq

62 Bur. mimosarum PAS44 (AY752958).seq

96 Bur. nodosa Br3437 (AY773189).seq 100 Bur. nodosa R-25485T (AM284971).seq

0.02

Figure 14: Arbre phylogénétique des souches associées aux Loteae d’Algérie

79 Résultats et discussion

La position au niveau de cet arbre des représentants des différents groupes PCR-RFLP que

La position au niveau de cet arbre des représentants des différents groupes PCR-RFLP que nous avons rapprochés d’une des souches de référence prises en considération confirme nos conclusions précédentes.

La souche Dor-rec1 représentant le groupe PCR RFLP CAHF est portée par la branche qui supporte la lignée des Mesorhizobium et ont pour plus proche voisin Mesorhizobium loti.

La souche Ant-tet2 représentant le groupe PCR RFLP BCFE est portée par la branche qui supporte la lignée des Sinorhizobium et ont pour plus proche voisin Sinorhizobium fredii, une espèce communément associée à Glycine max.

La souche Cor-jun3 représentant le groupe PCR RFLP DACB est portée par la branche qui supporte la lignée des Rhizobium et ont pour plus proche voisin Rhizobium etli, une espèce communément associée à Phaseolus vulgaris.

La souche Sco-mur3 représentant le groupe PCR RFLP CADB est portée par la branche qui supporte la lignée des Rhizobium et ont pour plus proche voisin Rhizobium leguminosarum, une espèce communément associée à Pisum sativum.

La souche Ant-hen1 représentant le groupe PCR RFLP BCCB est portée par la branche qui supporte la lignée des Rhizobium et ont pour plus proche voisin Rhizobium gallicum, espèce communément associée à Cicer arietinum.

La souche Hip-min1 représentant le groupe PCR RFLP CCDD est portée par la branche qui supporte la lignée des Rhizobium et ont pour plus proche voisin Rhizobium giardinii, espèce communément associée à Leucaena leucocephala.

La souche Hip-mul1 représentant le groupe PCR RFLP BCFD est portée par la branche qui supporte la lignée des Sinorhizobium et ont pour plus proche voisin Sinorhizobium meliloti, espèce communément associée aux représentants des genres Medicago, Trigonella et Melilotus.

80 Résultats et discussion

La souche Ant-vsa1 représentant le groupe PCR RFLP CAFF est portée par la branche qui supporte la lignée des Mesorhizobium et ont pour plus proche voisin Mesorhizobium ciceri, espèce communément associée à Cicer arietinum.

La souche Orn-sat1 représentant le groupe PCR RFLP AAAA est portée par la branche qui supporte la lignée des Bradyrhizobium et ont pour plus proche voisin Bradyrhizobium elkani.

La souche Lot-cre3 représentant le groupe PCR RFLP BBBA est portée par la branche qui supporte la lignée des Bradyrhizobium et ont pour plus proche voisin Bradyrhizobium liaoningense.

Quant aux souches non identifiées,

- Celles présentant le génotype FFJJ représentées sur l’arbre par la souche Cor-rep 2 correspondraient d’après leur position dans la lignée des Burkholderia et leur proximité de l’espèce Burkholderia tuberum

- Celles présentant le génotype DACB représentées sur l’arbre par les souches Cor-jun 1 et Orn-per 1 correspondraient d’après leur position dans la lignée des Rhizobium et leur proximité de l’espèce Rhizobium mongolense.

- Celles présentant le génotype CCFH représentées sur l’arbre par la souche Cor-sco1 correspondraient d’après leur position dans la lignée des Mesorhizobium et leur proximité de l’espèce Mesorhizobium mediterraneum.

Les résultats des profils de restriction et du séquençage du gène de l’ARN 16S, indique que les souches de Rhizobia associées aux Loteae d’Algérie sont nodulées par 5 lignées de Rhizobia.  Lignée des Rhizobia-Agrobacterium.  Lignée des Sinorhizobium.  Lignée des Mesorhizobium.  Lignée des Bradyrhizobium.  Lignée des Burkholderia.

81 Conclusion

82 Conclusion

A L’issue de cette étude sur la symbiose à Rhizobia chez les Loteae d’Algérie, nous pouvons conclure que ce groupe de légumineuses quantitativement et qualitativement bien représenté dans la flore d’Algérie est généralement nodulé et fixateur d’azote. Cette propriété permettrait aux Loteae de jouer le rôle d’espèce pionnière pour la colonisation des sols pauvres en azote, d’espèce améliorant le niveau de fertilité azotée des sols qui les supportent et par conséquent de jouer un rôle primordial dans la succession écologique au niveau de ces biotopes.

De ce fait, elles représentent un potentiel intéressant sur le plan agropastoral puisque elles permettent l’enrichissement en azote du sol et elle représente une source fourragère naturelle et non négligeable. C’est ce potentiel qui explique qu’une des espèces du genre, à savoir Lotus corniculatus est cultivée et appréciée dans le monde pour ses propriétés agropastorales.

D’autres espèces comme Lotus creticus, Scorpiureus vermiculatus, Dorycnium. pentaphyllum font l’objet d’un intérêt particulier des agronomes en particulier en Australie, Etats-Unis et Canada pour leur propriétés fourragères importantes et aussi pour leur pouvoir à enrichir le sol en azote grâce à leur capacité à fixé l’azote atmosphérique.

Les caractéristiques des nodules observées sur le système racinaire des Loteae que nous avons examinées nous ont amenés à séparer celles-ci en deux groupes. Le premier groupe renferme les genres Anthyllis, Dorycnium, Lotus, Hymenocarpos, il correspond à la tribu des Loteae comme définie par Polhill (1981). Les représentants de ce groupe se caractérisent tous par des nodules de type déterminé localisés essentiellement au niveau du collet.

Le second groupe renferme quant à lui les représentants des genres (Coronilla, Hippocrepis, Ornithopus, Scorpiurus) c'est-à-dire à la tribu des coronilleae telle que définie par Polhill (1981). Ce groupe se distingue du précédent par ses nodules de structure indéterminée et leur localisation essentiellement au niveau des racines secondaires.

Cette différence dans la structure des nodules observée entre les ex-Loteae et ex- Coronilleae indique que le regroupement de ces deux taxons au sein de la tribu des

83 Conclusion

Loteae - coronilleae poolhil (1994) n’est pas judicieux, comme cela a déjà été établi par de nombreux auteurs qui considèrent que les Coronilleae et Loteae sont phylogénétiquement divergents.

Cette divergence a été confirmée par les résultats des tests d’inoculation croisée qui ont montré que les souches extraites des Coronilleae et Loteae représentent globalement deux groupes d’inoculation croisée dissemblables se chevauchant très peu. En effet, les souches Loteae ne nodulent presque jamais les Coronilleae et inversement.

L’analyse des profils phénotypiques des souches par taxonomie numérique as permis de définir deux phénons confirmant ainsi la grande diversité des Rhizobia associées aux Loteae d’Algérie. Ces phénons se sont révélés d’inégale importance puisque certains d’entre eux renferment un grand nombre de souches tandis que d’autres n’en renferment que quelques unes voire une seule ce qui laisse indiquer qu’il s’agit respectivement de symbiotes préférentiels et occasionnels. Le dendrogramme construit laisse indiquer que les souches ex-Loteae et ex-Coronilleae constituent deux entités distinctes assez bien différenciées sur le plan phénotypique. Cependant, ces deux groupes de Rhizobia ont présenté un certain degré de recouvrement qui ne permet pas de trancher de manière absolue.

L’analyse des profils de restriction 16S rDNA nous as permis d’identifier 85 souches parmi les 93 examinées comme appartenant aux espèces Mesorhizobium loti (Ant- bar1, Ant-cyt1, Ant-cut2, Ant-mon, Ant-pol, Ant-tet1, Ant-vma1, Ant-vma2, Ant- vma3, Ant-vma4, Dor-pgr1, Dor-psu, Dor-rec1, Dor-rec2, Lot-bif1, Lot-bif2, Lot-bif3, Lot-bif4, Lot-con1, Lot-cor1, Lot-cor2, Lot-cor3, Lot-cor4, Lot-edu2, Lot-edu3, Lot- edu4, Lot-gli1, Lot-his1, Lot-his2, Lot-jol1, Lot-orn1, Lot-orn2, Lot-orn3, Lot-orn 4, Lot-pal1, Lot-pal2, Lot-ped2, Lot-pur1, Lot-pur4, Lot-rou1, Lot-rou2, Sco-mur1, Sco- mur2, Sco-mur4, Sco-ver2, Sco-ver4), Bradyrhizobium.japonicum (Lot-cre1, Lot-cre2, Lot-cre3, Lot-cre4, Lot-edu1, Lot-ped2, Lot-pur2, Orn-com1, Orn-ist1, Orn-pin1, Orn- pin2), Rhizobium (Cor-jun1, Ant-hen1, Cor-jun2, Cor-min1, Cor-min2, Cor-min3, Cor-rep3, Cor-vpe, Hip-are, Hip-alt1, Hip-bif1, Hip-min1, Hip-mul2, Hym-cyr1, Sco- mur3, Sco-ver1), Sinorhizobium (Ant-tet2, Cor-jun4, cor-sco2, Hip-mul1, Hip-mul3).

84 Conclusion

Les souches identifiées par PCR- RFLP ont permis de vérifier que ex Loteae sont essentiellement nodulées par Mesorhizobium loti et accessoirement Bradyrhizobium japonicum tandis que les ex Coronilleae sont nodulées pour leur part par Rhizobium et Sinorhizobium.

L’analyse des séquences de l’ARN 16S nous a permis de confirmer l’identité des souches identifiées par PCR-RFLP et d’identifier celles qui n’ont pas pu l’être par PCR-RFLP ; nous avons donc mis en évidence des souches de Burkholderia comme microsymbiotes pouvant être associés aux Loteae d’Algérie. Ce dernier résultat est l’un des plus marquants de ce travail car c’est le premier rapport concernant la nodulation des Loteae par Burkholderia connue surtout comme microsymbiote des mimosoidées. Notre résultat est conforté par d’autres auteurs du laboratoire qui rapportent la nodulation de vicia sicula par une autre souche de Burkholderia.

Nos résultats qui ont permis de préciser la nature des Rhizobia associés aux Loteae d’Algérie, d’appréhender leur diversité sur le plan symbiotique, phénotypique et génotypique. Ils indiquent par ailleurs que les sols d’Algérie renfermeraient des souches de BNL originales. C’est pour cette raison que nous comptons compléter ce travail sur la diversité des BNL en Algérie, en les étudiant sur des groupes de plantes ou des tribus dont le niveau d’endémisme est très élevé pour espérer y trouver des Rhizobia originaux. Parmi les groupes de plantes qui attirent notre attention nous citerons les Genistées dont un grand nombre d’espèces sont endémiques à l’Afrique du Nord voire à l’Algérie.

85 Références bibliographiques

86 Références bibliographiques

1. Abdelguerfi et Abdelguerfi-Laouar, 2004 - Les ressources génétiques d’intérêt fourrager et/ou pastoral: Diversité, collecte et valorisation au niveau méditerranéen. Cahiers Options Méditerranéennes. 62: 29-41. 2. Aguilard M.M., Ashby A.M., Richards A.J.M., Loake G.J., Watson M.D. et Shaw C.H, 1988 - Chemotaxis of Rhizobium leguminosarum biovar phaseoli towards flavonoid inducers of the symbiotic nodulation genes. J.Gen.Micobiol. 134: 2741-2746. 3. Allen O.N. et Allen E.K, 1981 - The Leguminosae, University of Wisconsin Press, MacMillan Publishing Company, Madison - London. 4. Allan G.J. et Porter M., J, 2000 - Tribal delimitation and phylogenetic relationships of loteae and coronilleae (:) with special reference to lotus: evidence from nuclear ribosomal its sequences. American Journal of Botany. 87 (12): 1871-1881. 5. Amarger N.V., Macheret et Laguerre G, 1997 - Rhizobium gallicum sp. nov. and Rhizobium giardinii sp. nov. from Phaseolus vulgaris nodules. Int. J. Syst. Bacteriol. 47: 996-1006. 6. Antoun H. et Prévost D, 2007 - Root Nodule Bacteria and Symbiotic Nitrogen Fixation., dans Gregorich E.G and Carter M.R. (dir.) - Soil Sampling and Methods of Analysis, 2nd Edition., CRC Press Taylor and Francis, Boca Raton, FL, USA, Chapitre 31. 7. Baldani J.I., Baldani V.L.D., Seldin L. et Döbereiner J, 1986 - Characterization of Herbaspirillum seropedicae gen. nov., sp. nov., a root-associated nitrogen-fixing bacterium. Int. J. Syst. Bacteriol. 36: 86- 93. 8. Barbour W.M., Hattermann D.R. et Stacey G, 1991 - Chemotaxis of Bradyrhizobium japonicum to soybean exudates. Appl. Environ. Microbiol. 57:2635 - 2639. 9. Bakemeier, H., Huberich T., Krabetz R., Liebe W., Schunck M., Mayer D, 1997 -.Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, (A2) VCH Verlagsegesellschaft mbH, Weinhein. 10.Beauchamp C.J, 1993 - Mode d'action des Rhizobactéries favorisant la croissance des plantes et potentiel de leur utilisation comme agents de lutte biologique. Phytoprot. Rev. 74:19-27. 11.Benhizia Y., Benhizia H., Benguedouar A., Muresu R., Giacomini A. et Squartini A, 2004 - Gamma proteobacteria can nodulate legumes of the genus hedysarum. Syst.Appl.Microbiol. 27:462-468. 12.Bergum A.A., Leibovitch S., Migner P. et Zhang F, 2001 - Specific flavonoïds induced nod gene expression and pre-actived nod genes of Rhizobium leguminosarum increased pea (Pisum sativum L.) and Lentil (Lens culinaris L.) nodulation in controlled growth chamber environments.J.Exp.Bot.Jul. 52:1537-1543.

87 Références bibliographiques

13.Brewin N.J, 1991 - Development of the legume root nodule. Annual. Rev. Cell. Biol. 7:191-226. 14.Buchanan, B.B., Gruissem W. et Jones R.L, 2000 - Biochemistry and molecular biology of plants. Am. Soc. Plant Physiol., Rockville, Maryland, 1367 p. 15.Caetano A G., Wrobel E. et Bauer W.D., 1992 - Growth and movement of spot inoculated Rhizobium meliloti on the root surface of alfalfa.Plant Physiology. 98: 1181-1189. 16.Chen W.M., Laevens S., Lee T.M., Coenye T., De Vos P., Mergeay M. et Vandamme P, 2001 - Ralstonia Taiwanensis sp.nov., isolated from root nodules of Mimosa and sputum of a cystic fibrosis patient.Int.J.Syst.Evol.Microbiol. 51:1729-1735. 17.Chen W.X., Yan G.H., Li J.L, 1988 - Numerical taxonomic study of fast-growing soybean rhizobia and a proposal that Rhizobium fredii be assigned to Sinorhizobium gen. nov. Int J Syst Bacteriol. 28: 392-397. 18.Corby H.D.L, 1981 - The systematic value of leguminous root nodules. In Advances in Legume Systematics, Part 2, Polhil. R.M and Raven, P.H. (Eds.): 657-669. 19.Corby H.D.L, 1988 - Types of rhizobial nodules and their distribution among the Leguminosae. Kirkia. 13: 53-123. 20.Cronk Q., Ojeda I. et Pennington R.T, 2006 - Legume comparative genomics: progress in phylogenetics and phylogenomics. Curr. Opin. Plant Biol. 9: 99-103. 21.Dakora F.D, 2000 - Commonality of root nodulation signals and nitrogen assimilation in tropical grain legumes belonging to the tribe Phaseoleae. Aust. J. Plant Physiol. 27:885-892. 22.Day D.A., Poole P.S., Tyerman S.D. et Rosendahl L, 2001 – Ammonia and aminoacid transport across symbiotic membranes in nitrogen-fixing legume nodules.Cell Mol.Life Scien. 58:61-71. 23.Dénarié J, Debellé F., Promé J.C, 1996 - Rhizobium lipo- chitooligosaccharide nodulation factors: signaling molecules mediating recognition and morphogenesis. Ann Rev Biochem. 65: 503-535. 24.Dixon.R.O.D. et Wheeler.C.T, 1986 - Nitrogen fixation in plants.Glasgow.U.K:Blackie press. 25.Dommergues Y., Duhoux E. et Diem H.G, 1999 - Les arbres fixateurs d'azote. Caractéristiques fondamentales et rôle dans l'aménagement des écosystèmes méditerranéens et tropicaux avec référence particulière aux zones subhumides et arides. 499 p. France: CIRAD, Editions Espaces, FAO, IRD, Montpellier, France.

88 Références bibliographiques

26.Dreyfus B., Garcia J.L. et Gillis M, 1988 - Caracterization of Azorhizobium caulinodans gen. nov., sp.nov., a stem-nodulating nitrogen-fixing bacterium isolated from Sesbania rostrata. Int. J. Syst. Bacteriol. 38:89-98. 27.Eady R.R, 1986 - Enzymology in free-living diazotrophs. Dans Nitrogen fixation (Molecular Biology).Broughton W.J. and Pühl A. (Eds.), Clarendon press, Oxford: 1-49. 28.Elmerich C, 1997 - Nitrogénase: aspect biochimiques, moléculaires et génétiques. Dans “Assimilation de l’azote chez les plantes”. Morot- Gaudry J.F. Ed, I.N.R.A., Paris: 163-177. 29.Fenton M., Jarvis B.D.W, 1994 - Expression of the symbiotic plasmid brom Rhizobium leguminosarum biovar trifolii in Sphingobacterium multivorum Canadian journal of microbiology. 40 (10):873-879. 30.Franssen H.J., Vijn I., Yang W.C. et Bisseling T, 1992 - Developmental aspects of the Rhizobium-legume symbiosis. Plant Molec. Biol. 19:89-107. 31.Gage D.J, 2004 - Infection and invasion of roots by symbiotic, nitrogen- fixing rhizobia during nodulation of temperate legumes. Microbiol Mol Biol Rev 68 (2):280-300. 32.Gavini F, Mergaert J., Beji A., Mielcarek C., Izard D, Kersters K. et de Ley J, 1972 - Transfer of Enterobacter agglomerans (Beijerinck 1888) Ewing and Fife 1972 to Pantoea gen. nov. as Pantoea agglomerans comb. nov. and description of Pantoea dispersa sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 39: 337-345. 33.Geurts R. et Franssen H, 1996 - Signal transduction in Rhizobium induced nodule formation. Plant Physiol. 112:447-453. 34.Graham P.H, 2007 - Ecology of the root-nodule bacteria of legumes. In Leguminous nitrogen-fixing symbioses. M.J. Dilworth et al. (eds.), Springer, Dordrecht. 7:23-58. 35.Gresshoff P.M, 2003 - Post-genomic insights into plant nodulation symbioses. Genome boil 4 (1):201. 36.Gualtieri G. et Bisseling T, 2000 - The evolution of nodulation. Plant Molecular Biology. 42:181-194. 37.Guinochet M., Vilmorin R, 1973-1984 - Flore de France. Paris, Editions du Centre National de la Recherche Scientifique, tome 1 (366 p.), tome 2 (452 p.), tome 3 (380 p.), tome 4 (396 p.), tome 5 (281 p.). 38.Halbleib C M., Zhang Y. et Ludden P. W, 2000 - Regulation of dinitrogenase reductase ADP-ribosyltransferase and dinitrogenase reductase-activating glycohydrolase by a redox-dependent conformational change of nitro-genase Fe protein. J. Biol. Chem. 275: 3493-3500.

89 Références bibliographiques

39.Harrier L.A., P.W. Whytty, J.M. Sutherland et J.I. Sprent, 1997 - Phenetic investigation of non- nodulating African species of Acacia (Leguminosae) using morphological and molecular markers. Plant Sys. 202: 27- 57. 40.Hill S, 1992 - Physiology of fixation in free-living heterotrophs. Dans: Biological nitrogen fixation. Stacey G., Burris R.H. et Evans H.J. (Eds.), Chapman et Hall, New York. 169-257. 41.Hogg B., Davies E., Wilson K.E., Bisseling T., Downie J. A, 2002 - Competitive nodulation blocking of cv. Afghanistan pea is related to high levels of nodulation factors made by some strains of Rhizobium leguminosarum bv. Viciae Molecular plant-microbe interactions., 15,(1):60-68. 42.Holmes B, Popoff M., Kiredjian M., Kersters K, 1988 -. Ochrobactrum anthropi gen. nov., sp. nov., from human clinic specimens and previously known group Vd. Int. J. Syst. Bacteriol. 38: 406-416. 43.Ildis, 2002 - Ildis word Database of legumes.J.Exp.Bot., 23:1076-1085. 44.Jarvis, B.D.W., C. Pankhurst et J.J. Patel, 1982 -. Rhizobium loti, a new species of legume root nodule bacteria. Int. J. Syst. Bac-teriol. 32:378-380. 45.Jarvis B.D.W., Van Berkum P., Chen W.X., Nour S.M., Fernandez M.P., Cleyet-Marel J.C. et Gillis M, 1997 - Transfer of Rhizobium loti, Rhizobium huakuii, Rhizobium ciceri, Rhizobium mediterraneum, Rhizobium tianshanense to Mesorhizobium gen. nov., International Journal of Systematic Bacteriology. 47: 895-898. 46.Jordan D.C, 1982 - Transfer of Rhizobium japonicum Buchanan 1980 to Bradyrhizobium gen. nov., a genus of slow-growing root nodule bacteria from leguminous plants. Int J Syst Bacteriol. 32:136-139. 47.Jourand P., Giraud E., Béna G., Sy A., Willems A., Gillis M., Dreyfus B. et De Lajudie P, 2004 - Methylobacterium nodulans sp.nov. for a group of aerobic, facultatively methylotrophic, legume root-nodule- forming and nitrogen-fixing bacteria. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54: 2269-2273. 48.Kasse E. et Wink M, 1997 - Phylogenetic relationships in the Papiliono- ideae (family Leguminosae) based on nucleotide sequences of cpDNA(rbcL) and ncDNA (ITS 1 and 2). Molecular Phylogenetics and Evolution. 8:65-88. 49.Kape R., Parniske M. et Werner D, 1991 - Chemotaxis and nod gene activity of Bradyrhizobium japonicum in response to hydroxycinnamic acids and isoflavonoids.Appl. Environ. Microbiol. 57:316-319. 50.Knosel D.H, 1984 -. Genus IV. Phyllobacterium nom. rev. In: Krieg NR, Holt JG, (eds) Bergey’s Manual of systematic Bacteriology Vol.1, Williams and Wilkins, Baltimore: 254-256.

90 Références bibliographiques

51.Laguerre G., Allard M R., Revoy F et Amarger N, 1994 - Rapid identification of rhizobia by restriction fragment lenght polymorphism analysis of PCR amplified 16s rDNA genes. Appl. Environ. Microbiol. 60 (1):56-63. 52.Lawson C.G.R., Rolfe B.G et Djordjevic M.A, 1996 - Rhizobium inoculation induces condition-dependent changes in the flavonoid composition of root exudates from Trifolium subterraneum. Aust.J.Plant Physiol. 23:93-101. 53.Lerouge P., Roche P., Faucher C., Maillet F., Truchet G., Prome J.C. et Denarié J, 1990 - Symbiotic host-specificity of Rhizobium meliloti is determined by a sulphated and acylated glucosamine oligosaccharide signal. Nature. 344: 781-784. 54.Lewis G., Schrire B., Mackinder B et Lack M, 2005 - legumes of the world. Editor. Royal Botanical Gardens, Kew, Richmond, Surrey, U.K. 55.Lindström K., Van Berkum P., Gillis M., Martíne E., Novikova N. et Jarvis B, 1995: in Proc. 10th Int. Cong. Nitrogen Fixation: Fundamentals and Applications (eds Tikhonovich, I. A. et al.): Kluwer Academic Publishers, Dordrecht: 365–370. 56.Losick et Kaiser, 1997 - Why and how bacteria communicate. Sci. Am. 276: 68-73. 57.Makkar N.S et Casida Jr.L.E, 1987 - Cupriavidus necator gen. nov., sp. nov.: a nonobligate bacterial predator of bacteria in soil. Int. J. Syst. Bacteriol. 37: 323-326. 58.Marbberley D.J, 1998 - The plant book, 2ème edition. Cambridge University Press, Cambridge. 612 p. 59.Martinez-Romero E, 1994 - Recent developments in Rhizobium . Plant Soil. 161: 11 -20. 60.Martinez-Romero E., Hernandez-Lucas I., Segovia L., et Pueppke S.G, 1995 – Phylogenetic relationships and host range of Rhizobium spp. that nodulate Phaseolus vulgaris L. Appl. Environ. Microbiol. 61: 2775- 2779. 61.Mateos P.F., Baker D.L., Petersen N., Velezquez E., Jimenez-Zurdo J.I., Martinez-Malina E., Squartini A., Orgambide G., Hubbell D.H. et Dazzo F.B, 2001 - Erosion of root epidermal cell walls by Rhizobium polysaccharides degrading enzymes as related to primary host infection in the Rhizobium-legume symbiosis. Can.J. Microbiol. 47: 475-487. 62.Marschner H, 1995 - Mineral Nutrition of Higher Plants (2nd edn), Academic Press. 63.Mergaert J., Cnockaert M.C., Swings J, 2002 -. Phyllobacterium myrsinaecearum (Subjective Phyllobacterium rubiacearum) emend. Int.J.Syst. Evol.Microbiol. 52: 1821-1823.

91 Références bibliographiques

64.Mantelin S., Fisher-Le Saux M., Zakhia F., Béna G., Bonneau S., Jeder H., de Lajudie P. et Cleyet-Marel J.C, 2006 - Emended description of the genus Phyllobacterium and description of four novel species associated with plant roots: Phyllobacterium bourgognense sp. nov., Phyllobacterium ifriqiyense sp. nov., Phyllobacterium leguminum sp. nov. and Phyllobacterium brassicacearum sp. nov. Int. J. Syst. Evol.Microbiol. 56: 827-839. 65.Mhamdi R., Mrabet M., Laguerre G., Tiwari R., Aouani M.E, 2005 - Colonisation of Phaseolus vulgaris nodules by Agrobacterium-like strains. Canadian Journal of Microbiology. 51: 105-111. 66.Moulin L., Munive A., Dreyfus B. et Boivin-Masson D.W, 2001 - Nodulation of legumes by members of the β-subclass of the Procaryobacteria. Nature. 411: 948-950. 67.Mrabet M., Mnasri B., Ben Romdhane, Laguerre G., Aouani M.E, Mhamdi R, 2006 - Agrobacterium strains isolated from root nodules of common bean specifically reduce nodulation by Rhizobium gallicum. FEMS Microbiology and Ecology. Vol. 56. (2): 304-309. 68.Nakagawa Y., Sakane T et Yokota A, 1996 - transfer of "pseudomonas riboflavina" (foster 1944), a gram-negative, motile rod with long-chain 3-hydroxy fatty acids, to Devosia riboflavina gen. nov., sp. nov., nom. rev. Int. J. Syst. Bacteriol. 46: 16-22. 69.Newton W.E, 1993 - Nitrogenase: Distribution, composition, structure and function. In “New horizons in nitrogen fixation”. Palacios R., Mora J., Newton W.E., (Eds.). Kluwer Acad. Publish., Dordrecht:. 5-18. 70.NCBI GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/). 71.Oldroyd G, 2001 - Dissecting symbiosis: Developments in Nod Factor signal transduction. Ann Bot. 87:709-718. 72.Oke V. et Long S.R, 1999 – Bacteroid formation in the Rhizobium- legume symbiosis. Curr. Opin. Microbiol. 2: 641-651. 73.Ozenda P, 1983. - Flore du Sahara, CNRS, Paris. 74.Parniske M, 2000 - Intracellular accommodation of microbes by plants: a common developmental program for symbiosis and desease. Curr.Opin. Plant. Biol. 3: 320-328. 75.Patriarca E.J., Tate R., Ferraioli S. et Iaccarino M, 2004 - Organogenesis of legume root nodules. Int Rev Cytol. 234: 201-62. 76.Patt T.E., Cole G.C. et Hanson R.S, 1976 - Methylobacterium, a new genus of facultatively methylotrophic bacteria. International Journal of Systematic Bacteriology. 26: 226-229. 77.Perret X., Staehelin C., et Broughton W.J, 2000 -. Molecular basis of symbiotic promiscuity. Microbiol Mol Biol Rev. 64: 180-201.

92 Références bibliographiques

78.Phillips D.A, 2000 - Biosynthesis and release of rhizobial nodulation gene inducers by legumes. In Prokaryotic Nitrogen Fixation: A Model System for the Analysis of a Biological Process (Triplett E.W., ed.): 349- 364. 79.Polhill R.M, 1981 - Papilionoideae. In R. M. Polhill and P. H. Raven [eds.], Advances in legume systematics, part 1, 191–208. Royal Botanic Gardens, Kew, UK. 80.Polhil R.M, 1994 - Classification of the Leguminosae. In F.A. Bisby, J. Bucking-ham, and J. B. Harborne [eds.], Phytochemical dictionary of the Legu-minosae, xxxv–lvii. Chapman and Hall, New York, New York, USA. 81.Postgate J.R, 1982 - The fundamentals of nitrogen fixation Cambridge University Press, Cambridge. 252 p. 82.Postgate J.R, 1998 -. Nitrogen Fixation, 3rd Edition. Cambridge University Press, Cambridge UK. 83.Pottier-Alapetite G, 1979 - Flore de la Tunisie Angiosperme- Dicotylédones. Apétales-Dialypétales. Première partie, Imprimerie Officielle de la République Tunisienne. 651 p. 84.Quezel P. et Santa L, 1962 - Nouvelle flore de l’Algérie et des régions désertiques méridionales. Ed.CNRS. 565p. 85.Ridge W.R, 1992 - A model of legume root hair growth and Rhizobium infection. Symbiosis. 14: 359-373. 86.Rivas R, 2003 –Description of Devsoia neptuniae sp.nov.that nodulates and fixes nitrogen in symbiosis with Neptuniae natans, an aquatic legume from India. Syst. Appl. Microbiol. 26: 47-53. 87.Roose E, 1994 - Introduction à la gestion conservatoire de l'eau, de la biomasse et de la fertilite des sols (GCES). Bulletin Pédologique FAO Rome, 70,420 p. 88.Sahgal M., Johri B.N, 2003 - The changing face of rhizobial systematics. Current Science. 84: 43-48. 89.Schlaman H.R.M., Okker R.J.H. et Lugtenberg B.J.J, 1992 - Regulation of nodulation gene expression by NodD in Rhizobia. Journal of Bacteriology. 174: 5177-5182. 90.Scholla M. H. et G. H. Elkan, 1984 - Rhizobium fredii sp. nov., a fast- growing species that effectively nodulates soybeans. Int. J. Syst. Bacteriol. 34: 484-486. 91.Shipley P.R., Meisinger J.J., Decker A.M, 1992 - Conserving residual nitrogen with cover crops. Agron. J. 84: 869-876. 92.Siqueira 0.J., Nair G.M., Hammerschmidt R. et Safir R.G, 1991 - Significance of phenolic compounds in plant-soil microbial systems.Critica1 Reviews in plant sciences., 10 (1): 63-121.

93 Références bibliographiques

93.Sneath P.H.A, 1974 - The history and future potential of numerical concepts in systematics: the contributions of H.G. Gyllenberg. Binary - Computing in Microbiology. 7: 32-36. 94.Sprent J.I, 2008 - Legume nodulation. John Wiley and sons, Grande Bretagne.200 p. 95.Sprent J I. et Parsons R, 2000 - Nitrogen fixation in legume and non- legume trees. Field Crops Res. 65: 183-196. 96.Sprent J.I, 2001 - Nodulation in legumes .Dickerson (Eds).Royal botanical garden, kew, united kingdom.364p. 97.Sprent J.I., Sutherland J.M., Faria S.M.D, 1987 - Some aspects of the biology of nitrogen-fixing organisms. Phil.Trans.R.Soc.B. 317: 111-129. 98.Streeter J, 1993 - Translocation a key factor limiting the efficiency of nitrogen fixation in legume nodules. Physiol. Plantarum. 87: 616-623. 99.Sy A., Giraud E., Jourand P., Garcia N., Willems A., De Lajudie P., Prin Y., Neyra M., Gillis M. Boivin-Masson C. et Dreyfus B, 2001 - Methylotrophic Methylobacterium bacteria nodulate and fix nitrogen in symbiosis with legumes. J. Bacteriol., 183: 214-220. 100. Triplett E.W., Sadowsky M.J, 1992 - Genetics of competition for nodulation of legumes. Annu. Rev. Microbiol. 46: 399-428. 101. Truchet G., Prome J.C. et Denarié J, 1993 - Symbioses bactéries - légumineuses : Un dialogue moléculaire. La recherche. 250: 92-94. 102. Vaclav S, 2001 - Enriching the Earth: Fritz Haber, Carl Bosch, and the Transformation of World Food Production, The MIT Press. 358 p. 103. Van De Sande K. et Bisseling T, 1997 – Signalling in symbiotic root nodule formation. Essay in biochemistry. 32: 127-142. 104. Vincent J.M, 1970 - A manual for the pratical study of the root nodule bacteria. IBP Handbook N°15 Blackwell Sci. Publ. Oxford 164 p. 105. Viprey V., Perret X., et Broughton W.J, 2000 - Host-plant invasion by rhizobia. Subcell. Biochem. 33: 437-456. 106. Wang E.T. et Martinez-Romero E, 2000 - Sesbania herbacea- Rhizobium huautlense nodulation in flooded soils and comparative characterization of S. herbacea-nodulating rhizobia in different environments. Microbiol. Ecol. 40: 25-32. 107. Watson L. et Dallwitz M.J, 2000 - The families of flowering plants: Description, illustrations and formation. Retrieval. 108. Woese C.R, 1987 - Bacterial evolution. Microbiol. Rev. 51: 221-271. 109. Wood S.M. et Newcomb W, 1989 - Nodule morphogenesis: the early infection of alfalfa (Medicago sativa) root hairs by Rhizobium meliloti. Canadian Journal of Botany. 67: 3108-3122.

94 Références bibliographiques

110. Yabuuchi E., Kosako Y., Oyaizu H., Yano I., Hotta H, Hashimoto Y., Ezaki T et Arakawa M, 1993 - Proposal of Burkholderia gen. nov. and transfer of seven species of the genus Pseudomonas homology group II to the new genus, with the type species Burkholderia cepacia (Palleroni et Holmes 1981) comb. nov. Microbiol. Immunol. 36: 1251- 1275. 111. Young J P W, 1993 - Molecular phylogeny of rhizobia and their relatives. In: Palacias R; Mora J and Newton W E, ed New horizons in nitrogen fixation. Dordrecht, the Netherlands, kluwer Scientific Publishers. 587-592. 112. Young J P.M, 2003 - The genus name Ensifer Casida 1982 - Takes Priority over Shinorhizobium.Chen et al. 1988 and Sinorhizobium morelense Wang et al. - is a later synonym of Ensifer adhaerens. 113. Zahran H.H, 1999 - Rhizobium-Legume Symbiosis and Nitrogen Fixation under Severe Conditions and in an Arid Climate. MMBR. 63: 968-989. 114. Zahran H.H, 2001 - Rhizobia from wild legumes: Diversity, taxonomy, ecology, nitrogen fixation and biotechnology .j. Biotechnol. 91: 143-153. 115. Zeze A., Mutch L.A. et Youg J.P, 2001 - Direct amplification of NodD from Community DNA reveals the genetic diversity of Rhizobium leguminosarum in soil. Environ. Microbiol. 3: 363-370. 116. Zurdo-Pineiro J.L., Rivas R., Trujillo M.E., Vizcaino N., Carrasco J.A, Chamber M, Palomares A, Mateos P.F, Martinez-Molina E et Velazkez E, 2007 - Ochrobactrum cytisi sp. nov., isolated from nodules of Cytisus scoparius in Spain. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 57: 784-788.

95 Annexes

96 Annexes

Annexe 1 Composition du milieu YMA (Vincent 1970)

Mannitol ...... 10 g

K2HPO4...... 0.5g

MgSO4-7H2O...... 0.2g Extrait de levure...... 0.4g NaCl...... 0.1g Rouge de Congo 1% ...... 10ml

Eau distillée……………………………………………………1000ml

Le pH du milieu est ajusté à pH 7 avec HCl ou KOH 10N et sa stérilisation est assurée par autoclavage à 120°C pendant 20 min.

Annexe 2 Composition du milieu TY (Tryptone Yeast Extract)

Tryptone ...... 5g Extrait de levure ...... 3g Eau distillée ...... 1000ml

Ajuster le pH à 7 avec KOH ou HCl N/10 - Stériliser à 120°C pendant 20mn et ajouter 6ml/l de CaCl2 (1M) stérile juste avant l’utilisation.

Annexe 3 Composition du milieu de conservation de souches

Glycérol...... 600g Eau distillée ...... 400ml

Ce milieu est stérilisé à 120°C pendant 20mn

97 Annexes

Annexe 4

Composition du milieu Amarger

Mannitol ...... 10g K2 HPO4...... 1g KH2PO4...... 1g FeCl3,6H2O...... 0.01g MgSO4, 7H2O...... 0.2g CaCl2...... 0.1g (NH4)2SO4 ...... 1g Agar ...... 4g Eau distillée ...... 1000ml

Ce milieu est stérilisé à 120°C pendant 20mn Coloré avec solution de bleu de bromothymol 1ml par 1000ml.

98 Annexes

Annexe 5 : Caractérisation phénétique de souches associées aux Loteae. l o t e e e e i e e B l e s e s n e e s e s s s s o e B e s o e l o s s l t e è o s o n e m l e l o i o t B B i s o d o i n s t t s e l e r o o o o g e l o i e s l n e s l a o i o t n t t b o i B B z r i i c c s t i o t r o s a e n t o o n s p i o u - i o o t m b i t n t o t t t t t t é i t b b a a c o f b b l c c i o h d a l l n l l i o a l l l o u l x f a e n r r i l l c c c r l i a a u y u b b é c a a a é é y a a l l u e e e a h i i c l r r o o y y r r a a a C C C A A N A A C D F G G G G G L L L M M M M M M R R R R S S T X X

Ant-bar + - - + - - + + - - + - + + - - - + - + + - - + - + - - - + - - + + Ant-cyt1 + - - + - - + - - - + - + + ------+ - + - + + - - + + - + + - Ant-cyt2 + - - + - - + + - - + - - + - - - + - - + - - + - - - - - + - + + - Ant-mon1 + - - + - - + + - - + - + + - - - + - + + ------+ - + + + Ant-pol1 + - - + - - + + - - + - + + - - - + - - + - + + - - - - + + - + + - Ant-tet1 + - - + - - + - - - + + + + - - + + - - + - - + - + - + - + - - + - Ant-tet2 + - - + - - + + - - - - + + - - - + - + + - - + - - - - - + - + - - Ant-vma1 + - - + - - - + - - + - - + - - - + ------+ + - - + + Ant-vma2 + - - + - - - + - - + - + + - - - + - - + - + + - + - - - - - + + + Ant-vma3 + - - + - - + + - - + - + + - - - + - - + - - - + - - - - + - - - - Ant-vma4 + - - + - - + - - - - + + + - + + + - - + - + + - + - + + - - + - - Ant-vsa1 + - - + - - + - - - + - + + - + - - - + + - - - - + - - - + - - + + Ant-vsa2 + - - + - - - + - - + - + + - + + ------+ + - - - - + - + + - Ant-hen + - - + - - + - - - - - + + - + - + - - + - + - - - - - + + - + + - Cor-jun1 + - - + - - + + - - + + + + - + + + ------+ - + - + - + + - Cor-jun2 + - - + - - + + - - + - + + - + - + - - - - + + - - - + - + - - + + Cor-jun3 + - - + - - + + - - + + + + - + - + - - + - - + - + - + + + - - + + Cor-jun4 + - - + ------+ - + + - + - - - - + - - + - + - + - + - + + + Cor-min1 + - - + - - + + - - + - + + - + - + - + + ------+ + + - + + - Cor-min2 + - - + - - + - - + + + + + - + - + - - + - + - + - - + - + - - + - Cor-min3 + - - + - - + + - + - + + + - + - + - + + - - - - + - + - + - - + + Cor-min4 + - - + - - + + - - + - + + - + + + + - + - + + - + - + + + - + + - Cor-rep1 + - - + - - + - - - - - + + - + - + - - + - - + - + - + - - - - + - Cor-rep2 + - - + - - + + - - + + + + - + - + - - + - - - - + - + - + - + + + Cor-rep3 + - - + - - + + - + + - + + + - + + + + + - - - + - - - + - - + + - Cor-sco1 + - - + - - + - - - + + + + - + - + - - - - + - - + - + - - - + + - Cor-sco2 + - - + - - + + - - + + + + - - - + - - - - + + - - - - - + - + - - Cor-vpe1 + - - + - - + - - - + - + + - - - + - - + ------+ + - - + - Dor-pgr1 + - - + - - + + - - + + + + - + - + - - + - + + - - - + + + - - + - Dor-psu1 + - - + - - + - - + - + + + - + - + - - + - - - - + - + - + - + - - Dor-rec1 + - - + - - + + - + + - + + - + - + - - + - - - + - - + - + - - + + Dor-rec2 + - - + - - + + - + + - + + - + - + - - + - - - - + - + + + - - + - Hip-are1 + - - + - - + - + + - + + + + + + + + - + - + + - - - + - + - - + + Hip-atl1 + - - + - - - + - - + - + + - + - + - + + - - - - + - + + - - + + - Hip-bif1 + - - + - - - - - + + + + + - + + - + - + - - + - - - + - + - - + + Hip-min1 + - - + - - - + - - + - - + - - - + - - + - + - + + - - - - - + - - Hip-mul1 + - - + - - + + - - + + + + - + - + - - + - - + - + - + + + - - + - Hip-mul2 + - - + - - + + - - + - - - - + + + + + + - + + + + - - - - - + + - Hip-mul3 + - - + - - - + - - + - + + - - - + - - + - - + - + - - + + - - + + Hym-cir1 + - - - - + - - - - + + - + - - - + - - + - + - - + - - - + - - + - Hym-cir2 + - - + - - + + - - + + + + - - - + - + + ------+ - + - - + + Lot-ara1 + - - + - - + + - - + + + + - - - + - - + - + - - + - - - + - + + - Lot-bif1 + - - - - + + + - - + + + + - - - + - - + - - + + - - - - + - - + -

99 Annexes Suite annexe 5 l l l l l l l l - e e e e n e e e e e e e e e e e e e e e e e B B B o o o o o o o o t m o t s t s t t t t t s t s s s s s s s s s s s s s s s d a n r i i i i i i i i B B B i n y r l t t t

o o o o o o o o o o o o o o o o o o è e t l s b i b b l l l i l p t t t t t e t y c c i c l i d a e l n r n n n b b g M x a o i y a b a i c c u c u b i i

a r r n a a z i c X u t a f r o t n i o R r e l l c l l n o f h b u a a m X

o i M R C l L l G c é c u r a A l a S l é M a é A A a D L a G a a S C C y r e r F e é l h M G M R L T A G N C G M R

Lot-bif2 + - - + ------+ - - + - - - + ------+ - + + + Lot-bif3 + - - + - - + + - - + - + + - - - + - - + - + + - - - + - + - + + - Lot-bif4 + - - + - - + + - - + - + + - - - + - - + - - - - + - - - + - - + + Lot-con1 + - - + - - + + - - + - + + - - - + - - + - + + - + - - - + - + + - Lot-cor1 + - - + - - - + - - + - - + - - - + - - + - + + - + - + - + - + + - Lot-cor2 + - - + - - + + - - - - + + - - - + - - + ------+ + - - - - Lot-cor3 + - - + - - + + - - + - + + - - - + - + + - + - + + - - - + - + + + Lot-cor4 + - - + - - + + - - + + + + - - - + - - - - + - - - - + - + - - - - Lot-cre1 + - - + - - + + - - + - + + - - - + - - + ------+ + - Lot-cre2 + - - + - - + + - - + + + + - - - + - - - - + - + + - - + + - - + - Lot-cre3 + - - + - - - + - - + + + + - + + + - - + - - - - + - - - + - + - - Lot-cre4 + - - + - - - + - - + + + + - - - + - + + ------+ - - - + - Lot-edu1 + - - + - - + + - - + + + + + + + + ------+ - + - + - + + + Lot-edu2 + - - + - - - + - - + - + + - - - + - - + - - + - + - + - + - + - - Lot-edu3 + - - + - - + + - - + - - + - + + + - + + - - - - + - + - + - - + - Lot-edu4 - - + - - + + + - - + + + + - - - + - + + ------+ - - - + + - Lot-gli1 - - + + - - + + - - + + + + - + - + - - + - - - - + - + + - - - + - Lot-his1 - - + - - + + + - - + - + + - + - + - - + - - + - + - + + - - + + + Lot-his2 - - + - - + + + - - + + + + - - - + - - + - + - + + - - - + - + + + Lot-jol1 - - + + - - - + - - + - + + - - - + - + + - - + - - - + - + - + + - Lot-orn1 - - + - - + + + - - + + + + - - - + - + + - - - + + - - + + - + + - Lot-orn2 - - + + - - + + - - + + + + - - - + - + + - + + - - - - - + - + + - Lot-orn3 - - + - - + + + - - + + + + - - - + - - + - - - - + - + + + - - + - Lot-orn4 - - + + - - + - - - + - - + - - - - - + ------+ + - - - + Lot-pal1 - + - - + - + - - - - - + - - - - + ------+ - - - + - - - + Lot-par1 - + - - + - + ------+ ------+ ------+ + - - - + Lot-par2 - + - - + - - - - - + - - + ------+ - - + + + Lot-ped1 - + - - + - + - - - - - + + ------+ + - - - - Lot-ped2 - - + - - + + + - - + + + + - - - + - - + - - + - - - - - + - - + + Lot-pur1 - - + + - - + + - - + + + + - - - + - + + - + + + + - + - + - + - - Lot-pur2 - - + - - + + + - - + + + + - - - + - - + - - - - + - + + - - - + - Lot-pur3 - - + - - + + + - - + + + + - - - + - - + - - - + - - + + + - - + + Lot-pur4 - - + - + - + - - - + - + + - - - + - + + - - + - + - + - + - + - + Lot-rou1 - - + - - + + + - - + + + + - - - + - - + - + - - + - - - + - - + - Lot-rou2 - + - - + - + ------+ ------+ ------+ + - + + + Orn-com1 - - + - + - + + - - + + + - - - - + - - + - + - - + - - - + - - - - Orn-com2 - - + - - + - + - - + + + + ------+ + - + - - - + + - Orn-ist1 - + - - + - + ------+ + - - - + Orn-per1 - - + + - - + + - - + + + + - - - + - + + - - + - + - + - + - + + + Orn-pin1 - - + + - - + + - - + + + + - - - + - - + ------+ - - + - Orn-pin2 - + - - - + + - - - + - - + ------+ - - - + Orn-sat1 - + - - + - + + - - + + + + - - - + - + + - + - - - - + - + - - + - Sco-mur1 - + - - + - + - - - + - - + ------+ + - + + + Sco-mur2 - - + + - - - + - - + + + + - + - + - - + - - - - + - + - + - - + - Sco-mur3 - + - - + - + - - - + - - + ------+ - - - - + Sco-mur4 - + - - + - + - - - + - - + ------+ - - + + Sco-ver1 - + - - + - + - - - + + + + ------+ + - - + + Sco-ver2 - - + + - - + + - - + + + + - - - + - - + - - - + + - + - + - - - + Sco-ver3 - - + - + - - + - - + + + + - - - - - + + - - + - + - + + + - + + - Sco-ver4 - - + - - + - + - - + + + + - - - + - - + ------+ + - - + - -

100 Annexes Suite annexe 5 l o n l c i l n i n i l l n n c i n i i n C n n l n i C n i c n i i i y l c C C G G G G G c c c i a c e i a l y c x C c y c l y y a a i E E E E E i y x m h N y y y C C C C C C a i N 4 5 8 9 m p i r c C

m N N d u P P P P P o p m m b n i ° ° ° ° ° ° c m d

o N ° m i m H H H H o N n o a t C m M l Z p 0 5 0 5 0 5 P a C C M a i m t

r y 5 o p p p p c t r M M % % % % % l p a a 1 1 4 4 5 5 t 5 n a n f 5 M h m e c n 5 5 i 0 0 0 0 0 o e r t e , 2 , a N e 7 1 r r e a , A 2 3 4 5 6 N , o t P R 0 1 T l K p 1 E G V 0 S h S C

Ant-bar ------+ ------+ ------+ + ------Ant-cyt1 - - - - + + ------+ + - - - + ------+ ------Ant-cyt2 + + - - - - - + + + + - + + + - - - - + + ------+ - - - - - + - - - - Ant-mon1 - + - - + - - - - - + + - - + - - - - + - - - - + - + - + - + ------Ant-pol1 - + + - - - + - - + + + + - + - - - - + ------+ ------Ant-tet1 + - - - + - - + - - + - - - + + - - - + + - - - - + ------+ - - - - Ant-tet2 - + - - - + - - - + + + + - + - - - - + ------+ ------Ant-vma1 - + - - - - + - - + + + + + + - - - - + ------+ ------+ + + - - Ant-vma2 + - - + + - - + + - - - - - + - - - - + - - - - - + - - - - + + ------Ant-vma3 - - - - - + ------+ + + - - + + - - - + - + - + ------+ - - - - Ant-vma4 + - - - + - - + - - + - - - + - - - - + + - - - + + + - + - + + + - - + + - - - Ant-vsa1 ------+ + + - - - + - - - - + + - + + ------+ + + - - Ant-vsa2 - + ------+ + - - + + - - - + - - - - - + + + + + + + - - - + - - - - Ant-hen + ------+ - - - - - + + + - - - + - - - - + + - + + - + + - - - + + - - - Cor-jun1 - + ------+ + + + - + + - - - + - - - - + - - - + - + + ------Cor-jun2 - + + - + - + + - + + + + + + + + - - + + + + + + + + - + + + + + + - + + + + + Cor-jun3 - + + - + - + + - + + + + + + + - - - + + + - - + + + + + + + + + - - + + - - - Cor-jun4 - + ------+ + + + + + - - - - + ------+ - - - - Cor-min1 + ------+ ------+ + - - - + + - - - + + + - + - + + - - - + + - - - Cor-min2 - + + ------+ + + - + + - - - - + - - - - + - - + + - + ------Cor-min3 - - - + + - - - + - - - - - + - - - - + - - - - - + + - + + - - - - - + - - - - Cor-min4 ------+ - - - + + - + + + + + - - + + + - + - + + + - - + + + + + Cor-rep1 ------+ - - - - + - + + + - - - + - - - - + - + - - - + + + - - + + - - - Cor-rep2 + + - - + - - + - + + + - - + + - - - + - - - - + + - + + ------Cor-rep3 + - - - - + + + ------+ + + - - + + - - - + - + - + - + + + - - + + - - - Cor-sco1 ------+ - - + + - - - - + ------+ - + - + + - - - + + - - - Cor-sco2 + - - - - - + + - - - - - + + + - - - + + - - - - - + ------+ + - - - Cor-vpe1 - + ------+ + + - + + - - - + - - - - + + + - + ------Dor-pgr1 - + - - - - + - - + + + + - + + - - - + - - - - + - - - + - + + - - - + + - - - Dor-psu1 - - + - + - + ------+ + - - - + + + - - - - + + + - + ------Dor-rec1 + + - - - + - + - - + + - + + + - - - + - - - - + + + - + - + - - - - + + + - - Dor-rec2 - - - - - + ------+ - - - - + - - - - - + + + + - + - - - - + + - - - Hip-are1 - + - - + - + + + + + + + + + + - - - + + + - - - + + - + - + + - - - + + + + + Hip-atl1 + - - - - - + + ------+ - - - - + - - - - - + + - + ------+ - - - - Hip-bif1 - + - - + - + + + + + + + + + + - - - + + + + - + - + - + - + + + + + + + - - - Hip-min1 - - - - + + + - - - - - + + + - - - - + - - - - - + + - + + - - - - - + - - - - Hip-mul1 + - - - - - + + - - + + - - + + - - - + - - - - - + + + + - + - - - - + + - - - Hip-mul2 - + - - + + + - - + + + + + + + + - - + + - - - + + + - + + + + + - - + + + - - Hip-mul3 - - - - - + ------+ - + - - - - + ------Hym-cir1 + - - - + - - + ------+ + - - - + - - - - + ------Hym-cir2 ------+ - - + 2 - + + - - - - + ------+ + - - - + - - - -

101 Annexes Suite annexe 5

l o

c i n

i n

l n c i l

e n

n n y i C i i c l l

n h C n

i c n c c i y a n n i m l p i C a C

c i y l n G G G G G y y i c o c N x c l m a a y c i N i l m C E E E E E y m i y n m m y o p i x N N a t a m c i t o c P P P P P M o a r i

m M t m r p a m c a c d N C C C C C C o i p y r M 5 5 M n l l o 4 5 8 9 h e n l a e n t ° ° ° ° ° ° % % % % % C t f r 5 7 2 5 e h a e i d u i r m r a o p t a b e n H H H H ° 0 5 0 5 0 5 , , M , , 0 0 0 0 0 A C E G K N N P R S S T V p p p p 5 1 1 4 4 5 5 Z C C N P C 0 0 1 1 1 2 3 4 5 6

Lot-ara1 ------+ - - - - + - - - - - + - + + - + - - - - + + - - - Lot-bif1 + - - - - + - + - - + - - + + - - - - + ------+ ------Lot-bif2 - + - - - - + - - - + + - + + + - - - + ------+ - - - - Lot-bif3 + + - - - + - + + + + + + - + + - - - + ------+ - - - - Lot-bif4 ------+ - - - - + - + - - - - + ------+ ------+ - - - - Lot-con1 - + - - + - - - - + + + + - + - - - - + ------+ ------Lot-cor1 - + ------+ + + + - + + - - - + ------+ + ------+ - - - - Lot-cor2 ------+ ------+ - - - - + ------+ - + ------Lot-cor3 + - - + - - - + + - - + + - + + + - - + ------+ - - - - Lot-cor4 - + - - - + - - - - + - + + + - - - - + ------+ ------+ + - - - Lot-cre1 ------+ + - - + - - - - + ------+ ------+ - - - - Lot-cre2 - + - - + + - - - + + - + + + + - - - + - - - - + ------Lot-cre3 - + - - - - - + - + + + - + + - - - - + - - - - + + + + + ------+ + - - - Lot-cre4 ------+ + - - - + ------Lot-edu1 - + ------+ + + + + + - - - + + - - - - - + + - + + + - - - - + + - - - Lot-edu2 + ------+ ------+ - - - - + ------+ ------Lot-edu3 + + - - + - + + - + + + + + + + - - - + - - - - + + - + + ------+ + - - - Lot-edu4 - + ------+ + + + - + - - - - + + - - - + - - + + ------+ + - - - Lot-gli1 - + ------+ + + - - + - - - - + ------Lot-his1 - + - - + + - - + + + - + - - + - - - + - - - - + - - - - - + ------Lot-his2 + - - - - + - + - - + - - + + - - - - + ------+ ------+ - - - - Lot-jol1 + + + - - - + + - + + + + + + - - - - + ------+ ------+ - - - - Lot-orn1 - - - - - + ------+ + - - - + ------+ + ------+ - - - - Lot-orn2 ------+ - - - - + - - - - + ------+ - - - - Lot-orn3 + + - + + - + + + - + - + - + + - - - + + + - - - - + - + ------Lot-orn4 - + - - + - - - + + + + + - + + - - - + ------+ - - - - Lot-pal1 ------+ - - - + + + - - + + + - - + + - - - - + + - - - + + - - - Lot-par1 + ------+ ------+ + + ------+ ------Lot-par2 - + ------+ + + + ------+ + + ------+ - + ------Lot-ped1 + - - - - - + + ------+ + - - - + + ------+ - - - - Lot-ped2 - - - - + - - - - - + - - - + + - - - + ------+ ------Lot-pur1 + - - - - + - + ------+ - - - - + ------+ ------Lot-pur2 ------+ - - - - + - - - - + + ------Lot-pur3 + ------+ - - - - - + + - - - - + ------+ + - + + - - - + + - - - Lot-pur4 + - - - + - - + ------+ - - - - + - + - - + + ------+ - - - - Lot-rou1 ------+ + - - + - - - - + ------Lot-rou2 ------+ - + - + - - - + + - - - + + + - - + - - - + ------+ - - - - Orn-com1 ------+ - - - - + - - - - + ------Orn-com2 - + - - - + - - - + + + + - + + - - - + ------+ ------+ - - - - Orn-ist1 ------+ - - - + - - - + - - - - - + + ------+ - - - - Orn-per1 + + ------+ + + - + + - - - - + + ------+ - - - - + + - - - Orn-pin1 ------+ + - - - + ------+ ------+ - - - - Orn-pin2 ------+ - - - - + ------+ ------Orn-sat1 ------+ - - - + + + - - - + + ------+ - - - - Sco-mur1 - + ------+ + + + - + + - - - + + + - - - + + ------+ - - - - Sco-mur2 ------+ + + - - - + + - - - - + + + + + + - - - - - + + - - - Sco-mur3 ------+ + + - - + + + ------Sco-mur4 - + - - - - + - - + + - + - + + + ------+ - + ------+ - - - - Sco-ver1 - + - + - - - - + + + + + - + + - - - + + + - - - + ------Sco-ver2 + - - - - + - + + - - - - - + - - - - + ------Sco-ver3 - - - - + - - - - - + + - - + - - - - + + ------+ - - - - + - - - - Sco-ver4 ------+ - - - + - - - - + + - - - - - + - + ------+ - - - -

102 Annexes

103 Summary

This study focused on prevalence of symbiosis and diversity of the Rhizobia associated in the leguminous tribe of Loteae in Algeria. Observation done on 101 plants representing 44 taxons and 8 genera, collected from different locations indicate that Rhizobia symbiosis is whide spread within these legumes (hoste range), analysis of 93 associated strain by mean of symbiotic (hoste range) phenotypic and genotypic (PCR-RFLP and sequencing of the 16S RNA gene) characters indicate that Loteae from Algeria are nodulated by al least 8 genera representing 5 lineage of the legumes nodulating bacteria LNB within the LNB associated to the Loteae in Algeria, we found a strain of Burkholderia known to nodulate Mimosîdes in central America.

Key words: Symbiosis, Loteae of Algéria, Rhizobia associated, phenotypic and genotypic (PCR-RFLP and sequencing of the 16S RNA gene) characters, Burkholderia .

ﻣﻠﺨﺺ

ھﺬه اﻟﺪراﺳﺔ ﺷﻤﻠﺖ اﻟﺘﻌﺎﯾﺶ و اﻟﺘﻨﻮع Rhizobia اﻟﻤﺮﺗﺒﻄﺔ ﺑﺎﻟﺒﺎﻗﻮﻟﯿﺎت ﻣﻦ ﻣﺠﻤﻮﻋﺔ Loteae اﻟﺠﺰاﺋﺮ. دراﺳﺔ 101 ﻧﺒﺘﺔ, ﺗﻤﺜﻞ 44ٍ ﺻﻨﻒ و 8 أﻧﻮاع, ﻣﺄﺧﻮذة ﻣﻦ ﻣﺨﺘﻠﻒ اﻟﻤﻨﺎﻃﻖ ﻣﻜﻨﺖ ﻟﻨﺎ ﻣﻦ اﻟﻘﻮل أن ﺗﻌﺎﯾﺶ الRhizobia ﻣﻨﺘﺸﺮ ﻋﻨﺪ ھﺬه اﻟﻤﺠﻤﻮﻋﺔ.

ﺧﺼﺎﺋﺺ اﻟﺘﻌﺎﯾﺶ, اﻟﻨﻤﻂ اﻟﻈﺎھﺮي و اﻟﺘﺮﻛﯿﺒﺔ اﻟﻮراﺛﯿﺔ (PCR-RFLP و اﻟﻘﺮاءة اﻟﺠﯿﻨﯿﺔ لARN-16S) ل93 ﺳﻼﻟﺔ ال Rhizobiaاﻟﻤﺮﺗﺒﻄﺔ ﻣﻜﻨﻨﺎ ﻣﻦ اﻟﻘﻮل أن Loteae اﻟﺠﺰاﺋﺮ ﺗﺤﺘﻮي ﻋﻠﻰ ﻋﻘﺪ ﺟﺬرﯾﺔ ﻣﻜﻮﻧﺔ ﻋﻠﻰ اﻷﻗﻞ ﻣﻦ 8 أﻧﻮاع ﺗﻤﺜﻞ 5 أﺻﻨﺎف ﻣﻦ اﻟﺒﻜﺘﯿﺮﯾﺎ اﻟﻌﻘﺪﯾﺔ ﻟﻠﺒﺎﻗﻮﻟﯿﺎت

ﻣﻦ ﺑﯿﻦ ﺗﻠﻚ اﻟﺒﻜﺘﯿﺮﯾﺎ اﻟﻌﻘﺪﯾﺔ ﻟﻠﺒﺎﻗﻮﻟﯿﺎت اﻟﻤﺮﺗﺒﻄﺔ ب Loteae اﻟﺠﺰاﺋﺮ, أﺑﺮزﻧﺎ ﺳﻼﻻت Burkholderia اﻟﺘﻲ ﺗﺮﺗﺒﻂ ب : Mimosoîdées أﻣﺮﯾﻜﺎ اﻟﻮﺳﻄﻰ.

ﻛﻠﻤﺎت ﻣﻔﺘﺎﺣﯿﺔ :ﺗﻌﺎﯾﺶ , Loteae , Rhizobia اﻟﺠﺰاﺋﺮ , اﻟﺘﻨﻮع , Burkholderia

104