N° D’ORDRE : 16/2009-M/S.N RÉPUBLIQUE ALGÉRIENNE DÉMOCRATIQUE ET POPULAIRE Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique Université des Sciences et de la Technologie Houari Boumediène Faculté des Sciences Biologiques MEMOIRE Présenté en vue de l’obtention du diplôme de MAGISTER EN SCIENCES DE LA NATURE Spécialité : Écobiologie et Amélioration Végétales Présenté par DJOUADI Samir le thème Caractérisation phénotypique et génotypique des Rhizobia associés aux Loteae d’Algérie Soutenu publiquement le 02 Décembre 2009 devant le jury composé de: Mme BOUGUEDOURA N. Professeur (FSB-USTHB) Présidente Mme AID F. Professeur (FSB-USTHB) Directrice de thèse Mr. HANIFI N. Maître de Conférences (FSB-USTHB) Examinateur Mr. KACI Y. Maître de Conférences (FSB-USTHB) Examinateur Mr. AMRANI S. Chargé de Cours (FSB- USTHB) Examinateur 1 Résumé Cette étude porte sur la prévalence de la symbiose et la diversité des Rhizobia associés chez les légumineuses de la tribu des Loteae en Algérie. L’examen de 101 plants, représente 44 taxons et 8 genres, prélevés de différentes régions ont permis d’établir que la symbiose à Rhizobia est courante chez ce groupe de plantes. La caractérisation symbiotique (Spectre d’hôte), phénotypique et génotypique (PCR-RFLP et séquençage du gène de l’ARN 16S) de 93 souches de Rhizobia associées à permis de montrer que les Loteae d’Algérie sont nodulés par au moins 8 espèces représentant 5 lignées phylogénétiques de BNL. Parmi ces BNL associées aux Loteae en Algérie, nous avons mis en évidence des souches de Burkholderia qui est associée aux Mimosoîdés d’Amérique centrale. Mots clé : Symbiose, Loteae Algérie, Rhizobia associées, caractérisation phénotypique et genotypique (PCR-RFLP et séquençage du gène de l’ARN 16S), Burkholderia. 2 Je dédie spécialement cette thèse à mes parents pour leur soutien inébranlable et sans qui je ne serais pas là aujourd'hui. Je la dédie également à mes sœurs et frères qui m’ont toujours donné le sourire dans les moments difficiles, qui ont toujours su raviver en moi cette flamme de l'espoir pour qu'elle ne s'éteigne jamais. Je voudrais simplement leur dire que je les aime de tout mon cœur. Et à tous ceux qui comptent pour moi 3 Remerciements Je souhaite tout d’abord adresser mes sincères remerciements à ma directrice de thèse, Mme Aïd F. Professeur à la Faculté des Sciences Biologiques (FSB) USTHB pour le grand honneur qu’elle m’a fait en acceptant de diriger ce travail, pour les connaissances et le savoir-faire qu’elle m’a apporté qui sont et resteront précieux pour moi.Je tiens à remercier aussi Mr Amrani S. MAA à la Faculté des Sciences Biologiques (FSB) USTHB qui a accepté de juger ce travail pour ses recommandations, ses discussions perspicaces ainsi que pour ses conseils qui ont beaucoup enrichi non seulement ma recherche au sein du laboratoire mais également différents aspects de ma vie. Mes remerciements s'adressent aussi à Mme BOUGUEDOURA N. Professeur à l’USTHB, pour l'honneur qu'elle me fait en acceptant de présider le jury de soutenance. Je remercie également Mr HANIFI N. Maître de Conférences à l’USTHB et Mr KACI Y. Maître de Conférences à l’USTHB qui m’ont fait l’honneur de juger ce travail. Je tiens à remercier également Mlle Noureddine N.E MAA à la (FSB) USTHB pour ses encouragements, pour son implication et les conseils scientifiques qu’elle m’a accordés. Je remercie également tous les membres des laboratoires ou ce travail a été réalisé : Le laboratoire de Biologie des Sols de la Faculté des Sciences Biologiques de l'USTHB. Le laboratoire de physiologie végétale de la Faculté des Sciences Biologiques de l'USTHB. Et à tous ceux qui ont participé de prés ou de loin à la réalisation de ce travail. Merci pour tout 4 Liste des abréviations % : Pourcentage ° : Degré °C : Degré Celsius CV : Cultivar µg mL-1 : Microgramme par millilitre µL : Micro litre µm : Micromètre 16S rDNA : Ribosomal Deoxyribonucleic acid BNL : Bactéries nodulant les légumineuses DNA : Deoxyribonucleic acid EPS : Exopolysaccharides Fig : Figure J :Jours h : Heure ILDIS : International Legume Database and Information Service. M.V.S.P : Multi-Variate Statistical Package LCO : Lipo-oligosaccharides mL : Millilitre mL.L-1 : Millilitre par litre mM :Millimolaire mn : Minute ncbi : National Center for Biotechnology Information OTU : Unité Taxonomique Opérationnelle PCR : Polymerase Chain Reaction PEG : Polyéthylène Glycol pH : Potentiel hydrogène RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism rpm : Revolutions per minute s : Seconde Tab : Tableau TBE : Tris Borate EDTA tr/mn : Tours par minute TY : Yeast Tryptone UV : Ultra Violet YEMA : Tryptone Yeast Extract Agar YEMA-RC : Yeast Extract Mannitol Agar – Rouge Congo YEMB : Tryptone Yeast Extract Broth 5 Liste des tableaux Tableau 1 : Liste des organismes fixateurs d’azote. Tableau 2 : Principaux remaniements taxonomiques à la tribu des Loteae d’Algérie. Tableau 3 : Caractéristiques principales des différents genres de la tribu des Loteae. Tableau 4 : Les Rhizobia capables de noduler les légumineuses et exceptionnellement des non-légumineuses. Tableau 5 : Liste des genres de Rhizobia nodulant les Loteae. Tableau 6: Amorces utilisées pour l’amplification et la détermination de la séquence nucléotidique du 16S rDNA. Tableau 7 : Différentes espèces de Loteae recueillis au cours de nos campagnes de prospection. Tableau 8 : Nombre de taxons par genre. Tableau 9 : Statut symbiotique (nodulation et fixation d’azote), type nodulaire et localisation des nodules chez les 44 taxons de Loteae examinées. Tableau 10 : Authentification des isolats bactériens extraits à partir des nodosités des 96 Plants de Loteae recueillis. Tableau 11 : Spectre d’hôte des différentes souches de Rhizobia associées aux Loteae d’Algérie Tableau 12: Profils phénotypiques des trois groupes d’isolats associés aux Loteae d’Algérie. Tableau 13. : Profils de restriction du 16S rDNA des souches de Rhizobia associées aux Loteae. Tableau 14 : Profils de restriction du gène de l’ARN 16S des 93 souches de Rhizobia associées au Loteae d’Algérie. 6 Liste des figures Figure 1 : Représentation schématique du fonctionnement du complexe nitrogénasique. Figure 2 : Les différents systèmes de fixation biologique de l’azote moléculaire et leur potentiel de fixation d’azote en kg/ha de sol. Figure 3 : Etapes du processus de nodulation lors de la symbiose Légumineuses – Rhizobium. Figure 4 : Schéma général de la structure du nodule chez les légumineuses. Figure 5 : Fixation de l’azote et transport de l’ammonium dans le symbiosome. Figure 6 :Localités de prélèvement des Loteae utilisées pour la constitution d’une collection de souches de Rhizobia associées Figure 7 : Nodules de plants de Loteae provenant de différentes localités d’Algérie. Figure 8 : Photos de nodules obtenus pour les tests d’authentification des isolats bactériens. Figure 9 : Phénogramme représentant la subdivision des souches de Rhizobia associées aux Loteae d’Algérie en fonction de leur spectre d’hôte. Figure 10 : Phénogramme représentant le traitement numérique simultané du spectre d’hôte et de l’efficience symbiotique des souches de Loteae associées. Figure 11 : Phénogramme représentant les caractères phénotypiques des souches de Rhizobia associées aux Loteae d’Algérie. Figure 12 : électrophorèse des amplifiats obtenus par PCR-RFLP de l’ADNr 16s.de quelques souches nodulant les Loteae. Figure 13 : Profils éléctrophorétique de la restriction par RFLP de l’ADNr 16S obtenu pour quelques souches après digestion par l’endonucléase Hinf1. Figure 14 : Arbre phylogénétique des souches associées aux Loteae d’Algérie. 7 Sommaire Liste des abréviations Liste des figures Liste des tableaux Introduction 1 Synthèse bibliographique 1-La fixation biologique de l’azote moléculaire 3 1-1- La nitrogénase 5 1-1-1 - Structure – Constitution 5 1-1-2 - Fonctionnement de la nitrogénase 6 1-2-Les différents systèmes de fixation biologique de l’azote 7 2-La symbiose Rhizobia légumineuses 10 2-1- Le macrosymbionte : les légumineuses 10 2-1-1 - Les Cesalpinoidées 10 2-1-2 - Les Mimosoïdées 11 2-1-3 - Les Papilionoïdées 12 2-1-4 - La tribu des Loteae 13 2-2- Le microsymbionte : Les Rhizobia 17 2-2-1 - Les bactéries nodulant les légumineuses 17 2-2-2 - Les Rhizobia associés aux Loteae 20 2-3- Etablissement de la symbiose 21 2-3-1 - La formation des nodules racinaires 21 2-3-2 - Fonctionnement du nodule 24 2-4- Utilisation de la symbiose Rhizobia légumineuses 25 Matériels et méthodes 1-Matériel 27 1-1-Matériel végétal 27 1-2-Semences 28 1-3-Milieux de culture 28 2-Méthodes 29 2-1- Evaluation de la prévalence de la nodulation et de la fixation d’azote chez les Loteae 29 2-1-1– Extraction 29 2-1-2- Isolement et purification 29 2-1-3-Conservation des souches 30 2-2-Détermination des caractéristiques symbiotiques des souches 30 2-2-1-Stérilisation superficielle des semences 30 2-2-2 -Substrat utilisé pour la culture des lotus au laboratoire 30 2-2-3- Préparation de l’inoculum 31 2-2-4 -Conditions de culture 31 2-3-Caractérisation phénotypique des souches 32 2-3-1-Préparation des milieux tests 32 2-3-2-Lecture des résultats 32 2-3-3- Analyse numérique 33 2-3-3-1- La taxonomie numérique 33 2-3-3-2- Indice de similitude 33 8 2-3-3-3 - Logiciel utilisé 33 2-4- Caractérisation génotypique 33 2-4-1- Extraction de L’ADN 33 2-4-2 - Amplification du 16S rDNA 34 2-4-3- Analyse des fragments de restriction 35 2-4-4 - Séquençage du 16S rDNA 36 2-4-5- Traitement des séquences 36 2-4-6 - Interrogation des bases de données de séquences génétiques (BLAST) 36 2-4-7 - Alignement