ISOLASI BAKTERI PENGHASIL ENZIM PROTEASE PADA ONCOM MERAH PASCA FERMENTASI 120 JAM DAN IDENTIFIKASI MOLEKULER BAKTERI BERBASIS GEN 16S Rrna

ISOLASI BAKTERI PENGHASIL ENZIM PROTEASE PADA ONCOM MERAH PASCA FERMENTASI 120 JAM DAN IDENTIFIKASI MOLEKULER BAKTERI BERBASIS GEN 16S rRNA

Manuscript

Aulia Harun G1C217306

PROGRAM STUDI D IV ANALIS KESEHATAN FAKULTAS ILMU KEPERAWATAN DAN KESEHATAN UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SEMARANG 2018

*Corresponding Author: Aulia Harun Program Studi DIV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan kesehatan Universitas Muhammadiyah Semarang. Semarang Indonesia 50273 Gmail: [email protected] http://repository.unimus.ac.id Isolasi Bakteri Penghasil Enzim Protease pada Oncom Merah Pasca Fermentasi 120 Jam dan Identifikasi Molekuler Bakteri Berbasis Gen 16S rRNA

Aulia Harun1, Sakti Imam Muchlissin2, Ana Hidayati Mukaromah3, Sri Darmawati1, Stalis Norma Ethica3

1.Program Studi DIV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas Muhammadiyah Semarang

2.Laboratorium Kelautan dan Oseanografi Universitas Diponegor, Semarang, Jawa Tengah

3.Program Studi DIII Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas Muhammadiyah Semarang

Abstrak Info artikel Enzim adalah molekul protein kompleks yang dihasilkan oleh sel hidup dan bekerja sebagai katalisator dalam berbagai proses kimia di dalam tubuh. Salah satu Enzim yang berperan penting dalam kehidupan manusia adalah Enzim protease. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui adanya bakteri penghasil protease yang terdapat pada oncom pasca fermentasi 120 jam dan mengidentifikasi bakteri berdasarkan analisis gen 16S rRNA. Proses isolasi dan purifikasi dilakukan menggunakan media Nutrient Agar dengan teknik spread. Dari keenam isolat bakteri yang diisolasi dari sampel oncom pascva fermentasi 120 jam, terdapat satu isolat yang memiliki aktivitas protease yaitu isolat IROD 5. Uji penghasilan enzim protease oleh bakteri dilakukan menggunakan media Skim Milk Agar. Proses identifikasi molekuler dilakukan melalui analisis sekuengen 16S rRNA menggunakan metode PCR menggunakan primer forward F: 5'-AGAGTTGATCCTGGCTCAG-3’ dan primer reverse R: 5'- GGTTACCTTGTTACGACTT-3’ yang dilanjutkan dengan proses sekuensing. Dari proses isolasi diperoleh hasil berupa satu isolat bakteri yang memiliki aktivitas proteolitik berdasarkan pengamatan area zona bening protease dengan diameter 72 mm. Sekuen 16S rRNA isolat bakteri proteolitik IROD5 telah diperoleh dan analisis Keywords : terhadap sekuen gen tersebut tingkat kemiripan 99% dengan sekuen gen yang sama pada Staphylococcus hominis. Dapat disimpulkan Enzim Protease, Gen 16S rRNA, isolat bakteri yang diperoleh dalam penelitian ini merupakan Oncom merah penghasil enzim protease yang potensial dan teridentifikasi secara molekuler sebagai bakteri Staphylococcus hominis strain IROD5.

Pendahuluan kimia di dalam tubuh. Industri enzim Enzim adalah molekul protein kompleks berkembang sangat luas dan berperan yang dihasilkan oleh sel hidup dan bekerja penting dalam bidang industri (Yunita, sebagai katalisator dalam berbagai proses 2014).

*Corresponding Author: Aulia Harun Program Studi DIV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan kesehatan Universitas Muhammadiyah Semarang. Semarang Indonesia 50273 Gmail: [email protected] http://repository.unimus.ac.id Menurut Suranto (2011), enzim berperan tradisional ini. Sebagai salah satu makanan penting dalam kehidupan semua mahluk tradisional hasil fermentasi, sebenarnya hidup, terutama pada manusia. Salah satu oncom pun tidak kalah dari tempe dan tahu. Enzim yang berperan penting dalam Oncom memiliki kandungan protein yang kehidupan manusia adalah Enzim protease. tinggi, selain itu oncom juga dapat diolah Enzim protease berperan sebagai penyokong menjadi pepes, sayur tumis campur leunca, kondisi tubuh agar tetap sehat luar dan sayur lodeh, keripik oncom, combro (oncom dalam. Enzim protease mampu mencerna dijero), dan berbagai macam makanan enak serpihan-serpihan yang tidak diinginkan lainnya. dalam darah termasuk bakteri dan virus (Yunita, 2014). PCR atau polimerisasi berantai adalah teknik amplifikasi (perbanyakan) DNA Indonesia dikenal sebagai negara yang spesifik dengan melakukan proses telah memanfaatkan enzim protease dalam pemanjangan nukleotida dari primer yang bidang industri pengolahan pangan seperti merupakan pasangan komplementer dari utas susu, roti, dan secaraa tradisional digunakan DNA secara simultan. Proses pemanjangan sebagai pelunak daging. Pentingnya enzim nukleotida dilakukan oleh DNA polimerase protease dan tingginya harga jual enzim berdasarkan cetakan DNA (Bardacki, 1994). protease mendorong para ilmuwan untuk mencari sumber – sumber enzim protease Pada peneliti sebelumnya telah yang baru yang dapat menghasilkan lebih dilakukan pada oncom segar. Namun pada banyak protease dan memiliki aktivitas tinggi oncom pasca fermentasi belum. Berdasarkan (Melliawati, 2015). hal tersebut, perlu dilakukan penelitian Isolasi bakteri penghasil protease isolasi bakteri penghasil enzim protease pada dalam media Nutrient Agar yang tidak oncom merah pasca fermentasi 120 jam dan mengandung sumber karbohidrat tetapi identifikasi molekuler bakteri berbasis gen memiliki kandungan sumber nitrogen yang 16S rRNA. cukup baik untuk pertumbuhan bakteri. Namun, kapang dan khamir tidak dapat Bahan dan metode tumbuh dengan baik. Kemudian dilanjutkan Jenis penelitian ini dilakukan dalam media Skim Milk Agar dengan dengan menggunakan analisis deskriptif kandungan kasein sebagai protein susu akan untuk mendapatkan data yang diperlukan. dipecah oleh mikroorganisme proteolitik Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium menjadi senyawa nitrogen terlarut sehingga Kelautan dan Oseanografi Universitas pada koloni dikelilingi area bening (Fatoni Diponegoro Semarang, Jawa Tengah.Waktu dkk., 2008). penelitian di laksanakan pada bulan April – Mei. Tahun 2018. Objek penelitian ini Penelitian Chayadi (2010) menyatakan bakteri penghasil enzim protease pada oncom bahwa oncom sebagai makanan khas dari merah pasca fermentasi selama 120 jam. Alat Jawa Barat yang merupakan warisan nenek yang digunakan adalah cawan petri, moyang bangsa Indonesia, memiliki nilai gizi mikropipet, inkubator, autoklaf, microwave, yang baik dan harganya pun sangat tabung reaksi, erlenmeyer, rak tabung, gelas terjangkau, namun sosialisasi oncom di ukur, laminar, NanoDrop Spektrofotometer, Indonesia masih sangat minim. Oncom masih lampu spirtus, ose jarum, pinset, neraca kalah terkenal dibandingkan hasil olahan analitik, mikrotube, waterbath, vortex, termal kacang-kacangan yang lain, seperti tahu dan cyler, cetakan gel agarose, alat elektroforesis, tempe. Banyak masyarakat Indonesia yang power supply, ultraviolet transilluminator, belum mengetahui bahwa oncom merupakan tabung ependrof.. Bahan yang dibutuhkan makanan tradisional yang bergizi tinggi dalam penelitian ini adalah sampel oncom sehingga banyak yang mengabaikan makanan merah, NaCl fiologis, dH2O, kapas dan kasa, *Corresponding Author: Aulia Harun Program Studi DIV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan kesehatan Universitas Muhammadiyah Semarang. Semarang Indonesia 50273 Gmail: [email protected] http://repository.unimus.ac.id plastik dan plastik wrap, aluminium foil, Kode Koloni Karakteristik Koloni pada kertas label, media Skim Milk Agar, aquades, Pewarnaan Gram IROD 5.1 Basil Gram-positif Nuclease free water (NFW), Promega Kit, bergerombol Etanol absolut 70%, TE Buffer, DNA IROD 5.2 Basil Gram-positif berderet Template (isolat DNA genom /total), PCR IROD 5.3 Coccus Gram-negatif bergerombol Master Mix (Promega), Primer Forward 8F IROD 5.4 Coccus Gram-negatif 16S rRNA, Primer Reverse 1492R 16S bergerombol rRNA, gel agarose, Loading dye, Larutan IROD 5.5 Coccus Gram-negatif bergerombol Tris Borat EDTA, media Nutrient Agar, IROD 5.6 Coccus Gram-positif Ethidium Bromida. bergerombol

Hasil Setelah pengamatan morfologi koloni, Dari hasil penelitian didapatkan total pada penelitian ini dilakukan pewarnaan jumlah bakteri koloni yang diperoleh dari Gram terhadap sel-sel bakteri. Pengamatan proses isolasi dari sampel oncom merah pewarnaan Gram berdasarkan tabel 8 pasca fermentasi 120 jam adalah 6 koloni menunjukkan 3 isolat bakteri bersifat Gram- bakteri murni dengan morfologi koloni yang negatif dan 3 isolat yang bersifat Gram- berbeda. Karakteristik morfologi masing – masing isolat dapat dilihat pada tabel 1 positif, dengan bentuk sel basil dan kokus. sebagai berikut.: Berdasarkan hasil dari isolasi dan identifikasi bakteri, maka dipilih satu bakteri Tabel. 1. Morfologi Koloni Bakteri pada Oncom dengan bentuk sel yang unik untuk Merah pasca fermentasi 120 jam selanjutnya dilakukan uji enzimatik penghasil Kode Bentuk Warna Ukuran Konsistensi enzim protease. Bakteri yang dipilih adalah Koloni IROD Bergerigi Putih Besar Kering isolat dengan kode sampel E diberi label 5.1 IROD5. IROD Bergerigi Putih kecil Berlendir 5.2 IROD Bulat Putih Besar Berlendir Koloni bakteri yang telah diisolasi dan 5.3 diidentifikasi kemudian dilakukan uji IROD Bulat Putih Kecil kering 5.4 enzimatik untik mengetahui kemampuan IROD Bulat Putih Kecil Berlendir 5.5 bakteri dalam memecah protein. Hasil uji IROD Bulat Kuning Kecil Berlendir enzimatik koloni bakteri dapat dilihat pada 5.6 gambar 1 sebagai berikut:

Berdasarkan tabel tersebut dapat dilihat bahwa 6 koloni bakteri yang ditemukan pada isolasi oncom merah pasca fermentasi 120 jam memiliki morfologi dan karakteristik yang berbeda.

Koloni bakteri yang ditemukan pada isolasi bakteri pada sampel oncom merah (a) (b) Gambar 1. (a) Hasil uji enzimatik (b) pengukuran zona pasca fermentasi 120 jam diidentifikasi bening karakteristik dan jenisnya berdasarkan pewarnaan Gram. Hasil pewarnaan Gram Isolat IROD 5 menghasilkan protease koloni bakteri dapat dilihat pada tabel 2 dalam jumlah besar, berdasarkan diameter sebagai berikut : zona bening yang dihasilkan jumlah Tabel. 2. Karakteristik koloni bakteri pada pewarnaan diameter zona bening adalah 72 mm. Gram

*Corresponding Author: Aulia Harun Program Studi DIV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan kesehatan Universitas Muhammadiyah Semarang. Semarang Indonesia 50273 Gmail: [email protected] http://repository.unimus.ac.id Berdasarkan hasil uji enzimatik, isolat IROD gen 16S rRNA bakteri isolat IROD5 dapat 5 kemudian dilanjutkan ke tahap uji dilihat pada gambar 2 sebagai berikut: kuantifikasi nilai absorbansi. (a) (b)

Uji kuantifikasi ekstrak DNA genom yang diperoleh berdasarkan prinsip 1500 bp absorbansi DNA menggunakan NanoDrop spektrofotomete di perlukan untuk mengetahui berapa volume isolat hasil ekstraksi DNA templat dalam PCR Gambar 2. Hasil amplifikasi fragmen 16S rRNA isolat (Nuraida, 2016). IROD5 a. marker b.IROD 5 Tabel. 3. Hasil kuantifikasi nilai absorbansi isolat IROD5 Berdasarkan gambar hasil amplifikasi

fragmen 16S rRNA didapatkan pita gen 16S No Sampel Nucleic Acid A260 A280 260 rRNA pada 1500 bp yang kemudian ID Conc 280 dilanjutkan ke tahap sequensing. Hasil 1 IROD 5 45, 5 (ng/µl) 0,91 0,289 3,15 sekuensing amplifikasi gen 16S rRNA Pada penelitian ini, nilai rasio konsentrasi dengan primer B27F dan U1492R didapat DNA pada panjang gelombang 260/280 data nukleotida yang layak untuk dianalisis adalah 3,15. Nilai ini jauh berada diatas nilai (Widyadnyana dkk., 2015). standar yaitu antara rasio 1,8-2,0. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh sampel DNA Uji sekuensing dilakukan untuk yang tidak murni disebabkan oleh adanya menentukan urutan nukleotida pada fragmen sisa-sisa etanol atau adanya sisa kandungan DNA yang terdeteksi dari hasil visualisasi metabolit sekunder bakteri yang diekstrak. DNA yang teramplifikasi dalam proses PCR Namun pada hasil dengan rasio di atas 2,0, menggunakan mesin sekuensing DNA selama visualisasi ekstrak DNA masih otomatis (Fatimawali, 2013). menunjukkan pita yang tebal , maka isolat Jumlah salinan gen 16S rRNA di Bakteri DNA dapat digunakan sebagai templat PCR beragam (1-15) di setiap Genom. Setiap (Fatchiyah dkk., 2011). salinan memiliki ukuran sekitar 1500 Bp.

Marchandin dkk . (2003) dalam Darmawati Berdasarkan hasil perhitungan absorbansi dkk . (2014) mengatakan urutan gen 16S dan hasil visualisasi ekstrak DNA dapat rRNA di setiap salinan setiap organisme itu dikatakan genom bakteri dengan kemurnian identik. yang cukup dapat digunakan sebagai template untuk PCR gen 16S rRNA. Penentuan urutan DNA (sekuensing) dilakukan melalui jasa komersial 1 st Base Produk amplifikasi fragmen DNA 16S DNA Sequencing, Malaysia. Pemeriksaan rRNA pada PCR konvensional divisuali hasil sekuens dilakukan dengan sasikan dan kualitasnya divisualisasikan menggunakan MEGA 7.0, kemudian hasil menggunakan gel elektroforesis. Hasil gel dimasukkan ke program BLASTn (Basic elektroforesis produk amplifikasi fragmen Local Alignment Search Tool – for

*Corresponding Author: Aulia Harun Program Studi DIV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan kesehatan Universitas Muhammadiyah Semarang. Semarang Indonesia 50273 Gmail: [email protected] http://repository.unimus.ac.id nucleotide) melalui website NCBI (National Gram-negatif bergerombol yang Center for Biotechnology Information). memiliki aktivitas protease ditandai dengan terbentuknya zona bening Sekuen yang diperoleh dari 1st Base DNA berdiameter 72 mm di sekeliling koloni Sequencing ditampilkan pada lampiran 2. bakteri pada medium Skim Milk Agar. Urutan basa nitrogen yang diperoleh oleh 2. Proses identifikasi molekuler isolat sekuensing dengan program BLAST IROD5 menghasilkan sekuen gen 16S menunjukkan kemiripan 99% dengan rRNA dengan urutan nukelotida yang fragmen gen 16S rRNA isolat bakteri menunjukkan tingkat kesamaan 99% Staphylococcus hominis strainK23 (Kode dengan urutan nukelotida gen 16S rRNA akses Genbank: KU922442.1). Sehingga bakteri Staphylococcus hominis sehingga isolat diberi nama Staphylococcus hominis isolat IROD5 dinyatakan sebagai bakteri strain IROD5 (IROD5= Indonesian Red Staphylococcus hominis strain IROD5 Oncom Day-5). (Indonesian Red Oncom Day-5).

Bakteri S. hominis ditemukan pada oncom Penelitian ini sebagai langkah awal pasca fermentasi 120 jam. Hal ini mendapatkan bakteri penghasil protease dari kemungkinan disebabkan karena adanya bahan pangan pangan oncom merah. Untuk kontaminasi akibat pengolahan dengan penelitian lanjutan akan sangat baik jika tangan pada proses pembuatan oncom, dapat diidentifikasi gen penyandi enzim sehingga terjadi kontak kulit manusia dengan protease pada Staphylococcus hominis strain oncom. IROD5 agar dapat dilakukan rekayasa Hal ini sejalan dengan kenyataan bahwa genetika yang memungkinkan produksi enzim protease untuk skala industri atau saat ini pembuatan oncom masih banyak komersial. dilakukan secara tradisional dan manual di rumah-rumah sebagai bagian dari industri Ucapan terimakasih rumah tangga. Dengan kemampuan menghasilkan zona bening protease yang Atas selesainya tugas akhir ini saya telah ditunjukkan dan dengan memperhatikan salaku peneliti mengucapkan terimah kasih kepada Dr. Stalis Norma Ethica., M.Si, Pd sifat bahayanya, Staphylococcus hominis dan Dr. Ana Hidayati Mukaromah M.Si strain IROD5 berpotensi menjadi sumber yang telah memberikan bimbingan dan protease non pangan, yang diharapkan dapat bantuannya selama penelitian dan terima dieksplorasi dalam skala yang lebih besar. kasih juga saya sampaikan untuk Ayah handaku Harun dan ibundaku Sappeami Kesimpulan dan Saran yang selalu mendo’akan di setiap sujudnya dan atas semua dukungan materil yang Berdasarkan hasil penelitian ini dapat diberikan kepada saya dalam menyelesaikan disimpulkan: perkuliahan serta tak lupa pula teman-teman seperjuangan DIV Analis Kesehatan 1. Isolasi bakteri dari sampel oncom merah Muhammadiyah Semarang tahun 2017 pasca fermentasi 120 jam didapat enam kelas B yang selalu memberikan dukungan isolat bakteri, dari keenam isolat bakteri dan semangat dalam menyelesaikan tugas terdapat satu isolat bakteri yaitu isolat akhir ini.

IROD 5, dengan morfologi sel Coccus

*Corresponding Author: Aulia Harun Program Studi DIV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan kesehatan Universitas Muhammadiyah Semarang. Semarang Indonesia 50273 Gmail: [email protected] http://repository.unimus.ac.id Referensi Ethica, S.N., Oedjijono, O., Semiarti, E., Widada, J. and Raharjo, T.J., 2018. Chayadi, Adityo; Surya, Angga. Genotypic and Phenotypic Penangkapan mikroba mixed culture Characterization Of Alcaligenes dari alam sebagai inokulum dalam javaensis Jg3 Potential AS An pembuatan ragi oncom menggunakan Effective Biodegrader. Biotropia-The media kacang tanah, kedelai, dan Southeast Asian Journal of Tropical jagung. 2010. PhD Thesis. Teknik Biology, 25(1), pp.1-10. Kimia UNDIP. Fatchiyah dkk., 2011., Biologi Molekuler- Darmawati,S., Sembiring,L., Asmara,S., Prinsip Dasar Analisis. 8th ed.,Erlangga. Artama.W.T., Kawaichi.M. 2014. Jakarta. Phylogenetic relationship of Gram Negative Bacteria of Fatimawali. 2013. Identifikasi Mikrobiologi Enterobacteriaceae Family in the dan Analisis Gen 16S rRNA Bakteri Positive Widal Blood Cultures based on Resisten Merkuri Isolat S3.2.2 yang 16S rRNA Gene Sequences. Indonesian Diperoleh dari Limbah Tambang Journal of Biotechnology. Vol. 19, No. Rakyat. 1, pp.64-70. Jurnal Ilmiah Farmasi – UNSRAT. Vol 2. No 04. Ethica, S. N. (2014). Detection Of Genes Involved In Glycerol Metabolism Of Fatoni, A.Z & Puji.L., 2008. Isolasi dan Alcaligenes sp . JG3. Karakterisasi Protease Ekstraseluler dari Bakteri dalam Limbah Tahu. Jurnal Ethica, S.N., Nataningtyas, D.R., Lestari, P., Natur Indonesia, 10.2.83-88. Istini, I., Semiarti, E., Widada, J. and Raharjo, T.J., 2013. Comprative Melliawati R. 2015. Selekksi Bakteri Asam Evalution of Conventional Versus Laktat sebagai Penghasil Enzim Rapid Methods for Amplifiable Protease. Pros Sem Nas Masy Biodiy Genomic DNA Isolation of Cultured Indon, 1.2. 184 – 188. Azospirillum sp. JG3. Indonesian Journal of Chemistry, 13(3), pp.28- Nuraida, F. 2016. EKSTRAKSI DNA 253. Salmonella TIFOID. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Ethica, S.N., Hammi, M.K., Lestari, P., Alam Universitas Lampung Bandar Semiarti, E., Widada, J. and Raharjo, Lampung. T.J., 2013. Amplification of Azospirillum sp. JG3 glpD gene Widyadnyana,D.G.A., I Dewa, M.S. & I fragment using degenerate primers Wayan,S. 2015. Identifikasi Bakteri generated by web-based tools. The Asam Laktat Isolat 9A dari Kolon Sapi Journal of Microbiology, Bali sebagai Probiotik melalui Analisis Biotechnology and Food Gen 16S rRNA. Jurnal Sain Veteriner. Sciences, 3(3), p.231. 33. 2.

Ethica, S.N. and Raharjo, T.J., Yunita dkk., Uji Aktivitas Enzim Protease 2014. Detection of genes involved in Dari Isolat Bacillus sp. Galur Lokal glycerol metabolism of Alcaligenes sp. Riau. Jurnal Online Mahasiswa (JOM) JG3 (Doctoral dissertation, Universitas Bidang Matematika dan Ilmu Gadjah Mada). Pengetahuan Alam, 2014, 2.1: 116- 122.