HURMADAN İZOLE EDİLEN MAYALARIN BAZI PROBİYOTİK ÖZELLİKLERİNİN ARAŞTIRILMASI

Jaafar Nozad Aakef AAKEF

YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

NİSAN 2018

Jaafar Nozad Aakef AAKEF tarafından hazırlanan “HURMADAN İZOLE EDİLEN MAYALARIN BAZI PROBİYOTİK ÖZELLİKLERİNİN ARAŞTIRILMASI” adlı tez çalışması aşağıdaki jüri tarafından OY BİRLİĞİ ile Gazi Üniversitesi Biyoloji Anabilim Dalında YÜKSEK LİSANS TEZİ olarak kabul edilmiştir.

Danışman: Prof. Dr. Yavuz BEYATLI

Biyoloji Anabilim Dalı, Gazi Üniversitesi Bu tezin, kapsam ve kalite olarak Yüksek Lisans Tezi olduğunu onaylıyorum. ...…………………

Başkan: Prof. Dr. Gönül DÖNMEZ

Biyoloji Anabilim Dalı, Ankara Üniversitesi Bu tezin, kapsam ve kalite olarak Yüksek Lisans Tezi olduğunu onaylıyorum. …………………...

Üye: Prof. Dr. Zehra YÜKSEKDAĞ

Biyoloji Anabilim Dalı, Gazi Üniversitesi Bu tezin, kapsam ve kalite olarak Yüksek Lisans Tezi olduğunu onaylıyorum. …………………...

Tez Savunma Tarihi: 27/04/2048

Jüri tarafından kabul edilen bu tezin Yüksek Lisans Tezi olması için gerekli şartları yerine getirdiğini onaylıyorum.

…………………….……. Prof. Dr. Sena YAŞYERLİ Fen Bilimleri Enstitüsü Müdürü

ETİK BEYAN

Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Tez Yazım Kurallarına uygun olarak hazırladığım bu tez çalışmasında;  Tez içinde sunduğum verileri, bilgileri ve dokümanları akademik ve etik kurallar çerçevesinde elde ettiğimi,  Tüm bilgi, belge, değerlendirme ve sonuçları bilimsel etik ve ahlak kurallarına uygun olarak sunduğumu,  Tez çalışmasında yararlandığım eserlerin tümüne uygun atıfta bulunarak kaynak gösterdiğimi,  Kullanılan verilerde herhangi bir değişiklik yapmadığımı,  Bu tezde sunduğum çalışmanın özgün olduğunu, bildirir, aksi bir durumda aleyhime doğabilecek tüm hak kayıplarını kabullendiğimi beyan ederim.

Jaafar Nozad Aakef AAKEF 27/04/2018

iv

HURMADAN İZOLE EDİLEN MAYALARIN BAZI PROBİYOTİK ÖZELLİKLERİNİN ARAŞTIRILMASI (Yüksek Lisans Tezi)

Jaafar Nozad AakefA AKEF

GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ Nisan 2018

ÖZET

Araştırmada, Libya, Irak ve Türkiye’den satışa sunulan toplam 16 adet hurma çeşidi kullanılmıştır. Bütün hurma örneklerinde mayalara rastlanmış ve sayıları 26,50 - 89,17 log kob/g arasında bulunmuştur. Hurma örneklerinden toplam 16 adet maya suşu izole edilmiştir. Bu suşların koloni ve morfolojik incelemeleri yapıldıktan sonra, moleküler tanımlamaları 18S rRNA dizi analizi ile gerçekleştirilmiştir. Analizler, RefGen Gen Araştırma ve Biyoteknoloji Şirketinde yaptırılmıştır. Tanımlama sonuçlarına göre, bu suşların 14 adedinin Pichia kudriavzeviive 2 adedinin Kluyveromyces marxianusolduğu belirlenmiştir. Tanımlanan türlerin birincil probiyotik seleksiyonlarında yer alan mide asit dirençliliği (pH 2) ve (%0,3) ince bağırsak safra toleranslılıkları belirlenmiştir. Maya suşlarının pH 2 ve %0,3 de inhibisiyonları sırası ile; (%33,41- 96,78) ve (%37,16 -%97,02)) arasında bulunmuştur. Tüm suşların ekzopolisakarit (EPS) üretimleri (108,53 - 45,2 g/L) arasında bulunmuştur. Bu suşların diğer probiyotik özelliklerden olan: agregasyon (otoagregasyon ve koagregasyon), hidrofibosite, antimikrobiyal aktivite ve antibiyotik duyarlılıkları tespit edilmiştir. Tüm suşların otoagregasyon değerleri (%12,47 - 70,96) arasında bulunmuştur. Bu suşların koagregasyon yetenekleri, probiyotik Lactobacillus acidophilus ATCC 4356ve patojen Escherichia coli ATCC 25922 ve Candida albicans ATCC 90028 test mikroorganizmaları ile tespit edilmiş ve sırası ile; (%23,42 - 48,09), (%17,31-%53,38) ve (%16,43- 54,06) arasında bulunmuştur. Suşların hidrofobisite özellikleri, nötral çözücü olan p-kesilen, asidik çözücü olan kloroform ve bazik çözücü olan etil asetatlı ortamlarında incelenmiştir. Tüm suşların bu ortamlarda yüzde hirofobisite değerleri, sırası ile; (%55,78-86,74), (%81,42-84,24) ve (%52,50- 72,23) arasında bulunmuştur. Bu suşların antimikrobiyal etkileri, L. acidophilus ATCC 4356, C. albicans ATCC 10239 ve Pseudomonas auroginosa ATCC, test mikroorganizmaları üzerinde araştırılmıştır. Suşların hiç birinin C. albicans üzerinde antimikrobiyal aktivitesinin olmadığı gözlenirken, L. acidophilus ve P. auroginosa bakterileri üzerinde inhibisyonlarının sırası ile; 8,01- 19,23 mm ve 11,01-24,17 mm zon çapında inhibisiyonları olduğu tespit edilmiştir. Suşların çoğunun test edilen Amoxicillin, Ampicilin, Gentamisin, Tetrasiklin,Trimethoprim antibiyotiklere karşı dirençli oldukları belirlenirken, bazı suşların bazı antibiyotiklere karşı duyarlı oldukları gözlemlenmiştir.Araştırmada, P. kudriavzeii ve K.marxianus suşlarının probiyotik özelliklere sahip oldukları, özelliklerinin cins, tür ve suşlar arasında farklılık gösterdiği gözlemlenmiştir. Bu suşlaradn, P. Kudriavzeii JD1 ve JD2 suşlarının diğer suşlara kıyasla daha üsütün probiyotik özelliklere sahip oldukları belirlenmiştir.

Bilim Kodu : 20309 Anahtar Kelimeler : Hurma, Maya, Probiyotik özellikler Sayfa Adedi : 101 Danışman : Prof. Dr. Yavuz BEYATLI v

INVESTIGATION OF SOME PROBIOTIC PROPERTIES OF YEASTS ISOLATED FROM DATES (M. Sc. Thesis)

Jaafar Nozad Aakef AAKEF

GAZİ UNIVERSITY GRADUATE SCHOOL OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES April 2018

ABSTRACT

In the present study, a total (16) different date samples obtained from Libya, Iraq and Turkey were used. All date samples were presentes yeasts ranging between (26-50 × 89,17 log kob/g). A total, (16) yeast strains were isolated and identified by molecular 18S rRNA sequence analysis. The analyzes were carried out at the RefGen Gen Research and Biotechnology Company. Molecular identification results showed that (14) strains were Pichia kudriavzeii and (2) strains were Kluyveromyces marxianus. The primary probiotic selections of the strains were tested according to the gastric acid (pH 2) and intestinal (%0,3) bile salts tolerances. The inhibition rates of the strains in pH 2 and %0,3 bile saltes ranged between (%33,41-96,78) and (%37,16 -%97,02) respectively. All the strains were produced Exopolysaccharide (EPS) ranging between (108.53 - 452.2 g/L). The other secondary probiotic properties of the strains were tested according to activities related with (aggregation (otoagregation, coagregation), hydrophobicity, antimicrobial activity and antibiotic susceptibilities). The otoaggregation of the strains were ranged between (%12.47 - 70.96). The coaggregation of the strains with probiotic L. acidophilus ATCC 4356, pathogenic E. coli 25922 and C. albicans 90028 were tested and estimated with ranging between (%23,42 - 48,09), (%17,31- %53,38) and (%16,43-54,06) respectively. The hydrophobic activities of the strains were determined in neutral solvent p-ksilen, acidic solvent chloroform and basic solvent ethyl acetate. The hidrophobosity of the strains were estimated and ranged between (%55.78-86.74), (%81.42- 84.24) and (%52.50-72.23) respectively. The antimicrobial activites of the strains on L. acidophilus ATCC 4356, C. albicans ATCC 10239 vand P. auroginosa ATCC were tested. The antimicrobial activites of the strains on L. acidophilus and P. auroginosa were ranged between (8,01-19,23 mm) and (11,01-24,17 mm) inhibition zones. None of the of the strains had showed any antimicrobial activities on C. albicans. Sensitivities of the strains to antibiotics (Amoxicillin, Ampisillin, Gentamycin, Tetracyclin, Trimethoprim) were determined. Generally, all strains were found to be resistant to all antibiotics while few of them were susceptible to some of antibiotics. In this study, all P. kudriavzeii and K.marxianus strains has showed probiotic properties and the characteristics were different between genus, species and strains. P. kudriavzeii JD1 and JD2 strains were found to have highest probiotic properties than the other strains.

Science Code : 20309 KeyWords : Dates, Yeast, Probiotic Properties Page Number : 101 Supervisor : Prof. Dr. Yavuz BEYATLI vi

TEŞEKKÜR

Bu çalışmanın gerçekleştirilmesinde, değerli bilgilerini benimle paylaşan, güler yüzünü ve samimiyetini benden esirgemeyen, her sorun yaşadığımda yanına çekinmeden gidebildiğim ve kullandığı her kelimenin hayatıma kattığı önemini asla unutmayacağım saygıdeğer danışman hocam Sayın Prof. Dr. Yavuz BEYATLI’ya teşekkürü bir borç biliyor ve şükranlarımı sunuyorum. Bu günlere gelmemde büyük öneme sahip olan, desteklerini benden hiçbir zaman esirgemeyen babam ve annem ve kardeşlerime teşekkür ederim, her zaman bana yardımcı olan arkadaşlarım Ümmügülsüm TÜKENMEZ, Kübra ÇELIK, Maihebubai ABUDUREYIMU, Selin UYSAL teşekkür ederim.

vii

İÇİNDEKİLER

Sayfa

ÖZET ...... iv

ABSTRACT ...... v

TEŞEKKÜR ...... vi

İÇİNDEKİLER ...... vii

ÇİZELGELERİN LİSTESİ ...... x

ŞEKİLLERİN LİSTESİ ...... xii

RESİMLERİN LİSTESİ ...... xiii

SİMGELER VE KISALTMALAR...... xiv

1. GİRİŞ ...... 1

2. KAYNAK ARAŞTIRILMASI ...... 3

2.1. Hurma ...... 3

2.2. Hurma Mikrobiyolojisi ve Funguslar ...... 4

2.3. Hurmanın Antimikrobiyal Aktivitesi ...... 7

2.4. Mayalar ...... 8

2.4.1. Mayaların sınıflandırılması ve taksonomisi ...... 8

2.4.2. Mayaların ekolojis ...... 9

2.4.3. Mayaların hücre yapısı ve sitolojisi ...... 11

2.4.4. Mayaların beslenme, metabolizma ve üremeleri ...... 13

2.4.5. Mayaların şeker metabolizması ...... 15

2.4.6. Mayaların biyoteknolojide kullanımı ...... 16

2.5. Probiyotikler ...... 19

2.5.1. Probiyotik mikroorganizmalarda bulunması gereken özellikler ...... 19

2.5.2. Probiyotiklerin etki mekanizmaları ...... 20

2.6. Ökaryot Probiyotikler ...... 20 viii

Sayfa

2.6.1. Ökaryot probiyotiklerin özellikleri ...... 20

2.6.2. Ökaryot probiyotiklerin kaynak ve üstünlükleri ...... 23

2.6.3. Ökaryot probiyotiklerin taksonomik karakterizasyonu ...... 25

2.6.4. Ökaryotların probiyotik potansiyelleri ...... 25

2.6.5. Ökaryot probiyotiklerin faydaları ...... 26

2.6.6. Ökaryotik probiyotiklerin güvenirliği ve genetik manipülasyonları ...... 29

2.7. Probiotik Mayaların Metabolik Ativiteleri ...... 30

2.7.1. Mayaların ekzopolisakkarit (EPS) üretimleri ...... 30

2.7.2. Mayaların antimikrobiyal aktiviteleri ...... 32

2.7.3. Mayaların antibiyotik duyarlılıkları ...... 36

2.7.4. Mayaların gastrointesitinal sistem (pH ve Safra tuzu) stresine karşı toleranslılıkları ...... 37

2.7.5. Mayaların agregasyon (koagregasyon ve otoagregasyon) ve hücre yüzeyinin hidrofobik özellikleri ...... 40

2.7.6. Mayaların antikolesterol aktivitesi ...... 42

2.7.7. Mayaların antioksidant ve antikanser aktiviteleri ...... 44

3. GEREÇ VE YÖNTEM ...... 49

3.1. İzolasyon ...... 49

3.1.1. İzolasyonda kullanılan hurma çeşitleri ...... 49

3.1.2. Hurmalardan mayaların izolasyonları ve sayımı ...... 49

3.1.3. Mayaların muhafazası ...... 51

3.1.4. İzole edilen mayaların 18S rRNA ile tanımlanması ...... 51

3.2. Mayaların EPS Üretimlerinin Belirlenmesi ...... 51

3.3. Mayaların Asit Dirençliliklerinin Belirlenmesi ...... 52

3.4. Mayaların Safra Dirençliliklerinin Belirlenmesi ...... 52

3.5. Mayaların %Otoagregasyon Özelliklerinin Belirlenmesi ...... 53

3.6. Mayaların %Koagregasyon Özelliklerinin Belirlenmesi ...... 53 ix

Sayfa

3.7. Mayaların Hidrofobisite Özelliklerinin Belirlenmesi ...... 54

3.8. Mayaların Antimikrobiyal Aktivitelerinin Belirlenmesi ...... 54

3.9. Mayaların Antibiyotik Duyarlılıkların Belirlenmesi ...... 55

4. DENEYSEL BULGULAR ...... 57

4.1. Hurmalarden Mayaların İzolasyonları ...... 57

4.2. Hurmalarda Mayaların Sayımı ...... 58

4.3. İzole Edilen Maya Suşlarının Tanımlanması ...... 59

4.4. Maya Suşlarının EPS Üretimi ...... 59

4.5. Maya Suşlarının % Otoagregasyon Değerleri ...... 61

4.6. Maya Suşlarının %Koagregasyon Değerleri ...... 62

4.7. Mayaların Hücre Yüzeyinin Hidrofobik Yapısının Belirlenmesi ...... 65

4.8. Mayaların Asit Dirençliliklerinin Belirlenmesi ...... 67

4.9. Maya Suşlarının Safra Dirençliliklerinin Belirlenmesi ...... 68

4.10. Maya Suşlarının Antimikrobiyal Aktivitelerinin Belirlenmesi ...... 69

4.11. Maya İzolatlarının Antibiyotik Duyarlılıklarının Belirlenmesi ...... 71

5. SONUÇ VE TARTIŞMA ...... 77

KAYNAKLAR ...... 89

ÖZGEÇMİŞ ...... 101

x

ÇİZELGELERİN LİSTESİ

Çizelge Sayfa

Çizelge 2.1. Mayaların taksonomik kategorileri...... 8

Çizelge 2.2. Doğal maya habitatları ...... 9

Çizelge 2.3. Maya hücrelerinde bulunan çeşitli yapısal bileşenlerinin fonksiyonları ... 12

Çizelge 2.4. Mayaların oksijen gereksinimlerine göre sınıflandırmaları ...... 14

Çizelge 2.5. Biyoteknolojide kullanılmakta veyapotansiyel kullanımda olan mayatürleri ...... 18

Çizelge 2.6. Ökaryot probiyotik özelliği gösteren bazı mayalar ...... 21

Çizelge 2.7. Prokaryotik ve ökaryotik probiyotiklerin karşılaştırılması ...... 23

Çizelge 3.1. YGC Agar besi ortamının içeriği ...... 50

Çizelge 3.2. YPD Broth besi ortamının içeriği ...... 50

Çizelge 3.3. Araştırmada kullanılan antibiyotikler ...... 56

Çizelge 4.1. Hurmalarda mayaların sayımları (kob/g) ...... 58

Çizelge 4.2. Hurmalarda izole edilen maya suşlarının moleküler molekü 18S rRNA dizi analizleri ...... 59

Çizelge 4.3. Hurmalardan izole edilen maya suşlarının EPS üretimleri (g/L) ...... 60

Çizelge 4.4. Maya suşlarının % otoagregasyon değerleri ...... 61

Çizelge 4.5. Maya suşlarının L. acidophilus ATCC 4356 ile %koagregasyondeğerleri ...... 62

Çizelge 4.6. Maya suşlarının E. coli ATCC 25922 ile % koagregasyon değerleri ...... 63

Çizelge 4.7. Maya suşlarının C. albicans ATCC 90028 suşu ile % koagregasyondeğerleri ...... 64

Çizelge 4.8. Maya suşlarının % hidrofobisiteleri ...... 66

Çizelge 4.9. Maya suşlarının pH 2’ de % inhibisiyonları ...... 67

Çizelge 4.10. Maya suşlarının %0,30 safra konsantrasyonunda % inhibisyondeğerleri ...... 68

Çizelge 4.11. Maya suşlarının test mikroorganizmalar üzerinde antimikrobiyal aktiviteleri ...... 70 xi

Çizelge Sayfa

Çizelge 4.12. Maya suşlarının antibiyotiklere karşı gösterdiği duyarlılık test sonuçları...... 72

Çizelge 4.13.CLSI kriterlerine göre antibiyotik duyarlılıklarının değerlendirilmesi ..... 72

Çizelge 4.14. Maya suşlarının karşılaştırmalı olarak primer probiyotik özellikleri ...... 74

Çizelge 4.15. Maya suşlarının karşılaştırmalı olarak sekönder probiyotik özellikleri ... 75 xii

ŞEKİLLERİN LİSTESİ

Şekil Sayfa

Şekil 2.1. Hurma çeşitleri...... 3

Şekil 2.2. Hurma meyveleri ...... 4

Şekil 2.3. Maya hücresinin elektron mikrografısi ...... 11

Şekil 2.4. Mayalarda fermentasyon ve solunum yolları ...... 15

Şekil 2.5. Saccharomyces cerevisiae ...... 21

Şekil 2.6. Kluyeveromyces marxian ...... 22

Şekil 2.7. Picihaikudriavzeii ...... 22

Şekil 3.1. Araştırmada kullanılan hurma örnekleri ...... 49

Şekil 4.1. Hurmalarda mayaların sayımları (log kob/g) ...... 58

Şekil 4.2. Hurmalardan izole edilen maya suşlarının EPS üretimleri (g/L)...... 60

Şekil 4.3. EPS standart eğrisi ...... 61

Şekil 4.4. Maya suşlarının %otoagregasyon değerleri ...... 62

Şekil 4.5. Maya suşlarının L. acidophilus ATCC 4356 ile %koagregasyon değerleri ...... 63

Şekil 4.6. Maya suşlarının E. coli ATCC 25922 ile % koagregasyon değerleri ...... 64

Şekil 4.7. Mayaların C.albicans ATCC 90028 suşu ile % koagregasyon değerleri ...... 65

Şekil 4.8. Maya suşlarının % hidrofobisiteleri...... 66

Şekil 4.9. Maya suşlarının pH2 derecelerinde % inhibisiyonları...... 68

Şekil 4.10. Maya suşlarının %0,30 safra konsantrasyonunda % inhibisyon değerleri ... 69

xiii

RESİMLERİN LİSTESİ

Resim Sayfa

Resim 4.1. YGC Agar besi ortamında üreyen maya kolonileri ve mayaların mikroskobik büyütmesi görüntüsü ...... 57

Resim 4.2. Mayaların mikroskobik görüntüsü (100X) ...... 57

Resim 4.3. P. kudriavzevii JBA, JBI ve JMA suşlarının L. acidophilus ATCC 4356 üzerinde antimikrobiyal aktiviteleri ...... 70

Resim 4.4. P. kudriavzeviiJBA, JH ve JST suşlarının P .aeuroginosa ATCC 278853 üzerinde antimikrobiyal aktiviteleri ...... 71

Resim 4.5. K. Marxianus JZ suşu içeren agarlı besiortamı ,0: Kontrol (Boş disk), 2: Trimethoprim ...... 73

xiv

SİMGELER VE KISALTMALAR

Bu çalışmada kullanılmış simgeler ve kısaltmalar, açıklamaları ile birlikte aşağıda sunulmuştur.

Simgeler Açıklamalar

% Yüzde API Analitik Profil İndeks ATP Adenozin tri fosfat Cm Santimetre Dk Dakika EPS Ekzopolisakkarit G Gram g/L Gram/Litre

H2O2 Hidrojen peroksit HCl Hidrojen klorür M Molar mg/L Miligram/litre Ml Mililitre Mm Milimolar NaCl Sodyum klorür NaOH Sodyum hidroksit oC Santigrat derece OD Optikal Dansite PBS Fosfat Tampon Çözeltisi pH Asitlik bazlık birimi Rpm Dakikada devir sayısı Spp Species (Türleri) Subsp Subspecies (Alt tür) U Unit (Birim) μg/ml Mikrogram/Mililitre Μl Mikrolitre Μm Mikrometre xv

Kısaltmalar Açıklamalar

Bkz. Bakınız 1

1. GİRİŞ

Probiyotikler, canlıda sağlık üzerinde önemli yararlı etkiye sahip olan mikrobiyal hücre prepartlarıdır. Prokaryotik probiyotikler üzerinde yoğun bilimsel çalışmalar gerçekleştirilirken, ökaryotik probiyotikler üzerinde çalışmalar son yıllarda önemli ölçüde artmıştır. Ökaryot probiyotiklerin konakçıya birçok yararlı terapötik etkilerinin olduğu bilimsel araştırmalarla desteklenmiştir. Ökaryot probiyotiklerin kullanım ve uygulamalarıyla ilgili daha fazla bilimsel araştırmaya gerek duyulmaktadır. İnsan, hayvan, gıda ve diğer canlılarda ökaryotik biotanın çeşitliliği ve işlevi hakkında bilgiler sınırlıdır. Doğada Saccharomyces türleri dışında diğer probiyotik mayaların çeşitliliği hakkında yoğun araştırmalara gerek duyulmaktadır (Sukanta, 2011). Ökaryot probiyotikler diğer probiyotik bakterilere kıyasla bazı avantaj ve üsütlüklere sahiptir. Bu özellikler insan intestinal sistem koşullarına (düşük pH ve safraya) karşı daha toleranslı olmaları, genetik maddelerin (antibiyotik rezistan genlerin) diğer mikroorganizmalara transferleri, insan ve hayvan sağlığında kullanılan farklı antibiyotiklere karşı dirençli olmaları ile ortamda bulunan diğer mikroorganizmalar, özellikle probiyotik bakteriler üzerinde sinerjestik aktivitelerinin olmasıdır (Kourelis ve diğerleri, 2010 b).

Hurma (Phoenix dactylifera L.), Kuzey Afrika, Orta Doğu ve Güney Asya ülkelerinin kurak ve yarı kurak bölgelerinde yetişen önemli bir meyve türü olup, yaşayan nüfusun diyetinde önemli bir kaynağını teşkil eder. Kimyasal yapısında; karbonhidrat, yağ, protein, lif, mineraller, vitaminler antosiyaninler, karotenoidler, fenolikler, steroller, prosiyanidinler ve flavonoidler gibi birçok biyoaktif bileşiklerin içerdiğini ve insan sağlığı üzerinde olumlu etkilerinin olduğu gösterilmiştir (Al-Farsi ve diğerleri, 2005).

Birleşmiş Milletler Gıda ve Tarım Örgütü’ne (FAO) göre, 2012 yılında küresel hurma üretiminin 8 milyon ton olduğu bildirilmiştir. Mısır, Suudi Arabistan ve İran hurma satan ilk üç ülke arasındadır (Faostat, 2012).

Hurma, besin, vitamin ve mineral maddeler içeriği ile mikrorganizmaların üremelerini teşvik etmektedir. Hurmada kontaminant maya, küf, patojen/patojen olmayan mezofil bakteri ve laktik asit bakterilerine (LAB) rastlanılabilir. Hurmada bulunan mikroorganizmaların tip ve sayıları hurmanın olgunlaşma durumuna da bağlıdır. Olgunlaşmakta olan hurmalarda mikrobiyal popülasyon, olgunlaşmış hurmalara kıyasala

2 daha yüksektir. Hurmada karbohidrat miktarı ((% 44-88) yüksektir ve su aktivite değeri düşüktür (aw=<0.90) . Bu iki faktör hurmada mikrobiyal üremeyi olmsuz yönde etkiler (Siddig, 2012).

Bu çalışmada, Libya, Irak ve Türkiye’de satışa sunulan hurma çeşitlerinde bulunan maya sayılarının belirlenmesi ile bu örneklerden izole edilen probiyotik mayaların bazı özelliklerinin araştırılması hedeflenmiştir. Bu özelliklerden; EPS üretimi, intestinal sistem koşullarına (düşük pH, safraya) karşı toleranslılıkları, agregasyon (otoagregasyon, koagregasyon), hidrofobik özellikleri, antibiyotiklere karşı duyarlılıkları ve antimikrobiyal aktiviteleri incelenmiştir.

3

2. KAYNAK ARAŞTIRILMASI

2.1. Hurma

Hurma, Phoenix dactylifera L. (Arecaceae veya Palmae) önemli bir tür olup, çoğunlukla Dünyanın kurak bölgelerinde yetiştirilmektedir. Dünyada, 100 milyon hurma ağacı bulunmakta olup, %60'nın Kuzey Afrika ve Ortadoğu'da var olduğu bildirilmiştir. Dünyada yaklaşık 3000 adet hurma çeşiti bulunmaktadır.Hurma türlerin rengi, yapısı, hacmi (Bkz. Şekil 2.1.) ve kimyasal yapıları birbirlerinden farklıdır (Al-Yahyai, 2010).

Şekil 2.1. Hurma çeşitleri (https://twitter.com/devlandimpuphu/status)

FAO’ya göre, 1962 yılında küresel hurma üretimi 1,8 milyon ton iken, 2012 yılında 8 milyon tona yükselmiştir. Bir hurma ağacı yılda 400-600 kg. meyve verir (Bkz. Şekil 2.2). Mısır, Suudi Arabistan ve İran hurma satan ilk üç ülke arasındadır (FAO STAT, 2012).

Yapılan çalışmalarda, hurmanın kimyasal yapısında beslenmede önemli olan birçok besin içeriği gözlenmiştir. Hurma, % 44-88 oranında enerji kaynağı olarak karbonhidrat içerir. Hurmada karbohidratlar; glukoz, fruktoz ve sakkaroz şekerlerinden oluşmaktadır.

4

Hurmada, yağlar (% 0,2-0,4), lif (% 6,4-11,5), proteinler (% 2,3-5,6), mineraller, vitaminler, antioksidanlarve antimutajenik bileşikler de bulunmaktadır (Elleuch ve diğerleri, 2008).

Şekil 2.2. Hurma meyveleri (http://www.bilgiustaniz.com)

Yapılan araştırmalarda, hurmanın antosiyaninler, karotenoidler, fenolik bileşikler, steroller, prosiyanidinler ve flavonoidler gibi birçok biyoaktif bileşiği içerdiği ve bu bileşiklerin insan sağlığı üzerinde olumlu etkilerinin olduğu bildirilmiştir. Hurmada total fenolik bileşikler 172 - 246 g/100 g arasındadır. Hurma farklı birçok vitamin içerir, örneğin askorbik asit (2,4–17,5 mg/100 g), tiamin (0,08–0,13 mg/100 g) ve riboflavin (0,13–17,5 mg/100 g) bunların arasında bulunur (Saada ve diğerleri, 2012).

2.2. Hurma Mikrobiyolojisi ve Funguslar

Hurma, besin, vitamin ve mineral maddeler içeriği ile mikrorganizmaların üremelerini stimüle eden uygun bir ortamdır. Hurmada kontaminant maya, küf, patojen/patojen olmayan mezofil bakteri ve laktik asit (LAB) bakterilerine sıklıkla rastlanılmaktadır. Hurmada bulunan mikroorganizmaların tipi ve sayıları hurmanın olgunlaşma durumuna ve kontaminasyonlarına bağlıdır. Olgunlaşma evresindeki hurmalarda mikrobial popülasyon, olgun hurmalara kıyasla daha yüksektir (Siddig, 2012).

Yapılan bir araştırmada, Cezayir'de üretilen 5 adet farklı hurma örneğinde küf ve mayaların sayıları belirlenmiştir. Hurma örneklerinden uygun dilisyonlar yapılıp, OGA (Oxytetracycline-glucose agar) besiortamında 25°C 'da 5 gün inkübe edilmiştir. İnkübasyon bitiminde örneklerde küf ve maya sayılarının 5,18 – 82,36 log cfu/g arasında değiştiği bildirilmiştir. Aynı araştırmada, hurma örneklerinde koliform, enterokok ve

5

Yersinia enterocolitica bakterilerinin varlığı ve sayıları tespit edilmiştir. Araştırmacılar, hurmaların temel bozulma nedenlerinin Zygosaccharomyces japonicus ve Saccharomyces mellis mayalarından kaynaklandığını bildirmişlerdir (Abekhtive ve diğerleri, 2013).

Hassanein ve Soliman (2010),Fas’ta yetişen 10 çeşit hurma örneğinin mikrobiyolojik analizlerini yapmışlardır. Araştırmacılar, örneklerde bulunan maya ve küflerin sayımını Malt Agar besi ortamında, 30°C 'de 7 gün inkübe edilerek tespit etmişlerdir. Örneklerde maya ve küflerin sayısı sırası ile; 0 - 15 cfu/g ve 1 - 5 cfu/g belirlemişlerdir. Aynı araştırmada hurmada bulunan total bakteri sayılarının 4 - 198 cfu/g, stafilokok 0 - 4 cfu/g, Bacillus 0 - 5 cfu/g, laktik asit bakteri (LAB) 0 - 3 cfu/g arasında olduğunu göstermişlerdir. Bütün hurma çeşitlerinde koliform ve E. coli bakterilerine rastlanmadığını açıklamışlardır. Çalışmada, hurma örneklerinde maya ve küf sayılarının diğer mikroorganizmalara kıyasla daha yüksek olduğu bildirilirken, hurmanın yüksek karbonhidrat içeriği (%61-83) ile düşük (aw=<0.90) su aktivitesinin mikroorganizmaların üremelerini durdurduğu açıklanmıştır. Benzer sonuçlar Moore ve diğerleri, 2001ve Shenasi ve diğerleri, 2002 taraflarından da gösterilmiştir.

Siddig, (2012),Suudi Arabistan’da üretilen 10 çeşit hurma örneğinde maya, küf, mezofilik bakteri ile laktik asit bakterilerin sayılarını araştırmıştır. 5 örnekte mayalara rastlanılmadığını, 1 örnekte 1,4x102cfu/g ve diğer 4 örneklerde mayaların sayısını19 - 38 cfu/g arasında olduğunu tespit etmiştir. Örneklerin 8’inde küflerin sayısının 1,5 – 9,0 x 102 cfu/g olduğu ve 2 örnekte küflerin sayının 52 cfu/g ve 87 cfu/golduğu bulunmuştur. Örneklerde mezofil aerob bakterilerin sayımı ise; 1 örnekte 4,2x 103 cfu/g, 3 örnekte (1,4 – 9,9 x103 cfu/g), 3 örnekte 1,1 - 6,4 x 104 cfu/gve diğer 3 örnekte1,3 - 6,0 x 105cfu/g arasında tespit edilmiştir. Örneklerin 8’inde laktik asit bakterilerine rastlanılmamış, diğer 2örnekte sayının 62 cfu/g ve 73 cfu/g olduğu gösterilmiştir. Aynı araştırmada, hurma örneklerini 4-7°C'da 6 ay muhafaza ederek, bu mikrorganizmaların sayılarını araştırmışlardır. Muhafaza edilen hurmadaki mikroorganizmaları sayılarının azaldığı gösterilmiştir. Araştırmacılar, örneklerden izole edilen maya izolatlarının tanımlamalarını gerçekleştirmiş ve izolatların; Zygosaccharomyces mellis, Candida lipolytica, Debaryomyces hansenii ve Torulaspora delbrueckii türleri olduğunu açıklamıştır.

Yapılan bir araştırmada satışa sunulan 3'er adet farklı sert ve yumuşak hurma örneklerinde mikrobiyolojik analizler yapılmıştır. Yumuşak ve sert hurma örneklerinde total bakteri

6 sayısının sırası ile; 4 x 105 – 19 x 105 cfu/g ve 10 x 105 – 20 x 105 cfu/g olduğu tespit edilmiştir. Bu örneklerden izole edilen bakterilerin; Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Escherichia coli, Salmonella, Strptococcus, Enterobacter olduğu gösterilmiştir. Sert ve yumuşak hurmalarda koliform bakterilerinin sayıları sırası ile; 3 - 9 cfu/g ve 11 -23 cfu/garasındadır. Bu bakterilerin sayıları 100 cfu/g'dan az olduğu içinkabul edilebilir sınırlar içerisinde olduğu bildirmiştir. Hurma örneklerinde küflerin sayısı sırası ile; 1,0 x 102 – 2,8 x 102cfu/g ve 4,8 x 103- 7,2 x 103 cfu/g arasında tespit edilirken, maya sayıları sırası ile; 1,6 x 102 – 8,2 x 103 cfu/g ve 5 x 104- 16 x104 cfu/garasında tespit edilmiştir. Araştırmalar, hurma örneklerinin kontaminasyonlarının işçilik, paketleme, aseptik ve uygun olmayan koşullarda satışa sunulması ile çevresel etkenlerden ileri geldiğini bildirmiştir (Raimi, 2013). Benzer sonuç, (Moore ve diğerleri, 2001) tarafından da gösterilmiştir. Bu araştırmacılar hurma örneklerinden insan sağlığı üzerinde potansiyel risk oluşturabilen patojen )Staphylococcus aurues, Staphylococcus, Streptococcus, Proteus mirabilis, Enterobacter, Escherichia coli, Salmonella, ve E. Coli( bakterileri izole etmişlerdir.

Hurma meyvelerinde fungus kontaminasyonlarına daha fazla rastlanılmaktadır. Birçok küf türü hurmaları kontamine edebilmektedir. Bilindiği gibi funguslar diğer mikroorganizma gruplarına kıyasla stres koşullarına karşı daha fazla dayanaklılık gösterirler. Yapılan araştırmalarda, bazı hurma meyvelerinin toksijenik küf türlerine rastlanıldığını bildirilmiştir. Aspergillus cinsine dahil olan ve aflatoksin üreten bazı küf türleri hurmalardan izole edilmiştir. Aflatoksin, kanserojenik ve toksik bir maddedir. Mayalar, yüksek karbonhidrat içeren gıda veya meyvelere kolayca adapte olabilen ve tolerans gösteren mikroorganizmalardır. Bu özelliklerinden dolayı bazı maya türleri biyoteknolojik olarak kullanılıp, etanol, tek hücre proteini (THP) ve diğer ürünlerin üretimi için değerlendirilmektedir (Shenasi ve diğerleri, 2002).

Gösterilen çalışmalarda kontaminant olarak hurma ve diğer meyvelerde bulunan mayaların meyvelerde karbohidratları fermente ederek etanol oluşturdukları ve arzulanmayan tadın oluşumuna neden oldukları gösterilmiştir. Araştırmacılar, farklı meyvelerden izole edilen farklı maya türlerinin biyoteknolojik olarak etanol üretiminde kulanımları üzerinde çalışmalar yapmaktadırlar. Bir araştırmada, koka meyvesinden izole edilen Pichia kudriavzevii, Pichia manshurica ve Saccharomycescerevisiae türlerinin yüksek miktarda

7 etanol ürettiği gösterilmiştir. Aynı çalışmada, meyveden izole edilen mayanında yüksek miktrarda etanol ürettiği bildirilmiştir (Papalexandratou ve diğerleri, 2011).

Mohamed ve diğerleri 2014), yaptıkları bir çalışmada, piyasaya sunulmuş farklı hurma örneklerinde bulunan maya türlerinin tespitini ve uygun izolatların biyoetanol ve tek hücre proteini (THP) üretiminde kullanımlarını araştırmışlardır. Hurma örneklerinden toplam 10 farklı izolat elde edilmiş ve moleküler tanımlamaları 23S rRNA analiziyle yapılmıştır. İzolatların, Hanseniaspora, Pichia, Yarrowia, Issatchenkia, Wickerhamomyces ve Zygosaccharomyces cinslerine dahil oldukları gösterilmiştir. Bu cinslere dahil olan türlerin dağılımı ise; 4ürününHanseniasporacinsine ait H. guilliermondii KKUY-0009, H. uvarum KKUY-0078, H. uvarum KKUY-0153 ve H. Opuntiae KKUY-0152 türleri olduğu gösterilmiştir. Pichia cinsine dahilP. kudriavzevii KKUY-0034 ve P. kudriavzevii KKUY- 0151 türleri belirlenmiştir. Diğer, 4 cinse dahil olan Yarrowia lipolytica KKUY-0054, Issatchenkia orientalis KKUY-0111, Wickerhamomyces anomalus KKUY-0051 ve Zygosaccharomyces rouxii KKUY-0157 türlerinin olduğu açıklanmıştır.

El-Juhany (2010), hurmaların ve hurma ağaçlarının böcek saldırısına uğradığınıve bu saldırılara karşı dirençsiz olduklarını bildirirken, böceklerin hurma ve ağaçlarının mikrobiyal kontaminasyonlarında önemli bir yer tuttuğunu açıklamıştır. Starmer ve Lachance, (2011) hurma meyvelerin yüksek miktarda karbonhidrat ve besin değerlerine sahip olduklarından ötürü sıklıkla maya kontaminasyonlara uğradığını bildirmişlerdir.

2.3. Hurmanın Antimikrobiyal Aktivitesi

Hurmada karbonhidrat miktarı yüksektir (% 44-88) ve su aktivite değeri düşüktür (aw=<0,90). Bu iki faktör hurmada mikrobiyal üremeyi olumsuz yönde etkiler. Ayrıca, hurmanın 4-7°C'de muhafaza edilmesi mikrobiyal üremeyi olumsuz yönde etkiler (Siddig, 2012).

Ishida ve diğerleri (2006), hurma meyvelerinin antimikrobiyal aktivite özelliğinde olan bazı maddeler içerdiğini ve bu maddelerden hurmalarda %2,5 oranında bulunan tanin maddesinin birçok fungus ve bakteri üzerinde antagonistik aktivite gösterdiğini açıklamışlardır. Ayrıca, birçok meyvede bulunan fitokimyasal bileşiklerden, örneğin fenolik bileşikler antimikrobiyal aktivite özelliğindedir. Fan ve diğerleri,(2008), polifenol

8

bileşiklerin mikroorganizmaların proteinlerini çöktürerek ve enzimlerin aktivitelerini inhibe ederek mikroorganizmalar üzerinde antimikrobiyal aktivite gösterdiğini açıklamışlardır.

Hurmanın içerdiği yüksek orandaki karbonhidrat (glukoz, fruktoz, sakkaroz) ile düşük su aktivitesi (aw=<0.90) antimikrobiyal aktivitede önemli bir rol üstlenmektedir.

Bir araştırmada, 3 farklı hurma örneği ekstraktı (eter, etanol, su) G- Escherichia coli ATCC 25922, G- Pseudomonas aeruginosa ATCC27853, G- Salmonella enterica ATCC 13076, G+ Listeria monocytogenes ATCC 7644, G+ Staphylococcus saprophyticus ATCC 15305, G+ Staphylococcus aureus ATCC 25923 ve G+ Staphylococcus aureus ATCC 29213 patojen test bakterileri üzerinde araştırılmıştır. Araştırmadan elde edilen sonuçlara göre; farklı tüm ekstraktların 4 G+ bakteri üzerindeki antimikrobiyal aktivitesi, 3 G- bakterilerle kıyaslandığında daha yüksek olduğu gösterilmiştir (Saleh ve Otabi, 2014).. G- bakterilerin antmikrobiyal dirençliliklerinin hücre membranındaki lipopolisakkaritlerden kaynaklandığı bildirilmiştir (Naz ve diğerleri, 2007).

2.4. Mayalar

2.4.1. Mayaların sınıflandırılması ve taksonomisi

Mayalar ökaryotik tek hücreli mikrofunguslardır. Mayalar; endüstri, çevre ve tıpta önemli role sahiptirler. Maya türlerinin sınfılandırılmasında birçok kiriterden yararlanılır. Bu kriteler hücre morfolojisi, fizyoloji ve moleküler biyoloji özellikleridir. Mayaların https://athenssciencecafe.wo taksonomik kategorileri, örneğin, ekmek mayası Saccharomyces cerevisiae’nın rdpress.com taksonomik kategorisi Çizelge 1.’de gösterilmiştir (Boekhout ve diğerleri, 2002).

Çizelge 2.1. Mayaların taksonomik kategorileri.

Taksonomik Kategori Örneğin (Saccharomyces cerevisiae) krallık (Alem) Mantarlar Bölüm Ascomycota Alt Bölüm Ascomycotina Sınıf Hemiascomycetes Order Endomycetales Aile Saccharomycetacae Alt Familya Saccharomyetoideae Cins Saccharomyces Tür Cerevisiae

9

Diğer maya cinsleri (örn, Cryptococcus spp. ve Rhodotorula spp.) Basidiomycota ve (örneğin, Candida spp. ve Brettanomyces spp.) Deuteromycotina altında kategorize edilmiştir. Şu ana kadar 100 maya cinsi ve yaklaşık 1000 tür tanımlanmıştır. Ancak, yeni türler düzenli olarak karakterize edilmekte ve Dünya'da önemli yeni tür biyoçeşitliğine rastlanılmaktadır(Boekhout ve diğerleri, 2002).

2.4.2. Mayaların ekolojis

Mayalar ekolojik durumları sebebiyle bakterilerden farklı olarak her yerde bulunmazlar. Ancak mayalar toprak, su, bitki, hayvan ve böceklerden izole edilebilir. Mayaların tercih ettikleri habitatlar bitki dokuları, yaprak, çiçek ve meyvelerdir. Bazı mayalar örneğin, Candida albicans, fırsatçı insan patojenidir. Bazı maya türleri ekstrem ortamlardan izole edilebilir. Örneğin, düşük su potansiyelindeki ortamlar (yüksek şeker veya tuz konsantrasyonu), düşük sıcaklık ve aşırı ortamlardan izole edilebilir. Bazı psikrofilik mayalar kutup bölgelerinden izole edilmiştir. Bazı mayalar, düşük oksijenli (örneğin, hayvanların bağırsak yolları) ortamlardan izole edilmiştir. Mayaların habitatları Çizelge 2.1.de özetlenerek verilmiştir (Botha, 2006).

Çizelge 2.2. Doğal maya habitatları (Botha, 2006).

Toprak mayaların uzun süre yaşamaları için uygun ortamdır. Ekili toprakların 10-15 cm derinliğinde, üst aerobik kısmının bir gramında Toprak 10.000 maya hücresine rastlanır. Bu kısımdan Lipomyces ve Schwanniomyces gibimayalar izole edilmektedir. Mayalar, taze ve tuzlu suların yüzey katmanlarında baskın olarak bulunurlar. Ancak, sayıları 1000 hücre/litre olarak tespit edilmiştir. Su Birçok su kaynağında kırmızı pigment oluşturan Rhodotorula cinsine ait türler bulunmaktadır. Debaryomyces hansenii aşırı tuza dayanıklı bir maya türü olduğundan tuzlu su ortamlarında çoğalabilir ve bu ortamlardan izole edilir. Toprak yüzey katmanlarında bulunabilen Cryptococcus, Atmosfer Cryptococcus,Rhodotorula, Sporobolomyces, ve Debaryomyces cinsi mayalar atmosferde de bulunduğu gösterilmiştir.

10

Çizelge 2.2. (devam) Doğal maya habitatları

Bitkilerin yüzey kısmındaki çözünür besin değerleri (örn. şeker) meyvelerde mayaların bulunmasında önemlidir. Drosophila spp. Bitki Gibi böceklerde mayanın yayılmasında etkendir. Bitkilerin üzerinde bulunan bazı maya türleri patojendir. Bitkilerde organik bileşiklerin varlığı ile (çiçek, meyve, rizofer vs.) bitkilerin gelişiminde yarar sağlar. Patojen olmayan birçok maya türü sıcak kanlı hayvanların bağırsak ve derisi ile ilişkilidir. Birkaç kaç maya türü (örn., Candida Hayvan albicans) insan ve hayvanlara karşı fırsatçı patojendir. Bir çok maya türü böcekler ile ortak yaşam sürdürür ve hayvanlara mayaların transformasyonunu gerçekleştirir. Mayalar, örneğin Aureobasidium pullulans (siyah maya) nemli İnşa Edilmiş binalarda bulunur. Saccharomyces cerevisiae ev duvar kağıdı, şarap Çevre şişesi, gemi ve borularının yüzeylerinden izole edilmiştir.

Mayalar besin zincirinde önemli rol oynamaktadır. Sayısız böcek türü, özellikle Drosophila spp. bitki materyallerinde kolonize olmuş mayalala beslenmekedir. Ascomycetous mayalar böceklerin beslenmesinde düşük molekül ağırlıklı azot bileşiklerini dönüştürerek katkı sağlarlar. Mayalar böceklerin fizyolojilerinde ve üremelerinde de yararlı etkileye sahiptir. Bu durum özellikle Drosophila’ da gözlenmiştir. Deniz ortamlarındaki mayalar denizde yaşayan canlılar için besleyici özellik gösterirler. Mayalar mikrobiyal ekolojiside ve bileşiklerin biyokimyasal döngüsünde bakteri ve funguslar kadar etkili değillerdir. Bununla birlikte, mayalar karbon kaynaklarını geniş bir şekilde kullanabilir ve karbon döngüsünde önemli bir role sahip olup, karbondioksite

(CO2)dönüştürürler. Bazı mayalar nitrojen döngüsünde nitrat veya amonyum nitratları indirgeyebilirler. Mayaların çoğunluğu amonyum iyonlarını veya aminoasitleri organik nitrojene asimile edebilirler ve mayaların çoğunluğu sülfatları indergemektedirler (Botha, 2006).

11

2.4.3. Mayaların hücre yapısı ve sitolojisi

Mayalar tek hücreli ökaryot mikroorganizmalardır. Mayaların kolay üremeleri, biyokimyasal, genetik ve moleküler biyoloji analizlerinin kolayca yapılmasından dolayı ökaryotik çalışmalarda model organizmalar olarakkullanılırlar. Mayaların hücre boyutları türler arasında değişir ve hücre boyutları üreme koşullarına bağlıdır. Bazı mayaların uzunluğu 2-3 mm iken, diğerleri 10 mm ve bazılarıda 20–50 mm arasında olabilir. Mayaların çapları 1 ile 10 mm arasında değişkenlik gösterir. Elips şeklinde olan S. cerevisiae mayasının çapı 5-10 mm arasındadır (Strathern, 2002).

Maya sitolojik çalışmalarda, farklı sitokimyasal ve sitofloresan boyaları kullanılarak faz kontrast mikroskobunda incelenir. Bu şekilde, mayaların hücre içi yapılarını (örneğin; hücre duvarları, kapsüller, çekirdekler, vakuoller, mitokondri vb. organeller) görselleştirmek mümkündür. İmmünofloresans tekniklerde mayaların görselleşmesinde kullanımları gösterilmiştir. Bu yöntemle, mayaların hücre içi proteinlerinin yerleşim bölgelerinin tespiti ve hücre döngüsündeki organel değişikliklerinin izlenmeside mümkün olmaktadır. Mayaların hücre yüzey yapılarının belirlenmesinde Taramalı Elektron Mikroskobu kullanılmaktadır. Atomik Kuvet Mikroskobu ve Yüksek Çözünürlük Transmisyon Elektron Mikroskobu (RTEM) da maya sitolojisi çalışmalarında kullanılmaktadır. Transmisyon Elektron mikroskobisinde bir maya hücresihücre duvarı, çekirdek, mitokondri, endoplazmik retikulum (ER), golgi bileşikleri, vakuoller ve salgı veziküllerinden oluşmaktadır (Bkz. Şekil 2.3).

Şekil 2.3. Maya hücresinin elektron mikrografısi (http://www.dianliwenmi.com)

12

Maya hücrelerinde bulunan çeşitli yapısal bileşenlerinin fizyolojik fonksiyonları Çizelge 2.3.te verilmiştir (Linder ve diğerleri, 2006).

Çizelge 2.3. Maya hücrelerinde bulunan çeşitli yapısal bileşenlerinin fonksiyonları

Organel/Hücre Bileşik Fonksiyon

Seçiçi ve geçirgen bir bariyer olarak plazma zarını içerir. Hidrofilik moleküllerin hücre içine girişi veya hücre dışına çıkışını kontrol eder. Hücre duvarından hücre içine geçemeyen protein ve enzimler bu zarda bulunur. Hücre Hücre zarı duvarı, hücrelerin ve hücre şeklinin korunmasında, hücreler arasındaki etkileşimin ve sinyallerin korunmasında ve bazı enzimlerin aktivitesinde rol alır. Ayrıca, cinsel konjugasyon ve hücreleri immün ataklara karşı da korur. Genetik bilgileri yavru hücrelere aktarmak üzere Nükleus (Çekirdek) kromozomları (DNA-protein kompleksleri) içerir. Nükleoluslar ise ribozomal RNA transkripsiyonunda ve hücre bölünmesinde görev alır. Aerobik koşullarda solunum metabolizmasından, anaerobik Mitokondri koşullarda yağ asit, sterol ve amino asitlerin metabolizmasından sorumludur. Üzerinde ribozomları içerir. Ribozomlar, mRNA’daki Endoplazmik Retikulum bilgileri, nükleotit dizilerinini belirler ve protein sentezi gerçekleşir. Protozomlar Çoklu kompleks proteazların alt birimi olup, proteinlerin düzenlenmesinde görev alırlar. Golgi aygıtı ve Veziküller Salgı sistemleri olup, proteinlerin alımı (endositoz) ve ihracında (ekzositoz) da görev alırlar. Hücre içinde (amino asit, polifosfat ve metal iyonları) Koful (Vakuol) bileşiklerininin deposunu gerçekleştiriler. Hücre içi pH’ın kontrolünü sağlar. Bazı metilotropik (metanol-kullanan) mayalarda bulunur. Katalaz ve oksidaz enzimlerini içererek Bazı özgül karbon ve Peroksizom nitrojen kaynaklarını çevirir. Glioksizomlar, glioksilat çevrimi gerçekleştirip, birçok enzim içerir.

13

2.4.4. Mayaların beslenme, metabolizma ve üremeleri

Mayalar beslenmede makro besin (karbon, azot, oksijen, kükürt, fosfor, potasyum ve magnezyum) kaynaklarına milimolar seviyede ve eser elementlere (örneğin Ca, Cu, Fe, Mn ve Zn) gereksinim duyarlar. Mayaların çoğunluğu basit besiortamında iyi gelişirler ve bu besi ortamlarının temel bileşimlerinde karbon, azot, inorganik iyonlar ve büyüme faktörleriin bulunması gereklidir. Mayalar, büyüme faktörlerine az miktarda gereksinim duyarlar ve bu bileşiklerin mayalarda katalitik ve yapısal rolleri vardır. Maya büyüme faktörleri arasında, vitamiler, pürinler ve pirimidinler; nükleozid ve nükleotidler; aminoasitler; yağ asitleri; steroller; ve diğer çeşitli bileşikler (örneğin, poliaminler ve kolin) gösterilmiştir (Kappeli, 1986).

Çoğu mayanın laboratuvar ortamında kompleks ve sentetik besi ortamlarında üretimleri kolaydır. Mayaların üretilmesi için genellikle Malt Extract veya pepton ve glikoz ile takviye edilmiş Yeast extract Peptone Glucose (YEPG) besi ortamları kullanılmaktadır. Mayalar için azot ve nitrojen kaynağı olarak amonyum sülfat ve asparagin tanımlanmış maddeler olarak kullanılmaktadır. Mayalar için karbon kaynağı olarak genelikle glukoz %1 (w/v) besi ortamına ilave edilmektedir (Kappeli, 1986).

Mayaların üremesinde fiziksel gereksinimler etkilidir. Mayaların çoğu sıcak, sulandırılmış, şekerli, asidik ve aerobik ortamlarda gelişir. Endüstriyel mayaların çoğu örneğin S. cerevisiae suşları, 20 - 30°C arasında en iyi gelişirler. Mayaların en düşük üreme sıcaklıkları 20°C ve en yüksek 50°C’dir. Mayalar üreme ve metabolizmasında yüksek miktarda suya gereksinim duyar. Gıdalarda bozulmaya neden olan bazı ozmotolerant maya cinsi (örn. Zygosaccharomyces) üyeleri düşük su potansiyel koşullarına (şeker veya tuz konsantrasyonlarına) karşı dayanıklıdırlar. Mayaların çoğunluğu pH 4,5 ile 6,5 arasında iyi gelişirler. Organik asitlerle (örn. asetik ve laktik) asitleştirilmiş maya besiortamları mayaların üremeleri üzerinde inhibitör etki yapar. Mineral maddeler ile (örn., hidroklorik asit) asitlendirilen besi ortamlarının inhibitör etkileri birinci gruba göre daha azdır. Bunun nedeni, ayrışmamış organik asitler mayaların hücre membranından hücre içine translokasyonunu sonucu pH’ın daha fazla düşmesi ile meydana gelir. pH’nın fazla düşmesi ile gıda bozulmasına neden olan maya ve diğer mikroorganizmaların üremeleri engellenerek, gıdanın bozulmasınında koruyucu etki sağlanır. Mayalar, gıda yolu ile hücre içine aldıkları zayıf organik asitleri (ör. süksinat, asetat) ve bu asitlerin hücre içinde

14 ayrışımı sonucu proton (H+) açığa çıkar ve pH’nın düşmesine neden olunur. Ancak, mayalar plazma zarında bulunan ve proton pompalayan ATPaz enzim sistemi ile fazla protonların hücre dışına çıkarılmasında etkilidir ve bu şekilde maya hücresi içinde pH korunur. Yapılan çalışmalarda, S. cerevisiae kültürünün optimum üremesinin hücre içi pH’nın 5 civarında olduğu gösterilmiştir (Simon ve diğerleri, 2000).

Mayaların çoğunluğu aerobtur. Mayalar genelikle tam anaerob koşullarda üreyemezler. Mayaların solunumunda terminal elektron alıcılara gerek duyarlar ve bu durum aerobik koşullarda ve oksijenin varlığında gerçekleşir. Ayrıca, mayaların aerobik gelişimlerinde hücre zar yağ asidi (örn. oleik asit) ve sterol (örn., ergosterol) biyosentezi gerçekleşir. Mayaların fermentatif üremede oksijen gereksinimlerine göre sınıflandırmaları Çizelge 2.4.te gösterilmiştir (Rodrigues,2006).

Çizelge 2.4. Mayaların oksijen gereksinimlerine göre sınıflandırmaları(Rodrigues,2006).

Sınıf Örnek Yorumlar Zorunlu Fermentatif Candida pintolopesii Solunumu yetersiz mayalardır. (Saccharomyces telluris) Yalnız fermentasyon yaparlar. Oksijenin varlığında da bu özelliğe gösterirler. Fakültatif Saccharomyces Bu tür mayalar ağırlıklı olarak fermentatif cerevisiae yüksek şeker içeren ortamlarda ve oksijen varlığında gelişirler. Zorunlu Aerobik Candida utilis Aerobik koşullarda etanol üretmeyen ve anaerobik koşullarda üreme göstermeyen mayalardır. Fermentatif Rhodotorula rubra Oksijenin varlığı veya yokluğunda Olmayanlar etanol üretmeyen mayalardır.

Mayalar kemoorganotrofik mikroorganizmalardır, üremelerinde karbon ve enerji kaynağı olarak organik bileşikleri kullanırlar. S. cerevisiae (glukoz, fruktoz, manoz, galaktoz, sukroz ve maltoz) gibi karbohidratları üremelerinde iyi bir şekilde kullanırlar. Ayrıca bu

şekerlerS. cerevisiae ile kolay bir şekilde etanol ve CO2’ye fermente edilirler. Diğer etanol, gliserol ve asetat gibi karbon kaynakları S. cerevisiae tarafından yalnız oksijenin varlığında

15 solunumda kullanılır. Bazı mayalar, (örn., Pichia stipitis ve Candida shehatae) D-ksiloz ve Larabinoz gibi beş karbonlu pentoz şekerleri üremede ve fermentasyonda kullanır. Birçok yağı kullanabilen mayalar örneğin, Candida tropicalis ve Yarrowia lipolytica gibi hidrokarbonları C10-C20 aralığındaki düz zincirli alkanları üremede kullanabilirler. Bazı mezotrofik mayalar örneğinHansenula polimorpha ve Pichia pastoris gibi metanolde iyi üreme yeteneği gösterebilirler. Metanol bu gibi mayalar için önemli karbon ve enerji kaynağıdır. İlgili mayalar metanollu ortamlarda üretilerek endüstüriyel çapta rekombinat proteinlerin üretiminde kullanılmaktadır (Jean veJean, 2001).

2.4.5. Mayaların şeker metabolizması

Mayalarda şeker metabolizması fermentasyon ve solunum ile birlikte, glikoneogenesis ve karbonhidrat biyosentez asimilasyon yollarına bağlıdır (Bkz. Şekil 2.4.),(Suástegui ve Shao, 2016).

Şekil 2.4. Mayalarda fermentasyon ve solunum yolları (https://www.scienceopen.com)

Fermentatif mayalar organik substratları (şekerler) anaerobik olarak elektron vericileri, elektron alıcısı ve karbon kaynaklarıolarak kullanırlar. Şekerlerin alkol fermantasyonu sırasında, S. cerevisiae ve diğer fermantatif mayalar koenzim NADH'yi NAD'ye indirgemiş olurlar. Birinci basamak reaksiyonda pirüvat, pirüvat dekarboksilaz enzimi ile

16 asetaldehide dönüştürülür ve dehidrogenaz enzimi ile alkola dönüşür. Glikolizizde alkol ve karbondioksit ile birlikte diğer metabolitlerde oluşur. Bu metabolitler arasında, izoamil alkol, polioller (örneğin gliserol), esterler (örneğin etil asetat), organik asitler (örn. Süksinat), visilil diketonlar (örneğin diasetil) ve aldehitler (örn., asetaldehit) bulunur. Bu metabolitler fermentatif ürünün özel tad ve kokusunu sağlar (Suástegui veShao,2016).

Mayalar önemli endüstriyel ürün olan gliserolu üretirler. Gliserol üretimi maya besiortamına sülfitin ilavesi ile gerçekleşir. Sülfit, asetaldehidi baskılayarak etanole dönüşümünü engeller ve bu şekilde maya yüksek miktarda gliserol üretimini gerçekleştirir. Mayalarda aerobik solunum (glikoliziz) önemli bir metabolik yol olup enerji üretimini sağlar. Maya ve filament mantarlarda sitrik asit döngüsü (Krebs döngüsü) şekerlerin ve diğer karbon kaynaklarının oksitlenmesinde yaygın bir yoldur ve bir piruvat molekülünden

2CO2, 3NADH, 1FADH2, 4H + ve 1GTP sonuçlanır (Suástegui veShao,2016).

2.4.6. Mayaların biyoteknolojide kullanımı

Mayaların yararlı fizyolojik özellikleri onların biyoteknoloji alanında kullanılmasına yol açmıştır. Mayalar, ekmek, hamur ve çeşitli fermentasyonlarda kullanılır. Fermente süt ürünleri ile fermente gıda ürünlerinde mayalar starter deskleyici kültürler olarak görev alırlar. Bu ürünlerin temel üretimleri LAB ile gerçekleşir. Alkollü içeceklerin fermantasyonunda mayalar önemli bir role sahiptirler. Mayalar, tüm fermentatif ürünlerde tat ve aromanın gelişiminde etkilidirler. Mayalar tarafından üretilen birçok biyoteknolojik ürün endüstüriyel çapta elde edilmektedir. Bu ürünlerden Tek Hücre Proteini (THP) insan beslenmesinde ve hayvan yeminde uzun yıllardan beri kullanılmaktadır. Birçok maya türü hücresel olarak yüksek miktarda protein, karbonhidrat, yağ, vitamin, mineral ve önemli aminoasitleri içerir ve beslenmede potansiyel bir kaynak olarak değerlendirilmektedir. Mayalar diğer hücresel bileşimlerinden olan enzimler, karotenoidler, lipidler, steroidler, polisakaritler, glukanlar, nükleotidler gibi bileşenlerini önemli miktarlarda içeririrler. Son yıllarda bu bileşimlerden yararlanılarak gıda katkı madeleri veya fonksiyonel gıdaların üretiminde yararlanılmaktadır. Bu bileşenler ayrıca, kimyasal, farmasötik, kozmetik ve diğer endüstriyel uygulamalarda da kullanılmaktadır. Mayalar birçok farmasötik ürünün üretimi için kullanılmaktadır. Bu ürünlerin çoğu S. cerevisiae kültürlerinden veya genetik modifiye edilmiş (GM) suşlardan elde edilmektedir. Tıp alanında mayalardan yararlanılmaktadır. Son yıllarda, aşılar, antijenler, hormonlar ve diğer biyoterapötik

17 bileşikler mayalara klonlanmış ve laboratuar düzeyinde ekspres edilmiş (örn., Insülin, interferon, hepatit A antijeni) mayalar olarak ticari üretimleri geçekleştirilmiştir (Satyanarayana ve diğerleri, 2009).

Mayalardan β-glukan üretimi sağlanmıştır. β-glukan insan ve veterinerlik tıbbı, farmasötik, kozmetik ve kimya endüstrisi, gıda ve yem üretimi gibi çeşitli kullanım alanlarına sahiptir. Mayalardan elde edilen β-glukan, gıda koyulaştırıcıları, diyet lifleri, emülsiyon yapıcılar ve filmler gibi gıda ürünlerinde kullanılmaktadır. Ayrıca, mayalardan elde edilen glukanların, su tutma, yağ bağlama gibi jelleşme özellikleri açısından önemli rolleri bulunmaktadır. Bununla birlikte β-glukanın su tutma özelliğinden dolayı, sosis ve et ürünleri, mayonez ve soslar, dondurulmuş tatlılar, yoğurtlar, fermente süt ürünleri, yumuşak hamurlar gibi diğer gıda ürünlerinin üretiminde de kullanımı söz konusudur (Tofalo ve Suzzi, 2016).

Mayaların diğer kullanım alanlarından; Biyodegradasyon özelliğine sahip mayaların biyolojik giderme ve çevre korunmasında kullanılabileceği düşünülmüştür. Hidrokarbon asimile eden mayaların yağların parçalanmasında kullanılabildiği gösterilmiştir. Biyosorbent olarak kullanılan maya hücreleri ağır metallerin ve radyoaktif izotopların gideriminde kullanılabildiği gibi,Trichosporon kutanum ve maya benzeri Aureobasidium pullulanssuşları da fenol ve bazı aromatik kimyasallarının gideriminde kullanılabilmektedir(Satyanarayana ve diğerleri, 2009). Low ve diğerleri, (2005) ekmek mayasının (Saccharomyces cerevisiae) buğday unundaki böcek ilacı glifosat kalıntılarını azalttığını bildirmiştir.

Mayaların biyolojik kontrol ajanları olarak kullanımları ilgi çekmektedir. Bazı maya türleri, özellikle Pichia guilliermondii, Pichia anomala ve Debaryomyces hansenii, meyve ve tahıllar üzerinde patojenik etki gösteren bazı küflerin çoğalmasını engelleyebilmektedir. Hasat sonrası hastalıkları ve mikotoksinlerin üretimini kontrol etmek için antagonistik mayaların olası kullanımı da kaydedilmiştir (Walker, 1998). Biyoteknolojide kullanılmakta veya kullanım potansiyeline sahip olan olan mayalar Çizelge 2.5.te gösterilmiştir(Buzzini ve Vaughan-Martini, 2006).

18

Çizelge 2.5. Biyoteknolojide kullanılmakta veyapotansiyel kullanımda olan mayatürleri (Buzzini ve Vaughan-Martini, 2006)

Maya Türü Kullanımı Alanı Candida milleri Hamur mayalama C. shehatae Biyoetanol üretimi C. sake Biyokontrol C. oleophila Biyokontrol C. maltosa Hidrokarbonlarda THP Debaryomyces hansenii Peynir, sosis olgunlaşma, proteaz üretimi D. (Schwanniomyces) occidentalis Amilaz üretimi Eremothecium ashbyi Riboflavin üretimi Geotrichum candidum Peynir olgunlaşmasında Hanseniaspora uvarum Bira fermentasyonu Kluyveromyces marxianus Süt fermentasyonu, Peyniraltı suyundan THP üretimi K. lactis Süt fermentasyonu, Peyniraltı suyundan THP üretimi Pachysolen tannophilus Biyoetanol üretimi Phaffia rhodozyma Astaksantin üretimi Pichia angusta (Hansenula polymorpha) Biyoetanol üretimi P. anomala Biyokontrol P. jadinii (C. utilis) Hammadde P. pastoris Heterolog proteinlerin üretimi P. stipitis Biyoetanol üretimi Pseudozyma flocculosa Biyokontrol ajanı Rhodotorula glutinis Karotin üretimi Schizosaccharomyces pombe Cider fermentasonu Saccharomyces cerevisiae Brewer’s, baker’s, bira mayası, Biyoetanol üretimi, invertaz üretimi, Heterolog proteinlerin üretimi S. exiguus Hamur mayalama S. boulardii (S. cerevisiae ) Probiyotik Saccharomycopsis fibuligera Amilaz üretimi Torulaspora delbrueckii Hamur mayalama Zygosaccharomyces rouxii Soya sosu üretimi

19

2.5. Probiyotikler

Dünya Sağlık Örgütü (WHO) ve Amerika Gıda ve Tarım Örgütü (FAO) tarafından probiyotiklerin tanımı yapılmıştır ve buna göre; yeterli miktarda alındığı zaman konak üzerinde sağlığa yararlı etkiler sağlayan yaşayan mikroorganizmalar olarak belirlenmiştir FAO/WHO, (2002), Probiyotikler bugün birçok enfeksiyon hastalığında ve patolojik durumlarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Probiyotikler gastrointestinal enfeksiyonların önlenmesi ve tedavisinde ayrıca insan normal ekolojisinin tekrar oluşturulmasında ds yararlanılmaktadır (Paulina ve Katarzyna, 2017).

Mikroorganizmaların çoğunluğunu LAB'ler oluşturmaktadır. LAB’lerden; Lactobacillus, Bifidobacterium, Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Tetracoccus (Pediococcus) ve Enterococcus cinsine ait bazı türler önemli probiyotik türlerdir. LAB’ler karbonhidratları homo/hetero fermentatif özellikleri ile şekerleri fermente ederek laktik asit oluştururlar. LAB’ler dışında probiyotik olarak kullanılan diğer mikroorganizmalar; Bacillus, Saccharomyces ve Aspergillus cinslerine ait bazı türlerdir (Mombelli ve Gismondo, 2000).

2.5.1. Probiyotik mikroorganizmalarda bulunması gereken özellikler

Probiyotiklerin insan sağlığına faydalı olabilmesi için bazı özelliklerinin göstermesi gereklidir(Pritib, 2012) Bunlardan;

 Mide ve duedonum’dan geçişi sırasında ortamdaki yüksek asitliğe toleranslı olmalıdır.  Çeşitli organik asitler üreterek bağırsağın pH’sını düşürebilmelidir.  Bağırsak epitel hücrelerinde kolonize olmalı ve çoğalmalıdır.  İnce bağırsağın üst kısmından geçişi sırasında safra tuzlarına karşı dirençli olmalıdır.  Antimikrobiyal maddeler (hidrojen peroksit, diasetil ve bakteriosin) gibi maddeler, üreterek patojen mikroorganizmaların sindirim sisteminde üremelerini engelemelidir.  Probiyotik etkinliği belirlenmiş ve sağlık bakımından güvenilir olmalıdır.  Patojenik olmamalı, antimutajenik, antikarsinojenik ve antagonistik etkiye sahip olmalıdır.  Antikor üretimini sitümüle ederek bağışıklık sistemini güçlendirmelidir.  Gıdaya arzulanan duyusal özellikleri kazandırmalıdır.  Transfer edebilecek antibiyotik direnç geni taşımamalı.

20

2.5.2. Probiyotiklerin etki mekanizmaları

Probiyotikler, konak canlıyı patojenlere karşı koruyarak ve immün sistemini güçlendirerek etki gösterirler. Probiyotikler yararlı etkilerini çeşitli mekanizmalar gösterirler (Liong, 2011), Bunlardan;

 Patojen bakterilerin epitel hücrelere tutunmasını azaltırlar,  Patojenlerin gelişimini önleyen antimikrobiyal (bakteriyosin), hidrojen peroksit, diasetil vd. maddeler salgılayarak aktivite gösterirler,  Antijen yükünü azaltacak makromolekülerin indirgenmesini sağlarlar,  İmmün hücre proliferasyonunu baskılıyarak etki gösterirler,  Epitel bariyerinin devamlılığını sağlar,  İmmün fonksiyonu modüle ederler.  Antioksidan aktivite gösterirler

2.6. Ökaryot Probiyotikler

2.6.1. Ökaryot probiyotiklerin özellikleri

Ökaryot mikroorganizmaların birçoğu prokaryotlardan farklı olarak insan ve hayvan sağlığında önemli etkilere sahiptirler. Dünyada uzun yıllardan beri ökaryotik mikroorganizmalar tek hücre proteini ve / veya gıda bileşinleri olarak insan ve hayvan tüketim ve beslenmesinde kullanılmaktadır. Bazı ökaryotik mikroorganizmalar intestinal mide ve bağırsak sistemlerine karşı dayanaklı olduğundan bunların insan için yararlı etkilerinden dolayı probiyotik olarak kullanımları uygun görülmüştür. Prokaryot probiyotiklerin kullanımları daha yaygın olmakla beraber, az sayıda ökaryotik küf ve maya probiyotik olarak kullanılmaktadır. Ökaryotik probiyotiklerden özellikle Saccharomyces türleri baskın olarak kullanılmaktadır (Czerucka ve diğerleri, 2007).

Ökaryot probiyotiklerden; algler örneğinChlorella, Spirulina türleri; funguslarörneğinAspergillus, Penicillium türleri; mayalar örneğin, Saccharomyces, Candida, Kluyveromyces, Pichia, Torulopsis türleri özellikle tek hücre proteini (THP) ve/veya gıda bileşinlerindekullanılmaktadır. Yaygın olarak probiyotik özellik gösteren ökaryotik mikroorganizma cinsleri Saccharomyces, Pichia, Metschnikowia, Yarrowia,

21

Candida, Debaryomyces, Isaatchenkia, Kluyveromyces ve Aspergillus olarak gösterilmiştir (Moslehi-Jenabian ve diğerleri, 2010). Ökaryot probiyotik özelliği gösteren bazı mayalar Çizelge 2.6.da gösterilmiştir (Liong, 2011). Bazı ökaryotik Saccharomyces cerevisiae, Kluyeveromyces marxiaizelgnus ve Pichia kudriavzeii mayalarının elektron mikroskop görünümleri Şekil 2.5. ve Şekil 2.7.de gösterilmiştir.

Çizelge 2.6. Ökaryot probiyotik özelliği gösteren bazı mayalar(Czerucka ve diğerleri, 2007)

Phylum Sınıf Order Famiya Cins Tür Basidiomycota Urediniomycetes Sporidiales Sporidiobolaceae Cryptococcus Mujuensis Cuniculi Ascomycota Saccharomycetes Saccharomycetales Dipodascaceae Yarrowia Lipolytica Metschnikowiaceae Metschnikowia Lochheadii Saccharomycetaceae Candida Humilis Pintolepsii Saitoana Utilis Pararugosa Debaryomyces Hansenii Cereviae Kluyveromyces Marxianus Lodderae Ctis Pichia Anomala Saccharomyces Cerevisiae Isaatchenkia Orientalis Euromycetes Eurotiales Trichocomaceae Aspergillus Oryzae Niger

Şekil 2.5. Saccharomyces cerevisiae (emaze, t.y.)

22

Şekil 2.6. Kluyeveromyces marxian(diark, 2018)

Şekil 2.7.Picihaikudriavzeii(file:///C:/Users/info/Desktop/51843651)

Saccharomyces cerevisiae ve Saccharomyces cerevisiae var boulardii suşlarıinsanların kullanımı için ticari olarak üretilmektedir (McFarland, 2010).S. CerevisiaeGıda ve İlaç İdaresi (FDA, ABD) tarafından onaylanmış ve güvenlir (GRAS) statüsüne sahiptir. Diğer bazı mayalar Candida pintolopesii, Candida utilis ve Candida saitoana(Czerucka ve diğerleri, 2007)ve Aspergillus türlerinden A. niger ve A. oryzae türleri hayvan beslenmesinde probiyotik olarak kullanılmaktadır (Lee ve diğerleri, 2006b). Mayalardan, Kluyveromyces, Isaatchenkia ve Debaryomyces cinsine dahil türler de ökaryot probiyotik olarak değerlendirilmiştir. Probiyotik olarak değerlendirilen mayalar antioksidant, antifungal, antibakterial, antiinflamatuar ve antitömür aktivitelerine göreyapılmıştır(Lee ve diğerleri, 2008b).

23

2.6.2. Ökaryot probiyotiklerin kaynak ve üstünlükleri

İnsan ve hayvan uygulamaları için uygun probiyotik mayaların izolasyon, tanımlama ve geliştirilmesine ilgi gösterilmektedir. Mayalara bakteriler gibi her habitatta rastlanılmayabilinir. Mayalar; bitki, hayvan, toprak, su ve atomsferde gelişirler. Ayrıca, mayalar insan ve hayvanların deri ve gastrointestinal sistemlerinde de bulunurlar (Urubschurov ve diğerleri, 2008). Mayalar çoğunlukla besinlerde, özellikle süt ve süt ürünlerinde bulunur. Yapılan araştırmalarda süt ve süt ürünlerinin önemli ve potansiyel probiyotik mayaların kaynağını teşkil ettiği bildirilmiştir. Bu ürünlerde; Candida (C. humilis), Debaryomyces (D. hansenii, D. occidentalis), Kluyveromyces (K. lactis, K. lodderae, K. marxianus), Yarrowia (Y. lipolytica) ve diğer birçok türün bulunduğu gösterilmiştir (Kumura ve diğerleri, 2004). İnsan ve hayvan gastrointestinal sistemi probiyotik mayaların iyi bir kaynağını teşkil eder. Probiyotik maya geliştirme programlarında, beyaz peynir ve insan gastrointestinal sisteminden izole edilen Saccharomyces ve Kluyveromyces suşlarından probiyotik suşlar geliştirilmiştir (Kourelis ve diğerleri, 2010a).

Probiyotik bakteriler %99 oranında mide-bağırsak sistemine kolonize olmalarından dolayı probiyotik olarak kullanılmaktadırlar. Prokaryotların tersine, ökaryot probiyotikler mide ve bağırsak sisteminin dominant mikrobiotası olmadığından yalnızca sınırlı sayıda maya suşu insan ve hayvanların kullanımı için uygundur. Prokaryot ve ökaryot probiyotikler birbirlerinden farklı etki mekanizması gösterirler (Bkz. Çizelge 2.7). Prokaryot probiyotiklerden; L. acidophilus ve Bifidobacterium türleri bağırsakta konjuge primer safra tuzlarını toksik olmayan ikincil safra tuzlarına dönüştürmektedir. Bu özellik sağlık bakımından önemli yarar sağlamaktadır. Bu durum ökaryot probiyotiklerde gözlenmemiştir (Kourelis ve diğerleri, 2010a).

Çizelge 2.7. Prokaryotik ve ökaryotik probiyotiklerin karşılaştırılması (Liong, 2011)

Parametre Prokaryotik (Bakteri) Ökaryotik (Maya) Hacim Küçük (0.5-5 µm) Büyük (10 x 5 µm) Hücre duvarı Peptidoglükan Kitin, Glükan, Manos Hücre Duvarı Bileşeni Lipoteicheic acid, Phospohopeptidomannan, Lipopolysaccharide Phospholipomannan

24

Çizelge 2.7. (devam) Prokaryotik ve ökaryotik probiyotiklerin karşılaştırılması (Liong, 2011)

Parametre Prokaryotik (Bakteri) Ökaryotik (Maya) Optimum Üreme Koşulları pH 6.5–7.5 4.5–6.5 Sıcaklık 10–80οC 20–30 οC Mide Asidine Toleranslılıkk Toleranslı Toleranslı Safra Tuzuna Toleranslılık Toleranslı Toleranslı Antibiotiklere Toleranslılık Hayır Toleranslı Sindirim Sisteminde Doğal Dominant (%99) (%1) veya daha az Bulunuş Genetik Madde Transfer Evet Hayır Yeteneği Bağırsakta Kolonize Olabilme Evet Az veya Orta Yeteneği Diğer Mikroorganizmalar Yoktur Vardır Üzerinde Sinirgestik Etkileri Probiyotik Olarak Uygulamaları Hayvanlarda Geniş Sınırlı Uygulama Tüketicinin Gelişim/ Besinsel Uygulama Etkileri Evet Evet İmmün Sitimilasyonu Antagonistik Bileşikler Üretme Evet Evet Yeteneği Yüksek Nadiren az Enterotoksinleri Nötrelize Yeteneği Yok Evet

Probiyotik bakterilerde antibiyotik direnç gen transferi önemli bir sorun teşkil etmektedir. Bu durum ökaryotik probiyotiklerde gözlenmemiştir. Konakçı bağırsağında probiyotik bakterilerden patojen bakterilere gen transferi mümkün olmaktadır. Ökaryot probiyotik mayalarda antibiyotik direnç genlerini kodlayan plazmid DNA olmadığınan, mayalardan bu gibi genlerin bakterilere transferi yapılmamaktadır (Kourelis ve diğerleri,2010a).

25

2.6.3. Ökaryot probiyotiklerin taksonomik karakterizasyonu

Probiyotiklerin etkinliğini değerlendirmekle, türler arasında benzerlik veya farklılıklar belirlenir ve bir suşun karakterizasyonu hakkında bilgiler elde edilir. Bu bilgiler suşun soyu, kökeni ve güvenlik durumunu kapsar. Bir organizmanın taksonomik konumu hakkındaki bilgiler, bunların probiyotik olarak seçiminde önem taşır.

Probiyotikler cins ve tür bazında mutlaka uluslararası kabul edilmiş standart yöntemler ile identifiye edilmelidir. Tanımlamada kullanılan yöntemler, DNA-DNA hibridizasyon veya DNA sıralanmasını kodlayan 26S rRNA ve tür tanımında uygulanan jel elektroforez veya rastgele çoğaltılmış polimorfik DNA uygulanmaktadır (Salminen ve diğerleri, 2001). Araştırmacılar, uzun yıllarda beri farklı kaynaklardan elde ettikleri çok sayıda probiyotik maya suşlarını moleküler teknikler kullanarak identifiye ve karakterize etmişlerdir (Buchl ve diğerleri, 2010). Mayaların moleküler tanımlamada 26S rRNA genindeki D1/D2 fragmantlerin sıralaması baz alınmaktadır. Benzer şekilde Aspergillus türlerinin tanımlanmasında da bu yöntem uygulanmaktadır (Lee ve diğerleri, 2006).

2.6.4. Ökaryotların probiyotik potansiyelleri

Ökaryot mikroorganizmalardan özellikle mayalar fizyolojik ve metabolik özellikleri bakımından potansiyel probiyotik olarak kullanılmaktadırlar. Bu özellikler, mayaların boyutları, morfolojik çeşitliliği, beslenme esneklikleri, azot, karbon ve fosfor kullanma yeteneği, stres tolerans yeteneği, düşük pH / oksijen / su aktivitesine sahip olmaları, yüksek ozmotik basınç, salgılanan enzim gücü (lipaz, peptidaz, amilaz, invertaz, fitaz, vb. enzimlerini geniş bir yelpazede salgılarlar), antioksidatif / antitümör / antimikrobiyal aktiviteleri (patojenlere karşı geniş etkilidirler) ve diğer yararlı birçok metabolitleri üretebilmeleridir. Ayrıca, olası probiyotik mayalar çoğu mikotoksik, alerjik ve patojen değildir (Fredlund ve diğerleri, 2002). Bununla birlikte probiyotik mayalar konağın sindirim sisteminin sert koşullarına karşı dayanaklı olmasını sağlayarak konakta yararlı etki gösterirler. Ancak, değişik mayaların biyolojik özelliklerinden dolayı tür içi önemli değişkenlikler vardır ve suşa özgül olarak değerlendirilmektedir (Posteraro ve diğerleri, 2005). Probiyotik S. cerevisiae var boulardii, S. cerevisiaeae ile kıyaslandığında asidik stres koşullarına daha toleranslı olduğu ve 37οC' de daha iyi üreme yeteneği gösterdiği görülmüştür (Fietto vediğerleri, 2004). Mayalar suşa bağlı olarak geniş bir sıcaklık aralığı,

26 tuz konsantrasyonu ve pH’ı tolere edebilir. Sıcaklık mayaların üreme ve metabolik aktiviteleri üzerinde etkilidir. Mayalar genelikle 20-30οC sıcaklıkta çok iyi ürerler. Mayaların üremeleri 20οC’nin altında veya 50οC’nin üstünde sınırlanır. Mayaların çoğunluğu pH 4,5–6,5’da iyi üreme gösterirler, ancak tüm türler pH 2,5’a kadar dayanaklıdırlar. Probiyotik mayaların tuz dirençlilikleri tür arasında farklılık gösterir. Probiyotik S. cerevisiae 1,5 M NaCl’ye dayanaklık gösterirken, D. Hansenii kültürün 2,5 M NaCl’ye dayanıklı olduğu gösterilmiştir.

2.6.5. Ökaryot probiyotiklerin faydaları

Ökaryot probiyotikler gıda ve yem takviyesi olarak alındığında konakçıda birçok besin faydası sağlar. İnsan ve hayvanlarda beslenmeye ve büyümeye faydaları aşağıdaki gibi sıralanmıştır;

Besinsel yaraları

Probiyotiklerin beslenme üzerinde etikleri yüksek olup, sindirim işlemleri üzerinde etkileri çeşitlidir. Özellikle selülozlu maddelerin sindirimini, mikrobiyal proteinlerin üretimini vebesin maddelerin emilimini artırır. Yapılan çalışmalarda, probiyotik mayaların hayvan beslenmesinde kullanımı ile, hayvanların hem yem alımı hem de vücüt kilo artışı olduğu bildirilmiştir (Kabir, 2009). Aspergillus oryzae küfününS. cerevisiae gibi hayvanların beslenmesinde yararlı olduğu gösterilmiştir. A. oryzae genelikle konakçının beslenmesinde önemli sindirim enzimleri olan amilotik ve proteolitik enzimlerini salgılar. Ayrıca,A. oryzae’nin amonyak ve serum kolesterol seviyesini düşürdüğüde bildirilmiştir (Kim vediğerleri, 2003).

27

Hastalıklardan koruma

Mayaların hastalıktan koruma yetenekleri çeşitli çalışmalarla gösterilmiştir. Mayalardan, özellikle Saccharomyces türlerinin terapötik etkileri ve farmakokinetik/ farmakodinamik mekanizmaları hayvan modellerinde ve klinik deneylerde belgelenmiştir. Bir çalışmada, 16 adet Saccharomyces türünden yalnız S. cerevisiae/S. cerevisiae var boulardii türlerinin biyoterapötik madde üreticileri olduğu gösterilmiştir (Dixit ve Gandhi, 2010). Mayaların biyoterapötik etkilerinden sindirim sorunlarının tedavisinde, diyarede, amebiasisde, bağırsak sendrom tahrişinde, inflamatuvar bağırsak sendromunda, kısa bağırsak sendromunda aşırı bakteri üremesinde, Crohn hastalığında (kronik ve iltihabi bir bağırsak hastalığı), ülseratif kolit ve lyme hastalığında (Borreliosis, genelde Ixodes ricinus türü kenelerin ısırması ile insana geçen Borrelia burgdorferi adlı bakterinin yol açtığı bir hastalıktır) yararlanılmaktadır (Guslandi ve diğerleri, 2000).

Probiyotik S. cerevisiae ve S. cerevisiae var boulardii çocuklarda akut enfeksiyon ve çeşitli ishal vakalarının önlenmesi ve tedavisinde etkilidirler. Ayrıca, ilgili mayalar yetişkinlerde patojenlerin, AIDS’in, antibiotik, tüple beslenen hastaların ve Clostridium difficile bakterisinin neden olduğu ishalin tedavisinde kullanılmaktadır (Aloysins ve diğerleri, 2005). Ayrıca, S. cerevisiae var boulardii suşunun laktoz intoleransı, idrar yolu enfeksiyonu, vajinal mantar enfeksiyonları, yüksek kolesterol düzeylerinin düşürülmesi, ürtiker (alerjik deri hastalıkları), ateş kabarcıkları, aft (ağızda meydana gelen yara, pamukçuk) ve sivilce rahatsızlıklarında etkili olduğu bildirilmiştir. Bununla birlikte, gıda alerjileri, Candida ve parazit enfeksiyonu ve uzun süreli antibiyotik kullanımından sonra normal bağırsağın işlevlerini yeniden düzenlenmesinde yararlı olduğu gösterilmiştir (Murzyn ve diğerleri, 2010).

Sindirim sisteminde S. cerevisiae kültürünün C. albicans, Candida krusei, Candida pseudotropicalis, Salmonella typhimurium ve Shigella flexneri mikroorganizmalarının sayılarını azalttığı bildirilmiştir (Rodrigues ve diğerleri, 1996). S. cereviceae var boulardii’nin iltihaplı reaksiyonları azalttığı ve C. albicans’ın sindirim sistemine kolonizasyonunu engellediği gösterilmiştir (Jawhara ve Poulain, 2007).

Probiyotikler, genellikle farklı ve çeşitli mekanizmalar yoluyla yararlı etkiler sağlar. Bunlardan; bağırsak dengesini sağlamaya yönelik trofik etki gösterirken, sistematik

28 bağışklık, antmikrobial ve toksin nötralize etme aktiviteleride gösterirler. Probiyotiklerin trofik etkileri, bağırsakta fazla ve zararlı maddelerin uzaklaştırılarak iç çevrenin dengeli bir durumda kalmasını sağlar. S. cerevisiae var boulardii’nin trofik etkisi maya tarafından üretilen bazı enzimlerle gerçekleşir ve bu enzimlerin yardımı ile kompleks makromolekülerin parçalandığını açıklanırken, bu enzimlerin konakçıda üretilmediği bildirilmiştir (Buts, 2009). İnsanlarda, S. cerevisiae / S. cerevisiae var boulardii ince bağırsakta bazı enzimleri aktifleştirilerek, bağırsak yüzeyinde besinlerin emilmine yardımcı oldukları açıklanmıştır (Jahn ve diğerleri, 1996).

Bağışıklık uyarılması

Ökaryotik probiyotiklerin bağışıklık sistemini sitümüle ettiği ve hastalıklardan korunmada yararlı oldukları gösterilmiştir. Mayalar, aktif madde üreterek konakçının bağışıklık ve diğer biyolojik sistemlerini tetikleyerek etkili olurlar. Mayaların hücre duvarılarında bulunan kompleks polimerlerden b-glukan, a-mananlar, manoprotein ve az miktarda kitin konakçının bağışıklık sistemini uyardığı bildirilmiştir (Smits et al. 1999).

Bir karşılaştırmalı çalışmada, S. cereviceae’nın immüno-stimülasyonu sIg A ve IL10 üretimi ile gerçekleştirdiği bildirilirken, probiyotik bakterilerden Bifidobacterium ve Lactobacillus’lardan daha iyi olduğunu açıklanmıştır. Probiyotik, S. cereviceae var boulardii fagositik aktivitenin yanı sıra farklı sitokin üretimini artırdığı gösterilmiştir (Czerucka ve diğerleri, 2007). Bir çalışmada, S. cerevisiae ve Kluyeveromyces lactis türlerinin polimorfonükleer, fagositik aktivite ve çeşitli sitokinleri artırdığı açıklanmış ve bağışıklığın suşa özgül olduğu gösterilmiştir (Kourelis ve diğerleri, (2010b).

Sinerjistik aktivite

Ökaryot mikroorganizmalar konakçının bağırsak mikroflorası üzerinde sinerjistik etki gösterirler. Probiyotik mayaların beslenmede ilavesi ile diğer probiyotiklerin üremelerini teşvik ettiği bildirilmiştir. Saccharomyces türlerinin bağırsak mikroorganizmaların sitümilasyon etkilerinin temel metabolitlerden olan pirüvat, amino asitler ve vitaminlerden kaynaklandığını gösterilmiştir (Jespersen, 2003).

29

Toksin nötralizasyon etkinliği

Patojenler tarafından üretilen toksinler epitel üzerindeki özel reseptör hücrelere bağlanarak, mukozada hasara ve enflamasyona neden olurlar. Ökaryotik probiyotikler toksik bileşiklerini reseptörler tarafından üretilen çeşitli enzimler özellikle proteaz enzimi ile giderirler. Mayaların (C. difficile, V. cholerae ve E. coli) patojen bakterilerin toksik üretimlerini inhibe ettiği ve/veya etkilerini önlediğini bildirilmiştir. S. cerevisiae tarafından üretilen proteaz enziminin C. difficile tarafından ürettilen A ve B toksinlerinden A toksini hidrolize ettiği gösterilmiştir. Mayanın toksik madde gideriminin A54-kDa ağırlıkta olan serin proteaz enzim aktivitesi ile gerçekleştiği bildirilmiştir (Liong, 2011). S. cerevisiae var boulardii’nin ürettiği 120-kDa proteinin V.cholerae bakterisinin ürettiği toksinin etkisini önlediği gösterilmiştir (Neves ve diğerleri, 2002).

2.6.6. Ökaryotik probiyotiklerin güvenirliği ve genetik manipülasyonları

Probiyotikler genellikle güvenilir olup, bazen duyarlı kişilerde komplikasyonlar ve yan etkilere neden olabilir. Probiyotik ökaryotlar, Avrupa Gıda Güvenliği Otoritesi tarafından onaylanmıştır (http://www.efsa.europa.eu). S. cerevisiae ve S. cerevisiae var boulardii insan ve hayvanlarda uygulanmakta olup, çok az hastalarda yan etkileri rapor edilmiştir. Bu iki kültürün bazı insanlarda fungemi (Mantarların kan dolaşımına geçmesi, kanda mantar bulunuşu) bildirilmiştir. Bu durum sadece bağışıklık sistemi baskılanmış hastalarla sınırlıdır. Hayvan model denemelerinde, S. cerevisiae/S. cerevisiae var boulardii mayalarının hayvan bağırsak mukozasına ve buradan diğer organlara geçtiği açıklanmıştır(Cassone ve diğerleri, 2003).

Son yıllarda ökaryot probiyotiklerin genetik manipülasyonları ve geliştirilmesine önem verilerek istenilen özellikte suşların geliştirilmesi mümkün olmuştur (Steidler, 2003). Daha önceleri Saccharomyces ve diğer mayaların genetik geliştirmeleri geleneksel mutasyonla gerçekleştirilmekteydi. Ancak son yıllarda rekombinant DNA tekniği, protoplast füzyon yöntemi uygulanarak arzulanan özellikte genetik olarak değiştirilmiş mayalar elde edilmektedir (Martins ve diğerleri, 2004). Gerçekleştirilen farklı çalışmalarda, yüksek biyoterapötik madde üreten, düşük pH’a karşı toleranslı, yüksek safraya dayanaklı, yüksek vitamin içeren ve birçok patojene karşı antagonisitk aktivite gösteren S. cerevisiae var

30 boulardii suşu mutasyon/protoplast füzyon yöntemlerinin uygulanması ile geliştirilmiştir (Pasha ve diğerleri, 2007).

2.7. Probiotik Mayaların Metabolik Ativiteleri

2.7.1. Mayaların ekzopolisakkarit (EPS) üretimleri

Ekzopolisakkaritler (EPS) ekzoselüler biyopolimerdir mikroorganizmaların yüzeyinde bulunur. EPS, birçok mikroorganizma tarafından üretilmekte ve üretici mikroorganizmayı dehidrasyon ve ozmotik basınca karşı koruyucu bir etkiye sahiptirler. EPS, üretici mikroorganizma tarafından enerji kaynağı olarak kullanılamamaktadır. Bu biyopolimerin kapsül veya mikrokapsül şekline polisakkarit adı verilmektedir. Mikroorganizmalar tarafından üretilen EPS'ler üç ana grup altında toplandırılmıştır. Bunlar;

1) Hücre yüzeyine bağlı olan kapsüler polisakkaritler (CPS), 2) Hücre duvarının bileşeninde bulunan polisakkaritler (LPS), 3) Dış ortama salınan veya hücre yüzeyi ile zayıf bağlarla bağlanmış polisakkaritler (LAM) olarak adlandırılmaktadır.

LAM'ler, gıda üretim endüstrisinde geniş kullanım alanına sahiptir. Mikroorganizmalar tarafından üretilen polisakkaritler karbohidrat içeriklerine göre homopolisakkaritler ve heteropolisakkaritler olarak adlandırılmıştır. EPS’nin moleküler ağırlığının 1- 2×106arasında olduğu gösterilmiştir(Sreenivas ve diğerleri, 2010).

Mikrobiyal EPS’lerin immun sistemi sitümüle ettiği, hücreyi fagositoza, faja, antibiyotik ve toksik maddelere karşı koruduğu bildirilmiştir. Bununlsa birlikte, EPS’ nin epitel yüzeylere tutunması, otoagregasyon ve koagregasyonda önemli olduğunu açıklamıştır. Mikroorganizmalar tarafından üretilen EPS’nin mikroorganizmayı mide ve bağırsak sistemindeki stres koşullarına özellikle asit ve safraya karşı direnç sağlamasına yardımcı olduğu bildirilmiştir (Iwona ve diğerleri, 2015).

Yapılan araştırmalarda, Bullera, Candida, Cryptococcus, Debaryomces, Lipomyces, Pichia, Pseudozyma Rhodotorula ve Sporobolomyces cinsi mayaların EPS ürettikleri gösterilmiştir. Mayalarda, EPS üretiminin sekonder metabolizmayla ilgili olduğu açıklanırken, EPS'lerin moleküler yapısı ve fiziksel özellikleri de birçok faktöre bağlıdır.

31

Bu faktörler; besi ortamının bileşenleri, asitlik (pH), sıcaklık, oksijen konsantrasyonu olarak gösterilmiştir (Rusinov ve diğerleri, 2010).

Bir araştırmada, Lipomyces, Pichia, Kluyveromyces, Debaryomyces, Candida, Torulopsis, Bullera ve Brettanomyces cinsi mayaların laktozlu besi ortamda geliştirildiğinde galaktooligosakkarit polimeri üreterek Bifidobakterlerin gastrointestinal sistemde üreme ve gelişmini teşvik ettiği bildirilmiştir. Bir diğer araştırmada, Rhodotorula glutinis maya tarafından üretilen mannoz, glikoz ve arabinozdan oluşan polimerin antioksidan, antiviral ve antitümör aktivitelere sahip olduğu bildirilmiştir. Mayalardan elde edilen eksopolisakkaritlerin biyoaktif gıda bileşenleri olabileceği düşünülmektedir. Cryptococcus laurentii maya tarafından üretilen EPS'nin, kan serumunda kolesterol ve trigliserit seviyelerinin düşürdüğü bildirilirken, EPS'nin bir gıda katkı maddesi olarak kullanılması 2002'de patentlenmiştir (Satyanarayana ve Kunze,2009). Bir çalışmada, üzüm, konserve ve humus örneklerinden izole edilen 132 adet mayanın EPS üretimleri araştırılmıştır. İzole edilen 3 adet mayanın yüksek miktarda EPS ürettiği gözlenmiştir. İlgili mayanın moleküler düzeyde tanımları yapılmış ve bunların Cryptococcus humicolus olduğu gösterilmiştir. Suşlar arasında bir suşun EPS üretiminin daha yüksek (2.046 g/L) olduğu bulunmuştur (Bao ve diğerleri, 2010).

Bir araştırmada, ülkemizde üretilen köy ve süzme yoğurtlarında bulunan mayaların sayısı, tanımlamaları ve bazı probiyotik özellikleri araştırılmıştır. Araştırmada, 52 adet Yoğurt örneği kullanılmış ve bu örneklerde toplam mayaların sayımı gerçekleştirilmiştir. Köy yoğurtlarından toplam 22 adet maya suşu izole edilmiş, tanımları API® / ID 32C kit ile gerçekleştirilmiştir. Tanımlama sonuçlarına göre bunların; 14 adedinin Saccharomyces kefir, 7 adedinin Cryptococcus humicola ve 1 adedinin Saccharomyces cerevisiae olduğu belirlenmiştir. Bu suşların EPS üretimleri sırası ile; 5,67-10,83, 2,79-7,19 ve 4,37 g/L olarak tespit edilmiştir. Süzme yoğurtlardan izole edilen ve tanımlanan 4 adet S. kefir ve 1 adet S. cerevisiaekültürlerinin EPS üretimleri sırası ile; 1.40-8,20 ve 2,40 g/L olarak bulunmuştur (Uysal, 2016). Bir diğer araştırmada, kefir vekefir granüllerinden izoleedilen ve tanımlanan1 adet S. kefir suşunun EPS üretimleri 2,19-9,86 g/L arasında tespit edilmiştir (Asadikoutmehr, 2015).

32

Mayaların farklı karbonhidrat içeren besi ortamlarında farklı miktarlarda EPS ürettiği bildirilmiş ve en yüksek EPS üretiminin sakkaroz içeren besi ortamında gerçekleştiği gösterilmiştir (Pietro ve Rosa,2014).

2.7.2. Mayaların antimikrobiyal aktiviteleri

Probiyotik mikroorganizmalar patojen mikroorganizmaları inhibe ederler. İnhibisiyonu besin maddelerine rekabet, adezyon ve çeşitli antimikrobiyal veya metabolitlerin oluşturması ile gerçekleştirirler. Birçok çalışmada ökaryotik probiyotiklerin Clostridium albicans, E. coli, Salmonella typhi, Shigella dysenteriae, Vibrio cholerae, Salmonella enteritidis, Clostridium difficile gibi patojenlerin üremelerini inhibe ettiği ve patojenleri öldürdüğü gösterilmiştir Ökaryotik probiyotiklerin patojen mikroorganizmaların epitel hücrelere tutulmasını önleyerek patojenik etkilerini önlediği bildirilmiştir. Ökaryotik probiyotikler patojen mikroorganizmaları direkt antagonistik veya değişik metabolitler salgılayarak ya da farklı enzimleri salgılayarak inhibe ederler (Filho-Lima vediğerleri, 2000).

S. cerevisiae var boulardii suşunun gıda ve mukozal reseptörlere kolonize olarak ve patojenlerle rekabet ederek patojenlerin önlenmesinde etkili oluduğu açıklanmıştır (Filho- Lima ve diğerleri, 2000). Probiyotik S. cerevisiae mayasının hücre duvarının dış tabakasında bulunan mannanın patojenlere karşı koruyucu etkisinin olduğu ve patojenlerin bu tabakaya bağlanarak intestinal epitel hücrelere bağlanmalarının önlediği bildirilmiştir (Spring ve diğerleri, 2000).

Probiyotik mayaların antimikrobiyal aktiviteleri iki yönlü olarak araştırılmaktadır. Bunlar; probiyotik mayaların patojen bakteriler üzerindeki inhibisiyon etkileri ve probiyotik mayaların starter LAB'ler üzerindeki antagonistik/simbiyotik ilişkileri şeklinde incelenmektedir. Probiyotiklerin patojen mikroorganizmalar üzerinde antagonistik aktiviteleri arzulanan bir özellik olarak gösterilirken, bunların starter bakteriler üzerinde inhibisiyon etkilerinin olması arzulanmamaktadır. Yapılan birçok araştırmalarda probiyotik mayaların patojen mikroorganizmalar üzerinde inhibisiyon etkilerinin olduğu gösterilmiştir.

33

Probiyotik mayalar patojen mikroorganizmalar üzerindeki antagonistik aktivitelerini birçok mekanizma ile gerçekleştirirebilirler. Bunlar besi ortamına rakebet etmesi, bulunduğu ortamdaki asitliliğin yükseltilmesi ile pH’nın düşürülmesi, yüksek miktarda etil alkol üretimi ile etanolun patojenler üzerinde osmatik basıncı artırması, epitel hücrelere adhezyonu ve çeşitli antimikrobiyal maddeler (toksin, mikosin gibi) salgılayarak veya metabolitler üreterek antagonistik aktiviteleri gerçekleştirdiği mekanizmalardır(Suzuki ve diğerleri, 2001).

Bir çalışmada, S. cerevisiae mayasınınprotein veya glikoprotein yapısındaolan"Mycocin" antimikrobiyal madde ürettiği gösterilmiş ve bu ajanın bazı mikroorganizmaların hücre membran fonksiyonuna zarar verdiği gösterilmiştir.Antimikrobiyal ajan olarak üretilen "Mycocin" birçok maya cinsinde (Saccharomyces, Candida, Cryptococcus, Debaryomyces, Kluyveromyces, Pichia, Torulopsis, Williopsis ve Zygosaccharomyces gösterilmiştir (Golubev, 2006). Bazı mayalarda, örneğin Candida lipolytica hücre dışına salgılanan proteaz enziminin antimikrobiyal aktivite özelliği gösterdiği belirtilmiştir (Šalomskienė ve Mačionienė, 2009).

Ökaryotik probiyotiklerin C. albicans, E. coli, S. typhi, S. dysenteriae, V. cholerae, S. enteritidis ve C. difficilegibi patojen bakteriler üzerinde antagonistik aktivitelerinin olduğu bildirilmiştir (Czerucka ve Rampal, 2002). Bir araştırmada mayalardan elde edilen amin bileşik ekstraktınınE. coli ve Staphylococcuscinsibakteriler üzerinde toksik etkisinin olabileceği açıklanmıştır (Viljoen, 2006). Debaryomyces hansenii mayasının Closteridium tyrobutyricum ve C. butyricum bakterileri üzerinde antimikrobiyal aktivitelerinin olduğu gösterilmiş, antimikrobiyal ajanın maya tarafından hücre dışına salgılanan antimikrobiyal bileşiklerden ileri geldiği bildirilmiştir (Fatichenti ve diğerler, 1983).Bir araştırmada, biranın bozulmasında yer olan B. Egateriumve L. plantarum bakterilerinin K. apiculata ve K. thermotolerans mayalar ile inhibe edildiği bildirilmiştir ( Bilinski ve Case, 1989).

Bir çalışmada Fransız kırmızı peynirinde bulunan patojen Listeria bakterisiniGeotrichum candidum mayası tarafından üretilen D-3-phenyllactic ve D-3-indollactic asit maddelerinininhibe ettiği bildirilmiştir (Cavalero ve Cooper, 2003).

Andreas ve diğerleri, (2010) Feta peynir ve çocuk gaita örneklerinden izole ettikleri mayalar ile bazı standart maya suşlarının antimikrobiyal etkilerini bazı probiyotik ve

34 patojen bakteriler üzerinde araştırmışlardır. Araştırmada, toplam 21 adet S. cerevisiae, K. Lactis, D. Hansenii,S. boulardi, C. albicans ve C. parapisolosis maya suşları kullanılmıştır. Bu suşların antagonistik aktiviteleri probiyotik Lactobacillus casei ATCC 334, Lactobacillus reuteri DSM 20016 ve patojen bakteriler olarak; Clostridium tyrobutyricum NCDO1754, Bacillus cereus, Clostridium sporogenes C2210, Enterococcus faecalis EF1, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus ve Yersinia enterocolitica suşları üzerinde incelenmiştir. Araştırmacılar, maya suşlarının hiçbirinin test edilen probiyotik veya patojen bakteriler üzerinde inhibisiyon aktivitesinin olmadığını göstermişlerdir.

Ülkemizde bazı fermente ürünlerden izole edilen probiyotik maya suşlarının patojen ve probiyotik mikroorganizmalar üzerindeki antimikrobiyal aktiviteleri araştırılmıştır. Bir araştırmada ülkemizin geleneksel yoğurtlarından izole edilen 4 adet Cryptococcus humicola, 2 adet Saccharomyces cerevisiae ve 9 adet Saccharomyces kefyr suşunun antimikrobiyal aktiviteleri Lactobacillus acidophilus ATCC 4356, Candida albicans ATCC 90028ve Pseudomonas auroginosa ATCC 278853 test mikroorganizmaları üzerinde araştırılmıştır. Araştırmadan elde edilen sonuçlara göre; maya suşlarının P. auroginosa suşu üzerinde inhibisiyonlarının sırası ile; 20,10-26,12 mm, 23,57-30,30 mm ve 16,74-25,77 mm zon çaplarında inhibisiyon gösterdiği tespit edilmiştir. Suşların probiyotik L. acidophilus üzerinde inhibisyonlarının sırası ile; 28,13-32,54 mm, 32,31-38,22 ve 22,91- 33,15 mm zon çaplarında olduğu belirlenmiştir. Aynı araştırmada,hiç bir maya suşlunuın patojen C. albicans ATCC 90028 üzerinde inhibisyon etkisinin olmadığı gösterilmiştir (Uysal, 2016).

Bir araştırmada, 9 adet maya suşunun Pseudomonas sp., Klebsiella sp., Bacillus sp., E. coli sp. ve Staphylococcus sp.bakterileri üzerinde antagonistik aktiviteleri araştırılmıştır. Araştırmadan elde edilen sonuçlara göre;, tüm suşların Bacillus sp. cinsi bakteriler üzerinde, 9 maya suşunun Pseudomonas sp. ve Klebsiella sp. bakterileri üzerinde, 7 adet suşun Bacillus sp. cinsi üzerinde, 6 adet suşun E. coli sp. ve 5 adet suşun Staphylococcus sp. cinsi bakteriler üzerinde inhibisiyon aktivitelerinin olduğu bildirilmiştir (Mangala ve Nilanjana, 2017).

Candida bombicola mayası tarafından üretilen glikolipidlerin (Sophorosides)’lerin S. aureus ve C. albicans üzerinde antagonistik aktivite gösterdiği bildirilmiştir. Bir çalışmada

35

C. intermedia mayasının Listeria bakterilerinin çoğalma ve üreme sayısını azalttığı gösterilmiştir. Aynı mayanın C. intermedia ve K. marxianus mayaları üzerinde antagonistik aktivite gösterdiği ve t suşlarının üremelerini azalttığı bildirilmiştir (Goerges ve diğerleri, 2006). Bir diğer araştırmada, Pichia norvegensis (WSYC592), C. krusei, ve K. Marxianus maya suşlarının patojen L. monocytogenes bakterinin üremesini azalttığı gösterilmiştir (Goerges,2011).

Bir çalışmada süt kaynaklı (D.hansenii, P. fermentans, C. tropicalis, W.anomala) mayalardan elde edilen hidrofobik-peptid bileşiklerinin antilisterial aktivitelerinin olduğu bildirilmiştir.Mayalarınantilisterial aktivitlerinin mayalar tarafından üretilen termostabil hidrofobik-peptid bileşiklerinden kaynaklandığı açıklanmıştır(Hatoum ve diğerleri,2012).

Son yıllarda, fermente gıdaların üretiminde kombine starter LAB'ler ve starter destekleyici mayaların kullanımları ilgi odağı olmuştur. Fermente süt ürünlerinin üretiminde kullanılacak olan maya ve starter bakterilerinin birbirleri üzerinde inhibisyon aktivitelerinin olmaması önemli kiriterlerden biridir. Kombine kültürlerinbirbirleri üzerindeki destekleyici ve sinsergestik aktivitelerinin olması önemli olarak görülmüştür (Viljoen,2001).

Fermente süt ürünlerinin üretiminde kullanılan maya ve LAB bakteri kombinasyonu, ürüne özel karakteristik özellikler kazandırırken, ürünün kalitesinide arttırmaktadır. Kombine kültürler ile yapılan ürünlerde mayalar vitamin, üreme faktörleri, aromatik bileşikler, CO2 ve etanol gibi bileşikler üreterek son ürünün kalitesini arttırdığı açıklanmıştır (Satyanarayana ve Gotthard, 2009). Ayrıca, kombinasyonda yer alan mayalar ile starter bakteriler birbirlerinin metabolizmalarını olumlu yönde etkileyerek farklı aromatik organik bileşiklerin oluşumlarına katkı sağlarken, son ürüne özgül özellikler kazandırırlar. Mayaların proteolitik ve lipolitik enzim aktivitelerileri sonucu bazı aromatik bileşiklerin oluşumuna ve bu şekilde ürüne özgül aromanın kazandırılmasına katkı sağladığı gösterilmiştir. Starter LAB’lerin ürettikleri laktik asit (laktat) mayalar tarafından katabolize edilerek, ortam pH’sının daha fazla düşmesine engel olurken, LAB’lerin sürekli metabolik aktivitelerinin devamlığını sağlayarak son ürün kalitesini olumlu yönde etkilediği de bildirilmiştir (Addis ve diğerleri,2001).

36

Bir araştırmada, starter destekleyici mayalar ile starter LAB’ler arasında uygun kombinasyonlar oluşturulmuş ve mayaların LAB’lerin üremeleri üzerindeki etkileri incelenmiştir. Bu amaçla, 9 adet maya suşu ile 3 adet Lactococcus ve 1 adet Lactobacillus paracasei subsp. paracasei LB11 bakterileriile kullanılmış ve kombinasyonlar oluşturulmuştur. Araştırmadan elde edilen sonuçlardan, tüm maya suşlarının2 adet Lactococcus suşunun üremelerini etkilemediği, diğer bir adet Lactococcus suşunun üremesini ise sitümüle ettiği bildirilmiştir. Tüm maya suşlarından yalnız 3 adet suşun L. paracasei bakterisinin üremesiniönemli derecede sitümüle ettiği bildirilmiştir (Gadaga ve diğerleri,2001a).

Bir araştırmada, S. kefyr’in 23 suşunun iki adet starter Lactococcusbakteri suşları ile kombinasyonlar oluşturarak mayaların sinergestik etkileri araştırılmıştır. Araştırmadan elde edilen sonuçlara göre maya suşlarının her iki adet LAB’lerin üremesini de az bir şekilde artırdığı bildirilmiştir. Mayalar tarafından üretilen aromatik ve aromatik olmayan bileşiklerden (etanol, karbon dioksit, 2-metil propanal, 2-metil-propanol, 3-metil bütanol) fermente süt ürünlerine karakteristik aromanın sağladığını açıklanmıştır (Gadaga ve diğerleri, 2001b).

2.7.3. Mayaların antibiyotik duyarlılıkları

Mayalar, genelikle birçok ilaca karşı dirençlilik gösterir. Mayaların çoklu ilaç dirençlilikleri çalışmalarla gösterilmiş ve sonuçların çoğunluğu S. cerevisiae ve patojen C. albicans türlerinden elde edilmiştir. S. cerevisiae mayada çoklu ilaç direncinin çok katmanlı hücre duvarı ve kromozomda bulunan PDR1p geni ile Gal4p transkripsiyon faktörü tarafından kodlandığı gösterilmiştir. Mikroorganizmalarda PDR1p ve transkripsiyon düzenleyicilerin görevisentezlendikleri özel protein yapısında bileşiklerle çeşitli ilaçların toksik etkilerinin önlenmesidir. Antibiyotik direnci; bir mikroorganizma türünün bazı suşlarının antibiyotikten etkilenmemesi veya antibiyotiğe duyarlı bir suşun çeşitli direnç mekanizmalarından biri ile dirençli hale gelmesi olarak tanımlanır. Kazanılmış antibiyotik direnci mikroorganizmaların kromozomunda meydana gelen mutasyonlarla veya dirençli bir mikroorganizmanın direnç geninin duyarlı bir mikroorganizmayatransferi ile ortaya çıkar (Addis ve diğerleri, 2001).

37

Min-Tze, (2011), Plazmid DNA kodlu antibiyotik direnç geni taşıyan herhangi bir mikroorganizmanın probiyotik olarak kullanımının mümkün olamayacağını bildirmiştir. Bir çalışmada, S. cerevisiae, S. boulardii, K. lactis, D. hansenii, C. parapsilosis ve Isaatchenkia orientalis maya türlerinde plazmid DNA kodlu antibiyotik direnç geni taşıyan plazmidlerin varlığı araştırılmış ve maya türlerinin hiç birinde bu plazmide rastlanılmadığı açıklanmıştır. Bir diğer araştırmada 20 adet maya suşunun ampisilin (10 ve 25 μg/ml), kloramfenikol (30 μg/ml), eritromisin (5 ve 15 μg/ml), penisilin (10 μg/ml), streptomisin (25 μg/ml), tetrasiklin (30 μg/ml)gibi farklı antibiyotiklere karşı dirençliliklerini araştırılmıştır. Tüm suşların test edilen antibiyotiklere karşı dirençli olduğunu gözlemişlerdir (Syal ve Vohra, 2013).

Bir çalışmada, köy ve süzme yoğurtlarından izole edilen 14 adet S. kefir,C. humicolave S. cerevisiae suşlarının;penisilin (10 μg), ampisilin (10 μg), gentamisin (10 μg) ve kloramfenikol (30 μg) antibiyotiklerine karşı duyarlılıkları araştırılmıştır. Elde edilen sonuçlar CLSI standardına göre değerlendirilmiş ve suşların tümünün belirtilen antibiyotiklere karşı %100 dirençli oldukları tespit edilmiştir (Uysal, 2016).

Mangala ve Nilanjana, (2017), yaptıkları bir çalışmada 9 adet maya suşunun 10 farklı antibiyotiğe karşı duyarlılıklarını araştırmışlardır. Araştırmada, Amoksisilin (30 μg/ml), Ampisilin (20 μg/ml), Gentamisin (10 μg/ml), Ketokonazol (10 μg/ml), Levofloksasin (10 μg/ml), Rifampisin (20 μg/ml), Vankomisin (20 μg/ml), Tetrasiklin (30 μg/ml), Tigesiklin (20 μg/ml), ve Trimetoprim (20 μg/ml) antibiyotikleri kullanılmıştır. Araştırmadan elde edilen sonuçlara göre; 8 adet suşun Amoksiline, 3 adet suşun Ampsiline,1 adet suşun Gentamisine, 2 adet suşun Ketokonazola, 6 adet suşun Levofloksasine, tüm suşların Rifampisin, 9 adet suşun Vankomisin, 4 adet suşun Tetrasikline, 3 adet suşun Tigesiklin ve 5 adet suşun Trimetoprime direçli olduğu bildirilmiştir. Araştırıcılar, farklı maya suşlarının antibiyotik duyarlılıkların farklı olabileceğini açıklamışlardır.

2.7.4. Mayaların gastrointesitinal sistem (pH ve Safra tuzu) stresine karşı toleranslılıkları

Mayalar, değişik stres koşullarından olan safra tuzları, organik asitler, pH, sıcaklık dereceleri gibi etkenlere karşı dayanaklıdırlar. Mayalar hücre içi enzimleri ile gastrointestinal sistem streslerine karşı dayanaklılık gösterir. Funguslar, maya ve küfler asitli ortamlarda aktivitelerini sürdürebilen asit dirençli mikroorganizmalardır. Mayalar,

38 pH4-6,0, küfler pH2-8,5 aralığında üreme yeteneğindedirler. Mikroorganizmaların çoğunluğu yüksek asitli ortam olan pH 2,0'yi tolere yeteneği gösteremezken, mayalar bu ortamlarda canlılıklarını koruyabilirler. Sindirim sisteminde midenin düşük pH’sı ve pepsin enzimin antimikrobiyal etkisi birçok mikroorganizmanın bağırsak sistemine girişinde etkili bir bariyer oluşturur (Saarela ve diğerleri,2009).

Probiyotik mikroorganizmaların karşılaştıkları bir diğer engelde ince bağırsak sisteminde canlılıklarını koruyabilmelidir. İnce bağırsak sisteminde bulunan safra tuzları ve pankreatin probiyotik mikroorganizmalar için uygun olmayan koşullardır. Bilindiği gibi gıdaların ince bağırsaktan geçiş süreleri 1 ile 4 saat arasında farklık gösterir. İnce bağırsak sisteminin pH’sı bazik olup, yaklaşık olarak 8,0’ dir. Probiyotik mikroorganizmaların seleksiyonunda %0,15 ile %0,30 arasındaki safra tuzu konsantrasyonu dikkate alınmaktadır. Belirtilen safra tuzu konsantrasyonları insan kullanımına uygun olarak önerilmektedir.

Mangala ve Nilanjan, (2017), araştırmalarında farklı kaynaklardan izole ettikleri 20 adet maya suşunun probiyotik özelliklerini araştırmışlardır. Bu suşlardan yalnız 12 adet suşun 35°C'depH 2'de iyi bir üreme yeteneği gösterdiklerini bildirmişlerdir. Aynı araştırıcılar, suşların %0,20-1,5 safra toleranslılıklarını incelemişlerdir. Suşların toleranslılıklarının farklı olduğunu gözlemlemişler ve bazı suşların %0,6 safrayı iyi bir şekilde tolere edebildiğini açıklamışlardır.

Probiyotiklerin safraya karşı toleranslı olması, ince bağırsaktan geçerek kalın bağırsakta bulunan epitel hücrelere ulaşma ve tutulma fırsatı bulunması probiyotiklerin seleksiyonlarında önemli bir kriter olarak bildirilmiştir. Yapılan bazı araştırmalarda Saccharomyces, Debaryomyces veKluyveromyces cinsi maya türlerinin safra tuzunu tolere edebilirliği gösterilmiştir(Van der ve diğerleri, 2005).

Probiyotik mayalarla yapılan araştırmalarda, S. cerevisiae mayanın %0,3 oksaltı pH 2,5 da tolere edebildiği açıklanırken (Van ve diğerleri, 2005),S. cereviceae ve K. lactis kültürlerinin %0,15 safrayı düşük pH 3,0’te tolere ettiği bildirildirilmiştir(Kourelis ve diğerleri, 2010).Bazı çalışmalarda, gastrointestinal sistem koşullarına Torulaspora delbrueckii, D. hansenii, Kluyerveromyces. lactis, K. marxianus,K. lodderae gibi

39 mayaların toleranslılıkların yüksek olduğu bildirilirken, bu mayaların probiyotik olarak kullanımlarının uygun olabileceği düşünülmüştür (Psanive Kotzekidou, 2006).

Andreas ve diğerleri (2010), araştırmalarında Feta peynir ve çouk gaita örneklerinden izole ettikleri mayaların probiyotik özelliklerini araştırmışlardır. Feta peynir örneklerinden 5 adet Saccahromyces cerevisiae ve 2 adet Kluyeveromyces lactis ve 1 adet Debaromyces hansenii maya suşu izole etmişlerdir. Çocuk gaita örneklerinden 2 adet Saccahromyces boulardi ve 4 adet Candida albicans suşunu izole edip, tanımlamışlardır. Araştırmada, ayrıca birer adet S. cerevisiae, D. Hansenii ve C. parapisolosis standart maya suşlarını da kullanmışlardır. Tüm suşların pH 3’te 3 saat inkübasyonları ile inhibisiyonlarını belirlemişlerdir. Feta peynir örneklerinde izole edilen S. cerevisiae kültürlerinin inhibisyonlarının %89,80-96,73, K. Lactis suşlarının inhibisyonlarının %77,28 ve %89,63 ve D. Hansenii suşunun inhibisyonunun %94,74 olarak tespit etmişlerdir. Çocuk gaita örneklerinde izole edilen 2 adet S. boulardi suşunun inhibisyonlarının %94,78 ve %97,30 ve 4 adet C. albicans suşunun inhibisyonlarının %91,38-94,37 arasında olduğunu göstermişlerdir. Standart S. cerevisiae, D. Hansenii ve C. parapisolosis suşlarının inhibisyonlarının sırası ile; %97,09, 597,39 ve %96,71 olarak bildirilirken, tüm suşların inhibisyonlarının %77-97 arasında değiştiğini açıklamışlardır.

Feta peynir örneklerinde izole edilen 4 adet S. cerevisiae kültürünün %0,3 safra ortamında inhibisyonlarının %6,16-99,74 arasında tespit edilmiş ve 1 adet suşun bu ortamda %21,10 oranında sitümülasyonu bildirilmiştir. K. lactis’in 2 suşunun inhibisyonlarının %6,73 ve %8,54 olduğu ve 1 adet D. hansenii suşunun sitümülasyonunun %94,74 olduğu bulunmuştur. Çocuk gaita örneklerinden izole edilen 2 adet S. boulardi suşunun inhibisyonları %7,25 ve %8,41 olarak belirlenmiştir. 4 adet C. albicans suşunun1 adetinde safranın %18,27 oranında sitümülasyonu bildirilirken, diğer 3 adet suşun inhibisiyonlarının %1,78-9,02 arasında olduğu bulunmuştur. Standart S. cerevisiae veD. hansenii kültürlerinde safranın üremeleri sırası ile; %2,80 ve 22,55 oranlarında sitümüle ettiği belirlenmiştir. 1 adet C. parapisolosis suşunun inhibisyonunun %20,33 olduğu gösterilmiştir (Andreas ve diğerleri, 2010).

Gösterilen bazı araştırmalarda, , safra tuzunun bazı maya tür veya suşlarının üremelerini belirli bir oranlarda inhibe/sitümüle edebileceği bildirilmiştir. Safradirenci mikroorganizmalarda, BSH (bile salt hidroliz) enzim aktivitesi ile gerçekleşmektedir.

40

Enzim safra tuzunu hidroliz ederek, konjuge safra asitini konjuge olmayan safra asiti (çökelti) haline dönüştürür. Hidrolizasyon sonucunda glisin ve turine bileşikleri oluşturulur ve bu ürünlerin mikroorganizmaların üremelerini sitümüle ettiği gösterilmiştir (Kourelis ve diğerleri, 2010b).

2.7.5. Mayaların agregasyon (koagregasyon ve otoagregasyon) ve hücre yüzeyinin hidrofobik özellikleri

Agregasyon, toplanma, bir araya gelme, kümeleşmedir. Mikroorganizmalar koagregasyon özelliği ile bulunduğu yüzeye ve birbirlerine yapışarak biyolojik bir bariyer oluşturur. Probiyotik mikroorganizmaların agregasyon özelliğine sahip olması probiyotik açıdan önemli bir kriterdir Agregasyon, otoagregasyon ve koagregasyon olmak üzere iki şekilde meydana gelir. Otagregasyon, aynı türe ait mikroorganizmaların birbirlerine tutunması ileoluşturdukları hücre kolonileridir. Koagregasyon, farklı türe ait iki mikroorganizmanın birbirine tutunmasıdır. Koagregasyon ile patojen miroorganizmalarınhücre doku reseptölerine girişi engellenmekte ve probiyotik mikroorganizmaların bulunmasında patojenlerin epitel hücrelere tutunması engellenmektedir (Aparna, 2013).

Mikroorganizmaların epitel yüzeye tutunması agregasyon ile birlikte hidrofobisitedir.Agregasyon ile hidrofobisite arasında doğrudan bir ilişkinin olmadığı çalışmalarla gösterilmiştir. Hidrofobisite, konak hücre yüzeyinin hidrofob oluşu ve yüzey yükleri ile ilişkilidir (Del Re ve diğerleri, 2000).

Bir araştırmada, C. albicans, C. tropicalis ve C. glabrata mayalarının bazı patojen bakteriler ile koagregasyon gerçekleştirdiği bildirilirken, maya-bakteri koagregasyonunun ekzopolisakkarit, lektin ve protein-protein intraksiyonundan ileri geldiği açıklanmıştır. (Kevin ve diğerleri 1998) .

Probiyotik mayaların probiyotik LAB’ler ile koagregasyonları bazı araştırmalarla gösterilmiştir. Bir çalışmada, fermente süt ürünü olan kefirden 12 adet L. kefir suşu izole edilip,S. lipolytica CIDCA 812 maya suşu ile koagregasyonlarını araştırılmıştır. Araştırmalar, yalnız 6 adet L. kefir suşunun test maya suşu ile koagregasyon gösterdiğini bildirilirken, L. kefir'in hücre yüzeyindeki bir proteinin intrekasiyonda önemli olduğunu açıklamışlardır (Marina ve diğerleri, 2009).

41

Mayaların hücre yüzeyleri glukanlar ve mannanlar gibi karbohidratlarla kitinden oluşur. Bu bileşenler mayaların koagregasyon ve koadhezyon olaylarında önemli rol oynadığı gösterilmiştir (Millsap ve diğerleri, 1998).

Son yıllarda, mayaların fermente gıda ürünlerinin üretiminde kullanımı ve kombine maya starter LAB kültürlerin geliştirilmesinde kullanımı gibi çalışmalar yapılmaktadır. Ayrıca, maya-maya entraksiyon çalışmalarıda sürdürülmektedir. Bir araştırmada, probiyotik S. cerevisiae kültürününCandida zemplinina , Torulaspora delbrueckii ve Metschnikowia pulcherrima mayalar ile kombine edilerek koagregasyonları incelenmiş ve S. cerevisiae'nın M. pulcherrima ile yüksek koagregasyon gösterdiği bildirilmiştir. Bu iki kültürün sinergestik etkileşimleri sonucu üretilecek üründe daha iyi aroma bileşiklerinin gelişminin sağlanacağı açıklanmıştır (Mohand ve diğerleri, 2012).

Probiyotik özelliği gösteren maya ve starter LAB’lerin koagregasyonları ve biyofilm oluşturmalarının önemli yararlar sağlayabileceği bazı çalışmalar ile açıklanmıştır. Bir araştırmada, probiyotik S. cerevisiae’nın starter Lactobacillus bakterileri ile koagregasyonları araştırılmış ve arzulanan sonuçlar elde edilmiştir (Furukawa ve diğerleri, 2010). Bir diğer çalışmada, S. cerevisiae’nın Pediococcus damnosus kültürüile koagregasyon yeteneğinin olduğu gösterilmiştir (Peng ve diğerleri, 2001). Ülkemizde yapılan bir çalışmada, köy yoğurtlarından izole edilen 4 adet C. humicola, 2 adet S. cerevisiae ve 9 adet S. kefyrmaya suşunun intestinal sistemde bulunan probiyotik L. acidophilus ATCC 4356 ile koagregasyonları araştırılmıştır. Bu suşların L. acidophilus bakterisi ile koagregasyonlarının sırası ile; (%28,73-39,12), (%54,2-58,56) ve (%40,14- 43,4) aralığında bulunduğu gösterilmiştir. Araştırmacılar, aynı maya suşlarının E. coli ATCC 25922 ile koagregasyonlarınıaraştırmış ve elde edilen sonuçlar sırası ile; (%46,1- 51,87), (%21,26-80,46) ve (%36,82-60,06) arasında bulunmuştur. Maya suşlarının C. albicans ATCC 90028 suşu ile koagregasyonları sırası ile; (%49,75-53,65), (%38,65- 46,58) ve (%42,66-48) arasında olduğu gösterilmiştir (Uysal, 2016).

Okamoto ve diğerleri (2013), yaptıkları bir çalışmadaS. cerevisiae BY4741 suşununL. plantarum ML 11-11 ile koagragasyonu ve biyofilm oluşturma yeteneğini araştırmışlardır. Maya hücre duvarında bulunan negatif yüklü mannan bileşiğinin, L. plantarum bakterisinin hücre duvarındabulunan positif yüklü proteinin elektrostatik koagregasyonundan sorumlu olduğunu açıklamışlardır.

42

Bir araştırmada, L. paracasei H9 ve S. cerevisiae kültürlerinin %40 oranında koagregasyon gösterdiği tespit edilmiştir. Araştırıcılar, bakterinin hücre duvarındaki proteinin ve mayanın hücre duvarındaki polisakkaritlerin koagregasyondansorumlu olduğunu bildirilmiştir (Xie ve diğerleri, 2012).

2.7.6. Mayaların antikolesterol aktivitesi

Yüksek kolesterol ile bağlantılı olan kalp-damar hastalıkları, batılı ülkelerdeki en önemli ölüm nedenlerinden biridir. Bu sebeple, serum kolesterol seviyelerinin düşürülmesi, özellikle kalp-damar hastalıklarının önlenmesi bakımından büyük önem taşımaktadır (Lim ve diğerleri, 2004). Bugüne kadar gerçekleştirilen çeşitli çalışmalar, bağırsaktaki probiyotik LAB’lerin kolesterol seviyelerini belirgin bir düzeyde düşürdüğünü göstermiş ve bu nedenle probiyotiklere duyulan ilgi daha da artmıştır. Probiyotiklerin antikolesterol mekanizması tam olarak belirlenememekle birlikte, bu konuda çeşitli mekanizmalar öne sürülmüştür (Jackson ve Lovergrove, 2002). Bu mekanizmalar arasında;

1) Bazı bağırsak bakterileri gıdalarla alınan kolesterolü metabolize ederek, kan ve dolaşım sistemine geçişini azalttığı, 2) Bazı mikroorganizmaların bağırsaklarda kolesterol öncül maddelerini veya kolesterol seviyesini düşürdüğünü, 3) Bazı Lactobacillus’ların safra tuzlarını parçalamasıyla bunların karaciğer tarafından emilminin engellendiğini ve böylece safra tuzu absorbe edemeyen karaciğerin, safra tuzu sentezlemek için fazla miktarda serum kolesterolünü kullanması sonucunda serumda kolesterol miktarını azalttığı açıklanmıştır.

Serum kolesterolünü yükselten faktörler arasında özellikle diyet yolu ile alınan kolesterol mevcuttur. Son yıllarda, fiziksel, kimyasal ve biyolojik yöntemler geliştirilerek çeşitli gıdalarda kolesterol seviyesinin düşürülme çalışmaları uygulanmaktadır. Bu yöntemler arasında probiyotik gıda ürünlerinin tüketimi daha fazla ilgi çekmektedir. İnsanların mide ve bağırsak sisteminde bulunan probiyotik maya türlerinin kolesterol asimilasyonu hakkındaki bilgiler yetersizdir. Bazı araştırmalarda Saccharomyces cerevisiae mayasının antikolesterol aktiviteleri gösterilmiştir ( Ness ve diğerleri, 1998).

43

Psomas ve diğerleri (2003), bebek dışkı ve yunan feta peynirilerinden izole ettikleri 8 adet maya türü ile S. serevisiae var boulardii kültürünün kolesterol asimilasyonlarını araştırmışlardır. Mayaların kolesterol asimilasyonlarını %0,3 oksal ve 224,2 μg/ml kolesterol içeren YEPG sıvı besiortamında 37 °C’de, farklı sürelerde inkübe ederek belirlemişlerdir. Mayaların 72 saat inkübasyonu sonucunda kolesterol asimilasyonlarının, S. serevisiae var boulardiikültüründe %93,2, S. cerevisiae KK1 %95,7, S. cerevisiae 832 %91,7, Isaatchenkia orientalis KK5.Y.1 %93,6, Candida albicans KK2.1 %%,.4, Candida parapsilosis KK6.P %4,5, Kluyveromyces marxianus 630 %2,7, Kluyveromyces lactis 570 % 4,0, Pichia farinosa 441 %7.9 tespit edilmiştir. Araştırmalar, Isaatchenkia orientalis KK5.Y.1 kültürünün diğer maya türlerine göre daha yüksek miktarda %93,6 oranında kolesterolü asimile ettiğini bildirirken, bu mayanın diğer LAB bakteri ve Bifidobacteria’lere kıyasla kolesterol asimilasyon aktivitesinin daha yüksek olduğunu açıklamıştır.

Mayaların üreme aşamalarında kolesterolü kullanarak asimile ettiği ve bu şekilde kolesterol seviyesini düşürdüğü açıklanmıştır. Lactobacillus’larda kolesterol giderminin, kolesterol misellerinin kararsız hale getirilmesi ve çökmesi ile meydana geldiğini açıklanmıştır. Yapılan birçok laboratuvar çalışmasında S. cerevisiae kültürünün kolesterolü asimile ettiği bildirilmiştir (Shinabarger ve diğerleri,1989).

Bir çalışmada, S. boulardii ve S. cerevisiae mayaların doymamış yağ asitlerin asimilasyon aktivitelerini incelemiştir. S. cerevisiae var boulardii kültürünün S. cerevisiae’ya kıyasla hücrede yağ ve yağ asitlerini daha yüksek miktarda biriktirdiği bildirmiştir. Araştırmacılar, mayaların kolesterol asimilasyonunlarının hücrede entroesteraz enzimi aktivitesi ile kolesterolün degredasyonlarının gerçekleştirdiğini açıklamışlardır (Krasowska ve diğerleri, 2007).

Aloğlu ve diğerleri (2016), yaptıkları bir çalışmada çiğ süt ve geleneksel yöntemle hazırlanan fermente gıdalardan peynir, sucuk, sosis, yoğurt, kefir, tarhana örneklerinde 150 adet maya suşu izole etmişlerdir. Bu suşların kolesterol asimilasyonlarının %1,36-%73,33 arasında olduğunu bildirmişlerdir. Aynı araştırımacıların yaptıkları bir diğer çalışmada, geleneksel olarak üretilen bir çeşit peynirden izole edilen probiyotik Ctyptococcus humicola M5-2 suşunun in vivo koşullarda yüksek kolesterol asimilasyon yeteneğine sahip olduğunu bildirmişlerdir. Araştırmacılar, suşun in vitro olarak zengin diyetle beslenen sıçanlarda HDL/LDL, kolesterol ve trigliserit seviyeleri üzerindeki etkilerini de araştırmışlardır.

44

Araştırmadan elde edilen sonuçlara göre; C. humicola M5-2 suşun trigliserit seviyesini %25 oranında düşürdüğü ve kolesterolü %73,33 oranında asimile ettiği şeklinde açıklanmıştır (Aloğlu ve diğerleri, 2015).

2.7.7. Mayaların antioksidant ve antikanser aktiviteleri

Antioksidanlar, hücrede okside olabilen moleküllerin oksidasyonunu engelleyen, geciktiren bileşiklerdir. Antioksidanlar oksitlenmeye karşı koruma sağlar. Bu nedenle bunlara “indirgeyici ajanlar” adı verilmektedir. Bütün kanserlerin %80-90’ının potansiyel olarak kontrol edilebilir nedenlerden oluştuğu ve %30-35’inin doğrudan diyetle ilgili olduğu düşünülmektedir. Kanser oluşturucu diyetetik ve çevresel faktörler, aktif oksijen ve süperoksit olarak adlandırılan radikalleri üretme kapasitesi olduğu gösterilmiştir (Hazem, 2011).

Birçok çalışmada fermente süt üretiminde kullanılan laktik asit bakterilerinin antioksidatif aktiviteye sahip olduğu bildirilmiştir. Laktik asit bakterileri süperoksit anyonunu ve hidrojen peroksidi indirgeme özelliğine sahiptirler. Bu bakteriler, antioksidatif aktivitelerini farklı mekanizmalarla gerçekleştirirler. LAB’lerin hidroksil radikalini indirgeyici bazı bileşenler ürettiği düşünülmektedir. Bunlar; bakteri tarafından üretilen metabolik bileşenler veya 4-20 kDa peptit ve aminoasit özellikle triptofan gibi süt proteinlerinin parçalanma ürünleri olabilmektedir (Virtanen ve diğerleri, 2006).

Mayaların oksijenli radikallere karşı antioksidan aktiviteleri enzimatik veya enzimatik olmayan yollarla gerçekleşir. Ayrıca, mayaların antioksidan aktiviteleri oksijenli radikal molekülerinin gidermi ve mayaların üremeleriyle oksijenin absorbisyonu ile ilgili olduğu da bildirilmiştir. Yapılan bir çalışmada, mayaların antioksidan özelliklerinin hücre içi bazı bileşimlerinden kaynaklandığı gösterilmiştir. Bu bileşimler; glutatyon (glutathione), Millard tepkime ürünleri ve sülfür içeren aminoasitlerdir. Wang ve diğerleri (2004), çalışmalarında depolanan sığır köftesinden izole ettikleri iki adet mayanın antioksidan aktivitelerinin asit reaktif bileşiklerden ileri geldiğini açıklamışlardır. Jan ve diğerleri,(2009), Saccharomyces cerevisiae, Coriolus versicol (mantar) ve Agrobacterium bakteri tarafından üretilen β- glukan’nın hastalıkların tedavisinde immün düzenleyici etkilerinin birbirinden farklı olduğunu bildirmişlerdir.

45

Yapılan bir çalışmada, probiyotik Saccharomyces cerevisiae mayasının tavuklarda antioksidan aktiviteleri ve ağırlık artışları üzerindeki etkilerini araştırılmıştır. Araştırmacıların elde ettikleri sonuçlardan; probiyotik mayanın tavuk antioksidan enzim aktivitesi gösteren [süperoksit dismutaz (SOD); katalaz (CAT); glutahion peroksidaz (GPx); malondialdehid (MDA)] enzimlerini sitümüle ettiğini ve tavukların 42 gün sonra ağırlıklarının kayde değer miktarda arttığını bildirilmişlerdir (Tagang ve diğerleri, 2013).

Probiyotiklerin önemli özellikleri arasında, antimutajenik ve antikarsinojenik aktivitesi de yer almaktadır. Mutajenler sıklıkla stres sırasında ya da bakteriyel veya viral enfeksiyonlar nedeni ile olabilmekte, fakat yaygın olarak besinler yoluyla alınmaktadır. Endojen DNA hasarı, yaşlanmaya veya yaşla ilgili çeşitli hastalıklara yol açan nedenlerden biridir. Lökositlerle savunma mekanizması H2O2, O2 ve NO gibi çeşitli bileşiklerinde dahil olduğu salınması yoluyla olmaktadır. Bu nedenle bakteriyel ve viral enfeksiyonlar sırasında savunma mekanizmaları, DNA hasarının ve mutasyonların meydana gelmesine neden olmaktadır. Epidemiyolojik çalışmalarda, probiyotik alımının kolon kanserinde bir azalmaya yol açtığıda bildirilmiştir. Canlı probiyotik bakterilerin bağırsakta canlılıklarını devam ettirmeleri ile mutajenlerin inhibisyonu sağlanmaktadır (Hirayama ve Rafter, 2000).

Probiyotikler, bağırsakta karsinojenik toksik maddeleri modifiye veya enzimleri detoksifiye ederek inaktif duruma getirerek, kolon kanserinin önlenmesinde etkili olurlar. İnsanların ve mikroorganizmaların sahip oldukları doğal antimutajenler bu canlıların orijinal genotiplerinin korunması ve DNA’larının zarar görmemesi konusunda çok önemli roller üstlenmektedirler. Bazı probiyotiklerin endojen toksik ve genotoksik bileşiklerin mutasyonları önlediği ve promutajenleri mutajenlere ve karsinojenlere dönüştürebilen NAD(P)H dehidrogenaz (azoreduktaz, itroredüktaz, glukuronidaz, glukozidaz ve dehidroksilaz) fekal enzim aktivitesini azalttığı belirlenmiştir. Bağırsakta yaygın olarak bulunan yararlı ve zararlı bakterilerin enzim aktiviteleri birbirinden farklılık gösterirler. Glükuronidaz enzimi Enterobacterium ve Clostridium’larda yüksek miktarda bulunur. Bazı probiyotik LAB bakterileri antikarsinojenik ve antimutajenik aktivite gösterirler. Bağırsaklarda laktik asit bakterilerinin gelişmesi sonucu oluşan laktik asit ve yoğurdun sahip olduğu diğer antibakteriyel özellikler, kalın bağırsakta indol ve skatol gibi fenolik bileşikler üreterek canlı dokuya zarar veren ve hatta kanser başlangıcına neden olanbilen bazı patojen bakterilere karşı engelleyici bir etki gösterirler. Yoğurtta bulunan kalsiyumun, kansere karşı koruyucu özelliğe sahip olduğu ileri sürülmüş, ayrıca laktik asit bakterileri tarafından antitümör özellik gösteren bileşiklerin sentezlendiği

46 bildirilmiştir. Bazı LAB’lerin tümör hücrelerini inhibe ettiği ve prokarsinojenleri karsinojen maddelere dönüştürebilen mikroorganizmalara karşı antagonistik aktivite gösterdiği bildirilmektedir. Bununla birlikte, LAB’ler kolonda fermantasyon ile bütirik asit oluşturarak, in-vitro olarak kolon kanseri hücrelerinin büyümesini yavaşlattığı açıklanmıştır (Devaraja ve Rashmi, 2016).

Bağırsak sistemindeki saprofit mikroflora, kanserojen maddelerden fenol ve nitritten nitrozamin üretir. Ayrıca, istenilmeyen bazı bakteriler aminlerin ve amonyağın emilimini zorlaştırır. Bu da kanser oluşumunda, tansiyon ve kolesterolün yükselişinde etkili olan nitrozaminlerin serumda artışına neden olur. Probiyotikler enterik bakterilerin aktivitelerini engelleyerek, serumda nitrozaminlerin artışını dolaylı olarak önlerler ve azoredüktaz, β glukoronidaz, nitroredüktaz gibi fekal enzimlerin aktivitesinde bir düşüşe ve bu şekilde karsinojenik olmayan maddelerin karsinojen maddelere dönüşümemesinde önemli rol alırlar. Ayrıca, fekal bakterilerin sayısını azaltarak, prokarsinojen enzim aktivite miktarını azalttığı da gösterilmiştir (Zhu ve diğerleri, 2011).

İn-vitro ve in-vivo olarak yapılan birçok araştırma probiyotiklerin antimutajenik antikanserojenik etkiye sahip olduklarını ortaya koymuştur. B. longum kolon, böbrek ve göğüs kanserini teşvik eden "2-amino-3-metilimidazol kuinolin" (IQ)’ yu inhibe etmekte veya azaltmaktadır. Ayrıca B. longum, kolonda glukuronit konjugelerin hidrolizinden çoğunlukla sorumlu olan β-glukuronidaz aktivitesini azaltarak toksik ve kanserojenik maddelerin oluşmasını önlemektedir (Rowland ve diğerleri, 1998).

Probiyotiklerin oral alınması ile bağırsak mukozasında yoğunluğu artarken, gram negatif anaeroblar ve Enterococcus cinsi bakterilerin yoğunluğunu düşürdüğü, fekal üreme pH değerini azalttığı, kolon kanseri gelişiminde etkili olan bazı bakteriyel enzim aktivitelerini de azaltmaktadır. Probiyotiklerle beslenen yetişkinlerde fekal pH ortamın ve fekal amonyak düzeyinin daha düşük olduğu bulunmuştur. Ayrıca β-glukuronidaz, nitroredüktaz, glikolik asit ve hidrolaz aktivesinin de azaldığı saptanmıştır. Probiyotikler tarafından kolon kanserinin baskılanması mekanizmalardan birisi de konakçı immun sisteminin aktivasyonudur (Bezkorovainy, 2001 ).

Uluslararası Kanser Araştırma Ajansına göre Aflatoksin B1’in in vitro ve in vivo olarak genotoksik etki gösterdiği ve insanlar için birinci derecede kanserojen olarak sınıfılandırılması

47 söz konusudur. Aflatoksin B1’in akciğer, böbrek ve kolon gibi organlarda tümörler oluşturduğu ve bu toksinin hedef organının karaciğer olduğu bildirilmiştir. Bir çalışmada, laktik asit bakterileri ile S. cerevisiae'nın mikotoksinleri adsorbe ettiğini, toksik maddenin etkisinin azaltıldığı gösterilmiştir S. cerevisiae kültürünün mikotoksin etkinliğinin hücre duvarı ile ilgili olduğu açıklanmıştır (Shetty ve Jespersen, 2006). Aflatoksin, gıdalarda Aspergillus flavus ve A. parasiticus küflerinin üremesi ile oluşturulan kanserojenik toksik bir bileşik olup, insan sağlığı açısından önemli risk oluşturmaktadır (Prathap ve Shetty, 2006).

48

49

3. GEREÇ VE YÖNTEM

3.1. İzolasyon

3.1.1. İzolasyonda kullanılan hurma çeşitleri

Hurmalardan mayaların izolasyonunda Libya, Irak ve Türkiye’den satışa sunulan toplam 16 hurma çeşiti kullanılmıştır. Araştırmada kullanılan hurma örneklari Çizelge 3.1’de gösterilmiştir.

Şekil 3.1. Araştırmada kullanılan hurma örnekleri

No. Hurma Örnekleri Hurma üretici Örnek Adedi

1 Deben Tunus 3 2 Barhi Iraq 5 3 Deglet Iraq 4 4 Saidi Mısır 2 5 Deben2 Türkiye 3 6 Khadrawi Iraq 3 7 Barhi Iraq Iraq 3 8 Majhool Libya Libya 2 9 Almadine Sudii Arabistan 3 10 Kodos Filistin 3 11 Zahidi Iraq 5 12 Halawi Mısır 3 13 Baghadad Iraq 2 14 Mabroom Mısır 4 15 Saidi Taorgha Libya 3 16 Khastawi Iraq 2

3.1.2. Hurmalardan mayaların izolasyonları ve sayımı

Araştırmada, farklı hurmalardan mayaların izolasyonları Yeast Extract Glucose Chloramphenicol (YGC) Agar besi ortamı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Örneklerden 10 g alınıp, steril kumda öğütülerek peptonlu solüsyonda (%0,1 Pepton, %0,85 Sodyum klorid, pH 7,0) dilüsyonları yapılmıştır. Dilüsyonları gerçekleştirilen örnekler YGC Agar besi ortamına inoküle edilerek, 37°C’de 48 saat inkübe edilmiştir. YGC besi ortamının içeriği Çizelge 3.2’ de belirtilmiştir. İnkübasyon bitiminde besiortamında üreyen maya

50 kolonilerinden seleksiyonlar yapılıp, YPD (Yeast Extract- Peptone-Dextrose) Broth besi ortamında 37°C’de 48 saat aktifleştirilmiştir (Diosma ve diğerleri, 2014). YPD broth besi ortamının içeriği Çizelge 3.3’ te gösterilmiştir.

Mayalar için seçici besiyeri olan YPD (Yeast Extract-Peptone-Dextrose) katı besiyerine ekim yapılmış, 37˚C’de 48 saat inkübe edilmiştir. Katı besi ortamı üzerinde gelişen kolonilerin sayımları gerçekleştirilmiştir. Maya sayıları kob/g (koloni oluşturan birim) (cfu/g) olarak hesaplanmıştır (Halkman, 2000).

Kob/g (cfu/g) = [Koloni sayısı × Seyreltme faktörü/Dilüsyon tüpünden petri kabına aktarılan örnek hacimi (ml)].

Seyreltme Faktörü = [1/Seyreltme Oranı]

Çizelge 3.1. YGC Agar besi ortamının içeriği

Maddeler g/L D- Glukoz 20 Yeast Extract 10 Pepton 20 Kloramfenikol 0,1 Agar-agar 15 Besi ortamının pH´ sı 0,01 M HCl / 0,01 M NaOH ile 6,5 ’e ayarlanıp, 121ºC da 15 dk. sterilize edilmiştir.

Çizelge 3.2. YPD Broth besi ortamının içeriği

Maddeler g/L D-Glukoz 20 Yeast Extract 10 Pepton 20 Besi ortamının pH´ sı 0,01 M HCl / 0,01 M NaOH ile 6,5 ’e ayarlanıp, 121°C da 15 dk. sterilize edilmiştir.

51

3.1.3. Mayaların muhafazası

Maya izolatları, YPD sıvı besiyerinde ard arda iki kez aktifleştirilmiştir. Aktif kültürlerden 800 µL alınıp, 2 mL’ lik ağzı kapaklı 800 µL gliserol içeren steril cryo tüplere ilave edilerek, -80°C’de muhafazaya alınmıştır (Diosma ve diğerleri, 2014).

3.1.4. İzole edilen mayaların 18S rRNA ile tanımlanması

Farklı hurma örneklerinden toplam 16 maya izolatı elde edilmiştir. Bu izolatların moleküler tanımlamaları 18S rRNA dizi analizi ile gerçekleştirilmiştir. Bu analizler, RefGen Gen Araştırma ve Biyoteknoloji Şirketinde hizmet alımı ile yaptırılmıştır.

3.2. Mayaların EPS Üretimlerinin Belirlenmesi

Hurmalardan elde edilen 16 maya izolatı YPD sıvı besi ortamında ard arda iki kez 37°C’de 48 saat aktifleştirilmiştir. Bu kültürlerin optikal yoğunlukları spektrofotometrede 600 nm’de 0,6 ± 0,2´ye ayarlanmıştır. Optikal yoğunlukları (OD değerleri) ayarlanan maya izolatlarından 5 mL´lik YPD sıvı besi ortamına paralel olarak %2 oranında inoküle edilmiştir. Kültürler, 37°C’de 24-48 saat inkübe edilmiştir. İzolatların ekzopolisakkarit (EPS) üretimleri Marsahll ve Rawson (1999)’un yöntemine göre yapılmıştır. Bu kültürlerin EPS üretimleri OD 490 nm dalga boyunda paralelli olarak spektrofotometrede okunmuş ve sonuçlar standart glukoza göre belirlenmiştir (g/L).

Fenol- sülfürik asit metodu

Örneklerin üzerine 0,5 mL fenol (Sigma) ve 5 mL saf sülfürik asit (Merck) eklenerek, 10 dk oda sıcaklığında bekletilmiştir. Kültürler, iyice karıştırılarak 37°C’de 15-20 dk bekletildikten sonra optik yoğunlukları 490 nm’de (Digilab Hitachi U–1800) spektrofotometrede ölçülmüştür (Bao ve diğerleri,2010). Kültürlerin EPS üretim miktarlarını belirlemek amacıyla 5–100 g/L arasında değişen oranlarda glukoz kullanılarak standart bir eğri elde edilmiş ve bu standarda göre örneklerin EPS miktarları g/L olarak belirlenmiştir (Dubois ve diğerleri, 1956).

52

3.3. Mayaların Asit Dirençliliklerinin Belirlenmesi

Maya izolatlarının asit dirençlilikleri Chung ve diğerlerinin (1999) yöntemine göre belirlenmiştir. İzolatlar, 37˚C’de 48 saat inkübe edilerek iki kez ardarda YPD sıvı besi ortamında aktifleştirilip, optik yoğunlukları 600 nm’ de spektrofotometrede 0,6 ± 0,2’ ye ayarlanmıştır. Optik yoğunlukları (OD) ayarlanan maya kültürleri %2 oranında pH’ı 1M HCl ile 2, 3 ve 6,5’ a ayarlanan YPD sıvı besiyerine inoküle edilmiştir. Kültürler, 37±1°C’ de 24 saat inkübasyonaterk edilmiştir. İnkübasyon bitiminde kültürlerin hücre yoğunlukları 600 nm (Digilab Hitachi U–1800) spektrofotometrede ölçülmüştür. Elde edilen optik yoğunluk (OD) değerleri kontrol grubu pH 6,5 olan sıvı besiyerinde üreyen kültürün OD yoğunlukları ile karşılaştırılarak, farklı pH değerlerinin mayalar üzerindeki yüzde inhibisyon değerleri verilen denkleme göre bulunmuştur.

% İnhibisyon= [(OD1- OD2)/ OD1] x 100

[OD1: Kontrol besi ortamında (pH 6,5 ) daki hücre yoğunluğu; OD2: Mayaların farklı pH ortamlarında hücre yoğunlukları].

3.4. Mayaların Safra Dirençliliklerinin Belirlenmesi

Maya izolatlarının safra tuzu dirençlilikleri Chung ve diğerlerinin (1999) metoduna göre tespit edilmiştir. Bu çalışmada, standardize edilmiş safra asitlerinin karışımı olan Oxgall (Sigma) kullanılmıştır. Maya kültürleri 37˚C’de 48 saat inkübe edilerek iki kez ard arda YPD (Yeast Extract Peptone Dextrose) besi ortamında aktifleştirilmiştir. Aktif kültürlerin optikal yoğunlukları 600 nm’ de (Digilab Hitachi U–1800) spektrofotometrede 0,6±0,2’ ye ayarlanmıştır. Optik yoğunlukları (OD) ayarlanan kültürler %2 oranında, % 0,0 (kontrol) ve 0,30 oranında safra içeren YPD sıvı besiyerine inoküle edilmiştir. Kültürler, 37±1 ˚C’ de 48 saat inkübe edilmiş, inkübasyon bitiminde üreyen hücrelerin OD yoğunlukları 600 nm’de spektrofotometrede ölçülmüştür. Elde edilen OD değerleri kontrol grubu (%0,0 safra içeren YPD sıvı besiyerinde gelişen kültürün yoğunluğu) ile karşılaştırırılmış ve %0,30 safra konsantrasyonunun üreme üzerindeki yüzde canlılık/sitümülasyon değerleri verilen denkleme göre belirlenmiştir.

% Canlılık =100 - { [(OD1- OD2)/ OD1] x 100}

53

[OD1: Kontrol besi ortamında (%0,0 safra) ortamndaki hücre yoğunluğu; OD2: %0,30 safra konsantrasyonunda kültürlerin hücre yoğunlukları.].

3.5. Mayaların %Otoagregasyon Özelliklerinin Belirlenmesi

Mayaların %otoagregasyon özelliklerinin belirlenmesi Kos ve diğerlerinin (2003) metoduna göre yapılmıştır. Maya izolatları YPD (Yeast Extract-Peptone-Dextrose) sıvı besi ortamında 37°C’de 48 saat inkübe edilerek aktifleştirildikten sonra 10,000 rpm’ de 15 dakika santrifüj edilmiştir. Santrifüj sonrası elde edilen maya pelleti iki defa fosfat tamponu (PBS; %0,02 KCl, %0,144 K2HPO4,%0,8 NaCl, %0,024 KH2PO4, pH:7,0) ile yıkandıktan sonra aynı tampon içinde tekrar çözülmüştür. Elde edilen çözeltinin optikal yoğunluğu spektrootometrede 600 nm’de 0,6±0,02 ’ye ayarlanmıştır. Çözelti oda sıcaklığında 4 saat bekletildikten sonra çözeltinin üst kısım fazından 0,1 mL alınarak, OD’si spektrofotometrede 600 nm’de okunmuş ve aşağıdaki formül kullanılarak maya izolatlarının otoagregasyon yüzdeleri hesaplanmıştır.

% Otoagregasyon= [ ( OD1-OD2)/ OD1] x 100

[OD1: İlk optikal dansite ; OD2: 4 saat sonraki optikal dansite].

3.6. Mayaların %Koagregasyon Özelliklerinin Belirlenmesi

Maya izolatlarının Escherichia coli ATCC 25922, Candida albicans ATCC 90028 ve Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 suşları ile koagregasyon özelliklerinin belirlenmesi (Rinkinen ve diğerlerinin, 2003) yöntemine göre yapılmıştır. İzolatlar, YPD (Yeast Extract- Peptone-Dextrose) sıvı besi ortamlarında 37°C’de 48 saat inkübe edilerek aktifleştirilmiştir. Aktif kültürler, 5000 rpm’de 15 dakika santrifüj edilmiş ve elde edilen maya pelletleri iki defa fosfat tamponu (PBS, pH 7,0) ile yıkandıktan sonra, aynı tampon içinde tekrar çözülmüştür. Her bir örneğin OD’si (Digilab Hitachi U–1800) spektrootometrede 600 nm’de 0,6±0,02 ’ye ayarlanmıştır. Eşit miktarlardaki maya kültürü ile test bakteri örnekleri aynı tüp içinde 10-15 saniye Vortex ile karıştırılmış, oda sıcaklığında 4 saat bekletilmiştir. İnkübasyon sonrası kültür karışımların üst kısmından 0,1 mL alınarak, OD değerleri 600 nm dalga boyunda spektrofotometrede okunmuştur. Kültürlerin koagregasyon yüzdeleri aşağıdaki formüle göre hesaplanmıştır.

54

% Koagregasyon = [(OD1+OD2) –2(OD3)]/ (OD1+OD2) x100

[OD1: Maya kültürlerinin optikal dansitesi; OD2: Test bakterilerin optikal dansitesi; OD3: Karışık kültürün 4 saat sonundaki optikal dansitesi].

3.7. Mayaların Hidrofobisite Özelliklerinin Belirlenmesi

Maya izolatlarının hidrokarbonlara tutunması (Zárate ve diğerlerinin, 2002) yöntemine göre belirlenmiştir. İzolatlar, YPD broth besiyerlerinde 37°C’de 48 saat inkübe edilerek aktifleştirilmiştir. Aktif kültürler, 10,000 rpm’de 15 dakika santrüfüj edilmiş ve elde edilen pelletler, iki kez fosfat tamponu (PBS; %0,02 KCl, %0,144 K2HPO4, %0,8 NaCl,

%0,024 KH2PO4, pH:7,0) ile yıkanmış ve 0,1 M KNO3 (pH 6,2) tamponu içinde tekrar

çözülmüş ve spektrofotometrede OD’si 600 nm’de 0,6±0,02’ye ayarlanmıştır (OD1). Maya süspansiyonundan 2 mL alınarak, 0,5 mL p-ksilen (polar olmayan nötral çözücü), kloroform (monopolar asidik çözücü), etil asetat (monopolar bazik çözücü) ve toluen hidrokarbonlarının üzerine konulmuş, oda sıcaklığında 10 dakika bekletilmiştir. Oda sıcaklığında 10 dakikalık ön inkübasyondan sonra ayrılan iki faz 2 dakika Vorteks ile karıştırılarak tekrar oda sıcaklığında 4 saat bekletilmiştir. İnkübasyondan sonra sulu fazın

OD’si spektrofotometrede 600 nm’de ölçülmüştür (OD2). Maya izolatlarının hidrokarbonlara mikrobiyal tutunma yüzdesi aşağıda belirtilen formüle göre hesaplanmıştır.

% Hidrofobosite = [(OD1-OD2)/ OD1 ] x 100

[OD1: Maya kültürlerinin optikal dansitesi; OD2: Karışık kültürün 4 saat sonundaki optikal dansitesi].

3.8. Mayaların Antimikrobiyal Aktivitelerinin Belirlenmesi

Mayaların gıda veya bağırsakta patojen olan bazı mikroorganizmalar üzerindeki antimikrobiyal etkisi Roostita ve diğerlerinin ( 2011) metoduna göre belirlenmiştir.

Maya izolatları YPD broth besiyerlerinde 37˚C’de 48 saat inkübe edilerek aktifleştirilmiştir. Aktif kültürlerin OD değerleri 600 nm’de 0,6±0,2’ye ayarlandıktan

55 sonra, 5000 rpm’de 15 dakika santrifüj edilmiştir. Santrifüj sonunda oluşan berrak kısım (süpernatant) steril koşullarda alınarak, 0,45 μm’lik mikrofiltrasyonla sterilize edilmiştir.

Çalışmada, test mikroorganizmaları olarak Escherichia coli ATCC 11229, Candida albicans ATCC 10239 ve probiyotik Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 suşları kullanılmıştır.

P. aeunoginosa ATCC 278853 ve Escherichia coli ATCC 11229 suşu Nutrient Broth sıvı besi ortamında, Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 suşu MRS sıvı besi ortamında ve Candida albicans ATCC 10239 suşu YPD sıvı besi ortamında ayrı ayrı 37°C’de 24-48 saat inkübe edilerek aktifleştirilmiştir. Aktif kültürler %0,875’lik serum fizyolojik çözeltisi ile 2 kez yıkandıktan sonra, hücre yoğunlukları 0,5 nolu Mc Farland standartına göre ayarlanmıştır. Yoğunluğu ayarlan kültürlerden steril plaklara 100 μ/L aktarılmış ve bu işlemden sonra daha önceden 121 °C’de 15 dk otoklavda sterilize edilmiş ve yaklaşık olarak 50 °C’ye kadar soğutulmuş olan mikroorganizmaların katı besi ortamlarına 20 mL eklenmiş, besi ortamı ve test mikroorganizmalarının homojen bir şekilde karışımı sağlanmıştır. Petri kaplarını donması için buzdolabında 2 saat bekletilmiş ve üzerinde 0,6 cm çapındaki steril çubukla kuyular açılmıştır. Kuyuların tabanları steril agarla tekrar sıvanmıştır. Kuyulara test maya izolatlarının mikrofiltrasyonla elde edilen süpernatantından 100 μL ilave edilmiş ve 37 °C’de 24-48 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda kuyu çevresinde oluşan zonların çapları kumpas ile ölçülmüştür.

3.9. Mayaların Antibiyotik Duyarlılıkların Belirlenmesi

Çalışmada maya izolatlarının gelişimini olumsuz yönde etkileyebileceği düşünülen ve sağlıkta yaygın olarak kullanılan bazı antibiyotikler kullanılmıştır (Bkz. Çizelge 3.4). Maya izolatlarının antibiyotik duyarlıklarının belirlenmesinde disk difüzyon yöntemi kullanılmıştır (Warminska-Radyko ve diğerleri, 2002),(Abudureyimu, M,. 2017).

56

Çizelge 3.3. Araştırmada kullanılan antibiyotikler

No. Antibiyotik Fonksiyon 1 Amoxicillin (P) Hücre duvar sentezini inhibe eder 2 Ampisillin (CN) Protein sentezini inhibe eder

3 Gentamycin(OFX) Nükleik asit sentezini inhibe eder

4 Tetracyclin (PB) Sitoplazmik zar sentezini inhibe eder

5 Trimethoprim (F) Enzimatik oksidasyon olayını inhibe ederler

Maya izolatları YPD sıvı besiyerlerinde 37 °C’de 48 saat iki kez ard arda aktifleştirilmiştir. 121 °C’de 15dk sterilize edilmiş olan YPD katı besiyerinden steril petri kaplarına 20 ml aktarılmış ve donması için oda sıcaklığında bekletilmiştir. Donan besi ortamı üzerine optikal yoğunluğu 0,6 ±0,2’ye ayarlanan maya kültürlerinden 100 μl aktarılmış ve steril drigalski spatülü ile besiortamı üzerinede kültürlerin homojen bir şekilde dağılımı sağlanmıştır. Besiyeri ve kültür içeren petri kapları üzerine araştırılacak olan antibiyotik diskleri yerleştirilmiştir. Petri kapları 37°C’de 36-48 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon bitiminde antibiyotik disk çevresinde oluşan zonların oluşumu kontrol edilmiş, zon çapları kumpas ile milimetrik olarak ölçülmüştür. Elde edilen sonuçlar Clinical and Laboratory Standards Institute kriterlerine göre değerlendirilmiştir (CLSI, 2015).

57

4. DENEYSEL BULGULAR

4.1. Hurmalarden Mayaların İzolasyonları

Araştırmada kullanılan hurma örneklerinde mayaların izolasyonu bölüm 3.1.1’de anlatıldığı gibi belirlenmiştir. Mayaların izolasyonları YGC Agar besi ortamında gerçekleştirilmiştir (Resim 4.1.) YGC Agar besi ortamında üreyen kolonilerden örnekler alınıp, mikroskobik incelemeleri yapılmıştır (Resim 4.1, 4.2).

Resim 4.1. YGC Agar besi ortamında üreyen maya kolonileri ve mayaların mikroskobik büyütmesi görüntüsü

Resim 4.2. Mayaların mikroskobik görüntüsü (100X)

58

4.2. Hurmalarda Mayaların Sayımı

Hurma örneklerinde mayaların sayımı YPD katı besiyerinde tespit edilmiştir. Örneklerde maya sayıları log kob/g olarak Çizelge 4.1’de gösterilmiştir. Hurmalarda maya sayıları 26,50 - 89,17 log kob/g arasında bulunmuştur. Hurma örneklerinde en yüksek maya sayısı 89,17 log kob/g olarak 9 Almadine numaralı örnekte belirlenirken, en düşük sayı 26,50 log kob/g olarak 14 Mabroom numaralı örnekte gözlenmiştir.

Çizelge 4.1. Hurmalarda mayaların sayımları (kob/g)

Sus No Hurma Örnekleri Maya Sayısı (logkob/g) 1 Deben 88,50±0,06 2 Barhi 79,00±0,01 3 Deglet 64,21±0,03 4 Saidi 82,00±0,02 5 Deben2 47,15±0,03 6 Khadrawi 76,05±0,03 7 Barhi Iraq 63,00±0,05 8 Majhool Libya 72,20±0,02 9 Almadina 89.17±0,05 10 Kodos 62,00±0,04 11 Zahdi 39,00±0,06 12 Halawi 69,40±0,01 13 Baghadad 58,01±0,03

14 Mabroom 26,50±0,04

15 Saidi Taorgha 82,09±0,02

16 Khastawi 78,22±0,03

100 80 60 40 20 0

Maya Sayısı (logkob/g)Sayısı Maya Hurma Örnekleri

Şekil 4.1. Hurmalarda mayaların sayımları (log kob/g)

59

4.3. İzole Edilen Maya Suşlarının Tanımlanması

Araştırmadakullanılan hurma örneklerinden toplam 16 maya izole edilmiştir. Bu suşların koloni incelemeleri ile morfolojik incelemeleri yapıldıktan sonra moleküler18S rRNA dizi analiz tanımları gerçekleştirilmiştir.İzolatların moleküler tanımlamaları 18S rRNA dizi analizleri ile gerçekleştirilmiştir. Analizler, RefGen Gen Araştırma ve Biyoteknoloji Şirketinde yaptırılmıştır. Tanımalama sonucunda bu suşların 14 ürünün Pichia kudriavzeviive 2 isinin Kluyveromyces marxianusolduğu belirlenmiştir (Bkz. Çizelge 4.2).

Çizelge 4.2. Hurmalarda izole edilen maya suşlarının moleküler molekü 18S rRNA dizi analizleri

Sus No Hurma Örnekleri İzole Edilen Tanımlanan Maya Suşlarının Kodları Suş Adedi 1 Deben 1 Pichia kudriavzevii JD1 2 Deben2 1 Pichia kudriavzevii JD2 3 Deglet 1 Pichia kudriavzevii JDG 4 Saidi 1 Pichia kudriavzevii JS 5 Barhi 1 Pichia kudriavzevii JB 6 Khadrawi 1 Pichia kudriavzevii JK 7 Barhi Iraq 1 Pichia kudriavzevii JBI 8 Majhool Libya 1 Pichia kudriavzevii JML 9 Almadine 1 Pichia kudriavzevii JAL 10 Kodos 1 Pichia kudriavzevii JKU 11 Zahdi 1 Pichia kudriavzevii JZ 12 Halawi 1 Pichia kudriavzevii JH 13 Baghadad 1 Pichia kudriavzevii JBA 14 Mabroom 1 Pichia kudriavzevii JMA 15 Saidi Taorgha 1 Kluyveromyces marxianus JST 16 Khastawi 1 Kluyveromyces marxianusJKH

4.4. Maya Suşlarının EPS Üretimi

Maya suşlarının ekzopolisakkarit (EPS) üretimleri Marsahll ve Rawson, 1999’un metoduna göre YPD besi ortamında yapılmıştır. Hurmalardan izole edilen maya suşlarının EPS üretimleri 108,53- 452,2 g/L arasında bulunmuştur. En yüksek EPS üretimi 452,2 g/L olarak Pichia kudriavzevii JD2 suşunda tespit edilirken, en düşük EPS üretimi 108,53g/L olarak Kluyveromyces marxianus JST suşunda gözlenmiştir (Bkz. Çizelge 4.3 ve Şekil 4.2).

60

Çizelge 4.3. Hurmalardan izole edilen maya suşlarının EPS üretimleri (g/L)

Sus No Maya Suşları EPS (g/L) 1 Pichia kudriavzevii JD1 160,86±0,01 2 Pichia kudriavzevii JD2 452,2±0,26 3 Pichia kudriavzevii JDG 146,19±0,11 4 Pichia kudriavzevii JS 205,06±0,27 5 Pichia kudriavzevii JB 303,69±0,08 6 Pichia kudriavzevii JK 291,36±0,19 7 Pichia kudriavzevii JBI 207,7±0,01 8 Pichia kudriavzevii JML 238,64±0,39 9 Pichia kudriavzevii JAL 399,30±0,16 10 Pichia kudriavzevii JKU 176,53±0,01 11 Pichia kudriavzevii JKH 171,64±0,19 12 Pichia kudriavzevii JH 187,86±0,08 13 Pichia kudriavzevii JBA 166,03±0,03 14 Pichia kudriavzevii JMA 195,86±0,41 15 Kluyveromyces marxianus JST 108,53±0,55 16 Kluyveromyces marxianus JZ 194,13 ±0,42

500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 EPS (g/L) (g/L) EPS 0

Maya Suşları

Şekil 4.2. Hurmalardan izole edilen maya suşlarının EPS üretimleri (g/L)

Mayaların EPS üretimlerinin belirlenmesinde 5–100 g/L arasında değişen oranlarda glukoz kullanılarak standart bir eğri çıkarılmıştır. Bu standarda göre örneklerin EPS miktarları g/L olarak belirlenmiştir (Bkz. Şekil 4.3).

61

EPS (g/L) 1,4

1,2 1 y = 0.003x + 0.116 0,8 R² = 0.998 0,6

0,4

0,2

0 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

Şekil 4.3. EPS standart eğrisi

4.5. Maya Suşlarının % Otoagregasyon Değerleri

Hurmalardan izole edilen maya suşlarının otoagregasyon özelliklerinin belirlenmesi Bölüm 3.5’te anlatıldığı şekilde yapılmış ve elde edilen otoagregasyon değerleri Çizelge 4.4 ve Şekil 4.4’te verilmiştir. Suşların otoagregasyon değerleri %12,47- 70.96 arasında tespit edilmiştir. En yüksek (%70,96) otoagregasyon özelliği Pichia kudriavzevii JD2 suşunda belirlenirken, en düşük (%12,47) otoagregasyon Pichia kudriavzevii JKU suşunda tespit edilmiştir.

Çizelge 4.4.Maya suşlarının % otoagregasyon değerleri

Maya Suşları %Otoagregasyon Pichia kudriavzevii JD1 %65,25±0,03 Pichia kudriavzevii JD2 %70,96± 0,04 Pichia kudriavzevii JDG %54,02± 0,02 Pichia kudriavzevii JS %39,08± 0,03 Pichia kudriavzevii JB %51,61± 0,06 Pichia kudriavzevii JK %22,94± 0,04 Pichia kudriavzevii JBI %26,99± 0,05 Pichia kudriavzevii JML %43,27± 0,04 Pichia kudriavzevii JAL %24,39± 0,02 Pichia kudriavzevii JKU %12,47± 0,03 Pichia kudriavzevii JKH %33,10± 0,02 Pichia kudriavzevii JH %32,88± 0,05 Pichia kudriavzevii JBA %28,80± 0,03 Pichia kudriavzevii JMA %41,93± 0,02 Kluyveromyces marxianus JST %30,86± 0,01 Kluyveromyces marxianus JZ %57,84± 0,01

62

80 60 40 20

0 %Otoagregasyon %Otoagregasyon

Maya suşları

Şekil 4.4. Maya suşlarının %otoagregasyon değerleri

4.6. Maya Suşlarının %Koagregasyon Değerleri

Hurmalardan izole edilen maya suşlarının Lactobacillus acidophilus ATCC 4356, Escherichia coli ATCC 25922 ve Candida albicans ATCC 90028 suşları ile koagregasyonları Bölüm 1.5’te anlatıldığı şekilde yapılmıştır. Maya suşlarının probiyotik L. acidophilus ATCC 4356 suşu ile koagregasyon yetenekleri %23,42- 48,09 arasında bulunmuştur (Bkz. Çizelge 4.5, Şekil 4.5). Pichia kudriavzevii JB suşuL. acidophilus ile en yüksek koagregasyon yeteneği göstermiştir. Bu suşun test bakteri ile koagregasyonları %48,09 bulunmuştur. Bu test bakterisi ile en düşükkoagregasyon %23,42 olarak Pichia kudriavzevii JK suşunda gözlenmiştir.

Çizelge 4.5.Maya suşlarının L. acidophilus ATCC 4356 ile %koagregasyondeğerleri

Suş Suşuları %Koagregasyon Pichia kudriavzevii JD1 %37,16±0,00 Pichia kudriavzevii JD2 %34,12±-0,01 Pichia kudriavzevii JDG %39,01±0,00 Pichia kudriavzevii JS %24,63±0,00 Pichia kudriavzevii JB %48,09±0,04 Pichia kudriavzevii JK %23,42±0,00 Pichia kudriavzevii JBI %41,84±0,00 Pichia kudriavzevii JM %31,12±0,00 Pichia kudriavzevii JA %39,14±0,00 Pichia kudriavzevii JKU %47,52±0,00 Pichia kudriavzevii JKH %40,15±0,00 Pichia kudriavzevii JH %32,04±0,00 Pichia kudriavzevii JBA %36,11±0,00 Pichia kudriavzevii JMA %29,27±0,01 Kluyveromyces marxianus JST %33,35±0,00 Kluyveromyces marxianus JZ %43,71±0,00

63

60 50 40 30 20 10

0

koagregasyon %

Maya Suşları

Şekil 4.5. Maya suşlarının L. acidophilus ATCC 4356 ile %koagregasyon değerleri

Maya suşlarının E. coli ATCC 25922 ile % koagregasyon değerlerleri %17,31-%53,38 arasında tespit edilmiştir (Bkz. Çizelge 4.6 ve Şekil 4.6).Kluyveromyces marxianus JZ suşu test bakterisi ile en yüksek %53,38 oranında koagregasyon yeteneği göstermiştir. Test bakterisi ile en düşükkoagregasyon %17,31 olarakPichia kudriavzevii JBI suşunda belirlenmiştir.

Çizelge 4.6. Maya suşlarının E. coli ATCC 25922 ile % koagregasyon değerleri

Maya Suşları %Koagregasyon Pichia kudriavzevii JD1 %42,17±0,01 Pichia kudriavzevii JD2 %46,24±0,00 Pichia kudriavzevii JDG %40,14±0,00 Pichia kudriavzevii JS %39,51±0,00 Pichia kudriavzevii JB %33,27±0,00 Pichia kudriavzevii JK %31,19±0,00 Pichia kudriavzevii JBI %17,31±0,00 Pichia kudriavzevii JML %44,1±0,00 Pichia kudriavzevii JAL %51,56±0,00 Pichia kudriavzevii JKU %47,58±0,00 Pichia kudriavzevii JKH %38,0±0,00 Pichia kudriavzevii JH %50,2±0,00 Pichia kudriavzevii JBA %21,58±0,00 Pichia kudriavzevii JMA %41,7±0,00 Kluyveromyces marxianus JST %19,11±0,01 Kluyveromyces marxianus JZ %53,38±0,00

64

60 50 40 30 20 10

0 %koagregasyon

Maya Suşları

Şekil 4.6. Maya suşlarının E. coli ATCC 25922 ile % koagregasyon değerleri

Maya suşlarının C. albicans ATCC 90028 ile %koagregasyon yetenekleri %16,43-54,06 arasında bulunmuştur (Bkz. Çizelge 4,7 ve Şekil 4.7). Pichia kudriavzevii JK test edilen maya suşu ile %54,06 oranında en yüksek koagregasyon yeteneği gösterirken en düşük

koagregasyon %16,43 oranında Pichia kudriavzevii JKU suşunda gözlenmiştir.

Çizelge 4.7. Maya suşlarının C. albicans ATCC 90028 suşu ile % koagregasyondeğerleri

Maya Suşları %Koagregasyon Pichia kudriavzevii JD1 %31,13±0,00 Pichia kudriavzevii JD2 %42,09±0,00 Pichia kudriavzevii JDG %40,23±0,00 Pichia kudriavzevii JS %38,81±0,00 Pichia kudriavzevii JB %39,19±0,02 Pichia kudriavzevii JK %54,06±0,00 Pichia kudriavzevii JBI %47,47±0,00 Pichia kudriavzevii JML %53,68±0,00 Pichia kudriavzevii JAL %48,03±0,00 Pichia kudriavzevii JKU %16,43±0,00 Pichia kudriavzevii JKH %26,12±0,00 Pichia kudriavzevii JH %44,56±0,00 Pichia kudriavzevii JBA %41,08±0,00 Pichia kudriavzevii JMA %37,05±0,00 Kluyveromyces marxianus JST %32,62±0,00 Kluyveromyces marxianus JZ %30,11±0,01

65

60 50 40 30 20 10

%koagregasyon 0

Maya Suşları

Şekil 4.7. Mayaların C.albicans ATCC 90028 suşu ile % koagregasyon değerleri

4.7. Mayaların Hücre Yüzeyinin Hidrofobik Yapısının Belirlenmesi

Maya suşlarının hidrofobisiteleri Bölüm 3.7’de anlatıldığı gibi belirlenmiş ve sonuçlar Çizelge 4.8 ve Şekil 4.8’de verilmiştir. Suşların, p-kesilen, kloroform ve etil asetat ile yüzde hirofobisiteleri, sırası ile; %55,78-86,74, %81,42-84,24ve %52,50-72,23arasında bulunmuştur. p-ksilen çözücü ortamında en yüksek hidrofobisite Pichia kudriavzevii JSsuşunda %86,74 oranında belirlenirken, en düşük hidrofobisite Pichia kudriavzevii JH suşunda%55,78 oranında tespit edilmiştir.

Kloroform çözücü ortamnda en yüksek hidrofobositePichia kudriavzevii JK suşunda %84,24 olarakbelirlenirken, en düşük Pichia kudriavzevii JH suşunda ve %81,42 olarak belirlenmiştir. Suşların etil aset çözücü ortamdaki en yüksek hidrofobisite oranı %72,23 olarak Pichia kudriavzevii JS suşunda belirlenirken, en düşük oran Kluyveromyces marxianus JST suşunda%52,50olarak tespit edilmiştir. Maya suşlarının asidik çözücü olan kloroform çözücü ortamda hidrofobisite özelliklerinin daha yüksek olduğu gözlenmiştir.

Maya suşlarının diğer asidik karakterde olan etil asetata ilgisinin olması, bunların hücre yüzey yapılarının asidik karakterde olabileceğini göstermektedir. Maya suşlarının nötral çözücü olan p-ksilene ilgisinin de olduğu gözlenmiştir. Maya suşlarının her üç çözücüde de

66 hidrofobisite göstermesi, suşların hücre yüzey yapılarının kompleks olduğunu

göstermektedir.

Çizelge 4.8. Maya suşlarının % hidrofobisiteleri

Maya Suşları P-ksilen Kloroform Etil asetat Pichia kudriavzevii JD1 %75,27±0,04 %83,40±0,02 %59,12±0,06 Pichia kudriavzevii JD2 %74,25±0,06 %83,32±0,00 %56,43±0,04 Pichia kudriavzevii JDG %74,55±0,02 %82,52±0,01 %58,19±0,07 Pichia kudriavzevii JS %86,74±0,05 %84,00±0,01 %72,23±0,19 Pichia kudriavzevii JB %82,23±0,10 %83,16±0,04 %54,34±0,04 Pichia kudriavzevii JK %71,00±0,02 %84,24±0,02 %70,69±0,12 Pichia kudriavzevii JBI %72,55±0,04 %83,22±0,05 %56,09±0,09 Pichia kudriavzevii JML %71., 5±0,04 %83,08±0,03 %55,10±0,08 Pichia kudriavzevii JAL %72,80±0,02 %83,33±0,04 %55,31±0,05 Pichia kudriavzevii JKU %72,40±0,07 %84,08±0,05 %54,70±0,12 Pichia kudriavzevii JKH %70,21±0,04 %84,09±0.03 %63,14±0,0 Pichia kudriavzevii JH %55,78±0,10 %81,42±0,12 %60,23±0,04 Pichia kudriavzevii JBA %72,16±0,06 %83,50±0,04 %52,71±0,06 Pichia kudriavzevii JMA %71,18±0,02 %81,58±0,06 %57,42±0,09 Kluyveromyces marxianus JST %73,03±0,08 %83,05±0,05 %52,50±0,05 Kluyveromyces marxianus JZ %70,32±0,04 %83,26±0,02 %55,61±0,00

100 90 80 70 60 50 40 P-ksilen 30 20 Kloroform 10 0

Etil asetat % hidrofobisiteleri %

Maya suşlarının

Şekil 4.8. Maya suşlarının % hidrofobisiteleri

67

4.8. Mayaların Asit Dirençliliklerinin Belirlenmesi

Maya suşlarının asit dirençliliği Bölüm 3.3’te anlatıldığı gibi yapılmıştır. Suşların farklı pH’larda spektrofotometrik olarak hücre yoğunlukları ölçülmüş ve kontrol grubunun (pH 6,5) hücre yoğunluğuna göre düşüşleri %inhibisyon olarak belirlenmiştir (Bkz. Çizelge 4.9 ve Şekil 4.9). Maya suşlarının üreme ortamında asitlik oranının artışına bağlı olarak hücre yoğunluğunda azalma gözlenmiştir. Suşların genelinde, pH 2,0’de hücre yoğunluğunda önemli bir azalma gözlenmiş ve inhibisyon değerleri %96’nın üzerine çıkmıştır. Maya suşlarının pH 2’de inhibisiyonları %33,41-96,78 arasında bulunmuştur. pH 2’ye Pichia kudriavzevii JD1suşunun, diğer suşlara kıyasla daha fazla toleranslı olduğu belirlenmiştir.

Çizelge 4.9. Maya suşlarının pH 2’ de % inhibisiyonları

Maya Suşları pH 2'de % inhibisyon Pichia kudriavzevii JD1 33,41±0,05 Pichia kudriavzevii JD2 37,31±0,11 Pichia kudriavzevii JDG 59,44±0,08 Pichia kudriavzevii JS 46,41±0,21 Pichia kudriavzevii JB 75,46±0,08 Pichia kudriavzevii JK 81,23±0,22 Pichia kudriavzevii JBI 70,11±0,09 Pichia kudriavzevii JML 93,01±0,13 Pichia kudriavzevii JAL 88,22±0,23 Pichia kudriavzevii JKU 90,12±0,14 Pichia kudriavzevii JKH 81,06±0,08 Pichia kudriavzevii JH 91,01±0,05 Pichia kudriavzevii JBA 89,10±0,12 Pichia kudriavzevii JMA 94,13±0,31 Kluyveromyces marxianus JST 87,09±0,07 Kluyveromyces marxianus JZ 96,78±0,00

68

120 100 80 60

'de 40 2 20

0

pH pH % inhibisyon%

Maya suşlarının

Şekil 4.9. Maya suşlarının pH2 derecelerinde % inhibisiyonları

4.9. Maya Suşlarının Safra Dirençliliklerinin Belirlenmesi

Maya suşlarının safra dirençliliklerinin belirlenmesiBölüm 3.4’te belirtildiği gibi yapılmıştır. Maya suşlarının % 0,3 ve kontrol % 0,0 ’lık safra konsantrasyonlarında üremeleri sağlanmış ve % inhibisyon değerleri belirlenmiştir (Bkz. Çizelge 4.10, Şekil 4.10). Maya suşlarının %0,3 safra konsantrasyonunda yüzde inhibisyonları %37,16ile %97,02arasında bulunmuştur. %0,3 safrada en yüksek %97,02inhibisyonu Kluyveromyces marxianus JST suşunda belirlenirken, en düşük inhibisyon %37,16 oranında Pichia kudriavzevii JBA suşunda tespit edilmiştir.

Çizelge 4.10. Maya suşlarının %0,30 safra konsantrasyonunda % inhibisyondeğerleri

Maya Suşları % İnhibisyon Pichia kudriavzevii JD1 47,12±0,18 Pichia kudriavzevii JD2 78,22±0,07 Pichia kudriavzevii JDG 85,02±0,14 Pichia kudriavzevii JS 73,11±0,22 Pichia kudriavzevii JB 91,46±0,16 Pichia kudriavzevii JK 80.05±0,00 Pichia kudriavzevii JBI 96,71±0,09 Pichia kudriavzevii JML 82,29±0,10 Pichia kudriavzevii JAL 70,41±0,16 Pichia kudriavzevii JKU 71,85±0,21 Pichia kudriavzevii JKH 64,15±0,06 Pichia kudriavzevii JH 88,04±0,15 Pichia kudriavzevii JBA 37,16±0,07 Pichia kudriavzevii JMA 89,38±0,14 Kluyveromyces marxianus JST 97,02±0,00 Kluyveromyces marxianus JZ 91,54±0,15

69

120 100 80 60 40 20

% inhibisyon% 0

Maya suşlarının

Şekil 4.10. Maya suşlarının %0,30 safra konsantrasyonunda % inhibisyon değerleri

4.10. Maya Suşlarının Antimikrobiyal Aktivitelerinin Belirlenmesi

Probiyotik olarak kullanımı araştırılan mikroorganizmaların sahip olması gereken en önemli özelliklerden biri de patojen mikroorganizmaları inhibe etme özelliğidir. Bu nedenle çalışmada hurmadan izole edilen 16 maya suşunun 3 referans kültür (Lactobacillus acidophilus ATCC 4356, Candida albicans ATCC 90028, Pseudomonas auroginosa ATCC 278853) üzerine inhibisyon etkileri Bölüm 1.9’da anlatıldığı gibi belirlenmiş ve sonuçlar Çizelge 4.11’de verilmiştir. Bütün suşların probiyotik L. acidophilus ATCC 4356 ve patojen P. auroginosa ATCC 278853 bakterileri üzerinde antgonistik aktivite gösterdiği belirlenirken, hiç bir suş patojen C. albicans ATCC 90028 maya suşu üzerinde inhibisyon etkisigöstermemiştir.

Maya suşlarının probiyotik L. acidophilus ATCC 4356 suşu üzerinde inhibisyonlarının 8,01-19,23 mm zon çapında değiştiği tespit edilimiştir. Test bakteri üzerinde en yüksek antagonistik aktivite Pichia kudriavzeviiJBA suşunda 19,23 mm olarak belirlenirken, en düşük inhibisyon Pichia kudriavzeviiJKU kültüründe 8,01 mm ile gerçekleşmiştir (Bkz. Çizelge 4.11). Pichia kudriavzevii JBA, Pichia kudriavzeviiJBI ve Pichia kudriavzeviiJMA suşlarının L. acidophilus üzerinde inhibisyon zonları Resim 4.3.te gösterilmiştir.

Maya suşlarının patojen P. auroginosa ATCC 278853 suşu üzerinde inhibisyonlarının 10,23-24,17 mmzonu çapında değiştiği tespit edilimiştir. Bakteri üzerinde en yüksek 24,17

70 mm antagonistik aktivite Pichia kudriavzeviiJH suşunda belirlenirken, en düşük inhibisyon Kluyveromyces marxianusJZ kültüründe 10,23 mm ile gerçekleşmiştir (Bkz. Çizelge 4.11). Pichia kudriavzeviiJH, Pichia kudriavzevii JKH ve Pichia kudriavzeviiJBA suşlarının P.auroginosa ATCC 278853 suşu üzerinde inhibisyon zonları Resim 4.4'te gösterilmiştir. Maya suşlarının hiç birinin patojen C. albicans ATCC 90028 suşu üzerinde antimikrobial aktivitesinin olmadığı gözlenmiştir.

Çizelge 4.11. Maya suşlarının test mikroorganizmalar üzerinde antimikrobiyal aktiviteleri

Maya Suşları L. acidophilus ATCC C. albicans ATCC P. auroginosa ATCC 4356 90028 278853 Pichia kudriavzevii JD1 17,01±0,03 - 11,01±0,07 Pichia kudriavzevii JD2 13,21±0,11 - 14,74±0,12 Pichia kudriavzevii JDG 10,21±0,09 - 11,13±0,15 Pichia kudriavzevii JS 9,08±0,15 - 11,21±0,00 Pichia kudriavzevii JB 15,17±0,05 - 15,77±0,00 Pichia kudriavzevii JK 14,21±0,12 - 21,27±0,12 Pichia kudriavzevii JBI 18,00±0,00 - 19,12±0,14 Pichia kudriavzevii JML 17,11±0,04 - 23,16±0,12 Pichia kudriavzevii JAL 16,21±0,16 - 19,26±0,00 Pichia kudriavzevii JKU 8,01±0,03 - 11,37±0,21 Pichia kudriavzevii JKH 19,14±0,01 - 22,02±0,13 Pichia kudriavzevii JH 18,21±0,11 - 24,17±0,06 Pichia kudriavzevii JBA 19,23±0,05 - 20,71±0,09 Pichia kudriavzevii JMA 12,00±0,13 - 14,01±0,13 Kluyveromyces marxianus JST 11,14±0,14 - 13,44±0,03 Kluyveromyces marxianus JZ 12,07±0,11 - 10,23±0,11 (-): İnhibisyon zonu gözlenmemiştir.

Resim 4.3. P. kudriavzevii JBA, JBI ve JMA suşlarının L. acidophilus ATCC 4356 üzerinde antimikrobiyal aktiviteleri

71

Resim 4.4. P. kudriavzeviiJBA, JH ve JST suşlarının P .aeuroginosa ATCC 278853 üzerinde antimikrobiyal aktiviteleri

4.11. Maya İzolatlarının Antibiyotik Duyarlılıklarının Belirlenmesi

P. kudriavzeiive,K. marxianus maya suşlarının Amoksisilin, Ampisilin, Gentamisin, Tetrasiklin, Trimethoprim antibiyotiklerine karşı duyarlılıkları disk difüzyon yöntemine göre belirlenmiştir (Bkz. Çizelge 4,12-4,13). 13 P. kudriavzeiisuşlarının Amoxicillin antibiyotiğine karşı dirençli oldukları belirlenirken, 1 P.kardriavzevii JD2 suşunun bu antibiyotiğe karşı 4,13 mm zon çapı ile duyarlı olduğu gözlenmiştir. 9 P. kudriavzeiisuşununAmpisillin antibiyotiğine karşı dirençli olduğu gözlenmiş ve 3 Pichia kudriavzevii JD2, JK ve JMLsuşlarının bu antibiyotiğe karşı sırası ile; 3,01 mm, 2,71 mm ve 3,78 mm zon çapları ile duyarlı bulunmuştur. 10 P.KardriavzeviisuşununGentamisinantibiyotiğine karşı dirençli olduğu belirlenirken, 2 Pichia kudriavzevii JD2 ve JK suşlarının bu antibiyotiğe karşı sırası ile; 4,11 mm ve 6,85 mm zon çapları ile duyarlı olduğu tespit edilmiştir. 10 P.kardriavzeviisuşunun Tetrasiklin antibiyotiğine karşı dirençli olduğu belirlenirken, 2 Pichia kudriavzevii JD1 ve JD2suşlarının bu antibiyotiğe karşı sırası ile; 5,11 mm ve 5,19 mm zon çapları ile duyarlı olduğu gözlenmiştir. 1P.Kudriavzevii JML suşuTrimetoprim antibiyotiğine karşı 4,09 mm zon çapı ile duyarlı olduğu bulunmuş, diğer 11 suşun bu antibiyotiğe karşı dirençli olduğu tespit edilmiştir (Bkz. Çizelge 4.12 – 4.13).

72

K. marxianus JST ve JZ suşlarınınAmoksisilin, Gentamisin, Tetrasiklin antibiyotiklere karşlı dirençli olduğu tespit edilmiştir. K. marxianusJZ suşun Ampisilin ve Trimethoprimantibiyotiklere karşı sırası ile; 5,71 mm ve 5,38 mm zon çapları ile duyarlı olduğu tespit edilmiştir (Bkz. Çizelge 4,12 -4,13).

Antibiyotik duyarlığı gösteren P. kudriavzeii ve K. marxianus suşlarının antibiyotik duyarlılıkları Resim 2.5.- 2.6. de gösterilmiştir.

Çizelge 4.12. Maya suşlarının antibiyotiklere karşı gösterdiği duyarlılık test sonuçları

Suş Adı Amoxicillin Ampisillin Gentamycin Tetracyclin Trimethoprim 20 μg 10 μg 10 μg 30 μg 5 μg Pichia kudriavzevii JD1 - - - 5,11 - Pichia kudriavzevii JD2 4,13 3,01 4,11 5,19 - Pichia kudriavzevii JDG - - - - - Pichia kudriavzevii JS - - - - - Pichia kudriavzevii JB - - - - - Pichia kudriavzevii JK - 2,71 6,85 - - Pichia kudriavzevii JBI - - - - - Pichia kudriavzevii JML - 3,78 - - 4,09 Pichia kudriavzevii JAL - - - - - Pichia kudriavzevii JKU - - - - - Pichia kudriavzevii JKH - - - - - Pichia kudriavzevii JH - - - - - Pichia kudriavzevii JBA - - - - - Pichia kudriavzevii JMA - - - - - Kluyveromyces marxianus JST - - - - - Kluyveromyces marxianus JZ - 5,71 - - 5,38 (-): Antibiyotiğe dirençli

Çizelge 4.13.CLSI kriterlerine göre antibiyotik duyarlılıklarının değerlendirilmesi

Etki Mekanizması Antibiyotik Dirençli Orta derecede Duyarlı duyarlı Hücre duvarı sentezi inhibitörü Amoxicillin ≤ 11 13-18 ≥ 18 20 μg Hücre duvarı sentezi inhibitörü Ampisilin (AMP) ≤13 14-16 ≥14 10 μg protein sentezi inhibitörü Gentamycin (CN) ≤12 13-14 ≥15 10 μg protein sentezini engeller Tetracyclin 30 μg Nükleik asit sentezi inhibitorü Trimethoprim ≤10 11-15 ≥16 5 μg

73

Resim 4.5. P. Kudriavzeii JD2 suşu içeren agarlı besiortamı ,1: Ampisilin (AMP)

Resim 4.5. K. Marxianus JZ suşu içeren agarlı besiortamı ,0: Kontrol (Boş disk), 2: Trimethoprim

Hurma örmeklerinden izole ve identifiye edilen (16) maya suşlarının probiyotik özellikleri karşılaştırmalı olarak (Bkz. Çizelge 4,14-4,15) de verilmiştir. Bu sonuçlara göre; (2) adet P. kudriavzeii JD1 ve JD2 suşların probiyotik özellikleri diğer suşlara kıyasla daha üstün nitelik gösterdikleri gözlenmiştir.

74

Çizelge 4.14. Maya suşlarının karşılaştırmalı olarak primer probiyotik özellikleri

Maya Suşları pH 2 Safra %0.3 EPS (g/L)

%inhibisyon %canlılık %inhibisyon %canlılık %inhibisyon P. kudriavzevii JD1 33,41±0,05 66.59 47,12±0,18 52.88 160,86±0,01 P. kudriavzevii JD2 37,31±0,11 62.69 78,22±0,07 21.78 452,2±0,26 P. kudriavzevii JDG 59,44±0,08 40.56 85,02±0,14 14.98 146,19±0,11 P. kudriavzevii JS 46,41±0,21 53.59 73,11±0,22 26.89 205,06±0,27 P. kudriavzevii JB 75,46±0,08 24.54 91,46±0,16 08.54 303,69±0,08 P. kudriavzevii JK 81,23±0,22 18.77 80.05±0,00 19.95 291,36±0,19 P. kudriavzevii JBI 70,11±0,09 29.89 96,71±0,09 03.29 207,7±0,01 P. kudriavzevii JML 93,01±0,13 06.99 82,29±0,10 17.71 238,64±0,39 P. kudriavzevii JAL 88,22±0,23 11.78 70,41±0,16 29.41 399,30±0,16 P. kudriavzevii JKU 90,12±0,14 09.88 71,85±0,21 28.15 176,53±0,01 P. kudriavzevii JKH 81,06±0,08 18.94 64,15±0,06 35.85 171,64±0,19 P. kudriavzevii JH 91,01±0,05 08.99 88,04±0,15 11.96 187,86±0,08 P. kudriavzevii JBA 89,10±0,12 10.09 37,16±0,07 62.84 166,03±0,03 P. kudriavzevii JMA 94,13±0,31 05.87 89,38±0,14 10.62 195,86±0,41 K. marxianus JST 87,09±0,07 12.91 97,02±0,00 02.98 108,53±0,55 K. marxianus JZ 96,78±0,00 03.22 91,54±0,15 08.46 194,13 ±0,42

Çizelge 4.15. Maya suşlarının karşılaştırmalı olarak sekönder probiyotik özellikleri

Maya Suşları %Koagregasyon %Hidrofobisite L. acidophilic E. C. albicans P-ksilen Kloroform Etil asetat % Antibiyotik Duyarlılıkları ATCC 4356 Coli ATCC 25922 ATCC 90028 Otoagregasyon

Amoxicillin Ampisillin Gentamycin Tetracyclin Trimethoprim

Pichia kudriavzevii JD1 %37,16±0,00 %42,17±0,01 %31,13±0,00 %75,27±0,04 %83,40±0,02 %59,12±0,06 %65,25±0,03 - - - 5,11 - Pichia kudriavzevii JD2 %34,12±-0,01 %46,24±0,00 %42,09±0,00 %74,25±0,06 %83,32±0,00 %56,43±0,04 %70,96± 0,04 4,13 3,01 4,11 5,19 - Pichia kudriavzevii JDG %39,01±0,00 %40,14±0,00 %40,23±0,00 %74,55±0,02 %82,52±0,01 %58,19±0,07 %54,02± 0,02 - - - - - Pichia kudriavzevii JS %24,63±0,00 %39,51±0,00 %38,81±0,00 %86,74±0,05 %84,00±0,01 %72,23±0,19 %39,08± 0,03 - - - - - Pichia kudriavzevii JB %48,09±0,04 %33,27±0,00 %39,19±0,02 %82,23±0,10 %83,16±0,04 %54,34±0,04 %51,61± 0,06 - - - - - Pichia kudriavzevii JK %23,42±0,00 %31,19±0,00 %54,06±0,00 %71,00±0,02 %84,24±0,02 %70,69±0,12 %22,94± 0,04 - 2,71 6,85 - - Pichia kudriavzevii JBI %41,84±0,00 %17,31±0,00 %47,47±0,00 %72,55±0,04 %83,22±0,05 %56,09±0,09 %26,99± 0,05 - - - - - Pichia kudriavzevii JML %31,12±0,00 %44,1±0,00 %53,68±0,00 %71., 5±0,04 %83,08±0,03 %55,10±0,08 %43,27± 0,04 - 3,78 - - 4,09 Pichia kudriavzevii JAL %39,14±0,00 %51,56±0,00 %48,03±0,00 %72,80±0,02 %83,33±0,04 %55,31±0,05 %24,39± 0,02 - - - - - Pichia kudriavzevii JKU %47,52±0,00 %47,58±0,00 %16,43±0,00 %72,40±0,07 %84,08±0,05 %54,70±0,12 %12,47± 0,03 - - - - - Pichia kudriavzevii JZ %40,15±0,00 %38,0±0,00 %26,12±0,00 %70,21±0,04 %84,09±0.03 %63,14±0,0 %33,10± 0,02 - - - - - Pichia kudriavzevii JH %32,04±0,00 %50,2±0,00 %44,56±0,00 %55,78±0,10 %81,42±0,12 %60,23±0,04 %32,88± 0,05 - - - - - Pichia kudriavzevii JBA %36,11±0,00 %21,58±0,00 %41,08±0,00 %72,16±0,06 %83,50±0,04 %52,71±0,06 %28,80± 0,03 - - - - - Pichia kudriavzevii JMA %29,27±0,01 %41,7±0,00 %37,05±0,00 %71,18±0,02 %81,58±0,06 %57,42±0,09 %41,93± 0,02 - - - - - Kluyveromyce smarxianus JST %33,35±0,00 %19,11±0,01 %32,62±0,00 %73,03±0,08 %83,05±0,05 %52,50±0,05 %30,86± 0,01 - - - - - Kluyveromycesmarxianus JKH %43,71±0,00 %53,38±0,00 %30,11±0,01 %70,32±0,04 %83,26±0,02 %55,61±0,00 %57,84± 0,01 - 5,71 - - 5,38 (-): Antibiyotiğe dirençli

75

76

77

5. SONUÇ VE TARTIŞMA

Mayalar, fermente gıda ürünlerinde starter LAB'ler ile birlikte bulunurlar ve ürünlere özgül tat ve koku sağlarlar. Son yıllarda, starter destekliyici mayaların probiyotik özelliklerinin araştırılması önem kazanmıştır. Bu çalışmalar ile starter ve probiyotik özeliği gösteren mayaların endüstüriyel kullanımları amaçlanmıştır. Bilindiği gibi mayalar genellikle gıda ürünlerinde kontaminant olarak bulunurlar. Bugün, birçok farklı gıda, meyve ve diğer ortamlarda bulunan mayaların ekolojik durumları incelenmekte ve bu ortamlardan yüksek starter ve probiyotik özelliği gösteren mayaının izolasyonları hedeflenmektedir (Soccol ve diğerleri, 2010). Hurma bir meyve türü olup dünyanın bazı bölgelerinde yüksek miktarlarda üretilmektedir. Hurmanın besin içeriği yüksek olduğu için beslenmede önemli bir yer tutmaktadır. Bugüne kadar bazı hurma örneklerinde mikrobiyal analizler gerçekleştirilmiş, ancak hurma örneklerinde bulunabilen probiyotik mikroorganizmaların durum ve özellikleri hakkında herhangi bir çalışmaya rastlanılmamıştır. Bu araştırma ile bazı hurma çeşitlerinde izole edilen mayalarınprobiyotik özelliği gösteren özellikleri araştırılmıştır.

Araştırmada, Irak, Libya ve Türkiye’de satışa sunulan 25 adet hurma örneği kullanılmıştır. Hurma örneklerinden mayaların izolasyonlarında YGC agar besi ortamı kullanılmıştır (Resim 4.1). Bu besi ortamında üreyen mayaların mikroskobik görüntüsü Resim 4.2.'de gösterilmiştir.

Hurma örneklerinde mayaların sayımı YPD katı besiyerinde tespit edilmiştir. Hurma örneklerinin 9 adedinde mayalara rastlanılmadığı, diğer 16 adet örnekte mayaların sayımı 26,50-89,17 kob/mL olarak belirlenmiştir (Bkz. Çizelge 4.1, Şekil 4.1).

Hurma, enerji kaynağı olarak yüksek miktarda karbonhidrat içerir. Ayrıca hurmada yağlar, lif, proteinler, mineraller, vitaminler, antioksidan ve antimutajenik bileşikler de bulunur. Hurma bileşimindeki maddeler birçok mikroorganizmanın gelişimini sitümüle eder (Al- Farsi ve Lee, 2008).

Hurmada kontaminant maya, küf, patojen/patojen olmayan mezofil bakteri ve LAB’lere sıklıkla rastlanılmaktadır. Hurmada bulunan mikroorganizmaların tipi ve sayıları hurmanın olgunlaşma durumuna ve kontaminasyonlarına bağlıdır. Olgunlaşma evresindeki

78 hurmalarda mikrobiyal popülasyonun olgun hurmalara kıyasla daha yüksek olduğu gösterilmiştir (Siddig, 2012).

Hurma çeşidine göre mikrobiyolojik yüklerinin de farklı olabileceği gösterilmiştir. Bir araştırmada, 10 çeşit hurma örneğinde maya ve küflerin sayısının sırası ile; 0 - 15 cfu/g ve 1 - 5 cfu/g olduğu gösterilmiştir. Araştırmacılar, hurma örneklerinde maya ve küflerin sayılarının diğer mikroorganizmalara kıyasla daha yüksek olduğunu açıklamışlardır (Hassanein ve Soliman, 2010).

Siddig (2012), çalışmasında Suudi Arabistan’da üretilen 10 çeşit hurma örneğinde maya, küf, mezofilik bakteri ile laktik asit bakterilerinin sayılarını araştırmıştır. 5 örnekte mayalara rastlanılmadığını, 1 örnekte 1,4x102cfu/g civarında ve diğer 4 örnekte mayaların sayılarını 19 - 38 cfu/g arasında olduğunu tespit etmiştir. Araştırmacılar, örneklerden izole edilen maya izolatlarının tanımlamalarını gerçekleştirmiş ve izolatların; Zygosaccharomyces mellis, Candida lipolytica, Debaryomyces hansenii ve Torulaspora delbrueckii türleri olduğunu açıklamışlardır.

Bir araştırmada satışa sunulan 3 farklı sert ve yumuşak hurma örneğinde mayaların sayıları tespit edilmiştir. Sert ve yumuşak hurma örneklerinde mayaların sayıları sırası ile; 1,6 x 102 – 8,2 x 103 cfu/g ve 5 x 104- 16 x104 cfu/g arasında belirlenmiştir. Araştırmalar, hurma meyvelerinin farklı birçok etkenden; işçilik, paketleme, aseptik ve uygun olmayan koşullarda satışa sunulması gibi çevresel koşullardan kontamine olabileceğini bildirmiştir (Raimi, 2013).

Mohamed ve diğerleri(2014), yaptıkları bir araştırmada piyasaya sunulmuş 10 farklı hurma örneğinde maya türlerinin tespitini yapmışlardır. Hurma örneklerinden toplam 10 adet izolat elde edilmiş ve moleküler düzeyde 26S RNA ile analizleri yapılmıştır. İzolatların, Hanseniaspora, Pichia, Yarrowia, Issatchenkia, Wickerhamomyces ve Zygosaccharomyces cinlerine dahil oldukları gösterilmiştir. Pichia cinsine dahil P. kudriavzevii KKUY-0034 ve P. kudriavzevii KKUY-0151 türleri olduğu gösterilmiştir.

Bu tez çalışmasında, 16 farklı hurma örneğinden toplam 16 maya suşu izole edilmiştir.Bu suşların koloni incelemeleri ile morfolojik incelemeleri yapıldıktan sonra moleküler düzeyde 18S rRNA dizi analizleri ile tanımlamaları gerçekleştirilmiştir. Tanımlama

79 sonucunda bu suşların 14 ürününPichia kudriavzevii ve 2 isininKluyveromyces marxianusolduğu belirlenmiştir (Bkz. Çizelge 4.2). Bilindiği gibi P. kudriavzeviive K. marxianus gibi önemli probiyotik maya türlerine birçok fermente gıda, meyve ve diğer ekolojik ortamlarda da rastlanılmaktadır. Son yıllarda yüksek probiyotik ve biyoteknolojik aktivite gösteren bu maya türlerinin gıda endüstürisinde veya önemli biyoteknolojik ürünlerin üretiminde kullanımları uygulama alanlarına girmiştir (Ravishanker ve Jamuna, 2015).

Ekzopolisakkarit (EPS), mikrobiyal hücre duvarının üzerinde bulunan tüm polisakkaritlerdir.Probiyotik ve starter özelliği gösteren mayalarınEPS üretimleri önem taşımaktadır. Mayalar tarafından üretilen EPS'ler hücreleri fiziksel ve kimyasal etkenlere karşı korurken, fermente ürünlerin vizkosite ve kıvamını arttırdığı açıklanmıştır. Son yıllarda mayalar tarafından üretilen EPS'lerin sağlık alanında antitümür, antikanser ve antikolesterol etkilerinin olduğuda gösterilmiştir (Ghada ve diğerleri, 2012).

Iwona ve diğerleri (2015),Bullera,Candida, Cruptococcus, Debaromyces, Lipomyces, Pichia, Kluyeveromyces, Pseudotorula, Sporobolomyces cinslerine dahil olan maya türlerinin EPS ürettiğini bildirilmişlerdir. Farklı maya cins ve türlerinin farklı miktarlarda EPS ürettiği, EPS üretiminin farklı etkenlerden etkilenebildiğini bildirmişlerdir. Araştırmacıların yaptığı çalışmada maya besiortamına sakkaroz veya glukoz gibi karbohidratlar ilave edildiğinde bazı maya türlerinin sırası ile; 5 g/L veya 3 g/L EPS ürettiğini gösterilmiştir.

Bu tez çalışmasında 14 P. kudriavzevii suşunun EPS üretimleri 146,19 - 452,2 g/L arasında tespit edilirken, iki K. marxianus JST ve JZ suşlarının EPS üretimleri sırası ile 108,53 ve 194,13 g/L olduğu belirlenmiştir. En yüksek EPS üretimi P. KudriavzeviiJD2suşunda 452,2 g/L tespit edilirken, en düşük EPS üretimi K. marxianus JST suşunda 108,53g/L gözlenmiştir (Bkz. Çizelge 4.3 ve Şekil 4.2). Ülkemizde yapılan bir araştırmada, farklı peynir örneklerinden izole edilen 8 P. kudriavzevii ve 10 K. marxianus suşlarının EPS üretimleri incelenmiştir. P. kudriavzevii suşlarının EPS üretimleri 92,4 - 254,02 mg/L arasında belirlenirken, K. marxianus suşlarının EPS üretimleri 55,3 - 190,6 mg/L arasında tespit edilmiştir (Abudureyimu, 2017).

80

Agregasyon, tutunma yeteneği olarak tanımlanmaktadır. Probiyotik mikroorganizmaların agregasyon yeteneği seleksiyonunda önemli bir kriter olarak değerlendirilmektedir. Mikroorganizmaların hücre agregasyonunun hücre yüzeyindeki; lipotekoik asit, protein ve karbonhidratlarla ilgili olduğu gösterilmiştir. Agregasyon, otoagregasyon ve koagregasyon olmak üzere iki grup altında toplandırılmıştır. Otoagregasyon, aynı türe ait mikroorganizmaların birbirlerine tutunarak oluşturdukları hücre kolonileri şeklinde tanımlanmaktadır. Probiyotik mikrooorganizmaların bağırsak epitel hücrelerine tutunmasında otoagregasyonun önemli bir kriterdir. Probiyotiklerotoagregasyon yetenekleri ilebirbirlerine tutunarak ortamda bulunan patojenlerin epitel hücrelere tutunmasını önlerler ve bu şekilde enfeksiyonlar da önlenir (Del Re ve diğerleri, 2000).

Yapılan bir çalışmada, P. kudriavzeii (URC57) suşunun,YPD besiyerinde 30οC'de 5 ve 24 saat inkübasyonu ile otoagregasyonu sırası ile, % 59,12 ve % 81,23 olarak tespit edilmiştir (Chelliah ve diğerleri, 2016).

Yapılan bir çalışmada, 3 K. marxianus suşunun otoagregasyonları YEPD sıvı besiortamında 37οC'de 2 saat inkübe edilerek araştırılmıştır. Suşların otoagregasyonları %52,8; %42,9 ve %39,1 olarak bulunmuştur (Fedda ve diğerleri, 2017).Binetti ve diğerleri (2013), araştırmalarında 8 K. marxianus suşunun otoagregasyonlarının %16-52,9 arasında olduğunu göstermişlerdir. Aynı araştırmacılar, K. marxianus suşlarının otoagregasyon, koagregasyon ve hidrofobisite yeteneklerini üç grup altında değerlendirmişlerdir. Birinci grup, otoagragasyonun %30'dan az olmasını düşük; ikinci grup otoagregasyonun %30-60 arasında olmasını orta ve otoagregasyonun %60’ın üzerinde olmasını yüksek olarak değerlendirip göstermişlerdir.

Abudureyimu (2017), 8 P. kudriavzevii ve 10 K. marxianus suşunun %otoagregasyon değerlerini tespit etmiştir. P. kudriavzevii suşlarının otoagragasyonlarını %70,6-98,2 arasında ortalama %88,58 bulmuştur. K. marxianussuşlarının otoagregasyon değerlerini ise%76-90,6 arasında ortalama %85,56 olarak tespit etmiştir.

Bu tez çalışmasında, 14 P. kudriavzeii suşunun YPD sıvı besi ortamında 37οC'de 4 saat muamele edilmesi sonucunda otoagregasyonlarını%12,47- 70,96 arasında bulunmuştur.K. marxianus JST ve JZ suşlarının otoagregasyonları sırası ile; %30,86 ve %57,84 olarak bulunmuştur.En yüksek otoagregasyon özelliği P.kudriavzevii JD2suşunda %70,96 olarak

81 belirlenirken, en düşük otoagregasyon P. kudriavzevii JKUsuşunda %12,47 oranındatespit edilmiştir (Bkz. Çizelg 4.4, Şekil 4.4).

Koagregasyon, farklı türe ait iki mikroorganizmanın birbirine tutunması şeklinde tanımlanmaktadır. Probiyotik mikroorganizmaların koagregasyon yetenekleri ile patojenlerin epitel hücrelere tutunması engellenir. Mikroorganizmaların koagregasyon yeteneklerinin birçok kaynaktan ileri geldiği açıklanmıştır (Vornhagen ve diğerleri, 2013).

Bu tez çalışmasında, P. kudriavzeii ve K. marxianus suşlarının Escherichia coli ATCC 25922, Candida albicans ATCC 90028 ve Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 test mikroorganizmaları ile koagregasyonları Çizelge 4.5, Şekil 4.5.te gösterilmiş olup, P. kudriavzeii suşlarının probiyotik L. acidophilus ATCC 4356 suşu ile koagregasyon yetenekleri %23,42 - 48,09 arasında bulunmuştur Pichia kudriavzevii JB suşunun L. acidophilus ile en yüksek koagregasyon yeteneği gösterdiği belirtilmiştir. Bu suşun test bakterisi ile koagregasyon %48,09 bulunmuştur. K. marxianus JST ve JZ suşlarının bu test bakterisi ile koagregasyonları sırası ile; %33,35 ve %43,71 olarak bulunmuştur (Bkz. Çizelge 4.5., Şekil 4.5.).

Bu tez çalışmasında, P. kudriavzeii suşunun Escherichia coli ATCC 25922 ile koagregasyon yetenekleri %17,31 - 51,56 arasında bulunmuştur P. kudriavzevii JAL suşunun test bakterisi ile en yüksek %56,56 oranında koagregasyon yeteneği gösterdiği tespit edilmiştir. K. marxianus JST ve JZ suşlarının bu test bakterisi ile koagregasyonları sırası ile; %19,11 ve %53,58 olarak bulunmuştur (Bkz. Çizelge 4.6, Şekil 4.6).

Bu tez çalışmasında, P. kudriavzeii suşlarının C. albicans ATCC 90028 ile koagregasyon yetenekleri %26,12 - 54,06 arasında bulunmuştur P. kudriavzevii JK suşunun test bakterisi ile en yüksek %54,06 oranında koagregasyon yeteneği gösterdiği tespit edilmiştir.K. marxianus JST ve JZ suşlarının C. albicans ile koagregasyonları sırası ile; %32,62 ve %30,11 olarak bulunmuştur (Bkz. Çizelge 4.7, Şekil 4.7).

Abudureyimu (2017),çalışmasında 8 P. kudriavzeii ve 10 K. marxianus suşunun E. coli ATCC 25922, C. albicans ATCC 90028 ve L.acidophilus ATCC 4356 test mikroorganizmaları ile koagregasyonlarını araştırmıştır. P. kudriavzeii suşlarının E. coli ile koagregasyonlarını %42,9-65,2 arasında tespit ederken, K. marxianus suşlarının bu test

82 bakterisi üzerindeki koagregasyon değerlerini %25,2-55,6 arasında bulmuştur. P. kudriavzeii suşlarının patojen C. albicans suşu ile koagregasyonları %88,2-96,4 arasında tespit edilirken, K. marxianus suşlarının C. albicans ile koagregasyonları %72,8-93,8 arasında bulunmuştur. P. kudriavzeii suşlarının L. acidophilus ile koagregasyonlarının %43,1-72,5 arasında bulunmuştur. K. marxianus suşlarının L. acidophilus ile koagregasyonlarının ise %30,7-77,7 arasında tespit edilmiştir.

Yapılan bir araştırmada, P. kudriavzeii L18 suşunun,E. coli V517 ve S. enteritidis OMS-Ca suşları ile koagregasyonları araştırılmış ve koagregasyonlarının sırası ile; %14 ve %55,7 olduğu gösterilmiştir. Aynı araştırmada, 6 K. marxianus suşunun bu test bakterileri ile koagregasyonlarının sırası ile; %34,6-66,7 ve %25,7- 92,4 olduğu tespit edilmiştir (Binetti ve diğerleri, 2013). Bir diğer araştırmada, P. kudriavzeii (URC57) suşunun, E. coli, S. aureus ve S. typhimuriumtest bakterileri ile koagregasyonlarının sırası ile, % 19,46, % 26,12 ve %18,43 oranlarında olduğu gösterilmiştir (Chelliah ve diğerleri, 2016).

Mikrorganizmaların farklı maddelere tutunmasında hücre yüzeylerinin fizikokimyasal özelliklerine bağlı olduğu bildirilmiştir. Hidrofobisitenin hücre duvarında bulunan protein ve lipitlerden ileri geldiği açıklanmıştır. Bu bileşimler yolu ile mikroorganizmalar birbirine, epitel dokulara ve bazı maddelere tutunur. Mikrorganizmalarda hidrofobisite cins, tür ve suşlara göre farklılık gösterir (Zárate ve diğerleri, 2002).

Ramachandran ve diğerleri (2016). P. kudriavzeiiURC579 suşunun ksilen ve toluen hidrokarbonlarına tutunma oranlarını sırası ile; %59 ve %75 olarak göstermişlerdir. Binetti ve diğerleri (2013). yaptıkları bir çalışmada 8 K. marxianus suşlarının hidrokarbonlara tutunma yeteneklerinin %45,3-72,5 araında değiştiğini bildirmişlerdir. Maria ve diğerleri (2017), yaptıkları çalışmada 3K. marxianus suşlarının n-heksadekana tutunma yetenkeklerinin %54,7, %59,1 ve %75,9 olduğunu tespit etmişlerdir.

Bu tez çalışmasında, 14 P. kudriavzeii ve 2 K. marxianus suşununp-ksilen, kloroform ve etil asetat ile % hidrofobisiteleri Çizelge 4.8. ve Şekil 4.8.de verilmiştir. P. kudriavzeii suşların, p-ksilen, kloroform ve etil asetat ile yüzde hirofobisiteleri sırası ile; %55,78- 86,74; %81,42- 84,24 ve %52,71-72,23 arasında bulunmuştur. Nötral çözücü olan p-ksilen çözücü ortamında en yüksek hidrofobisite P. kudriavzevii JSsuşunda %86,74 olarakbelirlenmiştir. Asidik çözücü olan kloroform ortamında en yüksek hidrofobisiteP.

83 kudriavzevii JK suşunda %84,24 oranında gözlenmiştir. P. kudriavzeviisuşlarının bazik çözelti olan etil asetat ortamında en yüksek hidrofobisite değeriP. kudriavzevii JS suşunda %72,23 olaraktespit edilirkenP. kudriavzeviisuşlarının asidik çözücü olan kloroform çözücü ortamında hidrofobisite özelliklerinin daha yüksek olduğu gözlenmiştir (Bkz. Çizelge 4.8 ve Şekil 4.8). Maya suşlarının her üç çözücüde de hidrofobisite göstermesi, suşların hücre yüzey yapılarının kompleks olduğunu göstermektedir.

K.marxianus JST ve JS suşlarının p-ksilen, kloroform ve etil asetat ile % hidrofobisiteleri sırası ile; %73,03 ve %70,32; 83,05 ve %83,26 ve %52,50 ve %55,61 olarak tespit edilmiştir (Bkz. Çizelge 4.8 ve Şekil 4.8).

Genel olarak hidrofobisite sonuçlarını değerlendirdiğimizde, suşların asidik çözücü olan kloroforma ilgisinin, nötral çözücü olan p-ksilene ve bazik çözücü olan etil asetata göre daha yüksek olduğu gözlenmiştir. Tüm suşların test edilen hidrokarbonlara yüksek düzeyde ilgisinin olması ve bu suşların yüzey yapılarının kompleks olduğunu göstermektedir.

Probiyotik mikroorganizmaların seleksiyonlarında ilk kriter suşların bağırsağın girişindeki asit ve safraya karşı canlılığını koruyabilmeleridir. Mikroorganizmaların midenin düşük pH’sına karşı toleransılıkları farklıdır. Midenin asitliği yüksek, pH’sı düşüktür (pH~2). Genellikle midenin pH’sı 3,5 ile 5,5 arasındadır (Saarela ve diğerleri, 2009).

Mayalar, asit toleranslı mikroorganizmalar olup optimum pH 4,5-5 arasında iyi gelişim gösterirler. Bu pH değerinin üstünde ve altında mayalar için uygun olmayan pH stres koşulları oluşur. Mayalar çok düşük pH ortamlarda üretildiğinde hücresel enzimatik aktivitelerinde azalma ve inhibisiyon meydana gelir. Mayalardaki pH toleranslılıklarının farklı mekanizmalar ve faktörlerden ileri geldiği gösterilmiştir (Saarela ve diğerleri,2009).

Mikroorganizmaların karşısındaki ikinci bir diğer engelde ince bağırsak sisteminde canlılık ve aktivitelerini koruyabilmesidir. İnce bağırsakta safra tuzları ve pankreatin mikrobiyal üremeyi olumsuz yönde etkilemektedir. Safra tuzlarının antimikrobiyal aktivitesi farklı mekanizmalar ile gerçekleşir (Megan ve Janet, 2009).

84

Mikroorganizmaların safraya karşı toleranslılıklarının belirlenmesinde besi ortamlarına %0,15 ile 0,3 safra ilave edilerek üremeleri araştırılmaktadır. Safraya dayanklı ve safrayı tolere edebilen mikroorganizmalar ince bağırsaktan geçerek kalın bağırsakta epitel hücrelere ulaşma ve bu hücrelere tutunma fırsatını bulur. Bu nedenlerden dolayı probiyotik mikroorganizmaların seleksiyonlarında bunların asit ve safra streslerine karşı toleranslı olmaları önemli faktörlerdir (Chen ve diğerleri, 2010). Safra tuzları bazı maya tür veya suşlarının üremelerinin belirli bir oranda inhibe ve sitümüle edebileceği bazı araştırıcılar tarafından gösterilmiştir (Kourelisve diğerleri, 2010).

Tez çalışmasında, maya suşlarının pH 2,0’de hücre yoğunluğunda önemli bir azalma gözlenmiş ve inhibisyon değerleri %96’nin üzerine çıkmıştır. P. kudriavzevii suşlarının pH 2’deinhibisiyonları %33,41-94,13 arasında bulunmuştur. pH 2’ye P. kudriavzevii JD1 suşunun, diğer suşlara kıyasla daha fazla toleranslı olduğu belirlenmiştir. Bu suşun pH 2'de inhibisiyonu %33,41 olarak gözlenmiştir. K.marxianus JST ve JS suşlarının pH 2'de inhibisiyonları sırası ile; %87,09 ve %96,78 olarak bulunmuştur (Bkz. Çizelge 4.9 ve Şekil 4.9).

Bir araştırmada, P. kudzriavzeii KT000037 suşunun pH 1-12 aralığında üreme ve toleranslılığı araştırılmıştır. Suşun, 120 saat pH 1,5, pH 2, pH 3 ve pH 11'de üremesi ile yüzde hücre canlığı sırası ile; %24, %70, %86 ve %47 oranında olduğu tespit edilmiştir. Araştırmacılar, P. kudzriavzeii suşununmide ve bağırsak asit koşullarına dayanaklı olduğunu bildirmişlerdir, (Ramachandran ve diğerleri, 2016).

Bir çalışmada, 3 probiyotik K. marxianus suşunun pH 2' de 90 dk inkübasyonu ile canlılıkları araştırılmıştır. Bir suşta canlılık oranınının %83, diğer iki suşta canlılık oranının %100 olduğu gösterilmiştir (Maria ve diğerleri, 2017).

Abudureyimu (2017), yaptığı bir çalışmada farklı peynirlerden izole ettiği 8P. kudzriavzeii suşunun pH 2, pH 3'te inhibisyonlarının sırası ile, %26,79-98,19 ve %10,78-91,53 arasında olduğunu göstermiştir. Aynı araştırıcı, 10 K. marxianus suşunun pH 2, pH 3'te inhibisyonlarının sırası ile; %97,71-98,21 ve 6,59-64,31 arasında tespit etmiştir.

Maya suşlarının safra dirençliliklerinin belirlenmesinde suşların % 0,3 ve kontrol % 0,0 ’lık safra konsantrasyonlarında üretilmeleri sağlanmış ve % inhibisyon değerleri

85 belirlenmiştir.P. kudriavzevii suşlarının %0,3 safra konsantrasyonunda yüzde inhibisyonları %37,16-89,38 arasında bulunmuştur. %0,3 safra konsantrasyonunda P. kudriavzevii JBA suşunun, diğer suşlara kıyasla daha fazla toleranslı olduğu belirlenmiştir. Bu suşun %0,3 safra ortamında inhibisiyonu %37,16 olarak tespit edilmiştir. K. marxianus JST ve JS suşlarının %0,3 safra konsantrasyonunda inhibisiyonları sırası ile; %97,02 ve %91,54 olarak bulunmuştur (Bkz. Çizelge 4.10, Şekil 4.10).

Bir çalışmada, P. kudzriavzeii URCS7 suşunun %0,3 safra tuzu ortamında 4 saat inkübe edildikten sonra canlılığının % 84 oranında olduğu gösterilmiştir (Ramachandran ve diğerleri, 2016). Farklı bir çalışmada, 8P. kudzriavzeii suşunun %0,3 safra ortamında canlılıkları %61,38-100 arasında tespit edilmiştir (Abudureyimu, 2017).

Yapılan bir araştırmada, 3K. marxianus suşunun 72 saat %0,3 safra tuzu ortamında canlılıklarını koruduğu gösterilmiştir. Bu suşlardan birinde safra tuzu hidroliz enzimi BSH varlığı tespit edilmiştir. BSH enzimi mikroorganizmayı safra tuzunun toksik etkisine karşı koruyabilmekte ve safranın hidrolizi sonucu oluşan bileşikler mikroorganizmanın üreme ve sitümülasyonunu gerçekleştirebilmektedir (Maria ve diğerleri, 2017).

Abudureyimu 2017, 10K. marxianus suşunun %0,3 safra ortamında canlılık oranlarını araştırmıştır. Araşımadan elde ettiği sonuçlara göre; 6 suşta canlılığın %18,97-98,21 arasında olduğunu, diğer 4 suşta safranın %100,46-181,91 oranlarında üreme üzerinde sitümülasyonun gözlendiğini göstermiştir.

Probiyotik olarak kullanımı düşünülen mikroorganizmaların en önemli özelliklerden biri de patojen mikroorganizmalar üzerindeinhibisiyon etkilerinin olmasıdır. Hurmadan izole edilen P. kudzriavzeii ve K. marxianus suşlarının 3 referans kültür L. acidophilus ATCC 4356, C. albicans ATCC 90028ve P. auroginosa ATCC 278853 üzerine inhibisyon etkileri araştırılmıştır (Bkz. Çizelge 4.11). Tüm suşların probiyotik L acidophilus ATCC 4356 ve patojen P. auroginosa ATCC 278853 bakterileri üzerinde antgonistik aktivite gösterdiği belirlenirken, suşların hiç birinin patojen C. albicans ATCC 90028 maya suşu üzerinde inhibisyon etkisinin olmadığı gözlenmiştir.

P. kudzriavzeiisuşlarının probiyotik L. acidophilus ATCC 4356 suşu üzerinde inhibisyonlarının 8,01-19,23 mm zon çapında değiştiği tespit edilmiştir. P.

86

KudriavzeviiJBA, P. Kudriavzevii JBI ve P. Kudriavzevii JMA suşlarının L. acidophilus üzerinde inhibisyon zonları Resim 4.3.te gösterilmiştir. 2K. marxianus JST ve JZ suşunun aynı test bakterisi üzerindeki inhibisyonları sırası ile; 11,14 ve 12,07 mm zon çapında bulunmuştur (Bkz. Çizelge 4.11).

P. kudzriavzeiisuşlarının P. aeuroginosa ATCC 278853 suşu üzerinde inhibisyonlarının 11,01-24,17 mm zonu çapında değiştiği tespit edilmiştir (Bkz. Çizelge 4.11). P. kudriavzeviiJH, P. kudriavzevii JKH ve P. kudriavzeviiJBA suşlarının P.aeuroginosa ATCC 278853 suşu üzerinde inhibisyon zonları Resim 4.4.tegösterilmiştir. 2K. marxianus JST ve JZ suşlarının aynı test bakterisi üzerinde inhibisyonları sırası ile; 13,44 ve 10,23 mm zon çapında bulunmuştur (Bkz. Çizelge 4.11). Maya suşlarının hiç birinde patojen C. albicans ATCC 90028 suşu üzerinde antimikrobial aktivitesinin olmadığı gözlenmiştir.

Bir araştırmada, P. kudriavzeii RY55 suşununE. coli, E. fecalis, Klebsiella , S. aureus, P. aeruginosa ve P. alcaligenes test bakterileri üzerinde inhibisiyon etkilerinin 11-12 mm zon çapında olduğu bildirilmiştir. Araştırmada, P. kudriavzeii suşunun test bakterileri üzerinde inhibisyon aktivitelerinin sentezlediği toksik maddelerden ileri geldiğini açıklamışlardır (Bajaj ve diğerleri, 2013).

Maria ve diğerleri (2017), yaptıkları çalışmada, 3K. marxianus suşlarının antimikrobiyal aktivitelerini C. glabrata ATCC-2001, C. parapsilosis ATCC22019, C. albicans ATCC 10231, S. cerevisiae ATCC 9763, S. aurus ATCC 25923, E. coli ATCC 35150, S. enentridis ATCC 13076, S. typhimurum ATCC 14028 ve L. monocytogenesis ATCC 7644 mikroorganizmaları üzerinde araştırmışlardır. Araştırmacıların elde ettiği sonuçlardan; K. marxianus suşlarının E. coli test bakterisi dışında diğer mikroorganizmalar üzerinde her hangi bir antimikrobiyal aktivitesinin olmadığını gösterilmiştir. Suşların, E. coli bakteri üzerinde 1-2 mm zon çapında inhibisyonunun olduğu gösterilmiştir.

Abudureyimu (2017),yaptığı çalışmada 8P. kudzriavzeii ve 10K. marxianus suşlarının antimikrobiyal etkisini E. coli ATCC 11229, S. aureus ATCC 25923, S. enteritidis ATCC 13076, B. cereus RSKK 863, P aeruginosa ATCC 27853 ve C. albicans ATCC 10239 L. acidophilus ATCC 4356 üzerinde antagonistik etkilerini araştırmış ve yalnız bir adet P. kudriavzeii M57 suşununB. cereus RSKK 863 ve P. aeruginosa ATCC 27853 suşları üzerinde sırası ile; 11,77 mm ve 11,96 mm zon çapında inhibisyon gösterdiğini

87 bildirmiştir. Diğer P. kudriavzeii ve K. marxianussuşlarının test edilen mikroorganizmalar üzerinde antagonistik aktivitelerinin olmadığı gözlenmiştir

Mayalar, diğer mikroorganizmalara kıyasla insan ve diğer alanlarda kullanılan antibiyotiklere karşı daha dirençlidirler. Mayalarda antibiyotik dirençliliği farklı mekanizmalar ile gerçekleşmektedir. Mayalarda antibiyotik dirençliliği cins, tür ve suşlar arasında farklılık gösterir (Kailash ve Scott, 2007).

P. kudriavzeii ve K. marxianus maya suşlarının Amoksisilin, Ampisilin, Gentamisin, Tetrasiklin, Trimetoprim antibiyotiklerine karşı duyarlılıkları belirlenmiştir (Bkz. Çizelge 4.12-4.13). Araştırmada, 13P. kudriavzeii suşununAmoksisilin antibiyotiğine karşı dirençli olduğu belirlenirken, 1Pichia kudriavzeviiJD2 suşunun bu antibiyotiğe karşı 4,13 mm zon çapı ile duyarlı olduğu gözlenmiştir. 9P. kudriavzeii suşununAmpisilin antibiyotiğine karşı dirençli olduğu gözlenmiş, 3ve Pichia kudriavzeviiJD2, Pichia kudriavzeviiJK Pichia kudriavzeviiJML suşlarının bu antibiyotiğe karşı sırası ile; 3,01 mm, 2,71 mm ve 3,78 mm zon çapları ile duyarlı olduğu tespit edilmiştir. 10P. kardriavzevii suşununGentamisinantibiyotiğine karşı dirençli ve 2Pichia kudriavzeviiJD2 ve Pichia kudriavzeviiJK suşlarının bu antibiyotiğe karşı sırası ile; 4,11 mm ve 6,85 mm, zon çapları ile duyarlı olduğu tespit edilmiştir. 10 P. kardriavzevii suşununTetrasiklinantibiyotiğine karşı dirençli oldukları belirlenirken, 2 Pichia kudriavzevii JD1 ve Pichia kudriavzeviiJD2 suşlarının bu antibiyotiğe karşı sırası ile; 5,11 mm ve 5,19 mm, zon çapları ile duyarlı olduğu görülmüştür. 1P. kudriavzeviiJML suşununTrimetoprim antibiyotiğine karşı 4,09 mm zon çapı ile duyarlı olduğu gözlenirken, diğer 11 suşun bu antibiyotiğe karşı dirençli olduğu tespit edilmiştir (Bkz. Çizelge 4.12 – 4.13).

K. marxianus JST ve JZ suşlarını Amoksisilin, Gentamisin ve Tetrasiklin antibiyotiklere karşlı dirençli olduğu tespit edilmiştir. K. marxianusJZ suşununAmpisilin ve Trimetoprim antibiyotiklere karşı sırası ile; 5,71 mm ve 5,38 mm zon çapları ile duyarlı olduğu gözlenmiştir (Bkz. Çizelge 4,12 -4,13). Antibiyotik duyarlılığı gösteren P. kudriavzeii ve K. marxianus suşlarının antibiyotik duyarlılıkları Resim 2.4.te gösterilmiştir.

Abudureyimu, (2017),farklı peynirlerden izole ettiği 8P. kudriavzeii ve 10K. marxianus suşlarının Penisilin; Gentamisin; Ofloksasin; Polimiksin ve Nitrofurantoin gibi antibiyotiklere karşı duyarlılıklarını araştırmıştır. Tüm, P. kudriavzeii suşlarının test edilen

88

Penisilin, Gentamisin, Ofloksasin, Nitrofurantoin antibiyotiklerine karşı dirençli olduğugösterilmiştir. P. kudriavzeii M5, M10, M13, M15 suşları polimiksin antibiyotiğine karşı 6,85-7,88 mm zon çapları ile duyarlılık gösterirken, diğer, P.kudriavzeii (M16, M17, M56, M57) suşları polimiksine karşı dirençli oldukları gözlenmiştir. Aynı araştırmada, 6K. marxianus suşunun polimiksin antibiyotiğine karşı 11,01-13,38 mm inhibisyon çapları ile orta derecede duyarlı olduklarını tespit edilmiştir. 3K. marxianusM37, M47, M60 suşunun penisilin antibiyotiğine karşı sırası ile; 6,83 mm, 6,76 mm ve 6,61 mm zon çapları ile duyarlı oldukları belirlenmiştir. Aynı suşların gentamisine karşı duyarlılıkları sırası ile; 6,81 mm, 6,85 mm ve 6,84 mm zon çapları ile tespit edilmiştir. 2 K. marxianus M37, M60 suşununNitrofurantoin antibiyotiğine karşı sırası ile; 6,90 mm ve 7,7 mm zon çapları ile duyarlılık göstermiştir. Diğer suşların bu antibiyotiğe karşı direçli oldukları gözlenmiştir.

Araştırmada, toplam 16 farklı hurma örneklerinden toplam 16 maya suşları izole edilmiştir. Bu suşların moleküler tanımlamaları 18S rRNA dizi analizi ile gerçekleştirilmiştir. Tanımlama sonuçlarına göre, bu suşların 14 P. kudriavzevii ve 2 K. marxianus olduğu belirlenmiştir.Tanımlanan türlerin birincil probiyotik seleksiyonlarında yer alan mide asit dirençliliği (pH 2) ve (%0,3) ince bağırsak safra toleranslılıkları belirlenmiştir. Bu suşların diğer probiyotik özelliklerden olan: [agregasyon (otoagregasyon ve koagregasyon), hidrofibosite, antimikrobiyal aktivite ve antibiyotik duyarlılıkları] tesbit edilmiştir.

Araştırma, genel olarak değerlendirildiğinde tüm suşların probiyotik özelik gösterdikleri, özelliklerinin cins, tür ve suşlara göre farklık gösterdiği belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlara göre; (2) P. kudriavzeii JD1 ve JD2 suşların probiyotik özellikleri diğer suşlara kıyasla daha üstün nitelik gösterdikleri gözlenmiştir. Bu suşların diğer probiyotik özelliklerden olan; [epitelyum hücrelere tutunma, antiklostrol ve antioksidant aktivite ve diğer özellikleri] araştırıldıktan sonra potansiyel kullanımları düşünülmüştür.

89

KAYNAKLAR

Abekhti, A., Zarour, K., Boulal, A., Benmechernene, Z. and Kihal, M. (2013). Evaluation of microbiological quality of the date fruit product “Btana” produced in Adrar South Algeria. Journal of Microbiology Research, 3(5), 163-170.

Abudureyimu, M. (2017). Peynirlerden izole edilen mayaların probiyotik özeliklerin araştırılması. Doktora Tezi, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Ankara.

Addis, E., Fleet, G. H., Cox, J. M., Kolak, D. and Leung, T. (2001). The growth, properties and interactions of yeasts and bacteria associated with the maturation of Camembert and blue-veined cheeses. International Journal of Food Microbiology, 69(1-2), 25- 36.

Al-Farsi, M. A., and Lee, C. Y. (2008). Nutritional and functional properties of dates: a review. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 48(10), 877-887.

Al-Farsi, M., Alasalvar, C., Morris, A., Baron, M., and Shahidi, F. (2005). Comparison of antioxidant activity, anthocyanins, carotenoids, and phenolics of three native fresh and sun-dried date (Phoenix dactylifera L.) varieties grown in Oman. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53(19), 7592-7599.

Aloğlu, H. Ş., Özer, E. D., Öner, Z., Savaş, H. B. and Uz, E. (2015). Investigation of a probiotic yeast as a cholesterol lowering agent on rats fed on a high cholesterol enriched diet. Kafkas Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, 21(5), 685-689.

Aluwong, T., Kawu, M., Raji, M., Dzenda, T., Govwang, F., Sinkalu, V. and Ayo, J. (2013). Effect of yeast probiotic on growth, antioxidant enzyme activities and malondialdehyde concentration of broiler chickens. Antioxidants, 2(4), 326-339.

Asadikoutmehr, Ş. (2015). Kefir ve kefir granüllerinden izole edilen mayaların probiyotik özelliklerinin araştırılması. Yüksek lisan Tezi, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Ankara.

Bajaj, B. K., Raina, S., and Singh, S. (2013). Killer toxin from a novel killer yeast Pichia kudriavzevii RY55 with idiosyncratic antibacterial activity. Journal of Basic Microbiology, 53(8), 645-656.

Balakrishna, A. (2013). In vitro evaluation of adhesion and aggregation abilities of four potential probiotic strains isolated from guppy (Poecilia reticulata). Brazilian Archives of Biology and Technology, 56(5), 793-800.

Baliga, M. S., Baliga, B. R. V., Kandathil, S. M., Bhat, H. P. and Vayalil, P. K. (2011). A review of the chemistry and pharmacology of the date fruits (Phoenix dactylifera L.). Food Research International, 44(7), 1812-1822.

Bao, Y., Liang, X. and Li, R. (2010). Screening and identification of exopolysaccharide- producing yeasts. Wei sheng wu xue bao= Acta microbiologica Sinica, 50(2), 278- 83.

90

Bezkorovainy, A. (2001). Probiotics: determinants of survival and growth in the gut–. The American Journal of Clinical Nutrition, 73(2), 399-405.

Bilinski, C. A. and Casey, G. P. (1989). Developments in sporulation and breeding of brewer's yeast. Yeast, 5(6), 429-438.

Binetti, A., Carrasco, M., Reinheimer, J. and Suárez, V. (2013). Yeasts from autochthonal cheese starters: technological and functional properties. Journal of Applied Microbiology, 115(2), 434-444.

Boekhout, T., Robert, V. and Smith, M. (2002). Yeasts of the world. Morphology, physiology, sequences and identification. Amsterdam: John Wiley & Sons.

Botha, A. (2006). Yeasts in soil. Heidelberg: Springer, 221-240.

Buts, J. P. (2009). Twenty-five years of research on Saccharomyces boulardii trophic effects: updates and perspectives. Digestive Diseases and Sciences, 54(1), 15-18.

Buzzini, P. and Vaughan-Martini, A. (2006). Yeast Biodiversity and Biotechnology. In C.A. Rosa, ve G. Péter Editörler). Biodiversity and ecophysiology of yeasts. Berlin: Springer, pp. 533-559.

Büchl, N. R., Hutzler, M., Mietke‐Hofmann, H., Wenning, M., and Scherer, S. (2010). Differentiation of probiotic and environmental Saccharomyces cerevisiae strains in animal feed. Journal of Applied Microbiology, 109(3), 783-791.

Cassone, M., Serra, P., Mondello, F., Girolamo, A., Scafetti, S., Pistella, E., and Venditti, M. (2003). Outbreak of Saccharomyces cerevisiae subtype boulardii fungemia in patients neighboring those treated with a probiotic preparation of the organism. Journal of Clinical Microbiology, 41(11), 5340-5343.

Cavalero, D. A., Cooper, D. G. (2003). The effect of medium composition on the structure and physical state of sophorolipids produced by Candida bombicola ATCC 22214. Journal of Biotechnology, 103(1), 31-41.

Chelliah, R., Ramakrishnan, S. R., Prabhu, P. R., and Antony, U. (2016). Evaluation of antimicrobial activity and probiotic properties of wild‐strain Pichia kudriavzevii isolated from frozen idli batter. Yeast, 33(8), 385-401.

Chen, L. S., Ma, Y., Maubois, J.L., Chen, L. J., Liu, Q. H. and Guo, J. P. (2010). Identification of yeasts from raw milk and selection for some specific antioxidant properties. Dairy Science and Technology, 63(1), 47-54.

Chen, W. B., Han, Y. F., Jong, S. C. and Chang, S. C. (2000). Isolation, purification, and characterization of a killer protein from Schwanniomyces occidentalis. Applied and Environmental Microbiology, 66(12), 5348-5352.

Clinical and Laboratory Standards Institute. (2015). M100-S25 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing, United States: Wayne Pennsylvania.

Czerucka, D., and Rampal, P. (2002). Experimental effects of Saccharomyces boulardii on diarrheal pathogens. Microbes and İnfection, 4(7), 733-739.

91

Czerucka, D., Piche, T., and Rampal, P. (2007). yeast as probiotics–Saccharomyces boulardii. Alimentary Pharmacology & Therapeutics, 26(6), 767-778.

Del Re, B., Sgorbati, B., Miglioli, M. and Palenzona, D. (2000). Adhesion, autoaggregation and hydrophobicity of 13 strains of Bifidobacterium longum. Letters in Applied Microbiology, 31(6), 438-442.

Diosma, G., Romanin, D. E., Rey-Burusco, M. F., Londero, A. and Garrote, G. L. (2014). Yeasts from kefir grains: isolation, identification, and probiotic characterization. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 30(1), 43-53.

D'souza, A. L., Rajkumar, C., Cooke, J. and Bulpitt, C. J. (2002). Probiotics in prevention of antibiotic associated diarrhoea: meta-analysis. British Medical Journal, 324(7350):1345-1346.

Dubois, M., Gilles, K. A., Hamilton, J. K., Rebers, P. T. and Smith, F. (1956). Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Analytical chemistry, 28(3), 350-356.

El-Juhany, L. (2010). Degradation of date palm trees and date production in Arab countries: causes and potential rehabilitation. Australian Journal of Basic and Applied Sciences,4(1), 3998–4010.

El-Juhany, L. I. (2010). Degradation of date palm trees and date production in Arab countries: causes and potential rehabilitation. Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 4(8), 3998-4010.

Elleuch, M., Besbes, S., Roiseux, O., Blecker, C., Deroanne, C., Drira, N. E., and Attia, H. (2008). Date flesh: Chemical composition and characteristics of the dietary fibre. Food Chemistry, 111(3), 676-682.

Fadda, M. E., Mossa, V., Deplano, M., Pisano, M. B. and Cosentino, S. (2017). In vitro screening of Kluyveromyces strains isolated from Fiore Sardo cheese for potential use as probiotics. Food Science and Technology, 75(1), 100-106.

Fadda, M. E., Mossa, V., Deplano, M., Pisano, M. B. and Cosentino, S. (2017). In vitro screening of Kluyveromyces strains isolated from Fiore Sardo cheese for potential use as probiotics. Food Science and Technology, 75, 100-106.

Fan, W., Chi, Y. and Zhang, S. (2008). The use of a tea polyphenol dip to extend the shelf life of silver carp (Hypophthalmicthys molitrix) during storage in ice. Food Chemistry, 108(1), 148-153.

FAO/WHO (2002). Guidelines for the evaluation of probiotics in food. Food and Agriculture Organization of the United Nations and World Health Organization Working Group Report, Canada, 1-11.

Fatichenti, F., Bergere, J. L., Deiana, P. and Farris, G. A. (1983). Antagonistic activity of Debaryomyces hansenii towards Clostridium tyrobutyricum and Cl. butyricum. Journal of Dairy Research, 50(4), 449-457.

92

Fietto, J. L., Araújo, R. S., Valadão, F. N., Fietto, L. G., Brandão, R. L., Neves, M. J. and Castro, I. M. (2004). Molecular and physiological comparisons between Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces boulardii. Canadian Journal of Microbiology, 50(8), 615-621.

Francois, J., Parrou, J. L. (2001). Reserve carbohydrates metabolism in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiology Reviews, 25(1), 125-145.

Fredlund, E., Druvefors, U., Boysen, M. E., Lingsten, K. J. and Schnürer, J. (2002). Physiological characteristics of the biocontrol yeast Pichia anomala J121. Yeast Research, 2(3), 395-402.

Furukawa, S., Yoshida, K., Ogihara, H., Yamasaki, M. and Morinaga, Y. (2010). Mixed- species biofilm formation by direct cell-cell contact between brewing yeasts and lactic acid bacteria. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 74(11), 2316-2319.

Gadaga, T. H., Mutukumira, A. N. and Narvhus, J. A. (2001). The growth and interaction of yeasts and lactic acid bacteria isolated from Zimbabwean naturally fermented milk in UHT milk. International journal of food microbiology, 68(1-2), 21-32.

Gayathri, D., and Rashmi, B. S. (2016). Anti-Cancer Properties of Probiotics: A Natural Strategy for Cancer Prevention. EC Nutrition, 5(4), 1191-1202.

Ghada, S. I., Manal, G. H., Mohsen, M. S. A. and Eman, A. G. (2012). Production and biological evaluation of exopolysaccharide from isolated Rhodotorula glutinins. Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 6(3), 401-408.

Gientka, I., Błażejak, S., Stasiak-Różańska, L. and Chlebowska-Śmigiel, A. (2015). Exopolysaccharides from yeast: insight into optimal conditions for biosynthesis, chemical composition and functional properties? review. Acta Scientiarum Polonorum Technologia Alimentaria, 14(4), 283-292.

Goerges, S., Aigner, U., Silakowski, B. and Scherer, S. (2006). Inhibition of Listeria monocytogenes by food-borne yeasts. Applied and Environmental Microbiology, 72(1), 313-318.

Goerges, S., Koslowsky, M., Velagic, S., Borst, N., Bockelmann, W., Heller, K. J. and Scherer, S. (2011). Anti-listerial potential of food-borne yeasts in red smear cheese. International Dairy journal, 21(2), 83-89.

Golowczyc, M. A., Mobili, P., Garrote, G. L., de los Angeles Serradell, M., Abraham, A. G. and De Antoni, G. L. (2009). Interaction between Lactobacillus kefir and Saccharomyces lipolytica isolated from kefir grains: evidence for lectin-like activity of bacterial surface proteins. Journal of Dairy Research, 76(1), 111-116.

Golubev, W. (2006). Antagonistic interactions among yeasts. G. Péterand C. Rosa. (Eds.). Bio-diversity and cophysiology of Yeasts. Berlin: Springer, 197–219.

Gulshan, K., Moye-Rowley, W.S. (2007). Multidrug resistance in fungi. Eukaryotic Cell, 6(11), 1933-1942.

93

Guslandi, M., Mezzi, G., Sorghi, M., and Testoni, P. A. (2000). Saccharomyces boulardii in maintenance treatment of Crohn’s disease. Digestive Diseases and Sciences, 45(7), 1462-1464.

Halkman, A. and Ayhan, H. (2000). 06.Bölüm Gıdaların mikrobiyolojik analizi: mikroorganizma sayımı, Gıda mikrobiyolojisi ve uygulamaları. Ankara: Sim Matbaacılık Ltd. Şti., 229-254.

Hamad, S. H. (2012). The microbial quality of processed date fruits collected from a factory in Al-Hofuf City, Kingdom of Saudi Arabia. Emirates Journal of Food and Agriculture, 24(2), 105-112.

Hassanein, S. and Soliman, N. (2010). Effect of Probiotic (Saccharomyces cerevisiae) addingto diets on intestinal microflora and performance of hy-line layers hens". Journal American Science, 6(11), 159–169.

Hatoum, R.; Labrie, S. and Fliss, I., (2012). Identification and partial characterization of anti listerial com pounds produced by dairy yeasts. Probiotics Antimicrob. Proteins, 64(1), 40-48.

Hazem, M. (2011). Antioxidant and immunostimmulating activities of yeast (Saccharomyces cerevisiae) autolysates. World Applied Sciences Journal, 15(8), 1110-1119.

Hirayama, K., Rafter, J. (2000). The role of probiotic bacteria in cancer prevention. Microbes and İnfection, 2(6), 681-686.

Højberg, O., Canibe, N., Poulsen, H. D., Hedemann, M. S. and Jensen, B. B. (2005). Influence of dietary zinc oxide and copper sulfate on the gastrointestinal ecosystem in newly weaned piglets. Applied and Environmental Microbiology, 71(5), 2267- 2277.

Ishida, K., de Mello, J. C. P., Cortez, D. A. G., Filho, B. P. D., Ueda-Nakamura, T. and Nakamura, C. V. (2006). Influence of tannins from Stryphnodendron adstringens on growth and virulence factors of Candida albicans. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 58(5), 942-949.

İnternet: (emaze, t.y.). Saccharomyces cerevisiae. URL: http://www.webcitation.org/query?url=https%3A%2F%2Fwww.emaze.com%2F%40 ALOLCOIR%2FPresentation&date=2018-05-09, Son Erişim Tarihi: 17.03.2014.

İnternet: Diark (2018). Candida intermedia CBS 141442. URL: http://www.webcitation.org/query?url=https%3A%2F%2Fwww.emaze.com%2F%40 ALOLCOIR%2FPresentation&date=2018-05-08, Son Erişim Tarihi: 17.03.2014.

İnternet: Dixit, K. and Gandhi, D. (2006). Biotherapeutic properties of probiotic yeast Saccharomyces species in fermented dairy foods. URL: http://www.webcitation.org/query?url=https%3A%2F%2Fwww.dairyscience.info%2 Findex.php%2Fprobiotics.html&date=2018-04-12, Son Erişim Tarihi: 17.03.2018.

94

İnternet: FAOSTAT. (2012). Food and agricultural commodities production". Available at: http://www.webcitation.org/query?url=http%3A%2F%2Ffaostat.fao.org%2Fsite%2F 567%2Fdefault.aspx%23ancor&date=2018-05-08, Son Erişim Tarihi: 29.03.2015.

Jackson, K., Lovergrove, J. (2002). Functional foods, blood lipids and coronary heart disease. Food Science and Technology Bulletin: Functional Foods, 1(1), 1-11.

Jahn, H. U., Ullrich, R., Schneider, T., Liehr, R. M., Schieferdecker, H. L., Holst, H. and Zeitz, M. (1996). Immunological and Trophical Effects of Saccharomycesboulardii on the Small Intestine in Healthy Human Volunteers. Digestion, 57(2), 95-104.

Jang, S., Par, S. and Lim, J. (2009). The comperative immunomodulatory effects of β- glucans from yeast, bacteria and mushroom on the function of macrophages. Journal of Food Science and Nutrition, 14(2), 102-109.

Jawhara, S., Poulain, D. (2007). Saccharomyces boulardii decreases inflammation and intestinal colonization by Candida albicans in a mouse model of chemically-induced colitis. Medical mycology, 45(8), 691-700.

Jespersen, L. (2003). Occurrence and taxonomic characteristics of strains of Saccharomyces cerevisiae predominant in African indigenous fermented foods and beverages. Yeast Research, 3(2), 191-200.

Käppeli, O. (1987). Regulation of carbon metabolism in Saccharomyces cerevisiae and related yeasts. Advances in Microbial Physiology, 28, 181-209.

Kellems, R. O., Lagerstedt, A. and Wallentine, M. V. (1990). Effect of feeding Aspergillus oryzae fermentation extract or Aspergillus oryzae plus yeast culture plus mineral and vitamin supplement on performance of Holstein cows during a complete lactation. Journal of Dairy Science, 73(10), 2922-2928.

Kevin, W., Henny, C., Rolf, B. and Henk, J. (1998). Adhesive interactions between medically important yeasts and bacteria. Microbiology Reviews, 21(4), 321-336.

Kim, S. H., Yu, D. J., Lee, S. J., Park, S. Y., Ryu, K. S., and Lee, D. G. (2003). Effects of feeding aspergillus oryzae ferments on performance, ıntestinal microfloua, blood serum components and environmental factors in broiler. Korean Journal of Poultry Science, 30, 151–159.

Kourelis, A., Kotzamanidis, C., Litopoulou-Tzanetaki, E., Scouras, Z. G., Tzanetakis, N., and Yiangou, M. (2010). Preliminary probiotic selection of dairy and human yeast strains. Journal of Biological Research-Thessaloniki), 13(1), 93-104.

Kourelis, A., Kotzamanidis, C., Litopoulou-Tzanetaki, E., Scouras, Z. G., Tzanetakis, N., and Yiangou, M. (2010). Preliminary probiotic selection of dairy and human yeast strains. Journal of Biological Research-Thessaloniki, 13, 93-104.

Krasowska, A., Kubik, A., Prescha, A. and Lukaszewicz, M. (2007). Assimilation of omega 3 and omega 6 fatty acids and removing of chlosterol from enviroment by Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces boulardiistrains. Journal of Biotechnology, 131(2), 211-241.

95

Kumura, H., Tanoue, Y., Tsukahara, M., Tanaka, T. and Shimazaki, K. (2004). Screening of dairy yeast strains for probiotic applications. Journal of Dairy Science, 87(12), 4050-4056.

Kurtzman, C., Fell, J. (1998). The yeasts a taxonomic study (4. Baskı). Amsterdam: Elsevier.

Lee, C. Z., Liou, G. Y., & Yuan, G. F. (2006). Comparison of the aflR gene sequences of strains in Aspergillus section Flavi. Microbiology, 152(1), 161-170.

Lee, K., Lee, S. K. and Lee, B. D. (2006). Aspergillus oryzae as probiotic in poultry-A review. International Journal of Poultry Science, 5(1), 01-03.

Lee, S. K., Kim, Y. W., Chi, S. G., Joo, Y. S. and Kim, H. J. (2009). The effect of Saccharomyces boulardii on human colon cells and inflammation in rats with trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis. Digestive Diseases and Sciences, 54(2), 255-263.

Lima Filho, J. V. M., Vieira, E. C. and Nicoli, J. R. (2000). Antagonistic effect of Lactobacillus acidophilus, Saccharomyces boulardii and Escherichia coli combinations against experimental infections with Shigella flexneri and Salmonella enteritidis subsp. typhimurium in gnotobiotic mice. Journal of applied microbiology, 88(3), 365-370.

Linder, P., Shore, D. and Hall, M. (2006). Landmark papers in yeast biology. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Liong, M. (2011). Probiotics, Microbiology Monographs 21. Berlin: Springer, 321.

Low, F. L., Shaw, I. C. and Gerrard, J. A. (2005). The effect of Saccharomyces cerevisiae on the stability of the herbicide glyphosate during bread leavening. Letters in Applied Microbiology, 40(2), 133-137.

Mangala, L., Nilanjana, D. (2017). İsolation and characterization of potential probioticyeasts from different sources. Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research, 10(4), 451-455.

Markowiak, P., Śliżewska, K. (2017). Effects of probiotics, prebiotics, and synbiotics on human health. Nutrients, 9(9), 1021.

Marshall, V. and Rawson, H. (1999). Effects of Exopolysaccharide Producing strains of thermophilic lactic acid bacteria an texture of sirred yoghurt". International Journal of Food Science & Technology, 34(2), 137-143.

Martins, C. V. B., Horii, J., and Pizzirani-Kleiner, A. A. (1999). Characterization of fusion products from protoplasts of yeasts and their segregants by electrophoretic karyotyping and RAPD. Revista de Microbiologia, 30(1), 71-76.

McFarland, L. (2010). Systematic review and meta-analysis of Saccharomyces boulardii in adultpatients. World Journal Gastroenterol, 16(18), 2202–2222.

96

Megan, E. M., Janet, R. D. (2009). Effect of bile salts on the DNA and membrane integrity of enteric bacteria. Journal of Medical Microbiology,5(8), 1533-1541.

Millsap, K., Van Der Mei, H., Bos, R. and Busscher, H. (1998). Adhesive interactions between medically important yeasts and bacteria. FEMS Microbiology Reviews, 21(4), 321–336.

Min-Tze, L. (2011). Probiyotics: Biology, genetics and health aspects. London, Newyork: Springer, 321.

Mohamed, M., Hesham, A., Alrumman S., Alamri, S. and Moustafa, M. (2014). Indigenous yeasts of the rotten date fruits and their potentiality in bioethanol and single-cell protein production. International Journal of Agriculture & Biolog, 16, 752-758.

Mombelli, B., Gismondo, M. (2000). The use of probiotics in medical practice. International Journal of Antimicrobial Agents, 16(1), 531-536.

Moore, J., Millar, J., Xu, B. and Elshilbly, S. (2001). Edible dates (Phoenix dactylifera L.), a potential source of Cladosporium cladosporioides and sporobolomyces roseus". implication for public health. Mycopathologica, 154, 25–28.

Moslehi-Jenabian, S., Lindegaard, L. and Jespersen, L. (2010). Beneficial effects of probiotic and food borne yeasts on human health. Nutrients, 2(4), 449-473.

Murzyn, A., Krasowska, A., Stefanowicz, P., Dziadkowiec, D. and Łukaszewicz, M. (2010). Capric acid secreted by S. boulardii inhibits C. albicans filamentous growth, adhesion and biofilm formation. PloS One, 5(8), e12050.

Naz, S., Siddiqi, R., Ahmad, S., Rasool, S. A. and Sayeed, S. A. (2007). Antibacterial activity directed isolation of compounds from Punica granatum. Journal of Food Science, 72(9), 341-345.

Ness, F., Achstetter, T., Duport, C., Karst, F., Spagnoli, R. and Degryse, E. (1998). Sterol uptake in Saccharomyces cerevisiae heme auxotrophic mutants is affected by ergosterol and oleate but not by palmitoleate or by sterol esterification. Journal of Bacteriology, 180(7), 1913-1919.

Neves, M. J., Etchebehere, L. I. L. I. A. N., Brandao, R. L., Castro, I. M., Lima, M. E., and Nicoli, J. R. (2002). Partial characterisation of cholera toxin binding of membranes of saccharomyces boulardii. Microecol Ther, 29, 185–190.

Okamoto, S., Shinohara, H., Mori, T., Matsubayashi, Y., & Kawaguchi, M. (2013). Root- derived CLE glycopeptides control nodulation by direct binding to HAR1 receptor kinase. Nature Communications, 4, 2191.

Ostergaard, S., Olsson, L. and Nielsen, J. (2000). Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 64(1), 34-50.

Papalexandratou, Z., Falony, G., Romanens, E., Jimenez, J. C., Amores, F., Daniel, H. M. and De Vuyst, L. (2011). Species diversity, community dynamics, and metabolite

97

kinetics of the microbiota associated with traditional Ecuadorian spontaneous cocoa bean fermentations. Applied and Environmental Microbiology, 77(21), 7698-7714.

Pasha, C., Kuhad, R. C., and Rao, L. V. (2007). Strain improvement of thermotolerant Saccharomyces cerevisiae VS3 strain for better utilization of lignocellulosic substrates. Journal of Applied Microbiology, 103(5), 1480-1489.

Peng, X., Sun, J., Michiels, C., Iserentant, D. and Verachtert, H. (2001). Decrease in Cell Surface Galactose Residues ofSchizosaccharomyces pombe Enhances Its Coflocculation with Pediococcus damnosus. Applied and Environmental Microbiology, 67(8), 3413-3417.

Pietro, B., Rosa, M. (2014). Cold-adapted yeasts. New York, London: Springer, 543.

Posteraro, B., Sanguinetti, M., Romano, L., Torelli, R., Novarese, L. and Fadda, G. (2005). Molecular tools for differentiating probiotic and clinical strains of Saccharomyces cerevisiae. International Journal of Food Microbiology, 103(3), 295-304.

Prathap, K., Shetty, H. (2006). Saccharomyces cerevisiae and lactic acid bacteria as potential mycotoxin decontaminating agents. Trends in Food Science & Technology, 17(2), 48-55.

Pritib, S. (2012). Probiotic an overview for selection and evanluatory. Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Science, 4(2), 14-21.

Psani, M., Kotzekidou, P. (2006). Technological characteristics of yeast strains and their potential as starter adjuncts in Greek-style black olive fermentation. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 22(12), 1329-1336.

Psomas, E., Fletouris, E. and Litopoulou-Tzanetaki, N. (2003). Assimilation of cholesterol by yeast strains ısolated from ınfant feces and feta cheese. Journal of Dairy Science, 86, 3416–3422.

Raimi, O. R. (2013). Microbiological assessment of date fruits purchased from owode market, Inoffa, kwara state nigeriaIosr. Journal Of Environmental Science, Toxicology And Food, 4(3), 23-26.

Ramachandran, C., Sudha, R.R., Prince, R.P. and Usha, A. (2016). Evaluation of antimicrobial activity and probiotic properties of wild-strain Pichia kudriavzevii isolated from frozen batter. Yeast, 33(1), 385-401.

Ravella, S. R., Quiñones, T. S., Retter, A., Heiermann, M., Amon, T. and Hobbs, P. J. (2010). Extracellular polysaccharide (EPS) production by a novel strain of yeast-like fungus Aureobasidium pullulans. Carbohydrate Polymers, 82(3), 728-732.

Ravishanker, Y., Jamuna, A.B. (2015). Benifical microbs in fermented and functional foods. New york: CRC Press, 531.

Rinkinen, M., Jalava, K., Westermarck, E., Salminen, S. and Ouwehand, A. C. (2003). Interaction between probiotic lactic acid bacteria and canine enteric pathogens: a risk factor for intestinal Enterococcus faecium colonization?. Veterinary Microbiology, 92(1-2), 111-119.

98

Rodrigues, A. C. P., Nardi, R. M., Bambirra, E. A., Vieira, E. C. and Nicoli, J. R. (1996). Effect of Saccharomyces boulardii against experimental oral infection with Salmonella typhimurium and Shigella flexneri in conventional and gnotobiotic mice. Journal of Applied Microbiology, 81(3), 251-256.

Rodrigues, F. (2006). Sugar Metabolism in Yeasts: an Overview of Aerobic and Anaerobic Glucose Catabolism. Newyork: Springer, 101-121.

Roostita, L., Fleet, G., Wendry, S., Apon, Z. and Gemilang, L. (2011). Determination of yeasts antimicrobial activity in milk and meat Products. Advance Journal of Food Science and Technology, 3(6), 442-445.

Rowland, I., Rumney, C., Coutts, J. and Lievense, L. (1998). Effect of Bifidobacterium longum and inulin on gut bacterial metabolism and carcinogen-induced aberrant crypt foci in rats. Carcinogenesis, 19(2), 281–285.

Rusinova-Videva, S., Pavlova, K., Panchev, I., Georgieva, K . and Kuncheva, M. (2010). Effect of different factors on biosynthesis of exopolysaccharide from Antarctic yeast. Biotechnology & Biotechnological Equipment, 24(1), 507-511.

Saarela, M. H., Alakomi, H. L., Puhakka, A. and Mättö, J. (2009). Effect of the fermentation pH on the storage stability of Lactobacillus rhamnosus preparations and suitability of in vitro analyses of cell physiological functions to predict it. Journal of Applied Microbiology, 106(4), 1204-1212.

Sadoudi, M., Tourdot-Maréchal, R., Rousseaux, S., Steyer, D., Gallardo-Chacón, J. J., Ballester, J., and Alexandre, H. (2012). Yeast–yeast interactions revealed by aromatic profile analysis of Sauvignon Blanc wine fermented by single or co-culture of non-Saccharomyces and Saccharomyces yeasts. Food Microbiology, 32(2), 243- 253.

Saleh, F. A., Otaibi, M. M. (2013). Antibacterial activity of date palm (Phoenix dectylifera L.) fruit at different ripening stages. Journal of Food Processing and Technology, 4(12), 1-6.

Salminen, S., von Wright, A., Ouwehand, A. and Holzapfel, W. (2001). Safety assessment ofprobiotics and starters. Adams MR, Nout MJR (eds), Fermentation and food safety. Gaithersburg: Aspen Publishers, 239–251.

Šalomskienė, J., Mačionienė, I. (2009). The influence of contamination yoghurt, quark and semi-hard cheese by yeasts on their sensory properties. Veterinarija ir Zootechnika, 48(70), 72-76.

Satyanarayana, T., Gotthard, K. (2009). Ecology and Biodiversity of Yeasts with potentialvalue in Biotechnology. Berlin: Springer Science, 151-161.

Satyanarayana, T., Kunze, G. (2009). Yeast biotechnology deviersity and aplication. New Del hi: Springer.

Shenasi, M., Aidoo, K. E. and Candlish, A. A. G. (2002). Microflora of date fruits and production of aflatoxins at various stages of maturation. International Journal of Food Microbiology, 79(1-2), 113-119.

99

Shetty, P. H., Jespersen, L. (2006). Saccharomyces cerevisiae and lactic acid bacteria as potential mycotoxin decontaminating agents. Trends in Food Science & Technology, 17(2), 48-55.

Shinabarger, D. L., Keesler, G. A. (1989). Regulation by heme of sterol uptake in Saccharomyces cerevisiae. Steroids, 53(3-5), 607-623.

Smits, G. J., Kapteyn, J. C., van den Ende, H. and Klis, F. M. (1999). Cell wall dynamics in yeast. Current Opinion in Microbiology, 2(4), 348-352.

Soccol, C. R., Vandenberghe, L. P., Spier, M. R., Medeiros, A. B. P., Yamaguishi, C. T., De Dea Lindner, J., Pandey, A. and Thomaz-Soccol, V. (2010). The potential of probiotics. Food Technology and Biotechnology, 48(4), 413-434.

Spring, P., Wenk, C., Dawson, K. A. and Newman, K. E. (2000). The effects of dietary mannaoligosaccharides on cecal parameters and the concentrations of enteric bacteria in the ceca of salmonella-challenged broiler chicks. Poultry science, 79(2), 205-211.

Starmer, W., Lachance, M. (2011). Yeast ecology. Amsterdam: Elsevier The Netherlands.

Steidler, L. (2003). Genetically engineered probiotics. Best Practice & Research Clinical Gastroenterology, 17(5), 861-876.

Strathern, J. (2002). The molecular biology of the yeast saccharomyces. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Suástegui, M., Shao, Z. (2016). Yeast factories for the production of aromatic compounds: from building blocks to plant secondary metabolites. Journal of İndustrial Microbiology & Biotechnology, 43(11), 1611-1624.

Sukanta, K. (2011). Biology of eukaryotic probiotics. ProbioticsMicrobiology Monographs,21, 29-55.

Suzuki, C., Ando, Y. and Machida, S. (2001). Interaction of SMKT, a killer toxin produced by Pichia farinosa, with the yeast cell membranes. Yeast, 18(16), 1471-1478.

Syal, P., Vohra, A. (2013). Probiotic potential of yeasts isolated from traditional Indian fermented foods. International Journal of Microbiology Research, 5(2), 390-398.

Şanlidere Aloğlu, H., Demir Özer, E. and Öner, Z. (2016). Assimilation of cholesterol and probiotic characterisation of yeast strains isolated from raw milk and fermented foods. International Journal of Dairy Technology, 69(1), 63-70.

Tofalo, R., Suzzi, G. (2016). Yeasts. B. Caballero, P. M. Finglas, F. Toldra, (Eds.), Encyclopedia of food and health, Newyork: Elsevier, 593-599.

Uysal, S. (2016). Yoğurtlardan İzole edilen Mayaların Probiyotik Özelliklerinin Araştırılması. Yüksek Lisans Tezi, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Ankara.

100

Van der Aa Kühle, A., Skovgaard, K. and Jespersen, L. (2005). In vitro screening of probiotic properties of Saccharomyces cerevisiae var. boulardii and food-borne Saccharomyces cerevisiae strains. International Journal of Food Microbiology, 101(1), 29-39.

Viljoen, B.C. (2001). The interaction between yeasts and bacteria in dairy environments. International Journal of Food Microbiology, 69(1-2), 37-44.

Viljoen, B. (2006). Yeast ecological interactions. Yeast’yeast, yeast bacteria, yeast fungi inter actions and yeasts as biocontrol agents. A. Querol and G. Fleet (Eds.). Yeasts in food and beverages. Berlin: Springer, 83–110.

Virtanen, T., Pihlanto, A., Akkanen, S. and Korhonen, H. (2007). Development of antioxidant activity in milk whey during fermentation with lactic acid bacteria. Journal of Applied Microbiology, 102(1), 106-115.

Vornhagen, J., Stevens, M., McCormick, D. W., Dowd, S. E., Eisenberg, J. N., Boles, B. R., and Rickard, A. H. (2013). Coaggregation occurs amongst bacteria within and between biofilms in domestic showerheads. Biofouling, 29(1), 53-68.

Walker, G. (1998). Yeast Physiology and biotechnology. UK: Wiley, Chicester, 300-362.

Wang, L. L., & Xiong, Y. L. (2005). Inhibition of lipid oxidation in cooked beef patties by hydrolyzed potato protein is related to its reducing and radical scavenging ability. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53(23), 9186-9192.

Warminska-Radyko, I., Laniewska-Moroz, L., and Babuchowski, A. (2002). Possibilities for stimulation of Bifidobacterium growth by propionibacteria. Le Lait, 82(1), 113- 121.

Xie, N., Zhou, T. and Li, B. (2012). Kefir yeasts enhance probiotic potantials of Lactobacillus paracasei HP: The positive effects of coagreggation between the two strains. Food Research International, 43, 394-401.

Zárate, G., Morata De Ambrosini, V. I., Chaia, A. P. and González, N. S. (2002). Adhesion of dairy Propionibacteria to intestinal epithelial tissue in vitro and in vivo. Journal of Food Protection, 65, 534-539.

Zhu, Y., Luo, T., Jobin, C. and Young, H. (2011). Gut microbiota and probiotics in colon tumorigenesis. Cancer Letters, 309, 119–127.

101

ÖZGEÇMİŞ

Kişisel Bilgiler Soyadı, adı : AAKEF, Jaafar Nozad Aakef Uyruğu : Iraq Doğum tarihi ve yeri : 01.01.1989, Dyala Medeni hali : Bakar Telefon : 05452303367 E-mail : [email protected]

Eğitim Derece Eğitim Birimi Mezuniyet Tarihi Yüksek Lisans Gazi Üniversitesi/Biyoloji Devam ediyor Lisans Omar Al- Muhtar Univ. 2014 Bilim & Gıda Teknolojileri Lise Al-Fatih/ Mühendislik Bilimleri 2008

YabancıDil Arapça, Türkçe, İngilizce

Yayınlar

Poster Bildiri

Jaafar, A., Beyatlı, Y. (2017, Aralık). Hurmalardan ızole edilen probiyotik kudriavzyevii ve kluyveromyces marxianus maya suşlarının hidrofoboiste yetenekleri ıle EPS üretimlerinin araştırılması. 19.Ulusal Biyoteknoloji Kongresinde sunuldu, Eskişehir.

Jaafar, A., Beyatlı, Y. (2017, Aralık). Hurmalardan izole edilen probiyotik bazı maya suşlarının otoagregasyon ve koagregasyon özelliklerinin incellenmesi. 19.Ulusal Biyoteknoloji Kongresinde sunuldu, Eskişehir.

Hobiler

Kitap okuma, Seyahat

102

GAZİ GELECEKTİR...