CARACTERIZAÇÃO BIOENERGÉTICA DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE EM FERMENTAÇÃO VINÁRIA
Tiago Monteiro Lomba Viana
Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia Alimentar
Orientador: Doutora Catarina Paula Guerra Geoffroy Prista
Co-orientador: Doutora Maria da Conceição da Silva Loureiro Dias
Jú ri:
Presidente: Doutor Virgílio Borges Loureiro, Professor Associado do Instituto Superior de Agronomia da Universidade Técnica de Lisboa.
Vogais: Doutor José Martínez Peinado, Professor Catedrático da Facultad de Ciencias Biologicas da Universidad Complutense de Madrid, Espanha.
Doutora Maria da Conceição da Silva Loureiro Dias, Professora Catedrática Convidada do Instituto Superior de Agronomia da Univesidade Técnica de Lisboa.
Doutora Catarina Paula Guerra Geoffroy Prista, Investigadora Auxilar do Instituto Superior de Agronomia da Universiadade Técnica de Lisboa.
Lisboa, 2009 AGRADECIMENTOS
Terminada esta etapa da minha formação académica, gostaria de expressar o meu reconhecimento e referir as pessoas e instituição que contribuíram para este trabalho, sem as quais muito dificilmente teria sido levado a cabo. As minhas primeiras palavras de agradecimento são dirigidas à Professora Doutora Maria da Conceição Loureiro Dias, a quem devo grande parte do meu interesse no mundo da Microbiologia, guiando os meus primeiros passos neste ramo da Ciência, mostrando-me o seu encanto e incentivando o meu entusiasmo. Foi um enorme privilégio ter iniciado a minha vida de investigação científica na sua equipa e poder contar com a sua sapiência. O seu contributo não foi apenas importante no progresso deste trabalho, mas foi igualmente essencial na minha formação científica/pessoal durante este tempo. Gostaria de expressar à Doutora Catarina Prista o meu sincero agradecimento por tudo a que este ano inesquecível diz respeito. Começo por lhe agradecer a sua amizade e o facto de me ter recebido tão bem no laboratório, proporcionando-me todas as condições que se podem desejar quando se desenvolve um trabalho desta natureza. A orientação de excelência com que conduziu este trabalho, o acompanhamento incondicional das diferentes etapas e a sua disponibilidade inolvidável em ajudar, discutir e iluminar todas as minhas dúvidas e dificuldades foram inexcedíveis… Muito obrigado! Um agradecimento especial também aos colegas de laboratório (Vanessa Salvador, Luís Leitão, Ana Madeira e Maria José) e à equipa da Cooking Lab (Susana Dias e Joana Moura), com quem aprendi muito e de tudo um pouco. Todos foram responsáveis por terem tornado este local de trabalho único, repleto de companheirismo, boa-disposição e óptimo espírito. No entanto, gostava de agradecer em especial à Vanessa e ao Luís, pela ajuda concedida e pelos conhecimentos partilhados que permitiram, em determinados momentos deste trabalho, formar teorias verdadeiramente hilariantes e revolucionárias. Não podia deixar de agradecer às equipas dos laboratórios de Microbiologia e de Fisiologia, pela cooperação e amizade concedidas. Em particular, ao André Barata por ter esclarecido as minhas dúvidas relativas à ecologia de leveduras. Ao Instituto Superior de Agronomia agradeço as facilidades concedidas para a realização deste trabalho, bem como a oportunidade de, ao longo do curso, me ter cruzado com diversos professores e colegas que, de uma forma directa ou indirecta, me marcaram e contribuíram na minha formação académica/pessoal. Finalmente os últimos e mais especiais agradecimentos à minha família e à Joana, por tudo o que fizeram por mim, pertencendo-lhes também este meu caminho e trabalho. Ao longo de todo este tempo, tem sido vital o apoio incondicional e a compreensão inexcedível
i dos meus pais e avó. São eles os verdadeiros responsáveis pelo trabalho diário nos bastidores. Aos meus irmãos e famílias respectivas agradeço todo o apoio que me têm dado ao longo do tempo. À Joaninha, minha fonte de inspiração, queria agradecer-lhe profundamente o estar comigo nos momentos mais importantes da minha vida, desafiando- me e apoiando-me constantemente. Obrigado por seres quem és e como és!
Muito obrigado a todos,
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ii RESUMO
Caracterização Bioenergética de Saccharomyces cerevisiae em Fermentação Vinária.
A fermentação vinária constitui um processo complexo ao longo do qual as leveduras são sujeitas a vários tipos de stresse (pressão osmótica, etanol, pH baixo, esgotamento de nutrientes, temperatura). O trabalho realizado avaliou o comportamento da estirpe industrial de Saccharomyces cerevisiae ISA1000 durante fermentações em mosto de uva branca, a
15ºC e a 30ºC, simulando condições reais em adega. Determinou-se o pH intracelular (pH in ), e o efluxo e influxo de protões, em células cultivadas às duas temperaturas, como indicadores de actividade catabólica e de permeabilidade a H+ da membrana plasmática. As células foram recolhidas em diferentes fases da fermentação. Avaliou-se também o efeito do etanol no efluxo e influxo de H+, às duas temperaturas.
Os resultados mais relevantes foram observados a 15ºC, em fase estacionária. Nestas condições, S. cerevisiae ISA1000 evidenciou pH in baixo (pH in ≈5), incapacidade de expulsar H+ e muito baixa permeabilidade da membrana plasmática aos mesmos. A 30ºC, na mesma fase, a mesma estirpe revelou-se pouco permeável a H+ e com baixa capacidade de os expulsar, mantendo, no entanto, um valor de pH in mais elevado (pH in ≈6). Para ambas as temperaturas, observou-se um menor efeito do etanol na permeabilidade de membrana para células em fase estacionária.
Palavras-chave: Fermentação vinária, etanol, temperatura, membrana plasmática, permeabilidade, pH intracelular.
*Orientador: Catarina Prista, PhD – Instituto Superior de Agronomia; Universidade Técnica de Lisboa
iii ABSTRACT
Bioenergetic Characterization of Saccharomyces cerevisiae on Wine Fermentation.
Wine fermentation is a complex process, during which yeast cells are submitted to a number of adverse stress conditions (osmotic pressure, low pH, ethanol, nutrient limitation and starvation, temperature). In this work, the performance of the industrial strain Saccharomyces cerevisiae ISA1000 was evaluated during white grape must fermentations, at 15ºC and 30ºC, in experiments simulating real winery conditions. Intracellular pH (pH i), proton influx and proton extrusion through the plasma membrane were measured, at both temperatures, as indicators of cell catabolic activity and plasma membrane permeability. Cells were harvested at different stages throughout fermentation. The effect of ethanol on proton extrusion and proton influx was evaluated at the same temperatures. The most relevant results were obtained at 15ºC, in stationary phase. Under these + conditions, S. cerevisiae ISA1000 exhibited low pH i (pH i≈5), inability to extrude H and very low H+ permeability. At 30ºC, at the same fermentation stage, the cells presented low H+ + permeability and low H extrusion capacity, although they had a higher pH i (pH i≈6) than at 15ºC. For both temperatures, the effect of ethanol on H + permeability was less evident in stationary phase cells.
Key-words: Wine fermentation, ethanol, temperature, plasma membrane, permeability, intracellular pH.
*Supervisor: Catarina Prista, PhD – Instituto Superior de Agronomia; Technical University of Lisbon
iv ABSTRACT
Bioenergetic Characterization of Saccharomyces cerevisiae on Wine Fermentation.
Wine fermentation is a complex ecological and biochemical process. Though grape must is relatively complete in nutrients content, it can support the growth of only a limited number of microbial species due to its adverse conditions such as low pH, high sugar content, pesticide residues and presence of SO 2. The selectivity of fermenting must is further strengthened by oxygen limitation, depletion of certain nutrients and increasing ethanol concentrations. This work was part of a project with the broad objective of improving the production/quality of wine, as far as it depends on yeast fermentation. Specifically, the present work aimed to characterize yeast proton homeostasis during must fermentation under experimental conditions simulating real winery conditions for white wine and red wine production. To accomplish this goal, an industrial strain of Saccharomyces cerevisiae (ISA1000), isolated from a commercial starter (FERMIVIN) was used. This strain was grown in white grape must, under experimental conditions simulating a real winery, at 15 and 30ºC, temperatures commonly used for white wine and red wine production, respectively. Six different growth situations were selected for 15ºC: the beginning, the middle and the final of exponential growth phase, the beginning and the middle stationary growth phase and the end of fermentation (when no sugar was detected by standard methods). For 30ºC, the same situations were chosen, except the first sample point. Results were compared with the same strain grown at the same temperatures in mineral medium, 2% glucose (usual lab conditions). To evaluate the efficiency of proton homeostasis, intracellular pH, proton extrusion and proton influx through the plasma membrane were measured at both temperatures. The effect of ethanol on proton extrusion and proton influx was also evaluated at the same temperatures for the same cells. Intracellular pH was assessed through the relative distribution of the non-metabolizable 14 substrate [7- C] benzoic acid. Up to the end of the exponential phase, pH i was very similar for both temperatures (between 6.1 and 6.4). Nevertheless, during the stationary phase, mainly at 15ºC, a pronounced drop occurred in pH i, reaching pH 5.0 at the end of fermentation. At 30ºC only a minor drop occurred (pH i 5.8 at the end of fermentation). Proton influx and proton extrusion were measured in unbuffered cell suspensions, with a standard pH meter connected to a recorder. H+ extrusion was calculated as the rate of increase of the concentration of extracellular protons. The acidification curve is the result of the H+ movements in both directions across the plasma membrane. Considering that H+
v extrusion is mainly due to the ATPase activity, results showed that, in general, H + efflux rate was higher at 30ºC than at 15ºC (for all the fermentation stages). At both temperatures, a stronger inhibition of H+ efflux by ethanol was also noticed in exponential phase cells than in stationary phase cells. The rate of proton influx was calculated as the rate of the decrease of the concentration of extracellular protons. All experiments were performed in the presence of 2-deoxy-D-glucose and antimycin to minimize H + movements created by the plasma membrane ATPase activity. Comparing the slope of the curves at each temperature, differences were observed. At 15ºC, in early fermentation stages (up to the end of the exponential phase), the H+ permeability was high ( ≈0.4 mmol.g -1.h -1) and quite sensitive to the presence of ethanol (16-18% ethanol). Nevertheless, during the stationary phase, cells presented very low H + permeability, not affected by ethanol present in the assay (up to 20%). At 30ºC, in general, the H+ permeability was higher than at 15ºC, mainly at early stages, and once again ethanol increased the rate of H+ influx. Summarizing the most relevant results: • The end of exponential phase represents a threshold, and the cells became much less permeable to protons; • This effect was more pronounced at 15ºC; • This impermeability occurred even when ethanol was present in the assay (0-20% ethanol); • At 15ºC during the stationary phase the intracellular content was more acidic, reaching pH 5.0 by the end of fermentation; • Fermentation proceeded under these conditions up to sugar exhaustion.
These results open new gates for research on yeast performance during late stages of wine fermentations.
Key-words: Wine fermentation, ethanol, temperature, plasma membrane, permeability, intracellular pH.
*Supervisor: Catarina Prista, PhD – Instituto Superior de Agronomia; Technical University of Lisbon
vi ÍNDICE
AGRADECIMENTOS ...... i RESUMO ...... iii ABSTRACT ...... iv LISTA DE TABELAS ...... x LISTA DE FIGURAS ...... xi LISTA DE ABREVIATURAS ...... xiii 1. INTRODUÇÃO GERAL ...... 1 1.1. Apresentação e enquadramento do tema ...... 1 1.2. Saccharomyces cerevisiae ...... 2 1.2.1. Classificação taxonómica ...... 2 1.2.2. Estrutura da célula ...... 4 1.2.2.1. Membrana plasmática ...... 4 1.2.2.1.1. Composição da membrana plasmática ...... 5 1.2.2.1.2. Fluidez de membrana ...... 5 1.2.2.1.3. H+-ATPase membranar ...... 6 1.3. Fermentação alcoólica por Saccharomyces cerevisiae ...... 9 1.3.1. Bioquímica do processo ...... 9 1.3.2. Produtos secundários ...... 10 1.4. Fermentação vinária ...... 11 1.4.1. Factores físico-químicos que afectam as cinéticas de fermentação vinária ..... 12 1.4.1.1. Etanol ...... 12 1.4.1.2. Temperatura ...... 17 1.4.1.3. Disponibilidade de oxigénio ...... 21 1.4.2. Respostas ao stresse ...... 22 1.4.3. Biodiversidade de leveduras ...... 24 1.5. Objectivos da dissertação ...... 27 2. MATERIAL E MÉTODOS ...... 28 2.1. Microrganismo ...... 28 2.2. Meios de cultura ...... 28 2.3. Condições de crescimento e recolha de amostras ...... 29 2.3.1. Manutenção das culturas ...... 29 2.3.2. Quantificação de biomassa ...... 29
vii 2.3.2.1. Acompanhamento das culturas ...... 29 2.3.2.2. Peso seco ...... 29 2.3.3. Preparação do pré-inóculo ...... 30 2.3.4. Ensaios em meio mineral ...... 30 2.3.5. Ensaios em mosto estéril ...... 30 2.3.6. Pontos de amostragem ...... 30 2.4. Ensaios preliminares de crescimento ...... 31 2.4.1. Ensaios preliminares em meio mineral ...... 31 2.4.2. Ensaios preliminares em mosto ...... 31 2.4.2.1. Determinação dos parâmetros físico-químicos ...... 31 2.4.2.2. Determinação dos parâmetros de crescimento ...... 32 2.5. Determinação do teor em glucose presente no mosto ...... 32 2.5.1. Base do método ...... 32 2.5.2. Procedimento experimental ...... 32 2.6. Determinação do teor em etanol presente no mosto ...... 33 2.6.1. Base do método ...... 33 2.6.2. Procedimento experimental ...... 34 2.7. Determinação do pH intracelular ...... 35 2.7.1. Base do método ...... 35 2.7.2. Características das soluções utilizadas ...... 36 2.7.3. Procedimento experimental ...... 37 2.7.3.1. Ensaios em meio mineral ...... 37 2.7.3.2. Ensaios em mosto ...... 38 2.8. Avaliação do efeito do etanol sobre a permeabilidade da membrana a H + ...... 40 2.8.1. Base do método ...... 40 2.8.2. Procedimento experimental ...... 40 2.8.2.1. Preparação das suspensões de células ...... 41 2.8.2.2. Ensaios com células ressuspendidas em água desmineralizada ...... 41 2.8.2.3. Ensaios com células ressuspendidas a diferentes pH extracelulares ...... 42 2.9. Avaliação do efeito do etanol sobre o efluxo de H + através da membrana plasmática 42 2.9.1. Base do método ...... 42 2.9.2. Procedimento experimental ...... 42 2.9.2.1. Preparação de suspensões de células ...... 42
viii 2.9.2.2. Ensaio experimental a diferentes temperaturas ...... 42 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...... 44 3.1. Ensaios preliminares ...... 44 3.1.1. Ensaio preliminar de Saccharomyces cerevisiae ISA 1000 a 15ºC ...... 45 3.1.1.1. Avaliação dos parâmetros de crescimento da estirpe ...... 45 3.1.1.2. Avaliação dos parâmetros físico-químicos do mosto ...... 47 3.1.2. Ensaio preliminar de Saccharomyces cerevisiae ISA 1000 a 30ºC ...... 51 3.1.2.1. Avaliação de parâmetros de crescimento ...... 51 3.1.2.2. Avaliação dos parâmetros físico-químicos ...... 52 3.2. Avaliação de parâmetros fisiológicos ...... 55 3.2.1. pH intracelular ...... 56 3.2.1.1. Em meio K ...... 56 3.2.1.2. Em mosto estéril ...... 60 3.2.2. Efluxo de H + através da membrana plasmática ...... 62 3.2.2.1. Em meio K ...... 63 3.2.2.2. Em mosto estéril ...... 64 3.2.3. Permeabilidade da membrana ao influxo de protões ...... 68 3.2.3.1. Em meio K ...... 68 3.2.3.2. Em mosto estéril ...... 69 3.2.3.2.1. Células suspensas e incubadas em água desmineralizada ...... 69 3.2.3.2.2. Células suspensas e incubadas em tampões ...... 71 3.3. Discussão Geral ...... 72 4. CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS FUTURAS ...... 79 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 81 ANEXO I ...... 99 ANEXO II ...... 100 ANEXO IV ...... 103 ANEXO V ...... 104 ANEXO VI ...... 106 ANEXO VII ...... 108 ANEXO VIII ...... 110
ix LISTA DE TABELAS
Nº Legenda Pág. 1 Classificação taxonómica de Saccharomyces cerevisiae. 2
2 Metabolitos presentes durante a fermentação alcoólica. 10 3 Factores de diluição utilizados para cada amostra dos ensaios a (a) 15ºC e a (b) 30ºC. 33 4 Factores de diluição utilizados para cada amostra dos ensaios a (a) 15ºC e a (b) 30ºC. 34 5 39 Dados utilizados nos ensaios de pH in . 6 Pontos de amostragem definidos para o crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 em 46 fermentações conduzidas a 15ºC. 7 Teor de glucose e de etanol em fermentações conduzidas a 15ºC, para os 6 pontos de 50 amostragem escolhidos. 8 Teor de glucose e de etanol em fermentações conduzidas a 30ºC, para os 6 pontos de 54 amostragem escolhidos. 9 Valores de pH intracelular de S. cerevisiae ISA 1000 obtidos nos ensaios, para as 61 diferentes fases de crescimento em mosto estéril, a 15ºC e a 30ºC. 10 Características técnicas da preparação comercial de levedura seca activa para 99 vinificação FERMIVIN ®. 11 Títulos alcoométricos de vinhos, expressos em % (v/v) 100 12 Parâmetros físicos do mosto ao longo da fermentação a 15ºC. 103 13 Parâmetros físicos do mosto ao longo da fermentação a 30ºC. 103 14 Parâmetros de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 ao longo da fermentação vinária 104 a 15ºC. 15 Parâmetros de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 ao longo da fermentação vinária 105 a 30ºC. 16 106 pH in de S. cerevisiae ISA 1000, cultivada a 15ºC em meio mineral e em mosto estéril. 17 107 pH in de S. cerevisiae ISA 1000, cultivada a 30ºC em meio mineral e em mosto estéril. 18 107 pH in de S. cerevisiae W-303, cultivada a 15ºC e a 30ºC em meio mineral. 19 Velocidades de efluxo de H + (mmol.g -1.h -1) de S. cerevisiae ISA 1000, cultivada em 108 meio K (fase exponencial, apenas) e em mosto (para diferentes fases de crescimento), a 15ºC. 20 Velocidades de efluxo de H + (mmol.g -1.h -1) de S. cerevisiae ISA 1000, cultivada em 109 meio K (fase exponencial, apenas) e em mosto (para diferentes fases de crescimento), a 30ºC. 21 Velocidades de influxo de H + (mmol.g -1.h -1) de S. cerevisiae ISA 1000, cultivada em 110 meio K (fase exponencial, apenas) e em mosto (para diferentes fases de crescimento), a 15ºC. 22 Velocidades de influxo de H + (mmol.g -1.h -1) de S. cerevisiae ISA 1000, cultivada em 111 meio K (fase exponencial, apenas) e em mosto (para diferentes fases de crescimento), a 30ºC.
x LISTA DE FIGURAS
Nº Legenda Pág. 1 (a) Saccharomyces sp. observada através de microscopia de contraste de fase, 4 ampliação de 1000x (b) Constituição de uma célula de levedura. 2 Representação do modelo de estrutura da cadeia polipeptídica da H +-ATPase 6 membranar. 3 10 Via glicolítica, fermentação alcoólica e desvio para a produção de glicerol. 4 21 Representação das etapas de consumo de O 2 na biossíntese de ergosterol. 5 Representação da transmissão de sinais ambientais através duma rede interligada de 24 vias de transdução de sinais numa célula de levedura. 6 Sistema de filtração em vácuo utilizado na determinação da concentração de 38 composto radioactivo presente no meio intracelular. 7 Variação de pH de uma suspensão aquosa de S. cerevisiae ISA 1000 (100 mg/mL) 40 após uma acidificação rápida de pH 5 para pH 4. 8 Representação do equipamento utilizado na medição da velocidade do movimento de 40 H+ através da membrana plasmática de S. cerevisiae ISA 1000. 9 41 Curva típica obtida nos ensaios de permeabilidade a H + da membrana plasmática. 10 Variação de pH de uma suspensão aquosa de S. cerevisiae ISA 1000 (100 mg/mL) 42 após um pulso de glucose. 11 43 Curva típica obtida nos ensaios de efluxo protónico. 12 45 Curva de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 em fermentação de mosto a 15ºC. 13 Evolução do (a) pH extracelular, da (b) massa volúmica (mg/mL) e do (c) ºBrix do 47 mosto, ao longo de fermentação de S. cerevisiae ISA 1000 em mosto de uva branca a 15ºC. 14 Consumo de glucose e produção de etanol de S. cerevisiae ISA 1000 ao longo de 50 fermentações de mosto a 15ºC. 15 51 Curva de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 em fermentação de mosto a 30ºC 16 Evolução do (a) pH extracelular, da (b) massa volúmica (mg/mL) e do (c) ºBrix do 53 mosto, ao longo de fermentação de S. cerevisiae ISA 1000 em mosto de uva branca a 30ºC. 17 Consumo de glucose e produção de etanol de S. cerevisiae ISA 1000 ao longo de 55 fermentações de mosto a 30ºC. 18 Valores medidos para pH intracelular de S. cerevisiae ISA 1000, a 15ºC, cultivada em 57 meio K, utilizando [1-14 C] ácido propiónico. 19 pH intracelular de S. cerevisiae W-303, cultivada em meio K a 15ºC, utilizando [1 - 58 14 C] ácido propiónico ou [7-14 C] ácido benzóico. 20 pH intracelular de S. cerevisiae W-303, cultivada em meio K a 30ºC, utilizando [1-14 C] 58 ácido propiónico ou [7-14 C] ácido benzóico. 21 pH intracelular de S. cerevisiae ISA 1000, cultivada em meio K, a 15ºC e a 30ºC, 59 utilizando [7-14 C] ácido benzóico. 22 pH intracelular para as diferentes fases de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 em 60 mosto estéril, a 15ºC, utilizando [7-14 C] ácido benzóico. 23 pH intracelular para as diferentes fases de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 em 61 mosto estéril, a 30ºC, utilizando [7-14 C] ácido benzóico. 24 Efluxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiae ISA 1000, em 63 meio K, a 15ºC e a 30ºC, utilizando diferentes concentrações de etanol no meio extracelular.
xi 25 Efluxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiae ISA 1000, para 64 as diferentes fases de crescimento em mosto a 15ºC, utilizando diferentes concentrações de etanol no meio extracelular. 26 Efluxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiae ISA 1000, para 66 as diferentes fases de crescimento em mosto a 30ºC, utilizando diferentes concentrações de etanol no meio extracelular. 27 Influxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiae ISA 1000, em 68 meio K a 15ºC e a 30ºC, utilizando diferentes concentrações de etanol no meio extracelular. 28 Influxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiae ISA 1000, para 69 as diferentes fases de crescimento em mosto a 15ºC, utilizando diferentes concentrações de etanol no meio extracelular. 29 Influxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiae ISA 1000, para 70 as diferentes fases de crescimento em mosto a 30ºC, utilizando diferentes concentrações de etanol no meio extracelular. 30 Influxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiae ISA 1000, em 71 fermentações de mosto a 15ºC, após ressuspensão e incubação das suspensões de células em água, Tris 10mM citrato pH 5 e Tris 10mM citrato pH 6,3, utilizando diferentes concentrações de etanol no meio extracelular, para as fases (a) meio da estacionária e (b) final de fermentação. 31 Influxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiae ISA 1000, em 72 fermentações de mosto a 30ºC, após ressuspensão e incubação das suspensões de células em água, Tris 10mM citrato pH 5 e Tris 10mM citrato pH 6,3, utilizando diferentes concentrações de etanol no meio extracelular, para as fases (a) meio da estacionária e (b) final de fermentação.
xii LISTA DE ABREVIATURAS
ABREVIATURAS DESIGNAÇÕES COMPLETAS
∆ψ gradiente electroquímico ∆pH gradiente protónico ºC graus Celsius ADP adenosina-5’-difosfato AMP adenosina-5’-monofosfato ATP adenosina-5’-trifosfato
Cf concentração final CPM contagens por minuto
D.O. 640nm densidade óptica medida a λ=640nm EDTA ácido etilenodiamino tetra-acético Final exp. final da fase exponencial / início da fase de desaceleração Final ferm. fase final de fermentação GBq gigabecquerel Iníc. est. início da fase estacionária Iníc. exp. início da fase exponencial MBq megabecquerel mCi microcurie Meio est. meio da fase estacionária Meio exp. meio da fase exponencial rL/L reagente rLuciferase/Luciferina pH in pH intracelular Pi fosfato inorgânico p.s. peso seco p/v peso por volume RLU unidades relativas de luminometria r.p.m. rotações por minuto TCA ácido tricloro-acético
Tmaxf temperatura máxima final de crescimento
Tmaxi temperatura máxima inicial de crescimento
Top temperatura óptima de crescimento Tris 2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiol UFC unidades formadoras de colónias UV ultravioleta v.q.p.r.d. vinhos de qualidade produzidos em regiões determinadas YPD yeast extract peptone dextrose
xiii INTRODUÇÃO GERAL
1. INTRODUÇÃO GERAL
1.1. Apresentação e enquadramento do tema
Durante a fermentação vinária as leveduras são expostas simultanea e sequencialmente a uma gama muito variada de situações de stresse [Querol et al ., 2003; Zuzuarregui & Olmo, 2004], que podem induzir múltiplas alterações no estado fisiológico das células, afectando o crescimento, a capacidade fermentativa, a capacidade metabólica e a viabilidade celular [Pérez-Torrado et al. , 2005]. O mosto de uva representa a primeira situação de stresse, devido ao seu elevado teor de açúcar (stresse osmótico), baixo pH, frequente carência de nutrientes (e.g. azoto assimilável, vitaminas) e presença de agentes antimicrobianos (e.g. resíduos de pesticidas, cobre e enxofre) [Carrasco et al ., 2001; Querol et al ., 2003; Zuzuarregui & del Olmo, 2004]. Além disso, é-lhe frequentemente adicionado dióxido de enxofre (SO 2), como antioxidante e antisséptico, contribuindo para a criação de um ambiente ainda mais adverso para as leveduras. Durante a fermentação vinária, as células estão sujeitas à diminuição do teor de açúcar, ao abaixamento do pH extracelular e ao aumento do teor de álcool e de CO 2 e ao aumento da temperatura, que intensificam os efeitos das outras formas de stresse referidas. Por estas razões, o estado fisiológico das leveduras altera-se profundamente durante o processo. Inicialmente ocorre crescimento, em regra durante 7-8 duplicações. Com o decorrer da fermentação, a taxa de crescimento baixa, a cultura entra em fase estacionária, decorrendo a maior parte do processo fermentativo com células nesta fase ( resting cells ). Embora tenham sido bem estudadas a fisiologia e a genética de estirpes laboratoriais de Saccharomyces cerevisiae , a maior parte deste conhecimento tem sido obtido em condições laboratoriais e com leveduras em fase exponencial de crescimento, nem sempre sendo possível extrapolar tal informação para explicar o desempenho da levedura na vinificação. Estudos prévios realizados no laboratório de Bioenergética Microbiana permitiram avaliar o desempenho de uma estirpe industrial de S. cerevisiae durante fermentações a 25ºC, em mosto real, confirmando a ideia de que o estado fisiológico das células em fase estacionária é muito diferente do das células em fase exponencial. Particularmente interessantes foram os resultados obtidos para o pH intracelular (pH in ) e para os fluxos de protões para e do interior das células que apontaram para um papel relevante de homeostase protónica na tolerância ao etanol das células nas últimas fases de fermentação. Os ensaios foram realizados paralelamente em meio mineral, de forma a permitir a comparação mais fiável entre os dados obtidos e os dados da literatura [C. Prista, comunicação pessoal]. O presente trabalho surge enquadrado no projecto atrás mencionado procurando-se, neste caso, dar um novo passo no sentido de aproximar as condições experimentais em
1 INTRODUÇÃO GERAL laboratório e as condições reais em adega. Para tal, realizaram-se fermentações a temperaturas normalmente utilizadas para a obtenção de vinho branco (15ºC) e de vinho tinto (30ºC). Propusemo-nos estudar o comportamento fermentativo da mesma estirpe de S. cerevisiae às temperaturas referidas, analisando diversos parâmetros fisiológicos (pH in , efluxo de protões através da membrana plasmática e permeabilidade da mesma aos protões) que poderão influenciar a capacidade da estirpe para manter a sua viabilidade e a regulação da sua homeostase protónica.
1.2. Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae é uma espécie de levedura utilizada há milhares de anos na panificação e na fermentação de bebidas alcoólicas, sendo a levedura fermentativa por excelência, tendo sido utilizada igualmente nos últimos anos para produção de bioetanol. É também muito importante como organismo modelo [Ostergaard et al. , 2000], quer em estudos fisiológicos (efeitos de diversos tipos de stresse - osmótico, oxidativo, etanol e ácidos fracos), quer na área de Biologia Celular e Molecular, sendo o microrganismo eucariótico mais estudado e aquele cujo genoma foi o primeiro a ser sequenciado [Williams, 1996].
1.2.1. Classificação taxonómica
A classificação taxonómica da espécie Saccharomyces cerevisiae foi proposta em 1883 por Meyen ex E.C. Hansen, e encontra-se descrita na Tabela 1.
Tabela 1: Classificação Taxonómica de Saccharomyces cerevisiae Super Reino Eukaryota Reino Fungi Filo Ascomycota Classe Saccharomycetes Ordem Saccharomycetales Família Saccharomycetaceae Género Saccharomyces Espécie Saccharomyces cerevisiae
Esta classificação baseia-se num conjunto de características definidas por vários autores [Kreger-van Rig, 1984; Barnett et al. , 1990; Ratledge & Hull, 1991], tais como: morfologia, capacidade de fermentar diferentes substratos, capacidade de utilizar diferentes substratos, temperatura de crescimento, entre outros.
2 INTRODUÇÃO GERAL
Morfologia
As colónias apresentam uma coloração que varia entre o branco (predominantemente) e o creme (ocasionalmente), são convexas e lisas. Este microrganismo pode formar pseudo- hifas, que consistem em cadeias simples de células esféricas, elipsoidais ou cilíndricas. Reproduzem-se na maioria das vezes por gemulação multilateral, onde a nova gémula é formada na porção lateral da célula-mãe. A conjugação de células individuais conduz à formação do asco, cuja composição pode variar entre um a doze ascósporos lisos, de forma oval ou redonda, em cada célula.
Fermentação
D-Glucose + Me α-D-glucósido +, - Melibiose + Melezitose +, - Amido +, -
D-Galactose +, - Sacarose +, - Lactose - Rafinose +, - Maltose +, - α,α- Trealose +, - Celobiose - Inulina -
Assimilação / Crescimento
D-Galactose +, - Melezitose +, - D-Glucuronato – sem Tiamina +, - L-Sorbose - Inulina - DL-Lactato +, - sem Biotina e Tiamina +, - D-Glucosamina - Amido +, - Succinato -, D sem Piridoxina +, - D-Ribose – Glicerol +, - Citrato – sem Niacina +
D-Xilose – Eritritol – Metanol – sem Ácido fólico + L-Arabinose – Ribitol – Etanol +, - sem PABA +, -
L-Ramnose – Xilitol – Nitrato – a 25ºC + Sacarose +, - L-Arabinitol – Nitrito – a 30ºC + Maltose +, - D-Glucitol -, D Etilamina – a 35ºC +, - α ,α-Trealose +, - D-Manitol -, D L-Lisina – a 37ºC +, - Me α-D-Glucosido +, - Galactitol – Cadaverina – a 42ºC +, - Celobiose – myo -Inositol – Creatina – 0,01% Cicloheximida – Salicina – D-Glucano-1,5-lactona -, D Creatinina – 0,1% Cicloheximida –
Arbutina – 2-Ceto-D-Gluconato – sem Vitaminas +, - 50% D-Glucose +, - Melibiose +, - 5-Ceto-D-Gluconato – sem myo -Inositol +, - 60% D-Glucose - Lactose – D-Gluconato - sem Pantotenato +, -
Rafinose +, - sem Biotina +, -
As respostas aos testes estão indicadas pelos símbolos +, -, D, os quais significam respectivamente respostas positivas, negativas e demorada.
Características adicionais
Esta levedura não produz amido, não hidrolisa a ureia e a reacção com o composto azul de diazónio B é negativa.
3 INTRODUÇÃO GERAL
1.2.2. Estrutura da célula
Relativamente à estrutura da célula, esta possui um citoplasma com vários organelos e um núcleo revestido por uma membrana que assegura a protecção dos cromossomas. Tal como as células vegetais, as células de levedura têm dois envelopes celulares: a p arede celular e a membrana. Na F igura 1 está exemplificado a constituição de uma célula de levedura.
Parede celular
Membrana Espaço periplásmico plasmática
Mitocôndria Complexo de Golgi Cromossoma Grânulos lipídicos
Plasmídio
Figura 1: (a) Saccharomyces sp . observada através de microscopia de contraste de fase, ampliação de Vacúolo 1000x (em Fugelsang & Edwards, DNA Retículo 2007) (b) Constituição de uma mitocondrial endoplasmático célula de levedura (Gai llardin & rugoso Ribossomas Helslot, 1987) “livres” Gémulas Polimetafosfato
1.2.2.1. Membrana plasmática
A composição e manutenção da integridade da membrana plasmática são essenciais para o funcionamento das células e sua adaptação às constantes alterações do ambiente extracelular [Konings, 2006]. Esta estrutura celular desempenha múltipl as funções na célula. Por um lado, funciona como barreira de separação entre o citoplasma e o ambiente exterior, permitindo à célula manter uma composição relativamente constante e reter os constituintes que lhe são próprios, o que é essencial para a manut enção do potencial de membrana necessário à realização de uma variedade de processos de transporte activo secundário [Konings & Velkamp, 1983; Konings et al ., 1995] . Por outro lado, a membrana possuí proteínas com múltiplas funções entre as quais transport e de substratos de e para o interior da célula, biossíntese de parede celular, constituição do citosqueleto e transdução de sinal [Konings, 2006]. A membrana plasmática tem ainda que permitir a passagem de nutrientes presentes no exterior e de produtos res iduais do metabolismo que têm de ser libertados, isto é, a membrana é permeável duma forma selectiva [Konings, 2006]. Esta característica deve -
4 INTRODUÇÃO GERAL se à sua composição lipídica e, em parte, aos seus sistemas de transporte que permitem à célula controlar as suas trocas com o meio. O funcionamento destes transportadores é, por sua vez, igualmente influenciado pela composição lipídica da membrana, da qual depende também a fluidez desta [Henschke & Rose, 1991; Ribéreau-Gayon et al ., 2006].
1.2.2.1.1. Composição da membrana plasmática
Sendo a membrana constituída por lípidos e proteínas, a sua composição determina as suas características e condiciona vários processos metabólicos. Os três principais fosfolípidos de membrana plasmática são fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilcolina (PC) e fosfatidilinositol (PI), representando 70-85% do total, existindo fosfatidilserina (PS) e difosfatidilglicerol (PG) em menor quantidade. Os ácidos gordos das membranas fosfolipídicas contêm maioritariamente entre 14 a 24 átomos de carbono. Os mais abundantes são os ácidos em C16 e os ácidos em C18, que podem ser saturados, como o ácido palmítico (C16) e o esteárico (C18), ou insaturados, como o oleico (C18, com dupla ligação na posição 9), linoleico (C18, com duas duplas ligações nas posições 9 e 12) e linolénico (C18, com 3 duplas ligações nas posições 9, 12 e 15) [Ribéreau-Gayon et al ., 2006]. A membrana plasmática é ainda constituída por ergosterol, considerado por vários autores como o principal esterol da membrana plasmática de leveduras [Parks & Casey, 1995; Snoek & Steensma, 2007; Guan et al ., 2009]. As enzimas responsáveis pela sua biossíntese foram localizadas na mitocôndria [Altmann & Westermann, 2005]. Relativamente às proteínas membranares, destacam-se os múltiplos transportadores e os receptores celulares específicos, responsáveis pela reacção da célula de levedura a vários estímulos do meio externo, tais como hormonas sexuais ou alteração da concentração externa de nutrientes [Ribéreau-Gayon et al ., 2006].
1.2.2.1.2. Fluidez de membrana
A composição da membrana em ácidos gordos e a sua proporção em esteróis controlam a sua fluidez. As cadeias de hidratos de carbono dos ácidos gordos da bicamada fosfolipídica membranar podem estar num estado rígido e ordenado [Ribéreau-Gayon et al ., 2006], onde algumas ou todas as ligações de carbono dos ácidos gordos são do tipo trans . No estado fluido, algumas dessas ligações tornam-se cis . A transição de um estado rígido para um estado fluido acontece quando a temperatura atinge valores superiores aos da temperatura de fusão, dependendo esta do comprimento das cadeias de ácidos gordos e do seu grau de insaturação. As cadeias rectilíneas dos ácidos gordos saturados interagem fortemente entre si [Ribéreau-Gayon et al ., 2006], intensificando-se as interacções com o aumento do comprimento da cadeia. A temperatura de transição, por consequência, sobe à
5 INTRODUÇÃO GERAL medida que as cadeias de ácidos gordos se tornam mais longas. As duplas ligações de ácidos gordos insaturados são geralmente cis , conferindo uma “curvatura” à cadeia. Esta “curvatura” compromete a organização das cadeias de ácidos gordos, diminuindo a temperatura de transição. O ergosterol, por sua vez, está perpendicularmente inserido na bicamada lipídica. Os seus grupos hidroxilo associam-se através de pontes de hidrogénio com a cabeça polar dos fosfolípidos e a sua terminação está inserida na região hidrofóbica da bicamada lipídica. O ergosterol encontra-se, desta forma, intercalado com os fosfolípidos da membrana, inibindo a cristalização das cadeias de ácidos gordos a baixas temperaturas. Por outro lado, à medida que a temperatura vai aumentando, o ergosterol regula o excesso de fluidez da membrana, reduzindo o movimento das cadeias de ácidos gordos [Zinser et al ., 1991; Alexandre et al ., 1994].
1.2.2.1.3. H+-ATPase membranar
A H+-ATPase membranar constitui 5 a 10% do total de proteína da membrana plasmática de leveduras [Bowman et al ., 1981]. Tem um tamanho aproximado de 100 kDa e pertence ao grupo de ATPases de tipo P 2 transportadoras de catiões, no qual estão incluídas a Na +/K+-ATPase e a Ca 2+ -ATPase de membranas plasmáticas de mamíferos [Kühlbrand, 2004]. A H +-ATPase apresenta como propriedades principais uma elevada afinidade para o ATP (Km entre 0,8 e 4,8 mM), um pH óptimo entre 5,0 e 6,7 para a hidrólise do ATP, sensibilidade ao vanadato, dietilstilbestrol e diciclohexilcarbodimida e insensibilidade à oligomicina, à azida e ao nitrato [Sigler & Hofer, 1991]. Através da análise do perfil de hidrofobicidade da H +-ATPase membranar foi proposto um modelo de organização estrutural da enzima [Hager et al ., 1986; Serrano et al ., 1986], representado na Figura 2, com 10 regiões transmembranares (10 hélices α hidrofóbicas) e extremidades N e C-terminal voltadas para o citosol.
Exterior
Membrana Interior Figura 2: Representação do modelo de estrutura da cadeia polipeptídica da H +- ATPase membranar. A posição marcada com um P é o local de fosforilação (Adaptado de Bowman & Bowman, 1986).
As 3 maiores porções de polipéptidos no citosol são: a cauda terminal azotada de cerca de 115 aminoácidos e dois grandes ganchos de cerca de 130 e 300 aminoácidos [Bowman & Bowman, 1986]. O maior gancho contém o local onde a enzima é fosforilada durante o ciclo reaccional, julgando-se também que esteja envolvido na ligação e hidrólise de ATP. Os dois ganchos citosólicos são as partes mais conservadas da proteína [Bowman & Bowman,
6 INTRODUÇÃO GERAL
1986; DeWitt et al ., 1998]. A principal H +-ATPase membranar é codificada pelo gene essencial PMA1 [Serrano et al ., 1986]. O gene PMA1 é fortemente expresso e é homólogo ao gene PMA2 que codifica, por sua vez, para uma H +-ATPase membranar que apresenta 89% de identidade com a proteína codificada por PMA1 , para além de lhe ser funcionalmente semelhante [Schlesser et al. , 1988]. Sob condições normais de crescimento o gene PMA2 é muito menos expresso do que o gene PMA1 e não é considerado essencial [Schlesser et al ., 1988; Supply et al ., 1993a,b]. Em condições de stresse de crescimento que estimulem a activação da H +- ATPase membranar de Saccharomyces cerevisiae verificou-se, através de ensaios de quantificação imunológica, que as células apresentaram uma menor quantidade de H +- ATPase, sendo este facto consistente com a menor expressão do gene PMA1 nessas mesmas condições de stresse [Monteiro et al ., 1994; Viegas et al ., 1994, 1995; Fernandes et al ., 1997]. A H +-ATPase presente na membrana plasmática de S. cerevisiae é conhecida por ser essencial a diversas funções celulares, entre as quais a absorção de nutrientes [Kotyk, 1994], a regulação do pH intracelular [Goffeau & Slayman, 1981] e do potencial de membrana [Carmelo et al ., 1997], o crescimento celular [Portillo & Serrano, 1989] e a osmorregulação [Martínez de Marãnón et al ., 2001]. A actividade da enzima associa a hidrólise de ATP à expulsão de protões, resultando no estabelecimento de um gradiente protónico electroquímico transmembranar que conduz o transporte secundário [Serrano, 1984; van Uden, 1985; Cartwright et al ., 1987; Serrano, 1988]. Quando a H +-ATPase não está funcional, muitos simportes de H + não podem prosseguir, mesmo que a diferença de pH medida entre os meios intra e extracelular seja suficiente para conduzir os simportes [Kotyk, 1983]. Para além disso, o gradiente electroquímico é igualmente utilizado na regulação da actividade de algumas enzimas intracelulares sensíveis ao pH [Serrano, 1984]. Johannson e colaboradores (1981) constataram que os ácidos gordos de cadeia longa aumentam a actividade da H+-ATPase membranar. A razão esterol/fosfolípido parece influenciar a actividade da H +-ATPase membranar [Johannson et al ., 1981]. Arami e colaboradores (1997) relataram um decréscimo da actividade da H+-ATPase membranar provocado por uma modificação estrutural da membrana, resultante da decomposição fotoquímica do ergosterol [Arami et al ., 1997]. Martínez de Marãnón e colaboradores (2001) estudaram de que forma a redução do volume celular provocado pelo aumento da pressão osmótica extracelular afectou a taxa de expulsão de H + in vivo . Após terem constatado que uma redução de 50% do volume celular provocou uma inibição total do processo de expulsão de H+, estes autores postularam que a inibição da acidificação extracelular poderia ser uma consequência da inibição da H +-
7 INTRODUÇÃO GERAL
ATPase induzida por modificações conformacionais da enzima, como resultado de deformações na membrana plasmática [Martínez de Marãnón et al ., 2001]. De acordo com alguns autores, a hipótese mais provável para a activação da H +-ATPase resulta da modificação pós-tradução da enzima PMA1 [Monteiro et al ., 1994; Viegas et al ., 1994, 1995], nos casos de esgotamento de fonte de glucose e de azoto [Portillo et al ., 1989; Benito et al ., 1992; Eraso & Portillo, 1994; García-Arranz et al ., 1994]. Para além disso, é possível que a activação da H+-ATPase esteja também, pelo menos parcialmente, relacionada com a alteração dos lípidos constituintes da membrana plasmática de células cultivadas sobre condições inibitórias, tal como foi proposto para a activação induzida por ácido decanóico [Alexandre et al ., 1996]. A glucose foi identificada como um factor que estimula a expulsão de protões em S. cerevisiae uma vez que rapidamente activa a H +-ATPase membranar da levedura [Sigler & Hofer, 1991; Brandão et al ., 1994]. Serrano (1983) demonstrou a necessidade de se proceder a uma pré-incubação com glucose para que se dê a activação da H +-ATPase membranar e se observem taxas significativas de transporte activo em leveduras [Borst- Pauwels, 1981; Serrano, 1983]. Para além disso têm sido descritos vários factores ambientais de stresse que estimulam a actividade desta enzima in vivo , tais como o etanol [Rosa & Sá-Correia, 1991; Rosa & Sá- Correia, 1992; Monteiro et al ., 1994], o ácido octanóico [Viegas & Sá-Correia, 1991; Viegas et al ., 1994], o pH extracelular ácido [Eraso & Gancedo, 1987], o cobre [Fernandes et al ., 1997; Fernandes & Sá-Correia, 1999] e temperaturas supra-óptimas (inferiores a 40ºC) [Viegas et al ., 1995], constituindo a activação da H +-ATPase uma resposta de defesa da célula face à dissipação da força protomotriz através da membrana e/ou ao decréscimo do pH interno [Cartwright et al ., 1986; Eraso et al ., 1987; Sá-Correia et al ., 1989; Rosa & Sá- Correia, 1991; Viegas & Sá-Correia, 1991; Rosa & Sá-Correia, 1992; Monteiro et al ., 1994; Viegas et al ., 1994; Viegas et al. , 1995]. Relativamente ao efeito do etanol, muito embora seja considerado por vários autores como um factor que estimule a actividade da H +-ATPase [Rosa & Sá-Correia, 1992; Monteiro et al ., 1994; Monteiro & Sá-Correia, 1998], existem paralelamente evidências de outros autores [Cartwright et al ., 1986; Cartwright et al ., 1987; Pascual et al ., 1988] de redução da actividade da H +-ATPase membranar para a gama de concentrações que reduzem significativamente a taxa de fermentação em ensaios em vesículas. Este efeito poderá resultar do efeito conjugado da inibição da actividade da H +-ATPase membranar e do estímulo do influxo passivo de protões, devido a um aumento não especifico da permeabilidade da membrana descrito por vários autores [Leão & van Uden, 1984a; van Uden, 1985; Salgueiro et al ., 1988].
8 INTRODUÇÃO GERAL
Estudos realizados por Malparida e Serrano (1981) demonstram que a H +-ATPase membranar mantém o pH intracelular de S. cerevisiae entre 6,0 e 7,0, mesmo quando ocorrem grandes variações no pH externo [Malpartida & Serrano, 1981]. O crescimento de leveduras em meios ácidos demonstrou provocar um aumento na actividade da H +-ATPase [Eraso & Gancedo, 1987], comprovando-se paralelamente a existência de uma correlação muito forte entre o aumento da actividade da enzima e o aumento da actividade catalítica [Eraso et al ., 1987]. A regulação dos pH’s intra e extracelular foi igualmente confirmada em mutantes com baixos níveis de H +-ATPase que apresentaram baixo pH intracelular, demonstrando uma maior sensibilidade à presença de ácidos fracos [McCusker et al ., 1987] e ao baixo valor do pH do meio extracelular. A H+-ATPase demonstrou ser essencial para o crescimento celular e para a expulsão de protões in vivo , facto comprovado através da letalidade das mutações null [Serrano et al ., 1986]. Para além disto, estudos com mutantes pma1 demonstraram que esta proteína é também essencial para a resistência a baixas temperaturas, ao pH ácido e a algumas drogas inibitórias, tais como vanadato metilamina e TPP + [McCusker et al ., 1987; Ulaszewski et al ., 1987a,b; Vallejo & Serrano, 1989].
1.3. Fermentação alcoólica por Saccharomyces cerevisiae 1.3.1. Bioquímica do processo
Quando uma hexose é transportada para o interior de uma célula de S. cerevisiae é degrada através da via glicolítica em duas moléculas de piruvato. Durante a glicólise há produção de 2 molécula de ATP e de duas moléculas de NADH, por molécula de hexose. As enzimas piruvato descarboxilase e álcool desidrogenase convertem o piruvato em etanol e em dióxido de carbono e re-oxidam 2 moléculas de NADH que são produzidas na glicólise [Barnett, 2003], sendo este o processo conhecido como fermentação alcoólica. Do ponto de vista energético, a glicólise (Figura 3) seguida de fermentação alcoólica fornece à levedura 2 moléculas de ATP por molécula de glucose degradada, ou, 14,6 Kcal (biologicamente utilizável) / mole de glucose fermentada. Do ponto de vista termodinâmico, a alteração de energia livre durante a degradação de uma mole de glucose e a consequente formação de etanol e CO 2 é de -40Kcal. A diferença (25,4 Kcal) é dissipada sob a forma de calor [Ribéreau-Gayon, 2006], traduzindo-se frequentemente no aumento de temperatura ao longo do processo fermentativo.
9 INTRODUÇÃO GERAL
Figura 3: Via glicolítica, fermentação alcoólica e desvio para a produção de glicerol. (Adaptado de Ribéreau - Gayon, 2006)
A capacidade de S. cerevisiae fermentar a çúcares é absolutamente vital para o seu crescimento em condições anaeróbias [Snoek & Steensma, 2007]. Esta espécie pertence ao grupo de leveduras Crabtree positivas (súbita resposta fermentativa sob condições de aerobiose e de adição de excesso de açúcar) , que produzem etanol para remover o excesso de NADH produzido pelo aumento do fluxo de hexoses para o interior da célula. Outro factor que contribui para que a fermentação se realize em condições de anaerobiose é o efeito de Pasteur, que é definido como a inibição do consumo de açúcares em aerobiose. A fermentação não consegue competir eficientemente com a respiração, em termos de rendimento em ATP, conduzindo a uma diminuição da taxa de fermentação sob condições aeróbias [Lagunas, 1986]. Em S. cerevisiae o efeito de Pasteur ocorre em culturas contínuas aeróbias com limitação de açúcar e em suspensões de células em fase estacionária (devido às baixas taxas de consumo de açú cares) [Weusthuis, 1994].
1.3.2. Produtos secundários
Durante a fermentação alcoólica, S. cerevisiae converte os açúcares fermentescíveis em etanol, produzindo igualmente um elevado número de compostos voláteis responsáveis pelo aroma do vinho, tais como ácidos gordos, álcoois superiores e ésteres (Tabela 2) [Rossouw et al ., 2008].
Tabela 2: Metabolitos presentes durante a fermentação alcoólica, adaptado de [Rossouw et al ., 2008] Metabolitos Ácidos Álcoois Ésteres Ácidos Ácidos gordos primários orgânicos superiores Glucose Citrato Metanol Acetato de etilo Ácido valérico Ácido octanóico Frutose Malato Propanol Acetato de hexilo Ácido propiónico Ácido decanóico Glicerol Acetato Isoamila lcool Acetato de isoamilo Ácido isovalérico Caprilato de etilo Etanol 2-feniletanol 2-etilfenilacetato Ácido isobutírico Lactato de etilo Isobutanol Ácido butírico Caprato de etilo Butanol
10 INTRODUÇÃO GERAL
O estudo de Rossouw e colaboradores (2008) permitiu constatar que apesar de se ter observado um aumento constante na concentração dos compostos aromáticos (referidos na Tabela 2) durante a fermentação em mosto sintético, o período em que ocorreu a maior acumulação de compostos aromáticos foi o início de fermentação [Rossouw et al ., 2008]. Os ácidos produzidos por S. cerevisiae durante a fermentação alcoólica pertencem ao grupo dos ácidos orgânicos fracos, que são compostos lipofílicos pertencentes a uma importante classe de aditivos alimentares antimicrobianos [Freese et al ., 1973; Warth, 1977; Cole & Keenan, 1987]. O mecanismo de actuação dos ácidos fracos é dependente do pH extracelular, na medida em que são tanto menos eficazes, quanto mais alcalino for o meio extracelular [Viegas et al ., 1989]. As moléculas não dissociadas atravessam a membrana plasmática por difusão simples até se atingir o equilíbrio, de acordo com o gradiente de pH que se estabelece entre o lado interno e o lado externo da membrana [Booth & Kroll, 1989; Pampulha & Loureiro-Dias, 1989; Viegas et al ., 1989]. A acumulação de aniões [Eklund, 1983; Eklund, 1985] e a diminuição do pH extracelular [Pampulha & Loureiro-Dias, 1989; Warth, 1991; Viegas & Sá-Correia, 1995] estão entre as causas possíveis de redução da taxa específica de crescimento [Pampulha & Loureiro-Dias, 2000], redução do rendimento em biomassa [Verduyn et al ., 1992] e perda de viabilidade [Prudêncio et al ., 1998] de células expostas a ácidos fracos.
O glicerol é o terceiro composto, a seguir ao etanol e ao CO 2, produzido em maiores quantidades, durante a fermentação alcoólica [Pizarro et al ., 2007]. Quando se associa a influência do glicerol no vinho, depreende-se que não está relacionada com o seu aroma, uma vez que o glicerol não é volátil, mas participa em vários atributos sensoriais importantes, tais como doçura (devido à natureza viscosa do glicerol), suavidade e corpo do vinho [Prior & Hohmann, 1997; Scanes et al ., 1998].
1.4. Fermentação vinária
O vinho é uma bebida alcoólica que resulta de fermentação do mosto de uva. A sua história tem mais de 8000 anos, considerando-se o seu processo de produção como um dos mais antigos processos biotecnológicos no mundo [Pretorius, 2000; This et al ., 2006]. Do ponto de vista bioquímico, o vinho pode ser definido como uma solução multi-componente líquida, constituída principalmente por água, etanol, glicerol e ácidos orgânicos. Como compostos minoritários (mas igualmente importantes) tem-se os componentes responsáveis pelo flavour [Rossouw et al. , 2008; Swiegers et al. , 2009]. Alguns destes compostos podem estar originalmente presentes nas uvas, ou podem ser sintetizados durante o processo de vinificação [Pizarro et al ., 2007].
11 INTRODUÇÃO GERAL
Saccharomyces assume um papel fundamental na transformação anaeróbica do mosto de uva em vinho. O processo fermentativo pode ser conduzido por estirpes de leveduras comerciais seleccionadas ou pode deixar-se o mosto fermentar com a flora nativa presente na adega e nas uvas. Em ambos os casos, S. cerevisiae e S. bayanus são as espécies de leveduras que conduzem a fermentação [Bisson, 2004] e as espécies predominantes ao longo da maior parte do processo [Querol et al ., 1994; Lopandic et al ., 2008]
1.4.1. Factores físico-químicos que afectam as cinéticas de fermentação vinária
A fermentação vinária é um processo bioquímico e ecológico complexo que envolve uma multiplicidade de factores de stresse que, de uma forma sinérgica, promovem o desenvolvimento sequencial de diferentes espécies de leveduras [Fleet & Heard, 1993; Bisson, 1999; Bauer & Pretorius, 2000; Fleet, 2003; Zott et al ., 2008]. No início de fermentação, o mosto constitui a primeira situação de stresse quer pela elevada concentração de açúcares presentes (elevada pressão osmótica), quer pela presença de compostos antimicrobianos (SO 2 e resíduos de pesticidas) e presença de microrganismos competidores (presença de factores killer e de moléculas quorum-sensing e influência da densidade espacial) [Yap et al ., 2000; Fleet, 2003; Nissen et al ., 2003; Hogan, 2006; Perez- Nevado et al ., 2006]. À medida que a fermentação decorre, aumenta a concentração de etanol e de CO 2, sobe a temperatura (nos casos em que não é controlada), ocorre o esgotamento de nutrientes e de O 2.
1.4.1.1. Etanol
Nas décadas de 70/80, vários grupos de investigadores estudaram os efeitos negativos que o aumento da concentração de etanol provocava na população de Saccharomyces cerevisiae , durante o processo de fermentação alcoólica. Diversos mecanismos subjacentes aos efeitos adversos deste composto foram igualmente descritos, nomeadamente a inibição hiperbólica não-competitiva de enzimas glicoliticas [Nagodawithana et al ., 1977], inibição do crescimento [Jones et al ., 1981; Ingram & Buttke, 1984; van Uden, 1985; Casey & Ingledew, 1986], diminuição da temperatura óptima e máxima de crescimento [van Uden & Duarte, 1981; Loureiro & van Uden, 1982], o estímulo de morte a baixa, média e alta temperatura [van Uden, 1985; Sá-Correia & van Uden, 1986], inibição do sistema de transporte de nutrientes, tais como glucose [Leão & van Uden, 1982a], frutose [Sá-Correia & van Uden, 1983], maltose [Loureiro-Dias & Peinado, 1982], amónia [Leão & van Uden, 1984b] e aminoácidos [Leão & van Uden, 1984b], ocorrência de mutações do tipo petite [Cabeça- Silva et al ., 1982] e estímulo da difusão de espécies químicas não polares [Leão & van Uden, 1984a].
12 INTRODUÇÃO GERAL
A membrana plasmática foi identificada como um dos principais alvos para a inibição provocada pelo etanol no transporte de nutrientes. O etanol interage com as membranas através da sua inserção no interior hidrofóbico, provocando um aumento da polaridade desta região, enfraquecendo as interacções hidrofóbicas, a barreira hidrofóbica da membrana às trocas livres de moléculas polares e afecta o posicionamento das proteínas na membrana [Ingram & Buttke, 1984]. Para além disso, observa-se um aumento de fluidez, com consequente aumento de permeabilidade passiva a iões e a pequenos metabolitos [Ingram & Buttke, 1984; Quintas et al. , 2000]. Como tal, a composição em ácidos gordos da membrana lipídica demonstrou ser importante na tolerância ao etanol [Thomas & Rose, 1979; Mishra & Prasad, 1989], sendo este composto responsável por um aumento da síntese de fosfolípidos membranares, nomeadamente da sua percentagem em ácidos gordos insaturados (ácido oleico, na maioria). A perda da integridade membranar diminui a capacidade da célula em manter um gradiente de concentração através da membrana plasmática, afectando uma série de sistemas de transporte de solutos [Leão & van Uden, 1984a,b]. Por outro lado, foi demonstrado que, a partir de determinadas concentrações, o etanol é capaz de promover a formação de um agregado fosfolipídico pouco usual, designado por fase interdigitada, em suspensões de L-α-dipalmitoilfofastidilcolina [McIntosh et al ., 1983; Simon & McIntosh, 1984]. Na fase interdigitada as cadeias carbonadas dos lípidos de monocamadas opostas interpenetram-se completamente, ficando expostos os terminais metílicos. Resultados obtidos por Rowe (1987) em misturas de fosfatidilcolina e fosfatidiletanolamina demonstraram que é possível coexistirem lípidos interdigitados e lípidos não interdigitados numa membrana. Zonas onde os lípidos se encontrem interdigitados podem contribuir para a ligação dos dois lados da bicamada e constituir zonas mais permeáveis de forma a facilitar o acesso ou a libertação de moléculas, podendo ocorrer naturalmente ou como resultado do efeito tóxico de qualquer tipo de substância [Rowe, 1987]. Recentemente, Gurtovenko e Anwar (2009) demonstraram pela primeira vez a formação de monocamadas lipídicas a partir de bicamadas fosfolipídicas, por exposição das membranas a soluções aquosas de concentrações elevada de etanol (>12 mol%), apresentando as estruturas em monocamada formadas semelhanças com micelas invertidas ao possuírem forma irregular, pequena dimensão e carácter persistente [Gurtovenko & Anwar, 2009]. Estes autores atribuíram igualmente um significado biológico a estas estruturas em monocamada, postulando que o etanol promove a hemifusão das camadas lipídicas adjacentes, através de rupturas provocadas nas mesmas, conduzindo subsequentemente à formação de zonas permeáveis que podem actuar como sistemas de libertação de moléculas polares, incluindo iões [Gurtovenko & Anwar, 2009]. O fluxo transmembranar de protões demonstrou ser sensível à presença de etanol, conduzindo à diminuição da taxa de fermentação [Cartwright et al ., 1986; Cartwright et al .,
13 INTRODUÇÃO GERAL
1987; Pascual et al ., 1988]. A dissipação do gradiente de protões induzida pelo etanol parece estar envolvida na inibição da actividade da H+-ATPase membranar [Cartwright et al ., 1987], no estímulo do influxo passivo de protões (devido ao aumento não especifico da permeabilidade da membrana plasmática) [Leão & van Uden 1984a; van Uden, 1985; Salgueiro et al ., 1988], ou numa combinação de ambos [Rosa e Sá-Correia, 1991]. A discussão sobre o efeito do etanol no pH intracelular é controversa. Dombek e Ingram (1987) detectaram apenas um ligeiro decréscimo nos valores de pH intracelular, durante as fases finais de fermentação com elevada concentração de etanol [Dombek & Ingram, 1987]. Por outro lado, Cartwright e colaboradores (1986), através da medição do pH intracelular na presença de etanol, detectaram uma acidificação significativa, mais pronunciada na ausência de glucose. Os mesmos autores referiram que o gradiente de pH ( ∆pH) através da membrana plasmática e o potencial de membrana ( ∆ψ ) foram igualmente afectados, interpretando os seus resultados como uma consequência do aumento do influxo passivo de H+ e inibição da H +-ATPase membranar [Cartwright et al ., 1986]. Os resultados obtidos por Loureiro-Dias e Santos (1990) confirmaram o estudo efectuado por Cartwright e colaboradores (1986), tendo descrito que, na ausência de etanol, se observa apenas uma ligeira acidificação do citoplasma, sendo esta fortemente acelerada quando se adicionava etanol ao processo fermentativo. Estes autores observaram igualmente o desaparecimento rápido do ∆pH através da membrana do tonoplasto para elevadas concentrações de etanol [Loureiro-Dias & Santos, 1990]. Outra explicação para a inibição da fermentação provocada pelo etanol diz respeito à sua possível actuação sinérgica com o ácido acético nas fases finais de fermentação. Este ácido encontra-se nas formas não ionizadas durante as fermentações vinárias onde, normalmente, o pH externo é baixo. Como consequência, a forma dissociada do ácido acético é acumulada no interior da célula [Pampulha & Loureiro-Dias, 1989]. Os resultados obtidos por Loureiro-Dias & Santos (1990) revelaram um outro mecanismo de inibição provocado pelo etanol que afecta a fase inicial de fermentação (fosforilação de açúcar). De acordo com alguns autores, este mecanismo surge como consequência da acumulação de etanol no interior da célula [Dombek & Ingram, 1988; Alterthum et al ., 1989]. Segundo estes autores, a inibição da fosforilação do açúcar deve-se à competição gerada entre o AMP e o ATP para o local activo da enzima. De acordo com os mesmos autores, o aumento da concentração de AMP intracelular resulta de um aumento do consumo de ATP devido à activação de H +- ATPase membranar que ocorre como tentativa da célula combater a acidificação intracelular em consequência do aumento da permeabilidade ao H + na presença de etanol. Na mesma linha de pensamento, os resultados de Loureiro-Dias e Santos (1990) indicaram que a inibição da fosforilação por acumulação de AMP no interior da célula é estimulada pela
14 INTRODUÇÃO GERAL produção e acumulação de ácido acético no citoplasma da célula de levedura [Loureiro-Dias & Santos, 1990]. O efeito conjugado do etanol e da temperatura numa população de leveduras foi inicialmente estudado por van Uden e Duarte que observaram o efeito directo do etanol na modificação das temperaturas cardiais de crescimento de Saccharomyces cerevisiae durante fermentações alcoólicas, uma vez que estas podiam terminar prematuramente devido ao efeito conjugado do etanol e da temperatura (principalmente na produção de vinhos tintos onde as temperaturas de fermentação são altas) [van Uden & Duarte, 1981; van Uden, 1984]. Nesse sentido, os mesmos autores constataram que à medida que a concentração de etanol aumentava, as três temperaturas cardiais (T op , T maxf e T maxi ) diminuíam e que, a partir de uma dada concentração crítica de etanol (dependente da estirpe e da temperatura de fermentação), o valor de T op se aproximava do valor de T maxi , de tal forma que qualquer aumento posterior da concentração de etanol, resultante da continuidade do processo fermentativo, poderia conduzir a população a um segundo período exponencial na gama das temperaturas supra-óptimas (T op < T < T maxf ), durante o qual a morte exponencial competia com o crescimento exponencial, mas com taxa específica de crescimento superior à taxa específica de morte [van Uden & Duarte, 1981]. Tendo em conta esta variação, com o aumento da concentração de etanol atingir-se-á uma situação em que
Tmaxf diminui para temperaturas inferiores à temperatura de fermentação. A partir do momento em que se atingia esta concentração de etanol, a taxa de morte será superior à taxa de crescimento, conduzindo à extinção da população viável [van Uden, 1984]. A sequência de eventos descrita depende da tolerância da estirpe ao álcool, da concentração final de etanol e da temperatura do processo [van Uden, 1984]. Investigadores do mesmo grupo estudaram o efeito conjugado do etanol e outros álcoois e da temperatura numa população de leveduras, tendo verificado que os alcanóis favoreciam a morte térmica [Leão & van Uden, 1982b]. Estes mesmos autores postularam que os denominados alvos de morte térmica de S. cerevisiae , cuja taxa de inactivação governa a cinética de morte térmica, estão localizados na membrana plasmática e que a forma de acção do etanol no estímulo da morte térmica não resulta de uma acção directa sobre alvos específicos, mas antes de um efeito não-específico sobre os lípidos de membrana que se tornam os alvos mais sensíveis à temperatura, sendo o mecanismo molecular de morte celular similar ou idêntico ao de morte térmica. Esta hipótese baseou-se, por um lado, por se ter observado que o etanol estimulou a morte térmica e diminuiu a temperatura máxima de crescimento de S. cerevisiae , sem ter destruído o seu perfil associativo de temperatura e, por outro, pelo facto dos álcoois testados não terem afectado a entalpia de activação de morte térmica (isto é, o coeficiente de morte térmica foi o mesmo na presença ou na ausência de álcoois) [Leão & van Uden, 1982b]. Com base nos resultados referidos, foi possível construir um modelo que
15 INTRODUÇÃO GERAL relaciona a temperatura máxima de crescimento de S. cerevisiae em presença de etanol com os parâmetros de morte térmica e os efeitos do etanol sobre estes parâmetros. Este modelo foi testado com sucesso na previsão da temperatura máxima à qual é possível prosseguir a fermentação em estirpes vínicas [Loureiro & van Uden, 1982]. A variação de tolerância ao etanol observada nas células em fase exponencial de crescimento pode ser explicada através de vários factores, tais como: composição lipídica da membrana plasmática [Jimenez & Benitez, 1987; Lloyd et al ., 1993; Sajbidor, 1997; Chi & Arneborg, 2000; You et al ., 2003; Takagi et al ., 2005], acumulação de trealose [Mansure et al ., 1994; Sharma, 1997; Lucero et al ., 2000] ou da proteína de choque térmico Hsp104 [Sanchez et al ., 1992; Piper, 1995], actividade da H +-ATPase membranar [Rosa & Sá- Correia, 1991; Supply et al ., 1995; Aguilera et al ., 2006] e estabilidade mitocondrial [Aguilera & Benitez, 1985; Ibeas & Jimenez, 1997]. O etanol é ainda referido na literatura como um forte indutor de mutantes respiratórios de S. cerevisiae [Norton et al ., 1995; Ibeas & Jimenez, 1997]. Os ensaios electroquímicos de Wang e colaboradores (2007) demonstraram que o limite máximo de tolerância ao etanol de S. cerevisiae é de 25% (v/v) etanol, coerente com os resultados obtidos pelos mesmos autores através das medições convencionais da capacidade fermentativa [Wang et al ., 2007]. A capacidade de adaptação de estirpes de S. cerevisiae a ambientes enológicos está dependente dos seus perfis específicos de expressão do genoma [Pérez-Ortín et al ., 2002]. Estudos realizados no sentido de esclarecer quais os agentes/mecanismos intervenientes na tolerância de estirpes de S. cerevisiae ao etanol revelaram que a superóxido dismutase mitocondrial (MnSOD) codificada por SOD2 [Costa et al ., 1993], a H +-ATPase membranar [Aguilera et al ., 2006; Lei et al ., 2007], a biossíntese de ergosterol [Lei et al ., 2007] e a biossíntese de fosfolípidos [Chi et al ., 1999] são essenciais para a aquisição de tolerância ao etanol. No entanto, muito embora tenham sido realizados vários estudos de resposta a estímulos extracelulares de estirpes laboratoriais é importante realçar que existem diferenças substanciais na resposta ao stresse de estirpes industriais, uma vez que estas crescem normalmente em ambientes mais complexos, para além de terem sido previamente seleccionadas de acordo com uma resposta melhor e mais rápida a várias condições de stresse, de forma a terem um melhor desempenho fermentativo [Pizarro et al ., 2008]. Os ensaios de DNA microarrays inicialmente realizados a estirpes de leveduras vínicas revelaram níveis elevados de expressão de genes envolvidos na biossíntese de aminoácidos e na biossíntese de porinas [Yang et al ., 1994; Cavalieri et al ., 2000; Backus et al ., 2001], muito embora a abordagem inicial dos DNA microarrays contemplasse apenas a resposta das células perante situações de curta duração de stresse ao etanol [Alexandre et al ., 2001]. Recentemente, a análise de expressão global de genes e as análises proteómicas
16 INTRODUÇÃO GERAL foram realizadas sob condições semelhantes às de fermentação vinária [Rossignol et al ., 2003; Varela et al ., 2005; Wu et al ., 2006; Marks et al ., 2008; Pham & Wright, 2008], considerando as dinâmicas de expressão génica e de biossíntese de proteínas na resposta ao stresse. Varela e colaboradores (2005) analisaram o transcriptoma de uma estirpe vínica de S. cerevisiae em 3 fases de crescimento definidas (meio da fase exponencial, início e final da fase estacionária), tendo observado para todas as fases estudadas uma maior expressão de genes relacionados com a produção de energia e com a resposta ao stresse [Varela et al ., 2005]. Estes autores postularam que mecanismos pós-transcricionais poderiam ser os responsáveis pela regulação de proteínas correspondentes a genes expressos numa determinada fase de crescimento, destacando a fase estacionária como a fase onde as células sofrem as maiores alterações fisiológicas, que provavelmente são provocadas pela elevada concentração de etanol existente no meio [Varela et al ., 2005]. Rossignol e colaboradores (2009) revelaram a existência de alterações substanciais na quantidade de proteína ao longo da fermentação alcoólica, sem estarem directamente associadas a alterações nos níveis de transcrito, sugerindo que o mRNA é selectivamente processado e/ou traduzido durante a fase estacionária [Rossignol et al ., 2009]. Para além dos mecanismos de defesa celular conhecidos em situações de stresse pelo etanol, tais com a acumulação de proteínas de choque térmico [Varela et al ., 2005; Pham et al ., 2006; Wu et al ., 2006; Zuzuarregui et al ., 2006], a acumulação de trealose [Varela et al ., 2005; Wu et al ., 2006; Pham & Wright, 2008] e o rearranjo de esteróis membranares [Varela et al ., 2005; Wu et al ., 2006], estudos paralelos revelaram a importância da função vacuolar [Marks et al ., 2008] e de proteínas envolvidas no transporte de electrões [Wu et al ., 2006]. De um modo geral, estes estudos moleculares demonstram a complexidade da resposta ao stresse de células de leveduras, destacando a importância do seu estado fisiológico e do seu background genético para uma eficiente resposta a factores de stresse, nomeadamente ao etanol.
1.4.1.2. Temperatura
A temperatura é um dos parâmetros ambientais mais importantes para o desempenho das leveduras durante o processo fermentativo [Fleet & Heard, 1993], influenciando o crescimento de diferentes espécies [Torija et al ., 2003b], a duração de fermentação [Torija et al ., 2001] e o metabolismo das leveduras, nomeadamente a formação de metabolitos secundários (e.g. glicerol, ácido acético e ácido succínico) [Lafon-Lafourcade, 1983]. As fermentações vinárias realizadas a baixas temperaturas têm vindo a tornar-se uma prática frequente em vinificação, uma vez que são responsáveis pela produção de vinhos com um perfil aromático rico [Killian & Ough, 1979; Kunkee, 1984] e promovem uma maior estabilidade do vinho, ao condicionarem fortemente o crescimento de bactérias lácticas e
17 INTRODUÇÃO GERAL acéticas. No entanto, ao se baixar a temperatura de fermentação aumenta-se o risco de ocorrer uma paragem prematura e amuo de fermentação [Torija et al ., 2003b]. O estudo realizado por Santos e colaboradores (2008) revelou como factores potencialmente causadores de fermentações incompletas a limitação de nutrientes, as temperaturas de fermentação excessivamente altas ou baixas, as más práticas enológicas, a ocorrência de microrganismos contaminantes e a presença de compostos tóxicos, como os fungicidas e o etanol [Santos et al ., 2008]. Diversos estudos [Sherman, 1959; Chang & Matson, 1972] referem que S. cerevisiae , uma levedura tipicamente mesófila, é capaz de crescer, sob determinadas condições, a 40ºC. Para além disso, esta espécie apresenta um perfil associativo de temperatura e é caracterizada por uma elevada aptidão para fermentar a glucose e por um baixo grau de insaturação de ácidos gordos na gama das temperaturas superiores à óptima de crescimento [Sinigaglia et al ., 1993]. As células em fase exponencial são muito mais termosensíveis do que em fase estacionária [Rosenberg & Wood, 1957; Sherman, 1956, 1959], sendo a formação da gémula o período mais sensível aos efeitos nefastos da temperatura elevada, uma vez que corresponde ao momento em que se realiza a síntese de DNA nuclear [Williamson, 1965]. Parry e colaboradores (1976) confirmaram que as células em fase exponencial de crescimento apresentaram uma resistência mínima ao choque térmico (52ºC, durante 30 minutos) comparativamente com as células em fase estacionária, confirmando a maior termossensibilidade que já havia sido descrita pelos outros autores [Parry et al. , 1976]. Para além disso, trabalhos posteriores têm vindo também a confirmar este tipo de comportamento [Piper, 1993; Werner-Washburne et al. , 1993; Steels et al. , 1994; Hallberg & Hallberg, 1996]. Vários autores referem as consequências ao nível celular da exposição de células de S. cerevisiae em fase exponencial a temperaturas superiores à temperatura óptima de crescimento: perda rápida de viabilidade [Schenberg-Fascino & Moustacchi, 1972; Sanchez & Lindquist, 1990], indução de síntese de proteínas de choque térmico e transposição gradual de células para a fase G1 do ciclo celular [Johnston & Singer, 1980], tornando-as termotolerantes [Lindquist & Craig, 1988]. Células termotolerantes em fase estacionária apresentam elevados níveis de proteínas de choque térmico [Boucherie, 1985; Petko & Lindquist, 1986; Piper, 1993; Werner-Washburne et al. , 1993; Steels et al. , 1994; Hallberg & Hallberg, 1996]. Hunter e Rose (1972) estudaram a composição lipídica de S. cerevisiae cultivada a 15ºC e a 30ºC, tendo observado que a diminuição da temperatura de crescimento da cultura era acompanhada por um aumento na composição total de lípidos, de ácidos gordos, triacilgliceróis e de fosfolípidos (maioritariamente fosfatidilcolina), não alterando a composição de diacilgliceróis, ácidos gordos livres, esteróis e ésteres de esteróis [Hunter &
18 INTRODUÇÃO GERAL
Rose, 1972]. Walton e Pringle (1980) postularam que as lesões na membrana plasmática são os eventos letais primários provocados por altas temperaturas [Walton & Pringle, 1980]. O estudo realizado por Torija e colaboradores (2003) demonstrou que o grau de insaturação dos lípidos da membrana plasmática de S. cerevisiae foi afectado pela temperatura de crescimento [Torija et al ., 2003a]. Para além disso, alguns autores verificaram que quanto menor é a temperatura de crescimento, mais insaturados são os ácidos gordos da membrana plasmática [Kates & Baxter, 1962; Arthur & Watson, 1976; Watson et al ., 1976; Watson & Rose, 1980; Watson, 1984]. S. cerevisiae , por exemplo, encurtou o comprimento das cadeias de ácidos gordos, através do aumento da quantidade de ácido palmitoleico comparativamente à quantidade de ácido oleico, ao se baixar a temperatura de crescimento de 35ºC para 10ºC [Suutari et al ., 1996]. Hilge-Rotmann e Rehm (1991) observaram que um elevado grau de saturação dos ácidos gordos conferiu uma protecção elevada para a célula, dada a correlação positiva entre a percentagem de saturação de ácidos gordos totais e taxa de fermentação de células imobilizadas de S. cerevisiae [Hilge-Rotmann & Rehm, 1991]. Estudos realizados por Gorenstein e Warner (1976, 1977) demonstraram que a exposição de células mutantes (sensíveis à temperatura) de S. cerevisiae a temperaturas não toleradas (33 e 36ºC) provocou uma diminuição exponencial da síntese de mais de 40 proteínas ribossomais, para ≈ 10 - 20% dos níveis basais em células crescidas a 23ºC [Gorenstein & Warner, 1976; Warner & Gorenstein, 1977]. A diminuição da síntese proteica ribossomal observada no mutante resultou de uma redução dos níveis de transcrição [Watson, 1987]. Miller (1970, 1982) e McAlister (1979), juntamente com os seus colaboradores, observaram indução e repressão da síntese de numerosos polipéptidos após um aumento da temperatura de 22-23ºC para 36-37ºC, levando à alteração gradual dos padrões de síntese proteica com o aumento de temperatura [Miller et al ., 1970; McAlister et al ., 1979; Miller et al ., 1982]. A resposta ao choque térmico é um sistema protector das células que envolve várias vias de regulação. Sob stresse térmico subletal, é induzida uma resposta altamente conservada que provoca alterações marcadas na expressão génica, resultando na indução da síntese de proteínas de choque térmico (HSPs) e na repressão da maioria das outras proteínas produzidas previamente ao choque [Bond, 2006]. Paralelamente, nestas situações as células acumulam uma grande quantidade de trealose que actua principalmente na protecção da membrana e, em algumas situações específicas, pode servir como hidrato de carbono de reserva [Van Laere, 1989; Wiemken, 1990]. O choque térmico provoca igualmente um aumento do teor de glucose intracelular, com inibição parcial da glicólise [Neves & Francois, 1992]. Como tal, a conversão da glucose em trealose pode ser ainda uma das vias de protecção face aos níveis potenciais de toxicidade resultantes da incompleta fosforilação da glucose em glucose-6-fosfato, que se realiza imediatamente após
19 INTRODUÇÃO GERAL a entrada de glucose na célula. Outros autores referem ainda que nestas situações de stresse térmico subletal se observa igualmente o estímulo da actividade da H+-ATPase membranar e da via RAS-adenilato ciclase [Piper, 1993]. Relativamente ao efeito da temperatura sobre a dinâmica de populações de S. cerevisiae ao longo de fermentação vinária, Torija e colaboradores (2003) observaram curvas de crescimento com a sequência normal de fases (latência, exponencial, estacionária e declínio) em fermentações conduzidas a 25 e 30ºC, enquanto a 35ºC observaram uma elevada taxa de mortalidade de leveduras [Torija et al ., 2003b]. Este fenómeno pode estar na origem de uma fase estacionária mais curta e do amuo de fermentação num período em que a concentração de açúcares residuais era ainda elevada. Estes resultados estão de acordo com estudos feitos anteriormente que revelaram que a viabilidade das leveduras diminuiu à medida que a temperatura de crescimento aumenta [Ough, 1966; Nagodawithana et al ., 1974; Casey et al ., 1984], o que pode ser explicado com base na alteração da estrutura da membrana plasmática [Lucero et al ., 2000] e nos efeitos de uma elevada acumulação de etanol no meio intracelular a elevadas temperaturas, produzindo toxicidade celular [Nagodawithana et al ., 1974]. A hipótese postulada por Nagodawithana e colaboradores (1974) de uma possível acumulação de etanol no meio intracelular foi refutada por estudos da década seguinte, na medida em que Loureiro e Ferreira (1983) observaram uma elevada permeabilidade da membrana plasmática ao 14 C-etanol adicionado ao meio extracelular, indiciando uma baixa probabilidade deste composto se ligar a algum componente da célula de forma a ficar retido [Loureiro & Ferreira, 1983]. Guijarro e Lagunas (1984) afirmaram que o etanol atravessa a membrana plasmática por difusão simples, suportando esta hipótese após terem verificado que, por um lado, a taxa de efluxo de etanol era superior à capacidade de produção de etanol e, por outro, a concentração intracelular de etanol determinada era similar à concentração do composto presente no meio extracelular [Guijarro & Lagunas, 1984]. Suportados nestes resultados, Dombek e Ingram (1986), confirmaram a elevada permeabilidade da célula ao etanol, fornecendo evidências da existência de concentrações similares de etanol produzido na célula e no meio extracelular [Dombek & Ingram, 1986]. Estudos recentes indicaram que a expressão do gene FPS1 , que codifica para uma aquagliceroporina que, por sua vez, medeia o efluxo de glicerol em condições de stresse ao etanol, contribui para uma diminuição da acumulação de etanol no interior de células de leveduras, sugerindo que Fps1p pode ser igualmente responsável pela regulação dos níveis intracelulares de etanol durante os processos de fermentação [Teixeira et al ., 2009]. Para além do efeito da temperatura sobre a dinâmica de população, Torija e colaboradores (2003) estudaram igualmente o efeito da temperatura de fermentação no metabolismo das leveduras, na medida em que a temperatura determina a composição
20 INTRODUÇÃO GERAL química do vinho [Torija et al ., 2003a]. Nos ensaios realizados, verificou -se que a concentração de álcool no meio diminuiu à m edida que a temperatura de fermentação aumenta, estando estes resultados de acordo com o decréscimo do rendimento de etanol e com a redução da utilização de substrato, observadas por Casey e Ingledew (1986) [Casey & Ingledew, 1986].
1.4.1.3. Disponibilidade de oxig énio
O oxigénio molecular (O 2) é necessário para uma série de vias biossintéticas, tais como, a síntese do grupo hemo [Snoek & Steensma, 2007], dos esteróis [Rosenfeld & Beauvoit, 2003], dos ácidos gordos insaturados [Snoek & Steensma, 2006], das pirimidi nas [Nagy et al ., 1992] e dos desoxirribonucleótidos [Chabes et al ., 2000].
Os esteróis são produzidos através de uma via dependente de O 2 (Figura 4).
Figura 4: Representação das etapas de consumo de O 2 na biossíntese de ergosterol (Adaptado de Snoek & Steensma, 2007).
Para a síntese de uma molécula de ergosterol, são necessárias 12 moléculas de O 2: 1 molécula de O 2 para a conversão de esqualeno a lanosterol, 9 moléculas de O 2 para a conversão de lanosterol a zimosterol e 2 moléculas de O 2 para a conve rsão de zimosterol a ergosterol [Rosenfeld & Beauvoit, 2003]. São conhecidas pelo menos 3 razões para as adaptações celulares necessárias para a célula crescer em anaerobiose [Snoek & Steensma, 2007]: (1) baixo rendimento energético em anaerobiose, (2) ne cessidade de O 2 de diversas vias metabólicas de biossíntese e (3) fluxo de diferentes moléculas entre o interior e exterior da célula. Em condições de anaerobiose, as células de leveduras são incapazes de completar a biossíntese de ácidos gordos insaturad os (UFAs) e de ergosterol, e acumulam intermediários do metabolismo dos lípidos [Bardi et al ., 1998; Bardi et al ., 1999; Belviso et al ., 2004]. Se os nutrientes lipídicos não estão disponíveis em anaerobiose, S. cerevisiae altera progressivamente a composi ção das suas fracções lipídicas (reduzindo a área superficial das membranas dos organelos), “diluindo-a” até ao limite de viabilidade [Henry, 1982]. Isto faz com que se observe que em anaerobiose, a membrana plasmática contém uma maior percentagem de ácido s gordos saturados e uma menor quantidade de esteróis totais, ergosterol e esqualeno [Nurminen et al ., 1975]. Estas diferenças podem ser explicadas através da incapacidade da célula em sintetizar estes compostos na ausência de
O2. Os resultados obtidos por Rosenfeld e colaboradores (2003) demonstraram que um
21 INTRODUÇÃO GERAL
-1 pulso de O 2 (1 a 10 mg.L ) pode estimular a fermentação alcoólica em anaerobiose
[Rosenfeld et al ., 2003]. Por esta razão, a adição de O 2 durante as fermentações vinárias é uma prática comum e legal. O O2 é utilizado para aumentar a taxa de fermentação em fermentações amuadas [Sablayrolles et al ., 1996], sendo que a sua adição (1,5 a 3,5mg -1 O2.g p.s. células) é eficiente apenas se for feita no momento em que as células se encontram no final da fase exponencial [Sablayrolles & Barre, 1986; Sablayrolles, 1990; Blateyron et al ., 1998]. A biossíntese de ergosterol parece ser essencial para a tolerância ao etanol, particularmente durante a fermentação de mosto de uva, processo em que as leveduras estão activas em condições de baixa oxigenação e crescentes concentrações de etanol [Shobayashi et al ., 2005]. De facto, a eficiência fermentativa e a resistência ao etanol estão geralmente associadas a um aumento na razão ergosterol/fosfolípido e a um decréscimo do índice de saturação de ácidos gordos nas células de levedura [Sajbidor et al ., 1995; Chi & Arneborg, 1999], podendo estar na origem da entrada em fase estacionária de crescimento. Em condições de anaerobiose, as células não conseguem sintetizar esteróis, tendo necessidade de os obter a partir do meio. O transporte de esteróis para o interior da célula é pois essencial para a fisiologia da célula quando esta se encontra em condições de anaerobiose [Wilcox et al ., 2002]. Os níveis celulares de ergosterol e de oleato são importantes para os processos de transferência de solutos entre os meios intra e extracelular [Burke et al ., 1997; Ness et al ., 1998]. No crescimento celular, em condições de ausência de O 2, o oleato pode ser adicionado ao meio na forma de Tween 80, podendo ser igualmente utilizado como fonte de ácidos gordos insaturados (UFAs). O efeito de limitação de oxigénio sobre a biossíntese de lípidos é exercido quer de forma directa, por bloqueio das enzimas dependentes de O 2 (e.g. ∆9-dessaturase, esqualeno epoxidase, complexo de desmetilação lanosterol) [Ratledge & Evans, 1989], quer indirectamente, ao causar a acumulação de ácidos gordos saturados (SFAs) [Bloomfield & Bloch, 1960] e percursores de ergosterol [Parks, 1978], que regulam negativamente a expressão da acetil-CoA carboxilase e hidroximetilglutaril-CoA redutase, respectivamente [Mannazzu et al ., 2008].
1.4.2. Respostas ao stresse
São vários os tipos de resposta ao stresse que S. cerevisiae dispõe e que são mencionados na literatura. Lindquist e Craig caracterizam a resposta das células de S. cerevisiae através da aquisição de uma maior termotolerância resultante de síntese de proteínas de choque térmico (HSPs) [Lindquist & Craig, 1988], que actuam como chaperonas na tentativa de sequestro e remoção de proteínas danificadas ou incorrectamente conformadas [Sanchez & Lindquist, 1990; Schlensinger, 1990]. Sob
22 INTRODUÇÃO GERAL condições laboratoriais, a proteína de choque térmico Hsp104p demonstrou ser responsável pela tolerância a uma série de condições de stresse (calor, etanol, arsenito e armazenamento a baixa temperatura) [Sanchez et al ., 1992] e a sua expressão demonstrou ser suficiente para célula adquirir termotolerância [Lindquist & Kim, 1996]. Para além disso, esta termotolerância pode também ser adquirida através de vários mecanismos fisiológicos: produção de trealose [Wiemken, 1990], água celular não congelável [Komatsu et al ., 1991 ], retenção do ciclo celular na fase G 0 [Plesset et al ., 1987], fosforilação independente de cAMP [Coote et al ., 1992] e actividade da H+-ATPase membranar [Coote et al ., 1991]. Em 2000, Sales e colaboradores demonstraram que Hsp12p desempenha funções protectoras da membrana plasmática face ao stresse induzido pela desidratação e pelo etanol [Sales et al ., 2000]. Por outro lado, as modificações na actividade da H +-ATPase membranar de S. cerevisiae vêm igualmente referidas como uma resposta da célula ao stresse. A enzima actua na regulação da homeostase do pH durante situações de stresse letais, de forma a manter a viabilidade celular. Experiências onde foram utilizados inibidores de H+-ATPase membranar (dietilstilboestrol - DES) [Coote et al ., 1991] e mutantes com actividade reduzida da H+- ATPase [Panaretou & Piper, 1990] parecem suportar esta hipótese. Há evidências de que o stresse térmico sub-letal resulta em 50% de redução dos níveis da enzima H +-ATPase membranar e Panaretou (1993) demonstrou que os restantes 50% de enzima são fosforilados, tornando-se a enzima duplamente activa [Panaretou, 1993]. Segundo Coote e colaboradores (1994), a célula nestas condições de stresse térmico sub-letal reduz o seu número de H+-ATPases na membrana, colocando-se a hipótese de que estas possam constituir pontos fracos ou canais por onde se realiza uma grande parte do influxo de protões para o interior da célula [Coote et al ., 1994]. Relativamente ao stresse provocado pelo etanol nas células de S. cerevisiae , os resultados obtidos por Rosa e Sá-Correia (1991) revelaram que a activação da enzima H+-ATPase membranar constitui seguramente uma resposta aos efeitos adversos deste álcool nas células (inibição da actividade da H+-ATPase e aumento da permeabilidade da membrana ao influxo de protões) [Rosa & Sá-Correia, 1991]. Como tal, uma adaptação celular de sucesso a alterações de parâmetros extracelulares que ocorrem durante a fermentação vinária requer a percepção ( sensing ) atempada de factores ambientais químicos e físicos, seguidos de uma transmissão perfeita de informação para os compartimentos relevantes da célula (Figura 5) [Pretorius, 2000].
23 INTRODUÇÃO GERAL
Figura 5: Representação da transmissão d e sinais ambientais através duma rede interligada de vias de transdução de sinais numa célula de levedura (adaptado de Pretorius, 2000).
Os sinais químicos que são emitidos durante a fermentação vinária incluem a dispon ibilidade/concentração de certos nutrientes (açúcares fermentescíveis, azoto assimilável, oxigénio, vitaminas, minerais, ergosterol e ácidos gordos insaturados) e a presença de substâncias inibitórias (etanol, ácido acético, ácidos gordos, sulfitos, resídu os agroquímicos e toxinas killer ) [Pretorius, 2000]. Os sinais de natureza física incluem a temperatura, a agitação e a pressão osmótica [Pretorius, 2000]. As respostas adaptativas estão normalmente relacionadas com a m udança dos padrões de transcrição , a modificação do ciclo celular e a a lteração dos padrões de gemulação e de crescimento polarizado [Pretorius, 2000].
1.4.3. Biodiversidade de leveduras
O conhecimento da biodiversidade de leveduras (associadas à uva e à produção de vinho) tem sido proporcionado po r numerosos estudos que têm realçado a importância e a influência que este tema exerce na produção de vinhos de qualidade. Numerosos géneros e espécies de leveduras são encontrados durante a produção de vinho. As leveduras que influenciam a composição do v inho podem pertencer à flora da uva e/ou da adega, podem ter sido disseminadas por insectos voadores (mosca da fruta, abelhas e vespas) ou podem provir de inoculações efectuadas a partir de preparações comerciais de levedura [Boulton et al ., 1996; Fleet et al ., 2002]. Embora sejam encontrados muitos géneros e espécies de leveduras no mosto, o género Saccharomyces , e, principalmente as espécies Saccharmomyces cerevisiae e S. bayanus são as grandes responsáveis pela fermentação alcoólica [Pretorius, 2000]. A diversidade de espécies de levedura nas uvas tem sido uma área de investigação explorada por diversos autores [Fleet, 1993; Kunkee & Bisson, 1993; Martini et al ., 1996; Fleet et al ., 2002; Prakitchaiwattana et al ., 2004; Combina et al ., 2005; Raspor et al ., 2006; Renouf et al ., 2007]. Alguns estudos sugerem que à superfície da uva se encontra uma concentração de leveduras de 3 x10 5 células.cm -2 [Rosini et al ., 1982], enquanto outros apontam para valores entre 10 4 e 10 6 células. cm -2 [Fleet et al ., 2002]. Sã o 3 as espécies
24 INTRODUÇÃO GERAL principais encontradas nas uvas: Hanseniaspora uvarum (forma anamórfica: Kloeckera apiculata ), Metschnikowia pulcherrima (forma anamórfica: Candida pulcherrima ) e Candida stellata . Segundo alguns autores, o género Hanseniaspora é normalmente o que domina a superfície do bago de uva [Beltran et al ., 2002; Combina et al ., 2005; Hierro et al. , 2006], enquanto outros indicam que o género dominante é Candida [Torija et al ., 2001; Clemente- Jimenez et al ., 2004]. O factor chave que determina as espécies presentes na superfície das uvas parece ser o estado de sanidade com que se encontra a uva, nomeadamente a ausência ou presença de lesões na película. No caso de ruptura da película do bago, quer por lesões físicas (mediadas por insectos, aves ou espécies fúngicas invasivas), quer por enrugamento (provocado pela desidratação do bago), pode ocorrer um enriquecimento em leveduras ascomicetas ( Hanseniaspora , Candida e Metschnikowia ) [Parish & Carroll, 1985; Fleet et al ., 2002; Prakitchaiwattana et al ., 2004], que vão dominar a flora superficial do bago à medida que a uva amadurece [Rosini et al ., 1982; Prakitchaiwattana et al ., 2004]. Pode ainda ocorrer a presença de outros géneros de leveduras, apesar de este tema não ser consensual. Durante o amadurecimento da uva ocorre uma modificação das espécies que estão presentes na superfície das uvas, dominando, numa primeira fase, as leveduras basidiomicetas ( Aureobasidium , Cryptococcus , Rhodosporidium e Rhodotorula ), enquanto no final do amadurecimento as leveduras basidiomicetas são substituídas por ascomicetas (Hanseniaspora , Candida e Metschnikowia ) [Bisson & Joseph, 2009]. Nos diversos estudos existentes em que as uvas foram colhidas de vinhas de diferentes regiões no mundo, as diferenças observadas ao nível das espécies que dominam a superfície podem ser atribuídas a factores como o clima, a altitude, os vectores existentes (e.g. insectos voadores), a variedade da uva, a sanidade do bago e as práticas na vinha [Bisson & Joseph, 2009]. Um número reduzido de estudos tem sido dedicado à flora existente nas superfícies de equipamentos e do material utilizado em adega. Foi demonstrado por alguns autores que a flora de adega representa uma fonte significativa de inoculação do mosto e do vinho [Fleet & Heard, 1993; Renouf et al ., 2007]. O material utilizado e as práticas de sanificação e de suplementação de nutrientes determinam a flora de adega. Dos estudos realizados às superfícies dos barris, há a indicação da presença de uma elevada concentração de Saccharomyces , enquanto Candida , Cryptococcus e Brettanomyces estão presentes em concentração baixa [Renouf et al ., 2006a, 2007]. As bactérias e bolores podem ser igualmente encontrados à superfície do equipamento [Picco & Rodolf, 2004]. Os estudos realizados à flora existente durante a fermentação vinária permitiram dividir a fermentação em: inoculada ou espontânea. A fermentação espontânea é a que é conduzida pela flora indígena das uvas e da adega. Numerosos estudos têm sido dedicados à
25 INTRODUÇÃO GERAL persistência da flora não-Saccharomyces durante as fermentações espontâneas [Torija et al ., 2001; Beltran et al ., 2002; Hierro et al ., 2006; Xufre et al ., 2006] e o crescimento significativo destas espécies durante as fermentações tem vindo a ser associado à produção de vinhos de baixo carácter e resultantes de fermentações amuadas [Bisson, 1999]. Todos estes estudos relativos à flora de não-Saccharomyces demonstraram um padrão semelhante de evolução das espécies de fermentação. No início do processo, as espécies presentes na superfície da uva (leveduras basidiomicetas e oxidativas ascomicetas) parecem ser as que dominam a fermentação. À medida que a fermentação prossegue, os níveis destas leveduras diminuem, ao passo que os níveis de Saccharomyces aumentam [Fleet & Heard, 1993]. No final de fermentação, Saccharomyces é o principal género encontrado e possivelmente o único capaz de ser isolado. A biodiversidade de estirpes vínicas do género Saccharomyces durante a fermentação alcoólica resulta provavelmente dos processos de selecção natural e de mutagénese aleatória [Bisson & Joseph, 2009]. A origem de S. cerevisiae é ainda objecto de alguma discussão, muito embora já se tenha descoberto que esta espécie se encontra praticamente ausente do bago de uva e dos solos da vinha [Martini & Vaughan-Martini, 1990]. Alguns autores propõem que S. cerevisiae tenha como habitat “natural” as plantas produtoras de frutos [Mortimer & Polsinelli, 1999; Sniegowski et al ., 2002]. Por outro lado, existem outros autores que postulam que S. cerevisiae é uma espécie domesticada originada a partir da espécie selvagem S. paradoxus largamente disseminada pelo mundo, associada a insectos, exsudados de árvores e a extractos de planta fermentescíveis [Naumov, 1996]. A ocorrência de S. cerevisiae na vinha seria, portanto, o resultado de uma transferência espacial da adega para a vinha, via insectos [Naumov, 1996]. Loureiro e Malfeito-Ferreira (2003) atribuíram uma classificação em grupos empíricos das leveduras associadas ao vinho, de acordo com as suas propriedades tecnológicas [Loureiro & Malfeito-Ferreira, 2003]. Leveduras oxidativas basidiomicetas, sem interesse ao nível enológico, como Sporobolomyces , Cryptococus , Rhodotorula , Filobasidium spp. e Aureobasidium pullulans , dominam o ambiente vínico (solo, madeira, folhas e bagos de uvas) [Davenport, 1974; Sabate et al ., 2002; Subden et al ., 2003; Prakitchaiwattana et al ., 2004; Renouf et al ., 2005]. Nas espécies pertencentes aos ascomicetas estão inseridas as leveduras apiculadas fracamente fermentativas ( Hanseniaspora e Kloeckera spp.) e as leveduras oxidativas ascomicetas (principalmente Candida , Pichia e Metschnikowia spp.), presentes em bagos maduros sãos [Davenport, 1974; Sabate et al ., 2002; Jolly et al ., 2003; Subden et al ., 2003; Prakitchaiwattana et al ., 2004; Renouf et al ., 2005]. O último grupo inclui as espécies fermentativas contaminantes da uva, que podem representar uma ameaça para a alteração do vinho, principalmente nas situações em que a película do bago da uva está danificada, com saída de mosto para a superfície do bago [Mortimer & Polsinelli, 1999;
26 INTRODUÇÃO GERAL
Barata et al ., 2008]. Neste grupo estão compreendidos Torulaspora spp., Zygosaccharomyces spp. e Dekkera spp. [Fleet et al ., 2002].
1.5. Objectivos da dissertação
Este trabalho teve como objectivo geral avaliar, de uma forma integrada, parâmetros fisiológicos determinantes na manutenção da viabilidade celular da estirpe Saccharomyces cerevisiae ISA 1000, acompanhando a sua evolução ao longo do processo de fermentação vinária a duas temperaturas (15ºC e 30ºC). Especificamente avaliaram-se vários parâmetros relacionados com a homeostase de protões em pontos definidos ao longo de fermentação de mosto de uva branca, nomeadamente:
pH intracelular; Efluxo de H + através da membrana plasmática; Permeabilidade da membrana a H+.
Paralelamente comparou-se o comportamento de S. cerevisiae ISA 1000 com o da mesma estirpe em plena fase exponencial de crescimento (D.O. 640nm 1), cultivada em condições laboratoriais comuns (meio mineral, 2% (p/v) glucose).
27 MATERIAL E MÉTODOS
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Microrganismo
O microrganismo utilizado neste estudo foi a estirpe ISA 1000 de Saccharomyces cerevisiae , pertencente à Colecção de Leveduras do Instituto Superior de Agronomia. Esta estirpe foi isolada a partir de uma preparação comercial de levedura seca activa para vinificação, de origem francesa, designada comercialmente por FERMIVIN ®. Para a execução dos ensaios de determinação do pH intracelular foi ainda utilizada uma segunda estirpe de S. cerevisiae W303-1A (MATa his3 leu2 trp1 ura3 ade2) [Wallis et al ., 1989].
2.2. Meios de cultura
Para a manutenção das culturas utilizou-se o meio YPD (“Yeast extract Peptone Dextrose”), com a seguinte composição: glucose 2% (p/v), peptona 1% (p/v), extracto de levedura 0,5% (p/v), agar 2% (p/v), em água desmineralizada pH 5,6. Este meio de cultura foi igualmente utilizado para a contagem em placas das unidades formadoras de colónias (UFC). Durante o presente trabalho realizaram-se ensaios em paralelo com células cultivadas em meio mineral K [van Uden, 1967] (Anexo III) e em mosto de uva branca proveniente das vindimas de 2008 das vinhas do Instituto Superior de Agronomia. Nos casos em que se cultivou a estirpe S. cerevisiae W-303, suplementou-se o meio K com uracilo (0,08 g/L), adenina (0,08 g/L), histidina (0,08 g/L), triptofano (0,32 g/L) e leucina (0,16 g/L), tendo em consideração as marcas auxotróficas da estirpe (Anexo III). Relativamente ao mosto de uvas brancas, nas etapas preliminares de preparação foi-lhe adicionado 50 mg/l de SO 2 e 10 mg/l de enzima clarificante Novoclair® Speed. Foi, igualmente, sujeito a um processo de decantação de 2 dias, a 5ºC, com o objectivo de lhe serem removidos os sólidos de maiores dimensões. O processo de conservação e esterilização do mosto teve como premissa a preservação máxima das suas características originais, executando procedimentos que visassem a minimização da alteração por factores de deterioração, nomeadamente, através da minimização da exposição ao O 2, à luz e a temperatura elevadas. Foram-nos disponibilizados 100 L de mosto pelo Instituto Superior de Agronomia, que foi dividido em alíquotas de aproximadamente 1 L, colocadas em sacos de plástico devidamente selados, aos quais foi retirado o O 2. Estes sacos foram colocados dentro de outros, de forma a reforçar a barreira mosto/O2, bem como a evitar possíveis condensações de água que alterassem a sua composição e foram congelados na câmara a -80ºC.
28 MATERIAL E MÉTODOS
Sempre que necessário procedeu-se à descongelação à temperatura ambiente, durante a noite e ao abrigo da luz, da fracção de mosto a utilizar. Posteriormente procedeu-se à sua esterilização, de acordo com a seguinte metodologia: centrifugação (Eppendorf 5810R Centrifuge ) a 12000 g, a 4ºC, com o objectivo de serem removidos, tanto quanto possível, os sólidos de maiores dimensões presentes em suspensão, seguida de filtrações sucessivas com membranas de poros progressivamente menores, começando por uma membrana de 1,2 µm ( Whatman GF/C), passando para uma membrana de 0,45 µm ( Millipore TYPE HA), terminando numa filtração esterilizante com membrana de 0,22 µm ( Millipore TYPE GSWP). O mosto estéril foi conservado a 4ºC, protegido da luz.
2.3. Condições de crescimento e recolha de amostras 2.3.1. Manutenção das culturas
As estirpes foram repicadas para tubos com meio sólido inclinado (meio YPD, secção 2.2) e incubadas em estufa, durante 24 a 48h, a 28ºC, após o qual foram mantidas a 4ºC. Executou-se este procedimento em todos os momentos que antecederam os ensaios, de forma a manter a cultura fresca e/ou a obter suficiente biomassa para os inóculos necessários.
2.3.2. Quantificação de biomassa 2.3.2.1. Acompanhamento das culturas
O acompanhamento do crescimento celular realizou-se através da leitura da densidade
óptica das culturas, a 640 nm (D.O. 640nm ), utilizando-se um espectrofotómetro Ultrospec 2100 pro (Amersham Biosciences®). As amostras foram retiradas em intervalos de tempo adequados e diluídas com água desmineralizada sempre que a D.O. 640nm excedeu o valor de
0,45, de forma a assegurar a proporcionalidade entre a D.O. 640nm e a biomassa presente.
2.3.2.2. Peso seco
Para determinar a quantidade de biomassa presente nos ensaios de medição das velocidades do efluxo protónico, permeabilidade aos H + da membrana plasmática, determinou-se o peso seco contido num volume de 100 µL de suspensão, utilizando pequenas folhas de alumínio pré-pesadas. Estas foram colocadas numa estufa a 80ºC, durante 24 horas. Após este período, foram colocadas num excicador e deixou-se arrefecer até atingir a temperatura ambiente, pesando-se posteriormente numa balança analítica. Nos ensaios de determinação do pH intracelular filtraram-se determinados volumes de suspensão de células, utilizando membranas filtrantes Millipore TYPE GSWP de porosidade 0,22 µm, pré-taradas, de forma a obter um peso seco celular mínimo de 5 mg/membrana.
29 MATERIAL E MÉTODOS
2.3.3. Preparação do pré-inóculo
A preparação do pré-inóculo, foi realizada por transferência de uma ansada de biomassa fresca (proveniente de um tubo com meio inclinado) para um balão de Erlenmeyer de 200 mL, contendo 100 mL de meio K ou de mosto estéril, conforme a experiência subsequente. As culturas foram incubadas, com agitação orbital (Shel Lab SI Series ), a 130 rpm, a 28ºC, durante aproximadamente 24 horas, de modo a manter as células em fase exponencial no momento da sua colheita. Preparou-se um pré-inóculo anteriormente a cada ensaio com o objectivo de reavivar as células, diminuindo o choque que lhes é causado quando se procede à sua transferência entre meios de cultura com estados físicos diferentes.
2.3.4. Ensaios em meio mineral
Nos ensaios em meio mineral, inoculou-se 200 mL de meio K em balões de Erlenmeyer de 500 mL, a partir de uma cultura em crescimento exponencial (pré-inóculo). A quantidade de células a inocular nestes balões foi controlada através da D.O. 640nm , (D.O. 640nm inicial ≈0,05). De seguida, incubaram-se as células com agitação magnética a 130 rpm, a 15ºC ou
30ºC (conforme o ensaio), até atingir D.O. 640nm 1.
2.3.5. Ensaios em mosto estéril
No que respeita às inoculações em mosto estéril, as células foram contadas em hemocitómetro (após crescimento do pré-inóculo até fase exponencial) e procedeu-se à inoculação de 1 x 10 6 células/mL de mosto (concentração habitualmente utilizada nas adegas a partir de inóculos comerciais), em 800 mL de mosto estéril, contidos num balão de Erlenmeyer de 1000 mL, previamente termostatizado à temperatura do ensaio a realizar (15ºC ou 30ºC). De seguida, incubou-se a cultura a 15ºC ou 30ºC, com agitação magnética a 130 rpm e ausência de arejamento suplementar, durante todo o período de fermentação.
2.3.6. Pontos de amostragem
Ao longo dos vários ensaios realizados em mosto recolheram-se células nos seguintes pontos de amostragem:
a. Para 15ºC colheram-se células em 6 pontos, correspondentes a 6 fases diferentes de crescimento: início da fase exponencial (P1), meio da fase exponencial (P2), final da fase de exponencial (P3), início da fase estacionária (P4), meio da fase estacionária (P5) e final de fermentação (P6). b. Para 30ºC, dado a quase ausência de fase de latência, colheram-se células em 5 pontos, correspondentes a 5 fases diferentes de crescimento: meio da fase
30 MATERIAL E MÉTODOS
exponencial (P1), final da fase de exponencial (P2), início da fase estacionária (P3), meio da fase estacionária (P4) e final de fermentação (P5).
2.4. Ensaios preliminares de crescimento
Com vista à determinação da duração da fase de latência e do tempo de duplicação das culturas em meio mineral e em mosto, bem como à determinação do período de fermentação e à selecção dos pontos de amostragem para recolha de células usadas nos restantes ensaios, realizaram-se ensaios preliminares de crescimento nos dois meios de cultura utilizados ao longo do trabalho.
2.4.1. Ensaios preliminares em meio mineral
Os ensaios em meio mineral para as duas estirpes de S. cerevisiae (ISA 1000 e W-303) foram executados conforme descrito na secção 2.3., tendo-se colhido amostras para medição de absorvância a 640nm ao longo do tempo, como regra de hora a hora.
2.4.2. Ensaios preliminares em mosto
Nos ensaios de crescimento em mosto estéril, para além de se ter acompanhado a evolução das D.O. 640nm , retiraram-se amostras para medir igualmente a evolução de parâmetros físico-químicos do mosto e de parâmetros de crescimento da estirpe S. cerevisiae ISA 1000.
2.4.2.1. Determinação dos parâmetros físico-químicos
Relativamente aos parâmetros físico-químicos do mosto, foi medido o pH extracelular por leitura directa de uma amostra no eléctrodo de pH (PHM220, Lab pH METER), a massa volúmica do mosto (pesando-se, em duplicado, volumes rigorosamente conhecidos, 1000 µL e 500 µL, de sobrenadante recolhido após centrifugação, 5 minutos a 14000 rpm, de amostra numa centrífuga de bancada) e ºBrix por leitura directa, recorrendo a um refractómetro (Portable Refractometer Brix/ATC). O teor em glucose no mosto, durante o processo de fermentação, foi seguido qualitativamente recorrendo às tiras-teste DIABUR-TEST ® 5000 (para controlo da fermentação, considerando-se que esta terminou quando se observou o esgotamento da glucose). Para além disso, recolheram-se amostras de sobrenadante que, após terem sido centrifugadas durante 5 minutos a 14000 rpm, foram utilizadas para determinação mais fina das concentrações de glucose (g/L) e de etanol (g/L).
31 MATERIAL E MÉTODOS
2.4.2.2. Determinação dos parâmetros de crescimento
Paralelamente, determinou-se o peso seco de acordo com o descrito no ponto 2.3.2.2. e o número de UFC/mL (determinado através do método de espalhamento em placa), procedendo-se ao espalhamento de 100 µL de suspensão de células em placas de meio YPD e incubação a 28ºC, durante 48 a 72 horas. Após este período contou-se o número de colónias por placa. Sempre que necessário foram efectuadas diluições, de forma a garantir que o número de colónias se situasse entre as 30 – 300 colónias / placa. As amostras foram plaqueadas em triplicado.
2.5. Determinação do teor em glucose presente no mosto 2.5.1. Base do método
A determinação de glucose consumida ao longo das fermentações vinárias, conduzidas a 15ºC e 30ºC, foi realizada pelo método UV (BOEHRINGER MANNHEIM / R-BIOPHARM, Roche, cat. 10.716.251.035). Este método baseia-se num conjunto de duas reacções enzimáticas:
(a) Na primeira, a D-glucose é fosforilada, na presença da enzima hexocinase (HK) e de adenosina-5’-trifosfato (ATP), a D-glucose-6-fosfato (G-6-P), com consequente formação de adenosina-5’-difosfato (ADP).
HK D-glucose + ATP G-6-P + ADP (1)
(b) Na segunda, na presença da enzima glucose-6-fosfato desidrogenase (G 6P-DH), a glucose-6-fosfato é oxidada pelo dinucleotídeo fosfatado de nicotinamida – adenina (NADP) a 6-fosfoglucono-∂-lactona, com formação de dinucleotídeo reduzido de nicotinamida – adenina (NADPH).
G6P-DH G-6-P + NADP + 6-fosfoglucono-∂-lactona + NADPH + H + (2)
A quantidade de NADPH formada na reacção (2) é estequiometricamente equivalente à quantidade de D-glucose consumida na reacção (1). O aumento da quantidade de NADPH formada é medido através da leitura de absorvância a 340nm.
2.5.2. Procedimento experimental
Durante o ensaio foram utilizadas as seguintes soluções:
Solução 1: 7,2g de mistura em pó (tampão trietanolamina, pH 7,6, NADP, 110mg; ATP, 260mg; sulfato de magnésio) com 45 mL de água redestilada. Solução 2: 1,1 mL de hexocinase, 320U; glucose-6-fosfato desidrogenase, 160U.
32 MATERIAL E MÉTODOS
Foram pipetados 500µL da solução 1, 50µL da amostra, 950µL de água destilada para uma cuvete e agitou-se. Após 3 minutos registou-se a absorvância a 340nm e adicionou-se 20µL da solução 2. Agitou-se novamente. Após 15 minutos leu-se novamente a absorvância. Sempre que necessário diluiu-se a amostra, de forma a ficar dentro dos limites do método (Tabela 3).
Tabela 3: Factores de diluição utilizados para cada amostra dos ensaios a (a) 15ºC e a (b) 30ºC.
(a) (b)
Fase de crescimento Factor de diluição Fase de crescimento Factor de diluição
Inoculação 500 Inoculação 500 Início de exponencial 500 Meio de exponencial 500 Meio de exponencial 500 Final de exponencial 500 Final de exponencial 500 Início de estacionária 500 Início de estacionária 500 Meio de estacionária 100 Meio de estacionária 100 Final de fermentação 1 Final de fermentação 1
∆A = (A2 - A1) amostra – (A2 – A1) branco (3) onde,
∆A – Variação de absorvância A1 – Primeiras absorvâncias lidas da amostra/branco A2 – Segundas absorvâncias lidas da amostra/branco
V. MW c = . ∆A (4)
ε.ν.1000 onde,
c – Concentração da amostra (g/L) V – Volume final: 1,520 mL MW – Massa molecular da glucose: 180,16g/mol ε – coeficiente de extinção do NADH: 6,3 L/(mmol.cm) ν – Volume da amostra: 0,05 mL
2.6. Determinação do teor em etanol presente no mosto
2.6.1. Base do método
A determinação do etanol produzido ao longo das fermentações vinárias, conduzidas a 15ºC e 30ºC, foi realizada pelo método UV (BOEHRINGER MANNHEIM / R-BIOPHARM, Roche, cat. 0.176.290). Este método baseia-se num conjunto de duas reacções enzimáticas:
33 MATERIAL E MÉTODOS
(a) Na primeira, o etanol é oxidado a acetaldeído, através da acção do dinucleotídeo de nicotinamida – adenina (NAD), na presença da enzima álcool desidrogenase (ADH).
ADH Etanol + NAD + Acetaldeído + NADH + H + (5)
O equilíbrio desta reacção tende naturalmente para o 1º membro (etanol e NAD). No entanto, em condições alcalinas o equilíbrio pode ser completamente deslocado para o 2º membro.
(b) Na segunda, o acetaldeído formado na reacção (6) é quantitativamente oxidado a acido acético, na presença da enzima aldeído desidrogenase (Al-DH).
Al-DH + Ácido acético + NADH + H + (6) Acetaldeído + NAD + H 2O
A quantidade de NADH formada na reacção (6) é estequiometricamente equivalente à quantidade de etanol consumido na reacção (5). O aumento da quantidade de NADH formado é medido através da leitura de absorvância a 340nm.
2.6.2. Procedimento experimental
Durante o ensaio foram utilizadas as seguintes soluções:
Mistura 2: Pastilha (NAD, 4mg; aldeído desidrogenase, 0,8U) com 3mL de tampão disulfato de potássio a pH 9. Suspensão 3: ADH, 7000U.
Foram pipetados 1500µL da mistura 2 e 50µL de amostra para cuvetes, taparam-se com parafilme e agitaram-se. Após 3 minutos registou-se a absorvância a 340nm e adicionaram- se 25µL da suspensão 3, tapando e agitando novamente as cuvetes. Após 10 minutos leu- se novamente a absorvância. Sempre que necessário diluiu-se a amostra de modo a ficar dentro dos limites do método (Tabela 4).
Tabela 4: Factores de diluição utilizados para cada amostra dos ensaios a (a) 15ºC e a (b) 30ºC.
(a) (b)
Fase de crescimento Factor de diluição Fase de crescimento Factor de diluição
Inoculação 10 Inoculação 10 Início de exponencial 100 Meio de exponencial 1000 Meio de exponencial 1000 Final de exponencial 1000 Final de exponencial 1000 Início de estacionária 5000 Início de estacionária 5000 Meio da estacionária 5000 Meio da estacionária 5000 Final de fermentação 5000 Final de fermentação 5000
34 MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizadas as seguintes fórmulas:
∆A = (A2 - A1) amostra – (A2 – A1) branco (7) onde,
∆A – Variação de absorvância A1 – Primeiras absorvâncias lidas da amostra/branco A2 – Segundas absorvâncias lidas da amostra/branco
V. MW c = . ∆A (8) ε . ν . 2 . 1000 onde,
c – Concentração da amostra (g/L) V – Volume final: 1,575 mL MW – Massa molecular do etanol: 46,07g/mol ε – coeficiente de extinção do NADH: 6,3 L/(mmol.cm) ν – Volume da amostra: 0,05 mL
2.7. Determinação do pH intracelular 2.7.1. Base do método
O pH intracelular (pH in ) foi determinado pelo método descrito por Rottenberg (1979) que consiste na medição da distribuição relativa de um ácido orgânico fraco marcado radioactivamente com 14 C entre os meios intracelular e extracelular das células. Este método baseia-se na utilização de ácidos ou bases cujas espécies neutras se difundem através da membrana, sendo esta impermeável às respectivas formas iónicas. Utilizam-se ácidos quando o pH intracelular é superior ao pH externo. Sempre que um ácido (AH) atinge uma situação de equilíbrio no interior (in) e no exterior
(ex) da célula (AH in = AH ex ) e atendendo a que as suas moléculas se dissociam em ambos os lados da membrana (assumindo que a constante de dissociação – Kd – não varia), obtém-se: + - + - [H ] [A ] [H ]ex [A ]ex in in Kd = = (9) [AH] in [AH] ex no equilíbrio:
[A -] in (10) pH in – pH ex = ∆pH = log - [A ]ex
se o pH extracelular (pH ex ) > pK + 1, a maior parte do ácido está na forma ionizada nos dois lados da membrana e a medida da razão da distribuição do ácido permite calcular o ∆pH, de acordo com a equação anterior. Caso contrário, uma fracção significativa do ácido
35 MATERIAL E MÉTODOS encontrar-se-á na forma não ionizada e, tendo em conta que a concentração total do ácido (A T) é expressa por: A T = A - + AH, obtém-se, então, no equilíbrio:
1 1 + T + A in Kd [H ]in = T (11) A ex 1 1 + + Kd [H ]ex
T T onde, A in e A ex são, respectivamente, as concentrações totais interna e externa do ácido propiónico e K d a sua constante de dissociação. Resolvendo a equação (11) em ordem ao pH intracelular, vem:
T A in 1 1 1 (12) pH in = log + - T + A ex [H ]ex Kd Kd
a qual permite estimar o valor do pH intracelular.
2.7.2. Características das soluções utilizadas
Para a execução deste ensaio foram preparadas soluções radioactivas de [1– 14 C] ácido propiónico ( NEN TM ) e de [7-14 C] ácido benzóico ( NEN TM ) (utilizado com a mesma metodologia que o anterior), tendo por base as suas características iniciais:
(a) [1- 14 C] ácido propiónico: quantidade de radioactivo presente em 0,25 mL de etanol - 9,25 MBq = 0,25 mCi ; actividade especifica - 2,0 GBq / mmol = 54,10 mCi / mmol.
(b) [7- 14 C] ácido benzóico: quantidade de radioactivo presente no composto sólido - 18,5 MBq = 0,5 mCi ; actividade especifica - 588,3 MBq / mmol = 15,90 mCi / mmol.
Para a dissolução do [7 - 14 C] ácido benzóico foi necessária a utilização de uma solução de hidróxido de sódio (NaOH) 10 µM, uma vez que este composto radioactivo demonstrou ser insolúvel a 25ºC em água. Uma vez feitas as soluções radioactivas procedeu-se à contagem preliminar de CPM de 5 µL de cada uma das soluções em 5 mL de líquido de cintilação. O resultado foi de ≈ 7,0 x 10 6 CPM para o [1 - 14 C] ácido propiónico e ≈ 1,0 x 10 7 CPM para o [7 - 14 C] ácido benzóico. Como tal, dadas as contagens preliminares terem sido elevadas, procedeu-se a uma diluição de 1:3 (v/v) dos respectivos compostos, tendo sido estas as soluções utilizadas nos ensaios.
36 MATERIAL E MÉTODOS
2.7.3. Procedimento experimental
O pH intracelular foi determinado nas culturas de células cultivadas às duas temperaturas de estudo (15ºC e 30ºC), para os diferentes pontos correspondentes a diferentes fases de crescimento (referidos na secção 2.3.6.).
2.7.3.1. Ensaios em meio mineral
Nos ensaios em meio mineral, cultivaram-se as células em 200 mL de meio K, em balões de Erlenmeyer de 500mL, até se atingir uma D.O. 640nm ≈ 1. Fez-se uma divisão equitativa da cultura (100mL) para 2 balões de Erlenmeyer de 500mL. Procedeu-se à marcação radioactiva de um dos balões (balão A) com 5 µL de composto radioactivo (C f < 1µM), mantendo-se o outro balão não marcado (balão B). Não foi necessário adicionar ácido não radioactivo ao segundo balão (designado de balão “frio”), pois a concentração final da forma dissociada no primeiro balão (designado de balão “quente”) era desprezável (C f < 1µM), não interferindo no valor de pH extracelular. Incubaram-se os dois balões nos banhos termostatizados à temperatura de 15ºC ou de 30ºC, conforme a experiência, com agitação magnética fraca (cerca de 130 rpm). O período de incubação máximo foi de 120 minutos a 30ºC e 210 minutos a 15ºC, com vista a garantir que se atingia o equilíbrio da forma não dissociada do composto radioactivo entre os meios extracelular e intracelular. Recolheram- se amostras ao fim de 60, 90 e 120 minutos a 30ºC e ao fim de 90, 120, 150, 180 e 210 minutos a 15ºC, dos dois balões:
Balão A – Determinação da concentração extracelular e intracelular de ácido fraco Balão B – Determinação do pH extracelular e do peso seco
Este procedimento foi realizado paralelamente com [1 - 14 C] ácido propiónico e [7 - 14 C] ácido benzóico para as estirpes S. cerevisiae ISA 1000 e W-303. A cada tempo de incubação mencionado, recolheram-se células dos dois balões, para as seguintes determinações:
Determinação do pH extracelular : do balão B recolheu-se um determinado volume calculado de suspensão de células para um copo, medindo-se o pH extracelular directamente no eléctrodo (PHM220, Lab pH METER) previamente calibrado.
Determinação do peso seco : filtrou-se um determinado volume de suspensão recolhido do balão B, utilizando membranas Millipore TYPE GSWP, com poro de 0,22 µm e procedeu-se conforme o descrito em 2.3.2.2.. O volume recolhido teve em conta o facto de se pretender manter ≈ 5 mg de células em cada membrana pesada.
37 MATERIAL E MÉTODOS
Determinação da concentração total de ácido radioactivo no meio extracelular : do balão marcado com ácido radioactivo (balão A) pipetou-se 500 µL da suspensão para dois tubos (2 mL) eppendorf de rosca e centrifugou-se durante 5 minutos, a 14.000 rpm, numa centrífuga de bancada. Recolheu-se 100 µL do sobrenadante para dois frascos com 5 mL de líquido de cintilação Optiphase “HiSafe” 2 ( Perkin Elmer ).
Determinação da concentração total de ácido radioactivo no meio intracelular : foi realizada através da determinação do número de CPM existente num volume de células conhecido (Tabela 5), recolhido por filtração em membrana com pressão negativa. Lavou-se o sistema de filtração (Figura 6) com água desmineralizada gelada, com o auxílio de uma membrana GF/B ( Whatman ). De seguida, filtrou-se um determinado volume de suspensão de células recolhidas do balão A, com o auxílio de uma membrana GF/C ( Whatman ), previamente humedecida com água gelada. Após a filtração, lavou-se a membrana com 5 mL de água gelada e recolheu-se a membrana para um tubo com 5 mL de líquido de cintilação Optiphase “HiSafe” 2 ( Perkin Elmer ). Fizeram-se duplicados de todas as determinações.
A contagem da radioactividade das amostras foi efectuada num contador Beckman LS 6000 LL, programável para leituras de carbono, com erro inferior a 1%.
Figura 6: Sistema de filtração em vácuo utilizado na determinação da concentração de composto radioactivo presente no meio intracelular.
2.7.3.2. Ensaios em mosto
As determinações do pH intracelular para as várias fases de fermentação em mosto de uva branca foram realizadas às 2 temperaturas e para a estirpe S. cerevisiae ISA 1000. O procedimento utilizado foi semelhante ao descrito para os ensaios com células cultivadas em meio K, com as seguintes modificações:
1) As células foram cultivadas em mosto, tendo-se recolhido amostras para a
determinação do pHin nos pontos de amostragem definidos (secção 2.3.6.).
38 MATERIAL E MÉTODOS
2) O volume de células recolhido a cada fase de fermentação foi calculado de forma a utilizar em cada ensaio uma quantidade de biomassa seca aproximadamente igual (≈5 mg/mL) (Tabela 5). 3) Utilizou-se apenas [7-14 C] ácido benzóico, tendo-se adicionado ao balão A um 14 determinado volume de ácido marcado (Tabela 5). A Cf do [7- C] ácido benzóico, nestes casos, nem sempre foi inferior a 1µM, no entanto, não foi necessário adicionar ao balão “frio” o mesmo volume de ácido benzóico (não radioactivo), uma vez que se tiver em consideração que o pH do mosto é de ≈ 3 e o pKa do ácido benzóico é de ≈ 4,2, a forma não dissociada estará em predominância, não influindo, portanto, no pH extracelular. 4) Incubaram-se os balões A e B, por 120 minutos a 30ºC e 210 minutos a 15ºC. Nos ensaios a 30ºC recolheram-se amostras ao fim de 60, 90 e 120 minutos, enquanto a 15ºC os tempos de amostragem foram 90, 120, 150, 180 e 210 minutos de forma a garantir o estabelecimento do equilíbrio. 5) O volume filtrado dos balões A e B para determinação da quantidade de ácido
radioactivo e de peso seco, respectivamente, diferiu em função da D.O. 640m da cultura em mosto correspondente a cada fase de fermentação, muito embora se tenha adoptado filtrar 1 mL para todos casos em que os volumes determinados tiveram um valor inferior a 1mL (Tabela 5).
Tabela 5: Dados utilizados nos ensaios de pH in .
15ºC
Volume recolhido Volume balão A Volume de ác. benzóico* [ác. benzóico] no Volume filtrado Fase de crescimento (mL) (mL) adicionado (µL) balão A (µM) (mL) Início de exponencial 300 150 7,5 1,05 10,00 Meio de exponencial 150 75 15 4,19 2,50 Final de exponencial 111 56 20 7,55 1,00 Início de estacionária 107 53 20 7,86 1,00 Meio de estacionária 106 53 20 7,89 1,00 Final de fermentação 106 53 20 7,92 1,00
30ºC Volume recolhido Volume balão A Volume de ác. benzóico* [ác. benzóico] no Volume filtrado Fase de crescimento (mL) (mL) adicionado (µL) balão A (µM) (mL) Meio de exponencial 220 110 5,5 1,05 10,00 Final de exponencial 130 65 13 4,19 2,50 Início de estacionária 105 53 20 7,95 1,00 Meio de estacionária 104 52 20 8,08 1,00
Final de fermentação 104 52 20 8,10 1,00
39 MATERIAL E MÉTODOS
2.8. Avaliação do efeito do etanol sobre a permeabilidade da memb rana a H+ 2.8.1. Base do método
A permeabilidade passiva a protões mediu -se com base no registo do pH de uma suspensão de célu las, durante um determinado perí odo de tempo. Na Figura 7 é apresentado um registo típico da variação do pH extracelular de uma suspensão de células de levedura quando se adiciona um pulso de ácido. A taxa específica de influxo foi calculada com base na variação da quantidade de H + por unidade de tempo, tendo em consideração a velocidade do papel registador e os dados obtidos para a calibra ção do sinal em cada ensaio e o peso seco correspondente ao volume de células utilizado (determinado pelo método descrito em 2.3.2.2.) .
Figura 7: Variação de pH de uma suspensão aquosa de S. cerevisiae ISA 1000 (100 mg/mL) após uma acidificação rápida de pH 5 para pH 4.
Estas experiências foram realizadas na presença de 2 -desoxi-D-glucose ( 0,2 M) e antimicina (0,4 mg/mL ) para minimizar os movimentos de protões resultantes da actividade da H +-ATPase membranar.
2.8.2. Procedimento experimental
A medição do movimento de protões foi efectuada através do dispositivo representado na Figura 8, constituído por um eléctrodo de pH de vidro combinado (Mettler Toledo ), ligado a um potenciómetro PHM82, Radiometer. Este, por sua vez, estava ligado a um registador linear BBC SE 460, Goerz Metrawatt. Entre o potenciómetro e o registador, foi incorporado um dispositivo de amplificação de sinal, construído nas oficinas do Instituto Gulbenkian de Ciência. Este dispositivo permitiu efectuar um ajuste do potencial basal, o que p ossibilitou realizar, no registador, a medição da variação da concentração de protões, com elevada sensibilidade.
Figura 8: Representação do equipamento utilizado na medição da ve locidade do + movimento de H através da membrana plasmática de S. cerevisiae ISA 1000.
40 MATERIAL E MÉTODOS
2.8.2.1. Preparação das suspensões de células
Para cada ensaio realizado para avaliação do influxo de protões através da membrana plasmática foram utilizadas suspensões concentradas de células em água, preparadas de forma a obter ≈ 100 mg p.s. / mL.
Para cada situação (pontos de amostragem de crescimento em mosto e D.O. 640nm 1 no crescimento em meio K) recolheu-se um volume apropriado de células em função do peso seco calculado com base no ensaio preliminar realizado (secção 2.4.). As células foram centrifugadas a 12.000 rpm, durante 4 minutos a 4ºC, numa centrífuga ( Eppendorf centrifuge 5810R). A suspensão de células obtida foi mantida em gelo, pelo menos 1 hora antes do início do ensaio, bem como durante a execução do mesmo.
2.8.2.2. Ensaios com células ressuspendidas em água desmineralizada
O eléctrodo de pH foi colocado num reactor com 2 mL de capacidade, termostatizado a 15ºC ou a 30ºC (conforme o ensaio) e munido de agitação magnética. Neste reactor colocou-se 800 µL de água desmineralizada ou de soluções previamente termostatizadas a 15ºC ou a 30ºC, com diferentes concentrações de etanol (2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 e 20% (v/v)). De seguida, adicionou-se 200 µL de suspensão de células (100 mg p.s./mL), 5 µL de antimicina 0,4 mg/mL e 5 µL de 2-desoxi-D-glucose 0,2 M. Ajustou-se a pH 4 com uma solução de HCl (10 mM ou 100 mM), conforme a situação e registou-se as alterações de pH, durante um periodo de tempo variável, dependente da temperatura a que se realizou o ensaio, da fase de crescimento das células e da concentração de etanol testada. Após a obtenção da curva pretendida (Figura 9), calibrou-se o sinal utilizando um volume conhecido de HCl (10 mM ou 100 mM).
X nmol H + pH
Velocidade do Calibração papel (cm.min -1)
Alcalinização do meio extracelular
Figura 9: Curva típica obtida nos ensaios de permeabilidade da membrana plasmática a H +, onde é possível observar uma alcalinização do meio extracelular. A calibração foi feita com soluções de HCl.
41 MATERIAL E MÉTODOS
2.8.2.3. Ensaios com células ressuspendidas a diferentes pH extracelulares
No caso das células recolhidas nos últimos 2 pontos de amostragem do período de fermentação (meio da estacionária e final de fermentação) , para além dos ensaios com células ressuspendidas em água desmineralizada, foram ainda realizados ensaios equivalentes em que se prepararam suspensões de células (100 mg/mL) ressuspendidas em tampão Tris-citrato (10mM Tris, pH 5) e T ris-citrato (10mM Tris, pH 6,3), testando concentrações finais de etanol de 0, 6, 10, 16 e 20% (v/v).
2.9. Avalia ção do efeito do etanol sobre o efluxo de H + através da membrana plasmática 2.9.1. Base do método
A avaliação do efeito do etanol sobre o efluxo de protões através da membrana plasmática tem por base o registo dos valores de pH ao longo do tempo, após um pulso d e glucose, de uma suspensão concentrada de células em água desmineralizada (Figura 10). A velocidade de movimento de H + é calculada através de uma calibração que relaciona variações de pH com quantidades conhecidas de base adicionada ao sistema [ Serrano, 1977].
Figura 10: Variação de pH de uma suspensão aquosa de S. cerevisiae ISA 1000 (100 mg/mL) após um pulso de glucose.
2.9.2. Procedimento experimenta l
O sistema utilizado durante os ensaios de medição das velocidades de efluxo protónico foi similar ao utilizado para medição das velocidades de influxo de H +, descrito na Figura 9.
2.9.2.1. Pre paração de suspensões de células
Os ensaios foram realizados a partir de suspensões de células preparadas de acordo com o descrito em 2.8.2.1.
2.9.2.2. Ensaio experimental a diferent es temperaturas
O eléctrodo foi colocado num reactor com 2 mL de capacidade, munido de agitação magnética e termostatizado (a 15ºC ou a 30ºC, conforme o ensaio). No reactor colocou -se 800 µL de água desmineralizada ou de soluções com diferentes concentraçõ es de etanol
42 MATERIAL E MÉTODOS
(previamente termostatizadas a 15ºC ou a 30ºC), de forma a obter durante o ensaio uma concentração final de 2%, 4%, 6%, 8%, 10%, 12%, 14%, 16%, 18%, 20% e 25%. De seguida, adicionou-se 100 µL de suspensão de células (100 mg p.s./mL). Ajustou-se o pH a 5 com uma solução de HCl (10 mM ou 100 mM) ou NaOH (10 mM ou 100 mM), conforme a situação e registou-se durante aproximadamente 1 minuto, de forma a obter a linha de base.
Ao fim desse tempo adicionou-se 100 µL de uma solução de glucose 20% (p/v) (C final 2%) e registou-se o pH durante um período de tempo (Figura 11) que se revelou novamente dependente da temperatura a que se realizou o ensaio, da fase de crescimento das células e da concentração de etanol testada. A taxa específica de efluxo de protões foi calculada com base na variação da quantidade de H + por unidade de tempo, tendo em conta a velocidade do papel registador e os dados obtidos para a calibração do sinal em cada ensaio e o peso seco correspondente ao volume de células utilizado.
100 µL glucose 20% (p/v) pH
Velocidade do papel (cm.min -1) Linha de base
Calibração
Acidificação do meio extracelular
- X nmol OH
Figura 11: Curva típica obtida nos ensaios de efluxo protónico, onde se pode verificar uma acidificação do meio extracelular após a adição de 100 µL de glucose (Cf = 2% (p/v)). A calibração foi feita com soluções de NaOH.
43 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
O trabalho apresentado surge no seguimento de um projecto anterior, em que os ensaios foram realizados a 25ºC, onde se estudaram vários parâmetros fisiológicos e bioenergéticos de forma a avaliar o desempenho de uma estirpe vínica de Saccharomyces cerevisiae (ISA 1000) ao longo de fermentação vinária. No presente estudo pretendeu-se avaliar parâmetros relacionados com a homeostase protónica de células ao longo de fermentação, quando cultivadas em mosto de uva a temperaturas às quais se realizam fermentações vínicas para produção de vinho branco e tinto. Num cômputo geral, procurou-se reproduzir em laboratório, tanto quanto possível, a situação real em que são efectuadas estas fermentações, com o objectivo final de uma possível transposição dos resultados obtidos para os resultados numa situação real em adega, com vista a melhorar a produção de vinho nos aspectos que dependem do desempenho da levedura. Com este objectivo, cultivou-se uma estirpe vínica de S. cerevisiae , isolada a partir de um fermento comercial liofilizado (FERMIVIN ®) e seleccionada pela sua elevada capacidade fermentativa, em mosto estéril de uva branca, a duas temperaturas (15ºC e 30ºC usadas na produção de vinhos branco e tinto, respectivamente). O mosto utilizado sofreu os tratamentos comuns em adega, tais como clarificação com 10 mg/L de enzima e adição de enxofre, de forma a garantir 50 ppm de sulfitos livres para estabilização, sendo posteriormente esterilizado por filtrações sucessivas em membranas (com pressão negativa). A fermentação decorreu em balões de Erlenmeyer de 1000mL, preenchidos com 800mL de mosto, incubados em banhos termostatizados a 15ºC ou a 30ºC, com agitação magnética fraca e sem arejamento suplementar, durante todo o período de fermentação. O final de fermentação foi estabelecido como o ponto a partir do qual não se detectou a presença de açúcares através dos métodos comuns em adega. Com vista a possibilitar a comparação entre os resultados obtidos em células recolhidas ao longo de fermentação de mosto de uva branca e células cultivadas em condições laboratoriais (para as quais o número de dados existentes na literatura é muito superior), realizaram-se paralelamente ensaios com a mesma estirpe cultivada em meio mineral (meio
K) e recolhidas em plena fase exponencial de crescimento (D.O. 640nm ≈ 1). Ao longo do trabalho, para a apresentação dos valores relativos aos vários parâmetros determinados, foi realizada na maior parte dos casos, pelo menos uma repetição, garantindo a reprodutibilidade dos mesmos.
3.1. Ensaios preliminares
Com o intuito de se avaliar o desempenho fermentativo de Saccharomyces cerevisiae ISA 1000 a 15ºC e a 30ºC, e, de definir os pontos de amostragem para os ensaios
44 RESULTADOS E DISCUSSÃO posteriores, foi necessário realizar ensaios preliminares de crescimento da estirpe a cada uma destas temperaturas. Procedeu -se ao crescimento de células às duas temperaturas de estudo conforme o descrito em 2.3.5., com inoculação de 1 x 10 6 células/mL em 800 mL de mosto estéril, em balões de Erlenmeyer de 1000 mL previamente termost atizados à temperatura do ensaio, com fraca agitação magnética (130 rpm) e ausência de arejamento suplementar, durante todo o período de fermentação. Ao longo da fermentação foram colhidas amostras, de acordo com o descrito em 2.3.6. Os ensaios preliminares permitiram verificar a evolução d e parâmetros físico -químicos do mosto (massa volúmica, pH extracelular e teor de glucose ) e a evolução de parâmetros de crescimento da estirpe
(D.O. 640nm , peso seco e UFC/mL).
3.1.1. Ensaio preliminar de Saccharomyces cerevisiae ISA 1000 a 15ºC 3.1.1.1. Avaliação dos par âmetros de crescimento da estirpe
O crescimento da estirpe S. cerevisiae ISA 1000 em mosto estéril a 15ºC foi monitorizado através da determinação da D.O. 640nm (descrito em 2.3.2.1.), comparando -se a sua evolução com a do peso seco e UFC/mL ( Figura 12)
(a)
T T4 5 T6
T3 T2
T1
(b)
Figura 12: Curva de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 em fermentação de mosto a 15ºC. (a) D.O. 640nm e peso seco e (b) D.O. 640nm e UFC/mL. No gráfico (a) estão assinalados os pontos de amostragem escolhidos (círculo laranja) .
45 RESULTADOS E DISCUSSÃO
O ensaio foi iniciado por inoculação de ≈ 1x10 6 células/mL a partir de um pré-inóculo em fase exponencial, preparado em mosto a 28ºC. Através da observação da curva de crescimento obtida a 15ºC (Figura 12a), foi possível verificar que, de acordo com as determinações de D.O. 640nm , a cultura apresentou uma fase de latência de ≈13 horas, seguida de uma fase exponencial que se prologou por ≈ 41 horas (com um tempo de duplicação de ≈ 6h 30m). Ao fim de 87 horas, a cultura entrou em fase estacionária, terminando a fermentação às 304 horas, altura em que se verificou um esgotamento total da glucose (Anexo IV). A partir da curva de crescimento obtida a 15ºC definiram-se 6 pontos de amostragem (Tabela 6), atendendo ao comportamento de estirpes vínicas comerciais sujeitas a variações, descritas na literatura, ao longo do processo de fermentação e à monitorização do trancriptoma de uma estirpe comercial de S. cerevisiae em mosto sintético [Querol et al ., 2003; Rossignol et al., 2003].
Tabela 6: Pontos de amostragem definidos para o crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 em fermentações conduzidas a 15ºC.
Pontos de amostragem Tempo de recolha das células (h) Início da exponencial (T1) ≈24 Meio da exponencial (T2) ≈36 Final da exponencial (T3) ≈65 Início da estacionária (T4) ≈87 Meio da estacionária (T5) ≈202 Final da fermentação (T6) ≈304
A fase de latência observada nas fermentações a 15ºC caracterizou-se essencialmente por um período em que as células se adaptaram ao stresse térmico imposto, uma vez que a passagem de 28ºC (do pré-inóculo) para 15ºC possivelmente abrandou o metabolismo celular. Ao se observar a evolução do peso seco durante a fermentação a 15ºC (Figura 12a), verificou-se que, tal com esperado, este acompanhou a evolução da D.O. 640nm , uma vez que ambos os parâmetros têm em consideração todo o tipo de células, independentemente da sua capacidade metabólica e de multiplicação. A partir de um determinado peso seco de células foi possível calcular o volume de colheita necessário para cada ponto de amostragem. Se tivermos em consideração a Figura 12b que relaciona a evolução do crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 e o número de células viáveis (com capacidade de multiplicação activa, expresso em UFC/mL), constata-se que a população inicial sofreu inicialmente um decréscimo atingindo um mínimo ao fim de 12-13h. Este decréscimo foi observado quer ao nível de D.O. 640nm (para as primeiras 2h), quer ao nível de células viáveis, correspondendo a
46 RESULTADOS E DISCUSSÃO uma redução efectiva da população , igualmente observada por alguns autores nesta fase de crescimento [Pham et al ., 2006] . Tendo em consideração que o pré-inóculo , a partir do qual as células foram inoculadas , foi preparado em mosto exactamente igual ao utilizado no ensaio, mas a 28ºC, a explicação mais plausível para a redução observada nas leituras de
D.O. 640nm e no número de células viáveis poderá estar relacionada com o choque térmico sofrido pela passagem de 28ºC para 15ºC e com a diluição efectuada à população proveniente do pré-inóculo . Após o período inicia l de decréscimo de população, o crescimento prosseguiu , constatando -se que ocorreram 6 a 7 duplicações durante a fase exponencial de crescimento, atingindo uma D.O. 640nm de ≈ 8 no final da mesma fase ( Figura 12b). Por outro lado, é perceptível na Figura 12b que a curva de UFC/mL acompanh ou a curva de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000, ao longo da fermentação a 15ºC, o que indicia que as células permanece ram viáveis até ao final de fermentação.
3.1.1.2. Avaliação dos parâmetros físico -químicos do mosto
Para além dos parâmetros de crescimento , foi observada a evolução do pH, da massa volúmica, do ºBrix e do teor de glucose e de etanol do mosto, com colheita de amostras ao longo da fermentação a 15ºC. Através da obse rvação dos gráficos da Figura 13, foi possív el constatar -se que: (a) o pH do mosto manteve-se relativamente constante ao longo do processo de fermentação (pH ≈3), oscilando entre 3,04 (pH inoculação ), 2,87 (pH início estacionária ) e 3,02 (pH final fermentação ); (b) a massa volúmica decresceu ao longo da fermentação, partindo de um valor inicial de ≈1074 mg/mL até atingir ≈990 mg/mL no final de fermentação; (c ) o ºBrix (que quantifica os açúcares solúveis no mosto) diminuiu ao longo da fermentação, no entanto foi possível constatar que só começou a diminu ir quando a cultura termin ou a fase exponencial e começ ou a entrar em fase estacionária.
(a) (b )
(c ) Figura 13: Evolução do (a) pH extracelular, da (b) massa volúmica (mg/mL) e do (c) ºBrix do mosto, ao longo de fermentação de S. cerevisiae ISA 1000 em mosto de uva branca a 15ºC.
47 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados relativos à variação do pH do mosto ao longo da fermentação a 15ºC permitiram concluir que o mosto pode ser considerado um meio com uma capacidade tampão considerável, uma vez que manteve o seu pH relativamente constante durante o processo fermentativo (pH ≈3). No que respeita à massa volúmica, foi possível constatar que houve uma grande variação nos resultados obtidos para este parâmetro, que pode estar relacionada com o facto do método utilizado para a sua determinação ter inerente um grau elevado de erro, uma vez que a avaliação deste parâmetro apenas teve como objectivo monitorizar qualitativamente a fermentação vinária a 15ºC. No entanto, o valor de massa volúmica correspondente ao final de fermentação (990 mg/mL) está próximo da gama de valores admissíveis (991-996 mg/mL) para esta fase [Ribéreau-Gayon et al ., 2006]. A medição da massa volúmica, segundo estes autores, deixa de ser precisa na monitorização da fermentação a partir do momento em que este parâmetro diminui para valores inferiores a 1000 mg/mL [Ribéreau- Gayon et al ., 2006], o que pode explicar a grande variabilidade dos valores registados inferiores a 1000 mg/mL. A avaliação do ºBrix das várias amostras colhidas ao longo da fermentação permitiu monitorizar qualitativamente igualmente os teores de glucose e frutose ao longo do processo. A razão pela qual se observou uma diminuição deste parâmetro a partir do momento em que as células terminaram a fase exponencial e iniciaram a fase estacionária (Figura 13c), poderá ter como possível explicação o facto de a sua determinação avaliar simultaneamente o consumo de glucose e frutose que, a par da baixa sensibilidade do método, não permitiu detectar pequenas quantidades de glucose consumidas no início de fermentação, onde existe uma quantidade elevada de açúcares ( ≈200 g/L). Relativamente à concentração de glucose (Tabela 7, Figura 14), doseada pelo método descrito em 2.5., constata-se que o teor de açúcares (glucose e frutose) presente no mosto de uva branca utilizado no presente trabalho ( ≈193 g/L) esteve de acordo com a gama normal de valores de açúcares totais (160-300 g/L) [Fleet & Heard, 1993] admitindo que as uvas e consequentemente o mosto contêm quantidades semelhantes de frutose e de glucose, apesar de alguns autores referirem que as alterações ambientais recentes têm vindo a aumentar a proporção de frutose comparativamente à de glucose nas uvas [Jones et al. , 2005]. Por outro lado, a observação da Figura 14 permite afirmar que ≈24% de glucose foi consumida entre o momento da inoculação (T0) e o final de fase exponencial (T3), ≈23% foi consumida entre o final de fase exponencial (T3) e o início de fase estacionária (T4) e mais de 50% de glucose foi consumida após a cultura entrar em fase estacionária (T4), vindo ao encontro das observações de Rossignol e colaboradores (2003), que verificaram que a maior parte do açúcar é fermentado por resting cells [Rossignol et al., 2003]. No final de fermentação (T6), as células praticamente esgotaram a glucose presente no meio,
48 RESULTADOS E DISCUSSÃO considerando-se terminada a fermentação. Outro facto interessante foi o baixo consumo de glucose observado em células compreendidas entre as fases meio de estacionária e final de fermentação (Figura 14), estando de acordo com os resultados obtidos no estudo a 25ºC onde foi possível constatar uma elevada actividade dos transportadores de hexoses de baixa afinidade nas fases iniciais de fermentação, ao passo que a actividade observada no final de fermentação, para além de ter sido baixa, foi essencialmente devida aos transportadores de alta afinidade [C. Prista, comunicação pessoal]. Estas observações do estudo a 15ºC e a 25ºC demonstraram ser coerentes com os estudos de alguns autores, na medida em que Brejning e colaboradores (2003) observaram a existência de elevada indução de HXT1 , HXT2 e HXT3 (genes de transportadores de hexoses de baixa afinidade) nos primeiros 20 minutos após se ter efectuado a inoculação [Brejning et al ., 2003]. Perez e colaboradores (2005) ao analisarem a expressão dos transportadores de hexoses de S. cerevisiae ao longo da fermentação de mosto sintético, verificaram que HXT1 foi expresso apenas no início de fermentação (não tendo qualquer função na fase estacionária), HXT3 foi expresso ao longo do processo fermentativo, no entanto, a quantidade de Hxt3p diminuiu a partir da fase estacionária de crescimento [Perez et al ., 2005]. Estes autores constataram que Hxt2p foi o único transportador que só foi expresso durante a fase de latência (sugerindo que este transportador tem uma função importante no arranque do crescimento), ao passo que Hxt6p e Hxt7p, com perfis de expressão semelhantes, foram expressos a partir do início de fase estacionária [Perez et al ., 2005]. Quando se comparam os gráficos da evolução do ºBrix (Figura 13c) e do consumo de glucose (Figura 14) observa-se que o valor do ºBrix que se atingiu no final de fermentação não foi próximo do nulo, tal como aconteceu face ao teor de glucose quantificado no final de fermentação (Figura 14), na medida em que o ºBrix quantifica, embora de uma forma menos sensível, teores de glucose e frutose, indicando que o seu valor no final de fermentação poderá estar relacionado com a presença de frutose no final de fermentação como açúcar residual, uma vez que S. cerevisiae tem preferência para o consumo de glucose, dando origem a uma discrepância de consumo destas duas hexoses ao longo da fermentação [Berthels et al ., 2004]. É precisamente esta a causa, segundo alguns autores, da ocorrência de doçura indesejável no final de fermentação, uma vez que a frutose tem um carácter mais edulcorante do que a glucose [Lee, 1987; Boulton et al ., 1996]. Para além disso, esta discrepância no consumo de glucose e de frutose provoca baixos rendimentos de produção de etanol e aumenta os riscos de contaminação do vinho resultante [Berthels et al ., 2004; Gafner & Schütz, 1996]. No que diz respeito ao etanol produzido durante a fermentação a 15ºC (Tabela 7, Figura 14), verificou-se que ≈21% foi produzido entre o momento da inoculação (T0) e o final de fase exponencial (T3), ≈27% foi produzido entre o final de fase exponencial (T3) e o início de
49 RESULTADOS E DISCUSSÃO fase estacionária (T4) e mais de 50% de etanol foi produzido após a cultura entrar em fase estacionária (T4), coincidindo com a fase de mai or consumo de glucose.
Tabela 7: Teor de glucose e de etanol em fermentações conduzi das a 15ºC, para os 6 pontos de amostragem escolhidos.
[glucose] % consumo [etanol] % etanol % produção Fase de crescimento (g/L) glucose (g/L) (v/v) etanol Inoculação 96,50 0,00 0,20 0,03 0,27 Início da exponencial 89,54 7,21 1,51 0,19 2,03 Meio da exponencial 81,72 15,32 10,02 1,27 13,49 Final de exponencial 73,46 23,87 16,01 2,03 21,55 Início de estacionária 51,73 46,40 35,70 4,52 48,06 Meio da estacionária 2,87 97,03 51,25 6,49 68,99 Final de fermentação 0,03 99,97 74,29 9,41 100,00
Figura 14: Consumo de glucose e produção de etanol e m S. cerevisiae ISA 1000 ao longo de fermentações de mosto a 15ºC.
Em teoria, se partíssemos do pressuposto de que toda a glucose e frutose seriam convertidas em etanol durante a fermentação teríamos um valor volúmico final teórico de ≈12,4% (v/v) de etanol. No nosso estudo, o teor volúmico em etanol obtido a 15ºC foi de 9,4% (v/v), que possivelmente pode ficar a dever -se, por um lado, à ocorrência de desvios do consumo de glucose para a produção de metabolitos secundários (e.g. glicero l e ácido acético) e, por outro, à possível existê ncia de quantidades residuais de frutose no final de fermentação , tal como anteriormente se referiu. No entanto, o teor final em etanol obtido nos nossos ensaios a 15ºC está de acordo com os valores mencionados n o Anexo II, no que respeita a o título alcoométrico volúmico total dos v.q.p.r.d. (descrito no REG (CE) nº1493/99 Anexo VI-F-nº5) que não pode ser inferior a 9% (v/v) , muito embora, o título alcoométrico volúmico mínimo total seja de 8,5% (v/v) para d eterminados v.q.p.r.d. brancos , constantes de uma lista a aprovar, que não tenham s ofrido qualquer enriquecimento.
50 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Atendendo à metodologia de determinação do etanol (descrita em 2.6. ), é provável que as várias manipulações e os tempos de espera a que as a mostras foram sujeitas (considerando inclusivamente o momento da sua colheita) tenham conduzido a uma evaporação parcial do etanol presente na amostra .
3.1.2. Ensaio preliminar de Saccharomyces cerevisiae ISA 1000 a 30ºC 3.1.2.1. Avaliação de parâmetros de crescimento
Após monitorização do crescimento através d e leitura da D.O. 640nm de amostras colhidas ao longo da fermentação, obteve -se a curva de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 a 30ºC (Figura 15a), determinando -se igualmente o peso seco e o número de células viáv eis, expresso em UFC/mL (Figura 15)
(a)
T4 T5 T3
T2
T1
(b)
Figura 15: Curva de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 em fermentação de mosto a 30ºC. (a) D.O. 640nm e peso seco e (b) D.O. 640nm e UFC/mL. No gráfico (a) estão assinalados os pontos de amostragem escol hidos (círculo laranja).
Nas fermentações a 30ºC , as leituras de D.O. 640nm não permitiram identificar uma fase de latência da cultura, notando -se, por outro lado, uma fase de aceleração nas primeiras 2
51 RESULTADOS E DISCUSSÃO horas após a inoculação. No entanto, nesta fase compreendida entre o momento de inoculação e o início de exponencial, quando se compara a leitura de D.O. 640nm à de UFC/mL, é possível verificar uma diminuição do número de células viáveis, que reduz a população para 1/10 da população inicial, apesar do aumento observado de D.O. 640nm . Constatou-se, portanto, que ocorreu uma perda de viabilidade inicial que poderá ser possivelmente explicada, por um lado, pela modificação da temperatura de crescimento (28ºC no pré-inóculo) para uma temperatura ligeiramente superior (30ºC na fermentação).
Por outro lado, se atendermos ao facto de que a D.O. 640nm contabiliza células totais (mortas e vivas) existentes numa suspensão, enquanto a contagem do número de UFC/mL contabiliza apenas células com capacidade de se multiplicar e formar colónias individualizadas, é possível inferir que o aumento observado da D.O. 640nm possa ter sido o resultado da cultura ter começado a multiplicar-se no início de fermentação, não permitindo a separação das gémulas e células adultas, traduzindo-se num menor número de colónias e, consequentemente, numa contagem inferior de UFC/mL comparativamente à D.O. 640nm lida. Após ultrapassar este período inicial de fermentação, a cultura entrou em fase estacionária ao fim de 24 horas, dando-se o final de fermentação às 71 horas, altura em que se verificou um esgotamento total da glucose (Anexo II). A partir da curva de crescimento obtida a 30ºC e atendendo às razões similares às referidas para a fermentação a 15ºC, definiram-se 5 pontos de amostragem que englobaram o meio da fase exponencial (T1, às ≈5 horas), o final da fase exponencial (T2, às ≈9 horas), o início da fase estacionária (T3, às ≈24 horas), meio da estacionária (T4, às ≈48 horas) e o final da fermentação (T5, às ≈71 horas).
O peso seco acompanhou tal como esperado a D.O. 640nm durante a fermentação a 30ºC (Figura 15a), uma vez que ambos os métodos contabilizam o número total de células. Constatou-se que a população inicial que cresceu a 30ºC sofreu 3 a 4 duplicações durante a fase exponencial de crescimento, atingindo uma D.O. 640nm de ≈ 2,5 no final da mesma fase (Figura 15b). Quando se compara o número de duplicações obtido a 15ºC e a 30ºC, durante a mesma fase de crescimento, constata-se que as 3 a 4 duplicações que as células a 30ºC sofreram repercutiram-se numa fase exponencial de crescimento mais curta, entrando no período de desaceleração mais cedo, comparativamente a 15ºC, onde a fase exponencial foi mais longa, permitindo à população sofrer 6 a 7 duplicações.
3.1.2.2. Avaliação dos parâmetros físico-químicos
À semelhança do que foi efectuado a 15ºC, ao longo da fermentação a 30ºC observaram- se as variações do pH, da massa volúmica, do ºBrix e do teor de glucose e de etanol no mosto.
52 RESULTADOS E DISCUSSÃO
A partir dos dados obtidos ( Figura 16) foi possível observar: (a) o pH do mosto manteve - se relativamen te constante ao longo do pro cesso fermentativo, decrescendo ligeiramente, apenas durante a fase exponencial, o seu valor inicial de 3,0 para 2,8 ; (b) a massa volúmica (mg/mL) do mosto decresceu ao longo da fermentação, partindo de um valor de ≈1058 mg/mL até atingir ≈948 mg/mL, no final de fermentaçã o; (c) o ºBrix diminui u ao longo da fermentação, mais significativamente quando a cultura terminou a fase exponencial e começou a desacelerar para entrar em fase estacionária.
(a) (b )
(c )
Figura 16: Evolução do (a) pH extracelular, da (b) massa volúmica (mg/mL) e do (c) ºBrix do mosto, ao longo de fermentação de S. cerevisiae ISA 1000 em mosto de uva branca a 30ºC.
Os resultados obtidos a 30ºC no que respeita ao pH extracelular confirmam o que fora referi do a 15ºC relativamente ao mosto ser um meio com uma capacidade tampão considerável, que mantém o seu pH relativamente constante durante o processo fermentativo (pH ≈3). Relativamente à variação da massa volúmica, foi interessante verificar que apenas se notou o decréscimo deste parâmetro durante a mesma fase de crescimento para a qual se notou o maior decréscimo no ºBrix, isto é, durante a transição entre o final da fase exponencial e o início da fase estacionária. Atendendo ao que foi mencionado para mesma situação a 15ºC e ao facto da massa volúmica poder essencialmente reflectir a variação que ocorre ao nível do consumo de glucose e consequente formação de etanol e de CO 2, a diminuição da massa volúmica obervada ao longo da fermentação poderá ter como explicação a evaporação do CO 2. Tal como acontecera a 15ºC e tendo em conta o facto deste método utilizado ter inerente um grau elevado de erro , foi curioso verificar que o valor de massa volúmica correspondente ao final de fermentação a 30ºC (9 48 mg/mL) esteve próximo da gam a de valores admissíveis (991 -996 mg/mL) [Ribéreau-Gayon et al ., 2006].
53 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Relativamente aos teores de glucose determinados nas fermentações a 30ºC (Tabela 8, Figura 17), é possível afirmar que ≈20% do seu teor foi consumido entre o momento da inoculação (T0) e o final de fase exponencial (T2), ≈40% foi consumido entre o final da fase exponencial (T2) e o início da fase estacionária (T3) e ≈40% foi consumido a partir do início da fase estacionária (T3). No último ponto de amostragem (T5), as células praticamente esgotaram a glucose presente no meio, considerando-se terminada a fermentação. Tal como se verificou a 15ºC e a 25ºC, a partir de meio da fase estacionária verificou-se um baixo consumo de glucose por parte das células, constatando-se novamente uma possível discrepância entre o consumo de glucose e de frutose, por comparação das Figuras 16c e 17, indicando a possível presença de quantidades residuais de frutose no final de fermentação. No que diz respeito ao etanol produzido durante a fermentação a 30ºC (Tabela 8, Figura 17), verificou-se que ≈11% foi produzido entre o momento da inoculação (T0) e o final de fase exponencial (T2), ≈58% foi produzido entre o final de fase exponencial (T2) e o início de fase estacionária (T3) e ≈31% de etanol foi produzido após a cultura entrar em fase estacionária (T3). A transição entre o final da fase exponencial e o início da fase estacionária a 30ºC foi o período de fermentação onde ocorreu uma grande parte do consumo de glucose ( ≈40%) e a maior parte da produção de etanol ( ≈58%), ao invés do que acontecera a 15ºC, onde estes acontecimentos ocorreram a partir da fase estacionária de crescimento.
Tabela 8: Teor de glucose e de etanol em fermentações conduzidas a 30ºC, para os 6 pontos de amostragem escolhidos.
[glucose] % consumo [etanol] % etanol % produção Fase de crescimento (g/L) glucose (g/L) (v/v) etanol Inoculação 96,50 0,00 0,20 0,03 0,35 Meio da exponencial 83,89 13,06 1,84 0,23 3,27 Final de exponencial 80,41 16,67 6,45 0,82 11,43 Início de estacionária 40,42 45,59 39,16 4,96 69,39 Meio da estacionária 4,26 87,21 43,19 5,47 76,53 Final de fermentação 0,05 93,82 56,44 7,15 100,00
54 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Figura 17: Consumo de glucose e produção de etan ol de S. cerevisiae ISA 1000 ao longo de fermentações de mosto a 30ºC.
Os resultados referentes ao etanol produzido durante as fermentações conduzidas a 15ºC e 30ºC permitiram constatar que a concentração de etanol para a qual a população a 30ºC entrou em fase de crescimento desacelerado (i.e., no período de transição entre as fases exponencial e estacionária de crescimento) foi inferior (6,45g/L de etanol no final de exponencial) à concentração de etanol (16g/L de etanol) que as células a 15ºC tiveram que lidar na fase correspondente . No entanto, é importante referir que estas concentrações são demasiado baixas para serem responsáveis per si pela paragem do crescimento. Tal como aconteceu a 15ºC, é provável que a 30ºC tenha sido subestimado o valor de concentração de etanol que se obteve nos diversos ensaios , tendo em conta a metodologia de determinação do etanol utilizada e a provável ocorrência de desvio s da produção de etanol para a produção de metabolitos secundários. Estes desvios podem explicar o menor rendimento etanol/glucose observado durante a fase estacionária, bem como o baixo teor final em etanol obtido na fermentação a 30ºC ( ≈7,15% (v/v)).
3.2. Avaliação de parâmetros fisiológicos
Existem vários estudos, antigos e recentes, que apontam no sentido d e existirem diferenças fisiológicas significativas entre as células nas várias fases do processo fermentativo, nomeadamente entre as células em crescimento exponencial (primeiras horas de fermentação) e células em fase estacionária [ Rossignol et al ., 2003; Varela et al ., 2005; Rossignol et al ., 2009], estando estas diferenças relacionadas com a sobrevivência das células em condições de concentrações elevadas de etanol e esgotamento de nutrientes como as que se observam a partir de um determinado ponto de fe rmentação vinária [Fleet & Heard, 1993; Bisson, 1999 , Querol et al ., 2003; Zuzuarregui et al ., 2006].
55 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados obtidos nos ensaios preliminares realizados a 15ºC e a 30ºC, em paralelo com os resultados previamente obtidos a 25ºC, apontaram no sentido da manutenção de viabilidade das células nas etapas finais de fermentação, levando a postular a existência de diferenças significativas no comportamento de células ao longo da fermentação, à semelhança do que fora descrito pelos autores acima referidos. Atendendo a este facto, procurou-se estudar o comportamento das células nos vários estádios de fermentação centrando a atenção em aspectos tais como: pH intracelular, capacidade de expulsar H + e permeabilidade passiva aos H +, uma vez que estes aspectos permitem avaliar a capacidade de homeostase protónica da célula, como indicador do seu estado fisiológico e capacidade de sobrevivência nas situações de stresse encontradas.
3.2.1. pH intracelular
Com o intuito de se observar o efeito das alterações que ocorrem ao longo da fermentação vinária no pH intracelular de S. cerevisiae ISA 1000 nas várias fases do processo, procedeu-se à determinação deste parâmetro pelo método descrito por Rottenberg (1979) (secção 2.7.), para células cultivadas a 15ºC e a 30ºC.
3.2.1.1. Em meio K
Tendo em conta que a maioria dos ensaios descritos na literatura para avaliação do pH in foram realizados em condições standard, a 25ºC com estirpes laboratoriais, foi necessário realizar um ensaio preliminar em meio mineral às duas temperaturas. Estes ensaios tiveram como finalidade avaliar o período de incubação mínimo ao fim do qual a forma não dissociada do ácido fraco marcado atingia o equilíbrio, uma vez que as velocidades de difusão passiva do ácido marcado estão directamente dependentes da fluidez de membrana, da constante de difusão da forma não dissociada através da bicamada lipídica e consequentemente da temperatura. Os resultados de estudos prévios realizados a 25ºC com esta estirpe indicaram que, após 90 minutos de incubação, o equilíbrio estabeleceu-se [C. Prista, comunicação pessoal]. Atendendo a estas condicionantes, estabeleceu-se como tempos de incubação:
150 minutos a 15ºC; 90 minutos a 30ºC.
Considerou-se que se atingiu o valor de pH intracelular assim que se verificou um equilíbrio do composto radioactivo nos meios intracelular e extracelular, que correspondeu a uma estabilização dos valores de pH intracelular nos gráficos que o relacionaram com o tempo de incubação do composto radioactivo.
56 RESULTADOS E DISCUSSÃO
O método padrão descrito por Rosenberg (1979) utiliza como ácido fraco marcado o [1 - 14 C] ácido propiónico . Quando se realizaram ensaios preliminares com células de S. cerevisiae ISA 1000 , cultivadas em meio K, utilizando ácido propiónico marcado e se recolheram células ao longo do tempo durante os períodos estabelecidos, observou -se que a 15ºC não foi possível atingir uma condição de equilíbrio entre a quantidade de ácido propiónico não dissociado (AH) no exterior e no interior da célula, isto é, AH ex ≠ AH in para todos os tempos em que se recolheram células, inclusive para um perí odo de tempo significativamente alargado de 350 minutos ( Figura 18). Nestas situações foi possível observar que ocorreu uma alcalinização aparente do meio intracelular relativa mente constante ao longo do tempo .
Figura 18: Valores medidos para pH intracelular de S. cerevisiae ISA 1000, a 15ºC, cultivada em meio K, utilizando [1-14 C] ácido propiónico.
O valor de pH intracelular de S. cerevisiae ISA 1000, cultivada a 15ºC em meio mineral, após 350 minutos de incubação com [1 -14 C] ácido propiónico, foi de de 7, 38, sendo superior aos valores de pH in normalme nte referenciados na literatura ( entre 5,50 e 6,50 [Kresnowati et al ., 2008]). Como tal, após a análise destes resultados, e dado o carácter surpreendente dos mesmos, foi testada a utilização de [1 -14 C] ácido propiónico nos ensaios de determinação do pH intracelular (utilizando a mesma metodologia, a 15ºC e a 30ºC) para a estirpe auxotrófica W-303 de S. cerevisiae , com o objec tivo de se averiguar se tal comportamento era exclusivo da estirpe ISA 1000 ou se, por outro lado, uma estirpe haplóide de referência (W -303), comummente utilizada em ensaios laboratoriais, exibia ou não o mesmo comportamento. Tal como se pode observar através da Figura 19, ao fim de 210 minutos também não foi possível estabelecer-se um equilíbrio , para estirpes laboratoriais, da forma não dissociada do [1-14 C] ácido propiónico nos meios intracelular e extracelular de S. cerevisiae W-303, cultivada em meio K, a 15ºC. No entanto, a alcalinização aparente do meio intracelular observada foi menos acentuada do que a observada para S. cerevisiae ISA 1000, nas mesmas condições (Figura 19 ). Substituindo o [1-14 C] ácido propiónico pelo [7 -14 C] ácido benzóico obteve-se uma maior estabilização do pH in ao longo do tempo, obtendo-se valores inferiores, mais próximos d a gama de valores de pH in normalmente referenciados [Kresnowati et al ., 2008].
57 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Figura 19: pH intracelular de S. cerevisiae W- 303, cultivada em meio K a 15ºC, utilizando [1 - 14 C] ácido propiónico ou [7 -14 C] ácido benzóico. Estão igualmente representados os valores de pH in de S. cerevisiae ISA 1000 cultivada nas mesmas condições.
14 A 30ºC foi possível determinar -se o pH in de S. cerevisiae W-303 utilizando [1- C] ácido propiónico, podendo afirmar-se que se estabeleceu o equilíbrio ao fim de 90 minutos (Figura
20). O valor de pH in determinado com este composto (pH in 6,75 após 90 minutos) encontra - se próximo da gama de valores de pH in normalmente referidos na literatura [Kresnowati et 14 al ., 2008], no entanto a utilização de [7- C] ácido benzóico permitiu obter um valor de pH in dentro do intervalo referido (pH in 6,14 após 90 minutos).
Figura 20: pH intracelular de S. cerevisiae W- 303, cultivada em meio K a 30 ºC, utilizando [1- 14 C] ácido propiónico ou [7-14 C] ácido benzóico.
Perante as evidências de , por um lado, não ter sido possível obter uma es tabilização do pH intracelular, por impossibilidade de estabelecimento de equilíbrio entre a forma não dissociada do composto radioactivo nos me ios extracelular e intracelular, utilizando [1-14 C] ácido propiónico nas determinações realizadas a 15ºC para ambas as estirpes e de, por 14 outro, o pH in determinado com [1 - C] ácido propiónico ter sido muito superior aos valores referidos na literatura, colocou -se a hipótese de estar a ocorrer a 15ºC uma incorporação do ácido propiónico na célula, o que levaria a um aumento de quantidade de ácido fraco determinado nas células filtradas , sem que tal correspondesse efectivamente a um aumento da forma dissociada retida em consequência do desvio do equilíbrio por o meio intracelular ser mais alcalino, conduzindo a uma sobrestimação do valor de pH in . Outro factor que poderá contribuir para a hipótese de incorporação da forma não diss ociada do ácido em membranas incide no facto de se ter obtido uma alcalinização intracelular aparente mais intensa d urante o ensaio em meio mineral a 15ºC, onde foi utilizado [1-14 C] ácido propiónico, comparativamente à acidificação extracelular observada nessas condições (Tabela 16, Anexo VI). A maior intensidade com que se deu a alcalinização intracelular aparente poderá estar relacionada com uma menor dissociação do ácido fraco no interior da célula,
58 RESULTADOS E DISCUSSÃO resultando numa menor acumulação de H + no meio intracelular que , caso ocorresse, acidificaria o meio intracelular ou provocaria a expulsão de H +, com consequente acidificação do meio extracelular. Garantindo que o pKa do ácido propiónico utilizado era superior ao pH extracelular , assegurou-se a predominância da forma não dissociada lipossolúvel do ácido. Esta poderá ser, igualmente, outra das razões pela qual a acidificação extracelular não ocorreu devid o à dissociaçã o do ácido no meio extracelular . Por outro lado, somente garantindo a predominância da forma n ão dissociada do ácido é que seria válido o método descrito por Rottenberg . A observação d a ocorrência de uma alcalinização intracelular mais intensa do que a aci dificação extracelular, poderá , portanto, contituir mais um argumento a favor da ocorrência d e um desvio da forma não dissociada do [1-14 C] ácido propiónico para a sua incorporação em membranas de células incubadas a 15ºC. Com vista a testar se se tratava de um artefacto, realizaram -se ensaios nas mesmas condições, substituindo o ácido propiónico marcado por ácido benzóico marcado para a qual existia a certeza de não ser incorporado em experiências anteriores [M. C. Loureiro -Dias, comunicação pessoal], utilizando a estirpe laboratorial como termo de validação dos resultados.
Os resultados obtidos p ara pH in determinado por este método encontram -se representados nas Figuras 19 e 20, onde se pode verificar que foi possível atingir o equilíbrio ao fim de 150 minutos a 15ºC e 90 minutos a 30ºC. Atend endo a estes resultados optou por se realizar todos os ensaios para determinação 14 do pH in em células recolhidas nas várias fases ao longo de fermentação, utilizando [7- C] ácido benzóico em substituição do [1-14 C] ácido propiónico, recolhendo -se amostras ao longo do tempo de forma a garantir uma situação de eq uilíbrio da forma não dissociada deste ácido entre os meios intra celular e extracelular. Na Figura 21 está descrito o comportamento de S. cerevisiae ISA 1000 cultivada em meio
K, a 15ºC e a 30ºC, relativamente a o pH intracelular. Os valores de pH in obtidos a 15ºC (ao fim de 150 minutos) e a 30ºC (ao fim de 90 minutos) foram, respectivamente, 6,48 e 6,60.
Figura 21: pH intracelular de S. cerevisiae ISA 1000, cultivada em meio K, a 15ºC (curva azul) e a 30ºC (curva vermelha), utilizando [7 -14 C] ácido benzóico. Em abcissa representa -se o tempo de incorporação do [7-14 C] ácido benzóico no ensaio.
59 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.2.1.2. Em m osto estéril
Os resultados obtidos para o pH in de células recolhidas ao longo de fermentação a 15ºC e a 30ºC encontram-se descritos na Tabela 9 e nas Figuras 22 e 23. Tal como foi possível observar, verific ou-se que:
1) Quer a 15ºC, quer a 30ºC ocorreu uma nítida acidificação do meio intracelular à medida que a fermentação foi decorrendo, com maior expressão principalmente nos dois últimos pontos de amostragem a 15ºC;
2) O pH in das células recolhidas nas primeiras fases de fermentação é semelhante para ambas as temperaturas; 3) A 15ºC existiram dois comportamentos nitidamente distintos con forme as fases de
fermentação nas quais as células foram recolhidas, sendo o pH in significativamente mais ácido para as células recolhidas em plena fase estacionária do que o observado para células recolhidas até à entrada desta fase. 4) A 30ºC não foi possível observar os dois comportamentos mencionados para o caso das células cultivadas a 15ºC, uma vez que a acidificação intracelular ao longo do processo fermentativo de células cultivadas a 30ºC decorreu de uma forma mais
moderada do que a 15ºC. Para além disso, o valor de pH in observado para as células de final de fermentação a 30ºC foi superior ao atingido pelas células na mesma fase de crescimento a 15ºC.
Figura 22: Determinação do pH intracelular para as diferentes fases de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 em mosto estéril, a 15ºC, utilizando [7 -14 C] ácido benzóico. Em a bcissa representa -se o tempo de incorporação do [7-14 C] ácido benzóico no ensaio.
60 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Figura 23: pH intracelular para as diferentes fases de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 em mosto estéril, a 30ºC, utilizando [7 -14 C] ácido benzóico. Em abcis sa representa -se o tempo de incorporação do [7-14 C] ácido benzóico no ensaio.
Tabela 9: Valores de pH intracelular de S. cerevisiae ISA 1000 obtidos nos ensaios, para as diferentes fases de crescimento em mosto estéril, a 15ºC e a 30ºC.
Temperaturas Fase de crescimento 15ºC 30ºC Início de aceleração 6,44 - Meio da e xponencial 6,30 6,42 Final de exponencial 6,09 6,22 Início de estacionária 6,09 5,95 Meio da estacionária 5,16 5, 94 Final de fermentação 5,02 5,84
Em meio mineral, o efeito d o etanol no pH intracelular de uma estirpe mutante respiratória de S. cerevisiae , cultivada a 25ºC, foi estudado por Loureiro-Dias e Santos (1990). Neste estudo, estes autores observaram a ocorrência de uma forte acidificação do compartimento citoplasmátic o após a adição de etanol a uma suspensão de células energizadas e desenergizadas. As temperaturas elevadas, em paralelo com outras formas de stresse (ex: etanol), foram identificadas por Piper (1993) como indutoras de um aumento da permeabilidade + membranar a H , provocando um decréscimo do pH in [Piper, 1993]. O declínio do pH in que se observou ao longo das fermentações a 15ºC e a 30ºC , em consonância com o possível aumento do influxo de H +, muitas das vezes associado à perturbação provocada pelo etanol na membrana plasmática [Gurtovenko & Anwar, 2009] , pode estimular a actividade da H +- ATPase membranar, resultando num aumento da expulsão de protões para o exterior das células, como tentativa de stas reagirem face à descida do pH in [Piper, 1993] .
61 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Com o objectivo de se tentar perceber de que forma é que as células incubadas a 15ºC exibiram no final de fermentação um pH in tão baixo (pH in ≈5) e mesmo assim se mantiveram metabolicamente activas, procedeu-se à avaliação das velocidades de efluxo e de influxo de H+ através da membrana plasmática.
3.2.2. Efluxo de H + através da membrana plasmática
A membrana plasmática é um dos principais alvos do etanol nas leveduras (van Uden, 1985). Estudos prévios de alguns autores indicaram que o etanol inibe processos de transporte mediado [Loureiro-Dias & Peinado, 1982; Leão & van Uden, 1984b; Sousa et al ., 1996] e estimula os processos de difusão simples [Leão & van Uden, 1984a; Casal et al ., 1998; Salgueiro et al ., 1988]. Estas alterações na permeabilidade da membrana plasmática podem ser prejudiciais para as células uma vez que limitam a entrada de nutrientes essenciais e promovem a perda de constituintes intracelulares ou a entrada de substâncias extracelulares as quais alteram a composição do citoplasma e, consequentemente, a homeostasia celular. Os protões estão usualmente em concentrações muito elevadas no meio extracelular e as células, nomeadamente as células de levedura, possuem H +-ATPases que mantêm os valores de pH intracelular a níveis compatíveis com a actividade fisiológica e geram força protomotriz através da membrana plasmática. Em 3.2.1. observou-se que o comportamento das células de Saccharomyces cerevisiae ISA 1000, a 15ºC e 30ºC, ao nível do pH intracelular, pode ser influenciado pelo etanol, uma vez que células colhidas nas fases finais de fermentação apresentaram um pH in inferior ao pH in de células de início de fermentação. De forma a serem observadas as alterações que ocorrem ao nível da capacidade de expulsão de H+ através da membrana em células colhidas ao longo da fermentação vinária em S. cerevisiae ISA 1000, principalmente por intermédio da actividade da H +-ATPase membranar, procedeu-se à determinação deste parâmetro através da metodologia descrita na secção 2.9. Sucintamente observou-se o movimento de protões, nas diferentes fases de crescimento, às duas temperaturas testadas (15ºC e 30ºC), através do registo do pH ao longo do tempo de uma suspensão de células desenergizadas, após adição de um pulso de glucose que permitiu verificar uma acidificação do meio extracelular. Iniciou-se o registo a pH 5, constatando-se que a acidificação extracelular ocorreu em todos os casos após a adição de glucose e resultou do balaço da actividade de transportadores de H + (principalmente da H +-ATPase membranar) e do influxo de protões (por difusão passiva de H+ através da membrana plasmática em função do ∆pH existente). Para o cálculo da velocidade de expulsão de protões traçou-se a tangente de cada curva de acidificação (posterior à adição de glucose) e registou-se o declive que, associado a uma calibração (com adição de X nmol de OH -) relaciona variações de pH com quantidades de
62 RESULTADOS E DISCUSSÃO base a dicionadas ao sistema, num determinado instante. Cada ponto representado nos gráficos das velocidades de efluxo de H + constitui a média das velocidade s registadas no ensaio original e na sua repetição.
3.2.2.1. Em m eio K
Par a a execução do primeiro ensaio em meio K, de determinação da velocidade de efluxo protónico de S. cerevisiae ISA 1000 foram utilizadas as condições experimentais descritas na secção 2.3.. Na Figura 24 estão represent adas as velocidades de efluxo de H + (expressas em mmol H+.g -1.h -1) a 15ºC e 30ºC, para S. cerevisiae ISA 1000 cultivada em meio K, utilizando concentrações crescentes de etanol entre 0% e 20% (v/v). Verificou-se que a velocidade de efluxo de H + obtida a 15ºC foi muito menor do que a obtida 30ºC , estando de acordo com as observações de diversos autores [Ahlers, 1981; Viegas et al ., 1995]. As velocidades mais elevadas de efluxo observad as a 30ºC poderiam, em parte, indicar uma tentativa das células reagirem face à d issipação da força protomotriz . A 15ºC a velocidade de expulsão de protões é muito baixa (valores compreendidos entre 0,17 e 0,57 mmol H +.g -1.h -1) e é praticamente insensível a concentrações crescentes de etanol no meio extracelular. A 30ºC observou-se que um aumen to da concentração de etanol provocou uma diminuição da velocidade de efluxo de protões , de tal forma que o valor obtido a 30ºC para 16% (v/v) de etanol (0,63 mmol H +.g -1.h -1) é muito próximo do valor obtido a 15ºC para 0% de etanol (0,57 mmol H +.g -1.h -1). Para além disso, foi possível constatar que o etanol actuou desde concentrações muito baixas na diminuição da velocidade de efluxo de células cultivadas a 30ºC, na medida em que 2% (v/v) de etanol provocou um decréscimo acentuado de 3,81 mmol H+.g-1.h -1 (0% (v/v) etanol) para 1,98 mmol H +.g -1.h -1 (2% (v/v) etanol), continuando a velocidade de efluxo de protões a diminuir de uma forma progressiva, com o aumento da concentração de etanol.
Figura 24: Efluxo de protões atr avés da membrana plasmática de S. cerevisiae ISA 1000, em meio K, a 15ºC (pontos azuis ) e a 30ºC (pontos vermelhos), utilizando diferent es concentrações de etanol no me io extracelular.
Apesar de s e ter constatado que os valores de velocidade de efluxo de H+ a 30ºC foram sempre superiores aos observados a 15ºC, foi possível constatar uma relativa aproximação
63 RESULTADOS E DISCUSSÃO dos valores obtidos às duas temperaturas para 14% (0,49 mmol H +.g -1.h -1 a 15ºC, 0,90 mmol H+.g -1.h -1 a 30ºC) e 16% (v/v) (0,30 mmol H +.g -1.h -1 a 15ºC, 0,63 mmol H +.g -1.h -1 a 30ºC) de etanol, uma vez que a 30ºC já não foi possível determinar o efluxo protónico a 20% (v/v) de etanol, na medida em que o valor de influxo foi superior para este caso, não se observando uma acidificação extracelula r após pulso de glucose.
3.2.2.2. Em m osto estéril
No caso das velocidades de efluxo de protões obtidas nos diferentes ensaios realizados a 15ºC para as diferentes fases de crescimento em mosto, avaliou-se a influência da concentração de etanol, em cada fase de cr escimento, neste parâmetro fisiológico (Figura 25).
Figura 25: Efluxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiae ISA 1000, para as diferentes fases de crescimento em mosto a 15ºC , utilizando diferentes concentrações de etanol no meio extracelular.
Relativamente às células recolhidas ao longo de fermentações conduzidas a 15ºC , foi possível fazer as seguintes observações (Figura 25; Anexo VII):
1) De uma forma geral, as células em fermentações conduzidas a 15ºC expulsa ram + -1 -1 protões a uma ba ixa velocidade (V máx registada = 0,73 mmol H .g .h para o final da fase exponencial, na ausência de etanol). 2) O perfil de velocidades de efluxo protónico em f unção da concentração de etanol observado no início da fase exponencial demonstrou semelhanças com o perfil de velocidades de células colhidas a partir da fase estacionária , quer por apresentar, no início da fase exponencial, velocidades de efluxo relativamente próximas de 0 mmol.g -1.h -1, quer por est as velocidades não terem sofrido oscilações pronunciadas + -1 -1 com o aumento da concentração de etanol (V média ≈ 0,20 mmol H .g .h ).
64 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3) O perfil de velocidades de efluxo de H + para as fases meio e final de exponencial foi algo irregular, no entanto foi possível observar que as velocidades permaneceram relativamente constantes até aos 8% (v/v) (na fase meio da exponencial) e 10% (v/v) (na fase final de exponencial) de etanol, notando-se em ambas as fases um aumento da velocidade de efluxo protónico para a gama de concentrações de etanol de 10% a 12% (v/v). A partir de 14%, igualmente para as duas fases de crescimento, registou- se um decréscimo das velocidades de efluxo protónico. A velocidade máxima de efluxo de H + a 15ºC registou-se para as células em fase final de exponencial, na + -1 -1 ausência de etanol (V máx = 0,73 mmol H .g .h ). Outro facto observado foi o de as velocidades de efluxo protónico destas duas fases terem sido superiores em valor absoluto às velocidades de células colhidas noutros pontos de amostragem pré- definidos. Por outro lado, quando se comparam velocidades de expulsão de H + de células em plena fase exponencial, cultivadas em meio mineral e em mosto, constata-se que em mosto as velocidades são menores do que em meio K a partir de 14% (v/v) de etanol (inclusive), muito embora não tenham sido registadas as velocidades de efluxo de H + de células cultivadas em meio K, para a gama de 2% a 6% (v/v) de etanol, não sendo possível portanto concluir se as velocidades de efluxo protónico nessa gama de concentrações de etanol continuariam a ser superiores em mosto. 4) No início da fase estacionária as velocidades de efluxo de H + decaíram para valores muito próximos de 0 (zero) mmol H +.g -1.h -1, registando-se uma baixa variação de velocidades com o aumento da concentração de etanol. 5) As velocidades de efluxo protónico para as fases finais de fermentação (meio da estacionária e final de fermentação) são as que apresentaram uma menor variação com o aumento da concentração de etanol e as que tiveram um valor inferior ao da velocidade de difusão de H + para o interior da célula.
O etanol apenas teve influência nas velocidades de efluxo protónico das fases meio e final da fase exponencial, observando-se nestas mesmas fases uma diminuição inicial da taxa de efluxo de H + para concentrações baixas de etanol (i.e., para 2% (v/v) etanol) e uma diminuição mais significativa para concentrações superiores a 10% (v/v), muito próximas das concentrações habitualmente encontradas no vinho. A situação observada no final de fermentação, a 15ºC, de velocidades de difusão superiores às de efluxo de H + origina questões acerca de qual (ou quais) o(s) mecanismo(s) fisiológico(s) que está(ão) implícito(s) na perda da capacidade da célula expulsar os protões, mantendo ainda assim a capacidade metabólica.
65 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Nas condições experimentais testadas a 15ºC não foi possível determinar as velocidades de efluxo protónico a 16% (v/v) de etanol para células recolhidas nas fases início e meio de exponencial, uma vez que as velocidades de influxo neste caso foram muito superiores às de efluxo, não tendo sido possível observar uma acidificação extracelular após pulso de glucose.
Figura 26: Efluxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiae ISA 1000, para as diferentes fases de crescimento em mosto a 30 ºC, utilizando diferentes co ncentrações de etanol no meio extracelular.
Relativamente à s células recolhidas ao longo de fermentações conduzidas a 30ºC foi possível fazer as seguintes observações (Figura 26; Anexo VII):
1) Para as fases iniciais de fermentação, que engloba o meio e o final de fase exponencial, o perfil de velocidades de efluxo de H+ foi algo irregular, na medida em que sofreu variações ascendentes e descendentes relativamente pronunciadas com o aumento da concentração de etanol, não obstante terem sido superiores em valor absoluto às velocidades de efluxo protónico de células a partir de meio da fase estacionária de crescimento; 2) Por oposição, e tal como se havia constatado a 15ºC, a variação de velocidades de efluxo protónico é menor para as fases de crescimento a partir d e meio de estacionária; 3) A velocidade máxima de efluxo protónico foi obtida para célula s em plena fase exponencial de crescimento (2,58 mmol.g -1.h -1), na ausência de etanol. Nesta fase de crescimento, a adição de concentrações baixas deste composto (até 4% (v/v)) provocou uma diminuição da velocidade até 1,17 mmol.g -1.h -1, atingindo o valor mínimo para esta fase . A adição de 8% (v/v) de etanol provocou um aumento da velocidade de efluxo protónico até 1,81 mmol.g -1.h -1. De 8% a 14% (v/v) de etanol, foi pequen a a variação de velocidades, indiciando uma relativa estabilização das
66 RESULTADOS E DISCUSSÃO
velocidades para esta gama de concentrações de etanol. Não foi possível obter velocidades para concentrações superiores a 14% (v/v) de etanol, pois observou-se durante a execução destes ensaios que as velocidades de influxo passivo de protões foram superiores às de efluxo de H +. Comparativamente às velocidades de expulsão de H + de células na mesma fase de crescimento, mas cultivadas em meio mineral, constata-se que as células cultivadas em meio K até 6% (v/v) (inclusive) de etanol expulsaram H + a uma velocidade superior relativamente às cultivadas em mosto. A partir de 8% aconteceu precisamente o inverso, pertencendo as velocidades superiores de efluxo de H + às células cultivadas em mosto. 4) As velocidades de efluxo protónico de células em fase final de exponencial foram as que variaram mais o seu perfil com o aumento da concentração de etanol. Tal como o observado para a fase anterior, a adição de concentrações baixas de etanol (até 4% (v/v) inclusive) diminuiu a velocidade de efluxo até 0,72 mmol.g -1.h -1, atingindo novamente o seu valor mínimo para esta fase de crescimento. A adição de 8% (v/v) de etanol provocou um aumento pronunciado da velocidade de efluxo protónico para 2,25 mmol.g -1.h -1 sendo que, para concentrações superiores de etanol (i.e., de 8% a 16% (v/v)), observou-se uma diminuição relativamente constante das velocidades de efluxo atingindo um valor de 0,68 mmol.g -1.h -1, para 16% (v/v) de etanol. Novamente não foi possível obter velocidades para concentrações superiores a 16% (v/v) de etanol pelas mesmas razões acima referidas. 5) Para células em início de fase estacionária a adição de 4% de etanol provocou um ligeiro aumento da velocidade de efluxo, comparativamente com a velocidade obtida na ausência de etanol, atingindo o valor 1,64 mmol.g -1.h -1 que foi máximo para esta fase. A adição de 6% (v/v) de etanol provocou um decréscimo da velocidade de efluxo, sendo que para a gama de concentrações de 8% a 16% (v/v) (inclusive) de etanol foi possível observar uma relativa estabilização das velocidades de efluxo de + -1 -1 H (V média ≈ 0,72 mmol.g .h ). 6) As velocidades de efluxo protónico para as fases finais de fermentação (meio da estacionária e final de fermentação) são as que apresentaram os valores mais baixos, comparativamente com as outras fases, e são as que tiveram uma menor variação com o aumento da concentração de etanol. Apesar disso, foi possível constatar que a adição de 2% e de 4% (v/v) provocou um ligeiro aumento da velocidade de efluxo protónico para as células em plena fase estacionária. A partir de 6% até 20% a velocidade de efluxo protónico de células em plena fase estacionária estabilizou-se nos ≈0,50 mmol.g -1.h -1. Para células em final de fermentação, a velocidade de efluxo protónico foi praticamente constante (≈0,45 mmol.g -1.h -1) para todas as concentrações de etanol testadas.
67 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.2.3. Permeabilidade da membrana ao influxo de protões
Paralelamente às de terminações das velocidades de efluxo protónico, foram realizados ensaios com o intuito de se observarem as alterações que ocorrem ao nível da permeabilidade da membrana plasmática relativamente aos H+, em célula s ao longo do processo de fermentação vinári a. Foram determinadas as velocidades de influxo de H+ para os diferentes pontos de amostragem (definidos em 2.3.6.), às duas temperaturas (15ºC e 30ºC), bem como foi estudada em simultâneo a influência de diferentes concentrações de etanol na permeabilidad e da membrana. A metodologia utilizada está descrita na secção 2.8, no entanto é importante referir que se procedeu ao registo do pH a partir de pH 4. À semelhança do que aconteceu nos ensaios de efluxo de H +, cada ponto representado nos gráficos de permea bilidade de H + constitui a média das velocidades registadas no ensaio original e na sua repetição.
3.2.3.1. Em m eio K
Figura 27: Influxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiae ISA 1000, em meio K a 15ºC (pontos azuis) e a 30ºC (pontos vermelhos) , utilizando diferentes concentrações de etanol no meio extracelular.
A observação da Figura 27 permite constatar que as velocidades de influxo de H + nas células a 30ºC são superiores comparativamente a 15ºC. Este resultado é observável para todas as concentrações de etanol testada s, estando de acordo com o esperado, na medida em que é conhecida a relação entre a temperatura e a difusão passiva de H + através da bicamada lipídica e é conhecido o efeito do etanol no estímulo do influxo passivo de H+ [Jiménez & van Uden, 1985]. Por outro lado, verifica-se que o etanol influenci ou de forma diferente as velocidades de influxo protónico conforme o crescimento tenha sido a 15ºC ou a 30ºC. A 15ºC, embora a variação de velocidade em função da concentração de etano l no geral tenha sido baixa, é notório que houve um ligeiro estímulo de entrada de H + com o aumento da concentração de etanol , enquanto a 30ºC se verificou uma diminui ção do influxo de H + para as mesmas condições .
68 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.2.3.2. Em m osto estéril 3.2.3.2.1. Células suspensas e incubadas em água desmineralizada
Nas Figuras 28 e 29 estão representadas as velocidades de influxo de protões através da membrana plasmática, para diferentes fases de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 em fermentações vinárias conduzidas a 15ºC e a 30ºC, respectivamente.
Figura 28: Influxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiae ISA 1000, para as diferentes fases de crescimento em mosto a 15ºC , utilizando diferentes concentrações de etanol no meio extracelular.
Relativamente às células recolhidas ao longo de fermentações conduzidas a 15ºC foi possível fazer as seguintes observações (Figura 28; Anexo VIII):
1) Para as fases iniciais de fermentação, incluindo o final d a fase exponencial, o perfil de velocidades de influxo de H + variou consoante a concentração de etanol adicionada à suspensão de células , no entanto, de uma forma geral as velocidades de influxo de H + foram superiores em valor absoluto às velocidades de células a partir de meio da fase estacionária de crescimento; 2) As fases início e meio de exponencial demonstraram ter um perfil de velocidades semelhante, no entanto é possível afirmar que, apesar das pequenas oscilações observadas em função da concentração de etanol no meio extracelular, se verificou uma relativa estabiliza ção do influxo protónico no início da fase exponencial a uma -1 -1 Vmédia ≈ 0,24 mmol.g .h , enquanto no caso das células em plena fase exponencial o influxo aumentou substancialmente a 20% (v/v) de etanol; 3) A fase final de exponencial foi a que demonstrou sofrer maiores oscilações nas velocidades de influxo de H + perante concentrações crescentes de etanol no meio extracelular , muito embora estas oscilações tenham demonstrado no geral uma tendência de aumento da velocidade de influxo de H +, com o aumento da concentração de etanol;
69 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4) As velocidades de influxo protónico de células e m início de fase estacionária foram muito próximas de 0 (zero) mmol.g -1.h -1, independentemente da concentração de etanol no meio extracelular. 5) Nas fases finais de fermentação (meio da estacionária e final de fermentação) as velocidades de influxo protónic o medidas foram nulas para todas as concentrações de etanol testadas.
Figura 29: Influxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiae ISA 1000, para as diferentes fases de crescimento em mosto a 30ºC , utilizando diferentes concentraçõe s de etanol no meio extracelular.
Relativamente às células recolhidas ao longo de fermentações conduzidas a 30ºC foi possível fazer as seguintes observações (Figura 29; Anexo VIII):
1) Durante a fase exponencial e o início de fase estacionária de crescimento as velocidades de influxo de H + sofreram oscilações consoante a concentração de etanol adicionada à suspensão de células, no entanto, foi possível constatar que foram superiores em valor absoluto às velocidades de células a partir de meio da fase estacioná ria de crescimento; 2) Relativamente à fase exponencial, foi possível observar que as células em plena fase exponencial mantiveram relativamente constantes as suas velocidades até à -1 -1 concentração de 16% (v/v) de etanol (V média ≈ 0,55 mmol.g .h ), aumentando a velocidade de influxo para concentrações superiores deste composto. Por comparação, as células nas fases final de exponencial e início de estacionária viram aumentadas as suas velocidades de influxo protónico para concent rações superiores a 14% e 18% (v/v) de etanol , respectivamente. A fase final de exponencial foi a que, de uma forma geral, demonstrou ter velocidades de influxo protónico superiores às das restantes fases;
70 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3) As velocidades de influxo protónico de células colhidas das fases finais de fermentação (meio da estacionária e final de fermentação) foram muito próximas de 0 (zero) mmol.g -1.h -1, independentemente da concentração de etanol no meio extracelular.
3.2.3.2.2. Células suspensas e incubadas em tampões
As constatações retiradas dos ensaios de efluxo de H +, onde especificamente foi possível verificar que S. cerevisiae ISA 1000 apresentou velocidades de efluxo muito próximas de zero em todas as fases de crescimento a 15ºC (onde inclusivamente a partir de meio da fase estacionária as velocidades de efluxo de H + observadas foram inferiores às de influxo - Figura 25) e dos ensaios de influxo de H + a 15ºC, onde as velocidades obtidas para as células colhidas e ressuspendidas em água desmineralizada a partir de fase estacionária foram nulas (Figura 28), independentemente da concentração de etanol adicionada ao meio extracelular, despoletou a necessidade de se procurar entender este comportamento peculiar das células, uma vez que todas estas observações indiciaram uma possível impermeabilização da membrana plasmática das células nas fases finais de fermentação a 15ºC e a 30ºC. A hipótese do pH interno de células colhidas a partir de meio da fase estacionária a 15ºC ser inferior ao pH extracelular poderia justificar as baixas velocidades de efluxo e a baixa permeabilidade observadas nesta fase por distúrbios que o pH interno estivesse a provocar nas componentes da força protomotriz ( ∆pH e ∆ψ ). Houve, então, a necessidade de se proceder a novas determinações de velocidades de influxo protónico, neste caso utilizando soluções tamponizadas (Tris 10mM citrato) a pH 5 (valor de pH que já garantia um ∆pH) e a pH 6,3 (valor de pH de células “saudáveis” no vaso reactor do ensaio) como meio de suspensão e de incubação das células, de forma a garantir que a causa da ocorrência de velocidades muito baixas de efluxo e de influxo protónico de células colhidas a partir de meio da fase estacionária não seria devido à ausência de ∆pH, mas à possibilidade de impermeabilização das células nesta fase de crescimento. Perante os resultados evidenciados através das Figuras 30 e 31 foi possível confirmar que as baixas velocidades de influxo protónico corresponderam efectivamente a uma permeabilidade a H + extremamente baixa de células em plena fase estacionária, cultivadas a 15ºC e a 30ºC, muito embora se tenha observado através da Figura 30 que as células a 15ºC evidenciaram uma permeabilidade que demonstrou ser ainda inferior (quase nula) à de células cultivadas a 30ºC (Figura 31).
71 RESULTADOS E DISCUSSÃO
(a) (b)
Figura 30: Influxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiae ISA 1000, em fermentações de mosto a 15ºC , após ressuspensão e incubação das suspensões de células em água (pont os azuis), Tris 10mM citrato pH 5 (pontos ve rmelhos) e Tris 10mM citrato pH 6,3, utilizando diferentes concentrações de etanol no meio extracelular, para as fases (a) meio da estacionária e (b) final de fermentação.
(a) (b)
Figura 31: Influxo de protões através da membrana plasmática de S. cerevisiae ISA 1000, em fermentações de mosto a 30ºC , após ressuspensão e incubação das suspensões de células em água (pontos azuis), Tris 10mM citrato pH 5 (pontos vermelhos) e Tris 10mM citrato pH 6,3, utilizando diferentes concentrações de etanol no meio extracelular, para as fases (a) meio da est acionária e (b) final de fermentação.
3.3. Discussão Geral
Foi pretendido com este trabalho estudar o efeito conjugado do etanol e da temperatura no s aspectos relacionados com a homeostase protónica de células ao longo da fermentação vinária realizada a 15ºC e a 30ºC por Saccharomyces cerevisiae ISA 1000 . Ao contrário da maioria dos estudos realizados ant eriormente sobre este tema , procurou- se com este trabalho aproximar tanto quanto possível as condições de estudo das condições em que normalmente são realizad as as fermentações em adega, procurando simular esta situação em laboratório atendendo às diferenças descritas por vários autores entre: 1) estirpes industriais vs estirpes laboratoriais [Pizarro et al ., 2007 ] e 2) condições laboratoriais vs condições de a dega [Pretorius, 2000]. Para tal, utilizou -se: 1) uma estirpe vínica de S. cerevisiae , isolada a partir de um fermento comercial liofilizado (FERMIVIN ®), 2) mosto de uva branca, que sofreu previamente os habituais tratamentos em adega, 3) condições de frac a agitação e 4) temperaturas a que normalmente são produzido os vinhos tintos (30ºC) e os vinhos brancos (15ºC). Estas condições descritas permitiram aproximar as condições de estudo das condições de adega, onde normalmente são utilizadas cubas sem
72 RESULTADOS E DISCUSSÃO agitação e sem arejamento (atingindo-se rapidamente condições de semi-anaerobiose) e onde frequentemente se utilizam pré-inóculos de leveduras liofilizadas com 1 x10 6 células/mL de mosto. O estabelecimento de pontos de amostragem às duas temperaturas de estudo, com base nos pontos escolhidos a partir do estudo de Rossignol e colaboradores (2003), permitiu-nos monitorizar de uma forma mais eficiente os diversos ensaios realizados a 15ºC e a 30ºC e avaliar as diferenças de comportamento da estirpe em vários aspectos de homeostase protónica. Atendendo às curvas de crescimento obtidas a 15ºC e a 30ºC, facilmente se pôde constatar que a temperatura demonstrou ser, de facto, um dos factores principais que influenciam as fermentações vinárias, pois o seu efeito fez-se sentir nos diferentes aspectos da fisiologia da levedura estudados. A utilização de temperatura baixa de crescimento provocou, tal como esperado, a diminuição da taxa específica de crescimento da estirpe e da taxa de fermentação, aumentando a duração do período de fermentação do mosto de uva branca (≈304h), comparativamente ao obtido a 30ºC ( ≈71h), à semelhança dos resultados obtidos por diversos autores em fermentações realizadas em mosto sintético [Torija et al ., 2003a; Torija et al ., 2003b, Novo et al ., 2003]. O rendimento em biomassa (g biomassa /mol glucose ) foi mais elevado a 30ºC (≈114g biomassa /mol glucose ) durante a fase exponencial de crescimento, comparativamente a 15ºC ( ≈87g biomassa /mol glucose ), podendo este resultado estar relacionado com (1) uma maior taxa específica de transferência de glucose obtida a 30ºC -1 -1 - (≈5,24mmol glucose .g biomassa .h ), comparativamente à obtida a 15ºC ( ≈1,25mmol glucose .g 1 -1 biomassa .h ) durante a fase exponencial de crescimento, o que significa que a esta temperatura houve uma maior quantidade de glucose mobilizada por quantidade de biomassa formada durante a fase exponencial e com (2) a diminuição de expressão de HXT1 (gene que codifica para transportador de hexoses de baixa afinidade, normalmente expresso durante a fase exponencial de crescimento), observada por Pizarro e colaboradores (2008) em fermentações de mosto sintético a 15ºC [Pizarro et al ., 2008], pressupondo que o mesmo se verifica em mosto real. A concentração final de etanol obtida a 30ºC foi mais baixa comparativamente à concentração obtida a 15ºC, confirmando as observações de diversos autores de ocorrência de uma menor produção de etanol para temperaturas altas de fermentação [Casey & Ingledew, 1986]. A possível explicação para este resultado poderá estar relacionada com o aumento da quantidade de produtos de outras vias metabólicas (e.g. acido acético e glicerol), durante a fermentação a 30ºC, que perturbam o metabolismo da levedura e conduzem a rendimentos mais baixos em etanol [Torija et al ., 2003a; Pizarro et al., 2008].
73 RESULTADOS E DISCUSSÃO
No período que comprende o final da fase exponencial e o início da fase estacionária de fermentações conduzidas a 30ºC ocorreu um resultado interessante referente ao consumo de glucose e produção de etanol. Durante este período foi consumido ≈40% da glucose e foi produzido ≈58% do etanol, indiciando que a transição entre estas fases teve uma importância acrescida nas fermentações a 30ºC. Até à data não são conhecidos estudos que tenham referido este comportamento das células neste período de desaceleração entre as fases final de exponencial e início de estacionária, deixando a questão em aberto. Para além do efeito conjugado do etanol e da temperatura mais pronunciado em fermentações conduzidas a 30ºC, existem outros factores que podem igualmente ter actuado no aumento da sensibilidade de células de levedura que se encontraram à entrada de fase estacionária, tais como: (1) baixa disponibilidade em O 2 e consequente implicação na biossíntese de ergosterol e (2) acção conjunta do etanol e ácidos fracos. A baixa disponibilidade de O 2 é particularmente relevante nas fermentações decorridas a 30ºC, uma vez que a solubilidade do O 2 é menor, quanto maior for a temperatura, razão pela qual a condição de anaerobiose é atingida mais cedo nas fermentações a 30ºC. Uma vez atingida esta condição, deixa de ocorrer a síntese de ergosterol, sendo comprometidas a biossíntese de membranas e o processo de gemulação e as células iniciam o seu processo de entrada em fase estacionária. Relativamente à acção conjunta do etanol e dos ácidos fracos, apesar de não se ter efectuado a quantificação de ácido acético neste estudo, se tivermos em consideração os resultados de Torija e colaboradores (2003b), onde foi referida uma maior produção de ácido acético a temperaturas mais altas de fermentação, podemos pressupor que a 30ºC o teor deste composto vai sendo superior ao longo das diferentes fases de fermentação a esta temperatura, comparativamente a 15ºC, razão pela qual o efeito sinérgico do etanol/ácido acético não poderá ser desprezado nas fermentações a 30ºC, onde possivelmente poderá ocorrer a acumulação intracelular da forma dissociada do ácido, perturbando o metabolismo e o crescimento das células em fase exponencial. Neste trabalho foi utilizada uma metodologia de “reavivamento” das células (prévia à inoculação) diferente da usual na indústria vínica, onde é feita comummente a rehidratação das leveduras liofilizadas comerciais em água a ≈38ºC para se proceder posteriormente à inoculação. O perfil de viabilidade (considerando apenas a leitura de UFC/mL) demonstrado pelas células a 15ºC e a 30ºC permitiu destacar dois períodos críticos: o início e o final de fermentação. No período inicial de fermentação constatou-se que houve um decréscimo da população viável face à população inicialmente inoculada (i.e., 1 x10 6 células/mL) para as duas temperaturas de estudo. No entanto, esse decréscimo foi mais evidente a 30ºC, uma vez que nas primeiras 2 horas de fermentação se observou uma redução de 1/10 da população inicial. Se atendermos a que as células em plena fase exponencial, provenientes de um pré-inóculo em mosto a 28ºC, foram inoculadas em 800 mL de mosto estéril a 30ºC,
74 RESULTADOS E DISCUSSÃO temos pelo menos 3 factores que podem ter actuado de uma forma sinérgica na redução da população viável inicial: (1) stresse provocado pela diluição efectuada à população proveniente do pré-inóculo, (2) aumento, pequeno mas significativo, da temperatura de crescimento, que possivelmente a aproximou da temperatura de morte térmica [van Uden, 1984] e (3) estado fisiológico das células no pré-inóculo, na medida em que as células em fase exponencial, mais sensíveis ao stresse [Mager & Varela, 1993], encontravam-se na presença de etanol quando foram colhidas. Como foi comprovado que qualquer aumento da temperatura de crescimento, mesmo que seja de pequena amplitude, pode provocar um distúrbio muito superior no crescimento das células, quando comparado com um abaixamento da temperatura de crescimento [van Uden, 1984], este aspecto terá de ser tido em consideração no procedimento de fermentação vinária em adega, uma vez que é frequente nestes casos a subida de temperatura do mosto para valores acima dos 30ºC, o que poderá conduzir a paragens prematuras de fermentação. Em condições de temperatura controlada, como foi o caso dos ensaios apresentados, a temperatura não funcionou per si na diminuição acentuada da população viável observada a 30ºC, uma vez que se observou a manutenção da viabilidade celular durante todo o processo fermentativo. Outros factores, tais como o efeito de diluição, a maior sensibilidade das células em fase exponencial de crescimento, o baixo pH extracelular e a presença de SO 2 e de resíduos de pesticidas [Querol et al ., 2003; Zuzuarregui & del Olmo, 2004], têm de ser igualmente tidos em consideração, pois provavelmente actuaram, de uma forma sinérgica, na criação de um ambiente inicial mais adverso para a população que provinha do pré-inoculo a 28ºC. No final de fermentação, quer a 15ºC, quer a 30ºC, foi possível constatar que a população viável acompanhou as leituras de D.O. 640nm , indicando que as células se mantiveram viáveis até esgotarem a glucose. As temperaturas 15ºC e 30ºC de crescimento não demonstraram ser suficientemente nefastas para, em paralelo com outros os factores anteriormente mencionados presentes no final de fermentação, serem capazes de criar um meio inóspito para a manutenção da população viável até ao final de fermentação. Ensaios realizados em paralelo, para os quais foi prolongado o período de recolha de pontos para além do final de fermentação, possibilitaram a observação de diminuição da viabilidade quer a 15ºC, quer a 30ºC [V. Salvador, comunicação pessoal]. O estudo de Pizarro e colaboradores (2008) revelou que os factores maioritariamente afectados pelas temperaturas sub-óptimas de crescimento são o processamento de RNA, o metabolismo da trealose e a resposta ao stresse [Pizarro et al ., 2008]. Por outro lado, a perda de viabilidade a 30ºC poderá estar relacionada com as perturbações celulares provocadas pelo efeito conjunto do etanol e da temperatura [van Uden, 1984; Casey et al ., 1984]: (1) alteração da estrutura da membrana plasmática [Walton & Pringle, 1980; Lucero et al ., 2000] e consequente aumento de fluidez da membrana [Ingram & Buttke, 1984], perda de
75 RESULTADOS E DISCUSSÃO integridade membranar (que afecta uma série de sistemas de transporte de solutos [Leão & van Uden, 1984a,b]) e aumento de permeabilidade passiva a iões e a pequenos metabolitos [Quintas et al., 2000], (2) diminuição da síntese proteica [Warner & Gorenstein, 1977; Hinnebusch, 2005], (3) formação de uma fase interdigitada na camada lipídica, criando zonas mais permeáveis a moléculas polares e a iões [Gurtovenko & Anwar, 2009], (4) dissipação do gradiente de protões, repercutindo-se na inibição da actividade da H +-ATPase membranar [Cartwright et al ., 1987] e no estímulo de influxo passivo de H + [Salgueiro et al ., 1988; van Uden, 1985] e (5) actuação sinérgica do etanol e do ácido acético [Pampulha & Loureiro-Dias, 1989]. Como o intuito de avaliar a capacidade de homeostase protónica das células e inferir sobre o seu estado fisiológico e a sua capacidade de sobrevivência nas diferentes situações de stresse ao longo da fermentação, centrou-se o estudo nos seguintes aspectos: pH intracelular, efluxo de H+ e permeabilidade passiva a H +.
Os resultados obtidos a partir dos ensaios preliminares de determinação do pH in de S. cerevisiae ISA 1000 e de S. cerevisiae W-303, em meio mineral a 15ºC, com utilização de [1-14 C] ácido propiónico, permitiram colocar a hipótese de estar a ocorrer uma incorporação da forma não dissociada do ácido fraco na membrana plasmática da célula a esta temperatura de crescimento. Se atendermos a que, por um lado, os ácidos gordos constituintes da membrana plasmática se tornam mais insaturados à medida que a temperatura de crescimento diminui [Watson, 1987] e por outro, os ácidos gordos de cadeia curta têm um efeito similar, em termos físicos, na membrana plasmática ao de uma dupla ligação de um ácido gordo de cadeia longa [Quinn & Chapman, 1980], a hipótese colocada de incorporação de ácido propiónico poderá fazer sentido numa perspectiva da célula aumentar a fluidez da sua membrana plasmática, permitindo a manutenção da actividade das proteínas constituintes da membrana, assim como os transportes membranares associados. Verificou-se igualmente, a partir das determinações do pH in , a ocorrência de acidificação intracelular ao longo das fermentações conduzidas a ambas as temperaturas, estando de acordo com as observações de alguns autores, que constataram que o etanol aumenta a permeabilidade da membrana plasmática ao influxo passivo de protões [Leão & van Uden, 1984a; Salgueiro et al ., 1988; van Uden, 1985] e pode inibir a actividade da H +- ATPase membranar [Cartwright et al ., 1987], resultando num aumento da concentração de protões no citoplasma. No entanto, é importante ressalvar que, no caso específico das determinações de pH in efectuadas neste trabalho, os ensaios foram realizados com células recolhidas directamente do mosto e sujeitas a situações de stresse inerentes ao próprio mosto. Como tal, o stresse provocado pelo etanol aplica-se, neste caso, à quantidade de composto formado durante a fermentação. Foi curioso ter observado a 15ºC que as células colhidas a meio da fase estacionária e no final de fermentação se mantiveram viáveis e
76 RESULTADOS E DISCUSSÃO
metabolicamente activas, apresentando valores de pHin muito baixos (pH in ≈5,00). Até à data, não se encontraram estudos que expliquem este comportamento das células observado no final de fermentação, apenas se pode acrescentar que a manutenção da viabilidade não está relacionada com a substituição de células mortas por novas células, uma vez que a observação ao microscópio confirmou que as células não se encontram a gemular nesta fase de fermentação. + Como o pH in está associado à concentração de H no citoplasma, era importante verificar os fluxos membranares, avaliando o efluxo e o influxo de H + nas diferentes fases de fermentação a 15ºC e a 30ºC. Os resultados referentes ao efluxo de H + demonstraram que a 30ºC a expulsão de protões foi superior à de 15ºC em todas as fases de fermentação, tanto em meio mineral, como em mosto, estando de acordo com as observações de vários autores [Ahlers, 1981;
Viegas et al ., 1995]. Este resultado poderá constituir uma explicação para o pH in obtido no final de fermentação a 30ºC ter sido mais alto ao homólogo obtido a 15ºC, garantindo a 30ºC uma menor acumulação de H+ no citoplasma. Constatou-se igualmente que baixas concentrações de etanol tiveram efeito na redução do efluxo a 30ºC, o que possivelmente poderá estar relacionado com a ocorrência de inibição, a 30ºC, da actividade da H +-ATPase membranar promovida pelo etanol [Cartwright et al ., 1987]. Por outro lado, foi possível observar, tanto a 15ºC, como a 30ºC, que as velocidades máximas de efluxo protónico foram atingidas em células colhidas durante a fase exponencial, que se encontram metabolicamente mais activas. Os resultados obtidos em meio mineral e em mosto, referentes à medição da permeabilidade a H+ da membrana plasmática, revelaram a ocorrência de um maior influxo de H + a 30ºC, estando de acordo com os estudos de diversos autores, que explicaram a ocorrência de maior permebilidade da membrana plasmática, com base no efeito sinérgico do etanol e da temperatura [Ingram & Buttke, 1984; Quintas et al ., 2000]. A constatação da ocorrência de velocidades muito baixas de influxo e de efluxo de H +, a 15ºC e a 30ºC, obtidas em células no final de fermentação, levou a colocar a hipótese de o pH interno ser inferior ao pH externo de células lavadas e ressuspendidas em água desmineralizada, no período que precede este tipo de ensaios. O possível distúrbio nas componentes da força protomotriz que o pH interno estivesse a provocar, justificaria as velocidades baixas de efluxo e de influxo obtidas. No entanto, os resultados obtidos nos ensaios posteriores de determinação do influxo protónico, onde foram utilizadas duas soluções tampão, a pH’s que garantissem a existência de ∆pH, permitiram concluir que as baixas velocidades de influxo protónico obtidas em células nas fases finais de fermentação corresponderam a uma permeabilidade extremamente baixa a H +.
77 RESULTADOS E DISCUSSÃO
O presente trabalho cumpriu com os objectivos propostos permitindo, por um lado, sustentar a hipótese defendida por vários autores de que existem diferenças significativas nos resultados obtidos quando se utilizam (1) condições laboratoriais e condições de adega e (2) estirpes laboratoriais e estirpes industriais. Por outro lado, este trabalho permitiu constatar que as células nas fases finais de fermentação a 15ºC são fisiologicamente diferentes das células presentes noutras fases, pois permanecem metabolicamente activas e viáveis até à conclusão do processo fermentativo por esgotamento da glucose, apesar de + + apresentarem baixo pH in , baixo efluxo de H e permeabilidade a H muito baixa.
78 CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS FUTUTRAS
4. CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS FUTURAS
Durante a fermentação vinária, as leveduras são submetidas a uma diversidade de situações de stresse. O estado fisiológico das células sofre alterações significativas, tornando as células em fase estacionária fisiologicamente muito diferentes das células nas primeiras fases de fermentação. Diversos autores têm referido que o etanol afecta aspectos chave da fisiologia de leveduras comprometendo, em condições laboratoriais, os principais sistemas de transporte membranar [van de Mortel et al ., 1988], reduzindo a actividade metabólica [Martini et al ., 2004] e induzindo mecanismos apoptóticos e de morte celular [Kitagakia et al ., 2007]. Apesar do mecanismo de toxicidade do etanol ser complexo, tudo indica que o principal alvo deste tipo de stresse seja a membrana plasmática [D’Amore et al ., 1990]. Como consequência desta situação tem-se um aumento da fluidez da membrana e um decréscimo na integridade da sua estrutura [Gurtovenko & Anwar, 2009], acompanhado de um aumento da permeabilidade [Leão & van Uden, 1984a] e dos processos de difusão não-mediada [Henriques et a l., 1997]. Recentemente têm sido feitos esforços no sentido de identificar genes específicos responsáveis pela tolerância ao etanol e a outros factores de stresse existentes nas fermentações vinárias [Dinh et al ., 2009; Zhao & Bai, 2009]. Alguns autores têm referido que a expressão mais elevada ou mais reduzida de diversos genes pode possivelmente estar relacionada com: (1) diversas vias regulatórias (e.g. HOG e TOR) [Hayashi & Maeda, 2006; Rossignol et al ., 2003], (2) função e transporte vacuolar [Teixeira et al ., 2009], (3) biossíntese da membrana plasmática e da parede celular [Lei et al ., 2007] e (4) homeostase iónica [Alexandre et al ., 2001]. Apesar do carácter extensivo das análises genómicas, os seus resultados normalmente põem em evidência a complexidade da resposta celular ao stresse [Marks et al ., 2008; Garay-Arroyo et al ., 2004], originando novas linhas de investigação para estudos mais aprofundados do seu significado fisiológico. Embora tenham sido realizados alguns estudos relacionando o etanol e outros factores de stresse, onde foi destacada a importância do estado fisiológico da célula [Loureiro & van Uden, 1986], a maioria dos estudos têm sido realizados com utilização de células em fase exponencial de crescimento, não existindo até à data estudos suficientes dedicados às células em fase estacionária [Yoshikawa et al ., 2009]. Nesse sentido, este trabalho realizado no âmbito da dissertação de Mestrado permitiu constatar que as células de S. cerevisiae que se encontravam nas fases finais de fermentação exibiram um comportamento fisiológico peculiar, pois não só foram capazes de manter a sua actividade metabólica, como apresentaram igualmente capacidade de sobreviver face às condições de stresse existentes e características dessas fases.
79 CONSIDERAÇÕES FINAIS E PERSPECTIVAS FUTUTRAS
No entanto, certamente que muitas questões ficaram por esclarecer. Numa primeira análise, ficou por se determinar e identificar os lípidos de membrana, com o objectivo de testar a validade da hipótese de incorporação de [1-14 C] ácido propiónico em membranas, bem como, noutra perspectiva, os níveis de oxigénio e azoto e controlar a produção de metabolitos secundários nos diferentes pontos de amostragem ao longo da fermentação. A médio/longo prazo seria particularmente importante “descodificar” os mecanismos responsáveis pela sobrevivência e manutenção da capacidade fermentativa de células nas fases finais de fermentação e atribuir-se uma função às vias regulatórias responsáveis pela aquisição deste carácter resistente das células. Como forma de atingir este objectivo, poderia começar por se fazer uma selecção de estirpes com mutações em determinados genes que estivessem envolvidos em diversas vias celulares (e.g. vias HOG e TOR, biossíntese de membrana e de parede celular, homeostase protónica), avaliando a capacidade das estirpes conduzirem a fermentação e permanecerem viáveis até ao final de fermentação de mosto sintético a 25ºC. Com estas estirpes seleccionadas, sob condições que simulassem tanto quanto possível as fermentações vinárias, proceder-se-ia a uma caracterização fisiológica e bioenergética, avaliando a tolerância ao etanol, o desempenho fermentativo (sob diferentes concentrações de etanol, de H+ e de ácido acético), o teor em ATP, trealose e glicogénio, o pH intracelular, a capacidade tampão do meio intracelular e o pKa intracelular de populações de células e de células individualizadas, o efluxo e o influxo de protões, a viabilidade (incluindo medições dos indicadores de apoptose e de necrose) e a actividade metabólica. Posteriormente, poder-se-ia construir e caracterizar um número reduzido de estirpes que seriam seleccionadas para sobre-expressar genes específicos. As que apresentassem o melhor desempenho fermentativo iriam, por fim, ser testadas em mosto de uva, simulando as condições reais de adega. O conhecimento dos mecanismos moleculares de sobrevivência responsáveis pela homeostase protónica, durante as fases finais de fermentação, contribuiria para o desenvolvimento de estirpes vínicas mais robustas que tornariam o processo fermentativo mais eficiente, diminuindo o tempo de fermentação e a ocorrência de fermentações amuadas, melhorando consequentemente a qualidade do vinho.
80 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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98 ANEXOS
ANEXO I
. Tabela 10: Características técnicas da preparação comercial de levedura seca activa para vinificação FERMIVIN ®
FERMIVIN ® é uma preparação comercial de levedura que se Aplicação responsabiliza pelo processo de fermentação de qualquer tipo de vinho.
Cinéticas de Curta fase de latência e crescimento rápido. fermentação
Rendimento 16,5 g de açúcar para 1% álcool. açúcar/álcool
Temperaturas óptimas: 15 – 35ºC
Tolerância ao álcool: 14% em condições standard e Características 16% na presença de nutrientes (incluindo azoto). técnicas Resistência ao SO 2 livre: 50 mg/L.
Baixa produção de espuma.
Qualidades do Média de produção de glicerol: 6 – 8 g/L. starter para Baixa produção de acidez volátil (< 0,15 g/L). vinificação Características Baixa produção de acetaldeído (< 20 mg/L). metabólicas
Baixa produção de H 2S.
Baixa produção de SO 2 (< 10 mg/L).
Baixa produção de álcoois superiores.
Degrada parcialmente o ácido málico (20 a 30%),
Outras estimulando o arranque da “fermentação” características maloláctica.
Boa capacidade de fermentar mosto clarificado.
Fenótipo: neutro ao factor killer .
99 ANEXOS
ANEXO II
Tabela 11: Títulos alcoométricos de vinhos, expressos em % (v/v) (informação recolhida a partir de uma página web do Instituto da Vinha e do Vinho - http://www.ivv.min-agricultura.pt/np4/89, 07/10/09)
Título alcoométrico Bebida alcoólica Referências %(v/v)
Vinhos adquirido vinhos de mesa > 9 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo I-nº13 vinhos espumantes > 9,5 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo V-H-nº11 c) v.e.q. do tipo aromático > 6 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo V-I-nº3 d) v.e.q.p.r.d. do tipo aromático > 6 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo VI-K-nº10 d) v.e.q.p.r.d. > 10 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo VI-K-nº4 vinhos licorosos > 15 e < 22 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo I-nº14-A v.l.q.p.r.d. > 15 e < 22 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo VI-L-nº3 b) vinhos frisantes > 7 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo I - nº17 vinho frisante gaseificado > 7 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo I - nº18 vinhos aguardentados > 18 e < 24 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo I - nº23 vinhos de uvas sobreamadurecidas > 12 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo I - nº24 total vinho de mesa < 15 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo I - nº13 v.q.p.r.d., v.e.q.p.r.d. > 9 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo VI-F-nº5 v.l.q.p.r.d. > 17,5 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo VI-L-nº3 c) vinho frisante > 9 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo I-nº17 vinho frisante gaseificado > 9 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo I-nº18 vinho de uvas sobreamadurecidas > 16 REG (CE) Nº 1493/99 Anexo I - nº24 Bebidas espirituosas aguardente vínica > 37,5 REG (CEE) Nº 1576/89 Artº 3-nº1 aguardente bagaceira > 37,5 REG (CEE) Nº 1576/89 Artº 3-nº1 brandy > 36,0 REG (CEE) Nº 1576/89 Artº 3-nº1
100 ANEXOS
ANEXO III
Para a preparação do meio K, descrito por van Uden (1967), utilizaram-se as seguintes soluções:
(a) Meio base:
(NH 4)2SO 4 0,50% (p/v)
KH 2PO 4 0,50% (p/v)
MgSO 4.7H 2O 0,05% (p/v)
CaCl 2.2H 2O 0,015% (p/v)
em 900 mL de água desmineralizada
Acertou-se o pH do meio a 4,5, utilizando pastilhas de NaOH. Esterilizou-se por autoclavagem (121ºC, 20 minutos, 1 atm) .
(b) Solução de oligoelementos A (Cfinal 0,5 g/L):
H3BO 3 0,18% (p/v)
KI 0,02% (p/v)
NaMoO 4.2H 2O 0,04% (p/v)
(c) Solução de oligoelementos B (Cfinal 0,5 g/L), pH 3,5:
CuSO 4.5H 2O 0,08% (p/v)
FeCl 3.6H 2O 0,04% (p/v)
MnSO 4.H 2O 0,08% (p/v)
ZnSO 4.7H 2O 0,08% (p/v)
Água desmineralizada q.b.
(d) Solução de vitaminas (Cfinal 0,5 g/L):
Biotina 0,001% (p/v)
Pantotenato de cálcio 0,08% (p/v)
Mio-inositol 4,00% (p/v)
Niacina 0,16% (p/v)
Piridoxina (HCl) 0,16% (p/v)
Tiamina (HCl) 0,16% (p/v)
Água desmineralizada q.b.
101 ANEXOS
(e) Fonte de carbono e energia (Cfinal 20 g/L):
D(+)-Glucose 20% (p/v)
Água desmineralizada q.b.
A solução de glucose foi preparada numa concentração 10 vezes superior à concentração final pretendida no meio de cultura (2%). As soluções referidas (solução de glucose, soluções de oligoelementos A e B, solução de vitaminas) foram esterilizadas por filtração a vácuo com membranas Millipore TYPE GSWP de porosidade 0,22 µm. As várias soluções foram misturadas assepticamente para a obtenção do meio completo, constituído por 2% (p/v) glucose, 0,05% (v/v) de oligoelementos A e B e 0,05% (v/v) de vitaminas. Para a preparação do meio necessário ao crescimento da estirpe auxotrófica Saccharomyces cerevisiae W-303 foi utilizado meio K indicado anteriormente, suplementado com os seguintes compostos (de acordo com as marcas auxotróficas da estirpe):
Histidina 0,08 g/L Adenina 0,08 g/L Uracilo 0,08 g/L Leucina 0,16 g/L Triptofano 0,32 g/L
Os produtos químicos utilizados pertencem às marcas BDH ®, Merck ® e Sigma ®.
102 ANEXOS
ANEXO IV
Parâmetros físico-químicos do mosto
Tabela 12: Parâmetros físicos do mosto ao longo da fermentação a 15ºC.
Fase de crescimento pH Massa volúmica (g/mL) Glucose (g/L) Etanol (g/L)
Início de fermentação (T 0) 3,04 1,074 96,50 0,20
Início de exponencial (T 1) 2,88 1,061 89,54 1,51
Meio de exponencial (T2) 2,87 1,037 81,72 10,02
Final de exponencial (T3) 2,80 1,033 73,46 16,01
Início de estacionária (T4) 2,87 1,036 51,73 35,70
Meio de estacionária (T5) 2,97 0,996 2,87 51,25
Final de fermentação (T6) 2,93 0,980 0,03 74,29
Tabela 13: Parâmetros físicos do mosto ao longo da fermentação a 30ºC.
Fase de crescimento pH Massa volúmica (g/mL) Glucose (g/L) Etanol (g/L)
Início de fermentação (T 0) 2,91 1,056 96,50 0,20
Meio de exponencial (T1) 2,87 1,060 83,89 1,84
Final de exponencial (T2) 2,79 1,054 80,41 6,45
Início de estacionária (T3) 2,70 1,018 40,42 39,16
Meio de estacionária (T4) 2,75 - 4,26 43,19
Final de fermentação (T5) 2,74 0,995 0,05 56,44
103 ANEXOS
ANEXO V
Tabela 14: Parâmetros de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 ao longo da fermentação vinária a 15ºC.
Fase de Tempo D.O. UFC/ mL Peso Seco Fase de Tempo D.O. UFC/ mL Peso Seco 6 6 crescimento (h) 640nm (x10 ) (mg/mL) crescimento (h) 640nm (x10 ) (mg/mL)
Iníc. ferm. 0,0 0,066 0,70 0,25 (…) 2,0 0,057 0,69 - 108,0 18,200 161,45 6,53 7,0 0,069 - - 111,0 15,500 108,15 5,20 10,0 0,086 0,48 0,35 119,4 15,900 113,00 5,33 13,0 0,098 0,40 0,25 122,0 19,200 124,40 5,83 17,0 0,103 - - 130,4 19,400 149,33 5,90 21,3 0,265 - 0,26 134,8 21,300 117,92 5,95 Iníc. exp. 24,0 0,366 2,97 - 143,8 21,500 126,13 5,58 25,0 0,346 2,17 - 145,8 - - 6,40 27,0 0,470 8,78 - 154,8 20,200 128,50 5,65 30,0 0,875 8,53 0,52 165,0 - 151,38 - 33,3 1,255 2,80 - 176,0 20,000 144,00 5,60 36,0 1,505 3,03 0,85 184,0 18,400 112,50 4,93 37,3 1,330 2,30 0,61 191,0 18,800 104,53 5,50 Meio expo. 41,0 2,360 6,27 - 195,0 18,000 145,20 5,13 45,3 3,340 2,94 1,26 Meio est. 202,0 20,100 117,67 5,50 48,3 4,960 6,60 2,00 208,8 16,900 - 5,70 49,0 5,300 - - 215,1 15,800 107,70 5,90 51,0 5,940 11,00 - 219,8 17,500 109,05 5,80 54,3 6,040 44,80 2,53 226,1 17,300 125,92 6,40 59,0 8,600 42,00 2,98 232,4 17,200 103,92 6,60 61,0 - 32,60 - 239,1 18,300 129,13 5,85 Final exp. 65,0 8,100 45,75 - 243,4 18,200 117,45 6,50 69,0 12,000 65,00 3,18 250,1 - - 6,05 72,0 11,000 99,38 3,18 256,3 16,900 112,78 6,40 73,0 9,400 67,47 - 263,0 17,100 118,45 - 75,0 13,000 126,83 - 267,3 18,000 107,00 5,80 78,2 13,900 - 4,55 274,0 17,600 119,00 5,85 81,3 12,400 138,33 - 280,0 16,700 - 6,20 84,0 17,800 143,83 5,08 287,3 18,100 106,93 5,50 Iníc. est. 87,0 16,300 94,40 4,95 291,0 17,400 102,60 6,00 93,0 14,700 366,05 - 299,0 16,900 - 5,50 97,0 15,400 - 5,45 Final ferm. 304,0 17,300 146,50 6,00 98,0 17,700 108,33 6,03 311,0 24,300 100,10 5,60 104,0 16,900 152,25 - 315,0 17,400 129,07 5,90 (…) 322,0 17,300 124,33 5,05
104 ANEXOS
Tabela 15: Parâmetros de crescimento de S. cerevisiae ISA 1000 ao longo da fermentação vinária a 30ºC.
Fase de Tempo D.O. UFC/ mL Peso Seco Fase de Tempo D.O. UFC/ mL Peso Seco 6 6 crescimento (h) 640nm (x10 ) (mg/mL) crescimento (h) 640nm (x10 ) (mg/mL) Iníc. ferm. 0,0 0,044 1,02 0,18 (…) 1,0 - 1,49 - 23,0 9,400 103,57 - 2,0 0,059 0,23 0,22 Iníc. est. 24,0 11,100 95,07 4,38 2,1 0,085 0,12 - 26,0 11,000 75,55 - 3,0 0,123 0,38 0,22 28,0 11,500 107,68 4,35 4,0 0,181 1,89 - 31,0 12,900 93,70 - Meio expo. 5,3 0,307 2,29 0,39 33,0 12,800 107,33 5,43 6,0 0,660 2,07 - 35,0 11,900 106,60 5,28 7,0 1,110 6,50 0,77 38,2 15,700 126,48 4,50 8,0 1,670 9,73 - 41,0 14,400 124,18 - 42,0 15,600 - - Final exp. 9,1 2,510 14,53 1,47 44,0 15,200 107,70 - 10,0 - 17,30 - Meio est. 48,0 15,200 99,27 4,80 11,0 - 16,40 2,06 49,2 17,200 126,62 5,63 12,0 - 25,00 - 52,0 15,600 97,28 - 13,0 4,550 23,26 1,95 56,0 16,000 129,53 - 14,0 4,030 - - 59,0 15,100 100,27 5,55 15,0 5,600 - 1,92 62,0 15,000 93,42 5,45 16,1 5,600 38,04 - 65,0 16,100 81,73 - 17,0 6,500 39,90 2,65 68,0 16,400 96,22 - 18,0 7,300 60,88 - Final ferm. 71,0 17,700 116,67 5,60 20,0 8,000 65,33 3,53 73,0 14,700 85,20 5,50 21,0 8,300 82,47 - 79,0 15,200 67,00 - 22,0 9,100 87,45 3,48 88,4 17,000 72,07 5,08 (…) 99,4 15,400 87,80 4,88
105 ANEXOS
ANEXO VI
in
pH Final ex fermentação pH
in 7 2,90 5,06 13 2,9023 5,23 2,9018 5,23 2,91 5,25 pH Meio ex 2,89 5,16 2,91 5,02 estacionária pH
in
pH
Início . ex estacionária pH
mosto in C] C] ác. benzóico pH 14 [7- Final ex exponencial pH
in
pH Meio ex exponencial pH
in
pH Início ex exponencial pH
cultivada 15ºC a em meio mineral e mosto em estéril , , in pH
C] ác. 14 ex benzóico [7- ISA1000
pH meioK in pH Meio exponencial C] ác. cerevisiae
14 . ex S [1-
propiónico
pH de
in
pH : 6 90 - - 3,09 6,42 2,93 6,34 2,86 6,24 2,83 5,87 2,81 6,10 2,88 5,1 100120150180 3,207,04-200 -210 3,16250 7,19 -300 - 3,117,28-350 3,04 - - 3,06 - 3,077,32- 6,48 6,49 3,047,35- 3,02 - 2,987,38- 2,87 - 6,49 2,90 - 3,01 6,44 6,41 - 6,41 2,86 2,89 - 2,85 6,30 - 6,29 - - 2,89 6,32 - 2,80 2,83 6,19 2,80 - - 6,09 6,24 - - 2,83 5,99 2,80 2,79 - - - 6,19 2,81 - 6,09 - 6,06 2,80 6,21 - - 2,80 - - 6,27 2,89 - 6,05 - 2,80 5, - - 2,89 - - 5,97 5, - - - 2,88 - - 5, ------(min) incubação incubação Tempo de Tabela 1
106 ANEXOS
1 in 76 pH Final ex ,95 5,84 fermentação pH
in pH Meio ex estacionária pH stoestéril. in pH in Início mosto
ex C] ác. benzóico pH estacionária pH 14 C] C] ác. [7- 14 in ex benzóico [7- pH pH
Final ex in exponencial pH pH
Meio exponencial C] C] ác. in 14 ex pH [1- propiónico pH Meio ex exponencial pH in pH in
C] ác. pH 14 ex benzóico [7- C] C] ác. 14 pH ex benzóico
[7- ISA 1000, cultivada 30ºC a em meio mineral e mo em W-303,cultivada a 15ºC e 30ºC a em meio mineral. pH 15ºC 30ºC in pH meioK in Meio exponencial pH C] C] ác. 14 Meio exponencial C] ác. ex 14 [1-
propiónico ex pH [1- cerevisiae S. cerevisiae S. propiónico pH de de in in pH pH
6090 - 3,30 6,86 - 3,30 - 5,97 - 3,49 6,75 3,57 3,49 6,73 6,14 3,57 6,13 60 - - 3,19 6,41 2,82 6,59 2,92 6,36 2,70 6,02 2,75 5,82 2,95 5,8 90 3,18 7,23 3,07 6,60 2,79 6,42 2,76 6,22 2,70 5,95 2,74 5,94 2 120150180210 3,28 3,25 6,90 3,23 6,93 3,28 3,22 7,09 3,25 5,87 7,04 3,23 5,90 3,22 5,87 3,40 5,83 6,76 - - 3,40 - - 6,13 ------120 - - 3,00 6,59 2,78 6,21 2,72 6,12 2,69 6,16 2,75 5,89 2,97 5, (min) (min) incubação incubação incubação incubação Tempo de Tempode Tabela 17: Tabela 18:
Outros dados: -5 Constante de dissociação (k d) do ácido propiónico = 1,35 x10 mol -5 Constante de dissociação (k d) do ácido benzóico = 6,4 x10 mol Volume intracelular de S. cerevisiae = 1,9 µL / mg (p.s.)
107 ANEXOS
ANEXO VII
02 08 07 -0,03 de base Com linha penas) e ,20 -0,02 0,090,080,08 -0,03 0,07 -0,02 -0,04 -0,03 Final fermentação de base Sem linha de base Com linha Meio estacionária de base Sem linha de base Com linha ) -1 .h -1 Início estacionária de base Sem linha mosto de base Com linha ISA 1000, cultivada em meio K (fase exponencial, a Final exponencial de base Sem linha S. cerevisiae de base Com linha Velocidades deVelocidades efluxo de protões (mmol.g ) de 1 - 15ºC. .h 1 - Meio exponencial de base Sem linha (mmol.g de base + Com linha Início exponencial de base Sem linha de base Com linha meio K Meio exponencial Velocidades de efluxo de H de base Sem linha 0 0,44 0,57 0,14 0,24 0,31 0,44 0,55 0,73 0,38 0,18 0,29 -0,03 0 2468 - - - 0,28 - - 0,30 - 0,13 0,26 0,20 0,24 0,05 0,21 - 0,19 0,29 0,19 0,30 0,38 0,24 0,29 0,42 0,48 0,38 0,45 0,37 0,54 0,31 0,55 0,51 0,35 0,50 0,27 0,24 0,16 0,17 0,02 0,11 0,39 0,06 0,28 0,25 -0,06 0,23 -0,10 -0,14 0,21 -0,14 0,17 0,15 -0, 0,14 -0, -0, 10121416 0,1818 0,1620 0,22 0,20 0,10 0,25 0,49 - 0,03 0,30 0,16 0,15 0,17 0,13 0,21 - 0,06 0,23 0,25 0,27 0,18 0,22 - - 0,14 0,51 0,07 0,57 0,38 - 0,31 - 0,24 0,19 0,15 0,53 - 0,07 0,71 - 0,43 0,16 0,26 0,11 - 0,09 0,02 - 0,06 0,05 0,08 0,14 - 0,03 0,05 0,17 0,14 -0,10 0,28 0,14 -0,04 - -0,03 0,06 -0,04 0,06 0,04 0,10 0,12 0,12 -0,05 -0,03 0,06 0,05 -0,02 -0,03 (v/v) Tabela 19: em mosto em (para diferentes fases crescimento), de a % [etanol] %
108 ANEXOS
de base Com linha penas) e Final fermentação de base Sem linha de base Com linha Meio estacionária de base Sem linha ) -1 .h -1 de base Com linha mosto Início estacionária de base Sem linha ISA 1000, cultivada em meio K (fase exponencial, a de base Com linha S. cerevisiae de base Sem linha ) de 1 Velocidades de efluxo de protões (mmol.g - 30ºC. .h 1 - de base Com linha (mmol.g + Meio exponencial Final exponencial de base Sem linha de base Com linha meio K Meio exponencial de base Sem linha Velocidades de efluxo de H 0246 1,748 1,54 1,08 3,81 1,34 1,98 0,85 2,00 2,18 2,09 1,54 1,30 1,00 2,58 1,08 1,56 1,34 1,17 1,59 1,40 0,95 1,81 0,50 1,70 1,90 1,16 1,33 0,72 1,85 2,25 2,24 1,77 2,12 1,59 1,66 1,60 0,98 1,64 1,14 1,21 1,70 0,83 1,37 0,69 0,92 1,04 0,79 1,03 0,55 0,63 0,66 0,61 0,56 0,36 0,42 0,53 0,56 0,47 0,25 0,43 10121416 0,7618 0,7120 0,36 1,29 0,07 1,35 0,90 - 0,63 0,93 - 0,80 0,49 1,53 - 1,50 - - 1,79 1,19 0,77 - 0,52 1,54 - - 1,37 1,30 0,34 0,04 - 0,42 - 0,31 0,58 0,68 0,63 - 0,72 0,70 - 0,36 0,33 0,27 0,61 - 0,83 0,39 - 0,40 0,28 0,15 0,27 - 0,23 0,42 - 0,29 0,52 0,50 - 0,16 - 0,13 0,48 0,10 0,43 0,66 0,66 0,08 - 0,47 (v/v) Tabela 20: em mosto em (para diferentes fases crescimento), de a % [etanol] %
109 ANEXOS
ANEXO VIII
Tris 10mM penas) e citrato pH=6,3
Tris 10mM citrato pH=5,0 Final fermentação água desmin. Tris 10mM citrato pH=6,3 ) -1 .h -1 Tris 10mM citrato pH=5,0 Meio estacionária mosto ISA 1000, cultivada em meio (fase K exponencial, a a desmin. Início S.cerevisiae estacionária Velocidades deVelocidades de influxo protões (mmol.g )de 1 - 15ºC. .h 1 - Final exponencial (mmol.g + Meio exponencial Início exponencial água desmin. água desmin. água desmin. água desmin. águ Meio meio K Velocidadesde influxo de H exponencial água desmin. 0246 0,208 - 0,17 0,13 0,19 0,27 - - 0,24 0,10 - 0,14 -0,39- 0,19 - - 0,28 0,00 0,31 0,25 0,04 0,00 - - 0,00 0,00 - - 0,00 0,00 - - - 0,04 0,00 - 0,00 0,00 - - - 0,00 0,00 - - 0,00 ------10121416 0,1518 0,2020 0,16 0,20 0,33 0,16 0,23 - 0,23 0,13 - 0,29 0,27 - - 0,39 0,18 - 0,31 0,43 0,41 0,00 0,45 0,40 0,51 - 0,00 - 0,03 0,02 - 0,00 0,00 - - 0,00 - 0,03 0,04 - 0,01 - 0,00 - 0,03 0,04 - - 0,00 0,00 - 0,00 0,04 - - 0,00 0,01 - 0,03 - - 0,02 - - - - (v/v) em mosto em (para diferentes fases crescimento), de a Tabela 21: % [etanol] %
110 ANEXOS
penas) e Tris 10mM
citrato pH=6,3
Tris 10mM citrato pH=5,0 Final fermentação água desmin. ) -1 Tris 10mM .h -1 citrato pH=6,3 mosto Tris 10mM citrato pH=5,0 Meio estacionária ISA 1000, cultivada em meio (fase K exponencial, a água desmin.
S.cerevisiae )de Velocidades Velocidades de deinfluxo protões (mmol.g Início 1 - 30ºC. .h estacionária água desmin. 1 - Final (mmol.g + exponencial água desmin. Meio exponencial água desmin. Meio meio K exponencial Velocidadesde influxo de H água desmin. 02468 0,67 0,85 0,73 0,70 0,61 0,60 0,52 0,42 0,46 0,68 0,62 0,71 0,82 0,64 0,35 0,79 0,32 0,30 0,28 0,06 0,29 - - 0,11 0,07 - - 0,09 0,17 - - 0,18 - 0,04 - - 0,05 0,03 - - 0,07 0,07 - - - 0,11 - - - - 10121416 0,6118 0,6020 0,57 0,42 0,66 - 0,71 - 0,49 0,46 0,90 0,86 0,90 - 1,15 1,13 0,43 0,38 0,26 1,29 1,60 0,31 0,10 - - 0,40 0,74 0,12 0,12 - 0,26 - 0,10 0,18 - 0,13 0,20 - 0,08 - - 0,48 0,08 0,09 - - - 0,15 0,08 0,11 - - 0,15 - 0,13 - 0,19 - - - (v/v) [etanol] em mosto em (para diferentes fases crescimento), de a Tabela 22:
111