Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa Stricto Sensu em Ciências Genômicas e Biotecnologia

CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA E MOLECULAR DA β-GALACTOSIDASE DURANTE A MATURAÇÃO DE FRUTOS DE COFFEA ARABICA

Autor: Sérgio Araujo Figueiredo Orientador: Dr. Francisco José Lima Aragão

Brasília - DF 2011

SÉRGIO ARAUJO FIGUEIREDO

CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA E MOLECULAR DA -GALACTOSIDASE DURANTE A MATURAÇÃO DE FRUTOS DE COFFEA ARABICA

Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação Stricto Sensu em Ciências Genômicas e Biotecnologia da Universidade Católica de Brasília, como requisito parcial para obtenção do Título de Doutor em Ciências Genômicas e Biotecnologia.

Orientador: Dr. Francisco José Lima Aragão

Brasília 2011

F475b Figueiredo, Sérgio Araujo Caracterização bioquímica e molecular da β-galactosidase durante a maturação de frutos de Coffea arabica. / Sérgio Araujo Figueiredo – 2011. 244 f .: il. ; 30 cm

Tese (doutorado) – Universidade Católica de Brasília, 2011. Orientação: Francisco José Lima Ara gão

1. Coffea arabica. 2. Polissacarídeos. 3. Biotecnologia. 4. Enzimas extracelulares. I. Aragão, Francisco José Lima, orient. II.Título.

CDU 633.73

Dedico este trabalho àqueles que têm estado ao meu lado ao longo desta jornada, sempre confiando em mim, amparando minhas incontáveis quedas com suas palavras de encorajamento, com seus ombros amigos, com suas orações, com seu amor ...

Aos meus pais, Matosinho e Francisquinha; À minha eterna namorada, Cláudia; Aos meus filhos, Isabela e Lucas.

AGRADECIMENTO

Registrar os nomes de todas as pessoas que me ajudaram ao longo deste tempo em que compartilhamos os mesmos objetivos é uma tarefa difícil de ser feita. Nas parcas vitórias e nas vastas frustrações, na alegria contagiante de um resultado animador e nas lágrimas do desânimo por mais uma decepção. Na esperança do começo de um projeto novo e no desespero por ver esta esperança se esvair quando os experimentos, aparentemente, não dão certo. Nas refeições compartilhadas com alegria sincera e na divisão de um simples chocolate para matar a fome avassaladora de quem tem que tem ainda um longo caminho nas noites do laboratório. Nas conversas em que se aprende não somente o conhecimento técnico, mas se absorve um pouco do ser que nos ampara a ignorância. Um aprendizado constante e infinito, que não termina com a defesa desta tese, ciente de que esta não passa de mais uma pequena peça no grande quebra-cabeça do conhecimento humano. Nomes serão esquecidos, isto é questão de memória; as pessoas com as quais aprendemos jamais o serão porque passaram a viver dentro de nós. Impossível citar todos, impossível não mencionar alguns ... Minha eterna gratidão ao meu mentor, meu orientador e amigo, Francisco (Dr. Francisco José Lima Aragão) que me acolheu em seu laboratório quando o mundo fechava todas as portas para mim, ensinando-me não somente com suas palavras e experiências, mas com seus atos de nobreza moral; À minha companheira de bancada, porto-seguro de todos no laboratório, que conquistou meu mais profundo respeito e amizade pelo ombro amigo, pelo silêncio nos meus dasabafos, pelos conhecimentos compartilhados em cima de uma ata de laboratório e pelos conselhos que nascem de um coração voltado para o bem maior, minha eterna gratidão à Elsa (Elsa Oliveira Paranaguá e Lago Nogueira); Aos colegas, amigos e amigas que estiveram comigo durante estes anos, compartilhando experiências, lágrimas e sorrisos, fosse pelo tempo que fosse. A todos estes cujos nomes vibram em meu ser, minha profunda gratidão por tudo que passamos juntos; Aos professores do Departamento de Botânica da Universidade de Brasília, pelo apoio e incentivo para que eu, mesmo cumprindo minhas obrigações acadêmicas junto à UnB, pudesse concluir esta etapa de minha formação profissional, em especial aos professores da área de Fisiologia Vegetal, prof. Dr. Augusto César Franco, prof. Dr. Fabian Borghetti, profa. Dr. Cristiane da Silva Ferreira e à profa. Dr. Lourdes Isabel Velho do Amaral; À Lourdes (profa. Dra. Lourdes Isabel Velho do Amaral) não somente pelo aprendizado compartilhado na condução da disciplina na UnB, mas especialmente pelo incansável apoio nas incontáveis horas de discussão e de análises no HPLC, guiando-me os passos frágeis de um ser que ainda não sabe andar com os próprios pés nesta área específica que ela domina com propriedade. Nos medos compartilhados, nas decepções e nas alegrias de ver um simples gráfico de uma amostra sendo analisada em pleno final de semana em que ela poderia estar descansando ou recuperando-se de seu frágil estado de saúde. Minha eterna amizade e gratidão ... Aos diversos pesquisadores da EMBRAPA que me ajudaram em vários momentos da tese, em especial ao João Batista (Dr. João Batista Teixeira) que sempre esteve disponível

para me ajudar com sua experiência e seu laboratório para a parte de cultura de tecidos do cafeeiro; Aos membros de minha banca de defesa de tese, Vera (Dra. Vera Tavares de Campos Carneiro), Betânia (Dra. Betânia Ferraz Quirino), Lourdes (profa. Dra. Lourdes Isabel Velho do Amaral) e Thales (Dr. Thales Lima Rocha) pela sempre presteza e boa-vontade em me ajudar no que fosse necessário, minha profunda gratidão; À D. Bel (Maria Isabel Martins da Costa) que, no anonimato e simplicidade de seu importante trabalho, sempre me deu o precioso apoio de seu sorriso, de sua experiência de vida e de sua fé inabalável em Deus, deixo registrado minha enorme gratidão; À Universidade Católica de Brasília pela oportunidade de cursar o doutorado num ambiente de respeito e profissionalismo, ampliando minhas percepções acadêmicas com disciplinas ministradas por docentes altamente qualificados; Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio financeiro e pela oportunidade de poder concluir meu doutoramento, minha gratidão; Aos amigos do plano espiritual que, no silêncio do meu íntimo e no anonimato, estiveram ao meu lado não para cumprir aquilo que era de minha obrigação fazer, mas pelo apoio, incentivo e encorajamento para seguir adiante em todas as circunstâncias; Ao Mestre Nazareno, pastor de minh’alma, meu guia, meu modelo, meu irmão-maior e ... A Deus, pela minha vida ... eu agradeço.

“Há dois tipos de sabedoria: a inferior e a superior. A sabedoria inferior é dada pelo quanto uma pessoa sabe e a superior é dada pelo quanto ela tem consciência de que não sabe. Tenha a sabedoria superior. Seja um eterno aprendiz na escola da vida.”

Chico Xavier

RESUMO

Referência: FIGUEIREDO, Sérgio Araujo. Título: Caracterização bioquímica e molecular da -galactosidase durante a maturação de frutos de Coffea arabica. 2011. 243 folhas. Tese (Ciências Genômicas e Biotecnologia) - Universidade Católica de Brasília, Brasília (DF), 2011.

As -galactosidases são uma classe de glicosil-hidrolases que atuam na parede primária das células vegetais, hidrolisando resíduos -D-galactosis de extremidades não redutoras de -D- galactosídeos presentes em diversas moléculas biológicas. Inicialmente foi feita uma caracterização dos monossacarídeos presentes na parede primária do pericarpo e do endosperma de frutos de Coffea arabica em distintas fases de maturação, identificando os polissacarídeos presentes nesta região celular, juntamente com os prováveis carboidratos-alvo para as -galactosidases. Em paralelo, foi realizada uma caracterização molecular e bioquímica das -galactosidases. Foi realizada uma caracterização parcial da estrutura do seu DNA genômico, juntamente com uma análise do nível de transcrição e da atividade bioquímica in vitro e in situ foram realizadas, identificando picos de expressão nas fases iniciais de crescimento e nos frutos completamente maduros. Por fim, visando avaliar os efeitos das -galactosidases na maturação de frutos de café, calos embriogênicos de C. arabica foram transformados por biobalística, utilizando a técnica do RNA interferente, com a finalidade de obtenção de plantas geneticamente modificadas de cafeeiro para o silenciamento da expressão do gene das -galactosidases. Foram obtidos três calos transgênicos crescendo em meio seletivo com glufosinato de amônio, dentre os quais dois continham o fragmento deste gene. Estes calos encontram-se em fase de formação de embriões somáticos e as plântulas resultantes desta regeneração serão analisadas, a posteriori, para confirmação da presença dos transgenes e avaliação dos efeitos do silenciamento do gene das -galactosidases sobre a maturação de frutos de café.

Palavras-chave: Coffea arabica. -galactosidase. Parede celular. Polissacarídeos. RNA interferente. Biobalística.

ABSTRACT

-galactosidases are a class of glycosyl-hydrolases that act on the plant cell primary walls, hydrolyzing -D-galactose at the nonreducing ends of -D-galactosides present in several biological molecules. Initially a characterization of the monosaccharides present in the primary wall of the pericarp and endosperm of Coffea arabica fruits at different ripening stages was performed, identifying the polysaccharides present in these regions, along with the putative carbohydrate target for the -galactosidase. In parallel, a molecular and a biochemical characterization of -galactosidase was performed. A partial characterization of -galactosidase genomic DNA structure, along with a transcription analysis and an in vitro and in situ biochemical activity were performed, identifying peaks of expression in the early stages of growth and in fully ripe fruit. Finally, in order to evaluate the -galactosidase effects on coffee fruit ripening, C. arabica calli were transformed by biolistic using RNA interference approach, in order to obtain genetically modified coffee plants with a silenced - galactosidase expression. Three transgenic calli growing on selective medium containing ammonium glufosinate were obtained, two of which contained the -galactosidase gene fragment. These calli are under embryogenic regeneration and the resulting seedlings will be further analyzed in order to confirm the presence of the transgenes and to assess of the effects of -galactosidase gene silencing on coffee fruit ripening.

Keywords: Coffea arabica. -galactosidase. Cell wall. Polysaccharides. Interfering RNA. Biolistic

LISTA DE FIGURAS

FiguraU 1. Gráfico representativo da produção de café no Brasil (A) e da área plantada no

território nacional (B) nos anos de 2005, 2006 e 2007. [Fonte: Brasil (2010)] U...... 22

FiguraU 2. Gráfico representativo das principais unidades federativas produtoras de café no

Brasil na safra de 2009, considerando o número de sacas beneficiadas. [Fonte: Brasil (2010)]U ...... 22

FiguraU 3. Produção dos principais países produtores de café na safra de 2010. [Fonte: Brasil

(2010)] U ...... 23

FiguraU 4. Classificação taxonômica e botânica de Coffea arabica. U...... 25

FiguraU 5. Fotos representativas do florescimento e maturação de frutos de C. arabica no campo. (A) Cafeeiro florescendo após a primeira chuva, findo o período de estresse hídrico indutor; (B e C) Cafeeiro com múltiplas florações, apresentando ramos com frutos e flores concomitantemente e (D) Amostragem de uma derriça parcial de frutos de café de um ramo

com frutos em diversas fases de maturação. U...... 28

FiguraU 6. Esquema representativo do desenvolvimento de frutos de café. (A) Corte transversal de fruto maduro de café; (B) Fases do desenvolvimento de frutos de café ao longo do

processo de maturação (Fonte: DE CASTRO e MARRACCINI, 2006). U ...... 29

FiguraU 7. Esquema estrutural proposto para uma pectina da classe de arabinogalactanos de

Coffea arabica (Fonte: REDGWELL et al., 2002). U ...... 52

FiguraU 8. Esquema da estrutura da hemicelulose do tipo galactomananos encontrada na parede

celular primária das plantas (Fonte: CARPITA e McCANN, 2000). U ...... 53

FiguraU 9. Esquema da estrutura da hemicelulose do tipo xiloglucano encontrada na parede

celular primária das plantas (Fonte: CARPITA e McCANN, 2000). U ...... 54

FiguraU 10. Esquema geral do protocolo para purificação dos monossacarídeos presentes na parede celular primária do pericarpo e do endosperma de frutos de C. arabica em diferentes estádios de desenvolvimento. (A) Procedimento para extração de lipídeos, ASTs, pool de arabinogalactano/galactomanano, proteínas, amido e para fracionamento da parede celular primária (extração com oxalato de amônio e série alcalina); (B) Procedimento de processamento dos componentes da parede celular primária para análise no ICS-3000 e de purificação/quantificação de celulose nas amostras; (C) Procedimento para quantificação de

amido nas amostras de frutos de café. U ...... 68

FiguraU 11. Classificação de frutos de C. arabica nos oito estádios de desenvolvimento, baseado no tamanho do fruto (frutos de café imaturos – estádios de 1 a 4) e na coloração do pericarpo (frutos de café amadurecendo – estádios de 5 a 8) (A); estádios de desenvolvimento dos frutos de C. arabica analisados quanto à composição de carboidratos na parede celular

primária (B). U ...... 69

FiguraU 12. Percentagem (m/m) da fração lipídica presente no pericarpo e no endosperma de frutos de C. arabica em três fases distintas de maturação.U ...... 71

Figura 13. Teores de açúcares solúveis totais presentes no pericarpo e no endosperma de

frutos de C. arabica em três fases distintas de maturação. U...... 72

FiguraU 14. Quantidade de proteínas solúveis presentes no pericarpo e no endosperma de frutos

de C. arabica em três fases distintas de maturação, com base na matéria seca. U ...... 74

FiguraU 15. Percentagem (m/m) de amido presente no pericarpo e no endosperma de frutos de

C. arabica em três fases distintas de maturação. U ...... 76

FiguraU 16. Percentagem (m/m) de celulose presente no pericarpo e no endosperma de frutos

de C. arabica em três fases distintas de maturação. U ...... 77

FiguraU 17. Percentagem (m/m) de ácidos urônicos presentes no pericarpo e no endosperma de

frutos de C. arabica em três fases distintas de maturação. U...... 78

FiguraU 18. Exemplo de cromatogramas obtidos de amostras hidrolisadas e purificadas do pericarpo e do endosperma de frutos de C. arabica em fases distintas de maturação, extraídos com diferentes soluções, no equipamento ICS-3000 (Dionex) com a coluna de separação CarboPac PA10 (Dionex) e pós-coluna com NaOH 0,5M. (A) Padrão de 10 M dos sete monossacarídeos básicos presentes na parede celular primária; (B) Pericarpo de frutos de café no estádio 5, extraído com oxalato de amônio 0,5%; (C) Pericarpo de frutos de café no estádio 4, extraído com NaOH 4M; (D) Pericarpo de frutos de café no estádio 7, extraído com NaOH 4M; (E) Endosperma de frutos de café no estádio 4, extraído com NaOH 1M; (F) Endosperma

de frutos de café no estádio 7, extraído com NaOH 1M. U ...... 81

FiguraU 19. Perfil da distribuição de monossacarídeos presentes no pericarpo de frutos de C. arabica em fases distintas de maturação (CV: pericarpo no estádio 4; CMV: pericarpo no estádio 5; CM: pericarpo no estádio 7; Fuc: fucose; Ara: arabinose; Rha: ramnose; Gal: galactose; Gli: glicose; Xil: xilose; Man: manose). U ...... 85

FiguraU 20. Esquema proposto para as pectinas da classe dos ramnogalacturonano tipo I (RGI)

(Fonte: CARPITA e McCANN, 2000). U ...... 86

FiguraU 21. Esquema proposto para as hemiceluloses da classe dos glucuronoarabinoxilanos

(GAX) (Fonte: CARPITA e McCANN, 2000). U ...... 88

FiguraU 22. Perfil da distribuição de monossacarídeos presentes no endosperma de frutos de C. arabica em fases distintas de maturação (EV: endosperma no estádio 4; EMV: endosperma no estádio 5; EM: endosperma no estádio 7; Fuc: fucose; Ara: arabinose; Rha: ramnose; Gal: galactose; Gli: glicose; Xil: xilose; Man: manose). U ...... 90

FiguraU 23. Classificação de frutos de C. arabica nos oito estádios de desenvolvimento baseado no tamanho do fruto (frutos de café imaturos – estádios de 1 a 4) e na coloração do pericarpo (frutos de café amadurecendo – estádios de 5 a 8) (painel inferior). No painel superior, cortes transversais e longitudinais de frutos de café, apresentando a atividade

histoquímica in situ da -galactosidase em cada fase de maturação. U ...... 116

FiguraU 24. Provável sequência parcial codante do gene da -galactosidase de Coffea arabica. (A) Sequência de nucleotídeos (linha superior) e sua sequência de aminoácidos traduzida in silico (linha inferior). Aminoácidos estão apresentados por letra maiúscula. Predito peptídeo sinal está indicado em negrito. Predito sítio ativo da família da 35 glicosil hidrolases está sublinhado. (B) Diagrama esquemático da sequência genômica parcial clonada de CaGal indicando os exons (retângulos preenchidos) e os introns (linhas). U ...... 120

FiguraU 25. Alinhamento de provável sequência de aminoácidos da -galactosidase de C. arabica, traduzida in silico, com a sequência de aminoácidos da -galactosidase de A. thaliana (CAB 64742). Quadrado vazado indica a localização do sítio ativo da família 35 glicosil hidrolase. U ...... 123

FiguraU 26. Expressão da -galactosidase no pericarpo de frutos de C. arabica, crescido em condições de campo, em diferentes fases de maturação. (A) RT-PCR específicos para CaGal estão apresentados no painel superior; RT-PCR do gene usado como controle constitutivo Fator de alongamento 1 (EF-1) estão apresentados no painel inferior; (+) controle positivo: plasmídeo contendo um fragmento do gene de CaGal; (-) controle negativo: água; (B)

Expressão relativa de CaGal nas diferentes fases de desenvolvimento de frutos de café. U .. 125

FiguraU 27. Expressão da -galactosidase no endosperma de frutos de C. arabica, crescida em condições de campo, em diferentes fases de maturação. (A) RT-PCR específicos para CaGal estão apresentados no painel superior; RT-PCR do gene usado como controle constitutivo Fator de alongamento 1 (EF-1) estão apresentados no painel inferior; (+) controle positivo: plasmídeo contendo um fragmento do gene de CaGal; (-) controle negativo: água; (B)

Expressão relativa de CaGal nas diferentes fases de desenvolvimento de frutos de café. U .. 126

FiguU ra 28. Atividade enzimática da -galactosidase, sob condições in vitro, expressa no pericarpo e no endosperma de frutos de C. arabica em diferentes fases de desenvolvimento

(média de três repetições). U ...... 127

FiguraU 29. Análise de Southern-blot de C. arabica Icatu Vermelho e C. arabica Catuai Vermelho de DNA genômico digerido com as enzimas de restrição DraI, EcoRI and HindIII, separadamente, e hibridizadas com sonda para o gene da -galactosidase. Marcadores de massas moleculares estão indicados. U ...... 129

FiguraU 30. Expressão por RT-PCR de CaGal em órgãos vegetativos e reprodutivos de Coffea arabica; (+) controle positivo: plasmídeo contendo fragmentos do gene da -galactosidase; (-) controle negativo: água. U ...... 131

FiguraU 31. Isoformas da -galactosidase de folhas jovens e adultas, ramos, pétalas, endosperma e pericarpo expressas em C. arabica. (A) Alinhamento das isoformas amplificadas de CaGal. (B) Alinhamento da sequência de aminoácidos, traduzidos in silico, das duas isoformas de CaGal. Quadrados vazados identificam as diferenças na sequência de aminoácidos. U ...... 133

FiguraU 32. Hipótese filogenética consenso da sequência deduzida de aminoácidos da - galactosidase de C. arabica com 36 sequências protéicas da -galactosidase usando a Máxima Parcimônia. A árvore filogenética foi construída usando o programa MEGA4 com 50% de cutoff. A percentagem de bootstrap aparece em cada ramificação da árvore. U ...... 136

FiguraU 33. Esquema do funcionamento da técnica do RNA interferente (RNAi) em plantas

[Fonte: MELLO e CONTE JR et al. (2007)] U ...... 148

FiguraU 34. Esquema de construção do vetor para silenciamento do gene da -galactosidase de Coffea arabica por RNAi. (A) e (B) etapas da construção do vetor de transformação pKANGALRNAi.U ...... 158

FiguraU 35. Sequência de preparo de calos embriogênicos de C. arabica para bombardeamento. (A) calos embriogênicos em meio indutor sólido de calos; (B) calos embriogênicos em meio líquido sob agitação; (C e D) detalhes do crescimento de calos embriogênicos em meio líquido; (E) calos embriogênicos em meio de multiplicação sólido contendo 0,5 M de manitol imediatamente antes de ser bombardeado com o vetor de transformação para silenciamento do gene da -galactosidase; (F) equipamento de transformação por biobalística utilizado na transformação de calos embriogênicos de café (EMBRAPA Recursos Genéticos e

Biotecnologia – Laboratório de Transferência de Genes). U ...... 163

FiguraU 36. Vetor pBI426 utilizado nos testes de expressão transiente do gene uidA para definição dos parâmetros de transformação de calos embriogênicos de C. arabica por biobalística. U ...... 164

FiguraU 37. Expressão transiente do gene gus em calos embriogênicos de C. arabica. (A) controle não bombardeado; (B) calos bombardeados com espermidina; (C e D) calos bombardeados com protamina. Setas indicam pontos azulados devido à expressão da - glucuronidase. Barra: 5 mm.U ...... 165

FiguraU 38. Amostras representativas da curva de seleção de calos embriogênicos de C. arabica submetidos a diferentes concentrações de glufosinato de amônio, após 20 dias de tratamento no escuro. U ...... 166

FiguraU 39. Crescimento de calos embriogênicos de C. arabica transformados com vetor pKANGALRNAi por biobalística em meio de multiplicação de calos (meio CPmod) contendo agente seletivo (5 mg.L-1 de herbicida glufosinato de amônio). (A) calos bombardeados sem regeneração (B) calos bombardeados apresentando setores embriogênicos se multiplicando; setas indicam os calos no 1 e no 2; (C) ampliação do setor embriogênico no 1; (D) ampliação o do setor embriogênico n 2. Barra: 5 mm.U ...... 167

FiguraU 40. PCR dos prováveis calos transgênicos de C. arabica; (+) controle positivo: vetor de transformação pKANGALRNAi; (-) branco: água; (NT) controle negativo: calos não transgênico de C. arabica; (1, 2, 3) prováveis calos transgênicos de C. arabica transformados com o vetor pKANGALRNAi utilizando a técnica de biobalística. U ...... 168

FiguraU 41. Teste imunológico para detecção da proteína PAT utilizando o kit imunológico Trait™ LL Test Strip. (1) Controle positivo: semente transgênica de Zea mays expressando a proteína PAT (não fervida); (2) Controle positivo: semente transgênica de Zea mays expressando a proteína PAT (fervida); (3) Controle negativo: calos de C. arabica não transgênico (não fervido); (4) Controle negativo: calos de C. arabica não transgênico (fervido); (5) Provável calo transgênico no 1 de C. arabica (não fervido); (6) Provável calo transgênico no 1 de C. arabica (fervido); (7) Provável calo transgênico no 2 de C. arabica (fervido); (8) Provável calo transgênico no 3 de C. arabica (fervido). Seta indica reação positiva para a proteína PAT.U ...... 169

FiguraU 42. Alinhamento da sequência de aminoácidos da proteína PAT codificada pelo gene Bar original com a sequência alterada deste gene presente no vetor pKANGALRNAi. Quadro

destaca a diferença entre estas duas sequências de aminoácidos. U ...... 171

LISTA DE TABELAS

TabelaU 1. Códigos utilizados para a identificação das amostras de frutos de C. arabica analisadas quanto à composição bioquímica dos componentes presentes nos diversos estádios de seu desenvolvimento. U ...... 70

TabelaU 2. Composição dos monossacarídeos que constituem as paredes celulares primárias do pericarpo e do endosperma de frutos de Coffea arabica em diferentes fases de desenvolvimento. U ...... 82

TabelaU 3. Rendimentos da extração das frações das amostras de pericarpo e de endosperma de frutos de C. arabica em diversos estádios de maturação (CV: pericarpo de fruto no estádio 4; CMV: pericarpo de fruto no estádio 5; CM: pericarpo de fruto no estádio 7; EV: endosperma de fruto no estádio 4; EMV: endosperma de fruto no estádio 5; EM: endosperma de fruto no estádio 7) U...... 83

TabelaU 4. Resumo geral das classes de polissacarídeos encontrados no pericarpo e no endosperma de frutos de Coffea arabica em três fases de maturação (estádios 4, 5 e 7). U ...... 92

TabelaU 5. Histórico dos métodos de transformação de plantas utilizados em Coffea sp. U ...... 152

TabelaU 6. Resumo geral das classes de polissacarídeos encontrados em frutos de Coffea arabica em diversas fases de maturação, identificando as classes que contém resíduos de galactose na sua estrutura e o respectivo tipo de ligação deste monossacarídeo. U ...... 183

TabelaU 7. Tabela compilada dos polissacarídeos que contém galactose na sua estrutura molecular, juntamente com os níveis de transcrição do gene da -galactosidase e sua respectiva atividade enzimática, expressa em frutos de C. arabica nos estádios de maturação

4, 5 e 7. U ...... 185

SUMÁRIO

SUMÁRIO ...... 16

Introdução Geral e Revisão Bibliográfica ...... 18

Revisão bibliográfica ...... 19 1.1. Café: origem e história ...... 19 1.2. O café e a economia brasileira ...... 21 1.3. Caracterização genética e botânica do cafeeiro ...... 24 1.4. O florescimento e frutificação do cafeeiro ...... 26 1.5. A maturação dos frutos de café: aspectos agronômicos e bioquímicos ...... 26 1.6. As -galactosidases ...... 31 1.7. Caracterização estrutural da parede celular vegetal ...... 32 1.8. Polissacarídeos da parede celular primária de plantas ...... 34 1.9. Silenciamento gênico por RNA interferente ...... 37

Justificativas ...... 39

Hipótese geral da tese ...... 41

Objetivo (geral) ...... 42

Objetivos específicos ...... 42

Referências ...... 43

Capítulo I – Caracterização dos carboidratos da parede primária de frutos de Coffea arabica em diferentes fases de desenvolvimento ...... 49

Introdução ...... 50

Objetivos ...... 56

Material e Métodos ...... 57

Resultados ...... 69

Discussão ...... 93

Referências ...... 98

Capítulo II – Clonagem do gene da -galactosidase e análise molecular e bioquímica da sua expressão durante o desenvolvimento de frutos de Coffea arabica ...... 103

Introdução ...... 104

Objetivos ...... 108

Material e Métodos ...... 108

Resultados e Discussões ...... 116

Referências ...... 138

Capítulo III – Silenciamento do gene da -galactosidase em plantas de Coffea arabica utilizando RNAi (RNA interferente) ...... 144

Introdução ...... 145

Objetivo Geral ...... 154

Objetivos Específicos ...... 155

Material e Métodos ...... 155

Resultados e Discussões ...... 163

Referências ...... 175

Capítulo IV – Discussão Geral e Perspectivas ...... 181

Discussão Geral e Perspectivas ...... 182

Referências ...... 188

Anexo 1 – Sequência do gene da -galactosidase de Coffea arabica depositada no GenBank (NCBI) ...... 191

Anexo 2 – Artigo relacionado com a tese, publicado na Journal of Experimental Botany .... 195

Anexo 3 – Capítulo de livro publicado sobre a aplicação da técnica do RNA interferente na área de fisiologia vegetal ...... 209

18

INTRODUÇÃO GERAL E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

19

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

1.1. CAFÉ: ORIGEM E HISTÓRIA Apesar do consenso de que o centro de origem do café seja a região nordeste do continente Africano na região de Kaffa [(região compreendida entre a Etiópia e o Sudão (LASHERMES et al., 1999)], foram os árabes os responsáveis pela propagação do seu cultivo e sua disseminação, o que resultou na denominação científica da principal espécie de café cultivada, Coffea arabica. O café chegou à Arábia no séc. XIII, de onde foi transferido para a Turquia durante o século XVI. Foi somente no início do século XVII que o café começou a ser conhecido e apreciado na Europa, trazido pelos comerciantes em suas expedições pelo Oriente Médio (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DA INDÚSTRIA DO CAFÉ, 2009). As primeiras mudas foram plantadas no Jardim Botânico de Paris e Jardim Botânico de Amsterdam, mas as condições climáticas européias não eram favoráveis à cafeicultura. Em 1714, os holandeses trouxeram o café para o Novo Mundo, onde o clima se mostrou favorável à cultura, rapidamente espalhando-se pelo continente americano (JOLY e HERMÓGENES, 1979). No Brasil, o café foi introduzido em 1727, inicialmente na região Norte, mais precisamente em Belém, trazido da Guiana Francesa para o Brasil pelo Sargento-Mor Francisco de Mello Palheta a pedido do governador do Maranhão e Grão Pará, que o enviara às Guianas com essa missão. Graças às condições climáticas favoráveis, o cultivo de café rapidamente se espalhou pelas demais regiões brasileiras. O café chegou ao Rio de Janeiro por volta do ano 1760, vindo do Maranhão, plantadas por padres capuchinhos em sua horta. Dessa plantação, mudas e sementes se espalharam pelo atual estado do Rio de Janeiro, tendo a província de Vassouras se transformado na capital do café brasileiro nas primeiras décadas do séc. XIX. O cultivo na atual região de São Paulo começou na década de 1790, onde resplandeceu devido ao trabalho escravo e de imigrantes trazidos pelos fazendeiros paulistas (mais cuidadosos nos tratos culturais com o café), bem como pela excelente qualidade físico- química do solo. Na década de 1860, a produção do vale do Paraíba cresceu tanto que a província de São Paulo passou a ser o principal centro produtor de café do país, com a produção voltada somente para o mercado doméstico (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DA INDÚSTRIA DO CAFÉ, 2009). 20

Num espaço de tempo relativamente curto, o café assumiu a posição de produto-base da economia brasileira. Findo o ciclo da mineração, o ciclo do café durou por quase um século, sendo esse fruto considerado a grande riqueza brasileira. As divisas geradas pela economia cafeeira aceleraram o desenvolvimento do Brasil e o inseriram nas relações comerciais internacionais, possibilitando inclusive o surgimento de cidades e dinamização de importantes centros urbanos por todo o interior do Estado de São Paulo, sul de Minas Gerais e norte do Paraná. Foram construídas ferrovias para permitir o escoamento da produção, substituindo o transporte animal e impulsionando o comércio inter-regional de outras importantes mercadorias. Findo o período da escravatura no Brasil (1888), a cultura cafeeira trouxe grandes contingentes de imigrantes no final do século XIX e início do século XX, vindos principalmente da Europa, consolidando a expansão da classe média, diversificando investimentos e incentivando movimentos culturais. O impacto da cafeicultura na economia brasileira neste período chegou a influenciar de forma significativa o meio político da incipiente República Brasileira com a política do “café com leite”. Esta política foi um acordo firmado entre as oligarquias estaduais e o governo federal durante a República Velha para que os presidentes da República fossem escolhidos entre os políticos de São Paulo e Minas Gerais e a origem deste nome era uma alusão à economia de São Paulo e Minas, grandes produtores de café e leite, respectivamente. Formalmente, a política do café-com-leite teve início em 1898, no governo do paulista Manuel Ferraz de Campos Salles e encerrou-se em 1930, com a chegada de Getúlio Vargas ao poder. Deste período em diante, o café e o povo brasileiro passam a ser indissociáveis. A economia brasileira, dependente da exportação do café no cenário internacional, sofreu fortíssimo abalo com a quebra na bolsa de Nova York em outubro de 1929, modificando o cenário da cafeicultura no Brasil devido à brusca queda do seu preço. Milhões de sacas de café estocadas foram queimadas e milhões de pés de café foram erradicados, na tentativa de estancar a queda contínua de preços provocada pelos excedentes de produção. Quando a economia mundial conseguiu se recuperar do golpe de 1929, o Sudeste do país voltou a crescer, desta vez com perspectivas lastreadas não somente na cafeicultura, mas na indústria que assumia parcelas maiores da economia. Em 1952 foi criado o Instituto Brasileiro do Café (IBC) para controlar a nova crise de superprodução. Na década de 1970, o panorama cafeeiro no Brasil apresentou notável alteração, com São Paulo voltando a liderar a produção e em 1990, durante a política de privatização do governo Fernando Collor de Mello, o IBC foi extinto. O café retomou sua importante posição nas exportações brasileiras e, 21

mesmo perdendo mercado para outros países produtores, o Brasil ainda se mantém como maior produtor de café do mundo. Das suas épocas áureas, ainda nos restaram as sedes das fazendas coloniais, um extenso material técnico-científico, plantações centenárias e o hábito nacional do cafezinho.

1.2. O CAFÉ E A ECONOMIA BRASILEIRA O cafeeiro é uma cultura perene de alto valor sócio-econômico e uma das principais commodities nos diversos países produtores de café, inclusive no Brasil, destacando-se no cenário econômico nacional e internacional como uma commodity e sendo negociada na BM&FBOVESPA (Bolsa de Mercadorias e Futuro – BOVESPA – Brasil) e na Bolsa de Nova Iorque (New York Stock Exchange – EUA). Esta valorização do produto “café” deve-se à demanda do mercado consumidor por esta commodity, cujos grãos são processados para obtenção de bebida de alta aceitação em diversas partes do mundo. Considerando apenas as culturas perenes plantadas no Brasil, segundo os dados do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (BRASIL, 2010) em termos de produção total, a cafeicultura ocupa a terceira posição no cenário nacional, superada apenas pela cultura da laranja e da banana (Figura 1 – A). No entanto, em termos de área plantada, a cafeicultura ocupa uma área de, aproximadamente, 2,3 milhões de hectares, ou seja, três vezes maior que a área plantada com a cultura da laranja (Figura 1 – B).

A 20000 18000 2005 16000 2006 14000 2007 12000 10000 8000

6000 Produção (mil ton) (mil Produção 4000 2000 0 Café Banana Laranja Uva Cacau

B 2500 2005 2000 2006 2007 1500

1000

Área plantada (mil ha) (mil plantada Área 500

0 Café Banana Laranja Uva Cacau A 20000 18000 2005 16000 2006 14000 2007 12000 10000 8000

6000 Produção (mil ton) (mil Produção 4000 2000 22 0 Café Banana Laranja Uva Cacau

B 2500 2005 2000 2006 2007 1500

1000

Área plantada (mil ha) (mil plantada Área 500

0 Café Banana Laranja Uva Cacau

Figura 1. Gráfico representativo da produção de café no Brasil (A) e da área plantada no território nacional (B) nos anos de 2005, 2006 e 2007. [Fonte: Brasil (2010)]

Dentre as diversas espécies de café descritas na literatura, no Brasil aproximadamente 70% da produção total de grãos de café in natura é de Coffea arabica; os demais 30% são de Coffea canephora. Considerando os estados produtores de café, Minas Gerais destaca-se no cenário nacional por ser o principal produtor com, aproximadamente, 50% do total de sacas beneficiadas (BRASIL, 2010) (Figura 2).

0.7% 0.4% 0.5% 1.2% 4.1%

3.8% 4.7% Minas Gerais Espírito Santo São Paulo 8.4% Paraná Bahia 50.3% Rondônia Mato Grosso

25.9% Pará Rio de Janeiro Outros

Figura 2. Gráfico representativo das principais unidades federativas produtoras de café no Brasil na safra de 2009, considerando o número de sacas beneficiadas. [Fonte: Brasil (2010)]

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Segundo o Informe Estatístico do Café, publicado pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (BRASIL, 2010), em 2009, a produção de café no Brasil foi da ordem de 39 milhões de sacas, dos quais 50,5% foram destinados à exportação. Em termos de exportação, estes valores representam, aproximadamente, 6,1% do total de commodities exportado em 2009. Apesar da grande competição no cenário internacional, o Brasil ainda se mantém como o principal país exportador de café (Figura 3), seguido do Vietnã e da Colômbia (BRASIL, 2010; Food and Agriculture Organization of the United Nations, 2010).

Brasil 1% Vietnã 1% 2% 12% Colômbia 3% Indonésia 32% 3% Etiópia Índia 3% México 4% Guatemala Peru 4% Honduras 4% 15% Costa do Marfim 9% Nicaragua 7% El Salvador Outros países

Figura 3. Produção dos principais países produtores de café na safra de 2010. [Fonte: Brasil (2010)]

No mercado interno, o consumo de café teve um incremento crescente desde 1990, passando de 8,4 milhões de sacas em 1990 para 18,2 milhões de sacas de café em 2009, ou seja, mais que dobrou nos últimos 20 anos (ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DA INDÚSTRIA DO CAFÉ, 2009), indicando seu impacto e sua importância para a economia brasileira. Devido ao seu destacado aspecto sócio-econômico, existe um significativo investimento público e privado no agronegócio do café. No setor público nacional, diversos institutos de pesquisa e fundações têm programas direcionados à cultura do cafeeiro como, por exemplo, a Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária voltada à cafeicultura (EMBRAPA Café), o Instituto Agronômico de Campinas (IAC) e o Instituto Agropecuário do Paraná (IAPAR), dentre outras. Além destes, diversas universidades públicas federais como a 24

Universidade Federal de Viçosa (UFV) e a Universidade Federal de Lavras (UFLa) também investem no desenvolvimento científico-tecnológico do cafeeiro. Vale destacar o Projeto Genoma do Café (Brazilian Coffee Genome Project), de cunho nacional e multi-institucional, que visa à formação de um banco de ESTs (Expressed Sequence Tags) de várias espécies de café (C. arabica, C. canephora e C. racemosa) de forma a ampliar os conhecimentos moleculares relacionados com esta cultura, fornecendo subsídios para o melhoramento genético do café. Investimentos significativos na pesquisa da cultura do café no cenário internacional têm sido direcionados visando a ampliação dos conhecimentos na área da genômica desta cultura, dada a sua importância econômica como uma commodity de alto valor. Kochko et al. (2010) faz uma revisão ampla neste tópico que merece a apreciação dos pesquisadores envolvidos na área de genômica do cafeeiro. No âmbito privado nacional, diversas empresas têm concentrado esforços para o aumento da produção e comercialização desta commodity como, por exemplo, a Fundação Procafé, uma entidade privada composta por sindicatos e cooperativas vinculadas ao café. Neste cenário, merece destaque a publicação de um artigo na revista Science em 2010 no qual foi relatado que o Brasil é o país com o maior número de publicações relacionadas com culturas de grande impacto na economia mundial como a cana-de-açúcar, a laranja e o café (REGALADO, 2010). Vale ressaltar que os investimentos em pesquisa na cultura do cafeeiro estão relacionados não somente com o aumento da produtividade e/ou resistência ao ataque de insetos e fitopatógenos, mas também na busca dos fatores genéticos e bioquímicos que poderiam estar relacionados com a qualidade da bebida de café, características estas de elevada importância para o mercado consumidor (LEROY et al., 2006), principalmente porque há uma relação direta entre a qualidade da bebida de café e seu valor de mercado. Em função da destacada importância sócio-econômica desta cultura no cenário nacional e internacional, percebe-se que a cafeicultura representa um dos principais agronegócios de impacto na balança comercial brasileira.

1.3. CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA E BOTÂNICA DO CAFEEIRO O centro de origem genética de Coffea é a região nordeste do continente africano onde estão situados, atualmente, a Etiópia e o Sudão (LASHERMES et al., 1999), de onde se espalhou pelo mundo em função de sua importância econômica por produzir uma bebida altamente apreciada pelo mercado consumidor. 25

Segundo o National Resources Conservation Services (UNITED STATES, 2009), a planta de café apresenta a seguinte classificação taxonômica (Figura 4):

Super-reino Eucariota Reino Viridiplantae Subreino Tracheofita Superdivisão Espermatofita Divisão Magnoliofita Classe Magnoliopsida Subclasse Asteridae Ordem Rubiales Família Rubiaceae Gênero Coffea Espécie Coffea arabica L.

Figura 4. Classificação taxonômica e botânica de Coffea arabica.

Dentro do gênero Coffea estão catalogadas 103 espécies e, considerando apenas as espécies utilizadas na produção de bebida, as mais utilizadas no cenário mundial são Coffea arabica, Coffea canephora e Coffea liberica (DAVIS et al., 2006). No Brasil, as principais espécies cultivadas e que dominam o mercado são Coffea arabica (70%) e Coffea canephora (30%). Estas duas espécies possuem diferenças genéticas e reprodutivas contrastantes: C. arabica é uma espécie alotetraplóide (2n – 4x – 44 cromossomos) e, predominantemente, autógama com, aproximadamente, 90% de autofecundação, enquanto C. canephora e outras espécies de café são diplóides (2n – 2x – 22 cromossomos) e são alógamas obrigatórias, apresentando autoincompatibilidade (FAZUOLI et al., 1999). Esta característica reprodutiva faz com que exista uma maior variabilidade genética em variedades de C. canephora do que em C. arabica, com implicações diretas sobre os programas de melhoramento do cafeeiro. C. arabica é uma planta perene, de porte arbustivo ou arbóreo, caule lenhoso, folhas persistentes e flores hermafroditas. As plantas desta espécie podem atingir 4 m de altura, apresentando ramos ortotrópicos (com crescimento vertical), dos quais se originam ramos plagiotrópicos (com crescimento lateral). Suas folhas são de formato oval, cor verde escura, contendo um pecíolo curto. A raiz de C. arabica é do tipo pivotante profunda, com grande ramificação nas primeiras camadas do solo (GRANER e GODOY-JÚNIOR, 1967). As gemas florais são produzidas nos ramos laterais, produzindo flores de coloração branca.

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1.4. O FLORESCIMENTO E FRUTIFICAÇÃO DO CAFEEIRO As plantas do gênero Coffea apresentam um ciclo fenológico composto por uma fase vegetativa e por uma fase reprodutiva subdividida em gema dormente, gema intumescida, abotoado, florada, pós-florada, chumbinho, expansão dos frutos, grão verde, verde cana, cereja, passa e seco (PEZZOPANE et al., 2003). Considerando a sazonalidade fenológica do café, o florescimento ocorre na primavera, a frutificação no verão, a maturação dos frutos no outono e o repouso no inverno. O órgão da planta de café com interesse comercial é o fruto. Este fruto é do tipo drupa, com duas lojas independentes de polinização, os quais poderão dar origem a duas sementes. Na sua constituição, os frutos apresentam (i) o pericarpo (composto por exocarpo – casca que apresenta a coloração típica do fruto; mesocarpo – polpa ou mucilagem; endocarpo – pergaminho), (ii) película prateada (testa do tegumento) e (iii) endosperma (grão) (ANTUNES FILHO e CARVALHO, 1954). Considerando o florescimento do cafeeiro, merecem destaque os fatores abióticos como fotoperiodismo e temperatura que podem agir como sinalizadores ambientais para a sua indução em plantas sensíveis a estes fatores, coordenando o início da fase reprodutiva (TAIZ e ZEIGER, 2009; VAZ et al., 2008). Entretanto, outros fatores ambientais podem ser considerados sinalizadores ambientais, agindo independentemente ou em conjunto com o fotoperiodismo e/ou temperatura para a indução do florescimento. Na cultura do cafeeiro, um destes fatores ambientais que se destaca é a água, ou melhor, a disponibilidade de água para as plantas após um período de estresse hídrico (déficit hídrico) (ALVIM, 1960). É sabido que o regime hídrico exerce um papel determinante no florescimento do cafeeiro, embora as razões fisiológicas envolvidas ainda não tenham sido elucidadas.

1.5. A MATURAÇÃO DOS FRUTOS DE CAFÉ: ASPECTOS AGRONÔMICOS E BIOQUÍMICOS Apesar de ser um dos principais produtos de exportação, o Brasil vem perdendo mercado devido ao aumento da competitividade do mercado internacional cada vez mais exigente por grãos de café de qualidade superior (CAIXETA, 2001). Além da produtividade, tamanho dos grãos, resistência a pragas e doenças, uma característica de alto interesse do mercado consumidor é a qualidade da bebida do café, com reflexo direto no valor deste produto no mercado. Na área da fisiologia celular e da biologia molecular, pesquisas têm sido feitas buscando elucidar os aspectos bioquímicos e moleculares que estão correlacionados com a qualidade da sua bebida (LEROY et al., 2006). 27

Por outro lado, ao longo das diversas etapas de produção de café (desde o campo até o beneficiamento e estocagem), vários fatores podem afetar a qualidade final dos grãos de café como, por exemplo, a espécie cultivada, as práticas agronômicas de manejo da cultura (controle de pragas e doenças, adubação e irrigação, dentre outras), bem como as condições edafoclimáticas e as práticas de colheita, processamento e beneficiamento dos grãos de café (DE MELLO, 2001). Considerando os fatores fisiológicos do desenvolvimento de frutos de café, a uniformidade de maturação dos frutos no momento da colheita é determinante para a qualidade do produto. Qualidade da bebida de café é uma característica complexa e multifatorial, envolvendo todas as etapas de produção e processamento. Dentre estes fatores, destaca-se como um dos mais difíceis de serem controlados a uniformidade de maturação dos frutos no momento da colheita, a qual está relacionada diretamente com a presença de múltiplas floradas, uma característica marcante desta cultura. Conforme anteriormente mencionado, um dos principais fatores ambientais que afetam o momento do florescimento do cafeeiro é o estresse hídrico que sincroniza o florescimento para poucos dias após a reidratação do cafeeiro após este período de baixa disponibilidade de água para as plantas. Além da florada principal, é comum o cafeeiro apresentar outras floradas sucessivas, dependendo das condições climáticas e da variabilidade genética (RENA e MAESTRI, 1987) que culminam com uma desuniformização da maturação de frutos no momento da colheita (Figura 5).

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A B

C D

Figura 5. Fotos representativas do florescimento e maturação de frutos de C. arabica no campo. (A) Cafeeiro florescendo após a primeira chuva, findo o período de estresse hídrico indutor; (B e C) Cafeeiro com múltiplas florações, apresentando ramos com frutos e flores concomitantemente e (D) Amostragem de uma derriça parcial de frutos de café de um ramo com frutos em diversas fases de maturação.

Além disso, o lento e complexo processo de maturação de frutos pode refletir também, numa desuniformidade de maturação de frutos de café provenientes de uma mesma florada (DE CASTRO e MARRACCINI, 2006) (Figura 6).

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A Exocarpo Mesocarpo

Endocarpo Pericarpo Camadaprateada Endosperma (grão)

B Perisperma Desenvolvimento Endosperma (fase maternal) do endosperma (perisperma = camada prateada)

Divisão celular / Alongamento do perisperma Alongamento celular Maturação do pericarpo Divisão celular do endosperma Fase de armazenamento do endosperma

Figura 6. Esquema representativo do desenvolvimento de frutos de café. (A) Corte transversal de fruto maduro de café; (B) Fases do desenvolvimento de frutos de café ao longo do processo de maturação (Fonte: DE CASTRO e MARRACCINI, 2006).

Desta forma, é comum a presença de frutos de café em diversos estágios de maturação no momento da colheita. Em muitas regiões de Minas Gerais, estado responsável por aproximadamente 50% da produção de café em 2009 (BRASIL, 2010) e de outros estados produtores de café, o relevo acidentado impossibilita a colheita mecanizada e, portanto, toda a colheita é feita manualmente. Isso aumenta os custos de produção e, em função desta desuniformidade de maturação dos frutos, muitos agricultores optam por realizar uma colheita mais tardia utilizando a técnica da derriça total sobre pano. Este procedimento reduz drasticamente a qualidade do café pelo fato de os grãos permanecerem mais tempo no campo, expostos ao ataque de insetos e patógenos e às intempéries, além do contato dos grãos com o solo no momento da colheita, alterando de forma negativa as características organolépticas da bebida do café, depreciando seu valor no mercado internacional. Embora de interesse comercial, a obtenção do sincronismo da maturação de frutos de café de uma mesma floração é uma característica agronômica difícil de ser obtida pelo 30

melhoramento genético tradicional em função do desconhecimento das vias metabólicas que regulam e coordenam este complexo processo. Analisando-se a maturação de frutos, verificamos que é um processo complexo, envolvendo diversas vias metabólicas que resultam não somente da alteração de pigmentação e da consistência dos frutos, mas também da modificação do metabolismo de açúcares, ácidos orgânicos, proteínas e de compostos oriundos do metabolismo secundário que influenciam diretamente nas características organolépticas do café (ROGERS et al., 1999; DE CASTRO e MARRACCINI, 2006). Dentre as modificações nas características físico-químicas que os frutos de café passam durante o seu amadurecimento, merece destaque a alteração da rigidez e da composição da parede celular. Estes parâmetros ocorrem devido à ação de enzimas específicas que hidrolisam os componentes da parede celular dos frutos de café. Apesar das informações a respeito da distribuição espaço-temporal da ação das diversas enzimas que atuam sobre a parede celular e da diversidade de composição da parede celular entre as diversas espécies, especial atenção tem sido dada a culturas-modelo como, por exemplo, tomate (BRUMMELL e HARPSTER, 2001) que tem sido referência para as demais espécies. Investimentos em pesquisa têm sido direcionados para ampliar os conhecimentos sobre o processo de maturação de frutos devido à sua importância comercial na fase de pós- colheita e processamento. Neste sentido, a biologia molecular tem contribuído de forma significativa para ampliar os conhecimentos básicos e aplicados da ação espaço-temporal das enzimas que atuam na parede celular de frutos em maturação, possibilitando não somente a identificação de genes envolvidos neste processo, mas também possibilitando um maior nível de controle do processo per se. Uma das primeiras aplicações utilizando a engenharia genética para controle do processo de maturação de frutos foi realizado em tomate (Lycopersicon esculentum Mill. Ailsa Craig) por meio de silenciamento da expressão do gene da poligalacturonase utilizando a técnica do RNA antisenso (BIRD et al., 1988). Esta pesquisa resultou no lançamento do primeiro produto geneticamente modificado no mercado norte-americano pela empresa Calgene Inc. (Califórnia, EUA), o tomate transgênico Flavr Savr. Este produto foi aprovado pelo FDA (Food and Drug Administration) nos Estados Unidos em 1992 e comercializado a partir de 1994. Embora não tivesse atingido o objetivo proposto que era de aumentar a firmeza dos frutos maduros no momento da colheita, o silenciamento do gene da poligalacturonase aumentou a vida pós-colheita dos frutos de tomate nas prateleiras. 31

Diversos genes envolvidos na síntese de enzimas que atuam diretamente na maturação de frutos têm sido estudados nas mais diversas culturas, dentre eles, as -galactosidases. Smith e Gross (2000) identificaram uma família multigênica composta por sete genes da - galactosidase em tomate, os quais se expressavam distintamente em diversas fases do desenvolvimento da planta e dos frutos. Smith et al. (2002) estudaram a supressão da expressão de um membro da família da -galactosidase em tomate (TBG4) utilizando a técnica do RNA antisenso. Eles observaram que o nível de supressão era variável entre as plantas de tomateiro regeneradas e que uma linhagem de tomateiro geneticamente modificado apresentou firmeza do fruto transgênico 40% maior quando comparado com o controle. Brummell e Harpster (2001) relacionaram uma série destas enzimas e suas atividades em frutos de tomate, indicando que as -galactosidases, juntamente com as expansinas, seriam das primeiras enzimas a serem expressas durante a maturação do tomate, restringindo e/ou controlando a expressão das demais enzimas envolvidas neste processo. Embora haja informações sobre a atividade das -galactosidases na maturação de frutos de café (GOLDEN et al., 1993; SALMONA et al., 2008; JOËT et al., 2009), existe uma carência de informações a respeito de sua participação no sincronismo do processo de maturação destes frutos.

1.6. AS -GALACTOSIDASES As -galactosidases (EC 3.2.1.23) constituem um grupo de enzimas que pertencem à família das glicosil-hidrolases e são caracterizadas por hidrolisarem resíduos terminais não- redutores de resíduos de -D-galactosil a partir de -D-galactosídeos (ESTEBAN et al., 2005). Sua capacidade de liberar galactose de galactolipídeos, de glicoproteínas e de componentes da parede celular durante os processos de expansão celular, senescência e amadurecimento de frutos tem sido identificada na literatura. As -galactosidases são largamente distribuídas em diversos reinos, presentes em bactérias, fungos, plantas e, inclusive, animais. Em bactérias, especificamente em Escherichia coli, têm sido amplamente utilizadas como ferramenta da biologia molecular para a seleção de colônias bacterianas transformadas com o fragmento de DNA de interesse como, por exemplo, nos vetores pGEM (Promega) e nos vetores TOPO (Invitrogen) que utilizam sistema de seleção blue-white screening que, por sua vez, está relacionado com a expressão da -galactosidase codificada pelo gene lacZ. Sambrook e Russell (2001) fazem uma descrição detalhada do uso da -galactosidase em procariotos para clonagem gênica, incluindo não 32

somente informações moleculares, mas também métodos de análise quantitativo e qualitativo da atividade da -galactosidase em E. coli. No campo da engenharia genética de plantas, na fase inicial das pesquisas visando a produção de plantas geneticamente modificadas, o gene da -galactosidase de E. coli foi utilizado como gene marcador heterólogo para identificação de eventos de transformação em girassol e em fumo (HELMER et al., 1984) mas, em função da disponibilidade de outros genes marcadores mais eficientes, seu uso no meio científico foi pouco difundido. A atividade enzimática da -galactosidase foi identificada em diversas plantas superiores como, por exemplo, tomate (SMITH et al., 1998; SMITH et al., 2002), manga (PRASANNA et al., 2005) e, inclusive, café (GOLDEN et al., 1993). Maiores detalhes relacionados com as -galactosidases em plantas serão apresentados no capítulo II desta tese (Caracterização molecular e funcional do gene da -galactosidase em C. arabica).

1.7. CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DA PAREDE CELULAR VEGETAL Genericamente, tem-se a idéia de que a parede celular é apenas um envoltório das células vegetais, dando-lhe uma estrutura tridimensional (definição da forma e do tamanho celular) e conferindo-lhe uma resistência mecânica. No entanto, a parede celular desempenha não apenas estas funções estruturais, mas participa de diversos processos nas células, dentre os quais se destacam: (i) regulação da expansão celular, (ii) participa na sinalização e reconhecimento celular, (iii) pode servir de reservatório de compostos e moléculas reguladoras e sinalizadoras celulares e (iv) pode participar no mecanismo de defesa e reconhecimento contra ataque de microorganismos. Além destes, pode ser acrescentada sua aplicação como produto natural em diversos setores da economia, dentre os quais se destacam a fabricação de papel e celulose, têxteis, fibras de algodão e linho (CARPITA e GIBEAUT, 1993; CARPITA e McCANN, 2000; BUCKERIDGE et al., 2008). Mais recentemente, tem-se aumentado o interesse pela parede celular por sua abundância no reino vegetal e por ser uma potencial fonte para geração de energia (biocombustíveis) (GÍRIO et al., 2010). Diante desta ampla gama de funções e aplicações, Buckeridge e Tiné (2001) destacaram que a compreensão da estrutura química da parede celular, bem como do metabolismo (anabolismo e catabolismo) dos polímeros que compõem a sua estrutura complexa, poderia levar ao desenvolvimento de novas tecnologias para geração de produtos de interesse, possibilitando ao homem a obtenção de benefícios. 33

As técnicas de microscopia possibilitaram uma exploração da estrutura da parede celular, principalmente a microscopia eletrônica. No entanto, estas abordagens elucidam apenas a morfologia da parede celular e não a sua composição bioquímica. Com os avanços tecnológicos de análise bioquímica de alta resolução, principalmente com o uso do HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Performance) e do GC-MS (Cromatografia Gasosa acoplada à Espectrometria de Massa), pode-se verificar que a estrutura da parede celular é complexa e apresenta um comportamento extremamente dinâmico, modificando-se nos diversos estádios de desenvolvimento das plantas como, por exemplo, na expansão celular, na abscisão de folhas e flores, bem como no amadurecimento de frutos (CAMPBELL e BRAAM, 1999). Anatomicamente, nas células vegetais podem ser encontrados dois tipos de parede celular, a depender da função celular e do seu estádio de desenvolvimento: a parede celular primária e a parede celular secundária. Além desta classificação genérica, a análise da parede celular por microscopia eletrônica possibilitou a identificação de três domínios distintos: a lamela média, a parede celular primária e, quando presente, a parede celular secundária (APPEZZATO-DA-GLÓRIA e CARMELLO-GUERREIRO, 2006). A lamela média é a primeira camada depositada na região do apoplasto na fase inicial de formação de uma célula, após a divisão celular. É uma camada extremamente fina composta, principalmente, por substâncias pécticas. Sua função primordial é a união de células adjacentes (CARPITA e McCANN, 2000; TAIZ e ZEIGER, 2009). A parede celular primária é o segundo domínio a ser depositado no apoplasto, após a formação da lamela média. Está presente em todos os tipos celulares vegetais, sendo característico de células jovens e em crescimento, assim como em células metabolicamente ativas. Embora apresentem padrões similares nos diversos tipos celulares, sua ultra-estrutura é altamente variável e relacionada com a função da célula que reveste (CARPITA e McCANN, 2000). Em termos estruturais, na parede celular primária podem ser encontrados três domínios que interagem entre si, a saber: o primeiro domínio é formado por uma rede de celulose e hemicelulose; o segundo domínio, por uma mistura de polissacarídeos pécticos e um terceiro domínio formado por proteínas. A parede celular secundária, por sua vez, não está presente em todos os tipos celulares e, quando presente, é depositada somente após a formação da parede celular primária, ou seja, é a mais interna de todos os domínios da parede celular. Na sua constituição química, além de serem encontradas celulose e hemicelulose, é encontrada a lignina cujos teores podem variar de 15 a 35% (FOSKET, 1994), o que lhe confere uma alta resistência física. A análise ultra- 34

estrutural da parede secundária permite identificar a presença de três camadas: S1 (mais externa), S2 (intermediária) e S3 (mais interna e próxima à plasmalema). Diante desta estrutura particular, a parede celular secundária pode apresentar duas funções distintas: (i) função estrutural, conferindo resistência física às células e (ii) função de reserva, armazenando polissacarídeos na sua matriz, os quais poderão ser utilizados na mobilização de carboidratos para as sementes (BUCKERIDGE et al., 2000).

1.8. POLISSACARÍDEOS DA PAREDE CELULAR PRIMÁRIA DE PLANTAS Bioquimicamente, a parede primária das células vegetais é composta por celulose, hemicelulose e pectina, embora também sejam encontradas proteínas dispersas na parede celular (CARPITA e McCANN, 2000; KERBAUY, 2008). Apesar de fazerem parte da estrutura da parede celular, interagindo entre si na sua matriz, estes grupos de polissacarídeos podem ser individualizados com base nas características bioquímicas das moléculas que os constituem. Desta forma, cada fração pode ser separada das demais em função dos diferentes graus de solubilidade que apresentam (SILVA, 2006), conforme segue:

Extrator Solubilidade do polímero Água Pectinas Alcalino fraco Hemiceluloses fracamente ligadas Alcalino forte Hemiceluloses fortemente ligadas Insolúvel (resíduo) Celulose

Neste aspecto, a solubilidade é importante para distinguir os carboidratos da parede celular que são, relativamente, inertes quanto à sua reatividade química. Esta solubilidade dos polissacarídeos da parede celular é uma característica biológica e físico-química importante para as sementes, além de afetar os produtos primários do café (café torrado e moído e café solúvel), determinando o seu rendimento e, consequentemente, o custo de processamento. No fruto maduro de café, os polissacarídeos compartimentados na espessa parede celular do endosperma, podem ser extraídos por meio de água quente, extrações em soluções de álcali ou tratamento com enzimas (BRADBURY, 2001 citado por SILVA, 2006) e a ordem para liberar esses polímeros da parede celular é arabinogalactano-galactomanano-celulose (SILVA, 2006). Diferentemente da celulose que é um polissacarídeo denominado glucano (formado somente por moléculas de glicose), as hemiceluloses e as pectinas também são 35

polissacarídeos, porém compostos por diversos tipos de monossacarídeos, em uma organização estrutural complexa, formando diversas classes destes polímeros. Diante deste cenário, segue um breve resumo de cada um dos componentes da parede celular primária das células vegetais.

Celulose A celulose representa de 20% a 30% da parede celular primária e, aproximadamente, 40% da parede celular secundária, sendo considerado o composto orgânico mais abundante no mundo (McNEIL et al., 1984). Estruturalmente, a celulose é um polissacarídeo composto por um único tipo de monossacarídeo, a -D-glucopiranose (glicose), ligadas pelos carbonos adjacentes 1 e 4 por ligação glicosídica tipo -D-(14). Esta ligação promove uma inversão de uma glicose a cada dois monossacarídeos (ASPINALL, 1980 citado por AMARAL, 2005), de tal forma que cada molécula de glicose fica disposta em uma rotação de 180º em relação à molécula de glicose adjacente. Esta organização forma a unidade básica da celulose, um dissacarídeo denominado celobiose que se repete inúmeras vezes. A enzima celulose sintetase, localizada na membrana plasmática das células vegetais em complexos protéicos denominados rosetas, é a responsável pelo alongamento das cadeias de celulose que são depositadas no apoplasto, formando microfibrilas que nada mais são do que cadeias lineares de unidades de celubiose repetitivas, dispostas de forma antiparalela (CARPITA e McCANN, 2000; BUCKERIDGE e CAVALARI, 2008). Em função da disposição das hidroxilas das moléculas de glicose, elas formam um grande número de ligações de pontes de hidrogênio, as quais competem com a água de hidratação. Com isso, na formação das microfibrilas, apenas um número reduzido de água permanece no cristal e, consequentemente, forma uma estrutura cristalina compacta e desidratada (KERBAUY, 2008).

Hemiceluloses As hemiceluloses são uma classe formada por polissacarídeos altamente maleáveis e heterogêneos que interagem firmemente com as microfibrilas de celulose por intermédio de pontes de hidrogênio e, em função desta interação, são mais solúveis em solventes alcalinos fortes (2 – 4 M NaOH) (CARPITA e McCANN, 2000; TAIZ e ZEIGER, 2009). Além disto, participam de diversas funções estruturais e bioquímicas relacionadas com o crescimento e desenvolvimento das plantas. 36

Vale destacar que a terminologia “hemicelulose” induz a um equívoco, uma vez que nos impele a imaginarmos a sua estrutura semelhante à celulose, o que não condiz com a realidade. Enquanto as celuloses são estruturalmente simples, bioquimicamente homogêneas e dispostas linearmente formando os microtúbulos, as hemiceluloses são estrutural e bioquimicamente heterogêneas. Este termo foi, inicialmente, proposto para descrever os compostos da parede celular solúveis em solventes alcalinos. As hemiceluloses são formadas por uma cadeia principal linear de xilose, manose ou glicose, unidos por ligações do tipo (1,4), denominado eixo osídico, podendo apresentar ramificações com diversos tipos de monossacarídeos. Quando este eixo central é formado por glicose, recebe a denominação glucano como, por exemplo, os xiloglucanos (uma das principais hemiceluloses encontradas na natureza) possuem o eixo formado por glicose. Quando o eixo central é formado por xilose, recebe a denominação xilano como, por exemplo, os glucuronoarabinoxilanos (outra classe hemicelulósica) que possuem o eixo principal formado por xilose. Existem diversas classes de hemiceluloses, dentre as quais se destacam os xiloglucanos (XG) (mais abundantes em dicotiledôneas), arabinoxilanos e os galactomananos (GM), dentre outros (COSGROVE, 2005).

Pectinas As pectinas, por sua vez, formam uma mistura de polissacarídeos ricos em monossacarídeos ácidos (p.ex. ácido galacturônico) e monossacarídeos neutros (ramnose, galactose e arabinose), além de serem bastante heterogêneas, complexas e ramificadas. Diferentemente das hemiceluloses, as pectinas não interagem fortemente com as microfibrilas de celulose e, portanto, são mais solúveis que as hemicelulose, podendo ser extraídas com água quente ou quelantes de cálcio (TAIZ e ZEIGER, 2009). Vale destacar que as pectinas têm sido classificadas como materiais que podem ser extraídos da parede celular por agentes quelantes de cálcio, EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético) e EGTA (ácido etilenoglicol tetra-acético), influenciando diretamente na porosidade da parede, na adesão célula-a-célula na lamela média, além de fornecer moléculas de reconhecimento para interação com microorganismos fitopatogênicos, simbiontes e de insetos (CARPITA e McCANN, 2000). Estes compostos são polissacarídeos ácidos, com uma cadeia central formada por unidades de ácido D-galacturônico, unidos por ligações do tipo (1,4) (BUCKERIDGE et al., 2008), podendo ou não ser ramificadas. Quando esta cadeia central apresenta ramificações, 37

esta cadeia apresenta não somente unidades de ácido galacturônico, mas também unidades de ramnose, intercalando as unidades de ácido galacturônico, sendo que as ramificações (com galactanos ou arabinanos) ocorrem nas unidades de ramnose. Dentro deste contexto, quantitativamente os três principais grupos de polímeros que compõem as pectinas são: 1 – Homogalacturonanos (HG): são pectinas não ramificadas formadas somente por ácido galacturônico com ligações do tipo (1,4); 2 – Ramnogalacturonanos I (RG I): são pectinas ramificadas com cadeia principal apresentando unidades de ramnose, intercaladas com ácido galacturônico, cujas ramificações ocorrem nas ramnoses. As ramificações com galactanos podem ser com ligações do tipo (1,4) e/ou ligações do tipo 1,3-1,6. As ramificações com arabinanos, por sua vez, são do tipo (1,5) (BUCKERIDGE et al., 2008). 3 – Ramnogalacturonanos II (RG II): normalmente ocorrem em pequena quantidade na parede celular vegetal, com algumas características das pectinas, mas são altamente complexas e não entraremos em detalhes sobre a sua constituição.

Este breve resumo ilustra a complexidade estrutural dos polissacarídeos encontrados na parede primária de células vegetais, mas uma revisão bibliográfica específica e mais detalhada sobre a composição de carboidratos identificados em frutos de café é apresentada no capítulo I desta tese (Caracterização dos carboidratos da parede primária de frutos de Coffea arabica em diferentes fases de desenvolvimento), juntamente com uma análise e discussão de sua composição durante diferentes estádios de sua maturação.

1.9. SILENCIAMENTO GÊNICO POR RNA INTERFERENTE No universo da biologia molecular, apenas o conhecimento da sequência de determinado gene é insuficiente para possibilitar a sua utilização, seja em ciência básica ou aplicada, sendo necessária a identificação da sua função na via metabólica da qual participa. Este é o panorama da genômica funcional que possui o objetivo de identificar a função de genes. Dentre as diversas abordagens utilizadas para se obter esta informação, a supressão parcial ou total de sua expressão é o princípio metodológico mais utilizado no meio científico e, dentre estas, há um aumento significativo no uso da técnica do RNAi (RNA interferente). Resumidamente, esta técnica consiste na formação de pequenos fragmentos de moléculas de RNA entre 21-26 nt (siRNA – small interfering RNA) a partir de fitas duplas de RNA (dsRNA 38

– double stranded RNA) que, por sua vez, é digerida por um complexo protéico chamado DICER (HAMILTON e BAULCOMBE, 1999; BERSTEIN et al., 2001). As fitas de siRNAs são, posteriormente, desenoveladas e uma fita é incorporada no complexo RISC (RNA- induced silencing complex), o qual guia este complexo para um mRNA de sequência complementar, clivando-a e induzindo o silenciamento gênico (MEISTER e TUSCHL, 2004; BAULCOMBE, 2005). O uso da técnica do RNAi para a descoberta e validação da função de determinado gene apresenta vantagens comparativamente com outras abordagens utilizadas com a mesma finalidade, mas precauções devem ser tomadas, uma vez que também existem desvantagens. Small (2007) faz um levantamento dos pontos positivos e negativos da estratégia do RNAi, dos quais destacamos os principais aspectos: Vantagens do uso da técnica do RNAi: 1. RNAi é sequência-específica, possibilitando focar, especificamente, o silenciamento do gene-alvo; 2. RNAi é dominante e, por esta razão, possibilita a identificação de mutantes na geração T1; 3. RNAi pode ser tecido-específico; 4. RNAi pode ser utilizado para regular a expressão de genes que compartilham homologia na sequência genômica alvo, facilitando o estudo de famílias multigênicas; 5. RNAi pode induzir um silenciamento total ou parcial da expressão gênica, produzindo diversos fenótipos mutantes, o que é crucial nos estudos de genes letais; 6. RNAi pode ser utilizado para o silenciamento de genes em genoma poliplóides (LAWRENCE e PIKAARD, 2003; TRAVELLA et al., 2006; FU et al., 2007); 7. Silenciamento por RNAi é estável, podendo seus efeitos serem avaliados na progênie (CARTHEW, 2001); 8. RNAi induz uma resposta sistêmica, induzindo a degradação de mRNA específicos em diversos órgãos/tecidos/células do organismo (HIMBER et al., 2003).

Desvantagens do uso da técnica do RNAi: 1. Embora ainda não descrito em plantas, em animais foram observados os efeitos do silenciamento de genes que não eram alvos do silenciamento (off-target effects) 39

pelo fato de apresentarem homologia com os siRNAs (FEDOROV et al., 2006; KULKARNI et al., 2006); 2. Reduzida penetrância do silenciamento do RNA na progênie (WANG et al., 2005). No entanto, Carthew (2001) e Stoutjesdijk et al. (2002) observaram exatamente o oposto, com um estável silenciamento gênico induzido por RNAi em diversas gerações da progênie. Outro exemplo foi observado por Bonfin et al. (2007) que produziram plantas de Phaseolus vulgaris resistentes ao BGMV (Bean golden mosaic virus) com o silenciamento do gene viral rep, envolvido na replicação do genoma viral. Estes pesquisadores acompanharam o nível de resistência da linhagem 5.1 por diversas gerações e observaram a manutenção desta resistência induzida por RNAi. No entanto, esta controvérsia requer maiores investigações por parte dos pesquisadores que atuam nesta área.

No caso do gene das -galactosidases, a utilização do silenciamento gênico com o uso da técnica do RNAi apresentou-se como a abordagem mais indicada por duas razões: (i) Como as -galactosidases pertencem a uma família multigênica em diversas espécies vegetais (SMITH e GROSS, 2000; TRAINOTTI et al., 2001; TRIANTAFILLIDOU e GEORGATSOS, 2001; AHN et al., 2007;), poderia ser também o fosse na cultura do café (esta suspeita foi confirmada em C. arabica – vide capítulo II desta tese) e; (ii) Como C. arabica é uma espécie alotetraplóide (FAZUOLI et al., 1999), a sua base genética contém múltiplas cópias de um mesmo gene. Desta forma, a utilização da técnica do RNAi para o silenciamento (parcial ou total) do gene da -galactosidase aumentaria a probabilidade de redução da expressão das múltiplas cópias deste gene na planta de café, possibilitando uma avaliação do seu efeito no sincronismo da maturação de frutos desta cultura. Maiores detalhes sobre a técnica do RNAi são abordados no capítulo III desta tese.

JUSTIFICATIVAS As exigências do mercado por produtos de qualidade superior e o aumento de competitividade dos mercados internacionais de café justificam os investimentos no melhoramento do cafeeiro e na busca de tecnologias que proporcionem a obtenção de grãos de café que atendam às expectativas do mercado. 40

Entretanto, pelo fato de o café ser uma cultura perene, os longos ciclos do melhoramento tradicional dificultam a incorporação de características de interesse num reduzido espaço de tempo. Além disso, muitas características não estão disponíveis no genoma da espécie, são multigênicas e/ou são reguladas por estímulos ambientais difíceis de serem controladas em condições de campo. Neste sentido, a biologia molecular tem permitido a obtenção de informações mais precisas sobre os genes envolvidos nas diversas vias bioquímicas de interesse, inclusive na maturação de frutos. Estes conhecimentos poderão ser utilizados para elaborar mecanismos de interferência no processo de forma controlada e num menor espaço de tempo, comparativamente com os métodos tradicionais. Sabe-se que a maturação de frutos é um processo complexo, multigênico, envolvendo várias reações bioquímicas sequenciais controladas espaço-temporalmente, além de ser influenciada por diversos fatores endógenos (p.ex. hormônios) e exógenos (disponibilidade de água, dentre outros). Apesar de sua enorme complexidade, a importância para a pós-colheita de frutos e seu impacto na balança comercial tem justificado investimentos em pesquisas que visam elucidar os processos relacionados com a maturação de frutos. Genes de várias enzimas responsáveis pela hidrólise de componentes da parede celular de frutos de diversas espécies já foram clonados e estudados, inclusive em café (MARRACCINI et al., 2001; MARRACCINI et al., 2005). Apesar disso, há uma carência de informações moleculares a respeito da expressão das -galactosidases e de sua participação na maturação de frutos de café. Em função das -galactosidases comporem uma família multigênica em outras espécies vegetais e devido à falta de informações em Coffea sp. no momento da elaboração desta tese, a utilização da técnica do RNA interferente (RNAi) apresentou-se como a mais promissora pelo fato de possibilitar a supressão, parcial ou total, de todos os membros desta provável família multigênica em cafeeiro. Em função dessa carência de informações sobre as -galactosidases expressas em café e da sua possível participação no processo de maturação dos frutos do cafeeiro, um grupo de pesquisa da EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia (Brasília/DF), liderado pelo Dr. Francisco J. L. Aragão, iniciou os estudos para a clonagem e silenciamento deste gene, utilizado a técnica do RNAi, em café. Assim sendo, a proposta da presente tese é clonar e sequenciar o gene da - galactosidase de C. arabica, caracterizando sua expressão molecular e bioquímica ao longo 41

do desenvolvimento de frutos de café, bem como avaliar o efeito do seu silenciamento por RNA interferente (RNAi) sobre a maturação dos frutos de café. Essas informações são essenciais para o projeto Genoma-Café (programa multi-institucional sob coordenação da EMBRAPA/Café) que tem por objetivo não somente sequenciar os ESTs (Expressed Sequence Tags) do banco de cDNAs já coletados do cafeeiro, mas também identificar as suas funções (genômica funcional). Além disso, se o silenciamento do gene da -galactosidase propiciar uma maior uniformidade dos frutos de café, estas linhagens de café poderão ser incorporadas em programas de melhoramento tradicional da cultura visando a introgressão desta característica para cultivares de interesse, abrindo perspectivas de interferência direcionada sobre a maturação de frutos de café no momento da colheita, respeitadas as normas da CTNBio (Comissão Técnica Nacional de Biossegurança). Do ponto de vista aplicado, esta característica poderá contribuir para a produção de frutos de café de qualidade superior, podendo vir a ter impacto na balança comercial do Brasil. A proposta original deste projeto não foi desvendar os aspectos moleculares ou bioquímicos do florescimento do cafeeiro, mas compreender a participação do gene da - galactosidase no processo de maturação de frutos de café o qual poderá, eventualmente, vir a ser utilizado na biotecnologia da cultura do cafeeiro com potencial de ser incorporado em programas de melhoramento desta cultura.

HIPÓTESE GERAL DA TESE Ciente da complexidade do processo de maturação de frutos e da elevada atividade enzimática da -galactosidase na fase madura de frutos de C. arabica (GOLDEN et al., 1993), a redução da expressão do gene da -galactosidase pode reduzir a velocidade de sua maturação nesta fase, possibilitando sincronizar a maturação de seus frutos (aumentar a uniformidade dos frutos de café) no momento da colheita, com impacto positivo na qualidade do café para produção de bebida. Em se confirmando esta hipótese, dois benefícios poderiam ser obtidos: (i) para o agricultor, aumentaria o período de colheita do café, reduzindo o efeito da sazonalidade da mão-de-obra no momento da colheita e (ii) a depender do momento deste silenciamento, reduzir a diferença da maturação de frutos de diferentes floradas e, consequentemente, aumentar a uniformidade de frutos no momento da colheita. Esta redução da desuniformidade dos frutos poderia aumentar a percentagem de frutos maduros de café no momento da 42

colheita, colaborando para um aumento na qualidade da bebida e redução do custo da colheita manual. Esta hipótese está baseada nos seguintes resultados: (i) Brummell e Harpster (2001) relacionaram uma série destas enzimas e suas atividades em frutos de tomate, indicando que as -galactosidases, juntamente com as expansinas, seriam uma das primeiras enzimas a ser expressa durante a maturação do tomate, restringindo e/ou controlando a expressão das demais enzimas envolvidas neste processo e (ii) Smith et al. (2002) silenciaram, usando RNA antisenso, a isoforma TBG4 do gene da -galactosidase em frutos de tomate e observaram uma maior firmeza dos frutos, aumentando a vida pós-colheita destes.

OBJETIVO (GERAL) Clonar o gene da -galactosidase expressa em frutos de C. arabica e caracterizar sua funcionalidade nos frutos espaço-temporalmente, avaliando o efeito do seu silenciamento na maturação de frutos de café.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS Os objetivos específicos são: (1) Caracterizar a composição de carboidratos da parede celular primária de frutos de Coffea arabica (do pericarpo e do endosperma, separadamente) em três fases distintas de desenvolvimento (verde, intermediário e maduro). Estas informações serão confrontadas, no futuro, com o perfil de carboidratos de frutos de café com o gene da -galactosidase silenciada (total ou parcialmente); (2) Clonar e sequenciar o gene da -galactosidase de C. arabica, bem como obter uma caracterização funcional (molecular e bioquímica) da sua expressão em frutos de café ao longo do processo de maturação no pericarpo e no endosperma, separadamente; (3) Silenciar a expressão do gene da -galactosidase por RNAi (RNA interferente) em C. arabica, utilizando a técnica de transformação de plantas por biobalística.

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CAPÍTULO I – CARACTERIZAÇÃO DOS CARBOIDRATOS DA PAREDE PRIMÁRIA DE FRUTOS DE COFFEA ARABICA EM DIFERENTES FASES DE DESENVOLVIMENTO

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INTRODUÇÃO

A composição química dos grãos de café é altamente complexa, envolvendo substâncias voláteis e não voláteis de diversos metabólitos como, por exemplo, proteínas, lipídeos, carboidratos, alcalóides, diterpenos, ácidos orgânicos, flavonóides, minerais e vitaminas, dentre outros (MAZZAFERA, 1999; ROGERS et al., 1999). Dentre os diversos fatores bioquímicos que estão relacionados com a qualidade da bebida de café, destacam-se os carboidratos. Existe um consenso na literatura de que os carboidratos presentes na parede celular primária de seus frutos correspondem de 48 a 60% do peso da matéria seca (WOLFROM et al., 1960 e WOLFROM et al., 1961, citados por BRADBURY e HALLIDAY, 1990; REDGWELL et al., 2002). Ou seja, em termos quantitativos, os polissacarídeos são os principais componentes de grãos de café in natura e torrados, mas em termos qualitativos, a composição destes carboidratos é variável a depender da espécie (FISCHER et al., 2001), das fases de crescimento e desenvolvimento dos grãos ao longo do processo de sua maturação (ROGERS et al., 1999), além de sofrerem modificações durante o seu processamento industrial (NUNES e COIMBRA, 2002; OOSTERVELD et al., 2003; MARTINS et al., 2005), influenciando de forma significativa as características organolépticas da sua bebida. Apesar da grande quantidade de informações disponíveis na literatura científica, a complexidade bioquímica e estrutural dos diversos tipos de polissacarídeos que fazem parte da constituição da parede celular vegetal extrapola as expectativas iniciais. Esta complexidade traz dificuldades inerentes para sua caracterização, principalmente quando se consideram as inter-relações das vias metabólicas que participam da sua síntese, deposição, degradação e modificações ao longo das fases de crescimento e desenvolvimento celular (WILLATS et al., 2001; COSGROVE, 2005; SEIFERT e ROBERTS, 2007; KONG, 2009; SCHELLER e ULVSKOV, 2010). Considerando o produto final da cafeicultura que é a bebida de café, a extração de carboidratos durante processamento industrial de seus grãos é considerada um fator crítico na determinação do rendimento do café solúvel (NUNES e COIMBRA, 1998; MARTINS et al., 2005; REDGWELL e FISCHER, 2006). Ainda, a dificuldade de solubilização de polissacarídeos presentes nos grãos de café estão envolvidos na formação de sedimentos na bebida (BRADBURY e ATKINS, 1997 citados por REDGWELL et al., 2002), afetando a sua qualidade. Desta forma, não é nenhuma surpresa que pesquisas direcionadas para a 51

compreensão da natureza e propriedades dos polissacarídeos presentes nos grãos de café in natura e processados vêm sendo conduzidas por mais de 40 anos. As primeiras publicações relacionadas com a identificação dos polissacarídeos presentes em frutos de café datam do início da década de 1960 com os trabalhos de Wolfrom et al. (1960, 1961), citados por Bradbury e Halliday (1990). Dentre os diversos carboidratos presentes na parede celular, os arabinogalactanos, os galactomananos e a celulose têm sido identificados como sendo as formas predominantes em frutos de café (BRADBURY e HALLIDAY, 1990; FISCHER et al., 2001; REDGWELL et al., 2002). Além destes polissacarídeos, Oosterveld et al. (2003) identificaram a presença de xiloglucanos na parede celular de grãos de café. Os arabinogalactanos são uma das diversas classes das pectinas cujos polímeros são formados por uma cadeia principal composta por monômeros de galactose com ligações do tipo (16), apresentando ramificações na posição O-6 com ligações do tipo (13), com cadeias laterais constituídas por resíduos de arabinose e/ou galactose (FISCHER et al., 2001; KONG, 2009). Segundo Bradbury (2001) (citado por SILVA, 2006), os arabinogalactanos podem ser solubilizados em água quente mas, no entanto, estes podem não ser completamente extraídos nestas condições, sugerindo que podem estar intimamente associados a outros componentes da parede celular. Redgwell et al. (2002) concluíram que grande parte dos arabinogalactanos presentes nos grãos de café estão associados a proteínas, formando complexo arabinogalactano-proteínas (AGPs). Estes complexos seriam uma mistura altamente heterogênea, contendo de 6 a 10% de ácido glucurônico (Figura 7).

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Figura 7. Esquema estrutural proposto para uma pectina da classe de arabinogalactanos de Coffea arabica (Fonte: REDGWELL et al., 2002).

Depois da celulose, os mananos (que também são da classe das hemiceluloses) são os polímeros mais difíceis de serem solubilizados e esta característica é considerada um fator crítico na produção de café solúvel durante a extração comercial (CLIFFORD, 1985, citado por REDGWELL e FISCHER, 2006). Os galactomananos são uma classe dos mananos, sendo considerados polissacarídeos de reserva da parede celular que, estruturalmente, são constituídos de uma cadeia principal formada por resíduos de manoses unidos por ligações do tipo (14), nos quais estão ligados resíduos monoméricos de galactose na posição O-6 das unidades de manoses, unidas por ligações (16), em intervalos variados e dispersos ao longo desta cadeia principal (BUCKERIDGE et al., 2000) (Figura 8). Segundo Bradbury e Halliday (1990), este polissacarídeo constitui de 20-30% (m/m) do peso seco de grãos de café Arábica e Robusta. Considerando a solubilidade dos galactomananos, um dos principais fatores que afetam esta característica é a frequência de substituição nos mananos presentes na cadeia principal com resíduos de galactose. Teoricamente, o aumento no grau de galactosilação de mananos pode aumentar o grau de solubilização destes (REDGWELL e FISCHER, 2006). Sabe-se que em algumas plantas, o grau de galactosilação final é determinado pela ação das -galactosidases que clivam resíduos de galactose de produtos sintéticos em condições in vitro. Se este mecanismo estiver presente em grãos de café, a diminuição da 53

expressão do gene das -galactosidases poderia resultar em grãos de café com maior razão Gal/Man, aumentando sua solubilidade.

Figura 8. Esquema da estrutura da hemicelulose do tipo galactomananos encontrada na parede celular primária das plantas (Fonte: CARPITA e McCANN, 2000).

Os xiloglucanos, por sua vez, são uma das principais hemiceluloses encontradas nas paredes celulares das angiospermas, formada por uma cadeia principal de monômeros de glicose unidos por ligações (14) com diversas unidades de xilose ligadas na posição O-6 das glicoses. Em algumas espécies, além das ramificações de xilose, podem ser encontradas também unidades de galactose e de fucose (BUCKERIDGE et al., 2000; CARPITA e McCANN, 2000; SCHELLER e ULVSKOV, 2010) (Figura 9).

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Figura 9. Esquema da estrutura da hemicelulose do tipo xiloglucano encontrada na parede celular primária das plantas (Fonte: CARPITA e McCANN, 2000).

A caracterização dos polissacarídeos ao longo do desenvolvimento de frutos de café são informações importantes, não somente por afetar diretamente a composição final dos grãos de café, mas por servirem de base para elucidação das vias metabólicas envolvendo estes compostos, propiciando a identificação de possíveis alvos para o melhoramento de características importantes para a qualidade do café. Com o enfoque de evolução de compostos presentes em frutos de café, Rogers et al. (1999) caracterizaram diversos componentes bioquímicos presentes em frutos de café, dentre estes alguns monossacarídeos (arabinose, xilose, galactose, frutose e glicose) e oligossacarídeos (sacarose, rafinose e estaquiose) ao longo do desenvolvimento de frutos de café, tanto em Coffea arabica quanto em Coffea canephora. No entanto, estes autores não avaliaram a composição dos monossacarídeos na parede celular dos frutos de café. Especificamente relacionado com polissacarídeos presentes na parede primária de frutos de café, Redgwell et al. (2003) caracterizaram os galactomananos de endosperma de grãos de café com 11, 15, 21, 26, 31 e 37 SAF (semanas após o florescimento). Nos estádios iniciais de desenvolvimento, aproximadamente 10% dos polissacarídeos eram compostos por galactomananos altamente substituídos (ramificados), na relação galactose:manose (Gal:Man) 55

entre 1:2 e 1:7. Nos estádios mais maduros, aproximadamente 50% dos polissacarídeos encontrados no endosperma era composto por galactomanano, mas o grau de substituição diminuiu e a relação Gal:Man ficou entre 1:7 e 1:40. Os autores concluíram que a relação final de Gal:Man era o resultado, embora parcial, da remoção de galactose por uma enzima específica da parede celular vegetal, no caso uma -galactosidase. Pouco se sabe a respeito das modificações estruturais que ocorrem na parede celular de grãos de café durante seu desenvolvimento. Redgwell et al. (2003) analisaram a variação na relação galactose:manose durante o desenvolvimento de frutos de café, caracterizando o perfil de monossacarídeos da parede celular do endosperma em diversas fases de desenvolvimento e propuseram que a arabinose e a galactose eram derivadas, principalmente, de arabinogalactanos e que a ramnose e ácido galacturônico eram componentes estruturais dos polissacarídeos pécticos. Estes autores identificaram que a razão Gal/Ara dos arabinogalactanos nas fases iniciais de crescimento era de 1.3:1, aumentando gradativamente durante o crescimento dos grãos, atingindo a relação 2.6:1 na maturidade. Além disso, os arabinogalactanos correspondiam a, aproximadamente, 50% do total de polissacarídeos nas fases iniciais de crescimento, decrescendo para 34% nos frutos completamente maduros. No caso dos polissacarídeos pécticos, nas fases iniciais de crescimento, o endosperma era composto por, aproximadamente, 20% do seu peso com estes polissacarídeos, os quais decresciam drasticamente na maturidade para, aproximadamente, 4%. Estes resultados são esperados, uma vez que, nas fases iniciais de rápido crescimento e divisão celular, as placas de divisão celular são ricas em polímeros pécticos. Resumidamente, durante o crescimento e desenvolvimento da parede celular de grãos de café há uma mudança progressiva na composição relativa dos diferentes tipos de polissacarídeos e nas suas características estruturais. Nas fases iniciais de crescimento dos frutos de café, a celulose e arabinogalactanos parecem ser os principais produtos sintetizados na parede celular das células do endosperma, com preponderância da celulose (FISCHER et al., 1999). Durante as fases intermediárias de crescimento, há uma alteração neste padrão inicialmente observado e a síntese de celulose parece cessar, com um concomitante aumento progressivo na síntese de mananos (principalmente galactomananos), comparativamente com outros polissacarídeos da parede celular à medida que os grãos aproximam-se da maturação. Além disso, durante o desenvolvimento do grão de café, o endosperma gradativamente substitui o tecido de origem materna, o perisperma (ROGERS et al., 1999; EIRA et al., 2006) 56

sendo que, na fase madura, o endosperma apresenta uma parede celular espessa e complexa, cujos polissacarídeos são difíceis de serem solubilizados em água quente, por extração química ou por tratamento enzimático (BRADBURY, 2001, citado por SILVA, 2006). Resumindo esta complexa bioquímica de polissacarídeos localizados nas paredes celulares vegetais, em grãos maduros de café in natura, foram identificadas a presença de galactomananos, arabinogalactanos e pectinas (REDGWELL et al., 2002), com a predominância da fração composta por galactomananos (aproximadamente 50% dos carbiodratos), seguido de arabinogalactanos (aproximadamente 30%), da fração celulósica (aproximadamente 15%) e de pectinas (aproximadamente 5%). Apesar de existirem diversas publicações caracterizando bioquimicamente e estruturalmente as diversas classes de carboidratos presentes nas paredes celulares de grãos de café, a grande maioria dos trabalhos está relacionada com grãos maduros in natura (endosperma de frutos de café) em função da sua importância comercial (FISCHER et al., 1999; MAZZAFERA, 1999; BUCKERIDGE et al., 2000; FISCHER et al., 2001; NUNES e COIMBRA, 2002; REDGWELL et al., 2003; DE CASTRO e MARRACCINI, 2006; REDGWELL e FISCHER, 2006). No entanto, são escassas as informações relacionadas com a modulação destes componentes na parede celular de frutos de café ao longo do seu processo de desenvolvimento e maturação. Além disso, mais escassas ainda são as informações relacionadas com a caracterização dos polissacarídeos presentes no pericarpo de frutos de café, uma vez que esta parte é descartada durante o processo de despolpa destes frutos e não apresentam interesse comercial. Além disto, percebe-se que existe uma lacuna de informações referentes à evolução dos monossacarídeos que compõem os polissacarídeos presentes na parede celular de frutos de café durante sua maturação, não somente no endosperma, mas também no que se refere aos que se localizam nos seus pericarpos.

OBJETIVOS Em função do levantamento do estado-da-arte dos polissacarídeos identificados em frutos de café, o objetivo deste capítulo foi fazer a caracterização quantitativa e qualitativa da composição de diversas classes de compostos bioquímicos (lipídeos, proteínas, açúcares solúveis totais, ácidos urônicos, amido, celulose e monossacarídeos) presentes no pericarpo e no endosperma de frutos de C. arabica em fases distintas de desenvolvimento, com ênfase 57

nos polissacarídeos que compõem a parede celular primária destes frutos, avaliando seus perfis de distribuição espaço-temporal durante o processo de maturação de frutos de café e; Vale ressaltar que estas informações serão cruciais no futuro próximo, uma vez que faz parte desta linha de pesquisa o silenciamento da expressão do gene da -galactosidase em C. arabica (vide Capítulo III), avaliando o seu efeito sobre desenvolvimento da planta de café e de seus frutos. A composição da parede celular primária dos frutos da planta de café transgênicos que apresentarem o silenciamento do gene da -galactosidase será analisada seguindo os mesmos procedimentos descritos na seção “Material e Métodos” deste capítulo e o perfil da composição de carboidratos de frutos de café transgênico será comparado com o perfil de carboidratos de café não-transgênico, buscando compreender o efeito do silenciamento deste gene na composição de carboidratos da parede celular de frutos de café em suas diversas fases de desenvolvimento.

MATERIAL E MÉTODOS 1. Material vegetal Frutos de Coffea arabica cv Catuai Vermelho 86 em diversos estágios de desenvolvimento foram, manualmente, coletados no campo de experimento da EMBRAPA Cerrados (Brasília/DF). Os frutos foram separados e classificados em oito fases distintas de desenvolvimento conforme o tamanho do fruto e a coloração do pericarpo (Figura 10 – A). Imediatamente após a coleta dos frutos no campo, os pericarpos foram separados dos endospermas, pesados em amostras de 1 a 2 g de matéria fresca, envoltos individualmente em papel alumínio, identificados, imersos em nitrogênio líquido e armazenados a -80oC. Desta classificação foram selecionados para análises bioquímicas de carboidratos frutos na fase 4 (fruto imaturo verde completamente desenvolvido), frutos na fase 5 (frutos na transição entre a fase verde e madura, com pericarpo amarelado/avermelhado) e frutos na fase 7 (frutos completamente maduros) (Figura 10 – B). Amostras de pericarpos e de endospermas de cada uma das três fases selecionadas contendo, aproximadamente, 2 g de matéria fresca foram liofilizadas por 48 h, seguidas de maceração em nitrogênio líquido e armazenadas em tubos de Falcon (15 mL) em dessecador até o momento da análise.

2. Análise da fração lipídica Para a quantificação da fase apolar contendo os lipídeos, optou-se pelo método gravimétrico. Aproximadamente 100 mg de amostras pulverizadas de endospermas e 58

pericarpos de cada fase de desenvolvimento de frutos de café foram transferidas para tubos de Falcon (50 mL), previamente pesados em balança de precisão digital Shimadzu AWU220 (Shimadzu Scientific Instruments, EUA). A extração de lipídeos foi feita baseada no procedimento proposto por Oosterveld et al. (2003) com modificações (não foi utilizado o equipamento Soxhlet por 6 h). Foram adicionados 25 mL do solvente apolar éter de petróleo a cada amostra, as quais foram rapidamente homogeneizadas em vórtex e submetidas à agitação de 200 rpm no Incubator Shaker Series I26 (New Brunswick Scientific, EUA) a 50oC durante 16 h. Após este período, foram adicionados 25 mL de etanol 80% (v/v) por amostras, que foram homogeneizadas rapidamente em vórtex e, novamente, submetidas à agitação a 50oC por 24 h. Após este período, as amostras foram transferidas, individualmente, para funis de separação de 125 mL e deixadas em repouso por 10-15 min à temperatura ambiente. Nesta etapa houve a formação de duas fases distintas: a fase superior (etérica) contendo os componentes apolares e a fase inferior (etílica) contendo os componentes polares e sedimentos. Cada fase foi coletada, separadamente, em tubos Falcon de 50 mL. Os funis de separação foram lavados com éter etílico para remoção de eventuais resíduos, os quais foram coletados juntamente com a fase etérica. Os tubos contendo a fase etérica (apolar) foram destampados e deixados em repouso dentro da capela de exaustão, à temperatura ambiente, por, aproximadamente, 5 dias até a completa evaporação do solvente. Posteriormente, estas amostras foram transferidas para uma incubadora com temperatura de 37oC, sem tampa, com pesagens periódicas até a não alteração do peso das amostras. Foram feitas duas repetições biológicas por amostra.

3. Extração e análise de AST (açúcares solúveis totais) Para a extração de AST, as amostras da fase etílica (composta pelo solvente etanol 80%) foram transferidas para estufa com temperatura de 70oC por, 48-72 h para redução do volume do solvente para, aproximadamente, 8 mL/amostra. As amostras foram transferidas, individualmente, para tubos Corex de 15 mL, homogeneizadas em vórtex e colocadas em banho-maria a 80oC por 4 h, com agitação periódica a cada 60 min, seguida de centrifugação a 8385 g por 10 min à temperatura ambiente. Os sobrenadantes foram coletados individualmente e os precipitados foram submetidos a três ciclos consecutivos de extração de AST da seguinte forma: foram adicionados 5 mL de etanol 80% (v/v) por amostra, as quais foram homogeneizadas em vórtex e colocadas em banho-maria a 80oC por 30 min, seguida de centrifugação a 8385 g por 10 min à temperatura ambiente. Os quatro sobrenadantes de cada 59

extração etílica de cada amostra foram coletados num mesmo pool, os volumes dos sobrenadantes foram medidos e armazenados a 4oC até o momento de análise. Os precipitados foram secos em estufa a 55oC por 24 h para completa evaporação do etanol. A quantificação de AST foi feita em placa de 96 poços segundo Masuko et al. (2005), a qual é baseada no método padrão do fenol-sulfúrico para quantificação de ASTs proposta por Dubois et al. (1956). Foi construída uma curva padrão utilizando glicose na concentração estoque de 0,75 mg.mL-1 com as quantidades 0, 20, 40, 60 e 80 g de glicose por ponto, analisados em triplicata. Para análise das amostras de ASTs do pericarpo e do endosperma de frutos de café, cada amostra foi composta por duas repetições, sendo cada repetição analisada em triplicata. Resumidamente, de cada pool do sobrenadante (extrato etílico) de cada amostra foi coletado o volume de 50 L (ajustando o volume da amostra e o volume de água a fim de permitir a estimativa da quantidade de AST dentro dos limites da curva padrão), acrescentando 150 L de ácido sulfúrico concentrado e homogeneizando com pipetagens consecutivas. Em seguida, foram adicionados 30 L de fenol 5% (v/v) e homogeneizado conforme anteriormente mencionado. Após este procedimento, a placa foi transferida para estufa a 90oC por 5 min e imediatamente transferida para geladeira por 5 min até as amostras atingirem a temperatura ambiente, seguido na leitura da absorbância a 490 nm utilizando o iMark™ Microplate Reader (BioRad, EUA).

4. Análise de amido Para análise dos teores de amido em, aproximadamente 10 mg das amostras de café (pericarpo e endosperma, separadamente) foi utilizado o método proposto por Amaral et al. (2007). Inicialmente foi feita a extração de AST deste material pelo método do etanol 80% conforme descrição a seguir: as amostras foram colocadas em tubos de microcentrífuga de 2000 L, às quais foram adicionados 500 L de etanol 80% (v/v), homogeneizadas em vórtex e incubadas a 80oC em banho-maria por 20 min, seguido de centrifugação a 12.470 g por 10 min à temperatura ambiente. O sobrenadante de cada amostra foi coletado, individualmente, em tubo à parte e o precipitado foi submetido ao mesmo procedimento acima citado por mais três vezes, sendo que os sobrenadantes de cada fase de extração foram acondicionados no respectivo tubo de cada amostra e armazenados a 4oC. Posteriormente, o precipitado foi seco à temperatura ambiente por 48 h e submetido à digestão enzimática: 500 L de solução de - amilase (120 U.mL-1) (MEGAZYME, Irlanda) foi preparado na hora de uso, diluído em tampão MOPS 10 mM pH 6,5, homogeneizado em vórtex e incubado em banho-maria a 75oC 60

por 30 min. Após este período, foram adicionados a cada amostra mais 500 L da solução de -amilase (120 U.mL-1), homogeneizado em vórtex e incubado, novamente, em banho-maria a 75oC por 30 min, totalizando 120 U de enzima por amostra. As amostras foram resfriadas a 50oC, às quais foram adicionados 500 L de solução de amiloglucosidase (AMG) (30 U.mL-1) (MEGAZYME, Irlanda), preparada na hora de uso, diluída em tampão acetato de sódio 100 mM pH 4,5. As amostras foram homogeneizadas em vórtex e incubadas em banho-maria a 50oC por 30 min. Após este período, a cada amostra foram, novamente, adicionados 500 L de solução de amiloglucosidase (AMG) (30 U.mL-1), homogeneizadas em vórtex e incubadas em banho-maria a 50oC por 30 min. Ao término deste período, foram adicionados 100 L de ácido perclórico 0,8 M a cada amostra para parar a reação. Posteriormente as amostras foram centrifugadas a 12.470 g por 5 min à temperatura ambiente. Os sobrenadantes contendo a fase a ser analisada foram coletados à parte e o precipitado foi descartado. A dosagem de amido foi feita pela quantificação de glicose liberada após as digestões enzimáticas. Para isto, foram acondicionados 20 L de cada sobrenadante em placa de ELISA, individualmente, aos quais foram adicionados 300 L do Reagente Glicose PAP Liquiform (CENTERLAB, Brasil) composto pelas enzimas glicose-oxidase (11000 U.mL-1) e peroxidase (700 U.mL-1), 290 mol.L-1 de 4-aminoantipirina e 50 mM de fenol pH 7,5. Após a incubação da reação a 37oC por 15 min, a quantidade de glicose foi determinada por espectrofotometria usando a absorbância com o comprimento de onda 490 nm. Cada amostra foi analisada em triplicata. Em paralelo foi construída uma curva padrão de glicose nas concentrações de 0; 2,5; 5,0; 7,5 e 10 g.mL-1, sendo cada ponto da curva padrão feito em triplicata.

5. Extração de arabinogalactanos e galactomananos das amostras Após a secagem dos precipitados à temperatura ambiente por 48 h para completa evaporação do etanol, foram adicionados 10 mL de água destilada por amostra, misturados vigorosamente para homogeneização e colocados em banho-maria a 80oC por 8 h, seguido do armazenamento a 4oC por 12 h. Posteriormente, as amostras foram centrifugadas a 8385 g por 10 min à temperatura ambiente, coletando-se o sobrenadante. Ao precipitado foram adicionados mais 10 mL de água destilada, repetindo-se o tratamento por temperatura previamente descrito. O sobrenadante obtido na segunda extração aquosa foi colocado juntamente com o primeiro sobrenadante e armazenados na geladeira até o momento da análise. 61

6. Extração e quantificação de proteínas Após a extração dos arabinogalactanos e galactomananos, aos precipitados de cada amostra de pericarpo e de endosperma de frutos de café foram adicionados 5 mL de tampão fosfato (PBS) pH 7,4 e homogeneizado em vórtex. As amostras foram colocadas em rotor vertical na velocidade de 3 rpm por 3 h a 4oC (câmara fria), seguida de centrifugação a 8385 g por 10 min à temperatura ambiente. Os sobrenadantes foram coletados e aos precipitados foram adicionados 5 mL de água destilada, homogeneizados em vórtex e colocados em rotor vertical na velocidade de 3 rpm por 3 h a 4oC (câmara fria), seguida de centrifugação a 8385 g por 10 min à temperatura ambiente. O sobrenadante desta segunda extração foi acondicionado juntamente com o sobrenadante de extração com tampão PBS e armazenados na geladeira até o momento da análise. Os precipitados foram, em seguida, liofilizados e pesados. A quantificação das proteínas presentes nos sobrenadantes das amostras do pericarpo e do endosperma de frutos de C. arabica em fases distintas de maturação foi feita pelo método de Bradford (BRADFORD, 1976) usando BSA (albumina soro bovina) como padrão. O protocolo foi adaptado para microplacas de 96 poços, ajustando o volume final para 200L e a leitura da absorbância a 595 nm foi feita no equipamento iMark™ Microplate Reader (BioRad, EUA), com três repetições por amostra.

7. Fracionamento da parede celular primária Após a extração do amido das amostras do pericarpo e do endosperma de frutos de café, foi feito o fracionamento sequencial da parede celular primária com os extratores oxalato de amônio 0,5 % (m/v) pH 7,0, NaOH 0,1 M, NaOH 1 M, NaOH 4 M e NaOH 8 M da seguinte forma: foram adicionados 8 mL do extrator aos precipitados que foram, a seguir, homogeneizados em vórtex e submetidos à fervura por 1 h (com agitação periódica a cada 15 min). Após o tratamento térmico, as amostras foram resfriadas à temperatura ambiente e centrifugadas a 8385 g por 10 min à temperatura ambiente. Os sobrenadantes foram coletados e os precipitados foram novamente extraídos com 8 mL do mesmo extrator, conforme anteriormente mencionado. Os sobrenadantes da segunda extração foram acondicionados juntamente com os sobrenadantes da primeira extração e foram, imediatamente, neutralizados com solução de NaOH 50% (m/v) e ácido acético glacial, quando necessário, antes de serem armazenados em geladeira até o momento da análise. Quando foi utilizado o extrator à base -1 de NaOH, foram adicionados 3 mg.mL de NaBH4 a cada amostra no momento da extração, 62

seguindo o mesmo procedimento de extração previamente descrito. Foram feitas duas repetições biológicas por amostra. Após as extrações dos componentes da parede celular primária com a série alcalina, os sobrenadantes de cada etapa foram dializados, individualmente, em membranas de diálise com 12.000 kDa de exclusão (LaborClin, Brasil) por 48 h em água corrente e duas diálises em água destilada por 24 h cada diálise, seguido do armazenamento em câmara fria.

8. Hidrólise ácida e purificação das amostras Após o fracionamento e neutralização das amostras, estas foram liofilizadas por 48 h, pesadas e, aproximadamente, 5 mg de cada amostra foram submetidas à hídrolise ácida

(SEAMAN, 1945), da seguinte forma: foram adicionados 100 L de H2SO4 72% (v/v) por amostra, homogeneizados e incubados a 30oC por 45 min, seguido da diluição da concentração de H2SO4 para 4% (v/v) com água destilada (foram adicionados 1,7 mL de água destilada por amostra). Esferas de vidro foram colocadas sobre os tubos contendo as amostras, os quais foram selados com parafilme e autoclavadas a 120oC por 1h. Após a autoclavagem, as amostras foram resfriadas e neutralizadas com NaOH 50% (p/v) e ácido acético glacial (quando necessário) para pH 7,0, seguido do armazenamento em câmara fria.

9. Quantificação de ácidos urônicos A quantificação dos ácidos urônicos presentes nas amostras processadas de frutos de café foi feita com base na metodologia proposta por Filisetti-Cozzi e Carpita (1991), adaptada para leitura em microplacas de ELISA (96 poços) em função da reduzida disponibilidade de material para análise. O protocolo padrão propõe que sejam utilizados 400 L de cada amostra, aos quais são adicionados 40 L de solução de ácido sulfâmico/sulfamato de potássio 4 M, pH 1,6, seguidos de agitação rápida (vórtex). Após este procedimento, adiciona- se 2,4 mL de tetraborato de sódio 75 mM, seguidos de agitação rápida (vórtex). Os tubos são tampados com esferas de vidro e imersos em água (banho-maria) à fervura por 20 min, seguido de resfriamento em gelo por 10 min. Posteriormente, são adicionados 80 L de solução m-hidroxidifenil 0,15 % (m/v) [dissolvido em NaOH 0,5 % (m/v)], seguido de agitação rápida (vórtex), aguardando 10 min à temperatura ambiente para desenvolvimento da coloração rósea. A absorbância é medida com o comprimento de onda 525 nm. Na presente análise de ácidos urônicos, reduzimos em 10 vezes o volume de cada componente da reação, mantendo a mesma sequência de reagentes. As agitações com vórtex foram substituídas por 63

diversas pipetagens para homogeneização das amostras, o banho-maria à fervura foi substituído por estufa a esta temperatura e o resfriamento das amostras no gelo foi substituído por geladeira. Foram construídas curvas padrões com ácido galacturônico nas condições propostas por Filisetti-Cozzi e Carpita (1991), os quais foram comparados com a curva padrão adaptada para placas de ELISA, mantendo-se a mesma proporção dos reagentes em um volume final de 292 L. Valores aproximados foram encontrados entre estas duas abordagens (dados não apresentados). A leitura da absorbância a 525 nm foi feita no equipamento Spectramax Plus 384 (MDS Analytical Technologies, EUA), sendo cada concentração analisada em triplicata.

10. Purificação das amostras Após a quantificação dos AST e dos ácidos urônicos das amostras pós-hidrólise ácida com pH neutralizado, as amostras foram passadas por colunas de resina de troca catiônica Dowex 50Wx8-200 (Sigma-Aldrich, EUA) e resina de troca iônica Dowex 1x8-200 (Sigma- Aldrich, EUA) nesta ordem, tendo ambas sido, previamente, equilibradas com sucessivas lavagens com água destilada até que o sobrenadante aquoso, após sedimentação das resinas, ficasse completamente translúcida e com pH em torno de 4,5-5,0 (conforme orientações do fabricante). As colunas foram montadas em seringa descartável de 5 mL contendo lã de vidro na saída da seringa para contenção das resinas, posicionadas de cabeça para baixo sobre um suporte, e o volume da seringa foi completado para 5 mL com as resinas, mantendo-as sempre umedecidas com água destilada. As amostras foram passadas, individualmente, em ambas as colunas e coletadas individualmente. Em seguida, as colunas foram lavadas com água destilada em cinco vezes o volume da amostra original, as quais foram, posteriormente, congeladas e liofilizadas. Os resíduos foram ressuspendidos em 1 mL de água Milli-Q e armazenados no congelador até o momento da análise.

11. Análise de monossacarídeos Foram analisados, aproximadamente, 20 g de ASTs de cada fração de frutos de café, quantificados conforme Masuko et al. (2005). Para análise de monossacarídeos da parede primária de frutos de café, foi utilizado o equipamento ICS-3000 Ion Chromatography System (Dionex Corporation, EUA) com as colunas CarboPac PA10 (2 X 250 mm) (Dionex Corporation, EUA), com o sistema acoplado de pós-coluna (Dionex Corporation, EUA), usando o eluente NaOH 0,5 M na vazão padrão de 1 mL/min. Foi utilizado o amostrador 64

automático (Dionex Corporation, EUA) no volume de 10 L/amostra, com fluxo de 200 L/min do eluente em 50 min de corrida por amostra. Os monossacarídeos foram detectados por pulso amperométrico e o seu perfil foi comparado com os padrões de monossacarídeos fucose (Fuc), arabinose (Ara), ramnose (Rha), galactose (Gal), glicose (Gli), xilose (Xil) e manose (Man). Para quantificação dos monossacarídeos, foram construídas curvas padrões de 50M, 25M, 10M, 5M, 2.5M e 1.25M, submetidas às mesmas condições de análise no ICS-3000 utilizado na identificação dos monossacarídeos extraídos de frutos de café. Cada amostra de pericarpo e de endosperma de frutos de C. arabica, nas distintas fases de maturação, foi analisada em duplicata.

12. Quantificação de celulose Os precipitados obtidos após o último fracionamento da parede celular primária com NaOH 8M foram ressuspendidos, individualmente, em 10 mL de água destilada, homogeneizados rapidamente em vórtex e o pH foi neutralizado utilizando ácido acético glacial. Em seguida, as amostras foram centrifugadas a 8385 g por 10 min à temperatura ambiente. Os sobrenadantes foram descartados e os pellets das amostras foram novamente resuspendidas em 10 mL de água destilada, homogeneizadas em vórtex e centrifugadas a 8385 g por 10 min à temperatura ambiente. Este procedimento foi repetido por 5 vezes para completa lavagem do material. Em seguida, as amostras foram congeladas, liofilizadas e os pellets foram hidrolisados com 5 mL do reagente de Updegraff (UPDEGRAFF, 1969) modificado, utilizando-se 15% (v/v) de ácido acético glacial concentrado e 5% (v/v) de ácido nítrico concentrado. As amostras foram homogeneizadas em vórtex e os tubos de vidro foram tampados com esferas de vidro e selados com parafilme. As amostras foram submetidas à fervura por 90 min, com agitação periódica a cada 15 min. Em seguida, as amostras foram resfriadas na geladeira até atingirem a temperatura ambiente e centrifugadas a 8385 g por 10 min à temperatura ambiente. Os sobrenadantes foram descartados e os pellets foram lavados por três vezes com água destilada da seguinte forma: os pellets foram ressuspendidos, individualmente, em 10 mL de água destilada, homogeneizadas em vórtex e centrifugados a 8385 g por 10 min à temperatura ambiente. Após a última lavagem, as amostras foram congeladas, liofilizadas por 48h e o pellet de cada amostra foi pesado individualmente, sendo esta fração correspondente à percentagem de celulose nas amostras analisadas. Foram feitas duas repetições biológicas por amostra. 65

Em função da complexidade das análises bioquímicas para extração e quantificação dos diversos metabólitos avaliados, um esquema visual apresentado a seguir possibilita uma compreensão do panorama geral utilizado no presente capítulo (Figura 10).

66

~100 mg amostra de café moído e liofilizado A Éter de petróleo

SBN PPT ETOH 80% / 80oC / 4h (4x) Lipídeos SBN PPT o H2O / 80 C / 8h (2x) AST SBN PPT PBS / 4oC / 3h Arabinogalactano Galactomanano SBN PPT o H2O / 4 C / 3h

SBN PPT

Proteína Secagem (liofilização)

Pesagem (amostra)

-amilase [75oC ; 30 min (1/2 + 1/2)]

AMG [50oC ; 30 min (1/2 + 1/2)]

SBN PPT

Amido H2O

SBN PPT

+ Oxa NH4 0.5% [fervura ; 1h (2x)]

SBN PPT NaOH 0.1M [fervura ; 1h (2x)]

SBN PPT NaOH 1M [fervura ; 1h (2x)]

SBN PPT NaOH 4M [fervura ; 1h (2x)]

SBN PPT NaOH 8M [fervura ; 1h (2x)]

SBN PPT

Continua … II Continua … I 67

Continua … II

SBNs SBN PPT B

Continua … I H2O

Neutralização (ác. acético) Diálise [48 h H2O corrente + 48 h H2O dest.] SBN PPT

Liofilização (48h) H2O (5x)

Pesagem (~5mg) Liofilização e pesagem (amostra)

Updegraff [fervura ; 90 min] 1o - H SO 72% [30oC ; 45 min] Hidrólise ácida 2 4 o o SBN PPT 2 - H2SO4 4% [120 C ; 1h]

H2O (3x) Neutralização (NaOH 50%)

SBN PPT Coluna resina Dowex 50W x 8-200 Ácidos urônicos Liofilização e pesagem (amostra)

Coluna resina Dowex 1 x 8-200 Celulose

Lavagem da coluna c/ H2O [5x vol. amostra]

Liofilização

Resuspender em1 mL H2O Milli-Q

Quantificação AST (20 g)

ICS-3000 Monossacarídeos

68

~10 mg amostra de café moído e liofilizado C

500 L ETOH 80%

Banho-maria [80oC ; 20 min] 3 X

SBN PPT

AST Secagem (Temp. amb. ; 48h]

500 L -amilase [75oC ; 30 min]

500 L -amilase [75oC ; 30 min]

500 L AMG [50oC ; 30 min]

500 L AMG [50oC ; 30 min]

100 L ác. perclórico

SBN PPT

20 L Descartado

300 L PAP [37oC ; 15 min]

Amido

Figura 10. Esquema geral do protocolo para purificação dos monossacarídeos presentes na parede celular primária do pericarpo e do endosperma de frutos de C. arabica em diferentes estádios de desenvolvimento. (A) Procedimento para extração de lipídeos, ASTs, pool de arabinogalactano/galactomanano, proteínas, amido e para fracionamento da parede celular primária (extração com oxalato de amônio e série alcalina); (B) Procedimento de processamento dos componentes da parede celular primária para análise no ICS-3000 e de purificação/quantificação de celulose nas amostras; (C) Procedimento para quantificação de amido nas amostras de frutos de café.

69

RESULTADOS Embora nosso foco principal fosse analisar a composição de polissacarídeos presentes na parede primária de frutos de C. arabica durante o seu desenvolvimento, também foram realizadas análises dos teores de lipídeos, amido, AST, proteínas e celulose nestes mesmos estádios de maturação. Apesar de haver uma escala de avaliação fenológica do processo reprodutivo do cafeeiro sugerida por alguns autores (PEZZOPANE et al., 2003; MORAIS et al., 2008), foi elaborada uma escala própria de classificação de frutos de café englobando todas as fases de seu desenvolvimento (Figura 11 – A). Desta escala, foram selecionados frutos correspondentes aos estádios de desenvolvimento 4, 5 e 7, uma vez que compreende os frutos que já atingiram o crescimento máximo e que estão em três fases distintas de maturação (Figura 11 – B).

A 10 mm 10

11 22 33 44 5 66 7 88

B

4 5 7

Figura 11. Classificação de frutos de C. arabica nos oito estádios de desenvolvimento, baseado no tamanho do fruto (frutos de café imaturos – estádios de 1 a 4) e na coloração do pericarpo (frutos de café amadurecendo – estádios de 5 a 8) (A); estádios de desenvolvimento dos frutos de C. arabica analisados quanto à composição de carboidratos na parede celular primária (B).

Foram analisados os pericarpos e os endospermas de cada fase de desenvolvimento dos frutos de café, separadamente. Desta forma, foi elaborada a seguinte codificação para cada fase e cada parte dos frutos analisados (Tabela 1). 70

Tabela 1. Códigos utilizados para a identificação das amostras de frutos de C. arabica analisadas quanto à composição bioquímica dos componentes presentes nos diversos estádios de seu desenvolvimento.

Fase de maturação Código Parte do fruto Código 4 – verde V Pericarpo (casca) C 4 – verde V Endosperma E 5 – meio verde MV Pericarpo (casca) C 5 – meio verde MV Endosperma E 7 – maduro M Pericarpo (casca) C 7 – maduro M Endosperma E

Desta forma, o código “CV” significa “pericarpo de frutos de café no estádio 4”, “EMV” significa “endosperma de frutos de café no estádio 5” e “CM” significa “pericarpo de frutos de café no estádio 7”. Identificadas as amostras, faz-se necessário ressaltar que existe uma grande variabilidade e complexidade das metodologias de análises bioquímicas de frutos/grãos de café disponíveis na literatura científica. Em função desta diversidade de metodologias, foi elaborado o presente protocolo visando à extração de diversos compostos presentes no pericarpo e no endosperma de frutos de C. arabica, bem como a purificação dos polissacarídeos da parede primária destes (Figura 10 – A, B e C) de acordo com a infraestrutura disponível nos laboratórios onde estas análises foram realizadas (EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia e o Laboratório de Bioquímica Vegetal/Depto Botânica/UnB). Em função da diversidade de compostos analisados e visando facilitar as interpretações dos resultados de cada composto presente no pericarpo e no endosperma de frutos de C. arabica, estes resultados são apresentados separadamente, seguindo a ordem mostrada no esquema dos protocolos utilizados para a separação de cada composto (Figura 10).

1. Lipídeos As análises dos resultados da fração lipídica indicaram que não houve diferença significativa entre os teores de lipídeos encontrados no pericarpo e no endosperma de frutos de café em nenhum dos estágios de desenvolvimento considerados, com valores médios entre 10 e 16% (m/m), embora tenha sido observada uma tendência de aumento destes teores no endosperma à medida que os frutos de café amadureceram (Figura 12). 71

25.0

20.0

15.0

10.0

% Lipídeos%(m/m) 5.0

0.0 CV CMV CM EV EMV EM Fase de desenvolvimento de frutos de café

Figura 12. Percentagem (m/m) da fração lipídica presente no pericarpo e no endosperma de frutos de C. arabica em três fases distintas de maturação.

Na fase inicial de purificação da parede celular primária, foi realizada a extração da fase hidrofóbica (lipídica) com o solvente orgânico éter de petróleo. Existem diversos métodos publicados na literatura científica para extração da fração lipídica de grãos de café, os quais apresentam variações dos solventes utilizados, muitos dos quais utilizam o equipamento Soxhlet (BRADBURY e HALLIDAY, 1990; OOSTERVELD et al., 2003; SPEER e KÖLLING-SPEER, 2006). No entanto, existem outras metodologias que não utilizam este equipamento como, por exemplo, os trabalhos de Fisher et al. (2001) que extrairam lipídeos de amostras de café por agitação overnight à temperatura ambiente e Kasai et al. (2006) que fizeram esta extração à temperatura ambiente por 24 h sem agitação. Na revisão sobre lipídeos em café publicados por Speer e Kölling-Speer (2006), existem várias metodologias oficialmente aceitas como padrões para análise de lipídeos, dentre os quais o German Society for Lipid Science (DGF), publicado em 1952, que sugere a maceração, secagem e extração da fração lipídica com éter de petróleo (40º-55ºC) por 4 horas. Na presente tese, não foi possível a utilização do Soxhlet em função da sua indisponibilidade e, portanto, a extração de lipídeos do pericarpo e do endosperma de frutos de café foi realizada utilizando o solvente orgânico éter de petróleo sob agitação a 55ºC overnight, semelhante ao proposto pela German Society for Lipid Science (DGF). Os valores observados na presente análise condizem com os valores observados por Oliveira et al. (2006) em frutos in natura e em grãos beneficiados de café não utilizados para consumo humano em função de suas imperfeições. Resultados semelhantes foram obtidos por 72

Oosterveld et al. (2003) em grãos in natura [11,3 % (m/m)] e torrados [(15,9 % (m/m)] de café tipo arábica. Embora não tenha sido observada uma diferença nos teores de lipídeos nas amostras analisadas de pericarpo e da ligeira tendência de seu aumento no endosperma de frutos de café em desenvolvimento, vale ressaltar que esta análise foi apenas quantitativa e não qualitativa. Com esta análise quantitativa dos teores de lipídeos em frutos de café não é possível fazer qualquer inferência sobre os tipos de ácidos graxos que compõem as amostras, os quais poderiam ou não apresentar diferenças entre as partes dos frutos de café analisadas, bem como nas fases distintas do seu desenvolvimento. Estas informações poderão ser, futuramente, investigadas, mas não foi objetivo da presente análise fazer uma avaliação qualitativa das frações lipídicas nestas amostras de frutos de café.

2. Açúcares solúveis totais (AST) Para a extração de ASTs, foram realizadas quatro extrações sucessivas com etanol 80% (v/v), as quais foram acondicionadas em um único pool e analisados pelo método do fenol-sulfúrico (MASUKO et al., 2005). Pode-se verificar que os níveis de ASTs aumentaram tanto no pericarpo quanto no endosperma à medida que os frutos amadureceram (Figura 13).

700

600

500

400 g/mg)  300

AST( 200

100

0 CV CMV CM EV EVM EM Fase de desenvolvimento de frutos de café

Figura 13. Teores de açúcares solúveis totais presentes no pericarpo e no endosperma de frutos de C. arabica em três fases distintas de maturação.

No pericarpo, os teores passaram de 44 g.mg-1 [(corresponde a 4,4 % (m/m)] nos pericarpos de frutos no estádio 4 (verde) para 545 g.mg-1 [(corresponde a 54,5 % (m/m)] nos frutos no estádio 7 (completamente maduro), representando um aumento de, aproximadamente, 12 vezes. Por outro lado, o endosperma de frutos de café no estádio 4 73

(verde) apresentaram um teor de 42,8 g.mg-1 [(corresponde a 4,28 % (m/m)] para 189,9 g.mg-1 [(corresponde a 18,99 % (m/m)] nos frutos no estádio 7 (completamente maduro), o qual representa um aumento da ordem de 4,6 vezes nos teores de ASTs. Além disso, pode-se observar que os níveis de ASTs foram maiores no pericarpo do que no endosperma. Vale ressaltar que, embora tenha sido feito uma análise quantitativa dos teores de ASTs nestas amostras de frutos de café, não foi realizada uma análise qualitativa para se determinar os tipos de carboidratos na fração de ASTs presentes, uma vez que o foco principal foi direcionado para a composição de monossacarídeos presentes na parede celular primária. Uma análise qualitativa dos teores de ASTs foi publicada por Rogers et al. (1999) onde os autores avaliaram, dentre vários compostos, a variação nos teores de diversos açúcares presentes nos pericarpos e nos endospermas de frutos de C. arabica e de C. canephora ao longo do seu crescimento e desenvolvimento. Estes autores verificaram que à medida que os frutos de café amadureciam, os teores de glicose e de frutose reduziam à medida que os teores de sacarose aumentaram, variando entre 3 e 12 % a depender da espécie e da cultivar. Por outro lado, estes mesmos autores verificaram que os níveis de estaquiose e de rafinose não variaram à medida que os frutos de café amadureciam. Os elevados teores de ASTs observados no pericarpo não são uma característica exclusiva de frutos de café, sendo amplamente encontrada em todos os frutos carnosos como um mecanismo evolutivo para disseminação das sementes, servindo de atrativo para animais que os consomem.

3. Proteínas Os teores de proteínas presentes no pericarpo e no endosperma de frutos de café foram quantificados nos sobrenadantes no pool do tampão PBS e água. Analisando as amostras, pode-se verificar que houve uma diferença significativa entre os teores de proteínas presentes no endosperma e no pericarpo de frutos de café nos diversos estágios de desenvolvimento analisados, sendo que o endosperma apresentou uma quantidade 4-5 vezes maior de proteínas solúveis totais do que o pericarpo (Figura 14).

74

0.160 0.140 0.120

g/mg) 0.100  0.080 0.060

0.040 Proteína( 0.020 0.000 CV CMV CM EV EVM EM Fase de desenvolvimento de frutos de café

Figura 14. Quantidade de proteínas solúveis presentes no pericarpo e no endosperma de frutos de C. arabica em três fases distintas de maturação, com base na matéria seca.

Considerando apenas o pericarpo, verifica-se que não houve diferença significativa entre as fases de desenvolvimento analisadas, mas quando esta análise foi feita apenas no endosperma, foi observada uma variação da quantidade protéica à medida que o fruto de café se desenvolvia. Embora o elevado desvio padrão do endosperma na fase 4 (verde) comprometa a análise desta fase, considerando as fases 5 (meio verde) e 7 (maduro), foi observada uma redução nos teores protéicos nesta última fase. Os teores protéicos observados no presente experimento foram muito inferiores aos observados por Oosterveld et al. (2003). Estes autores verificaram níveis de 5.8 % (m/m) em endosperma de grãos de café in natura, mas a comparação destes dados com os obtidos no presente trabalho é imprecisa, uma vez que aqueles autores fizeram uma estimativa dos teores protéicos baseados nos teores de nitrogênio convertidos em proteínas e não uma quantificação colorimétrica. Existem divergências na literatura científica disponível quanto aos teores protéicos presentes em grãos de café, especificamente no endosperma, uma vez que a grande maioria dos trabalhos publicados está direcionada para este tecido de reserva dos frutos de café. Além disto, na literatura consultada, várias publicações omitem as abordagens utilizadas para a extração e análise das proteínas, dificultando análises comparativas dos teores protéicos observados neste tecido. Para exemplificar este cenário, Fischer et al. (2001), ao estudarem os polissacarídeos de grãos de café in natura, comparando C. arabica e C. canephora, relataram que os teores protéicos encontrados foram de 13,4% e 12,5%, respectivamente, os quais são apenas citados. Redgwell et al. (2002), por sua vez, observaram um teor de proteína em torno de 2,5%, sem explicitar a metodologia de análise realizada. 75

Embora não tenham desenvolvido experimentos em plantas de café, Kolb e Joly (2010) estudaram a germinação de Tabebuia cassinoides em condições de estresse e um dos parâmetros avaliados estava relacionado às reservas da semente, utilizando a microscopia óptica. Os autores verificaram que as lâminas de cortes histológicos das sementes coraram intensamente para proteínas (corante Xylidine Ponceau, específico para proteínas), indicando que estas estavam presentes nas amostras analisadas em quantidades significativas, mas a quantificação protéica colorimétrica (BRADFORD, 1976) dos extratos das sementes indicou a presença de baixíssima quantidade de proteínas (comunicação pessoal) nas amostras analisadas. Em função destes resultados contrastantes, os autores sugeriram que as proteínas estavam na forma de glicoproteínas. No presente trabalho, as concentrações de proteínas nos extratos de pericarpo e de endosperma de frutos de café foram muito baixas, comparativamente com os dados observados na literatura. Há informações na literatura científica referentes aos arabinogalactanos de que estes estariam associados a proteínas (WOLFROM e PATIN, 1965; REDGWELL et al., 2002; REDGWELL e FISCHER, 2006; SEIFERT e ROBERTS, 2007). Embora não tenhamos feito cortes histológicos, corados com corantes específicos para proteínas, uma provável hipótese para explicar os baixos teores protéicos observados nos extratos das amostras analisadas poderia ser pelo fato destas proteínas estarem complexadas com pectinas da parede celular primária. Maiores estudos serão necessários para elucidar esta questão, assim como um maior aprofundamento nestas análises deverá ser feita para estudos de processos bioquímicos envolvendo o maquinário protéico expresso neste órgão do cafeeiro mas que, no entanto, foge aos objetivos do presente capítulo.

4. Amido As análises dos resultados indicaram que não houve diferença nos teores de amido entre pericarpo e o endosperma nas três fases de desenvolvimento dos frutos de café considerados (Figura 15), variando entre um mínimo de 5,59 % (m/m) e um máximo de 7,28 % (m/m), utilizando a metodologia proposta por Amaral et al. (2007) para estimar os teores de amido

76

9.0 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0 3.0

% Amido%(m/m) 2.0 1.0 0.0 CV CMV CM EV EMV EM Fase de desenvolvimento de frutos de café

Figura 15. Percentagem (m/m) de amido presente no pericarpo e no endosperma de frutos de C. arabica em três fases distintas de maturação.

Considerando o pericarpo, não foram observadas variações nos teores de amido nos estádios de maturação 4 e 5, porém houve um ligeiro aumento nos frutos de café no estádio 7. No entanto, no endosperma dos frutos de café analisados não foram observadas diferenças entre as distintas fases de maturação. Vale mencionar que não podem ser feitas inferências em relação aos teores de amido presentes nos seus estádios iniciais de desenvolvimento, uma vez que estes não foram analisados. Os teores de amido observados neste experimento foram significativamente maiores que os obtidos por Laviola et al. (2007), os quais observaram que os níveis de amido em frutos inteiros de C. arabica eram muito baixos nas fases iniciais de desenvolvimento, aumentando significativamente à medida que os frutos amadureciam, atingindo um patamar em torno de 2% (m/m). Estas diferenças podem ser devidas não somente ao cultivar de café analisado, mas aos distintos métodos de extração de amido utilizados. Além disto, estes autores verificaram que plantas de café da mesma cultivar, crescidas em altitudes diferentes, apresentaram níveis de acúmulo de amido distintos, incluindo mais uma variável neste cenário.

5. Celulose Ao final do processamento das amostras visando à extração e purificação dos polissacarídeos presentes nas paredes primárias do pericarpo e do endosperma de frutos de café, após a reação de UpdeGraff, o resíduo que sobra é composto, basicamente, por celulose. Analisando os teores de celulose no pericarpo (Figura 16), pode-se verificar que houve uma redução dos teores de celulose à medida que o fruto de café avançava no processo de 77

maturação. Contudo, resultado inverso foi observado no endosperma, onde os teores de celulose aumentaram quando os frutos de café completamente expandidos iniciaram o processo de maturação, sendo estes teores de celulose mantidos nos frutos maduros (fase 7).

25.0

20.0

15.0

10.0

% Celulose%(m/m) 5.0

0.0 CV CMV CM EV EMV EM Fase de desenvolvimento de frutos de café

Figura 16. Percentagem (m/m) de celulose presente no pericarpo e no endosperma de frutos de C. arabica em três fases distintas de maturação.

A celulose é considerada o polissacarídeo mais abundante no reino vegetal, estando localizado nas paredes celulares de todos os tecidos vegetais, mas apesar de sua ampla distribuição e de estudos envolvendo seu metabolismo (SOMERVILLE, 2006), não há na literatura disponível informações específicas relacionadas com o metabolismo da celulose presente em frutos de café. No entanto, apesar de não ter sido encontrado na literatura disponível informações referentes aos teores de celulose encontrado no pericarpo, em relação aos teores encontrados nos endospermas existem alguns trabalhos quantificando este carboidrato. Pimenta et al. (2004) observaram teores em torno de 22-24 % em grãos maduros de café, mas, no entanto, Wolfrom e Patin (1964) observaram teores de 5% de celulose no endosperma de frutos maduros de café. Estas discrepâncias encontradas nos teores de celulose podem estar relacionadas com as diferentes metodologias de extração utilizadas pelos autores, porém maiores estudos serão necessários para elucidar estas discrepâncias.

6. Ácidos urônicos Os ácidos urônicos (ácido glucurônico e ácido galacturônico) são derivações ácidas dos monossacarídeos glicose e galactose, respectivamente, que fazem parte da estrutura da cadeia principal de diversos compostos pécticos [homogalacturonanos, ramnogalacturonanos 78

tipo I (RGI) e ramnogalacturonanos tipo II (RGII)] presentes nas paredes primárias nas células vegetais (CARPITA e McCANN, 2000). Além disso, devido à sua menor interação com as microfibrilas de celulose (comparativamente com as hemiceluloses), as pectinas são mais facilmente extraídas com agentes quelantes e com soluções alcalinas pouco concentradas. Nas presentes amostras de frutos de café analisadas, pode-se verificar que houve uma maior extração de pectinas (avaliado pelos teores de ácidos urônicos) quando foram utilizados os extratores oxalato de amônio 0,5% (agente quelante) e hidróxido de sódio 0,1 M (Figura 17), conforme esperado. Os teores de ácidos urônicos observados nas frações extraídas em soluções de hidróxido de sódio com concentrações mais elevadas (1M, 4M e 8M) não estariam associados às pectinas, mas a classes específicas de hemiceluloses que contém ácidos urônicos na sua estrutura como, por exemplo, glucuronoarabinoxilanos (GAX).

12.0

10.0

8.0

6.0

4.0 Ácidosurônicos (%) 2.0

0.0

EV EV EV EV EV

CV CV CV CV CV

EM EM EM EM EM

CM CM CM CM CM

EMV EMV EMV EMV EMV

CMV CMV CMV CMV CMV

Oxalato NH + NaOH 0,1M NaOH 1M NaOH 4M NaOH 8M 4 Figura 17. Percentagem (m/m) de ácidos urônicos presentes no pericarpo e no endosperma de frutos de C. arabica em três fases distintas de maturação.

Podemos verificar ainda que, as amostras de pericarpo de frutos de café analisados, independentemente da fase de maturação considerada, apresentaram maiores teores de pectinas do que as amostras de endosperma de café, sendo que estas análises estão diretamente associados aos teores de ácidos urônicos extraídos nas frações oxalato de amônio e NaOH 0,1M. 79

Analisando o endosperma de frutos de café, considerando-se os extratores oxalato de amônio e NaOH 0,1M, pode-se observar que os teores de ácidos urônicos reduziram à medida que os frutos avançaram na sua maturação, indicando que houve uma redução dos teores de compostos pécticos nos endospermas de frutos em estádios de maturação mais adiantados (EM – estádio 7) quando comparados com os estádios menos amadurecidos (EV – estádio 4 e EMV – estádio 5). Por outro lado, os teores de ácidos urônicos observados nas frações endospérmicas extraídas com NaOH 1M e NaOH 4M não estariam relacionados com as pectinas, mas com outros polissacarídeos que contém ácidos urônicos na sua estrutura. No entanto, devido à carência de informações na literatura consultada a respeito dos teores de pectinas no endosperma e, principalmente, no pericarpo de frutos de café, fiou comprometida uma discussão mais aprofundada desse tópico.

7. Arabinogalactanos/galactomananos Após as extrações das fases lipídicas e dos ASTs das amostras do pericarpo e do endosperma de frutos de café, foi feita a extração da mistura de arabinogalactanos e galactomananos com duas extrações sucessivas utilizando água a 80oC. Teoricamente, este procedimento deveria extrair estes compostos pécticos da parede celular primária em função de sua solubilidade e da sua menor interação com outros componentes desta parede, bem como galactomananos de reserva. As amostras individualizadas do pericarpo e do endosperma de frutos de café foram armazenadas a 4oC até o momento da separação destes compostos por precipitação diferenciada com etanol para separação do pool de arabiongalactano e de galactomanano (NUNES e COIMBRA, 2002; SUÁREZ et al., 2005). Foram selecionados, aleatoriamente, duas amostras deste pool para testar esta metodologia mas, não houve a precipitação da fração de arabinogalactano após a adição de etanol. Este procedimento foi repetido com outras duas amostras e o mesmo resultado foi observado. Foram buscadas alternativas para a separação destas duas frações pécticas como, por exemplo, separação diferenciada em coluna de Sepharose 4B (AMARAL et al., 2007) ou precipitação diferenciada com óxido de bário (óxido de bário) (REDGWELL et al., 2002). No entanto, antes de continuar com estas novas abordagens para separação destes dois compostos, foi realizada uma quantificação de ASTs de todas as amostras, conforme Masuko et al. (2005). Utilizando o máximo volume de amostra possível, os valores de ASTs encontrados foram desprezíveis (muito próximos de zero) (dados não apresentados). Diante destes resultados, concluímos que a extração desta mistura de arabinogalactanos e galactomananos com água a 80

80oC não foi eficiente, ficando retidas na matriz da parede celular e, portanto, somente poderiam ser avaliadas após sua extração com oxalato de amônio e com a série alcalina.

8. Monossacarídeos A caracterização dos monossacarídeos presentes na parede celular primária do pericarpo e do endosperma de frutos de C. arabica em diferentes fases de desenvolvimento (estádios 4, 5 e 7) visou avaliar a evolução dos perfis de polissacarídeos durante sua maturação. Conforme ilustrado na figura 11-B, após a extração dos carboidratos das frações da série alcalina, as amostras foram dializadas e os polissacarídeos purificados em cada fração foram hidrolisados quimicamente (hidrólise ácida), rompendo as ligações entre os monossacarídeos que os constituem para, em seguida, serem analisadas pelo Cromatógrafo Iônico ICS-3000 (Dionex, Brasil) (Figura 18).

17fev2011 #22 [modified by Cliente] pad 10 ED_1 17fev2011 #41 [modified by Cliente, 6 peaks manually assigned] ED_1 16,0 80,0 nC nC A B

14,0 70,0 1 arabinose-

arabinose

fucose 1 fucose-

12,0 60,0

galactose 4 galactose-

10,0 50,0

galactose

3 galactose- glicose

8,0 5 GLICOSE- 40,0

arabinose 2 arabinose-

6,0 30,0

rhamnose

3 rhamnose-

manose

7 manose-

xilose 6 xilose-

4,0 20,0

glicose

4 GLICOSE-

rhamnose 2 rhamnose-

2,0 10,0

manose

6 manose-

xilose 5 xilose-

0,0 0,0

min min -2,0 -10,0 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 17fev2011 #31 [modified by Cliente, 6 peaks manually assigned] ED_1 CM1 4 ED_1 55,0 2,50 nC nC

50,0 C D 5 xilose- xilose 2,20

45,0

2,00

glicose 3 GLICOSE-

40,0 1,80

35,0 1,60

30,0 1,40

1,20 glicose

25,0 4 GLICOSE-

1,00 xilose 20,0 4 Xilose-

0,80

15,0

0,60 galactose 10,0 3 galactose-

0,40

galactose

2 Galactose-

manose

6 manose- manose

5,0 5 Manose-

arabinose

arabinose 1 Arabinose-

1 arabinose- 0,20

rhamnose 2 rhmnose-

0,0 -0,00

min min -5,0 -0,20 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0

EV1 1 ED_1 EM1 1 ED_1 14,0 9,0 nC nC

12,5 E F

8,0 galactose 11,3 3 Galactose- 7,0

10,0

galactose 3 Galactose- 6,0 8,8

7,5 5,0

xilose 5 Xilose- 6,3

4,0 arabinose 5,0 1 Arabinose-

3,0

3,8

arabinose 1 Arabinose-

2,0 glicose

2,5 4 GLICOSE-

manose

6 Manose-

xilose 5 Xilose-

1,3 glicose

1,0 4 GLICOSE-

manose

6 Manose-

rhamnose

rhamnose

2 Rhmnose - 2 Rhmnose -

0,0 0,0

min min -2,0 -1,0 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 17fev2011 #22 [modified by Cliente] pad 10 ED_1 17fev2011 #41 [modified by Cliente, 6 peaks manually assigned] ED_1 16,0 80,0 nC nC A B

14,0 70,0 1 arabinose-

arabinose

fucose 1 fucose-

12,0 60,0

galactose 4 galactose-

10,0 50,0

galactose

3 galactose- glicose

8,0 5 GLICOSE- 40,0

arabinose 2 arabinose-

6,0 30,0

rhamnose

3 rhamnose-

manose

7 manose-

xilose 6 xilose-

4,0 20,0

glicose

4 GLICOSE-

rhamnose 2 rhamnose-

2,0 10,0

manose

6 manose- xilose 5 xilose- 81 0,0 0,0

min min -2,0 -10,0 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0

17fev2011 #31 [modified by Cliente, 6 peaks manually assigned] ED_1 CM1 4 ED_1 55,0 2,50 nC nC

50,0 C D 5 xilose- xilose 2,20

45,0

2,00

glicose 3 GLICOSE-

40,0 1,80

35,0 1,60

30,0 1,40

1,20 glicose

25,0 4 GLICOSE-

1,00 xilose 20,0 4 Xilose-

0,80

15,0

0,60 galactose 10,0 3 galactose-

0,40

galactose

2 Galactose-

manose

6 manose- manose

5,0 5 Manose-

arabinose

arabinose 1 Arabinose-

1 arabinose- 0,20

rhamnose 2 rhmnose-

0,0 -0,00

min min -5,0 -0,20 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0

EV1 1 ED_1 EM1 1 ED_1 14,0 9,0 nC nC

12,5 E F

8,0 galactose 11,3 3 Galactose- 7,0

10,0

galactose 3 Galactose- 6,0 8,8

7,5 5,0

xilose 5 Xilose- 6,3

4,0 arabinose 5,0 1 Arabinose-

3,0

3,8

arabinose 1 Arabinose-

2,0 glicose

2,5 4 GLICOSE-

manose

6 Manose-

xilose 5 Xilose-

1,3 glicose

1,0 4 GLICOSE-

manose

6 Manose-

rhamnose

rhamnose

2 Rhmnose - 2 Rhmnose -

0,0 0,0

min min -2,0 -1,0 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0

Figura 18. Exemplo de cromatogramas obtidos de amostras hidrolisadas e purificadas do pericarpo e do endosperma de frutos de C. arabica em fases distintas de maturação, extraídos com diferentes soluções, no equipamento ICS-3000 (Dionex) com a coluna de separação CarboPac PA10 (Dionex) e pós-coluna com NaOH 0,5M. (A) Padrão de 10 M dos sete monossacarídeos básicos presentes na parede celular primária; (B) Pericarpo de frutos de café no estádio 5, extraído com oxalato de amônio 0,5%; (C) Pericarpo de frutos de café no estádio 4, extraído com NaOH 4M; (D) Pericarpo de frutos de café no estádio 7, extraído com NaOH 4M; (E) Endosperma de frutos de café no estádio 4, extraído com NaOH 1M; (F) Endosperma de frutos de café no estádio 7, extraído com NaOH 1M. Os cromatogramas de cada amostra do pericarpo e do endosperma de frutos de C. arabica em fases distintas de maturação foram analiticamente processados, possibilitando a obtenção de um perfil da composição de monossacarídeos de cada amostra analisada com os diferentes extratores (Tabela 2). 82

Tabela 2. Composição dos monossacarídeos que constituem as paredes celulares primárias do pericarpo e do endosperma de frutos de Coffea arabica em diferentes fases de desenvolvimento.

Estádio de Monossacarídeos maturação/extração Fucose Arabinose Rhamnose Galactose Glicose Xilose Manose % (M) % (M) % (M) % (M) % (M) % (M) % (M) CV Oxalato de amônio n.d.1 50,48 (181,44) 5,98 (29,39) 29,08 (57,43) 9,52 (21,22) 2,82 (10,76) 2,12 (5,64) NaOH 0,1M n.d. 65,44 (18,25) 2,28 (0,73) 27,02 (5,80) 2,94 (0,52) 2,32 (0,70) n.d. NaOH 1M n.d. 10,35 (10,06) 1,78 (2,16) 15,06 (7,93) 27,97 (15,59) 42,31 (40,35) 2,53 (2,05) NaOH 4M 0,41 (0,64) 1,92 (3,29) 0,31 (0,64) 6,94 (6,91) 23,00 (24,89) 61,15(100,14) 6,27 (8,58) NaOH 8M n.d. 5,26 (0,30) n.d. 15,34 (0,48) 45,15 (1,60) 34,25 (2,07) n.d. CMV Oxalato de amônio n.d. 38,26 (120,29) 6,10 (26,26) 35,32 (61,00) 12,38 (24,14) 1,40 (4,66) 6,53 (15,23) NaOH 0,1M n.d. 54,21 (375,29) 0,26 (2,47) 25,83 (98,22) 14,38 (61,73) 5,32 (39,10) n.d. NaOH 1M n.d. 20,32 (4,92) 4,18 (1,01) 19,00 (4,60) 34,52 (8,36) 18,26 (4,42) 3,72 (0,90) NaOH 4M 0,10 (0,34) 4,12 (10,86) n.d. 14,04 (25,03) 54,77 (112,74) 14,07 (49,28) 12,90 (33,59) NaOH 8M 2,62 (0,30) n.d. n.d. 18,53 (1,36) 75,60 (6,03) 3,26 (0,39) n.d. CM Oxalato de amônio n.d. 32,01 (13,61) 6,44 (3,74) 37,66 (8,80) 17,59 (4,64) 1,68 (0,76) 4,61 (1,45) NaOH 0,1M n.d. 52,70(232,56) 14,34 (31,80) 20,26 (55,62) 9,54 (35,92) 2,43 (14,28) 0,72 (3,52) NaOH 1M n.d. 11,58 (0,97) n.d. 18,39 (0,90) 59,42 (3,16) 8,32 (0,67) 2,29 (0,15) NaOH 4M n.d. 3,11 (0,57) n.d. 6,48 (0,69) 56,03 (6,49) 27,78 (4,87) 6,61 (0,97) NaOH 8M n.d. 3,87 (0,18) n.d. 22,90 (0,72) 62,23 (2,25) 2,17 (0,13) 8,84 (0,40) EV Oxalato de amônio n.d. 17,19 (9,64) 4,20 (3,22) 59,08 (18,20) 4,45 (1,55) 1,70 (1,01) 13,38 (5,56) NaOH 0,1M 6,73 (1,57) 21,98 (4,04) 2,77 (0,96) 64,63 (8,05) n.d. 2,15 (0,53) 1,74 (0,32) NaOH 1M n.d. 13,43 (9,12) 0,85 (0,87) 54,71 (22,89) 12,07 (5,76) 10,72 (8,12) 8,21 (4,81) NaOH 4M n.d. 7,70 (16,55) n.d. 42,82 (53,55) 11,88 (16,16) 8,96 (18,44) 28,65 (49,24) NaOH 8M n.d. 5,25 (0,62) n.d. 47,82 (3,29) 18,18 (1,36) n.d. 28,75 (2,72) EMV Oxalato de amônio n.d. 17,47 (3,36) 2,56 (0,67) 53,11 (5,61) 13,68 (1,63) n.d. 13,18 (1,88) NaOH 0,1M n.d. 38,30 (3,49) n.d. 48,37 (4,40) 6,25 (0,57) 4,50 (0,41) 2,58 (0,24) NaOH 1M 0,63 (0,50) 12,68 (9,92) 1,26 (1,43) 46,21 (21,93) 6,61 (3,44) 22,44 (19,44) 10,16 (6,94) NaOH 4M n.d. 5,64 (4,55) n.d. 26,59 (12,49) 3,99 (2,04) 38,94 (30,11) 24,85 (16,04) NaOH 8M n.d. 4,28 (0,32) n.d. 47,56 (2,05) 9,07 (0,43) 4,48 (0,32) 34,62 (2,05) EM Oxalato de amônio n.d. 17,52 (4,90) 2,01 (0,77) 62,06 (9,55) 6,31 (1,10) n.d. 12,11 (2,51) NaOH 0,1M n.d. 36,74 (0,87) n.d. 53,06 (1,26) 4,26 (0,10) n.d. 5,95 (0,14) NaOH 1M n.d. 13,19 (5,74) 1,52 (0,84) 38,78 (9,94) 5,27 (1,47) 30,08 (13,01) 11,17 (4,02) NaOH 4M 0,23 (1,01) 7,81 (29,89) 0,11 (0,64) 38,07 (94,99) 6,65 (18,98) 26,80 (128,67) 20,34 (81,52) NaOH 8M n.d. 4,64 (0,29) n.d. 46,66 (1,70) 4,37 (0,17) n.d. 44,33 (2,22)

(1 – n.d.: não detectado) 83

Esta caracterização qualitativa e quantitativa da evolução da composição de monossacarídeos presentes nas paredes celulares primárias do pericarpo e do endosperma de frutos de café é uma informação crucial para o entendimento dos mecanismos bioquímicos que estariam ocorrendo no metabolismo dos carboidratos nestes frutos. Com base nestes dados, pode- se fazer uma inferência das estruturas dos polissacarídeos presentes na parede celular primária destes tecidos. No entanto, para a confirmação destas estruturas, é necessária uma separação destas frações e um estudo de ligação dos monossacarídeos que os constituem, sendo estas análises realizadas por GC-MS (cromatografia gasosa associada à espectrometria de massa), mas estas análises de ligação não fazem parte do presente estudo. Após o fracionamento das amostras de pericarpo e de endosperma de frutos de café, foi avaliado o rendimento da extração de cada fração (Tabela 3).

Tabela 3. Rendimentos da extração das frações das amostras de pericarpo e de endosperma de frutos de C. arabica em diversos estádios de maturação (CV: pericarpo de fruto no estádio 4; CMV: pericarpo de fruto no estádio 5; CM: pericarpo de fruto no estádio 7; EV: endosperma de fruto no estádio 4; EMV: endosperma de fruto no estádio 5; EM: endosperma de fruto no estádio 7)

Estádio maturação Rendimento (%) /extrator CV CMV CM EV EMV EM + Oxalato de NH4 6,35 (3,89) 7,85 ( 0,49) 9,15 ( 1,48) 4,55 ( 2,90) 4,50 ( 0,28) 3,55 ( 1,20) NaOH 0,1M 9,85 (1,06) 8,30 ( 0,14) 8,60 ( 1,56) 8,15 ( 0,78) 6,25 ( 2,33) 5,20 ( 1,41) NaOH 1M 12,05 (0,49) 9,40 ( 0,05) 13,35 (0,21) 10,20 ( 1,41) 13,30 ( 2,97) 13,80 ( 0,09) NaOH 4M 26,08 (5,55) 13,13 ( 3,21) 14,34 (1,05) 13,60 ( 1,21) 20,38 ( 4,26) 15,81 ( 3,18) NaOH 8M 11,55 (4,26) 16,56 ( 7,16) 16,14 (5,45) 10,92 ( 1,83) 8,32 ( 5,28) 10,95 ( 1,90)

A análise destes dados possibilitou verificar que houve um maior rendimento das frações oxalato de amônio no pericarpo (CV, CMV e CM) do que no endosperma (EV, EMV, e EM). Este resultado é indicativo da presença de maiores teores de polissacarídeos da classe das pectinas nestes tecidos, uma vez que nesta fração são extraídos, principalmente, polissacarídeos da parede celular da classe das pectinas e hemiceluloses fracamente associadas a esta. Pode-se observar que, em todas as amostras de pericarpo e de endosperma, houve um aumento da extração dos polissacarídeos presentes nestes tecidos à medida que aumentava a concentração do extrator NaOH, com uma ligeira redução na maior concentração de NaOH (8M), independentemente do estádio de desenvolvimento do fruto de café. 84

Além destas análises, vale destacar a redução observada do rendimento da fração NaOH 4M no pericarpo de frutos de café. O rendimento foi maior nos frutos imaturos (CV: estádio 4), reduzindo nos frutos na fase intermediária de maturação (CMV: estádio 5) e completamente maduro (CM: estádio 7). Ciente de que nesta fração NaOH 4M foram extraídos os polissacarídeos da classe das hemiceluloses mais associados à matriz da parede celular e às microfibrilas de celulose, esta redução do rendimento desta fração é um forte indicativo da ação de hemicelulases, as quais poderiam estar relacionadas com a redução destes rendimentos e, consequentemente, da consistência da parede celular durante o processo de maturação. Considerando a interpretação da composição de monossacarídeos em frutos de café, vale destacar que traz grandes desafios em função da sua complexidade, além de dificuldades para sua discussão, uma vez que requer um profundo conhecimento da estrutura básica dos diversos tipos de polissacarídeos presentes nas paredes primárias das células vegetais. Desta forma, visando facilitar as interpretações destes resultados, as suas análises são apresentadas de forma individualizada, ou seja, as análises dos pericarpos são apresentadas separadamente das análises dos endospermas, conforme segue.

1. Análises dos monossacarídeos presentes no pericarpo de frutos de C. arabica. Com o objetivo de avaliar a composição dos monossacarídeos presentes no pericarpo de frutos de café em fase distintas de maturação, inicialmente foi feita uma compilação geral do perfil de todos os monossacarídeos extraídos com cada solvente separadamente em cada fase de desenvolvimento destes pericarpos (Figura 19). 85

600.0

500.0 M)  400.0 Fuc Ara 300.0 Rha Gal 200.0

Gli Monossacarídeos( 100.0 Xil Man 0.0 CV CVM CM Estádio de desenvolvimento de pericarpo de café

Figura 19. Perfil da distribuição de monossacarídeos presentes no pericarpo de frutos de C. arabica em fases distintas de maturação (CV: pericarpo no estádio 4; CMV: pericarpo no estádio 5; CM: pericarpo no estádio 7; Fuc: fucose; Ara: arabinose; Rha: ramnose; Gal: galactose; Gli: glicose; Xil: xilose; Man: manose).

Pode-se verificar nesta análise geral que nos pericarpos de frutos de café houve a predominância dos monossacarídeos arabinose (Ara), galactose (Gal) e glicose (Gli) em todos os estádios de maturação considerados, sendo que, no estádio 4 (CV), foram também observados elevados teores de xilose (Xil), comparativamente com os demais estádios de maturação. Para identificar com quais classes de polissacarídeos os monossacarídeos identificados no pericarpo de frutos de café (Tabela 2) estariam associados, fez-se necessário comparar estas informações com os teores de ácidos urônicos observados nestes tecidos (Figura 17). Nas frações oxalato de amônio, pode-se verificar que houve uma elevada extração de polissacarídeos que continham ácidos urônicos na sua estrutura e, à medida que houve um aumento nas concentrações dos solventes NaOH, houve uma redução desta extração (Figura 17). A compilação desta informação com a presença dos monossacarídeos ramnose (Rha), galactose (Gal) e arabinose (Ara) (Tabela 2) foi indicativo da presença de quantidades maiores de pectina da classe do ramnogalacturonano tipo I (RGI) (Figura 20) nas frações oxalato de amônio, os quais diminuiram na fração NaOH 0,1M, com resquícios na solução extratora NaOH 1M. Estes resultados da extração se repetiram nos pericarpos de frutos de café nas três fases de maturação analisadas (CV: estádio 4; CMV: estádio 5; CM: estádio 7). Como as concentrações observadas 86

de arabinose (Ara) e galactose (Gal) foram muito elevadas, isso pode ser considerado um indício de que as RGI (formada por monossacarídeos ramnose e ácido galacturônico intercalados entre si) apresentaram ramificações de arabinano e galactano (Figura 20) e não de arabinogalactano (AG), em função da proporcionalidade destes monossacarídeos.

Ramnose

Ácido galacturônico

Galactose

Arabinose

Figura 20. Esquema proposto para as pectinas da classe dos ramnogalacturonano tipo I (RGI) (Fonte: CARPITA e McCANN, 2000).

87

Vale destacar que as análises da composição de monossacarídeos foram realizadas no pericarpo como um todo, mas esta região é composta por três domínios distintos (exocarpo, mesocarpo e endocarpo), os quais não foram individualizados nestas análises. Desta forma, não é possível saber se os RGIs com ramificações de arabinanos e com galactanos estariam no mesmo domínio do pericarpo ou em domínios distintos deste tecido. Com os dados que foram obtidos na presente análise, não é possível fazer esta distinção. Além da presença de RGI no pericarpo, também foi identificada a presença da hemicelulose da classe dos xiloglucanos (XG) (Figura 9) nos pericarpos dos frutos de café. Nos estádios 4 (CV), 5 (CMV) e 7 (CM), à medida que aumentou a concentração de NaOH, também houve um aumento na extração de XG, sendo que, na concentração NaOH 8M, os teores de XGs foram residuais. Este foi um resultado esperado, uma vez que esta classe de hemicelulose é extraída somente com solventes alcalinos mais concentrados pelo fato de estar embebida na matriz da parede celular, interagindo com as microfibrilas de celulose na parede celular primária. No entanto, as análises destes XGs indicaram que, à medida que os frutos passaram do estádio 4 (CV) para o estádio 5 (CMV) de desenvolvimento, houve um aumento nos teores desta hemicelulose, mas quando os frutos amadureceram completamente (CM: estádio 7), os teores de XGs reduziram drasticamente, indicando que deve haver uma modulação deste polissacarídeo durante a maturação de frutos de café. Na composição de monossacarídeos presentes nos pericarpos de frutos verdes (CV: estádio 4) extraídos com NaOH 1M e 4M, podemos identificar a presença de outras classes de hemiceluloses: glucuronoarabinoxilanos (GAX) (Figura 21) e xilanos (polissacarídeo composto, basicamente, por monômeros de xilose), sendo que este estaria presente somente na fração NaOH 1M.

88

Figura 21. Esquema proposto para as hemiceluloses da classe dos glucuronoarabinoxilanos (GAX) (Fonte: CARPITA e McCANN, 2000).

Embora não haja dúvidas nos cromatogramas dos monossacarídeos obtidos das amostras analisadas no ICS-3000 (Dionex, EUA), foi observada a presença de manose nos pericarpos de frutos de café, o que foi inesperado. Inicialmente foi elaborada a hipótese de que este monossacarídeo fizesse parte da estrutura da hemicelulose da classe dos galactomananos (GM) (Figura 8), mas as proporções dos monossacarídeos que os constituem não corroboraram esta hipótese, além do fato de GM não serem encontrados nos pericarpos, uma vez que são polissacarídeos de reserva característicos de endosperma de dicotiledôneas (CARPITA e McCANN, 2000). Em função destes dados, estas manoses poderiam ser constituintes do polissacarídeo manano (polissacarídeo composto por monômeros de manose, podendo apresentar ramificações com resíduos de galactose), os quais estariam associados às microfibrilas de celulose (mais extraídos com NaOH 4M). Pode-se observar que, à medida que os frutos de café passaram do estádio 4 (CV) para o estádio 5 (CMV), os teores de manose no pericarpo de café aumentaram, mas quando estes amadureceram (CM: estádio 7), os teores de manose reduziram drasticamente. Desta forma, analisando a modulação dos monossacarídeos nas paredes celulares do pericarpo de frutos de café (Tabela 2) e fazendo uma correlação com os prováveis polissacarídeos com os quais estariam associados, as seguintes considerações podem ser feitas à medida que os frutos de café amadureciam: 89

(i) Foram identificados altos teores de xilose no pericarpo no estádio 4 (CV), indicativo da presença da hemicelulose do tipo xilano neste tecido; (ii) As frações pécticas presentes no pericarpo de frutos de café foram identificadas como sendo da classe dos ramnogalacturonanos tipo I, com ramificações de arabinano e galactano, mas não de arabinogalactano; (iii) À medida que os frutos amadureceram, os teores de glicose inicialmente aumentaram (estádio 5), decrescendo drasticamente na fase madura (estádio 7). Analisando estes dados juntamente como os teores de xilose, é indicativo da presença da hemicelulose do tipo xiloglucano nestes tecidos, com a mesma tendência de comportamento; (iv) A hemicelulose da classe dos mananos foi identificada, aumentando seus teores quando os frutos de café passam de verde (CV: estádio 4) para intermediário (CMV: estádio 5), mas reduzindo drasticamente nos pericarpos de frutos maduros (CM: estádio 7).

2. Análises dos monossacarídeos presentes no endosperma de frutos de C. arabica. De forma semelhante ao que foi realizado com o pericarpo, para obter uma visão geral dos monossacarídeos presentes no endosperma de café em fase distintas de maturação, foi feita uma compilação do total de cada monossacarídeo extraído com cada solvente em cada fase de desenvolvimento destes endospermas (Figura 22).

90

160.0

140.0

M) 120.0  Fuc 100.0 Ara 80.0 Rha 60.0 Gal Gli 40.0 Monossacarídeos( Xil 20.0 Man 0.0 EV EMV EM Estádio de desenvolvimento de endosperma de café

Figura 22. Perfil da distribuição de monossacarídeos presentes no endosperma de frutos de C. arabica em fases distintas de maturação (EV: endosperma no estádio 4; EMV: endosperma no estádio 5; EM: endosperma no estádio 7; Fuc: fucose; Ara: arabinose; Rha: ramnose; Gal: galactose; Gli: glicose; Xil: xilose; Man: manose).

Pode-se verificar que houve uma predominância dos monossacarídeos arabinose (Ara), galactose (Gal) e manose (Man) nos endospermas de frutos de café em todos os estádios de desenvolvimento analisados e, à medida que os frutos avançaram na sua maturação, houve um incremento nos teores de xilose (Xil) nestas amostras. Estas quantidades relativas dos três monossacarídeos inicialmente citados são indicativos da presença de arabinogalactanos (AGs) (Figura 7) e galactomananos (GMs) (Figura 8) nos endospermas de frutos verdes (estádio 4), meio-verdes (estádio 5) e completamente maduros (estádio 7). Esta análise preliminar nos possibilita uma visualização geral nos tipos de monossacarídeos e sua evolução ao longo das fases de desenvolvimento analisadas, mas faz-se necessário um aprofundamento destas análises, utilizando as informações detalhadas dos perfis de monossacarídeos obtidos com cada extrator (Tabela 2) juntamente com as informações relacionadas com os teores de ácidos urônicos em cada estádio de desenvolvimento dos endospermas de café (Figura 17). Nas frações oxalato de amônio e alcalina de baixa concentração (NaOH 0,1M), podemos identificar a presença não somente de AGs e GMs, mas também de pectinas da classe dos ramnogalacturonanos tipo I (RGI) (Figura 20) sendo que, nestas frações, os AGs estariam 91

associados aos RGI. Esta conclusão baseia-se na presença de ácidos urônicos nestas frações, os quais são unidades monoméricas constituintes dos RGI. Nas concentrações maiores de NaOH (1M, 4M e 8M), os RGI não foram detectados, uma vez que teriam sido completamente extraídos com oxalato de amônio e NaOH 0,1M em função da sua solubilidade nestes extratores. Estes resultados foram observados em todas as fases de desenvolvimento de endosperma de frutos de café (EV, EMV e EM). Vale destacar que na fração oxalato de amônio de endosperma de café na fase verde (EV – estádio 4), foi identificada uma pequena quantidade de xiloglucanos (XG) (Figura 9), o que não foi observado nos estádios mais avançados de maturação de endospermas de café (EMV e EM). Nas frações extraídas com concentrações maiores de NaOH (1M e 4M), os AGs não estariam mais associados ao RGI, mas dispersos na matriz da parede celular, provavelmente associados a proteínas. Pode-se observar também nestas concentrações de NaOH que houve um aumento drástico nos teores de xilose e de glicose nas amostras de endosperma analisadas (Tabela 2). Cientes de que o uso de extratores alcalinos mais concentrados extrai os polissacarídeos mais fortemente associados às microfibrilas de celulose presentes nas paredes celulares primárias e comparando estas observações juntamente com os teores de ácidos urônicos nestas frações (Figura 17), podemos identificar a presença de dois tipos de hemiceluloses: os xiloglucanos (XG) (Figura 9) e a provável presença de glucuronoarabinoxilanos (GAX) (Figura 21), cujos monossacarídeos constituintes estão presentes de forma proporcional nestas frações. Outra observação importante foi a identificação da presença da hemicelulose da classe dos galactomananos (GM) (Figura 8) nos endospermas de frutos de café em todas as fases de maturação analisadas. Pode-se verificar que estes polissacarídeos de reserva estavam mais embebidos na matriz da parede celular, associados às microfibrilas de celulose, uma vez que foram extraídos com concentrações maiores de NaOH (4M). Pode-se verificar que teores de GMs foram maiores no endosperma de frutos verdes (EV: estádio 4), reduziram nos estádio intermediários de maturação (EMV: estádio 5), aumentando drasticamente nos endospermas de frutos maduros. Desta forma, analisando a modulação dos monossacarídeos nas paredes celulares de endosperma (Tabela 2), podemos fazer as seguintes considerações à medida que os frutos de café amadureciam: 92

(i) Não foi observada uma grande variação nos teores de RGI nas fases de desenvolvimento analisadas, ou seja, os teores de pectinas não se alteraram à medida que ocorre o processo de maturação do endosperma de frutos de café; (ii) Houve um aumento nos teores de AGs e GMs nos endospermas de frutos maduros de café (EM); (iii) Houve um aumento nos teores de xilose à medida que os endospermas avançaram no processo de maturação, sendo que há indícios de que estes incrementos estejam associados às hemiceluloses do tipo glucuronoarabinoxilano (GAX);

Os monossacarídeos extraídos com NaOH 8M (extremamente associados à celulose) apresentaram um perfil característico de resíduos das frações NaOH 4M que não foram completamente extraídas com esta concentração de extrator, uma vez que mantém uma proporcionalidade com os monossacarídeos em maior concentração nesta fração. Resumindo, foram identificadas diversas classes de polisscarídeos na parede primária de frutos de C. arabica nas três fases de desenvolvimento analisadas, com algumas classes encontradas somente no pericarpo, outras somente no endosperma e outras, em ambos os tecidos. A tabela que segue apresenta uma compliação de todos estes polisscarídeos, independentemente da fase de maturação em que foi encontrado (Tabela 4).

Tabela 4. Resumo geral das classes de polissacarídeos encontrados no pericarpo e no endosperma de frutos de Coffea arabica em três fases de maturação (estádios 4, 5 e 7)

Tecido Polissacarídeo Pericarpo Endosperma Arabinogalactano - + Galactomanano - + Xiloglucano + + Ramnogalacturonano tipo I + + Arabinano + - Galactano + - Manano + - Glucuronoarabinoxilano + + Xilano + - Celulose + +

93

DISCUSSÃO

Com o objetivo de possibilitar sua adaptação aos diversos ambientes, as plantas desenvolveram diversas estratégias evolutivamente favoráveis a esta necessidade como, por exemplo, o acúmulo de substâncias que poderiam ser mobilizados durante seu desenvolvimento. Os produtos desta mobilização poderiam ser utilizados para distintas finalidades como, por exemplo, a geração de energia para a formação das células e dos tecidos. Dentre as principais substâncias armazenadas pelas plantas, alguns polímeros foram selecionados ao longo do complexo processo de evolução das espécies, prevalecendo as formas de amido, frutanos e polissacarídeos da parede celular (BUCKERIDGE et al., 2000). Conforme as análises dos resultados observados no presente capítulo e encontrado na literatura científica consultada, existe uma complexidade muito grande nas classes de polissacarídeos que fazem parte da estrutura primária das paredes celular presentes nos frutos de C. arabica ao longo de sua maturação. Em função da importância econômica, a grande maioria dos trabalhos publicados envolvendo análises de carboidratos na cultura do cafeeiro está concentrada no endosperma, o qual representa a parte do fruto de interesse comercial. Como o pericarpo é descartado durante o processamento dos frutos para extração do endosperma (despolpa), existe uma carência muito grande de informações sobre a sua caracterização e o metabolismo dos polissacarídeos presentes neste tecido. Ciente desta realidade, foi apresentada uma discussão individualizada das análises dos vários compostos bioquímicos presentes no pericarpo e no endosperma de frutos de C. arabica em diferentes estádios de maturação. No entanto, com a finalidade de fazer uma discussão mais focada, na presente discussão foi dada ênfase aos polissacarídeos identificados na parede celular primária, uma vez que uma breve discussão de cada substância analisada foi, previamente, realizada juntamente com a apresentação dos seus resultados. O pericarpo dos frutos de café, comumente chamado de “casca” é resultante do desenvolvimento das paredes do ovário após a fecundação da oosfera por um núcleo espermático, desempenhando funções biológicas relativas à nutrição do embrião nas fases iniciais de desenvolvimento e formação dos tecidos de reserva, bem como sua proteção, visando a perpetuação da espécie no ecossistema em que se insere (RAVEN et al., 2001). Nas diversas 94

culturas que apresentam frutos carnosos, dentre os diversos mecanismos bioquímicos que ocorrem durante o complexo processo de maturação destes frutos, as mudanças da consistência mecânica e da coloração do pericarpo são fenótipos indicativos da maturidade fisiológica do embrião, atraindo mecanismos de dispersão da semente contida no fruto. A cultura do café não foge a este mecanismo evolutivo, sendo estas modificações observadas no pericarpo um indicativo do momento da colheita. No entanto, durante o processamento dos frutos de café colhidos no campo para extração da parte de interesse comercial (endosperma), grande parte do pericarpo é eliminada por um mecanismo de prensagem, restando um resíduo deste tecido conhecido como mucilagem. Esta mucilagem é eliminada na fase imediatamente posterior à prensagem, por um mecanismo fermentativo, antes dos grãos passarem pela fase de secagem e beneficiamento (AVALLONE et al., 2000). Vale ressaltar que nesta mucilagem predomina o segundo e terceiro domínio do pericarpo, os quais são conhecidos como mesocarpo e endocarpo, respectivamente (DE CASTRO e MARRACCINI, 2006). Visando identificar os polissacarídeos presentes na mucilagem que permanecia aderida aos grãos maduros de café na fase pós-prensagem, Avallone et al. (2000) extrairam e analisaram a composição dos seus monossacarídeos. Estes autores observaram uma predominância de arabinose, seguido de galactose, xilose, ramnose e glucose, com quantidades mínimas de manose e fucose, além de altos teores de ácidos urônicos. Além destes monossacarídeos, estes autores identificaram a presença, embora em baixíssimas concentrações, de resíduos de metil-xilose, metil-fucose e de apiose, concluindo que havia a presença de pectinas do tipo ramnogalacturonano tipo II (RGII). No presente experimento, o perfil de monossacarídeos observados no pericarpo de frutos de café maduros (CM: estádio 7) foram muito semelhantes aos observados por Avallone et al. (2000), exceto pelo fato de que foram observados maiores teores de xilose do que de glicose. Apesar da identificação de pectinas no pericarpo de frutos de café neste estádio de desenvolvimento e das análises da composição dos monossacarídeos serem fortes indicativos de que perteçam à classe dos RGI, os dados obtidos nas presentes análises são insuficientes para sugerir a presença de pectinas da classe dos RGII em função da alta complexidade estrutural. A presença da hemicelulose da classe dos xilanos no pericarpo de frutos de café imaturos (estádio 4) pode estar relacionada com a redução do fluxo de água para o interior dos frutos, uma vez que apresentam uma natureza hidrofóbica. Amaral et al. (2009) avaliou as alterações nos 95

perfis de polissacarídeos nos tegumentos de sementes de Bixa orellana em desenvolvimento, identificando uma deposição de xilanos nas paredes celulares mais externas do tecido paliçádico. Estes autores deduziram que esta deposição de xilanos estaria relacionada com uma maior impermeabilização das sementes desta espécie. Fisiologicamente, as sementes passam por uma fase de dessecação durante sua formação (ANGELOVICI et al., 2010) e o controle da disponibilidade de água deve ser limitado. Desta forma, pode-se inferir que a deposição de xilanos no pericarpo de frutos de café no estádio 4 (verde) pode estar relacionado esta restrição hídrica, mas esta dedução precisa ser confirmada com estudos anatômicos, uma vez que, na presente análise do perfil de monossacarídeos, não foi feito a separação dos domínios do pericarpo. Ciente de que o pericarpo e o endosperma apresentam uma proximidade física, é possível que haja uma interação bioquímica entre estes tecidos nos frutos de café. Embora não tenha sido identificado estudo sobre esta interface na literatura consultada, chama atenção a variação espaço-temporal dos teores de manose nestes tecidos durante a maturação dos frutos de café. No pericarpo de frutos imaturos (CV: estádio 4), os teores de manose foram reduzidos, aumentando nos frutos na fase intermediária de maturação (CMV: estádio 5) e reduzindo quando os frutos estavam completamente maduros (CM: estádio 7). Este comportamento foi exatamente o inverso do observado com os teores de manose no endosperma. Desta forma, esta análise possibilita especular que a manose encontrada nos pericarpos (armazenado na forma de manano) poderiam ser uma fonte deste monossacarídeo para ser mobilizada nos endospermas (na forma de galactomanano) dos frutos de café na fase madura como uma reserva de carboidratos para suprir o embrião na fase germinativa. Maiores estudos serão necessários para validar esta hipótese. O presente trabalho de isolamento e caracterização dos monossacarídeos que constituem a parede celular primária do pericarpo de frutos de café apresenta-se como um marco inicial, o qual poderá servir de base para futuros estudos da bioquímica de carboidratos presentes no pericarpo de frutos carnosos, podendo ser confirmado ou contestado, conforme o avanço da ciência nesta área. Considerando os polissacarídeos encontrados nos endospermas dos grãos maduros de café in natura, há um consenso na literatura da presença da arabinogalactanos (AG) e de galactomananos (GM) (BRADBURY e HALLIDAY, 1990; REDGWELL et al., 2002; OOSTERVELD et al., 2003; REDGWELL e FISCHER, 2006). 96

Os dados observados no presente experimento claramente indicaram a presença de AGs e de GMs na parede celular de endosperma de café nas diversas fases de desenvolvimento. No entanto, a estimativa dos seus teores nas amostras analisadas tornou-se mais complexa, uma vez que não foi possível a separação destes polissacarídeos dos demais carboidratos presentes na parede celular primária com a metodologia utilizada. Desta forma, estes polissacarídeos ficaram retidos na matriz da parede celular primária e os monossacarídeos que os constituem foram separados durante o fracionamento desta parede. Oosterveld et al. (2003) obtiveram uma baixa extração de AGs e GMs utilizando água a 90oC, mas a extração de AGs foi maior quando a temperatura da água foi elevada para 170oC, enquanto que os teores de GM foram semelhantes aos teores extraídos com água a 90oC. Nos endospermas de frutos de café, houve uma redução nos teores de ramnose à medida que os frutos amadureceram (Figura 22) e uma redução dos teores de ácidos urônicos (Figura 17). As análises destes resultados indicaram a presença de um menor teor de pectinas nas paredes primárias das células endospérmicas em frutos maduros (EM), comparativamente com endospermas de frutos verdes (EV). Exceção feita à xilose, as proporções entre os demais monossacarídeos em cada fase de maturação não apresentaram diferenças marcantes. Fischer et al. (2001) estudaram, comparativamente, os polissacarídeos presentes nos frutos maduros in natura de C. arabica e C. canephora. O perfil de alguns monossacarídeos observados por estes autores foram semelhantes aos observados no presente trabalho (baixos teores de fucose e de ramnose e teores de glicose maiores do que estes, porém inferiores aos demais monossacarídeos), assim como arabinose e galactose, em uma proporção de 1:2,5, respectivamente. No entanto, Fischer et al. (2001) observaram baixos teores de xilose (próximos aos de ramnose e fucose) e teores mais elevados de manose do que de galactose. No presente experimento, os dados divergem destes, uma vez que os teores de xilose foram drasticamente superiores aos observados por Fischer et al. (2001) (Tabela 2 e Figura 22). Os dados obtidos foram novamente analisados, confirmando a notória presença de xilose nos endospermas de café maduro (EM: estádio 7) (Figura 18–F). Além desta contradição, também foi verificado uma inversão na relação Gal:Man, embora ambos os trabalhos tenham observado uma predominância de galactose e manose nas amostras analisadas (no presente trabalho inclui-se a xilose a estes monossacarídeos), pode-se verificar que houve uma inversão nos teores de Gal e de Man extraídos. Fisher et al. (2001) relatou maiores teores de Man do que de Gal, enquanto foram 97

observados maiores teores de Gal do que de Man na presente análise. Estas diferenças podem estar relacionadas com (i) as metodologias utilizadas para a purificação e de extração destes monossacarídeos da complexa matriz das paredes celulares primárias deste tecido e, mais provavelmente (ii) como no presente protocolo não houve a separação dos arabinogalactanos (AG) dos galactomananos (GM), é possível que parte destas galactoses estivesse associada aos AG. Redgwell et al. (2002) avaliaram os efeitos da torrefeção sobre a composição de carboidratos em grãos (endosperma) de três cultivares de C. arabica, incluindo grãos maduros in natura. O perfil de distribuição de monossacarídeos presentes no endosperma maduro de grãos in natura foi semelhante ao observado por Fischer et al. (2001). Conforme mencionado anteriormente, Redgwell et al. (2002) utilizaram um protocolo de extração de carboidratos da parede celular de grãos de café muito semelhante ao publicado por Fischer et al. (2001), utilizando PAW (2:1:1 de fenol:ácido acético:água). No entanto, Redgwell et al. (2002) não detectaram a presença de fucose nas frações analisadas. No presente trabalho, também foi identificada a presença de altos teores de xilose, o que é discrepante dos dados apresentados na literatura disponível que apresentam valores muito baixos deste monossacarídeo no endosperma de frutos de café maduros in natura (FISCHER et al., 2001; REDGWELL et al., 2002; OOSTERVELD et al.; 2003). Em função deste resultado inesperado, os dados foram conferidos, ratificando os dados observados (Figura 18 – E e F). Conforme previamente apresentado nos resultados, há evidências da presença de hemiceluloses da classe dos glucuronoarabinoxilanos (GAX), o que se apresenta como uma nova observação, uma vez que não consta da literatura consultada relacionada polissacarídeos em grãos de endosperma de café a presença desta classe de hemiceluloses. Vale ressaltar que este resultado necessita de análises complementares para produzir mais dados que ratifiquem a presença dos glucuronoarabinoxilanos no endosperma de frutos de C. arabica. Desta forma, as presentes análises trazem novas informações a respeito do complexo universo do metabolismo de polissacarídeos encontrados na parede celular de frutos de café em desenvolvimento, ampliando os conhecimentos nesta área que tem grande impacto para o aumento da qualidade da bebida de café. 98

Além disto, estas informações serão de fundamental importância no contexto da presente tese, identificando os prováveis polissacarídeos-alvo para a atividade das -galactosidases expressas em frutos de café, o que será apresentado na discussão final desta tese.

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CAPÍTULO II – CLONAGEM DO GENE DA -GALACTOSIDASE E ANÁLISE MOLECULAR E BIOQUÍMICA DA SUA EXPRESSÃO DURANTE O DESENVOLVIMENTO DE FRUTOS DE COFFEA ARABICA

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INTRODUÇÃO

A maturação de frutos é um processo complexo, envolvendo uma série de reações bioquímicas que resultam não somente na alteração de pigmentação e da consistência dos frutos, mas também da modificação do metabolismo de açúcares e de compostos secundários responsáveis pelas características organolépticas dos frutos, principalmente em frutos carnosos. Em frutos de café, a maturação é um processo longo que envolve não somente a formação do embrião e das reservas endospérmicas, mas também o aumento do tamanho do fruto, modificação da coloração do pericarpo e de mudanças bioquímicas relacionadas com a acidez, teor de açúcares solúveis e diversos outros compostos que contribuem para as características aromáticas e palatáveis dos grãos (DE CASTRO e MARRACCINI, 2006; EIRA et al., 2006). A bioquímica analítica de precisão e o uso de técnicas de biologia molecular têm revelado que a maturação de frutos é um processo muito mais complexo do que se pensava. No caso específico da parede celular, sabe-se que a sua estrutura é composta por diversas classes de polissacarídeos e tem-se observado um aumento nos estudos relacionados com a solubilidade das frações hemicelulósicas e pécticas, com a liberação de resíduos de carboidratos das cadeias laterais da matriz de polissacarídeos durante a maturação de frutos (SAKURAI e NEVINS, 1997; BRUMMELL e HARPSTER, 2001). Estas modificações ocorrem em resposta à ação de várias enzimas hidrolíticas que atuam diretamente sobre os carboidratos presentes na parede celular (FISCHER e BENNETT, 1991), alterando determinadas características físicas dos frutos, reduzindo a rigidez da parede celular. Estudos envolvendo estas enzimas hidrolíticas que atuam sobre os polissacarídeos da parede celular têm merecido destaque no meio científico voltado para esta área, fornecendo subsídios para se compreender o complexo processo de amadurecimento de frutos, especificamente as reações que ocorrem no apoplasto celular. Apesar da limitação de informações a respeito da distribuição espaço-temporal das diversas enzimas que atuam sobre a parede celular e da alta diversidade de polissacarídeos que compõem a parede celular nas diversas espécies vegetais, especial atenção tem sido dirigida a culturas-modelo como, por exemplo, tomate (BRUMMELL e HARPSTER, 2001), servindo de referência para as demais espécies. 105

Devido à importância comercial da pós-colheita de frutos, grandes investimentos em pesquisa vêm sendo direcionados para ampliar os conhecimentos sobre o processo de maturação. A biologia molecular tem contribuído de forma significativa neste sentido, possibilitando não somente a identificação de genes envolvidos neste processo, mas a inter-relação destes ao longo do crescimento e do desenvolvimento dos frutos, principalmente no tocante aos genes relacionados com as enzimas hidrolíticas que atuam sobre os componentes das paredes celulares. Um dos primeiros exemplos de sucesso utilizando a engenharia genética para controle do processo de maturação de frutos foi desenvolvido em tomate (Solanum lycopersicum Mill.) com o silenciamento da expressão do gene da poligalacturonase utilizando a técnica do RNA anti- senso (BIRD et al., 1988). Esta pesquisa culminou com o lançamento do tomate transgênico Flavr Savr, aprovado pelo FDA (Food and Drug Administration) no mercado consumidor dos Estados Unidos, em 1994. Entretanto, apesar da ação das poligalacturonases na despolimerização do domínio péctico da parede celular, aparentemente esta classe de enzimas não é capaz de induzir o amolecimento de frutos (diminuição da resistência da parede celular durante o processo de amadurecimento) quando atua de forma isolada (GIOVANNONI et al., 1989). Diversos genes envolvidos na síntese de enzimas que atuam diretamente na maturação de frutos têm sido estudados nas mais diversas culturas, dentre eles, as -galactosidases. A liberação de resíduos de galactose das cadeias laterais pécticas também estão relacionadas com a redução da resistência física dos frutos durante seu amadurecimento (GROSS, 1984; GROSS e SAMS, 1984; REDGWELL et al., 1992) e esta função está relacionada com a atividade das - galactosidases (EC 3.2.1.23). Bioquimicamente, esta classe de enzimas que degradam componentes da parede celular pertence ao grupo enzimático das glicosil-hidrolases, as quais são caracterizadas por hidrolisarem resíduos -D-galactosil de extremidades não redutoras de -D- galactosídeos (ESTEBAN et al., 2003). Em plantas superiores, as -galactosidases são conhecidas por serem as únicas enzimas capazes de hidrolisar resíduos de galactose de polissacarídeos da parede celular por clivagem de -(14) galactanos (SMITH et al., 1998). Sua atividade bioquímica relacionada com a liberação de resíduos de galactose a partir de carboidratos, galactolipídeos e glicoproteínas, bem como de componentes da parede celular durante a expansão celular, senescência e maturação de frutos já foi identificada na literatura (DE VEAU et al., 1993; BUCKERIDGE e REID, 1994; ROSS et al., 1994). 106

A expressão gênica e a atividade enzimática das -galactosidases têm sido identificadas em diversos tipos de células vegetais como, por exemplo, em grãos de pólen (ROGERS et al., 2001), sementes (SEKIMATA et al., 1989; BUCKERIDGE e REID, 1994) e plântulas em desenvolvimento (LI et al., 2001; ESTABAN et al., 2005). Em frutos, a atividade das -galactosidases foi identificada durante o desenvolvimento e maturação em diversas espécies, incluindo o tomate (SMITH et al., 1998; SMITH e GROSS, 2000; SMITH et al., 2002), carambola (BALASUBRAMANIAM et al., 2005), grão-de-bico (ESTEBAN et al., 2005), pêra (TATEISHI et al., 2001), pimenta (BILES et al., 1997), manga (PRASANNA et al., 2005), maçã (ROSS et al., 1994), arroz (CHANTARANGSEE et al., 2007), Arabidopsis (DEAN et al., 2007), morango (TRAINOTTI et al., 2001) e laranja (WU e BURNS, 2004), dentre outros. Em café, a atividade da -galactosidase foi descrita, pela primeira vez, por Golden et al. (1993). Estes pesquisadores verificaram que esta enzima foi capaz de liberar galactose de arabinogalactanos e galactanos, que são duas distintas cadeias laterais das pectinas. Eles avaliaram a atividade enzimática da -galactosidase durante o amadurecimento de frutos de café e verificaram que sua atividade era baixa em frutos imaturos. Entretanto, à medida que os frutos avançaram no amadurecimento, a atividade da -galactosidase apresentou um pico de atividade, com um aumento de seis vezes comparado com sua atividade em frutos verdes, seguido de um ligeiro decréscimo quando os frutos estavam completamente maduros. Estes pesquisadores também compararam a atividade da -galactosidase com várias outras enzimas hidrolíticas da parede celular de frutos de café (-galactosidase, -manosidases, N-acetil--D-galactosiminidase e N-acetil--D-glucosimindase) e verificaram que, durante o amadurecimento de frutos de café, principalmente na fase de transição para frutos maduros, a - galactosidase apresentou a maior atividade enzimática comparada com as demais enzimas hidrolíticas estudadas. Entretanto, estes autores limitaram suas análises à atividade enzimática e não identificaram se sua expressão era no pericarpo ou no endosperma, uma vez que analisaram o fruto de café como um todo. Uma característica das -galactosidases em várias plantas onde esta enzima foi estudada é que pertencem a uma família multigênica (SMITH e GROSS, 2000; AHN et al., 2007; TRAINOTTI et al., 2001; TRIANTAFILLIDOU e GEORGATSOS, 2001). Em tomate, Smith e 107

Gross (2000) identificaram uma família multigênica da -galactosidase composta por sete genes, os quais se expressavam distintamente em diversas fases do desenvolvimento da planta e dos frutos. Smith et al. (2002) estudaram a supressão da expressão de um membro da família da - galactosidase em tomate (TBG4) utilizando RNA anti-senso. Eles observaram que o nível de supressão era variável entre os clones de tomateiro regenerados e que, uma linhagem de tomateiro transgênico apresentou 40% a mais de firmeza do fruto quando comparado com o controle. Estes resultados possibilitam inferir que este processo pode ser reproduzido em outras espécies vegetais de interesse. Brummell e Harpster (2001) relacionaram uma série destas enzimas e suas atividades em frutos de tomate, indicando que as -galactosidases, juntamente com as expansinas, seriam uma das primeiras enzimas a serem expressas durante a maturação do tomate, restringindo e/ou controlando a expressão das demais enzimas envolvidas neste processo. Apesar de pesquisas relacionadas com a caracterização bioquímica dos componentes da parede celular de grãos de café estar disponível na literatura científica (BRADBURY e HALLIDAY, 1990; ROGERS et al., 1999; REDGWELL e FISCHER, 2006), poucos genes envolvidos com o metabolismo destes carbiodratos foram clonados e bioquimicamente caracterizados como, por exemplo, as -galactosidase (MARRACCINI et al., 2005) e as endo-- mannanases (MARRACCINI et al., 2001). Além disso, são poucos os estudos relacionados com o desenvolvimento de frutos de café publicados na literatura (DE CASTRO e MARRACCINI, 2006; GEROMEL et al., 2006; GEROMEL et al., 2008; MALUF et al., 2009), sendo que nenhum destes estudos sequer mencionam a presença e a atuação das -galactosidases na formação e maturação de frutos de café. Abordagens moleculares têm sido empregadas para aumentar os conhecimentos relacionados com a composição dos grãos de café e das vias metabólicas envolvidas com a qualidade de sua bebida. Neste contexto, Salmona et al. (2008), utilizando a combinação de arranjos de cDNA e de real-time RT-PCR, investigaram redes transcricionais específicas do desenvolvimento de sementes em C. arabica. Apesar destes pesquisadores terem identificado a presença de transcritos do gene da -galactosidase (agrupado com diversos outros genes no grupo-IV1), somente houve sua menção, sem qualquer outra consideração que pudesse contribuir para uma maior compreensão de sua função durante o desenvolvimento de sementes de café. Entretanto, até o presente momento, não há qualquer referência sobre a clonagem e estudo da expressão espaço-temporal do gene das -galactosidases em Coffea sp. Neste capítulo, 108

apresentamos a clonagem e o sequenciamento parcial do gene da -galactosidase em Coffea arabica, bem como a caracterização molecular e funcional de sua expressão durante o desenvolvimento de frutos de café, distinguindo-os no binômio espaço-temporal.

OBJETIVOS Clonar e sequenciar o gene da -galactosidase de C. arabica, bem como obter uma caracterização funcional (molecular e bioquímica) da sua expressão em frutos desta espécie ao longo do processo de maturação no pericarpo e no endosperma, separadamente.

MATERIAL E MÉTODOS 1. Fase inicial do projeto – desenvolvido pelo Dr. Aragão Vinte sequências de genes da -galactosidase de várias espécies vegetais foram obtidas do

GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/U )U e alinhadas in silico utilizando o programa DNAMAN (Lynnon Corporation). Duas regiões do alinhamento que apresentaram maior similaridade (mais conservadas) foram utilizadas para a síntese dos primers específicos BGALPLF (AGAAGCACTCCCGAGATGTGG) e BGALPLR (TGGCACATAACCCATGG) para amplificação de um fragmento do gene da -galactosidase por reação da PCR (Polymerase Chain Reaction). Frutos maduros de Coffea arabica cv Mundo Novo foram coletados no campo e os pericarpos foram separados dos endospermas. Dos pericarpos foram extraídos RNA totais utilizando Micro-to-midi Total RNA Purification System (Invitrogen, EUA) e cDNA foi preparado do RNA total por RT-PCR (Reverse Transcriptase – PCR) utilizando SuperScriptTM III Reverse Transcriptase (Invitrogen, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. cDNAs foram amplificados por PCR utilizando Platinum® Taq Polymerase High-Fidelity (Invitrogen, EUA) com 30 ciclos de desnaturação (95oC por 1 min), anelamento (55oC por 1 min) e amplificação (68oC por 2 min) seguido de um período de extensão a 68oC por 7 min. A amostra foi submetida à eletroforese em gel de agarose 1% (m/v) e foi obtido um único fragmento amplificado, o qual foi recuperado do gel utilizando o Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, EUA), clonado no vetor pGEM-T-Easy (Promega, EUA) conforme as 109

instruções do fabricante. Os clones foram selecionados utilizando blue-white screening em meio LB contendo 100 g.mL-1 de ampicilina, 0,1 M IPTG e 40 g.mL-1 X-Gal. O fragmento foi sequenciado e comparado in silico com sequências disponíveis no banco de dados do GenBank, utilizando o algoritmo tBLASTn. Os resultados indicaram uma alta homologia com genes da - galactosidase de outras espécies, sendo este o ponto de partida da presente tese.

2. Material vegetal Frutos de Coffea arabica cv Icatu Vermelho recém-coletados do campo de experimentos da Embrapa Cerrados (Planaltina, DF) foram classificados em uma escala fenológica de 1 a 8, baseados no tamanho e na coloração dos frutos (Figura 23). Nos quatro primeiros estádios, os frutos imaturos verdes foram visualmente classificados de acordo com o seu volume e comprimento; dos estádios 5º ao 8º, os frutos de café apresentavam o crescimento máximo e a classificação foi feita de acordo com a coloração do pericarpo. Esta classificação abrange todas as fases de desenvolvimento dos frutos de café, desde o chumbinho até o início da fase de café- passa. Após a classificação, os frutos foram seccionados, os pericarpos foram separados dos endospermas, ambos identificados e pesados individualmente, seguidos de imersão em nitrogênio líquido e armazenados a -80ºC. Flores, folhas (jovens e adultas) e ramos do ano de café também foram coletados e armazenados a -80ºC.

3. Isolamento de RNA e síntese de cDNA do gene da -galactosidase Para extração de RNA total, aproximadamente 100 mg de cada amostra de pericarpo e de endosperma de frutos de C. arabica, das oito fases de desenvolvimento previamente armazenadas a -80ºC, foram maceradas, individualmente, em nitrogênio líquido e a extração foi feita utilizando o Micro-to-midi Total RNA Purification System (Invitrogen, EUA), conforme as instruções do fabricante. Após a extração, as amostras foram quantificadas utilizando o NanoDrop® Spectrophotometer ND-1000 (Thermo Fisher Scientific Inc., EUA) e armazenadas a -80ºC. Para síntese de cDNAs foi utilizado RNA total e o kit SuperScriptTM III Reverse

Transcriptase (Invitrogen, EUA), usando o primer oligo(dT)20 de acordo com as instruções do fabricante.

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4. Análise da expressão do gene da -galactosidase A análise transcricional semi-quantitativa da expressão do gene da -galactosidase foi realizada por RT-PCR a partir dos cDNAs de frutos (pericarpos e endospermas), flores, folhas e ramos de café. Os parâmetros da reação da PCR foram otimizados para permitir uma análise semi-quantitativa da expressão da -galactosidase nos pericarpos e nos endospermas de frutos de café nas diversas fases de maturação, utilizando o fator de alongamento 1 (gene EF-1) como controle interno. Para análise da expressão do gene da -galactosidase foram utilizados os primers GALPLF (AGAAGCACTCCCGAGATGTGG) e GALPLR (TGGCACATAA CCCATGG), amplificando um fragmento único de 504 bp. As reações de PCR foram feitas usando 1,0 L de cDNA, tampão de reação da PCR Invitrogen 10X, 1,5 mM MgCl2, 10 mM de cada dNTP, 10 M de cada primer específico e 1 U Taq Polymerase (Invitrogen, EUA) em um volume final de 25 L por reação. O programa otimizado de amplificação por reação da PCR compreendia um ciclo a 94oC por 2 min, seguido de 30 ciclos de 94oC por 30 sec, 50oC por 1 min e 72oC por 1 min, após os quais as reações foram mantidas a 72oC por mais 10 min no equipamento PTC-100 Peltier Thermal Cycler (MJ Research, EUA). Para análise da expressão do controle interno EF-1, de expressão constitutiva, foram montadas PCR idênticas às previamente descritas para o gene da -galactosidase, exceto que foram usados os primers EF-1F (TGTTGCTGTTAAGGATTTGAAGCG) e EF-1R (AACAGTTTGACGCATGTCCCTAAC), os quais amplificaram um fragmento único de 358 pb. O ciclo de amplificação do fator de alongamento EF-1 foi o mesmo utilizado para amplificação do gene da -galactosidase.

5. Extração de DNA genômico e Southern Blot DNA genômico foi extraído de aproximadamente 200 mg de folhas adultas e visualmente sadias de Coffea arabica cv Icatu Vermelho utilizando o método com CTAB (DOYLE e DOYLE, 1987) modificado com tampão de extração contendo 2% (m/v) CTAB, 2% (m/v) PVP, 100 mM Tris-HCl pH 8, 25 mM EDTA e 2 mM NaCl, acrescidos de 2% (v/v) -ME e 2% (m/v) metabissulfito de sódio no momento da extração. Após a extração, as amostras foram quantificadas utilizando o NanoDrop® Spectrophotometer ND-1000 (Thermo Fisher Scientific Inc., EUA) e armazenadas a -20º C. 111

Para análise por Southern blot, alíquotas de 50 µg de DNA genômico foram digeridas individualmente com as enzimas de restrição DraI, EcoRI e HindIII, utilizando 5 U de enzima de restrição por amostra. As digestões foram realizadas a 37oC por, aproximadamente 16 h, seguidas de eletroforese em gel de agarose 0,8% (m/v) a 25 V/h. Após a corrida eletroforética, as amostras foram transferidas para membrana de nylon Hybond™-N+ (Amersham Biosciences, Reino Unido) pelo método da capilaridade alcalina utilizando NaOH 4 M (SAMBROOK e RUSSELL, 2001). Em seguida, a membrana foi pré-hibridizada com esperma de salmão a 65oC por 2 h (SAMBROOK e RUSSELL, 2001). A sonda de 426 pb foi produzida por PCR a partir do fragmento original do gene da - galactosidade de café utilizando os primers GALPLF (AGAAGCACTCCCGAGATGTGG) e RACER (TTCTCGTGAAAGCTCTCTCCG), utilizando o ciclo de amplificação previamente descrito para análise da expressão gênica da -galactosidase. A sonda foi marcada com o radioisótopo 32P utilizando o kit Ready-To-Go™DNA Labeled Beads (dCTP) (GE Healthcare, Reino Unido), conforme as instruções do fabricante. A membrana foi hibridizada a 55oC por 16 h, seguida de duas lavagens com solução 2X SSC 0,1% SDS (m/v) à temperatura ambiente por 15 min/lavagem e duas lavagens com solução 1X SSC 0,1% SDS (m/v) a 55oC por 10 min. Posteriormente, acondicionanda no cassete IP da Bio Imaging Analyzer (FujiFilm Life Science, EUA) por 48 h à temperatura ambiente e analisado no equipamento FUJIFILM Fluorescent Image Analyzer FLA-3000 (FujiFilm Life Science, EUA).

6. Extração da -galactosidase de frutos de café A enzima -galactosidase foi extraída de pericarpos e de endospermas de frutos de café em todas as fases de maturação de seus frutos. Aproximadamente 1 g de cada amostra foi macerada em nitrogênio líquido e a extração da enzima foi feita no gelo com o tampão de extração contendo 0,1 M de citrato de sódio pH 4,6; 1 mM de NaCl, 13 mM de EDTA, 1 % (m/v) PVP-10 e 100 g.mL-1 de PMSF, o qual foi adicionado na razão de 5 mL de tampão de extração por grama de matéria fresca. As amostras foram mantidas no gelo por 5 min com agitações periódicas, seguido de centrifugação a 8228 g por 20 min a 4oC. Os sobrenadantes contendo a enzima -galactosidase foram coletadas e armazenadas a -20oC.

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7. Estimativa da concentração de proteínas As proteínas foram estimadas a partir dos sobrenadantes extraídos para análise da atividade enzimática da -galactosidase pelo método de Bradford utilizando BSA como padrão (BRADFORD, 1976).

8. Ensaio da atividade enzimática da -galactosidase A atividade enzimática in vitro da -galactosidase foi realizada de acordo com Golden et al. (1993). Resumidamente, extratos do pericarpo e do endosperma de frutos de café contendo a enzima -galactosidase foram descongeladas no gelo e, aproximadamente, 20 g de proteínas solúveis totais foram utilizadas por amostra. Os extratos foram incubados com 13 mM PNPG (Sigma-Aldrich, EUA) a 37oC por 30 min e, após este período, as absorbâncias foram medidas usando o comprimento de onda 405 nm no equipamento iMark™ Microplate Reader (Bio-Rad, EUA) sendo cada amostra analisada em triplicata. A curva padrão foi preparada a partir de uma diluição seriada 2x de uma solução de 50 mM de p-nitrophenol (Sigma-Aldrich, EUA) em triplicata.

9. Ensaio histoquímico da -galactosidase A análise histoquímica in situ da atividade da enzima da -galactosidase foi realizada conforme Chantarangsee et al. (2007). Frutos recém-colhidos de Coffea arabica cv Icatu Vermelho em diferentes estágios de maturação (escala de 1 a 8) foram seccionados longitudinalmente e transversalmente, seguidos de incubação em solução de coloração contendo X-Gal [50 mM fosfato de sódio pH 7,0; 10 mM EDTA; 0,1% (m/v) sarcosil; 20% (v/v) metanol; 1 mM X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil--D-galactopiranosídeo)] por aproximadamente 4 horas à temperatura ambiente. Após este período, as soluções de coloração foram descartadas, as reações foram interrompidas com metanol e as amostras foram descoradas em metanol, seguido do armazenamento à temperatura ambiente até o momento de análise visual (Fig. 23).

10. Clonagem do gene da -galactosidase Parte da sequência do DNA genômico da -galactosidase de Coffea arabica foi obtida utilizando o GenomeWalker™ Universal Kit (Clontech, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. No entanto, não foram utilizadas as enzimas de restrição fornecidas pelo fabricante, 113

uma vez que sítios de restrição para estas enzimas estavam presentes no EST (Expressed Sequence Tag) inicial da -galactosidase de café. Foram preparadas bibliotecas de DNA genômico a partir de amostras de 2,5 g de DNA de Coffea arabica cv Icatu Vermelho digeridos, individualmente, com 80 U das enzimas de restrição DraI, FspI, ScaI, SspI, SmaI, NruI e StuI, em um volume final de 100 L a 37oC por 16 h. Após as digestões, a cada biblioteca foram ligados adaptadores específicos (fornecidos pelo fabricante) utilizando a enzima T4 DNA ligase a 16oC por 16 h, seguido de inativação a 70oC por 5 min. Para todas as bibliotecas, a primeira PCR do GenomeWalker direcionada para a extremidade 5’ do fragmento de interesse foi realizada utilizando o primer específico BGALPLR (TGGCACATAACCCATGG) e o primer AP1 (fornecido pelo fabricante). A reação foi montada conforme as intruções do fabricante em ciclo Touchdown, exceto que foi utilizado Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen, EUA). O ciclo da PCR Touchdown utilizado foi 95oC (1 min); 3 ciclos de 95oC (30 s), 62oC (30 s), 68oC (5 min); 3 ciclos de 95oC (30 s), 59oC (30 s), 68oC (5 min); 3 ciclos de 95oC (30 s), 56oC (30 s), 68oC (5 min); 30 ciclos de 95oC (30 s), 52oC (30 s), 68oC (5 min) e um ciclo final de 68oC (5 min). Uma alíquota do primeiro PCR foi diluído 1:50 e utilizado como template para a segunda reação da PCR do GenomeWalker, utilizando o primer específico GALRACER (TTCTCGTGAAAAGCTCTCTCCG) e o primer AP2 (fornecido pelo fabricante). A reação foi montada de forma semelhante ao primeiro PCR do GenomeWalker, exceto o ciclo do PCR Touchdown que foi adaptado para as características do primer específico GALRACER: 95oC (1 min); 3 ciclos de 95oC (30 s), 72oC (30 s), 68oC (5 min); 3 ciclos de 95oC (30 s), 69oC (30 s), 68oC (5 min); 30 ciclos de 95oC (30 s), 66oC (30 s), 68oC (5 min); e um ciclo final de 68oC (5 min). Ambas as reações das PCRs das duas bibliotecas foram submetidas à separação por eletroforese em gel de agarose a 1% (m/v) a 80 V e os fragmentos amplificados foram recuperados do gel utilizando o kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, EUA).

11. Screening da biblioteca BAC de C. arabica Bibliotecas BAC (Bacterial Artificial Chromosome) foram construídas utilizando DNA genômico de Coffea arabica cv IAPAR 59 (NOIR et al., 2004). Filtros de colônia de alta 114

densidade foram preparados utilizando Genetix Q-Bot. Clones BAC foram “espotados” em duplicata em filtros Hybond-N+ filters (Amersham-Pharmacia, EUA) no formato 4 x 4 como descrito por Tomkins et al. (1999). No total, 27.648 clones da biblioteca BAC foram “espotados” em filtros de 22.5 x 22.5 cm, representando, aproximadamente, 4 X equivalente ao genoma de C. arabica (igual a oito vezes o equivalente do genoma básico de café, considerando que dois sub- genomas diplóides, Ca e Ea, estão associados em C. arabica). Os filtros foram hibridizados com três sondas distintas obtidas por PCR, os quais correspondiam a diferentes regiões dos 504 bp -galactosidase EST (Expressed Sequence Tags). Fragmentos únicos foram obtidos por reação da PCR e utilizados como sondas. As sondas foram marcadas com [32P]-dCTP de acordo com as instruções do fabricante (Megaprime DNA labelling systems kit, Amersham). A hibridização foi feita como descrito por Sambrook e Russell (2001). Prováveis clones BAC foram crescidos por 48 h a 37°C em 1,5 mL de meio 2x YT (SAMBROOK e RUSSELL, 2001) contendo cloranfenicol (12.5 µg.mL-1) e o DNA plasmidial dos BACs foram extraídos usando o método da lise alcalina (SAMBROOK e RUSSELL, 2001).

12. Sequenciamento e análise do gene da -galactosidase O sequenciamento foi feito pela Macrogen Inc. (Maryland, EUA) usando os reagentes de sequenciamento BigDye ver. 3.1 (Applied Biosystems, Inc., EUA) com o sequenciador 3730xl DNA Analyzer da Life Technologies (Applied Biosystems, Inc., EUA). O programa BLASTn e BLASTx foi utilizado para busca de sequências de nucleotídeos e de amino ácidos homólogos, respectivamente, no banco de dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI – GenBank). A busca dos motifs da sequência deduzida de amino ácidos da -galactosidase foi

feita utilizando o algoritmo PROSITE (http://caU .expasy.org/prosite/).U

13. Análise filogenética molecular Para a construção da árvore filogenética molecular, a sequência traduzida de amino ácidos da sequência codificante do gene da -galactosidase de C. arabica foi comparada com outras 36 sequências de amino ácidos da -galactosidase de plantas disponíveis no National Center for Biotechnology Information (NCBI) Genbank. Os seguintes acessos foram selecionados:

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Espécie Acesso GenBank (NCBI) Arabidopsis thaliana BGAL6 CAB64742 Arabidopsis lyrata subsp. lyrata BGAL6 XP_002864867 Asparagus officinalis CAA54525 Brassica oleracea CAA59162 Capsicum annuum AAK40304 Carica papaya ACP18875 Cicer arientinum CAA06309 Citrus sinensis AAK31801

Fragaria x ananassa Gal1 CAC44500 Fragaria x ananassa Gal2 CAC44501 Fragaria x ananassa Gal3 CAC44502 Glycine max ACF22882 Gossypium hirsutum AAS76480

Solanum lycopersicum TBG2 AAF70821 S. lycopersicum TBG3 AAF70822 S. lycopersicum TBG4 AAC25984 S. lycopersicum TBG6 AAF70825

S. lycopersicum TBG7 AAF70823 Malus x domestica P48981 Mangifera indica SP26 AAB61470 Nicotiana tabacum TP5 CAC13966

Oryza sativa Indica ACC64531 Oryza sativa Japonica AAM34271 Petunia x hybrida BGAL2 ACC60982 Persea americana PaGAL4 BAF31234 Pyrus communis CAH18936 Populus trichocarpa EEE91791 Prunus persica ABV32545 Pyrus pyrifolia PpGal5 BAD91082 Raphanus sativus RsBGAL1 BAD20774

Ricinus communis XP_002521778 Sorghum bicolor XP_002437187 Vigna radiate AAF67341 Vitis vinifera BG1 AAK81874

Zea mays ACG42995

Como grupo externo para enraizamento da árvore filogenética foi utilizado Coffea arabica -galactosidase (CAI47559). 116

As sequência da -galactosidase foram alinhadas utilizando o programa BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit) e a análise filogenética foi realizada utilizando o algoritmo ClustalW disponível no programa MEGA4 (TAMURA et al., 2007). Foi aplicado o método Bootstrap com 1000 repetições para avaliar a confiabilidade da topologia das árvores filogenéticas obtidas (FELSENSTEIN, 1985) e o algoritmo da Máxima Parcimônia (MP) foi utilizada para construir a árvore filogenética para as -galactosidases.

RESULTADOS E DISCUSSÕES Apesar da existência de uma sugerida escala de avaliação fenológica do processo reprodutivo do cafeeiro (PEZZOPANE et al., 2003; MORAIS et al., 2008), foi feita a elaboração de uma escala própria de classificação de frutos de café englobando todas as fases de seu desenvolvimento de uma forma mais detalhada (Figura 23), servindo de referência para as análises moleculares e bioquímicas do gene da -galactosidase de Coffea arabica.

P

n.t.

E 10 mm 10

11 22 33 44 5 66 7 88

Figura 23. Classificação de frutos de C. arabica nos oito estádios de desenvolvimento baseado no tamanho do fruto (frutos de café imaturos – estádios de 1 a 4) e na coloração do pericarpo (frutos de café amadurecendo – estádios de 5 a 8) (painel inferior). No painel superior, cortes transversais e longitudinais de frutos de café, apresentando a atividade histoquímica in situ da - galactosidase em cada fase de maturação. 117

Isolamento e caracterização do gene da -galactosidase de C. arabica As -galactosidases (EC 3.2.1.23) participam ativamente da maturação de frutos em diversas espécies vegetais e, durante a maturação de frutos de café, apesar da -galactosidase apresentar a maior atividade dentre diversas glicosidases expressas no mesmo período (GOLDEN et al., 1993), até o presente momento não há na literatura disponível consultada qualquer informação específica relacionada com esta enzima hidrolítica da parede celular em Coffea sp. Inicialmente, foi realizada uma busca in silico do gene da -galactosidase no banco de EST de Coffea arabica do projeto Genoma Café, de acesso restrito, disponível na EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia (Brasília/DF), não tendo sido encontrada qualquer sequência relacionada com o gene de interesse. Além desta ausência de hits nesta busca no banco de EST de café, havia uma ausência de informações relativa à -galactosidase de C. arabica nos bancos de dados públicos. Devido a esta limitação de informações, foram sintetizados dois primers a partir de regiões de nucleotídeos altamente conservados no alinhamento de várias ESTs do gene da -galactosidase obtidas do NCBI GenBank usando o programa MegAlign (Lasergene, EUA). Foi feita uma reação da PCR a partir de cDNA extraído de frutos de café maduro (estádio 7 – Figura 23), obtendo-se uma única banda amplificada (dados não apresentados) que foi sequenciada e comparada com outras sequências depositadas no GenBank (NCBI). Usando o algoritmo blastn, não foi obtida qualquer sequência de nucleotídeos homóloga à sequência obtida de frutos de café. No entanto, ao analisarmos nossa sequência usando o algoritmo blastx que compara a sequência de aminoácidos traduzida de regiões codificantes contra as sequências protéicas depositadas neste banco de dados, claramente identificamos a sequência clonada de frutos de café como uma -galactosidase, a qual foi denominada CaGal. Para o isolamento e a clonagem do gene CaGal, inicialmente foi utilizada a técnica do RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends), amplamente divulgada na literatura científica e utilizada para clonagem de EST de diversos genes. Existem diversos kits disponíveis no mercado e, especificamente neste projeto, utilizamos o GeneRacer™ (Invitrogen, EUA), 5’ Race System for Rapid Amplification of cDNA Ends v.2.0 (Invitrogen, EUA) e SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit (Clontech, EUA). Entretanto, apesar de termos seguido as instruções do fabricante e de termos feito ajustes nos protocolos de acordo com as nossas condições, não obtivemos sucesso no isolamento e clonagem deste gene com esta técnica. Diante disto, buscamos novas metodologias para o isolamento e clonagem do gene CaGal, focando as 118

abordagens baseadas no uso da reação da PCR, publicados em periódicos científicos como, por exemplo, TAIL-PCR (Thermal Asymetric Interlaced PCR) (LIU et al., 1995), iPCR (OCHMAN et al., 1988), PCR baseado em sítio único de SdaI (MACGREGOR e OVERBEEK, 1991) e PCR baseado em único primer interno (ANTAL et al., 2004). Apesar dos diversos experimentos realizados, também não obtivemos sucesso significativo com nenhuma destas técnicas. Em virtude desses resultados, foi feita a opção pelo uso da abordagem do genome walking também baseada na técnica da PCR, porém com o uso de adaptadores e primers específicos fornecidos pelo fabricante. Com esta nova abordagem, uma parte da sequência genômica de CaGal foi obtida utilizando-se o kit Genome Walking™ Universal (Clontech, EUA). Vale ressaltar que não foram utilizadas as enzimas de restrição com terminação truncadas (blunt- ended) sugeridas pelo fabricante (DraI, EcoRV, PvuII e StuI), uma vez que a análise da sequência do CaGal identificou a presença destes sítios de restrição dentro de nosso fragmento, inviabilizando seu uso. Das bibliotecas construídas com várias outras enzimas de restrição blunt- ended, foram obtidas diversas sequências parciais que foram isoladas, sequenciadas e alinhadas com o fragmento original de CaGal. As sequências foram confirmadas como sendo fragmentos do gene da -galactosidase por análise in silico utilizando o algoritmo blastx disponível no GenBank. Diversos fragmentos foram obtidos utilizando esta abordagem, as quais foram alinhadas in silico com o programa MEGA4. No entanto, a eficiência do genome walking foi limitada em função da localização dos sítios de restrição, não possibilitando expandir a sequência do gene CaGal nas direções 5’ e 3’ muito além do fragmento originalmente clonado. Devido a esta dificuldade encontrada para a clonagem o gene CaGal, foi estabelecida uma colaboração com o Dr. Philippe Lasherms (INRD, França) para que fosse feito um screening das bibliotecas BAC (Bacterial Artificial Chromosomes) de C. arabica desenvolvida por sua equipe (NOIR et al., 2004) com três sondas específicas do EST de CaGal. Estas sondas foram preparadas por PCR com diversos primers específicos produzindo um amplicon na extremidade 5’ do fragmento do gene da CaGal, outro na extremidade 3’ (sem sobreposição com o amplicon da extremidade 5’) e um terceiro, englobando estes dois amplicons do EST clonado do gene da - galactosidase de C. arabica. Foram identificados oito prováveis clones na biblioteca BAC de C. arabica para CaGal, dentre os quais quatro clones hibridizaram com todas as três sondas de CaGal. Destes quatro, foi selecionado um clone, aleatoriamente, para o sequenciamento do gene 119

de interesse. O sequenciamento foi realizado pela Macrogen Corp. USA (www.macrogen.comU )U utilizando a abordagem por primer walking. A análise dos sequenciamentos deste clone BAC confirmou nossa sequência do CaGal previamente obtida por genome walking, expandindo o sequenciamento tanto para a extremidade 3’ quanto para a extremidade 5’ do fragmento original de CaGal. No entanto, em determinado momento do sequenciamento no sentido 3’-UTR (Untranslated Terminal Region), passou-se a obter sequências sem nenhuma relação com o gene CaGal e sem homologia com nenhuma sequência do gene da -galactosidase disponível no GenBank. Este resultado foi confirmado com diversos sequenciamentos utilizando vários primers e na sua análise verificamos que se tratava do vetor de clonagem do BAC (pIndigoBAC-5). Em função deste resultado inesperado, foi selecionado outro clone BAC e reiniciamos todo o processo de sequenciamento com os mesmos primers usados no sequenciamento do clone anterior. Os resultados confirmaram as sequências parciais obtidas anteriormente com o genome walking e com o primeiro clone BAC sequenciado por primer walking, expandindo o sequenciamento no sentido 3’-UTR. Desta forma, foi obtida uma sequência genômica parcial da CaGal de 3.948 pb pela montagem dos sequenciamentos obtidos com as duas abordagens de sequenciamento previamente descritas. A sequência foi depositada no banco de genes do NCBI GenBank com o código de acesso HQ283330 (CaGal) (Anexo 1). Análise in silico da sequência codificadora traduzida de CaGal foi comparada com o banco de proteínas do GenBank (blastx), confirmando esta sequência de C. arabica como sendo uma -galactosidase. Foram identificados nove exons nesta sequência (Figura 24 – B) que, processados in silico, produziram uma provável sequência codificante (EST) de 1.005 pb. Este EST foi traduzido in silico e obtivemos uma sequência de 334 resíduos de aminoácidos (MM = 37.651 Da) (Figura 24 – A).

120

1 ATGGGTGCTTTTTGGTTGAGCTGTTTTGGCTTGTTAATGGTTATGTGGACAACTACAAGG A 1 M G A F W L S C F G L L M V M W T T T R

61 GGTGGTGTTGAGGGAGGACAAGTTTCTTACGATGGAAGATCACTGATAATTGAAGGGCAA 21 G G V E G G Q V S Y D G R S L I I E G Q

121 AGAAAGCTCCTGTTTTCTGGTTCAATTCATTATCCTCGAAGCACTCCCCAGATGTGGCCA 41 R K L L F S G S I H Y P R S T P Q M W P

181 TCTTTGATATCAAAGGCCAAACATGGTGGACTAGATGTGATTGAAACCTATGTCTTTTGG 61 S L I S K A K H G G L D V I E T Y V F W

241 AATCTTCATGAACCTCGACATGGGCAGCAGTATGATTTTAAGGGAAGACATAATATAGTG 81 N L H E P R H G Q Q Y D F K G R H N I V

301 AGATTCATTAGAGAAATTCAAGCTCATGGCCTCTATGCATTCATCCGGATTGGACCCTTC 101 R F I R E I Q A H G L Y A F I R I G P F

361 ATTGAGGCTGAATGGACTTACGGGGGTCTACCATTTTGGCTGCATGATGTACCAGGAATT 121 I E A E W T Y G G L P F W L H D V P G I

421 GTTTATCGATCTGATAATGAACCCTTTAAGGTGCAGTATCATATGCAAAACTTCACAACA 141 V Y R S D N E P F K V Q Y H M Q N F T T

481 AAAATTGTCAACTTGTTCAAATCAGAAGGATTATATGCTCCACAAGGAGGGCCTATCATT 161 K I V N L F K S E G L Y A P Q G G P I I

541 CTTCAACAGATCGAGAATGAGTACAAAAATGCGGAGAGAGCTTTTCACGAGAAAGGACCG 181 L Q Q I E N E Y K N A E R A F H E K G P

601 CCTTATGTTCAGTGGGCAGCTGCCATGGCTGTCGGACTCCAAACGGGTGTGCCATGGGTT 201 P Y V Q W A A A M A V G L Q T G V P W V

661 ATGTGCAAGCAAGATGATGCTCCTGATCCTGTGGTAATAAACACATGTAATGGGAGGACG 221 M C K Q D D A P D P V V I N T C N G R T

721 TGTGGAGAAACATTTGTAGGGCCTAATTCACCAAACAAGCCAGCAATCTGGACAGACAAT 241 C G E T F V G P N S P N K P A I W T D N

781 TGGACAAGTTTGTTTCAGTATCATGGCGGTACAAATTTTGGCAGGACAGGTTCAGCATTT 261 W T S L F Q Y H G G T N F G R T G S A F

841 GTACTCACAAGCTATTATGATGAAGCTCCTATTGATGAATACGGTGGTTTGATTAGGCAA 281 V L T S Y Y D E A P I D E Y G G L I R Q

901 CCAAAATGGGGTCATCTGAAGCAGTTACATTCAGTAATAAAGTCATGCTCACAGACTCTA 301 P K W G H L K Q L H S V I K S C S Q T L

961 CTTCATGGAGTCATATCTGTTTCTCCACTTGGTCAGCAGCAAGAA 321 L H G V I S V S P L G Q Q Q E

B Escala 100 bp

Figura 24. Provável sequência parcial codante do gene da -galactosidase de Coffea arabica. (A) Sequência de nucleotídeos (linha superior) e sua sequência de aminoácidos traduzida in silico (linha inferior). Aminoácidos estão apresentados por letra maiúscula. Predito peptídeo sinal está indicado em negrito. Predito sítio ativo da família da 35 glicosil hidrolases está sublinhado. (B) Diagrama esquemático da sequência genômica parcial clonada de CaGal indicando os exons (retângulos preenchidos) e os introns (linhas). 121

A presença de múltiplos exons não é uma exclusividade do gene CaGal. Em Arabidopsis thaliana, Ahn et al. (2007) identificaram uma estrutura altamente complexa com 17 isoformas do gene da -galactosidase nesta espécie, com o número de regiões codificantes (exons) variando de 12 a 19. Além disto, estes pesquisadores observaram que as 17 sequências isofórmicas do gene da -galactosidase não compartilhavam todos os exons e introns, sugerindo que, durante a evolução, mecanismos de inserção e deleção (indel) podem ter atuado de forma a explicar este padrão de organização genômico. Cientes de que as -galactosidases são conhecidas por atuarem na parede celular, investigamos se a sequência deduzida de aminoácidos de CaGal estaria sendo direcionada para o apoplasto, utilizando o programa SignalP 3.0 Server (EMANUELSSON et al., 2007). A análise dos resultados indicou a presença de um peptídeo sinal de eucariotos na extremidade N terminal (probabilidade de peptídeo sinal = 1,000) com a probabilidade máxima de sítio de clivagem (0,834) entre os resíduos de glicina (Gly) localizados nas posições 21 e 22 (Figura 25 – A). Este resultado foi confirmado com o algoritmo TargetP (EMANUELSSON et al., 2000), indicando que o polipeptídeo maduro do gene da CaGal apresenta características típicas de proteínas que são direcionadas para a via secretora celular a fim de ser transportada para a parede celular onde poderiam estar envolvidas com modificações de componentes desta parede celular contendo resíduos de galactose. A presença do peptídeo sinal na sequência de aminoácidos não processados de CaGal indica que esta proteína deve ser transportada para o retículo endoplasmático e, posteriormente, para a parede celular onde é funcionalmente ativa. Entretanto, ensaios de imunolocalização e fracionamento celular são experimentos que poderiam ser realizados para confirmar a localização da CaGal nos frutos de café. Análise detalhada da sequência codificante traduzida de CaGal claramente indicou a presença do motif conservado da superfamília 42 glicosil hidrolase, dentro da qual foi localizado o sítio ativo da família da 35 glicosil hidrolase formado pela sequência G-G-P-I-I-L-Q-Q-I-E-N-

E-Y (http://ca.expasy.org/prosite/U )U (Figura 24 – A). Esta sequência de aminoácidos é um motif característico das -galactosidases, apesar de algumas pequenas modificações terem sido observadas nesta região (TRIANTAFILLIDOU e GEORGATSOS, 2001; TRAINOTTI et al., 2001; AHN et al., 2007), corroborando que a sequência clonada de C. arabica era uma - galactosidase. 122

A decisão de publicar o sequenciamento parcial do gene CaGal deve-se ao fato de que, após análise e organização dos resultados obtidos até o momento, avaliamos que as informações que possuíamos eram robustas o suficiente para consubstanciar um artigo científico. Com o objetivo de termos uma referência do quanto havíamos clonado e sequenciado do gene da - galactosidase de C. arabica, foi feito um alinhamento da sua provável sequência traduzida in silico com a sequência de uma -galactosidase expressa em Arabidopsis thaliana (CAB 64742) disponível no banco de dados GenBank do NCBI (Figura 25).

123

10 20 30 40 50 60 70 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | C.arabica --MG--AFWLSCFGLLMVMWTTTRGGVEGGQVSYDGRSLIIEGQRKLLFSGSIHYPRSTPQMWPSLISKA A.thaliana MEMGRLVFGLCLILIVGTFLEFSGGATAAKGVTYDGRSLIIDGQRKLLFSGSIHYPRSTPEMWPSLIKKT

80 90 100 110 120 130 140 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | C.arabica KHGGLDVIETYVFWNLHEPRHGQQYDFKGRHNIVRFIREIQAHGLYAFIRIGPFIEAEWTYGGLPFWLHD A.thaliana KEGGIDVIQTYVFWNLHEPKLG-QYDFSGRNDLVKFIKEIRSQGLYVCLRIGPFIEAEWNYGGLPFWLRD

150 160 170 180 190 200 210 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | C.arabica VPGIVYRSDNEPFKVQYHMQNFTTKIVNLFKSEGLYAPQGGPIILQQIENEYKNAERAFHEKGPPYVQWA A.thaliana VPGMVYRTDNEPFK--FHMQKFTAKIVDLMKSEGLYASQGGPIILSQIENEYANVEGAFHEKGASYIKWA

220 230 240 250 260 270 280 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | C.arabica AAMAVGLQTGVPWVMCKQDDAPDPVVINTCNGRTCGETFVGPNSPNKPAIWTDNWTSLFQ------A.thaliana GQMAVGLKTGVPWIMCKSPDAPDP-VINTCNGMKCGETFPGPNSPNKPKMWTEDWTSFFQVYGKEPYIRS

290 300 310 320 330 340 350 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | C.arabica ------YHGGTNFGRTGSAFVLTSYYDEAPIDEYGGLIRQPKWGHLKQLHSVI A.thaliana AEDIAFHAALFVAKNGSYINYYMYHGGTNFGRTSSSYFITGYYDQAPLDEYG-LLRQPKYGHLKELHAAI

360 370 380 390 400 410 420 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | C.arabica KSCSQTLLHGVISVSPLGQQQE------A.thaliana KSSANPLLQGKQTILSLGPMQQAYVFEDANNGCVAFLVNNDAKASQIQFRNNAYSLSPKSIGILQNCKNL

430 440 450 460 470 480 490 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | C.arabica ------A.thaliana IYETAKVNVKMNTRVTTPVQVFNVPDNWNLFRETIPASQAHLLKTNALLEHTNLTKDKTDYLWYTSSFKL

500 510 520 530 540 550 560 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | C.arabica ------A.thaliana DSPCTNPSIYTESSGHVVHVFVNNALAGSGHGSRDIRVVKLQAPVSLINGQNNISILSGMVGLPDSGAYM

570 580 590 600 610 620 630 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | C.arabica ------A.thaliana ERRSYGLTKVQISCGGTKPIDLSRSQWGYSVGLLGEKVRLYQWKNLNRVKWSMNKAGLIKNRPLAWYKTT

640 650 660 670 680 690 700 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | C.arabica ------A.thaliana FDGPNGDGPVGLHMSSMGKGEIWVNGESIGRYWVSFLTPAGQPSQSIYHIPRAFLKPSGNLLVVFEEEGG

710 720 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . C.arabica ------A.thaliana DPLGISLNTISVVGSSQAQSQFS

Figura 25. Alinhamento de provável sequência de aminoácidos da -galactosidase de C. arabica, traduzida in silico, com a sequência de aminoácidos da -galactosidase de A. thaliana (CAB 64742). Quadrado vazado indica a localização do sítio ativo da família 35 glicosil hidrolase. 124

A análise deste alinhamento indicou que, aproximadamente, 45,64% da sequência codificante de CaGal havia sido clonada. Também foi observado neste alinhamento que as sequências residuais de aminoácidos apresentaram 74,25% de homologia, sendo que o motif da família 35 glicosil hidrolase, característico das -galactosidases, foi claramente conservado entre estas duas espécies (Figura 25). Continuamos com o sequenciamento de CaGal e a sequência genômica integral será depositada quando este for concluído e confirmado. Esta confirmação deverá ser feita com a construção de primers específicos nas extremidades 3’ e 5’, amplificação da inteira região codante por reação da PCR, clonagem, sequenciamento, tradução in silico e alinhamento com sequências protéicas da -galactosidase disponíveis no NCBI Genbank.

Análise transcricional da -galactosidase, atividade enzimática in vitro e ensaio histoquímico in vivo

A análise da expressão semi-quantitativa da CaGal do pericarpo e do endosperma de frutos de C. arabica foi realizada por RT-PCR e a atividade enzimática in vitro foi feita com base na degradação do substrato PNPG em galactose e -nitrofenol pela enzima -galactosidase. A análise do nível de transcrição da CaGal indicou que este gene não é expresso de forma homogênea no pericarpo e no endosperma de frutos de café em desenvolvimento (Figuras 26 e 27, respectivamente), sendo que ambos apresentaram um padrão similar, com picos de transcrição em frutos imaturos na fase inicial de crescimento (Figura 23 – estádio 2) e outro pico quando os frutos estão próximos de estarem completamente desenvolvidos e maduros (Figura 23 – estádio 7).

125

_ A + 1 2 3 4 5 6 7 8

-Gal

EF-1

1 B

Gal 0.8 

da 0.6

0.4 relativa

0.2

Expressão 0 1 2 3 4 5 6 7 8

Estágio de desenvolvimento de frutos de café Figura 26. Expressão da -galactosidase no pericarpo de frutos de C. arabica, crescido em condições de campo, em diferentes fases de maturação. (A) RT-PCR específicos para CaGal estão apresentados no painel superior; RT-PCR do gene usado como controle constitutivo Fator de alongamento 1 (EF-1) estão apresentados no painel inferior; (+) controle positivo: plasmídeo contendo um fragmento do gene de CaGal; (-) controle negativo: água; (B) Expressão relativa de CaGal nas diferentes fases de desenvolvimento de frutos de café.

Nos pericarpos de frutos de café, foram observados dois picos distintos de expressão do gene da -galactosidase: um pico na fase ativa de crescimento (estádio 2) e outro, quando os frutos estavam completamente maduros (estádios 7-8) (Figura 26). Por outro lado, apesar de também ter sido identificada a presença de dois picos nos endospermas de frutos de café, houve uma baixa taxa de transcrição em café imaturos em rápido crescimento (estádio 2), seguido de uma expressão não detectável (baixíssimo nível de expressão) nas duas fases seguintes e, à medida que os frutos avançaram na maturação, houve um intenso incremento na expressão do gene da -galactosidase, apresentando um pico de transcrição quando totalmente madura (Figura 27). 126

_ A + 1 2 3 4 5 6 7 8

-Gal

EF-1

B 1 Gal

 0.8 da 0.6

relativa 0.4

0.2 Expressão 0 1 2 3 4 5 6 7 8

Estágio de desenvolvimento de frutos de café Figura 27. Expressão da -galactosidase no endosperma de frutos de C. arabica, crescida em condições de campo, em diferentes fases de maturação. (A) RT-PCR específicos para CaGal estão apresentados no painel superior; RT-PCR do gene usado como controle constitutivo Fator de alongamento 1 (EF-1) estão apresentados no painel inferior; (+) controle positivo: plasmídeo contendo um fragmento do gene de CaGal; (-) controle negativo: água; (B) Expressão relativa de CaGal nas diferentes fases de desenvolvimento de frutos de café.

Considerando a atividade enzimática do CaGal, também foi observada a presença de dois picos de sua atividade nos pericarpos de frutos de café, com um padrão semelhante aos observados na expressão transcricional durante o processo de maturação (Figura 28). No entanto, apesar de ter sido verificada a presença de dois picos de atividade enzimática nos endospermas de frutos de café, estas atividades enzimáticas da -galactosidase não refletiram os seus níveis transcricionais (Figuras 27 e 28). Embora não tenham sido realizados experimentos para identificar as razões deste resultado, uma provável hipótese é de que a sua atividade esteja relacionada com algum mecanismo de regulação pós-transcricional. 127

Vale ressaltar que a atividade enzimática in vitro da -galactosidase no pericarpo apresentou, aproximadamente, o dobro da atividade apresentada no endosperma (Figura 28). Este resultado sugere que específicos eventos hidrolíticos envolvendo esta enzima são mais proeminentes nos pericarpos do que nos endospermas, provavelmente relacionados com a composição da parede celular destes tecidos.

20.0 18.0

16.0

)

1 -

Gal 14.0

.g



1 -

da 12.0

10.0

mol.min

Gal activity Gal 

- 8.0

(

B

Atividade (umol/min.g) 6.0 4.0 2.0 0.0

HH2O2O 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 Coffee fruit ripening stages Pericarpo Endosperma

Frutos de café em diferentes estágios de maturação Figura 28. Atividade enzimática da -galactosidase, sob condições in vitro, expressa no pericarpo e no endosperma de frutos de C. arabica em diferentes fases de desenvolvimento (média de três repetições).

Com o objetivo de avaliar a distribuição espacial e temporal da atividade enzimática de CaGal em frutos de café, foi realizada a análise histoquímica in situ (Figura 23 – painel superior). As áreas azuladas indicam a atividade da -galactosidase que ocorre devido à degradação enzimática do substrato X-Gal, produzindo galactose e 5-bromo-3-cloro3- hidroxindol, o qual é, posteriormente, oxidado a 5-5’-dibromo-4-4’-dicloro-indigo, um produto insolúvel de coloração azul (SAMBROOK e RUSSEL, 2001). Ambos os cortes longitudinais e transversais de frutos de café recém-colhidos apresentaram padrões de coloração semelhantes. Foram observadas uma forte expressão nos endospermas durante as fases iniciais de desenvolvimento (estádios 1 a 3), decrescendo a expressão quando frutos verdes de café 128

completamente crescidos passaram para a fase inicial de amadurecimento (estádios 4 e 5). Após esta transição, foi observado novo pico de expressão em frutos de café completamente amadurecidos (estádios 6 e 7), decrescendo a expressão no estádio final de desenvolvimento quando os frutos começavam a desidratar (estádio 8). O pericarpo também apresentou padrão de expressão de CaGal semelhante ao observado no endosperma, com dois picos distintos: o primeiro pico na fase inicial de desenvolvimento dos frutos de café (estádio 3) e o segundo pico, quando frutos estavam muito próximos à completa maturação (estádios 6 e 7). Este padrão de resposta da atividade enzimática da -galactosidase foi observado em pelo menos quatro frutos de café analisados para cada fase de desenvolvimento dos frutos. As análises dos padrões histoquímicos de expressão de CaGal sob condições in vivo indicaram uma similaridade com os padrões observados da sua atividade enzimática sob condições in vitro, confirmando que este gene não se expressa de forma uniforme durante o desenvolvimento de frutos de café. Estas análises apresentaram dois picos distintos durante o desenvolvimento de frutos de café, semelhante aos resultados observados por RT-PCR, sugerindo que o gene CaGal pode estar envolvido em eventos bioquímicos localizados especificamente na parede celular em tempos distintos ao longo de sua maturação. No entanto, os níveis da atividade enzimática de CaGal não refletiram os níveis sua transcrição, principalmente no endosperma de frutos de café. Este resultado pode ser um indicativo de que haja um mecanismo de regulação da expressão gênica pós-transcricional relacionado com sua atividade enzimática. Estes resultados observados no pericarpo de frutos de café não são únicos. Ross et al. (1994) observaram resultados semelhantes durante a maturação de frutos de maçã, detectando uma alta atividade enzimática da -galactosidase sem que fosse detectado a sua expressão transcricional na análise por Northern blot. Durante o desenvolvimento de frutos de café, Marraccini et al. (2005) estudaram a expressão da -galactosidase e observaram que, apesar de detectarem a sua concomitante transcrição e atividade enzimática, esta atividade enzimática persistiu na seguinte fase analisada, mesmo sem que houvesse a detecção da sua transcrição nesta fase mais avançada de maturação. Por outro lado, Golden et al. (1993) observaram um incremento na atividade enzimática da -galactosidase à medida que frutos de café amadureciam. Frutos imaturos (verdes) apresentaram os menores níveis, enquanto que os maiores níveis de atividade enzimática da -galactosidase foram observados quando os frutos estavam na fase transitória para a maturação, próximos à maturação plena (Figura 1 – estádio 6), 129

com um incremento de quatro vezes de sua atividade específica quando comparada com a fase inicial analisada. Estes resultados corroboram nossos dados observados. No entanto, uma conclusão definitiva não pode ser obtida, uma vez que Golden et al. (1993) não fizeram a separação do pericarpo e do endosperma, analisando o fruto por inteiro, enquanto no presente experimento esta separação foi feita.

Análise do número de cópias do gene da CaGal no genoma de C. arabica A organização genômica do CaGal de C. arabica foi investigada pela análise por Southern blot sob condições de média estringência. DNA genômico foi digerido, individualmente, com as enzimas de restrição DraI, EcoRI e HindIII, nenhum dos quais apresentavam sítios de restrição dentro do fragmento de 426 bp da sonda utilizada para hibridização. Após a digestão individualizada enzimática com as três enzimas, foram observadas duas bandas e o mesmo padrão de hibridização, tanto para o cultivar Icatu Vermelho quanto para o cultivar Catuai Vermelho, sugerindo que este padrão de organização é conservado nestes cultivares (Figura 29).

Icatu Vermelho Catuai Vermelho

RI RI

I I

dIII dIII

Dra Eco Hin Dra Eco Hin

(bp)

6108 5090 4072

3054

2036

Figura 29. Análise de Southern-blot de C. arabica Icatu Vermelho e C. arabica Catuai Vermelho de DNA genômico digerido com as enzimas de restrição DraI, EcoRI and HindIII, separadamente, e hibridizadas com sonda para o gene da -galactosidase. Marcadores de massas moleculares estão indicados. 130

Estes resultados indicam que existem, pelo menos, duas cópias do gene da - galactosidase no genoma de C. arabica. Entretanto, o número de cópias gênicas não é uma questão simples nesta espécie, uma vez que, em termos de ploidia, é uma alotetrapóide (também conhecida como anfidiplóide) resultante do cruzamento natural das espécies diplóides C. eugenoides e C. canephora (LASHERMES et al., 1999). Os dados obtidos poderiam ser interpretados como o resultado de dois loci homeologos (um em cada subgenoma) ou a presença de dois genes parálogos ao invés de duas isoformas do mesmo gene. Vale ressaltar que apenas conseguimos realizar esta análise utilizando 50 µg de DNA por digestão, o que extrapola a quantidade de DNA genômico usualmente utilizado para análises de Southern (10 a 20 µg de DNA/digestão). Não foi possível precisar as razões desta quantidade elevada de DNA necessário para esta análise, uma vez que a sua qualidade e a quantificação foram avaliadas em gel de agarose 0,8% (m/v) e no NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, EUA). Foram também necessárias adaptações devido à disponibilidade e meia-vida dos isótipos radioativos, tipo de sonda utilizada (foram testadas duas sondas de PCR do fragmento do gene da -galactosidase), condições de estringência de hibridização (55oC e 65oC) e estringência da lavagem da membrana (temperatura e soluções utilizadas). A presença de múltiplas cópias do gene da -galactosidase no genoma das plantas não é uma particularidade do cafeeiro, uma vez que observações similares foram verificadas em maçã (ROSS et al., 1994), em Arabidopsis (ANH et al., 2007), em grão-de-bico (ESTEBAN et al., 2003), em tomate (SMITH e GROSS, 2000) e laranja (WU e BURNS, 2004), dentre outras.

Isoformas do gene da -galactosidase em C. arabica Apesar de nosso enfoque ter sido a expressão do gene CaGal em frutos de café nas diversas fases de seu desenvolvimento, também foi observada a sua expressão em órgãos vegetativos (folhas jovens, folhas adultas e ramos novos) e reprodutivos (pétalas) de C. arabica a partir de reações da PCR de cDNAs destes órgãos nas mesmas condições de análise utilizadas para pericarpo e endosperma de frutos de café (Figura 30). 131

Figura 30. Expressão por RT-PCR de CaGal em órgãos vegetativos e reprodutivos de Coffea arabica; (+) controle positivo: plasmídeo contendo fragmentos do gene da -galactosidase; (-) controle negativo: água.

Observou-se que os níveis de expressão em folhas novas, folhas adultas e flores foi semelhante, mas a expressão em ramos foi inferior aos outros órgãos da planta analisados. Estes resultados indicam que CaGal é um gene expresso não somente em frutos, mas também em órgãos vegetativos e reprodutivos do cafeeiro. Como nosso enfoque estava relacionado com o desenvolvimento de frutos de café, não aprofundamos as análises da expressão de CaGal nestes órgãos, porém estes resultados indicam que este gene deve estar envolvido com eventos bioquímicos relacionados com o crescimento e desenvolvimento destes órgãos, desempenhando funções específicas nas paredes celulares de alguns dos tecidos que os constituem. Todos estes órgãos vegetativos e reprodutivos amplificaram um fragmento único de 501 pb, os quais foram isolados, clonados, sequenciados e alinhados in silico com os fragmentos obtidos de pericarpo (estádio 7) e de endosperma (estádio 3) de frutos de C. arabica. As análises dos alinhamentos indicaram a presença de dois grupos de sequências distintos: um grupo formado pelo pericarpo, endosperma, pétalas e ramos novos e um segundo grupo, pelas folhas jovens e adultas de C. arabica (Figura 31 – A). Estes dois grupos apresentaram 71,06% de homologia na sequência de nucleotídeos, sugerindo que existem, pelo menos, duas isoformas de CaGal no genoma de C. arabica, confirmando os resultados obtidos por Southern blot (Figura 29) no qual pudemos observar a presença de, pelo menos, duas cópias de CaGal no genoma desta espécie. Considerando estes fragmentos amplificados de CaGal, pudemos observar que 132

não existiam diferenças apenas nas sequências de bases, mas também nas sequências de aminoácidos, traduzidos in silico a partir de suas respectivas sequências de nucleotídeos, entre estas duas isoformas de -galactosidase de café (Figura 31 – B). As sequências de aminoácidos apresentaram uma homologia de 74,25% mas, apesar desta elevada discrepância, foi possível identificar a presença do motif característico das -galactosidases G-G-P-I-I-(M/L)-S-Q-I-E-N-E-

Y-G referente à família 35 glicosil hidrolase (http://ca.expasy.org/prosite/U )U (TRAINOTTI et al., 2001; TRIANTAFILLIDOU e GORGATSOS, 2001; AHN et al., 2007).

10 20 30 40 50 60 70 . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | 10 20 30 40 50 60 70 Folha nova .A.G.A.A|G.C.A.C.T|C.C.C.G.A|G.A.T.G.T|G.G.C.C.T|G.A.T.C.T|T.A.T.A.C|A.G.A.A.G|G.C.T.A.A|A.G.A.C.G|G.A.G.G.C|T.T.G.G.A|T.G.T.G.A|T.A.C.A.A|A 133 Folha novaadulta AGAAGCACT10CCCGAGATGT20GGCCTGATCT30TATACAGAAG40GCTAAAGACG50GAGGCTTGGA60TGTGATACAA70A . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | FolhaPétala novaadulta AGAAGCACT10CCCGAGATGT20GGCGCATGGAGTGCT30TATACAGAAGG40GCTAAAGACTG50GAGGCTTGGA60TGTCGCATACGAAT70A Caule A. G. A. A. G| C. A. C. T. C| C. C. G. A. G| A. T. G. T. G| G. G. A. G. G| G. G. C. T. T| A. T. A. C. A| G. A. G. G. G| C. T. A. A. A| G. A. T. G. G| A. G. G. C. T| T. G. G. A. T| G. C. C. A. T| A. G. A. T. A| FolhaPétala adulta AGAAGCACT10CCCGAGATGT20GGCGCATGGAGTGCT30TATACAGAAGG40GCTAAAGACTG50GAGGCTTGGA60TGTCGCATACGAAT70A Pericarpo-7Folha nova A. G. A. A. GC. A. C. T. CC. C. G. A. GA. T. G. T. GG. G.CA.CG.TGG.AG.TC. T. TA. T. A. C. AG. A. G.AG. GC. T. A. A. AG. A. T.CG. GA. G. G. C. TT. G. G. A. TG. C.TC.GA. TA. G.CA. T.AA PétalaCaule AGAAG| CACT10C| CCGAG| ATGT20G| GGAGG| GGCT30T| ATACA| GAGG40G| CTAAA| GATG50G| AGGCT| TGGA60T| GCCAT| AGAT70A| Folha novaadulta AGAAGCACTCCCGAGATGTGGCCTGATCTTATACAGAAGGCTAAAGACGGAGGCTTGGATGTGATACAAA CaulePericarpo-7Endosperma-3 A. G. A. A. G| C. A. C. T. C| C. C. G. A. G| A. T. G. T. G| G. G. A. G. G| G. G. C. T. T| A. T. A. C. A| G. A. G. G. G| C. T. A. A. A| G. A. T. G. G| A. G. G. C. T| T. G. G. A. T| G. C. C. A. T| A. G. A. T. A| FolhaPétala adulta AGAAGCACT10CCCGAGATGT20GGCGCATGGAGTGCT30TATACAGAAGG40GCTAAAGACTG50GAGGCTTGGA60TGTCGCATACGAAT70A Pericarpo-7Endosperma-3Folha nova A. G. A. A. G| C. A. C. T. C| C. C. G. A. G| A. T. G. T. G| G. G.CA.CG.TG| G.AG.TC. T. T| A. T. A. C. A| G. A. G.AG. G| C. T. A. A. A| G. A. T.CG. G| A. G. G. C. T| T. G. G. A. T| G. C.TC.GA. T| A. G.CA. T.AA| FolhaPétalaCaule novaadulta AGAAGCACT10CCCGAGATGT20GGCGCATGGAGTGCT30TATACAGAAGG40GCTAAAGACTG50GAGGCTTGGA60TGTCGCATACGAAT70A A Pericarpo-7Endosperma-3 A. G. A. A. G| C. A. C. T.80C| C. C. G. A. G| A. T. G. T.90G| G. G. A. G. G| G. G. C. T.100T| A. T. A. C. A| G. A. G. G.110G| C. T. A. A. A| G. A. T. G.120G| A. G. G. C. T| T. G. G. A.130T| G. C. C. A. T| A. G. A. T.140A| FolhaPétalaCaule novaadulta A. G. A. A. G| C. A. C. T. C| C. C. G. A. G| A. T. G. T. G| G. C.GC.AT.GG| A.GT.GC. T. T| A. T. A. C. A| G. A. A.GG. G| C. T. A. A. A| G. A. C.TG. G| A. G. G. C. T| T. G. G. A. T| G. T.CG.CA. T| A. C.GA. A.TA| Pericarpo-7Endosperma-3 AGAAGCACT80CCCGAGATGT90GGGAGGGGCT100TATACAGAGG110GCTAAAGATG120GAGGCTTGGA130TGCCATAGAT140A FolhaPétalaCaule adultanova A.CG.TA.TA. |GTC.GA.TC.AT. |CTC.TC.TG. A.G|GAA. T. G. T. |GG.CC.GAC.AT.G|GAA.GT.GCC. T. |TA.CT. A.CC. |ATG. A.GA.GG.A|GAC.GT. A. A.T|AG.AA.TC.TG.T|GTA.GG.AG. C.G|TGT.CG.AG. A.G|TGG. T.CG.CA. |TA. C.GTA.CA.TG|AT FolhaCaulePericarpo-7Endosperma-3 novaadulta CATGTAATGGCTAACT80TCTCTCGGAAGATGT90GCGAGCAGAGGCGCT100TCATCACTAGGAAGAG110AGGCTATAAAGTATTG120TGGAAGGGCGTCTAGGGA130GTGCGCATATGCAGT140TA Pétala .A.G.A.A|G.C.A.C.T|C.C.C.G.A|G.A.T.G.T|G.G.G.A.G|G.G.G.C.T|T.A.T.A.C|A.G.A.G.G|G.C.T.A.A|A.G.A.T.G|G.A.G.G.C|T.T.G.G.A|T.G.C.C.A|T.A.G.A.T|A FolhaCaulePericarpo-7Endosperma-3Pétala novaadulta CATGCTAATGCGCTAACGT80TCTCTCGGAAGATCGAT90GCCGAGCATGAGGACGCT100TCATCACTAGGAAGAG110AGGCTTATTACAAGTATTG120TGCGAAGGAGCGTCTGAGGGA130GTGACTGCATATTGCAGGT140TA Caule C. C. T. A. C| G. T. G. T. T| C. T. G. G. A| A. C. A. T. C| C. A. T. G. A| A. C. C. T. T| C. T. C. C. T| G. G. A. A. A| T. T. T. C. A| A. T. T. T. C| G. A. A. G. G| G. A. G. A. T| A. T. G. A. T| T. T. G. G. T| FolhaPericarpo-7PétalaEndosperma-3 adulta CATGCTAATGCGCTAACGT80TCTCTCGGAAGATCGAT90GCCGAGCATGAGGACGCT100TCATCACTAGGAAGAG110AGGCTTATTACAAGTATTG120TGCGAAGGAGCGTCTGAGGGA130GTGACTGCATATTGCAGGT140TA Pericarpo-7Folha nova C. C.TT. A. CTG. T. G.AT. TC.TT. G. G. AA. C.TA.GT. CGC. A. T.CG. AA.GC. C. T. TC. T. C. C. TG. G. A. A. AT.GT. T.AC.TAA. T. T. T. CTG. A. A.GG. GG.CA. G. A.GTGA.GT.CG. A. TT.AT. G.CG. T PétalaEndosperma-3Caule CACGTAACG| GCTAGCT80TC| CTCGGAAG| ACTAGT90CG| CGAGTAGAG| AGCGCT100T| CATCACTA| GGAAGAG110AG| TCTTACAA| AGTATTG120CG| GAAGAGGCGT| GTAGGA130T| AGTCGCAT| TATGGAGT140TA| Folha novaadulta CTTATGTATTTTGGAATGTGCACGAGCCTTCTCCTGGAAAGTATAATTTTGAGGGCAGGGGCGATATCGT CaulePericarpo-7Endosperma-3 C. C. T. A. C| G. T. G. T. T| C. T. G. G. A| A. C. A. T. C| C. A. T. G. A| A. C. C. T. T| C. T. C. C. T| G. G. A. A. A| T. T. T. C. A| A. T. T. T. C| G. A. A. G. G| G. A. G. A. T| A. T. G. A. T| T. T. G. G. T| FolhaPétala adulta CTCTATCGTAGT80TTCTGGAATCGAT90GCCACTGAGACCT100TCTCCTGGAA110AGTTATTCAATTT120TCGAGAGGCGAGGA130GTGACTGATATTCGG140T Pericarpo-7Endosperma-3Folha nova C. C.TT. A. C|TG. T. G.AT. T| C.TT. G. G. A| A. C.TA.GT. C|GC. A. T.CG. A| A.GC. C. T. T| C. T. C. C. T| G. G. A. A. A| T.GT. T.AC.TA| A. T. T. T. C|TG. A. A.GG. G| G.CA. G. A.GT|GA.GT.CG. A. T| T.AT. G.CG. T| FolhaPétalaCaule novaadulta CTCTATCGTAGT80TTCTGGAATCGAT90GCCACTGAGACCT100TCTCCTGGAA110AGTTATTCAATTT120TCGAGAGGCGAGGA130GTGACTGATATTCGG140T Pericarpo-7Endosperma-3 C. C. T. A. C| G. T. G. T.150T| C. T. G. G. A| A. C. A. T.160C| C. A. T. G. A| A. C. C. T.170T| C. T. C. C. T| G. G. A. A.180A| T. T. T. C. A| A. T. T. T.190C| G. A. A. G. G| G. A. G. A.200T| A. T. G. A. T| T. T. G. G.210T| FolhaPétalaCaule novaadulta C. T.CT. A. T|CG. T. A.GT. T| T.CT. G. G. A| A. T.CG.AT. G|CC. A. C.TG. A| G.AC. C. T. T| C. T. C. C. T| G. G. A. A. A| G.TT. A.TT.CA| A. T. T. T. T|CG. A. G.AG. G| C.GA. G. G.AG|TG.AC.TG. A. T| A.TT. C.GG. T| Pericarpo-7Endosperma-3 CCTACGTGT150TCTGGAACAT160CCATGAACCT170TCTCCTGGAA180ATTTCAATTT190CGAAGGGAGA200TATGATTTGG210T FolhaPétalaCaule adultanova C. T.CAT.GA. |TCG.TT.CA.GCT. |TCT.CAT.AG. G.C|ATA. T.CGG.ATT.A|GCAC.AA. C.TGG.C|AG.AC. C.TT.G|TGC.TT.CC.TC.T|TG.AG.CA.GA.C|ACG.TCT.AA.TT.C|ATA.TT.CT.GT.C|TCAG.TA.TG.AG. |GCC.GA.CG.CG.AT|GTAG.ACC.TGG.TA.T|TA.TGT. C.GG.C|TA FolhaCaulePericarpo-7Endosperma-3 novaadulta CACGTATCTGCTCGT150CTACATGCGTAAGCTAAT160ACACAGTCGAGACTCGT170GTTCCTTCTCTAGCGGACA180CACTATTCTATACTGTCT190ACTGTAGAGCGCGCACGTA200ATCAGTTGTATGTTGCG210AT Pétala .C.C.T.A|C.G.T.G.T|T.C.T.G.G|A.A.C.A.T|C.C.A.T.G|A.A.C.C.T|T.C.T.C.C|T.G.G.A.A|A.T.T.T.C|A.A.T.T.T|C.G.A.A.G|G.G.A.G.A|T.A.T.G.A|T.T.T.G.G|T FolhaCaulePericarpo-7Endosperma-3Pétala novaadulta CTACGTAGTCTGCTCGAT150CTAACATGCGTAAGGCTAATC160ACACAGGTACGAAGACTCAGT170GTTCGCTTCTCATAGCGTGACAT180CAGCTATTCTATAGCTGTCTA190ACTGTAGAGCGCGCACGTTA200ATCATGTTGTATGTTGCG210AT Caule T. A. G. G. T| T. C. A. T. A| A. A. G. C. T| G. G. T. C. C| A. G. A. A. A| G. C. A. G. G| G. C. T. A. T| A. T. G. T. G| C. A. T. C. T| G. C. G. A. A| T. T. G. G. G| C. C. T. T. A| T. G. T. T. T| G. T. G. C. T| FolhaPericarpo-7PétalaEndosperma-3 adulta CTACGTAGTCTGCTCGAT150CTAACATGCGTAAGGCTAATC160ACACAGGTACGAAGACTCAGT170GTTCGCTTCTCATAGCGTGACAT180CAGCTATTCTATAGCTGTCTA190ACTGTAGAGCGCGCACGTTA200ATCATGTTGTATGTTGCG210AT Pericarpo-7Folha nova T.CA. G. G.ATT. C. A.CT. ACA. A. G. C. TG.AG. T. C.ACAA. G.AA.GA.CAG. C. A.TG. GG.TC. T. A.TTA. T.CG. T.CGCC. A. T. C. TG.TC. G. A.CAT. T. G. G. GCC. C. T.CT. AT.CG. T. T. TG. T. G. C. TA PétalaEndosperma-3Caule TCACGTGATC| TGCTAGT150AT| ACATGCGTA| GAGCTACT160C| ACGAATAGA| GACACGT170GT| GCCTTCACT| AGTGGATA180GA| CTATTCTA| GACTGTAT190AC| TGTAGAGG| CGCATGTA200AT| TAGTTGTAT| GTTGCG210T| Folha novaadulta CAGATTCCTCAAGCTAGTAAAAGCAGCTGGTCTTTACGCCCATCTTCGCATTGGCCCCTACGTTTGTGCA CaulePericarpo-7Endosperma-3 T. A. G. G. T| T. C. A. T. A| A. A. G. C. T| G. G. T. C. C| A. G. A. A. A| G. C. A. G. G| G. C. T. A. T| A. T. G. T. G| C. A. T. C. T| G. C. G. A. A| T. T. G. G. G| C. C. T. T. A| T. G. T. T. T| G. T. G. C. T| FolhaPétala adulta CTAGAGTTCCAT150CAAAGCTAGGTAC160ACAAGGACAAGCTAG170GTGCTTATACTGCT180CGCATCTTGCGCA190ATTGGCGCCCTT200ACTGTTTGTGC210AT Pericarpo-7Endosperma-3Folha nova T.CA. G. G.AT| T. C. A.CT. A|CA. A. G. C. T| G.AG. T. C.AC|AA. G.AA.GA.CA| G. C. A.TG. G| G.TC. T. A.TT| A. T.CG. T.CG|CC. A. T. C. T| G.TC. G. A.CA| T. T. G. G. G|CC. C. T.CT. A| T.CG. T. T. T| G. T. G. C. T|A FolhaPétalaCaule novaadulta CTAGAGTTCCAT150CAAAGCTAGGTAC160ACAAGGACAAGCTAG170GTGCTTATACTGCT180CGCATCTTGCGCA190ATTGGCGCCCTT200ACTGTTTGTGC210AT Pericarpo-7Endosperma-3 T. A. G. G. T| T. C. A. T.220A| A. A. G. C. T| G. G. T. C.230C| A. G. A. A. A| G. C. A. G.240G| G. C. T. A. T| A. T. G. T.250G| C. A. T. C. T| G. C. G. A.260A| T. T. G. G. G| C. C. T. T.270A| T. G. T. T. T| G. T. G. C.280T| FolhaPétalaCaule novaadulta C.TA. G. A.GT| T. C. C.AT. C|AA. A. G. C. T| A.GG. T. A.CA|CA. A.GG.AC.AA| G. C. T.AG. G| T.GC. T. T.AT| A. C.TG. C.TC|GC. A. T. C. T| T.GC. G. C.AA| T. T. G. G. C|GC. C. C.TT. A| C.TG. T. T. T| G. T. G. C. A|T Pericarpo-7Endosperma-3 TAGGTTCAT220AAAGCTGGTC230CAGAAAGCAG240GGCTATATGT250GCATCTGCGA260ATTGGGCCTT270ATGTTTGTGC280T FolhaPétalaCaule adultanova C.TGA. G.AA.GT|TGT.GC.AC.AT.C|CATA.TA.TG. C.G|TGA.GG. T. A.CT|ACTA.CA.GCG.ACC.AG|AGG.TC. T.AG. |GT.GCC.TT.AT.A|TAA. C.TG.AC.T|CGC.TA.GT.CC. |TCT.GC.GG.CC.A|ATT.GT.GG.AG.A|CGTC.TC.TC.TAT.G|AGC.TAG.CT.AT.G|TAG.CT.AG.AC. |ATG FolhaCaulePericarpo-7Endosperma-3 novaadulta GTAAGTGGTGTACACT220TATATAGGCGTGGTTC230TCCACGCAGAGATGCTAG240GCGTCATAATATAGCT250GTCGACTCCTGGCCGA260TAGTGTAGAGTGTCTCATGT270GAATCGATGTATCGATAGC280GT Pétala .T.A.G.G|T.T.C.A.T|A.A.A.G.C|T.G.G.T.C|C.A.G.A.A|A.G.C.A.G|G.G.C.T.A|T.A.T.G.T|G.C.A.T.C|T.G.C.G.A|A.T.T.G.G|G.C.C.T.T|A.T.G.T.T|T.G.T.G.C|T FolhaCaulePericarpo-7Endosperma-3Pétala novaadulta GTAAGTGGTGTACACT220TATATAGGCGTGGTCTC230TCCACGCAGATGATGCGTAG240GCGTTCATGAATAGTAGCT250GTCGACTCCTGGCCGA260TAGTCGTAAGAGCTGTCTCATGT270GAATCGATCGTATCGTATAGC280GT Caule G. A. G. T. G| G. A. A. T. T| T. T. G. G. G| G. G. C. T. T| C. C. C. T. G| T. G. T. G. G| T. T. G. A. A| G. T. A. T. G| T. A. C. C. T| G. G. C. A. T| C. A. G. C. T| T. C. A. G. A| A. C. C. G. A| T. A. G. C. G| FolhaPericarpo-7PétalaEndosperma-3 adulta GTAAGTGGTGTACACT220TATATAGGCGTGGTCTC230TCCACGCAGATGATGCGTAG240GCGTTCATGAATAGTAGCT250GTCGACTCCTGGCCGA260TAGTCGTAAGAGCTGTCTCATGT270GAATCGATCGTATCGTATAGC280GT Pericarpo-7Folha nova G. A. G.AT. GG. A. A. T.CTT. T. G. G. GG. G. C.TT. TC. C. C. T.GGT. G.CT. G. GT.CT. G.AA. AG.AT. A. T.CGT. A.GC. C. TCG. G. C. A. TC.GA.GG.AC.ATT. C.TA. G. AGA. C. C.AG. AT.CA. G.AC. G PétalaEndosperma-3Caule GTAGTGGT| GTACAT220TA| TATAGGCGT| GGCTTC230TC| CACGCATAGA| TGGCTAG240G| TGTCGTAAT| GATAGT250G| TCACTCT| GGCCGA260TA| CTATGCGTG| TCCATGT270A| ATCGCTGTAT| TGATGC280GT| Folha novaadulta GAATGGAACTTTGGGGGTTTCCCGGTCTGGCTAAAATACGTGCCCGGCATGGAATTTAGGACAGACAACG CaulePericarpo-7Endosperma-3 G. A. G. T. G| G. A. A. T. T| T. T. G. G. G| G. G. C. T. T| C. C. C. T. G| T. G. T. G. G| T. T. G. A. A| G. T. A. T. G| T. A. C. C. T| G. G. C. A. T| C. A. G. C. T| T. C. A. G. A| A. C. C. G. A| T. A. G. C. G| FolhaPétala adulta GAAGTGGAACT220TTTGGGGGTCT230TCCCGTGTCGTG240GCTTAGAAAGTACT250GTGACCCTGGCA260TGCGAAGACTTTCAG270GAACACGACTAAGC280G Pericarpo-7Endosperma-3Folha nova G. A. G.AT. G| G. A. A. T.CT| T. T. G. G. G| G. G. C.TT. T| C. C. C. T.GG| T. G.CT. G. G| T.CT. G.AA. A| G.AT. A. T.CG| T. A.GC. C. T|CG. G. C. A. T| C.GA.GG.AC.AT| T. C.TA. G. A|GA. C. C.AG. A| T.CA. G.AC. G| FolhaPétalaCaule novaadulta GAAGTGGAACT220TTTGGGGGTCT230TCCCGTGTCGTG240GCTTAGAAAGTACT250GTGACCCTGGCA260TGCGAAGACTTTCAG270GAACACGACTAAGC280G Pericarpo-7Endosperma-3 G. A. G. T. G| G. A. A. T.290T| T. T. G. G. G| G. G. C. T.300T| C. C. C. T. G| T. G. T. G.310G| T. T. G. A. A| G. T. A. T.320G| T. A. C. C. T| G. G. C. A.330T| C. A. G. C. T| T. C. A. G.340A| A. C. C. G. A| T. A. G. C.350G| FolhaPétalaCaule novaadulta G. A. A.GT. G| G. A. A. C.TT| T. T. G. G. G| G. G. T.CT. T| C. C. C. G.TG| T. C.GT. G. G| C.TT. A.GA. A| A.GT. A. C.TG| T. G.AC. C. C|TG. G. C. A. T| G.CG.AA.GA.CT| T. T.CA. G. G|AA. C. A.CG. A| C.TA. A.GC. G| Pericarpo-7Endosperma-3 GAGTGGAAT290TTTGGGGGCT300TCCCTGTGTG310GTTGAAGTAT320GTACCTGGCA330TCAGCTTCAG340AACCGATAGC350G FolhaPétalaCaule adultanova G. A.GA.GCT.C|GTG.TA.TA.TC.TA|TAT.GT.GG.CG. |GG.CG.AT.CAT. |TGC. C.AC.AG.T|GT.AC.GTT. G.T|GC.TT. A.GA.C|AGA.GT.AA. C.TA|GTT. G.AC.TC. |CTAG.AG.CC.TA.T|TGG.CAG.ATA.GA.C|TAT.GT.CA.CG.A|GAA. C.AA.CG.A|ATC.TA.TA.GC.T|GT FolhaCaulePericarpo-7Endosperma-3 novaadulta GGACGCTTGTGTATAAT290ATGTGTCGGGCGAGACT300GTCACACGTGATTGTTG310GTTAGCAGAAGATAAT320TGTGATCCATAGCGTCTA330GTACTAGACATGTTCCAAG340GAAACACAGTATTAGTC350TG Pétala .G.A.G.T|G.G.A.A.T|T.T.T.G.G|G.G.G.C.T|T.C.C.C.T|G.T.G.T.G|G.T.T.G.A|A.G.T.A.T|G.T.A.C.C|T.G.G.C.A|T.C.A.G.C|T.T.C.A.G|A.A.C.C.G|A.T.A.G.C|G FolhaCaulePericarpo-7Endosperma-3Pétala novaadulta GAGACGCTTGTGTATACAT290ATGTGTACGTGGCGAGACT300GTCACACGTAGATGTGTTGC310GATCTCAGCAGAAGATAAT320TGTGATCCTATCAGCGATCATA330GTACTAGACATGTTCCAAGT340GAAACACAGTAGTCTAGTC350TG Caule A. G. C. C. T| T. T. C. A. A| G. A. T. G. G| C. A. A. T. G| C. A. A. A. G| G. T. T. C. A| C. C. G. A. G| A. A. A. A. T| T. G. T. T. C| G. A. A. T. G| A. T. G. A. A| G. T. A. T. G| A. A. A. A. G| C. T. G. T. T| FolhaPericarpo-7PétalaEndosperma-3 adulta GAGACGCTTGTGTATACAT290ATGTGTACGTGGCGAGACT300GTCACACGTAGATGTGTTGC310GATCTCAGCAGAAGATAAT320TGTGATCCTATCAGCGATCATA330GTACTAGACATGTTCCAAGT340GAAACACAGTAGTCTAGTC350TG Pericarpo-7Folha nova A.GG. C. C. TT. T. C.TA. AG. A.GT.CG. GC. A. A. T. GC. A. A. A.GGG.AT. T. C.TAGC.TC.TG.AA.CGA. A. A. A. TT. G. T. T.CCAG.AA.CA.TT. GA. T. G. A. AG. T. A.CT.AGA. A. A. A. GTC.TT. G. T. T PétalaEndosperma-3Caule AGGACGCTTG| TGTACAAT290AT| GTATTGGG| CGAGACT300GT| CACACATG| GTTGTCG310AG| CTCTGAGA| AGATAAT320TG| TGATCTCCT| GAGACTA330GT| ACTAGACAT| GTTCATG340GA| AACACAGGA| CTTAGTC350TG| Folha novaadulta GGCCTTTTAAGGCGGCAATGCAAGGATTTGTTACGAAAATTGTCAACTTGATGAAGTCAGAAAATTTGTT CaulePericarpo-7Endosperma-3 A. G. C. C. T| T. T. C. A. A| G. A. T. G. G| C. A. A. T. G| C. A. A. A. G| G. T. T. C. A| C. C. G. A. G| A. A. A. A. T| T. G. T. T. C| G. A. A. T. G| A. T. G. A. A| G. T. A. T. G| A. A. A. A. G| C. T. G. T. T| FolhaPétala adulta GAGCCTTTTCA290AGGACTGGCAAT300GCAAGAGAGTTTC310GATCTCAGCAGAAAA320TTGTCTACAGCATAT330GATGAAGTCAAT340GAAAATGTCTGT350T Pericarpo-7Endosperma-3Folha nova A.GG. C. C. T| T. T. C.TA. A| G. A.GT.CG. G| C. A. A. T. G| C. A. A. A.GG| G.AT. T. C.TA|GC.TC.TG.AA.CG| A. A. A. A. T| T. G. T. T.CC|AG.AA.CA.TT. G| A. T. G. A. A| G. T. A.CT.AG| A. A. A. A. G|TC.TT. G. T. T| FolhaPétalaCaule novaadulta GAGCCTTTTCA290AGGACTGGCAAT300GCAAGAGAGTTTC310GATCTCAGCAGAAAA320TTGTCTACAGCATAT330GATGAAGTCAAT340GAAAATGTCTGT350T Pericarpo-7Endosperma-3 A. G. C. C. T| T. T. C. A.360A| G. A. T. G. G| C. A. A. T.370G| C. A. A. A. G| G. T. T. C.380A| C. C. G. A. G| A. A. A. A.390T| T. G. T. T. C| G. A. A. T.400G| A. T. G. A. A| G. T. A. T.410G| A. A. A. A. G| C. T. G. T.420T| FolhaPétalaCaule novaadulta G.AG. C. C. T| T. T. T.CA. A| G. G.AC.TG. G| C. A. A. T. G| C. A. A. G.AG| A.GT. T. T.CG|AT.CT.CA.GC.AG| A. A. A. A. T| T. G. T. C.TA|CA.GC.AT.AT. G| A. T. G. A. A| G. T. C.AA.TG| A. A. A. A. T|GT.CT. G. T. T| Pericarpo-7Endosperma-3 AGCCTTTCA360AGATGGCAAT370GCAAAGGTTC380ACCGAGAAAA390TTGTTCGAAT400GATGAAGTAT410GAAAAGCTGT420T FolhaPétalaCaule adultanova G.ACG. C.AC.G|TCT.CT. T.CA. |AGG. G.AC.TAG. |GC.AA.CA.CT.A|GAC.TA.TA. G.AT|GTA.GT. T.GT.C|GACT.CT.CA.GC.AG|GAA.TA. A.GA. |TGT.AG.AT.CC.TG|ACA.GC.ATT.AT. |GA.GT.CG.CA.C|AG. T. C.ATA.TG|GAA.GA.TA.GA.G|TGT.CAT.GG.AT. |TC FolhaCaulePericarpo-7Endosperma-3 novaadulta CAGACGCCTCTTCA360GAGGAATGGACCACAAT370AGTCTAATATGAGTGTTC380CACCAGGAAGTAAGAA390GTATAGCTGTACGTAAT400GGACTCGCAAGTTAGT410AGGATAGAGAGACGTAGT420CT Pétala .A.G.C.C|T.T.T.C.A|A.G.A.T.G|G.C.A.A.T|G.C.A.A.A|G.G.T.T.C|A.C.C.G.A|G.A.A.A.A|T.T.G.T.T|C.G.A.A.T|G.A.T.G.A|A.G.T.A.T|G.A.A.A.A|G.C.T.G.T|T FolhaCaulePericarpo-7Endosperma-3Pétala novaadulta CATGCACGCACTCTTCA360GAGGAATGGACCACAAT370AGTCTAATATGAGCTGTTC380CACCAGGAAGTAATGAA390GTATAGCTGTACGTAAT400GGACTCGACATAGTATAGTA410AGGACTAGAGAGACGTAAGTTA420CT Caule T. C. A. A. T| C. T. C. A. A| G. G. A. G. G| C. C. C. T. A| T. A. A. T. T| C. T. T. T. C| C. C. A. G. A| T. T. G. A. G| A. A. T. G. A| G. T. A. T. G| G. T. A. T. A| G. A. A. A. G| C. A. A. G. G| C. A. T. A. T| FolhaPericarpo-7PétalaEndosperma-3 adulta CATGCACGCACTCTTCA360GAGGAATGGACCACAAT370AGTCTAATATGAGCTGTTC380CACCAGGAAGTAATGAA390GTATAGCTGTACGTAAT400GGACTCGACATAGTATAGTA410AGGACTAGAGAGACGTAAGTTA420CT Pericarpo-7Folha nova T.CC.GA. A.GTCC. T. C. A. AGG. G. A. G. GC.AC. C. T.AAT. A.TA. T. TC.AT. T.GT. CC. C. A. G. AT. T.AG. A. GA. A. T.CG. AG. T. A. T. GG. T.CA.CT.CAG. A.TA.TA.GGAC.GA.TA.GG. GC.AA.GT.AA.TTC PétalaEndosperma-3Caule TACGACACT| CTTCA360A| GGAATGG| CCACAT370AG| TCAATATG| CGTTTC380CA| CCAGGAAG| TATAGAA390GT| ATAGTGTAC| GTAAT400G| GATAGTAA| GATAAT410G| CAAAGAG| CATTGAT420T| Folha novaadulta CGAGCCTCAGGGAGGACCAATTATTATGTCCCAGATAGAGAACGAGTATGGCCCAGTTGAGTGGGAGATC CaulePericarpo-7Endosperma-3 T. C. A. A. T| C. T. C. A. A| G. G. A. G. G| C. C. C. T. A| T. A. A. T. T| C. T. T. T. C| C. C. A. G. A| T. T. G. A. G| A. A. T. G. A| G. T. A. T. G| G. T. A. T. A| G. A. A. A. G| C. A. A. G. G| C. A. T. A. T| FolhaPétala adulta CTGCAGACTCTCA360GAGGAGGACCCAT370ATTAATTACTGTT380CCCAGATATGA390GAACTGAGTAT400GGCTCACTAGTATAGA410AGGCTAGAGGACGAATTA420CT Pericarpo-7Endosperma-3Folha nova T.CC.GA. A.GT|CC. T. C. A. A|GG. G. A. G. G| C.AC. C. T.AA| T. A.TA. T. T| C.AT. T.GT. C| C. C. A. G. A| T. T.AG. A. G| A. A. T.CG. A| G. T. A. T. G| G. T.CA.CT.CA| G. A.TA.TA.GG|AC.GA.TA.GG. G| C.AA.GT.AA.TT|C FolhaPétalaCaule novaadulta CTGCAGACTCTCA360GAGGAGGACCCAT370ATTAATTACTGTT380CCCAGATATGA390GAACTGAGTAT400GGCTCACTAGTATAGA410AGGCTAGAGGACGAATTA420CT Pericarpo-7Endosperma-3 T. C. A. A. T| C. T. C. A.430A| G. G. A. G. G| C. C. C. T.440A| T. A. A. T. T| C. T. T. T.450C| C. C. A. G. A| T. T. G. A.460G| A. A. T. G. A| G. T. A. T.470G| G. T. A. T. A| G. A. A. A.480G| C. A. A. G. G| C. A. T. A.490T| FolhaPétalaCaule novaadulta C.TG.CA. G.AC|TC. T. C. A. G|AG. G. A. G. G| A.CC. C. A.TA| T. T.AA. T. T| A.CT. G.TT. C| C. C. A. G. A| T. A.TG. A. G| A. A. C.TG. A| G. T. A. T. G| G. C.TC.AC.TA| G. T.AT.AG.AA|GG.CT.AG.AG. G| A.CG.AA.TT.AC|T Pericarpo-7Endosperma-3 TCAATCTCA430AGGAGGCCCT440ATAATTCTTT450CCCAGATTGA460GAATGAGTAT470GGTATAGAAA480GCAAGGCATA490T FolhaPétalaCaule adultanova C.TGG.CA. G.A|CTC.TT.CC. A. |GAG. G.TA. G.A|GAA.CGC. C.AA.T|AT. T.AA.CT.C|TAA.CT.AG.TT.G|CGC.GC. A.GG. |ACT.AA.TCG.AA. |GAA.TA.GC.TGG.C|ATG. T. A.TT.G|GTG.TC.TC.AC.TA|AG.AT.ACT.AG.AC|AGTG.CT.AGG.ATG. |GTA.CTG.ACA.TCT.A|CT FolhaCaulePericarpo-7Endosperma-3 novaadulta GTGCAGACTTCCTCA430GAGTGAAGAGGCCACT440ATACACTATACATTGT450GCGCCGAGCAATCTAGA460AGTAGAGTCGTAGTTAGT470TGCTGCTAATAAGCAACA480TGGCGATAGTGTCCACTA490T Pétala .T.C.A.A|T.C.T.C.A|A.G.G.A.G|G.C.C.C.T|A.T.A.A.T|T.C.T.T.T|C.C.C.A.G|A.T.T.G.A|G.A.A.T.G|A.G.T.A.T|G.G.T.A.T|A.G.A.A.A|G.C.A.A.G|G.C.A.T.A|T FolhaCaulePericarpo-7Endosperma-3Pétala novaadulta GTGCATGACTTCACTGCAT430GAGTGAACAGAGTGCCACT440ATACATCTGATACATTGT450GCGCCGATGCAATCTAAGAT460AGTAGAGTCGTAGTTAGT470TGCATGCTAACATGAAGCAGACA480TGGCGATAGGTGTCGCACTA490T Caule G. G. T. G. C| A. G. C. T. G| G. A. C. G. T| G. C. A. T. A| T. A. T. G. A| A. T. T. G. G| G. C. T. G. C| T. A. A. T. A| T. G. G. C. T| G. T. T. G. A| G. A. C. G. A| A. G. A. C. T| G. G. G. G. T| G. C. C. A. T| FolhaPericarpo-7PétalaEndosperma-3 adulta GTGCATGACTTCACTGCAT430GAGTGAACAGAGTGCCACT440ATACATCTGATACATTGT450GCGCCGATGCAATCTAAGAT460AGTAGAGTCGTAGTTAGT470CGATGCTAACATGAAGCAGACA480TGGCGATAGGTGTCGCACTA490T Pericarpo-7Folha nova G. G. T.AG. CA.TG.CC. T.AGG. A.TC.AG.ATAG. C. A. T. AT. A. T.CG.CAA. T.AT. G. GG. C. T.GG. CT.AA.CA. T.AAT. G. G. C. TG. T. T. G. ATG.TA.CC.AG.AAA. G.CA. C. TG. G. G.TG. TG.TC. C. A. T PétalaEndosperma-3Caule GTGCTAGACT| ACGTCTA430GA| GAGCAGTG| GCCACT440A| TATAGTAT| ACTTGT450GC| GCCTAGCA| TATAGTA460AG| TAGAGTCGTA| GTTAGT470AG| GATCAGTA| AGGAACA480TG| GCGAGAGTG| GCCACTA490T| Folha novaadulta GGAGCTCCAGGTAAAGCATATACCAAATGGGCGGCACAAATGGCTGTTGTCTCAAAACACTGGTGTTCCAT CaulePericarpo-7Endosperma-3 G. G. T. G. C| A. G. C. T. G| G. A. C. G. T| G. C. A. T. A| T. A. T. G. A| A. T. T. G. G| G. C. T. G. C| T. A. A. T. A| T. G. G. C. T| G. T. T. G. A| G. A. C. G. A| A. G. A. C. T| G. G. G. G. T| G. C. C. A. T| FolhaPétala adulta GGATGCTACGCAT430GGTAACAGATGCAT440ATACTCGAAATTG450GGCGTGCATCAAAT460ATGGCTGTTG470CATGCAACAGAACGAC480TGGTGGTTGCCA490T Pericarpo-7Endosperma-3Folha nova G. G. T.AG. C| A.TG.CC. T.AG| G. A.TC.AG.AT|AG. C. A. T. A| T. A. T.CG.CA| A. T.AT. G. G| G. C. T.GG. C| T.AA.CA. T.AA| T. G. G. C. T| G. T. T. G. A|TG.TA.CC.AG.AA| A. G.CA. C. T| G. G. G.TG. T| G.TC. C. A. T| FolhaPétalaCaule novaadulta GGATGCTACGCAT430GGTAACAGATGCAT440ATACTCGAAATTG450GGCGTGCATCAAAT460ATGGCTGTTG470TCATGCAACAGAACGAC480TGGTGGTTGCCA490T Pericarpo-7Endosperma-3 G. G. T. G. C| A. G. C. T.500G| G. A. C. G. T| G. C. A. T. A| T. A. T. G. A| A. T. T. G. G| G. C. T. G. C| T. A. A. T. A| T. G. G. C. T| G. T. T. G. A| G. A. C. G. A| A. G. A. C. T| G. G. G. G. T| G. C. C. A. T| FolhaPétalaCaule novaadulta G. G. A.TG. C| T.AC.GC. A.TG| G. TAACAGATGCATATACTCGAAATTGGGCGTGCATCAAATATGGCTGTTGTCATGCAACAGAACGACTGGTGGTTGCCAT Pericarpo-7Endosperma-3 GGTGCAGCT500GGACGTGCATATATGAATTGGGCTGCTAATATGGCTGTTGAGACGAAGACTGGGGTGCCAT FolhaPétalaCaule adultanova G. G. A.TGG.T|CTT.AC.GTC.GA.T|GG.CTAACAGATGCATATACTCGAAATTGGGCGTGCATCAAATATGGCTGTTGCATGCAACAGAACGACTGGTGGTTGCCAT FolhaCaulePericarpo-7Endosperma-3 novaadulta GGGTTGTCATGGCT500GCGACGTGCATATATGAATTGGGCTGCTAATATGGCTGTTGAGACGAAGACTGGGGTGCCAT Pétala .G.G.T.G|C.A.G.C.T|G.GACGTGCATATATGAATTGGGCTGCTAATATGGCTGTTGAGACGAAGACTGGGGTGCCAT FolhaCaulePericarpo-7Endosperma-3Pétala novaadulta GGGTTGTCATGGCT500GCGACGTGCATATATGAATTGGGCTGCTAATATGGCTGTTGAGACGAAGACTGGGGTGCCAT Caule G. G. G. T. T| A. T. G. T. G| C. FolhaPericarpo-7PétalaEndosperma-3 adulta GGGTTGTCATGGCT500GCGACGTGCATATATGAATTGGGCTGCTAATATGGCTGTTGAGACGAAGACTGGGGTGCCAT Pericarpo-7Folha nova G. G. G. T. TA. T. G. T. GC. PétalaEndosperma-3Caule GGGTTGTC| ATGGCT500G| CGACGTGCATATATGAATTGGGCTGCTAATATGGCTGTTGAGACGAAGACTGGGGTGCCAT Folha novaadulta GGGTTATGTGC CaulePericarpo-7Endosperma-3 G. G. G. T. T| A. T. G. T. G| C. FolhaPétala adulta GGGTTATGT500GC Pericarpo-7Endosperma-3Folha nova G. G. G. T. T| A. T. G. T. G| C. FolhaPétalaCaule adulta GGGTTAT10GT500GC 20 30 40 50 60 70 Endosperma-3Folha nova G. G. G. T. T| A. T. G. T. G| C. Pericarpo-7 . . .G.G|G.T.T.A.T|G.T.G. C. | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | B FolhaPétalaCaule novaadulta GGGTTATGTGC FolhaEndosperma-3Adultadulta leaf RSTGPGEGMTWTPADTLGITQGKCAKDGGLDVIQTYVFWNVHEPSPGKYNFEGRGDIVRFLKLVKAAGLYAHLRIGPYVCA FolhaPétalaCaulePericarpo-7 adulta GGGTTATGTGC Pericarp_7 RSTPEMWEGLIQRAKDGGLDAIDTYVFWNIHEPSPGNFNFEGRYDLVRFIKLVQKAGLYVHLRIGPYVCA PericarpoPétalaCaulePericarpo-7Endosperma-3-7 GGGTTATGTGC CaulePericarpo-7Endosperma-3 GGGTTATGTGC Pericarpo-7Endosperma-3 GGGTTAT80GTGC 90 100 110 120 130 140 Endosperma-3. . .G.G|G.T.T.A.T|G.T.G. C. | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | FolhaAdultadulta leaf EWNFGGFPVWLKYVPGMEFRTDNGPFKAAMQGFVTKIVNLMKSENLFEPQGGPIIMSQIENEYGPVEWEI PericarpoPericarp_7-7 EWNFGGFPVWLKYVPGISFRTDSEPFKMAMQRFTEKIVRMMKYEKLFQSQGGPIILSQIENEYGIESKAY

150 160 Família 35 glicosil hidrolase . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . . . | . . FolhaAdultadulta leaf GAPGKAYTKWAAQMAVAQNTGVPWVMC PericarpoPericarp_7-7 GAAGRAYMNWAANMAVETKTGVPWVMC

Figura 31. Isoformas da -galactosidase de folhas jovens e adultas, ramos, pétalas, endosperma e pericarpo expressas em C. arabica. (A) Alinhamento das isoformas amplificadas de CaGal. (B) Alinhamento da sequência de aminoácidos, traduzidos in silico, das duas isoformas de CaGal. Quadrados vazados identificam as diferenças na sequência de aminoácidos. 134

A presença de isoformas de CaGal sugere que este gene pode estar envolvido com vias metabólicas específicas dispersas em diversos tecidos e órgãos nas plantas de café, especificamente com componentes presentes na matriz da parede celular. Aparentemente este é o caso de CaGal, uma vez que a análise in silico detectou a presença da sequência de um peptídeo sinal que as direcionam para o apoplasto celular. Entretanto, vale destacar que nem todas as Gals apresentam sinalização de vias metabólicas (AHN et al., 2007). Em frutos de café, CaGal sequenciadas e expressas a partir de pericarpo e de endosperma foram idênticos (Figura 31), apesar de apresentarem diferentes níveis de transcrição e de atividade enzimática durante o desenvolvimento e maturação de frutos de café (Figuras 26 e 27, respectivamente). Este resultado preliminar sugere que a expressão deste gene poderia ser regulada na região do seu promotor, por serem promotores tecido-específicos ou mesmo por serem controlados por fatores de transcrição específicos. Estas hipóteses deverão ser futuramente investigadas pela clonagem da região 5’- UTR dos dois tecidos. A atividade de CaGal em folhas, ramos e pétalas do cafeeiro não foram consideradas nestas análises e deverão ser estudadas, futuramente, com o objetivo de se compreender o seu funcionamento nestes tecidos. Isoformas de -galactosidases têm sido identificadas em diversas espécies vegetais. Prasanna et al. (2005) identificaram três isoformas de -Gal em manga. Em tomate, Smith e Gross (2000) identificaram sete isoformas de -Gal, mas somente a isoforma TGB4 era ativa durante o desenvolvimento dos frutos e, em abacate, Tateishi et al. (2007) não somente identificaram três isoformas de -Gal, mas também verificou seus diferentes padrões de expressão durante a maturação do abacate. Durante a maturação de frutos de morango, Trainotti et al. (2001) identificaram três isoformas do gene da -galactosidase, mas somente a isoforma FaGal1 aumentou sua expressão durante a maturação dos frutos. A análise destes resultados sugere que isoformas do gene da -galactosidase não são únicos para C. arabica. Aparentemente, elas parecem ser amplamente distribuídas em diversas espécies vegetais em famílias multigênicas, mas nem todas as isoformas parecem estar envolvidas no processo de maturação de frutos.

135

Análise filogenética molecular Um hipotético cladrograma evolutivo de CaGal foi elaborado com base na comparação da tradução in silico da sequência codante do gene CaGal expresso em frutos de C. arabica com outras 36 sequências de aminoácidos de diferentes espécies vegetais obtidas com a busca usando o algoritmo Blastx no banco de dados do NCBI. As sequências foram alinhadas, manualmente editadas e a análise filogenética foi elaborada usando o algoritmo de Máxima Parcimônia com limite (cutoff) de 50% (Figura 32).

136

96 gi|7682677|gb|AAF67341.1|Vigna radiata (AAF67341) beta galact... 53 gi|193850557|gb|ACF22882.1|Glycine max (ACF22882) beta-gala...

52 gi|3641863|emb|CAA06309.1|Cicer arietinum (CAA06309) beta-galac... C.Capsicum annuum beta-galactosidase+BG1annuum (AAK40304) 100 gi|3299896|gb|AAC25984.1|S. lycopersicum TBG4 (AAC25984) beta-galact... gi|14970843|emb|CAC44502.1|Fragaria x ananassa BGal3 (CAC44502)beta-gala... 74 gi|222854244|gb|EEE91791.1|Populus trichocarpa (EEE91791) predicted... gi|1352078|sp|P48981.1|BGALMalus x domestica (P48981) MALus DOm... 99 gi|51507377|emb|CAH18936.1|Pyrus communis (CAH18936) beta-gala... M.Mangifera indica Manilaindica beta-D-galactosidase...(AAB61470) gi|20384648|gb|AAK31801.1|Citrus sinensis (AAK31801) beta-galac... S.S. lycopersicum beta-galactosidase+TBG3TBG3 (AAF70822) 93 C.Carica papayapapaya beta-galactosidase(ACP18875) pBG(a) 72 74 P.Prunus persicapersica beta-galactosidase(ABV32545) protein 2 73 F.Fragaria x ananassax ananassa beta-galactosidase+beta(2)BGal2 (CAC44501) A.Asparagus officinalis officinalisbeta-galactosidase(CAA54525) 72 gi|242093394|ref|XPSorghum bicolor (XP_002437187) 002437187.1| hypo... O.Oryza sativasativa Japonica Japonica Group(AAM34271) beta-galacto...

80 V.Vitis viniferavinifera putative(AAK81874) beta-galactosida... 99 P.Persea americanaamericana beta-D-galactosidase+PaGAL4PaGal4 (BAF31234) 51 S.S. lycopersicum putativeTBG6 (AAF70825)beta-galacto... 97 P.Pyrus pyrifoliapyrifolia beta-D-galactosidase+PpGAL5PpGAL5 (BAD91082)

97 R.Raphanus sativus beta-galactosidase+RsBGAL1sativus RsBGAL1 (BAD20774)

98 F.Fragaria x ananassax ananassa beta-galactosidase+beta...BGal1 (CAC44500) 96 S.S. lycopersicumlycopersicum putativeTBG2 (AAF70821)beta-galacto(2) gi|669059|emb|CAA59162.1|Brassica oleracea (CAA59162) beta-galact... 64 gi|195647054|gb|ACG42995.1|Zea mays (ACG42995) beta-gala... 94 gi|7939621|gb|AAF70823.1|AF154422S. lycopersicum TBG7 (AAF70823) 1 b... G.Gossypium hirsutum beta-galactosidasehirsutum (AAS76480)

78 N.Nicotiana tabacum tabacumputative beta-galactosidas...TP5 (CAC13966) 100 P.Petunia x hybrida x hybrida beta-galactosidaseBGAL2 (ACC60982) 2 pre... A.Arabidopsis lyrata subsp. lyrata lyrataBGAL6 beta-galactos... (XP_002864867) 100 A.Arabidopsis thaliana putative thaliana beta-galactosida... BGAL6 (CAB64742) O.Oryza sativasativa Indica Indica Group BGAL6beta-galactosi... (ACC64531) Beta-GalCoffea arabica cafe -Gal (HQ283330) R.Ricinus communiscommunis beta-galactosidase(XP_002521778) putati... gi|60417424|emb|CAI47559.1|Coffea arabica -Gal (CAI47559) alpha gal...

Figura 32. Hipótese filogenética consenso da sequência deduzida de aminoácidos da - galactosidase de C. arabica com 36 sequências protéicas da -galactosidase usando a Máxima Parcimônia. A árvore filogenética foi construída usando o programa MEGA4 com 50% de cutoff. A percentagem de bootstrap aparece em cada ramificação da árvore. 137

O alinhamento das sequências de aminoácidos apresentou 90,80% de variabilidade e 63,22% foram informativos para análise por parcimônia. A análise da proposta árvore filogenética da -galactosidase claramente indicou uma similaridade entre café (Coffea arabica), arroz (Oryza sativa subspecie Japonica), mamona (Ricinus communis) e Arabidopsis thaliana, agrupando-os à parte das demais espécies. Entretanto, o elevado grau de heterogeneidade observada nas sequências analisadas separou isoformas de uma mesma espécie como, por exemplo, em morango (FaGal1, FaGal2 e FaGal3) e em tomate (diversas TBGs), agrupando- os em clados filogenéticos distintos. Não foi possível identificar um padrão evolutivo organizacional de distribuição das espécies consideradas neste estudo, em nível de espécie, família ou ordem, devido ao elevado grau de heterogeneidade das sequências de aminoácidos analisados. Resultados semelhantes também foram observados por Ahn et al. (2007) com diversas isoformas de -galactosidase de Arabidopsis thaliana, Solanum lycopersicon e Oryza sativa que ficaram dispersos (não agrupados) na sua proposta árvore filogenética da - galactosidase. As -galactosidases são classificadas com base na sua atividade enzimática e como a composição da parede celular vegetal é altamente variável e dinâmica durante o crescimento e desenvolvimento das plantas (CAMPBELL e BRAAM, 1999), a análise dos resultados obtidos sugere que as -galactosidases possam ter evoluído em padrões distintos a fim de desempenhar funções bioquímicas específicas nas paredes celulares das plantas em situações distintas. Apesar da alta variabilidade da composição de aminoácidos nas sequências das -galactosidases analisadas, os sítios catalíticos (motifs) foram conservados, permitindo desempenharem suas funções bioquímicas características desta classe de hidrolase. Esta hipótese filogenética evolutiva preliminar deve ser considerada com precaução, uma vez que foi elaborada com a sequência codificante de uma parte do gene da CaGal, a qual foi traduzida in silico. Uma análise mais robusta deverá ser feita quando for completado o sequenciamento do gene da -galactosidase de C. arabica, possibilitando uma maior compreensão da evolução deste gene nas plantas. Os conhecimentos adquiridos com a caracterização molecular e bioquímica de CaGal revelaram um padrão de expressão mais complexo do que previamente esperado, o qual deverá ser contextualizado com outras enzimas hidrolíticas da parede celular de café, expressas durante 138

o desenvolvimento de seus frutos, com o objetivo de se obter uma compreensão mais abrangente do processo de maturação de frutos de café. A participação e o impacto do gene CaGal deverá ser investigada por silenciamento de sua expressão, produzindo plantas de café geneticamente modificadas, com redução da expressão de CaGal, seguida de análises relacionadas com a maturação de seus frutos. Como foram observadas as expressões de CaGal em tecidos vegetativos e reprodutivos, estas mesmas plantas transgênicas de café (com o silenciamento de CaGal) deverão ter o seu crescimento e desenvolvimento investigados em paralelo à maturação dos frutos destas plantas. Além disto, seria recomendável uma caracterização bioquímica do metabolismo de carboidratos durante a maturação dos frutos deste café transgênico, comparando- o com o perfil de polissacarídeos de frutos de café não-transgênico, com o objetivo de avaliar, com maior precisão, a participação do gene CaGal na maturação de frutos de café. Estas informações poderão acrescentar novos horizontes no âmbito do uso da biotecnologia na cultura do cafeeiro, não somente para o melhoramento genético desta espécie, mas também para a indústria do café.

Agradecimentos Gostaríamos de agradecer a colaboração de Marie-Christine Combes (IRD – Montpellier – França) pelo seu trabalho na identificação dos clones de -galactosidase nas bibliotecas BAC de Coffea.

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144

CAPÍTULO III – SILENCIAMENTO DO GENE DA -GALACTOSIDASE EM PLANTAS DE COFFEA ARABICA UTILIZANDO RNAI (RNA INTERFERENTE)

145

INTRODUÇÃO

Nas décadas de 1970 e 1980, a biologia molecular deu seus primeiros passos para a obtenção de sequências de DNA (genômicas e/ou codificantes), porém limitada pela disponibilidade de tecnologias apropriadas, pouco eficientes, lentas e laboriosas. Na década de 1990, com o desenvolvimento de tecnologias de sequenciamento mais eficientes dos que os antigos géis de poliacrilamida, nasceu a “era genômica”, com diversos projetos voltados para o sequenciamento de genomas inteiros de várias espécies, inclusive do homem. Neste cenário, em 2000 houve a publicação do primeiro genoma completo de um organismo vegetal: o genoma da planta modelo Arabidopsis thaliana (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000). No início do século XXI, grandes investimentos foram aplicados (e continuam sendo) nesta área, o que tem possibilitado o desenvolvimento de tecnologias de sequenciamento high-throughput, sem precedentes na história das ciências da vida, abrindo perspectivas do sequenciamento de genomas não somente de espécies, mas de indivíduos, com grande impacto para a agricultura, a pecuária, a fitopatologia, assim como para a área da saúde humana. No entanto, o conhecimento das sequências de DNA de uma determinada espécie é apenas o primeiro passo para o uso desta informação e não um fim per se. Concomitantemente com a genômica, nasceu a “genômica funcional” que buscava (e ainda busca) descobrir a função (ou funções) de determinado gene nas células onde ele se expressa. Diversas abordagens foram desenvolvidas com o objetivo de identificar a funcionalidade de determinado gene, sendo que a grande maioria era baseada no estudo de mutantes com perda de função (loss-of-function mutants) no qual ocorre o silenciamento (parcial ou total) da expressão do gene original devido às modificações pontuais e/ou de regiões das sequências codificantes. Estas alterações nas sequências codificante ocorrem de forma aleatória e têm como consequência a tradução de proteínas estruturalmente modificadas e, muitas das vezes, com função comprometida, produzindo um organismo deficiente na expressão daquele gene. Dentre as inúmeras formas disponíveis para produção deste tipo de mutante, podemos citar, por exemplo, a produção de mutantes com agentes físicos (radiação gama) ou químicos (EMS – Ethylmethane Sulphonate) (WU et al., 2005), a inserção de T-DNA (conhecido como T-DNA tagging) (WEIGEL et al., 2000; JEONG et al., 2002) e uso de transposons e retrotransposons (conhecido como transposon- 146

tagging) (RAMACHANDRAN e SUNDARESAN, 2001; KUMAR e HIROCHIKA, 2001), dentre outras. Por outro lado, algumas abordagens utilizam o silenciamento gênico direcionado (não aleatório), dentre os quais se destacam os métodos baseados no uso do RNA anti-senso (INOUYE, 1988) e do RNA interferente (RNAi). Cada uma destas abordagens tem características específicas, com prós e contras e não é nosso objetivo fazer uma abordagem aprofundada e comparativa de todas as metodologias, mas direcionado para o uso do RNAi. O paradigma da biologia molecular “DNA transcreve RNA que traduz proteínas” pressupõe que as moléculas de RNA sejam apenas carreadoras de informações entre o maquinário genético e o maquinário funcional das células, mas não moléculas reguladoras. No entanto, o silenciamento gênico induzido por RNA tem sido identificado como um mecanismo básico e amplamente difundido do controle da expressão gênica (BRODERSON e VOINNET, 2006). A supressão da expressão de um gene (silenciamento gênico) em plantas foi descoberta ao acaso em 1990, quando pesquisadores buscavam aumentar a pigmentação de flores de petúnia pela super-expressão do gene da chalcone sintase (CHS) sob o controle do promotor constitutivo 35S CaMV (NAPOLI et al., 1990). Estes pesquisadores observaram que as flores de petúnia geneticamente modificadas, em vez de aumentarem a biossíntese de antocianina, apresentaram uma redução da expressão do gene endógeno e do heterólogo, o que resultou em flores parcial ou totalmente despigmentadas. Este fenômeno foi denominado co-supressão e, posteriormente, identificado com um mecanismo de silenciamento gênico pós-transcricional (PTGS – post- transcriptional gene silencing). Diversos genes de organismos eucariotos podem ser regulados em nível transcricional ou pós-transcricional (TGS ou PTGS, respectivamente), ambos dependentes de sequências específicas e baseadas na homologia destas regiões. No caso do silenciamento transcricional (TGS), esta homologia está relacionada com a região promotora e se processa dentro do núcleo celular, enquanto que, no silenciamento pós-trancricional (PTGS), esta homologia ocorre com regiões codificantes e se processa no citoplasma (DING, 2000). Vale destacar que PTGS não é um mecanismo exclusivo de plantas, tendo sido identificada em fungos onde recebeu a denominação de quelling (ROMANO e MACINO, 1992) e em animais, onde é conhecida como RNA interferente (FIRE et al., 1998). Tanto quelling 147

quanto RNA interferente apresentam similaridades com o silenciamento gênico em plantas (DING, 2000; LLAVE et al., 2002; AGRAWAL et al., 2003; Small, 2007). Todos estes mecanismos são referidos como métodos de silenciamento de RNA e, como as principais reações apresentam similaridade, eles têm sido conhecidos como mecanismos de RNA interferente (RNAi), embora alguns pesquisadores discordem desta denominação coletiva. O mecanismo bioquímico do RNAi baseia-se na regulação da expressão de genes na fase pós-transcricional pela ativação da degradação de RNAs específicos por três vias distintas: (i) silenciamento de mRNA exógenos por pequenos RNAs interferentes (siRNA – do inglês small interfering RNA); (ii) silenciamento de mRNA endógenos por micro RNA (miRNA); e (iii) associado à metilação de DNA e, consequentemente, supressão da transcrição (AGRAWAL et al., 2003; BAULCOMBE, 2005). No presente estudo, o foco está relacionado com o silenciamento de mRNAs exógenos. O silenciamento gênico por RNAi, seja em plantas, fungos ou animais, compartilham três fases bioquímicas: (i) formação de RNA de fita dupla (dsRNA – do inglês double-stranded RNA); (ii) processamento do dsRNA em pequenos dsRNA (siRNA); e (iii) direcionamento do pequeno RNA de fita simples (siRNA) para sequências específicas de DNA ou RNA. Segundo Broderson e Voinnet (2006), embora diversos mecanismos possam gerar dsRNA, o processamento de siRNA e o direcionamento destes para alvos específicos têm bases bioquímicas muito semelhantes. Os siRNA, que são pequenas moléculas de RNA com 21 a 26 nucleotídeos, são componentes chave deste sistema e são originados a partir de longas fitas duplas de RNA (dsRNA) (HAMILTON e BAULCOMBE, 1999). Estas dsRNAs são clivadas por uma RNase específica denominada DICER (BERSTEIN et al., 2001), a qual é formada por sítios de ligação com dsRNA, por RNA helicase, por RNase III e por domínios catalíticos PAZ (Piwi/Argonaute/Zwille) (BRODERSON e VOINEET, 2006). As fitas de siRNAs são, posteriormente, desenoveladas e uma fita é incorporada no complexo RISC (complexo de indução do silenciamento de RNA – do inglês RNA-induced silencing complex), o qual contém uma proteína da família Argonauta (Ago) (HAMMOND et al., 2000; BRODERSON e VOINEET, 2006) que guia este complexo para um mRNA de sequência complementar, clivando- a (MEISTER e TUSCHL, 2004), induzindo o silenciamento gênico (Figura 33).

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Família multigênica ou Transcrição experimental ou de DNA exógeno dsRNA exógeno transgene repetitivo desenvolvimento Ativador

Montagem do transgene/DNA/ modificação da cromatina

RNA senso anormal

Intermediário

Silenciador

Alvo

Formação de heterocromatina e Destruição do mRNA or silenciamento transcricional repressão da tradução Figura 33. Esquema do funcionamento da técnica do RNA interferente (RNAi) em plantas [Fonte: MELLO e CONTE JR et al. (2007)]

RNAi pode ser induzido por RNA de fita dupla (dsRNA) ou pela formação de grampos de RNA de sequência parcialmente complementar (WANG e WATERHOUSE, 2001; SVOBODA e CARA, 2006). Além de sua aplicação como estratégia para produção de plantas mutantes com perda de função (loss-of-function mutations), RNAi participa de diversas funções biológicas como a regulação da expressão de genes endógenos por miRNA (BARTEL, 2004), formação de heterocromatina (XIE et al., 2004), repressão de transposons e defesa contra infecções virais (WATERHOUSE et al., 2001; BAULCOMBE, 2005). Segundo Small (2007), a técnica do RNAi apresenta diversas vantagens para genômica funcional devido ao seu potencial para o silenciamento parcial ou total de famílias multigênicas, uma vez que os siRNAs têm maior probabilidade de encontrar homologia com as diversas isoformas do referido gene. 149

Na literatura científica consultada até o momento, foram encontrados somente dois artigos que utilizaram a técnica do RNAi na cultura do café, ambos relacionados com a via biossintética de cafeína. Ogita et al. (2004) silenciaram a expressão do gene CaMXMT1 (7-N-metilxantina metiltransferase), previamente identificado sob condições in vitro como pertencente à rota biossintética de cafeína, utilizando a técnica do RNAi tanto em Coffea arabica quanto em Coffea canephora. Estes autores transformaram calos embriogênicos de café com Agrobacterium tumefaciens e observaram uma redução de transcritos de CaMXMT1, comparada com o controle. No entanto, também foi observado a redução de CaXMT1 e CaDXMT1 (xantosina metiltransferase e 3,7-dimetilxantina metiltransferase, respectivamente, ambos envolvidos na mesma via bioquímica do CaMXMT1) na maioria dos transformantes. Os calos embriogênicos transformados e as plântulas de café geneticamente modificadas apresentaram uma redução de teobromina (precursor imediato da cafeína) e de cafeína entre 30% e 50% quando comparado com o controle. Os autores concluíram que a supressão de CaMXMT1, utilizando a técnica do RNAi, reduziram não somente a expressão do CaMXMT1, mas também de CaXMT1 e de CaDSMT1, confirmando suas participações na rota de biossíntese de cafeína. A outra publicação com café na qual RNAi foi utilizada foi Ashihara et al. (2006) que conseguiram reduzir a expressão do gene de N-metiltransferases (CaMXMT1) em C. canephora, avaliando o silenciamento deste gene. No caso específico das -galactosidases, sabe-se que elas constituem uma família multigênica em diversas espécies vegetais como tomate (SMITH e GROSS, 2000), morango (TRAINOTTI et al., 2001) e Arabidopsis (AHN et al., 2007), bem como em Coffea arabica (FIGUEIREDO et al., 2011). Além disso, Coffea arabica é uma planta alotetraplóide (LASHERMES et al., 1999). Em função destas duas características, a utilização da técnica do RNA interferente (RNAi) apresenta-se como a mais adequada para o estudo da funcionalidade deste gene pelo fato de possibilitar a supressão, parcial ou total, de todos os membros desta família multigênica (LAWRENCE e PIKAARD, 2003; TRAVELLA et al., 2006; FU et al., 2007; SMALL, 2007). Para o silenciamento do gene da -galactosidase em Coffea arabica utilizando a técnica do RNAi, é necessária a introdução do vetor de transformação nas células-alvo, a qual pode ser feita por métodos diretos (p.ex.: biobalística) ou indiretos (p.ex.: Agrobacterium sp). 150

Apesar das intermináveis discussões no âmbito nacional e internacional, com repercussões no meio acadêmico/científico, público/privado e na mídia, esta com elevado impacto na formação de opiniões públicas, é uma realidade o uso da biotecnologia para diversas finalidades, com impacto direto e/ou indireto sobre o homem. O uso da biotecnologia para produção de plantas geneticamente modificadas representa um avanço significativo para o melhoramento de plantas, uma vez que aumenta o pool de genes disponíveis para serem incorporados no genoma de espécies de interesse, os quais, muitas das vezes, não estão presentes no genoma da espécie ou nas espécies sexualmente compatíveis com a mesma. Esta realidade se reveste de especial significado para as espécies lenhosas, principalmente devido ao longo tempo necessário para a produção de cultivares pelos métodos tradicionais de melhoramento vegetal, o qual se conta em anos e não em meses. É inquestionável o fato de que o melhoramento tradicional é o responsável por todos os avanços agronômicos obtidos até o momento com a cultura do café (resistência à ferrugem, aumento de produtividade e mudança da arquitetura da planta são alguns exemplos), mas a incorporação de características de interesse que levem ao lançamento de uma nova cultivar de café por estes métodos de melhoramento tradicionais pode levar de 20 a 35 anos (RIBAS et al., 2006). O uso da engenharia genética para a incorporação de características de interesse em cultivares elite de café poderia reduzir significativamente o tempo necessário para o lançamento de uma nova cultivar. Vale destacar que a produção de um organismo geneticamente modificado (incluindo o café) por qualquer método de transgenia implica, necessariamente, que este deverá passar por todas as análises de biossegurança regulamentados pela CTNBio (Comissão Técnica Nacional de Biossegurança) e comissões similares em outros países antes de ser lançado no mercado consumidor, o qual aumentará o tempo para que o produto biotecnológico final atinja o público de interesse. Apesar desta incontestável vantagem do uso da engenharia genética para a incorporação de características de interesse em plantas perenes e lenhosas, seu uso é limitado por diversos fatores, a saber: (i) é um processo laborioso; (ii) a regeneração das plântulas em condições in vitro é muito lenta e (iii) a eficiência dos métodos de transformação (diretos e indiretos) é baixa. Além destas limitações, as plantas perenes e lenhosas apresentam uma característica fisiológica relacionada com um longo período juvenil (variável de espécie para espécie) comparativamente com plantas anuais em que o período juvenil é de semanas ou meses (ROSILLO et al., 2003), retardando o florescimento das plantas regeneradas. No entanto, este fator limitante pode ser 151

eliminado (ou minimizado) desde que se utilize explantes provenientes de plantas adultas. Este é o cenário biotecnológico onde a planta de café se insere. Apesar destas limitações, avanços significativos têm sido obtidos com a aplicação de diversos métodos de transformação de café, muitos dos quais na fase de prova-de-conceito e poucos, ainda, com genes de interesse comercial/agronômico (Tabela 5).

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Tabela 5. Histórico dos métodos de transformação de plantas utilizados em Coffea sp.

Espécie Método de transformação Gene Referência C. arabica C. canephora A. tumefaciens (protoplastos) X uidA Spiral e Pétiard, 1991 Eletroporação (protoplastos) X nptII Barton et al., 1991 A. rhizogenes X X uidA Spiral e Pétiard, 1993 Biobalística X X uidA Van Boxtel et al., 1995 PEG (protoplastos) X uidA De Peña, 1995 Agrobacterium rhizogenes X Raízes fasciculadas Sugiyama et al., 1995 Agrobacterium tumefaciens X Bt Leroy et al., 1997 A. tumefaciens X uidA Hatanaka et al., 1999 A. tumefaciens X X Cry1Ac, csr1-1 Leroy et al., 2000 Biobalística X uidA Rosillo et al., 2003 Eletroporação (embriões secundários) X uidA e bar Da Silva e Yaffá, 2003 A. tumefaciens X uidA Cruz et al., 2004 A. tumefaciens X X GFP e outros Ogita et al., 2004 Biobalística X uidA e bar Cunha et al., 2004 Agrobacterium tumefaciens X uidA e HPT Mishra e Sreenath, 2004 Biobalística X uidA e bar Ribas et al., 2005 Agrobacterium tumefaciens X DsRFP e NPTII Canche-Moo et al., 2006 A. rhizogenes X uidA Kumar et al., 2006 A. tumefaciens X uidA e bar Ribas et al., 2006 A. rhizogenes X gusA Alpizar et al., 2006 Biobalística X uidA Esquivel et al., 2008 Biobalística X uidA Albuquerque et al., 2009 Biobalística X -AI1 Barbosa et al., 2010

Adaptado e atualizado de Ribas et al. (2006)

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As primeiras publicações que relatam o uso de técnicas de transformação na cultura do café remontam do início da década de 1990. Em 1991 foram publicados dois trabalhos utilizando protoplastos de café: Barton et al. (1991) eletroporou protoplastos de C. arabica, confirmando a integração do gene nptII (que codifica para a neomicina fosfotransferase), mas não obteve regeneração destes protoplastos transformados. Spiral e Pétiard (1991), por sua vez, observaram a expressão transiente do gene gus (uidA) que codifica para a - glucoronidase (GUS), em protoplastos de C. canephora utilizando Agrobacterium tumefaciens. A partir destes marcos, diversos grupos começaram a transformar café, a maioria utilizando o vetor de transformação Agrobacterium. No entanto, o primeiro trabalho de transformação de café com uma característica de interesse agronômico foi publicado por Leroy et al. (2000). Estes pesquisadores utilizaram o gene cry1Ac de Bacillus thuringiensis com o objetivo de obter resistência ao inseto Perileucoptera coffeella (bicho-mineiro). Embriões somáticos de C. arabica e C. canephora foram transformados com Agrobacterium tumefaciens e as plantas geneticamente modificadas foram analisadas por Western blot para detecção da presença da proteína e submetidas a bioensaios para avaliar o grau de resistência obtido contra este inseto. Especificamente com a técnica de transformação por biobalística na cultura do cafeeiro, o primeiro trabalho publicado foi de Van Boxtel et al. (1995) no qual foi avaliada a expressão transiente do gene uidA em diversos tipos de tecidos (folhas, embriões somáticos e suspensões celulares). Em 2003, Rosillo et al. (2003) avaliaram a expressão transiente do gene uidA em suspensões celulares de Coffea arabica avaliando os efeitos de diversos parâmetros físicos de transformação per se, bem como os efeitos de pré-tratamentos dos explantes sob diferentes condições osmóticas (0,25 ou 0,50 M manitol/sorbitol por 4 ou 20 h de pré- tratamento). As maiores taxas de expressão transiente do gene uidA foram observadas quando os explantes foram submetidos a um pré-condicionamento em meio contendo 0,50 M manitol/sorbitol por 4 h e os parâmetros de bombardeamento foram de 1550 psi de pressão de hélio, 12 cm de distância dos explantes e gap distance (distância entre a membrana carreadora das partículas contendo o vetor de transformação e a malha de retenção) de 9 mm. Entretanto, não foram obtidas plantas transgênicas e as análises foram encerradas na fase de formação de calos. No entanto, as primeiras plantas transgênicas de café utilizando a biobalística foram obtidas por Cunha et al. (2004). Estes pesquisadores utilizaram calos embriogênicos C. arabica, os quais foram submetidos a um pré-tratamento osmótico em meio de cultura 154

contendo 0,5 M manitol por 24 h antes do bombardeamento, utilizando os parâmetros de transformação conforme Aragão et al. (1996). No ano seguinte, Ribas et al. (2005) obtiveram plantas transgênicas de Coffea canephora bombardeando calos embriogênicos, porém os explantes foram submetidos a somente 4 h de pré-tratamento em meio de embriogênese acrescido de 0,4 M de manitol antes do bombardeamento. Foi utilizado 1300 psi de pressão de hélio e 6 cm de distância entre a malha de retenção e os explantes durante o bombardeamento. Os autores puderam observar a expressão transiente do gene uidA 24 h após o bombardeamento, bem como sua expressão estável em calos com 4 meses e em plântulas transgênicas regeneradas de calos embriogênicos. Em 2009, Albuquerque et al. (2009) obtiveram plantas de Coffea arabica transgênicas expressando os genes uidA e nptII sob controle do promotor 35S CaMV duplicado. Estes autores verificaram a expressão de GUS em diversos tecidos, inclusive em flores e frutos, bem como observaram uma segregação Mendeliana do gene uidA na geração seguinte (T1). No ano seguinte, Barbosa et al. (2010) transformaram calos embriogênicos de Coffea arabica com o gene heterólogo -AI1 (inibidor da -amilase 1 clonada de Phaseolus vulgaris) para resistência ao inseto Hypotheneumus hampei (broca-do-café). Foram obtidas plantas transgênicas de café expressando este gene e, sob condições in vitro, três plantas apresentaram uma taxa de inibição da -amilase da broca-do-café entre 20 e 88%. Até o presente momento, não há na literatura publicações com plantas geneticamente modificadas de café utilizando RNAi para silenciamento da expressão de um gene endógeno com a técnica de transformação por biobalística, visando uma característica de interesse agronômico.

OBJETIVO GERAL Obtenção de plantas transgênicas de Coffea arabica expressando o vetor para silenciamento do gene da -galactosidase por RNAi (RNA interferente), utilizando o método de transformação de plantas por biobalística, e avaliação dos efeitos deste silenciamento no desenvolvimento da planta de café e dos seus frutos durante o processo de maturação.

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OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1. Construir o vetor de silenciamento do gene da -galactosidase por RNA interferente para transformação por biobalística; 2. Obter calos embriogênicos de café; 3. Estabelecer e otimizar o protocolo de transformação de calos embriogênicos de café por biobalística; 4. Selecionar os prováveis calos embriogênicos transgênicos de café; 5. Obter plântulas de café transgênicas, seguido de sua aclimatação em casa-de- vegetação; 6. Confirmar o caráter transgênico das plântulas de café aclimatadas em casa-de- vegetação; 7. Crescer as plântulas em casa-de-vegetação, aguardando o florescimento e frutificação para análises moleculares e bioquímicas do silenciamento do gene da -galactosidase, bem como seus efeitos sobre o desenvolvimento da planta e dos frutos de café.

MATERIAL E MÉTODOS 1. Construção do vetor para silenciamento do gene da -galactosidase Utilizando o fragmento de 504 pb amplificado por RT-PCR do gene da - galactosidase (Capítulo 2), foram adicionados os sítios de restrição XbaI e XhoI à extremidade 5’ deste fragmento utilizando os primers (GALXBAXHOF – GTCTAGACTCGAGTCCC GAGATGTGGC) e os sítios HindIII e KpnI, na extremidade 3’ (GALHINDKPNR – GAAG CTTGGTACCACCCATGGCACACC) por reação da PCR utilizando Platinum® Taq DNA Polymerase High-Fidelity (Invitrogen, EUA) com o seguinte programa: 94oC (2 min), 35 ciclos de 94oC (30 s), 58oC (30 s) e 68oC (1 min), seguido de uma extensão final de 68oC (2 min). O fragmento amplificado foi clonado no vetor pGEM-T-Easy (Promega, EUA), originando o vetor pGEM-GAL. O vetor de transformação foi construído com base no vetor de clonagem pKannibal (WESLEY et al., 2001) que possui o promotor 35S CaMV (Cauliflower mosaic virus), o intron pdk (piruvato dehidrogenase quinase) de Flaveria trinervia e o terminador do gene ocs (octopina sintase) de A. tumefaciens, em duas etapas consecutivas: inicialmente, para clonagem do fragmento da -galactosidase no sentido senso, o vetor pGEM-GAL foi digerido com XhoI e KpnI e o fragmento do gene da -galactosidase foi clonado no vetor pKannibal digerido com estas mesmas enzimas de restrição, originando o vetor pKANGAL1. 156

Para clonagem do fragmento no sentido antisenso, o vetor pGEM-GAL foi digerido com as enzimas de restrição HindIII e XbaI e o fragmento do gene da -galactosidase foi clonado no vetor pKANGAL1 digerido com estas mesmas enzimas de restrição, originando o vetor pKANGAL2. Posteriormente, o vetor pKANGAL2 foi digerido com NotI e o fragmento da construção contendo o promotor 35S CaMV, o fragmento do gene da -galactosidase no sentido senso, o intron pdk, o fragmento do gene da -galactosidase no sentido antisenso e o terminador ocs foi clonado no vetor de expressão pBSSK-BAR contendo o promotor 35S CaMV e o gene seletivo bar (ppt – phosphinotricina acetiltransferase), também digerido com NotI, originando o vetor de transformação pKANGAL2BAR (Figura 34).

157

A

B-Gal

158

35S CaMV term 35S CaMV B

NotI (3) NotI (4178) BAR

pBSSK-BAR cassete 4183 pb

NotI

NotI

Figura 34. Esquema de construção do vetor para silenciamento do gene da -galactosidase de Coffea arabica por RNAi. (A) e (B) etapas da construção do vetor de transformação pKANGALRNAi.

2. Produção de calos embriogênicos de café Como explantes, foram utilizadas folhas adultas em bom estado fitossanitário (sem sintomas de deficiência nutricional ou da presença de fitopatógenos) de Coffea arabica coletadas do segundo ou terceiro nós de plantas matrizes crescidas em casa-de-vegetação. 159

As folhas foram lavadas em água corrente e, posteriormente, submetidas à desinfestação, sob condições assépticas, em câmara de fluxo horizontal. Posteriormente, as folhas foram imersas em solução de etanol 50% (v/v) por três minutos com agitação periódica. Em seguida, esta solução foi descartada e as folhas foram imersas em solução 2,4% (v/v) de hipoclorito de sódio, acrescido de 3-4 gotas de Tween 20, por 30 minutos, com agitações periódicas. Após este período, as folhas foram lavadas quatro vezes com água destilada estéril e cortadas, com a face abaxial voltada para cima, em fragmentos de, aproximadamente, 1 cm2. Posteriormente, estes explantes foliares foram transferidos para meio de indução de calos com a face adaxial em contato com o meio de indução de calos em placas de Petri de 9 cm de diâmetro, estéreis e descartáveis, conforme Teixeira et al. (2004). O meio de indução de calos embriogênicos (CPmod) foi composto pelo equivalente à metade da concentração de macro e micronutrientes do meio MS (MURASHIGE e SKOOG, 1962), vitaminas específicas para o café (10 mg.L-1 de tiamina, 1 mg.L-1 de ácido nicotínico, 1 mg.L-1 de piridoxina, 1 mg.L-1 de glicina), 100 mg.L-1 de mio-inositol, 20 g.L-1 de sacarose, 10 mg.L-1 de cisteína, 100 mg.L-1 de caseína hidrolizada, 200 mg.L-1 de extrato de malte, 250 mg.L-1 de ácido ascórbico, acrescidos de 20 μM 2,4-D (ácido 2,4-diclorofenoxiacético), 4,9 μM AIB (ácido indolbutírico) e 2,4 g.L-1 de Phytagel (Sigma Chemical Co., EUA). Após a esterilização em autoclave a 120oC por 20 min, foram adicionados 8 μM 2iP (2-isopenteniladenine), esterelizados a frio (filtro Millipore 0,22 m) e 200 mM de Timentin® (SmithKline Beecham Pharmaceuticals, Inglaterra), sob condições assépticas. Os explantes foliares de café foram transferidos para o meio CPmod sólido, as placas foram seladas com parafilme e transferidas para sala de crescimento com temperatura média de 23oC  2oC e mantidas no escuro por, aproximadamente, 4 a 5 meses. Após o surgimento dos calos embriogênicos de café, estes foram transferidos, sob condições assépticas, para o meio de indução de calos (CPmod) líquido (aproximadamente 30 mL em frascos de Erlenmyer de 125 mL), reconduzidos para a mesma sala de crescimento, porém mantidos sob agitação de 120 rpm e submetido ao fotoperíodo de 16 h. Estes calos embriogênicos foram subcultivados a cada 3-4 semanas.

3. Determinação dos parâmetros de transformação por biobalística Os parâmetros de transformação por biobalística foram baseados nos protocolos propostos por Cunha et al. (2004) e Albuquerque et al. (2009), utilizando o vetor de transformação pBI426 (Figura 36), contendo o gene da -glucuronidase (gus ou uidA) sob 160

controle do promotor constitutivo 35S CaMV (Cauliflower mosaic virus) duplicado e o terminador do gene da nopalina sintetase. Concomitantemente, foram feitos experimentos para avaliar os efeitos da substituição da espermidina pela protamina na expressão transiente do gene uidA nos explantes de C. arabica (calos embriogênicos) bombardeados (SIVAMANI et al., 2009). Para avaliar a expressão transiente gene uidA, foi utilizado o ensaio histoquímico com o substrato X-Gluc (5-bromo-4-cloro-3-indolil--D-glucuronídeo) 24 h após a transformação por biobalística (BRASILEIRO e CARNEIRO, 1998).

4. Transformação genética do cafeeiro por bombardeamento Calos embriogênicos de Coffea arabica com idade entre 14 a 21 dias, crescidos em meio CPmod líquido contendo 200 mM de Timentin® (SmithKline Beecham Pharmaceuticals, Inglaterra) sob agitação de 120 rpm foram utilizados como explantes para transformação. Sob condições assépticas, o meio CPmod líquido foi descartado e, aproximadamente, 40 mg dos calos (peso fresco) foram parcialmente secos em papel de filtro estéril, transferidos para placas de bombardeamento e submetidos a um pré-tratamento osmótico. Este pré-tratamento osmótico consistiu em manter os calos a serem bombardeados em meio CPmod sólido acrescido de 0,5 M de manitol por 24 h, no escuro e na sala de crescimento. Após este período, os explantes foram submetidos à transformação por biobalística (SANFORD et al., 1991) neste mesmo meio osmótico. Foram utilizadas partículas de tungstênio WP-100 (AEE, Bergenfield, NJ, EUA), com diâmetro médio de 10 m, envoltas com o vetor de transformação pKANGALRNAi (1 g.mL-1), não digerido, conforme Aragão et al. (1996) modificado, substituindo-se a espermidina por 1 mg.mL-1 de protamina (Sigma-Aldrich, Estados Unidos), conforme Sivamani et al. (2009). Os parâmetros de bombardeamento foram 1200 psi e a distância entre a malha de retenção da membrana carreadora e os explantes de café foi de 9 cm, conforme Albuquerque et al. (2009). Após o bombardeamento, os calos de café foram, imediatamente, transferidos para meio CPmod sólido sem 0,5 M de manitol, lacrados com parafilme, transferidos para sala de crescimento com temperatura 23oC  2oC e mantidos no escuro por, aproximadamente, 15 dias.

161

5. Curva de seleção de calos transgênicos de café com Finale® (glufosinato de amônio) Para o estabelecimento da curva de seleção com o agente seletivo glufosinato de amônio, calos embriogênicos de C. arabica com 14 dias de subcultivo em meio CPmod líquido sob agitação (120 rpm), acrescido de 200 mM de Timentin® (SmithKline Beecham Pharmaceuticals, Inglaterra), foram transferidos para placas de Petri de 9 cm de diâmetro, estéreis e descartáveis, contendo o mesmo meio de cultura, acrescido de 0,7 % (m/v) de ágar e diferentes concentrações de glufosinato de amônio (0, 2.5, 5, 10 e 20 mg.L-1), a partir de uma solução estoque de 5 g.L-1 de Finale® (Bayer CropScience AG, Alemanha), cuja concentração do princípio ativo (glufosinato de amônio) era de 200 g.L-1. Foram feitas três repetições por tratamento. As placas contendo os calos embriogênicos foram transferidas para sala de crescimento com temperatura 23oC  2oC e mantidas no escuro durante o experimento. O experimento foi feito em duplicata e conduzido por 20 dias, ao final dos quais foi realizada uma análise visual do desenvolvimento dos calos no meio seletivo, comparando os tratamentos com o controle.

6. Seleção de calos de C. arabica geneticamente modificados Quinze dias após a transformação, os calos bombardeados foram transferidos, sob condições assépticas, para meio CPmod sólido contendo 200 mg.L-1 de Timetim e 5 mg.L-1 de glufosinato de amônio, retornando para a sala de crescimento com temperatura 23oC  2oC onde permaneceram, no escuro, por 60-90 dias. Os prováveis calos transgênicos que começaram a desenvolver foram transferidos, individualmente, para novos meios CPmod sólido contendo 200 mg.L-1 de Timetim e 5 mg.L-1 de glufosinato de amônio, para não haver mistura de calos transgênicos e possibilitar o crescimento destes para as análises moleculares preliminares de confirmação do evento transgênico.

7. Extração de DNA genômico de calos de C. arabica e análise por PCR DNA genômico foi extraído de, aproximadamente, 30 mg de cada um dos prováveis calos transgênicos de C. arabica utilizando o método com CTAB (DOYLE e DOYLE, 1987) modificado com tampão de extração contendo 2% (m/v) CTAB, 2% (m/v) PVP, 100 mM Tris-HCl pH 8, 25 mM EDTA e 2 mM NaCl, acrescidos de 2% (v/v) -ME e 2% (m/v) metabissulfito de sódio no momento da extração. Para detecção do gene da -galactosidase foram utilizados os primers 35SAMVF (CCACTATCCTTCGCAAGAC) e GALRACER (TTCTCGTGAAAAGCTCTCTCCG), 162

amplificando um fragmento de 489 pb. As reações de PCR foram feitas usando 1,0 L de

DNA genômico, tampão de reação da PCR da Invitrogen 10X, 1,5 mM MgCl2, 10 mM de cada dNTP, 10 M de cada primer específico e 1 U Taq Polymerase (Invitrogen, EUA) em um volume final de 25 L por reação. O programa otimizado de amplificação por reação da PCR compreendia um ciclo a 94oC por 2 min, seguido de 30 ciclos de 94oC por 30 sec, 50oC por 1 min e 72oC por 1 min, após os quais as reações foram mantidas a 72oC por mais 10 min no equipamento MyCycler™ Thermal Cycler (BioRad, EUA). Para detecção do gene bar, foram utilizados os primers BAR90 (GGTCTGCACCATCGTCAACC) e BAR536C (CTGAAGTCCAGGTGCCAGAA), amplificando um fragmento de 447 pb, utilizando as mesmas condições de amplificação por PCR utilizadas para o gene da -galactosidase.

8. Detecção da proteína PAT por imunoensaio Para detecção da proteína PAT (fosfinotricina aminotransferase) nos calos transgênicos de C. arabica por imunologia, foi utilizado o kit Trait™ LL Test Strip (Strategic Diagnostics Inc., EUA) conforme as instruções do fabricante. Resumidamente, foram coletados, de cada um dos três prováveis calos transgênicos de café, aproximadamente 30 mg (matéria fresca), os quais foram transferidos, individualmente, para tubos de microcentrífuga. Os calos foram macerados em 200 L de tampão PBS 1X, à temperatura ambiente, com auxílio de um bastão de vidro estéril e uma fita de detecção foi imersa em cada microtubo, deixando-o em repouso por 5-10 min à temperatura ambiente, seguido da análise da reação imunológica. Como controle positivo, foi utilizado extrato de grão transgênico de Zea mays expressando a proteína PAT, extraída conforme previamente citado.

9. Regeneração de plantas geneticamente modificadas Informamos que não consta deste capítulo a regeneração de plantas geneticamente modificadas de C. arabica em função do elevado tempo para obtenção das plantas transgênicas de café, a qual pode variar de nove a dez meses (TEIXEIRA et al., 2004). Os calos transgênicos obtidos até o presente momento foram transferidos para o Dr. João Batista Teixeira (EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia – Brasília/DF) para regeneração das plântulas de café conforme Teixeira et al. (2004). As análises moleculares e bioquímicas das plantas geneticamente modificadas de café com o silenciamento do gene da -galactosidase serão realizadas quando forem obtidas plantas aclimatadas em casa-de-vegetação. 163

RESULTADOS E DISCUSSÕES Utilizando o protocolo para produção de calos embriogênicos de C. arabica conforme Teixeira et al. (2004) possibilitou a obtenção de calos embriogênicos friáveis, de coloração ligeiramente amarelada, após 4-5 meses em meio indutivo, os quais foram subcultivados a cada 3-4 semanas em meio indutivo líquido para permitir a obtenção de quantidade suficiente para os experimentos de bombardeamento, os quais foram realizados em série (Figura 35).

A B C

D E F

Figura 35. Sequência de preparo de calos embriogênicos de C. arabica para bombardeamento. (A) calos embriogênicos em meio indutor sólido de calos; (B) calos embriogênicos em meio líquido sob agitação; (C e D) detalhes do crescimento de calos embriogênicos em meio líquido; (E) calos embriogênicos em meio de multiplicação sólido contendo 0,5 M de manitol imediatamente antes de ser bombardeado com o vetor de transformação para silenciamento do gene da -galactosidase; (F) equipamento de transformação por biobalística utilizado na transformação de calos embriogênicos de café (EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia – Laboratório de Transferência de Genes).

No entanto, antes de serem iniciados os bombardeamentos de calos embriogênicos de C. arabica com o vetor pKANGALRNAi visando o silenciamento do gene da -galactosidase nesta espécie, foram avaliados os parâmetros de transformação por biobalística utilizando o vetor de transformação pBI426 (Figura 36), seguindo os protocolos propostos por Cunha et al. (2004) e Albuquerque et al. (2009). 164

Figura 36. Vetor pBI426 utilizado nos testes de expressão transiente do gene uidA para definição dos parâmetros de transformação de calos embriogênicos de C. arabica por biobalística.

Nos diversos experimentos testados, as análises das expressões transientes utilizando os protocolos de transformação propostos por Cunha et al. (2004) e por Albuquerque et al. (2009) mostraram-se muito ineficientes, com pouquíssimos pontos azulados no calos embriogênicos bombardeados (Figura 37 – B). Diversos ajustes nestes protocolos foram testados (distância entre a malha de retenção e os explantes, pressão de bombardeamento e condições do pré-tratamento osmótico dos calos embriogênicos) sem sucesso (dados não apresentados). Buscando alternativas para aumentar a taxa de expressão transiente, identificamos o artigo de Sivamani et al. (2009) que propunha a substituição da espermidina por protamina (Protamine – Sigma-Aldrich, EUA) na fase de precipitação/ligação do vetor de transformação nas partículas de tungstênio segundo o protocolo de preparo das partículas de tungstênio proposto por Aragão et al. (1996). Aqueles autores verificaram que os níveis de expressão transiente do gene gus aumentaram significativamente em cultura de células de milho e de arroz bombardeadas quando a espermidina foi substituída pela protamina na fase de preparo das partículas para bombardeamento. 165

A B

C D

Figura 37. Expressão transiente do gene gus em calos embriogênicos de C. arabica. (A) controle não bombardeado; (B) calos bombardeados com espermidina; (C e D) calos bombardeados com protamina. Setas indicam pontos azulados devido à expressão da - glucuronidase. Barra: 5 mm.

Foram realizados experimentos para avaliar o efeito da protamina, utilizando o protocolo de transformação proposto por Albuquerque et al. (2009). Embora não tenhamos realizado um ensaio fluorimétrico da expressão do gene gus, a análise visual da atividade histoquímica deste gene nitidamente identificou um aumento de sua expressão transiente (Figura 37 – C e D) quando a espermidina foi substituída por protamina, a qual foi avaliada pelo aumento no número de regiões apresentando coloração azulada devido à atividade enzimática da -glucuronidase. Estes resultados se repetiram em dois experimentos distintos, passando a ser utilizado no protocolo de transformação de calos embriogênicos de café apresentados neste capítulo. Em paralelo, foram realizados experimentos para determinação da concentração do agente seletivo glufosinato de amônio a ser utilizado para seleção dos prováveis calos transgênicos de C. arabica. Foram montadas duas curvas de seleção, independentes, com concentrações crescentes de glufosinato de amônio (0, 2.5, 5, 10 e 20 mg.L-1) no meio de multiplicação de calos CPmod (Figura 38).

166

0 mg/L 2,5 mg/L 5 mg/L 10 mg/L 20 mg/L

Figura 38. Amostras representativas da curva de seleção de calos embriogênicos de C. arabica submetidos a diferentes concentrações de glufosinato de amônio, após 20 dias de tratamento no escuro.

Após 20 dias em contato com o agente seletivo, foi realizada uma análise visual qualitativa da taxa de crescimento dos calos embriogênicos em meio de multiplicação de calos CPmod, comparando os diversos tratamentos com o controle (sem glufosinato de amônio). Os resultados dos dois experimentos foram muito semelhantes em todos os tratamentos analisados. Para a concentração de 2,5 mg.L-1 foi observada uma redução na taxa de crescimento dos calos embriogênicos de café comparado com o controle (0 mg.L-1), no entanto os calos continuaram crescendo lentamente nestas condições. Porém, quando a concentração de glufosinato de amônio foi aumentada para 5 mg.L-1, os calos praticamente não cresceram mais, ou seja, houve uma redução mais drástica da taxa de crescimento sem, no entanto, promover a morte destes explantes durante o período de realização deste experimento. Nas concentrações mais elevadas (10 e 20 mg.L-1), houve a indução da morte dos explantes, indicando que estas concentrações foram tóxicas para os calos embriogênicos de café. Estes resultados foram consistentes e se repetiram em todos os tratamentos e nos dois experimentos independentes. Em função desta análise, foi feita a decisão de se utilizar a concentração de 5 mg.L-1 de glufosinato de amônio, esterilizado a frio (filtragem em membrana Millipore 0,22 m) e adicionado ao meio de cultura após a autoclavagem, para seleção dos prováveis calos transgênicos de café obtidos por bombardeamento. Estabelecido a concentração do agente de seleção, foram iniciados os experimentos para produção de plantas geneticamente modificadas de C. arabica visando o silenciamento do gene da -galactosidase. Foram realizados 20 experimentos de bombardeamento, cada qual contendo, em média, 12 placas. Deste total, obtivemos somente três prováveis calos transgênicos, crescendo em meio de multiplicação de calos CPmod contendo o agente seletivo glufosinato de amônio (5 mg.L-1) (Figura 39). Estes calos foram, individualmente, transferidos 167

para novos meios de multiplicação de calos, mantendo o agente seletivo glufosinato de amônio, onde continuaram se multiplicando.

A B

1

2

C D

Figura 39. Crescimento de calos embriogênicos de C. arabica transformados com vetor pKANGALRNAi por biobalística em meio de multiplicação de calos (meio CPmod) contendo agente seletivo (5 mg.L-1 de herbicida glufosinato de amônio). (A) calos bombardeados sem regeneração (B) calos bombardeados apresentando setores embriogênicos se multiplicando; setas indicam os calos no 1 e no 2; (C) ampliação do setor embriogênico no 1; (D) ampliação do setor embriogênico no 2. Barra: 5 mm.

Embora o fenótipo dos prováveis calos de café transgênicos seja indicativo da inserção, transcrição, tradução e funcionalidade da proteína PAT (fosfinotricina acetiltransferase) que confere resistência ao herbicida glufosinato de amônio, foram realizadas análises moleculares para confirmar estes resultados. Visando a confirmação da inserção do fragmento do gene da -galactosidase e do gene Bar nestes prováveis calos transgênicos de café, foi utilizada a técnica da PCR com primers específicos para cada gene. A análise das reações da PCR dos prováveis calos transgênicos indicou que os calos no 1 e no 2 têm inserido no seu genoma o fragmento do gene da -galactosidase e do gene Bar, mas o calo no 3 tem somente o gene Bar inserido no seu 168

genoma, mas não o fragmento do gene da -galactosidase (Figura 40). Estes resultados foram rechecados com novas reações da PCR e confirmaram os resultados anteriores.

+ _ NT 1 2 3

Gal

Bar

Figura 40. PCR dos prováveis calos transgênicos de C. arabica; (+) controle positivo: vetor de transformação pKANGALRNAi; (-) branco: água; (NT) controle negativo: calos não transgênico de C. arabica; (1, 2, 3) prováveis calos transgênicos de C. arabica transformados com o vetor pKANGALRNAi utilizando a técnica de biobalística.

Apesar do fenótipo característico de crescimento em meio seletivo e da detecção da presença do gene de resistência por reação da PCR, foi realizada a análise da expressão da proteína PAT com o kit imunológico Trait™ LL Test Strip (Strategic Diagnostics Inc., EUA) nos três prováveis calos transgênicos de café. No entanto, sua expressão não foi detectada nas condições testadas (Figura 41). Este resultado foi inesperado, uma vez que todos estes três calos estavam crescendo em meio seletivo com glufosinato de amônio, o que é um fenótipo indicativo de que este herbicida estaria sendo degradado pela enzima PAT expressa nestes calos, mas no entanto, o kit imunológico não detectou a sua presença.

169

1 2 3 4 5 6 7 8

Figura 41. Teste imunológico para detecção da proteína PAT utilizando o kit imunológico Trait™ LL Test Strip. (1) Controle positivo: semente transgênica de Zea mays expressando a proteína PAT (não fervida); (2) Controle positivo: semente transgênica de Zea mays expressando a proteína PAT (fervida); (3) Controle negativo: calos de C. arabica não transgênico (não fervido); (4) Controle negativo: calos de C. arabica não transgênico (fervido); (5) Provável calo transgênico no 1 de C. arabica (não fervido); (6) Provável calo transgênico no 1 de C. arabica (fervido); (7) Provável calo transgênico no 2 de C. arabica (fervido); (8) Provável calo transgênico no 3 de C. arabica (fervido). Seta indica reação positiva para a proteína PAT.

Inicialmente, os testes para detecção da PAT foram feitos sem que as amostras fossem fervidas, conforme as instruções do fabricante (Figura 41 – amostras 1, 3 e 5), sendo possível detectar a presença desta enzima no controle positivo (Figura 41 – amostra 1), mas não detectou sua presença no provável calo transgênico no 1 de café (Figura 41 – amostra 5). Como este teste de fita é baseado em reação imunológica antígeno-anticorpo e a técnica de Western blot também é baseada neste mesmo princípio, foi realizado um teste para verificar se a proteína PAT poderia ser detectada com a fervura da amostra. Para isso, as amostras foram maceradas em tampão PBS 1X, fervidas por 5 min, seguida de imersão em gelo. Após 5 min, foi realizado o teste com as fitas de detecção (Figura 41 – amostra 2, 4, 6, 7 e 8). Não houve a detecção da proteína PAT em nenhum dos tratamentos, nem mesmo no controle positivo (Figura 41 – amostra 2), indicando que as amostras não podem ser aquecidas para este tipo de análise com fitas de detecção da proteína PAT. Este resultado fez-nos retroceder sobre todas as fases de construção do vetor de transformação pKANGALRNAi, principalmente no que se referia à clonagem do gene bar. 170

Nesta checagem, foi identificado um erro na construção do vetor: o gene Bar utilizado no vetor de transformação pKANGALRNAi foi clonado a partir do vetor pBSSK-Bar, gentilmente cedido pela Dra. Kenny Bonfim que o construiu no laboratório do Dr. Francisco Aragão (EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia – Brasília/DF). Quando este vetor foi construído, no momento da clonagem do gene bar, foi utilizada uma enzima de restrição que digeriu o vetor antes do stop códon do gene bar, eliminando-o da construção e, portanto, comprometendo a estrutura primária da proteína PAT codificada por este gene. Este erro foi confirmado, posteriormente, pelo sequenciamento deste vetor. Os prováveis calos transgênicos foram obtidos a partir desta construção contendo o gene bar faltando o stop códon mas, no entanto, a enzima PAT permaneceu funcional, uma vez que os calos estavam crescendo em meio com glufosinato de amônio. Os resultados apresentados neste capítulo foram obtidos com a construção pKANGALRANi com o gene bar modificado. Uma vez detectado o erro no vetor de transformação, os experimentos de bombardeamento foram suspensos para sua correção. Após a sua correção (dados não apresentados), os bombardeamentos foram retomados com o vetor pKANGALRANi corrigido para geração de novos eventos de transformação, uma vez que este projeto terá continuidade após a defesa da presente tese para fins de publicação. Foi realizada uma análise in silico para avaliarmos o grau de modificação da proteína PAT ocorrido devido à ausência do stop códon original no gene bar clonado no vetor pKANGALRNAi. Foi montada a sequência do gene bar clonada no vetor pKANGALRNAi, juntamente com a região downstream deste gene neste vetor, obtendo uma sequência codificante modificada do gene bar. A tradução desta sequência in silico, utilizando o programa DNAMAN, possibilitou a identificação de um stop códon nesta sequência modificada. Em paralelo, foi feita a tradução in silico da sequência correta original do gene bar utilizando o programa DNAMAN. As duas sequências de aminoácidos foram alinhadas utilizando o programa MEGA4 (TAMURA et al., 2007) e a análise deste alinhamento identificou a substituição dos 10 aminoácidos da terminação amino da proteína por 12 aminoácidos distintos da sequência original (Figura 42).

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Bar original MSPERRPADI RRATEADMPA VCTIVNHYIE TSTVNFRTEP QEPQEWTDDL Bar modificado MSPERRPADI RRATEADMPA VCTIVNHYIE TSTVNFRTEP QEPQEWTDDL

Bar original VRLRERYPWL VAEVDGEVAG IAYAGPWKAR NAYDWTAEST VYVSPRHQRT Bar modificado VRLRERYPWL VAEVDGEVAG IAYAGPWKAR NAYDWTAEST VYVSPRHQRT

Bar original GLGSTLYTHL LKSLEAQGFK SVVAVIGLPN DPSVRMHEAL GYAPRGMLRA Bar modificado GLGSTLYTHL LKSLEAQGFK SVVAVIGLPN DPSVRMHEAL GYAPRGMLRA

Bar original AGFKHGNWHD VGFWQLDFSL PVPPRPVLPV TEI-- Bar modificado AGFKHGNWHD VGFWQLDFSL PVPSSNFPDR SNIWQ

Figura 42. Alinhamento da sequência de aminoácidos da proteína PAT codificada pelo gene Bar original com a sequência alterada deste gene presente no vetor pKANGALRNAi. Quadro destaca a diferença entre estas duas sequências de aminoácidos.

Com o objetivo de elucidar o insucesso de detecção da proteína PAT com o kit imunológico Trait™ LL Test Strip, o fabricante deste kit foi contactado por e-mail, no qual nossos resultados foram explicitados com o objetivo de obtermos informações a respeito do anticorpo utilizado neste kit. A resposta foi dada por Tim Lawruk (Market Manager, Food Safety – SDIX – Newark, DE) com os seguintes comentários: ”The antibody was developed vs. the whole protein, however if the 10 missing amino acids are located in the binding epitope region it could have a large effect on reactivity. This is a monoclonal antibody so it is target to a single region” (comunicação pessoal). Infelizmente os esclarecimentos prestados foram insuficientes para elucidar a não detecção da proteína PAT nos calos transgênicos de café (confirmados por reação da PCR), uma vez que ele não nos informou se seria exatamente esta região a correspondente ao epitopo deste anticorpo. Embora este kit imunológico para detecção da proteína PAT tenha sido feito para análises in situ, era de se esperar que as análises fossem qualitativas. Apesar da não detecção da proteína PAT com este kit imunológico, não é possível descartar a possibilidade desta proteína estar presente nos prováveis calos transgênicos de café, uma vez que resultados semelhante foram observados na EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia (Laboratório de Transferência de Genes – Dr. Francisco J. L. Aragão) com Lactuca sativa transformada com vetor contendo o gene bar. Folhas de plântulas de prováveis alfaces geneticamente modificadas, crescendo em meio seletivo contendo o agente seletivo glufosinato de amônio, também não tiveram a presença da proteína PAT confirmadas por este kit. No entanto, quando a quantidade de amostra foi aumentada, o kit passou a identificar a presença desta proteína nas mesmas plântulas que, anteriormente, o kit não havia detectado 172

(comunicação pessoal). Desta forma, há evidências experimentais de que existe um componente quantitativo para detecção da proteína PAT com este kit imunológico. Com base nestas observações, não se pode descartar a possibilidade dos prováveis calos transgênicos de café estarem expressando a proteína PAT, uma vez que a quantidade de amostra de café analisada foi muito pequena. Ciente de que o objetivo era a obtenção de plantas geneticamente modificadas de café, foi feita a opção por prosseguir com o protocolo para produção de plântulas por embriogênese somática, postergando a análise de detecção da proteína PAT para o momento em que houvesse uma quantidade suficiente de material vegetal para estas análises. Considerando a eficiência da transformação de C. arabica por biobalística, não foi possível determinar, com precisão, o número de explantes bombardeados em função da natureza do explante (calos embriogênicos) utilizado nestes experimentos. No entanto, uma estimativa pode ser feita, baseada no número de placas submetidas ao bombardeamento. Considerando que foram bombardeadas, aproximadamente, 240 placas e que foram obtidos três calos transgênicos, este resultado implica em uma taxa de transformação de 1,25%, ou seja, foram observadas a produção de 1,25 calos geneticamente modificados e expressando o gene de resistência ao agente seletivo glufosinato de amônio a cada 100 placas bombardeadas. Embora tenha sido utilizado o mesmo procedimento básico de transformação, apenas otimizando estas condições com o uso da protamina na fase de preparo das partículas de tungstênio para bombardeamento, os resultados observados nos presentes experimentos foram muito inferiores aos obtidos por Albuquerque et al. (2009) e por Cunha et al. (2004). Albuquerque et al. (2009) reportou uma taxa média de 5,4 prováveis eventos de transformação por placa, considerando cada placa contendo 50 mg de calos bombardeados, dos quais obtiveram pelo menos um evento/placa confirmado por PCR. Embora Cunha et al. (2004) não tenham indicado a massa de calos embriogênicos submetidos ao bombardeamento, reportaram uma taxa média de 3,7 eventos de transformação por placa bombardeada. No entanto, estes últimos autores relataram que houve uma grande variação de eventos transgênicos entre as placas bombardeadas sem, no entanto, discorrer sobre as possíveis causas desta observação. Sabe-se que a introgressão do gene exógeno no genoma das células-alvo é um processo físico aleatório, sendo impossível controlar todas as variáveis envolvidas no processo. Submeter os calos embriogênicos ao tratamento osmótico prévio ao bombardeamento teve grande influência na taxa de transformação, uma vez que estas células estavam crescendo em meio líquido e eram altamente vacuoladas. Nos testes preliminares de bombardeamento destes explantes com o vetor pBI426, sem o pré-tratamento osmótico, não 173

houve diferença dos calos bombardeados com o controle não bombardeado (dados não apresentados). No entanto, não foi possível identificar as razões de termos obtido taxas de transformação tão inferiores aos obtidos por Albuquerque et al. (2009) e por Cunha et al. (2004). Foram identificados vários fatores que dificultaram a obtenção de plantas transgênicas de C. arabica visando o silenciamento do gene da -galactosidase, os quais merecem os comentários que seguem: Primeiramente em relação ao tempo necessário para obtenção de plantas em condições de análise: sendo o cafeeiro uma planta perene, existe uma dificuldade relacionada com a parte da cultura de tecidos de café e a obtenção de plantas em casa-de-vegetação na fase reprodutiva (florescimento e frutificação) requer um período de, aproximadamente, 24 a 30 meses, distribuída em duas etapas, a saber: (1) relacionada com o período in vitro que inclui a introdução de explantes foliares para condições in vitro, a indução de calos embriogênicos, a indução da embriogênese somática com a formação e maturação destes embriões e a obtenção de plântulas de café in vitro e (2) relacionada com a fase em casa-de-vegetação que inclui desde a aclimatação das plântulas até o florescimento e frutificação do cafeeiro. Segundo, os riscos em relação à contaminação, principalmente de origem bacteriana. No caso do café, não foram observados problemas de contaminações fúngicas provenientes dos explantes e da manipulação do material sob condições assépticas, mas foram detectados sérios problemas de contaminação bacteriana. Apesar da desinfestação dos explantes foliares, a desinfecção mostrou-se ineficiente. Enquanto os explantes iniciais foram mantidos em meio sólido, raramente foi detectado algum sinal característico de contaminação bacteriana no meio de cultura. No entanto, quando os calos embriogênicos foram transferidos do meio sólido para meio líquido, diversos recipientes contendo calos embriogênicos de café apresentaram um crescimento bacteriano típico, com aparência leitosa. Embora não tenha sido determinado o tipo de bactéria contaminante, o seu crescimento era de difícil controle e, aparentemente, difundido em diversos cultivares de café. Estas contaminações comprometeram diversos experimentos de transformação de calos embriogênicos de café, uma vez que tiveram que ser descartados, reduzindo a quantidade de experimentos analisados. Visando contornar este problema de contaminação bacteriana, foram testadas várias abordagens: (i) reintrodução de novos calos embriogênicos de meio sólido para meio líquido – esta abordagem foi feita com calos crescidos no Laboratório de Cultura de Tecidos de Plantas, sob responsabilidade do Dr. João Batista Teixeira (EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia – Brasília/DF), mas também foram buscados novos calos, gentilmente cedidos 174

pelo Dr. Carlos Henrique Siqueira de Carvalho (EMBRAPA/Café – Varginha/MG). No entanto, apesar de todos os cuidados na manipulação destes novos explantes, bactérias não tardaram crescer no meio de cultura líquida; (ii) experimentos para controle do crescimento bacteriano com diferentes dosagens de hipoclorito de sódio na lavagem dos calos contaminados, bem como sua adição ao meio de cultura líquido de multiplicação de calo (dados não apresentados) – a concentração de 0,03% (v/v) apresentou os melhores resultados, mas após três semanas de cultivo em meio líquido, as bactérias voltaram a crescer neste meio, indicando que a atividade do hipoclorito de sódio não era bactericida, mas bacteriostático; (iii) uso de antibióticos de largo espectro de ação: foram realizados testes a partir de culturas com calos embriogênicos contaminados com um antibiótico de largo espectro de ação, comercializado com o nome Timetin (SmithKline Beecham Pharmaceuticals, Inglaterra). Este antibiótico contém os princípios ativos (i) ticarcilina (ácido 6-[(carboxi-3-tienilacetil) amino]-3, 3-dimetil-7-oxo-4-thio-1-azabiciclo heptano-2-carboxílico) e (ii) clavulanato de potássio. Os calos embriogênicos contaminados foram lavados, assépticamente, com meio de multiplicação de calos (CPmod líquido) e transferidos para novos meios CPmod com diversas concentrações de Timetin avaliando-se, visualmente, o crescimento bacteriano após a sua adição ao meio de cultura líquido. Das diversas concentrações testadas, 200 mM Timetin foi a menor dosagem que apresentou uma inibição de 100% do crescimento bacteriano (dados não apresentados). Aparentemente, esta concentração de antibiótico não apresentou efeitos negativos sobre o crescimento dos calos embriogênicos de café, uma vez que estes continuavam se multiplicando na mesma taxa. Com base nestes resultados, Timetin passou a ser adicionada a todos os meios de cultura (esterilizadas a frio com filtro Millipore 0,22 m e adicionadas aos meios após sua autoclavagem) para evitar o eventual crescimento bacteriano e a transformação de calos embriogênicos de café com a técnica da biobalística pode ser reiniciada. Vale ressaltar que as análises das plantas geneticamente modificadas (PGM) de café serão realizadas, posteriormente, no momento em que forem obtidas plantas transgênicas desta cultura, regeneradas por embriogênese somática, conforme o organograma que segue: as linhagens de cafeeiro transgênicas serão aclimatadas e crescidas em casa-de-vegetação, localizada na EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia (Brasília/DF), de acordo com as normas da Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio). Plantas transgênicas de café serão caracterizadas por análises moleculares durante sua fase juvenil para confirmação da inserção dos genes de interesse (fragmento do gene da -galactosidase e gene 175

seletivo bar) utilizando a técnica da PCR. Das plântulas positivas para a inserção de ambos os genes, será realizada a análise de Southern Blot para estimar do número de cópias dos transgenes inseridos no genoma de café. As análises relacionadas com a expressão do gene da -galactosidase em PGM de cafeeiro serão realizadas em frutos da primeira floração, com as seguintes análises: 1 – Análise comparativa da velocidade de maturação de frutos de café transgênicos e não transgênicos, buscando avaliar o efeito do silenciamento do gene da -galactosidase sobre a maturação de frutos de café; 2 – Análises da expressão do gene CaGal por RT-PCR e de identificação dos siRNAs serão realizados os tecidos vegetativos (folhas novas, folhas adultas e ramos) e reprodutivos (pétalas) das PGM de café com a finalidade de avaliar os efeitos do silenciamento deste gene nestas planta de café; 3 – Análises bioquímicas da atividade da -galactosidase serão feitas por espectrofotometria conforme Golden et al. (1993) nos frutos de café transgênicos, comparando-os com sua expressão em frutos não-transgênicos; 4 – Caracterização dos carboidratos presentes na parede primária de frutos de PGM (plantas geneticamente modificadas) de C. arabica expressando o silenciamento do gene da - galactosidase. Estas análises serão realizadas ao longo do desenvolvimento de frutos de café e uma análise comparativa deste perfil de carboidratos será feita com o perfil obtido de frutos de café não transgênicos (Capítulo I). Estes resultados serão compilados, analisados e, posteriormente, publicados em revista indexada na área.

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CAPÍTULO IV – DISCUSSÃO GERAL E PERSPECTIVAS

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DISCUSSÃO GERAL E PERSPECTIVAS

O processo de maturação de frutos carnosos, dentre os quais os de café, apresenta uma complexidade que pode ser analisada sob diversos ângulos com a finalidade de ampliar a sua compreensão. Considerando as distintas abordagens para a análise do crescimento e desenvolvimento de frutos, as atividades de enzimas hidrolíticas que atuam nas paredes celulares destes frutos merecem destaque. Apesar de estarem localizadas no apoplasto celular, as paredes celulares não são funcionalmente inertes, conferindo apenas formato e resistência mecânica às células vegetais (CARPITA e GIBEAUT, 1993; CARPITA e McCANN, 2000; BUCKERIDGE et al., 2008; GÍRIO et al., 2010; SEIFERT e BLAUKOPF, 2010). Em função da sua importância biológica, diversas pesquisas têm sido feitas para elucidar não somente sua estrutura, mas o metabolismo dos compostos bioquímicos que nesta região se localizam, dentre os quais se destacam os polissacarídeos que podem ter função estrutural ou de reserva (BUCKERIDGE et al., 2000). Nesta complexa matriz de polissacarídeos constituintes das paredes celulares dos frutos atuam diversas enzimas responsáveis por sua deposição, suas modificações estruturais e sua degradação. Diversas revisões sobre a parede celular vegetal e seu metabolismo, com enfoque nas enzimas hidrolíticas que atuam nesta região têm sido publicadas (McNEIL et al., 1984; FISCHER, 1991; WALTON, 1994; FRY, 1995; COSGROVE, 1999; COSGROVE, 2005; REDGWELL e FISCHER, 2006; SANDHU et al., 2009; SARKAR et al., 2009). Dentre estas enzimas que atuam no apoplasto das células de frutos de café encontram- se as -galactosidases (EC 3.2.1.23), inicialmente estudadas por Golden et al. (1993). Estas enzimas pertencem à família das glicosil-hidrolases e são caracterizadas pela sua capacidade de hidrolisar resíduos terminais não-redutores de -D-galactosil a partir de -D-galactosídeos (ESTEBAN et al., 2005; NC-IUMBM, 2009). No entanto, somente quinze anos depois as - galactosidases voltaram a ser mencionadas na formação de sementes de café (SALMONA et al., 2008), em uma abordagem macro buscando compreender o complexo mecanismo molecular usando a “transcriptômica” (com arranjos de cDNA e PCR em tempo real), porém sem maiores detalhes. No ano seguinte, Joët et al. (2009) publicaram um amplo trabalho buscando compreender as diversas vias metabólicas envolvidas na formação de sementes de café, também utilizando uma abordagem “transcriptômica”. Neste estudo, os autores também 183

mencionaram a participação das -galactosidases no metabolismo de carboidratos durante o desenvolvimento dos frutos de café, novamente sem maiores comentários. No presente trabalho, foi enfocada a participação das -galactosidases que atuam no apoplasto celular que se localizam no pericarpo e no endosperma de frutos de café durante seu processo de amadurecimento. Com este enfoque, inicialmente foi feita uma caracterização da evolução do perfil de monossacarídeos presentes no pericarpo e no endosperma, separadamente, de frutos de café em fases distintas de maturação (Capítulo I). Com base nessas informações e conhecendo-se as estruturas dos polissacarídeos, foram identificados os polissacarídeos presentes nestes tecidos com o objetivo de identificar os prováveis carboidratos-alvo das -galactosidases. Diversos polissacarídeos foram encontrados nas paredes celulares de frutos de café em desenvolvimento, alguns amplamente divulgados na literatura científica e outros, ainda não (Tabela 6).

Tabela 6. Resumo geral das classes de polissacarídeos encontrados em frutos de Coffea arabica em diversas fases de maturação, identificando as classes que contém resíduos de galactose na sua estrutura e o respectivo tipo de ligação deste monossacarídeo.

Tecido Monossacarídeo Ligação da Polissacarídeo Pericarpo Endosperma Galactose galactose Arabinogalactano - + + (14) Galactomanano - + + (16) Xiloglucano + + + ) Ramnogalacturonano tipo I + + - - Arabinano + - - - Galactano + - + (14) Manano + - + (16) Glucuronoarabinoxilano + + - - Xilano + - - - Celulose + + - -

Analisando cada uma destas classes de polissacarídeos que contém galactose na sua constituição, com enfoque no tipo de ligação que estes resíduos de galactose fazem com os demais monossacarídeos presentes nos polissacarídeos depositados nas paredes celulares de frutos de café, podemos inferir as seguintes considerações com relação aos prováveis carboidratos-alvo para a atividade da -galactosidase expressa nestes tecidos: 184

(i) Os arabinogalactanos poderiam ser alvo da atividade das -galactosidases, uma vez que a cadeia principal é formada por unidades monoméricas de galactose com ligação do tipo (14); (ii) Os galactomananos não poderiam ser alvo da atividade das -galactosidases, uma vez que os resíduos de galactose estão ligados à cadeia principal de mananos por ligações do tipo (16); (iii) Os mananos também não poderiam ser alvo da atividade das -galactosidases, uma vez que a denominação manano se refere a um polissacarídeo formado por unidades monoméricas de manose, mas que tem até 10% de resíduos de galactose ligados à cadeia principal de manose por ligações do tipo (16). Vale destacar que a diferença entre um manano e um galactomanano (GM) está na quantidade de ramificações de galactose ligadas à cadeia principal de manose (BUCKERIDGE et al., 2000); (iv) Os xiloglucanos são uma classe de hemicelulose formado por uma cadeia principal de monômeros de glicose unidos por ligações do tipo (14), com ramificações de xilose unidas por ligações do tipo  na posição O-6 de resíduos de glicose. Além desta ramificação, podem ser encontradas resíduos de galactose [ligações )] ou fucose (unidas por ligações  no resíduo de galactose) na posição O-2 dos resíduos de xilose (McNEIL et al., 1984; BUCKERIDGE et al., 2000). Portanto, os xiloglucanos poderiam ser considerados polissacarídeos-alvo para as -galactosidases; (v) Os galactanos também poderiam ser alvo das -galactosidases pelo fato de serem formados por unidades monoméricas de galactose unidas por ligações do tipo (14); (vi) Os arabinanos (formados por unidades monoméricas de arabinose), os xilanos (formados por resíduos de xilose), os glucuronoarabinoxilanos (formados por uma cadeia principal de xilanos com ramificações de ácido glucurônico e arabinose) e a celulose (formada por unidades monoméricas de glicose) não poderiam ser considerados carboidratos-alvo para as -galactosidases, uma vez que não têm galactose associados às suas estruturas.

Feitas estas considerações, uma caracterização molecular e bioquímica da expressão do gene das -galactosidases expressas em frutos de C. arabica foi realizada (Capítulo II). Dentre as diversas análises feitas, foi conduzido um estudo de sua expressão espaço-temporal no pericarpo e no endosperma, separadamente. Uma diferença da expressão do gene da - 185

galactosidase nestes tecidos foi observada, com picos de expressão nas fases iniciais de crescimento dos frutos e, posteriormente, na fase de sua maturação. Compilando as informações de que os polissacarídeos presentes nas paredes celulares primárias de frutos de café em desenvolvimento que contém resíduos de galactose na sua estrutura são os arabinogalactanos, os xiloglucanos e os galactanos, e que as -galactosidases se expressam de forma diferenciada no pericarpo e no endosperma destes frutos, foi possível visualizar o seguinte panorama (Tabela 7).

Tabela 7. Tabela compilada dos polissacarídeos que contém galactose na sua estrutura molecular, juntamente com os níveis de transcrição do gene da -galactosidase e sua respectiva atividade enzimática, expressa em frutos de C. arabica nos estádios de maturação 4, 5 e 7.

Polissacarídeo (c/ resíduos de galactose) -Galactosidase Amostra de Expressão Atividade café Arabinogalactano Xiloglucano Galactano (mRNA) enzimática CV - + + + ++++ (pericarpo-4) CMV - ++ +++ +++ ++++ (pericarpo-5) CM - +/- + ++++ +++++ (pericarpo-7) EV ++ + - +/- + (endosperma-4) EMV + +/- - ++ +/- (endosperma-5) EM ++++ + - ++++ + (endosperma-7)

Analisando, separadamente, cada tecido dos frutos de café, pode-se verificar que, no pericarpo, há indícios de que os polissacarídeos xiloglucano e galactano podem ser considerados carboidratos-alvo para a atividade das -galactosidases expressas em frutos desta espécie. À medida que os frutos avançaram na sua maturação, houve um incremento nos níveis de expressão transcricional, juntamente com as respectivas atividades enzimáticas desta enzima. Em paralelo, embora inicialmente tenha sido observado um ligeiro aumento nos teores dos dois polissacarídeos, houve uma redução destes mesmos polissacarídeos quando os frutos amadureceram. Ou seja, a quantidade de carboidratos (galactano e xiloglucano) presentes no pericarpo diminuiu à medida que a atividade enzimática da -galactosidase aumentou, o que é uma evidência de que estes polissacarídeos podem ser alvo para a atividade das -galactosidases. 186

Embora não tenha sido identificada na literatura consultada referências relacionadas com a atividade das -galactosidases sobre galactanos ou xiloglucanos em frutos de café, Ross et al. (1994) avaliaram a atividade da -galactosidase sobre polissacarídeos presentes na parede celular de frutos de maçã, identificando sua alta atividade sobre a fração de galactanos, resultados semelhantes aos observados na presente tese. Por outro lado, os xiloglucanos também já foram identificados como sendo substratos para a atividade da -galactosidase em cotilédones de nasturtium (Tropaeolum majus L.) (EDWARDS et al., 1988), resultado também semelhante aos resultados observados no pericarpo de frutos de café. No entanto, experimentos complementares deverão ser conduzidos para confirmar estes resultados em frutos de café. Analisando o endosperma, não foi observado um sincronismo entre os níveis de transcrição do gene da -galactosidase e a sua atividade enzimática (previamente discutido no Capítulo II). Embora os arabinogalactanos estivessem em quantidades elevadas (em relação aos demais polissacarídeos considerados na presente análise), nos estádios de desenvolvimento analisados não foi possível fazer uma correlação entre os níveis deste carboidrato e a baixa atividade enzimática de -galactosidase no endosperma de frutos de café. Embora tenha sido observado este resultado, aparentemente, contraditório no endosperma de café, é importante que não se perca a perspectiva do estádio de desenvolvimento dos frutos e das implicações fisiológicas relacionadas com estas condições. Na fase madura (estádio 7), as sementes (constituídas basicamente pelo endosperma) encontram-se desidratadas, um processo natural e evolutivamente selecionado visando a perpetuação das espécies vegetais, inclusive identificado em sementes de café (EIRA et al., 2006). Esta desidratação gradual visa a redução do metabolismo celular e todas as atividades enzimáticas diminuem drasticamente, permanecendo nestas condições até o momento da germinação (ANGELOVICI et al., 2010). Feitas estas considerações, os resultados observados no endosperma de frutos de café na fase final de maturação são consistentes com esta realidade fisiológica das sementes. Os baixos níveis de água nas células do endosperma fariam com que a atividade enzimática das -galactosidases fosse baixa também, o que foi observado na presente tese (Capítulo II). Com isto, os arabinogalactanos, prováveis carboidratos-alvo para esta enzima, não teriam seus teores reduzidos, servido com polissacarídeo de reserva, armazenado nas paredes celulares primárias das células endospérmicas dos frutos de café. Quando houvesse a reidratação deste 187

tecido e a reativação do metabolismo, estes polissacarídeos poderiam ser mobilizados para o desenvolvimento embrionário como fonte de substratos para o metabolismo celular em atividade, auxiliando na formação da nova plântula de café. No entanto, estudos serão necessários para avaliar esta hipótese. Por último, visando avaliar a participação do gene da -galactosidase no processo de maturação de frutos de café, foi feito o silenciamento destes genes por intermédio da técnica do RNA interferente (RNAi) utilizando a metodologia de transformação por biobalística. Calos embriogênicos de café foram transformados com um vetor contendo dois fragmentos invertidos deste gene (no vetor pKannibal para a formação do grampo de RNA – RNA hairpin), juntamente com o gene seletivo bar. Foram obtidos três calos embriogênicos de café, os quais foram analisados por reação da PCR com primers específicos para o gene de resistência ao herbicida glufosinato de amônio e do fragmento do gene da -galactosidase. Os três prováveis calos transgênicos apresentaram o gene bar integrado no genoma de café, mas somente dois destes apresentaram a integração do fragmento do gene da -galactosidase. Por razões previamente expostas, não logramos produzir plantas de café geneticamente modificadas, mas somente calos que se encontram, no momento, na fase de formação de embriões somáticos visando a regeneração de plântulas de café que serão, posteriormente, aclimatadas em casa-de-vegetação. Estas plantas transgênicas de café serão submetidas a análises moleculares para confirmar a presença dos transgenes e a expressão dos siRNAs do gene da -galactosidase, juntamente com uma análise do efeito do seu silenciamento sobre o crescimento e desenvolvimento das plantas de café, bem como dos seus efeitos sobre a maturação de seus frutos. A hipótese inicialmente elaborada sobre os efeitos das -galactosidases sobre a maturação de frutos de café pode ser confirmada ou não, mas somente a experimentação poderá produzir dados que a confirme ou a negue. Além disso, é necessário estarmos atentos a prováveis efeitos off-target que podem ocorrer com o uso da técnica do RNAi mas, no entanto, não é possível predizer se isto ocorrerá no presente experimento. Vale mencionar que, em se confirmando o silenciamento do gene da -galactosidase nas plantas de café geneticamente modificadas (realizado pela identificação de siRNAs), serão realizadas análises bioquímicas da composição dos monossacarídeos presentes nas paredes celulares primárias dos tecidos presentes no pericarpo e no endosperma destas plantas transgênicas de café, avaliando os efeitos deste silenciamento na composição dos carboidratos presentes no apoplasto destes tecidos. 188

Algumas lacunas científicas precisarão ser complementadas e o serão a posteriori como, por exemplo, sequenciar o gene completo da -galactosidase, identificar e confirmar as regiões codificadoras deste gene, além de clonar e estudar a sua região promotora visando a obtenção de um promotor tecido-específico de frutos de café. Ainda, cortes histológicos de frutos de café em fases distintas de maturação, corados para a identificação de específicas classes de polissacarídeos poderão consubstanciar os dados observados com as análises cromatográficas apresentadas nesta tese, assim como o uso da técnica da imunocitoquímica, com anticorpos específicos para a proteína -galactosidase, poderiam precisar com detalhes a sua localização nas células do pericarpo e do endosperma de frutos de café. Desta forma, o presente trabalho de pesquisa contribuiu para ampliar os conhecimentos sobre o complexo processo de maturação de frutos de café, com uma abordagem bioquímica e molecular deste mecanismo, avaliando a participação das - galactosidases sobre esta complexa rede de reações bioquímica que interagem entre si, culminando com o amadurecimento dos frutos de café no campo.

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191

ANEXO 1 – SEQUÊNCIA DO GENE DA -GALACTOSIDASE DE COFFEA ARABICA DEPOSITADA NO GENBANK (NCBI) 192

Coffea arabica cultivar Icatu Vermelho beta-galactosidase (BGal) gene, partial CDs

GenBank: HQ283330.1

LOCUS HQ283330 3948 bp DNA linear PLN 19-FEB- 2011 DEFINITION Coffea arabica cultivar Icatu Vermelho beta-galactosidase (BGal) gene, partial cds. ACCESSION HQ283330 VERSION HQ283330.1 GI:323371173 KEYWORDS . SOURCE Coffea arabica (coffee) ORGANISM Coffea arabica Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta; Spermatophyta; Magnoliophyta; eudicotyledons; core eudicotyledons; asterids; lamiids; Gentianales; Rubiaceae; Ixoroideae; Coffeeae; Coffea. REFERENCE 1 (bases 1 to 3948) AUTHORS Figueiredo,S.A., Lashermes,P. and Aragao,F.J. TITLE Molecular characterization and functional analysis of the {beta}-galactosidase gene during Coffea arabica (L.) fruit development JOURNAL J. Exp. Bot. (2011) In press PUBMED 21239378 REMARK Publication Status: Available-Online prior to print REFERENCE 2 (bases 1 to 3948) AUTHORS Aragao,F.J.L. and Figueiredo,S.A. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (20-SEP-2010) Laboratorio de Transferencia e Expressao de Genes, Embrapa Recursos Geneticos e Biotecnologia, Parque Estacao Biologica - PqEB - Av. W5 Norte Caixa Postal 02372, Brasilia, DF 70770-917, Brazil FEATURES Location/Qualifiers source 1..3948 /organism="Coffea arabica" /mol_type="genomic DNA" /cultivar="Icatu Vermelho" /db_xref="taxon:13443" gene <1..>3948 /gene="BGal" mRNA join(<1..171,1304..1399,1486..1598,1935..2001, 279..2371,2460..2603,2882..2976,3136..3166,3417..3501, 3596..>3714) /gene="BGal" /product="beta-galactosidase" CDS join(1..171,1304..1399,1486..1598,1935..2001,2279..2371, 2460..2603,2882..2976,3136..3166,3417..3501, 3596..>3714) /gene="BGal" /EC_number="3.2.1.23" /function="hydrolysis of terminal non-reducing beta-D-galactose residues in beta-D-galactosides" /note="CaBGal" /codon_start=1 193

/product="beta-galactosidase" /protein_id="ADX59436.1" /db_xref="GI:323371174"

/translation="MGAFWLSCFGLLMVMWTTTRGGVEGGQVSYDGRSLIIEGQRKLL FSGSIHYPRSTPDMWPSLISKAKHGGLDVIETYVFWNLHEPRHGQYDFKGRHNIVRFI REIQAHGLYAFIRIGPFIEAEWTYGGLPFWLHDVPGIVYRSDNEPFKYHMQNFTTKIV NLFKSEGLYAPQGGPIILQQIENEYKNAERAFHEKGPPYVQWAAAMAVGLQTGVPWVM CKQDDAPDPVINTCNGRTCGETFVGPNSPNKPAIWTDNWTSLKNGSFVNYYMYHGGTN FGRTGSAFVLTSYYDEAPIDEYGLIRQPKWGHLKQLHSVIKSCSQTLLHGVISVSPLG QQQE" ORIGIN 1 atgggtgctt tttggttgag ctgttttggc ttgttaatgg ttatgtggac aactacaagg 61 ggtggtgttg agggaggaca agtttcttac gatggaagat cactgataat tgaagggcaa 121 agaaagctcc tgttttctgg ttcaattcat tatcctcgaa gcactcccga tgtatgtttt 181 ctcagtctct tgcttattta ctcttttttt ttttttttgg tcttggcttg tgtttttctt 241 gtggaatgtt aaaagaaatt tagagttgta caaagttata tgtttttaag aaacactcca 301 tccagcatta atttttgaat caatatttaa caataaaaag gtgattgtga aaagaagcaa 361 ttctccaaag ataagtgctt ttcaaaatat accattcaat gccatccatt catggttatg 421 aattaagatg aattcatttt attcgtcagc aaactcttgt acatacttag gaaaacacta 481 acctgatgcc cccttcattt gctggtacct tttcttaaat gtcatgattc agtcatgatt 541 caggttggta ggtgagtgtg tttgggtatg tgattatttg gaataatact atagcatttt 601 ttgtaatatg atgtatttaa aataaaaaaa aatagaaaat tttttattta tgatgcaaga 661 aagataatat ttataatttt gtttttaaaa ttatactatt cgaacagacc atggtgtgtt 721 tgttaatcac atgaattgta aacgtaagat tggttagaga tgctgctagg ctttggccca 781 tgatttttgt aagagagatt tatccatttt tgcctccgaa tatttttgat ggattcttca 841 atcactcttt tattgataat aattgtttga aaactttggt taaaattgat agttatatgg 901 gttgtatgtt tcactttact actttgtctc atcttacgat tgataaaggt gaagcactcc 961 tttgtagtat agtcccccag tcttctatct taagatccgc aaatttcaag aattacacag 1021 ctaattagtg gttagaggag ggttcttaga gttttcttca ttgtcagttt caggatttga 1081 atcttgtacc tgacagttgg gtgtagaagg gtgtgaagag gggtgagaga ataaaaaacc 1141 taaaacctac aaatctaatt aagaaaaatt cctcttaaac actcattctt gttaaaaaaa 1201 atgcatacaa ttaatttttg taaaatattt taagcatata aaatttccaa gggatggatt 1261 attagcaaga ttatcttgtt acgaaaatta tttttcatgg cagatgtggc catctttgat 1321 atcaaaggcc aaacatggtg gactagatgt gattgaaacc tatgtctttt ggaatcttca 1381 tgaacctcga catgggcagg taccttctcc agctctatgt aaattttcac gcatattttg 1441 tacatcaatt caactgaaat gacttttttg cttttcactt ttcagtatga ttttaaggga 1501 agacataata tagtgagatt cattagagaa attcaagctc atggcctcta tgcattcatc 1561 cggattggac ccttcattga ggctgaatgg acttacgggt aagaaagttt tgctaaaact 1621 ctagttgcct aatttttatg caaggtgaaa gtaaatatgc tgcttcaaga ttttacattc 1681 taaaaaaggt taactagaaa caccccttta tcagttcatt ttcatatcta tcctgtttta 1741 gtcacatatg gtactgtgta taaaacaagc aacttttgcc aacaacttgg ggaaatttgt 1801 caggaatttg tgcaagttaa aaagtatcgg actggaactg ccatatgtac caaataatgc 1861 acttaggatt tctaggatag ggagtagcat ctcgttatac tttgaatact tacagagttg 1921 atttgctgct gcagaggtct accattttgg ctgcatgatg taccaggaat tgtttatcga 1981 tctgataatg aaccctttaa ggtgatgcat attttactct cttttttttc ctttttcata 2041 ggcgaacagg tgggaagaat ccgtttggag gtgtggaaat gtttctcgaa cgtagaactc 2101 acaatttcag atttattgga gagtaaatct tgaaccaaaa taactgccag aaacacttgt 2161 atatcatttg acagtacaaa aagaaaacat tcttgatcaa gagcacaaca ctcccaaaca 2221 gatgaaaaaa agagaacggt tgctggtaat ctgacatccc ttctttggtt tgtgacagta 2281 tcatatgcaa aacttcacaa caaaaattgt caacttgttc aaatcagaag gattatatgc 2341 tccacaagga gggcctatca ttcttcaaca ggttaaatat ttatcacatc atgtgcagtg 2401 ctgtcatatg cttcagcaat aacatgttca atagtgaagt taaagattgt gctatgcaga 2461 tcgagaatga gtacaaaaat gcggagagag cttttcacga gaaaggaccg ccttatgttc 2521 agtgggcagc tgccatggct gtcggactcc aaacgggtgt gccatgggtt atgtgcaagc 2581 aagatgatgc tcctgatcct gtggtaacca tttctacctc tctttttgga caatgaaaca 2641 tgaactcaag ttcgttaaat aaacatcaaa ggaaaagttg cctgataccc tcacaaaatt 2701 ctcaagcaaa tcaaatgtag cacaaatata tatgcatcag aactcctacc ttttattttc 2761 tacaattatt gctatttttt ggtcttttga gtggaataat atgaggcaat agggctgctg 2821 ttgcagtaat gtctctaacg cagatgatac aatggaaaat tgaaacttga gcaatgtgca 2881 gataaacaca tgtaatggga ggacgtgtgg agaaacattt gtagggccta attcaccaaa 194

2941 caagccagca atctggacag acaattggac aagtttgtaa gttttcgcta acattgttcc 3001 ttgtacagat tcatataggt atgatctctg agaatttcct ccattgttgc ttgaagctat 3061 caagtctatg gtgacaagac cccattaaga tcagcagagg accttgcata taacgttgct 3121 ttattcatag ccaaggaaga acggaagctt tgtaaactac tacatggtaa gtaacagaaa 3181 caaccacaaa gaaagagtta gatgaagagg aaaagagtct tcccccattt gtgatgaaaa 3241 tacattcatt ttatctatga tggatacttt acgtgccttt actgagccag tttttcctac 3301 atatattgct aatatatagt aagatttgac tccatgtctg gatgccatct tccaaactgt 3361 ctccattatg gatcatagaa tacaaggtcc ttaagctaat gttgattgtg tttcagtatc 3421 atggcggtac aaattttggc aggacaggtt cagcatttgt actcacaagc tattatgatg 3481 aagctcctat tgatgaatac ggtaagtgag gctgtataat atcacatata gtatactatc 3541 atatatagtt cattattaag ttttaatcaa tgaagaagtt catggatatt aacaggtttg 3601 attaggcaac caaaatgggg tcatctgaag cagttacatt cagtaataaa gtcatgctca 3661 cagactctac ttcatggagt catatctgtt tctccacttg gtcagcagca agaagtaaga 3721 ttagcatctt cattctttcg gatagatttc gttttttcat tttttatatt aagtttcttc 3781 tgaatcatat actctttaac tctaccagta attgcttgac cctcttgtga ggggaagaaa 3841 agctacaaaa caaattatga gacatttatc acatgtacaa cgtatctcaa tactcaccag 3901 cttatctcga gataggccta tgtattccgc agggattcag gagaatgt //

Fonte: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/323371173?report=genbank&to=3948

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ANEXO 2 – ARTIGO RELACIONADO COM A TESE, PUBLICADO NA JOURNAL OF EXPERIMENTAL BOTANY

Journal of Experimental Botany, Vol. 62, No. 8, pp. 2691–2703, 2011 doi:10.1093/jxb/erq440 Advance Access publication 14 January, 2011

RESEARCH PAPER Molecular characterization and functional analysis of the b-galactosidase gene during Coffea arabica (L.) fruit development

Se´ rgio Araujo Figueiredo1,3, Philippe Lashermes2 and Francisco Jose´ Lima Araga˜ o3,* 1 Universidade Cato´ lica de Brası´lia, Campus II, SGAN 916, 70790-160, Brası´lia, DF, Brazil 2 IRD-Institut de Recherche pour le De´ velopement, UMR RPB (CIRAD, IRD, Universite´ Montpellier II), BP 64501, 34394 Montpellier Cedex 5, France 3 Embrapa Recursos Gene´ ticos e Biotecnologia, Laborato´ rio de Introducxa˜ o e Expressa˜ o de Genes, PqEB W5 Norte, 70770-900, Brası´lia, DF, Brazil

* To whom correspondence should be addressed. E-mail: [email protected] Downloaded from The nucleotide sequence data reported in this paper is deposited in the GenBank Nucleotide Database under accession number HQ283330 (CabGal). jxb.oxfordjournals.org Received 8 October 2010; Revised 6 November 2010; Accepted 7 November 2010

Abstract at Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecu?ria on May 19, 2011 b-D-Galactosidase (EC 3.2.1.23) has been detected in several plant species, and is characterized in different organs and tissues by its ability to hydrolyse terminal non-reducing b-D-galactosyl residues from b-D-galactoside polymers. In the present paper the cloning and the biochemical and molecular characterization of Coffea arabica b-galactosidase expressed in the pericarp and the endosperm of coffee fruits in all phases of ripeness are described. It was found that coffee b-galactosidase is not evenly transcribed throughout fruit ripening, oscillating with two distinct peaks: the first peak when immature fruits are at the active growing stage and the second when fully developed coffee fruits are completely ripe. Both in vitro enzymatic activity of coffee fruit protein extracts and in vivo histochemical assay of freshly harvested coffee fruits confirmed the uneven transcription of b-galactosidase as fruit maturation advanced. Partial genomic DNA sequencing indicated a complex arrangement of nine putative exons. In silico translation of the cloned coding sequences clearly revealed the cloned gene as b-galactosidase, with the presence of a signal peptide directing the enzyme to the apoplast. Two isoforms were distinguished by sequencing reverse transcription-PCR transcripts, one expressed in young and adult leaves and another in stems, petals, and coffee fruit endosperm and pericarp. Southern blot analysis indicates that there are at least two copies of this gene in the C. arabica genome that could explain the presence of two b-galactosidase isoforms.

Key words: Cell wall, Coffea arabica, coffee, fruit ripening, b-galactosidase.

Introduction Tissue softening during fruit ripening is a consequence of carbohydrate residues from the side chains of the poly- cell wall structural weakening due to the activity of several saccharide matrix during fruit maturation (Sakurai and cell wall-degrading enzymes (Fischer and Bennett, 1991). Nevins, 1997; Brummell and Harpster, 2001). The application of analytical biochemistry and molecular Despite the well characterized activity of polygalactur- techniques revealed that this physiological process is more onases on the depolymerization of the cell wall pectic complex than previously expected. The cell wall structure is polymers, it appears that polygalacturonase activity alone a matrix composed of several different polysaccharides, and is not sufficient to induce fruit softening (Giovannoni et al., an increase has been reported in the solubility of both 1989). The release of arabinosyl and galactosyl residues hemicellulosic and pectic fractions, with the release of from pectic side chains is also an important event involved

ª The Author [2011]. Published by Oxford University Press [on behalf of the Society for Experimental Biology]. All rights reserved. For Permissions, please e-mail: [email protected] 2692 | Figueiredo et al. in fruit softening (Gross, 1984; Gross and Sams, 1984; a-galactosidase (Marraccini et al., 2005) and endo-b-man- Redgwell et al., 1992), which is related to the activity of nanases (Marraccini et al., 2001). Molecular approaches are b-galactosidases (EC 3.2.1.23). This class of cell wall- also being used to expand the knowledge related to coffee degrading enzymes belongs to the glycosyl hydrolase bean grain composition and biochemical aspects involved in enzymatic group, which is characterized by its ability to coffee beverage quality. In this context, Salmona et al. hydrolyse b-D-galactosyl residues from the non-reducing (2008) investigated transcription networks specific to terminals of b-D-galactosides (Esteban et al., 2003). In C. arabica seed development, combining cDNA arrays and higher plants, b-galactosidase is known to be the only real-time reverse transcription-PCR (RT-PCR). Even though enzyme able to hydrolyse galactosyl residues from cell wall these authors identified the presence of a b-galactosidase polysaccharides by an endo-cleavage of b-1,4-galactan transcript (gathered with several other genes in cluster-IV1), (Smith et al., 1998). Its ability to release galactose from it was only mentioned without any further exploration. As carbohydrates, galactolipids, and glycoproteins, and from far as is known, there are no reports specifically on the cell wall components during cell expansion, senescence, and molecular analysis of coffee b-galactosidases. fruit ripening has been identified in the literature (De Veau In this work, the isolation, molecular characterization, and et al., 1993; Buckeridge and Reid, 1994; Ross et al., 1994). functional analysis of the b-galactosidase gene of C. arabica b-Galacosidase enzymatic activity and gene expression (CabGal) during coffee fruit development are presented, have been measured in different plant tissues undergoing distinguishing both temporal and spatial b-galactosidase developmental changes, such as pollen (Rogers et al., 2001), expression. seeds (Sekimata et al., 1989; Buckeridge and Reid, 1994), and

seedlings (Li et al., 2001; Esteban et al., 2005). In fruits, Downloaded from b-galactosidase activity was reported during fruit develop- ment and ripening for several species including tomato Materials and methods (Smith et al., 1998, 2002; Smith and Gross, 2000), carambola (Balasubramaniam et al., 2005), chick-pea (Esteban et al., Plant material jxb.oxfordjournals.org 2005), pear (Tateishi et al., 2001), pepper (Biles et al., 1997; Field-grown C. arabica cv Icatu Vermelho fruits were manually Ogasawara et al.,2007), mango (Prasanna et al.,2005), apple harvested from October to February at Centro de Pesquisa Agropecua´ria dos Cerrados/EMBRAPA, Planaltina, DF, Brazil (Ross et al., 1994), rice (Chantarangsee et al., 2007), (1535’35’’S, 4742’30’’W, 1007 m asl), with a lowest and a highest at Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecu?ria on May 19, 2011 Arabidopsis (Dean et al., 2007), strawberry (Trainotti et al., mean annual temperature of 12.6 C and 30.1 C, respectively. 2001), and orange (Wu and Burns, 2004), among others. In Coffee fruits at different ripening phases were classified based on coffee species, b-galactosidase enzymatic activity was first their phenological stages from 1 to 8, according to fruit size and described by Golden et al. (1993). These authors reported pericarp colouration (Fig. 1). In the first four stages, the immature fruits were visually classified by the increment in both volume and that Coffea b-galactosidase was not able to release galactose length and, from stage 5 to 8, the fully grown coffee fruits were from pectins, but did so from arabinogalactans and classified by pericarp colour changes. Once fruits were harvested galactans, which are two distinct side chains on the pectin and classified, the pericarps and endosperms were separated, backbone. They evaluated b-galactosidase enzymatic activ- identified, independently weighed, frozen in liquid nitrogen, and stored at –80 C. ity during coffee fruit ripening and verified that immature fruits presented low activity; however, as coffee fruits went into the ripening stage, b-galactosidase presented a peak with a 6-fold activity increase, followed by a slight decrease in completely ripe coffee fruits. These authors also com- pared b-galactosidase activity with four other glycosidases and verified that during coffee fruit ripening, b-galactosidase presented the highest enzymatic activity among all four cell wall-degrading enzymes analysed. However, they did not mention whether b-galactosidase was expressed in the pericarp or in the endosperm. Although coffee is an important commodity, few studies related to Coffea fruit development have been published (De Castro and Marraccini, 2006; Geromel et al., 2006, 2008; Maluf et al., 2009). However, it should be noted that efforts have been directed towards understanding the com- Fig. 1. Classification of field-grown C. arabica fruits at eight plex integrated transcription network involved in coffee developmental stages based on fruit size (immature coffee fruits, seed development (Salmona et al., 2008; Joe¨t et al., 2009). stages 1–4) and on pericarp colouration (ripening coffee fruits, Apart from the biochemical characterization of coffee cell stages 5–8) is presented in the lower panel. Transversal and wall components (Bradbury and Halliday, 1990; Rogers longitudinal coffee fruit sections are presented, respectively, in the et al., 1999; Redgwell and Fischer, 2006), only a few genes upper panel, presenting blue coloured regions that correspond to related to coffee fruit cell wall-degrading enzymes have in vivo b-galactosidase histochemical activity. P, pericarp; E, been cloned and biochemically characterized, such as endosperm. Expression of b-galactosidase in Coffea arabica | 2693

RNA extraction, cDNA synthesis, and RT-PCR Extraction of b-galactosidase from coffee fruits Total RNAs were extracted from ;100 mg of both pericarps and b-Galactosidase was extracted independently from coffee fruit endosperms of C. arabica fruits, previously stored at –80 C, using pericarp and endosperm at all eight ripening stages. Approxi- Micro-to-midi Total RNA Purification System (Invitrogen, USA). mately 1 g of each sample was ground in liquid nitrogen, and cDNAs were prepared from these RNAs with SuperScript III extracted in ice-cold extraction buffer containing 0.1 M sodium Reverse Transcriptase (Invitrogen, USA) using oligo(dT)20 accord- citrate pH 4.6, 1 M sodium cloride, 13 mM EDTA, 1% (w/v) PVP- ing to the manufacturer’s instructions. 10, and 100 lgml1 PMSF (phenylmethylsulphonyl fluoride), Semi-quantitative b-galactosidase transcription expression was which was added at the ratio of 5ml of extraction buffer per gram carried out by RT-PCR, which was optimized in order to allow of fresh weight. Samples were kept on ice for 5 min with periodic this analysis from coffee fruit pericarp and endosperm at different mixing, followed by centrifugation at 8000 rpm for 20 min at 4 C. ripening stages, using the elongation factor 1a gene (EF-1a)asan The supernatants containing b-galactosidase were harvested, and internal control. Three biological replicates of coffee fruit endo- stored at –20 C. sperm and pericarp at each developmental stage were used in this analysis. For b-galactosidase transcription analysis, bGALPLF Protein estimation (AGAAGCACTCCCGAGATGTGG) and bGALPLR (TGGCA- CATAACCCATGG) were used as primers, amplifying a single Protein was estimated from the supernantant extracted for fragment of 504 bp. The PCRs were carried out using 1 llof b-galactosidase enzymatic analysis by Bradford’s method using bovine serum albumin as standard (Bradford, 1976). cDNA, Invitrogen 103 PCR buffer, 1.5 mM MgCl2,10mMof each dNTP, 10 lM of each gene-specific primer, and 1 U of Taq polymerase (Invitrogen, USA) in a final volume of 25 ll. The PCR b-Galactosidase enzymatic assay amplification program was optimized, and consisted of one cycle b-Galactosidase enzymatic assay was performed according to at 94 C for 2 min, followed by 30 cycles of 94 C for 30 s, 50 C Golden et al. (1993). Fruit extracts from coffee pericarps and for 1min, and 72 C for 1min, after which the reactions were kept endosperms containing b-galactosidase were thawed on ice, and

Downloaded from at 72 C for another 10 min on PTC-100 Peltier Thermal Cycler 20 lg of total soluble protein was used per sample. Extracts were equipment (MJ Research, USA). For EF-1a gene expression, incubated with 13 mM PNPG (4-nitrophenyl-b-D-galactopyranoside; identical reactions were prepared in parallel, except that EF-1F Sigma-Aldrich, USA), incubated at 37 C for 30 min, and the (TGTTGCTGTTAAGGATTTGAAGCG) and EF-1R absorbance was measured at 405 nm using iMark Microplate (AACAGTTTGACGCATGTCCCTAAC) were used as primers, Reader (Bio-Rad, USA). Each sample was measured in triplicate. jxb.oxfordjournals.org amplifying a fragment of 358 bp. The PCR amplification cycle was The standard curve was prepared using a 2-fold serial dilution the same as that used for b-galactosidase. from 50 mM of p-nitrophenol (Sigma-Aldrich, USA) in triplicate. The RT-PCRs were run on a 1% (w/v) agarose gel by electrophoresis, and the relative intensity of the amplified frag- ments was determined by analysis of the gel images using the b-Galactosidase histochemical assay at Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecu?ria on May 19, 2011 Quantity One program v4.6.3. Relative quantification was done b-Galactosidase in vivo histochemical assay was performed accord- by comparing the intensities of CabGal and EF-1a bands. Three ing to Chantarangsee et al. (2007). Briefly, freshly harvested coffee biological replicates were analysed per coffee fruit at each de- fruits at all ripening stages were longitudinally and transversally velopmental stage. sectioned, and incubated in staining solution containing X-Gal [50 mM sodium phosphate pH 7; 10 mM EDTA; 0.1% (w/v) sarcosyl; 20% (v/v) methanol; 1 mM X-Gal (5-bromo-4-chloro-3- Genomic DNA extraction and Southern analysis indolyl-b-D-galactopyranoside)] for 4 h at room temperature. After Genomic DNA was extracted from 200 mg of healthy adult leaves this period, the staining solution was discarded, the reaction was of both C. arabica cv Icatu Vermelho and C. arabica cv Catuai stopped, and the samples were decolourized in methanol, and Vermelho using the cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) stored at room temperature for visual analysis (Fig. 1). method (Doyle and Doyle, 1987) with a modified extraction buffer containing 2% (w/v) CTAB, 2% (w/v) PVP (polyvinylpyrrolidone), Cloning b-galactosidase 100 mM Tris-HCl pH 8, 25 mM EDTA, and 2 mM sodium The partial genomic b-galactosidase sequence was obtained using chloride. At the moment of extraction, 2% (v/v) b-mercaptoetha- Genome Walking Universal Kit (Clontech, USA) with DraI, nol and 2% (w/v) sodium metabisulphite were added. FspI, ScaI, SspI, SmaI, NruI, and StuI to digest the genomic DNA For Southern blot analysis, 50 lg of genomic DNA was according to the manufacturer’s instructions. individually digested with DraI, EcoRI, and HindIII, followed by electrophoresis in a 0.8% (w/v) agarose gel at 25 V h1.Thedigested samples were transferred to a nylon membrane Hybond-N+ BAC library screening analysis (Amersham Biosciences, UK) by the alkaline capillary method A bacterial artificial chromosome (BAC) library constructed from (Sambrook and Russell, 2001), followed by pre-hybridization with the genomic DNA of C. arabica cv IAPAR 59 was used (Noir salmon sperm at 65 C for 2 h. A 426 bp probe from the original et al., 2004). High-density colony filters were prepared using coffee b-galactosidase expressed sequence tag (EST) was PCR a Genetix Q-Bot. BAC clones were double-spotted onto Hybond- amplified with the bGALPLF (AGAAGCACTCCCGA- N+ filters (Amersham-Pharmacia) in a 434 pattern as described by GATGTGG) and bRACE (TTCTCGTGAAAAGCTCTCTCCG) Tomkins et al. (1999). In total, 27 648 clones of the BAC library primers, using the amplification cycle previously described for gene were spotted onto a 22.5322.5 cm filter representing, approxi- expression analysis. The probe was radioactively labelled using mately, 43equivalent-arabica genomes (equal to eight times basic Ready-To-Go DNA Labeled Beads (dCTP) (GE Healthcare, coffee genome equivalents since two diploid subgenomes, Ca and UK), according to the manufacturer’s instructions. The membrane Ea, are associated in C. arabica). was hybridized at 55 C for 16 h, followed by two sequential The filters were hybridized with three different PCR-generated washes using 23 SSC, 0.1% (w/v) SDS at room temperature, and probes corresponding to different regions of the 504 bp C. arabica two washes with 13 SSC, 0.1% (w/v) SDS at 55 C. The washed b-galactosidase EST. Single amplified fragments were agarose membrane was placed in an imaging plate cassette from Bio purified and used as probes. Probes were labelled with [32P]dCTP Imaging Analyzer (Fuji Photo Film Co. Ltd, Japan) for 48 h, and according to the manufacturer’s recommendations (Megaprime analysed using FUJIFILM Fluorescent Image Analyzer FLA-3000 DNA labelling systems kit, Amersham). Filter hybridization was (FUJIFILM Life Science, USA). carried out as described by Sambrook and Russell (2001). Hit 2694 | Figueiredo et al.

BAC clones were grown for 48 h at 37 C in 1.5 ml of 2YT NCBI GenBank using the MegAlign program (Lasergene, 1 medium containing chloramphenicol (12.5 lgml ), and BAC USA), and a PCR was performed with cDNAs extracted DNA was extracted using an alkaline lysis procedure (Sambrook from mature coffee fruits (stage 7; Fig. 1). One single and Russell, 2001). band was amplified (data not presented), sequenced, and blasted against the NCBI translated nucleotide database, DNA sequencing and sequence analysis identifying the sequence as b-galactosidase, which was Sequencing was carried out by Macrogen Inc. (Maryland, USA) named CabGAL. using BigDye ver. 3.1 sequencing chemistry (Applied Biosystems, The nucleotide sequence was partially solved by genome Inc., USA) with the instrument 37303l DNA Analyzer from Life Technologies (Applied Biosystems, Inc., USA). The BLAST walking (Genome Walking Universal Kit, Clontech, program was used for searching homology against nucleotide and USA) which basically consists of PCR amplifications of amino acid sequence databases at GenBank. The motifs of the single-digested genomic DNA with blunt-ended restriction deduced amino acid sequence were searched using the PROSITE enzymes, followed by the ligation of specific adaptors algorithm (http://ca.expasy.org/prosite/). (provided by the manufacturer) to both ends of these DNA fragments. These adaptor-ligated DNA pools (‘libraries’) Molecular phylogenetic analysis are submitted to two PCR amplifications per library: (i) the In order to perform a phylogenetic analysis, partially cloned CabGal first PCR uses the outer adaptor primer (AP1) provided in translated coding sequence was compared with 36 plant b- the kit and an outer, gene-specific primer (GSP1) provided by galactosidase proteins available at the National Center for Bio- the researcher. The primary PCR mixture is then diluted and technology Information (NCBI) GenBank. The following accessions were selected: Arabidopsis thaliana BGAL6 (CAB64742), Arabidopsis used as a template for a nested PCR with a nested adaptor

lyrata subsp. lyrata BGAL6 (XP_002864867), Asparagus officinalis primer (AP2) and a nested gene-specific primer (GSP2). Downloaded from (CAA54525), Brassica oleracea (CAA59162), Capsicum annuum However, blunt-ended restriction enzymes other than those (AAK40304), Carica papaya (ACP18875), Cicer arientinum recommended by the manufacturer were used here, because (CAA06309), Citrus sinensis (AAK31801), Fragaria3ananassa bGal1 the partial EST sequence presented restriction sites for the

(CAC44500), Fragaria3ananassa bGal2 (CAC44501), Fragaria- jxb.oxfordjournals.org 3ananassa bGal3 (CAC44502), Glycine max (ACF22882), Gos- restriction enzymes provided with the kit. Several different sypium hirsutum (AAS76480), Solanum lycopersicum (formerly PCR cloning approaches published in peer-reviewed articles Lycopersicon esculentum) TBG2 (AAF70821), S. lycopersicum such as iPCR (Ochman et al., 1988), single-site Sda-PCR TBG3 (AAF70822), S. lycopersicum TBG4 (AAC25984), S. (MacGregor and Overbeek, 1991), and single oligonucletide lycopersicum TBG6 (AAF70825), S. lycopersicum TBG7 nested PCR (Antal et al., 2004), as well as RACE (Rapid at Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecu?ria on May 19, 2011 (AAF70823), Malus3domestica (P48981), Mangifera indica SP26 (AAB61470), Nicotiana tabacum TP5 (CAC13966), Oryza sativa Amplification of cDNA Ends) using GeneRacer (Invitro- Indica group (ACC64531), Oryza sativa Japonica group gen, USA) were also tested without success. In order to (AAM34271), Petunia3hybrida BGAL2 (ACC60982), Persea sequence the gene of interest, a C. arabica BAC library americana PaGAL4 (BAF31234), Pyrus communis (CAH18936), (Noir et al., 2004) was screened with three CabGal probes Populus trichocarpa (EEE91791), Prunus persica (ABV32545), (data not presented), identifying eight putative C. arabica Pyrus pyrifolia PpGal5 (BAD91082), Raphanus sativus RsBGAL1 (BAD20774), Ricinus communis (XP_002521778), Sorghum bicolor b-galactosidase BAC clones. Among these, four clones (XP_002437187), Vigna radiata (AAF67341), Vitis vinifera BG1 hybridized with all three probes, which were used for (AAK81874), Zea mays (ACG42995). Coffea arabica b-galactosidase sequencing the gene of interest. These putative CabGal (CAI47559) was used as outgroup to root the phylogenetic tree. genes were purified and sequenced by Macrogen Corp. USA The b-galactosidase sequences were aligned using BioEdit software (www.macrogen.com) by a primer walking approach. The (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit) and the phylogenetic analysis was performed using the ClustalW algorithm through the MEGA4 data analysis sequence confirmed the previous sequences program (Tamura et al., 2007). A bootstrap method (n¼1000) was and expanded both upstream and downstream from the employed to evaluate the reliability of tree topologies (Felsenstein, known nucleotide sequence. 1985) and the Maximum Parsimony (MP) algorithm was used to A partial genomic nucleotide sequence of 3948 bp was construct a b-galactosidase phylogenetic tree. obtained based on the assembly of overlapping genomic DNA sequences derived from C. arabica using both genome walking DNA fragments and putative positive BAC clones Results and Discussion sequenced by primer walking. The sequence was entered in b-Galactosidase gene isolation and characterization the NCBI GenBank database with the accession number HQ283330 (CabGal). b-Galactosidase (EC 3.2.1.23) participates actively in fruit In silico analysis of the cloned CabGal nucleotide maturation in a diverse group of plants and, although sequence blasted against the NCBI protein database (blastx) b-galactosidase presents the highest activity during coffee clearly indicated the gene of interest to be b-galactosidase. fruit maturation among other glycosidases (Golden et al., Nine exons were identified, producing a putative 1005bp 1993), to our knowledge no further investigation related to b-galactosidase-coding sequence (EST), which translated this cell wall-degrading enzyme has been carried out. into 334 amino acid residues (mol. wt¼37 651 Da) As no data related to C. arabica b-galactosidase were (Figs 2A, 4B). The presence of several exon regions is not available from any public database, initially two primers unique to the CabGal gene. Ahn et al. (2007) reported the were designed based on highly conserved nucleotide regions highly complex structure of 17 A. thaliana b-galactosidase of several aligned b-galactosidase ESTs obtained from the genomic sequences, identifying from 12 to 19 exons among Expression of b-galactosidase in Coffea arabica | 2695 Downloaded from jxb.oxfordjournals.org at Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecu?ria on May 19, 2011

Fig. 2. Partial putative C. arabica b-galactosidase EST. (A) The nucleotide sequence (upper line) and the predicted amino acid sequence (lower line). Deduced amino acids are shown in one-letter code. The predicted signal peptide is in bold. Underlining indicates the predicted glycosyl hydrolase 35 family putative active site. (B) Alignment of the C. arabica b-galactosidase predicted amino acid sequence with the A. thaliana (CAB 64742) b-galactosidase amino acid sequence. The box indicates the predicted glycosyl hydrolase 35 family putative active site. them. Not all intron sequences were shared by all 17 AtbGal To investigate whether the deduced b-galactosidase pro- genes, suggesting that, during evolution, indel mechanisms tein is targeted to the cell wall, analysis of the deduced might have been present in order to explain the observed amino acid sequence with the SignalP 3.0 Server program genomic organizational physical pattern. (Emanuelsson et al.,2007) predicted a eukaryotic signal 2696 | Figueiredo et al. Downloaded from jxb.oxfordjournals.org at Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecu?ria on May 19, 2011

Fig. 2. Continued

peptide at the polypeptide N-terminus (signal peptide which the glycosyl hydrolase family 35 active site sequence probability¼1.000) with a maximum cleavage site probabil- G-G-P-I-I-L-Q-Q-I-E-N-E-Y was identified (http://ca.expasy. ity (0.834) between glycine residues at positions 21 and 22 org/prosite/)(Fig. 2A). This amino acid sequence is a charac- (Fig. 2A). This result was confirmed by the TargetP teristic motif specific to b-galactosidases; however, slight (Emanuelsson et al., 2000) algorithm, indicating that the modifications within this region are also observed (Trainotti mature polypeptide should be targeted to the secretory et al.,2001; Triantafillidou and Georgatsos, 2001; Ahn et al., pathway, where it might be involved in cell wall galactosyl 2007). modification. The presence of a signal peptide in the The alignment of the CabGal predicted amino acid unprocessed form of the CabGal enzyme indicates that it sequence with a closely related b-galactosidase protein should be transported into the endoplasmic reticulum, and sequence from A. thaliana (CAB 64727) available at the thence to the cell walls, where it is functionally active. NCBI GenBank database indicated that ;45.64% of the However, immunolocalization and cell fractionation experi- CabGal coding sequence has been cloned (Fig. 2B). In this ments will be required to confirm the cellular localization of analysis, it could also be observed that the aligned amino CabGal in coffee fruits. acid sequences presented 74.25% homology, and the Detailed analysis of the deduced CabGal translated glycosyl hydrolase family 35 motif G-G-P-I-I-L-[Q/S]-Q-I- nucleotide sequence clearly indicated the presence of the E-N-E-Y, characteristic of b-galactosidases, was clearly glycosyl hydrolase superfamily 42 conserved motif, within conserved between these two species. Expression of b-galactosidase in Coffea arabica | 2697 b-Galactosidase transcription analysis, in vitro immature fruits (Fig. 1, stage 2) and another peak in near enzymatic activity and in vivo histochemical assay fully ripe coffee fruits (Fig. 1, stages 6 and 7). Considering CabGal expressed in the pericarp, one peak was clearly A semi-quantitative b-galactosidase transcription analysis observed in fast growing coffee fruit (stage 2), followed by from coffee fruit pericarp and endosperm was performed an expression decay (stages 4 and 5) and a second peak by RT-PCR, and in vitro enzymatic activity was evaluated when fruits were fully ripe (stage 7) (Fig. 3A). However, based on the enzymatic degradation of the substrate PNPG despite two peaks of CabGal expressed in the endosperm by b-galactosidase into galactose and p-nitrophenol. Tran- also being observed, initially there was a low transcription scription analysis revealed that CabGal was not evenly level in immature fast growing coffee fruit (stage 2), expressed in both tissues during fruit development (peri- followed by no detectable expression in the next two phases. carp, Fig. 3A; endosperm, Fig. 3B), and both presented As fruits went into more advanced ripening stages, the a similar pattern with a transcription peak in active growing endosperms presented a sharp increase in b-galactosidase Downloaded from jxb.oxfordjournals.org at Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecu?ria on May 19, 2011

Fig. 3. Expression of b-galactosidase in field-grown C. arabica fruits at different ripening stages. (A) Pericarp CabGal RT-PCR products are presented in the left upper lane. Constitutively expressed transcripts of the elongation factor 1a gene (EF-1a) by RT-PCR were used as control and are presented in the left lower lane. A histogram presenting the relative expression of CabGal and EF-1a band intensity is presented in the right panel; number of biological replicates¼3. (B) Endosperm CabGal RT-PCR products are presented in the left upper lane. Constitutively expressed transcripts of EF-1a by RT-PCR were used as the control and are presented in the left lower lane. A histogram presenting the relative expression of CabGal and EF-1a band intensity is presented in the right panel; number of biological replicates¼3; (+) positive control, plasmid carrying b-galactosidase EST; (–) negative control, water. (C) Coffea arabica b-galactosidase enzymatic activity during fruit development is presented for both pericarp and endosperm; number of biological replicates¼3. 2698 | Figueiredo et al. expression with a transcription peak at nearly full mature results in apple fruit maturation, detecting strong stages (stage 6 and 7). A low CabGal expression in the b-galactosidase activity without detectable expression by endosperm was also observed in the last stage when using northern blot analysis. In coffee fruit development, coffee fruit started to dehydrate (Fig. 3B). Considering Marraccini et al. (2005) studied the expression of another b-galactosidase enzymatic activity during coffee fruit de- galactosidase (a-galactosidase) and observed that even velopment, it could be clearly observed that coffee pericarp though transcription was concomitant with enzymatic also presented two peaks (Fig. 3C), with a similar pattern activity, the enzymatic activity persisted despite the fact observed during transcriptional analysis (Fig. 3A). On the that no transcription was detected in the following phase other hand, although it could be observed that coffee analysed. On the other hand, Golden et al. (1993) reported b-galactosidase enzymatic activity also presented peaks an increased b-galactosidase enzymatic activity as coffee (one during the early endosperm developing stage and fruits matured and ripened. Immature fruits which presented another when coffee fruit were fully ripe), the enzymatic the lowest activity levels and the highest b-galactosidase activity did not reflect the transcription level observed in the activities were observed as fruits were at the semi-ripe stage endosperm (Fig. 3B). This unexpected result could be (equivalent to phase 6, Fig. 1), with a 4-fold increase in related to some post-transcription regulation mechanism, specific activity compared with the initial phase analysed. which needs to be further investigated. It should be noted These results partially confirmed the present data, but a that in vitro b-galactosidase enzymatic activity in coffee detailed analysis cannot be performed since their assayed pericarps presented, approximately twice the activity com- extracts were derived from entire berries. More recently, pared with the endosperm. This result suggests that specific Joe¨t et al. (2009) analysed several different biochemical

hydrolytic events involving this cell wall-degrading enzyme pathways during coffee seed development (the pericarps Downloaded from are more intense in the pericarps than in the endosperm, were excluded from these analyses) by real-time RT-PCR probably related to the composition of the cell wall in these assays, including carbohydrate metabolism. Among several tissues. enzymes involved in this complex pathway, b-galactosidase In order to evaluate both the spatial and temporal expression was evaluated. These authors also reported the jxb.oxfordjournals.org distribution of b-galactosidase enzymatic activity in C. presence of two bGal transcription peaks during coffee seed arabica fruits, an in vivo histochemical analysis was (endosperm) development with a very similar pattern to that performed (Fig. 1). The blue areas indicate b-galactosidase observed in the present RT-PCR analysis, confirming the activity due to the enzymatic degradation of X-Gal results. at Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecu?ria on May 19, 2011 substrate yielding galactose and 5-bromo-4-chloro-3- hydroxyindole, which is further oxidized into 5,5’-dibromo- Southern blot and isoform analysis 4,4’-dichloro-indigo, an insoluble blue product (Sambrook and Russell, 2001). Both longitudinal and transversal fresh The genomic organization of the CabGal gene was in- stained coffee fruit sections revealed areas with similar vestigated by Southern blot analysis under medium strin- staining patterns. A strong expression was observed in gency (Fig. 4A). Genomic DNA was single-digested with endosperms at the initial development stages (phases 1–3), DraI, EcoRI, and HindIII, none of which presented re- decreasing during the transition from fully developed green striction sites within the 426 bp b-galactosidase cDNA coffee fruit into the initial ripening stages (phases 4 and 5), probe used for hybridization (Fig. 4B). Two slight bands followed by another peak activity when fully ripe (phases were observed with DraI, EcoRI, and HindIII digestions. 6 and 7), and decreasing in the final developmental stage The same hybridization pattern was observed in both Icatu when fruits began dehydration (stage 8) (Fig. 1, upper Vermelho and Catuai Vermelho C. arabica cultivars, suggest- lanes). In the pericarp, b-galactosidase expression presented ing that this gene pattern is conserved in these cultivars. a similar pattern with two peaks: the first peak in initial These results indicated that there were at least two copies of developmental phase 3, and a second peak when coffee fruits b-galactosidase genes in the C. arabica genome. However, were fully ripe (phases 6 and 7), similar to b-galactosidase gene copy number is not a trivial issue in this species, because expression in the endosperm (Fig. 1, upper lanes). it is an amphidiploid resulting from a natural cross between In vivo b-galactosidase histochemical analysis presented diploid species C. eugenoides and C. canephora (Lashermes a similar pattern to that observed by in vitro b-galactosidase et al.,1999). Hence it could be interpreted as either the result enzymatic activity, confirming that this gene was not of two homeologous loci (one in each subgenome) or the uniformly expressed throughout coffee fruit development. presence of two duplicate/paralogous genes rather than two Both presented two distinct peaks during coffee fruit isoforms of the same gene. development as observed by RT-PCR, indicating that this Even though the focus here was on b-galactosidase gene might be involved in specific cell wall events at expressed in coffee fruits at different developmental stages, different moments during coffee fruit development. The b-galactosidase expression was also observed by PCR inconsistent CabGal transcription and enzymatic activity amplification of cDNAs derived from young and adult observed mainly in the coffee endosperm suggests that post- coffee leaves, petals, and stems (data not presented). All transcriptional gene expression regulation might be related tissues amplified a single 501 bp DNA fragment that was to CabGal enzymatic activity. These results observed in sequenced and aligned. The sequence alignment indicated coffee are not unique. Ross et al. (1994) observed similar the presence of two distinct groups of PCR-amplified Expression of b-galactosidase in Coffea arabica | 2699

specific promoters or by control by specific transcription factors. These hypotheses should be further investigated by cloning the 5’-untranslated region (UTR) from both tissues. Another point to be considered is regarding CabGal RT- PCR analysis: RT-PCR fragments amplified at early de- velopmental stages (endosperm at stage 3, Fig. 1) and at late stages (pericarp at stage 7, Fig. 1) were sequenced and both DNA sequences were identical (Fig. 5A), indicating that bGal transcription analysis was mainly related to the isoform expressed in coffee fruits. Nevertheless, the possi- bility of the coffee leaf isoform being expressed cannot be definitely excluded, since the set of primers used was not specific to the coffee fruit isoform and every single amplified fragment was not sequence. The activity of CabGal in coffee leaves, stems, and petals is beyond the scope of this study and should be addressed in the future in order to un- derstand its involvement in these organs. b-Galactosidase isoforms have been identified in several plant species, including by Prasanna et al. (2005) who identified three

Fig. 4. Genomic DNA analysis. (A) Southern blot of C. arabica b-galactosidase isoforms in mango. In tomato, Smith and Downloaded from Icatu Vermelho and C. arabica Catuai Vermelho genomic DNA Gross (2000) identified seven b-galactosidase isoforms, but digested with DraI, EcoRI, and HindIII restriction enzymes and only isoform TGB4 was active during fruit ripening; and, in avocado (Persea americana), Tateishi et al. (2001) identified

hybridized with a b-galactosidase gene probe. Molecular markers jxb.oxfordjournals.org are indicated. (B) Schematic diagram of the partially cloned not only three b-galactosidase isoforms, but also their CabGal genomic DNA indicating the exons (boxes) and the introns unique expression pattern during fruit ripening. In straw- (lines). A restriction map is also presented, as well as the position berry fruit maturation, Trainotti et al. (2001) identified three b-galactosidase isoforms, but only isoform FabGal1

of the primers used to amplify the probe from CabGal EST. at Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecu?ria on May 19, 2011 increased expression during fruit maturation. These results suggest that b-galactosidase isoforms are not unique to C. CabGal: one group composed of coffee fruit pericarps, arabica. They appear to be ubiquitously present in several endosperms, petals, and stems, and the other composed plant species under the control of a multigene family, but of young and adult coffee leaves. These two groups not all isoforms appear to be related to ripening. presented 71.06% homology considering the nucleotide sequence (Fig. 5A), suggesting that there are, at least, two Molecular phylogenetic analysis b-galactosidase isoforms present in the C. arabica genome and confirming the Southern blot results (Fig. 4A). Analysis A b-galactosidase hypothetical evolutionary cladrogram of the predicted amino acid sequence of both isoforms was constructed based on the comparison of CabGal presented 74.25% homology (Fig. 5B). It should be noted translated coding sequences with another 36 b-galactosidase that, despite presenting amino acid divergence, both iso- amino acid sequences from different plant species obtained forms conserved the glycosyl hydrolase family 35 motif by Blastx search using the NCBI database. Sequences were G-G-P-I-I-(L/M)-Q-Q-I-E-N-E-Y which is characteristic of aligned, manually edited, and phylogenetic analysis was b-galactosidase (http://ca.expasy.org/prosite/)(Trainotti performed using the MP algorithm with a 50% cut-off limit et al., 2001; Triantafillidou and Georgatsos, 2001; Ahn (Fig. 6). et al., 2007). The aligned amino acid sequences were 90.80% variable The presence of CabGal isoforms suggests that this gene and 63.22% were parsimonious informative. Analysis of the might be involved in specific metabolic events which are b-galactosidase phylogenetic tree clearly indicated a similar- taking place in different tissues and organs of coffee plants, ity between coffee (C. arabica), rice (O. sativa subspecies mainly related to the composition of the cell wall matrix. Japonica), castor bean (R. communis), and A. thaliana, This appears to be the case for CabGal, since in silico placing them genetically apart from other species. However, analysis predicted the presence of a signal peptide sequence. the high level of heterogeneity observed in the database However, it should be noted that not all b-Gals present analysis separated isoforms from the same species, such as metabolic pathway signaling (Ahn et al., 2007). In coffee in strawberry (FabGal1, FabGal2, and FabGal3), and fruits, the sequenced CabGal genes expressed in coffee tomato (several TBGs) into different phylogenetic groups. pericarp and endosperm were identical (Fig. 5A), despite A clear organizational pattern could not be identifed, showing different transcription levels and enzymatic activity because it was not possible to correlate this hypothetical throughout coffee fruit development and ripening (Fig. 3A, evolutionary tree either with species or with family. Similar B). This preliminary result suggests that gene expression results were also observed by Ahn et al. (2007), where might be regulated in the promoter region, either by tissue- b-galactosidase isoforms from A. thaliana, S. lycopersicon, 2700 | Figueiredo et al. Downloaded from jxb.oxfordjournals.org at Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecu?ria on May 19, 2011

Fig. 5. b-Galactosidase isoforms from young and adult C. arabica leaves, stems, petals, endosperms, and pericarps. (A) Coffee b-galactosidase EST isoform alignment. (B) Predicted amino acid sequence alignment from the two C. arabica isoforms. Open boxes highlight the differences in the amino acid sequences. Expression of b-galactosidase in Coffea arabica | 2701 Downloaded from jxb.oxfordjournals.org at Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecu?ria on May 19, 2011

Fig. 6. Consensus b-galactosidase phylogenetic hypothesis based on the C. arabica b-galactosidase deduced amino acid sequence with 36 other plant b-galactosidase proteins using the MP algorithm. The phylogenetic tree was drawn using MEGA4 with a 50% cut-off limit. Bootstrap percentage appears on each branch. and O. sativa were spread throughout their proposed A more robust analysis must be carried out when C. arabica phylogenetic b-galactosidase tree. b-Galactosidases are b-galactosidase sequencing is completed, to obtain a better classified based on their similar enzymatic activities; how- understanding of b-galactosidase gene evolution within ever, because the composition of plant cell walls is highly plants. variable and dynamic throughout plant growth and de- The knowledge acquired with the current molecular and velopment (Campbell and Braam, 1999), the results suggest biochemical characterization of CabGal revealed a more that b-galactosidases might have evolved in distinct patterns complex expression pattern than previously expected, which in order to cope with specific biochemical cell wall now should be put into context with other coffee cell wall- modification requirements. Despite the observed high vari- degrading enzymes expressed during fruit development in ability in amino acid sequence, the biochemically active order to fully understand coffee ripening. The participation motifs were conserved, allowing them to perform as of the CabGal gene and its impact on coffee fruit ripening b-galactosidases. should be further investigated by gene silencing through This preliminary evolutionary hypothesis should be genetic engineering, producing biotech coffee plants with considered with caution since it was built on a partially reduced CabGal expression, followed by analysis of coffee sequenced CabGal translated coding nucleotide sequence. fruit ripening. Due to the fact that CabGal gene expression 2702 | Figueiredo et al. was observed in both vegetative and reproductive tissues, it De Castro RD, Marraccini P. 2006. Cytology, biochemistry and would be interesting to investigate further its influence on molecular changes during coffee fruit development. Brazilian Journal of plant growth and development. Furthermore, biochemical Plant Physiology 18, 175–199. characterization of carbohydrate metabolism during coffee De Veau EJI, Gross KC, Huber DJ, Watada AE. 1993. Degradation fruit ripening should also be exploited, correlating the and solubilization of pectin by b-galactosidases purified from avocado polysaccharide profiles with all known coffee cell wall- mesocarp. Physiologia Plantarum 87, 279–285. degrading enzymes. This information could lead to impor- Dean GH, Zheng H, Tewari J, et al. 2007. The Arabidopsis MUM2 tant biotechnological inputs not only for plant breeding, but gene encode a b-galactosidase required for the production of seed also for the coffee industry. coat mucilage with correct hydration properties. The Plant Cell 19, 4007–4021. Doyle JJ, Doyle JL. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small Acknowledgements quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin 19, 11–15. Emanuelsson O, Brunak S, von Heijne G, Nielsen H. 2007. We would like to acknowledge the collaboration of Marie- Locating proteins in the cell using TargetP, SignalP and related tools. Christine Combes (IRD, Montpellier, France) for her work Nature Protocols 2, 953–971. on the identification of b-galactosidase clones in Coffea BAC libraries. Emanuelsson O, Nielsen H, Brunak S, von Heijne G. 2000. Predicting subcellular localization of proteins based on their N-terminal amino acid sequence. Journal of Molecular Biology 300, 1005–1016.

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ANEXO 3 – CAPÍTULO DE LIVRO PUBLICADO SOBRE A APLICAÇÃO DA TÉCNICA DO RNA INTERFERENTE NA ÁREA DE FISIOLOGIA VEGETAL Research Signpost 37/661 (2), Fort P.O., Trivandrum-695 023, Kerala, India

A Transgenic Approach in Plant Biochemistry and Physiology, 2008: 111-111 ISBN: 978-81-308-0281-7 Editors: Marisela Rivera-Domínguez, Rosalba-Troncoso Rojas and Martín Ernesto Tiznado-Hernández

RNA interference as a tool for plant biochemical and 2 physiological studies

Francisco José Lima Aragão1, 2 and Sérgio Araújo Figueiredo1, 2, 3 1Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, PqEB W5 Norte, 70770-900 Brasília, DF, Brazil; 2Universidade Católica de Brasília, Campus II, SGAN 916 Norte, Av W5, 80790-160, Brasília, DF, Brazil; 3Universidade de Brasília Departamento de Botânica, Campus Universitário, 70910-900, Brasília, DF, Brazil

Abstract Gene silencing mediated by double-stranded RNA (dsRNA), known as RNA interference (RNAi), has recently been demonstrated in both plants and plant pathogens. The diversity of RNA interference applications has quickly made it an indispensable tool for both academic and industrial scientists interested in gene function characterization, signaling pathway analysis, and target validation, improving our understanding of plant molecular biology. This review

focuses on application of RNAi to study biochemical

Correspondence/Reprint request: Dr. Francisco José Lima Aragão, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia PqEB W5 Norte, 70770-900, Brasília, DF, Brazil. E-mail: [email protected] 2 Francisco José Lima Aragão & Sérgio Araújo Figueiredo and physiological phenomena in plants, as well as relevant aspects related to plant-pathogen interactions.

Introduction Plant scientists have always sought to understand the principles behind plant growth and development but, without technological support, success was always very limited. Nevertheless, remarkable discoveries were achieved: it is worth remembering that it was only at the end of the 19th century that the foundations of genetics were discovered with Mendel’s work on peas in the silence of a monastery, casting some light on the black box controlling crop improvement. Unprecedented scientific knowledge was acquired during the 20th century. The milestone in understanding the biochemistry of life came in 1954 when Watson and Crick develop the DNA structure model. The life code of all creatures, hidden inside the cells of every organism, was finally discovered a few years later. All biological science fields could now be analyzed and explored from a new perspective, through the eyes of a newborn science called molecular biology. Where there is a will, there is a way. The surge in biotechnological advances from the 1970’s up to the present has allowed scientists to search for answers to questions that could never be found before. Exchange of information encrypted in DNA molecules was no longer only restricted to sexually compatible organisms, but could now be manipulated in order to overcome the boundaries imposed by nature. Biochemical pathways in all living organisms could be not only understood, but also engineered in a very precise manner to achieve specific goals. Traditional plant breeding methods with all their outstanding achievements, but limited by sexual compatibility, time, labor and space, besides being restrained by linkage dragging, now had a new ally in overcoming these restrictions: an ally called genetic engineering. The grand finale in the rapidly expanding field of molecular science at the end of the 20th century was the development of genome projects, which aimed to sequence entire genomes of different organisms, including humans. Plants were among these international efforts and in 2000, the genome of Arabidopsis thaliana was completed (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000). Undoubtedly a very important achievement for agriculture, this was only the first step towards understanding the mysteries of plant growth and development. The “omics” era had just begun. Against this background, the very next question remained unanswered: what do those sequences do? Moving into the spotlight, functional genomics came into play. Several methods can be used to discover the functions of DNA sequences, but the full appreciation of this subject is beyond the scope of this chapter. RNA interference as a tool for plant biochemical and physiological studies 3

Nevertheless it is important to consider that one of the most used approaches to discover gene function is that of down-regulating gene expression by blocking it at the transcriptional level, by producing a non-functional mRNA or by post- transcriptional regulation. All these approaches lead to the formation of loss- of-function mutants, which can be correlated to a specific biochemical pathway or a specific phenotype. Among these approaches to inducing loss-of-function mutations in plants, one of the most recent and most effective methods is RNA interference which can silence gene expression in a sequence-specific manner. Here our story begins. Readers are also referred to relevant publications by Bosher and Labouesse (2000), by Mello and Conte Jr. (2004), by Lindbo and Dougherty (2005), and by Vilgelm et al. (2006), in which some aspects of RNAi-mediated gene silencing are discussed.

RNA interference discovery Through evolution, all organisms have developed protective systems to limit the deleterious effects of aberrant or exogenous gene expression. Among these, viruses and transposons are examples of gene expression and replication that need to be repressed within the cells. With the widespread advent of genetic engineering, we have realized that transgenes are also recognized as foreign genetic objects (Bosher and Labouesse, 2000). The paradigm of molecular biology - “DNA transcribes into RNA which translates into proteins” - views RNA molecules as carriers of information, not as regulatory molecules. Recently, gene silencing induced by RNA molecules has been identified as a widespread and fundamental component of gene expression (Broderson and Vionnet, 2006). The first event of gene silencing in plants was accidentally discovered during attempts to increase the pigmentation of petunia flowers by over- expressing chalcone synthase (CHS) gene under the control of constitutive 35S promoter (Napoli et al., 1990). Instead of increasing anthocyanin biosynthesis, the authors observed a reduction in both endogenous and transgenic CHS expression, resulting in mosaic and completely de-pigmented flowers. This phenomenon was named co-suppression and was further identified as a post- transcriptional gene silencing (PTGS) mechanism. Many eukaryotic genes can be regulated either by transcriptional or post- transcriptional gene silencing (TGS or PTGS, respectively), targeting genes based on sequence-specificity. Both TGS and PTGS are nucleotide sequence homology-dependent; however, genes silenced transcriptionally are homologous in promoter regions and the silencing occurs at the nucleus, whereas genes targeted for PTGS share homology in the transcribed regions and they occur at the cytoplasm (Ding, 2000). 4 Francisco José Lima Aragão & Sérgio Araújo Figueiredo

PTGS has not only been observed in plants, but also in fungi, where it is known as quelling (Romano and Macino, 1992), and in animals, known as RNA interference (Fire et al., 1998). Both quelling and RNA interference share similarities with gene silencing in plants (Ding, 2000; Llave et al., 2002; Agrawal et al., 2003; Small, 2007). All these mechanisms are collectively referred to as RNA silencing methods, but as they share homology in the core reactions, they have also been called RNA interference (RNAi) methods.

Mechanism of RNA interference RNA silencing is a biochemical mechanism that regulates gene expression by post-transcriptionally activating a sequence-specific RNA degradation by three different pathways: (i) small interfering RNA (siRNA) silencing of exogenous mRNA; (ii) micro RNA (miRNA) silencing of endogenous mRNAs, and (iii) associated with DNA methylation and suppression of transcription (Agrawal et al., 2003; Baulcombe, 2005). The present discussion is related to RNA silencing of exogenous mRNAs. These processes share three basic biochemical phases: (i) formation of double-stranded (ds)RNA; (ii) processing of dsRNA into small dsRNA molecules (sRNA); and (iii) targeting of single-stranded small RNA to sequence-specific DNA or RNA molecules. Although several mechanisms can generate dsRNA, the sRNA processing and effector phases have a common biochemical core (Broderson and Voineet, 2006) (Figure 1). One key-component of this system is small RNA molecules of 21 to 26 nt called siRNAs (small interfering RNAs) (Hamilton and Baulcombe, 1999) which originated from longer double-stranded RNA (dsRNAs) cleaved by a specific RNase endonuclease called DICER (Berstein et al., 2001) with distinctive dsRNA binding, RNA helicase, RNase III and PAZ (Piwi/Argonaute/Zwille) domains (Broderson and Voineet, 2006). The siRNA strands are further relaxed (unwound) and one strand is incorporated in a RISC complex (RNA-induced silencing complex) which contains a member of the Argonaute (Ago) protein family (Hammond et al., 2000; Broderson and Voineet, 2006), guiding this complex to an mRNA with a complementary sequence which is then cleaved (Meister and Tuschl, 2004), leading to gene silencing. RNAi can be triggered by double-stranded or partially self-complementary hairpin RNA formation. In addition to playing a powerful role in creating loss- of-function mutations in plants, RNAi biological functions include also the regulation of endogenous gene expressions, such as micro RNA (miRNA) (Bartel, 2004), heterochromatin formation (Xie et al., 2004), transposon repression and defence against viral infection (Waterhouse et al., 2001; Baulcombe, 2005). RNA interference as a tool for plant biochemical and physiological studies 5

Figure 1. A double-stranded RNA (dsRNA) enters the cell (such as transgene construction, RNA virus genome, or folded transcripts), and is recognized and cleaved by Dicer, which is a member of the RNase III superfamily, creating short double- stranded RNAs (siRNAs) that are characterized by two nucleotide long 3´ overhangs. These siRNAs form a complex with a ribonucleoprotein, known as RNA-induced Silencing Complex (RISC). This complex includes a nuclease nicknamed Slicer, and mediates siRNA unwinding. The single stranded siRNA that is coupled to RISC binds to mRNA in a sequence-specific manner and mediates the targeted mRNA to be cleaved by Slicer in the middle of the complementary sequence. The cleaved mRNA is 6 Francisco José Lima Aragão & Sérgio Araújo Figueiredo

Figure 1. Legend Contionued. recognized by the cell as aberrant and then destroyed, preventing translation, and silencing the expression of the gene. In plants, the aberrant RNA can also serve as a template for an RNA-dependent RNA polymerase (RdRP) to make a new dsRNA molecule in an unprimed RNA synthesis process. The resulting dsRNA is a substrate for Dicer activity, which generates more siRNAs. In plants and other organisms, siRNA un-associated with RISC binds into the target mRNA in a sequence-specific way and serves as a primer for an RdRP to polymerase an antisense RNA strand, generating a dsRNA that is also a substrate for the Dicer.

RNAi as a tool for functional genomics in plants The genomic DNA sequence from any organism, including plants, provides extensive information which is the basis for genetics and breeding programs. However, sequencing entire genomes is not only expensive, but also labor and time consuming. Although new technologies are providing valuable economy in this field, high throughput technology is still needed. Depending on the purpose of the study, sequencing only those genes expressed in a specific tissue at a specific time might provide more useful information. These expressed genes are called ESTs (expressed sequence tags). Once identified, the ESTs must be correlated to a specific biochemical pathway, and their functions have to be validated with further analysis (Small, 2007). Gene expression profiling holds tremendous promise for dissecting the regulatory mechanisms and transcriptional networks that underlie biological processes. However, this is far from being a simple task. Arabidopsis thaliana has one of the smallest plant genomes (approximately 125 Mb), and it is estimated to have from 20,000 to 25,000 genes. Assessing the function of all genes in every cell type will require years of careful analyses of the phenotypes caused by mutations in each gene (Østergaard and Yanofsky, 2004). Besides this complexity, we must bear in mind that not many traits of interest are mono or oligogenics. Actually, most agronomical traits are polygenic (QTL – quantitative trait loci) and this imposes serious limitations on functional genomics as we know it. When considering traits controlled by few genes, instead of using forward genetics, reverse genetics approaches are more appropriate to discover and validate gene functions, mainly by inducing loss-of-function mutations. Even though gain-of-function mutations have also been used in few cases (Weigel et al., 2000), the former approach is more widely used than the latter. In order to obtain loss-of-function mutations in plants, different strategies have been applied over the years, such as the use of chemical mutagenesis using ethyl methane sulfonate (EMS), anti-sense sequences, co-suppression technology, and insertional mutagenesis either by T-DNA insertion, by RNA interference as a tool for plant biochemical and physiological studies 7 transposon tagging, or by physical DNA insertion. More recently, RNA interference has been used to induce loss-of-function mutation in plants (Müller, 2006). Each method has advantages and disadvantages and choosing which one to use depends not only on the species, but also on the purpose of the research. The full appreciation of this subject is beyond the scope of this review; we will focus our discussion on RNAi technology. The increasing application of RNAi technology to discover and validate gene function has proved its usefulness and major advantages, but it is not a magic bullet, and disadvantages must be taken into consideration. Small (2007) summarizes these positive and negative aspects of using RNAi strategy as follows:

Advantages of RNA interference approach:

1. RNAi is sequence-specific, allowing relatively easy gene targeting; 2. RNAi is dominant, allowing the identification of mutants in T1 generation; 3. RNAi can be tissue-specific or time-controlled; 4. RNAi can be used to regulate the expression of genes sharing sequence homology by targeting conserved regions of the genes, facilitating the study of redundant gene functions; 5. RNAi can lead to complete or partial gene knock-down, producing a range of mutant phenotypes which is crucial in studying lethal genes; 6. RNAi can be used to silence genes in polyploid genomes (Lawrence and Pikaard, 2003; Travella et al., 2006; Fu et al., 2007); 7. RNAi silencing is stable, allowing its effects to be studied in progeny (Carthew, 2001); 8. RNAi induces a systemic response, propagating nucleotide sequence specific RNA turnover throughout the organism (Himber et al., 2003).

Disadvantages of RNA interference approach:

1. Although not yet reported in plants, in animal systems off-target effects have occurred due to short sequence homology of siRNA to non-predicted genes (Fedorov et al., 2006; Kulkarni et al., 2006); 2. Reduced penetrance of RNA silencing in the progeny (Wang et al., 2005). However, Carthew (2001) and Stoutjesdijk et al. (2002) observed exactly the opposite, postulating stable gene silencing induced by RNA interference approach in further generations. This controversy requires further investigation to fully appreciate the stability of RNAi gene silencing through generations.

Due to the advantages of RNAi approach in discovering gene function, large-scale high throughput methods have been applied to Arabidopsis thaliana. 8 Francisco José Lima Aragão & Sérgio Araújo Figueiredo

Figure 2. Number of research articles published in different journals until October 2007 related to gene silencing in plants using RNA interference approach.

In 2002, the AGRIKOLA project (Arabidopsis Genomic RNAi Knock-out Line Analysis) was initiated to study the function of about 25 000 Arabidopsis genes using RNAi (Hilson et al., 2004). The diversity of RNA interference applications has quickly made it an indispensable tool for both academic and industrial scientists interested in gene function characterization, signaling pathway analysis and target validation. These advantages of RNAi over other approaches in functional genomics surveys can be evidenced by the tremendous increase over the last decade in plant research publications using RNAi gene silencing technology (Figure 2).

RNAi and physiological phenomena in plants Plants are biologically active organisms, responding to biotic and/or abiotic stimuli from the surrounding environment by adapting their metabolism in order to survive and reproduce under these conditions. Agronomical practices seek to reduce these stresses in order to increase crop production but, whether considering wild-type species or varieties developed by generations of breeding programs, plants do not only share house-keeping biochemical pathways but also have a specific and unique metabolism that must be considered. This challenges plant researchers by producing an even more complex network of interacting biochemical pathways. In any living organism, whether considering a constitutively active or an induced-regulated biochemical pathway, most physiological responses are previously influenced by a modification of gene expression either at the transcriptional or at the post-transcriptional level. In order to better understand the importance of RNAi in the complex universe of plant physiological and biochemical events, we schematically organized the subjects into basic and applied research. RNA interference as a tool for plant biochemical and physiological studies 9 Basic research in plant physiology using RNA interference approach Photosynthesis and related aspects Even though several biochemical aspects of photosynthesis have been studied extensively, the function of many genes related to both photochemical and biochemical phases remain unclear. The photosystems are structurally and functionally complex multimeric units present on the membranes of the chloroplast’s tylacoids, controlling several physical and chemical reactions ranging from water photo-oxidation through electron transport. Jensen et al. (2004) used RNAi to characterize the function of the subunit PSI-O in Arabidopsis, and its role in balancing excitation energy between the two photosystems. Plants rely on ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco) for carbon fixation. Higher plant Rubisco is assembled by a large subunit (LS) encoded in the chloroplast by rbcL gene and the small subunit encoded by the nuclear RBCS gene family. Because its components accumulate stoichiometrically, rbcL and RBCS expression must be tightly coordinated. However, the underlying mechanisms remained undefined. Wostrikoff and Stern (2007) produced two transgenic lines deficient in LS biogenesis by RNAi in tobacco. The authors found that in both lines, LS translation was no longer regulated by the availability of small subunit (SS) but rather undergoes an autoregulation of translation. Another example is the application of RNAi approach in sucrose synthesis. Following the production of glyceraldehyde-3-phosphate in source-cells, the enzyme sucrose-6-phosphate phosphatase regulates the final step of this pathway. By silencing this gene using RNAi, Chen et al. (2005) identified that not only some transgenic tobacco plants had increased up to 1000-fold higher sucrose-6P content compared to wild-type leaves, but that these plants also had no alternative mechanism for carbon export, which seriously compromised plant development. These are examples of RNAi application bringing a more detailed comprehension of a basic but complex process like photosynthesis.

Trafficking through biological membranes Membrane selectivity has a major impact on many biochemical events, not only controlling the import and export of ions and molecules from plants cells, but also by regulating traffic among organelles within plant cells. Several functions of these transmembrane proteins have been identified by RNAi technology, such as vacuolar H+-ATPase (Padmanban et al., 2004), plastidic ATP/ADP co-transporters (Reiser et al., 2004), extrusion of heavy metals by ABC transporters (Kim et al., 2007), iron absorption by a putative basic helix- loop-helix (BHLB) protein (Zhang et al., 2006-b), and γTIP, which is a member of the tonoplast family of aquaporins (Ma et al., 2004), among others. 10 Francisco José Lima Aragão & Sérgio Araújo Figueiredo

Phytohormones Plant hormones are extremely active molecules underling many plant physiological events, broadly influencing growth and development in both vegetative and reproductive phases until achieving responses to biotic or abiotic stresses. These biomolecules act as chemical signals which are amplified through a series of reactions, resulting in a physiological response (Buchanan et al., 2000; Taiz and Zeiger, 2002), either alone or interacting synergistically or antagonistically with other phytohormones. RNAi has proved to be a powerful tool in studying these phytohormones, and some examples are summarized in table 1.

Table 1. Application of RNA interference strategy to study physiological aspects related to different classes of plant hormones.

Hormone Host Gene Physiological event Reference Class species studied and/or metabolic pathway evaluated Abscisic acid Hordeum 14-3-3 family Signal transduction Schoonheim vulgare pathway during seed et al., 2007 germination Abscisic acid Arabidopsis ERD15 Metabolic regulation Kariola et al., thaliana 2006 Auxins Arabidopsis AtSFL61 Lateral root formation Dong et al., thaliana (CEGENDUO) 2006 Auxins Oryza OsPIN1 Root development and Xu et al., sativa family tillering 2005 Ethylene Pyrus ACC oxidase Post-harvest longevity Hu et al., pyrifolia 2006 Ethylene Petunia x PhBSMT1, Methylbenzoate Underwood hybrida PhBSTM2 biosynthesis et al., 2005 Ethylene Lycopersicon ACC oxidase Ripening process Xiong et al., esculentum 2005 Gibberellic acid Lycopersicon GA20ox1, Plant development Xiao et al., esculentum GA20ox2, 2006 GA20ox3 Gibberellic acid Oryza sativa OsPDK1, Regulation of Jan et al., OsPDK2 mitochondrial 2006 PDK enzyme Gibberellic acid Oryza sativa OsXTH family Cell alongation Jan et al., 2004 Gibberellin and Cereals --- Antagonic interaction Ho et al., abscisic acid in aleurone cells 2003 Jasmonic acid Oryza sativa OsRMC Root development Jiang et al., 2007 Jasmonic acid Arabidopsis AtHDA19 Histone acetylation Zhou et al., and ethylene thaliana and pathogenesis- 2005 related gene expression

RNA interference as a tool for plant biochemical and physiological studies 11 Plant growth and development Although it is simple to say this, plant cell growth and differentiation is far from being a simple physiological process. It actually involves high levels of gene regulation of several metabolic pathways in order to coordinate physiological, anatomical and morphological organization both in space and in time to form tissues and organs according to the genetic code. RNAi technology has been used to access several factors controlling different aspects during the vegetative phase, for instance root (Wang et al., 2006; Woo et al., 2007) and leaf development (Yang et al., 2006), internode elongation (Zhou et al., 2006), cotyledon formation (Ikeda et al., 2006), seed development (Sin et al., 2006), and leaf senescence (Miao et al., 2004; Kong et al., 2006). Along with vegetative aspects of growth and development, RNAi has also been applied to plants’ reproductive phase, from flower development (Roccaro et al., 2005), male and female reproductive structure development (Liu et al., 2006; Pawloski et al., 2006), S-specific pollen rejection in self- incompatibility responses (Hancook et al., 2005), male and female gametogenesis (Acoste-Garcia and Vielle-Calzado, 2004; Moritoh et al., 2005), plant development involving phytochrome (Lin and Wang, 2004; Zhou et al., 2005; Hiltbrunner et al., 2006), and cytoplasmic male sterility due to mitochondrial rearrangements (Sandhu et al., 2007). Gene silencing through RNAi approach has also been used to study very basic aspects related to chromosome number reduction during meiosis (Siaud et al., 2004; Jagreet et al., 2006; Zhang et al., 2006).

Plant responses to abiotic stress The environment constantly imposes one or more restrictions on growth and development, not allowing the full expression of the plant’s potential. These physical and/or chemical environmental limitations are collectively called abiotic stresses. Agricultural practices have been developed to reduce these limitations imposed by nature in order to increase plant production: for instance, irrigation when water supply is limited; drainage when soil oxygen is limited; fertilization when the soil does not provide all required mineral nutrients; weed control to reduce water, nutrient, and light competition with crops of interest, and many others. However, despite these artificial efforts to reduce abiotic stresses, plants have developed sophisticated responses to cope and survive. These responses involve cellular physiology, gene regulation and genome remodeling (Madlung and Comai, 2004). Otherwise, natural selection would eliminate the unfit plant species from that environment. 12 Francisco José Lima Aragão & Sérgio Araújo Figueiredo

Not only understanding the biochemical pathways related to plant’s responses to environmental stresses, but also the genes regulating these processes, provides valuable information which can be used to produce plants more adapted to environments with limited resources. This would have an enormous economic impact on agriculture as we know it, not only by producing these more adapted plants, but also incorporating new agricultural lands that would otherwise be excluded from plant production due to environmental limitations. Considering the discovery and validation of genes related to abiotic stresses, incipient results have been accomplished using RNAi gene-silencing approach (Table 2).

Table 2. RNA interference gene silencing applied on functional genomics applied to plant's responses to abiotic stresses.

Abiotic Host Gene Metabolic Reference stress species pathway Salinity Arabidopsis Zat7 Zat7 transcriptional Ciftci-Yilmaz thaliana regulator involved in et al., 2007 salinity stress tolerance, and identification of EAR- motif as essential to stress response Osmotic Arabidopsis STZ/Zat10 Transcriptional Mittler et al., and salinity thaliana regulator protein Zat10 2006 induces tolerance to osmotic and salinity stresses Freezing Arabidopsis BMY8 Interaction with Kaplan thaliana photosynthetic electron and Guy, 2005 transport chain during freezing stress Water Oryza sativa OsARD Methionine metabolism Lin et al., 2005 and ethylene responses under water-related stress Heat Populus ISPS Isoprene related to Behnke et al., x canescens thermoprotection of 2007 photosynthesis and excessive energy dissipation Oxygen Arabidopsis AtATG18a Degradation of Xiong et al., thaliana oxidized proteins 2007 produced under oxidative stress conditions by autophagy RNA interference as a tool for plant biochemical and physiological studies 13

Table 2. Continued.

Water Arabidopsis ERD15 EARLY Kariola et al., and freezing thaliana RESPONSIVE TO 2006 DEHYDRATION 15 (ERD15) protein modulates stress- related ABA signaling responses Multiple Arabidopsis At4g24275 Identification of Devi et al., stresses thaliana activation sequence-1 2006 (as-1) cognate promoter elements related to stress stimuli Phosphorous Lupinus LaMATE Clustered root Uhde-Stone et deficiency albus L. development under al., 2005 phosphorous deficiency Ozone Arabidopsis AtMPK3 Mitogenic-activated Miles et al., thaliana and kinases (MAPKs) 2005 AtMPK6 protection against reactive oxygen species (ROS) induced by ozone stress Light Arabidopsis STO Salt tolerance protein Indorf et al., thaliana (STO) controls 2007 phytochrome and blue- light signaling

Applied research in plant physiology using RNA interference approach Traditional plant breeding has mainly targeted total yield production, but increasing attention has been given to improving nutritional value of plants (Galili et al., 2002). Modification of specific metabolic pathways in a controlled manner has always been one of the major advantages claimed by genetic engineers to complement traditional plant breeding programs. These modifications can be either the introduction of valuable characters or a reduction in negative ones in a host species. In general, these are not house-keeping constitutive pathways, but rather related to compounds belonging to secondary metabolism pathways which are not as well-characterized as the major ones. These quantitatively and/or qualitatively modified specific compounds are the focus of breeding programs involving both traditional and genetic engineering strategies. As RNA interference approach induces silencing of sequence-specific target genes, it fulfills the requirements to precisely modify metabolic pathways. 14 Francisco José Lima Aragão & Sérgio Araújo Figueiredo

In recent years, RNAi has been used in some relevant economic characters of interest, which are mentioned as follows.

RNAi exploited to improve food quality and/or nutritional value Caffeine is a widely consumed natural product present in both tea and coffee plants and the production of caffeine-free products has only been possible through industrial processing. Naturally occurring plants with low caffeine content are rare, and traditional breeding programs have not been able to achieve success in producing caffeine-free plants, besides being time, space and labor-consuming. In coffee, Ogita et al. (2004) reduced the content of theobromine (caffeine precursor) and caffeine by between 30 to 50% when compared to control coffee plants by suppressing the expression of CaMXMT1 (7-N-methylxanthine methytransferase) using double-stranded RNA interference technique. The suppression of CaMXMT1 reduced the expression of all other genes related to caffeine synthesis in coffee plants. Similar results were obtained by Zhang et al. (2006-a) in tea plants (Camellia sinensis) by inhibition of TCA (tea caffeine synthase) through RNAi approach. Another example is cottonseed, which has large amounts of protein that are completely discarded due to the presence of gossypol, a toxic compound produced inside seed glands. Despite all efforts, geneticists have not been able to eliminate this compound by traditional breeding programs without compromising the susceptibility to insect pests. Sunilkumar et al. (2006) silenced -cadinene synthase gene during seed development, which is involved in gossypol biosynthesis, by using RNAi approach. There was a significant reduction in cottonseed gossypol levels in a stable and heritable manner, without reducing the levels of gossypol and related terpenoids in the leaves and in the flowers, maintaining their function in plant defense against insects and diseases. RNAi technology has also been used to improve the nutritional value of cereal grains. Maize is a major crop used worldwide for feeding animals, including humans. However, grains are a limited source of proteins due to their reduced nutritional quality. Previous studies revealed that mutations like opaque-2 (o2) gene can be used in breeding varieties to improve this nutritional quality. However, o2 works in a recessive fashion by affecting the expression of a subset of 22-kD zeins. Segal et al. (2003) silenced o2 gene with RNA interference (RNAi) constructs derived from a 22-kD zein and were able to increase lysine content in these mutant maize plants, creating more nutritious crop plants. In potato (Solanum tuberosum), tubers are a natural starch reservoir. This polymer is composed of amylopectin and amylose, where the former is the RNA interference as a tool for plant biochemical and physiological studies 15 major component (75-80%). However, high-amylose starch from maize is on the market and it has much more valuable physicochemical properties than native starch. Production of high-amylose potato lines can be achieved by inhibition of two genes coding for starch branching enzymes (Sbe1 and Sbe2). Andersson et al. (2006) used RNA interference to inhibit both genes and produced more than 50% of the transgenic lines yielding high-amylose quality. An antisense construct, included in the study as a comparison, resulted in only 3% of the transgenic lines being of high-amylose type.

Figure 3. Applications of RNA interference. A) Transgenic soybean lines were produced using interfering RNA (RNAi) construct in order to silence the myo-inositol-1-phosphate (GmMIPS1) gene. The myo-inositol-1-phosphate is synthesized from glucose 6-phosphate in a reaction catalyzed by the enzyme myo-inositol-1-phosphate synthase. Inositol can be converted into phytic acid (phytate), the most abundant form of phosphate in seeds. 16 Francisco José Lima Aragão & Sérgio Araújo Figueiredo

Figure 3. Continued.

We demonstrated that the lack of expression of this gene in immature soybean seeds led to an absence of accumulation of phytate globoids, and is also involved in seed development. We observed that transgenic seeds (t) presenting an undetectable level of GmMIPS transcripts stopped developing at 2–3 mm size, while non-transgenic seeds (nt) developed normally. B) All geminiviruses encode a Rep protein (also called AC1), the replication initiator protein, which is necessary and sufficient for viral genome (ss-vDNA) replication. Rep is required, with factors produced by the host plant, for initiation and termination of rolling-circle viral DNA replication. Transgenic common bean plants (t) were generated expressing a dsRNA corresponding to a fragment of the rep gene, preventing the respective viral mRNA translation. Two lines presented high resistance upon inoculation with the virus, while all non-transgenic plants (nt) showed characteristic virus symptoms, with yellow-green mosaic of leaves, stunted growth, or distorted pods.

The myo-inositol-1-phosphate is synthesized from glucose 6-phosphate in a reaction catalyzed by the enzyme myo-inositol-1-phosphate synthase. Inositol can be converted into phytic acid (phytate), the most abundant form of phosphate in seeds, accounting for 50–90% of total seed phosphorus in several species (Loewus and Murthy, 2000; Raboy et al., 2001). However, phytate is not readily digested by non-ruminant animals, reducing the nutritional value of grains in feeding monogastric animals. Consequently, there is a considerable interest in reducing the phytate level in seeds. We demonstrate that the lack of expression of this gene in immature soybean seeds leads to an absence of accumulation of phytate globoids and is involved in seed development (Figure 3; Nunes et al., 2006). Soybean lines were produced using interfering RNA (RNAi) construct in order to silence the myo-inositol-1-phosphate (GmMIPS1) gene. We have observed an absence of seed development in lines in which the presence of GmMIPS1 transcripts was not detected. Moreover, a reduction in phytate (InsP6) content was achieved in transgenic lines (up to 94.5%) (Nunes et al., 2006). It is worth mentioning the use of RNAi to reduce food allergenicity. Profilin is a ubiquitous protein found in all eukaryotic cells, acting as an actin and involved in cytoskeleton regulation and signal transduction. However, profilin also contributes to allergenic reactions of many fruits, including tomato. Le et al. (2006) were able to reduce by 10-fold the expression of Lyc e 1.01 gene which is one of the genes involved in profilin synthesis using RNAi- induced gene silencing. They provided a proof of concept and demonstrated that RNAi can be used to design allergen-reduced food.

RNAi and natural products Identification and exploitation of the complex universe of natural compounds synthesized by plants is an endless task which we do not expect to fully understand for many years to come. Despite the huge scientific effort and RNA interference as a tool for plant biochemical and physiological studies 17 investment necessary, advances have been achieved using different strategies, including RNAi approach. Several classes of volatile compounds are responsible for floral scents. In petunia, one of these compounds is isoeugenol. Although the isoeugenol biosynthetic pathway is known, Dexter et al. (2007) identified a new gene belonging to the BAHD family named coniferyl alcohol acyltransferase (PhCFAT). PhCFAT transcript analysis revealed an expression pattern typical of a gene involved in the biosynthesis of floral scent. Inactivation of the PhCFAT gene by RNAi-induced gene silencing resulted in petunia flowers that neither synthesized nor emitted isoeugenol. RNAi has also been applied to reduce flavonoids in tobacco flowers (Nishihara et al., 2005), and to modify anthocyanin and flavonoid biosynthesis in Torenia hybrida flowers (Fukusaki et al., 2004). Another example worth mentioning is fiber quality improvement. Flax fibers are natural sources for textile industry but these fibers contain 3–5% lignin content, providing them with secondary cell wall mechanical resistance which reduces elasticity when compared to non-lignocellulosic fibers such as cotton fibers, but provides a physical barrier to pathogen infection. This lignin accumulation decreases fiber plasticity and negatively affects the degree of stem retting and thus the fiber quality. RNAi gene silencing of a key enzyme of lignin synthesis, cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD), was used to produce low-lignin flax plants and thus improve their elastic properties. They observed a decrease in lignin composites and an increase in phenolic acids, although the transgenic plants showed a higher sensitivity to Fusarium infections (Wrobel-Kwiatkowska et al., 2007).

Biotechnological application and studies on plant- microbe interactions The use of siRNAs (RNAi) has become a powerful tool for specifically down-regulating gene expression, and it has been demonstrated to be of great importance in basic and applied molecular plant-pathogen interaction studies. In addition, these advances in molecular biology have led to the development of pathogen-derived resistance, in which the expression of a pathogen-derived gene or sequence in a plant provides resistance to the pathogen.

Virus-plant interaction studies Several strategies have been employed for genetically engineering resistance to viruses in transgenic plants, including the expression of coat protein genes, the expression of truncated defective genes and antisense RNA. Now that we better understand the mechanisms of RNA silencing (RNAi) and 18 Francisco José Lima Aragão & Sérgio Araújo Figueiredo its biological functions, it is possible to look back on initial experiments from a new perspective. It is now known that plants naturally process viral RNAs to generate small sequences of a pathogen’s genetic material that can be specifically used against that pathogen through the RNA-induced silencing complex (Lindbo and Dougherty, 2005). It was recognized that an RNA- silencing (post-transcriptional gene silencing or PTGS) mechanism was responsible for the resistance against RNA viruses, and that it depends on the formation of double-strand RNA (dsRNA) whose antisense strand is complementary to the transcript of a targeted gene (Brodersen and Voinnet, 2006; Herr, 2005). This discovery led to the introduction in transgenic plants of constructs to produce intracellular generation of siRNA-like species to induce targeted gene silencing and virus resistance. RNA silencing has been an important tool to generate plants resistant to a large range of viruses (for a review see Tenllado et al., 2004). RNA sense- or antisense-mediated strategies resulted in a maximum resistance frequency of 20 %, but often far lower frequencies were obtained (Smith et al., 2000; Bucher et al., 2006; Faria et al., 2006). In addition, not all viral genes used in transgenic constructs rendered plants resistant. The use of inverted repeat constructs, resulting in dsRNA transcripts, rendered a very efficient system in which much higher frequency of transformed lines will display efficient gene knockdown or virus resistance (Smith et al., 2000; Waterhouse and Helliwell, 2003). The probable reason is that the dsRNAs fed directly into the silencing pathway at the level of the RNase III-like enzyme Dicer, and therefore there is no reliance on the action of plant-encoded RNA-dependent RNA polymerase proteins. So far, most examples of RNAi-mediated virus resistance are related to RNA plant viruses. However, there are relatively fewer reports of engineered resistance to DNA viruses, and most of the experiments have been carried out in model plants (Prins, 2003; Vanderschuren et al., 2006). Using a self-complementary hairpin RNA (hpRNA) construct containing the common region of the begomovirus Vigna mungo yellow mosaic virus in a transient assay, Pooggin et al. (2003) obtained recovery from virus infection in Vigna plants. Vanitharani et al. (2003) reported that the use of siRNAs blocked the accumulation of the AC1 mRNA of the geminivirus African cassava mosaic virus (ACMV) in cultured plant cells. Tobacco plants engineered to express the 3´ and 5´ regions from the AC1 gene from Cotton leaf curl virus, in sense and antisense orientations, revealed high resistance to the virus after continuous exposure to viruliferous whiteflies (Asad et al., 2003). Recently, Fuentes et al. (2006) reported immunity against the Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) in transgenic tomato plants transformed with an intron-hairpin construction produced with 726 bp within the C1 viral gene. Tomato plants transformed with an intron-hairpin construct from the C2 gene of Tomato leaf curl virus (TLCV) and, presenting C2-specific siRNA accumulation, developed mild symptoms at RNA interference as a tool for plant biochemical and physiological studies 19

20−25 d after virus inoculation (Bian et al., 2006). In contrast, tomato plants engineered through RNAi strategy to silence the rep (C1) gene of Tomato yellow leaf curl Sardina virus accumulated high amounts of specific siRNA but were susceptible to the virus when challenged by agroinoculation or use of high viruliferous whitefly pressure (Noris et al., 2004). We have generated transgenic common bean (Phaseolus vulgaris L.) plants with a intron-hairpin construction to silence the AC1 gene from the Bean golden mosaic virus (Figure 3; Bonfim et al., 2007). We hypothesized that silencing the expression of the AC1 viral gene, which codes for the only protein strictly essential for viral genome replication, by sequence-specific degradation of target mRNA interfering with viral replication would reduce or prevent viral DNA accumulation and, consequently, appearance of symptoms. One transgenic line presented immunity upon inoculation at high pressure (more than 300 viruliferous whiteflies per plant during the whole plant life cycle) and at a very early stage of plant development. A semi-quantitative polymerase chain reaction analysis revealed the presence of viral DNA in transgenic plants exposed to viruliferous whiteflies for a period of six days. However, when insects were removed, no virus DNA could be detected after an additional period of six days (Bonfim et al., 2007). An important drawback to using RNA mediated virus resistance (RMVR) in transgenic crops is the high level of sequence specificity. Viruses containing 10% nucleotide divergence are insensitive to this form of resistance, but with this level of divergence, these viruses would generally be considered different species (Prins, 2003). To overcome this problem, an alternative is expressing transgenes of different viruses or different genes of a given virus. The full- length coat protein (CP) gene of Turnip mosaic virus was linked to 218 bp N gene segments from Tomato spotted wilt virus and transformed into Nicotiana benthamiana. A high proportion (4 of 18) of transgenic lines was resistant to both viruses, and resistance was transferred to second generation (Jan et al., 2000). Still more impressive was the work reported by Bucher et al. (2006). N. benthamiana was transformed with a hairpin RNA construct containing four 150 bp consecutive fragments of the N gene of four tospoviruses (Tomato spotted wilt virus, Groundnut ringspot virus, Tomato chlorotic spot virus and Watermelon silver mottle virus). It was demonstrated that this construction was capable of rendering up to 82% of the transformed plant lines heritably resistant against all four viruses (Bucher et al., 2006).

Nematode-plant interaction studies RNAi technology provides a rapid and efficient method to study gene expression and function in nematode species. The discovery that RNAi can inhibit Caenorhabditis elegans gene expression has revolutionized the molecular 20 Francisco José Lima Aragão & Sérgio Araújo Figueiredo characterization of this nematode (Fire et al., 1998), making studies of gene function during development relatively simple (for a review see Hunter et al., 2006; Lamitina, 2006; and Timmons, 2006). Using methods that do not require time-consuming transformation, RNA silencing is induced by injecting the homologous dsRNA in the worm or even dipping the worm into solution containing the dsRNA (or bacteria expressing dsRNA molecules), allowing a null phenotype to be mimicked. For a period, these methods could not be used with plant-parasitic nematodes, because the invasive-stage juveniles did not to take up dsRNA from solution. However, Urwin et al. (2002) described a method that uses a neurotransmitter (octopamine) to induce feeding in preparasitic second-stage juveniles of two cyst nematodes, Heterodera glycines and Globodera pallida, allowing uptake of dsRNA from solution. Exploring this new dsRNA delivery method, three different cyst nematode genes were targeted for knocking out. Targeting cysteine proteinases genes (hgcp-I, gpcp-I, or gcp-I) did not reduce the number of parasites but caused a shift from the normal female/male ratio of 3:1 to 1:1 by fourteen days post infection. Exposure of H. glycines to dsRNA corresponding to protein genes with homology to C-type lectins (hgctl) did not affect sexual fate, but 41% fewer parasites were recovered from the plants. Finally, the treatment with dsRNA corresponding to the major sperm protein gene (MSP) had no effect on either parasite development or sexual fate over fourteen days (Urwin et al., 2002). Studies on nematode-plant pathology could also be carried out using a comparative genomics approach by anchoring the analysis with an organism, usually C. elegans. Unlike the plant pathogenic nematode, the C. elegans genome is fully sequenced and is well characterized with a number of lethal genes identified through experimental methods. Using this approach, Alkharouf et al. (2007) have compared EST database of H. glycines with the C. elegans genome, identifying genes that may be essential for H. glycines survival and would serve as an automated pipeline for RNAi studies. They found a total of nearly 8334 conserved genes between H. glycines and C. elegans. Of these, 1508 have lethal phenotypes/phenocopies in C. elegans. RNAi of a conserved ribosomal gene from H. glycines (Hg-rps-23) yielded dead and dying worms that exhibited typical RNA silencing as shown by RT- PCR. Nevertheless, an unrelated gene (Hg-unc-87) did not exhibit RNA silencing in the Hg-rps-23 dsRNA-treated C. elegans, demonstrating the specificity of gene silencing (Alkharouf et al., 2007). Using a modified protocol, based on the technique developed by Urwin and colleagues, Chen et al. (2005) analyzed the function of β-1,4, endoglucanases genes of the potato cyst nematode Globodera rostochiensis. These genes are expressed in the sub-ventral gland cells and are secreted from the nematode during migration through the host root. Knockout of the β-1,4, endoglucanases coding gene reduced the ability of the nematodes to invade RNA interference as a tool for plant biochemical and physiological studies 21 roots. This observation, coupled with the fact that the plants’ own cell-wall- degrading enzymes are responsible for the degradation of the cell walls within the syncytium, suggested that the functional role of the nematode β-1-4 endoglucanases is degradation of plant tissues in order to facilitate nematode invasion and migration (Chen et al. 2005). In addition, they demonstrated that a secreted protein of the amphids (the main sense organs), gr-ams-1, is critical for host location (Chen et al., 2005). Kimber and Fleming (2005) have proposed that the disruption of FMRFamide-like peptide (FLP) neuropeptides in plant parasitic nematodes could represent a form of parasite control. An FLP gene was RNAi silenced in G. pallida (Kimber et al., 2007). These peptides are one of the most diverse neuropeptide families known, and modulate sensory and motor functions. Silencing any of the five characterized G. pallida flp genes (Gp-flp-1, -6, -12, -14, or -18) incurred distinct aberrant behavioral phenotypes consistent with key roles in motor function (Kimber et al., 2007). Furthermore, the dsRNA exposure time (18 h or more) and concentration (0.1 µg/ml or more) were critical to the observed effects, which were reversible (Kimber et al., 2007). In Meloidogyne incognita, RNAi uptake by juveniles (in vitro feeding strategy) was also highly efficient (Bakhetia et al., 2005). Using this system, dual- oxidase genes (peroxidase and NADPH oxidase), from a class of enzyme associated with extracellular matrix cross-linking, were silenced in the root-knot nematode M. incognita. In planta, infection showed that a single 4-h pre-infection treatment with double-stranded RNA derived from the peroxidase region of a dual oxidase gene has effects on gene expression that are phenotypically observable 35 days after exposure to dsRNA. Moreover, a reduction in egg numbers was observed at 35 days of up to 70% (Bakhetia et al., 2005). Rosso et al. (2005) were able to apply RNA interference (RNAi) to knock- down two genes [calreticulin (Mi-crt) and the polygalacturonase (Mi-pg-1)] expressed in the subventral esophageal glands of M. incognita and potentially involved in parasitism. RNA uptake through the alimentary track of the nematodes and the silencing effect was highly time-limited, since no transcript depletion was detectable 68 h after soaking. Although long incubation times showed a deleterious effect on the nematodes, 4-h incubations did not show detrimental effects on nematode infectivity and development (Rosso et al., 2005). RNA interference has been used to investigate the function of a cathepsin L-cysteine proteinase Mi-cpl-1, in M. incognita (Shingles et al., 2007). A reduction in gene transcript was observed and the number of nematodes infecting plants was reduced by almost 60%, as was the number of established females producing eggs at 21 days post-infection (Shingles et al., 2007). Recently, the ability to elicit an RNAi response was also demonstrated by soaking the eggs of M. artellia in dsRNA solution. The target in this case was 22 Francisco José Lima Aragão & Sérgio Araújo Figueiredo a chitin synthase required for chitin production in the eggshells (Fanelli et al., 2005). The results demonstrated that the synthesis of chitin continues to take place in nematode eggs within the egg sac in the parasitic nematode, and that the removal of this activity affects egg development (Fanelli et al., 2005). RNA interference has been used to investigate the function of a cathepsin L-cysteine proteinase Mi-cpl-1, in M. incognita (Shingles et al., 2007). A reduction in gene transcript was observed and the number of nematodes infecting plants was reduced by almost 60%, as was the number of established females producing eggs at 21 days post-infection (Shingles et al., 2007). In order to determine transcript function, the consequences of RNAi treatment disruption of genes expressed in the three pharyngeal gland cells of Heterodera glycines after host invasion were studied (Bakhetia et al., 2007). RNAi-targeting of hg-eng-1 (which transcripts are found in subventral gland cells) reduced the number of females present on the plants at 10 days. Targeting of hg-gp, hg-cm, and hg-pel caused a change in sexual fate, favoring male development on roots. Both effects were evident after targeting hg-syv46. Suppression of hg-eng-1 mRNA levels in second-stage juveniles by RNAi was transient, with a recovery by 15 days of incubation in water after treatment (Bakhetia et al., 2007). Data obtained from in vivo and in vitro studies are now being used to engineer resistance against parasitic nematodes in transgenic plants. Huang et al. (2006) demonstrated that ingestion of 16D10 dsRNA in vitro silenced 16D10 [which encodes conserved root-knot nematodes’ (Meloidogyne species) secretory peptide that stimulates root growth and functions as a ligand for a putative plant transcription factor] in the nematodes and resulted in reduced nematode infectivity. In vivo expression of 16D10 dsRNA in Arabidopsis resulted in resistance effective against the four major root-knot nematodes species (M. incognita, M. javanica, M. arenaria, and M. hapla) as demonstrated by a 69–93% reduction in the number of nematode eggs per gram root in the transgenic plants (Huang et al., 2006). In another study, transgenic soybean plants were generated with an RNAi expression vector containing inverted repeats of a cDNA clone of the major sperm protein (MSP) gene from H. glycines (Steeves et al., 2006). The accumulation of MSP- specific short interfering RNA (siRNA) molecules was detected by northern blot analysis of transgenic soybeans. T0 plants displaying MSP siRNA accumulation were deployed in a bioassay to evaluate the effects of MSP- interfering molecules on H. glycines reproduction. This bioassay showed up to a 68% reduction in eggs per gram of root tissue, demonstrating that MSPi transgenic plants significantly reduced the reproductive potential of H. glycines. Moreover, an evaluation indicated that progeny nematodes were also impaired in their ability to reproduce successfully, as demonstrated by a 75% reduction in eggs per gram of root tissue. In addition, plants presented no RNA interference as a tool for plant biochemical and physiological studies 23 off-target effect (Steeves et al., 2006). Fairbairn et al. (2007) produced transgenic tobacco plants expressing different dsRNA hairpin structures targeting a root-knot nematode (M. javanica) putative transcription factor, MjTis11. The MjTis11 gene was specifically silenced in nematodes feeding on the roots of transgenic plants. Although the down-regulation of MjTis11 gene did not result in a lethal phenotype, this study demonstrates the feasibility of silencing root-knot nematode genes by expressing dsRNA in the host plant. The results of in planta RNAi silencing of parasite nematode genes could lead to the development of transgenic crops with effective broad host resistance to these agriculturally important pathogens.

Fungus-plant interaction studies Because RNA silencing processes are well described in their non- pathogenic fungi, such as Neurospora and Candida, there is also a great interest in applying RNAi to pathogenic fungi. Despite numerous reports on RNA silencing in a variety of microorganisms, only two species among filamentous fungi to date have been proven to have this mechanism: Neurospora crassa, and the human pathogenic fungus Cryptococcus neoformans (Kadotani et al., 2003; Liu et al., 2002). RNA silencing was first reported in the filamentous phytopathogenic fungus Magnaporthe oryzae (formerly Magnaporthe grisea), that causes the rice blast disease. Kadotani et al. (2003) assessed the ability of RNA species to induce RNA silencing in this fungus using the enhanced green fluorescence protein (eGFP) as a model to perform a detailed analysis on silencing molecular mechanisms. In the silenced transformants, the accumulation of eGFP mRNA was drastically reduced, but no methylation of the promoter or coding region was involved in it. In addition, small interfering RNAs (siRNAs) were only found in the silenced transformants, presenting at least three different sizes ranging from 19 to 23 nucleotides, and all of them contained both sense and antisense strands of the eGFP gene (Kadotani et al., 2003). RNAi-based gene silencing was employed to alter the expression of the rgb1 gene (coding for a 55-kDa R2 B regulatory subunit of a serine/threonine phosphatases) in the necrotrophic fungus Sclerotinia sclerotiorum. Isolates in which rgb1 RNA levels were decreased were slow growing, but viable (Erental et al., 2007). Melanin biosynthesis, infection-cushion production, and pathogenesis were significantly impaired in the rgb1 mutants, yet these mutants were pathogenic on wounded leaves (Erental et al., 2007). In order to address the role that isoflavonoid compounds would play in soybean resistance to Phytophthora sojae, two genes for their biosynthesis and a third gene controlling their elicitation was RNAi-mediated silenced in transgenic soybean tissues (Graham et al., 2007). Silencing either the 24 Francisco José Lima Aragão & Sérgio Araújo Figueiredo isoflavone synthase (IFS) gene or chalcone reductase (CHR) gene led to a breakdown of Rps locus-mediated resistance to race 1 of P. sojae in two soybean varieties. Moreover, loss of resistance was accompanied by suppression of hypersensitive cell death and suppression of cell death- associated activation of hydrogen peroxide and peroxidase. The P. sojae cell wall glucan elicitor, a potent elicitor of 5-deoxyisoflavonoids, triggered a cell death response in roots that was also suppressed by silencing either CHR or IFS. Furthermore, silencing of the elicitor-releasing endoglucanase (PR-2) led to a loss of hypersensitive cell deaths (Graham et al., 2007).

Plant-microbe symbiotic associations Microorganisms have evolved along with plants, and we generally consider these associations as if they were only parasitic associations, harming the host plants. However, symbiotic associations are also present, with benefits to both plants and microorganisms. For instance, mycorrhiza (fungi) and symbiotic nitrogen fixation (SNF) done by specific soil bacteria are examples of positive plant-microorganism interactions. These are highly complex and species-specific (even cultivar-specific) processes and understanding the intimate communication and responses between plant and microbes can provide precious knowledge to improve the range of symbiotic associations with significant economic impact. RNAi gene silencing has been used to identify and validate many steps associated with SNF. Root nodule formation is a highly coordinated process involving an intense communication between plant and Rhizobium bacteria. Nodulins (nodule-specific genes) are considered crucial compounds related to the establishment of nitrogen-fixing symbiosis between legume plants and Rhizobium. Gene silencing through RNAi of specific nodulins resulted in transgenic plants exhibiting very poor nodulation in Lotus japonica, either by inhibition of the infection thread (Shimonura et al., 2006) or preventing nodule primordial initiation and subsequent nodule development (Kumagai et al., 2006). However, not only nodulins, but also other proteins are involved in nodule formation. Root-specific PIN proteins in Medicago truncatula are mainly expressed in nodules. Reducing MtPIN family members using RNAi, Hou et al. (2006) observed that these transgenic plants displayed a reduced number of nodules by modifying not only auxin content, but also MtPIN proteins in the nodules.

Final remarks RNA interference (RNAi) has recently been demonstrated in both plants and plant pathogens. It is a powerful investigative tool for the genome-wide identification of gene function, which is improving our understanding of plant RNA interference as a tool for plant biochemical and physiological studies 25 molecular biology, biochemistry, physiology, genetics, nutrition, plant- pathogen and -environment interactions, plant development and morphogenesis. RNAi is also helping to identify genes and, hence, protein targets for pathogen control strategies, especially virus and nematode. Surprisingly, this approach is not being intensively used to study aspects related to pathogenic bacteria-plant interactions. Exploiting the increasing knowledge of RNA silencing and the fact that it can be efficiently provoked by double-stranded RNA (dsRNA) sequences, Waterhouse’s group developed transgenes arranged in an inverted repeat, expressing dsRNA sequences after transcription. This strategy has been demonstrated to be capable of generating post-transcriptional silence to quasi-undetectable levels of mRNA transcripts. Consequently, the range of applications for this strategy has broadened to include transformation-recalcitrant crops, because the use of inverted repeat transgenes has shown that only a few successful transformation events are needed for the generation of transgenic plants presenting the desirable phenotype. Great progress has been achieved in obtaining virus-resistant plants, especially for RNA-viruses. However, RNAi has recently been successfully used to obtain plants resistant to geminiviruses. We have generated highly BGMV-resistant common bean plants using interfering RNA. These transgenic bean lines were introduced into the breeding program to evaluate gene expression in different genetic backgrounds. In addition, transgenic lines are being tested under glasshouse and field conditions, accessing biosafety issues, and have the potential to become the first agricultural product based on RNAi to reach the market.

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