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Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa Stricto Sensu em Ciências Genômicas e Biotecnologia CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA E MOLECULAR DA β-GALACTOSIDASE DURANTE A MATURAÇÃO DE FRUTOS DE COFFEA ARABICA Autor: Sérgio Araujo Figueiredo Orientador: Dr. Francisco José Lima Aragão Brasília - DF 2011 SÉRGIO ARAUJO FIGUEIREDO CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA E MOLECULAR DA -GALACTOSIDASE DURANTE A MATURAÇÃO DE FRUTOS DE COFFEA ARABICA Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação Stricto Sensu em Ciências Genômicas e Biotecnologia da Universidade Católica de Brasília, como requisito parcial para obtenção do Título de Doutor em Ciências Genômicas e Biotecnologia. Orientador: Dr. Francisco José Lima Aragão Brasília 2011 F475b Figueiredo, Sérgio Araujo Caracterização bioquímica e molecular da β-galactosidase durante a maturação de frutos de Coffea arabica. / Sérgio Araujo Figueiredo – 2011. 244 f .: il. ; 30 cm Tese (doutorado) – Universidade Católica de Brasília, 2011. Orientação: Francisco José Lima Ara gão 1. Coffea arabica. 2. Polissacarídeos. 3. Biotecnologia. 4. Enzimas extracelulares. I. Aragão, Francisco José Lima, orient. II.Título. CDU 633.73 Dedico este trabalho àqueles que têm estado ao meu lado ao longo desta jornada, sempre confiando em mim, amparando minhas incontáveis quedas com suas palavras de encorajamento, com seus ombros amigos, com suas orações, com seu amor ... Aos meus pais, Matosinho e Francisquinha; À minha eterna namorada, Cláudia; Aos meus filhos, Isabela e Lucas. AGRADECIMENTO Registrar os nomes de todas as pessoas que me ajudaram ao longo deste tempo em que compartilhamos os mesmos objetivos é uma tarefa difícil de ser feita. Nas parcas vitórias e nas vastas frustrações, na alegria contagiante de um resultado animador e nas lágrimas do desânimo por mais uma decepção. Na esperança do começo de um projeto novo e no desespero por ver esta esperança se esvair quando os experimentos, aparentemente, não dão certo. Nas refeições compartilhadas com alegria sincera e na divisão de um simples chocolate para matar a fome avassaladora de quem tem que tem ainda um longo caminho nas noites do laboratório. Nas conversas em que se aprende não somente o conhecimento técnico, mas se absorve um pouco do ser que nos ampara a ignorância. Um aprendizado constante e infinito, que não termina com a defesa desta tese, ciente de que esta não passa de mais uma pequena peça no grande quebra-cabeça do conhecimento humano. Nomes serão esquecidos, isto é questão de memória; as pessoas com as quais aprendemos jamais o serão porque passaram a viver dentro de nós. Impossível citar todos, impossível não mencionar alguns ... Minha eterna gratidão ao meu mentor, meu orientador e amigo, Francisco (Dr. Francisco José Lima Aragão) que me acolheu em seu laboratório quando o mundo fechava todas as portas para mim, ensinando-me não somente com suas palavras e experiências, mas com seus atos de nobreza moral; À minha companheira de bancada, porto-seguro de todos no laboratório, que conquistou meu mais profundo respeito e amizade pelo ombro amigo, pelo silêncio nos meus dasabafos, pelos conhecimentos compartilhados em cima de uma ata de laboratório e pelos conselhos que nascem de um coração voltado para o bem maior, minha eterna gratidão à Elsa (Elsa Oliveira Paranaguá e Lago Nogueira); Aos colegas, amigos e amigas que estiveram comigo durante estes anos, compartilhando experiências, lágrimas e sorrisos, fosse pelo tempo que fosse. A todos estes cujos nomes vibram em meu ser, minha profunda gratidão por tudo que passamos juntos; Aos professores do Departamento de Botânica da Universidade de Brasília, pelo apoio e incentivo para que eu, mesmo cumprindo minhas obrigações acadêmicas junto à UnB, pudesse concluir esta etapa de minha formação profissional, em especial aos professores da área de Fisiologia Vegetal, prof. Dr. Augusto César Franco, prof. Dr. Fabian Borghetti, profa. Dr. Cristiane da Silva Ferreira e à profa. Dr. Lourdes Isabel Velho do Amaral; À Lourdes (profa. Dra. Lourdes Isabel Velho do Amaral) não somente pelo aprendizado compartilhado na condução da disciplina na UnB, mas especialmente pelo incansável apoio nas incontáveis horas de discussão e de análises no HPLC, guiando-me os passos frágeis de um ser que ainda não sabe andar com os próprios pés nesta área específica que ela domina com propriedade. Nos medos compartilhados, nas decepções e nas alegrias de ver um simples gráfico de uma amostra sendo analisada em pleno final de semana em que ela poderia estar descansando ou recuperando-se de seu frágil estado de saúde. Minha eterna amizade e gratidão ... Aos diversos pesquisadores da EMBRAPA que me ajudaram em vários momentos da tese, em especial ao João Batista (Dr. João Batista Teixeira) que sempre esteve disponível para me ajudar com sua experiência e seu laboratório para a parte de cultura de tecidos do cafeeiro; Aos membros de minha banca de defesa de tese, Vera (Dra. Vera Tavares de Campos Carneiro), Betânia (Dra. Betânia Ferraz Quirino), Lourdes (profa. Dra. Lourdes Isabel Velho do Amaral) e Thales (Dr. Thales Lima Rocha) pela sempre presteza e boa-vontade em me ajudar no que fosse necessário, minha profunda gratidão; À D. Bel (Maria Isabel Martins da Costa) que, no anonimato e simplicidade de seu importante trabalho, sempre me deu o precioso apoio de seu sorriso, de sua experiência de vida e de sua fé inabalável em Deus, deixo registrado minha enorme gratidão; À Universidade Católica de Brasília pela oportunidade de cursar o doutorado num ambiente de respeito e profissionalismo, ampliando minhas percepções acadêmicas com disciplinas ministradas por docentes altamente qualificados; Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo apoio financeiro e pela oportunidade de poder concluir meu doutoramento, minha gratidão; Aos amigos do plano espiritual que, no silêncio do meu íntimo e no anonimato, estiveram ao meu lado não para cumprir aquilo que era de minha obrigação fazer, mas pelo apoio, incentivo e encorajamento para seguir adiante em todas as circunstâncias; Ao Mestre Nazareno, pastor de minh’alma, meu guia, meu modelo, meu irmão-maior e ... A Deus, pela minha vida ... eu agradeço. “Há dois tipos de sabedoria: a inferior e a superior. A sabedoria inferior é dada pelo quanto uma pessoa sabe e a superior é dada pelo quanto ela tem consciência de que não sabe. Tenha a sabedoria superior. Seja um eterno aprendiz na escola da vida.” Chico Xavier RESUMO Referência: FIGUEIREDO, Sérgio Araujo. Título: Caracterização bioquímica e molecular da -galactosidase durante a maturação de frutos de Coffea arabica. 2011. 243 folhas. Tese (Ciências Genômicas e Biotecnologia) - Universidade Católica de Brasília, Brasília (DF), 2011. As -galactosidases são uma classe de glicosil-hidrolases que atuam na parede primária das células vegetais, hidrolisando resíduos -D-galactosis de extremidades não redutoras de -D- galactosídeos presentes em diversas moléculas biológicas. Inicialmente foi feita uma caracterização dos monossacarídeos presentes na parede primária do pericarpo e do endosperma de frutos de Coffea arabica em distintas fases de maturação, identificando os polissacarídeos presentes nesta região celular, juntamente com os prováveis carboidratos-alvo para as -galactosidases. Em paralelo, foi realizada uma caracterização molecular e bioquímica das -galactosidases. Foi realizada uma caracterização parcial da estrutura do seu DNA genômico, juntamente com uma análise do nível de transcrição e da atividade bioquímica in vitro e in situ foram realizadas, identificando picos de expressão nas fases iniciais de crescimento e nos frutos completamente maduros. Por fim, visando avaliar os efeitos das -galactosidases na maturação de frutos de café, calos embriogênicos de C. arabica foram transformados por biobalística, utilizando a técnica do RNA interferente, com a finalidade de obtenção de plantas geneticamente modificadas de cafeeiro para o silenciamento da expressão do gene das -galactosidases. Foram obtidos três calos transgênicos crescendo em meio seletivo com glufosinato de amônio, dentre os quais dois continham o fragmento deste gene. Estes calos encontram-se em fase de formação de embriões somáticos e as plântulas resultantes desta regeneração serão analisadas, a posteriori, para confirmação da presença dos transgenes e avaliação dos efeitos do silenciamento do gene das -galactosidases sobre a maturação de frutos de café. Palavras-chave: Coffea arabica. -galactosidase. Parede celular. Polissacarídeos. RNA interferente. Biobalística. ABSTRACT -galactosidases are a class of glycosyl-hydrolases that act on the plant cell primary walls, hydrolyzing -D-galactose at the nonreducing ends of -D-galactosides present in several biological molecules. Initially a characterization of the monosaccharides present in the primary wall of the pericarp and endosperm of Coffea arabica fruits at different ripening stages was performed, identifying the polysaccharides present in these regions, along with the putative carbohydrate target for the -galactosidase. In parallel, a molecular and a biochemical characterization of -galactosidase was performed. A partial characterization of -galactosidase genomic DNA structure, along with a transcription analysis and an in vitro and in situ biochemical activity were performed, identifying peaks of expression in the early stages of growth and in fully ripe fruit. Finally, in order to evaluate the -galactosidase effects on coffee fruit ripening, C. arabica calli were transformed by biolistic using RNA interference