Kovaalga Fajok Filogenetikai És Morfológiai Diverzitása

Duleba Mónika

Kovaalga fajok filogenetikai és morfológiai diverzitása

 Doktori értekezés 

Témavezető: Dr. Ács Éva, DSc tudományos tanácsadó MTA Ökológiai Kutatóközpont, Duna-kutató Intézet

Környezettudományi Doktori Környezetbiológia Doktori Iskola Program Iskolavezető: Dr. Jánosi Imre, DSc Programvezető: Dr. Ács Éva, DSc

Készült:

Eötvös Loránd Tudományegyetem, Budapest 2017

Tartalom Rövidítések jegyzéke ...... 4 1. Bevezetés ...... 6 2. Célkitűzések ...... 8 3. Irodalmi áttekintés ...... 9 3.1. A molekuláris taxonómiai módszerek szerepe a kovaalgák taxonómiájában ...... 9 3.2. A Thalassiosirales rend evolúciója ...... 15 3.3. Fajfogalmak a kovaalga taxonómiában ...... 22 3.4. A fajok DNS vonalkódja ...... 25 3.5. Molekuláris markerek a kovaalga taxonómiában és filogenetikában ...... 28 3.5.1. A riboszómális RNS ...... 28 3.5.2. A sig1 ...... 34 3.5.3. Mitokondriális markerek ...... 34 3.5.4. Kloroplasztisz markerek ...... 34 3.6. A morfológiai és a genetikai variabilitás összekötése ...... 38 4. Anyag és módszer ...... 41 4.1. Mintavétel ...... 41 4.2. A környezeti változók mérése ...... 42 4.3. Biomassza meghatározás és morfológiai vizsgálat ...... 43 4.4. Morfológiai vizsgálat ...... 43 4.5. A Cyclotella ocellata/Cyclotella comensis komplex morfometriai vizsgálata ...... 44 4.6. Molekuláris vizsgálatok ...... 45 4.6.1. DNS-kivonás ...... 45 4.6.2. Primertervezés és polimeráz láncreakció ...... 47 4.6.3. A szekvenciák elemzése: filogenetika és genetikai távolság ...... 50 4.7. Statisztikai elemzések ...... 53 5. A Skeletonema potamos vizsgálata ...... 55 5.1. Bevezetés ...... 55 5.1.1. A Skeletonema nemzetség és a Skeletonema potamos ...... 55 5.1.2. A Skeletonema potamos elterjedése és előfordulása a hazai vizekben ...... 56 5.2. Eredmények ...... 57 5.2.1. Morfológiai jellemzés ...... 57 5.2.2. A primerek specificitása ...... 58 5.2.3. Filogenetikai elemzés ...... 59 5.2.4. A Skeletonema potamos földrajzi elterjedése ...... 63

5.2.5. A Skeletonema potamos mennyiségének hosszú távú változása a Dunában a környezeti változók alakulásával összefüggésben ...... 63 5.3. Diszkusszió ...... 66 5.3.1. A Skeletonema potamos morfológiája ...... 66 5.3.2. A Skeletonema potamos filogenetikai helyzete ...... 66 5.3.3. A Skeletonema potamos földrajzi elterjedése ...... 67 5.3.4. A Skeletonema potamos és a Duna környezeti változásai közti kapcsolat ...... 67 6. A Cyclotella ocellataval és rokonsági körével kapcsolatos vizsgálatok ...... 71 6.1. Bevezetés ...... 71 6.1.1. A Cyclotella ocellata előfordulása és morfológiai variabilitása, a Cyclotella ocellata/Cyclotella comensis komplex ...... 71 6.2. Eredmények ...... 73 6.2.1. A morfológiai és morfometriai vizsgálat ...... 73 6.2.2. A morfológiai jellemvonások kapcsolata a környezeti változókkal ...... 82 6.2.3. A Cyclotella ocellata komplexhez tartozó minták DNS-einek szekvencia meghatározása 83 6.2.4. Genetikai divergencia ...... 85 6.2.5. Filogenetika ...... 88 6.2.6. A morfometriai és a filogenetikai adatok összevetése ...... 89 6.3. Diszkusszió ...... 90 6.3.1. A Cyclotella ocellata komplex morfológiai és morfometriai vizsgálata ...... 90 6.3.2. A filogenetikai divergencia és a DNS vonalkódok használata ...... 93 6.3.3. A filogenetikai összefüggések a Cyclotella ocellata/Cyclotella comensis komplexben ..... 96 7. A Cyclotella ocellata filogenetikai vizsgálata – a Pantocsekiella nemzetség ...... 98 7.1. Bevezetés ...... 98 7.1.1. A Cyclotella nemzetség ...... 98 7.2. Eredmények ...... 100 7.2.1. Morfológiai vizsgálat...... 100 7.2.2. A vizsgált fajok filogenetikai vizsgálata ...... 101 7.3. Diszkusszió ...... 106 8. Összefoglalás ...... 116 9. Summary ...... 119 10. Köszönetnyilvánítás ...... 122 11. Irodalom ...... 123 12. Függelék ...... I

Rövidítések jegyzéke

Ahol a rövidítés angol kifejezésből származik, ott ezt a kifejezést zárójelben adtuk meg.

18S rDNS – riboszóma kis alegység (18S) KOI – kémiai oxigénigény rRNS gén l – pervalváris tengely hossza 28S rDNS – riboszóma nagy alegység (28S) LSU – nagy alegység (large subunit) rRNS gén MEGA – Molecular Evolution Genetics A – terület Analysis szoftver BIC – Bayes információs kritérium (Bayesian MFP – marginális fultoportula Information Criterion) MFP sat – marginális fultoportulák BLAST – Basic Local Alignment Search Tool szatellitpórusainak száma bp – bázispár Mg2+ – magnéziumion koncentráció BSA – szarvasmarha szérum albumin (bovine NGS – újgenerációs szekvenálás (Next serum albumin) Generation Sequencing) + CFP – valvafelszíni fultoportula NH4 – ammónium ion koncentráció - CFP sat – valvafelszíni fultoportulák NO3 – nitrát ion koncentráció szatellitpórusainak száma NCBI – National Center for Biotechnology chl-a – a-klorofill koncentráció Information 2- CO3 – karbonátion koncentráció nt – nukleotid cob – citokróm b-t kódoló gén NTS – nem átíródó elválasztó szakasz (non- COI illetve cox1 – citokróm oxidáz I gén transcibed spacer) cond. – vezetőképesség (conductivity) OD – szélesebb benyomódások a CP43 – a II. fotorendszer egyik klorofill kötő valvafelszínen (orbiculi depressi) fehérjéje ODP – Óceáni Fúró Program (Ocean Drilling CVA – diszkriminancia analízis, más néven Program) kanonikus változó analízis (canonical PCA – főkomponens-analízis (principal variates analysis) component analysis) d – átmérő PCR – polimeráz láncreakció (polymerase D domének – A 28S rDNS hipervariábilis chain reaction) (divergens) régiói psbA – II. fotorendszer reakciócentrumának dCA – a centrális area átmérője D1 fehérjéjét kódoló gén DIC – differenciál interferencia kontraszt psbC – II. fotorendszer CP43 fehérjéjét divstria – kettéágazó stria kódoló gén DO – oldott oxigén koncentráció (dissolved PSRF – potential scale reduction factor oxygen) rbcL – a ribulóz-1,5-biszfoszfát-karboxiláz- EDTA – etilén-diamin-tetraecetsav oxigenáz, vagyis a RuBisCO nagy ESS – becsült mintaméret (estimated sample alegységét kódoló gén size) rbcL-3P – az rbcL gén 3’ végén lévő 748 bp ETS – külső átíródó elválasztó szakasz hosszú szakasz (external transcribed spacer) rDNS – rRNS gén - HCO3 – hidrogénkarbonát-ion koncentráció RP – rimoportula ITS – belső átíródó elválasztó szakasz RP ang – rimoportulának a valva peremével (internal transcribed spacer) bezárt szöge

4 rpoA – RNS-polimeráz alfa alegységét T – vízhőmérséklet kódoló gén TBE – Tris-borát-EDTA rRNS – riboszómális RNS TEM – transzmissziós elektronmikroszkóp SD – szórás (standard deviation) TP – összes foszfor koncentráció SDS – nátrium-dodecil-szulfát (sodium TSS – összes lebegőanyag koncentráció (total dodecyl sulfate) suspended solids) SEM – pásztázó elektronmikroszkóp tufA – a Tu elongációs faktort kódoló gén (scanning electron microscope) Turb – zavarosság (turbidity) sig1 – ivaros szaporodás során indukálódó UPA – a plasztisz 23S rDNS-ének variábilis gén (sexually induced gene) D5 régióját magába foglaló, rövid (~410 Sig1 – sig1 gén terméke bp) szakasza (universal plastid amplicon) SINA – SILVA Incremental Aligner program WD – vízhozam (water discharge)

SRP – ortofoszfát koncentráció (soluble zátlag – átlagos mélység reactive phosphorus) zmax – maximális mélység SSU – kis alegység (small subunit)

1. Bevezetés

A kovaalgák a fitoplankton és fitobentosz közösségek fontos tagjai, a vízminőség indikátorai, rendszerezésük alapja kovavázuk morfológiája (Round és mtsai. 1990). A fajok elkülönítését azonban megnehezíti, hogy a morfológiai változatosság fenotípusos plaszticitás eredménye is lehet (kovaalgák esetében pl. Kiss és mtsai. 2002) és a kis változatosság is rejthet több fajt (kriptikus fajok, Mann 1999). A doktori munkám során két kovaalga faj részletes morfológiai és genetikai vizsgálatát végeztük el. Ez a két faj a morfológiai variabilitást alig mutató Skeletonema potamos (C.I. Weber) Hasle és a nagy morfológiai változatossággal rendelkező Cyclotella ocellata Pantocsek volt. Mindkét faj az igen diverz kovaalga rendbe, a Thalassiosiralesbe tartozik. A S. potamos filogenetikai és ökológiai szempontból is érdekes faj, mivel egy főleg tengeri taxonokat tartalmazó nemzetség tagja, de a nemzetségbe sorolása csak morfológiai alapon történt, filogenetikai vizsgálattal ezt korábban nem erősítették meg. Jelentőségét növeli, hogy az édesvizekben egyre inkább terjed, hazánkban a Dunában évről évre egyre nagyobb arányt ér el a fitoplankton közösségben. Az eredetileg a Balatonból leírt C. ocellata számos élőhelyen, álló- és folyóvizekben egyaránt előfordul. Morfológiája változatos, ami alapján akár több faj is elkülöníthető lehet (pl. egy szögletes változatot Cyclotella trichonidea A. Economou-Amilli néven írta le Economou-Amilli, 1982). A C. ocellata gyakran fordul elő a Cyclotella comensis Grunow fajjal (= Cyclotella pseudocomensis W. Scheffler, Scheffler és Morabito 2003), mellyel sokszor átmeneti formákat is mutat. A kérdés, hogy hogyan lehet megkülönböztetni, ha egyáltalán meg lehet különböztetni a két fajt. Mikor a fajok azonosítása morfológiai alapon nehézségekbe ütközik, a genetikai vizsgálat segíthet. A fajokra jellemző DNS-szekvenciák lehetnek a fajokat azonosító vonalkódok (Hebert és mtsai. 2003). A C. ocellata a Thalassiosirales rend evolúciója szempontjából is fontos. A Cyclotella nemzetség nem monofiletikus, a C. ocellata és Cyclotella bodanica Eulenstein ex Grunow elkülönül a többi eddig vizsgált Cyclotella (Kützing) Brébisson fajtól (Alverson és mtsai. 2007, Jung és mtsai. 2010). Nakov és mtsai. (2015) morfológiai alapon ezt a két fajt 87 másik taxonnal együtt átsorolta a Lindavia (Schütt) De Toni et Forti nemzetségbe. Azonban a kérdés megmaradt, hogy a Lindavia több nemzetségre osztható-e. A Skeletonema potamos és a Cyclotella ocellata filogenetikai és vonalkód szekvencia vizsgálatra is lehetőséget adott, amelybe az utóbbi fajjal közeli rokon fajokat is bevontunk.

Dolgozatomban az irodalmi áttekintés és a módszerek közös ismertetése után a három vizsgálat eredményeit külön fejezetekben mutatom be.

2. Célkitűzések

Munkám során a következő kérdésekre kerestük a választ a fent említett három téma köré csoportosítva: A Skeletonema potamosra vonatkozó kérdések: 1. Hol helyezkedik el a faj a filogenetikai fán? 2. Előfordulását, mennyiségi eloszlását milyen környezeti tényezők befolyásolják? A Cyclotella ocellata/Cyclotella comensis komplexre vonatkozó kérdések: 1. Milyen morfológiai csoportok különíthetők el a komplexen belül? Ezek előfordulása milyen környezeti változókhoz kapcsolódik? 2. A morfológiai eltérésekhez DNS-szekvencia különbségek is társulnak? A Cyclotella nemzetség filogenetikájára vonatkozó kérdés: 1. A C. ocellata és a C. bodanica egy nemzetségbe (Lindavia) sorolható-e?

3. Irodalmi áttekintés

3.1. A molekuláris taxonómiai módszerek szerepe a kovaalgák taxonómiájában

A kovaalgák fő jellegzetessége a szilícium-dioxid alapanyagú vázuk, melyet frusztulumnak neveznek. Klasszikus rendszertanuk e kovaváz különböző bélyegein alapul (pl. Ettl és mtsai. 1986, Round és mtsai. 1990). Elsőként Medlin és mtsai. (1988) végeztek DNS-alapú filogenetikai vizsgálatot egy kovaalgán [a tengeri Skeletonema costatum (Greville) Cleve fajon]. A riboszóma kis alegység (16S-szerű, azaz 18S) rRNS génjének elsődleges szerkezetét (bázissorrendjét) határozták meg polimeráz láncreakción (PCR, Mullis és Faloona 1987) és dideoxi láncterminációs szekvenáláson (Sanger 1974, Sanger és Coulson 1975) alapuló módszerrel, melyhez eukariótákra általánosan alkalmazható primereket terveztek. Ezt a gént korábban Sogin és Gunderson (1987) alkalmazta eukarióták filogenetikájának vizsgálatára. Medlin és mtsai. (1988) a kapott nukleotidszekvenciát az akkor rendelkezésre álló, más eukarióta szervezetekből származó szekvenciákkal összehasonlítva határozták meg a S. costatum filogenetikai helyzetét. A kovaalga faj a fán egy petespórás gomba (Oomycota) és egy sárgamoszat (Chrysophyceae) fajjal alkotott egy kládot, ami összhangban volt Cavalier- Smith (1986) javaslatával a Chromista regnumról. Ezzel a vizsgálattal nemcsak kovaalgák helyzetét határozták meg más eukariótákhoz képest, hanem a DNS-alapú eljárásokat, és a 18S rDNS, mint molekuláris marker alkalmazását is bevezették a kovaalga taxonómiába, az általuk tervezett primerek pedig napjainkban is használatosak. A nukleáris gének, de főleg 18S rDNS igen gyakran alkalmazott markerek a kovaalgák molekuláris szisztematikai vizsgálatában (Mann és Evans 2007). Ezen kívül még más molekuláris markereket is alkalmaznak a vizsgálat céljától és a marker felbontóképességétől függően. A leggyakrabban használt markerek a sejtmagban kódolt 28S rRNS gén (pl. Lee és mtsai. 2013) és az ITS régió (pl. Moniz és Kaczmarska 2009, 2010), a kloroplasztisz genomban lévő rbcL (ribulóz-1,5- biszfoszfát-karboxiláz-oxigenáz nagy alegységét kódolja, pl. Alverson és mtsai. 2007) és a mitokondriális cox1 (citokróm c oxidáz I alegységét kódolja, pl. Ehara és mtsai. 2000a) gén. Emellett előfordul még a β-tubulin sejtmagban kódolt génje (Sörhannus és mtsai. 2010), a szintén nukleáris sig1 (Sig1 fehérjét kódolja, pl. Sörhannus és mtsai. 2010), a kloroplasztisz 16S rDNS (Medlin és Kaczmarska 2004), psbA (II. fotorendszer reakciócentrumának D1 fehérjéjét kódolja, Lee és mtsai. 2013), psbC (II. fotorendszer CP43 fehérjéjét kódolja, pl. Alverson és mtsai. 2007), tufA (a Tu elongációs faktort kódolja, Medlin és mtsai. 1997) és rpoA (RNS-polimeráz alfa alegységét kódolja, Fox és Sörhannus 2003).

Az, hogy a kovaalgák, mint jól definiált természetes csoportot képviselnek a heterokonták leszármazási ágán, már a molekuláris módszerek bevezetése előtt is ismert volt, a kovaalgák egy csoportjának hímivarsejtjein meglévő ostor sajátosságai, a kloroplasztisz szerkezete és a benne lévő pigmentek valamint a tartalék szénhidrát alapján (Mann és Evans 2007). A molekuláris vizsgálatok egyrészt megerősítették ezt (Bhattacharya és mtsai. 1992), másrészt kiderült, hogy a kovaalgák legközelebbi rokona a Bolidophyceae (Guillou és mtsai. 1999, Keeling 2013, 1. ábra). Emellett találtak néhány endoszimbiontát is, melyek első ránézésre nem tűntek kovaalgának, molekuláris adatok azonban bizonyították, hogy azok (pl. a tengeri Peridinium quinquecorne Abé dinoflagellata endoszimbiontája, Horiguchi és Takano 2006).

1. ábra: A Heterokonta klád filogenetikáját ábrázoló, 16S és 18S rDNS alapján készült fa (Medlin és Kaczmarska 2004). Az egyes osztályokba tartozó fajokat a szerzők az áttekinthetőség kedvéért háromszögekké összenyomva ábrázolták (a számok a háromszögekben az azokat alkotó szekvenciák számát mutatják).

Az első, kovaalgából [nevezetesen az Odontella sinensis Greville (Grunow) fajból] származó plasztisz szekvenciát először Kowalik és mtsai. (1995) közölték. Az első teljes kovaalga genomot (a Thalassiosira pseudonana Hasle et Heimdal fajét) Armbrust és mtsai. (2004) szekvenálták meg.

Bár a kovaalgák monofiletikusságához nem fért kétség, a csoporton belüli leszármazási viszonyok azonban már nem ilyen egyértelműek. Morfológiai alapon két fő típus különböztethető meg, melyeket a 20. század nagy részében rendekként vagy osztályokként kezeltek (Mann és Evans 2007, és a cikkükben említett hivatkozások). Az egyik a Centrales, melynek tagjaira radiális szimmetria jellemző, valváikon a héjfelszín központjából bordák és pórusok rendszere fut ki sugárirányban. A másik típus pedig a Pennales volt, melynek fajai bilaterális szimmetriával rendelkeznek, valváikon a bordák és a pórusok egy hosszanti sáv, a sternum mentén helyezkednek el (Mann és Evans 2007). Ez utóbbi típus még további két csoportra osztható az alapján, hogy a valván található-e egy hosszanti hasíték, a rafe (Round és mtsai. 1990). A Centralesek és a Pennalesek nemcsak vázukban térnek el, ivaros szaporodásuk is más. A Centraleseknél általában oogámia figyelhető meg, míg a Pennaleseknél izogámia vagy anizogámia is előfordulhat (Mann és Evans 2007). Round és mtsai. (1990) három osztályt különítettek el: a Centraleseket magába foglaló Coscinodiscophycae, a rafe nélküli Pennaleseket tartalmazó Fragilariophyceae és a raféval rendelkező Pennaleleseket felölelő Bacillariophyceae. Későbbi kutatások bizonyították, hogy ennek nem volt filogenetikai alapja (Sims és mtsai. 2006). A kovaalgák evolúciójának molekuláris biológiai vizsgálatával Linda Medlin kezdett el foglalkozni, több különböző szerzőtárssal együtt dolgozva, Evolution of the diatoms címmel egész cikksorozatot közöltek az évek során. Az első részben (Medlin és mtsai. 1993) négy Centrales, négy rafe nélküli és három raféval rendelkező Pennales faj helyzetét határozták meg 18S rDNS alapján készített filogenetikai fán más heterokontákhoz, mint külcsoporthoz viszonyítva. Az már ebből is kiderült, hogy sem a Centrales, sem a rafe nélküli Pennales csoport nem monofiletikus. Később (Medlin és mtsai. 1996a) több taxon bevonásával két kládot különítettek el. Az egyik a Centralesek közül csak a radiális Centraleseket tartalmazta, a másik pedig a bi- vagy multipoláris Centraleseket, a Thalassiosirales rendet (amelyet akkor még szintén a radiális Centralesek közé soroltak) és a Pennaleseket. Vagyis a Centrales rend parafiletikusnak bizonyult. Még ugyanebben az évben született publikációjukban (Medlin és mtsai. 1996b) megerősítették korábbi felfedezésüket, hogy a radiális szimmetriájú Thalassiosirales rend a Pennalesek testvércsoportja, valamint ez a két csoport együtt a bi- és multipoláris Centralesek testvércsoportja. DNS alapú eredményeiket fosszilis adatokkal is összevetették, amiből a Thalassiosirales (Medlin és mtsai. 1996b) mellett a Pennalesek és összességében a kovaalgák eredetére következtethettek (Kooistra és Medlin 1996). Megállapították, hogy a kovaalgák 18S rRNS-t kódoló régiója földtörténeti időben igen gyorsan változik (Kooistra és Medlin 1996).

Az áttörést Medlin és Kaczmarska (2004) tanulmánya jelentette, melyben a kovaalgák rendszertanának revízióját javasolták. A 18S rDNS és kloroplasztisz 16S rDNS szekvenciák alapján készült törzsfák két fő kládot mutattak, melyek egyikén belül két kisebb kládot különítettek el. A molekuláris eredményeket citológiai (Golgi-testek elhelyezkedése, az auxospóra fejlődése és sejtfala, a pirenoid szerkezete, a spermatozoid ultrastruktúrája) valamint morfológiai (elsősorban fosszilis taxonokon végzett megfigyelések szerint) bélyegek is alátámasztották. Ezért a szerzők két szubdivízió (Coscinodiscophytina és Bacillariophytina), ezeken belül pedig három osztály (Coscinodiscophyceae, Mediophyceae és Bacillariophyceae) elkülönítését javasolták (1., 2. ábra). A Coscinodiscophyceae a radiális Centraleseket, a Mediophyceae a bi- és multipoláris Centraleseket és a Thalassiosirales rendet, a Bacillariophyceae pedig a Pennaleseket foglalja magában. Az előzőektől eltérően az Evolution of the diatoms sorozat hatodik része (Medlin és mtsai. 2008) a raféval nem rendelkező Pennalesek két sokat vitatott nemzetségét, a Fragilaria Lyngbye és a Synedra Ehrenberg nemzetséget valamint ezek kapcsolatát vizsgálta molekuláris eszközök segítségével. A kovaalgák Medlin és Kaczmarska (2004) által közölt filogenetikájával nem minden kutató értett egyet. Theriot és mtsai. (2009, 2010) csak a 18S rDNS illetve a 18S rDNS és két kloroplasztisz gén (rbcL, psbC) alapján készített törzsfája nem mutatta a három monofiletikus kládot. Ehelyett a Centrales fajok egy sor kládot alkottak, és csak a Bacillariophyceae volt monofiletikus. Bár Ashworth és mtsai. (2012) három gén alapján már a Mediophyceae osztályt is monofiletikusnak írták le, de az egységes Coscinodiscophyceae helyett továbbra is kládok sorozatát kapták. Felmerült a kérdés, hogy a Medlin és Kaczmarska (2004) által meghatározott osztályok elfogadhatóak-e (Medlin 2016a). Medlin (2014, 2016a) szerint az eltérés abból adódik, hogy Theriot és munkatársai (2000, 2010) csak Bolidophyta vagy más Heterokonta fajokat használtak külcsoportként, nem pedig távolabbi rokon csoportokat. A filogenetikai vizsgálatok megmutatták, hogy a Centrales és Pennales, mint rendszertani kategóriák nem megtarthatók. Azonban leíró jelleggel használhatjuk ezeket az elnevezéseket abban az esetben, amikor meghatározott morfológiával és ivaros szaporodási móddal jellemezhető kovaalgákra utalunk (Medlin 2009).

2. ábra: A kovaalgák Bayes-módszerrel készült filogenetikai fája (Medlin és Kaczmarska 2004). Az egyes rendekbe tartozó fajokat a szerzők az áttekinthetőség kedvéért háromszögekké összenyomva ábrázolták.

Medlin (2016a, 2016b) által összegyűjtött információk szerint a kovaalgák evolúciójának főbb lépései a következő forgatókönyv szerint történhettek. A kovaalgák ősei, nem kovásodó egysejtűek („Ur-diatoms”) tengerparti vizekben élhettek. Ahogy az eusztatikus tengerek dagály után visszahúzódtak, ezek az élőlények kis tavacskákban visszamaradhattak. A tavacskák kezdtek kiszáradni, és azoknak a kezdeti kovaalgáknak, melyek túlélték a kiszáradást, alkalmazkodni kellett a félig szárazföldi körülményekhez. Valószínűleg ekkor fejlesztették azt a képességüket, hogy kovasavat metabolizálva kovafalat alakítsanak ki, amely védi őket a kiszáradástól, és azt a képességüket, hogy sejtjeik átmeneti kitartó állapotba kerüljenek, amíg a területet újra el nem önti a tenger. A tengerszint emelkedésével ezek a korai kovaalgák újra kolonizálhatták a tengerparti vizeket, azonban a planktonikus életmódhoz frissen szerzett kovavázuk miatt túl nehezek voltak, ezért a bentikus életmódra térhettek át. A legtöbben láncképzők lehettek, ami megakadályozta, hogy a turbulens közegben a sejtek elsodródjanak egymástól. A filogenetikai fán a radiális Centralesek első leágazását képviselő Ellerbeckia R.M. Crawford nemzetség tagjai állhatnak közel ahhoz az állapothoz, amilyenek ezek a korai kovaalgák lehettek. Az Ellerbeckia nemzetségbe tartozó kovaalgák lehetnek ennek az ősi nedves-szárazföldi közösségnek a túlélői. Az auxospóra egy specializált zigóta, amely addig nő, amíg vissza nem nyeri a sejt eredeti méretét. Az auxospóra fejlődése egyúttal morfológiai bizonyítékot szolgáltat a kovaalgák filogenetikájának Medlin és Kaczmarska (2004) által bemutatott változatára. Az auxospóra mellett az ivaros szaporodás módja is tükrözi a kovaalgák evolúcióját. A Coscinodiscophyceae osztály tagjainak auxospóráit kovapikkelyek fedik, melyek védelmet nyújtanak a sejtnek, ugyanakkor lehetővé teszik a sejt növekedését bármely irányba, ezáltal radiális sejteket eredményeznek. Később az auxospórához a pikkelyeken kívül gyűrűszerű szalagok (properizoniális szalagok, együttesen alkotják a properizoniumot) is adódtak, amelyek egymással átfedve nyereg formát képeztek, és amelyek korlátozták az auxospóra növekedését, de annak egy oldalát szabadon hagyták. Így bi- vagy multipoláris sejtek jöttek létre, amelyek a Mediophyceae osztályra jellemzőek. A Mediophyceae osztályban a Thalassiosirales rend tagjai kivételt képeznek, mert radiális szimmetriájú vázuk a Coscinophyceae osztály tagjaiéhoz hasonlít. Úgy tűnik az auxospórájuk másodlagosan elvesztette a properizoniális szalag képzésének képességét (a Thalassiosirales a Mediophyceae késői leágazását képezi). A Coscinodiscophyceae és a Mediophyceae osztály tagjaira az oogámia jellemző, melynek során az igazi, ostorral rendelkező hímivarsejtek kiszabadulnak a gametangiumból, a petesejtek is kiszabadulhatnak vagy a gametangiumban maradhatnak. A Bacillariophyceae-n belül a rafe nélküli kovaalgák két külön kládot alkotnak

(ezeket alosztály szintre emelte Medlin 2016a). Az alapi helyzetű csoport („basal araphids”, Urneidophycidae alosztály) properizoniális szalagok mellett még újabb szalagokat képzett az auxospórán (perizoniális szalagok: egy keresztirányú sorozat alatt hosszanti szalagok húzódnak). A rafe nélküli Pennalesek másik csoportja („core araphids”, Fragilariophycideae) már csak a perizoniális szalagok képzésének képességét tartotta meg, és ez jellemző a raféval rendelkező kovaalgákra is (Bacillariophycideae alosztály). A két rafe nélküli csoportra anizogámia jellemző, és egy speciális amöboid mozgású hímivarsejt (spermatium), amely egy mikrotubulus függelék segítségével magához tudja húzni a petesejtet. Az izogámia a Bacillariophycideae alosztály tagjainál jelent meg. A Bacillariophyceae-n belül is megtörtént a szalagképzés képességének elvesztése, és a radiális szimmetriájú váz visszanyerése például az Astrosyne Ashworth et Lobban nemzetségnél. A filogenetikai fa alapján valószínűsíthető, hogy a kovaalgák majdnem minden csoportja gyors adaptív radiáción ment keresztül, számos faj alakult ki evolúciós értelemben véve rövid időn belül (Kooistra és mtsai. 2007).

3.2. A Thalassiosirales rend evolúciója

A Thalassiosirales rend a planktonikus kovaalgák sikeres és diverz csoportja (Medlin és mtsai. 1996b), az egyik domináns kovaalga leszármazási vonal (Alverson és mtsai. 2007). A rend sok képviselője a plankton közösségek domináns tagja, és számos vízben elterjedt, tenger- és édesvízben egyaránt. Bár a váz sugaras szimmetriájú, mégis a bi- és multipoláris Centraleseket magába foglaló Mediophyceae osztályba tartozik, a Bacillariophytina szubdivízión belül, nem pedig a többi radiális szimmetriájú Coscinodiscophytina szubdivízóba (Medlin és Kaczmaraska 2004). Ennek a látszólagos ellentmondásnak a magyarázata, hogy Thalassiosirales leszármazási ágon másodlagosan elveszett a properizoniális szalagok képzésének képessége. Az auxospóra fejlődése során properizoniális szalagok nem alakulnak ki, így azok nem korlátozzák a növekedését, amely így minden irányban történhet, és így alakulhat ki a sugaras szimmetriájú váz (Medlin 2016a, b). Az első Thalassiosira Cleve faj a felső eocénben jelent meg (Medlin és mtsai. 1996b). A Thalassiosirales rend átlagos kora a 18S rDNS nukleotid szubsztitúciós ráták alapján 79 és 108 millió év között van (Medlin és mtsai. 1996b). Legkorábban 215 millió évvel ezelőttről eredeztethető, azonban ezt jó állapotú, felismerhető fosszíliák hiányában nehéz alátámasztani (Medlin és mtsai. 1996b). A csoport őse lehet például a Thalassiosiropsis G.R. Hasle (Medlin és mtsai. 1996b), amelyet a felső kréta rétegekben találtak (Hasle és Syvertsen 1985), vagy

Praethalassiosiropsis R. Gersonde et D.M. Harwood (Medlin és mtsai. 1996b), amely az alsó krétában fordult elő először (115-100 millió év, Gersonde és Harwood 1990). A rendet két morfológiai tulajdonság határozza meg: egyrészt az areolát fedő kovalemeznek, a velumnak sejtfalon belüli elhelyezkedése, másrészt pedig a támnyúlvány (fultoportula) megléte (Medlin és mtsai. 1996b). Ez utóbbi egy, a héjat áttörő csövecske, amelyen keresztül β-kitin fibrillumok nyúlnak ki, a láncképzés és a lebegés elősegítése és a kovaalgákat fogyasztó szervezetek elijesztése céljából (Round és mtsai. 1990, Medlin és mtsai. 1996b). Medlin és mtsai. (1996b) 18S rDNS alapú törzsfán kapott kládokat (Medlin és mtsai. 1996a) párhuzamba állították egy alsó kréta réteg [Óceáni Fúró Program (Ocean Drilling Program, ODP) 113-as szakasz, 693-as hely, Antarktisz, Gersonde és Harwood 1990] jól megőrződött kovaalga maradványaival, melyek négy csoportra oszthatóak. Az említett fosszilis kovaalgák egyikén sem található rimoportula (ajaknyúlvány) vagy fultoportula a jelenleg ismert változatában, azonban más nyúlványok igen. A 2-es fosszília csoportra egy központi csőszerű struktúra és a vázakat összekötő mechanizmusok redukciója jellemző, és ez lehetett a 18S rDNS fán lévő klád 2 ősi állománya (Medlin és mtsai. 1996b). A fosszilis maradványok alapján levezethető egy fejlődési sor az alsó kréta kovaalgák (pl. Archaegladiopsis V.A. Nikolaev et D.M. Harwood) valváján lévő betűrődésétől kezdve a Gladiopsis R. Gersonde et D.M. Harwood) és Thalassiosiropsis nemzetségre jellemző nyúlványokig. A fultoportula viszonylag hirtelen a miocénben jelent meg (Kaczmarska és mtsai. 2005). A felső krétában előforduló Thalassiosiropsis és az eocénben megjelent, első Thalassiosira között időbeli rés van. A szerzők szerint azonban a Thalassiosirales első képviselője inkább Ditylum J.W Bailey ex L.W. Bailey vagy Rhynchopyxis R. Gersonde et D.M. Harwood fajaihoz hasonló lehetett, és ezt megerősítik a 18S rDNS-alapú filogenetikai vizsgálatuk. A szatellit pórusok később adódhattak hozzá a centrális csőhöz vagy a támnyúlványhoz (Medlin és mtsai. 1996b).

tengeri édesvízi kérdéses

0,05 szubsztitúció/pozíció

3. ábra: A Thalassiosirales rend Bayes-módszerrel, négy gén (18S és 28S rDNS, rbcL, psbC) készült filogenetikai fája (Alverson és mtsai. 2007 nyomán). Az elágazásoknál a posterior valószínűségek találhatóak, a 0,95-nél nagyobb értékeket csillag jelzi. A számmal jelölt taxonok SEM képe látható a bal oldalon, a kis képek e taxonok fultoportuláját mutatják. A nemzetségnevek rövidítései: Be = Bellerochea Van Heurck, H = Helicotheca M. Ricard, Li = Lithodesmium Ehrenberg, Dt = Ditylum J.W. Bailey ex L.W. Bailey, Po = Porosira Jørgensen, L = Lauderia Cleve, R = Roundia I. V. Makarova, T = Thalassiosira Cleve, Cy = Cyclotella (Kützing) Brébisson, Sk = Skeletonema Greville, Sh = Shionodiscus A.J. Alverson, S.H. Kang et E.C. Theriot, B = Bacterosira Gran, De = Detonula F. Schütt es De Toni, M = Minidiscus Hasle, Di = Discostella Houk et Klee, Cs = Cyclostephanos Round, S = Stephanodiscus Ehrenberg.

4. ábra: A Thalassiosirales rend evolúciójának kronogramja két elemzés eredményeként (Alverson 2014, módosítva). A narancssárga vonalak az édesvízi, a fekete vonalak a tengeri taxonokat jelzik. A fekete teli körök a fosszilis adatok alapján kalibrált pontokat jelöli, az üres körök pedig a többi viszonyítási pontot. A 3. analízisben a Discostella és a Puncticulata nem volt kalibrálva, a 7. analízisben a két nemzetség minimum korának 40 millió évet állított be a szerző. A nemzetségnevek rövidítései a következők: Po = Porosira, L = Lauderia, R = Roundia, T = Thalassiosira, C = Cyclotella, Sk = Skeletonema, Sh = Shionodiscus, B = Bacterosira, De = Detonula, M = Minidiscus, Di = Discostella, Pu = Puncticulata Håkansson, Cs = Cyclostephanos, St = Stephanodiscus.

A Thalassiosirales testvércsoportja a Lithodesmidiales (ezt mutatta a 18S rDNS vizsgálata, Kaczmarska és mtsai. 2005, a cox1 vizsgálata, Ehara és mtsai. 2000a, valamint plasztisz gének vizsgálata, Medlin és Kaczmarska 2004). Az eredeti Lithodesmidiales rendet azonban Kaczmarska és mtsai. (2005) parafiletikusnak találták, és egy taxonómiai revíziót közöltek róla. Eszerint a rend megkülönböztető bélyege, amely csak itt fordul elő, egy kétlebenyes nyúlvány. Kaczmarska és mtsai. (2005) 18S rDNS szekvenciák felhasználásval végeztek filogenetikai vizsgálatot és ezzel párhuzamosan a fultoportula evolúcióját is megvizsgálták. Feltételezték, hogy a fultoportula vagy az areolát belülről borító, nagyon vékony, lyuggatott kovalemez, a kribrum vagy a mai Lithodesmidiales fajokon található marginális élekhez hasonló struktúrák módosulásából származik, vagy a centrális és a marginális fultoportulák eredete különbözik. Kaczmarska és mtsai. (2005) adatai megerősítették, hogy a fultoportulával rendelkező kovaalgák természetes filogenetikai csoportot alkotnak. A Thalassiosiraceae, a Skeletonemaceae és Stephanodiscaceae családot, valamint a Thalassiosira nemzetséget azonban parafiletikusnak találták (ezt később Alverson és mtsai. 2007 még három további gén alapján is megerősítették, de a Stephanodiscaceae-t polifiletikusnak találták). Lee és mtsai. (2013) három gén (18S, 28S rDNS, rbcL) alapján kimutattak egy monofiletikus csoportot a Thalassiosira nemzetségen belül, de ez nem tartalmazta az összes vizsgált Thalassiosira fajt, a Thalassiosira weissflogii (Grunow) G. Fryxell et Hasle, T. pseudonana és Thalassiosira oceanica Hasle elkülönült. Lee és mtsai. (2013) szerint még több Thalassiosira faj bevonásával tisztázódhat a nemzetség mono-, para- vagy polifiletikusságának kérdése. A három „kilógó” faj egyike, a T. pseudonana a Cyclotella ághoz állt közel. Alverson és mtsai. (2011) visszaadták ennek a kovaalgának az eredeti Cyclotella nana Hustedt nevet. Stachura- Suchoples és Williams (2009) azokat az eredetileg Thalassiosira fajokat, amelyek folytonos kribrummal rendelkező rekeszes (loculate) areolákkal és nem redőzött valvafelszínnel rendelkeztek, Conticribra Stachura-Suchoples et D.M. Williams néven önálló nemzetségként írták le. Korábban, Johansen és mtsai. (2008) leírták a Spicaticribra J. Johansen, P. Kociolek et R. Lowe nemzetséget, amelynek morfológiai bélyegei hasonlóak, mint a Conticribra nemzetségé. Így a Conticribra a Spicaticribra szinonímája, és a hasonló belső kribrum szerkezettel rendelkező Thalassiosira fajok tartoznak ide (Khursevich és Kociolek 2012). A kribrum egy gyakran kupolaszerűen kiboltosuló hártya vékonyságú kovalemez, amely az areolákat a héjfelszín belsején borítja (Ács és Kiss 2004). Kaczmarska és mtsai. (2005) a Thalassiosirales rend filogenetikai viszonyait vizsgálták, elsősorban az ezt a leszármazási vonalat meghatározó morfológiai bélyeg, a fultoportula

19 lehetséges eredetét. Ebbe a kutatásba több Thalassiosira és Skeletonema Greville fajt is bevontak, a Stephanodiscus Ehrenberg nemzetségből kettőt, ezzel szemben a többi nemzetségből azonban csak egy-egy fajt (bár azt maguk a szerzők is írták, hogy egy mélyebb analízis lenne szükséges, több faj és variabilisabb génrégiók bevonásával). Elemzésükből az kiderült, hogy a Cyclotella meneghiniana Kützing illetve a Stephanodiscus hantzschii Grunow / Stephanodiscus parvus Stoermer et Håkansson és Stephanodiscus niagarae Ehrenberg közelebbi rokonai egyes Thalassiosira fajoknak, mint egymásnak, de azt csak Alverson és mtsai. (2007) mutatták ki, hogy a Cyclotella nemzetség nem monofiletikus, és az egyik ág (C. ocellata és C. bodanica) a Stephanodiscus nemzetséghez áll közel. Ezt Lee és mtsai. (2013) is megerősítették. Az eredeti Cyclotella nemzetségből Houk és Klee (2004) leválasztották azokat a fajokat, amelyek marginális fultoportulái és rimoportulája(i) bordák között helyezkednek el, de a rimoportula(k) külső nyílása közelebb van a valva széléhez, mint a marginális fultoportulához (ezek az ún. „stelligeroid” taxonok) , és létrehozták a Discostella V. Houk et R. Klee nemzetséget, amelynek típusfaja a Discostella stelligera (Cleve et Grunow) Houk et Klee lett. Ezt később molekuláris (18S és 28S rDNS) alapon Jung és mtsai. (2010) is megerősítettek. Jung és mtsai. (2010) is kimutatták, hogy a C. ocellata és C. bodanica elkülönül a többi Cyclotellatól, és a Discostellahoz áll közel (ebben a vizsgálatban más nemzetségek, például Stephanodiscus nem szerepeltek). Nakov és mtsai. (2015) a C. ocellatat és C. bodanicát több más fajjal együtt a Lindavia nemzetségbe helyezte a rimoportula helyzete alapján. A rimoportula és a marginális fultoportulák helyzete fontos bélyeg a thalassiosiroid nemzetségek meghatározásában, megkülönbözteti például a Stephanodiscust Cyclostephanos Round nemzetségtől (Tuji és mtsai. 2014). A Stephanodiscus esetében a rimoportula a tüskék szintjében van, a marginális fultoportulák pedig közel vannak a valva szegélyéhez, a rimoportula szintje alatt. Tuji és mtsai. (2014) azonban az areola mintázata, valamint a marginális fultoportulák bordákhoz viszonyított helyzete alapján elkülönítettek a Stephanosdiscustól Praestephanos A. Tuji et M. Julius néven egy új nemzetséget, amit 18S és 28S rDNS, rbcL és psbC alapján végzett vizsgálataik is alátámasztottak. Alverson és mtsai. (2007) már négy gén (18S és 28S rDNS, rbcL és psbC) alapján rekonstruálták a Thalassiosirales renden belüli filogenetikai viszonyokat, mindezt a tenger- édesvíz határ átlépésével összefüggésben, mivel a sikeres határátlépések ritka és meghatározó események a kovaalgák evolúciójában, amelyek hatására számos faj alakulhatott ki rövid időn belül (3. ábra). Eredményeik azt mutatták, hogy ezek a kovaalgák legalább három független alkalommal kolonizálták az édesvizet: 1., Thalassiosira gessneri Hustedt egy feltehetően

20 tengeri, brakkvízi és édesvízi Thalassiosira fajokat tartalmazó klád egyetlen képviselője ezen a törzsfán, 2., a Cyclotella vonalon több faj (pl. Cyclotella distinguenda Hustedt), 3., a Discostella-C. ocellata, C. bodanica-Cyclostephanos-Stephanodiscus ág, ami kizárólag édesvízi. Az utóbbi két vonal képezte a Stephanodiscaceae családot, amely polifiletikusnak bizonyult ebben a vizsgálatban. A Thalassiosirales kovaalgák több alkalommal újrakolonizálták a tengert, kétszer a Cyclotella nemzetségen belül, és mindkettő fajképződéshez vezetett. Így ez a vonal egyike azoknak a ritka nemzetségeknek, amelyek valóban euryhalinok, vagyis a sókoncentráció széles tartományában képesek megélni (Mann 1999). Az elemzésbe nem vont fajokat figyelembe véve az „átszivárgások” (kisléptékű átlépések) száma a tengeri és az édesvízi élőhely között jóval nagyobb lehet, mint amennyit az elemzés feltárt. A korábbi vizsgálat folytatásaként Alverson (2014) fosszilis adatokat használva kalibrációs pontokként becsülte a Thalassiosirales renden belüli elválások idejét, ezzel együtt a tenger- édesvíz átmenetek idejét (4. ábra). Az édesvízi Thalassiosirales fosszíliák sora viszonylag teljes egészen a miocénig visszamenően, viszont a csoport tengeri ősmaradványainak gyűjteménye elég hiányos (Alverson 2014). Az édesvízi Cyclotella és a cyclostephanoid ág eredetét hagyományosan a miocénig vezetik vissza (pl. Fourtanier és mtsai. 1993), azonban Wolfe és Siver (2009) a középső eocén rétegben (Giraffe Kimberlite Pipe, Kanada) Cyclotella, Discostella és Puncticulata H. Håkansson maradványokat talált, amivel egy 30 millió éves rés keletkezett az adatokban (Alverson 2014). Alverson (2014) több elemzést is végzett, és ezekben mindkét lehetséges időpontot tesztelte kalibrációs pontként. A vizsgálatot tovább bonyolította, hogy a fultoportula és így Thalassiosirales eredete a fosszíliák, illetve az azokat feldolgozó publikációk alapján nem egyértelmű (Alverson 2014). A szerző a minimum kor becslésére a Thalassiosiropsist használta (75 millió év), feltételezve, hogy az a testvércsoportja a Thalassiosiralesnak vagy azzal együtt parafiletikus csoportot alkot, és hogy ennek nyúlványa homológ a fultoportulával. Maximumként pedig a Sörhannus (2007) és a Medlin és mtsai. (1996b) által közölt adatok alapján 110 millió évet használt. A szerző által preferált analízis szerint az édesvíz két fő kolonizációja egymás után történt: a Cyclotella ág már kialakult, de alig diverzifikálódott, mikor a cyclostephanoid ág kezdett kialakulni. E két ág ma élő faj diverzitásának nagy része a középső miocénig (kb. 10-15 millió év) nyúlik vissza. A Thalassiosirales időskála becslést nagyban befolyásolta az, hogy a Discostella esetében a szerző eocén vagy miocén eredetet használt-e. Azonban eredményei nem erősítették meg az eocén eredetet. A modern típusú cyclostephanoid kovaalgák a messini korban jelentek meg és máig élnek (Tuji és mtsai. 2014). 21

3.3. Fajfogalmak a kovaalga taxonómiában

A taxonómiai vizsgálatokban a fajokat szeretnénk meghatározni és egymástól elkülöníteni, ehhez azonban először is tisztázni kell azt, hogy mi a faj. A fajnak több, különböző szempontokon alapuló meghatározása lehet, ezekről a fajfogalmakról és a kovaalga taxonómiára gyakorolt hatásukról Beszteri (2005) és Alverson (2008) publikációk adnak áttekintést. Hagyományosan a kovaalga fajok meghatározásának és osztályozásának alapját a kovaváz morfológiai jellemzői képezik, egy fajnevet a többé-kevésbé diszkrét, morfológiailag hasonló fenotípusok kapnak. A morfológiai fajfogalom azon az elképzelésen alapul, hogy a természetben megfigyelt morfológiai változatosság nem folytonos, így a fajok morfológiailag különálló élőlények csoportjai (Alverson 2008). Mann és Vanormelingen (2013) legalább 30000-re becsülte a ma élő kovaalga fajok számát, az AlgaeBase (2017. szeptember 17-ig, Guiry és Guiry 2017) 14311 fajt tartott számon. A biológiai fajfogalom (Mayr 2000) értelmében a reproduktív izoláció jelzi a fajképződést. Alapja az az elmélet, mely szerint az ivaros szaporodás a genetikai információ megosztásának útja, és reproduktív barrierek szükségesek a kialakuló fajok közti genetikai homogenizáció megakadályozásához (Beszteri 2005). Amato és mtsai. (2007) hangsúlyozzák, hogy bár a molekuláris módszerekkel végzett vizsgálatok egyes esetekben genetikailag elkülönülő csoportokat találnak morfológiai alapon meghatározott fajokon (morfofajokon) belül, azonban ezekhez a genetikai különbségekhez nem kötnek biológiai jelentést. A morfológiai és genetikai adatok közti szakadék, párosítási kísérletekkel hidalható át. A biológiai fajfogalom nem határozza meg, hogy a populációk közti reproduktív izolációnak milyen erősnek kell lennie ahhoz, hogy különálló fajoknak tekintsük őket (Leilaert és mtsai. 2014). Az ivarosan szaporodó fajok közötti reproduktív barrierek nem mindig teljesek, hibridek is kialakulhatnak (pl. Casteleyn és mtsai. 2009). A biológiai fajfogalommal szemben az egyik legfőbb kritika az, hogy csak olyan fajok esetében alkalmazható, melyek a természetben együtt élnek, és megvan a tényleges lehetőségük arra, hogy egymással párosodjanak (Alverson 2008). Eszerint az in vitro párosítási kísérletek közül azok értékesek, amelyeket szimpatrikus (földrajzilag nem elkülönült) populációk között hajtanak végre (ilyen pl. Amato és mtsai. 2007). Az allopatrikus populációk közt végzett kísérletek kevesebbet érnek, ugyanakkor az is igaz, hogy nincs egyetértés abban, hogy vannak-e igazán allopatrikus kovaalga fajok (Alverson 2008). Továbbá a laboratóriumi keresztezési kísérletek csak a belső reproduktív barriereket veszik

22 figyelembe, a külsőket, például az ivaros szaporodás idejét vagy ökológiai preferenciákat nem (Leilaert és mtsai. 2014). Ráadásul a biológiai fajfogalom nehezen alkalmazható olyan algákra, melyek esetében az ivaros szaporodás laboratóriumi körülmények között csak nehezen indukálható (Leilaert és mtsai. 2014). Egy másik kritikus kérdést az ősmaradványok jelentik. A kovaváz ellenálló, ezért fosszíliaként megőrződhet, a fosszíliák által hordozott információ pedig evolúciós hipotézisek vizsgálatába beépíthető (Sims és mtsai. 2006). Azonban párosítási kísérletek fosszilis kovaalgákon nem végezhetők, így ezekre a fajokra, melyek a kovaalgák teljes fajdiverzitásának nagy részét képviselik, a biológiai fajfogalom nem vonatkoztatható. Mindezek ellenére a párosítási kísérletek értékes információval szolgálhatnak a fajok közti határok megállapításánál, de nem mondhatnak ellent a fajképződést jelző morfológiai, molekuláris vagy más bizonyítékoknak, és nem lehetnek szükségesek ahhoz, hogy jól megalapozott, karakter alapú fajhatárokat találjunk (Alverson 2008). Ha a fajt egy evolúciós leszármazási vonalnak tekintjük (a közvetlen ős-leszármazott kapcsolatok egy vonala vagy egy ág a filogenetikai fán, de Queiroz 2007), akkor a fajfogalom maga elkülöníthető azoktól az adatoktól, amelyek alapján a fajt azonosíthatjuk (Alverson 2008). A szisztematikus maga dönti el, hogy mennyi információt tart elegendőnek ahhoz, hogy úgy ítélje meg, hogy a két leszármazási vonal már eljutott ahhoz a ponthoz, hogy külön fajoknak tekinthetők, és így a fajfogalomtól függetlenül a fajok elhatárolása mindig szubjektivitással terhelt (Alverson 2008). Több, egybehangzó bizonyíték a leszármazási vonalak biztosabb szétválasztásához és robusztusabb fajhatárok meghúzásához vezet, az egybehangzáshoz viszont a karakterek értelmezésének filogenetikai megközelítése kell (Alverson 2008). A leszármazási vonal alapú fajfogalom a gyakorlatban inkább csak a különböző típusú bizonyítékok értelmezését érinti, és kisebb hatással van a fajszintű szisztematikai vizsgálatokra (Alverson 2008). A biológiai fajfogalom erős riválisa a filogenetikai fajfogalom (Leilaert és mtsai. 2014), amely szerint a fajok a természetes szelekció és leszármazás egységei, amelyek az összehasonlítható egyedekben megfigyelhető karakterállapotok egyedi kombinációja alapján (diagnosztizálhatóság) és/vagy reciprok monofiletikusság alapján azonosíthatóak (Leilaert és mtsai. 2014). A karakterállapot örökölt jellemző, amely az ugyanahhoz a történeti populációhoz, kládhoz vagy végső leszármazási ághoz tartozó összehasonlítható egyedekben megvan. A fogalom célja, hogy megtaláljuk azokat a legkisebb egységeket, melyek kladisztikai módszerekkel elemezhetőek és filogenetikai történet eredményeiként értelmezhetőek (Nixon és Wheeler 1990). Ez azonban nem határozza meg pontosabban, hogy

23 milyen típusú bélyegeket lehet használni az azonosításhoz (Beszteri 2005). Filogenetikai elemzés morfológiai (kvantitatív és kvalitatív bélyegeket egyaránt bevonva) és molekuláris adatok alapján is végezhető (Alverson 2008), így mindkétféle bélyeg szolgálhat a diagnosztizálhatóság és a reciprtok monofiletikusság alapjául (Leilaert és mtsai. 2014). A kohéziós fajfogalom a fajokat evolúciós leszármazási vonalakként határozza meg, amelyek kohéziós mechanizmusok révén jönnek létre (Templeton 1998). A fajfogalom azokra a tényezőkre koncentrál, amelyek egy fajon belül a genetikai variáció homogenizálódásához vezetnek (Beszteri 2005). A fajon belüli kohézió legáltalánosabb mechanizmusa az ivaros szaporodás, de emellett más mechanizmus is előfordulhat, például prokariótáknál (Beszteri 2005). Hibridizáció előfordulhat egyértelműen különálló fajok között is és fajtárs parapatrikus populációk elválhatnak egymástól annak ellenére, hogy génáramlás van köztük, ebben a szelekció játszik fontos szerepet (Beszteri 2005). A kohéziós fajfogalom értelmében a demográfiailag kicserélhető szervezetek ökológiailag egyenértékűek (de Queiroz 2007). Megemlítendő még az evolúciós fajfogalom, amely a fajt evolúciós egységként kezeli, melyeknek egyedi evolúciós szerepe, tendenciái és történeti sorsa van (de Queiroz 2007), és a genealógiai fajfogalom, amely szerint a fajokat az allélek kizárólagos egyesülése jellemzi (egy adott gén összes allélja egy ősi allélből származik, és más faj alléljeivel nem közös, de Queiroz 2007). A genealógiai fajfogalom szerint a faj egy zártkörű csoport, melynek tagjai egymással közelebbi rokonok, mint bármely más élőlénnyel. Ez onnan ered, hogy egyre gyakrabban használtak molekuláris módszereket és genealógiai fákat fajok vizsgálatában (Beszteri 2005). Ezek mellett még több fajfogalom létezik. Számos közülük összefügg egymással, azonban egyik sem teljes, és a fajhatárokat illetően különböző következtetésekhez vezethetnek (Leilaert és mtsai. 2014). Ennek ellenére elérhetnek egy konszenzust, mivel általános az egyetértés abban, hogy a fajok biológiai egységek, melyek mögött közös evolúciós elmélet áll (Leilaert és mtsai. 2014): a fajok úgy alakulnak ki, hogy a populációk izolálódnak, mert megszűnik köztük a génáramlás, ezután a szelekció és genetikai sodródás miatt divergálódnak, és végül egymástól elkülönülten evolválódó metapopuláció vonalak jönnek létre. Így a fajok között nagyobb lesz az evolúciós függetlenség, mint egy fajon belül a populációk között (Leilaert és mtsai. 2014). Amikor két ág elválik, akkor végül külöböző tulajdonságokat szereznek (pl. ivaros szaporodásban inkompatibilisek lesznek vagy morfológiailag különböznek), ami a fajok elhatárolásához lehet diagnosztikai bélyeg (Leilaert és mtsai. 2014). A fajképződés során ezek a másodlagos tulajdonságok nem szükségszerűen egyidőben vagy szabályos sorrendben alakulnak ki, az sem biztos, hogy egyáltalán

24 kialakulnak. Ezért lehet a fajfogalmak között sok esetben konfliktus, főleg a nemrég kialakult fajok esetében (Leilaert és mtsai. 2014). Mikor a molekuláris biológiai vizsgálatokat bevezették a kovaalgák rendszertanába, néhány fajról kiderült, hogy nagy genetikai variabilitással rendelkezik, ami akár azt is jelentheti, hogy az eredeti faj valójában több, ún. kriptikus fajt takar. Az igazi, definíció szerinti kriptikus fajokat morfológiailag sehogy sem lehet megkülönböztetni egymástól (Mann és Evans 2007). Azonban akadnak olyan fajok is, melyek között nemcsak genetikai, de morfológiai különbség is van, bár ez utóbbi igen kismértékű. Ezeknek a fajoknak a megnevezésére két fogalmat is bevezettek. A pszeudokriptikus fajokat csak nehéz azonosítani, a szemikriptikus fajokat pedig csak akkor lehet megkülönböztetni egymástól, ha nemcsak a morfológiát ismerjük, hanem a minta származási helyét is. A szemikriptikus fajok metrikus karaktereinek tartománya és/vagy minőségi jellemzői lehetséges karakterállapotainak gyakorisága részben átfed (Mann és Evans 2007). A fajok közötti határokat gyakran fajkomplexeken vizsgálják, és az elemzés sokszor kriptikus, pszeudo- és szemikriptikus fajok felfedezéséhez vezet. A legjobban tanulmányozott fajkomplexek közé tartozik például a Skeletonema costatum (pl. Sarno és mtsai. 2005), Sellaphora pupula (Kützing) Mereschkowsky (pl. Evans és mtsai. 2007), a Nitzschia palea (Kützing) W. Smith (pl. Trobajo és mtsai. 2010) és a Pseudonitzschia delicatissima (Cleve) Heiden (pl. Orsini és mtsai. 2004).

3.4. A fajok DNS vonalkódja

A fajok morfológiai azonosításának nehézségeire Hebert és mtsai. (2003) a genetikai alapú azonosításban látták a megoldást, nevezetesen, hogy a fajokra jellemző DNS-szekvenciákat a taxonok azonosítójaként, vonalkódként (barcode) lehet alkalmazni. A gyakorlatban jól alkalmazható vonalkód marker legalább három feltételnek tesz eleget: nagyobb interspecifikus genetikai távolságot mutat, mint intraspeciefikus távolságot (adott vonalkód esetében monofiletikus klaszterek alkotják a fajokat), egy amplifikációban kinyerhető hosszúságú szekvenciával rendelkezik, és konzervatív régiók szegélyezik, ami lehetővé teszi univerzális primerek tervezését (Moniz és Kaczmarska 2010). A DNS vonalkódokkal kapcsolatban több kérdés is felmerül. Egyrészt a molekuláris alapon történő csoportosítások hogyan feleltethetőek meg biológiailag (morfológiai bélyegek és párosodási tulajdonságok alapján) definiált taxonoknak? Másrészt mekkora variabilitás engedhető meg a vonalkód egységen (fajon) belül, és mekkora variabilitás jelez már több

25 különböző egységet (fajt)? Harmadrészt melyek azok a gének, amelyek ilyen célra megfelelnek (Mann és Evans 2007)? Hebert és mtsai. (2003) a mitokondriális citokróm oxidáz I gént (COI) vizsgálták meg ebből a szempontból hét állattörzsből származó fajok, részletesebben pedig rovarok (elsősorban lepkék) szekvenciái alapján. Később ezt a megközelítést más élőlénycsoportokon is kezdték alkalmazni: COI gént például gombák (Seifert és mtsai. 2007) és vörösalgák (Robba és mtsai. 2006) esetében vagy rbcL gént szárazföldi növényeknél (Newmaster és mtsai. 2006). Kovaalgák esetében Evans és mtsai. (2007) összehasonlítottak négy gént vonalkódként való alkalmazhatóságuk szempontjából, és elsősorban a citokróm oxidáz I gént (melynek neve kovaalgák esetében cox1) találták megfelelőnek. Ez a vizsgálat azonban csak néhány fajra (a Sellaphora pupula fajkomplexre és rokonsági körére, valamint néhány külcsoportként alkalmazott fajra) terjedt ki. A Sellaphora Mereschkowsky nemzetség esetében továbbra is alkalmazhatónak bizonyult (pl. Jahn és mtsai. 2008, Evans és Mann 2009). Több szerző is újra megvizsgálta a cox1 gént más génekkel összevetve. Moniz és Kaczmarska (2009) már 28 fajt elemeztek, melyek mindhárom osztályt képviselték (ezen belül pedig hét rendet). A cox1 egy meghatározott szakaszát (az 5’ végén lévő régiót) két másik markerrel (majdnem a teljes 18S rDNS és az ITS2 az 5,8S rDNS-sel kombinálva) vetették össze, és ezek közül az 5,8S + ITS-2 fragmentumot tartották a legjobb jelöltnek. Ezt később újra tesztelték a Mediophyceae és Bacillariophyceae osztály kiválasztott tagjain, és mivel a biológiailag is definiált fajoknak a 99,5%, az összes vizsgált fajnak pedig a 91%-át sikerült elválasztaniuk, ezért vonalkódnak javasolták az 5,8S rDNS 5’ végétől az ITS2-n belül a hélix III konzervatív motívumáig tartó szakaszt (Moniz és Kaczmarska 2010). Trobajo és mtsai. (2010) a Nitzschia palean tesztelték a cox1, és mellette az rbcL és 28S rDNS markerek alkalmasságát, és bár a cox1 bizonyult a legvariábilisabbnak, de univerzális kovaalga vonalkódnak nem javasolták, mert nehezen amplifikálható és szekvenálható. Ezért inkább a másik két markert tartották elfogadhatónak, ahogyan Mann és mtsai. (2010) is. Hamsher és mtsai. (2011) a kloroplasztisz genom több lehetséges markerét is szemügyre vették a 28S rDNS-sel együtt, melyek közül az rbcL 3’ végén lévő 748 bázispár (bp) hosszú szakaszt (rbcL-3P) javasolták vonalkódnak. MacGillivary és Kaczmarska (2011) az rbcL egy másik szakaszát tanulmányozták Mediophyceae és Bacillariophyceae esetében, és arra a következtetésre jutottak, hogy az önmagában nem, csak az 5,8S + ITS2 marker vizsgálatával kiegészítve lehet alkalmas a fajok elválasztására. Az előzőektől eltérően Zimmermann és mtsai. (2011) a 18S rDNS-en belül kerestek és találtak egy vonalkódnak alkalmas szakaszt, nevezetesen a V4 alrégiót, amelyet elsősorban

Pennales fajokon teszteltek, és amelynek vizsgálatára kidolgoztak egy protokollt is. A V4 alrégiót tartalmazó, de rövidebb szakaszt vizsgáltak Luddington és mtsai. (2012) Centrales fajok esetében. A korábbi tanulmányoktól eltérően már nemcsak a marker alkalmasságát igyekeztek felmérni, hanem azt is, hogy hol van a választóvonal az intra- és interspecifikus variabilitás között (Wiemers és Fiedler 2007 az ún. barcoding gap-nek, „vonalkód résnek”nevezte). Ilyen határérték megállapítására csak néhány marker esetében tettek kísérletet (pl. rbcL esetében MacGillivary és Kaczmarska 2011). Enélkül a kapott szekvenciák sem adnak egyértelmű információt a mintában jelenlévő fajok számáról (pl. Urbánková és Veselá 2013, Kistenich és mtsai. 2014 esetében). Rimet és mtsai. (2014) a Nitzschia palea komplex példáján próbáltak egy objektív módszert keresni a komplexen belüli fajok elhatárolására 28S rDNS, rbcL és cox1 gének alapján, azonban nem jártak sikerrel. Még a párosítási kísérleteik sem tették lehetővé a fajok közti határok megállapítását. A következő nagy kérdés az volt, hogy vonalkód szekvenciák felhasználhatóak-e környezeti minták vizsgálatában (különösen biomonitorozás céljára) az egyes fajok azonosítására („környezeti vonalkódolás”, environmental metabarcoding, Taberlet és mtsai. 2012). Ehhez járult még az is, hogy az egyre inkább elterjedő újgenerációs szekvenálási (Next Generation Sequencing, NGS) technikák a vonalkódok használatának új módját kínálták (Baird és Hajibabaei 2012). Hajibabaei és mtsai. (2011) ismert összetételű folyami bentikus makrogerinctelen közösségen próbálták ki a módszert, és eredményeik alapján ígéretesnek, de még csiszolandónak találták. Kovaalgák körében Kermarrec és mtsai. (2013) végeztek hasonló vizsgálatot. Harminc morfológiailag meghatározott törzsből (melyek 21 fajt képviseltek) álló közösséget hoztak létre, melynek 18S rDNS, rbcL és cox1 (majdnem) teljes szekvenciáit nyerték ki és hasonlították össze. A törzsek Sanger-féle módszerrel kinyert szekvenciáiból egy referencia adatbázist hoztak létre, amelyet össze tudtak vetni az összeállított közösség új generációs szekvenálással nyert adataival. A DNS kivonás és a PCR hibájából adódóan fals negatív, míg a piroszekvenálás hibájaként fals pozitív eredményeket is kaptak (ez utóbbi főleg a közeli rokon fajok esetében fordult elő). A három marker közül az rbcL bizonyult a legmegbízhatóbbnak. Zimmermann és mtsai. (2015) már valódi közösségeket, a Neisse és Odera folyókból származó epilitikus minták kovaalgáit vizsgálták szimultán fénymikroszkóppal és 18S rDNS V4 vonalkód alapú új generációs szekvenálással. A molekuláris módszerrel majdnem az összes olyan taxon megfigyelhető volt, ami fénymikroszkóp alatt, sőt a legtöbb esetben a NGS több taxont eredményezett, mint a morfológiai megközelítés. Azonban a szerzők az előbbi módszer hátrányaira illetve fejlesztendő pontjaira is felhívták a figyelmet. Így például arra, hogy ahhoz, hogy ez az eljárás

27 mennyiségi vizsgálatra is alkalmas legyen (ahogy az a környezeti felmérések esetében elvárt), többet kell tudni a vizsgált genetikai marker kópiaszámáról, a genomméretről és ezek kapcsolatáról a sejtmérettel (Zimmermann és mtsai. 2015). A vonalkód szekvenciák környezeti minták vizsgálatában való alkalmazásának feltétele egy jó minőségű referencia adatbázis, melynek egyik legfontosabb jellemzője, hogy minden szekvenciának egy voucher példányhoz kell kapcsolódnia (Zimmermann és mtsai. 2014, 2015). Az említett szerzők a berlini vizekből naviculoid kovaalgák tenyészeteit hozták létre, majd ezek 18S V4 és rbcL vonalkód szekvenciáit állították elő, és ezeket az adatokat az AlgaTerra Információs Rendszerben helyezték el (AlgaTerra Information System, www.algaterra.net). Egyúttal kidolgozták egy referencia adatbázis létrehozásának irányelveit is. Rimet és mtsai. (2016) létrehoztak egy szabad hozzáférésű referencia vonalkód adatbázist (R-Syst::Diatom, http://www.rsyst.inra.fr), mely az INRA törzsgyűjteményének és a NCBI nukleotid adatbázisának 18S rDNS és rbcL szekvencia adatait tartalmazza.

3.5. Molekuláris markerek a kovaalga taxonómiában és filogenetikában

3.5.1. A riboszómális RNS Számos élőlénycsoport, így a kovaalgák körében is a leggyakrabban vizsgált marker a nukleáris rDNS cisztron (riboszómális RNS gén, 5. ábra), mivel több előnyös tulajdonsággal is rendelkezik (1. táblázat).

5. ábra: Az rDNS szakasz az eukariótákban. NTS = nem átíródó elválasztó szakasz (non-transcibed spacer), ETS = külső átíródó elválasztó szakasz (external transcribed spacer), ITS = belső átíródó elválasztó szakasz (internal transcribed spacer) (Hillis és Dixon 1991).

Az rDNS cisztron különböző szakaszai különböző ütemben evolválódnak, így különböző szintű filogenetikai kapcsolatokat tudnak feltárni. A kis alegység (small subunit, SSU vagy 18S) rDNS magasabb szintű kapcsolatok rekonstruálására alkalmas a kovaalgák teljes csoportjára nézve (pl. Alverson és mtsai. 2006, Sörhannus 2004), míg a gyorsabban evolválódó részek, mint a nagy alegység (large subunit, LSU vagy 28S) rDNS variábilis D1-

D3 régiója valamint az átíródó elválasztó szakaszok (internal transcribed spacer, ITS) faj- vagy néha populáció szintű kapcsolatok felderítésére képes (pl. Godhe és mtsai. 2006). Az rDNS cisztron több százszor-ezerszer is megtalálható a genomban, néha több kromoszómán szétszórva (Alvarez és Wendel 2003). A számos paralóg cisztron között polimorfizmusok fordulnak elő, amelyeket adott idő elteltével az összehangolt evolúció (concerted evolution, Hillis és Dixon 1991, Elder és Turner 1995) gyakori egyenlőtlen kereszteződés vagy génkonverzió révén homogenizál (Alvarez és Wendel 2003). Előfordulhat azonban, hogy a homogenizáció nem elég gyors ahhoz, hogy lépést tartson a variábilis régiókban a mutációk felhalmozódásával (Beszteri és mtsai. 2005). Ez genomon belüli (intragenomiális) variabilitást eredményezhet, ami elméletileg megnehezítheti a fajok közötti határok megállapítását, a gyakorlatban azonban kovaalgák esetében még nem írtak le ilyen konfliktust az rDNS-alapú filogenetikai fa illetve az élőlények valódi leszármazási viszonyai között (Alverson 2008). A nagy kópiaszám miatt a pszeudogének (a gének nem működő másolatai) is széleskörben elterjedtek, az rDNS-nek gyakrabban alakulnak ki pszeudogénjei, mint más kódoló régióknak (Alvarez és Wendel 2003). Az ilyen nem működő génkópiák nincsenek kitéve az olyan szelektív kényszereknek, amelyek a kódoló példányokra hatnak, ezért divergálódhatnak. A pszeudogének mellett a hibridizáció (pl. Casteleyn és mtsai. 2009) és poliploidia (pl. Chepurnov és mtsai. 2002) is előfordulhat kovaalgák esetében, melyek következményei elméletben téves következtetésekhez vezethetnek. Általában felismerhetőek (Coleman 2007) és a kovaalgák evolúciójában valószínűleg nem játszanak fontos szerepet (Bowler és mtsai. 2008, Moniz és Kaczmarska 2009).

3.5.1.1. A 18S (SSU) rDNS A 18S rRNS gént számos kovaalga filogenetikai vizsgálatba bevonták (pl. Kooistra és Medlin 1996, Medlin és mtsai. 1996a, b, Medlin és Kaczmarska 2004, Alverson és mtsai. 2007). Ilyen elemzésekben általában a teljes vagy majdnem teljes szakaszát alkalmazzák. Vonalkódként azonban más markereknél kisebb variabilitása miatt az egész 18S rDNS szakasz használata nem ajánlott (Evans és mtsai. 2007, Moniz és Kaczmarska 2009). Azonban egyes régióinak varianciája már kellő mértékű a kovaalga fajok elkülönítéshez környezeti mintákban (Zimmermann és mtsai. 2011). Zimmermann és mtsai. (2011) a Nelles és mtsai. (1984) nevezéktana szerint V4-nek nevezett, körülbelül 60 bp hosszú régiót találták megfelelőnek erre a célra, amely a legnagyobb és legösszetettebb variábilis régió a 18S rDNS lókuszon belül (Nickrent és Sargent 1991). Ez a régió számos variábilis karakter helyett,

29 inverziót, inzerciót és deléciót tartalmaz rövid szakaszon (Zimmermann és mtsai. 2011). Többféle primerpár tervezésével és kipróbálásával Zimmermann és mtsai. (2011) végül azonosították a megfelelő, konzervatív primer kötő helyeket, amelyek alapján egy körülbelül 400 bp hosszú szakasz szaporítható fel, amely tartalmazza a V4 alrégiót (6. ábra). Kidolgoztak módszert, amely rutinszerűen alkalmazható az említett szakasz vizsgálatára kovaalgák esetében. A szakasz alkalmasságát 123, elsősorban Pennales faj alapján tesztelték, és az intragenerikus (vagyis a fajok közötti) változatosság majdnem minden esetben magasabbnak bizonyult, mint akár a fajon belüli, akár a törzsön belüli, így alkalmas vonalkód marker lehet. Azonban ez nem volt érvényes a Stephanodiscus nemzetségre, melynek fajai kisméretűek, a fajok közt gyakran valva plaszticitás figyelhető meg és néhány taxon földtörténeti értelemben csak nemrég vált el (Zimmermann és mtsai. 2011). A kiválasztott régió a Sellaphora pupula komplexen belül sem tudta egyértelműen elválasztani a fajokat. Zimmermann és mtsai. (2011) ugyan megemlítik, hogy egy vonalkód markert meghatározott fajszintű küszöbértékkel szokás használni, ami élőlénycsoportonként és markerenként változik, ők maguk azonban nem állapítanak meg határt a fajok elválasztásához. Luddington és mtsai. (2012) több tekintetben is továbbléptek Zimmermann és mtsai. (2011) vizsgálatához képest. Egyrészt a V4 régió vonalkódként való alkalmazhatóságát Centraleseken (többek között Thalassiosirales fajokon) tesztelték. Másrészt egy adott határértéket (p=0,02) is teszteltek, ami a vizsgált fajok 96,9%-át is elválasztotta. Azonban bizonyos fajok között nem volt vagy nagyon kicsi volt a távolság (pl. a Cyclostephanos vagy a Skeletonema nemzetségben), és e fajoknak csak egy részénél volt elég a szekvenciák kiterjesztése a divergencia megnöveléséhez. Ugyanakkor a távolság alapú módszer (ami csak az eltérések számát veszi figyelembe) mellett karakter alapú analízist (vagyis az eltérő nukleotidok minőségének és pozíciójának meghatározását) is javasoltak. Egyes esetekben, mikor az előbbi módszer nem ad egyértelmű eredményt, az utóbbi módszer segíthet.

ACGU - több, mint 98% konzervatív acgu - 90-98% konzervatív  - 80-90% konzervatív  - több, mint 20% variabilitás

6. ábra: A 18S (SSU) rDNS konszenzus másodlagos szerkezete a kovaalgákban, 181 szekvencia felhasználásával, a Toxarium undulatum J.W. Bailey 18S másodlagos szerkezet modell, mint referencia szekvencia alapján (Zimmermann és mtsai. 2011). A nagybetűk a 98-100%-ban konzervatív szekvenciák, a kisbetűk a 90-98%-ban konzervatív szekvenciák, a pontok 80-90%-ban konzervatív szekvenciák pozícióit mutatják, a körök több, mint 20%-os variabilitást jeleznek. Az ábrán a feliratok és különböző színek a V4 régiót és a Zimmermann és mtsai. (2011) által tervezett primerek kötőhelyeit jelölik.

3.5.1.2. A 28S (LSU) rDNS A LSU a legnagyobb rRNS kódoló régió. A viszonylag konzervatív, a riboszóma funkcióhoz szükséges mag szakaszokon kívül még tizenkét hipervariábilis D (divergens) domént tartalmaz (Hassouna és mtsai. 1984). A D domének szekvencia variabilitásuk miatt alkalmasak a viszonylag recens evolúciós események rekonstruálására alacsonyabb taxonómiai szinten, például (fajok és nemzetségek szintjén, Lee és mtsai. 2013). A legnagyobb variáció a D1-D3 doménekben van, a D4-D12 doménekben a variabilitás kisebb (Lee és mtsai. 2013). Ezért inkább a D1, D2, D3 doméneket, illetve ezek kombinációit alkalmazzák filogenetikai vizsgálatokban (pl. D1-D2 doméneket a Thalassiosirales rend esetében, Alverson és mtsai. 2007), de például Lee és mtsai. (2013) a D1-D5 régiót használta kiválasztott Centrales nemzetségek filogenetikai vizsgálatában. Az utóbb említett szerzők 12,3% (SD=0,76) átlagos p-távolságot mutattak ki a vizsgált Centrales fajok között, és a parszimóniailag informatív pozíciók aránya 17,6% volt. Lee és mtsai. (2013) vélték, hogy a D1-D3 LSU régió alapján készült filogenetikai fa pontosan ábrázolta a tesztelt Centralesek filogenetikai kapcsolatait, és ezért alkalmas molekuláris markernek vélték ezt a gént. Alverson és mtsai. (2007) szerint a LSU rDNS a SSU rDNS-sel együtt inkább a mélyebb elválások rekonstruálása alkalmas. Ugyanakkor 28S rDNS D1-D3 doménjei akár vonalkód markerként is alkalmazhatóak. Hamsher és mtsai. (2011) vizsgálatában a LSU D2/D3 szakasz, amely majdnem olyan variábilis volt, mint az rbcL, csak két közel rokon fajt nem tudott elválasztani. Azonban nem tudtak meghatározni egy vonalkód rést az intra- és interspecifikus variabilitás között: 1 bp különbség intraspecifikus variabilitásba tartozott még, a fajok között 0,3-8,2% (2-50 bp) különbséget számoltak. A LSU rDNS használatának gyakorlati problémái is akadhatnak (1. táblázat).

3.5.1.3. Az ITS régió Az rDNS cisztronban a kis alegység és nagy alegység RNS gént az ITS régió választja el egymástól (5. ábra): ennek első tagja az ITS1, amelyet az 5,8S rRNS gén, majd az ITS2 követ. A cisztronról átíródó RNS feldolgozása során a nukleoluszban megfelelő enzimek kivágják az ITS1-et és az ITS2-t, és így készül a végső 18S, 5,8S és 28S rRNS a riboszómákhoz. A feldolgozás irányításában fontos szerepe van az RNS másodlagos szerkezetének (Coleman 2007). Az ITS régió nagyon variábilis, főleg a 18S rDNS-hez képest (Evans és mtsai. 2007). Emiatt populáción belüli genetikai variabilitás vizsgálatára használták néhány esetben (pl.

Pseudonitzschia delicatissima esetében Orsini és mtsai. 2004, Sellaphora pupula esetében Behnke és mtsai. 2004). Hossza is változhat (pl. Sellaphora pupula és Sellaphora laevissima (Kützing) D.G. Mann esetében, Behnke és mtsai. 2004). Ugyanakkor a fajok elválasztására is alkalmas lehet, főleg az ITS2, amelyet több filogenetikai vizsgálatba vonták be, jóval többe, mint az ITS1-et. Szekvenciája faj szinten egyedi, sőt általában alfaj szinten is (Coleman 2007). Az ITS2 konzervatív és labilis szekvenciájú nukleotid régiókat egyaránt tartalmaz (Coleman és Mai 1997). A legkonzervatívabb régiók a kezdeti RNS transzkriptum másodlagos szerkezetében lévő hélixek párba állásához járulnak hozzá, ennek következtében pedig a feldolgozás irányításához (Coleman 2007). Eukariótákban előforduló négy hélixe közül a II és III tartalmazza a legkonzervatívabb régióit (akár az összes eukariótára vonatkozóan, Coleman 2007) Moniz és Kaczmarska (2009, 2010) egy olyan szakaszt javasolt vonalkódnak, amely 5,8S rDNS régióban kezdődik és az ITS2-ről átíródó kezdeti RNS II hélixének az összes eukariótában konzervatív motívumában ér véget. Az 5,8S rDNS, amelynek variabilitása néhány faj és a legtöbb nemzetség elválasztásához elég volt, horgonyzópontként szolgál. A korábbi vizsgálatukban (Moniz és Kaczmarska 2009) ez a vonalkód P=0,07 eltérés/hely küszöbértéket alkalmazva sikeresen elválasztotta a vizsgált biológiailag definiált fajokat és a 107 morfofaj 88%-át. Moniz és Kaczmarska (2010) egy szélesebb körű vizsgálatban újra bizonyította a javasolt vonalkód sikeres használatát Mediophyceae és Bacillariophyceae fajok esetében. A vizsgált morfofajok 91%-át, a biológiailag definiált fajok 99,5%-át elválasztotta, ha fajspecifikus küszöbértéket alkalmaztak, a definiált fajokat akkor is elválasztotta, amikor Mediophyceae fajok esetében 0,11 eltérés/hely, Bacillariophyceae esetében pedig 0,18 eltérés/hely küszöbértket alkalmaztak. Az ITS2-vel kapcsolatban is felmerülnek azok a problémák, amelyek a teljes rRNS lókuszt érintik: a sok kópia genomon belül és emiatt lehetséges intragenomiális variabilitás, pszeudogének jelenléte, a hibridizáció és poliploidia (Coleman 2007). A gyakorlatban azonban ez általában nem zavarja a filogenetikai vizsgálatot (pl. Behnke és mtsai. 2004, Orsini és mtsai. 2004), illetve megvan a módszer például a pszeudogének felismerésére (Coleman 2007) és kiküszöbölésére (Moniz és Kaczmarska 2009). A gyakorlatban az ITS2 variabilitása inkább a szekvenciák illesztésénél okoz gondot (pl. Kistenich és mtsai. 2014, 1. táblázat).

3.5.2. A sig1 A sig1 (= sexually induced gene) gén terméke, a Sig1 fehérje feltehetően a hímivarsejt és a petesejt felismerésében vesz részt (Armbrust 1999). Bár Thalassiosira fajok esetében jól működő marker volt (Armbrust és Galindo 2001), Kistenich és mtsai. (2014) Cyclotella comensis komplex, C. ocellata, Cyclostephanos delicatus (S.I. Genkal) S.J. Casper et W. Scheffler és Stephanodiscus alpinus Hustedt esetében már nem tudták amplifikáni.

3.5.3. Mitokondriális markerek A mitokodriális genomnak állatok esetében vannak olyan tulajdonságai, amelyek filogenetikai vizsgálatokban igen hasznosnak bizonyulnak, ugyanazokat a fehérjekódoló géneket tartalmazzák, ráadásul ezek a gének csak egy kópiában fordulnak elő (Alverson 2008). A kovaalgák teljesen ismert mitokondriális genom DNS szekvenciái (pl. Ambrust és mtsai. 2004) alapján úgy tűnik, hogy ez kovaalgák esetében így van (Alverson 2008). Ennek ellenére a több, mint harminc mitokondriális gén közül csak a citokróm oxidáz I alegység (COI vagy cox1, Ehara és mtsai. 2000a) és a citokróm b (cob) géneket tesztelték (Alverson 2008), ezek közül is a cox1 alkalmazása terjedt el. Nagy divergenciája a cox1 miatt alkalmas jelölt a kovaalga fajokat azonosító markernek (Evans és mtsai. 2007), alkalmazása protiszták körében azonban inkább csak egy-egy nemzetségen belül sikeres (Moniz és Kaczmarska 2009; a marker használatának előnyeit, hátrányait az 1. táblázat tartalmazza).

3.5.4. Kloroplasztisz markerek A kloroplasztiszok, az elsődleges endoszimbiózis leszármazottai, amely szerint az ősi heterotróf eukarióta sejt egy cianobaktériumot kebelezett be és a cianobaktérium végül elvesztette legtöbb génjét, ezek többsége a gazda sejtmagjába került. Ebből az ősi fotoszintetikus ágból alakultak ki az elsődleges kloroplasztisszal rendelkező modern csoportok: vörös és zöld algák, a Glaucophyta és a szárazföldi növények. Ezután, a másodlagos endoszimbiózis során, a nem fotoszintetizáló eukarióta gazdasejt, kloroplasztisszal rendelkező eukarióta sejtet kebelezett be. A kovaalgák a fotoszintetizáló heterkontákhoz tartoznak, amelyek kloroplasztisza vörösalga endoszimbiontából származik (Oudot-Le Secq és mtsai. 2007). A filogenetikai és molekuláris taxonómiai vizsgálatokban, a kloroplasztisz gének közül (7. ábra), elsősorban ribulóz-1,5-biszfoszfát-karboxiláz/oxigenáz (RuBisCO) nagy alegységét kódoló gén, az rbcL gén használata terjedt el. Emellett még, a prokarióta riboszóma kis alegység (16S) rRNS gén (pl. Medlin és Kaczmarska 2004), és a II. fotorendszer fehérjéit

34 kódoló gének (psbA, Lee és mtsai. 2013, psbC, Alverson és mtsai. 2007, Theriot és mtsai. 2010) használatosak. Alverson és mtsai. (2007) szerint az rbcL és psbC az inkább alacsonyabb, fajszintű kapcsolatok feloldásában volt hasznos, mint a mélyebb elágazások feltárásában.

7. ábra: A Thalassiosira pseudonana kloroplasztisz genom térképe. A nyilak az átíródás irányát mutatják (Oudot-Le Secq és mtsai. 2007 nyomán).

Filogenetikai vizsgálatokban általában az rbcL teljes vagy majdnem teljes szakasza használatos (pl. Daugbjerg és Guillou 2001, Alverson és mtsai. 2007, Theriot és mtsai. 2010, Lee és mtsai. 2013), viszont fajok elválasztására (vonalkódként) kisebb szakasz is elég lehet.

Egy rövid szakasz egy primer kombinációval felszaporítható (Hamsher és mtsai. 2011), de nincs egyetértés abban, hogy melyik a megfelelő régió. Hamsher és mtsai. (2011) az rbcL 3' végén lévő 748 bp hosszú szakaszt (rbcL-3P) javasolták, Stoof-Leichsenring és mtsai. (2012) viszont egy rövid (67-76 bp) rbcL szakaszt alkalmaztak vonalkód markerként. MacGillivary és Kaczmarska (2011) egy, az rbcL start kodonjától 417 bp távolságra lévő, 540 bp hosszú fragment vizsgált, amely azonban önmagában nem bizonyult elég variábilisnak a Mediophyceae és Bacillariophyceae fajok elválasztásához, ezért használatát a szerzők csak 5,8S+ITS2 markerrel kiegészítve ajánlották. Ugyanígy Hamsher és mtsai. (2011) is egy második marker (LSU D2/D3) alkalmazását tanácsolták az rbcL-3P mellé, mely önmagában a közel rokon fajokat nem biztos, hogy megkülönbözteti. Sherwood és Presting (2007) a plasztisz 23S rDNS-ének variábilis D5 régióját magába foglaló, rövid (~410 bp) szakaszát javasolta algafajok azonosításához használható markerként (universal plastid amplicon, UPA), azonban ez kovaalgáknál kevéssé használható (Hamsher és mtsai. 2011, 1. táblázat).

1. táblázat: A kovaalgák taxonómiájában leggyakrabban alkalmazott DNS markerek előnyös és hátrányos tulajdonságai. Marker Tulajdonság (Referencia) riboszómális előnyök - univerzálisan előfordul prokariótáktól a többsejtű eukariótákig, DNS: funkció nem változott, ezért számos vizsgálat alanya (Alverson 2008) számos univerzális primer, - egyre növekvő, sok taxonra kiterjedő szekvenciaadatbázis - a konzervatív régiók elősegítik a szekvencia-illesztést, variábilis régiók filogenetikailag informatív karaktereket tartalmaznak (Alverson 2008) nagy kópiaszám (több száz – ezer, Alvarez és Wendel 2003) - ennek előnye: megkönnyíti a PCR-t és a szekvenálást - hátránya: intragenomális polimorfizmus - ellene hat: összehangolt evolúció hátrányok - nem működő pszeudogének - általában felismerhetőek, valószínűleg nem jelentős - interspecifikus hibridizáció, genomon belüli variabilitás, majd különböző rDNS típusok eltűnhetnek - általában felismerhető (Coleman 2007), valószínűleg nincs fontos szerepe a kovaalgák evolúciójában (Bowler és mtsai. 2008, Moniz és Kaczmarska 2009) - poliploidia - általában felismerhető (Coleman 2007), valószínűleg nincs fontos szerepe a kovaalgák evolúciójában (Bowler és mtsai. 2008, Moniz és Kaczmarska 2009)

1. táblázat folytatás Marker Tulajdonság (Referencia) 18S rDNS előny - magasabb szintű kapcsolatok rekonstruálására, nagyobb csoportok közti mélyebb elágazások felbontására alkalmas (Alverson és mtsai. 2007, Sörhannus 2004) hátrányok - intragenomiális polimorfizmus (pl. Skeletonema fajok, Alverson és Kolnick 2005) - vitatott, hogy változásai a kovaalgák evolúcióját tükrözi-e (Medlin és Kaczmarska 2004, Theriot és mtsai. 2009) a teljes gén varianciája alacsony (Evans és mtsai. 2007, Moniz és Kaczmarska 2009) ezért: →több szekvenálási lépés és primer kell a fajok elválasztásához szükséges divergencia kimutatásához →a kis távolság növeli a szekvenálási hiba valószínűségét ITS2 előnyök - nagyon variábilis - szekvenciájának eltérései és a szexuális inkompatibilitás közt összefüggést találtak (Behnke és mtsai. 2004) - szekvenciája faj, és általában alfaj szinten is egyedi (Coleman 2007), - felszaporításához jó primerkötő helyet biztosít az 5,8S rDNS és a 28S rDNS 5' vége, ezekre a konzervatív területekre törzsspecifikus primerek tervezhetőek (Moniz és Kaczmarska 2009) - hossza általában 350 nt-nál rövidebb, egy körben szekvenálható (Coleman 2007) - a konzervatív szakaszok a másodlagos szerkezetében megkönnyíthetik az illesztést (Moniz és Kaczmarska 2009) hátrányok - intragenomiális polimorfimus (pl. Cyclotella meneghiniana, Beszteri és mtsai. 2005, Sellaphora pupula, Behnke és mtsai. 2004) - nem annyira jól illeszthető, mint a fehérjekódoló régiók (Coleman 2007, Moniz és Kaczmarska 2009), néha nem is lehetséges (Kistenich és mtsai. 2014) 28S rDNS előnyök - a hipervariábilis D domének szekvencia variabilitásuk miatt alkalmasak a viszonylag recens evolúciós események rekonstruálására alacsonyabb taxonómiai (pl. fajok, nemzetségek) szinten (Lee és mtsai. 2013) - a 18S rDNS-sel együtt inkább a mélyebb elválások rekonstruálására alkalmas (Alverson és mtsai. 2007) hátrányok - polimorfizmus törzsön belül (pl. Cyclotella meneghiniana Kützing, Beszteri és mtsai. 2005), fajon belül Skeletonema marinoi Sarno et Zingone esetében Godhe és mtsai. 2006) - nincs egyértelmű vonalkód rés az intra- és interspecifikus variabilitás között (Hamsher és mtsai. 2011) - univerzális primerek használata néha leolvashatatlan szekvenciákat eredményez a tenyészetekben lévő szennyezők felszaporodása miatt (Hamsher és mtsai. 2011) - távolabbi rokonok között nehezebb illeszteni (Hamsher és mtsai. 2011) sig1 előny - a Sig1 fehérje feltehetően a hímivarsejt és a petesejt felismerésében vesz részt (Armbrust 1999), így sig1 eltérése reproduktív izolációt jelezhet. hátrány - gyors evolúción megy át, ezért nagy divergencia fajon belül is (Armbrust és Galindo 2001)

1. táblázat folytatás Marker Tulajdonság (Referencia) kloroplasztisz hátrányok - kloroplasztisz száma a kovaalgákban változó Stoof-Leichsenring és markerek: mtsai. (2012) - a kloroplasztisz öröklődése lehet kétszülős (sok Pennales esetében) (Levialdi Ghiron és mtsai. 2008) - természetes hibridizáció (Casteleyn és mtsai. 2009) rbcL előny - magas divergencia (Hamsher és mtsai. 2011) hátrányok - több belső primer is kell a teljes szekvencia kinyerésére (Hamsher és mtsai. 2011) - nincs egyetértés abban, hogy mekkora és melyik szakaszát érdemes alkalmazni fajok elválasztására (MacGillivary és Kaczmarska 2011) - introgresszió előfordulhat (Amato és mtsai. 2007) - stabil intraklonális polimorfizmus előfordulhat (Levialdi Ghiron és mtsai. 2008) UPA = előny - univerzális primerek (Sherwood és Presting 2007) universal plastid hátrányok - kovaalgáknál sokkal konzervatívabb, mint más algacsoportoknál, amplicon divergenciája nem elég a fajok elkülönítéséhez (Hamsher és mtsai. 2011) - a heterotróf kovaalgákból kinyert szekvenciák az illesztésnél "kilógnak" (több inszerciót, deléciót tartalmaznak) mitokond- előny - génkomplement és génkópiák száma konzervatív (Alverson 2008) riális markerek: hátrány - kovaalgáknál nem feltétlenül egyszülős a mitokondrium öröklődése: az összes Pennales és sok Centrales esetében mindkét szülő teljes citoplazma tartalma hozzájárul a zigóta kialakításához a mitokondriumok is fúzionálhatnak (Medlin és Kaczmarska 2004, Keeling és Palmer 2008) cox1 előnyök - nagy divergencia (Evans és mtsai. 2007, Hamsher és mtsai. 2011) - fehérjekódoló gén, ezért szekvenciái könnyen illeszthetőek (Alverson 2008) hátrányok - sok esetben nehéz felszaporítani (Hamsher és mtsai. 2011, Kistenich és mtsai. 2014) - nehéz olyan konzervatív régiót találni, amelyre univerzális primer tervezhető, ezért csak egy-egy csoporton alkalmazható sikerrel (Moniz és Kaczmarska 2009) - gyakran bakteriális DNS szaporodik fel kovaalga DNS helyett (Moniz és Kaczmarska 2009) - intront tartalmazhat (Ehara és mtsai. 2000b)

3.6. A morfológiai és a genetikai variabilitás összekötése

A kovaalgák körében végzett filogenetikai elemzések (pl. Medlin és Kaczmarska 2004, Alverson és mtsai. 2007) és a fajok meghatározására, fajok közötti határok megállapítására vonatkozó vizsgálatok (pl. Wolf és mtsai. 2002, Behnke és mtsai. 2004) nagy része tenyészthető törzsek vizsgálatán alapul (Lang és Kaczmarska 2011), mivel ilyen

38 vizsgálatokban fontos azt biztosítani, hogy az összes kovaalga sejt, amelynek morfológiai és genetikai tulajdonságait vizsgáljuk ugyanahhoz a fajhoz tartozzon (Sherbakova és mtsai. 2000). Ugyancsak tenyészeteket alkalmaznak egy faj biogeográfiai elterjedésének vizsgálatában (pl. Godhe és mtsai. 2006) vagy populáció genetikai tanulmányokban (pl. Rynerson és Armbrust 2004). Környezeti minták esetében egymással párhuzamosan végzett mikroszkópos és molekuláris vizsgálat általában arra az eredményre vezet, hogy a kétféle módszerrel kapott fajlista nem pontosan fedi egymást, DNS alapon általában több faj mutatható ki, mint morfológiai alapon (pl. Zimmermann és mtsai. 2015). A tenyészetek használatának is megvannak a korlátai (Hamsher és mtsai. 2011). A kovaalgák vegetatív szaporodásuk során mitotikusan osztódnak, a leánysejtek megkapják az anyasejt vázának epi- illetve hipotékáját, majd ezt epitékaként használva egy hipotékát alakítanak ki hozzá. Ezért a sejtek egy vonalán a sejtméret folyamatosan csökken, amíg el nem éri a minimum méretet. Ekkor a sejtek auxospórát képeznek, és visszaállítják méretüket. Ez általában ivaros szaporodással jár együtt (Hamsher és mtsai. 2011). Néhány faj homotallikus, és monoklonális tenyészetben be tudja fejezni életciklusát, mások pedig ivaros szaporodás nélkül is fenn tudják tartani sejtméretüket. Azonban bizonyos taxonok esetében az izolátumoknak más törzsekkel kell párosodnia, máskülönben elpusztulnak, például Sellaphora fajoknál (Hamsher és mtsai. 2011). Tenyészetben a valvák morfológiája gyakran megváltozik (Hamsher és mtsai. 2011). A tenyészthető törzsek csak egy kis részét képezik a ma élő kovaalga fajoknak, ezért szükség van tenyésztéstől független technikákra (Lang és Kaczmarska 2011). Megoldást jelenthet olyan módszer kifejlesztése, amelynek során egy (vagy néhány) sejtből nyerünk PCR-alapú módszer segítségével szekvenciát, ezután a sejt kovavázát visszanyerjük, és mikroszkóppal tanulmányozzuk. Ilyen technika kidolgozására kovaalgák esetében csak néhányszor történt kísérlet. Sherbakova és mtsai. (2000) kissé körülményes eljárása, amelyet Aulacoseira skvortzowii M.B. Edlund, Stoermer et C.M. Taylor és Cyclotella minuta (Skvortzov) Antipova fajokon teszteltek, azon alapul, hogy Pasteur- pipettával kiválogatott és fedőlemezre tett sejtek vázán mikromanipulátorhoz kötött üvegtű segítségével lyukat ütöttek, amelyen át a protoplaszt kiszabadulhatott. A protoplasztokból megfelelő oldatokkal kinyerhető volt a DNS, míg a perforált vázak a fedőlemezen visszamaradtak, és pásztázó elektronmikroszkóppal (SEM) tanulmányozhatóak voltak. Orsini és mtsai. (2004) Pseudonitzschia delicatissima tenyészetekből izoláltak mikropipettával egy- egy rövid láncot, amelyből a DNS-t kivonták. Azonban a PCR után nem nyerték vissza a vázakat, morfológiai vizsgálatot csak a tenyészeteken végeztek.

Az előző vizsgálatokat élő sejteken és egy-egy DNS-szakaszon (rbcL, Sherbakova és mtsai. 2000 illetve ITS, Orsini és mtsai. 2004) végezték. Ehhez képest előrelépést jelentett Lang és Kaczmarska (2011) módszere, amelyet etanollal tartósított mintákra és két régióra (rbcL és ITS) terveztek. Az előbbit többszöri sterilvízben való mosással, az utóbbit pedig azzal oldották meg, hogy mindkét marker primereit bevonták egy reakcióba. Az eljárás külön DNS-kivonást nem tartalmazott, csak egy hődenaturációs lépést, ami felszabadította a sejtekből a DNS-t. Mivel az így kinyert DNS mennyisége igen kicsi volt, ezért nested (fészkes) PCR-t alkalmaztak, vagyis két PCR-t végeztek egymás után: az első reakció terméke biztosította a templátot a második reakcióhoz, és a másodszorra alkalmazott primerek kötőhelye az első reakció termékén belül volt. Az elegyet szűrőpapírra cseppentve nyerték vissza a sejtek vázát, így azok elektronmikroszkópban vizsgálhatóvá váltak. Hamilton és mtsai. (2015) módszere bizonyos szempontból hasonló volt. A tartósítószert/szennyező sejteket szintén vízben való mosással távolították el, és szintén nested (vagy kétszeresen nested) PCR-t alkalmaztak. A DNS-kivonást hődenaturációval és/vagy rázással, centrifugálással végezték. Az izolálás és a DNS-kivonás között a mintákat Chelexben tárolták, amely egy kelátor tulajdonsággal rendelkező gyanta, amely nagy affinitással köti meg a többértékű fémionokat, ezáltal gátolja a DNS degradálódását (Walsh és mtsai. 1991). Azonban PCR előtt eltávolítandó, ugyanis a magnéziumionokkal is komplexet képez, ezáltal gátolja a reakciót katalizáló enzim, a Taq polimeráz működését (Walsh és mtsai. 1991). Hamilton és mtai. (2015) próbaképpen néhány minta esetében kihagyták a Chelex-ben történő inkubálást, és úgy is hasonló eredményt értek el, mint az inkubációs lépés alkalmazásával. Élő, illetve kétféle tartósítószerrel tartósított sejteket teszteltek, ezek közül a Lugol-oldattal tartósított sejtekből korlátozott sikerrel történt a DNS-kinyerés. További érdekesség, hogy egyszerre három gént (18S rDNS, rbcL, psbA) és különböző polimeráz enzimeket is teszteltek. Így ki tudtak dolgozni egy eljárást a több gén szekvencia egy sejtből történő kinyerésére. A polimeráz enzimek minősége, pontossága különböző, ami befolyásolhatja a polimeráz láncreakció sikerességét, specificitását. A szerzők két különböző minőségű enzimet vetettek össze, melyek esetükben egyforma szekvenciákat eredményeztek. Mivel az egyes gének, DNS-szakaszok felbontóképessége különböző (különböző a konzervatív és variábilis szakaszok aránya), ezért több gén együttes vizsgálata megbízhatóbb eredményt ad, mint egyetlen géné. Azonban a szerzők a PCR után a vázakat nem nyerték vissza.

4. Anyag és módszer

4.1. Mintavétel

Dunai fitoplankton mintavétel 1979 óta heti rendszerességgel zajlik Gödnél (1669 folyam kilométer), melynek során fél liter merített mintát veszünk a fő sodorvonalból, 20-30 cm-rel a vízfelszín alatt, ezt Lugol-oldattal tartósítjuk. Kvantitatív vizsgálatokat Utermöhl (1958) módszer szerint inverz mikroszkóppal (Olympus IX70 és Opton invertiscope D) végezzük. Ezeket az adatokat használtuk a Skeletonema potamos ökológiai tulajdonságait érintő kérdéseink megválaszolására. A DNS-vizsgálatot a 2011 júniusában a Dunából, Gödnél és 2012 augusztusában a Tiszából, Tiszaújvárosnál vett, nem tartósított mintán végeztük. A Cyclotella ocellata/Cyclotella comensis komplex vizsgálatához tíz víztestből gyűjtöttünk, valamint horvát (Koraljka Kralj Borojević és Andjelka Plenković-Moraj) és török (Cüneyt Nadir Solak) kutatóktól kaptunk fitoplankton mintákat. A mintavételi helyek elhelyezkedését 8. ábra mutatja, leírásukat a Függelék F/1. táblázat tartalmazza.

8. ábra: Mintavételi helyek a Cyclotella ocellata/Cyclotella comensis komplex vizsgálatához. Csillaggal azokat a mintákat jelöltük, amelyeken csak morfometriai analízist végeztünk, fekete ponttal pedig azokat, amelyeken DNS- és morfometriai vizsgálatokat is. 1 = Balaton, 2 = Himódi bányató, 3 = Dunaharaszti bányató, 4 = Nyékládházi bányató, 5 = Hegyeshalmi bányató, 6 = Csiszlói-tó, 7 = Szanyi bányató, 8 = Visovac-tó, 9 = İnli forrás, 10 = Yalovai patak.

Harmadik tanulmányunkban a korábbi, C. ocellata/C. comensis vizsgálatokhoz vett minták egy részét valamint Dr. Mirko Dreßlertől (Universität Rostock, Németország) és Dr. Frédéric Rimet-től (L’Institut National de la Recherche Agronomique, Franciaország) kapott mintákat, illetve szekvenciákat használtuk fel (Függelék F/5. táblázat) a C. ocellata és C. bodanica filogenetikai helyzetének pontosításához. Morfológiai vizsgálatra tisztított frusztulumokat tartalmazó roncsolt mintákat kaptunk egy C. costei (C. comensis csoport tagja, Genfi-tó, Thonon-les-Bains) tenyészetből, és tartósított, roncsolatlan mintákat két Lindavia radiosa (Grunow) De Toni et Forti tenyészetből (Nehmitz- és Stechlin-tó, Neuglobsow). Dr. Mirko Dreßler tisztított DNS mintát is küldött a Stechlin-tóból származó, S1 jelzésű L. radiosa tenyészetből, melyet a már meglévő és szintén a rendelkezésünkre bocsátott 18S rDNS és rbcL szekvenciák meghosszabbítására használtunk. A kapott minták mintavételi helyének jellemzését a Függelék F/6. táblázat tartalmazza, mintavétellel és -feldolgozással kapcsolatos információk Kistenich és mtsai. (2014) publikációban olvashatók.

4.2. A környezeti változók mérése

A dunai fitoplankton mintavételek során mért környezeti változók a következők: vízhőmérséklet, összes lebegőanyag, ammónium-, nitrátion, ortofoszfát és a-klorofill koncentráció, kémiai oxigénigény, vízhozam. Az minimum és maximum átlagértékeket a 8. táblázat tartalmazza. A dolgozatban a jelenleg alkalmazott mérési módszereket mutatom be. Korábban klasszikus módszerekkel, laboratóriumban történt e változók mérése, az eljárások azóta változtak, de úgy, hogy az eredmények összevethetőek legyenek. A Cyclotella ocellata/Cyclotella comensis komplex vizsgálatához történt mintavételek alkalmával következő környezeti változókat mértük: vezetőképesség, pH, oldott oxigén tartalom, vízhőmérséklet, zavarosság, ammónium-, nitrát-, karbonát-, hidrogénkarbonátion, ortofoszfát, összes foszfor és a-klorofill koncentráció. Az adatokat a Függelék F/2. táblázat tartalmazza. A vízhőmérsékletet (T), vezetőképességet (cond.), pH-t és oldott oxigén koncentrációt (DO) WTW multiline hordozható mérőműszerrel, a zavarosságot pedig Lovibond PC Checkit® műszerrel a mintavétel helyén mértük. Az összes lebegő anyagot (TSS, total suspended solids) gravimetriásan határoztuk meg (Eaton és mtsai. 2005), a membránszűrő pórusátmérője 0,45 µm volt. Az ammónium + - koncentrációt (NH4 ) az ISO 7150-1:1984 szabvány szerint, a nitrát koncentrációt (NO3 ) nátrium-szalicilát módszerrel (Vijayasarathy 2011) mértük. Az ortofoszfát koncentráció

(SRP) mérése ammónium-molibdát módszerrel, az összes foszfor koncentráció mérése manuális emésztési módszerrel (Eaton és mtsai. 2005), a kémiai oxigénigény (KOI) mérése pedig savas kálium-permanganát módszerrel (ISO 8467: 1993) történt. Az a-klorofill koncentrációt (chl-a) forró metanollal történő kivonás után spektrofotometriásan (Iwamura és 2- - mtsai. 1970) mértük. A karbonát (CO3 ) és hidrogénkarbonát (HCO3 ) ionok koncentrációját 0,1 M HCl felhasználásával volumetriás titrálással, a kalcium és magnézium ionok koncentrációját pedig 0,01 M EDTA oldat felhasználásával komplexometriás titrálással határoztuk meg. A vízhozam (WD) adatokat az Országos Vízügyi Főigazgatóság honlapjáról (www.hydroinfo.hu) szereztük.

A dolgozatban látható térképeket ESRI ArcInfo 9.3 GIS programmal készítettük. A S. potamos elterjedési térképének elkészítéséhez használt publikációk Duleba és mtsai. (2014) cikkben találhatók.

4.3. Biomassza meghatározás és morfológiai vizsgálat

A S. potamos biomasszáját (nedves tömegét) a következőképpen határoztuk meg: 50 egyed átmérőjét (d) és pervalvaris tengelyének hosszát (l) lemértük, ebből kiszámoltuk a sejt térfogatát (a sejt alakját hengernek véve) a (d/2)2*π*l képlettel, és megszoroztuk a sejtszámmal (Utermöhl 1958). Ha a minta egyedszáma mililiterenként 1000-nél kisebb, akkor kevesebb, mint 50 Skeletonema egyedet mértünk le. A térfogatot Menden-Deuer és Lessard (2000) formulája szerint számoltuk át széntartalommá.

4.4. Morfológiai vizsgálat

A Lugol-oldattal tartósított minták egy részét hagytuk ülepedni, hogy koncentráljuk a kovaalga sejteket, melyeket azután sósavval és hidrogén-peroxiddal tisztítottunk meg a szerves anyagtól (roncsolás, CEN 2003). Roncsolás közben a mintákat általában főztük (forró hidrogén-peroxidos roncsolás, CEN 2003), azonban a törékeny vázú fajokat (Skeletonema potamost) tartalmazó mintákat főzés nélkül roncsoltuk (hideg hidrogén-peroxidos roncsolás, CEN 2003). A mintákat fény- illetve elektronmikroszkóppal vizsgáltuk.

A fénymikroszkópos vizsgálathoz a roncsolt mintákat desztillált vízzel mostuk, majd Naphrax® beágyazó anyagba ágyaztuk. A megfigyeléseket Olympus IX70 mikroszkóppal 1000-szeres nagyításon DIC (differenciál interferencia kontraszt) optikával végeztük. A pásztázó elektronmikroszkópos vizsgálathoz a roncsolt mintákat desztillált vízzel mostuk, majd 3 µm pórusátmérőjű membránszűrőre szűrtük. A mintát tartalmazó szűrőlapot szénkorong segítségével fémtuskóra rögzítettük, majd arany-palládium illetve arany réteggel vontuk be. Az arany-palládiummal bevont preparátumokat Hitachi S-2600N, az arannyal bevont mintákat Zeiss EVO MA10 elektronmikroszkóppal vizsgáltuk. A S. potamosról TESLA BS500 transzmisszós elektron mikroszkóppal (TEM) is készültek felvételek.

4.5. A Cyclotella ocellata/Cyclotella comensis komplex morfometriai vizsgálata

Pásztázó elektronmikoszkóp alatt az egyes mintákból 15-30 véletlenszerűen kiválasztott valvát fényképeztünk le belső illetve külső nézetből. Tizenegy morfometriai változót mértünk (tpsDig2 programmal, Rohlf 2004) illetve számoltunk a lefényképezett valvákon (ezeket a 9. ábra szemlélteti). A külső és belső nézetben is vizsgált paraméterek:  valva átmérő (jelölése: d)  a centrális area átmérője (jelölése: dCA)  a marginális fultoportulák száma (jelölése: MFP) A csak külső nézetben vizsgált paraméterek:  szélesebb benyomódások (orbiculi depressi) száma (jelölése: OD)  pontszerű bemélyedések (punctumok) száma (jelölése: puncta)  a striák száma a valvafelszín szélén (jelölése: stria)  a kettéágazó striák száma (jelölése: divstria)  a radiálisan szimmetrikus szektorok száma (jelölése: ns) A csak belső nézetben vizsgált paraméterek:  valvafelszíni fultoportulák száma (central fultoporulae, jelölése: CFP)  a rimoportulák száma (jelölése: RP)  a rimoportuláknak a valva peremével bezárt szöge (jelölése: RP ang) Mivel a legtöbb paraméter (az egyetlen kivétel a puncta volt) a valvaátmérővel összefüggött (szignifikáns Spearman-féle rangkorreláció), ezért átalakításokkal igyekeztünk függetlenné tenni a paramétereket az átmérőtől. A centrális area átmérőjét elosztottuk a

44 valvaátmérővel (dCA/d). A valva és centrális area alakját körnek véve, kiszámoltuk a valva kerületét és a centrális area területét, aminek segítségével meghatároztuk a 10 µm valvakerületre eső stria, elágazó stria és MFP számot (stria/10, divstria/10, MFP/10), valamint a 10 µm2 centrális area területre eső OD és puncta számot (OD/10CA, puncta/10CA). A valvák szerkezeti elemeit Genkal (1977, 1984) módszerei szerint mértük és elemeztük, figyelembe véve Theriot (1987) munkáját. Anonymous (1975), Ross és mtsai. (1979) valamint Theriot és Serieyssol (1994) terminológiáját követtük.

9. ábra: A mért morfometriai paraméterek és a számolt morfológiai bélyegek a valva külső (A) és belső oldalán (B). Jelölések: d = valva átmérő, dCA = a centrális area átmérője, OD = orbiculi depressi, MFP = marginális fultoportula, CFP = valvafelszíni fultoportula, RP = rimoportula, RP ang = rimoportula labium irányultsága, divstria = a kettéágazó stria.

4.6. Molekuláris vizsgálatok

4.6.1. DNS-kivonás DNS-vizsgálat céljára nem, illetve abszolút etanollal (Reanal) tartósított mintákat használtunk. Feldolgozás szempontjából a minták két csoportra oszthatóak. A fény- illetve elektronmikroszkópos vizsgálat alapján egyes mintákból közösségi DNS-t vontunk ki, más mintákból pedig sejteket izoláltunk (2. táblázat).

2. táblázat: A minták feldolgozásának módja. Mintavételi A minta A választott módszer oka hely tartalma izolált, kétsejtes sejtek izolálásához elegendő számú S. potamos egyed a Göd (Duna) láncok mintában

Tiszaújváros

potamos közösség sejtek izolálásához kevés S. potamos egyed a mintában

(Tisza) Skeletonema Skeletonema

Himódi,

Dunaharaszti a SEM vizsgálat során a C. ocellata/C. comensis (2012 és 2013),

Cyclotella Cyclotella közösség komplexnek csak az egyik vizsgált tagját láttuk (és

/ / Hegyeshalmi, nem láttunk más Thalassiosirales fajt)

komplex Szanyi bányató, Csiszlói-tó

comensis Nyékládházai nemcsak az egyik vizsgált faj volt jelen a SEM bányató, izolált sejtek

Cyclotella ocellata Cyclotella vizsgálat alapján Visovac-tó

A közösségi DNS-t a következők szerint vontunk ki. A mintákhoz először lízis puffert kevertünk (10 mM Tris, 1 mM Na2-EDTA, 200 mM NaCl, 0,02% SDS, pH=8), majd -20°C- on inkubáltuk 30 percig, ezután pedig 95°C-on 10-15 percig. A sejtek feltárását a vázuk törékenységének megfelelő módszerrel folytattuk. A gyengén kovásodott, törékeny vázú Skeletonema potamost tartalmazó mintát 10 percig 14000 g gyorsuláson centrifugáltuk. Az erősebb vázzal rendelkező Cyclotella ocellata/Cyclotella comensis sejteket tartalmazó mintákat 10 percig 14000 g gyorsuláson centrifugáltuk, majd a csapadékot 2 percig 25 Hz rezgésszámmal sejtmalomban rázattuk üveggyöngyökkel. Ezt követően mindegyik mintában Proteinase K (rekombináns, Fermentas) enzimmel emésztettük a fehérjéket 56°C-on 3 órán keresztül. Az így kinyert DNS-t DNeasy® Plant Mini Kit (Qiagen) segítségével tisztítottuk a gyártó leírását követve. A másik mintacsoportot a következőképpen készítettük: Olympus IX70 inverz fénymikroszkóp alatt, 400-szoros nagyításon mikromanipulátor segítségével adott fajba tartozó sejteket 100 µl steril TE pufferbe (10 mM Tris, 1 mM Na2-EDTA, pH=8) vagy 2X Phire Pant PCR pufferbe (Phire Plant PCR Kit, Thermo Scientific) izoláltunk, ebből nyers lizátumot állítottuk elő. A törékeny vázú Skeletonema potamos sejtekből 5 percig tartó 20000 g gyorsuláson történő centrifugálással szabadítottuk fel a DNS-t. Az erősebb frusztulummal rendelkező sejtek DNS-ét hődenaturációt (95°C 15 perc), a fehérjék enzimes emésztését (Proteinase K, rekombináns, Fermentas) és centrifugálást (20000 g, 5 perc) magába foglaló

46 eljárással nyertük ki. A nyékládházai mintából két izolálást készítettünk: a Nyékládháza I elnevezésű minta fénymikroszkópban is jól látható OD-vel rendelkező sejteket tartalmazott, míg a Nyékládháza II-be fénymikroszkópban látható OD-vel nem rendelkező sejteket válogattunk.

4.6.2. Primertervezés és polimeráz láncreakció Az első, Skeletonema potamos-ra irányuló vizsgálatsorozatban, a National Center for Biotechnology Information (NCBI) intézet GenBank adatbázisából letölthető Skeletonema szekvenciák felhasználásával, a polimeráz láncreakciókhoz és az azt követő bázissorrend meghatározáshoz (szekvenáláshoz) a nemzetségre specifikus kezdőszekvenciákat (primereket) terveztünk a nukleáris 18S és 28S rDNS-re valamint a kloroplasztisz genomban kódolt rbcL és psbC génekre (a primerek szekvenciái az 3. táblázatban találhatók). A NCBI Primer-BLAST alkalmazásának (Ye és mtsai. 2012) segítségével határoztuk meg primerek helyét és ellenőriztük specificitásukat, a primerek elméleti olvadáspontját és a dimer képződés valószínűségét az Integrated DNA Technologies cég OligoAnalyzer alkalmazásával számítottuk ki. A primerpárok pontos anellációs hőmérsékletét gradiens PCR-rel határoztuk meg. A primerek specificitásáról a gyakorlatban S. potamos-on végzett vizsgálatokból szereztünk információt. A további, nem Skeletonema-ra vonatkozó vizsgálatokban csak azokat a 18S rDNS és rbcL primereket használtuk, melyek főleg a Thalassiosirales rend tagjaira bizonyultak specifikusnak. Úgy véltük, hogy ha eltérés (mismatch) fordult elő egy adott szekvencia és a primer közt a primer 3’ végén (különösen a 3. pozícióban), ez meg tudja akadályozni a primer kötődését. Kiegészítésképpen, a Skeletonema nemzetségre specifikusnak bizonyult 18S rDNS primerek primerek helyett a Medlin és mtsai. (1988) által eukariótákra tervezett 1F és 1528R primereket használtuk. A PCR-khez négyféle DNS-polimerázt is kipróbáltunk. A munkát a Fermentas Taq polimerázzal kezdtük. Ezzel az enzimmel amplifikáltuk az izolált S. potamos sejtekből a 28S rDNS és a psbC szakaszokat. Azonban egyes mintákból ezzel az enzimmel nem sikerült PCR- terméket előállítani, ezért Dream TaqTM DNS-polimerázra (Thermo Scientific) váltottunk, ami elég hatékonynak bizonyult, így a legtöbb minta esetében ezt alkalmaztuk.

3. táblázat: A DNS-vizsgálatokhoz használt primerek. 1Az első PCR-ben használt primerek. 2A nested PCR- ben használt primerek. sSzekvenáló primerek. Az 1F és 1528R jelű primereket Medlin és mtsai. (1988) cikkéből, az rbcL66F jelzésű primert Alverson és mtsai. (2007) munkájából vettük át, a psbC_F és psbC_R primereket Alverson és mtsai. (2007) által, a dp7R primert Daugbjerg és Andersen (1997) által tervezett primerek módosításával alakítottuk ki. A többi primert 4.3.2. fejezetben leírtak szerint terveztük. A félkövér betűstílussal jelzett primerekről bebizonyosodott, hogy specifikusak a Skeletonema nemzetségre. Az utolsó oszlop azt a taxont jelöli, amelynek a filogenetikai vizsgálatában az adott primert használtuk. A rövidítések magyarázata a következő: Sp = Skeletonema potamos, Co = Cyclotella ocellata/Cyclotella comensis komplex, Lr = Lindavia radiosa. Név Marker Szekvencia (5’-3’ irányban) Taxon 1F1 18S rDNS AACCTGGTTGATCCTGCCAGTA Lr Sk-50F1 18S rDNS CATGTGTAAGTATAAGATACTT Sp Sk-600F2,s 18S rDNS AAATCCCTTATCGAGTATCA Sp, Co Sk-900Fs 18S rDNS TTGGTTTGCGAGTCAAAGTA Sp, Co Sk-1550R1,2,s 18S rDNS TCTCGGCCAAGGTTATAT Sp, Co, Lr Sk-1850R1,2,s 18S rDNS TACGGAAACCTTGTTACGACTTCA Sp 1528R1 18S rDNS CTTCTGCAGGTTCACCTAC Lr Sk-28S-15F1 28S rDNS CTAGATTTGGTAGGTGCACTT Sp Sk-28S-120F2,s 28S rDNS CCGGAATGAATGTACCTCATCTAT Sp CTGTTACTTTCATTACGCATATCAG Sp Sk-28S-860Rs 28S rDNS T Sk-28S-1250R1,2,s 28S rDNS AACCTTCATTCGACGCCAG Sp psbC_F1 psbC ACAGGTTTCGCTTGGTGGAGTGG Sp Sk-psbC90F2,s psbC TTTTGGGCTGGTGCAATGATCTT Sp Sk-psbC890Rs psbC TTGCACCTAAACGTTGATCACG Sp psbC_R1,2,s psbC CACGACCAGAATGCCACCAGT Sp TTAAGGAGAAATAAATGTCTCAAT Sp, Co, Lr rbcL66F1,s rbcL CTG Sk-rbcL90F1,2,s rbcL TGTGATTTATTTGAAGAAGCTT Sp Sk-rbcL400Fs rbcL ATTAACTCTCAACCATTCATGC Sp, Co Sk-rbcL975Rs rbcL CAACATCATCACCTAAATAGTG Sp, Co GCTGTATCTGTAGAAGTATAGTCG Sp Sk-rbcL1210R1,2,s rbcL A dp7R1,s rbcL AAGCAACCTTGTGTAAGTCTC Sp, Co, Lr

A Nyékládháza II és Visovac minták esetében a termékmintaként kapott Phire® Hot Start II DNS polimerázt és Phire Plant PCR Kitet (Thermo Scientific) próbáltuk ki. A Stechlin-tóból származó, S1 jelű Lindavia radiosa tenyészetből a 18S rDNS felszaporításához HotMaster Taq polimerázt (5 Prime) használtunk, mivel ezt a kísérletet egy, a bremerhaveni Alfred

Wegener Intézetbe tett tanulmányút során nyílt alkalmam elvégezni, és az ottani kutatók ezt a polimerázt alkalmazzák. Az alkalmazott enzimhez igazítottuk a reakcióelegy összetételét (4. táblázat) és a reakció hőmérsékleti profilját is (5. táblázat). Az anellációs hőmérsékletet adott primerpár esetében gradiens PCR-rel határoztuk meg (6. táblázat). A PCR termék várható hossza és az alkalmazott Taq polimeráz gyártójának leírása alapján állítottuk be az egyes reakciók indításakor az extenziós lépések időtartamát.

4. táblázat: A PCR elegyek összetétele az alkalmazott enzimtől függően. Koncentráció/térfogat Phire® Hot Start Dream TaqTM II DNS HotMaster Taq polimeráz DNS-polimeráz Összetevő polimeráz Taq polimeráz (Fermentas) (Thermo (Thermo (5 Prime) Scientific) Scientific) DNS-polimeráz 1 U 1,25 U 0,4 µl 0,05 U puffer 1X 1X 1X 1X a puffer a puffer a puffer MgCl 2 mM 2 tartalmazta tartalmazta tartalmazta dATP, dCTP, dGTP, a puffer 200 mM 200 mM 0,2 mM dTTP tartalmazta forward primer 0,325 µM 0,325 µM 0,5 µM 0,5 µM reverz primer 0,325 µM 0,325 µM 0,5 µM 0,5 µM BSA 0,1 mg/µL - - - templát DNS 1-3 µl 1 µl 10 izolált sejt 1 µl Végtérfogat 25 µl 25 µl 20 µl 50 µl

A PCR-termékeket 1 vegyes %-os agaróz gélben, TBE pufferben, 20 percig 100 V-on történt gélelektroforézis után ECO Safe Nucleic Acid Staining Solution (Avegene) festékkel megfestve UV alatt detektáltuk. A nyers lizátumokban és bizonyos esetekben, a közösségi mintákban is alacsony volt a célfaj sejtjeinek száma, és így DNS-ének koncentrációja. Ezért PCR termékét felhasználva egy második PCR-t is végeztünk, vagy ugyanazokkal a primerekkel, vagy az egyik primert egy a vizsgált szakaszon bentebb (a másik primer kötőhelyéhez közelebb) kötő primerre cserélve, vagyis ún. semi-nested elrendezésben. A szekvenáló reakciókat és a kapilláris elektroforéziseket a Biomi Kft. munkatársai végezték. A kapott szekvenciák a DDBJ/EMBL/GenBank adatbázisokban a KF621297- KF621302 (S. potamos), KJ755337-KJ755348 (C. ocellata/C. comensis komplex), KU295761- KU295762 (L. radiosa) számon érhetőek el.

5. táblázat: A PCR-k hőprofilja. *adott primerpár esetében gradiens PCR-rel határoztuk meg, **a várt termék hosszától függ; az enzim 1 perc alatt 1 kb hosszúságú szakasz polimerizációját katalizálja. Fermentas Taq polimerázzal kezdeti 32 ciklus végső ill. DreamTaqTM DNS- denaturáció extenzió polimerázzal denaturáció anelláció extenzió hőmérséklet (°C) 98 94 52-63* 72 72 60-90 időtartam 5 perc 1 perc 30 mp 10 perc mp** Phire® Plant Direct PCR kezdeti 40 ciklus végső Kittel denaturáció denaturáció anelláció extenzió extenzió hőmérséklet (°C) 98 94 60 72 72 időtartam 5 perc 5 perc 5 mp 30 mp 1 perc kezdeti 35 ciklus végső HotMaster Taq polimerázzal denaturáció denaturáció anelláció extenzió extenzió hőmérséklet (°C) 94 94 58 72 72 időtartam 5 perc 1 perc 2 perc 2 perc 1 perc

6. táblázat: A polimeráz lácreakciókban és szekvenáló reakciókban, a különböző primer párokhoz alkalmazott anellációs hőmérséklet értékek. Anellációs Marker Forward primer Reverz primer hőmérséklet (oC) 18S rDNS Sk-50F Sk-1550R 52 18S rDNS Sk-600F Sk-1550R 52 18S rDNS Sk-250F Sk-1850R 60 18S rDNS Sk-250F Sk-1550R 60 18S rDNS Sk-900F Sk-1850R 60 28S rDNS Sk-28S-15F Sk-28S-1250R 58 28S rDNS Sk-28S-120F Sk-28S-1250R 63 psbC psbC_F psbC_R 61 psbC Sk-psbC90F psbC_R 62 rbcL rbcL-66F dp7 56 rbcL Sk-rbcL90F Sk-rbcL975R 52 rbcL rbcL-66F Sk-rbcL1210R 58 rbcL Sk-rbcL90F dp7 55

4.6.3. A szekvenciák elemzése: filogenetika és genetikai távolság A szekvenciák elemzéséhez a MEGA (Molecular Evolution Genetics Analysis) szoftver 5.05 (Tamura és mstai. 2011) illetve 6 (Tamura és mtsai. 2013) verzióját használtuk. A programba épített Clustal W algoritmussal állítottuk össze a több fragmentumból álló szekvenciákat. A szekvenálás során kapott, illetve a fragmentumokból összeállított szekvenciákat, az NCBI GenBank adatbázisában lévő szekvenciákhoz illesztettük BLAST (Basic Local

Alignment Search Tool, Altschul és mtsai. 1990) alkalmazás segítségével, hogy megtaláljuk, hogy az adatbázis mely szekvenciáival mutatják a legnagyobb hasonlóságot. A keresést a nukleotid adatbázisban (Nucleotide collection database, nr/nt) Standard Nucleotide BLAST programmal, megablast (highly similar sequences) algoritmussal végeztük az alapbeállítás mellett. A S. potamos szekvenciáinkat elsősorban a következő szerzők cikkéhez tartozó szekvenciákkal vetettük össze (az elérési számokat a 13-14. ábrák, Függelék F/3-F/6. ábrák tartalmazzák): Alverson és Kolnick (2005), Sarno és mtsai. (2005, 2007), Alverson és mtsai. (2007), Kooistra és mtsai. (2008), Alverson (2014), Yamada és mtsai. (2013, AB728775.1 számú 18S rDNS szekvencia, AB728772.1 számú 28S rDNS szekvencia). Az összehasonlításokhoz Dr. Andrew J. Alverson a Missouriból (38°46’42”N 90°28’48”W) izolált S. potamos tenyészetéből származó szekvenciákat (ma már a KJ081744- KJ081747 számon elérhetőek), illetve Dr. Mirko Dreßler Cyclotella ocellata (Kiesgrube- Krugsdorf, Németország), Cyclotella comensis (Baggersee, Ausztria), Cyclotella pseudocomensis (Hausssee, Németország), Cyclotella costei (Gültzsee, Németország és Fernsteinsee, Ausztria) tenyészetek szekvenciáit bocsátotta rendelkezésünkre. Ezek közül a Cyclotella szekvenciák Kistenich és mtsai. (2014) munkájának eredményei. A MEGA program Clustal W algoritmusának segítségével saját szekvenciáinkat az NCBI GenBank adatbázisból letöltött szekvenciákhoz hasonlítottuk. Az illesztett szekvenciákat mindkét oldalon azonos hosszúságúra vágtuk, ezzel eltávolítottuk a hiányzó adatokat tartalmazó pozíciókat. A Cyclotella ocellata filogenetikai vizsgálata során az rbcL szekvenciákat MEGA6 program Clustal W algoritmusával kodon szerint illesztettük, 18S szekvenciákat pedig az RNS másodlagos szerkezete szerint illesztettük a GenBank adatbázisból letöltött szekvenciákhoz SILVA Incremental Aligner (SINA, Pruesse és mtsai. 2012, elérhető a http://www.arb-silva.de/aligner/ címen) programmal. A MEGA program „Find best DNA/Protein models” opciója segítségével határoztuk meg az egyes gének esetében a legmegfelelőbb szubsztitúciós modellt. A program által ajánlott modellek közül a Bayes információs kritérium (Bayesian Information Criterion, BIC) szerinti legmegfelelőbbet választottuk. Az ajánlott modellek (7. táblázat) alapján ugyanezzel a programmal készítettünk külön-külön a gének szekvenciáin maximum likelihood elemzéseket és fákat, melyeket bootstrap módszerrel 500 ismétlésben teszteltünk.

7. táblázat: A MEGA5 illetve MEGA6 program „Find best DNA/protein models” funkciója által ajánlott szubsztitúciós modellek. A rövidítések a következők: K2=Kimura kétparaméteres modellje (Kimura 1980), HKY=Hasegawa-Kishino-Yano modell (Hasegawa és mtsai. 1985), T92=Tamura 1992-es modellje (Tamura 1992), TN93 = Tamura és Nei modellje (Tamura és Nei 1993), GTR=generalised time-reversible model (Rodríguez és mtsai. 1990), G=gamma eloszlás a pozíciók között, I=invariáns pozíciók meglétének feltételezése. * A Skeletonema potamos illetve a Cyclotella ocellata és Cyclotella bodanica filogenetikai helyzetének meghatározásához a Thalassiosirales rend eltérő képvisekőinek szekvenciáit használtuk fel, valamint az összehasonlított szekvenciák hossza is különbözött, ezért különbözhet a szubsztitúciós modell a két esetben. Szubsztitúciós Marker Klád Kérdéses taxon modell Skeletonema potamos T92+G+I 18S rDNS Thalassiosirales Cyclotella ocellata és Cyclotella TN93+G* bodanica 28S rDNS Thalassiosirales TN93+G+I Skeletonema potamos rbcL Thalassiosirales GTR+G+I Skeletonema potamos psbC Thalassiosirales GTR+G+I Skeletonema potamos 28S rDNS Skeletonema TN93+I Skeletonema potamos 18S rDNS Skeletonema K2+G Skeletonema potamos Cyclotella- Cyclotella cf. ocellata és 18S rDNS Stephanodiscus- HKY+G Cyclotella cf. comensis Cyclostephanos Cyclotella- Cyclotella cf. ocellata és rbcL Stephanodiscus- TN93+G Cyclotella cf. comensis Cyclostephanos

Bayes elemzéseket végeztünk a szekvencia adatokon génenként külön-külön illetve a géneket egymással kombinálva is. A posterior valószínűségeket a MrBayes 3.2 (Ronquist és mtsai. 2012) programba épített Metropolis-kapcsolt Markov-lánc Monte Carlo (Metropolis- coupled Markov Chain Monte Carlo, MCMCMC) módszerrel becsültük. Az elemzésben két futást indítottunk, mindkettőben egy cold-chain („hűvös lánc”) és három heated-chain („hevített lánc”) indult („robotok”). Az elemzést úgy állítottuk be, hogy minden 100. generációban vegyen mintát, és a minták első 25%-át zárja ki (burn-in). A két futás konvergenciájának ellenőrzésére az alapbeállítás szerinti diagnosztikát (a független elemzések split frekvenciáinak átlagos szórása, average standard deviation of split frequencies across independent analyses) alkalmaztuk. Az elemzést addig folytattuk, amíg ez az érték 0,01 alá csökkent, vagy amíg 0,01 és 0,03 között elért egy adott értéket, amely körül ingadozott. A másik diagnosztikai érték a PSRF (potential scale reduction factor) volt, amely minden paraméter esetében 1-hez közeli értéket mutatott, jelezve, hogy az elemzés elég ideig futott, és a két futás konszenzusából elkészíthető a legvalószínűbb fa. Az átlagos becsült mintaméret (estimated sample size, ESS) az összes paraméter esetében nagyobb volt, mint a minimum ESS. A törzsfákat FigTree v.1.3.1. (Rambaut 2009) programmal jelenítettük meg.

A szekvenciák közti különbségek ábrázolására, manuálisan, parszimónia hálózat ábrákat készítettünk (a C. ocellata/C. comensis komplex vizsgálata esetében), illetve p-távolság értékeket számoltunk MEGA6 (Tamura és mtsai. 2013) segítségével, valamint manuálisan a következő képlet szerint: azoknak a pozícióknak a száma, melyekben eltérést mutattak p − távolság = az összes összehasonlított pozíció száma A C. ocellata filogenetikai vizsgálata során csoporton belüli és csoportok közötti átlagos p- távolság értékeket is számoltunk manuálisan és MEGA6 (Tamura és mtsai. 2013) segítségével. Az ugyanabba a nemzetségbe tartozó fajok/tenyészetek/izolátumok szekvenciáit tekintettük egy csoportnak.

4.7. Statisztikai elemzések

A Skeletonema potamos abundancia és biomassza adatait összevetettük a mért környezeti változókkal, hogy megtudjuk, mely változó(k) gyakorolja/ják a legnagyobb hatást a faj eloszlására a Dunában. Mivel a S. potamos előfordulása a Dunában a meleg időszakra (május- október) korlátozódik, ezért az elemzésekbe az egyes évekből csak a májustól októberig tartó időszak adatait vontuk be. Mivel a teljes fitoplankton abundancia és biomassza az elmúlt évtizedekben csökkenő tendenciát mutat (Verasztó és mtsai. 2010), és ugyanez tapasztalható a S. potamos esetében is, ezért relatív abundancia és biomassza adatokkal dolgoztunk. Az a- klorofill adatokon köbgyök, a lebegő anyag, vízhozam és ammónium ion adatokon + - négyzetgyök transzformációt végeztünk. A trofitással összefüggő változókra (NH4 , NO3 , SRP, KOI és a-klorofill) R programnyelv (R Development Core Team 2010), „vegan” csomag (Oksanen és mtsai. 2013) segítségével főkomponens analízist végeztünk, melynek első két főkomponensét (PCA1 és PCA2) használtuk fel a következő elemzésben a trofitás és tápanyag elérhetőség jelzésére. Lineáris kevert hatás modellt illesztettünk a S. potamos relatív abundancia és biomassza adatokra az „nlme” csomag (Pinheiro és mtsai. 2013) segítségével. A modellben a vízhozam, vízhőmérséklet, a lebegő anyag, valamint a PCA1 és PCA2 tengelyek képviselték a rögzített hatásokat, míg az év és a hónap a random hatásokat. A Cyclotella ocellata/Cyclotella comensis komplex morfológiai variabilitásának számszerűsítéséhez mért illetve számolt változók közül a d, ns, dCA/d, stria/10, divstria/10, MFP/10, OD/10CA, puncta/10CA változókat vontuk be statisztikai elemzésbe. Pontdiagram mátrixot (scatterplot matrix) készítettünk R 3.02 (R Development Core Team 2013) környezetben a változók közti páronkénti kapcsolatok illetve a morfotípusok közti kétváltozós

53 kapcsolatok feltárására. Azért, hogy kiderítsük, hogy a különböző alakok a változók kombinácója alapján különálló csoportokat alkotnak-e, diszkriminancia analízist, más néven kanonikus változó analízist (canonical variates analysis, CVA) végeztünk Past 2.16 szoftverrel (Hammer és mstai. 2001). Ugyanezzel a programmal számoltunk korrelációt (Spearman-féle rangkorreláció) a környezeti változók és CVA-val elkülönített csoportok (morfofajok) mintákban mutatott relatív abundanciája valamint a morfometriai paraméterek mintánként átlagolt értékei között.

5. A Skeletonema potamos vizsgálata

5.1. Bevezetés

5.1.1. A Skeletonema nemzetség és a Skeletonema potamos A Skeletonema nemzetséget Greville (1865) hozta létre egy barbadosi üledékminta fosszilis faja, a Skeletonema barbadense Greville alapján. Sims (1994) kimutatta, hogy a fosszilis S. barbadense jelentősen különbözik a ma élő Skeletonema fajoktól, ezért a fosszilis fajokat a Skeletonemopsis P.A. Sims új nemzetségbe sorolta, míg a ma élők számára fenntartotta a Skeletonema nemzetséget, melynek a holotípusa a Skeletonema costatum (Greville) Cleve lett. A S. costatumot eredetileg Melosira costata Greville néven írta le Greville (1866), majd Cleve (1873) helyezte át a Skeletonema nemzetségbe az akkori típusfajhoz, a S. barbadensehez való hasonlósága miatt. Ezután különítették el morfológiai alapon a nemzetség több faját, például Skeletonema tropicum Cleve, Skeletonema cylindraceum Proshkina-Lavrenko et Makarova, Skeletonema menzelii Guillard, Carpenter et Reimann fajokat (Sarno és mtsai. 2005) vagy helyezték át más nemzetségből, például Skeletonema subsalsum (Cleve-Euler) Bethge (Hasle és Evensen 1975), S. potamos (Hasle) Evensen (Hasle és Evensen 1976) fajokat. Sarno és mtsai. (2005) egy javított diagnózist adtak a Skeletonema nemzetségről. A Skeletonema costatumot több fiziológiai vizsgálatba is bevonták (pl. Sanders 1979, Anning és mtsai. 2000), sőt ez volt az első kovaalga faj, amelyen populációgenetikai vizsgálatot végeztek (Gallagher 1980). Filogenetikai helyzetét is ennek a kovaalgának határozták meg először egy DNS-szakasz (16S-szerű (=18S) rDNS) alapján (Medlin és mtsai. 1988). Később különböző kutatócsoportok a S. costatum vagy S. costatum-szerű kovaalgákon végzett molekuláris és/vagy morfológiai vizsgálatok során számos új fajt különítettek el: Skeletonema pseudocostatum Medlin (Medlin és mtsai. 1991), Skeletonema grevillei Sarno et Zingone (Zingone és mtsai. 2005), Skeletonema dohrnii Sarno et Kooistra, Skeletonema grethae Zingone et Sarno, Skeletonema japonicum Zingone et Sarno, Skeletonema marinoi Sarno et Zingone (Sarno és mtsai. 2005) és Skeletonema ardens Sarno et Zingone (Sarno és mtsai. 2007). Alverson és mtsai. (2007) öt faj (S. grethae, S. japonicum, Skeletonema menzelii Guillard, Carpenter et Reimann, S. pseudocostatum, S. subsalsum) vizsgálata alapján megállapították, hogy a Skeletonema nemzetség monofiletikus és tengeri eredetű. Mindössze két nem tengeri faj található a nemzetségben: a S. subsalsum, mely főleg sós és félsós vizekben, alkalmanként édesvízben fordul elő (Aké Castillo és mtsai. 1995, Gibson és mtsai.

1993, Hasle és Evensen 1975, Hustedt 1957), és a S. potamos, melyet édesvízben és enyhén brakkvizű élőhelyeken találtak (Kiss és mtsai. 1994, 2012). A S. potamost eredetileg Microsiphonia potamos C.I. Weber néven írta le Weber (1970) egy 1966-ban Cincinattinél, a Little Miami folyóból gyűjtött mintából. Ugyanebből a folyóból 1973. május 25-én vett újabb mintát vizsgálva Hasle és Evensen arra a megállapításra jutott, hogy ez a faj nagyon hasonlít a Skeletonema nemzetség más fajaira, a S. costatumra és S. subsalsumra, így javasolták az áthelyezését ebbe a nemzetségbe, Skeletonema potamos (C.I. Weber) Hasle in Hasle & Evensen néven (Hasle és Evensen 1976). A szerzők egy 1922-ből, a Jensensee-ből származó mintában (Hustedt Gyűjtemény E 4555) is megtalálták a szóban forgó taxont, melyre Hustedt (1928) a Stephanodiscus subsalsus (Cleve-Euler) Hustedt nevet használta.

5.1.2. A Skeletonema potamos elterjedése és előfordulása a hazai vizekben A S. potamos széles körben elterjedt faj, több helyen is invazívnak gondolják, pl. Nagy- tavakban (Mills és mtsai. 1993), a Loire-ban (Descy és mtsai. 2012) és az Elbában (Desortová és mtsai. 2011) valamint különböző szlovákiai és csehországi álló és folyóvizekben (Kaštovský és mtsai. 2010).

10. ábra: A Skeletonema potamos elterjedése a hazai vizekben (Kiss és mtsai. 2012). A pontok a Kiss és mtsai. (2012) által vizsgált mintavételi pontok közül azokat jelölik, ahol a S. potamos előfordult.

1979-ben kezdődtek Gödnél a heti rendszerességű dunai fitoplankton vizsgálatok. A dunai fitoplankton közösség domináns tagja a S. potamos melegvizes időszakban (Kiss 1985, Verasztó és mtsai. 2010). Először az 1950-es évek végén gyűjtött mintákban találták meg a

Dunában (Kiss 1986), az 1960-as évek végére abundánssá vált a magyarországi szakaszon (Schmidt és Vörös 1981, Kiss és mtsai. 1994). A S. potamos a Duna mellett a Tiszában is előfordul (Kiss és mtsai. 2012, 10. ábra), mennyiségét tekintve domináns ill. szubdomináns tagja lehet a közösségnek (Kelemen 1992).

A S. potamos filogenetikai helyzetét négy gén alapján határoztuk meg a 4.6. fejezetben leírtak szerint. Morfológiáját fény- és elektronmikroszkóppal vizsgáltuk (4.4. fejezet). Az előfordulását befolyásoló környezeti változókat a dunai hosszútávú adatsorok statisztikai elemzésével kerestük a 4.7. fejezetben ismertetett módon.

5.2. Eredmények

5.2.1. Morfológiai jellemzés A S. potamos az egyik legkisebb Centrales faj a Dunában, vékony frusztuluma és kicsi kloroplasztiszai (11./A. ábra) vannak. Általában 2-4 sejtből álló láncokként fordul elő, de különálló sejtek és hosszabb (6-10 sejtes) láncok is előfordulhatnak. A láncokon belül a sejtek marginális fultoportulákkal kapcsolódnak össze (11./B, C. ábra), melyek kezeletlen mintában fénymikroszkóp alatt alig látszanak (11./A. ábra). A sejtátmérő 3 és 6,5 µm között változik (az átlag: 4,5 µm), a pervalváris tengely hossza pedig 5 és 18 µm között (átlag: 10 µm). A valvafelszín középen lapos és enyhén lekerekített a köpeny mellett (11./F. ábra). Finom radiális striák vannak a valvafelszínen, melyek szabálytalan poligonális areolákból állnak és melyeket kétszer-háromszor elágazó vékony interstriák választanak el egymástól (11./D, E. ábra). Négy-nyolc marginális fultoportulából álló gyűrű helyezkedik el a valva szélén (11./F, G. ábra). A fultoportulák kívülről csövesek, hasítékkal a disztális végükön, a kovaváz itt viszonylag vastag, ugyanúgy, mint a valvafelszínen, melyen a valva felszínétől a fultoportuláig terjedő kiemelkedések vannak (11./E, F, H. ábra). A fultoportulák alapjánál nincsenek külső pórusok (ellentétben a S. subsalsummal). Egy rimoportula található a marginális fultoportulák gyűrűjéhez közel (11./F. ábra), helye a terminális és interkaláris valvákon különböző lehet (hasonlóan más Skeletonema fajokhoz). A köpeny szerkezete ugyanolyan, mint a szabálytalan poligonális areolákkal rendelkező valvafelszíné (11./D, F. ábra). Az öv számos szalagból áll. A valva erősebben kovásodott, mint az öv.

11. ábra: A: fénymikroszkópos, B-D: transzmissziós, E-H: pásztázó elektronmikroszkópos felvételek a Dunából (A-F) és Tiszából (G, H) származó Skeletonema potamosról. A nyíl a rimoportulát mutatja. Mérték = 2 µm (B-G), 2,5 µm (H), 10 µm (A).

5.2.2. A primerek specificitása Tiszta (egyértelműen leolvasott) 18S és 28S rDNS szekvenciákat mind a dunai (izolált sejtek), mind a tiszai mintából (közösségi DNS) sikerült kinyerni, azonban tiszta rbcL és psbC szekvenciákat csak az izolált sejtekből.

Szekvenciáinkat össze tudtuk vetni a Missouriból származó S. potamos törzs szekvenciáival, amelyekkel egy kivétellel teljes azonosságot mutattak, így a faj azonosságáról meg tudtunk győződni. Az egyetlen kivétel az rbcL szekvencia volt, amely egy nukleotidban különbözött a missouri szekvenciától, és ez az egy eltérés is a kodon harmadik, „lötyögő” pozíciójában volt. Mindebből arra a következtetésre jutottunk, hogy 18S és 28S rDNS primereink vagy legalábbis egy részük valóban specifikus a Skeletonema nemzetségnek legalább egy fajára, és sikerrel alkalmazható egy közösségből a S. potamos kinyerésére, amennyiben csak egy Skeletonema faj van jelen. A plasztisz génekre tervezett primerek ugyanakkor konzervatívabbnak bizonyultak, és nem korlátozódtak a Skeletonema nemzetség tagjaira, ezért csak izolált sejtekből nyerhetőek velük tiszta szekvenciák.

5.2.3. Filogenetikai elemzés A dunai és tiszai mintából származó 18S (13. ábra, Függelék F/1., F/3. ábra) és 28S rDNS (14. ábra, Függelék F/1., F/4. ábra) szekvenciák egymással azonosak voltak, valamint a missouri törzs szekvenciáival is megegyeztek. Emellett egy japán brakkvizekből származó, S. subsalsum néven leírt FCH024 tenyészet szekvenciáival (18S rDNS szekvencia elérési száma AB728775, a 28S rDNS-é AB728772) is teljes egyezést mutattak. Mivel a GenBank adatbázisban lévő S. subsalsum szekvenciákkal nem, de a S. potamos szekvenciákkal megegyeztek ezek a szekvenciák, az FCH024 jelű tenyészetet minden bizonnyal tévesen határozták meg. Az egy-egy génen (Függelék F/3-F/6. ábra), a nukleáris (Függelék F/1. ábra) és plasztisz géneken (Függelék F/2. ábra), valamint a mind a négy génen (12. ábra) végzett filogenetikai elemzés szerint is a S. potamos a Skeletonema nemzetségen belül helyezkedett el, ami megerősítette a nemzetség monofiletikusságát. Legközelebbi rokonának a S. subsalsum adódott az összes elemzés szerint. A 12. ábrán is látható, hogy a S. potamos a tengeriből édesvízi környezetbe való átlépés egy újabb ágát képviseli, amely független az Alverson és mtsai. (2007) által azonosított cyclostephanoid és Cyclotella vonalaktól.

12. ábra: A Thalassiosirales fajokhoz tartozó 18S és 28S rDNS, rbcL és psbC szekvenciák alapján Bayes- módszerrel készült filogenetikai fa. A Ditylum brightwelli (T. West) Grunow, Bellerochea malleus (Brightwell) Van Heurck és Lithodesmium undulatum Ehrenberg a külcsoportok. A szubsztitúciós modelleket az 7. táblázat tartalmazza. Generációk száma: 300000, a konvergencia diagnosztikai érték az utolsó generációban: 0,004140. A nemzetségnevek rövidítése: Bacterosira (B.), Bellerochea (Be.), Cyclostephanos (Cs.), Cyclotella (Cy.), Detonula (D.), Discostella (Di.), (Dt.), Lauderia (La.), Lithodesmium (Li.), Minidiscus (M.), Porosira (P.), Shionodiscus (Sh.), Skeletonema (S.), Stephanodiscus (St.), Thalassiosira (T.). Skála = 0,03 szubsztitúció/nukleotid pozíció. A kék szín az édesvízi, a fekete a tengeri, a szürke a brakkvízi taxonokat jelöli.

A plasztisz gének alapján a S. potamos és a S. subsalsum a nemzetségen belül a többi fajtól elkülönülő kládot alkotott (Függelék F/2. ábra). Mivel több Skeletonema fajból érhető el 18S rDNS és 28S rDNS szekvencia a GenBank adatbázisban, mint rbcL vagy psbC, ezért a riboszómális gének alapján megvizsgálhattuk a S. potamos helyzetét más Skeletonema

60 fajokhoz képest. S. costatum rbcL és psbC szekvenciákat csak az egygénes elemzésekbe vontuk be (Függelék F/5-F/6. ábra), mivel ezek a szekvenciák két különböző törzsből származtak. Mindkét riboszómális gén alapján a S. potamos-S. subsalsum ág a S. costatumot is magában foglalta, de ennek a vonalnak a helyzete különbözött a 18S (13. ábra) és a 28S rDNS fán (14. ábra).

13. ábra: A Skeletonema fajokhoz tartozó 18S rDNS szekvenciák alapján Bayes-módszerrel készült filogenetikai fa. Thalassiosira nordenskioeldii FB02-19, T. minima CCMP990, T. minuscula FB02-31 a külcsoportok. A nemzetségnevek rövidítése: Skeletonema (S.), Thalassiosira (T.). Szubsztitúciós modell: K2+G. Generációk száma: 400000, a konvergencia diagnosztikai paraméter az utolsó generációban: 0,007856. Skála = 0,02 nukleotid/pozíció. A kék szín az édesvízi, a fekete a tengeri, a szürke a brakkvízi taxonokat jelöli.

A legtöbb Skeletonema faj esetében intraspecifikus variabilitást láttunk legalább a 18S rDNS génben, a S. marinoi-dohrnii, S. menzelii, S. grethae, S. tropicum és S. costatum esetében ez mindkét riboszómális gén esetében megfigyelhető volt. Megjegyzendő azonban, hogy csak egy S. grevillei 18S rDNS szekvencia volt az adatbázisban. A S. potamos esetében mindkét gén változatlan volt (13-14. ábra).

14. ábra: A Skeletonema fajokhoz tartozó 28S rDNS szekvenciák alapján Bayes-módszerrel készült filogenetikai fa. Thalassiosira nordenskioeldii FB02-19, T. minima CCMP990, T. minuscula FB02-31 a külcsoportok. A nemzetségnevek rövidítése: Skeletonema (S.), Thalassiosira (T.). Szubsztitúciós modell: TN93+I. Generációk száma: 500000, a konvergencia diagnosztikai paraméter az utolsó generációban: 0,010370. Skála = 0,3 nukleotid/pozíció. A kék szín az édesvízi, a fekete a tengeri, a szürke a brakkvízi taxonokat jelöli.

5.2.4. A Skeletonema potamos földrajzi elterjedése A S. potamos széles körben elterjedt a mérsékelt övben (15. ábra). Európában a leggyakoribb, főleg nagy folyókban és azok tározóiban, lassú folyású mellékfolyóiban és a kapcsolódó tavakban (összesen 91 víztestben).

15. ábra: A Skeletonema potamos elterjedése a világon [a koordinátákat és a hozzájuk tartozó irodalomjegyzéket Duleba és mtsai. (2014) publikáció tartalmazza]. A nyíl Weber (1970) leírása szerinti típushelyet mutatja.

Észak-Amerikában eddig pár tóban, és az Atlanti- illetve a Csendes-óceánba torkolló folyókban és torkolataikban találták meg (összesen 61 víztestben). Emellett Brazíliában és Argentínában is kimutatták folyókból és az Atlanti-óceán mentén lévő lagúnákból (összesen 5 víztestből). Ázsiában az Ob folyóban, a mongóliai Hövszgöl-tóban és egy Xiamennél lévő csatornában, valamint Japánban négy tóban és az Ariake-tengerben fordult elő. Ausztrália három folyójában is megtalálták. Tengerekben és lagúnákban beömlő folyók torkolati szakaszán fordult elő, ahol a sótartalom kisebb, például a Patos-lagúnában azokon a területeken, ahol kimutatták, a szalinitás 8‰ alatt volt (Torgan és mtsai. 2009).

5.2.5. A Skeletonema potamos mennyiségének hosszú távú változása a Dunában a környezeti változók alakulásával összefüggésben A vizsgált időszakban mért környezeti változók minimum és maximum értékeit az 8. táblázat tartalmazza. Mivel a S. potamos abundanciája és biomasszája a meleg időszakban (májustól októberig) mutat szezonális csúcsokat, ezért a 1979-től 2012-ig tartó adatsorból csak ezeket az adatokat használtuk fel arra, hogy elemezzük, mely környezeti tényezők

63 befolyásolják e faj mennyiségét. Tehát a következőkben közölt adatok erre a meleg időszakra vonatkoznak. A S. potamos aránya a teljes fitoplankton abundanciában (16./A. ábra; R2=0,035, p<0,001) és biomasszában (16./B. ábra; R2=0,028, p<0,001) szignifikáns növekedést mutatott az utóbbi harminc évben. Az átlagos relatív abundanciája 5,2%-ról 23,6%-ra, míg az átlagos relatív biomasszája 11,3%-ról 35,1%-ra nőtt 1979-től 2009-ig. A S. potamos aránya 2009-ben érte el a legmagasabb értékeket (abundancia:87,4%, biomassza: 91,4%) a vizsgált időszakban. A relatív abundancia és a relatív (szénben kifejezett) biomassza alapján készült lineáris kevert hatás modell szerint is a vízhőmérséklet (az abundancia alapú modellben meredekség: 0,15, p<0,001, a biomassza alapú modellben a meredekség: 0,13, p<0,001) és a vízhozam (az abundancia alapú modellben meredekség: -0,03, p<0,01, a biomassza alapú modellben a meredkeség: -0,03, p<0,01) volt szignifikáns tényező.

8. táblázat: A Gödnél mért környezeti változók május-október átlagának hosszú távú minimum és maximum értékei. Az értékekhez tartozó éveket zárójelben adtuk meg. Környezeti változó Minimum (év) Maximum (év) vízhozam (m3/L) 1628,83 (2003) 3163,53 (2010) vízhőmérséklet (°C) 14,88 (1984) 19,55 (2008) klorofill-a (µg/L) 13,58 (2008) 88,52 (1986) KOIps (mg/L) 3,01 (2007) 17,70 (1979) + NH4 -N (mg/L) 0,03 (2009) 0,42 (1992) - NO3 -N (mg/L) 1,28 (1992) 2,07 (1987) 3- PO4 -P (µg/L) 8,20 (2005) 88,99 (1989) összes lebegőanyag (mg/L) 11,72 (2003) 55,76 (1987)

A Duna vízhőmérséklete az 1979 és 2012 közti időszakban nőtt (8. táblázat, 16./C. ábra, R2=0,036, p<0,001). A május-októberi időszak átlaghőmérséklete 14,9-17,7°C volt az 1990- es évek végéig, 2000 és 2012 között az átlaghőmérséklet már soha nem csökkent 16°C alá, és gyakran meghaladta a 18°C-ot (16./C. ábra). Az éves maximum hőmérséklet 19,6 és 24°C között változott az 1979-1999 időszakban, míg 22 és 27°C között a 2000-2012 időszakban. A vizsgált intervallumban nagy és kis vízhozamú évek váltakoztak, de az évek során a vízhozam szignifikáns változást nem mutatott (16./D. ábra).

16. ábra: A boxplot ábrák a Skeletonema potamosnak a fitoplankton abundanciában (A) és biomasszában (B) való részesedésének, a vízhőmérséklet (C) és a vízhozam (D) a hosszú távú változását mutatják. Az adatok az 1979-2012 májustól októberig tartó időszakból származnak. 2004-ből és 2012-ből hiányoznak a vízhőmérséklet, 1999-ből pedig a relatív abundancia és biomassza adatok. A boxplotok az adatok minimumát és maximumát (az alsó és felső vízszintes vonal a „dobozon” kívül), az első és harmadik kvartilist (a „doboz” alja és teteje) valamint a mediánt (a vízszintes vonal a „dobozon” belül) mutatják. A pontok pedig a kiugró adatokat jelölik. A szürke vonalak az illesztett lineáris modelleket mutatják.

5.3. Diszkusszió

5.3.1. A Skeletonema potamos morfológiája A S. potamos a Dunában rendszerint 2-4 sejtet tartalmazó láncokat alkot. A láncok hossza feltehetően a folyam turbulenciájától függ: kisvizes időszakokban, mikor az áramlás és a turbulencia alacsony, akkor sokkal gyakoribbak a 6-10 sejtes láncok, mint nagyvizes időszakokban, mikor az áramlás és a turbulencia is erőteljesebb (Kiss és mtsai. 1994). A Dunában és a Tiszában élő S. potamos populációt vizsgáltuk, a S. subsalsummal összehasonlítva. A S. potamos valváin 4-8 csöves fultoportula figyelhető meg, melyek végén hasíték van, és nincs pórus az alapjuknál (ezek a jellemvonások láthatóak Cavalcante és mtsai. (2013) által közölt elektronmikroszkópos képeken is). Ezzel szemben a S. subsalsum 7- 14 lapos, lapos-kettéágazó vagy lapos kanálszerű marginális fultoportulával rendelkezik, melyek alapjánál egy külső pórus található (Hasle és Evensen 1975, Kiss és mtsai. 2012). Ezeket figyelembe véve, a S. potamos és S. subsalsum morfológiailag egyértelműen elkülöníthető aszerint, hogy a marginális fultoportulák alapjánál található-e külső pórus. A rimoportula alakja és helyzete a SEM képeken is alig látható, TEM-pal készült felvételeken egy kicsit jobban kivehető, ha a valvafelszín helyzete megfelelő (5.2./B, D. ábra nyíl). A rimoportula kis külső pórusát is nehéz észrevenni a SEM fényképeken.

5.3.2. A Skeletonema potamos filogenetikai helyzete A filogenetikai analízis azt mutatta, hogy a S. potamos a Skeletonema nemzetségen belül helyezkedik el (12-14. ábra, Függelék F/1-F/6. ábrák). Ez molekuláris biológiai bizonyíték arra, amit Hasle és Evensen (1976) morfológiai alapon megállapított, nevezetesen arra, hogy a Microsiphonia potamos a Skeletonema nemzetségbe tartozik. A filogenetikai vizsgálat azt is felfedte, hogy a S. potamos legközelebbi rokona a S. subsalsum. A Skeletonema nemzetség tengeri eredetű (Alverson és mtsai. 2007). A S. subsalsum eurihalin, főleg sós és félsós vizekben, alkalmanként édesvízben fordul elő (Aké Castillo és mtsai. 1995, Gibson és mtsai. 1993, Hasle és Evensen 1975, Hustedt 1957). A S. potamos némileg specializáltabb, elterjedése az édes- és enyhén brakkvízi élőhelyekre korlátozódik (Kiss és mtsai. 2012). Így a S. potamos egy újabb keletű, filogenetikailag korlátozott tenger- édesvíz átmenetet képvisel a Thalassiosirales renden belül (Alverson és mtsai. 2007). Korábbi populáció szintű vizsgálatok más Skeletonema fajoknál a riboszómális DNS esetében néha kifejezetten nagymértékű intraspecifikus variabilitást fedeztek fel (Sarno és mtsai. 2005, 2007) még intragenomiális variabilitást is (Alverson és Kolnick 2005). Ezzel

66 szemben mi nem találtunk különbséget a magyarországi, amerikai és a japán populációk 18 és 28S rDNS-ében. A Japán brakkvizéből izolált FCH024 jelű tenyészetet a szerzők (Yamada és mtsai. 2013) eredetileg S. subsalsumként azonosították, azonban a 18S (AB728775) és 28S rDNS (AB728772) szekvenciák megegyeztek a Dunából, Tiszából illetve Missouriból nyert S. potamos szekvenciákkal, ezért feltételeztük, hogy a japán törzs is ebbe a fajba tartozik. Később a NCBI GenBank adatbázisban S. potamosra javították a szekvenciákhoz tartozó fajnevet. Összevetve a S. potamos riboszómális RNS génjeinek változatlanágát a más fajokon belül tapasztalt variabilitással (Alverson és Kolnick 2005, Sarno és mtsai. 2005, 2007) arra következtethetünk, hogy a S. potamos fiatal faj, még csak nemrég terjedt el a Földön.

5.3.3. A Skeletonema potamos földrajzi elterjedése Krammer és Lange-Bertalot (1991) még viszonylag ritkának tartotta a S. potamost. Mostanra azonban már több, mint 150 víztestből írták le. Elterjedése majdnem kizárólag a mérsékelt övre korlátozódik. Az egyetlen kivétel egy trópusi sekély csatorna Brazíliában (Cavalcante és mtsai. 2013). A számos helyről származó adatok azt mutatták, hogy a S. potamos ott és akkor fordul elő, mikor a vízhőmérséklet 10 és 29°C között van (pl. Weber 1970, Muñoz Garcia 1990). Ez lehet a S. potamos hőmérsékleti tolerancia tartománya. A számára kedvezőtlen időszakokat, mikor a vízhőmérséklet túl magas vagy túl alacsony, kitartó képletek kialakításával vészelheti át (hasonlóan sok más mikroalgához, McQuoid és Hobson 1995).

5.3.4. A Skeletonema potamos és a Duna környezeti változásai közti kapcsolat A S. potamos relatív abundanciája és biomasszája a Dunában hosszú távon nőtt és pozitív korrelációt mutatott a vízhőmérséklettel, a lineáris kevert hatás modellben a vízhőmérséklet a faj relatív abundanciáját és biomasszáját jelentősen befolyásoló tényezőnek bizonyult. Kiss és mtsai. (1994) kimutatták, hogy a S. potamos évszakos dinamikája a vízhőmérséklet változásait követi. Megfigyelték, hogy a populáció júniusban indult növekedésnek, mikor a vízhőmérséklet 15°C körül volt, szeptember-októberben pedig csökkent, mikor a vízhőmérséklet 14-16°C alá esett. Hasonló trendet fedeztek fel a Little Miami (Egyesült Államok, Weber 1970) és a Rott (Németország, Chang és Steinberg 1988) folyókban élő populációk esetében is. Lehman (2000) azt találta, hogy a S. potamos gyakran fordul elő a San Francisco-öböl torkolat déli deltájában nyáron, mikor a mezőgazdasági víz kibocsátása miatt a szalinitás magas és a hosszú tartózkodási idő megnöveli a vízhőmérséklet szezonális maximumát. Kaeriyama és mtsai. (2011) kimutatták, hogy hét másik Skeletonema faj

67 előfordulását a japán Dokai-öbölben főleg a vízhőmérséklet befolyásolja, nem a besugárzás. Ebben a vizsgálatban kísérleti körülmények között a fajok 15 és 25°C közötti tartományban nőttek. A globális felmelegedés hatását a Duna más Thalassiosirales fajai esetében is megfigyelték. Kimutatták a télvégi Centrales csúcs (melyben a Stephanodiscus minutulus Kützing az egyik domináns faj) eltolódását (Kiss és Genkal 1997, Kiss 2000). A 2000-es években általában három-négy héttel korábban következik be, mint az 1980-as években. Számos szerző jósol korábbi alga biomassza maximumokat a klímaváltozáshoz kapcsolódóan, amit általában a biomassza növekedése kísér (Flanagan és mtsai. 2003, Sipkay és mtsai. 2012), különösen tavasszal (Dokulil és mtsai. 2010, Nõges és mtsai. 2010, Sipkay és mtsai. 2009, Thackeray és mtsai. 2008). A S. potamos a Tiszában is előfordul, ahol hasonló klimatikus hatásoknak van kitéve, mint a Dunában. A fentiek alapján várható lenne, hogy mindkét vízfolyásban hasonlóan abundáns legyen a faj. Azonban a Tiszában a lebegő anyag tartalom egész évben nagyobb, mint a Dunában (Istvánovics és mtsai. 2010), és ez korlátozhatja a valószínűleg nagy fényigényű S. potamos elterjedését a Tiszában. E feltevés tisztázására további bizonyítékokra van szükség. Említésre méltó, hogy más vízi ökoszisztémákban (közvetve) kimutattak kapcsolatot a S. potamos abundanciája és a fény között. A Paraná folyó rendszerében pozitív korrelációt találtak a S. potamost is magába foglaló D funkcionális csoport abundanciája és biotérfogata, valamint a Secchi-álátszóság között, mely utóbbit a szállított lebegő anyagon keresztül az áramlási viszonyok befolyásolják (Devercelli 2006, Devercelli és O’Farrell 2013). Torgan és mtsai. (2009) feltételezték, hogy a S. potamos populáció fejlődését a brazíliai Patos-lagúnában valószínűleg elsősorban a fény és/vagy láncképző Centrales fajokkal (pl. Aulacoseira granulata (Ehrenberg) Simonsen és A. ambigua (Grunow) Simonsen, melyek szintén tömegesek voltak a lagúnában) mutatott versengés befolyásolja. Az említett Aulacoseira Thwaites fajok mind a Dunában, mind a Tiszában sokkal kisebb mennyiségben vannak jelen, ezért a versengés velük feltehetően nem számottevő. A S. potamos egyik közeli rokona, a S. costatum esetében Shikata és mtsai. (2008) kimutatták, hogy a bár a kitartó képletekből történő kicsírázáshoz alacsony fényintenzitás is elég, de ezután a vegetatív sejtek életben maradásához és szaporodásához erős fény szükséges. Az elmúlt évtizedekben a Duna lebegőanyag-tartalma csökkent (17. ábra) és fényklímája javult, ami feltehetően hozzájárult a S. potamos részarányának növekedéséhez. Azonban, mivel a modellünk nem mutatta szignifikáns hatótényezőnek a lebegőanyag-tartalmat, ezért a

Dunában ennek inkább másodrendű lehet a hatása a hőmérsékletéhez képest. A S. potamos hőmérsékleti viszonyokkal szemben szűktűrésű (sztenoterm), és ez a tulajdonsága magyarázza azt is, hogy az őszi kisvizes időszakban a hideg vizes időszak beköszöntével gyakorlatilag eltűnik (Kiss és mtsai. 1994).

17. ábra: A lebegőanyag-tartalom hosszú távú változása. Az adatok az 1979-2012 májustól októberig tartó időszakból származnak. A szürke vonal az illesztett lineáris modellt mutatja (R2=0,038, p<0,001).

Korábbi vizsgálatok (Kiss és mtsai. 1994, Sipkay és mtsai. 2012, Verasztó és mtsai. 2010) kimutatták, hogy a Duna vízhozamának évközi változásai hatással vannak a S. potamos mennyiségére. Mostani vizsgálatunkban inkább a hosszú távú változásokra koncentráltunk, és szignifikáns kapcsolatot találtunk a vízhozammal a S. potamos relatív abundanciája és relatív szénbiomasszája esetében is. Tekintve, hogy a vízhozam hosszú távon szignifikáns változást nem mutatott, ezért a kapott összefüggés, inkább a szezonális változásokat tükrözheti. Eredményeink azt mutatják, hogy a S. potamos a Duna fitoplanktonjának domináns tagja lett a meleg vizű időszakokban, és szezonális dominanciát figyeltek meg más édesvízi tavakban (pl. Postmünster-tó, Chang és Steinberg 1988), folyókban (pl. Rajna, Friedrich és Pohlman 2009, Ibelings és mtsai. 1998) és torkolatokban is (pl. Chesapeake-öböl, Marshall és Egerton 2009). Mivel keveset tudunk a faj ökológiájáról, ezért ennek az eltolódásnak a következményeit sem tudjuk megjósolni. Azonban a Skeletonema fajokról ismert, hogy előidézhetnek vízvirágzást, néha közel monodomináns közösségek alakulnak ki (Borkman és Smayda 2009, Rost és mtsai. 2003). Ez annak köszönhető, hogy amikor a szilícium nem

69 limitál, nagy a növekedési potenciáljuk, ami erősebb kompetítorrá teszi őket más mikroalgákkal szemben (Egge és Aksnes 1992). Ezenkívül kimutatták, hogy a Skeletonema fajok negatív hatással lehetnek a zooplanktonra, vagy azáltal, hogy mechanikailag gátolják az ágascsápú rákok (Cladocera) táplálék szűrögetését (Müller-Solger és mtsai. 2002), vagy, hogy megzavarják az őket fogyasztó néhány evezőlábú rák (Copepoda) petéinek kikelését (Ban és mtsai. 1997, Miralto és mtsai. 1999). Ezek alapján a S. potamos dominanciája a fitoplanktonban komoly hatással lehet a táplálékhálózatra és így az energiaáramlásra nézve az adott ökoszisztémában. Ezért további vizsgálatok szükségesek a faj tápanyag körforgalomban betöltött szerepét illetően. Különösen azért, mert úgy tűnik, hogy a felszíni vizek melegedése kedvez a fajnak, ezáltal a jelenlegi élőhelyein dominánssá válhat, valamint további terjedése is várható. Ennek a kutatásnak a legfontosabb eredményeit Duleba és mtsai. (2014) cikkben publikáltuk.

6. A Cyclotella ocellataval és rokonsági körével kapcsolatos vizsgálatok

6.1. Bevezetés

6.1.1. A Cyclotella ocellata előfordulása és morfológiai variabilitása, a Cyclotella ocellata/Cyclotella comensis komplex A Cyclotella ocellata fajt Pantocsek (1901) írta le a Balatonból. Azóta világszerte számos víztestben kimutatták, főleg tavakban (pl. a spanyolországi Las Madres tó, Kiss és mtsai. 1996), de folyókban (pl. Duna magyarországi szakasza, Kiss és mtsai. 2012), kis patakokban (pl. a törökországi Türkmen-hegységben, Solak és Kulikovskiy 2013) is előfordul. Fosszilis állapotban különböző korú rétegekben is megtalálták (az oroszországi El’gygytgyn-tó pleisztocén-holocén üledékeiben, Cherepanova és mtsai. 2010), és paleolimnológiai rekonstrukciókban is alkalmazzák (pl. Fallu és mtsai. 2004). Hazánkban is számos víztestben előfordul (Kiss és mtsai. 2012), elterjedését a 18. ábra szemlélteti (az 18./A. ábrán az összes mintavételi hely és ezek közül a Cyclotella ocellata előfordulásainak bejelölése a faj gyakoriságát is mutatja).

18. ábra: A Cyclotella ocellata elterjedése a hazai állóvizekben (A, Ács és Kiss még nem publikált eredményei) és folyóvizekben (B, Kiss és mtsai. 2012).

A C. ocellata nagy morfológiai variabilitást mutat. Ezt elsősorban típusanyagának újbóli vizsgálata bizonyította (Kiss és mtsai. 1999), de más területekről származó minták elemzésekor is megfigyelhető volt: például a németországi Dagow-tó (Schlegel és Scheffler 1999), a spanyolországi Las Madres-tó (Kiss és mtsai. 1996), a chilei Rapel-víztározó (Rivera és mtsai. 2003), a mongóliai Hövszgöl-tó (Genkal és Popovskaya 2008a), az Északkelet-

Szibériában található El’gygytgyn-tó (Cremer és mtsai. 2005), északnyugat-németországi Gallberg-tó (Hegewald és Hindáková 1997). Emiatt a nagy morfológiai változatosság miatt, és a C. ocellata és más fajok közti átmeneti formák jelenléte miatt, több szerző úgy véli, hogy a C. ocellata egy fajkomplex része, melybe közeli rokonai is beletartoznak, így pl. Cyclotella krammeri Hakansson, Cyclotella rossii Hakansson, Cyclotella tripartita Hakansson, Cyclotella kuetzingiana Thwaites, Cyclotella polymorpha B. Meyer et Hakansson és C. comensis (Edlund és mtsai. 2003, Cherepanova és mtsai. 2010). A csoporton belül a fajok elkülönítése nehéz (pl. Wunsam és mtsai. 1995, Knie és Hübener 2007, Genkal és Popovskaya 2008a). Teubner (1995) nem talált egyértelmű különbséget a C. krammeri, Cyclotella kuetzingiana var. planetophora Fricke, Cyclotella kuetzingiana var. radiosa Fricke, C. ocellata és C. comensis között. A Cyclotella trichonidea szintén hasonlít a C. ocellatara, a legfőbb különbség az, hogy a C. trichonidea valvái radiális undulációt (hullámosságot) mutatnak, ami valva nézetben négyszögletes körvonalat kölcsönöz nekik (Economou-Amilli 1982). A C. trichonidea fajt Economou-Amilli (1979) különítette el a a görögországi Trichonis-tóból származó minta alapján, ezen kívül csak kevés helyen találták meg (pl. a szintén görögországi Amvrakia- tóban, Danielidis és mtsai. 1996). A Cyclotella comensis, melyet elsőként Hustedt (1930) írt le a Comoi-tóból, széles földrajzi elterjedést mutat, Európában (Wunsam és mtsai. 1995), Észak-Amerikában (Werner és Smol 2006) és Ázsiában (Alfasane és mtsai. 2013) is előfordul. Az oligotróf-mezotróf vizek indikátorának tartják (Wunsam és mtsai. 1995) és jelentős szerepe van a paleolimnológiai vizsgálatokban (pl. Hausmann és Lotter 2001, Wolin és Stoermer 2005). Wunsam és mtsai. (1995) fajon belül négy formát különítettek el alpesi tavak felszíni üledékében, míg Hausmann és Lotter (2001) a Svájci Alpokból származó felszíni üledék mintákat vizsgálva hat alakot különböztetett meg, melyek főleg a stria hosszában különböztek és az átlagos nyári levegő hőmérséklettel mutattak összefüggést. Scheffler és Morabito (2003) csak egy alakot, a minima morfotípust írta le a tipikus forma mellett. Cyclotella pseudocomensis fajt Scheffler (1994) hozta létre a Großer Boberow-tóból való minta alapján. Később Scheffler és mtsai. (2003) két morfotípus együttes előfordulását figyelték meg, még tiszta tenyészetekben is. Ehhez képest az ITS-2 szekvenciákban nem találtak eltérést, és az auxosporuláció során a két forma közti átmenetet észlelték. A Comoi- tóból származó példányok morfológiai bélyegei alapján Scheffler és Morabito (2003) úgy vélték, hogy C. pseudocomensis a C. comensis szinonimája, a C. pseudocomensis minima morfotípusa (Scheffler és mtsai. 2003) pedig a C. comensis minima morfotípusának a

72 szinonimája. Scheffler és mtsai. (2005) azt a következtetést vonták le, hogy a C. comensis egy dimorf faj, két morfotípust foglal magában: a nagyon variábilis comensis alakot és a minima formát, mely csak kismértékű változatosságot mutat a centrális area alakjában és szerkezetében. Werner és Smol (2006) három további alakot („rossi”, „socialis”, „fine”) különített el. A Cyclotella costei Duart et Straub fajt a Paladru-tóból írta le Druart és Straub (1988). Scheffler és Morabito (2003) bár külön taxonként kezelte, mégis úgy vélte, hogy a C. comensis egyik formája. Mikor Alverson és mtsai. (2007) DNS szekvencia adatok alapján rekonstruálták a Thalassiosirales rend filogenetikai viszonyait, a komplex tagjai közül csak a C. ocellatat vonták be az elemzésbe. A törzsfán a C. ocellata a C. bodanicaval együtt elkülönült a többi Cyclotellatól (C. meneghiniana és vele közel rokon fajok alkotta csoporttól), így kiderült, hogy a Cyclotella nemzetség nem monofiletikus. Kistenich és mtsai. (2014) morfológiai és molekuláris bélyegek alapján is vizsgálták a C. comensis csoportot. Eredményeik azt mutatták, hogy a C. comensis megkülönböztethetetlen a C. pseudocomensistől és a C. costeitől, így alátámasztották Scheffler és Morabito (2003) megállapításait. Referencia taxonként a C. ocellatat használták, mely a C. comensis csoport közeli rokonának bizonyult. Scheffler és Morabito (2003) szintén felfedezett hasonlóságokat a C. comensis és a C. ocellata valvái között.

A vizsgált közösségekben (a mintavétel leírása a 4.1. fejezetben található) az elektronmikroszkópos megfigyeléseink (4.4. fejezet) alapján morfotípusokat különítettünk el C. ocellata/C. comensis komplexben, melyeket morfometriai elemzésnek vetettünk alá (4.5. fejezet). A morfotípusok arányát illetve a morfometriai paraméreteket a mért környezeti változókkal is összevetettük (4.7. fejezet). Emellett a mintákból kinyert 18S rDNS és rbcL szekvenciákat elemeztük (filogenetikai analízis és p-távolság számolás, 4.6. fejezet).

6.2. Eredmények

6.2.1. A morfológiai és morfometriai vizsgálat A minőségi és mennyiségi jellegek alapján öt alakot („ocellata”, „trichonidea”, „comensis”, „pseudocomensis” és „costei”) tudtunk elkülöníteni (a különböző alakok kvantitatív jellemzőit a 9. táblázatban foglaltuk össze, míg az egyes mintákban mért adatokat a Függelék F/3. táblázat tartalmazza). Az egyes formák közti átmenetek képezték a hatodik csoportot.

Belső nézetből az alakok elkülöníthetetlenek voltak. Minden valvának volt egy (néha 2-3) helytülő, kerek külső nyílással rendelkező rimoportulája, ami egy interstrián helyezkedett el. A rimoportula orientációja változó volt. Az alveolusok belső nyílása kerek vagy megnyúlt volt. A bordák általában egyenlő hosszúak voltak, de azok, amelyeken fultoportula is volt, általában rövidebbek voltak. A C. ocellata faj klasszikus formáját mutató „ocellata” alak (pl. 19./A-J. ábra) frusztulumai korong alakúak voltak, általában magányosak, azonban rövid láncok is előfordultak időnként. A valvafelszínen akár hat bemélyedést (orbiculi depressi, OD) találtunk, az ugyanennyi nagyobb papillával szemben. A papillák gyakran letörtek, így csak az alapjuk látszott (20./A. ábra). A valvák centrális areájának átmérője a valva átmérő 20- 80%-a volt, kis kiemelkedések voltak ezen a területen (19./A-I. ábra). Az OD-k mellett viszonylag kicsi, pontszerű bemélyedések (punctum) is láthatóak voltak a valva külső felszínén. Közöttük az egy (időnként 2-4) valvafelszíni fultoportula (CFP) külső nyílása nehezen volt kivehető. A CFP-t belülről általában 2 (1-3) szatellit pórus vette körül. A legtöbb valva radiálisan undulált (hullámos) volt, de enyhe tangenciális unduláltság volt látható a három- és négysugarú valvák centrális areáján döntött helyzetben (19./D, F, H. ábra), ami 3- 5 szimmetriatengelyt eredményezett. A valva szélén 10 µm-en 14-24 striát számoltunk. A köztük lévő interstriák hossza különböző volt, és néhányuk elágazott. Kis granulumokat figyeltünk meg az interstriákon a valva széle közelében vagy a striákon elszórtan. Általában minden harmadik-ötödik (a teljes skála: mindegyik-minden hatodik) interstrián volt marginális fultoportula (MFP) két szatellit pórussal. A „trichonidea” alak annyiban különbözött az „ocellata” alaktól, hogy frusztulumai négyszögletűek voltak (27./C, F. ábra). A „comensis” alak (pl. 26./A-C, F. ábrák) centrális areáján mindig volt tangenciális unduláltság, de szabálytalan elrendezésben. A valvafelszínen sohasem volt OD, de a centrális areán kis kiemelkedések és pontszerű bemélyedések voltak. Az egyetlen CFP külső nyílása általában látható volt a pontszerű bemélyedések között. A „pseudocomensis” alak (23./D. ábra) nagyon hasonlított a „comensis” alakhoz, de ahhoz képest a centrális area tangenciális unduláltsága és kiemelkedésekben gazdagsága kevésbé volt kifejezett, valamint a kiemelkedés csak a valva egyik felét, míg a bemélyedés csak a másik felét érintette. A „costei” alak (pl. 22./F-J. ábrák) abban különbözött a „comensis” és „pseudocomensis” alakoktól, hogy kis granulumok voltak a valvafelszínen, a centrális area nem volt undulált és a valva szélén 16-24 stria volt 10 µm-en.

A Balaton (19./A-L. ábrák), Dunaharaszti 2013 (21./A-H. ábrák), Yalova és Inli (27./E- L. ábrák) mintában szinte csak egy alak (az „ocellata”) fordult elő. Ez az alak volt a domináns a Himód mintában (20./A-B. ábrák) is, de néhány „costei” (20./D-H. ábrák) és átmeneti alak (20./C. ábra) is előfordult. A „comensis” alak volt domináns a Kunsziget (a vizsgált valvák 75%-a, 24./A-F. ábrák) és Hegyeshalom mintában (57%, 25./A-H. ábrák). A „costei” alak alkotta a valvák 75%-át a Dunaharaszti 2012 mintában (22./F-J. ábrák). A „trichonidea” alak csak a Visovac mintában (27./C, F. ábra) fordult elő. A „pseudocomensis” alakot pedig csak a Nyékládháza (23./C. ábra) és Szany mintában láttuk. A Nyékládháza minta tartalmazta a legdiverzebb közösséget, ötöt a hat alak közül (23./A-L. ábrák). (A morfotípusok arányát az egyes közösségekben a Függelék F/4. táblázat tartalmazza.) A fentiekből látható, hogy Dunaharaszti mintában egy „alak eltolódást” tapasztaltunk, mivel a 2012-ben (áprilisban) vett mintában főleg a „costei” alak volt jelen, míg a 2013-ban (májusban) vett mintában az „ocellata” alak dominált. A vizsgált morfometriai változók közül csak az OD-k száma mutatott különbséget az egyes közösségek közt (Függelék F/3. táblázat). Nem volt OD a Dunaharaszti 2012, Kunsziget, Szany és Hegyeshalom mintákban lévő valvákon. A változók páros kombinációi nem mutatták az alakok elkülönülését (Függelék F/7. ábra).

19. ábra: Cyclotella cf. ocellata közösség a Balatonból (A–I: klasszikus „ocellata” forma). Mérték = 5 μm.

20. ábra: Cyclotella cf. ocellata közösség a Himódi bányatóból (A-B: klasszikus „ocellata” forma, C: átmeneti forma, D-H: „costei” forma). Mérték = 5 μm (A-D, F, G, J-L); 2,5 μm (E, G, I).

21. ábra: Cyclotella cf. ocellata közösség a Dunaharaszti bányatóból 2013-ból (A-H: klasszikus „ocellata” forma, I: „costei” forma). Mérték = 5 μm (A, E-G, I-L); 2,5 μm (B-C); 2 μm (D, H).

22. ábra: Cyclotella cf. comensis közösség a Dunaharaszti bányatóból 2012-ből (A: klasszikus „ocellata” forma, B-D: „comensis” forma, E: átmeneti forma, F-J: „costei” forma). Mérték = 5 μm (A, C-F, I, K); 3 μm (G- H); 2 μm (B, J, L).

23. ábra: Cyclotella cf. ocellata/comensis közösség a Nyékládházi tóból (A-B: klasszikus „ocellata” forma, C: „pseudocomensis” forma, D-E: „comensis” forma, F-H: aff. „comensis” forma, I: „costei” forma). Mérték = 10 μm (A, B, K, L); 5 μm (C, E, G, I, J); 2,5 μm (D, F, H).

24. ábra: Cyclotella cf. comensis közösség a Hegyeshalmi bányatóból (A-F: „comensis” forma, G-J: „costei” forma). Mérték = 5 μm (D, F, G, K); 2,5 μm (A, B, J, L); 2 μm (C, E, H, I).

25. ábra: Cyclotella cf. comensis közösség a Csiszlói-tóból; A-H: „comensis” forma, I-K: „costei” forma). Mérték = 5 μm (A-C, F-H, J); 2,5 μm (K-L); 2 μm (D-E, I).

26. ábra: Cyclotella cf. comensis közösség a Szanyi bányatóból (A-C, F: „comensis” forma, D-E, G: aff. „costei” forma, H-I: „costei” forma, J: iniciális sejt). Mérték = 10 μm (J); 5 μm (A, C, F, G, I, K, L); 2,5 μm (B, D, E, H).

27. ábra: Cyclotella cf. ocellata közösség a Visovac-tóból (A-F; A-B: klasszikus „ocellata” forma, C, F: aff. „trichonidea” forma, D-E: aff. „comensis” forma); Inli forrásból (G-H: aff „ocellata” forma) és Yalova patakból (I-L; I: klasszikus „ocellata” forma). Mérték = 10 μm (F); 5 μm (A-C, G, H, K-L); 2,5 μm (D-E); 2 μm (I); 1 μm (J). 79

Diszkriminancia analízist végeztünk, hogy lássuk, hogy a mért, illetve a számolt morfometriai változók együttesen elválasztják-e egymástól az öt alakot. Az elemzés szerint a vizsgált valvák két fő csoportra váltak szét (28. ábra). A Cyclotella cf. comensis csoportot főleg a „comensis”, „pseudocomensis”, „costei” és átmeneti alakok alkották, míg a C. cf. ocellata csoportot elsősorban az „ocellata” és „trichonidea” alakok. Az első csoporton belül a „costei” alakok kissé elkülönültek a többitől. A csoportok elválását leginkább meghatározó paraméter a puncta/10CA volt, míg a divstria/10 és az OD/10CA is viszonylag jelentős mértékben járult hozzá az elváláshoz. A legkisebb szerepe a dCA/d és MFP/10 paramétereknek volt. A Balaton, Dunaharaszti 2013, Yalova és Inli mintából származó valvák, melyeket a kezdeti morfológiai osztályozásban főleg „ocellata” alakba soroltunk, két kivétellel mind a C. cf. ocellata csoportba kerültek. A két kivétel a Dunaharaszti 2013 minta egy „ocellata” és egy „costei” példánya volt. A Dunaharaszti 2012, Kunsziget, Szany és Hegyeshalom minták valvái pedig elsősorban a C. cf. comensis csoportba kerültek (kivételek voltak: egy „ocellata” forma a Dunaharaszti 2012 mintából, egy-egy „comensis” a Kunsziget és Hegyeshalom mintából, egy „costei” és egy „pseudocomensis” a Szany mintából. A Himód, a Visovac és a Nyékládháza minták valvái megoszlottak a két csoport között. E minták „ocellata” és „trichonidea” alakba tartozó példányai a C. cf. ocellata csoportba tartoztak (a Himód mintából származó két „ocellata” kivételével), a többi alak a C. cf. comensis csoportba került (egy Visovac valva kivételével). A morfológiai vizsgálat alapján a Nyékládháza I, Himód, Visovac, Dunaharaszti 2013 mintákra C. cf. ocellata, a Nyékládháza II, Kunsziget, Szany, Dunaharaszti 2012 és Hegyeshalom mintákra pedig C. cf. comensis néven hivatkozunk.

9. táblázat: A morfotípusok morfometriai adatai. Jelölések: d = valvaátmérő (µm), dCA = a centrális area átmérője (µm), stria = striák száma, stria/10 = 10 µm-re eső striaszám, MFP = marginális fultoportulák száma, puncta = pontszerű bemélyedések száma, OD = nagyobb bemélyedések (orbiculi depressi) száma, divstria = elágazó striák száma, ns = radiálisan szimmetrikus valvaszektorok száma. d dCA stria stria/10 MFP puncta OD divstria ns

„ocellata” 4,0-15,5 1,7-9,3 25-87 14,2-24,3 6-29 0-19 0-6 0-19 0-5 „trichonidea” 8-15,5 3,2-10,3 47-87 14,8-19,5 13-21 0-3 3 0-6 3 „costei” 4,3-9,2 1,4-4,1 28-57 15,9-24,4 4-15 0-19 0 0-14 0-2 „comensis” 4,8-9,3 2,1-4,4 29-54 16,8-23,4 6-13 4-24 0 0-9 0-7 „pseudo- 6,3-10,8 3,8-5,9 38-63 17,0-19,2 7-11 11-16 0 0-3 0-2 comensis” átmeneti 3,0-10,2 1,5-5,3 26-60 16,4-26,0 5-17 0-18 0-3 0-14 0-3

3.2

2.4

1.6

div stria/10

0.8 OD/10CA

2 d s

i ns x

A -4.8 -3.6 -2.4 -1.2 stria/10 MFP/10 1.2 2.4 3.6 4.8 6.0 dCA/d

-0.8

-1.6

-2.4

-3.2

puncta/10CA -4.0 Axis 1 28. ábra: A minták egyedein mért, illetve számolt morfometriai változók felhasználásával végzett diszkriminancia analízis eredménye. A körök az „ocellata”, a csillag a „trichonidea”, a négyzet a „costei”, a háromszög a „comensis”, a rombusz a „pszeudocomensis”, a kereszt az átmeneti formákat jelöli. A változók rövidítésének magyarázata az Anyag és módszer fejezetben található.

6.2.2. A morfológiai jellemvonások kapcsolata a környezeti változókkal A morfofajok relatív abundanciája nem mutatott szignifikáns kapcsolatot egyik környezeti változóval sem. A morfometriai paraméterek közül a puncta/10CA a magnéziumion (29./B. és hidrogénkarbonát ion koncentrációval (29./D. ábra) mutatott negatív, a div_stria/10 a magnéziumion koncentrációval negatív (29./A. ábra), az összes foszforral pozitív korrelációt (29./C. ábra). Két paraméter (stria/10 és dCA/d) mutatott összefüggést az oldott oxigén koncentrációval (29./E-F. ábrák).

29. ábra: A mintánként átlagolt morfometriai paraméterek a környezeti változók függvényében. r = Spearman-féle rangkorrelációs együttható. Kereszt = Cyclotella cf. comensis közösségek, pont = Cyclotella cf. ocellata közösségek, csillag = mindkét morfofajt tartalmazó közösségek. Jelölések: disvstria/10 = 10 µm-re eső elágazó striák száma, stria/10 = 10 µm-re eső striák száma, puncta/10CA = 10 µm2 centrális area területre eső pontszerű bemélyedések száma, dCA/d = centrális area átmérője osztva a valvaátmérővel, Mg2+ = - magnéziumion-, HCO3 = hidrogénkarbonátion-, TP = összes foszfor-, DO = oldott oxigén koncentráció.

6.2.3. A Cyclotella ocellata komplexhez tartozó minták DNS-einek szekvencia meghatározása Három mintából amplifikáltuk és szekvenáltuk sikeresen mindkét markert (18S rDNS, rbcL), azonban négy mintából csak a 18S rDNS-t, két mintából csak a rbcL-t sikerült (10. táblázat). A Visovac minta egyaránt tartalmazott „trichonidea” és „ocellata” alakba tartozó sejteket, ebből a mintából mégis egy 876 nukleotid (nt) hosszú, tiszta (a szekvenátor által leolvasott csúcsok alatt kisebb csúcsokat nem tartalmazó) részleges 18S rDNS szekvenciát kaptunk. Kevert rbcL és tiszta 18S rDNS szekvenciákat kaptunk a Dunaharaszti 2013 és Hegyeshalom mintákból. Ennek a különbözőségnek az oka lehetett, hogy az alkalmazott rbcL primerek nem szigorúan specifikusak a Thalassiosirales rend tagjaira. A Primer-BLAST szerint a Sk-rbcL400F és Sk-rbcL975R tökéletesen illeszkedik a Craticula cuspidata (Kützing) D.G. Mann szekvenciájához, illetve egy vagy néhány eltéréssel (melyek nem a 3’- végen fordulnak elő) számos más, nem Thalassiosirales faj szekvenciáihoz (pl. Asterionella formosa Hassall, Diatoma tenue C. Agardh). Ezeket a kevert szekvenciákat nem vettük bele az elemzésekbe. A Visovac és Nyékládháza II mintákhoz közvetlenül hozzáadtuk a PCR elegy összetevőit, és csak egy primerpárral dolgoztunk, így csak 18S rDNS szekvenciát kaptunk. A Nyékládháza I mintából egy tiszta 18S rDNS szekvenciát nyertünk ki (30./A. ábra), de a minta rbcL elektroferogramjában kis csúcsok voltak a szekvenátor által leolvasott, domináns csúcsok alatt (30./B. ábra). A Nyékládháza II mintából származó 18S rDNS kromatogram szintén tartalmazott kis csúcsokat (Függelék F/24. ábra), ami több alak/faj 18S rDNS-ének felszaporítására utal. E minták esetében a szekvenátor által leolvasott szekvenciákat használtuk a szekvenciatípusok elkülönítéséhez (a későbbiekben tehát a leolvasott szekvenciákra utal a Nyékládháza I rbcL és Nyékládháza II 18S rDNS szekvencia kifejezés).

30. ábra: A C. cf. ocellata Nyékládháza I. minta Sk-600F és Sk-1550R primerekkel (A), valamint Sk-rbcL- 975R primerrel (B), továbbá a C. cf. comensis Dunaharaszti 2012 minta Sk-600F primerrel (C) és Sk-rbcL-400F primerrel (D) nyert elektroferogramjának kiválasztott részei. A nyilak a szekvenciatípusok közt eltérő pozíciókat mutatják.

6.2.4. Genetikai divergencia A részleges 18S rDNS szekvenciák alapján három szekvencia csoportot kaptunk (31. ábra), melyek egy vagy két nukleotid pozícióban különböztek egymástól (ez maximum 0,25% p-távolságnak felelt meg), illetve 1-3 pozícióban (maximum 0,34%, 10., 11. táblázat) a C. ocellata LB8 törzs Alverson és mtsai. (2007) által meghatározott szekvenciájától (ez utóbbi alkotta a „D” szekvencia típust, 31. ábra). Szekvenciáinkat összehasonlítottuk a Kistenich és mtsai. (2014) által rendelkezésünkre bocsátott szekvenciákkal (31. ábra), melyek hossza a mieinknek körülbelül a fele volt (403 nt). Kistenich és mtsai. (2014) szekvenciáinak eltérése a mi szekvenciáinktól 0-1 nukleotid pozíció (0-0,25%) volt, a C. ocellata LB8 törzshöz képest pedig 1-2 nt (0,25-050%) volt. Az egész, több, mint 800 nt szakaszon három variábilis nukleotid pozíciót találtunk, ezek közül csak kettő volt a Kistenich és mtsai. (2014) által is vizsgált régióban. A kapott szekvenciákat is beillesztettük a korábban elkülönített szekvencia típusokba, a C. ocellata szekvencia az „A” típusnak, a C. comensis, C. pseudocomensis és C. costei szekvenciák pedig a „B” típusnak feleltek meg. Leggyakrabban a „B” szekvencia típus fordult elő, az ebbe tartozó szekvenciák C. comensis/pseudocomensis/costei morfológiával rendelkező mintákból származtak. Az egyetlen kivétel a Visovac minta volt, amely „ocellata” és „trichonidea” alakokat tartalmazott. Ehhez a típushoz képest egy szubsztitúció (transzverzió) fordult elő az „A” típusban, amely C. ocellata morfológiájú mintákból származó szekvenciákat tartalmazott. Egy transzverzió csak a Nyékládháza II mintára (a „C” típusra) volt jellemző. Megjegyzendő azonban, hogy ez a pozíció, amely a „B” és „C” típust megkülönböztette egymástól kívül esett a Kistenich és mtsai. (2014) által vizsgált régión. Így elképzelhető, hogy a Kistenich és munkatársainak „B” típusba sorolt szekvenciái valójában a „C” típusba tartoztak. Egy tranzíció csak a C. ocellata LB8 törzs szekvenciájában volt megfigyelhető. A parciális rbcL szekvenciák alapján szintén három csoportot kaptunk (négyet, mikor Kistenich és munkatársaitól kapott szekvenciákat is belevettük, 32. ábra), melyek 1-3 pozícióban (maximum 0,66%) különböztek egymástól. A Kistenich és mtsai. (2014) által küldött szekvenciák kicsivel hosszabbak (507 nt) voltak a mieinknél. Az „A” típus, mely a C. ocellata morfológiájú mintákat foglalta magában, teljesen azonos volt a C. ocellata LB8 szekvenciájával (10., 12. táblázat). Ez a típus kettő (egy tranzíciót és egy transzverziót csak az „A” típusban detektáltunk) vagy három pozícióban különbözött a C. comensis/pseudocomensis/costei morfológiát képviselő „B”, „C” és „D” típustól. Ez utóbbi három típus egy vagy két pozícióban tért el (egy tranzíció csak a „C” típusra, míg egy másik

85 helyen történt tranzíció csak a „D” típusra volt jellemző). Az összes megfigyelt szubsztitúció a kodon harmadik pozícióját érintette.

„B” típus: C. ocellata Visovac „A” típus: C. comensis Dunaharaszti 2012 C. ocellata Dunaharaszti 2013 1 nt C. comensis Hegyeshalom 2013 C. ocellata Nyékládháza 2012 I C. comensis Szany 2013 C. ocellata Kiesgrube C. comensis Baggersee C. pseudocomensis Haussee Krugsdorf C. costei Gültzsee C. costei Fernsteinsee 2 nt

1 nt 1 nt 2 nt

„D” típus: „C” típus: Cyclotella ocellata LB8 C. comensis Nyékládháza 2012 II

3 nt 31. ábra: A 18S rDNS szekvenciatípusok parszimónia hálózata.

„A” típus: C. ocellata LB8 C. ocellata Kiesgrube Krugsdorf C. ocellata Nyékládháza 2012 I C. ocellata Himód 2013

3 nt 2 nt 3 nt

1 nt 1 nt „B” típus: C. comensis Szany 2013 C. comensis B aggersee C. costei F erns teinsee C. pseud ocomensis „D” típus: Haus see „C” típus: C. comensis C. costei Gültzsee Kunsziget 2013 C. comensis 2 nt Dunaharaszti 2012

32. ábra: Az rbcL szekvenciatípusok parszimónia hálózata.

10. táblázat: A Cyclotella cf. ocellata és Cyclotella cf. comensis közösségekből nyert szekvenciák elérési száma és a Cyclotella ocellata LB8 törzs GenBank adatbázisban lévő szekvenciáival mutatott hasonlósága. hasonlóság 18S rDNS rbcL hasonlóság Cyclotella Minta Cyclotella szekvencia szekvencia ocellataval (nt/nt) ocellataval (nt/nt) Himód – – KJ755338.1 467/467 (100 %) Dunaharaszti KJ755342.1 794/795 (99,87 %) – – 2013 Dunaharaszti KJ755348.1 909/911 (99,78 %) KJ755339.1 451/454 (99,34 %) 2012

Nyékládháza I. KJ755343.1 874/875 (99,89 %) KJ755337.1 499/499 (100 %)

Nyékládháza II. KJ755345.1 873/876 (99,66 %) – –

Hegyeshalom KJ755346.1 807/809 (99,75 %) – – Kunsziget – – KJ755340.1 451/454 (99,34 %) Szany KJ755347.1 855/857 (99,77 %) KJ755341.1 452/454 (99,56 %) Visovac KJ755344.1 874/876 (99,77 %) – –

11. táblázat: A Cyclotella cf. ocellata és Cyclotella cf. comensis közösségekből valamint a Cyclotella ocellata LB8 törzsből (elérési száma DQ514904) származó 18S rDNS szekvenciák közti páronkénti eltérések (százalékban kifejezett p-távolság értékek). Az eltérő nukleotidok száma van zárójelben. Duna- Duna- C. Nyéklád- Nyéklád- Hegyes- haraszti haraszti Szany Visovac ocellata háza I. háza II. halom 2013 2012 LB8 Duna- haraszti – 2013 Duna- haraszti 0,13 (1) – 2012 Nyéklád- 0 (0) 0,11 (1) – háza I. Nyéklád- 0,25 (2) 0,11 (1) 0,23 (2) – háza II. Hegyes- 0,13 (1) 0 (0) 0,12 (1) 0,12 (1) – halom Szany 0,13 (1) 0 (0) 0,12 (1) 0,12 (1) 0 (0) –

Visovac 0,13 (1) 0 (0) 0,11 (1) 0,11 (1) 0 (0) 0 (0) –

C. ocellata 0,23 0,13 (1) 0,22 (2) 0,11 (1) 0,34 (3) 0,25 (2) 0,22 (2) – LB8 (2)

12. táblázat: A Cyclotella cf. ocellata és Cyclotella cf. comensis közösségekből valamint a Cyclotella ocellata LB8 törzsből (elérési száma DQ514832) származó rbcL szekvenciái közti páronkénti eltérések (százalékban kifejezett p-távolság értékek). Az eltérő nukleotidok száma van zárójelben. Dunaharaszti Nyékládháza Kun- Cyclotella Himód Szany 2012 I. sziget ocellata LB8 Himód – Dunaharaszti 0,66 (3) – 2012 Nyékládháza I. 0 (0) 0,66 (3) –

Kunsziget 0,66 (3) 0 (0) 0,66 (3) –

Szany 0,44 (2) 0,22 (1) 0,44 (2) 0,22 (0) – Cyclotella 0 (0) 0,66 (3) 0 (0) 0,66 (3) 0,44 (2) – ocellata LB8

6.2.5. Filogenetika A két gén adatai alapján készült filogenetikai fán (33. ábra) a C. cf. ocellata szekvenciák ugyanabba a csoportba kerültek, mint a Kiesgrube-Krugsdorf mintából való illetve a LB8 törzs C. ocellata szekvencia. Ez a csoport testvércsoportja volt a C. cf. comensis/comensis/pseudocomensis/costei kládnak, és együtt pedig a C. bodanica testvércsoportját képezték. Az egész C. bodanica/ocellata/comensis klád legközelebbi rokonai a Stephanodiscus Ehrenberg nemzetség fajai voltak. A parciális 18S rDNS alapján (Függelék F/8A. ábra) az összes szekvencia típus egy nehezen felosztható csoportot alkotott a C. ocellata LB8 törzzsel együtt, habár ez utóbbi az „A” típust képviselő Dunaharaszti 2013 mintával együtt kissé elkülönült a többi szekvenciától (a Szany minta által képviselt „B” és a Nyékládháza II által képzett „C” típustól). Ez a C. ocellata/cf. ocellata/cf. comensis klaszter egy nagyobb csoport részét képezte, mely magában foglalta a C. bodanicát, valamint az összes Discostella, Cyclostephanos és Stephanodiscus fajt. A részleges rbcL szekvenciák alapján készült filogenetikai fa (Függelék F/8B. ábra) hasonlóképpen az összes típus és a C. ocellata LB8 egy kládba csoportosulását mutatta. Ezen a csoporton belül az „A” típusnak kinevezett C. ocellata LB8 elkülönült a „B”, „C” és „D” típusoktól. A C. ocellata/cf. ocellata/cf. comensis csoport a C. bodanicával együtt egy, a Stephanodiscus nemzetség (testvércsoport) tagjaitól elkülönülő ágat alkotott.

33. ábra: A két gén adatai alapján, Bayes-módszerrel készült filogenetikai fa. Szubsztitúciós modellek: 18S rDNS esetében Hasegawa-Kishino-Yano gamma eloszlással, rbcL esetében Tamura-Nei modell gamma eloszlással. A Cyclotella meneghiniana LS03-01 és T1 törzseket és Cyclotella striatat használtuk külcsoportként. Generációk száma: 400000, a konvergencia diagnosztikai érték az utolsó generációban: 0,004794. Skála = 0,009 szubsztitúció/nukleotid pozíció. A százalékban kifejezett posterior valószínűségeket tünettük fel az elágazási pontoknál. Az ebben a vizsgálatban nyert szekvenciákat félkövér betűkkel jeleztük. A szekvenciák csoportosításának magyarázata a szövegben olvasható.

6.2.6. A morfometriai és a filogenetikai adatok összevetése A morfometriai paraméterek alapján az előzetesen szétválasztott alakok két csoportot alkottak, vagyis az alakok két morfofajt képviselhettek (C. cf. ocellata és C. cf. comensis). Általánosságban a szekvencia adatok megegyeztek ezzel az elválással. Az „A” 18S rDNS (Dunaharaszti 2013, Nyékládháza I) és rbcL (Nyékládháza I) szekvenciatípust képviselő mintákból származó valvák javarészt a C. cf. ocellata morfofajba estek. A „B” és „C” 18S rDNS (Dunaharaszti 2012, Hegyeshalom, Szany, Nyékládháza II) valamint a „B” és „D” rbcL (Dunaharaszti 2012, Szany, Kunsziget) típust képviselő valvák főleg a C. cf. comensis morfofajba kerültek. Mindazonáltal a Nyékládháza I és II minta problémát jelentett, mert az alsó csúcsok a kromatogrammokon a nem megfelelő izolálásból is származhattak. Két kivétel volt a morfometriai és filogenetikai adatok közti egyezés alól. A Himód mintában „ocellata” és „costei” alakba tartozó valvák is előfordultak (ugyanúgy, mint átmeneti formák), azonban ebből a mintából csak egy „A” típusú rbcL szekvenciát kaptunk (32. ábra). A Visovac minta OD-vel rendelkező „ocellata” és „trichonidea” alakú héjakat valamint átmeneti formákat tartalmazott. A DNS-vizsgálatra használt Visovac mintába OD-

89 vel rendelkező sejteket válogattunk (melyek az „ocellata” és „trichonidea” alakot képviselték). Ennek ellenére az ebből a mintából nyert 18S rDNS szekvencia egy „comensis” típusnak („B” típus, 31. ábra) felelt meg.

6.3. Diszkusszió

6.3.1. A Cyclotella ocellata komplex morfológiai és morfometriai vizsgálata A C. ocellata klasszikus formája (3-5 OD, papillák, Pantocsek 1901, Håkansson 1993, Kiss és mtsai. 1996, 1999) a tizenegy vizsgált közösségből ötben volt jellemző. A C. ocellata eredeti leírása szerint (Pantocsek 1901: 318. ábra) három OD-vel és viszonylag keskeny striázott résszel rendelkezik. Ugyanebben a publikációban Pantocsek egy másik fajt is leírt, Cyclotella crucigera Pantocsek néven, melyet később Fricke (Schmidt’s Atlas der Diatomeenkunde 1906) a C. ocellataval szinonimizált. Hustedt (1928), Håkansson (Krammer és Lange-Bertalot 1991 munkájában) és Kiss és mtsai. (1999) is úgy vélték, hogy a C. crucigera a C. ocellata szinonímája. Mikor Kiss és mtsai. (1999) újra megvizsgálták a C. ocellata típusanyagát, nagyfokú morfológiai variabilitást tártak fel. Az OD-k száma akár tíz is lehet, valamint egyazon frusztulum epi- és hipovalváján lévő OD-k száma és a marginális fultoportulák elrendezése is eltérhet (Kiss és mtsai. 1999: 16., 17. ábra). A marginális fultoportulák elrendezése szabálytalan lehet, a valva centrális részén kis kiemelkedések és akár egy tucat pontszerű bemélyedés is lehet. Hasonlóan nagyfokú morfológiai variabilitást találtak a spanyolországi Las Madres-tóban (Kiss és mtsai. 1996), a németországi Dagow-tóban (Schlegel és Scheffler 1999) és Gallberg-tóban (Hegewald és Hindáková 1997), a chilei Rapel-víztározóban (Rivera és mtsai. 2003). A Gallberg-tó természetes populációját és klónjait vizsgálva Hegewald és Hindáková (1997) olyan valvákat is megfigyelt, melyek centrális areáján nem volt OD, csak kis kiemelkedések és/vagy pontszerű bemélyedések. Cremer és mtsai. (2005) szintén bemutattak OD nélküli valvákat, melyek akár teljesen laposak is lehettek. Edlund és mtsai. (2003) enyhén négyszögletes C. ocellata valvákat is találtak a mongóliai Hövszgöl-tóban. Ugyanebben a tóban Genkal és Popovskaya (2008a) a klasszikus forma mellett számos olyan frusztulumot is talált, melyek valvafelszíne lapos volt és a centrális areáján enyhe tangenciális unduláltság volt. Ezért nem volt meglepő, hogy lapos felszínű valvák voltak a vizsgált magyar- és horvátországi mintákban. A SEM felvételeken a C. ocellata, C. comensis, C. pseudocomensis, C. costei fajokra hasonlító valvák és átmeneti formák széles skáláját láttuk (19.-27. ábrák). Azonban a

90 nominális fajok között különbséget tenni (vagyis az egyes alakokat szétválasztani) nem volt könnyű. Bár az OD jellemző a C. ocellatara, nem volt jelen minden egyeden. Ezenkívül mivel az OD nem töri át a valvafelszínt, az OD-vel rendelkező és nem rendelkező valvákat belső nézetből nem lehetett megkülönböztetni. Scheffler és Morabito (2003) morfológiai leírást és számos SEM képet közölt a Comoi- tóban talált C. comensisről. Ezek alapján a C. comensis centrális areája többé-kevésbé tangenciálisan undulált, néha radiálisan vagy szabálytalanul redőzött, ritkán radiális vagy szabálytalan, bemélyedésekkel (melyek az OD-kre és a punctumokra hasonlítanak) borított, mérete és a szabálytalanul elhelyezkedő bemélyedések és kiemelkedések száma igen változatos. A striák laposak vagy enyhén kiemelkedőek, egyenesek és a hosszuk különbözik. Mint Scheffler és Morabito (2003) írta „ennek a fajnak az egyes valvái hasonlítanak a C. ocellata szerkezetére és nem lehet őket egyértelműen csoportosítani” (Scheffler és Morabito 2003, 11. ábra). Houk és mtsai. (2010) számos SEM fotót közöltek olyan C. comensis valvákról, melyek centrális areáján enyhe tangenciális unduláltság és radiális mintázat van, sok valván radiálisan elrendezett mély lyukak vannak, melyek azonosak az OD-vel. Scheffler és Morabito (2003) sok lapos valvafelszínű frusztulumot talált, melyeket a C. comensis minima morfotípusának nevezett (elnevezése: Cyclotella comensis morphotype minima Scheffler et al.). Ez a forma ugyanúgy néz ki, mint a C. ocellata Hövszgöl-tóban talált kis valvái (Genkal és Popovskaya 2008a), ami akkor lesz egyértelmű, ha összehasonlítjuk Scheffler és Morabito (2003) 24. valamint Genkal és Popovskaya (2008a) 2. ábráját. A klasszikus, radiális szimmetriájú centrális résszel rendelkező C. ocellata alaktól („ocellata” alak) a lapos központi résszel rendelkező formákon át a klasszikus, tangenciálisan hullámos centrális areával rendelkező C. comensis alakig („comensis” alak) különböző átmeneti formákat találtunk több mintában is. A Himód, Dunaharaszti 2012 és Nyékládháza mintákban klasszikus „ocellata” és enyhe tangenciális unduláltságú „comensis” alakokat, valamint lapos átmeneti formákat is találtunk. A Hegyeshalom, Kunsziget és Szany mintákban a valvák laposak voltak vagy a jellegzetes tangenciális unduláltságot mutattak [„comensis” alak, hasonló ahhoz, amilyet Houk és mtsai. (2010) 215. táblájának 4., 5. ábráján látni]. A Visovac mintában az „ocellata” alak mellett enyhén négyszögletes körvonalú „trichonidea” alak és lapos felszínű forma is előfordult. Számos szerző hívta fel a figyelmet a C. ocellata csoport taxonómiai bizonytalanságaira. Fénymikroszkópos vizsgálatok alapján Teubner (1995) kimutatta, hogy a C. krammeri, C. kuetzingiana var. planetophora Fricke, C. kuetzingiana var. radiosa, C. ocellata és C. comensis taxonómiai elkülönítése problematikus a valva polimorfizmusa miatt. Bemutatta,

91 hogy különbség lehet ugyanazon frusztulum két valvája között és különböző frusztulumok valvái között, és felvetette a kérdést, hogy a morfológiai változatok a sejtfalfejlődés különböző fokozatait vagy a sejtciklus különböző állapotait képviselik vagy különböző környezeti körülmények közti növekedést tükröznek. Genkal és Popovskaya (2008a) megállapította, hogy a C. ocellata, C. tripartita, C. rossii, C. polymorpha, C. kuetzingiana és Cyclotella hispanica Kiss, Hegewald et Ács belső nézetben nagyon hasonló. Az általunk vizsgált morfometriai paraméterek nem különítették el az „ocellata” és „trichonidea” alakot. Economou-Amilli (1982) talált különbségeket a C. ocellata és a C. trichonidea között, de az is igaz, hogy ő átmeneti formákat nem vizsgált. Mivel a C. trichonidea bizonyos, Economou-Amilli (1982) által leírt jellegzetességeit a „trichonidea” alakba sorolt valvákon nem láttuk (pl. nem volt jelentős különbség a MFP-t hordozó és nem hordozó bordák vastagságában), az általunk megfigyelt példányok a két faj közti átmeneti formákat is képviselhetik. Így elképzelhető, hogy ezek nem azonos fajok, csak nagyon közeli rokonok. Bár Scheffler (1994) írta le a C. pseudocomensist, mint új, a C. comensistől különálló fajt, később mégis munkatársaival együtt ő (Scheffler és Morabito 2003, Scheffler és mtsai. 2005) helyezte át a C. comensisbe. Houk és mtsai. (2010), akik szintén egy majdnem teljes átmenetet figyeltek meg a két faj tipikus morfológiája között, mégis külön fajként kezelték a C. comensist és C. pseudocomensist az ökológiai igényeik miatt. Eszerint a C. comensis az oligotróf körülményeket részesíti előnyben, míg a C. pseudocomensis oligotróf-mezotróf vagy mérsékelten eutróf tavakban fordul elő. Genkal és mtsai. (2015) azonban mezo- és eutróf víztestekben (pl. a karéliai Rabsud-tóban) is megtalálták a C. comensist. Kistenich és mtsai. (2014) nyolc ausztriai és németországi tóból származó C. comensis, C. pseudocomensis és C. costei törzset hasonlítottak össze, melyek inkább egy morfológiai kontinuumot alkottak, mint különálló fajokat. Így arra a következtetésre jutottak, hogy a három morfofaj egy komplexet alkot, a C. comensis fajkomplexet. Az általunk is vizsgált morfológiai bélyegek (CFP és RP száma, MFP és RP helyzete) értékei beleillenek a Kistenich és mtsai. (2014) által közölt tartományokba. A diszkriminancia analízis eredményünk is alátámasztotta, hogy a C. comensis, C. pseudocomensis és C. costei egy fajba tartoznak. Bár az összes mért paraméter együtt két csoportot különített el, egyesek önmagukban vagy párosával nem választották el egyértelműen azokat. Nem volt egyszerű az alakok vizuális elkülönítése a SEM fényképek alapján sem, és több mintában találtunk köztes, lapos centrális areával rendelkező valvákat, melyeket nehezen lehetett besorolni. Továbbá, a fenotípusos plaszticitás kovaalgák esetében is ismert jelenség. Például Kiss és mtsai. (2002) kimutatták,

92 hogy egy C. hispanica sejt egyik valvája sima és finoman striázott, míg a másikon figyelemre méltó bemélyedések és kiemelkedések, valamint jól fejlett striázottság látható. Azt is megfigyelték, hogy a környezet milyen hatással lehet a valva morfológiára, például a C. meneghiniana esetében (Håkansson és Chepurnov 1999). Összefoglalva, eredményeink alapján elmondható, hogy a vizsgált fajok közeli rokonok, de több jellemző együttes vizsgálatával elkülöníthetők (főleg OD, stria és punctum sűrűség alapján). Wunsam és mtsai. (1995) azt találták, hogy az összes foszfor tartalom és a vezetőképesség volt a két legfontosabb környezeti változó, amely a Cyclotella taxonok eloszlását magyarázta. Vizsgálatukban az összes foszfor tartalom 4-144 µg/l között, a vezetőképesség pedig 137-465 µS/cm között változott azokon a területeken, ahol a C. ocellata előfordult. A mi vizsgálataink során azokban a tavakban, melyekben a C. cf. ocellata csoport képviselőit találtuk, az összes foszfor koncentráció beleesett ebbe a tratományba (9-114 µg/l), a vezetőképesség egy kissé magasabb (240-866 µS/cm) volt. Azokban a tavakban pedig, ahol C. cf. comensis morfofajba sorolható valvákat találtunk, az összes foszfor tartalom 42 és 102 µg/l, a vezetőképesség 425 és 872 µS/cm között változott. Ez összhangban volt Kistenich és munkatársainak (2014) eredményeivel, melyek szerint az általuk vizsgált genodémek (genetikai populációk) nem kötődtek különleges trofikus viszonyokhoz. Fritz és mtsai. (1993) valamint Stoermer és Yang (1969) is megfigyelték a C. ocellatat ultraoligotróf tavakban is. Ezek alapján úgy tűnik, hogy a C. ocellata tág trofikus tartományban fordul elő, így nem használható a trofikus viszonyok indikátoraként. A striák illetve kettéágazó striák számának kapcsolata magnéziumion, foszfor- és oldott oxigén koncentrációval a striák anyagcserében betöltött szerepével (Bukhtiyarova 2009) állhat összefüggésben. A puncta funkciójának vizsgálatáról eddig nem készült tanulmány.

6.3.2. A filogenetikai divergencia és a DNS vonalkódok használata A 18S rDNS általunk vizsgált területe teljesen átfedett a Zimmermann és mtsai. (2011) által vonalkódnak javasolt, a V4 alrégiót is magába foglaló, körülbelül 400 bp hosszú szakasszal, melyről a szerzők kimutatták, hogy elegendő információt tartalmaz a legtöbb általuk vizsgált kovaalga faj azonosításához. Mi összesen három divergens pozíciót találtunk, mikor C. cf. ocellata és C. cf. comensis mintáinkat a C. ocellata LB8 törzshöz hasonlítottuk (ami maximum 0,34% p-távolságot jelentett). Ezek közül a pozíciók közül csak kettő helyezkedett el a V4 szubrégióban, a harmadik kívül esett a szerzők által vizsgált 400 bp hosszú tartományon. Zimmermann és mtsai. (2011) 123, főleg Pennales fajt alapul véve azt találták, hogy a fajon belüli (intraspecifikus) átlagos p-távolság 375 nt hosszú régióban 0 és

0,53% között változott (ez 0-2 nt eltérésnek felelt meg), melynél szignifikánsan nagyobb volt a fajok közötti (interspecifikus) távolság. Azonban a Stephanodiscus nemzetség kivételt jelentett ez alól, itt az intraspecifikus változatosság is igen alacsony volt (Ki 2009 is hasonló eredményre jutott ezzel a nemzetséggel kapcsolatban). Ebben a vizsgálatban ugyan nem szerepelt a C. ocellata és rokonsági köre, azonban Alverson és mtsai. (2007) szerint ezek a fajok (C. ocellata és C. bodanica) sokkal közelebbi rokonai a Stephanodiscus fajoknak, mint más Cyclotella fajoknak. Luddington és mtsai. (2012) szintén hatékony vonalkódnak tartották a V4 alrégiót a kovaalgák esetében. Az ezt tartalmazó 333 nt hosszú szakaszon 2% p- távolságot javasoltak interspecifikus küszöbértéknek, mivel ez az érték elválasztotta az általuk vizsgált Thalassiosirales, Cymatosirales és Lithodesmiales fajok 96,9%-át. Az 1%-os határ ugyan megnövelte a fajok elválasztásának hatékonyságát, azonban több faj esetében is átfedett az intraspecifikus variabilitással, például a Cyclostephanos nemzetség esetében, amely a Stephanodiscus testvércsoportja (Alverson és mtsai. 2007). Sajnos sem a Stephanodiscus nemzetséget, sem a C. ocellatat nem vonták be ezekbe az elemzésekbe. A Stephanodiscusszal ellentétben a C. ocellata és C. bodanica fajokat nem tartalmazó Cyclotella és a Discostella nemzetség magas interspecifikus variabilitást mutatott Jung és munkatársainak (2010) elemzésében (a p-távolság 1,8% illetve 1,3% volt), habár ők közel a teljes 18S rDNS szakaszt vizsgálták. A szerzők a Cyclotella atomus Hustedt és Cyclotella striata (Kützing) Grunow közt találták a legkisebb (0,5%) eltérést. A C. meneghiniana izolátumok közti 0,3% variabilitást elhanyagolhatónak tartották, mivel a 18S-28S rDNS, mint multigén család összehangolt evolúciónak van kitéve (Hillis és Dixon 1991, Elder és Turner 1995). Kistenich és mtsai. (2014) a morfológiai bélyegek mellett több molekuláris markert, köztük a 18S rDNS-t is vizsgálták, melynek során Zimmermann és mtsai. (2011) által javasolt szakaszt valamint a Luddington és mtsai. (2012) által ajánlott küszöbértékeket (intraspecifikus variabilitás 0,7% alatt, interspecifikus variabilitás határa 2% 333 nt szakaszon) vették alapul. Eszerint 0-0,25% eltérés az általuk vizsgált C. comensis, C. pseudocomensis és C. costei törzsek között azt jelezte, hogy ezek ugyanabba a fajba tartoznak. Sőt, ez alapján a C. ocellatat, mely 0-0,5% különbséget mutatott az említett törzsekkel, sem lehet elkülöníteni tőlük. Ugyanebben a vizsgálatban más gének nagyobb eltérést mutattak a C. comensis/pseudocomensis/costei csoport és a C. ocellata között, de közeli rokonoknak mutatták őket. A 2% határértéket alkalmazva a mi szekvenciáink Zimmermann és mtsai. (2011) által ajánlott részére, az összes minta egy fajhoz tartozna. A C. cf. ocellata morfológiájú, de C. cf.

94 comensis genotípusú („B” szekvenciatípus) Visovac minta alátámasztani látszik ezt. Továbbá, a C. cf. ocellatat képviselő „A” és „D”, illetve a C. cf. comensishez tartozó „B” és „C” szekvenciák közötti legkisebb távolság 0,11% (1 nt eltérés), amekkora eltérés egy morfofajon belül is előfordult (az „A” és „D”, illetve „B” és „C” csoport között). A 18S rDNS magas intraspecifikus variabilitását a Thalassiosisirales renden belül a Skeletonema Greville nemzetségnél is kimutatták (Alverson és Kolnick 2005). Mindemellett az is igaz, hogy ez a régió nem választja el egymástól a Stephanodiscus és Cyclostephanos nemzetséget (Függelék F/8A. ábra). Ezért valószínűbb, hogy a Zimmermann és mtsai. (2011) által javasolt szakasz nem rendelkezik elegendő variabilitással a fajok elkülönítéséhez nemcsak a Stephanodiscus nemzetségen belül (ahogy azt a szerzők is megállapították), hanem a Cyclostephanos nemzetségen és a C. ocellata csoporton belül sem. A 18S rDNS mellett az rbcL gén részleges szekvenciáját is megvizsgáltuk. Ezt a gént szintén több szerző (pl. Hamsher és mtsai. 2011, Lee és mtsai. 2013) is javasolta vonalkód markernek, nincs egyetértés atekintetben, hogy melyik régióját érdemes használni, és hogy milyen küszöbértéket érdemes alkalmazni az egyes kovaalga csoportoknál. Az általunk vizsgált szakasz a start kodontól számítva a 628 nt-nál kezdődő (a C. ocellata LB8 törzshöz viszonyítva) 454-499 nt hosszú régió volt, melyben a legnagyobb eltérés a vizsgált minták és a C. ocellata LB8 között 0,66% (3 nt) volt. Ezt azonban nehéz a korábbi vizsgálatokban szereplő szakaszokhoz hasonlítani, melyek hossza, helye eltérő, akárcsak a tanulmányozott kovaalga csoport. Evans és mtsai. (2007) szerint a 0,4% divergencia (5 nt) a teljes (1400 nt hosszú) szakaszon az „elliptikus” Sellaphora pupula izolátumok és a 2,2% különbség (30 nt ugyanazon a szakaszon) a Sellaphora laevissima izolátumok között is több kriptikus faj jelenlétét jelzik. Ehhez képest a két S. laevissima izolátum között 0,4% (8 nt) különbséget figyeltek meg a szerzők a 18S rDNS esetében. Hamsher és mtsai. (2011) az rbcL-3P elnevezésű, a gén 3’ végén található 748 nt hosszú szakaszt javasolták vonalkódnak, amely az 5’ végén részben átfedett az általunk vizsgált szakasszal. A legkisebb különbség két faj között ebben a régióban 1-2 nt volt (két Sellaphora faj között, Hamsher és mtsai. 2011). A szerzők azonban csak a Bacillariophyceae osztály két rendjének, a Naviculales és a Bacillariales rendnek a képviselőit elemezték. Ezzel szemben más szerzők kifejezetten magas intraspecifikus variabilitásról számoltak be. Rimet és mtsai. (2014) 2% variabilitást találtak 1270 nt hosszú szakaszon a Nitzschia palea törzsek között. Stoof-Leichenring és mtsai. (2012) pedig 1,3-8% különbséget figyeltek meg 76 nt hosszú szakaszon a S. laevissima és S. pupula törzsein belül.

MacGillivary és Kaczmarska (2011) az rbcL egy 540 nt hosszú szakaszán, amely 5’ irányban 219-316 nt hosszon átfedett a mi szekvenciáinkkal, 1% intra/interspecifikus küszöbértéket vizsgált meg a Bacillariophyceae és 2% határt a Mediophyceae osztály esetében. Azonban ezek a határok csak a fajok 96 illetve 93%-át különítették el, illetve a biológiailag definiált Bacillariophyceae fajoknak mindössze 80%-át. Ezért a szerzők ezt a szakaszt önmagában nem, csak 5,8S+ITS2 markerrel együtt ajánlották a fajok elválasztására. Kistenich és mtsai. (2014) 507 nt hosszú szakaszon 0,4%-nál kisebb különbséget mutattak ki a C. comensis, C. pseudocomensis és C. costei között. A szerzők úgy vélték, hogy ez egy faj intraspecifikus variabilitását jelenti, ami 0,4-0,6%-ban tér el a C. ocellatatól. A C. cf. ocellata morfofajt képviselő „A” rbcL típus 0,50-0,75% (2-3 nt 402 nt szakaszon) tért el a C. cf. comensishez tartozó szekvenciatípusoktól, ami elég nagy különbség lehet két faj szétválasztásához. Azonban az egy morfofajhoz tartozó „C” és „D” típus is különbözött egymástól 2 nt pozícióban. Összességében, a DNS-szekvencia divergencia alacsony volt a morfofajok között, és a változatosság morfofajokon belül is megfigyelhető volt. Különösen igaz ez a 18S rDNS-re, mely teljes szakaszának összehasonlítása talán segít eldönteni a kérdést, hogy a C. ocellata és C. comensis egy fajt alkot-e. A részleges rbcL szekvenciák jobban működtek, divergenciájuk magasabb volt, mint amit Kistenich és mtsai. (2014) számoltak a C. comensis, C. pseudocomensis és C. costei között. Továbbá, az rbcL szekvenciák variabilitása valamivel jobban tükrözte a morfofajokat. Eredményeink nem támasztották alá azt az elképzelést, hogy a C. ocellata és a C. comensis ugyanaz a faj lenne.

6.3.3. A filogenetikai összefüggések a Cyclotella ocellata/Cyclotella comensis komplexben A korábbi filogenetikai tanulmányok (Alverson és mtsai. 2007, Jung és mtsai. 2010, Lee és mtsai. 2013), melyekben csak a C. ocellata LB8 törzs képviselte a C. ocellata csoportot, azt mutatták, hogy ez a faj a C. bodanicaval együtt elkülönül a többi Cyclotella fajtól. Ezt a mi eredményeink is alátámasztották. Kistenich és mtsai. (2014), akik C. comensis/ pseudocomensis/costei komplexet összehasonlították a C. ocellataval nem közöltek filogenetikai fát. Az általunk készített fákon a minták kissé szétválnak két klasztert (C. cf. ocellata és C. cf. comensis) alkotva, melyek két közel rokon fajt képviselhetnek. Bár Kistenich és mtsai. (2014) hangsúlyozták, hogy ilyen fajta taxonómiai kérdés megválaszolásához fontos a klonális tenyészetek morfológiai és molekuláris vizsgálata, eredményeink azt mutatták, hogy egyetlen Thalassiosirales fajt tartalmazó közösségek és

96 főleg a Thalassiosirales rend tagjaira specifikus primerek használata is elfogadható. Az általunk használt primerek a Thalassiosirales rend számos tagjának szekvenciáira specifikusak, ezért olyan mintákból, melyekben elektronmikroszkópos vizsgálat szerint csak C. ocellata/C. comensis komplex volt a Thalassiosirales fajok közül, de azon belül tartalmaztak kriptikus fajt, kevert szekvenciákra számítottunk (ld. elektroferogramok 30. ábra, Függelék F/9A-B. ábrák). Ennek a kutatásnak a legfontosabb eredményeit Duleba és mtsai. (2015) cikkben publikáltuk.

7. A Cyclotella ocellata filogenetikai vizsgálata – a Pantocsekiella nemzetség

7.1. Bevezetés

7.1.1. A Cyclotella nemzetség A Cyclotella (Kützing) Brébisson nemzetséget, amelyet Brébisson (1838) írt le, sokáig egységesnek tartották (pl. Krammer és Lange-Bertalot 1991), mely ugyan morfológiailag diverz fajokat foglalt magában, de ezeket mégis összekötötte egy közös bélyeg: a valva centrális területe, mely striákat nem, de más díszítőelemeket tartalmazott és a marginális területe, mely a striákat hordozta, elkülönült egymástól. Azonban több szerző (Lowe 1975, McFarland és Collins 1978, Serieyssol 1981, Servant-Vildary 1986, Loginova 1990) is elkülönített néhány morfológiai csoportot a nemzetségen belül. Később egyre több taxonómus tartotta túl általánosnak a nemzetség leírását, és így újabb és újabb nemzetségeket írtak le más kritériumok (pl. a rimoportula alakja és helyzete) alapján recens és fosszilis taxonokat egyaránt figyelembe véve. Így jött létre a Tertiarius Håkansson et Khursevich (Håkansson és Khursevich 1997), a Puncticulata Håkansson (Håkansson 2002) és a Discostella Houk et Klee (Houk és Klee 2004) nemzetség. A Puncticulata nemzetséget később javították. A leírás elsőbbsége miatt Handmannia Peragallo (Handmann 1913) nevet kapta (Khursevich és Kociolek 2012). Később Nakov és mtsai. (2015) nomenklatúra elsőbbség miatt érvénytelenítették mind a Handmannia, mind a Puncticulata nevet, és a Lindavia (F. Schütt) De Toni et Forti nevet adták a nemzetségnek Schütt (1899a) valamint De Toni és Forti (1900) leírása nyomán. Azt, hogy a Cyclotella nemzetség nem monofiletikus, molekuláris biológiai alapon (két nukleáris gén 18S és 28S rDNS, és két kloroplasztisz genomban kódolt gén, az rbcL és a psbC alapján) először Alverson és mtsai. (2007) bizonyították. A csak a nukleáris gének, a csak a kloroplasztisz gének, illetve mind a négy gén felhasználásával készült fa ugyanazt mutatta: a C. ocellata és C. bodanica egyértelműen elkülönült a C. meneghiniana csoporttól (Cyclotella sensu stricto, amelybe többek között a következő, a C. meneghinianaval közel rokon fajok tartoznak: C. atomus, Cyclotella cryptica Reimann, J.C. Lewin et Guillard, Cyclotella choctawhatcheeana Prasad, C. distinguenda, Cyclotella gamma Sovereign, Cyclotella litoralis C. B. Lange et Syvertsen), Cyclotella quillensis L. W. Bailey, C. striata, Cyclotella stylorum Brightwell). Emellett a Discostella fajok is egyértelműen külön kládot alkottak, mely a C. ocellata és C. bodanica alkotta leágazás testvércsoportjaként jelent meg a fán.

Jung és mtsai. (2010) egy hosszú génszakasz alapján, mely magában foglalta a teljes 18S rDNS-t és a 28S rDNS egy részét is, megerősítették, hogy a Discostella nemzetség és C. ocellata, C. bodanica alkotta klád együtt, egy nagyobb klád része, mely elkülönül a Cyclotella meneghiniana-csoporttól. Felvetették, hogy a C. bodanica és C. ocellata fajok vagy a Discostella vagy pedig egy új nemzetségbe tartoznak genetikai szempontból. Mivel Håkansson (2002) a C. bodanicat a Puncticulata nemzetségbe helyezte át, ezért Alverson (2014) is a Puncticulata ocellata és a Puncticulata bodanica (Grunow in Schneider) Håkansson néven említette, noha korábban már Khursevich és Kociolek (2012) egyértelműen leírta, hogy a Handmannia névnek prioritása van a Puncticulata névvel szemben. Khursevich és Kociolek (2012) összefoglalta és továbbfejlesztette a nemzetségen belüli morfológiai csoportokat, és komplex diagnózist adott a következő bélyegek alapján: a) az alveolák szerkezete, b) a rimoportula szerkezete, száma és helyzete, c) a striák szerkezete. Mindezek alapján tizenkét morfológiai Cyclotella csoportot különítettek el. A C. ocellata és a C. tripartita a hatodik csoportba, míg a Cyclotella costei, a Cyclotella gracilis Nikiteeva et Likhoshway, a C. kuetzingiana, C. rossii és a C. schumannii (Grunow) Håkansson a hetedik csoportba tartoztak. A két csoport a szerzők által adott leírás szerint a fent említett három fő szempont szerint nem tért el. Különbséget a centrális area unduláltságának irányultságában (a hatos csoportban radiális és a hetesben, ha van, akkor átlós irányú), a centrális areán lévő bemélyedésekben (a hatos csoportban: a bemélyedések papillákkal váltakozva vagy azokkal együtt háromszögletű szektorokba rendeződve fordulnak elő, a hetes csoportban: kicsi és nagy bemélyedések fordulnak elő, de hiányozhatnak is) és a valvafelszíni fultoportulák számában (hatos csoportban 1-11, hetes csoportban 1-5) fogalmaztak meg. Nakov és mtsai. (2015) a C. ocellatat számos más fajjal (pl. a Handmannia fajokkal) együtt a Lindavia nemzetségbe helyezték a rimoportula helyzete alapján, de felvetették a lehetőségét, hogy a későbbiekben a Lindavia több nemzetségre bontható. Molekuláris biológiai vizsgálatok azonban nemcsak a Cyclotella nemzetség felosztását erősítik meg, hanem a nemzetség kibővítését is. Alverson és mtsai. (2011) a korábbi vizsgálatban (Alverson és mtsai. 2007) kapott szekvenciák újbóli elemzése alapján a Thalassiosira pseudonana visszahelyezését javasolták a Cyclotella nemzetségbe, Cyclotella nana néven, mivel ez a faj a legközelebbi rokonságot a C. meneghiniana-csoporttal mutatta.

A kérdés megválaszolására, hogy a C. ocellata és a C. bodanica ugyanabba a nemzetségbe, a Lindaviaba sorolható-e, a kapott minták és szekvenciák (ezeket a 4.1. fejezetben

99 ismertettem) felhasználásával morfológiai (4.4. fejezet), valamint filogenetikai és p-távolság elemzéseket (4.6. fejezet) végeztünk.

7.2. Eredmények

7.2.1. Morfológiai vizsgálat A Lindavia (Handmannia) radiosa Stechlin- (34./A, B ábra) és Nehmitz-tóból (34./C, D ábra) származó klonális tenyészetét volt lehetőségünk megvizsgálni. Ezek alapján a L. radiosa frusztulumok korong alakúak; a valvák kör alakúak voltak, átmérőjük 6-12,9 µm közt változott. A poligonális centrális area az átmérőtől függetlenül lehetett kicsi vagy nagy, lapos volt vagy enyhén koncentrikusan hullámos, konvex vagy konkáv, kívülről sima vagy kis kiemelkedésekkel teli, néha radiálisan ráncos. A striázottság finom volt, 7-9 striát számoltunk 10 µm-en, melyek egyenlőtlen hosszúak voltak. A striázottsági mintázathoz összetett alveoláris szerkezet tartozott, a belső alveoláris nyílások 3-7 vékony bordával váltakoztak két megvastagodott borda között. Minden megvastagodott borda egy-egy marginális fultoportulát hordozott a valva széle közelében, mellettük két-két szatellit pórust láttunk. Az areolák és a valvafelszíni fultoportulák radiális sorokba rendezve vagy elszórtan helyezkedtek el. A valvafelszíni fultoportulák az areolák közt elszórva helyezkedtek el vagy pedig a radiális areola sorok közé ékelődtek egy gyűrűt formálva. A valvafelszíni fultoportulák kívülről kis nyílásokként látszottak, belülről három szatellit pórus vette őket körül. Gyakran fordultak elő izolált areolák a valva közepén.

34. ábra: Lindavia radiosa SEM felvételek (A-B: Stechlin-tóból izolált tenyészet, C-D: Nehmitz-tóból izolált tenyészet). A, C. ábra: a valvafelszín külső nézetből, a striák különböző hosszúak, az areolák középen elszórtan, a valvafelszíni fultoportulák pedig gyűrűben helyezkednek el, tüskék vannak a valva szélén, és granulumok a közepén. B, D. ábra: a valva belső nézetből az areolák középen elszórtan, a valvafelszíni fultoportulák pedig gyűrűben helyezkednek el. Mérték = 1 μm.

100

A valvafelszín szubmarginális zónájában egy-két rimoportulát találtunk. Külső nyílásuk a rövid striák végén lévő hialinos bordán helyezkedett el, míg belül helytülő, nyílása résszerű, ami vagy radiálisan vagy a valva peremével párhuzamosan állt. A morfológiai bélyegek alapján javasolni lehetett a C. ocellata-comnesis csoport új nemzetségként való leírását, amit Ács és Kiss Pantocsekiella K.T. Kiss et Ács néven meg is tett (1. függelék, Ács és mtsai. 2016), ezért a későbbiekben ezen a néven hivatkozom a C. ocellata-comensis ágra.

7.2.2. A vizsgált fajok filogenetikai vizsgálata Frédéric Rimet-től egy, a Genfi-tóból izolált C. costei klonális tenyészetből származó teljes rbcL (1500 nt hosszú) illetve majdnem teljes 18S rDNS (1699 nt hosszú) szekvenciát kaptunk. Mirko Dreßler két L. radiosa tenyészet parciális rbcL (mindkettő 506 nt hosszú) és 18S rDNS (391 és 399 nt hosszú) szekvenciáit bocsátotta rendelkezésünkre. A két tenyészet szekvenciái teljesen azonosak voltak. A Stechlin-tóból származó L. radiosa szekvenciákat meghosszabbítottuk (rbcL: 1407 nt, 18S rDNS: 1667 nt). A BLAST keresés eredményét a 13. táblázat foglalja össze.

13. táblázat: Az újonnan kapott szekvenciák összehasonlítása NCBI GenBank adatbázis szekvenciáival (BLAST programmal). A táblázat csak a Stechlin-tóból származó Lindavia radiosa tenyészet kibővített szekvenciáinak összehasonlítását tartalmazza. A csillaggal (*) jelölt szekvencia a GenBank adatbázisban nem szerepel, és hosszabb, mint az adatbázisban lévők, ezért nem a teljes hosszában lehetett az adatbázisban lévőkhöz illeszteni. Tenyészet Gén A legközelebbi törzs/elérhető (mintavételi Bázispár (hasonlóság [%]) (elérési szám) szekvencia hely)

* Cyclotella rbcL Cyclotella ocellata LB8 törzs 1427/1438 nt (99%) costei TCC353 Cyclotella ocellata LB8 törzs 1685/1699 nt, 2 gap (99%) (Genfi-tó) 18S rDNS több Stephanodiscus és (KT072952.1) 1688/1699 nt, 2 gap (99%) Cyclostephanos szekvencia négy Stephanodiscus 1372-1375/1407 nt (98%) rbcL szekvencia (KT072951.1) Lindavia Lindavia bodanica J98-1 törzs 1371/1407 nt (98%) radiosa S1 több Stephanodiscus (köztük (Stechlin-tó) 18S rDNS Praestephanos triporus) és 1642-1652 nt/1667, 1 gap (99%) (KU295762.1) Cyclostephanos szekvencia

Cyclotella ocellata LB8 törzs 1645/1667 nt, 1 gap (99%)

101

Általánosságban a két vizsgált faj szekvenciái a C. ocellata, L. bodanica, Stephanodiscus és Cyclostephanos szekvenciákkal mutatták a legnagyobb hasonlóságot.

7.3.3. A filogenetikai távolság analízise A p-távolság értékeket két adatsoron számoltuk ki. Az egyik esetben mind a rövid, mind a hosszú szekvenciákat (a C. costei és L. radiosa tenyészetek szekvenciáit, illetve a Függelék F/5. táblázatban felsoroltakat) bevontuk, a második esetben csak a hosszú szekvenciákat vizsgáltuk. Általánosságban a p-távolság értékek alacsonyabbak voltak a kevesebb szekvencia hosszabb szakaszán, mint a több szekvencia rövidebb szakaszán.

Átlagos távolság a csoportokon belül: Az összes és csak a hosszú rbcL szekvenciák alapján is a javasolt Pantocsekiella nemzetségen belül volt a legalacsonyabb a csoporton belüli átlagos p-távolság (az összes szekvencia alapján: 0,29%, míg a többi nemzetségben 0,96-6,48%; csak a hosszú szekvenciák alapján: 0,84%, míg a többi csoportban 0,95-7,50%). A Pantocsekiella 18S rDNS szekvenciák is viszonylag alacsony csoporton belüli p- távolságot mutattak (összes szekvencia alapján 0,49%, csak a hosszúak alapján 0,58%), csak három nemzetségé (Bacterosira Gran, Stephanodiscus, Cyclostephanos) volt alacsonyabb (0- 0,46% illetve 0,11-0,23%, az összes illetve csak a hosszú szekvenciák alapján. A legnagyobb értékek a Cyclotella (az összes szekvencia alapján: 2,80%, a hosszú szekvenciák alapján: 1,83%) és a Skeletonema (összes: 2,28%, csak hosszú: 2,12%) nemzetségen belül fordultak elő.

Átlagos távolság a csoportok között: A Pantocsekiella néven megjelölt csoport az rbcL szekvenciák esetében a Lindaviaval mutatta a legkisebb távolságot (14. táblázat), azonban 18S rDNS esetében Stephanodiscusszal (15. táblázat). A Pantocsekiella és Lindavia nemzetség közti távolság mindkét gén esetében, mind az összes, mind csak a hosszú szekvenciák felhasználásával készült elemzésben nagyobb volt, mint a Stephanodiscus és Cyclostephanos közti távolság (14., 15. táblázat), melyek szintén egymással közel rokon, de különböző nemzetségek (35. ábra).

102

14. táblázat: Az rbcL szekvenciák százalékban kifejezett átlagos távolsága a nemzetségek, mint csoportok között. Az első szám az összes szekvencia átlagos távolságát jelzi, ez az összehasonlítás 415 nukleotid pozíciót tartalmazott. A második szám zárójelben a rövid szekvenciák kihagyásával számolt átlagos távolságot mutatja, az elemzésbe ekkor 1306 pozíciót vontunk be. A nemzetségnév utáni szám zárójelben az egyes csoportok elemzésbe vont fajainak a számát jelzi, az első szám az összes szekvenciával, a második szám pedig csak a hosszú szekvenciákkal készült elemzésbe vont fajok száma. Azokat a távolságokat, amelyek mindkét

elemzésben kisebbek voltak a Pantocsekiella–Lindavia távolságnál, dőlttel jelöltük.

(6/5)

(12/10)

(2/2)

(4/4) (12/12)

(2/2)

Pantocsekiella Lindavia Cyclotella Discostella Stephanodiscus Cyclostephanos Bacterosira Shionodiscus 4,30 Lindavia (2/2) (3,41) Cyclotella 8,48 7,60 (12/12) (6,47) (6,25) 6,50 5,51 8,18 Discostella (4/4) (5,26) (5,03) (6,65) Stephanodiscus 4,95 3,45 7,51 4,74 (12/10) (3,44) (2,79) (6,01) (4,28) Cyclostephanos 6,36 4,38 7,70 5,00 3,42 (6/5) (4,02) (3,25) (5,92) (4,16) (2,17) 5,81 5,48 8,45 5,30 4,34 3,95 Bacterosira (2/2) (5,90) (5,86) (7,15) (5,26) (5,22) (4,95) Shionodiscus 10,12 8,98 10,43 9,58 8,98 9,22 8,73 (2/2) (7,48) (7,35) (7,82) (7,30) (7,16) (7,23) (7,04) Skeletonema 8,44 7,31 8,87 7,00 6,95 6,23 5,86 10,36 (6/6) (6,29) (6,04) (6,96) (5,79) (5,60) (5,39) (5,65) (7,80)

Mind a Pantocsekiella, mind a Lindavia kisebb távolságot mutatott a Stephanodiscusszal, mint a Cyclostephanosszal a két gén kétféle adatsorán végzett elemzésben (14., 15. táblázat).

103

15. táblázat: A 18S rDNS szekvenciák százalékban kifejezett átlagos távolsága a nemzetségek, mint csoportok között. Az első szám az összes szekvencia átlagos távolságát jelzi, ez az összehasonlítás 360 nukleotid pozíciót tartalmazott. A második szám zárójelben a rövid szekvenciák kihagyásával számolt átlagos távolságot mutatja, az elemzésbe ekkor 1564 pozíciót vontunk be. A nemzetségnév utáni szám zárójelben az egyes csoportok elemzésbe vont fajainak a számát jelzi, az első szám az összes szekvenciával, a második szám pedig csak a hosszú szekvenciákkal készült elemzésbe vont fajok száma. Mivel a Cyclotella stylorum Brightwell 18S rDNS szekvenciája nem elérhető, ezért a 18S rDNS-vizsgálatban a Cyclotella nemzetségből csak 11 faj szekvenciáját tudtuk elemezni, míg a rbcL esetében 12 fajét. Azokat a távolságokat, amelyek mindkét

elemzésben kisebbek voltak a Pantocsekiella–Lindavia távolságnál dőlttel jelöltük.

(6/5)

(12/10)

(2/2)

(4/4) (11/11)

(2/2)

Pantocsekiella Lindavia Cyclotella Discostella Stephanodiscus Cyclostephanos Bacterosira Shionodiscus 1,76 Lindavia (2/2) (1,13) 7,70 8,66 Cyclotella (11/11) (4,87) (5,21) 1,91 3,26 8,20 Discostella (4/4) (1,81) (2,28) (4,73) Stephanodiscus 1,10 1,39 7,79 2,31 (12/10) (0,85) (1,21) (4,54) (1,57) Cyclostephanos 1,25 1,55 7,89 2,45 0,33 (6/5) (0,89) (1,21) (4,54) (1,56) (0,27) 2,52 2,71 6,94 2,78 1,94 2,18 Bacterosira (2/2) (1,93) (2,24) (4,82) (2,22) (1,37) (1,56) 2,52 2,71 7,89 2,60 1,94 2,18 1,11 Shionodiscus (2/2) (1,79) (2,13) (4,77) (2,10) (1,37) (1,46) (1,15) 7,00 8,10 10,46 6,94 7,54 7,75 5,69 6,44 Skeletonema (6/6) (5,48) (5,96) (7,51) (5,53) (5,53) (5,68) (5,27) (5,45)

7.2.4. Filogenetikai elemzés A filogenetikai fák megbízhatóságának növelése érdekében, ezekből az elemzésekből a rövid szekvenciákat kizártuk. Mind az egy-egy génen (Függelék F/10-F/13. ábra), mind a két génen (35. ábra) alapuló fa azt mutatta, hogy a Pantocsekiella ocellata és a P. comensis (costei) szekvenciák egy klasztert képeztek, mely elkülönült a L. radiosa és Lindavia bodanica (Eulenstein ex Grunow) T. Nakov, Guillory, Julius, Theriot et Alverson alkotta kládtól. A Pantocsekiella mindegyik fán monofiletikusnak bizonyult, így önálló nemzetségként való elkülönítése indokolt. Legközelebbi rokonának a Lindavia tekinthető (35. ábra, Függelék F/10-F/13. ábra).

104

35. ábra: A két gén szekvenciáiból Bayes-módszerrel készült filogenetikai fa. A szubsztitúciós modellek a következők voltak: 18S rDNS esetében Tamura-Nei modell (Tamura és Nei 1993) gamma eloszlással, rbcL esetében GTR modell (Rodríguez és mtsai. 1990) gamma eloszlással és invariáns helyekkel. Generációk száma: 700000, a konvergencia diagnosztikai érték az utolsó generációban: 0,010198. Az elágazásoknál a posterior valószínűségeket tüntettük fel. Skála = 0,02 szubsztitúció/hely. Narancssárga színnel a Pantocsekiella, kékkel a Lindavia, zölddel a Cyclotella szekvenciákat emeltem ki.

105

7.3. Diszkusszió

Az elmúlt évtizedekben készült tanulmányok (a legfontosabbak: Lowe 1975, Genkal és Kuzmin 1979, Genkal és Zagorenko 1987, Klee és Steinberg 1987, Håkansson 1990, Hegewald és Hindáková 1997, Knie és Hübener 2007, Cherepanova és mtsai. 2010, valamint a 16. táblázatban felsorolt hivatkozások) a C. ocellata részletes elektronmikroszkópos elemzéseivel rámutattak a faj figyelemre méltó morfológiai variabilitására és a valvafelszín szerkezet heterovalvás (a két valva különbözik) jellegére. A Pantocsekiella nemzetség leírásánál főleg ezek a publikációk jelentették a támpontot. Megjegyzendő, hogy a Pantocsekiella nemzetség kis átmérőjű képviselői külső nézetben nagyon hasonlítanak egymásra (pl. Cyclotella ocellata: Genkal és Zagorenko 1987, p-s ábra, C. hispanica: Kiss és mtsai. 2002, 7., 8., C. comensis: Scheffler és Morabito 2003, 18-20, 24. ábra). Mikor Medlin és Kaczmarska (2004) molekuláris, citológiai és morfológiai vizsgálatok eredményeit felhasználva két kládra (Coscinodiscophyceae és Mediophyceae) választotta szét a korábbi Centrales rendet, a morfológiai bélyegek közül nagy jelentőséggel bírt a rimoportula és a marginális fultoportula. Ebből kiindulva ezen bélyegek eltérései összefügghetnek a filogenetikai szétválásokkal. A rimoportula és a fultoportula funkciójának vizsgálatáról Round és mtsai. (1990) adnak áttekintő képet. A rimoportula a felszínhez vagy egy másik kovaalga sejthez való kapcsolódás kezdeti szakaszában vehet részt (Round és mtsai. 1990), illetve a mozgásban lehet szerepe (Medlin és Crawford 1986). A fultoportula pedig β-kitin fibrillumok kiválasztásában közreműködik (Round és mtsai. 1990). A C. meneghiniana-csoportban (38./D. ábra) a rimoportula a valvafelszín peremén helyezkedik el, a belső oldalon egy valva köpeny bordáról emelkedik ki. A marginális fultoportulák szintén az azonos méretű bordákon helyezkednek el. Korábban a Cyclotella nemzetség magában foglalta a Discostella nemzetséget is, melyet azonban morfológiai bélyegek alapján elválasztottak (Houk és Klee 2004). Ezt később filogenetikai bizonyítékok is alátámasztották (Jung és mtsai. 2010). A Discostella nemzetségben a rimoportula szintén a peremen, a bordákon található, azonban a marginális fultoportulák a bordák között helyezkednek el. A rimoportulák általában szesszilisek, ritkán nyélen ülnek. Nakov és mtsai. (2015) a rimoportula helyzetét a valvafelszínen szünapomorfiának tartották a Cyclotella comta és C. ocellata csoportokra nézve, és az ezzel a tulajdonsággal rendelkező taxonokat a Lindavia nemzetségbe sorolták. A szerzők Theriot és munkatársainak (1987) munkáját idézték, miszerint „filogenetikai nézőpontból az areolák és a

106 fultoportulák a valvafelszínen problémásak, mert mindkettő pleziomorf (vagyis ősi) a Thalassiosiralesen belül”, azonban az idézett cikk nem tartalmaz ilyen kijelentést. Éppen ezért úgy véltük, hogy a kupolás kribrummal rendelkező valvafelszín ezen a leszármazási vonalon nem pleziomorf, hanem új (apomorf) bélyeg, mely a Pantocsekiella nemzetségben nem jelent meg. Alverson (2014) által közölt filogenetikai fa szerint az ezzel a bélyeggel rendelkező csoportok (pl. Stephanodiscus, Cyclostephanos) később alakultak ki, mint azok, melyek valvafelszínén nincsenek areolák (pl. Cyclotella sensu stricto). A Handmannia nemzetségben, melyet Nakov és mtsai. (2015) szintén a Lindaviaba soroltak, a centrális area areolái kupolás kribrummal fedettek, és számos fajnál [H. comta (Ehrenberg) Kociolek et Khursevich (Khursevich és Kociolek 2012)] a valvafelszínen több fultoportula található, míg másoknál csak areolák [pl. H. glabriuscula (Grunow) Kociolek et Khursevich (Khursevich és Kociolek 2012)]. Ezzel szemben a Cyclotella ocellata csoport (vagyis a javasolt Pantocsekiella nemzetség) tagjainak több valvafelszíni fultoportulája is lehet, azonban más nem töri át a centrális areát. Kociolek és Williams (2015) rámutatott, hogy az egy csoportba sorolt taxonok mindegyikének rendelkeznie kell a diagnosztikus bélyeggel/bélyegekkel, valamint felhívták a figyelmet arra, hogy új nemzetség leírásánál fontos, hogy az monofiletikus legyen. Ezek a Pantocsekiella nemzetség esetében teljesülnek. Több tanulmány is irányult arra, hogy megtalálják azt a DNS vonalkód szakaszt, amelyet kovaalgák esetében a fajok azonosítására lehet alkalmazni. Ilyen például a 18S rDNS V4 alrégiója (Zimmermann és mtsai. 2011), vagy az rbcL 3’ végén lévő szakasz (Hamsher és mtsai. 2011). A pontos azonosításhoz a taxonómiai szinteket elválasztó küszöbértékek (pl. határ az intra- és interspecifikus variabilitás mértéke között) is szükségesek. Bizonyos markereken néhány szerző próbált ilyen határértéket definiálni (pl. Luddington és mtsai. 2012), azonban ez nem egyszerű (Rimet és mtsai. 2014). Küszöbértéket meghatározni nemzetség szinten még nehezebb, mint faj szinten, mivel azok már több leszármazási vonalat foglalnak magukban (Kermarrec és mtsai. 2014). Referencia könyvtárak vizsgálatával Kermarrec és mtsai. (2014) megkísérelték definiálni az inter-/intraspecifikus és az inter-/intragenerikus határértékeket, hogy nemzetség- és fajnevet adhassanak bentikus közösségekből származó szekvenciáknak. Törzsekből összeállított, tehát ismert összetételű (főleg Pennalesekből álló) közösségen tesztelték a határokat. Akkor kapták a legjobb becslést a valódi közösség összetételre, mikor 18S rDNS esetében faj és nemzetség szintjén is 99%, rbcL esetében faj szintjén 99%, nemzetség szintjén 98%-os szekvencia- hasonlóságot használtak. A fajokra használt leolvasási szelekciós kritérium túl szigorú volt a nemzetségekhez. A Pantocsekiella áltagos távolsága bármelyik másik csoporttól rbcL

107 esetében 2% felett volt, és ugyanezt figyeltük meg az egyes szekvenciák páronkénti összehasonlításánál is. A 18S rDNS esetében a Pantocsekiella átlagos távolsága Cyclostephanostól és Stephanodiscustól 1%-nál alacsonyabb volt (a hosszú szekvenciák esetén, 7.3. táblázat). A Pantocsekiella szekvenciák páronkénti távolsága a legtöbb Stephanodiscus és Cyclostephanos szekvenciával, valamint a Praestephanos triporus (Genkal et G.V. Kuzmin) Tuji et J.-S. Ki szekvenciájával 1% alatt volt (0,56-0,84% az összes szekvenciát figyelembe véve, 0,54-0,94% csak a hosszúak alapján). Megjegyzendő, hogy Kermarrec és mtsai. (2014) főleg Pennalesek alapján definiálták a küszöbértékeket. A szerzők szerint is nehéz meghatározni olyan határértéket, amely az összes kovaalga taxonra alkalmazható, mert az egyes leszármazási vonalak nem ugyanabban az ütemben fejlődtek. Luddington és mtsai. (2012) a 18S rDNS egy 333 nt hosszú, a V4 alrégiót is magába foglaló szakaszát vizsgálták Thalassiosirales, Lithodesmiales és Cymatosirales rend összesen 26 nemzetsége esetében, és 0,001-0,235 (vagyis 0,1-23,5%) p-távolságot találtak köztük. A Pantocsekiella és testvércsoportja, a Lindavia (35. ábra) közti távolság is illeszkedett ebbe a tartományba, azonban a szerzők által a fajazonosítási határként meghúzott 2% alatt maradt (15. táblázat). Hasonló génszakasz alapján Kistenich és mtsai. (2014) is összevetették a Cyclotella comensis csoportot más nemzetségből származó fajokkal (Cyclostephanos delicatus és Stephanodiscus alpinus), és a számolt intergenerikus távolság szintén 2% alatti érték volt (0,74%). Az egynél több szekvencia felhasználásával végzett elemzésünkben a Pantocsekiella átlagos távolsága mind a Stephanodiscustól, mind a Cyclostephanostól, nagyobb volt, mint 0,74%, de kisebb volt, mint 2% (15. táblázat). Az rbcL egy parciális szakaszán (507 nt) Kistenich és mtsai. (2014) 4,54-6,11% eltérést találtak a három nemzetség egy-egy képviselője között. Az összes rbcL szekvencia összevetésével kapott eredményeink szerint a Pantocsekiella-Stephanodiscus távolság beleesett ebbe a tartományba, a Pantocsekiella-Cyclostephanos távolság pedig meg is haladta ezt. A Lindavia az említett két nemzetségnél közelebb áll a Pantocsekiellahoz, így nem meglepő, hogy a távolságuk is kisebb volt az előzőekhez képest, de nem sokkal (14. táblázat). Megjegyzendő, hogy a Himód mintából származó rbcL szekvencia 3’ irányban 105 nukleotiddal el volt tolódva a Kistenich és mtsai. (2014) által vizsgált szakaszhoz képest, így az összehasonlítás csak 402 nt hosszú szakaszon volt lehetséges. Ki (2009) valamint Jung és mtsai. (2010) majdnem teljes hosszúságú (1689 illetve 1704 nt) 18S rDNS szakasz alapján vizsgálták a Cyclotella, Discostella és Stephanodiscus nemzetségek kapcsolatát. A p-távolság és filogenetikai elemzéseik a három nemzetség szignifikáns elkülönülését mutatták. Azonban ezek a vizsgálatok csak a C. meneghiniana-

108 csoportra terjedtek ki az eredeti Cyclotella nemzetségen belül, a C. ocellata és C. bodanica fajokat kizárták, mivel úgy gondolták, hogy ezek hovatartozása nem egyértelmű, vagy a Discostellahoz tartoznak vagy egy önálló nemzetséget alkotnak (Jung és mtsai. 2010). A Kimura kétparaméteres modellje alapján számított p-távolság 5,4±0,45 volt a Stephanodiscus és a Cyclotella között, 1,7±0,28 a Stephanodiscus és a Discostella között (Ki 2009), a Cyclotella és a Discostella között pedig 94,4±0,5% volt a hasonlóság (Jung és mtsai. 2010). Az átlagos távolság ugyanezzel a modellel számolva 1564 nt szakaszon 4,69%-nak adódott a Stephanodiscus és a Cyclotella között, 1,60% volt a Stephanodsicus és a Discostella között, és 4,89% volt a Cyclotella és a Discostella között. Ezzel a módszerrel a Pantocsekiella és a Lindavia között 1,15% távolságot számoltunk. Egy Stephanodiscus törzset, melyet eredetileg Ki (2009) hozott létre és vizsgált, nemrég Tuji és mtsai. (2014) egy új nemzetségbe, a Praestephanosba soroltak, P. triporus néven. Ezt a nemzetséget morfológiai bélyegei (a rimoportulák és a marginális fultoportulák helyzete, az areolák mintázata) és négy marker gén (18S és 28S rDNS, rbcL és psbC) felhasználásával készült filogenetikai fán mutatott különálló pozíciója alapján írták le. Ebből a nemzetségből csak a Praestephanos triporus szekvenciái (Stephanodiscus sp. néven, KHR001 törzs) voltak elérhetőek, ezért ezeket használtuk a Pantocsekiellaval való összehasonlításban. A Pantocsekiella tagjaival történt páronkénti összehasonlítás eredményeként a rövidebb illetve a hosszú szakaszon 18S rDNS esetében 0,56-1,12% illetve 0,96-1,12%, rbcL esetében pedig 3,86-4,59 illetve 3,00-3,67% p-távolság adódott. Mind a maximum likelihood, mind a Bayes-módszerrel készült fák topológiája eltért a korábban publikált Thalassiosirales fákétól (Alverson és mtsai. 2007, Alverson 2014). A legfőbb különbség az volt, hogy a mi 18S rDNS fáinkon a Stephanodsicus és Cyclostephanos nem volt monofiletikus, ami azt jelzi, hogy feltéve, hogy a felhasznált szekvenciák nemzetségbe sorolása helytálló, a vizsgált régió nem tartalmaz elég filogenetikai jelet ebben a kovaalga csoportban a két nemzetség elválasztásához. Az összes szekvencia összehasonlításakor az átlagos távolság ezek között a csoportok között alacsony volt (0,33) az összehasonlított szakaszon. Ez a szakasz, amely tartalmazta a V4 alrégiót, kismértékű változatosságot mutat a Stephanodiscuson belül (Zimmermann és mtsai. 2011). A távolság a hosszú szakaszon is kicsi volt (0,27). A legtöbb különbség csak egy-egy szekvenciában fordult elő. Csak Cyclostephanos és Stephanodiscus szekvenciákat összehasonlítva a MEGA6 programmal hat parszimóniailag informatív helyet találtunk. Parszimóniailag informatív helynek azokat a pozíciókat vettük, ahol legalább két különböző nukleotid fordult elő, és mindegyik legalább két különböző taxonban. Az ezeken a helyeken talált szubsztitúciók csak

109 a szekvenciák egy-egy csoportjára voltak jellemzők, de egyik sem különítette el a két nemzetséget. Például a 188. pozícióban egy kivétellel az összes Cyclostephanosnál guanin állt, Cyclostephanos tholiformisnál és a Stephanodiscusoknál pedig adenin, a 239. pozícióban az összes Cyclostephanos és a Stephanodiscus hantzschii WTC21 szekvenciája is citozint tartalmazott, a többi Stephanodiscusé pedig timint. Az Alverson (2014) által közölt filogenetikai fa szerint a Stephanodiscus és a Cyclostephanos közel rokon nemzetségek, melyek viszonylag nemrég váltak el, ami magyarázatot adhat a szekvenciáik közti kevés eltérésre. Alverson és mtsai. (2007) 18S és 28S rDNS adatok együttesére alapozva bizonyították a Stephanodiscus és a Cyclostephanos monofiletikusságát, de külön-külön a két gén alapján nem. Meglehet, hogy a 18S rDNS önmagában nem képes elválasztani ezt a két nemzetséget, csak egy másik markerrel kombinálva, például 28S rDNS-sel vagy esetünkben rbcL-lel. A hosszú 18S rDNS szakaszon négy pozícióban mutatkozott különbség a Lindavia és a Pantocsekiella között. Az rbcL esetében a Stephanodiscus monofiletikusságát a Praestephanos triporus zavarta meg, amely egy csoportot alkotott a Stephanodiscus szekvenciákkal. A Praestephanos nemzetséget Tuji és mtsai. (2014) egy olyan fajra alapozva hozták létre, amelyet a Stephanodiscusból soroltak át az új nemzetségbe. Az elemzésünkben használt Praestephanos szekvencia is eredetileg Stephanodiscus volt. Morfológiai (pl. Lowe 1975) és molekuláris (pl. Alverson és mtsai. 2007) bizonyítékok is egyértelművé tették, hogy az eredeti Cyclotella nemzetséget további nemzetségekre kell osztani, ahogy azt Nakov és mtsai. (2015) meg is tették. Azonban az eddig készült molekuláris vizsgálatokba a C. meneghiniana-csoporton kívül csak a C. ocellatat és a C. bodanicat vonták be, mely utóbbiak az előbbiektől ugyan jól elkülönülő kládot alkottak, de ezen belül a két faj kapcsolatát nem vizsgálták. Azért, hogy megvizsgáljuk, hogy két faj egy nemzetségbe (Lindavia) tartozik-e, mindkét faj mellé bevontuk egy-egy másik (az adott fajhoz diagnosztikus morfológiai bélyegeiben hasonló) faj szekvenciáit is az elemzésbe (Cyclotella comensis csoport és Lindavia radiosa). Eredményeink azt jelzik, hogy a C. ocellata (és a C. comensis csoport) nem tartozik egyik korábban leírt nemzetségbe sem, hanem egy különálló nemzetséget (Pantocsekiella) képviselnek.

A morfológiai bélyegek alapján a nemzetségek differenciál diagnózisa (37-38. ábrák): Cyclotella: a striák egyenlő hosszúak, a centrális area kerek (37./A, 38./A. ábra), egyszerű alveolák (38./D. ábra), egy (ritkán két) rimoportulája van, mely belülről a valva palástnál

110 lévő borda szélén, a perem közelében ered, (38./D. ábra), kívülről elkülönült kerek nyílás vagy hasíték. Lindavia (Handmannia): nem egyenlő hosszúságú striák (37./C, 38./B., E. ábra), a centrális area poligonális, valvafelszíni fultoportulák és areolák vagy csak areolák vannak a centrális areán, az areolát belül kupolás kribrum fedi, kívül lyukak (formanina) találhatóak (38./B., E. ábra). Összetett alveoláris szerkezet jellemzi, amit vastag, marginális fultoportulával rendelkező elsődleges bordák és vékony másodlagos bordák alkotnak, utóbbiak elágazhatnak (38./E. ábra). A helytülő rimoportula a valvafelszín szubmarginális zónájában található (38./B., E. ábra). Pantocsekiella: egyenlőtlen hosszúságú striák (37./B., 38./C. ábra), centrális area poligonális, lapos vagy radiálisan vagy tangenciálisan undulált; az alveolák egyszerűek (38./F. ábra); egy vagy néhány szesszilis rimoportula van a valvafelszín szubmarginális zónájában vagy a centrális lamina végén (38./F. ábra). Belülről csak a valvafelszíni fultoportula töri át a centrális areát, más struktúra nem jellemzi a középső részt.

Határozókulcs: 1. striák egyenlő hosszúak ...... Cyclotella striák nem egyenlő hosszúak ...... 2 2. centrális areán areolák vannak ...... Handmannia (Lindavia) centrális areán nincsenek areolák ...... Pantocsekiella A nemzetség típusfaja a Pantocsekiella ocellata. A nemzetség leírását az 1. függelék tartalmazza.

A Puncticulata nemzetség, a Puncticulata comta (Kützing) Håkansson és a Cyclotella ocellata csoport kapcsolata a szakirodalom alapján nem egyértelmű. Lowe (1975) a Cyclotella nemzetséget három csoportra osztotta (C. meneghiniana, C. comta és C. stelligera csoportra). A C. comta csoport ugyan magába foglalja a C. comtat és C. ocellatat is, azonban a szerző a csoporton belül elkülönít egy alcsoprtot is, amelybe a C. comta beletartozik, de a C. ocellata nem.

111

36. ábra: SEM felvételek a Pantocsekiella ocellataról. A-F. ábrák külső nézet, G-I. ábrák belső nézet. A. ábra: Valva három OD-vel, három papillával, az interstriákon granulumok (Balaton). B. ábra: Valva három OD- vel, két papillával (Himód). C. ábra: Valva három OD-vel (iker OD) és három papillával (Visovac-tó). D. ábra: Valva hét OD-vel és három papillával, interstriákon granulumok vannak (Balaton). E. ábra: Valva négy OD-vel, papilla nélkül (Dunaharaszti). F. ábra: Enyhén négyszögletes valva három OD-vel és három papillával, interstriákon granulumok (Visovac-tó). G. ábra: Valva egy valvafelszíni fultoportulával, egyenlő hosszúságú bordákkal (Balaton). H. ábra: Valva négy valvafelszíni fultoportulával, a marginális fultoportulával rendelkező bordák rövidebbek (Balaton). I. ábra: Enyhén négyszögletes valva két valvafelszíni fultoportulával és három rimoportulával, a marginális fultoportulával rendelkező bordák rövidebbek (Visovac-tó). Mérték = 10 μm (I); 5 μm (A, B, D, F–H); 2.5 μm (E); 2 μm (C).

37. ábra: Cyclotella, Pantocsekiella és Lindavia nemzetségek jellemző fajainak LM képe: Cyclotella meneghiniana (A. ábra), Pantocsekiella ocellata (B. ábra), Lindavia radiosa (C. ábra). Mérték = 10 μm (A. ábra); 5 μm (B, C. ábra).

112

16. táblázat: a Cyclotella ocellata morfológiai variabilitása. d = valva átmérő (µm), stria = striák száma 10 µm-en, VFP = valvafelszíni fultoportulák száma, sz-vfp = valvafelszíni fultoportulák szatellit pórusainak száma, MFP = margninális fultoportulák száma, szp-mfp = marginális fultoportulák szatellit pórusainak száma, RP = rimoportulák száma. *A mikroszkópos felvételeken történt számolások alapján. d stria VFP szp- MFP szp- RP Referenciák vfp mfp 6–25 13–15 Krammer és Lange-Bertalot 1991 3–33 10–20 1–3 2 minden 4–9 2 1–3 Kozurenko és mtsai. 1992 bordán 5–27 14–23 1–6 2 minden 2–7 2 Kiss és mtsai. 1996 bordán 5,6–25 14–20 0–5 2 minden 2–7 2 1 Kiss és mtsai. 1999 bordán 8–13 15–18 1–2 2 minden 2–4 2 1 Alfinito és mtsai. 2001 bordán 2–18 1–3 2 minden (4)5–7 2 1 Håkansson 2002 bordán 2,5–43 10–19 1–7 2 minden 2–6 2 1–4 Edlund és mtsai. 2003 bordán 5,5–35,3 10–22 1–6 Genkal és Bondarenko 2004 3,4–44,2 11–25 1–13 1–3 minden 1–8 2 1–4 Genkal és Popovskaya 2008a bordán 4,4–16,4 18–20 Genkal és Popovskaya 2008b 7,6–16,4 14–20 Popovskaya és Genkal 2008 3,5–24,3 12–30 Genkal és mtsai. 2009 5–22 14–20 1–4 2 minden 2–5 2 1 Houk és mtsai. 2010 (5) bordán 5,3–17,8 14–25 1–9 2* minden 4–6 2* 1* Genkal és Yarushina 2010 bordán * 6–18,6 14–25 Kharitonov és Genkal 2010 8,8–22,2 12–14 Genkal és Bondarenko 2011 4–44 14–20 1–13 2 minden 3–6 2 1 (2) Kiss és mtsai. 2012 bordán 5,5–19 19–22 Solak és Kulikovskiy 2013 5–19 16–18 1 2 minden 4–5 2 1 Cvetkoska és mtsai. 2014 bordán 2–44,2 10–30 0–13 1–3 minden 1–9 2 1–4 min-max a táblázatból bordán

113

38. ábra: Cyclotella, Lindavia (Handmannia) és Pantocsekiella jellemző fajainak SEM felvételei (külső és belső nézet). A, D. ábra: Cyclotella meneghiniana, fehér nyíl: rimoportula. B, E. ábrák: Lindavia radiosa, fehér nyíl: rimoportula, fekete nyíl: kupolás kribrumok a belső oldalon és lyukak (foramina) a külső oldalon. C, F. Pantocsekiella ocellata, fehér nyíl: rimoportula. Mérték = 10 μm (A. ábra); 5 μm (D, C, F. ábrák); 2 μm (B, E. ábrák).

Håkansson (2002) a Puncticulata nemzetség fontos jellemzőjének tartotta azt, hogy a centrális area vagy areolákkal és fultoportulákkal is rendelkezik vagy csak areolákkal vagy csak fultoportulákkal. Csak két faj [Puncticulata notata (Loseva) Håkansson és a Puncticulata kurdica (Håkansson) Håkansson] esetében figyelhetőek meg a centrális areán csak fultoportulák. Ezek a fajok morfológiai tulajdonságaikat tekintve jelentősen különböznek a Puncticulata nemzetség más tagjaitól. Emellett, a SEM felvételek tanúsága szerint külső nézetből nagyon hasonlítanak a C. ocellatara: 3-4 (P. notata, Håkansson 2002: 475-478. ábra) illetve 4-6 (P. kurdica, Håkansson 2002: 482-485. ábra) orbiculi depressi jelenléte a valva külső oldalán, C. ocellatahoz hasonló alveoláris kamra és borda szerkezet a belső oldalon (P. notata Genkal és Popovskaya 2008b: 26-32. ábra, P. kurdica Håkansson 2002: 487., 488. ábra), sok valvafelszíni fultoportula a P. kurdica esetében (Genkal és Popovskaya 2008a). Mindezek miatt P. notata és P. kurdica feltehetően nem sorolható a Puncticulata nemzetségbe. Ezt támasztja alá az is, hogy Khursevich és Kociolek (2012) a Handmannia leírásánál már nem tartotta a nemzetségre jellemző bélyegnek a csak fultoportulákkal áttört centrális areát, és sem a Cyclotella notata Loseva, sem a Cyclotella kurdica Håkansson fajt nem sorolta át a Handmannia nemzetségbe. Az utóbbit a Cyclotella 12. csoportjába helyezték.

114

Nakov és mtsai. (2015) a Puncticulata és Handmannia fajokat Lindavia néven szinonimizálta nomenklatúrai elsőbbség alapján. Ennek a kutatásnak a legfontosabb eredményeit Ács és mtsai. (2016) cikkben publikáltuk.

115

8. Összefoglalás

A kovaalgák a fitoplankton és fitobentosz közösségek fontos tagjai, a vízminőség indikátorai. Hagyományosan a kovaváz (frusztulum) morfológiai jellegzetességei alapján rendszerezik ezeket az élőlényeket. A fajok morfológiai alapú meghatározása nagy tapasztalatot igényel, ráadásul a fajokat azonosító bélyegek vizsgálatához sokszor nem elég a rutinszerűen alkalmazott fénymikroszkóp, hanem pásztázó elektronmikroszkópra van szükség. Emellett egyes fajok nagymértékű morfológiai variabilitása, illetve fenotípusos plaszticitása is megnehezítheti a határozást. A kovaalgák tanulmányozásában egyre inkább tért hódítanak a molekuláris biológiai módszerek, mind a kovaalgák evolúciójának vizsgálatában, mind a fajok elválasztását és azonosítását illetően. Ez utóbbi területen alkalmazhatóak az ún. DNS vonalkódok. Ezek rutinszerű használata a gyakorlatban azonban még kidolgozás alatt áll. A kovaalgákon végzett molekuláris vizsgálatok némely esetben több kriptikus fajt is feltártak. A doktori munkám során filogenetikai elemzést végeztünk néhány, Thalassiosirales rendbe tartozó faj esetében (Skeletonema potamos és a Pantocsekiella nemzetség leírásának alapjául szolgáló Cyclotella ocellata), amelyhez morfológiai vizsgálatot is kapcsoltunk. Emellett a Cyclotella ocellata/C. comensis komplex esetében két faj kapcsolatát vizsgáltuk vonalkód markerek és morfológiai bélyegek alapján. Munkám során az alábbi vizsgálatokban a következő új tudományos eredményeket kaptam: 1) A Skeletonema potamos egy édesvízi faj a tengeri eredetű és elsősorban tengeri fajokat magába foglaló Skeletonema nemzetségben. A faj morfológiai jellemzését fény-, pásztázó és transzmissziós elektronmikroszkóppal történt vizsgálat alapján adtuk meg. Két sejtmagban kódolt (18S és 28S rDNS) valamint két kloroplasztisz gén (rbcL és psbC) közel teljes szekvenciáinak filogenetikai vizsgálatával igazoltuk, hogy az eredetileg Microsiphonia potamos néven leírt faj valóban a Skeletonema nemzetségbe tartozik, valamint meghatároztuk, hogy legközelebbi rokona a S. subsalsum. A Dunából és a Tiszából gyűjtött S. potamos minta valamint a Missouriból, illetve japán brakkvízből származó törzs 18S és 28S rDNS-ének azonossága alapján megállapítottuk, hogy a S. potamos nem mutat intraspecifikus variabilitást, ami a nemzetség más fajaira jellemző. Ebből feltételezhető, hogy a faj csak nemrég terjedt el a Földön.

116

2) A S. potamos különböző vízi ökoszisztémák, többek között a Duna fitoplankton közösségének domináns tagja. Az 1979 óta végzett rendszeres vizsgálatok lehetővé tették, hogy nyomon kövessük a dunai fitoplankton közösség összetételének, benne a S. potamos egyedszámának és biomasszájának hosszú távú változását. Ezek alapján megállapítható volt, hogy a faj részaránya jelentősen emelkedett. Ez korrelációt mutatott a Duna átlagos vízhőmérsékletének globális felmelegedés okozta hosszú távú emelkedésével. Részarányának növekedése azzal is összefügghet, hogy a Duna átlagos lebegőanyag-tartalmának hosszú távú csökkenése következtében a víz fényklímája javult. Szakirodalmi adatok azt mutatták, hogy a S. potamos a mérsékelt övben terjedt el, de ökológiai vizsgálatunk eredménye alapján elterjedési területének növekedése várható. 3) A Cyclotella ocellata/C. comensis komplex tagjai nagy morfológiai variabilitást mutatnak, és gyakran folytonos morfológiai átmeneteket képeznek egymással. Ebben a vizsgálatunkban a komplex tagjait tartalmazó közösségeket tanulmányoztunk molekuláris és morfológiai módszerekkel magyar- és horvátországi tavakból valamint törökországi patakokból származó minták alapján. A vizsgált közösségek olyan egyedeket tartalmaztak, melyek morfológiája a C. ocellatahoz és közel rokon fajokhoz, C. comensishez, C. pseudocomensishez, C. costeihez és C. trichonideahoz hasonlított. Ezek alapján öt morfotípust különítettünk el, a hatodik típust az átmeneti formák képezték. Tíz morfometriai paramétert vizsgáltunk, amelyek önmagukban illetve párban nem választották el a morfotípusokat a közösségekben. Azonban a többváltozós diszkriminancia analízis két csoportot különített el. Az egyik csoport (C. cf. ocellata) elsősorban a C. ocellata és C. trichonidea morfológiájú egyedeket, a másik csoport (C. cf. comensis) pedig főleg a C. comensis, C. pseudocomensis és C. costei morfológiájú egyedeket tartalmazta. 4) Környezeti DNS, illetve izolált sejt mintákból 18S rDNS és rbcL gének szakaszait szaporítottuk fel és szekvenáltuk. A szekvenciák kis variabilitást mutattak a minták között. A C. cf. ocellata és C. cf. comensis csoport molekuláris és morfometriai elemzés alapján is elvált. Azonban ugyanakkora mértékű szekvencia eltéréseket találtunk egyes csoportokon belül, mint amekkorákat a csoportok között, így az sem zárható ki, hogy a két csoport egy fajba tartozik. Ez rávilágít arra, hogy a jelenleg ismert DNS-vonalkód markerek használatát tovább kell finomítani, mert az eddig tesztelt feltételek szerint nem alkalmazhatóak a kovaalgák minden csoportjára. Ennek oka, hogy az ilyen jellegű vizsgálatokba több kovaalga csoport képviselőit nem vagy csak korlátozott számban vonták be. Ilyen alulreprezentált csoportot képviselnek a korábban a Centrales rendbe sorolt kovaalgák, amelyek közé az általunk vizsgált taxonok is tartoznak. A megfelelő variabilitást mutató DNS-szakasz

117 kiválasztása mellett nagyon fontos megtalálni azt a küszöbértéket, amely már faji szintű elválást jelez. 5) A korábbi morfológiai vizsgálatok azt mutatták, hogy a Cyclotella nemzetség leírása túl általános, és új morfológiai kritériumok szerint recens és fosszilis taxonok alapján új nemzetségeket írtak le (pl. Discostella, Handmannia, Puncticulata, Tertiarius). Továbbá molekuláris biológiai elemzések bizonyították, hogy a Cyclotella nemzetség nem monofiletikus: a C. ocellata és C. bodanica valamint a Discostella ág elkülönült a C. meneghiniana-csoporttól. Mindezek alapján a Cyclotella nemzetséget négy nemzetségre választották (Cyclotella sensu stricto, Discostella, Tertiarius, Lindavia). A Lindavia nemzetséget a rimoportula helyzete alapján hozták létre, és többek között a C. ocellata és a C. bodanica fajt is átsorolták ide. A morfológiai vizsgálatokkal ellentétben az eddigi molekuláris biológiai elemzések jóval kevesebb taxonra terjedtek ki, a C. ocellata és C. bodanica kapcsolatát nem vizsgálták. Azért, hogy megvizsgáljuk, hogy a két faj egy nemzetségbe (Lindavia) tartozik-e, bővítettük az elemzésbe bevont taxonok számát a Cyclotella comensis csoport tagjaival és a Lindavia radiosaval, melyek a diagnosztikus morfológiai bélyegeikben a C. ocellatahoz (előbbi) illetve a C. bodanicahoz (utóbbi) hasonlóak. A morfológiai vizsgálat, valamint 18S rDNS és rbcL szekvenciák filogenetikai elemzése és genetikai távolsága alapján megállapítottuk, hogy a C. ocellata és a C. comensis csoport nem tartozik egyik korábban leírt nemzetségbe sem, hanem önálló nemzetséget alkot. Így egy új nemzetség, a Pantocsekiella nemzetség került leírásra.

118

9. Summary

Diatoms are important members of the phytoplankton and phytobenthos communities and the indicators of water quality. Traditionally, the morphological features of the diatom cell wall (frustule) are used to classify these organisms. Morphology-based identification of species requires deep experiences, moreover diagnostic characters cannot be distinguished under light microscope routinely applied, these could be investigated only with scanning electron microscope. Additionally, great morphological variability or phenotypic plasticity of some species could make the identification more difficult. Molecular biological methods are becoming more and more widely used both in the study of diatom evolution and in the separation and identification of species. In the latter area DNA barcodes can be applied. However, the routine usage of barcodes in practice is still under development. In some cases molecular investigations of diatoms revealed cryptic species. During the doctoral work phylogenetic analyses were performed on some species belonging to the order Thalassiosirales (Skeletonema potamos and Cyclotella ocellata underlying the description of a new Pantocsekiella genus). Morphological investigations were connected to these analyses. Besides, we studied the relationship of two species in the Cyclotella ocellata/C. comensis complex using barcode markers and morphological features. During my work I found the following new scientific results in the studies mentioned below: 1) Skeletonema potamos is a freshwater species in an ancestrally marine Skeletonema genus mainly involving marine species. Morhological characterisation of the species was provided based on light, scanning and transmission electron microscopy study. Phylogenetic analysis of almost full sequences of two nuclear (18S and 28S rDNA) and two chloroplast genes (rbcL and psbC) confirmed the placement of the species originally described as Microsiphonia potamos in the genus Skeletonema. The investigation also identified S. subsalsum as the closest relative of S. potamos. The identity of 18S and 28S rDNA sequences of S. potamos samples collected from the Rivers Danube and Tisza and cultures from the Missouri and Japanese brackish waters indicated that S. potamos lacks intraspecific variability in these genes, a phenomenon characteristic to other species of the genus. This result suggests that S. potamos has recently spread on Earth. 2) S. potamos is dominant element of the phytoplankton community of several aquatic ecosystems including the River Danube. Regular investigations since 1979 allowed tracking

119 the phytoplankton community composition of the River Danube including the long-term changes in abundance and biomass of S. potamos. Based on these data we could detect significant increase in the contribution of the species to the total phytoplankton abundance and biomass. This was in correlation with the long-term increase of the mean water temperature caused by the global warming. The increase of its contribution could be in relation with the mending photic climate caused by the decrease in the mean content of total suspended solids in the River Danube. Data collected from the literature showed that S. potamos was spread in the temperate zone but based on the results of our ecological study the expansion of its range could be expected. 3) Taxa of the Cyclotella ocellata/C. comensis complex show great morphological variability and often form continuous transitions with each other. In this study communities containing members of the complex were investigated using molecular and morphological methods based on samples from lakes in Hungary and Croatia and from streams in Turkey. The investigated assemblages involved specimens with morphology resembling C. ocellata and its close relatives, C. comensis, C. pseudocomensis, C. costei and C. trichonidea. Accordingly five morphotypes were distinguished, the sixth one was formed by transitional forms. Ten morphometric parameters were analysed. Alone or in pairs these parameters could not distinguish the morphotypes in the assemblages. However, multivariate discriminant analysis separated two groups, one of them (C. cf. ocellata) involved predominantly valves with C. ocellata and C. trichonidea morphology, the other group included mainly the individuals with C. comensis, C. pseudocomensis and C. costei morphology. 4) Partial 18S rDNA and rbcL were amplified and sequenced from environmental DNA and isolated cell samples. The sequences showed low variability between the samples. The C. cf. ocellata and the C. cf. comensis group separated based on both the molecular and the morphometric analyses. However, in some cases we found sequence deviations within group in the same degree that occurred between groups. Therefore, the conspecificity of the studied taxa could not be excluded. This highlights that the currently known DNA barcode markers need to be refined because in the conditions tested previously these markers can not be applied to all groups of diatoms. The reason is that representatives of several groups were not involved or were included in limited number. Diatoms previously classified into the order Centrales are such an underrepresented group. Taxa in our study also belong to the former Centrales. Beside chosing DNA region with adequate variability it is important to find the threshold indicating species-level distinction.

120

5) Previous morphological studies showed that the description of the genus Cyclotella was too general, therefore applying new morphological criteria new genera (e. g. Discostella, Handmannia, Puncticulata, Tertiarius) were established based on recent and fossil taxa. Moreover, molecular biological analyses proved that Cyclotella genus was not monophyletic: C. ocellata and C. bodanica as well as the Discostella lineage separated from the C. meneghiniana group. Regarding all of this information the genus Cyclotella was divided to four genera (Cyclotella sensu stricto, Discostella, Tertiarius, Lindavia). The genus Lindavia was described based on the position of the rimoportula and among others C. ocellata and C. bodanica were transferred into it. In contrast to morphological studies the molecular analyses included fewer taxa, the relationship between C. ocellata and C. bodanica was not investigated. In order to find out if the two species are belonging to the same genus (Lindavia), we extended the number of species involved in the analysis: members of C. comensis group and Lindavia radiosa that shared diagnostic morphological features with C. ocellata and C. bodanica, respectively. Our morphological study as well as phylogenetic and genetic distance analysis of 18S rDNA and rbcL sequences indicated that the C. ocellata and the C. comensis group did not belong to either of the previously described genera, instead they formed a separate genus. Hence a new genus, Pantocsekiella has been described.

121

10. Köszönetnyilvánítás

Ezúton szeretném megköszönni a segítséget: Dr. Ács Évának, témavezetőmnek, aki lehetővé tette a kutatások elvégzését és a dolgozatom elkészítését, és mindenben támogatott. Dr. Jánosi Imrének, Dr. Kiss Ádámnak, Dr. Galácz Andrásnak, az ELTE Környezettudományi Doktori Iskola jelenlegi és korábbi vezetőinek, akik lehetővé tették, hogy a doktori iskola keretein belül végezhessem munkámat. Dr. Makk Juditnak és Dr. Borbély Györgynek, akik a dolgozat előbírálatát végezték és ezzel elősegítették a végleges változat elkészültét. Dr. Kiss Keve Tihamérnak, aki az ELTE Környezettudományi Doktori Iskola Környezetbiológia Programjának vezetőjeként lehetővé tette a programban való részvételemet, tanácsaival segített, valamint a dunai fitoplankton minták feldolgozását végzi. Pohner Zsuzsannának, aki sokat segített a DNS-vizsgálatokban és megtervezte a 18S rDNS primereket. Dr. Báldi Andrásnak és Dr. Engloner Attilának, akik lehetővé tették, hogy az Duna-kutató Intézetben végezhessem a doktori munkámat. Dr. Márialigeti Károlynak, aki lehetővé tette, hogy a molekuláris munkákat az ELTE Mikrobiológia Tanszékén végezhessem, valamint Nagymáté Zsuzsannának és Dr. Jurecska Laurának, akik befogadtak a laborjukba. Földi Angélának, Pozderka Virágnak, Trábert Zsuzsának, Bánfi Renátának, Dr. Jäger Katalinnak, Dr. Abonyi Andrásnak, Dr. Dobosy Péternek, akikre kollégaként és barátként számíthattam. Dr. Tóth Bencének és Dr. Dobosy Péternek, akik a vízkémiai vizsgálatokat végezték. Dr. Horváth Zsófiának és Dr. Vad Csabának, akik a statisztikai elemzésekben segítettek. Dr. Jakó Éenának, Dr. Ari Eszternek, Dr. Vajna Balázsnak, akik sokat segítettek a szekvenciák elemzésében. Maglódi Ágnesnek, Bodolai Katalinnak, Balogh Anikónak, Simka Ágnesnek, akik a mintavételben illetve laboratóriumi munkák elvégzésében segítettek. Molnár Leventének, aki segített a dunai fitoplankton és vízkémiai adatsor összeállításában. Dr. Beszteri Bánknak, Dr. Beszteri Sárának, Dr. Anique Stechernek, Sara Olischlägernek, Michael Klosternek, akiknek segítségével Bremerhavenben, az Alfred Wegener Intézetben végezhettem a munka egy részét. Dr. Luc Ectornak, akitől rengeteg cikket kaptam a S. potamosról, és aki társszerzőként nagy precizitással javította a közös kéziratainkat. Dr. Andjelka Plenković-Morajnak, Dr. Koraljka Kralj Borojevićnek, Dr. Sonja Kistenichnek, Dr. Mirko Dreßlernek, Dr. Frédéric Rimetnek, Dr. Cüneyt Nadir Solaknak és Dr. Andrew Alversonnak, akiktől mintákat illetve szekvenciákat kaptam.

Családomnak pedig köszönöm a végtelen türelmet és a kitartó támogatást.

A kutatás anyagi hátterét a KTIA-OTKA 80140 pályázat biztosította.

122

11. Irodalom

Aké Castillo J., Meave Del Castillo M. E., Hernández-Becerril D. U. (1995): Morphology and distribution of species of the diatom genus Skeletonema in a tropical coastal lagoon. European Journal of Phycology 30: 107-115. Alfasane M. A., Ullah M. U., Khondker M. (2013): Limnology of Lake Rainkhyongkain with a new record of Marchantia polymorpha L. var aquatica Nees. Bangladesh Journal of Botany 42 (2): 223-229. Alfinito S., Cavacini P., Tagliaventi N. (2001): The genus Cyclotella (Bacillariophyta, Thalassiosiraceae) in fresh- and brackish-water habitats of Latium and Molise (Central Italy). Algological Studies 101: 57-73. Guiry, M.D. & Guiry, G.M. (2017): AlgaeBase. World-wide electronic publication, National University of Ireland, Galway. http://www.algaebase.org. Alvarez I., Wendel J. F. (2003): Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference. Molecular Phylogenetics and Evolution 29: 417-434. Alverson A. J. (2008): Molecular systematics and the diatom species. Protist 159(3): 339-353. Alverson A. J. (2014) Timing marine-freshwater transitions in the diatom order Thalassiosirales. Paleobiology 40:91-101. Alverson A. J., Beszteri B., Julius M. L., Theriot E. C. (2011): The model marine diatom Thalassiosira pseudonana from a freshwater ancestor in the genus Cyclotella. BMC Evolutionary Biology 11: 125. Alverson A. J., Kolnick L. (2005): Intragenomic nucleotide polymorphism among small subunit (18S) rDNA paralogs in the diatom genus Skeletonema (Bacillariophyta). Journal of Phycology 41: 1248-1257. Alverson A. J., Cannone J. J., Gutell R. R., Theriot E. C. (2006): The evolution of elongate shape in diatoms. Journal of Phycology 42: 655-668. Alverson A. J., Jansen R. J., Theriot E. C. (2007): Bridging the Rubicon: Phylogenetic analysis reveals repeated colonizations of marine and fresh waters by thalassiosiroid diatoms. Molecular Phylogenetics and Evolution, 45: 193-210. Altschul S. F., Gish W., Miller W., Myers E. W., Lipman D. J. (1990): Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology 215: 403-410. Anning T., MacIntyre H. L., Pratt S. M., Sammes P. J., Gibb S., Geider R. J. (2000): Photoacclimation in the marine diatom Skeletonema costatum. Limnology and Oceanography 45(8): 1807-1817. Anonymous (1975): Proposals for standardization on terminology and diagnoses. Nova Hedwigia Beiheift 53: 323-354. Amato A., Kooistra W. H. C. F., Levialdi Ghiron J. H., Mann D. G., Pröchold T., Montresor M. (2007): Reproductive isolation among sympatric cryptic species in marine diatoms. Protist 158: 193-207. Armbrust V. E. (1999): Identification of a new gene family expressed during the onset of sexual reproduction in the centric diatom Thalassiosira weissflogii. Applied and Environmental Microbiology 65: 3121-3128.

123

Armbrust V. E. Berges J.A., Bowler C., Green B. R., Martinez D., Putnam N.H., Zhou S., Allen A.E., Apt K. E., Bechner M., Brzezinski M.A., Chaal B. K., Chiovitti A., Davis A. K., Demarest M.S., Detter J. C., Glavina T., Goodstein D., Hadi M. Z., Hellsten U., Hildebrand M., Jenkins B.D., Jurka J., Kapitonov V. V., Kröger N., Lau W. W., Lane T. W., Larimer F. W., Lippmeier J. C., LucasS., Medina M., Montsant A., Obornik M., Parker M.S., Palenik B., Pazour G. J., Richardson P.M., Rynearson T. A., Saito M. A., Schwartz D. C., Thamatrakoln K., Valentin K., Vardi A., Wilkerson F.P., Rokhsar D.S. (2004): The genome of the diatom Thalassiosira pseudonana: ecology, evolution, and metabolism. Science 306: 79-86. Armbrust V. E., Galindo H. M. (2001): Rapid evolution of a sexual reproduction gene in centric diatoms of the genus Thalassiosira. Applied and Environmental Microbiology 67(8): 3501-3513. Ashworth M. P., Ruck E. C., Lobban C. S., Romanovicz D. K., Theriot E. C. (2012): A revision of the genus Cyclophora and description of Astrosyne gen. nov. (Bacillariophyta), two genera with the pyrenoids contained within pseudosepta. Phycologia 51(6): 684-699. Ács É., Ari E., Duleba M., Dreßler M., Genkal S. I., Jakó É., Rimet F., Ector L., Kiss K. T. (2016): Pantocsekiella a new centric diatom genus based on morphological and genetic studies. Fottea 16(1): 56-78. Ács É., Kiss K. T. (2004, szerk.): Algológiai Praktikum. ELTE Eötvös Kiadó, Budapest. Baird D. J., Hajibabaei M. (2012): Biomonitoring 2.0: a new paradigm in ecosystem assessment made possible by next-generation sequencing. Molecular Ecology 21: 2039-2044. Ban S., Burns C., Castel J., Chaudron Y., Christou E., Escribano R., Umani S. F., Gasparini S., Ruiz F. G., Hoffmeyer M., Ianora A., Kang H., Laabir M., Lacoste A., Miralto A., Ning X., Poulet S., Rodriguez V., Runge J., Shi J., Starr M., Uye S., Wang Y. (1997): The paradox of diatom-copepod interactions. Marine Ecological Progress Series 157: 287-293. Behnke A., Friedl T., Chepurnov A., Mann D. G. (2004): Reproductive compatibility and rDNA analyses in the Sellaphora pupula species complex (Bacillariophyta). Journal of Phycology 40(1): 193-208. Belcher J. H., Swale E. M. F. (1978): Skeletonema potamos (Weber) Hasle and Cyclotella atomus Hustedt (Bacillariophyceae) in the plankton of rivers in England and France. British Phycological Journal 13: 177-182. Beszteri B. (2005): Morphometric and molecular investigations of species limits in Cyclotella meneghiniana (Bacillariophyceae) and closely related species. Doktori disszertáció, Universiät Bremen. pp. 124. Beszteri B., Ács É.., Medlin L. K. (2005): Ribosomal DNA sequence variation among sympatric strains of the Cyclotella meneghiniana complex (Bacillariophyceae) reveals cryptic diversity. Protist 156: 317-333. Bhattacharya D., Medlin L. K., Wainright P. O., Ariztia E. V., Bibeau C., Stickel S. K., Sogin M. L. (1992): Algae containing chlorophylls a + c are paraphyletic: Molecular evolutionary analysis of the Chromophyta. Evolution 46(6): 1801-1817.

124

Borkman D. G., Smayda T. (2009): Multidecadal (1959-1997) changes in Skeletonema abundance and seasonal bloom patterns in Narragansett Bay, Rhode Island, USA. Journal of Sea Research 61: 84-94. Bowler C., Allen A. E., Badger J. H., Grimwood J., Jabbari K., Kuo A., Maheswari U., Martens C., Maumus F., Otillar R. P., Rayko E., Salamov A.,Vandepoele K., Beszteri B., Gruber A., Heijde M., Katinka M., Mock T., Valentin K., Verret F., Berges J. A., Brownlee C., Cadoret J. P., Chiovitti A., Choi C. J., Coesel S., De Martino A., Detter J. C., Durkin C., Falciatore A., Fournet J., Haruta M., Huysman M. J., Jenkins B. D., Jiroutova K., Jorgensen R. E., Joubert Y., Kaplan A., Kröger N., Kroth P. G., La Roche J., Lindquist E., Lommer M., Martin-Jézéquel V., Lopez P. J., Lucas S., Mangogna M., McGinnis K., Medlin L. K., Montsant A., Oudot-Le Secq M. P., Napoli C., Obornik M., Parker M. S., Petit J. L., Porcel B. M., Poulsen N., Robison M., Rychlewski L., Rynearson T. A., Schmutz J., Shapiro H., Siaut M., Stanley M., Sussman M. R., Taylor A. R., Vardi A., von Dassow P., Vyverman W., Willis A., Wyrwicz L. S., Rokhsar D. S., Weissenbach J., Armbrust E. V., Green B. R., Van de Peer Y., Grigoriev I. V. (2008): The Phaeodactylum genome reveals the evolutionary history of diatom genomes. Nature 456: 239-244. Brébisson A. de (1838): Considérations sur les Diatomées et essai d'une classification des genres et des espèces appartenant à cette famille. Brée l'Ainé Imprimeur-Libraire, Falaise. 20 pp. Bukhtiyarova L. N. (2009): Frustule functions and functional morphology of Bacillariophyta. Algologia 19(3): 321-331. Casteleyn G., Adams N. G., Vanormelingen P., Debeer A. E., Sabbe K., Vyverman W. (2009): Natural hybrids in the marine diatom Pseudo-nitzschia pungens (Bacillariophyceae): genetic and morphological evidence. Protist 160: 343-354. Cavalcante K. P., Tremarin P. I., Ludwig T. A. V. (2013): Taxonomic studies of centric diatoms (Diatomeae): unusual nanoplanktonic forms and new records for Brazil. Acta Botanica Brasilica 27: 237-251. Cavalier-Smith T. (1986): The kingdom Chromista: origin and systematics. Progress in Phycological Research 4: 309-347. CEN (2003): Water quality - Guidance standard for the routine sampling and pretreatment of benthic diatoms from rivers. European Standard EN 13946. European Committee for Standardization, Brussels. pp. 1-14. Chang T.-P., Steinberg C. (1988): Seasonal changes in the diatom flora in a small reservoir with special reference to Skeletonema potamos. Diatom Research 3: 191-201. Chepurnov V. A., Mann D. G., Vyverman W., Sabbe K., Danielidis D. (2002): Sexual reproduction, mating system and protoplast dynamics of Seminavis (Bacillariophyceae). Journal of Phycology 38: 1004-1019. Cherepanova M. V., Usol’steva M. V., Pushkar V. S., Dubrovina Y. F. (2010): Morphogenesis in Cyclotella ocellata-complex from Lake El’gygytgyn (Chukchi Peninsula) during the Pleistocene-Holocene. Paleontological Journal 44: 1-10. Cleve P. T. (1873): Examination of diatoms found on the surface of the sea of Java. Bihang til Kongliga Svenska Vetenskaps-akademiens Handlingar 11: 3-13.

125

Coleman A. W. (2007): Pan-eukaryote ITS2 homologies revealed by RNA secondary structure. Nucleic Acids Research 35(10): 3322-3329. Coleman A. W., Mai J. C. (1997): Ribosomal DNA and ITS-2 sequence comparisons as a tool for predicting genetic relatedness. Journal of Molecular Evolution 45(2): 168-177. Cremer H., Wagner B., Juschus O., Melles M. (2005): A microscopical study of diatom phytoplankton in deep crater Lake El' gygytgyn, Northeast Siberia.Archiv für Hydrobiologie Supplement Algological Studies 116: 147-169. Cvetkoska A., Hamilton P. B., Ognjanova-Rumenova N., Levkov Z. (2014): Observations of the genus Cyclotella (Kützing) Brébisson in ancient lakes Ohrid and Prespa and a description of two new species C. paraocellata sp. nov. and C. prespanensis sp. nov. Nova Hedwigia 98: 313-340. Danielidis D. B., Spartinou M., Economou-Amilli A. (1996): Limnological survey of Lake Amvrakia, western Greece. Hydrobiologia 318: 207-218. Daugbjerg N., Andersen R. A. (1997): A molecular phylogeny of the heterocokont algae based on analyses of chloroplast-encoded rbcL sequence data. Journal of Phycology 33:1031-1041. Daugbjerg N., Guillou L. (2001): Phylogenetic analyses of Bolidophyceae (Heterokontophyta) using rbcL gene sequences support their sister group relationship to diatoms. Phycologia 40(2): 153-161. de Queiroz K. (2007): Species concepts and species delimitation. Systematic Biology 56(6): 879-886. Desortová B., Havel L., Šťastný J. (2011): Živiny, fiytoplankton a zooplankton ve střední části Českého Úseku Labe: Stav v období 1996-1999 a 2006-2009 [Nutrients, phytoplankton and zooplankton in the middle part of the Czech Elbe stretch: state in the period 1996-1999 and 2006-2009]. Vodohospodářské Technicko-Ekonomické Informace 53: 1-4. De Toni G. B., Forti A. (1900): Contributo alla conoscenza del plancton del Lago Vetter. Atti del Reale Istituto Veneto di Scienze Lettero ed Arti 59: 537-568. Devercelli M. (2006): Phytoplankton of the Middle Paraná River during an anomalous hydrological period: a morphological and functional approach. Hydrobiologia 563: 465-478. Devercelli M., O’Farrell I. (2013): Factors affecting the structure and maintenance of phytoplankton functional groups in a nutrient rich lowland river. Limnologica 43: 67- 78. Descy J.-P., Leitao M., Everbecq E., Smitz J. S., Deliège J.-F. (2012): Phytoplankton of the River Loire, France: a biodiversity and modelling study. Journal of Plankton Research 34:120-135. Dokulil M. T., Teubner K., Jagsch A., Nickus U., Adrian R., Starile D., Jankowski T., Herzig A., Padisák J. (2010): The impact of climate change on lakes in Central Europe. 411- 436. - George D. G. (szerk.): The Impact of Climate Change on European Lakes. Springer, Dordrecht, p: 1-507. Druart J. C., Straub F. (1988): Description de deux nouvelles Cyclotelles (Bacillariophyceae) de milieux alcalins et eutrophes: Cyclotella costei nov. sp. et Cyclotella wuetrichiana nov. sp. Schweizererische Zeitschrift für Hydrobiologie 50: 182-188.

126

Duleba M., Ector L., Horváth Zs., Kiss K.T., Molnár L.F., Pohner Zs., Szilágyi Zs., Tóth B., Vad Cs.F., Várbíró G., Ács É. (2014): Biogeography and phylogenetic position of a warm-stenotherm centric diatom, Skeletonema potamos (C.I. Weber) Hasle and its long-term dynamics in the River Danube. Protist 165(5): 715-729. Duleba M., Kiss K. T., Földi A., Kovács J., Borojević K. K., Molnár L. F., Plenković-Moraj A., Pohner Zs., Solak C.N., Tóth B., Ács É. (2015): Morphological and genetic variability of assemblages of Cyclotella ocellata Pantocsek/C. comensis Grunow complex (Bacillariophyta, Thalassiosirales). Diatom Research Diatom Research 30: 283-306. Eaton A. D., Clesceri L. S., Rice E. W., Greenberg A. E. (szerk.) (2005): Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (21st ed.), APHA, AWW, WEF, Washington, DC, USA. 1296 pp. Economou-Amilli A. (1979): Two new taxa of Cyclotella Kützing from Lake Trichonis, Greece. Nova Hedwigia 31: 467-477. Economou-Amilli A. (1982): SEM-studies on Cyclotella trichonidea (Bacillariophyceae). Archiv für Hydrobiologie, Supplement Algological Studies 30: 25-34. Edlund M. B., Williams R. M., Soninkhishig N. (2003): The planktonic diatom diversity of ancient Lake Hovsgol, Mongolia. Phycologia 42: 232-260. Ehara M., Inagaki Y., Watanabe K. I., Ohama T. (2000a): Phylogenetic analysis of diatom coxI genes and implications of a fluctuating GC content on mitochondrial genetic code evolution. Current Genetics 37: 29-33. Ehara M., Watanabe K. I., Ohama T. (2000b): Distribution of cognates of group II introns detected in mitochondrial cox1 genes of a diatom and a haptotype. Gene 256: 157-167. Egge J. K., Aksnes D. L. (1992): Silicate as regulating nutrient in phytoplankton competition. Marine Ecology Progress Series. Oldendorf 83: 281-289. Elder Jr., J. F., Turner B. J. (1995): Concerted evolution of repetitive DNA sequences in eukaryotes Quarterly Review of Biology 70(3): 297-320. Ettl H., Gerloff J., Heynig H. (1986): Bacillariophyceae 1. Teil: Naviculaceae. 1-876. - Krammer K, Lange-Bertalot H (szerk.): Süßwasserflora von Mitteleuropa Band 2/1. VEB Gustav Fischer Verlag, Jena, Germany. Evans K. M., Mann D. G. (2009): A proposed protocol for nomenclaturally effective DNA barcoding of microalgae. Phycologia 48(1): 70-74. Evans K. M., Wortley A. H., Mann D. G. (2007): An assessment of potential diatom ‘‘barcode’’ genes (cox1, rbcL, 18S and ITS rDNA) and their effectiveness in determining relationships in Sellaphora (Bacillariophyta). Protist 158: 349-364. Fallu M.-A., Pienitz R., Walker I. R., Lavoie M. (2004): Paleolimnology of a shrub-tundra lake and response of aquatic and terrestrial indicators to climatic change in arctic Québec, Canada. Palaeogeography, Palaeoclimatology, Palaeoecology 215: 183-203. Flanagan K. M., McCauley E., Wrona F., Prowse T. (2003): Climate change: the potential for latitudinal effects on algal biomass in aquatic ecosystems. Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences 60: 635-639. Floury M., Delattre C., Ormerod S. J., Souchon Y. (2012): Global versus local change effects on a large European river. Science of the Total Environment 441:220-229.

127

Flower R. J., Gasse F., Håkansson H. (1990): A new species of Cyclotella, C. azigzensis sp. nov., described from modern material collected from upland lakes in Morocco. Diatom Research 5: 253-260. Fox M. G., Sörhannus U. M. (2003): RpoA: A useful gene for phylogenetic analysis in diatoms. The Journal of Eukaryotic Microbiology. 50(6): 471-475. Fourtanier E., Gasse F., Bellier O., Bonhomme M. G., Robles I. (1993): Miocene non-marine diatoms from the western Cordillera basins of Northern Peru. Diatom Research 8(1): 13-30. Fricke F. (szerk.) (1906): Schmidt’s Atlas der Diatomaceen-kunde. O.R. Reisland, Aschersleben, Leipzig & Berlin. 266 pp. Friedrich G., Pohlman M. (2009): Long-term plankton studies of the lower Rhine/Germany. Limnologica 39: 14-39. Fritz S. C., Kingston J. C., Engstrom D. R. (1993): Quantitative trophic reconstruction fromsedimentary diatom assemblages: a cautionary tale. Freshwater Biology 30: 1-23. Gallagher J. C. (1980): Population genetics of Skeletonema costatum (Bacillariophyceae) in Narragansett Bay. Journal of Phycology16: 464-74. Genkal S. I. (1977): K metodike podscheta nekotorykh taksonomicheski znachimykh strukturnykh ehlementov stvorki u diatomovykh vodoroslej sem. Thalassiosiraceae Lebour emend. Hasle (Bacillariophyta). [On counting of some taxonomically significant structural elements of valves in the diatom algae of the family Thalassiosiraceae Lebour emend. Hasle (Bacillariophyta).] Botanicheskii Zhurnal 62: 848-851. Genkal S. I. (1984): O morfologicheskoj izmenchivosti osnovnykh elementov stvorki u vidov roda Stephanodiscus (Bacillariophyta). [On morphological variability of the main structural valve elements in the species of the genus Stephanodiscus (Bacillariophyta).]Botanicheskii Zhurnal 69: 403-408. Genkal S. I., Chekryzheva T. A., Komulaynen S. F. (2015): To the taxonomy of Cyclotella comensis (Bacillariophyta). Botanicheskii Zhurnal 100: 389-394. Genkal S. I. (2013): Morphological variability, taxonomy, and ecology of species of the complex Handmannia comta / H. radiosa (Bacillariophyta). International Journal on Algae 15: 331-254. Genkal S. I., Bondarenko N.A. (2004): Electron microscopic studies of Bacillariophyta in the plankton of mountain lakes of the Lena basin. I. Centrophyceae. Botanicheskii Zhurnal 89: 1588-1596. Genkal S. I., Bondarenko N. A. (2011): Diatom algae in mountain lakes of the Dzherginskiy reserve (the Baikal area). 1. Centrophyceae. Povolzhskyi Ekologicheskyi Zhournal 2: 127-136. Genkal S. I., Kuzmin G. V. (1979): Ultrastructura et variabilitas morphologica frustulorum Cyclotellae ocellatae Pant. (Bacillariophyta). Novosti Sistematiki Nizshih Rastenii 16: 5- 7. Genkal S. I., Popovskaya G. I. (2008a): Morphological variability of Cyclotella ocellata from Lake Khubsulug (Mongolia). Diatom Research 23: 75-91. Genkal S. I., Popovskaya G. I. (2008b): Centric diatom algae of the Selenga River and its delta branches. Inland Water Biology 1: 120-128.

128

Genkal S. I., Yarushina M. I. (2010): Addition of centric diatoms to the flora in waterbodies of the northern slope of the Polar Ural. Inland Water Biology 3: 217-228. Genkal S. I., Zagorenko G. F. (1987): New data about the fine structure of the valve Cyclotella ocellata Pant. (Bacillariophyta). Biology of Inland Waters 74: 11-15. Genkal S. I., Babanazarova O. V., Haffner G. D. (2009): New data on the flora of diatom algae (Centrophyceae) in Lake Erie (Canada). International Journal on Algae 11: 337- 350. Gersonde R., Harwood D. M. (1990): Lower Cretaceous diatoms from ODP Leg 113 Site 693 (Weddell Sea): Part 1: Vegetative cells. In: Barker P. F., Kennett J. P. O’ Connell S., Pisias N. G. (szerk.): Proceedings of the Ocean Drilling Program, Scientific Results 113: 365-402. Gibson C. E., McCall R. D., Dymond A. (1993): Skeletonema subsalsum in a freshwater Irish lake. Diatom Research 8: 65-71. Godhe A., McQuoid M. R., Karunasagar I., Karunasagar I., Rehnstam-Hol A.-S. (2006): Comparison of three common molecular tools distinguishing among geographically separated clones of the diatom Skeletonema marinoi Sarno et Zingone (Bacillariophyceae). Journal of Phycology 42: 280-291. Greville R.K. (1865): Descriptions of new and rare diatoms.Series XVI. Transactions of the Microscopical Society, New Series, London 13: 43-57. Greville R. K. (1866): Description of new and rare diatoms. Series 20. Transactions of the Microscopical Society, New Series, London 14: 77-86. Guillou L., Chrétiennot-Dinet M. J., Medlin L. K., Claustre H., Loiseauxde-Goër S., Vaulot D. (1999): Bolidomonas, a new genus with two species belonging to a new algal class, the Bolidophyceae (Heterokonta). Journal of Phycology 35: 368-381. Hajibabaei M., Shokralla S., Zhou X., Singer G. A. C., Baird D. J. (2011): Environmental Barcoding: A Next-Generation Sequencing approach for biomonitoring applications using river benthos. PLoS ONE 6(4): e17497. Håkansson H. (1990): A comparison of Cyclotella krammeri sp. nov. and C. schumannii Håkansson stat. nov. with similar species. Diatom Research 5: 261-271. Håkansson H. (1993): Morphological and taxonomic problems in four Cyclotella species (Bacillariophyceae). Diatom Research 8: 309-316. Håkansson H. (2002): A compilation and evaluation of species in the genera Stephanodiscus, Cyclostephanos and Cyclotella with a new genus in the family Stephanodiscaceae. Diatom Research 17: 1-139. Håkansson H., Chepurnov V. (1999): A study of variation in valve morphology of the diatom Cyclotella meneghiniana in monoclonal cultures: the effect of auxospore formation and different salinity conditions. Diatom Research 14(2): 251-272. Håkansson H., Khursevich G. (1997): Tertiarius gen. nov., a new genus in the Bacillariophyceae, the transfer of some cyclotelloid species and a comparison to closely related genera. Diatom Research 12: 19-33. Hamilton P. B., Lefebvre K. E., Bull R. D. (2015): Single cell PCR amplification of diatoms using fresh and preserved samples. Frontiers in Microbiology Methods 6: 1084.

129

Hammer Ø., Harper D. A. T., Ryan P. D. (2001): PAST: Paleontological Statistics software package for education and data analysis. Palaeontologica Electronica 4: 9 http://palaeo-electronica.org/2001_1/past/issue1_01.htm [elérve 2016. 11. 26-án] Hamsher S. E., Evans K., Mann D. G., Pouličková A., Saunders G. W. (2011): Barcoding diatoms: Exploring alternatives to COI-5P. Protist 162: 405-422. Handmann R. (1913): Die Diatomeenflora des Almseegebiets. Mitteilungen Mikrologischer Verein Linz 1: 4-30. Hasegawa M., Kishino H., Yano T. (1985): Dating of the human-ape splitting by a molecular clock of mitochondrial DNA. Journal of Molecular Evoltuion 22: 160-174. Hasle G. R., Evensen D. L. (1975): Brackish water and freshwater species of the diatom genus Skeletonema Grev. I. Skeletonema subsalsum (A. Cleve) Bethge. European Journal of Phycology 14: 283-297. Hasle G. R., Evensen D. L. (1976): Brackish water and freshwater species of the diatom genus Skeletonema. II. Skeletonema potamos comb. nov. Journal of Phycology 12: 73- 82. Hasle G. R., Syvertsen E. E. (1985): Thalassiosiropsis, a new diatom genus from the fossil records. Micropaleontology 31(1): 82-91. Hassouna N., Michot B., Bachellerie J.-P. (1984): The complete nucleotide sequence of mouse 28S rRNA gene. Implications for the process of size increase of the large subunit rRNA in higher eukaryotes. Nucleic Acids Research 12: 3563-3583. Hausmann S., Lotter F. A. (2001): Cyclotella comensis and its importance for quantitative temperature reconstructions. Freshwater Biology 46: 1323-1333. Hebert P. D. N., Cywinska A., Ball S. L., deWaard J. R. (2003): Biological identifications through DNA barcodes. Proceedings of the Royal Society B 270(1512): 313-321. Hegewald E., Hindákova A. (1997): Variabilität von einer natürlichen Population und von Klonen des Cyclotella ocellata-Komplexes (Bacillariophaceae) aus dem Gallbergweiher, Nordwestdeutschland. Archiv für Hydrobiologie Supplement Algological Studies 86: 17-37. Hillis D. M., Dixon M. T. (1991): Ribosomal DNA: molecular evolution and phylogenetic inference. Quarterly Review of Biology 66(4): 411-453. Horiguchi T., Takano Y. (2006): Serial replacement of a diatom endosymbiont in the marine dinoflagellate Peridinium quinquecorne (Peridiniales, Dinophyceae). Phycological Research 54: 193-200. Houk V., Klee, R. (2004): The stelligeroid taxa of the genus Cyclotella (Kützing) Brébisson (Bacillariophyceae) and their transfer into the new genus Discostella gen. nov. Diatom Research 19: 203-228. Houk V., Klee R., Tanaka H. (2010): Atlas of freshwater centric diatoms with a brief key and descriptions. Part III. Stephanodiscaceae A. Cyclotella, Tertiarius, Discostella. Fottea 10 (Supplement): 1-498. Hustedt F. (1928): Die Kieselalgen Deutschlands, Österreichs und der Schweiz unter Berücksichtigung der übrigen Länder Europas sowie der angrenzenden Meeresgebiete. - Rabenhorst L (szerk.): Kryptogamen Flora von Deutschland, Österreich und der Schweiz. Akademische Verlagsgesellschaft m.b.h. Leipzig, 7 (Teil 1, Lief. 2), pp 273- 464.

130

Hustedt F. (1930): Die Kieselalgen Deutschlands, Österreichs und der Schweiz unter Berücksichtigung der übrigen Länder Europas sowie der angrenzenden Meeresgebiete. - Rabenhorst L. (szerk.): Kryptogamenflora von Deutschland, Österreich und Schweiz. Akademische Verlagsgesellschaft, Leipzig: 7. Hustedt F. (1957): Die Diatomeenftora des FluBsystems der Weser im Gebiet der Hansestadt Bremen. Abh natllrwVer Bremen 34: 181-440. Ibelings B., Admiraal W., Bijkerk R., Ietswaart T., Prins H. (1998): Monitoring of algae in Dutch rivers: Does it meet its goal? Journal of Applied Phycology 10: 171-181. ISO 7150-1 (1984): Water quality - Determination of ammonium - Part 1: Manual spectrometric method. ISO 8467 (1993): Water quality - Determination of permanganate index. Istvánovics V., Honti M., Vörös L., Kozák Zs. (2010): Phytoplankton dynamics in relation to connectivity, flow dynamics and resource availability - the case of a large lowland river, the Hungarian Tisza. Hydrobiologia 637: 121-141. Iwamura T., Nagai H., Ichimura S. (1970): Improved methods for determining contents of chlorophyll, protein, ribonucleic acid and deoxyribonucleic acid in planktonic populations. Internationale Revue der gesamten Hydrobiologie und Hydrographie. 55: 131-147. Jahn R., Mann D. G., Evans K. M., Poulickova A. (2008): The identity of Sellaphora bacillum (Ehrenberg) DG Mann. Fottea 8(2): 121-124. Johansen J., Kociolek P., Lowe R. (2008): Spicaticribra kingstonii, gen. nov. et sp. nov. (Thalassiosirales, Bacillariophyta) from Great Smoky Mountains National Park, U.S.A. Diatom Research 23: 367-375. Jung S.W., Han M.-S., Ki J.-S. (2010): Molecular genetic divergence of the centric diatom Cyclotella and Discostella (Bacillariophyceae) revealed by nuclear ribosomal DNA comparisons. Journal of Applied Phycology 22: 319-329. Kaczmarska I., Beaton M., Benoit A. C., Medlin L. K. (2005): Molecular phylogeny of selected members of the order Thalassiosirales (Bacillariophyta) and evolution of the fultoportula. Journal of Phycology 42: 121-138. Kaeriyama H., Katsuki E., Otsubo M., Yamada M., Ichimi K., Tada T., Harrison P. J. (2011): Effects of temperature and irradiance on growth of strains belonging to seven Skeletonema species isolated from Dokai Bay, southern Japan. European Journal of Phycology 46: 113-124. Kaštovský J., Hauer T., Mareš J., Krautová M., Bešta T., Komárek J., Desortová B., Heteša J., Hindáková A., Houk V., Janeček E., Kopp R., Marvan P., Pumann P., Skácelová O., Zapomělová E. (2010): A review of the alien and expansive species of freshwater cyanobacteria and algae in the Czech Republic. Biological Invasions 12: 3599-3625. Keeling P. J. (2013): The number, speed and impact of plastid endosymbiosis in eukaryotic evolution. Annual Review of Plant Biology 64: 583-607. Keeling P. J., Palmer J. D. (2008): Horizontal gene transfer in eukaryotic evolution. Nature 9: 605-618. Kelemen K. (1992): Fitoplankton vizsgálatok a Tisza szolnoki szelvényében. Hidrológiai Közlöny 72(1): 52-57.

131

Kermarrec L., Franc A., Rimet F., Chaumeil P., Humbert J. F., Bouchez A. (2013): Next- generation sequencing to inventory taxonomic diversity in eukaryotic communities: a test for freshwater diatoms. Molecular Ecology Resources 4: 607-619. Kermarrec L., Franc A., Rimet F., Chaumeil P., Frigerio J.-M., Humbert J.-F., Bouchez, A. (2014): A next-generation sequencing approach to river biomonitoring using benthic diatoms. Freshwater Science 33: 349-363. Kharitonov V. G., Genkal S. I. (2010): Centric diatom algae (Centrophyceae) of ultraoligotrophic Lake Elgygytgyn and water bodies of its basin (Chukotka, Russia). Inland Water Biology 3: 1-10. Khursevich G.K., Kociolek J.P. (2012): A preliminary, worldwide inventory of the extinct, freshwater fossil diatoms from the Orders Thalassiosirales, Stephanodiscales, Paraliales, Aulacoseirales, Melosirales, Coscindiscales, and Biddulphiales. Nova Hedwigia Beihefte 141: 315-364. Ki J.-S. (2009): Comparative molecular analysis of freshwater centric diatoms with particular emphasis on the nuclear ribosomal DNA of Stephanodiscus (Bacillariophyceae). Algae 24: 129-138. Kimura M. (1980): A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. Journal of Molecular Evolution 16(2): 111-120. Kiss K. T. (1985): Changes of trophity conditions in the River Danube at Göd. Danubialia Hungarica XCIV. Annales Universitatis Scientiarum Budapestinensis de Rolando Eötvös Nominatae. Sectio Biologia 24-26: 47-59. Kiss K. T. (1986): Species of the Thalassiosiraceae in the Budapest section of the Danube. Comparison of samples collected in 1956-63 and 1979-83. - Ricard M (szerk.): Proceedings of the Eight International Diatom Symposium, Paris, August 27 - September 1, 1984. Koeltz Scientific Books, Koenigstein, pp. 23-31. Kiss K. T. (2000): Növekedett-e a Duna trofitási szintje a Bősi-vízlépcső hatására? Hidrológiai Közlöny 80:316-318. Kiss K. T., Ács É., Kovács A. (1994): Ecological observations on Skeletonema potamos (Weber) Hasle in the River Danube, near Budapest (1991-92, daily investigations). Hydrobiologia 289: 163-170. Kiss K. T., Genkal S. I. (1997): Télvégi-koratavaszi Centrales (Bacillariophyceae) vízvirágzás a Dunán (1996). Hidrológiai Közlöny 77: 57-58. Kiss K. T., Klee R., Hegewald E. (1999): Reinvestigation of the original material of Cyclotella ocellata Pantocsek (Bacillariophyceae). Archiv für Hydrobiologie Supplement Algological Studies 93: 39-53. Kiss K. T., Klee R., Ector L., Ács É. (2012): Centric diatoms of large rivers and tributaries in Hungary: morphology and biogeographic distribution. Acta Botanica Croatica 71: 311-363. Kiss K. T., Hegewald E., Ács É. (2002): Cyclotella hispanica a new dimorphic centric diatom species. Algological Studies 106: 1-6. Kiss K. T., Rojo C., Álvarez-Cobelas M. (1996): Morphological variability of a Cyclotella ocellata (Bacillariophyceae) population in the lake Las Madres (Spain). Archiv für Hydrobiologie Supplement Algological Studies 82: 37-55.

132

Kistenich S., Dreßler M., Zimmermann J., Hübener T., Bastrop R., Jahn R. (2014): An investigation of the morphology and genetics of Cyclotella comensis and closely related taxa.Diatom Research 29: 423-440. Klee R., Steinberg C. (1987): Kieselalgen bayerischer Gewässer. Loseblattsammlung, Informationsberichte Bayerisches Landesamt für Wasserwirtschaft 4/87, München, pp. 112. Knie M., Hübener T. (2007): Morphological variability of the Cyclotella ocellata-krammeri- rossii complex in field samples and cultures. - Kusber W.-H., Jahn R. (szerk.) Proceedings of the 1st Central European Diatom Meeting 2007. Berlin-Dahlem, 23-25 March 2007. Botanic Garden and Botanical Museum Berlin-Dahlem, Freie Universität Berlin, pp. 83-86. Kociolek J. P, Williams D. M. (2015): How to define a diatom genus? Notes on the creation and recognition of taxa, and a call for revisionary studies of diatoms. Acta Botanica Croatica 74(2): 195-210. Kooistra W. H. C. F., Medlin L. K. (1996): Evolution of the diatoms (Bacillariophyta) IV: A reconstruction of their age from small subunit coding regions and the fossil record. Molecular Phylogenetics and Evolution 6: 391-407. Kooistra W. H. C. F., Gersonde R., Medlin L. K., Mann D. G. (2007): The origin and evolution of the diatoms: Their adaptation to a planktonic existence. - Falkowski P. G., Knoll A. H. (szerk.): Evolution of primary producers in the sea. Elsevier Academic Press. pp. 207-249. Kooistra W. H. C. F., Sarno D., Balzano S., Gu H., Andersen R. A., Zingone A. (2008): Global diversity and biogeography of Skeletonema species (Bacillariophyta). Protist 159: 177-193. Kozurenko T. F., Loginova L. P., Genkal S. I., Chursevich G. K., Sheshukova-Poretzkaja, V. S. (1992): Cyclotella Kütz. - Gleser S. I., Makarova I. V., Moiseeva A. A., Nikolaev V. A. (szerk.): The Diatoms of the USSR (fossil and recent). Vol. II. Fasc. 2. St.- Petersburg. Nauka. p. 24-47. Kowalik K. V., Stoebe B., Schaffran I., Kroth-Pancic P., Freier U. (1995): The chloroplast genome of a chlorophyll a+c containing alga, Odontella sinensis. Plant Molecular Biology Reporter 13: 336-342. Krammer K., Lange-Bertalot H. (1991): Bacillariophyceae. 3. Teil: Centrales, Fragilariaceae, Eunotiaceae. - Ettl H., Gerloff J., Heynig H., Mollenhauer D. (szerk.): Süßwasserflora von Mitteleuropa 2(3). Gustav Fisher Verlag, Stuttgart, pp 576. Lang I., Kaczmarska I. (2011): A protocol for a single-cell PCR of diatoms from fixed samples: method validation using Ditylum brightwellii (T. West) Grunow. Diatom Research 26(1): 43-49. Lee M.-A., Faria D. G., Han M.-S., Lee J., Ki J.-S. (2013): Evaluation of nuclear ribosomal RNA and chloroplast gene markers for the DNA taxonomy of centric diatoms. Biochemical Systematics and Ecology 50: 163-174. Leilaert F., Verbrugen H., Vanormelingen P., Steen F., López-Bautista J. M., Zuccarello G. C., de Clerck O. (2014): DNA-based species delimitation in algae. European Journal of Phycology 49(2): 179-196.

133

Lehman P. W. (2000): The influence of climate on phytoplankton community biomass in San Francisco Bay Estuary. Limnology and Oceanography 45: 580-590. Levialdi Ghiron J. H., Amato A., Montresor M., Kooistra W. H. (2008): Plastid inheritance in the planktonic raphid pinnate diatom Pseudo-nitzschia delicatissima (Bacillariophyceae). Protist 159: 91-98. Loginova L. P. (1990): Classification of the diatom genus Cyclotella. - Simola H. (szerk.) Proceedings of the Tenth International Diatom Symposium. Joensuu, Finland, August 28 - September 2, 1988. Koeltz Scientific Books, Koenigstein, pp. 37-53. Lowe R. L. (1975): Comparative ultrastructure of the valves of some Cyclotella species (Bacillariophyceae). Journal of Phycology 11: 415-424. Luddington I. A., Kaczmarska I., Lovejoy C. (2012): Distance and character-based evaluation of the V4 region of the 18S rRNA gene for the identification of diatoms (Bacillariophyceae). PloS ONE 7(9): e45664. MacGillivary M. L., Kaczmarska I. (2011): Survey of the efficacy of a short fragment of the rbcL gene as a supplemental DNA barcode for diatoms. Journal of Eukaryotic Microbiology 58: 529-536. Mann D. G. (1999): The species concept in diatoms. Phycologia 38 (6): 437-495. Mann D. G., Sato S., Trobajo R., Vanormelingen P., Souffreau, C. (2010): DNA barcoding for species identification and discovery in diatoms. Cryptogamie Algologie 31(4): 557-577. Mann D. G., Evans K. M. (2007): Molecular genetics and the neglected art of diatomics. - Brodie J., Lewis J. (szerk.): Unravelling the algae: the past, present and future of algal systematics. pp. 231-265. Mann D. G., Vanormelingen P. (2013): An inordinate fondness? The number, distributions and origins of diatom species. The Journal of Eukaryotic Microbiology 60: 414-420. Marshall H. G., Egerton T. A. (2009): Phytoplankton blooms: their occurrence and composition within Virginia’s tidal tributaries. Virginia Journal of Science 60: 149- 164. Mayr E. (2000): The biological species concept. - Species concepts and phylogenetic theory: a debate. Columbia University Press, New York: 17-29. McFarland B. H., Collins G. B. (1978): A key to the species of the diatom genus Cyclotella (Kütz.) Bréb., based on new morphological data. Abstract, 26th annual meeting of North American Benthological Society, Winnipeg, Mannitoba, p. 35. McQuoid M. R, Hobson L. A. (1995): Importance of resting stages in diatom seasonal succession. Journal of Phycology 31: 44-50. Medlin L. K. (2009): The use of the terms centric and pennate. Diatom Research 24(2): 499- 501. Medlin L. K. (2014): Evolution of the diatoms: VIII. Re-examination of the SSU-Rrna gene using multiple outgroups and a cladistic analysis of valve features. Journal of Biodiversity, Bioprospecting and Development. 1(3): 129. Medlin L. K. (2016a): Opinion: Can coalescent models explain deep divergences in the diatoms and argue for the acceptance of paraphyletic taxa at all taxonomic hierarchies? Nova Hedwigia 102(1-2): 107-128.

134

Medlin L. K. (2016b): Evolution of the diatoms: major steps in their evolution and a review of the supporting molecular and morphological evidence. Phycologia 55(1): 79-103. Medlin L. K., Crawford R. M. (1986): Histochemical and ultrastructural evidence for the function of the labiate process in the movement of centric diatoms. British Phycological Journal 21(3): 297-301. Medlin L., Elwood H. J., Stickel S., Mitchell L. S. (1988): The characterization of enzymatically amplified eukaryotic 16S-like rRNA-coding regions. Gene 71:491-499. Medlin L. K., Elwood H. J., Stickel S., Sogin M. L. (1991): Morphological and genetic variation within the diatom Skeletonema costatum (Bacillariophyta): Evidence for a new species, Skeletonema pseudocostatum. Journal of Phycology 27(4): 514-524. Medlin L. K., Jung I., Bahulikar R., Mendgen K., Kroth P., Kooistra W. H. C. F. (2008): Evoltuion of the diatoms VI. Assessment of the new genera in the araphids using molecular data. Nova Hedwigia, Beiheft 133: 81-100. Medlin L. K., Kaczmarska I. (2004): Evolution of the diatoms V: Morphological and cytological support for the major clades and a taxonomic revision. Phycologia 43: 425-470. Medlin L. K., Kooistra W. H., Gersonde R., Wellbrock U. (1996a): Evolution of the diatoms (Bacillariophyta) II: Nuclear-encoded small-subunit rRNA sequence comparisons confirm a paraphyletic origin for the centric diatoms. Molecular Biology and Evolution 13: 67-75. Medlin L. K., Kooistra W. H., Gersonde R., Wellbrock U. (1996b): Evolution of the diatoms (Bacillariophyta): III. Molecular evidence for the origin of the Thalassiosirales. Nova Hedwigia Beiheft 112: 221-234. Medlin L. K., Kooistra W. H. C. F., Potter D., Saunders G. W., Andersen R. A. (1997): Phylogenetic relationships of the ‘golden algae’ (haptophytes, heterokont chromophytes) and their plastids. - Chapter Origins of algae and their plastids. Plant Systematics and Evolution 11: 187-219. Medlin L. K., Williams D. M., Sims P. A. (1993): The evolution of the diatoms (Bacillariophyta). I. Origin of the group and assessment of the monophyly of its major divisions. European Journal of Phycology 28(4): 261-275. Menden-Deuer S., Lessard E. J. (2000): Carbon to volume relationships for dinoflagellates, diatoms, and other protist plankton. Limnology and Oceanography 45: 569-79. Mills E. L., Leach J. H., Carlton J. T., Secor C. L. (1993): Exotic species in the Great Lakes: A history of biotic crises and anthropogenic introductions. Journal of Great Lakes Research 19: 1-54. Miralto A., Barone G., Romano G., Poulet S. A., Ianora A., Russo G. L., Buttino I., Mazzarella G., Laabir M., Cabrini M., Giacobbe M. G. (1999): The insidious effect of diatoms on copepod reproduction. Nature 402: 173-176. Moniz M., Kaczmarska I. (2009): Barcoding diatoms: Is there a good marker? Molecular Ecology Resources 9 (Suppl. 1): 65-74. Moniz M., Kaczmarska I. (2010): Barcoding of diatoms: Nuclear encoded ITS revisited. Protist 161: 7-34. Mullis K. B., Faloona F. A. (1987): Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase- catalyzed chain reaction. Methods in Enzymology 155: 335-350.

135

Müller-Solger A. B., A. Jassby D., Müller-Navarra D. C. (2002): Nutritional quality of food resources for zooplankton (Daphnia) in a tidal freshwater system (Sacramento-San Joaquin River Delta). Limnology and Oceanography 47: 1468-1476. Muñoz Garcia I. (1990): Limnologia de la part Baixa del Riu Ebre I els canals de reg: Els factors fisico-quimics, el fitoplancton i els macroinvertebrats bentonics [Limnology of the lower Ebro River and irrigation canals: physico-chemical factors, phytoplankton and benthic macroinvertebrates]. PhD értekezés Universitat de Barcelona [University of Barcelona] Barcelona, Spain. [katalán nyelven, angolra fordított címmel] Nakov T., Guillory W. X., Julius M. L., Theriot E. C., Alverson A.J. (2015): Towards a phylogenetic classification of species belonging to the diatom genus Cyclotella (Bacillariophyceae): Transfer of species formerly placed in Puncticulata, Handmannia, Pliocaenicus and Cyclotella to the genus Lindavia. Phytotaxa 217(3): 249-264. Nelles L., Fang B. L., Volckaert G., Vandenberghe A., De Wachter R. (1984): Nucleotide sequence of a crustacean 18S ribosomal RNA gene and secondary structure of eukaryotic small subunit ribosomal RNAs. Nucleic Acid Research 12: 8749-8768. Newmaster S. G., Fazekas A. J., Ragupathy S. (2006): DNA barcoding in land plants: evaluation of rbcL in a multigene tiered approach. Canadian Journal of Botany 84: 335-341. Nickrent D. L., Sargent M. L. (1991): An overview of the secondary structure of of the V4 region of eukaryotic small-subunit ribosomal RNA. Nucleic Acids Research 19(2): 227-235. Nixon K. C., Wheeler Q. D. (1990): An amplification of the phylogenetic species concept. Cladistics 6(3): 211-223. Nõges P., Adrian R., Anneville O., Arvola L., Blenckner T., George G., Jankowski T., Järvinen M., Maberly S., Padisák J., Starile D., Teubner K., Thackeray S. (2010): The impact of variations in the climate on seasonal dynamics of phytoplankton 275-292 - George D. G. (szerk.): The Impact of Climate Change on European Lakes. Springer, Dordrecht, pp. 1-507. Oksanen J., Kindt R., Legendre P., Minchin P. R., O’Hara R. B., Simpson G. L., Solymos P., Stevens M. H. H., Wagner H. (2013): vegan: Community Ecology Package. R package version 2.0-9. Orsini L., Procaccini G., Sarno D., Montresor M. (2004): Multiple rDNA ITS-types within the diatom Pseudo-nitzschia delicatissima (Bacillariophyceae) and their relative abundances across a spring bloom in the Gulf of Naples. Marine Ecology Progress Series 271: 87-98. Országos Vízügyi Főigazgatóság honlapja (www.hydroinfo.hu) Oudot-Le Secq M.-P., Grimwood J., Shapiro H., Armbrust V. E., Bowler C., Green B. R. (2007): Chloroplast genomes of the diatoms Phaeodactylum tricornutum and Thalassiosira pseudonana: comparison with other plastid genomes of the red lineage. Molecular Genetics and Genomics 277(4): 427-39. Pantocsek J. (1901): Die Kieselalgen oder Bacillarien des Balaton. Im Auftrage des ungarischen geographischen Gesellschaft auf Basis eigener Aufsammlungen. - Resultate der wissenschaftlichen Erforschung des Balatonsees. II. Band. Anhang zur

136

II. Section des 2. Theiles, K. und K. Hofbuchdruckerei des Victor Hornyánszky, Budapest. 112 pp. Pinheiro J., Bates D., DebRoy S., Sarkar D. and the R Development Core Team (2013): nlme: Linear and Nonlinear Mixed Effects Models. R package version 3.1-113. Popovskaya G. I., Genkal S. I. (2008): Materials on the flora of diatoms (Centrophyceae) from lakes of the Baikal Region and Transbaikalia. Inland Water Biology 1: 311-319. Pruesse E., Peplies J., Glöckner F. O. (2012): SINA: accurate high-throughput multiple sequence alignment of ribosomal RNA genes. Bioinformatics 28: 1823-1829. Rambaut A. (2009). FigTree version 1.3.1. Institute of Evolutionary Biology, University of Edinburgh, Edinburgh, UK. http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/ Rimet F., Trobajo R., Mann D. G., Kermarrec L., Franc A., Domaizon I., Bouchez A. (2014): When is sampling complete? The effects of geographical range and marker choice on perceived diversity in Nitzschia palea (Bacillariophyta). Protist 165: 245-259. Rimet F., Chaumeil P., Keck F., Kermarrec L., Vasselon V., Kahlert M., Franc A., Bouchez A. (2016): R-Syst::diatom: an open-access and curated barcode database for diatoms and freshwater monitoring. Database: baw016. Rivera P., Cruces F., Vila I. (2003): Cyclotella ocellata Pantocsek (Bacillariophyceae): Primera cita en Chile y comentarios sobre su variabilidad morfologica. Gayana Botánica 60: 123-131. Robba L., Russell S. J., Barker G. L., Brodie J. (2006): Assessing the use of the mitochondrial cox1 marker for use in DNA barcoding of red algae (Rhodophyta). American Journal of Botany 93: 1101-1108. Rodríguez F., Oliver J. L., Marín A., Medina J. R. (1990): The general stochastic model ofnucleotide substitution. Journal of Theoretical Biology 142: 485-501. Rohlf F. J. (2004): TpsDig, digitize landmarks and outlines, version 2.0. Department of Ecology and Evolution, State University at Stony Brook. http://life.bio.sunysb.edu/morph/ Ronquist F., Teslenko M., van der Mark P., Ayres D. L., Darling A., Höhna S., Larget B., Liu L., Suchard M. A., Huelsenbeck J. P. (2012): MrBayes 3.2: Efficient Bayesian phylogenetic inference and model choice across a large model space. Systematic Biology 61: 539-542. Ross R., Cox E. J., Karayeva I., Mann D. G., Paddock T. B. B., Simonsen R., Sims P. A. (1979): An amended terminology for the siliceous components of the diatom cell. Nova Hedwigia, Beiheft 64: 513-533. Rost B., Riebesell U., Burkhardt S., Sültemeyer D. (2003): Carbon acquisition of bloom- forming marine phytoplankton. Limnology and oceanography 48: 55-67. Round F. E., Crawford, R. M., Mann, D. G. (1990): The diatoms: Biology and morphology of the genera. Cambridge University Press, pp. 747. R Development Core Team (2010): R: a language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. http://www.R-project.org/ R Development Core Team (2013): R: a language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. http://www.R-project.org/

137

Rynerson T. A., Armbrust V. E. (2004): Genetic differentiation among populations of the planktonic marine diatom Ditylum brightwellii (Bacillariophyceae). Journal of Phycology 40(1): 34-43. Sanders J. G. (1979): Effects of arsenic speciation and phosphate concentration on arsenic inhibition of Skeletonema costatum (Bacillariophyta). Journal of Phycology 15(4): 424-428. Sang T., Crawford D. J., Stuessy T. F. (1995): Documentation of reticulate evolution in peonies (Paeonia) using internal transcribed spacer sequences of nuclear ribosomal DNA: implications for biogeography and concerted evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92: 6813-6817. Sanger F., Donelson J. E., Coulson A. E., Kössel H., Fischer D. (1974): Determination of a nucleotide sequence in bacteriophage f1 DNA by primed synthesis with DNA polymerase. Journal of Molecular Biology 90: 315-333. Sanger F., Coulson A. R. (1975): A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. Journal of Molecular Biology 94: 441-448. Sarno D., Kooistra W. H. C. F., Medlin L. K., Percopo I., Zingone A. (2005): Diversity in the genus Skeletonema (Bacillariophyceae). II. An assessment of the taxonomy of S. costatum-like species with the description of four new species. Journal of Phycology 41: 151-176. Sarno D., Kooistra W. H. C. F., Balzano S., Hargraves P. E., Zingone A. (2007): Diversity in the genus Skeletonema (Bacillariophyceae): III. Phylogenetic position and morphological variability of Skeletonema costatum and Skeletonema grevillei, with the description of Skeletonema ardens sp. nov. Journal of Phycology 43: 156-170. Seifert K. A., Samson R. A., deWaard J. R., Houbraken J., Lévesque C. A., Moncalvo J.-M., Louis-Seize G., Hebert P. D. N. (2007): Prospects for fungus identification using CO1 DNA barcodes, with Penicillium as a test case. Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America 104: 3901-3906. Scheffler W. (1994): Cyclotella pseudocomensis nov. sp. (Bacillariophyceae) aus norddeutschen seen. Diatom Research 9: 355-369. Scheffler W., Morabito G. (2003): Topical observations on centric diatoms (Bacillariophyceae, Centrales) of Lake Como (N. Italy). Journal of Limnology 62: 47- 60. Scheffler W., Nicklisch A., Hepperle D. (2003): Dimorphism in Cyclotella pseudocomensis (Heterokontophyta, Bacillariophyceae) as revealed by morphological, ecological and molecular methods. Advances in Limnology 58: 157-173. Scheffler W., Nicklisch A., Schönfelder I. (2005): Beiträge zur Morphologie, Ökologie und Ontogenie der planktischen Diatomee Cyclotella comensis Grunow: Untersuchungen an historischem und rezentem Material. Diatom Research 20: 171-200. Schlegel I., Scheffler W. (1999): Seasonal Development and Morphological Variability of Cyclotella ocellata (Bacillariophyceae) in the Eutrophic Lake Dagow (Germany). International Review of Hydrobiology 84: 469-478. Schmidt A., Vörös L. (1981): A Duna magyarországi szakaszának fitoplanktonja az 1970-es években (Das Phytoplankton des südungarischen Donau-Abschnittes in den 1970-er Jahren). Hidrológiai Közlöny 61: 322-330.

138

Schütt F. (1899a): Ein neues Mittel der Koloniebildung bei Diatomeen und seine systematische Bedeutung. Bericht der Deutschen Botanischen Gessellschaft 17: 215- 221. Sherbakova T. A., Rubtsov N. B., Likhoshway Ye. V., Grachev M. A. (2000): Combined SEM ultrastructure studies and PCR with individual diatom cells. Diatom Research 15(2): 349-354. Sherwood A. R, Presting G. G. (2007): Universal primers amplify a 23S rDNA plastid marker in eukaryotic algae and Cyanobacteria. Journal of Phycology 43: 605-608. Shikata T., Nagasoe S., Matsubara T., Yoshikawa S., Yamasaki Y., Shimasaki Y., Oshima Y., Jenkinson I. R., Honjo T. (2008): Factors influencing the initiation of blooms of the raphidophyte Heterosigma akashiwo and the diatom Skeletonema costatum in a port in Japan. Limnology and Oceanography 53(6): 2503-2518. Serieyssol K. (1981): Cyclotella species of Late Miocene age from St. Bauzile, France. - Ross R. (szerk.): Proceedings of the 6th Symposium on Recent and Fossil Diatoms. Koeltz, Königstein, pp. 27-42. Servant-Vildary S. (1986): Fossil Cyclotella species from Miocene lacustrine deposits of Spain. - Ricard M. (szerk.): Proceedings of the 8th International Diatom Symposium. Koeltz Scientific Books, Königstein, pp. 495-511. Sims P. A. (1994): Skeletonemopsis, a new genus based on the fossil species of the genus Skeletonema Grev. Diatom Research 9: 387-410. Sims P. A., Mann D. G., Medlin L. K. (2006): Evolution of the diatoms: insights from fossil, biological and molecular data. Phycologia 45: 361-402. Sipkay Cs., Kiss K. T., Drégelyi-Kiss Á., Farkas E., Hufnágel L. (2009): Klímaváltozási szcenáriók elemzése a dunai fitoplankton szezonális dinamikájának modellezése alapján. Hidrológiai Közlöny 89: 56-58. Sipkay Cs., Kiss K. T., Vadadi-Fülöp Cs., Homoródi R., Hufnagel L. (2012): Simulation modeling of phytoplankton dynamics in a large eutrophic river, Hungary - Danubian Phytoplankton Growth Model (DPGM). Biologia (Section Botany) 67: 323-337. Sogin M. L., Gunderson J. H. (1987): Structural diversity of eukaryotic small subunit ribosomal RNAs. Evolutionary implications. Annals of the New York Academy of Sciences, 503: 125-139. Solak C. N., Kulikovskiy M. (2013): Species composition and distribution of centric diatoms from Türkmen Mountain (Sakarya River Basin/Turkey). Turkish Journal of Botany 37: 589-596. Sörhannus U. (2004): Diatom phylogenetics inferred based on direct optimization of nuclear- encoded SSU rRNA sequences. Cladistics 20: 487-497. Sörhannus U. (2007): A nuclear-encoded small-subunit ribosomal RNA timescale for diatom evolution. Marine Micropaleontology 65: 1-12. Sörhannus U., Ortiz J. D., Wolf M., Fox M. G. (2010): Microevolution and speciation in Thalassiosira weissflogii (Bacillariophyta). Protist 161 (12): 237-249. Stachura-Suchoples K., Williams D. M. (2009): Description of Conticribra tricircularis, a new genus and species of Thalassiosirales, with a discussion on its relationship to other continuous cribra species of Thalassiosira Cleve (Bacillariophyta) and its freshwater origin. European Journal of Phycology 44 (4): 477-486.

139

Steinberg C., Heindel B., Tille-Backhaus R., Klee R. (1987): Phytoplanktonstudien an langsamfließenden Gewässern: Donau und Vils. Archive für Hydrobiologie Supplement 68, Veröff. Arbeitsgemeinschaft Donauforschung 7: 437-456. Stoermer E. E., Yang J. J. (1969): Plankton diatom assemblages in Lake Michigan. Great Lakes Research Division, Institute of Science and Technology, University of Michigan, Ann Arbor, Michigan, GLRD, Special Report No. 47. 268 pp. Stoof-Leichsenring K. R., Epp L. S., Trauth M. H., Tiedemann R. (2012): Hidden diversity in diatoms of Kenyan Lake Naivasha: a genetic approach detects temporal variation. Molecular Ecology 21: 1918-1930. Taberlet P., Coissac E., Pompanon F., Brochmann C., Willerslev E. (2012): Towards next- generation biodiversity assessment using DNA metabarcoding. Molecular Ecology 21(8): 2045-2050. Tamura K. (1992): Estimation of the number of nucleotide substitutions when there are strong transition-transversion and G+C-content biases. Molecular Biology and Evolution 9: 678-687. Tamura K., Nei M. (1993): Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees. Molecular Biology and Evolution 10: 512-526. Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. (2011): MEGA5: Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Molecular Biology and Evolution 28: 2731-2739. Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., Kumar S. (2013): MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0.Molecular Biology and Evolution 30: 2725-2729. Templeton A. R. (1998): Species and speciation: Geography, population structure, ecology, and gene trees. - Howard D. J., Berlocher S. H. (szerk.): Endless forms: Species and speciation. Oxford University Press, New York, pp. 32-43. Thackeray S. J., Jones I. D., Maberly S. C. (2008): Long-term change in the phenology of spring phytoplankton: species-specific responses to nutrient enrichment and climatic change. Journal of Ecology 96: 523-535. Teubner K. (1995): A light microscopical investigation and multivariate statistical analyses ofheterovalvar cells of Cyclotella-species (Bacillariophyceae) from lakes of the Berlin-Brandenburg region. Diatom Research 10: 191-205. Theriot E. (1987): Principal component analysis and taxonomic interpretation of environmentally related variation in silicification in Stephanodiscus (Bacillariophyceae). British Phycological Journal 22: 359-373. Theriot E., Stoermer E., Håkansson H. (1987): Taxonomic interpretation of the rimoportula of freshwater genera in the centric diatom family Thalassiosiraceae. Diatom Research 2: 251-256. Theriot E. C., Cannone J. J., Gutell R. R., Alverson A. J. (2009): The limits of nuclear encoded SSU rDNA for resolving the diatom phylogeny. European Journal of Phycology 44(3): 277-290.

140

Theriot E. C., Ashworth M., Ruck E., Nakov T., Jansen R. K. (2010): A preliminary multigene phylogeny of the diatoms (Bacillariophyta): challenges for the future research. Plant Ecology and Evolution 143: 278-296. Theriot E., Serieyssol K. (1994): Phylogenetic systematics as a guide to understanding features and potential characters of the centric diatom family Thalassiosiraceae. Diatom Research 9: 429-450. Torgan L. C., Becker V., Bahi dos Santos C. (2009): Skeletonema potamos (Bacillariophyta) in Patos Lagoon, southern Brazil: Taxonomy and distribution. Revista Peruana de Biología 16: 93-96. Trobajo R., Mann D. G., Clavero E., Evans K. M., Vanormelingen P., McGregor R. C. (2010): The use of oartial cox1, rbcL and LSU rDNA sequences for phylogenetics and species identification within Nitzschia palea species complex (Bacillariophyceae). European Journal of Phycology 45(4): 413-425. Tuji A., Mohri Y., Ki J.-S., Jung S. W., Julius M. L. (2014): Phylogeny of Praestephanos gen. nov. (Thalassiosirales, Bacillariophyceae) based on Stephanodiscus suzukii, and related freshwater thalassiosiroid diatoms. Plankton and Benthos Research 9: 132-140. Urbánková P., Veselá J. (2013): DNA-barcoding: A case study in the diatom genus Frustulia (Bacillariophyceae). Nova Hedwigia 142: 147-162. Utermöhl H. (1958): Zur Vervollkommnung der quantitativen Phytoplankton-Methodik. Mitteilungen Internationale Vereinigung für Teoretische und Angewandte Limnologie 9: 1-38. Verasztó Cs., Kiss K. T., Sipkay Cs., Gimesi L., Vadadi-Fülöp Cs., Türei D., Hufnagel L. (2010): Long-term dynamic patterns and diversity of phytoplankton communities in a large eutrophic river (the case of River Danube, Hungary). Applied Ecology and Environmental Research 8: 329-349. Vijayasarathy P. R. (2011): Engineering Chemistry (2nd ed.). PHI Learning Private Ltd., New Delhi. pp. 310. Walsh P. S., Metzger D. A., Higuchi R. (1991): Chelex100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. BioTechniques 10(4): 506-513. Weber C. I. (1970): A new freshwater centric diatom Microsiphona potamos gen. et sp. nov. Journal of Phycology 6: 149-153. Werner P., Smol J. P. (2006): The distribution of the diatom Cyclotella comensis in Ontario (Canada) lakes. Nova Hedwigia 130: 373-391. Wiemers M., Fiedler K. (2007): Does the DNA barcoding gap exist? - a case study in blue butterflies (Lepidoptera: Lycaenidae). Frontiers in Zoology 4:8. Wolf M., Scheffler W., Nicklisch A. (2002): Stephanodiscus neoastraea and Stephanodiscus heterostylus (Bacillariophyta) are one and the same species. Diatom Research 17(2): 445-451. Wolin J. A., Stoermer E. F. (2005): Response of a Lake Michigan coastal lake to anthropogenic catchment disturbance. Journal of Paleolimnology 33: 75-94. Wolfe A. P., Siver P. A. (2009): Three extant genera of freshwater thalassiosiroid diatoms from Middle Eocene sediments in northern Canada. American Journal of Botany 96(2): 487-497.

141

Wunsam S., Schmidt R., Klee R. (1995): Cyclotella-taxa (Bacillariophyceae) in lakes of the Alpine region and their relationship to environmental variables. Aquatic Sciences 57: 360-386. Yamada M., Otsubo M., Tsutsumi Y., Mizota C., Iida N., Okamura K., Kodama M., Umehara A. (2013): Species diversity of the marine diatom genus Skeletonema in Japanese brackish water areas. Fisheries Science 79: 923-934. Ye J., Coulouris G., Zaretskava I., Cutcutache I., Rozen S., Madden T. L. (2012): Primer- BLAST: A tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics 13:134. Zimmermann J., Abarca N., Enke N., Skibbe O., Kusber W.-H., Jahn R. (2014): Taxonomic reference libraries for environmental barcoding: A best practice example from diatom research. PLoS ONE 9(9): e108793. Zimmermann J., Glöckner G., Jahn R., Enke N., Gemeinholzer B. (2015): Metabarcoding vs. morphological identification to assess diatom diversity in environmental studies. Molecular Ecology Resources 15(3): 526-542. Zimmermann J., Jahn R., Gemeinholzer B. (2011): Barcoding diatoms: evaluation of the V4 subregion on the 18S rRNA gene, including new primers and protocols. Organisms, Diversity and Evolution 11: 173-192. Zingone A., Percopo I., Sims P., Sarno D. (2005): Diversity in the genus Skeletonema (Bacillariophyceae). I. A reexamination of S. costatum with the description of S. grevillei sp. nov. Journal of Phycology 41: 140-150.

142

12. Függelék

1. függelék: Az új nemzetség leírása

Pantocsekiella K.T. Kiss et Ács gen. nov.

Típusfaj:Cyclotella ocellata Pantocsek (1901), Die Kieselalgen oder Bacillarien des Balaton, p 104, pl. 15, fig. 318. Diagnózis: A frusztulumok korong alakúak, egyedülállóak, ritkán rövid láncokat képeznek. A valvák kör alakúak vagy egyhén négyszögletesek, a valvafelszín egy poligonális centrális areára és egy striázott marginális területre osztott. A poligonális centrális area többé-kevésbé sík vagy radiálisan undulált (3-5unduláció) vagy enyhén tangenciálisan undulált. Az undulált formákon három vagy több váltakozó lacunából és papillákból vagy csak lacunákból álló mintázat figyelhető meg; ez a mintázat hat vagy több háromszög alakú szektorban van elrendezve, vagy a centrális areán számos véletlenszerűen elhelyezkedő lacuna és kis puncta van, amelyek nem törik át a sejtfalat. A centrális area lehet viszonylag kicsi vagy nagy, függetlenül az átmérőtől. A valva marginális része alveolált striákból épül fel kívül, ezeket hialin csíkok választják el egymástól. A striák egyenesek, nem egyenlő hosszúak, és néhányuk kettéágazik. A marginális területen egyszerű alveolák vannak belül. Az alveolák belső nyílása lehet kerek vagy hosszúkás. A bordák általában egyenlő hosszúak, de azok, amelyeken marginális fultoportula van, gyakran rövidebbek. A valvának egy vagy néhány rimoportulája van, amely(ek) a szubmarginális zónában, a bordán vagy éppen az alatt helyezkednek el. A rimoportula/rimoportulák belül helytülőek, kívülről egy kerek nyílást képeznek. Az ajak orientációja változó. Általában, minden harmadik- ötödik interstrián van egy marginális fultoportula, de mindegyik-minden hatodik interstrián is lehet. A belső nyílásukat két szatellit pórus veszi körül. Az 1-4 valvafelszíni fultoportulát (VFP) általában 2 (1-3) szatellit pórus övezi. Sok esetben a VFP külső nyílását nehéz észrevenni, mert számos valván van néhány puncta, amelyek szabálytalanul helyezkdenek el a centrális részen. Gyakran kis granulumok figyelhetőek meg az interstriákon a valva szélének közelében és elszórtan az egész valvafelszínen. Cyclotella a Pantocsekiellatól a marginális fultoportulák és a rimoportulá(k) elrendezésében különbözik. A Cyclotella rimportulá(i) a marginális fultoportulák alkotta gyűrűben helyezkednek el, és striák (bordák) egyenlő hosszúak. A Lindavia fajok a centrális area szerkezetében különböznek a Pantocsekiellatól. A Lindavia fajok centrális areáján areolák vannak és összetett alveoláris szerkezettel rendelkeznek. Ezen tulajdonságok egyike sem figyelhető meg a Pantocsekiella és a Cyclotella esetében.

Szisztematikai besorolás: Osztály Coscinodiscophyceae Round et Crawford Alosztály Archaegladiopsophycidae Nikolaev et Harwood Rend Stephanodiscales Nikolaev et Harwood Család Stephanodiscaceae Gleser et Makarova Nemzetség Pantocsekiella K.T. Kiss et Ács gen. nov. Etimológia: Az új nemzetség a nevét Pantocsek József, a világszerte híres diatomológus után kapta, aki eredetileg leírta a Cyclotella ocellata fajt.

Typus generis: Pantocsekiella ocellata (Pantocsek) K.T. Kiss et Ács, comb. nov.

Pantocsekiella ocellata (Pantocsek) K.T. Kiss et Ács, comb. nov. Basionym:—Cyclotella ocellata Pantocsek (1901), Die Kieselalgen oder Bacillarien des Balaton, p 104, pl. 15, fig. 318. Szinonimák:—Cyclotella crucigera Pantocsek 1901, p. 104, pl. 15, fig. 325; Cyclotella kuetzingiana var. planetophora Fricke in Schmidt 1900, pl. 222, figs. 9–12; Cyclotella tibetana Hustedt 1922a, p. 117; pl. 9, fig. 19; Cyclotella trichonidea var. parva Economou-Amilli 1979, p. 470, figs. 21–25. Lindavia ocellata (Pantocsek) Nakov et al. 2015, p. 256. Típushely:—Balaton, Magyarország. Általános leírás:—A frusztulumok korong alakúak, a valvák kör alakúak, ritkán enyhén négyszögletesek (Visovac-tóban). A valvafelszín poligonális, centrális area többé-kevésbé sík vagy radiálisan undulált, 3-5 unduláció az orbiculi depressi számától függően (OD, 36./A-F. ábrák). Általában a valvafelszín centrális areájának és marginális területének szerkezete különbözik az OD-vel rendelkező valvákon, de gyakran majdnem homogénnek látszik az OD nélküli kis valvákon. A centrális area enyhe tangenciális unduláltsága a négy- és háromszögletes valvákon látható döntött helyzetben (36./A. ábra). A valvafelszínen van OD és 0 (36./E. ábra) – 5 papilla. Az OD mellett viszonylag kis puncták is lehetnek (0-11). A valva centrális része lehet viszonylag kicsi vagy nagy (2.5–7.3 μm), az átmérőtől függetlenül, és különböző méretű és elhelyezkedésű kis kiemelkedést

I tartalmaz. A valva marginális része alveolált striákból épül fel kívül, amelyeket hialin csíkok választanak el egymástól, a striák egyenesek, nem egyenlő hosszúak és néhányuk kettéágaznak (36./B-D. ábra). Gyakran kis granulumok figyelhetőek meg az interstriákon a valva széle közelében, és elszórtan a striákon (36./A, D, F. ábra) vagy az egész valvafelszínen. Belül a margniális területen egyszerű alveolák vannak. Az alveolák belső nyílása kerekek vagy hosszúkásak lehetnek. A bordák általában egyenlő hosszúak, de azok, amelyeken marginális fultoportula van, gyakran rövidebbek (36./G-I. ábrák) veszi körül. A valván egy vagy néhány rimoportula van, a szubmarginális zónában a bordán vagy éppen alatta (belül helytülő, kívül kerek nyílással rendelkezik); az ajak orientációja változó. Általában minden harmadik-ötödik interstrián van egy marginális fultoportula (MFP), de mindegyik-minden hatodik interstrián előfordulhat. Belső nyílásaikat két szatellit pórus veszi körül. Az 1-4 valvafelszíni fultoportulát (VFP, 36./G, H. ábra) 2 (1-3) szatellit pórus (36./G-I. ábrák). Sok esetben a VFP külső nyílását nehéz észrevenni, mert sok valván van néhány puncta szabálytalanul elrendezve a centrális areán.

Új nomenklatúrai kombinációkat javasoltunk a javasolt új Pantocsekiella nemzetséggel kapcsolatban, melyek Ács és mtsai. (2016) publikációban olvashatóak.

Függelék 12. 2. Táblázatok

Függelék 12.2.1. A Cyclotella ocellata/C. comensis komplex vizsgálatához kapcsolódó táblázatok

F/1. táblázat: A mintavételi helyek leírása. Hu=Magyarország, Hr=Horvátország, Tr=Törökország, A=terület, zátlag=átlagos mélység, zmax=maximális mélység. Település/ GPS/ország Terület és mélység Trofitás Antropogén hatás Megjegyzés víztest N 46º58′58,52′′ A: 59300 ha, Alsóörs/Balaton: E 17º58′37,57′′ z : 3,2 m, mezotróf rekreáció biogenikus mészkő kiválás természetes tó átlag Hu zmax: 12,2 m Himód/ N 47º31′49,7′′ A: 6 ha, eutróf halban gazdag horgásztó kavicsbányató E 17º01′29,8′′ Hu zmax: kb. 20 m N 47º20′30,88′′ E A: 10,4 ha, Dunaharaszti/kavicsbányató mezotróf jetski pálya 19º07′03,07′′ Hu zmax: 4-5 m N 47º58′55,26′′ Nyékládháza/Nyékládházi-tavak: A: 361 ha, jelenleg is bányászott tavak E 20º53′26,09′′ oligo-mezotróf kavicsbányató z : 30 m csoportja Hu max

III N 47º54′06,1′′ A: 70 ha, búvárkodás, horgászat, Hegyeshalom/kavicsbányató E 17º08′53,8′′ mezo-eutróf z : 50 m szörfözés Hu max N 47º43′58,7′′ A: 3,7 ha Kunsziget/Csiszlói-tó: kavicsbányató eutróf halban gazdag horgásztó E 17º30′05,6′′ Hu zmax: kb. 20 m N 47º26′53,7′′ A: 5 ha Szany/kavicsbányató eutróf horgásztó E 17º18′19,8′′ Hu zmax: kb. 20 m N 43º48′05,35′′ Losovac/Visovac-tó: természetes, meleg A: 790 ha, Krka-folyón helyezkedik el, két E 15º58′34,79′′ oligo-mezotróf nemzeti park monomiktikus z : 55 m travertin gát határolja Hr max N 39°27'48,42′′ İnli-fennsík/forrás E 30°20'02,28′′ oligotróf tipikus holokrén hegyi forrás Tr N 40°36′40,01′′ Marmarean folyómedence kis Yalova/patak eutróf E 29°13′00,14′′ Tr patakja

F/2. táblázat: A mintavételi helyeken mért vízkémiai változók (İnli forrás vízkémiai változóit nem mértük). Cond. = vezetőképesség, Turb. = zavarosság, DO = oldott oxigén koncentráció.

Cond. DO Turb. Cl- CO 2-(mg HCO 2- Ca2+ Mg2+ TP PO –P NO –N NH –N Chla (µg víztest pH 3 3 4 3 4 (µS cm-1) (mg L-1) (NTU) (mg L-1) L-1) (mg L-1) (mg L–1) (mg L–1) (µg L–1) (µg L–1) (mg L–1) (mg L–1) L–1) Balaton 750,0 8,6 11,3 4,0 88,0 27,0 274,0 37,0 66,0 26,8 13,5 0,01 0,040 6,30 Himódi bányató 504,8 8,5 8,7 4,7 52,4 16,9 85,9 53,7 15,3 113,6 20,6 0,1 0,002 15,43 Dunaharaszti bányató 871,9 7,2 8,0 4,3 143,3 8,4 180,4 53,1 52,5 42,3 9,7 0,21 0,051 – Nyékládházi bányató 866,0 8,0 9,4 7,7 47,5 0,0 106,7 115,3 – – – – – – Hegyeshalmi bányató 611,4 8,0 0,1 59,0 16,9 107,4 58,1 18,3 64,6 19,4 2,4 0,000 2,38 Csiszlói-tó 835,9 8,1 8,0 3,0 64,9 16,9 128,8 76,4 40,6 101,8 27,8 0,2 0,006 2,24 Szanyi bányató 424,8 6,5 8,2 10,2 60,2 8,4 60,1 50,0 11,6 90,6 20,6 0,1 0,002 4,59 Visovac-tó 452,0 7,9 9,7 - - - - – – 9,0 6,0 0,1 0,005 6,78 Yalovai patak 240,0 7,6 8,9 - 10,0 - - – – – 40,0 – – –

F/3. táblázat: Az egyes populációk egyedein vizsgált morfometriai paraméterek. A mintavételi helyek neve után álló számok az adott mintából elemzett SEM képek számát jelzi (elsőszám a külső, a második szám a belső nézetből készült képek számát). d = valvaátmérő (µm), dCA = a centrális area átmérője (µm), OD = orbiculi depressi száma , ns = radiálisan szimmetrikus valvaszektorok száma, puncta = pontszerű bemélyedések száma , stria/10 = striák száma 10 µm-en, divstria = elágazó striák száma , CFP = valvafelszíni fultoportulák száma, CFP sat = valvafelszíni fultoportulák szatellitpórusainak száma, MFP/10=marginális fultoportulák száma 10 µm-en , MFP sat = marginális fultoportulák szatellitpórusainak száma, RP = rimoportulák száma, RP ang = rimoportulák szöge.

Minta d dCA OD ns puncta stria/10 divstria CFP CFP sat MFP/10 MFP sat RP RP ang

Balaton (59; 21) 4-14,1 2,5-7,3 0-5 3-5 0-11 14-21 0-8 1(-4) 2 (1-3) 2-6 2 1 28°-87°

Himód bányató (34; 5-13,7 1,7-8,0 0-6 0-5 1-15 16-24 2-10 1-3 2 4-7 2 1-2 25°- 90° 13) Dunaharaszti bányató 2013 (27; 3,8-10,6 1,7-4,3 0-5 (0)3-5 0-10 18-24 0-9 1 2(1) 3-6 2 1 22°-89° 15) Dunaharaszti bányató 2012 (28; 4,3-9,2 1,4-3,4 0 0 0-10 16-22 6-14 1 2(1) 3-4 2 1 21°-90°

V 25) Nyékládháza bányató 2012 (25; 5,3-16 2,5-7,3 0-3 0-3 0-19 15-22 0-19 1-3 2 3-6 2 1-3 29°-89° 21) Hegyeshalom 4,8-10,8 1,5-4,1 0 0-2 (5) 0-24 17-23 1-12 1 2 3-5 2 1 47°-90° bányató (21; 14)

Csiszlói-tó (28; 14) 4,7-8,6 1,8-4,4 0 0-2 (7) 0-17 17-22 0-9 1 2 3-6 2 1 43°-90°

Szany bányató 5,6-12,9 1,9-5,9 0 0-2 4-19 17-21 0-14 1 2 3-5 2 1 42°-81° (21; 18) 1,6- Visovac-tó (22; 23) 3-16,5 0-3 0-3 0-7 15-26 0-8 1(2) 2 2-7 2 1(3) 15°-77° 10,3

Yalova patak (5; 3) 5-14,6 3-9,3 3 3 1-11 19-21 1-8 1 2 4-6 2 1-2 39°-87°

İnli forrás 9,3–11,7 4,5-6,5 2–3 3 8-19 18–19 6-10 1(2) 2 5–7 2 1(-2) 41°-90° (4; 4)

F/4. táblázat: Az alakok egyedszám aránya az egyes populációkban.

Minta „ocellata” „trichonidea” „costei” „comensis” „pseudocomensis” átmeneti összes Balaton 59 0 0 0 0 0 59 Himód 16 0 5 0 0 13 34 bányató Dunaharaszti 26 0 1 0 0 0 27 bányató 2013 Dunaharaszti 1 0 21 3 0 3 28 bányató 2012 Nyékládháza 5 0 3 7 4 6 25 bányató Hegyeshalom 0 0 4 12 0 5 21 bányató Csiszlói-tó 0 0 7 21 0 0 28 Szany 0 0 3 8 1 9 21 bányató Visovac-tó 8 5 0 0 0 9 22 Yalova patak 5 0 0 0 0 0 5 İnli forrás 4 0 0 0 0 0 4

Függelék 12.2.2. A C. ocellata filogenetikai vizsgálatához kapcsolódó táblázatok

F/5. táblázat: A morfológiai illetve genetikai vizsgálatban használt minták/szekvenciák származása. Ha az adott mintához/szekvenciához elérhető publikáció, azt zárójelben jeleztük. Az összes szekvenciát a p-távolság számolásánál használtuk. Faj/Fajkomplex Tenyészet Mintavételi hely Minta Forrás (Referencia) Balaton csak szekvencia (18S Cyclotella ocellata BA0 Dr. Mirko Dreßler (Magyarország) rDNS és rbcL) Dr. Mirko Dreßler Kiesgrube-Krugsdorf csak szekvencia (18S Cyclotella ocellata KK4 (Kistenich és mtsai. (Németország) rDNS és rbcL) 2014) Dunaharaszti, bányató saját Cyclotella ocellata saját (Magyarország) (Duleba és mtsai. 2015) Himód, bányató saját Cyclotella ocellata saját (Magyarország) (Duleba és mtsai. 2015) Visovac-tó saját Cyclotella ocellata saját (Horvátország) (Duleba és mtsai. 2015) roncsolt minta + Cyclotella comensis- Genfi-tó TCC353 szekvencia (18S rDNS Dr. Frédéric Rimet csoport (C. costei) (Franciaország) és rbcL) Nehmitz-tó, Cyclotella comensis- csak szekvencia (18S NE 3 Brandenburg Dr. Mirko Dreßler csoport rDNS és rbcL) (Németország) Jonsvannet Cyclotella comensis- csak szekvencia (18S JO 2 (Trondheim, Dr. Mirko Dreßler csoport rDNS és rbcL) Norvégia) Dr. Mirko Dreßler Cyclotella comensis- csak szekvencia (18S BG 2 Baggersee (Ausztria) Kistenich és mtsai. csoport (C. comensis) rDNS és rbcL) (2014) Dr. Mirko Dreßler Cyclotella comensis- Fernsteinsee csak szekvencia (18S F1 Kistenich és mtsai. csoport (C. costei) (Ausztria) rDNS és rbcL) (2014) Cyclotella comensis- Gültzsee csak szekvencia (18S Dr. Mirko Dreßler GUL csoport (C. costei) (Németország) rDNS és rbcL) Kistenich et al. (2014) Cyclotella comensis- Dr. Mirko Dreßler Haussee csak szekvencia (18S csoport (C. HS1 (Kistenich és mtsai. (Németország) rDNS és rbcL) pseudocomensis) 2014) Lindavia (Handmannia) Demenzsee, OVP csak szekvencia (18S DM 1 Dr. Mirko Dreßler comta-csoport: L. (Németország) rDNS és rbcL) radiosa Lindavia (Handmannia) Stechlinsee roncsolatlan minta + S1 Dr. Mirko Dreßler comta-csoport: L. (Németország) DNS radiosa Lindavia (Handmannia) roncsolatlan minta + NE1 Nehmitzsee (Ausztria) Dr. Mirko Dreßler comta-csoport: L. DNS radiosa Ziegelinnen-tó, Cyclostephanos csak szekvencia (18S MD 11 Schwerin Dr. Mirko Dreßler delicatus rDNS és rbcL) (Németország) Schweriner Innensee Stephanodiscus csak szekvencia (18S SN 3 (Seewarte) Dr. Mirko Dreßler alpinus rDNS és rbcL) (Németország)

VII

F/5. táblázat folytatás Faj/Fajkomplex Tenyészet Mintavételi hely Minta Forrás (Referencia) Stephanodiscus Genfi-tó csak szekvencia (18S TCC355 Dr. Frédéric Rimet minutulus (Franciaország) rDNS és rbcL) Ziegelinnen-tó, Stephanodiscus csak szekvencia (18S MD 9 Schwerin Dr. Mirko Dreßler medius Håkansson rDNS és rbcL) (Németország) Stephanodiscus Lake Hohen-tó csak szekvencia (18S parvus Stoermer et HSP 7 Sprenzer Dr. Mirko Dreßler rDNS és rbcL) Håkansson -csoport (Németország) Stephanodiscus Balaton csak szekvencia (18S BA 2 Dr. Mirko Dreßler parvus-csoport (Magyarország) rDNS és rbcL) Vie, Fenouillet csak szekvencia (18S Cyclotella atomus TCC596 Dr. Frédéric Rimet (Franciaország) rDNS és rbcL) Cyclotella csak szekvencia (18S BG 3 Baggersee (Ausztria) Dr. Mirko Dreßler distinguenda-csoport rDNS és rbcL) Cyclotella Warnow, Rostock csak szekvencia (18S meneghiniana- W 8 Dr. Mirko Dreßler (Németország) rDNS és rbcL) csoport

F/6. táblázat: A kapott minták mintavételi helyének jellemzése. Fr = Franciaország, Ge = Németország, A = terület, zmax = maximális mélység. Tó/legközelebbi GPS/ ország Terület és Trofitás Mintavétel Minta Célfaj város/víztípus mélység időpontja

Genfi-tó/Thonon- N 46°27’ A: 581000 ha, újra 2009 július klonális Cyclotella les-Bains/ E 6°32’ Fr zmax: 308 m oligotróf tenyészet comensis természetes fázis csoport (C. costei) Stechlin-tó/ N 53°9′6″ A: 425 ha, oligotróf 2011 május klonális Lindavia Neuglobsow/ E 13°1′34″ zmax: ~68 m tenyészet (Handmannia) természetes Ge radiosa Nehmitz-tó/ N 53°08´12” A: 161 ha, mezotróf 2011 május klonális Lindavia Neuglobsow/ E12°59´05” zmax: ~18.6 m tenyészet (Handmannia) természetes Ge radiosa

VIII

Függelék 12.3. Ábrák

Függelék 12.3.1. A Skeletonema potamos vizsgálatához kapcsolódó ábrák

F/1. ábra: A Thalassiosirales fajokhoz tartozó 18S és 28S rDNS szekvenciák alapján Bayes-módszerrel készült filogenetikai fa. Ditylum brightwelli, Bellerochea malleus és Lithiodesmium undulatum a külcsoportok. A nemzetségnevek rövidítése: Bacterosira (B.), Bellerochea (Be.), Cyclostephanos (Cs.), Cyclotella (Cy.), Detonula (D.), Discostella (Di.), Ditylum (Dt.), Lauderia (La.), Lithodesmium (Li.), Minidiscus (M.), Porosira (P.), Shionodiscus (Sh.), Skeletonema (S.), Stephanodiscus (St.), Thalassiosira (T.). Szubsztitúciós modellek: 18S rDNS: T92+G+I, 28S rDNS: TN93+G+I. Generációk száma: 500000, a konvergencia diagnosztikai paraméter az utolsó generációban: 0,024743. Skála = 0,06 nukleotid/pozíció.

F/2. ábra: A Thalassiosirales fajokhoz tartozó rbcL és psbC szekvenciák alapján Bayes-módszerrel készült filogenetikai fa. Ditylum brightwelli, Bellerochea malleus és Lithiodesmium undulatum a külcsoportok. A nemzetségnevek rövidítése: Bacterosira (B.), Bellerochea (Be.), Cyclostephanos (Cs.), Cyclotella (Cy.), Detonula (D.), Discostella (Di.), Ditylum (Dt.), Lauderia (La.), Lithodesmium (Li.), Minidiscus (M.), Porosira (P.), Shionodiscus (Sh.), Skeletonema (S.), Stephanodiscus (St.), Thalassiosira (T.). Szubsztitúciós modell mindkét gén esetében: GTR+G+I. Generációk száma: 600000, a konvergencia diagnosztikai paraméter az utolsó generációban: 0,016415. Skála = 0,04 nukleotid/pozíció.

F/3. ábra: A Thalassiosirales fajokhoz tartozó 18S rDNS szekvenciák alapján Bayes-módszerrel készült filogenetikai fa. Ditylum brightwelli, Bellerochea malleus és Lithiodesmium undulatum a külcsoportok. A nemzetségnevek rövidítése: Bacterosira (B.), Bellerochea (Be.), Cyclostephanos (Cs.), Cyclotella (Cy.), Detonula (D.), Discostella (Di.), Ditylum (Dt.), Lauderia (La.), Lithodesmium (Li.), Minidiscus (M.), Porosira (P.), Shionodiscus (Sh.), Skeletonema (S.), Stephanodiscus (St.), Thalassiosira (T.). Szubsztitúciós modell: T92+G+I. Generációk száma: 1000000, a konvergencia diagnosztikai paraméter az utolsó generációban: 0,009560. Skála = 0,05 nukleotid/pozíció.

F/4. ábra: A Thalassiosirales fajokhoz tartozó 28S rDNS szekvenciák alapján Bayes-módszerrel készült filogenetikai fa. Ditylum brightwelli, Bellerochea malleus és Lithiodesmium undulatum a külcsoportok. A nemzetségnevek rövidítése: Bacterosira (B.), Bellerochea (Be.), Cyclostephanos (Cs.), Cyclotella (Cy.), Detonula (D.), Discostella (Di.), Ditylum (Dt.), Lauderia (La.), Lithodesmium (Li.), Minidiscus (M.), Porosira (P.), Shionodiscus (Sh.), Skeletonema (S.), Stephanodiscus (St.), Thalassiosira (T.). Szubsztitúciós modell: TN93+G+I. Generációk száma: 700000, a konvergencia diagnosztikai paraméter az utolsó generációban: 0,012938. Skála = 0,2 nukleotid/pozíció.

XII

F/5. ábra: A Thalassiosirales fajokhoz tartozó rbcL szekvenciák alapján Bayes-módszerrel készült filogenetikai fa. Ditylum brightwelli, Bellerochea malleus és Lithiodesmium undulatum a külcsoportok. A nemzetségnevek rövidítése: Bacterosira (B.), Bellerochea (Be.), Cyclostephanos (Cs.), Cyclotella (Cy.), Detonula (D.), Discostella (Di.), Ditylum (Dt.), Lauderia (La.), Lithodesmium (Li.), Minidiscus (M.), Porosira (P.), Shionodiscus (Sh.), Skeletonema (S.), Stephanodiscus (St.), Thalassiosira (T.). Szubsztitúciós modell: GTR+G+I. Generációk száma: 900000, a konvergencia diagnosztikai paraméter az utolsó generációban: 0,016179. Skála = 0,03 nukleotid/pozíció.

XIII

F/6. ábra: A Thalassiosirales fajokhoz tartozó psbC szekvenciák alapján Bayes-módszerrel készült filogenetikai fa. Ditylum brightwelli, Bellerochea malleus és Lithiodesmium undulatum a külcsoportok. A nemzetségnevek rövidítése: Bacterosira (B.), Bellerochea (Be.), Cyclostephanos (Cs.), Cyclotella (Cy.), Detonula (D.), Discostella (Di.), Ditylum (Dt.), Lauderia (La.), Lithodesmium (Li.), Minidiscus (M.), Porosira (P.), Shionodiscus (Sh.), Skeletonema (S.), Stephanodiscus (St.), Thalassiosira (T.). Szubsztitúciós modell: GTR+G+I. Generációk száma: 1000000, a konvergencia diagnosztikai paraméter az utolsó generációban: 0,011821. Skála = 0,06 nukleotid/pozíció.

XIV

Függelék 12.3.2. A Cyclotella ocellata/C. comensis komplex vizsgálatához kapcsolódó ábrák

1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6 7 2 3 4 5 6 7 0 10 20 30 40 50 0 2 4 6

0 1

minta 6

2 5

3 alak

4 1

d 8

4 6

4 ns

2 0

stria/10 2

1 6

4 MFP/10 2

0 3

dCA/d .

5 0

2 puncta/10 CA

5 1

OD/10 CA 5 0

4 div stria/10 0 2 4 6 8 10 4 6 8 10 14 14 16 18 20 22 24 26 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0 5 10 15 F/7. ábra: A C. cf. ocellata/cf. comesis minták valváin mért illetve számolt morfometriai változókra készített pontdiagram mátrix. d = valvaátmérő (µm), dCa/d = a centrális area átmérője (µm) osztva a valvaátmérővel (µm), OD/10 CA = orbiculi depressi száma 10 µm2 centrális area területen, ns = radiálisan szimmetrikus valvaszektorok száma, puncta = pontszerű bemélyedések száma 10 µm2 centrális area területen, stria/10 = striák száma 10 µm-en, divstria/10 = elágazó striák száma 10 µm-en, MFP/10 = marginális fultoportulák száma 10 µm-en. A szimbólumok az egyes alakokat jelölik: kör =„ocellata”, csillag =„trichonidea”, háromszög =„comensis”, rombusz =„pseudocomensis”, négyzet =„costei”, kereszt = átmeneti alak.

A Cyclostephanos invisitatus DQ514899 Cyclostephanos dubius KC284714 64 Stephanodiscus neoastraea DQ514906 Stephanodiscus minutulus Y95-6 DQ514916 84 Stephanodiscus hantzschii DQ514914 Cyclostephanos tholiformis DQ514898 Cyclotella bodanica DQ514901 98 68 Cyclotella ocellata LB8 DQ514904 Cyclotella cf. ocellata Dunaharaszti 2013 KJ755342 100 Cyclotella cf. comensis Nyékládháza 2012 II KJ755345 Cyclotella cf. comensis Szany 2013 KJ755347 Discostella stelligera DQ514903 97 Discostella pseudostelligera DQ514905 Cyclotella striata DQ514851 Cyclotella meneghiniana LS03-01 DQ514856 97 Cyclotella meneghiniana TI1 DQ514860

0.005

B Cyclotella cf. comensisSzany 2013 KJ755341 72 Cyclotella costei GUL Gültzsee 100 Cyclotella cf. comensis Kunsziget 2013 KJ755340 76 Cyclotella ocellata LB8 DQ514832 61 Cyclotella bodanica DQ514829 Stephanodiscus neoastraea DQ514834 57 Stephanodiscus hantzschii DQ514842 92 Stephanodiscus minutulus Y95–6 DQ514843 64 Discostella pseudostelligera DQ514833 Discostella stelligera DQ514831 36 Cyclostephanos tholiformis DQ514826 47 Cyclostephanos invisitatus DQ514827 88 Cyclostephanos dubius KC284710 Cyclotella striata DQ514771 98 Cyclotella meneghiniana LS03–01 DQ514777 100 Cyclotella meneghiniana TI1 DQ514781

0.01 F/8. ábra: A C. cf. ocellata/cf. comesis mintákból nyert 18 rDNS (A) és rbcL (B) szekvenciák alapján előállított maximum likelihood fa. Szubsztitúciós modell: 18S rDNS esetében Hasegawa-Kishino-Yano modell gamma eloszlással (HKY+G), rbcL esetében Tamura-Nei modell gamma eloszlással (TN93+G). Cyclotella meneghiniana LS03–01 és Tl1 valamint C. striata volt a külcsoport. Skála = 0,005 szubsztitúció/pozíció (A) illetve 0,01szubsztitúció/pozíció (B). A taxonok neve után az alkalmazott szekvencia GenBank elérési száma látható. Bootstrap értékeket tüntettük fel az elágazási pontoknál. Az ebben a vizsgálatban kapott szekvenciák félkövérrel vannak szedve. A 18S rDNS esetében a C. cf. ocellata Dunaharaszti 2013 az „A”, C. cf. comensis Szany a „B”, C. cf. comensis Nyékládháza II a „C”, C. ocellata LB8 a „D” szekvenciatípust képviseli, az rbcL esetében C. ocellata LB8 az „A”, C. cf. comensis Szany a „B”, C. costei Gültzsee a „C”, C. cf. comensis Kunsziget a „D” szekvenciatípust képviseli.

XVI

XVII

F/9. ábra: A C. cf. comensis Nyékládháza II. minta Sk-600F és Sk-1550R primerekkel (A) és a C. cf. ocellata Himód minta Sk-rbcL-400F primerrel (B) nyert elektroferogramjának kiválasztott részei. A nyilak a szekvenciatípusok közt eltérő pozíciókat mutatják.

Függelék 12.3.3. A C. ocellata filogenetikai vizsgálatához kapcsolódó ábrák

F/10. ábra: A Thalassiosirales rend Bayes-módszerrel, 18S rDNS szekvenciák alapján készült filogenetikai fája. Szubsztitúciós modell: Tamura 3-paraméteres modellje (Tamura és Nei 1993) gamma eloszlással. Generációk száma: 900000. A konvergencia diagnosztikai paraméter az utolsó generációban: 0,015144. Skála = 0,03 szubsztitúció/pozíció. A taxonnevek után a felhasznált szekvenciák GenBank elérési számait tüntettük fel. A posterior valószínűség értékek láthatóak az elágazási pontoknál. Külcsoportok: Bellerochea malleus CCMP143, Helicotheca tamesis CCAP 1076-1, Ditylum brightwellii CCAP 1022-2, Lithiodesmium undulatum CCMP1806.

XVIII

F/11. ábra: A Thalassiosirales rend maximum likelihood módszerrel, 18S rDNS szekvenciák alapján készült filogenetikai fája. Szubsztitúciós modell: Tamura 3-paraméteres modellje (Tamura és Nei 1993) gamma eloszlással. Skála = 0,02 szubsztitúció/pozíció. A taxonnevek után a felhasznált szekvenciák GenBank elérési számait tüntettük fel. Bootstrap értékek láthatóak az elágazási pontoknál. Külcsoportok: Bellerochea malleus CCMP143, Helicotheca tamesis CCAP 1076-1, Ditylum brightweelii CCAP 1022-2, Lithiodesmium undulatum CCMP1806. A feliratok a szekvenciák a p-távolság számításnál történt csoportba sorolását jelöli.

XIX

F/12. ábra: A Thalassiosirales rend Bayes-módszerrel, rbcL szekvenciák alapján készült filogenetikai fája. Szubsztitúciós modell: GTR modell (Rodríguez és mtsai. 1990) gamma eloszlással és invariáns helyekkel (GTR+G+I). Generációk száma: 900000. A konvergencia diagnosztikai paraméter az utolsó generációban: 0,008216. Skála = 0,04 szubsztitúció/pozíció. A taxonnevek után a felhasznált szekvenciák GenBank elérési számait tüntettük fel. A posterior valószínűség értékek láthatóak az elágazási pontoknál. Külcsoportok: Bellerochea malleus CCMP143, Helicotheca tamesis CCMP1760, Ditylum brightwellii CCMP1810, Lithiodesmium undulatum CCMP1806.

F/13. ábra: A Thalassiosirales rend maximum likelihood módszerrel, rbcL szekvenciák alapján készült filogenetikai fája. Szubsztitúciós modell: GTR modell (Rodríguez és mtsai. 1990) gamma eloszlással és invariáns helyekkel (GTR+G+I). Skála = 0,02 szubsztitúció/pozíció. A taxonnevek után a felhasznált szekvenciák GenBank elérési számait tüntettük fel. Bootstrap értékek láthatóak az elágazási pontoknál. Külcsoportok: Bellerochea malleus CCMP143, Helicotheca tamesis CCMP1760, Ditylum brightwellii CCMP1810, Lithiodesmium undulatum CCMP1806. A feliratok a szekvenciák a p-távolság számításnál történt csoportba sorolását jelöli.

XXI

ADATLAP

a doktori értekezés nyilvánosságra hozatalához*

1. A doktori értekezés adatai A szerző neve: Duleba Mónika MTMT-azonosító: 10043234 A doktori értekezés címe és alcíme: Kovaalga fajok filogenetikai és morfológiai diverzitása Dfrl-azonositóae: 10.1 5476/EL TE.20 17.132 A doktori iskola neve: Környezettudományi Doktori Iskola A doktori iskolán belüli doktori program neve: Környezetbiológia Doktori Program A témavezető neve és tudományos fokozata: Dr. Ács Éva, DSc A témavezető munkahelye: MTA Ökológiai Kutatóközpont, Duna-kutató Intézet II. Nyilatkozatok 1. A doktori értekezés szerzőjeként a) hozzájárulok. hogy a doktori fokozat megszerzését követően a doktori értekezésem és a tézisek nyilvánosságra kerüljenek az ELTE Digitális Intézményi Tudástárban. Felhatalmazom a Természettudományi kar Dékáni Hivatal Doktori, Habilitációs és Nemzetközi Ügyek Csoportjának ügyintézőjét, hogy az értekezést és a téziseket feltöltse az EL TE Digitális Intézményi Tudástárba, és ennek során kitöltse a feltöltéshez szükséges nyilatkozatokat. b) kérem, hogyamellékelt kérelemben részletezett szabadalmi, illetőleg oltalmi bejelentés közzétételéig a doktori értekezést ne bocsássák nyilvánosságra az Egyetemi Könyvtárban és az ELTE Digitális Intézményi Tudástárban; c) kérem, hogyanemzetbiztonsági okból minősített adatot tartalmazó doktori értekezést a minősítés (dátum)-ig tartó időtartama alatt ne bocsássák nyilvánosságra az Egyetemi Könyvtárban és az ELTE Digitál is Intézményi Tudástárban; d) kérem, hogya mű kiadására vonatkozó mellékelt kiadó szerződésre tekintettel a doktori értekezést a könyv megjelenéséig ne bocsássák nyilvánosságra az Egyetemi Könyvtárban, és az ELTE Digitális Intézményi Tudástárban csak a könyv bibliográfiai adatait tegyék közzé. Ha a könyv a fokozatszerzést követőn egy évig nem jelenik meg, hozzájárulok, hogy a doktori értekezésem és a tézisek nyilvánosságra kerüljenek az Egyetemi Könyvtárban és az ELTE Digitális Intézményi Tudástárban. 2. A doktori értekezés szerzőjeként kijelentem, hogy a) az ELTE Digitális Intézményi Tudástárba feltöltendő doktori értekezés és a tézisek saját eredeti, önálló szellemi munkám és legjobb tudomásom szerint nem sértem vele senki szerzői jogait; b) a doktori értekezés és a tézisek nyomtatott változatai és az elektronikus adathordozón benyújtott tartalmak (szöveg és ábrák) mindenben megegyeznek. 3. A doktori értekezés szerzőjeként hozzájárulok a doktori értekezés és a tézisek szövegének plágiumkereső adatbázisba helyezéséhez és plágiumellenőrző vizsgáJatok Jefuttatásához.

Kelt: Budapest, 2017. szeptember 21.

a doktori értekezés szerzőjének aláírása

*ELTE SZMSZ SZMR /2. sz. melléklet