Algaközösségek ökológiai, morfológiai és genetikai diverzitásának vizsgálata

Duleba Mónika Környezettudományi Doktori Iskola II. évf. Témavezető: Dr. Ács Éva Előzmények

• Pályázat - Pannon ökorégió 9 jellegzetes, szárazföldi, vízi, vizes élőhelyének kevéssé zavart és zavart változatának ökológiai, morfológiai és genetikai diverzitásának meghatározása – része: eukarióta alga-közösségek • Zavarás  bióta válasza  közösséget alkotó fajok adaptációs képességétől  genetikai diverzitástól függ • A közösség-szintű diverzitás felmérésének alapja a fajok egyértelmű megkülönböztetése Célkitűzések 1. Diverzitás vizsgálat közösségi szinten: • A különböző élőhely-komplexek mikrobiális diverzitásának összehasonlítása  Balaton bentikus mikrobiális közössége 2. Diverzitás vizsgálat faj/populáció szinten: • Egy szűk elterjedésű morfológiai variabilitást alig mutató faj kiválasztása – Melyik tengeri faj a legközelebbi rokona? – Datálható-e a faj édesvízbe való kerülése ill. legközelebbi rokontól való elválása? • Egy széles körben elterjedt és nagy morfológiai variabilitást mutató faj kiválasztása – Az egyes populációk közt kimutatható-e genetikai különbség? – A nagy morfológiai variabilitás mögött több kriptikus faj rejlik-e? – A vele együtt előforduló fajok filogenetikai helyzete?

Kiválasztott fajok: potamos • A Skeletonema genus egyetlen édesvízi faja; Skeletonema subsalsum (ritkán) • A Duna nyári fitoplanktonjának meghatározó tagja • Filogenetikai helyzete nem tisztázott Célkitűzések 1. Diverzitás vizsgálat közösségi szinten: • A különböző élőhely-komplexek mikrobiális diverzitásának összehasonlítása  Balaton bentikus mikrobiális közössége 2. Diverzitás vizsgálat faj/populáció szinten: • Egy szűk elterjedésű morfológiai variabilitást alig mutató faj kiválasztása – Melyik tengeri faj a legközelebbi rokona? – Datálható-e a faj édesvízbe való kerülése ill. legközelebbi rokontól való elválása? • Egy széles körben elterjedt és nagy morfológiai variabilitást mutató faj kiválasztása – Az egyes populációk közt kimutatható-e genetikai különbség? – A nagy morfológiai variabilitás mögött több kriptikus faj rejlik-e? – A vele együtt előforduló fajok filogenetikai helyzete?

Anyag és módszer

Skeletonema – specifikus rbcL - (szennyezés miatt) primerek tervezése 4 génre (filogenetikai információ)

Plasztiszban: psbC trnK ycf12 ycf9

~1100bp

Sejtmagban: 18S rDNS 28S rDNS ITS1 5,8S ITS2

~950bp ~1100bp Anyag és módszer • Mintavétel: Duna (Göd) 2011. június • Tenyésztés nehéz • Sejtek izolálása - mikromanipulátor • DNS-izolálás (kevés sejt, törékeny váz!) (semi)nested PCR szekvenálásillesztéstörzsfa

Stephanodiscus minutulus 74 Stephanodiscus hantzschii Eredmények 72 Cyclostephanos invisitatus 81 Cyclotella bodanica 31 18S rDNS törzsfa Cyclotella ocellata 22 Discostella pseudostelligera Detonula pumila 11 33 Thalassisiosira angustelineata (neighbour joining 77 Thalassiosira nodulolienata 64 módszer, maximum Minidiscus trioculatus composite likelihood 57 Bacterosira bathyomphala szubsztitúciós modell, 29 Shionodiscus ritscheri gamma eloszlás, 64 Thalassiosira oceanica bootsrap, 500 ism.) Skeletonema menzellii Skeletonema potamos

99 96 Skeletonema pseudocostatum CCAP1077 7 I 46 Skeletoenma pseudocostatum CCAP1077 7 B 97 Skeletonema subsalsum

52 Skeletonema costatum NB02 45 2A 98 69 66 Skeletonema costatum NB02 45 A Skeletonema japonicum 73 CCAP1077 3

63 Skeletonema costatum CCAP1077 3 61 Skeletonema costatum CCAP1077 4

93 Cyclotella meneghiniana LS03 01 Cyclotella striata 100 Thalassiosira pseudonana ETC1 100 Thalassiosira pseudonana CCMP1057 Porosira pseudodenticulata Lauderia annulata

0.01 95 Stephanodiscus minutulus Eredmények 82 Stephanodiscus hantzschii 79 Cyclostephanos invisitatus Cyclotella ocellata 28S rDNS törzsfa 49 99 Cyclotella bodanica 17 Discostella pseudostelligera 3 Shionodiscus ritscheri (neighbour joining 12 Bacterosira bathyomphala módszer, maximum 28 Detonula pumila composite likelihood 37 Minidiscus trioculatus szubsztitúciós modell, Thalassiosira nodulolineata gamma eloszlás, Thalassiosira angustelineata 47 bootsrap, 500 ism.) 60 Skeletonema subsalsum 90 Skeletoenema potamos 29 Skeletonema costatum 68 100 Skeletonema menzelii Skeletonema japonicum 99 100 Skeletonema pseudocostatum 95 Skeletonema grethae 4 99 93 Cyclotella stylorum Cyclotella meneghiniana LS03 01 99 Thalassiosira pseudonana ETC1 100 Thalassiosira pseudonana CCMP1057 Thalassiosira oceanica Porosira pseudodenticulata Lauderia annulata

0.05 100 Stephanodiscus minutulus Eredmények 58 Stephanodiscus hantzschii 87 Cyclostephanos invisitatus Cyclotella ocellata psbC törzsfa 16 95 Cyclotella bodanica Discostella pseudostelligera 16 37 Thalassiosira nodulolineata (neighbour joining Minidiscus trioculatus módszer, maximum 13 20 Bacterosira bathyomphala composite likelihood 27 Thalassiosira angustelineata 6 szubsztitúciós modell, Shionodiscus ritscheri gamma eloszlás, Detonula pumila Thalassiosira pseudonana ETC1 bootsrap, 500 ism.) 22 22 100 Thalassiosira pseudonana CCMP1057

99 Skeletonema subsalsum Skeletonema potamos

98 Skeletonema menzellii 40 Skeletonema costatum 95 Skeletonema japonicum 49 Skeletonema pseudocostatum 81 77 Skeletonema grethae CCAP1077 4 100 Skeletonema grethae CCAP1077 3 Thalassiosira oceanicia Lauderia annulata 99 Porosira pseudodenticulata Cyclotella stylorum 98 Cyclotella meneghiniana LS03 01

0.01 Eredmények

• Fa kalibrálása fosszilis adatok alapján: – Stephanodiscus megjelenése: min. 5 Mév (Sim et al., 2006) – Pinnularia megjelenése: min. 40 Mév (Souffreau et al., 2011) – Pinnularia borealis megjelenése: min. 13 Mév (Souffreau et al., 2011) • Skeletonema subsalsum - S. potamos ág leválása: min. 8,4 Mév (18S rDNS), min. 1,9 Mév (28S rDNS) • S. subsalsum és S. potamos elválása: min. 5,1 Mév (18S rDNS), min. 0,84 Mév (28S rDNS) mindhárom gén  konszenzus fa kell Sellaphora_blackfordensis

P_borealis_Tor12d 37,2647 8,0074 P_borealis_v_subislandica 5,0399 13,9329 P_borealis_Alka1 Pinnularia_viridis 11,3048 Pinnularia_nodosa 18S rDNS törzsfa Discostella_pseudostelligera Cyclotella_ocellata 11,3791 elválási időkkel Stephanodiscus_hantzschii 6,5344 0,6204 Stephanodiscus_minutulus_Y98_1 (max likelihood, 1,4519 Stephanodiscus_minutulus_Y95_6 GTR, gamma) 16,5036 4,6958 Stephanodiscus_neoastraea 0,7904 Cyclostephanos_invisitatus

56,1875 Thalassiosira_nodulolineata 8,8008 24,0092 Thalassiosira_angustelineata

Thalassiosira_oceanica

Skeletonema_menzellii

Skeletonema_costatum_NB02_45_2A 18,8743 0,8561 Skeletonema_japonicum 1,8111 Skeletonema_costatum_NB02_45_A 3,9658 14,3713 Skeletonema_costatum_CCAP1077_3 35,7507 2,5434 Skeletonema_grethae 5,9043 1,6039 Skeletonema_costatum_CCAP1077_4

Skeletonema_pseudocostatum_CCAP1077_7_I 8,4008 1,2749 Skeletonema_pseudocostatum_CCAP1077_7_B

40,7449 Skeletonema_potamos 5,1245 Skeletonema_subsalsum

Porosira_glacialis 10,6347 Lauderia_annulata

Porosira_pseudodenticulata

6.0 Sellaphora_blackfordensis

35,7951 Pinnularia_viridiformis

13,7421 Pinnularia_nodosa

11,7158 P_borealis_v_subislandica 7,5164 Pinnularia_borealis_Tor12d 5,1414 45,3828 Pinnularia_borealis_Alka1

Lauderia_undulatum

Lauderia_annulata 13,0913 Porosira_glacialis 22,3606 35,3473 Porosira_pseudodenticulata

Thalassiosira_oceanica

Thalassiosira_angulata 28,1482 Shionodiscus_ritscheri 14,5671 Thalassiosira_angustelineata 8,8268 12,8615 Thalassiosira_nodulolineata 20,9277 Skeletonema_pseudocostatum 1,7882 11,613 Skeletonema_grethae 0,8101 3,1141 Skeletonema_japonicum

Skeletonema_menzellii 4,5614 16,6414 Skeletonema_costatum_c 1,9682 Skeletonema_potamos 0,8367 28S rDNS törzsfa elválási Skeletonema_subsalsum Cyclostephanos_invisitatus

időkkel (max likelihood, 4,8782 Stephanodiscus_neoastraea

2,306 Stephanodiscus_hantzschi GTR, gamma) 0,2537 Stephanodiscus_minutulus_Y98 8,1733 0,7036 Stephanodiscus_minutulus_Y95

Cyclotella_bodanica 3,2729 Cyclotella_ocellata

5.0 Célkitűzések 1. Diverzitás vizsgálat közösségi szinten: • A különböző élőhely-komplexek mikrobiális diverzitásának összehasonlítása  Balaton bentikus mikrobiális közössége 2. Diverzitás vizsgálat faj/populáció szinten: • Egy szűk elterjedésű morfológiai variabilitást alig mutató faj kiválasztása – Melyik tengeri faj a legközelebbi rokona? – Datálható-e a faj édesvízbe való kerülése ill. legközelebbi rokontól való elválása? • Egy széles körben elterjedt és nagy morfológiai variabilitást mutató faj kiválasztása – Az egyes populációk közt kimutatható-e genetikai különbség? – A nagy morfológiai variabilitás mögött több kriptikus faj rejlik-e? – A vele együtt előforduló fajok filogenetikai helyzete?

Kiválasztott fajok: Cyclotella ocellata

Sokféle élőhelyen előfordul, gyakori faj

ÁLLÓVÍZI ELŐFORDULÁSOK FOLYÓVÍZI ELŐFORDULÁSOK Cyclotella ocellata Változatos morfológia (méret, valvafelszín) ocellum

fultoportula

Cyclotella trichonidea ? Cyclotella ocellata Gyakran fordul elő együtt a más Cyclotella fajokkal, melyek filogenetikai helyzete nem Cyclotella comensis (=Cyclotella pseudocomensis; ismert Scheffler&Morabito, 2003)

Cyclotella radiosa

Cyclotella balatonis legtöbb Cyclotella faj

A Cyclotella genus nem monofiletikus (Alverson et al., 2007)

Cyclotella ocellata (LB8) és C. bodanica Célkitűzések 1. Diverzitás vizsgálat közösségi szinten: • A különböző élőhely-komplexek mikrobiális diverzitásának összehasonlítása  Balaton bentikus mikrobiális közössége 2. Diverzitás vizsgálat faj/populáció szinten: • Egy szűk elterjedésű morfológiai variabilitást alig mutató faj kiválasztása – Melyik tengeri faj a legközelebbi rokona? – Datálható-e a faj édesvízbe való kerülése ill. legközelebbi rokontól való elválása? • Egy széles körben elterjedt és nagy morfológiai variabilitást mutató faj kiválasztása – Az egyes populációk közt kimutatható-e genetikai különbség? – A nagy morfológiai variabilitás mögött több kriptikus faj rejlik-e? – A vele együtt előforduló fajok filogenetikai helyzete?

Mintavételi helyek

Mályi Hegyeshalom

Nyékládháza

Dunaharaszti Alsóörs Bugyi

+ Horvátország (C. trichonidea?) Módszerválasztás Rokon fajok vizsgálata Kriptikus fajok kimutatása

Minta-közösség Minta-populáció (~) (morfológiailag egy faj) Klónozás, de ismeretlen szekvenciák (kevés 18S rDNS, ismeretlen faj legyen a mintában) 5,8SrDNS+ITS2, cox1 18S rDNS, 5,8SrDNS+ITS2, cox1 Populációgenetika Minta-egy sejt Minta-populáció („egy sejt PCR”) (morfológiailag egy faj) Egyeden  populáción Egyeden + populáción belüli belüli polimorfizmus polimorfizmus ITS1, ITS2, Sig1?, SIT1-3? Mikroszatellita (primer?) (AFLP fajspecifikusság?)

Haploid markerek – rbcLS intergenikus régió hosszpolimorfizmusa Módszerek Genetikai vizsgálatok: Sejtek izolálása mikromanipulátorral  Minta - 1 sejt Tenyésztés - szükséges mintamennyiség? Minta - populáció 1 sejt PCR? – minta szükséges sejtmennyiség? nem ismételhető; felszaporítani teljes •élő sejtek (1x PBS) genomot •Lugol - •Alkohol (96%) () •DNS-kinyerés (fagyasztás, főzés, centrifugálás)  •Fenol-kloroform ()

Morfológiai vizsgálatok: SEM + morfometria

Összefoglalás • Skeletonema potamos – filogenetikai helyzetének meghatározása – Pontosítás: hosszabb szakaszok; az elválás idejének meghatározásához több fosszilis adat; mind3 gén – konszenzus fa • Cyclotella ocellata (és vele együtt előforduló Cyclotella fajok) – módszerek kiválasztása és beállítása fajok elválasztásához ill. populációk közti különbségek feltárásához Publikáció, konferencia • Pohner, Zs., Ács, É., Borsodi, A., Kiss, K. T., Palatinszky, M., Reskóné N. M., Várbíró, G., Mészáros, É., Duleba, M., Bíró, P. (2011): Bevonatban élő mikroba-közösségek genetikai diverzitásának összehasonlítása a Balaton két eltérő trofitású medencéjében. Hidrológiai Közlöny 91/6: 68-71.

• Duleba, M., Ács, É., Borsodi,A., Kiss, K.T., Palatinszky, M., Pohner, Zs., Reskóné, N.M., Várbíró, G., Bíró, P. : Comparison of the biota and the whole benthic communities of Lake Balaton. European Journal of Phycology, 5th European Phycological Congress, Rhodes, Greece 2011, 46: 166.

• Pohner, Zs., Duleba, M., Kiss, K.T., Ács, É.: Preliminarily studies of inter- and intraspecific genetic polymorphism of two Thalassiosirales species. European Journal of Phycology, 5th European Phycological Congress, Rhodes, Greece 2011, 46: 185.

Köszönöm a figyelmet! -

2. elektroforézis + (gél, kapilláris)

3. detektálás: DNS-festék, jelölt primer

AFLP amplifikált fragmenthossz polimorfizmus Balaton bentikus mikrobiális közössége • korábbi mikroszkópos kovaalga-vizsgálat kiegészítése a teljes bakteriális és eukarióta közösség molekuláris biológiai vizsgálatával – 16S és 18S rDNS DGGE • Bakteriális közösség: északi és déli part elválása, Siófoki-medencében legmagasabb a diverzitás (alacsony trofitás), • Eukarióta közösség: aljzat szerinti elválás, kő legalacsonyabb diverzitású • Szekvenciák (kovaalga, fonalféreg, poloska) Multiple displacement amplification

Lizált sejtek Hexamer primerek módosított 3’ vég Polimeráz 3’5’ exonukleáz aktivitással 1. Primerek kötődése a denaturált DNS-szálakhoz 2. Lánchosszabbítás az újonnan szintetizált, kettős szálú DNS eléréséig, majd kezdi kiszorítani az új szálat elágazás 3. A primerek az újonnan szintetizált szálra kötődnek 4. Lánchosszabbítás az újonnan szintetizált szálon