Secretaria Nacional De Ciencia Y Tecnología -Senacyt

CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -CONCYT- SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -SENACYT- FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -FONACYT- UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACIA ESCUELA DE BIOLOGIA MUSEO DE HISTORIA NATURAL

INFORME FINAL

“EVALUACIÓN DE LA INCIDENCIA DE QUITRIDIOMICOSIS EN ANFIBIOS EN TRES REGIONES DE ENDEMISMO: LOS CASOS DE LOS BOSQUES NUBOSOS DE ZACAPA, BAJA VERAPAZ Y SAN MARCOS, GUATEMALA”

PROYECTO FODECYT No. 70-2009

Lic. Edgar Gustavo Ruano Fajardo Investigador Principal

GUATEMALA, AGOSTO DE 2012

EQUIPO DE INVESTIGACIÓN

Liza Iveth García Recinos Investigador Asociado

Lic. Carlos Vásquez Almazán Investigador Asociado y Coordinador Institucional

Lic. Ángel Jacobo Conde Pereira Investigador Asociado

Licda. Olga Alejandra Zamora Jerez Auxiliar de Laboratorio

AGRADECIMIENTOS:

La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por La Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología -SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología - CONCYT-.

OTROS AGRADECIMIENTOS

Se agradece a la Escuela de Biología y Decanatura de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, específicamente a la Licda. Rosalito Barrios y Dr. Oscar Cóbar Pinto por el apoyo institucional brindado. A la Licda. Mercedes Barrios –CDC/CECON– por sus aportes y comentarios al desarrollar el proyecto, a Dr. Roberto Flores -IIQB– de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia por el préstamo de vehículo. Un especial agradecimiento a los comunitarios de la Aldea La Trinidad, Tajumulco, San Marcos, a la municipalidad de San Rafael Pie de la Cuesta, San Marcos, por permitirnos el ingreso al “Refugio del quetzal”, a la Asociación de Desarrollo Sostenible de Chilascó -ADESOCHI-, al personal del CECON en especial al personal del Biotopo para la Conservación del Quetzal “Mario Dary Rivera”, al Ing. Hernández de la finca Cerro Verde y a la Familia Xicol (Gustavo, Julian y Roberto Antonio) de la Finca Sachut en Purulhá, Baja Verapaz. También se agradece a Vicente Franco de la Reserva Bella Vista en el área de Las Granadillas, Zacapa y a la Municipalidad de la Unión, Zacapa, por su cooperación. A la vez, se agradece a todas las personas que fueron guías y coordinadores en sus comunidades para desempeñar el trabajo de campo: Don Juan José Martínez García, Audelio Romero, Rogelio Romero y Vicente Franco. También a los compañeros Elida Leiva, Erick López y Jorge del Cid por su desempeño y apoyo en el campo. Al M.Sc. Samuel Mérida por sus valiosos aportes en el análisis de hemoparásitos de anfibios. Algunas fotos y esquemas fueron aportados por los doctores Allan Pessier -Amphibia disease laboratory, Institute for consevation research, San Diego Zoo global-, Erica Bree Rosenblum -Department of Biological Sciences, University of Idaho-, y M.Sc Tina Chen -Department of Biology- San Francisco State University; y especialmente Al Dr. Vance Vredenburg -Department of Biology- San Francisco State University, por el apoyo brindado por su laboratorio.

ÍNDICE RESUMEN ...... 4 PARTE I ...... 6 I.1 INTRODUCCIÓN ...... 6 I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ...... 8 I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS ...... 9 I.3.1 Objetivos ...... 9 I.3.1.1 General ...... 9 I.3.1.2 Específicos ...... 9 I.3.1.3 Hipótesis ...... 9 I.4 METODOLOGIA ...... 10 I.4.1 Las Variables ...... 10 I.4.2 Indicadores ...... 10 I.4.3 Estrategia Metodológica ...... 10 I.4.4 El Método ...... 10 I.4.5 La Técnica Estadística ...... 13 I.4.6 Materiales ...... 16 PARTE II ...... 17 MARCO TEÓRICO (CONCEPTUAL) ...... 17 II.1 Información General de anfibios...... 17 Diversidad de anfibios en Guatemala ...... 18 II.2 Quitridiomicosis ...... 18 I.2.1. Ciclo de vida de B. dendrobatidis: ...... 20 I.2.2 Origen de la enfermedad ...... 21 II.3 Declives y enfermedades en Poblaciones de Anfibios y su relación con quitridiomicosis ...... 22 II.4 Bosques nubosos ...... 27 II.5 Áreas de Estudio ...... 28 II.5.1 Bosques nubosos ...... 28 II.5.1.1 Biotopo Universitario “Mario Dary Rivera” para la Conservación del Quetzal ...... 28 II.5.1.2 Bosque municipal de la Unión, Zacapa ...... 29 II.5.1.3 Bosque nuboso del volcán Tajumulco...... 30 PARTE III ...... 32 III. RESULTADOS ...... 32 III.1 Discusión de Resultados ...... 44 PARTE IV ...... 48 IV.1 CONCLUSIONES ...... 48 IV.2 RECOMEDACIONES ...... 49 IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 50 IV.4 ANEXOS ...... 55 ANEXOS ...... 57 IV.5 Fotografías de las localidades muestreados y algunas especies portadoras de Bd ...... 57 SAN MARCOS ...... 57 BAJA VERAPAZ ...... 58 ZACAPA ...... 59 1

Listado de Cuadros

Cuadro 1. Localidades y alturas de los muestreos en los bosques nubosos muestreados. . 10 Cuadro 2. Prevalencia de Bd por familias en los bosques nubosos muestreados...... 32 Cuadro 3. Especies portadoras de B. dendrobatidis en bosques nubosos de Baja Verapaz (BV), Zacapa (ZAC) y San Marcos (SM)...... 32 Cuadro 4. Especies portadoras de Bd con su respectiva prevalencia por especímenes ..... 33 Cuadro 5. Número de casos de B. dendrobatidis en bosques nubosos de Baja Verapaz (BV), Zacapa (ZAC) y San Marcos (SM)...... 34 Cuadro 6. Prevalencia de Bd en los bosques nubosos por cada región muestreada...... 35 Cuadro 7. Nivel de infección promedio por modo reproductivo presente en los bosques nubosos muestreados...... 36 Cuadro 8. Correlación de Pearson y Kendall entre las variables de microhabitat y los ejes de ordenación del PCA...... 36 Cuadro 9. Parásitos en las muestras sanguíneas en anfibios en base a dos técnicas de tinción...... 41 Cuadro 10. Especies que presentaron parásitos en las muestras sanguíneas...... 42 Cuadro 11. Porcentaje de contribución al modelo de las variables climáticas ...... 56

Listado de Tablas

Tabla 1. Prevalencias de (Bd) por temporadas de muestreo y por región de muestreo...... 55 Tabla 2. Prevalencias de (Bd) por localidad de muestreo...... 55

Listado de Figuras y Gráficas

Figura 1. Localidades donde se realizaron los muestreos para B. dendrobatidis ...... 11 Figura 2. Ciclo de Vida de Batrachochytrium dendobatidis...... 20 Figura 3. Zoosporangio de Batrachochytrium dendobatidis en células de epidermis de una rana del Género Leptodactylus...... 21 Figura 4. Mapa mostrando las localidades Positivas a B. dendrobatidis en el mundo. .... 23 Figura 5. Mapa mostrando la dispersión de B. dendrobatidis en CA...... 24 Figura 6. Número de individuos infectados con Bd en relación a su Modo de desarrollo...... 35 Gráfica 1. Análisis de Componentes Principales -PCA- para B. dendrobatidis para diferentes variables tomadas en el campo...... 37 Gráfica 2. Curva de acumulación de especies de anfibios de la Región de Baja Verapaz. 38 Gráfica 3. Curva de acumulación de especies de anfibios de la Región de Zacapa...... 38 Gráfica 4. Curva de acumulación de especies de anfibios de la Región de San Marcos.... 39 Gráfica 5. Curva de acumulación de especies de anfibios comparando las 3 regiones...... 39

Mapa 1. Modelo de la distribución potencial de B. dendrobatidis en Guatemala...... 40 Fotografía 1.Trypanosoma sp. encontrado en una Plectrohyla matudai en el bosque municipal de La Unión, Zacapa...... 43 Fotografía 2.A) Plasmodium “A” sp. B) Plasmodim “B” encontrados en varios bosques muestreados...... 43

ANEXOS

Fotografía 1. A. Bosque en de La Trinidad, Tajumulco. B. Refugio del Quetzal, San Marcos ...... 57 Fotografía 2.Bolitolgossa flavimembris ...... 57 Fotografía 3.Plectrohyla matudai ...... 57 Fotografía 4.Plectrohyla hartwegi ...... 57 Fotografía 5.Plectrohyla avia...... 57 Fotografía 6.A. Bosque de Piedras Quebradas, San Rafael Chilascó. B. Finca Sachut, Purulhá, Baja Verapaz...... 58 Fotografía 7.Plectrohyla matudai en amplexo ...... 58 Fotografía 8.Bolitoglossa daryorum ...... 58 Fotografía 9.Craugastor bocourti ...... 58 Fotografía 10.A. Bolitoglosa helmrichi y B. Ptychohyla hypomykter ...... 58 Fotografía 11. A. Bosque Municipal de La Unión y B. Bosque en Montañas Las Granadilla...... 59 Fotografía 12.A. Bromeliohyla bromeliacea y B. Bolitoglossa rufescens ...... 59 Fotografía 13.A. Bolitoglossa dofleini y B. Plectrohyla matudai ...... 59 Fotografía 14.Craugastor laticeps...... 59 Fotografía 15.Análisis de Hemoparásitos de la sangre de anfibios ...... 60 Figura 1. Poster de divulgación de Hongo de Quitridiomicosis...... 61

RESUMEN

Las poblaciones de anfibios están declinando a nivel mundial y la Quitridiomicosis, causada por el hongo Batrachochytrium dendrobatidis, es uno de los factores asociados a este declive poblacional de anfibios. Esta enfermedad ya fue registrada para algunas especies en el país, por lo que puede predecirse que sus poblaciones y muchas otras especies asociadas estén en riesgo de decaer rápidamente, incluso llegando a la extinción local. Este fenómeno ha sido causa de alarma mundial, debido a que además de la pérdida de biodiversidad, los anfibios son considerados como un elemento base de la cadena trófica y como indicadores de la salud de un ecosistema. El efecto negativo en su resistencia inmunológica causado por la sensibilidad que presentan al cambio climático los hace candidatos a presentar nuevas enfermedades provenientes de otros organismos silvestres o ser reservorios de enfermedades re-emergentes que podrían afectar la salud humana. La detección temprana y el monitoreo de enfermedades emergentes de vida silvestre empieza a ser una necesidad en una región como Guatemala, que es considerada como uno de los lugares con mayor tendencia en el mundo para el surgimiento de nuevas enfermedades. La alta diversidad y endemismo de anfibios en áreas de altitud media de Guatemala, especialmente en bosques nubosos, pone en foco el estudio del estado de salud y conservación actual de los anfibios de estas regiones. Estos representan para las comunidades humanas asociadas al bosque una alternativa de base económica (ecoturismo, prospección farmacológica, etc.), cultural y de identidad nacional. También son de interés, para científicos y tomadores de decisiones, en el manejo ambiental y la prevención de enfermedades emergentes provenientes de la vida silvestre. Con la presente investigación se identificaron 14 especies de anfibios portadoras del hongo Batrachochytrium dendrobatidis entre el 43 al 50% de especies encontradas para cada región son portadoras del hongo y a la vez encontramos hemoparásitos como Plasmodium sp. y Trypansoma sp. e inclusiones virales en los eritrocitos de anfibios en tres regiones de Bosque nuboso de Guatemala: Biotopo para la Conservación del Quetzal “Mario Dary Rivera”, Purulhá, Baja Verapaz; Bosque Municipal de La Unión, Zacapa y el volcán de Tajumulco, San Marcos. Se cuantificó la proporción de individuos infectados por cada especie de anfibios encontrada, y se identificando que todas las áreas muestreadas dentro de bosques nubosos prístinos presentan una prevalencia alta de B. dendrobatidis. La detección del hongo se hizo a través de RT-PCR y la detección de otros patógenos por pruebas sanguíneas. Esta información y el estado de salud de los anfibios servirán de base a las entidades gubernamentales y no gubernamentales, relacionadas con el manejo de la diversidad biológica para retroalimentar sus estrategias e incluir secciones preventivas de dispersión de enfermedades silvestres.

SUMMARY

Amphibian populations are declining worldwide and Chytridiomycosis, one of the factors associated with this population decline of amphibians is caused by the fungus Batrachochytrium dendrobatidis. This disease has already been registered for some species in Guatemala, so their populations and many other associated species are at risk of decline rapidly, reaching even to local extinction. This phenomenon has caused worldwide alarm, because besides the loss of biodiversity, amphibians are considered a basic element of the food chain and as an indicator of ecosystem health. The negative effect on amphibian immune resistance caused by sensitivity to climate change makes them candidates to carry emerging new diseases from other wild organisms as reservoirs or re-emerging diseases that could affect human health. Early detection and monitoring of emerging diseases of wildlife is becoming a necessity in a region such as Guatemala, which is regarded as one of the most susceptible in the world for the emergence of new diseases. The high diversity and endemism of amphibians in mid-altitude areas of Guatemala, especially in cloud forests, brings into focus the study of health status and current amphibian conservation in these regions. They account for forest-associated human communities an alternative economic base (ecotourism, pharmaceutical prospecting, etc.), Cultural and national identity. Also is of interest for scientists and decision makers in environmental management and prevention of emerging diseases from wildlife. In the present study we identified 14 species of amphibians carry the fungus Batrachochytrium dendrobatidis. In total 43 to 50% of species found for each region are carriers of the fungus and also found blood parasites of amphibians such as Plasmodium sp., Trypasoma sp. and some unknown viral inclusions in three regions of Guatemala Cloud Forest: Conservation Biotope Quetzal "Mario Dary Rivera" Purulhá, Baja Verapaz, Forest City in La Union, Zacapa and Tajumulco volcano, San Marcos. We quantified the proportion of individuals infected by each species of amphibians found, and identifying that all areas sampled in pristine cloud forests have a high prevalence of B. dendrobatidis. The detection of the fungus was done by RT-PCR and detection of other pathogens by blood tests. This information and the health status of amphibians will inform government agencies and organizations concerned with biodiversity management strategies for feedback and include preventive sections of spreading of this disease in wildlife populations.

PARTE I

I.1 INTRODUCCIÓN

Los anfibios son considerados sensibles a los cambios ambientales especialmente por su fisiología y ciclo de vida complejo (bifásico: acuático y terrestre). También existen varias evidencias de su importancia en la cadena trófica principalmente por sus hábitos alimenticios, que indican que los adultos contribuyen a mantener las poblaciones de insectos en equilibrio y como renacuajos regulan las poblaciones de algas en arroyos montañosos. A la vez los renacuajos mantienen las corrientes de agua limpias, ya que se alimentan de las algas. Las ranas adultas se alimentan de grandes cantidades de insectos, incluyendo vectores de enfermedades que pueden transmitir enfermedades fatales a los humanos (mosquitos de la malaria por ejemplo). Los anfibios también sirven como una importante fuente de alimento para una diversidad de depredadores, incluyendo peces, serpientes, aves y hasta monos. Por lo que la desaparición de las poblaciones de estos animales interrumpe las cadenas alimenticias, y resulta en impactos negativos en los ecosistemas (Kriger 2009).

Se ha investigado el efecto de la ausencia de anfibios adultos y sus larvas en ecosistemas de agua dulce tropical, y se ha determinado que al estar ausentes hay un incremento de algas y un cambio del nivel de nitrógeno del sistema, acarreando efectos a las cadenas tróficas relacionadas (Connelly et al. 2008).

En las últimas décadas las poblaciones de anfibios han declinado a nivel mundial, atribuyéndose esto a diversas causas como contaminación y destrucción del hábitat (avance de frontera agrícola y urbana), cambio climático y el surgimiento de enfermedades infecciosas. Este grupo de animales es considerado como el más amenazado en la Tierra, casi un tercio de las 6,485 especies de anfibios en el mundo se encuentran en peligro y por lo menos 150 especies han desaparecido en las últimas décadas. Una de las principales razones que ha contribuido a está extinción masiva de especies y poblaciones, es la infección cutánea provocada por el hongo quítrido Batrachochytrium dendrobatidis -Bd-, afectando incluso áreas de bosques prístinos. Este hongo fue identificado en 1998 y ha sido detectada en por lo menos 385 especies de anfibios en 36 países.

Guatemala, como parte de la región Mesoamericana (y a su vez del Neotrópico) posee una alta diversidad de anfibios, constituida por 143 especies (3 órdenes, 10 familias y 36 géneros), de éstas, 46 son endémicas nacionales (25 especies de rana, 20 de salamandras y un sapo). Las áreas que presentan mayor endemismo son las zonas de montaña, principalmente los bosques nubosos (Acevedo, 2006; Vásquez- Almazán et al., 2009). Y estas áreas son las que están más en riesgos de perdida de biodiversidad por Bd.

De hecho el hongo Bd ya había sido reportado en algunas especies de anfibios en 4 localidades de Guatemala, en los departamentos de Zacapa, Izabal, Baja Verapaz y San 6

Marcos. Se desconocía en la actualidad si presentan otras enfermedades o si el hongo ya ha afectado a otras especies en áreas cercanas a los registros. De igual manera la sensibilidad que presentan los anfibios, los hace vulnerables a presentar enfermedades nuevas provenientes de otros organismos silvestres o ser reservorios de enfermedades re- emergentes que podrían afectar la salud humana por lo que es de importancia hacer estudios de hemoparásitos ya que no se tiene ningún registró de este tema para Guatemala.

En este estudio se obtuvo información sobre las especies: más vulnerables y las portadoras del patógeno Bd, y la presencia de algunos patógenos de la sangre de los anfibios. A la vez se contrasto las prevalencias relativas de esta enfermedad en tres bosques nubosos distribuidos a lo largo de Guatemala en San Marcos, Baja Verapaz y Zacapa y la vez se registró cuál es la especie, familia, modo reproductivo y/o grupo funcional más afectado.

También se propone un modelo potencial de distribución de las áreas que presentaron más probabilidad de presencia Bd para todo el país. Estas áreas fueron las áreas de elevación más alta y media de la cadena volcánica, cerro Miramundo en Jalapa, el área de Sierra de las Minas, Sierra de Los Cuchumatanes, y la parte media-alta de Quiché. Los lugares con menos probabilidad de ocurrencia fueron las tierras bajas de Guatemala incluyendo los bosques espinosos, tropicales y subtropicales de las vertientes del pacífico y Atlántico de Guatemala. Asimismo se caracterizaron los diferentes hábitats y microhábitat ya que no existe información específica para muchas especies de anfibios en algunas áreas.

Toda esta información servirá de base a las entidades gubernamentales y no gubernamentales, relacionadas con el manejo de la diversidad biológica, para la generación de estrategias de conservación y prevención de enfermedades emergentes de vida silvestre. Además se fortaleció el conocimiento de la fauna en el país y su representatividad en las colecciones científicas nacionales. Por último se distribuyo poster de divulgación y se presenta un manual preventivo e informativo sobre la Quitridiomicosis en anfibios para Guatemala.

I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La extinción y declive poblacional de anfibios alrededor del mundo ha sido documentado durante varios años, especialmente en especies que habitan a altitudes medias y altas de montañas (Young et al., 2001; Rovito et al., 2009). Cientos de especies han sido afectadas, muchas de éstas en bosques prístinos, sin razón aparente para que las poblaciones declinaran (Stuart et al., 2004; Berger et al., 1998). Varios de estos declives han sido relacionados directa o indirectamente con el cambio climático, ya sea por patógenos favorecidos por estos cambios, produciendo brotes de epidemias sobre más hospederos y en especies hospederas nuevas o por incrementar la susceptibilidad de los hospederos a infecciones debido a la debilidad de la condición física de los anfibios, formando un ciclo vicioso (Beldomenico et al., 2008).

En varios lugares se ha encontrado que la infección cutánea causada por el hongo B. dendrobatidis es una de las principales razones de los declives (Lips, 1998 y 1999, Lips et al., 2006). Este hongo ya fue reportado en 7 especies y 4 localidades de Guatemala poniendo en evidencia que este patógeno y fenómenos relacionados con el cambio climático están afectando la vida silvestre del país. En la actualidad se desconoce si hay incidencia del hongo en los lugares con estos primeros reportes, ni cuáles especies son las afectadas, tampoco se tiene información del estado poblacional de anfibios o si el hongo se ha dispersado a otros lugares aledaños, lo cual es preocupante debido a que el efecto de la enfermedad suele ser devastador en poco tiempo, por lo que se pueden estar extinguiendo poblaciones locales de anfibios. De igual manera varios autores han planteado que se debe poner atención a los lugares con registros de enfermedades emergentes de vida silvestre, porque sugieren un vínculo con enfermedades emergentes en humanos (Realman et al., 2008; Jones et al., 2008) tema que es de interés de estudio en otros países al día de hoy.

Con el presente estudio se investigó la prevalencia e incidencia de -Bd- y otros patógenos en anfibios en regiones con registros previos del hongo y bosques nubosos aledaños.

I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS

I.3.1 Objetivos

I.3.1.1 General

Evaluar la incidencia de Quitridiomicosis en anfibios en tres regiones de endemismo: los bosques Nubosos de Zacapa, Baja Verapaz y San Marcos, Guatemala.

I.3.1.2 Específicos

1. Identificar y evaluar las especies de anfibios infectados con el hongo Batrachochytrium dendrobatidis y enfermedades detectables por pruebas sanguíneas.

2. Cuantificar la proporción de individuos infectados por Batrachochytrium dendrobatidis en las diferentes especies de anfibios encontrados.

3. Determinar y caracterizar los factores que inciden en la infección y diseminación del hongo Batrachochytrium dendrobatidis.

4. Verificar la incidencia y nivel de infección causado por el hongo en áreas donde ha sido reportado anteriormente y su dispersión hacia tres bosque nuboso aledaños de en el Biotopo para la Conservación del Quetzal, “Mario Dary Rivera”, Purulhá, Baja Verapaz; Bosque Municipal de La Unión, Zacapa y el volcán de Tajumulco, San Marcos.

5. Proponer recomendaciones para la prevención del hongo Batrachochytrium dendrobatidis.

6. Divulgar a las autoridades, actores sociales e instituciones en el campo de su competencia la información obtenida de la investigación.

I.3.1.3 Hipótesis

Las localidades con registros previos de una o dos especies de anfibios infectados de Batrachochytrium dendrobatidis, presentarán un mayor número de anfibios asociados infectados con el patógeno.

I.4 METODOLOGIA

I.4.1 Las Variables

I.4.1.1. Variables dependientes: presencia de Bd, nivel de infección (número de zoosporas equivalentes), presencia de hemoparásitos. I.4.1.2. Variables independientes: especie, localidad, temperatura ambiental, temperatura del individuo, temperatura del microhábitat, humedad relativa.

I.4.2 Indicadores

I.4.3 Estrategia Metodológica I.4.3.1 Población y Muestra - Población: todos los anfibios presentes en los 3 bosques nubosos. - Muestra: individuos capturados (unidad muestreal: una noche de colecta con esfuerzo de 12 hora/persona).

I.4.4 El Método

Selección de localidades: se realizaron muestreos en tres regiones con registros previos de infección de Batrachochytrium dendrobatidis: San Marcos, Baja Verapaz y Zacapa (Fig. 1). Para documentar si el hongo se ha dispersado a otras áreas aledañas se muestreo otros sitios en un radio de 30 - 50 Km alrededor de las localidades con reportes, esta distancia es considerada lo que puede dispersarse el patógeno en pocos años (Lips, 1998). Las localidades aledañas de interés se definen en el siguiente mapa (Fig. 1 y Cuadro 1). A la vez, en todas las áreas donde se hicieron las búsquedas de anfibios eran consideradas bosques nubosos y sus alturas eran un poco diferentes para las diferentes regiones pero estuvieron dentro de un rango de 1222-2000 msnm.

Cuadro 1. Localidades y alturas de los muestreos en los bosques nubosos muestreados. Fechas Fechas Altura Localidad Coord X Coord Y (2010) (2011) (Msnm)

Biotopo El Quetzal, Baja Verapaz Julio Enero 15.21302 90.21664 1645-1828 Finca Sachut, Baja Verapaz Julio Enero 15.24221 90.1917 1668 Cerro Verde, Baja Verapaz Julio Enero 15.17547 90.1939 1685 - 1700 Chílasco, Baja Verapaz Julio Enero 15.06315 90.06183 1997 - 2204

Bosque municipal La Unión, Zacapa Septiembre Febrero 14.95835 89.28226 1216-1452 Bosque Las Granadillas, Zacapa Septiembre Febrero 14.92817 89.42013 1222 Bosque Este La Unión, Zacapa Septiembre Febrero 14.90651 89.3247 1345

Reservorio del Quetzal, San Marcos Noviembre Marzo 14.93836 -91.8737 1786-1827 Río Tzoc, La Trinidad, San Marcos Noviembre Abril 14.99493 -91.9178 1759

Río Negro, La Trinidad, San Marcos Noviembre Abril 14.99993 -91.923 1723 Fuente: FODECYT 70-2009

Figura 1. Localidades donde se realizaron los muestreos para B. dendrobatidis

Fuente: FODECYT 70-2009

Muestreos: para obtener replicabilidad y obtener índices comparativos de infección de B. dendrobatidis espacial y temporalmente, se utilizó el método de Relevamientos por Encuentros Visuales - REV ó con sus siglas en ingles -VES - en transectos de muestreo. Con este método se realizaron recorridos nocturnos en transectos con esfuerzo de 3 horas con cuatro investigadores (12 hora/hombre). Se realizaron 3 noches de muestreo por sitio (3 réplicas) en tres localidades para cada región, realizando 2 viajes a cada región, uno en época seca y otro en época lluviosa, para tener una representación objetiva de la riqueza del área de interés e inferir sobre su estado de salud actual.

Todos los muestreos se realizaron en bosques nubosos pristinos (el rango altitudinal muestreado fue de 1212 a 2204 msnm, ya que las distribución altitudinal de este tipo de bosque varía en cada región, pero mantiene características comunes como tipo de vegetación y variables ambientales) y alejados aproximadamente 20 metros de otros elementos del paisaje (Potreros, Guamiles o urbanización) para evitar especies producto del efecto de borde y sobrestimar la riqueza de los bosques (Urbina-Cardona y Reynoso, 2007). Se tomaron datos ambientales de temperatura (grados centígrados) y humedad relativa (% HR).

Para sistematizar el muestreo, se realizó dentro del rango de 19:00 a 23:00 horas (horas idóneas para el muestreo de anfibios) y también se tomó en cuenta la fase lunar, para colectar todas las muestras en los últimos días de cuarto menguante, durante la luna nueva, y los primeros días del cuarto creciente (Acevedo, 2006).

Colecta de anfibios: los individuos fueron capturados manualmente utilizando guantes o bolsas de plástico, los cuales fueron cambiados entre tomas de muestra (individuos) para evitar contagio de otros individuos. Al utilizar la red para la captura de anfibios, las zoosporas de B. dendrobatidis podrían adherirse a la red y éstas posiblemente se transferirían a otros individuos, por lo tanto se utilizaron diversas redes, o se desinfectaron (Briggs y Vredenburg, 2007). Se tomaron las siguientes anotaciones en una libreta de campo: Identificación del sitio, Nombre del Sitio, Observaciones, Hora, Especie, Microhábitat (río, charco estanque, rocas, hojarasca, etc), Estadio de vida (larva, sub- adulto, adulto), Sexo cuando era posible, Notas de la condición del animal, Temperatura ambiental, del individuo y del microhábitat (grados centígrados), Humedad relativa (%). Los datos de temperatura y humedad fueron tomados con un higrotermómetro infrarrojo.

Toma de frotis epidérmico: para tomar las muestras en anfibios adultos y metamórficos se realizó un frotis sobre la piel (vientre, patas e ingle) con un hisopo estéril (“SWAB”). (Vredenburg y Briggs, 2007; Amphibiaweb, 2008). El hisopo se deslizó un total de 35 veces en las siguientes partes: para anuros, 5 veces en cada pata (delanteras y traseras), 5 veces en cada ingle y 5 veces en la parte inferior del vientre; para salamandras, 5 veces en cada pata (delanteras y traseras), 10 veces en la parte gular y 5 veces en la parte inferior del vientre. Se agregó una gota de alcohol a 95º al hisopo y se dejó secar al aire, por aproximadamente 5 minutos. Se quebró y colocó el hisopo en un tubo de 1.5 ml para microcentrífugar (viales Fisher Scientific).

Toma de muestra de sangre: se tomó con una jeringa para insulina, tomando 1 ml de sangre directamente del corazón (debido que para analizar hemoparásitos se necesita sangre periférica), inmediatamente después de ser anestesiado el individuo, y se colocó la sangre en un portaobjetos, frotándola a lo largo del portaobjeto. Se agregó una o dos gotas de metanol absoluto sobre la muestra para fijarla. Se colocó el número de colecta en el vial y el portaobjeto.

Fijación y preservación de especímenes: los especímenes de dudosa identificación fueron colectados y dormidos hasta la eutanasia con MS-222 (anestesia), en algunos casos se tomaron muestras de tejido en viales de 1.5 ml con etanol al 95% para análisis moleculares. Por último se prepararon etiquetas identificadas con número de registro y colector para cada espécimen colectado, los cuales se colocaron en una bandeja de plástico con formol al 10% por 24 horas y se introdujeron en un recipiente con formol al 10% para su posterior identificación en el laboratorio (Heyer et al., 1994).

Análisis de muestras: la identificación del hongo se realizó mediante la técnica especifica de identificación molecular de Batrachochytrium dendrobatidis por medio de PCR de tiempo real (“Taqman assay”) estandarizada por Boyle et al. (2004). Los niveles de infección son expresados en zoosporas equivalentes por individuo.

En el Análisis de muestras de sangre se hicieron tinciones con Giemsa y Wright,y se analizaron las muestras con microscopio con aumentos de 40X y 10X, respectivamente. Utilizamos la tinción de GIEMSA como coloración estándar para las muestras; de las muestras con más de una lámina aplicamos coloración de WRIGHT.

I.4.5 La Técnica Estadística

Se realizó un análisis descriptivo con la información obtenida de las diferentes enfermedades encontradas y se localizaron los puntos de incidencias en un mapa georeferenciado para visualizar patrones de distribución. En base a estos resultados se cuantificó la proporción de individuos infectados por sitio y región en sus diferentes etapas de desarrollo (Prevalencia). Como primer paso, por medio del programa GRAPHPAD INSTAT 3, se realizó la prueba de normalidad de Kolmogorov-Smirnov - KS - a todas las variables asociadas al estudio y también a los datos de prevalencia. En base a que no cumplieron el requisito de normalidad se utilizó la prueba no paramétrica de Kruskal- Wallis y se evaluó si hay diferencias entre la prevalencia entre las regiones y diferentes modos reproductivos de todas las especies portadoras. Para la relaciones entre los sitios de muestreo se realizó una prueba de Dunn.

Para encontrar variables determinantes de la presencia del hongo en anfibios se empezó por encontrar el largo del gradiente de respuesta de las diferentes variables que pueden influenciar la presencia del hongo utilizando la técnica de análisis multivariado - DCA - (“Detrent Component Análisis”). Esta técnica determina el largo del gradiente y la respuesta unimodal de las especies hacia ella. Un valor mayor a 3.0 indica un gradiente amplío con respuesta unimodal de las variables en los ejes, y valores debajo de 2.0 indica que la respuesta es lineal y el valor entre estos dos números es indefinida y se puede utilizar 13

otros métodos (McGarigal, 2000), nuestro muestreo obtuvo un gradiente mayor en sus ejes. Se tomaron en cuenta los primeros tres ejes de ordenación basados en la agrupación de sitios, luego se interpretaron los resultados basados en los ejes. Se utilizó el programa PcOrd 5.0.

Posterior al conocer el largo del gradiente se identificó las diferentes variables que pueden influenciar la presencia del hongo, utilizando el método de Análisis de Componentes Principales - PCA - (McGarigal et al., 2000). Como primer paso, por medio del programa GRAPHPAD INSTAT 3, se realizó la prueba de normalidad de Kolmogorov-Smirnov - KS - a todas las variables asociadas a los datos de colecta y se hizo una correlación no paramétrica de Spearman para encontrar correlaciones entre ellas. Se evaluó la significancia de las correlaciones con un ajuste con el Método de Bonferroni [´= ([/k) donde K es el número de correlaciones realizadas (Sokal y Rohlf, 1995). El nivel de significancia fue a nivel de P´ <= 0.001. Debido a que el PCA es susceptible a los datos no normales y a la alta correlación de variables continuas (James y McCulloch, 1990), se descartaron algunas variables tomadas en cuenta en el estudio, sin embargo, serán tomadas en cuenta en otros análisis. Para obtener los Componentes Principales - CP - se utilizaron correlaciones para relacionar las variables y permutaciones de Monte Carlo para decidir cuál de los ejes a analizar.

También se tomó en cuenta la varianza de explicación de cada eje (>15%) y la relación entre el Eigenvalor del eje y el Eigenvalor de “Broken-Stick”. Para escoger entre las variables que están asociadas a cada uno de los ejes se realizó una correlación de Pearson, para tomar en cuenta su efecto se consideró que debería tener un valor de R > 0.5. Por último, se analizaron los componentes principales que explicaban la mayor varianza y se relacionaron descriptivamente la presencia del hongo. Para estimar cuanta riqueza pudo representar este estudio se utilizaron curvas de acumulación de especies y estimadores de riqueza no paramétricos (Chao, 2005; Coldwell et al. 2005; Coldwell y Coddington, 1994) y se graficaron los resultados para verificar si el esfuerzo logrado es representativo para las áreas de estudio (Coldwell y Coddington, 1994). Por último se comparó entre los valores máximos de riqueza observada y estimada para representar el nivel de inventario (Escalante, 2003; Coldwell, 2005; Urbina-Cardona y Reynoso, 2005). Se utilizó el programa EstimateS 8.0 para todas las estimaciones (Coldwell, 2005).

Para estimar cuanta riqueza de anfibios se pudo representar en este estudio se utilizaron curvas de acumulación de especies y estimadores de riqueza, desarrollamos una curva de acumulación de especies en base al esfuerzo para cada región de estudio. Para estas estimaciones utilizamos un estimador paramétrico, el modelo de Clench (Jiménez-Valverde y Hortal, 2003; Colwell y Coddington, 1994; Chao, 2005; Colwell et al., 2004). El modelo se basó en datos del número de eventos de avistamiento de cada especie durante el muestreo. Realizamos un suavizado de los datos observados por medio del orden de entrada de las unidades de esfuerzo de muestreo aleatorizado y el número medio de especies. De esta manera, obtenemos la ‘curva ideal’ o el promedio estadístico de adición de especies con el aumento del esfuerzo (Jiménez-Valverde y Hortal, 2003), esto se realizó con un remuestreo Bootstrap de los datos observados (1000 “randomizations”) por medio del programa EstimateS 7.2. Para estimar si nuestro esfuerzo fue suficiente para obtener un inventario representativo de especies de anfibios, realizamos un cálculo del valor asintótico 14

de nuestra curva predicha con la ecuación de Clench (Jiménez-Valverde y Hortal, 2003) con este método se tiene de cierta forma resultados más objetivos sobre la calidad de inventario que se realizó. Las estimaciones se hicieron por medio de la ecuación de Clench combinada con la función “Loss” en base al algoritmo Simplex y Quasi- Newton, todo por medio del programa STATISTICA versión 9.1 trial.

Para evaluar el ajuste del modelo con los datos observados se comparó los coeficientes de determinación (R2) (que es una medida descriptiva de la proporción de varianza explicada por la función utilizada) sus valores van de 0 a 1, más próximos a este último cuanto mejor se ajuste la función a los datos, con este criterio se escogía la mejor función. Por último se calculó la pendiente que nos indica que si hemos logrado un inventario bastante completo y altamente fiable (<0.1). Y para encontrar la proporción de anfibios registrados, que también nos da una idea de la calidad del inventario se hizo la relación entre la asíntota y el ultimó nivel de esfuerzo de la curva (Jiménez-Valverde y Hortal, 2003). También se compararon las curvas para ver si existían diferencias en la riqueza entre los 3 sitios. Esto se hizo mediante a los datos observados y sus intervalos de confianza (I.C. 95%) con sus esfuerzo estandarizado y en base a e este esfuerzo estandarizado si hicieron las comparaciones de prevalencia de los tres sitios. Ya que todos los estudios casi obtuvieron una asíntota su base comparativa fue el número de individuos y esto hace una comparación más objetiva en lo que riqueza concierne (Gotelli & Colwell, 2001).

Para realizar la modelación de la distribución potencial (Probalidad de presencia en el pais) de B. dendrobatidis en Guatemala se utilizó el programa de uso libre Maxent 3.3.3 (Phillips et al. 2006). Se utilizaron las capas de información de variables climáticas de la base de datos Worldclim, la resolución utilizada fue 2.5 min= ~5 kms. Se tomaron en cuenta las variables climáticas que influyen más en la presencia o ausencia del hongo. Las variables fueron las siguientes: Temperatura media anual, rango de temperatura diurna, cambio de temperatura a lo largo de la temporada, temperatura máxima del mes más tibio, temperatura mínima de mes más frío, precipitación anual, precipitación de mes más húmedo, precipitación de mes más seco y cambio de la precipitación a lo largo de la temporada. El programa se corrió con los siguientes parámetros: 1000 iteraciones de bootstrap como máximo, 75% de los datos fueron utilizados como puntos de entrenamiento (training points) y el 25 % como puntos de validación (test points). Se corrieron 100 réplicas, al finalizar el proceso se tomaron en cuenta los 10 mejores modelos, dependiendo del valor del área bajo la curva (AUC). Los mapas se cargaron en Diva Gis 7.3 y se obtuvo la media del valor de probabilidad de presencia de cada uno de los píxeles. Este valor iba de 0 a 1.

I.4.6 Materiales

Material de campo Material de Laboratorio • Linterna grande con 3 baterías “D” • Guías de identificación • Bombillas de 4.5 v. halógenas • Etanol al 95% y al 70% • Linterna de bolsillo baterías“AAA” • Bandejas de plástico herméticas • Linterna de Cabeza • Anestésico (MS-222) o cloroetono • Baterías extras “D” y “AAA” • Formol al 10% (Formalina) • Hojas y libreta de campo impermeable • Un paquete de papel absorbente • Bolsas plasticas de 10 lbs. • Guantes de látex desechables • Capa o impermeable • Isopos estériles. • Rapidógrafos y marcadores indelebles • Viales Fisher Scientific 1.5 ml. • GPS Garmin etrex • Gradillas • Higrotermómetro infrarojo • Pinzas y aguja de disección • Rastrillos • Viales NALGENE de 1.8 ml. • Higrotermómetro infrarojo • Kit de disección • Pistola infraroja de temperatura • Colorantes de Giemsa y Wright • Botas de hule • Metanol absoluto • Cámara digital • Jeringas • Vehículo 4x4 • Portaobjetos y vidreo de reloj • Reloj • Pisetas • Estereoscopio

PARTE II

MARCO TEÓRICO (CONCEPTUAL)

II.1 Información General de anfibios.

Pertenecen a la Clase Amphibia, entre los vertebrados, y se consideran como la transición entre el hábito acuático y el terrestre. La mayoría presenta ambas formas de vida, de ahí su nombre, generalmente la etapa larvaria acuática y la adulta terrestre. Una de las principales características de este grupo es que sufren metamorfosis, para pasar de una etapa a otra. Otra característica que los distingue de los demás grupos de vertebrados, es que poseen una piel mucosa muy delgada, por medio de la cual pueden respirar, que no presenta ninguna estructura externa como escamas, plumas o pelos (Duellman y Trueb, 1994).

Los anfibios son considerados sensibles a los cambios ambientales especialmente por su fisiología y ciclo de vida complejo (bifásico: acuático y terrestre). También existen varias evidencias de su importancia en la cadena trófica principalmente por sus hábitos alimenticios, que indican que los adultos contribuyen a mantener las poblaciones de insectos en equilibrio (incluyendo vectores de algunas enfermedades o plagas) y como renacuajos regulan las poblaciones de algas en arroyos montañosos (evitan eutrofización del agua). Además son presas de otros animales silvestres (especialmente vertebrados) Por lo que la desaparición de las poblaciones de estos animales interrumpe las cadenas alimenticias, y resulta en impactos negativos en los ecosistemas (Kriger 2009).

Muchas especies de ranas y salamandras requieren un hábitat apropiado tanto en ambientes acuáticos como terrestres y tienen una piel permeable que puede absorber fácilmente químicos tóxicos. Estos rasgos los hacen especialmente susceptibles a las perturbaciones ambientales, por lo que los anfibios son considerados como indicadores de estrés ambiental precisos. La salud de las ranas es indicio de la salud de la biósfera como un todo (Kriger 2009).

Las ranas también han sido utilizadas en medicina. Estos animales producen una variedad de secreciones, muchas de las cuales tienen un potencial significativo para mejorar la salud humana por su uso como farmacéuticos. Cuando una especie de rana desaparece, también lo hace la posibilidad de mejorar la medicina humana (Kriger 2009).

Los anfibios son el grupo animal más amenazado en la Tierra. Casi un tercio de las 6,485 especies de anfibios en el mundo se encuentran en peligro y por lo menos 150 especies han desaparecido en las últimas décadas. Existen seis factores principales que afectan negativamente a los anfibios, y todos son consecuencias de la actividad humana: destrucción de hábitat, enfermedades infecciosas, contaminación y pesticidas, cambio de clima, especies invasoras y sobreexplotación para alimento y mascotas (Kriger 2009).

Diversidad de anfibios en Guatemala

Los factores que contribuyen a la gran diversidad biológica en Guatemala, son la fisiografía compleja, vegetación y climas variados. También influye la posición geográfica en los trópicos pero influenciada por invasiones de fauna tanto subtropical como templada. Los anfibios han desarrollado numerosas adaptaciones e invadido prácticamente todos los tipos de hábitat, siendo la temperatura y principalmente la humedad los factores medioambientales que más afectan la distribución de anfibios y reptiles en Centroamérica (Duellman, 1966).

Campbell y Vannini (1989) dividieron al país en ocho regiones según la distribución de anfibios y reptiles, que denominaron “áreas faunísticas”, las cuales son una modificación de las áreas bióticas de Stuart. Estas áreas son: área del Petén, área Queqchí, área de la Sierra, área de Zacapa, área de Jalapa, área de Huehuetenango, área de Fuego y área de Escuintla. Según el análisis que realizaron, los anfibios en el país presentan ciertos patrones de distribución, como por ejemplo las salamandras son más abundantes en tierras altas húmedas con clima frío. En el caso de las ranas, son abundantes en casi todas las áreas, aumentando en altitudes medias. En general, la diversidad de anfibios en el país es moderada de 0-800 msnm, disminuyendo mínimamente de 800-1000 msnm, con un marcado aumento en el rango altitudinal de 1300-1700 msnm y disminuyendo lentamente arriba de los 1500 msnm (Campbell y Vannini, 1989).

Los géneros endémicos de la región se restringen casi solamente a las tierras altas del sur de México y Centroamérica Nuclear (para anuros y salamandras), sobre todo en el rango altitudinal de 800-2800 msnm (Campbell, 1999), casi cada complejo montañoso en Guatemala cuenta con una o varias especies de anfibios endémicas (Acevedo, 2006).

En Guatemala, el 55% de las especies de anfibios se encuentra con algún grado de amenaza, siendo el país con mayor porcentaje de amenaza para este grupo en Mesoamérica y se encuentra entre los 10 más amenazados de toda América. Las tierras altas del país se encuentran entre las más amenazadas de Mesoamérica y las especies endémicas de ranas, sobre todo las que tienen rangos restringidos a una sola área montañosa, son las más vulnerables a la extinción (Young et al, 2004).

II.2 Quitridiomicosis

Quitridiomicosis es una enfermedad infecciosa emergente de vida silvestre (Daszak et al. 2000 y Daszak et al. 1999) causada por el hongo zoospórico, Batrachochytrium dendrobatidis. En vida silvestre, esta enfermedad puede ser capaz de causar pérdidas poblaciones catastróficas, a veces acabando por completo con poblaciones locales. El factor 18

más importante que conduce a estas enfermedades en vida silvestre es la introducción antropogénica de los patógenos a nuevas áreas geográficas (Cunningham et al. 2003; Daszak et al. 2000; y Daszak et al. 2001 en Mazzoni et al. 2003).

Este hongo fue identificado en 1998 y ha sido detectada en por lo menos 385 especies de anfibios en 36 países. Fue propuesta como la causa de la muerte de poblaciones de ranas en los bosques nubosos de Australia y Panamá y fue asociada con el declive de las poblaciones de ranas en América del Sur, Norte América, América Central, Nueva Zelanda, Europa y África (Kriger 2009 y Berger et al. 1998; Lips 1999; Bonaccorso et al. 2003; Bosh et al. 2000 en Weldon et al. 2004).

Descripción y Patología.

Batrachochytrium dendrobatidis es el primer hongo quitridio patógeno a vertebrados. Sus zoosporas son flageladas y se movilizan en el agua, crece en las células epidérmicas queratinizadas de anfibios (Longcore et al., 1999). La infección en los anfibios produce engrosamiento y erosión de la piel y puede provocar ulceraciones. En renacuajos infecta solo las partes bucales, que son las únicas superficies queratinizadas en este estadio. Esto provoca la pérdida de estas partes en el renacuajo pero no es fatal, hasta que después de la metamorfosis, al propagarse la infección a otras áreas, el individuo muere (Berger et al., 1998). Crece en un amplio rango de temperaturas (4°- 25° Celsius), siendo la temperatura óptima de 17°- 25° Celsius, por encima de la cual no presenta mayor crecimiento pero puede sobrevivir. Se supone que el contagio se da de individuo a individuo en el apareamiento o en otro tipo de agregaciones (Piotrowsky et al., 2004). También es posible que sobreviva saprofíticamente en el ambiente, en estructuras queratinizadas, hasta infectar a un hospedero (Longcore et al., 1999).

Al igual que otros quítridos, Bd presenta un ciclo de vida con dos estadíos: a) zoosporas móviles uniflageladas, y b) un talo reproductivo sésil (inmóvil) con un solo zoosporangio. Las zoosporas son de vida libre (independiente de un sustrato) y al encontrar un hospedero se enquistan y luego se desarrollan en un talo reproductivo del cual se producen y liberan nuevas zoosporas (Berger et al., 1998; Longcore et al., 1999). Se ha deducido que el contagio se da de individuo a individuo en el apareamiento o en otro tipo de agregaciones.

En los anfibios adultos B. dendrobatidis coloniza solamente las células queratinizadas de la piel y usualmente se puede encontrar en parches aislados en la parte ventral del animal, infectando mayormente la parte cercana a la ingle y la membrana interdigital de las extremidades posteriores (Longcore et al. 1999; Pessier et al. 1999 en Annis et al. 2004). Los animales infectados pueden tener infección en las superficies tanto ventral como dorsal (Parker et al. 2002).

Algunos signos clínicos típicos de la infección en los adultos son la muda excesiva de la piel, y la hiperemia (enrojecimiento) de la piel pálida. Los dedos normalmente son los primeros afectados. En renacuajos, la queratina del área bucal puede presentar deformaciones. Aunque algunas veces no llega a ser letal en esta etapa. No obstante, en varios brotes epidémicos, la muerte súbita ha sido la única manifestación clínica observada. 19

Es muy probable que toda la sintomatología esté relacionada con alteraciones en la regulación osmótica de la piel, aunque la invasión de otros agentes secundarios también pudiera ocurrir en algunos casos (Angulo et al. 2006).

La piel de los anfibios es única entre los vertebrados terrestres porque está activamente involucrada en el intercambio de gases, agua y electrolitos. Debido a su papel en mantener el balance osmótico, otros estudios han sugerido que B. dendrobatidis puede interrumpir la osmorregulación cutánea (Berger et al. 1998 y Voyles et al. 2007 en Voyles et al. 2009).

Para mantener el balance osmótico, los anfibios deben lograr la regulación de la absorción de electrolitos por la epidermis, esto involucra a los canales de sodio y la bomba de Na+/K+ (Heatwole, 1994; Boutilier et al. 1992; Deyrup 1964 en Voyles et al. 2009; y Wright y Whitaker 2001) por lo que cuando este balance es afectado, se cree que es la causa la muerte de los anfibios por Bd.

I.2.1. Ciclo de vida de B. dendrobatidis:

Este hongo es diploide y, principalmente, parece reproducirse por mitosis. Su ciclo consta de dos etapas de vida distintos: la infecciosa donde es considerado una zoosporas flagelada y la tálica, donde puede producir uno o más organismos sésiles reproductivos llamados zoosporangios (donde las zoosporas se desarrollan) (Longcore et al. 1999; Berger et al. 2005).

Figura 2. Ciclo de Vida de Batrachochytrium dendobatidis

Dibujo: Coronado 2011; Basado en Rosenblum et al. 2008. 20

La zoospora es de vida libre y nada a través del agua, no por mucha distancia > 2cm datos de laboratorio y dura menos de 24 horas (Piotrowski et al. 2004), aunque 2008 muestra que la zoospora podría durar algunas semanas en depósitos de agua, de una forma u otra está hace contacto con la piel de los anfibios, y luego entra en alguna célula queratinizada de la piel y se enquistan dentro de esta célula epidérmica (Longcore et al. 1999). Una vez que se enquista la zoospora, comienza el desarrollo de la segunda etapa del ciclo de vida de Bd, el cual produce el zoosporangio (Longcore et al. 1999). Dentro de cada zoosporangio salen múltiples zoosporas nuevas que pueden re-infectar al individuo o pasar al agua.

Figura 3. Zoosporangio de Batrachochytrium dendobatidis en células de epidermis de una rana del Género Leptodactylus

(Foto: Pessier 2011).

I.2.2 Origen de la enfermedad

En un principio se creía que el origen de la quitridiomicosis se remotaba a Sudáfrica, ya que se había encontrado infecciones en Xenopus laevis, Afrana fuscigula y Strongylopus grayii (Weldon 2004) y que la dispersión global desde este continente se dio por el comercio de X. laevis. Luego de ser desarrollada una prueba de embarazo en humanos en 1934, enormes cantidades de estos individuos fueron capturados y exportados alrededor del mundo. La prueba se basaba en el principio de que la ovulación de X. laevis se inducía por la orina de las mujeres embarazadas, debido a los altos niveles de la hormona gonadotropina (Weldon 2004). El comercio global de esta especie ha sido masivo, después de la introducción de pruebas de embarazo no biológicas, X. laevis se convirtió en un modelo importante para el estudio científico de inmunología, embriología y biología

molecular, además ha sido utilizada para investigar mecanismos de amplexo, debido a que es fácil mantenerla en cautiverio (Weldon 2004).

Aunque este modelo de dispersión de la enfermedad es respaldado actualmente, la publicación de Goka et al. (2009) reporta que existen en Japón diversos haplotipos (incluso algunas cepas que parecen ser endémicas a especies nativas del área) además, se ha identificado signos de infección de Bd en un espécimen de la salamandra gigante Andrias japonicus colectado en 1902, esto evidencia que podría existir algunas relaciones comensales entre esta especie y el hongo. La combinación de alta diversidad y la evidente infección asintomática del Bd en especies nativas japonesas ha llevado a postular que Bd pudo haber surgido en Asia.

II.3 Declives y enfermedades en Poblaciones de Anfibios y su relación con quitridiomicosis

Los declives en poblaciones de anfibios se remontan a las décadas de 1970 y 1980 y se han encontrado diversas causas para este fenómeno, entre ellas destrucción de hábitat, contaminación del ambiente, cambio climático, rayos ultravioleta y patógenos (Blaustein y Wake, 1995). La mayoría de los declives inexplicables han ocurrido en los trópicos (y muchos en áreas templadas) y se limitan a áreas de bosques prístinos, sin degradación aparente del hábitat, lo cual llevó a los científicos a realizar estudios en estas áreas (Berger et al., 1998; Lips, 1998 y 1999; Lips et al., 2006).

En varias de éstas se encontró la presencia de B. dendrobatidis en la piel de anfibios hallándose también varias similitudes que indican el surgimiento de una nueva enfermedad con origen acuático: los declives ocurren abruptamente y en pocos meses, los adultos mueren mientras aún se pueden encontrar renacuajos, que después de la metamorfosis mueren (Berger, 1998; Lips, 1999), por lo que el impacto de la enfermedad en los individuos es específico al estadío y en individuos post-metamórficos el impacto es específico a la especie (Briggs et al., 2005). Los anfibios más afectados son especies con estadíos acuáticos (Lips, 1998; Lips, 1999) y que habitan sitios montañosos a altitudes medias y altas (mayores a 600 msnm) (Lips, 1998), lo que sugiere una interacción sinergística entre el agente infeccioso y alguna condición ambiental que varía con la elevación.

A partir de su descubrimiento, B. dendrobatidis ha sido asociado a declives de poblaciones de anfibios, tanto libres como en cautiverio, en regiones de Australia (Berger et al., 1998), Centro y Sur América (Berger et al., 1998; Lips, 1998; Mendelson et al., 2004; Lips et al., 2004 y 2006) y los Estados Unidos (Figura 4). Se han diagnosticado 2 órdenes de anfibios, 14 familias y 93 especies infectadas con el hongo en 5 continentes (Speare y Berger, 2004).

En Mesoamérica, la evidencia directa de declive de anfibios por quitridiomicosis ha sido documentada en Panamá (Berger et al. 1998), Costa Rica (Lips et al. 2003) y México (Lips et al. 2004). Evidencia indirecta de la enfermedad partes de la boca de renacuajos perdidas o deformadas ha sido reportada para Guatemala (Campbell y Smith 1992) y 22

Honduras (McCranie y Wilson 2002). Chen et al. (2011) obtuvo muestras positivas de Bd en especímenes colectados a mediados de los años 90 y propone que según la velocidad dispersión del hongo este llegó a Guatemala en los años 80 (Fig. 5).

Esto se propone debido a que se han encontrado muestras positivas en México que datan de los años 70s y en Costa Rica que datan de finales de la década de los 80. Este patógeno se dispersó atreves de Centro América (Fig. 5) a una velocidad de entre 25-252 km/año y paso del hemisferio Norte al sur para seguir su actual expansión en una ola que tiene una velocidad de 17 km/año (Lips et al. 2008).

Figura 4. Mapa mostrando las localidades Positivas a B. dendrobatidis en el mundo.

Fuente: Fischer et al. 2009

Se ha evidenciado que cuando el hongo entra a un área nueva en el trópico, este ha llegado a extinguir hasta un 50% de las especies locales en un periodo de 6 meses y las especies sobrevivientes sufren un declive de hasta el 80% de su población local (Lips et al. 2003) por lo general afectando más rápidamente a especies asociadas a sistemas ribereños y posteriormente a especies terrestres.

Esto muestra el peligro que puede tener las poblaciones de anfibios al introducir el hongo, y especialmente en nuestro caso, la importancia de evitar una reinfección con nuevos haplotipos exóticos (Goka et al. 2009) más virulentos que podrían acabar con los sobrevivientes a esta ola pandémica. Diversos estudios (Berger et al. 2005; Fisher et al. 2009) han demostrado que la virulencia de B. dendrobatidis varían dependiendo de la cepa. La etapa de vida del organismo es un factor importante, ya que dependiendo de la especie y la etapa en la que es expuesto al hongo (García et al. 2006) la cepa puede ser más o menos virulenta. Incluso puede existen especies que son resistentes y solamente transmiten el patógeno, como el caso de P. matudai (AmphibiaWeb 2011) la cuál que se

encuentra distribuida en Guatemala. Sin embargo, si se les expone a una nueva cepa puede que estos anfibios resistentes se vuelvan vulnerables.

Aunque las formas en que se puede dispersarse este hongo en vida silvestre está todavía en discusión y estudio, se ha asumido que la dispersión del Bd debe ocurrir a través de anfibios portadores (adultos o larvas), las zoosporas en el agua, o algún huésped alternativo (Morgan et al. 2007).

Figura 5. Mapa mostrando la dispersión de B. dendrobatidis en CA.

Fuente: Chen et al. 2011

Anfibios infectados claramente puede servir para dispersar el Bd, en particular las etapas larvarias de las especies. Otras formas de dispersión que se ha considerado es que el hongo puede sobrevivir en biopelículas (Amphibiaweb 2011) y que posiblemente puede ser transportado por medio de hojas, ramas o troncos que vengan de un hábitat acuático infectado. A la vez, una de las formas dispersión más documentadas del hongo es por medio de humanos especialmente por el comercio de especies exóticas (Pet Trade), también especies para consumo huma (Rana castebiana y Telmatobius), el intercambio de especies para estudios científicos (Xenopus laevis).

Especies Portadoras en Guatemala

En el 2004 se documenta el primer caso de quitridiomicosis en Guatemala, en el área montañosa de Purulhá, Baja Verapaz, donde se colectaron renacuajos de la especie Ptychohyla hypomykter y de algunas especies del género Plectrohyla con deformidades en partes queratinizadas de la cavidad oral, esta deformidad está relacionada con la presencia de quitridiomicosis (Mendelson et al. 2004). Este hallazgo era predecible debido a que países vecinos, como México y Costa Rica, reportaron su presencia pocos años antes. Recientemente Vredenburg y Vásquez-Almazán (Com. pers., 2009) detectaron la presencia de B. dendrobatidis en la salamandra Bolitoglossa conanti en el área de La Unión, Zacapa Esta salamandra presentó alta cantidad de zoosporas sin presentar síntomas clínicos. Éste es uno de los primeros casos de infección en salamandras arbóreas neotropicales; también detectaron tres individuos de Rana berlandieri con una infección leve, en el área de Montaña Chiclera, Morales, Izabal. Asimismo se encontraron casos de infección en el Occidente del país, en el área de San Marcos, en este lugar las especies afectadas fueron encontradas en un gradiente altitudinal (1200 – 2800 msnm), siendo las especies portadoras Dendrotriton bromeliacius, Bolitoglossa lincolni, y el híbrido Bolitoglossa franklini x lincolni (Rovito et al., 2009).

Aunque el primer registro es del año 2004, análisis de especímenes colectados en la década de 1990 determinaron que individuos colectados en 1994 estaban infectados (Chen et al., 2011), siendo este el reporte más antiguo para el país. No se cuentan con datos de años anteriores ya que en la década de 1980 no se realizaron muestreos, debió a la guerra interna. Sin embargo se han encontrado individuos positivos de la década de 1970 en México y de la década de 1980 en Costa Rica. Se cree una de las posibles causas del declive de Pseudoeurycea puede estar asociado a la presencia de Bd en el país desde mediados de los años ochenta (Chen et al., 2011).

Se ha planteando a nivel mundial varias estrategias de conservación para mitigar la amenaza de la Quitridiomicosis, esto va desde: 1) Esfuerzos para evitar la dispersión de Bd, 2) Estudios de crianza en cautiverio de especies vulnerables 3) Estudios básicos de la enfermedad y 4) Estudios para posibles controles biológicos en vida silvestre. Se recomiendan tomar en cuenta las siguientes medidas:

Cuidados que se deben tener al extender permisos de investigación, importación y exportación de especímenes:

1. Al extender permisos de investigaciones fomentar normas de bioseguridad, como lavado de equipo de campo y para evitar la dispersión del hongo. 2. No introducir anfibios exóticos ni fomentar su uso como mascotas. 3. Exigir cuarentenas y tratamientos de desinfección para anfibios (vivos) importados, si fuese aprobado su uso comercial en acuarios. 4. Al exportar anfibios (vivos) exigir a la vez una cuarentena o tratamiento al país de destino. 5. Hacer inspecciones en los acuarios, y hacer pruebas de frotis de hongo quitridio por medio de una técnica estándar molecular. 25

Cuidados que debe tener el investigador responsable en el campo:

1. Al realizar colectas de anfibios se debe utilizar guantes de látex para manipular a los individuos, los guantes deben ser desechados entre colectas. Si no se cuenta con guantes el colector debe lavarse bien las manos. No se debe utilizar fuentes de agua a la cual los animales se encuentren expuestos. Desinfectantes de manos a base de alcohol también son una buena opción. El agua utilizada no debe ser desechada cerca de cuerpos de agua (ríos, lagos, quebradas, etc). 2. Si se colecta anfibios, estos no deben ser colocados en un recipiente con otros individuos. Además si se ha utilizado el recipiente para otros individuos, este debe ser desinfectado utilizando cloro al 1-4% o con calor (60 °C). 3. Instrumentos para tomar muestras, colectar o manejar individuos debe ser esterilizado entre individuos con desinfectantes químicos, como etanol al 70% o cloro al 1-4% 4. Los anfibios deben ser manipulados y liberados lo más pronto posible y deben ser liberados en el sitio donde fueron capturados. 5. Los renacuajos se pueden mantener en el mismo recipiente, siempre y cuando todos los miembros de un grupo pertenezcan al mismo sitio. No se debe liberar renacuajos en otros cuerpos de agua. 6. Si se encuentran anfibios muertos u obviamente enfermos estos deben ser manejados con guantes o bolsas plásticas. Si se encuentra un individuo enfermo o recién fallecido, este debe ser colectado y preservado para realizar análisis de enfermedades. 7. Los zapatos deben ser lavados para quitar cualquier resto de lodo del sitio de colecta. Se deben desinfectar utilizando cloro entre el 1 - 4% por un minuto y dejando que sequen por completo (Johnson et al. 2003). Esto se debe hacer entre cada sitio o cuerpo de agua a visitar. Las llantas de los vehículos también deben ser lavadas y desinfectadas con cloro 5%. La desinfección con cloro también sirve para evitar la dispersión de Ranavirus.

Otras enfermedades

Las diferentes especies de anfibios pueden sufrir de muchos tipos de enfermedades tanto en estado silvestre como en cautiverio, debido a su complejo ciclo de vida y piel delgada y sensible. Muchas de estas enfermedades se han descubierto recientemente debido al declive mundial de las poblaciones de anfibios, y entre estas enfermedades se pueden mencionar las de origen bacterial, viral, micótico y parasítico (Bosch, 2003):

 Bacteriales: Dermatosepticemia bacterial, flavobacteriosis, micobacteriosis y clamidiosis.  Virales: ranavirus, herpesvirus y otros.  Micóticas: Quitridiomicosis, zigomicosis, cromomicosis, saprolegniasis y mesamycetozoa.  Parásitos: protozoarios y metazoarios.

Entre las más comunes están la dermatosepticemia bacterial (que produce eritema cutáneo), los ranavirus, las causadas por hongos (generalmente en la piel) y parásitos (como helmintos), aunque ha sido hasta en los últimos años que se ha empezado a investigar otros agentes. Muchas de estas enfermedades no son mortales en sí, pero debilitan el sistema inmunológico del individuo causando que contraiga otras enfermedades más graves e incluso mortales. Por ejemplo, los agentes micóticos generalmente son ubicuos en la naturaleza y son oportunistas afectando individuos estresados, heridos o con baja inmunidad (Densmore y Green, 2007).

Los animales silvestres pueden ser reservorios de enfermedades emergentes que podrían afectar a otros vertebrados incluyendo al hombre, e inclusive podrían tener efectos negativos en animales de importancia económica (Jones et al., 2008).

II.4 Bosques nubosos

Es difícil definir los bosques nubosos a escala global, parte de la definición más aceptada es: “Los bosques nublados (Tropical Montane Cloud Forests) constituyen ecosistemas forestales que normalmente ocurren en una franja altitudinal donde el ambiente se caracteriza por una cobertura de nubes persistente o estacional. Esta persistente nubosidad reduce la radiación solar y el déficit de vapor, llegando a suprimir los procesos de evapotranspiración. La precipitación total que llega al interior del bosque se ve significativamente incrementada por el aporte de la neblina interceptada por la vegetación (precipitación horizontal). Se caracterizan por presentar una proporción alta de epífitas (briofitas, líquenes y helechos) y una reducción en las lianas leñosas. Los suelos en general son húmedos y presentan una gruesa capa de materia orgánica humificada. Los valores de biodiversidad de árboles, hierbas, arbustos y epífitas son altos, considerando su reducida superficie con relación a la selva tropical lluviosa, en la cual la alta riqueza específica se concentra en los árboles principalmente. Los valores de endemismo son también muy altos. Ocurren en un rango muy amplio de precipitación (500-10000 mm anuales) (Brown y Kappelle, 2001).

En Guatemala, los bosques nubosos presentan alta biodiversidad, en un rango altitudinal entre los aproximadamente 1,200 y 2,400-2,600 msnm en las diferentes regiones montañosas. Se encuentran en los departamentos de Huehuetenango (Sierra de los Cuchumatanes), San Marcos (Cadena Volcánica), Quetzaltenango (Cadena Volcánica), Quiché, Alta Verapaz, Baja Verapaz y Zacapa (Sierra de las Minas) e Izabal. La superficie de bosque nublado en el país es de 50,000 ha, de las cuales 20,000 están protegidas (Véliz e Islebe, 2001). Estas zonas presentan una alta frecuencia de nubosidad durante todo el año, así como una alta precipitación pluvial neta y humedad atmosférica. La temperatura media anual varía entre 12-23ºC (para México), para el Volcán de Acatenango es de 12.5-18.5ºC (Véliz). El promedio anual de precipitación pluvial es de 2,000 a 5,000 mm, siendo el período de mayor precipitación entre los meses de mayo a octubre (Véliz e Islebe, 2001).

Estos bosques son muy importantes en la protección de cuencas hidrográficas y su degradación generalmente afecta negativamente la calidad del agua, así mismo son cruciales por su capacidad de capturar la humedad atmosférica (Brown y Kappelle, 2001). 27

La cobertura forestal es muy importante para controlar la cantidad de humedad y luz solar en la mayoría de hábitats. En los bosques nubosos el suelo permanece generalmente húmedo a lo largo del año y presenta una capa profunda de materia orgánica, lo cual favorece la presencia de anfibios. Éstos están muy restringidos por condiciones de microhábitat, por lo que su distribución local refleja la presencia o ausencia de estas condiciones (Duellman, 1966). La representación de estos bosques en el sistema de áreas protegidas en el país es casi nula por lo que existe una alta prioridad en su conservación y estudio (Schuster et al., 2000).

II.5 Áreas de Estudio

II.5.1 Bosques nubosos

II.5.1.1 Biotopo Universitario “Mario Dary Rivera” para la Conservación del Quetzal

Está ubicado en la parte central del país, al noreste del departamento de Baja Verapaz (Municipios de Purulhá y Salamá, Baja Verapaz), en las coordenadas Latitud 90°13’15’’ y Longitud 15°13’00’’. La entrada se ubica en el kilómetro 160.5 de la carretera CA-14, que conduce de la ciudad de Guatemala a la cabecera departamental de Cobán, a 4.5 kilómetros al sur de la cabecera municipal de Purulhá. El punto más bajo del Biotopo es 1500 msnm y el más alto 2348 msnm. La reserva cubre unas 1044 hectáreas de selva nublada. El área de amortiguamiento abarca 4504 ha de bosque muy húmedo subtropical frío. Es administrado por el Centro de Estudios Conservacionistas –CECON- de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la Universidad de San Carlos de Guatemala (CECON- CONAP, 2000). Algunas especies que podemos mencionar para el área son las salamandras Cryptotriton veraepacis, Bolitoglossa daryorum, B. meliana, Nyctanolis pernix; las ranas Hyla bocourti, Craugastor daryi, C. bocourti, C. brocchi, C. xucanebi, Plectrohyla hartwegi, P.pokomchi, Ecnomiohyla minera entre otras (Campbell y Smith, 1998).

Dentro del área del Biotopo se encuentran representadas dos zonas de vida según Holdridge: Bosque Pluvial Montano Bajo Subtropical y Bosque Muy Húmedo Subtropical (frío). El bosque pluvial ocupa la mayor parte del área, representado por vegetación de bosque latifoliado que se desarrolla arriba de los 1500 msnm. La vegetación es bastante abundante, siendo más notable la presencia de plantas características de alta humedad como los helechos, musgos, líquenes, orquídeas y tilansias. El bosque muy húmedo subtropical se localiza en una pequeña franja localizada en el extremo este del área, cuya vegetación está representada por coníferas (De la Cruz, 1976). La vegetación es bastante abundante, siendo más notable la presencia de plantas características de alta humedad como: helechos, musgos, líquenes, orquídeas y tilansias que cubren ramas y tallos de árboles con alturas hasta de 30 metros de las especies Engelhardtia guatemalensis, Nogal; Alfaroa costarricensis; Magnolia guatemalensis, Palo puro; Quercus spp., Encino; Cyathea spp., Helecho arborescente; Dendropanax arbore, entre otras (Ponciano y Glick, 1980).

El Bosque muy húmedo Subtropical frío se localiza en una pequeña franja localizada en el extremo Este del área. La vegetación está representada por 4 especies de 28

coníferas, principalmente por Pinus tenuifolia, pino candelillo (Ponciano y Glick, 1980). La lluvia registrada muestra precipitaciones promedio anuales de 2,069,80 mm, siendo los meses menos lluviosos de noviembre a mayo, y los más lluviosos de junio a septiembre. Los registros climáticos de la estación ubicada en Albores, coordenadas UTM Latitud 150303 y Longitud 895800, indican una temperatura promedio anual de 20.04 ºC. La humedad relativa promedio oscila entre 85.5% a 95.9%, siendo su promedio anual de 90.7% (INSIVUMEH, 2006).

Los ríos, riachuelos y quebradas existentes en el Biotopo, en general se caracterizan por correr en pendientes sobre terrenos accidentados, lo que define corrientes rápidas, que por la naturaleza de los suelos permite la existencia de aguas cristalinas. Dado a que la mayor parte de BUCQ se localiza en una zona lluviosa, la mayoría de las quebradas son de carácter perenne y las pendientes de los lechos son muy escarpadas. Los saltos han formado pequeños estanques que durante el verano permanecen abastecidos de agua. Además, drenajes subterráneos y puntos de agua se observan en todo el bosque. Los ríos arriba de los 1,000 msnm se definen como ríos de altura, caracterizándose por su baja productividad, lo que se refleja en una baja biodiversidad. Sin embargo, se han detectado especies adaptadas a esas características, como es el caso de especies de anfibios de la familia Leptodactylidae, que aprovechan tanto las corrientes continuas como las intermitentes en los períodos de lluvia para el desarrollo de sus larvas (Brule, 1982).

Dentro de la herpetofauna se han encontrado por lo menos 48 formas diferentes, algunas endémicas, distribuidas así: 20 anfibios, 9 saurios y 19 serpientes (3 venenosas). Dentro de los grupos con mayor endemismo que se encuentran en el área están la familia de ranas Hylidae y de salamandras Plethodontidae (CECON-CONAP, 2000).

Una de las áreas aledañas que se incluyen en esta investigación es la región Oeste de la Sierra de las Minas (entrando por la Comunidad de Chilascó). En la Sierra de las Minas se encuentran las siguientes especies endémicas, la lagartija Abronia gaiophantasma, la culebra Chapinophis xanthocheilus, la salamandra Cryptotriton veraepacis (también presente en el BUCQ), la rana Craugastor daryi (Campbell, 2001), Cryptotriton sierraminensis (Vásquez-Almazán et al., 2009), Bolitoglossa daryorum (también presente en el BUCQ), B. tzultacaj (Campbell et al., 2010) y Plectrohyla pokomchi (Duellman & Campbell, 1984). Herpetofaunísticamente, esta área comparte muchas especies con el área de las verapaces, incluyendo el Biotopo del Quetzal (Campbell, 2001).

II.5.1.2 Bosque municipal de la Unión, Zacapa

El Municipio de La Unión se encuentra ubicado en las montañas de la Sierra del Merendón, en un rango altitudinal de 1,000 a 1,500 m.s.n.m. Cuenta con varios ríos entre ellos: Río Timushan, Río Pacayalito, que juntos forman el Rio La Jigua el cual tiene una longitud aproximada de 10 Kms. siendo limite del Municipio de Gualán, a este último se le une la Quebrada Colorada y el río Guaranjá; otro río importante es el Peshjá, naciendo en la aldea "Morola", Jocotán del departamento de Chiquimula tiene una longitud aproximada de 12 Kms.

El territorio de La Unión, contiene un sistema hidrográfico compuesto por varios ríos y quebradas que le dan una exuberante belleza a la región. El clima que prevalece está determinado por los accidentes geográficos del lugar, los cuales ejercen incidencias en la formación del mismo. Con relación a esto podemos decir que es variable y que es de una zona de vida sub-tropical húmedo (De la cruz, 1976). El suelo contiene: Rocas platónicas sin dividir, Roca Volcánica sin dividir y Roca metamórficas sin dividir (Simons, 1956).

El bosque se mantiene en buenas condiciones debido a que la Municipalidad de La Unión es dueña del terreno e inscribió el área en la categoría de Bosque Regional Municipal ante el Consejo Nacional de Áreas Protegidas, con un área de 3,627 hectáreas (Vásquez, 2010)

Dentro de la región se encuentra la salamandra Cryptotritonmonzonicategorizada en Peligro Crítico (Vásquez, 2010), la cual es endémica de estos bosques. Otras especies que se encuentran en el área son Bromeliohyla bromeliacia (CR), Ptychohyla hypomykter (CR), Bolitoglossa conanti y Bolitoglossa rufescens. Es importante resaltar que las quebradas y cascadas frías que se forman en las bases y vertientes de la montaña son ecosistemas únicos, importantes para la reproducción de los anfibios que habitan el bosque y otros animales nativos (Vásquez, 2010).

La parte alta de la montaña denominada “Las Granadillas” forma parte del bosque nuboso de esta región, ubicada en los municipios de Jocotán y Camotán, Chiquimula y los municipios de la Unión, Zacapa, Estanzuela, Río Hondo y Gualán, en el departamento de Zacapa. El rango altitudinal varía desde los 184 a los 1748 msnm. (CDC-CECON-USAC, 2011). En las áreas de mayor altitud de la montaña, la temperatura es templada, con máximas anuales promedio de 36.4°C y mínimas de 11°C. La precipitación varía de 1,869 a 1,397 mm/año y la humedad relativa va de 59% a 87%. Toda esta región montañosa es una zona importante de captación hídrica que abastece de agua a las poblaciones aledañas (CDC-CECON-EB-USAC & Nature Serve 2009).

Entre otras especies de herpetofauna las especies de anfibios reportados para esta área son las Salamandras Bolitoglossa mexicana, B. rufescens, B. dofleini, B. conanti, Smilisca baudinii, y Ecnomiohyla salvaje (Campbell y Smith, 1998).

II.5.1.3 Bosque nuboso del volcán Tajumulco.

El Volcán Tajumulco está situado en el Departamento de San Marcos, aproximadamente a unos 20 kilómetros de la frontera con México. Tiene una altura de 4,220 metros SNM. El tipo es un estrato-volcán compuesto, aparentemente con evolución normal magmática. El Volcán Tajumulco es la montaña más alta de Centro América y la cúspide máxima de nuestro País.

En lo que concierne a herpetofauna, la alta diversidad y endemismo de anfibios se reporta en alturas medias alrededor de los 1200- 1700 msnm (Campbell y Vannini, 1989; Wake, 1987), específicamente en los bosques nubosos de esta región, a la vez también existen especies importantes en ensambles en otras alturas de especies en alturas que van de los 600 msnm hacía los 3500 msnm, esta área es denominada como la región 30

herpetofaunística de Fuego (Campbell y Vanini, 1989). Esta área consta de aproximadamente 52 especies de anfibios, muchos de estos se distribuyen en diferentes tipos de vegetación y en diferentes bandas altitudinales sobre el nivel del mar (Campbell y Vannini, 1989b; Wake et al., 1991; Campbell et al, 2010). Por lo que resalta la importancia de su conservación en el país especialmente en la cadena volcánica del sur de Guatemala. Algunos estudios han sido de salamandras en los años setenta y recientemente algunos viajes de campo (Rovito et al., 2009), las especies reportadas para alturas medias y altas han sido Bolitoglossa engelhardti, B. flavimembris, B. franklini, B. morio, B. lincolni, B. rostrata, Dendrotriton bromeliacia, Pseudoeurycea rex, P. goebeli, y P. brunata (Wake et al., 1992). También se encuentran las especies Bufo canaliferus, Bufo marinus, Agalychnis moreleti, Plectrohyla hartwegi, Plectrohyla matudai, Eleutherodactylus rhodopis, Rana maculata, Bolitoglossa occidentalis.

PARTE III III. RESULTADOS

Se muestrearon un total de 481 individuos de 32 especies pertenecientes a 5 familias del orden Anura (7 géneros, 23 especies) y 1 familia del orden caudata (2 géneros, 9 especies). De las 5 familias de anfibios encontradas, 3 presentaron el hongo, siendo la más afectada la familia de anuros Hylidae con una prevalencia de 48.1% (con 6 de 8 especies afectadas, 2 de 3 géneros, N=216), seguida de la familia de salamandras Plethodontidae, 14.4% (3 de 9 especies afectadas, 1 de 2 géneros, N=180) y por último la familia Craugastoridae con 7.7% (5 de 12 especies, 1 género, N=80) (Tabla 1). Las familias Leptodactylidae, Microhylidae y Ranidae no presentaron el hongo, pero el número muestreado de estas familias fue muy bajo.

Cuadro 2. Prevalencia de Bd por familias en los bosques nubosos muestreados. Prev. Zoosp. Familia Individuos positivos Bd DE (%) Eq. CRAUGASTORIDAE 6/78. 7.7 550.57 ± 1227.5 LEPTODACTYLIDAE 0/2

MYCROHYLIDAE 0/1 HYLIDAE 103/214 48.1 366.09 ± 409.5 RANIDAE 0/2 PLETHODONTIDAE 26/180 14.4 49.93 ± 40.3 Fuente: FODECYT 70-2009

Cuadro 3. Especies portadoras de B. dendrobatidis en bosques nubosos de Baja Verapaz (BV), Zacapa (ZAC) y San Marcos (SM). Especie BV ZAC SM CRAUGASTORIDAE Craugastor bocourti (Brocchi, 1877) X

Craugastor laticeps (A.H.A. Duméril, 1853) X

Craugastor rodophis (Cope, 1867) X

Craugastor rostralis (Werner, 1896) X

Craugastor “A” X

HYLIDAE Plectrohyla avia (Stuart, 1952) X

Plectrohyla hartwegi (Duellman, 1968) X

Plectrohyla matudai (Hartweg, 1941) X X

Plectrohyla quecchi (Stuart, 1942) X

Plectrohyla sagorum (Hartweg, 1941) X X

Ptychohyla hypomykter (McCranie y Wilson, 1993) X X PLETHODONTIDAE Bolitoglossa conanti (McCranie y Wilson, 1993) X

Bolitoglossa daryorum (Campbell et. al., 2010) X

Bolitoglossa helmrichi (Schmidt, 1936) X

Fuente: (FODECYT, 70-2009)

Se esperaría que Plectrohyla guatemalensis (En San Marcos) fuera portadora, pero su número de muestras fue bajo. Para los otros géneros las prevalencias fueron considerablemente menores.

Cuadro 4. Especies portadoras de Bd con su respectiva prevalencia por especímenes Individuos Zoosp. Especie positivos Bd Prev. (%) Eq. DE CRAUGASTORIDAE Craugastor bocourti (Brocchi, 1877) 3/14 21.4 5.81 ± 3.9 Craugastor brocchi (Boulenger, 1882) 0/3 Craugastor chac (Savage, 1984) 0/2 Craugastor charadra (Campbell y Savage, 2000) 0/1 Craugastor laticeps (A.H.A. Duméril, 1853) 1/18 5.5 0.11 Craugastor lineatus (Brocchi, 1879) 0/22 Craugastor rodophis (Cope, 1867) 1/1 0.51 Craugastor rostralis (Werner, 1896) 1/5 20.0 0.01 Craugastor "A" 1/3 33.3 2746.40 Craugastor “B” 0/1 Craugastor stuarti (Lynch, 1967) 0/2 Craugastor xucanebi (Stuart, 1941) 0/6 LEPTODACTYLIDAE Leptodactylus sp. 0/2 HYLIDAE Bromeliohyla bromeliacia (K. Schmidt, 1993) 0/3 Plectrohyla avia (Stuart, 1952) 4/5 80.0 1112.76 ± 1248.5 Plectrohyla guatemalensis (Brocchi, 1877) 0/5 Plectrohyla hartwegi (Duellman, 1968) 4/19 21.1 57.64 ± 75.32 Plectrohyla matudai (Hartweg, 1941) 68/123 55.3 135.68 ± 541.2 Plectrohyla quecchi (Stuart, 1942) 6/17 35.3 156.22 ± 253.6 Plectrohyla sagorum (Hartweg, 1941) 14/24 58.3 577.71 ± 1952.4 Ptychohyla hypomykter (McCranie y Wilson, 1993) 7/18 38.9 156.50 ± 317.9 33

MYCROHYLIDAE Hypopachus variolosus (Cope, 1866) 0/1 RANIDAE Lithobates sp. 0/2 0.0 PLETHODONTIDAE Bolitoglossa conanti (McCranie y Wilson, 1993) 9/59 15.3 85.44 ± 136.2 Bolitoglossa daryorum (Campbell et. al., 2010) 1/11 9.1 6.10 Bolitoglossa dofleini (Werner, 1903) 0/10 Bolitoglossa engelhardti (Schmidt, 1936) 0/3 Bolitoglossa flavimembris (Schmidt, 1936) 0/8 Bolitoglossa helmrichi (Schmidt, 1936) 16/67 23.9 58.25 ± 84.7 Bolitoglossa rufescens (Cope, 1869) 0/12 Cryptotriton monzoni (Campbell and Smith, 1998) 0/5 Cryptotriton veraepacis (Lynch and Wake, 1978) 0/5 Fuente: FODECYT 70-2009

El hongo fue detectado en las 9 localidades de las 3 regiones muestreadas; en Baja Verapaz 30 de 160 individuos muestreados dieron positivo para Bd, 50 de 188 en Zacapa y 56 de 133 en San Marcos. En base a los muestreos estandarizados por cada región encontramos que la región con mayor número de casos fue San Marcos y en comparación al número de muestras existe un diferencia bastante marcada con 42.1% de casos positivos (Cuadro 5).

Cuadro 5. Número de casos de B. dendrobatidis en bosques nubosos de Baja Verapaz (BV), Zacapa (ZAC) y San Marcos (SM).

BV ZAC SM Casos positivos 33 50 56 Muestras 160 188 133 Proporción % 20.6 26.6 42.1 Fuente: (FODECYT, 70-2009)

En cada uno de los muestreos por localidad encontramos que no hay diferencia en la prevalencia de Bd entre cada localidad (ANOVA P=0.071, Cuadro # Anexos), esta muestra no es tan representativa, por no tener las suficientes unidades de replicas por cada punto (solo n=5 unidades muéstrales). La comparación regional que presentamos a continuación (Mínimo n= 11, 15 y 15 réplicas), nos enseña de una manera más robusta la alta prevalencia que tiene el Bd en bosques nubosos (Cuadro 5).

Cuadro 6. Prevalencia de Bd en los bosques nubosos por cada región muestreada. BAJA VERPAZ ZACAPA SAN MARCOS medi a 0.20 0.21 0.35 Sd 0.13 0.18 0.19 IC 95% 0.15 0.21 0.21 Fuente: FODECYT 70-2009

Las prevalencias por región fueron significativamente diferentes (ANOVA, p<0.05, BV vs. SM), aunque solo son diferentes entre Baja Verapaz y San Marcos, presentando Baja Verapaz la menor prevalencia (18.1 + 13.6), seguido de Zacapa (20.62 + 18.56) y San Marcos con la mayor prevalencia (34.8 + 18.47). Basado también en las dos fechas de muestreo (Cuadro 11, Anexos) se encontró que no hay diferencia de prevalencias entre las temporadas de muestreo (ANDEVA, F=2.482982, P = 0.052922, Cuadro 1 Anexos).

En lo que concierne al tipo de desarrollo que pueden tener los anfibios, se encontró que un gran número de individuos positivos están asociadas a un ciclo de vida bifásico en este caso las especies de la familia Hylidae (Indirecto 48.7 % n= 260 con 103 positivos, y Directo 23.1 % n=214 con 32 positivos).

Figura 6. Número de individuos infectados con Bd en relación a su Modo de desarrollo.

Indirecto Directo

Fuente: FODECYT 70-2009

No se encontró que hubiera diferencias en su nivel de infección. El número de individuos con infecciones altas fueron mínimos. Cabe mencionar que se encontraron solo 10 individuos muestreados con lo se considera una infección alta o media de Bd estos fueron: Plectrohyla matudai (5), Plectrohyla avia (2), Ptychohyla hypomykter (1), Bolitoglossa conanti (1) y Craugastor “A” (1). Ninguno presentó síntomas que indicaran que tenían vascularización o que estuviesen deprimidos, síntomas que están asociados con su mortalidad.

Cuadro 7. Nivel de infección promedio por modo reproductivo presente en los bosques nubosos muestreados. Modo Reproductivo Zoosporas eq. (± SD) Desarrollo Directo 133.8 ± 478.2 Desarrollo Indirecto 227.8 ± 866.1 Fuente: FODECYT 70-2009

Relación de las variables de escala de microhabitat y la presencia B. dendrobatidis:

En base a los análisis hechos encontramos, que al menos para los bosques nubosos, no hay una relación directa entre los anfibios portadores de B. dendrobatides y sus variables ambientales a un nivel de microescala, dentro de estos bosques. Aunque las variables respondieron a los dos primero ejes del análisis y estuvieron correlacionados con este de una buena manera, no se encontró un patrón aparente (Fig. 8) que pudiera estar indicando una relación. En el siguiente cuadro se muestra la relación entre las variables y su eje en el PCA (Cuadro7). Entre las variables más importantes que pudieron responder a la presencia de quítrido fueron la humedad relativa y temperatura ambiental, el resto de variables tomadas como temperatura de microhabiat y temperatura de espécimen a la hora de colecta fueron no incluidas por su alta correlación con las variables de HR% y T°ambiental. Esto fue una medida para no sobre estimar la influencia de las variables en cada eje. A pesar de esto se sospecha que algunas variables de escala mayor como temperatura máxima promedio mensualmente podrían estar más vinculadas con la presencia y específicamente con la prevalencia del hongo en anfibios.

Cuadro 8. Correlación de Pearson y Kendall entre las variables de microhabitat y los ejes de ordenación del PCA. Eje 1 Eje 2 Eje 3 r r² Tau r r² tau r r² Tau

T°Amb -0.775 0.601 -0.562 0.153 0.023 0.12 0.013 0 0.05 HR % -0.675 0.456 -0.456 0.374 0.14 0.277 -0.382 0.146 -0.295 Alt 0.512 0.262 0.322 0.499 0.249 0.366 -0.645 0.416 -0.468 DT° 0.144 0.021 0.068 0.804 0.646 0.524 0.575 0.331 0.338 Fuente: FODECYT 70-2009

La temperatura de los especímenes varió de 9.9 a 20.2 ºC (14.9 + 2.38, N=429) y la del microhábitat de 9.7 a 20.9 ºC (14.9 + 2.48, N=443). No se encontró una relación significativa entre alguna de estas dos variables y la presencia de Bd o el número de zoosporas equivalentes. Las temperaturas y variables no fueron de una manera tan variable para cada región lo que indica que los muestreos fueron hechos en bosques nubosos que presentan humedad parecida y temperaturas parecidas entre sí y entran en los rangos de crecimiento del hongo.

Gráfica 1. Análisis de Componentes Principales -PCA- para B. dendrobatidis para diferentes variables tomadas en el campo.

HR%= Humedad Relativa, T°amb= temperatura ambiental, DT= diferencial de temperatura entre especie y microhabitat, Alt= Altura a la que se encontró. Circulos Blancos=Muestras positivas con Bd. Muestras= Primeras dos letras de cada especie, ej. CrXu (Craugastor Xucanebi). Fuente: FODECYT 70-2009

Diversidad

En base a la Riqueza de especies observada para cada región se modelaron curva de acumulación de especie con un esfuerzo de 180 persona/hora. También se predijo basado en calculó de la asíntota de la curva (Número total de predicción por el modelo) los niveles 37

de inventario para cada región. Se ha tomado en cuenta que un nivel de inventario mayor al 80% es considerado un nivel representativo del área de colecta, en base a esto se pueden hacer comparaciones de la diversidad entre las tres regiones.

Gráfica 2. Curva de acumulación de especies de anfibios de la Región de Baja Verapaz.

Fuente: FODECYT 70-2009

En el área de Baja Verapaz se observaron un número de 13 especies y en base a la asíntota estimada de 15.43 especies (aprox. 15) se encontró que el nivel de inventario para Baja Verapaz fue de 84%. Esta región de bosque nuboso fue la que tuvo menos casos positivos de Bd (33 de 181 muestras)

Gráfica 3. Curva de acumulación de especies de anfibios de la Región de Zacapa.

Fuente: FODECYT 70-2009

En el área de Zacapa se observaron un número total de 14 especies y en base a la asíntota estimada de 17.4 especies (aprox. 17) se encontró que el nivel de inventario para Zacapa fue de 81%.

Gráfica 4. Curva de acumulación de especies de anfibios de la Región de San Marcos.

Fuente: FODECYT 70-2009

En el área de San Marcos se observaron un número total de 10 especies y en base a la asíntota estimada de 12.57 especies (aprox. 12) se encontró que el nivel de inventario para esta región fue del 87%. Cabe mencionar que el área de San Marcos es el lugar con más precipitación en comparación de los demás, se encuentra entre 3500 y 4500 mm al año. Por lo que las localidades de San Marcos siempre estuvieron asociadas a ríos y riachuelos aumentado el número de especies asociadas a etapa bifásica en este caso el género Plectrohyla. A la vez fue la región con mayor número de casos de Quitridiomicosis (56 de 133 muestras). Al comparar la riqueza entre las 3 regiones, basada en un esfuerzo estándar igual (180 persona/hora) para todas las regiones encontramos que tanto la riqueza como la diversidad biológica fue menor en San Marcos.

Gráfica 5. Curva de acumulación de especies de anfibios comparando las 3 regiones (San Marcos, Zacapa, Baja Verapaz)

a) b) Fuente: FODECYT 70-2009

Al modelar los datos positivos a Bd encontrados para el País (Incluyendo datos de Zamora, en prensa) utilizamos la ubicación geográfica (UTM) y datos climáticos de la base de datos Worlclim para realizar el siguiente modelo.

Mapa 1. Modelo de la distribución potencial de B. dendrobatidis en Guatemala.

FODECYT: 70-2009

El área bajo la curva (AUC) de los diez mejores modelos estuvo entre 0.9987 y 0.9982, si se toma en cuenta las 100 réplicas estas tuvieron un AUC entre 0.9987 y 0.9922. Del modelo final se obtuvieron 5 rangos de probabilidad de presencia del hongo siendo estos los siguientes: Muy alta: 0.7716 a 1.000; Alta: 0.5788 a 0.7716; Media: 0.3861 a 0.5788; Baja 0.1934 a 0.3861 y Muy baja: 0.1934 a 0.000.

Las variables climáticas con mayor porcentaje de contribución al modelo fueron: el cambio de la temperatura durante la temporada con un 53.08%, seguida por la precipitación del mes más seco y la temperatura máxima del mes más tibio con 11.89% y 11.14% respectivamente (Cuadro 14, Anexos).

Las áreas que presentaron más probabilidad de presencia de presencia fueron las áreas de altura más alta y media de la cadena volcánica, cerro Miramundo en Jalapa, el área de Sierra de las Minas, Sierra de Los Cuchumatanes, y la parte media-alta de Quiché. Los lugares con menos probabilidad de ocurrencia fueron las tierras bajas de Guatemala incluyendo los bosques espinosos, tropicales y subtropicales de las vertientes del Pacífico y Atlántico de Guatemala.

Análisis de Hemoparásitos en Anfibios:

Procesamos un total de 166 muestras con GIEMSA y 85 muestras con WRIGHT. De los totales reportados, 55 muestras de GIEMSA y 34 de WRIGHT no son aptas para diagnóstico y fueron descartadas. De las 112 restantes con GIEMSA y 51 con WRIGHT, determinamos una prevalencia de (Cuadro 9):

Cuadro 9. Parásitos en las muestras sanguíneas en anfibios en base a las dos técnicas de tinción. Hemoparásitos GIEMSA WRIGHT Plasmodium “A” 14.28 % (16 /112) 21.56% (11/51) Plasmodium “B” (Microgametos) 43.75% (49/112) 49.01% (25/51) Trypanosoma sp 00.89% (1/112) 01.96% (1/51) Inclusiones no tipíficadas* 05.35% (6/112) 11.74 % (6/51) Forma 1** 07.14% (8/112) 0% (0/51) + Corresponde a una forma de plasmodio característica y diferente a los microgametos de plasmodio (Plasmodium). * Formas constantes que no fueron identificadas como ninguna forma en las claves de clasificación; probablemente correspondan a hemogregarinas. **Posiblemente inclusiones virales. FODECYT: 70-2009 En base a la carga parasitaría encontrada pudimos ubicar que las prevalencias eran mayores en especies de la familia Hylidae (66.7%) y estas a la vez presentaron el mayor número de carga parasitaría donde generalmente se encontraron cuatro tipificaciones. La Familia Hylidae a la vez esta más asociada a los sistemas ribereños de los bosques y a la vez fue la familia más afectada por el hongo quítrido.

El haber detectado un tipo de Trypanosoma es de suma importancia, ya que este podría ser el mismo Trypanosoma que causa el Mal de Chagas en Humanos, estamos pendientes de hacer análisis moleculares para su detección para confirmar esta posibilidad aunque basado en la fotografía tomada (Fig. 11) de la muestra positiva parece ser un Trypanosoma diferente al humano y posiblemente nuevo para la ciencia (Com. Per. Dra. Monroy, LENAP).

Cuadro 10. Especies que presentaron parásitos en las muestras sanguíneas. Tipos de hemoparásitos encontrados: A= Plasmodium “A”; B = Plasmodium “B” (Microgametos); C = Hemoparásito; D = Inclusiones; E = Trypanosoma sp.

Especies Muestras (+) Prevalencia (%) Tipo CAUDATA PLETHODONTIDAE 04/11. 36.4 Bolitoglossa conanti 0/1 Bolitoglossa daryorum 0/1 Bolitoglossa helmrichi 4/5 80 ABC Bolitoglossa engelhardti 0/1 Bolitoglossa flavimembris 0/2 Bolitoglossa franklini 0/1 AMPHIBIA CRAUGASTORIDAE 15/29 51.7 Craugastor bocourti 3/6 50 ABC Craugastor brocchi 2/3 66.7 ABC Craugastor charadra 1/1 AB Craugastor laticeps 3/7 42.9 AB Craugastor lineatus 3/7 42.9 ABC Craugastor rostralis 1/1 AB Craugastor stuarti ½ 50 A Craugastor xucanebi ½ 50 A HYLIDAE 36/54 66.7 Plectrohyla avia 0/1 Plectrohyla guatemalensis 2/3 66.7 ABD Plectrohyla hartwegi 8/12 67 ABC Plectrohyla matudai 9/12 75 ABCE Plectrohyla sagorum 5/11 45.4 ABCD Plectrohyla quecchi 5/5 100 AD Ptychohyla hypomykter 7/10 70 ABCD RANIDAE Lithobates sp. 2/2 AB Fuente: FODECYT 70-2009

A la vez se encontró dos posibles Plasmodium (Fig. 12) que a la vez deberán ser corroborados molecularmente. Las inclusiones son producto de un virus en las células sanguíneas, por lo que no se puede detectar que virus fue el que las produjo por medio de este método.

Fotografía 1. Trypanosoma sp. encontrado en una Plectrohyla matudai en el bosque municipal de La Unión, Zacapa.

Fuente: FODECYT 70-2009

Fotografía 2. A) Plasmodium “A” sp. B) Plasmodium “B” encontrados en varios bosques muestreados.

A B.

Fuente: FODECYT 70-2009

III.1 DISCUSIÒN DE RESULTADOS

Del total de individuos 136 resultaron positivos para Batrachochytrium dendrobatidis (28.3%), pertenecientes a 14 especies (11 de anuros y 3 salamandras), lo que representa el 43.8% de las especies (cuadro 3). A la vez, se encontró que cada región presentó entre 5 y 6 especies portadoras de (Bd) respectivamente, esto representa en base a los niveles de inventarios encontrados (> 80%) un 50% aproximadamente de especies encontradas. Se ha encontrado en lugares como Costa Rica que cuando el hongo entra a un área nueva en el trópico, este ha llegado a extinguir hasta un 50% de las especies locales en un periodo de 6 meses y las especies sobrevivientes sufren un declive de hasta el 80% de su población local (Lips et al. 2003) por lo general afectando más rápidamente a especies asociadas a sistemas ribereños y posteriormente a especies terrestres. En el caso de estos muestreos que obtuvimos en bosques nubosos al hacer el segundo muestreo (4 meses después) se mantuvo la prevalencia y el número de especies infectadas, mostrándonos la posibilidad de que haya un tipo de estabilización (P>0.05, Cuadro 11, anexos). Se ha encontrado el mismo patrón en algunos países del trópico africano en Gabón (Bel et al. 2011) y Kenya (Kielgast et al. 2010) los cuáles presentan una alta prevalencia como la que presenta Guatemala (Mayor al 20%) para las regiones de bosques nubosos muestreados. Los estudios en Kenya muestran también que básicamente, los casos son asintotícos y que esta prevalencia alta es en parte por este hongo enzootíco de Africa, aunque resaltan que no pueden rechazar la posibilidad que si exista mortalidad y que ellos no la pudieron detectar (Kielgast et al. 2010), a la vez en Canadá Deguise et al., en el 2009 muestra una alta prevalencia de Bd en el sapo Anaxyrus boreas y no encuentra signos aparentes de la enfermedad. Nuestros resultados que son bastante similares a estos indican la posibilidad de que este hongo no sea realmente originario de África y que la ola producto de la dispersión se haya estabilizado en nuestros bosques, aunque no se puede descartar que el hongo esté latente esperando condiciones óptimas para que se desarrolle la enfermedad y sea mortal, esto solo se podrá establecer con un periodo de muestreo temporal de algunos años. Esto hace pensar en un posible origen en Asia donde se han encontrado un gran diversidad de haplotipos (Goka et al. 2009) y realmente este patrón tan parecido al africano sea simplemente el mismo efecto de la ola de dispersión del hongo. Se encontró que la familia Hylidae fue la más afectada con el mayor número de individuos portadores, 103 individuos en total lo que representa el 75.73% de todas las muestras positivas. La familia Plethodontidae tuvo 26 individuos portadores (19.11%) y la familia Craugastoridae tuvo 7 resultados positivos (5.14%). Esto se puede deber al ciclo de vida y modo reproductivo de estas especies y a la asociación que tienen con los cuerpos de agua. El agua es el medio de dispersión del hongo y por ello estas especies se encuentran más expuestas. En el caso de los Craugastoridae y Plethodontidae la prevalencia no es tan alta y se cree que es debido a que estos habitan dentro de los bosques y no están tan asociados a cuerpos de agua además se ha encontrado que algunas salamandras pueden tener menores niveles de infección cuando las condiciones ambientales son más secas (Weinstein 2009). De igual forma en los bosques nubosos se presentan condiciones idóneas para mantener la enfermedad en especies terrestres y de desarrollo directo. Se sabe de antemano que la Quitridiomicosis puede ser más severa en condiciones frescas y de alta humedad como los hábitats de bosques de niebla y zonas de salpicaduras alrededor de los arroyos (Kriger y Hero 2007; Woodhams et al. 2005). 44

En varias parte del mundo existen evidencias de que algunos anfibios funcionan como vectores para mantener la enfermedad y dispersarla, especialmente en el hemisferio norteamericano, por especies de salamandras acuáticas sobre todo, y ranas como (Lithobates catesbeiana), ranas leopardo (L. pipiens), rana común (L. berlandieri) y también ranas africanas como (Xenopus laevis) son sospechosos de ser portadores de esta enfermedad (Daszak et al. 2004; Hanselmann et al. 2004; Peterson et al., 2007; Woodham et al. 2007). En nuestro caso la alta prevalencia de Bd en P. matudai (55.6%) nos hace pensar la posibilidad de que esta especie sea un potencial portador, y a la vez su distribución está ligada a los bosques nubosos de Zacapa y San Marcos, presentando en estas localidades una alta prevalencia también. A la vez las especies del género Plectrohyla tienen las prevalencias más altas, y muchas presentaron un alto número de zoosporas equivalentes en comparación con otras especies, lo que nos sugiere que debido a su modo reproductivo al presentar mejores condiciones para portar el hongo las hace más susceptibles en bosques nubosos. Tenemos que agregar que el rango temperatura en condiciones in vitro donde el hongo crece es de entre 4°C-25°C e idealmente su máximo crecimiento es entre 17°C - 25°C. La exposición de temperaturas por 6 días a 30°C mata al hongo en 50% (Piotrowski et al. 2004). La temperatura de los especímenes varió de 9.9 a 20.2 ºC (14.9 + 2.38, N=429) y la del microhábitat de 9.7 a 20.9 ºC (14.9 + 2.48, N=443) en todos las localidades muestreadas, aunque estas temperaturas son nocturnas, tomadas en el periodo de actividad de los anfibios, ésta se encuentra entre la temperatura de crecimiento de Bd.

Las localidades con registros previos de una o dos especies de anfibios infectados de Batrachochytrium dendrobatidis, presentaron un mayor número de anfibios asociados infectados con el patógeno como lo esperado. Con los datos encontrados en la literatura científica, comunicación personal con expertos y los datos aportados por el proyecto “FODECYT 70-2009” se reporta un total de 31 especies portadoras de Batrachochytrium dendrobatidis (Bd) para el área de Guatemala. Además estos datos son de diversas localidades lo cual indica que el patógeno se encuentra bastante disperso por el país. Sin embargo a pesar de estar tan disperso no se encontró ningún individuo con síntomas de infecciones leves (enrojecimiento o engrosamiento de la piel, decaimiento y debilidad (Angulo et al. 2006), todos los individuos colectados se observaban sanos. Esto puede indicar que solamente son portadores de la enfermedad o no han llegado al punto donde sus zoosporas equivalentes produzcan síntomas y mortalidad. Según Vredenburg, el hospedero tiene una infección letal cuando el conteo de zoosporas es mayor al umbral letal de 10,000 zoosporas, esta es la regla de las 10,000 zoosporas (Kinney et al. 2011), ninguna muestra tomada en nuestros datos supera este nivel, la más alta fue una Plectrohyla sagorum con 7074.4 zoosporas equivalentes, y aparentemente estaba sana. Esta fue colectada en el área de San Marcos. Esta puede ser una de las razones por la cual no hay indicios de individuos enfermos o de mortalidad en masa en las poblaciones de anfibios, también podría existir un tipo de inmunidad por parte de las especies o simplemente los cambios en el estado de la enfermedad en las ranas individualmente por las condiciones climáticas cambiantes, éstas tienden a aparecer en los meses más fríos y desaparecer en los meses más cálidos (Kriger y Hero 2006). No nos atrevemos a concluir la reducción de mortalidad de los adultos, sin embargo algunos estudios sugieren, que B. dendrobatidis no reduce la supervivencia de adultos en muchas poblaciones de anfibios, incluso mucho después de que se ha establecido 45

en un sitio (Kriger y Hero 2006) en nuestro caso el mayor número de muestras corresponden a etapas de subadultos y adultos, los cuales fueron asintomáticos. Una variedad de factores puede provocar que esta enfermedad tenga un brote mortal en individuos con infecciones asintomáticas. Esto incluye los factores de estrés antropogénicos reducen la respuesta inmune y los cambios climáticos que favorecen el parásito (Pounds et al., 2006). Basado también en las dos fechas de muestreo (Cuadro 11, Anexos) se encontró que no hay diferencia de prevalencias entre las temporadas de muestreo (ANDEVA, F=2.482982, P = 0.052922, Cuadro 1 Anexos), aunque estas dos muestreos posiblemente no representaron la época más seca en los bosques nubosos de igual forma se mantuvo la alta prevalencia. En lugares como Australia la prevalencia de Bd ha sido a sido estudiada en distintas temporadas en las zonas templadas, con una mayor incidencia durante los meses más fríos y una menor incidencia durante los meses más cálidos (Kriger y Hero 2006). Lo que nos hace dudar de la estabilidad de las prevalencias en los bosques nubosos de Guatemala, aunque las diferencias en estos bosques no son tan cambiantes dentro de un bosque cabe mencionar que estas diferencias se esperarían en diferentes usos de suelo (especialmente cultivos, guamiles y potreros). Van Sylus y Hero (2009) en Queensland, Australia publicaron la diferencia de prevalencias en machos de la rana Litoria wilcoxii entre un bosque prístino y lugares abiertos siendo la primera la que tenía menor prevalencia.

Solo existe diferencia entre las prevalencias de San Marcos y Baja Verapaz, aunque las dos de igual forma son altas. Las zonas ribereñas alrededor de los arroyos (Kriger y Hero 2006; Woodhams et al. 2005) son las más propensas a presentar Bd por lo que la alta prevalencia de San Marcos puede ser explicada en base a que esta región es una de las más húmedas de Guatemala con 3500 a 4000 mm al año (Worldclim 2011) por ende existe un gran número de ambientes ribereños, esto produce una diversidad alta de anfibios asociados a estos hábitats como la familia Hylidae.

No hay una relación directa entre la presencia de B. dendrobatidis y sus variables ambientales a un nivel de microescala, esto podría ser explicado por el hecho que en lugares con una perturbación media la temperatura promedio diario máxima es más alta pudiendo naturalmente disminuir las condiciones del hongo para su crecimiento. Así mismo hay evidencias que variables de escala mayor especialmente la temperatura máxima media de cada región están relacionadas con las prevalencias (Bustamante et al. 2010), por lo que un análisis con estas temperaturas nos daría idea de si existe relación.

Según nuestro modelo de distribución potencial de las áreas más propensas (probabilidad media a muy alta) al hongo, éstas son las que presentan una precipitación media anual entre 1500 y 2500 mm, como el área de Los Cuchumatanes, entre 2500 y 3500 mm para el área de Sierra de las Minas y parte central de la Cadena Volcánica y entre 3500 y 4500 mm para el área de Occidente de la Cadena Volcánica. La mayor parte de las áreas con probabilidad baja o muy baja la precipitación media anual se encuentra entre 650 y 1500 mm. Estos datos indican que la precipitación es una variable que puede afectar la incidencia del patógeno, sin embargo se cree que la temperatura es uno de los factores primordiales en el crecimiento del hongo y su más rápida patogenecidad podría llegar a ser una variable más importante o igual de importante. Entornos favorables, donde la infección 46

puede extenderse, deben ser frescos y húmedos. Ambientes cálidos y secos se consideran hostiles, y las temperaturas altas pueden ayudar a los anfibios infectados en la limpieza de la infección (Piotrowski 2004; Woodhams et al. 2004; Richards-Zawacki 2010). Se determinó que las tierras altas (mayores a 2400 mts) tienen una probabilidad alta o muy alta de presencia de Bd y esta aumenta a medida que lo hace la elevación. Las áreas con mayor probabilidad son: Sierra de las Minas, Sierra de los Cuchumatanes, Cerro Miramundo y la parte occidental de la cadena volcánica. Áreas con elevaciones intermedias entre 1500 y 2400 msnm presentan una probabilidad media. En estas áreas predominan bosques nubosos, los cuales tienen las condiciones óptimas para el crecimiento del patógeno, como temperaturas medias y mucha humedad. A diferencia de estos lugares las áreas en las que la probabilidad es baja la elevación llega a ser menor a los 1500 msnm y menor a 700 msnm cuando la probabilidad de presencia es muy baja. En estos ecosistemas la temperatura suelen ser más elevadas y la precipitación es menor (exceptuando las selvas tropicales). Las áreas con menor probabilidad de presencia son las tierras baja de Petén, el corredor seco del Valle del Motagua y la Costa Sur. La variable climática que más contribuyó al modelo fue el cambio de temperatura durante la temporada, seguido por la precipitación del mes más seco y la temperatura máxima del mes más tibio. Para la sobrevivencia y crecimiento ideal del patógeno la temperatura y la humedad son variables muy importantes. En estudios realizados en Australia (Kriger y Hero 2006) se ha demostrado que el hongo crece mejor a temperaturas menores a 20°C y se encontró que los niveles de infección eran altos incluso a los 12.3°C.

En base a la carga parasitaría encontrada pudimos determinar que las prevalencias eran mayores en especies de la familia Hylidae y estas a la vez presentaron el mayor número de carga parasitaria donde generalmente se encontraron cuatro tipificaciones. La Familia Hylidae a la vez está más asociada a los sistemas ribereños de los bosques y a la vez fue la familia más afectada por el hongo quítrido. El haber detectado un tipo de Trypanosoma es de suma importancia ya que la región donde fue encontrado es típica del mal de Chagas (Zacapa en la parte del bosque seco) por ende encontrar una posible nueva especie de este parásito en un anfibio representa la posibilidad que estos sean reservorios de este patógeno. Es posible que la forma de transmisión en este caso fuera que este individuo comió una chinche infectada (Com. Per. Dra. Carlota Monroy), existen varias interrogantes en este caso al cuál hay que dar seguimiento.

PARTE IV

IV.1 CONCLUSIONES

1. Se identificó y evaluó las especies de anfibios en Bosques nubosos de Baja Verapaz, Zacapa y San Marcos y se encontró un número total de 14 especies infectadas con Bd, la mayoría de positivos tuvieron una infección leve. Los hemopatógenos encontrados fueron Plasmodium sp., Trypanosoma sp. e inclusiones virales. 2. Se cuantificó la proporción de individuos infectados por especie, encontrando que las mayores prevalencias para el hongo Batrachochytrium dendrobatidis las presentó la Familia Hylidae la cual está mayormente asociada a hábitats ribereños. La especie Plectrohyla matudai tiene la mayor prevalencia registrada en Guatemala. 3. Se caracterizaron variables ambientales y asociadas al microhábitat de los anfibios muestreados, se encontró que no hay relación entre variables microclimáticas y la incidencia del hongo dentro de los bosques nubosos de Zacapa, Baja Verapaz y San Marcos. Según el modelo potencial de distribución, las variables climáticas que más influencia tienen en la presencia del hongo son el cambio de temperatura durante la temporada, seguido por la precipitación del mes más seco y la temperatura máxima del mes más tibio. 4. Se verificó la presencia y una alta prevalencia del hongo en anfibios de los Bosques nubosos de Baja Verapaz, Zacapa y San Marcos. Todas las localidades presentaron individuos y especies infectadas. 5. En los Bosques nubosos de Baja Verapaz, Zacapa y San Marcos existe una alta prevalencia promedio (20%) para cada localidad. 6. Las especies con una etapa bifásica (terrestre y acuática) tienden a tener una prevalencia más alta de Bd. 7. En base a un modelo potencial de distribución del hongo el área de Los Cuchumatanes, Sierra de las Minas, Cerro Miramundo y la Cadena Volcánica occidental tienen las condiciones ideales para la presencia de Bd. 8. La hipótesis no se rechaza, ya que las localidades con registros previos de Bd (Biotopo para la Conservación del Quetzal, Bosque de La Unión y Bosque en Tajumulco) presentaron un mayor porcentaje de especies infectadas.

IV.2 RECOMENDACIONES

1. Seguir con la investigación de hemoparásitos de la sangre de anfibios en vida silvestre ya que pueden representar nuevos vectores de enfermedades emergentes de vida silvestre.

2. Realizar un monitoreo continuo de las poblaciones positivas para Bd para poder observar cambios en la estructura poblacional de los anfibios en ese lugar y sus respectivas prevalencias.

3. Realizar estudios posteriores en los que se pueda determinar los haplotipos de Bd que se encuentran en Guatemala, así como determinar si existe algún tipo de resistencia por parte del hospedero. Esto es importante ya que con monitoreos continuos se puede determinar si entra un haplotipo exótico que pueda causar declives poblacionales nuevos.

IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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IV.4 ANEXOS

Tabla 1. Prevalencias de (Bd) por temporadas de muestreo y por región de muestreo.

BAJA VERAPAZ ZACAPA SAN MARCOS Cerro La La Unión Río Refugio BUCQ Chilasco Sachut verde Granadillas Unión Este Tzoc Negro Q Agosto Septiembre Noviembre 2010 0.29 0.20 0.36 0.00 0.00 0.00 0.00 0.14 0.13 0.00 0.33 0.43 0.09 0.57 0.45 0.55 0.11 0.00 0.33 0.40 0.00 0.20 0.39 Enero Febrero Abril 2011 0.14 0.45 0.35 0.28 0.33 0.08 0.29 0.40 0.00 0.18 0.10 0.08 0.50 0.00 0.32 0.11 0.33 0.53 (P>0.05) no significativo Fuente: FODECYT 70-2009

Tabla 2. Prevalencias de (Bd) por localidad de muestreo.

BAJA VERPAZ ZACAPA SAN MARCOS

Cerro Union Río Refugio BUCQ Chilasco Sachut Granadillas Union Tzoc verde Este Negro Quetzal 0.29 0.2 0.36 0 0 0 0 0.14 0.13 0.35 0 0.33 0.43 0.09 0.57 0.45 0.55 0.11 0 0.08 0.33 0.4 0 0.2 0.4 0.39 0.14 0.45 0.28 0.33 0.08 0.29 0.11 0 0.18 0.1 0.5 0 0.32 0.53 0.33 Media 0.17 0.18 0.26 0.29 0.23 0.1 0.35 0.37 0.32 DS 0.07 0.17 0.16 0.18 0.21 0.13 0.19 0.18 0.23 IC 95% 0.06 0.15 0.18 0.16 0.19 0.11 0.22 0.18 0.23 Fuente: FODECYT 70-2009

Cuadro 11. Porcentaje de contribución al modelo de las variables climáticas Variable climáticas Porcentaje de contribución %

Cambio de la temperatura durante la temporada 53.08 Precipitación del mes más seco 11.89 Temperatura máxima del mes más tibio 11.14 Precipitación del mes más húmedo 9.45 Media de la temperatura anual 3.8 Temperatura mínima del mes más frío 3.34 Media mensual del rango de temperatura diurno 2.95 Precipitación anual 2.2 Cambio de la precipitación durante la temporada 2.08 Fuente: FODECYT 70-2009

IV.5 ANEXOS Fotografías de las localidades muestreadas y algunas especies portadoras de Bd (Fuente fotografìas: FODECYT: 70-2009)

SAN MARCOS

A. B. Fotografía 1. Bosques en San Marcos, A. Bosque de La Trinidad, Tajumulco. B. Refugio del Quetzal, San Rafael Pie de la Cuesta

Fotografía 2. Bolitolgossa flavimembris Fotografía 3. Plectrohyla hartwegi

Fotografía 4. Plectrohyla matudai Fotografía 5. Plectrohyla avia

BAJA VERAPAZ

A. B.

Fotografía 6. A. Bosque de Piedras Quebradas, San Rafael Chilascó. B. Finca Sachut, Purulhá, Baja Verapaz.

Figura 19. Craugastor bocourti

Fotografía 7. Plectrohyla matudai en amplexo Fotografía 8. Craugastor bocourti

A. B.

Fotografía 9. Bolitoglossa daryorum Fotografía 10. A. Bolitoglosa helmrichi y B.Ptychohyla hypomykter

ZACAPA

A. B . Fotografía 11. A. Bosque Municipal de La Unión y B. Bosque en Montañas Las Granadillas.

A. B.

Fotografía 12. A. Bromeliohyla bromeliacea y B. Bolitoglossa rufescens

A. B.

Fotografía 13. A. Bolitoglossa dofleini y B. Plectrohyla matudai

Fotografía 14. Craugastor laticeps.

Fotografía 15. Análisis de muestras de la sangre de anfibios para detectar Hemoparásitos

Figura 1. Poster de divulgación de Hongo de Quitridiomicosis. 61