Estudo Taxonômico E Molecular De Zygomycetes Em Excrementos De Herbívoros No Recife, Pernambuco, Brasil

ANDRÉ LUIZ CABRAL MONTEIRO DE AZEVEDO SANTIAGO

Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes em excrementos de herbívoros no Recife, Pernambuco, Brasil

Recife-PE 2008

ANDRÉ LUIZ CABRAL MONTEIRO DE AZEVEDO SANTIAGO

Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes em excrementos de herbívoros no Recife, Pernambuco, Brasil

TESE APRESENTADA AO CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DE FUNGOS DO DEPARTAMENTO DE MICOLOGIA, CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS, UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO, COMO PARTE DOS REQUISITOS PARA OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR EM BIOLOGIA DE FUNGOS.

Orientadora: Profª. Drª. Maria Auxiliadora de Queiroz Cavalcanti

Co-orientadora: Profª. Drª. Elaine Malosso

Recife-PE

2008

Santiago, André Luiz Cabral Monteiro de Azevedo. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes em excrementos de herbívoros no Recife, Pernambuco, Brasil / André Luiz Cabral Monteiro de Azevedo Santiago. – Recife: O Autor, 2008.

111 xxx folhas: il., fig., tab.

Tese (Doutorado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCB. Departamento de Micologia. Programa de Pós-Graduação em Biologia de Fungos, 2008.

Inclui bibliografia e anexos.

1. Coprófilos. 2. Dimargaritales. 3. Variabilidade Genética 4. Mucorales. 5. Zoopagales. I. Título.

582.281.2 CDU (2.ed.) UFPE 579.53 CDD (22.ed.) CCB – 2008-190

III

A minha esposa Bruna, aos meus pais, Vinícius e Ana e irmãos, Felipe, Fernanda e Beatriz por todo apoio, amor e confiança.

AGRADECIMENTOS

À professora Dra. Maria Auxiliadora de Queiroz Cavalcanti pela orientação e atenção desde a iniciação científica. À professora Dra. Elaine Malosso pela co-orientação apoio e atenção. À professora Sandra Trufem por toda a ajuda na identificação dos Zygomycetes desde a iniciação científica. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo apoio financeiro o qual possibilitou a realização deste trabalho. À coordenação e aos professores do Programa de Pós-Graduação em Biologia de Fungos pelo apoio e ensinamentos. À minha esposa Bruna e aos meus pais Vinícius e Ana e irmãos Felipe, Fernanda e Beatriz pelo carinho, apoio, confiança e compreensão. À professora Leonor Costa Maia pela revisão de dois dos artigos escritos e pelo total apoio durante o todo o curso. Ao Professor Paulo Santos pela ajuda com as análises estatísticas. Às amigas Marielle, Danielle e Liliani e a professora Dra. Neiva Tinti pela importante ajuda com os experimentos de biologia molecular. Aos amigos Dr. Gladstone Silva e Dr. Bartolomeu dos Santos pela essencial ajuda na purificação do rDNA e nas análises dos seqüenciamentos dos espécimes. Aos amigos de turma pela ajuda e agradável convivência durante o curso de Doutorado. Aos amigos do laboratório de Pós-Graduação em Biologia de Fungos: Micheline, Luciana, Ivone, Josilene, Daniele, Sílvia, Flávia e Eduardo pela agradável convivência durante todo o curso. Aos amigos Elisandro, Bruno, Tatiana, Felipe, Marcela e Jadergudson pela amizade e ajuda. Ao amigo Felipe Reis pela ajuda na revisão da língua inglesa em alguns dos trabalhos produzidos. À direção do Zoológico da Reserva de Dois Irmãos pela permissão concedida para a coleta dos excrementos e ao tratador dos animais, Damião dos Santos, pela ajuda nas coletas. Aos demais amigos do Departamento de Micologia por todo apoio e amizade. Aos funcionários do Departamento de Micologia por toda ajuda.

Aos que, de alguma maneira, contribuíram para a minha formação intelectual e profissional.

VII

SUMÁRIO Pág.

AGRADECIMENTOS VI

RESUMO XIII

ABSTRACT XIV

1 - INTRODUÇÃO GERAL 1

1.1 - Zygomycetes ...... 3

1.1.1 - Mucorales Schröter ...... 4

1.1.2 - Zoopagales Bessey ex R. K. Benjamin...... 6

1.1.3 - Dimargaritales R. K. Benjamin, 1979 ...... 7

1.2 - Fungos coprófilos ...... 7

1.3 - Isolamento de Zygomycetes de excrementos ...... 9

1.4 - Taxonomia Molecular ...... 14

1.5 - Marcadores moleculares em seqüências gênicas baseados na Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)...... 15

1.6 - Espaçador Interno Transcrito (ITS) do DNA Ribossomal ...... 16

1.7 - Genética Molecular dos Zygomycetes ...... 16

1.8 - Variabilidade genética intra-específica nos Zygomycetes ...... 17

2 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...... 19

CAPÍTULO I - Zygomycetes em excrementos de herbívoros do Parque de Dois Irmãos no Recife, Pernambuco, Brasil...... 31

CAPÍTULO II - Variabilidade genética em Mucorales isolados de excrementos de herbívoros no Parque de Dois Irmãos, Recife, Pernambuco Brasil ...... 56

CAPÍTULO III - Gilbertella persicaria (Mucorales): um novo relato para o Brasil ... 77

CAPÍTULO IV – Pilobolus (Mucoraceae) em excrementos de herbívoros no Recife, Pernambuco, Brasil...... 84

VIII

SUMÁRIO (CONTINUAÇÃO)

CAPÍTULO V - Mucor guilliermondii : uma espécie rara isolada de excrementos de herbívoro nos neotrópicos ...... 98

CAPÍTULO VI - Dimargaris : uma nova ocorrência para o continente sul americano...... 105

2 - CONCLUSÕES GERAIS ...... 110

ANEXOS

LISTA DE FIGURAS Pág.

CAPÍTULO I

Figura 1: Número de táxons de Zygomycetes ocorrentes entre junho/2005 e maio/2006 em excrementos de herbívoros da Reserva Ecológica de Dois Irmãos no Recife, Pernambuco, Brasil. A. Em função da pluviosidade média mensal. B. Em função da temperatura média mensal. 44

CAPÍTULO II

Figura 1: Análise filogenética de Mucorales isolados de excremento de herbívoros. A árvore é um fenograma de máxima parcimônia baseado em um alinhamento de 520 bases da região ITS do rDNA. Os números nos ramos indicam a porcentagem de recuperação de 1000 “bootstraps” (> 60%). As seqüências obtidas no “GenBank” são precedidas pelos números de acesso. 75

Figura 2 Análise filogenética de Mucorales isolados de excremento de herbívoros. A árvore é um fenograma de “Neighbor Joining” baseado nas distâncias de Kimura-2-parâmetros obtidas de um alinhamento de 520 bases da região ITS do rDNA. Os números nos ramos indicam a porcentagem de recuperação de 10.000 “bootstraps” (> 60%). As seqüências obtidas no “GenBank” são precedidas pelos números de acesso. 76

CAPÍTULO III

Figura 1: Gilbertella persicaria A) Esporangióforo com esporângio imaturo; B): Esporangióforo com esporângio imaturo e columela C) Columela; D) Clamidósporos; E, F) Esporangiósporos. Escala: A=25 µm; B=50 µm; C=50 µm, D=25 µm; E=25 µm; F=10 µm. 80

CAPÍTULO IV

Figura 1: Pilobolus crystallinus var. crystallinus A) Vesícula subesporangial e esporângio; B) Vesícula subesporangial e columela; C) Trofocisto; D) Esporangiósporos; P. crystallinus var. kleinii E) Vesícula subesporangial e esporângio; F) Vesícula e columela; G) Trofocisto; H) Esporangiósporos; P. crystallinus var. hyalosporus I) Vesícula subesporangial e esporângio; J) Vesícula subesporangial e columela; K) Trofocisto; L) Esporangiósporos; P. lentiger var. lentiger M) Vesícula subesporangial e esporângio; N) Vesícula subesporangial e columela; O) Trofocisto; P) Esporangiósporos. 90

LISTA DE FIGURAS (CONTINUAÇÃO)

Figura 2: Pilobolus lentiger var. minutus A) Vesícula e esporângio; B) Vesícula e columela; C) Trofocisto; D) Esporangiósporos; P. longipes E) Vesícula e esporângio; F) Vesícula e columela; G) Trofocisto; H) Esporangiósporos; P. roridus var. roridus I) Vesícula e esporângio; J)

Vesícula e columela; K) Trofocisto; L) Esporangiósporos; P roridus var. umbonatus M) Vesícula e esporângio; N) Trofocisto; O) Esporangiósporos. 94

CAPÍTULO V Figura 1: Mucor guilliermondii A) Esporangióforo com esporângio; B) Esporângio; C) Esporangióforo com columela; D) Esporangiósporos. Escala: A = 40 µm; B = 20 µm; C = 4 µm; D = 5 µm. 101

CAPÍTULO VI

Figura 1: Dimargaris bacillispora A, B) Esporóforos e cabeças férteis em diferentes estágios de desenvolvimento; C) Hifa com septo e cavidade lenticular; D) Merosporangiosporos. Escala: A = 25 µm; B = 25 µm; C = 10 µm; D = 5 µm. 108

LISTA DE TABELAS Pág.

CAPÍTULO I Tabela 1: Alimentação dos herbívoros da Reserva Ecológica de Dois Irmãos no Recife, Pernambuco, Brasil (Dados fornecidos pela administração da Reserva). 36 Tabela 2: Análise química dos excrementos dos herbívoros da Reserva Ecológica de Dois Irmãos no Recife, Pernambuco, Brasil. 36 Tabela 3: Zygomycetes ocorrentes nos excrementos de herbívoros da Reserva Ecológica de Dois Irmãos no Recife, Pernambuco, Brasil. 39 Tabela 4: Freqüência de ocorrência de Zygomycetes nos excrementos de herbívoros da Reserva Ecológica de Dois Irmãos no Recife, Pernambuco, Brasil durante o período de junho/2005 a maio/2006. 41 Tabela 5: Análise de dissimilaridade de SIMPLER da composição de espécies entre os excrementos dos herbívoros da Reserva Ecológica de Dois Irmãos no Recife, Pernambuco, Brasil. 43

CAPÍTULO II

Tabela 1: Mucorales isolados de excrementos de herbívoros da Reserva de Dois Irmãos no Recife, Pernambuco, Brasil. 73

Tabela 2: Origem geográfica dos espécimes seqüenciados e disponíveis no “GenBank”. 74

XII

RESUMO

Os excrementos de herbívoros têm sido citados como um dos principais substratos para o isolamento de Zygomycetes. No entanto, existem poucos estudos relacionados ao conhecimento da composição de espécies desse grupo nesses substratos e à variabilidade genética existente entre Zygomycetes oriundos de diferentes regiões geográficas. Os objetivos desse trabalho foram: a) isolar e identificar Zygomycetes a partir de excrementos de herbívoros do Recife, Pernambuco, Brasil; b) comparar o número e a composição de espécies de Zygomycetes ocorrentes nos excrementos dos diferentes animais e entre os meses do ano; c) comparar as seqüências das regiões ITS do rDNA de Mucorales isolados com seqüências das mesmas espécies provenientes de diferentes regiões geográficas e depositadas no “GenBank”. A partir de coletas mensais (junho/2005 a maio/2006) de excrementos de anta, camelo, jumento-branco, cervo- nobre, “waterbuck”, lhama, cavalo e cutia, foram identificados 39 táxons de Zygomycetes distribuídos em 15 gêneros. Os resultados indicaram que a composição e o número de táxons variam para cada herbívoro e que a sazonalidade influencia a composição de espécies de Zygomycetes nos excrementos, mas não o número de táxons. Polimorfismo genético entre isolados de Cunninghamella elegans , Mycocladus blakesleeanus e Mucor circinelloides f. circinelloides foi constatado, enquanto os espécimes de Rhizopus oryzae foram incluídos em um mesmo clado. As quatro formas de M. circinelloides conhecidas formaram um grupo, não sendo possível a diferenciação genética entre as mesmas com a metodologia utilizada.

Palavras-chave: coprófilos; Dimargaritales; variabilidade genética; Mucorales; Zoopagales

XIII

ABSTRACT

Herbivore dung has been cited as one of the main substrates for isolation of Zygomycetes. However, there are few studies about species composition in these substrates and genetic variability between Zygomycetes from different geographic regions. The aims of this work were: a) To identify and isolate Zygomycetes from herbivore dung from Recife, Pernambuco, Brazil; b) To compare the number and species composition of Zygomycetes occurring in different animal dung and months; c) To compare the ITS rDNA sequences of the Mucorales isolates with sequences of the same species from different geographic regions deposited in the GenBank. The dung of tapir, camel, white-donkey, deer, waterbuck, llama, horse, and agouti were collected monthly from June/2005 to May/2006. Overall, thirty nine taxa, distributed in 15 genera, were identified. The results indicate that the number of taxa and species composition varies for each animal. The season influence Zygomycetes composition on dung but not the number of taxa. Polymorphism between different isolates of Cunninghamella elegans , Mycocladus blakesleeanus and Mucor circinelloides f. circinelloides was found; however, all specimens of Rhizopus oryzae were included in one clade. The molecular method employed here did not allow the four known forms of M. circinelloides to be resolved as the isolates formed one clade.

Key words: coprophilous; Dimargaritales; genetic variability; Mucorales; Zoopagales

XIV

1 Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes... 1 - INTRODUÇÃO GERAL

Os Zygomycetes são fungos que se caracterizam pela produção de um esporo de resistência, de parede espessa, denominado zigósporo, o qual se desenvolve dentro de um zigosporângio formado após fusão completa de dois gametângios, iguais ou desiguais, que podem surgir do mesmo micélio ou de micélios distintos (Alexopoulos et al ., 1996). Embora espécies de Zygomycetes economicamente importantes possam ser isoladas de uma grande variedade de substratos (Cardoso et al ., 1992; Domsch et al ., 1993; Alexopoulos et al ., 1996), os excrementos de herbívoros oferecem as melhores condições para o crescimento e desenvolvimento das mesmas, pois são constituídos por nitrogênio, alto teor de vitaminas, sais minerais, restos de hemácias e micróbios do rúmen, além de apresentarem pH neutro a levemente básico (Dix & Webster, 1995). Entretanto, são poucos os relatos da ocorrência e composição dos Zygomycetes neste substrato. No Brasil, a partir de excrementos de herbívoros, poucas espécies de Mucor (Batista et al ., 1961a; Batista et al ., 1961b; Batista et al ., 1961c; Trufem, 1984; Trufem & Viriato, 1985; Alves et al ., 2002), Absidia (Batista et al ., 1961a; Batista et al ., 1961b; Batista et al ., 1961c; Trufem & Viriato, 1985), Circinella (Trufem & Viriato, 1985), Rhizopus (Batista et al ., 1961a), Syncephalastrum (Trufem, 1984; Viriato & Trufem, 1985b) e Phycomyces (Trufem & Viriato, 1985) foram isoladas. Espécies de Pilobolus (Trufem, 1984; Viriato & Trufem, 1985a), Pilaira (Trufem, 1984; Viriato & Trufem, 1985a), Syncephalis (Trufem, 1984; Viriato & Trufem, 1985b), Piptocephalis (Trufem, 1984; Viriato & Trufem, 1985b) e Dispira (Viriato & Trufem, 1985b) foram reportadas, mas não isoladas.

A identificação de Zygomycetes economicamente importantes, mesmo nos dias atuais, tem sido baseada em características morfofisiológicas (White et al ., 2006). Em contraste, métodos moleculares são universalmente aplicados e fornecem segurança na sistemática desses microrganismos, sendo utilizados tanto para a identificação quanto para estudos de variabilidade genética (Hibbett, 1992). A elaboração e o aprimoramento de técnicas e de diferentes marcadores moleculares como “Random amplified polymorphic DNA” (RAPD), “Restriction fragment length polymorphism” (RFLP), “microsatellite PCR fingerprinting”, seqüenciamento da região ITS do rDNA, Microssatélites e Sítio de “Splicing” do íntron, têm colaborado com os estudos taxonômicos dos fungos (Ferreira & Grattapaglia, 1998; Kumeda & Asao, 2001; Dendis et al ., 2003). Schwarz et al . (2006) mostraram que o seqüenciamento da região ITS é

2 Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes... uma técnica segura para a identificação de gêneros e espécies de Zygomycetes. No entanto, são poucos os relatos envolvendo a biologia molecular na identificação de Zygomycetes (Voigt et al., 1999; Nagao et al ., 2005; Iwen et al ., 2007).

Análises de variabilidade genética são importantes por fornecerem dados para estudos filogenéticos, taxonômicos, de genética populacional e monitoramento de amostras com potencial biotecnológico. Em Zygomycetes, algumas técnicas como análise de isoenzimas, RAPD, RFLP, “microsatellite PCR fingerprinting” têm sido aplicadas para o conhecimento da variabilidade genética de espécies fitopatógenas e com potencial biotecnológico. Embora comparações da região ITS do rDNA possam apresentar resultados mais apurados para análises de variabilidade genética intra- específica, raros estudos têm enfocado o seqüenciamento de regiões de DNA para essa finalidade (Takó & Csernetics, 2005).

Tendo em vista que pouco se conhece sobre a ocorrência de Zygomycetes no Brasil, principalmente em excrementos de herbívoros e, considerando-se importância da biologia molecular como ferramenta adicional para a identificação de fungos em nível específico e para estudos de variabilidade genética, este trabalho teve como objetivos: isolar e identificar Zygomycetes a partir de excrementos de herbívoros do Recife, Pernambuco, Brasil; comparar o número e a composição de espécies de Zygomycetes ocorrentes nos excrementos dos diferentes animais e entre os meses do ano e comparar as seqüências das regiões ITS do rDNA de Mucorales isolados com seqüências das mesmas espécies provenientes de diferentes regiões geográficas e depositadas no “GenBank”.

3 Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes... 1.1 - Zygomycetes

Os Zygomycetes são caracterizados por apresentarem micélio bem desenvolvido, constituído por hifas cenocíticas que contêm septos apenas na base das estruturas reprodutivas, como esporângios ou gametângios e, ocasionalmente, em outras partes, quando o micélio envelhece (Alexopoulos et al ., 1996). No entanto, algumas espécies de Dimargaritales e Kickxellales apresentam septos espaçados regularmente desde o início da formação do micélio (Benny et al ., 2001). A reprodução sexual ocorre pela produção de zigósporos e a assexual dá-se pela produção de esporangiósporos no interior de esporângios comumente globosos ou levemente achatados, podendo apresentar-se cilíndricos, clavados e em forma de halteres, apofisados ou não. Esporangíolos e merosporângios são comumente observados (Viriato, 2003). Assexuadamente, algumas espécies produzem clamidósporos, artrósporos e podem se reproduzir por gemação. A forma de levedura pode ocorrer em condições anaeróbicas, em concentrações de glicose superiores a 5% e na presença de fenetil – álcool (Alexopoulos et al ., 1996). O micélio de alguns Zygomycetes pode produzir rizóides que fixam o fungo ao substrato e estolões que conectam grupos de rizóides. Quanto ao hábito, os Zygomycetes podem ser sapróbios, simbiontes e parasitas de plantas, fungos e animais. Várias espécies deste grupo de fungos podem ser isoladas de solo, água, fezes, grãos estocados, frutos, folhas e outros órgãos de plantas vivas, fungos, vertebrados e invertebrados (Cardoso et al ., 1992; Alexopoulos et al ., 1996). Kirk et al . (2001) descreveram os Zygomycetes contendo 10 ordens, 32 famílias, 124 gêneros e 870 espécies. Significante alteração foi a remoção dos fungos micorrízicos arbusculares de Zygomycota e sua reclassificação em um filo separado, Glomeromycota (Schüßler et al ., 2001). Hoje, 9 ordens de Zygomycota são aceitas: Asellariales, Dimargaritales, Endogonales, Entomophthorales, Harpellales, Kickxellales, Mortierellales, Mucorales e Zoopagales (White et al ., 2006). O mais recente trabalho sobre classificação filogenética dos fungos (Hibbett et al ., 2007) propôs a extinção do Filo Zygomycota, baseando-se em contrariedades verificadas entre os resultados de Liu et al . (2006), que afirmaram a monofilia de Zygomycota, e os resultados de James et al . (2006), os quais sugeriram que Zygomycota é polifilético. Diante desta divergência, foram propostos quatro subfilos com sede incerta: Mucoromycotina Benny, subphylum nov. (ordens: Mucorales Fr., Endogonales Moreau ex R. K. Benj. e Mortierellales Caval.-Sm.), Entomophthoromycotina Humber,

4 Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes... subphylum nov. (ordem: Entomophthorales G. Winter, Rabenh.), Zoopagomycotina Benny, subphylum nov. (ordem: Zoopagales Bessey ex R.K. Benj.) e Kickxellomycotina Benny, subphylum nov. (ordens Kickxellales Kreisel ex R. K. Benj., Dimargaritales R. K. Benj., Harpellales Lichtw. & Manier e Asellariales Manier ex Manier & Lichtw).

1.1.1 - Mucorales Schröter

Com mais de 300 espécies descritas (Hawksworth et al ., 1995), esta é a maior ordem dentre os subfilos propostos por Hibbett et al . (2007). A ordem Mucorales continha, inicialmente, quatro famílias (van Tieghem, 1878), sendo outras posteriormente adicionadas por vários autores. Hesseltine (1955) dedicou-se ao tratamento desta ordem incluindo as famílias Choanephoraceae, Cunninghamellaceae, Endogonaceae, Kickxellaceae, Mortierellaceae, Mucoraceae, Pilobolaceae e Thamnidiaceae. Benjamin (1959), Boedijn (1959) e Ellis & Hesseltine (1974) adicionaram Syncephalastraceae, Piptocephalidaceae, Dimargaritaceae, Helicocephalidaceae, Radiomycetaceae e Saksenaeaceae à ordem Mucorales. Benjamin (1979) criou a ordem Dimargaritales e validou as ordens Endogonales, Zoopagales e Kickxellales. O mesmo autor removeu as famílias Helicocephalidaceae e Piptocephalidaceae para a ordem Zoopagales, bem como Endogonaceae para ordem Endogonales. Dimargaritaceae e Kickxellaceae foram incluídas em Dimargaritales e Kickxellales, respectivamente. Contribuições oferecidas por Mirza et al . (1979), von Arx (1982), Benny et al . (1985), Benny (1991) e Benny et al . (1992) incluíram as famílias Dicranophoraceae, Absidiaceae, Phycomycetaceae, Mycotyphaceae, Gilbertellaceae e Sigmoideomycetaceae em Mucorales. Posteriormente, Tanabe et al . (2000) transferiram Sigmoideomycetaceae para Zoopagales. Recentemente, Meyer & Gams (2003) incluíram Micromucor, Mortierella, Mucor e Umbelopsis em Umbelopsidaceae. Atualmente, são apenas reconhecidas as famílias Mucoraceae e Umbelopsidaceae, desde que as demais famílias de Mucorales foram colocadas em sinonímia com Mucoraceae (Benny, 2005). Os representantes dos Mucorales são denominados “fungos do açúcar”, sendo pioneiros na decomposição da matéria orgânica (Trufem, 1978). Tipicamente, o soma dos Mucorales é um micélio bem desenvolvido, cenocítico em algumas espécies, apresentando septos na base de estruturas reprodutivas, sendo mais facilmente visualizados em micélios mais “velhos”. Entretanto, em algumas espécies, septos 4

5 Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes... irregularmente espaçados podem ser observados, desde o início de sua formação (Alexopoulos et al ., 1996). Exceto por Umbelopsidaceae, cujas espécies formam colônias de crescimento restrito e lento, todos os outros Mucorales produzem colônias de crescimento rápido com abundante micélio aéreo, aspecto cotonoso ou pulverulento e coloração que varia em tons de branco, cinza, marrom, amarelo e alaranjado, preenchendo toda a placa de Petri em menos de uma semana (Benny, 2005). Estruturas com funções de absorção, fixação e disseminação, como rizóides e estolões, são comumente visualizadas e clamidósporos são freqüentemente formados na hifa vegetativa ou em estruturas de reprodução (Benjamim, 1959). A reprodução assexual é realizada por aplanósporos produzidos em esporângios localizados no ápice dos esporangióforos, que podem estar isolados ou em grupos. Podem ainda ser simples ou apresentarem ramificações monopodiais, simpodiais, racemosas ou cimosas (Viriato, 2003). Em alguns Mucorales, a produção dos esporangiósporos ocorre dentro dos esporangíolos, os quais podem apresentar-se cilíndricos, sendo denominados merosporângios (Alexopoulos & Mims, 1996). As columelas são comumente esféricas, clavadas, depressas, ovóides, campanuladas e elipsóides, com ou sem projeções apicais. Podem apresentar parede lisa, incrustada, com ou sem colarete. A reprodução sexual ocorre pela formação de zigósporos produzidos em zigosporângios formados pela fusão de gametângios similares ou, mais raramente, não similares (Benjamin, 1959; O’Donnell, 1979; Alexopoulos et al ., 1996; Benny et al ., 2001; James & O’Donnell, 2004). Em Mucorales, o heterotalismo é mais comum do que o homotalismo e a reprodução sexual não foi documentada para muitas espécies (O’Donnell et al ., 2001). De maioria sapróbios, Mucorales são alguns dos fungos mais comumente isolados de matéria orgânica vegetal e animal em decomposição, de solos e excrementos, sendo todos facilmente crescidos em meios de cultura. Algumas espécies são parasitas e patógenas de fungos e animais, incluindo as causadoras de infecções sistêmicas em humanos, especialmente em pacientes imuno-comprometidos (Jeffries, 1985; Rinaldi, 1989; De Hoog et al ., 2000; Ribes et al ., 2000). Outras são conhecidas por causarem doenças em plantas e sementes (Partida-Martinez & Hertweck, 2005) e o apodrecimento de frutas e sementes estocadas (James & O’Donnell, 2004). Em contraste, espécies benéficas são tradicionalmente utilizadas na produção de alimentos fermentados na Ásia (Hesseltine, 1986; Nout & Kiers, 2005). Espécies de Mucor , Cunninghamella e Rhizopus , dentre outras, são capazes de sintetizar produtos industriais como amilase, lipase, inulinase, pectinase, renina, protease e outros metabólitos

6 Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes... (Cordeiro-Neto et al ., 1997; Alves et al ., 2005; Santiago & Souza-Motta, 2006). São também empregadas na produção de ácidos cítrico, linolênico, aracdônico, oxálico e láctico (Yin et al ., 1998; Zhou et al ., 1999; Kavadia et al ., 2001; Magnuson & Lasure, 2004). Estudos envolvendo a utilização dos Mucorales em processos de biorremediação de metais pesados (Yan & Viraraghavan, 2003; Zafar et al ., 2007) têm sido realizados.

1.1.2 - Zoopagales Bessey ex R. K. Benjamin

Quando Bessey (1950) propôs a ordem Zoopagales, três famílias foram incluídas: Zoopagaceae Drechsler ex Drechsler emend. Duddington, Harpellaceae Léger & Duboscq. e Genestellaceae Léger & Gauthier, as duas últimas atualmente pertencentes aos Trichomycetes. Posteriormente, Alexopoulos & Mims (1979) e Benjamin (1979) incluíram Cochlonemataceae e Piptocephalidaceae em Zoopagales e Tanabe et al . (2000), baseados em comparações nas seqüências da região 18S do rDNA, adicionaram Sigmoideomycetaceae à ordem. De acordo com Benny (2005), hoje são reconhecidas as famílias Cochlonemataceae, Piptocephalidaceae, Helicocephalidaceae, Sigmoideomycetaceae e Zoopagaceae. Todos os representantes dessa ordem são parasitas ou predadores de pequenos animais e fungos. A aparência do talo desses organismos varia de acordo com a espécie. Nos representantes predadores, o soma consiste de um micélio com ramificações irregulares, sendo coberto com uma substância viscosa que facilita a adesão da presa. Os animais capturados são “invadidos” por um haustório delgado e ramificado. Nas espécies endoparasítas, o soma consiste de hifas curtas e espessas, ramificadas ou não, podendo apresentar forma de espiral. Nas espécies ectoparasitas, um esporo que adere externamente ao hospedeiro funciona como um talo e os nutrientes são absorvidos por um haustório ramificado que surge do esporo e se estende para dentro do hospedeiro. A reprodução assexuada, na maioria dos Zoopagales, ocorre por esporangiósporos de várias formas e a sexuada por zigósporos (Alexopoulos et al ., 1996). Os esporangiósporos dos Zoopagales são delimitados simultaneamente, acompanhados pelo aparecimento de zonas hialinas separando os mesmos (Saikawa, 1986; Saikawa & Sato, 1991).

7 Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes... 1.1.3 - Dimargaritales R. K. Benjamin

A ordem Dimargaritales compreende apenas uma família (Dimargaritaceae) contendo quatro gêneros: Dimargaris, Dispira, Spinalia e Tieghemiomyces . (Benjamin, 1965; Zycha et al ., 1969; Hesseltine & Ellis, 1973; Benjamin, 1979; Benny et al ., 1992). Todas as espécies são micoparasitas produtoras de haustórios, parasitando a maioria dos Mucorales. A maior parte dos Dimargaritaceae são coprófilos, embora várias espécies possam ser isoladas do solo. São cultivados, em laboratório, em colônias de Cokeromyces recurvatus Poitras, exceto Dispira simplex R. K. Benj. (Benjamin, 1959; 1961) e D. implicata Misra & Lata (Misra & Lata, 1979), as quais normalmente são parasitas de espécies de Chaetomium (Benjamin, 1979; Benny, 2005). Apresentam micélio ramificado, septado, produzindo esporóforos simples ou ramificados. Os septos das hifas apresentam cavidades lenticulares, contendo plugues que se dissolvem em KOH (2-3%). Reproduzem-se assexuadamente por esporangiósporos produzidos em merosporângios bi-esporados que se formam diretamente de uma vesícula terminal ou de ramificações esporíferas especializadas que surgem de uma vesícula ou de um ápice não inflado do esporóforo. As ramificações esporíferas podem ser simples ou ramificadas. A reprodução sexual ocorre pela produção zigósporos hialinos, mais ou menos globosos, com parede lisa ou ornamentada. A parede dos zigosporângios apresenta-se delgada e lisa (Benny, 2005). Em Dimargaris bacillispora R. K. Benj. e D. oblongispora B. S. Mehrotra & Baijal, o esporangíolo inicial se alonga e depois ocorre uma constrição central, formando dois esporangiósporos iguais. Em outros membros da família, os merosporângios se desenvolvem acropicamente (Benjamin, 1966). Na maturidade, a parede dos esporangiósporos apresenta camada dupla quando visualizada por microscópio eletrônico de transmissão e fragmentos das paredes merosporangiais se aderem às seções laterais dessa parede (Benjamim, 1979).

1.2 - Fungos coprófilos

Os fungos coprófilos são aqueles que habitam excrementos de animais ou estão associados a esses substratos, incluindo solos contaminados com fezes. São importantes componentes do ecossistema, responsáveis pela decomposição de materiais fecais e pelo fluxo de carbono, nitrogênio e energia (Angel & Wicklow, 1974; Wicklow, 1981), além de serem utilizados como fonte de nutrientes para artrópodes coprófagos e micófagos (Halffter & Matthew, 1971). A maioria desses fungos é encontrada em excrementos de

8 Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes... mamíferos não selvagens, selvagens e de aves (Krug et al ., 2004). Os excrementos são um rico substrato para o crescimento dos fungos, pois contêm carbono, nitrogênio, vitaminas, sais minerais, além de apresentarem pH entre 6,5 e 7,0 e elevada capacidade de retenção de água (Dix & Webster, 1995).

As espécies coprófilas podem ser diferenciadas em obrigatórias e facultativas. As primeiras incluem indivíduos cujos esporos precisam, necessariamente, passar pelo trato digestivo dos animais para que haja a quebra de dormência dessas células pelas enzimas gástricas produzidas (Dix & Webster, 1995). De acordo com Viriato (2003), “tais espécies geralmente não crescem em meios de cultura sintéticos, exceto se apresentarem em sua composição sais biliares, pepsina ou outras substâncias que estimulem a germinação, simulando as condições existentes no trato digestivo do animal”. Segundo o mesmo autor, “as espécies coprófilas secundárias ou facultativas são aquelas que se desenvolvem sobre este tipo de substrato, mas passíveis de crescimento em meios de cultura sintéticos e não necessitam passar pelo trato digestivo de animais para que seus esporangiósporos germinem. Geralmente, seus esporos se encontram no solo e, em contato com as fezes, são estimulados a germinar, colonizando o substrato com se fosse qualquer outro tipo de matéria orgânica”.

Os fungos coprófilos freqüentemente crescem e esporulam em condições específicas. Portanto, diferentes micobiotas podem ocorrer em condições de umidade e temperatura variadas. O pH ótimo também pode variar mas, geralmente, os fungos coprófilos exibem crescimento satisfatório em meios com pH 7,0 (Krug et al ., 2004). Outros fatores como: intensidade de luz (Morinaga et al ., 1980), competição fúngica intra e inter-específica (Harper & Webster, 1964), presença de insetos predadores de fungos (Helsel & Wicklow, 1978), tempo mínimo requerido para a esporulação (Harrower & Nagy, 1979) e teor de umidade (Pasricha et al ., 1994) influenciam a composição e diversidade da micobiota nos excrementos. Estudos realizados por Abdullah (1982), Angel & Wicklow (1975), Parker (1979) e Wicklow et al . (1980) sugerem que os diferentes herbívoros apresentam micobiota variada e que a composição de fungos encontrada nos excrementos de ruminantes varia em relação ao observado nas fezes dos não ruminantes. Segundo Lundqvist (1972), o habitat do hospedeiro parece ser mais importante do que o substrato. Em se tratando se Zygomycetes, apenas espécies de Pilobolus podem ser consideradas coprófilas obrigatórias, sendo necessária a adição de extrato de fezes ou

9 Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes... hemina ao meio de cultura para que as mesmas sejam cultivadas em laboratório. Alguns gêneros de Zygomycetes como Basidiobolus , Conidiobolus , Coemansia , Absidia , Circinella , Mucor , Mycotypha , Parasitella , Pirella , Radiomyces , Rhizomucor , Rhizopus , Thamnidium , Helicocephalum, Piptocephalis , Syncephalis e Sigmoideomyces apresentam, tipicamente, muitas espécies coprófilas e não coprófilas. Entretanto, Dimargaris , Dispira , Tieghemiomyces , Kickxella , Spirodactylon , Spiromyces , Benjaminiella , Chaetocladium , Cokeromyces , Dichotomocladium , Ellisomyces , Fennelomyces , Phascolomyces , Phycomyces , Pilaira , Thamnostylum , Utharomyces , Zychaeae , Reticulocephalis e Thamnocephalis apresentam espécies predominantemente coprófilas, mas podem ocorrer poucas espécies não coprófilas. Outros gêneros como Mortierella , Dissophora , Actinomucor , Backusella , Blakesleea , Choanephora , Cunninghamella , Gilbertella , Helicostylum , Micromucor , Protomycocladus , Syncephalastrum , Rophalomyces e Stylopage apresentam espécies primariamente colonizadoras de outros substratos. Entretanto, podem ser verificadas algumas espécies coprófilas (Krug et al ., 2004).

1.3 - Isolamento de Zygomycetes de excrementos

Estudos de diversidade e sucessão de fungos coprófilos têm sido realizados em vários países (Bell, 1975; Wicklow et al ., 1980; Wicklow, 1981; Piontelli et al ., 1981; Ebersohn & Eicker, 1997; Caretta et al ., 1998; Richardson, 2001a; Richardson, 2001b; Nyberg & Persson, 2002; Masunga et al. , 2006). No entanto, são raros os que se referem, exclusivamente, aos Zygomycetes coprófilos, estando grande parte dos relatos concentrados no gênero Pilobolus (Foos & Rakestraw, 1985; Foos, 1989; Nand & Mehrotra, 1968; 1977; Hu et al ., 1989), visto ser o único gênero de Zygomycetes que apresenta espécies essencialmente coprófilas (Krug et al ., 2004). Grove (1934) realizou importante estudo taxonômico sobre Pilobolus isolados de excrementos de herbívoros no Canadá, que incluiu a delimitação de nove espécies reconhecidas e sete consideradas duvidosas, além de descrições e ilustrações dos espécimes observados. O autor descreveu P. crystallinus , P. longipes , P. roridus , P. kleinii , P. sphaerosporus , P. heterosporos , P. oedipus , P. umbonatus e P. nanus . Foos & Rakestraw (1985) descreveram Pilobolus crystallinus (excrementos de cavalo e boi), P. kleinii (boi) e P. longipes (cavalo e pônei) em Ohio, EUA. Em um estudo da diversidade de Pilobolaceae no “Yellowstone Nacional Park” (EUA), Foos (1989) descreveu Pilobolus crystallinus , P. kleinii e P. roridus isolados de 9

10 Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes... excrementos de cervos e Foos & Royer (1989) isolaram, na mesma localidade, P. crystallinus (excrementos de antílope, “bighorn sheep”, bisão, alce e “mule deer”), P. kleinii (antílope, “bighorn sheep”, bisão, alce, cavalo e cervo) e P. roridus (antílope, “bighorn sheep”, alce, cervo e “mule deer”). Boedijn (1959) relatou a ocorrência de Zygomycetes em excrementos de animais na Indonésia. Foram reportadas Absidia merdaria , A. ramosa , A. corymbifera , (animal não informado), Coemansia reversa (excremetos de coelho), C. erecta (morcego), Helicostylum nigricans (animal não informado), Phascolomyces articulosus (rato), P. kleinii (porco), P. morinii (coelho), P. hyalosporus (carneiro), P. crystallinus (animal não informado) e Utharomyces epallocaulus (rato). Nand & Mehrotra (1968, 1977) reportaram 10 espécies de Pilobolus isoladas de excrementos e de solo na Índia: P. crystallinus (excrementos de búfalo, boi e camelo), P. oedipus (humanos), P. umbonatus (boi), P. borzianus (solo), P. roridus (cabra, coelho e pavão), P. sphaerosporus (gato, pavão e boi), P. longipes (cavalo), P. kleinii (cavalo, jumento e cabra), P. nanus (rato) e P. heterosporus (rato, boi e pavão). Hu et al . (1989) delimitaram Pilobolus em cinco espécies compreendendo sete variedades: P. crystallinus var. crystallinus , P. crystallinus var. hyalosporus , P. crystallinus var. kleinii , P. lentiger var. lentiger , P. lentiger var. minutus , P. longipes , P. oedipus , P. roridus var. roridus e P. roridus var. umbonatus . Em um estudo sobre a sucessão de fungos coprófilos em excrementos de canguru e coelho na Austrália, Nagy & Harrower (1979) identificaram 22 espécies de fungos, das quais Pilaira anomala , Pilobolus crystallinus , Rhizopus nigricans e Mucor mucedo foram verificadas nos excrementos dos dois animais citados. McCarthy (2000) estudou a sucessão de fungos em fezes de eqüinos coletadas nos estábulos de Armidale, Austrália (30°31’S, 151°39’L), incluindo os Zygomycetes. Vinte e seis gêneros foram identificados, incluindo 8 Zygomycetes ( Cunninghamella spp., Mortierella spp., Mucor spp., Pilaira spp., Pilobolus spp. Piptocephalis spp., Rhizopus spp. e Syncephalis spp.). Piontelli et al . (1981) verificaram a diversidade de fungos coprófilos em eqüinos no Chile. Foram identificados 82 táxons representando 53 gêneros. Dentre os Zygomycetes, foram verificados Pilobolus kleinii, Mucor hiemalis, M. circinelloides, M. racemosus , M. parvispora , Actinomucor elegans, Chaetocladium brefeldii, Piptocephalis lepidula, Rhopalomyces elegans e Thamnostylum piriforme.

11 Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes... Delgado-Ávila et al . (2005) isolaram 11 gêneros e 15 espécies de fungos provenientes de amostras de excrementos de animais coletadas em 17 municípios do Estado de Zulia, Venezuela. Dentre os Zygomycetes, foram citados Pilobolus crystallinus , Rhizopus stolonifer , Mucor fragilis , Mortierella capitata , Mycotypha indica , Ellisomyces anomallus , Rhopalomyces elegans e Utharomyces epallocaulus , sendo os 5 últimos táxons reportados como novas ocorrências para a Venezuela. Abdullah (1982) verificou a presença de fungos coprófilos em excrementos de jumento, carneiro e camelo coletados em áreas de deserto semi-árido no sul do Iraque. Quarenta espécies foram reportadas (34 Ascomycetes, 3 Zygomycetes e 1 fungo anamórfico). Dentre os Zygomycetes, Pilobolus kleinii (excrementos de jumento e camelo), Pilaira sp. (jumento e carneiro) e Mucor sp. (jumento, carneiro e camelo) estiveram presentes. Ebersohn & Eicker (1997), ao estudarem a sucessão de fungos coprófilos isolados de excrementos de elefante, girafa, zebra, leopardo, “blue wildebeest” e “steenbok”, na África do Sul, verificaram a ocorrência de Pilobolus kleinii , P. crystallinus , P. longipes e Rhizopus stolonifer , dentre outras espécies pertencentes a outros grupos de fungos. Estudo sobre a diversidade de fungos em excrementos de zebra, antílope, búfalo e hipopótamo no Estado de Marula, Quênia, foi realizado por Caretta et al . (1998). Cento e setenta e três espécimes de fungos representando 40 gêneros e 59 espécies foram reportadas. Apenas 5 Zygomycetes (8,5%) estiveram dentre os fungos isolados. Foram verificados Actinomucor elegans (excrementos de “reedbuck”), Mucor sp. (búfalo africano), M. hiemalis f. hiemalis (boi zebu), Pilobolus sp. (“bushbuck” e “waterbuck”) e P. crystallinus (“reedbuck”, “steenbok”, impala, “bushbuck”, “waterbuck”, búfalo africano, boi zebu e eland). A diversidade e ocorrência de fungos coprófilos em excrementos de carneiro, boi, cervo, coelho, lebre e galo coletados em diferentes latitudes [Inglaterra, Austrália, França, Ilhas Gregas, Costa Rica, Porto Rico, República Dominicana, Ilhas Canárias e Brasil (Mato Grosso do Sul)] e em duas estações do ano (verão e inverno) foram estudadas por Richardson (2001a). Trinta e duas espécies foram identificadas, estando apenas Pilaira moreauri (excrementos de cervo e carneiro), Pilobolus crystallinus (cervo, carneiro e boi) e P. kleinii (cervo, carneiro, boi e coelho) dentre os Zygomycetes verificados. Basicamente, foram observadas diferenças significativas na composição da

12 Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes... micota entre os excrementos dos variados animais e entre as fezes coletadas nas diferentes latitudes e nas duas estações do ano. Caretta & Piontelli (1996) estudaram a ocorrência de fungos coprófilos em excrementos de cervo em Pavia (Lombardia, Itália). Foram coletadas, durante o verão, 80 amostras de excrementos de cervos confinados em um parque. Quarenta gêneros distribuídos em 57 espécies foram registrados. Foram isoladas Mortierella reticulata , Mucor bainieri , M. hiemalis , M. plumbeus , M. racemosus , Phycomyces blakesleeanus , Pilobolus kleinii , Piptocephalis lepidula , Rhizopus stolonifer , Syncephalis cornu e Thaminidium elegans . Dentre as espécies obtidas, M. hiemalis apresentou maior freqüência de ocorrência (76,2%). Nyberg & Persson (2002) citaram a ocorrência de Pilobolus crystallinus em excrementos de alce na província de Angermanland na Suíça. Vánová & Kubátová (2004) estudaram a diversidade de fungos coprófilos em regiões contaminadas por resíduos industriais na Polônia e na República Tcheca. Cinqüenta táxons foram isolados de 23 amostras de excrementos de coelho, lebre e cervo coletados durante o verão e inverno. Foram verificados 10 táxons pertencentes aos Zygomycetes: Mucor hiemalis f. hiemalis , M. hiemalis f. corticola , M. circinelloides , M. mucedo , M. wosnessenskii , Cunninghamella elegans , C. echinulata , Pilaira anomala, Pilobolus crystallinus e Rhizopus stolonifer . Dentre as espécies ocorrentes, M. hiemalis f. hiemalis apresentou freqüência de ocorrência mais elevada (21,7%). Com exceção de M. circinelloides , todas as espécies foram verificadas em excrementos de cervo e apenas C. elegans , C. echinulata , Mucor hiemalis f. hiemalis e P. crystallinus não ocorreram em fezes de coelho ou lebre. Segundo os autores, maioria dos Zygomycetes foi verificada nas amostras coletadas durante o verão. Batista (1948) e Batista & Pontual (1948), descreveram P. kleinii (excrementos de boi), P. nanus (porco), P. longipes (cavalo), P. crystallinus (caprinos) e P. argentinus (cavalo) em Recife, Pernambuco. Batista et al . (1961a) registraram a ocorrência de fungos em 629 amostras de excrementos de bovinos em Recife, alimentados com ração. Vinte e oito espécies foram isoladas, dentre as quais Absidia repens , Mucor racemosus e Rhizopus nigricans pertenciam aos Zygomycetes. A ocorrência de A. repens e M. racemosus foi também registrada por Batista et al . (1961a, b) em excrementos de galináceos, suínos, caprinos, eqüinos e asininos em Recife.

13 Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes... Trufem (1984) relatou a ocorrência de Zygomycetes em excrementos de cabra- de-malta, camelo, carneiro-da-montanha, cavalo, girafa, gnu, orix, veado-catingueiro e zebra, mantidos na Fundação Parque Zoológico do Estado de São Paulo. Dez espécies de Mucorales foram verificadas: Mucor hiemalis , M. mucedo , M. plumbeus , Pilaira anomala , Pilobolus crystallinus , P. kleinii , Piptocephalis repens , Syncephalis cornu e S. tengi . A autora constatou diferenças no número de espécies entre os excrementos dos animais, sendo as fezes de orix as mais propícias para a ocorrência de Mucorales, com 10 espécies ocorrentes, seguidas pelas fezes de cabra de malta, camelo, carneiro-da- montanha (5 espécies), girafa (4), veado-catingueiro (3), zebra (2) e cavalo (1). Em um estudo sobre a diversidade de espécies de Zygomycetes em excrementos de herbívoros, mantidos em cativeiro na Fundação Parque Zoológico do Estado de São Paulo, Viriato & Trufem (1985b) e Trufem & Viriato (1985) analisaram 80 amostras de excrementos de cabra-de-malta, camelo, carneiro-da-montanha, égua, girafa, guanaco, gnu, orix-cimitarra, orix-gazela, veado-catingueiro e zebra. Dentre as espécies facilmente isoladas em meio de cultura, foram obtidas Mycocladus ramosus (como Absidia ramosa ) (fezes de orix-cimitarra e orix-gazela), Circinella minor (orix- cimitarra, veado-catingueiro e zebra), C. muscae (girafa, guanaco, orix-cimitarra e zebra) C. umbellata (cabra-de-malta, carneiro-da-montanha, guanaco, orix-cimitarra, orix-gazela e veado-catingueiro), Mucor circinelloides (girafa), M. fuscus (gnu, orix- cimitarra e zebra), M. hiemalis (cabra-de-malta, carneiro-da-montanha, égua, guanaco, gnu, orix-cimitarra, orix-gazela, veado-catingueiro e zebra), M. mousanensis (girafa), M. mucedo (cabra-de-malta, girafa, gnu, guanaco, orix-cimitara, veado-catingueiro e zebra), M. piriformis (camelo, girafa, orix-cimitarra e zebra) e Phycomyces blakesleeanus (égua). Dentre as espécies que não crescem facilmente em meios de cultura, foram reportadas Dispira cornuta (égua e guanaco), Piptocephalis repens (cabra-de-malta, égua, girafa, guanaco, orix-gazela, veado-catingueiro e zebra), Syncephalis asymmetrica (camelo e zebra), S. cornu (égua e girafa), S. penicillata (girafa), S. sphaerica (égua), S. tengi (égua) e Syncephalastum verruculosum (égua). Viriato & Trufem (1985a) relataram a ocorrência de nove espécies de Pilobolus em excrementos de onze mamíferos herbívoros (cabra-de-malta, camelo, carneiro-da- montanha, égua, girafa, guanaco, gnu, orix-cimitarra, orix-gazela, veado-catingueiro e zebra), mantidos em cativeiro na Fundação Parque Zoológico de São Paulo. Foram descritas as espécies P. crystallinus, P . kleinii, P . sphaerosporus, P . pullus, P.

14 Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes... heterosporus, P . borzianus, P . morinii, P . longipes e P. oedipus. Os autores forneceram chave de identificação para as espécies descritas. Richardson (2001b) verificou a diversidade de fungos em excrementos de boi, ovelha, cervo, cavalo e capivara coletados em Bonito, Brasil (56°30`W, 21°0,5`S) e Corumbá (57°4,5`W, 19°26,5`S). Foram isolados 75 espécimes representando 32 espécies de fungos. Dentre os Zygomycetes, apenas Pilobolus crystallinus (fezes de cervo e carneiro) e P. sphaerosporus (carneiro, capivara e cavalo) foram reportadas. Alves et al . (2002) verificaram a ocorrência de Mucor em excrementos de bisão, boi, búfalo, cabra, coelho, cutia, eland, cavalo, ovelha e veado-catingueiro coletados no Parque Dois Irmãos e Departamento de Zootecnia da Universidade Federal Rural de Pernambuco. Foram isoladas Mucor circinelloides f. circinelloides (fezes de bisão e boi), M. circinelloides f. griseocyanus (bisão, cabra, carneiro, coelho, eland e veado- catingueiro), M. circinelloides f. janssenii (coelho, eland e veado-catingueiro), M. circinelloides f. lusitanicus (veado-catingueiro), M. hiemalis f. hiemalis (bisão, cabra, cavalo, coelho e cutia), M. hiemalis f. luteus (cabra, cavalo, carneiro, coelho e cutia), M. genevensis (carneiro e cutia), M. piriformis f. piriformis (cavalo), M. piriformis f. nanus (bisão), M. racemosus f. chibinensis (bisão, cabra, coelho e cutia), M. subtilissimus (cavalo) e M. variosporus (veado-catingueiro). Maior diversidade foi verificada nas fezes de bisão, coelho, cutia e veado-catingueiro. Viriato (2003) verificou a ocorrência de Pilobolus em excrementos de camelo, cavalo, cutia, guanaco, orix, veado-catingueiro, cervo-nobre e zebra na Fundação Parque Zoológico de São Paulo. Foram descritas 11 espécies, sendo uma desconhecida para a ciência: Pilobolus sp., P. oedipus , P. sphaerosporus , P. borzianus , P. longipes , P. nanus , P. morinii , P. heterosporus , P. crystallinus , P. pullus e P. kleinii .

1.4 - Taxonomia Molecular

A taxonomia clássica dos Zygomycetes baseia-se na identificação das espécies considerando-se diferentes características macroscópicas (ex: cor a aspecto das colônias) e microscópicas (ex: morfologia e dimensão dos esporangióforos, esporângios, esporangíolos, merosporângios, columelas, trofocistos, vesículas subesporangiais, esporangiósporos e merosporangiosporos). Morfologia, dimensão e coloração dos zigosporângios (estruturas de reprodução sexuada) também são características utilizadas como critérios taxonômicos. Entretanto, em alguns casos, existe grande dificuldade na identificação das espécies deste grupo, devido à elevada 14

15 Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes... diversidade fenotípica existente. Torna-se, portanto, necessária a utilização de métodos moleculares que forneçam segurança na sistemática desses microrganismos, sendo utilizados tanto para a identificação como para estudos de variabilidade genética (Hibbett, 1992). A elaboração e o aprimoramento de técnicas e de diferentes marcadores moleculares como “Random amplified polymorphic DNA” (RAPD), “Restriction fragment length polymorphism” (RFLP), “Microsatellite PCR fingerprinting” e seqüenciamento da região ITS, têm colaborado com o estudo taxonômico dos fungos, pois permitem a verificação de variabilidade genética (Ferreira & Grattapaglia, 1998; Kumeda & Asao, 2001; Dendis et al ., 2003). No entanto, o sequenciamento de diferentes alvos moleculates, incluindo a região ITS (região menos conservada) do rDNA tem sido utilizado com segurança para identificação de espécies de fungos (Kobayashi et al ., 2004; Schwarz, 2006).

1.5 - Marcadores moleculares em seqüências gênicas baseados na Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

Dentre as técnicas moleculares utilizadas para estudos genéticos dos fungos, a reação em cadeia da polimerase (PCR) tem se mostrado eficiente por ser um método rápido, específico e sensível que auxilia a detecção e identificação dos micorganismos (Scheu et al ., 1998). Esta técnica, descrita por Kary Mullis em 1980, consiste na amplificação in vitro de determinada seqüência de DNA, utilizando a enzima termorresistente DNA polimerase, cofatores, desoxirribonucleotídeos trifosfatos (dNTP´s) e oligonucleotídeos que flanqueiam a região alvo e pareiam-se às fitas opostas do DNA. A mistura destes componentes adicionada ao DNA molde é colocada em um termociclador em que 3 temperaturas (1 ciclo) são alternadas para que ocorra a amplificação do DNA. Um ciclo de PCR consta das etapas de desnaturação, anelamento e alongamento ou polimerização. Na primeira, o DNA é desnaturado em função do aumento da temperatura (92-95 °C). Na segunda etapa, ocorre uma redução da temperatura (35-60 °C), permitindo a hibridação dos iniciadores com as seqüências complementares do DNA. Em seguida, a temperatura é elevada a 72°C para que a DNA polimerase realize a extensão da cadeia a partir de cada terminal 3` dos iniciadores (Ferreira & Gratapaglia 1998). Os produtos da amplificação são observados, após a eletroforese, em gel de agarose corado com brometo de etídio.

16 Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes... A possibilidade de gerar grandes quantidades de fragmentos de DNA de segmentos específicos do genoma foi um dos aspectos fundamentais dos avanços na pesquisa científica proporcionados pela PCR. O seqüenciamento das regiões amplificadas permite, por exemplo, a identificação rápida de espécies de microrganismos, além de auxiliar em estudos de diagnóstico e melhoramento genético de plantas e animais, de filogenia e de possibilitar o conhecimento sobre variações genéticas intra-específicas (Ferreira e Gratapaglia 1998; Paccola-Meirelles, 1998; Stummer et al ., 2000, Driver et al ., 2000).

1.6 - Espaçador Interno Transcrito (ITS) do DNA Ribossomal

Em eucariontes, o rDNA é encontrado em unidades repetidas dentro da região organizadora nucleolar. Cada unidade consiste de regiões altamente conservadas dos genes que codificam o rRNA 18S, 5,8S e 28S, intercaladas por regiões variáveis de espaçadores não-codificantes. Cada unidade de transcrição é composta de uma região promotora líder (ETS – “External Transcribed Spacer”), uma região codificadora do rRNA 18S, um espaçador não-codificante interno (ITS1), uma região codificadora de rRNA 5,8S, outro espaçador não-codificante interno (ITS2), uma região codificadora de rRNA 28S e, finalmente, um segmento intergênico espaçador não-transcrito, IGS (Polanco et al. , 1998; Lewin 2001). Por ocorrerem em múltiplas cópias no genoma, as seqüência de rDNA são facilmente amplificáveis por PCR (Edel et al., 1996). As regiões ITS evoluem rapidamente, sendo apropriadas para discriminar espécies relacionadas ou, até mesmo, variedades de uma mesma espécie. O fato das regiões ITS serem curtas (500 a 800pb), flanqueadas por segmentos conservados e aparecerem em grande número de cópias no genoma, permite que sejam amplificadas e seqüenciadas com facilidade (Fungaro, 2000; Guimarães & Sá, 2002).

1.7 - Genética molecular dos Zygomycetes

A maioria dos relatos envolvendo a genética molecular dos Zygomycetes concentra-se em estudos filogenéticos (Nagahama et al ., 1995; Jensen et al ., 1998; O`Donnell et al ., 1998; Tanabe et al ., 2000; Tanabe et al ., 2004; White et al ., 2006), em que diferentes regiões do DNA de espécimes previamente identificados e estocados em bancos de culturas são utilizadas como alvo para o entendimento das relações evolutivas deste grupo. Poucos são os trabalhos acerca da utilização da biologia molecular como

17 Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes... ferramenta para a identificação bem como para o estudo de variabilidade genética intra- específica dos Zygomycetes (Galgóczy, 2005). Ferramentas moleculares têm se mostrado eficientes na identificação de fungos, principalmente os responsáveis por micoses em humanos (Iwen et al ., 2002). As regiões 18S e 28S do rDNA são as mais conservadas, sendo utilizadas para comparação de organismos distantemente relacionados e, em alguns casos, entre diferentes gêneros. Variações individuais entre repetições do rDNA podem ser observadas em ambas as regiões ITS, as quais têm mostrado suficiente variabilidade para discriminar isolados em nível específico e intra-específico (Hibbett, 1992; White et al ., 1990; Chen et al ., 2000; Chen et al ., 2001). Há evidências de que o seqüenciamento direto dos produtos de PCR obtidos com auxílio de iniciadores ainda é a alternativa mais segura para a identificação genética dos Zygomycetes (Kobayashi et al ., 2004). No entanto, são poucos os relatos da utilização da biologia molecular na identificação desse grupo. Voigt et al . (1999), estudando as regiões 28S do rDNA de 42 espécimes de Zygomycetes clinicamente importantes, desenvolveram iniciadores para PCR espécie-específicos, visando a rápida identificação dos mesmos. Nagao et al . (2005) realizaram a identificação de espécies de Rhizopus baseando-se no seqüenciamento da região ITS. Schwarz et al . (2006) validaram o seqüenciamento da região ITS dos Zygomycetes como uma técnica eficaz para a identificação de 54 espécimes pertencentes a 16 espécies, sendo o mesmo verificado por Iwen et al . (2007) na identificação de Mucor circinelloides . Entretanto, os autores relatam a carência de dados disponíveis no "GenBank" para comparação das seqüências de rDNA de vários Zygomycetes.

1.8 - Variabilidade genética intra-específica nos Zygomycetes

Estudos sobre variabilidade genética são importantes por fornecerem dados para estudos filogenéticos, taxonômicos, análises de genética populacional e monitoramento de amostras com potencial biotecnológico. Em Zygomycetes, algumas técnicas como análise de isoenzimas, RAPD, RFLP e “microsatellite PCR fingerprinting” têm sido aplicadas para o conhecimento da variabilidade genética de espécies fitopatógenas e com potencial biotecnológico (Takó & Csernetics, 2005). Os diferentes padrões de bandas observados entre isolados de uma espécie, com a utilização das técnicas supracitadas, indicam a variabilidade genética intra-específica em Zygomycetes.

18 Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes... Vágvölgyi et al. (2001) identificaram variações genéticas entre 12 isolados de Mucor genevensis dos EUA e África do Sul, utilizando as izoenzimas catalase, glutamato desidrogenase, malato desidrogenase, superóxido dismutase e glicose-6- fosfato desidrogenase. Seis padrões eletroforéticos foram verificados pela utilização da catalase e 4 padrões foram observados com o uso de glicose-6-fosfato desidrogenase e malato desidrogenase. Apenas 3 padrões eletroforéticos foram observados para as enzimas superóxido desmutase e glutamato desidrogenase. Polimorfismo genético em Rhizomucor pussillus foi verificado por Vastag et al . (1998) através da análise das isoenzimas fosfatase ácida, β-esterase, glutamato desidrogenase e glucose-6-fosfato desidrogenase. Maior variabilidade foi observada com a última enzima, em que 6 padrões eletroforéticos foram vizualizados, enquanto apenas dois padrões foram citados para as enzimas fosfatase ácida e glutamato desidrogenase. Elevado polimorfismo em 31 espécimes de M. hiemalis , isolados de diferentes regiões geográficas, foi verificado por Havens (1976), pela análise das isoenzimas álcool desidrogenase, benzaldeído oxidase, α-esterase, desidrogenase láctica e desidrogenase málica. Maior variação foi observada pela α-esterase, que apontou 16 padrões eletroforéticos. Vágvölgyi et al . (1996) observaram diferentes padrões eletroforéticos entre 59 isolados de Mucor piriformis , utilizando as izoenzimas catalase, α-esterase, glucose-6-fosfato desidrogenase, lactato desidrogenase, malato desidrogenase e superóxido dismutase. Quatro diferentes padrões eletroforéticos foram observados pela utilização da α-esterase e glucose-6-fosfato desidrogenase, enquanto a utilização da malato desidrogenase apontou apenas 2 padrões eletroforéticos. A partir do uso da técnica de RAPD, Bidochka et al . (1995) encontraram três diferentes padrões de amplificação do DNA para 8 espécimes de Entomophaga grylli originados do Canadá, EUA e Austrália, utilizando 3 diferentes iniciadores. Burmester & Wöstemeyer (1994) reportaram a elevada variabilidade entre sete isolados de Parasitella parasitica (3 isolados dos EUA e 4 com origem geográfica indeterminada), utilizando 4 diferentes iniciadores. Papp et al . (2001) verificaram 9 padrões de amplificação para 16 espécimes de Gilbertella persicaria , isoladas em diferentes locais na Califórnia, utilizando 6 iniciadores distintos e Vágvölgyi et al . (2004) reportaram 3 diferentes padrões de amplificação entre 29 espécimes Rhizopus stolonifer , provenientes da Califórnia, Japão, Suíca, Holanda e Índia, utilizando 6 iniciadores. Os diferentes padrões de amplificação observados entre isolados de uma espécie, com a utilização do RAPD, demonstram a variabilidade genética intra-específica destas espécies.

19 Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes... Park et al . (2003) verificaram variabilidade genética entre 20 isolados de Rhizopus com o uso da técnica de RFLP em combinação com PCR, utilizando a região ITS (ITS1-5,8S-ITS2) como alvo. Dois diferentes padrões de bandas foram verificados em Rhizopus oryzae isolados dos EUA, Japão e Coréia. ITS-RFLP foi aplicado por Chakrabarti et al . (2003) para diferenciar Apophysomyces elegans de outras espécies de Zygomycetes, enquanto a técnica de “microsatellite PCR fingerprinting” foi utilizada para a análise de polimorfismo genético intra-específico em isolados de A. elegans . Dois padrões de bandas foram observados para os 12 isolados estudados com a utilização dos iniciadores GTG5 e GAC5. A análise da variabilidade genética intra-específica em Cunninghamella echinulata e C. elegans , aplicando o protocolo de ITS-RFLP (utilizando duas enzimas de restrição) e “microsatellite PCR “fingerprinting” (utilizando os iniciadores GTG5 e GAC5), foi realizada por Lemmer et al. (2002). Foram verificados 2 padrões de bandas entre 3 isolados de C. elegans (origem geográfica não informada) e 2 padrões de bandas entre 2 espécimes de C. echinulata isolados dos EUA e Índia.

2 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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31 Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes... CAPÍTULO I

Zygomycetes em excrementos de herbívoros da Reserva Ecológica de Dois Irmãos no Recife, Pernambuco, Brasil

(Artigo a ser enviado para a revista Fungal Diversity)

32 Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes...

Zygomycetes em excrementos de herbívoros da Reserva Ecológica de Dois Irmãos no Recife, Pernambuco, Brasil

André L. C. M. A. Santiago

Trinta e nove táxons de Zygomycetes distribuídos em 15 gêneros foram verificados em excrementos de anta ( Tapirus terrestris ), camelo ( Camelus bactrianus ), cavalo ( Equus caballus ), cervo-nobre ( Cervus elaphus ), cutia (Dasyprocta aguti ), jumento-branco ( Equus asinus ), lhama ( Lhama glama ) e "waterbuck" ( Kobus ellipsiprymnus ), coletados na Reserva Ecológica de Dois Irmãos localizada em Recife, Estado de Pernambuco, Nordeste do Brasil. As amostras foram coletadas mensalmente, de junho/2005 a maio/2006, levadas ao laboratório e incubadas em câmaras úmidas. Maior número de táxons foi observado nos excrementos de anta, seguido pelas fezes de cervo-nobre e cutia. Dentre os gêneros, Mucor apresentou o maior número espécies, seguido de Pilobolus . As análises estatísticas apontaram diferenças significativas no número e composição de táxons entre os excrementos dos herbívoros. A sazonalidade influenciou a composição dos Zygomycetes, mas não o número de táxons. Variações na composição dos táxons entre as fezes de ruminantes e não ruminantes foram também observadas. Palavras chave: coprófilos, taxonomia, ecologia, ruminantes

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Introdução

Os fungos coprófilos são componentes importantes dos ecossistemas, participando ativamente da ciclagem de nutrientes nos excrementos dos animais (Wicklow, 1981). Dentre as espécies de Zygomycetes comumente encontradas em excrementos, algumas podem ser coprófilas obrigatórias, necessitando de meio com extrato de excremento ou hemina para o seu crescimento, ou facultativas, que se desenvolvem em meios de cultura comuns (Krug et al., 2004). Vários estudos de diversidade e sucessão de fungos coprófilos têm sido realizados utilizando excrementos de diferentes animais (Bell, 1975; Wicklow et al., 1980; Wicklow, 1981; Piontelli et al., 1981; Ebersohn & Eicker, 1997; Caretta et al., 1998; Richardson, 2001a,b; Nyberg & Persson, 2002; Masunga et al., 2006). No entanto, são raros os que se referem, exclusivamente, aos Zygomycetes coprófilos, estando a maior parte dos relatos concentrados em Pilobolus (Nand & Mehrotra 1968, 1977; Foos & Rakestraw, 1985; Foos, 1989; Hu et al., 1989), visto ser o único gênero de Zygomycetes que apresenta todas as espécies essencialmente coprófilas (Krug et al., 2004). No Brasil, apenas espécies de Mucor (Batista et al., 1961a, b, c; Trufem, 1984; Trufem & Viriato, 1985; Alves et al., 2002) Absidia (Batista et al., 1961a, b, c), Circinella (Trufem & Viriato, 1985), Mycocladus (Trufem & Viriato, 1985), Rhizopus (Batista et al., 1961a), Syncephalastrum (Trufem, 1984; Viriato & Trufem, 1985b), Phycomyces (Trufem & Viriato, 1985), Pilobolus (Batista 1948; Batista e Potual 1948; Trufem, 1984; Viriato & Trufem, 1985a), Pilaira (Trufem, 1984; Viriato & Trufem, 1985a), Syncephalis (Trufem, 1984; Viriato & Trufem, 1985b), Piptocephalis (Trufem, 1984; Viriato & Trufem, 1985b) e Dispira (Viriato & Trufem, 1985b) foram verificadas em excrementos de herbívoros. Considerando-se os poucos relatos da ocorrência de Zygomycetes em excrementos de herbívoros no Brasil e, tendo em vista as evidências de

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que certas espécies de fungos coprófilos são mais freqüentes do que outras em fezes de herbívoros (Angel & Wicklow, 1975; Wicklow et al., 1980), e que fezes de diferentes animais e de diferentes procedências apresentam micota distinta (Dix & Webster, 1995), este trabalho teve como objetivos: relatar a ocorrência de espécies de Zygomycetes em excrementos de mamíferos herbívoros, mantidos em cativeiro em Recife, Pernambuco, Brasil, e comparar a composição e o número de espécies de Zygomycetes ocorrentes entre os excrementos dos diferentes herbívoros e entre os diferentes meses do ano.

Materiais e métodos

As amostras dos excrementos de anta ( Tapirus terrestris ), camelo (Camelus bactrianu s), cavalo ( Equus caballus ), cervo-nobre ( Cervus elaphus ), cutia ( Dasyprocta aguti ), jumento-branco ( Equus asinus ), lhama (Lhama glama ) e “waterbuck” ( Kobus ellipsiprymnus ) foram coletadas na Reserva Ecológica de Dois Irmãos (8°7'30"S e 34°52'30"W), que inclui um parque zoológico, localizada em Recife, Estado de Pernambuco, Nordeste do Brasil. A área abrange 387ha, sendo uma Reserva Ecológica de Mata Atlântica. As coletas foram realizadas, mensalmente, de junho/2005 a maio/2006, totalizado 96 amostras de excrementos. As fezes de cada herbívoro foram coletadas com o auxílio de espátulas previamente esterilizadas, acondicionadas em sacos plásticos, levadas ao laboratório e incubadas em câmaras úmidas (em triplicata) a 28°C ± 2°C por 15 dias. As câmaras úmidas foram deixadas sobre bancada com alternância entre luz natural e escuridão. Para o isolamento dos Zygomycetes que crescem facilmente em meios de cultura, os esporangióforos foram retirados do substrato com o auxílio de micro-pinça ou micro-agulha e transferidos para superfície dos meios de cultura M ágar (extrato de malte 20g, glicose 20g, peptona 1g, ágar 16g, água destilada esterilizada 1000mL) (O’ Donnell

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1979) e ágar suco V8 (suco V8 355mL, CaCO 3 3g, água destilada esterilizada 645mL) (Benny & Benjamin 1991), adicionados de cloranfenicol (80mg/L). As espécies foram identificadas pela observação das características macroscópicas (coloração, aspecto e diâmetro das colônias) e microscópicas (microestruturas), de acordo com Benny (1982, 1991), Schipper (1978, 1984, 1990), Domsch et al. (1993), Hesseltine & Fennel (1995), dentre outros. A identificação das espécies pertencentes aos gêneros Dispira , Dimargaris , Pilaira , Pilobolus , Piptocephalis e Syncephalis , que não crescem nos meios de cultura utilizados, foi realizada através da observação das estruturas microscópicas, a partir de fragmentos das colônias retirados diretamente do substrato, de acordo com Boedijn (1959), Benjamin (1959, 1965), Indoh (1962), Mehrotra & Prasad (1965), Nand & Mehrotra (1968, 1977), Zycha et al. (1969) e Hu et al. (1989). A verificação das diferenças entre o número de táxons de Zygomycetes ocorrentes nos excrementos dos diferentes herbívoros e entre o número de táxons verificados nos diferentes meses do ano foi realizada através da Análise de Similaridade (ANOSIM Primer 5.2.4) de acordo com Clarke & Warwick (1994). Diferenças na composição dos Zygomycetes entre os excrementos dos herbívoros foram verificadas pela Análise de Friedman e Análise de Dissimilaridade de Simper (Zar 1996). Para a constatação de diferenças entre a composição das espécies nos diferentes meses do ano foi utilizada a Análise de Friedman (Zar 1996). A composição alimentícia dos animais foi fornecida pela administração da Reserva Ecológica de Dois Irmãos (Tabela 1) e a análise química dos excrementos foi realizada no Laboratório de Bioquímica Vegetal da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE) (Tabela 2). Os dados pluviométricos foram fornecidos pelo Instituto Nacional de Meteorologia (http://www.inmet.gov.br).

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Tabela 1. Alimentação fornecida aos herbívoros da Reserva Ecológica de Dois Irmãos no Recife, Pernambuco, Brasil. Animal Alimento Anta Capim-elefante, mamão, melancia, abóbora, cenoura, batata-doce, tomate, goiaba, maçã, banana, couve-folha. Camelo Capim-planta, ração bovina, abóbora, cenoura, batata-doce. Cutia Ração para roedor, mamão, banana, melancia, melão, cenoura, batata-doce, abóbora. Cavalo Capim-elefante, ração eqüina. Jumento-branco Capim-elefante, ração eqüina, abóbora, cenoura, batata-doce. Cervo-nobre Capim-planta, ração para bezerro, abóbora, cenoura, batata-doce, banana, mamão, melão, melancia, maçã. "Waterbuck" Capim-planta, ração para bezerro. Lhama Capim-planta, ração para bovino, cenoura, batata-doce.

Tabela 2. Análise química dos excrementos dos herbívoros da Reserva Ecológica de Dois Irmãos no Recife, Pernambuco, Brasil. Glicose Animal (mg/g) P (mg/g) N (%) C (%) Camelo 6,79 13,97 2,18 27,78 Cavalo 4,64 4,38 1,23 20,12 Cervo-nobre 7,26 17,82 2,69 28,23 "Waterbuck" 8,57 24,13 1,97 28,95 Lhama 11,83 11,76 2,49 22,87 Anta 12,24 13,1 1,79 29,02 Cutia 9,35 13,48 1,86 27,67 Jumento-branco 10,22 10,33 1,77 25,02

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Resultados

Trinta e nove táxons de Zygomycetes, pertencentes a 15 gêneros e distribuídos entre as ordens Mucorales (34 táxons), Dimargaritales (2) e Zoopagales (3) foram identificados nos excrementos dos herbívoros estudados. Maior número de táxons foi verificado nos excrementos de anta (22 táxons), seguido por cervo-nobre (21), cutia, jumento-branco e lhama (15). Menor número de táxons foi verificado nos excrementos de cavalo (6). Dentre os gêneros, Mucor apresentou o maior número espécies (9) e formas (6), seguido por Pilobolus , com 4 espécies e 7 variedades (Tabela 3). Thamnostylum piriforme ocorreu em todos os meses do ano, apresentando freqüência de ocorrência (F.O.) de 100%, seguido por Mucor circinelloides f. circinelloides (F.O. = 83,33%), Dispira cornuta , M. mounsanensis , M. subtilissimus (F.O = 75%), Circinella muscae , Pilobolus crystallinus var. kleinii (66,67%). Mucor racemosus f. chibinensis , M. ramosissimus , P. crystallinus var. crystallinus e P. lentiger var. lentiger ocorreram em seis dos doze meses de coleta (F.O. = 50%). As demais espécies, formas e variedades observadas apresentaram freqüência de ocorrência abaixo de 50% (Tabela 4). Alguns táxons exibiram preferência pelos substratos de determinados animais. Mycocladus blakesleeanus , C. rigida e M. fuscus ocorreram apenas nos excrementos de lhama. Cunninghamella blakesleeana , Cunninghamella sp., M. circinelloides f. lusitanicus e Backusella lamprospora foram verificadas nos excrementos de cutia, enquanto M. guilliermondii e Dimargaris bacillispora ocorreram, exclusivamente, nas fezes de anta. Pilaira anomala , Syncephalis cornu e M. circinelloides f. griseocyanus foram observadas apenas nos excrementos de camelo, cervo-nobre e "waterbuck", respectivamente. Enquanto a maioria das espécies ocorreu tanto nos excrementos de ruminantes como de não ruminantes, M. blakesleeanus , C. rigida , M. circinelloides f. griseocyanus , M. fuscus e S. cornu apresentaram preferência pelos excrementos de

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ruminantes, enquanto B. lamprospora , Cunninghamella sp., D. bacillispora , M. circinelloides f. lusitanicus , M. guilliermondii , P. roridus var. roridus , P. roridus var. umbonatus , Piptocephalis lepidula e Rhizopus oryzae ocorreram, exclusivamente, nos excrementos dos não ruminantes (Tabela 3). Diferenças na composição de espécies foram mais evidentes entre os excrementos de jumento-branco e cutia (94,6%), cavalo e lhama (90,7%), cavalo e anta (90,7%) e camelo e cutia (90,17%) (Tabela 5). Maior número de táxons ocorreu nos meses de agosto/05 (16 táxons), setembro/05 (20) e março/06 (18) (Tabela 3, Figura 1). As análises estatísticas apontaram diferenças significativas na composição (R Global = 0.269, p = 0, número de permutações = 10.000) e no número de táxons (P = 0,0015, G.L. = 7, FR = 23,38) de Zygomycetes entre os excrementos dos diferentes herbívoros. Variações na composição de táxons nos excrementos de cada animal ao longo dos meses do ano (R Global = 0.102, número de permutações = 10.000, Nível de significância = 0,004%) também foram verificadas. No entanto, não foram constatadas diferenças no número de táxons presentes nos excrementos de cada animal ao longo dos meses do ano (p = 0,0632, G.L. = 10). Diferenças significativas na composição de táxons de Zygomycetes entre os animais ruminantes e não ruminantes (dissimilaridade média = 80,54%) foram verificadas, embora os testes não tenham detectado diferenças significativas no número de táxons de Zygomycetes entre os excrementos dos ruminantes e não ruminantes [Z (U) = 1,064, p = 0,2873].

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Tabela 3. Zygomycetes ocorrentes nos excrementos de herbívoros da Reserva Ecológica de Dois Irmãos no Recife, Pernambuco, Brasil.

Excremento

Zygomycetes (R) (R) Jumento- Anta (NR) Anta (NR) Lhama (R) Cutia (NR) branco (NR) Cavalo (NR) Cervo-nobre Camelo (NR)

Waterbuck (R) Backusella lamprospora (Lendn.) Benny & R.K. Benj. - + ------Circinella muscae (Sorok īn) Berl. & De Toni + + + - - - - + C. rigida G. Sm. ------+ C. umbellata Tiegh. & G. Le Monn. + + - - - + + + Cunninghamella phaeospora Boedijn - + ------C. echinulata (Thaxt.) Thaxt. ex Blakeslee + + - - - + - - C. blakesleeana Lendn. - + ------Dimargaris bacillispora R. K. Benj. + ------Dispira cornuta Tiegh. + - - - + + - Gilbertella persicaria (E.D. Eddy) Hesselt. + - + - - + - - Mucor circinelloides f. circinelloides Tiegh. + + + + - + + + M. circinelloides f. griseocyanus (Hagem) Schipper ------+ - M. circinelloides f. janssenii (Lendn.) Schipper - + - - - + - + M. circinelloides f. lusitanicus (Bruderl.) Schipper - + ------M. guilliermondii Nadson & Philippow + ------M. hiemalis f. hiemalis Wehmer + - - - + + + + M. mousanensis Baijal & B.S. Mehrotra + + - - + + + + M. mucedo Fresen + + + - + + + + M. racemosus f. chibinensis (Neophyt.) Schipper + + - + + + + - M. ramosissimus Samouts. + - + - - + - - M. subtilissimus Oudem. + - + - - + + + M. fuscus (Berk. & M.A. Curtis) Berl. & De Toni ------+ Mycocladus blakesleeanus (Lendner) Mirza ------+ M. ramosus (Lindt) Mirza - + - - - + - - Pilaira anomala (Ces.) J. Schröt. - - - - + - - - Pilobolus crystallinus var. crystallinus (F.H. Wigg.) Tode + - + - + + + - P. crystallinus var. hyalosporus (Boedijn) F.M. Hu & R.Y. Zheng + - + - + - - +

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Tabela 3 continuação. Zygomycetes ocorrentes nos excrementos de herbívoros da Reserva Ecológica de Dois Irmãos no Recife, Pernambuco, Brasil.

Excremento

Zygomycetes (NR) (NR) Anta (NR) Anta (NR) Lhama (R) Cutia (NR) Cavalo (NR) Camelo (NR) Waterbuck (R) Waterbuck (R) Jumento-branco Cervo-nobre (R) P. crystallinus var. kleinii (Tiegh.) R.Y. Zheng & G.Q. Chen + - + + + + + + P. lentiger var. lentiger Corda + - + - + + - - P. lentiger var. minutus (Speg.) R.Y. Zheng & G.Q. Chen + + + - + + - + P. longipes Tiegh. - - + + + - - - P. roridus var. roridus (Bolton) Pers. - - + + - - - - P. roridus var. umbonatus Buller - - - + - - - - Piptocephalis lemonnieriana Vuill. - - - - + + - - P. lepidula (Marchal) P. Syd. + - + - - - - - Rhizopus oryzae Went & Prins. Geerl. + - + - - - - - Syncephalastrum racemosum Cohn ex J. Schröt. + - - - - + - - Syncephalis cornu Tiegh. & G. Le Monn. - - - - - + - - Thamnostylum piriforme (Bainier) Arx & H.P. Upadhyay + + - - + + + + Total de espécies 22 15 15 6 13 21 12 15 R = ruminante; NR = não ruminante; + presença da espécie; - ausência da espécie

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Tabela 4. Freqüência de ocorrência de Zygomycetes nos excrementos de herbívoros da Reserva Ecológica de Dois Irmãos no Recife, Pernambuco, Brasil durante o período de junho/05 a maio/06.

Mês/ano

Zygomycetes Jul/05 Set/05 Jan/06 Fev/06 Jun/05 Dez/05 Out/05 Ago/05 Nov/05 Abr/06 Mai/06 Mar/06 Mar/06 ocorrência Freqüência Backusella lamprospora ------+ + + + 33,3% Circinella muscae + + - + - - + + - + + + 66,7% C. rígida ------+ + - - 16,7% C. umbellata + + + + + - + + - - + + 75,0% Cunninghamella sp. - - - + ------8,3% C. echinulata - - - + + - - - - + - - 25,0% C. blakesleeana ------+ - - 8,3% Dimargaris bacillispora ------+ 8,3% Dispira cornuta - + + + + + + + + + - - 75,0% Gilbertella persicaria - - + - - - - - + - - - 16,7% Mucor circinelloides f. circinelloides + + - + + + + - + + + + 83,3% M. circinelloides f. griseocyanus ------+ + - 16,7% M. circinelloides f. janssenii - - + - - - - - + - - + 25,0% M. circinelloides f. lusitanicus - - + ------8,3% M. guilliermondii + ------8,3% M. hiemalis f. hiemalis - + + + - + ------33,3% M. mousanensis + + + + - - + + - + + + 75,0% M. mucedo + + - - + - + - - + + + 58,3% M . racemosus f. chibinensis + - - + + + + - - + + - 58,3% M. ramosissimus + + - + - - - - - + + + 50,0% M. subtilissimus + + + + - + + + - + - + 75,0% M. fuscus - - + ------8,3% Mycocladus blakesleeanus ------+ + + + - 33,3% M. ramosus + ------+ 16,7%

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Tabela 4 Continuação. Freqüência de ocorrência de Zygomycetes nos excrementos de herbívoros da Reserva Ecológica de Dois Irmãos no Recife, Pernambuco, Brasil durante o período de junho/05 a maio/06.

Mês/ano

Zygomycetes Jul/05 Set/05 Jan/06 Fev/06 Jun/05 Dez/05 Out/05 Ago/05 Nov/05 Abr/06 Mai/06 Mar/06 Mar/06 ocorrência Freqüência Pilaira anomala - + - + ------16,7% Pilobolus crystallinus var. crystallinus + - + + + + + - - - - - 50,0% P. crystallinus var. hyalosporus - + + - + - + - - + - - 41,7% P. crystallinus var. kleinii - - + + + + + + + + - - 66,7% P. lentiger var. lentiger - - + + + - - + + + - - 50,0% P. lentiger var. minutus - - + + + + - - + - - - 41,7% P. longipes + - + - - + + + - - - - 41,7% P. roridus var. roridus - - - + + ------16,7% P. roridus var. umbonatus - - - - + ------8,30% Piptocephalis lemonnieriana - + - + ------+ 25,0% P. lepidula - + - + ------16,7% Rhizopus oryzae + - - - - - + - + - - - 25,0% Syncephalastrum racemosum + ------8,30% Syncephalis cornu - + - - - - + - - - - + 25,0% Thamnostylum piriforme + + + + + + + + + + + + 100,0% Total de espécies 15 15 16 20 14 10 15 10 12 18 11 14 + presença da espécie; - ausência da espécie

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Tabela 5: Análise de dissimilaridade (SIMPLER) da composição de espécies entre os excrementos dos herbívoros da Reserva Ecológica de Dois Irmãos no Recife, Pernambuco, Brasil.

Animais Anta Cutia nobre Cervo- Cavalo branco Lhama Camelo Jumento- Waterbuck

Anta 0% 83,1% 75,1% 90,7% 72,2% 69,8% 73,6% 85,5% Camelo 0% 90,1% 85,2% 70,6% 78,7% 68,9% 76,5% Cutia 0% 89,7% 83,2% 78,1% 81,5% 94,6% Cavalo 0% 90,7% 87,7% 88,2% 78,4% Lhama 0% 74,1% 69,8% 80,0% Cervo-nobre 0% 67,5% 82,1% Waterbuck 0% 79,0% Jumento-branco 0%

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Número de táxons A Pluviosidade

20 750

18 700 650 16 600

550 Pluviosidadeemmm 14 500 12 450 400 10 350 8 300 250 6 200 Táxons de Zygomycetes de Táxons 4 150 100 2 50 Jul/05 Set/05 Abr/06 Out/05 Jan/06 Mai/06 Jun/05 Fev/06 Mar/06 Nov/05 Dez/05 Ago/05 Mês

Número de táxons B Temperatura 22 30

18 25

16 20 14 Temparatura(ºC) 12 15 10 8 10 6 Táxons de de Zygomycetes Táxons 4 5 2

Jul/05 Set/05 Jan/06 Jun/05 Out/05 Fev/06 Abr/06 Dez/05 Mai/06 Mar/06 Ago/05 Nov/05 Mês

Figura 1. Número de táxons de Zygomycetes ocorrentes entre junho/2005 e maio/2006 em excrementos de herbívoros da Reserva Ecológica de Dois Irmãos no Recife, Pernambuco, Brasil. A. Em função da pluviosidade média mensal. B. Em função da temperatura média mensal.

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Discussão

Os resultados obtidos nesse trabalho apontam a elevada diversidade de Zygomycetes nos excrementos de herbívoros em Recife, PE, Brasil, sendo este o relato da maior ocorrência deste grupo de fungos nesse substrato, no país, com 39 táxons distribuídos em 3 ordens. A ocorrência de Zygomycetes nos excrementos de animais foi anteriormente citada por outros autores, estando os dados obtidos nesse trabalho apoiados pelos relatos de Trufem (1984), que reportou a ocorrência de Mucor hiemalis , M. mucedo , M. plumbeus , Pilaira anomala , Pilobolus crystallinus , P. kleinii , Piptocephalis repens , Syncephalis cornu e S. tengi , em excrementos de 9 diferentes herbívoros; Viriato & Trufem (1985b) e Trufem & Viriato (1985), que descreveram Mycocladus ramosus (como Absidia ramosa ), Circinella minor , C. muscae , C. umbellata , Mucor circinelloides , M. fuscus , M. hiemalis , M. mousanensis , M. mucedo , M. piriformis , Phycomyces blakesleeanus , Dispira cornuta , Piptocephalis repens , Syncephalis asymmetrica , S. cornu, S . penicillata , S. sphaerica , S. tengi e Syncephalastum verruculosum em excrementos de 10 herbívoros. Dos 23 táxons verificados pelos autores citados, 13 estão reportados neste trabalho, embora apenas as fezes cavalo e camelo tenham sido igualmente utilizadas em ambos os estudos, indicando que várias espécies de Zygomycetes não demonstram especificidade pelas fezes dos variados animais. Os resultados obtidos neste estudo corroboram os relatos de Batista (1948), Batista & Pontual (1948), Tandon (1968), Zycha et al. (1969), Nand & Mehrotra (1977), Piontelli et al. (1981), Foos & Rakestraw (1985), Caretta & Piontelli (1996), Foos (1989), Foos & Royer (1989), Hu et al. (1989), Ebersohn & Eicker (1997), Caretta et al. (1998), MCcarthy (2000), Richardson (2001a), Alves et al. (2002), Nyberg & Persson (2002) e Delgado-Ávila et al. (2005), os quais observaram a ocorrência de diferentes espécies de Zygomycetes nas fezes de diferentes animais, principalmente de herbívoros.

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Mucor e Pilobolus foram mais representativos em número de espécies (Tabelas 2 e 3). De acordo com Krug et al. (2004), apenas Pilobolus é essencialmente coprófilo, enquanto Mucor apresenta espécies coprófilas facultativas. Segundo Caretta e Piontelli (1996), mucoráceos são comuns em excrementos dos animais, podendo também ocorrer em outros tipos de matéria orgânica em decomposição. Como várias espécies de Mucor estão comumente presentes no solo (Domsch et al., 1993), alguns táxons desse gênero isolados neste trabalho podem ser originados de contaminação das fezes em contato esse substrato. Nossos dados estão de acordo com os de Alves et al. (2002), que descreveram 12 táxons de Mucor provenientes de excrementos de 10 herbívoros mantidos em cativeiro na Reserva Ecológica de Dois Irmãos e no Departamento de Zootecnia da Universidade Federal Rural de Pernambuco, Brasil, dos quais Mucor circinelloides f. circinelloides , M. circinelloides f. griseocyanus , M. circinelloides f. janssenii , M. circinelloides f. lusitanicus , M. hiemalis f. hiemalis , M. racemosus f. chibinensis e M. subtilissimus foram também isoladas no presente trabalho. Embora, dentre os excrementos dos herbívoros utilizados por Alves et al. (2002), apenas fezes de cavalo tenham sido também utilizadas para este estudo, deve-se considerar que os autores realizaram maior parte das suas coletas na Reserva de Ecológica de Dois Irmãos, estando os animais sujeitos as mesmas condições nutricionais, o que pode explicar as coincidências entre as espécies isoladas. De acordo com Pasricha et al. (1994), fatores nutricionais são determinantes na composição da micota dos excrementos. Mucor mucedo (Harper & Webster, 1964; Nagy & Harrower, 1979; Trufem, 1984; Trufem & Viriato, 1985), M. hiemalis (Trufem, 1984; Trufem & Viriato, 1985; Piontelli et al., 1981; Caretta & Piontelli, 1996), M. hiemalis f. hiemalis (Caretta et al., 1998), M. Mousanensis (Trufem & Viriato, 1985) e M. circinelloides (Piontelli et al., 1981; Trufem & Viriato,

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1985), M. racemosus (Caretta & Piontelli, 1996), foram também isoladas de excrementos de herbívoros, corroborando os dados deste trabalho. Poucos táxons como Thamnostylum piriforme , Mucor circinelloides f. circinelloides, Dispira cornuta , Circinella muscae e Pilobolus crystallinus var. kleinii apresentaram freqüência de ocorrência mais elevada (igual ou superior a 66,7%), enquanto a maioria apresentou freqüência de ocorrência baixa. Comportamento semelhante foi verificado por Richardson (2001a) e Nyberg & Persson (2002) para fungos coprófilos ocorrentes em diferentes animais. Algumas espécies exibiram preferência pelos excrementos de determinados animais, corroborando os dados de Richardson (1972), o qual verificou que espécies de Ascomycetes podem ser associadas com tipos particulares de excrementos, enquanto outras podem apresentar menor especificidade pelo substrato. Thamnostylum piriforme foi a espécie mais freqüente com F.O = 100%. Segundo Benny & Benjamin (1975), esse táxon ocorre mais comumente em excrementos, podendo, ocasionalmente, ser encontrado em solo e em matéria orgânica em decomposição. A ocorrência de espécies de Pilobolus em excrementos é bem documentada, estando os resultados referidos neste estudo apoiados pelos de Naumov (1935), Batista (1948), Batista & Pontual (1948), Nand & Mehrotra (1968, 1977), Tandon (1968), Zycha et al. (1969), Trufem (1984), Viriato & Trufem (1985), Foos & Rakestraw (1985), Foos (1989), Foos & Royer (1989) e Hu et al. (1989). Com representantes essencialmente coprófilos, Pilobolus é um dos primeiros gêneros a ocorrer nesse tipo de substrato (Dix & Webster 1995). A maioria das espécies citadas neste trabalho foi anteriormente reportada em excrementos de animais. De acordo com Krug et al. (2004), Absidia , Circinella , Mucor , Rhizopus , Piptocephalis e Syncephalis apresentam muitas espécies coprófilas e muitas não coprófilas. Dimargaris , Dispira , Pilaira e Thamnostylum apresentam espécies predominantemente

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coprófilas, embora possam ocorrer poucas espécies não coprófilas. Entretanto, Backusella , Cunninghamella , Gilbertella e Syncephalastrum apresentam espécies primariamente colonizadoras de outros substratos, podendo ocorrer uma ou mais espécies coprófilas. A análise estatística apontou diferenças significativas entre o número e composição de espécies nos excrementos dos diferentes herbívoros, com maior número de táxons nos excrementos de anta (22 táxons), cervo-nobre (21) e cutia (16) e menor número de táxons nos excrementos de cavalo (6), indicando que, dentro das condições experimentais apresentadas neste estudo, o número de espécies e a composição de Zygomycetes nos excrementos variam de acordo com o animal. Diferenças na composição de uma comunidade podem decorrer de vários fatores abiótios e bióticos. Tipos de sistema digestivo e variações na alimentação dos animais, localização geográfica, teor de umidade dos excrementos, competições intra e inter- específicas e presença de insetos e predadores podem influenciar na micota dos excrementos (Wicklow & Hirschfield, 1979; Harrower & Nagy, 1979; Hughes & Sands, 1979; Anson et al., 1985; Kuthubutheen & Webster, 1986; Pasricha et al., 1994; Caretta & Piontelli 1996; Ebersohn & Eicker 1997). Como os excrementos foram mantidos em câmaras úmidas, em condições laboratório (mesma temperatura, intensidade de luz e longe de insetos predadores), algumas dessas variáveis podem ser descartadas, sendo a alimentação dos animais e os componentes orgânicos dos excrementos limitantes para a composição da micota no presente estudo. A tabela 4 mostra que os animais foram alimentados com diferentes tipos de capins, rações e frutas, o que pode explicar as diferenças existentes no número e composição dos Zygomycetes encontradas. De acordo com a análise química dos excrementos (Tabela 2), as fezes de cavalo apresentaram teores de glicose (4,64mg/g), fósforo (4,38mg/g) e nitrogênio (1,23%) reduzidos em relação ao verificado para os outros animais. Em contraste, as fezes de anta contêm teores de glicose

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(12,24mg/g), fósforo (13,1mg/g) e nitrogênio (1,79%) mais elevados. De acordo com Dix & Webster (1995), muitos Zygomycetes (principalmente Mucorales) utilizam a glicose com principal fonte de carbono e apenas se desenvolvem em ambientes com elevados teores de nitrogênio, o que pode explicar a baixa ocorrência de Zygomycetes nos excrementos de cavalo e o elevado número de espécies nas fezes de anta. Obseva-se que cavalo foi alimentado apenas com capim-elefante e ração eqüina, enquanto anta foi alimentada com capim-elefante, verduras, além de frutas e batata doce, o que explica a maior concentração de glicose encontrada nos excrementos da anta. Os resultados apontaram variações no número de táxons ocorrentes nos excrementos dos ruminantes (25 táxons) em comparação com os excrementos dos não ruminantes (29), tendo alguns táxons exibido especificidade para as fezes de ruminantes ou de não ruminantes (Tabela 3). Entretanto, os testes não apontaram diferenças significativas no número de táxons de Zygomycetes entre os dois grupos de herbívoros, embora tenham apontado significativas variações na composição de táxons entre esses dois grupos. Os processos digestivos dos ruminantes e não ruminantes são importantes fatores seletivos na composição de espécies nos excrementos, já que as enzimas digestivas atuam por mais tempo sobre os esporos dos fungos nos ruminantes (Wicklow et al. 1980, Dix & Webster 1995). Os testes estatísticos apontaram diferenças significativas na composição de espécies de Zygomycetes nos excrementos de cada animal, nos diferentes meses do ano, embora não tenham ocorrido variações entre o número de espécies ao longo dos meses, indicando que a sazonalidade influencia na composição dos Zygomycetes, mas não no número de táxons. Semelhante ao observado neste trabalho, Viriato (2003) constatou variações na composição de Zygomycetes em fezes de 8 herbívoros em São Paulo, Brasil ao longo de 11 meses. O mesmo foi verificado por Alves et al. (2002) para táxons de Mucor em excrementos de herbívoros em Recife,

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Pernambuco, Brasil. Bell (1975), em um estudo de três anos sobre a micota em excrementos de gambá ( Trichosurus vulpecula Kerr), na Nova Zelândia, atribuiu maior ocorrência de algumas espécies de fungos às chuvas de inverno. Entretanto, Richardson (2001a) afirmou que variações de temperatura nas diferentes estações do ano também podem ter influenciado os resultados da autora, já que algumas espécies isoladas eram psicrófilas. A análise da figura 1 e tabela 2 não permite determinar um padrão de variação do número e composição de táxons de Zygomycetes nos excrementos em função da pluviosidade e da temperatura média mensal ao longo do ano. Nos meses de maior ocorrência de espécies (setembro/2005 e março/2006), as pluviosidades médias foram baixas (menores que 150mm/mês). No entanto, em novembro/2005, janeiro/2006, fevereiro/2006 e maio/06 as pluviosidades médias também foram baixas, assim como o número de táxons. Em contraste, em abril/2006 a pluviosidade média esteve acima de 300mm/mês e o número de táxons não aumentou. É provável que esta variável não influencie diretamente a ocorrência de espécies de Zygomycetes nos substratos estudados ou que o número de amostras de excrementos coletados não tenha sido satisfatório. Como a temperatura média mensal pouco variou ao longo dos meses (na maioria dos meses entre 25 e 27º C) não se pode estabelecer qualquer ligação desta variável com a composição ou número de táxons ao longo dos meses, já que a maioria dos Zygomycetes cresce bem na faixa de temperatura citada. De acordo com os resultados obtidos, verificou-se que excrementos de mamíferos herbívoros do Recife, Pernambuco, Brasil são substratos favoráveis para o crescimento de Zygomycetes. Assim como observado para outros grupos de fungos, a composição e o número de táxons de Zygomycetes nos excrementos dos herbívoros variam de acordo com a espécie do animal e parecem depender diretamente do hábito alimentar dos herbívoros. Entretanto, não se pôde constatar como, ou se, temperatura e pluviosidade influenciam a composição da micota nos excrementos ao longo

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dos meses, sendo necessários estudos mais aprofundados com aumento no número de amostras para que resultados mais conclusivos sejam alcançados.

Agradecimentos

Os autores agradecem à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo suporte financeiro fornecido ao primeiro autor e à direção do Parque Zoológico da Reserva de Dois Irmãos pela ajuda na coleta das amostras dos excrementos.

Referências

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56 Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes...

CAPÍTULO II Variabilidade genética em Mucorales isolados de excrementos de herbívoros no Parque de Dois Irmãos, Recife, Pernambuco, Brasil.

(Artigo a ser enviado para a revista Brazilian Journal of Microbiology)

Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes... 57

Variabilidade genética em Mucorales isolados de excrementos de herbívoros no Parque de Dois Irmãos, Recife, Pernambuco, Brasil.

André L. C. M. A. Santiago

RESUMO

Mucorales são fungos cosmopolitas com elevado potencial biotecnológico, podendo ser isolados de matéria orgânica vegetal e animal em decomposição, de solos e excrementos. Considerando-se que poucos estudos de variabilidade genética intra- específica têm sido realizados com representantes de Mucorales, fragmentos da região

ITS do rDNA de espécimes isolados de excrementos de mamíferos herbívoros da

Reserva Ecológica de Dois Irmãos, localizada no Recife, Pernambuco, Brasil, foram seqüenciados e as seqüências comparadas com aquelas depositadas no “GenBank” para a verificação de variabilidade genética intra-específica entre isolados de diferentes regiões geográficas. Para a construção das árvores filogenéticas, foram utilizados os métodos de máxima parcimônia e “Neighbor Joining”, com 1000 e 10.000 “bootstraps”, respectivamente. Os resultados mostraram que a comparação de seqüências da região

ITS é uma técnica viável para a verificação de diferenças gênicas inter e intra- específicas no grupo, sendo os resultados da análise de “Neighbor Joining” mais favoráveis para o estudo de variabilidade nos Mucorales. O agrupamento dos táxons com base nas seqüências de rDNA coincidiu com a identificação morfológica dos gêneros. Variações genéticas intra-específicas em Cunninghamella elegans , Mycocladus blakesleeanus e Mucor circinelloides f. circinelloides foram constatadas. Espécimes de

Rhizopus oryzae foram incluídos em um único clado, embora três dos táxons estudados pareçam mais semelhantes entre si do que com os outros espécimes. Mucor circinelloides f. circinelloides , M. circinelloides f. janssenii , M. circinelloides f.

Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes... 58 lusitanicus e M. circinelloides f. griseocyanus formaram um único grupo, não sendo possível a diferenciação entre as quatro formas com o método utilizado.

Palavras chave: Zygomycetes, seqüenciamento, rDNA, polimorfismo

INTRODUÇÃO

Mucorales são fungos cosmopolitas comumente isolados de matéria orgânica vegetal e animal em decomposição, de solos e de excrementos (2), sendo a maior ordem dentre os Mucoromycotina (10), com mais de 300 espécies descritas (9). Muitos espécimes são amplamente utilizados na biotecnologia para a síntese de enzimas (3, 7,

27) e de ácidos orgânicos (13, 17, 37, 39). Algumas espécies são parasitas e patógenas de fungos e animais, incluindo as causadoras de infecções sistêmicas em humanos, especialmente em pacientes imuno-comprometidos (8, 12, 24, 25, 28).

Estudos sobre variabilidade genética são importantes por fornecerem dados para abordagens filogenéticas e taxonômicas, análises de genética populacional e monitoramentos de amostras com potencial biotecnológico (30). Técnicas como análise de isoenzimas (30, 33, 34, 35), RAPD (19, 32), RFLP (21) e “microsatellite PCR fingerprinting” (5) têm sido aplicadas para o conhecimento de variações genéticas em

Mucorales fitopatógenos, patógenos de humanos e com potencial biotecnológico.

Entretanto, comparações das regiões ITS do rDNA têm sido raramente aplicadas para análises de variabilidade genética ao nível de subespécie (30), sendo mais freqüentemente utilizadas em estudos taxonômicos e filogenéticos de categorias acima do nível específico.

Considerando que os Mucorales são fungos cosmopolitas com elevada aplicabilidade biotecnológica, além de serem patógenos de humanos, plantas e animais e que a diversidade genética de uma espécie pode ser responsável por diferentes

Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes... 59 mecanismos de adaptabilidade e sobrevivência da mesma em diferentes hábitat e regiões geográficas, este trabalho teve como objetivos comparar as seqüências das regiões ITS do rDNA de Mucorales isolados de excrementos de mamíferos herbívoros em Recife, Pernambuco, Brasil com as seqüências (ITS) de espécies isoladas em diferentes áreas geográficas, para a constatação de variabilidade genética entre as mesmas e verificar a eficácia do estudo da região ITS do rDNA como uma alternativa segura para estudos de variabilidade intra-específica em Mucorales.

MATERIAIS E MÉTODOS

Mucorales utilizados

As 18 amostras de Mucorales utilizadas para a extração do DNA foram isoladas de excrementos de mamíferos herbívoros mantidos em cativeiro no Zoológico da

Reserva Ecológica de Dois Irmãos em Recife, Pernambuco, Brasil (Tabela 1). As sequências da região ITS do DNA dos espécimes de outros países foram obtidas no

“GenBank” (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Obtenção de micélio para extração do DNA

Esporangiósporos dos espécimes de Mucorales crescidos em meio M ágar (18) à

28ºC por 7 dias foram retirados e suspensos em 100mL de M ágar líquido (O’Donnell

1979), contidos em Erlenmeyers de 250mL, os quais foram mantidos sob agitação a 27 rpm por 120 horas à 28ºC para o crescimento do micélio. Posteriormente, o micélio foi coletado por filtração a vácuo, lavado com água destilada esterilizada, e estocado a -

20°C até o momento de uso para extração de DNA.

Extração do DNA genômico e amplificação da Região ITS do rDNA

A extração do DNA genômico foi realizada de acordo com Kuramae-Izioka et al. (15). A massa micelial foi triturada na presença de nitrogênio líquido e o micélio

Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes... 60 colocado em tubos de Eppendorf de 1,5 mL. Foram adicionados 700 µL do tampão de extração (tris-HCl 1M; pH 8,0; NaCl 5M; EDTA 0,5 mM; pH 8,0; dodecil sulfato de sódio 10%) previamente aquecido a 65°C. As amostras foram incubadas em banho- maria a 65°C, por 30 minutos, e agitadas, levemente, a cada 10 minutos. Em seguida, adicionou-se 500 µL de acetato de potássio (5M), procedendo-se a homogeneização, incubação no gelo por 30 minutos e centrifugação a 14500g por 10 minutos. Retirado o sobrenadante, um volume da solução clorofil (clorofórmio/álcool isoamílico) na proporção de 24:1, foi adicionado, seguido de centrifugação a 14500g por 10 minutos.

Após a centrifugação, o sobrenadante foi transferido para novos tubos, aos quais foi adicionado um volume de isopropanol absoluto resfriado a 4°C. Após inversão dos tubos por várias vezes, os mesmos foram centrifugados para precipitação do DNA, descartando-se o sobrenadante em seguida. O “pellet” foi lavado com etanol 75%, e as amostras submetidas à centrifugação a 14500g por 10 minutos. Após secagem em temperatura ambiente, o DNA foi ressuspendido em 70 µL de tampão TE (Tris-HCl 1M e EDTA 0,5M; pH 8,0), e a suspensão de DNA foi armazenada a -20°C até o momento do uso.

As reações de amplificação foram efetuadas para um volume final de 25µL contendo tampão 1X [Tris-HCl 20 mM; pH 8,4; KCl 50mM; MgCl 2 1,5 mM], dNTP

0,2mM, iniciador 0,2µM, Taq DNA polimerase 0,04U (“Invitrogen Life Technologies”) e 25ng de DNA. Foram utilizados os iniciadores universais para fungos ITS4 (5`-

TCCTCCGCTTATTGATATGC-3`) e ITS5 (5`-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-

3`). A amplificação da região ITS foi realizada utilizando-se o termociclador Techne

TC-512 com desnaturação inicial por 5 minutos a 94°C, 40 ciclos de amplificação com desnaturação a 94°C por 30 segundos, anelamento a 59°C por 30 segundos, elongação a

72°C por 1 minuto e extensão final a 72°C por 30 segundos. Os produtos de

Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes... 61 amplificação do locus ITS1-5.8S-ITS2 do rDNA foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,4% a 3 V/cm em tampão de corrida TBE 0,5X, pH 8,0, utilizando-se marcador de peso molecular 100pb (“Invitrogen Life Tecnologies”), corado em solução de brometo de etídio por 30 minutos e visualizado em trans-iluminador de luz ultravioleta.

Purificação do DNA e seqüenciamento da região ITS

O DNA amplificado foi purificado utilizando-se o “Kit Easy DNA” (Invitrogen) seguindo instruções do fabricante. As amostras de DNA foram seqüenciadas no Centro de Biotecnologia da Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (Esalsq)/USP utilizando seqüenciador automático ABI3100 (“Applied Biosystems”).

Análise dos dados

As seqüências das regiões ITS das espécies isoladas e as disponíveis no

“GenBank” (Tabela 2) foram alinhadas utilizando-se o programa CLUSTALX 2.0 (31).

Para a construção das árvores filogenéticas, análises de máxima parcimônia (MP) e

“Neighbor Joining” (NJ), com 1000 e 10.000 “bootstraps” (BP) foram respectivamente utilizadas com auxílio do programa Paup 4.0 Beta 10 (29). Seqüências de Endogone lactiflua (AY997045) e E. pisiformis (AY997046) foram utilizadas para representar o grupo externo, pelo fato de Endogonales ser um grupo irmão de Mucorales (36).

RESULTADOS

As árvores obtidas por MP e NJ foram similares com todos os táxons agrupados de acordo com o gênero a que pertencem. Ambas as árvores mostraram

Rhizopus como um grupo basal (C) e dois clados maiores (A e B), o primeiro contemplando espécies de Mucor e Gilbertella (BS = 100% para MP e NJ) e o segundo com representantes de Cunninghamella , Circinella , Mycocladus e Syncephalastrum

Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes... 62 com BS de 93% para NJ e 62% para MP. No entanto, as duas árvores diferenciaram-se em relação à Mucor circinelloides f. circinelloides isolada de excrementos de cutia que, na árvore obtida por NJ, foi posicionada externamente ao subclado A3 que contém M. circinelloides f. janssenii , M. circinelloides f. lusitanicus e M. circinelloides f. griseocyanus (isoladas dos excrementos de herbívoros no Recife-PE) e M. circinelloides f. circinelloides (AY 243942 e AY243943, seqüências obtidas no "GenBank") (Tabelas

3 e 4). Já na árvore obtida por MP, M. circinelloides f. circinelloides foi incluída no subclado A3. Diferenças entre as duas árvores também foram verificadas para os espécimens de C. elegans , que foram posicionados no mesmo subclado na árvore construída por MP, enquanto em NJ observou-se a formação de sucessivos grupos para os diferentes isolados desta espécie, exceto para os espécimes AF254928 e AF254929, que foram agrupados no último subclado. Em ambas as árvores, os isolados de

Mycocladus blakesleeanus , exceto pelos espécimes AY44893 e AY44894 (clones), foram posicionados em sucessivos grupos e os diferentes espécimes de Rhizopus oryzae foram agrupados em um único clado, embora os isolados AY213684, DQ990329 e

DQ641304 estejam mais próximos entre si em um subclado separado. Os dois espécimes de G. persicaria e de Syncephalastrum racemosum foram agrupados em clados à parte.

DISCUSSÃO

Os resultados mostraram que as árvores construídas utilizando análises de máxima parcimônia (MP) e “Neighbor Joining” (NJ) são similares. Foram observados três principais clados com todos os táxons agrupados de acordo com o gênero a que pertencem (baseando-se em análises morfológicas), indicando a confiabilidade das análises realizadas. As árvores mostraram que algumas espécies apresentam variabilidade genética intra-específica, sendo os resultados da análise de NJ mais

Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes... 63 favoráveis para o estudo de variabilidade nos Mucorales, já que apontaram polimosfirmo genético entre os espécimes de Cunninghamella elegans e Mucor circinelloides f. circinelloides .

Pelas análises de NJ e MP não foi constatada variabilidade genética entre

Gilbertella persicaria isolada de cervo-nobre no Brasil e o isolado AJ278362 obtido no

"GenBank", mesmo tendo sido o último proveniente dos EUA. Diferente do observado neste trabalho, Papp et al. (20), utilizando a técnica de RAPD, verificaram elevado polimorfismo em 16 diferentes isolados de G. persicaria provenientes de várias regiões da Califórnia. No entanto, deve-se considerar que apenas um (1) isolado foi utilizado no presente trabalho e que apenas uma (1) seqüência de G. persicaria encontra-se disponível para comparação no “GenBank”, o que diminui a probabilidade de serem encontradas variações genéticas. Resultados semelhantes foram observados para

Cunninghamella blakesleeana (isolada de excrementos de cutia, no Brasil) e

Syncephalastrum racemosum (isolada de excrementos de cervo-nobre, no Brasil), as quais foram comparadas com seqüências do "GenBank" de espécimes com origens na

Suíca e França, respectivamente. No entanto, verificou-se que diferentes isolados de C. elegans formaram sucessivos grupos para os diferentes espécimes, indicando a variabilidade genética entre os indivíduos de diferentes regiões geográficas. Interessante notar que os espécimes AF254928 e AF254929, mesmo tendo sido agrupados em um mesmo subclado, são originados de diferentes países, EUA e China (38), respectivamente, enquanto o espécime AF254927, mesmo sendo proveniente da China, ficou separado do AF254929. Esses dados indicam que a origem geográfica nem sempre é determinante para a variabilidade genética das espécies, já que recombinações gênicas e mutações, responsáveis por polimorfismos genéticos em organismos vivos, podem ocorrer dentro de uma mesma região geográfica (6, 22, 23). Estudos com

Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes... 64

Histoplasma capsulatum revelaram que pode haver associações entre o genótipo e as diversas áreas geográficas dentro de um mesmo país (4, 14). Considerando que o espécime AF254927 foi isolado de Hubei e que AF254929 é oriunda de Hebei

(diferentes províncias da China) (38), não parece imprópria a distância entre esses dois espécimes na árvore.

Os resultados revelaram que C. elegans e C. blakesleeana foram posicionadas em clados irmãos. Essa duas espécies foram tratadas como sinonímias por Zycha et al.

(40) e Lunn & Shipton (16). Entretanto, Zheng & Chen (38) sustentam que as espécies são diferentes, baseando-se no tamanho dos esporangíolos, que são mais largos em C. blakesleeana , além da morfologia do zigosporângio e das células suspensoras que são dissimilares entre essas espécies. Os resultados deste trabalho confirmam o entendimento de que essas espécies devem continuar separadas.

Em ambas as árvores, Mycocladus blakesleeanus isoladas no Brasil, Japão

(AY944892) e EUA (AY44893, AY44894) foram posicionadas em subclados diferentes, comprovando que esses isolados diferem geneticamente. O fato dos táxons provenientes dos Estados Unidos estarem juntos no último subclado deve-se ao fato deles serem clones.

Em relação aos espécimes de Rhizopus oryzae , verificou-se, tanto nas análises de

NJ como em MP, a formação de um grande clado com todos os representantes da espécie (BS = 100%). No entanto, os espécimes AY213684, DQ 9903329 e DQ641304

(C2) (BS = 73% para NJ e MP) parecem ser mais semelhantes entre si do que com os outros isolados. Apesar do espécime AY213684 ser de origem indeterminada, verifica- se que DQ9903329 e DQ641304 são provenientes da China, enquanto os outros são originários do Brasil [ R. oryzae (A), R. oryzae (B) e R. oryzae (C)], França (DQ119029) e Japão (AB109758). Embora os resultados não tenham indicado elevada variabilidade

Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes... 65 entre os isolados de R. oryzae , Park et al. (21) verificaram que treze espécimes de R. oryzae se agruparam em dois diferentes grupos utilizando a técnica de ITS-RFLP. Abe et al. (1), ao seqüenciarem a região ITS do DNA de nove diferentes espécimes de R. oryzae , mostraram que os táxons também se agruparam em dois diferentes clados, sugerindo, portanto, que R. oryzae fosse reclassificado e um grupo-oryzae fosse criado.

Relacionando os resultados aqui mostrados com os dos últimos autores, pode-se inferir que todos os isolados analisados neste trabalho podem pertencer a um dos dois grupos propostos por Abe et al. (1), já que os três espécimes, aparentemente mais semelhantes, não parecem estar suficientemente separados dos outros R. oryzae a ponto de representarem uma nova variedade dentro do grupo. Todavia, mais estudos envolvendo maior número de espécimes devem ser encorajados, para que resultados mais conclusivos sejam alcançados.

Pela análise de NJ foi verificado que Mucor circinelloides , isolada de excrementos de cutia no Brasil, foi posicionada externamente ao subclado que contém

M. circinelloides f. janssenii , M. circinelloides f. lusitanicus e M. circinelloides f. griseocyanus (isoladas de fezes de cervo-nobre, cavalo e "waterbuck", respectivamente no Brasil) e M. circinelloides f. circinelloides (AY243942 e AY243943) obtidos no

"Genbank", indicando que existem diferenças genéticas entre M. circinelloides f. circinelloides isolada no Brasil com os isolados cujas seqüências estão depositadas no

"GenBank". Embora os três isolados tenham origens geográficas distintas, apenas o isolado do Brasil destacou-se do subclado em questão. Como Schipper (27) diferenciou as formas de M. circinelloides baseando-se em características macroscópicas

(coloração, aspecto e diâmetro das colônias), microestruturas e diferenças de termo- tolerância, era esperado que as formas fossem agrupadas em mais de um clado, como ocorreu entre os espécimes de M. circinelloides f. circinelloides que, mesmo

Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes... 66 pertencendo à mesma forma, exibiram diferenças genéticas. É possível que a região do rDNA estudada não seja a mais adequada para a diferenciação entre essas formas. Em contrapartida, Schwarz et al. (28) afirmaram a existência de variabilidade nas regiões

ITS do rDNA de M. circinelloides (sem identificação das formas), encontrando seis diferentes pontos de divergência de bases ao longo da região ITS de cinco isolados da espécie. Entretanto, como o autor não construiu árvores filogenéticas, não se sabe se essas variações são de fato relevantes. Os resultados deste trabalho comprovam que a comparação de seqüências da região ITS do rDNA dos Mucorales é uma técnica eficaz para a comprovação de polimorfismo intra-específico em vários táxons. No entanto, os resultados não permitiram estabelecer a separação das quatro formas de Mucor circinelloides , embora diferenças morfológicas entre esses táxons tenham sido bem caracterizadas por Schipper (27), destacando-se a importância da utilização da taxonomia clássica para a diferenciação das mesmas. Como o observado por Iwen et al.

(11), a seqüência completa da região ITS está apenas disponível no "GenBank" para dois isolados de M. circinelloides f. circinelloides e apenas a seqüência parcial (ITS1) encontra-se disponível para M. circinelloides f. janssenii , o que dificulta comparações.

Como apenas um representante de cada espécie isolada dos excrementos dos herbívoros no Recife, Brasil, foi seqüenciado e, considerando-se a carência de seqüências depositadas no "GenBank", mais estudos devem ser realizados, com maior número amostras de cada espécie, para que resultados mais conclusivos sejam alcançados.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem à Mariele Leão e Daniele Maciel pela ajuda nas etapas de extração do DNA e PCR das amostras, à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa de doutorado fornecida ao primeiro autor e ao

Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes... 67

Dr. Bartolomeu dos Acioli pela ajuda com a purificação dos produtos de PCR e com a análise das seqüências.

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Tabela 1: Mucorales isolados de excrementos de herbívoros da Reserva de Dois Irmãos em Recife, Pernambuco, Brasil.

Espécies Herbívoro (excremento) Cunninghamella sp. Cutia C. blakesleeana Lendn. Cutia Circinella muscae (Sorok īn) Berl. & De Toni Anta C. umbellata Tiegh. & G. Le Monn. “Waterbuck” C. rigida G. Sm. Lhama Gilbertella persicaria (E.D. Eddy) Hesselt. Cervo-nobre Mucor circinelloides f. circinelloides Tiegh. Cutia M. circinelloides f. lusitanicus (Bruderl.) Schipper Cavalo M. circinelloides f. janssenii (Lendn.) Schipper Cervo-nobre M. circinelloides f. griseocyanus (Hagem) Schipper “Waterbuck” M. racemosus f. chibinensis (Neophyt.) Schipper Cutia M. fuscus (Berk. & M. A. Curtis) Berl. & De Toni Lhama Mycocladus blakesleeanus (Lendner) Mirza Lhama M. ramosus (Lindt) Mirza Cutia Rhizopus oryzae Went & Prins. Geerl. (A) Jumento-branco Rhizopus oryzae Went & Prins. Geerl. (B) Jumento-branco Rhizopus oryzae Went & Prins. Geerl. (C) Cutia Syncephalastrum racemosum Cohn ex J. Schröt. Cervo-nobre

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Tabela 2: Origem geográfica dos espécimes seqüenciados e disponíveis no “GenBank”.

N° de Espécie Origem geográfica acesso

Cunninghamella blakesleeana AF254932 Suíça

C. elegans Lendn. AF254927 China C. elegans AF254928 EUA C. elegans AF254929 China C. elegans EU076936 Vietnan C. elegans AF346409 Bélgica Cunninghamella echinulata var. antarctica (Caretta & Piont.) R.Y. Zheng & G.Q. Chen AF254938 Antártica

Gilbertella persicaria AJ278362 EUA G. persicaria AJ278364 EUA Mucor circinelloides f. circinelloides AY243942 Índia

M. circinelloides f. circinelloides AY243943 Holanda

Mycocladus blakesleeanus (como Absidia blakesleeana var. artrospora ) AY944892 Japão

Mycocladus blaesleeanus (como A. blakesleeana ) AY944894 EUA Mycocladus blaesleeanus (como A. blakesleeana ) AY944893 EUA Rhizopus oryzae DQ641304 China

R. oryzae DQ990329 China

Origem não R. oryzae AY213684 identificada R. oryzae DQ119029 França

R. oryzae AB109758 Japão

Syncephalastrum racemosum DQ119016 França

Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes... 75

Figura 1: Análise filogenética de Mucorales isolados de excremento de herbívoros. A

árvore é um fenograma de máxima parcimônia baseado em um alinhamento de 520 bases da região ITS do rDNA. Os números nos ramos indicam a porcentagem de recuperação de 1000 “bootstraps” (> 60%). As seqüências obtidas no “GenBank” são precedidas pelos números de acesso.

Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes... 76

Figura 2: Análise filogenética de Mucorales isolados de excremento de herbívoros. A

árvore é um fenograma de “Neighbor Joining” baseado nas distâncias de Kimura-2- parâmetros obtidas de um alinhamento de 520 bases da região ITS do rDNA. Os números nos ramos indicam a porcentagem de recuperação de 10.000 “bootstraps” (>

60%). As seqüências obtidas no “GenBank” são precedidas pelos números de acesso.

Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes... 77

CAPÍTULO III

Gilbertella persicaria (Mucorales): um novo relato para o Brasil

(Artigo publicado na Revista Mycotaxon)

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Gilbertella persicaria (Mucorales): um novo relato para o Brasil

ANDRÉ LUIZ CABRAL M. DE A. SANTIAGO , MARIA A. Q. CAVALCANTI

Resumo - Gilbertella persicaria foi isolada pela primeira vez para o Brasil a partir de excrementos de anta ( Tapirus terrestris ), jumento-branco ( Equus asinus ) e cervo ( Cervus elaphus ) coletados na Reserva Ecológica de Dois Irmãos (8°7'30" S e 34°52'30" W), localizada em Recife, Pernambuco, nordeste do Brasil. Palavras chave - Zygomycetes , Gilbertellaceae , herbivores, taxonomy Introdução Gilbertella persicaria (Eddy) Hesseltine pertence à classe Zygomycetes e tem sido descrita como “storage-hot” organismo (Papp et al. 2001). Caracteriza-se por produzir esporângios com parede persistente contendo uma sutura longitudinal que, ao romper-se, separa os mesmos em duas metades mais ou menos iguais (Benny 1991). Os esporangiósporos possuem apêndices hialinos e os zigósporos são como os de Mucor . Esta espécie foi originalmente descrita como Choanephora (Eddy 1925) por apresentar esporângios choanephoraceos e esporangiósporos com apêndices hialinos polares. Hesseltine (1960) foi o primeiro a incluir Gilbertella em Mucoraceae , considerando que esta espécie produz zigósporos tipo-Mucor . Posteriormente, vários autores como Merhotra & Merhotra (1964), Benny (1982), Hawksworth et al. (1983) e Kirk (1984) também incluíram Gilbertella em Mucoraceae . Benny (1991) propôs Gilbertellaceae como uma nova família monogenérica baseando-se apenas em caracteres morfológicos. Papp et al. (2003), baseando-se em análises moleculares de espécies de Mucor , Rhizomucor , Blakeslea , Choanephora , Poitrasia e Gilbertella , afirmaram que Gilbertellaceae ocupa posição intermediária entre Choanephoraceae e Mucoraceae . Materiais e métodos As amostras de excrementos de anta ( Tapirus terrestris ), jumento branco ( Equus asinus ) e cervo nobre ( Cervus elaphus ) foram coletadas na Reserva Ecológica de Dois Irmãos (8°7'30"S e 34°52'30"W), que inclui um Parque Zoológico, localizada em Recife, Estado de Pernambuco, Nordeste do Brasil. A área abrange 387ha, sendo uma Reserva Ecológica de Mata Atlântica. As amostras de excrementos foram coletadas com o auxílio de espátulas previamente esterilizadas, acondicionadas em sacos plásticos, levadas ao laboratório e incubadas em câmara úmidas a 28°C ± 2°C por 15 dias. As câmaras úmidas foram deixadas sobre bancada com alternância entre luz natural e escuridão

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Fragmentos do micélio foram removidos diretamente das amostras com auxílio de lupa e transferidos para a superfície do meio M ágar (O’Donnell 1979) adicionado de cloranfenicol (80mg/mL). A identificação foi realizada baseada nos aspectos macroscópicos (cor, aspecto e diâmetro das colônias) e microscópicos (microestruturas) de acordo com Benny (1991) e Mehrotra & Mehrotra (1963). Após a identificação, G. persicaria foi transferida para o meio ágar suco V8 (Benny & Benjamin 1991) para descrição.

Taxonomia Gilbertella persicaria (E.D. Eddy) Hesselt., Bull. Torrey Bot. Club 87:24.1960. Fig. 1 a-f Colônias em ágar V8, 9cm em diâmetro em 72 horas a 25°. Verso inicialmente branco e posteriormente coberto com esporângios negros, especialmente nas regiões periféricas da cultura. Esporóforos simples, eretos, alguns curvados no ápice, 12,5– 35µm diâm. Esporângios 32,5–175µm diâm., amarelos quando jovens e marrons escuros na maturidade, subglobosos e globosos a levemente achatados com parede persistente coberta com espinhos cristalinos; Esporângio maduro com sutura longitudinal separando o mesmo em duas metades mais ou menos iguais. Columela subglobosa, obovóide, piriforme e elipsóide, algumas com a base truncada, 21–93 x 22,5–55µm diâm. com parede lisa e colarinho basal evidente. Esporangiósporos hialinos, parede lisa, subglobosos a elipsóides ou fusiformes, alguns com formas irregulares 5,5–12 x 4,5–7,5µm, contendo 2-7 apêndices hialinos surgindo das extremidades de cada esporo. Clamidósporos hialinos, parede lisa, glolobos a subglobosos ou cilíndricos a doliformes 17,5-27,5 x 12,5–20µm. Zigósporos não visualizados.

80 Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes...

Fig. 1 Gilbertella persicaria A) Esporangióforo com esporângio imaturo; B) Esporangióforo com esporângio imaturo e columela; C) Columela; D) Clamidósporos; E, F) Esporangiósporos. Escala: A=25 µm; B=50 µm; C=50 µm, D=25 µm; E=25 µm; F=10 µm.

81 Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes...

Habitat: Excrementos de anta, jumento-branco e cervo. Distribuição: Índia (Mehrotra & Mehrotra 1963, 1964; Mehrotra 1966), China (Cheng & Hu 1964) e América do Norte (Butler et al. 1960, Hesseltine 1960). Este é o primeiro relato para o Brasil. Notas: As características das amostras de G. persicaria reportadas neste trabalho apresentam similaridade com as descrições de Benny (1991) e Mehrotra & Mehrotra (1963). Benny (1991) citou o crescimento radial de 8,5cm em 3 dias, coloração negra das colônias e raros esporangióforos ramificados. Entretanto, Mehrotra & Mehrotra (1963) reportaram colônias de coloração marrom e descreveram uma nova variedade, G. persicaria var. indica , com taxa de crescimento lento (5,4cm diâm. em 8 dias) e esporangióforos ramificados. Segundo Benny (1991) esta variedade é sinônimo de G. persicaria . Embora os esporangiósporos de G. persicaria pareçam lisos ao microscópio de luz, observações ultra-estruturais de Bracker (1966), O’Donnell (1979) e Whitney & Arnott (1988) mostraram que os mesmos são estriados longitudinalmente. De acordo com Benny (1991), “as ornamentações estão abaixo dos limites de resolução, exceto durante condições ótimas.” Este trabalho documenta a primeira ocorrência de G. persicaria em excrementos de anta, jumento-branco e cervo, contribuindo como o conhecimento da diversidade dos Mucorales nesses substratos. O isolamento de G. persicaria a partir de excrementos foi reportado por Cheng & Hu (1965). A partir de excrementos de herbívoros, no Brasil, apenas espécies de Mucor (Batista et al. 1961a, b, c; Trufem 1984, Trufem & Viriato 1985, Alves et al. 2002), Absidia (Batista et al. 1961a, b, c; Trufem & Viriato 1985), Circinella (Trufem & Viriato 1985), Rhizopus (Batista et al. 1961a), Syncephalastrum (Trufem 1984, Viriato & Trufem 1985b) e Phycomyces (Trufem & Viriato 1985) foram anteriormente isolados. Espécies de Pilobolus (Trufem 1984, Viriato & Trufem 1985a), Pilaira (Trufem 1984, Viriato & Trufem 1985a), Syncephalis (Trufem 1984, Viriato & Trufem 1985b), Piptocephalis (Trufem 1984, Viriato & Trufem 1985b) e Dispira (Viriato & Trufem 1985b) foram referidas, mas não isoladas a partir de excrementos no Brasil. Gilbertella persicaria pode ainda ser isolada de tomate (Mehrotra 1963), maçã, pêra (Mehrotra & Mehrotra 1963), pêssego (Hesseltine 1960, Mehrotra 1966, Ginting et al. 1996) e solo (Mehrotra & Mehrotra 1964).

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Agradecimentos

Os autores agradecem ao Dr. Paul Kirk e Dr. Gerald Benny pela revisão do artigo, Felipe Vasconcelos Reis pela revisão do inglês e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior pela bolsa de doutorado fornecida ao primeiro autor. Comentários recebidos pelo Prof. Walter Gams no primeiro rascunho também foram apreciados.

Referências Alves MH, Trufem SFB, Milanez AI. 2002. Táxons de Mucor Fresen. ( Zygomycota ) em fezes de herbívoros, Recife, PE, Brasil. Rev. bras. Bot. 25 (2): 147–160. Batista AC, Vasconcelos CT, Fischman O, Staib F. 1961a. Fungos leveduriformes e filamentosos de fezes de bovinos, no Recife. Bol. Inst. Micol. Univ. Recife 325: 1–27. Batista AC, Fishman O, Vascondelos CT, Rocha IG. 1961b. Leveduras e outros fungos das fezes de ovinos, caprinos, suínos, galináceos e animais cativos, no Recife. Bol. Inst. Micol. Univ. Recife 327:1–27. Batista AC, Vasconcelos CT, Fischman O, Silva JO. 1961c. Flora micótica intestinal de eqüinos e asininos, no Recife. Bol. Inst. Micol. Univ. Recife 326: 1–16. Benny GL. 1982. Zygomycetes . 184-195, in Parker SP (ed.), Synopsis and classification of living organisms. Vol 1. New York, McCraw-Hill Book Company. Benny GL. 1991. Gilbertellaceae, a new family of the Mucorales (Zygomycetes ). Mycologia 83 (2): 150– 157. Benny GL, Benjamin RK. 1991. The Radiomycetaceae (Mucorales ; Zygomycetes ).III. A new species of Radiomyces , and cladistic analysis and taxonomy of the family; with a discussion of evolutionary ordinal relationships in Zygomycotina . Mycologia 83(6): 713–735. Bracker CE. 1966. The ultrastructure and development of sporangia in Gilbertella persicaria . Mycologia 60: 1016–1067. Butler EE, Ogawa JM, Shalla T. 1960. Notes on Gilbertella persicaria from California. Bull. Torrey Bot. Club 87:397-401 Cheng JY, Hu FM. 1964. The Mucorales of China. I. Choanephoraceae . Acta. Phytotax. Sin. 9: 13–30. Cheng JY, Hu FM. 1965. A knew species of Gilbertella . Acta. Phytotax. Sin. 9: 13–30. Eddy ED. 1925. A Storage rot of peaches caused by a new species of Choanephora . Phytopathology 15: 607–610. Ginting C, Zehr EI, Westcott SW III. 1996. Inoculum sources and characterization of isolates of Gilbertella persicaria from peach fruit in South Carolina. Plant. Dis. 80: 1129–1134. Hawksworth DL, Sutton BC, Ainsworth GC. 1983. Ainsworth & Bisby`s dictionary of the fungi. 7. ed. Kew, Commonwealth Mycologial Institute. Hesseltine CW. 1960. Gilbertella gen. nov. ( Mucorales ). Bull.Torrey Bot. Club 87: 21–30. Kirk PM. 1984. A monograph of the Choanephoraceae . Mycol. Pap. 152:1–61. Mehrotra MD. 1963. Fruit rot of tomato caused by Gilbertella persicaria var. indica . Sydowia 17: 124– 125. Mehrotra BS, Mehrotra MD. 1963. A morphological and physiological study of Gilbertella in India. Mycologia 55: 582–594. Mehrotra BS, Mehrotra MD. 1964. Taxonomic studies of Choanephoraceae in India. Mycologia 55: 582– 594. Mehrotra MD. 1966. Fruit of hot of peach by Gilbertella persicaria var. indica from India. Micopathol. Micol. Appl. 29: 151–154. O’Donnell KL. 1979. Zygomycetes in culture. Georgia, University of Georgia. Papp T, Klára Á, Ildikó N, Erzsébet N, Vágvölgyi C. 2003. Phylogenetic relationship of the genus Gilbertella and related genera within the order Mucorales based on 5.8 S ribosomal DNA sequences. Acta Biologica Hungarica 54 (3-4): 393-402.

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CAPÍTULO IV

Pilobolus (Mucoraceae) em excrementos de herbívoros no Recife, Pernambuco, Brasil

(Trabalho enviado para a revista Mycotaxon)

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Pilobolus (Mucoraceae ) em excrementos de herbívoros no Recife, Pernambuco, Brasil

ANDRÉ LUIZ CABRAL M. DE A. SANTIAGO

Resumo - Quatro espécies de Pilobolus , incluindo sete variedades, foram estudadas a partir de excrementos dos herbívoros anta ( Tapirus terrestris ), camelo ( Camelus bactrianus ), cutia ( Dasyprocta aguti ), jumento-branco ( Equus asinus ), lhama ( Lama glama ), cavalo ( Equus caballus ), cervo-nobre ( Cervus elaphus ) e “waterbuck” ( Kobus ellipsiprymnus ), coletados na Reserva Ecológica de Dois Irmãos (8°7’30” S e 34°52’30” W), localizada em Recife, Estado de Pernambuco, Nordeste do Brasil. Pilobolus crystallinus var. hyalosporus , Pilobolus roridus var. roridus e P. roridus var. umbonatus são citadas pela primeira vez para o Brasil. Este trabalho fornece chave de identificação para as espécies de Pilobolus estudadas no Brasil. Palavras chave - Mucoromycotina , coprófilos, taxonomia Introdução Pilobolus pertence ao subfilo Mucoromycotina (Hibbett et al. 2007), família Mucoraceae , ordem Mucorales (Benny 2005) e tem sido descrito como coprófilo obrigatório (Krug et al. 2004). Grove (1934) realizou um importante estudo taxonômico que incluiu a delimitação das espécies de Pilobolus com descrições e ilustrações de nove espécies reconhecidas. Desde então, valiosas contribuições foram fornecidas por Naumov (1935), McVickar (1942), Boedijn (1959), Nand & Mehrotra (1968), Tandon (1968), Zycha et al. (1969), Nand & Mehrotra (1977), Foos & Rakestraw (1985), Zheng & Hu (1979), Foos (1989), Foos & Royer (1989), entre outros. Entretanto, o mais recente relato a respeito do gênero foi fornecido por Hu et al. (1989) que re-delimitaram Pilobolus em cinco espécies compreendendo sete variedades: P. crystallinus (F. H. Wigg.) Tode var. crystallinus , P. crystallinus var. hyalosporus (Boedijn) F. M Hu & R. Y. Zheng, P. crystallinus var. kleinii (Tiegh.) R. Y. Zheng & G. Q. Chen, P. lentiger Corda var. lentiger , P. lentiger var. minutus (Speg.) R. Y. Zheng & G. Q. Chen, P. longipes van Tiegh., P. oedipus Mont., P. roridus var. roridus (Bolt.) Pers. e P. roridus var. umbonatus (Buller) F. M. Hu & R. Y. Zheng. Considerando-se que são escassos os trabalhos com espécies de Pilobolus no Brasil (Batista 1948, Batista & Pontual 1948, Trufem 1984, Viriato e Trufem 1985) e que algumas espécies descritas são atualmente consideradas duvidosas e/ou sinônimos de outras espécies reconhecidas, este trabalho teve como objetivos descrever e ilustrar espécies de Pilobolus crescidas em excrementos de mamíferos herbívoros mantidos em cativeiro na Reserva Ecológica de Dois Irmãos em Recife, Pernambuco e elaborar chave de identificação para as espécies estudadas no Brasil.

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Materiais e métodos Amostras dos excrementos de anta ( Tapirus terrestris ), camelo ( Camelus bactrianu s), cavalo ( Equus caballus ), cervo-nobre ( Cervus elaphus ), cutia (Dasyprocta aguti ), jumento-branco ( Equus asinus ), lhama ( Lama glama) e “waterbuck” ( Kobus ellipsiprymnus ), foram coletadas na Reserva Ecológica de Dois Irmãos (8°7’30”S e 34°52’30”W), localizada em Recife, Estado de Pernambuco, Nordeste do Brasil. A área abrange 387ha, sendo uma Reserva Ecológica de Mata Atlântica. As coletas foram realizadas mensalmente de junho/2005 a maio/2006, totalizado 96 amostras de excrementos. As amostras de excrementos de cada herbívoro foram coletadas com o auxílio de espátulas previamente esterilizadas, acondicionadas em sacos plásticos, levadas ao laboratório e incubadas em câmaras úmidas a 28°C ± 2°C por 15 dias. As câmaras úmidas foram deixadas sobre bancada com alternância entre luz natural e escuridão. As espécies foram estudadas a partir do seu crescimento no próprio substrato com auxílio de estereomicroscópio e microscópio de luz. A sinonímia de cada espécie e suas variedades foram obtidas no Index Fungorum (http://www.speciesfungorum.org/Names/Names.asp). A chave de identificação inclui, além das espécies descritas nesse trabalho, Pilobolus oedipus , que foi estudada por Viriato & Trufem (1985) a partir de excrementos de cavalo em São Paulo, SP, Brasil. Taxonomia Pilobolus crystallinus (F. H. Wigg.) Tode var. crystallinus , Schrift. d. Berl. Gesell. naturf. Freunde 5: 47 (1784) Fig. 1 a-d Esporangióforos eretos, longo-cilíndricos, não ramificados, cenocíticos, parede lisa, fototrópicos positivos 1,3-10mm × 43-160 µm. Trofocistos subglobosos a elípticos, imersos no substrato, terminais, algumas vezes intercalares, 170-740 × 180-370 µm. Vesículas subesporangiais ovóides e ovóides-elípticas com pigmentação laranja na base. Esporângios hemisféricos, pretos, 55-335 × 135-440 µm. Columelas mamiformes, 155-200 × 155-290 µm. Esporangiósporos elipsóides, lisos, amarelos pálidos ou hialinos, 7,5-11 × 5-7,5 µm. Zigósporos não observados. Habitat: Excrementos de anta, camelo, jumento-branco, cervo-nobre e "waterbuck". No Brasil, há relatos de ocorrência em excrementos de caprinos (Batista 1948), camelo, cavalo, girafa, guanaco, gnu, orix-gazela (Viriato & Trufem 1985), cabra-de- malta, carneiro da montanha, orix e veado-catingueiro (Trufem 1984). Há citações de ocorrência em excrementos de búfalo (Nand & Mehrotra 1968, 1977), elefante (Hu et al. 1989, Masunga et al. 2006), raposa, canguru (Nagy & Harrower 1979, Hu et al. 1998), mula, porco, “muntjac” (Hu et al. 1998), coelho (Nagy & Harrower 1979, Hu et al. 1989, Richardson 2001), camelo (Nand & Mehrotra 1968, 1977; Hu et al. 1998), cervo, carneiro (Hu et al. 1998, Richardson 2001), cavalo, boi (Foos &

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Rakestraw 1985, Hu et al. 1998, Richardson 2001), antílope, carneiro da montanha, bisão, “muler deer” (Foos & Royer 1989), lebre (Richardson 2001), “reedbuck”, “steenbuck”, impala, "waterbuck", hipopótamo, búfalo-africano, zebu, eland (Caretta et al. 1998), gambá (Bell 1975) e alce (Nyberg & Persson 2002). Comentários: As características das amostras de Pilobolus crystallinus var. crystallinus observadas neste estudo apresentam similaridade com as descrições de Grove (1934), Boedijn (1959), Nand & Mehrotra (1968, 1977) e Hu et al. (1989). No entanto, diferentes tamanhos de esporangióforos foram descritos. Grove (1934) e Hu et al. (1989) observaram esporangióforos com 5-12mm de comprimento, diferindo de 1-3,8cm (Nand & Mehrotra 1968, 1977) e 400-800 µm (Viriato & Trufem 1985). Trufem (1984) descreveu essa estrutura com até 1,5cm. Pilobolus crystallinus var. crystallinus difere de P. crystallinus var. kleinii por apresentar esporangiósporos menores, amarelos pálidos ou hialinos (7,5-11 × 5- 7,5 µm). Esporangiósporos de P. crystallinus var. kleinii apresentaram-se amarelos intensos e maiores (10-19,5 × 5,5-8,5 µm). P. crystallinus var. kleinii (Tiegh.) R. Y. Zheng & G. Q. Chen , Mycosystema 2: 119 (1989) Fig. 1 e-h Esporangióforos eretos, longo-cilíndricos, não ramificados, cenocíticos, parede lisa, fototrópicos positivos 2,2-6,7mm × 95-155 µm. Trofocistos ovóides-cilíndricos, 310- 860 × 190-420 µm. Vesículas subesporangiais ovóides e levemente elipsóides, com pigmentação castanho-alaranjada na base, 410-600 × 330-510 µm. Esporângios hemisféricos, negros, 125-340 × 170-460 µm. Columelas cônico-cilíndricas, algumas com constrição em sua porção central, 190-230 × 250-345 µm. Esporangiósporos elípticos, amarelos intensos ou laranja-amarelados, 10-19,5 × 5,5-8,5 µm. Zigósporos não observados. Habitat: Excrementos de camelo, cavalo, lhama, jumento-branco, cervo-nobre e anta. No Brasil, há relatos em excrementos de boi (Batista 1948), cavalo, girafa, guanaco, gnu (Viriato & Trufem 1985), cabra-de-malta (Trufem 1984), camelo e orix (Trufem 1984, Viriato & Trufem 1985). A ocorrência de P. crystallinus var. kleinii em excrementos de búfalo (Nand & Mehrotra 1968, 1977), carneiro, cervo, coelho (Hu et al. 1998, Richardson 2001), elefante, raposa, canguru, mula, porco, “muntjac” (Hu et al. 1998), cavalo (Piontelli et al. 1981, Foos & Royer 1989, Hu et al. 1998) boi, camelo (Nand & Mehrotra 1968, 1977; Abdullah 1982, Hu et al. 1998, Richardson 2001), antílope, carneiro da montanha, bisão, alce (Foos & Royer 1989) e jumento (Abdullah 1982) foi previamente citada. Comentários: As características das amostras de P. crystallinus var. kleinii observadas apresentam similaridade com as descrições de Grove (1934), Naumov (1939), Boedijn (1959), Nand & Mehrotra (1968, 1977) e Hu et al. (1989). No entanto, diferenças nos tamanhos dos trofocistos de diferentes isolados foram

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reportadas. Neste trabalho, verificamos variações de 310-860 × 190-420 µm. Hu et al. (1989) e Boedijn (1959) reportaram a mesma estrutura com 40-455 × 125-295 µm e 400-460 × 200-250 µm, respectivamente. Diferente das descrições da maioria dos autores citados neste estudo, foram encontrados alguns espécimes com esporangióforos com até 1,5cm em comprimento, trofocistos subglobosos a elípticos, columelas cônicas e esporangiósporos mais largos do que o usualmente descrito para a espécie, fortemente alaranjados com 10- 17,5 × 7,5-12,5 µm. Esses espécimes apresentam esporangiósporos maiores e mais largos do que os de P. crystallinus var. crystallinus , mais largos do que os esporangiósporos de P. crystallinus var. kleinii e maiores e com coloração mais intensa do que os de P. crystallinus var. hyalosporus . No entanto, Boedijn (1959) reportou uma amostra isolada de excrementos de porco com esporangiósporos mais largos (quase ovóides) e amarelos escuros com 9-12 × 6-8µm. Segundo esse autor, essas diferenças não são suficientes para caracterizar uma nova variedade. Pilobolus crystallinus var. hyalosporus (Boedijn) F. M. Hu & R. Y. Zheng, Mycosystema 2: 119 (1989) Fig. 1 i-l Esporangióforos eretos, longo-cilíndricos, não ramificados, cenocíticos, parede lisa, fototrópicos positivos, 1-3mm × 85-125 µm. Trofocistos ovóides, alguns elipsóides, imersos no substrato, 335-500 × 200-400 µm. Vesículas subesporangiais ovóides com pigmentação laranja-clara na base, 230-730 x 210-490 µm. Esporângios hemisféricos, negros, 135-170 x 180-345 µm. Columelas mamiformes 100-190 × 90- 140 µm. Esporangiósporos ovóides, amarelos pálidos, quase hialinos, 7,5-10 × 5,5- 8µm. Zigósporos não observados. Habitat: Excrementos de anta, camelo, jumento-branco e lhama. Há relatos em excrementos de camelo, galinha, boi, cervo, burro, cavalo, macaco, rato, porco e carneiro (Hu et al. 1989). Esta é a primeira citação de Pilobolus crystallinus var. hyalosporus para o Brasil. Comentários: Pilobolus crystallinus var. hyalosporus diferencia-se de P. crystallinus var. crystallinus e de P. crystallinus var. kleinii por produzir esporangiósporos mais largos e pálidos (Hu et al. 1989). Esporangiósporos de P. crystallinus var. hyalosporus são menores do que os de P. crystallinus var. kleinii . Pilobolus lentiger Corda, Icon. Fung. (Prague) 1:22 (1837) var. lentiger Fig 1. m-p = Pilobolus borzianus Morini = Pilobolus sphaerosporus (Grove) Palla Esporangióforos eretos, longo-cilíndricos, não ramificados, cenocíticos, parede lisa, fototrópicos positivos, 1,8-6mm × 65-125 µm. Trofocistos imersos no substrato, ovóides, alguns elípticos, 290-395 × 240-330 µm. Vesículas subesporangiais

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elipsóides, lisas, com pigmentação laranja na base, algumas com pigmentação castanho-clara em alguns pontos, 310-470 × 170-350 µm. Esporângios hemisféricos, negros, 135-270 × 200-320 µm. Columelas cônico-obtusas, lisas, 160-190 × 240- 330 µm. Esporangiósporos globosos, diferentes tamanhos, amarelos, alguns alaranjados, conteúdo granuloso, 7,5-17 µm diâm. Habitat: Excrementos de anta, camelo, jumento-branco e cervo-nobre. Para o Brasil, há registros dessa espécie (com denominação de P. borzianus e P. sphaerosporus ) em excrementos de cavalo (Viriato & Trufem 1985, Richardson 2001), cabra-de- malta, camelo, girafa, gnu, orix-cimitrarra, orix-gazela, veado-catingueiro, zebra (Viriato & Trufem 1985), carneiro e capivara (Richardson 2001). De acordo com Hu et al. (1989), P. lentiger var. lentiger pode ser encontrada em excrementos de urso, camelo, gato, galinha, boi, cervo, elefante, raposa, cavalo, leopardo, macaco, rato, mula, panda, porco e carneiro. Trata-se da primeira ocorrência de P. lentiger var. lentiger para o Brasil. Comentários: Pilobolus lentiger var. lentiger apresenta vários sinônimos, tendo sido principalmente descrita como P. borzianus Morinii (Grove 1934, Boedijn 1959, Naumov 1939, Nand & Mehrotra 1968, 1977; Tandon 1968, Viriato & Trufem 1985) e como P. sphaerosporus (Grove) Palla (Grove 1934, Naumov 1939, Buller 1958, Nand & Mehrotra 1968, 1977; Zycha et al. 1969, Viriato & Trufem 1985). Hu et al. (1989) consideraram P. borzianus e P. sphaerosporus como sinônimos de Pilobolus lentiger Corda var. lentiger . Pilobolus lentiger var. lentiger assemelha-se à P. lentiger var. minutus diferenciando- se, principalmente, pelo tamanho dos esporangiósporos que são maiores em P. lentiger var. lentiger . Diferentes tamanhos de esporangiósporos foram descritos para P. borzianus : 16-23 µm diâm. (Grove 1934); 8-15 µm em diâm. (Nand & Mehrotra 1977); 9-22 µm diâm. (Viriato & Trufem 1985) e para P. sphaerosporus : 12-20 µm diâm. (Zycha et al. 1969); 6,5-12,5 µm diâm. (Nand & Mehrotra 1977) e 8-14 µm diâm. (Viriato & Trufem 1985).

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Fig 1 Pilobolus crystallinus var. crystallinus A) Vesícula subesporangial e esporângio; B) Vesícula subesporangial e columela; C) Trofocisto; D) Esporangiósporos; P. crystallinus var. kleinii E) Vesícula subesporangial e esporângio; F) Vesícula e columela; G) Trofocisto; H) Esporangiósporos; P. crystallinus var. hyalosporus I) Vesícula subesporangial e esporângio; J) Vesícula subesporangial e columela; K) Trofocisto; L) Esporangiósporos; P. lentiger var. lentiger M) Vesícula subesporangial e esporângio; N) Vesícula subesporangial e columela; O) Trofocisto; P) Esporangiósporos.

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Pilobolus lentiger var. minutus (Speg.) R. Y. Zheng & G. Q. Chen. Mycosystema 2: 122 (1989) Fig 2. a-d ≡ Pilobolus minutus Speg., = Pilobolus morinii Sacc. Esporangióforos eretos, longo-cilíndricos, não ramificados, cenocíticos, parede lisa, fototrópicos positivos, 1,3-7mm × 85-150 µm. Trofocistos subglobosos a ovóides, imersos no substrato, 180-610 × 125-270µm. Vesículas subesporangiais ovais com pigmentação laranja na base, 290-490 × 200-375 µm. Esporângios subglobosos a hemisféricos, pretos, 135-240 × 180-330 µm. Columelas cilíndricas, lisas, com leve constrição no meio, 140-230 × 130-300 µm. Esporangiósporos amarelos, globosos, 7-11 µm diâm. Zigósporos não observados. Habitat: Excrementos de anta, camelo, cutia, jumento-branco, lhama e cervo-nobre. No Brasil, há relatos de P. lentiger var. minutus , com denominação de P. morinii , em excrementos de camelo, gnu, orix-cimitarra, orix-gazela (Viriato & Trufem 1985). Segundo Hu et al. (1989), esta espécie pode ser ainda encontrada em excrementos de burro, mula e carneiro. Comentários: Pilobolus lentiger var. minutus tem sido descrita principalmente como P. morinii e P. minutus (Grove 1934, Viriato & Trufem 1985, Buller 1958, Boedijn 1959, Tandon 1968). Hu et al. (1989) consideraram essas duas espécies como sinonímias e as renomearam de P. lentiger var. minutus (Speg.) R. Y. Zheng & G. Q. Chen. Pilobolus lentiger var. minutus assemelha-se à P. lentiger var. lentiger diferenciando- se, principalmente, pelo tamanho dos esporangiósporos que são menores em P. lentiger var. minutus . Diferentes tamanhos de esporangiósporos foram descritos para P. morinii : 5-9µm diâm. (Viriato & Trufem 1985); 4,5-6µm diâm. (Grove 1934); 5,5- 7µm diâm. (Boedijn 1959). Pilobolus longipes Tiegh. Annls Sci. Nat., Bot., sér. 6 4(4): 338 (1878) [1876] Fig. 2 e-h Esporangióforos eretos, longo-cilíndricos, não ramificados, cenocíticos, parede lisa, fototrópicos positivos, 0,3-2,5cm × 90-140 µm. Trofocistos alongados horizontalmente, crescendo paralelos ao substrato, amarelos, 410-1800 µm × 240- 420 µm. Vesículas subesporangiais ovóides, lisas, 385-1300 × 290-1370 µm com pigmentação laranja na base. Esporângios globosos, alguns aplanados a hemisféricos, negros, 220-340 × 220-540 µm. Columelas cônicas, algumas com ápices arredondados, quase cilíndricas, 75-330 × 170-375 µm. Esporangiósporos globosos e subglobosos a ovóides, conteúdo amarelo, parede espessa, 10-18,5µm diâm. Zigósporos não observados.

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Habitat: Excrementos de camelo, cavalo e jumento-branco. No Brasil, P. longipes foi registrado em excrementos de zebra (Viriato & Trufem 1985), orix (Trufem 1984) e cavalo (Batista 1948, Trufem 1984, Viriato & Trufem 1985). Pilobolus longipes pode ser encontrada em excrementos de camelo, boi, elefante, cavalo, mula e carneiro (Hu et al. 1989). Comentários: As características das amostras de P. longipes reportadas nesse trabalho apresentam similaridade com as descrições de Grove (1934), Naumov (1939), Nand & Mehrotra (1968, 1977), Tandon (1968), Trufem (1984), Viriato & Trufem (1985) e Hu et al. (1989). Pilobolus longipes difere das outras espécies do gênero por apresentar trofocisto extremamente alongado, crescendo paralelamente ao substrato. Pilobolus roridus (Bolton) Pers., Syn. meth. fung. (Göttingen) 1: 118 (1801) var. roridus Fig. 2 i-l Esporangióforos eretos, longo-cilíndricos, não ramificados, cenocíticos, parede lisa, fototrópicos positivos, 3-6mm × 85-490 µm. Trofocistos ovóide-elípticos, 230-385 × 125-290 µm. Vesículas subesporangiais ovóides, com pigmentação laranja na base, 230-550 × 210-490 µm. Esporângios hemisférios, pretos, 96-150 × 130-310 µm. Columelas plano-convexas, cinza-escuras, 85-115 × 150-300 µm. Esporangiósporos elipsóides, amarelos-claros, 4-7 × 3-4,5 µm. Zigósporos não observados. Habitat: Excrementos de cavalo e jumento-branco. Pilobolus roridus var. roridus foi reportado em fezes de camelo, galinha, boi, porco, carneiro (Hu et al. 1998), cabra, pavão (Nand & Mehrotra 1968, 1977), antílope, alce, carneiro da montanha e “mule deer” (Foos & Royer 1989). Trata-se da primeira citação de P. roridus var. roridus para o Brasil. Comentários: As características das amostras de P. roridus var. roridus reportadas nesse estudo apresentam similaridade com as descrições de Grove (1934), Nand & Mehrotra (1968, 1977), Hu et al. (1989), Foos (1989) e Foos & Royer (1989). No entanto, diferenças de tamanho dos esporangióforos foram reportadas por Hu et al. (1989) e Foos (1989), que descreveram esporangióforos com 4-12mm e 2-3mm em comprimento, respectivamente. Foos & Royer (1989) reportaram esporangióforos com 1-8mm em comprimento. Nand & Mehrotra (1977) e Grove (1934) citaram 1- 1,5 e 1-2cm em comprimento, respectivamente, para a mesma estrutura. Este táxon se diferencia das outras espécies do gênero, principalmente, por apresentar o esporângio reduzido em relação à vesícula subesporangial e pela formação de columela plano-convexa cinza-escura. Pilobolus roridus var. umbonatus (Buller) F. M. Hu & H. Y. Zheng, Mycosystema 2: 129 (1989) Fig. 2 m-o

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Esporangióforos eretos, longo-cilíndricos, não ramificados, cenocíticos, parede lisa, fototrópicos positivos, 3-9mm × 85-145 µm. Trofocistos ovais, alguns napiformes, imersos no substrato, 190-395 × 140-270 µm. Vesículas subesporangiais ovóides para elipsóides com pigmentação laranja na base, 340-680 × 265-460 µm. Esporângios negros, hemisféricos e umbonados, 130-190 × 150-230 µm. Esporangiósporos elipsóides, amarelos claros a hialinos, 5-8 × 3,3-4µm diâm. Columelas não visualizadas. Zigósporos não observados. Habitat: Excrementos de cavalo. Pilobolus roridus var. umbonatus pode ser também encontrada em fezes de boi camelo, porco, carneiro (Hu et al. 1989). Pilobolus roridus var. umbonatus está sendo citada pela primeira citação para o Brasil. Comentários: As características das amostras de P. roridus var. umbonatus reportadas nesse trabalho apresentam similaridade com as descrições de Grove (1934), Nand & Mehrotra (1968, 1977) e Hu et al. (1989). Entretanto, diferenças no tamanho das vesículas foram reportadas. Hu et al. (1989) descreveram vesículas de 455-745 × 380-535 µm, enquanto Nand & Mehrotra (1977) citaram vesículas de 90- 500 × 80-400 µm. Pilobolus roridus var. umbonatus diferencia-se as outras espécies do gênero por apresentar esporângio umbonado.

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Fig. 2 Pilobolus lentiger var. minutus A) Vesícula e esporângio; B) Vesícula e columela; C) Trofocisto; D) Esporangiósporos; P. longipes E) Vesícula e esporângio; F) Vesícula e columela; G) Trofocisto; H) Esporangiósporos; P. roridus var. roridus I) Vesícula e esporângio; J) Vesícula e columela; K) Trofocisto; L) Esporangiósporos; P roridus var. umbonatus M) Vesícula e esporângio; N) Trofocisto; O) Esporangiósporos.

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Chave de identificação para espécies de Pilobolus do Brasil 1. Esporangiósporos elipsóides, se ovóides, até 10 µm em comprimento...... 2 1. Esporangiósporos globosos e subglobosos a ovóides, os últimos com até 18,5 µm diâm...... 6 2. Esporângio umbonado...... P. roridus var. umbonatus 2. Esporângio não umbonado...... 3 3. Columelas mamiformes, cônicas a cilíndricas, esporangiósporos elipsóides ou ovóides de diferentes tamanhos...... 4 3. Columelas plano convexas, cinzas-escuras, esporangiósporos elipsóides, 4-7 × 3-4,5 µm...... P. roridus var. roridus 4. Esporangióforos 1-3mm em comprimento, esporangiósporos ovóides 7,5-10 × 5,5-8µm.....P. crystallinus var. hyalosporus 4. Esporangióforos até 10mm em comprimento, esporangiósporos elipsóides...... 5 5. Columelas mamiformes, esporangiósporos amarelos ou hialinos 7,5-11 × 5-7,5 µm...... P. crystallinus var. crystallinus 5. Columelas cônicas cilíndricas, algumas levemente constritas em sua porção central, esporangiósporos amarelos intensos ou amarelos-alaranjados 10-19,5 × 5,5-8,5 µm...... P. crystallinus var. kleinii 6. Trofocistos muito longos, crescendo paralelamente ao substrato, até 1800 µm em comprimento, esporangióforos até 2,5cm em comprimento...... P. longipes 6. Trofocistos inseridos no substrato, não excedendo 610 µm em comprimento, ovóides à elípticos, subglobosos a ovóides, napiformes, esporangióforos até 7mm em comprimento...... 7 7. Esporangiósporos com parede espessa, esféricos a ovóides...... P. oedipus 7. Esporangiósporos de parede delgada, globosos...... 8 8. Columelas cônico-obtusas, 160-190 × 240-330 µm, esporangiósporos globosos de diferentes tamanhos, 7,5-17 µm diâm...... P. lentiger var. lentiger 8. Columelas cilíndricas, algumas com leve constrição no meio, 140-230 × 130-300 µm esporangiósporos globosos 7-11 µm diâm...... P. lentiger var . minutus

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Agradecimentos Os autores são gratos ao Dr. Paul Kirk e Dr. Hsiao-man Ho pela revisão deste artigo e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo suporte financeiro fornecido ao primeiro autor.

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CAPÍTULO V

Mucor guilliermondii : uma espécie rara isolada de excrementos de herbívoro nos neotrópicos

(Trabalho a ser enviado para a Revista Mycotaxon)

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Mucor guilliermondii (Mucorales ): uma espécie rara isolada de excrementos de herbívoro nos neotrópicos

ANDRÉ LUIZ CABRAL M. DE A. SANTIAGO

Resumo - Mucor guilliermondii foi isolado pela primeira vez nos neotrópicos a partir de excrementos de anta ( Tapirus terrestris ), coletados na Reserva Ecológica de Dois Irmãos (8°7’30” S e 34°52’30” W), localizada em Recife, Pernambuco, Nordeste do Brasil. Este trabalho fornece chave de identificação para espécies de Mucor isoladas de excrementos de herbívoros no Brasil.

Palavras chave - Zygomycetes , Mucoraceae , taxonomia Introdução O gênero Mucor compreende cerca de 80 espécies cosmopolitas, sendo considerado o mais representativo e estudado dentre os Mucoraceae (Domsch et al. 1995). Pertence ao subfilo Mucoromycotina (Hibbett et al. 2007), família Mucoraceae , ordem Mucorales (Benny 2005) e apresenta muitas espécies coprófilas (Krug et al. 2004). Mucor guilliermondii foi descrita por Nadson & Philippow (1925) e Schipper (1978) a partir de excrementos de barata ( Periplaneta americana ) na Rússia. Há raros relatos de isolamento de solo na Malásia (IMI 350568) e de húmus na Bélgica (MUCL 38359). Mucor guilliermondii diferencia-se das outras espécies do gênero por produzir columela cônica alongada com colarinho extremamente pequeno ou ausente e esporangiósporos elipsóides, cilíndricos a reniformes, geralmente com uma gútula em cada extremidade (Schipper 1978). Este trabalho teve como objetivo descrever M. guilliermondii isolada de excrementos de anta no Brasil. Materiais e métodos As amostras de excrementos de anta ( Tapirus terrestris ) foram coletadas no Parque Zoológico da Reserva Ecológica de Dois Irmãos (8°7’30”S e 34°52’30”W), localizada em Recife, Estado de Pernambuco, Nordeste do Brasil. A Área abrange 387ha de mata Atlântica. As amostras de excrementos foram coletadas com o auxílio de espátulas previamente esterilizadas, acondicionadas em sacos plásticos, levadas ao laboratório e incubadas em câmaras úmidas a 28°C ± 2°C por 15 dias. As câmaras úmidas foram deixadas sobre bancada com alternância entre luz natural e escuridão. Fragmentos do micélio foram retirados diretamente dos excrementos com auxílio de estereomicroscópio e transferidos para placas de Petri contendo meio batata dextrose ágar (Lacaz et al. 2002) adicionado de cloranfenicol (80mg/L). A identificação foi baseada em características macroscópicas (coloração, aspecto e diâmetro das

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colônias) e microscópicas (microestruturas), de acordo com Nadson & Philippow (1925) e Schipper (1978). Taxonomia Mucor guilliermondii Nadson & Philippow, Rev. Gén. Bot. 37: 450 (1925) Fig 1. a-d Colônias de crescimento limitado, 6,5cm diâm. e 3mm alt. em 6 dias a 26°C em BDA. Verso branco e aspecto cotonoso com bordos irregulares e reverso amarelo. Aroma levemente adocicado. Esporangióforos não ramificados, 2,7-6µm diâm., eretos, alguns curvados, colapsados. Esporângios hialinos com aspecto vítreo, amarelos, globosos e subglobosos à levemente depressos, 14,5-52,5 µm diâm. com parede lisa, transparente e deliqüescente. Columelas cônicas alongadas, raramente subglobosas e elipsóides com parede levemente incrustada, 15-30 × 5,5-14,5 µm, maioria com 15-20 × 5-9µm. Colarinho muito pequeno ou ausente. Esporangiósporos hialinos, parede lisa, 3,5-8 × 2,2-4,5 µm, elipsóides, cilíndricos a reniformes, alguns irregulares, apresentando uma gútula em cada extremidade. Alguns esporos podem conter mais de duas gotículas. Clamidósporos globosos, 12,5-23 µm, subglobosos, cilíndricos, doliformes, 10-22,5 × 8-22 µm formados no micélio submerso. Zigósporos não observados.

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Fig. 1 Mucor guilliermondii A) Esporangióforo com esporângio; B) Esporângio; C) Esporangióforo com columela; D) Esporangiósporos. Escala: A = 40 µm; B = 20 µm; C = 4 µm; D = 5 µm.

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Habitat: Excrementos de anta. Distribuição Geográfica: Rússia (CBS 174.27), Malásia (IMI 350568), Bélgica (MUCL 38359). Trata-se da primeira citação para os neotrópicos. Notas: As características das amostras de Mucor guilliermondii reportadas neste trabalho apresentam similaridade com as descrições Nadson & Philippow (1925) e Schipper (1978). Entretanto, diferenças de coloração das colônias e diâmetro dos esporangióforos foram citadas. Nadson & Philippow (1925) observaram esporangióforos mais largos (7-10 µm diâm.) em relação ao descrito por Schipper (1978) (até 7,0 µm diâm.) e pelo descrito nesse trabalho (2,7-6µm diâm.). A cor das colônias pode variar de branca (Nadson & Philippow 1925) à cinza pálido (Schipper 1978). Embora os esporangiósporos normalmente exibam uma gútula em cada extremidade, de acordo com Nadson & Philippow (1925) esse número de gútulas pode variar (3, 4 ou mais). Mucor guilliermondii foi tratada como sinônima de M. subtilissimus Oudem por Zycha (1969). Segundo Schipper (1978) “a columela quase oboclavada em M. guilliermondii , dificilmente pode ser relacionada com a columela de M. subtilissimus , que foi descrita por Oudemans (1898) como sendo globosa”. A forma globosa da columela de M. subtilissimus foi também observada por Alves et al. (2002), referindo, ainda, que os esporangióforos de M. subtilissimus apresentam constrição abaixo do esporângio e dilatação à 50 µm abaixo da columela, características não visualizadas em M. guilliermondii . Este trabalho documenta a primeira ocorrência de Mucor guilliermondii em excremento de anta, contribuindo com o conhecimento da diversidade de Mucorales nesse substrato . No Brasil, M. fuscus, M. mousanensis (Trufem & Viriato 1985) , M. mucedo, (Trufem & Viriato 1985, Trufem 1984), M. plumbeus (Trufem 1984), M. circinelloides (Trufem & Viriato 1985, Alves et al. 2002) , M. hiemalis (Trufem 1984, Trufem & Viriato 1985, Alves et al. 2002) , M. piriformis ( Trufem & Viriato 1985, Alves et al. 2002) , M. racemosus ( Batista et al. 1961a, b, c; Alves et al. 2002) , M. subtilissimus e M. genevensis (Alves et al. 2002) foram isoladas de excrementos de herbívoros.

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Chave de identificação para espécies de Mucor isoladas de excrementos de herbívoros no Brasil 1. Zygósporos presentes em cultura monospórica...... M. genevensis 1. Zigósporos ausentes em cultura monospórica...... 2 2. Micélio delicado, esporangiósporos contendo um ou mais grânulos em cada extremidade...... 3 2. Micélio vigoroso, esporangiósporos sem grânulos nas extremidades………...... ……….…. 4 3. Columelas globosas, esporangióforos com constrição perto dos esporângios jovens ou dilatação a 50 µm abaixo da columela………...... M. subtilissimus 3. Columela cônico-alongada, esporangióforos não como acima…...... …M. guilliermondii 4. Esporângio com parede persistente………………………………………………………….. 5 4. Esporângio com parede deliqüescente...... 6 5. Columelas globosas, obovóides; esporangiósporos com formas e tamanhos variados...... M. variosporus 5. Columelas cônico-alongadas ou elipsóides; esporangiósporos elipsóides, regulares em tamanho…...... M. mousanensis 6. Esporângios freqüentemente maiores do que 150 µm diâm...... 7 6. Esporângios freqüentemente menores do que150 µm diâm...... 8 7. Esporangiósporos elipsóides até 10 µm em comprimento; rápido crescimento em ágar cereja ou “acid beerwort agar”...... M. piriformis 7. Esporangiósporos cilíndrico-elipsóides, freqüentemente acima de 10 µm em comprimento; crescimento restrito em ágar cereja ou “acid beerwort agar”...... M. mucedo 8. Esporangióforos simples ou fracamente simpodialmente ramificados...... 9 8. Esporangióforos repetidamente simpodialmente ramificados...... 10 9. Columelas globosas; esporangiósporos elipsóides, fusiformes…...... M. hiemalis f. luteus 9. Columelas subglobosas com a base truncada, algumas subglobosas; esporangiósporos elipsóides, alguns com um dos lados inchado...... M. hiemalis f. hiemalis 10. Clamidósporos abundantes em esporangióforos...... M. racemosus f. chibinensis 10. Clamidósporos raros em esporangióforos...... 11 11. Esporangiósporos globosos e globosos para subglobosos, raros irregulares...... 12 11. Esporangiósporos subglobosos e elipsóides, alguns globosos...... 13 12. Esporangióforos com ramificações simpodiais e monopodiais; columela freqüentemente com projeções...... M. plumbeus 12. Esporangióforos com ramificações simpodiais; raras columelas com projeções...... M. fuscus 13. Colônias, inicialmente, brancas e, posteriormente, cinzas a 26°C em BDA …...... 14 13. Colônias inicialmente, brancas e, posteriormente, marrons a 26°C em BDA ...... 15

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14. Esporangiósporos subglobosos, alguns globosos até 7 µm diâm...... M. circinelloides f. janssenii 14. Esporangiósporos elipsóides, 5-11,2 x 2,5-6,2 µm………. M. circinelloides f. griseocyanus 15. Columelas obovóides para elipsóides, globosas nos esporângios menores...... M. circinelloides f. circinelloides 15. Columelas globosas...... M. circinelloides f. lusitanicus

Agradecimentos Os autores são gratos ao Dr. Paul Kirk e Dr. Gerald Benny pela revisão desse artigo, à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível superior (CAPES) pela bolsa de estudos de Doutorado fornecida ao primeiro autor.

Referências Alves MH, Trufem SFB, Milanez AI. 2002. Táxons de Mucor Fresen. ( Zygomycota ) em fezes de herbívoros, Recife, PE, Brasil. Rev. Bras. Bot. 25 (2): 147-160. Batista AC, Vasconcelos CT, Fischman O, Staib F. 1961a. Fungos leveduriformes e filamentosos de fezes de bovinos, no Recife. Bol. Inst. Micol. Univ. Recife 325: 1-27 Batista AC, Fishman O, Vascondelos CT, Rocha IG. 1961b. Leveduras e outros fungos das fezes de ovinos, caprinos, suínos, galináceos e animais cativos, no Recife. Bol. Inst. Micol. Univ. Recife 327:1-27. Batista AC, Vasconcelos CT, Fischman O, Silva JO. 1961c. Flora micótica intestinal de eqüinos e asininos, no Recife. Bol. Inst. Micol. Univ. Recife 326:1-16. Benny GL. 2005. Zygomycetes . Publicado na Internet em http://www.zygomycetes.org. Domsch KH, Gams W, Anderson TH. 1995. Compendium of soil fungi. Germany, IHW-Verlag. Hibbett DS, Binder M, Bischoff JF, Blackwell M, Cannon PF, Eriksson OE, Huhndorf S, James T, Kirk PM, Lücking R, Lumbsch HT, Lutzoni F, Matheny PB, Mclaughlin DJ, Powell MJ, Redhead S, Schoch CL, Spatafora JW, Stalpers JA, Vilgalys R, Aime MC, Aptroot A, Bauer R, Begerow D, Benny GL, Castlebury LA, Crous PW, Dai YC, Gams W, Geiser DM, Griffith GW, Gueidan C, Hawksworth DL, Hestmark G, Hosaka K, Humber RA, Hyde KD, Ironside JE, Kõljalg U, Kurtzman CP, Larsson KH, lichtwardt R, Longcore J, Miadlikowska J˛ Miller A, Moncalvo JM, Mozley- Standridge S, Oberwinkler F, Parmasto E, Reeb V, Rogers JD, Roux C, Ryvarden L, Sampaio JP, Schüßler A, Sugiyama J, Thorn RG, Tibell L, Untereiner WA, Walker C, Wang Z, Weir A, Weiss M, White MM, Winka K, Yao YJ, Zhang N. 2007. A higher-level phylogenetic classification of the fungi. Mycol. Res. 3: 509-547. Krug JC, Benny GL, Keller HW. 2004. Coprophilous fungi. 467-499, in GM Mueller et al. (eds.), Biodiversity of fungi. Inventory and monitoring methods. London, Elsevier Academic Press. Lacaz CS, Porto E, Martins JECM, Heins-Vaccari EM, Melo NT. 2002. Tratado de Micologia Médica. Lacaz. São Paulo, Savier. Nadson MMG, Philippow G. 1925. Une nouvelle Mucorinée. Mucor guilliermondii nov. sp. et ses forms- levures. Rev. Gén. Bot. 37: 450-463. Oudemans CAJ. 1898. Contributions a la flore mycologique des Pays-Bas. Nederl. Kruidkunding Arch. 3: 340-536. Schipper MAA. 1978. On certain species of Mucor with a key to all accepted species. Stud. Mycol. 17: 1- 69. Trufem SFB, Viriato A. 1985. Mucorales do Estado de São Paulo. 6. Mucoraceae coprófilas. Rickia 12: 113-123. Trufem SFB. 1984. Mucorales do Estado de São Paulo. 4. Espécies coprófilas. Rickia 11: 65-75. Zycha H, Siepmann R, Linnemann G. 1969. Mucorales . Germany, J. Cramer.

Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes... 105

CAPÍTULO VI

Dimargaris para o continente sul americano

(Artigo a ser enviado para a revista Mycotaxon)

106 Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes...

Dimargaris : uma nova ocorrência para o continente sul americano

ANDRÉ LUIZ CABRAL M. DE A. SANTIAGO

Resumo - Dimargaris bacillispora foi isolada pela primeira vez no continente sul americano a partir de amostras de excrementos de anta ( Tapirus terrestris ) coletadas na Reserva Ecológica de Dois Irmãos (8°7'30" S e 34°52'30" W), localizada em Recife, Pernambuco, Nordeste do Brasil. Palavras chave - Zygomycetes, Dimargaritaceae, herbívoros, taxonomia Introdução O primeiro relato de Dimargaris foi fornecido por van Tieghem (1875), o qual introduziu o gênero e descreveu Dimargaris cristalligena a partir de excrementos de rato em Paris, França. Posteriormente, valiosas contribuições foram realizadas por Benjamin (1959, 1965), Mehrotra & Baijal (1963, 1964), Boedijn (1959), Mikawa (1976), Kirk (1984) e Wrzosek & Gajowniczek (1998). Atualmente, são reconhecidas D. arida , D. bacillispora , D. cristalligena , D. oblongispora , D. simplex , D. verticillata e D. xerosporica (Benny 2005). D. bacillispora foi descrita pela primeira vez por Benjamin (1959) a partir de excrementos de rato na Califórnia EUA e, desde então, não há nenhum novo registro desta espécie. Assim como os outros representantes do gênero, D. bacillispora é parasita de Mortierellales e Mucorales (Benny 2005). Este trabalho tem como objetivo descrever D. bacillispora ocorrente em excrementos de anta em Recife, Pernambuco, Brasil. Materiais e métodos As amostras dos excrementos de anta ( Tapirus terrestris ) foram coletadas na Reserva Ecológica de Dois Irmãos (8°7'30"S e 34°52'30"W), que inclui um parque zoológico, localizada em Recife, Estado de Pernambuco, Nordeste do Brasil. A área abrange 387ha, sendo uma Reserva Ecológica de Mata Atlântica. As amostras de excrementos foram coletadas com o auxílio de espátulas previamente esterilizadas, acondicionadas em sacos plásticos, levadas ao laboratório e incubadas em câmaras úmidas a 28°C ± 2°C por 15 dias. As câmaras úmidas foram deixadas sobre bancada com alternância entre luz natural e escuridão. Dimargaris bacillispora foi estudada a partir do seu crescimento no próprio substrato, com auxílio de estereomicroscópio e microscópio de luz. O espécime foi descrito de acordo com Benjamin (1959). Taxonomia Dimargaris bacillispora R.K. Benjamin, 1959 (Aliso 4: 376) Fig 1. a-d

107 Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes...

Esporóforos eretos, sem coloração, 1,2-3,2mm alt. com ramificações simples e em verticilos, produzindo cabeças férteis em sua porção terminal. Septos contendo cavidade lenticular. Ramificações férteis , 50-400 x 6,5-12µm formadas abaixo de cada um dos septos do espororóforo principal podendo produzir uma ou duas ramificações secundárias. Células distais do esporóforo principal, 100- 210µm em comprimento. Células basais do esporóforo principal, 7,5-13µm comprimento. Cabeças férteis 30-60µm diâm. compostas por três ou quatro ramificações esporíferas divergentes. Células basais alargadas, 10-18 × 7,5- 10µm. As células das ramificações primárias produzem de uma a três células divergentes que podem formar diretamente os merosporângios ou formar novas células que produzem merosporângios. Merosporângios cilíndricos produzindo, simultaneamente, dois merosporangiosporos baciliformes, levemente curvados, 5- 6 (-7,5) × 1,5-2,5µm contendo uma gútula em cada extremidade. Zigósporos não visualizados. Todas as células das cabeças esporíferas, exceto por poucas células proximais das ramificações primárias e secundárias, desarticulam-se, quando maduras, formando, junto com os merosporangiosporos imersos em gotas de líquido, esferas brancas e brilhosas de 22-45µm diam.

108 Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes...

Fig 1. Dimargaris bacillispora A, B) Esporóforos e cabeças férteis em diferentes estágios de desenvolvimento; C) Hifa com septo e cavidade lenticular; D) Merosporangiosporos. Escala: A = 25 µm; B = 25 µm; C = 10 µm; D = 5 µm.

109 Santiago, A. L. C. M. A. Estudo taxonômico e molecular de Zygomycetes...

Habitat: Excremento de anta. Distribuição: Mexico, Califórnia, Flórida, Arizona (EUA) e Paquistão. Trata-se da primeira citação para a América do Sul. Notas: As características do espécime descrito neste trabalho apresentam similaridade com a descrição de Benjamin (1959). Mehrotra & Baijal (1963) reportaram uma espécie isolada de excrementos de boi na Índia denominada D. oblongispora que, segundo os autores, se aproxima de D. bacillispora , diferenciando-se por apresentar esporos oblongos e ramificações dos esporangióforos geralmente septadas. Entretanto, de acordo com Kirk (1984), pela descrição e ilustrações, D. oblongispora não parece ser significantemente diferente de D. bacillispora , devendo as duas espécies serem tratadas como sinônimas. Diferente do observado por Benjamin (1959), os merosporangiosporos do espécime descrito neste trabalho exibem uma gútula em cada extremidade. No entanto, essa característica não parece ser suficiente para a caracterização de uma nova variedade. Este manuscrito relata a primeira ocorrência de Dimargaris na América do Sul, em excrementos de anta (Tapirus terrestris ), elevando o conhecimento da diversidade de Dimargaritales nesse substrato. Dentre os representantes desta ordem, apenas Dispira cornuta (Viritato & Trufem 1985) foi reportada para o Brasil. Agradecimentos Os autores são gratos ao Dr. Gerald Benny e Dr. Walter Gams pela revisão deste artigo e à Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível superior (CAPES) pela bolsa de estudos de Doutorado fornecida ao primeiro autor.

Referências Benjamin RK. 1959. The merosporangiferous Mucorales . Aliso 4: 321-433. Benjamin RK. 1965. Addenda to ‘the merosporangiferous Mucorales ’ III. Dimargaris . Aliso 6: 1-10. Benny GL. 2005. Zygomycetes . Publicado na Internet em http://www.zygomycetes.org. Boedijn KB. 1959. Notes on the Mucorales of Indonesia. Sydowia 12: 321-362. Kirk PM, Kirk JP. 1984. Dimargaris , a genus new to the British isles. Trans. Brit. Mycol. Soc. 82:551-553. Mehrotra BS, Baijal U. 1963. A new species of Dimargaris from India. Canadian Journal of Botany 41: 499-502. Mehrotra BS, Baijal U. 1964. Dimargaris verticillata Benjamin var. xerosporica var. nov. and Dimargaris simplex sp. nov. from India. Zentralbl. Bakteriol. Hyg., 2 Abt. 118:171-177. Mikawa T. 1976. Materials for the fungus flora of Japan (21). Trans. Mycol. Soc. Japan 17: 4-8. van Tieghem P. 1875. Nouvelles recherché sur les Mucorinées. Ann. Sci. Nat. Bot. Sér. (6) 1:154. Viriato A, Trufem SFB. 1985. Mucorales de São Paulo. 7. Espécies Merosporangiadas. Rickia 12:147-154. Wrzosek M, Gajowniczek Z. 1998. Some zygomycetous fungi new to Poland. Acta Mycol. 33: 265- 271.

110

2 - CONCLUSÕES GERAIS

De acordo com os resultados obtidos, dentro das condições conduzidas, conclui-se que:

• Excrementos de anta, cutia, cervo-nobre, “waterbuck”, lhama, jumento-branco,

cavalo e camelo são favoráveis para o crescimento de Zygomycetes;

• Pelo menos, trinta e nove táxons de Zygomycetes ocorrem em excrementos de

herbívoros na Reserva Ecológica de Dois Irmãos em Recife, PE, Brasil, sendo

Mucorales a ordem mais representada em número de táxons;

• Ruminantes e não ruminantes apresentam Zygomicota variada;

• Gilbertella persicaria , Pilobolus crystallinus var. hyalosporus , P. roridus var.

roridus , P. roridus var. umbonatu s e Piptocephalis lepidula constituem

primeiras referências para o Brasil. Mucor guilliermondii e Dimargaris

bacillispora são novas ocorrências para os neotrópicos e América do Sul,

respectivamente;

• A composição dos Zygomycetes varia nos excrementos dos diferentes

herbívoros;

• A sazonalidade influencia a composição de Zygomycetes nos excrementos dos

herbívoros estudados, mas não o número de táxons ocorrentes;

• Certas espécies de Zygomycetes são mais específicas do que outras em relação à

ocorrência nos excrementos de herbívoros;

• O seqüenciamento da região ITS do rDNA é uma técnica eficaz para a

verificação de variabilidade intra-específica em Mucorales, embora não seja

capaz de diferenciar as formas (f.) de Mucor circinelloides ;

• Isolados de Cunninghamella elegans , Mycocladus blakesleeanus e Mucor

circinelloides f. circinelloides , provenientes de diferentes países, apresentam

111 variabilidade genética intra-específica na região ITS do rDNA, o que não ocorre com isolados de Rhizopus oryzae oriundos do Brasil, França, Japão e China.

ANEXOS

MYCOTAXON Volume 102, pp. 333-337 October-December, 2007

Gilbertella persicaria (Mucorales ): a new record from Brazil

ANDRÉ LUIZ CABRAL M. DE A. SANTIAGO & MARIA A. Q. CAVALCANTI [email protected], [email protected] Programa de Pós-graduação em Biologia de Fungos Universidade Federal de Pernambuco Av. Prof. Nelson Chaves, s/n, 5670-420, Recife, PE, Brasil

Abstract — Gilbertella persicaria was isolated for the first time in Brazil, from tapir (Tapirus terrestris ), white donkey ( Equus asinus ) and elk ( Cervus elaphus) dung collected at the Reserva Ecológica de Dois Irmãos (8°7'30" S and 34°52'30" W), located in Recife, State of Pernambuco, Northeast Brazil. Key words — Zygomycetes , Gilbertellaceae , herbivores, taxonomy

Introduction Gilbertella persicaria belongs to the class Zygomycetes and has been described as a storage-rot microorganism (Papp et al. 2001). It is characterized by producing sporangia with a persistent wall with a longitudinal suture where it separates into two more or less equal halves (Benny 1991). The sporangiospores bear hyaline appendages and the zygospores are Mucor -type. This species was originally described as Choanephora (Eddy 1925) because of the choanephoraceous sporangia and sporangiophore with polar, hyaline appendices. Hesseltine (1960) was the first to include Gilbertella in the Mucoraceae based on the production of Mucor -type zygospores. Later, several authors (Mehrotra & Mehrotra 1964, Benny 1982, Hawksworth et al. 1983, Kirk 1984) also included Gilbertella in the Mucoraceae . Benny (1991) introduced Gilbertellaceae as a new monogeneric family based only on morphological characters. Papp et al. (2003), based on molecular analyses of species of Mucor , Rhizomucor , Blakeslea , Choanephora , Poitrasia and Gilbertella , affirmed that Gilbertellaceae occupies an intermediate position between Choanephoraceae and Mucoraceae .

Material and methods The samples of tapir ( Tapirus terrestris ), white donkey ( Equus asinus ) and elk (Cervus elaphus ) dung were collected at Reserva Ecológica de Dois Irmãos

(8°7'30"S and 34°52'30"W), which includes a Zoological Park and is located in Recife, State of Pernambuco, Northeast Brazil. The area contains 387 ha and is an Atlantic Forest Ecological Reserve. The samples of dung were collected with a sterilized spatula, placed in plastic bags, taken to the laboratory and incubated in moist chamber. Fragments of mycelium were removed directly from the samples at the stereomicroscope and transferred to the surface of the M agar (O’Donnell 1979) plus chloranphenicol medium. The identification was made based on macroscopic (color, aspect and diameter of the colonies) and microscopic (microstructures) aspects according to Benny (1991) and Mehrotra & Mehrotra (1963). After identification, G. persicaria was transferred to V8 juice agar (Benny & Benjamin 1991) medium.

Taxonomy Gilbertella persicaria (E.D. Eddy) Hesselt., Bull. Torrey Bot. Club 87:24.1960. Fig. 1 a-f Colony on V8 juice agar, 9cm diam in 72 hour at 25°C. White at first, later covered with black sporangia, especially in the peripheral regions of the culture. Sporophores simple, erect, some bending in the apex, 12.5-35 µm diam. Sporangia 32–175 µm diam, yellow when young and dark brown at maturity, subglobose to globose, slightly flattened, with a persistent wall and covered with crystalline spines; mature sporangia with a longitudinal suture, the sporangium separating into two halves. Columellae subglobose, obovoid, pyriform and ellipsoid, some with a truncate base, 21–93 × 22.5–55 µm in diam with smooth wall and distinct basal collar. Sporangiospores hyaline, smooth-walled, subglobose to ellipsoid or fusiform, some irregular in shape, 5.5–12 × 4.5–7.5 µm, with 2-7 hyaline appendages arising from the ends of each spore. Chlamydospores hyaline, smooth-walled, globose to subglobose or cylindrical to doliiform, 17.5-27.5 × 12.5–20 µm. Zygospores not observed. Habitat: tapir ( Tapirus terrestris ), white donkey ( Equus asinus ) and elk ( Cervus elaphus. ) dung. Distribution: India (Mehrotra & Mehrotra 1963, 1964; Mehrotra 1966), China (Cheng & Hu 1964) and North America (Butler et al. 1960, Hesseltine 1960). This is the first report in Brazil. Remarks: The characteristics of the strains of G. persicaria reported here show a close similarity with the descriptions of Benny (1991) and Mehrotra & Mehrotra (1963). Further, Benny (1991) cited a radial growth of 8.5 cm in 3 days, a black colony color and rare branched sporophores. However, Mehrotra & Mehrotra (1963) reported colonies with brown coloration and described a new variety, G. persicaria var. indica , with a slow growth rate (5.4 cm diam in 8 days) and branched sporophores. According to Benny (1991), this variety is a synonym of G. persicaria .

Fig. 1 Gilbertella persicaria A) Sporophore with mature sporangia; B) Sporophore with immature sporangia and columellae: C) Columellae; D) Chlamydospores; E, F) Sporangiospores. Scale bars: A=25 µm; B=50 µm; C=50 µm, D=25 µm; E=25 µm; F=10 µm.

Although G. persicaria sporangiospores appear to be smooth under LM, ultrastructural observations of Bracker (1966), O’Donnell (1979), and Whitney & Arnott (1988) showed that they are longitudinally striate. According to Benny (1991), ‘the ornaments are below the limits of resolution except during the most optimal conditions.’ This paper reports the first occurrence of G. persicaria for tapir ( Tapirus terrestris ), white donkey ( Equus asinus ) and elk ( Cervus elaphus ) dung, contributing with the

knowledge of Mucorales diversity on these substrata. Isolation of G. persicaria from dung was reported by Cheng & Hu (1965). From herbivore dung in Brazil, only species of Mucor (Batista et al. 1961a, b, c; Trufem 1984, Trufem & Viriato 1985, Alves et al. 2002) Absidia (Batista et al. 1961a, b, c; Trufem & Viriato 1985), Circinella (Trufem & Viriato 1985), Rhizopus (Batista et al. 1961a), Syncephalastrum (Trufem 1984, Viriato & Trufem 1985b) and Phycomyces (Trufem & Viriato 1985) had been previously isolated. Species of Pilobolus (Trufem 1984, Viriato & Trufem 1985a), Pilaira (Trufem 1984, Viriato & Trufem 1985a), Syncephalis (Trufem 1984, Viriato & Trufem 1985b), Piptocephalis (Trufem 1984, Viriato & Trufem 1985b) and Dispira (Viriato & Trufem 1985b) were also reported, but not isolated, from dung in Brazil. Gilbertella persicaria may also be isolated from tomato (Mehrotra 1963), apple, pear (Mehrotra & Mehrotra 1963), peach (Hesseltine 1960, Mehrotra 1966, Ginting et al. 1996), and soil (Mehrotra & Mehrotra 1964).

Acknowledgments The authors are thankful to Dr. Paul Kirk and Dr. Gerald Benny for article review, Felipe Vasconcelos Reis for English review and Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nivel Superior for PhD Scholarship provided to the first author. Comments received from Prof. Walter Gams on an early draft are also appreciated.

References

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MYCOTAXON Mycotaxon Styles 2 Revised, February, 2007

Pilobolus (Mucoraceae ) from herbivore dung in Recife, PE, Brazil

1 1 ANDRÉ LUIZ CABRAL M . DE A . SANTIAGO , MARIA A . Q. CAVALCANTI & SANDRA 2 FARTO BOTELHO TRUFEM [email protected], [email protected] , [email protected] 1Programa de Pós-graduação em Biologia de Fungos. Universidade Federal de Pernambuco. Av. Prof. Nelson Chaves, s/n, 50670-420, Recife, PE, Brasil; 2Universidade São Marcus. Av. Nazaré 900, 04262-100, São Paulo, SP, Brasil.

Abstract — Four species of Pilobolus , including seven varieties, were studied from tapir (Tapirus terrestris ), camel ( Camelus bactrianus ), agouti ( Dasyprocta aguti ), white donkey ( Equus asinus ), lhama ( Lhama glama ), horse ( Equus caballus ), deer ( Cervus elaphus ) and waterbuck ( Kobus ellipsiprymnus ), dung collected at the Reserva Ecológica de Dois Irmãos (8°7'30" S and 34°52'30" W), located in Recife, State of Pernambuco, Northeast Brazil. Pilobolus crystallinus var. hyalosporus (Boedijn) F. M. Hu & R. Y. Zheng, Pilobolus roridus var. roridus (Bolton) Pers. and P. roridus var. umbonatus (Buller) F. M. Hu & H. Y. Zheng are cited for the first time in Brazil. This manuscript also provides an identification key for species of Pilobolus studied in Brazil. Key words —Mucoromycotina , coprophilous, taxonomy

Introduction Pilobolus belongs to the subphylum Mucoromycotina (Hibbett et al. 2007), family Mucoraceae , order Mucorales (Benny 2005) and has been described as obligate coprophilous (Krug et al. 2004). Grove (1934) provided an important taxonomic study which included a delimitation of the species of Pilobolus , descriptions and illustrations of eight recognized species out of which seven were considered doubtful. Since then, valuable contributions have been given by Naumov (1939), McVickar (1942), Boedijn (1958), Nand & Mehrotra (1968, 1977), Tandon (1968), Zycha et al. (1969), Zheng & Hu (1979), Foos & Rakestraw (1985), Foos (1989), Foos & Royer (1989), among others. However, the latest study regarding to this genus was given by Hu et al. (1989) who re-delimited Pilobolus into five species comprising seven varieties: P. crystallinus (F. H. Wigg.) Tode var. crystallinus , P. crystallinus var. hyalosporus (Boedijn) F. M. Hu & R. Y. Zheng, P. crystallinus var. kleinii (Tiegh.) R. Y. Zheng & G. Q. Chen, P. lentiger Corda var. lentiger , P. lentiger var. minutus (Speg.) R. Y. Zheng & G. Q. Chen, P. longipes van Tiegh., P. oedipus Mont., P. roridus var. roridus (Bolt.) Pers. and P. roridus var. umbonatus (Buller) F. M. Hu & R. Y. Zheng.

Considering the few reports related to Pilobolus species in Brazil (Batista 1948, Batista & Pontual 1948, Trufem 1984, Viriato & Trufem 1985) and that some described species are doubtful and/or synonyms of other recognized species, the aims of this manuscript were to describe and illustrate species of Pilobolus from mammalian herbivores dung, kept in captivity, in Recife, PE, and to provide an identification key for Pilobolus studied in Brazil.

Material and methods Samples of tapir ( Tapirus terrestris Linnaeus 1758), camel ( Camelus bactrianus Linnaeus 1758), agouti ( Dasyprocta aguti Linnaeus 1766), white donkey ( Equus asinus Linnaeus 1758), lhama ( Lhama glama Linnaeus 1758), horse ( Equus caballus Linnaeus 1758), deer ( Cervus elaphus Linnaeus 1758) and waterbuck ( Kobus ellipsiprymnus Ogilby 1833) dung were collected at the Reserva Ecológica de Dois Irmãos (8°7'30"S and 34°52'30"W) which includes a Zoological Park and is located in Recife, State of Pernambuco, Northeast of Brazil. The area contains 387 ha, and is an Atlantic Forest Ecological Reserve. The samples were monthly collected, from june/2005 to may/2006, totalizing 96 dung samples. They were collected with a sterilized spatula, placed in plastic bags, taken to the laboratory and incubated in moist chamber at 28°C ± 2°C for 7 days under light and dark periods. The specimens were studied directly from the substrata under stereomicroscope and light microscope. Synonymies of each species and their varieties were obtained from Index Fungorum (http://www.speciesfungorum.org/Names/Names.asp). In addition to the species here studied, the identification key provided for this manuscript includes Pilobolus oedipus which was studied by Viriato & Trufem (1985) from horse dung in Sao Paulo, SP, Brazil. Taxonomy Pilobolus crystallinus (F. H. Wigg.) Tode var. crystallinus , Schrift. d. Berl. Gesell. naturf. Freunde 5: 47 (1784) Fig. 1 a-d = Hydrogera crystallina F. H. Wigg., Prim. fl. holsat. (Kiliae): 110 (1780). = Mucor obliquus Scop., Fl. carniol., Edn 2 (Wien) 2: 494 (1772). = Pilobolus crystallinus (F. H. Wigg.) Tode, Schr. naturf. Fr. Berlin 5: 96 (1784). = Pilobolus ramosus McVickar , Am. J. Bot. 29: 379 (1942). = Pilobolus schmidtii Sacc., Syll. Fung. (Abellini) 24 (1): 11 (1926). = Pilobolus simplex McVickar, Am. J. Bot. 29: 379 (1942). Sporangiophores erect, long-cylindrical, unbranched, nonseptate, smooth-walled, phototrophic, 1.3-10 mm × 43-160 µm. Trophocysts subglobose to ellipsoid, buried in the substratum, terminal, sometimes intercalary, 170-740 × 180-370 µm. Subsporangial swellings ovoid and ovoid-ellipsoid, orange at the base, 130-200 × 155-235 µm. Sporangia hemispherical, black, 55-335 × 135-440 µm. Columellae

nipple-like, 155-200 × 155-290 µm. Sporangiospores ellipsoid, smooth-walled, pale yellow or hyaline, 7.5-11 × 5-7.5 µm. Zygospores not found. Habitat: Tapir, camel, white donkey, elk and waterbuck dung. In Brazil, P. crystallinus var. crystallinus was found in goat (Batista 1948), camel, horse, giraffe, guanaco, wildebeest, (Viriato & Trufem 1985), bighorn sheep, gemsbok and brocket deer (Trufem 1984) dung. This species was also observed on buffalo (Nand & Mehrotra 1968, 1977), elephant (Hu et al. 1989, Masunga et al. 2006), kangaroo (Nagy & Harrower 1979, Hu et al. 1998), fox, mule, pig, muntjac (Hu et al. 1998), rabbit (Nagy & Harrower 1979, Hu et al. 1989, Richardson 2001), camel (Nand & Mehrotra 1968, 1977; Hu et al. 1998), deer, sheep (Hu et al. 1998, Richardson 2001), horse, cow (Foos & Rakestraw 1985, Hu et al. 1998, Richardson 2001), antelope, bighorn sheep, bison, muler deer (Foos & Royer 1989), hare (Richardson 2001), reedbuck, steenbuck, impala, waterbuck, hippopotamus, african buffalo, zebu, eland (Caretta et al. 1998), opossum (Bell 1975) and moose (Nyberg & Persson 2002) dung . Notes: The characteristics of the strains of P. crystallinus var. crystallinus reported here show a close similarity with the descriptions by Grove (1934), Boedijn (1958), Nand & Mehrotra (1968, 1977) and Hu et al. (1989). However, different size of sporangiophores has been reported. Grove (1934) and Hu et al. (1989) observed sporangiophores with 5-12 mm in length, differing from 1-3.8 cm (Nand & Mehrotra 1968, 1977) and 400-800 µm (Viriato & Trufem 1985). Trufem (1984) described this structure up to 1.5 cm. Pilobolus crystallinus var. crystallinus differs from P. crystallinus var. kleinii mainly for possessing smaller, pale yellow or hyaline sporangiospores (7.5-11 × 5-7.5 µm). Sporangiospores of P. crystallinus var. kleinii are intense yellow and larger (10-19.5 × 5.5-8.5 µm). P. crystallinus var. kleinii (Tiegh.) R. Y. Zheng & G. Q. Chen , Mycosystema 2: 119 (1989) Fig. 1 e-h = Hydrogera kleinii (Tiegh.) Kuntze, Revis. gen. pl. (Leipzig) 2: 855 (1891). = Pilobolus crystallinus sensu Klein (Jb. Wiss. Bot. 8: 360 (1872); fide Saccardo (1888). = Pilobolus gracilis Lyr, Arch. Protistenk. 99: 288 (1954). = Pilobolus heterosporus Palla, Öst. Bot. Z. 50: 349 (1900). = Pilobolus Kleinii Tiegh., Annls Sci. Nat., Bot., sér. 6 4(4): 337 (1878) [1876]. = Pilobolus Kleinii subsp. hallensis Lyr, Arch. Protistenk. 99: 288 (1954). = Pilobolus roseus Speg., Anal. Soc. cient. argent 9: 175 (1880). Sporangiophores erect, long-cylindrical, unbranched, nonseptate, smooth-walled, phototrophic, 2.2-6.7 mm × 95-155 µm. Trofocysts buried in the substratum, ovoid- cylindrical, 310-860 × 190-420 µm. Subsporangial swellings ovoid and slightly ellipsoid, orange brown at base, 410-600 × 330-510 µm. Sporangia hemispherical,

black, 125-340 × 170-460 µm. Columellae conical-cylindrical, some slightly narrowed at the middle, 190-230 × 250-345 µm. Sporangiospores ellipsoid, intense yellow or orange-yellow, 10-19.5 × 5.5-8.5 µm. Zygospores not found. Habitat: Camel, horse, lhama, white donkey, deer and tapir. In Brazil, there are reports from cow (Batista 1948), horse, giraffe, guanaco, gnu (Viriato & Trufem 1985), camel and gemsbok (Trufem 1984, Viriato & Trufem 1985) dung. The occurrence of P. crystallinus var. kleinii in buffalo (Nand & Mehrotra 1968, 1977), sheep, deer, rabbit (Caretta & Piontelli 1996, Hu et al. 1998, Richardson 2001), elephant, fox, kangaroo, mule, pig, muntjac (Hu et al. 1998), horse (Piontelli et al. 1981, Foos & Royer 1989, Hu et al. 1998) cow, camel (Nand & Mehrotra 1968, 1977; Abdullah 1982, Hu et al. 1998, Richardson 2001), antelope, bighorn sheep, moose (Foos & Royer 1989) and donkey (Abdullah 1982) dung was previously cited. Notes: The characteristics of the strains of Pilobolus crystallinus var. kleinii reported here show a close similarity with the descriptions of Grove (1934), Naumov (1939), Boedijn (1958), Nand & Mehrotra (1968, 1977) and Hu et al. (1989). However, different sizes of trofocysts were reported by several authors. We observed trofocysts with 310-860 × 190-420 µm, but Hu et al. (1989) and Boedijn (1958) reported trofocysts with 140-455 × 125-295 µm and 400-460 × 200-250 µm, respectively. Different from what most authors have cited, we found some specimens with sporangiophores up to 1.5 cm in length, trofocysts subglobose to ellipsoid, collumelae conical and sporangiospores broader, strong orange, 10-17.5 × 7.5-12.5. These specimens produces bigger and broader sporangiospores than those of P. crystallinus var. crystallinus , broader sporangiospores than that described to P. crystallinus var. kleinii and bigger sporangiospores, with more intense color than those referred to P. crystallinus var. hyalosporus . However, Boedijn (1968) reported an isolate from pig dung with broader (9-12 × 6-8 µm) and dark yellow sporangiospores. According to this author, these differences are not enough to characterize a new variety. Pilobolus crystallinus var. hyalosporus (Boedijn) F. M. Hu & R. Y. Zheng, Mycosystema 2: 119 (1989) Fig. 1 i-l = Pilobolus hyalosporus Boedijn, Sydowia 12: 340 (1959). Sporangiophores erect, long-cylindrical, unbranched, nonseptate, smooth-walled, phototrophic, 1-3 mm × 85-125 µm. Trofocysts buried in the substratum, ovoid, some elliptical, 335-500 × 200-400 µm. Subsporangial swellings ovoid, light orange at base, 230-730 × 210-490 µm. Sporangia hemispherical, black, 135-170 × 180-345 µm. Columellae nipple-like 100-190 × 90-140 µm. Sporangiospores ovoid, pale yellow, almost hyaline, 7.5-10 × 5.5-8 µm. Zygospores not found.

Habitat: Tapir, camel, white donkey and lhama dung. There are occurrence reports from camel, chicken, cow, deer, mule, horse, monkey, rat, pig and sheep dung (Hu et al. 1989). This is the first record of P. crystallinus var. hyalosporus for Brazil. Notes: Pilobolus crystallinus var. hyalosporus differs from P. crystallinus var. crystallinus and from P. crystallinus var. kleinii for producing broader sporangiospores pale in color (Hu et al. 1989). Sporangiospores of P. crystallinus var. hyalosporus are also shorter than those of P. crystallinus var. kleinii. Pilobolus lentiger Corda, Icon. Fung. (Prague) 1:22 (1837) var. lentiger Fig 1. m- p = Pilobolus borzianus Morini, Mem. R. Acad. Sci., Bologna, Ser. 4 3: 126 (1905) [1904]. = Pilobolus borzianus var. geminatus Morini, Rc. Secc. Accad. Sci. Ist. Bologna, sér. 6 6: 123 (1909). = Pilobolus crystallinus sensu Bonorden; fide Saccardo (1888). = Pilobolus exiguus Bainier, Étud. Mucor., (Tèse, Paris) (Paris): 47(1882). = Pilobolus kleinii f. sphaerospora Grove, J. Bot., London 22: 132 (1884). = Pilobolus kleinii var. sphaerosporus (Grove) A. Fisch., Rabenhorst`s Kryptogamenfl., 1. Abt. 1(6): 263 (1892). = Pilobolus lentiger Corda, Icon. fung. (Prague) 1: 22 (1837). = Pilobolus lentiger var. macrosporus Berl. & De Toni, in Berlese, De Tony & Fischer, Syll. fung. (Abellini) 7: 188 (1888). = Pilobolus sphaerosporus (Grove) Palla, Öst. bot. Z. 50: 365 (1900). = Pycnopodium lentigerum Corda, Icon fung. (Prague) 5: 18 (1842). Sporangiophores erect, long-cylindrical, unbranched, nonseptate, smooth-walled, phototrophic, 1.8-6 mm × 65-125 µm. Trofocysts buried in the substratum, ovoid , some elliptical, 290-395 × 240-330 µm. Subsporangial swellings elliptical, smooth- walled, orange at base, some filled with light orange brown pigment, 310-470 × 170- 350 µm. Sporangia hemispherical, black, 135-270 × 200-320 µm. Columellae obtusely conical, smooth-walled, 160-190 × 240-330 µm. Sporangiospores globose, yellow, some orange, granular content, 7.5-17 µm diam. Zygospores not found. Habitat: Tapir, camel, white donkey and deer dung. In Brazil, there are occurrence reports of P. lentiger var. lentiger (as P. borzianus and P. sphaerosporus ) from horse (Viriato & Trufem 1985, Richardson 2001), camel, giraffe, gnu, gemsbok , scimitar oryx, zebra (Viriato & Trufem 1985), sheep and capybara (Richardson 2001) dung. According to Hu et al. (1989), P. lentiger var . lentiger can also be found in bear, camel, cat, chicken, cow, deer, elephant, fox, horse, leopard, monkey, rat, mule, panda, pig and sheep dung. This is the first report of P. lentiger var . lentiger for Brazil. Notes: Pilobolus lentiger var. lentiger presents several synonyms and have been mainly described as P. borzianus Morinii (Groove 1934, Boedijn 1958, Naumov

1939, Nand & Mehrotra 1968, 1977; Tandon 1968, Viriato & Trufem 1985) and P. sphaerosporus (Groove) Palla (Groove 1934, Naumov 1939, Nand & Mehrotra 1968, 1977; Zycha et al. 1969, Viriato & Trufem 1985). Hu et al. (1989) considered P. borzianus and P. sphaerosporus as synonyms of Pilobolus lentiger Corda var. lentiger Pilobolus lentiger var. lentiger is similar to P. lentiger var. minutus but differs, mainly, in the size of the sporangiospores which are bigger in the former. Different sizes of sporangiospores have been described for P. borzianus : 16-23 µm diam (Groove 1934); 8-15 µm diam (Nand & Mehrotra 1977); 9-22 µm diam (Viriato & Trufem 1985) and for P. sphaerosporus : (-6) 12-20 µm diam (Zycha et al. 1969); 6.5-12.5 µm diam (Nand & Mehrotra 1977) and 8-14 µm diam (Viriato & Trufem 1985).

Fig 1 Pilobolus crystallinus var. crystallinus A) Subsporangial swelling and sporangia; B) Subsporangial swelling and columellae; C) Trofocyst; D) Sporangiospores; P. crystallinus var. kleinii E) Subsporangial swelling and sporangia; F) Subsporangial swelling and columellae; G) Trofocyst; H) Sporangiospores; P. crystallinus var. hyalosporus I) Subsporangial swelling and sporangia; J) Subsporangial swelling and columellae; K) Trofocyst; L) Sporangiospores; P. lentiger var. lentiger M) Subsporangial swelling and sporangia; N) Subsporangial swelling and columellae; O) Trofocyst; P) Sporangiospores.

Pilobolus lentiger var. minutus (Speg.) R. Y. Zheng & G. Q. Chen. Mycosystema 2: 122 (1989) Fig 2. a-d = Pilobolus minutus Speg., Anal. Soc. cient. argent. 9: 176 (1880). = Pilobolus kleinii var. minor Dewèvre, Grevillea 22 (no. 103): 78 (1894). = Pilobolus morinii Sacc., Syll. fung. (Abellini) 17: 505 (1905). Sporangiophores erect, long-cylindrical, unbranched, nonseptate, smooth-walled, phototrophic, 1.3-7 mm × 85-150 µm. Trofocysts buried in the substratum, subglobose to ovoid, 180-610 × 125-270 µm. Subsporangial swellings ovoid, orange at base, 290-490 × 200-375 µm. Sporangia subglobose to hemispherical, black, 135-240 × 180-330 µm. Columellae cylindrical, some slightly narrowed at the middle, smooth-walled, 140-230 × 130-300 µm. Sporangiospores yellow, globose, 7-11 µm diam. Zygospores not found. Habitat: Tapir, camel, agouti, white donkey, lhama and deer dung. In Brazil, there are reports of P. lentiger var. minutus (as P. morinii ) in camel, gnu, scimitar oryx and gemsbok (Viriato & Trufem 1985) dung. According to Hu et al. (1989), P. lentiger var. minutus can also be found in donkey, mule and sheep dung. Notes: Pilobolus lentiger var. minutus has been described mainly as P. morinii and P. minutus (Groove 1934, Viriato & Trufem 1985, Boedijn 1958, Tandon 1968). Hu et al. (1989) considered P. morinii and P. minutus as synonyms and renamed them P. lentiger var. minutus . Pilobolus lentiger var. minutus is similar to P. lentiger var. lentiger but differs, mainly, in the size of the sporangiospores which are smaller in the former. Different sizes of sporangiospores have been described for P. morinii : 5-9 µm diam (Viriato & Trufem 1985); 4.5-6 µm diam (Grove 1934); 5.5-7 µm diam (Boedijn 1958). Pilobolus longipes Tiegh. Annls Sci. Nat., Bot., sér. 6 4(4): 338 (1878) [1876] Fig. 2 e-h = Hydrogera longipes (Tiegh.) Kuntze, Revis. gen. pl. (Leipzig) 2: 855 (1891). Sporangiophores erect, long-cylindrical, unbranched, nonseptate, smooth-walled, phototrophic, 0.3-2.5 cm × 90-140 µm. Trofocysts very long, growing parallel to the substratum, yellow, 410-1800 × 240-420 µm. Subsporangial swellings ovoid, smooth-walled, 385-1300 × 290-1370 µm orange at base. Sporangia globose, some hemispherical, black, 220-340 × 220-540 µm. Columellae conical, some rounded at apex, almost cylindrical, 75-330 ×170-375 µm. Sporangiospores globose and subglobose to ovoid, yellow, thick-walled, 10-18.5 µm in diam. Zygospores not found. Habitat: Camel, horse and white donkey dung. In Brazil, P. longipes was registered on zebra (Viriato & Trufem 1985), gemsbok (Trufem 1984) and horse (Batista 1948, Trufem 1984, Viriato & Trufem 1985) dung. P. longipes can also be found in camel, cow, elephant, horse, mule and sheep dung (Hu et al. 1989).

Notes: The characteristics of the strains of P. longipes reported here show a close similarity with the descriptions of Grove (1934), Naumov (1939), Nand & Mehrotra (1968, 1977), Tandon (1968), Trufem (1984), Viriato & Trufem (1985) and Hu et al. (1989). Pilobolus longipes differ from other species of Pilobolus , mainly, for presenting a very long trofocyst, growing parallel to the substrata. Pilobolus roridus (Bolton) Pers., Syn. meth. fung. (Göttingen) 1: 118 (1801) var. roridus Fig. 2 i-l = Hydrogera rorida (Bolton) Kuntze, Revis. gen. pl. (Leipzig) 2: 855 (1891). = Mucor roridus Bolton, Hist. fung. Halifax 3: tab. 132, fig. IV (1789). = Pilobolus crystallinus subsp. anisosporus Lyr, Arch. Protistenk. 99: 289 (1954). = Pilobolus crystallinus subsp. typicus Lyr, Arch. Protistenk. 99: 289 (1954). = Pilobolus microsporus L. Klein, Jb. wiss. Bot. 8: 360 (1872). = Pilobolus roridus (Bolton) Pers., Syn. meth. fung. (Göttingen) 1: 118 (1801). Sporangiophores erect, long-cylindrical, unbranched, nonseptate, smooth-walled, phototrophic, 3-6 mm × 85-490 µm. Trofocysts ovate-ellipsoid, 230-385 × 125-290 µm. Subsporangial swellings ovoid, orange at base, 230-550 × 210-490 µm. Sporangia hemispherical, black, 96-150 × 130-310 µm. Columellae plane-convex, dark gray, 85-115 × 150-300 µm. Sporangiospores elliptical, light yellow, 4-7 × 3- 4.5 µm. Zygospores not found. Habitat: Horse and white donkey dung. Pilobolus roridus var. roridus was reported from camel, chicken, cow, pig, sheep (Hu et al. 1998), goat, peacock (Nand & Mehrotra 1968,1977), reedbuck, elk, moose, bighorn sheep and mule deer (Foos & Royer 1989) dung. This is the first report of P. roridus var . roridus for Brazil. Notes: The characteristics of the strains of P. roridus var. roridus reported here where similar to those described by Grove (1934), Nand & Mehrotra (1968,1977), Hu et al. (1989), Foos (1989) and Foos & Royer (1989). However, different sizes of sporangiophores were reported. Hu et al. (1989) and Foos (1989) observed sporangiophores with 4-12 mm and 2-3 mm in length, respectively. Foos & Royer (1989) reported sporangiophores with 1-8 mm. Nand & Mehrotra (1977) and Groove (1934) cited 1-1.5 e 1-2 cm in length, respectively, for this structure. Pilobolus roridus var . roridus differs from the other Pilobolus as the former presents dark grey and plane-convex columellae and reduced sporangia in relation to the subsporangial swelling. Pilobolus roridus var. umbonatus (Buller) F. M. Hu & H. Y. Zheng, Mycosystema 2: 129 (1989) Fig. 2 m-o = Pilobolus umbonatus Buller Researches Fungi 6: 178 (1934)

Sporangiophores erect, long-cylindrical, unbranched, nonseptate, smooth-walled, phototrophic 3-9 mm × 85-145 µm. Trofocysts buried in the substratum, ovoid to napiform, 190-395 × 140-270 µm. Subsporangial swellings ovoid to ellipsoid, orange at base, 340-680 × 265-460 µm. Sporangia hemispherical, umbonate, black, 130-190 × 150-230 µm. Sporangiospores ellipsoid, light yellow to hyaline, 5-8 × 3.3-4 µm. Columellae not visualized. Zygospores not found. Habitat: Horse dung. Pilobolus roridus var. umbonatus can also be found on cow, camel, pig and sheep (Hu et al. 1989) dung. This is the first report of P. roridus var. umbonatus for Brazil. Notes: The characteristics of the strains of P. roridus var. umbonatus reported here show a close similarity with the descriptions given by Grove (1934), Nand & Mehrotra (1968,1977) and Hu et al. (1989). However, differences in the size of the subsporangial swellings were reported. Hu et al. (1989) described subsporangial swellings with 455-745 × 380-535 µm, while Nand & Mehrotra (1977) cited this structure with 90-500 × 80-400 µm. Pilobolus roridus var. umbonatus differs from the other Pilobolus for possessing umbonate sporangia.

Fig. 2 Pilobolus lentiger var. minutus A) Subsporangial swelling and sporangia; B) Subsporangial swelling and columellae; C) Trofocyst; D) Sporangiospores; P. longipes E) Subsporangial swelling and sporangia; F) Subsporangial swelling and columellae; G) Trofocyst; H) Sporangiospores; P. roridus var. roridu s I) Subsporangial swelling and sporangia; J) Subsporangial swelling and columellae; K) Trofocyst; L) Sporangiospores; P roridus var. umbonatus M) Subsporangial swelling and sporangia; N) Trofocyst; O) Sporangiospores.

Identification key for species of Pilobolus from Brazil 1. Sporangiospores ellipsoid, if ovoid then up to 10 µm in length………...... 2 1. Sporangiospores globose and subglobose to ovoid, the last ones up to 18.5 µm diam…………..…...……………...……...... 6 2. Sporangia umbonate...... P. roridus var. umbonatus 2. Sporangia not umbonate...... 3 3. Columellae nipple-like, conical to cylindrical, sporangiospores ellipsoid or ovoid with different sizes...... 4 3. Columellae plane-convex, dark gray, sporangiospores ellipsoid, 4-7 × 3-4.5 µm...... P. roridus var . roridus 4. Sporangiophores 1-3 mm in length, sporangiospores ovoid 7.5-10 × 5.5-8 µm…...………….…P. crystallinus var. hyalosporus 4. Sporangiophores up to 10 mm in length, sporangiospores ellipsoid...... 5 5. Columellae nipple-like, sporangiospores yellow or hyaline 7.5-11 × 5-7.5 µm...... P. crystallinus var. crystallinus 5. Columellae conical-cylindrical, some slightly narrowed at the middle, sporangiospores intense yellow or orange-yellow, 10-19.5 × 5.5-8.5 µm…………...…………….... P. crystallinus var. kleinii 6. Trofocysts very long, growing parallel to the substratum, up to 1800 µm in length, sporangiophores up to 2.5 cm in length…………………………………………………………..... P. longipes 6. Trofocysts burried in the substratum, not exceeding 610 µm in length, ovoid to ellipsoid, subglobose to ovoid, napiform, sporangiophores up to 7 mm in length...... 7 7. Sporangiospores thick-walled, spherical to broad ovoid…...... P. oedipus 7. Sporangiospores thin-walled, globose...... 8 8. Columellae obtusely conical, 160-190 × 240-330 µm, sporangiospores globose, 7.5-17 µm diam...... P. lentiger var. lentiger 8. Columellae cylindrical, some slightly narrowed at the middle, 140-230 × 130-300 µm, sporangiospores globose 7-11 µm diam...... P. lentiger var. minutus

Acknowledgments The authors are thankful to Dr. Paul Kirk and Dr. Hsiao-man Ho for article review, Felipe Vasconcelos Reis for English review, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nivel Superior (CAPES) for a PhD Scholarship provided to the first author, and Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) for providing a research grant to the second author.

References Abdullah SK. 1982. Coprophilous mycoflora on different dung types in southern desert of Iraq. Sydowia 35: 1-5. Batista AC. 1948. Pilobolus crystallinus (Wiggs) Tode. Boletim da Secretaria de Agricultura, Indústria e Comércio 15: 1-6. Batista AC, Pontual D. 1948. Alguns fungos coprófilos de Pernambuco. Boletim da Secretaria de Agricultura, Indústria e Comércio. 15: 27-44. Bell A. 1975. Fungal succession on dung of the brush-tailed opossum in New Zealand. New Zealand J. Bot. 13: 437-62. Benny GL. 2005. Zygomycetes . Publicadona Internet em http://www.zygomycetes.org. Boedijn, 1958 [1959]. Notes on the Mucorales of Indonesia. Sydowia 12: 321-362. Caretta G, Piontelli E. 1996. Coprophilous fungi from confined deers in Pavia (Lombardia, Italy). Boletín Miológico 11 (1-2): 41-50. Caretta G, Piontelli E, Savino E, Bulgheroni A. 1998. Some coprophilous fungi from Kenya. Mycopathologia 142: 125–134. Foos MK, Rakestraw JB. 1985. A survey of Pilobolus from Lake County, Ohio. Ohio J. Sci. 85 (3):137- 138. Foos, MK. 1989. Isolation of Pilobolus spp. from the northern elk herd in Yellowstone National Park. J. Wildlife Diseases 25 (2): 302-304. Foos MK, Royer JA. 1989. A survey of Pilobolus from Yellowstone National Park. Mycotaxon 34 (2): 395-397. Grove WB, 1934. A systematic account and arrangement of the Pilobolidae . 191-224, in AHR Buller (ed.), Researches on Fungi. Vol 6. London, Longmans Green and Co. Hibbett DS, Binder M, Bischoff JF, Blackwell M, Cannon PF, Eriksson OE, Huhndorf S, James T, Kirk PM, Lücking R, Lumbsch HT, Lutzoni F, Matheny PB, Mclaughlin DJ, Powell MJ, Redhead S, Schoch CL, Spatafora JW, Stalpers JA, Vilgalys R, Aime MC, Aptroot A, Bauer R, Begerow D, Benny GL, Castlebury LA, Crous PW, Dai YC, Gams W, Geiser DM, Griffith GW, Gueidan C, Hawksworth DL, Hestmark G, Hosaka K, Humber RA, Hyde KD, Ironside JE, Kõljalg U, Kurtzman CP, Larsson KH, lichtwardt R, Longcore J, Miadlikowska J˛ Miller A, Moncalvo JM, Mozley-Standridge S, Oberwinkler F, Parmasto E, Reeb V, Rogers JD, Roux C, Ryvarden L, Sampaio JP, Schüßler A, Sugiyama J, Thorn RG, Tibell L, Untereiner WA, Walker C, Wang Z, Weir A, Weiss M, White MM, Winka K, Yao YJ, Zhang N. 2007. A higher-level phylogenetic classification of the fungi. Mycol. Res. 3: 509-547. Hu FM, Zheng RY, Chen GQ. 1989. A redelimitation of the species of Pilobolus . Mycosystema 2: 111- 133. Krug JC, Benny GL, Keller HW. 2004. Coprophilous fungi. 467-499, in GM Mueller et al. (eds.), Biodiversity of fungi. Inventory and monitoring methods. London, Elsevier Academic Press. Masunga GS, Andresen Ø, Taylor JE, Dhillion SS. 2006. Elephant dung decomposition and coprophilous fungi in two habitats of semi-arid Botswana. Mycol. Res. 110: 1214-1226. McVickar, DL. 1942. The light-controlled diurnal rhythm of asexual reproduction in Pilobolus . American Jour. Bot. 29: 272-3380. Nand K, Mehrotra BS. 1968. Species of Pilobolus and Pilaira from India. Sydowia 22: 299-306. Nand K, Mehrotra BS. 1977. Species of Pilobolus and Pilaira from India. Sydowia 30: 283-289. Nagy LA, Harrower KM. 1979. Analysis of two southern hemisphere coprophilous fungus successions. Trans. Brit. Mycol. Soc. 72 (1): 69-74. Naumov NA. 1935. Opredeliel Mukorovych ( Mucorales ). 2. ed. Moscow and Lenningrad, Bot. Inst. Acad. Sci. U.R.S.S. Nyberg Å, Persson IL. 2002. Habitat differences of coprophilous fungi on moose dung. Mycol. Res. 106 (11): 1360-1366. Piontelli E, Santa-Maria MAT, Caretta G. 1981. Coprophilous fungi of the horse. Mycopathologia 74: 89- 105. Richardson MJ. 2001. Diversity and occurrence of coprophilous fungi. Mycol. Res. 105 (4): 387-402.

Tandon RN. 1968. Mucorales of India. India, New Delhi: Indian Council of Agricultural Research. Trufem, SFB. 1984. Mucorales do Estado de São Paulo. 4. Espécies coprófilas. Rickia 11: 65-75. Viriato A, Trufem SFB. 1985. Mucorales do Estado de São Paulo. 5. Pilobolaceae . Rickia 12: 77-88. Zheng RY, Hu FM. 1979. Mucorales of China. 1-1527, in FL Tai (ed.), Sylloge Fungorum Sinicorum. Beijing, Science Press. Zycha H, Siepmann R, Linnemann G. 1969. Mucorales . Germany, J. Cramer.

MYCOTAXON Instructions to Authors

Mycotaxon is an international mycological journal devoted to research on the taxonomy and nomenclature of fungi. Publication is open to everyone. Authors are responsible for obtaining peer reviews from experts in the field prior to pre-submission of their manuscripts to the Nomenclature and French Language Editors . The Editor-in-Chief reviews all expert peer reviews, pre-submission recommendations, and author submissions. Sheridan Press prints the digital files prepared by the Editor-in-Chief from accepted manuscript files, distributes volumes to subscribers, and handles reprints. Subscriptions, author invoices, and payments are handled by the Business Manager. Mycotaxon is indexed by the Index Editor . The Webmaster oversees the Mycotaxonwebsite.

What is suitable for publication in MYCOTAXON? Mycotaxon is restricted to papers on the taxonomy and nomenclature of fungi. We intend this broadly to include monographic works, reviews of taxonomic groups and/or taxonomic criteria, arguments dealing with specific nomenclatural problems, proceedings of symposia on taxonomic or nomenclatural matters, and well-documented floras. Papers that deal with other mycological disciplines (cytology, ecology, genetics, phylogenetics, physiology, etc.) should be submitted to another journal unless their primary focus is taxonomic. Prospective authors are invited to send a draft to the Editorin-Chief if they have doubt the suitability of their manuscripts for publication in thejournal. Articles may be of any length. Most authors pay no page charges, although sole/senior authors who exceed 100 pages per year may be charged $18 per excess page. Authors are granted two halftone plates for every ten (10) text pages (11-20 text pages qualify for 4 halftones, 21-30 pages for 6 halftones, etc.). Fees are $20 for each excess halftone plate. Black & white line drawings, phylotrees, graphs, and tables are not considered halftones and count as text in assessing page charges. Color processing fees are $475 per color plate. There are also fees for digitizing original artwork, converting non-standard graphics files to tif or eps format, and correcting author errors in pdf proofs. Mycotaxon reserves the right to reject papers of questionable taxonomic merit or those that do not meet criteria listed in the following instructions. Manuscripts are reviewed in the order received and acknowledged within two weeks of receipt. (As acknowledgments usually slow during field season or at press time, submitters are asked to wait at least 14 days before sending a letter of inquiry regarding receipt of final submissions.) The Book Review Editor coordinates reviews of recently published books and journals. The French Language Editor reviews papers written in French. The Nomenclature Editor assigns permanent accession numbers and reviews nomenclature of all submitted text documents. The Editor-in-Chief dictates editorial policy and styles, receives and reviews all final submissions, converts files into pdf press proofs, and sends proofs to authors for final approval, correcting errors prior to publication, and selects the cover illustration for each volume from among submitted drawings.

About regional (distributional) checklists Until 2003, Mycotaxon published annotated regional checklists of fungi, which often served as first fungal records from under-explored areas. Now, web-based documents offer a searchable interface and permit rapid integration of new information. Thus, Mycotaxon no longer publishes regional fungal inventories in the print journal in their entirety, but asks authors to publish 1- to 4-page summaries in Mycotaxon and post longer checklists on the Internet. Both urls to checklists posted on authors’ own websites and downloadable PDF checklists are posted on the Mycotaxon weblists page. There is a one-time $25 posting fee for uploading a distributional or annotated species pdf onto the Mycotaxon website. Summaries must adhere to the same editorial requirements as regular manuscripts, and both original checklist and summary must undergo pre-submission peer review. Only the summary is submitted for accessioning and nomenclatural review, but both summary and complete checklist are sent to the Editor-in-Chief during final submission . Checklist authors are strongly encouraged to cite references used to identify the taxa in their research and must

include the URL to their checklist in the summary abstract. After final editorial approval, authors wishing to post on Mycotaxon’s webpage should contact the Business Manager, who will send an invoice for payment of uploading the weblist pdf. All pdfs, which may be updated for a $10 revision fee, must display original submission and revision dates on the first page.

Mycotaxon submission procedures Authors are asked to type ‘Mycotaxon + author name + date’ or ‘Mycotaxon + accession number’ into the subject headers of E-mails sent to any Mycotaxon Editor and reminded to add the following E-mail addresses below to their server’s spam-friendly address list.

Dr. Lorelei L. Norvell, Mycotaxon Editor-in-Chief (6720 NW Skyline Boulevard, Portland OR 97229-1309 USA) [email protected] (backup: [email protected])

Dr. Shaun R. Pennycook, Mycotaxon Nomenclature Editor (Manaaki Whenua Landcare Research, Auckland, New Zealand) [email protected]

Dr. Cony Decock, Mycotaxon French Language Editor (Mycothéque de l’Université Catholique de Louvain, Place Croix du Sud 3, B-1348 Ottignies—LLN, Belgium) [email protected]

Authors and coauthors are all responsible for providing error-free, properly formatted text and should download the Mycotaxon Word shell and the expanded Instructions for Authors pdf files from the Mycotaxon Author Instructions page before preparing a manuscript for Mycotaxon. (All files will be E-mailed by the Editor-in-Chief on request.) Authors who submit press pdfs and photo-ready hard copy are also both designer and printer of their paper and must realize that the Editor cannot change their submitted text. Authors who need additional guidance are urged to ask their peer reviewers or the Editor-in-Chief for help. Authors who plan to prepare print-quality pdfs must pre-flight the files through Sheridan Press before final submission and be prepared to insert masthead and page numbers exactly as requested at press-time. Those intending to submit text for scanning and digital conversion should first contact the Editor-in-Chief for special instructions.

As protection against internet viruses, editors open only E-mail messages with ‘Mycotaxon’ written somewhere in the subject header when the sender’s address is not yet already listed in the Mycotaxon database. Authors should in turn add Mycotaxon editorial addresses to their ‘white’ E-mail address list. Authors who mail hard copy are reminded to package all materials securely, enclose address information within the packet, and to use stiff boards, bubble wrap & plastic cases to protect artwork/CDs.

Peer & French Language Review (Step 1). Authors send formatted manuscript text & graphics files with the Mycotaxon instruction pdf and the Reviewer’s Guidelines to two experts for pre-submission peer review. Peer reviewers are expected to (i) return edited manuscripts to authors and (ii) E-mail Reviewer comment forms directly to the Mycotaxon Editor-in-Chief. Authors of papers written in French should submit their files to the French Language Editor after peer review.

Nomenclature & Pre-submission Review (Step 2) Authors send a revised, formatted master text file (containing no graphics) with peer reviewer E-mail addresses (REQUIRED) to the Nomenclature Editor . The Nomenclature Editor returns annotated text files with a list of needed corrections to the authors and Editor-in-Chief. Authors correct the text files, consulting their peer reviewers and French Language Editor when necessary.

Final submission (Step 3)—Authors send by E-mail attachment (or post) to the Editor-in- Chief : One body text file with tables, figures, footnotes, and legends removed (required); One table text file and/or one legend text file when tables, illustrations, and/or footnotes are present (required);

Mycotaxon submission form (with all questions answered with information highlighted or typed in as needed) E-mailed by the corresponding author as a document file attachment (not in pdf format or mailed as hard copy) (required). Graphics digital jpg/tif files or (if absolutely necessary) original hard copies (when illustrations are included); (One manuscript preview — as pdf/MSword preview file or printed hard copy — showing graphics, tables, and legends in place is optional.)

Editorial review and press-preparation (Step 4) The Editor-in-Chief (i) acknowledges submission (usually within 2 weeks) and later (ii) either E-mails approval or returns revised files to all coauthors for approval or further revision. Authors return approval or revised files with a paragraph granting the Editor-in-Chief permission to adjust text as needed during press preparation. The Editor-in-Chief returns a press-quality pdf proof for final inspection before publication. Any outstanding fees should be sent to the Business Manager after final PDF approval.

Preparing text files Authors must prepare concise, well-formatted, error-free copy that accurately conveys the author’s ideas with an economy of space. Articles may be written in either English or French. Authors submitting copy in English should apply uniform spelling and grammatical conventions (either American or British, but not a mixture of both) throughout the manuscript. Digital submission is encouraged, with MSWord® text files and Adobe Photoshop® graphics files preferred. The Digital Art pdf prepared by Mycotaxon’s printer, Sheridan Press, explains how to prepare illustrations for publication. Sheridan Press also permits authors to submit up to 3 digital tif files to ‘Digital Expert’ for free diagnosis of potential problems prior to submission. Authors wishing to prepare their own press pdf files must contact the Editor-in-Chief for special instructions and pre-flight their pdf with Sheridan Press before final submission. Authors are welcome to submit pdfs for the purpose of guiding figure placement to the Editor-in- Chief without Press approval. Hard-copy submission is still accepted, but authors are asked to consult with the Editor- in-Chief for additional guidance before submission. Mycotaxon now charges a $5 per page/illustration scanning fee to digitize hard copy and is unable to scan artwork larger than 23 × 31 cm (9" × 12").

Text must conform to the following specifications

Note: Title, author address, abstract, key words, body text, figure legend, acknowledgment, & literature-cited elements must adhere to all requirements. Our sample manuscript (pp. 17–22) illustrates optional formats for other sections common to “new species” papers.

Print area size is 11 × 17.5 cm (4.33" × 6.89"). The Mycotaxon Word shell is formatted for a US letter paper size with 5.25 cm top/bottom & 5.3 cm side margins. It also contains a mock-up of the Mycotaxon logo and header for the first page. Those using other wordprocessing applications should format their documents similarly and allow 2.5 cm (1") for the title page masthead.

Fonts & Paragraph formatting —Authors are asked to use two basic font families: serif times or times new roman (tnr)—and sans serif arial or helvetica (helv). Characters not displayed on keyboards ( α, β, µ, ×, ≡) should be selected from the symbols menu if not available in the regular fonts. Courier is used only when comparative columnar arrangement is essential (e.g., DNA sequence data). All other fonts require editorial permission and must be listed on the submission form. Lines must be singlespaced within paragraphs, and authors should use paragraph format menu options to separate paragraphs or indent first lines. (Files containing double returns to space paragraphs or tab keys to indent paragraphs will be returned for reformatting.)

Required formats:

• Title—Font: Arial, 11-pt, Bold, sentence (not upper or title) case; Paragraph: no period (dot) at the end (unless ending with an abbreviation), no indent, center aligned.

Special: Set Latin scientific names in bold italic. Titles should not exceed three lines. Titles with author citations will be rejected unless an authority is needed in the title to prevent confusion. Abbreviate genus names after the first use, but otherwise avoid abbreviations. Use arabic (not roman) numerals. Example: Studies in Agaricales 3: Phaeocollybia phaeogaleroides and P. rifflipes, new western North American species.

• Author names—Font: Times, 10-pt, Roman (regular), ‘Small caps’; Paragraph: no indent, center aligned. Special: Given names and initials precede surnames. Separate authors with commas except use ‘&’ before the last author’s name.

• Address information—Font: Times, 9-pt, Italic; Paragraph: no indent, center aligned, no periods at line ends; Placement: E-mail address (required for first author) on top line; Institution/Street on middle line; City, Code, Country on bottom line. Special: Junior author E- mail addresses recommended, but optional. Keep street & institutional information to one line. Do not end lines with commas or full stops (except for abbreviations).

• Abstract & Key words—Font: Times, 8-pt; set ‘ Abstract ’ and ‘Key words ’ in bold, but format the em-dash and remaining text in regular or italic as needed. Paragraphs: 1 cm right & left margins, no indent, left-justified. Abstract: Abstracts briefly summarize the content & conclusions and list all new taxa (but not authorities unless differentiating homonyms). English abstracts are required; 1–2 abstracts in other languages are permitted for longer articles. Abstracts should not exceed 15 printed lines. Key words: Up to five key words or phrases are encouraged. Do not repeat terms already used in the title or abstract. Separate terms with commas and capitalize the first letters of proper nouns only. Do not end the list with a full stop.

• Subheadings: Primary (stand-alone)—Font: Arial 10-pt, Bold/Bold Italic; Paragraph: no indent, center aligned. Secondary (stand-alone)—Font: Arial 9-pt, Bold/Bold Italic; Paragraph: no indent, left aligned. Taxonomic (special)—Font: Times ; Size & Style: Latin name—10-pt Bold Italic, Author citation—9-pt regular; ‘nom. nov.’, sp. nov., gen. nov, etc.’ & ‘Fig. #’—9-pt bold. Paragraph: hanging indent, left aligned; set right tab to 11 cm to justify Fig. # at right (i.e. place a backward arrow tab directly at the right margin marker in the tab bar ruler.) Special: figure references for new names may stand on the same line as the MycoBank number.

• Basic text—Font: Times 10-pt; Paragraphs: left-justified. Use the format>paragraph menu to select one of the following options: either set 6 pts before the paragraph or indent the first line by 0.5 cm. Introduce your subject briefly by citing significant background literature. You may choose to make your first primary subheading ‘Introduction’. Provide necessary abbreviations and other data in a brief ‘Materials & methods’ section (9-pt font permitted here). Document your own observations concisely, stressing new discoveries. Minimize confusion between generic epithets beginning with the same initial letter by abbreviating one using the first two letters of the generic name . Italics are required for Latin scientific names at all levels and reserved elsewhere for emphasis; common Latin abbreviations (e.g., i.e., et al., etc.) and references must not be italicized. List author citations once only: where first mentioned in the text, in the taxonomic subheading introducing descriptions, or in a table containing several taxonomic names. Authors should list previously misidentified taxa as ‘misapplied’ not ‘sensu + author + reference.’

Required references: Consult the current international code of botanical nomenclature when describing new taxa or proposing new combinations . Author citations must follow either the international plant names index or the authors of fungal names PDF (available on Index Fungorum). Consult index herbariorum for herbarium/collection acronyms. Authors describing new taxa must cite relevant acronyms and numbers to facilitate retrieval by readers and deposit new names/data in mycobank, type specimens in an official public herbarium , ex-type strains in a public culture collection , and/or sequence data in genbank.

• MycoBank & GenBank numbers, nomenclators, Latin diagnoses, holotype information, etymologies, and ‘Specimens examined’ —Font: Times, 8-pt; Paragraph: margins indented 1 cm, fully justified with first line flush. Special: Italicize all Latin text in diagnoses but only Latin

scientific names in nomenclators & ‘Specimens examined.’ (Latin scientific names should stand in regular font in otherwise italicized diagnoses.)

• Acknowledgments —Font: Times, 9-pt. Paragraph: no indent, left-justified. Special: Mycotaxon requires recognition of peer reviewers in this section.

• Literature cited —Font: Times, 8-pt; Paragraph: Hanging indent, 10-pt leading. Required: All references must be cited in the main text. Follow a consistent citation style throughout. Single space all entries. Author names: substitute initials (no periods after initials) for given names, order surnames before initials and do not separate with commas, separate author entries only by commas and never by ‘&’ or ‘and’, placing a full stop after the last author entry. Standardize journal abbreviations. Do not use more than one space after full stops or other punctuation. See sample manuscript for examples.

Useful references: See botanico-periodico-huntianum (bph: Lawrence & al. 1968), botanico- periodico-huntianum/supplementum (bph/s: Bridson 1991, 2004), taxonomic literature, (tl2: Stafleu & Cowan 1976-2000), and supplements to taxonomic literature (Stafleu & Mennenga 1992-1995) for recommended abbreviations.

How to prepare text files for M YCOTAXON Experienced authors accustomed to placing the research narrative before the figure legends, footnotes, and tables in manuscripts destined for other scientific journals should have no difficulty in preparing text files for Mycotaxon. The following pages are written in sufficient detail to help students and less experienced authors prepare the separate body, legend, table, and master digital text files required for Mycotaxon review and submission. All authors should find the hints and guidelines helpful.

Body text file [Label file with accession number + body (e.g., 08-117body.doc)] First: download the formatted Mycotaxon template from the Mycotaxon website for instructions and formatting requirements. Reveal formatting — Always ‘reveal’ your formatting while writing. Turn on this option in MSWord by following the view>reveal formatting pathway in the menu bar. Click to reveal pale gray symbols between characters: → (right arrows indicating tab stops ), (left arrows indicating line breaks ), ¶ (paragraph signs indicating ends of paragraphs ), and • • • (dots indicating spaces, with one dot per space ). These are visible only on screen and only when the application is set to ‘reveal’ on your own computer.

Eliminating empty lines and double spacing — Use revealed formatting while writing to ensure that all paragraph symbols are preceded by text. Empty lines, which result from hitting the return key twice after ending a paragraph, interfere with press processing and must be removed. All files submitted to Mycotaxon must be single-spaced. Files using double, triple, or 1 1/2 line spacing will be automatically rejected.

Formatting paragraphs — To format paragraphs in msword: select format (in the menu bar) to open the paragraph window. This format window controls paragraph margins, first line indents, spacing above and below paragraphs, line spacing, font leading, and tab key options. The two most frequent paragraph types are ‘block’ and ‘indented’:

To format block paragraphs: Under –indentation–special: select (none) to keep first line flush with margin. To set paragraph spacing, type [ 6] in the –spacing–before box. Click ok. [Thereafter, each keyboard return will set a new block paragraph 6 points below the previous block paragraph.]

To format paragraphs with indented first lines: Under –indentation–special: select (First line). Type 0.5 cm into the by: box. Click ok. [Here, each keyboard return sets a new indented paragraph directly below the previous.]

Line breaks — Authors create ‘line breaks’ in MSWord® by pressing shift + return simultaneously; line breaks are a way to distribute text more evenly. However, such breaks interfere with text flow during Mycotaxon pdf conversion and are NOT permitted except to

separate the title or author addresses into appropriate segments. Authors who customarily use line breaks are cautioned to read all text files prior to final submission with the formatting revealed to eliminate all other line breaks. (Line breaks appear in MSWord® as gray left arrows at line ends.)

Section & Page Breaks — Authors frequently insert section and page breaks to distribute text properly around figures & tables in a document files where such elements are present. However, section or page breaks are NEVER permitted in Mycotaxon text files and must be eliminated prior to final submission.

Tab key settings — Authors should remove all tab stop key settings (except the 11-cm right tab stop) from Mycotaxon body and legend text files; this reminds authors not to indent paragraph first lines with the tab key (!) and allows the tab stop to force text to the right margin when required. In Mycotaxon’s MSWord template files:

To open the tab format window : Click the tabs . . . box at the lower left of the format>paragraph window.

To remove tab stop settings: Click clear or clear all, then ok to close the tab window.

To force text to right margin (for key leads & figure references): Type 11 cm in the tab stop position box. Click set, then ok to close window.

To set leader dots between key entries and key leads: Set right tab to 11 cm as above but click 2... under —leader— before setting and closing the tab format window. [ note: authors should never type dots between entries and leads in taxonomic keys; they interfere with press processing.]

Word spacing — Computers are not typewriters! Only one space should stand between each word and between sentences in pre-press files. Use the Find & Replace All window to replace all double spaces with single spaces before final submission.

Legend text file [Label file with accession number + legend (e.g., 08-117legend.doc )] First: download the formatted legend text shell from the Mycotaxon website. Type a placement instruction for a footnote or legend (caption) in Arial 9-pt bold. On the next line, type the footnote or legend text in 8-pt Times/TNR. [ Example of 9-pt bold instruction—Editor to insert Figure 1 + legend on page 3.] Note: No page footnotes or legends should appear in the body text file. They belong here. Figures and text in text frames are not permitted.

Table text file [Label file with accession number + table (e.g., 08-117table.doc )] First: download the formatted table text shell from the Mycotaxon website. Place all table titles, tables, and table footnotes into this file. Set placement instructions in Arial 9-pt bold above each table. [ Example of 9-pt bold instruction—Editor to insert Table 1 on page 6.] Note: No table titles or tables should appear in the body text file. They belong here, in the table file. Text frames are not permitted.

Master text file [Label file with senior author name + _master (e.g., Li_master.doc )] For pre-submission peer and nomenclatural review, copy the text from the three above files into a mycotaxon template. This master file contains the Mycotaxon banner and all manuscript text including footnotes, legends, and tables. Authors may add graphics to the file intended for peer review. Graphics do not belong in the file sent to the Nomenclature Editor, but empty lines that approximate the location of the missing illustrations may be added to indicate the approximate length of the published paper. Authors who do insert figures into document or pdf files for peer review may include that file in their final submission as an aid to the Editor-in-Chief. The Nomenclature Editor always copies the Editor-in-Chief when returning annotated master files, so authors are asked not to submit master text files again during final submission.

Preparing illustrations Size & placement Illustrations should be submitted at page width size (4.33” or 11 cm) and distributed throughout the paper whenever possible. Remember that each article will begins on an odd- numbered (right-hand) page and that each plates should face the first reference to it within the text. Group figures into plates to aid in comparing species. Do not border either photographs or drawings with a line. The Editor-in-Chief will place legends (captions) below illustrations or at the bottom of the page facing full-page illustrations when there is not enough room for both plate and legend on the same page.

Line drawings Authors may submit digital images prepared from scanned originals, high quality reduced photocopies, or original artwork. Authors with access to computer scanners and photographic software are encouraged to digitize original drawings themselves.

Digital files —Digital files that incorporate fonts or fine lines must have a 900–1200 dpi (dots per inch) resolution for the mycotaxon page width (4.33" or 11 cm). Acceptable format types include (i) tif using lzw compression (bitmap or grayscale mode, unless paying $475 for color processing), (ii) jpg, (iii) eps or ai, or (iv) high resolution files embedded in MSWord. Scan simple line drawings using software such as adobe photoshop®, but use more sophisticated illustration software (e.g., adobe illustrator®) to convert phylotrees and other drawings containing vector information to eps format. Image adjustments—e.g., insertion of scales, numbers, and arrows — should be handled in such applications. Remember that digital art should not include legends, which belong in the legend text file. Hard copy —Authors who submit digital text with hard copy artwork may include photocopies within a manuscript printout to indicate figure placement; however, they should also submit line drawings separately without legends. Authors who submit printed manuscripts for scanning should position line drawings onto existing text pages with captions printed directly below or to the side of each drawing. With care, authors can scale down oversized drawings using the reduction feature on photocopiers without decreasing image quality to assemble an attractively arranged plate from the cut & paste illustrations.

Photographs: ‘halftones’ and color Mycotaxon prints only grayscale (‘black & white’) halftones without extra charge, but authors who submit film-based (not digital) prints may submit color photos for conversion to grayscale halftones when necessary .

Digital grayscale halftones —Use a photographic application (e.g., Adobe Photoshop®) to prepare jpgs and tifs. lzw compressed tifs do not degrade, are the same size as jpgs (which do degrade when edited), and so are preferred and used during press preparation. Tif or jpg photos intended to be printed without color must be set in grayscale mode with a minimum resolution of 300-600 dpi matching the target width, generally 4.33" (11 cm). Authors should ensure that the contrast among individual photographs within a single plate is not too great; individual photographs within plates may be set flush (generally preferred) or separated by a 1-2 mm white or black band. Note: Authors who wish to combine line drawings with photographs in one plate should send two files for each combined plate: a line drawing file formatted at 900-1200 dpi and a photographic file formatted at 300 dpi. The Editor-in-Chief will combine the two ‘semiplates’ into a single plate at no charge. Digital color plates —Current press charges are $475 per color page, and those wishing to publish color illustrations should contact the Editor-in-Chief before final submission. Color plates must be submitted in tif format (using lzw compression) at 300 dpi resolution and in cmyk color mode. Authors are encouraged to preflight their color files with Sheridan Press prior to final submission. Negative-based photographs —To prepare hard copy plates from negative-based photographs, crop individual photographs so that edges touch and the plate is exactly 4.33" (11 cm) wide. Mount photographs on separate sheets of heavy white paper or matte board. Apply annotations (arrows, numbers, scales, etc.) and band strips after the photographs are positioned. Print the senior author’s name, Mycotaxon accession number, and plate number on the back in soft pencil. Note: Authors must not submit halftone prints prepared from digital files

as hard copy intended for publication. Scans of files printed from digital files produce unacceptable ‘moiré’ artifacts and will be rejected.

Labeling Title all graphic files (jpg, tif, eps) with the senior author’s name, figure number, and 3- letter extension label (e.g., name_fig#.tif ). The file label should have only one dot, placed before the extension (e.g., change ‘fig.3-8.jpg’ to ‘fig3-8.jpg’ by removing the dot after fig.). Label all art hard copy with the senior author’s name and figure number on the reverse side.

Final notes about digital images Because the Editor-in-Chief can convert many different file formats quickly to tif or eps files in Adobe Photoshop®, there are no fees for converting photoshop, bmp, jpg, pcx, pict, pixar, png, scitex ct, or targa files that open in Photoshop in proper grayscale/bitmap mode and have the required resolution. Fees are no longer charged for processing Word-embedded pictures through Adobe Illustrator® unless the original photograph lacks sufficient resolution for processing. The Editor-in-Chief cannot improve the quality of a bad image. Authors should submit as clear and clean an image as possible but must remember that, in science, reality supersedes beauty. Do not ‘over-photoshop’ or otherwise distort images. Authors should note in their ‘Materials and methods’ section when artifacts have been removed from images. Always retain digital files in their original format and edit only tif-formatted copies. (Compressed jpgs lose resolution each time a file is edited; uncompressed tifs are the least damaged by editing.) Resolution of a low-resolution file cannot be increased by simply typing in a higher dpi. Authors with low-resolution files must (i) photograph or scan the objects again or (ii) design their manuscript to accommodate a smaller plate. If authors submit only substandard illustrations, they should expect to find their paper rejected or run without the illustrations. Each MYCOTAXON front cover now displays a drawing chosen from a paper published in that volume.

MYCOTAXON Mycotaxon Styles 2008 Revised 3 December 2007

This file serves as a Mycotaxon template when ‘saved as’ with a different file name. Retain one copy for reference before deleting all instructions to insert your own text.

MYCOTAXON paragraph styles Highlighted text demonstrates paragraph styles as they should appear in the final manuscript (except for the yellow color). Non-highlighted text explains each style. Template style names appear in [ brackets ]. The style sheet is formatted for Times & Arial fonts required for final submission (Times New Roman & Helvetica accepted). For final submission, legends, footnotes, and tables must be submitted as separate files. See http://www.mycotaxon.com/ for full information and to download templates for the required LEGEND TEXT FILES & TABLE TEXT FILES . First page Manuscript title [MycA title ] Arial 11-pt bold, centered, Sentence case, no full stop

AUTHORS [MycB auth ] Times 10-pt Roman, centered, small caps, Title Case, 12-pt above Email & Address information [MycB_address ] Times 9-pt italic, centered, Title Case, no full stop or commas at end of lines

Abstract — ‘Abstract’ in bold; dash & following text not bold, 12-pt before; end with full stop. [ MycBab ] Key words — ‘Key words’ bold, dash & list not bold, 3-pt before, NO full stop at end [ MycBkey ] Both sections in Times 8-pt Roman, margins indented by 1 cm, fully justified. All Latin taxonomic names in italics. Do not include author citations. Subheadings Primary subtitles [MycC sub ] Arial, 10-pt, bold, centered, Sentence case, 6- to 12-pt before

Acknowledgments / Literature cited [MycC sub lit ] Arial, 9-pt, bold, centered, Sentence case, 12-pt before, 6-pt after

Secondary subtitle [MycC sub2 — Paragraph text follows on next line] Arial, 9-pt, bold, left (ragged), Sentence case, 6-pt before.

TERTIARY SUBTITLE — [MycC sub3— Paragraph text continues on same line] Times, 10-pt, regular, SMALL CAPS , left justified, Sentence case, 6-pt before unless indented.

Taxonomic subtitle Author citation, tax. nov. PLATE # [MycC taxon ] Times, 10-pt, bold italic, left (ragged), hanging 1 cm, 12-pt before. Only Latin name in bold italic: author citation 9-pt regular, new taxon abbreviation in 9-pt bold when present; figure reference 9-pt either bold or SMALL CAPS , tabbed right to 11 cm as shown. Body text styles

Basic text 1 [MycD base1^ ] Times 10-pt, left justified, first line flush, 6-pt before Basic text 2 [MycD base2> — for paragraphs with indented first lines] Times 10-pt, left justified, first line indented by 0.5 cm, 0-pt before

1. Key Lead [MycD key — for forming keys with leader dots] ...... 2 Times 9-pt, left (ragged), 2-pt before, hanging 1 cm, tab right 11 cm w leader dots

MYCO BANK [MycE mycoB — MycoBank numbers + alternate Figure reference tab right] Times 8-pt regular, left justified exactly @10-pt, first line indented 0.5 cm, 0-pt before, tab right 11cm

Latin diagnoses [MycE Latin — for italicized Latin diagnoses] Times 8-pt italic, left justified exactly @10-pt, margins indented by 1 cm, 3-pt before

Subordinated text [ MycE sub —etymologies, holotypes, collections]

Times 8-pt, left justified exactly @10-pt, margins indented by 1 cm, 3-pt before

Acknowledgments [MycF acks — for thanking reviewers, colleagues, grants, etc.] Times 9-pt Roman; fully justified, 6-pt before, margins flush.

Literature cited [ MycF lit — for alphabetized list of references] Times 8-pt Roman, left justified @ exactly 10-pt, hanging by 0.7 cm, 0-pt before.

Important formatting hints when using MSWord®

Use the FORMAT >DOCUMENT >PAGE SET -UP >PAGE SIZE menu to select US LETTER page size. Set the MYCOTAXON 11 ×17.5 cm print area by typing ‘5.25 cm’ into the top & bottom and ‘5.3 cm’ into the right & left margin boxes. To force figure references & key entries to the right margin, follow the FORMAT >PARAGRAPH >TAB pathway to set the right tab to 11 cm (4.33”). Do not type in full stops in keys; instead select the #2 option under LEADER to produce leader dots (…) when the tab key is pressed. See key format option above. Paragraph styles import when pasted into a new file! Before submission to the Nomenclature Editor and the Editor- in-Chief , please remove unnecessary styles (especially hyperlink, header, & footnote styles) following the FORMAT > STYLES > STYLES IN USE menu pathway. Delete all styles that you have not used.

AUTHOR NAMES —Type names after the main title in Times 10-pt Regular as usual. Then convert to small caps following the FORMAT >FONT >SMALL CAPS menus. Remove all internet address HYPERLINKS from text using the menu pathway: INSERT >HYPERLINK >REMOVE . Mac- users can remove hyperlinks by keying COMMAND + K (Command = the ‘apple’ key).

KEY WORDS may contain up to FIVE (5) terms. Do NOT repeat terms already present in the title or abstract. Separate terms with commas. Do NOT end the list with a full stop (period).

Place all TITLES and STAND -ALONE SUBHEADINGS into SENTENCE CASE [i.e., only capitalize the initial letters of the first word and proper names. NEVER place full stops (periods) at the end of subheadings (unless the last word is an abbreviation requiring a full stop). Unless otherwise required, left justify all paragraphs. NEVER use the tab key or space bar to indent first lines: use only the FORMAT >PARAGRAPH pathway or FORMATTING PALETTE to indent left & right margins by 1 cm for subordinating text.

Reserve italics for Latin scientific names & diagnoses (required) or — occasionally — for emphasis. MYCOTAXON requires italics for names of taxa at all levels. Short Latin terms such as ‘et al.’ or ‘etc.’ should NOT be italicized.

LITERATURE CITED : Format all entries by selecting the ‘hanging indents’ option from the FORMAT >PARAGRAPH >SPECIAL menu pathway. Do not place empty lines between entries and do not place ‘and’ or ‘&’ between author names. Remove commas between surnames and initials and remove all spaces between initials. Italicize only Latin scientific names (not journal names or book titles). ‘Literature cited’ sample entries: Author1 AA, Author2 AB, Author3 WZ. 1006. Journal article title in sentence case. Mycotaxon #: #–#. Author AA, Author QJ. 1588. Journal article title in sentence case. Mycotaxon 1: 1607–1620. Author AA, Author2 AB, Author3 WZ. 2008. Book title in sentence case. Publisher: City (Country). # pp.

FUNGAL DIVERSITY INSTRUCT IONS TO AUTHORS

Fungal Diversity is an international journal that publishes papers in all fields of mycology, with preference in biodiversity, systematics, and molecular phylogeny. Review papers are welcome. Papers should be at least ten pages in Fungal D iversity Format. Publication is open to all persons. Corresponding authors will receive their published articles in PDF format.

Corresponding authors will receive their published articles in PDF format .

General Instructions

• Manuscripts should be submitted to the Editor-in-Chief (editor-in-chief@ fungaldiversity.org, [email protected], [email protected],) as email attachments and should include a covering letter including (i) title of the article (ii) name, address, fax. and e-mail address of the corr esponding author. The authors will receive acknowledgement through email within seven days after submitting. If there is no acknowledgement the authors may conclude that the manuscript has not been reached to Fungal Diversity. • Electronic manuscripts shou ld be submitted in word format. For review purposes all figures and tables should be inserted into the text. All figures, trees and plates should also be submitted as separate jpeg or Tiff files. Excel files for Tables are not acceptable. • The template of manuscript can be downloaded from the web site at the end of this page. • Page size 21.6 × 28 cm (8.5 × 11 inches), leave 4 cm margin on all sides and 1.5-spaced throughout. All paragraphs should be indented and justified aligned, except tables that shou ld be left aligned. • The content should be set out into four major sections: (i) Introduction; (ii) Materials and methods; (iii) Results; and (iv) Discussion, in most circumstances. Acknowledgements, references, figure legends, figures and tables should be followed in order. Commonly used abbreviations are as follows: (i) volume: mL; (ii) length: km; (iii) concentration: M; (iv) weight: kg; (v) temperature: °C; (vi) others: Fig., Figs. Months are not abbreviated. • Take all symbols from symbol (normal te xt) in MS Word. • Words of non-English origin, like in vivo, et al., ibid. and scientific names should be italicised. • Brackets are used in the following order: {level 3 [level 2 (level 1)]}. • Citation of nomenclatural authorities for taxa is optional except for taxonomic papers. For abbreviation of authors' names, use http://www.indexfungorum.org /Names/AuthorsOf FungalNames.asp. • Multiple references cited in text should be in chronological order, while multiple references from the same year are cit ed in alphabetical order. Where there are three or more authors, cite the first name only in text, adding et al. for all citations (Armstrong, 2000; Bell and Bell, 2000; Armstrong et al., 2002a,b, 2003). • References in reference list should be in ascending order of authors' names first, followed by year. Journal names and book titles should be spelt in full form. • Figures should be numbered consecutively with Arabic numbers, and in the order that they are referenced in the text. • Figures must be submitted as electronic files and they must be composed into plates. Figures must fit a maximum of 20 cm high by 13.5 wide including space for the legend after reduction. Single photographs that need mounting together are not acceptable. Electronic figures must be captured at or above 600 dpi resolution. • Sequences must be deposited in the GenBank, full alignment of datasets must be submitted to the TreeBASE and a Mycobank number must be added for new species and taxonomic changes. • Please note that all papers in Fungal Diversity are peer reviewed.

English Revision Editorial Policy

Papers will be sent for review and editors will check the scientific as well as English content. Authors however cannot expect editors to significantly rewrite poor English. Therefore if the paper is scientifically acceptable but the English requires substantial rewriting the paper will be rejected and returned to the authors. We however will offer an English Revision Service and will inform you of the costs involved. You may also find someone else to rewrite the English content of your papers. In this case you must resubmit the revised manuscript with a letter from the English reviser stating that he now considers the paper of sound English.

Title of manuscript

Kevin D. Hyde 1* and K.Q. Zhang 2

1K.D. Hyde’s address, no full stop at the end of address

2K.Q. Zhang’s address

Hyde, K.D. and Zhang, K.Q. (2003). Title of manuscript. Fungal Diversity 100: 1-2.

The abstract is in one paragraph and not indented. Omit reference citation and authors of taxa in abstract.

Key words: arrange in alphabetical order, do not replicate the title.

Introduction

Text can be organised under at most three levels of subheadings:

First level subheading

Start paragraph here.

Second level subheading

* Corresponding author: K.D. Hyde; e-mail: [email protected]

Start paragraph here.

Third level subheading . Start paragraph here.

Materials and methods

Results

Fungus name1 K.D. Hyde & K.Q. Zhang, sp. nov. (Fig. 1) Etymology : Explain here. Ascomata singularia, 2-9 mm diam. Asci 90-200 × 7-9 µm. Ascospores 10-11 × 4-5 µm. Ascomata single, 2-9 mm diam. Asci 90-200 × 7-9 µm ( x = 111.1 × 8.2 µm). Ascospores 10-11 × 4-5 µm ( x = 10.3 × 4.3 µm). Anamorph : not seen. Habitat : On living leaves of Livistona chinensis . Known distribution : Hong Kong. Material examined : CHINA, Hong Kong, The Peak, on decaying leaves of Livistona chinensis , 1 January 2003, K.D. Hyde (HERB 1111; holotype designated here ). Notes : Comment here.

Fungus name2 (K.D. Hyde) K.Q. Zhang & K.D. Hyde, Fungal Diversity 12: 3 (2003). (Figs. 2, 3) ≡ Mould name K.D. Hyde, Fungal Diversity 1: 11 (1998). Material examined : CHINA, Hong Kong, The Peak, on decaying leaves of Livistona chinensis , 1 January 1998, K.D. Hyde and K.Q. Zhang (HERB 2222; holotype ).

Discussion

Discuss here.

Acknowledgements

Acknowledge here.

References

Bell, A.A. and Bell, B.B. (1990a). Article title. Full Journal Name 1: 1-10. Bell, A.A., Bell, B.B. and Bell, E.E. (1981). Article title. Full Journal Name 2: (In press). Bell, A.A. and Bell, C.C. (1990b). Article title. In: Book Title: A Guide Book (eds. G. Bell, K. Bell and H. Bell). Press, Country: 21-54. [German, abstract] Mill, F.F. and Mill, D.D. (1990). Book Title . Vol . 2. 2nd edn. Press, Country. White, A.A. (1990). Thesis Title . Ph.D. thesis. University, Country.

(Received ***; accepted ***)

Fig. 1. Fungus name1 (from holotype). Asci and ascospores. Bar = 20 µm. Figs. 2, 3. Fungus name2 (from holotype). 1. Asci. 2. Ascospores. Bars: 1 = 20 µm; 2 = 5 µm.

Table 1. Type title here.

Fungus Ascomata Asci Ascospore

Fungus name1 2-10 mm diam Clavate 90-200 × 7-9 µm Oblong 10-11 × 4-5 µm Fungus name3 2-10 mm diam Cylindrical 50-100 × 4-5 µm Rhomboid 5-7 × 2-3 µm

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INSTRUÇÕES AOS AUTORES

• Objetivo e política editorial • Preparação de originais

ISSN 1517-8382 versão impressa ISSN 1678 -4405 versão online

Objetivo e política editorial

A Brazilian Journal of Microbiology destina-se à publicação de trabalhos de pesquisa originais, notas breves e, ocasionalmente, revisões, envolvendo todos os aspectos da microbiologia. Os textos submetidos à publicação devem ser redigidos em inglês, e conter Título, Resumo e Palavras-chave também em português. A Brazilian Journal of Microbiology tem uma política muito severa de avaliação dos trabalhos submetidos à publicação, sendo cada manuscrito avaliado por pelo menos dois revisores criteriosamente selecionados.

Brazilian Enviando originais pa ra publicação

Ser membro da Sociedade Brasileira de Microbiologia não é um pré-requisito para a aceitação de um manuscrito para publicação. Trabalhos de pesquisadores do Brasil e de outros países, não membros da SBM, são igualmente considerados para publicação.

Quando um manuscrito é submetido à publicação, entende-se que todos os autores e suas instituições estão de acordo com a publicação. Manuscritos submetidos à publicação na Brazilian Journal of Microbiology não podem ter sido publicados anteriormente (exceto na forma de resumo), nem ter sido sumbetidos à publicação em outro periódico.

Brazilian Journal of Microbiology não assume qualquer responsabilidade por erros cometidos pelos autores. Além disso, a Brazilian Journal of Microbiology não assume qualquer responsabilidade pelas conclusões dos autores.

Todos os manuscritos devem ser submetidos em triplicata aos Editores , e enviados ao endereço abaixo (por e-mail ou por fax não são aceitos).

Publicação de um manuscrito

Manuscritos são aceitos para publicação somente após criticamente revisados. Os

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trabalhos são avaliados por revisores indicados pelo Editores. Após a revisão, os manuscritos são devolvidos para o autor indicado, par a as correções sugeridas pelos revisores, quando necessárias. Os autores devem retornar o novo texto para os Editores. O autor indicado recebe uma notificação sobre o recebimento, a aceitação ou a recusa de um trabalho submetido à publicação.

Quando um man uscrito é aceito, o autor indicado é avisado sobre a necessidade de envio de um disquete de computador contendo o texto. O autor indicado receberá provas tipográficas para correção, que deverão ser cuidadosamente revisadas de acordo com as instruções enviadas e devolvidas no prazo de 5 dias.

Preparação de originais

Tipos de trabalhos

Os seguintes tipos de trabalho podem ser publicados na Brazilian Journal of Microbiology :

Trabalho de pesquisa relata os resultados de pesquisa original ainda não publica da. O texto deve ter de 12 a 15 páginas impressas, em espaço duplo, além das referências bibliográficas, tabelas e figuras pertinentes. Um Resumo com Título e Palavras-chave em português também devem ser incluídos.

Nota breve é um relato conciso de novas e importantes descobertas. A Nota Breve deve ser redigida de acordo com as instruções para a preparação de Trabalho de Pesquisa, mas sem as divisões em tópicos. Os Resumos em português e em inglês devem conter no máximo 50 palavras. Tabelas e Figuras devem limitar-se a duas tabelas ou duas figuras, ou uma tabela e uma figura. A designação short communication aparecerá no topo do trabalho. O autor deve indicar que o manuscrito é uma nota breve, permitindo que o texto seja avaliado de maneira apropriada.

Mini-revisão - Artigos de revisão serão sobre temas de interesse geral na área de microbiologia, escritos por especialistas convidados. Além dos resumos em inglês e em português, o texto poderá ter também um índice.

Preparação do texto

Geral

1. Todos os manuscr itos devem ser datilografados em espaço duplo, com amplas margens, com as páginas numeradas em seqüência. Trabalhos de pesquisa devem ter no máximo 15 páginas impressas, incluindo figuras e tabelas. Notas breves devem ter no máximo 6 páginas.

2. Todos os manuscritos devem ser redigidos em inglês. Os Editores recomendam que, antes de ser submetido, o texto seja cuidadosamente revisado por alguém

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fluente em inglês. Manuscritos em inglês precário não serão aceitos.

3. O texto deve ser organizado em tópicos, c onforme descrito no próximo parágrafo. O nome dos tópicos deve ser digitado em letras maiúsculas (ABSTRACT, INTRODUCTION etc.). A citação de tabelas e de figuras deve iniciar com maiúsculas (as shown in Table 1..., as presented in Fig. 2..., etc.).

4. A ab reviação de palavras e de símbolos deve seguir as recomendações da IUPAC-IUB Commission. O Sistema Métrico deve ser adotado em todo o texto.

5. Como regra, as referências devem ser citadas por seus números. Excepcionalmente, quando autores são mencionados no texto, a menção deve ser feita de acordo com os seguintes exemplos: Bergdoll (número) reported that..., Bailey and Cox (número) observed that..., ou Smith et al . (número) mentioned that... Não utilizar letras maiúsculas.

6. Aos autores dos trabalhos ace itos para publicação será solicitado o envio de um disquete de 3 1/2" contendo o trabalho digitado em um processador de texto adequado para PC. Esse material pode ser enviado também por correio eletrônico.

Organização

Página de título : Uma página separada deve conter o título do trabalho, o nome completo (inclusive o primeiro nome e as iniciais intermediárias) e a afiliação de cada autor. Um asterisco deve indicar o autor para correspondência. Os números de telefone e fax e o endereço eletrônico, quando dis ponível, devem ser assinalados no pé da página. A página de título não deve ter nenhum texto. O título deve ser o mais conciso possível e indicar claramente o objetivo do trabalho, não devendo conter abreviações. Expressões do tipo "Effects of...", "Influe nce of...", "Study on..." etc. devem ser evitadas. O título deve ser preparado com muito cuidado pois ele é utilizado nos sistemas de busca.

Abstract : Deve ser apresentado em uma página separada, limitando-se a no máximo 250 palavras. Ele deve resumir o c onteúdo básico do trabalho, devendo ser compreensível mesmo sem a consulta do texto completo. Um abstract não deve conter referências, tabelas ou abreviações incomuns. Abstracts devem ser preparados com muito cuidado pois são publicados em textos de referê ncia e lidos por pessoas que não têm acesso ao trabalho completo. Três a cinco keywords também devem ser apresentados.

Resumo : Resumo é o abstract redigido em português. Sua preparação deve seguir as recomendações para a preparação do abstract em inglês. O resumo deve ter também um título em português. As regras para o título em português são as mesmas para o título em inglês (ver acima). Três a cinco palavras-chave também devem ser apresentadas. O resumo e o título em português também devem ser apresentados em página separada.

Introdução : Deve iniciar em página nova e fornecer ao leitor informações suficientes para que os resultados relatados no trabalho possam ser avaliados sem consulta à literatura. Entretanto, a introduction não deve ser uma extensa revi são de literatura. Deve também dar subsídios para a compreensão dos

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objetivos do trabalho que está sendo apresentado.

Materiais e Métodos : Esse tópico deve fornecer informações suficientes para a repetição do trabalho. Descrição repetida de detalhes de téc nicas anteriormente publicadas deve ser evitada. Quando um método publicado é modificado pelos autores, essas modificações devem constar do texto. A origem de reagentes, meios de cultura e equipamentos (companhia, cidade, estado, país) deve ser mencionada. Nomes comerciais e marcas registradas também devem ser indicados. A utilização de subtópicos geralmente facilita a leitura e a compreensão desse item.

Resultados : Esse tópico deve, através de texto, tabelas ou figuras, fornecer os resultados experimentais. Caso um tópico relativo à Discussion seja incluído, evitar a excessiva interpretação dos resultados, que deverá ser feita na Discussion. Caso Results e Discussion sejam combinados em um único tópico, os resultados devem ser discutidos no texto quando ade quado. Tabelas devem ser numeradas independentemente das figuras, devendo-se utilizar números arábicos. Todas as tabelas e figuras devem ser mencionadas no texto. A localização mais adequada das tabelas e figuras deve ser assinalada.

Discussão : Deve fornec er a interpretação dos resultados em função das informações disponíveis.

Agradecimentos : Esse tópico é opcional e deve vir após a discussão. Destina-se a agradecimentos por apoio financeiro e pessoal.

Referências : A lista de referências bibliográficas dev e ser apresentada em ordem alfabética, de acordo com o sobrenome do primeiro autor. Todos os autores devem ser mencionados. As referências devem ser numeradas em ordem crescente. Cada referência deve ser citada no texto por seu número. Os nomes das revista s devem ser abreviados de acordo com o sistema utilizado pelo Biological Abstracts ou Chemical Abstracts . Todas as referências mencionadas na lista devem ser citadas no texto, assim como todas as referências citadas no texto devem constar da lista. Seguir os seguintes exemplos: a. Artigo em revista

Campos, L.C.; Whittam, T.S.; Gomes, T.A.T.; Andrade, J.R.C.; Trabulsi, L.R. Escherichia coli serogroup 0111 includes several clones of diarrhaegenic strains with different virulence properties. Infect. Immun. , 62:3282-3288, 1994. b. Trabalho ou capítulo em livro

Nelson, E.B. Current limits to biological control of fungal phytopathogens. In : Arora, D.K.; Rai, B.; Mukerji, K.G.; Knudsen, G. (eds). Handbook of applied mycology: soils and plants . Marcel Dekker, New York, 1991, p.327-355. c. Livro pelos autores

Salyers, A.A.; Whitt, D.D. Bacterial pathogenesis. A molecular approach . ASM,

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Washington, 1994, 418p. d. Patente

Hussong, R.V.; Marth, E.H.; Vakaleris, D.G. Manufacture of cottage cheese. U.S. Pat. 3,117,870 . Jan.14, 1964. e. Tese

Calzada, C.T. Campylobacter jejuni e Campylobacter coli – caracterização em sorogrupos e biotipos das cepas isoladas no município de São Paulo no período de 1983-1989 . São Paulo, 1991, 131p. (Ph.D. Thesis. Instituto de Ciências Biomédicas. USP). f. Publicação com autor ou editor desconhecido

Anonymous. The economy of by-products. Álcool Alcoolquim., 2: 33-40, 1985. g. Communicações em eventos (Simpósios, Conferências etc.)

Simões, G.S.; Silva, J.; Toledo, A.S.; Gontijo Filho, P.P. Micobactérias não tuberculosas isoladas de pacientes com sindrome da imunodeficiência adquirida . XVII Congresso Brasileiro de Microbiologia, Santos, 1993, p.41.

Referências como personal communication ou unpublished data devem ser evitadas, embora algumas vezes elas sejam necessárias. Nesses casos, elas devem ser citadas no texto e não na lista de referências bibliográficas. Referências a respeito de trabalhos accepted for publication ou in press podem ser utilizadas. No entanto, referências de trabalhos submitted ou in preparation não devem ser utilizadas.

Tabelas

As tabelas não devem estar no meio do texto. Cada tabela deve ser apresentada em uma página separada e numerada em seqüência empregando números arábicos. O título da tabela deve aparecer no topo, e descrever de maneira clara as informações apresentadas. Títulos e subtítulos devem ser concisos, apresentando os dados em colunas e linhas, cuidadosamente arranjadas.

Figuras

As figuras devem ser identificadas com números arábicos. Dados apresentados em tabelas não devem ser repetidos nas figuras. A legenda deve vir no pé da figura.

Fotografias e desenhos

Apenas fotografias extremamente necessárias para a compreensão do trabalho devem ser apresentadas. Sua qualidade deve ser suficiente para garantir boa reprodução. As fotografias devem ser numeradas no verso e identificadas com o

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nome do autor. No caso de desenhos, os detalhes devem ter qualidade suficiente para permitir redução. Desenhos e figuras devem ser desenhados ou impressos em preto e devem ser pre parados como indicado para as fotografias. Ilustrações coloridas não são aceitas.

Cópias

O autor indicado receberá gratuitamente quinze cópias do trabalho. Cópias adicionais, pagas, devem ser requisitadas no retorno da prova gráfica corrigida.