Uso De Assinaturas Estruturais Para Proposta De Mutações Em Enzimas Β-Glicosidase Usadas Na Produção De Biocombustíveis

i UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS PROGRAMA INTERUNIDADES DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOINFORMÁTICA DIEGO CÉSAR BATISTA MARIANO Uso de assinaturas estruturais para proposta de mutações em enzimas β-glicosidase usadas na produção de biocombustíveis Belo Horizonte 2019 ii UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS PROGRAMA INTERUNIDADES DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOINFORMÁTICA DIEGO CÉSAR BATISTA MARIANO Uso de assinaturas estruturais para proposta de mutações em enzimas β-glicosidase usadas na produção de biocombustíveis Tese apresentada ao Programa Interunidades de Pós- Graduação em Bioinformática da Universidade Fe- deral de Minas Gerais, como requisito à obtenção do título de Doutor em Bioinformática. Orientadora: Dra. Raquel Cardoso de Melo Minardi Belo Horizonte 2019 043 Mariano, Diego César Batista. Uso de assinaturas estruturais para proposta de mutações em enzimas β-glicosidade usadas na produção de biocombustíveis [manuscrito] /Diego César Batista Mariano. – 2019. 98 f. : il. ; 29,5 cm. Orientadora: Dra Raquel Cardoso de Melo Minardi. Tese (doutorado) – Universidade Federal de Minas Gerais, Instituto de Ciências Biológicas. Programa Interunidades de Pós-Graduação em Bioinformática. 1. Bioinformática - Teses. 2. Biocombustíveis. 3. Mutação. I. Minardi, Raquel Cardoso de Melo. II. Universidade Federal de Minas Gerais. Instituto de Ciências Biológicas. III. Título. CDU: 573:004 Ficha elaborada por Sônia M. S. Moraes CRB 6/1357 - ICB/UFMG i Resumo β-glicosidases (EC 3.2.1.21) são enzimas chave no processo de produção de biocombustíveis de segunda geração. Elas agem em conjunto com endoglucanases e exoglucanases na conver- são de biomassa em açúcares fermentáveis. Entretanto, a maior parte das β-glicosidases co- nhecidas são altamente inibidas por grandes concentrações de glicose. Assim, a busca por mu- tações que melhorem a atividade de β-glicosidases não tolerantes a inibição por glicose é de grande importância para a indústria. Nesta tese, é apresentada uma revisão sistemática da literatura para coletar informações sobre β-glicosidases glicose-tolerantes e construir uma base de dados, denominada BETAGDB. Além disso, são caracterizados resíduos importantes no bolsão catalítico para atividade e glicose-tolerância. Por fim, apresenta-se um método baseado na diferença de variação de assinaturas estruturais para propor mutações em enzimas, deno- minado SSV (Structural Signature Variation). SSV usa modelagem em grafos para criar uma assinatura estrutural identificadora de β-glicosidases glicose-tolerantes. O método SSV foi avaliado em três estudos de caso: (i) 27 mutações descritas na literatura foram manualmente classificadas como benéficas ou não. A seguir, a classificação foi reproduzida utilizando SSV. O método obteve uma acurácia de 0,74 e uma precisão de 0,89; (ii) 18 mutações benéficas foram propostas para a β-glicosidase não tolerante Bgl1B. Resultados experimentais de três mutações corroboram os resultados obtidos pelo segundo estudo de caso e demonstram que SSV é um método eficaz para proposta de mutações em β-glicosidases; e (iii) comparou-se SSV com SVM para verificar se a distância euclidiana, métrica usada por SSV para compara- ção de assinaturas, era eficaz. Comparou-se ainda com BioGPS, um método que usa fingerprints para proposta de mutações baseadas em estruturas tridimensionais. SSV obteve valores de precisão e especificidade superiores a SVM. Na comparação com BioGPS, SSV foi capaz de predizer corretamente cinco em sete mutações validadas em bancada que inseriam atividade amidase em uma lipase. Os resultados obtidos nesta tese podem ajudar na produção de enzimas β-glicosidases mutantes capazes de aperfeiçoar a produção de biocombustíveis de segunda geração. O método SSV pode ser estendido a outras enzimas e pode ainda ser utilizado em conjunto com outras estratégias e ferramentas para propor mutações mais eficientes. SSV está disponível em: <http://bioinfo.dcc.ufmg.br/ssv>. Palavras-chave: biocombustíveis, β-glicosidases, assinaturas estruturais, mutações, SSV ii Abstract β-glucosidases (EC 3.2.1.21) are key enzymes in the second-generation biofuel production. They act synergically with endoglucanases and exoglucanases in the conversion of biomass to fermentable sugars. However, most known β-glucosidases are highly inhibited by high glucose concentrations. Hence, the search for mutations that improve the activity of non-tolerant β-glucosidases has great importance to the industry. In this thesis, I present a systematic re- view of the literature to collect information about glucose-tolerant β-glucosidases and to con- struct a database, called BETAGDB. In addition, important residues for the activity and glucose-tolerance were characterized in the catalytic pocket. Finally, I proposed a method based on the difference of variation of structural signatures to propose mutations in enzymes, called Structural Signature Variation (SSV). SSV uses graph modeling to create a structural signature that identifies glucose-tolerant β-glucosidases. The SSV method was evaluated in three case studies: (i) 27 mutations described in the literature were manually classified as beneficial or not. The classification was then reproduced using SSV. The method obtained an accu- racy of 0.74 and a precision of 0.89; (ii) 18 beneficial mutations were proposed for the non- tolerant β-glucosidase Bgl1B. Experimental results of three mutations corroborate the out- comes obtained by the second case study and demonstrate that SSV is an effective method for the proposal of mutations in β-glucosidases; and (iii) SSV was compared with SVM to verify whether the Euclidean distance, metric used by SSV for comparison of signatures, was effective. It was also compared with BioGPS, a method that uses fingerprints to propose mutations based on three-dimensional structures. SSV obtained values of precision and specificity superior to SVM. In the comparison to BioGPS, SSV was able to correctly predict five in seven bench-validated mutations that inserted amidase activity into a lipase. The results obtained in this thesis may aid in the production of mutant β-glucosidase enzymes capable of enhancing the production of second-generation biofuels. The SSV method can be extended to other enzymes and can also be used together to other strategies and tools to propose more efficient mutations. SSV is available at <http://bioinfo.dcc.ufmg.br/ssv>. Keywords: biofuels, β-glucosidases, structural signatures, mutations, SSV iii Agradecimentos Gostaria de agradecer às agências de fomento à pesquisa: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq); ao Programa de Pós-graduação em Bioinformática da UFMG; e à equipe do Labora- tório de Bioinformática e Sistemas que me auxiliou nesta jornada. Agradeço a minha família pelo apoio e incentivo aos estudos; a meus orientadores de iniciação científica, mestrado e doutorado, que auxiliaram na minha construção como pesqui- sador; agradeço à comunidade de desenvolvedores de software livre e de divulgação científi- ca; e agradeço à Universidade Federal de Minas Gerais por fomentar minha formação intelec- tual, moral e ética. “O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001”. Edital Biolo- gia Computacional. Número de processo 23038.004007/2014-82. iv SUMÁRIO Resumo .................................................................................................................................................. i Abstract ................................................................................................................................................ ii Agradecimentos .............................................................................................................................. iii SUMÁRIO ............................................................................................................................................. iv Lista de Figuras ................................................................................................................................ vi Lista de Tabelas ............................................................................................................................. viii Lista de abreviações ....................................................................................................................... ix Produção Acadêmica ....................................................................................................................... x Artigos publicados diretamente relacionados a esta tese ...................................................................... x Prêmios obtidos durante o período de doutorado .................................................................................... x 1. Introdução ................................................................................................................................... 15 1.1 Enzimas β-glicosidase ...................................................................................................................... 19 1.2 Tolerância a glicose .......................................................................................................................... 22 1.3 Estimulação por glicose .................................................................................................................

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