Vetagro Sup Campus Veteri Aire De Lyo

VETAGRO SUP CAMPUS VETERI AIRE DE LYO

Année 2014 - Thèse n°

ETUDE D’U FOYER D’AAPLASMOSE BOVIE DAS LE DEPARTEMET DE LA LOIRE

THESE

Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I (Médecine - Pharmacie) et soutenue publiquement le 5 septembre 2014 pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire

par

Gasquet Charlotte Née le 10 octobre 1989 à Aix-En-Provence

2 Liste des enseignants du campus vétérinaire de Lyon

3 4 Remerciements

A Monsieur le professeur Charles Dumontet De la faculté de médecine de Lyon Qui m’a fait l’honneur d’accepter la présidence de mon jury de thèse Sincères remerciements et hommages respectueux

A Monsieur le professeur Lionel Zenner Du campus vétérinaire de Lyon Pour m’avoir proposé ce sujet et m’avoir soutenu tout au long de ce travail Sincères remerciements

A Madame le professeur Dominique Legrand Du campus vétérinaire de Lyon Pour m’avoir fait l’honneur d’accepter de participer à ce jury Sincères remerciements

A Monsieur Jean Luc Pingret Du laboratoire Scanélis ® Sans qui cette thèse n’aurait jamais vu le jour Pour sa participation, sa disponibilité et son professionnalisme Qu’il soit remercié de sa participation et de son implication

Au Docteur vétérinaire R V U Pour m’avoir proposé ce sujet et m’avoir soutenu tout au long de ce projet Pour son implication, son aide précieuse et sa disponibilité Sincères remerciements

A Monsieur l’éleveur Pour l’accueil chaleureux son élevage Pour sa disponibilité, son implication et sa gentillesse Sincères remerciements

A Madame Marie Thérèse Poirel Pour son aide précieuse lors des manipulations Pour sa gentillesse et son savoir faire Sincères remerciements

5 A mon Pépé parti trop tôt, Sans toi rien de tout cela n’aurait été possible Tu m’as transmis tes valeurs et des tonnes de souvenirs Tu resteras un modèle pour moi et j’espère t’avoir rendu fier

A mes parents Qui ont su m’encourager et me soutenir durant ces longue études Qui m’ont inculqué leurs valeurs et une certaine vision de la vie Qui y ont cru parfois plus que moi Qui sont toujours là quand j’ai besoin d’eux Milles merci

A Joana et Thomas Pour notre complicité et nos fous rires qui ont toujours su me faire oublier nos disputes

A ma mamie Pour être toujours là quand j’ai besoin d’elle Pour avoir toujours été présente dans ma vie dans les bons comme les mauvais moments

A Mimi Pour notre complicité et le rôle essentiel que tu as joué dans ma vie Pour ton soutien indéfectible et ta franchise légendaire

A ma famille Pour leur présence et leur soutien

6 Table des matières Remerciements 5 Liste des tableaux et des figures 13 Liste des abréviations 14

Introduction 15

Partie bibliographique 16

I Définition 17 II Histoire et découverte 17 III Etude bactériologique 18 III.A) Taxinomie 18 III.A.1) Place d’Anaplasma marginale dans la taxinomie 18 III.A.2) Autres Rickettsioses des ruminants 21 III.A.2.a) Anaplasma centrale 21 III.A.2.b) Anaplasma bovis 21 III.A.2.c) Anaplasma ovis 21 III.A.2.d) Anaplasma phagocytophilum 22 III.A.2.e) Ehrlichia ruminantium 22 III.B) Morphologie 24 III.C) Culture 25 III.D) Pouvoir antigénique 26 III.D.1) MSP1 27 III.D.1.a) MSP1a 27 III.D.1.b) MSP1b 27 III.D.2) MSP2 27 III.D.3) MSP3 28 III.D.4) MSP4 28 III.D.5) MSP5 28 III.E) Réponses immunitaire 29 III.E.1) Réponse humorale 29 III.E.1.a) Réponse à MSP1 29 III.E.1.b) Réponse à MSP2 30 III.E.2) Réponse cellulaire 30 III.E.2.a) Mécanismes généraux de la réponse cellulaire 30 III.E.2.b) Synergie entre les protéines 32

IV Epidémiologie 33 IV.A) Epidémiologie descriptive 33 IV.A.1) Populations affectées 33 IV.A.2) Répartition géographique 33 IV.A.3) Répartition saisonnière 34 IV.A.4) Importance économique 36 IV.B) Epidémiologie analytique 37 IV.B.1) Source de contamination et matières virulentes 37 IV.B.2) Modes de transmission 37 IV.C) Réservoirs 38 IV.D) Facteurs de réceptivité 38

V) Transmission vectorielle par les tiques 39 V.A) Caractéristiques principale des espèces de tiques 40 retrouvées dans notre étude V.A.1) Ixodes ricinus 40 V.A.2) Dermacentor marginatus 41 V.A.3) Dermacentor reticulatus 43 V.B) Transmission trans-stadiale et trans-ovarienne 43 V.C) Rôle essentiel des tiques mâles 44 V.D) Cas particulier des souches non transmissibles par 45 les tiques V.E) Illustration de l’importance de la lutte contre les 45 vecteurs V.F) Efficacité de la transmission d’ Anaplasma marginale 46

VI Pathogénie 46 VI.A) Pénétration dans les cellules 46 VI.B) Développement chez la tique 47 VI.C) Développement chez les bovins 47 VI.D) Exclusion d’un génotype par un autre 49 VI.E) Evolution de la bactériémie chez les bovins 50

VII Etude clinique 52 VII.A) Symptômes 52 VII.B) Modifications paracliniques 54 VII.C) Lésions nécropsiques 55 VII.C.1) Aspect macroscopique 55 VII.C.2) Aspect microscopique 57 VI.D) Pronostic 57

VIII Diagnostic 57 VIII.A) Epidémiologique 57 VIII.B) Clinique et lésionnel 58 VIII.C) Différentiel 58 VIII.D) Expérimental 59 VIII.D.1) Frottis 59 VIII.D.2) Sérologique 60 VIII.D.2.a) Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) 60 VIII.D.2.b) Test de fixation du complément 61 VIII.D.2.c) Agglutination sur carte 61 VIII.D.2.d) Immunofluorescence indirecte 61 VIII.D.3) Génetique 62 VIII.D.3.a) Polymerase chain réaction PCR 62 VIII.D.3.b) Autres méthodes utilisant l’AD/ 63

IX Traitement 64 IX.A) Traitement des animaux malades 64 IX.A.1) Traitement symptomatique 64 IX.A.2) Traitement spécifique 64 IX.A.2.a) Tétracyclines 65 IX.A.2.b) Imidocarb (carbésia /D) 65 IX.A.2.c) Autres 65 IX.B) Traitement des animaux porteurs 65

9 X Prophylaxie 66 X.A) Sanitaire et hygiénique 66 X.A.1) En zone endémique 66 X.A.2) En zone indemne 67 X.B) Médicale 67 X.B.1) Chémoprophylaxie 67 X.B.2) Vaccination 68 X.B.2.a) Vaccins vivant autologues 68 X.B.2.b) Vaccins vivants à Anaplasma centrale 69 X.B.2.c) Vaccins inactivés 70 X.B.2.d) Perspectives 71

Partie expérimentale 73

I.) Introduction 74 II) Matériel et méthode 75 II.A) Collecte des données de l’élevag e antérieure à la 75 période d’étude II.B) Traitements effectués sur certains animaux 75 porteurs II.C) Prélèvements sanguins 75 II.D) Collecte des tiques 76 II.E) Extraction de l’AD des tiques 82 II.F) Réalisation des PCR 83 II.G) Analyses statistiques des résultats 84

III Résultats 86 III.A) Antécédents et situation de l’élevage A avant la 86 fusion III.B) Essais de traitements effectués 88 III.C) Identification des tiques 88 III.D) Répartition des tiques dans les pâtures 89 III.E) Portage d’ A. marginale par les tiques 93 III.F) Prévalence de l’infection avant la fusion des 94 deux élevages III.G) Portage d’ A. marginale par les animaux après 96 une saison de pâturage commune

IV Discussion 96 IV.A) Prélèvements de sang 96 IV.B) Choix de la méthode de détection d’ Anaplasma 97 marginale IV.C) Choix de la méthode de collecte des tiques 97 IV.D) Choix de la PCR sur tique entière 98 IV.E) Traitements effectués sur les animaux porteurs 98 IV.F) Tiques récoltées lors de cette étude 99 IV.G) Portage d’ Anaplasma marginale par les tiques 100 collectées dans les pâtures IV.H) Prévalence de l’infection dans l’élevage A 101 IV.I) Etude de la diffusion de l’infection dans le 102 troupeau B après fusion des deux troupeau

V Conclusion sur le gestion du foyer et les 103 mesures envisageables V.A.) Utilisation d’acaricides sur les animaux 103 V.B) Lutte dans le milieu 105 V.C) Eviter l’apparition de cas cliniques 106 V.D) Vaccination 106 V.E) Traitement afin d’éradiquer les animaux porteurs 107

Conclusion 108 Bibliographie 109 Annexes 125

11 Liste des tableaux et figures

Liste des tableaux :

Tableau I : Principales caractéristiques des rickettsioses des 23 ruminants. Tableau II : Caractéristiques principales des protéines de la famille 29 MSP Tableau III : Comparaison des différents tests de diagnostic 62 sérologique Tableau IV : Différents protocoles de traitement efficaces pour 66 éliminer le portage chronique [91] Tableau V : Numération formule sanguine et analyses biochimiques 87 de la vache N° 38 Tableau VI : Résultats des PCR des animaux traités 88 Tableau VII : Identification des tiques récoltées 88 Tableau VIII : Identification des tiques dans les différentes pâtures 89 lors des collectes Tableau IX : Résultats de la recherche A. marginale sur les deux 95 troupeaux en avril 2013 Tableau X : Résultats des PCR sur sang dans les deux troupeaux 96 après une saison de pâturage commun

Liste des figures :

Figure 1 : A Inclusions de Anaplasma marginale visibles sur un 24 frottis sanguin de bovin atteint d’anaplasmose B Inclusion d’ Anaplasma marginale contenant trois sous- 24 unités au microscope électronique [87] Figure 2 : Morphologie d’ Anaplasma marginale au microscope 25 électronique Figure 3 : Répartition mondiale de l’anaplasmose 34 Figure 4 : Carte des départements ayant fait l’objet de publications 36 faisant état de cas d’anaplasmose bovine (liste non exhaustive ) Figure 5 : Spectre d'hôtes des différents stades d' Ixodes ricinus 40 Figure 6 : Distribution d’ Ixodes ricinus en Europe [31] 41 Figure 7 : Spectre d’hôtes des différents stades de Dermacentor 42 marginatus Figure 8 : Distribution de la tique Dermacentor marginatus en 42 Europe [31] Figure 9 : Spectre d’hôtes des différents stades de Dermacentor 43 reticulatus

12 Figure 10 : Distribution de la tique Dermacentor reticulatus en 44 France [31] Figure 11 : Cycle de A. marginale dans la cellule hôte 47 Figure 12 : Transmission vectorielle d’ Anaplasma marginale 49 Figure 13 : Bactériémie cyclique lors d’infection chronique à 50 Anaplasma marginale Figure14 : Mécanisme d’émergence de nouveaux variants de MSP2 51 Figure 15 : Ictère visible au niveau de la vulve sur une vache atteinte 53 d’anaplasmose [17] Figure 16 : Carcasse d’un animal atteint d’anaplasmose, noter la 56 pâleur de la carcasse et le léger ictère [17] Figure 17 : Foie d’un animal atteint d’anaplasmose, on note une 56 hypertrophie de la vésicule biliaire ainsi qu’une hypertrophie et un aspect marbré du foie [17] Figure 18 : Présence d’ Anaplasma marginale sur un frottis sanguin 59 [109]° Figure 19 : Emplacement des transects de la pâture n°2 78 Figure 20 : Emplacement des transects de la pâture n°3 78 Figure 21 : Emplacement des transects des pâtures n°17 et n°18 79 Figure 22 : Emplacement de transects de la pâture n°5 79 Figure 23 : Script du test de Fisher réalisé pour comparer les 84 prévalences d’ A. marginale dans les différentes espèces de tique Figure 24 : Script du test de Fisher exact réalisé dans R pour 85 comparer les fréquence de portage d’A. marginale dans les deux troupeaux avant la fusion. Figure 25 : Script du test de Fisher exact réalisé dans R pour 86 comparer les fréquence de contamination par A. marginale dans les deux troupeaux au cours de la saison de pâturage commun Figure 26 : Répartition des tiques par espèce dans les pâtures 90 Figure 27 : Répartition des tiques sur les pâtures 91 Figure 28 : Nombre moyen de tiques par transect sur chaque pâture 92 Figure 29 : Localisation des tiques positives sur les pâtures : la croix 94 bleu foncé représente la tiques Ixodes ricinus adulte positive et les croix bleu clair représentent les nymphes Ixodes ricinus positives

13 Liste des abréviations

ADN : Acide désoxyribonucléique ALKP : Phosphatase alcaline ARN : Acide ribonucléique ASAT : Aspartate amino transférase AMM : Autorisation de mise sur le marché Anses : Agence nationale de sécurité sanitaire de l’alimentation, de l’environnement et du travail dNTP : Dinucléotide triphosphote ELISA : Enzyme linked immuno sorbent assay Fig. : Figure GGT : Gamma Glutamyl Transpeptidase LA : Longue action MCHC : Concentration corpusculaire moyenne en hémogobine MSP : Major Surface Protein ND : Nom déposé PBS : Phosphate buffered saline PCR : Polymérase chain reaction Tab. : Tableau UV : Ultra Violet

14 Introduction

L’anaplasmose est une maladie causée par une bactérie de l’ordre des Rickettsiale et de la famille des Anaplasmataceae : Anaplasma marginale . Il s’agit d’une maladie vectorielle qui touche les bovins et peut être transmise par les tiques et certains insectes hématophages. Le tableau clinique de cette maladie est dominé par de l’hyperthermie, une anémie et parfois un ictère, pouvant parfois causer la mort de l’animal en quelques jours. Cette maladie est enzootique dans une grande partie des Etats Unis, de l’Amérique latine, de l’Asie et de l’Afrique. On observe depuis quelques années une remontée de la maladie vers le nord aussi bien sur le continent américain qu’en Europe. Cette maladie est sporadique en Europe et notamment en France où des cas ont été décrits depuis plusieurs dizaines d’années. L’anaplasmose est aussi connue en France sous le nom de « piroplasmose blanche ». Autrefois Maladie à Déclaration Obligatoire elle n’apparaît plus dans la classification actuelle des maladies réglementées.

Dans ce contexte, il semble intéressant d’étudier un foyer d’anaplasmose dans notre pays. Dans une première partie nous ferons le point sur les connaissances actuelles sur l’anaplasmose en nous intéressant successivement aux caractéristiques d’ Anaplasma marginale , à l’épidémiologie de la maladie, à sa transmission par les tiques, à sa pathogénie, à ses manifestations cliniques, à son diagnostic, à son traitement et enfin à sa prophylaxie. Dans une deuxième partie nous étudierons un foyer d’anaplasmose bovine dans un élevage laitier situé dans la Loire. Dans cette étude le premier objectif sera de déterminer si les tiques présentes sur les parcelles de l’exploitation sont porteuses d’ A. marginale et ainsi de mettre en évidence un vecteur biologique pour A. marginale dans cet élevage. Le deuxième objectif sera d’observer la diffusion de l’infection d’un troupeau atteint vers un troupeau sain au cours d’une saison de pâturage commun.

Partie bibliographique

I Définition

L’anaplasmose bovine est une maladie infectieuse, inoculable et transmissible par des arthropodes piqueurs, qui touche les bovins et qui est due à une bactérie, Anaplasma marginale, qui apparaît sous forme d’inclusions dans les érythrocytes.

Cette bactérie appartient à l’ordre des Rickettsiales et à la famille des Anaplasmataceae . L’anaplasmose bovine se manifeste cliniquement par un syndrome fébrile, une anémie sévère et parfois un ictère.

II Histoire et découverte

En 1910, en Afrique du Sud, Arnold Theiler visualise sur les frottis sanguins de bovins atteints de la « Gall-sickness » des corpuscules qu’il nomme « corps marginaux » situés dans les érythrocytes. Il décrit alors cet agent pathogène comme un protozoaire responsable de la maladie et l’appelle Anaplasma marginale en raison de sa position périphérique dans les érythrocytes [85], [96].

Auparavant, ces corpuscules étaient confondus avec des babésies comme le montrent les travaux de Smith et Kilbornes, qui, en 1893, décrivent les mêmes « corps marginaux » mais les assimilent à une forme de Piroplasma bigemina . L’anaplasmose décrite par Theiler en 1911 est par la suite reconnue aux Etats Unis en 1926 lorsqu’elle est identifiée par Darlington au Kansas [85],[87], [96].

En 1911 Arnold Theiler découvre aussi Anaplasma centrale (aujourd’hui dénommée Anaplasma marginale subsp. centrale ) qui est très proche de Anaplasma marginale et cause des symptômes similaires mais beaucoup plus modérés. Theiler a alors l’idée d’utiliser Anaplasma centrale comme un vaccin contre Anaplasma marginale [85], [96].

Anaplasma marginale est par la suite rattachée à l’ordre des Rickettsiale en 1957 [51].

17 III Etude bactériologique

III.A) Taxinomie

III.A.1) Place d’ Anaplasma marginale dans la taxinomie

Pendant longtemps le genre Anaplasma a été placé parmi les protozoaires notamment par analogie avec les babésies. Depuis 1957 il a été rattaché à l’ordre des Rickettsiale du fait de ses propriétés métaboliques, morphologiques et sérologiques [51]. Ainsi Anaplasma marginale appartient à la sous-classe α des protéo- bactéries et à l’ordre des Rickettsiale . Les bactéries de cet ordre sont définies comme des bactéries Gram -, de petite taille, se divisant par scission binaire, cultivables sur des tissus vivants et pouvant causer des infections chez les vertébrés et les invertébrés [85], [96].

Avant 1993 l’ordre des Rickettsiale était subdivisé en trois familles : celle des Rickettsiaceae , celle des Anaplasmataceae et celle des Bartonellaceae . La famille des Rickettsiaceae était divisée en trois tribus : celle des Rickettsiaeae , celle des Ehrlichieae, et celle des Wolbachieae .

18 La classification alors admise était la suivante :

Ordre des Rickettsiale Famille des Rickettsiaceae Tribu des Rickettsiaeae Genre des Rickettsia Genre des Rochalimaea Genre des Coxiella Tribu des Ehrlichieae Genre Ehrlichia Genre Cowdria Genre /eorickettsia Tribu des Wolbachieae Genre Wolbachia Genre Rickettsiella Famille des Anaplasmataceae Genre Anaplasma Genre Aegyptianella Genre Haemobartonella Genre Eperythrozoon Famille des Bartonellaceae Genre Bartonella Genre Grahamelle

Cette classification a été plusieurs fois remodifiée depuis, notamment avec l’exclusion de la famille des Bartonellaceae [24], [13]) et des genres Coxiella [139], Eperythrozoon et Haemobartonelle [113], [137] Cependant il faudra attendre 2001 pour qu’une nouvelle classification soit proposée par Dumler et al. [50].

La classification proposée par Dumler et al. est basée sur l’analyse des séquences de l’ARN 16S, des gènes de l’opéron GroESL, et des gènes codants pour des protéines de surface [50], [161]. Elle a été validé en 2004 et apparaît actuellement dans le Bergey’s manual of Systemic Bacteriology [23].

19 Cette nouvelle classification est la suivante :

Ordre des Rickettsiales Famille des Rickettsiaceae Genre Rickettsia Genre Orienta Famille des Anaplasmataceae Genre Anaplasma Anaplasma phagocytophilum Anaplasma marginale Anaplasma ovis Anaplasma bovis Anaplasma platys Genre Ehrlichia Ehrlichia chaffeensis Ehrlichia ruminantium Ehrlichia ewingii Ehrlichia ovis Ehrlichia canis Ehrlichia muris Genre /eorickettsia /eorickettsia helminthoeca /eorickettsia risticii /eorickettsia sennetsu Genre Wolbachia Wolbachia pipientis

La famille des Anaplasmataceae regroupe des bactéries intracellulaires obligatoires se répliquant dans des vacuoles présentes dans le cytoplasme de cellules hôtes eucaryotes. Celle des Rickettsiaceae regroupe des bactéries intracellulaires obligatoires qui croissent directement dans le cytoplasme de cellules hôtes eucaryotes [86].

Les bactéries du genre Anaplasma sont des bactéries Gram négatif, de petite taille, polymorphes (ellipsoïdes ou rondes), qui se multiplient dans des vacuoles à l’intérieur du cytoplasme de leurs cellules hôtes sous forme de morula (contenant plusieurs bactéries). Leurs cellules hôtes sont des cellules hématopoïétiques matures ou immatures (neutrophiles, érythrocytes, plaquettes…). Ces bactéries infectent des mammifères (humains, bovins, petits ruminants, chien, chevaux…) et ont pour vecteur diverses espèces de tiques [50].

20 En ce qui concerne Anaplasma marginale , des études phylogénétiques et l’étude des séquences du gène msp4 (codant pour une protéine de surface) ont montré l’existence de différents clades contenant chacun plusieurs souches et étant différemment répartis géographiquement : un clade en Amérique latine contenant deux sous clades (mexicain et sud américain ), deux aux Etats-Unis (le clade du Sud en Floride, Virginie et au Mississipi et le clade de l’Ouest en Californie, Idaho, Oklahoma et au Texas) [87], [98].

Nous allons à présent faire une revue de quelques bactéries de l’ordre des Rickettsiale affectant les ruminants.

III.A.2) Autres Rickettsioses des ruminants

III.A.2.a) Anaplasma centrale

Anaplasma centrale est une espèce proche de Anaplasma marginale . Cette bactérie infecte les érythrocytes des bovins et cause des symptômes similaires à l’anaplasmose bovine, mais très atténués. Découverte par Theiler en 1911, elle est visible sur les frottis sanguins des animaux atteints sous forme d’inclusions intra-érythrocytaires en position centrale contrairement à Anaplasma marginale .

L’infection d’un bovin par Anaplasma centrale lui confère une protection contre la maladie provoquée par Anaplasma marginale . Ainsi Anaplasma centrale est utilisée dans certains pays comme vaccin vivant contre l’anaplasmose bovine [50].

III.A.2.b) Anaplasma bovis

Cette bactérie, anciennement nommée Ehrlichia bovis est responsable de l’anaplasmose générale bovine chez les bovins. Elle infecte les monocytes et entraîne des symptômes tels que fièvre, faiblesse et pâleur des muqueuses [50]

III.A.2.c) Anaplasma ovis

Anaplasma ovis infecte les petits ruminants chez lesquels elle provoque des symptômes similaires à l’anaplasmose bovine mais plus modérés. Les caprins y sont plus sensibles que les ovins [50].

21 III.A.2.d) Anaplasma phagocytophilum

Cette espèce rassemble les bactéries précédemment nommées Ehrlichia equi, Ehrlichia phagocytophila et agent de l’ehrlichiose granulocytaire chez l’homme (HGE). Ces bactéries étaient considérées comme des espèces distinctes. Suite aux travaux de Dumler et al. en 2001 elles sont aujourd’hui considérées comme une même espèce subdivisée en différents philums [50]. Anaplasma phagocytophilum infecte les neutrophiles de différents mammifères [50].

Cette bactérie est responsable de l’ehrlichiose bovine, de l’ehrlichiose granulocytaire équine, de l’ehrlichiose granulocytaire humaine et d’une forme d’ehrlichiose granulocytaire canine[50].

Chez les chevaux et les chiens, la maladie est caractérisée par de la fièvre, une dépression, de l’anorexie, une leucopénie et une thrombocytopénie. Chez les chevaux elle peut aussi provoquer une ataxie ou un œdème des membres et elle peut être compliquée par des infections opportunistes.

Chez les ruminants, Anaplasma phagocytophilum est à l’origine de l’ehrlichiose bovine souvent confondue, à tort, avec l’anaplasmose bovine. Cette maladie est appelée « tick-borne fever » par les anglo-saxons. Elle provoque de la fièvre parfois un œdème des membres et une leucopénie.

Anaplasma phagocytophilum infecte aussi l’homme chez qui la maladie est caractérisée par de la fièvre, des céphalées, des myalgies, une thrombocytopénie et des lésions hépatiques[50], [67].

II.A.2.e) Ehrlichia ruminantium

Cette bactérie anciennement appelée Cowdria ruminantium est responsable de la maladie dénommée cowdriose ou « heartwater » par les anglo-saxons, qui affecte les bovins, chez qui elle provoque une hydro-péricardite. Cette maladie est endémique en Afrique [67].

Le tableau 1 présente les caractéristiques des principales rickettsioses des ruminants.

Tableau I : Principales caractéristiques des rickettsioses des ruminants .

Bactérie Maladie Espèces atteintes cellules hôtes symptômes

idem anaplasmose mais Anaplasma centrale Anaplasmose à A. centrale bovins érythrocytes atténués Anaplasma bovis fièvres, faiblesse et pâleur (anciennement Anaplasmose générale bovine bovins monocytes des muqueuses Ehrlichia bovis ) idem anaplasmose mais Anaplasma ovis Anaplasmose ovine petits ruminants érythrocytes atténués Anaplasma phagocytophilum Ehrlichiose granulocytaire hommes, chevaux, polynucléaires fièvre anorexie dépression, (anciennement équine, canine et humaine, chiens, bovins neutrophiles œdème des membres Ehrlichia ehrlichiose bovine phagocytophila ) Ehrlichia ruminantium cellules petits ruminants, (anciennement Cowdriose ou "heartwater" endothéliales hydro-péricardite bovins Cowdria et neutrophiles ruminantium )

23 III.B) Morphologie

Anaplasma marginale est une bactérie Gram négatif contenant un génome circulaire de petite taille (estimé à 1,2 à 1,6 Mb) [3], [87], qui, comme les autres bactéries de la famille des Anaplasmataceae, ne contient pas de Lipopolysaccharide [119].

Elle est visible sur frottis sanguin coloré au Giemsa sous forme d’inclusions rondes, denses, pourpre foncé, de 0,3 à 0,8 microns de diamètre, accolées à la membrane des érythrocytes et aux contours légèrement irréguliers (ce qui les différencie des corps de Howell-Joly qui sont parfaitement ronds). Ces inclusions contiennent 4 à 8 sous-unités appelées « corps initiaux » et constitués chacun d’une bactérie [85], [96].

Au microscope électronique, ces corps initiaux contiennent une membrane externe et une membrane interne, qui entourent une matière filamenteuse dense comme on peut le voir sur les figures 1et 2 [85], [96].

Figure 1 : A Inclusions de Anaplasma marginale visibles sur un frottis sanguin de bovin atteint d’anaplasmose B Inclusion d’ Anaplasma marginale contenant trois sous-unités au microscope électronique [87].

24 Membrane de l’érythrocyte

Corps initiaux

Membrane de la vacuole

Figure 2 : Morphologie d’ Anaplasma marginale au microscope électronique

III.C) Culture

La culture de Anaplasma marginale est difficile. La croissance sur les lignées cellulaires habituellement utilisées, ou sur œufs embryonnés, est faible voire nulle, ce qui est probablement dû à l’absence des métabolites nécessaires ou à un environnement défavorable [39].

Les premiers succès ont été obtenus par culture dans des érythrocytes bovins, des cellules provenant de moelles osseuses de lapin, des cellules de nœuds lymphatiques bovins et dans des cellules de moustique Aedes albopictus , La bactérie survivait quelques jours et parfois se multipliait [39].

En 1978, Davis et al. ont démontré que cultivée sur des érythrocytes bovins Anaplasma marginale reste en vie et garde son infectivité 5 jours. Durant cette période les bactéries présentent une activité métabolique (mise en évidence par l’incorporation de métabolites radioactifs) et synthétisent de l’ADN et des protéines [43], [14], [39].

En 1996, une lignée de cellules dérivées d’embryons d’ Ixodes scapularis (la lignée IDE8) est mise au point. Cultivée sur cette lignée pendant trois ans Anaplasma marginale conserve son pouvoir infectieux pour les bovins et les tiques et reste morphologiquement semblable aux formes observées chez les tiques [9], [111].

Le cycle observé en culture est le même que celui observé dans les cellules de tiques in vivo . Anaplasma marginale est successivement présente sous deux formes : une forme dense qui contient une concentration dense et homogène en ribosomes et dont les fibrilles d’ADN ne sont pas apparentes en microscopie électronique, qui est la forme infectieuse de la bactérie, et une forme réticulée dans laquelle la concentration en ribosome est moins dense et dont les fibrilles d’ADN sont visibles qui est la forme végétative de la bactérie ayant la capacité de se multiplier par scission binaire.

Ainsi, en culture, les formes denses présentes dans l’inoculum adhèrent aux cellules et les infectent, puis elles se transforment en formes réticulées qui se divisent par scission binaire pour former des colonies larges constituées de plusieurs bactéries, qui donnent à nouveau des formes denses, capables d’infecter d’autres cellules (cf. Partie VI) [9], [14], [87].

La culture est également possible sur une autre lignée (nommé BME26) constituée de cellules de Rhipicephalus microplus [163].

III.D) Pouvoir antigénique

Anaplasma marginale est une bactérie intra-cellulaire qui se développe dans les érythrocytes. Nous allons maintenant voir les antigènes principaux de cette bactérie. Nous verrons ainsi leur rôle lors de l’infection de l’hôte et des vecteurs ainsi que le rôle immunologique et diagnostique de certains de ces antigènes.

Nous nous intéresserons plus particulièrement à une famille d’antigène très importante qui est la famille des Major surface protein (MSP) qui regroupe les protéines MSP1, MSP2, MSP3, MSP4 et MSP5 qui ont des rôles immunologiques, infectieux et diagnostiques essentiels.

26 III.D.1) MSP1

La protéine MSP1 (précédemment appelée Am105) est un hétéro-dimère constitué de deux sous-unités : MSP1a et MSP1b [11], [86].

III.D.1.a) MSP1a

MSP1a est une protéine trans-membranaire codée par le gène msp1α. Cette protéine de surface a un rôle dans l’adhésion aux érythrocytes bovins et aux cellules de tiques, et un rôle dans la transmission de la bactérie aux bovins par la tique Dermacentor sp. [41]. Elle est également la cible d’anticorps neutralisants qui empêchent l’infection des érythrocytes in vivo [15], [40], [64], [103].

MSP1a contient des épitopes pour les lymphocytes et induit une solide réponse des lymphocytes T [46], [85].

III.D.1.b) MSP1b

MSP1b est une protéine polymorphique codée par une famille de gènes nommés msp1β [159]. Plusieurs variants de MSP1b sont présents simultanément lors de l’infection [19].

MSP1b est une adhésine permettant l’adhésion de la bactérie aux érythrocytes bovins mais pas aux cellules de tiques contrairement à MSP1a [102]. Ainsi cette protéine est essentielle pour l’infection des animaux [40], [64], [103]. MSP1b possède un épitope ayant un rôle dans la fixation des anticorps neutralisant à la bactérie.

III.D.2) MSP2

Lors d’infections chroniques, la séquence de la protéine MSP2 varie de manière cyclique avec émergence de nouveaux variants toutes les 4 à 8 semaines [8]. MSP2 est constituée d’une région centrale hyper-variable hydrophile exposée à la surface de la bactérie et de deux régions (N-terminale et C- terminale) hydrophobes et stables permettant l’ancrage à la membrane de la bactérie [56].

27 MSP2 est codée par une famille de gènes polymorphiques. En fait il n’existe qu’une séquence transcrite de MSP2 sur le génome mais il existe 9 pseudogènes de MSP2, qui sont des séquences d’ADN non transcrites réparties sur le génome, et capables de se recombiner dans la séquence transcrite du gène MSP2 pour donner de nouveaux variants [21], [99].

MSP2 est à l’origine d’une réponse immunitaire protectrice. Les régions conservées mais aussi la région hyper-variable de MSP2 portent en effet des T- épitopes ce qui pourrait expliquer l’existence d’une rickettsiémie cyclique lors d’infections chroniques [28]. Une nouvelle réponse lymphocyte T est initiée lors de l’émergence d’un nouveau variant de MSP2, permettant une augmentation de la rickettsiémie le temps que cette réponse se mette en place, et entraînant par la suite une diminution de la rickettsiémie lorsque la réponse est en place. Cependant lors d’infections chroniques la rickettsiémie reste tout de même plus faible que lors de l’infection initiale grâce à la réponse dirigée contre les épitopes conservés [28].

III.D.3) MSP3

MSP3 est codée par une famille de gènes polymorphiques [4]. Elle présente le même mécanisme de variation antigénique que MSP2 [106].

III.D.4) MSP4

MSP4 est conservée dans les différentes souches de Anaplasma marginale d’un point de vue structurel et génétique et elle est codée par un seul gène. Le rôle de cette protéine n’est pas connu [87], [120], [124].

III.D.5) MSP5

MSP5 est codée par un seul gène et partage un épitope avec Anaplasma centrale et ovis . MSP5 est utilisée pour l’élaboration de tests diagnostiques car elle est très stable. De plus, elle est la cible d’Immunoglobulines synthétisées lors de l’infection à Anaplasma marginale [9], [82], [133], [160].

28 Le tableau 2 résume les principales caractéristiques des protéines de la famille des Major Surface Protein :

Tableau II : Caractéristiques principales des protéines de la famille MSP

Présence de variations Protéine Gène codant antigéniques au Rôles Rôle immunitaire cours de l'infection adhésion aux érythrocytes cible d'anticorps MSP1a msp1α non et aux cellules de tique neutralisants MSP1 cible d'anticorps MSP1b msp1β non adhésion aux érythrocytes neutralysants cible d'une réponse MSP2 msp2 oui immunitaire protectrice MSP3 msp3 oui MSP4 msp4 non connu non connu MSP5 msp5 rôle diagnostique cible d'anticorps

Ces différents antigènes sont la cible de la réponse immunitaire de l’hôte. Dans la partie suivante nous évoquerons les principaux mécanismes de cette réponse immunitaire.

III.E) Réponses immunitaires

La réponse immunitaire des animaux face à une infection par Anaplasma marginale passe à la fois par une réponse humorale et par une réponse cellulaire.

III.E.1) Réponse humorale

La réponse humorale est entre autre dirigée contre les protéines MSP1 et MSP2 [149]. Comme pour toutes les bactéries intra-cellulaires, la réponse humorale n’a qu’un rôle limité, car durant la majeure partie du temps les bactéries sont à l’abri de cette réponse humorale dans les érythrocytes. Cependant les anticorps peuvent avoir un rôle en empêchant la fixation des bactéries aux érythrocytes et donc leur internalisation ou en permettant l’activation de la réponse cellulaire.

III.E.1.a) Réponse à MSP1

Les anticorps dirigés contre le complexe MSP1, MSP1a ou MSP1b permettent l’opsonisation de la bactérie et empêchent ainsi sa fixation aux érythrocytes.

29 L’immunisation des bovins avec la protéine MSP1 provenant de bactéries prélevées dans les érythrocytes entraîne une protection des animaux à la fois contre les souches homologues et les souches hétérologues. Cette protection est associée au développement d’anticorps neutralisants et opsonisants [26], [121], [47]. Cela montre l’importance de cette protéine dans la réponse immunitaire de l’hôte.

III.E.1.b) Réponse à MSP2

Il y a aussi une immunité humorale dirigée contre MSP2 qui est efficace. En effet, si le titre en anticorps anti-MSP2 est suffisant, cela peut permettre de bloquer l’infection par les bactéries porteuses de ce variant de MSP2 [122]. Lors d’auto stérilisation des bovins, on observe la disparition des anticorps anti-MSP2.

Cependant l’importance de l’immunité humorale dans la réponse à Anaplasma marginale est à moduler, car il n’y a pas de transmission passive de l’immunité lorsque l’on transfuse à des veaux non immunisés du sérum de vaches immunisées contre Anaplasma marginale et contenant des anticorps dirigés contre cette bactérie. De plus, on constate qu’il y a transmission d’une immunité colostrale de la mère au veau qui persiste environ deux mois mais qui n’est pas protectrice [12], [62], [63], [72].

Cela montre que l’immunité humorale n’est pas suffisante. En outre, on observe qu’après un traitement immunosuppresseur, la bactériémie augmente chez les porteurs chroniques. Cette augmentation est trop rapide pour être consécutive à une baisse du taux d’Immunoglobuline G2, ce qui laisse supposer l’existence d’une immunité cellulaire [27].

III.E.2) Réponse cellulaire

III.E.2.a) Mécanismes généraux de la réponse cellulaire

Après immunisation avec des extraits de membrane externe d’ Anaplasma marginale purifiés , on observe une protection des veaux contre des souches homologues. Cette protection est associée à une réponse des cellules mononucléées du sang spécifiques de l’antigène (lymphocytes T CD4+ et lymphocytes produisant l’interféron gamma ), elle protège les animaux à la fois contre les signes cliniques et contre le portage. Ainsi l’immunité cellulaire est le mécanisme protecteur le plus important contre Anaplasma marginale [27].

Comme pour toutes les bactéries intra-cellulaires, la réponse à Anaplasma marginale est avant tout basée sur une réponse cellulaire. En effet, les bactéries ne sont accessibles aux mécanismes de défense humoraux qu’avant leur entrée dans les érythrocytes donc durant un temps très bref.

Cette réponse immunitaire cellulaire est dirigée contre des épitopes situés sur MSP1a, MSP1b, MSP2 et MSP3 [27], [87].

Les effecteurs de l’immunité les plus importants dans la réponse à Anaplasma marginale sont les macrophages, qui appartiennent au système réticulo-endothélial. Ainsi les macrophages phagocytent les érythrocytes infectés et permettent leur destruction.

Les lymphocytes T CD4+ de type Th1 ont, quant à eux, un rôle d’activation des macrophages. En effet, après la reconnaissance des cellules infectées par les lymphocytes CD4+ naïfs par l’intermédiaire du Complexe Majeur d’Histocompatibilité de type 2, ces Lymphocytes T CD4+ se différencient en lymphocytes T CD4+ de type Th1 et sécrètent des lymphokines telles que l’interféron ɤ et le Tumor Nécrosis Factor [27], qui ont la capacité d’activer les macrophages. On observe lors de l’immunisation des animaux contre Anaplasma marginale, une production d’Interféron gamma importante, ce qui peut faire penser à une réponse contre Anaplasma marginale majoritairement basée sur cette production d’interféron ɤ [27].

L’interféron ɤ permet : la synthèse d’Immunoglobuline G2 par les lymphocytes B, qui sont les anticorps opsonisants principaux chez les bovins, et l’activation des macrophages entraînant une augmentation de l’expression des récepteurs, de la phagocytose, de la fusion des phagosomes et des lysosomes et la libération de monoxyde d’azote (NO) [87].

Le rôle du monoxyde d’azote (NO) produit par les macrophages contre Anaplasma marginale n’est pas encore bien établi. En effet, le monoxyde d’azote est un inhibiteur de nombreux pathogènes intracellulaires dont les bactéries du genre Rickettsia . Cependant l’action du monoxyde d’azote contre Anaplasma marginale n’a pas pu être démontré. Au contraire : l’utilisation d’un inhibiteur du NO (l’aminoguanine) permet de diminuer la bactériémie, peut-être à cause de l’effet immunosuppresseur du monoxyde d’azote [62].

En plus de leur rôle dans la phagocytose, les macrophages agissent dans la régulation de la réponse cellulaire à A. marginale . En effet, ils produisent des cytokines telles que l’interleukine 12 (IL-12) qui ont un rôle essentiel pour permettre une réponse efficace contre la bactérie.

Des études ont ainsi montré que l’utilisation de l’interleukine 12, qui est sécrétée lors d’infection par les macrophages, comme adjuvant dans un vaccin contenant MSP2, augmente la production d’interféron gamma par les cellules CD4+, accroît la multiplication des cellules dans les nœuds lymphatiques, entraîne la production d’Interleukine 2, et augmente le taux en anticorps. Ainsi l’Interleukine 12 permet la mise en place d’une réponse mémoire à Immunoglobuline G et une réponse des cytokines [154].

Les lymphocytes T helpers ont aussi un rôle puisqu’ils permettent aux lymphocytes B de synthétiser des Immunoglobulines G2 plutôt que des immunoglobulines G1. Or, les Immunoglobulines G2 sont les principaux anticorps opsonisants chez les bovins [27].

Lors du premier contact de l’organisme avec Anaplasma marginale il y a aussi différenciation de lymphocytes T naïfs en lymphocytes T mémoires qui vont avoir un rôle essentiel car leur réponse rapide contribue au contrôle de la bactériémie durant l’infection persistante (durant laquelle la bactériémie reste cent à mille fois inférieure à celle observée durant la phase aiguë). Cette reconnaissance par les Lymphocytes T mémoire pourrait aussi accélérer la synthèse d’anticorps par les lymphocytes B [25].

III.E.2.b) Synergie entre les protéines

Une étude a montré l’importance de la liaison entre les protéines pour la reconnaissance des épitopes et notamment de la liaison entre MSP1a et MSP1b car la réponse immunitaire contre la protéine MSP1 n’est efficace que si les animaux sont immunisés avec un dimère contenant ces deux protéines [26], [121].

De même, aucune protéine de surface isolée ne peut induire la même protection qu’un complexe formé de protéines de la membrane externe ou d’un complexe formé de protéines de surface. Cela montre la nécessité de l’existence d’une diversité d’antigène pour induire une protection, ou de la nécessité de la reconnaissance conjointe de protéines dans des complexes associés aux membranes [119].

La réponse anticorps anti-MSP1a est plus forte lorsque l’immunisation est faite avec des Anaplasma marginale tuées dérivées d’érythrocytes bovins, alors que lorsque Anaplasma marginale dérive de la culture de cellules de tique la réponse en anticorps est surtout dirigée contre MSP1b. Or on peut observer que MSP1a est moins exprimée dans les glandes salivaires et les cellules de tique en culture, que dans les érythrocytes. Cette différence est due à une différence de transcription. Ainsi il se pourrait qu’il existe une immunodominance de MSP1a sur MSP1b : si MSP1a est présente en grande quantité (comme dans les érythrocytes) moins d’anticorps contre MSP1b sont synthétisés [118].

IV Epidémiologie

IV.A) Epidémiologie descriptive

IV.A.1) Populations affectées

Anaplasma marginale est spécifique des ruminants et plus particulièrement des bovidés et cervidés. Cependant, les signes cliniques ne s’observent que chez les bovins, qui sont sensibles à la fois à Anaplasma marginale et à Anaplasma centrale [85], [129] . Il est important de préciser que les bovins sont aussi sensibles à Anaplasma phagocytophilum mais que cette bactérie, qui se multiplie dans les polynucléaires neutrophiles, provoque une maladie appelée ehrlichiose dont les symptômes (fièvre, œdème des membres, chute de la production laitière) sont très différents de ceux de l’anaplasmose.

IV.A.2) Répartition géographique

Anaplasma marginale est présente sur les 5 continents. La prévalence est forte dans les zones tropicales et subtropicales où la maladie est endémique car de nombreux vecteurs sont présents [85], [129].

33 Ainsi Anaplasma marginale est endémique dans une grande partie des Etats Unis, en Amérique latine, en Australie, en Asie, et en Afrique. La répartition d’ Anaplasma marginale dans ces zones dépend du climat et de la répartition des vecteurs. Dans ces régions d’endémie, la séropositivité à Anaplasma marginale est supérieure à 60% et atteint souvent 90% [127], [129].

Depuis quelques dizaines d’années, on observe une remontée de la maladie vers le Nord que ce soit sur le continent américain ou en Europe.

Ainsi depuis 2000 des cas d’anaplasmose sont rapportés au Canada alors qu’il s’agissait auparavant d’une zone indemne [86]. De même on observe une émergence de cas en Europe, ainsi des cas ont été décrits en Italie, en Suisse, en Hongrie (en 2009), en Autriche (en 1992), au Portugal, en Espagne et en France (1976, 1956, 1972, 1987) [35], [48], [59], [78], [94], [145], [151]. La répartition mondiale de l’anaplasmose est présenté sur la figure 3.

Figure 3 : Répartition mondiale de l’anaplasmose

34 Nous allons à présent détailler un peu plus la situation en Europe.

En Italie différents cas d’anaplasmose ont été décrits depuis quelques dizaines d’années. La maladie est endémique dans le sud de l’Italie mais tend à remonter de plus en plus vers le nord. Il a été montré que la transmission d’ Anaplasma marginale en Italie se fait grâce aux tiques des genres Ixodes, Hyalomma, Dermacentor et Rhipicephalus [151].

En Suisse, la séroprévalence de l’anaplasmose était estimée à 2,3% en 1998 dans la région des Grisons, frontalière de l’Italie. Différents cas ont été observés dans ce pays, avec notamment une épizootie d’anaplasmose observée en 2002 dans un élevage causant des signes cliniques sévères [74].

En Espagne on retrouve Anaplasma marginale en particulier dans les régions du Sud du pays. Elle est notamment présente dans la faune sauvage chez Cervus elaphus hispanicus (cerf élaphe), qui pourrait être un réservoir. Elle est retrouvée dans les tiques de l’espèce Rhipicephalus bursa, connue comme étant un vecteur pour Anaplasma marginale, et dans celles de l’espèce Hyalomma marginatus prélevées chez ces animaux. Cependant il n’a jamais été démontré que cette espèce de tique est un vecteur pour Anaplasma marginale [47].

En France des cas ont été décrits dans la région toulousaine, en Saône et Loire, en Gironde, dans l’Est de la France, en Haute Saône, en Aveyron, dans les Côtes d’Armor, dans la Manche et le Calvados, dans le Sud-Ouest de la France etc. [35], [48], [59], [94], [78], [145]. Ces cas sont décrits depuis les années 1930. Il apparaît donc que l’anaplasmose est sporadique en France [47], [74], [76] [85], [129], [151], [164]. Il est possible que d’autre cas soient apparus sans que le diagnostic n’ait été établi car de nombreux vétérinaires évoquent des cas de « piroplasmose blanche ». Au cours de ce travail toutes les Directions départementales de la protection des populations ont été contactées. Seule celle du département du Jura avait reçu une déclaration de cas d’anaplasmose bovine clinique.

Figure 4 : Carte des départements ayant fait l’objet de publication faisant état de cas d’anaplasmose bovine (liste non exhaustive)

IV.A.3) Répartition saisonnière

L’anaplasmose pouvant être transmise par les tiques qui ont une activité saisonnière (printemps et automne principalement), on observe plus de cas cliniques a ces périodes. Cependant, il est à noter que la durée d’incubation de la maladie peut durer jusqu’à soixante jours. On peut ainsi observer des cas cliniques en été et en hiver si l’incubation a été longue. Il a été montré que dans les régions où la transmission se fait principalement par les insectes hématophages les cas d’anaplasmose sont plus fréquents durant la saison d’activité de ces insectes. Cependant une étude de Guglielmone et al. a montré que cette saisonnalité n’est présente que chez les bovins allaitants ce qui tend à montrer que dans chez les bovins laitiers la transmission iatrogène pourrait jouer un rôle important dans la diffusion de la maladie [69].

IV.A.4) Importance économique

L’impact économique de l’anaplasmose est très important dans les pays où cette maladie est endémique. Ainsi, au Etats-Unis, des pertes estimées à 300 millions de dollars par an sont engendrées par les conséquences de la maladie chez les animaux (mortalités, chutes de production, avortements, infertilité), mais aussi par le coût des traitements, de la prévention et de la limitation des mouvements d’animaux pour éviter l’extension de la maladie [87].

36 IV.B) Epidémiologie analytique

IV.B.1) Source de contamination et matières virulentes

La seule source de contamination de l’anaplasmose est le sang des animaux infectés. Il peut s’agir de bovins présentant une anaplasmose clinique, de bovins porteurs chroniques, ou d’espèces de ruminants sauvages porteuses, qui peuvent constituer des réservoirs pour l’anaplasmose.

IV.B.2) Modes de transmission

Quatre modes de transmission existent pour Anaplasma marginale : • Transmission par les tiques qui sont des vecteurs biologiques • Transmission par les insectes hématophages qui sont des vecteurs mécaniques • Transmission iatrogène (utilisation de matériel souillé et transfusion sanguines) • Transmission in utéro

Nous détaillerons le premier mode de transmission, qui est le mode principal, dans la partie V.

La transmission iatrogène s’effectue par l’intermédiaire d’aiguilles souillées par du sang et réutilisées, d’un matériel de tatouage ou de castration insuffisamment nettoyé, mais aussi lors de transfusions si le bovin donneur est porteur. L’efficacité de la transmission iatrogène est variable selon la virulence de la souche d’ Anaplasma marginale [85].

Anaplasma marginale est capable de traverser la barrière placentaire. Ainsi, in utero, la transmission a lieu lors des deux derniers trimestres de gestation. Il peut en résulter un avortement ou une infection néonatale. Dans des conditions expérimentales la prévalence de la transmission au fœtus est de 15,6% [87], [128].

Quel que soit le mode de transmission, les porteurs chroniques jouent un rôle très important de réservoir.

37 La transmission d’ Anaplasma marginale est possible mécaniquement par des insectes hématophages tels que les tabanidés, certaines espèces de diptères, les mouche Hippelates pusio, Stomoxis calcitrans, et celle du genre Haematobia [5] [36]. Lors d’une transmission mécanique par des insectes hématophages, ceux-ci restent porteurs d’ Anaplasma marginale pendant environ 2h ce qui limite la transmission [142].

Cependant les femelles de ces espèces se nourrissent en général successivement sur plusieurs animaux ce qui peut permettre la transmission d’un animal à un autre [5], [75].

IV.C) Réservoirs

Seul les bovins peuvent présenter des signes cliniques suite à une infection par Anaplasma marginale , chez les petits ruminants A. marginale cause une infection inapparente, de nombreuses espèces de ruminants sauvages peuvent être porteuses et donc servir de réservoir pour Anaplasma marginale et être à l’origine d’enzooties [84], [129].

Ces espèces sont entre autres : Bison bison (bison américain) , Odocoileus hemionus hemionus (cerf mulet) , Odocoileus hemonius colombianus, Bubalus bubalus ( Buffle d’asie), Cervus elaphus nelsoni (cerf élaphe) , Damaliscus dorcas (blesbok), Sylvicapra grimma (céphalope), etc. [5], [32], [47], [80], [147], [161].

IV.D) Facteurs de réceptivité

La sensibilité des bovins à Anaplasma marginale varie en fonction [96][127] : • - de l’âge : les veaux présentent une résistance naturelle jusqu’à l’âge de 9 -10 mois, puis la sensibilité augmente progressivement. Ainsi les animaux infectés entre 0 et 1 an resteront asymptomatiques, ceux infectés entre 1 et 3 ans présenteront généralement des signes cliniques modérés, et ceux infectés après 3 ans présenteront des symptômes d’anaplasmose aiguë. Ainsi 81% des cas d’anaplasmose sont retrouvés chez des bovins âgés de 2 à 4 ans, et parmi ces bovins atteints, 94% ont plus de trois ans [87] • - de la race : les animaux issus de races améliorées semblent plus sensibles [87] • - de l’alimentation : les animaux soumis à un régime moins énergétique semblant présenter des signes d’anaplasmose moins sévères

38 • - du sexe : les mâles sont plus souvent atteints que les femelles. Une explication possible étant que les oestrogènes permettraient de diminuer la rickettsiémie. Cependant cette différence entre les femelles et les mâles semble disparaître dans les zones où la prévalence de Anaplasma marginale est forte [77]. • - des conditions d’élevage : la maladie est plus sévère lorsque les conditions d’élevage sont mauvaises • - de la production : les vaches laitières hautes productrices sont plus sensibles • - de la sensibilité individuelle de chaque animal à une immunisation préalable : après la première infection les animaux présentent une immunité forte et durable qui les protège d’une nouvelle infection • - de facteurs extérieurs tels que le stress, l’existence de maladies intercurrentes dans l’élevage • - de la zone géographique : l’apparition de signes cliniques est rare en zone enzootique car la pression d’infection est élevée. Les animaux sont donc infectés tôt (en moyenne à 11 semaines en zone d’endémie) et ne manifestent pas de signes cliniques. Les changements hématologiques observés sur ces animaux sont brefs et légers, et une immunité solide est mise en place par la suite. Il en résulte que, dans ces zones, les cas d’anaplasmose clinique apparaissent chez des animaux naïfs introduits dans un troupeau atteint, par extension des vecteurs ou aux interfaces entre zone endémique et zone non atteinte [17], [77], [87], [96], [127].

V) Transmission vectorielle par les tiques

Plus de 20 espèces de tiques sont connues pour être des vecteurs d’ Anaplasma marginale : les plus importantes sont les espèces du genre Boophilus (B. microplus, B. decoloratus et B.annulatus), Rhipicephalus sanguineus Rhipicephalus sinus et Rhipicephalus evertsi, Hyolomma excavatum et Dermacentor variabilis [96], [143].

Cependant d’autres espèces de tiques sont également des vecteurs pour Anaplasma marginale telles que Argas persicus, Dermacentor albicus (qui sévit en hiver aux Etats-Unis et peut donc être à l’origine de cas hivernaux d’anaplasmose [52]) D. andersoni, Ixodes ricinus, Rhipicephalus bursa.

39 Beaucoup de ces tiques sont présentes en région tropicale et subtropicale [95], [96], [143]. Des études menées en Europe ont montré que Dermacentor reticulatus, qui est une des espèces de tiques largement retrouvée en Europe, peut être un vecteur pour Anaplasma marginale [164].

Les espèces de tiques retrouvées dans cette étude sont : Dermacentor marginatus et Dermacentor reticulatus et Ixodes ricinus . Nous allons détailler par la suite les principales caractéristiques de ces espèces.

V.A) Caractéristiques principales des espèces de tiques retrouvées dans notre étude

IV.A.1) Ixodes ricinus

Il s’agit de l’espèce de tique la plus commune et dont le rôle de vecteur pour différentes maladies est le plus marqué. Ixodes ricinus présente, à tous les stades, un spectre d’hôte très large et parasite ainsi les ongulés à tous les stades (Fig. 5) [126].

Figure 5 : Spectre d'hôtes des différents stades d' Ixodes ricinus

40 En laboratoire, à une température de 15 à 20°C, le cycle d’Ixodes ricinus dure de 5 à 10 mois. Du fait des variations saisonnières de température, dans la nature il dure 2 à 3 ans [126].

Ixodes ricinus est active toute l’année, mais en France on observe deux pics d’activité : le premier et le plus important s’étend de mai à juillet, le deuxième est moins important et a lieu durant l’automne [126].

En France (climat méso-humide) ces tiques recherchent l’humidité et se retrouvent donc en forêt, le long des haies en région de bocage, dans les buissons et les bosquets. En ce qui concerne la végétation au sol, on retrouve ces tiques dans les zones couvertes de joncs, de carex, de moulinies, de bruyères, de fougères aigle….

Les Ixodes ricinus sont des tiques peu thermophiles mais très hydrophiles. En France on les retrouve donc sur l’ensemble du territoire, sauf dans les zones où l’altitude est supérieure à 1300-1500m, et dans la région méditerranéenne où elle ne sont présentes que dans des sites frais (Fig.6) [126].

Figure 6 : Distribution d’ Ixodes ricinus en Europe [31]

IV.A.2) Dermacentor marginatus

Les larves et les nymphes sont présentes dans les abris de leurs hôtes qui sont des micro-mammifères, et les adultes parasitent essentiellement les ongulés, aussi bien domestiques que sauvages. Contrairement aux tiques de l’espèce Dermacentor reticulatus , D. marginatus ne parasite qu’occasionnellement les carnivores. Comme nous pouvons le voir dont la figure suivante (Fig. 7) :

41 Figure 7 : Spectre d’hôtes des différents stades de Dermacentor marginatus

Les adultes sont principalement actifs de fin janvier à début mai, et les nymphes de septembre à octobre. D. marginatus est thermophile, en France on retrouve cette espèce partout sauf dans les zones très froides. Elle est présente principalement dans des biotopes ouverts et plutôt secs, mais aussi en forêt dans les clairières et le long de grandes allées et routes (Fig. 8) [126].

Figure 8 : Distribution de la tique Dermacentor marginatus en Europe [31]

42 IV.A.3) Dermacentor reticulatus

Les larves et les nymphes parasitent les micro-mammifères, et les stades adultes parasitent principalement les carnivores, en particulier les chiens mais aussi, secondairement, les ongulés (Fig. 9) [126].

Figure 9 : Spectre d’hôtes des différents stades de Dermacentor reticulatus

Les adultes sont actifs d’octobre à juillet, et les nymphes sont actives en juillet. Ces tiques sont moins xéro-thermophiles que Dermacentor marginatus . En France, elles sont largement distribuées, sauf dans les zones très sèches ou en altitude. On les retrouve dans des biotopes ouverts tels que des prairies pâturées, des landes… mais aussi dans des biotopes boisés, dans les clairières par exemple, ainsi qu’en milieux urbains et sur-urbains, notamment dans les terrains en friche (Fig. 10) [126].

Figure 10 : Distribution de la tique Dermacentor reticulatus en France [31]

IV.B) Transmission trans-stadiale et trans-ovarienne

Chez les tiques, la transmission trans-stadiale a été démontrée chez plusieurs espèces ( D. andersoni, D. variabilis, R. sinus, Boophilus spp.) mais la transmission trans-ovarienne n’a jamais été démontrée à ce jour [87]. De même, contrairement à d’autres espèces bactériennes, il a été montré que lors de la prise de repas simultanée sur un même animal non infecté de deux tiques, dont l’une est infectée et pas l’autre (co-feeding), il n’y a pas de transmission d’ Anaplasma marginale à la tique non infectée [84].

IV.C) Rôle essentiel des tiques mâles

Les tiques mâles jouent un rôle très important dans la transmission d’ Anaplasma marginale . En effet les mâles se nourrissent de manière intermittente : après un repas principal durant 4 à 8 jours les mâles peuvent ensuite s’attacher successivement à d’autres animaux, et ainsi transmettre Anaplasma marginale d’un animal à l’autre. De plus il a été démontré que la transmission par les tiques adultes semble être plus importante si celles-ci ont été infectées au stade adulte plutôt qu’au stade larve, ce qui souligne encore l’importance des mâles qui se nourrissent successivement sur plusieurs animaux au stade adulte [55], [119].

44 IV.D) Cas particulier des souches non transmissibles par les tiques

Certaines souches d’ Anaplasma marginale ne sont pas transmissibles par les tiques. En effet, certaines souches ne sont pas capables d’envahir le système digestif des tiques ou d’être transmises à l’animal hôte à partir des glandes salivaires des tiques. Cette différence de transmissibilité par les tiques entre les différentes souches pourrait être due à une différence au niveau des protéines de surface exposées par la bactérie. En effet si l’on compare des bactéries Escherichia coli recombinantes qui synthétisent MSP1a provenant soit d’une souche de Floride (non transmissible par les tiques), soit d’une souche Oklahoma (transmissible par les tiques), seules les Escherichia coli exprimant MSP1a de la souche Oklahoma adhèrent aux cellules de tique en culture [42]. Anaplasma marginale subsp centrale (anciennement nommée Anaplasma centrale ) notamment n’est pas transmissible par les tiques [42], [155], [156].

IV.E) Illustration de l’importance de la lutte contre les vecteurs

Aux Etats Unis, dans les années 40, des mesures de lutte très importantes ont permis d’éradiquer Boophilus microplus qui était auparavant le principal vecteur d’ Anaplasma marginale dans ce pays. En effet tous les stades de Boophilus microplus se nourrissent sur les bovins, ce qui permet une transmission par une tique infectée au stade précédent.

Depuis l’éradication de cette espèce de tique, les vecteurs principaux de Anaplasma marginale aux Etats Unis sont Dermacentor andersoni et variabilis, qui sont de moins bons vecteurs car les stades larvaires et nymphaux de ces espèces se nourrissent sur des petits mammifères, empêchant donc la contamination par Anaplasma marginale à ces stades.

Cependant une étude a montré que malgré l’absence de contact et donc de co-évolution entre les souches américaines et la tique Boophilus microplus pendant 70 ans, cette dernière a conservé sa capacité à transmettre ces souches, ce qui montre la nécessité de continuer la lutte contre ce vecteur aux Etats Unis, et le faible impact de l’éradication d’une espèce de tique temporairement dans un milieu [57], [104].

45 IV.F) Efficacité de la transmission d’ Anaplasma marginale

Chez la tique Dermacentor andersoni, il a été montré que la transmission du bovin à la tique est corrélée positivement à la bactériémie au moment du repas sanguin. Cependant le nombre de bactéries présentes ensuite dans la tique ne dépend pas de cette bactériémie, car les bactéries se multiplient de façon importante dans la tique [55].

VI Pathogénie

VI.A) Pénétration dans les cellules

Comme nous l’avons vu précédemment, Anaplasma marginale est successivement présente sous deux formes dans les cellules qu’elle infecte : • une forme dense, qui contient une concentration dense et homogène en ribosomes et dont les fibrilles d’ADN ne sont pas apparentes en microscopie électronique, qui est la forme infectieuse de la bactérie. • une forme réticulée dans laquelle la concentration en ribosome est moins dense et dont les fibrilles d’ADN sont visibles, qui est la forme végétative de la bactérie, qui a la capacité de se multiplier par scission binaire. [86], [134]

En culture (sur des lignées cellulaires constituées de cellules de tique) Anaplasma marginale sous forme dense adhère aux cellules hôtes (ici les cellules de tique) grâce à des protéines de surface notamment MSP1a et MSP1b, puis, une projection de la membrane de la cellule hôte s’accole le long de la membrane externe d’ A. marginale . Une dépression se forme ensuite dans la cellule hôte entourant la bactérie. Ainsi, A. marginale est entourée par la membrane de la cellule hôte, et internalisée dans une vacuole à l’intérieur de la cellule hôte [86], [134].

A. marginale apparaît ensuite sous sa forme réticulée (végétative) qui se divise par scission binaire, donnant des colonies de plusieurs centaines de bactéries en 48h. En trois jours la forme réticulée laisse place à la forme dense.

Le quatrième jour la membrane de la vacuole contenant les colonies fusionne avec la membrane plasmique de la cellule hôte, permettant la libération des formes denses, et entraînant un nouveau cycle d’infection (Fig. 11).

46 Adhésion de la bactérie à l a cellule hôte

A. marginale sous forme dense

Internalisation de la bactérie

Membrane de la cellule hôte

Multiplication de la bactérie sous forme réticulée

Passage de la forme réticulée à la forme dense

Libération des bactéries

Figure 11 : Cycle de A. marginale dans la cellule hôte

47 Ce cycle semble être retrouvé chez toutes les cellules hôtes, qu’il s’agisse des érythrocytes bovins ou des cellules de tique. En culture la mort des cellules de tique survient après que la plupart des cellules aient été infectées : les cellules de tiques se séparent, et les conséquences des effets cytopathogènes exercés par A. marginale sont observables en microscopie [86], [134]. Le mécanisme d’entrée et de sortie de A. marginale dans les cellules hôtes, semble être contrôlé à la fois par la bactérie et par la cellule hôte [134].

VI.B) Développement chez la tique

La source d’infection de la tique, est représentée par les bactéries présentes dans les globules rouges ingérés lors du repas sanguin. Ces bactéries sont libérées dans la lumière du tube digestif. Elles infectent les cellules du tube digestif puis se propagent (probablement via l’hémolymphe) dans divers tissus de la tique, dont les glandes salivaires via lesquelles Anaplasma marginale est transmise au bovin lors du repas sanguin de la tique [86], [134].

VI.C) Développement chez les bovins

Chez les bovins, les cellules cibles d’Anaplasma marginale sont les érythrocytes. Or, lors du repas sanguin de la tique, celle-ci ne pique pas directement dans les vaisseaux sanguins. Comment les érythrocytes sont-ils infectés ?

Il a été montré d’abord in vitro puis in vivo , que A. marginale est capable d’infecter les cellules endothéliales. Ainsi il est possible que A. marginale contamine les érythrocytes à partir des cellules endothéliales, par contact cellulaire. Les cellules endothéliales pourraient ainsi servir soit de site de réplication initial de la bactérie, soit de réservoir de A. marginale lors d’infections persistantes [30], [110].

Les érythrocytes contaminés sont phagocytés par les cellules du système réticulo-endothélial, ce qui permet la libération des bactéries, et l’infection d’autres érythrocytes. Cette hémolyse extra-vasculaire explique l’absence d’hémoglobinurie et d’hémoglobinémie. La rate joue un rôle très important dans cette hémolyse extra-vasculaire, ce qui explique la splénomégalie observée chez les animaux atteints [35].

Dans les érythrocytes la bactérie se multiplie par scission binaire jusqu’à ce que 4 à 6 corps initiaux soient présents par érythrocyte [96].

48 La figure 12 résume le cycle de transmission de A. marginale .

Figure 12 : Transmission vectorielle d’ Anaplasma marginale [87]

VI.C) Exclusion d’un génotype par un autre

En 2001 et 2002, des études ont montré que dans les zones où l’anaplasmose est endémique, et où plusieurs génotypes sévissent, chaque animal n’est infecté que par un seul génotype ce qui suggère un mécanisme d’exclusion entre les différents génotypes. Plus précisément, lorsqu’un animal est infecté par un génotype même s’il est exposé par la suite à un autre génotype, il reste porteur uniquement du premier génotype [43], [125].

De même si on inocule à un animal simultanément et à dose égale deux souches, il n’est infecté que par l’une des deux souches. Cette exclusion est présente aussi dans les cellules de tique in vitro [43], [125].

Ce phénomène d’exclusion a été décrit plusieurs fois chez les bactéries du genre Rickettsia, mais son mécanisme reste inconnu [19], [43], [44], [125].

49 Cependant, depuis d’autres études ont montré qu’un même animal peut être infecté simultanément par deux souches si celles-ci sont suffisamment éloignées. Ce phénomène est appelé Superinfection [97]. Il a aussi été montré que dans ce cas les tiques se nourrissant sur les animaux infectés par les deux souches, peuvent être infestées elles aussi par les deux souches et peuvent les transmettre toutes deux.

VI.E) Evolution de la bactériémie chez les bovins

Deux à trois semaines après l’inoculation on observe une augmentation rapide du pourcentage d’érythrocytes infectés jusqu’à un pic durant lequel ce pourcentage atteint 30 à 70%. Les signes cliniques apparaissent 4 à 6 semaines après l’inoculation. Si les animaux guérissent, la bactériémie diminue ensuite rapidement [81]. Lors d’infections chroniques la bactériemie est cyclique. En effet le nombre d’érythrocytes infectés par mililitres varie entre 10 2 et 10 7 selon un cycle de 5 à 8 semaines [55], [56], [58]. On observe ainsi des pics de bactériémie successifs qui sont suivis d’une diminution très rapide de la bactériémie. Ces pics sont plus faibles que le premier pic observé lors de l’infection aiguë (Fig. 13).

Figure 13 : Bactériémie cyclique lors d’infection chronique à Anaplasma marginale [122]

En fait, ces cycles successifs sont dus à l’émergence de nouveaux variants antigéniques qui échappent à la réponse immunitaire initialement mise en place et contre lesquels une nouvelle réponse immunitaire apparaît ensuite, entraînant une diminution de la bactériémie. Le temps que cette nouvelle réponse immunitaire se mette en place, la bactériémie augmente, permettant l’apparition des pics successifs [10], [58].

Cette variation antigénique est notamment portée par la protéine de surface MSP2. En effet MSP2 est codée par des gènes polymorphiques qui représentent 1% du génome [10], [58]. MSP2 est constituée d’une région hyper-variable hydrophile au centre entourée de région N-terminale et C-terminale hydrophobes peu variables. En fait il existe un site unique d’expression de MSP2 dans le génome d’ Anaplasma marginale , cependant il existe au moins neuf pseudo-gènes de MSP2 qui sont appelés pseudogènes fonctionnels, car ils ont la capacité de se recombiner au niveau du site d’expression et ainsi de générer de nouveaux variants. Il peut y avoir recombinaison soit de l’intégralité du pseudo-gène, soit d’une petite séquence du pseudo-gène, ce qui permet la création de mosaïques de MSP2 par association de petites séquences provenant des différents pseudo-gènes. Ce gène subit aussi des délétions et des insertions. Ce mécanisme est schématisé sur la figure 14. La diversité antigénique résultant de ce mécanisme est suffisante pour permettre l’émergence de nouveaux variants durant toute la vie de l’animal [22], [123].

pseudogène

Site d’expression de MSP2 Recombinaison

Figure 14 : Mécanisme d’émergence de nouveaux variants de MSP2

Ainsi lors de l’infection initiale de nombreux variants antigéniques de MSP2 sont exprimés puis une réponse immunitaire se met en place qui élimine plus de 99% des bactéries mais n’élimine pas complètement l’infection, cela se reproduit lors de chaque pic de bactériémie. Il est possible que certains variants persistent lors du pic suivant durant lequel de nouveaux variants émergent aussi ce qui contribue à la formation de nouveaux épitopes notamment par la formation de dimères [10], [56]. Une réponse lymphocyte B est ainsi mise en place à chaque cycle, contre les nouveaux variants avec la synthèse d’immunoglobulines G2 dirigées contre les nouveaux épitopes. Or en général la réponse Immunoglobuline G2 est consécutive à la synthèse d’IFNγ synthétisé par les lymphocytes T CD4+, il doit donc y avoir aussi une réponse T CD4+ dirigée contre ces nouveaux épitopes.

Lorsqu’une tique se nourrit sur un bovin infecté, quels que soient les variants présents chez le bovin, de nouveaux variants spécifiques de la souche d’ Anaplasma marginale et de l’espèce de la tique vont s’exprimer chez celle-ci. Ce sont ces variants qui sont détectables dans la tique 48h après le repas sanguin et ce sont eux qui vont être transmis aux bovins [140], [141], [165].

VII Etude clinique

Les animaux infectés par A. marginale peuvent développer une forme aïgue de la maladie ou devenir porteurs chroniques asymptomatiques. Nous verrons par la suite que les animaux porteurs chronique ont un rôle très important dans la transmission de la maladie.

VII.A) Symptômes

La durée d’incubation est variable selon la dose infectante et se situe entre 7 et 60 jours avec une moyenne de 28 jours. Il s’agit de la phase durant laquelle les anaplasmes se multiplient dans les érythrocytes [85].

Lorsque les animaux sont atteints de la forme aiguë de la maladie, ils présentent une hyperthermie oscillante (généralement inférieure à 40,5°C) accompagnée d’un syndrome fébrile qui se manifeste par une perte de l’appétit et de poids, une chute de la production laitière et une léthargie [130].

52 L’anémie causée par la maladie entraîne une pâleur des muqueuses et, dans les cas graves, elle peut entraîner un ictère (par accumulation de bilirubine due à la destruction massive des érythrocytes atteints) (Fig. 15), une polypnée et une tachycardie qui peut être accompagnée d’un souffle cardiaque [130].

Les animaux atteints peuvent aussi présenter des signes digestifs tels que constipation et indigestion du feuillet (fèces sèches, coiffées de mucus et contenant parfois du sang) [94], [127].

Chez les femelles gravides, l’anaplasmose peut entraîner un avortement surtout dans le dernier tiers de gestation. Il se produit généralement 2 à 4 semaines après l’apparition des premiers signes cliniques [37].

Contrairement à ce que l’on observe dans le cas de la piroplasmose il n’y a jamais d’hémoglubinurie ou d’hémoglobinémie lors d’anaplasmose clinique car les érythrocytes sont détruits par le système réticulo-endothélial.

Figure 15 : Ictère visible au niveau de la vulve sur une vache atteinte d’anaplasmose [16].

D’autres signes, plus rares, peuvent apparaître : un œdème des paupières, un larmoiement, des troubles nerveux par défaut d’oxygénation du cerveau (irritabilité, parfois agressivité ou parésie du train postérieur), des tremblements musculaires (des muscles triceps et tenseurs du fascia lata), une augmentation de la fréquence d’émission de l’urine, de l’infertilité, et un anoestrus chez les génisses ou une dégénérescence testiculaire et anomalie des spermatozoïdes chez les taureaux [130].

53 Souvent les animaux âgés de plus de 2 ans meurent en 3 à 4 jours après l’apparition des signes cliniques. Les animaux qui survivent à l’infection aiguë deviennent le plus souvent des non-valeurs économiques [130].

Parfois on observe une évolution beaucoup plus lente durant 15 jours à un mois, ou au contraire une forme suraiguë causant la mort des animaux en 24h [130].

Chez les animaux récupérant de la forme aiguë on peut observer une perte de poids et d’appétit, une anémie et un ictère pendant une période pouvant durer jusqu’à trois mois. De plus la convalescence est toujours longue et le risque de rechute non négligeable. Les animaux infectés chroniquement peuvent présenter des problèmes de reproduction avec notamment des avortements [130].

Lorsque la maladie atteint des animaux de moins de deux ans, l’évolution est généralement favorable : la bactériémie reste faible, les animaux présentent de l’anorexie, une anémie légère et un syndrome fébrile modéré.

Les animaux infectés restent porteurs durant toute leur vie. Ils développent une infection permanente caractérisée par une bactériémie faible non détectable sur frottis sanguin et par l’existence d’une immunité de longue durée. Ces animaux porteurs chroniques ne présentant pas de signes cliniques mais ils constituent un réservoir non négligeable pour la maladie [85], [127], [130].

Dans les zones d’endémie les veaux sont infectés généralement entre 4 et 24 semaines environ. On a alors un pic de bactériémie pendant une à deux semaines, mais elle reste généralement faible (inférieure à 1%). C’est aussi à ce moment-là que l’on observe une diminution de l’hématocrite qui revient à la normale 4 à 6 semaines après infection. Quelques veaux montrent alors des signes cliniques tels que faiblesse et apathie. Ces animaux restent ensuite porteurs durant toute leur vie mais ne présenteront plus d’épisodes cliniques [38].

VII.B) Modifications paracliniques

Lors de la phase aiguë de la maladie on observe une diminution du nombre de globules rouges jusqu’à atteindre 1,5 millions/µL, une anisocytose, une poikilocytose, une polychromasie, une réticulocytose, une thrombocytose, une diminution de l’hématocrite (entre 7 et 25%), une diminution de l’hémoglobine, une leucocytose et une monocytose [59], [94], [112], [127], [130].

Des modifications biochimiques sont aussi présentes telles que : une augmentation de la protéine Sérum Amyloïd A (SAA) (qui est un marqueur plus sensible que le fibrinogène), de l’haptoglobine, de la cérulaplasmine, du fibrinogène, une augmentation de la bilirubine totale due à la destruction massive des érythrocytes, une augmentation de la bilirubine conjuguée traduisant l’arrêt de l’élimination biliaire, une augmentation de l’urée (entre 0,6 et 1,5g/L), une augmentation des phosphatases alcalines (PAL) et aspartate amino-transférases (ASAT), une inversion du rapport albumine/globuline, et une hyperalbuminurie [112], [127].

VII.C) Lésions nécropsiques

VII.C.1) Aspect macroscopique

A l’autopsie, on observe une maigreur, une pâleur généralisée de la carcasse, une décoloration des muscles et un ictère (Fig. 16). A l’ouverture des grandes cavités un exsudat jaunâtre ou teinté de sang peut être présent. Le sang est aqueux et les tissus conjonctifs sont œdémateux. La rate est hypertrophiée et légèrement friable ce qui lui donne un aspect « confiture de fraise ». Le foie apparaît stéatosé, marbré et friable avec une vésicule biliaire dilatée contenant une bile épaisse (Fig. 17). On observe aussi des pétéchies sur la plèvre, le diaphragme et le cœur. La moelle osseuse a un aspect gélatineux du à l’hématopoïèse. Les nœuds lymphatiques sont hypertrophiés. Il est aussi possible d’observer un dessèchement du contenu du feuillet [96], [127].

Figure 16 : Carcasse d’un animal atteint d’anaplasmose, noter la pâleur de la carcasse et le léger ictère [16]

Figure 17 : Foie d’un animal atteint d’anaplasmose, on note une hypertrophie de la vésicule biliaire ainsi qu’une hypertrophie et un aspect marbré du foie [16].

VII.C.2) Aspect microscopique

On observe au niveau du foie, une infiltration graisseuse avec des signes de dégénérescence cellulaire et de nécrose, et un gonflement des cellules endothéliales ainsi qu’une prolifération des cellules de Kuppfer [127].

Au niveau du rein on peut noter une dégénérescence et une nécrose des cellules tubulaires rénales. On observe aussi une hyperplasie de la moelle osseuse [127].

VI.D) Pronostic

Le pronostic médical est variable selon l’âge des animaux et l’intensité des signes cliniques. Les signes en faveur d’une rémission sont une température rectale normale, un retour de l’appétit et une activité hématopoïétique marquée. Si l’hématocrite est inférieure à 15% les chances de rémission sont faibles, si l’hématocrite passe en dessous de 10% il y a un risque d’arrêt cardiaque. Le pronostic économique est sombre du fait de la chute de production engendrée, de l’amaigrissement important des animaux et du risque d’avortement [127].

VIII Diagnostic

VIII.A) Epidémiologique

Il faut prendre en compte :

• le lieu, en tenant compte de l’émergence possible de foyer dans des régions où la maladie était précédemment absente, • la saison (la maladie est plus fréquente lors des saisons chaudes et humides où les vecteurs sont présents), • le signalement des animaux : animaux de plus d’un an, vaches gestantes ou en lactation qui pourraient être plus sensibles de même que les vaches laitières hautes productrices, • l’alimentation, en effet les cas d’anaplasmose sont plus sévères chez les animaux recevant une alimentation riche en énergie, • l’entrée d’un animal provenant d’une zone atteinte [127].

57 VIII.B) Clinique et lésionnel

La fièvre est souvent le premier signe observé, suivi d’un ictère, d’une pâleur des muqueuses, d’une léthargie, d’une perte de poids, d’une diminution de la production, d’une atonie des pré-estomacs et de l’intestin ainsi que d’une stase ruminale. On n’observe jamais d’hémoglobinurie [85], [127]. A l’autopsie les lésions le plus fréquemment observées sont une maigreur, une pâleur généralisée, un ictère, ainsi qu’une hypertrophie, et une diminution de consistance de la rate.

VIII.C) Différentiel

Le diagnostic différentiel doit être fait avec les autres causes d’anémie périphérique hémolytique (régénérative). Ce type d’anémie est caractérisé par une réticulocytose, un taux de protéine plasmatique normal à augmenté, une anémie normochrome et normocytaire au début puis macrocytaire et normo ou hypochrome, une polychromatophilie, avec la présence de corps de Howell-Joly. Ce type d’anémie peut être du à une intoxication : au cuivre, au plomb, à l’oignon, à la fougère aigle, aux nitrates, aux nitrites, aux crucifères, aux phénothiazines, à la mercuriale, à d’autres plantes ou aux mycotoxines. Ces intoxications sont caractérisées par une hémoglobinurie ou une hématurie, une absence de fièvre plus ou moins accompagnées d’autres symptômes tels que de la diarrhée, des pétéchies etc.

Il faut aussi faire la différence avec des maladies bactériennes telles que : • une theilériose • la maladie du charbon due à Bacillus anthracis , (au vu de l’aspect de la rate à l’autopsie) • la leptospirose : caractérisée par une hémoglobinurie, un ictère flamboyant, de la fièvre et une coloration orangée du lait, • une entérotoxémie (fièvre, ictère, congestion, hémoglobinurie, troubles nerveux), • l’hémoglobinurie bacillaire (fèces décolorées, hématurie, anémie intense et fièvre), • un lymphosarcome multi-centrique, • une theilériose, • des affections staphylococciques causant de la fièvre et une anémie, • une theilériose (hyperthermie, hypertrophie des ganglions, absence d’hémoglobinurie) • une Eperythrozoonose infraclinique (Hyperthermie, anémie)

Il faut aussi faire le diagnostic différentiel avec un accident transfusionnel, une hémoglobinurie post-partum (ictère, hémoglobinurie, apyrexie), une anémie inflammatoire hyporégénérative, une leucose enzootique ou une anémie par perte sanguine [127].

VIII.D) Expérimental

VIII.D.1) Frottis

Anaplasma marginale peut être mise en évidence dans les érythrocytes sur frottis sanguin après coloration de Giemsa ou coloration rapide (Ral 55, Diff quick) sous forme d’inclusions rondes, denses, pourpres foncées de 0,3 à 1 micron de diamètre aux contours légèrement irréguliers (ce qui les différencie des corps de Joly qui sont parfaitement ronds) accolées à la membrane des érythrocytes (à l’intérieur). Le nombre d’érythrocytes parasités lors d’une infection peut être de 70% voire plus [117], [122], [135].

Figure 18 : Présence d’ Anaplasma marginale sur un frottis sanguin. [109]

Pour la réalisation du frottis le sang doit être pris au niveau d’un gros vaisseau tel que la jugulaire (contrairement aux babésies dont la visualisation au frottis est plus facile si le sang est prélevé au niveau de petits vaisseaux tels que ceux des oreilles).

59 Pour un diagnostic post–mortem les étalements doivent être préparés à partir d’organes internes (foie, rein, cœur, poumons) ou à partir de vaisseaux périphériques surtout si la décomposition est déjà avancée.

Cependant il n’est possible de mettre en évidence Anaplasma marginale sur frottis que si la bactériémie est supérieure à 10 7 érythrocytes infectés par millilitre. Ainsi microscopiquement il est possible de diagnostiquer les cas d’anaplasmose aiguë car la bactériémie est élevée mais pas les porteurs chroniques car la bactériémie est alors inférieure à 10 7 érythrocytes infectés par millilitre [122]. La visualisation sur frottis n’est donc pas une bonne méthode pour identifier les porteurs chroniques.

De plus sur frottis il est possible de confondre A. marginale avec des artefact ou avec les corps de Howel-Joly ou de Heinz [116], [117], [122], [129] [135].

VIII.D.2) Sérologique

L’utilisation de tests sérologiques est très largement répandue dans le monde mais peu de tests sérologiques permettent de mettre en évidence les porteurs chroniques. Or les porteurs chroniques peuvent constituer un réservoir majeur de la maladie. De plus lors de ces tests il peut y avoir des réactions croisés avec d’autre hémopathogènes [144]. Nous détaillerons d’abord les principales méthodes utilisées puis nous nous intéresserons aux autres techniques.

VIII.D.2.a) Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)

Le test ELISA le plus utilisé est le test ELISA compétitif. Ce test permet de détecter les anticorps dirigés contre un épitope de MSP5 qui est retrouvé dans les différentes espèces : A. ovis, A. marginale et A. centrale . L’antigène utilisé est un antigène recombinant synthétisé in vitro par des Escherichia coli recombinantes appelé rMSP5.

Ce test a la capacité de détecter très tôt les porteurs parfois avant même l’apparition des signes cliniques à partir de neuf jours après l’infection [33], [82], [153]. Il présente une spécificité de 95 à 100% selon les études [7], [82] , [101]. Ce test permet aussi de détecter les porteurs jusqu’à six ans après l’infection. La sensibilité du test est de 100% durant le pic de bactériémie et après, lorsque l’infection devient chronique [33]. Ce test permet donc de détecter les porteurs chroniques ce qui est très intéressant dans la lutte contre l’anaplasmose car cela permet d’éviter d’introduire dans un troupeau des animaux porteurs. Ce test ne présente pas de réactions croisées avec Anaplasma phagocytophilum [147] mais présente des réactions croisées avec Anaplasma ovis et centrale [33]. Il existe aussi d’autre test ELISA tels que le DOT ELISA ou un test de type ELISA indirect qui sont moins utilisés. Une étude a montré la possibilité d’effectuer un test ELISA indirect sur le lait qui permet de détecter les anticorps dirigés contre MSP5. La sensibilité de ce test est de 98% de même que la spécificité. Cette méthode permettrait une détection facile sans nécessité d’effectuer des prises de sang. Ce test pourrait aussi être utilisé sur lait de mélange facilitant grandement la détection dans les troupeaux [152].

VIII.D.2.b) Test de fixation du complément

Chez les porteurs chroniques la sensibilité est faible ce qui en fait un mauvais test pour détecter ces porteurs chroniques [20], [51], [114]. De plus cette méthode est difficile à automatiser et peut présenter des réactions croisées avec d’autres espèces du genre Anaplasma . Ainsi cette méthode est progressivement abandonnée au profit de la méthode d’ELISA compétitif.

VIII.D.2.c) Agglutination sur carte

Il s’agit d’une méthode simple, pratique, rapide et sensible (98%). Ce test est le test de référence aux Etats Unis. Cependant il ne permet pas de détecter les porteurs chroniques [51].

VIII.D.2.d) Immunofluorescence indirecte

Cette méthode est aussi sensible et spécifique que la méthode ELISA compétitif mais est plus compliquée à mettre en œuvre et donc peu utilisée [53].

Le tableau 3 récapitule les principales caractéristiques des tests sérologiques les plus utilisés.

Tableau III : Comparaison des différents tests de diagnostic sérologique

Détection des Existence de réactions Test Sensibilité Spécificité porteurs croisées chroniques ELISA compétitif 100% 95 à 100% oui avec A.ovis et A. centrale

avec autres espèces Fixation du complément 66,70% 96.2-99,9% non d' Anaplasma

Agglutination sur carte 98% 98.6% non avec A. centrale

Immunofluorescence avec A. centrale (parfois avec 88,95% 100% oui indirecte A. phagocytophilum )

VIII.D.3) Génétique

VIII.D.3.a) Polymerase chain réaction PCR

Cette méthode est aujourd’hui très utilisée et tend à remplacer les méthodes sérologiques détaillées précédemment.

Cette méthode est très sensible et peut être utilisée pour rechercher Anaplasma marginale à la fois chez les bovins (recherche sur sang conservé dans un tube EDTA) et chez les tiques permettant aussi bien le diagnostic qu’une aide précieuse dans le domaine expérimental.

Plusieurs amorces peuvent être utilisées. De même plusieurs méthodes de détection du produit de PCR peuvent être utilisées : ELISA, hybridation, identification sur gel d’agarose sous lumière UV etc. [60], [146]. Souvent ces méthodes permettent d’augmenter la spécificité du test [98].

La PCR en temps réel est elle aussi de plus en plus utilisée car il s’agit d’une méthode rapide, sensible, reproductible et qui permet une quantification de la bactériémie cependant cette méthode nécessite un matériel coûteux [29], [117].

62 Il est aussi possible d’utiliser des PCR multiplex qui amplifient des séquences communes à différentes espèces d’hémopathogènes comme par exemple Babesia bigemina , Babesia bovis , d’autres espèce du genre Anaplasma. Ces PCR sont alors couplées à d’autres méthodes permettant de différencier les différentes espèces (utilisation d’enzymes de restrictions, hybridation…) [117].

La plupart des couples d’amorces ne permettent pas de différencier Anaplasma marginale , Anaplasma ovis et Anaplasma centrale ce qui nécessite l’utilisation de méthodes additionnelles pour les différencier [150].

Il est aussi possible d’utiliser une technique appelée nested-PCR qui consiste à utiliser successivement deux paires d’amorces différentes. La deuxième paire d’amorces permet d’amplifier une séquence d’ADN comprise dans le fragment amplifié par la première paire mais est plus spécifique d’espèce que la première. La deuxième paire d’amorces est ajoutée après dix cycles de PCR avec la première paire d’amorces. Cette méthode est ainsi à la fois sensible et spécifique [108].

En 2010 une étude de Noaman et Shayan a démontré l’intérêt de l’utilisation de l’enzyme de restriction Bst 1107 I sur le produit de PCR d’un fragment de l’ARN 16S qui coupe uniquement le fragment de Anaplasma marginale [115].

En 2012 A Torino a mis au point une technique de PCR utilisant des amorces différentes pour Anaplasma marginale et Anaplasma ovis permettant de les différencier en effectuant uniquement une PCR [150].

VIII.D.3.b) Autres méthodes utilisant l’AD/

Il est possible d’utiliser des méthodes d’hybridation grâce à des sondes à ADN et à ARN. Cette méthode permet la détection dans le sang et dans les tiques et est sensible, permettant ainsi de détecter l’infection deux semaines environ avant l’apparition des bactéries sur le frottis et lors du portage chronique [54], [65], [66], [68].

63 IX Traitement

IX.A) Traitement des animaux malades

IX.A.1) Traitement symptomatique

Lorsque l’anémie est très marquée ( hématocrite inférieure à 15%, nombre d’érythrocytes inférieur à 2,5x10 9 ou tachycardie très marquée), il est conseillé de transfuser les animaux avec du sang total.

L’animal donneur est choisi dans l’élevage, il doit être en bonne santé (bon état général, pas de traitement en cours et statut connu pour les différentes maladies infectieuses de préférence). Il est possible de prélever jusqu’à 7 litres de sang sur une vache de 500 kg. Le sang est prélevé dans un récipient propre additionné d’anticoagulant ou (de préférence) dans une poche à transfusion contenant déjà de l’anticoagulant. L’administration au receveur doit se faire grâce à une tubulure avec filtre pour bloquer les caillots éventuellement présents dans le sang du donneur.

Il faut perfuser environ 10 ml/kg et la transfusion ne doit pas être faite de manière trop rapide (5 à 8 litres en une heure) pour éviter le risque de collapsus cardio-vasculaire par choc hypervolémique. Si l’animal receveur doit être à nouveau transfusé par la suite il faut attendre 24h après la première transfusion mais moins d’une semaine car c’est le temps qu’il faut aux anticorps pour être formés : au-delà d’une semaine entre les deux transfusions il y a un risque de choc transfusionnel lors de la deuxième transfusion.

Le traitement symptomatique passe aussi par l’administration d’hépato- protecteurs (par exemple Ornipural ND (Vétoquinol)), de stimulant de l’hématopoïèse et de régulateurs du rumen pour relancer le transit.

IX.A.2) Traitement spécifique

Il est difficile d’évaluer l’efficacité des traitements sur les animaux exprimant cliniquement la maladie d’une part du fait de la possibilité de guérison spontanée et d’autre part du fait que les animaux sont souvent diagnostiqués tardivement ce qui limite fortement l’efficacité du traitement [91].

IX.A.2.a) Tétracyclines

Pour espérer une rémission le traitement doit être mis en place très tôt. Le protocole consiste alors en l’injection intra-musculaire d’oxytétracycline longue action à 20 mg/kg en une fois ou deux fois à 7 jours d’intervalle ou d’oxytétracycline à 6 à 10 mg/kg/jours pendant trois jours [34], [61], [100], [129].

IX.A.2.b) Imidocarb (Carbésia /D)

La posologie est de 2 à 5 mg/kg en intra-musculaire. Une injection unique permet de diminuer la rickettsiémie mais pas de stériliser les animaux. Deux injections peuvent aussi être réalisées à 15 jours d’intervalle [1].

IX.A.2.c) Autres

L’oestradiol cypronate à la dose de 14,3 mg/kg en intra-musculaire réduit la bactériémie mais ne permet pas son élimination [129]. Cette molécule n’est pas disponible actuellement.

IX.B) Traitement des animaux porteurs

Pour éliminer les porteurs il est nécessaire d’effectuer plusieurs administration. Plusieurs protocoles sont ainsi décrits, les principaux sont : • tétracyclines à 10mg/kg/ jours pendant 10 à 16 jours en intra- musculaire, • tétracyclines à 22mg/kg/jour pendant 5 jours en intra-veineuse, • tétracycline longue action 20 mg/kg tous les 7 jours en effectuant 2 à 4 injections successives • imidocarb 4,5 à 6mg/kg/jour pendant trois jours [12] • imidocarb à 5mg/kg en sous cutanée ou en intra-musculaire deux fois à 14 jours d’intervalle. Cependant en 1974 Mchardy et Simpson ont montré que l’injection de 6mg/kg d’imidocarb deux fois à deux semaines d’intervalle échoue à éliminer la bactériémie chez des animaux porteurs mettant en doute l’efficacité de ce dernier protocole [105].

65 Le tableau 4 résume les différents protocoles à base de tétracyclines ayant montré une efficacité pour éliminer le portage chronique.

Tableau IV : Différents protocoles de traitement efficaces pour éliminer le portage chronique [91]

Nombre de Dose (en Voie Fréquence Molécule traitements mg/kg) d'administration d'administration successifs Tétracycline 11 IV ou IM 10 quotidienne Oxytétracycline 11 IV ou IM 12 à 14 quotidienne 16,5 IV 16 quotidienne 2,22 orale 41 quotidienne 5,5 orale 45 quotidienne 1,11 orale 120 quotidienne 11 orale 30-60 quotidienne Chlortetracycline 11 orale 60 quotidienne 5,5 orale 60 quotidienne 3,33 orale 60 quotidienne 11 orale 45-60 quotidienne 11 orale 30 quotidienne

X Prophylaxie

X.A) Sanitaire et hygiénique

X.A.1) En zone endémique

Les mesures consistent principalement à éviter l’apparition de cas cliniques pour cela il peut être intéressant que tous les animaux de l’élevage soient porteurs : en effet les animaux porteurs sont protégés contre l’infection clinique.

Dans ce cas les animaux naïfs introduits doivent être protégés par la vaccination ou la mise sous antibiotiques le temps que leur immunité contre Anaplasma marginale se mette en place, le plus souvent pendant la première saison à risque [136].

Il est possible d’éliminer le portage chronique de tous les animaux mais cela s’avère laborieux et coûteux du fait du coût des traitements mais aussi du fait des temps d’attentes associés à ces médicaments [136].

66 Il est aussi possible d’éviter l’extension de l’infection notamment en limitant la transmission iatrogène pour cela il est nécessaire d’utiliser une aiguille par vache lors des injections ou des prises de sang et de nettoyer correctement le matériel utilisé lors de castration ou autre chirurgie, il est aussi possible d’utiliser des systèmes d’injection sans aiguilles [132].

Le contrôle des vecteurs est également envisageable par l’utilisation d’insecticides et d’acaricides sur les animaux. Cependant cela pose un problème environnemental du fait de l’utilisation massive de substances chimiques, de la possibilité de créer des résistances à ces substances et du coût de ces substances.

X.A.2) En zone indemne

Des contrôles sérologiques à l’introduction permettent d’éviter d’introduire un animal porteur. Si un cas apparaît, il est conseillé de le traiter et de l’isoler ou de protéger le reste du troupeau par la vaccination ou un traitement médical préventif à l’aide de tétracyclines [129].

Le facteur limitant l’efficacité des tests sérologiques à l’introduction est la sensibilité de ces tests qui, souvent, ne permettent pas de détecter des porteurs avec un niveau de bactériémie très faible. De nos jours ces tests sérologiques sont faits par la méthode ELISA compétitif avec une protéine de surface recombinée qui a une sensibilité importante et peut donc permettre de repérer des individus porteurs. Il est aussi possible d’utiliser la PCR pour détecter des porteurs car cette méthode permet de repérer des individus avec une bactériémie très faible (de l’ordre de 30 érythrocytes infectés par millilitre) permettant ainsi la détection des porteurs.

X.B) Médicale

X.B.1) Chémoprophylaxie

La chémoprophylaxie consiste à administrer des antibiotiques à des animaux non-atteints. L’administration de ces antibiotiques peut être faite par voie injectable ou orale, elle empêche l’apparition des signes cliniques mais pas l’infection et donc le portage.

Les protocoles utilisés sont par voie injectable 1,5 à 2,5 mg/kg d’oxytétracycline tous les 28 jours par voie intra-musculaire pendant la saison où les tiques sont actives ou 0,25 mg/kg d’oxytétracycline ou de chlortétracycline par voie orale tous les jours [136].

Les problèmes majeurs causés par la chémoprophylaxie sont le risque d’apparition de résistances, le coût important de ces traitements, l’existence de temps d’attente pour les tétracyclines ainsi que la difficulté de respecter l’observance du traitement. Cette méthode est utilisée aux Etats Unis car dans ce pays il est interdit d’utiliser des vaccins tués (qui ont été retirés du marché) [83], [91].

X.B.2) Vaccination

Il est à noter qu’aucun vaccin contre l’anaplasmose ne possède une Autorisation de Mise sur le Marché en France.

X.B.2.a) Vaccins vivant autologues

Les vaccins vivants non atténués sont produits à partir du sang de veaux splénectomisés. Ces veaux sont maintenus en quarantaine pour éviter toute autre maladie et infectés expérimentalement par Anaplasma marginale. Il est nécessaire d’effectuer cette vaccination avant l’âge de 1 an et en hiver pour éviter la transmission aux autres classes d’âge lors de la saison des tiques pour éviter tout risque d’extension de la maladie dans la zone géographique. Il est aussi possible de vacciner des animaux plus âgés en couplant la vaccination à une chémoprévention [87], [92], [98]. L’injection de ces vaccins entraîne une infection persistante (jusqu’à 3 ans) chez les animaux aucun rappel n’est donc nécessaire [108].

Il est aussi possible d’utiliser des vaccins vivants atténués qui sont d’utilisation moins risquée, on utilise alors des souches avirulentes irradiées au Cobalt 60 ou adaptées à la croissance chez le mouton. On observe après la vaccination des signes cliniques modérés à absents.

68 La vaccination protège les animaux contre les signes cliniques. Cependant il n’y a pas de réactions croisées (et donc de protection) avec des souches d’origines géographiques différentes [91]. Il existe aussi un risque de retour à la virulence après différents passages bovins/tiques/bovins…. Certaines études clament l’efficacité de ces vaccins mais d’autres auteurs ont montré la présence de réactions vaccinales telles que chute de lait, fièvre anorexie, ictère, adynamie et parfois mort. Ces vaccins ne sont pas recommandés sur les animaux de plus de 12 mois [90].

L’utilisation de ces vaccins vivants présente un risque d’isoérythrolyse néonatale chez les veaux issus de mère vaccinée. En effet il est possible que ces vaccins contiennent des antigènes d’hématie issus de l’animal producteur de vaccin. Une vache vaccinée peut alors synthétiser des anticorps contre ces antigènes et les transmettre à son veau par l’intermédiaire du colostrum. Si les hématies du veau contiennent les mêmes antigènes que ceux contenus dans le vaccin ces anticorps vont détruire les hématies du veau. Ce risque d’isoérythrolyse néonatale est cependant limité par le fait que la vaccination se fait au moyen d’une injection unique [49]. L’autre problème de ces vaccins est que lors de la production sur animaux vivants il y a un risque de transmission d’agents pathogènes aux animaux vaccinés comme par exemple la leucose bovine.

Il est mieux d’utiliser des vaccins dans l’aire géographique où ils ont été produits car ces vaccins fonctionnent uniquement sur des souches proches [138].

X.B.2.b) Vaccins vivants à Anaplasma centrale

Il est possible de vacciner les animaux contre Anaplasma marginale au moyen d’un vaccin hétérologue dirigé contre Anaplasma centrale .

A. centrale a été découverte par Theiler en 1911, il pense alors à l’utiliser comme vaccin contre l’anaplasmose.

Ce type de vaccin est utilisé en Israël, en Afrique, en Australie et en Afrique du Sud. Il entraîne une affection modérée à inapparente puis une protection contre les formes cliniques de l’anaplasmose. Ce vaccin n’est pas utilisé aux Etats-Unis du fait des risques associés à son utilisation (transmission d’autres pathogènes notamment) [89].

Le principal problème de ce vaccin est le risque de transmettre d’autres pathogènes.

69 Ce vaccin est à faire sur les animaux jeunes en une seule injection. Suite à la vaccination, on peut observer chez les animaux jeunes des réactions modérées sans signes cliniques alors que les adultes montrent des réactions sévères avec une bactériémie plus marquée et une plus forte diminution de l’hématocrite qui peut nécessiter la mise en place d’un traitement [6]. Cependant, dans une étude de 2003, Melendez et al. ont montré que le vaccin est sûr chez des vaches adulte et gestantes 3 à 5 mois de gestation : dans cette étude aucun cas d’anaplasmose clinique ou d’avortement n’a été détecté [71], [107].

L’efficacité de ce vaccin repose sur le fait que Anaplasma centrale partage des épitopes immuno-dominants avec A. marginale ce qui pourrait expliquer cette protection croisée. Des études ont montré des variations cycliques de MSP2 chez Anaplasma centrale comme chez A. marginale [89].

Des échecs de cette technique de vaccination sont rapportés sur le terrain comme en laboratoire et la vaccination peut causer une anaplasmose clinique chez des veaux splénectomisés et parfois chez des adultes notamment chez les vaches laitières hautes productrices [89]. Les animaux restent porteurs de A. centrale pendant toute leur vie de production [142]. Un des avantages de l’utilisation d’ A. centrale est que cette bactérie ne se transmet pas par les tiques [6]. La vaccination avec A. centrale ne confère pas une immunité totale mais permet d’éviter la mort et de trop grosses pertes économiques.

X.B.2.c) Vaccins inactivés

Ces vaccins sont apparus dans les années 60, et ont été retirés du marché Américain en 1999.

Le protocole vaccinal consiste en deux injections à 4 semaines d’intervalles la dernière injection devant avoir lieu au moins deux semaines avant le début de la saison des tiques. Ces vaccins diminuent la sévérité des signes cliniques mais ne préviennent pas l’infection.

L’ajout d’adjuvant dans ces vaccins est nécessaire pour stimuler l’immunité des bovins.

Les avantages de ce type de vaccin sont qu’il y a moins de risque de transmission d’autres agents pathogènes lors de la vaccination, qu’il y a peu de réactions vaccinales et que le stockage de ces vaccins est économique [87].

70 Cependant il y a un risque là aussi d’isoérythrolyse néonatale si le vaccin est mal purifié, or la purification du vaccin est un processus coûteux. Ce risque d’isoérythrolyse néonatale a justifié le retrait du marché de ces vaccins aux Etats unis. Pour éviter le problème de la présence d’antigènes d’érythrocyte dans le vaccin il serait envisageable d’utiliser des Anaplasma marginale en culture, en effet, des études préliminaires ont montré la possibilité de produire des vaccins avec des Anaplasmes provenant de culture [87].

Ces vaccins sont efficaces uniquement sur des souches proches [138]. Un des moyens d’améliorer l’efficacité de ces vaccins serait de faire des vaccins avec un mélange des différentes souches. Un des inconvénients de ces vaccins est que l’injection d’une haute dose de A. marginale pourrait saturer le système immunitaire et entraîner une moins bonne protection [88], [138].

X.B.2.d) Perspectives

Une des perspectives d’avenir en ce qui concerne la vaccination contre l’anaplasmose est la création de vaccins sous-unités [87]. Cependant pour l’instant la protection conférée par ces vaccins n’est que partielle. De plus, la création de ces vaccins est difficile en raison de l’existence d’une variation antigénique de A. marginale au cours de son cycle chez les bovins, de la difficulté de trouver une composition du vaccin qui permette une présentation de l’antigène vaccinal au système immunitaire optimale et de l’importance de la conformation des protéines de surface pour la mise en place d’une réponse immunitaire. Ainsi la production de vaccins sous-unités nécessite de connaître les épitopes d’ A. marginale présentés par le complexe majeur d’histocompatibilité et ceux reconnus par les lymphocytes T CD4+ helper, les épitopes affectés par des variations antigéniques, les mécanismes de la réponse immune protectrice mise en jeu lors d’une infection à A. marginale chez un bovin et les antigènes protecteurs.

Récemment des méthodes de culture cellulaire efficaces sont apparues ce qui pourrait permettre le développement de nouveaux vaccins sous-unités vivants ou tués. L’utilisation de ces systèmes de culture peut permettre de produire des antigènes pour des vaccins sous-particules et peut être même des bactéries permettant la production de vaccins vivants [87].

71 Ces vaccins produits à partir d’ A. marginale en culture pourrait être standardisés ce qui est un avantage indéniable en ce qui concerne le coût de production. Cette méthode de production permet aussi d’obtenir des vaccins purifiés qui ne contiennent pas de stroma d’érythrocyte ou d’agents pathogènes contaminant et qui ne nécessitent pas l’utilisation d’animaux pour la production.

Des essais de vaccin à ADN ont été menés avec expression du gène MSP1a in vivo à partir d’un plasmide spécial pour les cellules eucaryotes. On observe alors une réponse immunitaire de type IgG1 et une prolifération des lymphocytes T, ainsi, les vaccins à ADN pourraient constituer une perspective d’avenir intéressante [47].

Partie expérimentale

73 I) Introduction

Comme nous l’avons vu dans la partie bibliographique, l’anaplasmose bovine est maladie spécifique des ruminants due à Anaplasma marginale transmise par les tiques et par certains arthropodes piqueurs. Chez les bovins adultes elle entraîne des symptômes tels que hyperthermie, abattement, ictère, chute de la production laitière, etc. qui mènent souvent à la mort de l’animal en quelques jours si celui-ci n’est pas traité. Cette maladie est endémique dans plusieurs régions d’Europe et sporadique en France. Elle était précédemment classée maladie réputée contagieuse jusqu’en 2013 mais n’apparaît plus dans la liste des maladies réglementées. Ainsi du fait de l’apparition sporadique de cas en France il semble intéressant d’étudier l’apparition d’un cas dans un département supposé précédemment indemne. C’est ce que nous nous proposons de faire dans cette deuxième partie qui s’intéresse à un foyer d’anaplasmose bovine apparu dans le département de la Loire dans un élevage de vaches laitières. En effet en dehors de ce cas il n’y a pas eu de déclarations d’anaplasmose dans la Loire (avant août 2013 date à laquelle l’anaplasmose a été supprimée de la liste des maladies réglementées).

Nous nous intéresserons dans cette étude à l’élevage A. Il s’agit initialement d’un élevage laitier de 35 vaches, situé dans le département de la Loire (42) dans lequel les premiers cas d’anaplasmose bovine sont apparus en 2011. La période d’étude s’étend de janvier 2013 à mai 2014. Cependant nous utiliserons les résultats précédemment obtenus les premiers cas ayant été observés en février 2012.

Au cours de cette période l’élevage A a fusionné en avril 2013 avec l’élevage B qui est également un élevage laitier. Par la suite toutes les vaches en production sont logées sur le site de l’élevage A, les génisses étant placées sur le site de l’élevage B.

Le premier objectif de l’étude était de déterminer si les tiques présentes sur les parcelles de l’exploitation sont porteuses d’ A. marginale et ainsi de mettre en évidence un vecteur biologique pour A. marginale dans cet élevage. Pour cela des tiques ont été collectées dans les pâtures puis une recherche d’ A. marginale a été effectuée par Polymerase Chain Reaction (PCR) en temps réel.

Le deuxième objectif était d’observer la contamination par Anaplasma marginale du troupeau B, qui est supposé sain, notamment après la fusion avec l’élevage A. Cela nous permettra d’évaluer l’existence d’une contamination au cours d’une saison de pâture avec l’élevage A. Pour atteindre cet objectif des PCR en temps réel ont été réalisées sur l’ensemble des deux troupeaux avant la fusion et après la saison une saison de pâturage dans des près afin de mettre en évidence une contamination des animaux sains par les animaux porteurs.

II) Matériel et méthode

II.A) Collecte des données de l’élevage antérieures à la période d’étude

Le premier cas d’anaplasmose confirmée est apparu en février 2012, or l’étude a commencé en avril 2013. Les données sur les cas cliniques sont celles collectées par le vétérinaire traitant de l’élevage qui a aussi demandé les premières recherches d’ A. marginale au laboratoire Scanélis ND sur les animaux atteints puis sur l’ensemble du troupeau.

II.B) Traitements effectués sur des animaux porteurs

Suite à la recherche d’ A. marginale sur le troupeau, le vétérinaire en accord avec le laboratoire a décidé de tenter de traiter quatre animaux porteurs chroniques. Pour trois de ces animaux ( les N° 17,18 et 25) le traitement a consisté en deux injections d’Oxytétracycline à 48 h d’intervalle à la dose de 20 mg/kg en intra-musculaire, le quatrième animal (N° 40) a, en plus, reçu une injection d’Imidocarb (Carbésia ND (MSD santé animale)) à la dose de 2,125 mg/kg simultanément à la première injection d’Oxytétracycline. Une recherche d’ A. marginale par PCR en temps réel sur le sang de ces animaux à été réalisé à J0 (jour de la première injection), à J2 (jour de la deuxième injection), à J7, à J14 puis 6 mois et 12 mois plus tard.

II.C) Prélèvements sanguins

Les premiers prélèvements sanguins ont été réalisés en avril 2013 juste avant la fusion des deux élevages. A ce moment là les deux troupeaux n’avaient jamais été en contact ou pâturé sur les mêmes terrains.

Lors de ce premier échantillonnage des prises de sang ont été réalisées sur toutes les vaches laitières de chaque troupeau de manière à déterminer le statut des deux troupeaux vis-à-vis de l’anaplasmose et la prévalence de l’infection dans chaque troupeau avant la fusion.

Les secondes prises de sang ont été réalisées en décembre 2013 lors de la rentrée à l’étable sur les animaux déjà testés en avril 2013 afin de voir l’influence d’une saison de pâturage commun entre des animaux porteurs et des animaux sains sur la contamination de ces derniers.

Lors de chaque campagne de prélèvement toutes les prises de sang ont été réalisées le même jour.

Le sang a été prélevé au niveau de la veine caudale au moyen d’une aiguille 25mm et d’un système vacutainer dans des tubes en verre contenant de l’EDTA, un anticoagulant permettant de réaliser par la suite des analyses PCR car il n’interfère pas avec les réactions mises en jeu contrairement à l’héparine.

Après le prélèvement les tubes étaient identifiés au moyen du numéro de travail de l’animal, puis stockés à –20°C jusqu’à leur envoi au laboratoire Scanélis ND. Les animaux ont aussi tous reçu un numéro (entre 1 et 74) qui permet de les identifier au cours de l’étude. • II.D) Collectes des tiques • Des collectes de tiques au drapeau ont été effectuées durant le printemps 2013. Les parcelles sélectionnées sont celles situées sur l’élevage A où les bovins ont pâturé les deux années précédentes lorsque les cas d’anaplasmose ont été détectés. Il a été décidé d’exclure de cette étude les pâtures situées sur le site de l’élevage B du fait que seules les génisses (réputées peu sensibles à l’infection par A. marginale ) y pâturent.

Ainsi cinq pâtures ont été étudiées, ces pâtures sont numérotées 2, 5, 3, 17 et 18. Dans notre étude les pâtures 17 et 18 sont parfois considérées comme une même pâture car elles sont adjacentes et souvent les animaux passent de l’une à l’autre.

Dans ces pâtures, qui pour certaines sont de très grande taille, nous avons parfois fait le choix de n’échantillonner qu’une partie de la pâture, dans ce cas les zones échantillonnées ont été sélectionnées sur les conseils de l’éleveur (zone dans lesquelles les animaux attrapent des tiques) et en fonction des critères définis par Raoux et Vah dans leurs thèses : présence de sous bois ou de haies en bordure de pâture, présence de joncs, etc. [131], [157].

La méthode de collecte utilisée est la méthode au drapeau décrite par Vassalo et al en 2000 et par Macleod en 1932. Cette méthode consiste à marcher en traînant derrière soi un drapeau constitué d’un tissu en molleton blanc de dimension 1m x 1m et d’un manche de 1m de long attaché par une ficelle de manière à tracter le drapeau étendu au sol. Le drapeau est étendu au sol puis tracté par une personne marchant au pas (à une environ 0,5m/s) sur 10 mètres puis le drapeau est minutieusement inspecté de manière à collecter toutes les tiques présentes sur le drapeau à l’aide d’une pince. Chaque segment de 10 m ainsi échantillonné est appelé transect. Cette méthode permet de collecter des tiques non gorgées dans l’environnement extérieur et permet de collecter les trois stades d’évolution des tiques.

Tous les transects sont localisés sur les bords de pâture, en effet les bords de pâture sont plus propices à la présence des tiques [73], [93]. Entre chaque transect nous laissons une distance de 20m de manière à ce que tous les transects soient indépendants les uns des autres.

L’emplacement des transects est représenté sur les figures 19, 20, 21 et 22 par les flèches de couleurs.

Figure 19 : Emplacement des transects de la pâture n°2

Figure 20 : Emplacement des transects de la pâture n°3

Figure 21 : Emplacement des transects des pâtures n°17 et n°18

Figure 22 : Emplacement de transects de la pâture n°5

L’emplacement des transects a été repéré en fonction de l’environnement : (végétation, relief, positionnement par rapport à la clôture) et grâce à la mise en place de ficelles de couleur pour repérer le début et la fin des transects.

Chaque transect a été numéroté et est associé à une pâture. • Il avait été au départ décidé d’effectuer deux collectes par saison favorable aux tiques espacées d’au moins 15 jours de manière à assurer l’indépendance des collectes. Les saisons favorables aux tiques sont la période de mai à juillet et la période de septembre à octobre. Cependant il s’est avéré que durant l’automne l’éleveur n’a pas observé de tiques sur ses animaux et que durant la seule collecte ayant pu être effectuée (du fait de la météo) seulement deux tiques ont été récoltées. Il a ainsi été décidé de ne pas effectuer d’autre collecte durant l’automne et de ne pas s’intéresser à ces deux tiques. Au début du printemps 2013 la date de la première collecte a été déterminée grâce à l’éleveur lorsque celui-ci a commencé à observer des tiques sur ses animaux rentrant du pâturage.

Par la suite la seconde date de collecte a été choisie en fonction de la météo. En effet un temps pluvieux empêche la collecte du fait de l’absence de tiques à l’affût lorsqu’il pleut et du fait que la collecte au drapeau est impossible si le drapeau est humide. De plus la présence d’un vent fort peu aussi empêcher la récolte des tiques au drapeau. Les collectes ont ainsi été effectuées le 13 avril 2013 et le 10 mai 2013.

Les collectes ont chacune été effectuées sur une journée par une seule personne, elles commençaient vers 10h, heure à laquelle la rosée commençait à sécher et s’étendait généralement jusqu’à 17h – 18h Lors des collectes un tableau a été rempli répertoriant pour chaque transect : - la pâture, - l’heure, - la présence ou l’absence de talus, - la hauteur d’herbe, - l’index de végétation (comme défini dans les thèses de Vah et Raoux [129], [155] : 1 clôture sans haie, 2 présence d’une haie discontinue, 3 présence d’une haie continue de plus de moins de deux mètres d’épaisseur, 4 présence d’une haie continue entre 2 et 5 mètres d’épaisseur, 5 présence d’une haie d’épaisseur supérieure à 5 mètres, clôture accolée à un sous bois ou transect situé dans un sous-bois), - la présence de jonc, de feuilles ou de ronces,

80 - la présence de traces de l’existence d’hôte, - la présence de bovins, la température extérieure, - l’hygrométrie et la température extérieure (mesurée à l’aide d’une station météorologique portative) - le nombre de tiques collectées sur chaque transect. Ces données n’ont pas été exploitées dans le cadre de notre étude mais pour une possible utilisation ultérieure par le laboratoire de parasitologie.

Les tiques collectées ont ensuite été stockées dans l’alcool à 70°C dans des tubes Eppendorf et identifiées par un code qui est une combinaison de une lettre et trois chiffres ex X.00.00.00 La lettre correspond à la date de la collecte : • absence de lettre : collecte du 13/04/13 • A : collecte du 10/05/13 Le premier chiffre correspond au numéro de la pâture. Le deuxième chiffre correspond au numéro de transect. Le troisième chiffre permet de différencier les tiques collectées sur le même transect (si cinq tiques ont été collectées le même jour sur le même transect elles portent chacune un troisième numéro compris entre 1et 5).

Les tiques sont ensuite observées à la loupe binoculaire une par une pour déterminer pour chacune : son espèce, son stade et son sexe s’il s’agit d’un adulte. Cette identification est effectuée à l’aide de l’ouvrage : « Les tiques : identification, biologie, importance médicale et vétérinaire » Claudine Perez Eid, Edition Lavoisier 2007 [126]. Les tiques ont ensuite été lavées selon le protocole suivant : 10 minutes dans 1 ml l’alcool à 70°, 10 minutes dans 1ml de tampon phosphate salin (PBS), 10 minutes dans 1 ml l’alcool à 70° et enfin 10 minutes dans 1ml de PBS. Avant le dernier lavage au PBS la tique est placée dans un tube neuf précédemment identifié pour ne pas risquer une contamination résiduelle dans le premier tube sale. A la fin du dernier lavage le tube est vidé du PBS puis laissé ouvert sous la hotte pendant une demi-journée de manière à sécher la tique afin que la congélation et par la suite le broyage de la tique soient plus efficace. Puis le tube est refermé puis placé au congélateur à –20°C en attendant l’extraction de l’ADN.

81 II.E) Extraction de l’AD des tiques

Les tiques sont tout d’abord broyées soit en utilisant l’automate Tissus Lyzer ND soit en les découpant à l’aide d’une lame de scalpel à usage unique. Lorsque l’automate est utilisé, on ajoute une bille métallique stérile dans chaque tube puis les tubes sont tout d’abord placés dans les portants eux même placé au congélateur à –20°C pendant 30 minutes. Puis les portants sont placés dans la machine et secoués pendant 30 secondes à 40 Hz. Lorsque les tiques sont broyées à la main une lame de scalpel à usage unique est utilisée et chaque tique est broyée directement dans son tube pour ne pas risquer une contamination. Par la suite le protocole d’extraction de l’ADN utilisé est celui décrit dans le « génomic DNA from Tissue user Manual Nucléospin » fourni avec le kit d’extraction utilisé : Nucléospin ND tissue. Après le broyage 180 µL de Buffer T1 et 25 µL de protéinase K sont déposés dans les tubes qui sont ensuite vortexés puis placés à 56°C pendant toute une nuit. Le lendemain les tubes sont à nouveau vortexés puis 200 µL de tampon B3 sont déposés dans chaque tube qui sont ensuite vortexés et placé à une température de 70°C pendant 10 minutes avant d’être à nouveau vortexés. 210 µL d’éthanol à 100% sont ensuite ajoutés, les tubes sont à nouveaux vortexés. Le contenu des tubes est ensuite versé dans des colonnes d’élution elles-mêmes placées dans des tubes de collection puis l’ensemble est centrifugé une minute à 11000 tours/minute. Le liquide collecté dans les tubes est éliminé. 500 µL de tampon BW sont ensuite placés dans la colonne d’élution. Les colonnes sont ensuite centrifugées 1 minute à 11 000 tours/minute puis le liquide collecté dans le tube collecteur est éliminé. 600 µL de tampon B5 sont ensuite placé dans la colonne qui est à nouveau centrifugé 1 minute à 11 000 tours/minute avant l’élimination du liquide récolté dans le tube collecteur. La colonne est à nouveau centrifugée 1 minute puis placée dans un tube Ependorf neuf précédemment identifié. 100 µL de tampon BE chauffé à 70°C après une incubation de 1 minute la colonne est centrifugée 1 minute à 11 000 tours/minute. Puis le tube est récupéré, identifié à l’aide d’une étiquette selon le code défini précédemment pour les tiques et placé au réfrigérateur avant d’être envoyé au laboratoire Scanélis ND pour la réalisation de la PCR. Pour vérifier l’efficacité des extractions d’ADN sur les tiques nous avons réalisé des amplifications par PCR permettant de détecter l’ADN de tique. Ainsi si l’extraction d’ADN a été efficace l’amplification mettra en évidence de l’ADN de tique puisque l’ensemble de l’ADN de la tique a été extrait. Ces amplifications PCR sont basées sur l’amplification d’une séquence du gène de l’ARNr 16S mitochondrial (constitutif des ribosomes) permettant d’obtenir un fragment de 320 paires de base.

82 Les amorces utilisées sont les suivantes : -TQ16S+1F : 5' CTG CTC AAT GAT TTT TTA AAT TGC TGT GG 3' -TQ16S-2R : 5' ACG CTG TTA TCC CTA GAG 3' Ces amorces ont été décrite en 1994 par Black et Piesman. L’amplification est réalisée avec 2,5µL d’ADN préalablement extrait. Le mélange est constitué de 2,5 µL de tampon 10X (à une concentration de 200 mM deTris-HCl et de 500 mM KCl), 0,75 µL de MgCl2 (à une concentration de 50mM), 0,5 µL de dNTP mix (à une concentration de 10mM), 1,25 µL de chaque amorce (à une concentration de 10 µM chacune), 0,1 µL de Taq polymérase et 16,15 mL d’eau distillé de manière à obtenir un volume de 25 µL. Ce mélange est placé dans le thermocycler le cycle de température utilisé est le suivant : - 8 minute à 94°C

- 1 minute à 92°C Ce cycle est répété - 1 minute à 48°C 10 fois - 1,5 minute à 72°C

- 1 minute à 92°C - 1 minute à 54°C Ce cycle est répété - 1,5 minute à 72°C 32 fois

- 5 minutes à 72°C

II.F) Réalisation des PCR

Les PCR ont été réalisées par le laboratoire Scanélis ND au moyen d’une PCR en temps réel développée par ce laboratoire pour détecter Ehrlichia canis , Anaplasma platys , Anaplasma phagocytophila, Anaplasma marginale contenant un mélange d'amorces adaptées pour amplifier ces bactéries et trois sondes taqman avec des fluorophores différents (un spécifique de E.canis , un spécifique d' A.marginale , et un détectant A.phagocytophyla et A.platys ).

83 Ce test a été développé et validé selon les recommandations de la norme AFNOR XP- U 47-600-2. Les seuils de détection à 95% ont été déterminés pour chacune des bactéries détectées et à chaque série d'analyse un nombre important de contrôles sont systématiquement ajoutés: • un contrôle négatif = témoin négatif de processus • trois contrôles de détection (un pour chacune des trois sondes) : il s'agit d'un échantillon très faiblement concentré (3 fois la limite de détection à 95%) en cible afin de vérifier que les performances attendues du test sont bien obtenues à chaque série d'analyse • des contrôles de quantifications pour chacune des cibles considérées afin de permettre une estimation quantitative du résultat.

II.G) Analyse statistiques des résultats

Les analyses statistiques des résultats ont été réalisées à l’aide du logiciel R.

Ainsi, la comparaison des fréquences de tiques positives entre les différentes espèces a été réalisée au moyen d’un test de Fisher qui permet de comparer des fréquences sur des séries indépendantes.

Le script de ce test est présenté sur la figure 23.

> iric=c(3,53) > dmar=c(0,63) > dret=c(0,11) > tabtic=rbind(iric,dmar,dret) > tabtic [,1] [,2] iric 3 53 dmar 0 63 dret 0 11 > fisher.test(tabrhinite) Error in is.data.frame(x) : object 'tabrhinite' not found > fisher.test(tabtic)

Fisher's Exact Test for Count Data data: tabtic p-value = 0.2036 alternative hypothesis: two.sided

Figure 23 : Script du test de Fisher réalisé pour comparer les prévalences d’A. marginale dans les différentes espèces de tique

84 La comparaison des proportions de vaches porteuses entre les deux élevages a également été réalisée au moyen d’un test de Fisher grâce au logiciel R car les effectifs sont de petite taille. Le script de ce test est présenté dans la figure 24.

> eleva=c(16,15) > elevb=c(0,24) > tabvavt=rbind(eleva,elevb) > tabvavt [,1] [,2] eleva 16 15 elevb 0 24 > fisher.test(tabvavt)

Fisher's Exact Test for Count Data data: tabvavt p-value = 1.149e-05 alternative hypothesis: true odds ratio is not equal to 1 95 percent confidence interval: 5.003574 Inf sample estimates: odds ratio Inf

Figure 24 : Script du test de Fisher exact réalisé dans R pour comparer les fréquences de portage d’A. marginale dans les deux troupeaux avant la fusion. • Un test de Fisher a aussi été réalisé avec le logiciel R de manière à comparer les fréquences des vaches indemnes dans les deux troupeaux ayant été contaminés par l’anaplasmose durant leur saison de pâturage commun. Le script de ce test dans R est présenté dans la figure 25.

> eleva=c(2,12) > elevb=c(0,15) > tabvaps=rbind(eleva,elevb) > tabvaps [,1] [,2] eleva 2 12 elevb 0 15 > fisher.test(tabvaps) data: tabvaps p-value = 0.2241 alternative hypothesis: true odds ratio is not equal to 1 95 percent confidence interval: 0.2041167 Inf sample estimates: odds ratio Inf Fisher's Exact Test for Count Data

Figure 25 : Script du test de Fisher exact réalisé dans R pour comparer les fréquences de contamination par A. marginale dans les deux troupeaux au cours de la saison de pâturage commun

III Résultats

III.A) Antécédents et situation de l’élevage A avant la fusion

En février 2012 le vétérinaire est appelé pour une génisse (N°14) qui présente un ictère, un abattement et une hyperthermie. Elle reçoit d’abord une transfusion de deux litres de sang prélevé chez une autre vache du troupeau et une perfusion de 500 mL d’Energépa ND (Virbac ND), elle reçoit aussi une injection de Génixine ND (Coophavet ND) à la posologie de 2 mg/kg en une injection intra-veineuse unique, puis elle est traitée au moyen d’Oxytétracycline 10% ND (Vétoquinol ND) à la posologie de 10 mg/kg/jour pendant 5 jours. Le lendemain la génisse reçoit une injection de Carbésia ND (MSD santé animale) à la posologie de 2,125 mg/kg en une injection unique. Une PCR en temps réel pour la recherche de l’anaplasmose bovine est réalisée par le laboratoire Scanélis ND et est positive pour Anaplasma marginale . La génisse se remet ensuite progressivement.

86 En mars 2012, la vache numéro 38 présente un ictère et une hyperthermie. L’anaplasmose est à nouveau suspectée. Elle est traitée au moyen d’une injection de 100ml d’Ornipural ND (Vétoquinol), de Carbésia ND (MSD santé animale) à la posologie de 2,125 mg/kg en une injection unique, de 20 mL de Fercobsang ND (Vétoquinol) et reçoit une transfusion de 2L de sang prélevé chez une autre vache de l’élevage. Une numération formule et une analyse biochimique sont réalisées, les résultats sont les suivants :

Tableau V : Numération formule sanguine et analyses biochimiques de la vache N° 38

paramètre Valeur Unité Valeurs usuelles hématocrite 9,9 % 25,0-42,0 hémoglobine 3,2 g/dL 8,0-14 MCHC 32,3 g/dL 27-34,9 9 9 WBC 35,6 X10 /L 4,0-12,0 X10 9 9 Granulocytes 32,9 X10 /L 2,0-6,0 X10 granulocytes pourcentage 92 /L 9 9 Lymphocyte monocyte 2,7 X10 /L 3,0-7,5 X10 8 % 9 9 Plaquettes 398 X10 /L 175-500 X10

ALKP 56 U/L 28-233 AST 1966 U/L 50-150 GGT 190 U/L 0-87

On note ainsi une anémie très marquée, une granulocytose et une lymphopénie ainsi qu’une augmentation des Aspartate aminotransférase (ASAT) et des Gamma Glutamyl Transpeptidase (GGT).

Suite au résultat positif à A. marginale en PCR pour la génisse n°14 il a été décidé par le vétérinaire de tester tous les animaux du troupeau. Les prises de sang ont été réalisées le 14 mai 2012 les résultats sont présentés dans l’annexe 2 (première colonne de résultats) : vingt deux vaches sont positives sur trente vaches testées. Ce qui nous donne une prévalence de 73%. Au vu de ces résultats un problème de contamination lors des prélèvements durant lesquels l’aiguille n’a pas été changée sur chaque animal est suspecté. Les prélèvements sont donc refaits le 16 juillet 2012. Vingt deux vaches sur trente huit testées sont positives la prévalence est donc de 71% (avec 3 PCR non concluantes à refaire). Cette prévalence très élevée est de l’ordre de celle retrouvée dans les zones d’endémie.

87 III.B) Essai de traitement réalisé

Les résultats PCR sur les prises de sang réalisées sur les animaux traités sont présenté dans le tableau VI.

Tableau VI : Résultats des PCR des animaux traitées

N° animal J0 J2 J7 J14 J213 J473 17 Positive Positive Positive Positive Non Présente Non Présente 18 Positive Positive Positive Positive Négative Négative 25 Positive Positive Positive Positive Négative Positive 40 Positive Positive Positive Positive Non Présente Non Présente

Les animaux N° 17 et 40 ont été réformés au cours de la période d’étude. On constate que les animaux traités toujours présent à J213 ne sont plus porteurs d’A. marginale à ce moment là.

III.C) Identification des tiques

Au total au cours des deux collectes 130 tiques ont été collectées Lors de la première collecte réalisée le 13 avril 2013, cinquante huit tiques ont été collectées. Lors de la deuxième collecte réalisée le 10 mai 2013, 72 tiques ont été collectées les résultats de ces collectes sont présentés dans le tableau VII.

Tableau VII : Identification des tiques récoltées

Espèce larves nymphes mâles femelles Ixodes ricinus 0 0 2 4 Collecte avril Dermacentor marginatus 0 0 27 23 2013 Dermacentor reticulatus 0 0 1 1 Ixodes* 0 31 7 12 Collecte mai Dermacentor marginatus 0 0 2 11 2013 Dermacentor reticulatus 0 0 1 8

*Lors de cette collecte de nombreuses nymphes ont été trouvées; or l’identification de l’espèce des nymphes est difficile. Il a donc été décidé de se limiter au genre qui est ici Ixodes pour toutes les nymphes.

88 III.D) Répartition des tiques dans les pâtures :

Le tableau 8 présente la répartition des tiques dans les pâtures en fonction de l’espèce et du sexe des tiques lors des deux collectes :

Tableau VIII : Identification des tiques dans les différentes pâtures lors des collectes

pâture Ixodes Dermacentor marginatus Dermacentor reticulatus Nymphe Mâle Femelle Nymphe Mâle Femelle Nymphe Mâle Femelle 17 0 1 1 0 9 8 0 0 0 18 0 0 3 0 9 13 0 1 1 Collecte 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 avril 2013 3 0 0 0 0 6 2 0 0 0 5 0 1 0 0 3 0 0 0 0 17 7 4 3 0 2 7 0 1 6 18 3 0 1 0 0 2 0 0 2 Collecte 2 12 1 4 0 0 0 0 0 0 mai 2013 3 3 2 2 0 0 1 0 0 0 5 6 0 2 0 0 1 0 0 0

On constate que lors de la première collecte 81% des tiques ont été collectées dans les pâtures n os 17 et 18. Cela est en accord avec les observations de l’éleveur qui constate que les animaux revenant de ces pâtures sont fortement parasités. Par contre on note que lors de la deuxième collecte on retrouve une meilleure répartition des tiques sur les pâtures avec une prédominance des tiques du genre Ixodes dans toutes les pâtures.

La figure 2 montre la répartition des tiques par espèce (lors des deux collectes) en fonction des pâtures :

89 30

Ixodes 15 Dermacentor marginatus Dermacentor reticulatus Nombre de tiques de Nombre

0 17 18 2 3 5 Numéro des pâtures

Figure 26 : Répartition des tiques par espèce dans les pâtures

On remarque ici que l’on retrouve des tiques du genre Ixodes sur toutes les pâtures mais que les tiques du genre Dermacentor se retrouvent surtout sur les pâtures n os 17 et 18.

90 Les figures suivantes (Fig. 27) représentent la répartition des tiques sur les pâtures (le nombre de tiques indiqué correspond à la somme des tiques retrouvées durant les deux collectes) :

Figure 27 : Répartition des tiques sur les pâtures

On remarque que dans certaines zones beaucoup de tiques sont présentes notamment entre les pâtures n os 17 et 18, au Nord des pâtures n os 17 et 18 et au Sud-Est de la pâture n o 5.

Si on ajoute la totalité des tiques trouvées durant les deux collectes et que l’on calcule pour chaque pâture le nombre de tique moyen par transect on obtient le graphique suivant (Fig. 28) :

3,5

2,5

2 nombre de tiques par transect

1,5

nombre de tiques moyen par transect par moyen tiques de nombre 1

0,5

0 17 18 2 3 5 pâture

Figure 28 : Nombre moyen de tiques par transect sur chaque pâture

On remarque ainsi que les pâtures n os 17 et 18 sont celles où nous avons collecté le plus de tiques par transect. Le nombre de tiques moyen récoltées par transect y est nettement supérieur à celui des autres pâtures.

92 III.E) Portage d’ A. marginale par les tiques

Les résultats des PCR sur les tiques sont présentés dans l’annexe 1.

Les amplifications permettant de vérifier l’extraction correcte de l’ADN des tiques n’ont pas permis la mise en évidence d’ADN de tique pour 15 tiques lors des deux collectes. Ce résultat indique que l’extraction de l’ADN n’a pas été efficace pour ces tiques. Ces tiques ont ainsi été par la suite éliminées de l’étude pour ne pas fausser les résultats de la recherche d’ A. marginale . Ces amplifications n’ont pas pu être réalisées pour toutes les tiques et notamment les nymphes car trop peu d’ADN avait été extrait et la totalité de cet ADN a donc été directement envoyé au laboratoire Scanélis ND. Au cours de cette étude trois tiques de l’espèce Ixodes ricinus étaient porteuses d’ Anaplasma marginale : deux nymphes et un mâle adulte. Il s’agit des tiques A.5.85.1, A.2.95.5 et A.2.95.6. Nous avons collecté 130 tiques et 15 ont été exclues de l’étude suite à une extraction d’ADN non concluante ce qui nous donne une prévalence de 2,6% de tiques porteuse d’ A. marginale . Le lieu de collecte de ces tiques porteuse est schématisé sur la figure 29.

Figure 29 : Localisation des tiques porteuses sur les pâtures : la croix bleu foncé représente la tique Ixodes ricinus adulte positive et les croix bleu clair représentent les nymphes Ixodes ricinus positives

L’analyse statistique visant à comparer la prévalence d’ A. marginale en fonction de l’espèce de tique a révélé que cette différence de prévalence n’est pas significative. En effet lors du test de Fisher on obtient une p-value supérieure au seuil de 0,05 la différence de fréquence entre les espèces est donc non significative.

III.F) Prévalence de l’infection avant la fusion des deux élevages

Lors du début de notre étude en avril 2013 des prises de sang ont été réalisées sur l’ensemble des deux troupeaux laitiers des deux élevages avant la fusion. Une recherche d’ Anaplasma marginale a ainsi été effectuée par amplification par PCR sur tous les animaux avant qu’ils ne soient mis en contact. Les résultats de ces PCR sont représentés dans l’annexe 2 dans la troisième colonne de résultat (03.04.13)

Le tableau IX résume la situation avant la fusion en fonction de la provenance des animaux :

Tableau IX : Résultats de la recherche A. marginale sur les deux troupeaux en avril 2013

Elevage A Elevage B Nombre de vaches positives 16 0 Nombre de vaches négatives 15 24 Total 31 24

Comme on peut le voir, toutes les vaches de l’élevage B étaient négatives à l’anaplasmose avant la fusion alors que 52% des vaches de l’élevage A étaient toujours positives à ce moment là. Par la suite nous allons donc pouvoir mettre en évidence la contamination par l’anaplasmose chez les animaux naïfs.

Comme l’on peut le voir sur la figure 28 (paragraphe II.G)) présentant le test de Fisher permettant de comparer la fréquence de portage de A. marginale entre les deux élevage la p-value est inférieure à 0,05 la différence entre ces fréquences est donc significative. L’élevage B peut ainsi être considéré comme indemne d’anaplasmose avant la fusion.

Sur l’annexe 2 les numéros surlignés en jaunes sont ceux des vaches ayant reçu un traitement le traitement décrit dans la partie II.B). Les numéros surlignés en orange sont ceux des animaux ayant présentés un épisode d’anaplasmose clinique.

95 III.G) Portage d’ A. marginale par les animaux après une saison de pâturage commun

Les résultats individuels des PCR sur sang sont présentés dans l’annexe 2 (colonne 19.12.14). Les résultats par élevage sont présentés dans le tableau X.

Tableau X : Résultats des PCR sur sang dans les deux troupeaux après une saison de pâturage commun

Elevage A Elevage B Nombre de vaches positives 14 0 Nombre de vaches négatives 13 15 Total 27 15

La prévalence de l’infection dans l’élevage B est resté de 0%. On peut voir sur l’annexe que deux vaches de l’élevage A devenues porteuses au cours de cette période. La prévalence dans l’élevage est de 29%, la prévalence dans le troupeau A est de 51,8%. Le test de Fisher visant à comparer les fréquences des vaches indemnes dans les deux troupeaux ayant été contaminés par l’anaplasmose durant leur saison de pâturage commun a mis en évidence une p-value supérieure à 0,05 la différence de contamination entre ces deux troupeaux n’est donc pas significative.

IV Discussion

IV.A) Prélèvements de sang

Il a été choisi dans toute cette étude de ne s’intéresser qu’aux vaches laitières et non pas aux génisses et aux veaux à la fois pour des raisons pratiques car les bâtiments consacrés au pré-troupeau se trouvent à distance du bâtiment des vaches laitières et du fait que la maladie ne se manifeste généralement pas chez les animaux jeunes.

96 IV.B) Choix de la méthode de détection d’ Anaplasma marginale

Nous avons ici choisi de réaliser des analyses par PCR car il s’agit d’une méthode sensible et spécifique qui permet de détecter aussi bien les animaux malades que les animaux porteurs contrairement à de nombreuses méthodes sérologiques. Or les animaux porteurs jouent un grand rôle dans l’épidémiologie de l’anaplasmose. En effet ils constituent un réservoir susceptible de contaminer les vecteurs et donc des animaux sains. De plus dans les zones d’endémie les animaux porteurs représentent une très grande part des animaux atteints. Une autre raison de l’utilisation de la PCR dans cette étude est que le diagnostic d’anaplasmose dans cet élevage avait été posé grâce à cette méthode, il était donc intéressant, pour pouvoir comparer les résultats à différentes périodes d’utiliser cette méthode. Les analyses PCR ont été réalisées par le laboratoire Scanélis ND, situé à Toulouse qui avait déjà réalisé les premiers tests afin d’avoir une uniformité des méthodes tout au long de l’étude.

IV.C) Choix de la méthode de collecte des tiques

Il existe trois méthodes pour collecter des tiques [129], [155] : - le prélèvement des tiques directement sur les animaux : cette méthode est peu aisée à réaliser sur des bovins et ne permet que la collecte de tiques gorgées. Or le sang contenu dans les tiques gorgées pourrait contenir des bactéries de l’espèce A. marginale et donc interférer avec la recherche de ces bactéries dans les tiques entières. - la méthode au piège à dioxyde de carbone : elle consiste à attirer les tiques dans un piège constitué d’eau ou de papier collant grâce à du CO2 provenant de carboglace ou de bouteille de gaz carbonique et qui simule la présence d’un hôte. Cette méthode a l’inconvénient d’être chère et de ne permettre que le piégeage des tiques présentes dans un rayon de seulement 0,5m. - la méthode au drapeau utilisée dans cette étude est simple à mettre en œuvre, peu coûteuse et permet de recueillir tous les stades de tiques sur une surface importante mais elle a l’inconvénient d’être très dépendante des conditions climatiques et de nécessiter une grande vigilance de la part de l’opérateur lors du recueil des tiques sur le drapeau. Elle a été utilisée ici du fait de sa simplicité de mise en oeuvre et car elle permet de collecter des tiques non gorgées dans les pâtures.

97 IV.D) Choix de la PCR sur tique entière

Dans cette étude nous avons choisi de rechercher Anaplasma marginale par PCR. En effet la PCR est une méthode sensible et spécifique qui est plus facile à mettre en oeuvre que des techniques telle que l’immunofluorescence. Nos recherches ont été effectuées sur tique entière. Or deux méthodes sont utilisables pour rechercher des agents pathogènes chez les tiques : la recherche sur tique entière, qui permet de déterminer la prévalence du portage de l’infection chez les tiques et qui est utilisée pour la majorité des études de prévalence, et la recherche uniquement dans les glandes salivaires des tiques, qui permet d’évaluer le nombre de tiques infectantes (et donc susceptible de transmettre l’agent pathogène) dans une population. Nous avons ici choisi d’effectuer la recherche sur tique entière car cela permet d’obtenir une prévalence globale de l’infection dans la population de tique étudiée [70]. La recherche des agents pathogènes sur tique entière présente le désavantage que l’extraction de l’ADN sur tique entière est difficile pour différentes raisons : d’une part, il est nécessaire et parfois difficile de détruire l’exosquelette chitineux de la tique avant de pouvoir réaliser l’extraction, d’autre part il apparaît que l’ADN extrait de tiques entières est sensible à la dégradation, enfin l’existence d’inhibiteurs de la Taq polymérase dans les tiques est suspectée [70].

IV.E) Traitements effectués sur les animaux porteurs

Sur les quatre animaux traités aucun animal n’est devenu non porteur à J7 et J14 par contre les deux animaux toujours présents dans l’élevage sont négatifs à J213 après le traitement. Cela s’explique par le fait que le renouvellement des hématies chez les bovins se fait tous les 120 jours. Ainsi après le traitement même si les bactéries sont tuées elles sont toujours présentes dans les hématies circulantes. Or la recherche d’ A. marginale a été effectuée par PCR qui est une méthode ne permettant pas de différentier les bactéries vivantes des bactéries mortes. Le traitement de ces trois animaux a donc bien permis de stopper le portage par ces animaux bien que ce protocole n’ait pas suivi les recommandations de la littérature. A J473 l’animal N°25 est à nouveau porteur d’ A. marginale , il a pu se re- contaminer au cours de la saison de pâture car les animaux porteurs qui redeviennent sains après un traitement peuvent à nouveau être infectés par A. marginale .

98 De même on remarque sur l’annexe 2 où ils sont surlignés en orange, que les animaux ayant manifesté un épisode clinique et ayant par conséquent été traités sont négatifs l’année suivant le traitement. En effet le protocole de traitement utilisé par le vétérinaire a pu éliminer le portage d’ A. marginale chez ces animaux.

IV.F) Tiques récoltées lors de cette étude

Lors de la première collecte réalisée en avril 2013 on retrouve essentiellement des adultes qui sont le stade le plus représenté à cette époque. Comme nous l’avons vu précédemment, la répartition mâle/femelle est équitable. Au niveau des espèces retrouvées il s’agit d’espèces bien représentées dans cette région car il s’agit d’espèces largement distribuées en France. De plus il s’agit d’espèces dont au moins un stade (adulte pour le genre Dermacentor spp. et tous les stades pour l’espèce Ixodes ricinus ) peut parasiter les bovins.

Lors de la deuxième collecte de nombreuses nymphes ont été trouvées. Or l’identification de l’espèce des nymphes est difficile il a donc été décidé de se limiter au genre qui est ici Ixodes pour toutes les nymphes. Les mêmes espèces sont retrouvées dans cette seconde collecte. La proportion de nymphes par rapport aux adultes est plus importante lors de cette collecte ce qui peut s’expliquer par le fait que, comme nous l’avons vu précédemment, les nymphes apparaissent plus tard au cours de la saison que les adultes. Aucune larve n’a été trouvée. Ces nymphes étaient toutes du genre Ixodes , cela est en accord avec le fait que les nymphes des deux autres espèces sont actives plus tardivement dans la saison (juillet pour Dermacentor reticulatus et septembre octobre pour Dermacentor marginatus ) [126].

A propos de la répartition des tiques sur les pâtures, comme nous l’avons vu les pâtures 17 et 18 sont les pâtures où l’on retrouve le plus de tiques. Cela est concordant avec les observations de l’éleveur qui a noté que les vaches ramènent beaucoup de tiques de ces pâtures. Cette observation est intéressante car dans le cadre de la lutte contre les maladies transmises par les tiques il pourrait être intéressant, si possible, d’éviter au maximum de faire pâturer les animaux dans ces pâtures. Il est aussi envisageable d’éviter que les vaches aillent pâturer dans les zones les plus à risque dans ces pâtures, par exemple en utilisant un fil de clôture qui empêcherait les animaux d’y accéder. Les zones à éviter en priorité sont celles où de nombreuses tiques ont été retrouvées, ces zones sont repérées en rouge sur la figure 24 présentée dans le paragraphe II.D)

99 IV.G) Portage d’ Anaplasma marginale par les tiques collectées dans les pâtures

Au cours de cette étude trois tiques de l’espèce Ixodes ricinus sont positives à Anaplasma marginale : deux nymphes et un mâle adulte. Comme nous le montre l’annexe 1. Ces tiques ont toutes les trois été collectées en mai dans les pâtures 2 et 5 or la pâture 5 n’a pas été utilisée par l’éleveur au cours de la saison, la nymphe retrouvée positive a donc du être contaminée durant la saison précédente. Il est ainsi probable qu’il existe dans les différentes pâtures des tiques porteuses qui peuvent ainsi transmettre l’anaplasmose aux bovins.

Le rôle de vecteur de l’anaplasmose bovine Dermacentor reticulatus et Ixodes ricinus a été prouvé dans de précédentes études [95], [96], [142]. Il n’existe pas, à notre connaissance, d’étude ayant démontrée que Dermacentor marginatus puisse être un vecteur d’ A. marginale. Cependant dans une étude de 2013 Bonnet et al. ont montré que D. marginatus peut être porteur d’ A. marginale sans que le rôle de vecteur de cette espèce de tique n’ait été démontré, et ce malgré le fait que de nombreuses espèces du genre Dermacentor puissent être vectrices de A. marginale . De plus, comme nous l’avons vu précédemment ces tiques peuvent parasiter les bovins et dans cet élevage de nombreuses tiques sont retrouvées chez les animaux lors des saisons favorables aux tiques.

Parmi les trois espèces de tiques collectées dans cette étude, seule Ixodes ricinus est parasite des bovins durant ses trois stades de développement ce qui en fait un vecteur efficace. En effet il n’y a pas de transmission trans-ovarienne de A. marginale chez les tiques, ainsi pour transmettre le pathogène à un animal la tique doit avoir été infectée au stade précédant (sauf pour les tiques mâles qui, comme nous l’avons vu précédemment, peuvent effectuer plusieurs repas au stade adulte).

100 Lors de notre étude au printemps 2013 trois tiques sont positives à A. marginale sur 115 tiques collectées : la prévalence est donc de 2,6%. Dans d’autres études réalisées notamment au Guatemala [158] ont mis en évidence une prévalence de 18% chez la tique Boophilus microplus cependant il est difficile de comparer ces prévalences à celle trouvée ici car au Guatemala l’anaplasmose est endémique et présente depuis de nombreuses années. Or le cas qui nous intéresse est un cas sporadique et à priori récent. Si on compare la prévalence retrouvée ici à celle d’une étude réalisée dans différents sites en France en 2013 [18]. La prévalence d’ A. marginale était de 0,5% chez Dermacentor marginatus, de 1% chez Dermacentor reticulatus et de 1% chez Ixodes ricinus . Ces prévalences sont comparables à celle retrouvée lors de notre étude et montre qu’en France ces trois espèces de tiques peuvent être porteuses d’ A. marginale .

IV.H) Prévalence de l’infection dans l’élevage A avant la fusion :

La prévalence de l’infection à Anaplasma marginale dans l’élevage A était de 52% cette prévalence est proche de celles retrouvées dans les zones d’endémie. On peut noter que la prévalence est moins élevée que celle retrouvée l’année précédente lors des premières analyses. Cette diminution de la prévalence peut s’expliquer par le fait que certaines vaches positives ont été réformées, que certaines vaches ne sont plus porteuses (animaux traités) et que des animaux indemnes ont été introduits dans le troupeau.

On peut noter sur l’annexe 2 qu’entre le 14 mai 2012 et le 13 avril 2013 la vache n° 11 est passé de positive à négative alors qu’elle n’a subi aucun traitement particulier, or, les vaches porteuses le reste normalement à vie. Il est possible qu’en réalité le résultat positif obtenu en mai 2012 soit du à une contamination car lors de ce premier échantillonnage beaucoup de contaminations ont eu lieu entre les prélèvements, les aiguilles n’ayant pas été changées à chaque animal.

101 IV.I) Etude de la diffusion de l’infection dans le troupeau B après fusion des deux troupeaux

Avant la fusion aucune des vaches de l’élevage B n’était porteuse de A. marginale et seize vaches de l’élevage A étaient porteuses. L’analyse statistique de ces résultats a montré que le troupeau B peut être considéré comme indemne d’anaplasmose avant la fusion.

Comme nous l’avons vu au cours de notre étude qui a eu lieu sur une saison de pâture aucune des vaches du troupeau B présente lors des deux campagnes de prélèvement de sang n’est devenue porteuse d’ A. marginale au cours de cette saison de pâturage.

Le test de Fisher réalisé pour comparer les fréquences de contamination par A. marginale dans les deux troupeaux a montré une p-value supérieure à 0,05, la différence de contamination entre ces deux troupeaux n’est donc pas significative. La faible contamination des animaux au cours de cette saison de pâturage peut être reliée au fait que peu de tiques sont porteuses d’ A. marginale et donc susceptible de la transmettre aux animaux.

Cependant il ne faut pas oublier que la transmission d’ A. marginale peut aussi être mécanique par les insectes hématophages ou par du matériel souillé (les aiguilles notamment). Nous n’avons pas étudié la transmission par les insectes hématophages dans notre étude notamment du fait de la difficulté de capturer des insectes porteurs, ceux-ci le restant seulement pendant quelques heures.

102

V Conclusion sur le gestion du foyer et les mesures envisageables

Comme nous l’avons vu dans la partie bibliographique les mesures envisageables sont de deux types : il est possible d’agir soit sur les vecteurs afin de limiter la contamination de nouveaux animaux, soit sur les animaux en traitant les animaux atteints de façon à éliminer le portage ou en vaccinant les animaux pour éviter l’apparition de signes cliniques.

V.A) Utilisation d’acaricides sur les animaux

Dans le cas de l’élevage étudié nous avons vu que les animaux pâturent sur des pâtures où des tiques sont infectées ainsi il serait envisageable de traiter les animaux à l’aide d’acaricides pour éviter qu’il ne soit en contact avec les tiques contaminées.

Différents traitements acaricides sont disponibles en France [34] :

- le fenvalerate Acadrex 60 ND (Novartis Santé animale) : ce produit s’applique soit sous forme de pulvérisation, la reconstitution du produit se fait alors en ajoutant 100 mL de produit dans 3,5 litres d’eau, il faut ensuite appliquer cette solution à la dose de 0,25L par bovin, soit sous forme de spray en pulvérisant 10 secondes en insistant sur les zones d’élection des tiques (chignon, dessus de la tête, garrot, flancs, face postérieure de la mamelle). L'efficacité persiste 3 à 4 semaines. Les temps d’attente sont de 28 jours pour la viande et les abats et de 7 jours pour le lait.

- la flumethrine Bayticol 1% pour on ND (Bayer santé) Ce traitement permet la lutte contre les tiques européennes : le traitement peut alors être répété toutes les 4 semaines mais la fréquence d’application est à moduler selon la pression d'infestation et la climatologie. Il permet aussi la lutte contre les tiques tropicales : le traitement peut alors être répété toutes les 2 à 3 semaines. La posologie est de 10 ml pour 100 kg en une application (soit 1 mg/kg de fluméthrine). Le temps d’attente pour la viande et les abats est de 5 jours et celui pour le lait est de 10 jours.

- la deltamethrine Butox 50 0/00 ND (MSD santé animale) : il s’utilise en pulvérisation contre les tiques, la solution est à diluer à la dose de 5 ml de Butox pour 10 litres d’eau (soit une concentration de 25 ppm).

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Il faut commencer par traiter les animaux deux fois à 15 jours d’intervalle puis renouveler les traitements régulièrement en fonction de la pression d’infestation. Les temps d’attente sont de 28 jours pour la viande et les abats et de 24 heures pour le lait. Il existe aussi une autre présentation : Butox 7,5 pour on ND (MSD santé animale) à appliquer directement sur la ligne du dos de l’animal à la dose de 15 ml/100kg sans dépasser 75 ml par animal les délais d’attentes sont de 18 jours pour la viande et les abats et 2,5 jours pour le lait.

- le dimpylate Dympigal ND (Qalian) qui s’applique en pulvérisation, 56 ml de Dympigal dans 10L d’eau, pulvériser cette solution sur l’ensemble du corps de l’animal. Les temps d’attente sont de 14 jours pour la viande et les abats et de 4 traites pour le lait.

- le phoxime Sébacil ND (Bayer santé) : que nous n’évoqueront pas ici car il ne peut pas être utilisé pour les vaches laitières

- L’amitraz Taktic ND (MSD santé animale), il s’utilise en pulvérisation ou en spray. La solution est préparée avec 30 mL de produit et 10 L d’eau. L’application doit être renouvelée régulièrement à une fréquence dépendant de la pression d’infestation. Les temps d’attente sont de 14 jours pour la viande et les abats et de 24 heures pour le lait.

Comme nous pouvons ainsi le voir, ces produits sont difficilement utilisable en élevage laitier du fait des pertes causées par l’élimination du lait à cause des temps d’attente qui sont au minimum de deux traites. De plus ces pertes sont démultipliées du fait que tous ces produits nécessitent des administrations fréquentes (en moyenne toutes les quatre semaines).

Si on prend une production laitière moyenne de 20 litres par jour pour une vache laitière de race montbéliarde, cela correspond pour un temps d’attente de 24 heures (temps d’attente le plus réduit) à une perte de 20 litres par vache et donc de 5 euros par vache (en prenant 0,25 euros comme prix du litre de lait). Pour 60 vaches en lactation (comme dans cet élevage) cela correspond à 300 euros à chaque traitement donc tous les mois pendant les périodes favorables aux tiques (mars avril mai septembre octobre) ce qui fait 1500 euros par an en utilisant les produits ayant les temps d’attentes les plus courts sans compter le prix d’achat de ces produits.

L’application peut aussi se révéler longue et compliquée à mettre en œuvre car il est nécessaire de pulvériser l’ensemble des vaches ce qui s’avère long et laborieux sur des grands troupeaux.

104 L’autre problème posé par l’application régulière de ces acaricides sur les animaux est l’existence de résistances à ces substances.

Ainsi il est difficile de conseiller l’utilisation d’acaricide dans ce troupeau laitier, cependant ce type de traitement serait très facilement envisageable pour des troupeaux allaitant le seul facteur limitant étant alors la nécessité de manipulation des animaux très régulièrement pour l’application.

V.B) Lutte dans le milieu

L’éradication totale des tiques dans un milieu a été entreprise notamment aux Etats Unis où l’espèce Boophilus microplus a été éradiquée au moyen de l’utilisation obligatoire des acaricides sur les bovins présents ainsi que sur les bovins entrant dans le pays. Or cette éradication n’a été possible que parce que cette espèce parasite quasi exclusivement le bétail, rendant l’utilisation des acaricides sur celui-ci très efficace pour éliminer cette espèce.

Cependant l’éradication totale des tiques dans un milieu est utopique dans la plupart des cas d’une part à cause de l’existence de résistances aux acaricides et d’autre part du fait que la plupart des tiques ont d’autres hôtes que les bovins. Ainsi l’utilisation d’acaricides sur ceux-ci n’empêche pas les tiques de réaliser leur cycle notamment sur des animaux sauvages [79].

Une des solutions envisageables est de rendre le milieu défavorable aux tiques en effet il a été prouvé que l’environnement joue un rôle dans la répartition des tiques qui seraient trouvées préférentiellement dans les zones boisées, en bordure de haie, etc. Cette méthode est difficile à mettre en œuvre du fait des importants aménagements qu’elle nécessite dans le milieu. De plus un déboisement massif est opposé aux différentes mesures prévues par la Politique Agricole Commune qui encourage l’existence de haies et zones boisées sur les bords des pâtures.

Dans l’élevage concerné la plupart des pâtures sont entourées de zones boisées rendant très difficile la modification du milieu.

105 Il est par contre envisageable d’éviter les zones à risques. Dans cet élevage deux pâtures (les n os 17 et 18) sont particulièrement à risque car beaucoup de tiques y ont été retrouvées. De même les zones marquées en rouge sur la figure 27 sont des zones à risques. Il serait possible d’éviter que les animaux aillent pâturer dans ces zones en mettant en place des fils de clôture par exemple. Cela permettrait (à moindre coût) de limiter les piqûres de tique et donc le risque de transmission d’agents pathogènes par ces dernières.

Ces actions sur les vecteurs ont l’avantage de permettre la lutte simultanée contre d’autres maladies transmissibles par les tiques comme par exemple la piroplasmose.

V.C) Eviter l’apparition de cas cliniques

Comme nous l’avons vu précédemment les animaux jeunes sont peu sensibles à l’anaplasmose et ne développent pas la maladie clinique. De plus les animaux porteurs ne développent pas non plus la forme clinique de la maladie. Une des solutions pour éviter les pertes dues à l’apparition de cas cliniques est ainsi de faire en sorte que les animaux deviennent porteurs lorsqu’ils sont jeunes pour éviter qu’ils ne développent la forme clinique. Pour cela il est possible de faire pâturer les génisses dans les pâtures où la densité en tiques est forte et où nous avons retrouvé des tiques infectées, les animaux s’infectent alors jeunes et sont protégés pour le reste de leur vie. Les animaux adultes peuvent être mis à pâturer sur les parcelles où la densité en tique est plus faible de manière à limiter les risques de contamination à l’âge adulte.

V.D) Vaccination

L’anaplasmose étant une maladie sporadique en France il n’existe pas de vaccin ayant une AMM contre l’anaplasmose dans notre pays. Du fait que les vaccins vivants généralement utilisés doivent être conservés au froid et sont commercialisés dans les régions tropicales il n’est pas envisageable de vacciner les animaux.

106 V.E) Traitement afin d’éradiquer les animaux porteurs

Comme nous l’avons vu précédemment il est possible d’éliminer la bactérie chez les animaux porteurs en utilisant des administrations répétées de tétracycline ou d’imidocarb. Plusieurs problèmes se posent pour l’utilisation de ces traitements pour éliminer le portage latent dans le troupeau. Tout d’abord ces traitements du fait de leurs délais d’attente ne peuvent être envisagés qu’au tarissement pour éviter des pertes trop importantes dues à l’élimination du lait. Ensuite le prix d’un tel traitement devient rapidement élevé en raison du grand nombre d’animaux atteints. Enfin nous avons vu que les tiques sont porteuses de l’anaplasmose dans l’environnement fournissant une source d’ A. marginale pour les bovins, or, les animaux porteurs sont protégés de toute ré-infection et donc de l’apparition des signes cliniques. Si un animal n’est plus porteur il peut être réinfecté par la maladie et présenter des signes cliniques.

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123 Annexes

résultat PCR 16S Identification (1=positif, tiques espèce sexe stade Date PCR 16S 0=négatif) PCR Scanelis 17.1.1 Dermacentor marginatus F A 30/05/2013 0 0 17.2.1 Dermacentor marginatus M A 28/05/2013 1 0 17.4.1 Dermacentor marginatus M A 28/05/2013 1 0 17.6.1 Ixodes ricinus M A 31/05/2013 1 0 17.6.2 Dermacentor marginatus M A 31/05/2013 1 0 17.8.1 Dermacentor marginatus M A 28/05/2013 1 0 17.9.1 Dermacentor marginatus M A 31/05/2013 0 0 E.20.1 Dermacentor marginatus M A 28/05/2013 1 0 E.20.2 Ixodes ricinus F A 31/05/2013 1 0 E.20.3 Dermacentor marginatus F A 28/05/2013 1 0 E.20.4 Dermacentor marginatus F A 30/05/2013 1 0 E.21.1 Dermacentor marginatus F A 28/05/2013 1 0 E.21.2 Dermacentor marginatus F A 31/05/2013 1 0 E.21.3 Dermacentor marginatus M A 28/05/2013 1 0 E.22.1 Dermacentor marginatus F A 31/05/2013 0 0 E.22.2 Dermacentor marginatus F A 31/05/2013 0 0 E.23.1 Dermacentor marginatus M A 31/05/2013 0 0 E.23.2 Dermacentor marginatus M A 31/05/2013 0 0 E.23.3 Dermacentor marginatus F A 31/05/2013 0 0 18.24.1 Dermacentor marginatus F A 31/05/2013 0 0 18.26.1 Dermacentor marginatus F A 31/05/2013 0 0 18.26.2 Dermacentor reticulatus M A 31/05/2013 1 0 18.28.1 Dermacentor marginatus F A 31/05/2013 0 0 18.28.2 Dermacentor marginatus F A 31/05/2013 1 0 18.28.3 Dermacentor marginatus M A 31/05/2013 0 0 18.28.4 Dermacentor marginatus F A 31/05/2013 0 0 18.28.5 Dermacentor marginatus M A 31/05/2013 0 0 18.28.6 Dermacentor marginatus M A 30/05/2013 1 0 18.29.1 Dermacentor marginatus F A 30/05/2013 1 0 18.29.2 Dermacentor marginatus F A 28/05/2013 1 0 18.29.3 Dermacentor marginatus F A 31/05/2013 1 0 18.29.4 Dermacentor marginatus F A 31/05/2013 1 0 18.30.1 Dermacentor marginatus F A 31/05/2013 1 0 18.30.2 Dermacentor marginatus M A 30/05/2013 1 0 18.30.3 Dermacentor marginatus M A 30/05/2013 1 0 18.31.1 Dermacentor marginatus M A 30/05/2013 1 0 18.32.1 Dermacentor marginatus F A 30/05/2013 1 0 18.32.2 Dermacentor marginatus M A 30/05/2013 1 0 18.32.3 Dermacentor reticulatus F A 30/05/2013 1 0 18.32.4 Dermacentor marginatus F A 30/05/2013 1 0 18.32.5 Dermacentor marginatus M A 30/05/2013 1 0 18.33.1 Ixodes ricinus F A 30/05/2013 1 0 18.33.2 Ixodes ricinus F A 30/05/2013 1 0 18.33.3 Dermacentor marginatus F A 30/05/2013 1 0 18.33.4 Dermacentor marginatus M A 30/05/2013 1 0

124 18.33.5 Ixodes ricinus F A 30/05/2013 1 0 3.34.1 Dermacentor marginatus M A 30/05/2013 1 0 3.34.1 Dermacentor marginatus F A 30/05/2013 1 0 3.39.1 Dermacentor marginatus M A 30/05/2013 1 0 3.39.2 Dermacentor marginatus M A 30/05/2013 1 0 3.39.3 Dermacentor marginatus M A 30/05/2013 1 0 3.40.1 Dermacentor marginatus F A 30/05/2013 1 0 3.40.2 Dermacentor marginatus M A 30/05/2013 1 0 3.41.1 Dermacentor marginatus M A 30/05/2013 1 0 5.73.1 Dermacentor marginatus M A 30/05/2013 1 0 5.76.1 Ixodes ricinus M A 30/05/2013 1 0 5.80.1 Dermacentor marginatus M A 30/05/2013 1 0 5.82.1 Dermacentor marginatus M A 30/05/2013 1 0 A.17.1.1 Dermacentor marginatus A M 14/06/2013 1 0 A.17.1.2 Dermacentor reticulatus A F 14/06/2013 1 0 A.17.1.3 Dermacentor reticulatus A F 14/06/2013 1 0 A.17.1.4 Ixodes ricinus A F 14/06/2013 1 0 A.17.1.5 Ixodes N 0 A.17.1.6 Ixodes N 0 A.17.1.7 Ixodes N 0 A.17.2.1 Dermacentor marginatus A F 14/06/2013 1 0 A.17.2.2 Dermacentor reticulatus A F 14/06/2013 1 0 A.17.2.3 Ixodes ricinus A M 0 A.17.2.4 Ixodes N 0 A.17.4.1 Ixodes N 0 A.17.5.1 Dermacentor marginatus A F 14/06/2013 1 0 A.17.6.1 Dermacentor reticulatus A F 14/06/2013 1 0 A.17.14.1 Ixodes N 0 A.17.14.2 Ixodes ricinus A M 0 A.17.14.3 Ixodes ricinus A F 14/06/2013 1 0 A.E.17.1 Ixodes ricinus A M 14/06/2013 1 0 A.E.17.2 Ixodes ricinus A F 14/06/2013 1 0 A.E.17.3 Dermacentor reticulatus A F 14/06/2013 1 0 A.E.20.1 Dermacentor reticulatus A F 14/06/2013 1 0 A.E.21.1 Dermacentor marginatus A F 14/06/2013 0 0 A.E.21.2 Dermacentor marginatus A F 14/06/2013 1 0 A.E.21.3 Dermacentor marginatus A F 14/06/2013 1 0 A.E.21.4 Dermacentor marginatus A M 14/06/2013 1 0 A.E.22.1 Dermacentor marginatus A F 14/06/2013 1 0 A.E.23.1 Ixodes N 0 A.E.23.2 Ixodes ricinus A M 14/06/2013 1 0 A.E.23.3 Dermacentor marginatus A F 14/06/2013 1 0 A.E.23.4 Dermacentor reticulatus A M 14/06/2013 1 0 A.18.24.1 Dermacentor marginatus A F 14/06/2013 1 0 A.18.24.2 Ixodes N 0 A.18.26.1 Dermacentor reticulatus A F 14/06/2013 1 0 A.18.26.2 Ixodes ricinus A F 14/06/2013 1 0 A.18.26.3 Dermacentor marginatus A F 14/06/2013 1 0 A.18.26.4 Ixodes N 0 A.18.26.5 Ixodes N 0

125 A.18.27.1 Dermacentor reticulatus A F 14/06/2013 1 0 A.3.34.1 Dermacentor marginatus A F 14/06/2013 1 0 A.3.47.1 Ixodes ricinus A 14/06/2013 1 0 A.3.47.2 Ixodes ricinus A 14/06/2013 0 0 A.3.49.1 Ixodes ricinus A M 14/06/2013 1 0 A.3.50.1 Ixodes ricinus A F 14/06/2013 1 0 A.3.53.1 Ixodes N 0 A.3.53.2 Ixodes N 0 A.3.53.3 Ixodes N 0 A.2.60.1 Ixodes ricinus A F 14/06/2013 1 0 A.2.61.1 Ixodes N 0 A.2.61.3 Ixodes N 0 A.2.64.1 Ixodes N 0 A.2.68.1 Ixodes N 0 A.2.69.1 Ixodes N 0 A.5.77.1 Ixodes ricinus A F 14/06/2013 1 0 A.5.83.1 Ixodes N 0 A.5.85.1 Ixodes N A.marginale A.5.88.1 Ixodes N 0 A.5.88.2 Ixodes N 0 A.5.89.1 Ixodes N 0 A.5.89.2 Dermacentor marginatus A F 14/06/2013 1 0 A.5.89.3 Ixodes N 0 A.5.93.1 Ixodes ricinus A F 14/06/2013 1 0 A.phagocytophi A.2.95.1 Ixodes N la A.2.95.2 Ixodes ricinus A F 14/06/2013 1 0 A.2.95.3 Ixodes N 0 A.2.95.4 Ixodes ricinus A F 14/06/2013 1 0 A.2.95.5 Ixodes ricinus A M 14/06/2013 1 A.marginale A.2.95.6 Ixodes N A.marginale A.2.101.1 Ixodes ricinus N 0 A.2. .1 Ixodes N 0 A.2.104.1 Ixodes N 0 A.2.104.2 Ixodes N 0 A.2.105.1 Ixodes ricinus A F 14/06/2013 1 0

Annexe 1 : Résultats des PCR sur tiques pour la recherche d’ADN de tiques (efficacité de l’extraction) et pour la recherche d’ Anaplasma marginale F : Femelle M : Mâle A : Adulte N : Nymphe 1= positif 0= négatif

126

N° Animal provenance 14.05.12 16.07.2012 03.04.13 19.12.13 1 élevage A positive non présente non présente non présente 2 élevage A négative négative négative négative 3 élevage A non présente non présente négative négative 4 élevage A non présente non présente négative négative 5 élevage A positive positive positive positive 6 élevage A positive positive positive positive 7 élevage A non présente négative non présente négative 8 élevage A positive positive positive positive 9 élevage A non présente à refaire non présente non présente 10 élevage A négative non présente négative négative 11 élevage A positive à refaire négative négative 12 élevage A positive positive positive positive 13 élevage A négative non présente négative négative 14 élevage A positive non présente N phago négative 15 élevage A négative positive positive positive 16 élevage A négative non présente non présente non présente 17 élevage A positive positive non présente non présente 18 élevage A positive positive négative négative 19 élevage A positive positive positive positive 20 élevage A non présente négative non présente non présente 21 élevage A non présente non présente positive non présente 22 élevage A non présente à refaire positive positive 23 élevage A négative négative non présente non présente 24 élevage A non présente positive non présente non présente 25 élevage A positive positive négative positive 26 élevage A positive positive positive non présente 27 élevage A non présente négative non présente non présente 28 élevage A non présente positive non présente non présente 29 élevage A non présente non présente négative positive 30 élevage A non présente non présente positive positive 31 élevage A non présente non présente négative non présente 32 élevage A non présente non présente négative négative 33 élevage A non présente non présente négative négative 34 élevage A positive positive non présente non présente 35 élevage A positive positive positive non présente 36 élevage A positive positive positive positive 37 élevage A négative négative positive positive 38 élevage A non présente non présente négative négative 39 élevage A positive positive non présente non présente 40 élevage A non présente positive non présente non présente 41 élevage A positive positive non présente non présente 42 élevage A positive positive non présente non présente 43 élevage A négative négative négative non présente 44 élevage A positive positive non présente non présente 45 élevage A non présente négative positive positive 46 élevage A positive positive non présente non présente 47 élevage A non présente négative positive non présente 48 élevage A positive positive positive positive

127 49 élevage A non présente négative non présente non présente 50 élevage A positive négative non présente négative 51 élevage B non présente non présente négative négative 52 élevage B non présente non présente négative négative 53 élevage B non présente non présente négative négative 54 élevage B non présente non présente négative non présente 55 élevage B non présente non présente négative non présente 56 élevage B non présente non présente négative non présente 57 élevage B non présente non présente négative non présente 58 élevage B non présente non présente négative négative 59 élevage B non présente non présente négative négative 60 élevage B non présente non présente négative négative 61 élevage B non présente non présente négative non présente 62 élevage B non présente non présente négative non présente 63 élevage B non présente non présente négative négative 64 élevage B non présente non présente négative non présente 65 élevage B non présente non présente négative négative 66 élevage B non présente non présente négative négative 67 élevage B non présente non présente négative non présente 68 élevage B non présente non présente négative non présente 69 élevage B non présente non présente négative négative 70 élevage B non présente non présente négative négative 71 élevage B non présente non présente négative négative 72 élevage B non présente non présente négative négative 73 élevage B non présente non présente négative non présente 74 élevage B non présente non présente négative négative

Annexe 2 : résultats des PCR réalisées sur le sang des bovins.

128 129 GASQUET Charlotte

TITRE : Etude d’un foyer d’anaplasmose bovine dans le département de la loire

Thèse d’Etat de Doctorat Vétérinaire : Lyon, 5 septembre 2014

RESUME : Cette étude a pour objet un élevage dans lequel de nombreux cas d’anaplasmose ont été découverts en 2012. Le premier objectif de ce travail est d’étudier la répartition des tiques dans les pâtures de l’élevage et le portage d’Anaplasma marginale par ces tiques. Le deuxième objectif est d’étudier l’évolution du portage d’A. marginale par les animaux au cours d’une saison de pâturage commun entre des animaux sains et des animaux atteints. Au cours de ce travail des tiques ont ainsi été prélevées dans les pâtures et identifiées puis le portage d’Anaplasma marginale par ces tiques a été déterminé par PCR. Au cours de la période d’étude le troupeau de l’élevage étudié a fusionné avec un troupeau sain. Des prises de sang ont été réalisées sur les animaux avant et après la saison de pâturage et le portage d’Anaplasma marginale a été déterminé par PCR.Les tiques collectées dans notre étude appartiennent aux espèces Dermacentor marginale, Dermacentor reticulatus et Ixodes ricinus. La prévalence du portage par les tiques était de 2,6% ce qui est très inférieur au prévalences retrouvées dans les pays où la maladie est endémique. Une faible contamination des animaux sains a été observée au cours de la saison de pâturage étudiée.

MOTS CLES : - Tiques - Bovins - Anaplasma marginale

JURY : Président : Monsieur le Professeur Charles Dumontet

1er Assesseur : Monsieur le Professeur Lionel Zenner 2ème Assesseur : Madame le Professeur Dominique Legrand

DATE DE SOUTE'A'CE : 5 septembre 2014

ADRESSE DE L’AUTEUR :

Le Reclus 04500 Riez