1 A nukleinsavkémiai kisszótár: aminoacil-tRNS szintetáz: adott aminosavat a megfelelő tRNS-hez kapcsoló enzim DNS: dezoxiribonukleinsav, DNA
aminoacil-tRNS szintetáz: adott aminosavat a megfelelő tRNS-hez kapcsoló enzim genetikai kód: a nukleinsavszekvenciák aminosavszekvenciára „fordítását” meghatározó szabályrendszer, az mRNS 3 bázisa alkot egy kodont, ami egy aminosavat határoz meg oly módon, hogy adott antikodonú tRNS ismeri fel a transzláció során Kodon: Nukleotid-hármas a DNS/RNS-en, mely egy-egy aminosavat kódol Kromoszóma: (a görög chroma=színes és soma=test) egyetlen hosszú DNS, amely számos gént, szabályozó és egyéb szekvenciákat tartalmaz. Kromatin: a kromoszóma anyaga, mely eukarióta sejtekben DNS (rendszerint kettős szálú) és fehérje komplexe. (Festhető, innen a neve.) Antikodon: Nukleotid-hármas a tRNS-en, mely reverz-komplementje a kodonnak (tehát Watson- Crick párosítással illeszkedik a kodonhoz transzláció közben) Gén: Az öröklődő DNS egy fehérjét kódoló része. genetikai kód: a nukleinsavszekvenciák aminosavszekvenciára „fordítását” meghatározó szabályrendszer, ahol az mRNS 3 bázisa alkot egy kodont, amely egy fehérjeépítő aminosavat határoz meg oly módon, hogy azt a transzláció során egy adott antikodonú tRNS felismeri. 3 Genom: A gének összesége (egy egyedben/fajban), pl. a humán (emberi) genom. Exon: Egy gén/mRNS azon része(i), mely(ek) tényleges fehérjeszekvenciát kódól(nak) Intron: Egy gén/mRNS azon része(i), mely(ek) nem kódolnak fehérjeszekvenciát, és az RNS érés során (transzkripció és transzláció között) kivágódnak, pre-mRNS -> m-RNS.
Restrikciós endonukleáz: DNS-hasító enzim, mely csak egy meghatározott szekvencia egy meghatározott pontján hasítja a DNS-t. Palindrom szekvencia: DNS szekvencia, mely megegyezik a reverz-komplementjével, pl. AATT, GGATCC, stb. Antiszensz oligonukleotid: A kódoló DNS szálhoz kapcsolódó oligonukleotid, amely speciális szakaszhoz kötődve gátolhatja a DNS átíródását (transzkipciót). PCR: Polimerase-Chain-Reaction: polimeráz-láncreakció, egy eljárás a sejten-kívüli (in vitro) DNS sokszorosítására. (templát DNS + primer + polimeráz + nukleotidok(monomerek) + hőmérsékletváltakozás = sokszorozódás)
RNS- polimeráz: egy enzim amely széttekeri a DNS kettős spirált Promoter: a DNS-nek az a része ahova az RNS-polimeráz kötődik és ahol megkezdi a transzkripciót riboszóma: a fehérjeszintézist végző sejtszervecske, egy ribonukleoprotein komplex RNS nukleotidok, mint építőelemek Terminátor: prokarióták azon DNS része ami jezi a transzkripció végét Transzkripciós egység: Az a DNS darab ami RNS-é átíródik. Transzkripcós factorok: az eukarióta sejtek azon fehérjéi amelyek az RNS-polimeráz kötését, illetve a transzkripció megkezdését elősegítik. Transzkripciós Iniciációs Komplex: A transzkripciós faktorok és a promoter régióhoz kapcsolódó RNS-polimeráz II együttese. TATA Box: A DNS promoter része 4 A nukleinsavkémia koronázatlan királyai:
Francis Harry James Dewey Maurice Hugh Compton Crick Watson Frederick Wilkins Lord Alexander 1962 Nobel-díj a DNS molekuláris Johannes Friedrich R. Todd szerkezetének felismeréséért Miescher (angol biokémikus) svájci orvos-kémikus 1957 Nobel-díj 1869-ban felfedezi és A nukleotidok és a izolálja a DNS-t. nukleotid koenzimek felfedezéséért
Picture 51 Rosalind Franklin
5 Oswald T. Avery (DNS a kromószóma anyaga) A nukleinsavkémia koronázatlan királyai, kémiai és orvosi Nobel-díjak:
1980 Paul Walter Frederick Stanford Moore és William H. Stein Berg Gilbert Sanger amerikai biokémikusok rekombináns-DNS A nukleinsavak 1972 Nobel-díj szekvenálásáért a ribonukleáz aktív centrumának katalitikus aktivitása és kémiai szerkezete közötti kapcsolat feltárásáért
Luis Federico Leloir (argentín biokkémikus) 1970 Nobel-díj a cukor nukleotidok felfedezéséért és a Aaron Klug (angol kémikus ) 1982 Nobel-díj szénhidrátok a krisztallográfiai elektronmikroszkóp kifejlesztéséért bioszintézise kapcsán illetve a bilológiai szempontból fontos nukleinsav6 - elért eredményeiért fehérjekomplexek szerkezetfelderítéséért Sir James Gertrude George H. Sidney Altman és Thomas R. Cech W. Black B. Elion Hitchings Amerikai/kanadai és amerikai kémikus 1988 Nobel-díj a purin alapú kemoterápiás gyógyszerek kifejlesztéséért 1989 Nobel-díj az RNS katalitikus tulajdonságainak felfedezéséért.
Kary B. Mullis Venkatraman Thomas Ada Yonath Michael Smith Ramakrishnan Steitz 1993 Nobel-díj 2009 Nobel-díj Polimeráz Irányított a riboszóma szerkezetének és 7 láncreakció (PCR) mutagenezis funkciójának tanulmányozásáért Tomas Lindahl, Paul Modrich és Aziz Sancar
2015 Nobel-díj „A DNS-javítás mechanizmusának tanulmányozásáért” 9 Nukleinsavak:
1) A kromoszóma és felépítése 2) DNS- RNS építőelemek: Nukleozidok, nukleotidok, nukleinsavak Nem-RNS és -DNS alkotó purinszármazékok A DNS térszerkezete, a bázispárok 3) DNS nanorendszerek 4) DNS (RNS) reaktivitása: hidrolízise az építőelemek kémiai szintézise kémiai (szilárdfázisú) szintézis enzimatikus szintézis: a replikáció 5) Transzkripció 6) Transzláció 7) DNS analitika: szekvenálás 8) Bioenergetika
10 1) A kromoszóma és felépítése A prokarióták, körülhatárolt sejtmag Az eukarióták olyan élőlények, amelyek valódi nélküli élőlények, tipikusan sejtmaggal (a mag anyagát a citoplazmától egy egysejtűek, ilyenek az archeák és a maghártya választja el) rendelkező sejtekből baktériumok épülnek fel (eu = valódi, karyon = sejtmag). Mind a prokatiota-, mind az eukarióta- sejtekben az információtárolásra a DNS hivatott.
Escherichia coli Egy eukarióta sejt genetikai anyagának többsége a 11 baktérium papucsállatka sejtmagban, kromoszómák formájában van tárolva. Egy férfi diploid sejt kariogramja: Fajfüggő az eukarióta sejtek 22*2 testi kromoszóma = 44 kromoszómáinak a száma: 2 nemi kromoszóma: X és Y = 2 rozs 14 Σ= 46 galamb 16 giliszta 36 mezei nyúl 46 ember 46 csimpánz 48 Y kromoszómán csak kutya 78 melyek mutációja férfi meddőséget okozhat, azaz nem öröklődik a baj ponty 104 X kromoszóma kb. pillangó 380 fontosak az intellektus fejlődésében, páfrány 1200 mutációjuk mentális betegségek soráért lehet felelős
A szexuális úton szaporodó fajok mind 1) diploid (két kromoszómakészlet; 44+2) vagy poliploid (több készlet; triploid – magnélküli dinnye, stb.) testi, mind 2) haploid (egy készlet; 22+1) ivari Egy női diploid sejt kariogramja: sejtekkel rendelkeznek. 22*2 testi kromoszóma = 44 2 nemi kromoszóma: X + X = 2 Σ= 46 Egy női diploid sejt kariogramja: apai anyai 22*2 testi kromoszóma = 44 „örökségünk”: 2 nemi kromoszóma (X és X) = 2 minden diploid sejt kromoszóma-párja egy anyai és egy apai kromoszómát tartalmaz
kromoszóma gének bázispárok száma száma Egy biblia 3,5 millió 1 2 968 245 203 898 2 2 288 243 315 028 karakter, azaz kb. 13 7 48 114 151 656 800 db. bibliányi a 21 303 46 976 537 genetikai kód 22 288 49 476 972 X (ivari kromoszóma) 1184 152 634 166 Y (ivari kromoszóma) 231 50 961 097 összesen = 46 ~30.000 ~3,2 109 3,2 gigabyte-nyi betűt 13
Egy eukarióta sejtciklusa: a sejtosztódás lépései: A G0 fázisban a sejtek változatlan állapotba kerülnek, várva a sejtciklusba vezető jelre.
- G1 fázis: első növekedési szakasz, - S fázis: a DNS replikálódik (46-ból 92 kromószóma lesz)
- G2 fázis: második növekedési szakasz, és felkészülés az osztódásra, - M fázis (vagy mitózis + citokinezis): a sejt két utódsejtre válik szét
replikáció
14 A feladat: az eukarióta A kromoszómapár hierarchikus szerkezeti elrendeződése. sejtek mintegy 3.2 milliárdnyi bázispárját feltekerve, azt néhány mikrométerbe tömöríteni.
histon
m
μ
2 2
- 0,2 kromatin a nukleoszóma a 8 histon fehérjét telomer régiók körülölelő
146 bázispárnyi DNS-ből áll. A centromer komplexet a H1 megkettőződött kromoszóma linker fehérjék a metafázisban stabilizálják. A „supercoiling” 15000 szeres kondenzációt tesz lehetővé A kódolo DNS aránya a teljes genomhoz viszonyított (%)
Eukarióta sejtek génjében van nem- kódoló rész; intronok. (prokarióta sejtekben tipikusan nincs intron.) Az mindig jobb menetes, antiparallel, (kivéve a Z-DNS) intron a pre-mRNS-be átíródik, majd 16 az egészet a H-hidak tartják egyben. az RNS érés során az kivágódik. Kromoszóma: (a görög chroma=színes és soma=test) egyetlen hosszú DNS, amely számos gént, szabályozó és egyéb szekvenciákat tartalmaz.
1) Giemsa-festés: a „bázikus” festék a P-O− gerinchez kötődik, de különösen az A-T bázispárban gazdag régiókhoz (A-T résznél sötétebb a szín)
Gustav Giemsa (1867 – 1948), német mikrobiológus 2) Quinacrine-festés fluoreszcens festés
17 2) DNS- RNS építőelemek memo: nucleus = sejtmag
A nukleinsavak két fő fajtája a - dezoxiribonukleinsavak (DNS) - ribonukleinsavak (RNS)
- savanyú jellegű (híg lúgban oldódó), nagy molekulasúlyú polimer vegyület - molekulák, amelyek az átörökítendő információ tárolására, annak átírására (transzkripció) és átfordítására (transzláció) alkalmasak, aminek köszönhetően a sejt összes fehérjéje meg tud szintetizálódni. (Alkalmasak továbbá reakciók katalízisére is.)
Kémiai építőelemek: nukleotidok és nukleozidok
O heterociklusos bázis HO P O 5' N OH O -N-glikozidos kötés 4' 3' 2' 1'
OH OH
egy nukleotid
hidrolízis
•heterociklusos bázis: purin vagy pirimidin •ötszénatomos monoszacharid: D-ribóz vagy 2-dezoxi-D-ribóz 18 •foszfátion Foszforsavészterek hidrolízise: Nukleinsav (polinukleotid) enyhe degradáció nukleáz 1N NaOH, 25 °C
Nukleotid (monomer)
nukleotidáz N cc. NH3, 180 °C NH2 N
N Nukleozid (glikozid) + H PO H O N 3 4 O purin Q=OH adenozin Q=H dezoxiadenozin nukleozid H+ HO Q foszforiláz* A N-glikozidkötés hidrolízise: Nukleotidbázis + pentóz (nucleobase) * ez a foszforiláz valójában egy hidroláz Nukleinsav építőelemek; a D-ribóz D-ribóz D-arabinóz D-xilóz D-lixóz memo:
O O pirán furán
O O tetrahidro-2H -pirán tetrahidrofurán Ciklusos félacetál képződése, avagy hogyan rajzoljuk a furanózokat:
A nyílt láncú D-fruktóz különbözö konformációi
H 5 H H 5 H2COH 1 C O CH2OH 4 O O O C Nukleozidokban H C OH 4 C 2 HO C H C H mindig 5 tagú H H 1 H H H 1 H 3C OH C C C C (furanóz) gyűrű 3 3 2 H C OH 2 4 OH OH OH OH formájában van
5 CH2OH nyílt láncú D-ribóz nyílt láncú D-ribóz a ribóz vagy
5 5 dezoxi-ribóz HOCH2 O OH HOCH2 O H jelen. C C1 4 C C 1 4 H H H H H H H OH C C C C 3 2 3 2 20 OH OH OH OH -D-ribofuranóz -D-ribofuranóz Nukleinsav építőelemek; a heterociklus két heteroatomos hattagú gyűrűk (Bruckner. III/1 .)
Aromás vegyületek:
Nem aromás származékok
memo: gyenge bázisok: a piperazin 10%-os vizes 21 oldatának pH-ja 10.8-11.8. a barbitursav Pirimidinszármazékok, nukleinsav építőelemek; fontosabb tautomerjei
Az uracil keto-enol tautomer egyensúlyi formái:
memo: csak a laktim- laktám vagy a dilaktám forma jöhet szóba, az N-glikozid kötés miatt. 22 Nukleinsav építőelemek; purinszármazékok
A guanin keto-enol tautomer egyensúlyi formái:
Melyik tautomer forma a stabilabb?
23 NH2 NH2
N N adenozin N N
N N H O N N O HO O RNS építőelem H H HO OH H H adenozin OH OH 9-(-D-ribofuranozil)-adenin op= 235oC
NH2 NH2
N N N adenozid N N O N N N
-O P O HO O O H H O- H H H H H H OH OH OH O NH2 NH2
adenozin-5'-foszfát O P O- adenozin-3'-foszfát N N 5'-AMP 3'-AMP N N O- dezoxiadenozin
N N H O N N O HO O H H HO H H dezoxiadenozin OH H 9-(2'-dezoxi--D-ribofuranozil)-adenin op= 190oC
NH2 NH2
N N N N dezoxiadenozid N O N N N
-O P O HO O O H H DNS építőelem O- H H H H H H OH H O H 24 dezoxiadenozin-5'-foszfát O P O- dezoxiadenozin-3'-foszfát 5'-dAMP 3'-dAMP O- OH OH
N N guanozin N N
N N H O N NH2 N NH2 O HO RNS építőelem O H H HO OH H H guanozin OH OH 9-(-D-ribof uranozil)-guanin op= 240oC
OH OH
N N N guanozid N
N N NH O N NH2 N 2
-O P O HO O O H H O- H H H H H H O OH OH OH OH OH guanozin-5'-foszfát O P O- guanozin-3'-foszfát 3'-GMP N N 5'-GMP N N O- dezoxiguanozin
N N NH N H O N 2 NH2 O HO O H H HO H H dezoxiguanozin OH H 9-(2'-dezoxi--D-ribofuranozil)-guanin
OH OH
N N N N dezoxiguanozid
N N O N NH2 N NH2
-O P O HO O O DNS építőelem H H O- H H H H H H OH H O H 25 dezoxiguanozin-5'-foszfát O P O-dezoxiguanozin-3'-foszfát 5'-dGMP 3'-dGMP O- NH2
N NH2 citidin N N O H O RNS építőelem O HO N O O H H HO OH H H citidin OH OH 3-(-D-ribof uranozil)-citozin op= 230oC
NH NH2 2 citidinf oszfátok N N O N O -O P O N O HO O O - H H H H O NH H H 2 H H NH2 OH OH O OH
- citidin-3'-foszfát citidin-5'-foszfát O P O N N 5'-CMP 3'-CMP O- dozoxicitidin HO N O N O H O O O H H H H dezoxicitidin OH H HO 3-(2'-dezoxi--D-ribofuranozil)-citozin
NH dezoxicitidinfoszfátok NH2 2
N N O N O -O P O N O HO O O H H DNS építőelem O- H H H H H H OH H O H 26 dezoxicitidin-5'-foszfát O P O- dezoxicitidin-3'-foszfát 5'-dCMP 3'-dCMP O- RNS építőelem
OH OH
H3C H C N 3 N timidin HO N O N O H O O O H H H H timidin OH H HO 3-(2'-dezoxi--D-ribofuranozil)-timin op= 183o
OH timidinfoszfátok OH
H3C H3C N N O N O -O P O N O HO O O H H DNS építőelem O- H H H H H H OH H O H 27 timidin-5'-foszfát O P O- timidin-3'-foszfát 5'-TMP 3'-TMP O- Nem-RNS és -DNS alkotó purinszármazékok: A purin degradációs út: PNPáz:= Purin nukleozid foszforiláz
AMP →
Adenozin nukleotidáz dezamináz
PNPáz GMP →
memo: purinvázas alkaloidok: di- és trimetil xantinok:
28 A DNS foszforsavdiészter típusú, Az RNS kémiai szerkezete nem-elágazó, lineáris polimer, kémiai szerkezete amit az 5’→3’ irányba írunk: ..-5’-C-G-T-A-3’-..
5’
3’
29 A Chargaff-szabály megadja a nukleotidok belső arányait a DNS-ben: Σ(pur.)/Σ(pir.) ≈ (G+A)/(C+T) ≈ 1 és A/T ≈ 1 és G/C ≈ 1 memo: (G+C)/(A+T) változik: ez adja a DNS termostabilitását (lásd később) Erwin Chargaff 1905 - 2002
3’ P 5’
C G P
P
G C P
P
T A P
P
A T 5’ P 30 3’ A DNS térszerkezete, a bázispárok A DNS jobbmenetes kettős hélix téralkatú, körülbelül 10 nukleotidpárral hélix menetenként. A spirálokat H-hidak tartják össze, az egyik a kódoló a másik a templát szál. Az adenint és a timint 2, míg a guanint és a citozint 3-H híd köti össze. Ezt a téralkatot először James Watson and Francis Crick becsülték (határozták) meg helyesen 1953-ban Rosalind Franklin diffrakciós méréseinek köszönhetően.
31 A DNS térszerkezete, a bázispárok - parciális d töltés
interface: kedvező elektrosztatikus kcs. színkódja: d+
Crick párképzés Crick
- Watson
G C A T Hoogsteen párképzés Hoogsteen interface: kedvezőtlen elektrosztatikus kcs. interface: kedvező elektrosztatikus kcs. 32 Watson-Crick Hoogsteen
33 Watson-Crick Hoogsteen
34 Watson-Crick párképzés: fontos, ez található elsősorban a duplexekben A amino (aromás) míg T dilaktám forma G is C is amino-laktám forma
- a hidrofil és negatív töltésű „foszfodezoxiribóz” gerinc „kifelé” mutat - a bázisok befelé állnak, intermolekuláris H-hidakkal A kettős hélix stabilizáltak, (double helix, duplex) - a cukor-foszforsav diészter 1953 gerinc teljesen konzervatív, míg a heterociklusok permutálódnak, - a bázispárok miatt a DNS két szála komplementer jellegű - a heterociklusok pontos krisztallográfia (1952) szekvenciája hordozza az Francis Harry James35 Dewey DNS elektronsörűség- Rosalind Franklin információt. eloszlása Compton Crick Watson Mutáció I: Normális és „abnormális” bázispár képzés Replikáció #1 Replikáció #2
szülő gyerek unoka -G- -G- -C- -C- -G- -C- -G- -G- -C- -C-
mutáció
-G*- -A- -T- -T- -G- -C- -G- -G- -C- -C- memo: ugyanúgy megvan a „3. H-híd” is, ám míg a normál esetben (felső) a purin bázis a 3. H- hídban az akceptor, addig a mutációra vezető esetben ugyanitt a H-híd donor szerepét tölti be. A két 36 tautomer eltérő H-híd mintázatú, s ezért eltérő partnerrel (pirimidin bázissal) képez WC párt. 37 Mutáció II: a kémiai reagensek kiváltotta mutációk:
Pl. salétromossav (NaNO2 + HCl)
magyarázat:
mutáció
-H*- -G- -C- -C- indukált mutáció: -A- memo: ugyanúgy megvan a -T- -A- -A- 2. H-híd, ám míg a normál esetben (NH…O=C) a purin -T- -T- bázis a 2. H-hídban donor, szülő gyerek unoka addig a mutációra vezető -A- -A- esetben az akceptor -T- -T- (C=O…HN) szerepét tölti be. A két purin származék eltérő -A- H-híd mintázatú, s ezért -T- eltérő partnerrel (pirimidin -A- -A-38 bázissal) képez WC párt. -T- -T- A DNS térszerkezete, a bázispárok
A leggyakoribb forma a B-DNS, amely jobbmenetes, a két szál antiparallel elhelyezkedésű
3’ P 5’
A T P
P nagyárok G
C P
P
C G P
kisárok P
C G 5’ P 3’ memo: Legtöbb DNS téralkata a B-forma amikor vízzel egyensúlyt tart a molekula. Ha lecsökken a víz tenziója (pl. tömény NaCl oldattal tart egyensúlyt a DNS, s ezért kisebb a tenzió), akkor megjelenhet az A-forma. kérdés: mi lehet a helyzet a kromoszómába becsomagolt DNS esetén? 39 memo: Az A olyan mint a B-forma, csak „tömörebb”. jobbmenetes hélix jobbmenetes hélix
Az A-DNS hélix balmenetes tömzsibb és rövidebb, hélix mint a B-DNS, Az B-DNS hélixben a főtengelyhez képest a a főtengelyhez bázispárok síkja képest a bázispárok döntött ( ┴ képest 19o). síkja merőleges (┴ O o R képest 1 ). O H O H Az Z-DNS hélix R O H karcsúbb, O H C-3' a sík felett főtengelyhez képest a H C-3' endo O H bázispárok síkja 40 o C-2' a sík felett döntött (┴ képest 9 ). C-2' endo A DNS 3 fő formájának szerkezeti jellemzői:
kérdés: milyen hosszú az emberi genom (kihúzva és „egyesítve”)?
válasz: a teljes genom (44 +2 kromoszóma) összesen mintegy 3,2 milliárd bázispárból épül fel: 3,2 109 * 3.32 10-10 m = 1, 06 m gemetriai jellemzők: A-DNS B-DNS Z-DNS hélix típús jobbmenetes jobbmenetes balmenetes ismétlödő egység 1 bp 1 bp 2 bp bp-onkénti elcsvarodás 32.7° 35.9° 60°/2 1 menetre eső bp száma 11 10.5 12 főtengelytől vett „eltérés” +19° −1.2° −9° emelkedés/bp 2.3 Å (0.23 nm) 3.32 Å (0.332 nm) 3.8 Å (0.38 nm) menethossz 28.2 Å (2.82 nm) 33.2 Å (3.32 nm) 45.6 Å (4.5641 nm) átmérő 23 Å (2.3 nm) 20 Å (2.0 nm) 18 Å (1.8 nm) H H H3C O H N N A DNS hőstabilitása / denaturálása N H O N N H N N N ribóz N H N N N tétel: A DNS T -pontja nő a GC-frakció adenin m N N ribóz ribóz O timin növekedésével; ribóz O H N guanin oxo-f orma citozin H oxo-f orma 1 2 oxo-f orma Tm < Tm ha GC1/total T 350 kérdés: miért nő a Tm-pont ugyanolyan GC y = 39,7x + 324 345 frakció mellett akkor, ha magasabb az oldat só R2 = 0,996 koncentrációja? 340 – válasz: a DNS felszíni negatív töltései P-O 335 kompenzálódnak. 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 GC- frakció megjegyzés: - Minnél több a belső H-híd a DNS 2 szála között az annál stabilabb dimert képez. (Fehérjék esetében ez nem memo: igaz, ott a belső H-hidakkal nem nő lineárisan a fehérje - magas pH termostabilitása!) - magas T (K) - A DNS T (60-80oC) pontja lényegesen magasabb mint m A-T gazdag a testhőmérsékletünk, és jelentősen magasabb mint a 42 legtöbb fehérjénkké! Atkins de Paula 118 régió Nem-klasszikus DNS szerkezetek: triplex DNS: háromszálú DNS quadruplex DNS: négyszálú DNS előfordul: pl. telomerek (kromoszómavégek) 4xG: négy guanidin helyezkedik el egy síkban, egy kation + 4x 2 hidrogénhíd (a purinváz 7-es N-jével is) stabilizálja a szerkezetet. 43 Nukleinsavak: 1) A kromoszóma és felépítése 2) DNS- RNS építőelemek: Nukleozidok, nukleotidok, nukleinsavak Nem-RNS és -DNS alkotó purinszármazékok A DNS térszerkezete, a bázispárok 3) DNS nanorendszerek 4) DNS (RNS) reaktivitása: hidrolízise az építőelemek kémiai szintézise kémiai (szilárdfázisú) szintézis enzimatikus szintézis: a replikáció 5) Transzkripció 6) Transzláció 7) DNS analitika: szekvenálás 8) Bioenergetika 44 3’ 3) DNS nanorendszerek I: 1) vegyünk egy tompa végű DNS kettős hélixet: Holliday-junction, H-elágazás „helikáz” („kocka csúcsa”) hogyan csináljunk 5’ 3’ 5’ ilyen alakzatot? 3’ 5’ 3’ 5’ 180° 3’ 5’ 5’ 3’ 5’ azonos 3’ 5’ 3’ „helikáz” TCTGCACATA Holliday, R. (1964). A mechanism for AGACGTGTAT gene conversion in fungi. 5’ 3’ 5’ Genetical Research, 5, 282–304. 3’ 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ memo: a kétszálú hélix és a „kereszt 45 5’ 3’ forma” egyensúlyban lehet, (DS!) 2) A DNS két szála nem feltétlenül egyforma hosszú: ilyenkor van túlnyúló szakasz (3’ overhang, 5’ overhang): Az ilyen DNS is továbbalakítható: 3) Készíthetünk olyan 3’ DNS-t melynek 1) egy részében a két szál 5’ egymásnak nem komplementere, a 3’ szétszedéshez tehát nem 5’ kell a helikáz,valamint 2) amelynek mindkét oldalán van egy-egy túlnyúló szakasz: 5’ Az ilyen DNS is továbbalakítható: Az összes H-hidak száma: 3’ 10*(CG =3) → 30 CG =3 4*(CG =3) → 12 10*(AT =2) → 20 46 AT=2 6*(AT =2) → 12 5’ 3’ 4) Készítsünk olyan DNS szálakat, ahol a túlnyúló szakaszok szekvenciáit alkalmasan választjuk meg: barna-tompavég barna-hegyesvég 4.1) barna-barna (a 8 H-híd összetartja majd a ligáz összeköti) 4.3) fekete-fekete (a 10 H-híd összetartja, ligáz összeköti) 4.2) lila-lila (a 12 H-híd összetartja majd a ligáz összeköti) 47 5) Készítsünk ennek fényében olyan DNS szálakat amelyek spontán módon, s a túlnyúló szakaszaik révén egyértelműen asszociálódnak: 6) Készíthetünk ilyen módon kockát, vagy komplexebb idomokat, minden csak tervezés kérdése ezután? : a) DNS nano-kocka, b) poliéder, c) csomó, stb. N.C.Seeman, 48 MolBiotechnol, 2007,37,246-57 DNS nanorendszerek II: T-elágazás („kocka csúcsa”) 5’ 3’ 5’ TAGCAGTTCCTATGAG 5’ TAGCAGTT AACTGCTA TAGCAGTT AACTGCTA 3’ 3’ 5’ 3’ ACGACGTCAACTGCTA GACGTCGT 5’ 3’ 5’ 3’ CTCATAGG 3’ CTCATAGGGACGTCGT CTCATAGGGACGTCGT 5’ Összefoglalva: 3’ CCTATGAG CTCATAGG 5’ 49 50 DNS és RNS hidrolízise: 1) Savas hidrolízis az eredmény: „depurinálás” (A v. G) memo: az RNS és a DNS kb. egyforma sebességgel hidrolízál savban kérdés: a 2-deoxi D-ribóz félacetálja savban felnyílik-e? 51 2) Lúgos hidrolízis (az RNS lúgos hidrolízise): eredmény: lánchasadás memo: ezért az RNS kevésbé, míg a DNS jobban ellenáll a lúgos hidrolízisnek memo: azért tárol a DNS és nem csak RNS alapinformációt, mert az előbbi jobban ellenáll a lúgos hidrolízisnek, azaz stabilabb! 52 DNS, RNS építőelemek kémiai szintézise: 1) Nukleozid szintézis I: a Hilbert-Johnson-nukleozid szintézis T.B. Johnson, G. E. Hilbert, Science 69, 579 (1929) 53 G. E. Hilbert, T. B. Johnson, J. Am. Chem. soc. 52, 2001, 4489 (1930). 2) Nukleozid szintézis II: kapcsolás ribozilaminnal A reakció javasolt mechanizmusa: 54 3) Szubsztituált nukleozid (purin) származékok továbbalakítása: Cl N N HO N N O OH OH NH3 H2 / Ni H2S NH2 S H H N N N N N N N N N N N N R R R adenozin R: -D-ribofuranozil 55 4) Nukleotid szintézis: nukleozidok foszforilezése (pl. dibenzil-foszfokloridáttal) H2C O P Cl H2C Orvosi alkalmazások: OH dibenzil-foszfokloridát SH N O N N N H N N N N N N OH H H N N H 2 N allopurinol 6-merkapto-purin O aciklovir Gyerekeknél akut leukémia kezelésére Herpes virus kezelésére 56 80%-os gyógyulás köszvény kezelésére 2 C-atom hiányzik a ribózból Oligonukleotid szintézis:foszforamidit kapcsolási módszer McBridge és Caruthers 1983. 1. Dmtr hasítás (dimetoxi-tritil) 1. 2. Aktiválás és 2. kapcsolás 3. Oxidálás I2 (H2O vagy THF) 4. 3. 4. Lánczárás (az elreagálatlan 5’-OH-t acetilezzük) DNS kémiai (szilárdfázisú) szintézise: észter kötés(ek) kialakítása, SN foszfor centrumon O HN C Védőcsoportok I: A N N N6-benzoilezés a bázisok védelme N N „permanens” O Rib O csoportokkal HN C HN C CH3 N4-benzoilezés N4-acetilezés Cél: a primer aminok N N védelme, avagy a C vagy O N nukleofil csoportok O N Rib álcázása, hogy a Rib majdani kapcsolásnál O N már csak a ribóz HO-5’ NH O legyen csupán az G N2-izobutiril C egyetlen Nu. N N N H Rib O H CH3 N T nem kell védeni O N 58 Rib Védőcsoportok II: a foszfodiészter védelme „permanens” csoporttal B O H H H H O H N C O P O cianoetilészter B O formában O CNE H H H H O H Mindkét típusú permanens védőcsoport típus (N-benzoil vagy N-acetil és a CNE) is eltávolítható: vizes NH3-val memo: a szintézis végén az összes állandó védőcsoport vizes ammóniával kvantitatíve eltávolítható 59 Védőcsoportok III: az 5’-OH csoport „ideiglenes” védelme Dmtr MeO OMe (enyhén savas rendszer) CH Cl + B 2 2 HO B 3% O O H H O CCl3-COOH H H H H O H H H O H N C N C O P O O P O O O MeO narancs szín OMe 60 A szilárd hordozó: CPG (controlled pore glass) kontrolált pórusú üveg OMe -kémiailag inert CPG Si (CH2)n NH2 -nem duzzad -amino funkcionalizált OMe O H A „linker”: OMe C N Pl. borostyánkősav O C (CH2)n Si CPG O OMe H2C COOH NH3 / H2O hasító hely H2C COOH O 61 A DNS szintézis lépésről lépésre : -szilárdfázisú szintézis 3’-től 5’ irányba halad a „Caruthers”-módszer O Dmtr B1 memo: a bioszintézis menete O az 5’-től 3’ irányba halad H H H H O H H 1. Dmtr hasítás OMe C N (dimetoxi-tritil) O C (CH2)n Si CPG O OMe enyhe savas detritilezés (3% TCA) H O B1 O H H H H O H H OMe C N O C (CH2)n Si CPG O OMe 2. Aktiválás és kapcsolás 62 2. Aktiválás és kapcsolás H O B1 O H H H H O H H OMe C N O C (CH2)n Si CPG O OMe Dmtr O B2 O MeCN N H H N tetrazol + foszforamidit H H N (gyenge sav) O H N H P CNE O N SN (5' OH SN reakciója) 63 3. Lánczárás (az elreagálatlan 5’-OH-t acetilezzük) 4. Oxidálás I2 (H2O vagy THF) Ciklus végén NH4OH-val: - minden permanens védőcsoport eltávolítása - gyantáról való lehasítás 64 Legvégén: kromatográfiás tisztítás Összefoglalás: oligonukleotidok laboratóriumi szintézisére Foszforamidit kapcsolási módszer DMTr O B3 O HO 2 B O O DMTr O B3 O P O B2 O RO O O RO P O 1 B P i O O RO N Pr2 O 1 tetrazol RO P O B O O O CPG 1. lépés Kapcsolás O CPG B1,B2,B3: védett bázisok DMTr : tetrazol: H R: N C CH CH 2 2 N -cianoetil H O O N egy savra stabil, de bázisra érzékeny védõcsoport N N dimetoxitritil CPG: "controlled pore glass" (porózus üveg) egy savra érzékeny védõcsoport 65 DMTr O HO B3 B3 O O O O RO P O RO P O B2 B2 O O O O O O I2 HA RO P O B1 RO P O B1 O O O O 2. lépés Oxidáció O 3. lépés Védõcsoport O CPG eltávolítása CPG memo: A PCR-től eltérően a kémiai szintézis nem igényel „templátot” 66 A szintetikus biológia hajnala J. Craig Ven Science 2 July 2010: Vol. 329 no. 5987 pp. 52-56 Creation of a Bacterial Cell Controlled by a Chemically Synthesized Genome „íme az első olyan élő szervezet amely atyja egy számítógép, s amely megalkotása az emberi elme és egynéhány robot műve volt” 2003-ban még „csak” egy alig több mint 5000 bázispárt, 2010-ben már 1 millió bázispárt lehet szintetikusan „összerakni”! 67 http://www.youtube.com/watch?v=QHIocNOHd7A Aldous Huxley Szép új világ A DNS enzimatikus szintézis: a replikáció cél: a genetikai kód megkettőződése: A kettős hélix az egyik pontján kitekeredik, majd a templátok mentén a komplementer szálak megszintetizálódnak. 68 A DNS enzimatikus szintézis: a replikáció DNS polimeráz I: 5’ => 3’ irányba szintetizál (lassabb, de pontosabb, javítani is tud….) DNS polimeráz II: 5’ => 3’ irányba szintetizál (alig ismert még) DNS polimeráz III: 5’→3’ irányban szintetizálja az új láncot, ATP, GTP, CTP és TTP melyek „magukon hordozzák” az aktiváláshoz szükséges energiát. Leading strand = „vezető” szál, folyamatos szálszintézis Lagging strand = „követő, sántikáló” szál, darabonkénti szálszintézis, majd utólagos összekötés (DNS ligáz) Primer: alkalmas RNS Primase: RNS primert hozza létre amely kell ahhoz hogy a DNS polimerázok el 69 tudjanak kezdeni dolgozni. DNS ligáz: „csak” összekapcsol két láncot Kary PCR vagy Polymerase Chain Reaction (magyar polimeráz láncreakció) egyszerű és hatékony enzimatikus módszer a DNS-molekulák számának - adott 1993 láncvégek (primerek ) közötti – növelésére. (VIDEO) A feladat: [ ]n 1. ciklus 5’ 3’ fütés T=95°C és alkalmas 2 primer hozzáadása 3’ 5’ T=55°C: a primerek 5’ helyrekerülnek 5’ (letapadnak, annelláció) 3’ 5’ 5’ 3’ T=72°C: nukleotidok egyesévél bekapcsolódnak, majd a polimeráz enzim egy lánccá kapcsolja össze, a szintézis iránya 70 5’→3’ csak! memo: praktikus termostabil 2. ciklus fütés T=95°C és alkalmas primerek hozzáadása T=55°C (helyre kerülnek az új primerek) T=72°C-on a nukleotidok bekapcsolódnak, s a polimeráz összeligálja az új szálakat memo: 4 kópia van de ebből még mind csak közti termék, tehát egyik sem jó még! 71 memo: azért lesz rövidülés, mert a polimeráz szintézis iránya 5’→3’ csak! 3. ciklus végén 8 kópia van s ebből már 2 jó! 4. ciklus végén 16 kópia van, ebből 8 rossz, de 8 jó! 5. ciklus végén 32 kópia van, ebből 10 rossz, 22 jó! 6. ciklus végén 64 kópia van, ebből 12 rossz 52 jó! 10. ciklus végén 1024 kópia van, ebből 20 rossz, 1004 jó! Kary B. Mullis USA biokém. összes kópiák száma: 2n, ebből rossz 2n, jó (2n −2n) 1983-ban kifejleszti a PCR72 -t, 1993-ban megkapja a Nobel-d. 30. ciklus után a helyes kópiák száma (a várt termék) >1 milliárd *30 tehát: [ ]n>109 Lényegében tiszta terméket kapunk, mert 2n << (2n −2n) 73 Nukleinsavak: 1) A kromoszóma és felépítése 2) DNS- RNS építőelemek: Nukleozidok, nukleotidok, nukleinsavak Nem-RNS és -DNS alkotó purinszármazékok A DNS térszerkezete, a bázispárok 3) DNS nanorendszerek 4) DNS (RNS) reaktivitása: hidrolízise az építőelemek kémiai szintézise kémiai (szilárdfázisú) szintézis enzimatikus szintézis: a replikáció 5) Transzkripció 6) Transzláció 7) DNS analitika: szekvenálás 8) Bioenergetika 74 5) Transzkripció A DNS-ről mint információhordozóról a gének leolvasása, a hírvivő RNS szintézise: DNS transzkripció „átírás”, „másolás” RNS polimeráz (enzim) (transzlokáció és mRNS mRNS érés) transzláció „fordítás”, „dekódolás” riboszóma (ribozim) fehérje RNA-Polimerase A DNS-ről RNS-re átírás kezdete: Transzkripciós faktor (fehérje complex) Folyamata: a bioszintézis menete 75 az 5’-től 3’ irányba halad RNS polimeráz Transzkripció lépései: iniciáció: promoter régió 5’CATCCAATTGG 3’ kódoló DNS szál elongáció 5’CAUCCAAU3’ születő RNS szál 3’GTAGGTTAACC 5’ templát DNS szál A transzkripció iránya terminálás 76 Ribonukleinsav (RNS) és fehérjeszintézis gén: olyan DNS szegmens amely tartalmazza mindazon információk összességét amely az adott polipeptid vagy fehérje szintéziséhez szükséges. (pl. egy egyszerű bacilus DNS-e is legalább 3000 különböző enzimfehérjét kódol.) A transzkipció folyamatának szereplői: RNS-polimeráz: egy enzim amely széttekeri a DNS kettős spirált Promoter: a DNS-nek az a része ahova az RNS-polimeráz kötődik és ahol megkezdi a transzkripciót RNS nukleotidok, mint építőelemek Terminátor: prokarióták azon DNS része ami jelzi a transzkripció végét Transzkripciós egység: az a DNS darab amely RNS-é átíródik. Transzkripcós faktorok: az eukarióta sejtek azon fehérjéi amelyek az RNS-polimeráz kötését, illetve a transzkripció megkezdését elősegítik. Transzkripciós iniciációs komplex: a transzkripciós faktorok és a promoter régióhoz kapcsolódó RNS-polimeráz II együttese. 77 TATA „box”: A DNS promoter része etc. A hírvivő-RNS (messenger-RNS, röviden mRNS) szintézise: etc. P A etc. etc. etc. U P A U A U P P C P P P G P C G C G P C P P P P G P C C G láncszétválás P G polimeráz RNS G P P P C P DNS G G C komple- menter RNS. DNS C DNS komple- menter RNS dezoxiribóz: ribóz: Transzkripció a sejtmagban történik, a szintetizálódott RNS-nek van fehérjét kódoló (exon: „expressed sequence”) és nem-kódoló része (intron: „intervening sequence”). Az intron a pre-mRNS-be átíródik, majd az RNS érés során kivágódik. A kész m-RNS elvándorol a citoplazmába ahol a 78 fehérjeszintézis templátjaként szerepel. fehérje DNS: pre-mRNS mRNS - nem kódoló részek - kódoló részek (gének) >>>>>> mRNS: - nem-kódoló részek (intron: „intervening sequence”) - kódoló részek (exon: „expressed sequence”) >>>>>>> fehérje 79 RNS fajták és funkciójuk: kódoló RNS: • mRNS: hírvivő (angol: messenger) RNS: DNS-ből másolt RNS, mely a genetikai információt hordozza, és ezt a riboszómához szállítja, ahol a rajta lévő információ alapján a fehérjék szintetizálódnak. Három egymás melletti bázis alkot egy-egy kodon-t, amely egy-egy aminosavat kódol. • pre-mRNS: éretlen mRNS. Az érés során a nem-kódoló részek (intronok) kivágódnak, csak a kódoló részek (exonok) maradnak az érett mRNS-ben. nem-kódoló RNS: • tRNS: transzfer-RNS: segít az mRNS-en található kód (kodon) leolvasásában. Minden létező kodonhoz külön tRNS tartozik, mely a kodonnak megfelelő aminosavat hordozza, és a riboszómához szállítja, majd ott részt vesz a fehérjeszintézisben • rRNS: riboszomális RNS: a riboszóma alkotóeleme, mely a fehérjeszintézis katalitikus centrumát alkotja. léteznek további nem-kódoló RNS-ek is, mint például: • siRNS: (small interfering RNA): gének kikapcsolásáért felelős rövid RNS részek, amelyek a DNS-hez kötődve meggátolják az adott rész átíródását. 80 Az RNS térszerkezete: - általában egyszálú, de - Watson-Crick-féle párképzés az egy szálon belül, azaz önmagával is kialakulhat: egy „hairpin” RNS téralkat E.coli rRNS kis- alegységének téralkata tRNS térszerkezete 81 Szállító RNS (transzfer-RNS, tRNS) feladata: hogy a megfelelő helyre eljuttassa az aminosavat, felépítése: A,U,C,G mellett módosított nukleotidok is: PSU, RT, stb. A tRNS aminosav 3’ akceptor karja antikodon hurok 82 Szállító RNS (transzfer-RNS, tRNS) jellemzői: - 70-90 nukleotidból áll, - mindig a CCA- véghez kapcsolódik a 3’ pontnál, észterkötéssel az aminosav (pl. Tyr), - minden aminosavnak saját tRNS-e van, amelyen az annak az aminosavnak megfelelő antikodon található (egy aminosavhoz egy vagy akár több tRNS is tartozhat) - például: Met UAC ….tRNS: antikodon (CAU) AUG ….mRNS: kodon 83 A mRNS tripletjei a genetikai kód: egy aminosavhoz egynél több kodon (egynél több antikodonnal ellátott t-RNS) tarozik: As. m-RNS As. m-RNS As. m-RNS 5’→3’ 5’→3’ 5’→3’ Ala GCA His CAC Ser AGC GCC CAU AGU GCG Ile AUA UCA GCU AUC UCG Arg AGA AUU UCC AGG Leu CUA UCU CGA CUC Thr ACA kodon CGC CUG ACC X CGG CUU ACG Y CGU UUA ACU Z Asn AAC UUG Trp UGG antikodon AAU Lys AAA Tyr UAC Asp GAC AAG UAU GAU Met AUG Val GUA Cys UGC Phe UUU GUG UGU UUC GUC Gln CAA Pro CCA GUU CAG CCC Glu GAA CCG lánckezdő GAG CCU fMet AUG Gly GGA GGC lánczárás UAA GGG UAG 84 GGU UGA Transzláció, az információ lefordítása “fehérje nyelvre”, mely lépés során a citoszólban a ribószómán megtörténik a fehérjeszintézis. A szintézis - résztvevői: mRNS (kodon) + tRNS (antikodon + aminosav) - helyszíne: a riboszóma - eredménye: a fehérje 85 Összefoglaló: az információáramlás hierarchiája: DNS kodon → mRNS kodon → tRNS antikodon→ aminosav 5’ACCTTTCTAAAG → ACCTTTCTAAAG UGGAAAGAUUUC5’ → UGGAAAGAUUUC 5’ACCUUUCUAAAG ACCUUUCUAAAG TrpLysAspPhe Kodon „táblázat” az mRNS tripletjeinek kódját rendeli az aminosavakhoz 86 Prokarióta riboszóma térszerkezete a riboszóma egy RNS-fehérje komplex: két alegység funkciója: kisalegység: köti az mRNS-t nagy alegység: katalitikus aktivitás, fehérje szintézis mérete: - prokarióta esetén 70S (30S és 50S), MW~ 2.6MDa, - eukarióta esetén 80S (40S és 60S), MW~ 4MDa, összetétele: RNS és 30-50 fehérje (L1,..L34) szintézis sebessége: 15-40 amidkötés/sec szintézis megbízhatósága: ~1 hiba/106 amidkötés memo: nem az L1,..L34 fehérjék hanem az RNS végzi a 30S 50S katalízist, ezért a riboszóma nem enzim hanem ribozim. S: (Svedberg egység) centrifugálás során a szedimentációs 87 sebesség Transzláció 1. lépés: (itt kezdődjön a transzláció) mindig az „AUG” mRNS triplet. 2. ide mindig az N-For-Met aminosav kerül 3. szintézis irány N-term.-től a C-term. Felé (N→C) 4. lánczáró kodonok az mRNS-en: UAA, UAG és UGA. („a mondat végi pontot jelölik”) 5. a szintézis legvégén a For-csoportot egy enzim lehidrolizálja . 88 Az amid szintézis mechanizmusát lásd később 89 90 A ribozim katalizálta peptidszintézis elemi kémiai lépései: az 50S alegység 2486 adeninje segíti a nukleofil addiciót : 1) Az adenin nemkötő elektronpárjának protonvonzása részlegesen deprotonálja az aminocsoportot, ezzel fokozva annak nukleofil jellegét. 2) A tertaéderes köztitermék elbomlását a proton visszaadása iniciálja, kialakítva így a peptidkötést. 91 (Science 289; 920-30, 2000) Transzláció lépéseinek áttekintése: - ciklusonként 3 db. GTP-t használ fel 92 Kérdés: mi a következő DNS templáthoz szekvenciához tartozó fehérje aminosav-sorrendje? DNS: 5’ – TGA TTC GTA TTG CTC GTG – 3’ DNS: 5’ – TGA TTC GTA TAG CTC GTG – 3’ mRNS:3’ – ACU AAG CAU AUC GAG CAC – 5’ Peptid: – Ser -Glu -Tyr - Leu - Glu - His – – S - E - Y - L - E - H – kérdés: helyes-e ez az átírás? DNS → mRNS 5’A…3’T → 5’U T… A → A G… C → C 3’C…5’G → 3’G memo1: Ügyeljünk tehát a bázissorrend irányultságára (5’→3’ ≠ 3’→5’) 93 memo2: minden enzim az 5’ oldal felől olvas! Az antibiotikumok egy jelentős hányada a riboszómához kötve fejti ki szelektív hatását: Az Erythromycin A kölcsönhat az 50S (nagy alegység) 2058-as adeninjével, s igy beül és blokkolja azt a csatornát amelyen keresztűl bújik ki a fehérje. Meggátolja tehát a bakteriális fehérje szintézisét és a baktérium elpusztúl. A Eukarióták riboszómájának 2058 nukleotidja nem A hanem G, s ehhez nem köt az antibiotikum, igy lesz szelektív a hatás A Clindamycin az amidkötés kialakítását gátolja meg a Nature 413, 814-821 (2001) ribószóma felületén erre a helyre kötődve 94 Nukleinsavak: 1) A kromoszóma és felépítése 2) DNS- RNS építőelemek: Nukleozidok, nukleotidok, nukleinsavak Nem-RNS és -DNS alkotó purinszármazékok A DNS térszerkezete, a bázispárok 3) DNS nanorendszerek 4) DNS (RNS) reaktivitása: hidrolízise az építőelemek kémiai szintézise kémiai (szilárdfázisú) szintézis enzimatikus szintézis: a replikáció 5) Transzkripció 6) Transzláció 7) DNS analitika: szekvenálás 8) Bioenergetika 95 7) DNS analitika: a szekvenálás cél egy DNS fragmens bázissorrendjének meghatározása: megoldás: A lánczáró festékkel jelölt didezoxynukleotid (ddNTP) vagy Sanger-féle módszer alapgondolata: a 3'-hidroxi-csoport hiánya megakadályozza a PCR-ezés Frederick során a lánc továbbépülését: lánctörést okoz. Sanger Chain Termination Method (Sanger, F., et al: PNAS, 1977, 74, 5463.) A szekvenálandó (templát) DNS 3’C-G-A-A-T-A-T-G-C-G-A-G-T-C-T-G-G-C-A-A-C-T5’ amelyre mint templátra PCR –rel komplementer szálakat fogunk előállítani, de szintézis során nem csak a szokásos ATP, GTP, CTP és TTP nukleotidokat használunk, hanem ddATP, ddGTP, ddCTP és ddTTP-t is. 96 templát DNS és alatta a különböző PCR termékek amelyek rendre a ddNTP-k beépülése miatt terminálódtak: 3’C-G-A-A-T-A-T-G-C-G-A-G-T-C-T-G-G-C-A-A-C-T5’ G-C-T-T-A-T-A-C-G-C-T-C-A-G-A G-C-T-T-A-T-A-C-G-C-T-C G-C-T-T-A-T-A-C-G-C-T-C-A-G-A-C-C-G-T agaróz gélen G-C-T (oszlopon) G-C-T-T-A megfuttatjuk, G-C-T-T-A-T-A-C amely méret G-C-T-T-A-T-A-C-G-C-T-C-A-G-A-C-C-G G-C szerint szeparál, G-C-T-T s az oszlop alján G-C-T-T-A-T-A-C-G-C az éppen G-C-T-T-A-T-A-C-G-C-T-C-A-G-A „kifolyó” G-C-T-T-A-T-A-C-G-C-T-C-A-G-A-C fragmenst színe G-C-T-T-A-T-A-C-G-C alapján stb. azonosítjuk minden lehetséges fragmenst előállítunk G-C-T-T-A-T-A-C-G-C-T-C-A-G-A-C-C-G-T-T-G-A bizonytalan szegmens 97 egy valódi szekvenálás végeredménye: 98 8) Bioenergetika Elektromágneses energia forrása hőerőgép és belsőégésű motor lehet, amelyekben a hőenergia égésből, azaz kémiai átalakulásból származik. Ezek rendre az atomok és molekulák elektronszerkezetéhez köthető átalakulások, azaz elektromágneses folyamatok. Az élőlények számára is kémiai folyamatok, azaz az elektromágneses kölcsönhatás biztosítja az energiatárolást és energiafelhasználást, tehát a biológiai energiák is elektromágneses eredetűek. memo: Az energiaformákat vissza lehet vezetni a fizika négy alapvető kölcsönhatásának valamelyikére. A négy alapvető kölcsönhatás 1) a gravitációs, 2) az elektromágneses, 3) a gyenge (β-bomlás (elektron, ill. pozitron emisszió), illetve az elektronbefogás) 4) az erős kölcsönhatás. 99 8) Bioenergetika ATP: adenozin -5’- trifoszfát foszforsavanhidrid foszfátészter DG~ –30.5 kJD molG~ -–145.6 kJ mol-1 ATP + H2O → ADP + Pi ΔG˚ = −30.5 kJ/mol (−7.3 kcal/mol) ATP + H2O → AMP + PPi ΔG˚ = −45.6 kJ/mol (−10.9 kcal/mol) 100 ATP is an unstable molecule in unbuffered water, which hydrolyses to ADP and phosphate. This is 8) Bioenergetika ATP és GTP mint energiahordozók: „elem” / „akkumulátor” (újrafeltölthető!) (ATP) felhasználás: (ATP) feltöltés: direkt módon: kapcsolt reakció direkt módon: A sejtben igényelt anyagok szintézisében szubsztrát szintű foszforiláció: az endoterm ill. endergonikus a metabolizmus (ételek, raktározott zsírsavak, reakciókhoz a kapcsolódó ATP/GTP egyéb anyagok lebontása) során az exoterm hidrolízis adja a megfelelő hajtóerőt a ill. exergonikus reakciókban történő reakció lefutásához. ADP/GDP foszforilációja. pl.a felhasználásra: indirekt módon: oxidatív foszforiláció - transzláció (fehérjeszintézis) a metabolizmus során redox-reakciókban - kreatin (energiaraktár az redukált koenzimek keletkeznek: + izomban) NADH és FADH2 - … Ezek a redukált koenzimek elektrontranszporttal egybekötött, szabályozott regenerálása (oxidációja) során keletkezik ATP. 101 Atkins & de Paula 99 8) Bioenergetika kérdés: mennyi glükóz elégetése teszi lehetővé hogy egy 30 g össztömegű madár számára, hogy 10 m magasra repüljön? tapasztalat: 1 mol szilárd glükóz x CO2 gázzá és y folyékony H2O való oxidációja 25 °C-on ~ 2828 kJ (2,8 MJ) szabadentalpia (DG) felszabadulást eredményez. válasz: az elvégezendő munka nagysága mgh= (30*10-3 kg)*(9,81*ms-2)*(10 m) = 2,943 kg m2s-2 = 2,943 J mivel 1 mol glükóz → DG ~ 2,828 106 J munka végzéséhez elegendő, 2,943 J munka elvégzéséhez 2,943 / 2,828 106 mol glükózra van szükség, ami 1,04 μmol cukrot jelent. -6 Mivel a glükóz MW-je ~180 g/mol ezért ez hozzávetőlegesen (180 g/mol * 1,04*10 mol) = 0,19 mg kérdés: a koncentráló emberi agy ~25 J energiát igényel másodpercenként. Mennyi cukor (glükóz) elégetése szükséges ehhez óránként? tapasztalat: 1 mol glükóz oxidációja 25 °C-on ~ 2828 kJ szabadentalpia (DG) felszabadulását eredményezi. válasz: az elvégezendő munka nagysága óránként = (25 Js-1)* (3,6*103s) = 90000 J = 90 kJ mivel 1 mol glükóz → DG ~ 2,828 10-3 kJ munka végzéséhez elegendő, 90 kJ munka elvégzéséhez 90 / 2,828 10-3 mol glükózra van szükség, ami 32 mmol glükózt jelent. -1 -3 Mivel a glükóz MW-je ~180g mol ezért ez hozzávetőlegesen (180 * 32*10 g ) = 5,7 g/óra Tehát az emberi agy naponta ~ 24 * 5,7g ~140g glükózt igényel. 102 A napi 140 – 160 g glükóz többsége ATP-vé alakul és így hasznosul a sejtekben. Aerob körülmények között 1 mol Glc (glükóz) mintegy 38 mol ATP eredményez. mivel Mw(ATP)/ Mw(glükóz) ≈ 507/180 = 2,82 ezért 2,82 * 38 * 160g ≈ 17,1 kg ATP Ténylegesen egy 70 kg-os ember napi ATP „fogyasztása” ~ 145 kg (nem csak szénhidrátot, de zsírt és fehérjét is fogyasztunk!) Ám a szervezetben egyszerre kb. 51 g össz ATP áll rendelkezésre, ami a teljes szükséglet (51 g /1,45 105 g) kb. 0,035% -a. Ez az tartalékolt ATP mennyiség tehát kb. (24* 3600s) * (3,5 10-4) ~ 30 s-ra elegendő mindössze! Tehát az ember ATP szükséglete ~ 100g / perc (aktív mozgás esetén 500g /perc) ADP/ATP ciklus (a foszforiltranszfer) A kémiai reakció: 4– 2– 2– -1 ATP (aq) + H2O → ADP (aq) +HPO4 (aq) DG~ –30 kJ mol A biokémiai rész ciklus: ½ O2 H2O 2– 2– 4– ADP + HPO4 ATP – DG 103 A teljes biokémiai ciklus: ”égetés” CO „C” +2H O 2 2 pl. D-Glc – DG + DG NADH + H+ NAD+ NAD+ (Nikotinamid-adenin-dinukleotid) FADH2 FAD – DG elektron-átvitel ½ O2 + DG H2O 2– 2– 4– ADP + HPO4 ATP foszfor-átvitel – DG memo: a félkövér résztvevők + („C”, NADH+H , FADH2, ATP) azok a nagyobb energiájú molekulák a megfelelő párokban. FAD (Flavin-adenin-dinukleotid) memo: A negatív DG-s reakciók Tűz, a levessel a hajtják a velük összekapcsolt levegőn keresztül „csatolódik” („csatolt”) pozitív DG-s (piros nyíl) reakciókat. Néhány fontosabb foszfátvegyület memo: foszfátcsoport(jai) hidrolízisének DG- értékei 37 oC-on: foszfoenol-piruvát DG~ –62 kJ mol-1 ATP → ADP DG~ –31 kJ mol-1 ADP → AMP DG~ –28 kJ mol-1 AMP DG~ –14 kJ mol-1 glükóz-1-foszfát DG~ –21 kJ mol-1 glükóz-6-foszfát DG~ –14 kJ mol-1 fruktóz-6-foszfát DG~ –16 kJ mol-1 kérdés: mit takar az „ATP DG~ –31 kJ mol-1” információ? A hidrolízis exergonikus DG< 0 és éppen 31 kJ mol-1 energiát „ad át” más vele csatolt - esetleg endergonikus - reakciók lefolytatásához. Ezért „becézzük” a megfelelő savanhidrid kötést gyakran „nagyenergiájú” kötésnek. memo: vegyük észre hogy DG sorozatban az ATP és ADP „középen” helyezkednek el, ezért lehet foszfát donor és akceptor is. 105 4– 2– 2– ATP (aq) + H2O → ADP (aq) +HPO4 (aq) tény: az ATP DG~ –31 kJ mol-1 valamint a DH~ –20 kJ mol-1 és DS~ +34 JK-1mol-1 TDS~ 310 K *34 JK-1mol-1~ +11 kJ mol-1 ) memo: mivel DG = DH – TDS memo: az 1 mol víz a hidrát burok része, mivel a reakció nem vákuumban megy (ezért „nem számít”). Tehát formálisan mólszám növekedés van (1-ből 2 mol lesz), s emiatt jár ez a reakció entrópia növekedéssel, avagy a komplexitás csökkenésével, amely egy további kedvező tény. A DG értéke (–31 kJ mol-1) ezért is ilyen kedvező. Az ATP hidrolízise felhasználható olyan csatolt endergonikus reakciókhoz, amelyek DG-je nem nagyobb mint +31 kJ mol-1 . pl. egy peptidkötés szintézise amely erősen endergonikus: DG~ +17 kJ mol-1 memo: az 1 mol víz a hidrát burok része lesz, mivel a reakció nem vákuumban megy. Innen a nagy entrópia csökkenés (2-ből 1-re), a komplexitás növekedés. DG ezért is ilyen kedvezőtlen. memo: nem csak az entalpiaváltozás, de a szintézis entrópia csökkenése (komplexitás növekedése) is jelentős! kérdés: hogy mehet végbe a reakció 37 oC-on? válasz: úgy hogy ATP csatolt ez a folyamat. memo: a csatolt rendszer értelmében a két reakció ATP hidrolíziseé és amidkötés kialakítása össze van kapcsolva! (Ha e két reakció elkülönítve (2 edényben) menne végbe, vagy ha csak úgy összeöntenénk a reagenseket, akkor a folyamat nem menne végbe.) Csatolást végzi a ribozim (riboszóma) megfigyelés: Itt nem részletezett okok miatt 1 peptidkötés kialakításához 3 ATP (v. GTP) szükséges. kérdés: hány gramm glükóz kell 1 mol hemoglobin bioszintéziséhez, ha az 153 aminosavból épül fel? válasz: 153*3 = 459 ATP szükséges. 1 mol glükóz 38 ATP eredményez, tehát 459/38~ 12 mol glükóz szükséges. tehát: (12*180 g)~ 2,2 kg cukor kell 1 mol (16,7 kDa) fehérje szintéziséhez (~16,7 kg) A vörösvértest szárazanyag-tartalmuk 90%-a hemoglobin 107 Érdekes nano-rendszerek How to safely store genetic material: cable reels in the cell nucleus... Legend: The nucleosome Nucleosomes are cable reels for genetic material. In the cell’s nucleus, the genetic material (DNA) is organized in different chromosomes and protectively packaged. In this storage packing, the DNA is wound around nucleosomes, just as a cable on a reel. Each nucleosome consists of four pairs of proteins called histones. Apart from their role as cable reels, nucleosomes are also involved in gene regulation as they prevent DNA from being read at wrong positions. 108 Érdekes nano-rendszerek I am not giving away the original data! A copy is good enough... Legend: RNA polymerase RNA polymerase is essential for each cell. This protein reads the genetic code from the genetic material in the cell nucleus and copies it onto so-called mRNA molecules. These copies are then shipped to the ribosomes where they serve as blueprints for proteins. Thus, the precious original always stays in the vault of the nucleus, and only copies are shipped. Because RNA polymerase is so important, its function is constantly monitored 109 and controlled by a multitude of other molecules. Érdekes nano-rendszerek DNA is long… where does a gene begin and how to find it? Legend: The TATA-box binding protein (TBP) in yellow The repetition of the amino acids threonine (T) and alanine (A) T-A-T-A marks the beginning of a gene. The TATA-box binding protein (TBP) recognizes this specific genetic start sequence and allows correct positioning of RNA polymerase. Without TBP, genes could not be copied to mRNA and would, hence, not be read out. If the tail of TBP is too long, it causes110 some of the most severe neurodegenerative diseases Replikáció Ismétlés Szemidiszkontinuus Azaz a DNS megkettőződése mindkét fonal mellett, ugyanabba az irányba történik Ez azt feltételezi, hogy a replikációs mechanizmus mind 5’->3’ , mind 3’->5’ irányban képes DNS-t szintetizálni De a DNS-polimeráz csak 5’->3’ irányban képes haladni, vagyis elsőként az 5’ helyen levő nukleotidot építi be, majd 3’ irányba folytatja a láncot Vezető szál: folyamatosan szintetizálódik Követő szál: szakaszosan szintetizálódik (Okazaki-fragmentumok) Itt a szintézis iránya ellentétes a replikációs villa mozgásának irányával A követő szál a villától távolodva szintetizálódhat 111 Transzkripció Ismétlés Iniciáció Az RNS polimeráz felismeri a DNS promoter szakaszát, hozzákötődve szétválaszt 12bp-nyi szakaszt, és megkezdi az RNS szál felépítését: ATP, UTP, GTP, CTP Elongáció Az RNS-polimeráz 5’->3’ irányban építi be a ribonuleotidokat, működése során a DNS-lánc mentén mozog Termináció A terminátor szakaszok lényegében lazítják a DNS és RNS közötti kapcsolatot memo: a folyamat aszimmetrikus: csak az egyik szál másolódik, a DNS két szála csak rövid ideig távolodik el egymástól 112 Transzláció Ismétlés Iniciáció Egy riboszóma, amelyik már befejezte egy másik mRNS transzlációját, alegységeire disszociál (IF-3) IF-3 kötődik 30S-hez és egy új RNS-hez IF-2 hozzákapcsolja 30S-hez az első aminoacil-tRNS-t Ehhez az iniciációs komplexhez kötődik GTP, majd 30S, ezután IF-3 leválik GTP -> GDP: IF-2 is leválik 113 Transzláció Ismétlés Elongáció A transzláció iránya = transzkripció iránya = 5’ -> 3’ Az aa-tRNS minőségét az mRNS második kodonja határozza meg, amely az üres A-helyen van (Katalizátor: EF-Tu, Energia: GTP A peptidil transzferáz az fMet-t a P-helyen levő tRNS-ről az A-helyen levő aa-tRNS-re kapcsolja, így egy dipeptid alakul ki az A hely tRNS-én A transzlokáció során az mRNS az A-helyre kapcsolódó peptidil-tRNS-sel együtt egy kodonnal továbblép balra (EF-G) A P-helyen levő dezacilált tRNS leválik a riboszómáról Az A-helyen levő dipeptidil-tRNS az A-helyre lép A következő kodon az A-helyre kerül 114 Transzláció Ismétlés Termináció RF-1 és RF-2 ismeri fel a STOP kodonokat RF-3-mal és GTP-vel leállítják a transzlációt 115