Novel Genetic and Molecular Regulation of HDL Metabolism
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Novel Genetic and Molecular Regulation of HDL Metabolism Iulia Iatan Department of Biochemistry McGill University Montreal, Canada August 2012 A thesis submitted to McGill University in partial fulfillment of the requirements of the degree of Doctor of Philosophy © Iulia Iatan, 2012 ABSTRACT Coronary artery disease (CAD) is the leading cause of mortality and morbidity worldwide. Low levels of high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) constitute a major independent risk factor for CAD, influenced by a combination of genetic and environmental factors. In this thesis, we aimed to advance our understanding of the genetic regulation of HDL-C, through the identification and characterization of novel candidate genes, and to delineate the molecular mechanisms underlying HDL biogenesis, in the hopes of better elucidating the complexities of HDL metabolism. First, we examined whether variation at the PCSK5 gene locus influences HDL-C levels. Through familial segregation analyses and two-stage genetic association studies in unrelated subjects of French Canadian descent and low HDL-C Finnish families (ntotal=883), we reported a region-wide significance of PCSK5 SNPs with HDL-C, suggesting that genetic variability at the PCSK5 locus regulates HDL-C levels, possibly through the inactivation of endothelial lipase. Second, to search for rare-low frequency variants responsible for low HDL-C, we used whole exome sequencing in a multigenerational French Canadian family (n=75) with HDL-C<5th age-sex specific percentile. Through this approach, we identified a complex combination of two non-synonymous variants, in the ATP-binding cassette transporter (ABCA1) and the lipoprotein lipase genes, predicted to be damaging and causing low HDL-C. These results emphasize the need for exome sequencing of complex lipid traits in unexplained familial cases. Third, we sought to characterize a novel genetic determinant involved in HDL-C regulation. Recent studies from our group identified the WW domain-containing oxidoreductase (WWOX) gene locus to be associated with low serum HDL-C levels in 9,798 subjects. In this study, we examined the role of WWOX in lipoprotein and HDL metabolism using a combination of in vivo functional studies, by means of total Wwox knock-out and Wwox liver-specific mouse models, gene microarray and next generation resequencing analyses in HDL- deficient French Canadian families. We demonstrated that the effects of WWOX i on lipoprotein metabolism involve multiple mechanisms, including cholesterol homeostasis, apoA-I and ABCA1-mediated pathways and fatty acid/triglyceride metabolism. Fourth, with novel insight into genetic regulations of HDL metabolism, we focused on elucidating the mechanistic basis of nascent HDL formation. Specifically, we investigated the lipidation of ApoA-I and its interaction with an ABCA1/phosphatidylcholine(PC)-rich microdomain, the high- capacity binding site (HCBS). Using sucrose gradient fractionation, we also demonstrated that the ABCA1/ HCBS partitions to nonraft domains, thus playing a pivotal role in the selective desorption of PC molecules by apoA-I, creating an optimal environment for nascent HDL formation and cholesterol release. In summary, this work has collectively advanced our understanding of the molecular and genetic basis of HDL metabolism. It has brought to light novel genes governing plasma HDL-C levels in humans, highlighting the need to use multiple integrative genetic approaches to identify causal common and rare variants conferring susceptibility to low HDL-C. These findings have also helped elucidate the mechanistic basis of the nascent HDL genesis pathway. Together, this thesis has combined genetic and biochemical strategies to provide a more comprehensive understanding of the complexities of the HDL metabolism and cellular cholesterol transport, which may lead to the characterization of novel therapeutic targets for CAD. ii RESUMÉ La maladie coronarienne athérosclérotique (MCAS) est la principale cause de mortalité et de morbidité à l’échelle mondiale. Un niveau bas des lipoprotéines de cholestérol de haute densité (HDL-C) représente un facteur de risque majeur pour la MCAS et est influencé par une combinaison des facteurs génétiques et environnementaux. Dans cette thèse, nous avons abordé la régulation génétique des HDL-C grâce à l'identification et la caractérisation de nouveaux gènes candidats, et de mécanismes moléculaires liés à la biogenèse des HDL, dans l'espoir de mieux élucider la complexité du métabolisme des HDL. En premier, nous avons examiné si la variation au niveau du locus du gène proprotéine convertase PCSK5 peut affecter les niveaux de HDL-C. Grâce aux analyses de ségrégation familiale et aux études d'association génétique dans une population canadienne-française et chez les familles finlandaises (nTotal=883) avec un niveau de HDL-C bas, nous avons constaté une large corrélation régionale entre les variations polymorphiques (SNPs) de PCSK5 et HDL-C. Ceci suggère que la variabilité génétique au niveau du locus PCSK5 réglemente le HDL-C, éventuellement par le biais de l'inactivation de la lipase endothéliale, une enzyme clé dans la modulation des niveaux plasmatiques de HDL-C. Deuxièmement, pour rechercher des variants de fréquence rare qui sont responsables d’un bas niveau de HDL-C, nous avons utilisé la technique du séquençage de l’exome dans une famille multi-générationnelle canadienne- française (n=75) avec un HDL-C<5e percentile spécifique (âge-sexe). Grâce à cette approche, nous avons identifié une combinaison complexe de deux variants non-synonymes dans le transporteur ABCA1 et dans le gène de la lipoprotéine lipase provoquant un taux faible de HDL-C. Ces résultats soulignent la nécessité du séquençage de l’exome des traits lipidiques complexes dans les cas familiaux inexpliqués. Troisièmement, nous avons caractérisé un nouveau gène impliqué dans la régulation du HDL-C. Nous avons examiné le rôle de WWOX dans le métabolisme du HDL en utilisant des études fonctionnelles in vivo avec des souris Wwox total knock-out (KO) et des souris Wwox KO spécifiques au foie, une iii technologie des puces à ADN et du reséquençage dans des familles canadiennes- françaises déficientes en HDL. Nous avons démontré que l'effet de WWOX sur le métabolisme des lipoprotéines implique plusieurs mécanismes, y compris l'homéostasie du cholestérol, les voies de régulation à travers l'ApoA-I et l'ABCA1 et le métabolisme d'acides gras/triglycérides. Quatrièmement, nous voulions élucider le mécanisme de formation du HDL naissant. Plus précisément, nous avons étudié la lipidation de l’ApoA-I et son interaction avec des sites constitués de microdomaines ABCA1/phosphatidylcholine (PtdC) que nous avons appelés « site de liaison de grande capacité (HCBS) ». En utilisant un gradient de densité de sucrose, nous avons observé que l’ABCA1 et le HCBS sont localisés dans des domaines membranaires solubles aux détergents et que l’ApoA-I désorbe sélectivement la PtdC de ces domaines ainsi créant un environnement optimal pour la formation des molécules naissantes de HDL et la libération de cholestérol. Collectivement, ce travail a élargi notre compréhension des sciences moléculaires et génétiques du métabolisme du HDL. Il a mis en lumière de nouveaux gènes impliqués dans la régulation des niveaux de HDL-C, soulignant la nécessité d'utiliser plusieurs approches intégratives génétiques pour identifier les causes des variants communs et rares conférant une susceptibilité à un faible taux de HDL-C. Ces résultats ont également contribué à élucider le mécanisme de biogenèse du HDL naissant. Ainsi, cette thèse a combiné des stratégies génétiques et biochimiques pour fournir une meilleure compréhension de la complexité du métabolisme des HDL et du transport du cholestérol cellulaire, qui pourrait ainsi conduire à l'élaboration des nouvelles cibles thérapeutiques pour la MCAS. iv TABLE OF CONTENTS ABSTRACT ....................................................................................................................... I RESUMÉ ........................................................................................................................ III TABLE OF CONTENTS................................................................................................. V LIST OF TABLES AND FIGURES .............................................................................. IX LIST OF ABBREVIATIONS ...................................................................................... XII CONTRIBUTIONS OF AUTHORS .......................................................................... XIV ORIGINAL CONTRIBUTION TO KNOWLEDGE ............................................ XVIII ACKNOWLEDGEMENTS.......................................................................................... XX CHAPTER 1. GENERAL INTRODUCTION ............................................................... 1 1.1 CARDIOVASCULAR DISEASE...................................................................................... 2 1.1.1 Cardiovascular disease worldwide and in Canada ........................................... 2 1.1.2 Pathophysiology of Atherosclerosis .................................................................. 2 1.1.3 Risk factors associated with CVD ..................................................................... 5 1.1.4 Epidemiology of HDL ........................................................................................ 5 1.2 OVERVIEW OF LIPOPROTEIN METABOLISM ..............................................................