Thesis
Investigation phytochimique de plantes alpines
MUNARI, Caroline
Abstract
As a part of our ongoing investigations of alpine plants from the Valley of Aoste (Italy), the methanol and dichloromethane extracts of 45 plants have been studied from a phytochemical view point. These species grow at altitudes from 2200 to 2700 meters in extreme habitat. Thus, 100 extracts were investigated for their free radical scavenging activity against DPPH and antifungal activities with different tests: against the plant pathogenic fungus Cladosporium cucumerinum by direct bioautography, the commensal yeast Candida albicans by bioautography « agar overlay » and Pyrenophora teres by mycelial growth tests in artificial media. Some extracts showed significant activities and were studied by measuring the inhibition of the fractions against the growth of the pathogenic fungi. About twenty compounds have been isolated and the structures of these compounds were determined by means of spectrometric methods, including 1D and 2D NMR experiments and MS analysis.
Reference
MUNARI, Caroline. Investigation phytochimique de plantes alpines. Thèse de doctorat : Univ. Genève, 2006, no. Sc. 3785
URN : urn:nbn:ch:unige-33548 DOI : 10.13097/archive-ouverte/unige:3354
Available at: http://archive-ouverte.unige.ch/unige:3354
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1 / 1 UNIVERSITÉ DE GENÈVE FACULTÉ DES SCIENCES Section des Sciences Pharmaceutiques Directeur de thèse Laboratoire de Pharmacognosie et de Phytochimie Prof. Kurt Hostettmann
Investigation phytochimique de plantes alpines: Etude d’espèces du genre Oxytropis (Fabaceae) et isolement de composés antifongiques et antiradicalaires à partir d’Oxytropis fetida (Vill.) DC., Potentilla grandiflora L. (Rosaceae) et Vaccinium uliginosum ssp. microphyllum (Lange) Tolm. (Ericaceae).
THÈSE
présentée à la Faculté des sciences de l’Université de Genève pour obtenir le grade de Docteur ès sciences, mention sciences pharmaceutiques
par Caroline MUNARI de Mosogno (TI)
Thèse N°
Genève Atelier de reproduction de la Section de physique 2006
REMERCIEMENTS
Ce travail de thèse a été réalisé entre l’Institut de Pharmacognosie et Phytochimie de l’Université de Lausanne (Mars 2002 - Septembre 2004) et le Laboratoire de Pharmacognosie et Phytochimie de l’Université de Genève (Septembre 2004 – Septembre 2006), sous la direction du Professeur Kurt Hostettmann. Je tiens tout d’abord à remercier chaleureusement mon directeur de thèse, Monsieur le Professeur Kurt Hostettmann, pour m’avoir accueilli au sein de son institut et permis de faire mon travail de thèse dans l’environnement stimulant d’un groupe de recherche de renommée mondiale. J’ai ainsi eu l’occasion de présenter quelques uns de mes résultats scientifiques lors de différents congrès internationaux tels qu’à Barcelone (Espagne), Florence (Italie) ou encore Funchal (Madère) et ces expériences m’ont tout particulièrement marqué. Je suis également reconnaissante de la confiance qu’il m’a accordée dans mes tâches d’assistanat, dans l’organisation d’un congrès international à Leysin, ainsi qu’en me nommant responsable informatique de son institut durant de nombreuses années. Mes remerciements vont aussi aux autres membres de mon jury de thèse : Madame la Docteur Anne-Emmanuelle Haye-de-Bettignies – de l’Université de Genève, Monsieur le Professeur Pascal Richomme – de l’Université d’Angers et Monsieur le Docteur Bertrand Ducrey – de Debio Recherche Pharmaceutique S.A. J’ai beaucoup apprécié notre interaction lors de mon examen de thèse, ainsi que les corrections pertinentes et fouillées de mon manuscrit. Ma profonde reconnaissance va à Monsieur le Docteur David Guilet, Maître de Conférences à l’Université de Lyon, pour m’avoir guidé et soutenu lors des 12 premiers mois de ma thèse, qui ont été pour moi les plus décisifs. un superviseur technique très compétent, disponible, et un ami. Un très grand merci à M. Anchisi pour la récolte et l’identification de toutes les plantes alpines de ce travail et dont les compétences botaniques m’ont été d’un grand secours. Pendant ces quelques quatre années de thèse, j’ai eu beaucoup de plaisir à me consacrer aux diverses tâches d’enseignement qui m’étaient confiées. Je remercie chaleureusement les étudiants que j’ai suivis lors de divers travaux pratiques, ainsi que mes collègues assistants des autres instituts. Je remercie tout particulièrement Carolina Amman et Julie Golleret pour leur contribution à ma thèse dans le cadre de leurs travaux de Diplôme. Je remercie également tous mes collègues passés et présents du Laboratoire de Pharmacognosie et Phytochimie pour tous les bons moments passés ensemble : A Karine, Jean-Luc, André, Jean-Robert, Philippe et Emerson pour leurs conseils expérimentés et leurs expertises scientifiques.
i A Martine, ma deuxième maman (!), pour sa bonne humeur, sa pertinence scientifique et humaine, nos fou rires informatiques et pour son soutien de tous les instants. A Manouche pour sa joie de vivre, son dynamisme, son franc-parler et surtout pour son immense et précieuse aide lors de ma rédaction. A Fred pour ses incroyables connaissances scientifiques, informatiques et culturels, son très stimulant esprit de contradiction (!), son calme et notre complicité. A Julie pour sa contribution à ma thèse dans le cadre de son travail de Diplôme, sa vitalité, nos délires nocturnes et surtout sa couverture (!). A Anne-Laure pour ces dix années inoubliables de « Pharma » passé ensemble et pour son amitié indéfectible. A Catherine pour notre cohabitation mouvementée (!) dans notre bureau de Lausanne, sa motivation sportive et sa vision enrichissante de la vie. Aux « Anciens » Boris, Alain, Julien, Anne-Laure, Milena, Patrice, Johanne, Jonathan pour votre accueil et vos encouragements et aux « petits Nouveaux » Daphnée, Sandra, Claudia, Sylvian, Elia, Gaëtan, Aline, Aurélie pour la bonne ambiance au bureau et tous les bons souvenirs. Merci aussi à tous les autres que j’ai côtoyés et qui ont su rendre agréable la réalisation de cette thèse. Finalement, un grand merci à mes parents et mon frère Philippe – qui m’ont soutenu à toutes les étapes de ma vie.
ii
COMMUNICATIONS SCIENTIFIQUES
Ce travail de thèse a été réalisé de mars 2002 à juillet 2006 à l’Institut de Pharmacognosie et Phytochimie (IPP) de l’Université de Lausanne (mars 2002 à septembre 2004) et au Laboratoire de Pharmacognosie et Phytochimie (LPP) de l’Université de Genève (septembre 2004 à juillet 2006), sous la direction de Monsieur le Professeur Kurt Hostettmann. Certains aspects de la présente recherche ont été partiellement publiés ou présentés lors de congrès internationaux sous forme de posters.
Publications C. Munari, D. Guilet, C. Ammann, and K. Hostettmann. An antifungal and radical scavenger acylphloroglucinol from Potentilla grandiflora. (En préparation).
C. Munari, D. Guilet, A.-E. Hay, and K. Hostettmann. Antifungal and antioxidant compounds from the roots of Oxytropis fetida (Vill.) DC. (Fabaceae). (En préparation).
Posters C. Munari, D. Guilet and K. Hostettmann (2004). Isolation and on-line identification of active compounds of Oxytropis spp. and Astragalus frigidus A. Gray. 15th International Symposium on Pharmaceutical and Biomedical Analysis (PBA), Florence, Italy, May 2-6, 2004.
C. Munari, D. Guilet, E.-F. Queiroz, C. Amman and K. Hostettmann (2005). Isolation of antifungal compounds of alpine plants. Phytotherapy: The role of an ancient tradition in modern times, Madeira, Portugal, November 1-5, 2005.
C. Munari, D. Guilet, E.-F. Queiroz, C. Amman and K. Hostettmann (2006). Isolation of antifungal compounds of alpine plants. 4th International congress on natural products: Natural products: a chance for the future of mankind, Leysin, Switzerland, May 28-31, 2006.
iii TABLE DES MATIÈRES
REMERCIEMENTS...... I COMMUNICATIONS SCIENTIFIQUES ...... III TABLE DES MATIÈRES...... IV ABRÉVIATIONS, SYMBOLES ET CONVENTIONS ...... VIII
1. BUTS DU TRAVAIL...... 1
2. INTRODUCTION...... 5
2.1 LES ALPES, CLIMAT ET VÉGÉTATION...... 7 2.1.1 Historique et situation des Alpes ...... 7 2.1.2 Adaptation au climat et à l’altitude des plantes alpines...... 8 2.1.2.1 Pression atmosphérique...... 9 2.1.2.2 Température...... 9 2.1.2.3 Rayonnement solaire ...... 9 2.1.2.4 Précipitation et humidité ...... 10 2.1.2.5 Conditions d’enneigement...... 10 2.1.2.6 Vent...... 10 2.1.2.7 Adaptation des plantes alpines...... 11 2.1.3 Végétation et étage de végétation dans la chaîne alpine...... 11 2.1.4 Intérêts des plantes alpines ...... 12 2.2 MALADIES FONGIQUES HUMAINES ET VÉGÉTALES ET LEURS TRAITEMENTS ...... 15 2.2.1 Introduction...... 15 2.2.2 Maladies fongiques humaines...... 16 2.2.3 Traitement des mycoses au jour d’aujourd’hui...... 17 2.2.4 Maladies fongiques des végétaux ...... 19 2.2.5 Traitement des cultures au jour d’aujourd’hui...... 20 2.2.6 Organismes étudiés...... 21 2.2.6.1 Candida albicans...... 22 2.2.6.2 Cladosporium cucumerinum ...... 22 2.2.6.3 Pyrenophora teres ...... 22 2.3 LA FAMILLE DES FABACEAE...... 24 2.3.1 Introduction...... 24 2.3.2 Classification systématique et aspects botaniques...... 24 2.3.3 Intérêts économiques et médicaux de la sous-famille des Faboideae...... 26 2.3.4 Présentation du genre Oxytropis ...... 28 2.3.5 Toxicité du genre Oxytropis ...... 29 2.3.6 Travaux scientifiques antérieurs sur le genre Oxytropis...... 30 2.3.6.1 Alcaloïdes et autres métabolites azotés naturels...... 30 2.3.6.2 Flavonoïdes...... 34 2.3.6.3 Triterpènes et stéroïdes...... 35 2.3.7 Utilisations médicinales et traditionnelles des Oxytropis ...... 38 2.3.8 Présentation des différentes espèces d’Oxytropis sélectionnées...... 38 2.3.8.1 Oxytropis fetida (Vill.) DC...... 39 2.3.8.2 Oxytropis campestris (L.) DC...... 40 2.3.8.3 Oxytropis jacquinii Bunge...... 41 2.3.8.4 Oxytropis helvetica Scheele ...... 42 2.4 LA FAMILLE DES ROSACEAE...... 44 2.4.1 Introduction...... 44 2.4.2 Classification systématique et aspects botaniques...... 44 2.4.3 Intérêts économiques et médicaux...... 46
iv
2.4.4 Présentation du genre Potentilla ...... 49 2.4.5 Travaux scientifiques antérieurs sur le genre Potentilla...... 49 2.4.5.1 Tanins...... 50 2.4.5.2 Flavonoïdes...... 51 2.4.5.3 Triterpènes et stéroïdes...... 51 2.4.5.4 Coumarines...... 53 2.4.5.5 Polyprénols ...... 54 2.4.5.6 Ionones...... 54 2.4.6 Utilisations médicinales et traditionnelles des Potentilla ...... 55 2.4.7 Présentation de Potentilla grandiflora L...... 57 2.5 LA FAMILLE DES ERICACEAE...... 58 2.5.1 Introduction...... 58 2.5.2 Classification systématique et aspects botaniques...... 58 2.5.3 Intérêts économiques et médicaux...... 60 2.5.4 Présentation du genre Vaccinium...... 61 2.5.5 Travaux scientifiques antérieurs sur le genre Vaccinium...... 62 2.5.5.1 Anthocyanosides...... 63 2.5.5.2 Flavonoïdes...... 63 2.5.5.3 Tanins...... 63 2.5.5.4 Terpènes et stéroïdes ...... 64 2.5.5.5 Acides phénols et phénols simples...... 65 2.5.5.6 Travaux scientifiques antérieurs sur l’espèce Vaccinium uliginosum ssp. microphyllum (Lange) Tolm...... 67 2.5.6 Utilisations médicinales et traditionnelles des Vaccinium...... 68 2.5.7 Présentation de Vaccinium uliginosum ssp. microphyllum (Lange) Tolm...... 69
3. RÉSULTATS...... 71
3.1 RECOLTE DES PLANTES ALPINES ET PREPARATION DES EXTRAITS BRUTS ...... 73 3.2 CRIBLAGES BIOLOGIQUE ET BIOCHIMIQUE DES PLANTES ALPINES ...... 76 3.2.1 Introduction...... 76 3.2.2 Résultats et discussion ...... 76 3.3 FRACTIONNEMENT BIOGUIDE DE L’EXTRAIT DICHLOROMETHANIQUE DES RACINES D’OXYTROPIS FETIDA (VILL.) DC...... 82 3.3.1 Analyse LC/DAD-UV préliminaire...... 82 3.3.2 Fractionnement bioguidé de l’extrait dichlorométhanique des racines...... 84 3.3.2.1 Activités de l’extrait ...... 84 3.3.2.2 Fractionnement et isolement des composés A à J ...... 85 3.3.3 Déterminations structurales des composés A à J ...... 88 3.3.3.1 Composés A, B et H ...... 88 3.3.3.2 Composé H ...... 89 3.3.3.3 Composé B...... 91 3.3.3.4 Composé A ...... 93 3 .3.3.5 Composé G ...... 94 3.3.3.6 Composé I...... 99 3.3.3.7 Composé F...... 100 3.3.3.8 Composé J...... 102 3.3.3.9 Composés C, D et E...... 104 3.3.3.10 Composé C...... 107 3.3.3.11 Composé D ...... 109 3.3.3.12 Composé E...... 111 3.3.4 Considérations phytochimiques...... 112 3.4 FRACTIONNEMENT BIOGUIDE DE L’EXTRAIT METHANOLIQUE DES RACINES D’OXYTROPIS FETIDA (VILL.) DC...... 115 3.4.1 Analyse LC/DAD-UV préliminaire...... 115 3.4.2 Fractionnement bioguidé de l’extrait méthanolique des racines...... 118 3.4.2.1 Activités de l’extrait ...... 118
v 3.4.2.2 Fractionnement et isolement des composés K à R ...... 118 3.4.3 Déterminations structurales des composés K à R ...... 121 3.4.3.1 Etudes préliminaires des composés K à R ...... 121 3.4.3.2 Composé P...... 123 3.4.3.3 Composé Q ...... 128 3.4.3.4 Composés M, L, K et O...... 130 3.4.3.5 Composés N et R ...... 131 3.4.4 Considérations phytochimiques...... 132 3.5 OXYTROPIS FETIDA (VILL.) DC. : BIOSYNTHESE, ACTIVITES BIOLOGIQUES ET BIOCHIMIQUES...... 134 3.5.1 De la biosynthèse des isoflavonoïdes ...... 134 3.5.2 Activités biologique et biochimique des composés A à R...... 137 3.5.2.1 Activité antifongique contre C. cucumerinum des composés isolés...... 137 3.5.2.5 Activité antiradicalaire sur le DPPH des composés isolés ...... 140 3.6 ETUDE D’ESPECES DU GENRE OXYTROPIS : O. CAMPESTRIS (L.) DC., O. HELVETICA SCHEELE, O. JACQUINII BUNGE ET O. FETIDA (VILL.) DC...... 142 3.6.1 Comparaison des différents extraits d’O. fetida (Vill.) DC...... 142 3.6.2 Analyses LC/UV/ESI-MSn de quatre espèces du genre Oxytropis...... 145 3.7 FRACTIONNEMENT BIOGUIDE DE L’EXTRAIT DICHLOROMETHANIQUE DE POTENTILLA GRANDIFLORA L...... 146 3.7.1 Analyses LC/DAD-UV et LC/UV/APCI-MSn préliminaires ...... 146 3.7.2 Fractionnement bioguidé de l’extrait dichlorométhanique ...... 151 3.7.2.1 Activités de l’extrait ...... 151 3.7.2.2 Fractionnement et isolement des composés A à D ...... 151 3.7.3 Détermination de structure des composés A et B ...... 154 3.7.3.1 Composé A ...... 154 3.7.3.2 Composé B...... 159 3.7.4 Activités biologique et biochimique des composés ...... 164 3.7.4.1 Activités biologique et biochimique du composé A...... 164 3.7.5 Discussion...... 165 3.8 FRACTIONNEMENT BIOGUIDE DE L’EXTRAIT METHANOLIQUE DES FEUILLES DE VACCINIUM ULIGINOSUM SSP. MICROPHYLLUM (LANGE) TOLM...... 166 3.8.1 Analyse LC/DAD-UV préliminaire...... 166 3.8.2 Fractionnement de l’extrait méthanolique des feuilles ...... 168 3.8.2.1 Activités de l’extrait ...... 168 3.8.2.2 Fractionnement et isolement des composés...... 169 3.8.3 Considérations phytochimiques...... 172
4. CONCLUSIONS ...... 174
5. PARTIE EXPERIMENTALE ...... 180
5.1 MATERIEL VEGETAL ET EXTRACTION ...... 182 5.2 TECHNIQUES DE SEPARATION ANALYTIQUE...... 185 5.2.1 Chromatographie sur couche mince (CCM) ...... 185 5.2.2 Chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrophotométrie ultraviolet/visible (HPLC/DAD-UV)...... 185 5.2.3 Chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse (HPLC/UV/MS)...... 186 5.3 TECHNIQUES DE SEPARATIONS PREPARATIVES ...... 188 5.3.1 Chromatographie de partage centrifuge (CPC)...... 188 5.3.2 Chromatographie liquide à moyenne pression (MPLC) ...... 188 5.3.3 Chromatographie liquide semi-préparative à haute pression...... 189 5.4 METHODES PHYSICO-CHIMIQUES ...... 190
vi
5.4.1 Polarimétrie ([α]D)...... 190 5.4.2 Spectrophotométrie UV/Visible...... 190 5.4.3 Spectrométrie de masse (MS) ...... 190 5.4.4 Spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN) ...... 191 5.5 METHODES CHIMIQUE ET BIOCHIMIQUE DE CRIBLAGE ...... 193 5.5.1 Réactifs de révélation chimique sur CCM...... 193 5.5.2 Mise en évidence de l’activité antiradicalaire sur le DPPH...... 193 5.5.3 Mise en évidence de l’activité inhibitrice de l’acétylcholinestérase...... 194 5.6 METHODES BIOLOGIQUES DE CRIBLAGE ...... 196 5.6.1 Mise en évidence de l’activité antifongique sur Cladosporium cucumerinum par bioautographie directe ...... 196 5.6.2 Mise en évidence de l’activité antifongique sur Pyrenophora teres par test de croissance du mycélium sur milieu artificiel...... 196 5.6.3 Mise en évidence de l’activité antifongique sur Candida albicans par bioautographie « agar overlay » ...... 196 5.7 CONSTANTES PHYSIQUES ET DONNEES SPECTRALES DES COMPOSES ISOLES...... 198 5.7.1 Composés isolés de l’extrait dichlorométhanique des racines d’Oxytropis fetida (Vill.) DC...... 198 5.7.2 Composés isolés de l’extrait méthanolique des racines d’Oxytropis fetida (Vill.) DC...... 211 5.7.3 Composés isolés de l’extrait dichlorométhanique de Potentilla grandiflora L...... 222
6. RÉFÉRENCES...... 226
7. RÉSUMÉ...... 244
8. ABSTRACT...... 248
vii ABRÉVIATIONS, SYMBOLES ET CONVENTIONS
[α]D Pouvoir rotatoire à la longueur d’onde de la raie D du sodium (589,3 nm) δ Déplacement chimique ε Coefficient d’extinction molaire A, B, C,… Désignation des composés naturels isolés dans le présent travail APCI Ionisation chimique à pression atmosphérique (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) CCM Chromatographie sur Couche Mince
CHCl3 Chloroforme
CHCl3-d1 Chloroforme Deutérié
CH2Cl2 Dichlorométhane
CH2Cl2-d2 Dichlorométhane diDeutérié d Doublet Da Dalton (unité de masse moléculaire) DAD Détecteur à barrettes de diodes (Diode Array Detector) DCM DiChloroMéthane dd Double Doublet DEPT Distorsionless Enhancement by Polarization Transfer
DMSO-d6 DiMéthylSulfOxyde hexaDeutérié DPPH Radical 1,1-DiPhényl-2-PicrylHydrazyle EI Ionisation par impact électronique (Electron Impact ionization) ESI Ionisation par électrospray (ElectroSpray Ionization) EtOH Ethanol gDQF-COSY Double Quantum Filtered COrrelation SpectroscopY gHMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence gHSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence HPLC Chromatographie liquide à haute performance (High Performance LC) HR Haute Résolution (High Resolution) i.d. Diamètre interne int. rel. Intensité relative IT Analyseur à piège d’ions (Ion Trap analyzer) J Constante de couplage LC Chromatographie liquide (Liquid Chromatography) m Multiplet MeCN Acétonitrile MeOH Méthanol
viii
MeOH-d4 Méthanol tétraDeutérié Mp Point de fusion (Melting Point) MPLC Chromatographie liquide à moyenne pression (Medium Pressure LC)
Mr Poids moléculaire (Molecular weight) MS Spectrométrie de masse (Mass Spectrometry) MSn Spectrométrie de masse tandem à plusieurs étapes (multiple stage tandem MS) m/z Rapport entre la masse et le nombre de charges élémentaires d’ions RMN Spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy) NOESY Nuclear Overhauser Enhancement SpectroscopY ppm Unité de δ (Parties Par Million, Parts per Million = 10-6)
Rf Facteur de rétention (Retention Factor)
Rt Temps de rétention (Retention Time) RP Phase inverse (Reversed Phase) s Singulet sh. Epaulement (shoulder) spp. Plusieurs espèces du même genre botanique t Triplet THF TétraHydroFuranne TMS TétraMéthylSilane UV Spectrophotométrie/rayonnement dans le domaine de l’Ultra-Violet
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1. BUTS DU TRAVAIL
1. BUTS DU TRAVAIL
Depuis quelques années, la chimie combinatoire suivie d’un criblage à haut débit, est considérée comme la solution à l’obtention de nouveaux composés de tête (« Lead compound »). Néanmoins cette approche débouche de moins en moins sur la découverte de nouvelles molécules actives et un certain retour en arrière est en train d’être observé. Ainsi, l’utilisation des produits naturels comme sources de nouvelles structures actives, combinée à des techniques de synthèse combinatoire, plutôt que comme entité finale du médicament (« natural product mimic ») est à nouveau d’actualité [Newman et al., 2003]. Les métabolites secondaires issus de produits naturels végétaux, animaux ou encore de mycètes apparaissent alors à nouveau comme une source inexhaustible de nouveaux médicaments potentiels.
Actuellement, au cœur de la recherche de nouvelles substances à activité pharmacologique, deux problématiques sont toujours d’actualité : les maladies infectieuses et le stress oxydatif. Dans le cadre des diverses maladies infectieuses, une forte augmentation durant la dernière décennie de la prévalence des infections fongiques systémiques et topiques a été constatée. Les facteurs principaux de cette augmentation incluent entre autres, l’utilisation intensive d’antifongiques à large spectre d’où l’apparition de résistance, l’augmentation du nombre de personnes immunodéprimées (SIDA, thérapies immunosuppressives), le vieillissement de la population, ou encore l’utilisation de méthodes invasives [Vicente et al., 2003]. Un intérêt grandissant concerne également le stress oxydatif en biologie et en médecine et s’explique par les mises en évidence de son implication dans de très nombreux mécanismes pathologiques, notamment ceux dus au vieillissement, tels que l’athérosclérose, le cancer, les maladies auto-immunes ou encore les maladie de Parkinson et d’Alzheimer [Salvi, 1998; Salvi et al., 2002].
C’est dans ce cadre qu’une investigation de diverses plantes alpines a été entreprise ici. L’intérêt des plantes alpines pour la médecine et pour la recherche de nouvelles molécules actives s’explique par leur environnement naturel singulier qui leur confère des caractéristiques très particulières. Elles sont, en effet, exposées à des conditions climatiques extrêmes qui ne se trouvent nulle part ailleurs. Différents paramètres obligent ainsi les plantes à développer des mécanismes de protection efficaces, contre à la fois les attaques par les micro-organismes, les champignons et les insectes, mais aussi contre un stress oxydatif important en haute altitude. Des espèces hautement réactives, source de composés potentiellement actifs, sont ainsi synthétisées par la plante pour sa survie et sa lutte contre ses prédateurs. Elles peuvent donc être la source de nouveaux composés intéressants et actifs.
3 1. BUTS DU TRAVAIL
Dans ce travail, une sélection de 45 plantes alpines de diverses familles a été récoltée. Toutes les plantes ont été cueillies en août 2001 dans les Alpes centrales dans les étages suprasubalpin et alpin à des altitudes allant de 2200 à 2700 mètres. Elles ont ensuite été soumises à un criblage comprenant un test antiradicalaire sur le DPPH et plusieurs tests antifongiques, tels que la mise en évidence de l’activité sur Candida albicans par bioautographie « agar overlay », sur Cladosporium cucumerinum par bioautographie directe ou encore sur Pyrenophora teres par test de croissance du mycélium sur milieu artificiel.
Quatre extraits de plantes alpines ont ainsi été sélectionnés pour un fractionnement bioguidé selon leurs potentialités antifongique et antiradicalaire. Un genre a particulièrement retenu notre attention, pour l’uniformité de son activité antifongique. En effet, tous les extraits apolaires des espèces du genre Oxytropis se sont révélés plus ou moins actifs, alors que deux extraits polaires de ce même genre ont montré une activité significative. De plus l’extrait dichlorométhanique des racines d’Oxytropis fetida (Vill.) DC. est le seul extrait apolaire montrant une bonne activité antiradicalaire. Les extraits méthanolique et dichlorométhanique d’Oxytropis fetida (Vill.) DC. ont donc été choisis pour une étude phytochimique plus approfondie, tandis que les autres extraits de ce genre ont été analysés par LC/DAD-UV et LC/UV/ESI-MSn. L’extrait dichlorométhanique de Potentilla grandiflora L. et l’extrait méthanolique des feuilles de Vaccinium uliginosum ssp. microphyllum (Lange) Tolm. ont quant à eux fait également l’objet d’un fractionnement bioguidé selon leur activité antifongique.
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2. INTRODUCTION
2. INTRODUCTION
2.1 Les Alpes, climat et végétation
2.1.1 Historique et situation des Alpes Les Alpes sont une chaîne de montagnes relativement jeunes d’environ 40 millions d’années et situées à l’ouest de l’Europe. Elles recouvrent la frontière nord de l'Italie, le sud-est de la France, la Suisse, le Liechtenstein, l'Autriche, le sud de l'Allemagne et la Slovénie centrale (Figure II-1).
Figure II-1 : Les Alpes vue depuis l’espace (NASA, 2002).
Les Alpes peuvent être subdivisées en trois parties :
les Alpes occidentales (de la Méditerranée au Mont-Blanc) les Alpes centrales (du Val-d’Aoste au Brenner) les Alpes orientales (du Brenner à la Slovénie)
Parmi les grands systèmes montagneux d’Europe, c’est la chaîne la plus puissante en longueur, largeur et altitude moyenne. En effet, l’arc alpin mesure 1’200 kilomètres de long et s’étend sur environ 200’000 km2. De nombreux massifs culminent à plus de 4’000 mètres ; le sommet du Mont-Blanc, sur la frontière franco-italienne, en est le point culminant à 4 808 mètres. Comme nous pouvons le voir sur la figure II-2, la largeur maximale de la chaîne est de 250 kilomètres au centre des Alpes orientales (au niveau du Tyrol et des Dolomites) et sa largeur la plus faible, 140 kilomètres environ, se situe dans les alpes nord-occidentales [Ozenda, 1985; Landolt et Aeschimann, 2005].
7 2. INTRODUCTION
Figure II-2 : Situation, dimensions et limites des Alpes d’après Landolt (2005).
En Europe, les grandes glaciations de l’ère quaternaire ont recouvert complètement les Alpes d’une énorme calotte glacière. Durant 100’000 années, ces glaciations successives ont modelé un paysage montagneux bien particulier, caractérisé par de profondes vallées longitudinales et par l’existence, à la périphérie de la chaîne, de grands lacs tels que les lacs Léman, de Constance, de Chiem, Majeur, de Lugano, de Côme, d’Isée et de Garde [Ozenda, 1985; Landolt et Aeschimann, 2005].
2.1.2 Adaptation au climat et à l’altitude des plantes alpines Les Alpes sont principalement situées dans la zone némorale de l’Europe, au climat tempéré et aux forêts caducifoliées. Dans cette zone, le climat des Alpes est subocéanique (hivers relativement doux et courts, étés modérément chauds et plutôt humides). Seul le sud-ouest des Alpes montre déjà une nette influence méditerranéenne. Le climat de la chaîne alpine est la résultante de deux groupes de composantes [Ozenda, 1985] :
les caractères généraux du climat de montagne, liés à l’altitude (augmentation de l’insolation, diminution des températures, accroissement des précipitations et de la couverture nivale) ou au modelé topographique (influence de l’exposition). les caractères propres aux Alpes, liés à la complexité de la chaîne et notamment à son épaisseur, à sa situation en limite de plusieurs grandes provinces climatiques, aux modifications qu’elle crée elle-même dans les climats généraux de l’Europe centro-méridionale.
Les différences de climat ont une influence profonde sur la végétation. La diversité et les caractéristiques de la végétation alpine ne peuvent être saisies que grâce à une certaine
8 2. INTRODUCTION
connaissance des facteurs climatiques. Les plus importants sont brièvement présentés ici [Ozenda, 1985; Landolt et Aeschimann, 2005].
2.1.2.1 Pression atmosphérique La pression atmosphérique décroît avec l’altitude suivant une loi exponentielle. Elle n’exerce qu’une action indirecte sur les plantes, dans la mesure où l’air des altitudes supérieures contient moins de vapeur d’eau et de gaz carbonique pour un volume donné. Ainsi, la plante se déshydrate plus rapidement en ouvrant ses stomates. D’autre part, de manière à assimiler autant de gaz carbonique pour une synthèse équivalente de sucre, la plante doit ouvrir ses stomates plus longtemps. Ainsi, son bilan hydrique en cas de sécheresse peut devenir précaire.
2.1.2.2 Température La température de l’air diminue de la moyenne annuelle de 0.55 °C pour une augmentation de 100 mètres d’altitude. Cette valeur est une moyenne et est étonnamment valable pour les régions les plus diverses. Etant donné que de nombreux processus vitaux sont dépendants de la température, ce facteur joue un rôle déterminant dans la vie des plantes. En général, la vitesse des processus vitaux (donc aussi la croissance) augmente proportionnellement à la température (jusqu’à une limite propre à chaque plante). C’est pourquoi la croissance des plantes d’altitude est en général moins intensive que celle des plantes de plaine. De plus, en montagne, l’intense rayonnement terrestre nocturne entraîne un risque de gel pour les plantes proches de la surface du sol, durant presque toute l’année. Ainsi, les plantes doivent être résistantes au gel, même pendant la période de croissance.
2.1.2.3 Rayonnement solaire A nébulosité égale, la luminosité augmente avec l’altitude. En effet, le rayonnement solaire est plus élevé du fait que celui-ci a traversé une épaisseur d’atmosphère plus faible qu’en plaine. La composition spectrale de la lumière se modifie aussi avec l’altitude croissante. En haute montagne, elle est plus riche en rayons de faible longueur d’onde et notamment en ultraviolet. La forte intensité lumineuse favorise l’assimilation chez les plantes et permet l’élaboration de sucre en quantité suffisante, malgré les basses températures. Mais la plante doit pouvoir se protéger face à une trop forte intensité de rayonnement ultraviolet, grâce à des pigments rouges, un duvet de poils ou une cuticule épaisse. L’intense rayonnement solaire permet de compenser en partie la faible température de l’air (cf. 2.1.2.2) et ceci principalement sur les versants exposés au sud. C’est pourquoi la végétation y prospère à des altitudes plus élevées que sur les versants orientés au nord.
9 2. INTRODUCTION
2.1.2.4 Précipitation et humidité Les précipitations annuelles augmentent avec l’altitude et la proximité des Alpes. Un refroidissement de l’air humide provoque des précipitations (sous forme de pluie, neige ou grêle). Lorsque l’air arrive à proximité des montagnes, il s’élève et par conséquent se refroidit. C’est la raison pour laquelle les précipitations sont plus abondantes au voisinage des Alpes qu’en plaine. Les Alpes internes sont donc aussi plus sèches que les chaînes externes, mais ceci s’égalise avec l’altitude ; de ce fait, pour les plantes des étages alpin et subnival (au-dessus des forêts), les différences de précipitations ne jouent presque plus aucun rôle. Par contre, l’humidité de l’air diminue en moyenne avec l’altitude. En raison de cet air plus sec, les plantes perdent davantage d’eau par transpiration en montagne qu’en plaine. Il en résulte un danger accru de dessèchement, car l’eau trop fraîche du sol ne peut être mise à disposition suffisamment vite pour compenser les pertes.
2.1.2.5 Conditions d’enneigement Les plantes à fleurs ne peuvent prospérer qu’aux endroits dépourvus de neige pendant au moins deux mois par an ; sous la neige, la température et l’intensité lumineuse sont en effet trop faibles pour assurer une croissance continue. Dans les Alpes, la durée d’enneigement augmente avec l’altitude (environ 10 jours pour 100 mètres) et la limite climatique des neiges (limite à laquelle la neige fond, en été, sur les plans horizontaux) est située entre 2400 et 3200 mètres selon que l’on se trouve dans les Alpes septentrionales, internes ou méridionales. La couche de neige est néanmoins un isolant thermique et nécessaire car en dessous de celle-ci, le sol n’est jamais vraiment gelé. De plus, la couche hivernale de neige est un réservoir d’eau important (surtout pendant la période végétative), qui maintient le sol humide jusque dans ses profondeurs. Une épaisse couche de neige protège donc les plantes à la fois contre le froid et le dessèchement. En période hivernale et de grand froid, la neige est utile afin que les pousses aériennes de beaucoup de plantes ne soient pas détruites, alors qu’il est essentiel d’avoir une assez longue période sans couverture nivale le reste de l’année.
2.1.2.6 Vent Le vent peut exercer sur les plantes des effets variés, parfois très néfastes. La vitesse moyenne des vents augmente avec l’altitude. Près du sol, la vitesse du vent est considérablement ralentie par le frottement. L’action des vents violents se fait dès lors, surtout sentir sur les sommets isolés et les crêtes. Dans les Alpes, les végétaux qui croissent dans les lieux exposés doivent être bien enracinés et résistants aux dommages mécaniques ; ils doivent en outre posséder une protection efficace contre l’évapotranspiration, celle-ci étant augmentée par l’effet du vent.
10 2. INTRODUCTION
Tous ces paramètres sont considérés dans un cadre très théorique, mais il faut aussi bien entendu prendre en considération que les Alpes sont des montagnes de formes quelconques, faisant partie d’un système ou d’une chaîne complexe. Des facteurs tels que l’exposition, le modelé des pentes, les microclimats ou encore les faits bioclimatiques propre à la chaîne alpine (au moins cinq divisions climatiques peuvent être distinguées) doivent être pris en compte [Ozenda, 1985; Landolt et Aeschimann, 2005].
2.1.2.7 Adaptation des plantes alpines Les conditions extrêmes abordées précédemment provoquent un certain nombre d’adaptations chez les plantes, telles que [Ozenda, 1985; Landolt et Aeschimann, 2005] :
Le nanisme qui permet une meilleure utilisation de la chaleur du sol et offre une protection contre les vents desséchants et l’évapotranspiration. D’autre part, en hiver, les plantes basses sont beaucoup mieux protégées par la couche de neige. De plus, la forte intensité lumineuse et les basses températures nocturnes freinent leur croissance. Un système radiculaire important et des organes souterrains bien développés qui leur permettent d’absorber de plus grandes quantités d’eau et de substances nutritives tirées du sol, ainsi qu’une meilleure assise. Une longue durée de vie pouvant atteindre plusieurs dizaines d’années Diverses stratégies contre l’évapotranspiration, telles que les stomates sur la face inférieure, de petites feuilles larges et coriaces, souvent enroulées ou succulentes, une pilosité dense ou encore un revêtement cireux. Une courte période de végétation et des stratégies de pollinisation élaborées.
2.1.3 Végétation et étage de végétation dans la chaîne alpine. La végétation est l’ensemble des plantes qui croissent à un endroit déterminé. L’aspect et la composition de la végétation dépendent en grande partie des conditions extérieures de vie (climat, sol, concurrence) et de la situation géographique. La végétation peut être divisée selon des coupures altitudinales, déterminées essentiellement par le gradient de température, qui sont dites « étage de végétation » [Ozenda, 1985; Landolt et Aeschimann, 2005]. Dans la chaîne alpine, la végétation est divisée en cinq étages principaux, de bas en haut :
L’étage collinéen : au pied des montagnes L’étage montagnard : correspondant à la partie centrale L’étage subalpin : transition entre les forêts et les étage à pelouses L’étage alpin : correspondant aux pelouses L’étage nival : correspondant aux neiges éternelles
11 2. INTRODUCTION
Les limites des étages ne sont pas tranchées, car de larges zones intermédiaires et une imbrication intime des diverses formations végétales les estompent. La figure II-3 présente les principaux étages de végétations ainsi que certaines sous-divisions caractéristiques des Alpes helvétiques.
Figure II-3 : Etages de végétation dans les Alpes helvétiques d’après Landolt (2005). 1 : étage collinéen (étage du chêne et du hêtre). 1a : variante septentrionale à chênes pédonculé et sessile (Quercus robur, Q. petraea), ainsi que beaucoup de hêtre (Fagus sylvatica). 1b : variante interne à chêne pubescent (Quercus pubescens), mais sans hêtre. 1c : variante méridionale à chêne pubescent et hêtre. 2 : étage montagnard, à hêtre (Fagus sylvatica) et sapin blanc (Abies alba) 3 : étage subalpin, à épicéa (Picea abies). 3a : variante interne avec l’apparition du pin sylvestre 4 : étage montagnard continental, à pin sylvestre (Pinus sylvestris) 5 : étage suprasubalpin, à arolle (Pinus cembra) 6 : étage alpin (étage des pelouses) 7 : étage subnival (étage des plantes en coussinets) 8 : étage nival (étage des neiges éternelles, sans plantes à fleurs, sauf en certains emplacements favorables)
2.1.4 Intérêts des plantes alpines L’intérêt des plantes alpines pour la médecine et pour la recherche de nouvelles molécules actives s’explique par leur environnement naturel singulier qui leur confère des caractéristiques très particulières. Comme nous avons pu le voir précédemment, les plantes des Alpes sont exposées à des conditions climatiques extrêmes qui ne se trouvent nulle part ailleurs [Baltisberger, 1997].
12 2. INTRODUCTION
Un facteur qui retiendra plus particulièrement notre attention est le rayonnement solaire, celui- ci est nettement plus intense et donc potentiellement nocif en haute altitude. En effet, il favorise la formation d’espèces réactives, appelées radicaux libres, hautement toxiques pour les constituants cellulaires tels que les lipides, les protéines, les sucres ou l’ADN. L’ensemble de ces dégâts est regroupé sous le terme de stress oxydatif. L’intérêt grandissant concernant le stress oxydatif en biologie et en médecine s’explique par les mises en évidence de son implication dans des mécanismes pathologiques, notamment ceux dus au vieillissement, tels que l’athérosclérose, le cancer, les maladies auto-immunes ou encore la maladie de Parkinson ou d’Alzheimer [Salvi, 1998; Salvi et al., 2002]. En altitude, pour se protéger du rayonnement solaire, les plantes synthétisent des substances de défense aux propriétés antioxydantes et antiradicalaires [Hostettmann, 2001]. Ces molécules sont alors une cible pour la recherche pharmaceutique, car elles sont susceptibles de neutraliser les radicaux libres, d’inhiber l’oxydation des Low Density Lipoproteins (LDL) ou lipoprotéines de basse densité in vitro ou encore démontrent des propriétés antiagrégantes, hépatoprotectrices ou chimiopréventives [Salvi, 1998].
Divers autres facteurs, tels que la température de l’air, du sol, les conditions d’enneigement ou encore le rayonnement terrestre nocturne impliquent une période de végétation nettement raccourcie des plantes alpines par rapport à celles de plaine. Ces différents paramètres obligent les plantes à développer des mécanismes de protection efficaces contre les attaques par les micro-organismes, les champignons et les insectes, non seulement pour pouvoir se reproduire en un minimum de temps lors de la belle saison, mais aussi pour optimiser leur croissance dans le court temps qui leur est imparti [Baltisberger, 1997]. Des espèces réactives hautement toxiques sont ainsi synthétisées par la plante pour sa lutte contre ses prédateurs. Comme nous allons le voir dans le point 2.2 : Maladies fongiques humaines et végétales et leurs traitements, les substances antifongiques sont actuellement une cible de recherche très importante. La prévalence des infections fongiques systémiques et topiques ayant très significativement augmenté durant la dernière décennie.
Les plantes alpines synthétisent des molécules qui ont un rôle précis comme les pigments ou des substances de défense contre les stress oxydatif, les insectes ou les champignons pouvant présenter un rôle médical certain. Malheureusement, bon nombre de ces plantes alpines sont aujourd’hui protégées et l’on se trouve souvent confronté aux difficultés de les cultiver dans un environnement qui ne leur est pas propre pour pouvoir les récolter et les étudier [Künzle, 1947].
13 2. INTRODUCTION
Dans ce travail, une sélection de 45 plantes alpines de diverses familles a été récoltée. Toutes les plantes ont été cueillies par Monsieur Egidio Anchisi, Jardin Alpin de Champex (Suisse), en août 2001 dans les Alpes centrales :
dans la région autour du col du Petit-Saint-Bernard (Savoie, France) dans la région autour du col du Petit-Saint-Bernard (val d’Aoste, Italie) dans le vallon de l’Urtier (val d’Aoste, Italie) dans la région du col du Bard (val d’Aoste, Italie)
Ces différentes plantes alpines ont été spécialement récoltées dans les étages suprasubalpin et alpin à des altitudes allant de 2200 à 2700 mètres.
14 2. INTRODUCTION
2.2 Maladies fongiques humaines et végétales et leurs traitements
2.2.1 Introduction Jusqu’aux années 70, les infections fongiques étaient considérées comme largement curables et la demande de nouveaux traitements était relativement faible [Vicente et al., 2003]. Actuellement, dans de nombreux domaines, tels que la médecine, l’agro-alimentaire ou encore l’agriculture, le besoin de nouvelles molécules, de préférence avec de nouveaux modes d’action, se fait sentir. Alors que les phytopathogènes sont responsables d’une diminution de 20 % du rendement mondial des cultures de céréales, et que les gouvernements doivent faire face à la croissance exponentielle de la population, l’augmentation des rendements devient essentielle [Hadacek et Greger, 2000]. De plus, la prévalence des infections fongiques systémiques et topiques a très significativement augmenté durant la dernière décennie. Les facteurs principaux de cette dramatique augmentation, incluent entre autre, l’utilisation intensive d’antibiotiques à large spectre, l’augmentation du nombre de personnes immunodéprimées, le vieillissement de la population, ou encore l’utilisation de méthodes invasives telles que les voies veineuses [Vicente et al., 2003].
Depuis quelques années, la chimie combinatoire de molécules simples (« drugs like »), est considérée comme la solution à l’obtention de très grandes librairies de composés nécessaires aux criblages basés sur les cibles moléculaires. Néanmoins, et contre toute attente, la découverte de nouvelles entités chimiques ne cesse de diminuer depuis quelques années ; 2001, par exemple, a été une des années au plus bas rendement depuis 20 ans. Très récemment, un certain retour en arrière a pu s’observer. Ainsi, l’utilisation des produits naturels comme sources de nouvelles structures actives, combinée à des techniques de synthèse combinatoire, plutôt que comme entité finale du médicament (« natural product mimic ») est à nouveau d’actualité [Newman et al., 2003]. Les métabolites secondaires apparaissent alors à nouveau comme une source inexhaustible de nouveaux composés tels que de nouveaux antimicrobiens, antiviraux, anticancéreux, ou encore agents pour l’agriculture [Vicente et al., 2003]. Ceci est particulièrement évident dans le domaine des maladies infectieuses et de l’oncologie, où respectivement plus de 60 et 70 % des médicaments sont d’origine naturelle [Newman et al., 2003]. Encore récemment, cela concernait peu le cas des antifongiques, mais pour la première fois depuis les années 70, deux produits naturels modifiés ont été enregistrés en 2001 (Cancidas®) et 2002 (Fungard®) pour la thérapie antifongique. Ils sont les premiers d’un type nouveau, dérivés des échinocandine/pneumocandine (inhibiteurs du glucane), depuis les années
15 2. INTRODUCTION
80, alors que tous les autres antifongiques étaient des azoles ou des inhibiteurs de la squalène époxidase du type terbinafine [Newman et al., 2003].
2.2.2 Maladies fongiques humaines La grande majorité des 100'000 espèces de champignons actuellement connues sont des saprophytes strictes, vivant de matières organiques en décomposition. Seulement une cinquantaine d’espèces sont pathogènes pour l’homme et provoquent pour la plupart, des maladies superficielles de la peau ou des muqueuses [Agrios, 1988]. Les maladies fongiques chez l’homme peuvent être classées en trois catégories [Barrett, 2002] :
les réactions allergiques aux protéines fongiques les intolérances aux toxines de certains champignons les infections ou mycoses
Les deux premières pathologies impliquant principalement des mécanismes immunologiques, nous nous intéresserons uniquement à la dernière catégorie, qui va des infections superficielles (dermatomycoses) aux mycoses systémiques potentiellement mortelles [Vicente et al., 2003].
Les mycoses topiques ou superficielles des cheveux, de la peau, des muqueuses et des ongles sont une source majeure de morbidité à travers le monde. Il a été estimé que ces infections étaient responsables de 5 % des nouvelles consultations chez les dermatologues dans les climats tempérés, alors que dans les climats tropicaux, ce pourcentage atteint 20 %. Les infections fongiques touchant des individus sains, en particulier des enfants du tiers monde, souffrant de conditions sanitaires déficientes, sont en constante augmentation [Rai et Mares, 2003]. Les organismes responsables étant majoritairement des dermatophytes ou des levures, principalement du genre Candida (candidoses cutanéo-muqueuses par ex. buccales ou génitales). Les infections fongiques systémiques restent des affections graves et sont de plus en plus fréquentes. Les principaux pathogènes responsables étant Candida spp., Cryptococcus neoformans (méningites, broncho-pneumonies), Aspergillus spp., Pneumocystis carinii (pneumonies) et Histoplasma capsulatum (pneumonies, infections opportunistes) [Vicente et al., 2003]. A côté de l’apparition de mycoses d’importation dues à la multiplication des voyages, la cause principale de cette croissance réside très probablement dans l’augmentation considérable des facteurs de risque et plus particulièrement du nombre de patients sévèrement immunodéprimés. Cette immunodépression peut être d’origine constitutive (déficits immunitaires), mais surtout acquise (infection par le HIV) ou iatrogène et associée aux progrès de la médecine (traitement
16 2. INTRODUCTION
anti-rejets). D’autres facteurs prédisposant peuvent encore être pris en compte tels que la thérapie antibactérienne, le traumatisme cutané, le diabète, la grossesse, la chimiothérapie. Ainsi, des services hospitaliers de spécialités très diverses doivent faire face à un nouveau risque infectieux majeur. En effet, les dermatomycoses peu virulentes, tout comme les mycoses systémiques, peuvent être mortelles chez les immunodéprimés, les prématurés, les cancéreux sous chimiothérapie, les transplantés ou les grands brûlés [Garraffo, 2003; Rai et Mares, 2003].
2.2.3 Traitement des mycoses au jour d’aujourd’hui Bien qu’en apparence une grande quantité de médicaments pour le traitement des mycoses superficielles et systémiques soient disponibles sur le marché, seuls peu d’entre eux sont des antifongiques réellement efficaces. De nombreux traitements ont des effets secondaires ou sont réellement toxiques (amphotéricine B), sont fongistatiques et non fongicides (azoles), ou sont responsables d’induire le développement de résistances (5-fluorocytosine). Les résistances aux médicaments sur le marché sont en croissante augmentation, et ceci malgré l’avènement de thérapies combinées. Il existe ainsi une réelle demande pour une nouvelle génération d’agents antifongiques plus sûrs et plus efficaces [Rai et Mares, 2003].
OH OH O OH
HO O OH OH OH OH O CO2H
O O OH NH OH 2
Figure II-4 : Amphotéricine B (1)
Le tableau II-1 résume les principaux types de composés utilisés en thérapeutique au jour d’aujourd’hui ainsi que leurs champs et modes d’action.
Depuis 2003, de nouvelles formulations lipidiques d’amphotéricine B, diminuant ses effets secondaires et plus particulièrement sa néphrotoxicité , ainsi qu’un certain nombre de triazoles de deuxième génération plus performants sont actuellement sur le marché (Vfend® : voriconazole, posaconazole et ravuconazole : en cours d’accréditation) [Barrett, 2002].
17 2. INTRODUCTION
Tableau II-1 : Principaux médicaments antifongiques utilisés actuellement [Rai et Mares, 2003].
Antifongiques Type de composés Type d’infection Mode d’action Amphotéricine B Polyènes Aspergilloses Complexe avec l’ergostérol Blastomycoses dans la membrane plasmique Candidoses fongique Cryptococcoses 5-Fluorocytosine Dérivé fluoré de la Candidoses Inhibition de la synthèse de pyrimidine Traitements combinés l’ADN et l’ARN Terbinafine Allylamines Dermatomycoses Inhibition de la biosynthèse Naftifine Mycoses des muqueuses de l’ergostérol par blocage de la squalène époxidase Ketoconazole Imidazoles Blastomycoses Inhibition de la biosynthèse Miconazole Coccidioïdomycoses de l’ergostérol par blocage Itraconazole Triazoles Histoplasmoses de la 14-deméthylation du Fluconazole Paracoccidioïdomycoses lanostérol
De même, de nouveaux antifongiques, les inhibiteurs de synthèse des glucanes (Cancidas® : acétate de caspofungine, Fungard® : sodium de micafungine), ont des caractéristiques permettant d’espérer une efficacité contre certains germes résistants.
HO OH O HO O NH NH O(CH2)4CH3
N N O H2N O O HN OH O
HO NH O O N HO NH
OH OH O
NaO3SO
HO
Figure II-5 : Sodium de micafungine (2)
Ces dérivés des échinocandines/pneumocandines sont les premiers inhibiteurs du glucane sur le marché, alors que la structure de base des échinocandines a été pour la première fois reportée en 1974 [Newman et al., 2003]. Les pneumocandines sont des produits naturels dérivés de la fermentation de Glarea lozoyensis [Vicente et al., 2003]
De nouvelles stratégies sont en cours d’exploration, notamment les associations d’antifongiques et l’adjonction de traitements immunostimulants (cytokines) [Granier, 2003]. Bien que ces
18 2. INTRODUCTION
diverses voies ouvrent des perspectives intéressantes, elles ne résolvent pas tous les problèmes. Il est donc impératif de trouver de nouveaux composés ayant des mécanismes d’actions originaux et sélectifs, une activité fongicide plutôt que fongistatique, un large spectre d’action et un minimum d’induction de résistance [Rai et Mares, 2003].
2.2.4 Maladies fongiques des végétaux Dans les pays industrialisés, les pertes induites par les phytopathogènes entraînent des pertes économiques pour les agriculteurs, l’augmentation des prix de vente, ou encore la destruction des plantes ornementales. Certaines populations du tiers monde vivent de leurs cultures et les pertes dues aux attaques fongiques ou à d’autres phytopathogènes peuvent avoir des conséquences dramatiques telles que la malnutrition, la famine, la migration ou décimer les cheptels. La destruction des ressources alimentaires est à l’origine de graves désastres depuis des siècles et est malheureusement aujourd’hui toujours d’actualité [Agrios, 1988].
De nombreuses espèces de champignons vivent dans le sol. La plupart sont uniquement saprophytes, mais un certain nombre peut se développer aux dépens de plantes vivantes et sont alors à l’origine de graves affections. Plus de 8000 espèces de champignons peuvent ainsi provoquer des maladies fongiques chez les plantes [Agrios, 1988]. L'interaction entre les mycètes pathogènes et leurs plantes hôtes est extrêmement complexe et devrait être regardée des deux points de vue. Les facteurs biologiques importants à prendre en considération chez le mycète pathogène sont entre autres : la façon dont il se reproduit et la nécessité pour sa survie d’un hôte intermédiaire ou d’un hivernage. D'autres facteurs importants incluent les moyens par lesquels le mycète atteint la plante, tels que le vent, les insectes vecteurs comme des coléoptères, ou encore des conditions de stockage inadéquates. De la perspective de la plante hôte, sa physiologie et son métabolisme doivent être pris en compte. Les effets de l'environnement physique influant sur la croissance, le développement, ou les processus biochimiques, sont également des facteurs importants.
Certains champignons sont des parasites primaires à pouvoir pathogène élevé, d’autres sont des parasites secondaires qui ne peuvent s’installer que sur des plantes affaiblies ou blessées. La colonisation des tissus des plantes par ces parasites peut se limiter aux racines ou au collet dont les parenchymes sont alors partiellement ou complètement détruits par pourriture ou nécrose. Ceci provoquant des arrêts de développement, des dépérissements, des flétrissements ou la mort des plantes. Cette mort peut être rapide lorsque l’attaque a lieu au stade de plantule. Une catégorie particulière de parasites primaires très destructeurs est constituée par les champignons responsables de maladies vasculaires. Pénétrant par une racine, ils se développent dans les
19 2. INTRODUCTION
vaisseaux par l’intermédiaire desquels ils colonisent la plante de façon interne, provoquant généralement sa mort [Bailly et al., 1980].
2.2.5 Traitement des cultures au jour d’aujourd’hui L’infinie variété et la complexité des nombreuses maladies fongiques végétales ont induit le développement d’un grand nombre d’approches pour leur contrôle. Les caractéristiques particulières du cycle de vie de chaque champignon, ses préférences d’habitats et ses performances selon certaines conditions environnementales, sont quelques uns des points les plus importants à considérer lors du contrôle d’une attaque fongique. Bien que, dans certains cas les maladies puissent être traitées par un seul type de moyens, en général une combinaison de mesures doit être entreprise pour un contrôle complet de l’infection. Les mesures les plus courantes incluent : l’utilisation de graines ou de plantules non infectées, la destruction des plantes infectées, la rotation des cultures, l’utilisation de variétés de plantes résistantes, etc. La méthode la plus efficace et parfois la seule disponible est l’application de produits chimiques sur les plantes, leurs semences ou sur les sols de cultures [Agrios, 1988].
L’application de produits chimiques a connu une grande avancée au cours de ce dernier siècle, depuis l’utilisation des premiers antifongiques inorganiques jusqu’aux QoI, ou « Quinone outside Inhibitors », qui représentent le développement le plus important réalisé par l'industrie chimique en termes de protection fongique. Le tableau II-2 résume l’introduction des différents types de fongicides aux cours de ces 100 dernières années, ainsi que l’apparition de traitements de plus en plus sûrs et puissants [Russell, 2005].
Tableau II-2 : Principaux antifongiques depuis le 19ème siècle et relation entre la diminution des dosages et l’augmentation de la sûreté [Russell, 2005].
Antifongiques Année Dosage usuel Oral LD50 mg d’introduction Kg a.i. / ha a.i. / kg (mammifères) Sulfures 19ème siècle 10-20 400-500 Sulfates de cuivre 19ème siècle 10-20 472 Chlorures mercurique 1891 Traitement des semences 1-5 Dithiocarbamates 1940-1969 1.5-3.5 > 8’000 Phthalimides 1950-1969 < 2.0 > 5’000 > 22’000 Chlorothalonil 1964 0.75-1.25 > 10’000 Méthyl benzimidazole Années 60 0.25-1.00 > 15’000 carbamates (MBC) Dicarboximides Années 70 0.750 3500-10’000 Inhibiteurs de la Années 70 0.125-0.250 568 >6’200 déméthylation (DMI) Strobilurines Années 90 0.125-0.250 > 5’000
20 2. INTRODUCTION
Actuellement, trois grandes classes de fongicides sont très populaires. Les azoles, rentrés dans la classe des inhibiteurs de la déméthylation (DMI), sont toujours très utilisés et de nouvelles molécules sont régulièrement mises sur le marché. La dernière en date (2002) est le prothioconazole. Malheureusement, cette classe de composés induit de jour en jour d’avantage de résistance. L’introduction de morpholines (par exemple : fenpropidine), d’inhibiteurs de la biosynthèse des stérols dépourvus d’induction de résistance utilisés conjointement aux DMI, résout partiellement le problème [Russell, 2005].
(H3C)3C
N
(3)
N
N NH O
Cl OH S MeO OMe
O N CF3
Cl
(4) (5)
Figure II-6 : Exemple de fongicides actuellement utilisés Fenpropidine (3), Prothioconazole (4), Picoxystrobine (5)
Les QoI sont des fongicides qui agissent comme inhibiteurs du site d'oxydation du coenzyme Q situé sur la face externe du cytochrome b. Les QoI résultent de la fusion de trois familles de fongicides, les strobilurines et deux nouvelles familles représentées par la fenamidone et la famoxadone. Les strobilurines dérivent d’un fongicide naturel : l’acide β-méthoxy-acrilique. Elles possèdent des actions prophylactiques, systémiques, éradiquantes et sont actives contre une grande majorité de champignons pathogènes. En 2000, le picoxystrobine a été commercialisé [Russell, 2005].
2.2.6 Organismes étudiés Dans ce travail, les différents extraits de plantes alpines sélectionnés ont été soumis à un criblage comprenant plusieurs tests antifongiques : mise en évidence de l’activité sur Candida albicans par bioautographie « agar overlay », sur Cladosporium cucumerinum par bioautographie directe et sur Pyrenofora teres par test de croissance du mycélium sur milieu artificiel. Les deux premiers tests sont effectués en routine au Laboratoire de Pharmacognosie et de Phytochimie de l’Université de Genève. Bien que d’autres techniques existent, il s’agit de méthodes de choix dans la recherche de nouveaux composés antifongiques provenant de
21 2. INTRODUCTION
plantes, de part leur simplicité et leur rapidité [Hostettmann et Marston, 1994]. L’essai sur Pyrenophora teres a été réalisé en collaboration avec le Syngenta ® Jealott's Hill International Research Center, le choix s’étant porté sur cet organisme suite à un criblage général des extraits effectué par leurs soins.
2.2.6.1 Candida albicans Candida albicans, l’espèce la plus importante du genre, est une levure faisant partie de la flore commensale gastro-intestinale, buccale et vaginale de l’être humain. Ce champignon microscopique unicellulaire peut cependant devenir pathogène chez les personnes qui possèdent des mécanismes de défense naturels déficients. Comme vu précédemment, différents facteurs peuvent induire cette immunodéficience et de nos jours, l’infection la plus grave et potentiellement mortelle est probablement la candidose systémique apparaissant chez les patients atteints du HIV. De même que pour la plupart des mycoses, cliniquement, on distingue les infections superficielles cutanées et muco-cutanées (muguet, candidose vaginale) et les infections profondes locales [Reynolds, 1996]. Actuellement, les candidoses représentent 8 à 9 % de la totalité des infections nosocomiales, ce qui place ce genre au quatrième rang des germes pathogènes responsables de ce type d’infection [Olson et al., 2005].
2.2.6.2 Cladosporium cucumerinum La moisissure Cladosporium cucumerinum est un champignon microscopique phytopathogène s’attaquant particulièrement aux membres de la famille des Cucurbitaceae. Alors qu’il existe d’autres espèces phytopathogènes proches (p. ex. : C. fulvum pour la tomate, C. herbarum), le genre Cladosporium est aussi impliqué dans des pathologies humaines comme des allergies respiratoires, des infections cutanées ou du système nerveux central (C. cladosporioides, C. bantianum) [Salaki et al., 1984; Elgart, 1996; Cruz et al., 1997].
2.2.6.3 Pyrenophora teres La levure Pyrenophora teres Drechs., téléomorphe ou forme sexuée de Drechslera teres Shoem. (anamorphe ou forme asexuée) est un champignon unicellulaire phytopathogène [Scott, 1991]. Les spores de P. teres sont habituellement propagées par le vent, puis la nutrition et la croissance de cet organisme parasite sur la plante hôte, induit la nécrose, la sénescence et la mort de cette dernière. Il existe deux « formes » de Pyrenophora teres, qui diffèrent selon les symptômes observés : P. teres f. teres, produisant des nécroses brunes en raies et P. teres f. maculata Smedeg, produisant des lésions circulaires ou elliptique. Dans de nombreux pays, les dommages causés par cette levure impliquent de sérieuses conséquences économiques. En effet, elle provoque dans les
22 2. INTRODUCTION
climat humides et tempérés l’helminthosporiose ou rayure réticulée de l’orge (Hordeum spp., Poaceae) et induit de sérieuses diminutions de rendement des cultures [Weiergang et al., 2002]. L’orge, en 2004 selon la banque de donnée FAOSTAT, occupait la quatrième plus importante surface de culture de céréales dans le monde, la pertinence du choix de cet organisme est alors mieux comprise.
23 2. INTRODUCTION
2.3 La famille des Fabaceae
2.3.1 Introduction Les Fabaceae constituent la troisième famille des angiospermes de par le nombre de ses représentants. Elles ont une distribution quasi cosmopolite et se trouvent dans les zones tropicales, subtropicales ou tempérées (Figure II-7). Cette famille s’accommode d’une très large gamme d’habitats, et inclue autant des plantes herbacées, aquatiques ou xérophytes, que des arbustes, des arbres ou des plantes grimpantes à lianes volubiles ou à vrilles. Les Fabaceae sont souvent caractérisées par un métabolisme azoté élevé et des acides aminés inhabituels. Elles présentent souvent des nodosités traduisant une symbiose avec la bactérie fixatrice d'azote Rhizobium, c'est particulièrement le cas chez les Faboideae Elles comptent 600 à 700 genres et plus de 18’000 espèces différentes [Heywood, 1996; Judd et al., 2002; Spichiger et al., 2004].
Figure II-7 : Carte de répartition géographique des Fabaceae d’après Heywood (1996).
2.3.2 Classification systématique et aspects botaniques Le monophylétisme des Fabaceae est attesté par de nombreux caractères morphologiques et par les données de la séquence rbcl. Trois sous-groupes sont généralement reconnus à l’intérieur des Fabaceae : les Caesalpinioideae, les Mimosoideae et les Faboideae (= Papilionoideae). Les Faboideae sont cosmopolites, alors que les Mimosoideae et les Caesalpinioideae sont plutôt tropicales. Dans la plupart des classifications, ces groupes sont considérés comme des sous- familles, mais ils sont parfois traités en familles indépendantes, comme par exemple dans la classification de Cronquist. Le concept « Leguminosae » est lui utilisé soit à un niveau familial (chez Engler), soit à un niveau ordinal (chez Cronquist). Bien que le terme Fabaceae soit actuellement préféré dans la nouvelle classification systématique de l’Angiosperm Phylogeny Group (APG), le terme Leguminosae est encore couramment utilisé par certaines catégories de scientifiques (spécialistes des légumineuses). Ces deux termes sont considérés comme des
24 2. INTRODUCTION
synonymes par l’International Code of Botanical Nomenclature (ICBN). [Judd et al., 2002; Spichiger et al., 2004]. La position systématique des Fabaceae est présentée dans le tableau II- 3.
Tableau II-3 : Position systématique des Fabaceae selon différentes approches phylogénétique ou morphologique [Engler et Prantl, 1889; Cronquist, 1988; Thorne, 1992; Thorne, 1992b; The Angiosperm Phylogeny Group, 1998]. Engler (1887-1915) Cronquist (1988) Thorne (1992) APGII (1998) Règne Plantae Plantae Plantae Plantae Embranchement Embryophyta Magnoliophyta Spermatophytae Spermatophyta Sous- Angiospermae - Angiospermae Angiospermae embranchement Classe Dicotyledonae Magnoliopsida Magnoliidae Eudicotyledonae Sous-classe Archichlamydeae Rosidae Rutanae Rosidae Ordre Rosales Fabales Rutales Eurosidae I Sous-ordre Leguminosineae - Fabineae Fabales Famille Leguminosae Fabaceae Fabaceae Fabaceae (=Papilionaceae) (=Leguminosae) Mimosaceae Caesalpiniaceae Sous-famille Faboideae Faboideae Faboideae Mimosoideae Mimosoideae Mimosoideae Caesalpinoideae Caesalpinoideae Caesalpinoideae Swartzioideae
Les Fabaceae étant une famille extrêmement vaste, pour la suite de cette discussion nous allons nous intéresser plus particulièrement à la sous-famille des Faboideae qui comprend 440 à 500 genres, dont Oxytropis, et plus de 12'000 espèces. Les caractères morphologiques principaux des Faboideae sont les suivants [Spichiger et al., 2004]:
Feuilles : - Généralement alternes, composées pennées, souvent trifoliées, parfois unifoliées. - Stipules et stipelles, rarement modifiées en épines, en feuilles ou en vrilles. - Feuilles avec mouvement « veille - sommeil ». Inflorescences : racème, panicule ou épi. Fleurs : - Bisexuée. - Zygomorphe papilionacée. - Sépales plus ou moins soudés en tube bilabié. - Pétales à préfloraison vexillaire, organisés en un étendard (pétale supérieur), deux ailes (latéraux), et une carène issue de deux pétales soudés (inférieur).
25 2. INTRODUCTION
- Etamines diadelphes, parfois libres ou monadelphes, soudées par leur filet (parfois nectarifères à la base) autour de l’ovaire ; anthères à déhiscence longitudinale. - Ovaire supère à carpelle unique ; style et stigmate terminaux, placentation marginale, deux à plusieurs ovules. Fruits : - Gousse ou légume (follicule issu d’un seul carpelle, déhiscent par deux valves, ventrale et dorsale), parfois loment ou samare. - Graine à court funicule, sans albumen. Embryon courbe.
2.3.3 Intérêts économiques et médicaux de la sous-famille des Faboideae Les Fabaceae, et plus particulièrement la sous-famille des Faboideae, ne seraient dépassées que par les Poaceae dans un classement des familles par importance économique. De nombreuses plantes alimentaires, mais aussi des plantes fourragères, ornementales ou encore médicinales de premier ordre appartiennent à cette sous-famille. Il est néanmoins important de noter que de nombreux genres sont hautement toxiques ; cette particularité de certaines Faboideae, et plus spécifiquement des Oxytropis, sera développée dans un autre chapitre (cf. 2.3.7) [Heywood, 1996; Bruneton, 1999; Judd et al., 2002; Spichiger et al., 2004].
Une grande quantité de graines et de cosses de diverses espèces herbacées de Faboideae, communément appelées légumineuses ou légumes secs, sont une source alimentaire universelle autant humaine qu’animale. Ces plantes alimentaires de grande consommation comprennent entre autres Arachis hypogaea L. (l’arachide ou cacahuète), Cajanus cajan (L.) Millsp. (le pois d’Angole), Cicer arietinum L. (le pois chiche), Dolichos lablab L. (le pois indien), Glycine max Merr. (le soja), Glycyrrhiza glabra L. (la réglisse), Lens (les lentilles), Phaseolus (les haricots), Pisum (les pois) et Vicia (les fèves). Ces espèces, des espèces voisines et leurs très nombreuses variétés sont cultivées dans le monde entier. Elles sont recherchées pour leur haute teneur en protéines et en minéraux, plus particulièrement dans certaines régions du monde où l’apport en protéines animales est problématique. Plus anecdotiquement, les jeunes feuilles, fermentées et séchées, d’Aspalathus linearis (Burm.f.) R.Dahlgr ou « Rooibos Tea » sont utilisées comme une alternative au thé, en particulier en Afrique du Sud. La consommation de ce thé s’étend actuellement, y compris en Europe, et ce d’autant plus que certains lui prêtent des vertus antioxydantes [Bruneton, 1999; Judd et al., 2002].
De nombreux genres sont également fourragers : Medicago sativa L. (la luzerne), Melilotus officinalis L. (le mélilot), Trifolium (les trèfles) et Vicia (les vesces). Certaines espèces sont même enfouies dans les sols comme engrais vert (par ex. Trifolium repens L.), augmentant dans
26 2. INTRODUCTION
de notables proportions la concentration en azote du sol et formant la base de l’assolement des cultures [Judd et al., 2002].
Certains genres font parties des plantes ornementales les plus prisées autant dans les pays tempérés que tropicaux. Les plus connus étant Cytisus (les gênets), Laburnum anagyroides Medik. (la pluie d’or ou Cytise à grappes), Lathyrus (les gesses), Lupinus (les lupins), Wisteria (les glycines) et Genista. Ce dernier possède une espèce très utilisée en industrie pour ses propriétés colorantes, Genista tinctoria L. ou genêt des teinturiers, de même que certaines espèces d’Indigofera dont est tirée la teinture d’indigo [Heywood, 1996; Spichiger et al., 2004]. De nombreuses Faboideae ont, ou ont joué, un rôle important dans l’histoire de l’industrie pharmaceutique. Dans la majeure partie des cas, non pas pour leur utilisation en tant que médicaments, mais comme source de matière première (par ex. lécithines de Glycine max
Merr.), de molécules actives, de molécules pour l’hémisynthèse de médicaments (par ex. phytostérols de Glycine max Merr. ou des saponines de Trigonella foenum-graecum L.) ou encore d’excipients divers (par ex. baume du Pérou de Myroxylon balsamum Harms. ou gomme adragante d’Astragalus gummifer Labill.). Une sélection des espèces les plus intéressantes est présentée dans le tableau II-4 [Bruneton, 1999].
Actuellement plusieurs molécules très utilisées en thérapeutique sont extraites de diverses espèces de Faboideae : la spartéine, un alcaloïde ganglioplégique utilisé en cardiologie et en obstétrique, isolée de Cytisus scoparius (L.) Link, la rutine, un flavonoïde utilisé en phlébologie, isolée de Sophora japonica L. ou encore la physostigmine issue de Physostigma venenosum Balf. Cette dernière est un inhibiteur réversible des cholinestérases, utilisée comme antidote de l’intoxication par les parasympatholytiques et testée dans le traitement de la maladie d’Alzheimer. Elle n’est pas utilisée dans cette dernière indication, mais a permis la préparation d’analogues synthétiques potentiellement très prometteurs [Bruneton, 1999].
27 2. INTRODUCTION
Tableau II-4 : Quelques Faboideae intéressantes répertoriées [Bruneton, 1999; Wichtl et Anton, 2003]. Diverses Faboideae Nom français Organes Composition chimiques Utilisations Astragalus gummifer Labill. Astragale à Exsudation Polysaccharides Auxiliaire de fabrication gomme adragante gommeuse Amidon (viscosifiant, émulsifiant) Substances minérales Laxatif Cytisus scoparius (L.) Link Genêt à balais Rameaux Amines Source industrielle de spartéine Fleurs Flavonoïdes Alcaloïdes (spartéine) Derris spp. Derris Racines Roténoïdes Insecticide pour l’agriculture biologique Ichtyotoxique Dipteryx odorata (Aublet) Fève Tonka Graines Coumarine Historiquement : 1er isolement de la Willd coumarine Aromatisation des tabacs Glycine max (L.) Merr. Soja Graines Protéines Source industrielle de lécithines, de Isoflavonoïdes phytostérols (stigmastérol, Saponines sitostérol), de phyto-œstrogènes Stérols Lécithines Glycyrrhiza glabra L. Réglisse Racines Flavonoïdes Matière première pour la confiserie Stolons Saponines (glycyrrhizine) (aromatisant, édulcorant) Antitussif Antiulcéreux gastrique Anti-inflammatoire Medicago sativa L. Luzerne Plantes Phytoménadione (Vit. K) Source de concentré protéique entières Saponines Coumestrol Melilotus officinalis (L.) Mélilot Sommités Saponines Historiquement : découverte des Pallas et Melilotus altissima fleuries Flavonoïdes anticoagulants Thuill. Mélilotoside Aromatisant Coumarine (Dicoumarol) Anti-œdémateux Anti-hémorroïdaire Physostigma venenosum Fève de calabar Graines Alcaloïdes (physostigmine) Source industrielle de Balf. physostigmine Sophora japonica L. Sophora Boutons Rutine Source industrielle de rutine floraux Trigonella foenum graecum Fenugrec Graines Protéines Source industrielle de saponines L. C-flavonoïdes Antidiabétiques Stérols Hypocholestérolémiantes Saponines Hypolipidémiantes
2.3.4 Présentation du genre Oxytropis Le genre Oxytropis DC. appartient à la tribu des Galegeae, une des dix tribus des Faboideae. Ce genre compte environ 300 espèces principalement situées dans les régions froides et
28 2. INTRODUCTION
montagneuses d’Europe, d’Asie et Nord-Américaine. Une dizaine d’espèces se retrouvent dans les Alpes helvétiques. Les Oxytropis sont normalement des plantes typiques des Toundras ou des Steppes, mais suite aux diverses glaciations les prairies de l’étage alpin contiennent des espèces boréales, arctiques ou steppiques. Les espèces du genre Oxytropis sont des plantes herbacées pérennes ou arbustives. Les feuilles sont imparipennées, usuellement avec cinq feuillets ou plus. Les fleurs sont groupées en tête ou en épi dense avec une carène obtuse- apiculée. Les fruits sont des gousses souvent renflées, dépassant le calice. Le genre Oxytropis est principalement connu pour sa toxicité neurologique due à la présence d’alcaloïdes indolizidiniques (cf. 2.3.5). [Bruneton, 2001; Zhu et Du, 2002; Spichiger et al., 2004; Landolt et Aeschimann, 2005].
2.3.5 Toxicité du genre Oxytropis Un nombre non négligeable de Fabaceae sont dangereuses : il faut toutefois se rappeler que, la famille comprenant plus de 18'000 espèces, ce danger reste très relatif. Agronomes et éleveurs sont particulièrement concernés par cette famille qui fournit des espèces précieuses pour l’alimentation animale. Chez les Fabaceae, le métabolisme des acides aminés est souvent orienté vers la production d’alcaloïdes. Ceux-ci sont fréquemment des produits formés à partir de l’ornithine et/ou de la lysine et sont très souvent toxiques : pyrrolizidines (Crotalaria spp.), indolizidines (Astragalus, Castanospermum, Oxytropis, Swainsona), quinolizidines (Anagyrus, Cytisus, Genista, Lupinus, etc.). En Amérique du Nord, certaines de ces espèces ont été dénommées « locoweeds » à cause de leur responsabilité dans certaines maladies neurologiques (« locoism ») chez les bovins, les ovins et les chevaux : Astragalus (par ex. A. lentiginosus Dougl.) et Oxytropis (O. sericea Nutt., O. besseyi, O. lambertii et O. lagopus). Les symptômes observés chez le bétail intoxiqué par ces espèces sont principalement dus à un alcaloïde indolizidinique : la (-)-swainsonine.
OH OH H
OH N
Figure II-8 : (-)-Swainsonine (6)
La (-)-swainsonine a été isolée de plusieurs Fabaceae : Swainsona canescens (Benth.) F. Muell. d’Australie, Astragalus lentiginosus Dougl., Oxytropis sericea Nutt. d’Amérique du Nord et autres espèces de ces trois genres. Elle est également élaborée par des champignons (Rhizoctonia, Metarhizium) et plus récemment, elle a été détectée chez un Ipomoea (Convolvulaceae). Les symptômes dus à cette substance (incoordination, dysfonction sexuelle,
29 2. INTRODUCTION
malformations congénitales, troubles de la démarche et autres troubles neurologiques) sont liés à des altérations axonales au niveau du système nerveux central. Ils rappellent ceux que l’on observe en cas de déficit congénital en α-D-mannosidases lysosomiales. Cet alcaloïde est un puissant inhibiteur des glycosidases : la swainsonine inhibant principalement les mannosidases. En termes d’activité pharmacologique, les potentialités de molécules comme la swainsonine sont multiples : inhibition de la prolifération et de la dissémination tumorale (antimétastasique), ou encore action immunomodulatrice (stimulante de la production d’interleukine-2 par ex.). La swainsonine a fait l’objet d’au moins un essai clinique de phase I.
2.3.6 Travaux scientifiques antérieurs sur le genre Oxytropis De par leur grande toxicité et les incidences économiques liées à celle-ci, les « locoweeds », ou certaines espèces bien particulières d’Astragalus et d’Oxytropis, ont fait l’objet de très nombreuses publications. Ces études ont été effectuées majoritairement dans les régions les plus touchées par ces toxines, telles que l’Amérique du Nord, l’Asie centrale, l’Asie de l’Est et la Russie. Au jour d’aujourd’hui, vingt-trois espèces d’Oxytropis ont été le sujet d’investigations phytochimiques, celles-ci portant principalement sur la teneur et la composition en alcaloïdes indolizidiniques de ces plantes [James et al., 2004]. D’autres types d’alcaloïdes, par exemple des alcaloïdes quinolizidiniques, ou de dérivés azotés ont également été isolés dans ce genre. Comme pour les Fabaceae, nous retrouvons dans le genre Oxytropis, les grandes classes de métabolites secondaires typiques de cette famille, telles que des alcaloïdes bien sûr mais aussi des oligosaccharides, des lipides, des protéines et des flavonoïdes. Les Fabaceae, comparées aux autres familles d’Angiospermes, sont toutes particulièrement riches en cette dernière classe de composés [Harborne et al., 1971]. La présence de quelques métabolites secondaires moins fréquents, tels que des dérivés terpéniques (principalement des saponines), ou encore des hétérosides cyanogènes, va aussi être discutée dans ce présent chapitre.
2.3.6.1 Alcaloïdes et autres métabolites azotés naturels Comme vu précédemment (cf. 2.3.5), chez les Fabaceae le métabolisme des acides aminés est souvent orienté vers la production d’alcaloïdes. Dans le genre Oxytropis, ceux-ci sont majoritairement des produits formés à partir d’un seul précurseur : la lysine. Cet acide aminé est à l’origine de plusieurs types d’alcaloïdes, principalement indolizidiniques ou quinolizidiniques, plus souvent connus pour leur toxicité que pour leurs actions pharmacologiques.
30 2. INTRODUCTION
Les alcaloïdes indolizidiniques sont assez rares chez les végétaux et aucune plante produisant des alcaloïdes dérivés de l’indole n’est actuellement utilisée en thérapeutique. Néanmoins des composés comme la (-)-swainsonine, isolée dans certaines espèces des genres Oxytropis, Astragalus ou encore Swainsona, suscitent comme nous avons pu le voir (cf. 2.3.5) un intérêt certain compte tenu de ses propriétés inhibitrices à l’encontre des glycosidases [Bruneton, 1999]. Lors de son isolement initial, la swainsonine était le premier et unique alcaloïde polyhydroxyindolizidinique connu. Elle, ainsi que son N-oxyde, ont été isolés dans une dizaine d’espèces d’Oxytropis (O. campestris, O. lambertii, O. sericea, O. kansunsis, O. ochrocephala, O. glacialis, etc.) à des teneurs comprises entre 0.01 et 0.02 pourcent. D’autres alcaloïdes de cette même famille, tel que la 8-méthyl-1-hydroxyindolizidine ont par exemple été obtenu d’O. kansuensis [Molyneux et al., 1991; Molyneux et al., 1991; Zhao et al., 2001; Tong et al., 2003].
OH OH OH OH H H
OH OH N N
O
(6) (7)
OH Me OH H OH H HO
N N HO
(8) (9)
Figure II-9 : Alcaloïdes polyhydroxyindolizidiniques (-)-Swainsonine (6), (-)-Swainsonine N-oxyde (7), (+)-Castanospermine (8), 8-méthyl-1-hydroxyindolizidine (9)
Il est actuellement reconnu que la swainsonine n’est plus une molécule orpheline, mais l’avant- garde d’une classe d’alcaloïdes polyhydroxyindolizidiniques, provenant principalement de la famille des Fabaceae et possédant de nouvelles et spécifiques propriétés comme inhibiteurs des glycosidases [Molyneux et al., 1991; Zhao et al., 2001]. La (+)-castanospermine par exemple a été isolée des graines d’une autre Fabaceae australienne introduite en Californie (Castanospermum australe A. Cunn ex Mudie) ainsi que des feuilles et gousses de diverses espèces d’Alexa de l’Amérique du Sud. Cet alcaloïde est également un inhibiteur des glycosidases et plus particulièrement des glucosidases. La castanospermine, molécule assez peu toxique, est active contre le cytomégalovirus humain et son activité sur les rétrovirus n’est pas négligeable. Sa capacité à interférer avec les fonctions de l’enveloppe glycoprotéique du virus
31 2. INTRODUCTION
de l’immunodéficience humaine (HIV) a été démontrée. Seule ou en association, elle a été testée chez l’animal comme inhibitrice du rejet de greffes. Dans ces différents genres des Fabaceae, un nombre considérable d’alcaloïdes minoritaires sont probablement présents et certains ont été mis en évidence tels que la lentiginosine dans A. lentiginosus, ou encore la 6- épicastanospermine et la 7-déoxy-6-épicastanospermine dans C. australe. Sans aucun doute, de nombreuses structures similaires variant de par leur degré d’hydroxylation et de substitution sont encore à découvrir [Molyneux et al., 1991].
Les alcaloïdes quinolizidiniques sont largement distribués chez les Fabaceae et sont souvent responsables de leurs activités ou de leur toxicité. Leur occurrence dans les espèces du genre Oxytropis a été découverte récemment [Bruneton, 1999]. Une série d’alcaloïdes tels que la spartéine, la (-)-anagyrine, la lupanine ou encore la N-formylcytisine ont été isolée d’O. glabra et O. ochrocephala des espèces du Nord-est de la Chine [Dong et al., 1993; Meng et al., 1994; Meng et al., 1994]. Ces quatre alcaloïdes étant également présents dans d’autres Fabaceae ornementales connues pour leur toxicité tels le cytise (Laburnum anagyroides Medikus), le genêt à balais (Cytisus scoparius (L.) Link.) ou les lupins (Lupinus spp.) [Bruneton, 1999; Bruneton, 2001].
H H H N OH N
N N H H H O O (10) (11)
H H H
N R1 N * * ** N N H H H H O
* = S (12) R1 = OH * = S ** = R (14) * = R (13) R1 = H * = R ** = S (15)
Figure II-10 : Alcaloïdes quinolizidiniques isolés dans le genre Oxytropis N-Formylcytisine (10), Lupanine (11), (-)-Thermopsine (12), (-)-Anagyrine (13), 13-hydroxyspartéine (14), Spartéine (15)
Plus anecdotiquement, des alcaloïdes dérivés non pas de la lysine mais d’autres acides aminés, comme le tryptophane ont été décrits dans le genre Oxytropis. L’harmine, de la série des β- carbolines, des alcaloïdes indoliques à propriétés hallucinogènes, a été isolée d’O. puberula.
32 2. INTRODUCTION
[Akhmedzhanova et al., 1993]. Ces composés se retrouvent dans certaines drogues masticatoires de l’Amérique du Sud de la famille des Malpighiaceae [Bruneton, 1999].
N H3CO N H
Figure II-11 : Harmine (16)
Dans le genre Oxytropis, une classe particulière de métabolites secondaires azotés est fréquente : les phényléthylamines. Elles sont présentes dans de très nombreux végétaux et si certaines sont spécifiques et ont des propriétés pharmacologiques marquées, d’autres sont des produits habituels du métabolisme des acides aminés aromatiques : tyramine, phényléthylamine. Ces structures ne correspondent pas à la définition « traditionnelle » des alcaloïdes mais plutôt à celle des proto-alcaloïdes. En effet leur atome d’azote n’est pas inclus dans un système hétérocyclique [Bruneton, 1999]. De nombreux auteurs les considèrent néanmoins comme de vrais alcaloïdes. Les composés trouvés dans le genre Oxytropis ont la particularité d’être tous des amides. La première série de composés sont tous des phényléthylbenzamides (Figure II-12) [Demeuov et al., 1999]. La muricatide, par exemple, a été isolée pour la première fois d’O. muricata sur le territoire Mongolien [Akhmedzhanova et Batsuren, 1997].
O
R2 * N R1 H
R1 = C R2 = O * = - (17) R1 = C R2 = OH * = S (20)
R1 = C R2 = H * = - (18) R1 = N R2 = OH * = R (21)
R = N R =OH * = S (22) R1 = C R2 = OAc * = S (19) 1 2
Figure II-12 : Phényléthylbenzamides isolées dans le genre Oxytropis Muricatisine (17), N-(2-phényléthyl)benzamide (18), Muricatide (19), N-[(2S)-2-hydroxy-2-phényléthyl]-benzamide (20), (R)-N- (2-hydroxy-2-phényléthyl)-3-pyridinecarboxamide (21), (S)-N-(2-hydroxy-2-phényléthyl)-3-pyridinecarboxamide) (22)
La deuxième série de substances est composée de phényléthylcinnamamides (Figures II-13 et II-14) [Batsuren et al., 1992; Kojima et al., 2001].
33 2. INTRODUCTION
H R1
N * R2
O
R1 = H R2 = Ph * = trans (23)
R1 = H R2 = Ph * = cis (24)
R1 = Ph R2 = OH * = trans (25)
Figure II-13 : Phényléthylcinnamamide isolées dans le genre Oxytropis 3-phényl-N-(2-phényléthyl)-2-propenamide (23), (E)-N-Phenéthylcinnamamide (24), N-[(2S)-2-hydroxy-2-phényléthyl]-3- phényl-(2E)-2-propenamide (25)
La seule exception à cette série d’amides est la trichophidine, qui a été isolée des parties aériennes d’O. trichophysa [Akhmedzhanova, 1994].
O NH2 N O
O OH
(26) (27)
Figure II-14 : Phényléthylamines isolées dans le genre Oxytropis N-benzoylphenylaminomethylcarbinol (26), Trichophidine (27)
2.3.6.2 Flavonoïdes Dans le genre Oxytropis, une grande série de flavonols très communs tels que la myricétine, la quercétine ou encore le kaempférol, ainsi que leurs dérivés glycosylés ont été isolés. Ces flavonoïdes sont largement distribués dans les fleurs et les feuilles de la famille des Fabaceae et une description exhaustive de ces derniers ne présente aucun intérêt pour le présent travail [Harborne et al., 1971]. Une observation intéressante peut être effectuée, c’est l’absence, à notre connaissance, complète d’isoflavones dans ce genre, classe de composés pourtant typique de la sous-famille des Faboideae. Néanmoins, quelques flavonoïdes originaux et complexes, des esters coumariques et caféiques de glycosides de la quercétine et du kaempférol ont été isolés d’O. myriophylla (Figure II-15) [Lu et al., 2004].
34 2. INTRODUCTION
R1
OH OH O O O CH3
O OH OH OH O R3 O HO OH
OH O R2 O O O OH
OH OH
R1 = OH R2 = H R3 = H (28) R1 = OH R2 = OCH3 R3 = H (31)
R1 = OH R2 = OH R3 = H (29) R1 = OH R2 = H R3 = OH (32)
R1 = H R2 = H R3 = H (30)
Figure II-15 : Flavonoïdes complexes isolés dans le genre Oxytropis Myriophylloside B (28), Myriophylloside C (29), Myriophylloside D (30), Myriophylloside E (31), Myriophylloside F (32)
2.3.6.3 Triterpènes et stéroïdes Des différentes études effectuées sur le genre Oxytropis, une vingtaine de dérivés terpéniques et plus précisément de saponines ont été isolées. La nature de leur génine est uniquement de type triterpénique comme pour la plupart des Angiospermes Dicotylédones et donc des Fabaceae. Une exception notable et économiquement très importante chez les Fabaceae est celle du fenugrec (Trigonella foenum-graecum L.) qui est une source industrielle, de par ses graines, en saponines à génine stéroïdique [Bruneton, 1999]. Les saponines triterpéniques sont issues de la cyclisation du (3S)-2,3-époxy-2,3-dihydrosqualène. Cette cyclisation conduit en premier lieu aux dammaranes puis aux lanostanes, des molécules tétracycliques. Une série d’hétérosides de génines tétracycliques de la série du lanostane : des cycloartanes ou 9,19-cyclolanostanes ont été isolées d’O. bicolor et d’O. myriophylla (Figure II-16) [Sun et al., 1991; Sun et Chen, 1997; Okawa et al., 2002].
35 2. INTRODUCTION
OH
R5 OR6
H R2 H R4
R O R 1 H 3
R1 = H R2 = H R3 = H R4 = O-β-D-Glc-β-D-Glc R5 = a-L-Ara-oxy R6 = H (33)
R1 = H R2 = H R3 = H R4 = O-β-D-Glc-β-D-Glc R5 = OH R6 = H (34)
R1 = H R2 = OH R3 = OH R4 = H R5 = H R6 = O-D-apio-β-D-Fuc-(1-4)-O-β-D-Xyl-β-D-Glc (35)
R1 = O-β-D-Glc-β-D-Glc R2 = H R3 = H R4 = OH R5 = OH R6 = H (36)
R1 = O-β-D-Glc-β-D-GLc R2 = H R3 = H R4 = OH R5 = OH R6 = (6-déoxy-a-L-Man) oxy (37)
Figure II-16 : Saponines à génine tétracyclique isolées dans le genre Oxytropis
Un certain nombre de glycosides de ce type de génine ont déjà été isolés de certaines espèces d’Astragalus par des groupes japonais et russes, comme par exemple la série des astrasieversianine, à activité hypotensive, isolées d’A. sieversianus [Hostettmann et Marston, 1995].
Beaucoup plus fréquemment, le composé tétracyclique de type dammarane ou lanostane n’est qu’un intermédiaire qui évolue vers des squelettes pentacycliques : oléananes (β-amyrine), ursanes (α-amyrine) et lupanes qui peuvent eux-mêmes subir quelques réarrangements [Bruneton, 1999]. De nombreuses saponines à génines triterpéniques du type oléanane ont été isolées dans le genre Oxytropis, comme par exemple des dérivés du soyasapogénol E d’O. glabra ou encore le myrioside C et l’hédérasaponine C d’O. myriophylla [Sun et Jia, 1990; Okawa et al., 2002]. L’hédérasaponine C, saponine majoritaire (5 à 7 %) dans le lierre (Hedera helix L., Araliaceae), est une pro-drogue qui par hydrolyse donne l’α-hédérine, un puissant antifongique (Figure II-17) [Bruneton, 1999].
36 2. INTRODUCTION
R4
R3 H R2
H
R1 H
HO
R1 = OH R2 = Me R3 = O R4 = Me (38)
R1 = β-D-GlcA R2 = Me R3 = H R4 = β-D-Glc-oxy (39)
R1 = [2-O-(6-déoxy-α-L-Man)-α-L-Ara] oxy R2 = O-6-déoxy-α-L-Man-O-β-D-Glc-β-D-Glc ester R3 = H R4 = Me (40)
Figure II-17 : Saponines à génine pentacyclique isolées dans le genre Oxytropis Soyasapogénol E (38), Myrioside C (39), Hédérasaponine C (40)
L’aglycone majoritaire étant néanmoins la soyasapogénol B, une génine se retrouvant uniquement chez les Faboideae et plus particulièrement dans les genres Astragalus, Glycine, Medicago, Phaseolus, Vigna, etc. (Figure II-18).
R3 H H
H R1 OH
R2
R1 = Me R2 = OH R3 = O-α-L-Ara-β-D-GlcA (41)
R1 = Me R2 = ΟΗ R3 = O-β-L-Glc-β-D-GlcA (42)
R1 = COOH R2 = H R3 = β-D-GlcA (43)
R1 = COOH R2 = H R3 = O-β-D-Glc-β-D-GlcA (44)
R1 = 3-yl-2-O-β-D-Xyl R2 = H R3 = O-β-D-Glc-oxy-β-D-GlcA (45) Figure II-18 : Saponines à génine de type soyasapogénol B isolées dans le genre Oxytropis Soyasaponine IV (41), Azukisaponine II (42), Myrioside B (43), Azukisaponine III (44), Myrioside D (45)
Différentes saponines ont été isolées de plusieurs espèces d’Oxytropis telles que O. glabra, O. lanata, O. myriophylla, O. bicolor ou encore O. ochrocephala [Sun et al., 1987; Sun et al., 1989; Sun et Jia, 1990; Sun et al., 1991; Sun et al., 1992; Sun et Chen, 1997; Okawa et al., 2002].
37 2. INTRODUCTION
2.3.7 Utilisations médicinales et traditionnelles des Oxytropis Comme nous avons pu le voir au point précédent (cf. 2.3.6), une grande quantité d’études ont été effectuées dans les régions du monde où le genre Oxytropis est fréquent voir endémique, telles que l’Amérique du Nord, l’Asie centrale, l’Asie de l’Est ou encore la Russie. Dans ces études, les différentes espèces sont principalement étudiées soit pour leur appartenance aux « locoweeds » toxiques et pour l’activité de leurs alcaloïdes indolizidiniques, soit d’un point de vue uniquement phytochimique. Les activités, ainsi que le potentiel thérapeutique de la swainsonine et de ses dérivés ayant déjà été évoqués (cf. 2.3.5), nous nous concentrerons uniquement sur les utilisations médicinales et traditionnelles des Oxytropis. Les espèces de ce genre n’ont que des utilisations médicinales marginales. Il existe, par exemple, un brevet russe pour un agent intra-nasal contenant un extrait sec d’O. oxyphylla (Pall.) DC pour la prophylaxie et le traitement de la rhinite [Lesiovskaya et al., 2003]. Les divers usages traditionnels répertoriés proviennent principalement de l’Asie du Sud, de l’Est et de la Russie, tels que l’utilisation comme antiseptique, pour les blessures et comme antidote d’O. reniformis dans la médecine traditionnelle himalayenne [Wangchuk, 2004]. Une grande série d’espèces sont ainsi utilisées dans les médecines tibétaine, mongolienne, sibérienne et transbaïkale (O. baicalia, O. deflexa, O. filiformis, etc.). La plupart des publications n’étant pas écrites en anglais, ces informations ne sont malheureusement disponibles que partiellement.
Quelques usages traditionnels de certaines tribus d’Amérindiens sont rapportés dans la littérature. Différentes espèces de « locoweeds » et plus particulièrement O. lagopus Nutt. sont utilisées en décoction, solution ou savon pour les cheveux, la tête ou le corps lors de maladies de la peau et de la circulation. O. campestris est utilisée en bain de vapeur pour diminuer le gonflement et les douleurs rhumatismales, une décoction des racines est aussi utilisée dans certains rites de purification comme boisson et solution capillaire. O. lagopus est également mâché pour les gorges endolories et pour apaiser les inflammations [Thie, 1999]. En outre, il existait au sein de ces tribus, quelques utilisations fortement spécialisées d’espèces qui aujourd'hui sont considérées comme dangereuses. Des espèces du genre Oxytropis ont été employées contre les maux de gorges, l’asthme, des blessures, ou des problèmes auriculaires, et comme galactogène. Ces espèces contiennent des substances toxiques, et ainsi une utilisation réussie impliquait des connaissances considérables [Kindscher, 1992].
2.3.8 Présentation des différentes espèces d’Oxytropis sélectionnées Parmi les différentes plantes alpines récoltées, se trouvent quatre espèces du genre Oxytropis : O. campestris (L.) DC., O. helvetica Scheele, O. jacquinii Bunge et O. fetida (Vill.) DC. Outre l’intérêt grandissant pour ce genre et ses alcaloïdes indolizidiniques, les racines de cette
38 2. INTRODUCTION
dernière espèce appelée aussi oxytropis fétide s’est avérée très prometteuse dans les criblages biologiques, biochimiques et chimiques (cf. 3.2). Les extraits d’Oxytropis fetida ont ainsi montré les plus grands potentiels d’isolement de produits originaux et actifs et ont fait l’objet d’un fractionnement bioguidé. Une investigation phytochimique, ainsi qu’une étude comparative avec O. fetida, des autres espèces a été effectuée. Ces espèces n’ont jamais été étudiées à l’exception d’O. campestris qui a été l’objet d’une quinzaine de publications, dont trois de nature phytochimique.
2.3.8.1 Oxytropis fetida (Vill.) DC. Oxytropis fetida (Figure II-19) est une plante vivace herbacée de 5 à 15 centimètres de haut, généralement acaule et à hampe plus ou moins glanduleuse. Son nom provient de son odeur résineuse à fétide. Les feuilles sont imparipennées à 15 à 25 paires de folioles, épaisses, lancéolées à oblongues- lancéolées. Les stipules sont soudées au pétiole. Les fleurs sont en groupe de 3 à 7, la corolle blanchâtre est un étendard de 12 à 22 millimètres. Les fruits sont des gousses glanduleuses partiellement biloculaires, de 2 à 3 centimètres de long.
Figure II-19 Photographie d’Oxytropis fetida (Vill.) DC.
Elle pousse dans les éboulis et les rocailles alpines entre 1700 et 2800 mètres d’altitude. C’est une plante rare des étages subalpin et alpin, des Alpes méridionale et occidentales. Il existe deux sous-espèces : O. fetida (Vill.) DC. subsp. fetida (très glanduleuse et fétide) et O. fetida (Vill.) DC. subsp. viscosa (Vill.) Kerguélen (moins glanduleuse et à odeur plutôt résineuse) [Lauber et Wagner, 2000; Landolt et Aeschimann, 2005]. La figure II-20 représente sa répartition géographique en Suisse.
39 2. INTRODUCTION
Figure II-20 : Carte de répartition géographique (suisse) d’Oxytropis fetida (Vill.) DC.
2.3.8.2 Oxytropis campestris (L.) DC. Oxytropis campestris (Figure II-21) est une plante vivace herbacée de 5 à 15 centimètres de haut, généralement acaule et à hampe couverte de poils plus ou moins apprimés à étalés- dressés. Les feuilles sont imparipennées à 10 à 15 paires de folioles elliptiques ou lancéolées. Les stipules sont soudés entre elles jusqu’au ¾ au plus et soudées au pétiole sur la moitié de leur longueur au plus. Les fleurs sont en groupe de 5 à 15, la corolle jaunâtre à blanche est un étendard de 15 à 20 millimètres. Les fruits sont des gousses dressées partiellement biloculaires, de 1 à 2 centimètres de long.
Figure II-21 Photographie d’Oxytropis campestris (L.) DC.
Elle pousse dans les pâturages, les pelouses et les rocailles alpines entre 1200 et 2900 mètres d’altitude. C’est une plante arctico-alpine assez fréquente dans les Alpes et les Pyrénées orientales. Il existe deux sous-espèces : O. campestris (L.) DC. subsp. campestris (corolle jaunâtre à blanche) et O. campestris (L.) DC. subsp. tiroliensis (Sieber) Leins (corolle blanche pourvue de 2 tâches violettes latérales à l’extrémité de la carène) [Lauber et Wagner, 2000; Landolt et Aeschimann, 2005]. La figure II-22 représente sa répartition géographique en Suisse.
40 2. INTRODUCTION
Figure II-22 : Carte de répartition géographique (suisse) d’Oxytropis campestris (L.) DC.
2.3.8.3 Oxytropis jacquinii Bunge Oxytropis jacquinii (Figure II-23) est une plante vivace herbacée de 5 à 20 centimètres de haut, caulescente. Elle est généralement couchée ou étalée sur le sol. Les feuilles sont imparipennées à 15 à 20 paires de folioles, lancéolées à ovales-lancéolées, à pilosité éparse ou glabrescente. Les stipules sont soudées à la base et soudées au pétiole sur un tiers de leur longueur environ, les pétioles sont généralement rouges. Les fleurs sont en grappe dense, la corolle violacée est un étendard de 10 à 13 millimètres. Les fruits sont des gousses uniloculaires dressées de 2 à 3 centimètres de long, elles sont couvertes de poils courts et munies d’un carpophore net au moins aussi long que le tube du calice.
Figure II-23 Photographie d’Oxytropis jacquinii Bunge.
Elle pousse dans les pelouses ouvertes et les crêtes entre 1700 et 2800 mètres d’altitude. C’est une plante assez fréquente des étages subalpin et alpin, des Alpes méridionales et occidentales [Lauber et Wagner, 2000; Landolt et Aeschimann, 2005]. La figure II-24 représente sa répartition géographique en Suisse.
41 2. INTRODUCTION
Figure II-24 : Carte de répartition géographique (suisse) d’Oxytropis jacquinii Bunge.
2.3.8.4 Oxytropis helvetica Scheele Oxytropis helvetica (Figure II-25) est une plante vivace herbacée de 5 à 40 centimètres de haut, acaule, à hampe grêle velue-soyeuse. Les feuilles sont imparipennées à 10 à 12 paires de folioles lancéolées. Les stipules sont libres entre eux mais brièvement soudés au pétiole. Les fleurs sont en grappe ovoïde, la corolle panachée de violet et de bleu est un étendard de 10 à 15 millimètres. Les fruits sont des gousses uniloculaires, étalées ou pendantes, de 2 à 3 centimètres de long, elles sont velues et munies d’un carpophore égalant environ la demi-longueur du tube du calice.
Figure II-25 Photographie d’Oxytropis helvetica Scheele
Elle pousse dans les pelouses ouvertes et les rocailles entre 1700 et 2800 mètres d’altitude. C’est une plante de l’agrégat de l’Oxytropis de Jacquin, O. jacquinii aggr. poussant dans les Alpes méridionales et occidentales et se rencontre plus particulièrement en Valais, val d’Aoste et Savoie [Lauber et Wagner, 2000; Landolt et Aeschimann, 2005]. La figure II-26 représente sa répartition géographique en Suisse.
42 2. INTRODUCTION
Figure II-26 : Carte de répartition géographique (suisse) d’Oxytropis helvetica Scheele.
Le matériel végétal étudié dans ce travail (racines et parties aérienne d’O. fetida (Vill.) DC, plante entière d’O. campestris (L.), d’O. helvetica Scheele et d’O. jacquinii Bunge) a été récolté par Monsieur Egidio Anchisi, Jardin Alpin de Champex (Suisse), dans la région du vallon de l’Urtier et du Col du Petit-Saint-Bernard dans le Val d’Aoste (Italie) à une altitude de 2200 à 2650 mètres.
43 2. INTRODUCTION
2.4 La famille des Rosaceae
2.4.1 Introduction Les Rosaceae représentent une grande famille cosmopolite de plantes à fleurs, spécialement représentée dans les régions tempérées de l’hémisphère Nord (Figure II-27). Elle comprend aussi bien des plantes herbacées vivaces que des arbustes ou des arbres. Elle compte 100 à 115 genres et plus de 3000 espèces différentes [Heywood, 1996; Spichiger et al., 2004].
Figure II-27 : Carte de répartition géographique des Rosaceae d’après Heywood (1996).
2.4.2 Classification systématique et aspects botaniques En dépit de la grande diversité de ses caractères anatomiques et végétatifs, et de la morphologie variable de ses fruits, les Rosaceae ont été depuis longtemps considérées comme monophylétique. Les étamines nombreuses et l’absence d’albumen peuvent être les apomorphies de base. Les récentes analyses des séquences rbcl sont en faveur de ce monophylétisme. La classification de cette famille selon les différentes approches phylogénétique ou morphologique est bien établie, contrairement à sa division en quatre sous- familles bien plus controversée, et dont le critère traditionnel est le type de fruit : Amygdaloideae (famille du pêcher), Maloideae (famille du pommier), Rosoideae (famille du rosier) et Spiraeoideae (famille de la spirée). En effet, les sous-familles classiques ne sont pas confirmées par l’analyse moléculaire, les Spiraeoideae n’étant pas monophylétiques [Judd et al., 2002]. La position systématique des Rosaceae est présentée dans le tableau II-5.
44 2. INTRODUCTION
Tableau II-5 : Position systématique de la sous-famille Rosoideae selon différentes approches phylogénétique ou morphologique [Cronquist, 1988; Thorne, 1992; Thorne, 1992b; The Angiosperm Phylogeny Group, 1998]. Cronquist (1988) Thorne (1992) APGII (1998) Règne Plantae Plantae Plantae Embranchement Magnoliophyta Spermatophytae Spermatophyta Sous-embranchement - Angiospermae Angiospermae Classe Magnoliopsida Magnoliidae Eudicotyledonae Sous-classe Rosidae Rosanae Rosidae Ordre Rosales Rosales Eurosidae I Sous-ordre - Rosales Famille Rosaceae Rosaceae Rosaceae Sous-famille Rosoideae Rosoideae Rosoideae
Les caractères morphologiques principaux des Rosaceae sont les suivants [Judd et al., 2002]:
Feuilles : généralement alternes, simples à souvent composées palmées ou pennées, généralement stipulées. Inflorescences : variables. Fleurs : - hermaphrodites ou rarement unisexuées. - généralement actinomorphes, à hypanthium aplati, cupulaire ou cylindrique, libre ou adné aux carpelles, souvent accrescent dans le fruit, et à anneau nectarifère interne. - généralement cinq sépales et cinq pétales. - étamines généralement nombreuses, à filets libres ou soudés à la base du disque nectarifère. - un ou plusieurs carpelles, libres ou soudés, parfois adnés à l’hypanthium ; ovaire supère ou infère ; style en nombre égal à celui des carpelles ; stigmates terminaux ; un ou plusieurs ovules par carpelle, basaux, latéraux, apicaux ou en placentation axile. Fruits : - fleur inférovariée : pomme. - fleur superovariée et hypogyne : groupe d’akènes, de follicules, de drupéoles portés par le réceptacle accrescent et constituant un fruit composé. - fleur superovariée, péri- et épigyne : drupe. - graine sans albumen.
45 2. INTRODUCTION
2.4.3 Intérêts économiques et médicaux La famille des Rosaceae est l’une des plus importantes économiquement, avec de nombreuses espèces cultivées pour leurs fruits comestibles, comme plantes ornementales ou médicinales.
Les plantes alimentaires sont principalement du genre Malus (pommier), représenté de nos jours par des milliers de cultivars répandus dans toutes les régions tempérées. Les autres fruits, présentant aussi un intérêt commercial très important, sont des genres : Prunus (P. armeniaca : abricot ; P. avium : cerise ; P. cerasus : griotte ; P. dulcis : amande ; P. persica : pêche), Pyrus (P. communis : poire), Rubus (R. fruticosus : mûre ; R. idaeus : framboise), Fragaria (F. vesca : fraise des bois) et Eriobotrya (E. japonica : nèfle du japon) [Judd et al., 2002; Spichiger et al., 2004].
Les plantes ornementales de cette famille sont représentées par différents genres d’herbacées tels qu’Alchemilla (les alchémilles), Geum (les benoîtes), Cotoneaster (les cotoneasters), Pyracantha (les pyracantha) ou Potentilla (les potentilles) ; et par de nombreuses plantes ligneuses dont le genre le plus répandu dans le monde est incontestablement Rosa. Les roses (Rosa spp.) sont des hybrides complexes dérivés d’environ neuf espèces sauvages [Judd et al., 2002; Spichiger et al., 2004].
Une description exhaustive des plantes médicinales de la famille des Rosaceae n’est évidemment ni envisageable ni le but de ce présent travail. Une présentation de certaines de ces drogues est ainsi effectuée selon différents critères, tels que leur présence dans les Pharmacopées Helvétique et Européenne, la pertinence de leur activité pharmacologique, l’étendue de leur utilisation ou leur importance économique ou historique. Ces divers critères nous permettent d’obtenir trois catégories de Rosaceae :
les Rosaceae à tanins les Rosaceae cyanogènes un choix de Rosaceae intéressantes.
La catégorie de Rosaceae la plus importante du point de vue médicinal, est sans aucun doute celle des Rosaceae à tanins, présentée dans le tableau II-6. Ces différentes drogues ont toutes en commun une utilisation traditionnelle de par des propriétés (astringence, antisepsie, inhibition enzymatique, etc.) qui, pour autant qu’elles soient démontrées, pourraient être la conséquence de la présence de tanins. Elles contiennent des proportions variables, mais néanmoins conséquentes, de tanins condensés et hydrolysables, leurs activités astringentes étant principalement dues à ce dernier type de tanins aussi dénommés tanins galliques ou ellagiques.
46 2. INTRODUCTION
Une autre constatation peut être effectuée, c’est l’appartenance majoritaire de ces drogues à la sous-famille des Rosoideae avec comme seule exception, Sorbus aucuparia L. En effet, une étude chimiotaxonomique a démontré que les tanins hydrolysables monomères sont largement distribués chez les espèces herbeuses et frutescentes des Rosoideae, et quasiment absents chez les espèces arborescentes des autres sous-familles. De plus, les tanins hydrolysables oligomères peuvent être utilisés comme marqueurs chimiotaxonomiques de certaines espèces de Rosoideae. Le genre Rubus est caractérisé par la présence de sanguiines H-6 et H-11, le genre Geum par celle de la gémine A et les genres Agrimonia, Fragaria et Potentilla par celle de l’agrimoniine [Okuda et al., 1992; Bruneton, 1999].
Tableau II-6 : Quelques Rosaceae à tanins répertoriées pour leur usage médicinal [Bruneton, 1999; Wichtl et Anton, 2003]. Rosaceae à tanins Nom français Organe Substances Utilisation Agrimonia eupatoria L. Aigremoine Sommités fleuries Tanins Traditionnelle des tanins séchées Hétérosides (Astringent, Vulnéraire, flavonoïques Antiseptique, Antidiarrhéique, etc.) Alchemilla vulgaris L. (syn. Alchémille vulgaire Parties aériennes Tanins Traditionnelle des tanins Alchemilla xanthochlora séchées Flavonoïdes Rothm.) Fragaria vesca L. Fraisier des bois Feuilles séchées Tanins Traditionnelle des tanins Rhizomes Flavonoïdes Acide ascorbique Potentilla erecta (L.) Tormentille Souches rhizomateuses Tanins Traditionnelle des tanins Raüschel Rosa canina L. et Rosa Eglantiers (rosier des Fruits (cynorhodon) Caroténoïdes Traditionnelle des tanins pendulina L. chiens et rosier des Tanins Carence en vitamine C alpes) Flavonoïdes Acide ascorbique Rubus fruticosus Agg. et Mûrier et framboisier Feuilles séchées Tanins Traditionnelle des tanins Rubus idaeus L. Flavonoïdes Sorbus aucuparia L. Sorbier, cormier Fruits (cormes) Tanins Traditionnelle des tanins Sorbitol Carence en vitamine C Acide ascorbique Hétéroside de l’acide parasorbique
La deuxième catégorie est celle des Rosaceae médicinales cyanogènes, elle comprend majoritairement des espèces du genre Prunus, ces dernières étant présentées dans le tableau II- 7. Ce genre mais, aussi beaucoup d’autres Maloideae (Cotoneaster, Cydonia, Malus, Pyracantha, Sorbus) ont la capacité d’élaborer des hétérosides cyanogènes générateurs d’acide
47 2. INTRODUCTION
cyanhydrique (HCN). Ces composés sont connus pour leur toxicité, la dose létale minimale en HCN étant de l’ordre de 100 mg pour un adulte, mais le danger réel des Rosaceae cyanogènes ornementales, fruitières ou sauvages est pratiquement nul. En effet l’absorption doit être massive et dans le cas des fruits, leur pulpe ne contient pas d’hétérosides, dans celui des feuilles généralement riches en hétérosides, elles ne sont que rarement ingérées. La seule espèce conservant un usage en pharmacie est Prunus laurocerasus L. ou laurier-cerise, sa feuille fraîche sert à la préparation de l’eau distillée de laurier-cerise (aromatisant, antispasmodique, stimulant respiratoire) [Bruneton, 1999; Bruneton, 2001].
Tableau II-7 : Quelques Rosaceae cyanogènes répertoriées pour leur usage médicinal ou leur toxicité [Bruneton, 1999; Wichtl et Anton, 2003]. Rosaceae cyanogènes Nom français Organe Substance Utilisation Prunus dulcis (Miller) D.A. Amandier Huile Acides gras Cosmétologie Webb var. dulcis et Prunus Graines Insaponifiable Dermatologie dulcis (Miller) D.A. Webb Hétérosides Anti-inflammatoire var. amara (DC.) cyanogénétiques Laxatif (amygdaloside) (var. Antispasmodique amara) Stimulant respiratoire Prunus armeniaca L. et Abricotier Huile Acides gras Cosmétologie autres Prunus Noyaux Insaponifiable Dermatologie Hétérosides cyanogénétiques (amygdaloside) Prunus laurocerasus L. Laurier-cerise Feuilles fraîches Hétérosides Aromatisant cyanogénétiques Antispasmodique (prunasine), HCN Stimulant respiratoire Prunus serotina Ehrh. Prunier de virginie Ecorces Hétérosides Aromatisant cyanogénétiques Antispasmodique (prunasine), HCN Stimulant respiratoire
Le tableau II-8 présente la dernière catégorie de Rosaceae sélectionnées : quelques espèces à activités très diverses mais très importantes sur le marché des phytomédicaments ou de l’agro- alimentaire telles que l’aubépine (Crataegus laevigata (Poiret) DC. et Crataegus monogyna Jacq.), le bois de Panama (Quillaja saponaria Molina) ou encore le prunier d’Afrique (Prunus africana Kalkman).
48 2. INTRODUCTION
Tableau II-8 : Quelques Rosaceae intéressantes répertoriées [Bruneton, 1999; Wichtl et Anton, 2003]. Diverses Rosaceae Nom français Organes Composition chimiques Utilisations Crataegus laevigata (Poiret) Aubépine Fruits Tanins condensés Cardiotonique DC. et Fleurs séchées (proanthocyanidols) Hypotenseur Crataegus monogyna Jacq. Sommités fleuries Flavonoïdes séchées Filipendula ulmaria (L.) Reine des prés, Fleurs séchées Dérivés salicylés Anti-inflammatoire Maxim spirée, ulmaire Sommités fleuries Flavonoïdes Analgésique séchées Tanins Huile essentielle Prunus africana Kalkman Prunier d’Afrique Ecorces Acides gras Hyperplasie bénigne de Phytostérols la prostate Acides triterpéniques Alcanols linéaires Quillaja saponaria Molina Bois de panama Ecorces séchées Saponines Détergent Adoucissant Antiprurigineux
2.4.4 Présentation du genre Potentilla Le nom Potentilla a été attribué à la plante par le naturaliste suédois Karl von Linné. Il dérive du latin potens (puissant) ou potentia (puissance), faisant allusion aux propriétés astringentes de certaines espèces. En effet, les « potentilles », de même que beaucoup de Rosoideae, sont historiquement connues pour leur grande teneur en tanins et pour tous leurs emplois traditionnels liés à ces composés (cf. 2.4.3). Les espèces du genre Potentilla sont des plantes herbacées pérennes ou arbustives. Les fleurs sont à 5 verticilles, solitaires ou en grappes, de couleur généralement jaune, mais certaines espèces ont des fleurs blanches, roses ou brun-pourpre. Elles ont de nombreuses étamines (>10). Les fruits sont des akènes. Les feuilles sont imparipennées ou digitées avec souvent 5 folioles, d’où les divers noms de « quintefeuille », « Fingerkraut », « cinquefoil » ou « five- finger ». Ce genre compte environ 500 espèces dans les régions tempérées et une trentaine d’espèces dans les Alpes helvétiques [Landolt et Aeschimann, 2005] .
2.4.5 Travaux scientifiques antérieurs sur le genre Potentilla De part son grand intérêt économique et sa répartition géographique étendue, la famille des Rosaceae a fait l’objet de très nombreuses publications. Au jour d’aujourd’hui, dix-sept espèces de Potentilla ont fait le sujet d’investigations phytochimiques, celles-ci portant majoritairement sur quatre espèces dont trois sont officinales dans de nombreux pays (P. anserina L., P. erecta (L.) Raeuschel, P. fruticosa L. et P. reptans L.). De ces études en résulte l’isolement d’environ quatre-vingt métabolites secondaires, tels que des dérivés terpéniques (triterpènes, saponines,
49 2. INTRODUCTION
phytostérols), des polyphénols divers (flavonoïdes, tanins, coumarines), des acides organiques simples et des composés, fréquents dans les plantes à fleurs mais rares dans ce genre, tels que des polyprénols ou des dérivés glycosylés d’ionones [Xue et al., 2005].
La sous-famille Rosoideae possède un marqueur qui lui est propre, le 2-pyrone-4,6-acide dicarboxylique. Ce composé présente un intérêt certain lorsque l’on considère qu’il est présent dans toutes les espèces de cette sous-famille. Les dix-sept espèces de Potentilla investiguées, dont P. erecta, P. aurea, P. anserina et P. grandiflora, en contiennent dans des proportions variables [Wilkes et Glasl, 2001].
COOH
O O COOH
Figure II-28 : 2-pyrone-4,6-acide dicarboxylique (46)
2.4.5.1 Tanins Comme vu précédemment (cf. 2.4.3 et 2.4.5), le genre Potentilla contient de prime abord des plantes à tanins. Les composés isolés sont autant des monomères que des oligomères de tanins hydrolysables : agrimoniine, acides agrimoniques A et B, potentilline ou encore casuarictine, que des tanins condensés, principalement sous forme d’oligomères (procyanidine B-1, B-2, B- 3, B-5, B-6, C-2) [Okuda et al., 1984; Schleep et al., 1986; Vennat et al., 1992; Feng et al., 1996]. Le rhizome de P. erecta (L.) Raeuschel est, par exemple, particulièrement riche en tanins condensés (70%) et hydrolysables. Dans certains cas, ces tanins sont utilisés comme marqueurs chimiotaxonomiques de la sous-famille des Rosoideae ou même de certains genres. L’agrimoniine, isolée pour la première fois dans Agrimonia pilosa, a été mise en évidence dans plusieurs espèces de Potentilla [Lund et Rimpler, 1985; Okuda et al., 1992].
50 2. INTRODUCTION
OH
HO O
O HO OH O O HO OH O OH O O O OH HO O O O O OH O HO O O OH HO OH O O OH O HO O O HO OHHO OH OH O O O OH
OH HO OH
HO OHHO OH
Figure II-29 : Agrimoniine (47)
2.4.5.2 Flavonoïdes Un très grand nombre de flavonoïdes sont décrits dans de multiples espèces de ce genre, majoritairement des flavonols substitués de manière très simple par des groupes hydroxy ou méthoxy uniquement [Xue et al., 2005], très fréquents dans la famille des Rosaceae. Une étude chromatographique de la composition en flavonoïdes des fleurs de vingt-six espèces de Potentilla a été effectuée et vient compléter ces informations [Harborne et Nash, 1984]. Une particularité est à souligner : un biflavanoïde original, la potentillanine, possédant une liaison 6’,8 entre les deux monomères flavanols a été isolée de P. viscosa Steud. [Zhang et al., 1988].
OH
OH
HO O OH
OH
OGlc HO O OH
OGlc OH
Figure II-30 : Potentillanine (48)
2.4.5.3 Triterpènes et stéroïdes Outre la présence de tanins en grande quantité, le genre Potentilla contient également une proportion significative de métabolites terpéniques tels que les triterpènes, saponines,
51 2. INTRODUCTION
phytostérols ou encore ecdystéroïdes [Dinan et al., 2001]. Une autre classe de composés apparentés et issue de la dégradation de ces derniers, les ionones, sera quant à elle présentée séparément (cf. 2.4.5.6.). Différentes études ont permis l’identification, à partir de P. multifida (L.) et de P. fruticosa (L.), d’une série de différents acides dérivant des squelettes oléanane (α-amyrine) et ursane (β- amyrine) qui sont des triterpènes pentacycliques [Ganenko et Semenov, 1989; Xue et al., 2004]. Ces dérivés de l’α et β-amyrine, tels que l’acide tormentique ou l’acide ursolique sont communs dans la famille des Rosaceae et ont déjà été isolés dans les genres Rubus, Rosa et Eriobotrya (Figure II-31) [Young et al., 1987; Lien et al., 1999; Taniguchi et al., 2002].
R2 R1
R3
H R3 H CO2H R2 H H HO R1 H H HO R1 = β-OH R2 = H R3 = H (49)
R1 = β-OH R2 = OH R3 = OH (50) R1 = H R2 = Me R3 = COOH (55)
R1 = α-OH R2 = H R3 = H (51) R1 = Me R2 = H R3 = Me (56)
R1 = β-OH R2 = OH R3 = H (52)
R1 = α-OH R2 = OH R3 = OH (53)
R1 = β-OH R2 = H R3 = OH (54)
Figure II-31 : Triterpènes isolés dans le genre Potentilla Acide ursolique (49), Acide tormentique (50), Acide moninoursolique A (51), Acide colosolique (52), Acide euscapique (53), Acide pomolique (54), 3,23-dihydroxy-, (3β, 4β )- (9CI) (55), Urs-12-ène-3,23-diol, (3β , 4β)- (9CI) (56)
De même, des saponines dérivant de ces triterpènes, tel que le tormentoside, un monoglucoside de l’acide tormentique, ont également été décrites dans le genre Potentilla et plus particulièrement dans P. erecta (L.) Raeuschel [Bilia et al., 1994; Stachurski et Strzelecka, 1994; Stachurski et al., 1995]. Les saponines isolées dans ce genre sont toutes des sapogénines triterpéniques monodesmosidiques substituées par un D-glucose (Glc) (Figure II-32). La présence de saponines chez les Rosaceae est relativement anecdotique, l’exception étant le bois de Panama (cf. 2.4.3) ou Quillaja saponaria Molina, utilisé massivement dans l’industrie pour son pouvoir détergent dû à une forte proportion de « quillayasaponine » [Bruneton, 1999].
52 2. INTRODUCTION
R4 R5 HO R4 R3 R3
H CO2Glc H CO2Glc HO R1 H H R 1 HO R2 H H R2
R1 = OH R2 = H R3 = Me R4 = H (57) R1 = H R2 = Me R3 = H R4 = OH R5 = Me (61)
R1 = H R2 = OH R3 = Me R4 = H (58) R1 = OH R2 = Me R3 = H R4 = Me R5 = H (62)
R1 = OH R2 = H R3 = H R4 = Me (59) R1 = H R2 = Me R3 = OH R4 = Me R5 = H (63)
R = OH R = COOH R = OH R = Me R = H (64) R1 = OH R2 = H R3 = Me R4 = H (60) 1 2 3 4 5
Figure II-32 : Saponines isolées dans le genre Potentilla Tormentoside (57), Kajiichigoside F1 (58), Arjunétine (59), Rosamultine (60), Olean-12-ène-28-oique acide, 3,19-dihydroxy-, β- D-glucopyranosyl ester, (3β,19α)- (9CI) (61), Urs-12-ène-28-oique acide, 2,3-dihydroxy-, β-glucopyranosyl ester, (2α,3β)- (9CI) (62), Urs-12-ène-28-oique acide, 3,19-dihydroxy-, β-D-glucopyranosyl ester, (3α)- (9CI) (63), Trachelospéroside A1 (64)
Issus du même squelette de base, l’époxysqualène, quelques phytostérols ont été isolés de P. anserina (L.) et P. fruticosa (L.) (Figure II-33) [Ganenko et al., 1991; Li et al., 2003]. Le sitostérol et le stigmastérol se retrouvent dans l’insaponifiable de l’huile de soja (Glycine soja Siebold & Zucc., Fabaceae) et ces composés sont une des principales sources de phytostérols pour l’hémisynthèse des stéroïdes par l’industrie pharmaceutique [Bruneton, 1999].
R2 H H
H H
R1 HO
R1 = OH R2 = Et (65) (68)
R1 = OH R2 = Me (66)
R1 = O-Glc R2 = Et (67)
Figure II-33 : Stérols isolés dans le genre Potentilla Sitostérol (65), Campastérol (66), Daucostérine (67), Stigmastérol (68)
2.4.5.4 Coumarines Des études de P. anserina, P. argentea et P. erecta [Goncharov et al., 1987; Goncharov et Kotov, 1991] ont permis de mettre en évidence, pour la première fois dans le genre, quelques coumarines simples : coumarine, ombelliférone, esculétine et scopolétine. Alors que plus d’un millier de coumarines ont été décrites, et que les plus simples d’entre elles sont largement
53 2. INTRODUCTION
répandues chez les végétaux supérieur; leur présence dans la famille des Rosaceae et plus particulièrement dans le genre Potentilla est relativement rare.
R1
O O R2
R1 = H R2 = H (69) R1 = OH R2 = OH (71)
R = H R = OH (70) 1 2 R1 = OMe R2 = OH (72)
Figure II-34 : Coumarines isolées dans le genre Potentilla Coumarine (69), Ombelliférone (70), Esculétine (71), Scopolétine (72)
2.4.5.5 Polyprénols Des composés (Figure II-35) décelés dans les feuilles de P. aurea (L.) sont les plus longues chaînes poly-cis-prénols sous forme d’esters d’acides gras connues jusqu’ici dans les angiospermes [Swiezewska et Chojnacki, 1991]. Des poly-cis-prénols de taille moindre se retrouvent chez d’autres représentants de ce genre (P. anserina) [Swiezewska et Chojnacki, 1989].
2 n OH
n = 13-41
Figure II-35 : Structure des polyprénols de P. aurea (L.) (73)
2.4.5.6 Ionones Récemment et pour la première fois dans le genre Potentilla, des dérivés glycosylés d’ionones
de la classe des C13-norisoprénoïdes ont été isolés (Figure : III-36) [Xue et al., 2005]. Ces dérivés sont des composés issus de la dégradation de molécules non volatiles tels que des terpènes et se retrouvent par exemple dans les huiles essentielles. Ils proviennent de la dégradation (autooxydation, photo-oxygénation et dégradation thermique) ou du clivage enzymatique des carotènes et sont fréquents dans les fruits où ils contribuent à la composition
des arômes [Bruneton, 1999; Baldermann et al., 2005]. Des C13-norisoprénoïdes ont déjà été isolés de plusieurs genres de Rosaceae tels que Averrhoa, Cydonia, Eriobotrya, Rosa ou encore Prunus [Tommasi et al., 1992; Kaul et al., 1999; Ito et al., 2001; Lutz-Roder et al., 2002; Fleischmann et al., 2003; Baldermann et al., 2005] et ceci principalement pour des espèces comestibles.
54 2. INTRODUCTION
OH OH
OH HO
O OH O HO H HO O OH OH O OH C H C H C OH C
OH O O
(74) O (75) OH O OH
OH HO OH
OH OH O OH O O OH OH O O
(76) (77)
Figure II-36 : Ionones isolées dans le genre Potentilla Citroside A (74), Icariside B (75), Vomifoliol-9-O-β-D-xylopyranosyl- (1-->6)-O-β-D-glucopyranoside (76), Roseoside A (77)
Quatre dérivés glycosilés d’ionones ont été isolés dans P. multifida et leurs structures ont été identifiées comme étant le citroside A, l’icariside B1, le roseoside A et le vomifoliol-9-O-β- D-xylopyranosyl-(1-->6)-O- β-D-glucopyranoside [Xue et al., 2005].
2.4.6 Utilisations médicinales et traditionnelles des Potentilla Parmi le genre Potentilla, trois espèces ont été ou sont toujours considérées comme officinales : P. anserina L., P. erecta (L.) Raeuschel et P. reptans L. [Hänsel et al., 1994]. L’espèce la plus connue est sans doute P. erecta appelée aussi Tormentille ou Herbe au Diable. Historiquement, les rhizomes de la Tormentille étaient utilisés en usage externe en rinçage et gargarisme contre les stomatites et les angines, pour traiter les maux de dents et la poudre moyennement fine était considérée comme un excellent dentifrice. Des bains et des compresses en cas d’ulcères, de brûlures, d’engelures ou d’hémorroïdes étaient aussi préconisés. De nombreux usages internes sont répertoriés tels que pour la dysenterie, les ulcères, la goutte, les sciatiques, la fièvre et les affections pulmonaires, cardiaques et hépatiques. Les feuilles servaient à combattre la fièvre, l’épilepsie, les ictères ; elles étaient aussi employées en compresses pour soigner les plaies [Schaffner et al., 1992; Hänsel et al., 1994; Wichtl et Anton, 2003].
55 2. INTRODUCTION
L'Ansérine (P. anserina) ou Herbe aux Oies, est aussi appelée « Argentine », la face inférieure des feuilles portant de nombreux poils argentés. En médecine empirique, la drogue est particulièrement utilisée dans le traitement des dysménorrhées d’origine spastique, voire dans l’incontinence urinaire. Au jour d’aujourd’hui et malgré de nombreuses publications, le bien- fondé de ces indications ainsi, que la présence de composés à activité spasmolytiques, n’ont pu être démontrés [Bliss Jr. et al., 1940; Ther et Ventzke, 1947; Youngken et al., 1949; Smetana et Fischer, 1963; Hänsel et al., 1994]. En raison de leur teneur élevée en tanins, ces différentes Potentilla ont des indications très similaires découlant de ces composés. Elles ont des propriétés astringentes, anti-inflammatoires et sont utilisées par voie interne comme antidiarrhéique, dans les gastroentérites et les dysenteries ainsi que dans la symptomatologie hémorroïdaire. Par voie externe, elles sont utilisées dans les inflammations des muqueuses buccopharyngées, notamment en gargarismes, en lavage et badigeonnage [Bruneton, 1999; Wichtl et Anton, 2003]. Une étude a mis en évidence sur les extraits aqueux de P. erecta et P. anserina une inhibition in vitro de la biosynthèse des prostaglandines et de l’exocytose induite par le PAF (platelet activating factor), pouvant résulter en un possible effet anti-inflammatoire [Tunon et al., 1995]. Par voie interne, les tanins exercent un effet antidiarrhéique et antiseptique clairement démontré [Bruneton, 1999]. Une étude contrôlée, randomisée, en double aveugle effectuée pour tester l’efficacité d’un extrait de P. erecta lors de gastro-entérite chez les jeunes enfants (principalement dues aux rotavirus) confirme encore cette indication [Subbotina et al., 2003]. Plus récemment, d’autres activités pharmacologiques ont été mises en évidence à partir d’extraits et ont montré sur le rat un pouvoir bactériostatique, molluscicide contre l’hôte intermédiaire du vecteur de la schistosomiase (P. erecta (L.) Rausch) et antiviral [Schaufelberger et Hostettmann, 1983; Vennat et al., 1992; McCutcheon et al., 1995], ainsi que des effets antiallergiques, antihypertensifs, antiulcéreux (P. reptens L.) et hypoglycémiques (P. fulgens L.) [Syiem et al., 2002; Wichtl et Anton, 2003; Gürbüz et al., 2005]. De nombreux tanins, hydrolysables ou condensés ont des propriétés antioxydantes et antiradicalaires. Diverses études effectuées sur des Potentilla ont confirmées ces activités. Ainsi, la fraction hydrosoluble de P. erecta agirait comme capteur de l’anion superoxide et serait donc antiradicalaire. Les pentamères et hexamères de proanthocyanidines seraient les plus actifs [Vennat et al., 1994]. Une autre étude portant sur le même genre a confirmé les propriétés antioxydantes de ces proanthocyanidines par le biais de l’inhibition de la lipoperoxydation et de l’élastase, une enzyme protéolytique [Bos et al., 1996].
56 2. INTRODUCTION
2.4.7 Présentation de Potentilla grandiflora L. Parmi les différentes plantes alpines récoltées, se trouve une seule Rosaceae : Potentilla grandiflora (L.) (Figure II-37) ou potentille à grandes fleurs. Outre l’intérêt grandissant pour ce genre, P. grandiflora possède le grand avantage de n’avoir jamais été investiguée avant nos travaux et le criblage s’est avéré prometteur (cf. 3.2).
Figure II-37 Photographie de Potentilla grandiflora L.
P. grandiflora est une plante herbacée vivace de 10 à 30 centimètres de haut. Les feuilles trifoliées et dentelées sont longues de 2 à 3 centimètres, longuement pétiolées, portent des poils gris sur leur face inférieure et celles de la base persistent à la floraison. Les fleurs, de 1 à 1.5 centimètres de larges, sont à 5 verticilles, solitaires ou en grappes de couleur jaune. Elles ont de nombreuses étamines (>10). Les fruits sont des akènes. Elle pousse dans les pâturages et herbages acidiphiles alpins entre 800 et 3000 mètres d’altitude. C’est une plante peu fréquente, des montagnes d’Europe centrale et méridionale [Lauber et Wagner, 2000; Landolt et Aeschimann, 2005]. La figure II-38 représente sa répartition géographique en Suisse.
Figure II-38 : Carte de répartition géographique (suisse) de Potentilla grandiflora L.
Le matériel végétal étudié dans ce travail (plante entière de Potentilla grandiflora (L.)) a été récolté par Monsieur Egidio Anchisi dans la région du vallon de l’Urtier dans le Val-d’Aoste (Italie) à une altitude de 2600 mètres.
57 2. INTRODUCTION
2.5 La famille des Ericaceae
2.5.1 Introduction Les Ericaceae ont une distribution quasi cosmopolite, mais sont spécialement bien représentées dans les zones froides ou tempérées dans les montagnes tropicales, en Afrique, dans l’est de l’Amérique du nord et en Asie orientale (Figure II-39). Elles ont une très forte concentration dans l’Himalaya, en Nouvelle-Guinée, en Afrique du sud et dans les Andes. Elles sont par contre absentes en Australie, où elles sont largement remplacées par les Epacridaceae. La majeure partie des espèces sont des buissons héliophiles sur des sols arides, mais cette famille contient également des arbres, des arbustes, des herbes ou encore des lianes. La plupart sont bien adaptées aux terres acides, aux tourbières et aux marécages. La famille des Ericaceae compte dans le monde près de 3000 espèces réparties en environ 100 genres [Heywood, 1996; Judd et al., 2002; Spichiger et al., 2004].
Figure II-39 : Carte de répartition géographique des Ericaceae d’après [Heywood, 1996]).
2.5.2 Classification systématique et aspects botaniques La classification globale des Ericaceae et de certaines familles proches a été l’objet de vives controverses pendant de nombreuses années. De récentes recherches phylogénétiques effectuées par l’APG ont résulté à l’inclusion dans les Ericaceae, des Empetraceae, des Epacridaceae, des Monotropaceae, des Prionotaceae et des Pyrolaceae, habituellement considérées comme indépendantes. Actuellement la classification comprend donc huit sous- familles dont les Enkianthoideae, les Monotropoideae, les Arbutoideae, les Cassiopoideae, les Styphelioideae, les Harrimanelloideae, les Ericoideae et les Vaccinioideae. Les deux dernières sous-familles étant les plus importantes, elles comprennent respectivement trois des principaux genres de cette famille soit Rhododendron (800 spp.), Erica (600) et Vaccinium (400) [Judd et
58 2. INTRODUCTION
al., 2002; Kron et al., 2002; Spichiger et al., 2004]. La position systématique des Ericaceae est présentée dans le tableau II-9.
Tableau II-9 : Position systématique des Ericaceae selon différentes approches phylogénétique ou morphologique [Cronquist, 1988; Thorne, 1992; Thorne, 1992b; The Angiosperm Phylogeny Group, 1998]. Cronquist (1988) Thorne (1992) APGII (1998) Règne Plantae Plantae Plantae Embranchement Magnoliophyta Spermatophytae Spermatophyta Sous-embranchement - Angiospermae Angiospermae Classe Magnoliopsida Magnoliidae Eudicotyledonae Sous-classe Dilleniidae Dillenianae Rosidae Ordre Ericales Ericales Asterids Sous-ordre - - Ericales Famille Ericaceae Ericaceae Ericaceae
Les caractères morphologiques principaux des Ericaceae sont les suivants [Judd et al., 2002; Spichiger et al., 2004]:
Feuilles : alternes, parfois opposées ou verticillées, simples, entières à dentées-serrées. Dans les zones montagneuses extra-tropicales, souvent en aiguilles (éricoïdes) adaptées à des régimes hydriques défavorables. Pas de stipules. Inflorescences : souvent racémeuse ou paniculée, parfois fleur solitaire. Fleurs : - généralement hermaphrodites, rarement unisexuées, actinomorphes à légèrement zygomorphes. - 4 ou 5 sépales souvent libres ou légèrement soudés, calice parfois réduit à un anneau. 4 ou 5 pétales généralement soudés, formant une corolle cylindrique ou urcéolée, à lobes petits ou grands, imbriqués ou valvaires, parfois campanulée ou infundibuliforme, parfois dialypétale. - 8 à 10 étamines, filets libres et fixés sur le réceptacle, anthères à déhiscence poricide, souvent avec appendices bicornes. - Ovaire supère, parfois infère (Vaccinioideae), pluriloculaire, un seul style, stigmate généralement capité, placentation axile, plusieurs ovules par loge, généralement anatropes, unitégumentés. Fruits : - capsule, baie ou drupe - petite graine, souvent ailée, albumen charnu, embryon droit.
59 2. INTRODUCTION
2.5.3 Intérêts économiques et médicaux Les Ericaceae ne possèdent ni l’impact économique des familles présentées précédemment telles que les Fabaceae ou les Rosaceae ni leur importance médicinale. Néanmoins elles comprennent de nombreuses espèces ornementales, des baies comestibles très répandues et utilisées dans certaines régions de l’hémisphère nord ainsi que quelques plantes médicinales intéressantes.
Les plantes alimentaires, principalement du genre Vaccinium, fournissent de nombreux fruits comestibles. Certaines de ces espèces et de leurs hybrides sont sujettes à des cultures intensives dans certaines régions du monde, telles que les USA ou l’Asie orientale. C’est particulièrement le cas pour la myrtille (V. myrtillus), la myrtille géante (V. corymbosum) et la canneberge (V. macrocarpum). 270 000 tonnes de cette dernière ont été récoltées en 2004 aux USA selon la banque de donnée FAOSTAT. Ces différents fruits sont connus et appréciés en nature (frais ou séchés) ainsi que sous forme de jus, de sauce pour leur valeur gustative et leur teneur en vitamine C. L’arbousier (Arbutus unedo) et le thé du Canada (Gaultheria procumbens) ne font pas l’objet de cultures intensives comme certains Vaccinium, mais sont également des Ericaceae utilisées pour leurs fruits comestibles.
Cette famille comprend de nombreuses espèces ornementales dans les genres Arbutus (l’arbousier), Calluna (la callune), Erica (la bruyère), Gaultheria (thé du Canada) et Rhododendron (l’azalée, le rhododendron). Les genres les plus fréquents étant sans aucun doute Rhododendron et Erica dont de nombreuses espèces et hybrides ornent nos jardins.
Les Ericaceae ne fournissent pas un très grand nombre de plantes médicinales, néanmoins quelques unes doivent être soulignées et sont présentées dans le tableau II-10.
60 2. INTRODUCTION
Tableau II-10 : Quelques Ericaceae intéressantes répertoriées [Bruneton, 1999; Wichtl et Anton, 2003; Spichiger et al., 2004]. Diverses Rosaceae Nom français Organes Composition chimiques Utilisations Arbutus unedo L. Arbousier Fruits Tanins Antidiarrhéique Feuilles Anthocyanosides Stimulation sanguine Anti-inflammatoire Arctostaphyllos uvae-ursi Busserole Feuilles Tanins Astringent (L.) Spreng Raisin d’ours Hétérosides phénoliques Désinfectant urinaire (arbutine) Flavonoïdes Gaultheria procumbens L. Gaulthérie couchée Feuilles Tanins Antiseptique Thé du Canada Essence de wintergreen Salicylate de méthyle Antirhumatismal Antalgique Vaccinium macrocarpon Canneberge Fruits Anthocyanosides Antiseptique Aiton Acides-phénols Désinfectant urinaire Flavonoïdes Vaccinium myrtillus L. Myrtille Feuilles Anthocyanosides Traitement de troubles Fruits Acides-phénols vasculaires Flavonoïdes (rétinopathies) Proanthocyanidols Hypoglycémiant Astringent Antidiarrhéique Antimicrobien
Dans ces quelques Ericaceae médicinales, nous pouvons remarquer la présence de deux espèces du genre Vaccinium, leurs utilisations médicinales et traditionnelles seront exposées plus en détails ultérieurement (cf. 2.5.6)
2.5.4 Présentation du genre Vaccinium Les Vaccinium sont des petits arbustes montagnards de 20 à 50 cm de haut des régions tempérées. Leur répartition géographique s'étend des zones circumboréales aux montagnes des zones tropicales, notamment en Amérique du Nord et dans les massifs anciens d'Europe. Comme toutes les Ericaceae, ce sont des plantes acidophiles. Les fleurs sont à 4 à 7 pétales, généralement soudés. Les fruits sont sphériques à l’aspect de baie et provenant d’un ovaire infère. Ils sont donc, botaniquement, de fausses baies. Les feuilles sont arrondies, ovales ou largement lancéolées, souvent coriaces. Le feuillage est généralement persistant, seules quelques espèces sont caduques. Ce genre compte environ 400 espèces dont six sont présentes dans les Alpes helvétiques.
Comme nous avons pu le voir précédemment (cf. 2.5.2 et 2.5.3), chez les Ericaceae, les fausses baies du genre Vaccinium ont une grande importance économique et dans une moindre mesure
61 2. INTRODUCTION
médicale. Les différentes espèces de ce genre fournissent les fameuses « berries » ou airelles, du latin atra : « brûlé » :
V. myrtillus : myrtille V. oxycoccos : canneberge des marais ou canneberge à petits fruits V. uliginosum : airelle des marais V. vitis-idaea : airelle rouge V. macrocarpum : canneberge ou atoca V. corymbosum : corymbelle ou myrtille géante V. angustifolium airelle à feuilles étroites ou bleuet
La dénomination de ces différents fruits par leurs noms communs peut être relativement ardue, le terme airelle étant non seulement employé pour plusieurs espèces et désignant aussi bien le végétal que son fruit. De même, la terminologie anglaise des Vaccinium ou « berries » : blueberries, cranberries, bilberries etc. semble conduire à de nombreuses confusions. En effet, rien que sous l’appellation blueberries trois différentes espèces sont répertoriées : V. myrtillus, V. corymbosum et V. angustifolium. La plus grande prudence est alors de mise lors de l’utilisation des noms communs, des différents qualificatifs anglo-saxons et de leur équivalence avec les noms botaniques de ces plantes [Bruneton, 2001; Judd et al., 2002; Landolt et Aeschimann, 2005].
2.5.5 Travaux scientifiques antérieurs sur le genre Vaccinium De part son grand intérêt économique et alimentaire, le genre Vaccinium a fait l’objet de très nombreuses publications. Au jour d’aujourd’hui, 12 espèces ont été le sujet d’investigations phytochimiques, celles-ci portant majoritairement sur 5 espèces dont une est officinale dans de nombreux pays (V. myrtillus L.). De ces études en résulte l’isolement de nombreux métabolites secondaires, principalement des polyphénols issus du métabolisme général des flavonoïdes, tels que des anthocyanosides, des flavonoïdes, des leucoanthocyanosides et des tanins condensés. Des dérivés terpéniques (iridoïdes, triterpènes, saponines), un grand nombre d’acides organiques simples ainsi que des traces d’alcaloïdes quinolizidiniques (myrtine, épimyrtine : dans les feuilles uniquement) ont également été isolés de ce genre [Bruneton, 1999]. Aux vues de la pléthore de publications sur ce genre, nous nous intéresserons premièrement uniquement aux recherches portant sur les organes autres que les fruits, ce qui correspondra aux extraits actifs dans ce travail. En effet, les fruits de ce genre sont très bien étudiés d’un point de vue phytochimique, contrairement aux feuilles et aux tiges. Deuxièmement, nous nous intéresserons aux travaux effectués sur Vaccinium uliginosum ssp. microphyllum (Lange) Tolm.
62 2. INTRODUCTION
2.5.5.1 Anthocyanosides Le terme d’anthocyane, initialement forgé pour désigner la substance responsable de la coloration des fleurs du bleuet, s’applique à un groupe de pigments hydrosolubles responsables de la coloration rouge, rose, mauve, pourpre, bleue ou violette de la plupart des fleurs et des fruits. Ces pigments sont caractéristiques des fruits des Vaccinium et sont présents dans les feuilles en bien moindre proportions [Bruneton, 1999].
2.5.5.2 Flavonoïdes Un grand nombre de flavonoïdes sont décrits dans de multiples espèces de ce genre. Singulièrement, la littérature décrit uniquement des flavonols glycosilés dont les génines sont de deux types : quercétine ou kaempférol. Ces dernières sont très rarement substituées et de manière très simple par des groupes hydroxy ou méthoxy uniquement. Les hétérosides flavonoïdiques sont substitués uniquement sur l’hydroxyl en C-3 par des hexoses ou des pentoses. Les flavonoïdes isolés dans les feuilles de ce genre ont donc une très grande homogénéité structurelle [Bohm et Koupai-Abyazani, 1994; Smolarz et al., 2000].
2.5.5.3 Tanins Les feuilles des différentes espèces de Vaccinium contiennent une forte proportion de tanins (jusqu’à 10%), majoritairement de type proanthocyanidols (tanins condensés). Divers composés ont été isolés tels que la catéchine, l’épicatechine, la gallocatéchine ou encore l’épigallocatéchine [Friedrich et Schoenert, 1973; Bohm et Koupai-Abyazani, 1994].
R1
OH
HO O
R2
OH
OH
Série 2-R, 3-S Série 2-R, 3-R
R1 = OH R2 = H (78) R1 = OH R2 = H (80)
R = OH R = OH (79) R1 = OH R2 = OH (81) 1 2
Figure II-40 : Proanthocyanidols isolés dans le genre Vaccinium Catéchine (78), Gallocatéchine (79), Epicatéchine (80), Epigallocatéchine (81).
63 2. INTRODUCTION
2.5.5.4 Terpènes et stéroïdes Outre la présence de polyphénols divers en grande quantité, le genre Vaccinium contient, comme le genre Potentilla, quelques métabolites terpéniques tels que des iridoïdes, des triterpènes ou des phytostérols. Différentes études ont permis l’identification, à partir de V. bracteatum Thunb. et de V. corymbosum L., d’une série de différents acides dérivant des squelettes oléanane (α-amyrine) et ursane (β-amyrine) qui sont des triterpènes pentacycliques (Figure II-41) [Tu et al., 1997; Migas et al., 2005].
R1 R2
R3
H H CO2H H H H H
HO R1 H
R1 = H R2 = Me R3 = H (82) R1 = CO (84)
R = OH (85) R1 = Με R2 = H R3 = H (83) 1
Figure II-41 : Triterpènes isolés dans le genre Vaccinium Acide ursolique (82), Acide oléanolique (83), Friedeline (84), Friedelinol (85).
Issus du même squelette de base, l’époxysqualène, quelques phytostérols, comme le stigmastérol et la daucostérine, ont été isolés de V. bracteatum Thunb. et V. vitis-idaea L. (Figure II-42) [Tu et al., 1997].
R2 H H
H H
R1 HO
R1 = O-Glc R2 = Et (86) (87)
Figure II-42 : Stérols isolés dans le genre Vaccinium Daucostérine (86), Stigmastérol (87)
Quelques iridoïdes ont été isolés des feuilles de ce genre. Le vaccinoside a, par exemple, été isolé pour la première fois des fleurs de V. bracteatum Thunb. (Figure II-43) [Swiatek et Komorowski, 1972; Sakakibara et al., 1973].
64 2. INTRODUCTION
HO
HO OH AcO O H HO O O HO H H H HO O H O O H HO OH OH O O HO
H COOH (88) (89) HO
HO O
O HO O OH H H OH O O OH H COOH
(90)
Figure II-43 : Iridoïdes isolés dans le genre Vaccinium Monotropéine (88), Asperuloside (89), Vaccinoside (90)
2.5.5.5 Acides phénols et phénols simples Différentes feuilles de ce genre contiennent un très grand nombre de phénols simples et plus particulièrement pour certaines, des dérivés de l’arbutine (Figure II-44).
HO R1O
OH HO R2O OH O O
HO O R3O O OH OR4
R1 = H R2 = H R3 = H R4 = H (91) (95)
R1 = Ac R2 = H R3 = H R4 = H (92)
R1 = H R2 = H R3 = H R4 = Ac (93)
R1 = Ac R2 = Ac R3 = Ac R4 = Ac (94)
Figure II-44 : Phénols simples isolés dans le genre Vaccinium Arbutine (91), Pyroside (92), Isopyroside (93), 2,3,4,5-tétraacétate-arbutine (94), Salidroside (95)
65 2. INTRODUCTION
La présence d’hydroquinone, de son glucoside l’arbutine ou encore de son monométhyléther, les composés actifs d’Arctostaphyllos uva-ursi, sont controversés dans certaines espèces comme V. myrtillus. Leur présence dans certaines autres, comme V. vitis-idaea, est non seulement bien documentée, mais en plus ils sont très riches en composés comme le pyroside ou la 3,4-dihydroxycinnamate-arbutine [Britton et al., 1965].
HO OH HO
HO O O
O HO O OH
(96)
Figure II-45 : 3,4-dihydroxycinnamate-arbutine (96)
De nombreux acides-phénols dérivés de l’acide benzoïque et principalement de l’acide cinnamique ont également été isolés (Figure II-46) [Mzhavanadze et al., 1971; Dombrowicz et al., 1991].
OH OH
HO OH OH
O O
O O
HOOC OH
(97)
R OH HO 3 OH R2 O O COOH HO
O O R4 R5 OH HO OH R1
R1 = H R2 = OH R3 = H R4 = COOH R5 = H (98) (100)
R1 = OH R2 = H R3 = COOH R4 = H R5 = OH (99)
Figure II-46 : Acides phénols isolés dans le genre Vaccinium Acide isochlorogénique A (97), Acide 5-p-coumaroylquinique (98), Acide 3-O-caffeoylquinique (99), Acide rosemarique (100)
66 2. INTRODUCTION
2.5.5.6 Travaux scientifiques antérieurs sur l’espèce Vaccinium uliginosum ssp. microphyllum (Lange) Tolm. Les travaux scientifiques sur cette espèce de Vaccinium sont relativement peu fréquents et concernent principalement la distribution et le taux des composés phénoliques dans les fruits. Plusieurs publications parues dans le « Journal of Agricultural and Food Chemistry » ont rapporté les taux totaux de flavanoïdes, flavonoïdes, anthocyanidines, proanthocyanidines et de catéchines dans plusieurs fruits du genre Vaccinium dont V. uliginosum [Haekkinen et al., 1999; Kaehkoenen et al., 2001; Maeaettae-Riihinen et al., 2004; Taruscio et al., 2004; Maeaettae-Riihinen et al., 2005]. Alors que les taux de flavanols sont relativement stables dans toutes les espèces, cette espèce possèderait le plus haut taux de flavonols. Les composants majoritaires dans V. uliginosum sont des anthocyanidines dont toute une série ont également été isolés de divers organes. Les génines sont des cinq types les plus fréquents (malvidine, cyanidine, pétunidine, delphinidine et péonidine) et sont toutes substituées en C-3 par un sucre pour donner des anthocyanosides stables et hydrosolubles (Figure II-47) [Andersen, 1987; Bruneton, 1999].
R1
OH
HO O
+ R2
O-Gly
OH
R1 = OCH3 R2 =OCH3 (101) R1 = OH R2 = OH (104)
R1 = OH R2 = H (102) R1 = OCH3 R2 = H (105)
R1 = OCH3 R2 = OH (103)
Figure II-47 : Anthocyanosides isolés dans V. uliginosum Malvidine-3-O-glycoside (101), Cyanidine-3-O-glycoside (102), Pétunidine-3-O-glycoside (103), Delphinidine-3-O-glycoside (104), Péonidine-3-O-glycoside (105)
Des dérivés du phloroglucinol et de l’acide filicinique, isolés principalement dans le genre Hypericum et plus particulièrement chez H. uliginosum H.B. & K., ont également été isolés des fruits de V. uliginosum [Hayashi, 1949; Parker et Johnson, 1968]. L’uliginosine A et B ont montré des activités in vitro significatives et prometteuses contre Staphylococcus aureus [Taylor et Brooker, 1969; Dall'Agnol et al., 2005].
67 2. INTRODUCTION
O O
OH OH O OHHO HO OHHO
O O
OH O OH O
(106) (107)
Figure II-48 : Dérivés du phloroglucinol isolés dans V. uliginosum Uliginosine B (106), Uliginosine A (107)
De nombreuses études ont été effectuées sur les composés volatiles des fruits du genre Vaccinium, et dans certains cas elles incluent également les fruits de V. uliginosum. Une grande série de composés terpéniques responsables de certains arômes tels que la vanilline, le citronellol, la myristicine ou encore le farnésol ont été isolés [Hirvi et Honkanen, 1983].
2.5.6 Utilisations médicinales et traditionnelles des Vaccinium Comme nous avons pu le voir précédemment (cf. 2.5.5 et 2.5.3) principalement deux espèces de Vaccinium ont une importance médicinale : V. macrocarpon Aiton et V. myrtillus L.. Cette dernière est également officinale dans de nombreux pays.
Les feuilles et les fruits de la myrtille ou « blueberry » (V. myrtillus L.) sont officinaux et sont non seulement utilisés en phytothérapie mais également par l’industrie pharmaceutique pour l’extraction des anthocyanosides. Les feuilles sont traditionnellement utilisées dans la symptomatologie hémorroïdaire, dans les manifestations subjectives de l’insuffisance veineuse, dans les traitements symptomatiques des diarrhées légères et sont plus particulièrement considérées comme hypoglycémiantes et entrent dans la composition de tisanes antidiabétiques. L’effet hypoglycémiant est actuellement en cours d’investigation et l’efficacité des indications revendiquées traditionnellement n’ayant pas été prouvée, l’utilisation thérapeutique de préparations à base de feuilles de myrtille n’est actuellement pas recommandée. Les fruits de V. myrtillus, en raison de leur teneur en tanins, sont considérés comme antidiarrhéique dans les cas légers d’entérite. Les anthocyanosides de la myrtille sont recommandés pour améliorer la microcirculation dans les troubles capillaires et veineux. Classiquement, il est admis et confirmé que ces composés, en facilitant la régénération de la rhodopsine, améliorent la vision en lumière atténuée. Chez l’homme, des résultats expérimentaux et des observations cliniques nombreuses font état de résultats favorables dans le traitement de troubles vasculaires (phlébopathies, microangiopathies diabétiques, ecchymoses, purpuras, gingivorragies). Les anthocyanosides ont également été testés dans le traitement des rétinopathies d’origine
68 2. INTRODUCTION
hypertensive ou diabétique. Ils sont également utilisés pour régénérer l’épithélium dans les cas d’ulcères gastriques et intestinaux, et même en usage externe pour améliorer la cicatrisation des plaies [Bruneton, 1999; Wichtl et Anton, 2003].
La canneberge ou « cranberry » (V. macrocarpon Aiton), une espèce spontanée de l’est de l’Amérique du Nord, produit des petits fruits rouge foncé, largement consommés en nature, sous forme de confiture ou encore de jus très riche en vitamine C. Aujourd'hui elle est cultivée industriellement aux USA et au Canada dans des cannebergières, terrains aménagés qui, à l'image des rizières, peuvent être ennoyées pour la culture et surtout pour la récolte qui a lieu par flottaison des baies. Un usage très ancien lui attribuait des effets bactériostatiques bénéfiques dans le traitement des infections urinaires. Cet usage a été confirmé et selon les publications les plus récentes l’action serait liée à une inhibition de l’adhérence des bactéries sur les muqueuses. Si cette action a été démontrée in vitro dans le cas de l’adhésion d’E. coli sur des cellules uroépithéliales ; et qu’un essai clinique en double aveugle vs placebo récent a montré que la consommation quotidienne de jus de canneberge induisait chez les personnes âgées une diminution significative de la fréquence de contamination bactérienne de l’urine (4 à 8 semaines de traitements), actuellement le ou les principes actifs ne sont pas connus. Une nature procyanidolique n’est pas exclue [Bruneton, 1999; McMurdo et al., 2005].
2.5.7 Présentation de Vaccinium uliginosum ssp. microphyllum (Lange) Tolm. L’airelle des marais, Vaccinium uliginosum ssp. microphyllum (Lange) Tolm. (Figure II-49), comme son nom l’indique, est prospère dans les tourbières et les marais. On lui donne aussi le nom de myrtiller de loup, d’airelle bleue ou orcette.
Figure II-49 Photographie de Vaccinium uliginosum ssp. microphyllum (Lange) Tolm.
Il existe une dizaine de sous-espèces et/ou variétés répertoriées. Dans les Alpes Suisse, on en retrouve principalement deux : V. uliginosum L. S. Str. et V. uliginosum ssp. microphyllum (Lange) Tolm. (syn. V. gaultherioides Bigelow) Le présent travail a été effectué sur cette dernière sous-espèce. Son étude a été entreprise à la suite de résultats très prometteurs du criblage, principalement une activité antifongique marquée contre Pyrenophora teres.
69 2. INTRODUCTION
V. uliginosum est un arbuste nain de 10 à 20 cm de haut. Les feuilles caduques sont entières, arrondies, de 1 à 1.5 cm de large, bleu-vert à la face supérieure et gris-vert à la face inférieure et glauques. Les fleurs, de 1 à 1.5 cm de larges, sont à 5 verticilles, solitaires ou en grappes de couleur jaune. Elles ont de nombreuses étamines (>10). Les fruits sont des fausses baies globuleuses, bleu noir, ressemblent beaucoup aux myrtilles mais leur intérieur est blanc et non rouge. Considérées comme non vénéneuses, elles provoquent pourtant des nausées lorsqu'elles sont consommées en grande quantité. Elle pousse dans les tourbières, les landes, les pentes rocheuses subalpines et les bois humides des montagnes circumboréales. C’est une plante fréquente des montagnes d’Europe centrale et méridionale [Lauber et Wagner, 2000; Landolt et Aeschimann, 2005]. La figure II-50 représente sa répartition géographique en Suisse.
Figure II-50 : Carte de répartition géographique (suisse) de Vaccinium uliginosum ssp. microphyllum (Lange) Tolm.
Le matériel végétal étudié dans ce travail (tiges de Vaccinium uliginosum ssp. microphyllum (Lange) Tolm. a été récolté par Monsieur Egidio Anchisi dans la région autour du col du Petit- Saint-Bernard dans le Val-d’Aoste (Italie) à une altitude de 2200 mètres.
70
3. RÉSULTATS
3. RÉSULTATS
3.1 Récolte des plantes alpines et préparation des extraits bruts
Dans ce travail, une sélection de 45 plantes alpines de diverses familles a été récoltée. Toutes les plantes ont été cueillies en août 2001 dans les Alpes centrales dans les étages suprasubalpin et alpin à des altitudes allant de 2200 à 2700 mètres. De ces différentes plantes, 106 extraits bruts ont été préparés selon un protocole d’extraction standard du Laboratoire de Pharmacognosie et de Phytochimie (LPP). L’épuisement successif des drogues séchées par un solvant apolaire, le dichlorométhane (DCM), et un solvant polaire, le méthanol (MeOH) permet l’extraction d’une majeure partie de leurs constituants. Le matériel végétal et les protocoles sont décrits dans la partie expérimentale (cf. 5.1). Le tableau III-1 présente le résultat de ces extractions.
Tableau III-1 : Extraits préparés à partir des plantes alpines récoltées.
Famille Nom botanique Organe (poids sec) Extrait Poids Rendement DCM 4.2 g 3.2 % Asteraceae Achillea erba-rotta All. Plante entière (130 g) MeOH 16.2 g 12.5 % DCM 1.5 g 1.4 % Artemisia borealis Pall. Plante entière (106 g) MeOH 8.0 g 7.5 % DCM 1.0 g 1.4 % Doronicum clusii Tausch Plante entière (70 g) MeOH 6.1 g 8.7 % DCM 3.0 g 2.6 % Dryas octopetala L. Plante entière (115 g) MeOH 28.4 g 24.7 % DCM 3.9 g 3.2 % Erigeron uniflorus L. Plante entière (122 g) MeOH 5.5 g 4.5 % DCM 1.7 g 1.5 % Gnaphalium norvegicum Gunn. Plante entière (114 g) MeOH 13.8 g 12.1 % DCM 1.3 g 4.6 % Hieracium auricula L. Plante entière (28 g) MeOH 5.9 g 21.1 % DCM 1.9 g 2.8 % Hieracium pilosella L. Plante entière (67 g) MeOH 9.6 g 14.3 % Leucanthemopsis alpina (L.) DCM 1.3 g 2.8 % Plante entière (46 g) V.H.Heywood MeOH 8.6 g 18.7 % DCM 4.4 g 2.2 % Senecio doronicum L. Plante entière (200 g) MeOH 7.1 g 3.6 % DCM 2.5 g 3.2 % Senecio incanus L. Plante entière (78 g) MeOH 11.9 g 15.3 % DCM 3.6 g - Senecio rupestris Waldst. & Kit. Plante entière (- g) MeOH 3.6 g - DCM 3.8 g - Apiaceae Bupleurum ranunculoides L. Plante entière (- g) MeOH 3.8 g - DCM 3.0 g 3.3 % Brassicaceae Arabis alpina L. Plante entière (92 g) MeOH 7.5 g 8.2 % DCM 0.9 g 2.7 % Partie aérienne (33 g) MeOH 6.3 g 19.1 % Hugueninia tanacetifolia (L.) Rchb. DCM 1.0 g 0.8 % Racine (128 g) MeOH 9.4 g 7.3 % Murbeckiella pinnatifida (Lam.) DCM 2.9 g 5.4 % Plante entière (54 g) Rothm. MeOH 10.7 g 19.8 % DCM 1.6 g 2.1 % Petrocallis pyrenaica (L.) R.Br. Plante entière (76 g) MeOH 5.1 g 6.7 %
73 3. RÉSULTATS
Famille Nom botanique Organe (poids sec) Extrait Poids Rendement DCM 0.9 g 2.5 % Thlaspi lereschianum Rouy & Fouc Plante entière (36 g) MeOH 7.2 g 20.0 % DCM 1.3 g 1.1 % Caryophyllaceae Herniaria alpina Vill. Plante entière (121 g) MeOH 2.6 g 2.1 % DCM 3.4 g 2.1 % Minuartia laricifolis Schinz & Thell. Plante entière (159 g) MeOH 16.2 g 10.2 % DCM 2.1 g 2.1 % Minuartia recurva Schinz & Thell. Plante entière (100 g) MeOH 9.4 g 9.4 % DCM 0.9 g - Saponaria lutea L. Plante entière (- g) MeOH 5.5 g - DCM 0.5 g 1.3 % Dipsacaceae Scabiosa lucida Vill. Plante entière (39 g) MeOH - - DCM 1.7 g 1.1 % Feuille (160 g) Vaccinium uliginosum ssp. MeOH 6.0 g 3.8 % Ericaceae microphyllum (Lange) Tolm. DCM 1.9 g 0.5 % Brindilles (385 g) MeOH 3.9 g 1.0 % DCM 2.7 g 0.7 % Feuille (398 g) MeOH 7.1 g 1.8 % Rhododendron ferrugineum L. DCM 1.9 g 0.4 % Partie aérienne (430 g) MeOH 5.4 g 1.3 % DCM 2.2 g 2.1 % Fabaceae Lotus alpinus Schleich. ex Ramond Plante entière (103 g) MeOH 4.3 g 4.2 % DCM 1.8 g - Astragalus frigidus (L.) A. Gray Plante entière (- g) MeOH 12.4 g - DCM 5.3 g 2.3 % Oxytropis campestris (L.) DC. Plante entière (229 g) MeOH 26.7 g 11.7 % DCM 0.9 g 1.8 % Partie aérienne (49 g) MeOH 2.8 g 5.7 % Oxytropis fetida (Vill.) DC. DCM 1.5 g 2.9 % Racine (51 g) MeOH 3.1 g 6.1 % DCM 1.0 g 2.5 % Oxytropis helvetica Scheele Plante entière (40 g) MeOH 5.1 g 12.75 % DCM 2.3 g 2.1 % Oxytropis jacquinii Bunge Plante entière (108 g) MeOH 10.6 g 9.8 % DCM 0.6 g 1.4 % Lamiaceae Scutellaria alpina L. Plante entière (43 g) MeOH 5.8 g 13.4 % DCM 12.2 g 10.8 % Thymus praecox Opiz Plante entière (113 g) MeOH 11.8 g 10.4 % DCM 1.1 g 1.1 % Onagraceae Epilobium alpestre (Jacq.) Krocker Plante entière (96 g) MeOH 9.8 g 10.2 % DCM 2.1 g - Epilobium fleischeri Hochst. Plante entière (- g) MeOH 2.1 g - DCM 0.7 g 1.1 % Plumbaginaceae Armeria alpina Willd. Plante entière (65 g) MeOH 3.9 g 6.0 % DCM 1.2 g 1.8 % Polygonaceae Oxyria digyna Hill Plante entière (62 g) MeOH 5.7 g 9.2 % DCM 2.0 g 1.9 % Ranunculaceae Anemone baldensis L. Plante entière (104 g) MeOH 14.0 g 13.5 % DCM 1.6 g 2.1 % Callianthemum coriandrifolium Rchb. Plante entière (76 g) MeOH 6.6 g 8.7 % DCM 1.9 g - Pulsatilla halleri Willd. Plante entière (- g) MeOH 1.9 g - DCM 3.5 g 3.0 % Ranunculus aconitifolius L. Plante entière (115 g) MeOH 18.9 g 16.4 % DCM 1.9 g 1.8 % Rosaceae Potentilla grandiflora L. Plante entière (106 g) MeOH 13.0 g 12.3 %
74 3. RÉSULTATS
Famille Nom botanique Organe (poids sec) Extrait Poids Rendement DCM 0.8 g 1.5 % Scrophulariaceae Pedicularis cenisia Gaud. Plante entière (53 g) MeOH 11.6 g 21.9 % DCM 0.7 g 1.4 % Pedicularis kerneri Dalla Torre Plante entière (51 g) MeOH 7.1 g 13.9 % DCM 1.9 g 5.8 % Partie aérienne (33 g) MeOH 7.3 g 22.1 % Valerianaceae Valeriana saliunca All. DCM - - Racine (60 g) MeOH 16.1 g 26.8 %
75 3. RÉSULTATS
3.2 Criblage des plantes alpines
3.2.1 Introduction Les extraits bruts des plantes alpines présentées précédemment (cf. 3.1) ont été soumis à différents tests biologiques, biochimiques et chimiques, afin de déterminer leurs potentiels activités et intérêts. Ces tests sont principalement de nature antifongique et radicalaire, en accord avec la problématique de ce travail, mais des tests menés en routine dans le laboratoire ont également été effectués : Tests antifongiques activité antifongique sur Cladosporium cucumerinum (C. c.), activité antifongique sur Candida albicans (C. a.), activité antifongique sur Pyrenophora teres (P. t.), Tests antiradicalaires activité antiradicalaire avec le 1,1-diphényl-2-picrylhydrazyle (DPPH), Autres tests activité inhibitrice de l’acétylcholinestérase (AchE).
Mis à part le test antifongique sur Pyrenophora teres effectué en collaboration avec le Syngenta® Jealott's Hill International Research Center, ces tests ont tous été effectués sur chromatographie sur couche mince (CCM) après élution des extraits testés. Ils sont décrits en détails dans la partie expérimentale (cf. 5.5 et 5.6).
3.2.2 Résultats et discussion Les résultats du criblage biologique, biochimique et chimique sont présentés dans le tableau III- 2. Différents paramètres sont à prendre en compte pour une bonne compréhension et analyse de ces résultats. Pour les tests effectués par CCM, l’appréciation des activités est faite de manière visuelle et comparative entre les extraits. C’est donc une analyse basée sur une échelle relative et non absolue. Dans ce criblage, il ne faut jamais perdre de vue que nous travaillons avec des extraits bruts et qu’un résultat positif est la composante de deux paramètres : l’activité intrinsèque des produits actifs et leur quantité relative dans l’extrait. Il convient donc de souligner qu’une activité observée pour ces tests peut être due à un ou plusieurs composés minoritaires très actifs ou à un ou plusieurs composés majoritaires peu actifs.
76 3. RÉSULTATS
Tableau III-2 : Criblage des extraits bruts des plantes alpines.
Famille Nom botanique Organe Extrait C. c. C. a. P. t. AchE DPPH Plante DCM 0 nd 0 0 0 Asteraceae Achillea erba-rotta All. entière MeOH 0 nd 0 0 ++ Plante DCM + + +++ 0 0 Artemisia borealis Pall. entière MeOH 0 - 0 0 ++ Plante DCM 0 nd 0 + 0 Doronicum clusii Tausch entière MeOH 0 nd 0 0 + Plante DCM 0 nd 0 0 0 Dryas octopetala L. entière MeOH 0 nd 0 0 0 Plante DCM 0 nd 0 0 +/- Erigeron uniflorus L. entière MeOH 0 nd 0 +/- ++ Plante DCM 0 nd 0 0 0 Gnaphalium norvegicum Gunn. entière MeOH 0 nd 0 +/- ++ Plante DCM 0 nd nd 0 0 Hieracium auricula L. entière MeOH 0 nd nd 0 +++ Plante DCM +/- nd nd 0 0 Hieracium pilosella L. entière MeOH 0 nd nd 0 +++ Leucanthemopsis alpina (L.) Plante DCM +++ 0 nd 0 +/-
V.H.Heywood entière MeOH 0 0 nd 0 +++ Plante DCM 0 nd 0 0 +/- Senecio doronicum L. entière MeOH 0 nd 0 0 +/- Plante DCM +/- nd 0 0 0 Senecio incanus L. entière MeOH 0 nd 0 0 + Plante DCM 0 nd 0 0 +/- Senecio rupestris Waldst. & Kit. entière MeOH 0 nd 0 0 0 Plante DCM +/- nd 0 0 + Apiaceae Bupleurum ranunculoides L. entière MeOH 0 nd 0 0 + Plante DCM 0 nd 0 0 ++ Brassicaceae Arabis alpina L. entière MeOH 0 nd 0 0 +/- Partie DCM ++ nd nd + + aérienne MeOH 0 nd nd 0 ++ Hugueninia tanacetifolia (L.) Rchb. DCM + nd nd + + Racine MeOH 0 nd nd 0 + Murbeckiella pinnatifida (Lam.) Plante DCM 0 nd nd +/- +
Rothm. entière MeOH 0 nd nd 0 + Plante DCM + nd nd ++ + Petrocallis pyrenaica (L.) R.Br. entière MeOH 0 nd nd 0 ++ Plante DCM 0 nd nd 0 +/- Thlaspi lereschianum Rouy & Fouc entière MeOH 0 nd nd 0 0 Plante DCM 0 nd 0 0 0 Caryophyllaceae Herniaria alpina Vill. entière MeOH 0 nd 0 0 0 Minuartia laricifolis Schinz & Plante DCM +/- nd nd +/- 0
Thell. entière MeOH 0 nd nd 0 + Plante DCM +/- nd nd +/- 0 Minuartia recurva Schinz & Thell. entière MeOH 0 nd nd 0 + Plante DCM 0 nd 0 0 0 Saponaria lutea L. entière MeOH 0 nd 0 0 0 Plante DCM 0 nd 0 0 0 Dipsacaceae Scabiosa lucida Vill. entière MeOH 0 nd 0 0 +/- DCM 0 0 0 0 + Feuille Vaccinium uliginosum ssp. MeOH 0 0 +++ 0 ++ Ericaceae microphyllum (Lange) Tolm DCM 0 0 0 0 0 Tiges MeOH 0 0 +++ 0 ++ DCM +/- 0 0 0 + Feuille MeOH 0 0 0 0 ++ Rhododendron ferrugineum L. Partie DCM 0 0 0 0 + aérienne MeOH 0 0 +++ 0 ++
77 3. RÉSULTATS
Famille Nom botanique Organe Extrait C. c. C. a. P. t. AchE DPPH Lotus alpinus Schleich. ex DCM 0 nd 0 0 0 Fabaceae Plante entière Ramond MeOH 0 nd 0 0 0 DCM 0 nd nd 0 0 Astragalus frigidus (L.) A. Gray Plante entière MeOH 0 nd nd 0 0 DCM +/- 0 0 0 +/- Oxytropis campestris (L.) DC. Plante entière MeOH 0 0 0 0 0 Partie DCM +++ 0 0 0 +/- aérienne MeOH 0 0 0 0 +/- Oxytropis fetida (Vill.) DC. DCM +++ 0 0 0 ++ Racine MeOH ++ 0 0 0 + DCM + 0 0 0 0 Oxytropis helvetica Scheele Plante entière MeOH 0 0 0 0 0 DCM + 0 0 0 0 Oxytropis jacquinii Bunge Plante entière MeOH + 0 0 0 0 DCM 0 nd 0 0 0 Lamiaceae Scutellaria alpina L. Plante entière MeOH 0 nd 0 +/- ++ DCM 0 nd 0 0 0 Thymus praecox Opiz Plante entière MeOH 0 nd 0 +/- ++ Epilobium alpestre (Jacq.) DCM 0 nd 0 0 0 Onagraceae Plante entière Krocker MeOH 0 nd 0 0 ++ DCM 0 nd 0 0 0 Epilobium fleischeri Hochst. Plante entière MeOH 0 nd 0 0 ++ DCM 0 nd 0 0 0 Plumbaginaceae Armeria alpina Willd. Plante entière MeOH 0 nd 0 0 ++ DCM 0 nd nd +/- 0 Polygonaceae Oxyria digyna Hill Plante entière MeOH 0 nd nd 0 +++ DCM 0 nd 0 0 0 Ranunculaceae Anemone baldensis L. Plante entière MeOH 0 nd 0 0 + Callianthemum coriandrifolium DCM 0 nd nd +/- + Plante entière Rchb. MeOH 0 nd nd 0 +/- DCM 0 nd 0 0 +/- Pulsatilla halleri Willd. Plante entière MeOH 0 nd 0 +/- ++ DCM 0 nd 0 0 +/- Ranunculus aconitifolius L. Plante entière MeOH 0 nd 0 0 +/- DCM ++ 0 0 0 + Rosaceae Potentilla grandiflora L. Plante entière MeOH 0 0 0 0 + DCM 0 nd 0 0 + Scrophulariaceae Pedicularis cenisia Gaud. Plante entière MeOH 0 nd 0 0 ++ DCM 0 nd 0 0 0 Pedicularis kerneri Dalla Torre Plante entière MeOH 0 nd 0 0 +/- Partie DCM ++ nd nd 0 0 aérienne MeOH 0 nd nd 0 +/- Valerianaceae Valeriana saliunca All. DCM + nd nd 0 + Racine MeOH 0 nd nd 0 0
nd : activité non déterminée ; 0 : pas d’activité ; +/- : activité faible ; + : activité moyenne ; ++ : bonne activité ; +++ : forte activité
Plusieurs extraits des plantes alpines sélectionnées se sont révélés actifs sur Cladosporium cucumerinum. Mis à part, les extraits méthanoliques des racines d’Oxytropis fetida (Vill.) DC. et d’Oxytropis jacquinii Bunge, ce sont principalement des extraits apolaires qui ont retenu notre attention. Trois extraits dichlorométhaniques ont montré une forte activité sur la moisissure phytopathogène Cladosporium cucumerinum, celui de Leucanthemopsis alpina (L.) V.H.Heywood et ceux des parties aériennes et des racines d’Oxytropis fetida. (Vill.) DC.
78 3. RÉSULTATS
De plus, les extraits dichlorométhaniques d’Hugueninia tanacetifolia (L.) Rchb., Potentilla grandiflora L. et Valeriana saliunca All. possèdent également une bonne activité antifongique. Un genre retient particulièrement notre attention, pour l’uniformité de son activité antifongique. En effet, tous les extraits apolaires des espèces du genre Oxytropis se sont révélés plus ou moins actifs, tandis que deux extraits polaires de ce même genre ont une activité significative. Dans le genre Oxytropis, comme nous l’avons vu précédemment (cf. 2.3.6.3), de nombreuses saponines ont été isolées. Ces composés sont connus pour leur activité à l’encontre des champignons, aussi bien à l’égard d’espèces phytopathogènes qu’à l’encontre de divers Candida ou de dermatophytes. Par exemple l’hédérasaponine C d’O. myriophylla DC., est une pro-drogue qui par hydrolyse donne l’α-hédérine, un puissant antifongique [Bruneton, 1999]. Les extraits méthanolique (bonne activité) et dichlorométhanique (forte activité) d’Oxytropis fetida (Vill.) DC ont donc été choisis pour une étude phytochimique plus approfondie, tandis que les autres extraits de ce genre ont été analysés par des expériences LC/DAD-UV et LC/UV/ESI-MSn.
Le test autobiographique sur Candida albicans a été effectué, non pas sur la totalité des extraits de plantes alpines, mais sur une sélection de ces derniers. Un seul extrait a montré une faible activité sur cet organisme, il s’agit de l’extrait dichlorométhanique d’Artemisia borealis Pall.
Le test en solution sur Pyrenophora teres a permis de tester les extraits des plantes alpines sur une cible antifongique différente. L’appréciation des activités s’effectue de manière automatisée et est de type « non actif / actif ». L’extrait dichlorométhanique d’Artemisia borealis Pall., ainsi que les extraits méthanoliques des feuilles, des tiges de Vaccinium uliginosum ssp. microphyllum (Lange) Tolm. et des parties aériennes de Rhododendron ferrugineum L., deux Ericaceae, ont montré une activité. Après indication du Syngenta ® Jealott's Hill International Research Centrer, l’extrait le plus actif soit l’extrait méthanolique des feuilles de Vaccinium uliginosum ssp. microphyllum (Lange) Tolm. a été choisi.
Pour le test d’inhibition de l’acétylcholinestérase, seul des extraits dichlorométhaniques ont montrés des activités conséquentes. L’extrait de Petrocallis pyrenaica (L.) R.br. a ainsi présenté une bonne activité, tandis que les extraits de Doronicum clusii Tausch. et des parties aériennes et des racines d’Hugueninia tanacetifolia (L.) Rchb. ont montré une activité moyenne. D’autres extraits dichlorométhaniques sont très faiblement actifs tels que les extraits de Callianthemum coriandrifolium Rchb., Minuartia laricifolia Schinz & Thell., Minuartia recurva Schinz &
Thell., Murbeckiella pinnatifida (Lam.) Rothm. et Oxyria digyna Hill. Quelques extraits méthanoliques sont également très faiblement actifs tels que les extraits d’Erigeron uniflorus
79 3. RÉSULTATS
L., Gnaphalium norvegicum Gunn., Pulsatilla halleri Willd., Scutellaria alpina L. et Thymus praecox Opiz. Il est intéressant de constater que trois des Brassicaceae de cette étude ont fourni les extraits dichlorométhaniques les plus actifs. Cette remarque laisserait penser que certains constituants peu polaires de cette famille possèdent une activité bloquant la dégradation de l’AChE, enzyme-clef dans le développement du syndrome d’Alzheimer. Quelques travaux récents ont montré l’intérêt des Brassicaceae, et plus particulièrement des thiocyanates, dans cette problématique. Le sinapine thiocyanate, par exemple, un dérivé de l’acide cinnamique connu comme un important antioxydant naturel et isolé des graines de Sinapis alba L., possèderait une forte activité inhibitrice de l’AChE in vitro et pourrait potentiellement être utilisé dans le traitement de cette maladie [Liu et al., 2005; Liu et al., 2006; Uchida, 2006]. Néanmoins la plus grande prudence est de mise et plus particulièrement pour les extraits apolaires, ce test est très sensible et peut donner des résultats discutables, ainsi, des résultats « faux positifs » ont déjà été rapportés [Rhee et al., 2003]. De plus, certains insecticides synthétiques utilisés pour protéger des cultures en plein air (dérivés organophosphorés, carbamates,…) se sont révélés de puissants inhibiteurs de cholinestérases et donc certains échantillons végétaux ont pu être contaminés par ce biais [Mendoza et Shields, 1973; Weins et Jork, 1996]. Ainsi, l’étude d’un extrait apolaire, en l’occurrence l’extrait dichlorométhanique de Petrocallis pyrenaica (L.) Rbr., le seul extrait potentiellement intéressant, peut s’avérer périlleux. La faible masse de cet extrait, ainsi que des résultats décevants dans le reste du criblage, nous ont poussés à ne pas retenir ce choix.
Le test antiradicalaire sur DPPH a montré des résultats positifs pour la plupart des extraits méthanoliques de nos plantes alpines. En effet, dans les extraits polaires se retrouvent un grand nombre de composés phénoliques de type flavonoïdes, dont l’activité antiradicalaire a été largement documentée et n’est plus à démontrer [Potterat, 1997]. Les plantes sélectionnées provenant toutes d’altitude supérieure à 2200 mètres et le rayonnement solaire augmentant avec l’altitude, ces conditions favorisent l’élaboration de pigments protecteurs et antiradicalaires (cf. 2.1.2.3). Certains extraits méthanoliques ont une très forte activité et c’est particulièrement le cas pour la majorité des plantes appartenant aux Asteraceae, famille riche en flavonoïdes très divers. Une trentaine de types flavonoïdiques différents ont déjà pu être identifiés dans cette famille [Bruneton, 1999]. Le but de ce travail étant de mettre en évidence des molécules nouvelles potentiellement actives et non d’isoler des composés déjà élucidés, les extraits possédant uniquement une activité antiradicalaire ne seront donc pas choisis pour la suite de ce travail. D’autre part, certains extraits dichlorométhaniques montrent quelque activité antiradicalaire, certes moins marquée que celle des extraits méthanoliques, mais digne d’intérêt. Plus particulièrement, l’extrait dichlorométhanique des racines d’Oxytropis fetida (Vill.) DC.
80 3. RÉSULTATS
est le seul extrait apolaire montrant une bonne activité antiradicalaire. Ces résultats soulignent un peu plus l’intérêt pour cette plante alpine.
Plusieurs conclusions peuvent être effectuées suite à cette analyse du criblage des extraits bruts de plantes alpines. Certains extraits sont de grand intérêt dans notre recherche de composés antifongiques. Le genre Oxytropis, et plus particulièrement les deux extraits des racines de l’espèce O. fetida montrent une activité antifongique marquée sur Cladosporium cucumerinum renforcée par une activité antiradicalaire significative. Concernant les autres extraits apolaires actifs sur cet organisme, parmi ceux d’Artemisia borealis Pall., Leucanthemopsis alpina (L.) V.H.Heywood, Hugueninia tanacetifolia (L.) Rchb., Valeriana saliunca All. et Potentilla grandiflora L., c’est uniquement ce dernier extrait qui a également été sélectionné. Les autres extraits étant soit en quantité trop faible pour espérer un résultat probant, soit provenant d’un genre voire d’une espèce source de très nombreuses publications. En collaboration avec le Syngenta ® Jealott's Hill International Research Centrer, l’extrait le plus actif contre Pyrenophora teres a été choisi, soit l’extrait méthanolique des feuilles de Vaccinium uliginosum ssp. microphyllum (Lange) Tolm. Mis à part l’extrait dichlorométhanique d’Artemisia borealis Pall., il est intéressant de constater l’absence de corrélation entre les résultats des différents tests antifongiques. Cela souligne les structures cellulaires et le métabolisme particulier de chaque plante, et nous fait espérer l’obtention de structures nouvelles et intéressantes et non d’une cytotoxicité non spécifique. Les extraits des plantes alpines sélectionnés pour un fractionnement bioguidé selon leur activité antifongique sont donc les extraits dichlorométhanique et méthanolique des racines d’Oxytropis fetida (Vill.) DC., l’extrait dichlorométhanique de Potentilla grandiflora L. et l’extrait méthanolique des feuilles de Vaccinium uliginosum ssp. microphyllum (Lange) Tolm. Ces quatre extraits présentant tous également des activités antiradicalaires plus ou moins marquées sur le DPPH, celles-ci seront aussi systématiquement évaluées en cours de fractionnement sur les différentes fractions et produits purs.
81 3. RÉSULTATS
3.3 Fractionnement bioguidé de l’extrait dichlorométhanique des racines d’Oxytropis fetida (Vill.) DC.
3.3.1 Analyse LC/DAD-UV préliminaire Comme précédemment évoqué (cf. 2.3 et 3.2), l’extrait dichlorométhanique des racines d’Oxytropis fetida (Vill.) DC. possède plusieurs caractéristiques qui rendent son étude approfondie intéressante :
Une forte activité antifongique sur la moisissure phytopathogène Cladosporium cucumerinum. Seul extrait apolaire montrant une bonne activité antiradicalaire sur le DPPH. Aucune référence phytochimique répertoriée sur cette espèce. Présence dans le genre de molécules à hautes potentialités pharmacologiques (swainsonine, castanospermine).
Afin d’obtenir des informations préliminaires sur les composés présents dans cet extrait, une analyse LC/DAD-UV a été entreprise. La préparation de l’extrait dichlorométhanique est effectuée selon la méthode de routine effectuée au Laboratoire de Pharmacognosie et de Phytochimie de l’Université de Genève (cf. 5.1). Sur le chromatogramme LC/UV (254 nm) de cet extrait, une quinzaine de pics UV-majoritaires ont été enregistré (Figure III-1). L’analyse des spectres UV/Visible correspondants indique notamment la présence de trois classes de composés différenciés par leurs maxima d’absorption. Elles comprennent les composés (1, 2, et 6), (7, 12 et 13) et (5, 8 à 11). Les composés 3, et 4 ne peuvent être appariés à aucun autre composé.
Les spectres UV/Visible des composés 1, 2 et 6 pourraient être significatifs de la présence d’un composé de type phényléthylamine ou phényléthylamide. En effet, ce type de molécules est courant dans le genre Oxytropis (cf. 2.3.6.1) et le spectre UV/Visible des composés montre deux maxima d’absorption à 215 et 275 nm [Akhmedzhanova, 1996]. Les composés 7, 12 et 13 présentent tous le même spectre UV/Visible avec un épaulement à 230 nm suivi d’un maximum d’absorption à 285 nm. Les composés 5, 8 à 11 présentent des maxima similaires aux composés 7, 12 et 13 et possèdent en plus un maximum d’absorption plus intense à 310 nm. Ces spectres UV/Visible pourraient être significatifs de la présence de composés de type ptérocarpane.
82
mAU mAU 500 3 1200 4 400 1000
300 800
600 200 400 % MeCN (+ 0.25 % a.a.) 100 mAU 200 0 0 4 250 300 350 400 450 500 550 nm 250 300 350 400 450 500 550 nm 100
mAU 300 60 1, 2, 6 90 50 3 40
30 11 20 250 10 80 0 250 350 450 550 nm
200 70 mAU 10 600 7, 12, 13 500
400 150 300 60 200 100
0 250 300 350 400 450 500 550 nm 100 2 13 1 8 50 mAU 5 12 6 9 500 5, 8-11 50 7 400 40 300
200
100
0 0 250 300 350 400 450 500 550 nm 30
0 20 40 60 80 100 120 min Figure III-1 : Analyse LC/DAD-UV de l’extrait DCM des racines d’O. fetida (Vill.) DC. Conditions chromatographiques : Colonne: Waters SymmetryShield C18 (150 × 2.1 mm i.d., 5 µm) avec une précolonne du même matériel (1.5 x 2.1 mm i.d., 5 µm) ; Eluant: gradient acétonitrile (0.25 % a.a.) - eau (0.25% a.a.) (30:70 à 100:0 en 100 min) ; injection 100 µg ; débit: 0.2 ml/min ; détection à 254 nm, spectre UV/Visible (DAD) balayé de 190 à 600 nm.
3. RÉSULTATS
Pour les composés 5, 8 à 11, l’apparition d’un maximum d’absorption supplémentaire à 310 nm pourrait être dû la présence d’un cycle dioxolane sur la molécule [Markham, 1982; Vidal et Conan, 1987]. Alors que le spectre UV/Visible du composé 4 est spécifique de celui des isoflavones avec un maximum d’absorption à 260 nm, ainsi que deux épaulements entre 290 et 350 nm [Markham, 1982], le spectre UV/Visible du composé 3 montre des maxima d’absorption à 204 et 280 nm, ainsi qu’un épaulement à 225 nm suggérant la présence d’une isoflavane ou d’un ptérocarpane [Xu et al., 2006]. Le tableau III-3 récapitule les maxima d’absorption des composés 1 à 13.
Tableau III-3 : Maxima d’absorption des composés 1 à 13 de l’extrait DCM des racines d’O. fetida (Vill.) DC.
Composés Maxima d’absorption (λmax) Type de composé supposé
1 215, 275 nm Phényléthylamine/ Phényléthylamide 2 215, 275 nm Phényléthylamine/ Phényléthylamide 3 204, 225 (sh), 280 Isoflavane / Ptérocarpane 4 260, 290 (sh), 325 (sh) Isoflavone 5 230 (sh), 285, 310 nm Ptérocarpane 6 215, 275 nm Phényléthylamine/ Phényléthylamide 7 230 (sh), 285 nm Ptérocarpane 8 230 (sh), 285, 310 nm Ptérocarpane 9 230 (sh), 285, 310 nm Ptérocarpane 10 230 (sh), 285, 310 nm Ptérocarpane 11 230 (sh), 285, 310 nm Ptérocarpane 12 230 (sh), 285 nm Ptérocarpane 13 230 (sh), 285 nm Ptérocarpane
Selon l’analyse LC/DAD-UV préliminaire de l’extrait dichlorométhanique des racines d’O. fetida, les pics UV-majoritaires sont principalement soit des isoflavonoïdes (isoflavones, isoflavanes, ptérocarpanes), soit des phényléthylamines / phényléthylamides. Alors que la présence de cette dernière classe de composés n’est pas étonnante dans ce genre (cf. 2.3.6.1), la présence d’isoflavonoïdes dans une espèce du genre Oxytropis n’a encore jamais été rapportée.
3.3.2 Fractionnement bioguidé de l’extrait dichlorométhanique des racines 3.3.2.1 Activités de l’extrait Lors du criblage réalisé sur les différents extraits de plantes alpines (cf. 3.2), l’extrait dichlorométhanique des racines d’O. fetida (Vill.) DC. a montré des activités antifongique sur Cladosporium cucumerinum et antiradicalaire sur le DPPH intéressantes. Les zones d’inhibition
sont situées à des Rf entre 0.3 et 0.5 (Figure III-2) pour le test sur C. cucumerinum et entre 0.5
84 3. RÉSULTATS
et 1.0 pour le test sur le DPPH. Aucune activité contre C. albicans et P. teres n’a été observée (cf. 3.2).
DPPH Cc 1
0.5
0
Figure III-2 : Activités antiradicalaire (DPPH : 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle) et antifongique (Cc : Cladosporium cucumerinum) de l’extrait DCM des racines d’O. fetida (Vill.) DC. Eluant : Toluène : Acétate d’éthyle (30 :70) ; Dépôt : 100 µg
3.3.2.2 Fractionnement et isolement des composés A à J L’extrait dichlorométhanique des racines (960 mg) de O. fetida a été fractionné par CPC avec
un système de solvant biphasique C6H6-MeCN-EtOH (55:29:16) (v/v/v) (Capacité : 320 ml, Vitesse de rotation : 1000 tours/min, Débit : 3 ml/min, Détection UV : 254 nm, Voltage : 500 mV) et 11 fractions ont été obtenues (1a à 11a). La suite du fractionnement de l’extrait a été principalement effectuée selon les résultats des tests autobiographiques sur C. cucumerinum et des tests antiradicalaires sur le DPPH pour ces 11 premières fractions (Figure III-3).
Les fractions les plus actives étaient les fractions 7a et 8a pour le test autobiographique contre C. cucumerinum et 4a, 7a, 8a et 11a pour le test sur le DPPH. Les zones d’inhibition correspondent vraisemblablement à celles de l’extrait initial et se situent respectivement autour
de Rf de 0.5 et 0.8. Au niveau de la première fraction, une très forte zone d’inhibition sur C.
cucumerinum à un Rf de 0.4 est également présente, mais au vu de l’activité initiale de l’extrait, elle n’est pas considérée comme significative.
85 3. RÉSULTATS
2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle 1
0.5
0 1a 2a 3a 4a 5a 6a 7a 8a 9a 10a 11a
Cladosporium cucumerinum 1
0.5
0 1a 2a 3a 4a 5a 6a 7a 8a 9a 10a 11a
Figure III-3 : Activités antiradicalaire (DPPH) et antifongique (Cladosporium cucumerinum) des fractions CPC de l’extrait DCM des racines d’O. fetida (Vill.) DC. Eluant : Toluène : Acétate d’éthyle (1 :99) ; Dépôt : 100 µg
Les fractions 4a et 11a étant des mélanges complexes de masses trop faibles, seules les fractions 7a et 8a ont été purifiées et ont conduit à l’obtention de 10 composés (Figure III-4). La fraction 7a a été purifiée sur SP-LC avec une colonne à compression radiale µBondapak®
Waters (100 x 25 mm i.d, 10 µm) avec une élution en mode isocratique MeCN-H2O (Débit : 10
ml/min, MeCN-H2O (30 :70), Détection : 210 nm) pour obtenir les composés A (4 mg), B (4 mg), C (3 mg), D (1 mg), E (1 mg), F (5 mg) et G (3 mg).
La fraction 8a a été purifiée sur SP-LC avec une colonne à compression radiale µBondapak®
Waters (100 x 25 mm i.d, 10 µm) avec une élution en mode isocratique MeCN-H2O (Débit : 10
ml/min, MeCN-H2O (35 :65), Détection : 210 nm) pour obtenir les composés H (2 mg), I (2 mg), et J (1 mg).
86
Oxytropis fetida (Vill.) DC.
Extrait CH2Cl2 des racines (960 mg)
CPC: mélange de solvant C6H6-MeCN-EtOH (55:29:16) (Capacité : 320 ml, Vitesse de rotation : 1000 tours/min, Débit : 3 ml/min, Détection UV : 254 nm, Voltage : 500mV)
1a 2a 3a 4a 5a 6a7a 8a 9a 10a 11a (275 mg) (66 mg)
SP-LC: élution en mode isocratique MeCN-H2O SP-LC: élution en mode isocratique MeCN-H2O (Colonne µBondapak: 100 x 25 mm i.d., 10 µm, Débit : 10 ml/min, (Colonne µBondapak: 100 x 25 mm i.d., 10 µm, Débit : 10 ml/min,
MeCN-H2O (30:70), Détection : 210 nm) MeCN-H2O (35:65), Détection : 210 nm)
A B C D E F G H I J 4 mg 4 mg 3 mg 1 mg 1 mg 5 mg 3 mg 2 mg 2 mg 1 mg
Figure III-4 : Schéma d’isolement des composés A, B, C, D, E, F, G, H, I et J de l’extrait DCM des racines d’O. fetida (Vill.) DC.
3. RÉSULTATS
3.3.3 Déterminations structurales des composés A à J 3.3.3.1 Composés A, B et H Lors de la synthèse des travaux scientifiques antérieurs sur le genre Oxytropis, une classe particulière de métabolites secondaires azotés est apparue comme fréquente : les phényléthylamines (cf. 2.3.6.1). Dans ce genre, ces proto-alcaloïdes ont la particularité d’être tous des amides et au jour d’aujourd’hui deux séries de composés différents ont été isolées : des phényléthylbenzamides et des phényléthylcinnamamides [Batsuren et al., 1992; Akhmedzhanova et Batsuren, 1997; Demeuov et al., 1999; Kojima et al., 2001]. Dans ce fractionnement bioguidé de l’extrait dichlorométhanique des racines d’O. fetida, trois phényléthylamides déjà connues ont pu être identifiées (A, B et H). Certains éléments structuraux similaires à celles-ci sont présentés ici, tandis que les points particuliers à chacune d’entre elles seront présentés aux points 3.3.3.2 à 3.3.3.4. Les spectres UV/Visible des composés A, B et H sont semblables et présentent deux maxima d’absorption d’intensité similaire à 215 et 275 nm caractéristiques des phényléthylamines (Figure III-5) [Akhmedzhanova, 1996].
mAU 60
50
40
30
20
10
0 250 350 450 550 nm
Figure III-5 : Spectre UV/Visible des composés A, B et H
De plus, l’analyse des spectres de masse basse résolution des expériences EI-MS et LC/UV/ESI-MSn en mode positif de ces trois composés génèrent des ions caractéristiques, de la scission de la liaison du carbonyle avec l’azote, de la scission de la liaison C1-C2 ou encore du départ d’une unité hydroxyle sous forme d’une molécule d’eau, observées dans le cas des phényléthylbenzamides et des phényléthylcinnamides (Figure III-6 et Tableau III-4) [Borges- del-Castillo et al., 1984; Huneck et al., 1986; Kojima et al., 2001].
5’
4’ 6' H O
3’ 1’ 2’ 1 2 N R2
R1 H
R1= H ou OH R2= dérivé cinnamoyle ou benzoyle
Figure III-6 : Fragmentation EI-MS et ESI-MS des composés A, B et H.
88 3. RÉSULTATS
Tableau III-4 : Résultats des analyses EI-MS et LC/UV/ESI-MSn des composés A, B et H.
Données ESI-MSn Données EI-MS Composés . [M+H]+ MS2 M + Fragments EI
A 242 224 241 136 + + [M+H] -H2O [M-C7H5O] 122 121 + + [M+H] -C8H10N [M-C8H10N] B 268 250 267 - + [M+H] -H2O 148 147 + + [M+H] -C8H10N [M-C8H10N] 120 119 + + [M+H] -C8H10N-CO [M-C8H10N-CO] H 252 132 251 131 + + [M+H] -C8H10N [M-C8H10N] 104 103 + + [M+H] -C8H10N-CO [M-C8H10N-CO]
L’analyse des données RMN (1H, 13C, gDQF-COSY, gHSQC, gHMBC et NOESY) de ces trois composés a permis de confirmer et d’identifier leur structure complète.
3.3.3.2 Composé H Le composé H se présente sous forme d’une poudre amorphe blanche. Par analyse des spectres RMN 1H (Figures III-7 et III-8) et 13C, les hypothèses structurales faites ci-dessus se confirment
et il semblerait que le groupement R1 soit un hydrogène et le R2 un cinnamoyle. TMS H-2’ H-1’ H-6, H-7, H-5’,H-6’ H-2 H-4’ H-3 H-5 NH
8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm
Figure III-7 : Spectre RMN-1H du composé H Spectre enregistré dans le chloroforme-d1 à 499.87 MHz avec le TMS comme standard interne.
89 3. RÉSULTATS H-2’ H-1’ H-6, H-7 H-7 H-6, H-6’ H-5’, H-4’ H-5 H-3
7.7 7.6 7.5 7.4 7.3 7.2 7.1 3.70 3.75 2.85 2.95 ppm
Figure III-8 : Détails du spectre RMN-1H du composé H Spectre enregistré dans le chloroforme-d1 à 499.87 MHz avec le TMS comme standard interne.
En effet sont observés, un multiplet à δH 7.23-7.38 ppm correspondant aux 10 protons
aromatiques de deux cycles benzéniques monosubstitués, un large massif à δH 5.59 ppm
susceptible d’être associé au proton de l’azote, deux méthylènes saturés H-1’ (δH 3.67 ppm, dd,
J = 6.8 Hz, 2H et δC 40.8 ppm) et H-2’ (δH 2.90 ppm, t, J = 6.8 Hz, 2H et δC 35.7 ppm), deux
protons éthyléniques H-3 (δH 7.62 ppm, d, J = 15.6 Hz, 1H et δC 141.1 ppm), H-2 (δH 6.31
ppm, d, J = 15.6 Hz, 1H et δC 120.5 ppm) couplés en trans, ainsi qu’un carbone à δC 166.3 ppm caractéristique d’une fonction amide. L’assignement des pics 13C a également été confirmé par les expériences DEPT, gHSQC et gHMBC. L’enchaînement éthylacrylamide, de même que le positionnement des deux cycles benzéniques monosubstitués, corroborent avec l’observation des corrélations hétéronucléaires 1H-13C longues distances sur le spectre gHMBC. Elles impliquent principalement les méthylènes
saturés H-1’ et H-2’ à δH 3.67 et 2.90 ppm, les protons éthyléniques H-3 et H-2 à δH 7.62 et
6.31 ppm et le carbone du carbonyle de la fonction amide à δC 166.3 ppm. (Figures III-9 et III- 10). C-5’, C-4’ C-5 C-2’ C-1’ C-3’ C-1 C-4
H-2’ 3.0 H-1’ 3.5 4.0 4.5 5.0
5.5 ppm 6.0 H-2 6.5 H-4’ 7.0 H-6, H-7, H-5’,H-6’ H-5 7.5 H-3 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 ppm Figure III-9 : Spectre de corrélations hétéronucléaires gHMBC du composé H
90 3. RÉSULTATS
6' H H O H
3’ 5’ 1’ 1 3 2’ N 2 4’ 4 H H H H 5 7 6
Figure III-10 : Principales corrélations hétéronucléaires 1H-13C longues distances du composé H
L’enregistrement du spectre de masse basse résolution en ESI positif indique que le composé H présente un pic moléculaire protoné à m/z 252 [M+H]+ s’accordant avec la formule brute
correspondante en C17H17NO, ceci confirmant ainsi l’hypothèse structurale l’assimilant au N- trans-cinnamoyl-β-phényléthylamine. [Borges-del-Castillo et al., 1984; Kojima et al., 2001]. Le N-trans-cinnamoyl-β-phényléthylamine ou phénéthylcinnamide a été isolé pour la première fois à partir d’une Asteraceae utilisée en médecine traditionnelle au Salvador : Spilanthes ocymifolia A.H.Moore [Borges-del-Castillo et al., 1984]. Il a également déjà été retrouvé dans trois espèces du genre Oxytropis (O. pseudoglandulosa Gontsch. ex Grub., O. muricata (Pall.) DC. et O. myriophylla (Pall.) DC.) [Huneck et al., 1986; Akhmedzhanova et Batsuren, 1997; Kojima et al., 2001]. Les valeurs spectrales ont été déterminées comme exactement similaires à celles de la littérature [Kojima et al., 2001].
5'
4' 6' O H
3'
1' 1 3 2' N 2 4
H H 5 7 6
Composé H Phénéthylcinnamide
3.3.3.3 Composé B Le composé B se présente sous forme d’une poudre amorphe blanche. L’enregistrement du spectre de masse basse résolution en ESI positif du composé B indique que ce composé
91 3. RÉSULTATS
présente un pic moléculaire protoné à m/z 268 [M+H]+. Le gain de 16 uma par rapport au composé H, suggère la présence d’un oxygène supplémentaire. La comparaison des spectres RMN-1H (Figure III-11) et 13C du composé B avec ceux du composé H montre de plus
l’apparition d’un groupement méthine saturé déblindé en position 2’ (δH 4.86 ppm, dd, J = 8.1,
3.7 Hz, 1H et δC 73.2 ppm) à la place d’un méthylène saturé (δH 2.90 ppm, t, J = 6.8 Hz, 2H et
δC 35.7 ppm). La présence de deux doublets de doublets pour le méthylène saturé en C-1’ (δH
3.76 ppm, dd, J = 13.9, 3.7 Hz, 1H et δC 47.6 ppm) et (δH 3.43 ppm, dd, J = 13.9, 8.1 Hz, 1H et
δC 47.6 ppm) au lieu d’un unique doublet de doublet observé pour deux protons équivalents confirme également la substitution de C-2’ par un hydroxyle. H-6, H-7, H-5’, H-6’, H-4’ H-2 TMS H-5 H-3 H-1’ H-1’ H-2’
9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm
Figure III-11 : Spectre RMN-1H du composé B Spectre enregistré dans le chloroforme-d1 à 499.87 MHz avec le TMS comme standard interne.
L’analyse de ces différentes données, ainsi que la comparaison avec la littérature, nous confirme l’hypothèse structurale assimilant le composé B au (-)-(2’R)-N-trans-cinnamoyl-β-
hydroxyphényléthylamine s’accordant avec la formule brute correspondante en C17H17NO2. De
même que pour le composé H, la double liaison C2-C3 est trans (δH 6.45 et 7.62 ppm, d, J =
25 15.3 Hz pour chacun) et de plus, B a un pouvoir rotatoire -58.6° (MeOH; c 1.0) en accord [α]D avec la littérature ( 25 -9.66° (MeOH; c 1.0)), sa configuration absolue étant alors (2’R) []α litt [Kojima et al., 2001]. Le (-)-(2’R)-N-trans-cinnamoyl-β-hydroxyphényléthylamine ou (-)- (2’R)-2’-hydroxy-phénéthylcinnamide a été isolé pour la première et unique fois à partir d’une espèce du genre Oxytropis : O. myriophylla (Pall.) DC. Cette espèce est très populaire dans la médecine mongolienne traditionnelle. Connue sous le nom de « Stag-sha », elle est utilisée contre les maux de dents et la rage [Kojima et al., 2001].
92 3. RÉSULTATS
5' 6' 4' O H
3' R 1' 1 3 2' N 2 4
OH H H 5 7
6
Composé B (-)-(2’R)-2’-Hydroxyphénéthylcinnamide
3.3.3.4 Composé A Le composé A se présente sous forme d’une poudre amorphe blanche. L’enregistrement de son spectre de masse basse résolution en ESI positif indique que ce composé présente un pic moléculaire protoné à m/z 242 [M+H]+. La différence de 26 uma par rapport au composé B, suggère la perte de deux méthines. Ceci est confirmé par la comparaison des spectres RMN 1H (Figure III-12) et 13C des composés A et B montrant la disparition des signaux correspondant aux protons éthyléniques du groupement cinnamoyle.
H-4, H-5 H-4’, H-5’, H-6’ H-3 H-1’ H-1’ H-2’ TMS
8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm
Figure III-12 : Spectre RMN-1H du composé A Spectre enregistré dans le chloroforme-d1 à 499.87 MHz avec le TMS comme standard interne.
Les autres signaux étant identiques, ces données nous suggèrent que le composé A est similaire au composé B à l’exception de la présence d’un groupement benzoyle et non cinnamoyle relié au groupement β-hydroxyphényléthylamine.
93 3. RÉSULTATS
L’analyse de ces différentes données, ainsi que la comparaison avec la littérature, nous confirme l’hypothèse structurale assimilant le composé A au (-)-(2’R)-N-benzoyl-β-hydroxy-
phényléthylamine s’accordant avec la formule brute correspondante en C15H15NO2. Le pouvoir rotatoire 25 -11.7° (MeOH; c 1.0) mesuré est également en accord avec la littérature ( 25 - []α D [α]litt 4.27° (MeOH; c 1.0)), sa configuration absolue étant alors (2’R) [Kojima et al., 2001].
Le (-)-(2’R)-N-benzoyl-β-hydroxyphényléthylamine ou (-)-(2’R)-2’-hydroxyphénéthyl- benzamide été isolé à de nombreuses reprises dans le genre Oxytropis : O. pseudoglandulosa Gontsch. ex Grubov, O. muricata (Pall.) DC., O. myriophylla (Pall.) DC, O. puberula Boriss, O. trichophysa Bunge. Ces différentes espèces d’Oxytropis proviennent toutes de la région de Mongolie et certaines sont utilisées en médecine traditionnelle. O. muricata (Pall.) DC. est, par exemple, fréquemment utilisé au Tibet, seule ou en association, comme anti-anthelminthique, cardiotonique, diurétique, anticancéreux ou encore lors d’infection du foie [Huneck et al., 1986; Batsuren et al., 1992; Akhmedzhanova et Batsuren, 1997; Demeuov et al., 1999; Kojima et al., 2001].
5'
4' 6' O
3' R 1' 1 2' N 2
OH H 3 5
4
Composé A (-)-(2’R)-2’-Hydroxyphénéthylbenzamide
3 .3.3.5 Composé G Le composé G se présente sous forme d’une poudre amorphe blanche. L’analyse des données RMN (1H, 13C, DEPT, gDQF-COSY, gHSQC, gHMBC, NOESY et TOSCY) et MS (LC/UV/ESI-MSn mode positif : m/z 301 [M+H]+) a permis son élucidation structurale. Après analyse des spectres RMN-1H (Figures III-13 et III-14) et 13C, une première hypothèse structurale peut être effectuée et suggère la présence d’un composé de type ptérocarpane [Pachler et Underwood, 1967]. Cette hypothèse est renforcée par la présence d’un spectre
94 3. RÉSULTATS
UV/Visible caractéristique de ce type de composés présentant un épaulement à 230 nm, suivi d’un maximum d’absorption à 285 nm [Vidal et Conan, 1987]. 3 3 9-OCH 3-OCH H-4 H-6 H-8 H-7 H-7 H-6 H-11a H-1 H-1 10-OH H-2 H-2 H-6a
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 ppm
Figure III-13 : Spectre RMN-1H du composé G Spectre enregistré dans le chloroforme-d1 à 499.87 MHz avec le TMS comme standard interne.
3 3 H-4 H-6 9-OCH 3-OCH H-8 H-7 H-6 H-2 H-6a
6.80 6.75 6.70 6.65 6.60 6.55 6.50 6.45 6.40 4.3 4.2 3.9 3.8 3.7 3.6 3.5 ppm
Figure III-14 : Détails du spectre RMN-1H du composé G Spectre enregistré dans le chloroforme-d1 à 499.87 MHz avec le TMS comme standard interne.
En effet, l’analyse de ces spectres indique la présence de signaux caractéristiques associés au
groupement O-CH2-CH-CH-O correspondant à un méthylène saturé (δH 4.25 ppm, dd, J =
10.9, 5.2 Hz, δH 3.67 ppm, dd, J = 11.1, 10.9 Hz, 2H et δC 66.4 ppm, H-6) et à deux méthines
saturés (δH 3.56 ppm, m, 1H et δC 40.1 ppm, H-6a) et (δH 5.57 ppm, d, J = 6.8 Hz, 1H et δC 79.3 ppm, H-11a) [Pachler et Underwood, 1967]. De plus, ils révèlent la présence de cinq signaux dans la zone aromatique correspondant à un système de spin ABX impliquant les protons
aromatiques en positions H-1, H-2 et H-4 (δH 7.51 ppm, d, J = 8.7 Hz, 1H et δC 132.3 ppm), (δH
95 3. RÉSULTATS
6.64 ppm, dd, J = 8.7, 2.4 Hz, 1H et δC 109.0 ppm), (δH 6.47 ppm, d, J = 2.4 Hz, 1H et δC 101.5
ppm) et à un système de spin AB impliquant les protons aromatiques en H-7 et H-8 (δH 6.46
ppm, d, J = 8.1 Hz, 1H et δC 103.7 ppm), (δH 6.75 ppm, d, J = 8.1 Hz, 1H et δC 114.7 ppm). Ces signaux sont caractéristiques de cycles benzéniques tri- et tétrasubstitués. Des signaux
correspondant à deux méthoxyles aromatiques (δH 3.79 ppm, s, 3H et δC 55.7 ppm) et (δH 3.88
ppm, s, 3H et δC 56.7 ppm) et à un hydroxyle aromatique (δH 5.31, s) sont également présents [Pachler et Underwood, 1967; Kurosawa et al., 1978; Subarnas et al., 1991]. Selon ces données, le composé G peut être assimilé à un hydroxy-diméthoxyptérocarpane. L’assignement des pics 13C a également été confirmé par les expériences DEPT, gHSQC et gHMBC.
La position des groupements hydroxyle et méthoxyle se déduit de l’observation du spectre RMN 13C et des corrélations hétéronucléaires 1H-13C longues distances sur le spectre gHMBC (Figures III-15 et III-16).
C-9 C-10a C-11a C-4a C-3 C-6a
3.5 3-OCH3 9-OCH3 4.0 H-6 4.5
5.0 10-OH 5.5 F2 (ppm) 6.0
H-7 6.5 7.0 H-1 7.5
160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40
F1 (ppm) Figure III-15 : Spectre de corrélations hétéronucléaires gHMBC du composé G
96 3. RÉSULTATS
HO OCH3 10 9 10a H H O D H H 8 1 C H 6b 2 7 11a 11b 6a H AB 3 6 H 4a O H3CO 4 H H
Figure III-16 : Principales corrélations hétéronucléaires 1H-13C longues distances du composé G
La configuration de la molécule a été déterminée comme étant identique à celle des composés isolés précédemment, les déplacements chimiques étant exactement similaires à ceux de la littérature. La constante de couplage (J = 6.8 Hz) pour H-11a et H-6a indique qu’ils sont en cis par rapport au plan de la molécule. La configuration absolue du composé G a été déterminée grâce à la mesure du pouvoir
25 rotatoire : -220° (CHCl3; c 0.4). Ce dernier étant négatif, les carbones C-6a et C-11a sont []α D donc définis comme étant (R/R). En effet, bien que les ptérocarpanes contiennent deux centres chiraux, uniquement les configurations R,R et S,S sont stériquement possibles. Il est ainsi généralement admis que tous les ptérocarpanes lévogyres ont une configuration 6aR,11aR, tandis que tous les dextrogyres ont une configuration 6aS,11aS [Harborne, 1996; Song et al., 1997].
L’enregistrement du spectre de masse basse résolution en ESI positif indique que le composé G présente un pic moléculaire protoné à m/z 301 [M+H]+ s’accordant avec la formule brute 2 3 correspondante en C17H16O5 Les fragmentations MS et MS génèrent des ions caractéristiques + + + à m/z 177 [M+H] -C7H8O2, 193 [M+H] -C7H8O, et 153 [M+H] -C9H8O2 correspondant respectivement à la perte de fragments méthoxyphénolique, phénolique et benzofuranique (Figure III-17). Ces fragments sont typiquement formés en EI-MS par la scission des liaisons entre C-4 et O-5, O-5 et C-6 et/ou entre C-6 et C-6a. En ESI-MS, les voies de fragmentation sont comparables mise à part l’absence des fragments benzofuraniques en tant qu’ions positifs. L’observation de la fragmentation des ptérocarpanes permet ainsi de confirmer la substitution des cycles aromatiques [Piccinelli et al., 2005]. Le composé G est ainsi le (-)-(6aR,11aR)-10- hydroxy-3,9-diméthoxyptérocarpane ou (-)-(6aR,11aR)-3-méthoxy-vesticarpane.
97 3. RÉSULTATS
153 c H
100 + + H 95 H3CO OH 90 + O OCH3
85 [(M+H)-148] OH a 80 75 70 H + H CO HO H 65 3 60 + O OCH 55 3 OH b 50 45 Relative Abondance Relative 40 H +
+ H 35 H CO 3 O
30 + + O OCH 25 3 OH c 20 [(M+H)-124] + 15 177 a [(M+H)-108]
10 193 b [M+H] 5 301 0 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 m/z
Figure III-17 : Spectre LC/UV/ESI-MSn en mode positif du composé G
Il a été isolé pour la première et unique fois à partir d’une Fabaceae : Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge [Song et al., 1997]. Le genre Astragalus appartient à la tribu des Galegeae, de même que le genre Oxytropis. Comme nous avons pu le voir précédemment (cf. 2.3.6.1), certaines espèces de ces deux genres sont regroupées, de part leur toxicité et certaines similitudes dans leur métabolisme secondaire, sous la même appellation de « locoweeds ». Alors que de nombreux isoflavonoïdes ont été rapportés pour le genre Astragalus, au jour d’aujourd’hui aucun composé de type ptérocarpane n’a été isolé dans le genre Oxytropis.
HO OCH3 10 9 10a O 8 H 1 11a 6a 6b 7 2 R 11b R
3 H 6 H CO 4a 3 4 O
Composé G (-)-(6aR,11aR)-3-méthoxyvesticarpane
98 3. RÉSULTATS
3.3.3.6 Composé I Le composé I se présente sous forme d’une poudre amorphe blanche. L’analyse des données RMN (1H, gDQF-COSY, gHSQC et gHMBC) et LC/UV/ESI-MSn a permis son élucidation structurale. L’enregistrement de son spectre de masse basse résolution en ESI positif indique que ce composé présente un pic moléculaire protoné à m/z 315 [M+H]+. Le gain de 14 uma par rapport au composé G, suggère la présence d’un méthylène supplémentaire.
Le spectre UV/Visible du composé I est également similaire au composé G et présente de même un épaulement à 230 nm, suivi d’un maximum d’absorption à 285 nm, caractéristique d’un ptérocarpane [Vidal et Conan, 1987]. La comparaison des spectres RMN 1H (Figure III- 18) et 13C du composé I avec ceux du composé G montre l’apparition d’un troisième singulet
caractéristique d’un groupement méthoxyle (δH 3.94 ppm, s, 3H et δC 60.7 ppm). Ce singulet,
intégrant pour trois protons, corrèle avec un unique carbone à δC 60.7 ppm sur le spectre
gHSQC et à δC 134.6 ppm sur le spectre gHMBC. Les autres signaux étant identiques, ces données nous suggèrent que le composé I est similaire au composé G à l’exception de la présence d’un groupe méthoxyle en C-10 à la place du groupe hydroxyle.
3 3 3 3-OCH 9-OCH 10-OCH H-6 H-4 H-8 H-1 H-7 H-6 H-11a H-2 H-6a
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 ppm
Figure III-18 : Spectre RMN-1H du composé I Spectre enregistré dans le chloroforme-d1 à 499.87 MHz avec le TMS comme standard interne.
Les fragmentations MS2 et MS3 associées au pic moléculaire génèrent en ESI-MS des ions + + + caractéristiques à m/z 191 [M+H] -C7H8O2, 207 [M+H] -C7H8O, et 167 [M+H] -C9H8O2
99 3. RÉSULTATS
identique à ceux issus de la fragmentation du composé G. L’hypothèse structurale assimilant le composé I comme étant un analogue méthoxylé sur le cycle D du composé G est confirmée par l’analyse des fragments de ces deux composés, une incrémentation systématique de 14 uma est visible pour tous les ions caractéristiques [Piccinelli et al., 2005]. L’analyse de ces données ESI-MS, ainsi que la comparaison avec la littérature, confirme que le composé I est le (-)- (6aR,11aR)-3,9,10-triméthoxyptérocarpane s’accordant avec la formule brute correspondante
en C18H18O5. Les carbones C-6a et C-11a ont de même que pour le composé G une configuration cis (H-6a et H-11a, d, J = 6.9 Hz pour chacun). Tandis que la configuration absolue du composé I a été déterminée comme (R/R) grâce à la mesure du pouvoir rotatoire :
25 25 -218° (CHCl3; c 0.4) ( -200.0° (CHCl3; c 0.4)) [Subarnas et al., 1991; Harborne, []α D []α Litt 1996].
Le (-)-(6aR,11aR)-3,9,10-triméthoxyptérocarpane ou (-)-(6aR,11aR)-3,9-diméthoxynissoline a été isolé pour la première fois à partir d’une Fabaceae : Lathyrus nissolia L. et chez deux espèces du genre Astragalus : A. mongholicus Bunge et A. membranaceus Bunge. Les racines d’A. mongholicus Bunge sont utilisées en médecine traditionnelle orientale comme antisudorale, diurétique et comme tonique [Robeson et Ingham, 1979; Subarnas et al., 1991; Song et al., 1997].
H3CO OCH3 10 9 10a O 8 H 1 11a 6a 6b 7 2 R 11b R
3 H 6 H CO 4a 3 4 O
Composé I (-)-(6aR,11aR)- 3,9-Diméthoxynissoline
3.3.3.7 Composé F Le composé F se présente sous forme d’une poudre amorphe blanche. L’analyse des données RMN (1H, 13C, gDQF-COSY, gHSQC, gHMBC et NOESY) et MS a permis son élucidation structurale. L’enregistrement de son spectre de masse basse résolution en ESI positif indique que ce composé présente un pic moléculaire protoné à m/z 285 [M+H]+. Le spectre UV/Visible du composé F présente un épaulement à 230 nm suivi de deux maxima d’absorption à 285 et
100 3. RÉSULTATS
310 nm. Ces maxima sont comparables à ceux des composés G et I avec l’apparition d’un maximum supplémentaire à 310 nm correspondant probablement à la modification d’un des chromophores. Comme nous avons pu le voir précédemment (cf. 3.3.2), cette nouvelle bande pourrait provenir de l’apparition d’un groupement méthylènedioxyle sur l’un des cycles [Vidal et Conan, 1987].
La comparaison des spectres RMN-1H (Figure III-19) et 13C du composé F avec ceux du composé G montre des modifications sur les cycles A et D. le spectre RMN 1H suggère notamment l’absence de groupements méthoxyles de par la disparition des singulets aux environ de 3.5 ppm. Il semble que le 3-OMe présent dans le composé G, soit remplacé par un
groupement hydroxyle (δH 4.94 ppm, br s, 1H). Sur le cycle D, l’apparition de deux singulets
impliquant les protons aromatiques en position 7 et 10 (δH 6.72 ppm, s, 1H et δC 104.9 ppm),
(δH 6.44 ppm, s, 1H et δC 94.1 ppm) à la place d’un système de spin AB est également observée. Ces données ainsi que le blindage des carbones en C-7 et C-10 et le fort déblindage du carbone en C-8 indiquent probablement la substitution du cycle D, non plus en C-9, C-10 mais en C-8 et C-9. Les spectre RMN 1H et 13C suggèrent de plus l’apparition d’une fonction
méthylènedioxyle caractérisée par deux singulets à δH 5.90 et 5.92 ppm et un nouveau carbone
à δC 101.3 ppm.
O 2 H-10 OCH H-6 H-7 H-4 H-1 H-2 H-11a H-6 H-6a 3-OH
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 ppm
Figure III-19 : Spectre RMN-1H du composé F Spectre enregistré dans le chloroforme-d1 à 499.87 MHz avec le TMS comme standard interne.
101 3. RÉSULTATS
Selon ces données, le composé F peut donc être assimilé à un hydroxy- méthylènedioxyptérocarpane, et les données spectrales correspondent aux valeurs lues dans la littérature [Mizuno et al., 1990; Chaudhuri et al., 1995]. La configuration absolue de F est identique à celle de G et I. En effet, la constante de couplage des protons H-11a et H-6a à J =
25 25 6.8 Hz et le pouvoir rotatoire de -157° (CHCl3; c 0.23) ( -167.0° (CHCl3; c 0.34)) [α]D [α]Litt prouvent cette hypothèse [Harborne, 1996; Park et al., 2003].
Le composé F correspond donc au (-)-(6aR,11aR)-3-Hydroxy-8,9-méthylènedioxyptérocarpane ou (-)-(6aR,11aR)-maackiaine. Ce ptérocarpane simple a de nombreuses fois été rapporté et est aussi fréquent dans certains genres de la famille des Fabaceae (Cicer, Lathyrus, Ononis, Sophora, Trifolium, etc.) que des isoflavonoïdes tels que la daidzéine, la génistéine ou encore la formononétine [Harborne, 1996; Bruneton, 1999].
O 10 9
10a O O H 8 1 11a 6a 2 R 6b 7 11b R 3 H 6 4a HO 4 O
Composé F (-)-(6aR,11aR)-Maackiaine
3.3.3.8 Composé J Le composé J se présente sous forme d’une poudre amorphe blanche. L’analyse des données RMN (1H, gDQF-COSY, gHSQC et gHMBC) et MS a permis son élucidation structurale. L’enregistrement de son spectre de masse basse résolution en ESI positif indique que ce composé présente un pic moléculaire protoné à m/z 299 [M+H]+. Le gain de 14 uma par rapport au composé F, suggère la présence d’un méthylène supplémentaire. Le spectre UV/Visible du composé J est également similaire au composé F et présente de même un épaulement à 230 nm suivi de deux maxima d’absorption à 285 et 310 nm. La comparaison des spectres RMN 1H (Figure III-20) et 13C avec ceux du composé F montre uniquement l’apparition d’un singulet
caractéristique d’un groupement méthoxyle (δH 3.79 ppm, s, 3H et δC 55.5 ppm). Le spectre
102 3. RÉSULTATS
3 gHMBC nous indique une corrélation en J de ces protons à δH 3.79 ppm avec le carbone à δC 161.2 ppm (C-3).
3 O 2 3-OCH OCH H-10 H-6 H-7 H-1 H-6 H-4 H-2 H-11a H-6a
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 ppm
Figure III-20 : Spectre RMN-1H du composé J Spectre enregistré dans le chloroforme-d1 à 499.87 MHz avec le TMS comme standard interne.
Ainsi, de par ces différentes et par comparaison du pouvoir rotatoire avec la littérature, le composé J peut être assimilé au (-)-(6aR,11aR)-3-Méthoxy-8,9-méthylènedioxyptérocarpane
25 25 -236° (CHCl3; c 0.42) ( -167° (CHCl3; c 0.34)) [Baruah et al., 1984; Mori et Kisida, []α D []α Litt 1988; Harborne, 1996]. De même que la (-)-maackiaine, le (-)-(6aR,11aR)-3-Méthoxy-8,9- méthylènedioxyptérocarpane ou (-)-ptérocarpine, est un ptérocarpane fréquent chez les Fabaceae [Harborne, 1996].
O 10 9
10a O O H 8 1 11a 6a 6b 7 2 R 11b R
3 H 6 H CO 4a O 3 4
Composé J (-)-(6aR,11aR)- Ptérocarpine
103 3. RÉSULTATS
3.3.3.9 Composés C, D et E Au cours du fractionnement bioguidé de l’extrait dichlorométhanique des racines d’O. fetida, trois isoflavonoïdes connus ont pu être identifiés (C, D et E). Dans le genre Oxytropis, une grande série de flavonols très communs tels que la myricétine, la quercétine ou encore le kaempférol, ainsi que leurs dérivés glycosylés ont été isolés (cf. 2.3.6.2), mais c’est la première fois que des isoflavonoïdes sont rapportés dans ce genre. Certains éléments structuraux similaires à C, D et E sont présentés ici, tandis que les points particuliers les concernant seront présentés aux points 3.3.3.10 à 3.3.3.12.
L’observation de leur spectre UV/Visible, ainsi que de leurs maxima d’absorption, indiquent leur appartenance aux flavonoïdes (Figure III-21). L’utilisation du terme « Flavonoïdes » implique quelques précisions quant à sa signification. En effet, dans ce présent travail, il a été choisi d’utiliser l’appellation de flavonoïdes (lato sensu) pour tous les composés ayant une origine biosynthétique commune et ainsi, d’y inclure également les dérivés flavaniques, les anthocyanosides et les isoflavonoïdes [Bruneton, 1999]. Le spectre UV/Visible du composé C est spécifique de celui des isoflavones avec un maximum d’absorption à 260 nm, ainsi que deux épaulements entre 290 et 350 nm. Le composé D (230 (sh), 275, 305 (sh)) pourrait être une isoflavone ou une isoflavanone, tandis que le spectre UV/Visible du composé E montre des maxima d’absorption à 204 et 280 nm, ainsi qu’un épaulement à 225 nm suggérant la présence d’une isoflavane [Markham, 1982; Maillard et al., 1989; Xu et al., 2006].
5’ OH Maxima d’absorbance de différents type de flavonoïdes 6’ 4’ B 8 Bande I [nm] Bande II [nm] Type de flavonoïdes O 3’ HO 1’ 7 8a 2 2’ I A C 250-280 310-350 Flavones 4a 6 3 II 5 4 250-280 330-360 Flavonols (3-OH substitués)
OH O 250-280 350-385 Flavonols (3-OH libres) II 245-275 310-330 (sh) Isoflavones I 275-295 300-330 (sh) Flavanones ou dihydroflavonols
230-270 340-390 Chalcones
230-270 380-430 Aurones 300 400 500 nm 270-280 465-560 Anthocyanidines ou anthocyanines
Figure III-21 : Considérations spectroscopiques sur les flavonoïdes [Markham, 1982]
104 3. RÉSULTATS
Lors des analyses de masse basse résolution EI-MS, une fragmentation Retro-Diels-Alder (RDA) (Figure III-22 et Tableau III-5) peut être observée pour la plupart des flavonoïdes isolés dans ce travail. Des informations importantes sur la substitution des cycles A et B sont ainsi obtenues [Subarnas et al., 1991; Hedin et Phillips, 1992; Wolfender et al., 2000]. Ainsi, pour les composés C, D et E seulement les fragments [1,3A]+ , [1,3A+H]+ ou [1,3B]+ sont observés. Les fragments [1,3A]+ à m/z 136 pour le composé C et les fragments [1,3A+H]+ à respectivement m/z 137 et m/z 123 pour les composés D et E indiquent qu’ils sont tous trois substitués par un seul hydroxyle sur le cycle A. Concernant le composé E, avec un fragment [1,3B]+ à m/z 180, il est quant à lui substitué par un hydroxyle et deux méthoxyle sur le cycle B (Tableau III-6). La confirmation et l’identification complète de ces trois composés ont pu s’effectuer grâce à l’analyse des données RMN (1H, 13C, gDQF-COSY, gHSQC, gHMBC et NOESY).
Flavones Flavanones
1,3 + 1,3 + [ A] /[ A+H] [1,3A]+/[1,3A+H]+
B O O 1
A 2 [0,2B]+ 4 3
1,3 + 1,3 + O [ B] O [ B] [0,4B]+ → [0,4B-H O]+ 2 [1,4B+-2H]+ →[1,4B-2H-CO]+
Isoflavones Flavanes
[1,3A-CO]+ ← [1,3A]+ [1,3A]+/[1,3A+H]+
O O
R 3
O [1,3B]+ R 4 1,3 + [ B]
Figure III-22 : Principales fragmentation RDA de certains types de flavonoïdes
105
Tableau III-5 : Principaux fragments RDA de différents types de flavonoïdes
Fragments des cycles A et B Classe de flavonoïdes 1,3 + 1,3 + 1,3 + 0,2 + 0,4 + 0,4 + 1,4 + 1,4 + 1,3 + [ A] / [ A+H] [ B] [ B] [ B] [ B-H2O] [ B-2H] [ B-2H-CO] [ A-CO]
Flavones + + + + + - - -
Isoflavones + + ------
Flavanones + + - - - + + -
Flavanes + ------+
Tableau III-6 : Résultats des analyses EI-MS des composés C, D et E.
Composés Fragments des cycles A et B isolés [M]+ 1,3 + 1,3 + 1,3 + 0,2 + 0,4 + 0,4 + 1,4 + 1,4 + 1,3 + [ A] [ A+H] [ B] [ B] [ B] [ B-H2O] [ B-2H] [ B-2H-CO] [ A-CO]
C 282 136 (10) - 146 (95) ------
D 314 - 137 (40) 178 (100) ------
E 302 - 123 (60) 180 (50) ------
106 3. RÉSULTATS
3.3.3.10 Composé C Le composé C se présente sous forme d’une poudre amorphe. Comme nous avons pu le voir précédemment (cf. 3.3.3.9), le spectre UV/Visible du composé C est caractéristique d’une isoflavone (220, 260, 290 (sh) et 350 (sh) nm) [Markham, 1982]. De plus, la présence sur le 1 spectre RMN- H, dans la zone aromatique, d’un singulet à δH 7.92 ppm (Figure III-22) caractéristique d’un proton H-2 d’une isoflavone, confirme cette hypothèse [Markham, 1982].
O 2 OCH H-5’ H-8 H-5 H-2 H-6’ H-6 H-2’
8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 ppm
Figure III-22 : Spectre RMN-1H du composé C Spectre enregistré dans le chloroforme-d1 à 499.87 MHz avec le TMS comme standard interne.
1 Sur le spectre RMN- H apparaissent également six signaux dans la zone aromatique à δH 8.11, 7.08, 6.96, 6.93, 6.88 et 6.84 ppm correspondant à deux systèmes de spin ABX caractéristiques
des protons H-5 (δH 8.11 ppm, d, J = 8.8 Hz, 1H et δC 127.9 ppm), H-6 (δH 6.93 ppm, dd, J =
8.8, 2.2 Hz, 1H et δC 115.4 ppm) et H-8 (δH 6.84 ppm, d, J = 2.4 Hz, 1H et δC 102.6 ppm), ainsi
que des protons H-5’(δH 6.88 ppm, d, J = 7.8 Hz, 1H et δC 108.5 ppm), H-6’ (δH 6.96 ppm, dd,
J = 7.8, 1.5 Hz, 1H et δC 122.5 ppm) et H-2’ (δH 7.08 ppm, d, J = 1.5 Hz, 1H et δC 110.0 ppm) des cycles A et B. Comme vu précédemment (cf. 3.3.3.9) selon la fragmentation RDA, le cycle A est de plus substitué par un hydroxyle. Les corrélations 1H-13C longue distance observées sur
le spectre gHMBC entre un carbone déblindé à δC 162.6 ppm et certains des protons du système ABX nous indiquent sa position en C-7’. Les spectres RMN-1H et gHSQC indiquent, de même que pour les composés F et J, une fonction méthylènedioxy caractérisée dans ce cas par un
singulet à δH 6.00 ppm (s, 2H, et δC 101.3 ppm) intégrant pour deux protons. La présence d’un groupement méthylènedioxy, ainsi que sa position ont été confirmées par l’observation des 1 13 corrélations hétéronucléaires H- C longues distances : corrélation entre le singulet à δH 6.00
107 3. RÉSULTATS
ppm et les carbones C-3’ et C-4’ à δC 147.8 ppm (Figures III-23 et III-24) et par comparaison avec la littérature [Veitch et al., 2003].
O 2 C-1’ C-2’ OCH C-3 C-3’, C-4’C-3’, C-7 C-8a C-4
5.5
OCH2O 6.0
6.5 H-8 H-5’ H-6 H-6’ H-2’ 7.0 F2 (ppm)
7.5
H-2 H-5 8.0
176 168 160 152 144 136 128 120 112 104 96 88 80 F1 (ppm)
Figure III-23 : Spectre de corrélations hétéronucléaires gHMBC du composé C
H 1 8 HO O 2 H 7 8a H A C 4a 3 2’ 3' 6 O H 5 4 1' H B H O 6' 4' O H H 5'
H
Figure III-24 : Principales corrélations hétéronucléaires 1H-13C longues distances du composé C
Le composé C présente un pic moléculaire protoné à m/z 283 [M+H]+ en LC/UV/ESI-MSn
s’accordant avec la formule brute C16H10O5. La 7-Hydroxy-3',4'-méthylènedioxyisoflavone ou pseudobaptigénine est une isoflavone fréquente dans de nombreux genre de Fabaceae et est un précurseur biosynthétique de la maackiaine [Biggs et Lane, 1978; Dewick et Ward, 1978; Harborne, 1996].
108 3. RÉSULTATS
1 8 HO O 2 7 8a
4a 3 2' 6 3' O 5 4 1'
O 6' 4' O 5'
Composé C Pseudobaptigénine
3.3.3.11 Composé D Le composé D se présente sous forme d’une poudre amorphe. Son spectre UV/Visible (UV
λmax : 210, 275, sh 240, sh 300 nm) est moins caractéristique que celui du composé C et peut suggérer la présence d’une isoflavone, d’une isoflavanone, d’une flavanone ou encore d’un dihydroflavonol [Markham, 1982; Maillard et al., 1989]. Cependant, la présence sur le spectre 1 RMN H de trois doublets de doublet à δH 4.51, 4.44 et 4.22 ppm correspondant respectivement
aux protons H-2b (δH 4.51 ppm, t, J = 11.0 Hz, 1H et δC 71.2 ppm), H-2a (δH 4.44 ppm, dd, J =
11.0, 5.4 Hz, 1H et δC 71.2 ppm) et H-3 (δH 4.22 ppm, dd, J = 11.0, 5.4 Hz, 1H et δC 47.5 ppm) sont caractéristiques d’une isoflavanone (Figure III-25) [Wanjala et Majinda, 2000]. 3 2’-OCH O 2 H-3’ OCH H-6’ H-2 H-2 H-5 H-3 H-8 H-6
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 ppm
Figure III-25 : Spectre RMN-1H du composé D Spectre enregistré dans le chloroforme-d1 à 499.87 MHz avec le TMS comme standard interne.
La comparaison des spectres RMN 1H et 13C du composé D avec ceux du composé C montre la
présence du même système de spin ABX dans la zone aromatique à δH 7.83 (H-5, d, J = 8.8 Hz,
1H et δC 129.7 ppm), 6.54 (H-6, dd, J = 8.8 / 2.4 Hz, 1H et δC 110.8 ppm) et 6.38 (H-8, d, J =
109 3. RÉSULTATS
2.4 Hz, 1H et δC 102.9 ppm) ppm et confirme la présence en C-7 d’un hydroxyle aromatique observé précédemment grâce à l’analyse EI-MS.
La substitution du cycle B peut être déduite de l’observation des spectres RMN 1H et gHMBC
(Figure III-26) par la présence de deux singulets à δH 6.58 et 6.59 ppm correspondants aux
protons H-3’ (δC 95.4 ppm) et H-6’ (δC 109.8 ppm), d’une fonction méthylènedioxy
caractérisée par un singulet à δH 5.91 ppm (s, 2H et δC 101.2 ppm) et d’un singulet
caractéristique d’un groupement méthoxyle (δH 3.74 ppm, s, 3H et δC 56.5 ppm) attribué au carbone C-2’. La présence des groupements méthoxyle et méthylènedioxy, respectivement en C-2’, C-4’ et C-5’ a été confirmée par comparaison avec la littérature [Kovalev et al., 1975; Maximo et al., 2002].
H 1 H HO 8 O H OCH 7 8a 2 H 3 4a 2' 3' H 6 3 H 5 4 1'
H O 4' H 6' 5' O O H H
Figure III-26 : Principales corrélations hétéronucléaires 1H-13C longues distances du composé D
L’enregistrement de son spectre de masse basse résolution en ESI mode positif indique que ce composé présente un pic moléculaire protoné à m/z 315 [M+H]+ et confirme ainsi l’hypothèse structurale assimilant le composé D à la (+/-)-7-Hydroxy-2’-méthoxy-4',5'- méthylènedioxyisoflavanone. Le composé D a été isolé sous sa forme racémique.
La (+/-)-7-Hydroxy-2’-méthoxy-4',5'-méthylènedioxyisoflavanone ou (+/-)-onogènine est un composé rare, comme beaucoup d’isoflavanones [Harborne, 1996]. Elle a été isolée pour la première fois à partir d’Ononis arvensis L. et a ensuite été uniquement isolée à partir de deux espèces du genre Ulex (U. airensis et U. europaeus ssp. europaeus L.) [Kovalev et al., 1975; Maximo et al., 2002].
110
3. RÉSULTATS
O O
1 O OH OH
OH 8
8 8 8 2 7 a OCH3
4a 3 2’ 6 3’
5 4 1’
O O
O 4’
6’ O O O
5’
O O O
Composé D (+/-)-Onogènine
3.3.3.12 Composé E Le composé E se présente sous forme d’une poudre amorphe. Selon l’analyse LC/DAD-UV et la fragmentation caractéristique en EI-MS (m/z 123 [1,3A+H]+ et 180 [1,3B]+) (cf. 3.3.3.9), ce composé pourrait être une isoflavane dont le cycle A est substitué par un hydroxyle et le cycle B par un hydroxyle et deux méthoxyles [He et Findlay, 1991]. La présence sur le spectre RMN- 1 H (Figure III-27) de signaux caractéristiques du groupement –CH2-CH-CH2-O d’une
isoflavane correspondant aux protons en C-2 (δH 4.07 ppm, t, J = 10.5 Hz, 4.34 ppm, dd, J =
11.0, 3.0, 1.9 Hz, 2H et δC 69.8 ppm), C-3 (δH 3.54 ppm, m, 1H et δC 32.2 ppm) et C-4 (δH 2.92
ppm, dd, J = 15.0, 6.0 Hz, 2.99 ppm, dd, J = 15.0, 10.0 Hz, 2H et δC 30.3 ppm) confirme cette hypothèse [He et Findlay, 1991; Subarnas et al., 1991]. 3 3 3’-OCH 4’-OCH H-6’ H-5’ H-6 H-2 H-8 H-5 H-4 H-4 H-2 H-3
7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 ppm
Figure III-27 : Spectre 1H-RMN du composé E Spectre enregistré dans le chloroforme-d1 à 499.87 MHz avec le TMS comme standard interne.
111 3. RÉSULTATS
L’hypothèse de la présence d’une structure de type isoflavane est encore renforcée par le fort
blindage du carbone C-4 et l’apparition d’un méthylène saturé à δH 2.92 et 2.99 ppm). La présence sur le spectre RMN-1H de deux singulets caractéristiques de groupements méthoxyles
(δH 3.92 ppm, s, 3H et δC 61.4 ppm) et (δH 3.85 ppm, s, 3H et δC 56.0 ppm) est observée. Les groupements hydroxyle et méthoxyles respectivement en C-2’, C-3’ et C-4’ sur le cycle B ont été confirmés par l’observation des corrélations hétéronucléaires 1H-13C courtes et longues distances des spectres gHSQC et gHMBC et par comparaison avec la littérature [He et Findlay, 1991]. La comparaison des spectres RMN 1H et 13C du composé E avec ceux de C et D indique
la présence d’un hydroxyle en C-7 et d’un système de spin ABX à δH 6.92 (d, J = 8.3 Hz, 1H et
δC 130.5), 6.37 (dd, J = 8.3 / 2.2 Hz, 1H et δC 107.9) et 6.34 (d, J = 2.2 Hz, 1H et δC 103.6) correspondant aux protons H-5, H-6 et H-8.
Ainsi, de par ces différentes données et par comparaison du pouvoir rotatoire avec la littérature, le composé E peut être assimilé à la (-)-(3R)-7,2’-Hydroxy-3’,4’-méthoxyisoflavane ( 25 -35° []α D
25 (CHCl3; c 1.0) ( -13° (CHCl3; c 0.3) [Wang et al., 2003]). Sa configuration absolue étant []α Litt alors (3R). Le (-)-(3R)-isomucronulatol a été isolée pour la première fois comme phyto-alexine à partir de Glycyrrhiza glabra L., et ensuite comme constituant de Gliricidia sepium Heartwood. Elle a également été isolée dans le genre Astragalus [Ingham, 1977; Al-Ani et Dewick, 1985; Subarnas et al., 1991; Wang et al., 2003].
OH OH OH O O
8 1 O
HO HO 2 HO 7 8a 4a R 3 2’ OCH 6 3’ 3
5 4 1’ 4’ 6’ OCH3 5’
Composé E (-)-(3R)-Isomucronulatol
3.3.4 Considérations phytochimiques Le fractionnement bioguidé de l’extrait dichlorométhanique des racines d’O. fetida a conduit à l’isolement et à l’identification de dix constituants : trois phényléthylamides (A, B et H), quatre ptérocarpanes (F, G, I, et J), une isoflavone (C), une isoflavanone (D) et une isoflavane (E).
112
% MeCN (+ 0.25 % a.a.) mAU C DG 100
300 90 E
250 11 80
200 10 70
150 60
100 B 13 A J 50 12 F H 9 50 I 40
0 30
0 20 40 60 80 100 120 min Figure III-28 : Analyse LC/DAD-UV de l’extrait DCM des racines d’O. fetida (Vill.) DC. Conditions chromatographiques : Colonne: Waters SymmetryShield C18 (150 × 2.1 mm i.d., 5 µm) avec une précolonne du même matériel (1.5 x 2.1 mm i.d., 5 µm) ; Eluant: gradient acétonitrile (0.25 % a.a.) - eau (0.25% a.a.) (30:70 à 100:0 en 100 min) ; injection 100 µg ; débit: 0.2 ml/min ; détection à 254 nm, spectre UV/Visible (DAD) balayé de 190 à 600 nm.
3. RÉSULTATS
Ces composés correspondent aux pics 1 (A), 2 (B), 3 (E), 4 (C, D, G), 5 (F), 6 (H), 7 (I) et 8 (J) du chromatogramme de l’analyse LC/DAD-UV préliminaire de l’extrait dichlorométhanique d’O. fetida (cf. 3.3.1) (Figure III-28).
Les composés les plus apolaires, soit les composés 9 à 13 n’ont pas été isolés, les fractions les comprenant ne montrant pas d’activité digne d’intérêt. Les activités biologiques des composés A à J seront présentées au point 3.5 : Oxytropis fetida (Vill.) DC. : Biosynthèse, activités biologiques et biochimiques. Ces résultats concordent avec ceux de l’analyse préliminaire de l’extrait dichlorométhanique des racines d’O. fetida. En effet, dans cet extrait les pics UV- majoritaires sont principalement issus de deux types de composés soit des phényléthylamides et des isoflavonoïdes.
114 3. RÉSULTATS
3.4 Fractionnement bioguidé de l’extrait méthanolique des racines d’Oxytropis fetida (Vill.) DC.
3.4.1 Analyse LC/DAD-UV préliminaire De même que l’extrait dichlorométhanique, l’extrait méthanolique des racines d’Oxytropis fetida (Vill.) DC. possède quelques caractéristiques qui rendent son étude approfondie intéressante (cf. 2.3 et 3.2) :
Seul extrait polaire montrant une activité antifongique sur la moisissure phytopathogène Cladosporium cucumerinum. Bonne activité antiradicalaire sur le DPPH. Aucune référence phytochimique répertoriée sur cette espèce. Présence de molécules à hautes potentialités pharmacologiques (swainsonine, castanospermine) dans le genre.
Afin d’obtenir des informations préliminaires sur les composés présents dans l’extrait méthanolique des racines de O. fetida, une analyse LC/DAD-UV a été entreprise. De même que pour l’extrait dichlorométhanique, la préparation de l’extrait méthanolique est réalisée selon la méthode de routine effectuée au Laboratoire de Pharmacognosie et de Phytochimie de l’Université de Genève (cf. 5.1). Les pics UV-majoritaires enregistrés sur le chromatogramme LC/UV (254 nm) (composés 1 à 20) ont été analysés (Figure III-29). Les spectres UV/Visible correspondants, ainsi que les maxima d’absorption, sont respectivement présentés à la figure III-30 et dans le tableau III-7. Lors de cette analyse, deux différentes classes de composés peuvent être définies selon leurs maxima d’absorption et comprennent les composés (3 à 11, 13 à 15 et 17) et (18 à 20). Les composés 3 à 11, 13 à 15 et 17 semblent tous appartenir à la classe des flavonoïdes, et seraient soit des flavones, des flavonols, des isoflavones, des dihydroflavonols ou encore des flavanones (cf. 3.3.3.9) [Markham, 1982].
Les composés 3, 5, 9, 10, 11, 13 et 15 ne présentent pas tous exactement les mêmes maxima d’absorption, mais leur spectre UV/Visible est caractéristique des isoflavonoïdes. En effet, ils présentent tous un maximum entre 250 et 260 nm, ainsi qu’un épaulement entre 300 et 330 nm. Le composé 14 (290, 335 (sh) nm) quant à lui pourrait être une flavanone ou encore un dihydroflavonol, tandis que le spectre UV/Visible des composés 6 et 17 montre des maxima d’absorption caractéristiques à 270 et 335 nm d’une flavone ou d’un flavonol [Markham, 1982; Maillard et al., 1989]. Les pics UV-majoritaires 12 et 16 semblent être tous deux des mélanges d’isoflavones avec des maxima d’absorption similaires aux composés 9-11, 13, et 15.
115
12 mAU % MeCN + 0.25 % aa.
1 100 300 15 90
250 16 17 80
70 200 11 3 60 150 19 18 50
2 6 13 14 100 7 20 40 4 5 8 910 30 50
20
0 10 0 20 40 60 80 100 min Figure III-29 : Analyse LC/DAD-UV de l’extrait MeOH des racines d’O. fetida (Vill.) DC. Conditions chromatographiques : Colonne: Waters SymmetryShield C18 (150 × 2.1 mm i.d., 5 µm) avec une précolonne du même matériel (1.5 x 2.1 mm i.d., 5 µm) ; Eluant: gradient acétonitrile (0.25 % a.a.) - eau (0.25% a.a.) (10:90 à 100:0 en 100 min) ; injection 100 µg ; débit: 0.2 ml/min ; détection à 254 nm, spectre UV/Visible (DAD) balayé de 190 à 600 nm.
mAU mAU mAU mAU 60 175 3, 5 9, 11 300 10, 13, 15 300 6, 17 150 50 250 250 125 40 200 200 100 30 150 150 75 20 100 100 50 25 10 50 50 0 0 0 0 300 400 500 nm 300 400 500 nm 300 400 500 nm 300 400 500 nm
mAU mAU mAU 300 140 14 120 18 40 19, 20 250 100 200 30 80 150 20 60 100 40 10 50 20 0 0 0 300 400 500 nm 300 400 500 nm 300 400 500 nm
Figure III-30 : Spectres UV/Visible des composés 3, 5-6, 8, 10-11, 13-15, 17-20 de l’extrait MeOH des racines d’O. fetida (Vill.) DC.
Tableau III-7 : Maxima d’absorption des composés 1 à 20 de l’extrait MeOH des racines d’O. fetida (Vill.) DC.
Composés Maxima d’absorption (λmax) Types de composés supposés 1 220, 280 nm Indéterminé 2 - Indéterminé 3, 5 260, 330 (sh) nm Isoflavone 4 - Indéterminé 6, 17 270, 335 nm Flavone ou flavonol 7, 8 260 (sh), 295 nm Indéterminé 9, 11, 12, 16 250, 265 (sh), 290, 310 (sh) nm Isoflavone 14 290, 335 (sh) nm Flavanone ou dihydroflavonol 10, 12, 13, 15, 16 260, 290 (sh), 330 (sh) nm Isoflavone 18 255, 300 (sh), 350 nm Indéterminé 19, 20 255, 280 (sh), 330 nm Indéterminé
3. RÉSULTATS
Les spectres UV/Visible des composés 18, 19 et 20 semblent relativement similaires, mais leurs maxima d’absorption ne sont pas tout à fait identiques. Alors que les composés 19 et 20 présentent des maxima d’absorption à 255 et 330 nm, ainsi qu’un épaulement à 300 nm, le composé 18 présente lui des maxima à 255, 280 (sh) et 330 nm. Les autres pics UV-majoritaires de ce chromatogramme n’ont pu être classifiés, en effet soit leur spectre UV/Visible n’est pas caractéristique d’une classe donnée de composés (1, 7 et 8), soit ils sont constitués de plusieurs composés (2 et 4).
Selon cette analyse préliminaire LC/DAD-UV, l’extrait méthanolique des racine d’O. fetida contient principalement des composés polaires issus de la même voie biosynthétique que les composés de l’extrait dichlorométhanique, soit des isoflavonoïdes.
3.4.2 Fractionnement bioguidé de l’extrait méthanolique des racines 3.4.2.1 Activités de l’extrait L’extrait méthanolique des racines d’Oxytropis fetida (Vill.) DC. a montré une activité antifongique sur Cladosporium cucumerinum et antiradicalaire sur le DPPH. Les zones
d’inhibition sont situées à des Rf entre 0.8 et 1.0 (Figure III-31) pour le test sur C. cucumerinum et entre 0.5 et 0.8 pour le test sur le DPPH. L’extrait méthanolique des racines de O. fetida n’a montré aucune activité contre C. albicans et P. teres (cf. 3.2).
1
0.5
0 DPPH Cc
Figure III-31 : Activités antiradicalaire (DPPH : 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle) et antifongique (Cc : Cladosporium cucumerinum) de l’extrait MeOH des racines d’O. fetida (Vill.) DC. Eluant : Dichlorométhane : Méthanol : Eau (40 : 50 : 10) ; Dépôt : 100 µg
3.4.2.2 Fractionnement et isolement des composés K à R L’extrait méthanolique des racines (2500 mg) de O. fetida a été fractionné par CPC avec un
système de solvant biphasique CH2Cl2-MeOH-H2O (50:25:25) (v/v/v) (Capacité : 320 ml, Vitesse de rotation : 1000 tours/min, Débit : 2 ml/min, Détection UV : 254 nm, Voltage : 500 mV) et 16 fractions ont été obtenues (1a à 16a). Le schéma de fractionnement complet est présenté à la figure III-33. Un premier regroupement (9 fractions) a été effectué avant le
118 3. RÉSULTATS
criblage sur la base des données LC/DAD-UV de ces 16 fractions. Les résultats des tests antifongique et antiradicalaire sont présentés à la Figure III-32.
2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle 1
0.5
0 Extrait 1a-2a 3a-5a 6a-7a 8a-9a 10a-11a 12a 13a 14a-15a 16a
Cladosporium cucumerinum 1
0.5
0 Extrait 1a-2a 3a-5a 6a-7a 8a-9a 10a-11a 12a 13a 14a-15a 16a
Figure III-32 : Activités antiradicalaire (DPPH) et antifongique (Cladosporium cucumerinum) des fractions CPC de l’extrait MeOH des racines d’O. fetida (Vill.) DC. Eluant : Dichlorométhane : Méthanol : Eau (40 : 50 : 10) ; Dépôt : 100 µg
Les fractions les plus actives étaient les fractions 3a-5a, 6a-7a, 8a-9a et 10a-11a pour le test sur le DPPH. Pour le test autobiographique contre C. cucumerinum, les fractions 1a-2a, 3a-5a et 6a- 7a peuvent être considérées comme faiblement active. Les zones d’inhibition correspondent
vraisemblablement à celles de l’extrait initial et se situent respectivement autour de Rf de 0.5 à
0.8 et de Rf de 0.8 à 1.0. La suite du fractionnement de l’extrait a été effectuée selon les résultats des tests antifongique et antiradicalaires. Les fractions sélectionnées sont les fractions 3a-5a, 8a-9a et 10a-11a, elles ont été purifiées et ont conduit à l’obtention de huit composés. Les fractions 1a-2a et 6a-7a n’ayant pas été étudiées malgré leur activité, leur masse étant trop faibles. Après fractionnement et obtention des différentes fractions, les activités contre la moisissure C. cucumerinum sont relativement faibles. Un effet synergique des composés minoritaires de l’extrait méthanolique des racines, pourrait expliquer ces résultats.
119
Oxytropis fetida (Vill.) DC. Extrait MeOH des racines ( 2500 mg)
CPC: mélange de solvant CH2Cl2-MeOH-H2O (50:25:25) (Capacité : 320 ml, Vitesse de rotation : 1000 tours/min, Débit : 2 ml/min, Détection UV : 254 nm, Voltage : 500mV)
1a 2a 3a 4a 5a 6a 7a 8a 9a 10a 11a 12a 13a 14a 15a 16a (14 mg) (7 mg) (36 mg) (25 mg) (42 mg) (10 mg) (20 mg)
Fraction 3a-5a Fraction 8a-9a Fraction 10a-11a ( 57 mg) ( 67 mg) ( 30 mg)
SP-LC: élution en mode isocratique MeCN-H2O SP-LC: élution en mode isocratique MeCN-H2O SP-LC: élution en mode isocratique MeCN-H2O (Colonne µBondapak: 100 x 25 mm i.d., 10 µm, (Colonne µBondapak: 100 x 25 mm i.d., 10 µm, (Colonne µBondapak: 100 x 25 mm i.d., 10 µm,
Débit : 10 ml/min, MeCN-H2O (30:70), Débit : 10 ml/min, MeCN-H2O (23:77), Débit : 10 ml/min, MeCN-H2O (28:72), Détection : Détection : 254 nm) Détection : 254 nm) 210 nm)
K L M N O P Q R 4 mg 1 mg 4 mg 4 mg 3 mg 4 mg 5 mg 3 mg Figure III-33 : Schéma d’isolement des composés K, L, M, N, O, P, Q, et R de l’extrait MeOH des racines d’O. fetida (Vill.) DC.
3. RÉSULTATS
La fraction 3a-5a a été purifiée par SP-LC avec une colonne à compression radiale µBondapak® Waters (100 x 25 mm i.d, 10 µm) avec une élution en mode isocratique MeCN-
H2O (Débit : 10 ml/min, MeCN-H2O (30 :70), Détection : 254 nm) pour obtenir le composé K (4 mg). La fraction 8a-9a a été purifiée par SP-LC avec une colonne à compression radiale µBondapak® Waters (100 x 25 mm i.d, 10 µm) avec une élution en mode isocratique MeCN-
H2O (Débit : 10 ml/min, MeCN-H2O (23 :77), Détection : 254 nm) pour obtenir les composés L (3 mg), M (4 mg), N (5 mg) et O (3 mg). La fraction 10a-11a a été purifiée par SP-LC avec une colonne à compression radiale µBondapak® Waters (100 x 25 mm i.d, 10 µm) avec une élution en mode isocratique MeCN-
H2O (Débit : 10 ml/min, MeCN-H2O (28 :72), Détection : 210 nm) pour obtenir les composés P (4 mg), Q (1 mg) et R (4 mg).
3.4.3 Déterminations structurales des composés K à R 3.4.3.1 Etudes préliminaires des composés K à R Alors que lors du fractionnement bioguidé de l’extrait dichlorométhanique des racines d’O. fetida (cf. 3.3), les sept premiers isoflavonoïdes de ce genre ont pu être identifiés (trois isoflavonoïdes et quatre ptérocarpanes), une flavone, une flavanone, cinq isoflavones et une isoflavane ont été isolés lors du fractionnement de l’extrait méthanolique. Les éléments structuraux similaires des flavonoïdes isolés à partir des extraits dichlorométhanique et méthanolique, à l’exception des ptérocarpanes, sont présentés ici, tandis que les déterminations structurales particulières des composés K à R sont présentées aux points 3.4.3.2 à 3.4.3.9.
Comme nous avons pu le voir précédemment (cf. 3.3.3.9) les analyses LC/DAD-UV, ainsi qu’EI-MS livrent des informations structurales importantes sur les différents flavonoïdes et ces différentes informations sont résumées dans le tableau III-8 [Subarnas et al., 1991; Hedin et Phillips, 1992; Wolfender et al., 2000].
Selon leurs maxima d’absorption, les composés K, L, M, O et Q seraient tous des isoflavones. Ces différents composés présentent trois types de substitution sur le cycle A selon leur fragmentation [1,3A]+ ou [1,3A+H]+. Les composés L, M et Q (m/z 136 [1,3A]+ ou 137 [1,3A+H]+) sont ainsi substitués par un hydroxyle, contre deux pour le composé O (m/z 153 [1,3A+H]+), alors que le composé K (m/z 167 [1,3A+H]+) est substitué par un hydroxyle et un méthoxyle. Concernant les substitutions du cycle B de ces composés, la fragmentation [1,3B]+ nous indique que le composé O est substitué par un hydroxyle (m/z 118 [1,3B]+), contre deux pour le composé K (m/z 134 [1,3B]+) et les composés L et M (m/z 148 [1,3B]+) par un hydroxyle et un méthoxyle.
121
Tableau III-8 : Résultats des analyses LC/DAD-UV et EI-MS des flavonoïdes isolés des extraits DCM et MeOH d’O. fetida (Vill.) DC.
Fragments des cycles A et B Type de Composés Maxima d’absorption (λ ) flavonoïdes isolés max + 1,3 + 1,3 + 1,3 + 1,3 + 0,2 + 0,4 + 0,4 + 1,4 + 1,4 + [M ] [ A] [ A+H] [ A-CO] [ B] [ B] [ B] [ B-H2O] [ B-2H] [ B-2H-CO]
Isoflavone C 260, 290 (sh), 330 (sh) nm 282 136 (10) - - 146 (95) - - - - -
K 260, 290 (sh), 330 (sh) nm 300 - 167 (100) - 134 (40) - - - - -
O 260, 290 (sh), 330 (sh) nm 270 - 153 (100) - 118 (40) - - - - - 136 L 250, 265 (sh), 290, 310 (sh) 284 - - 148 (40) - - - - - (100) M 250, 265 (sh), 290, 310 (sh) 284 - 137 (15) 148 (50) - - - - -
Q 250, 265 (sh) 310 (sh) 298 - 137 (60) - 162 (50) - - - - -
Isoflavane E 225 (sh), 275 302 123 (60) - 95 (5) 180 (50) - - - - -
P 225 (sh), 275 320 123 (10) ------178 Isoflavanone D 230 (sh), 275, 305 314 - 137 (40) - - - - (100) Flavanone N 290, 335 (sh) 272 153 (60) - 120 (20) - - - 147 (100) 119 (90) 121 Flavone R 270, 335 270 153 (30) - - - - (30)
3. RÉSULTATS
Les composés N et R sont tous deux substitués par trois hydroxyles, deux sur le cycle (A [1,3A]+ à m/z 153) et un sur le cycle B. Cette substitution sur le cycle B est observée grâce au fragment [1,3B]+ à m/z 120 pour le composé N et au fragment [0,2B]+ à m/z 121 pour le composé R. En effet, ces deux composés n’ont pas le même type de fragmentation, le composé N est probablement une flavanone, alors que le composé R serait lui plutôt une flavone.
Le spectre UV/Visible du composé P est similaire à celui du composé E précédemment isolé et indique la présence d’une flavane. Ces deux composés possèdent de plus la même fragmentation [1,3A]+ à m/z 123 indiquant une substitution d’un seul hydroxyle sur le cycle A. Aucune conclusion n’a pu être effectuée au sujet de la substitution du cycle B.
La confirmation et l’identification complète de ces composés a pu s’effectuée grâce à l’analyse des données RMN 1D et 2 D.
3.4.3.2 Composé P Le composé P se présente sous forme d’une poudre amorphe blanchâtre et l’analyse des données RMN (1H, gDQF-COSY, gHSQC, gHMBC et NOESY) et HRESI-MS a permis son élucidation structurale. Sa formule brute, établie par analyse HRESI-MS (m/z 343.11552
calculée pour C17H20O6Na 343.11521) est de C17H20O6 et implique une molécule possédant huit cycles et/ou insaturations. Le spectre UV/Visible du composé P (cf. 3.4.3.2) montre des maxima d’absorption à 205 et 275 nm, ainsi qu’un épaulement à 225 nm suggérant la présence d’une structure de type isoflavane ou ptérocarpane [He et Findlay, 1991; Xu et al., 2006].
La présence sur le spectre RMN-1H (Figure III-34) de signaux caractéristiques associés au
groupement –CH2-CH-CH2-O correspondant aux protons en C-2 (δH 3.82 ppm, dd, J = 10.2 Hz,
4.26 ppm, dd, J = 10.2 Hz, 2H et δC 69.6 ppm), C-3 (δH 2.57 ppm, m ,1H et δC 32.6 ppm) et C-
4 (δH 2.53, dd, J = 14.6 Hz ,2.77 ppm, dd, J = 14.6 Hz, 2H et δC 27.2 ppm) et non pas de
signaux caractéristiques d’un groupement O-CH2-CH-CH-O typique des ptérocarpanes, corroborerait donc plutôt avec l’hypothèse d’une structure de type isoflavane [He et Findlay, 1991; Subarnas et al., 1991].
123 3. RÉSULTATS
3 3 OCH OCH H-6’ H-5’ H-2 H-5 H-4 H-3 H-4 H-1’ H-2 H-8 H-6 H-6’
6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 ppm
Figure III-34 : Spectre RMN-1H du composé P Spectre enregistré dans le méthanol-d4 à 499.87 MHz avec le TMS comme standard interne.
De plus, trois protons enregistrés dans la zone aromatique à δH 6.81, 6.28, et 6.17 ppm
présentent un système de spin ABX caractéristique des protons en H-5 (δH 6.81 ppm, d, J = 8.3
Hz, 1H et δC 130.4 ppm ), H-6 (δH 6.28 ppm, dd, J = 8.3, 2.5 Hz, 1H et δC 108.3 ppm) et H-8
(δH 6.17 ppm, d, J = 2.5 Hz, 1H et δC 102.8 ppm). Selon la fragmentation RDA (cf. 3.4.3.2), le composé P est substitué sur le cycle A par un hydroxyle (m/z 123 [1,3A]+). La corrélation
gHMBC entre un carbone déblindé à δC 156.8 ppm et le proton H-5, ainsi que la comparaison des déplacements chimiques avec ceux du composé E et ceux de la littérature, indiquent sa position en C-7.. La structure partielle de P (Figure III-35) peut alors être représentée ainsi :
8 HO O 2 7 8a
4a 6 3 5 4
Figure III-35 : Structure partielle du composé P
124 3. RÉSULTATS
Compte tenu des informations HRESI-MS, la partie restante du composé P devrait contenir 3
cycles et/ou insaturations et être en C8H11O4. La présence de plusieurs protons non aromatiques entre 1.8 et 4.6 ppm suggèrent l’attachement à l’unité principale d’un cycle B non benzénique. 1 En effet, sont observés sur le spectre RMN- H, un groupement méthylène saturé (δH 2.20 ppm,
m et 1.83 ppm, m, 2H et δC 29.5 ppm), un groupement méthine saturé (δH 2.38 ppm, m, 1H et
δC 44.8 ppm), un groupement méthinique oxygéné (δH 4.55 ppm, m, 1H et δC 66.1 ppm) et deux
singulets caractéristiques de groupements méthoxyles (δH 3.62 ppm, s, 3H et δC 59.8 ppm) et
(δH 4.09 ppm, s, 3H et δC 58.8 ppm).
L’enchaînement de ces groupements peut être déduit de l’analyse des expériences gDQF-COSY et gHMBC. Les corrélations homonucléaires 1H-1H, issues d’une expérience gDQF-COSY (Figures III-36 et III-37), indiquent la présence d’un système de spin impliquant le groupement
méthine saturé en C-3 du cycle C à δH 2.57 ppm avec le groupement méthine saturé à δH 2.38
ppm, les deux protons du méthylène saturé à δH 1.83 et 2.20 ppm et ainsi que le groupement
méthinique oxygéné à δH 4.55 ppm.
3 3 H-6’ OCH OCH H-4 H-3 H-5’ H-5 H-8 H-2 H-6 H-2 H-4 H-1’ H-6’
0
1 H-6’ H-6’ 2 H-4 H-1’ H-3 H-4 3 OCH3 H-2 OCH3 4 H-2 (ppm) F1 H-5’ 5
H-8 6 H-6 H-5 7
7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 F2 (ppm)
Figure III-36 : Spectre de corrélations homonucléaires gDQF-COSY du composé P
125 3. RÉSULTATS
H
8 H HO O
7 8a 2 H O
3 2' 4a H OCH 6 4 3 5 H 1' 3' H H H 6' H 4' H 5' OCH3 H H OH
Figure III-37 : Principales corrélations homonucléaires gDQF-COSY du composé P
Sur le spectre gHMBC (Figures III-38 et III-39) de la molécule, les corrélations 1 13 hétéronucléaires H- C longues distances associées aux deux multiplets à δH 2.20 et 1.83 ppm
sont observées à δC 66.1, 164.8 ppm et à δC 196.9 ppm, déplacement chimique caractéristique d’une fonction carbonyle. Une corrélation hétéronucléaire 1H-13C longues distances est
également visible entre le proton méthinique oxygéné à δH 4.55 et un carbone à δC 137.1 ppm.
C-2 C-7 C-8a C-5’ C-3 C-4 C-2’ C-4’ C-3’ C-4a C-8
0
1 H-6’ H-6’ 2 H-4 H-1’ H-3 H-4 3 OCH3 H-2 OCH3 H-2 4 H-5’ F2 (ppm)
5
H-8 6 H-6 H-5 7
220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 F1 (ppm)
Figure III-38 : Spectre de corrélations hétéronucléaires gHMBC du composé P
126 3. RÉSULTATS
Les déplacements chimiques des carbones à δC 164.8 et 137.1 ppm, ainsi que l’hypothèse précédente de la présence de trois cycles et/ou insaturations pour le cycle B, suggèrent la présence d’un cycle de type cyclohexènone portant deux carbones éthyléniques oxygénés. Pour finir, les corrélations hétéronucléaires 1H-13C courtes et longues distances, déduite des spectres
gHSQC et gHMBC, indique des corrélations entre les carbones à δC 164.8 et 137.1 ppm et
respectivement les protons des groupements méthoxyles à 4.09 (δC 58.8 ppm) et 3.62 (δC 59.8 ppm) ppm. Les unités méthyles étant ainsi portées par les deux carbones éthyléniques oxygénés.
H
8 H HO O 2 7 8a H O H 4a 3 2' 6 1' OCH3 4 H 5 3' H H H H 4' 6' H 5' OCH3 H H OH
Figure III-39 : Principales corrélations hétéronucléaires gHMBC du composé P
La réunification de toutes les informations, assimile le composé P à la 2’-céto-3’,4’-diméthoxy- 7,5’-dihydroxy-1’,6’-dihydroisoflavane. L’analyse de masse basse résolution réalisée en ESI positif a révélé un pic moléculaire protoné à m/z 321 s’accordant avec la formule brute
proposée en C17H20O6 (Figure III-40).
+ c ESI Full ms [ 150.00-1200.00] 321 [M+H]+ 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 Abondance relative 40 35 30 25 20 15 10 5 0 200 250 300 350 400 450 m/z
Figure III-40 : Spectre ESI-MSn en mode positif du composé P
127 3. RÉSULTATS
Par ailleurs, la fragmentation MS2 génère un ion à m/z 303 correspondant probablement au départ d’une unité hydroxyle sous forme d’une molécule d’eau (18 uma).
La mesure du pouvoir rotatoire a montré que le composé P était dextrogyre : 25 +49.1° []α D
(CHCl3; c 1.0). La configuration absolue de la molécule n’est pas connue, des analyses par dichroïsme circulaire seraient ainsi nécessaires.
Le composé P est une molécule originale rapporté ici pour la première fois, de plus le cycle 4- hydroxy-2’,3’-diméthoxycyclohex-2-èn-1-one est une nouvelle classe de métabolite secondaire qui s’apparente aux isoflavanquinones [Harborne, 1996]. Cette classe de flavonoïdes est très restreinte, quelques composés uniques, tels que la claussequinone (Pterocarpus soyauxii Taub., Dalbergia spp.), la pendulone (Wisteria brachybotrys Siebold, Millettia dielsiana Harms. ex diels.) ou plus dernièrement la laurentiquinone (Millettia laurentii De Wild.) ont été décrits. Ils ont tous été, sans exception, isolé de différentes espèces de Faboideae et ont montré des potentialités pharmacologiques intéressantes comme antibactérien (claussequinone, pendulone) ou encore contre la leishmaniose (pendulone) [Bezuidenhoudt et al., 1987; Hamburger et al., 1987; Kaneko et al., 1988; Yahara et al., 1989; Wang et Geng, 1990; Kamnaing et al., 1999; Takahashi et al., 2006].
8 HO O 2 7 8a O
4a 3 2' 6 1' OCH3 5 4 3'
6' 4' 5' OCH3
HO
Composé P 2’-céto-3’,4’-diméthoxy-7,5’-dihydroxy-1’,6’-dihydroisoflavane
3.4.3.3 Composé Q Le composé Q se présente sous forme d’une poudre amorphe. Comme nous avons pu le voir précédemment (cf. 3.4.3.1), son spectre UV/Visible est caractéristique d’une isoflavone (250, 265 (sh) et 310 (sh) nm) [Markham, 1982]. De plus, la présence sur le spectre RMN 1H, dans la
128 3. RÉSULTATS
zone aromatique, d’un singulet à δH 8.12 ppm (Figure III-41) caractéristique d’un proton H-2 d’une isoflavone, confirme cette hypothèse [Markham, 1982]. O 2 OCH H-2 H-5 H-8 H-6’ H-3’ H-6 H-6
8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 ppm
Figure III-41 : Spectre 1H-RMN du composé Q Spectre enregistré dans le méthanol-d4 à 499.87 MHz avec le TMS comme standard interne.
L’enregistrement de son spectre de masse basse résolution en ESI positif indique que ce composé présente un pic moléculaire protoné à m/z 299 [M+H]+. En EI-MS, l’obtention d’un fragment [1,3A+H]+ à m/z 137 (cf. 3.4.3.1) indique la substitution du cycle A par un hydroxyle. Le même fragment [1,3A+H]+ est observé pour C. Ces deux composés ont une différence de 16 uma à leur pic moléculaire [M]+, respectivement m/z 282 (C) et m/z 298 (Q). Cependant le fragment [1,3B]+ est visible à m/z 162 pour Q et à m/z 146 pour C. Cette différence démontre la présence d’un hydroxyle sur le cycle B du composé Q par rapport à C.
Le système de spin ABX observé pour le cycle A n’est pas visible pour le cycle B avec
l’apparition de deux singulets à δH 6.59 (s, 1H et δC 102.1 ppm) et 6.62 (s, 1H et δC 112.4 ppm) ppm correspondant aux protons H-3’ et H-6’. Le cycle B est donc bien substitué par un hydroxyle en C-2’, sa position ainsi que la présence d’un groupement méthylènedioxy ont été confirmées par comparaison avec la littérature. Le composé Q est une 7,2’-Dihydroxy-4’,5’-méthylènedioxyisoflavone ou 2’-Hydroxy- pseudobaptigénine. Cette isoflavone est un précurseur, au même titre que la pseudobaptigénine, de la maackiaine et a été isolée pour la première fois dans le genre Trifolium [Dewick et Ward, 1978; Ingham et Dewick, 1980; Ingham, 1981; Banks et Dewick, 1982].
129 3. RÉSULTATS
8 HO O 7 8a 2 OH
4a 2' 6 1' 3 3' 5 4
O 6' 4' 5' O
O Composé Q 2’-Hydroxy-pseudobaptigénine
3.4.3.4 Composés M, L, K et O L’analyse des données LC/DAD-UV préliminaires des composés K, L, M, et O indique la présence de quatre isoflavones (cf. 3.4.3.1). L et M présentent des maxima à 250, 265 (sh), 290, 310 (sh) nm, et 260, 290 (sh), 330 (sh) nm pour K et O. De même que pour Q, le spectre RMN- 1 H de ces quatre composés montre la présence d’un singulet à δH 8.04, 8.13, 8.12 et 8.03 ppm (pour respectivement K, L, M, et O), ce qui confirme l’hypothèse d’une structure de type isoflavone [Markham, 1982]. Cependant, ces informations suggèrent que L et M forment une paire ayant des chromophores distincts de la paire K et O.
L et M présentent ainsi, les mêmes maxima d’absorption et ainsi que les mêmes déplacements
chimiques pour le proton en C-2 (δH 8.13 et 8.12 ppm). De plus, selon leur fragmentation RDA (cf. 3.4.3.1), ils possèdent les mêmes types de substitution sur le cycle A (m/z 136 [1,3A]+ ou m/z 137 [1,3A+H]+), soit un hydroxyle et sur le cycle B (m/z 148 [1,3B]+) soient un hydroxyle et un méthoxyle. Ainsi, l’enregistrement de leur spectre de masse basse résolution en ESI positif présente de façon similaire un pic moléculaire protoné à m/z 285 [M+H]+. L’analyse des données RMN 1H, ainsi que la comparaison avec celles des composés C et Q confirment que les composés L et M possèdent également un hydroxyle substitué en C-7 sur le cycle A. Après comparaison avec les données de la littérature et analyse des données LC/DAD-UV, LC/UV/ESI-MSn, EI-MS, RMN 1H, le composé L pourrait être assimilé au 7,4'-dihydroxy-3’- méthoxyisoflavone ou 3'-méthoxydaidzéine [Yahara et al., 1989] et le composé M au 7,3’- dihydroxy- 4’-méthoxyisoflavone ou calycosine [Xiao et al., 2005]. Les expériences NOESY et gHMBC effectuées sur ces deux composés n’ont pas pu confirmer définitivement le positionnement des méthoxyles respectivement en 3’ et 4’.
130 3. RÉSULTATS
8 8 HO O HO O 2 2 7 8a 7 8a 2’ 2’ 4a OCH 4a OH 6 3 1’ 3’ 3 6 3 1’ 3’ 5 4 5 4 O 6’ 4’ O 6’ 4’ 5’ OH 5’ OCH3
Composé L Composé M 3'-Méthoxydaidzéine Calycosine
K et O présentent les mêmes maxima d’absorption et ainsi que les mêmes déplacements
chimiques pour le proton en C-2 (δH 8.04 et 8.03 ppm). Selon leur fragmentation RDA (cf. 3.4.3.1), sur le cycle A, le composé O (m/z 153 [1,3A+H]+) possède deux hydroxyles, tandis que le composé K (m/z 167 [1,3A+H]+) est substitué par un hydroxyle et un méthoxyle. Concernant les substitutions du cycle B de ces composés, la fragmentation [1,3B]+ nous indique que le composé O porte un hydroxyle (m/z 118) et K (m/z 134) deux hydroxyles. Selon ces informations et l’analyse des données RMN 1H, il s’agirait ainsi de la 2',4',5-trihydroxy-7- méthoxyisoflavone ou cajanine (composé K) [Dahiya et al., 1984; Adesanya et al., 1985; Tahara et al., 1986; Dahiya, 1987; Waffo et al., 2000; Maver et al., 2005] et de la 4',5,7- trihydroxyisoflavone ou génistéine (composé O) [Kanakubo et al., 2001].
8 8 H3CO O HO O 2 2 7 8a OH 7 8a
4a 2’ 4a 2’ 6 3 1’ 3’ 6 3 1’ 3’ 5 4 5 4
OH O 6’ 4’ OH O 6’ 4’ 5’ OH 5’ OH
Composé K Composé O Cajanine Génistéine
Les données LC/DAD/UV, LC/UV/ESI/MSn, EI-MS, RMN (1H, gHSQC, gHMBC et NOESY), ainsi que la comparaison avec les données de la littérature, ont permis la confirmation de ces deux hypothèses structurales.
3.4.3.5 Composés N et R L’analyse des données LC/DAD-UV et EI-MS préliminaires des composés N et R a indiqué respectivement la présence d’une flavanone et d’une flavone toutes deux substituées par deux
131 3. RÉSULTATS
hydroxyles sur le cycle A et un hydroxyle sur le cycle B (cf. 3.4.3.1). Selon ces hypothèses, il s’agirait ainsi de la (-)-(2S)-naringénine (composé N) ( 25 -10° (EtOH; c 0.4) ( 25 -14.7° [α]D []α Litt (EtOH; c 0.36)[Giorgio et al., 2004]) et de l’apigénine (composé R) deux flavonoïdes très communs. L’analyse des données LC/DAD/UV, LC/UV/ESI/MSn, EI-MS, RMN 1D, ainsi que la comparaison avec les données de la littérature, ont permis la confirmation de ces deux hypothèses structurales [Shen et al., 1993; Fatope et al., 2003; Miyazawa et Hisama, 2003].
5’ OH 5’ OH 6’ 4’ 6’ 4’
8 8 3’ 3’ HO O 1’ HO O 1’ 7 8a S 2 2’ 7 8a 2 2’
4a 4a 6 3 6 3 5 4 5 4
OH O OH O Composé N Composé R (-)-(2S)-Naringénine Apigénine
3.4.4 Considérations phytochimiques Le fractionnement bioguidé de l’extrait méthanolique des racines d’O. fetida a conduit à l’isolement et à l’identification de huit constituants : une flavane (P), cinq isoflavones (K, L, M, O et Q), une flavanone (N) et une flavone (R). Ces composés correspondent, à l’exception du composé P non UV-majoritaire, respectivement aux pics 11 (L), 12 (M), 13 (Q), 14 (N), 15 (K), 16 (O) et 17 (R) du chromatogramme de l’analyse LC/DAD-UV préliminaire de l’extrait méthanolique d’O. fetida (cf. 3.4.1) (Figure III-42). Les composés UV-majoritaires de l’extrait méthanolique des racines d’O. fetida sont ainsi issus de la même voie biosynthétique que la grande partie des composés isolés dans l’extrait dichlorométhanique, ce sont tous des flavonoïdes. Les activités biologiques des composés K à R seront présentées au point 3.5 : Oxytropis fetida (Vill.) DC. Biosynthèse et activités des composés A à P.
132
M mAU % MeCN + 0.25 % aa.
1 100 300 K 90
250 OR 80
70 200 L 3 60 150 19 18 50
2 6 Q N 100 7 20 40 4 5 8 910 P 30 50
20
0 10 0 20 40 60 80 100 min Figure III-42 : Analyse LC/DAD-UV de l’extrait MeOH des racines d’O. fetida (Vill.) DC. Conditions chromatographiques : Colonne: Waters SymmetryShield C18 (150 × 2.1 mm i.d., 5 µm) avec une précolonne du même matériel (1.5 x 2.1 mm i.d., 5 µm) ; Eluant: gradient acétonitrile (0.25 % a.a.) - eau (0.25% a.a.) (10:90 à 100:0 en 100 min) ; injection 100 µg ; débit: 0.2 ml/min ; détection à 254 nm, spectre UV/Visible (DAD) balayé de 190 à 600 nm.
3. RÉSULTATS
3.5 Oxytropis fetida (Vill.) DC. : Biosynthèse, activités biologiques et biochimiques.
3.5.1 De la biosynthèse des isoflavonoïdes Au cours du fractionnement bioguidé des extraits dichlorométhanique et méthanolique des racines d’O. fetida (Vill.) DC., quinze flavonoïdes (lato sensu) ont été identifiés. Ces derniers sont principalement des isoflavonoïdes de différents types, tels que des isoflavones, des isoflavanones, des isoflavanes ou encore des ptérocarpanes. Une flavone et une flavanone ont également été isolées. Comme nous l’avons déjà évoqué (cf. 2.3.6.2 et 3.3.3.9), dans le genre Oxytropis, une grande série de flavonols dérivés de la myricétine, de la quercétine et du kaempférol ont été décrits, contrairement aux isoflavonoïdes qui eux n’ont jamais été isolés dans ce genre. La distribution des isoflavonoïdes est restreinte à 22 genres d’angiospermes appartenant majoritairement à la sous-famille des Faboideae (Fabaceae) [Yu et McGonigle, 2005]. Cette spécificité est vraisemblablement liée à l’étroite spécialisation de l’enzyme responsable de leur formation, ainsi que de sa distribution limitée. Alors que tous les flavonoïdes ont une origine biosynthétique commune de par la condensation, catalysée par la chalcone-synthase, de trois molécules de malonyl-CoA avec le 4-coumaroyl-CoA, et, de ce fait, possèdent le même élément structural de base, à savoir l’enchaînement 2-phénylcromane, la migration du phényl catalysée par l’isoflavone synthase conduit au 3-phénylchromane, structure de base des isoflavonoïdes [Bruneton, 1999]. Cette migration s’effectuant entre autre sur les précurseurs des isoflavonoïdes et des 5-désoxyisoflavonoïdes, à savoir respectivement la naringénine et la liquiritigénine pour donner la génistéine et la daidzéine. Ces isoflavones vont être ensuite métabolisées par une série d’enzymes pratiquement spécifiques aux Fabaceae, pour donner forme aux isoflavanes, aux isoflavanones et aux ptérocarpanes [Bruneton, 1999; Yu et McGonigle, 2005]. La figure III-43 présente l’origine biosynthétique de ces différents types de flavonoïdes, ainsi que les voies biosynthétiques des différents composés isolés. Ces dernières sont toutes bien référencées [Al-Ani et Dewick, 1985; Harborne, 1996; Aoki et al., 2000], à l’exception de celle de l’isoflavanone onogènine (D) et du produit naturel original P, soit la 2’- céto-3’,4’-diméthoxy-7,5’-dihydroxy-1’,6’-dihydroisoflavane.
134 3. RÉSULTATS
VOIE DE L’ACIDE SHIKIMIQUE
Phénylalanine
Malonyl CoA 4-coumaroyl CoA OH O
-O CoAS 3x CoAS O +
Chalcone synthase Chalcone synthase + polyketide reductase
OH OH
HO OH HO OH
OH O O FLAVONOIDES 2’,4’,6’,4-Tetrahydroxychalcone Isoliquiritigénine Chalcone isomérase OH OH OH HO O HO O HO S O S 5-DEOXYFLAVONOIDES Flavones synthases Flavones synthases OH O O OH O Apigénine (R) (-)-(2S)-Naringénine (N) Liquiritigénine Isoflavanone synthase
2,5,7,4’-Tétrahydroxyisoflavanone 2,7,4’-Trihydroxyisoflavanone ISOFLAVONOIDES 5-DEOXYISOFLAVONOIDES Deshydratase H CO O 3 OH HO O HO O HO O
OCH3 OH O OH OH O O OH O OR OH Cajanine (K) Génistéine (O) R = H Daidzéine 3’Méthoxydaidzéine (L) R = CH Formononétine HO O HO O 3
OH OH
O OCH O Calycosine (M) 3 Calycosine (M) OCH3 HO O
O Hydroxylases O-méthyltransferases O Etc. O Pseudobaptigénine (C)
Isoflavone 2’-hydroxylase HO O HO O O = Composés isolés OH O OH O O O O HO HO OCH Koparine 3 2’Hydroxyisoflavone 2’ Hydroxypseudobaptigénine (Q)
HO O OH
OCH3
O OCH3 7,2’dihydroxy-3’,4’diméthoxyisoflavone
Isoflavone reductase
H H H O O O O O O HO O HO O OH O OCH3 R R
OCH ?
3 O
O O O
O O O O O
HO O
OCH3 HO O
O O 7,2’dihydroxy-3’,4’diméthoxyisoflavanone 2’Hydroxyisoflavanone (-)-(3R)-Sophorol (+/-)-Onogénine (D) O
O
OH OH OH O O
HO O HO HO O HO O Ptérocarpane synthase OH OCH R HO 3 OCH3 Isoflavanol ? O O OCH3 OCH3
HO H O O O O Deshydratase O H 2’-Céto-3’,4’-diméthoxy-7,5’- (-)-(3R)-Isomucronulatol (E) R R R dihydroxy-1’,6’-dihydro-isoflavane (P) H R O-méthyltransferases H O HO O O H3CO Ptérocarpane (-)-(6aR,11aR)-Maackiaine (F) (-)-(6aR,11aR)-Ptérocarpine (J) ISOFLAVANE Hydroxylase Ptérocarpane synthase PTEROCARPANES O O O HO OCH 3 H CO OCH ? 3 3
HO O O H O-méthyltransferases H Isoflavanquinone Isoflavane O R R R H R H
H3CO O H3CO O (-)-(6aR,11aR)-3-Méthoxyvesticarpane (G) (-)-(6aR,11aR)-3,9-Diméthoxynissoline (I)
Figure III-43 : Origine biosynthétique des flavonoïdes isolés [Kurosawa et al., 1978; Al-Ani et Dewick, 1985; Harborne, 1996; Aoki et al., 2000]
135 3. RÉSULTATS
L’obtention des ptérocarpanes et des isoflavanes passe par les mêmes étapes biosynthétiques, à savoir un intermédiaire isoflavanonique, et engage les mêmes enzymes (isoflavones 2’- hydroxylases, isoflavones réductases) à l’exception d’une ptérocarpane synthase pour les ptérocarpanes. Ces deux voies sont illustrées par les exemples de la maackiaine (F) et de l’isomucronulatol (E) dans le schéma de la figure III-43.
L’onogénine (D) pourrait être incorporée à la voie biosynthétique de la maackiaine (F) par une simple méthylation en 2’, grâce à une O-méthyltransférase par exemple, du sophorol, l’isoflavanone précurseur de ce ptérocarpane [Banks et Dewick, 1982]. Cette hypothèse est d’autant plus plausible que tous les intermédiaires de cette voie, à l’exception du sophorol, ont été isolés dans ce travail. L’onogènine a été isolée uniquement à partir d’Ononis arvensis L. et de deux espèces du genre Ulex (U. airensis et U. europaeus ssp. europaeus L.), la maackiaine (F) ayant déjà été isolée dans ces deux genres [Barrero et al., 1998; Maximo et Lourenco, 1998].
Comme évoqué précédemment, la voie biosynthétique des isoflavanes est relativement bien connue et suit les mêmes grandes étapes que celles des ptérocarpanes. L’obtention par contre des isoflavanquinones, supposées provenir des isoflavanes, découle d’un mécanisme enzymatique ou non enzymatique encore non complètement élucidé [Harborne, 1996]. Concernant le nouveau produit naturel, l’isoflavane P, la mise en perspective des éléments que sont, sa présence en tant que constituant très minoritaire du métabolisme secondaire de O. fetida, sa structure inhabituelle, ainsi que la présence simultanée de ce dernier et de l’isomucronulatol (E), pourrait suggérer un rôle d’intermédiaire dans la formation de cette isoflavane ou d’isoflavanquinones comme par exemple la pendulone ou la colutequinone A. Ces isoflavanquinones n’ayant par contre pas été détectées dans les extraits d’O. fetida (Vill.) DC..
De par l’appartenance du genre Oxytropis à la sous-famille des Faboideae, la présence de l’isoflavone synthase et d’un métabolisme secondaire principalement dirigé vers la production d’isoflavonoïdes n’est donc pas étonnant pour ce genre. De plus, la grande majorité des composés isolés l’ont également été dans le genre Astragalus de la même tribu des Galegeae que le genre Oxytropis. Comme nous avons pu le voir précédemment (cf. 2.3), ces deux genres sont regroupés, de par leur toxicité, sous la même appellation de « locoweeds ». De grandes similitudes dans leur métabolisme secondaire ne sont donc pas surprenantes.
136 3. RÉSULTATS
3.5.2 Activités biologique et biochimique des composés A à R Les activités antifongique contre Cladosporium cucumerinum et antiradicalaire sur le DPPH ont été évaluées pour les composés purs A à R. Les composés présentant une activité à une quantité de 10 µg ont été sélectionnés et leurs activités antifongique et antiradicalaire ont été évaluées par l’observation de dilutions successives.
3.5.2.1 Activité antifongique contre C. cucumerinum des composés isolés. Les résultats du test autobiographique contre la moisissure phytopathogène C. cucumerinum pour les composés A à R sont présentés dans le tableau III-9.
Tableau III-9 : Résultats des tests autobiographiques contre C. cucumerinum des composés A à R isolés dans les racines d’O. fetida (Vill.) DC.
Type Composé Nom C. c
Ptérocarpanes F Maackaine 0.1 µg G 3-Méthoxyvesticarpane
I 3,9-Méthoxynissoline Inactif J Ptérocarpine
Isoflavanes E Isomucronulatol 0.1 µg
P 2’-céto-3’,4’-diméthoxy-7,5’-dihydroxy-1’,6’-dihydroisoflavane
Isoflavanone D Onogénine 1.0 µg
Isoflavones C Pseudobaptigénine
K Cajanine
L 3’-Méthoxy-daidzéine
M Calycosine 10.0 µg
O Génistéine
Q 2’-Hydroxy-pseudobaptigénine
Flavanone N Naringénine
Flavone R Apigénine
Phényléthylamide A 2’-Hydroxy-phénéthylcinnamide Inactif
B 2’-Hydroxy-phényléthylbenzamide
H Phénéthylcinnamide
Les composés C, D, E, F, G et P présentent une bonne activité antifongique à 10 µg sur le test autobiographique contre la moisissure phytopathogène C. cucumerinum et ont été sélectionnés pour évaluer leurs activités par l’observation de dilutions successives. Les composés K, L, M,
137 3. RÉSULTATS
O et Q présentent une très faible activité à 10 µg, tandis que les composés A, B, H, I, J, N et R ne présentent aucune activité.
Les composés E, F et G inhibent la croissance du champignon à une quantité de 0.1 µg, alors que les composés C et D l’inhibent à une quantité de 1 µg. La substance de référence, la nystatine, étant inhibitrice dès 0.2 µg, les composés E, F et G possèdent donc une bonne activité (Figure III-44).
F Cladosporium cucumerinum
Cladosporium cucumerinum C 10 µg 1 µg 0.1 µg 0.05 µg 0.01 µg
E Cladosporium cucumerinum
10 µg 1 µg 0.1 µg 0.05 µg 0.01 µg 10 µg 1 µg 0.1 µg 0.05 µg 0.01 µg
D Cladosporium cucumerinum G Cladosporium cucumerinum
10 µg 1 µg 0.1 µg 0.05 µg 0.01 µg 10 µg 1 µg 0.1 µg 0.05 µg 0.01 µg
Figure III-43 : Activité antifongique (C. cucumerinum) des composés C, D, E, F et G
Les composés C, D, E, F et G étant tous issus du fractionnement bioguidé de l’extrait dichlorométhanique des racines d’O. fetida, ce résultat concorde avec ceux obtenus lors du criblage initial ayant montré une nette activité pour cet extrait. Par contre, ces composés provenant tous de la fraction 7a, l’activité de la fraction 8a ne peut être expliquée, les composés H, I et J ne présentant aucune activité. La fraction 8a contenait trois produits fortement majoritaires, soit les composés isolés H, I et J, mais également en moindres proportions les composés actifs isolés de la fraction 7a soit les composés C, D, E, F et G. Un effet synergique de ces composés minoritaires pourrait ainsi expliquer l’activité de la fraction 8a.
Chez les végétaux, bon nombre de structures isoflavonoïdiques sont des phyto-alexines, c’est-à- dire des substances de défenses contre une infection par un agent pathogène, le plus souvent de nature fongique. Ces dernières sont soit constitutives, soit induites en réponse à l’attaque d’un microorganisme. Les isoflavonoïdes et en particuliers les ptérocarpanes, les isoflavanes, les isoflavones et les isoflavanones sont ainsi toxiques contre les pathogènes fongiques. Ces substances inhibent la germination des spores, l’élongation du tube germinal, la croissance des hyphes par divers mécanismes (destruction des membranes, interférences avec le métabolisme :
138 3. RÉSULTATS
inhibition enzymatique, porosité membranaire, etc.) [Andersen et Markham, 2006]. Diverses études ont été effectuées sur la relation structure-activité des différents isoflavonoïdes en regard avec leur activité antifongique, mais malgré leur grand nombre, cette relation n’est pas vraiment clarifiée de manière satisfaisante. Plusieurs remarques peuvent néanmoins être effectuées. La structure tridimensionnelle de ces composés semble avoir une grande importance dans l’interaction avec un éventuel récepteur membranaire et ainsi dans la toxicité fongique [VanEtten, 1976]. En effet, les ptérocarpanes ainsi que les isoflavanes semblent posséder de plus grandes potentialités antifongiques de par leur conformation non planaire par rapport aux isoflavones ou aux coumestanes. Chez les ptérocarpanes, les deux cycles aromatiques sont en effet perpendiculaires, alors que les isoflavanes peuvent prendre une conformation similaire de par leur liaison C-3 C-1’ [VanEtten, 1976]. Un second paramètre important pour la présence d’une activité est le caractère lipophile des phyto-alexines. Celles-ci devant être à la fois assez lipophiles pour obtenir une bonne pénétration de la paroi cellulaire fongique et pouvoir produire des radicaux libres in situ et assez hydrophiles pour être solubles [Arnoldi et Merlini, 1990]. L’apport, dans une certaine mesure, de diverses substitutions telles que des prénylations, des méthoxylations ou des chaînes diméthylallyles augmente ainsi en général l’activité des isoflavonoïdes. Néanmoins, la présence d’une fonction phénolique paraît nécessaire pour obtenir une certaine activité et ceci principalement en C-3 et C-9 pour les ptérocarpanes et en C-7 et C-4’ pour les autres isoflavonoïdes. Dernièrement, la présence en C-6a et C-11a pour les ptérocarpanes et en C-3 et C-4 pour les isoflavanes de carbones non substitués augmente leur activité antifongique [VanEtten, 1976; Adesanya et al., 1986; Arnoldi et Merlini, 1990; Weidenboerner et Jha, 1994].
Les isoflavonoïdes ayant probablement différents modes d’action, des corrélations claires entre tous ces paramètres sont difficiles à obtenir. Concernant les composés isolés, les résultats obtenus concordent avec ceux de la littérature. Ainsi des quatre ptérocarpanes isolés, la maackaine (F) et le 3-méthoxyvesticarpane (G) montrent une bonne activité alors que les ptérocarpanes (ptérocarpine (J) et 3,9-diméthoxynissoline (I)) ne présentant aucun hydroxyle libre ne sont pas actifs. Alors que l’isoflavone pseudobaptigénine (C) et l’isoflavanone onogénine (D) présentent des activités moyennes, l’isoflavane isomucronulatol (E) est elle très active. En effet, cette substance présente à la fois une conformation non planaire, des oxygénations en 7 et 3’, ainsi qu’une certaine lipophilie. A l’exception de la nouvelle isoflavane (P) qu’il serait vraiment intéressant de tester, les composés issus du fractionnement bioguidé de l’extrait méthanolique ne présentent que peu d’intérêt. En effet, il s’agit d’une flavone et d’une
139 3. RÉSULTATS
flavanone inactives ainsi qu’une série d’isoflavones connues pour leur activité antifongique très moyenne (génistéine, cajanine, etc.), néanmoins ces tests sont en cours.
3.5.2.5 Activité antiradicalaire sur le DPPH des composés isolés Les résultats du test antiradicalaire sur le DPPH pour les composés A à R sont présentés dans le tableau III-10.
Tableau III-10 : Résultats des tests antiradicalaires sur le DPPH des composés A à R isolés dans les racines d’O. fetida. (Vill.) DC.
Composé Type Nom DPPH Composé Type Nom DPPH 2’-Hydroxy- A Phényléthylamide 0 J Ptérocarpane Ptérocarpine +/- phénéthylcinnamide 2’-Hydroxy- B Phényléthylamide 0 K Isoflavone Cajanine ++ phénéthylbenzamide 3’-Méthoxy- C Isoflavone Pseudobaptigénine + L Isoflavone +/- daidzéine D Isoflavanone Onogénine + M Isoflavone Calycosine + E Isoflavane Isomucronulatol + N Flavanone Naringénine +++ F Ptérocarpane Maackiaine + O Isoflavone Génistéine + 3-Méthoxy- Nouvelle G Ptérocarpane + P Isoflavane + vesticarpane isoflavane 2’-Hydroxy- H Phényléthylamide Phénéthylcinnamide 0 Q Isoflavone + pseudobaptigénine 3,9- I Ptérocarpane + R Flavone Apigénine +++ Méthoxynissoline
0 : pas d’activité ; +/- : activité faible ; + : activité moyenne ; ++ : bonne activité ; +++ : forte activité
Les composés isolés étant tous des flavonoïdes, à l’exception des phényléthylamides inactives A, B et H, l’activité antiradicalaire des extraits dichlorométhanique, méthanolique ainsi que de certaines de leurs fractions (extrait dichlorométhanique : fractions 4a, 7a, 8a et 11a et extrait méthanolique : fractions 3-5a, 6-7a, 8-9a et 10-11a) n’est donc pas étonnante. De nombreux flavonoïdes lato sensu possèdent d’importantes activités antioxydantes et antiradicalaires. Leurs effets protecteurs dans les systèmes biologiques sont liés à leur capacité à transférer des électrons aux radicaux libres, à chélater les métaux, à activer des enzymes antioxydantes, à réduire les radicaux de l’α-tocophérol ou encore à inhiber des oxydases. Ces capacités dépendent entre autre de leur affinité pour les radicaux et donc de leur structure. Les flavonoïdes possédant tous un noyau phénylchromane, le nombre, la position et le type de leurs substitutions vont influencer leurs propriétés antiradicalaires. Ainsi in vivo, différents paramètres vont être importants pour une activité antiradicalaire, tels que le nombre d’hydroxylations et leur position, principalement celles du cycle B, la présence du carbonyle en C-4 ainsi que de la double liaison en C-2-C-3 et l’absence de substitutions telles que des
140 3. RÉSULTATS
groupement méthoxyles ou des glycosides. Les flavonoïdes (stricto sensu) étant de plus généralement plus actifs que les différents isoflavonoïdes [Heim et al., 2002; Butkovic et al., 2004]. Les résultats du test antiradicalaire sur le DPPH sont en général en accord avec la littérature, les composés les plus actifs étant la naringénine et l’apigénine. Les isoflavones présentent ensuite diverses activités selon leur degré d’hydroxylation et de méthoxylation, alors que les ptérocarpanes sans hydroxyle libre ne montrent aucune activité antiradicalaire. Les composés isolés étant tous, à l’exception du composé P (2’-céto-3’,4’-diméthoxy-7,5’- dihydroxy-1’,6’-dihydroisoflavane), des produits connus avec des activités antiradicalaires en général bien documentées, les dilutions successives sur les produits les plus actifs n’ont pas semblées pertinentes. Le composé P de par sa nature flavanique et les substituants de son cycle B (méthoxyles) ne présente pas une activité antiradicalaire marquée sur le DPPH. En effet, il réduit le DPPH à une quantité de 5 µg (Figure III-45).
2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle 1
0.5
0 E 10-11a 50µg 10µg 5µg 1µg 0.5µg
Figure III-45 : Activité antiradicalaire (DPPH) du composé P Eluant : Dichlorométhane : Méthanol : Eau (40 : 50 : 10); Dépôt : 100 µg
141 3. RÉSULTATS
3.6 Etude d’espèces du genre Oxytropis : O. campestris (L.) DC., O. helvetica Scheele, O. jacquinii Bunge et O. fetida (Vill.) DC.
Comme nous avons pu le voir précédemment (cf. 3.2 à 3.4), le fractionnement bioguidé des extraits des racines d’O. fetida (Vill.) DC. a conduit à l’isolement de quinze flavonoïdes et de trois phényléthylamides. Les composés UV-majoritaires actifs de ces extraits, principalement des isoflavonoïdes, ont ainsi pu être isolés. Dans un premier temps, une comparaison par LC/UV/ESI-MSn des différents extraits méthanolique et dichlorométhanique d’O. fetida (Vill.) DC. (racines et parties aériennes) de ces différents composés a été effectuée. Ensuite, les trois différentes espèces d’Oxytropis présentes dans ce travail ont été comparées entre elles par LC/UV/ESI-MSn, afin d’estimer la similitude de leur métabolisme secondaire.
3.6.1 Comparaison des différents extraits d’O. fetida (Vill.) DC. Selon la comparaison des chromatogrammes des analyses LC/UV/ESI-MSn des racines d’O. fetida (Vill.) DC. (Figures III-46 et III-47), la quasi-totalité des composés isolés sont présents dans les deux extraits en diverses proportions. Ils représentent ainsi les composés UV-
majoritaires polaires de l’extrait dichlorométhanique (Rt de 10 à 50 min), et les composés UV-
majoritaires de la partie apolaire de l’extrait méthanolique (Rt de 60 à 100 min), leur temps de rétention correspondant à des pourcentages d’acétonitrile entre 35 et 55 %.
L’activité antifongique la plus forte a été détectée dans l’extrait dichlorométhanique des racines et est principalement due à la présence des isoflavonoïdes C, D, E, F et G. Concernant l’extrait méthanolique, la faible activité des différentes fractions (cf. 3.4.2.2), ainsi que la nature des isoflavonoïdes isolés, soit des isoflavones moins actives, sont difficiles à corréler avec l’activité initiale de celui-ci. Il s’avère ainsi que les composés actifs dans l’extrait méthanolique des racines d’O. fetida (Vill.) DC. sont à la fois des composés majoritaires peu actifs (L, M, K et O) et des composés minoritaires plus actifs (C, D, F et G). Il en résulte un effet synergique dans cet extrait méthanolique, alors que dans l’extrait dichlorométhanique quelques composés majoritaires très actifs sont probablement responsables de la totalité de l’activité. Dans les extraits des racines d’O. fetida (Vill.) DC. deux zones bien distinctes peuvent être observées sur les chromatogrammes, la partie plus polaire de l’extrait contenant les composés
actifs ainsi que les trois phényléthylamides isolées (Rt 0 à 70 min) et la partie apolaire contenant selon l’étude préliminaire de cet extrait probablement principalement des
ptérocarpanes (Rt 70 à 140 min) (cf. 3.3.1).
142 3. RÉSULTATS
Oxytropis fetida (Vill.) DC. (racines) mAU C DG 175 E 150 O R 757 [M+H]+ 125 K + + 100 781 [M+H] 765 [M+H] 696 [M+H]+ 75 B 932 [M+H]+ J 50 H 778 [M+H]+ L M F I 25 A
0 20 40 60 80 100 120 140 min Oxytropis fetida (Vill.) DC. (parties aériennes) mAU 140 B
120 H 100 A 80 268 [M+H]+ 60 268 [M+H]+ 40 20 0 20 40 60 80 100 120 140 min
mAU Oxytropis campestris (L.) DC. (plantes entières) 757 [M+H]+ 120 100 887 [M+H]+ 80 887 [M+H]+ 60 268 [M+H]+ 322 [M+H]+ 593 [M+H]+ 932 [M+H]+ 40 627 [M+H]+ 20 0 20 40 60 80 100 120 140 min
593 [M+H]+ mAU Oxytropis jacquinii Bunge (plantes entières) 100
80 887 [M+H]+ 322 [M+H]+ + 60 871 [M+H] 627 [M+H]+ 40 268 [M+H]+ 20
0 20 40 60 80 100 120 140 min
Oxytropis helvetica Scheele (plantes entières) + mAU 887 [M+H] + 50 871 [M+H] 593 [M+H]+ 40 322 [M+H]+
30 627 [M+H]+ 20
10
0 20 40 60 80 100 120 140 min Figure III-46 : Analyse LC/UV/ESI-MSn en mode positif (254 nm) des extraits DCM de différentes espèces d’Oxytropis Condiotions chromatographiques : identiques à celles des points 3.3 et 3.4 pour les analyses préliminaires des extraits d’O. fetida (Vill.) DC. Conditions MS : Génération d’ions positifs ; pression du gaz de nébulisation (sheath gas ; N2) : 60 psi ; température du capillaire : 265 °C ; voltage du capillaire : 45 V ; courant de la source : 80 µA ; voltage de la source : 6 kV; énergie de collision : 35 %.
143 3. RÉSULTATS
Oxytropis fetida (Vill.) DC. (racines) mAU 300 M 250 K R 200 O D L 150 Q GB, I 100 N F H P 50 0 0 20 40 60 80 100 min Oxytropis fetida (Vill.) DC. (parties aériennes) mAU 175 741 [M+H]+ 150 125 100 75 50 771 [M+H]+ + N K R, D 25 625 [M+H] L O H 0 0 20 40 60 80 100 min
mAU Oxytropis campestris (L.) DC. (plantes entières) 250 625 [M+H]+ 625 [M+H]+ 200 595 [M+H]+ + +
150 667 [M+H]+ 639 [M+H]+ 100 665 [M+H] 665 641 [M+H] 641 711 [M+H]+ 50 L
0 20 40 60 80 100 min Oxytropis jacquinii Bunge (plantes entières) mAU + 600 465 [M+H] + 500 449 [M+H]
400
300 551 [M+H]+ 433 [M+H]+ 535 [M+H]+ 200 L 100
0 20 40 60 80 100 min
mAU Oxytropis helvetica Scheele (plantes entières) + 500 465 [M+H]
+ 400 449 [M+H]
300 551 [M+H]+ 200 433 [M+H]+ 535 [M+H]+ 100 R
0 20 40 60 80 100 min Figure III-47 : Analyse LC/UV/ESI-MSn en mode positif (254 nm) des extraits MeOH de différentes espèces d’Oxytropis Condiotions chromatographiques : identiques à celles des points 3.3 et 3.4 pour les analyses préliminaires des extraits d’O. fetida (Vill.) DC. Conditions MS : Génération d’ions positifs ; pression du gaz de nébulisation (sheath gas ; N2) : 60 psi ; température du capillaire : 265 °C ; voltage du capillaire : 45 V ; courant de la source : 80 µA ; voltage de la source : 6 kV; énergie de collision : 35 %.
144 3. RÉSULTATS
Il apparaît que dans l’extrait dichlorométhanique des parties aériennes, une majorité de composés sont de type phényléthylamides. En effet, les seuls composés des racines mis en évidence sont les composés A, B et H, ces derniers se retrouvant dans les parties aériennes en tant que composés UV-majoritaires. De plus, deux pics de cet extrait présentent des maxima 2 3 + d’absorbance (λmax à 214 et 278 nm), ainsi que des fragments MS et MS à m/z 250 ([M+H] - + + H2O) et 132 ([M+H] -C8H10N) (m/z 268 [M+H] ) caractéristiques de ce type de composés. Aucun composé de type alcaloïdes indolizidinique ou quinolizidinique n’ont été détectés dans les différents extraits d’O. fetida (Vill.) DC. Concernant l’extrait méthanolique, D, H, L, K, N, O et R sont également présents dans les parties aériennes et sont observés en tant que composés UV-minoritaires. Dans l’extrait méthanolique se trouvent principalement des flavonols tri- glycosilés substitués en position C-3.
3.6.2 Analyses LC/UV/ESI-MSn de quatre espèces du genre Oxytropis Après ces quelques considérations sur les extraits d’O. fetida (Vill.) DC., ces derniers ont été comparés par LC/UV/ESI-MSn aux extraits dichlorométhaniques et méthanoliques des plantes entières d’O. campestris (L.) DC., d’O. helvetica Scheele, et d’O. jacquinii Bunge. Une première constatation est l’absence quasi complète des divers composés isolés, en tant que produits UV-majoritaires, dans les trois autres espèces étudiées. Ces espèces présentent entre elles des profils similaires et plusieurs composés communs, mais pratiquement aucune similitude avec les racines et les parties aériennes d’O. fetida (Vill.) DC. Les isoflavonoïdes actifs d’O. fetida (Vill.) DC. se situant dans les racines, ils se trouvent donc peut être en tant que produits UV-minoritaires dans les extraits des plantes entières des autres espèces. Ces différences dans le métabolisme secondaire des différentes espèces d’Oxytropis, ainsi que l’utilisation de divers organes, expliqueraient en partie l’activité moindre de ces extraits contre la moisissure phytopathogène C. cucumerinum lors du criblage des plantes alpines. Une série de composés apolaires de haut poids moléculaires sont observés dans les extraits dichlorométhaniques des différentes espèces d’Oxytropis. Ces analyses LC/UV/ESI-MSn, n’ont pu confirmer la présence supposée de ptérocarpanes lors des analyses préliminaires LC/DAD- UV (cf. 3.3.1). Les composés présents dans les autres espèces d’Oxytropis ne présentant, de
plus, pas le même type de spectres UV/Visible caractéristiques des ptérocarpanes (λmax 230 (sh), 285 nm et 230 (sh), 285, 310 nm). Selon leur spectre UV/Visible et les fragmentations MS2 et MS3, les pics UV-majoritaires des extraits méthanoliques d’O. campestris (L.) DC., d’O. jacquinii Bunge et d’O. helvetica Scheele sembleraient être principalement des flavones et des flavonols di ou tri-glycosilés.
145 3. RÉSULTATS
3.7 Fractionnement bioguidé de l’extrait dichlorométhanique de Potentilla grandiflora L.
3.7.1 Analyses LC/DAD-UV et LC/UV/APCI-MSn préliminaires Comme nous l’avons précédemment évoqué (cf. 2.4 et 3.2), l’extrait dichlorométhanique de Potentilla grandiflora L. possède plusieurs caractéristiques qui rendent son étude approfondie intéressante :
Une activité antifongique marquée contre Cladosporium cucumerinum, ainsi qu’une activité antiradicalaire sur le DPPH (2,2-diphényl-1- picrylhydrazyle). Aucune référence phytochimique sur cette espèce. Trois espèces sont officinales dans de nombreux pays (P. anserina L., P. erecta (L.) Raeuschel et P. reptans L.) et de multiples activités pharmacologiques ont récemment été découvertes dans ce genre.
Afin d’obtenir des informations préliminaires sur les composés présents dans l’extrait dichlorométhanique de P. grandiflora, des analyses LC/DAD-UV et LC/UV/APCI-MSn en mode positif ont été entreprises. La préparation de l’extrait dichlorométhanique est effectuée selon la méthode de routine du Laboratoire de Pharmacognosie et de Phytochimie de
l’Université de Genève (cf. 5.1). L’analyse a été effectuée sur une colonne en phase inverse C18 avec un gradient acétonitrile-eau additionné de 0.25 % d’acide acétique. Sur le chromatogramme LC/UV (254 nm) de cet extrait, une douzaine de pics UV-majoritaires ont été enregistrés (Figure III-48).
L’analyse des spectres UV montre distinctement la présence de quatre classes de composés différenciés par les maxima d’absorption observés sur leurs spectres UV/Visible. De plus, les composés de ces quatre groupes se répartissent clairement selon leur temps de rétention : de 0 à 8 minutes pour les composés 1 à 3, de 16 à 20 minutes pour les composés 4 et 5, de 24 à 34 minutes pour les composés 6 à 11 et de 36 à 42 minutes pour les composés 12 et 13.
Alors que les composés 1 à 3 ne possèdent pas de chromophore bien caractéristique d’une classe de composés, les spectres UV/Visible des composés 4 et 5 sont typiques de la présence d’un chromophore aromatique acylé sur la molécule et sont souvent de type acylphloroglucinol (cf. 3.6.3.1). Le spectre UV/Visible des composés montrent deux maxima d’absorption, l’un à 227 nm et l’autre plus intense à 285 nm, ainsi qu’un épaulement autour de 332 nm.
146
mAU % MeCN
200 5 100 mAU 250 1, 2, 3 200
175 90 150
100
50 8 80 0
150 200 250 300 350 400 450 500 550 nm
mAU 70 40 4, 5 125 30
60 20
10 100 0 50 200 250 300 350 400 450 500 550 nm
mAU 75 400 6 11 7 13 40 - 11 300 10 200 50 1 9 12 30 100
0 4 6 200 250 300 350 400 450 500 550 nm 25 20 3 mAU 2 300 12, 13
250 10 200 0 150
100 0 50 0 10 20 30 40 50 60 min 200 250 300 350 400 450 500 550 nm Figure III-48 : Analyse LC/DAD-UV de l’extrait dichlorométhanique de Potentilla grandiflora L. Conditions chromatographiques : Colonne: Nova-Pak C18 (150 × 3.9 mm i.d., 5 µm) avec une précolonne du même matériel (1.5 x 3.9 mm i.d., 5 µm) ; Eluant: gradient acétonitrile (0.25 % a.a.) - eau (0.25% a.a.) (5:95 à 100:0 en 40 min) ; injection 100 µg ; débit: 1.0 ml/min ; détection à 254 nm, spectre UV/Visible (DAD) balayé de 190 à 600 nm.
3. RÉSULTATS
Les composés 6, 7, 8, 9, 10 et 11 présentent tous le même spectre UV/Visible avec un premier maxima d’absorption à 207 nm et un épaulement à 240 nm suivi d’un deuxième maxima d’absorption moins intense à 288 nm et d’un large épaulement de 320 à 350 nm. Ces types de maxima pourraient être ceux de composés de types flavanones, dihydroflavonols ou encore proanthocyanidoliques [Markham, 1982]. Les composés 12 et 13 possèdent un maxima d’absorption majoritaire à 407 nm.
L’analyse LC/UV/APCI-MSn et les spectres résultant ont été obtenus en même temps que les spectres UV. Le courant ionique total («total ion current trace », TIC) est comparable au spectre UV/Visible à 254 nm (Figure III-49). Les différents constituants ont des ions moléculaires protonés m/z [M+H]+ compris entre 190 et 650 (Tableau III-11). Tandis que les composés 1 à 3, vraisemblablement des isomères ou des composés très similaires, possèdent de petits poids moléculaires avec un ion moléculaire m/z [M+H]+ à 192 ou 194, les autres composés possèdent des masses plus importantes comprises principalement entre 420 et 650. Pour les composés 6 à 11, les traces MS2 et MS3 présentent des fragments très similaires suggérant une très grande similitude structurale entre ces composés (fragments m/z de 433, 419, 417, 293 et 153).
148
433 100 95 90 85 80 75 70 65 60 1 55 MS 50 45 40 Abondance relative relative relative Abondance Abondance Abondance 35 30 25 (5)(5) 20 209 434 + c APCI Full MS 15 10 293 5
100 [150.0-1200.0] 223223 0 433 [CID 35 %] 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z 209 100 90 95 90 85 80 75 70
80 (8)(8) 65 2 60 MS 55 225 293 50 45 433433 40 70 35 30
Abondance relative relative relative Abondance Abondance Abondance 25 20 207 15 (13) (13) 10 153 60 5 0 209 [CID 35 %] 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 (7)(7) 607607 m/z (12) (12) (10) (10) 153 100 50 95 (1)(1) (11) (11)
419419 90
( 9)( 9) 85 593593 641641 80
AbondanceAbondance relative relative 75 194194
641641 70
40 627627 3 65
(4)(4) MS 60
(6)(6) 55 (2)(2) 50 45 141
(3)(3) 40 349349 AbondanceAbondanceAbondance relative relative relative 30 641641 35
192192 30 25 20 209 192 192 192 15 10 194 20 5 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 m/z 10
0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Temps (min) Figure III-49 : Analyse LC/UV/APCI-MSn de l’extrait dichlorométhanique de Potentilla grandiflora L. Conditions MS : Génération d’ions positifs ; courant de décharge de l’électrode (corona discharge) : 7.0 µA ; température du vaporisateur : 400 °C ; pression du gaz de nébulisation (sheath gas ; N2) : 90 psi ; température du capillaire : 150 °C. Les expériences MSn ont été réalisées en programmant des événements dépendants des scans successifs. Le premier événement est un scan MS (150.0- 1200 Da) (MS1) ; durant le second événement le ion le plus abondant est sélectivement excité et fragmenté dans l’analyseur à piège d’ions (MS2) ; le troisième événement (MS3) représente l’isolement et la fragmentation sélective du ion le plus abondant en MS2. L’énergie de collision était de 35 %.
Tableau III-11 : Résultats des analyses LC/UV/APCI-MSn de l’extrait dichlorométhanique de Potentilla grandiflora. Composés [M+H]+ MS2 MS3 [194→177] 1 194 177 (100), 159 (10) 159 (100), 87 (50) [192→175] 2 192 175 (100), 137 (5), 71 (5) 87 (20), 71 (100), 59 (5) [192→175] 3 192 175 (100), 137 (5), 71 (5) 87 (20), 71 (100) [349→209] 4 349 210 (10), 209 (100) 209 (10), 153 (100), 141 (40) [223→208] 5 223 208 (100), 205 (15), 152 (15) 152 (100), 124 (10) [641→641] 6 641 641 (100), 419 (20), 293 (40), 277 (50) 641 (100) [419→279] 7 419 279 (60), 225 (100), 195 (90), 153 (10) 195 (30), 153 (100), 141 (10) [433→209] 8 433 293 (10), 225 (50), 209 (100), 207 (15), 153 (10) 209 (20), 194 (10), 153 (100), 141 (40) [627→403] 9 627 487 (20), 435 (20), 433 (70), 419 (80), 403 (100), 293 (20) 263 (20), 209 (100), 195 (60), 153 (10) [641→433] 10 641 433 (100), 417 (60), 349 (30), 293 (20) 293 (80), 225 (60), 209 (100), 153 (30) [641→433] 11 641 433 (100), 417 (40), 349 (20), 293 (20), 209 (20) 417 (40), 293 (60), 225 (60), 209 (100) [593→593] 12 593 593 (100), 533 (10) 593 (100), 533 (10) [607→607] 13 607 607 (100), 547 (10) 607 (100), 547 (10)
3. RÉSULTATS
3.7.2 Fractionnement bioguidé de l’extrait dichlorométhanique 3.7.2.1 Activités de l’extrait Les activités antiradicalaire sur le DPPH et antifongique sur Cladosporium cucumerinum, Candida albicans et Pyrenophora teres de l’extrait dichlorométhanique de Potentilla grandiflora L. ont été testées. Cet extrait montre une activité antifongique contre C. cucumerinum apparaissant comme des taches blanches sur le test par bioautographie directe sur
CCM. Les Rf (à 0.4 et 0.55) de ces composés actifs (figure III-50) sont similaires à ceux montrant une activité antiradicalaire sur le DPPH. Ces activités impliquant des mécanismes différents, aucune conclusion sur la présence d’un ou de plusieurs composés, actifs sur une ou plusieurs cibles, ne peut être actuellement tirée. Des Rf similaires pouvant être dus à une simple coïncidence. L’extrait dichlorométhanique de P. grandiflora n’a montré aucune activité contre C. albicans et P. teres.
DPPH Cc 1
0.5
0
Figure III-50 : Activités antiradicalaire (DPPH : 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle) et antifongique (Cc : Cladosporium cucumerinum) de l’extrait DCM de Potentilla grandiflora L. Eluant : Hexane : Acétate d’éthyle (1 :1) ; Dépôt : 100 µg
3.7.2.2 Fractionnement et isolement des composés A à D L’extrait dichlorométhanique (1.0 g) de P. grandiflora a été fractionné par CPC avec un
système de solvants biphasiques C6H6-MeCN-EtOH (55:29:16) (v/v/v) (Capacité : 320 ml, Vitesse de rotation : 1000 tours/min, Débit : 2 ml/min, Détection UV : 210 nm, Voltage : 500mV) et 16 fractions ont été obtenues (1a à 16a). La suite du fractionnement de l’extrait a principalement été effectuée selon les résultats des tests autobiographiques sur C. cucumerinum sur ces 16 premières fractions (Figure III-51). Le suivi de l’activité antiradicalaire a cependant également été pris en compte.
151 3. RÉSULTATS
2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle 1
0.5
0 Extrait 1a 2a 3a 4 a 5a 6a 7a 8a 9a 10a 11a 12a 13a 14a 15a 16a ext.
Cladosporium cucumerinum 1
0.5
0 Extrait 1a 2a 3a 4 a 5a 6a 7a 8a 9a 10a 11a 12a 13a 14a 15a 16a ext.
Figure III-51 : Activités antiradicalaire (DPPH) et antifongique (Cladosporium cucumerinum) des fractions CPC de l’extrait DCM de Potentilla grandiflora L. Eluant : Hexane : Acétate d’éthyle (1 :1) ; Dépôt : 100 µg
Pour ces deux tests, les fractions actives étaient les fractions 12a, 13a et la fraction 14a dans une moindre mesure. La zone d’inhibition correspondant au(x) produit(s) actif(s) se situe autour
d’un Rf de 0.5. Au niveau de la première fraction, une faible zone d’inhibition à un Rf de
d’environ 0.3 est également présente. Les Rf des zones d’inhibition correspondent vraisemblablement à ceux de l’extrait initial.
Le schéma de fractionnement complet est présenté à la figure III-52. Les fractions actives 12a et 13a (380 mg) ont été réunies puis fractionnées par MPLC sur LiChroprep RP-18 (450 x 20 mm i.d., 15-25 µm) avec une élution en mode gradient MeCN-
H2O (Débit : 3 ml/min, Gradient : MeCN 5 % à 100 % en 3 jours, Détection : 210 nm). 9 fractions (1b à 9b) ont été obtenues dont l’une est pure et contient le composé A (8 mg).
152
Potentilla grandiflora L. Extrait CH 2Cl2 (1000 mg)
CPC: mélange de solvant C 6H6-MeCN-EtOH (55:29:16) (Capacité : 320 ml, Vitesse de rotation : 1000 tours/min, Débit : 2 ml/min, Détection UV : 210 nm, Voltage : 500mV)
1a 2a 3a 4a 5a 6a 7a 8a 9a 10a 11a 12a 13a 14a 15a 16a (93 mg) (287 mg)
MPLC: élution en mode gradient MeCN-H 2O (colonne LiChroprep RP-18: 450 x 20 mm i.d., 15-25 µm, Débit : 3 ml/min, Gradient : MeCN 5 % à 100 % en 3 jours, Détection : 210 nm)
Fraction 12a-13a (380 mg)
2b 3b 4b 5b 6b7b 8b 9b (17 mg) (13 mg) (24 mg) A SP-LC: élution en mode isocratique MeCN-H 2O + 0.05 % TFA 8 mg (colonne µBondapak: 100 x 25 mm i.d., 10 µm, Débit : 10 ml/min, MeCN-H2O + 0.05 % TFA (70:30), Détection : 210 nm) 3c 4c (4 mg) (10 mg) B 8 mg SP-LC: élution en mode isocratique MeCN-H 2O + 0.05 % TFA (colonne µBondapak: 10 x 8 mm i.d., 10 µm, Débit : 1 ml/min, MeCN-H2O + 0.05 % TFA (70:30), Détection : 210 nm)
C D 1 mg 1 mg Figure III-52 : Schéma d’isolement des composés A, B, C et D de l’extrait dichlorométhanique de Potentilla grandiflora L.
3. RÉSULTATS
Les fractions 2b, 3b et 4b ont été purifiées par SP-LC sur une colonne à compression radiale µBondapak® Waters (100 x 25 mm i.d, 10 µm) avec une élution en mode isocratique MeCN-
H2O + 0.05 % TFA (Débit : 10 ml/min, MeCN-H2O + 0.05 % TFA (70 :30), Détection : 210 nm) pour obtenir les fractions 3c, 4c et le composé B (8 mg). Les fractions 3c et 4c ont été à nouveau purifiées par SP-LC sur une colonne à compression radiale µBondapak® Waters (10 x 8 mm i.d, 10 µm) avec une élution en mode isocratique
MeCN-H2O + 0.05 % TFA (Débit : 1 ml/min, MeCN-H2O + 0.05 % TFA (70 :30), Détection : 210 nm) pour obtenir les composés C (4 mg) et D (10 mg). Les composés C et D sont actuellement en cours d’identification.
3.7.3 Détermination de structure des composés A et B 3.7.3.1 Composé A Le composé A se présente sous forme d’une poudre blanche amorphe. Sa formule brute, établie + par analyse HRESI-MS (m/z 247.09374 [M+H] ), est de C12H16O4 (calculée pour C12H16O4Na, 247.09408) impliquant donc une molécule possédant cinq cycles et/ou insaturations. Le spectre RMN 13C du composé A (Figure III-53) présente 10 signaux, correspondant à un carbone avec
un déplacement chimique caractéristique δC à 210.3 ppm d’une fonction carbonyle, à quatre
carbones insaturés à δC 94.4, 104.7, 163.5 et 165.3 ppm et à cinq carbones saturés inférieurs à
δC 60 ppm (δC 11.8, 16.5, 26.9, 45.7 et 55.6 ppm). 3 CDCl 3 C-3 / C-5 C-4’ OCH C-3’ C-5’ C-2’ C-4 C-1’ C-1 C-2 / C-6
200 175150 125100 7550 25 ppm
Figure III-53 : Spectre 13C-RMN du composé A 13 L’attribution des pics C a été confirmée par les expériences DEPT, gHSQC et gHMBC. (Spectre enregistré dans le CDCl3–d1 à 125.70 MHz avec le CDCl3 comme standard interne).
154 3. RÉSULTATS
Le spectre UV/Visible du composé A montre deux maxima d’absorption, l’un à 227 nm et l’autre plus intense à 285 nm, ainsi qu’un épaulement autour de 332 nm. La mise en perspective des divers éléments que sont le profil du spectre UV/Visible, le nombre de cycles et/ou d’insaturations, la présence d’une fonction carbonyle et la mesure de quatre carbones insaturés sur le spectre RMN 13C suggère la présence d’un chromophore aromatique, probablement benzénique, acylé sur la molécule.
Cette première hypothèse structurale implique l’existence d’un plan de symétrie sur ce noyau aromatique qui expliquerait alors l’enregistrement sur le spectre RMN 13C de seulement quatre signaux aromatiques et non six. Sur le spectre RMN 1H du composé A (Figure III-54), seul un singulet intégrant pour deux protons est observé dans la zone aromatique.
3 OCH H-5’ H-3’ H-3 / H-5 / H-3 H-4’ H-4’ H-2’ OH
11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 ppm
Figure III-54 : Spectre 1H-RMN du composé A Spectre enregistré dans le CDCl3 à 499.87 MHz avec le CDCl3 comme standard interne.
L’analyse des corrélations hétéronucléaires 1H-13C courtes distances, déduite du spectre gHSQC (figure III-55), indique que ce singulet, correspondant donc à deux protons, corrèle
avec un unique carbone à δC 94.4 ppm. La présence de ces deux méthines aromatiques
équivalents (δH 5.95 ppm et δC 94.4 ppm) corrobore l’hypothèse structurale précédente puisque leur équivalence s’expliquerait par leur positionnement de part et d’autre du plan de symétrie du noyau aromatique.
155 3. RÉSULTATS 3 C-3C-5 / C-2’ C-4’ OCH C-3’ C-5’ C-1
H-5’ H-3’ H-4’ 1 H-4’ 2
H-2’ 3 OCH3 4
5 H-3 / H-5 6 F2 (ppm) 7
8
9
10
11
140 120 100 80 60 40 20 0
F1 (ppm)
Figure III-55 : Spectre de corrélations hétéronucléaires gHSQC du composé A
Sur le spectre gHMBC de la molécule (figure III-56), les corrélations hétéronucléaires 1H-13C
longues distances associées au singulet à δH 5.95 ppm sont observées à δC 94.4, 104.7, 163.5 et 165.3 ppm. Il est important de souligner que l’enregistrement d’une corrélation longue distance
entre le singulet à δH 5.95 ppm et le carbone à δC 94.4 ppm confirme sans ambiguïté la présence de deux méthines aromatiques équivalentes.
Par ailleurs, les valeurs de déplacement chimique mesurées pour les carbones du noyau aromatique sont typiquement celles enregistrées pour les dérivés 1,3,5-trihydroxyphényles (i.e. phloroglucinol) à savoir une série de valeurs fortement blindées associée aux carbones en
position ortho des sites oxygénés (ici, δC 94.4 et 104.7 ppm) et une seconde série de valeurs
fortement déblindées associée aux carbones oxygénés (ici, δC 163.5 et 165.3 ppm) [Kosasi et al., 1989]. En tenant compte de la symétrie du noyau aromatique, les deux protons aromatiques sont alors encadrés de la même manière par deux sites oxygénés caractérisés par des
déplacements chimiques à δC 163.5 et 165.3 ppm.
156 3. RÉSULTATS 3 C-2’ C-4’ OCH C-3 / C-5 C-3’ C-5’ C-4 C-2 / C-6 C-1’ C-1
H-5’ H-3’ H-4’ 1 H-4’ 2
H-2’ 3
OCH3 4
5 H-3 / H-5 6 F2 (ppm)
7
8
9
10
11
220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 F1 (ppm)
Figure III-56 : Spectre de corrélations hétéronucléaires gHMBC du composé A
Sur le spectre gHMBC de la molécule, une corrélation 1H-13C longue distance est observée
entre les protons d’un groupe méthoxy (δH 3.80 ppm, s, 3H et δC 55.4 ppm) et le carbone
aromatique oxygéné à δC 165.3 ppm permettant ainsi de distinguer la position aromatique
méthoxylée (δC 165.3 ppm) des deux positions hydroxylées équivalentes (δC 163.5 ppm).
Pour finir, l’analyse des corrélations homonucléaires 1H-1H, issues d’une expérience gDQF- COSY (figure III-57), indique la présence d’un système de spin impliquant un groupe méthyle
(δH 0.93 ppm, t J= 7.0 Hz, 3H et δC 11.8 ppm), un groupement méthylène saturé (δH 1.86 ppm,
m, 1H et 1.43, m, 1H et δC 26.9 ppm), un groupement méthine saturé (δH 3.75 ppm, m, 1H et δC
45.7 ppm) et un second groupe méthyle (δH 1.18 ppm, d J= 7.0 Hz, 3H et δC 16.5 ppm). L’enchaînement 2-méthyl-1-oxobutyle se déduit ensuite par l’observation de corrélations hétéronucléaires 1H-13C longues distances entre la chaîne saturée et le carbone du carbonyle à
δC 210.3 ppm. La chaîne acyle se positionne alors sur le dernier carbone aromatique à δC 104.7 ppm. Un dernier élément de RMN concerne la présence sur le spectre RMN 1H du composé A
enregistré dans le chloroforme deutéré d’un large massif à δH 10.05 ppm susceptible d’être associé aux deux groupes hydroxyles phénoliques.
157 3. RÉSULTATS 3 H-3’ H-5’ OCH H-3 / H-5 / H-3 H-2’ H-4’ H-4’
H-5’
1 H-3’ H-4’
H-4’ 2
H-2’ 3 F1 (ppm)
OCH3 4
5
H-3 / H-5
6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 F2 (ppm)
Figure III-57 : Spectre de corrélations homonucléaires gDQF-COSY du composé A
L’hypothèse structurale assimilant le composé A au 1-(2,6-dihydroxy-4-méthoxyphényl)-2- méthylbutan-1-one ainsi proposée a, par la suite, été confirmée par l’analyse par spectrométrie de masse basse résolution du produit (Figure III-58). - ] [M-H 223.6 100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 - ]
45 3 -
40 ] 9 Abondance relative H
35 4 30
25 [(M-H)-CH 20 208.5 [(M-H)-C 15 152.4 10 5 0 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 m/z
Figure III-58 : Spectre LC/APCI-MS en mode négatif du composé A
158 3. RÉSULTATS
Cette analyse réalisée en APCI négatif a révélé un pic moléculaire déprotonné à m/z 223.5 2 s’accordant avec la structure proposée en C12H16O4. Par ailleurs, la fragmentation MS associée au pic moléculaire génère un ion à m/z 208.5 correspondant probablement au départ du groupe méthyle (15 uma) du motif méthoxyle. La fragmentation de cet ion à m/z 208.5 (i.e. analyse MS3) produit quant à elle un ion à m/z 152.3 Da pouvant s’accorder avec la perte de la chaîne
acyle et ainsi le départ d’un groupe C4H9 (57 uma). La mesure du pouvoir rotatoire a montré que le composé A était dextrogyre : 25 + 7.8° (MeOH ; c 0.74). [α]D
Bien que de nombreux acylphloroglucinols soient répertoriés dans la littérature, le composé A n’a lui jamais été décrit, il s’agit donc d’un composé original rapporté ici pour la première fois.
H
H CO 5 OH 5' 3 4
6 4'
3 1 1' 2' H 2 3'
OH O
Composé A 1-(2,6-dihydroxy-4-méthoxyphényl)-2-méthylbutan-1-one
3.7.3.2 Composé B Le composé B se présente sous forme d’une poudre blanche amorphe et l’analyse des données RMN (1H, 13C, gDQF-COSY, gHSQC, gHMBC et NOESY) et MS (m/z [M+H]+ 487.6) a permis son élucidation structurale.
Le spectre RMN 13C du composé B (Figure III-59) dans le chloroforme-d1 présente 30 carbones. L’analyse de ce spectre et de l’expérience DEPT indique entre autres cinq carbones
quaternaires à δC 40.4, 41.4, 43.7, 45.8 et 47.7 ppm, un carbone quaternaire oxygéné à δC 73.1
ppm, un carbone tertiaire oxygéné à δC 82.9 ppm, quatre carbones tertiaires à δC 41.1, 47.2,
52.9, et 54.5 ppm, huit carbones méthyléniques saturés à δC 18.7, 23.6, 25.3, 25.9, 28.2, 32.4,
37.4 et 53.1 ppmet sept carbones correspondant aux groupes méthyles à δC 16.0, 16.3, 16.3, 16.4, 24.3, 27.4 et 29.4 ppm.
159 3. RÉSULTATS C-21 C-22 C-15 C-8 C-18 C-17 C-14 C-1 C-4 C-5 C-30 C-10 C-7 C-24 C-25 C-26 C-24 C-25 C-20 C-27 C-29 C-11 C-9 C-16 C-19 C-23 C-6
75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 ppm C-28 C-13 C-12 C-3
200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 ppm
Figure III-59 : Spectre 13C-RMN du composé B 13 L’attribution des pics C a été confirmée par les expériences DEPT, gHSQC et gHMBC. (Spectre enregistré dans le CDCl3 à 125.70 MHz avec le TMS comme standard interne).
L’analyse des deux spectres 1D (Figure III-59 et III-60) et des corrélations hétéronucléaires 1H- 13C longues distances, déduites du spectre gHMBC (Figure III-61) nous suggèrent que le composé B est un triterpène de la famille des ursanes ou dérivé de l’α-amyrine. H-21 H-21 H-27 H-23 H-24 H-29 H-26 H-25 H-30 H-1 H-9 H-5 H-7 H-21 H-20 H-15 H-18 H- H-18 22 H-1 H-15 H-22 H- 16 H-16 H-11
3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 ppm H-3 H-12
7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0 ppm
Figure III-60 : Spectre 1H-RMN du composé B Spectre enregistré dans le CDCl3 à 499.87 MHz avec le TMS comme standard interne.
160 3. RÉSULTATS
De plus, ces spectres indiquent un carbone C-2 avec un déplacement chimique caractéristique à
δC 211.0 ppm correspondant à une fonction carbonyle, les carbones éthyléniques C-12 et C-13 à
δC 128.5 et 138.2 ppm, un groupe hydroxyle en C-19 et un carbone C-28 avec un déplacement
chimique caractéristique à δC 182.5 ppm d’une fonction carboxyle [Kriwacki et Pitner, 1989; Jia et al., 1992]
C-13 C-12 C-2 C-28
0
0.5
H-29 1.0 H-27 1.5 H-9 H-1 2.0 H-1 H-18 2.5 (ppm) F2
3.0
3.5 H-3 4.0
216 208 200 192 184 176 168 160 152 144 136 128 120 F1 (ppm)
Figure III-61 : Spectre de corrélations hétéronucléaires gHMBC du composé B
La configuration relative de la molécule a été déterminée comme étant identique à celle des triterpènes du type α-amyrine, les déplacements chimiques étant exactement similaires à ceux de la littérature. La configuration du composé B a ensuite été confirmée par l’analyse du spectre de corrélations homonucléaires NOESY (Figure III-62). Une interaction spatiale est observée
entre H-3 et 23-CH3 en accord avec leur orientation α et entre 25-CH3 et 26-CH3 orientés en β.
De plus, d’importantes corrélations sont visibles entre H-18, H-12, H-20 et 29-CH3 [Lontsi et al., 1998].
161 3. RÉSULTATS
H 30 29 20 H HO H 12 18
25 26 CO2H O
3 27 HO H 23 24
Figure III-62 : Principales corrélations homonucléaires NOESY du composé B
25 Le pouvoir rotatoire []α D + 67.2° (MeOH; c 0.20) mesuré est également en accord avec la littérature [Lien et al., 1999]. Enfin, l’enregistrement du spectre de masse basse résolution du composé B en APCI positif indique que ce composé présente un pic moléculaire protoné à m/z
487.9 s’accordant avec la formule brute correspondante C30H46O5 et confirmant ainsi l’hypothèse structurale assimilant le composé B à l’acide 2-oxopomolique. La fragmentation MS2 associée au pic moléculaire génère des ions à m/z 445, 293 et 223. En EI-MS, cette fragmentation est caractéristique des composés de type oléanane ou ursane ∆12-insaturés et est caractérisée par une réaction retro-Diels-Alder dans le cycle C donnant deux fragments en
C14H22O2 et C16H24O3, la charge restant alors sur le groupement diène (Figure III-63). Dans certaines conditions particulières la charge observée se situe sur le fragment b. Cette situation est également observée dans le cas du composé B en condition APCI-MS mode positif [Budzikiewicz et al., 1963; Ogunkoya, 1981].
162 3. RÉSULTATS + [M+H] -194 487 100 + HO 95 -42 90 + COOH 85 [(M+H)-194] 80 293
75 [(M+H)-42] a 70 445 + 65 -264 (a) 60 + 55 O 50 45 Abondance relative Abondance 40
+ HO 35 30 25 [(M+H)-a] b 20 223 (b) 15 10 5 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 m/z
Figure III-63 : Spectre LC/APCI-MS en mode positif du composé B
Le composé B est répertorié dans la littérature comme l’acide 3β,19α-dihydroxy-2-oxo-urs-12- èn-28-oïque, acide pirolonique ou acide 2-oxopomolique. L’acide 2-oxopomolique a déjà été isolé à partir de plusieurs espèces de trois genres différents de Rosaceae, Rubus (R. cochinchinensis Tratt., R. buergeri Gand., R. irenaeus Focke et R. swinhoei Hance) Rosa multiflora Thunb. et Sanguisorba alpina Bunge [Jia et al., 1992; Liu et Jia, 1993; Lien et al., 1999; Deng et al., 2001; Zhao et al., 2001; Li et al., 2002; Liu et al., 2003].
30
29 20 21 HO 19 12 18 22 11 13 17 25 26 CO2H O 14 16 28 1 9 2 10 8 15
3 27 7 HO 4 5 6
23 24 Composé B Acide 2-oxopomolique
163 3. RÉSULTATS
3.7.4 Activités biologique et biochimique des composés Les activités antifongique contre Cladosporium cucumerinum et antiradicalaire sur le DPPH ont été évaluées par l’observation de dilutions successives pour les composés purs A et B. Les résultats présentés concernent uniquement le composé A, le composé B n’ayant montré aucune activité.
3.7.4.1 Activités biologique et biochimique du composé A Le composé A inhibe la croissance du champignon à une quantité de 1 µg, ce qui correspond à une activité intéressante, la substance de référence étant la nystatine qui est inhibitrice dès 0.2 µg (Figure III-64). Ce résultat concorde ceux obtenus lors du criblage initial ayant montré une nette activité pour P. grandiflora, puis sur les fractions 12a et 13a montrant elle aussi une bonne activité antifongique. Le composé A montre une très bonne activité antiradicalaire en réduisant le DPPH à une quantité de 0.5 µg (Figure III-65). Rappelons ici également le résultat positif obtenu pour ce test lors du criblage initial.
Cladosporium cucumerinum 1
0.5
0 E 12a A 50µg 10µg 5µg 1µg 0.5µg
Figure III-64 : Activité antifongique (Cladosporium cucumerinum) du composé A Eluant : Hexane : Acétate d’éthyle (1 :1) ; Dépôt : 100 µg
2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle 1
0.5
0 E 12a A 50µg 10µg 5µg 1µg 0.5µg
Figure III-65 : Activité antiradicalaire (DPPH) du composé A Eluant : Hexane : Acétate d’éthyle (1 :1) ; Dépôt : 100 µg
164 3. RÉSULTATS
3.7.5 Discussion Un nouveau produit naturel dérivant d’acylphloroglucinol (composé A), et un triterpène déjà répertorié dans la littérature, l’acide 2-oxopomolique (composé B) ont été obtenus suite à l’investigation phytochimique de l’extrait dichlorométhanique de Potentilla grandiflora L.
A notre connaissance, concernant le composé A, il s’agit du premier acylphloroglucinol répertorié dans le genre Potentilla. Les acylphloroglucinols, que l’on retrouve dans nombre de plantes supérieures, sont surtout très présents dans la famille des Clusiaceae, ainsi ils ont été répertoriés pour Hypericum chinense L. [Chiba et al., 1992]. Un autre exemple de plante contenant des dérivés phloroglucinols est Jatropha multifida L. (Euphorbiaceae). Le latex tiré de cette plante est utilisé en médecine traditionnelle pour le traitement d’infections de la peau, effet que l’on peut certainement attribuer aux dérivés phloroglucinol actifs sur le système immunitaire qu’il contient [Kosasi et al., 1989].
Le composé A présente des activités intéressantes, à savoir des propriétés antifongiques sur Cladosporium cucumerinum et antiradicalaires sur le DPPH. Pour le composé B, nous n’avons pas pu observer ces activités. En outre, l’effet antiradicalaire du composé A n’est pas étonnante, considérant qu’il s’agit d’un composé phénolique.
Ces résultats sont intéressants lorsque l’on considère les activités d’autres drogues contenant des dérivés phloroglucinols tels que le houblon (Humulus lupulus L.) ou la fougère mâle (Dryopteris filix-mas spp.). En effet, les dérivés prénylés du phloroglucinol que sont l’humulone ou la lupulone, responsables du goût et de l’amertume de la bière faite à partir de houblon, présentent des propriétés antibactériennes [Zuurbier et al., 1995]. D’autre part les dimères d’acylphloroglucinols aspidine et desaspidine isolés de la fougère mâle, ont montré de bons résultats comme inhibiteurs de la croissance de tumeurs cancéreuses [Kapadia et al., 1996]. La fougère mâle était par ailleurs autrefois utilisée comme ténifuge, mais cette utilisation est aujourd’hui désuète. Certains acylphloroglucinols, inhibent la croissance bactérienne. D’autre part, des diacylphloroglucinols [Chiba et al., 1992] synthétiques sont des inhibiteurs de la réplication virale comme herpes simplex, le virus d’Epstein-Barr ou même le HIV. Une activité inhibitrice de tumeurs de la peau est également rapportée. Ainsi, la recherche de nouveaux composés dérivés du phloroglucinol constitue une voie d’investigation considérable dans la recherche de nouveaux composés actifs.
165 3. RÉSULTATS
3.8 Fractionnement bioguidé de l’extrait méthanolique des feuilles de Vaccinium uliginosum ssp. microphyllum (Lange) Tolm.
3.8.1 Analyse LC/DAD-UV préliminaire Dans les chapitres précédents de ce travail (cf. 3.1, 3.2 et 3.7), les fractionnements bioguidés des extraits dichlorométhanique et méthanolique des racines d’O. fetida, ainsi que de l’extrait dichlorométhanique de P. grandiflora ont été suivi principalement selon leur activité antifongique sur la moisissure phytopathogène Cladosporium cucumerinum. ». Une cible antifongique différente a également été utilisée grâce à des tests en solution sur Pyrenophora teres et il s’est avéré, après indication du Syngenta ® Jealott's Hill International Research Centrer, que l’extrait le plus actif était l’extrait méthanolique des feuilles de Vaccinium uliginosum ssp. microphyllum (Lange) Tolm. Il présente de plus quelques caractéristiques intéressantes (cf. 2.5 et 3.2) :
Extrait montrant la plus forte activité antifongique sur la moisissure phytopathogène Pyrenophora teres. Bonne activité antiradicalaire sur le DPPH. Références phytochimiques rares sur les feuilles et les tiges pour le genre. Présence d’espèces à hautes potentialités pharmacologiques (V. macrocarpon Aiton : antibactérien ; V. myrtillus : rétinopathies) dans le genre.
Des informations préliminaires sur les composés présents dans l’extrait méthanolique des feuilles de V. uliginosum ont été recueillies grâce à une analyse LC/DAD-UV. La préparation de l’extrait méthanolique a été effectuée selon la méthode de routine du Laboratoire de Pharmacognosie et de Phytochimie de l’Université de Genève (cf. 5.1). Sur le chromatogramme LC/UV (280 nm) de cet extrait, une dizaine de pics UV-majoritaires uniquement ont été enregistrés (Figure III-66). Malgré l’apparente simplicité de cet extrait de part son chromatogramme, il s’avère, après une analyse plus détaillée, que celui-ci contient de très nombreux composés. En effet, les pics UV-majoritaires 1, 7 et 8 par exemple, sont constitués de plusieurs composés avec des spectres UV/Visible d’aspects similaires, mais avec des maxima d’absorption tous différents à quelques nm près.
166
mAU
1000
800 1
600
% MeCN (+ 0.2 % a.a.) 400 mAU 1 200 100 0 7 200 250 300 350 400 450 500 550 nm
mAU 500 90 500 400 2 300 80 200 100
400 0 200 250 300 350 400 450 500 550 nm 70 mAU 175 150 3 60 125 300 4 100 75 50 25 50 0 8 250 300 350 400 450 500 550 nm 200 mAU
40 500
400 5, 6, 7
300 5 30 200 100 6 100 0 3 200 250 300 350 400 450 500 550 nm 2 20
mAU 300 8 0 10 250 200
150
100 10 20 30 40 50 60 70 80 min 50
0 200 250 300 350 400 450 500 550 nm Figure III-66 : Analyse LC/DAD-UV de l’extrait méthanolique des feuilles de V. uliginosum ssp. microphyllum (Lange) Tolm. Conditions chromatographiques : Colonne: Waters SymmetryShield C18 (150 × 2.1 mm i.d., 5 µm) avec une précolonne du même matériel (1.5 x 2.1 mm i.d., 5 µm) ; Eluant: gradient acétonitrile (0.2 % a.a.) - eau (0.2 % a.a.) (10:90 à 100:0 en 85 min) ; injection 100 µg ; débit: 0.2 ml/min ; détection à 280 nm, spectre UV/Visible (DAD) balayé de 190 à 600 nm.
3. RÉSULTATS
Une majorité de composés de cet extrait semblent de part leur maxima d’absorption être des flavonoïdes. Alors que le spectre UV/Visible des composés 5, 6 et 7 pourrait être celui de chalcones ou de flavonols avec des maxima d’absorption à 255 et 355 nm, ainsi qu’un épaulement 298 nm, le spectre UV/Visible du composé 8 montre des maxima d’absorption légèrement différents à 266 et 348 nm, ainsi qu’un épaulement à 298 nm suggérant la présence également de chalcones ou de flavonols mais ces derniers étant probablement substitués en 3- OH [Markham, 1982].
Les autres pics UV-majoritaires de ce chromatogramme n’ont pu être classifiés, en effet soit leur spectre UV/Visible n’est pas caractéristique d’une classe donnée de composés, soit ils sont constitués de plusieurs composés (1, 2, 3 et 4). Le tableau III-12 récapitule les maxima d’absorption des composés 1 à 8.
Tableau III-12 : Maxima d’absorption des composés 1 à 8 de l’extrait MeOH des feuilles de V. uliginosum ssp. microphyllum (Lange) Tolm.
Composés Maxima d’absorption (λmax) Type de composé supposé
1 220, 240, 298, 325 nm Indéterminé 2 224, 280, 325 nm Flavonoïdes (Flavanes, flavanones ou dihydroflavonols) 3 230, 312 nm Indéterminé 4 - Indéterminé 5 255, 298, 355 nm Flavonoïdes (Flavonols ou chalcones) 6 255, 298, 355 nm Flavonoïdes (Flavonols ou chalcones) 7 255, 298, 355 nm Flavonoïdes (Flavonols ou chalcones) 8 265, 298, 348 nm Flavonoïdes (Flavonols 3-OH substitué ou chalcones)
3.8.2 Fractionnement de l’extrait méthanolique des feuilles 3.8.2.1 Activités de l’extrait Les activités antiradicalaire sur le DPPH et antifongique contre Cladosporium cucumerinum, Candida albicans et Pyrenophora teres de l’extrait méthanolique des feuilles de Vaccinium uliginosum ssp. microphyllum (Lange) Tolm. ont été testées (cf. 3.2). L’extrait a montré une activité antifongique sur P. teres et antiradicalaire sur le DPPH (Figure III-67). Aucune activité antifongique contre C. albicans et C. cucumerinum n’a été trouvée (cf. 3.2). Les tests antifongiques sur P. teres étant des tests en solutions effectués par le Syngenta ® Jealott's Hill International Research Centrer, uniquement les CCM des tests antiradicalaires seront donc présentées.
168 3. RÉSULTATS
1
0.5
0 DPPH
Figure III-67 : Activité antiradicalaire (DPPH : 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle) de l’extrait MeOH des feuilles de V. uliginosum ssp. microphyllum (Lange) Tolm. Eluant : Acétate d’éthyle : Méthanol : Eau (90 : 25 : 10) ; Dépôt : 100 µg
3.8.2.2 Fractionnement et isolement des composés L’extrait méthanolique des feuilles de V. uliginosum (4000 mg) a été fractionné par MPLC sur une phase LiChroprep RP-18 (460 x 51 mm, i.d. 15-25 µm) avec une élution en mode gradient
(Débit : 7 ml/min, MeOH-H2O + 0.2 % a.a 10 à 100 % en 53 heures, Détection : 280 nm). Un premier regroupement a été effectué avant le criblage sur la base des données CCM et HPLC/DAD-UV sur les fractions MPLC et 26 fractions ont été obtenues. Les activités antiradicalaire sur le DPPH (Figure III-68) et antifongique contre P. teres de ces 26 fractions ont été testées. Les résultats des tests sur ces 26 fractions contre P. teres sont en cours au Syngenta ® Jealott's Hill International Research Centrer et ne peuvent malheureusement être présentés dans ce manuscrit.
2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle 1
0.5
0 1a 2a 3a 4a 5a 6a 7a 8a 9a 10a 11a 12a 13a 14a 15a 16a 17a 18a 19a 20a 21a 22a 23a 24a 26a 27a
Figure III-68 : Activité antiradicalaire (DPPH) des fractions MPLC de l’extrait MeOH des feuilles de V. uliginosum ssp. microphyllum (Lange) Tolm. Eluant : Acétate d’éthyle : Méthanol : Eau, (90 : 25 : 10) ; Dépôt : 100 µg
169 3. RÉSULTATS
Il a déjà été discuté de la pertinence de la recherche de composés antiradicalaires dans des extraits méthanoliques de plantes alpines (cf. 3.2). En effet, dans les extraits polaires se retrouvent un grand nombre de composés phénoliques de type flavonoïdes, dont l’activité antiradicalaire a été largement documentée et n’est plus à démontrer [Potterat, 1997]. Néanmoins, en l’attente des résultats des tests antifongiques, quelques fractions de cet extrait méthanolique des feuilles de V. uliginosum ayant présenté une très forte activité antiradicalaire sur le DPPH, une investigation basée uniquement sur l’activité antiradicalaire de ces dernières a donc quand même été effectuée. Les fractions 1a à 7a n’ont montré qu’une très faible activité antiradicalaire tandis que les fractions 9a à 26a contiennent apparemment de nombreux composés actifs. Les fractions présentant les activités les plus fortes ont été étudiées en priorité. Les fractions sélectionnées sont donc les fractions 11a, 15a, 20a, 21a et 22a-23a. Le schéma de fractionnement complet est présenté à la figure III-69.
Ces différentes fractions ont toutes été purifiées par SP-LC avec une colonne à compression radiale µBondapak® Waters (100 x 25 mm i.d, 10 µm) avec une élution soit en mode
isocratique ou soit gradient MeCN-H2O + 0.2 % a.a. (Débit : 10 ml/min, Détection : 280 nm) pour obtenir les composé A (3 mg), B (2 mg), C (2 mg), D (7 mg), E (2 mg), F (30 mg), G (2 mg), H (4 mg) et I (7 mg). Les différentes conditions chromatographiques, ainsi que les composés obtenus sont présentés dans le tableau III-13.
Tableau III-13 : Conditions chromatographiques des fractions 11a, 15a, 20a, 21a et 22-23a de l’extrait MeOH des feuilles de V. uliginosum ssp. microphyllum (Lange) Tolm.
Fractions Elutions Composés isolés
11a Isocratique MeCN-H2O + 0.2 % a.a. (5:95) En cours
15a Gradient MeCN-H2O + 0.2 % a.a. (13 à 100 en 50min) A et B
20a Isocratique MeCN-H2O + 0.2 % a.a. (15:85) C, D et E
21a Isocratique MeCN-H2O + 0.2 % a.a. (10:90) F
22-23a Gradient MeCN-H2O + 0.2 % a.a. (12 à 100 en 60 min) G, H, et I
170
Vaccinium uliginosum L. Extrait MeOH (4000 mg)
MPLC: élution en mode gradient MeOH-H 2O + 0.2 % a.a. (Colonne LiChroprep RP-18: 460 x 51 mm i.d., 15-25 µm, Débit : 7 ml/min, Gradient : MeOH 10 % à 100 % en 53 heures, Détection : 280 nm)
1a 2a 3a 4a 5a 6a 7a 8a9a 10a 11a 12a 13a 14a 15a16a17a 18a 19a 20a 21a 22a 23a 24a 25a26a (35 mg) (70 mg) (30 mg) (81 mg) (81 mg) (29 mg)
Fraction 22a-23a ( 110 mg)
SP-LC: élution en mode isocratique SP-LC: élution en mode gradient SP-LC: élution en mode isocratique SP-LC: élution en mode isocratique SP-LC: élution en mode gradient
MeCN-H 2O + 0.2 % a.a. (5: 95) MeCN-H 2O + 0.2 % a.a. (13 à 100 MeCN-H 2O + 0.2 % a.a. (15: 85) MeCN-H 2O + 0.2 % a.a. (10: 90) MeCN-H 2O + 0.2 % a.a. (12 à 100 (Colonne µBondapak: 100 x 25 mm en 50 min) (Colonne µBondapak: (Colonne µBondapak: 100 x 25 mm (Colonne µBondapak: 100 x 25 mm en 60 min) (Colonne µBondapak: i.d., 10 µm, Débit : 10 ml/min, 100 x 25 mm i.d., 10 µm, Débit : 10 i.d., 10 µm, Débit : 10 ml/min, i.d., 10 µm, Débit : 10 ml/min, 100 x 25 mm i.d., 10 µm, Débit : 10 Détection : 280 nm) ml/min, Détection : 280 nm) Détection : 280 nm) Détection : 280 nm) ml/min, Détection : 280 nm)
En cours
A B C D E F G H I 3 mg 2 mg 2 mg 7 mg 2 mg 30 mg 2 mg 4 mg 7 mg Figure III-69 : Schéma d’isolement des composés A, B, C, D, E, F, G, H, et I de l’extrait méthanolique des feuilles deV. uliginosum ssp. microphyllum (Lange) Tolm.
3. RÉSULTATS
3.8.3 Considérations phytochimiques Les élucidations structurales, ainsi que les tests antiradicalaires en dilutions sur le DPPH des composés isolés A à J sont actuellement en cours. Malgré l’aspect lacunaire de ce fractionnement bioguidé de l’extrait méthanolique des feuilles de V. Uliginosum ssp. microphyllum (Lange) Tolm. quelques réflexions peut être effectuées. Comme nous avons pu le voir précédemment (cf. 2.5.5), de part son grand intérêt économique et alimentaire, le genre Vaccinium et plus particulièrement ses fruits ont fait l’objet de très nombreuses publications. De ces études en résulte principalement l’isolement de composés issus du métabolisme général des flavonoïdes et notamment les anthocyanosides seraient caractéristiques uniquement des fruits des Vaccinium [Bruneton, 1999]. Ces observations se confirment pour cet extrait méthanolique de V. uliginosum, en effet selon l’analyse des spectres UV/Visible si des anthocyanosides sont présents dans les feuilles c’est en bien moindre proportions et ne constituent pas les composés UV-majoritaires. Les spectres UV/Visible des anthocyanosides étant très caractéristiques avec des maxima d’absorption entre 270 et 280 nm pour la bande II et entre 465 et 560 nm pour la bande I. Selon les quelques études effectuées sur les feuilles de ce genre, les flavonoïdes isolés sont d’une très grande homogénéité structurelle et sont uniquement des flavonols glycosilés dont les génines sont de deux types : quercétine ou kaempférol. Ces dernières sont très rarement substituées et de manière très simple par des groupes hydroxy ou méthoxy uniquement. Les hétérosides flavonoïdiques sont substitués uniquement sur l’hydroxyl en C-3 par des hexoses ou des pentoses [Bohm et Koupai-Abyazani, 1994; Smolarz et al., 2000]. De même que précédemment, ces observations se confirment dans ce travail, les composés C, D, E, F, G, H et I isolés présentent tous des temps de rétention ainsi que des maxima d’absorbance similaires et correspondent au pic UV-majoritaire 7 de l’analyse LC/DAD-UV préliminaires de l’extrait méthanolique des feuilles de V. uliginosum (cf. Figure III-70). Des essais d’amélioration de la méthode chromatographique sont actuellement en cours. Ces résultats intermédiaires laissent à supposer ou à espérer que l’activité antifongique contre P. teres de cet extrait est due aux composés non UV-majoritaires et de nature non flavonoïdiques.
172
% MeCN (+ 0.2 % a.a.) mAU 1 C, D, E, F, G, H, I 100
500 90
80 400 70
A, B 300 60
50 8 200 40
5 30 6 100 3 2 20
0 10
10 20 30 40 50 60 70 80 min Figure III-70 : Analyse LC/DAD-UV de l’extrait méthanolique des feuilles de V. uliginosum ssp. microphyllum (Lange) Tolm. Conditions chromatographiques : Colonne: Waters SymmetryShield C18 (150 × 2.1 mm i.d., 5 µm) avec une précolonne du même matériel (1.5 x 2.1 mm i.d., 5 µm) ; Eluant: gradient acétonitrile (0.2 % a.a.) - eau (0.2 % a.a.) (10:90 à 100:0 en 85 min) ; injection 100 µg ; débit: 0.2 ml/min ; détection à 280 nm, spectre UV/Visible (DAD) balayé de 190 à 600 nm
4. CONCLUSIONS
4. CONCLUSIONS
Dans le but de valoriser l’intérêt des plantes alpines dans le domaine de la recherche de nouveaux composés biologiquement actifs, une centaine d’extraits provenant de 45 plantes des Alpes centrales ont été évalués à l’aide de méthodes de criblage biologique, biochimique et chimiques. De par leur intérêt, les deux axes de recherches que sont les infections fongiques et le stress oxydatif ont été choisis. Les extraits ont donc été soumis à différents tests antifongiques tels que les tests sur Cladosporium cucumerinum par bioautographie directe, sur Candida albicans par bioautographie « agar overlay » et sur Pyrenophora teres par test de croissance du mycélium sur milieu artificiel, ainsi que sur un test antiradicalaire sur le DPPH. Ce criblage a permis de sélectionner quatre extraits présentant une activité antifongique marquée, pour un fractionnement bioguidé. Les extraits dichlorométhanique et méthanolique des racines d’Oxytropis fetida (Vill.) DC. (Fabaceae) et l’extrait dichlorométhanique de Potentilla grandiflora L. (Rosaceae) se sont montrés actifs contre C. cucumerinum, alors que l’extrait méthanolique des feuilles de Vaccinium uliginosum ssp. microphyllum (Lange) Tolm. (Ericaceae) a présenté une forte activité contre P. teres.
L’investigation phytochimique des racines d’Oxytropis fetida (Vill.) DC., une plante alpine de la famille des Fabaceae a permis l’isolement de dix-huit composés. Dans un premier temps, le fractionnement de l’extrait dichlorométhanique en suivant son activité antifongique contre la moisissure phytopathogène C. cucumerinum a permis la purification et l’identification de trois phényléthylamides et sept isoflavonoïdes actifs. De même, le fractionnement bioguidé de l’extrait méthanolique a conduit à l’isolement et à la purification de trois flavonoïdes et cinq isoflavonoïdes dont un nouveau produit naturel : la 2’- céto-3’,4’-diméthoxy-7,5’-dihydroxy-1’,6’-dihydro-isoflavane :
HO O O
OCH3
OCH3 HO
Chez les Fabaceae, le métabolisme des acides aminés est souvent orienté vers la production d’alcaloïdes, la présence de phényléthylamides dans cette espèce n’est donc pas étonnante. De nombreux phényléthylamides ont, de plus, déjà été isolés dans ce genre (cf. 2.3.6.1). Cette classe particulière de métabolites secondaires azotés est néanmoins plutôt considérée comme des proto-alcaloïdes de par la présence de leur atome d’azote hors d’un système hétérocyclique
176 4. CONCLUSIONS
[Bruneton, 1999]. Dans le genre Oxytropis, les alcaloïdes vrais sont majoritairement des produits formés à partir d’un seul précurseur : la lysine. Cet acide aminé est à l’origine de plusieurs types d’alcaloïdes, principalement indolizidiniques ou quinolizidiniques, comme la swainsonine ou la spartéine isolés dans plusieurs espèces d’Oxytropis [Dong et al., 1993; Meng et al., 1994; Meng et al., 1994]. Aucun alcaloïde indolizidinique ou quinolizidinique n’a été isolé dans ce travail. La recherche de ce type de composés, souvent minoritaires, nécessite l’étude d’extraits spécifiques aux alcaloïdes. Des études préliminaires sur ce type d’extraits sont en cours et n’ont pour l’instant pas démontré la présence d’alcaloïdes, et plus particulièrement de swainsonine ou de castanospermine, dans les différentes espèces d’Oxytropis. L’absence de ce type d’alcaloïdes indolizidiniques n’est pas improbable, toutes les espèces d’Oxytropis ou d’Astragalus ne sont pas des « Locoweed » toxiques.
La présence d’isoflavonoïdes dans une espèce du genre Oxytropis n’avait encore jamais été rapportée jusqu’à présent. De par l’appartenance du genre Oxytropis à la sous-famille des Faboideae, la présence de l’isoflavone synthase et d’un métabolisme secondaire principalement dirigé vers la production d’isoflavonoïdes dans les racines d’une de ces espèces n’est donc pas étonnante. Chez les végétaux, bon nombre de structures isoflavonoïdiques sont des phyto- alexines, c’est-à-dire des substances de défenses contre une infection par un agent pathogène, le plus souvent de nature fongique. Ces dernières sont soit constitutives, soit induites en réponse à l’attaque d’un microorganisme. De même, la présence d’une certaine quantité de polyphénols antiradicalaires dans les extraits d’Oxytropis, et plus particulièrement dans les organes non souterrains, confirme les nombreuses études postulant qu’un environnement non favorable (forte radiation UV, froid, etc.) peut induire les enzymes de la voie biosynthétique des flavonoïdes ainsi qu’une accumulation de métabolites antioxydants et antiradicalaires dans les tissus de la plante. Ainsi la comparaison d’O. fetida (Vill.) DC. avec d’autres espèces montrent que ces plantes ont des voies biosynthétiques légèrement différentes. Cette étude n’a de loin pas été exhaustive et une analyse plus détaillée des autres espèces doit encore être entreprise pour établir des relations taxonomiques précises entre les différents membres de ce genre. En plus de jouer de nombreux rôles dans l’interaction entre les plantes et les microorganismes, les flavonoïdes et les isoflavonoïdes montrent de diverses activités pharmacologiques chez les humains (antiviraux, antioxydants, anti-inflammatoires et des propriétés vasculaires).
Le fractionnement bioguidé de l’extrait dichlorométhanique de Potentilla grandiflora L. a conduit à l’isolement et à l’identification de l’acide 2-oxopomolique et d’un nouveau dérivé naturel de l’acylphloroglucinol, le 1-(2,6-dihydroxy-4-méthoxyphényl)-2-méthylbutan-1-one :
177 4. CONCLUSIONS
H
OH H3CO
H
OH O
A notre connaissance, il s’agit du premier acylphloroglucinol répertorié dans le genre Potentilla. Cette classe de composés se retrouve dans nombre de plantes supérieures, et sont surtout très présents dans la famille des Clusiaceae (Hypericum chinense L.). Ce composé phénolique présente des propriétés antifongiques sur Cladosporium cucumerinum et antiradicalaires sur le DPPH. Des activités prometteuses ont été découvertes chez certains dérivés d’acylphloroglucinol, telles que les propriétés antibactériennes ou anti-tumorales de divers dérivés d’Humulus lupulus L. [Zuurbier et al., 1995] ou encore les activités antivirales sur herpes simplex, le virus d’Epstein-Barr ou même le HIV de diacylphloroglucinols synthétiques [Chiba et al., 1992].
L’extrait méthanolique des feuilles de Vaccinium uliginosum ssp. microphyllum (Lange) Tolm. a montré une activité antifongique marquée sur Pyrenophora teres et l’investigation de cet extrait en collaboration avec le Syngenta® Jealott's Hill International Research Center est actuellement en cours. Certaines espèces de ce genre ont montré des potentialités pharmacologiques intéressantes dans la lutte contre les maladies infectieuses. La canneberge ou « cranberry » (V. macrocarpon Aiton), une espèce spontanée de l’est de l’Amérique du Nord, était réputée selon un usage très ancien pour avoir des effets bactériostatiques bénéfiques dans le traitement des infections urinaires. Cette activité a été récemment confirmée par quelques essais cliniques en double aveugle vs placebo. L’action serait liée à une inhibition de l’adhérence des bactéries sur les muqueuses, cette action a été pour l’instant démontrée in vitro dans le cas de l’adhésion d’E. coli sur des cellules uroépithéliales. Actuellement, le ou les principes actifs ne sont pas connus et une nature procyanidolique n’est pas exclue [Bruneton, 1999; McMurdo et al., 2005]. Tout aussi récemment, une étude sur des extraits enrichis en dérivés flavonoïdiques de la canneberge, a montré des activités inhibitrices de la croissance de Candida krusei prometteuses [Kondo et al., 2003].
Les plantes alpines étudiées dans ce travail de thèse, ainsi que les divers produits naturels isolés ont montré des potentialités intéressantes. Dans ce contexte, l’étude des genres Oxytropis, Potentilla et Vaccinium et dans un sens plus large l’étude des plantes alpines sont encourageantes pour la découverte de nouvelles molécules actives.
178
5. PARTIE EXPERIMENTALE
5. PARTIE EXPÉRIMENTALE
5.1 Matériel végétal et extraction
Dans ce travail, une sélection de 45 plantes alpines de diverses familles a été récoltée. Toutes les plantes ont été cueillies en août 2001 dans les Alpes centrales dans :
La région autour du col du Petit-Saint-Bernard (Savoie, France) (1) La région autour du col du Petit-Saint-Bernard (Val-d’Aoste, Italie) (2) Le vallon de l’Urtier (Val-d’Aoste, Italie) (3) La région du col du Bard (Val-d’Aoste, Italie) (4)
Ces différentes espèces alpines ont été principalement récoltées dans les étages suprasubalpin et alpin à des altitudes allant de 2200 à 2700 mètres. Elles ont été identifiées botaniquement par Monsieur Egidio Anchisi, du Jardin Alpin de Champex (Valais, Suisse) et des échantillons de référence ont été déposés au Laboratoire de Pharmacognosie et de Phytochimie (LPP) de l’Université de Genève (Suisse). Le tableau V-1 présente l’origine, l’altitude, l’organe utilisé et le poids de ces différents échantillons naturels.
Tableau V-1 : Tableau récapitulatif du matériel végétal étudié.
Famille Nom botanique Lieu et altitude Organe Poids sec Val-d’Aoste (4) Asteraceae Achillea erba-rotta All. Plante entière 130 g 2300 m Val-d’Aoste (3) Artemisia borealis Pall. Plante entière 106 g 2400 m Val-d’Aoste (3) Doronicum clusii Tausch Plante entière 70 g 2700 m Val-d’Aoste (2) Dryas octopetala L. Plante entière 115 g 2300 m Savoie (1) Erigeron uniflorus L. Plante entière 122 g 2250 m Savoie (1) Gnaphalium norvegicum Gunn. Plante entière 114 g 2300 m Savoie (1) Hieracium auricula L. Plante entière 28 g 2250 m Val-d’Aoste (4) Hieracium pilosella L. Plante entière 67 g 2300 m Leucanthemopsis alpina (L.) Savoie (1) Plante entière 46 g V.H.Heywood 2300 m Val-d’Aoste (2) Senecio doronicum L. Plante entière 200 g 2200 m Savoie (1) Senecio incanus L. Plante entière 78 g 2500 m Savoie (1) Senecio rupestris Waldst. & Kit. Plante entière - 2250 m Val-d’Aoste (2) Apiaceae Bupleurum ranunculoides L. Plante entière - 2100 m Savoie (1) Brassicaceae Arabis alpina L. Plante entière 92 g 2200 m Savoie (1) Partie aérienne 33 g Hugueninia tanacetifolia (L.) Rchb. 2200 m Racine 128 g
182 5. PARTIE EXPÉRIMENTALE
Famille Nom botanique Lieu et altitude Organe Poids sec Murbeckiella pinnatifida (Lam.) Savoie (1) Plante entière 54 g Rothm. 2300 m Val-d’Aoste (3) Petrocallis pyrenaica (L.) R.Br. Plante entière 76 g 2700 m Val-d’Aoste (3) Thlaspi lereschianum Rouy & Fouc Plante entière 36 g 2700 m Val-d’Aoste (3) Caryophyllaceae Herniaria alpina Vill. Plante entière 121 g 2650 m Val-d’Aoste (4) Minuartia laricifolis Schinz & Thell. Plante entière 159 g 2100 m Val-d’Aoste (3) Minuartia recurva Schinz & Thell. Plante entière 100 g 2600 m Val-d’Aoste (3) Saponaria lutea L. Plante entière - 2500 m Savoie (1) Dipsacaceae Scabiosa lucida Vill. Plante entière 39 g 2300 m Vaccinium uliginosum ssp. Val-d’Aoste (2) Feuille 160 g Ericaceae microphyllum (Lange) Tolm. 2200 m Brindilles 385 g Val-d’Aoste (2) Feuille 398 g Rhododendron ferrugineum L. 2200 m Partie aérienne 430 g Val-d’Aoste (2) Fabaceae Lotus alpinus Schleich. ex Ramond Plante entière 103 g 2200 m Col du Sanetsch Astragalus frigidus (L.) A. Gray Antérieur à août Plante entière - 2001 Val-d’Aoste (2) Oxytropis campestris (L.) DC. Plante entière 229 g 2200 m Val-d’Aoste (3) Partie aérienne 49 g Oxytropis fetida (Vill.) DC. 2650 m Racine 51 g Val-d’Aoste (3) Oxytropis helvetica Scheele Plante entière 40 g 2600 m Val-d’Aoste (2) Oxytropis jacquinii Bunge Plante entière 108 g 2600 m Val-d’Aoste (3) Lamiaceae Scutellaria alpina L. Plante entière 43 g 2300 m Val-d’Aoste (2) Thymus praecox Opiz Plante entière 113 g 2200 m Savoie (1) Onagraceae Epilobium alpestre (Jacq.) Krocker Plante entière 96 g 2300 m Savoie (1) Epilobium fleischeri Hochst. Plante entière - 2300 m Val-d’Aoste (3) Plumbaginaceae Armeria alpina Willd. Plante entière 65 g 2500 m Savoie (1) Polygonaceae Oxyria digyna Hill Plante entière 62 g 2300 m Val-d’Aoste (3) Ranunculaceae Anemone baldensis L. Plante entière 104 g 2600 m Val-d’Aoste (3) Callianthemum coriandrifolium Rchb. Plante entière 76 g 2550 m Val-d’Aoste (3) Pulsatilla halleri Willd. Plante entière - 2300 m Savoie (1) Ranunculus aconitifolius L. Plante entière 115 g 2200 m Val-d’Aoste (3) Rosaceae Potentilla grandiflora L. Plante entière 106 g 2600 m Val-d’Aoste (3) Scrophulariaceae Pedicularis cenisia Gaud. Plante entière 53 g 2600 m Val-d’Aoste (3) Pedicularis kerneri Dalla Torre Plante entière 51 g 2600 m Val-d’Aoste (2) Partie aérienne 33 g Valerianaceae Valeriana saliunca All. 2600 m Racine 60 g
183 5. PARTIE EXPÉRIMENTALE
Après la récolte, le matériel végétal frais est étendu en couche fine pour qu’il sèche à l’air libre. Cette opération est effectuée directement au Laboratoire de Pharmacognosie et Phytochimie (LPP), les lieux de récoltes de ces plantes alpines étant assez proches de celui-ci pour que cela puisse être possible. Ce matériel est directement broyé ou conditionné sous forme de drogue sèche jusqu’à ce qu’il soit étudié.
La première étape dans la préparation d’extraits végétaux est le broyage du matériel végétal en
présence d’azote liquide (N2), afin d’éviter toute dégradation thermique. Sous cette forme broyée, la drogue présentera une plus grande surface de contact avec les solvants extracteurs, permettant ainsi d’améliorer le rendement des extractions. La méthode d’extraction choisie est la macération successive par deux solvants de polarité croissante : le dichlorométhane et le méthanol. La drogue broyée est d’abord mise en contact avec le dichlorométhane à raison de 1,5 l de solvant pour 250 g de drogue. Après 24 heures d’agitation mécanique à température ambiante, le mélange hétérogène est filtré sur papier plissé (Schleier & Schuell, Dassel, Allemagne) et le résidu est à nouveau extrait 2 fois 24 heures dans les mêmes conditions. Les filtrats sont réunis, le solvant évaporé à l’aide d’un évaporateur rotatif à une température maximale de 40°C (Büchi Labortechnik AG, Flawil, Suisse) et le résidu sec est lyophilisé et pesé : l’extrait brut dichlorométhanique (DCM) est alors obtenu. Le résidu non extractible au dichlorométhane est traité de la même manière avec 3 extractions successives au méthanol. Après réunion des filtrats, évaporation du solvant et lyophilisation, l’extrait brut méthanolique (MeOH) est également obtenu et pesé.
184 5. PARTIE EXPÉRIMENTALE
5.2 Techniques de séparation analytique
5.2.1 Chromatographie sur couche mince (CCM) Les analyses par chromatographie sur couche mince (CCM) ont été effectuées avec des plaques
de Silicagel 60 F254 sur feuille d’aluminium (Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, Germany) et celles-ci sont développées dans des cuves en verre conventionnelles (Camag, Muttenz, Suisse), dont l’atmosphère aura préalablement été saturée en vapeurs de la phase mobile. Les quantités déposées sur les plaques sont normalement de 100 µg pour les extraits et de 10 µg pour les produits purs. Après développement, les plaques ont été observées à la lumière du jour, et sous lampe UV à 254 et 366 nm. Selon les cas elles ont ensuite été révélées par un réactif de détection ou utilisées pour des tests par bioautographie (cf. 5.5 et 5.6).
5.2.2 Chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrophotométrie ultraviolet/visible (HPLC/DAD-UV) Les analyses de chromatographie liquide à haute performance (HPLC, High Performance Liquid Chromatography) ont été réalisées avec un système HP (Hewlett-Packard, Palo Alto, CA, USA) series 1100 couplé à un détecteur à réseau de diodes HP series 1100 pour l’enregistrement des spectres UV/Visible. Les injections sont effectuées par un injecteur automatique intégré. Les analyses préliminaires des différents extraits, ainsi que les extraits
DCM et MeOH de Potentilla grandiflora ont été injectés sur une colonne Nova-Pak C18 (150 × 3.9 mm de diamètre interne (i.d.), 5 µm) (Waters Co., Milford, MA, USA), en utilisant une
phase mobile acétonitrile/eau (CH3CN-H2O) contenant 0.25 % d’acide acétique à un débit de 1.0 ml/min. Les extraits DCM et MeOH des différentes espèces d’Oxytropis et de Vaccinium
uliginosum ont été analysés sur une colonne SymmetryShield C18 (150 x 2.1 mm i.d., 5 µm) (Waters Co., Milford, MA, USA) avec une pré-colonne de même phase stationnaire (1.5 x 2.1
mm i.d., 5 µm), en utilisant une phase mobile CH3CN-H2O contenant 0.25 % d’acide acétique à un débit de 0.2 ml/min. Ces appareillages, pilotés par le logiciel Agilent ChemStation Rev. A.10.02, permettent de travailler en mode isocratique (composition constante de la phase mobile) ou en mode gradient (phase mobile de composition variable en cours d’analyse). Dans le domaine de l’analyse phytochimique, l’étude de matrices complexes rend indispensable l’élution en mode gradient, afin de garder le temps d’analyse dans des limites raisonnables, tout en ne diminuant pas trop la résolution. Différents gradients ont été utilisés et adaptés selon la complexité de chaque analyse. Dans cette étude, la chromatographie liquide à haute performance a été employée pour analyser les extraits et les fractions, pour guider et optimiser
185 5. PARTIE EXPÉRIMENTALE
les conditions de séparation et d'isolement avec la MPLC et la HPLC semi-préparative (cf. 5.3.2 et 5.3.3), et pour vérifier la pureté des produits d'isolement.
5.2.3 Chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse (HPLC/UV/MS) La chromatographie liquide à haute performance (HPLC) couplée à la spectrométrie de masse (MS, Mass spectrometry) combine les avantages de ces deux techniques, à savoir la haute sélectivité, l’efficacité de séparation de la HPLC et une détection puissante et sensible de la MS ainsi que des informations structurales importantes pour l’identification [Niessen, 1999]. De nos jours, la détection MS est généralement employée couplée à la HPLC, et la grande quantité de données spectrales obtenues peut faire de cet outil une technique couplée puissante.
Dans cette étude, différents systèmes ont été utilisés selon les besoins spécifiques de chaque analyse. Le spectromètre de masse a toujours été couplé à un système HPLC HP (Hewlett- Packard, Palo Alto, CA, USA) 1100 series couplé à un détecteur à réseau de diodes HP series 1100 pour l’enregistrement des spectres UV/VIS. Les injections sont effectuées par un injecteur automatique intégré. Le système est contrôlé par le logiciel Agilent ChemStation Rev. A.10.02.
Les analyses préliminaires des extraits de Potentilla grandiflora par HPLC/UV/MS ont été réalisées en mode positif dans les conditions chromatographiques décrites ci-dessus (cf. 5.2.2) alors que l’analyse des composés purs a été effectuée selon les cas en mode positif ou négatif. Le système HPLC a été couplé à un spectromètre de masse LCQ (Finnigan MAT, San Jose, CA, USA) à analyseur à piège d’ions (IT, Ion Trap) contrôlé par le logiciel Xcalibur avec une interface à ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI, Atmospheric Pressure Chemical Ionization). Les paramètres opératoires APCI-MS généraux sont les suivants : génération d’ions positifs ou négatifs ; courant de décharge de l’électrode (corona discharge) : 7.0 µA ; température du vaporisateur : 400 °C ; pression du gaz de nébulisation (sheath gas ;
N2) : 90 psi ; température du capillaire : 150 °C. Les ions obtenus en mode positif sont de type [M+H]+ et de type [M-H]− en mode négatif. Les débits élevés compatibles avec ce mode d’ionisation (jusqu’à 2 ml/min) en font une technique de choix pour la mise en œuvre du couplage avec la chromatographie liquide.
Les analyses des extraits des différentes espèces d’Oxytropis et de Vaccinium uliginosum ssp. microphyllum (Lange) Tolm. par HPLC/UV/MS ont été réalisées en mode négatif dans les conditions chromatographiques décrites ci-dessus (cf. 5.2.2). Le système HPLC a été couplé à un spectromètre de masse LCQ (Finnigan MAT, San Jose, CA, USA) à analyseur IT contrôlé
186 5. PARTIE EXPÉRIMENTALE
par le logiciel Xcalibur avec une interface à ionisation par électrospray (ESI, ElectroSpray Ionization). Les paramètres opératoires ESI-MS généraux sont les suivants : génération d’ions positif ;
pression du gaz de nébulisation (sheath gas ; N2) : 60 psi ; température du capillaire : 265 °C ; voltage du capillaire : 45 V ; courant de la source : 80 µA ; voltage de la source : 6 kV. Les ions obtenus en mode positif sont de type [M+H]+.
En spectrométrie de masse tandem à plusieurs étapes (multiple stage tandem mass spectrometry, MSn), les ions d’intérêt sont isolés dans l’analyseur à piège d’ions et sélectivement excités pour produire des fragments qui sont à leur tour détectés. Cette opération, abrégée MS2, peut être répétée sur les fragments, générant ainsi des spectres MSn à plusieurs étapes.
187 5. PARTIE EXPÉRIMENTALE
5.3 Techniques de séparations préparatives
5.3.1 Chromatographie de partage centrifuge (CPC) Les séparations par chromatographie de partage centrifuge (CPC) ont été réalisées sur un appareil CCC-1000 Planetary Countercurrent Chromatograph (Pharma-Tech Research Corporation, Baltimore, MA, USA) d’une capacité de 320 ml (i.d. 2.6 mm) avec une vitesse de rotation de 1000 tours/min. Les phases étaient délivrées par deux pompes à flux constant Waters 6000A (Milford, MA, USA) à un débit de 2 à 3 ml/min (boucle d’injection de 20 ou 60 ml). Un détecteur UV/VIS à longueur d’onde variable Knauer (Berlin, Allemagne) (210 ou 254 nm) et un enregistreur LKB Bromma 2210 étaient connectés à l’appareillage. Parmi les extraits étudiés, les extraits DCM et MeOH d’Oxytropis fetida et l’extrait DCM de Potentilla grandiflora ont été soumis à une séparation par CPC. Les systèmes de solvants choisis après la consultation de diagrammes ternaires ou l’utilisation de gammes préétablies [Oka et al., 1991; Camacho-Frías et Foucault, 1996; Berthod et al., 2002] sont présentés dans le tableau V-3.
Tableau V-3 : Choix des systèmes de solvants pour la chromatographie de partage centrifuge pour les différents extraits étudiés
Plante Extrait Solvant 1 Solvant 2 Solvant 3 Proportions
Potentilla grandiflora L. DCM Hexane Acétonitrile Ethanol (55 :29 :16)
Oxytropis fetida (Vill.) DC DCM Hexane Acétonitrile Ethanol (55 :29 :16)
Oxytropis fetida (Vill.) DC MeOH Dichlorométhane Méthanol Eau (50 :25 :25)
Suivant les cas, la phase inférieure ou la phase supérieure des systèmes sélectionnés a d’abord été utilisée comme phase mobile, puis au cours du fractionnement le sens de remplissage (T → Q à Q → T) a été inversé et l’autre phase utilisée comme éluant. Les fractions ont été recueillies par un collecteur automatique RediFrac (Pharma Biotech), et rassemblées selon les résultats des analyses par CCM.
5.3.2 Chromatographie liquide à moyenne pression (MPLC) Le principe de la chromatographie à moyenne pression (MPLC, Medium Pressure Liquid Chromatography) est semblable à celui de la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) (cf. 5.2.2), mais permet la séparation d'une plus grande quantité de mélanges complexes en une analyse, tout en conservant une résolution raisonnable. Cette technique a été utilisée pour l’extrait méthanolique de Vaccinium uliginosum et pour la fraction 12-13 de l’extrait dichlorométhanique de Potentilla grandiflora.
188 5. PARTIE EXPÉRIMENTALE
Le système utilisé pour la MPLC était constitué d’une pompe Büchi 681 (Büchi Labortechnik AG, Flawil, Suisse), d’un détecteur à longueur d’onde fixe UV Detector Knauer 2001 (Berlin, Allemagne) et d’un enregistreur Pharmacia LKB·REC 1 (Pharmacia). Nous avons travaillé exclusivement avec une phase stationnaire inverse, la LiChroprep RP-18 (15-25 µm ; Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne), conditionnée dans une colonne de verre à gaine plastique (45 x 2-4 cm), adaptée à la pression de travail. En MPLC, la pression de travail est comprise entre 15 et 20 bars. Une pré-colonne à gaine métallique, remplie de phase stationnaire, permet d’alléger la charge imposée sur les parois de la colonne. Les systèmes d’élution utilisés dans ce travail
étaient des mélanges binaires MeOH-H2O + 0.05 % TFA ou MeCN-H2O en proportions variables. Les conditions d’élution sont déterminées par une analyse préalable par HPLC-DAD- UV/VIS avec une colonne LiChrosorb RP-18 (250 x 4 mm i.d., 7 µm) (LiChroCART, Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne). La détection étant effectuée à 210 ou 280 nm. Le changement de phase mobile en cours d’analyse s’effectuait manuellement (« gradient par palier », step gradient) ou à l’aide d’un dispositif à gradient Büchi B-687 (Büchi Labortechnik AG, Flawil, Suisse). L’échantillon, mélangé à 2-3 fois son poids de phase stationnaire, est disposé dans une cartouche d’introduction en verre, puis recouvert de sable pour remplir le volume mort. Le tout est raccordé en série au système à moyenne pression, juste avant la précolonne. Les fractions étaient récoltées dans des cylindres de 250 ml disposés sur un collecteur Büchi 684 (Büchi Labortechnik AG, Flawil, Suisse).
5.3.3 Chromatographie liquide semi-préparative à haute pression La chromatographie liquide semi-préparative à haute pression est une technique largement répandue pour les étapes finales de purification, elle est utilisée pour la séparation de mélanges de 1 à 100 mg. Par convention, elle correspond aux colonnes avec un diamètre interne (i.d.) de 8 à 10 mm et avec des particules de 5 à 10 µm. Dans ce présent travail, cette technique a été employée afin de purifier et séparer les fractions précédemment obtenues par MPLC ou par CPC. Les séparations par chromatographie semi-préparative ont été réalisées sur des colonnes à compression radiale µBondapak® de différentes capacités (10 µm, 10 x 8 ou 100 x 25 mm i.d.) (Waters, Milford, MA, USA). Plusieurs appareillages ont été utilisés, avec détection à 210, 254 ou 280 nm : une pompe 2 voies Shimadzu LC-10AD, un détecteur UV LKB Bromma 2151, et un enregistreur LKB 2210 (colonne 10 x 8 mm i.d.) une pompe 2 voies Shimadzu LC-8A, un détecteur UV LKB Bromma 2151 ou Knauer, et un enregistreur LKB 2210 (colonne 100 x 25 mm i.d.).
Des systèmes de solvants MeCN-H2O ou MeOH-H2O, acidifié ou non (+ 0.05 % TFA), ont été utilisés comme phase mobile en mode isocratique ou gradient.
189 5. PARTIE EXPÉRIMENTALE
5.4 Méthodes physico-chimiques
5.4.1 Polarimétrie ([α]D) Le pouvoir rotatoire des composés isolés, dissous dans du méthanol, est mesuré à température ambiante grâce à un polarimètre Perkin Elmer 241 MC (Wellesley, Ma, USA) équipé d’une lampe à sodium. La solution, introduite dans une cellule de 10 cm de longueur (l), est traversée par un rayon lumineux polarisé à la longueur d’onde de la raie D du sodium (589,3 nm). La formule utilisée est alors la suivante : 1000 ⋅ α []α T = D l ⋅ c
α = angle de rotation en degrés lu à la température T l = longueur en décimètres de la cellule polarimétrique c = concentration de la substance en g/l.
Dans le chapitre 5.8, les concentrations se rapportant aux mesures polarimétriques sont exprimées par convention en g/100 ml.
5.4.2 Spectrophotométrie UV/Visible Les composés naturels isolés originaux (purs ou sous forme de mélange d’isomères) sont dissous dans du méthanol et leur spectre UV-Visible est mesuré à l’aide d’un spectrophotomètre Perkin Elmer Lambda 20 (Wellesley, Ma, USA), piloté par un logiciel adapté, développé par la même entreprise. Les données issues de ces mesures sont reprises dans
MeOH MeOH la partie 5.8 sous la forme : λ max nm (logε) , où λ max nm représente les longueurs d’onde des maxima en nm, ε est l’absorbance molaire à ces longueurs d’onde, si b (couche de solution traversée) est exprimé en centimètres et c (concentration) en moles par litre dans la formule suivante (loi de Beer-Lambert) :
A=ε ⋅ c ⋅b
Les spectres UV/VIS des produits connus ont été mesurés par HPLC-DAD-UV.
5.4.3 Spectrométrie de masse (MS) La spectrométrie de masse (MS, Mass spectrometry) est fondée sur la mesure directe du rapport entre la masse et le nombre de charges élémentaires (m/z), positives ou négatives, d’ions obtenus à partir de la substance à analyser. Ce rapport est exprimé en daltons (1 Da = masse de l’atome d’hydrogène). Les ions sont formés dans la « source » de l’appareil, séparés par
190 5. PARTIE EXPÉRIMENTALE
l’« analyseur » et finissent par atteindre le « détecteur ». Le spectre obtenu représente l’abondance relative des différentes espèces ioniques présentes, comme une fonction de m/z [Vollhardt et Schore, 1994].
Les produits purs isolés sont caractérisés par leurs spectres de masse obtenus en mode d’ionisation par impact électronique (EI). L’ensemble des opérations s’effectue dans une enceinte dans laquelle règne un vide poussé (10-3 à 10-6 Pa). L’appareillage utilisé dans notre laboratoire est un spectromètre de masse tandem à analyseurs quadrupolaires TSQ 700 Finnigan MAT (Thermo Electron Corporation, Waltham, MA, USA) dont les paramètres expérimentaux sont les suivants : Une énergie de 70 eV est appliquée sur le filament lors des mesures. La température de la sonde augmente linéairement de 50 °C à 300 °C en 1 min, alors que les températures de la source et des quadrupôles sont maintenues respectivement à 150 °C et 70 °C. Si les mesures EI produisent rarement des ions moléculaires en abondance, elles sont par contre une importante source d’information sur les processus de fragmentation et donc sur la structure des composés étudiés.
Dans le cas des produits nouveaux, des mesures en spectrométrie de masse à haute résolution sont nécessaires, afin de confirmer leur formule chimique brute. Ces analyses ont été menées soit par le Laboratoire de Chimie Organique du Prof. T. Jenny à l’Université de Fribourg sur un spectromètre de masse à électrospray Bruker FTMS 4.7T BioAPEX II (HRESI-MS) (Billerica, MA, USA), soit au Laboratoire de Pharmacognosie et de Phytochimie de l’Université de Genève avec un spectromètre de masse Micromass LCT à temps de vol (Manchester, UK), en mode positif, utilisant une interface électrospray (ESI) avec les paramètres suivants : voltage du capillaire : 3200 V ; voltage du cône d’échantillonnage : 35 V ; température du gaz de
désolvatation (N2) : 300°C ; débit du gaz : 550 L/h pour un débit HPLC de 200µL/min ; température de la source : 120°C. La substance de référence utilisée est le sulfadiméthoxine (Sigma) à un débit de 3µl/min, avec [M+1]+=311.0814.
5.4.4 Spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN) La méthode de choix pour l’identification des composés naturels isolés est la spectrométrie de résonance magnétique nucléaire (RMN), qui repose sur la propriété qu’ont des noyaux tels que 1H, 13C, 14N, 17O, 19F et 31P de posséder un moment magnétique nucléaire permanent. Placés dans un champ magnétique extérieur, ils prennent par rapport à celui-ci certaines orientations bien définies auxquelles correspondent des niveaux d’énergie distincts. Pour une valeur donnée de champ, des transitions entre niveaux immédiatement contigus sont dues à l’absorption de
191 5. PARTIE EXPÉRIMENTALE
radiations électromagnétiques de longueurs d’onde caractéristiques dans la région des radiofréquences [Vollhardt et Schore, 1994]. Dans notre institut, les mesures de RMN sont effectuées sur spectromètre à impulsions UNITY Inova 500 de Varian (Palo Alto, CA, USA), piloté par le logiciel Solaris VNMR du même fabriquant installé sur une station de travail Sun. Sur ce type d’appareil, toutes les transitions sont excitées simultanément par irradiation avec une impulsion multifréquence (large bande), puis l’ordinateur transforme les interférogrammes ainsi obtenus en un spectre conventionnel par une opération mathématique (transformée de Fourier). Les déplacements chimiques δ des différents signaux sont exprimés en ppm par rapport au signal de référence du standard interne, le tétraméthylsilane (TMS). Pour chaque élément possédant un moment magnétique nucléaire permanent, ces déplacements sont caractéristiques de son environnement nucléaire et électronique dans la molécule. Les solvants deutériés utilisés pour les mesures RMN dans le r présent travail sont le MeOH-d4, le CHCl3-d1, le CH2Cl2-d2 et le DMSO-d6 (D Glaser SA). La température de travail a été fixée à 30 °C. Les spectres 1H-RMN sont enregistrés à une radiofréquence de 499,87 MHz et les spectres 13C- RMN à 125,70 MHz. Des mesures complémentaires, dites « bidimensionnelles », sont souvent nécessaires pour mettre en évidence des corrélations homo- et hétéronucléaires entre les atomes de carbone et d’hydrogène au sein des molécules analysées. Il s’agit des expériences suivantes, réalisées grâce à des programmes de séquences d’impulsions fournis par Varian pour l’instrument décrit plus haut : gHMBC, gHSQC, gdqfCOSY, DEPT, gHSQCTOCSY.
192 5. PARTIE EXPÉRIMENTALE
5.5 Méthodes biochimique et chimique de criblage
5.5.1 Réactifs de révélation chimique sur CCM L’utilisation de réactifs chimiques en solution, vaporisés sur les chromatogrammes sur couche mince, permettent de compléter les observations faites visuellement sous les lampes UV à 254 nm (extinction de la fluorescence) et 366 nm (fluorescence propre). En effet, un choix adapté de réactifs permet non seulement de mettre en évidence des constituants ou classes de constituants présents dans un extrait (criblage général), mais offre en plus une méthode simple et rapide pour localiser un composé particulier dans un mélange (extrait, fraction enrichie,…). L’utilisation d’un réactif polyvalent est particulièrement adaptée pour réunir rationnellement les fractions primaires récoltées suite à une séparation préparative ou semi-préparative. Le tableau V-4 présente les différents réactifs chimiques pour CCM utilisés dans ce travail.
Tableau V-4 : Réactifs chimiques pour la révélation des CCM.
Réactif Substances révélées Mode d’utilisation
Mélanger en parts égales une solution éthanolique de vanilline à 1% et une solution aqueuse d’acide perchlorique à 3 %. Vaporiser le mélange sur la plaque, puis une solution Godin Polyvalent éthanolique d’acide sulfurique à 10 %. Après chauffage intense, les composés organiques apparaissent sous forme de taches colorées [Godin, 1954].
Vaporiser successivement une solution méthanolique de NST/PEG diphénylboryloxy-éthylamine à 1 % (= NST) et une solution (Naturstoff- éthanolique de PEG 4000 à 5 % (= PEG) sur la plaque. Les Flavonoïdes Polyethylengly flavonoïdes apparaissent sous forme de taches fluorescentes kol) orange, jaunes, bleues et vertes à 366 nm [Wagner et Bladt, 1996].
5.5.2 Mise en évidence de l’activité antiradicalaire sur le DPPH Les radicaux libres sont produits dans notre organisme sous l’action de facteurs déclenchant externes (UV, radiations ionisantes, fumées de combustion, médicaments, pesticides, solvants,…), mais également dans le cadre de phénomènes biologiques importants, comme la respiration cellulaire. Certaines cellules immunitaires (leucocytes, macrophages) utilisent quant à elles les radicaux libres pour la destruction de microorganismes infectieux dans leurs lysosomes. Parmi les radicaux libres auxquels notre organisme est exposé, on retrouve les ·- · espèces réactives de l’oxygène tels que les radicaux superoxyde (O2 ), hydroxyle (OH ) et · 1 peroxyles (RO2 ), le peroxyde d’hydrogène (H2O2) et l’oxygène singulet ( O2). La production permanente de ces molécules réactives dans notre corps est généralement contrôlée par l’action
193 5. PARTIE EXPÉRIMENTALE
de systèmes enzymatiques (superoxyde dismutase, glutathion peroxydase, catalase,…) ou d’antioxydants (vitamine E, β-carotène, …). Lorsque cet équilibre précaire est rompu en faveur des radicaux libres, il se produit un « stress oxydatif », qui va entraîner la peroxydation des lipides et l’attaque des bases azotées et des acides aminés. Par les dommages ainsi causés à nos cellules, ces différents mécanismes semblent jouer un rôle prépondérant dans les phénomènes du vieillissement et engendrer des pathologies telles que des cancers et des troubles neurodégénératifs, comme les maladies d'Alzheimer ou de Parkinson. L’apport exogène d’antioxydants (alimentation, médicaments,…) pourrait donc ralentir, voire prévenir, ces désordres physiologiques [Cuendet, 1999]. Pour détecter l’activité antiradicalaire dans notre laboratoire, nous utilisons le 1,1-diphényl-2- picrylhydrazyle (DPPH), un radical stable, violet en solution et présentant un maximum d’absorption caractéristique à 517 nm. Le protocole appliqué en routine repose sur la disparition de ce maximum lorsque le DPPH est réduit par un composé à propriété antiradicalaire, entraînant ainsi une décoloration. Le test peut être effectué sur plaque CCM (évaluation qualitative ou semi-quantitative d’extraits, fractions ou produits purs) et sur microplaque à 96 puits (évaluation quantitatives de produits purs). Dans ce travail, seulement le test sur plaque CCM a été effectué. Il se déroule de la façon suivante : Vaporiser sur les plaques CCM développées et séchées, une solution méthanolique de DPPH à 0,2 %. Après un temps de réaction optimal de 30 min, les composés à propriété antiradicalaire sont localisés par l’apparition de zones jaunes sur fond violet. Le 2,6-di(tert-butyl)-4-méthylphénol (butylhydroxytoluène, BHT), un antioxydant de synthèse utilisé dans l’industrie alimentaire (E 321), et la quercétine sont utilisé comme produits de référence respectivement modérément et fortement actifs [Cuendet et al., 1997].
5.5.3 Mise en évidence de l’activité inhibitrice de l’acétylcholinestérase L’acétylcholinestérase (AChE) est l’enzyme responsable de l’hydrolyse du neurotransmetteur acétylcholine (ACh) au niveau des synapses cholinergiques. Les inhibiteurs de cette enzyme (iAChE) provoquent donc une augmentation de la transmission cholinergique, avec les effets parasympathomimétiques qui l’accompagnent. Leur usage clinique regroupe des indications telles que la maladie d’Alzheimer, le glaucome et la myasthénie grave. Le test de l’inhibition de l’AChE mené dans notre laboratoire pour le criblage des extraits et produits naturels est le suivant :
Une solution d’AChE à 1000 unités dans 150 ml de tampon tris de pH 7,8 (6 g/l H2O = 0,05 M) est préparée et 150 mg d’albumine (= sol. A) lui est ajoutée. Une part d’une solution éthanolique d’acétate de 1-naphtyle à 250 mg / 100 ml est mélangée à quatre parts d’une solution aqueuse de « Fast Blue Salt B » à 200 mg / 80 ml (= sol. B). La solution A est
194 5. PARTIE EXPÉRIMENTALE
vaporisée sur les plaques CCM développées et séchées, puis celles-ci sont incubées 20 min en atmosphère humide (boîte en PEHD avec un fond d’eau) à 37 °C. La solution B est ensuite vaporisée : une coloration pourpre apparaît sur la plaque CCM après 1-2 min, sauf dans les zones incolores occupées par des inhibiteurs de l’AChE. Les dépôts sont réalisés à raison de 10 µg pour les extraits et les fractions et de 1 µg pour les produits purs. La galanthamine est utilisée comme produit de référence (0.01 µg) [Marston et al., 2002].
195 5. PARTIE EXPÉRIMENTALE
5.6 Méthodes biologiques de criblage
5.6.1 Mise en évidence de l’activité antifongique sur Cladosporium cucumerinum par bioautographie directe La moisissure Cladosporium cucumerinum est un champignon microscopique phytopathogène s’attaquant particulièrement aux membres de la famille des Cucurbitaceae. Alors qu’il existe d’autres espèces phytopathogènes proches (p. ex. : C. fulvum pour la tomate, C. herbarum), le genre Cladosporium est aussi impliqué dans des pathologies humaines comme des allergies respiratoires, des infections cutanées ou du système nerveux central (C. cladosporioides, C. bantianum) [Salaki et al., 1984; Elgart, 1996; Cruz et al., 1997]. Le test par bioautographie directe utilisé dans notre laboratoire a été décrit par [Homans et Fuchs, 1970]: Sur les plaques CCM développées et soigneusement séchées est vaporisé, avec parcimonie, une suspension de conidies de C. cucumerinum (fournies par Novartis Agro) dans du bouillon de Sabouraud maltosé (Difco). Les plaques sont ensuite incubées pendant 3 jours à température ambiante en atmosphère humide (boîte en PEHD avec un fond d’eau). Le champignon se développe en produisant un pigment gris-vert, ce qui permet la visualisation aisée des zones d’inhibition de croissance incolores. Les extraits et fractions sont déposés à raison de 100 µg, les produits purs de 10 µg. Des dilutions successives ont été effectuées pour les produits purs montrant une activité digne d’intérêt (1 µg/µl, 0.1 µg/µl, 0.01 µg/µl, 0.005 µg/µl, 0.001 µg/µl) et sont déposés à raison de 10 µl. L’amphotéricine B (10 µg), le miconazole (10 µg) ou la nystatine (0.2 µg) sont utilisées comme contrôle positif, alors que le chloramphénicol est déposé comme contrôle négatif (10 µg).
5.6.2 Mise en évidence de l’activité antifongique sur Pyrenophora teres par test de croissance du mycélium sur milieu artificiel. Le test antifongique contre Pyrenophora teres est effectué en collaboration avec le Syngenta® Jealott's Hill International Research Center selon le protocole en vigueur.
5.6.3 Mise en évidence de l’activité antifongique sur Candida albicans par bioautographie « agar overlay » Le test par bioautographie « agar overlay » utilisé dans notre laboratoire avec C. albicans a été mis au point par [Rahalison et al., 1991]. Les chromatogrammes sur couche mince sont d’abord développés sur des plaques de silicagel de 10 x 20 cm avec un support en verre. La phase mobile doit être exempte d’acide et il est très important de sécher complètement les plaques afin d’éliminer toute trace de solvant. Toutes les opérations décrites ci-après sont effectuées
196 5. PARTIE EXPÉRIMENTALE
sous flux laminaire, avec les précautions d’usage lors de la manipulation de microorganismes potentiellement pathogènes et le souci d’éviter toute contamination des milieux de culture utilisés par d’autres germes. La souche de C. albicans utilisée est fournie par le Dr Michel Monod du Service de Dermatologie du Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV, Lausanne, Suisse). La technique de l’« agar overlay » consiste à verser sur les plaques CCM développées, à l’aide d’une pipette stérile et en fine couche de 1-2 mm d’épaisseur, 20 ml d’un inoculum (env. 105 cellules / ml) à base de gélose à l’extrait de malt. Ce dernier se solidifie alors en refroidissant. Après incubation pendant 1 nuit à 30 °C en atmosphère humide (boîte de PEHD avec un fond d’eau), les bioautogrammes sont révélés par vaporisation d’une solution aqueuse de bromure de 3-(4,5-diméthyl-2-thiazolyl)-2,5-diphényl-2H-tétrazolium (MTT) à 2,5 mg / ml. Cette substance, métabolisée par C. albicans en un dérivé formazan violet, permet de visualiser, après 4 h d’incubation dans les mêmes conditions que précédemment, les zones d’inhibition incolores sur fond violet. Pour la conservation des bioautogrammes, de l’éthanol à 94 % est vaporisé sur les plaques pour arrêter la croissance fongique avant de les laisser sécher et de les recouvrir avec un film adhésif transparent. Les extraits et fractions sont déposés à raison de 100 µg, les produits purs de 10 µg. Le miconazole est utilisé comme contrôle positif (10 µg), alors que le chloramphénicol est déposé comme contrôle négatif (10 µg).
197 5. PARTIE EXPÉRIMENTALE
5.7 Constantes physiques et données spectrales des composés isolés
5.7.1 Composés isolés de l’extrait dichlorométhanique des racines d’Oxytropis fetida (Vill.) DC.
Composé A
5'
4' 6' O
3' R Structure 1' 1 2' N 2
OH H 3 5
4
Noms chimiques (-)-(2’R)-N-Benzoyl-β-hydroxyphényléthylamine
(-)-(2’R)-2’-Hydroxyphényléthylbenzamide
Formule C15H15NO2
Masse exacte 241.1103 Da
Poids moléculaire 241.2851 Da
Aspect Poudre amorphe blanche
25 []α D -11.7 ° (MeOH ; c 1.0)
Données RMN-1H Voir tableau V-5
Données RMN-13C Voir tableau V-5
+ 2 + 3 242 (100) [M+H] . MS : 224 (100) [M+H] -H2O, 225 (10). MS : 106 ESI m/z (rel. int.) + (100) [M+H] -C8H10N
+ + + EIMS m/z (rel. int.) 241 (5) [M] , 136 (90) [M-C7H5O] , 105 (80) [M-C8H10N]
198 5. PARTIE EXPÉRIMENTALE
Composé B
5'
6' 4' O H
3' R Structure 1' 1 3 2' N 2 4
OH H H 5 7
6
Noms chimiques (-)-(2’R)-N-trans-Cinnamoyl-β-hydroxyphényléthylamine
(-)-(2’R)-2’-Hydroxyphénéthylcinnamide
Formule C17H17NO2
Masse exacte 267.1259 Da
Poids moléculaire 267.3224 Da
Aspect Poudre amorphe blanche
25 []α D -58.6 ° (MeOH ; c 1.0)
Données RMN-1H Voir tableau V-5
Données RMN-13C Voir tableau V-5
+ 2 + + 268 (100) [M+H] . MS : 250 (100) [M+H] -H2O, 132 (5) [M+H] - 3 + + ESI m/z (rel. int.) C8H10N. MS : 132 (100) [M+H] -C8H10N, 104 (10) [M+H] -C8H10N- CO
+ + 267 (5) [M] , 131 (100) [M-C8H10N] , 161 (99), 160 (55), 103 (45) [M- EIMS m/z (rel. int.) + C8H10N-CO]
199 5. PARTIE EXPÉRIMENTALE
Composé C
1 8 HO O 2 7 8a
4a 3 2' Structure 6 3' O 5 4 1'
O 6' 4' O 5'
Nom chimique 7-Hydroxy-3’,4’-méthylènedioxyisoflavone
Nom trivial Pseudobaptigénine
Formule C16H10O5
Masse exacte 282.0528 Da
Poids moléculaire 282.2476 Da
Aspect Poudre amorphe
25 []α D -
Données RMN-1H Voir tableau V-6
Données RMN-13C Voir tableau V-6
283 (100) [M+H]+. MS2 : 283 (100), 253 (80), 225 (30). MS3 : 283 (80), ESI m/z (rel. int.) 253 (70), 153 (60)
282 (100) [M]+, 146 (95) [1,3B]+., 167 (80), 144 (55), 267 (10), 136 (10) EIMS m/z (rel. int.) [1,3A]+
200 5. PARTIE EXPÉRIMENTALE
Composé D
O
1 O OH
OH 8
8 8 2 7 a OCH3
4a 3 2’ 6 3’
Structure
5 4 1’
O
O 4’
6’ O O
5’
O O
Nom chimique (+/-)-7-Hydroxy-2’-méthoxy-4’,5’-méthylènedioxyisoflavanone
Nom trivial (+/-)-Onogènine
Formule C17H16O6
Masse exacte 314.0790 Da
Poids moléculaire 314.2894 Da
Aspect Poudre amorphe
25 []α D 0° (CH2Cl2 ; c 0.8)
Données RMN-1H Voir tableau V-6
Données RMN-13C Voir tableau V-6
315 (100) [M+H]+. MS2 : 298 (100), 255 (15). MS3 : 163 (100), 98 (55), ESI m/z (rel. int.) 228 (20)
EIMS m/z (rel. int.) 314 (20) [M]+, 178 (100) [1,3B]+, 137 (40) [1,3A]+
201 5. PARTIE EXPÉRIMENTALE
Composé E
OH OH O
8 1 O
HO 2 HO 7 8a 4a R 3 2’ OCH Structure 6 3’ 3 5 4 1’ 4’ 6’ OCH3 5’
Nom chimique (-)-(3R)-7,2’-Dihydroxy-3’,4’-diméthoxyisoflavane
Nom trivial (-)-(3R)-Isomucronulatol
Formule C17H18O5
Masse exacte 302.1154 Da
Poids moléculaire 302.3218 Da
Aspect Poudre amorphe
25 []α D -35 ° (CHCl3 ; c 1.0)
Données RMN-1H Voir tableau V-6
Données RMN-13C Voir tableau V-6
303 (100) [M+H]+. MS2 :168 (100), 124 (30), 181 (30). MS3 : 153 ESI m/z (rel. int.) (100), 168 (70), 135 (10)
302 (20) [M]+, 97 (75), 123 (60) [1,3A]+, 180 (50) [1,3B]+, 95 (5) [1,3A- EIMS m/z (rel. int.) CO]+
202 5. PARTIE EXPÉRIMENTALE
Composé F
O 10 9
10a O O H 8 1 Structure 11a 6a 2 R 6b 7 11b R 3 H 6 HO 4a O 4 Nom chimique (-)-(6aR,11aR)-3-Hydroxy-8,9-méthylènedioxyptérocarpane
Nom trivial (-)-(6aR,11aR)-Maackiaine
Formule C16H12O5
Masse exacte 284.0685 Da
Poids moléculaire 284.2635 Da
Aspect Poudre amorphe blanche
25 []α D -157° (MeOH ; c 0.23)
Données RMN-1H Voir tableau V-7
Données RMN-13C Voir tableau V-7
ESI m/z (rel. int.) 285 (100) [M+H]+. MS2 : 281 (100), 283 (25). MS3 : 281 (100)
203 5. PARTIE EXPÉRIMENTALE
Composé G
HO OCH3 10 9 10a O 8 H Structure 1 11a 6a 6b 7 2 R 11b R
3 H 6 4a H3CO O 4 Nom chimique (-)-(6aR,11aR)-10-Hydroxy-3,9-diméthoxyptérocarpane
Nom trivial (-)-(6aR,11aR)-3-Méthoxyvesticarpane
Formule C17H16O5
Masse exacte 300.0998 Da
Poids moléculaire 300.3059 Da
Aspect Poudre amorphe blanche
25 []α D -220° (CHCl3 ; c 0.40)
Données RMN-1H Voir tableau V-7
Données RMN-13C Voir tableau V-7
+ 2 + + 301 (100) [M+H] . MS : 153 (100) [M+H] -C9H8O2, 177 (15) [M+H] - ESI m/z (rel. int.) + 3 C7H8O2, 193 (10) [M+H] -C7H8O. MS : 125 (100), 153 (80)
204 5. PARTIE EXPÉRIMENTALE
Composé H
5'
4' 6' O H
3'
Structure 1' 1 3 2' N 2 4
H H 5 7 6
Noms chimiques N-trans-Cinnamoyl-β-phényléthylamine
Phénéthylcinnamide
Formule C17H17NO
Masse exacte 251.1310 Da
Poids moléculaire 251.3230 Da
Aspect Poudre amorphe blanche
25 []α D -
Données RMN-1H Voir tableau V-5
Données RMN-13C Voir tableau V-5
+ 2 + 3 252 (100) [M+H] . MS : 132 (100) [M+H] -C8H10N. MS : 144 (100), ESI m/z (rel. int.) + 104 (80) [M+H] -C8H10N-CO
+ + + EIMS m/z (rel. int.) 251 (20) [M] , 131 (100) [M-C8H10N] , 103 (35) [M-C8H10N-CO]
205 5. PARTIE EXPÉRIMENTALE
Composé I
H3CO OCH3 10 9 10a O 8 H Structure 1 11a 6a 6b 7 2 R 11b R
3 H 6 4a H3CO O 4 Nom chimique (-)-(6aR,11aR)-3,9,10-Triméthoxyptérocarpane
Nom trivial (-)-(6aR,11aR)-3,9-Diméthoxynissoline
Formule C18H18O5
Masse exacte 314.1154 Da
Poids moléculaire 314.3325 Da
Aspect Poudre amorphe blanche
25 []α D -218° (CHCl3 ; c 0.4)
Données RMN-1H Voir tableau V-7
Données RMN-13C Voir tableau V-7
+ 2 + + 315 (70) [M+H] . MS : 167 (100) [M+H] -C9H8O2, 191 (15) [M+H] - + 3 + ESI m/z (rel. int.) C7H8O2, 207 (10) [M+H] -C7H8O. MS : 152 (100), 167 (60) [M+H] - C9H8O2
206 5. PARTIE EXPÉRIMENTALE
Composé J
O 10 9
10a O O H 8 1 Structure 11a 6a 6b 7 2 R 11b R
3 H 6 4a H3CO O 4 Nom chimique (-)-(6aR,11aR)-3-Méthoxy-8,9-méthylènedioxyptérocarpane
Nom trivial (-)-(6aR,11aR)-Ptérocarpine
Formule C17H14O5
Masse exacte 298.0841 Da
Poids moléculaire 298.2901 Da
Aspect Poudre amorphe blanche
25 []α D -236° (CHCl3 ; c 0.42)
Données RMN-1H Voir tableau V-7
Données RMN-13C Voir tableau V-7
299 (100) [M+H]+. MS2 : 271 (100), 282 (20), 150 (20), 137 (10). MS3 : ESI m/z (rel. int.) 213 (100), 240 (70), 255 (20), 166 (20)
207
1 13 Tableau V-5– Données RMN- H (499.87 MHz) et RMN- C (125.70 MHz) des phényléthylamides (A, B et H) mesurées dans le chloroforme-d1 (δ en ppm et J en Hz).
A B H Pos. 1H 13C 1H 13C 1H 13C 1 (C=O) - 168.7 - 167.5 - 166.3 2 - 141.7 6.45 d (15.3) 120.0 6.31 d (15.6) 120.5 3 7.77 dd (7.5, 1.5) 141.1 7.62 d (15.3) 141.6 7.62 d (15.6) 141.1 4 7.40-7.77 135.3 - 134.8 - 135.3 5 7.40-7.77 127.8 7.52 dd (7.3, 2.0) 128.0 7.48 dd (7.3, 2.0) 127.8 6 - - 7.36-7.42 128.3 7.32-7.38 128.8 7 - - 7.36-7.42 130.0 7.32-7.38 129.5 NH - - - - 5.59 br s - 1’ 3.86 dd (13.9, 3.7) 47.8 3.76 dd (13.9, 3.7) 47.6 3.67 dd (6.8) 40.8 3.50 dd (13.9, 8.1) 3.43 dd (13.9, 8.1) 2’ 4.93 dd (8.1, 3.7) 73.7 4.86 dd (8.1, 3.7) 73.2 2.90 t (6.8) 35.7 3’ - 134.0 - 141.8 - 139.3 4’ 7.40-7.77 128.8 7.36-7.42 126.1 7.23 d (6.8) 128.8 5’ 7.40-7.77 128.7 7.36-7.42 128.5 7.32-7.38 128.7 6’ 7.40-7.77 126.6 7.36-7.42 126.6 7.23-7.27 126.6 Multiplicités : m : multiplet, s : singulet, d : doublet.
1 13 Tableau V-6– Données RMN- H (499.87 MHz) et RMN- C (125.70 MHz) des isoflavonoïdes (C, D et E) mesurées dans le chloroforme-d1 (δ en ppm et J en Hz).
C D E Pos. 1H 13C 1H 13C 1H 13C O ------2 7.92 s 153.1 4.44 dd (11.0, 5.4) 71.2 4.07 t (10.5) 69.8 4.51 t (11.0) 4.34 ddd (11.0, 3.0, 1.9) 3 125.8 4.22 dd (11.0, 5.4) 47.5 3.54 m 32.2 4 176.4 192.4 2.92 dd (15.0, 6.0) 30.3 2.99 dd (15.0, 10.0) 4a 117.4 114.6 114.9 5 8.11 d (8.8) 127.9 7.83 d (8.8) 129.7 6.92 d (8.3) 130.5 6 6.93 dd (8.8, 2.2) 115.4 6.54 dd (8.8, 2.4) 110.8 6.37 dd (8.3, 2.2) 107.9 7 162.6 154.8 8 6.84 d (2.4) 102.6 6.38 d (2.4) 102.9 6.34 d (2.2) 103.6 8a 158.4 163.9 155.4 1’ 124.6 115.5 120.5 2’ 7.08 d (1.5) 110.0 152.8 147.4 3’ 147.8 6.58 s 95.4 135.4 4’ 147.8 141.5 151.1 5’ 6.88 d (7.8) 108.5 147.8 6.44 d (8.3) 103.9 6’ 6.96 dd (7.8, 1.5) 122.5 6.59 s 109.8 6.78 d (8.3) 121.9 3.74 s 56.5 2’-OCH3 3.92 s 61.4 3’-OCH3 3.85 s 56.0 4’-OCH3 6.00 s 101.3 5.91 s 101.2 OCH2O Multiplicités : m : multiplet, s : singulet, d : doublet.
1 13 Tableau V-7– Données RMN- H (499.87 MHz) et RMN- C (125.70 MHz) des ptérocarpanes (F, G, I et J) mesurées dans le chloroforme-d1 (δ en ppm et J en Hz).
F G I J Pos. 1H 13C 1H 13C 1H 13C 1H 13C 1 7.37 d (8.3) 132.1 7.51 d (8.7) 132.3 7.50 d (8.8) 132.2 7.40 d (8.8) 131.9 2 6.56 dd (2.5, 8.3) 109.8 6.64 dd (2.4, 8.7) 109.0 6.65 dd (2.5, 8.8) 109.1 6.65 dd (2.5, 8.8) 109.4 3 160.3 162.6 161.3 161.2 4 6.42 d (2.5) 103.9 6.47 d (2.4) 101.5 6.47 d (2.0) 101.6 6.47 d (2.4) 101.9 4a 156.8 157.1 157.2 156.7 4.23 dd (11.4, 4.7) 4.25 dd (10.9, 5.2) 4.25 m 4.23 dd (11.2, 5.8) 6 66.4 66.4 66.4 66.7 3.65 dd (11.2, 10.8) 3.67 dd (11.1, 10.9) 3.68 dd (11.2, 10.8) 3.67 dd (11.2, 10.7) 6a 3.48 m 40.4 3.56 m 40.1 3.55 m 39.8 3.50 m 35.4 6b 118.1 122.1 121.9 118.0 7 6.72 s 104.9 6.75 d (8.1) 114.7 6.89 d (7.8) 118.1 6.73 s 104.7 8 141.9 6.46 d (8.1) 103.7 6.46 d (7.8) 104.9 142.0 9 148.3 148.3 153.4 148.3 10 6.44 s 94.1 131.1 134.6 6.43 s 94.1 10a 154.4 146.8 151.5 154.3 11a 5.47 d (6.8) 78.5 5.57 d (6.8) 79.3 5.55 d (6.9) 78.9 5.49d (6.8) 78.7 11b 112.9 112.8 112.1 112.6 3-OH 4.94 br s
3-OCH3 3.79 s 55.3 3.79 s 55.3 3.79 s 55.5
9-OCH3 3.88 s 56.5 3.85 s 56.2 10-OH 5.31 br s -
10-OCH3 3.94 s 60.7 5.90 s 5.90 s OCH O 101.3 101.2 2 5.92 s 5.92 s Multiplicités : m : multiplet, s : singulet, d : doublet.
5. PARTIE EXPÉRIMENTALE
5.7.2 Composés isolés de l’extrait méthanolique des racines d’Oxytropis fetida (Vill.) DC.
Composé K
8 H3CO O 2 7 8a OH
4a 2’ Structure 6 3 1’ 3’ 5 4
OH O 6’ 4’ OH 5’
Nom chimique 2',4',5-Trihydroxy-7-méthoxyisoflavone
Nom trivial Cajanine
Formule C16H12O6
Masse exacte 300.0633 Da
Poids moléculaire 300.2628 Da
Aspect Poudre amorphe
25 []α D -
Données RMN-1H Voir tableau V-9
Données RMN-13C Voir tableau V-10
ESI m/z (rel. int.) 301 (100) [M+H]+. MS2 : 301 (100), 273 (15). MS3 : 301 (100), 273 (15)
EIMS m/z (rel. int.) 300 (70) [M]+, 167 (100) [1,3A]+ +H, 134 (40) [1,3B+]
211 5. PARTIE EXPÉRIMENTALE
Composé L
8 HO O 2 7 8a 2’ 4a OCH Structure 6 3 1’ 3’ 3 5 4 O 6’ 4’ OH 5’
Nom chimique 7,4'-Dihydroxy-3’-méthoxyisoflavone
Nom trivial 3'-Méthoxydaidzéine
Formule C16H12O5
Masse exacte 284.0684 Da
Poids moléculaire 284.2634 Da
Aspect Poudre amorphe
25 []α D -
Données RMN-1H Voir tableau V-9
Données RMN-13C Voir tableau V-10
285 (100) [M+H]+. MS2 :285 (100), 253 (15). MS3 : 285 (100), 270 (20), ESI m/z (rel. int.) 253 (15).
EIMS m/z (rel. int.) 284 (30) [M]+, 136 (100) [1,3A+], 148 (40) [1,3B+].
212 5. PARTIE EXPÉRIMENTALE
Composé M
8 HO O 2 7 8a 2’ 4a OH Structure 6 3 1’ 3’ 5 4 O 6’ 4’ OCH 5’ 3
Nom chimique 7,3’-Dihydroxy- 4’-méthoxyisoflavone
Nom trivial Calycosine
Formule C16H12O5
Masse exacte 284.0684 Da
Poids moléculaire 284.2634 Da
Aspect Poudre amorphe
25 []α D -
Données RMN-1H Voir tableau V-9
Données RMN-13C Voir tableau V-10
285 (100) [M+H]+. MS2 : 285 (100), 270 (15), 253 (15). MS3 : 285 (100), ESI m/z (rel. int.) 270 (15), 253 (15)
EIMS m/z (rel. int.) 284 (100) [M]+, 137 (15) [1,3A+ ]+H, 148 (50) [1,3B+].
213 5. PARTIE EXPÉRIMENTALE
Composé N
5’ OH 6’ 4’
8 3’ HO O 1’ Structure 7 8a S 2 2’ 4a 6 3 5 4
OH O Nom chimique (-)-(2S)-4’,5,7-Trihydroxyflavanone
Nom trivial (-)-(2S)-Naringénine
Formule C15H12O5
Masse exacte 272.0684 Da
Poids moléculaire 272.2527 Da
Aspect Poudre amorphe
25 []α D
Données RMN-1H Voir tableau V-9
Données RMN-13C Voir tableau V-10
ESI m/z (rel. int.) 273 (100) [M+H]+. MS2 : -. MS3 : -.
EIMS m/z (rel. int.) 272 (100) [M]+, 153 (60) [1,3A+], 120 (20) [1,3B+]
214 5. PARTIE EXPÉRIMENTALE
Composé O
8 HO O 2 7 8a
4a 2’ 6 3 1’ Structure 3’ 5 4
OH O 6’ 4’ OH 5’
Nom chimique 4',5,7-Trihydroxyisoflavone
Nom trivial Génistéine
Formule C15H10O5
Masse exacte 270.0528 Da
Poids moléculaire 270.2369 Da
Aspect Poudre amorphe
25 []α D -
Données RMN-1H Voir tableau V-9
Données RMN-13C Voir tableau V-10
ESI m/z (rel. int.) 271 (100) [M+H]+. MS2 : 271 (100). MS3 : 271 (100).
EIMS m/z (rel. int.) 270 (60) [M]+, 153 (100) [1,3A+ ]+H, 118 (40) [1,3B+]+H.
215 5. PARTIE EXPÉRIMENTALE
Composé P
8 HO O 2 7 8a O
4a 3 2' 6 1' OCH3 Structure 5 4 3'
6' 4' 5' OCH3
HO Nom chimique 2’-Céto-3’,4’-diméthoxy-7,5’-dihydroxy-1’,6’-dihydroisoflavane
Nom -
Formule C17H20O6
Masse exacte 320.1260 Da
Poids moléculaire 320.3371 Da
Aspect Poudre amorphe
25 []α D +49.1 ° (CHCl3 ; c 1.0)
UV λmax (log ε) 205, 225 (sh), 275 nm
Données RMN-1H Voir tableau V-8
Données RMN-13C Voir tableau V-8
321 (100) [M+H]+. MS2 : 303 (100), 167 (25). MS3 : 243 (100), 271 ESI m/z (rel. int.) (60), 155 (20), 303 (20)
EIMS m/z (rel. int.) 320 [M]+, 123 (10) [1,3A+].
HRESMS m/z 343.11552 (calculée pour C17H20O6Na, 343.11521)
216 5. PARTIE EXPÉRIMENTALE
Composé Q
8 HO O 7 8a 2 OH
4a 2' 6 1' 3 3' Structure 5 4
O 6' 4' 5' O
O Nom chimique 7-2’ Dihydroxy-4’,5’-méthylènedioxyisoflavone
Nom trivial 2’-Hydroxy-pseudobaptigénine
Formule C16H10O6
Masse exacte 298.0477 Da
Poids moléculaire 298.2470 Da
Aspect Poudre amorphe
25 []α D -
Données RMN-1H Voir tableau V-9
Données RMN-13C Voir tableau V-10
299 (100) [M+H]+. MS2 : 242 (40), 270 (20), 137 (5). MS3 : 242 (40), 270 ESI m/z (rel. int.) (20), 137 (5).
EIMS m/z (rel. int.) 298 (100) [M]+, 149 (70), 137 (60) [1,3A+]+H, 162 (50) [1,3B+]
217 5. PARTIE EXPÉRIMENTALE
Composé R
5’ OH 6’ 4’
8 HO O 1’ 3’ Structure 7 8a 2 2’ 4a 6 3 5 4
OH O Nom chimique 4’,5,7-Trihydroxyflavone
Nom trivial Apigénine
Formule C15H10O5
Masse exacte 270.0528 Da
Poids moléculaire 270.2369 Da
Aspect Poudre amorphe
25 []α D -
Données RMN-1H Voir tableau V-9
Données RMN-13C Voir tableau V-10
ESI m/z (rel. int.) 271 (100) [M+H]+. MS2 : 271 (100). MS3 : 271 (100)
EIMS m/z (rel. int.) 270 (100) [M]+, 153 (30) [1,3A+], 121 (30) [0,2B+], 167 (30).
218
1 13 Tableau V-8– Données RMN- H (499.87 MHz) et RMN- C (125.70 MHz) du composé P mesurées dans le méthanol-d4 (δ en ppm et J en Hz).
P Pos. 1H 13C O - - 2 4.26 dd (10.2) 69.6 3.82 dd (10.2) 3 2.57 m 32.6 4 2.77 dd (14.6) 27.2 2.53 dd (14.6) 4a - 112.8 5 6.81 d (8.3) 130.4 6 6.28 dd (8.3/2.5) 108.3 8 6.17 d (2.5) 102.8 8a - 155.6 1’ 2.38 m 44.8 2’ - 196.9 3’ - 137.1 4’ - 164.8 5’ 4.55 m 66.1 6’ 2.20 m 29.5 1.83 m 7-OH - 156.8 5’-OH - 66.1 3.62 s 59.8 3’-OCH3 4.09 s 58.8 4’-OCH3 Multiplicités : m : multiplet, s : singulet, d : doublet.
1 Tableau V-9– Données RMN- H (499.87 MHz) des flavonoïdes (K, L, M, N, O, Q et R) mesurées dans le méthanol-d4 (δ en ppm et J en Hz).
K L M N O Q R Pos. 1H 1H 1H 1H 1H 1H 1H O ------
2 8.04 s 8.13 s 8.12 s 5.33 dd (12.7, 2.9) 8.03 s 8.12 s -
3 3.10 dd (17.3, 12.7) - - - - - 6.59 s 2.68 dd (17.3, 2.9) 4 ------4a ------5 8.02 d (8.8) 8.03 d (8.8) 8.03 d (8.8) 6 6.40 d (2.5) 6.89 dd (8.8, 2.0) 6.91 dd (8.8, 2.0) 5.88 s 6.19 d (1.9) 6.92 dd (8.8, 2.0) 6.20 d (2.4) 7 ------8 6.53 d (2.5) 6.78 d (2.4) 6.82 d (2.0) 5.87 s 6.31 d (2.4) 6.82 d (2.0) 6.54 d (2.4) 8a ------1’ ------2’ - 7.15 d (1.9) 7.03 s 7.30 d (8.3) 7.36 dd (8.8) - 7.84 d (8.8) 3’ 6.38 d (2.4) - - 6.81 d (8.3) 6.83 dd (8.8) 6.59 s 6.92 d (8.8) 4’ - - 6.97 s - - - - 5’ 6.36 dd (8.4, 2.4) 6.83 d (8.3) - 6.81 d (8.3) 6.83 dd (8.8) - 6.92 d (8.8) 6’ 7.04 d (8.3) 6.95 dd (8.3, 2.0) 6.97 s 7.30 d (8.3) 7.36 dd (8.8) 6.62 s 7.84 d (8.8)
OCH3 3.87 s 3.89 s 3.88 s
OCH2O 5.94 s Multiplicités : m : multiplet, s : singulet, d : doublet.
13 Tableau V-10– Données RMN- C (125.70 MHz) des flavonoïdes (M, N, O, et Q) mesurées dans le méthanol-d4 (δ en ppm et J en Hz).
M N O Q Pos. 13C 13C 13C 13C O - - - - 2 154.8 79.5 159.1 - 3 125.7 42.9 123.8 126.3 4 178.0 196.9 181.4 177.1 4a 117.8 102.4 105.2 117.0 5 128.4 164.1 162.3 - 6 116.4 96.1 99.6 116.2 7 164.5 168.0 166.3 - 8 103.3 95.4 94.1 102.6 8a 159.9 163.9 158.8 159.0 1’ 126.3 130.1 122.4 124.9 2’ 117.4 128.1 130.5 - 3’ 149.1 115.4 115.3 102.1 4’ 112.6 158.3 157.8 149.5 5’ 147.4 115.4 115.3 134.9 6’ 121.6 128.1 130.5 112.4 7-OCH3 56.4 -
OCH2O 101.9 Multiplicités : m : multiplet, s : singulet, d : doublet
5. PARTIE EXPÉRIMENTALE
5.7.3 Composés isolés de l’extrait dichlorométhanique de Potentilla grandiflora L.
Composé A
H
OH H3CO
Structure
H
OH O Nom chimique 1-(2,6-Dihydroxy-4-méthoxyphényl)-2-méthylbutan-1-one
Nom trivial -
Formule C12H16O4
Masse exacte 224.1049 Da
Poids moléculaire 224.2530 Da
Aspect Poudre amorphe blanche
25 []α D + 7.8° (MeOH ; c 0.74)
UV λmax (log ε) 227, 285, 332 (sh)
Données RMN-1H Voir tableau V-11
Données RMN-13C Voir tableau V-11
− − − APCI m/z (rel. int.) 223.6 (100) [M−H] , 208.5 (20) [M-CH3] , 152.3 (10) [M-C4H9]
+ HRESMS m/z 247.09374 [M+H] (calculée pour C12H16O4Na, 247.09408)
222 5. PARTIE EXPÉRIMENTALE
Tableau V-11 – Données RMN-1H (499.87 MHz) et RMN-13C (125.70 MHz) de l’acylphloroglucinol A mesurées dans le chloroforme-d1 (δ en ppm et J en Hz).
A Pos. 1H 13C 1 - 104.7 2 10.05 s (OH) 163.5 3 5.95 s 94.4 4 - 165.3 5 5.95 s 94.4 6 10.05 s (OH) 163.5
4 OCH3 3.80 s 55.6 1’ (C=O) - 210.3 2’ 3.75 m 45.7 3’ 1.18 d (7.0) 16.5 4’ 1.43 m / 1.86 m 26.9 5’ 0.93 t (7.0) 11.8 Multiplicités : m : multiplet, s : singulet, d : doublet.
223 5. PARTIE EXPÉRIMENTALE
Composé B
30
29 20 21 HO 19 12 18 22 11 13 17 Structure 25 26 CO2H O 14 16 28 1 9 2 10 8 15 3 27 7 HO 4 5 6
23 24
Nom chimique Acide 3β,19α-dihydroxy-2-oxo-urs-12-èn-28-oïque
Nom trivial Acide 2-oxopomolique
Formule C30H46O5
Masse exacte 486.3345 Da
Poids moléculaire 486.6832 Da
Aspect Poudre amorphe blanche
25 []α D + 67.2° (MeOH ; c 0.20)
UV λmax (log ε) -
Données RMN-1H Voir tableau V-12
Données RMN-13C Voir tableau V-12
487.9 (100) [M+H]+, 445.6 (70) [M−42]+, 293.4 (80) [M−194]+, 223.7 APCI m/z (rel. int.) (20) [M−264]+
224 5. PARTIE EXPÉRIMENTALE
Tableau V-12 – DonnéesRMN-1H (499.87 MHz) et RMN-13C (125.70 MHz) de l’acide 2-oxpomolique (B) mesurées dans le chloroforme-d1 (δ en ppm et J en Hz). B Pos. 1H 13C 2.48 d (12.0) 1 53.1 2.12 d (12.0) 2 (C=O) - 211.0 3 3.93 l s 82.9 4 - 45.8 5 1.48 m 54.5 6 Non déterminé 18.7 7 1.40 m 32.4 8 - 40.4 9 1.98 m 47.2 10 - 43.7 11 2.00 m 23.6 12 5.36 s 128.5 13 - 138.2 14 - 41.4 15 1.76 m / 1.11 m 28.2 16 1.82 m / 1.70 m 37.4 17 - 47.7 18 2.57 s 52.9 19 - 73.1 20 1.44 m 41.1 21 1.73 m / 1.33 m 25.9 22 2.57 m / 1.62 m 25.3 23 1.21 s 29.4 24 0.70 s 16.4 25 0.90 s 16.3 26 0.74 s 16.3 27 1.33 s 24.3
28 (CO2H) - 182.5 29 1.23 s 27.4 30 0.97 d (6.5) 16.0 Multiplicités : m : multiplet, s : singulet, d : doublet.
225
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7. RÉSUMÉ
7. RÉSUMÉ
Dans le but de valoriser l’intérêt des plantes alpines dans le domaine de la recherche de nouveaux composés biologiquement actifs, une centaine d’extraits provenant de 45 plantes des Alpes centrales ont été évalués à l’aide de méthodes de criblage biologique, biochimique et chimique. Les extraits ont été soumis à différents tests antifongiques tels que les tests sur la moisissure phytopathogène Cladosporium cucumerinum par bioautographie directe, sur la levure commensale Candida albicans par bioautographie « agar overlay » et sur Pyrenophora teres par test de croissance du mycélium sur milieu artificiel, ainsi que sur un test antiradicalaire sur le DPPH. Ce criblage a permis de sélectionner différents extraits présentant une activité antifongique marquée pour un fractionnement bioguidé et vingt composés naturels ont été isolés. La caractérisation complète de ces composés s’est effectuée à l’aide de différentes méthodes spectroscopiques (UV, MS, RMN 1D et 2D)
Le genre Oxytropis (O. fetida (Vill.) DC., O. campestris (L.) DC., O. jaquinii Bunge et O. helvetica Scheele) a particulièrement retenu notre attention, pour l’uniformité de son activité antifongique contre C. cucumerinum. De plus, l’extrait dichlorométhanique des racines d’Oxytropis fetida (Vill.) DC. est le seul extrait apolaire montrant une bonne activité antiradicalaire. L’investigation phytochimique des extraits dichlorométhanique et méthanolique des racines d’O. fetida (Vill.) DC., les plus actifs, a été entrepris et a permis la purification et l’identification de dix-huit composés : trois phényléthylamides et sept isoflavonoïdes actifs dans l’extrait dichlorométhanique, trois flavonoïdes et cinq isoflavonoïdes, dont un nouveau produit naturel, la 2’-céto-3’,4’-diméthoxy-7,5’-dihydroxy-1’,6’-dihydro-isoflavane, dans l’extrait méthanolique. La présence d’isoflavonoïdes dans une espèce du genre Oxytropis n’avait encore jamais été rapportée jusqu’à présent. Les autres extraits de ce genre ont été analysés par LC/DAD-UV et LC/UV/ESI-MS et la comparaison avec O. fetida (Vill.) DC. montre des voies biosynthétiques légèrement différentes.
Le fractionnement bioguidé de l’extrait dichlorométhanique de P. grandiflora L. a conduit à l’isolement et à l’identification de l’acide 2-oxopomolique et d’un nouveau dérivé naturel actif de l’acylphloroglucinol, le 1-(2,6-dihydroxy-4-méthoxyphényl)-2-méthylbutan-1-one. A notre connaissance, il s’agit du premier acylphloroglucinol répertorié dans le genre Potentilla.
L’extrait méthanolique des feuilles de V. uliginosum ssp. microphyllum (Lange) Tolm. a montré une activité antifongique marquée sur P. teres et l’investigation de cet extrait en collaboration avec le Syngenta® Jealott's Hill International Research Center est actuellement en cours. Il a été observé, en accord avec la littérature, que probablement ce sont des flavonoïdes d’une très grande homogénéité structurelle qui constituent les composés UV-majoritaires de cet extrait.
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8. ABSTRACT
8. ABSTRACT
As a part of our ongoing investigations of alpine plants from the Valley of Aoste (Italy), the methanol and dichloromethane extracts of 45 plants have been studied from a phytochemical view point. These species grow at altitudes from 2200 to 2700 meters in extreme habitat. Thus, 100 extracts were investigated for their free radical scavenging activity against DPPH and antifungal activities with different tests: against the plant pathogenic fungus Cladosporium cucumerinum by direct bioautography, the commensal yeast Candida albicans by bioautography « agar overlay » and Pyrenophora teres by mycelial growth tests in artificial media. Some extracts showed significant activities and were studied by measuring the inhibition of the fractions against the growth of the pathogenic fungi. About twenty compounds have been isolated and the structures of these compounds were determined by means of spectrometric methods, including 1D and 2D NMR experiments and MS analysis
The genus Oxytropis (O. fetida (Vill.) DC., O. campestris (L.) DC., O. jaquinii Bunge and O. helvetica Scheele) showed a very uniform antifungal activity against C. cucumerinum. Moreover, the dichloromethane extract of the roots of Oxytropis fetida (Vill.) DC. was the only non-polar extract showing a good free radical scavenging activity. The dichloromethane and methanol extracts of the roots of O. fetida (Vill.) DC., the most active, were investigated and about eighteen compounds have been isolated : three phenylethylamides and seven active isoflavonoids in the dichloromethane extract, three flavonoids and five isoflavonoides, with one new natural compound, the 2’-keto-3’,4’-dimethoxy-7,5’-dihydroxy-1’,6’-dihydro-isoflavan, in the methanol extract. This is the first time that isoflavonoids were described in a species of the genus Oxytropis. The other extracts were analyzed by LC/DAD/UV and LC/UV/ESI-MSn and the comparison with O. fetida (Vill.) DC. showed different biosynthetic pathways.
A new acylphloroglucinol, 1-(2,6-dihydroxy-4-methoxyphenyl)-2-methylbutan-1-one, has been isolated from the dichloromethane extract of Potentilla grandiflora L. (Rosaceae), together with 2-oxopomolic acid, a known ursane derivative. The acylphloroglucinol exhibited antifungal activity against the plant pathogenic fungus Cladosporium cucumerinum and showed also radical scavenging properties towards the 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl radical (DPPH). To our knowledge, this is the first acylphloroglucinol described in the Potentilla genus.
The methanol extract of the leaves of Vaccinium uliginosum ssp. microphyllum (Lange) Tolm. showed an interesting antifungal activity against P. teres and thus investigation in collaboration with the Syngenta® Jealott's Hill International Research Center is underway. In agreement with the literature, in this extract, the compounds mainly observed in UV will be probably only Flavonoids with a great structural homogeneity.
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