UNIVERSITE EVRY VAL D'essonne THESE Présentée
Total Page：16
File Type：pdf, Size：1020Kb
UNIVERSITE EVRY VAL D’ESSONNE THESE présentée pour obtenir le grade de DOCTEUR ES SCIENCES DE L’UNIVERSITE EVRY VAL D’ESSONNE par Franck BORDIER Nouvelles activités nitrilase : application à la synthèse de produits d'intérêt. Soutenue le vendredi 14 décembre 2012 devant les membres du jury : Pr. Laurence HECQUET RAPPORTEUR Pr. Magali REMAUD RAPPORTEUR Dr. Jamal OUAZZANI EXAMINATEUR Dr. Véronique de BERARDINIS EXAMINATEUR Dr. Carine VERGNE VAXELAIRE EXAMINATEUR Pr. Anne ZAPARUCHA DIRECTRICE DE THESE 1 Remerciements Je tiens tout d’abord à remercier Jean Weissenbach, directeur de l’Institut de génomique (CEA), de m’avoir permis de travailler dans cet établissement et d’avoir accepté de me financer quelques mois supplémentaires pour finir ma thèse dans de bonnes conditions. Je remercie les membres du jury qui ont accepté de juger mon travail : - Madame Laurence Hecquet, Professeur au Laboratoire de Biocatalyse en Synthèse Organique à l’Université Blaise Pascal de Clermont-Ferrand. - Madame Magali Remaud, Professeur au Laboratoire d'Ingénierie des Systèmes Biologiques et des Procédés de l’Université de Toulouse. - Monsieur Jamal Ouazzani, Docteur à l’Institut de Chimie des Substances Naturelles. Je tiens à remercier tout particulièrement Madame Anne Zaparucha, Professeur à l’Université d’Evry de m’avoir accueilli dans l’équipe et de m’avoir encadré tout au long de ma thèse. Sa disponibilité, sa pédagogie et son soutient (surtout à la fin de la thèse) m’ont permis de m’épanouir et d’enrichir pleinement mes connaissances. Je tiens à remercier Madame Carine Vaxelaire, Ingénieur Docteur de m’avoir co-encadré durant ma thèse, sa grande patience, sa gentillesse, sa disponibilité et ses conseils m’ont permis de progresser tout au long de ma thèse, tant sur le plan scientifique que humain. Je tiens aussi à remercier Pierre-Loïc Saaidi, Maitre de conférences, pour sa disponibilité et ses conseils qui m’ont été très précieux. Je remercie également Aurelie Fossey, technicienne supérieure, pour sa disponibilité et sa gentillesse. Je remercie aussi le Docteur Véronique de Berardinis avec qui j’ai eu la chance de collaborer au cours de ma thèse : sa disponibilité, sa gentillesse, et sa gaité ont permis une collaboration dans un bon état d’esprit et une bonne ambiance. Mes remerciements vont également aux autres personnes avec qui j’ai eu la chance de collaborer : - Alain Perret, pour ses conseils avisés sur les tests enzymatiques et le criblage à haut débit. 2 - Aline Mariage et Virginie Pellouin avec qui j’ai pris plaisir à intéragir. - Sabine Tricot et Ekatarina Dariy pour leur patience et leur pédagogie. Leurs conseils sur les spectromètres de masses m’ont été très utiles. - Jean Louis Petit et Adrien Debard pour leur disponibilité et leurs réponses sur les interrogations que j’avais sur les aspects du clonage et la production des enzymes. - Toute l’équipe de bioinformatique, et plus particulièrement Mark Stam. Je remercie également les thésards de l’institut avec qui j’ai eu la chance de partager mon quotidien et faire du sport. Je remercie Lucille Stuani, en 2ème année de thèse avec qui j’ai bien ri et qui m’a soutenu à la fin de la thèse (merci pour tes encouragements). Je remercie également Damien Baud, mon très cher collègue de bureau en 3ème année de thèse, avec qui j’ai partagé de bons moments (et quels moments parfois… !). Je tiens à remercier également les autres personnes avec qui j’ai pris plaisir à discuter dans les couloirs, en particulier Christine Pellé. Je me rappellerai de nos petites scénes de ménages qui ont été très drôles. Je remercie également Madeleine Bouzon pour avoir pris de son temps pour lire ma thèse, merci pour tes remarques et tes corrections. Enfin, je remercie mes proches et tous ceux qui m’ont soutenu, notamment ma sœur et ma conjointe qui ont contribué à la correction de ma thèse et m’ont soutenu moralement. 3 Sujet : nouvelles activités nitrilase : application à la synthèse de produits d’intérêt. Résumé Le travail décrit dans ce manuscrit porte sur la recherche de nouvelles activités enzymatiques nitrilases et plus particulierement α-aminonitrilases. Le but de ce travail était, dans un premier temps, de tester un grand nombre de nitrilases candidates sur un large panel de nitriles pour appréhender leurs activités et établir un catalogue de nouvelles activités nitrilases. Dans un second temps, la recherche de nouvelles activités α-aminonitrilase a été menée dans l’objectif de réaliser la synthèse d’α-aminoacides par dédoublement cinétique dynamique assistée par couplage avec une racemase. 163 protéines ont été sélectionnées par une approche génomique, et testées sous forme de lysat cellulaire à l’aide d’un test enzymatique couplé à la glutamate deshydrogénase sur 28 nitriles répartis en 7 familles (α-aminonitriles exclus). Le grand nombre de résultats positifs obtenus à l’issu du criblage nous a permis d’évaluer les activités nitrilases et d’établir un catalogue de ces activités et d’envisager l’utilisation de certaines de ces nouvelles nitrilases dans la synthèse de synthons chimiques. Après sélection de 38 nitrilases et vérification de leurs activités sur enzymes purifiées, 8 nitrilases ont été testées sur 5 nouveaux nitriles déclinés du 3-phénylpropanenitrile. Une synthèse énantiospécifique de β-ester acide précurseur possible de quinolines fonctionnalisées a été réalisée. La déclinaison des dinitriles a également été abordée, 12 nitrilases sélectionnées ont été testées sur 6 dinitriles. Une nouvelle nitrilase nous a permis de réaliser la désymétrisation de l’iminodiacétonitrile par monohydrolyse. Enfin, de nouvelles activités nitrilases ont été observées sur des cyclooxonitriles pour la formation de plateformes chirales fonctionnalisées. Selon une autre approche génomique, 425 nitrilases candidates ont été selectionnées et testées (en plus les 163 nitrilases du précédent criblage) sous forme de lysat cellulaire grâce à la mise au point d’un suivi de l’activité nitrilase par dérivatisation et analyse par LC-MS sur 6 α- aminonitriles précurseurs d’α-aminoacides naturels. Le criblage a permis de mettre en évidence de nouvelles activités α-aminonitrilases sur le phénylglycinonitrile et le 2-amino pentanenitrile. De nouveaux nitriles déclinés du phénylglycinonitrile, précurseurs d’α-aminoacides d’interêt pharmacologique, ont été téstés sur 4 α-aminonitrilases. MOTS CLÉS : nitrilase, α-aminonitrilase, dédoublement cinétique dynamique, LC-MS, criblage. 4 5 Sommaire Abréviations ............................................................................................................................. 10 Introduction générale ................................................................................................................ 13 CHAPITRE I : Présentation du sujet de recherche, état de l’art .............................................. 16 I- Les nitrilases. .................................................................................................................... 16 I-1 Présentation des nitrilases. .......................................................................................... 16 I-1.a Découverte et origines. ........................................................................................ 16 I-1.b Rôle biologique des nitrilases. ............................................................................. 17 I-1.c Classification. ...................................................................................................... 19 I-1.d Structure et mécanisme. ....................................................................................... 21 I-1.d.i Structure. ....................................................................................................... 21 I-1.d.ii Mécanisme. ................................................................................................... 23 I-2. Intérêt des nitrilases. .................................................................................................. 23 I-2.a Biodégradation des herbicides. ............................................................................ 24 I-2.b Traitement des déchets. ....................................................................................... 24 I-2.c Intérêt en synthèse organique. ............................................................................. 25 II- L’enjeu et les axes d’études............................................................................................. 27 III- Les nitrilases : état de l’art. ............................................................................................ 28 III-1 Nitrilases actives sur des substrats autres que des α-aminonitriles. ......................... 28 III-2 Nitrilases actives sur les α-aminonitriles. ................................................................ 36 IV- Les α-aminoacides. ........................................................................................................ 38 IV-1 Présentation. ............................................................................................................. 38 IV-2. Synthèse d’α-aminoacides. ..................................................................................... 40 IV-2.a Synthèse racémique........................................................................................... 40 IV-2.b Synthèse asymétrique. ...................................................................................... 42 IV-2.b.i Utilisation du pool chiral. ..........................................................................