TARCISO MAIA SANTOS
Eventos antigos de especiação híbrida no grupo bifoliado do gênero Cattleya Lindl. (Orchidaceae) inferidos a partir de uma filogenia baseada em 16 regiões de DNA nuclear e plastidial
Feira de Santana – Bahia
2011
Universidade Estadual de Feira De Santana
Departamento de Ciências Biológicas Programa de Pós-Graduação Em Botânica
Eventos antigos de especiação híbrida no grupo bifoliado do gênero Cattleya Lindl. (Orchidaceae) inferidos a partir de uma filogenia baseada em 16 regiões de DNA nuclear e plastidial
TARCISO MAIA SANTOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Botânica da Universidade Estadual de Feira de Santana como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Botânica.
ORIENTADOR: PROF. DR. CÁSSIO VAN DEN BERG (UEFS)
Feira de Santana – Bahia
2011
DEFESA DE DISSERTAÇÃO
CANDIDATO: Tarciso Maia Santos
TÍTULO DA DISSERTAÇÃO: “Eventos antigos de especiação híbrida no grupo bifoliado do gênero Cattleya Lindl. (Orchidaceae) inferidos a partir de uma filogenia baseada em 16 regiões de DNA nuclear e plastidial”.
BANCA EXAMINADORA
Feira de Santana – BA 2011
A minha família, meu amor, minha vida.
AGRADECIMENTOS
O presente estudo, o qual cita o meu nome como autor, é na realidade fruto do trabalho e cooperação de várias instituições e pessoas que contribuíram durante todas as etapas que fizeram com que eu chegasse até aqui. Espero não ser injusto e peço que para aqueles que por algum motivo eu esquecer, que me perdoi e entenda que os méritos de sua colaboração transcendem algumas palavras de agradecimento presente nesse papel. Então, queria agradecer a CAPES pela bolsa de mestrado concedida. Ao CNPq pelo financiamento do projeto, Sistemática, Filogenia e Variabilidade de Laeliinae (Orchidaceae): estudos integrados PII, coordenado pelo professor Dr. Cássio van den Berg (orientador); à Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS) por todas as oportunidades e possibilidades oferecidas desde a minha graduação até o presente mestrado.
Ao Programa de Pós-Graduação em Botânica da UEFS (PPGBot/UEFS) pelo apoio financeiro e logístico. Ao corpo de professores e funcionários que permitiram a promoção e desenvolvimento dos meus estudos. Em especial queria agradecer a Adriana Estrela e Gardênia por toda solicitude.
Ao Laboratório de Sistemática Molecular de Plantas (LAMOL), local onde passei mais de “dois terços” de minha vida acadêmica e realizei boa parte dos trabalhos, Ao Herbário da Universidade Estadual de Feira de Santana (HUEFS) por apresentar estrutura e condições adequadas para o desenvolvimento dos meus trabalhos. Aos amigos e funcionários do HUEFS. A todos os curadores que confiaram e emprestaram materiais para o estudo dos espécimes.
Aos amigos e colecionadores do Espírito Santo, Alex Zaslawski, Sávio Caliman e Edson Sperandio pela colaboração com amostras de folhas para o estudo do DNA de algumas espécies. Ao Jomar Gomes Jardim que contribuiu com coletas de algumas amostras do Rio Grande do Norte. Ao Marcos Paulo Morfim que contribuiu com coletas de algumas amostras do Rio Grande do Sul.
Ao parque Nacional da Chapada Diamantina, representado aqui na pessoa de Cezar Neubert Gonçalves, por ter nos recebido e dado o apoio necessário.
Ao meu orientador Cássio van den Berg, ao qual tenho uma parceria científica que a mais de cinco anos, pela colaboração, orientação e apoio no desenvolvimento desse estudo.
Aos meus grandes amigos Lamoianos, Ricardo (Doutorzão) (que sempre quebrou um galho, seja nos reagentes seja na informática, resumindo o cara é fera), ao recém chegado Dissinho. As meninas que com suas belezas iluminam e embeleza o laboratório, Adelina Vitória, Aline, Ana Luisa do Fabrício (Anéthe), Ana Luisa do Ricardo, Barbara, Cláudia (Claudéte), Elisa (Abre o olho), Élvia (Bem), Laura, Maria Cristina (Criss Roberts), Maria José (Alga Maria), Marla (Marloca), Patrycia Reijane, Priscila, Silvia (Advogada) e Tutti (quase sogra). A rapaziada do LAMOL, Alison (Farofa), Anderson (Mano Chico), Evandro, Fabrício da Anéthe, Floriano (Suassuna), Herlon, Marcos, Tiago Arruda e Tiago Pontes.
Aos amigos que passaram pelo LAMOL, Ciça, Déa, Luiz Menini, Milene, Paty Natividade, Sabrina (Sá), Silvana Ferreira e Silvana Helena.
Quero agradecer de forma especial a Paty Luz (Tia) e Paulo Ricardo (tô cansado) pela amizade e apoio no desenvolvimento dessa dissertação.
Aos amigos e colegas da pós-graduação, Jully, Catharina, Joseane, Jumara, Ricardo Landim, Ricardo Perdiz, Fábio, Paula, Cássia, Pétala, Grênivel, Michelle, Sâmia, Carla e Eloina.
Aos amigos e agregados do Residencial, Alécio (Brother Léco), Pedro (Lettle Peter), Diógenes (Papá), George, Jonaicon, Leilton, Angélica, Mariana, Maria, Eider e Lizandra que sempre colaboraram e torceram para esse fim.
Em especial a Deus e a minha família (meu pai Pascoal, minha mãe Maria e meus irmãos Tandson e Taylon) pelo apoio ao meu trabalho e compreensão em relação a minha ausência durante todo esse tempo.
Por fim, obrigado a todos e todas, vocês foram fundamentais para esse trabalho.
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS
LISTA DE TABELAS
LISTA DE FIGURAS
RESUMO
ABSTRACT
INTRODUÇÃO...... 1
METODOLOGIA...... 9
RESULTADOS...... 15
DISCUSSÃO...... 20
CONCLUSÃO...... 31
REFERÊNCIAS...... 33
ANEXOS...... 58
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Primers e programas utilizados para a amplificação das regiões utilizadas neste estudo...... 46
Tabela 2. Características das matrizes e das árvores mais parcimoniosas encontradas nas análises de Máxima Parcimônia individuais e combinadas e dos modelos evolutivos selecionados para inferência Bayesiana...... 48
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Árvores de consenso estrito resultantes das análises de Máxima Parcimônia individuais. A, agt1. B, accD. C, atpF-atpH. D, ITS. Os números acima dos ramos indicam os valores de suporte de bootstrap (%)...... 49
Figura 2. Árvores de consenso estrito resultantes das análises de Máxima Parcimônia individuais. E, ndhJ. F, matK. G, psbA-trnH. I, psbK-psbI. Os números acima dos ramos indicam os valores de suporte de bootstrap (%)...... 50
Figura 3. Árvores de consenso estrito resultantes das análises de Máxima Parcimônia individuais. I, rpl32-trnL. J, trnD-trnT. K, rpoB. L, rpoC1. Os números acima dos ramos indicam os valores de suporte de bootstrap (%)...... 51
Figura 4. Árvores de consenso estrito resultantes das análises de Máxima Parcimônia individuais. M, trnL-trnF. N, trnS-trnG. O, ycf1. Os números acima dos ramos indicam os valores de suporte de bootstrap (%)...... 52
Figura 5. Árvore de consenso de maioria das 18.000 árvores resultantes da análise Bayesiana, com modelo de evolução particionado da matriz Plastídeo (dados das 14 regiões de plastídeo). Os números acima dos ramos indicam: a esquerda os valores de bootstrap (%) oriundo das análises de máxima parcimônia e a direita os valores de ٭ probabilidade posterior (em escala de 0 - 1) gerados na inferência bayesiana. Os representam valores de bootstrap inferior a 50%. As letras representam os clados formados, A (Walkeriana), B (Intermedia), C (Falcata) e E (subclado Bicolor)...... 53
Figura 6. Árvore de consenso de maioria das 12.000 árvores resultantes da análise Bayesiana, com modelo de evolução particionado da matriz Combinada I (dados das 13 regiões de plastídeo, ITS e agt1). Os números acima dos ramos indicam: a esquerda os valores de bootstrap (%) oriundo das análises de máxima parcimônia e a direita os valores ٭ de probabilidade posterior (em escala de 0 - 1) gerados na inferência bayesiana. Os
representam valores de bootstrap inferior a 50%. As letras representam os clados formados, A (Walkeriana), B (Intermedia), C (Falcata), D (subclado Elongata) e E (subclado Bicolor)...... 54
Figura 7. Árvore de consenso de maioria das 14.000 árvores resultantes da análise Bayesiana, com modelo de evolução particionado da matriz Combinada II (dados das 14 regiões de plastídeo, agt1 e ITS) excluindo terminais que geravam incongruência. Os números acima dos ramos indicam: à esquerda os valores de suporte de bootstrap (%) e a direita os valores de probabilidade posterior da inferência bayesiana (em escala de 0 - 1). representam valores de bootstrap inferior a 50%. As letras representam os clados ٭ Os formados, A (Walkeriana), B (Intermedia), E (subclado Bicolor...... 55
Figura 8. Super-rede (supernetwork) das árvores de consenso da análise de máxima parcimônia com valores de bootstrap igual ou superior a 50% a partir dos dados combinados de plastídeo, de ITS e de agt1. O número mínimo de árvores foi igual a 2.....56
Figura 9. Rede de consenso não-enraizado (30% de limite para construção da rede) sumarizando as incongruências existentes entre as topologias dos três conjuntos de dados (14 regiões de plastídeo, ITS e agt1) usando árvores de consenso de maioria com > 50% de bootstrap. Na figura apenas a topologia é apresentada, pois os ramos não são escalonados com comprimento de ramo. As linhas em negrito representam as possíveis reticulações. A imagens referem-se as espécies ou represententes de clados envolvidos em possíveis processos de evolução reticulada...... 57
RESUMO As Cattleyas bifoliadas (Orchidaceae) compõem um grupo de 21 espécies que morfologicamente se distingue das outras espécies do gênero por apresentar duas ou raramente três folhas sobre o pseudobulbo. A maioria das espécies ocorre exclusivamente no Brasil, apenas três (C. violacea, C. nobilior e C. loddigesii) ocorrem também em outros países. Estudos prévios envolvendo espécies do grupo bifoliado geraram árvores filogenéticas com pouca resolução e sugeriram que a evolução de algumas espécies dentro do grupo pode estar associada a processos de reticulação. Nesse contexto, o presente estudo teve como objetivos, produzir uma hipótese filogenética para as relações entre as espécies do grupo bifoliado, bem como avaliar os possíveis processos de evolução reticulada no grupo. Para tanto, foram utilizadas 16 regiões, sendo 14 do genoma plastidial (accD, atpF-atpH, matK, ndhJ, psbK-psbI, psbA-trnH, ycf1, rpoB, rpoC1, rpl32-trnL, trnl- trnF (íntron, exon e espaçador intergênico), trnD-trnT e trnS-trnG) e duas do genoma nuclear (agt1 e ITS). As análises foram realizadas através do método da máxima parcimônia e da inferência bayesiana através de análises individuais e combinadas. Em níveis gerais, os dados apresentaram baixa variação nucleotídica, mas alguns clados foram reconhecidos. Foram verificadas incongruências entre os dados plastidiais e nucleares. Os conflitos no sinal filogenético foram tratados como indícios de evolução reticulada. As incongruências foram filtradas e um consenso de rede (consensus network) foi construído. O consenso de rede sugeriu que a origem de C. aclandiae, C. dormaniana, C. porphyroglossa, C. schilleriana e C. tigrina envolveram processos de reticulação entre linhagens ancestrais de algumas espécies do grupo bifoliado.
Palavras-chave: Cattleya, bifoliadas, evolução reticulada, consenso de redes.
ABSTRACT
[Phylogenetics of the bifoliate lineage of Cattleya Lindl. (Orchidaceae) based in 16 DNA regions with evidence for reticulate evolution] The bifoliate Cattleya (Orchidaceae) comprise a group of 21 species morphologically distinct from other species in the genus by presenting two or rarely three leaves per pseudobulb. Most species occur exclusively in Brazil, and only three (C. violacea, C. nobilior and C. loddigesii) occur in neighboring countries. Previous studies involving species in the bifoliate group generated phylogenetic trees with poor resolution and suggested that the evolution of some species within the group can be associated with processes of reticulation. In this context, this study aimed to produce a phylogenetic analysis for relationships among species of the bifoliate group, and assess the possible processes of reticulate evolution. For this, we produced sequence data from 16 DNA regions, being 14 from the plastidial genome (accD, atpF-atpH, matK, ndhJ, psbK-psbI, psbA-trnH, ycf1, rpoB, rpoC1, rpl32-trnL, trnL-trnF (intron, exon and intergenic spacer), trnD-trnT e trnS-trnG) and two from the nuclear genome (agt1 and ITS). Analyses were performed using methods of maximum parsimony and Bayesian inference in individual and combined datasets. The trees obtained indicated that most DNA regions showed low variation, but some clades could be recognized. We found incongruence between the plastid and nuclear data. The conflicts in phylogenetic signal were treated as evidence of reticulate evolution. The incongruences were filtered and a consensus network was built. The consensus network suggested that the origin of C. aclandiae, C. dormaniana, C. porphyroglossa, C. schilleriana and C. tigrina could incorporate processes of reticulation between ancestral lineages of some species within the bifoliate group.
Keywords: Cattleya, bifoliate, reticulate evolution, consensus network.
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. A família Orchidaceae Juss. e o gênero Cattleya Lindl. Inserida na ordem Asparagales Link (APG III, 2009), a família Orchidaceae com cerca de 24.500 espécies, é considerada a maior família de plantas (Dressler, 1993, 2005). Sua distribuição é cosmopolita, com exceção da região Antártica, entretanto são mais abundante e diversificada em florestas tropicais. No Brasil, as orquídeas estão distribuídas em praticamente todo o território, sendo registradas 2.419 espécies, das quais 1.620 são endêmicas (Barros et al., 2010).
No sistema de classificação mais recente para família Orchidaceae (Pridgeon et al., 1999, 2001, 2003, 2005), baseado principalmente em dados moleculares, são reconhecidas cinco subfamílias: Apostasioideae Rchb.f., Cypripedioideae Kostel., Orchidoideae Eaton, Vanilloideae Szlach. e Epidendroideae Lindl.. Esta última é considerada a maior subfamília de Orchidaceae, sendo subdividida em 16 tribos e 650 gêneros (Pridgeon et al., 2005, 2007). Suas espécies ocorrem principalmente nos trópicos e subtrópicos, mas também podem ser encontradas em clima temperado até o Circulo Ártico (Pridgeon et al., 2005).
A subtribo Laeliinae Benth., depois de Pleurothallidinae Lindl. ex G.Don e Oncidiinae Benth., ocupa o terceiro lugar em tamanho dentro da subfamília Epidendroideae. A subtribo é formada por cerca de 50 gêneros e 1.500 espécies, com distribuição estritamente neotropical (Dressler, 1993). Alguns de seus gêneros como Cattleya Lindl. e Rhyncholaelia Schltr. apresentam grande valor horticultural, outros como Encyclia Hook., Epidendrum L. e Prosthechea Knowles & Westc. são elementos comuns da florística dos neotrópicos. A grande diversidade morfológica presente na subtribo provavelmente deve estar relacionada a especialização em particular dos polinizadores bem como adaptações aos diferentes hábitats (van der Pijl & Dodson, 1966).
O estabelecimento do gênero Cattleya, se deu por John Lindley em 1821, na literatura citada na obra "Collectanea Botanica", ao descrever a espécie brasileira Cattleya labiata Lindl. importada por acaso do Brasil pelo colecionador William Cattley em 1818 (Braem, 1984). Entretanto, algumas espécies já tinham sido descritas, com outros nomes, em trabalhos anteriores, como na "Flora Fluminensis" de Vellozo em 1790 (publicada em 2
1829) e na obra "Nova Genera et Species Plantarum" publicada em 1815 (van den Berg, 1996).
O gênero se caracteriza morfologicamente por flores de tamanho grande e labelo não fundido à coluna (ver Anexos III e IV), características que o separam de Epidendrum, e coluna não protrusa dorsalmente, o que o separa de Encyclia (Withner, 1988). Laelia Lindl. foi durante muito tempo considerado o gênero mais próximo a Cattleya, dentro da subtribo Laeliinae, sendo que alguns autores como Braem (1984), defendiam que a principal diferença de Laelia e Cattleya seria a presença de oito polínias no primeiro e quatro no último. Embora Cattleya e Laelia fossem considerados grupos próximos, estudos de filogenia molecular com dados de sequências de DNA (van den Berg et al., 2000, 2009) mostraram que Brassavola R.Br. seria o gênero mais próximo de Cattleya. Além disso, os dados de sequência de DNA não evidenciaram uma proximidade entre as espécies brasileiras de Laelia com as espécies que ocorre no México, nem com a espécie tipo do gênero. Como solução, foram propostas grandes alterações na circunscrição de Laelia, e as espécies brasileiras foram, na sua totalidade, transferidas para o gênero Sophronitis Lindl. (van den Berg et al., 2000) e combinadas por van den Berg & Chase (2000). Recentemente, estudos realizados com oito regiões (ITS, matK, trnL-F (intron e espaçador), trnK, rps16, atpB-rbcL e psbA-trnH), mostraram que as espécies do gênero Sophronitis (anteriormente classificadas como Laelia “brasileiras”) se agruparam dentro do gênero Cattleya (van den Berg et al., 2009). Buscando acomodar essas informações, as espécies desse grupo foram transferidas para o gênero Cattleya (van den Berg, 2008), o qual juntamente com Brassavola, Rhyncholaelia e Guarianthe Dressler & W.E.Higgins formam o clado da aliança Cattleya, com cerca de 135 espécies.
Apesar das diferentes classificações propostas ao longo do tempo, tanto para as espécies brasileiras de Cattleya (Cogniaux, 1898; Pabst & Dungs, 1975; Fowlie, 1977) quanto para o gênero como um todo (Rolfe, 1895; Withner, 1988; van den Berg et al., 2000; van den Berg, 2008), vários são os problemas taxônomicos no gênero. Além disso, a transferência das espécies de Sophronitis (antigas Laelia brasileiras, van den Berg, 2008) para o gênero fez crescer o número de espécies e também a sua heterogeneidade morfológica. Contudo, morfologicamente dois grandes grupos podem ser detectados: um formado pelas espécies unifoliadas (apresentam apenas uma folha sobre o pseudobulbo) e 3
outro formado pelas espécies bifoliadas (apresentam apenas duas ou raramente três folha sobre o pseudobulbo).
Excluindo as espécies do grupo unifoliado, que são predominantemente andinas (com seis espécies no Brasil), e as espécies vindas do gênero Sophronitis, ainda sobram cerca de 21 espécies as quais compõem o grupo bifoliado. Destas, apenas C. violacea (Kunth) Rolfe, C. nobilior Rchb.f. e C. loddigesii Lindl. ocorrem também em outros países e as restantes são endêmicas do Brasil. De modo geral, o grupo bifoliado não é morfologicamente homogêneo, e vários são os questionamentos taxonômicos encontrados em suas relações internas. Cattley dormaniana (Rchb.f.) Rchb.f. por exemplo, difere das demais espécies do grupo por apresentar, as vezes, oito polínias (sendo quatro dessas não funcionais); C. walkeriana Gardner e C. nobilior diferem por serem heteromodulares, produzindo flores laterais, sobre pseudobulbos especiais, desprovidos de folhas, o que dá a impressão de que as flores saem do rizoma (Braem, 1984). Além disso, a maioria dos indivíduos de C. walkeriana apresenta apenas uma folha sobre o pseudobulbo. Braem (1984) argumentou que alguns pares de espécies apresentam um status específico duvidoso, como C. harrisoniana Batem. ex Lindl. e C. loddigesii. Situação semelhante ocorria entre outras espécies do grupo bifoliado como C. nobilior e C. walkeriana, C. granulosa Lindl. e C. schofieldiana Rchb.f.. Apesar de haver muita semelhança entre essas espécies de Cattleya, os estudos baseados em dados morfológicos (van den Berg, 1996) e moleculares (Santos et al., não publicado no caso de C. loddigesii e C. harrisoniana e Jin et al., (2004) no caso de C. nobilior e C. walkeriana) indicaram a manutenção do status específicos das mesmas.
1.2. Biogeografia do grupo bifoliado
Segundo van den Berg (1996), o gênero Cattleya se adéqua muito bem à teoria de refúgios florestais do Pleistoceno (Brown, 1979, 1987), e parcialmente à teoria biogeográfica de Fowlie (1977). Segundo a teoria de Fowlie (1977), o centro de origem das Cattleya bifoliadas seria na região costeira, entre o Litoral Norte Paulista e Sul do Rio de Janeiro, e também o Vale do Paraíba e regiões montanhosas da Serra da Mantiqueira e Serra dos Órgãos. Durante a evolução do grupo, teria ocorrido uma grande dispersão seguida de eventos de vicariância e especiação durante as glaciações do Quaternário recente. Durante o glacial máxima, haveria uma grande área de habitats de brejos 4
litorâneos desde a região de Boracéia, São Paulo, passando pelo Rio de Janeiro, Espírito Santo e Bahia, penetrando pelos vales do Rio São Francisco e Rio Doce. Nestas áreas teria havido uma dispersão massiva de C. bicolor Lindl. e outras espécies bifoliadas, seguida de uma fragmentação diante do retrocesso das geleiras. Para van den Berg (1996), as áreas que são hoje ocupadas por C. bicolor seriam refúgios florestais do Pleistoceno, entretanto as ligações através do Vale do São Francisco e Rio Doce são pouco prováveis de terem existido. Neste caso a melhor hipótese seria uma dispersão anterior à glaciação, seguida de extinção nas áreas desfavoráveis.
1.3. Incongruências e Evolução Reticulada
Ao longo dos últimos anos a sistemática molecular vem experimentando um crescente aumento no número de regiões de DNA usadas para resolver as relações evolutivas (Degnan & Rosenberg, 2009). Entretanto, apesar de todo esforço na coleta de dados, muitos estudos em plantas apresentam topologias com baixa resolução nos nós, principalmente em estudos de espécies que divergiram recentemente ou de táxons intraespecíficos (Crawforf & Mort, 2004; Mort et al., 2007). Para Rokas & Carrol (2005) a falta de resolução não está necessariamente relacionada à pequena amostragem de regiões, e sim à combinação entre o tempo curto de cladogênese e a grande quantidade de homoplasias. Visando uma melhor resolução nas topologias, vários estudos em plantas, vêm utilizando uma combinação de dados do genoma plastidial (herança uniparental) e do genoma nuclear (herança biparental). Em relação aos dados do genoma plastidial, a maioria dos estudos utiliza sequências de DNA não codificantes, as quais pressupõem apresentarem menos restrições funcionais que regiões codificantes e, portanto, podem apresentar maiores níveis de variação (Gielly & Taberlet, 1994; Shaw et al., 2005, 2007). Nas revisões feitas por Shaw et al. (2005, 2007) sobre a utilização de regiões do genoma plastidial, foi detectado que os espaçadores intergênicos apresentavam maior nível de variação e poderiam ser utilizados para estudo entre espécies próximas.
Em relação ao genoma nuclear (nDNA), a maioria dos estudos filogenéticos sempre focaram na utilização da porção ribossomal (rnDNA) em específico os espaçadores transcritos internos (ITS) e recentemente os espaçadores transcritos externos (ETS) (Colonge et al., 2009). Apesar das críticas feitas aos dados de ITS (Alvarez & Wendel, 2003), o alto nível de variação apresentado pela região (por exemplo, na família 5
Orchidaceae (Douzery et al., 1999; Smidt, 2007; Monteiro, 2007), o tipo de herança e a presença de múltiplas cópias facilitando a amplificação o tornam uma valiosa região para estudos filogenético principalmente em estudos de híbridos (van den Hof et al., 2008; Alvarez & Wendel, 2003; Feliner & Rossello, 2007). Um dos grandes problemas referentes a essa região é a presença de cópias parálogas. Contudo, esse não parece ser um grande problema em Orchidaceae, exceto em Angraecinae (Carlsward et al., 2006). Atualmente devido ao maiores estudos no genoma nuclear, outras porções vêm sendo cada vez mais estudas e utilizadas nas reconstruções filogenéticas em plantas, principalmente aos genes nucleares de baixas cópias LCNG (do inglês, Low-Copy Nuclear Genes) (Small et al., 2004; Hughes et al., 2006; Wu et al., 2006; Aguileta et al., 2008; Li, et al., 2008; Colonge et al., 2009; Górniak et al., 2010). Dentre as vantagens dessas regiões, pode-se citar: a rápida taxa de evolução quando comparado com genomas das organelas, presença de múltiplos loci independentes (não ligados) e herança biparental. Assim como o ITS, os LCNG apresentam algumas desvantagens, como a complexa arquitetura genética e dinâmica evolutiva, bem como dificuldade de isolamento e identificação de genes ortológos (Small et al., 2004). Dentro dessa perspectiva, vário autores vêm desenvolvendo primers para essas regiões, como Wu et al. (2006) e Li et al. (2008) (que desenvolveram o conjunto de genes ortológos conservados COS - do inglês, Conserved Ortholog Set) e Ford et al., (2006) que desenvolveram primers para a região PgiC (que codifica uma enzima citoplasmática - citosolic phosphoglucose isomerase).
Análises filogenéticas a partir da combinação de dados do genoma plastidial e nuclear tem sido muito frequentes nos estudos, entretanto muitas incongruências tem sido verificas entre esses conjuntos de dados (Topik et al., 2005; Fehrer et al., 2007; Fan et al., 2009; Spalik et al., 2009; Kelly et al., 2010; Pelser et al., 2010). Estudos revelam que mesmo dentro de um mesmo genoma, geralmente, quanto mais genes são amostrados mais incongruência entre as árvores dos genes são encontradas (Rokas et al., 2003). van der Niet & Linder (2008) argumentaram que as incongruências encontradas entre os conjuntos de dados podem ser enquadradas em duas classes. A primeira classe, refere-se a fatores não biológicos que podem estar na gênese das incongruências, como a amostragem insuficiente de táxons (Stockley et al., 2005) ou a atração de ramos logos na análise de máxima parcimônia (Felsenstein, 1978; Kennedy et al., 2005). A segunda classe corresponde a eventos que podem gerar relações filogenéticas diferentes entre os genes devido a histórias 6
filogenéticas diferentes ocorridas com esses genes (Maddison, 1997). Diversos processos biológicos podem estar por trás desse tipo de incongruência, como conflito entre cópias ortológas e paralógas (Vanderpoorten et al., 2004), lineage sorting (Doyle et al., 2004), transferência horizontal de genes (Won & Renner, 2003) e hibridização (Rieseberg et al., 1996a,b; Sang & Zhong, 2000; Heuertz et al., 2006; Joly et al., 2009). van der Niet & Linder (2008) também comentam que em muitos estudos os clados incongruentes são incluídos na análise combinada sem que seja dado um atenção especial as incongruências ou são ignorados e retirados das análises, e que uma análise mais detalhada dessas incongruências pode contribuir para uma melhora na resolução da árvore de espécies. Para Fehrer et al. (2007) o processo de hibridação interespecífica representa um dos maiores fatores responsável na geração de incongruência entre loci. Entretanto, distinguir hibridação de lineage sorting a partir de incongruência entre conjuntos de dados não é tarefa fácil (Pelser et al., 2010). Em relação à lineage sorting, Moore (1995) argumentou que os dados de plastídeo são menos suscetíveis a esse processo, devido à rápida coalescência.
A formação e especiação de híbridos naturais é um mecanismo muito comum em plantas (Hegarty & Hiscock, 2005). Estima-se que 25% das espécies de plantas vasculares formem híbridos com outras espécies (Mallet, 2005) e talvez 11% das espécies de plantas tenham surgido através de hibridação (Ellstrand et al., 1996; Russell et al., 2010). O crescente avanço nas técnicas moleculares tem permitido entender melhor os processos decorrentes da hibridação, como a mudança no padrão de expressão gênica e alterações na organização cromossomal (Baack & Rieseberg, 2007). Estudos revelam que o número de híbridos diplóides identificados é muito menor que o número de espécies híbridas alopoliplóides (Linder & Rieseberg, 2004; Sang et al., 2004). Entretanto, essa diferença pare estar mais relacionada a maior dificuldade na detecção da hibridação homoplóide (Seehausen, 2004; Mallet, 2005). Além disso, o fluxo gênico entre espécies via introgressão é um evento muito comum, principalmente em genomas de espécies permeáveis a alelos de outras espécies proximamente relacionadas (Baack & Rieseberg, 2007; Lexer et al., 2009; Russell et al., 2010). De modo geral, a hibridação entre espécies geram nas análises combinadas conflito no sinal filogenético. Contudo, a percepção desses conflitos é de suma importância na construção das árvores de espécies e devem ser representados como eventos de reticulação (Linder & Rieseberg, 2004). 7
Para Linder & Riesenberg (2004) existem pelo menos três linhas de evidências empregadas para detectar hibridação. A primeira linha assume que, na ausência de outras causas que geram incongruência entre os conjuntos de dados, as incongruências representam eventos de reticulação (Fehrer et al., 2007; van der Niet & Linder, 2008). A segunda linha baseia-se na criação de sequências quiméricas (oriundas da combinação de múltiplos loci independentes de ambas as espécies suspeitas de hibridação) e utilização na análise na busca de um sinal filogenético que evidencie uma história evolutiva envolvendo hibridação (Huson, 1998; Kelly et al., 2010). Uma terceira linha baseia-se na busca de associação entre desequilíbrio de ligação e hibridação. Essa linha assume que os loci estreitamente ligados em uma determinada espécie híbrida são geneticamente mais propensos a vir de uma mesma espécie progenitora, e a gerarem um desequilíbrio de ligação (Doebley et al., 1984; Rieseberg et al., 1996a, 2003).
Nas análises envolvendo incongruências, os conflitos no sinal filogenético são interpretados como eventos de hibridação e são representados como redes de relações filogenéticas. Huson & Bryant (2006) comentam que existe certa confusão na literatura sobre o conceito de redes filogenéticas. Dentre os conceitos sugeridos por esses autores, as redes reticuladas representam uma explicita história evolutiva decorrente de eventos de reticulação, como a hibridação e recombinação. Nessas redes os nós internos representam espécies ancestrais e os nós com mais de dois “pais” correspondem aos eventos de reticulação (Huson & Bryant, 2006; Huson et al., 2011). Esses mesmos autores tem ao longo dos últimos anos implementado vários algoritmos na tentativa de explicitar uma melhor hipótese de reticulação. Contudo os estudos de hibridação a partir de conflitos no sinal filogenético estão em fases iniciais.
A família Orchidaceae, em especial, é marcada pela presença de grande quantidade de híbridos artificiais e naturais, tanto em nível intergenérico como interespecífico (Pabst & Dungs, 1975, 1977; Braem, 1995; Borba & Semir, 1998; Nielsen, 2000; Klier et al. 1991, Barkman & Simpson, 2002; Azevedo et al., 2006). Assim como na família, o gênero Cattleya é marcado pela presença de grande quantidade de híbridos naturais. Fowlie (1977) e Pabst & Dungs (1975) citam pelo menos 24 híbridos naturais para o grupo bifoliado de Cattleya, entretanto esse número provavelmente é muito maior. Braem (1995), por exemplo, descreveu mais um híbrido natural dentro do grupo, Cattleya × tenuata V.P.Castro & Campacci ex G.J.Braem, resultante do cruzamento de C. elongata 8
Barb.Rodr. com C. tenuis Campacci & Vedovello. Alguns híbridos naturais (por exemplo, C. × dolosa Rchb.f. (C. loddigesii × C. walkeriana), C. × elegans C.Morren (C. tigrina A.Rich. × C. purpurata (Lindl. & Paxton) van den Berg) e C. × albanensis (C. warneri T.Moore × C. grandis (Lindl. & Paxton) A.A.Chadwick) chegam a formar verdadeiros enxames de indivíduos, as vezes compondo populações simpátricas em relação as populações das espécies parentais. A presença de um número cromossômico pouco variável (2n = 40) dentro do gênero Cattleya bem como as semelhanças morfológicas e de polinizadores pode ter contribuído para possíveis processos de hibridação homoplóides.
Estudos anteriores envolvendo espécies do grupo bifoliado usando dados apenas de ITS e de plastídeos apresentaram baixo suporte para a maioria dos clados formados, e sugeriram a adição de mais regiões do genoma plastidial e/ou a utilização de genes nucleares de copia simples para melhorar a compreensão sobre a evolução do grupo (van den Berg et al., 2000, 2009). Além disso, os estudos sugerem que a evolução de algumas espécies dentro do gênero Cattleya pode estar associada a processos de reticulação (van den Berg et al., 2000, 2009). Diante disso, o presente estudo teve como objetivos: (1) produzir uma hipótese filogenética para as relações entre as espécies dentro do grupo bifoliado do gênero Cattleya, (2) identificar, a parir das incongruências geradas entre os diferentes conjuntos de dados, espécies com possível origem envolvendo evolução reticulada e (3) testar a variabilidade de novas regiões plastidiais e nucleares para a subtribo Laeliinae. 9
2. METODOLOGIA
2.1. Materiais de plantas
O estudo molecular para o grupo bifoliado de Cattleya foi conduzido a partir de sequências de DNA. Na análise filogenética foi utilizado um indivíduo de cada espécie, ou mais indivíduos em espécies que apresentam ampla distribuição geográfica ou variedades geográficas. O DNA de todas as espécies encontra-se armazenado em Biofreezer a - 85 °C no Laboratório de Sistemática Molecular de Plantas (LAMOL) da UEFS.
Na reconstrução filogenética, a definição do grupo interno e externo foi baseada nos resultados dos trabalhos anteriores de filogenia da subtribo Laeliinae (van den Berg et al., 2000, 2005, 2009). O grupo interno foi composto pelas 21 espécies do grupo “Bifoliado” (ver Anexo I e II), mais algumas espécies do grupo “Unifoliado”: C. labiata Lindl., C. lawrenceana Rchb.f., C. lueddemanniana Rchb.f., C. luteola Lindl., C. wallisii Linden ex. Rchb.f. e alguns representantes do grupo das espécies transferidas do gênero Sophronitis para Cattleya (as antigas Laelia brasileiras): C. lundii (Rchb.f. & Warm) van den Berg, C. pfisteri (Pabst & Senghas) van den Berg, C. purpurata (Lindl. & Paxton) van den Berg e C. sincorana (Schltr.) van den Berg. Para compor o grupo externo, foram usadas duas espécies do gênero Brassavola (B. cucullata (L.) R.Br. e B. tuberculata Hook.) e duas espécies do gênero Rhyncholaelia (R. digbyana (Lindl.) Schltr. e R. glauca (Lindl.) Schltr.).
2.2. Extração de DNA
O DNA de cada amostra foi extraído utilizando uma modificação do protocolo 2x CTAB de Doyle & Doyle (1987), adicionando um passo inicial de maceração em 2ml de STE (NaCl 5M, Tris-HCl 1M, EDTA 0,5M, pH 8.0) gelado, seguindo de centrifugação, e depois tampão CTAB 2% (brometo de cetilmetil amônio) e purificação com clorofórmio/álcool isoamílico (24:1) como no protocolo original, adaptado para microtubos. A limpeza do pellet foi realizada duas vezes com álcool 70% e posterior suspensão em tampão TE. A concentração do DNA extraído foi estimada no gel de agarose a 1%, a partir do padrão de banda do marcador Lambda – Hind III, usando o programa Kodak 1D 3.6.
10
2.3. Obtenção e análise das sequências de DNA
Inicialmente foram feitas buscas no GenBank do NCBI (National Center for Biotechnology Information) e obtidas todas sequências de estudos prévios para as espécies em estudo (ver Anexo I e II).
Objetivando encontrar regiões com níveis consideráveis de variação foram testadas diversas regiões tanto de cpDNA quanto rnDNA e regiões nucleares de cópia única. A maioria das regiões plastidiais testadas são regiões não codificantes (introns ou espaçadores intergênicos) relatados por Shaw et al. (2005, 2007) e Hollingsworth et al. (2009) como variáveis e indicadas para estudos de baixo nível taxonômico. Além dessas regiões plastidiais foi usada a região ycf1 (hypothetical chloroplast open reading frame 1), sugerida por Neubig et al. (2009) como uma região variável e informativa para estudos no nível de espécies dentro da família Orchidaceae. Em relação às regiões nucleares, foram testadas as regiões sugeridas por Li et al. (2008). Destas, apenas a região amplificada com o primer Agt1 (gene da enzima alanina-glyoxylato aminotransferase) apresentou sucesso tanto na amplificação como no sequenciamento e, portanto, foi utilizada nesse estudo. Mais três regiões nucleares também foram testadas, Rpb2 (Ronçal et al., 2005), PgiC (Ford et al., 2006) e o espaçador externo transcrito ETS (com o primer ETS-Orchid, Monteiro, 2007, e 18S-IGS, Baldwin & Markos, 1998).
As reações em cadeia da DNA polimerase (PCR), foram executadas em termociclador (GeneAmp. PCR System 9700) utilizando os pares de oligonucleotídeos iniciadores (primers) específicos para cada região (Tabela 1). As reações foram realizadas em um volume total de 15-25 μL, contendo os seguintes componentes: 1× do tampão (100 mM Tris-HCl), 2,5 mM MgCl2, 0.2 mM dNTP, 7.5 pmol de cada oligunucleotídeo iniciador (primer), 2,5 unidades de Taq polimerase de DNA (Phoneutria) e aproximadamente 1 ng de DNA genômico. Em amostras que apresentaram dificuldade na amplificação foram utilizados aditivos como 1M de Betaína, 1µg de BSA e 2% de DMSO. Para as regiões Atg1 e rpl32 foi utilizado o Kit de amplificação TopTaq (Quiagen). Os parâmetros das reações de amplificação para cada região estão descritos na Tabela 1.
Os produtos da reação de PCR foram quantificados através de eletroforese em gel de agarose a 1% de concentração com tampão Sódio Borato (Brody & Kern, 2004), por 60min à 100V, 62W, 60ma em fonte eetroforética (Consort-E-832). O gel foi corado com 11
brometo de etídio (5μg/mL) e visualizado em um transluminador de luz ultravioleta (UV). As concentrações (em ng) dos produtos da PCR foram estimadas pela comparação da intensidade das bandas produzidas na PCR com a intensidade das bandas do marcador Lambda – Hind III, através do programa Kodak 1D 3.6.
Todos os produtos da PCR foi purificados por precipitação com Polietileno Glicol (PEG 8000 10% e NaCl 2,5M) e ressuspendidos em mesmo volume da PCR com água ultrapura.
As reações de sequenciamento ocorreram num volume final de 10µl, com 1,5µl (tampão 1,0 µl e 0,5µl Big Dye) do Kit Big Dye terminator versão 3.1 (Applied Biosystems), 2,5 pmol de primer e aproximadamente 5ng de DNA para cada 100pb de produto da PCR. As amostras foram sequenciadas em ambas as direções no sequenciador automático 3130XL DNA Analyzer (Applied Biosystems) no LAMOL.
2.4. Edição das sequências e alinhamento das matrizes
Os eletroferogramas obtidos foram editados através do programa PREGAP-4 e GAP4 do Pacote Staden (Staden et al., 1998) e as sequências obtidas foram submetidas à pesquisa no BLASTn do NCBI. As sequências editadas foram alinhadas de forma automática no programa Muscle versão 3.6 (Edgar, 2004). O resultado do alinhamento foi manualmente revisado no programa Mesquite2 (Maddison & Maddison, 2010), seguindo as diretrizes de Kelchner (2000). Regiões ambíguas foram excluídas da análise e os indels foram codificados pelo método de Codificação Simples (Simmons & Ochoterena, 2000) no programa SeqState versão 1.4.1 (Müller, 2005).
2.5. Análise filogenética dos dados
A construção das árvores de espécies seguiu o protocolo estabelecido por van der Niet & Linder (2008) que consiste na identificação da incongruência, teste de sua significância, identificação das causas de incongruência e reconstrução da árvore de espécies. A identificação das incongruências foi realizada a partir do Testes de Homogeneidade de Partição (THP) (Farris et al., 1995). Os testes foram conduzidos no PAUP* (Phylogenetic analysis using parsimony) versão 4.0b10a (Swofford, 2002) através do critério de Máxima Parcimônia (MP), utilizando busca heurística com 1000 réplicas, 5 adições randômicas de táxon, rearranjo das árvores com algoritmo TBR (tree-bisection 12
and reconnection) e salvando 15 árvores a cada replicação. Os testes de congruência foram feitos inicialmente entre as regiões de cada genoma par a par (plastidial e nuclear) e depois entre os conjuntos de dados dos dois genomas. As matrizes de nucleotídeo e a matriz de gaps de uma mesma região foram tratadas como conjunto de dados independentes. As análises de THP processaram-se com a inclusão progressiva de uma região e avaliação da congruência desta com os demais conjuntos de dados já analisados. Caso não fosse detectada incongruência, um novo conjunto de dados era adicionado, se o contrário fosse observado, o conjunto de dados incongruente era retirado da análise e esta seguia com a adição de um novo conjunto de dados. Foram feitas várias réplicas do teste começando com a adição inicial com regiões diferentes para evitar víeis de confundimento.
As análises de MP foram realizadas individualmente para cada conjunto de dados e de maneira combinada. As análises combinadas foram assim denominadas: análise Plastídeo (combinada com todos os dados de plastídeo), análise Combinada I (composta por todos os dados plastidiais mais os dados de ITS e agt1) e análise Combinada II conduzida com as mesmas regiões da análise Combinada I, excluindo apenas as espécies indicada indiretamente no teste de THP como responsáveis pelas incongruências entre as topologias (C. aclandiae Lindl., C. dormaniana, C. porphyroglossa Linden & Rchb.f., C. schilleriana Rchb.f. e C. tigrina). Análises de MP foram conduzidas no PAUP a partir de buscas heurísticas, através da parcimônia de Fitch (1971), com 3.000 replicações, adição aleatória de táxons e rearranjos das árvores com algoritmo TBR. Foram salvas 15 árvores em cada pseudo-replicação, evitando assim a buscas extensivas em ilhas subótimas. Uma segunda análise foi realizada com buscas heurísticas, através da parcimônia de Fitch, sem limites de replicação, algoritmo TBR, tendo como ponto de partida o conjunto de árvores produzidas na primeira análise. A segunda análise de cada conjunto de dados foi finalizada quando o conjunto de árvores encontradas somava 30.000 (trinta mil) árvores. Nas análises, os caracteres receberam pesos iguais, e os estados dos caracteres foram especificados como não ordenados. A otimização dos comprimentos de ramos foi do tipo ACCTRAN (Accelerated transformation). O suporte dos clados foi avaliado através de bootstrap não-paramétrico dos caracteres (Felsenstein, 1985), por meio de busca heurística, com 1.000 replicações, adição simples de táxons e rearranjos através do algoritmo TBR. Foram salvas 15 árvores a cada pseudo-replicação evitando-se assim a buscas em ilhas subótimas. O suporte do bootstrap, porcentagem de bootstrap (PB), foi 13
interpretado como: de 50-70 baixo, 71-85 moderado e forte quando superior a 85 (Kress et al., 2002).
Os modelos evolutivos para a Inferência Bayesiana (IB) foram obtidos através do Critério de Informação de Akaike (AIC) no programa MrModeltest 2.3 (Nylander, 2008), individualmente para cada região. Para os indels foi utilizado o modelo coding=all oferecidos pelo MrBayes 3.1.2 (Ronquist & Huelsenbeck, 2003). Nas análises combinadas, os dados de cada região foram particionados e a cada um deles aplicado o modelo evolutivo mais adequado. Eles foram analisados em conjunto, mas desligados entre si, de modo que os parâmetros foram estabelecidos individualmente para cada uma das regiões. As análises foram conduzidas no programa Mrbayes com 18.000.000 gerações, salvando uma árvore a cada 1.000 gerações (evitando assim autocorrelação entre as árvores produzidas), em duas corridas simultâneas, cada qual com três cadeias quentes e uma fria. Em cada análise, tentou-se utilizar apenas as árvores geradas após a convergência entre as corridas (desvio padrão das freqüências entre as corridas < 0,01). As árvores selecionadas foram utilizadas para construir um consenso de maioria no PAUP*, de modo que as porcentagens de cada clado representam sua probabilidade posterior (PP).
Vários estudos (Cummings et al., 2003; Simmons et al., 2004) tem mostrado que os valores de PP são inflados e que devem ser interpretados com cautela. Diante de tais achados seguimos a recomendações de Erixon et al. (2003) e consideraremos clados bem sustentados aqueles que apresentarem valores de PP igual ou superior a 95%. O qual corresponde a valores de bootstrap na parcimônia ao redor de 70% (Hillis & Bull, 1993; Alfaro et al., 2003).
Os mesmos conjuntos de dados submetidos a análise de MP foram também submetidas a análises a partir do método de distância, utilizando o algoritmo de Neighbor- joining (NJ) (Saitou & Nei, 1987) a partir da distância de Jukes e Cantor (JC). O objetivo principal foi checar a existência de atração de ramos-longos na análise de MP através da comparação das topologias mais parcimoniosas com a árvore gerada na análise de NJ.
2.6. Evolução Reticulada
Os conflitos no sinal filogenético nas diferentes topologias (incongruências) foram filtrados e graficamente representados pelo filtro super-rede (supernetwork) (Splitstree 4.10; Huson & Bryant, 2006). A rede de consenso (consensus network) foi construída no 14
programa Dendroscope 2.3 (Huson et al., 2007) a partir do algoritmo de galhas (galled network algorithm) o qual infere cada evento de reticulação independente de todos os outros.
O consenso de galhas network foi construído a partir das três árvores geradas nas análises de bootstrap (MP) realizadas separadamente para a matriz Plastídeo, para os dados de ITS e para os dados de agt1. Foram utilizadas como árvores de entrada no programa Dendroscope, o consenso do bootstrap de cada um dos conjuntos de dados com valores de sustentação igual ou superior a 50%. Foram conduzidas análises adotando como limite de sustentação da possibilidade de reticulação 20 e 30%. Para as diferenças em amostragem de táxons nos diferentes conjuntos de dados, devido a problemas na amplificação e sequenciamento, foi utilizada a correção a partir do algoritmo Z-closure, implementado dentro do Dendroscope, o qual considera aos táxons ausentes como dados faltantes (Huson et al., 2004). 15
3. RESULTADOS
3.1. Características gerais do conjunto de dados
O presente estudo utilizou um total de 513 sequências de DNA. Destas, 230 foram baixadas do GenBenk e 283 foram geradas nesse estudo, das quais 109 são inéditas para o gênero Cattleya (Anexos I e II). As 283 sequências foram obtidas a partir de onze regiões plastidiais (atpF-atpH, ndhJ, psbK-psbI, ycf1, rpoB, rpoC1, rpl32-trnL, trnL-trnF (íntron, exon e espaçador intergênico, considerando aqui o íntron e o espaçador intergênico como duas regiões), trnD-trnT e trnS-trnG) e duas regiões nucleares (agt1 e ITS) (Tabela 1). Entre as dezesseis regiões utilizadas, oito continham indels (Tabela 2). Contudo, apenas os indels de quatro regiões (atpF-atpH, rpl32-trnL, trnL-trnF e ITS) apresentaram sinal filogenético e, portanto foram utilizados nas análises. A região ETS apresentou boa amplificação para cinco espécies e apenas três destas apresentaram bom sequenciamento. Diante deste resultado, a região foi excluída das análises. A região Rpb2 apresentou boa amplificação para 80% das espécies utilizadas no estudo. Entretanto, as amostras apresentaram sérios problemas no sequenciamento, muitos desses devido a existência de cópias paralógas. Frente ao limitado tempo existente para a execução do projeto, optou-se por não clonar a região e encontrar cópias ortológas, portanto, a mesma foi excluída das análises. As análises Plastídeo e Combinada I incluíram 44 terminais cada uma e a análise Combinada II incluiu 39 terminais (Tabela 2).
A matriz completa (Combinada I) com todos os dados das 16 regiões utilizadas totalizou 11.506 caracteres, sendo 11.308 caracteres referentes aos nucleotídeos e 119 caracteres referentes aos indels. Dos 11.506 caracteres, 5,23% são variáveis, e 3,43% são informativos para a parcimônia. Os dados referentes ao tamanho das matrizes alinhadas, número de terminais, número de sítios variáveis, número de passos evolutivos das árvores geradas, número de árvores salvas, Índices de Retenção, Consistência bem como os modelos evolutivos selecionados para a análise bayesiana são apresentados na Tabela 2.
As corridas em paralelo na IB não alcançaram a estabilidade (média de desvio < 0,001) em nenhuma análise. Mesmo depois de correr 22.000.000 de gerações para os dados de Plastídeo e 20.000.000 de gerações para os dados da matriz Combinada I as médias de desvio entre as duas corridas ainda eram 0,020895 e 0,022649, respectivamente. 16
Entretanto, esses valores de desvio entre as corridas já tinham sido alcançados e permaneciam mais ou menos constantes desde as 11.000.000 de gerações nos dados Plastídeo e 13.000.000 de gerações nos dados Combinada I. Objetivando retirar o máximo de árvores discrepantes, e levando em consideração que foram salvas uma árvore a cada 1.000 gerações, foram excluídas das análises as primeiras 13.000 árvores de cada corrida na análise Plastídeo e 14.000 de cada corrida na análise Combinada I. Por fim, ao juntar as árvores das duas corridas dentro de cada análise, os conjuntos finais foram compostos por 18.000 árvores na análise Plastídeo e 12.000 árvores na análise Combinada I. De maneira similar aos resultados anteriores, a análise Combinada II não alcançou a estabilidade das corridas. Entretanto, a média de desvio entre as duas corridas ficou constante (0,012345) a partir de 13.000.000 de gerações. A análise foi conduzida até 20.000.000 de gerações sendo utilizadas as últimas 7.000 árvores de cada corrida, totalizando 14.000 árvores como representativas da distribuição posterior.
Os clados encontrados no presente estudo se baseiam na topologia gerada na IB a partir da matriz Combinada I e foram rotulados da seguinte maneira. O clado A denominado Walkeriana é formado por C. nobilior, C. violacea e C. walkeriana. O clado B denominado Intermedia é formado por C. dormaniana, C. forbesii Lindl., C. harrisoniana, C. intermedia Graham ex Hook., C. loddigesii e C. porphyroglossa. O grande clado C, denominado Falcata, é formado pelas demais espécies do grupo bifoliado. O clado C se divide em dois subclados (clado D e clado E). O subclado D (Elongata), pouco sustentado nas análises, é formado por C. elongata, C. kerrii Brieger & Bicalho e C. schilleriana. O subclado E (Bicolor) é formado por C. amethystoglossa Linden & Rchb.f. ex Warner, C. bicolor, C. granulosa, C. guttata Lindl., C. schofieldiana, C. tenuis, C. tigrina e C. velutina Rchb.f..
3.2. As Incongruências no conjunto de dados
O resultado do THP entre as partições referentes aos nucleotídeos de todos os plastídeos mais os indels da região rpl32-trnl não apresentaram incongruência significativa (p = 0,104). O THP realizado com a matriz Plastídeo (com a adição dos indels das regiões atpF-atpH e trnL-trnF) indicou incongruência entre o conjunto de dados (p = 0,016). Entretanto se admitirmos 99% como nível de confiança para o teste de THP, como sugerido por Cunningham (1997) e Hipp et al. (2004), o valor apresentado mostra 17
congruência no conjunto de dados. O resultado do THP indicou incongruência significativa (p = 0,004) ao combinar a matriz Plastídeo com o conjunto de dados de ITS (nucleotídeos mais indels). Erros humano representa uma das causas de incongruência nos conjuntos de dados, esses erros geralmente estão associados a troca de material na amplificação ou seqüenciamento (van der Niet & Linder, 2008). Diante da diferença no posicionamento de C. schilleriana e C. porphyroglossa na árvore de ITS em relação aos dados plastidiais, uma nova amostra de cada espécie foi amplificada e sequenciada para esta região, entretanto as posições dessas espécies na topologia não se alteraram, mostrando que a incongruência não está relacionada a essa causa. Testes feitos com a combinação dos dados da região nuclear agt1 com as demais regiões mostraram que esse conjunto de dados é incongruente tanto com a região nuclear ITS (p = 0,005) bem como com o conjunto de dados plastidiais (p = 0,009). O THP conduzido na matriz combinada I revelou incongruência entre o conjunto de dados (p = 0,002).
Seguindo os critérios utilizados por Pelser et al. (2010) na detecção de incongruências fortemente sustentadas, detectamos que a presença de C. aclandiae, C. dormaniana, C. porphyroglossa, C. schilleriana e C. tigrina geravam topologias incongruentes. A análise de THP a partir da matriz Combinada com a remoção dessas espécies mostrou completa congruência entre os conjuntos de dados (p = 0,110). Diante desses resultados, optamos por apresentar e comparar as topologias das análises Combinada I e Combinada II.
3.3. Análises individuais
As comparações entre as topologias apresentadas nas análises de Neighbor-Joining (árvores não apresentadas) com as da MP não evidenciaram significativa ocorrência de atração de ramos longos. Esse resultado sugere que não há desbalanços significantes nas taxas evolutivas entre as espécies a ponto de comprometer as análises de MP.
De modo geral, as análises de MP individuais das regiões plastidiais e da região nuclear agt1 produziram árvores com pouca resolução entre os terminais (Figuras 1, 2, 3 e 4). Entre os plastídeos, a região rpl32-trnL apresentou maior proporção de caracteres informativos para a parcimônia (ca. 4,4%) (Tabela 2).
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3.4. Análises Plastídeo
A matriz Plastídeo totalizou 10.292 caracteres sendo 4,1% variáveis e 2,3% informativos para a parcimônia. A busca heurística com os dados de plastídeo geraram 30.000 árvores (limitado artificialmente) igualmente parcimoniosas com 843 passos, com índice de consistência (IC) de 0,9197 e índice de retenção (IR) de 0,8050 (Tabela 2). Como esperado, o consenso de maioria da IB de Plastídeo gerou uma topologia mais resolvida que a gerada na análise de MP (Fig. 5). O grupo bifoliado mostrou-se monofilético com 99% PB e 1.0 PP. O clado A (91% PB e 1.0 PP) aparece na base do grupo bifoliado. Internamente, C. aclandiae aparece como espécie irmão das demais que se dividem entre o clado A e clado C. O clado B (83% PB e 1.0 PP) apresentou tanto na análise de MP como na IB forte suporte para as relações internas. O clado C e E foram apenas reconhecidos na IB, entretanto o suporte apresentado é muito baixo. Cattleya guttata e C. tigrina aparecem como espécies irmãs com 96% PB e 1.0 PP. As demais relações dentro do grupo apresentam baixo suporte de bootstrap e de probabilidade posterior.
3.5. Análises Combinadas I e II
A matriz Combinada I gerou na busca heurística 48 árvores igualmente parcimoniosas com 1.522 passos, com CI = 0,7020 e RI = 0,7371 (Tabela 2; Fig. 6). O grupo bifoliado mostrou-se monofilético (100% PB e 1.0 PP). De maneira similar aos resultados encontrados na análise Plastídeo, o clado A aparece na base do grupo bifoliado (86% PB e 1.0 PP), seguido mais internamente por C. aclandiae. O posicionamento de C. dormaniana na base do clado B foi evidenciado na IB a partir da análise Combinada I (1.0 PP). Entretanto, a análise de MP não recuperou essa relação. Além disso, o suporte do clado B (C. forbesii, C. harrisoniana, C. intermedia, C. loddigesii e C. porphyroglossa) apresentou baixa sustentação na análise de MP (54 % PB). Entretanto, as relações entre C. forbesii, C. intermedia, C. harrisoniana e C. loddigesii apresentam alto suporte nas duas análises. Diferente da análise de MP, o clado C aparece com bom suporte (0.96 PP) e abarcam as espécies classificadas por Withner (1988) como pertencentes ao subgênero Falcata (excluindo C. porphyroglossa e C. schilleriana), subgênero Schomburgkoidea (C. bicolor e C. tenuis – excluindo C. elongata e C. violacea) e C. velutina (classificada por este autor como pertencente ao subgênero Aclandia). A IB apresentou alto suporte para o 19
par C. guttata e C. tigrina (0.99 PP). Entretanto a análise de MP não apresentou suporte para essa relação. O clado E apresentou alto suporte na IB (1.0 PP), entretanto esse clado não foi reconhecido na MP. Os espécimes de C. bicolor BRA e C. bicolor FOR formam um clado com 0.94 de PP, seguido por C. granulosa e C. velutina com baixo suporte. O clado composto por C. bicolor DIA, C. bicolor ITA, C. tenuis e C. schofieldiana BA aparece com um bom suporte (0.95 de PP). Entretanto as relações entre esses clados não são resolvidas em nenhuma das análises.
A matriz Combinada II gerou na busca heurística 1.158 árvores igualmente parcimoniosas com 1.356 passos, com CI = 0,7316 e RI = 0,7632 (Tabela 2; Fig. 7). O grupo bifoliado mostrou-se monofilético (100% PB e 1.0 PP). A exclusão das espécies que geravam topologias incongruentes fez desaparecer o subclado D e cosequentemente o clado C encontrado na IB com a matriz Combinada I (Fig. 7). As espécies que compunham esse clado se distribuíram: C. kerrii foi para a base do clado B (50% PB e 0.67 PP) e C. elongata se posicionou com alto suporte (99% PB e 1.0 PP) na base do grado formado pelos clados B e E (clado C na análise Combinada I, com a exclusão de C. elongata e C. kerrii). Dentro do clado E, C. amethystoglossa e C. guttata formaram um par de espécies (0.89 PP). C. schofieldiana BA e C. schofieldiana ES formaram um grado na base do subclado que contem C.bicolor DIA, C. bicolor ITA e C. tenuis (0.96 e 0.52 de PP, respectivamente).
3.6. Evolução Reticulada
As diferenças entre as árvores foram representadas graficamente pelo filtro da super-rede (Fig. 8). As regiões de interligação na rede representam conflitos no sinal filogenético entre as topologias das diferentes regiões (plastídeos, ITS e agt1). As áreas de incongruência dentro do grupo bifoliado residem principalmente na base do clado A, clado B e nas relações de C. amethystoglossa, C. bicolor ITA, C. guttata e C. tigrina. O consenso de rede de galhas dentro das interligações representa uma hipótese alternativa de inferência filogenética entre as árvores dos três conjuntos de dados (Fig.9). Os consensos de redes de galhas conduzidos com 20 e 30% de limite apresentaram a mesma topologia de reticulação (Fig. 9). Entre as espécies envolvidas em uma possível reticulação encontra-se C. tigrina, C. bicolor BRA-2, o complexo (C. dormaniana, C. porphyroglossa e C. schilleriana) e C. aclandiae. 20
4. DISCUSSÃO
4.1. Evolução molecular
Seguindo uma tendência apontada por Degnan & Rosenberg (2009) em sistemática molecular, o presente estudo utilizou uma grande quantidade de regiões (dezesseis) tanto do genoma plastidial (quatorze) quanto do genoma nuclear (duas). Apesar do esforço de coleta de dados, as topologias geradas não apresentaram boa resolução em todos os nós. De maneira geral as taxas de evolução de sequências de plastídeo em Orchidaceae parecem bastante baixas (ex. rbcL, Cameron et al.,1999 e Freudenstein et al., 2004). Além disso, a baixa resolução poderia estar associada a presença de homoplasias ou mesmo a um curto tempo de cladogênese, como sugerido por Rokas & Carrol (2005). A presença de homoplasia dentro da subtribo Laeliinae não é algo incomum e muitos dos caracteres morfológicos utilizados na classificação podem ser especialmente homoplásticos, sendo a morfologia floral muito susceptível a mudanças rápidas, geralmente atribuídas à seleção relacionada ao tipo de polinização (van den Berg et al. 2000). Cattleyaya dormaniana, por exemplo, apresenta características morfológicas típicas do grupo bifoliado. Entretanto, a presença de oito polínias (apesar de quatro serem rudimentares) nessa espécie difere de todas as espécies do grupo (e das Cattleyas no conceito tradicional anterior ao de van den Berg, 2008) que apresentam quatro. A presença de oito polínias parece ser um estado mais primitivo na subtribo (van den Berg et al., 2000). Porém, considerando a profunda inserção filogenética de C. dormaniana no clado bifoliado (Fig. 5 e 6), fica claramente evidenciado que o se trata de um caráter secundariamente derivado.
O maior nível de variação apresentado pela região rpl32-trnL entre todos os plastídeos condiz com os resultados de Shaw et al. (2007). Entretanto, a variação apresentada por essa região não foi suficiente na resolução de alguns clados dentro do grupo bifoliado. Os indels da região rpl32-trnL foram muito informativos para a parcimônia, porém o tamanho destes no gênero Cattleya (26 pb) foi bem menor que os encontrados em outros gêneros de angiospermas (Minuartia (Caryophyllaceace) com 56 pb e Magnolia (Magnoliaceae) com 50 pb) (Shaw et al., 2007). De maneira similar aos resultados de Neubig et al. (2009) a região ycf1 mostrou-se mais variável que a região matK. Entretanto, o nível de variação apresentado pela região não foi capaz de produzir uma filogenia com boa resolução. As demais regiões plastidiais apresentaram baixa variação, com destaque para aquelas codificantes utilizadas pelo Plant Working Group do 21
CBOL (accD, rpoB, rpoC1, ndhJ) (Hollingsworth et al., 2009). Apesar da baixa variação apresentada pelos dados plastidiais, as regiões rpl32-trnL e ycf1 mostram-se como uma boa opção para estudos de espécies próximas.
4.2. Relações entre as espécies do grupo bifoliado
Como esperado, a análise de inferência bayesiana conseguiu recuperar um maior número de clados que as análises de MP e, portanto será usada como base para a discussão entre as relações das espécies.
A presença de duas ou três folhas sobre o pseudobulbo é uma caráter bem marcante na separação do grupo bifoliado em relação às demais espécies do gênero Cattleya sendo aqui apenas reafirmado o monofiletismo já reconhecido geneticamente desde os trabalhos de van den Berg et al. (2000, 2009).
O posicionamento mais basal do clado A (C. nobilior, C. violacea e C. walkeriana) condiz muito bem com aspectos da morfologia como a presença de uma ou duas folhas sobre os pseudobulbos em C. walkeriana o pequeno porte e o pseudobulbo fusiforme presente em C. nobilior e C. walkeriana. As similaridades morfológicas entre essas espécies são tão grandes a ponto de alguns autores chegaram a questionar sobre a validade de separar o par em duas espécies (Braem, 1984). Entretanto, estudos feitos a partir da morfometria floral (van den Berg, 1996) e RAPD (Jin et al., 2004) mostraram uma nítida separação entre as duas espécies. Os resultados da MP e IB na Combinada I mostraram uma maior proximidade entre C. nobilior e C. violacea (56% PB e 1.0 PP), sendo C. walkeriana espécie irmã desse par. Apesar da divergência no posicionamento entre as espécies do clado A em relação ao esperado pela morfologia, algumas características comuns entre ela podem ser observadas, como flores de coloração rósea escura e disco amarelo no labelo (ver Anexo III). Além disso, ao associar a possível origem e irradiação da subtribo Laeliinae da América Central para a América do Sul (van den Berg et al., 2000; Antonelli et al., 2010) com o posicionamento basal do clado A e ampla distribuição de C. violacea (desde as matas de galeria do Planalto Central até a Amazônia Peruana e Colombiana, bem como Venezuela e Guiana (Braem, 1984)) é completamente admissível a hipótese de que essa espécie seja derivada da linhagem mais antiga do grupo bifoliado. Provavelmente, durante sua dispersão em direção ao Brasil, houve processo de especiação 22
e formação de C. walkeriana no bioma cerrado, a qual se expandiu dentro deste bioma na região Sudeste e Centro-Oeste (Goiás, Minas Gerais e São Paulo) (van den Berg, 1996). Barreiras geográficas ou fatores ecológicos levaram a especiação dentro das populações de C. walkeriana originando C. nobilior que preferencialmente ocupou as regiões ao Norte e Oeste (sobretudo Oeste de Goiás, Mato Grosso, Tocantins e Mato Grosso do Sul) de C. walkeriana, e se expandiu também até a Bolívia. Populações de C. nobilior, como ocorre na distribuição atual (Fowlie, 1977; van den Berg, 1996), permaneceram mantendo contato com populações de C. violacea na transição entre o Planalto Central e a região amazônica. Esse contato provavelmente pode ter permitido repetidos processos de hibridação e introgressão entre populações dessas duas espécies. A presença de duas folhas em C. nobilior poderia ser decorrente desse processo (ou alternativamente ser plesiomófico).
Os estudos morfométricos e de sequência de DNA indicaram proximidade de C. aclandiae com o clado A (van den Berg, 1996 e van den Berg et al., 2000, respectivamente). A adição dos dados de plastídeo no presente estudo sugere que C. aclandiae está mais internamente no grupo e compõe a base das demais espécies bifoliadas. O conflito detectado no posicionamento de C. aclandiae indica que a origem dessa espécie possa ter surgido por processo de reticulação, como discutido mais a frente.
Entre todos os clados formados, o clado B (espécies relacionadas a C. intermedia) foi o mais sustentado em todas as análises. Com exceção de C. porphyroglossa, todas as espécies do clado B apresentam uma morfologia muito similar e sempre foram consideradas como espécies próximas (Cogniaux, 1898; Fowlie, 1977; Brieger et al., 1981, Withner, 1988). A morfologia dessas espécies é muito parecida, sendo marcada pelas pétalas geralmente mais estreitas que as sépalas, lobos laterais do labelo proeminentes e arredondados, lobo mediano do labelo relativamente pequeno, e pequenas reentrâncias (sinus) separando os lobos laterais gerando um istmo (distância entre o término da base dos lobos laterais a base do lobo mediano) curto. As flores de todas as espécies apresentam colorações similares em tons rosa-claro (com exceção de C. forbesii que apresenta coloração creme-arroxeada) (ver Anexo III). A formação dos pares de espécie C. harrisoniana - C. loddigesii, C. forbesii - C. intermedia e o posicionamento mais basal de C. dormaniana é completamente concordante com o agrupamento encontrado na análise morfométrica feita para o grupo (van den Berg, 1996). Todas as espécies que compõe o grupo ocorrem no litoral Sudeste e Sul do Brasil (apenas C. loddigesii e C. forbesii 23
penetram para o interior), e suas distribuições se sobrepõem na região ao redor da cidade do Rio de Janeiro e Vale do Paraíba (van den Berg, 1996). Para van den Berg (1996) a distribuição dessas espécies, o posicionamento mais basal de C. dormaniana dentro do clado e a presença de oito polínias nessa última indicavam um posicionamento basal do clado Intermedia dentro do grupo bifoliado. De fato, C. dormaniana é a espécie mais basal do clado, entretanto a presença de oito polínias parece ser homoplástico ao invés de plesiomórfico e, portanto esse caráter não serve como indicativo para uma posição basal para este clado.
A maioria das espécies que compõem o clado C sempre foram mantidas juntas nas diversas classificações feitas para o gênero. Os resultados dos dados moleculares foram parecidos aos encontrados na morfometria floral (van den Berg, 1996), ao sugerir a fusão dos subgêneros Falcata e Schomburgkoidea de Withner (1988) e a inclusão de C. kerrii. A presença de C. velutina no clado C diverge da posição apresentada pelos dados morfométricos que a colocaram próxima das espécies que compõe o clado A (van den Berg, 1996). Withner (1988) defendia que a estrutura vegetativa da planta e a exposição da coluna eram suficientes para colocar C. velutina como próxima de C. aclandiae. Contudo, a análise de agrupamento conduzida por van den Berg (1996) a partir dos dados dos pigmentos de flavonóides em pétalas e sépalas de Cattleya de Tosello (1969) agruparam C. velutina com C. bicolor, de forma similar aos resultados obtidos no presente estudo.
O posicionamento de C. kerrii e C. schilleriana entre os dados de plastídeo e ITS foram muito discordantes. Os dados de ITS indicaram uma forte relação de C. kerrii e C. schilleriana (99% PB) com as espécies mais internas do clado B (C. forbesii, C. harrisoniana, C. intermedia e C. loddigesii) (Fig. 1 D). O forte suporte (84% PB) para o posicionamento de C. schilleriana entre as espécies do clado B, apresentado pelos dados de ITS, foi de certa forma surpreendente do ponto de vista da morfologia. Em virtude desse posicionamento, outro espécime de C. schilleriana foi amplificado e sequenciado, entretanto o posicionamento não se alterou. A relação de parentesco entre C. schilleriana, C. elongata e C. kerrii é fracamente sustentada na IB. A exclusão de C. schilleriana da análise (análise Combinada II – Fig. 7) mudou o posicionamento de C. kerrii. Essa mudança na topologia reforça a idéia de que o posicionamento de C. schilleriana na base de C. kerrii e C. elongata deve-se a uma atração dessa espécie por C. kerrii. O posicionamento de C. kerrii na base do clado B não é tão conflitante com a morfologia 24
floral dessa espécie, alguns autores já reconheciam essa proximidade (por exemplo, Brieger et al., 1981; Withner, 1988). Entretanto, a análise morfométrica de caracteres florais revelou uma maior similaridade de C. kerrii com C. amethystoglossa, C. guttata, C. elongata, C. schilleriana e C. tigrina (van den Berg, 1996).
A morfologia vegetativa e a distribuição de C. elongata e C. kerrii são bastante diferentes e não sugerem essa proximidade filogenética encontrada no presente estudo. Cattleya kerrii apresenta plantas de pequeno porte, flores quase sésseis, e pseudobulbos muito finos, com a presença de uma ou duas folhas sobre o pseudobulbo e hábito epifítico (Withner, 1988). Cattleya elongata apresenta um grande porte e hastes florais muito longas (Cruz et al., 2003, 2011). Seu pseudobulbo é o mais espesso entre todas as espécies bifoliadas, e geralmente contém duas a três folhas. Além disso, ela é a única espécie dentro do grupo que apresenta hábito rupícola, crescendo diretamente sobre o sol (van den Berg, 1996) (ver Anexo IV). A análise de agrupamento a partir dos pigmentos de flavonóides das sépalas e pétalas mostrou uma maior similaridade dos pigmentos de C. elongata com outras espécies de morfologia vegetativa e floral similar, tais como C. granulosa, C. guttata, C. schofieldiana e C. tigrina (van den Berg, 1996). Em relação à distribuição, C. elongata ocorre em abundância na Chapada Diamantina no estado da Bahia (Toscano de Brito & Cribb, 2005). Cattleya kerrii apresenta uma distribuição bem disjunta de C. elongata, sendo endêmica das planícies litorâneas na Mata Atlântica do Sul da Bahia.
Os diferentes espécimes de C. bicolor não formaram um grupo monofilético em nenhum dos dados de sequência de DNA. Esse resultado é bem interessante e reflete algumas considerações sobre a biogeografia dessa espécie. Cattleya bicolor é uma espécie que apresenta variedades morfológicas, sendo que algumas delas lembram híbridos entre C. bicolor x C. amethystoglossa e C. bicolor x C. harrisoniana (Withner, 1988). Essas variedades morfológicas estão associadas a distintas regiões geográficas (Fowlie, 1977). No presente estudo foram utilizadas quatro representantes das três subespécies de C. bicolor: C. bicolor subsp. bicolor Fowlie (C. bicolor ITA, distribuída na Vale do Paraíba, Serra da Bocaina e Serra dos Órgaos), C. bicolor subsp. brasiliensis Fowlie (C. bicolor FORM e C. bicolor BRA, com ocorrência em matas ripárias sobre solo calcário no sudoeste de Minas Gerais e em Mata de Brejo no Distrito Federal, respectivamente) e C. bicolor subsp. minasgeraiensis Fowlie (C. bicolor DIA ocorrendo em matas ripárias na região leste e central de Minas Gerais). Fowlie (1977) considerava que mesmo 25
apresentando uma distribuição disjunta, a população de C. bicolor de Formiga-MG apresentava uma morfologia mais similar a C. bicolor subesp. brasiliensis que ocorre no planalto central. Os resultados da morfometria floral (van den Berg, 1996) bem como o presente estudo com sequência de DNA confirmam também essa relação. As outras duas subespécies apareceram com maior relação filogenética com C. tenuis e C. schofieldiana (Fig. 6). A ausência ou redução dos lobos laterais do labelo em C. bicolor, deixando a coluna completamente exposta é uma característica única dentro do grupo bifoliado (ver Anexo IV). Entretanto, a morfologia, o padrão de coloração floral e os hábitos vegetativos dessa espécie são similares a C. tenuis e C. elongata. Contudo, essa relação só foi evidenciada entre C. bicolor subsp. bicolor (C. bicolor ITA), C. bicolor subsp. minasgeraiensis (C. bicolor DIA) e C. tenuis.
A proximidade filogenética entre C. guttata e C. tigrina sempre foi reconhecida por diferentes autores (por exemplo, Fowlie, 1977; Brieger et al., 1981; Withner, 1988) e confirmada nos diferentes estudos, até então, feitos para o gênero Cattleya, como as análises de agrupamento a partir dos pigmentos de flavonóides a da morfologia floral (van den Berg, 1996). No presente trabalho os dados de plastídeo e da região nuclear agt1 corroboraram com essa idéia, entretanto os dados de ITS separaram essas duas espécies. As análises de MP e IB a partir da matriz Plastídeo reafirmaram a proximidade entre as duas espécies com um bom suporte (96 PB e 1.0 PP), já o consenso estrito da MP a partir dos dados de ITS não evidenciou essa relação (árvore não apresentada). Além disso, as análises de MP e IB a partir da matriz Combinada I geraram resultados divergentes em relação a essas duas espécies. A IB reconheceu o par de espécies com 0.99 de PP, entretanto a MP não apresentou suporte de bootstrap concistente para o par. As diferenças encontradas entre os dois métodos podem estar atreladas a no mínimo dois fatores. Primeiro, a origem de uma das duas espécies pode estar associada a um possível processo de hibridação natural não detectada nos dados de plastídeo (herança uniparental). Segundo, as diferenças geradas nos dois métodos podem estar relacionadas a uma desigualdade nas taxas de evolução entre as espécies em relação a região ITS, as quais podem ocasionar a atração de ramos longos na análise de MP. O posicionamento de C. guttata e C. tigrina como espécies irmãs nos dados de agt1 poderia ser utilizado para descartar a hipótese de origem hibrida para uma das espécies, contudo o padrão de herança dos alelos resultante de uma origem hibrida ainda são pouco conhecidos. Em relação à atração de ramos longos 26
Felsentein (1978) argumenta que métodos que incorporam um modelo explícito de evolução das sequências, como a inferência bayesiana, são menos susceptíveis a atração de ramos longos. Entretanto, a comparação da topologia gerada análise de NJ (árvore não mostrada) com a topologia gerada na análise de MP para os dados de ITS não evidenciaram atração de ramos longos nas análises de MP. Na análise Combinada II, C. guttata formou um par de espécies com C. amethystoglossa o que é completamente concordante com a morfologia dessas espécies e com os resultados de van den Berg (1996).
Os dois táxons inicialmente tratados como espécimes de C. granulosa (um com ocorrência no Sul da Bahia e outro com ocorrência em Pernambuco) não se agruparam em nenhum das regiões analisadas. Os resultados da análise Combinada II, aliado aos resultados encontrados na morfometria floral das populações dessa espécie (van den Berg, 1996), sugerem que a populações do Sul da Bahia inicialmente tratada como C. granulosa BA é na realidade C. schofieldiana BA. Dessa maneira C. granulosa apresenta agora uma ocorrência mais ao norte desde Pernambuco até o Rio Grande do Norte (principalmente em regiões de restinga nesse último) e C. schofieldiana passa a ter sua ocorrência ampliada para o estado da Bahia. Outro achado interessante é o não pareamento entre C. granulosa e C. schofieldiana. As semelhanças na estrutura vegetativa e na morfologia foral sempre foram reconhecidas e utilizadas como indício de proximidade entre essas espécies (Braem, 1984; Withner, 1988). Os padrões de pigmentos dos flavonóides e da morfometria floral (van den Berg, 1996) também apontaram para uma forte relação entre C. granulosa e C. schofieldiana. Entretanto, os resultados das análises indicaram que C. granulosa é mais próximos filogeneticamente de C. velutina e C. bicolor subsp. brasiliensis. Já C. schifieldiana seria mais próxima de C. tenuis e das outras subespécies de C. bicolor. Apesar de os dados das regiões não apontarem para a relação sugerida pela morfologia, os resultados aqui encontrados, pelo menos para as relações que envolvem C. granulosa, apresentaram baixo suporte e, portanto devem ser interpretado com cautela.
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4.3. Evolução Reticulada
De modo geral os dados de plastídeos e agt1 sustentam alguns posicionamentos incongruentes com os dados de ITS. Uma possível explicação para essa incongruência reside na possibilidade de eventos de reticulação/introgressão envolvendo a origem de algumas espécies no grupo (van der Niet & Linder, 2008; Spalik et al., 2009; Pelser et al., 2010, Huson et al., 2011). A presença apenas das incongruências não devem ser tomadas como prova do processo de reticulação/introgressão, mas associação desta com características biológicas das espécies envolvidas como: distribuição, morfologia e fenologia podem ser importantes na sustentação dessa hipótese (Rieseberg et al., 1996a).
Os conflitos no sinal filogenético entre os conjuntos de dados, detectados no filtro da super-rede (Fig. 8), geraram um topologia que divergiu da esperada pela morfologia, e dentre outros fatores, sugere uma hipótese de evolução reticulada para algumas espécies do grupo. Diante da grande quantidade de híbridos naturais dentro do grupo bifoliado (Fowlie, 1977; Pabst & Dungs, 1975), aliado ao sucesso de alguns desses híbridos, torna-se plausível discutir hipóteses filogenética que envolva processos de hibridação para explicar a evolução de algumas espécies. Devido à baixa amostragem de terminais dos grupos externos e de Cattleya fora do grupo bifoliado, a discussão será restrita as relações dentro desta linhagem.
A rede de consenso sugere uma possível origem de C. aclandiae envolvendo o ancestral do clado A com o ancestral das demais espécies do grupo bifoliado. C. aclandiae difere das demais espécies do grupo bifoliado, dentre outros fatores, pela ausência da espata na inflorescência e raízes excepcionalmente espessas (como em C. nobilior e C. walkeriana) (Braem, 1984). Entretanto, alguns elementos de sua morfologia são comuns tanto ao clado A como as demais espécies bifoliadas, como o fino pseudobulbo, similar ao de C. velutina (lembra um fino) e a exposição da coluna devido ao não recobrimento por parte dos lobos laterais do labelo, como ocorre em C. nobilior, C. velutina e C. walkeriana (ver Anexo III). O padrão de pigmentação das sépalas e pétalas presente em C. aclandiae difere do rosa presente no clado A e no clado B (com exceção de C. forbesii). Seu padrão de pigmentação das sépalas e pétalas lembra o presente em C. schilleriana e C. tigrina (ver Anexo IV). Esse padrão de pigmentação, mais a presença de sinus no labelo, pseudobulbos sem engrossamento e folhas múltiplas, presentes no grupo bifoliado, compunham um 28
conjunto de características denominado por Withner (1988) como "Síndrome Costeira Brasileira". Com exceção de C. bicolor e C. elongata (que também se distribuem mais para o interior do país) as demais espécies que expressão esse padrão de pigmentação nas sépalas e pétalas apresentam uma distribuição intimamente costeira.
A presença de C. porphyroglossa dentro do clado B não condiz com a morfologia e sugere uma explicação alternativa para sua evolução. A morfologia de C. porphyroglossa é muito diferente das demais espécies do clado Intermedia. Os pequenos lobos laterais com ápices pontiagudos, o estreito e longo istmo do lobo mediano do labelo, bem como a presença de granulações em sua superfície, sugere um maior parentesco dessa espécie com C. granulosa e C. schofieldiana. Essas semelhanças sempre foram reconhecidas nas diferentes classificações e levaram os autores a colocarem essas três espécies em uma seção a parte, seção Granulosae (por exemplo, Fowlie, 1977; Withner, 1988). Em contraste, as flores de C. porphyroglossa são muito menores do que destas duas espécies, e a planta também é menor e com pseudobulbos finos, similar a C. velutina. A árvore do consenso de redes sugere a formação de C. porphyroglossa a partir do ancestral do clado B com um provável ancestral de C. amethystoglossa, C. guttata, C. kerrii e C. schilleriana. Rieseberg & Carney (1998) comentam que a formação de híbridos é um processo assimétrico e unidirecional, onde o sucesso do processo depende da espécie que irá contribuir com o gameta masculino e da espécie que irá contribuir com o gameta feminino. O posicionamento de C. porphyroglossa gerados pelos dados plastidiais aliado ao tipo de herança (uniparental) apresentado por esse marcador sugere que o ancestral do clado B contribuiu de forma materna para a formação dessa espécie.
Aspectos da morfologia floral e o padrão de coloração de C. schilleriana lembram C. guttata e C. tigrina (ver Anexo IV), e nas diversas classificações propostas para o gênero essa espécie sempre foi reconhecida como próxima de C. guttata (Cogniaux, 1898; Pabst & Dungs, 1975; Brieger et al., 1981; Withner, 1988). Na classificação de Withner (1988) a espécie foi incluída no subgênero Falcata seção Guttatae. Contudo, o labelo de C. schilleriana apresenta um istmo reduzido e um lobo mediano bem mais largo diferindo do labelo das outras espécies dessa seção. A análise de agrupamento a partir da morfometria floral (van den Berg, 1996) mostrou que C. schilleriana apresenta uma grande distância fenética em relação às demais espécies do subgênero Falcata. O consenso de redes sugere que a formação de C. schilleriana envolveu a participação do ancestral de C. kerrii ou 29
algum descendente de C. guttata com o ancestral do clado Intermedia. Essa possível origem de C. schilleriana faz sentido com sua distribuição. C. schilleriana ocorre desde a Bacia do pequeno Rio Jucu, no médio Espírito Santo (Withner, 1988) até o extremo sul da Bahia na região de Juçari. Na Bacia do Rio Jucu populações de C. schilleriana ocorrem em simpatria com C. schofieldiana, C. velutina e C. harrisoniana. Curiosamente, C. harrisoniana (clado B) é a única que floresce junto com C. schilleriana (Braem, 1994) e a ocorrência de híbridos naturais entre essas duas espécies é citada na literatura (Fowlie, 1977).
A análise da topologia gerada a partir da matriz Combinada I e do filtro da super- rede sugere que o clado C como um todo seria derivado de linhagens ancestrais de C. elongata, a partir da qual ocorreram vários processos de vicariância, especiação, formação de híbridos e introgressão. Corroborando com a hipótese de van den Berg (1996), a região norte do Espírito Santo e sul da Bahia seriam o centro secundário de especiação do grupo bifoliado onde provavelmente teria ocorrido a formação e diversificação das espécies do clado C (sendo o primeiro centro responsável pela formação das espécies do clado A e do clado B). Nesse contexto, C. tenuis e C. elongata parecem ser espécies mais antigas do grupo. A presença de pseudobulbo quebradiço único nessas duas espécies, bem como a presença de populações de C. tenuis com três folhas sobre o pseudobulbo, característica muito comum em C. elongata, corroboram essa idéia. A fenologia floral dessas espécies é semelhante a apresentada pelas espécies do clado A (florescendo de maio a julho) (van den Berg, 1996) e ao relacionar com o posicionamento do clado A nas topologias, parece ser uma condição plesiomórfica no grupo. Entretanto, C. tenuis apresenta característica da morfologia floral compartilhadas por C. elongata, C. bicolor, C. granulosa e C. schofieldiana. Provavelmente, C. bicolor descende de linhagens ancestrais de C. tenuis, pois a morfologia floral de C. bicolor lembra a flor de C. tenuis sem a presença dos lobos laterais do labelo (ver Anexo IV). Uma linhagem descendente desse complexo teria originado as espécies do subgênero Falcata (Withner, 1988), as quais teriam se diversificado, mas algumas continuaram mantendo contato com C. bicolor e provavelmente se envolvendo em processo de introgressão (como C. granulosa, C. schofieldiana e C. guttata a qual teria originado C. tigrina, ver discussão mais a frente). Nesse contexto C. kerrii seria uma espécie antiga, intimamente relacionada com a evolução de C. elongata e do clado intermedia. 30
O padrão de distribuição de C. amethystoglossa, C. bicolor DIA, C. guttata e C. tigrina, as semelhanças morfológicas entre C. guttata e C. tigrina e a topologia gerada no consenso da super-rede, sugerem duas hipóteses diferentes e excludentes para a possível evolução dessas espécies. A primeira reside na idéia de que C. guttata é resultante da especiação de linhagens de C. tigrina e que a proximidade entre C. bicolor ITA e C. tigrina é produto de introgressão entre essas duas espécies. A posição de C. tigrina como mais antiga em relação a C. guttata pode ser apoiada na sua ampla distribuição (desde o Rio Grande do Sul e Santa Catarina, Litoral Sul de São Paulo até a região de Campo Formoso no Norte da Bahia) (van den Berg, 1996). Em contraste, C. guttata apresenta uma distribuição mais restrita a região Sudeste mais próximo ao litoral (van den Berg, 1996). Nessa perspectiva, populações de C. tigrina durante o processo de expansão em direção ao Sul da Bahia e ao Rio Grande do Sul, teriam mantido contato com populações de C. bicolor culminando em introgressão entre essas espécies. Entretanto, o panorama atual da destruição dessas espécies nos sugere que esse contato seria pouco provável devido, entre outros fatores, a ocorrência de C. bicolor em altitudes mais elevadas (1.000 metros) que C. tigrina, que geralmente ocorre ao nível do mar. A segunda hipótese reside na idéia de que C. tigrina é resultante do processo de hibridação natural entre C. bicolor e C. guttata. Provavelmente esse processo teria ocorrido na porção Leste da Cadeia do Espinhaço, onde essas espécies poderiam manter contato. Entretanto, essas espécies não compartilham de um mesmo período fenológico (van den Berg, 1996). A grande semelhança de C. guttata com C. tigrina, bem como o forte suporte registrado pelos dados plastidiais poderia ser decorrente de uma contribuição assimétrica (nesse caso maternal por parte de C. guttata) no processo de hibridação (Rieseberg & Carney, 1998). A ampla distribuição de C. tigrina poderia estar atrelada a formação de híbridos com grande variabilidade a qual permitisse ocupar novas regiões, como o Norte da Bahia que apresenta condições climáticas semelhantes a encontradas por populações de C. bicolor em Minas Gerais. O posicionamento de C. amethystoglossa dentro da rede de interações que envolvem C. bicolor ITA, C. guttata e C. tigrina se encaixa muito bem na segunda hipótese. Nessa perspectiva, C. amethystoglossa e C. guttata são decorrentes de especiação que ocorreram provavelmente no Sul da Bahia. Após esse processo C. amethystoglossa se expandiu em direção ao Norte até a região do Rio Paraguaçu no Recôncavo Baiano (van den Berg, 1996) e para a Caatinga no interior (Cruz et al., 2003) e C. guttata se expandiu para o Sul até o Paraná. 31
5. CONCLUSÃO
O presente estudo utilizou um grande conjunto de dados para inferir a filogenia das espécies do grupo bifoliado do gênero Cattleya. De modo geral, os dados apresentaram baixa variação nucleotídica, entretanto alguns clados foram reconhecidos e fortemente sustentados. Entre as regiões que apresentaram nível significativo de variação, vale destacar as regiões plastidiais rpl32-trnL e ycf1, as quais podem ser uma boa opção para estudos envolvendo espécies próximas em plantas.
A presença de duas folhas sobre o pseudobulbo se configurou como um caractere morfológico e geneticamente referenciado na delimitação do grupo bifoliado em relação as demais espécies do gênero Cattleya. Ambas as análise de máxima parcimônia e inferências bayesiana reconheceram as proximidades filogenéticas existente entre as espécies basicamente dentro de três clados: clado A (Walkeriana), clado B (Intermedia) e clado C (Falcata). De modo geral, os clados encontrados abarcaram espécies consideradas nas diversas classificações como espécies próximas (Rolfe, 1895, Cogniaux, 1898; Pabst & Dungs 1975; Fowlie, 1977; Withner, 1988), principalmente em relação as espécies que compõe o clado B. Entretanto, sempre houve uma falta de consenso entre os autores na classificação das espécies que compões o clado C. Muitas dessas espécies são morfologicamente similares e de difícil distinção (como C. guttata – C. tigrina, C. granulossa – C. schofieldiana). Os resultados desse estudo para esse clado apresentaram baixa resolução e não esclareceu completamente as relações entre algumas espécies.
Os resultados sugerem que as populações ocorrentes no sul da Bahia reconhecidas em trabalhos anteriores como C. granulosa (por exemplo, van den Berg, 1996), devam ser reconhecidas como C. schofieldiana.
Baseado, entre outros fatores, na presença de conflitos no sinal filogenético entre os dados plastidiais e nucleares, foram levantados algumas hipóteses sobre a evolução do grupo. Provavelmente C. aclandiae, C. dormaniana, C. porphyroglossa, C. schilleriana e C. tigrina tiveram suas origens a partir de processos que envolveram reticulação entre linhagens ancestrais de outras espécies do grupo bifoliado. Como supracitado, os resultados aqui apresentados são apenas hipóteses (apesar de estarem embasadas em características morfológicas, fenológicas e de distribuição das espécies) e, portanto 32
carecem de mais estudos experimentais que venham a elucidar esses possíveis processos de evolução.
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46
Tabela 1. Primers e programas utilizados para a amplificação das regiões utilizadas neste estudo. Primers Desnaturação Amplificação N°. ciclos na Extensão amplificação final agt11 F forward (GATTTCCGHATGGATGANTGGGG) 95° (2 min) 94° (40 seg) + 52° (30 seg) + 72° (40 seg) 35 72° (5 min) R reverse (CCAYTCCTCCTTCTGHGTGCAGTT) atpF-atpH2 atpF forward (ACTCGCACACACTCCCTTTCC) 94° (1 min) 94° (30 seg) + 53° (40 seg) + 72° (40 seg) 30 72° (5 min) atpH reverse (GCTTTTATGGAAGCTTTAACAAT) ETS* ETS-Orchid3 forward (CATATGAGTTGTTGCGGACCWT) 94° (1 min) 94° (30 seg) + 54° (40 seg) + 72° (40 seg) 38 72° (5 min) 18S-IGG4 reverse (AGACAAGCATATGACTACTGGCAGG) ITS 17SE5 forward (ACGAATTCATGGTCCGGTGAAGTGTTCG) 94° (1 min) 94° (45 seg) + 52° (50 seg) + 72° ( min) 28 72° (5 min) 26SE5 reverse (TAGAATTCCCCGGTTCGCTCGCCGTTAC) 6 92 # forward (AAGGTTTCCGTAGGTGAAC) Sequenciamento 7 4 # reverse (TCCTCCGCTTATTGATATGC) Sequenciamento ndhJ8 forward (CATAGATCTTTGGGCTTYGA) 94° (1 min) 94° (30 seg) + 53° (40 seg) + 72° (40 seg) 30 72° (5 min) reverse (TACATGAGCATCTTGTATTTC) 9 10 PsbA -trnH psbA forward (GTTATGCATGAACGTAATGCTC) 94° (1 min) 94° (30 seg) + 53° (40 seg) + 72° (40 seg) 30 72° (5 min) trnH reverse (CGCGAATGGTGGATTCACAAATC) 11 psbK-psbI psbK forward (TTAGCCTTTGTTTGGCAAG) 94° (1 min) 94° (30 seg) + 53° (40 seg) + 72° (40 seg) 30 72° (5 min) psbI reverse (AGAGTTTGAGAGTAAGCAT)
47
Tabela 1. Continuação Primers Desnaturação Amplificação N°. ciclos na Extensão amplificação final 12 Rpb2 * RPB2-INT-23F forward (CAACTTATTGAGTGCATCATGG) 94° (1 min) 94° (30 seg) + 52,5° (40 seg) + 72° (1,5 min) 72° (5 min) RPB2-INT-23R reverse (CCACGCATCTGATATCCAC) 13 rpl32-trnL F forward (CAGTTCCAAAAAAACGTACTTC) 80° (5 min) 95° (1 min) + 50° (1 min) + 65° (4 min) 30 65° (4 min) (UAG) reverse (CTGCTTCCTAAGAGCGT) 14 rpoC1 forward (GTGGATACACTTCTTGATAATGG) 94° (1 min) 94° (30 seg) + 53° (40 seg) + 72° (40 seg) 30 72° (5 min) reverse (CCATAAGCATATCTTGAGTTGG) 15 trnL-trnlF C forward (CGAAATCGGTAGACGCTACG) 94° (1 min) 94° (30 seg) + 53° (40 seg) + 72° (40 seg) 36 72° (5 min) F reverse (ATTTGAACTGGTGACACGAG) 16 trnD-trnT (GUG) forward (ACCAATTGAACTACAATCCC) 94° (1 min) 94° (30 seg) + 54° (40 seg) + 72° (1 min) 35 72° (5 min) (GGU) reverse (CTACCACTGAGTTAAAAGGG) 17 trnS-trnG (GCU) forward (GTAGCGGGAATCGAACCCGCATC) 94° (1 min) 94° (30 seg) + 54° (40 seg) + 72° (1 min) 30 72° (5 min) (UCC) reverse (AGATAGGGATTCGAACCCTCGGT) 18 ycf1 3720F forward (TACGTATGTAATGAACGAATGG) 94° (1 min) 94° (30 seg) + 53° (40 seg) + 72° (50 seg) 40 72° (5 min) 5500R reverse (GCTGTTATTGGCATCAAACCAATAGCG) intF forward (GATCTGGACCAATGCACATATT) intR reverse (TTTGATTGGGATGATCCAAGG) 1- Li et al. (2008); 2- Kress et al. (2005); 3- Monteiro (2007); 4- Baldwin & Markos (1998); 5- Sun et al. (1994); 6- Desfeaux et al., (1996), 7- White et al., (1990), 8- Kress et al., (2005); 9- Sang et al. (1997); 10- Tate & Simpson, (2003); 11- Kress et al., 2005; 12- Ronçal et al. (2005); 13- Shaw et al. (2007 ); 14- Kress et al., 2005; 15- Taberlet et al. (1991); 16- Demesure et al. (1995); 17- Shaw et al. (2005); 18- Neubig et al. (2009). * significa, amplificada e sequenciada para algumas amostras, mas não utilizada no presente estudo. # significa primers usados apenas no seqüenciamento. Os demais primers foram usados na amplificação e seqüenciamento. 48
Tabela 2. Características das matrizes e das árvores mais parcimoniosas encontradas nas análises de Máxima Parcimônia individuais e combinadas e dos modelos evolutivos selecionados para inferência Bayesiana. Regiões N° de Caracteres N° de N° de caracteres N° de Nº de N° de CI RI Modelo táxon analisados caracteres inf. p/ passos da árvores Indels evolutivo variáveis parcimônia árvore para IB ITS 44 733 116 (15,8%) 142 (19,4%) 495 239 58 0,6040 0,7863 GTR+G+I rpl32-trnL 42 955 53 (5,6%) 42 (4,4%) 114 30.000 26 0,8589 0,8794 GTR+G ycf1 36 1566 46 (2,9%) 61 (3,9%) 120 16 21 0,9339 0,9448 GTR+G agt1 37 481 50 (10,4%) 18 (3,7%) 94 30.000 - 0,7872 0,7059 HKY+I+G ndhJ 37 441 15 3,4%) 15 (3,4%) 36 170 - 0,8611 0,8780 F81+I atpF-atpH 31 373 11 (2,9%) 12 (3,2%) 45 26.640 12 0,8021 0,8467 HKY+I matK 32 805 37 (4,6%) 24 (3%) 84 30.000 - 0,7857 0,8364 GTR+G+I psbA-trnH 37 907 32 (3,5%) 22 (2,4%) 64 30.000 38 0,9063 0,8696 F81+I+G psbK-psbI 31 464 15 (3,2%) 11 (2,4%) 29 30.000 18 0,8966 0,9250 GTR+G trnL-trnF 33 995 48 (4,8%) 23 (2,3%) 83 30.000 23 0,9033 0,9238 GTR+I trnD-trnT 31 1781 92 (5,2%) 25 (1,4%) 130 30.000 61 0,9231 0,8734 GTR+G rpoC1 36 518 19 (3,7%) 5 (1%) 26 12.000 - 0,9231 0,9000 HKY+G rpoB 30 451 6 (1,3%) 4 (0,9%) 11 6 - 0,9091 0,9583 HKY accD 30 244 2 (0,8%) 2 (0,8%) 4 1 - 1,0000 1,0000 HKY trnS-trnG 26 775 19 (2,4%) 6 (0,7%) 26 30.000 - 1,0000 1,0000 GTR Plastídeo 44 10.292 428 (4,1%) 235 (2,3%) 843 30.000 - 0,9197 0,8050 - Combinada I 44 11.506 601 (5,2%) 393 (3,4%) 1522 48 - 0,7020 0,7371 - Combinada II 39 11.506 556 (4,8%) 370 (3,2%) 1356 1158 - 0,7316 0,7632 - CI = Índice de Consistência e RI = Índice de Retenção. 49
Figura 1. Árvores de consenso estrito resultantes das análises de Máxima Parcimônia individuais. A, agt1. B, accD. C, atpF-atpH. D, ITS. Os números acima dos ramos indicam os valores de suporte de bootstrap (%). 50
Figura 2. Árvores de consenso estrito resultantes das análises de Máxima Parcimônia individuais. E, ndhJ. F, matK. G, psbA-trnH. I, psbK-psbI. Os números acima dos ramos indicam os valores de suporte de bootstrap (%). 51
Figura 3. Árvores de consenso estrito resultantes das análises de Máxima Parcimônia individuais. I, rpl32-trnL. J, trnD-trnT. K, rpoB. L, rpoC1. Os números acima dos ramos indicam os valores de suporte de bootstrap (%). 52
Figura 4. Árvores de consenso estrito resultantes das análises de Máxima Parcimônia individuais. M, trnL-trnF. N, trnS-trnG. O, ycf1. Os números acima dos ramos indicam os valores de suporte de bootstrap (%).
53
54/0.69 Cattleya bicolor BRA 2 57/0.70 Cattleya bicolor FORM 2 */0.65 Cattleya bicolor BRA 1 Cattleya bicolor FORM 1 Cattleya amethystoglossa 96/1.00 Cattleya guttata */0.66 Cattleya tigrina */0.58 Cattleya schofieldiana ES Cattleya bicolor DIA 1 Cattleya bicolor ITA 1 E*/ 0.71 Cattleya schofieldiana BA Cattleya granulosa Cattleya velutina Cattleya tenuis Cattleya */0.84 79/1.00 Cattleya elongata 1 Bifoliada C */0.70 Cattleya elongata 2 */0.68 Cattleya kerrii 1 Cattleya kerrii 2 75/1.00 Cattleya schilleriana 98/1.00 Cattleya forbesii 74/1.00 Cattleya intermedia 84/1.00 Cattleya harrisoniana 98/1.00 78/1.00 Cattleya loddigesii B 83/1.00 66/0.98 Cattleya porphyroglossa 1 Cattleya porphyroglossa 2 99/1.00 Cattleya dormaniana Cattleya aclandiae 59/0.98 Cattleya nobilior A 91/1.00 Cattleya violacea 68/0.95 Cattleya walkeriana 100/1.00 Cattleya labiata CE 93/1.00 Cattleya labiata PE */0.71 Cattleya luteola 91/1.00 Cattleya lawrenceana 100/1.00 */0.81 Cattleya wallisii 56/97 Cattleya lueddemanniana Cattleya lundii 91/1.00 Cattleya purpurata 73/0.92 Cattleya sincorana Cattleya pfisteri Brassavola cucullata Brassavola tuberculata Rhyncholaelia digbyana Grupo Rhyncholaelia glauca externo
Figura 5. Árvore de consenso de maioria das 18.000 árvores resultantes da análise Bayesiana, com modelo de evolução particionado da matriz Plastídeo (dados das 14 regiões de plastídeo). Os números acima dos ramos indicam: a esquerda os valores de bootstrap (%) oriundo das análises de máxima parcimônia e a direita os valores de ٭ probabilidade posterior (em escala de 0 - 1) gerados na inferência bayesiana. Os representam valores de bootstrap inferior a 50%. As letras representam os clados formados, A (Walkeriana), B (Intermedia), C (Falcata) e E (subclado Bicolor). 54
50/0.64 Cattleya bicolor BRA 1 51/0.64 Cattleya bicolor BRA 2 */0.94 Cattleya bicolor FORM 1 */0.59 Cattleya bicolor FORM 2 Cattleya granulosa Cattleya velutina Cattleya bicolor DIA 1 */0.98 Cattleya bicolor ITA 1 */0.95 E */1.00 Cattleya tenuis Cattleya schofieldiana BA */0.99 Cattleya guttata Cattleya tigrina */0.96 Cattleya amethystoglossa C Cattleya schofieldiana ES 98/1.00 Cattleya elongata 1 Cattleya */0.99 Cattleya elongata 2 60/0.99 Bifoliada D */0.73 Cattleya kerrii 1 Cattleya kerrii 2 96/1.00 Cattleya schilleriana 94/1.00 Cattleya forbesii 90/1.00 Cattleya intermedia 80/1.00 Cattleya harrisoniana 67/1.00 54/1.00 Cattleya loddigesii B */1.00 100/1.00 Cattleya porphyroglossa 1 Cattleya porphyroglossa 2 100/1.00 Cattleya dormaniana Cattleya aclandiae 56/1.00 Cattleya nobilior 74/0.99 A 86/100 Cattleya violacea Cattleya walkeriana 100/1.00 Cattleya labiata CE 100/1.00 Cattleya labiata PE 100/1.00 Cattleya luteola 100/1.00 Cattleya purpurata 99/1.00 Cattleya sincorana 56/0.75 Cattleya pfisteri 100/1.00 88/1.00 Cattleya lundii */0.89 Cattleya lawrenceana 94/1.00 Cattleya wallisii Cattleya lueddemanniana 100/1.00 Brassavola cucullata Brassavola tuberculata Rhyncholaelia digbyana Grupo Rhyncholaelia glauca externo
Figura 6. Árvore de consenso de maioria das 12.000 árvores resultantes da análise Bayesiana, com modelo de evolução particionado da matriz Combinada I (dados das 13 regiões de plastídeo, ITS e agt1). Os números acima dos ramos indicam: a esquerda os valores de bootstrap (%) oriundo das análises de máxima parcimônia e a direita os valores ٭ de probabilidade posterior (em escala de 0 - 1) gerados na inferência bayesiana. Os representam valores de bootstrap inferior a 50%. As letras representam os clados formados, A (Walkeriana), B (Intermedia), C (Falcata), D (subclado Elongata) e E (subclado Bicolor). 55
*/0.52 Cattleya bicolor BRA 1 */0.51 Cattleya bicolor BRA 2 52/0.85 Cattleya bicolor FORM 1 */0.80 Cattleya bicolor FORM 2 */0.82 Cattleya velutina Cattleya granulosa Cattleya bicolor DIA 1 */1.00 Cattleya bicolor ITA 1 E*/ 0.79 */0.96 Cattleya tenuis */0.52 Cattleya schofieldiana BA Cattleya schofieldiana ES Cattleya */0.63 */0.89 Cattleya amethystoglossa Cattleya guttata Bifoliada 98/1.00 Cattleya forbesii 100/1.00 Cattleya intermedia 89/1.00 Cattleya harrisoniana 99/1.00 B 50/0.67 Cattleya loddigesii 62/0.77 Cattleya kerrii 1 Cattleya kerrii 2 100/1.00 98/1.00 Cattleya elongata 1 Cattleya elongata 2 */0.97 Cattleya nobilior 81/1.00 A 96/1.00 Cattleya violacea Cattleya walkeriana 100/1.00 Cattleya labiata CE 100/1.00 Cattleya labiata PE */1.00 Cattleya luteola 100/1.00 Cattleya purpurata 99/1.00 Cattleya sincorana 67/0.87 Cattleya pfisteri 100/1.00 88/1.00 Cattleya lundii */0.80 Cattleya lawrenceana 94/1.00 Cattleya wallisii Cattleya lueddemanniana 100/1.00 Brassavola cucullata Brassavola tuberculata Rhyncholaelia digbyana Grupo Rhyncholaelia glauca externo
Figura 7. Árvore de consenso de maioria das 14.000 árvores resultantes da análise Bayesiana, com modelo de evolução particionado da matriz Combinada II (dados das 14 regiões de plastídeo, agt1 e ITS) excluindo terminais que geravam incongruência. Os números acima dos ramos indicam: à esquerda os valores de suporte de bootstrap (%) e a direita os valores de probabilidade posterior da inferência bayesiana (em escala de 0 - 1). representam valores de bootstrap inferior a 50%. As letras representam os clados ٭ Os formados, A (Walkeriana), B (Intermedia), E (subclado Bicolor). 56
Figura 8. Super-rede (supernetwork) das árvores de consenso da análise de máxima parcimônia com valores de bootstrap igual ou superior a 50% a partir dos dados combinados de plastídeo, de ITS e de agt1. O número mínimo de árvores foi igual a 2. 57
Figura 9. Rede de consenso não-enraizado (30% de limite para construção da rede) sumarizando as incongruências existentes entre as topologias dos três conjuntos de dados (14 regiões de plastídeo, ITS e agt1) usando árvores de consenso de maioria com > 50% de bootstrap. Na figura apenas a topologia é apresentada, pois os ramos não são escalonados com comprimento de ramo. As linhas em negrito representam as possíveis reticulações. As fotos referem-se as espécies ou represententes de clados envolvidos em possíveis processos de evolução reticulada. 58
ANEXOS 59
ANEXO I Espécies analisadas indicando voucher e número de acesso do GenBank para as sequências oriundas de outros trabalhos. Espécies Voucher accD ITS matK ndhJ psbA-trnH rpoB rpoC1 Brassavola cucullata (L.) R.Br. MWC (6177) para ITS e trnL-trnF e W.E. Higgins - AY008589.1 - AGB - - - 130 (FLAS 198290) para os demais Brassavola tuberculata Hook. Brieger Coll. 3497 (ESA) - AF260217.1 AF263818.1 AGB - - AGB
Cattleya aclandiae Lindl. * Brieger Coll. 32982 (ESA) EU139872.1 AF260207.1 AF263810.1 - GQ248259.1 GQ248738.1 GQ248899.1 Cattleya amethystoglossa Linden Brieger Coll. 8272 (ESA) EU139873.1 AY008610.1 EU139957.1 EU140261.1 EU140024.1 EU140099.1 EU140180.1 & Rchb.f. ex Warner * Cattleya bicolor Lindl. BRA Brieger Coll. 22574 (ESA) EU139875.1 AY008626.1 - EU140263.1 EU140026.1 EU140101.1 EU140182.1 (Brasília - 1) * Cattleya bicolor Lindl. BRA Brieger Coll. 22579 (ESA) - AGB - - - - AGB (Brasília - 2) * Cattleya bicolor Lindl. DIA Brieger Coll. 30656 (ESA) - AY008625.1 - AGB AGB - AGB (Diamantina) * Cattleya bicolor Lindl. FORM Brieger Coll. 4336 (ESA) EU139876.1 AY008627.1 - EU140264.1 EU140027.1 EU140102.1 EU140183.1 (Formiga - 1) * Cattleya bicolor Lindl. FORM Brieger Coll. 4333 (ESA) - AGB - - - - - (Formiga - 2) * Cattleya bicolor Lindl. ITA Brieger Coll. 891 (ESA) EU139877.1 AY008624.1 - EU140265.1 AGB - EU140184.1 (Itatiaia) * Cattleya dormaniana (Rchb.f.) Brieger Coll. 23977 (ESA) EU139879.1 AY008608.1 - EU140267.1 EU140029.1 EU140105.1 EU140186.1 Rchb.f. * Cattleya elongata Barb.Rodr. (1) * Brieger Coll. 8078 (ESA) EU139881.1 AY008619.1 EU139964.1 EU140269.1 EU140031.1 EU140107.1 EU140188.1
Cattleya elongata Barb.Rodr. (2) * Brieger Coll. 32748 (ESA) - AGB - - - - - Cattleya forbesii Lindl. * trnL-trnF: WEH 59 / demais Brieger Coll. 5358 EU139884.1 AY008617 EU139965.1 EU140270.1 EU140032.1 EU140108.1 EU140191.1 (ESA) Cattleya granulosa Lindl. * Brieger Coll. 22482 (ESA) EU139885.1 AY008621.1 EU139966.1 EU140271.1 EU140033.1 EU140111.1 EU140192.1 60
ANEXO I Continuação. Espécies Voucher accD ITS matK NdhJ psbA-trnH rpoB rpoC1 Cattleya guttata Lindl. * Brieger Coll. 11299 (ESA) EU139886.1 AY008609.1 EU139967.1 EU140272.1 EU140034.1 EU140112.1 EU140193.1 Cattleya harrisoniana Bateman ex Brieger Coll. 16036 (ESA) EU139887.1 AY008615.1 EU139968.1 EU140273.1 EU140035.1 EU140113.1 EU140194.1 Lindl. * Cattleya intermedia Graham ex Brieger Coll. 4095 (ESA) EU139890.1 AF260204.1 EU139969.1 EU140274.1 EU140036.1 EU140116.1 EU140197.1 Hook. * Cattleya kerrii Brieger & Bicalho Brieger Coll. 18765 EU139893.1 AY008613.1 EU139972.1 EU140277.1 EU140039.1 EU140119.1 EU140200.1 (1) * (Holotype-HB) Cattleya kerrii Brieger & Bicalho Zaslawski s.n. (HUEFS) - AGB - - - - - (2) * Cattleya labiata Lindl. (Ceara) Brieger Coll. 20545 (ESA) EU139895.1 AF260214.1 - EU140278.1 EU140040.1 EU140121.1 EU140203.1 Cattleya labiata Lindl. Brieger Coll. 5487 (ESA) EU139896.1 AF260214.1 EU139973.1 EU140279.1 EU140041.1 EU140120.1 EU140202.1 (Pernambuco) Cattleya lawrenceana Rchb.f. Brieger Coll. 3802 (ESA) EU139897.1 AF260208.1 EU139974.1 EU140280.1 EU140043.1 EU140123.1 -
Cattleya loddigesii Lindl. * Brieger Coll. 2483 (ESA) EU139898.1 AY008616.1 U139975.1 EU140281.1 EU140042.1 EU140124.1 EU140204.1
Cattleya lueddemanniana Rchb.f. Brieger Coll. 3759 (ESA) EU139899.1 AY008629.1 EU139976.1 EU140282.1 EU140044.1 EU140125.1 EU140205.1 Cattleya lundii (Rchb.f. & Warm) Brieger Coll. 30692 (ESA) EU139944.1 AY008645.1 EU140013.1 EU140318.1 EU140318.1 - EU140247.1 van den Berg Cattleya luteola Lindl. Brieger Coll. 32187 (ESA) EU139900.1 AY008605.1 EU139977.1 EU140283.1 EU140045.1 EU140126.1 EU140206.1
Cattleya nobilior Rchb.f. * Brieger Coll. 30978 (ESA) EU139904.1 AY008607.1 GQ248092.1 EU140285.1 GQ248260.1 GQ248739.1 GQ248900.1 Cattleya pfisteri (Pabst & Senghas) van den Berg C226 (ESA) EU139947.1 AY008662.1 EU140015.1 EU140321.1 EU140088.1 EU140169.1 EU140251.1 van den Berg Cattleya porphyroglossa Linden & sem voucher (Kew 1986– EU139906.1 AY008612.1 EU139980.1 EU140287.1 EU140049.1 EU140130.1 EU140210.1 Rchb.f. (1) * 2034) Cattleya porphyroglossa Linden & sem voucher (LAMOL - AGB - - - - - Rchb.f. (2) * 389.2) 61
ANEXO I Continuação.
Espécies Voucher accD ITS matK NdhJ psbA-trnH rpoB rpoC1 Cattleya purpurata (Lindl. & para ITS Selby B.G. 84- Paxton) van den Berg 0459 (SEL) e para as EU139950.1 EU140285.1 AY396104.1 EU140324.1 EU140091.1 EU140172.1 EU140249.1 demais Brieger Coll. 1822 (ESA) Cattleya schilleriana Rchb.f. * Brieger Coll. 6640 (ESA) EU139908.1 EU139908.1 EU139982.1 EU140289.1 - EU140132.1 EU140211.1 Cattleya schofieldiana Rchb.f. BA Brieger Coll. 19216 (ESA) - AGB - - - - - (Bahia) * Cattleya schofieldiana Rchb.f. ES Brieger Coll. 6656 (ESA) EU139909.1 EU139909.1 EU139983.1 EU140290.1 EU140051.1 EU140133.1 EU140212.1 (Espírito Santo) * Cattleya sincorana (Schltr.) van sem voucher (Kew 1990- EU139952.1 AY008635.1 EU140018.1 EU140325.1 EU140093.1 EU140174.1 EU140255.1 den Berg 1998) Cattleya tenuis Campacci & C211-Machado s.n. (ESA) - AY008622.1 EU139985.1 EU140292.1 EU140053.1 EU140135.1 - Vedovello * Cattleya tigrina A.Rich. * sem voucher (Kew 1993- EU139911.1 AY008611.1 EU139986.1 EU140293.1 EU140054.1 EU140136.1 EU140214.1 2845) Cattleya velutina Rchb.f. * Brieger Coll. 7043 (ESA) EU139913.1 AY008618.1 EU139988.1 EU140295.1 EU140056.1 EU140138.1 EU140216.1
Cattleya violacea (Kunth) Rolfe * Brieger Coll. 28495 (ESA) EU139914.1 AF260206.1 EU139989.1 EU140296.1 EU140057.1 EU140139.1 EU140217.1
Cattleya walkeriana Gardner * Brieger Coll. 1627 (ESA) EU139915.1 AF260205.1 EU139990.1 EU140297.1 EU140058.1 EU140140.1 EU140218.1 Cattleya wallisii (Linden ex Brieger Coll. 28787 (ESA) EU139916.1 - - EU140298.1 EU140059.1 EU140141.1 EU140219.1 Rchb.f.) Rhyncholaelia digbyana (Lindl.) Brieger Coll. 6107 (ESA) - AY008583.1 EF079309.1 AGB AGB - AGB Schltr. Rhyncholaelia glauca (Lindl.) Para matK FLAS 200736 e - AY008584.1 AY396101.1 AGB AGB - AGB Schltr. para as demais MWC 1246 Os * indicam as espécies que compões o grupo bifoliado do gênero Cattleya. AGB = Aguardando número de aceso do GenBank.
62
ANEXO II Espécies analisadas indicando voucher para as sequências oriundas desse trabalho. Espécies Voucher agt1 atpH-atpH psbK-psbI rpl32-trnL trnD-trnT trnS-trnG ycf1 trnL-trnF Brassavola cucullata (L.) R.Br. MWC (6177) para trnL-trnF e W.E. Higgins 130 (FLAS 198290) para os demais AGB - AGB AGB AGB - AGB AF267058.1
Brassavola tuberculata Hook. Brieger Coll. 3497 (ESA) AGB AGB - AGB AGB AGB AGB AF267057.1 Cattleya aclandiae Lindl. * Brieger Coll. 32982 (ESA) AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB - Cattleya amethystoglossa Linden Brieger Coll. 8272 (ESA) AGB AGB AGB AGB AGB AGB - AGB & Rchb.f. ex Warner * Cattleya bicolor Lindl. BRA Brieger Coll. 22574 (ESA) - AGB AGB AGB AGB AGB AGB - (Brasília - 1) * Cattleya bicolor Lindl. BRA Brieger Coll. 22579 (ESA) - - - AGB - - - AGB (Brasília - 2) * Cattleya bicolor Lindl. DIA Brieger Coll. 30656 (ESA) AGB - - - AGB - AGB - (Diamantina) * Cattleya bicolor Lindl. FORM Brieger Coll. 4336 (ESA) AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB (Formiga - 1) * Cattleya bicolor Lindl. FORM Brieger Coll. 4333 (ESA) - - - AGB - AGB AGB - (Formiga - 2) * Cattleya bicolor Lindl. ITA Brieger Coll. 891 (ESA) AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB (Itatiaia) * Cattleya dormaniana (Rchb.f.) Brieger Coll. 23977 (ESA) AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB Rchb.f. * Cattleya elongata Barb.Rodr. (1) * Brieger Coll. 8078 (ESA) AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB Cattleya elongata Barb.Rodr. (2) * Brieger Coll. 32748 (ESA) - - - AGB - - - AGB Cattleya forbesii Lindl. * trnL-trnF: WEH 59 / demais, Brieger Coll. 5358 (ESA) - AGB AGB AGB AGB - AGB AY422405.1
Cattleya granulosa Lindl. * Brieger Coll. 22482 (ESA) AGB - - AGB AGB - AGB AF267051.1 Cattleya guttata Lindl. * Brieger Coll. 11299 (ESA) AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB
63
ANEXO II Continuação.
Espécies Voucher agt1 atpH-atpH psbK-psbI rpl32-trnL trnD-trnT trnS-trnG ycf1 trnL-trnF Cattleya harrisoniana Bateman ex Brieger Coll. 16036 (ESA) AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB Lindl. * Cattleya intermedia Graham ex Brieger Coll. 4095 (ESA) AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB Hook. * Cattleya kerrii Brieger & Bicalho Brieger Coll. 18765 AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB (1) * (HolotypO-HB) Cattleya kerrii Brieger & Bicalho Zaslawski s.n. (HUEFS) - - - AGB - - - AGB (2) * Cattleya labiata Lindl. (Ceara) Brieger Coll. 20545 (ESA) AGB - AGB AGB AGB AGB AGB AGB Cattleya labiata Lindl. Brieger Coll. 5487 (ESA) AGB AGB AGB AGB - - - AGB (Pernambuco) Cattleya lawrenceana Rchb.f. Brieger Coll. 3802 (ESA) AGB AGB AGB AGB AGB - - AGB Cattleya loddigesii Lindl. * Brieger Coll. 2483 (ESA) AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB Cattleya lueddemanniana Rchb.f. Brieger Coll. 3759 (ESA) AGB AGB AGB AGB - - AGB AGB Cattleya lundii (Rchb.f. & Warm) Brieger Coll. 30692 (ESA) AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB van den Berg Cattleya luteola Lindl. Brieger Coll. 32187 (ESA) AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB Cattleya nobilior Rchb.f. * Brieger Coll. 30978 (ESA) AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB Cattleya pfisteri (Pabst & Senghas) van den Berg C226 (ESA) AGB AGB AGB AGB - - AGB AGB van den Berg Cattleya porphyroglossa Linden & sem voucher (Kew 1986– AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB Rchb.f. (1) * 2034) Cattleya porphyroglossa Linden & sem voucher (LAMOL 389.2) Rchb.f. (2) * - - - AGB - - AGB AGB Cattleya purpurata (Lindl. & Brieger Coll. 1822 (ESA) AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB AF267024.1 Paxton) van den Berg Cattleya schilleriana Rchb.f. * Brieger Coll. 6640 (ESA) AGB AGB AGB AGB - AGB AGB AGB Cattleya schofieldiana Rchb.f. BA Brieger Coll. 19216 (ESA) - AGB - AGB - - AGB AGB (Bahia) * 64
ANEXO II Continuação.
Espécies Voucher agt1 atpH-atpH psbK-psbI rpl32-trnL trnD-trnT trnS-trnG ycf1 trnL-trnF Cattleya schofieldiana Rchb.f. ES Brieger Coll. 6656 (ESA) - - AGB AGB - - AGB - (Espírito Santo) * Cattleya sincorana (Schltr.) van sem voucher (Kew 1990- AGB AGB - AGB - AGB AGB AGB den Berg 1998) Cattleya tenuis Campacci & C211-Machado s.n. (ESA) AGB AGB AGB AGB AGB - - AGB Vedovello* Cattleya tigrina A.Rich. * sem voucher (Kew 1993- AGB - AGB AGB AGB AGB AGB AGB 2845) Cattleya velutina Rchb.f. * Brieger Coll. 7043 (ESA) AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB Cattleya violacea (Kunth) Rolfe * Brieger Coll. 28495 (ESA) AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB AGB Cattleya walkeriana Gardner * Brieger Coll. 1627 (ESA) AGB - AGB AGB AGB - AGB AGB Cattleya wallisii (Linden ex Brieger Coll. 28787 (ESA) ------AGB Rchb.f.) Rhyncholaelia digbyana (Lindl.) Brieger Coll. 6107 (ESA) AGB AGB - AGB AGB AGB AGB AGB Schltr. Rhyncholaelia glauca (Lindl.) MWC 1246 AGB AGB - AGB AGB - AGB AGB Schltr. Os * indicam as espécies que compões o grupo bifoliado do gênero Cattleya. AGB = Aguardando número de aceso do GenBank.
65
Anexo III. Variação floral entre as espécies do grupo bifoliado. Clado A (A, C. nobilior; B, C. violacea; C, C. walkeriana). D, C. aclandiae. Clado B (E, C. loddigesii; F, C. intermedia; G, C. dormaniana; H, C. porphyroglossa). Destaque para o padrão de coloração rosa presente nos dois clados e exposição da coluna no clado A e em C. aclandiae. (Fotos: Cássio van den Berg). 66
Anexo IV. Variação floral entre as espécies do grupo bifoliado. Algumas espécies representantes do Clado C (I e J, C. elongata. L, C. bicolor. M, C. tenuis. N, C. kerrii. O, C. amethystoglossa. P, C. schilleriana. Q, C. tigrina. R, C. guttata. S, C. velutina. Destaque para o padrão de pigmentação das sépalas e pétalas presente nas espécies, bem como o hábito rupícola em C. elongata diferente de todas as demais espécies. (Fotos: de I- P e S, Cássio van den Berg; Q e R, © Google, 2011).