UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS PROGRAMA DE PÓS- GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA Conservação genética de Cattleya granulosa Lindley: uma orquídea ameaçada de extinção
Tese de Doutorado
Cristiane Gouvêa Fajardo
Orientador: Dr. Wagner Franco Molina Co-orientador: Dr. Fábio de Almeida Vieira
Natal-RN 2014
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CRISTIANE GOUVÊA FAJARDO
Conservação genética da orquídea Cattleya granulosa Lindley
Tese de Doutorado apresentada como requisito para a obtenção do título de Doutor, pelo Programa de Pós Graduação em Ecologia, Área de Ecologia Terrestre, Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Natal RN 2014
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“O mundo é um lugar perigoso de se viver, não por causa daqueles que fazem o mal, mas sim por causa daqueles que observam e deixam o mal acontecer.”
Albert Einstein
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SUMÁRIO Apresentação ...... 1 Resumo ...... 2 Abstract ...... 3 Introdução ...... 4 Objetivos ...... 8 Referências ...... 9
Capítulo 1 Conservação Genética de Populações Naturais: Uma Revisão para Orchidaceae ...... 12 1. Resumo ...... 13 2. Abstract ...... 14 3. Introdução ...... 15 4. Conservação genética e ecologia molecular ...... 16 4.1. Aplicações ...... 16 4.2. Unidades evolutivas significativas ...... 17 4.3. Conservação e filogeografia: O que conservar? ...... 18 5. Conservação Genética em Orchidaceae ...... 21 6. Considerações finais ...... 32 7. Referências ...... 33 Capítulo 2 Distribuição espacial de Cattleya granulosa Lindl.: uma orquídea ameaçada de extinção ...... 42 1. Resumo ...... 43 2. Abstract ...... 44 3. Introdução ...... 44 4. Material e Métodos ...... 46 5. Resultados e Discussão ...... 49 6. Conclusões ...... 53 7. Referências ...... 53
Capítulo 3 Interspecific Genetic Analysis of Orchids in Brazil Using Molecular Markers ...... 56 1. Abstract ...... 58 2. Introduction ...... 59 3. Material and Methods ...... 60 4. Results ...... 62 5. Discussion ...... 63 6. References ...... 67
Capítulo 4 Estrutura genética de Cattleya granulosa Lindley: uma orquídea ameaçada da Floresta Atlântica Brasileira ...... 76 1. Resumo ...... 77 2. Abstract ...... 78 3. Introdução ...... 79 4. Material e Métodos ...... 81 5. Resultados ...... 86 6. Discussão ...... 94 7. Implicações para Conservação de C. granulosa ...... 100 8. Referências ...... 102
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APRESENTAÇÃO
A presente tese está organizada em quatro capítulos que correspondem aos artigos elaborados com base nos resultados obtidos para a espécie Cattleya granulosa Lindl. (Orchidaceae). O primeiro capítulo corresponde ao artigo “Conservação genética de populações naturais: uma revisão para Orchidaceae”, preparado para envio à revista Annual Review & Research in Biology . Esse artigo teve como objetivo revisar e propor uma discussão sobre a importância da conservação genética para a elaboração de estratégias conservacionistas adequadas à distribuição espacial da diversidade genética, sendo apresentados e contextualizados exemplos de estudos de conservação genética e filogeografia para família Orchidaceae. O segundo capítulo se refere à “Distribuição espacial de Cattleya granulosa Lindl.: uma orquídea ameaçada de extinção” que foi enviado na forma de artigo para a revista FLORAM (Floresta e Ambiente ) e teve como objetivo avaliar os níveis de agregação espacial em uma população de Cattleya granulosa Lindl.e analisar as possíveis causas associadas. O terceiro capítulo corresponde ao artigo “Interspecific genetic analysis of orchids in Brazil using molecular markers” o qual foi aceito para publicação no periódico Plant Systematics and Evolution e discute as relações filogenéticas de Cattleya granulosa Lindl. com outras quatro espécies de Epidendroideae, Brassavola tuberculata Hook, Cattleya bicolor Lindl, Cattleya labiata Lindl. e Cattleya schofieldiana Rchb.f., utilizando marcadores ISSR. O quarto capítulo, intitulado “Estrutura genética de Cattleya granulosa Lindley: uma orquídea ameaçada da Floresta Atlântica Brasileira” será submetido ao periódico Biodiversity and Conservation e teve como objetivo avaliar a diversidade genética de 12 populações de Cattleya granulosa , auxiliando nas estratégias de conservação.
Natal, 08 de fevereiro de 2014.
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Resumo Cattleya granulosa Lindl. é uma orquídea de grande porte endêmica de fragmentos de Floresta Atlântica do litoral do Nordeste brasileiro. A facilidade de coleta, singularidade de suas flores, que possuem cores variadas entre o verde e castanho avermelhado, e distribuição em áreas costeiras de interesse econômico tornam suas populações um alvo constante da coleta predatória, que também sofrem degradação ambiental. Devido ao impacto gerado em suas populações, a espécie está ameaçada. Este estudo teve como objetivos avaliar os níveis de agregação espacial em uma população preservada, analisar as relações filogenéticas de C. granulosa Lindl. com outras quatro espécies de Laeliinae (Brassavola tuberculata , C. bicolor , C. labiata e C. schofieldiana ) e ainda avaliar a diversidade genética remanescente de 12 populações de C. granulosa , por meio de marcadores ISSR. Verificou se especificidade da epífita C. granulosa Lindl. com um único forófito, indivíduos arbóreos de Eugenia sp. C. granulosa Lindl. possui padrão espacial agregado, com maior densidade de vizinhos no raio de até 5 m. Quanto às relações filogenéticas e padrões genéticos com outras espécies do gênero, C. bicolor exibiu o maior índice de diversidade genética (H E = 0,219), enquanto C. labiata exibiu o nível mais baixo (H E = 0,132). A porcentagem de variação genética entre as espécies (AMOVA) foi de 23,26%. A análise de componentes principais (PCA) mostrou divergência genética entre as espécies unifoliadas e bifolioladas. A PCA também indicou uma relação estreita entre C. granulosa Lindl. e C. schofieldiana , que é considerada por muitos pesquisadores uma variedade de C. granulosa . Análises genéticas populacionais utilizando ISSR apresentaram todos os locos polimórficos. A alta diferenciação genética das populações (ФST = 0,391; P < 0,0001) determinou a estruturação em nove grupos, conforme modelo Log likelihood da análise Bayesiana, com padrão similar no dendrograma (UPGMA) e PCA. Uma correlação positiva e significativa entre as distâncias geográficas e genéticas foi identificada entre as populações (r = 0,794; P = 0,017), indicando o isolamento pela distância. Padrões de diversidade alélica sugerem a ocorrência de gargalos populacionais na maioria das populações de C. granulosa Lindl. (n = 8) . Os dados genéticos obtidos permitem indicar que a manutenção da diversidade genética da espécie é complexa e está diretamente relacionada com a conservação de diversas unidades ou grupos que estão espacialmente distantes. Palavra-chave: Epífita, Filogenia, Genética de Populações, Mata Atlântica, Orchidaceae, Gargalos Genéticos.
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Abstract
Cattleya granulosa Lind is a large and endemic orchid in Atlantic Forest fragments in Northeast Brazil. The facility of collecting, uniqueness of their flowers, which have varying colors between green and reddish brown, and distribution in coastal areas of economic interest make their populations a constant target of predation, which also suffer from environmental degradation. Due to the impact on their populations, the species is threatened. In this study, we evaluate the levels of spatial aggregation in a preserved population, analyze the phylogenetic relationships of C. granulosa Lindl. with four other Laeliinae species ( Brassavola tuberculata , C. bicolor , C. labiata and C. schofieldiana ) and also to evaluate the genetic diversity of 12 remaining populations of C. granulosa Lindl. through ISSR. There was specificity of epiphytic C. granula Lindl. with a single host tree, species of Eugenia sp. C. granulosa Lindl. own spatial pattern, with the highest density of neighbors within up to 5 m. Regarding the phylogenetic relationships and genetic patterns with other species of the genus, C. bicolor exhibited the greatest genetic diversity (H E = 0.219), while C. labiata exhibited the lowest level (H E = 0.132). The percentage of genetic variation among species (AMOVA) was 23.26%. The principal component analysis (PCA) of ISSR data showed that unifoliate and bifoliolate species are genetically divergent. PCA indicated a close relationship between C. granulosa Lindl. and C. schofieldiana , a species considered to be a variety of C. granulosa Lindl. by many researchers. Population genetic analysis using ISSR showed all polymorphic loci. The high genetic differentiation between populations (Ф ST = 0.391, P < 0.0001) determined the structure into nine groups according to log likelihood of Bayesian analysis, with a similar pattern in the dendrogram (UPGMA) and PCA. A positive and significant correlation between geographic and genetic distances between populations was identified (r = 0.794, P = 0.017), indicating isolation by distance. Patterns of allelic diversity suggest the occurrence of population bottlenecks in most populations of C. granulosa Lindl. (n = 8). Genetic data indicate that enable the maintenance of genetic diversity of the species is complex and is directly related to the conservation of different units or groups that are spatially distant. Keyword: Epiphyte, Phylogeny, Population Genetics, Atlantic Forest, Orchidaceae, Bottlenecks.
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Introdução
Aspectos biológicos e de distribuição da espécie Cattleya granulosa Lindl. Orchidaceae possui distribuição cosmopolita, porém predominantemente tropical. É constituída por cerca de 850 gêneros e 20.000 espécies, sendo considerada a família mais numerosa das Angiospermas (World Checklist of the Monocotyledons 2006). A maior diversidade desta família encontra se na região Neotropical com cerca 200 gêneros e 2.500 espécies (Souza & Lorenzi, 2008). Em todas as formações vegetais brasileiras há a ocorrência de orquídeas, contudo elas são mais numerosas nas formações florestais úmidas, principalmente, no domínio da Mata Atlântica, onde se encontra o maior endemismo e riqueza de gêneros e espécies (Stehmann et al., 2009; Barros et al., 2010). Entre as Angiospermas, Orchidaceae contém a maior proporção de espécies em vias de extinção com cerca de 6% das espécies de orquídeas consideradas diretamente ameaçadas (Hopper & Brown, 2007). Desta forma, é caracterizada a necessidade de estudos intensivos e mais específicos. O gênero Cattleya Lindl. é exclusivamente Neotropical, possui ampla distribuição pelo Brasil com aproximadamente 30 espécies, das quais 25 são endêmicas (Pabst & Dungs, 1975). Cattleya é muito importante na floricultura e tem sido cultivado desde o século XIX (Pinheiro et al., 2012). Devido ao elevado valor ornamental este gênero é um dos mais importantes da família e todas as espécies são coletadas intensamente na natureza para cultivo. O extrativismo descontrolado tem provocado o desaparecimento das populações de orquídeas e consequentemente, muitas espécies estão em risco de extinção (Cruz et al., 2003, Camara Neto et al., 2007, Ramalho & Pimenta, 2010). Dentre as espécies de Cattleya , a C. granulosa Lindl. (Figura 1), por exemplo, encontra se na lista oficial das espécies ameaçadas de extinção da flora brasileira elaborada pela Fundação Biodiversitas sob encomenda do Ministério do Meio Ambiente (MMA, 2008; Martinelli & Moraes, 2013). De acordo com os critérios da International Union for Conservation of Nature , IUCN, ela está na categoria de vulnerável (Martinelli & Moraes, 2013).
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a b c d e f Figura 1: Espécimes da orquídea Cattleya granulosa Lindl. encontradas nas populações do Rio Grande do Norte (a, b, c, d, e, f) (Foto: Edson Mat tos)
Cattleya granulosa Lindl. possui caules rizomatosos com pseudobulbos, eretos, cilíndricos que podem atingir de 40 a 60 cm de altura, e que dá origem
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ao nome popular “canela de ema”. No ápice do pseudobulbo encontram se duas ou três folhas coriáceas e carnosas revestidas por uma camada de cutícula brilhosa, assim como, uma espata simples com inflorescência racemosa terminal contendo de 1 a 9 flores laxas distribuídas numa espiral em torno de uma curta raque de 8 a 10 cm de diâmetro (Costa, 2010). A espécie é epífita com flores bilateralmente simétricas e três sépalas petaloides carnosas, sendo uma dorsal e duas laterais com cores que variam entre os tons esverdeados, amarelados e castanhos avermelhados apresentando se, na maioria das vezes, com manchas granulares na cor vinácea (Camara Neto et al., 2007). Cattleya granulosa Lindl. caracteriza se pela presença de osmóforos localizados na parte interna dos lobos laterais do labelo que exalam odor fortemente adocicado e guias de néctar no labelo que absorvem luz ultravioleta. Mimetizam um modelo geral de flor tipicamente melitófila, porém produzem pouco néctar floral e podem estar atuando com um mecanismo de engodo. Além disso, C. granulosa Lindl. é autocompatível, porém dependente de polinizador para sua reprodução (Costa, 2010). A espécie ocorre preferencialmente em região litorânea do Nordeste do Brasil e mais raramente em Floresta Montanhosas (Felix e Lima, 2002). Desenvolve de forma preferencial em áreas compreendidas entre dois a 20 Km da orla marítima, restrita a fragmentos de Floresta Atlântica do Nordeste do Brasil, sendo encontrada desde o nível do mar até o topo de algumas dunas. Ocorrendo especialmente no Rio Grande do Norte, mas também em Pernambuco, Alagoas, Paraíba, Bahia e Espírito Santo (Barros et al., 2014). Como as epífitas em geral, Cattleya granulosa Lindl. constitui um potencial indicador biológico de qualidade de hábitat, pois o ambiente de ocorrência da espécie é sensível às interferências antrópicas em virtude da ocupação de nichos especializados (Camara Neto et al., 2007). Entretanto, a espécie é particularmente visada por colecionadores pela beleza, facilidade de ser encontrada e o alto valor de mercado. Todavia as extrações constantes e perda de hábitats têm comprometido seriamente a integridade da espécie. O dano ambiental, embora ainda com extensão desconhecida, se mostra de difícil reparação, sobretudo em relação às restrições que alcance o retorno ao estado original (Ramalho & Pimenta, 2010). De fato, apesar da importância ecológica, C. granulosa Lindl. encontra se ameaçada pelo desenvolvimento urbano
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acelerado, crescimento da especulação imobiliária e coleta predatória (Camara Neto et al., 2007), merecendo pesquisas urgentes visando determinar seu estado atual de conservação.
Perda e isolamento de hábitats: implicações na estrutura genética das populações naturais A fragmentação das florestas nativas, assim como a extração ilegal de orquídeas, tiveram uma influência forte na extinção local de muitas espécies. Atualmente, a família Orchidaceae é um dos melhores exemplos nos quais as espécies em extinção resultam das atividades humanas (Ávila Diaz & Oyama, 2007). Com isso, há um aumento da demanda por informações científicas oriundas das áreas de genética de populações, evolução e biologia da conservação para as orquídeas, visando à conservação e definição de estratégias de preservação da biodiversidade. As inferências de conservação genética e filogeográficas permitem compreender sobre a evolução das espécies em seus biomas de ocorrência, bem como desenvolver estratégias de conservação que maximizem a diversidade genética da espécie e preservem os processos evolutivos (Avise, 2000). A manutenção da diversidade genética entre e dentro das populações é algo crítico, e é objeto de estudo para programas de conservação em longo prazo. A alta diversidade genética nas populações permite as espécies adaptarem se melhor a mudanças ambientais e determinar sua capacidade evolutiva (Futuyma, 2002). De fato, análises no campo demonstraram a existência de uma correlação positiva entre os níveis de diversidade genética e a aptidão em plantas (Schmidt & Jensen, 2000). Para espécies em risco de extinção, a identificação de populações e genótipos divergentes é um passo importante para definir unidades de conservação com importância evolutiva (Ávila Diaz & Oyama, 2007). Os poucos estudos de genética de populações de orquídeas enfocaram geralmente as plantas terrestres (Trapnell et al. 2004). Em contraste, apesar da alta diversidade de espécies e importância ecológica de espécies epífitas, estas têm recebido menos atenção, provavelmente por causa das dificuldades ao acessar o dossel e a estrutura metapopulacional dos mesmos (Trapnell et
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al. 2004; Trapnell & Hamrick, 2005). Tais estudos têm revelado que espécies de fecundação cruzada têm maior diversidade genética do que espécies de autofecundação e apomíticas (Sun & Wong, 2001; Wallace, 2004), espécies de maior distribuição geográfica em geral apresentam maiores níveis de variação genética do que espécies endêmicas e de distribuição restrita (Case et al., 1998; Borba et al., 2001) e, frequentemente, grandes populações têm maior diversidade genética (Gustafsson, 2000; Cozzolino et al., 2003). A avaliação das consequências da redução e isolamento de populações é fundamental para predizer o destino de espécies em fragmentos florestais e para o planejamento efetivo de programas de manejo em pequenas áreas de floresta (Vieira et al., 2012). Em populações pequenas e isoladas, como os indivíduos se tornam restritos a pequenos fragmentos, ocorre o isolamento espacial entre as populações remanescentes (Young et al., 1996). Tais alterações refletem nos processos de deriva genética, fluxo gênico, seleção e no sistema de cruzamentos (Couvet, 2002). Sendo esses processos determinantes do grau de diversidade genética na espécie, bem como sua distribuição entre indivíduos e populações. Os principais efeitos genéticos são a mudança na estrutura genética populacional e o aumento da endogamia, que podem acarretar fortes prejuízos às populações de orquídeas (Alcantara et al., 2006). Apesar da grande diversidade de espécies de Orchidaceae, a família é caracterizada por possuir um baixo sucesso reprodutivo devido à limitação de polinização. O sucesso reprodutivo é desviado para alguns indivíduos em uma população e muitas vezes o tamanho efetivo populacional torna se pequeno. A estrutura espacial da população, o sucesso reprodutivo e fluxo gênico entre as populações sugerem que, em muitas situações, a deriva genética pode ser tão importante como a seleção na promoção da variação genética e morfológica nesta família (Tremblay et al., 2005). Orchidaceae representa um excelente exemplo de diversificação rápida de espécies, incluindo a irradiação adaptativa, propiciando a investigação sobre uma grande quantidade de processos ecológicos e evolutivos (Tremblay et al., 2005). Em geral, o potencial de reprodução e fluxo gênico de muitas populações de orquídeas é comprometido devido aos elevados níveis de endemismo, dispersão esporádica e perda de hábitat. Para as espécies que já
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estão ameaçadas de extinção, reduções no fluxo gênico podem afetar rapidamente o valor adaptativo (Pinheiro et al, 2012). Percebe se que atualmente a destruição do hábitat é a maior ameaça para a sobrevivência das populações de C. granulosa . Algumas populações encontram se seriamente ameaçadas de extinção, devido principalmente ao reduzido número de indivíduos e isolamento espacial das populações, consequência da expansão imobiliária e à exploração extrativista (Ramalho & Pimenta, 2010). Considerando esse perfil demográfico para a espécie e associando o às predições teóricas, esperam se baixos níveis de variação genética dentro das populações e altos níveis de diferenciação genética entre as populações, devido especialmente à deriva genética e a limitada dispersão de genes, que têm efeito significativo em populações reduzidas (Couvet, 2002). Assumindo este cenário, hipotetiza se que as populações atuais da espécie sofreram recentes gargalos genéticos ( bottlenecks ), com significativos decréscimos no tamanho efetivo populacional. Objetivos
Objetivo Geral Acessar a distribuição espacial da variabilidade genética de populações de Cattleya granulosa , o nível de diferenciação genética em relação a outras espécies do gênero Cattleya e proposições para a conservação biológica da espécie.
Objetivos Específicos i. Revisar estudos de diversidade genética e conservação genética dentro da família Orchidadeae; ii. Caracterizar o padrão espacial de distribuição dos indivíduos de C. granulosa Lindl. dentro de uma população modelo e inferir aspectos de sua dispersão; iii. Estimar o nível de diversidade genética e o grau de parentesco entre cinco espécies de Laeliinae por meio de marcadores ISSR . iv. Avaliar a diversidade genética inter e intrapopulacional de C. granulosa .
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______CAPÍTULO 1
CONSERVAÇÃO GENÉTICA DE POPULAÇÕES NATURAIS: UMA REVISÃO PARA ORCHIDACEAE
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CONSERVAÇÃO GENÉTICA DE POPULAÇÕES NATURAIS: UMA REVISÃO PARA ORCHIDACEAE
Cristiane Gouvêa Fajardo 1, Fábio de Almeida Vieira 1, Wagner Franco Molina 2
1 Unidade Acadêmica Especializada em Ciências Agrárias, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, UFRN, Macaíba/RN. 2 Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, UFRN, Natal/RN.
Resumo
Esta revisão apresenta a importância da conservação genética para a elaboração de estratégias conservacionistas adequadas à distribuição espacial da diversidade genética, sendo apresentados e contextualizados exemplos de estudos de genética de populações e filogeografia na família Orchidaceae. O principal foco da biologia da conservação é a compreensão e a manutenção da diversidade genética, já que ela fornece o potencial adaptativo e evolutivo de uma espécie. Deste modo, o conhecimento da diversidade genética de uma espécie é primordial para as ações de conservação e manejo. Os níveis de variabilidade genética podem ser determinados pela estrutura populacional de uma espécie, sendo o resultado de características reprodutivas e demográficas, ocasionadas pela interação e ação uma série de mecanismos evolutivos e ecológicos. A avaliação da estrutura populacional das espécies permite descobrir as Unidades Evolutivas Significativas (UESs), que devem ser explicitamente definidas em características que realcem o potencial para a sobrevivência da espécie. Por conseguinte, é necessário que haja um foco na preservação da diversidade funcional. Técnicas genéticas são essenciais, pois fornecem estimativas de fluxo gênico entre as populações e, assim, norteiam os esforços para sustentar os níveis genéticos e intercâmbio entre as populações. Os métodos filogenéticos e filogeográficos contribuem para responder diversas questões em biologia da conservação, como quais são os locais prioritários para a conservação, quais espécies conservar e quais são os esforços conservacionistas necessários. E, finalmente, delineiam as estratégias que devem ser tomadas para conservar a maior quantidade de diversidade genética, visando manter o potencial evolutivo de uma espécie ou população.
Palavras-chave: ecologia molecular, espécie ameaçada, estratégias de conservação, diversidade genética, unidades evolutivas significativas.
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CONSERVATION GENETICS OF NATURAL POPULATIONS: A REVIEW FOR ORCHIDACEAE
Abstract
This review shows the importance of genetic conservation for developing appropriate conservation strategies to the spatial distribution of genetic diversity, and is presented and contextualized examples of studies of population genetics and phylogeography in the Orchidaceae. The main focus of conservation biology is the understanding and maintenance of genetic diversity, since it provides the adaptive and evolutionary potential of a species. Therefore, knowledge of the genetic diversity of a species is essential for the conservation and management actions. Levels of genetic variability may be determined by the population structure of a species as the result of reproductive and demographic characteristics, caused by the interaction and action a number of evolutionary and ecological mechanisms. The evaluation of the population structure of the species allows discovering the Evolutionarily Significant Units (ESUs) that must be explicitly defined features which enhance the potential for the survival of the species. Therefore, there must be a focus on preservation of functional diversity. Genetic techniques are essential because they provide estimates of gene flow between populations and thereby guide the efforts to sustain the levels and genetic exchange between populations. Phylogenetic and phylogeographic contribute to answer various questions in conservation biology. As which sites are priorities for conservation, which conserve species, which conservation efforts are needed. And, finally, how to save the most amount of genetic diversity to maintain the evolutionary potential of a species or population.
Keywords: Molecular ecology, endangered species, conservation strategies, genetic diversity, evolutionarily significant units.
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Introdução
A compreensão e a manutenção da diversidade genética é um dos principais focos da biologia da conservação, já que é ela que fornece o potencial adaptativo e evolutivo de uma espécie (Moritz, 1994). Dessa forma, o conhecimento da diversidade genética de uma espécie é primordial para as ações de conservação e manejo. Os níveis de variabilidade genética podem ser determinados pela estrutura populacional de uma espécie, sendo o resultado de características reprodutivas e demográficas, ocasionadas pela interação e uma série de mecanismos evolutivos e ecológicos (eg. Alvarez Buylla et al., 1996; Smithson, 2006; Vieira et al., 2012). Neste sentido, é fundamental avaliar se os padrões de estruturação da diversidade genética se devem às características naturais da espécie, ou consequência de barreiras físicas, muitas vezes produzidas por ações antrópicas, como o processo de fragmentação do hábitat (Frankham et al., 2008). A fragmentação dos ecossistemas provoca uma descontinuidade da distribuição da vegetação original, acarretando importantes reduções nos hábitats disponíveis às plantas e animais silvestres. Este processo pode levar a perdas da biodiversidade e mudanças na distribuição e abundância dos vegetais, associadas aos padrões de dispersão e migração (Olson, 2001). Estudos em biologia da conservação têm procurado integrar disciplinas como a ecologia, a sistemática baseada em dados moleculares e a genética de populações, criando uma área de investigação científica denominada Conservação Genética (Frankham, 1995). Nas últimas décadas houve tentativas de unir os princípios teóricos da Genética de Populações, interessada nas alterações de frequências alélicas e genotípicas, com os princípios teóricos da Ecologia de Populações, preocupados em entender as relações de causa e efeito na regulação do número de indivíduos. Assim, surgiu a Biologia de Populações, que vem oferecendo embasamento teórico consistente para analisar e interpretar, sob o enfoque evolutivo, a dinâmica populacional (Simberloff, 1988). Na medida em que os processos de evolução e especiação por seleção natural ocorrem de forma variável em cada local, a distribuição espacial da diversidade genética segue padrões geográficos (Wright, 1931). Nesse contexto, uma espécie pode ter distribuição cosmopolita ou seguir padrões de 16
endemismo de acordo com as variações e barreiras geográficas. Uma explicação possível para a distribuição da diversidade genética de um táxon é a de que sua distribuição geográfica atual deve se a uma dispersão a partir da região na qual a linhagem evoluiu originalmente (Guo et al., 2012). Tanto a partir da dispersão, com a qual um novo ambiente pode ser ocupado, quanto por mudanças na distribuição espacial associada a processos de isolamento geográfico, muitos padrões de vicariância foram produzidos, e, consequentemente, de endemismo (Kruckeberg & Rabinowitz, 1985). Neste sentido, métodos filogenéticos e filogeográficos são ferramentas importantes para a genética de populações (Moritz & Faith 1998; Newton et al., 1999), que podem contribuir para responder algumas questões em biologia da conservação: O que conservar? Onde focalizar os esforços conservacionistas? Como conservar a maior quantidade de diversidade genética visando manter o potencial evolutivo de uma espécie ou população? O objetivo deste trabalho é revisar a importância da conservação genética para a elaboração de estratégias conservacionistas adequadas à distribuição espacial da diversidade genética, sendo apresentados e contextualizados exemplos de estudos de conservação genética e filogeografia na família Orchidaceae. Conservação Genética e Ecologia Molecular
Aplicações
Atualmente a Conservação Genética e a Ecologia Molecular são duas áreas amplamente sobrepostas, uma vez que grande parte dos estudos considerados como pertencendo à Ecologia Molecular trata da utilização de polimorfismo genético em populações naturais como base para a compreensão de fenômenos evolutivos, demográficos ou ecológicos (Milligan et al., 1994), os quais devem ser considerados nas estratégias de conservação genética dos táxons (Vieira & Carvalho, 2008). A reconstrução do padrão evolutivo pode determinar prioridades para a conservação biológica. Isto inclui a investigação das relações filogenéticas, ou taxa supra específicos, que visam compreender os processos evolutivos e
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biogeográficos que atuam em determinado grupo, ou ainda, definir problemas de sistemática envolvendo espécies ameaçadas (Moritz, 1995). Essas averiguações podem ter grande influência no delineamento de políticas para a preservação do grupo em questão (O´Brien & Mayr, 1991). Uma proposta relevante, por exemplo, seria a de que taxa distantes filogeneticamente, ou seja, que não apresentam grupos irmãos próximos, devam ser priorizados para fins de esforços de conservação em relação a outros que pertencem a grupos amplamente representados na biota atual (Eizirik, 1996). Desde a sua concepção, a Genética da Conservação tem se concentrado nas consequências genéticas de populações pequenas, que podem limitar a sobrevivência de espécies (Frankel, 1974). Além disso, contribui com a resolução de incertezas taxonômicas e unidades de gestão (Bytebier et al., 2007), e do uso de análises genéticas moleculares em medicina forense e compreensão da biologia das espécies (Chen et al., 2012). Os marcadores genéticos auxiliam nos programas de conservação genética, monitoram espécies raras e ameaçadas e permitem identificar potencial de resiliência, capacidade evolutiva e taxa de sobrevivência das futuras gerações (Kramer & Havens, 2009). A reorganização do padrão evolutivo em nível infraespecífico é também de grande importância para a determinação de estratégias adequadas para a conservação biológica, pois permite a identificação de estrutura geográfica e subdivisões populacionais históricas e ou atuais em espécies ameaçadas (Avise et al., 1987). Estudos destes padrões filogeográficos têm sido extremamente úteis na definição de unidades para a conservação e que se baseiam primariamente em filogenias intraespecíficas de linhagens do mtDNA (Avise et al., 1987), ou cpDNA para plantas (Beheregaray, 2008).
Unidades evolutivas significativas
Ryder (1986) definiu o conceito de Unidades Evolutivas Significativas (UESs) ( Evolutionary Significant Unit ). De acordo com Waples (1991) as UESs seriam populações que estão reprodutivamente separadas e possuem adaptações únicas. Desde então, as UESs vem sendo discutidas e aprofundadas por diversos autores (Vogler et al., 1993; Moritz, 1994): uma UESs consiste essencialmente de uma população ou grupo de populações que
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se encontram diferenciados em termos ecológicos, genéticos, e morfológicos, de populações próximas, refletindo uma história de isolamento geográfico em níveis variáveis. Esses grupos possuem características próprias, e merecem ser considerados como unidades independentes para fins de conservação. A maneira de definir estas unidades certamente depende de como interpretar os padrões de variação observados entre populações no contexto da história de vida de cada espécie, sua evolução e biogeografia (Cavers et al., 2003). Segundo Moritz (1994) o critério genético para a definição de UESs seria: “ devem ser reciprocamente monofiléticas para ‘alelos’ no mtDNA e oferecer divergência significativa nas frequências alélicas em loci nucleares ”. Esta definição é bastante consistente em termos operacionais e refletiria o padrão e a antiguidade da separação geográfica entre os grupos populacionais de animais e plantas. Unidades Evolutivas Significativas devem ser explicitamente definidas em características que realcem o potencial para a sobrevivência da espécie. Portanto, é necessário que haja um foco na preservação da diversidade funcional (Crandalla et al., 2000). Técnicas genéticas são essenciais, pois fornecem estimativas de fluxo gênico entre as populações e, assim, norteiam os esforços para sustentar os níveis genéticos e intercâmbio entre as populações. Adicionalmente, a rede de conexões genéticas entre populações é a teia que mantém o potencial para evolução (Manni et al., 2004). Assim, ao invés de focar apenas em populações isoladas, os esforços devem ser guiados para a manutenção da diversidade ao longo da paisagem de ocorrência natural das espécies (Storfer et al., 2007).
Conservação e filogeografia: o quê conservar?
A diversidade genética é componente fundamental da biodiversidade e sua proteção deve ser incorporada às ações e políticas conservacionistas. Entretanto, questiona se a eficiência dos conceitos e métodos usados para verificar o valor da conservação da diversidade genética em relação à distribuição geográfica. Assim, a utilização de métodos filogeográficos pode ser útil para identificar conjuntos de espécies com histórias de vicariância comuns (Moritz & Faith, 1998).
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Há 25 anos, Avise e colaboradores propuseram a integração da filogenia e da genética de populações para investigar a ligação entre os fenômenos micro e macro evolutivos, e esse novo campo foi denominado filogeografia (Avise et al., 2008). O termo filogeografia foi proposto primeiramente para descrever a área de estudo que se ocupa dos princípios e processos que direcionam a distribuição das linhagens genealógicas, especialmente aquelas em nível intraespecífico. A filogeografia associa a filogenia à biogeografia, no intuito de contribuir para o planejamento da conservação, revelando rompimentos históricos entre populações e espécies, ou ainda áreas com alta diversidade genética e endemismo (Beheregaray, 2008). Espécies geneticamente próximas apresentam divisões filogeográficas similares provavelmente causadas pelas mesmas barreiras, favorecendo estratégias de conservação fundamentadas nas UESs (Criscione et al., 2007). Desta forma, a filogeografia permite a detecção de áreas prioritárias para conservação fundamentadas em altos níveis de diversidade genética e endemismo (Newton, 1999). Descrições hierárquicas, como a construção de árvores genealógicas baseadas em marcadores nucleares ou de organelas (mtDNA ou cpDNA), podem refletir relações filogenéticas entre populações e espécies (Gros Louis et al., 2005). Nesse contexto de avaliação da biodiversidade, privilegia se o uso de filogenias moleculares interespecíficas para esclarecer distinções filogenéticas e seu valor para conservação (Crozier, 1997). Na abordagem filogenética, grupos monofiléticos representam linhagens historicamente isoladas, sendo definidas como UESs (Moritz & Faith, 1998). Uma abordagem complementar à análise de diversidade filogenética é a comparação de filogeografia intraespecífica para diferentes espécies de distribuição geográfica similar, visando identificar áreas entre as quais tais comunidades coevoluíram independentemente durante algum tempo, devido a eventos de vicariância (Bell et al., 2011). Desta maneira, a filogeografia comparativa permite identificar UESs intraespecíficas e assembleias de espécies, incorporando a informação espacial em escala regional à diversidade genética, e permitindo o planejamento adequado das estratégias de conservação da biodiversidade (Moritz & Faith, 1998).
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Três passos devem ser seguidos numa investigação filogeográfica comparativa (Bermingham & Moritz, 1998): 1) definir áreas apropriadas para análise, seja por critérios externos à informação genética, como biogeografia da espécie, dados históricos da paisagem e anseios conservacionistas, ou então, os próprios dados genéticos podem ser utilizados para definir as áreas de populações distintas; 2) determinar se existe história de vicariância entre as áreas comparadas, indicando convergência de padrões filogeográficos entre espécies ou o reconhecimento de barreiras biogeográficas; 3) identificar combinações de áreas visando maximizar a diversidade total a ser representada. O uso da filogeografia comparativa para identificar áreas ou comunidades evolutivamente distintas vem buscando a avaliação qualitativa da similaridade entre filogenias (Marcili et al., 2009). Podem se avaliar padrões de distribuição espacial da diversidade genética influenciados por eventos de vicariância que moldaram comunidades de localidades distintas (Bremer et al., 2005), e determinar valores para a conservação de áreas prioritárias. Portanto, espera se que a distribuição da diversidade genética e o endemismo de espécies como medidas de biodiversidade estejam em concordância quando submetidas por forças históricas similares, isto é, histórias de vicariância comuns (Adamowicz et al., 2004). Previsões recentes sobre as perspectivas da filogeografia evidenciam um grande avanço nos estudos (Hickerson et al., 2009). A próxima fase provavelmente abrangerá de forma interativa análises múltiplas de táxons por meio de modelos coalescentes, estudos genômicos de seleção natural, modelagem de nicho ecológico, inferências sobre a especiação em comunidades e a evolução de características funcionais (Carstens & Richards, 2007). As abordagens filogeográficas e de conservação genética podem ser particularmente úteis para identificar barreiras biogeográficas e refúgios, para testar modelos demográficos alternativos, na identificação de padrões demográficos concordantes inter e intraespecífico para um único ecossistema e na análise de conservadorismo do nicho temporal (Scoble & Lowe, 2010). Os marcadores moleculares têm muito a oferecer à modelagem de distribuição de espécies, em particular na compreensão da dinâmica histórica dos haplótipos (demografia) em função de variações climáticas (Jakob et al., 2007). Além
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disso, incorporar os conhecimentos adquiridos por meio desses estudos permitirá aos gestores de conservação definir estratégias eficientes para a manutenção em longo prazo do potencial evolutivo das espécies (Scoble & Lowe, 2010). Conservação Genética em Orchidaceae Orchidaceae é a maior família, em número de espécies, entre as monocotiledôneas. Segunda a classificação da APG III (2009) pertence à ordem Asparagales, sendo constituída por aproximadamente 26.000 espécies distribuídas em cerca de 800 gêneros (Joppa et al., 2011). É composta por plantas epífitas, terrícolas, rupícolas, perenes e algumas são saprófitas e temporárias. Sua distribuição é cosmopolita, apesar de ser mais abundante e diversificada em florestas tropicais (Gravendeel et al., 2004). Lineu e Darwin foram os primeiros grandes admiradores dessa exuberância, contudo o tamanho da família tem sido historicamente um obstáculo para seu estudo (Fay & Chase, 2009). Além de ser uma família numerosa, possuem muitas espécies singulares, que compõe um grupo muito importante para a biologia da conservação (Pillon & Chase, 2007). Entretanto, há escassez de dados sobre as relações filogenéticas do grupo, impedindo a construção da história evolutiva da família (Swarts & Dixon, 2009a). Como a maioria das plantas, as orquídeas são particularmente ameaçadas pela perda de hábitat, especialmente as epífitas que habitam, preferencialmente, florestas primárias, e espécies terrestres que são sensíveis à poluição dos solos (Pillon & Chase, 2007). Outra questão preocupante com as populações naturais de orquídeas é a coleta indiscriminada, a quebra nas conexões ecológicas, alteração das condições abiótica, e pragas que provocam doenças, tornando várias espécies ameaçadas de extinção. Além disso, ainda sofrem com os impactos das alterações climáticas que acarretam consequências prejudiciais para muitas espécies em seu hábitat degradado (Swarts & Dixon, 2009b). A irradiação rápida dos grupos isolados filogeneticamente deve ser prioridade de conservação também, devido à grande biodiversidade de táxons (Crozier, 1997).
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Apesar dos estudos realizados nas últimas décadas sobre a filogenia de alguns grupos, há ainda muitas lacunas no conhecimento taxonômico de Orchidaceae (Bytebier et al., 2007; Fay & Chase, 2009). Os primeiros estudos em sistemática molecular de Orchidaceae basearam se na variação entre sequências de cloroplasto com intuito de compreender a posição filogenética da família em relação às outras famílias próximas bem como entre suas subfamílias (Albert, 1994; Yukawa et al., 1996; Cameron et al., 1999). Infelizmente, Orchidaceae está sujeita a excessivos erros taxonômicos devido à variabilidade morfológica e atração carismática pelos historiadores naturais amadores (Pillon & Chase, 2007). Há duas décadas têm se observado um aumento crescente do uso de técnicas moleculares por Jardins Botânicos e grupos de pesquisa na área de conservação de orquídeas. Os dados moleculares fornecem um quadro empírico, através do qual os profissionais em conservação terão informações necessárias para definir prioridades, reduzir custos e aperfeiçoar decisões de gestão. Em particular, dados moleculares permitem aos conservacionistas abordar questões de variação genética entre populações, delimitação de espécies e a manutenção de processos evolutivos (van den Berg et al., 2009). As orquídeas apresentam uma série de questões genéticas complexas relacionadas, em parte, à sua elevada diversidade e, para muitos táxons, a recente radiação evolutiva (Swarts & Dixon, 2009b). Estudos de filogenia Estudos recentes filogenéticos baseados em sequências de rbcL (DNA de plastídeos) identificaram a monofilia das cinco subfamílias atualmente reconhecidas: (Apostasioideae (Vanillioideae (Cyripedioideae (Orchidoideae (Epidendroideae))))). Epidendroideae e Orchidoideae são as duas maiores subfamílias e estão divididas em 19 tribos e 43 subtribos (Cameron, 2010). Adicionalmente, regiões de rápida evolução, tais como o espaçador ITS do DNA nuclear e os espaçadores intergênico trnL-F e matK do DNA de plastídeos, têm sido intensamente utilizadas em estudos em nível de gêneros e espécies (e.g. Bateman et al. 2003, Clements et al. 2002, van den Berg et al., 2000).
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Segundo Cameron (2010) estudos taxonômicos e filogenéticos ancoram a elaborações de projetos de conservação em Orchidaceae. As relações filogenéticas auxiliam os conservacionistas na definição das prioridades para a conservação (Swarts & Dixon, 2009a). Primeiramente, porque guiam os taxonomistas na revisão de classificações de grupos de espécies, que é fundamental para os inventários florísticos. Em segundo, podem revelar espécies crípticas, ou raras, que precisam e merecem reconhecimento e a proteção. Em terceiro, contribuem para a definição da existência ou não de um táxon, ou seja, delimitam os complexos de espécies. E por último, permitem encontrar e divulgar novas variedades. Reconstruir a filogenia de grupos vegetais contribui para o reconhecimento de sua enorme diversidade de espécies. Por exemplo, o sequenciamento de DNA nuclear e plastidal em espécies do gênero Spiranthes , que habitam a região Ocidental da América do Norte, apontou a descoberta de novas espécies (Brown et al., 2008). A taxonomia da espécie rara Dracula aphrodes , descrita em 1989 na Colômbia, foi recentemente revisada. A filogenia do gênero Dracula foi proposta através de sequências nucleares ribossomais ITS e plastidiais matK, no qual foram posicionados em dois clados distintos. Os dados obtidos sugerem ainda a ocorrência de D. aphrodes como híbrido natural entre D. ventriculosa e D. insolita (Cameron, 2010). As árvores filogenéticas têm sido ainda utilizadas no reconhecimento de características sinapomórficas, que podem apresentar ou não valor medicinal e econômico. Neste sentido, algumas análises têm sido focadas, por exemplo, no gênero Vanilla . Existem mais de 100 espécies distribuídas pelo mundo, das quais somente uma única espécie, V. planifolia , provavelmente endêmica das florestas tropicais no leste do México, é substancialmente de valor econômico, sendo fonte natural de sabor e da fragrância de baunilha (Bory et al., 2008). Recentemente há um número crescente de novas informações moleculares voltadas à elucidação da sistemática de Vanilla (Bouetard et al., 2010, Cameron, 2009; Bory et al., 2008; Ramirez et al., 2007; Soto Arenas, 2006). Duas espécies, V. tahitensis e V. pompona , também são cultivadas como aromáticas, porém, em menor escala. Assim, o conhecimento do grau de parentesco entre as espécies de potencial econômico poderá coordenar os
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cruzamentos de Vanilla com o objetivo de melhoramento genético e aumento da variação genética. Medidas de conservação ex situ têm permitido proteger os indivíduos selvagens, contudo, persistem dúvidas sobre a extensão das espécies a serem protegidas. Análises filogenéticas moleculares de Vanilla revelaram que as espécies produtoras de frutas aromáticas estão no clado de espécies neotropicais (Cameron, 2005). De uma perspectiva econômica é apropriado buscar as espécies neste clado como um primeiro passo para a conservação e para a melhoria das culturas. Desta forma, o conhecimento das relações interespecíficas permite escolher a melhor estratégia para conservar um grupo ou um táxon. Há um grande esforço internacional para proteger e estudar as espécies do gênero em suas áreas de origem, bem como em áreas onde a cultura foi introduzida, uma vez que é considerado como um patrimonial genético de importância econômica (Bory et al., 2008). Algumas espécies, como V. tahitensis , cuja distribuição é restrita na Polinésia Francesa e Papua na Nova Guiné apresentam a sua presença duvidosa. Tem sido investigada a suposta hibridação e descendência de V. tahitensis em relação aos progenitores Neotropicais (Lubinsky et al., 2008). A herança uniparental materna de cpDNA sugere que V. planifolia e V. odorata serviram como seus respectivos contribuintes genômicos maternos e paternos. Enquanto a elevada porcentagem de sítios polimórficos conservados na maioria dos indivíduos de V. tahitensis indica um híbrido F 1, de V. planifolia e V. odorata , e que ocorreram pelo menos alguns episódios de poliploidia e regeneração sexual. Uma vez que V. tahitensis é evolutivamente recente, é possível que um cenário plausível para sua origem histórica seja acessos de V. planifolia e V. odorata trazidos e cultivados juntos em sistema agroflorestal compartilhado, onde ocorreu a hibridação. Seguiu se a propagação por métodos artificiais ou, ocorreu no Novo Mundo, por meios naturais (Hughes et al., 2007). Essa hibridização intencional ou inadvertida poderia ter acontecido entre 1350 a 1500 ainda na Mesoamérica, quando as populações de Vanilla foram exploradas por silvicultores Maias (Barrera & Fernández, 2006). É importante ressaltar que há um número grande de espécies de orquídeas sem interesse econômico. Entretanto, essas espécies podem fornecer pistas sobre a evolução, ecologia, ou padrões de biogeográficos da
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família. Por exemplo, dois gêneros irmãos Clematepistephium e Eriaxis da Ilha do Pacífico da Nova Caledônia são intimamente relacionados com espécies do gênero Epistephium da América Sul (Cameron, 2010). A posição dos ramos da Vanilloideae tem o potencial de fornecer hipótese para a origem antiga de orquídeas no supercontinente de Gondwana há mais de 90 milhões de anos. A recente descoberta na República Dominicana de uma abelha extinta sem ferrão, Problebeia dominica , preservada em âmbar juntamente com a polínea da orquídea Meliorchis caribea , do Mioceno, permitiu estimar que o ancestral comum das orquídeas viveu durante o Cretáceo (76 84 Ma), há pelo menos 20 milhões de anos, após o rompimento do Gondwana (Ramirez et al., 2007). Em apoio a estes dados foram encontrados macrofósseis de folhas de dois gêneros de orquídeas epífitas, Dendrobium e Earina , em sedimentos na Nova Zelândia (Conran et al. 2009). Tal achado forneceu a primeira evidência robusta da diversificação do clado da maior subfamília Epidendroideae, durante o final do Cretáceo (Lovisa et al. 2010; Lee et al. 2012). A análise minuciosa da filogenia da subfamília Cypripedioideae, composta por cinco gêneros e conhecida popularmente como orquídeas “sapatinho”, de distribuição disjunta em regiões temperadas e tropicais, esclareceu como provavelmente ocorreu à diversificação da família das orquídeas tropicais e herbáceas. Guo et al. (2012) revelaram que o gênero Cypripedium, com ampla distribuição em regiões temperadas do Norte e Zonas Subtropicais, divergiram primeiro, seguido por Selenipedium , que é endêmica na América do Sul. Os gêneros Mexipedium e Phragmipedium que ocorrem nos Neotrópicos se mostram estreitamente relacionados com o clado irmão para Paphiopedilum da Ásia tropical. De acordo com estimativas de relógio molecular, Selenipedium surgiu no Paleoceno, enquanto que o ancestral mais recente comum de orquídeas “sapatinho” pode ser datado do Eoceno. A reconstrução dos ancestrais indicou que a vicariância é responsável pela distribuição disjunta das orquídeas “sapatinho” em regiões Palaeotropical e Neotropical (Guo et al., 2012). Análises filogenéticas constituem ferramenta potencial para datar eventos históricos e contribuem com informações sobre a evolução de ecossistemas (Bytebier et al., 2011). A análise da filogenia molecular da orquídea do gênero Disa da África do Sul revelou como o fogo foi um
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componente crucial na evolução da flora do Cabo da África do Sul, uma região caracterizada por elevado nível de riqueza de espécies e endemismo. Novas ferramentas moleculares têm sido desenvolvidas nos últimos anos fornecendo meios para atribuição de táxons vegetais. Muitas questões evolutivas e taxonômicas podem ser respondidas com base nesses marcadores, que anteriormente não seriam possíveis com apenas métodos fenotípicos morfológicos. Técnicas moleculares como AFLP, RAPD, RFLP, ISSR, SSR, SNP, DNA barcoding, entre outros, têm sido usados para estudos de diversidade de espécies vegetais (Arif et al., 2010; CBOL Plant Working Group, 2009; Kocyan et al., 2008) Estudos de genética de populações Em nível de população, as ferramentas moleculares esclarecem eventos de diversidade genética, estrutura genética, gargalos genéticos, fluxo gênico, endogamia e deriva genética. Pesquisas com essas abordagens têm resolvido os impactos da fragmentação do hábitat sobre fluxo gênico e estrutura da população de orquídeas (Wallace, 2002; Jacquemyna et al., 2007; Juárez et al., 2011), consequências genéticas de síndromes de polinização (Tremblay et al., 2005; Gaskett 2011; Vereecken, 2010; Gaskett 2012), potencial evolutivo das populações (Ackerman & Ward, 1999; Ackerman et al., 2007; Kisel et al., 2012), endogamia (Wallace 2003; Borba et al. 2007; Smithson 2006), deriva genética (Tremblay & Ackerman 2001; Chung & Chung, 2007; Chung & Park, 2008; Chung 2009; Phillips et al., 2012) e estrutura genética espacial das populações em fina escala em orquídeas (Wallace, 2006; Chung et al., 2004; Chung et al, 2005; Jacquemyn et al., 2012). Diversos estudos têm sido empregados no intuito de elucidar os processos demográficos e evolutivos envolvidos na diversificação de espécies e linhagens, como hibridação e poliploidia (Hedrén et al., 2008), e fatores demográficos originados pela dinâmica histórica de oscilações climáticas em Anacamptis palustris (Jacq.) R.M.Bateman, Pridgeon & M.W.Chase em populações do Mediterrâneo e Europa Ocidental (Cozzolino et al., 2003). Muitas orquídeas podem possuir um ciclo de vida longo permitindo inúmeros cruzamentos e a dispersão de sementes a longa distância,
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características essas almejadas para produzir populações geneticamente diversas com pouca diferenciação entre populações. Segundo Hamrick & Godt
(1996) a diversidade genética média esperada (G ST ) em Orchidaceae é 0,087, que é relativamente baixa, entretanto está dentro do padrão para espécies herbáceas. Contudo, nenhuma tendência foi clara nos estudos populacionais em Orchidaceae até a presente data, com valores de GST que variam entre 0,012 em Pterostylis angusta A.S.George (Sharmaa et al., 2001) e 0,924 em Zeuxine strateumatica (Ln.) Schltr. (Sun & Wong, 2001). Portanto, há uma dificuldade na padronização de metodologias para os programas de conservação em orquídeas. Constata se que para cada espécie é necessário um plano de manejo apropriado embasado em dados genéticos. Assim, a análise molecular das populações e das espécies é uma ferramenta essencial para a delimitação da procedência, amostragem e propagação de sementes, precisão taxonômica, identificação de clones e seleção de genótipos adequados para programas de reintrodução e armazenamento em longo prazo. Torna se necessário ainda agregar informações sobre as paisagens naturais de ocorrência das espécies (Storfer et al., 2007) e identificação dos nichos mais prováveis das espécies em diferentes escalas temporais (Carstens & Richards, 2007). O conhecimento da diversidade genética permeia as estratégias de conservação, pois a resistência em longo prazo das espécies depende do nível de variação genética. Geralmente espécies que apresentam altos níveis de diversidade genética tornam se mais eficientes em suportar mudanças ambientais, pois suas populações possuem melhor capacidade de se adaptar a essas alterações. Portanto, maior diversidade genética aumenta a aptidão e diminui a risco de extinção (Brzosko et al., 2011). Baixos níveis de variação genética, normalmente estão associados à raridade das espécies (Frankham et al., 2003), embora Gitzendanner & Soltis (2000) contra argumentem essa hipótese. Previsões teóricas e dados empíricos mostram que a variação genética baixa muitas vezes é consequência do pequeno tamanho populacional (Cozzolino et al., 2003; Nazareno & Jump, 2012). Populações pequenas e isoladas são muitas vezes geradas a partir de uma contínua fragmentação ou perda de hábitat devido à pressão antrópica (Frankham et al., 2003). Impactos humanos reduzem o tamanho da população e aumentam a
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distância entre populações remanescentes, reduzindo o fluxo de genes entre elas. Populações pequenas, fragmentadas e isoladas têm geralmente baixa variação genética e, portanto, são mais vulneráveis a oscilações demográficas, ambientais e estocasticidades genéticas; isto levanta o risco de extinção. Consequentemente, aumenta a probabilidade de deriva genética e depressão por endogamia nessas populações (Brzosko et al., 2011). Estudos de conservação genética de espécies são primordiais para estabelecer planos de manejo para conservar a biodiversidade. A destruição, modificação e fragmentação de florestas naturais, bem como a extração ilegal de orquídeas de populações naturais, tiveram uma forte influência na extinção de muitas espécies em várias regiões de todo o mundo. A família Orchidaceae possui inúmeros exemplos de espécies que foram extintas devido a ações antrópicas. Dessa forma, verifica se a intensificação de estudos de diversidade genética para construção de planos de conservação em Orchidaceae (Àvila Diaz & Oyama, 2007). As orquídeas epífitas geralmente possuem um padrão de estrutura genética diferencial quando comparadas com os outros hábitos. A maioria das orquídeas epifíticas aponta uma alta diversidade genética e estruturação populacional (Àvila Diaz & Oyama, 2007). A diversidade genética de populações e estrutura ao longo da sua distribuição geográfica de Laelia speciosa Schltr. (HBK), orquídea mexicana endêmica e ameaçada de extinção, foi examinada por Ávila Diaz & Oyama (2007). E verificaram que entre as populações há baixos níveis de diversidade genética. Os autores sugeriram estratégias de restauração, principalmente utilizando a reintrodução de indivíduos a partir de propagação in vitro de sementes das populações próximas a área de reintrodução, para manter a mesma estrutura encontrada no campo. Além disso, recomendam um projeto multidisciplinar sobre L. speciosa incluindo estudos biológicos bem como programas de educação ambiental nas comunidades locais. A diversidade genética de seis populações de Oncidium hookeri Rolfe, espécie epífita neotropical e ameaçada de extinção, encontrada em remanescentes de Mata Atlântica brasileira na Serra da Mantiqueira foram avaliadas por Alcantara et al. (2006). Treze locos polimórficos de aloenzimas foram utilizados para avaliar o fluxo gênico entre as populações e a ocorrência
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de gargalos recentes. Vários alelos raros foram encontrados em todas as populações e três populações apresentaram alelos privados. Constaram se baixa diferenciação genética entre as populações de O. hookeri e foi detectada
FST = 0,029. A diferenciação genética entre as populações foi baixa, tendo nenhuma correlação com a matriz de distância geográfica (teste de Mantel: r = 0,34, P = 0,72), porém não significativa. Apenas duas populações mostraram sinais de gargalos recentes. A deficiência de heterozigotos encontrada, provavelmente pode ser causada pelo comportamento de polinizadores, já as frequências baixas de vários alelos de diferentes loci podem ser mantidas devido à propagação clonal. Apesar da natureza estocástica da dispersão pelo vento das sementes a longas distâncias, este processo pode promover um fluxo gênico eficaz entre as populações, e assim evitar a diferenciação genética (Alcantara et al., 2006). Outra espécie brasileira ameaçada de extinção devido à perda de hábitat e pela intensa pressão de coleta é a Cattleya labiata (Pinheiro et al., 2012). Os primeiros dados sobre a diversidade genética e estrutura de seis populações selvagens foram estimados por meio de marcadores RAPD e ISSR em remanescentes de Floresta Atlântica no Nordeste do Brasil (Pinheiro et al., 2012). Os dados de marcadores indicaram um alto nível de polimorfismo e complexa estruturação genética para as populações de C. labiata . A similaridade genética entre indivíduos de C. labiata com aqueles de diferentes regiões sugere que a dispersão anemocórica de suas sementes ocorre a longas distâncias. Os índices de diversidade genética encontrados indicaram maior nível de diferenciação dentro da população, em comparação com outros estudos de espécies de Orchidaceae por meio de marcadores dominantes. As populações de C. labiata examinada não estão localizadas em áreas protegidas, sendo isso um fator importante para a prioridade de conservação desta espécie de orquídea (Pinheiro et al., 2012). Análise de diversidade genética em espécie endêmica do Nordeste Brasil foi realizada em Cattleya elongata , orquídea rupícola, que ocorre em ilhas de afloramento rochoso em campo rupestre da vegetação da Chapada Diamantina (Cruz et al., 2011). Foram avaliadas nove populações naturais quanto à variabilidade morfológica e genética, cobrindo toda a área de distribuição da espécie, empregando marcadores isoenzimáticos e ISSR, e
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análises de morfometria multivariada. As populações são geneticamente estruturadas e com baixa endogamia (isoenzimas, FIS = 0,06). A similaridade genética entre as populações foi elevada em ambos os marcadores, apesar da descontinuidade dos afloramentos da Chapada Diamantina. Observaram se ainda alta variabilidade morfológica com diferenciação moderada entre as populações, mas não foi encontrada qualquer correlação entre distâncias genéticas, morfológicas e geográficas, e entre a variabilidade encontrada na morfologia e marcadores genéticos. As diferenças observadas entre os dois marcadores genéticos e variáveis morfológicas ressalta a importância da avaliação de parâmetros para a conservação, planejamento ou de gestão da variabilidade encontrada as diferentes populações (Cruz et al., 2011). Níveis de variação de aloenzimas e a estrutura genética detectada na rara orquídea terrestre Epipactis thunbergii foram examinados para oito populações na Coréia do Sul (Chung & Chung 2007). Foram encontrados níveis extremamente baixos de variação de aloenzimas dentro das populações: a frequência média de loci polimórficos foi de 3,8%, o número médio de alelos por loco foi de 1,04, e a heterozigosidade média esperada de 0,013. O índice de fixação foi próximo de zero FIS = 0,069, embora a espécie seja autocompatível. No entanto, um grau muito elevado de diferenciação populacional foi encontrado entre as populações ( FST = 0,388) na área estudada. Além disso, análise de autocorrelação espacial revelou significativa coancestria em um raio de até 3 m do indivíduo focal dentro das populações. Estas observações sugerem que os principais fatores explicativos para os níveis extremamente baixos da diversidade genética e da formação da estrutura genética de populações de E. thunbergii são a deriva genética, como resultado de um pequeno tamanho da população efetiva, um fluxo de genes restrito, e o isolamento das populações. Considerando a atual estrutura genética de E. thunbergii , três diretrizes foram sugeridas para o desenvolvimento de estratégias de conservação para as espécies na Coreia do Sul: (1) proteção dos hábitats das populações, (2) a proibição por lei de qualquer coleta de E. thunbergii , e (3) a proteção de populações dos polinizadores, dado o fato da produção de frutos em hábitats naturais ser muito baixa (Chung & Chung, 2007).
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A orquídea Orchis militaris L. é uma das mais raras orquídeas da Grã Bretanha com apenas três populações conhecidas. Duas destas populações contêm cerca de 200 plantas, mas a terceira é ainda muito menor, com apenas seis plantas quando a população foi descoberta. Esta pequena população se distancia em apenas 9 km do Buckinghamshire, sugerindo que tenha sido derivada dessa maior população como resultado da dispersão recente de sementes (Hutchings et al., 1998). O marcador AFLP demonstra claramente que as três populações são distintas, e não há evidências de que a população Oxfordshire é derivada a partir da população Buckinghamshire. Além disso, a população de Suffolk, apesar de seu tamanho, tem muito pouca variação genética, enquanto que em Oxfordshire a população das plantas originais é claramente distinguível. Assim, uma pequena amostra de sementes a partir de Suffolk irá captar toda a diversidade genética deste local, enquanto que uma amostragem muito mais completa é necessária em outros locais, para maximizar a amostragem da variação genética. Os microssatélites também demonstraram a similaridade da população Oxfordshire (Smith et al., 2003). A orquídea Cypripedium calceolus L. também é considerada como extinta como a O. militaris , com apenas um indivíduo na natureza no Reino Unido. Além dessa, existem diversos espécimes em coleções e dois indivíduos supostamente introduzidos na natureza. A análise dos marcadores AFLP nessa espécie demonstrou se altamente problemática devido ao grande genoma (Fay & Cowan, 2001). C. calceolus , embora difundida por toda a Eurásia, é uma espécie rara em muitos países. De acordo com Fay et al. (2009), marcadores cloroplastidiais são os mais esclarecedores para avaliar espécies poliploides como C. calceolus . Estudos de genética de populações baseados em microssatélite plastidiais e espaçador intergênicos trnL-trnF foram utilizados para a compreensão da variação dentro e entre 32 populações e dos padrões biogeográficos de C. calceolus na Europa. Dentro das populações naturais da Inglaterra foram encontrados indivíduos originados de autopolinização, ou polinização cruzada com outras orquídeas e devem ser excluídos do programa de reintrodução da espécie. Apesar do extremo efeito gargalo sofrido por esta espécie na Inglaterra, encontraram se um maior nível de diversidade genética nas populações maiores do que nas populações da Dinamarca. Os dados para microssatélites também mostram que os espécimes ingleses e suecos são
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geneticamente mais variáveis que as plantas dinamarquesas, que são geneticamente homogêneas. A ausência de polimorfismo nas populações dinamarquesas poderia ser devido a um efeito fundador, sendo provavelmente fundada pela longa distância de dispersão de sementes (Fay et al. 2009). Outro importante exemplo de espécies de orquídeas que tem valor científico para um melhor entendimento dos processos evolutivos em plantas é o estudo de Pinheiro et al. (2010). Os autores testaram a hipótese de fluxo gênico entre as espécies com grau de poliploidia diferentes no gênero Epidendrum entre as espécies E. fulgens e E. puniceoluteum que ocorrem no litoral brasileiro. Estudos como esse não são comuns, pois essas espécies são consideradas isoladas reprodutivamente por causa das barreiras pós zigóticas. Foram analisadas populações naturais alopátricas e simpátricas com a utilização de microssatélites plastídiais e nucleares. Todas as populações simpátricas analisadas apresentaram zonas híbridas e introgressão, além disso, o estudo sugere que a hibridização e introgressão são processos evolutivos que desempenham um importante papel na diversificação do gênero. Em seu livro “ A origem das espécies de orquídeas ” Darwin argumentou que a grande diversidade e incrível beleza dessas plantas poderia ser o produto de um fenômeno que é impulsionado por altos níveis de variabilidade e complexidade, que cria situações que geram níveis de especiação cada vez maiores, como por exemplo, os casos extremos de Angraecum sesquipedale e o do gênero Ophrys . Portanto estudos sobre a diversidade genética são essenciais para que se possa identificar genótipos endêmicos e a importância evolutiva dessas espécies de plantas. Além disso, os projetos multidisciplinares que englobam estudos biológicos como aspectos ecológicos, biogeográficos, taxonômicos e filogenéticos, a conscientização ambiental das comunidades locais, além de ações imediatas para preservar o hábitat dessas plantas em todo seu alcance geográfico, são indispensáveis para se alcançar uma conservação efetiva das espécies de orquídeas. Considerações finais
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Como a biota enfrenta níveis sem precedentes de extinção devido à influência humana nas mudanças climáticas, destruição do hábitat, introdução de espécies invasoras, extrativismo, e ocupação de áreas naturais pelo crescimento da população, as prioridades de conservação devem ser definidas rapidamente. Programas de conservação são complexos e exigem conhecimento atualizado sobre o status da taxonomia, biologia, ecologia, filogenia, filogeografia das espécies (Seaton et al., 2010). A proteção da diversidade genética foi incorporada nos protocolos conservacionistas. No entanto, percebe se pouco progresso em relação à proteção da diversidade genética, pois a base de dados convencional se mostra inadequada e não existe consenso em como incorporar a diversidade genética no planejamento do uso da terra e de estratégias conservacionistas (Moritz & Faith, 1998). Referências
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______CAPÍTULO 2
DISTRIBUIÇÃO ESPACIAL DE Cattleya granulosa Lindl.: UMA ORQUÍDEA AMEAÇADA DE EXTINÇÃO
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DISTRIBUIÇÃO ESPACIAL DE Cattleya granulosa Lindl.: UMA ORQUÍDEA AMEAÇADA DE EXTINÇÃO
Cristiane Gouvêa Fajardo 1* , Rosaly de Araújo Costa 2, Fábio de Almeida Vieira 3, Wagner Franco Molina 4
1 Departamento de Botânica, Ecologia e Zoologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, UFRN, Natal/RN. 2 Departamento de Botânica, Universidade Federal de Pernambuco, UFPE, Recife/PE. 3 Unidade Acadêmica Especializada em Ciências Agrárias, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, UFRN, Macaíba/RN. 4 Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, UFRN, Natal/RN. Resumo
Cattleya granulosa Lindl. é uma orquídea endêmica da região litorânea do Nordeste do Brasil, ameaçada de extinção. Análises do padrão espacial intrapopulacional auxiliam nas relações com os fatores bióticos e abióticos, que determinam o recrutamento e mortalidade dos vegetais. Este estudo teve como objetivos avaliar os níveis de agregação espacial em uma população preservada da espécie, em uma área de 4.225 m 2. A função de segunda ordem da densidade de vizinhos (NDF) foi utilizada para determinar o padrão espacial nas classes de distâncias, com o uso do programa SpPack. Quanto ao hábito de vida, 73% das plantas eram epífitas ( N = 136) e 27% terrestres ( N = 50). A epífita tem especificidade com um único forófito, indivíduos arbóreos de Eugenia sp . (Myrtaceae). C. granulosa Lindl. possui padrão espacial agregado, com maior densidade de vizinhos (NDF) no raio de até 5 m. Estes dados sugerem um potencial dispersivo restrito e com influência direta sobre ações de conservação biológica da espécie.
Palavras-chave: Orchidaceae, densidade de vizinhos, dispersão.
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SPATIAL DISTRIBUTION OF Cattleya granulosa Lindl.: AN ENDANGERED ORCHID
Abstract
Cattleya granulosa Lindl. orchid is endemic in the coastal region of northeastern Brazil, an endangered species. Analysis of spatial pattern intrapopulation assists in relations with the biotic and abiotic factors that determine recruitment and mortality of plants. This study aimed to evaluate the levels of spatial aggregation in a population preserved the species, in an area of 4.225 m 2. The second order function of the density of neighbors (NDF) was used to determine the spatial distribution in the distance classes, with the use of the program SpPack. As the habit of life, 73% of the plants were epiphytes ( N = 136) and 27% ground ( N = 50). The epiphyte has specificity with a single host tree, the Eugenia sp. (Myrtaceae). Cattleya granulosa Lindl. own spatial pattern, with the highest density of neighbors (NDF) in radius of up to 5 m. These data suggest a dispersive restricted and potential direct influence on actions for conservation of the species. Keywords: Orchidaceae, neighbourhood density, dispersion
Introdução Os padrões espaciais têm sido um tema particularmente importante em ecologia tropical devido a elevada diversidade e baixas densidades de espécies (Condit et al., 2000). Nas regiões tropicais a diversidade de plantas vasculares é extraordinária, e as espécies epífitas contribuem com 35% da flora (Leigh et al., 2004). Processos que incluem a dispersão de sementes, interações intraespecíficas e interespecíficas, e condições de crescimento em locais heterogêneos determinam, em geral, a intensidade de agregação dos vegetais (Wiegand et al., 2007). As populações de orquídeas são frequentemente pequenas e dispersas, ou hiper dispersas (Raventós et al., 2011). Várias hipóteses foram sugeridas para esse padrão característico, muitas das quais estão relacionadas com a dinâmica da vegetação e atributos de espécie. Por exemplo, a rara produção de frutos, o longo alcance da dispersão, o regime diferencial de chuvas e a perturbação antrópica, podem ser responsáveis pelas desigualdades de riqueza e abundância de espécies de orquídeas com baixa densidade
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populacional (Hietz, 1997; Neiland & Wilcock, 1998; Hietz et al., 2006; Winkler et al., 2009). Pouco se sabe, entretanto, sobre os padrões espaciais dentro das populações de plantas epífitas e, particularmente entre as orquídeas (Otero et al., 2007). Em Orchidaceae, a germinação é criticamente dependente da presença de fungos micorrízicos (Rasmussen & Rasmussen, 2009). Deste modo, seu recrutamento e estabelecimento são sensíveis às contingências da distribuição espacial e abundância de fungos micorrízicos (Jacquemyn et al., 2012a). De fato, a maioria das orquídeas mostram preferências por substratos de certas árvores e arbustos (Tremblay et al., 1998; Parra Tabla et al., 2011), e são afetadas pela distribuição espacial de seus forófitos, que corresponde à planta hospedeira (Adhikari et al., 2012). Estas preferências podem estar relacionadas aos atributos físicos e químicos da casca, arquitetura da planta, ou a presença de insetos (Flores Palacios & Ortiz Pulido, 2005; Martínez Meléndez et al. 2008; Gowland et al., 2011). Assim, as preferências podem ser determinadas pela distribuição de seus simbiontes micorrízicos que são necessários para a germinação de sementes (Otero et al., 2005; Phillips et al., 2011; Jacquemyn et al., 2012b; Johnson & Kane, 2012; McCormick et al., 2012). Análises do padrão espacial intrapopulacional fornecem informações críticas sobre fatores bióticos e abióticos, competição inter e intraespecífica, e a disponibilidade de recursos e dos processos de recrutamento e mortalidade (Wiegand et al., 2007; Vieira et al., 2012). Não há relatos sobre a distribuição intrapopulacional de C. granulosa , uma orquídea endêmica da região litorânea do Nordeste do Brasil ameaçada de extinção (MMA, 2008; Martinelli & Moraes, 2013). A espécie possui alto valor ornamental e ocorre em áreas de expansão urbana e turística, tornando a particularmente suscetível à coleta predatória e redução de hábitat. Atualmente, suas populações estão reduzidas a fragmentos de vegetação isolados e perturbados, com precário conhecimento sobre o estado de conservação. Neste sentido, o presente trabalho teve como objetivo avaliar os níveis de agregação espacial em uma população de Cattleya granulosa Lindl. e analisar as possíveis causas associadas.
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Material e Métodos
Espécie alvo
Cattleya granulosa , popularmente conhecida como “canela de ema”, é uma erva epífita de crescimento vegetativo simpodial, com caules rizomatosos, pseudobulbos eretos e cilíndricos, que atingem entre 40 e 60 cm de altura. No ápice do pseudobulbo encontram se duas ou três folhas coriáceas e carnosas revestidas por uma camada de cutícula brilhosa, assim como uma espata simples com inflorescência racemosa terminal, contendo de 1 a 9 flores, laxamente distribuídas numa espiral em torno de uma curta raque de 8 a 10 cm de diâmetro (Camara Neto et al., 2007). As flores são bilateralmente simétricas e com três sépalas petaloides carnosas, sendo uma dorsal e duas laterais com cores que variam entre os tons esverdeados, amarelados e castanhos avermelhados apresentando se, na maioria das vezes, com manchas granulares na cor vinácea. Possui nectário floral na base do ginostêmio, tecidos glandulares nas extremidades e bases das sépalas, além de nectários extraflorais localizados nas brácteas, pedúnculo, pedicelo, botões e ainda nos frutos (Camara Neto et al., 2007). Caracterizam se pela presença de osmóforos localizados na parte interna dos lobos laterais do labelo, que exalam odor fortemente adocicado e guias de néctar no labelo que absorvem luz ultravioleta. Mimetizam um modelo geral de flor tipicamente melitófila, porém produz pouco néctar floral, provavelmente atuando com um mecanismo de engodo (Costa, 2010). Além disso, C. granulosa Lindl. é autocompatível, porém dependente de polinizador para reprodução, possivelmente abelhas (Costa, 2010). O fruto tem deiscência da cápsula ao longo da linha média entre os carpelos, que ao atingir a maturação liberam sementes dispersas pelo vento (Costa, 2010). Área de Estudo
O estudo foi realizado no Parque Estadual das Dunas do Natal (PEDN) (05º 48´S e 35º 12´ W) que se localiza em região litorânea na parte oriental do Estado do Rio Grande do Norte, Nordeste do Brasil, no município de Natal
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(Figura 1). O PEDN possui 1.172 hectares ao longo de 15 km de extensão longitudinal, com a largura média de 2 km e superfície de 30 km 2 do litoral (Bezerra et al., 2007).
Figura 1. Mapa do Parque Estadual das Dunas do Natal localizado na região costeira da cidade de Natal, no Estado do Rio Grande do Norte, Nordeste do Brasil. Fonte: Queiroz & Loiola (2009). A vegetação predominante é classificada como Floresta Estacional Semidecidual e Floresta de Restingas, pertencendo ao domínio Mata Atlântica (Velozo et al., 1991), com elementos de Caatinga e Tabuleiro Costeiro. O clima da região é tropical úmido com precipitações pluviométricas variando de 800 mm até mais de 1.500 mm anuais e temperaturas médias anuais em torno de 26,4°C (Costa, 2010). A topografia é acidentada, constituída por depósitos eólicos, ou seja, as dunas apresentam elevações em torno de 80 a 120 metros (Carvalho, 2001). Na área de estudo, além da C. granulosa Lindl. há outras Orchidaceae como Cyrtopodium flavum ( Nees) Link & Otto ex Rchb., Epidendrum cinnabarium Salzm., Eulophidium maculatum Pfitz, Polystachia concreta (Jacag.) Garay & Sweet e Vanilla bahiana Hoehne (Freire, 1990). O PEDN foi criado por meio do decreto n° 7.237 do ano de 1977, em decorrência da execução de um projeto de ligação viária entre as praias Areia Preta (norte) e Ponta Negra (sul), distantes cerca de 8 km. O objetivo era preservar o remanescente de vegetação, já que a via litorânea foi executada à margem de uma extensa formação dunosa, rica em vegetação nativa. Além deste impacto ambiental, na época era constante a retirada de lenha da
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vegetação, a ocorrência de queimadas, e extração em larga escala de areia para atender a construção civil (Freire, 1990). Análises da distribuição espacial
Todos os indivíduos de Cattleya granulosa Lindl. foram mapeados em uma área de 4.225 m 2, por meio das coordenadas geográficas (posições x e y). As plantas foram classificadas quanto ao hábito de vida (epífita ou terrestre) e quanto a classe etária (adultas ou juvenis). Consideraram se plantas epífitas os indivíduos de C. granulosa Lindl. que no momento da observação utilizavam outra espécie como suporte, sem ligação com o solo. Já os indivíduos adultos, aqueles que apresentavam eventos reprodutivos na época da avaliação ou resquício de eventos anteriores. O padrão de distribuição espacial de C. granulosa Lindl. foi analisado por meio da função univariada de segunda ordem da densidade de vizinhos ou NDF ( Neighbourhood Density Function ) (Condit et al., 2000). A estatística NDF, também conhecida como correlação de função aos pares (Perry et al., 2006), é similar à função K de Ripley, porém não é cumulativa, o que favorece a interpretação. Foram utilizadas classes de distância ( t) entre 1 e 45 m, pois, como sugerido por Haase (1995), elas devem ser aproximadamente ½ do menor comprimento da parcela para que não ocorra decréscimo significativo dos valores nas classes finais de distância. Adicionalmente, foi calculada a correção do efeito de borda, baseado em Goreaud & Pelissier (1999). Por meio de simulações, as classes de distância nos correlogramas foram especificadas com intervalos de 5 m, a fim de se evitar o efeito “jagged plot” ou padrão denteado (Wiegand & Moloney, 2004). Os valores da estatística NDF ( t) foram plotados no correlograma em função da distância t e comparados a “envelopes” de completa aleatoriedade (intervalos de confiança), obtidos a partir de 499 simulações randômicas de Monte Carlo (alfa = 0,01). As seguintes hipóteses foram testadas: 1) hipótese nula de completa aleatoridade espacial das amostras: quando os valores de NDF se encontravam dentro da faixa de valores do intervalo de confiança (IC superior e IC inferior); 2) Hipótese alternativa de padrão agregado: quando os valores de NDF estimados estão acima do IC superior e; 3) Hipótese alternativa de padrão
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espacial segregado: quando os valores de NDF estimados estão abaixo do IC inferior. Essas análises foram realizadas por meio do programa SpPack 1.38 (Perry, 2004).
Resultados e Discussão
Na área de estudo foram encontrados 186 indivíduos de C. granulosa Lindl. (Figura 2). 9,357,290
9,357,280
9,357,270
9,357,260 Y 9,357,250
9,357,240
9,357,230 8 m
9,357,220 70 00 10 ,450 ,460 ,4 ,5 ,5 57 57 257 257 2 257,480 257,490 257 2 257,520 257,530 X Figura 2. Distribuição espacial de indivíduos de C. granulosa Lindl. na área amostrada de 4.225 m 2. Os valores dos eixos x e y são dados em UTM (Universal Transverse Mercator). Do total de plantas 186, 136 eram epífitas (73%) e 50 terrestres (27%). Quanto às classes etárias, 162 plantas foram consideradas adultas (85%) e 24 juvenis (15%). Na relação de epifitismo, foi observado que todas as plantas de C. granulosa Lindl. utilizavam a espécie Eugenia sp . (Myrtaceae), conhecida como uvaia, como hospedeira (Figura 3).
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a b
Figura 3. Indivíduos de C. granulosa Lindl. sobre a espécie arbórea Eugenia sp . (a) e indivíduo adulto terrestre com o evento reprodutivo de floração (b) no Parque Estadual Dunas do Natal. O padrão espacial de C. granulosa Lindl. mostrou significantes níveis de agregação até um raio de 25 m do indivíduo focal, com os valores de NDF superiores ao intervalo de completa aleatoriedade (Figura 4). Nas distâncias entre 25 e 30 m o padrão espacial é aleatório, ou seja, as plantas são mais espaçadas do que o esperado pelo acaso. A partir dos 35 m, observa se nível de segregação dos indivíduos na população.
Figura 4. Padrão espacial obtido por meio da análise univariada da densidade de vizinhos (NDF) de indivíduos de C. granulosa . Linhas pontilhadas
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correspondem ao intervalo de confiança de 99% para a hipótese nula de padrão espacial completamente aleatório. Na função NDF, os padrões espaciais são analisados por meio de círculos com raios ( t) crescentes de tal forma que as escalas dos padrões podem ser detectadas. Os vegetais podem apresentar três padrões espaciais: aleatório, agregado ou segregado (regular), com base na ocorrência de vizinhos ao seu redor (Condit et al., 2000). Estes padrões podem surgir a partir de uma variedade de processos, incluindo a dispersão de sementes localizada, interações intra e interespecíficas e heterogeneidade local, que proporciona condições diferentes para o crescimento, tais como variações na topografia, distribuição de recursos, ou tipo de vegetação (Otero et al., 2005). Para esse estudo, verificou se maior densidade de vizinhos (NDF) no raio de até 5 m, caracterizando o padrão espacial agregado. Sendo assim, supõe se que grande parte das sementes de C. granulosa Lindl. é depositada próximo à planta mãe. Isso se deve provavelmente a dispersão anemocórica restrita no local e ao hábitat favorável para o recrutamento de plântulas. Tal condição biológica é crítica, pois a torna vulnerável a ações de desmatamento e coleta predatória. Os padrões espaciais em Cattleya granulosa Lindl. podem ser explicados ainda devido à associação desta epífita com outras espécies vegetais. De fato, algumas associações entre as espécies podem ser comum em plantas, mas podem variar em sua área de ocorrência (Wiegand et al., 2007). Sabe se que os fungos micorrízicos são necessários para a germinação das sementes das orquídeas e podem ter efeitos profundos sobre os padrões de distribuição e levar à aglomeração espacial de orquídeas (Otero et al., 2007). Na área de estudo, a distribuição agregada de C. granulosa Lindl. pode ser influenciada pela especificidade com a sua hospedeira Eugenia sp. (Myrtaceae), também relatada em outros remanescentes de Florestas Estacionais Semideciduais de Restingas do Rio Grande do Norte (Camara Neto et al., 2007; Costa, 2010). As outras espécies de orquídeas no local, por sua vez, não estavam associadas a Eugenia sp. Os diferentes padrões de associação e distribuições desiguais de fungos micorrízicos associados a condições ambientais específicas podem levar a padrões de distribuição desigual de orquídeas e, possivelmente, também
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restringir a abundância de espécies. Por exemplo, a variação espacial e segregação espacial nas orquídeas Anacamptis morio (L.) R.M. Bateman, Pridgeon & M.W. Chase, Orchis mascula (L.) L. e Gymnadenia conopsea (L.) R. Br., que ocorrem em simpatria e demonstram um padrão agregado (entre 1,2 e 5 metros), parecem ser influenciados pela simbiose com diferentes parceiros micorrízicos (Jacquemyn et al., 2012c). McCormick et al. (2009) quantificaram a abundância de indivíduos adultos da orquídea Corallorhiza odontorhiza (Willd.) Nutt. e correlacionaram com a ocorrência de fungos micorrízicos. Além de encontrarem padrão espacial agregado na população, os autores encontraram forte relação entre a distribuição de indivíduos adultos da orquídea e abundância e distribuição de fungos. Assim, concluíram que locais com maior abundância de fungos micorrízicos facilitam a germinação das sementes de orquídeas silvestres (McCormick et al., 2012). Neste sentido, para a preservação das populações remanescentes de Cattleya granulosa Lindl. deve se considerar sua íntima relação com os forófitos, neste caso espécies de Eugenia sp. (Myrtaceae). Em uma escala de tempo evolutivo, a distribuição irregular de orquídeas, com padrões espaciais segregados e tamanhos populacionais pequenos podem ter contribuído para a diversificação de espécies de orquídeas, ocasionando restrito fluxo gênico entre as populações e pequenos tamanhos efetivos (Tremblay et al., 2005; Jacquemyn et al., 2012a). Entre as causas, estão fatores como a dispersão restrita da semente e subsequente recrutamento de novos indivíduos na população, que são importantes processos que afetam a dinâmica populacional, a diversidade genética e estrutura espacial dos genótipos das plantas (Jacquemyn et al., 2009; Vieira et al., 2012). Desse modo, a ocorrência da Cattleya granulosa Lindl. em regiões com características diversas da analisada no presente estudo estimula análises complementares da estrutura genética espacial, para melhor compreensão da amplitude dos padrões de dispersão da espécie e influência dos fatores ambientais. Neste sentido, estudos que investiguem aspectos da sua real área de distribuição, níveis de variabilidade genética e da dispersão são necessários.
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Conclusões As plantas de Cattleya granulosa Lindl. possuem padrão espacial agregado com maior densidade de vizinhos no raio de até 5 m, indicando dispersão restrita ao redor do parental. Desse modo, fatores como a dispersão de sementes restrita ao redor da planta materna e a especificidade com um único forófito, indivíduos arbóreos de Eugenia sp . (Myrtaceae) possivelmente são responsáveis pelo padrão espacial encontrado para a espécie.
Agradecimentos À administração do Parque Estadual Dunas do Natal, pela autorização concedida para pesquisa, e os guardas ambientais, pelo auxílio. Referências
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______CAPÍTULO 3
INTERSPECIFIC GENETIC ANALYSIS OF ORCHIDS IN BRAZIL USING MOLECULAR MARKERS
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INTERSPECIFIC GENETIC ANALYSIS OF ORCHIDS IN BRAZIL USING MOLECULAR MARKERS
Cristiane Gouvêa Fajardo 1* , Fábio de Almeida Vieira 2, Wagner Franco Molina 3
1 Departamento de Botânica, Ecologia e Zoologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, CEP 59078 970, Natal, RN, Brazil. 2 Unidade Acadêmica Especializada em Ciências Agrárias, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, CEP 59280 000, Macaíba, RN, Brazil. 3 Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, CEP 59078 970, Natal, RN, Brazil.
Abstract
Several species of Orchidaceae, one of the largest plant families, are considered endangered throughout South America and legal protection policies are needed so they can be preserved. ISSRs markers are a potential tool to be used in the phylogenetic reconstruction of closely related species. In this study, we evaluate the polymorphic information content (PIC) and optimum number of ISSR markers (ONM) for five Laeliinae orchids in order to assess genetic diversity. The phylogenetic relationships between Cattleya granulosa , an endangered Brazilian orchid, and four other native Brazilian species (Brassavola tuberculata , Cattleya bicolor , Cattleya labiata and Cattleya schofieldiana ) were analyzed for genetic diversity and differentiation. The 11 selected primers generated 166 unambiguous loci (PIC = 0.354; ONM = 156). Of the five studied species, C. bicolor exhibited the highest level of genetic diversity ( HE = 0.219), while C. labiata exhibited the lowest level ( HE = 0.132). The percentage of genetic variation among species (AMOVA) was 23.26%. The principal component analysis (PCA) of ISSR data showed that unifoliate and bifoliolate species are genetically divergent. Additionally, PCA indicated a close relation between C. granulosa Lindl. and C. schofieldiana , a species considered to be a variety of C. granulosa Lindl. by many researchers. Thus, we conclude that ISSR genetic markers are effective in detecting genetic differentiation among orchid species.
Keywords Brassavola tuberculata , Cattleya , ISSR, Genetic differentiation, Laeliinae, Orchidaceae
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Introduction
With approximately 24,000 recognized species and about 800 genera, Orchidaceae is one of the largest plant families (World Checklist of the Monocotyledons 2006). The family presents some of the most complex and intriguing pollination mechanisms ever recorded (Lovisa et al. 2010) and its flowers are pollinated by diverse groups of insects and birds (Dodson et al. 1969). Within this family, Laeliinae is a strictly Neotropical subtribe with approximately 1,500 species and around 50 genera; it is the second largest subtribe of Orchidaceae (van den Berg et al. 2009). While artificial hybridization can be employed to combine various genera for horticultural purposes, many interspecific and intergeneric hybrids have also been found in natural hábitats (Azevedo et al. 2006; van den Berg et al. 2009; Pinheiro et al. 2010; Storti 2011). Hybridization in nature has been documented through the identification of several intra and intergeneric species, especially involving Cattleya , one of the most economically important genus. Throughout South America, several species of this genus are considered endangered (MMA 2008) and legal policies for their protection are necessary. Inter simple sequence repeats (ISSRs) have been used extensively to characterize genetic diversity in orchids, such as Anoectochilus formosanus (Zhang et al. 2010), Cymbidium goeringii (Wang et al. 2009a), and Vanilla species (Verma 2009). Through ISSR markers it is also possible to verify the genetic stability of micropropagated plantlets from tissue culture (e.g. Vanda stangeana , Kishor and Devi 2009). ISSR markers can be useful in informing genetic conservation and sustainable use strategies (e.g. Cymbidium ensifolium , Wang 2011). However, genetic analyses of endemic South American orchids are still rare (Ávila Diaz and Oyama 2007; Borba et al. 2001). The ISSR technique has the ability to generate a large number of multilocus markers and can be applied to analyze almost any organism (Arcade et al. 2000). ISSR is one of many fingerprinting techniques based on PCR (Polymerase Chain Reaction) and is defined as a variant of PCR using sequence primers to amplify simple and repetitive regions between target sequences (Zietjiewicz et al. 1994). The ISSR method assesses the abundance and random distribution of Simple Sequence Repeats (SSRs) in genomes of plants and other organisms, amplifying DNA sequences contained between 60
these SSRs (Reddy et al. 2002). Moreover, ISSR studies at the population level have recently demonstrated the hyper variable nature of these markers and their potential use in population analyses (Pinheiro et al. 2010). ISSR are especially valuable when studying closely related taxa , due to the difficulty in finding DNA regions that are sufficiently variable in recently radiated taxa (Archibald et al. 2006). In a previous study, phylogenetic analysis of the Laeliinae subtribe was performed with ribosomal ITS sequences and plastidal DNA; however, inconsistencies in the trees were reported (van den Berg et al. 2000 and 2009). Added to the sequencing data, dominant ISSR markers have been proposed by several authors as being potentially useful for phylogenetic reconstruction of closely related species (Joshi et al. 2000; Hao et al. 2002; Sudupak et al. 2004). Thus, this study assesses the use of a further genetic marker technique in an attempt to address this lack of genetic resolution. Furthermore, we analyze the phylogenetic relationships of the endangered Brazilian orchids Cattleya granulosa Lindl., Cattleya labiata Lindl. and Cattleya schofieldiana Rchb.f. (Martinelli and Moraes 2013; MMA 2008), with two other native Brazilian species of Epidendroideae: Brassavola tuberculata Hook. and Cattleya bicolor Lindl. Materials and methods Plant samples Fresh leaves were collected from five individuals of each orchid, placed in 2.0 mL tubes containing 10% CTAB (cetyltrimethyl ammonium bromide), and stored at –20º C in the laboratory. The species presents a low population density, so the sample size obtained was small. Individuals of C. granulosa Lindl. were sampled from the Atlantic Rainforest in the northeast of Brazil (Municipality of Ceará Mirim, Rio Grande do Norte State), along with samples of Brassavola tuberculata (Municipality of Rio do Fogo, Rio Grande do Norte State), and C. labiata (Paraíba State). Specimens of C. schofieldiana and C. bicolor were donated by private collectors from the Brazilian southeast. DNA extraction and ISSR amplification Genomic DNA was extracted from leaves using the CTAB protocol (Doyle and Doyle 1987). Of the 20 screened primers, we selected 11 primers
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for use in this study (Table 1). PCR amplifications were performed in 12 L reaction containing DNA 2 ng, PCR buffer (500 mM KCl, 100 mM pH 8.4; 1%
Triton X 100, 20 mM MgCl 2), dNTP (2.5 mM), plus an additional 50 mM MgCl 2, 1 U Taq DNA polymerase, and ISSR primer (2 M). All amplifications were carried out in a MJ Research PTC 100 thermocycler using the following sequence: an initial step of 2 min at 94°C; followed by 37 cycles of 15 s at 94°C, 30 s at 42°C and 1 min at 72°C; and a final extension step of 7 min at 72°C. Amplification products were resolved by electrophoresis on 1.5% agarose gel, running at 100 V for 3.5 hours. Gels were stained with GelRed TM in 1 X TAE (Tris Acetate EDTA) buffer and photographed under ultraviolet light. Molecular weights were estimated using a 1,000 bp DNA ladder. The criterion for choosing primers was that they had unambiguous and reproducible bands. Identification of the optimal number of bands The optimum number of ISSR markers (ONM) was calculated using the GENES software (Cruz 2001), through bootstrap analysis (Manly 1997). For each pair of plants, the genetic similarity was estimated from thirty simulations with different sizes (1, 6, 11, ..., 161 bands). The sum of squared deviations (SSD), stress ( S), and the correlation ( r) values between the original and simulated matrices were used to evaluate the optimal number of polymorphic bands according to Kruskal (1964). S values indicate the difference between the original matrix and the simulated matrix. When the value of S is less than 0.05, the number of fragments is considered sufficient for the analysis (Kruskal 1964). Genetic analysis The amplified DNA fragments were scored as present (1) or absent (0). Only reproducible bands were scored; smeared and weak bands were excluded. To assess the polymorphic information content (PIC), we used the 2 th formula PIC = 1 Σpi , where pi is the frequency of the i amplified allele . The PIC indicates the ability of each marker to be found in two different states (presence/absence) in two plants chosen randomly from the population.
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The genetic diversity parameters for each orchid species were analyzed using POPGENE version 1.32 (Yeh el al. 1999) to estimate: the percentage of polymorphic bands ( PL, 0.95 criterion, Nei 1987), number of alleles ( Na ), Nei’s
(1973) expected heterozygosity ( HE), and the Shanon index of diversity ( I). The level of genetic differentiation among species was estimated using the analysis of molecular variance (AMOVA), performed in ARLEQUIN software (Excoffier et al. 2007). The test of significance for AMOVA was carried out with 10,000 permutations, as well as the pairwise FST values and significance. Principal component analysis was performed with STATISTICA 7.0 (StatSoft 2004) using the genetic distance matrix of the individuals with UPGMA as the grouping algorithm (Sneath and Sokal, 1973). Aggregations of plotted individuals reveal sets of genetically similar individuals.
Results ISSR profiles The 11 selected ISSR markers generated 166 unambiguous and reproducible bands, 161 (96.7%) of which were polymorphic, with sizes ranging from 300 bp to 8,000 bp. The number of bands varied from 9 (UBC 862) to 21 (UBC 898) with an average of 15 bands per ISSR markers (Table 1). Both the primers UBC 898 and UBC 827 presented 21 and 20 ISSR loci for di nucleotide CA and AC repeats, respectively. This was the most informative result among the tested ISSR primers. The PIC values ranged from 0.245 (UBC 822) to 0.479 (UBC 898) with a mean of 0.354, thus demonstrating the strong discriminatory power of the markers identified (Table 1). Optimum number of ISSR markers For all species we found high correlation values ( r > 0.96) between the original (analyzed bands) and simulated matrices (Table 2), with consistency in 156 bands (ONM) at which point the correlation value reached 0.9952 and stress reached 0.0365 for all species. The results in this study showed that the ONM was lower than the number of loci used (166 bands); from this, it can be
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inferred that the estimates of genetic diversity detected among individuals of B. tuberculata , C. bicolo r, C. granulosa , C. labiata , C. schofieldiana present excellent accuracy, between 116 and 146 loci ( E < 0.05) (Figure 1). Genetic diversity Using the ISSR markers, genetic variation was analyzed within each orchid species (Table 3). C. bicolor and C. schofieldiana showed the greatest number of polymorphic loci ( L), with 94 and 93 respectively. The percentage of polymorphic loci ( P) ranged from 30.12% in C. labiata to 56.63% in C. bicolor .
Of the five species, C. bicolor exhibited the highest level of variability ( HE =
0.219; I = 0.323), while C. labiata exhibited the lowest level ( HE = 0.132; I= 0.193) (Table 3). Genetic differentiation According to the AMOVA analysis, the percentage of genetic variation within Laeliinae species was 76.74%, indicating that genetic differentiation was found mainly within species rather than between species (Table 4). The fixation index showed that the most structured species is C. granulosa , with an FST value of 0.322 (Table 3). Principal component analysis of all five species sampled showed that species were clearly and unequivocally differentiated along ordination axis 1 (Figure 2), which captured 26.70% of the total variance. Axis 2 (36.57% of the total variance) differentiated the B. tuberculata population from the Cattleya sp.
Discussion ISSR markers and genetic variation Molecular marker based studies of genetic diversity in plant species are important tools for plant breeding and conservation (Nybom and Bartish 2000). This study represents the first use of the ISSR genotyping technique to measure the genetic variation and assess phylogenetic inferences of five Laeliinae species from the Atlantic Forest of Brazil. The majority of studies on
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the Laeliinae subtribe focus on the phylogeny of the group using plastid markers and nuclear ITS rDNA (van den Berg et al. 2000; van den Berg et al. 2009). In the literature, only the analysis of genetic diversity in C. labiata and its related genera using RAPD (Jin et al. 2004) has been discussed. Recently, Pinheiro et al. (2012) also evaluated natural populations of C. labiata and ten species of the same genus using RAPD and ISSR. The number of loci used in studies of genetic diversity of plant species, with ISSR molecular markers is variable (e.g. Zhang et al. 2010; Brandão et al. 2011). Verma et al. (2009) selected 11 ISSR primers to analyze genetic diversity of nine species of Vanilla , and found 108 loci of which 93 were polymorphic (86.11%). Wang et al. (2009b) evaluated the genetic diversity and phylogenetic relationships among 31 Dendrobium species with 17 ISSR primers and obtained 278 loci with 100% polymorphism. According to Colombo et al. (2000), between 50 and 100 bands is considered sufficient to estimate genetic relationships among and within plant species. Thus, we concluded that the ISSR markers used in this study are sufficient not only for quantifying the genetic diversity of B. tuberculata , C. bicolor , C. granulosa , C. labiata and C. schofieldiana , but also to identify polymorphism between individuals in populations. The results show that the genetic parameters Ne , He and I were statistically identical among B. tuberculata , C. bicolor and C. shofieldiana , as compared with the standard error (Table 3). However, the Na parameter was statistically different among the five species. Although the sampling strategy does not permit us to make conclusions about the levels of genetic diversity, long lived and outcrossing species are expected to be more variable than annual and self compatible species (Hamrick and Godt 1990). Thus, in future studies, the sampling of populations should consider the geographical distribution of the species, as well as its demographic and reproductive characteristics. Species characterization, phylogenetic relationships and genetic differentiation
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Laeliinae occurs exclusively in the Neotropical region, so it has many peculiarities and ecological morphological traits. The majority of species of the subtribe are epiphytes or rupicolous and have thick leaves and pseudobulbs as an adaptation to xeric habitats (van den Berg et al. 2009). Unlike C. labiata , the other Cattleya species assessed in this study, C. granulosa , C. schofieldiana and C. bicolor , are part of the bifoliolate group (Table 5). The genus Cattleya is characterized by its large flowers and its lip is not fused to the column. Cattleya plants exhibit a strong rootstock, that is slightly reptant, and each growing season, one or two leaf groups root and a new branch is formed. This branch is claviform, flattened laterally, and elongated and thin (bifoliolate species). There are two species groups: the first has spindle shaped pseudobulbs that are strongly compressed laterally with only one leaf (unifoliate); the second is cylindrical and has clavate pseudobulbs with two bracts (bifoliate), and occasionally present three shoots (Braem 1984). The flower buds are surrounded by one or two bracts, which are called the spathe. The flowers are composed of three petals and sepals and two petals form the lip. The lip structure is much more elaborate than the other parts of the flower and involves the spine (Braem 1994). Cattleya labiata Lindl. is a unifoliate orchid (Table 5). According to Menezes (2002) it is known as the " Queen of Northeast Brazil " because of its beauty, variety of fragrances, and cultivability; the plant is adaptable to different locations and types of substrate. C. labiata is characterized as having only one leaf per pseudobulb ranging from 7 20 cm long. The flowers range from 10 20 cm in length. They are usually pinkish purple or pinkish red, but several varieties have been recorded. Analyses using RAPD and ISSR markers found high levels of polymorphism in the C. labiata (Pinheiro et al. 2012). The species is endangered (MMA 2008) and suffers from extractivism and habitat loss from deforestation. Cattleya granulosa Lindl. varies in size and the plants may have long or short pseudobulbs containing from two to three leaves. The flowers are approximately 15 cm in diameter and vary in number from three to seven per pseudobulb. Flowers range in color from yellow to green to red. C. granulosa Lindl. was included on the official list of endangered flora published by the Brazilian Ministry of the Environment in 2008. This species has suffered
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significant losses due to the harvesting of specimens and habitat loss (Barros et al. 2013). Cattleya schofieldiana is endemic to Brazil and it is found in the phytogeographic domain of the Atlantic Forest, occurring in the states of Espírito Santo and Rio de Janeiro. The plants reach one meter in height and the flowers can reach 10 cm in length and are very fragrant. C. schofieldiana produces between two to five flowers per stem, of yellow to dark brown with stains on the petals and sepals. The purple or magenta lip protrusion has many hairs and has a white border (Barros et al. 2013). Cattleya bicolor is considered a vulnerable species due to several factors, including over collection and habitat destruction. Of all the species in the genus, C. bicolor is the species for which the taxonomy is most often confused. The lateral lobes of the lips are significantly reduced, allowing easy identification within the genus. C. bicolor orchid is medium to large in size. The pseudobulbs are long, cylindrical, ribbed, and oblong with two leaves. The petals and sepals of C. bicolor feature a mahogany brown with purple tones, the lip is rosy pink or magenta. The colors of the flowers can vary considerably between individuals. The point of the flower emerges from a basal sheath and emits between one and seven flowers (Mora et al. 2008). Phylogenetic studies on the Laeliinae subtribe (Epidendroideae, Orchidaceae) suggest important taxonomic changes in recent years (van den Berg 2000; van den Berg et al. 2009). The first molecular phylogenetic analysis on Laeliineae, which was based on ITS sequences, suggested that the genus is not monophyletic (van den Berg et al. 2000).
The results of our study show that the fixation index for C. bicolor (FST =
0.177), B. tuberculata (FST = 0.214), and C. shofieldiana (F ST = 0.219) are similar to the average found for Orchidaceae (F ST = 0.146), which is typically characterized by relatively low genetic differentiation among populations
(Phillips et al. 2012). Despite the genetic differences observed in this study ( FST = 23.2%), the Brassavola group is a close relative of the unifoliate Cattleya (e.g. C. labiata , see Table 5). B. tuberculata often occur on inselbergs, as an epiphyte in the salt marshes of the coast of Brazil, and on rocky outcrops as rupicolous (Cunha and Forzza 2007). This species, also known as the "rat tail orchid", is characterized by having long arching leaves. Its flowers, with
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greenish petals and sepals and white lip ranging from four to 10 per stem, open in the summer coinciding with the blooming of C. labiata (Barros et al. 2013). In fact, principal component analysis (PCA) showed greater genetic similarity between these two unifoliate species (Figure 2). Still, according to the PCA, bifoliate species are divergent from unifoliate species, forming a secondary group explained by axis 2. Finally, the data suggest that C. shofieldiana and C granulosa Lindl. are closely related. C. shofieldiana is often considered a variety of C. granulosa Lindl. and is known as Cattleya granulosa var. schofieldiana (Rchb.f.) A.H.Kent (Govaerts 2003; Barros et al. 2013). The data obtained using ISSR markers to analyze these species have shown that they are effective in assessing interspecific differentiation. Such analyses may contribute to the conservation of Neotropical orchid populations and species. In fact, phylogenetic relationships are being used increasingly as a tool to study conservation genetics. In such analyses, one of the most important applications is in the definition of taxonomic units (Allendorf and Luikart 2007). Thus, the results of this study can be applied to studies of population genetics in order to define priority areas for the conservation of orchids in their remaining natural habitats. Acknowledgements The authors acknowledge the Brazilian agency “Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)” for providing a PhD fellowship to C.G. Fajardo. We also thank Dr. Evelyn Nimmo for editing the English language of the manuscript.
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Table 1. Summary of ISSR primers used in the screening of B. tuberculata , C. bicolor , C. labiata , C. granulosa and C. shofieldiana. Polymorphic % P , 0.95 Range of amplified bands ISSR primers Sequence (5’–3’) Loci L PIC loci ( PL) criterion (bp)
UBC 807 AG 8T AGA GAG AGA GAG AGA GT 14 14 100 600 2000 0.329
UBC 809 AG 8G AGA GAG AGA GAG AGA GG 17 17 100 600 2500 0.448 UBC 821 GT 8T GTG TGT GTG TGT GTG TT 11 11 100 700 2000 0.334 UBC 822 TC 8A TCT CTC TCT CTC TCT CA 16 16 100 1000 8000 0.245 UBC826 AC 8C ACA CAC ACA CAC ACA CC 17 16 94 600 2500 0.406 UBC 827 AC 8G ACA CAC ACA CAC ACA CG 20 19 95 600 3000 0.297 UBC 842 GA 8YG GAG AGA GAG AGA GAG AYG 16 16 100 300 1300 0.458 UBC851 GT 8YG GTGTGTGTGTGTGTG TYG 12 12 100 600 1500 0.258 UBC 860 TG 8RA TGT GTG TGT GTG TGT GRA 13 13 100 600 2000 0.366
UBC 862 AGC 6 AGC AGC AGC AGC AGC AGC 9 6 66.7 600 1500 0.274
UBC 898 CA 6RY CAC ACA CAC ACA RY 21 21 100 500 2500 0.479 Average 15 14 96.99 0.354 Total 166 161
Table 2. Analysis of optimal number of ISSR markers (ONM) for five species of Laeliinae. Species ONM Correlation SQ Stress Deviatio n B. tuberculata 146 0.9958 0.0049 0.0424 C. bicolor 136 0.9924 0.0072 0.0476 C. granulosa 141 0.9968 0.0021 0.0495 C. labiata 146 0.9810 0.0021 0.0486 C. schofieldiana 116 0.9661 0.0088 0.0490 All species 156 0.9952 0.0571 0.0365
Table 3. Measures of genetic diversity of B. tuberculata (Bt), C. bicolor (Cb), C. labiata (Cl), C. granulosa (Cg) and C. schofieldiana (Cs) .
Codes n L P Na Ne HE I FST Bt 5 87 52.41 1.524 ±0.0388 1.387 ±0.0315 0.216 ±0.0168 0.314 ±0.0239 0.214 Cb 5 94 56.63 1.566 ±0.0386 1.383 ±0.0303 0.219 ±0.0161 0.323 ±0.0230 0.177 Cl 5 50 30.12 1.323 ±0.0364 1.230 ±0.0273 0.132 ±0.0152 0.193 ±0.0219 0.256 Cg 5 51 30.72 1.395 ±0.0381 1.292 ±0.0305 0.163 ±0.0162 0.237 ±0.0232 0.322 Cs 5 93 56.02 1.560 ±0.0386 1.374 ±0.0326 0.213 ±0.0162 0.314 ±0.0230 0.219
Sample size ( n), polymorphic loci ( L) and percentage of polymorphic loci P (0.95) , number of
alleles (Na , mean ± s.e.), effective number of alleles (Ne , mean ± s.e.), gene diversity ( HE,
mean ± s.e.), Shannon index of diversity ( I, mean ± s.e.), fixation index ( FST ).
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Table 4. Analysis of molecular variance (AMOVA) for B. tuberculata , C. bicolor , C. granulosa , C. labiata and C. schofieldiana based on 166 ISSR markers. Source of d.f. Sum of Variance % total of variation P variation squares components Among 4 64.536 2.10536 23.26 0.00030 species Within 17 118.100 6.94706 76.74 0.00001 species Total 182.636 9.05242
Fixation ФST : 0.232 Index d.f. = degrees of freedom.
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Table 5. Taxonomic data, geographical distribution, habitat, somatic chromosome number (2n), and conservation status of Laeliinae species.*
Species Leaf Endemism Phytogeographic domains Geographical distribution Habitat 2n Endangered B. tuberculata Unifoliate No Caatinga, Cerrado and Atlantic Argentina, Bolivia, Epiphyte or 40 No Forest Paraguay, Peru, and Brazil rupiculous North (TO), Northeast (RN, PB, PE, BA, AL, SE), Southeast (MG, SP, RJ), South (PR, SC, RS). C. bicolor Bifoliolate Yes Cerrado and Atlantic Forest Southeastern states (SP, Epiphyte 40 Yes RJ, MG, ES), the Midwest and (DF) 80 C. labiata Unifoliate Yes Atlantic Forest and Caatinga Northeastern states (CE, Epiphyte or 40 Yes PA, PE, AL, SE) and rupiculous states Southeast (ES RJ) C. granulosa Bifoliolate Yes Atlantic Forest Northeastern states (RN, Epiphyte or 40 Yes PA, PE and AL) and terrestrial Southeast (ES) C. schofieldiana Bifoliolate Yes Atlantic Forest Northeastern states (BA) Epiphyte 40 Yes Southeast states (ES, RJ) * Barros et al. (2013); Braem (1994); Cunha and Forzza (2007); Menezes (2002); Mora et al. (2008). Abbreviation of the Brazilian states: Alagoas (AL), Bahia (BA), Ceará (CE), Distrito Federal (DF), Espirito Santo (ES), Minas Gerais (MG), Paraíba (PB), Paraná (PR), Pernambuco (PE), Santa Catarina (SC) Sergipe (SE), São Paulo (SP), Rio de Janeiro (RJ), Rio Grande do Norte (RN), Rio Grande do Sul (RS), Tocantins (TO).
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Figure 1. Optimum number of ISSR markers for B. tuberculata (Bt), C. bicolor (Cb), C. granulosa (Cg), C. labiata (Cl), C. bicolor (Cb), and C. schofieldiana (Cs).
Figure 2. Principal component analysis of ISSR data for Laeliinae. Percentage of variance accumulated on the axes: axis1 = 26.70%; axis 2 = 36.57%. B. tuberculata (Bt), C. bicolor (Cb), C. granulosa (Cg), C. labiata (Cl) and C. schofieldiana (Cs).
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______CAPÍTULO 4
ESTRUTURA GENÉTICA DE Cattleya granulosa Lindley: UMA ORQUÍDEA AMEAÇADA DA FLORESTA ATLÂNTICA BRASILEIRA
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ESTRUTURA GENÉTICA DE Cattleya granulosa Lindley: UMA ORQUÍDEA AMEAÇADA DA FLORESTA ATLÂNTICA BRASILEIRA
Cristiane Gouvêa Fajardo 1* , Fábio de Almeida Vieira 2, Leonardo Pessoa Felix 3, Wagner Franco Molina 4
1 Departamento de Botânica, Ecologia e Zoologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, CEP 59078 970, Natal, RN, Brasil. 2 Unidade Acadêmica Especializada em Ciências Agrárias, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, CEP 59280 000, Macaíba, RN, Brasil. 3 Departamento de Fitotecnia, Centro de Ciências Agrárias, Universidade Federal da Paraíba, Campus III, CEP 58397000 Areia, PB – Brasil 4 Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, CEP 59078 970, Natal, RN, Brasil.
Resumo
Atualmente muitas orquídeas brasileiras estão ameaçadas de extinção em consequência da perda de hábitat e intensa pressão de coleta em razão do valor ornamental. A diversidade genética remanescente é fundamental para a sobrevivência destas espécies nos ambientes naturais. Este trabalho teve como objetivo avaliar a diversidade genética de Cattleya granulosa , auxiliando nas estratégias de conservação. Foram amostrados 151 indivíduos em 12 populações da Floresta Atlântica do Nordeste do Brasil, avaliados por 91 marcadores ISSR. Foram determinados a variabilidade genética por meio da variância molecular, índices de diversidade, agrupamentos de genótipos por meio de inferência Bayesiana e testes de gargalo genético. A partir dos 100% de locos polimórficos, a diversidade genética (H E) variou entre 0,210 e 0,321 e índice de Shannon entre 0,323 e 0,472. A alta diferenciação genética das populações (ФST = 0,391; P < 0,0001) determinou a estruturação das populações em nove grupos, conforme modelo Log likelihood da análise Bayesiana, com padrão similar no dendrograma (UPGMA) e análise dos componentes principais. Houve correlação positiva e significativa entre as distâncias geográficas e genéticas entre as populações (r = 0,794; P = 0,017), indicando isolamento pela distância. Padrões de diversidade alélica sugerem a ocorrência de gargalos populacionais na maioria das populações de C. granulosa Lindl. (n = 8) . Assim, a manutenção da diversidade genética da espécie está diretamente relacionada com a conservação das unidades ou grupos que estão espacialmente distantes.
Palavras-chave: Orchidaceae, diversidade genética, espécie vulnerável, gargalo genético.
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GENETIC STRUCTURE OF Cattleya granulosa : AN ENDANGERED ORCHID OF BRAZILIAN ATLANTIC FOREST
Abstract
Actually many Brazilian orchids are endangered due to habitat loss and intense harvesting pressure owing to the ornamental value. The remaining genetic diversity is critical to the survival of these species in natural environments. This study aimed to evaluate the genetic diversity of Cattleya granulosa , contributing in conservation strategies. We sampled 151 individuals from 12 populations of the Atlantic Forest in northeastern Brazil, evaluated by 91 ISSR markers. Molecular variance estimates, diversity index, clusters of genotypes using Bayesian inference and genetic bottleneck tests were determined. From 100% of polymorphic loci, the genetic diversity (H E) ranged between 0.210 and 0.321 and the Shannon index between 0.323 and 0.472. The high genetic differentiation between populations (ФST = 0.391, P < 0.0001) determined the structure of populations into nine groups according to Log likelihood of Bayesian analysis, supported by a similar pattern in the dendrogram (UPGMA) and principal component analysis. There were significant positive correlation between geographical and genetic distances between populations ( r = 0.794, P = 0.017), indicating isolation by distance. Patterns of allelic diversity suggest the occurrence of population bottlenecks in most populations of C. granulosa Lindl. (n = 8). Thus, the maintenance of genetic diversity of the species is directly related to the conservation of units and groups that are spatially distant.
Keywords: Orchidaceae, genetic diversity, vulnerable species, bottleneck
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Introdução
Orchidaceae é o grupo mais derivado dentro de monocotiledôneas (Niknejad et al., 2009). A família possui uma alta diversidade e ampla gama de estratégias reprodutivas, que resultou em uma enorme variedade de padrões de diferenciação genética entre as populações (Wallace, 2003; Niknejad et al., 2009). Possuem um grande sucesso adaptativo e plasticidade fenotípica, e, consequentemente, adaptam se e colonizam diversos nichos, até mesmo regiões mais remotas no planeta, como em ilhas na Antártica (Chase et al., 2003). Orchidaceae apresenta uma grande proporção de gêneros e espécies em perigo de extinção em relação a outras famílias (Hopper & Brown, 2007; Martinelli & Moraes, 2013). A fragmentação das florestas nativas e a extração ilegal de orquídeas tiveram uma influência forte na extinção local dessas espécies. Atualmente, a família é um dos mais claros exemplos de extinção de espécies resultantes das atividades humanas (Ávila Diaz & Oyama, 2007). Desta forma, é caracterizada a necessidade urgente de estudos intensivos e mais específicos. O gênero Cattleya Lindl. é exclusivamente Neotropical, o qual possui ampla distribuição pelo Brasil com aproximadamente 30 espécies, das quais 25 são endêmicas (Pabst & Dungs, 1975). Dentre as espécies de orquídeas ameaçadas de extinção destaca se Cattleya granulosa Lindl. Sua distribuição é ainda controversa, ocorrendo especialmente no Rio Grande do Norte, mas também em Pernambuco, Alagoas, Paraíba, Bahia e Espírito Santo (Cruz et al., 2003). Registros recentes indicam a ocorrência nos Estados do Rio Grande do Norte, Paraíba e Bahia (Martinelli & Moraes, 2013). Ocorre principalmente na faixa litorânea, em áreas de restinga. A espécie tem como ameaça a fragmentação do hábitat, ocasionada principalmente pelo desenvolvimento urbano e pressão de coleta predatória, em função do seu valor ornamental. Devido estas ameças, a espécie foi incluída como vulnerável (VU) de acordo com os critérios da International Union for Conservation of Nature , IUCN (MMA, 2008; Martinelli & Moraes, 2013). Esforços significativos têm sido feitos nas últimas três décadas para se obter informações a respeito da variabilidade genética, entretanto ainda são insuficientes diante da diversidade de espécies de orquídeas, principalmente as 80
espécies brasileiras e aquelas ameaçadas de extinção (Borba et al., 2007, Cruz et al., 2011). Os poucos estudos de genética de populações de orquídeas têm enfocado geralmente as plantas terrestres (Trapnell et al., 2004). Em contraste, apesar da alta diversidade de espécies e importância ecológica de espécies epífitas, estas têm recebido menos atenção, provavelmente por causa das dificuldades de acessar o dossel e a estrutura metapopulacional das mesmas (Trapnell et al,. 2004; Trapnell & Hamrick, 2005). Tais estudos têm revelado que espécies de fecundação cruzada têm maior diversidade genética do que espécies de autofecundação e apomíticas (Sun & Wong, 2001; Wallace, 2004); espécies de ampla distribuição geográfica em geral apresentam maiores níveis de variação genética do que espécies endêmicas e de distribuição restrita (Case et al., 1998; Borba et al., 2001) e, frequentemente, grandes populações têm maior diversidade genética (Gustafsson, 2000; Cozzolino et al., 2003). A conservação da diversidade genética é importante para manter a capacidade evolutiva de uma espécie em responder às mudanças ambientais e também manter a viabilidade de suas populações em longo prazo (Toro & Caballero, 2005). Os parâmetros genéticos populacionais podem ser estimados a partir dos dados obtidos com o uso de marcadores moleculares baseados na amplificação da sequência de DNA, possibilitando a análise da diversidade e estruturas genéticas (dentro e entre populações) e compreender a dinâmica dos alelos nestas populações (George et al., 2009; Pinheiro et at., 2012). A estrutura genética de uma população é moldada pela interação dos fatores evolutivos como mutação, seleção, migração e deriva genética, e influenciada pelo tamanho populacional, ciclo de vida das espécies e fluxo alélico (Couvet, 2002). Este último fator é o resultado tanto da eficiência dos dispersores e polinizadores em alcançar outras populações como do isolamento entre elas (Loveless & Hamrick, 1984; Nybom & Bartish, 2000). Assim, o objetivo deste trabalho foi descrever os níveis de diversidade e estrutura genética intra e interpopulacional e estudar os padrões de distribuição espacial da variabilidade genética, com a finalidade de verificar a existência de isolamento pela distância ou unidades significativas para a conservação de C. granulosa. A ocorrência de eventos recentes de redução severa do tamanho efetivo populacional ( bottlenecks ) foi também estimada para identificar
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populações com maior risco de extinção devido à perda de variação genética e consequentemente do potencial adaptativo.
Material e Métodos
Espécie alvo
Cattleya granulosa , popularmente conhecida como “canela de ema” é epífita (eventualmente terrestre), perene, possui caules rizomatosos com pseudobulbos eretos e cilíndricos, que podem atingir de 40 a 60 cm de altura (Costa, 2010). Possui flores bilateralmente simétricas e três sépalas petaloides carnosas, sendo uma dorsal e duas laterais com cores que variam entre os tons esverdeados, amarelados e castanhos avermelhados apresentando se, na maioria das vezes, com manchas granulares na cor vinácea (Camara Neto et al., 2007). As flores caracterizam se pela presença de osmóforos localizados na parte interna dos lobos laterais do labelo, que exalam odor fortemente adocicado, e guias de néctar no labelo que absorvem luz ultravioleta. A orquídea mimetiza o modelo geral de flor tipicamente melitófila, porém produzem pouco néctar floral, provavelmente indicando um mecanismo de engodo com a seleção dependente da frequência negativa (Costa, 2010). Adicionalmente, C. granulosa Lindl. é autocompatível e dependente de vetores bióticos para a reprodução sexuada, que são muito raros; logo a frutificação é baixa (Costa, 2010). Esse mesmo padrão de autocompatibilidade, a raridade de eventos de polinização em ambientes naturais, muitas vezes determinada pela restrição de polinizadores, é igualmente observado em outras espécies de Laeliinae (Borba & Braga, 2003, Vale et al., 2013; Pansarin & Amaral, 2008; Silva Pereira et al., 2007)
Locais de estudo e amostragem
A amostragem dos indivíduos de C. granulosa Lindl. foi realizada em áreas de Floresta Estacional Semidecidual e Floresta de Restingas, pertencentes ao domínio Mata Atlântica (Velozo et al., 1991) no Nordeste do Brasil, cujas populações estão limitadas a pequenos remanescentes disjuntos desse bioma. Foram amostrados 151 indivíduos de C. granulosa Lindl. (Tabela
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1), a partir de 12 populações naturais localizadas nos Estados do Rio Grande do Norte, Paraíba e Pernambuco (Figura 1). Dentre as populações, ESC e MUR são as mais distantes geograficamente com 303,2 Km, e as populações GEN1 e GEN2 são as mais próximas com 1,1 Km. A amostragem visou uma melhor representatividade das populações, incluindo indivíduos seguindo metodologias já empregadas para outras espécies da família (Chung, 2009). As populações foram georreferenciadas por GPS.
Tabela 1 . Localização geográfica das populações de Cattleya granulosa , código das populações, coordenada geográfica, número de indivíduos, n tamanho amostral, altitude. RN – Rio Grande do Norte; PB – Paraíba; PE – Pernambuco. População/estado Abbr. Latitude/longitude n Altitude Muriú (RN) MUR 5° 35' S/ 35° 16' O 18 41 APA Genipabu1 (RN) GEN1 5°42' S / 35°12'O 12 40 APA Genipabu2 (RN) GEN2 5°42' S / 35°13'O 13 33 Parque das Dunas N (RN) PER 5°48' S/ 35°11'O 13 86 Parque das Dunas S (RN) CAR 5°49' S/ 35° 11' O 22 82 Parque Dom Nivaldo (RN) NIV 5° 50' S/ 35° 13' O 10 77,2 Barreira do Inferno (RN) BAR 5° 55' S/ 35° 10' O 10 16 Alcaçuz (RN) ALC 5°59' S / 35°08' O 10 57 Mataraca (PB) MAT 6º 29' S/ 34º 58' O 11 69 Mamanguape (PB) PAB 6° 52' S/ 35° 06' O 14 11 Cabo de Santo Agostinho (PE) SAN 08°16' S/ 34° 57' O 10 26 Escada (PE) ESC 8°20' S/ 35°11' O 6 177
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Figura 1. Localização geográfica das áreas de amostragem de Cattleya granulosa. Em A, o mapa do Brasil com as regiões de coleta das populações da orquídea, destacadas em cinza. Em B, as populações de Cattleya granulosa Lindl. nos estados do Rio Grande do Norte (RN), Paraíba (PB) e Pernambuco (PE) dentro do domínio Mata Atlântica.
Material Vegetal
Amostras de folhas jovens e sadias foram coletadas e acondicionadas em tubos de 2 mL contendo 10% de CTAB (brometo de cetiltrimetilamônio). O material foi armazenado em freezer a 20ºC até o momento da extração do DNA.
Extração de DNA e amplificação de ISSR Para a extração do DNA foi utilizado o método descrito por Doyle & Doyle (1987). As reações para amplificação do DNA foram realizadas em termociclador Techne TC 412. Foram efetuados 37 ciclos de amplificação constituídos de uma etapa de iniciação de 2 minutos a 94°C, seguido por uma
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etapa de desnaturação a 94°C por 15 segundos, uma etapa de anelamento do primer ISSR ao DNA molde (pareamento) a 42°C por 30 segundos, e uma etapa de extensão a 72°C, por 1 minuto. Ao final, ocorreu a etapa de extensão a 72°C, por 7 minutos. A concentração de cada amostra amplificada foi de 2 ng de DNA adicionados a 10 L de mix de reação [tampão PCR 10X (500 mM KCl, 100 mM pH 8.4; 1% Triton X 100, MgCl 2 20 mM), dNTP a 2,5 mM; MgCl 2 a 25 mM, 1 U Taq polimerase, primer a 2 M e completado o volume final com água ultrapura]. Os produtos da amplificação foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1,5%, corado com GelRed TM em 1 X TAE (Tris Acetato EDTA). Posteriormente, os géis foram fotografados sob luz UV. Utilizou se marcador de DNA (ladder) de 1 kb para estimar o tamanho molecular dos fragmentos amplificados. Foram testados 20 primers (iniciadores) para identificar quais deles apresentaram o melhor perfil de amplificação. Para isso, foram escolhidas aleatoriamente quatro amostras de DNA do conjunto total de indivíduos. Foram selecionados seis iniciadores com o maior número de amplicons (Tabela 2). Análises estatísticas
Diversidade genética populacional
Os perfis dos géis de ISSR amplificados foram registrados de acordo com a presença (1) e a ausência (0) dos fragmentos para a construção da matriz binária utilizada nas análises estatísticas. Os parâmetros de diversidade genética, tais como porcentagem de locos polimórficos ( P), número de alelos efetivos ( Ne ), número de alelos observados (Na ), diversidade genética de Nei ( He ) e índice de Shannon ( I) foram calculados usando o programa POPGENE v.1.32 (Yeh et al., 1999). Ainda com auxílio do programa POPGENE, o fluxo gênico indireto ( Nm ) foi calculado utilizando a fórmula: Nm = 0,5 (1 – GST )/G ST (McDermott & McDonald, 1993), onde G ST é o coeficiente de diferenciação populacional de Nei (1978). O fluxo
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gênico histórico foi estimado entre os pares de população, para verificar aquelas que mais contribuíram para a movimentação de alelos entre elas.
Estrutura genética
A análise de variância molecular (AMOVA) foi estimada por meio do programa ARLEQUIN v.3.5.1.3 (Excoffier et al., 2009) para determinar a estruturação da variabilidade genética das populações. O teste de significância da AMOVA foi realizado com 10.000 permutações, bem como o valor de ФST e a sua significância. A representação simplificada da identidade genética de Nei (1978), obtida no POPGENE, foi realizada pela construção de um dendrograma pelo método de agrupamento UPGMA Unweighted Pair-Group Method with Arithmatic Mean , com auxílio do programa NTSYS v.2.11 (Rohlf, 2000). A hipótese de isolamento pela distância foi testada com o uso da correlação de Mantel, com o programa PC Ord 4.14 (McCune & Mefford, 1997). Para a randomização dos dados, utilizou se o método de Monte Carlo com 1.000 permutações aleatórias para obter a significância das correlações matriciais, entre os pares de distância genética (GST ) e a matriz de distância geográfica das populações. A análise dos componentes principais (PCA) foi realizada no programa GenAlEx (Peakall & Smouse, 2006).
Análise bayesiana
Para inferir o número de grupos genéticos (K) que representam as populações amostradas, foi utilizada a análise Bayesiana por meio do programa Structure v.2.2 (Pritchard & Wen, 2002). O número de grupos genéticos (K) utilizados variou de k=1 a k=12, sendo estimado com o uso do modelo de ancestralidade não misturada ( no admixture ) com a frequência de alelos correlacionados. Foram realizadas 12 corridas independentes para cada K. Cada corrida constituiu de 100.000 simulações de Monte Carlo via Cadeia Markov (MCMC) e burn-in de 50.000. O número de K populações é obtido pelo cálculo médio de cada K pelo modelo Log likelihood, ‘ log of probability ’ (LnP(D)), onde espera se que o número de grupos genéticos seja o valor K
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máximo observado, ou com o menor número negativo de Ln (Pritchard et al. 2000). Detecção de recentes decréscimos populacionais
Com a finalidade de verificar a ocorrência de diminuições contemporâneas significativas do tamanho efetivo, devido à redução populacional ou colonização recente, foi usado o programa Bottleneck 1.2.02 (Cornuet & Luikart, 1997). Para isso foi utilizado o modelo de alelos infinitos (IAM), com base em Kimura & Crown (1964), e o modelo de passos de mutação (SMM), segundo Kimura & Otha (1978). Luikart & Cornuet (1998) recomendam empregar o SMM, apenas ao analisar sequências simples (ex. microssatélites), pois geram resultados robustos. Entretanto, uma vez que o verdadeiro modelo de mutação para a maioria dos locus é intermediário entre IAM e SMM, ambos os modelos são recomendados (Luikart & Cornuet, 1998). ISSRs e microssatélites são de origem semelhantes (Godwin et al., 1997) e devem seguir o mesmo modelo de mutação. Foi aplicado o teste do sinal (α = 0,05), a partir da frequência dos alelos, para revelar gargalos genéticos recentes significativos (Luikart & Cornuet, 1998). Resultados
Marcadores ISSR
Os seis iniciadores de ISSR utilizados neste estudo geraram 91 locos polimórficos. O número de locos, conforme Tabela 2, variou entre 11 e 18 locos por iniciador (média = 15), com tamanho da sequência variando entre 600 e
2.500 pb. A concentração final do MgCl 2 foi otimizada, variando conforme o iniciador, entre 2,0 e 2,3 mM (Tabela 2).
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Tabela 2. Iniciadores otimizados com suas respectivas temperaturas de anelamento, concentração de MgCl 2 e número de locos. Iniciador ISSR Sequências (5’–3’) Temperatura Concentração de Loci otimizada (°C) MgCl 2 (mM) 47 2,2 11 UBC 807 (AG)8 T AGA GAG AGA GAG AGA GT 47 2,3 17 UBC 822 (TC)8 A TCT CTC TCT CTC TCT CA 42 2,2 18 UBC826 (AC)8C ACA CAC ACA CAC ACA CC 47 2,0 15 UBC 827 (AC)8 G ACA CAC ACA CAC ACA CG 47 2,2 14 UBC 841 (GA)8 YC GAG AGA GAG AGA GAG AYC 47 2,2 16 UBC 898 (CA)6 RY CAC ACA CAC ACA RY 96 TOTAL R, purina (A or G); Y, pirimidina (C or T).
Diversidade genética populacional
Todos os 91 locos foram polimórficos, com número de alelos ( Na ) igual a
2 (± 0,000) e número de alelos efetivos ( NE) igual a 1,571 (± 0,261). A
diversidade genética de Nei (1973, HE) para o total das populações, assumindo o equilíbrio de Hardy Weinberg, foi de 0,344 (± 0,118) e o índice de Shannon ( I) de 0,519 (± 0,144). Em Natal, as populações do Parque das Dunas (CAR e PER), e no Centro de Lançamento da Barreira do Inferno (BAR) apresentaram os maiores
índices de diversidade genética ( HE) (Tabela 3). As porcentagens de locos polimórficos nessas populações foram respectivamente de 96,70%, 89,01% e 85,71% (Tabela 3). As populações de Escada (ESC) e Cabo de Santo Agostinho (SAN), no Estado de Pernambuco, apresentaram a menor porcentagem de locos polimórficos ( P): 50,55% e 68,13%. Contudo, ESC possui o índice diversidade
genética (H E) superior às populações da APA Genipabu 1 (GEN1), SAN e PAB,
que apresentaram os menores valores de H E (0,210; 0,232 e 0,260 respectivamente). Estas três populações também possuem baixa porcentagem de locos polimórficos: 67,03%, 68,13% e 78,02%, respectivamente. Os índices de diversidade genética de Shannon ( I) das populações BAR (0,472) e CAR (0,468), no Estado do Rio Grande do Norte, e MAT (0,439), no Estado da Paraíba, foram superiores ao restante das outras populações. Por outro lado, GEN1 e SAN mostraram I inferiores (0,323 e 0,366). Além disso, o número de alelos efetivos (Ne ) em GEN1 e SAN também foram os menores 88
(1,345 e 1,370, respectivamente). As populações Barreira do Inferno (BAR), Mataraca (MAT) e Parque Dom Nivaldo (NIV), mostraram o maior número de alelos efetivos (Ne ) (1,570; 1,511 e 1,496, respectivamente).
Tabela 3. Estimativas da diversidade genética em 12 populações de Cattleya granulosa no NE do Brasil.
População UC n L %P Na Ne HE I ALC NÃO 10 74 81,32 1,813 ±0,392 1,494 ±0,362 0,287±0,184 0,429±0,252 BAR SIM 10 78 85,71 1,857±0,352 1,570± 0,372 0,321±0,184 0,472± 0,247 NIV SIM 10 73 80,22 1,802±0,400 1,496±0,372 0,287±0,185 0,428± 0,254 MUR NÃO 20 72 79,12 1,791±0,409 1,426 ±0,353 0,255±0,181 0,388± 0,251 PER SIM 13 81 89,01 1,890± 0,314 1,401± 0,293 0,256±0,152 0,401±0,207 CAR SIM 22 88 96,70 1,967 ±0,179 1,499± 0,300 0,305±0,141 0,468±0,181 GEN1 SIM 12 61 67,03 1,670±0,473 1,345±0,347 0,210±0,184 0,323±0,263 GEN2 SIM 13 70 76,92 1,769± 0,424 1,471± 0,346 0,279±0,180 0,417±0,255 PAB NÃO 14 73 80,22 1,802±0,4005 1,422±0,321 0,260±0,169 0,398±0,237 MAT NÃO 11 71 78,02 1,780 ±0,416 1,511± 0,351 0,297±0,183 0,439±0,257 ESC NÃO 6 46 50,55 1,780± 0,418 1,489 ±0,382 0,281±0,191 0,419±0,262 SAN NÃO 10 62 68,13 1,838± 0,371 1,370± 0,323 0,232±0,164 0,366 ±0,225 Populações em unidade de conservação (UC), Tamanho amostral ( n), locos polimórficos
(L), porcentagem de locos polimórficos (% P (0.95) ), número de alelos (Na ), número de
alelos efetivos (Ne ), diversidade genética ( HE), índice de diversidade genética de Shannon (I). Os valores apresentados são a média ± desvio padrão. Na comparação entre as populações, conforme Tabela 4, a distância genética de Nei (1978) foi menor entre Parque das Dunas N (PER) e Parque das Dunas S (CAR) (0,014) e entre BAR e NIV (0,019). Já as populações que apresentaram maior distância genética foram entre ESC e PAB (0,503) e entre
ESC e PER (0,501). O valor médio de distância genética de Nei (G ST ) de todas as combinações foi de 0,177.
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Tabela 4 . Estimativas de distâncias genéticas de Nei (1978), abaixo da diagonal, e distância geográfica (Km), acima da diagonal, entre as populações de Cattleya granulosa . Os valores mínimos e máximos estão representados em negrito.
ALC BAR NIV MUR PER CAR GEN1 GEN2 PAB MAT ESC SAN ALC 0 9,2 19,6 46,5 21,6 20,8 33,5 32,4 96,9 58,5 259,5 253,1 BAR 0,038 0 10,8 37,5 12,7 11,4 24,8 23,8 105,0 66,8 267,4 261,4 NIV 0,051 0,020 0 28,0 6,2 5,0 16,0 14,9 114,0 76,7 275,8 270,4 MUR 0,109 0,114 0,124 0 25,0 26,1 13,4 14,0 141,5 103,8 303,2 298,0 PER 0,082 0,093 0,106 0,144 0 1,45 12,0 11,2 117,6 79,1 279,9 274,0 CAR 0,086 0,083 0,096 0,154 0,014 0 13,1 12,4 116,3 78,0 278,5 272,8 GEN1 0,100 0,114 0,145 0,161 0,164 0,169 0 1,1 130,5 91,9 291,5 285,7 GEN2 0,100 0,089 0,117 0,16 0,119 0,096 0,094 0 128,6 91,3 290,5 284,8 PAB 0,043 0,071 0,069 0,088 0,080 0,068 0,107 0,107 0 44,1 163,3 156,6 MAT 0,039 0,060 0,062 0,109 0,075 0,063 0,125 0,111 0,033 0 205,8 197,3 ESC 0,433 0,450 0,426 0,458 0,501 0,486 0,396 0,408 0,503 0,448 0 26,8 SAN 0,280 0,274 0,251 0,344 0,216 0,208 0,314 0,238 0,317 0,276 0,182 0
Estrutura Genética
Pela análise de variância molecular (AMOVA) observa se uma maior proporção da variabilidade genética ocorrendo entre indivíduos dentro das populações (60,85%) do que entre as populações (Tabela 5). Da diversidade
genética total, 39,15% da variação ocorreu entre as populações (ФST = 0,391, P < 0,0001). Tabela 5. Análise de variância molecular (AMOVA) em populações de Cattleya
granulosa . GL: graus de liberdade e SQ: soma do quadrado dos desvios. Ф ST : diferenciação genética. Fonte de Componentes Variação GL SQ P variação da variância Total (%) Entre 11 2,645 0,01736 39,15 < 0,0001 populações Dentro de 137 3,697 0,02699 60,85 < 0,0001 populações Total 148 6,342 0,04434 100 ФST 0,39146 O teste de Mantel revelou a existência de correlação positiva e significativa ( r = 0,794; P = 0,017) entre as distâncias genéticas e geográficas entre as populações (Figura 2).
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Figura 2 . Relação entre as distâncias genéticas e geográficas entre as populações de C. granulosa. O fluxo gênico histórico ( Nm ), obtido pelo cálculo indireto entre os pares de populações (McDermott & McDonald, 1993), revelou maior Nm entre as populações CAR e PER (35,21), NIV e BAR (24,50) e entre MAT e PAB (14,65). Os menores valores de fluxo gênico foram observados entre a população ESC (Estado de Pernambuco) com as demais, que em média foi de 0,6 migrantes. A partir dos valores de identidade genética (Nei, 1978), foi construído um dendrograma pelo método UPGMA (Figura 3), que sugere a existência de um padrão hierárquico de semelhança genética da forma (1) [(((ALC, (PAB, MAT)), (BAR, NIV)), (PER e CAR))]; (2)[(GEN1, GEN2), MUR]; (3) [ESC, SAN]. O agrupamento (3) possui a maior distância geográfica, maior distanciamento genético e menor valor de H E quando comparado com os outros grupos ou populações.
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Figura 3. Análise de agrupamento (UPGMA) das identidades genéticas de Nei entre as 12 populações de C. granulosa . A PCA revelou que o primeiro e o terceiro componente principal explicaram a maior parte da variabilidade total (PC 1 = 53,22 % e PC 3 = 10,78%) (Fig.4).
Figura 4. Análise de componentes principais das populações de C. granulosa , com base na identidade genética de Nei.
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Análise bayesiana A análise Bayesiana realizada no programa Structure revelou a existência de nove grupos genéticos distintos (K = 9), conforme os valores de (LnP(D) da Figura 3.
Figura 3. Valores de K e suas respectivas probabilidades médias, LnP(D), obtidos por meio da abordagem Bayesiana, demonstrando k = 9 como o valor provável de agrupamentos do número total de indivíduos.
O valor de K revela o número real de grupos genéticos, apontado pelo maior valor observado de LnP(D). Assim, as 12 regiões amostradas estão estruturadas em nove grupos, ordenados nas respectivas populações (Figura 4 A e B). A população MUR apresentou alta estruturação, indicada pelos genótipos de cor azul.
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Figura 4. Análise Bayesiana de Cattleya granulosa com a respectiva proporção dos genótipos nas 12 populações amostradas (A) e a ordenação dos nove grupos finais definidos pela estatística Bayesiana (B). As populações são delimitadas pela barra vertical escura. A Figura 5 está organizada de acordo com o valor de Q, ou seja, o coeficiente de participação de cada um dos 151 indivíduos em cada grupo.
Figura 5 . Estimativa da estrutura genética de Cattleya granulosa a partir da análise Bayesiana. Os indivíduos estão representados por linhas verticais e seus respectivos números e população. Cada (n) significa a população de origem, sendo: (1, MUR), (2, GEN1), (3, GEN2), (4, PER), (5, CAR), (6, NIV), (7, BAR), (8, ALC), (9, MAT), (10, PAB), (11, CAB), (12, ESC).
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Detecção de recentes decréscimos populacionais Pelos testes de adequação aos modelos IAM e SMM, apenas quatro populações (ALC, MUR, GEN2 e MAT) mostraram equilíbrio entre mutação e deriva. Para as outras oito populações (BAR, NIV, PER, CAR, GEN1, PAB, ESC e SAN), os modelos indicaram significativamente a ocorrência de gargalos populacionais ( bottlenecks) recentes (Tabela 6). Para ESC e SAN o teste do sinal revelou déficit de heterozigosidade altamente significativo ( P < 0,0001) para ambos os modelos IAM e SMM. Tabela 6 . Testes de equilíbrio entre mutação e deriva genética para as populações de Cattleya granulosa sobre os modelos IAM e SMM. IAM SMM
Populações n Hd/H e P n Hd/H e P ALC 51 46/45 0,13897 51 48/43 0,05797 BAR 53 35/56 0,27065 42 35/56 0,00318** NIV 53 47/44 0,04012* 42 47/44 0,41654 MUR 43 46/45 0,40850 47 49/42 0,14464 PER 39 55/36 0,26576 49 58/33 0,00048** CAR 39 34/57 0,00008** 48 42/49 0,44775 GEN1 36 63/28 0,04555* 45 68/23 0,00000** GEN2 37 49/42 0,16583 42 53/38 0,24080 PAB 42 46/45 0,28812 52 52/39 0,00393** MAT 47 39/52 0,19407 46 41/50 0,25445 ESC 48 65/26 0,00000** 47 65/26 0,00001** SAN 48 70/21 0,00000** 47 70/21 0,00000** n = número esperado de locos com excesso de heterozigosidade sob o respectivo modelo; Hd/He = número de loci com déficit heterozigosidade e excesso de heterozigosidade; P = probabilidade; * e ** = significativo a 5% e 1% de probabilidade, respectivamente.
Discussão
Diversidade genética populacional
O uso de marcadores ISSR mostrou a existência de elevado polimorfismo genético nas populações de Cattleya granulosa . Altas porcentagens de locos polimórficos têm se mostrado comuns em algumas espécies no gênero Cattleya. De fato, esta condição foi observada em oito espécies do gênero,
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utilizando marcadores RAPD (Benner et al., 1995), bem como em C. labiata em que foram analizados conjuntamente marcadores ISSR e RAPD (Pinheiro et al., 2012). Em C. granulosa , mais da metade das populações estudadas apresenta porcentagem de locos polimórficos acima de 70% (ALC, BAR, NIV, MUR, PER, CAR, GEN2, PAB, MAT), sendo que a população de ESC apresentou o menor valor (50,55%). Este valor reduzido de locos polimórficos é provavelmente pelo baixo número de indivíduos encontrados nesta população, com apenas seis indivíduos, decorrente da baixa densidade populacional. Qian et al. (2013) encontraram resultados similares, com marcadores dominantes ISSR, com 96,8% de locos polimórficos para a orquídea rara e endêmica Calanthe tsoongiana , porém com metade das populações exibindo polimorfismo abaixo de 50%. O número de locos utilizados em estudos de diversidade genética em espécies de orquídeas, com o uso de marcador molecular ISSR, tem se mostrado variável. Em Octomeria crassifolia e O. grandiflora foram avaliados 92 e 98 locos, respectivamente (Barbosa et al., 2013); em Calanthe tsoongiana foram utilizados 124 locos (Qian et al., 2013). A proporção entre locos monomórficos e polimórficos é um parâmetro importante que é utilizado em estudos de conservação genética de populações, obtidos a partir de marcadores dominantes (Cota et al., 2011; Oliveira et al., 2012). A distribuição de variabilidade genética dentro e entre as populações pode ser influenciada por características da história de vida, sistema reprodutivo e apresentar um efeito particularmente significativo nas espécies (Nybom & Bartish 2000). Orquídeas epífitas, por exemplo, apresentam índices de diversidade mais elevados quando comparadas com em orquídeas terrestres, pois possuem estratégias de sobrevivência diferentes; exemplos incluem a ocorrência de indivíduos com sistemas reprodução alógama e autógamas e plantas perenes com expectativa de vida longa (Ávila Díaz & Oyama 2007). De fato, os índices de diversidade genética para C. granulosa
Lindl. (H E = 0,344; I = 0,519) foram bem similares aos encontrados para outras orquídeas também epífitas, como Octomeria crassifolia (HE = 0,352; I = 0,530) e
O. grandiflora (HE =0,338 I = 0,508) (Barbosa et al., 2013); e pouco inferior à espécie Calanthe tsoongiana (HE = 0,398; I = 0,576) (Qian et al., 2013). Já
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quando comparado ao de outras três espécies terrestres, ameaçadas e endêmicas, o índice de diversidade genética de C. granulosa Lindl. foi superior ao de Piperia yadonii R. Morgan & Ackerman (H E= 0,06; George et al., 2009),
Paphiopedilum micranthum Tang & Wang (H E= 0,15;. Li et al., 2002), e
Changnienia amoena SS Chien (H E = 0,12; Li e Ge., 2006). Na comparação com espécies filogeneticamente próximas, verifica se que a diversidade genética em C. elongata (H E = 0,175) (Cruz et al., 2011) foi inferior ao da C. granulosa . O mesmo se repetiu em C. labiata (H E = 0,17; I = 0,25) e para outras espécies do mesmo gênero em uma análise conjunta de C. gaskelliana , C. lawrenceana , C. wallissi , C. warneri C. warscewiczii , C. lueddemanniana , C. maxima, C. percivaliana, C. schroeder, C. trianae (H E = 0,22; I = 0,36) (Pinheiro et al., 2012).
A diferenciação genética média esperada (G ST ) em Orchidaceae tem sido estimada em 0,087 (Hamrick & Godt, 1996). Utilizando este parâmetro, o nível de diferenciação genética entre as populações de C. granulosa Lindl. (G ST = 0,177) demonstra ser superior ao esperado para a família. Contudo, os padrões populacionais obtidos para a família têm se mostrado heterogêneos, com valores de G ST que variam entre 0,012 em Pterostylis angusta A.S.George, espécie endêmica (Sharmaa et al., 2001) e 0,924 em Zeuxine strateumatica (Ln.) Schltr., orquídea terrestre de distribuição restrita (Sun & Wong, 2001).
Comparativamente, o valor médio de GST para C. granulosa Lindl. é próximo aos estimados para espécies de vida longa e perene (GST = 0,19), sistema de reprodução mista (GST = 0,20), dispersão anemocórica (GST = 0,17) e de espécies de ocorrência endêmicas (GST = 0,18) (Nybom, 2004). Isso reforça a hipótese de que nestas espécies a maioria das populações remanescentes ainda conserva um elevado grau de variabilidade genética, condição importante para sua sobrevivência e conservação ao longo do tempo. Padrões geográficos da variação genética
A AMOVA revelou alta diferenciação genética entre as populações de C. granulosa Lindl. (39,15%). Este nível de diferenciação é superior ao observado entre populações de C. elongata (18%; Cruz et al., 2011) e C. labiata (15%; Pinheiro et al., 2012), ambas endêmicas do Nordeste brasileiro. Entretanto, o
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valor de diferenciação foi semelhante ao valor descrito para espécies de reprodução mista (Ф ST = 40%) (Nybom, 2004). Isto é condizente com o sistema reprodutivo de C. granulosa , que é autocompatível e dependente de polinizador para a reprodução sexuada (Costa, 2010). A seleção natural altera as frequências gênicas e age em concordância com a migração, dispersão e outros processos que geram a estrutura genética, como por exemplo, o isolamento pela distância (Wright, 1951). Este é o principal modelo para se explicar como ocorrem as subdivisões das populações grandes de distribuição contínua, organizadas aleatoriamente. Esse modelo baseia se na exceção biológica que o cruzamento depende da distância entre os indivíduos, ou da variância na dispersão de seus propágulos, com as populações remotas diferenciando se meramente por meio do isolamento pela distância (Wright 1943). Neste sentido, a alta diferenciação genética de C. granulosa Lindl. caracteriza indícios da segregação espacial dos genótipos. De fato, esta hipótese se mostra compatível para a C. granulosa , conforme expectativas. A correlação positiva e significativa entre a distância genética e a matriz de distância geográfica das populações de C. granulosa Lindl. (r = 0,794, P = 0,017) foi similar ao encontrado para as populações de C. labiata (r = 0.56; P = 0,0001; Pinheiro et al, 2012). Este padrão contrasta com o observado em Cattyea elongata (r = 0,0742, P = 0,4924; Cruz et al., 2011), que apesar de exibir populações com distribuições geográficas disjuntas não apresentavam correlação com a distância geográfica, mesmo em locais onde previamente já foram detectadas a segregação genética espacial de outras espécies de plantas. Um fator importante que deve ser considerado na estruturação genética de C. granulosa Lindl. é a alta taxa de fragmentação do bioma Mata Atlântica. Nas últimas décadas, a região nordeste do Brasil teve grande expansão urbana e agrária. Neste contexto, as populações de C. granulosa Lindl. amostradas ocorrem, no geral, isoladas em Parques Urbanos, em vegetação remanescente próximas a grandes municípios, e circunvizinhas às áreas de monoculturas de cana e exploração de mineração. Grandes áreas cultivadas de cana, em destaque nos Estados da Paraíba e Pernambuco, intensificam o efeito de isolamento das populações de C. granulosa Lindl. em seu hábitat.
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A fragmentação, ou mesmo a perda de hábitat, pode levar a uma erosão da variabilidade genética. Isso ocorre devido a modificações nos sistemas de cruzamentos das plantas, ocasionando endogamia e diminuição na taxa de fluxo gênico, que por sua vez leva ao aumento da diferenciação das populações (Young et al., 1996; Jump & Peñuelas, 2006; Lowe et al., 2005; Ortego et al., 2010). O isolamento reprodutivo das populações, juntamente com a diminuição demográfica, pode causar perda de alelos devido à deriva genética, caso o fluxo gênico não seja restabelecido ao longo das gerações (Souza et al., 2004). Nas três abordagens que foram utilizadas para diferenciar os agrupamentos de genótipos da espécie houve semelhanças na estruturação genética das populações. A partir da identidade genética (Nei, 1978) percebe se o agrupamento de pares de populações geograficamente próximas. Por exemplo, o agrupamento ESC SAN é constituído por duas populações que ocorrem no extremo sul da amostragem, geograficamente contíguos (26,8 km), mas com distância média de 263,8 Km em relação às demais populações. O mesmo ocorre com agrupamentos de outras espacialmente próximas, como PER CAR (Parque Estadual das Dunas) e GEN1 GEN2 (APA de Genipabu). Isto é apoiado pelos agrupamentos gerados através de PCA, com base na distância genética de Nei. Através da análise Bayesiana, foi possível identificar padrões geográficos intragrupo da distribuição dos genótipos, indicando a existência de nove grupos genéticos distintos (K = 9). De fato, alguns dos agrupamentos identificados por UPGMA e PCA, com base na identidade e distância genética de Nei (ex. GEN1 GEN2 e PER CAR) apresentam proporção distinta de genótipos, suficiente para serem caracterizados como populações distintas e consequentemente unidades únicas para a conservação genética. Assim, embora alguns pares de áreas amostradas apresentaram menor estruturação genética por compartilharem em proporções semelhantes os mesmos genótipos, como BAR ALC, MAT PAB e SAN ESC, outras populações, diferentemente, apresentaram frequência maior de um único genótipo (ex. população MUR) ou frequência similar de diferentes genótipos (ex. NIV; Figura 4). Estas populações contêm alelos com maior frequência, mas não exclusivos, indicando uma conexão antiga entre elas.
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O fluxo gênico ( Nm ) é primordial para a homogeneização dos alelos entre as populações (Hartl & Clark, 1997). Níveis de fluxo gênico de 1,0 a 10 migrantes por geração, entre as populações, contrapõem os efeitos da deriva genética (Mills & Allendorf, 1996; Wang, 2004). Nm superiores a 4,0 migrantes por geração podem evitar os efeitos do cruzamento de indivíduos aparentados, que eventualmente ocorrem dentro das populações (Wright, 1951; Slatkin, 1987). Apesar da significativa distância geográfica que separa algumas populações de C. granulosa Lindl. (média de 111,2 km), historicamente o fluxo gênico ocorreu entre elas ( Nm = 2,4). Geograficamente, percebe se que a diferenciação genética entre as populações amostradas é menor na região central da distribuição geográfica, representada pelas combinações das populações ALC, MAT e PAB, filogeneticamente próximas, que provavelmente contribuíram para a dinâmica do fluxo gênico histórico entre as populações (Tabela 4). Recentes gargalos populacionais Populações com equilíbrio entre a mutação e deriva genética possuem igual probabilidade de que um loco apresente um excesso ou um déficit de heterozigosidade, considerando um tamanho efetivo populacional que se manteve constante em um passado recente (Cornuet & Luikart 1996). Por outro lado, populações recentemente reduzidas, ou seja, que passaram por um processo de bottleneck , exibem uma redução mais rápida do número de alelos do que da heterozigosidade, possuindo assim um excesso temporário de heterozigosidade (Luikart et al., 1998; Luikart & Cornuet, 1998). Esta condição é apresentada para as populações de C. granulosa Lindl. do Estado de Pernambuco (ESC e SAN), considerando os modelos IAM e SMM (α = 0,01). A detecção de populações que experimentaram gargalos populacionais recentes têm óbvias conotações evolutivas e para a conservação, principalmente por permitir inferir sobre os riscos de extinção local, em consequência do tamanho populacional reduzido (Luikart et al., 1998; Lee et al., 2002). A identificação de gargalos populacionais permite evitar ou minimizar os efeitos deletérios do evento através de procedimentos mitigadores de manejo ou introdução de imigrantes. Assim, o gargalo genético recente
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detectado, o baixo fluxo gênico histórico entre as duas populações de Pernambuco e as demais ( Nm = 0,49 a 1,90) e a situação irreversível da fragmentação das populações de C. granulosa Lindl. torna se prioritária a conservação das populações remanescentes da região.
Implicações para a conservação genética de C. granulosa
Os índices de diversidade e estruturação genética, estimados a partir das frequências alélicas, são importantes para subsidiar medidas de preservação e indicar populações prioritárias para a conservação. Entretanto, as práticas de manejo devem estar aliadas ao contexto demográfico das populações. Neste sentido, é consensual que C. granulosa Lindl. passa por um declínio populacional drástico, resultado do alto grau de fragmentação na Mata Atlântica, no Nordeste do Brasil, perda de hábitats para a ocupação humana e coleta predatória. Neste bioma, C. granulosa Lindl. tem ocorrência nos Estados do Rio Grande do Norte, Paraíba e Bahia (Martinelli & Moraes, 2013), além de Pernambuco. Embora os níveis de diversidade genética da espécie, encontrados neste estudo, favoreçam a amplitude ecológica na sua extensa distribuição geográfica, reconhece se que em ambientes perturbados pode ocorrer perda da variabilidade genética e do fitness da espécie. O aumento das práticas agrícolas, nos estados de Pernambuco e Paraíba é o principal responsável pelo desaparecimento de C. granulosa Lindl. da vegetação primária. Tal condição aumenta o risco de extinções das populações locais em curto prazo e, em longo prazo promove a limitação do potencial evolutivo da espécie frente às mudanças climáticas e ambientais (Barrett & Kohn, 1991; Young et al., 1996). Embora algumas populações estejam oficialmente preservadas em unidades de conservação, como o Parque Estadual das Dunas, APA Genipabu, Parque Dom Nivaldo, e Barreira do Inferno, outras áreas sofrem os efeitos acentuados da remoção ilegal de exemplares, apesar dos esforços, ainda são coletadas até mesmo dentro das áreas de proteção. Como outras espécies de orquídeas (Li & Ge, 2006), C. granulosa Lindl. em geral têm preferência por hábitat e dependência de polinizadores. A biologia reprodutiva da C. granulosa Lindl. revela que o sucesso reprodutivo da
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espécie depende da disponibilidade da visita de polinizadores, que são raras e resultam na baixa produção de frutos (Costa, 2010). Assim, em função do fácil acesso às plantas, que em geral se encontram em vegetação próxima ao solo, a polinização artificial, apesar de laboriosa, poderia ser uma alternativa viável para favorecer a variabilidade genética dentro das populações de C. granulosa . Embora os dados genéticos apresentados forneçam um importante subsídio aplicado para a conservação. No entanto, destacamos que o transplante artificial de indivíduos entre diferentes populações ou regiões, propostos para espécies em vias de extinção (Avise & Hamrick, 1996; Kingston et al., 2004), deve ser praticado com cautela, tendo em vista a necessidade de estudos futuros que caracterizem a distribuição geográfica dos polinizadores e suas especificidades em determinados hábitats de C. granulosa Lindl. (Costa, 2010). Finalmente, dos dados genéticos apresentados, emerge a necessidade de que para que a diversidade genética total da espécie seja conservada, mais populações devem ser protegidas para maximizar a cobertura de toda a distribuição geográfica. Isto é particularmente oportuno para aquelas populações com composições genéticas distintas ou com alta diversidade (eg. ESC, SAN, PAB, MAT, ALC, MUR) que devem ser priorizadas através de estratégias de conservação ex situ ou in situ .
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