MARIA APARECIDA FERNANDES

PADRÕES TEMPORAIS E GRAU DE DIVERSIFICAÇÃO CARIOTÍPICA EM ESPÉCIES ATLÂNTICAS DA FAMÍLIA ()

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, em cumprimento às exigências para obtenção do título de Mestre em Sistemática e Evolução.

Orientador: Prof. Dr. Wagner Franco Molina

NATAL-RN 2015

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Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de Biociências

Fernandes, Maria Aparecida. Padrões temporais e grau de diversificação cariotípica em espécies Atlânticas da família Acanthuridae (Perciformes) / Maria Aparecida Fernandes. – Natal, RN, 2015.

54 f.: il.

Orientador: Prof. Dr. Wagner Franco Molina.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução.

1. Evolução cromossômica. – Dissertação. 2. Fusões cêntricas. – Dissertação. 3. Acanthuridae. – Dissertação . I. Molina, Wagner Franco II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 575

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MARIA APARECIDA FERNANDES

PADRÕES TEMPORAIS E GRAU DE DIVERSIFICAÇÃO CARIOTÍPICA EM ESPÉCIES ATLÂNTICAS DA FAMÍLIA ACANTHURIDAE (PERCIFORMES)

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, em cumprimento às exigências para obtenção do título de Mestre em Sistemática e Evolução.

Área de concentração: Sistemática e Evolução

Aprovada em 26/03/2015

BANCA EXAMINADORA:

______Dr. Wagner Franco Molina Universidade Federal do Rio Grande Do Norte (Orientador)

______Dra. Sathyabama Chellappa Universidade Federal do Rio Grande do Norte

______Dr. Roberto Ferreira Artoni Universidade Estadual de Ponta Grossa

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DEDICATÓRIA

A meus pais Vilmar (In memoriam) e Inácia,

por todo amor, conselhos e dedicação, e a meu esposo Leandro pelo incondicional

apoio ao longo desses anos. A vocês todo meu amor e gratidão.

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AGRADECIMENTOS

Gostaria de agradecer especialmente aos meus pais, por todo esforço empenhado em minha educação. As minhas irmãs (Josivânia e Josenilda) e irmãos (Adriano, Mariano e João Paulo) pela maravilhosa convivência familiar, pelo carinho demonstrado e principalmente pela compreensão nos momentos difíceis! Ao meu esposo Leandro pelo companheirismo e por contribuir sempre de maneira incondicional para o meu crescimento pessoal e profissional. Ao professor Dr. Wagner Franco Molina, pelo apoio, orientação e confiança depositados durante a realização deste trabalho. Aos companheiros de luta do LGRM: Gideão, Karlla, Rafael, Rodrigo, Amanda, Paulo, Clóvis, Juliana, Inailson, Allyson, Josi, Roberta, Calado e Cris. Obrigada a todos pelas significativas contribuições seja nos procedimentos laboratoriais e/ou em campo, e pelos momentos de descontração durante nossos cafezinhos. Registro também meu agradecimento à minha querida professora Drª. Simone Almeida por todo apoio, disponibilidade e conselhos (acadêmicos e pessoais) desde os primeiros momentos da minha vida acadêmica. Agradeço também as professoras Drª Danielle Pereti, Danielly Alves e Drª Maisa Clari pelo apoio durante a graduação e a transição para o mestrado. À CAPES pela concessão da bolsa de estudos. À UFRN e ao Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução por me permitir concluir mais esta estapa de meu processo educacional. Ao CNPq pelo suporte financeiro (Processo No. 556793/2009-9), INCT “Ciências do Mar,” , FAPESB (no. APP0064/2011) e ICMBio/SISBIO (licenças 19135-1, 131360-1, e 27027-2) pela autorização de coleta de espécimes.

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO

1.1. Família Acanthuridae 11 1.2. Filogenia e evolução da família Acanthuridae 12 1.3. Aspectos biológicos e taxonômicos do gênero 13 1.4. Citogenética como ferramenta para inferências evolutivas 16

2. OBJETIVOS 2.1. Objetivo geral 19 2.2. Objetivos específicos 19

3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1. Material 20 3.2. Métodos 20 3.2.1. Obtenção de cromossomos mitóticos 20 3.2.2. Análises cromossômicas e montagem do cariótipo 20 3.2.3. Detecção de regiões organizadoras de nucléolo 21 3.2.4. Detecção de heterocromatina constitutiva 21 3.2.5. Dupla coloração com fluorocromos base-específicos 21 3.2.6. Hibridação in situ fluorescente FISH 22 3.2.6.1. Obtenção de sondas para hibridação 22 3.2.6.2. Hibridação cromossômica 22

4. CAPÍTULO I - Sequential Steps of Chromosomal Differentiation in 24

Atlantic Surgeonfishes: Evolutionary Inferences

5. CAPÍTULO II - Atlantic Surgeonfishes Bear Only Minor 37

Microstructural Changes in Highly Derived Karyotypes

6. CONCLUSÕES 48 7. REFERÊNCIAS 49

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LISTA DE FIGURAS

Parte introdutória

Figura 1. (a) Hipótese filogenética para a família Acanthuridae, 13 modificado de Sorenson et al. (2013). (b) Relações entre espécies do gênero Acanthurus presentes no Atlântico, proposta por Bernal & Rocha (2011). Figura 2. Espécime de . Em destaque indivíduo na 15 fase juvenil. Barra: 2 cm.

Figura 3. Espécime de Acanthurus chirurgus. Barra: 2 cm. 15 Figura 4. Espécime de Acanthurus bahianus. Barra: 2 cm. 16

Capítulo 1

Figura 1. Mapa da América do Sul mostrando os pontos de coleta de 26 Acanthurus coeruleus (a), A. bahianus (b), e A. chirurgus (c) no estado do Rio Grande do Norte (1) e Bahia (2), nordeste do Brasil.

Figura 2. Cariótipos de Acanthurus coeruleus ((a) e (b)) com 2푛 = 48, A. 28 bahianus ((c) e (d)) com 2푛 = 36, e A. chirurgus ((e) e (f) ) com 2푛 = 34, após coloração convencional com Giemsa ((a), (c), e (e)) e badamento-C ((b), (d) e (f)). Os cromossomos portadores de RONs, de cada espécie, após tratamento com nitrato de prata são apresentados em caixas (par 2 de A. coeruleus e par de 8 de A. bahianus e A. chirurgus). Figura 3. Idiogramas de conjuntos cromossômicos de Acanthurus 29 coeruleus (a), A. bahianus (b), e A. chirurgus (c) mostrando as características citogenéticas mais conspícuas divididas em caixas. Em (d), o cariótipo basal dos Perciformes (2푛 = 48a) e uma hipótese filogenética com base em rearranjos

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cromossômicos sequênciais inferidos nas três espécies Acanthurus.

Capítulo 2

Figura 1. Cariótipo e metáfases de A. coeruleus (A), A. bahianus (B) e A. 40 chirurgus (C) após a coloração Giemsa (esquerda), two-color FISH (centro) com DNAr 18S (vermelho) e 5S DNAr (sinais

verdes) distribuição de sondas de (TTAGGG)n sequências (direita). Caixa, os cromossomos portadores de RONs são mostrados após a coloração de nitrato de prata (esquerda) e coloração com fluorocromos (centro). Barra = 5m.

Figura 2. Idiograma de A. coeruleus (A), A. bahianus (B) e A. chirurgus 44 (C), combinando os resultados de NOR / localização de região rica em GC e mapeamento físico de ribossomal e sequências teloméricas. Os cromossomos homeólogos derivados de inversões pericêntricas (cromossomos sm-st) e fusões cêntricas (m-cromossomos) são destacados nas caixas. O asterisco no par 7 de A. chirurgus indica uma suposta autapomorfia (fusão em tandem) para esta espécie.

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LISTA DE ABREVIATURAS

2n – Número diploide a – Acrocêntrico AFLP – Amplified fragment lenght polymorphism

AgNO3 – Nitrato de prata Ag-RONs – Regiões organizadoras de nucléolo evidenciadas pela impregnação com nitrato de prata AT – Adenina e Timina

Ba(OH)28H2O – Hidróxido de bário BC – Bandamento C

CMA3 – Cromomicina A3 DAPI – 4`4’,6-diamidino-2-fenilindol DNA – Ácido desoxirribonucleico DNAr/rDNA – Ácido desoxirribonucleico ribossômico FISH – Fluorescence in situ hybridization GC – Guanina e Citosina HCl – Ácido clorídrico KCl – Cloreto de potássio LGRM – Laboratório de Genética de Recursos Marinhos m – Metacêntrico Ma – Milhões de anos MM - Mitramicina n – Número amostral NF – Número fundamental RN – Rio Grande do Norte RNAr/rRNA – Ácido ribonucleico ribossômico RONs – Regiões organizadoras de nucléolo sm – Submetacêntrico st – Subtelocêntrico UFRN – Universidade Federal do Rio Grande do Norte

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RESUMO

A família Acanthuridae é um grupo bastante representativo dentre os peixes marinhos e que desempenha um papel fundamental na dinâmica ecológica dos recifes de corais. Três espécies pertencentes ao gênero Acanthurus são comuns ao longo dos recifes costeiros do Atlântico Ocidental: A. coeruleus, A. bahianus e A. chirurgus. No presente estudo, são apresentados dados citogenéticos para estas três espécies de Acanthurus com base em métodos citogenéticos clássicos e no mapeamento de sequências ribossomais repetitivas, como DNAr 18S e 5S, além de sondas teloméricas com a finalidade de auxiliar na compreensão da carioevolução deste grupo. O padrão citogenético dessas espécies indica que as etapas sequenciais de rearranjos cromossômicos, que datam 19-5 milhões de anos atrás (Ma), são responsáveis por suas diferenças interespecíficas. Acanthurus coeruleus (2n=48; 2sm + 4st + 42a), A. bahianus (2n=36; 12m + 2sm + 4st + 18a) e A. chirurgus (2n=34; 12m + 2sm + 4st + 16a) compartilham um antigo conjunto de três pares cromossômicos originados através de inversões pericêntricas. Um conjunto de seis grandes pares metacêntricos formados por translocações Robertsonianas (Rb) encontrado em A. bahianus e A. chirurgus e uma suposta fusão em tandem presente em A. chirurgus são eventos mais recentes. A falta de sequências teloméricas intersticiais (ITS), apesar de várias fusões cêntricas em A. bahianus e A. chirurgus pode estar relacionada com o longo período de tempo após a sua ocorrência (estimado em 5 Ma). Além disso, as homeologias entre os pares de cromossomos que carregam os genes ribossomais, além de outras características estruturais, destacam grandes regiões cromossômicas conservadas nas três espécies. Nossos resultados indicam que as mudanças macroestruturais ocorreram durante a cladogênese dessas espécies não foram seguidas por rearranjos microestruturais visíveis nos cariótipos.

Palavras-chave: Evolução cromossômica; fusões cêntricas; rearranjos Robertsonianos; Acanthuridae; telômeros.

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ABSTRACT

The Acanthuridae family is a representative group from the marine fish that plays a key role in ecological dynamics of coral reefs. Three are common along coastal reefs of Western Atlantic: Acanthurus coeruleus, Acanthurus bahianus and Acanthurus chirurgus. In the present study, cytogenetic data are presented for these three species Acanthurus based on classical cytogenetic methods and mapping of repetitive sequences such as ribosomal 18S and 5S rDNA and telomeric repeats to improve their karyotype evolutionary analyses. The cytogenetic pattern of these species indicated sequential steps of chromosomal rearrangements dating back 19 to 5 millions of years ago (M.a.) that accounted for their interspecific differences. A. coeruleus (2n=48; 2sm+4st+42a), A. bahianus (2n=36; 12m+2sm+4st+18a) and A. chirurgus (2n=34; 12m+2sm+4st+16a) share an older set of three chromosomal pairs that were originated through pericentric inversions. A set of six large metacentric pairs formed by Robertsonian (Rb) translocations found in A. bahianus and A. chirurgus and a putative in tandem fusion found in A. chirurgus are more recent events. The lack of interstitial telomeric sequences (ITS) in spite of several centric fusions in A. bahianus and A. chirurgus might be related to the long period of time after their occurrence (estimated in 5 M.a.). Furthermore, the homeologies among the chromosome pairs bearing ribosomal genes, in addition to other structural features, highlight large conserved chromosomal regions in the three species. Our findings indicate that macrostructural changes occurred during the cladogenesis of these species were not followed by conspicuous microstructural rearrangements in the karyotypes.

Keywords: Chromosomal evolution; centric fusions; Robertsonian rearrangements; surgeonfish; telomeres.

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1. INTRODUÇÃO

1.1. Família Acanthuridae A família Acanthuridae está inserida na Ordem dos Perciformes, subordem . Esta família conta com seis gêneros (Acanthurus, , Naso, , e ) subdivididos em 80 espécies (NELSON, 2006). É caracterizada morfologicamente por indivíduos de pequeno a médio porte, podendo chegar a 36 cm, com um corpo alto, oval e comprimido lateralmente (RANDALL, 2001). São conhecidos popularmente como peixes-cirurgião (surgeonfishes), devido à presença de um espinho dobrável alojado dentro de uma bainha em cores, em ambos os lados do pedúnculo caudal, utilizado durante comportamentos agressivos inter e intraespecíficas. Tal característica constitui-se como a autapomorfia compartilhada pelo grupo (RANDALL, 2001). Os cirurgiões são exclusivamente marinhos e distribuídos em mares tropicais e subtropicais de todo o mundo, sendo ausentes somente no Mediterrâneo (NELSON, 2006). A maioria das espécies de Acanthuriadae são herbívoras errantes diurnos com associação obrigatória a ambientes recifais (BELLWOOD; WAINWRIGHT, 2002; NELSON, 2006). A maioria das espécies de Acanthuridae têm estômagos com paredes finas e pastam em algas, e alguns têm estômagos semelhantes a moelas, com paredes espessas estes utilizam a areia para macerar detritos (FERREIRA et al., 2004; RANDALL, 2005). Este grupo possui uma posição relevante do ponto de vista ecológico e evolutivo nas comunidades dos recifes tropicais. Sendo um importante agente físico (bioerosão) devido sua atividade de escavar o substrato contribuindo para sedimentação intensiva e biológica (herbivoria) influenciando na composição, desenvolvimento, abundância e padrão de distribuição da população de algas e comunidades associadas (HORN, 1989). Ao longo de sua história de vida sofrem mudanças ontogenéticas sobre os aspectos da preferência por tipos de habitats (FERREIRA et al., 2004; ROCHA, 2002) com ovos planctônicos que eclodem após cerca de um dia, um período pelágico larval relativamente longo variando entre 51 até 75 o que lhes conferem enorme capacidade de dispersão e adultos sedentários associados a recifes de corais (THRESHER, 1984; MUSS et al., 2001; ROCHA et al., 2002, RANDALL, 2005). Em ambiente natural os adultos podem ser observados geralmente formando pequenos cardumes, e eventualmente indivíduos isolados. Entretanto, em períodos de reprodução, ou, quando estão forrageando em territórios defendidos por outros peixes, podem 12 ser encontrados constituindo grandes cardumes heterogêneos (RISK, 1998; LAWSON, et al., 1999; BELL e KRAMER, 2000; ROCHA et al., 2002).

1.2. Filogenia e evolução da Familia Acanthuridae Acanthuridae é um grupo monofilético relativamente antigo, com cerca de 54 milhões anos (SORBINI e TYLER, 1998; TANG et al., 1999; SORENSON et al., 2013). A primeira aparição da família se deu no Eoceno Médio. A maioria dos acanthurideos fósseis conhecidos foi encontrada na região do Monte Bolca, no norte da Itália, que é a região mais representativa da rica ictiofauna recifal do Eoceno (BELLWOOD, 1996; CLEMENTS et al., 2003;. KLANTEN et al., 2004). Embora muitos dos caracteres supraespecíficos que definem este grupo tenham uma duração prolongada no registro fóssil, o moderno conjunto de espécies parece ser de origem recente. Apoio à origem recente das espécies de peixes de recife é fornecido por McMillan e Palumbi (1997), que apresentaram argumentos para especiação recente ligada às mudanças no nível do mar, temperatura dos mares e clima global, ocorridas no Pleistoceno. Questões referentes à filogenia desta família têm sido estudadas profundamente através de evidências morfológicas (WINTERBOTTOM, 1993; GUIASU e WINTERBOTTOM, 1993; TYLER et al., 1989) e análises moleculares (HOLCROFT e WILEY, 2008; KLANTEN et al., 2004; TANG et al., 1999). De forma geral, as relações filogenéticas dentro da família Acanthuridae estão bastante esclarecidas, entretanto, a relação entre os gêneros Acanthurus e Ctenochaetus tem gerado controvérsias ao longo das décadas. Embora a possibilidade de parafiletismo entre esses dois grupos já tivesse sido sugerida com base em caracteres osteológicos compartilhados e caracteres merísticos (RANDALL, 1955; WINTERBOTTOM, 1993; GUIASU e WINTERBOTTOM, 1993), esta questão só foi elucidada por Clements et al. (2003) e mais tarde corroborada por Sorenson et al. (2013), estabelecendo uma filogenia mais compreensiva desta família através de análises moleculares (Figura1a). Além da corroboração da hipótese de parafiletismo entre os gêneros Acanthurus/Ctenochaetus, existem indícios de que os gêneros desta família são relativamente antigos, com intensos episódios de especiação, pelo menos três ao longo da história filogenética (SORENSON et al., 2013; BERNAL e ROCHA, 2011). Análises filogeográficas identificaram que A. bahianus, em relação às espécies A. chirurgus e A. coeruleus, parece altamente sensível a restrição ecológica imposta pela pluma de água doce do Orinoco-Amazonas (ROCHA et al., 2002) e tem sido utilizada como exemplo de profunda estruturação populacional devido à separação evolutiva por uma barreira 13

geográfica. De fato, as linhagens do Atlântico Sul e do Caribe de A. bahianus são, na verdade, espécies diferentes, a linhagem caribenha foi nomeada como A. tractus (Figura 1b) (BERNAL e ROCHA, 2011).

a b

Figura 1. (a) Hipótese filogenética para espécies do gênero Acanthurus, modificado de Sorenson et al. (2013). (b) Relações entre espécies do gênero Acanthurus presentes no Atlântico, proposta por Bernal & Rocha (2011).

O plano corporal comum aos cirurgiões atuais apareceu no limite entre o Paleoceno/Eoceno Inferior, e passou por uma dramática radiação durante o Eoceno Médio (50 Ma). Dentro do gênero Acanthurus a irradiação da espécie A. coeruleus ocorreu em meados do Mioceno (20 Ma) e a separação entre A. chirurgus e A. tractus (espécie irmã da A. bahianus) no Final do Mioceno (10 m.a.) (SORENSON et al., 2013).

1.3. Aspectos biológicos e taxonômicos do gênero Acanthurus O gênero Acanthurus possui ao todo 36 espécies, sendo o único, dentre toda a família, a ocorrer no Atlântico Ocidental (RANDALL, 2002). Na costa brasileira podemos encontrar três espécies deste gênero: Acanthurus coeruleus Bloch & Schneider (1801), Acanthurus chirurgus (BLOCH, 1787), Acanthurus bahianus Castelnau (1855) (RANDALL, 1956; MENEZES e FIGUEIREDO, 1985; FLOETER et al., 2008; BERNAL e ROCHA, 2011). A taxonomia detalhada das espécies citadas é representada por: Filo - Chordata Subfilo - Craniata 14

Superclasse - Gnasthostomata Classe - Subclasse - Neopterygii Divisão - Teleostei Subdivisão - Euteleostei Superordem - Acanthopterygii Série - Percomorpha Ordem - Perciformes Subordem - Acanthuroidei Família - Acanthuridae Subfamília - Tribo - Acanthurini Gênero - Acanthurus Forsskål (1775) Espécies - Acanthurus chirurgus (BLOCH, 1787) Acanthurus coeruleus Bloch & Schneider (1801) Acanthurus bahianus Castelnau (1855)

A espécie A. coeruleus (Figura 2), exibe um comportamento territorialista, embora possam eventualmente, formar pequenos cardumes. São quase que exclusivamente herbívoros, e por isso, diferentemente das demais espécies aqui estudadas, possui um estômago com parede mais finas. Pode ser encontrada em profundidades que variam de 2-60 metros (LAWSON e KRAMER, 1999; ROCHA et al., 2000). Sua diagnose apresenta 9 espinhos e 26-28 raios na nadadeira dorsal e anal com 3 espinhos e 24-26 raios. A coloração do corpo quando juvenis é na cor amarela passando gradativamente ao azul violáceo com linhas estreitas e escuras no flanco quando adultos; eventualmente, durante o período reprodutivo, os machos podem adquirir um padrão bicolor, mais escuro na porção anterior e mais claro na porção posterior do corpo (CERVIGÓN et al., 1993; FIGUEIREDO e MENEZES, 2000; ARAÚJO et al., 2004). 15

Figura 2. Espécime de Acanthurus coeruleus. Em destaque indivíduo na fase juvenil. Barra: 2 cm.

A mais comum dentre as espécies de acanthurideos encontradas no litoral brasileiro, A. chirurgus (Figura 3), geralmente, formam grandes cardumes, tem preferência por recifes mais rasos e possui hábito alimentar semi-detritívoro (DIAS et al., 2001; FRANCINI-FILHO et al., 2010). Morfologicamente se diferencia das demais espécies por apresentar a nadadeira dorsal com 9 espinhos e 24-25 raios; a nadadeira anal com 3 espinhos e 22-23 raios e caudal emarginada. A coloração do corpo é acinzentada com 10 barras verticais mais escuras e o pedúnculo caudal mais claro que o restante do corpo (CERVIGÓN et al., 1993; FIGUEIREDO e MENEZES, 2000; CARPENTER, 2002).

Figura 3. Espécime de Acanthurus chirurgus. Barra: 2 cm.

A espécie A. bahianus (Figura 4) é caracterizada por apresentar na nadadeira dorsal com 9 espinhos e 23-26 raios e anal com 3 espinhos e 21-23 raios. O padrão de cor do corpo é semelhante ao A. chirurgus, com ausência das barras verticais nos flancos e uma nadadeira caudal lunada (CERVIGÓN et al., 1993; FIGUEIREDO e MENEZES, 2000; CARPENTER, 2002). Ocorre em grupos de cinco ou mais indivíduos, habitando recifes rasos de até 25 16 metros (ROCHA, 2002). Considerada também como semi-detritívora, tem em comum com A. chirurgus e algumas outras espécies do gênero, a presença de um estômago constituído por paredes grossas semelhantes a uma “moela” onde a areia ingerida ajuda a triturar as algas (FERREIRA e GONÇALVES, 2006; DIAS et al., 2001; FRANCINI-FILHO et al., 2010).

Figura 4. Espécime de Acanthurus bahianus. Barra: 2 cm.

1.4. Citogenética como ferramenta para inferências evolutivas Análises citotaxonômicas contribuem significativamente para o estudo da evolução pelo fato do material genético estar contido nos cromossomos (ALMEIDA-TOLEDO, 1998). Portanto, alterações como, rearranjos cromossômicos, polimorfismos estruturais e/ou numéricos, poliploidia natural, sistemas de cromossomos sexuais entre outros, são quase sempre significativas para que se possa inferir o rumo evolutivo das espécies (GUERRA, 1988). As técnicas citogenéticas convencionais (Giemsa, banda-C, Ag-RONs) e moleculares como a marcação com fluorocromos base-específicos (DAPI/MM) e o desenvolvimento nos últimos anos, de novas ferramentas de análise mais aprofundadas como a técnica de Hibridação in situ Fluorescente (FISH), são de grande importância na identificação de diversificação cromossômica. Juntas, a citogenética clássica e a molecular têm fornecido contribuições importantes para o entendimento da composição e estrutura dos cromossomos e em estudos que visem à formulação de hipóteses filogenéticas (BERTOLLO et al., 1978; FELDBERG et al., 2003; MARTINS et al., 2011). A técnica por impregnação por nitrato de prata (Ag-RONs) é utilizada para evidenciar as Regiões Organizadoras de Nucléolos (RONs), porção particulalrmente variável do genoma eucarioto, as quais possuem sítios ribossômicos ativos, que podem estar 17 localizados nas posições terminais ou intersticiais dos cromossomos (FORESTI e TOLEDO, 1985). A caracterização do número e posição das RONs tem sido muito utilizada em peixes e pode constituir um excelente marcador citotaxonômico para alguns grupos (GALETTI, 1998; MOLINA et al., 2002). Os bandamentos cromossômicos foram as primeiras ferramentas usadas para comparação de genomas, pois, espécies próximas apresentam um padrão muito similar de bandas tornando o estudo comparativo viável. O bandamento C permite a localização de regiões ricas em heterocromatina constitutiva (sequências de DNA altamente repetitivas). Em estudos evolutivos, a análise de heterocromatina pode fornecer dados para a caracterização de ocorrência de rearranjos em espécies próximas (MEDRANO et al., 1988). O uso de fluorocromos é muito importante, principalmente DAPI e MM tem sido muito usados para discriminar a composição de bases da região heterocromática e o número e localização dos sítios de DNA ribossomal (MARTINS et al., 2011). Com o desenvolvimento da técnica de hibridação in situ fluorescente (FISH), a citogenética obteve avanços significativos para o conhecimento do genoma com base nos cromossomos (MARTINS et al., 2011). Esta técnica definiu a transição da era clássica da citogenética à era molecular, permitindo estudos mais detalhados com a integração da informação molecular das sequências de DNA e sua localização física ao longo dos cromossomos e genomas (SCHWARZACHER, 2003; JIANG e GILL, 2006). Análises citogenéticas moleculares utilizando a técnica de FISH são atualmente muito utilizadas e vêm se mostrando eficientes ferramentas no estudo da evolução cariotípica em peixes, devido ao mapeamento de sequências ribossomais 5S e 18S (MARTINS e GALETTI, 2001; MOLINA, 2002; MARTINS et al., 2011a; MOTTA-NETO et al., 2011b; CALADO et al., 2013; CALADO et al., 2014). Informações citogenéticas em peixes marinhos têm aumentado nas últimas décadas, Entretanto, somente cerca de 7% das espécies, em sua maioria da Ordem Perciformes, grupo mais representativo entre os teleósteos (NELSON, 1996; GALLETTI et al., 2000). Onde, em grande parte de suas espécies, um padrão marcante de conservadorismo cromossômico, com número diploide composto por 48 cromossomos acrocêntricos (MOLINA, 2007; MOTTA- NETO et al., 2011). Uma maior divergência de padrões cariotípicos em Perciformes é geralmente descrita para espécies dulcícolas, representada pela família Cichlidae e Percidae (OHNO, 1974), ou em grupos sedentários como Gobiidae e Bleniidae (BRUM e GALETTI, 1997). Além disso, variações genéticas no ambiente marinho podem ser principalmente encontradas em espécies 18 que se mostram adaptadas ou isoladas em ambientes singulares, como, as que são associadas a recifes de corais e ilhas oceânicas, onde as massas de água que os circundam podem funcionar como a barreira geográfica e limitar a dispersão (PALUMBI, 1994; ROCHA, 2003). Os peixes recifais são principalmente compostos por Perciformes e contêm uma elevada diversidade de espécies que representam linhagens evolutivas distintas. Dentre os Perciformes um dos grupos mais representativos e carismáticos é a família Acanthuridae (ROBERTSON, 1983; LAWSON et al., 1999), que devido a sua diversidade na forma de forrageamento e sua forte associação com recifes de corais são um grupo bastante utilizado em estudos que busquem identificar o ritmo de evolução que conduz a biodiversidade em peixes de corais, e na investigação da importância dos fatores ecológicos na diversificação de ambientes recifais (SORENSON et al., 2013). A família Acanthuridae é relativamente bem estudada, sobretudo sob aspectos da evolução morfológica (TYLER, 1970a, b; GUIASU e WINTERBOTTOM, 1993; BORDEN, 1998; WINTERBOTTOM, 1993), e da filogenia molecular (ROCHA et al., 2002; CLEMENTS et al., 2003; BERNAL e ROCHA, 2011; SORENSON et al., 2013). Entretanto, no que tange a evolução cromossômica, a família Acanthuridae ainda está sub-representada, menos de 5% das espécies, sendo todas no oceano Pacífico (ARAI, 2011). As três espécies analisadas do Pacífico, (LINNAEUS, 1758), Prionorus scalprum Valenciennes, 1835 (ARAI e INOUE, 1976) e Ctenochaetus striatus (QUOY e GAIMARD, 1825) (OJIMA e YAMAMOTO, 1990) mostram um cariótipo conservado com 2n=48 acrocênticos, considerado basal entre os Perciformes (BRUM e GALETTI, 1997; ARAI, 2011). Não existem quaisquer informações sobre espécies de Acanthuridae presentes no Oceano Atlântico, a ausência destas informações impede inferências filogenéticas e dificulta uma visão mais ampla dos processos de evolução cariotípica do grupo.

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2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo geral Tendo em vista a importância das informações citogenéticas e a carência delas no que diz respeito às espécies da família Acanthuridae, o presente trabalho tem como foco principal estabelecer aspectos carioevolutivos, com base em análises da citogenética clássica e molecular de três espécies da família Acanthuridae presentes no Atlântico Ocidental.

2.2 Objetivos específicos  Caracterizar cromossomicamente por meio de bandamento C, Ag-RONs e coloração com fluorocromos base-específicos MM/DAPI as espécies A. coeruleus, A. bahianus e A. chirurgus.

 Mapear as sequências das subunidades ribossomais DNAr 5S e 18S por meio de dual- color FISH das espécies analisadas das famílias Acanthuridae.

 Identificar os mecanismos evolutivos envolvidos na diferenciação cariotípica das espécies estudadas.

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3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1. Material Os exemplares das espécies A. coeruleus (n=23), A. bahianus (17) e A. chirurgus (12) foram coletados ao longo da costa de Natal, Rio Grande do Norte (5o46'S, 35o12'O) e Salvador, Estado da Bahia (13°00'S, 38°32'O), nordeste do Brasil. As coletas ocorreram por meio de mergulho livre em recifes costeiros nas áreas citadas utilizando-se de apetrechos de pesca como puçás e tarrafas. Após a coleta os exemplares foram transportados vivos ao Laboratório de Genética de Recursos Marinhos, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, e mantidos em aquários aerados até que se procedesse à realização de preparações cromossômicas.

3.2. Métodos 3.2.1. Obtenção de cromossomos mitóticos Vinte e quatro horas antes da preparação cromossômica, os animais foram inoculados via intramuscular com uma solução de complexos antígenos para indução mitótica (MOLINA et al., 2010). Após esse período, os exemplares foram anestesiados e sacrificados seguindo procedimento estabelecido por Blessaing et al. (2010). Para obtenção de cromossomos mitóticos, fragmentos do rim anterior foram adicionados em meio de cultura RPMI 1640 de acordo com a técnica in vitro preconizada por Gold et al. (1990). Os fragmentos foram dissociados em 9 ml de meio de cultura RPMI 1640 através de aspirações com seringas de vidro de 10 ml até obter um mistura homogênea, onde foi adicionado 5 gotas de colchicina 0,025%, deixando agir por 30 minutos em temperatura ambiente. Após o processo anterior o material foi centrifugado por 10 minutos a 1000 rpm. Após descarte do sobrenadante, foi adicionado 8 ml da solução hipotônica de KCl a 0,075M, que após ser homogeneizada agiu por 28 minutos em temperatura ambiente. A suspensão celular foi pré-fixada com 0,5 ml de solução de metanol e ácido acético (3:1) recém- preparado. Após homogeneização a suspensão foi centrifugada por 10 minutos. O processo de fixação do material foi repetido por 3 vezes, após o que as suspensões celulares foram estocados em tubos Eppendorf de 1,5 ml à -20oC.

3.2.2. Análises cromossômicas e montagem do cariótipo As suspensões celulares foram gotejada sobre uma lâmina recoberta por um filme de água destilada aquecido a 60°C e corada com solução de Giemsa a 5%, diluída em tampão fosfato pH 6,8. 21

As análises foram realizadas em microscópio óptico de epifluorescência Olympus™ BX51 e fotografadas sob aumento de 1.000X através de sistema digital de captura Olympus DP70 utilizando o software DPController 1.2.1.108 (Olympus Optical Co. Ltd.). Cerca de trinta metáfases foram analisadas para cada espécime. As melhores metáfases foram selecionadas para montagem do cariótipo a partir da nomenclatura preconizada por Levan et al. (1964) com modificações, onde os cromossomos foram definidos, quanto à posição dos centrômeros, em metacêntricos (m), com a razão entre o braço maior e menor (RB) variando de 1,00 a 1,70; submetacêntricos (sm), RB=1,71–3,00; subtelocêntricos (st), RB=3,01–7,00; e acrocêntricos (a), RB>7,01.

3.2.3. Detecção de regiões organizadoras de nucléolos A detecção de regiões organizadoras de nucléolos foi obtida pela técnica de impregnação por prata preconizada por Howell & Black (1980). Sobre uma lâmina previamente preparada com suspensão celular foram adicionadas 7 gotas de solução gelatinosa (1g de gelatina incolor, dissolvida em 50ml água e 0,5ml ácido fórmico), e 6 gotas de solução de nitrato de prata (AgNO3) à 50%. A solução foi homogeneizada com a extremidade de uma lamínula e recoberta por ela sendo então incubada em estufa a 60°C, até obtenção da cor amarelo escuro. Após a remoção da lamínula com jatos de água destilada, eventualmente, para destacar as marcações argênteas, as preparações podiam ser coradas por cerca de 20 segundos com solução de Giemsa a 5%.

3.2.4. Detecção de heterocromatina constitutiva A análise das regiões heterocromáticas foi realizada através do bandamento-C, segundo Sumner (1972). Foram utilizadas lâminas com material envelhecido em estufa a 37°C por no mínimo 3 dias, após esse período a lâmina foi imersa em HCl 0,2 N por 14 minutos em temperatura ambiente, sendo lavada com água destilada e seca. Posteriormente a lâmina foi mergulhada em uma solução a 5% de Ba(OH)28H2O à 42°C por cerca de 1 minuto e 35 segundos sendo rapidamente lavadas em HCl 0,1N e posteriormente água destilada. Após secar ao ar, a lâmina foi então imersa em solução salina 2x SSC a 60°C em estufa por 40 minutos. Para análise o material foi corado com Giemsa 5% por 8 minutos.

3.2.5. Dupla coloração com fluorocromos base-específicos Fluorocromos base-específicos foram utilizados para detectar regiões ricas em pares de bases, como a Mitramicina (MM) para pares de bases GC e DAPI para regiões ricas em 22 pares de bases AT, de acordo com Carvalho et al. (2005). As lâminas com suspensão celular de cada exemplar foram coradas com 30µl de (MM) 0,5 mg/ml cobertas com lamínulas e depositadas em câmara úmida, no escuro, sendo lavadas com água destilada após 60 minutos, coradas com 30 µl de DAPI 2µl/ml, cobertas por lamínulas e colocada em câmara úmida, no escuro, por 30 minutos. Posteriormente as lâminas foram lavadas com água destilada e montadas com tampão glicerol-Mcllvaine pH 7,0 (1:1) coberto com lamínula e selado com esmalte incolor. As lâminas foram então guardadas à 4oC em câmara escura e analisadas após 3 dias (DAPI) e 15 dias (MM) com fotomicroscópio de epifluorescência (Olympus™ BX51) com filtros apropriados, em aumento de 1.000x. As preparações foram capturadas pelo sistema digital Olympus DP73 com uso do software DPController, v. 1.2.1.108 (Olympus Optical Co. Ltd.).

3.2.6. Hibridação in situ fluorescente – FISH 3.2.6.1. Obtenção de sondas para hibridização A FISH foi realizada de acordo com Pinkel et al. (1986) usando sondas teloméricas de 18S e 5S. As sondas de DNAr 5S (200 pb) e 18S DNAr (1400 pb) foram obtidos a partir de amostras de DNA de A. coeruleus via PCR utilizando os iniciadores A 5'-TAC CCG CGA TCT CGT CCG ATC-3 '/ B 5'-CAG GGT GCT ATG CCG GTA AGC-3' (PENDAS et al., 1994) e NS1 5'-GTC ATA GTA TGC TTG TCT C-3' / NS8 5'-TCC GCA GGT TCA CCT ACG AG-3' (WHITE et al., 1990), respectivamente. A sonda 18S foi marcada por nick translation digoxigenina-11-dUTP (Roche) e a sonda DNAr 5S foi marcada por nick translation biotina-14-dATP (Roche) , de acordo com as especificações do fabricante. As sequências (TTAGGG)n foram mapeadas pela técnica de FISH com Kit FISH Telomere PNA/FITC de acordo com as instruções do fabricante (DakoCitomation).

3.2.6.2. Hibridização cromossômica FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) foi realizada em metáfases mitóticas (PINKEL et al., 1986) das três espécies. Análise por dual-color FISH foi desenvolvida usando sondas DNAr 18S e DNAr 5S. Os cromossomos foram tratados com RNAse livre de DNAse (20mg / mL em 2xSSC ) à 37°C por 1 hora, com pepsina (0,005 % em HCl 10mM) à 37°C por 10 minutos e fixados com formaldeído a 1% por 10 minutos, em seguida desidratados em série alcoólica. Os cromossomos foram, então, desnaturados em 70% formamida/2×SSC a 72°C por 5 minutos. A solução de hibridização consistiu em 50% de formamida, 2×SSC, 10% de sulfato de dextran e a sonda desnaturada (5 ng/µl). Após hibridação, overnight à 37°C, as 23 lâminas foram lavadas em 15% formamida/0.2×SSC à 42°C por 20 minutos, 0,1×SSC à 60 °C por 15 minutos e Tween20 0,5%/4×SSC à temperatura ambiente. O sinal de hibridização da sonda foi detectado usando avidin-FITC (Sigma) para a sonda DNAr 5S e anti-digoxigenina rodamina conjugada (Roche) para a sonda DNAr 18S. Os cromossomos foram contracorados com Vectashield/DAPI (1,5 µg/ml). As análises da FISH e registro fotográfico foram realizados conforme descrito para as análises de fluorocromos.

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4. Capítulo I

Abstract Surgeonfishes are a species-rich group and a major biomass on coral reefs. Three species are commonly found throughout South Atlantic, Acanthurus bahianus, A. chirurgus, and A. coeruleus. In this paper, we present the first cytogenetic data of these species, revealing a sequential chromosomal diversification. A. coeruleus was characterized by a relatively conserved karyotype evolved by pericentric inversions of some pairs (2n = 48, 2sm + 4st + 42a). In contrast, the karyotypes of A. bahianus (2n = 36) and A. chirurgus (2n = 34) were highly differentiated by the presence of six large metacentric pairs in A. bahianus (12m + 2sm + 4st + 18a) and A. chirurgus (12m + 2sm + 4st +1 6a) probably derived by chromosomal fusions that corroborate their closer relationship. A discernible in tandem fusion represents an autapomorphic character to A. chirurgus. In spite of macrostructure variation, single nucleolar organizer regions (NORs) on short arms of a subtelocentric pair and similar distribution of C- bands were observed in the three species. Overlapping of chromosomal data with molecular phylogeny indicated pericentric inversions which took place nearly at 19Ma while centric fusions are as recent as 5Ma. A physical mapping of coding and noncoding sequences in Acanthurus could clarify the role of additional rearrangements during their chromosomal evolution.

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1. Introduction Acanthuridae are a monophyletic fish family composed of about 80 species, popularly known as surgeonfishes or tangs (NELSON, 2006). This is an ancient group (nearly 54Ma) and most of genera (Acanthurus, Ctenochaetus, Naso, Paracanthurus, Prionurus e Zebrasoma) diverged between 17 and 21 Ma in Early Miocene (NELSON, 2006). Apparently, the Pacific Ocean is the center of origin of surgeonfishes, retaining most of Acanthuridae richness (TANG et al., 1999; GUIASU e WINTERBOTTOM, 1993). Further colonization events resulted in distribution of this family to virtually all tropical and subtropical seas of the world, but Mediterranean Sea (SORENSON et al., 2013; TANG et al., 1999) The genus Acanthurus is the largest within the family, but monophyly of the genus is still controversial (TANG et al., 1999; CLEMENTS et al., 2003). This fish group is morphologically and ecologically diversified, mainly in relation to foraging behavior and dentition, composing one of themost representative herbivorous fish group on coral reefs (TANG et al., 1999; FRANCINI-FILHO et al., 2010) A total of four species of Acanthuridae, all belonging to the genus Acanthurus, are present in western Atlantic (BERNAL e ROCHA, 2011). Three species are common along the Brazilian coast (Western South Atlantic): Acanthurus coeruleus (blue tang), A. bahianus (barber surgeonfish), and A. chirurgus (doctorfish) (BERNAL e ROCHA, 2011; FIGUEIREDO e MENEZES, 2000). Another Acanthurus species (A. monroviae) was also recorded off southeastern coast of Brazil, but it seems to be an occasional occurrence (LUIZ JR. et al., 2004). Moreover, A. bahianus was thought to range from USA to southern Brazil, but morphological and genetic analyses have shown that populations from Massachusetts to Caribbean actually refer to another species, validated as A. tractus (FIGUEIREDO e MENEZES, 2000). In spite of the low diversity of Atlantic species when compared to Pacific and Indian oceans, surgeonfishes are a dominant fish group forming large assemblages in several reef areas from South Atlantic (TANG et al., 1999). A. coeruleus specimens are usually solitary due to their territoriality behavior, while A. bahianus and A. chirurgus are commonly found in small to large schools, depending on the ontogenetic stage (LAWSON et al., 1999). As most Acanthurids, these species present relatively long pelagic larval stages with a mean duration from 51,6 to 55,2 days (ROCHA et al., 2002). Usually, wide-range reef fish species with long pelagic larval development are characterized by a lack of genetic subdivision among populations (EBLE et al., 2011) and low rates of chromosomal variation (MOLINA, 2007). 26

Figure 1. Map of South America showing the collections sites of Acanthurus coeruleus (a), A. bahianus (b), and A. chirurgus (c) in the states of Rio Grande do Norte (1) and Bahia (2), northeastern Brazil.

However, reports about cytogenetic patterns of Acanthuridae are still underrepresented (less than 5% of species) and restricted to Indo-Pacific species (ARAI, 2011). The three analyzed species from Pacific, Acanthurus triostegus, Prionurus scalprum (ARAI & INOUE 1976), and Ctenochaetus striatus (OJIMA e YAMAMOTO, 1990) all share a conservative Perciformes-like karyotype with 2푛 = 48a, considered basal to this fish group (BRUM e GALETTI, 1997). In order to increase the karyotypic data of Acanthuridae and to infer the chromosomal evolution of Atlantic species, cytogenetical analyses were carried out for three Acanthuridae species from Brazilian coast, South Atlantic.

2. Material and Methods Nine individuals of A. coeruleus, four individuals of A. bahianus, and 17 individuals of A. chirurgus were cytogenetically studied. were collected using hand nets (60x100 cm) by snorkeling at coastal reef areas from the states of Rio Grande do Norte (5°46’S, 35°12’W) and Bahia (13°00’S, 38°32’W and 13°52’S, 38°56’W) in northeastern Brazilian shore (Figure 1). Right after collection, specimens were transported in plastic bags with 27 oxygen to the laboratories and placed in 60 L tanks equipped with filtration and aeration systems. Twenty-four hours prior to chromosomal preparation, the animals were inoculated via intramuscular with a solution of antigen complexes (Munolan) for mitotic induction (MOLINA et al., 2010). After this period, the specimens were anesthetized and euthanized by immersion in in water at 0–4º Cup to complete interruption of gill movements (Blessaing et al., 2010). To obtain mitotic chromosomes in vitro, portions of anterior kidney were removed and transferred to RPMI medium (Cultilab) with about 50 휇L of 0.025% colchicine, followed by hypotonic treatment (KCL 0.075M) for 20 minutes at 37∘C and fixation in Carnoy’s fixative (methanol : acetic acid 3 : 1) (GOLD et al., 1990). Chromosomes were stained with 5% Giemsa in phosphate buffer (pH 6.8) for karyotypic analyses. Nucleolus organizer regions (NORs) were detected by silver nitrate staining (Ag-NORs) (HOWELL e BLACK, 1980), whereas heterochromatic regions were evidenced by Cbanding (SUMNER, 1972). Metaphases were photographed using an Olympus BX51 (Olympus, Tokyo, Japan) epifluorescence photomicroscope equipped with digital capture system. Chromosomes were classified as metacentric (m), submetacentric (sm), subtelocentric (st), and acrocentric (a) based on arm ratio (LEVAN, 1964). The pairs were arranged in decreasing order size according to each morphological category (m, sm, st, and a) in karyotypes using the software Adobe Photoshop CS6 v. 13.0.

3. Results The three Acanthurus species showed remarkable karyotype diversification. Acanthurus coeruleus presented 2푛=48, composed of two submetacentric, four subtelocentric, and 42 acrocentric chromosomes (Figure 2(a)). The diploid number of A. bahianus equals 2푛=36 with a karyotype composed of 12 large metacentric, two submetacentric, four subtelocentric, and 18 acrocentric chromosomes (Figure 2(c)) while A. chirurgus was characterized by 12 large metacentric, two submetacentric, four subtelocentric, and 16 acrocentric chromosomes (2푛=34) (Figure 2(e)). Small amounts of heterochromatin were detected mainly at pericentromeric regions and interspersed with NORs in studied species (Figures 2(b), 2(d), and 2(f)). In A. bahianus, terminal C-bands were also observed in some pairs (Figure 2(d)).

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Figure 2: Karyotypes of Acanthurus coeruleus ((a) and (b)) with 2푛=48, A. bahianus ((c) and (d)) with 2푛=36, and A. chirurgus ((e) and (f)) with 2푛=34 after conventional Giemsa staining ((a), (c), and (e)) and C-banding ((b), (d), and (f)). The NOR-bearing chromosomes after silver nitrate staining of each species are shown in boxes (pair 2 of A. coeruleus and pair 8 of A. bahianus and A. chirurgus).

Single nucleolar organizer regions (NORs) were located by silver nitrate staining on short arms of the largest subtelocentric pair in the three Acanthuridae species (Figure 2, inbox). Based on chromosomal data, idiograms were generated to highlight particular karyotype traits for each species and the inferred pathways of chromosomal differentiation based on a phylogenetic hypothesis to Atlantic Acanthurus (Figures 3(a)–3(d)). 29

Figure 3. Idiograms of chromosomes sets of Acanthurus coeruleus (a), A. bahianus (b), and A. chirurgus (c) showing the most conspicuous shared cytogenetic traits in boxes. In (d), the basal karyotype of Perciformes (2n=48a) and a phylogenetic hypothesis based on sequential chromosomal rearrangements inferred in the three Acanthurus species.

4. Discussion It is assumed that the presence of 48 acrocentric chromosomes represents a plesiomorphic feature within Perciformes (BRUM e GALETTI JR., 1997; GALETTI JR. et al., 2006). This condition is particularly frequent among marine fish and could be related to 30 dispersal abilities (high gene flow) between populations, thereby preventing the fixation of new chromosomal rearrangements and karyotypic divergence (MOLINA, 2007). In fact, the low genetic structure in reef fish species has been correlated to the production of planktonic eggs and/or larvae that can be dispersed over large distances (EBLE et al., 2011). This trend (2n=48a) seems to be valid for Acanthuridae species from Indo-Pacific Ocean of different genera, such as Acanthurus, Ctenochaetus, and Prionurus (ARAI, 2011). However, inconsistent relationship between pelagic larval duration (PLD) and genetic connectivity or chromosomal patterns has been reported in some marine species (ROCHA et al., 2002; AFFONSO e GALETTI JR., 2005). In these cases, ecological and biogeographic aspects of each species might be more relevant to explain the genetic variation than PLD itself, as observed in the present study. As expected for widely distributed species with long PLD, A. coeruleus presented typical Perciformes-like features, that is, a diploid number of 48, single NORs, and a large number of acrocentric chromosomes (Figure 2a).The karyotype of this species (2sm + 4st + 42a) demonstrates the occurrence of pericentric inversions in three chromosome pairs (1st, 2nd, and 3rd pairs), a common rearrangement in Perciformes that accounts for most of karyotype diversification in marine fish (GALETTI JR. et al., 2006). A similar set of three chromosomal pairs in both morphology and size is also observed in A. bahianus and A. chirurgus, represented by a submetacentric pair and two subtelocentric pairs, including the NOR-bearing pair. Because of the high resemblance of such pairs in the three Acanthurus species, they are supposed to share a common origin before the differentiation of each lineage, thereby indicating a symplesiomorphic trait. Estimates of divergence time between the subclade that comprises A. coeruleus and that clusters A. chirurgus and A. tractus (SORENSON et al., 2013), a sister-species of A. bahianus, suggest that these putative homeologous pairs (sm and st) had arisen at nearly 19Ma. On the other hand, A. bahianus and A. chirurgus presented an evolutionary chromosomal pattern rarely found in typical marine fishes. The drastic reduction in diploid number from 48 chromosomes to 2n=36 and 2n=34, respectively, along the presence of large metacentric pairs is evidence of sequential Robertsonian rearrangements or centric fusions (Figures 2c and 2e). Indeed, the uniqueness of Robertsonian translocations in karyotypes of A. bahianus and A. chirurgus (Figure 3), and similar size of metacentric pairs reinforces these rearrangements are a recently shared trait between both species. An additional fusion representing an autapomorphic condition is presented in A. chirurgus 31 karyotype since this species has an exclusive large sm pair (7th) and lacks the smallest acrocentric pair observed in the other two species (Figure 2e). The chromosomal speciation observed in Acanthurus species of South Atlantic is likely to reflect historical events. Extensive analysis of biogeography and evolution of reef fish from Atlantic indicated that changes in ocean dynamics over the past 10Ma have determined the differential richness and endemism levels of fish genera and families of reef fish (FLOETER et al., 2008). As discussed by Galetti et al. (2006) the rate of chromosomal evolution in reef fish from Atlantic Ocean also seems to be strongly related to habitat isolation of coastal areas during glaciation periods followed by further sea level uprising. Unfortunately, no reports about time of divergence between A. bahianus and A. chirurgus are available, thus hindering the minimum time span after Robertsonian rearrangements that gave rise to the large metacentric chromosomes, herein referred as a single trait. However, estimates inferred for A. chirurgus and A. tractus (SORENSON et al., 2013) being the latter a sibling species of A. bahianus (FRANCINI-FILHO et al., 2010), point out that these rearrangements took place by at least 5Ma. Even though the time estimates for the occurrence of chromosomal fusions in both Acanthurus species might require some bias correction, they are intermediary to periods of major biogeographic isolation events in Atlantic Ocean such as Amazon outflow (∼10Ma) and uplifting of Panama isthmus (∼3Ma) (Rocha, 2003). Nonetheless, the influence of these biogeographic barriers in the putative fixation of chromosomal rearrangements remains unclear and further cytogenetic studies in other species, particularly A. tractus, are highly encouraged. Different from pericentric inversions, centric fusions or Robertsonian rearrangements are usually reported in non-Perciformes marine fish, such as flatfish (Pleuronectiformes) (BITENCOURT et al., 2014) toadfish (Batrachoidiformes) (COSTA e MOLINA, 2009) and some mullets (Mugiliformes) (NIRCHIO et al., 2005) Centric fusions are particularly common in Batoidea (stingrays, guitarfish, and skates), the most derived superorder of elasmobranchs (ROCCO et al., 2007). Conversely, these rearrangements have been scarcely identified in Perciformes at a polymorphic stage in Pomacentridae (MOLINA e GALETTI JR., 2002) Gobiidae (GILES et al., 1985; THODE et al., 1985), Lutjanidae (NIRCHIO et al., 2008), Apogonidae (OJIMA e KOJIMA, 1985) and Uranoscopidae (VITTURI et al., 1991) or else restricted to a particular taxon like Sparisoma (parrotfishes) (SENA e MOLINA, 2007). Therefore, the karyotypes of A. bahianus and A. chirurgus can be regarded as highly derived in relation to basal karyotype suggested to Perciformes. 32

While the macrostructure was variable, the NOR-bearing chromosomes seem to be conserved in the three species (Figure 2, inbox). This pattern indicates that these chromosomal regions as poor cytotaxonomic markers, differing from other Atlantic fishes in which the identification of ribosomal cistrons has proved to be efficient to distinguish apparently homogeneous karyotypes, as in Lutjanidae (ROCHA e MOLINA, 2008) Serranidae (MOLINA et al., 2002) and Gerreidae (CALADO et al., 2012) or even population units (ACCIOLY et al., 2012) Similarly, heterochromatin was virtually similar among A. coeruleus, A. bahianus, and A. chirurgus, being mainly dispersed over centromeres and NORs, as commonly found in most Perciformes (MOLINA et al., 2013) Therefore, it is unclear if the deep divergences in these fish karyotypes are followed by microstructural changes. Further analyses using other banding methodologies and mapping of sequences by fluorescence in situ hybridization (FISH) are required to evaluate the extension of such apparent homogeneity of specific chromosomal regions in Acanthurus. The amount of chromosomal traits in the three Acanthurus species from Brazilian coast allows raising a phylogenetic hypothesis to them. Indeed, the ordination and sharing of the traits show a closer phylogenetic relationship between A. bahianus and A. chirurgus than to A. coeruleus. This result is corroborated by previous genetic analyses. Indeed, analysis of CytB sequences showed a more basal condition between A. coeruleus in relation to the other two congeners (FRANCINI-FILHO et al., 2010). Recently, a phylogenetic analysis of Acanthuridae based on sequence data of two mitochondrial and seven nuclear genes (SORENSON et al., 2013) corroborated the ancestral position of A. coeruleus in relation to A. chirurgus and A. tractus, which replaces A. bahianus in the Caribbean (FRANCINI- FILHO et al., 2010; CALASTELLANOS-GELL et al., 2012). Thus, for analyzed Atlantic species, the chromosomal traits show robust support to clarify the phylogenetic arrangement among them serving as useful markers to evolutionary studies in Acanthuridae. Moreover, in agreement with phylogeographic studies (ROCHA et al., 2002; FLOETER et al., 2008), the chromosomal differences between Atlantic species of Acanthurus seem to be more related to ecology and evolutionary history than to dispersal potential since the three species share a relatively long PLD.

5. Conclusion In conclusion, the chromosomal analyses in Acanthurus allowed identifying sequential events related to speciation process that differ from most cytogenetical reports on marine Perciformes, where specific rearrangements are often unclear. A step-by-step 33 karyotype modification can be inferred from the most basal pattern, involving few structural rearrangements (pericentric inversions in A. coeruleus) to high derived ones, originated by Robertsonian fusions in both A. bahianus and A. chirurgus and additional in tandem fusion in A. chirurgus. This scenario reveals a unique condition to tracing back the order of chromosomal evolutionary changes in Atlantic surgeonfish.

Acknowledgments The authors thank CAPES, CNPq (no. 556793/2009-9), INCT “Ciências do Mar,” and FAPESB (no. APP0064/2011) for the financial support and ICMBio/SISBIO (licenses 19135-1, 131360-1, and 27027-2) for the authorization in collecting specimens. They are also grateful to Dr. José Garcia Júnior for the taxonomic identification of specimens.

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5. Capítulo II

Abstract Acanthurus is a representative and widespread genus of marine fish that plays a key role in ecological dynamics of coral reefs. Three species are common along coastal reefs of Western Atlantic: A. coeruleus, A. bahianus and A. chirurgus. The cytogenetic pattern of these species indicated sequential steps of chromosomal rearrangements dating back 19 to 5 millions of years ago (M.a.) that accounted for their interspecific differences. Acanthurus coeruleus (2n=48; 2sm+4st+42a), A. bahianus (2n=36; 12m+2sm+4st+18a) and A. chirurgus (2n=34; 12m+2sm+4st+16a) share an older set of three chromosomal pairs that were originated through pericentric inversions. A set of six large metacentric pairs formed by Robertsonian (Rb) translocations found in A. bahianus and A. chirurgus and a putative in tandem fusion found in A. chirurgus are more recent events. In the present study, new cytogenetic data are being reported for these three Acanthurus species based on mapping of repetitive sequences such as ribosomal 18S and 5S rDNA and telomeric repeats to improve their karyotype evolutionary analyses. The lack of interstitial telomeric sequences (ITS) in spite of several centric fusions in A. bahianus and A. chirurgus might be related to the long period of time after their occurrence (estimated in 5Ma). Furthermore, the homeologies among the chromosome pairs bearing ribosomal genes, in addition to other structural features, highlight large conserved chromosomal regions in the three species. Our findings indicate that macrostructural changes occurred during the cladogenesis of these species were not followed by conspicuous microstructural rearrangements in the karyotypes.

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1. Introduction The Acanthuridae family (Perciformes) is a monophyletic and relatively ancient group of marine fishes (nearly 54 millions of years ago) with fast evolutionary divergence (CLEMENTS et al., 2003; SORENSON et al., 2013). Nowadays, this family is divided into six genera and comprises about 80 species, popularly known as surgeonfishes (NELSON, 2006). The genus Acanthurus Forsskål (1775) is one of the mostemblematic groups of surgeonfishes closely associated to coastal reefs (BELLWOOD and WAINWRIGHT, 2002; NELSON, 2006). This genus is widespread over tropical and subtropical seas, playing a major role in the ecology and evolution of coral reefs due to their herbivory habit (VALENTINE and HECK JR., 1999). The large assemblages of Acanthuridae and other grazers (e.g. parrotfishes and damselfishes) influence the coral reef structure by promoting bioerosion and controlling the spread of macroalgae cover (HORN, 1989; PADDACK et al., 2006). Four Acanthurus species are recorded in Western Atlantic, being three of them commonly found throughout brazilian coast; A. coeruleus Bloch and Schneider (1801), A. bahianus Castelnau (1855), and A. chirurgus (BLOCH, 1787) (BERNALL and ROCHA, 2011; MENEZES and FIGUEIREDO, 1985). These three species present highly differentiated karyotypes (2n=48, 36, and 34, respectively) in which Robertsonian rearrangements reduced the diploid values from 2n=48 to 2n=36 in A. bahianus and 2n=34 in A. chirurgus. In fact, six large metacentric pairs, which are absent in A. coeruleus, were derived from centric fusions and are apparently homeologous between A. bahianus and A. chirurgus, corroborating their close phylogenetic relationship. Such remarkable differences in the karyotype macrostructure are rare in marine fishes. Comparing these results to molecular data available for Acanthuridae, it was possible to infer that centric fusions have taken place about 5 M.a. while the pericentric inversions shared by the three species were more ancient events (nearly 19 M.a.) (AFFONSO et al., 2014). In view of the unusual cytogenetic variation in Atlantic Acanthurus, chromosomal banding and cytogenetic mapping of ribossomal genes and telomeric sequences were performed in A. coeruleus, A. bahianus and A. chirurgus. Our purpose was to infer if microstructural chromosome differentiation also followed the diversification in the karyotype macrostructure.

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2. Material and methods Cytogenetic analyses were carried out in specimens of A. coeruleus (N=23), A. bahianus (N=12) and A. chirurgus (N=17) collected along the shoreline of Natal, Rio Grande do Norte state (5o46’S, 35o12’W) and Salvador, Bahia state (13°00’S, 38°32’W), northeastern Brazil. Mitotic stimulation was performed by the inoculation of antigen complexes in the specimens (MOLINA, 2001, MOLINA et al., 2010). After 24 h, the animals were anesthetized with crave oil (1 mL/15 L of salt water) and euthanized for removal of anterior kidney. The experiments and euthanasia of specimens were authorized by the Committee of Ethics (CEUA/UESB) from Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia (#32/2013). Chromosomal spreads were obtained by interrupting the cell cycle in vitro (GOLD et al., 1990). The active nucleolar organizer regions (NORs) were detected by silver nitrate staining (HOWELL and BLACK, 1980). Once heterochromatin patterns have been previously reported in the analyzed species (AFFONSO et al., 2014), chromosomes were stained with base-specific fluorochromes to locate GC- and AT-rich sites by mithramycin (MM) and 4’-6- diamino-2-fenilindole (DAPI), respectively (SCHWEIZER, 1980). FISH was performed according to Pinkel et al. (1986) using 18S, 5S and telomeric probes. The probes of 5S rDNA (nearly 200 bp) and 18S rDNA (nearly 1400 bp) were obtained from DNA samples of A. coeruleus via PCR using the primers A 5’-TAC GCC CGA TCT CGT CCG ATC-3’/B 5’-CAG GCT GGT ATG GCC GTA AGC-3’ (Pendás et al., 1994) and NS1 5’-GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3’/NS8 5’-TCC GCA GGT TCA CCT ACG GA-3’ (WHITE et al., 1990), respectively. Both probes were labeled by nick translation (Roche, Mannheim, Germany). The 5S rDNA probes were labeled with biotin-14-dATP (Invitrogen) and detected with avidin-FITC (Sigma); while the 18S rDNA probes were labeled with digoxigenin-11-dUTP (Roche) and detected with anti-digoxigenin-rhodamin

(Roche). The (TTAGGG)n sequences were mapped by FISH using Telomere PNA FISH Kit/FITC according to manufacturer’s instructions (DakoCitomation). The micrographs were obtained using an epifluorescence photomicroscope OlympusTM BX51 (Olympus, Tokyo, Japan) with appropriate filters equipped with digital capture system Olympus DP73 using the software CellSens (Olympus). The karyotypes were arranged as previously defined by Affonso et al. (2014) with identification of metacentric (m), submetacentric (sm), subtelocentric (st) and acrocentric (a) chromosomes based on arm ratio. An idiogram was built based on the structural features of chromosomal pairs of each species combining the results of mapped sequences.

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3. Results The karyotypic patterns agree with the previous results reported for the three Acanthurus species (AFFONSO et al., 2014). Therefore, A. coeruleus presented 2n=48 (2sm+4st+42a; NF=54), A. bahianus 2n=36 (12m+2sm+4st+18a; NF=54) e A. chirurgus 2n=34 (12m+2sm+4st+16a; NF=52) (Figure 1A-C). Active NORs were located at terminal position on short arms of the largest st pair of each species, corresponding to pairs 2, 8 and 8 of A. coeruleus, A. bahianus and A. chirurgus, respectively (Figure 1, inbox). The GC-rich sites (MM+/DAPI-) were identified only at active NORs while AT-rich heterochromatin segments were absent in the three species.

Figure 1. Karyotypes and metaphases of A. coeruleus (a), A. bahianus (b) and A. chirurgus (c) after Giemsa staining (left column), two-color FISH (middle column) with 18S rDNA (magenta signals) and 5S

rDNA (green signals) probes and distribution of (TTAGGG)n sequences (right column). Inbox, the NOR-bearing chromosomes are shown after silver nitrate staining (left column) and fluorochrome staining (middle column). Bar = 5µm. 41

The 18S rDNA sites were coincident with Ag-NORs in all species, except for A. coeruleus that presented an additional and probably inactive NOR site (unidentified by silver nitrate staining) on pair 13. On the other hand, the 5S rDNA sites were invariably located in the largest acrocentric pair of the three acanthurids, corresponding to pair 4 in A. coeruleus, and pair 10 in both A. bahianus and A. chirurgus. The (TTAGGG)n sequences were located exclusively at terminal chromosomal regions (Figure 1). The two-color FISH with ribossomal probes showed lack of synteny between the 18S and 5S rDNA sites.

4. Discussion Previous cytogenetic reports allowed tracing back the occurrence of chromosomal rearrangements in the Atlantic surgeonfish A. coeruleus, A. bahianus and A. chirurgus (AFFONSO et al., 2014). These authors verified that a set of sm-st chromosomes (pairs 1 to 3 in A. coeruleus and 7 to 9 in A. bahianus and A. chirurgus) shared by these species derived from relatively ancient pericentric inversions when compared to the basal karyotype of Perciformes (2n=48a). On the other hand, a set of large metacentric pairs (1 to 6), associated with the drastic reduction in 2n values of A. bahianus and A. chirurgus, indicated a more recent event of Rb translocations that corroborates the closer phylogenetic relationship between both species in relation to A. coeruleus. This approach was favored by the rare possibility of dating chromosomal rearrangements in this group. The divergence period estimated for the three Acanthurus species (considering A. tractus as sister-group of A. bahianus) by molecular analyses (SORENSON et al., 2013) provides a reliable indication that the set of six metacentric chromosomes related to Rb rearrangements and shared by A. bahianus and A. chirurgus has arisen at least 5 Ma (AFFONSO et al., 2014). In the face of karyotype macrostructure variation in Acanthuridae from brazilian coast, the mapping of repetitive sequences is particularly useful to the identification of possible shared chromosomal similarities as well as refining the understanding about the interspecific differentiation after the origin of chromosomal rearrangements. In the three Acanthurus species, the heterochromatin is mainly distributed over pericentromeric regions and interspersed to NORs. Following this trend, the qualitative analysis of heterochromatic segments presented in this study also revealed similar base composition with homogenous amounts of GC and AT content after fluorochrome staining. The only exception were the GC-rich sites (MM+/DAPI- signals) at NORs, as usually detected in teleosteans. 42

This reduced and quite homogenous heterochromatic pattern of Acanthuridae (AFFONSO et al., 2014) has been considered as an obstacle to evolutionary changes in karyotypes of marine Perciformes (MOLINA, 2007). Indeed, the mapping of repetitive sequences in several families of this order, characterized by stable karyotypes, revealed a reduced phylogenetic variation (MOTTA-NETO et al., 2011a, b; CALADO et al., 2013). On the other hand, heterochromatin heterogeneity has been reported in some fish groups with remarkable karyotypic changes such as Gobiidae (CAPUTO et al., 1997; LIMA-FILHO et al., 2014; MOLINA et al., 2014), Characidae (MANTOVANI et al., 2000) and Erythrinidae (CIOFFI et al., 2009; BLANCO et al., 2011). For instance, some species of marine Perciformes like Centropyge aurantonotus (Pomacanthidae), presented unusual karyotype for the family and a unique richness of C- bands and GC-rich sites (AFFONSO et al., 2005). Therefore, the absence of heterochromatin variation in the differentiated karyotypes of Acanthurus species in the present work represents an unusual condition. However, it should be pointed out that heterochromatin might be more complex than previously thought after analyses of other repetitive sequences (histones, transposons, retrotransposons and microsatellites), as revealed in some Perciformes species (COSTA et al., 2013; COSTA et al., 2014). The location of 18S and 5S rRNA genes has been proved to be efficient cytotaxonomic markers in distinct marine fish groups like Gerreidae (CALADO et al., 2013; CALADO et al., 2014), Lutjanidae (ROCHA and MOLINA, 2008) and Nototheniidae (PISANO and GHIGLIOTTI, 2009). Usually, both families of these ribosomal genes are not syntenic (GORNUNG, 2013), as observed in Acanthurus (Figure 1). Nonetheless, the distribution of both 18S and 5S rDNA sites were quite similar among the three species, being apparently located in homeologous pairs. The major NOR-bearing pairs identified by silver nitrate and fluorochrome staining as well as by FISH with 18S rDNA probes were included in “sm-st chromosomes set” possibly formed by pericentric inversions that took place before the split of the three Acanthurus species around 19 Ma (SORENSON et al., 2013). In spite of the conservatism of NORs in these acanthurids, an additional 18S rDNA site was located on pair 13 in the karyotype of A. coeruleus, regarded as the most basal taxon among the analyzed species (BERNAL and ROCHA, 2011; CASTELLANOS-GELL et al., 2012; SORENSON et al., 2013). Differently from the rDNA at pair 2 identified by both FISH and silver nitrate staining, the ribosomal site in pair 13 lacks argyrophylic nature indicating either an inactive copy of 43 ribosomal gene (SANTORO, 2005) or pseudogenes (AFFONSO et al., 2005; LIMA-FILHO et al., 2014). The lack of conspicuous microstructural changes in karyotypes of Acanthurus contrasts with the remarkable variation in chromosomal number and morphology found in A. bahianus and A. chirurgus, particularly caused by Robertsonian (Rb) translocations or centric fusions that formed the “m-chromosomes set” pairs in both species. Previous reports in fishes suggested that Rb rearrangements are favored by the presence of terminal 18S or 5S rDNA sites interspersed with heterochromatin in formerly acrocentric chromosomes (FUJIWARA et al., 1998; MOLINA and GALETTI, 2002). This seems to be the case of Selene setapinnis (Carangidae) in which a Rb translocation was inferred to explain internalized 18S rDNA regions previously located at terminal regions (Jacobina et al., 2013). Similarly, biarmed chromosomes derived from centric fusions in the pomacentrids Chromis flavicauda and C. jubauna shared 5S rDNA sites (MOLINA and GALETTI, 2002). The mapping of 18S rDNA in A. bahianus and A. chirurgus did not show these sequences in the m-chromosomes set. However, the presence of an extra rDNA site in the terminal position of an acrocentric pair of A. coeruleus, a species carrying the basal karyotype 2n=48, does not excludes the role of this DNA family in the Rb processes occurred in the Acanthurus genus. The mapping of telomeric sequences by FISH is highly indicated to species or populations with reduced chromosomal numbers by centric fusions (REED and PHILLIPS, 1995). This approach is able to reveal internal telomere sequences (ITS) that serve as evidence of Rb rearrangements (BITENCOURT et al., 2014; MEYNE et al., 1990). However, several cases of centric fusions are not followed by the presence of these ectopic sites. In vertebrates, this lack of correlation between Rb rearrangements and ITS has been related to losses during centric fusions or modification of telomeric sequences after long periods of internalization (NANDA et al., 1995; OCALEWICZ, 2013). Likewise, ITS were absent in the fused chromosomes of A. bahianus and A. chirurgus. Taking into account that Rb rearrangements in both species have probably taken place at nearly 5Ma it seems plausible to infer that the telomeric-like sequences internalized by fusions accumulated enough mutations or were lost during this long period of time. A more recent chromosomal rearrangement was inferred in A. chirurgus and representing an autapomorphic feature. Putatively, the reduction of the chromosomal number (2n=34) in this species was derived from a tandem fusion of a small acrocentric pair (present in A. bahianus) on the short arms of the chromosomal pair 7 in A. chirurgus (Figure 2). 44

Usually, ectopic telomeric sequences could also be preserved after tandem fusions (CIOFFI et al., 2011; HARTMANN and SCHERTHAN, 2004). However, internal (TTAGGG)n sequences were not identified in this case and could have been probably lost during the chromosomal rearrangements.

Figura 2. Idiogram of A. coeruleus (a), A. bahianus (b) and A. chirurgus (v) combining the results from NOR/GC-rich region location and physical mapping of ribossomal and telomeric sequences. The homeologous chromosomes derived from pericentric inversions (sm-st chromosomes set) and centric fusions (m-chromosomes set) are highlighted in boxes. The asterisk in pair 7 of A. chirurgus

indicates a putative autapomorphy (in tandem fusion) to this species.

In conclusion, the refined analysis of karyotypic features in the three species of Acanthurus showed little microstructural changes despite of their long-term evolutionary history of chromosomal rearrangements. The coincident distribution of ribosomal genes, as well as the presence of homeologous and phylogenetically related sets of sm-st chromosomes (3 pairs) and m chromosomes (6 pairs) reveals the conservatism of large syntenic chromosomal regions in these species. This condition has been reported in other marine Perciformes (MOLINA, 2007; MOLINA et al., 2013; MOTTA-NETO et al., 2011a), revealing that chromosomal rearrangements have probably taken place during cladogenesis of these groups and remained fixed ever since.

Acknowledgments The authors thank CNPq (#556793/2009-9; 301409/2009-9), INCT “Ciências do Mar”, and FAPESB (#APP0064/2011) for the financial support, CAPES for the MSc 45 scholarship to M.A.F., and ICMBio/SISBIO (licenses 19135-1, 131360-1, and 27027-2) for the authorization in collecting specimens. We are also grateful to Dr. José Garcia Júnior for the taxonomic identification of specimens.

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6. CONCLUSÕES

 As espécies de Acanthurus do Atlântico Ocidental apresentam cariótipos conspicuamente diferenciados.

 Diferentes rearranjos estruturais tiveram participação na diferenciação dos cariótipos das espécies. Inversões pericêntricas em A. coeruleus, fusões Robertsonianas em A. bahianus e A. chirurgus, espécies que apresentaram maior derivação, e uma possível fusão em tandem com ocorrência adicional em A. chirurgus.

 Os padrões de divergência citogenética são concordantes com processos sequenciais de cladogênese destas espécies. Estes conjuntos de rearranjos datam de 19 milhões (inversões pericêntricas) a 5 milhões (translocações Robertsonianas) de anos atrás.

 A distribuição coincidente de genes ribossomais, bem como a presença de conjuntos homeólogos de cromossomos sm-st (3 pares) e cromossomos m (6 pares) revela o conservadorismo em grandes regiões cromossômicas sintênicas nestas espécies.

 As espécies de Acanthurus apresentam uma microestrutura cromossômica conservada, com poucas modificações, apesar da ocorrência de rearranjos cromossômicos antigos ao longo de sua história evolutiva.

 As informações obtidas estimulam o uso de marcadores citogenéticos mais resolutivos, proporcionados pelo mapeamento sequências repetitivas de DNA, para um melhor entendimento dos processos envolvidos na diversificação cromossômica da família.

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