République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique Université Larbi Ben M’Hidi Oum El-Bouaghi Faculté des Sciences Exactes et des S.N.V Département Sciences de la Matière
N° d’ordre.… /2019
MEMOIRE
Pour l’obtention du diplôme de Master en chimie
Option : chimie pharmaceutique
Etude phytochimique et évaluation de l’activité antibactérienne des extraits des plantes Mentha pulegium L et Thymelaea hirsuta Endel
Présenté Par : ZEGHMAR Safia GHOUL Kenza
Sous la direction de : Dr. HAZOURLI Abdelkrim
Soutenu le : 11/07/2019
Devant le jury de soutenance suivant :
Pr. SID Assia Pr. GHERRAF NOUREDDINE Dr. HAZOURLI Abdelkrim
Année Universitaire : 2018/2019
Dédicace
A mes parents Saïd et El Zohra, Pour vos mains qui ont tant travaillées, Pour votre cœur qui m’a tant donné Pour votre sourire qui m’a tant réchauffé, Pour vos yeux qui furent parfois mouillés, Pour vous qui m’avez tant aimé.
A la plus chère au monde, Mon frère Bilal qui a Toujours m’encouragé durant Mes études
A mes frères : Bilal, Ibrahim, Kamel et Abd El-Kader.
A mes sœurs : Meriem, Fatiha, Rabia, Karima, Aicha, Sabrina A mes neveux AbdAlsamie, Zineb, Chayma A mon binôme d’étude Safia A mes amis de la promotion de master en Biochimie A tous mes collègues et mes amies
Kenza Dédicace
Je dédie ce modeste travail à mon Très chère Frère Hacen Qui m’a toujours soutenu, et qu'a été Toujours présent pour Moi A mon mère FAKIA Pour votre cœur qui m’a tant donné Pour votre sourire qui m’a tant réchauffé Aux plus chères au monde.
Mes grandes mères Kamir, Fatiha qui ont Toujours m’encouragés durant Mes études
A mes frères : Bachir, Youssef
A mes sœurs : Rayan, Achwak, MALAK, NAWAL, HASSINA, BASSMA.
A mon fiancé Abd El Kader
A mes cousins Kawthar, Jinan, Rital, Ali, AbdElrahman
A mon binôme d’étude Kanza
A tous mes collègues et mes amies
Safia Remerciements
Je remercie tout d’abord ALLAH le tout puissant de m’avoir donné la santé la patience, la puissance et la volonté pour réaliser ce mémoire.
Je tiens particulièrement à remercier mon promoteur, A. HAZOURLI, docteur à l’université d’Oum el bouaghi , je le remercie pour sa disponibilité, ses pertinents conseils et de m’avoir guidé durant la préparation de mon mémoire de Master. Ce travail témoigne de sa confiance et de son soutien dans les moments les plus difficiles. Qu’elle trouve ici l’expression de ma reconnaissance et de mon respect . Je remercie Monsieur, NoureddineGherrafProfesseur à l’université d’oum el bouaghi D'avoir assuré la présidence du jury de ma soutenance et pour ses nombreux conseils et suggestions scientifiques et techniques.
Je remercie Monsieur, Zellagui Amar,Professeur à l’université d’oum el bouaghi pour les laboratoires de recherche scientifiques.
Je remercie Mme, DAMMANDABIH, docteur à l’université d’oum el bouaghi pour leurs efforts moraux qui nous ont donné la force d'atteindre la fin de cet humble travail et Je remercie Mme Professeur SID Assia pour avoir accepté d'examiner ce Travail.
Je remercie les doctorantes, MmeWidad, Mme Ahlam, Mme Meryem pour sa disponibilité, ses pertinents conseils et de m’avoir guidé durant la préparation de partie pratique de mon mémoire de Master
Je remercie les médecins dentistes, docteur BASSMA,docteurMERYEM ,la pharmacienne docteur yassmin Je remercie tous ceux et celles qui m’ont marqué par leur soutien et encouragements et je leur exprime mon respect et ma profonde sympathie : tous les membres de notre laboratoire et tous les collègues de ma promotion. Aux personnels du laboratoire de l'université L’Arbi Ben M’hidi pour leur aide, en particulier Mme Sonya, Mme Djouhra, Mr Salem, Mr Azzeddine,MrLahssen Enfin nous remercions toute personne qui a participé de près ou de loi, directement ou indirectement à la réalisation de ce travail.
Merci à tous… Liste des figures
Partie I - Chapitre I
Figure 01 : Acide gallique 4-hydroxybenzoates ...... 8
Figure 2 : Structure de base des acides benzoїque et cinnamique ...... 8
Figure 03 : Structure de base des flavonol(Quercétine) ...... 10
Figure 4 : Exemple d'alcaloïde la morphine ...... 14
Figure 5 : Structure de l’unité isoprène ...... 15
Partie I - Chapitre II
Figure 1 : L’O2, à l’origine des radicaux libres ...... 22
Figure 2 : Classification des systèmes antioxydants ...... 24
Figure 3 : acide L-ascorbique ...... 25
Figure 4 : Quercétine, un flavonol...... 26
Partie I - Chapitre III
Figure 1 : Plantes médicinales, source potentielle de revenus extérieurs ...... 36
Figure 2 : Représentation schématique et photo de la Menthe pulegium...... 38
Figure 3 : Thymelaeahirsuta (Linné) Endlicher (Photos originales)...... 42
Figure 4 : Représentation schématique et photo de la Thymelaeahirsuta ...... 44
Partie II - Matérielles et Méthode
Figure 1 : Menthapulegium ...... 54 Figure 2 : Thymelaeahirsuta ...... 54
Figure 3 : Menthapulegium après le séchage ...... 55
Figure 4 : Thymelaeahirsutaaprès le séchage ...... 55
Figure 5 : les Extraits bruts de Menthapulegium ...... 59
Figure 6 : les extraits bruts de Thymelaeahirsuta ...... 59
Figure 7 : Protocole pour extraction des composées phénoliques ...... 60
Figure 8 : La coloration vert-noir confirme La présence des tanins condensés ...... 62
Figure 9 : La coloration bleu -noir confirme La présence des tanins condensés ...... 62
Figure 10 : Détection de saponine Dans l’extrait de Thymelaeahirsuta ...... 63
Figure 11 : Détection de saponinedans l’extrait de Menthapulegium ...... 63
Figure 12 : Etapes du dosage des polyphénols totaux ...... 66
Figure 13 : Etape du dosage des flavonoïdes ...... 67
Partie II - Activités Biologique
Figure 1 : Mécanisme réactionnel de test DPPH ...... 70
Figure 2 : Souches provenant du laboratoire de bactériologie ...... 72
Figure 3 : Staphylococcus aureus(ATCC 25923) ...... 73
Figure 4 : Escherichia coli (ATCC 25922) ...... 73
Figure 5 : Pseudomonas aeruginosa(ATCC27853) ...... 74
Figure 6 : CandidaAlbicans ...... 74
Figure 7 : Parois des Bactéries à Gram + et Gram - ...... 75
Figure 8 : Protocol pour faire un frotti ...... 78
Figure 9 : Protocole de coloration de gram ...... 79
Figure 10 : des Cocci à gram positif ...... 80
Figure 11 : des Bacile a gramme négatif ...... 80 Figure 12 : des Cocci à gram négatif ...... 81
Figure 13 : Condida Alibicans ...... 81
Figure 14 : Les milieux de culture ...... 82
Figure 15 : Série des concentrations différents des extraits dissouts dans le (DMSO) ...... 82
Figure 16 : Technique d’ensemencement des souches (ATCC) dans l’eau physiologie comparant avec McFarland ...... 83
Figure 17 : Technique d’ensemencement dans les boites de Pétrie ...... 84
Figure 18 : Protocole de détermination de la zone d’inhibition en milieu solide...... 85
Partie III - Résultat et discutions
Figure 1 : Rendement d’extraction de la plante d’Menthapulegium L ...... 89
Figure 2 : Rendement d’extraction de la plante de ThymelaeahirsutaEndel ...... 90
Figure 3 : Rendements des extraits méthanoliques de Menthapulegium L ...... 91
Figure 4 : Rendements des extraits méthanoliques de Thymelaeahirsuta Endel ...... 92
Figure 5 : Rendement en polyphénols de Menthapulegium L ...... 94
Figure 6 : Rendement en polyphénols de Thymelaeahirsuta Endel ...... 95
Figure 7 : Rendement en flavonoidesMenthapulegium L ...... 96
Figure 8 : Rendement en flavonoides de Thymelaeahirsuta Endel ...... 97
Figure 9 : Courbe d’étalonnage de l’acide gallique ...... 98
Figure 10 :teneur en polyphénols de plante Menthapulegium L ...... 98
Figure 11 : teneur en polyphénols de plante Thymelaeahirsuta Endel ...... 99
Figure 12 : Courbe d’étalonnage de la quercétine ...... 100
Figure 13 : teneur en flavonoïdes de plante Menthapulegium L...... 100
Figure 14 : teneur en flavonoïdes de plante Thymelaeahirsuta Endel...... 101
Figure 15 : courbe d’étalonnage d’acide ascorbique ...... 102 Figure 16 : Pourcentage d’inhibition du radical libre DPPH, en fonction de concentrations
Utilisées pour les extraits méthanoliques chloroforme, Hexane, acétate d’éthyle, n- butanol de la plante Menthapulegium L ...... 103
Figure 17 : : Pourcentage d’inhibition du radical libre DPPH, en fonction de concentrations utilisées pour les extraits méthanoliques chloroforme, Hexane acétate d’éthyle, n- butanol de plante ThymeleahirsutaEndel...... 104
Figure 18 : Escherichia coli (ATCC 25922) ...... 108
Figure19 : Staphylococcus aureus (ATCC 25923) ...... 108
Figure 20 : Pseudomonas aeruginosa(ATCC27853) ...... 109
Figure21 :Candidaalbicans ...... 109
Figure 22 : Escherichia coli (ATCC 25922) ...... 111
Figure 23 : Staphylococcus aureus (ATCC 25923) ...... 111
Figure 24 : Pseudomonas aeruginosa(ATCC27853) ...... 112
Figure 25 :Candidaalbicans ...... 112
Liste des tableaux
Partie I - Chapitre II
Tableau 1 : Principaux radicaux libres et radicaux non libres Et leur structure chimique 22
Partie II - Matérielles et Méthode
Tableau 1 : Protocole de la macération ...... 56
Tableau 2 : Protocole d’évaporation ...... 57
Tableau 3 : Protocol dudosage des polyphénols totaux ...... 65
Partie II - Activités Biologique
Tableau 1 : Observation macroscopique des souches ...... 73
Tableau 2 : Observation microscopique des souches...... 80
Partie III - Résultat et discutions
Tableau 01 : Criblage phytochimique Thymelaeahirustaet de Menthapulegium ...... 88
Tableau 2: Rendements des extraits méthanoliques deMenthapulegium L ...... 88
Tableau 3 : Rendements des extraits méthanoliques deThymelaeahirsuta Endel...... 88
Tableau 4 : Rendements des polyphénols totaux de Menthapulegium L...... 88
Tableau 5 : Rendements des polyphénols totaux de Thymelaeahirsuta Endel...... 88
Tableau 6 : Rendements des flavonoïdes totaux de Menthepulegium L ...... 88
Tableau 7 : Rendements des flavonoïdes totaux de Thymelaeahirsuta Endel ...... 96 Tableau 8 : les valeurs d’IC50 des extraits MeOH et aqueux de Menthapulegium Let de l’acide ascorbique ...... 105
Tableau 9 : les valeurs d’IC50 des extraits MeOH de Thymelaeahirsuta Endel...... 106
Tableau 10 : Activité antibactérienne de l’extrait méthanoliqueM. pulegiumcontre les souches bactériennes testées ...... 110
Tableau 11 : Activité antibactérienne de l’extrait méthanoliqueThymelaeahirsuta contre les souches bactériennes testées ...... 113
Abréviationset Symboles utilisés A
Abs :Absorbance .
ATCC : l’American Type Culture Collection .
Al :Aluminium .
Alcl3 :Trichlorure d’Aluminium .
D
DPPH : 2, 2 diphényl-1-picrylhydrasyl .
DMSO :Diméthylsulfoxyde .
E
EAG : Equivalent Acide Gallique .
EOA : Espèces oxygénées actives .
EQ :Equivalent Quercétine .
ERO :Espèce réactive de l’oxygène.
G g/l :gramme par litre.
I
IC50 : Concentration inhibitrice .
M mg/ml :milligramme par millilitre.
MHA : Mueller-Hinton-Agar.
N
NO .: le monoxyde d’azote .
O
OH :groupement hydroxyle . OH :le radical Hydroxyle
R
R :Rendement
RL :Radicaux libres
U
UV :Ultra-violet
Introduction générale
Parce que la science nous balance sa science,
Science sans conscience égale science de
L’inconscience.
MC Solaar
Introduction générale
Au travers des âges, l’homme a pu compter sur la nature pour subvenir à sesbesoins de base : nourriture, abris, vêtements et également pour ses besoinsmédicaux. L’utilisation thérapeutique des vertus des plantes pour le traitement desmaladies ne date pas d’aujourd’hui il est ancestral [1].
Le développement de la chimiemoderne vers la fin du XIXe siècle et la découverte de nouveaux médicaments puissantscomme les antibiotiques a fait évincer la phytothérapie de sa place comme remède de premierplan en particulier dans les pays développés, tandis que dans d’autres pays du monde, elle n’acessé d’être le moyen de guérir de nombreuses maladies. Le temps et la science ont donnéraison aux millions d’êtres humains qui se sont soignés avec des plantes médicinales depuislongtemps, en raison de l’absence d’effets secondaires comparé aux médicaments. Les plantesmédicinales restent encore le premier réservoir de nouveaux médicaments [2].
Cela tientprincipalement au fait que le règne végétal représente une source importante d’une immensevariété de molécules bioactives. Cette matière végétale contient un grand nombre demolécules qui ont des intérêts multiples mis à profit dans l’industrie alimentaire, encosmétologie et en pharmacie. Parmi ces composés on retrouve, les coumarines, lesalcaloïdes, les acides phénoliques, les tannins, les terpènes et les flavonoïdes [3].
Le progrèsscientifique et technique a fait de la phytothérapie un domaine à part dans la recherche et ledéveloppement de nouvelles formes thérapeutiques et galéniques encore plus sûres et plusefficaces.Dans un autre domaine celui l’industrie alimentaire, deux antioxydants de synthèse lebutylhydroxytoluène et le butylhydroxyanisole sont largement utilisés comme additifsalimentaires pour prévenir la détérioration des aliments. Bien que ces antioxydantssynthétiques montrent une activité antioxydante plus puissante que celle des antioxydantsnaturels comme l’acide ascorbique et l’α-tocophérol [4], il y a une préoccupation
1
Introduction générale
concernantleurs effets néfastes sur la santé, car ils peuvent être impliqués dans les dommages hépatiqueset la carcinogénèse [5].
L’Algérie ce pays immense recèle un patrimoine végétal important par sarichesse et sa diversité dans les régions côtières, les massifs montagneux, les hauts-plateaux, la steppe et les oasis sahariennes : on y trouve plus de 3000 espècesvégétales. Parmi ces ressources naturelles les plantes aromatiques et médicinalesoccupent une large place et jouent un rôle important dans l’économie nationale. Ellessont utilisées dans différents domaines : industrie alimentaire, conserverie,pharmacie, et phytothérapie [6].
Afin d’exploiter ces potentialités nationales, beaucoup de chercheurs se sont intéressés au domaine de la phytochimie. Ce modeste travail a été réalisé afin d’étudier la composition phytochimique, l’activité antioxydante et l’activité antibactérienne de deux plantes médicinales de la famille Lamiaceae et Thymelaeaceae contenus dans différents extraits préparés à l’aide de différents solvants.
Le présent mémoire est composé de deux parties :
La première partie est consacrée à un rappel bibliographique, elle se compose de trois chapitres :
- Le premier chapitre est dédié aux plantes médicinales et aux principes actifs,
- le deuxième chapitre est consacré aux deux plantes étudiées : Menthapulegium. L, Thymelaeahirsuta Endel,
- Le troisième chapitre est consacré à l’étude des activités biologique (activité antioxydante et antibactérienne).
La deuxième partie a été consacrée à la partie expérimentale, elle se compose de deux chapitres :
- Le quatrième chapitre a été dédié au screening phytochimique des plantes étudiées,
- le cinquième chapitre a été consacré à l’évaluation de l’activité antioxydante et antimicrobienne des extrais des deux plantes.
Dans la troisième partie, nous avons rapporté les résultats obtenus, les rendements, les teneurs des composés phénoliques et l’étude de l’activité antioxydant, antibactérienne ainsi que leurs discussions
2
Introduction générale
Enfin, une conclusion générale et perspectives.
Références
[1] : Gurib-Fakim A., 2006. Medicinal plants : Traditions of yesterday and drugs of tomorrow.
Molecular Aspects of Medicine, Vol. 27 : 193
[2] : Maurice N., 1997. L'herboristerie d'antan à la phytothérapie moléculaire du XXIe siècle.
Ed. Lavoisier, Paris, p. 12-14.
[3] : Bougatef A., Hajji M., Balti R., Lassoued I., Triki-Ellouz Y., Nasri M., 2009.
Antioxidant and free radical-scavengingactivities of smoothhound (Mustelusmustelus) muscle
proteinhydrolysatesobtained by gastrointestinal proteases.Food Chemistry, 114 : 1198-1205.
[4] : Bougatef A., Hajji M., Balti R., Lassoued I., Triki-Ellouz Y., Nasri M., 2009.
Antioxidant and free radical-scavengingactivities of smoothhound (Mustelusmustelus) muscle
proteinhydrolysatesobtained by gastrointestinal proteases.Food Chemistry, 114 : 1198-1205.
[5] : Gulcin I., Alici H.A., Cesur M., 2005. Determination of in vitro antioxidant and radical
scavengingactivities of propofol.Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 53(3) : 281-285.
[6] : Duraffourd C., Lapraz JC., ChemliR., 1997. La plante médicinale de la tradition à
lascience. 1er congrès Intercontinental. Tunis. Ed. Granche. Paris, 222.
3
Chapitre I Plantes médicinales et principes actifs L’imaginationest plus importante
Que la connaissance
Albert Einstein
I. Généralités
І-1- Définition des plantes médicinales
Dans le code de la Santé publique, il n'existe pas de définition légale d'une plante médicinale au sens juridique, mais en France « une plante » est dite médicinale lorsqu'elle est inscrite à la pharmacopée et que son usage est exclusivement médicinal. C’est-à-dire qu’elles sont présentées pour leurs propriétés préventives ou curatives à l'égard des maladies humaines ou animales [1].
Ce sont des plantes utilisées en médecine traditionnelle dont au moins une partie possède des propriétés médicamenteuses. Leur action provient de leurs composés chimiques (métabolites primaires ou secondaires) [2].
D'après Hordé les plantes médicinales sont utilisées par l'homme depuis près de 7000 ans et que certains animaux les consomment aussi dans un but thérapeutique. Environ 35 000 espèces de plantes sont employées à l'échelle mondiale à des fins médicinales, ce qui constitue le plus large éventail de biodiversité utilisé par les êtres humains.Leurs préparations à base végétales contiennent un ou plusieurs principes actifs utilisables à des fins thérapeutiques. Et d’après Odile et Daniel environ plus de 30% des médicaments contiennent des principes actifs d’origine naturelle [3].
І-2- Définition des principes actifs
Le principe actif c’est une molécule contenue dans une drogue végétale ou dans une préparation à base de drogue végétale et utilisé pour la fabrication des médicaments [4]. Cette molécule présentant un intérêt thérapeutique curatif ou préventif pour l'homme ou l'animale, elle est issue de plantes fraîches ou des séchées, nous pouvons citer comme des parties utilisées: les racines, écorces, feuilles, fleurs, fruits, ou encore les graines [5].
Les plantes contiennent des métabolites secondaires peuvent être considérées comme des substances indirectement essentielles à la vie des plantes par contre aux
6
Chapitre I Plantes médicinales et principes actifs Métabolites primaires (glucides, protides, lipides,et les acides nucléiques) qu'ils sont les principales dans le développement et la croissance de la plante, les métabolites secondaires participent à l'adaptation de la plante avec l'environnement, ainsi à la tolérance contre les chocs (lumière UV, les insectes nocifs, variation de la température …) [6].
Ces composés sont des composés phénoliques, des terpènes et stéroïdes et des composés azotés dont les alcaloïdes, les saponines
І-2-1-Différents groupes des principes actifs
I-2-1-1- Polyphénols
Les polyphénols ou composés phénoliques forment une grande classe de produits chimiques qui on trouve dans les plantes au niveau des tissus superficielles, ils sont des composés photochimiques polyhydroxylés et comprenant au moins un noyau aromatique à 6 carbones. Ils subdivisent en sous classe principales ; les acides phénols, les flavonoïdes, les lignines, les tanins, Les coumarines.... [6].
Comme ces molécules constituent la base des principes actifs que l'on trouve chez les plantes, elles ont un rôle principal à la vie de plante, à la défense contre les pathogènes ; principalement les moisissures et les bactéries phytopathogènes et la protection contre les rayonnements UV ; sachant que tous les composés phénoliques absorbent les rayonnements solaires [6].Ils possèdent un effet antioxydant, antibactérien et antifongique et ils sont des protecteurs contre l'apparition de certains cancers [7].
L'activité antioxydant des polyphénols est reconnue et pourrait expliquer leur rôle potentiel dans la prévention de plusieurs maladies associées au stress oxydatif, telles que le cancer, les maladies cardiovasculaires et neurodégénératives. [8]
7
Chapitre I Plantes médicinales et principes actifs
Figure 01 : Acide gallique 4-hydroxybenzoates[9]
І-2-1-1-1- Acides phénoliques
Les phénols ou les acides phénoliques sont des petites molécules constituées d'un noyau benzénique et au moins d'un groupe hydroxyle, elles peuvent être est érifiées, éthérifiées et liées à des sucres sous forme d'hétérosides, ces phénols sont solubles dans les solvants polaires, leur biosynthèse dérive de l'acide benzoïque et de l'acide cinnamique [10]
Les phénols possèdent des activités anti-inflammatoires, antiseptiques et analgésiques (médicament d'aspirine dérivée de l'acide salicylique) [11]
Acide benzoїque Acide cinnamique
Figure 2 : Structure de base des acides benzoїque et cinnamique [12]
8
Chapitre I Plantes médicinales et principes actifs
І-2-1-1-1- 1- Propriétés thérapeutiques
Les acides phénoliques sont considérés comme substances phytochimiques avec des effets prébiotiques, de chélation et anti-inflammatoire. Leur toxicité est faible. Pharmacologiquement, le mieux caractérisé est l’acide caféique, cet acide et l’acide férulique empêchent la formation du cancer des poumons chez les souris [13]. L’acide gallique inhibe la formation du cancer oesophagien chez les rats [14]. L’acide rosmarinique, est fortement anti-inflammatoire. Les acides phénoliques sont connus aussi pour leurs propriétés antibactériennes antifongiques, et anti-oxydantes [15].
І-2-1-1-2- Flavonoïdes
Terme en latin ; flavus= jaune. Ont une structure de C6-C3-C6 à poids moléculaire faible, ils peuvent être considérés parmi les agents responsables des couleurs de plante à côté des chlorophylles et caroténoïdes [10].
Les flavonoïdes ont des sous-groupes caractérisés à contenant deux ou plusieurs cycles aromatiques existent sous forme libre dite aglycone ou sous forme d’hétérosides, chacun portant une ou plusieurs groupes hydroxyles phénoliques et reliées par un pont carboné [16].
Les flavonoïdes sont généralement des antibactériennes [10].Ils peuvent être exploités de plusieurs manières dans l'industrie cosmétique et alimentaire (jus de citron) et de l'industrie pharmaceutique (les fleurs de trèfle rouge traitent les rhumes et la grippe en réduisant les sécrétions nasales), comme certains flavonoïdes ont aussi des propriétés anti- inflammatoires et antivirales, antitumorales, anticarcinogènes, hypotenseurs et diurétiques,antioxydantes [16].
Le terme flavonoïde désigne une très large gamme de composés naturels appartenant à la famille des polyphénols, ils sont considérés comme des pigments quasiment universels des végétaux, souvent responsables de la coloration des fleurs, des fruits et parfois des feuilles. À l’état naturel les flavonoïdes se trouvent le plus souvent sous forme d’hétérosides.[17].
І-2-1-1-2- 1- classification
Les flavonoïdes forment une sous classe des polyphénols ; ils représentent une source importante d’antioxydants dans notre alimentation.Il y en a plus de 9000 à avoir été décrits
9
Chapitre I Plantes médicinales et principes actifs chez le règne végétal où ils sont présents le plus souvent sous la forme soluble d’hétérosides.
Les plus importants sont les flavones, les isoflavones, les flavanones, les flavonols, les dihydroflavonols, les chalcones, les anthocyanes, et les aurones [18].
Figure 03 : Structure de base des flavonol (Quercétine) [9].
I-2-1-1-2-2 Localisation et distribution
Les flavonoïdes possèdent une large répartition dans le monde végétal, ils sont distribués dans les feuilles, les graines, l’écorce et les fleurs des plantes. Les formes hétérosidiques des flavonoïdes, s’accumulent dans les vacuoles et selon les espèces, elles se concentrent dans l’épiderme des feuilles ou se répartissent entre l’épiderme et le mésophylle. Dans le cas des fleurs, elles sont concentrées dans les cellules épidermiques [17].
I-2-1-1-2-3 Propriété antioxydant
En tant qu’antioxydants, les flavonoïdes sont capables d’inhiber la carcinogenèse. Ils inhibent en plus l’angiogenèse, la prolifération cellulaire et affectent le potentiel invasif et métastatique des cellules tumorales [19].
I-2-1-1-2-4 Propriété antibactérienne
Les flavonoïdes sont reconnus par leur toxicité vis-à -vis des microorganismes. Le mécanisme de toxicité peut être lié à l'inhibition des enzymes hydrolytiques (les protéases et les carbohydrolases) ou d'autres interactions pour inactiver les adhésines microbiens, les protéines de transport et d'enveloppe cellulaire [19].
10
Chapitre I Plantes médicinales et principes actifs
І-2-1-1-3- Tanins
Tanin est un terme provient d'une pratique ancienne qui utilisait des extraits de plantes pour tanner les peaux d’animaux. En effet, les tanins forment des complexes stables avec le collagène des peaux. En chimie, la première définition des tanins, proposée par Bate- Smith, précise que le terme « tanins » désigne les composés phénoliques hydrosolubles de masses molaires comprises entre 500 et 3000, capables de précipiter les alcaloïdes et les protéines [20].
І-2-1-1-3-1 Classification des tanins
On distingue deux grandes familles de tanins : les tanins hydrolysables et les tanins condensés [21].
І-2-1-1-3-1-1 Les tanins hydrolysables
Les tanins hydrolysables sont constitués de produits phénoliques simples comme l’acide gallique, l’acide digallique, l’acide ellagique et de monosaccharides, surtout le glucose. Ils tirent leur nom de leur facilité à s’hydrolyser en présence d’un acide ou d’une base [21].
І-2-1-1-3-1-2 Tanin condensés
Les tannins condensés sont constitués d’unités flavonoïdes. Présentant différents degrés de polymérisation, ils sont associés à leurs précurseurs : catéchines (flavanes-3-ols), leuco anthocyanes (flavanes-3,4-diols) et à des carbohydrates dont la plus ou moins grande proportion influence la viscosité et la réactivité du tannin [21].
І-2-1-1-3-2 Propriétés thérapeutiques
Les plantes riches en tanins sont utilisées pour retendre les tissus souples et pour réparer les tissus endommagés par un eczéma ou une brûlure, elles rendent les selles plus liquides, facilitant ainsi le transit intestinal [11].
Les tanins sont connus pour leurs Propriétés antibactériennes, antifongiques et antivirales et Activités antioxydants (particulièrement les tanins hydrolysables). Sont des inhibiteurs enzymatiques Autres propriétés : hypoglycémiants, des contres poisons des alcaloïdes et des métaux lourds [22].
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Chapitre I Plantes médicinales et principes actifs
І-2-1-1-3-3 Utilisation des tanins
En pharmacie
Grâce à leur astringente les tanins sont utilisés comme anti diarrhéiques, vasoconstricteurs et hémostatiques, mais surtout comme protecteurs veineux dans le traitement des varices et hémorroïdes [20].
Dans l’industrie
Ils sont largement employés dans l’industrie du cuir surtout dans celle des vernis et peintures [20].
І-2-1-1-4 Coumarines
Les coumarines constituent une très grande classe de composés présents dans tout le règne végétal leur nom de classe à « Coumarou », nom vernaculaire de la fève tonka [23].
Elles sont classées dans la famille des benzopyrones. Qui consistent tous en un cycle benzène lié à un cycle pyrone. Les benzopyrones peuvent être subdivisés en benzo-alpha- pyrones auxquelles appartiennent les coumarines et en benzo-gama-pyrones, dont les flavonoïdes sont les membres principaux. La plupart des coumarines se trouvent dans les plantes supérieures est également se trouvent aux plus hauts niveaux dans les fruits (comme la myrtille, la chicouté), suivies des racines, des tiges et des feuilles, le thé vert et d'autres aliments [23].
Il existe quatre principaux sous-types de coumarine : les coumarines simples, les furanocoumarines, les pyranocoumarines et les coumarines à substitution pyrone :
Les coumarines simples (par exemple, la coumarine, la 7-hydroxycoumarine et la 6,7-dihydroxycoumarine) sont les dérivés hydroxylés, alcoxylés et alkylés du composé parent, la coumarine, ainsi que leurs glycosides. La génistéine est une isoflavone et fait partie des benzo-gama-pyrones. C'est un composant naturel du soja qui a fait l'objet de nombreuses études en tant qu'agent chimio- préventif, principalement contre les cancers du sein et de la prostate à régulation hormonale chez des modèles animaux. [23].
12
Chapitre I Plantes médicinales et principes actifs
І-2-1-1-4-1 Propriétés thérapeutiques
Les coumarines présentent un grand intérêt en raison de leurs propriétés biologiques, Leur activité physiologique, bactériostatique et antimorale. Weber et ses collaborateurs ont montré que la coumarine et son métabolite, la 7-hydroxycoumarine, avaient une activité antimorale contre plusieurs lignées de cellules tumorales humaines. La coumarine et les dérivés de la coumarine se sont révélés prometteurs comme inhibiteurs potentiels de la prolifération cellulaire dans diverses lignées cellulaires de carcinomes. De plus, il a été montré que la 4-hydroxycoumarine et la 7-hydroxycoumarine inhibaient la prolifération cellulaire dans une cellule de carcinome gastrique. [23].
Les coumarines sont cytotoxiques, antivirales, immunostimulantes, tranquillisantes, vasodilatatrices anticoagulantes (au niveau du coeur), hypotensives ; elles sont également bénéfiques en cas d’affections cutanées [17].
І-2-1-1-5- Lignines
Composés qui s'accumulent au niveau des parois cellulaires (tissus sclérenchymes ou le noyau des fruits), au niveau de sève brute qu'ils permettent la rigidité des fibres, ils sont le résultat d'association de trois unités phénoliques de base dénommées monolignols de caractère hydrophobe [6].
І-2-1-2-Alcaloïdes
Ce sont des substances organiques azotées d'origine végétale, de caractère alcalin et de structure complexe (noyau hétérocyclique), on les trouve dans plusieurs familles des plantes, la plupart des alcaloïdes sont solubles dans l'eau et l'alcool et ont un gout amer et certains sont fortement toxiques [8].
Certains alcaloïdes sont utilisés comme moyen de défense contre les infections microbiennes (nicotine, caféine, morphine, lupinine ).Des anticancéreuses (vincristine et la vinblastine) [8].
13
Chapitre I Plantes médicinales et principes actifs
Figure 4 : Exemple d'alcaloïde la morphine [9].
Structurellement Les alcaloïdes sont des structures très variées le plus souvent mono ou polycycliques. Le point commun est la présence de l’azote qui confère le caractère alcalin à la molécule. L’azote peut être sous forme d’amine primaire, secondaire, tertiaire ou même quaternaire. L’azote est le plus souvent intra-cyclique et entre dans la formation d’un noyau de base déterminant la classification. Elles ont un caractère basique, leur basicité dépend de la disponibilité du doublet de l’azote [24].
Elles sont utilisées comme antalgiques majeurs (morphine), antipaludéen (quinine), pour combattre l'excès d'acide urique (colchicine), comme substance paralysante (curare, caféine), comme poisons (strychnine, nicotine), comme stupéfiants (cocaïne, mescaline), comme cholinergique (pilocarpine) ou comme anticancéreux (vinblastine, vincristine) [25].
І-2-1-3- Terpènes et stéroïdes
Les terpènoïdes sont une vaste famille de composés naturels près de 15000 de molécules différentes et de caractère généralement lipophiles, leurs grandes diversités due au nombre
de base qui constituent la chaîne principale de formule (C5H8) n selon la variation de nombre n, dont les composés monoterpènes, sesquiterpènes, diterpènes, triterpènes, … [8].
Les terpènes sont des hydrocarbures naturels, de structure cyclique ou non (acyclique, monocyclique, bicyclique ou tricyclique). Leur particularité structurale la plus importante est la présence dans leur squelette d’unités isoprénique (2-methyl-1,3-butadiene) à cinq
atomes de carbone (C5H8) (Figure 05) [26]
14
Chapitre I Plantes médicinales et principes actifs
Figure 5 : Structure de l’unité isoprène [26] .
І-2-1-3-1- Saponosides
Les saponines sont généralement connues comme des composés non-volatils, tensio-actifs qui sont principalement distribués dans le règne végétal [27]. Le nom « saponine » est dérivé du mot latin sapo, qui signifie « savon ». En effet, les molécules de saponines dans l’eau forment une solution moussante. [12].
Ce sont des composés qui servent de défense à la plante. De nombreuses revues rapportent que les saponines existent dans les plantes sous forme biologiquement active et sont impliquées dans la phyto-protection antimicrobienne.Plusieurs plantes à saponines sont utilisées par l’industrie pharmaceutique pour l’obtention de formes galéniques d’autres ont des applications en phytothérapie [27].
Les saponines trouvent également de nombreuses applications dans l'industrie alimentaire et dans l’industrie cosmétique en raison de leur propriété moussante et émulsifiante, les applications des saponines s’étendent à l’agriculture, avec utilisation pour l'assainissement des sols,et pesticides naturels [27].
Au niveau structural, les saponines sont composées d’une chaine mono ou polysaccharidique hydrophobe liée à une partie aglycone hydrophobe et peuvent être classées en deux groupes selon la nature de la génine, saponine stéroïdique et saponine triterpénique. [27]
Les saponines sont connues pour leurs activités anti-tumorales, anti-inflammatoires, immunostimulants et immuno adjuvants, molluscicides, anti-microbiennes [27].
15
Chapitre I Plantes médicinales et principes actifs II. Références
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17
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Chapitre II Activités biologiques
On ne connaît pas complétement une science
Tan qu’on n’en sait pas l’histoire
Auguste Comte
I. Généralités
Les remèdes à base de plantes constituent une alternative dans les systèmes de soins primaires et donc, une voie prometteuse pour le développement des médicaments traditionnellement améliorés. Récemment, beaucoup de chercheurs s’intéressent aux plantes médicinales pour leur richesse en agents antimicrobiens et antioxydants naturels à savoir les polyphénols et les huiles essentielles. De ce fait, l’exploitation de nouvelles molécules bioactives ayant des effets secondaires limités ou inexistants depuis des sources naturelles et leur adoption comme une alternative thérapeutique aux molécules synthétiques est devenue un objectif prioritaire pour les recherches scientifiques en industries alimentaires et en pharmaceutiques[1].
II- Activités Antioxydants
II.1Physiopathologie de l’oxydation
Les espèces oxygénées réactives (EOR) et les espèces réactives de l’azote (ERN) deviennent néfastes et toxiques pour l’organisme à des doses excessives. Cette surproduction des EOR au-delà des capacités antioxydantes des systèmes biologiques donne lieu au stress oxydant qui est impliqué dans l’apparition de plusieurs maladies allant de l’artériosclérose au cancer tout en passant par les maladies inflammatoires, et le processus du vieillissement [2].
II.1.1. Radicaux libres et Stress oxydatif
II.1.1.1 Radicaux libres
Les radicaux libres sont des molécules ou atomes qui possèdent un ou plusieurs électrons non appariés sur leur couche externe. Ils apparaissent soit au cours de la rupture symétrique d’une liaison covalente chaque atome, soit au cours d’une réaction redox avec perte ou gain d’électrons à partir d’un composé non radical [3].
21
Chapitre II Activités biologiques
L'ensemble des radicaux libres et de leurs précurseurs est souvent appelé espèces réactives de l'oxygène (EAO) [2]. Les espèces réactives de l'oxygène, ERO, (en anglais : Réactive Oxygen Species : ROS) regroupent l'ensemble des dérivés radicalaires de l'oxygène mais
également d'autres composés non radicalaires très réactifs (peroxyde d'hydrogène H2O2) etc. (tableau 1) [4].
Les radicaux libres sont des espèces chimiques très instables qui jouent un rôle dans l’action de certains traitements anticancéreux, de même qu’à l’origine du vieillissement.
Leur structure comprend un électron célibataire qu’ils cherchent à apparier en attaquant et en endommageant les molécules voisines. L’appellation “ dérivés réactifs de l’oxygène ” n’est pas restrictive. Elle inclut les radicaux libres de l’oxygène proprement dit, mais aussi certains dérivés oxygénés réactifs non radicalaires dont la toxicité est importante tel
peroxyde d’hydrogène (H2O2), peroxynitrite (ONOO.)[2].
Tableau 1 : Principaux radicaux libres et radicaux non libres
Et leur structure chimique [4]
Figure 1 : L’O2, à l’origine des radicaux libres[5].
II.1.1.2Stress oxydatif
Le stress oxydant est défini comme un déséquilibre entre les systèmes oxydants et les capacités antioxydantes d’un organisme, ou d’une cellule Cellulaire, il se produit dans la
22
Chapitre II Activités biologiques
cellule quand la concentration des espèces réactives excès de les capacités antioxydantes de cette cellule [5].
Ainsi, le stress oxydant est la conséquence d’une
Augmentation dans la génération des espèces réactives (dans le cas par exemple des intoxications aux métaux lourds, dans l’irradiation, dans les ischémies/ reperfusions, tabagisme, les maladies inflammatoires, le stress …etc.) [5]. Et /ou d’une défaillance dans les systèmes antioxydants à cause : Soit d’un déficit nutritionnel en antioxydants comme les vitamines ou aux anomalies génétiques responsables d’un mauvais codage d’une protéine soit enzymatique ment antioxydante, Soit synthétisant un antioxydant Soit régénérant un antioxydant, soit d'un promoteur de ces mêmes gènes que la mutation rendra incapable de réagir à un excès de radicaux. Généralement, le stress oxydant sera la résultante de plusieurs de ces facteurs et se produira dans un tissu et un type cellulaire bien précis [6].
II.2 Antioxydants L’organisme a développé des systèmes de défense très efficaces contre la production des RL (radicauxlibres).Les molécules contrôlant cette production sont désignées par le terme « antioxydant »[7].
II.2.1 définitions
Les antioxydants sont l'ensemble des molécules susceptibles d'inhiber directement la production, de limiter la propagation ou de détruire les espèces réactives de l'oxygène. Ils peuvent agir en réduisant ou en dismutant ces espèces, en les piégeant pour former un composé stable,[8] Cette définition peut être élargie et le terme "antioxydant" englobe ainsi toutes les substances qui protègent les systèmes biologiques contre les effets délétères potentiels des processus ou réactions qui engendrent une oxydation excessive. Ils agissent en formant des produits finis non radicaux, d’autres en interrompant la réaction en chaîne de peroxydation, en réagissant rapidement avec un radical d’acide gras avant que celui-ci ne puisse réagir avec un nouvel acide gras, tandis que d’autres antioxydants absorbent l’énergie excédentaire de l’oxygène singlet pour la transformer en chaleur. En même
23
Chapitre II Activités biologiques
temps, les antis oxydants arrêtent la réaction, la plupart du temps parce que la structure des antioxydants est relativement stable [2].
II.2.2 Classification des systèmes antioxydants: [2]
Les antioxydants
Antioxydants Antioxydants naturels endogènes
- Caroténoïdes (bêta carotène.) Systèmes antioxydants - L’albumine enzymatiques - Les flavonoïdes
- Les composés phénoliques
- L’acide ascorbique
- La vitamine E.…etc.
Un système de Un système de défense primaire Défense secondaire
- Enzymes protéolytiques, et Phospholipases...Etc. - Le superoxyde dismutase (SOD) - La catalase …etc.
Figure 2 : Classification des systèmes antioxydants [2]
24
Chapitre II Activités biologiques
II.2.2.1 Antioxydants endogènes
Le superoxyde dismutase (SOD) : diminue la durée de vie de l’anion superoxyde
O2·
O2° - + O2° - 2H+ H2O2 + O2 …………………………. [7]
La catalase : transforme le peroxyde d’hydrogène (H2O2) en simple molécule d’eau [1]
2 H2O2 2H2O + O2 …………………………………………. [7]
II.2.2.2 Antioxydants naturels
Β-carotènes : Contrôlent efficacement la génération de radicaux libres notamment en captant l’oxygène singulet.
O2 (1)+ Β-carotènes → Β-carotènes + O2 ………………………………. [7]
La vitamine C ou acide L-ascorbique est une espèce chimique hydrosoluble, c'est-à- dire soluble dans l'eau. Il s'agit d'un antioxydant particulièrement efficace contre les dommages créés dans l'organisme par les radicaux libres. Même si la plupart des mammifères peuvent synthétiser cette vitamine, l'organisme humain en a perdu la capacité au cours de l'évolution. Il doit donc la puiser chaque jour dans les aliments tels que les fruits et légumes. Certains fruits et légumes, en particulier crus, sont particulièrement riches en vitamine C : - Poivron rouge, - Orange, - Citron, - pamplemousse, - Fraise, - Brocoli, - Tomate, etc... Figure 3 :Acide L-ascorbique [9]
25
Chapitre II Activités biologiques
À côté de ses propriétés antioxydantes, la vitamine C est aussi un micronutriment essentiel. Une carence prolongée en vitamine C favorise le scorbut. En effet, les personnes privées de fruits et delégumes pendant de longues périodes, notamment les marins, ont longtemps souffert de scorbut jusqu'au XVIIIe siècle, période à laquelle on a découvert que la consommation de citrons prévenait cette maladie.
Le scorbut se manifestait par des saignements des gencives, des blessures qui n'arrivaient pas à guérir et une faiblesse généralisée ; elle était souvent mortelle au cours de longs voyages en bateau. En 1928, Albert Szent-Gyorgyi a isolé la vitamine C à partir de divers aliments, il l'a nommée « antiscorbutique » ou acide ascorbique. Cette découverte lui vaudra un prix Nobel en 1938. En 1938, elle fut la première vitamine synthétisée en laboratoire à des fins commerciales [9].
Les polyphénols :
1- La quercétine molécule naturelle présente dans de nombreux légumes et particulièrement abondante dans les oignons (35-120 mg par 100 g de matière fraîche) le thé ou la peau des pommes [9].
Figure 4 :Quercétine, un flavonol[9].
II.3 Impacts des polyphénols sur le stress oxydant
Le régime alimentaire peut jouer un rôle dans la modulation du statut antioxydant, soit en augmentant les niveaux d’antioxydants alimentaires, par exemple par l’apport des polyphénols, soit via la synthèse des antioxydants endogènes.
Les polyphénols sont des micro-nutriments dont la capacité antioxydante permet de maintenir l’équilibre de la balance oxydante/ antioxydante par cinq mécanismes d’action :
26
Chapitre II Activités biologiques
1) en piégeant de manière directe les RL.
2) en inhibant les enzymes impliquées dans le stress oxydant et la chélation des ions métalliques responsables de la production des RL.
3) en modulant la protection des systèmes de défense antioxydant ainsi que celui du processus de détoxification par les enzymes.
4) en diminuant la peroxydation lipidique, l’oxydation des protéines et les dommages de l’ADN.
5) Et en préservant la perméabilité des membranes et les fonctions mitochondriales [10].
III- Activité antimicrobienne
III.1 Maladies infectieuses
Les maladies infectieuses revêtent différentes formes. Elles sont provoquées par des bactéries, des virus, des parasites ou des champignons qui entrent dans l’organisme pour l’affaiblir. Ces maladies se transmettent d’une personne à l’autre ou peuvent être véhiculées par des animaux. La liste des maladies infectieuses est très longue : gastroentérite, bronchiolite, tuberculose, hépatite, rougeole, infection saisonnière, grippe, paludisme, etc. Comme pour toute infection bactérienne, son traitement repose sur des antibiotiques. Aujourd’hui, les maladies infectieuses tuent encore de nombreuses personnes en France et partout dans le monde [11].
III.2 LES AGENTS INFECTIEUX :
Le terme « microbes » recouvre les bactéries, les virus, certains champignons et certains parasites. La rencontre d’un de ces agents infectieux avec une personne réceptive peut causer l’apparition d’une maladie infectieuse. Les signes de la maladie infectieuse, sa gravité, son traitement varient selon le microbe en cause et l’état de santé du récepteur [12].
III.2.1 LES BACTÉRIES :
Les bactéries sont des cellules vivantes. Certaines sont utiles à l’organisme (comme celles du tube digestif, par exemple, qui aident à la digestion), d’autres sont pathogènes (comme le bacille de Koch, responsable de la tuberculose), (Escherichia coli responsable de l'appareil urinaire) et (staphylocoques succèdent généralement à une infection cutanéo- muqueuse) ...etc.
27
Chapitre II Activités biologiques
Lorsqu’une bactérie agresse l’organisme, les défenses naturelles luttent contre l’infection. Parfois, le recours à des antibiotiques est nécessaire[12].
III.2.1.1Infections bactériennes
Escherichia coli : 1- Définition
C'est une bactérie qui appartient à la famille des entérobactéries. Elles ont comme dimensions moyennes 2 à 3 micromètres de long et 0,6 micromètre de large.Cette bactérie est connue depuis longtemps comme commensale du tube digestifet pathogène pour l'appareil urinaire. La majorité des infections urinaires de la jeune femme observée enpratique médicale de ville est due à Escherichia coli [13].
2- Habitat
E.coli est une espèce comme nsale du tube digestif de l'homme et des animaux. Dans l'intestin, E.coli est l'espèce aérobie facultative quantitativement la plus importante. Sa présence d 'E.coli dans l'eau est témoin d'une contamination fécale [13].
3- Caractères culturaux :
E.coli se développe en 24 H à 37° C sur des milieux gelosés en donnant de colonies rondes lisses à bords réguliers, de 2 à 3 mm de diamètre non pigmentées [13] .
Staphylococcus aureus 1- Définition
Ce sont des cocci à Gram positif très fréquents chez l'homme à l'état commensal ou pathogène. Il est immobile, non sporulé et ne possède pas de capsule visible au microscope optique. Il mesure 0,8 à 1 micromètre. Ils se présentent de façon isolée, en diplocoques ou groupés en amas [13].
2- Habitat
Ils sont rependus dans la nature (air,eau,sol) et vivent souvent à l'état commensal sur la peau et les muqueuses des organismes humains et animaux [13] .
3- Physiologie
28
Chapitre II Activités biologiques
Les septicémies à staphylocoques succèdent généralement à une infection cutanéo- muqueuse souvent passée inaperçue. Elles peuvent être accompagnées d'infections génito- urinaire [13].
4- Caractères cùlturaux :
Le staphylocoque se multiplie facilement à 37° C sur des milieux ordinaires ( gelose) que sur des milieux sélectifs, telle milieu hypersalé de chapman. Ce milieu est utilisé pour les prélèvements plurimicrobiens. , Ilformeen 24 H des colonies lisses de 1 à 4 mm de diamètres [13] .
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas est un germe trouvé dans l'environnement. Cela peut se produire dans des zones humides telles que des éviers ou des bains. Il cause rarement des maladies en dehors d’un hôpital ou d’un établissement de santé. Si votre système immunitaire est
Affaibli, en particulier si vous êtes très jeune ou âgé, vous pouvez être exposé au risque d'infection à Pseudomonas [14]. Les pseudomonas peuvent causer diverses infections, notamment : - pneumonie (infections thoraciques) - infections des voies urinaires - infections de plaies - septicémie (infection sanguine) - infection du système gastro-intestinal
Des pseudomonas peuvent également être trouvés sur la peau de certaines personnes et ne pas nécessairement causer une infection. Ceci est connu comme la colonisation [14].
III.2.2 LES CHAMPIGNONS
Les maladies dues aux champignons sont appelées mycoses. En général, les champignons infectent la peau et les muqueuses (buccales, génitales). Leur apparition est favorisée par la dimi-nution des défenses de notre peau (par exemple en cas d’eczé-ma, de peau irritée et moite), mais également lors de la prise d’antibiotiques ou lors de certaines maladies, comme le diabète. Dans quelques cas plus rares de maladie affaiblissante, les champignons peuvent envahir d’autres parties du corps (les poumons par exemple) [12].
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Chapitre II Activités biologiques
Candida albicans
Candida albicansest une levure faisant partie de la flore commensale gastro-intestinale, buccale et vaginale de l’être humain. Ce champignon microscopique peut cependant devenir pathogène chez les pesonnes qui possèdent des mécanismes de défense naturels déficients. Les facteurs prédisposants comprennent la thérapie antibactérienne, le traumatisme cutané, le diabète, la grossesse, la chimiothérapie et l’immunodéficience. De nos jours, l’infection laplus grave et potentiellement mortelle est la candidose systémique apparaissant chez les patients à SIDA. Cliniquement, on distingue encore les infections superficielles cutanées et muco-cutanées (muguet, candidose vaginale) et les infections profondes locales [15]
III.3 Définition de l’activité antibactérienne
L’activité d’antibactérienne correspond à activité d’une molécule ou composé présent au sein d’un végétal qui à très faible concentration, inhibe le développement d’une bactérie ou la tue [16].
III.4 Activité antimicrobienne des polyphénols
III.4.1 Activité antimicrobienne des flavonoïdes
Les flavonoïdes sont parmi lesplus communs des produits naturels qui présentent un large spectre d’activité antibactérienne [17].
Des études scientifiques menées au cours des dernières années a généré un intérêt croissant dans leur rôle potentiellement important dans le maintien de la santé humaine. Un nombre considérable de plantes médicinales contiennent des flavonoïdes, qui ont été rapportés par de nombreux auteurs comme ayant des propriétés antibactériennes [18].
L'activité de la quercétine, par exemple, a été au moins partiellement attribuée à l'inhibition de l'ADN gyrase d’E coli. La catéchine, flavonoïde isolée du thé vert, est douée de propriétés antimicrobiennes [19]
De nombreux groupes de flavonoïdes ont été isolé et identifié comme possédant une activité antifongique, antivirale et antibactérienne [20] Ozçelik et ses collaborateurs (2008)[21] ont rapporté que les flavonoïdes ont montré in vitro une activité antimicrobienne contre les souches de Klebsiella pneumoniae.
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Chapitre II Activités biologiques
III.4.2 Activité antimicrobienne des acides phénoliques
L’activité antimicrobienne des acides phénolique sa été rapportée dans plusieurs recherches. Les acides phénoliques comme l’acide P-coumarique, acide caféique agissent en tant que des facteurs empêchant la croissance de Staphylococcus aureus [22]. L’activité antimicrobienne est liéeàla présence des groupements hydroxyles dans leur structure [19] Une étude in vitro faite par Khatkaretal. (2014) [23] a également démontré que les dérivés synthétiques de l’acide P-coumarique possèdent une activité antibactérienne contre Staphylococcus aureus, Bacillus subtiliset Escherichia coli
31
Chapitre II Activités biologiques
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Chapitre II Activités biologiques
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[15] : Julien Ferrari ., 2002. Contribution à la connaissance du métabolisme secondaire desThymelaeaceae et investigation phytochimique de l’une d’elles : GnidiainvolucrataSteud. Ex A. Rich. Thèse de doctorat. Faculté des Sciences de l’Université de Lausanne. Consulté en ligne le 17/06/2019.
[16] : Nicolas, M., Daniel, C., 1998. Activités technologiques en microbiologie1 - Techniques de base et méthodologie. Editeurs CRDP D’Aquitaine-Bordeaux, PP : 152.
[17] : Boussa K ., Izeraren L., 2016. Etude de l activité antibactérienne des extraits de rhamnus alaternes L. mémoire de master. Université de Bejaia.
[18] : Malešev D., and Kunti, V., 2007. Investigation of metal–flavonoidchelates and the determination of flavonoids via metal–flavonoidcomplexingreactions. Journal of serbianchemical society, 72(10) : 921–939.
[19] : Cowan, M.M., 1999. Plantsproducts as antimicrobial agent. Clinical. Microbiology,Review. 12 : 75-82
[20] : Cushnie, T.P., Lamb, A.J., 2005.Antimicrobialactivity of flavonoids. International Journal Antimicrobial Agents, 26(5) :343-356
33
Chapitre II Activités biologiques
[21] : Ozçelik B., Deliorman Orhan, D., Ozgen S., Ergun, F., 2008.Antimicrobial Activity of Flavonoidsagainst Extended-Spectrum β-Lactamase (ESβL)-Producing Klebsiella pneumoniae.Tropical Journal of Pharmaceutical Research, 7(4) : 1151-1157.
[22] : Stojković D., Petrović J., Soković M., Glamočlija J., Kukić-Marković JandPetrović S., 2013. In situ antioxidant and antimicrobialactivities of naturallyoccurringcaffeicacid, p-coumaricacid and rutin, usingfoodsystems.Journal of theScienceofFood and Agriculture, 93(13) :3205-3208
[23] : Khatkar A., Nanda A.,Kumar P., Narasimhan B., 2017.Synthesis, antimicrobialevaluation and QSAR studies of p-coumaricacidderivatives. Arabian Journal of Chemistry, Volume 10, Supplement 2 : 3804-S3815.
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CHAPITRE III Présentation des plantes étudiées
Quand les mystères sont trèmlins,
Ils se cachent dans la lumiére
Jean Giono
I. Introduction
En Algérie l’usage de plantes médicinales est une tradition de mille ans. Les premiers écrits sur les plantes médicinales ont été faits au ΙΧème siècle par Ishâ-Ben-Amran et Abdallah-Ben-Lounès, mais la plus grande production de livres a été réalisée au XVIIème et au XVIIIème siècle [1]. Même pendant le colonialisme français de 1830 à 1962, les botanistes ont réussi à cataloguer un grand nombre d’espèces médicinales. En 1942, Fourment et Roques ont publiés un livre de 200 espèces végetales d'intérêt médicinales et aromatique, la plupart d’entre elles sont du Nord d’Algérie et seulement 6 espèces sont localisées au Sahara [1]. Le travail le plus récent publié sur les plantes médicinales Algériennes est reporté dans les ouvrages de Beloued (1998) et Baba Aissa (1999). L’Algérie comprenait plus de 600 espèces de plantes médicinales et aromatiques [2]. Des chiffres recueillis auprès du centre national du registre de commerce, montrent qu'à la fin de l'année 2009, l'Algérie comptait 1.926 vendeurs spécialisés dans la vente d'herbes médicinales, dont 1.393 sédentaires et 533 ambulants. La capitale en abritait, à elle seule, le plus grand nombre avec 199 magasins, suivie de la wilaya de Sétif (107), Bechar (100) et El Oued avec 60 magasins [3]. En effet, l'Algérie constitue aujourd'hui un importateur net de plantes aromatiques et médicinales (A.P.S, 2015) [4].
Figure 1 : Plantes médicinales, source potentielle de revenus extérieurs (A.P.S, 2015)[4].
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CHAPITRE III Présentation des plantes étudiées
II. Généralité sur famille Mentha pulegium L
Mentha pulegium L. est une plante vivace herbacée appartenant à la famille des Lamiaceae, mieux connue sous le nom de pennyroyal / pennyroyal européen, originaire d'Afrique du Nord (Maroc, Algérie, Tunisie, Libye, Égypte ; Éthiopie), d'Europe, d'Asie mineure et du Moyen-Orient.
Il pousse de manière sauvage dans les zones humides des plaines et des montagnes. En Algerie, M.pulegium L.est connu sous le nom arabe "Fliyou"
Les parties aériennes de cette plante contiennent une grande diversité de métabolites secondaires tels que : tanins, résines, pectines, principes amers et huiles essentielles, Feuilles fraîches ou séchées et floraison les hauts sont couramment utilisés pour leurs propriétés curatives et culinaires. La plante entière et son huile essentielle ont une odeur forte et caractéristique.
Pennyroyal est une source importante d’huiles essentielles est utilisée en aromathérapie et pour la fabrication de tisanes. Elle est également utilisée pour soulager les maux d'estomac et soulager les flatulences. Les feuilles fraîches ou séchées du pennyroyal ont également été utilisées dans le traitement du rhume, de la grippe et des crampes abdominales, ainsi que dans le traitement de la transpiration. Maladies telles que la variole et la tuberculose, et en favorisant la menstruation latente [6].
II.1 Description botanique
Mentha pulegium L. c’est une plante vivace, pubescente, couchée, parfois dressée de petite taille à taille moyenne (10 à 30 cm de haut, 45 de large) radicante, généralement poilue, à tiges florifères dressées, fortement aromatique à odeur piquante avec des petites feuilles étroites elliptiques à ovales, à peine dentées, à pétiole court, souvent poilues au revers avec des bractées foliacées. Elle possède des fleurs lilas, de 4,5 à 6 mm de long, qui apparaissent l'été, de juillet à fin septembre, parfois rose et d’autres fois blanches échelonnées le long de la tige. Ses corolles ont 4 lobes presque égaux et 4 étamines saillantes, en verticilles denses, très espacés mais pas en capitule terminal (sommet de la tige non fleuri).
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CHAPITRE III Présentation des plantes étudiées
Elle possède des verticilles à l’aisselle des feuilles supérieures et moyennes avec un calice velu, nettement cannelé, poilu dans la gorge, les 2 dents inférieures plus étroites. Sa floraison étant de juillet à octobre [7].
Figure 2 : Représentation schématique et photo de la Menthe pulegium . [7].
II.2 Distribution géographique
Mentha pulegium L. c'est une espèce spontanée dans l'ensemble de l’Europe (toute l'Union européenne, Ukraine, Russie.) l'ouest de l'Asie (de Chypre, Turquie, Iran, Liban, Syrie, Caucase, Russie, Kazakhstan, Turkménistan) ; et le nord de l'Afrique (du Maroc, Algérie, Tunisie, Libye, Égypte ; Éthiopie).
La menthe s'est naturalisée dans de nombreux pays : Australie, Nouvelle-Zélande, États-Unis, Brésil, Argentine, Chili, Uruguay.
Elle est cultivée en Géorgie, Inde, Indonésie, Europe, Canada, États-Unis, Mexique, Cuba, Brésil Chili.
La menthe croît de préférence sur la silice et les alluvions, dans les endroits humides champs et prairies, bords des mares, lieux inondés l’hiver [8].
II.3 CULTURE ET RÉCOLTE
Mentha pulegium L. fait l'objet d'une grande culture, elle demande un sol frais, argileux, léger, riche. Sa multiplication s'opère par les drageons qui s'enracinent facilement à l'automne ou au printemps. Deux récoltes sont possibles, une en juin, l'autre en septembre. Coupez les plantes après la rosée, réunissez-les en bouquets, suspendez-les dans des locaux chauds et aérés[8].
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CHAPITRE III Présentation des plantes étudiées
III-1-1-4- Nomenclature
Règne : Végétal. Ordre : Lamiales. Famille : lamiaceae. Genre : lamiaceae. Nom scientifique : Mentha pulegium L.1753. Nom vernaculaire : Fliou. Division : Magnoliophyta. Classe : Magnoliopsida
II.5 USAGES
La Menthe occupe une place privilégiée dans la phytothérapie digestive grâce a l'huile essentielle que renferment ses feuilles et qui lui confère un très grand pouvoir calmant des spasmes intestinaux. Elle est active aussi sur les crampes digestives et les nausées. L’action antiseptique de l'huile essentielle limite les fermentations intestinales et soigne les ballonnements. Une étude clinique réalisée en 1990 a montré que la menthe, associée au fenouil, est particulièrement efficace pour soigner les troubles de la digestion tels que nausées, ballonnements. pesanteur après le repas, aérophagie, douleur épigastrique [8].
II.6 Effets thérapeutiques
Mentha pulegium est utilisée pour ces actions carminatives, diaphorétiques, stimulantes et emménagogues, et elle est principalement utilisée contre les désordres provoqués par le froid ou lefroid soudain. Elle est également salutaire dans les cas des spasmes, hystérie, flatulence et elle estutilisée pour chauffer l'estomac [9] .
Aussi traitées les pathologies suivantes [10] :
-Affections respiratoires - Affections neurologiques
-Affections du tube digestif - Affections ostéo-articulaires
II.7 La Toxicité
Mentha pulegium L est également riche en pulegone, un composé organique volatil hautement toxique qui affecte les fonctions hépatique et utérine. L’utilisation de l'huile
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CHAPITRE III Présentation des plantes étudiées essentielle de la plante doit être évitée en raison de sa toxicité pour l'homme et les animaux, même à des niveaux extrêmement faibles [11].
L'huile de pennyroyal possède des propriétés abortives par irritation de la région utérinogénito-urinaire avec des effets secondaires sur le système nerveux et le foie. Des troubles nerveux sont observés avec plus de 2g d'H.E.L'essence irrite le tissu conjonctif oculaire. De préférence, il faut éviter le contact avec les yeux.
L'utilisation de L'huile de pennyroyal doit être avec prudence, elle risque les spasmes et la goutte. La prise simultanée des médicaments homéopathiques avec la menthe est contre-indiquée [11].
III. Généralité sur le genre Thymelaea hirsuta Endel
La famille des Thymelaeaceae est une famille, appartenant aux Magnoliopsida, composée de quelques1200 espèces réparties en 67 genres [12]. Elle constitue l’une des principales familles parmi les neufs formant l’ordre des Malvales [13]. En étymologie, les thymélées doivent leur nom générique à une espèce dont les feuilles ressemblent à celles du thym et le fruit à une petite « olive»,du grec «elaia»[14]. Les Thymelaeaceae sont représentées par une dizaine d’espèces appartenant aux genres Thymelaeaet Daphne [15]. Les membres de cette famille sont répandus dans les zones tropicales et tempérées de la planète, particulièrement en Afrique, mais sont absents dans les régions aux climats les plus froids [16]. Dans les régions Méditerranéennes, Thymelaea est un genre comportant environ 31espèces d’arbustes et d’herbes à feuilles persistantes [17]. Dans ce genre, thymelaea hirsuta est considérée comme l’espèce la plus typique du littoral [18].
III.1 Description botanique
Thymelaea hirsuta Endel est une plante vivace arbustive susceptible d’atteindre 2-3 mètres de hauteur, à feuilles très petites densément imbriquées, coriaces ovoïdes aigues, glabres en dessous, pubescentes- laineuses en dessus ainsi que les tiges. Fleurs 2-5 au sommet des rameaux à calice rapidement caduc, jaunâtre, polygame. La plante porte sur des pieds différents soit des fleurs unisexuées soit des fleurs.
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CHAPITRE III Présentation des plantes étudiées
Hermaphrodites. Les fruits sont des baies glabres, consommées par les animaux (dispersion zoochore). La floraison va d’octobre à avril, c’est une plante entomogame [19]
Figure 3 : Thymelaea hirsuta (Linné) Endlicher (Photos originales).
Feuilles cotonneuses, fleurs mâles, fleurs femelles [19].
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CHAPITRE III Présentation des plantes étudiées
III.2 Distribution géographique
Le genre Thymelaea comprend 20 espèces que l'on trouve autour de la Méditerranée, et jusqu'en Asie centrale et Pakistan. Son aire de distribution est essentiellement circumméditerranéenne (sud de l’Europe, sud-ouest de l’Asie, Afrique du Nord). Elle s’étend cependant à l’ouest au littoral atlantique du sud de l’Espagne, du sud du Portugal et du Maroc nord-occidental. En Afrique du Nord, la limite sud de son aire coïncide à peu près exactement avec la bordure du Sahara [19].
III.3 Nomenclature
Règne : Végétal Sous règne : Tracheobionta Embranchement : Phanérogames ou Magnoliophyta Sous Embranchement : Angiospermes Classe : Eudicots ou Dicotylédones Sous classe : Rosidae Ordre : Malvales Famille : Thymelaeaceae Genre : Thymelaea Nom Latin : Thymelaea hirsuta Endel. Nom français : Passerine hérissée, Passerine hirsute, Thymélée hirsute Nom anglais : Hairy Thymelaea Nom arabe : Mitnan,Metenan, Methnane , Matnan el akhdar
III.4 composition chimique
Les Thymelaeas hirsuta Endel on fait l’objet de nombreuses études phytochimiques, Les esters diterpeniques de type tigliane, daphnane sont la classe de composées les plus caractéristiques des Thymelaeas. [20]
Ces métabolites peuvent se retrouver dans toutes les parties de la plante (racines, tiges, feuilles, fruits et graines) [12]. Ce sont des purgatifs violents qui déclenchent par contact avec la peau ou les muqueuses une réaction inflammatoire intense et des effets
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CHAPITRE III Présentation des plantes étudiées
Neurotrophiques et anticancéreux [20]. Selon et (Miyamae et al.)[21] des diterpénes daphnanes ont été isolés à partir des feuilles et des rameaux de Thymelaea hirsuta
La caractéristique frappante des Thymelaeaceae réside dans la diversité de leur métabolisme flavonoïdique, produit naturel antioxydant et anti-tumoraux ceci peut expliquer le fait qu’elle possède différentes propriétés pharmacologiques, surtout pour leurs parties aériennes [20].
Les stérols sont courants chez les Thymelaeaceae, principalement représentés par le ß- sitostérol, qui est ubiquitaire dans le règne végétal. Levin [22] a observé la présence des alcaloïdes chez 36%des espèces de thymeleacées, alors que Touati [23] a signalé que Thymelaea hirsutan’ en contient pas. Quant aux tannins, ils semblent être peu courants dans la famille des Thymelaeas Lorsqu’ils apparaissent, il s’agit généralement de dérivés du leucocyanidol Alors que les feuilles de Thymelaea hirsuta contiennent des tannins de type gallique [20].
Ferrari [12] affirme que les thymelaeaceae ne sont pas une famille à saponines.
III.5 Effets thérapeutiques
Les extraits de cette plante possèdent des effets antimélanogenèse dus aux daphnanes. Elle est utilisée en médecine traditionnelle pour ses propriétés antiseptique, hypoglycémique, anti-hypertension, contre les affections de la peau (dermatoses). C’est aussi une source de fibres à papier [19].
Figure 4 : Représentation schématique et photo de la Thymelaea hirsuta [19].
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CHAPITRE III Présentation des plantes étudiées
III.6 La Toxicité
La toxicité des Thymelaeas est bien établie pour les êtres humains, aussi bien que pour de nombreuses espèces animales. En effet, les diterpènes de type tigliane et daphnane sont des purgatifs violents qui déclenchent, par contact avec la peau ou les muqueuses, une réaction inflammatoire intense.
Le contact externe avec du matériel végétal provenant de certaines Thymelaeaceae provoque des dermatites inflammation des lèvres, de la langue et dupharynx, sécheresse buccale suivie de salivation, déglutition difficile, soif, rhinite, inflammatoires avec des rougeurs, des vésicules guérissant lentement et des pustules qui tendent à s’ulcérer. De plus, ces symptômes sont accompagnés de démangeaisons intenses. Ces symptômes sont suivis de convulsions et le pronostic est fatal dans 20-25 % des cas [12].
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CHAPITRE III Présentation des plantes étudiées
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[8] :Kissoumle .H ., 2012 : Guide Des Plantes Medicinales 2. Consulté en ligne le 03/06/2019. Disponible sur : https://fr.scribd.com/doc/97398034/Guide-Des-Plantes- Medicinales-2
[9] : Grieve M., 2018 :PennyroyalBotanical: Mentha Pulegium (LINN.) Family : N.O. Labiatae. Consulté en ligne le 04/06/2019. Disponible sure : http://www.botanical.com/botanical/mgmh/p/pennyr23.html.”.
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CHAPITRE III Présentation des plantes étudiées
[10] : Chraibi M., Fikri-Benbrahim K., Amrani M., Bari A., Benziane Ouaritini Z., 2018. Etude Ethnobotanique Sur L’utilisation De Mentha Pulegium,Mentha Piperita Et Pelargonium Graveolens Au Nord Du Maroc (Taounate) et Évaluation de leur pouvoir antimicrobien. European Scientific Journal edition Vol.14, 1857 – 7881 (Print) e - ISSN 113- 133.
[11] : Aouadhi .S., 2010. Atlas des risques de la phytothérapie traditionnelle. Étude de 57 plantes recommandées par les herboristes. Master spécialisé en toxicologie. Faculté de médecine de Tunis .
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[13] : W. S. Judd, C. S. Campbell, E. A. Kellogg, P. F. Stevens, M. J. Donoghue., 2002. Plant Systematics: A Phylogenetic Approach, 2nd edition Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts ISBN 0-87893-403-0.
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CHAPITRE III Présentation des plantes étudiées
[21] : Miyamae Y., Orlina Villareal M., Ben Abdrabbah M., Isoda H., Shigemori H., Hirseins A.B., 2009. Daphnane diterpenoids from T. hirsuta that inhibit melanogenesis in B16 melanoma cells. Journal of Natural Products, 72 : 938–941.
[22] : Levin D.A., 1976. Alkaloid bearing plants : an ecogeographic perspective. Am. Nat. 110(972) : 261-284.
[23] : Touati D., 1985. Contribution à la connaissance du profil biochimique des dicotylédones buissonnantes et arbustes de la Méditerranée. Thèse de Doctorat. Université Lyon I.
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Chapitre VI Matériels et méthodes
CHAPITRE IV Matériels et méthodes
La chance ne sourit qu’aux esprits bien préparés
Louis Pasteur
I. Matériel végétal
Dans cette étude, les échantillons du matériel végétal utilisé, comporte les parties aériennes des plantes récoltées. L’espèce de Thymelaea hirsutaont été collectés durant le mois de 10 fiverier 2019 au niveau de la commune de SIGUSde la Willaya de d'Oum El Bouaghi.
Alors que les espèces Mentha pulegiumont été collectées de la région de Lkhroub de la Willaya de Constantineau cours de la période de floraison d'avril 2018.
Figure 1 : Mentha pulegium.Figure 2 : Thymelaea hirsuta.
II. Méthodologie de travail Les tests ont été réalisés au niveau du Laboratoire Des Ressources Naturelles Et Amenagement Des Milieux Sensibles.
II.1 Technique de séchage
Après la récolte, le matériel végétal est débarrassé des débris. Pour s’assurer de la bonne conservation de notre plante, Les échantillons sont séchés à l'abri de la lumière et de l’humidité, à température ambiante pendant 7 jours. Puis le matériel végétal a été broyé à L’aide d’un broyeur électrique de type Waring Products Division Torrington, CT USAet Sachets en papier à température ambiante, dans un endroit sec et à l’abri de l’humidité et de la lumière jusqu’à son utilisation.
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CHAPITRE IV Matériels et méthodes
Figure 3 : Mentha pulegium après le séchage.Figure 4 : Thymelaea hirsutaaprèsle
Séchage.
II.2 Préparation de l’extrait brut
II.2.1 Extraction des composés phénoliques et des flavonoïdes
Les composés phénoliques et flavonoïdes ont été extraits à partir de cette plante par la méthode : Extraction par macération dans le méthanol.
II.2.1.1 Extraction par macération dans le méthanol (extraction solide/liquide)
La macération est une opération qui consiste à laisser séjourner la matière végétale (broyat) dans le méthanol pour extraire les principes actifs (composés phénoliques et flavonoïdes).
Le protocole de la macération de cette plante est le suivant : ( Tableau 1 )
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CHAPITRE IV Matériels et méthodes
Tableau 1 : Protocole de la macération
2-
Mettre la matière végétale (50g) 1- Peser 50 grammes de la matière végétale Sur le méthanol (300 ml)
3- Laisser macérer pendant 24 h, 4 - Récupérer le filtrat dans un flacon Ensuite filtrer
5 - Répéter la procédure 6- Les macéras alcoolique Trois fois (Fraction retenue De 3 jours sont placés dans Par le filtre dans 300 ml méthanol) Un seul récipient.
II.2.1.1.1 Evaporation Les trois solutions obtenues ont été évaporés à l’aide d’un évaporateur rotatif, ou rotavap ( Rotavapeur Heidolph Laborota 4002 ) qui permet a éliminé le solvant sous vide.
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CHAPITRE IV Matériels et méthodes
Le protocole d’évaporation est le suivant : (Tableau2) Tableau 2 : Protocole d’évaporation
2- Procéder à l’évaporation jusqu'à 1- Placer la solution dans le ballon Disparition Complète du solvant d’évaporation (To = 70 C° et vitesse de rotation = 3)
4- Peser le ballon afin de calculer Le rendement d’extraction
3- Retirer le ballon du rotavap Et attendre qu’il soit froid
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CHAPITRE IV Matériels et méthodes
5-
Recueillir l’extrait dans de
L’eau
Chaude (MeOH) 6- Laisser le tout à décanter pendant 24 h à (L’intérêt de l’utilisation de température ambiante L’eau distillée Bouillantec’est pour assurer La récupération Des composés restés accolés À la paroi Du ballon d’évaporation)
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CHAPITRE IV Matériels et méthodes
II.3 Fractionnement de l’extrait brut (Extraction liquide- liquide)
La méthode d’extraction que nous avons adoptée est la macération successive par quatre solvants organiques de polarité croissante ; il s’agit d hexane, chloroforme, acétate d’éthyle, et n-butanol.
Figure 5 : les Extraits bruts de mentha p. Figure 6 : les extraits bruts de thymélaea h.
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CHAPITRE IV Matériels et méthodes
50g du Matériel végétal sec broyés + 300 ml de méthanol
- Macération méthanolique pendant 72 h
Extraction méthanolique
- Extraction par le chloroforme -Filtration
Résidu végétal sec Filtrat
- Extraction par l’hexane - Filtration Extrait chloroformique
Résidu végétal Filtrat
sec
- Extraction par l’acétate Extrait d’hexane. d’éthyle - Filtration
Résidu végétal Filtrat sec
-Extraction par n-butanol Extrait d’acétate d’éthyle. - Filtration
Résidu végétal sec Filtrat
Extrait butanolique.
Figure 7 : Protocole pour extraction des composées phénoliques [1].
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CHAPITRE IV Matériels et méthodes
III. Analyses qualitatives (screening phytochimique )
Cette étude permet de mettre en évidence la présence de quelques groupes des metabolites secondaires dans les plantes.
III.1. Réactions de caractérisation
L'analyse phytochimique a été réalisée sur l’extrait obtenu par l’infusion des tiges feuillues et les fleurs en utilisant des procédures chimiques pour identifier les différents constituants comme décrit par Aiyegoro et Okoh [2],Tamilselvi , et al., [3] et Sheikh et al.,[4] .
La révélation de certaines familles chimiques de la plante a été réalisée grâce aux tests de détection chimique telle que : les alcaloïdes, les composes phénoliques et les tanins (réaction au chlorure ferrique), les flavonoïdes (réaction a` la cyanidine), les saponines (indice de mousse), les stérols et triterpènes, coumarines (test de confirmation). [5]
III.1.1 Détection des polyphénols
Les polyphénols sont des groupes de molécules de structures variées. L’élément structural fondamental qui les caractérise est la présence de noyaux aromatiques (benzénique) porteurs de fonctions hydroxyles (phénoliques).
L'extrait (50 mg) a été dissous dans 5 ml d'eau distillée. A ceci, 3 ml d'acétate de plomb à 10% ont été ajoutés. Un précipité blanc indique la présence des polyphénols [5].
III.1.2 Détection des tannins
Les tanins sont des composés phénoliques hydrosolubles. On distingue des tanins galliques qui sont des esters de l’acide gallique et du glucose qui sont des composés hydrolysables et des tanins catéchiques ou tanins condensés non hydrolysables [5].
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CHAPITRE IV Matériels et méthodes
On prend 5 ml de l'infusé, aux quelle on n’ajoute goutte à goutte 1 ml d'une solution de Chlorure ferrique (FeCl3) à 1%. La coloration bleu-noir ou vert-noir ou la précipitation confirme la présence des tannins, tanins condensés [6].
Figure 8 :La coloration vert-noir confirme La présence des tanins condensés thymelea
Figure 9 : La coloration bleu-noir confirme la présence des tanins condensés Mentha
III.1.3 Détection des flavonoïdes
Les flavonoïdes sont très répandus chez les végétaux. Ils constituent les principaux pigments jaunes des fleurs et certains fruits. Leur présence ou leur absence dans un extrait peut être mise en évidence par la réaction à la cyanidine. Cette réaction utilise en effet le pouvoir réducteur de métaux en milieu acide pour réduire spécifiquement le noyau flavonoïdique [5]. Le test consiste à ajouter à 4ml de l’infusé, quelques gouttes d’HCl concentré (5 à 6) et deux à trois copeaux de magnésium. Laisser agir 3 min et observer le changement de couleur. La présence de flavonoïdes est confirmée par la coloration rouge. [4].
III.1.4 Détection des saponines
La mise en évidence des saponines dans un extrait végétal est basée sur la capacité d’une solution aqueuse de l’extrait à donner une mousse, après agitation. Cette propriété
62
CHAPITRE IV Matériels et méthodes
est à la base de la méthode permettant d’apprécier la richesse d’un extrait en saponosides : mesure de l’indice de mousse [5].
2g de plante végétale sous forme poudre sont utilisés pour préparer une décoction avec 100 ml d'eau distillée. On porte à ébullition pendant 30 min. Après refroidissement et filtration,on réajuste le volume à 100 ml. Dans une série de 10 tubes à essai, répartir 1 ml de l’extrait dans le tube n° 1, 2 ml dans le tube n° 2, …, 10 ml dans le tube n° 10. Le volume final dans chaque tube étant de nouveau réajusté à 10 ml avec de l'eau distillée. Les tubes sont agités fortement en position horizontale pendant 15 secondes. Après un repos de 15 minutes en position verticale, on relève la hauteur de la mousse persistante en cm [6].
Figure 10 :Détection de saponine Dansl’etrait de thymeleae
Figure 11 :Détection de saponine Dans l’extrait de mentha III.1.5 Les stérols et polyterpènes
Les stérols et les polyterpènes ont été mis en évidence par la réaction de Liebermann- Buchard. 1ml d’infusé est mélangé à chaud avec 1ml de chloroforme, dans un tube à essai dans lequel sont coulés lentement 0,5 ml une solution concentrée de l'acide sulfurique pour former une couche. L’apparition d’une coloration violette qui vire au bleu puis au vert
63
CHAPITRE IV Matériels et méthodes
indique une réaction positive. La couleur bleu pour les terpénoïdes et verte pour les stéroïdes [5].
VI. Analyses quantitatives
L’étude quantitative des extraits phénoliques, préparés à partir des 2 plantes étudies aumoyen des dosages spectrophotométriques avaient pour objectif de la détermination des teneurs des polyphénols totaux et flavonoïdes.
VI.1 Dosage des polyphénols totaux
Le dosage des polyphénols totaux a été effectué selon la méthode de Folin-Ciocalteu (FC)[1].
VI.1.1 Principe
Le réactif de Flin Ciocalteu est un acide constitué par un mélange d'acide phosphotungstique (H3PM12O40) et d'acide phosphomolybdique (H3PW12O40). Il est réduit, lors de l'oxydation des phénols, en un mélange d'oxydes bleus de tungstène (W8O23) et de molybdène (Mo8O23)[6].
La coloration produite, dont l'absorption maximum à 765 nm[1], est proportionnelle à la quantité de polyphénol présent dans les extraits végétaux.
VI.1.2 Mode opératoire
La détermination des polyphénols a été réalisée à l'aide d'un dosage photométrique modifié de Folin-Ciocalteau [1]. Le protocol dudosage des polyphénols totaux sont résumées dansle Tableau [3].
64
CHAPITRE IV Matériels et méthodes
Tableau 3 : Protocol dudosage des polyphénols totaux [1].
1- 500 ul de chaque extrait méthanolique ont été mélangés avec 2500 ul de réactif DeFolin-Ciocalteu (IN), 2.5 ml de carbonate de sodium (7.5%) et continue avec l’eau distillée jusqu’à le trait de jauge.
2- Les solutions ont été homogénéisées, couvertes et protégées
De la lumière et maintenues à température ambiante pendant 30 minutes.
3- La courbe standard a été obtenue 4- l’absorbance a été mesuré à 765 nm. En utilisant des solutions standard d’acide Gallique en utilisant l’eau à blanc À la même concentration que l’échantillon.
65
CHAPITRE IV Matériels et méthodes
Les résultats obtenus sont exprimés en μg équivalent d’acide gallique par milligramme d’extrait (μg E d’acide gallique / mg d’extrait) en utilisant l’équation de la régression linéaire de la courbe d’étalonnage tracée d’acide gallique.
Les étapes de cette quantification sont résumées dans la figure ci –dessous :
500 μl de chaque extrait méthanolique de plante
2,5 ml de réactif Folin-Ciocalteau à 1/10
Incubation pendant 5 min à l’obscurité et à température ambiante
2,5 ml de carbonate de sodium (Na2CO3)
Incubation pendant 30 min à l’obscurité
et température ambiante
Mesurer l'absorbance à 765
nm
66
CHAPITRE IV Matériels et méthodes
Figure12 :Etapes du dosage des polyphénols totaux [1].
VI.2 Dosage des flavonoïdes
La teneur en flavonoïdes des extraits a été déterminée en utilisant la méthode colorimétriqueau trichlorure d’aluminium (AlCl3) [1].
VI.2.1 Principe
Le trichlorure d'aluminium forme un complexe jaune avec les flavonoïdes et la soudeforme un complexe de couleur rose absorbe dans le visible à430 nm[1].
VI.2.2 Mode opératoire
La méthode colorimétrique au chlorure d'aluminium a été utilisée pour les flavonoïdes [1]. Chaque extrait de plante(1 ml) a été mélangé séparément avec 1 ml d'une solution de chlorure d'aluminium dans le méthanol (2%). Les solutions ont été homogénéisées, couvertes et protégées de la lumière et maintenues à la température ambiante. L'absorbance a été mesurée à 430 nm [1]. En utilisant le méthanol à blanc. La courbe standard a été obtenue en utilisant une concentration en série de solutions de quercétine. La teneur en flavonoïdes était exprimée en microgrammes d'équivalent quercétine par milligramme d’extrait[1].
Les étapes de ce dosage sont résumées dans la figure ci –dessous.
1 ml de chaque extrait méthanolique de plante
1 ml d'AlCl3 à2%
Incubation pendant 10 min à Tº ambiante
Mesurer l'absorbance à 430 nm
67
CHAPITRE IV Matériels et méthodes
Figure 13 : Etape du dosage des flavonoïdes [1]. Référence
[1] : Yasmine Arab, Amar Zellagui, Saber Boutellaa, Khaled Mesbah and Noureddine
Gherraf : Total phenolic and flavonoids content, and in vitro antioxidant and antimicrobial
activity of ethyl acetate and butanol extract from Senecio delphinifolius Vahl. Der
Pharmacia Lettre, 2014, 6 (4) : 522-525. Avec modification
[2] : Aiyegoro OA. & Okoh AI. (2010). Preliminary phytochemical screening and in vitro
antioxidant activities of the aqueous extract of Helichrysum longifolium DC. BMC
Complementary and Alternative Medicine, 10(1): 10-21.
[3] :Tamilselvi N, Krishnamoorthy P, Dhamotharan R, Sagadevan E. (2012). Analysis of
total phenols,total tannins and screening of phytocomponents in Indigofera aspalathoides
(Shivanar Vembu) Vahl EX DC. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research 4(6) :
3259-3262.
[4] : Sheikh N, Kumar Y, Misra AK, Pfoze L. (2013). Phytochemical screening to validate
the ethnobotanical importance of root tubers of Dioscorea species of Meghalaya, North
East India. Journal of Medicinal Plants Studies 1(6) : 62- 69.
[5] : Thèse de Doctorat : Activités biologiques d’Helichrysum stoechas. Présentée par
BOUBEKEUR Hafsa . Soutenue publiquement le 21/02/2019.
[6] : Mémoire de master : Contribution à l’étude phytochimique et les activités biologiques
d’une plante médicinale Syzygium aromaticum. Préparé par : Medfouni Raouia et Hafsi
Nadia . univ.LARBI BEN MHIDI OUM EL BOUAGHI 2017-2018
68
Chapitre V Evaluation biologique
Chapitre V Evaluation Biologique
J’ai découvert les antibiotiques par hasard,
Mais contrairement à la rumeur,je n’ai jamais
Sauvé Winston Churchill de la mort
Alexander Fleming Activités biologiques
La présente étude, s’intéresse particulièrement à l’activité antioxydante, antibactérienne, des extraits de Mentha pulegiumet de Thymelaea hirsuta
I.1 Evaluation de l’activité antioxydante
I.1.1 Activités antiradicalaire au DPPH
Principe
Test de DPPH consiste à mesurer la capacité réductrice d’un antioxydant en présence d’un radical libre, le DPPH• (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl). C’est un radical libre de coloration violette présentant une absorption à 517 nm dans le méthanol. La réduction du DPPH• par un donneur d’atome H (AH) conduit à la formation de 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazine incolore (DPPH-H) et au radical A• (Figure 1). L’intensité de la couleur est proportionnelle à la capacité des antioxydantsprésents dans le milieu à donner des protons [1].
Figure 1 : Mécanisme réactionnel de test DPPH
70
Chapitre V Evaluation Biologique
I.1.2 Mode opératoire
La capacité de deux extraits de Mentha pulegiumet de Thymelaea hirsutaà réduire le radical 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle (DPPH) a été évaluée à l'aide de la méthode de Masuda et al[2]. 15 µL de l'extrait à différentes concentrations ont été ajoutées à 1,5 mL d'une solution méthanolique de DPPH. Le mélange a été secoué vigoureusement et laissé au repos à la température ambiante pendant 30 minutes dans l'obscurité. L'absorbance de la solution résultante a ensuite été mesurée à 517 nm. La couleur pourpre normale de DPPH devient jaune lorsque son électron singulet est associé à un atome d'hydrogène provenant d'un antioxydant potentiel. Le pourcentaged’inhibition (INB %) ou le pourcentage de l’activité antiradicalaire est calculé par la relation suivante :[3]
(INB %) = Ac – At / Ac * 100
INB % :Le pourcentaged’inhibition.
Ac : Absorbance decontrôle.
At : Absorbance du test effectué.
I.2. Evaluation de l’Activité antimicrobienne
Les tests de l'activité antimicrobienne ont été réalisés au niveau du Laboratoire de Biomolécules Végétales et des Amélioration des Plantes. Université d’Oum El Bouaghi.
I.2.1 Les souches testées
Les souches utilisées pour déceler l’activité antimicrobienne des extraits bruts de mentha et thym font partie de quatre genres de microorganismes, dont trois sont des souches référentielles bactérienne de l'American Type Culture Collection (ATCC) , il s'agit de : Staphylococcus aureusà Gram positif(ATCC 25923), Escherichia coli à Gram négatif , (ATCC 25922), Pseudomonas aeruginosa à Gram négatif(ATCC27853), Ces souches provenant du laboratoire de bactériologie de l’hôpital « Hamouda amour » d’Ain Fakroun , Oum el Bouaghi.
Et une souche de levure : Condida Albicans, cette levure ai été fournie par leLaboratoire de Biomolécules Végétales et des Amélioration des Plantes. Université d’Oum El Bouaghi.
71
Chapitre V Evaluation Biologique
Figure 2 : Souches provenant du laboratoire de bactériologie de l’hôpital
« Hamouda amour » d’Ain Fakroun
72
Chapitre V Evaluation Biologique
Tableau 1 : Observation macroscopique des souches
Les souches
Souchesréférenti Référence Observation macroscopique elles
Bactérienne
Staphylococcus (ATCC 25923) aureus.
Figure 3 : Staphylococcus aureus
(ATCC 25923).
Escherichia coli (ATCC 25922)
Figure 4 : Escherichia coli
(ATCC 25922).
73
Chapitre V Evaluation Biologique
Pseudomona ATCC(27853) s aeruginosa
Figure 5 : Pseudomonas aeruginosa
(ATCC27853).
Souche Référence Observation macroscopique de levure
Condida / Albicans
Figure 6 : Condida Albicans.
Après avoir récupéré les souches du laboratoire,la souche a été ensemencée en stries sur les milieux gélosés pour obtenir des colonies isolées. Après incubation de 18h à 37°C. Nous obtenons les résultats dans le tableau 1ci-dessus.
74
Chapitre V Evaluation Biologique
I.2.1.1 Aspect microscopique
I.2.1.1.1 Observation microscopique
Observation microscopique permet de faire une étude morphologique des cellules d'une espèce microbienne. Elle comprend l'examen à l'état frais (examen entre lame et lamelle des bactéries vivantes) l'examen après coloration (le plus souvent sur frottis séchés et fixés) [4].
I.2.1.1.1.1 Coloration de Gram
Le colorant utilisé est le violet de gentiane qui colore l'intérieur des bactéries. Celles-ci sont ensuite décolorées à l’alcool. En raison de leur paroi de structure plus épaisse et de composition chimique particulière, les bactéries Gram+ garde la coloration violette. Les bactéries Gram-, avec une paroi plus fine et plus perméable à la décoloration, perdent la couleur violette.
De manière à visualiser les bactéries Gram-, on recolore avec de la fuschine (rose). Les bactéries Gram+ resteront violettes alors que les Gram- seront maintenant teintées en rose [5].
Figure 7 : Parois des Bactéries à Gram + et Gram -[5].
L'EXPERIENCE:
1) Protocole
A partir des boîtes de pétri :
Vous recevez 4 boîtes de pétri contenant 3 souches de bactéries différentes et un
75
Chapitre V Evaluation Biologique champignon : Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa , Staphylococcus aureus, et condida lbicans , Observer l'aspect, la couleur et la forme des colonies. a) Faire un frottis :
Nettoyer une lame à l'alcool. Déposer une goutte d'H20 sur la lame. Toucher une colonie à l'aide d'une pipette pasteure stérile pour prélever des bactéries. Il n'est pas nécessaire de prendre beaucoup de bactéries. Frotter la pointe dans la goutte d'eau. Laisser sécher à l'air. Passer 3 fois la lame dans la petite flamme (veilleuse) du bec Bunsen pour fixer l'échantillon à la chaleur.
Figure 8 : Protocol pour faire un frottis
76
Chapitre V Evaluation Biologique b) Coloration et explications
Déposer quelques gouttes de solution de violet de gentiane (cristal violet) sur le frottis fixé. Laisser agir 1 minute. Le violet de gentiane colore le cytoplasme des bactéries.
Jeter l'excès de colorant dans un bécher.
Rincer très brièvement en faisant couler de l'H2O sur la lame au-dessus du frottis (pas directement sur le frottis). Déposer quelques gouttes de lugol sur le frottis. Le Lugol (composé iodé) est un mordant qui permet de fixer le violet dans les bactéries. Laisser agir 1 minute.
Jeter la solution de Lugol dans un bécher et rincer brièvement à l'H2O comme précédemment décrit.
77
Chapitre V Evaluation Biologique
Décolorer en faisant couler la solution de décoloration sur la lame jusqu'à ce que le violet ne s'écoule plus du frottis (5 à 10 secondes).La solution de décoloration contient un mélange d’alcool. Les pores de la paroi des Gram+ sont fermés par la déhydratation à l'alcool. La paroi est alors imperméable et le colorant violet reste dans les bactéries. La membrane des Gram- est dissoute par le mélange alcool. La paroi plus mince et de composition différente laisse alors sortir la coloration violette.
Rincer à l'H2O.
Contre-colorer en déposant la solution de fuschine (rose) pendant 1 minute. Ce colorant permet de visualiser les bactéries Gram- décolorées à l'étape précédente. Cette coloration moins forte que le violet n'affecte pas la couleur des Gram+.
Rincer à l'H2O.
Laisser sécher à l'air.
78
Chapitre V Evaluation Biologique
Observer au microscope (grossissement 400x ou, avec une goutte d'huile à immersion, au grossissement 1000x).
Figure 9 : Protocole de coloration de gram
79
Chapitre V Evaluation Biologique
Tableau 2 : Observation microscopique des souches.
Les souches
Souches Observation microscopique référentielles bactérienne
Staphylococcu
s aureus
Figure10 : des cocci à gram positif.
Escherichia
coli
Figure 11 : des Bacile à gramme négatif.
80
Chapitre V Evaluation Biologique
Pseudomonas
aeruginosa
Figure 12 : des cocci à gram négatif.
Souche de Observation microscopique levure
Condida
Albicans
Figure 13 : Condida Alibicans.
I.2.2 Mode opératoire
I.2.2.1 Les milieux de culture
Selon les méthodes utilisées dans l’essai et selon les souches, nous avons utilisé les milieux suivants :
- La gélose nutritive pour l’isolement et l’entretien des souches bactériennes.
- La gélose Mueller Hinton pour l’étude de la sensibilité des bactéries aux différents extraits de mentha et thymelaea.
81
Chapitre V Evaluation Biologique
Figure 14 : Les milieux de culture
I.2.2.2 Préparation d’une solution :
Les extraits ont été repris avec le Dimethylsulfoxide (DMSO). Une série de concentration de l’ordre de 8 mg/ml, 4 mg/ml pour l’extrait aqueux, 2 mg/ml, et 1 mg/ml, 0.5mg/ml, 0.25mg/ml pour l’extrait méthanoïque a été ensuite réalisé[6].
Figure 15 : Série des concentrations différents des extraits dissouts dans le diméthylsulfoxyde (DMSO).
82
Chapitre V Evaluation Biologique
I.2.2.3 Méthode de diffusion en milieux gélose:
Principe a) Préparation de l’inoculum bactérien :
Chaque souche a été ensemencée en stries sur les milieux gélosés pour obtenir des colonies isolées. Après incubation de 18h à 37°C, on a choisi 4 à 5 colonies bien isolées qu’on a transféré à l’aide d’une pipette pasteur dans un tube de solution d’eau physiologique afin d’avoir une densité cellulaire initiale ou une turbidité voisine à celle de Mc Farland 0,5 (106 UFC/ml). Cette comparaison est mesurée à l’aide d’un étalon McFarland [6].
Figure 16 : Technique d’ensemencement des souches (ATCC) dans l’eau physiologie comparant avec McFarland.
83
Chapitre V Evaluation Biologique
b) Ensemencement :
Dans les 15min suivant l’ajustement de la turbidité de la suspension d’inoculum, on a trempé un écouvillon dans la suspension et on a étalé la surface entière de la gélose Muller Hinton à trois reprises, en tournant la boite à environ 60°
Après chaque application dont le but d’avoir une distribution égale de l’inoculum. Enfin, on a écouvillonné partout autour du bord de la surface de la gélose [6].
Figure 17 : Technique d’ensemencement dans les boites de Pétrie. c) Tests antimicrobiens
Afin d’évaluer l’activité antimicrobienne des extraits de la plante, nous avons utilisé la méthode de diffusion en milieu gélosé (antibiogramme), celle-ci permet de déterminer la zonne d’hinibition à partir d’une gamme de concentrations d’extrait [6]. c).1 Application :
Des disques de papier filtres stériles Whatmann de 6 millimètres de diamètre sont imprégnés de différentes solutions des extraits préalablement dissouts dans le diméthylsulfoxyde (DMSO).
À l’aide d’une pince stérile les disques sont déposés à la surface d’un milieu ensemencé (étalé) par une suspension microbienne d’une densité optique de 0.5 McFarland. Après diffusion, les boites sont incubées pendant 18 à 24 heures à 37 °C[7].
84
Chapitre V Evaluation Biologique c).2 Lecture des antibiogrammes :
Après l’incubation l’effet des extraits se traduit par l’apparition autour de disque d’une zone circulaire transparente correspondant à l’absence de la croissance. Plus le diamètre de cette zone est grand plus la souche est sensible [7].
L’activité antibactérienne a été déterminée en mesurant à l’aide d’une règle le diamètre de la zone d’inhibition, déterminée par les différentes concentrations des différents extraits autour des disques.
Figure 18 : Protocole de détermination de la zone d’inhibition en milieu solide
(Par disque)
85
Chapitre V Evaluation Biologique
Références
[1] : Dima M., 2014. Eco-Extraction des huiles essentielles et des arômes alimentaires en vue d’une application comme agents antioxydants et antimicrobiens. Thèse de doctorat en Sciences. Université d’Avignon et des Pays de Vaucluse. P-19. Consulté en ligne le 22/06/2019.
[2] : T Masuda, S Yonemori, Y Oyama, Y Takeda and T Tanaka., 1999. J Agric Food Chem. 47(4):1749-54.
[3] : Arab.Y, Zellagui A, Boutellaa S, Mesbah.Kh and Gherraf .N., 2014. Total phenolic and flavonoids content, and in vitro antioxidant and antimicrobial activity of ethyl acetate and butanol extract from Senecio delphinifolius Vahl. Der Pharmacia Lettre, 6 (4) : 522-525. Avec modification.
[4] : Auteur inconnu., 2015. Examen Macroscopique Et Microscopique Des Cultures Bactriens. Consulté en ligne le 29/06/2019. Disponible sur le site https://fr.scribd.com/
[5] : Auteur inconnu, BiOutils. l’interface de l’Université de Genè.ve pour soutenir l'enseignement des Sciences de la Vie. Coloration de Gram, bactéries, paroi bactérienne, frottis, analyses médicales, yogourt. Support de Biologie expérimentale depuis 2007. Consulté en ligne le 10/06/2019. Disponible sur le site : https://www.bioutils.ch/protocoles/5-la-coloration-de-gram
[6] : Derouiche.k, Zellagui.A, Gherraf .N, Bousetla.A, Dehimat .L , Rhouati .S ., 2013. Chemical composition, antimicrobial and antioxidant activities of the essential oils of Santolina africana flowers, endemic in Algeria. ISSN : 1314-6246 Derouiche et al. J. BioSci. Biotech2(3) : 201-206.
[7] : Choi Y.M., Noh D.O., Cho S.Y., Suh H.J., Kim K.M., and Kim J.M., 2006. Antioxidant and antimicrobial activities of propolis from several regions of Korea. LWT. 39:756-761.
86
Partie VI Résultats et Discussion
I- Screening phytochimique
Les tests phytochimiques ont été réalisés sur Thymelaea hirusta et Mentha pulegium en utilisant des réactifs spécifiques de révélation basés sur des réactions de précipitation et de changement de couleur spécifique. Les résultats expérimentaux du criblage phytochimique sont mentionnés dans le tableau 01
Tableau 01 : Criblage phytochimique Thymelaea hirusta et de Mentha pulegium
Métabolite secondaire Thymelaea hirusta Mentha pulegium
Polyphénols + +
Tanins catéchiques + +
Tanins galliques - -
Saponosides - -
Flavonoïdes + +
Terpènes et + +
Stérols
+ : présence / - : absence.
Le screening phytochimique nous a permis de mettre en évidence la présence de métabolites secondaires au niveau des tissus végétaux de nos deux plantes : les Polyphénols, les tanins catéchiques, les saponosides, les flavonoïdes et les terpènes. Cependant, les tests se sont révélés négatifs pour les tanins galliques, et les saponosides.
Les travaux antérieurs sur les tests phytochimiques de Thymelaea hirusta de la région de Khenchela par kadi et al (2016)ont démontré que les flavonoïdes, les tanins, les stéroïdes, les saponosides et les alcaloïdes sont présents en quantités considérables. Nous notons que les flavonoïdes sont présents en faible quantité. Ceci est comparable à nos résultats, sauf dans la présence des saponosides.
88
Partie VI Résultats et Discussion
De même, les tests phytochimiques réalisés sur M. pulegium du Annaba par BOUHADDOUDA Nabila(2016) ont montré la présence des mêmes constituants chimiques détectés dans la plante étudiée, sauf dans la présence des saponosides, nous ne les avons pas trouvés. En plus des alcaloïdes et des tanins galliques.
II. Rendement d’extraction :
Le rendement de l’extraction se calcule par le rapport entre la masse de polyphénols extraits et la masse de la matière première végétale traitée. Le rendement exprimé en pourcentage est calculé par la formule suivante :
Rdt (%) = P1 – P2/ P3 x 100
P1 : poids du ballon avant évaporation ;
P2 : poids du ballon après évaporation ;
P3 : poids de la matière végétale de départ.
II.1 Rendement d’extraction Mentha pulegium L et Thymelaea hirsuta Endel:
Nous avons calculé le rendement de l’extraction, le résultat obtenu est présente dans la figure suivante :
1 0.75 0.9674 % 0.5 0.25 rendement(%) 0 extrait metanolique
Figure 1 : Rendement d’extraction de la plante d’Mentha pulegium L.
Le calcul de la teneur de rendement d’extraction repose sur plusieurs facteurs à savoir température d’extraction, nature du solvant de la matière végétale initiale et l’humidité [3]
Selon le résultat obtenu, on constate une différence de rendement pour l’extrait d’Mentha pulegium L présentéà 0.974%qui est inferieur a celui de l’étude de Bouhaddouda nabila2015/2016 [2] qui est entre 24.87 %.
89
Partie VI Résultats et Discussion
1.5
1 1.28%
0.5 rendement(%) 0 extrait metanolique
Figure2 : Rendement d’extraction de la plante de Thymelaea hirsuta Endel.
Selon le résultat obtenu, on constate une différence de rendement pour l’extrait de Thymelaea hirsuta Endel présenté à 1.28% qui est inférieure à celui de travail de rayhanna ilihoum 2018 qui est compris entre 4.82% et7.8% [10].
II.2 Rendements des extraits :
A partir de l’extrait méthanolique brut de chaque plante, quarts extraits ont été préparés avec des solvants de polarité croissante, il s’agit de l’hexane, du chloroforme, de l’acétate d’éthyle et du n-butanol. Ces extraits préparés et séchées ont été conservés durant une longue période de 2 mois. Les rendements dans les tableaux 2 et 3 ont été calculées par rapport l’extrait méthanolique brut, d’autres études préfèrent le rapport à la masse sèche. Ces rendements sont faibles par rapport à d’autres études cela est peut-être dû à la longue durée de conservation des extraits methanoliques
90
Partie VI Résultats et Discussion
Mentha pulegium L :
Tableau2 : Rendements des extraits de Mentha pulegium L
Extraits Rendement % Chloroforme 2.4378 % Hexane 3.246 % Acétate d’éthyle 1.5087 % n -butanol 2.5421 %
hexane, Acetate d 4 chloroform 3.246 ethyle, n-butanol, e, 2.4378 1.5087 2.5421
2
0
Pourcentage(%)
Figure 3 : Rendements des extraits de Mentha pulegium L.
91
Partie VI Résultats et Discussion
Thymelaea hirsuta Endel :
Tableau 3 : Rendements des extraits de Thymelaea hirsuta Endel
Extrait Rendement %
Chloroforme 2.751 %
Hexane 0.651 %
Acétate d’éthyle 1.6018 %
N -butanol 0.6562 %
chloroform e, 2.751 3 Acetate d ethyle, 2 1.601 hexane, n-butanol,
1 0.651 0.656 Pourcentage(%) 0
Figure 4 : Rendements des extraits de Thymelaea hirsuta Endel.
III. Quantification des composés phénoliques
C’est une étape qui permet d’avoir une estimation sur la teneur en phénol totaux et en
Flavonoides de l’échantillon. a. La teneur en polyphénols totaux :
Le dosage des polyphénols totaux, nous donne une estimation globale de la teneur en déférentes classes des composés phénoliques contenu au niveau de l’extrait.
92
Partie VI Résultats et Discussion
Les méthodes colorimétriques ont été utilisées pour évaluer la quantité des composés phénoliques dans la matière végétale. La macération et le choix du solvant utilisé sont les principaux critères à prendre en considération pour une extraction rentable [4].
Avant de procéder à la détermination de la teneur en composés phénoliques ; nous avons établi une courbe d’étalonnage en utilisant l’acide gallique.
0.6 y = 0.0051x + 0.1001 0.5 R² = 0.9692 0.4
0.3
Absorbance 0.2
0.1
0 0 20 40 60 80 100 concentration μg/ml Figure5 : Courbe d’étalonnage de l’acide gallique.
acetat ethyl, 200 chloroforme , 180.77 170.37 180 n-butanol, 162.92 160 140 120 100 hexane, 74.49 80 60
40
mg sec EAG extrait /g mg Teneur en polyphenoles en Teneur 20 0 chloroforme hexane acetat ethyl n-butanol
Figure 6 : teneur en polyphénol de plante Mentha pulegium L
Le dosage colorimétrique de Foline-Ciocalteu nous a permis d’avoir une idée sur les variations qualitatives des composés phénoliques précisément les polyphénols totaux.
93
Partie VI Résultats et Discussion
La teneur en polyphénols totaux étant observé avec l’acétate d’éthyle 180.77 EAGmg/g d extrait sec; c’est la teneur la plus forte des résultats de dosage.
acetat ethyl, 132.92 140 n-butanol, 119.59 120 chloroforme , 99.2 100 hexane, 75.86 80
60
40 mg sec EAG extrait /g mg
Teneur en polyphenoles en Teneur 20
0 chloroforme hexane acetat ethyl n-butanol
Figure 7 : teneur en polyphénols de plante Thymelea hirsuta Endel.
La teneur en polyphénols totaux étant observé avec l’acétate d’éthyle elle est égale à 132.92 EAGmg/g d extrait sec ; c’est le taux le plus fort des résultats.
b. Teneur en flavonoïdes :
On s’est intéressé aux flavonoïdes cette classe de polyphénols parce que les flavonoïdes constituent une classe polyphénolique la plus importante, avec plus de 5000 composés déjà décrits [5].
Le dosage des flavonoides a été réalisé selon la méthode de trichlorure d’aluminium
(AlCl3), à partir de la courbe d’étalonnage du quercétine. L’absorbance a été lue dans une longueur d’onde de 430 nm. Les résultats obtenus sont exprimés en milligramme par gramme.
94
Partie VI Résultats et Discussion
2.5 y = 0.029x 2 R² = 0.9919
1.5
1 Absorbance
0.5
0 0 20 40 60 80 100 Concentration μg/ml
Figure 8 : Courbe d’étalonnage de la quercétine.
La teneur en flavonoïdes est déterminée à partir d’une courbe d’étalonnage par rapport à la quercétine.
35 chloroforme, 30.14 30
25 n-butanol, 20.1 acetat ethyl, 20 15.72 hexane, 13.14 15
10 mg EAQsec extrait /g mg
Teneur en polyphenoles en Teneur 5
0 chloroforme hexane acetat ethyl n-butanol
Figure 9 : Teneur en flavonoïdes de plante Mentha pulegium L.
La teneur en flavonoïdes totaux étant observé avec chloroforme elle est égale à 30.14 EAGmg/g d extrait sec ; c’est le taux le plus fort des résultats.
95
Partie VI Résultats et Discussion
n-butanol, 83.86 84 chloroforme, 81.621 hexane, 81.59 82
80
78
76 acetat ethyl, 73.55 74
72 mg EAQsec extrait /g mg Teneur en polyphenoles en Teneur 70
68 chloroforme hexane acetat ethyl n-butanol
Figure 10 : Teneur en flavonoïdes de plante Thymelaea hirsuta Endel.
La teneur en flavonoïdes totaux étant observé avec n-butanol elle est égale à 83.86 EAGmg/g d extrait sec ; c’est le taux le plus fort des résultats.
VI. Evaluation du pouvoir antioxydant
VI.1. Test de réduction du radical stable le DPPH
L’activité antioxydante est évaluée en utilisant la méthode du test DPPH. Le composé chimique 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyle est un radical de couleur violacée qui absorbe dans l’UV- visible à la langueur d’onde de 517nm. Il fut l’un des premiers radicaux libres utilisés pour étudier l’activité antioxydante des composés phénoliques.
La réduction du radical libre DPPH par un antioxydant peut être suivie par spectrophotométrie UV-visible, en mesurant la diminution de l’absorbance à 517 nm. Le DPPH est initialement violet, se décolore lorsque l’électron célibataire s’apparie.
Dans ce test, le substrat est un radical stable qui, en réagissant avec une molécule antioxydante, se transforme en DPPH-H (2,2-diphényl-1-picrylhydrazine) avec perte de son absorbance caractéristique à 517 nm. Les réactions ont lieu à température ambiante et
96
Partie VI Résultats et Discussion en milieu Méthanolique, qui permet une bonne solubilisation de la plupart des antioxydants.
Ce tes test très utilisé, car il est rapide, facile et non couteux.
Avant de procéder à la détermination de la teneur en composés phénoliques ; nous avons établi une courbe d’étalonnage en utilisant l’acide ascorbique.
Les résultats sont exprimés en milligramme (mg) équivalent d’acide ascorbique par gramme des extraits methanolique.
0.8 y = 0.0116x - 0.0167 R² = 0.9968 0.7 0.6 0.5 0.4
Absorbance 0.3 0.2 0.1 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Concentration ug/ml
Figure 11 : courbe d’étalonnage d’acide ascorbique [9].
A partir des résultats des courbes des régressions linéaires de référence (acide ascorbique) ont été construites dans le but de trouver l’équation du graphe et le coefficient de détermination r2.les r2 indiquent une bonne correspondance entre la courbe et les données.
L’acide ascorbique (standard) a présente une CI50= 0.13879μg / ml après 60mn.
97
Partie VI Résultats et Discussion
VI.1.1.1 Calcul des pourcentages d’inhibitions :
Nous calculons ainsi les pourcentages d’inhibition par la formule suivante :
INB%=((Ac-At) /Ac) *100
Ac : absorbance du contrôle.
At : absorbance du test effectué.
Mentha pulegium L :
90 y = 69,926x - 1,2304 y = 58,528x + 5,96 y = 76,862x + 0,4335 R² = 0,714 R² = 0,996 80 R² = 0,9727 Acétate d'éthyle Chloroforme 70 n-butanol 60 y = 24,984x - 3,9161 INB%-Chloroforme 50 R² = 0,9818 INB%-Hexane 40 Hexane INB%-Acétate E
INB % INB 30 INB%-n-butanol 20 Linear (INB%-Chloroforme) Linear (INB%-Hexane) 10 Linear (INB%-Acétate E) 0 Linear (INB%-n-butanol) -10 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 Concentration mg/l
Figure 12 : Pourcentage d’inhibition du radical libre DPPH, en fonction de concentrations. Utilisées pour les extraits de Hexane, chloroforme, d’acétate d’éthyle et de n- butanol pour la plante Mentha pulegium L.
Les résultats de plante Mentha pulegium L celle de d’acétate d’éthyle parmi toutes les fractions présente la plus importante activité de piégeage des radicaux libres (CI50=0.645 mg/l) après 30 min dans la gamme de concentration 0.125, 0.25, 0.5 ,1 mg/l .il était visible
98
Partie VI Résultats et Discussion qu’il y avait un changement de couleur du violet au jaune. Alors que la fraction révèle une activité moindre avec une CI50 égale à2.16mg/l d’hexane.
Les résultats de l’activité antioxydante sont en bon accord avec les résultats du dosage des polyphénols possédant des protons labiles. En effet, la fraction acétate d’éthyle représente une teneur en polyphénols de 133.56 mg/l.
Thymelea hirsuta Endel :
90 y = 65,098x + 16,02 R² = 0,716 80 acetat ethyle
y = 66,655x + 10,168 70 R² = 0,9828 Hexane 60 y = 63,853x + 3,7491 R² = 0,9994 chloroforme 50 y = 62,839x + 14,092 R² = 0,9689 INB% 40 n-butanol INB%-Chloroforme INB%-Hexane 30 INB%-Acétate E INB%-n-butanol 20 Linear (INB%-Chloroforme) Linear (INB%-Hexane) Linear (INB%-Acétate E) 10 Linear (INB%-n-butanol)
0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 Concentration mg/l
Figure 13 : Pourcentage d’inhibition du radical libre DPPH, en fonction de concentrations utilisées pour les extraits de Hexane, chloroforme, d’acétate d’éthyle et de n- butanol de plante Thymelea hirsuta Endel.
L’activité antioxydant est déterminée par la diminution de l’absorbance qui est due à la réduction à une forme non radicalaire par les antioxydants.
Les résultats de plante Thymelea hirsuta Endel celle d’Acétate d’éthyle parmi toutes les fractions présente la plus forte activité de piégeage des radicaux libres CI50=0.522
99
Partie VI Résultats et Discussion mg/l après 30 min dans la gamme de concentration 0.125, 0.25, 0.5 ,1 mg/l.Il était visible qu’il y avait un changement de couleur du violet au jaune. Alors que la fraction révèle une activité moindre avec une CI50 égale à0.724 mg/l de chloroforme. Les déférentes activités de piégeage relatives peuvent être attribuées à l’atome d’hydrogène.
Les résultats de l’activité antioxydante sont en bon accord avec les résultats du dosage des polyphénols possédant des protons labiles. En effet, la fraction acétate
D’éthyle présente une teneur en polyphénols de 86.44mg/l.
Détermination d’IC50
L’IC50 est inversement proportionnel à la capacité antioxydant d'un composé, parce qu’il exprime la quantité d'antioxydant requise pour diminuer la concentration du radical libre de 50%. Plus la valeur d’IC50 est petite, plus l'activité antioxydant d'un composé est grande.
Cette activité est mesurée comparativement à l’acide ascorbique (antioxydant standard).
Les concentrations effectives d’échantillons nécessaires pour piéger le radical DPPH de 50 % (valeurs CI50) ont été calculées à partir de l’équation de régression, entre 50% d’inhibition et la concentration. Il existe une relation inverse entre le pourcentage de potentiel d inhibitions de l’échantillon et les valeurs de CI50
100
Partie VI Résultats et Discussion
Tableau 8 : les valeurs d’IC50 des extraits de Mentha pulegium Let de et de l’acide ascorbique.
IC 50 Extrait et standard (mg/l)
Chloroforme 0.7524
Hexane 2.1580
Acétate d’éthyle 0.6448
N-butanol 0.732
Acide ascorbique. 0,13879
D’après le tableau 8,la fraction d’acétate d’éthyle représente l’extrait le plus actif avec une IC50=0.6448 mg/l suivi par la fraction n-butanol(0.732 mg/l), puis par l’extrait de Chloroforme(0.7524 mg/l) et enfin l’extrait d’Hexane avec une IC50 (2.1580 mg/l). Les activités déterminées restent toujours, inférieure à celle du standard (l’acide ascorbique) avec une IC50 de 0,13879 mg/l.
Tableau 9 : Valeurs d’IC50 des extraits de Thymelaea hirsuta Endel.
Extrait IC 50
mg/l
Chloroforme 0.7243
Hexane 0.5975
Acétate d’éthyle 0.5219
N-butanol 0.5714
101
Partie VI Résultats et Discussion
D’après le tableau 9, la fraction Acétate d’éthyle représente l’extrait le plus actif avec une IC50 =0.5219 mg/l suivi par la fraction N-butanol (0.5714mg/l), puis par l’extrait Hexane (0.5975 mg/l) et enfin l’extrait de Chloroforme, avec une IC50 (0.7243 mg/l) . Les activités déterminées restent toujours, inférieure à celle du standard (l’acide ascorbique) avec une IC50 de 0,13879 mg/l.
102
Partie VI Résultats et Discussion
V. Activité antimicrobienne
L’activité antimicrobienne des extraits méthanoliques de Mentha pulegiumet Thymelaea hirusta contre les bactéries testées est expérimentée par la méthode des disques [7], où leur potentiel antibactérien est qualitativement et quantitativement évalué par la mesure du diamètre des zones d'inhibition.
Rappelons que chaque disque contient 30 μl d’extrait méthanolique de M. pulegium et Thymelaea hirusta.
Les résultats du test de diffusion sur disque ont été appréciés comme suit :
Pas sensible (-) de diamètre inférieur ou égal à 8.0 mm,
Moyennement sensible (+) pour un diamètre compris entre 8.0 et 14.0 mm,
Sensible (++) pour un diamètre compris entre 14.0 et 20.0 mm,
Et extrêmement sensible (+++) pour un diamètre égal ou supérieur à 20.0 mm [6].
V.1 Antibiogramme
Les tests de sensibilités de nos extraits de Thymelaea hirsuta et M. pulegiumvis-à-vis de ces microorganismes nous ont permis de déterminé les diamètres d'inhibition de chaque concentration d’extraits méthanoliques.
Les mesures des zones d’inhibition figurant dans les figures (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7,8) et le tableau :
103
Partie VI Résultats et Discussion
- Plante 1 : Extrait méthanoliquedeM. pulegium.
Figure 14 : Escherichia coli(ATCC 25922).
Figure 15 : Staphylococcus aureus(ATCC 25923).
104
Partie VI Résultats et Discussion
Figure 16 :Pseudomonas aeruginosa(ATCC27853).
Figure 17 : Candida albicans.
Figure 18, 19,20,21 : représentent l’effet des disques sur les souches bactériennes testées.
105
Partie VI Résultats et Discussion
Tableau 10 : Activité antimicrobienne de l’extrait méthanolique M. pulegium contre les souches bactériennes testées.
Diamètres des zones d’inhibition (mm)
Concentration 8 mg/ml 4 2 mg/ml 1 mg/ml 0.5 0.25 mg mg/ml mg/ml mg/ml /ml
Souches
Escherichia coli R R 38 mm R R R
(ATCC 25922) (+++)
Staphylococcus 7.6 mm 2 mm 5.6 mm R 6 mm R
aureus (-) (-) (-) (-) (ATCC 25923)
Pseudomonas R R R R R R aeruginosa(ATC C27853)
Condida albicans 14 mm 11.3 6.3 mm R R R
(+) mm (-) (+)
(R) : Résistante ; (-) : pas sensible ; (+) : moyennement sensible ; (++) : sensible ; et
(+++) : Extrêmement sensible.
Le tableau 8 montrent que les deux souches Escherichia coli (ATCC 25922) et Candida albicanssont des souches sensibles possèdent des zones d’inhibition de diamètre de : (38mm) et (14, 11.3 mm ) respectivement pour les concentration :
106
Partie VI Résultats et Discussion
( 2 mg/ml ) et ( 8 , 4 mg/ml ). Par contreStaphylococcus aureus(ATCC 25923) et Pseudomonas aeruginosa(ATCC27853) sont résistante pour les concentrations d’extraits méthanolique.
L’activité antibactérienne de l’extrait méthanolique de M. pulegium a été testée sur
Escherichia coli et Staphylococcus aureus et contrairement à nos résultats, ces souches y ont été sensibles avec des diamètres d’inhibition de 17.5 et 15.25, respectivement
(Khaled-Khodja et al., 2014). Contrairement à nos résultats.
On note qu’Escherichia coli est la seule souche bactérienne plus sensible à ce l’extrait méthanolique, En plus Candida Albicans est la seule souche fongique sensible à cette l’extrait méthanolique.
Plante 2 :Extrait méthanolique de Thymelaea hirsuta
Figure 18 : Escherichia coli (ATCC 25922).
Figure 19 : Staphylococcus aureus(ATCC 25923).
107
Partie VI Résultats et Discussion
Figure 20 : Pseudomonas aeruginosa (ATCC27853).
Figure 21 : Candida albicans.
Figure 18, 19, 20, 21 : représentent l’effet des disques sur les souches bactériennes testées.
108
Partie VI Résultats et Discussion
Tableau 11 : Activité antimicrobienne de l’extrait méthanolique Thymelaea hirsuta contre les souches bactériennes testées.
Diamètres des zones d’inhibition (mm)
Concentration 8 mg/ml 4 2 mg/ml 1mg/ml 0.5 0.25 mg/ml mg/ml mg/ml mg/ml
Souches
Escherichia coli 6 mm R R R R R
(ATCC 25922) (-)
Staphylococcus R R R R R R aureus
(ATCC 25923)
Pseudomonas 14.3 mm 10 mm 7 mm 5.6 mm 5 mm 4.3 mm aeruginosa(ATC (++) (+) (-) (-) (-) (-) C27853)
Candida albicans R R R R R R
(R) : Résistante; (-) : pas sensible ; (+) : moyennement sensible ; (++) : sensible.
Le tableau 9 montre que :
L’extrait méthanoliques de Thymelaea hirsuta a :
Un effet inhibiteur présentant une zone d’inhibition de la souche Pseudomonas aeruginos a(ATCC27853) égale à (14.3 et 10 mm), respectif pour les deux concentrations (8 et 4 mg/ml).Par contre les trois autres souches Candida albicans, Escherichia coli (ATCC 25922) et Staphylococcus aureus(ATCC 25923) ont présenté une résistance contre le même extrait.
109
Partie VI Résultats et Discussion
Alors que notre extrait s’est montré à un effet inhibiteur présentant une zone d’inhibition de croissance de diamètres qui varient entre 14.3 et 10 mm
110
Partie VI Résultats et Discussion
Références
[1] : Kadi K., Hamli S., Zeraib A., Yahia A., 2016. Effet antibactérien des extraits de Thymelaeahirsuta L. Revue des Régions Arides n°43 (3/2017) – Numéro spécial – Actes du 5ème Meeting International sur l’Aridoculture et les Cultures Oasiennes : Biotechnologie végétale en zones arides et oasiennes Zarzis (Tunisie), 19-21 décembre 2016.
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[3] : Wattiaux. D ., 1997. Prediction of the electronic equipement during a pyrotechnic shock., In first Ineternational Symposium on Envirnmental Testing Engineering,(23) :541- 545.
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[6] : Djabou N., Lorenzi V., Guinoiseau E., Andreani S., Giuliani M.C., Desjobert J.M., Bolla J.M., Costa J., Berti L., Luciani A. &Muselli A., 2013. Phytochemical composition of CorsicanTeucrium essential oils and antibacterialactivityagainstfoodborne or toxi-infectiouspathogens. Food Control. 30 : 354-363.
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[8] : Khaled-Khodja N., Boulekbache-Makhlouf L. & Madani K., 2014. Phytochemical screening of antioxidant and antibacterialactivities of methanolic extracts of someLamiaceae. Ind. Crop. Prod. 61 :41–48.
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Partie VI Résultats et Discussion
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[9] : Ilihoum. R., 2018.Comparaison des activités biologiques des feuilles et racines de Thymelaea hirsuta .Mémoire de master Université d’Oum El Bouaghi.
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Conclusion générale
Conclusion et perspectives
Conclusion
Dans le cadre de la valorisation des ressources naturelles de la région d’Oum-El- Bouaghi,nous avons entrepris une étude phytochimique et biologique sur deux plantes, à savoir la Menthapulegium et la Themylaeahirusta. Le screening phytochimique nous a permis de mettre en évidence la présence de métabolites secondaires au niveau des tissus végétaux de nos deux plantes : les polyphénols, les tanins catéchiques, les flavonoïdes et les terpènes. Cependant, les tests se sont révélés négatifs pour les tanins galliques et les saponosides. A partir de l’extrait méthanolique brut de chaque plante, quarts extraits ont été préparés avec des solvants de polarité croissante, il s’agit de l’hexane, du chloroforme, de l’acétate d’éthyle et du n-butanol. Ces extraits préparés et séchées ont été conservés durant une longue période de 2 mois.
L’évaluation du contenu en polyphénols totaux a indiqué que, les deux plantes sont riches en composées phénoliques mais avec des valeurs variables en fonction des solvants d’extraction. On peut constater que les teneurs les plus élevées ont été détectés dans l’extrait d’acétate d’éthyle varient entre 113,56 et 86,44 μg EAG / mg d’extrait. Tandis que, les teneurs les plusfaibles sont constatées dans l’extrait d’Hexane. La détermination du contenu en flavonoïdes par la méthode d’AlCl3 nous mène à conclure que, les teneurs en flavonoïdes varient d’une espèce à l’autre, selon les solvants utilisés pour l’extraction. Elles varient entre 83.87 et 30.137 μg équivalent/ mg d’extrait de plante MenthapulegiumL et Thymelaeahirsuta Endel. Les résultats obtenus montrent que le Menthapulegium L. et Thymelaeahirsuta Endel sontdes plantes riches en polyphénols et flavonoïdes dans toute sa partie aérienne. Les résultats de l’activité antioxydante obtenus par la méthode au DPPH sont en bon accord avec les résultats du dosage des polyphenols possédant des protons labiles.Cette activité semble être liée à la présence des composés phénoliques.
L’activité antimicrobiene de l’extrait méthanolique M. Pulegiumc a montré que les deux souches Escherichia coli (ATCC 25922) et Condidaalbicans sont des souches Conclusion générale sensibles par contre Staphylococcus aureus (ATCC 25923) et Pseudomonas aeruginosa (ATCC27853) sont résistantes pour les concentrations de l’extraits méthanolique utilisées. Dans le cas de l’activité antibactérienne et antifongicique de l’extrait méthanoliques de Thymelaea hirsuta, elle a montré qu’un effet inhibiteur présentant une zone d’inhibition de la souche Pseudomonas aeruginosa (ATCC27853), par contre les trois autres souches Condida albicans, Escherichia coli (ATCC 25922) et Staphylococcus aureus (ATCC 25923) ont montré une résistance contre le même extrait. Les résultats de l’activité antibactérienne et antifongique pourrait être étaient perturbés par le long séjour de conservation des extraites préparés.
Perspectives
L’étude réalisée avec les deux plantes :Mentha pulegium et Themylaea hirusta, nous a permit d’obtenir des résultats considérables se qui nous a permis de constatons que l’effet antioxydant est assez important, en plus sur le champ antibactérien et antifongique présente un effet thérapeutique considérable.
A Cet effets, nous espérons contribuer à des recherches approfondies sur ces plantes dans le domaine pharmaceutique pour lutter contre certaines maladies telles que : l’Alzaymer, les tumeurs et le diabète.
Résumé
Dans le cadre d’une valorisation des ressources naturelles de la région d’Oum-El- Bouaghi, nous avons entrepris une étude phytochimique et biologique sur deux plantes, à savoir la Mentha pulegium et la Themylaea hirusta. Les extraits méthanoliques contiennent une importante teneur en polyphénols totaux de l’ordre de 113.56 mg/g et 86.44 mg/g pour Mentha pulegium et Themylaea hirusta respectivement. Les teneurs en flavonoïde totaux sont de l’ordre de 30.14 mg/g et 83.86 mg/g pour Mentha pulegium et Themylaea hirusta, respectivement. L’activité antioxydante des extraits méthanoliques a été évaluée par le test du piégeage du radical libre DPPH. L’extrait de l’acétate d’éthyle pour la Mentha pulegium est celui qui présente la plus forte activité antioxydante (IC50= 0.645ug/ml). Meme constat pour la Themylaea hirustadans c’est l’acétate d’éthyle qui présente la plus forte activité antioxydante (IC50= 0.521 ug/ml). Les activités antimicrobiennes et antifongiques des extraits méthanoliques des plantes Mentha pulegium et la Themylaea hirusta ont été mis en évidence.
Mots clés :Themylaea hirusta, Mentha pulegium, polyphénols, flavonoïdes, activité antioxydante, activité antibactérienne, activité antifongique.
Abstract
As part of the development of the natural resources of the region of Oum-El-Bouaghi, we undertook a phytochemical and biological study on two plants, namely Mentha pulegium and Themylaea hirusta. The methanolic extracts contain a high content of total polyphenols in the order of 113.56 mg / g and 86.44 mg / g for Mentha pulegium and Themylaea hirusta respectively. The total flavonoid contents are in the order of 30.14 mg / g and 83.86 mg / g for Mentha pulegium and Themylaea hirusta, respectively. The antioxidant activity of the methanolic extracts was evaluated by the DPPH free radical scavenging test. The ethyl acetate extract for Mentha pulegium has the highest antioxidant activity (IC50 = 0.645 μg / ml). Even finding for Themylaea hirustadans is ethyl acetate which has the highest antioxidant activity (IC50 = 0.521 ug / ml). The antibacterial and antifungal activities of the methanolic extracts of Mentha pulegium plants and Themylaea hirusta have been demonstrated. Key words:Themylaea hirusta, Mentha pulegium, polyphenols, flavonoids, antioxidant activity, antibacterial activity, antifungal activity.
الملخص
من اجل تثمين الموارد الطبيعية لمنطقة ام البواقي قمنا بدراسة صنفين لنبتات الطبية نظرا الستخدامهما على نطاق واسع وهما Themylaea hirusta, Mentha pulegiumتحتوي المستخلصات الميثانولية على نسبة عالية من البوليفينول الكلي في حدود 113.56 ملغم / جم و86.44 ملغم / غرام بالنسبة لنبتة Themylaea hirusta, Mentha pulegiumعلى التوالي. تكون محتويات الفالفونويد الكلية في حدود 30.14 ملغم / جم و83.86 ملغم / جم بالنسبة لنبتةThemylaea hirusta, Mentha pulegium، على التوالي. تم تقييم نشاط مضادات األكسدة في المستخلصات الميثانولية بواسطة اختبار مسح الجذور الحرة .DPPH يحتوي مستخلص أسيتات اإليثيل لـ Mentha pulegiumعلى أعلى نشاط مضاد لألكسدة IC50 = 0.645) ميكروغرام / مل(. حتى االستنتاج عن hemylaea hirusta هو أسيتات إيثيل التي لديها أعلى نشاط مضاد لألكسدة IC50 = 0.521 ميكروغرام / مل(. وقد تم عرض األنشطة المضادة للبكتيريا والفطريات من المستخلصات الميثانولية من نباتات Mentha pulegium و Themylaea hirusta.
الكلمات المفتاحية: ثيمليا هيروستا،منتا بالجيوم ، بوليفينول ، فالفونويدات ، نشاط مضاد لألكسدة ، نشاط مضاد للجراثيم ، نشاط مضاد للفطريات.