Prunus Mahaleb L. × P. Avium L.) VE MAZZARD F12-1 (P

T.C. SÜLEYMAN DEMİREL ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

MAXMA 14 (Prunus mahaleb L. × P. avium L.) VE MAZZARD F12-1 (P. avium L.) KİRAZ ANAÇLARININ IN VITRO ÇOĞALTIMI VE REJENERASYONU

Fulya DEMİR

Danışman Doç. Dr. Fatih Ali CANLI

YÜKSEK LİSANS TEZİ TARIMSAL BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI ISPARTA - 2013

İÇİNDEKİLER

Sayfa İÇİNDEKİLER ...... i ÖZET ...... iii ABSTRACT ...... iv TEŞEKKÜR ...... v ŞEKİLLER DİZİNİ ...... vi ÇİZELGELER DİZİNİ ...... viii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ ...... ix 1. GİRİŞ ...... 1 2. KAYNAK ÖZETLERİ ...... 4 2.1. Multiplikasyon Çalışmaları ...... 4 2.2 Rejenerasyon Çalışmaları...... 8 3. MATERYAL VE YÖNTEM ...... 15 3.1. Materyal ...... 15 3.1.1. Bitki Materyali ...... 15 3.1.1.1. ‘Mazzard F12-1’ ...... 15 3.1.1.2‘Maxma 14’ ...... 15 3.1.2. Besin ortamı ...... 16 3.1.3. Sterilizasyon, in vitro doku kültürlerin oluşturulması ...... 16 3.2. Yöntem ...... 17 3.2.1. Kültür odası şartları ...... 17 3.2.2. Alt kültürler ...... 18 3.2.3. Multiplikasyon denemeleri ...... 18 3.2.3.1. Benziladenin (BA)’ in Mazzard F 12-1 ve Maxma 14 kiraz anacının çoğalması üzerine etkileri ...... 18 3.2.3.2. Thidiazuron (TDZ)’ un Mazzard F 12-1 ve Maxma 14 kiraz anacının çoğalması üzerine etkileri ...... 19 3.2.4. Yapraktan regenerasyon denemeleri ...... 19 3.2.4.1 Benziladenin (BA) ‘nin Mazzard F 12-1 ve Maxma 14 kiraz anacının yaprak rejenerasyonuna etkileri ...... 20 3.2.4.2. Thidiazuron (TDZ)’nun Mazzard F 12-1 ve Maxma 14 kiraz anacının yaprak rejenerasyonuna etkileri ...... 20 3.2.5. Optimizasyon denemeleri ...... 21 3.2.5.1. Mazzard F12-1 kiraz anacının aydınlık ortamda NAA (Naftelenasetikasit) ve BA (Benziladenin)‘ in kombinasyonları üzerinde yapılan çalışmalar ...... 21 3.2.5.2. Rejenerasyon gösteren TDZ Muamelesi etrafında optimizasyon ...... 21 3.2.5.3. Karanlık inkübasyonunun regenerasyona etkilerinin belirlenmesi . 21 3.2.5.4. Thidiazuron (TDZ) ile ön muamelenin regenerasyona etkilerinin belirlenmesi ...... 22 3.2.5.5. Benziladenin (BA) ile ön muamelenin regenerasyona etkilerinin belirlenmesi ...... 22 3.2.6. Köklendirme ve alıştırma...... 23 3.2.7. Veri toplanması ve istatistikî analizlerin yapılması ...... 23 4. ARAŞTIRMA BULGULARI...... 24 4.1. Multiplikasyon Denemeleri ...... 24 4.1.1. Benziladenin (BA) ‘nin Mazzard F12-1 ve Maxma 14 kiraz anacının multiplikasyonu üzerine etkileri ...... 24 4.1.1.1. Benziladenin (BA) ‘nin Mazzard F12-1 kiraz anacının multiplikasyonu üzerine etkileri ...... 24 4.1.1.2. Benziladenin (BA) ‘nin Maxma 14 kiraz anacının multiplikasyonu üzerine etkileri ...... 25

4.1.2. Thidiazuron (TDZ)’nun Mazzard F12-1 ve Maxma 14 kiraz anacının multiplikasyonu üzerine etkileri ...... 27 4.1.2.1. Thidiazuron (TDZ)’nun Mazzard F12-1 kiraz anacının multiplikasyonu üzerine etkileri...... 27 4.1.2.2. Thidiazuron (TDZ)’nun Maxma 14 kiraz anacının multiplikasyonu üzerine etkileri ...... 28 4.2. Yapraktan Rejenerasyon Denemeleri...... 29 4.2.1. Benziladenin (BA) ‘nin Mazzard F12-1 ve Maxma 14 kiraz anacının yaprak rejenerasyonu üzerine etkileri ...... 29 4.2.1.1 Benziladenin (BA)’ın aydınlık ortamda Mazzard F 12-1 kiraz anacının yaprak rejenerasyonuna etkisi ...... 29 4.2.1.2. Benziladenin (BA)’in karanlık ortamda (10 günlük karanlık inkübasyon uygulaması) Mazzard F12-1 kiraz anacının yaprak rejenerasyonuna etkisi ...... 31 4.2.1.3. Benziladenin (BA)’in aydınlık ortamda Maxma14 kiraz anacının yaprak rejenerasyonuna etkisi ...... 32 4.2.1.4. Benziladenin (BA)’in karanlık ortamda (10 günlük karanlık inkübasyon uygulaması) Maxma14 kiraz anacının yaprak rejenerasyonuna etkisi ...... 33 4.2.2. Thidiazuron (TDZ)’nun Mazzard F12-1 ve Maxma 14 kiraz anacının yaprak rejenerasyonu üzerine etkileri ...... 33 4.2.2.1. Thidiazuron (TDZ)’ un aydınlık ortamda Mazzard F 12-1 kiraz anacının yaprak rejenerasyonuna etkisi ...... 33 4.2.2.2. Thidiazuron (TDZ)’ un karanlık ortamda (10 günlük karanlık inkübasyon uygulaması) Mazzard F12-1 kiraz anacının yaprak rejenerasyonuna etkisi ...... 34 4.2.2.3. Thidiazuron (TDZ)’ un aydınlık ortamda Maxma 14 kiraz anacının yaprak rejenerasyonuna etkisi ...... 35 4.2.2.4. Thidiazuron (TDZ)’ un karanlık ortamda (10 günlük karanlık inkübasyon uygulaması) Maxma 14 kiraz anacının yaprak rejenerasyonuna etkisi ...... 37 4.3. Optimizasyon Denemeleri ...... 38 4.3.1. Mazzard F12-1 kiraz anacının aydınlık ortamda NAA (Naftelenasetikasit) ve BA (Benziladenin)‘ in kombinasyonları üzerinde yapılan çalışmalar ...... 38 4.3.2. Rejenerasyon gösteren TDZ Muamelesi etrafında optimizasyon ...... 39 4.3.3. Karanlık uygulamasının rejenerasyona etkisi (5-10-15-20 gün karanlık uygulaması) ...... 40 4.3.3.1. Mazzard F12-1 kiraz anacının yaprak rejenerasyonu gösteren benziladenin (BA) üzerinde yapılan karanlık inkübasyon çalışmaları ...... 40 4.3.3.2. Mazzard F12-1 kiraz anacının yaprak rejenerasyonu gösteren thidiazuron (TDZ) üzerinde yapılan karanlık inkübasyon çalışmaları ...... 41 4.3.4. TDZ ile ön muamelenin rejenerasyona etkisi...... 42 4.3.5. BA ile ön muamelenin rejenerasyona etkisi ...... 44 4.3.5.1. Mazzard F12-1 kiraz anacının yaprak rejenerasyonu gösteren 10 mg lˉ¹ benziladenin (BA) dozu üzerinde 1 saat uygulanan BA ön muamelesi uygulaması (aydınlık) ...... 44 4.3.5.2. Mazzard F12-1 kiraz anacının yaprak rejenerasyonu gösteren 2,5 mg lˉ¹ benziladenin (BA) dozu üzerinde 1 saat uygulanan BA ön muamelesi uygulaması (karanlık) ...... 44 4.4. Köklenme Denemeleri ...... 45 4.4.1.Indole-3-butyric acid (IBA)’in Maxma 14 kiraz anacının köklenmesi üzerine etkisi ...... 45

4.4.2.Indole-3-butyric acid (IBA)’in Mazzard F 12-1 kiraz anacının köklenmesi üzerine etkisi ...... 46 4.4.3. Rejenerasyonla elde edilen bitkilerin dış koşullara alıştırılması ...... 47 5. TARTIŞMA VE ÖNERİLER...... 49 5.1. Multiplikasyon Çalışmaları ...... 49 5.2. Rejenerasyon Çalışmaları...... 52 KAYNAKLAR ...... 55 ÖZGEÇMİŞ ...... 62

iii

ÖZET

Yüksek Lisans Tezi

MAXMA 14 (Prunus mahaleb L. × P. avium L.) VE MAZZARD F12-1 (P. avium L.) KİRAZ ANAÇLARININ IN VITRO ÇOĞALTIMI VE REJENERASYONU

Fulya DEMİR

Süleyman Demirel Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Tarımsal Biyoteknoloji Anabilim Dalı

Danışman: Doç. Dr. Fatih Ali CANLI

Bu tez çalışması ile Mazzard F/12-1 ve Maxma14 kiraz anaçlarının in vitro multiplikasyonu ve yapraktan rejenerasyonu çalışılmıştır. Multiplikasyon denemelerinde BA ve TDZ bitki büyüme düzenleyicilerinin farklı dozlarının sürgün çoğaltılması üzerindeki etkileri araştırılmıştır. Ms (+0,54 µM NAA) besin ortamı kullanılmış ve F 12-1 bitkisinde en iyi kardeşleme sonuçları 20 mg lˉ¹ BA (1.40 sürgün/eksplant), 10 mg lˉ¹ BA (1,20 sürgün/eksplant), 5 mg lˉ¹ BA (1,36 sürgün/eksplant) ve 2,5 mg lˉ¹ BA (1,08 sürgün/eksplant) ve 0,125 mg lˉ¹ TDZ (1,03 sürgün/eksplant), 0,25 mg lˉ¹ TDZ (1,52 sürgün/eksplant), 0,5 mg lˉ¹TDZ (1,16 sürgün/eksplant) dozlarından elde edilmiştir. Maxma14 anacında ise bu oranlar 2 mg lˉ¹ TDZ (1,2 sürgün/eksplant), 1,5 mg lˉ¹ TDZ (1,03 sürgün/eksplant), 1 mg lˉ¹ TDZ (0,96 sürgün/eksplant) ve 20 mg lˉ¹ BA dozunda (1,26 sürgün/eksplant), 10 mg lˉ¹ BA (1,10 sürgün/eksplant) şeklindedir.

Anaçların yapraklarından çalışılan rejenerasyon denemelerinde 0,54 µM NAA ilave edilerek hazırlanan WPM ortamı kullanılmıştır. Denemelerde hormonların, karanlık inkübasyonlarının ve ön muamelerinin yaprak rejenerasyonu üzerine etkisi araştırılmıştır. Maxma14 anacında rejenerasyon elde edilememiş, F 12-1 kiraz anacı yapraklarında %5 oranında BA 2,5 mg lˉ¹ (karanlık), %5 oranında BA 10 mg lˉ¹ (aydınlık) ve TDZ 2 mg lˉ¹ (aydınlık) %5 oranında rejenerasyon elde edilmiştir. Karanlık uygulamasının (5, 10, 15, 20 gün) rejenerasyona etkisi araştırılmıştır. F 12-1 anacında 5 ve 15 gün karanlık uygulaması %2,5 rejenerasyon oranı elde edilmiştir. Rejenerasyon oranı arttırmak için uygulanan TDZ ve BA ön mualeme çalışmalarından sonuç alınamamıştır. IBA kullanılan köklenme denemelerinde Maxma14 ve F12-1 anaçlarında en iyi köklenme oranları IBA 2 mg lˉ¹ ve IBA 1 mg lˉ¹ dozlarında görülmüştür. Rejenerasyondan elde edilen bitkiler 2 mg lˉ¹ IBA ortamında köklenmeye alınmış daha sonra toprağa aktarılarak dış koşullara alıştırılmıştır.

Anahtar Kelimeler: Prunus avium L., Rejenerasyon, Multiplikasyon, NAA, BA, TDZ, Kiraz 2013, 62 sayfa

ABSTRACT

M.Sc. Thesis

IN VITRO REGENERATION AND MULTIPLICATION OF MAXMA14 (Prunus mahaleb L. × P. avium L.) AND MAZZARD F12-1 (P. avium L.) CHERRY ROOTSTOCKS

Fulya DEMİR

Süleyman Demirel University Graduate School of Applied and Natural Sciences Agricultural Biotechnology

Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Fatih Ali CANLI

In this thesis, in vitro multiplication and regeneration of Mazzard F 12-1 and Maxma 14 rootstocks were studied. In multiplication studies, effect of BA, TDZ and their different concentration on in vitro shoot propagation were investigated. MS medium was used in these studies. The best results on multiplication obtained from 20 mg lˉ¹ BA (1.40 /explant), 10 mg lˉ¹ BA(1,20 /explant), 5 mg lˉ¹ BA (1,36 /explant), 2,5 mg lˉ¹ BA (1,08 /explant), 0,125 mg lˉ¹ TDZ (1,03 /explant), 0,25 mg lˉ¹ TDZ (1,52 /explant) and 0,5 mg lˉ¹ TDZ (1,16 /explant). In Maxma 14, the best result were obtained from 2 mg lˉ¹ TDZ (1,2 /explant), 1,5 mg lˉ¹ TDZ (1,03 /explant), 1 mg lˉ¹ TDZ (0,96 /explant), 20 mg lˉ¹ BA (1,26 /explant), and 10 mg lˉ¹ BA (1,10 /explant).

Regeneration studies carried out on WPM medium containing 0,54 µM NAA. In regeneration studies, the effects of Plant Growth Regulators (PGR), dark and pre- treatments were investigated. No shot regeneration was obtained in Maxma 14. In Mazzard F 12-1 %5 shoot regeneration was obtained in BA 5 mg lˉ¹, BA 10 mg lˉ¹ and TDZ 2 mg lˉ¹. Effect of dark incubation (5, 10, 15 and 20 days) on regeneration was also investigated and % 2,5 regeneration was obtained in 5 and 15 days dark incubation. Optimization studies with TDZ and BA were carried out to increase the regeneration rates without success. IBA was used to the rootstocks and the best rooting percentages were obtained with 2 mg lˉ¹ IBA and 1 mg lˉ¹ IBA. Shoots obtained from regeneration studies were rooted in MS medium containing 2 mg lˉ¹ IBA then transferred to soil and acclimatized.

Keywords: Prunus avium L., Regeneration, Multiplication, NAA, BA, TDZ, Cherry 2013, 62 pages

TEŞEKKÜR

Bu araştırma için beni yönlendiren, maddi manevi desteğini esirgemeyen değerli Danışman Hocam Doç. Dr. Fatih Ali CANLI’ya teşekkürlerimi sunarım.

Araştırmanın yürütülmesinde manevi yardımlarını gördüğüm, sorunların üstesinden beraber geldiğimiz arkadaşlarım Ayşe OLYAÇ, Duygu GEYİK ve Sevde KÖSE’ ye, her konuda desteğini ve yardımlarını esirgemeyen Uzman Biyolog Belkıs MUCA’ ya, çalışmalarımız sırasında destek veren Ziraat Yüksek Mühendisi Özgür YILMAZ’ a, tez dönemi boyunca yanımızda olan Safiye ÖZÇELİK’ e ve Ayşe SOYLU’ ya teşekkürü bir borç bilirim.

3504-YL1-13 No`lu Proje ile tezimi maddi olarak destekleyen Süleyman Demirel Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Yönetim Birimi Başkanlığı’na teşekkür ederim.

Tezimin her aşamasında beni yalnız bırakmayan aileme yardımları ve anlayışları için sonsuz sevgi ve saygılarımı sunarım.

Fulya DEMİR ISPARTA, 2013

ŞEKİLLER DİZİNİ

Sayfa Şekil 3.1. Sterilizasyonu yapılmış, dikime hazır sürgünler ...... 17 Şekil 3.2. Sürgünlerin dikimi için kullanılan kültür tüpleri...... 17 Şekil 3.3. Kültür odası rafları ...... 18 Şekil 3.4. Yaprakların orta damarına yapılan yaralama işlemi ...... 19 Şekil 3.5. İklim odasında 1 ay beklemeye alınmış rejenerasyon denemeleri ...... 20 Şekil 3.6. Karanlık uygulaması için ışıkla teması kesilen petriler ...... 21 Şekil 3.7. Mazzard F 12-1 kiraz anacında TDZ ön muamelesinin uygulanması ...... 22 Şekil 4.1. F12-1 anacında BA multiplikasyon denemesinden bir görüntü...... 24 Şekil 4.2. Benziladenin (BA)’ in Maxma 14 anacında multiplikasyon üzerine etkileri ...... 26 Şekil 4.3. Thidiazuron (TDZ)’ un Mazzard F12-1 anacında multiplikasyonu üzerine etkileri ...... 27 Şekil 4.4. Maxma 14 anacında TDZ multiplikasyon denemesinden bir görüntü ...... 29 Şekil 4.5. BA 10 mg lˉ¹ (aydınlık) dozunda yapraktan elde edilen rejenerasyon ..... 30 Şekil 4.6. BA 2,5 mg lˉ¹(karanlık)dozunda yapraktan elde edilen rejenerasyon ...... 31 Şekil 4.7. Maxma14 anacında rejenerasyon denemesinden bir görüntü ...... 32 Şekil 4.8. TDZ 2 mg lˉ¹ (aydınlık) dozunda yapraktan elde edilen rejenerasyon ...... 34 Şekil 4.9. Mazzard F12-1 anacının rejenerasyon denemesinde oluşan pembe-yeşil renkteki kalluslardan bir görüntü ...... 35 Şekil 4.10. Maxma14 anacında TDZ 1.5 mg lˉ¹dozundaki rejenerasyon denemesinde oluşan kalluslar ...... 36 Şekil 4.11. Maxma14 anacında TDZ Rejenerasyon denemesinde kök oluşumu ...... 37 Şekil 4.12. Benziladenin (BA) + Naftelenasetikasit (NAA) kombinasyonlarından kurulan rejenerasyon denemeleri ...... 38 Şekil 4.13. (a) BA 2,5 mg lˉ¹ 5günlük karanlık uygulamasıyla yapraktan elde edilen rejenerasyon (b) BA 2,5 mg lˉ¹ 15 gün karanlık uygulamasıyla elde edilen rejenerasyon ...... 40 Şekil 4.14. 24 saat TDZ ön muamele uygulanan Mazzard F12-1 anacının Yaprakları ...... 42 Şekil 4.15 Mazzard F12-1 anacında TDZ ön muamele denemesinden bir görüntü 43 Şekil 4.16. IBA’nın Maxma 14 anacının köklenmesi üzerine etkileri ...... 46 Şekil 4.17. IBA’nın Mazzard F12-1 anacının köklenmesi üzerine etkileri ...... 47 Şekil 4.18. (A)Maxma14 anacının toprağa aktarımı (B)Rejenerasyon bitkisinin otoklavlanmış toprak ve besin ortamıyla toprağa alıştırılması. (C)Torflu toprağa aktarım (D) F12-1 anacının dış koşullara alıştırılması ...... 48

vii

ÇİZELGELER DİZİNİ

Sayfa Çizelge 1.1. Dünyadaki önemli kiraz üretici ülkeler ve 2004-2009 yıllarına ait üretim miktarları (ton) ...... 2 Çizelge 2.1. Prunus türlerinin çeşitli eksplantları kullanılarak geliştirilen rejenerasyon protokolleri ...... 12 Çizelge 4.1. Benziladenin (BA)’ inMazzard F 12-1 kiraz anacı multiplikasyonu üzerine etkileri ...... 25 Çizelge 4.2. Benziladenin (BA)’ in Maxma14 kiraz anacı multiplikasyonu üzerine etkileri ...... 26 Çizelge 4.3 Thidiazuron (TDZ) ‘ in Mazzard F 12-1 kiraz anacı multiplikasyonu üzerine etkileri...... 28 Çizelge 4.4. Thidiazuron (TDZ)’in Maxma14 kiraz anacı multiplikasyonu üzerine etkileri ...... 29 Çizelge 4.5. Benziladenin (BA)’ in aydınlık ortamda Mazzard F 12-1 kiraz anacının yaprak rejenerasyonuna etkisi ...... 30 Çizelge 4.6. Benziladenin (BA)’in karanlık ortamda (10 günlük karanlık inkübasyon uygulaması) F 12-1 Kiraz Anacının Yaprak Rejenerasyonuna Etkisi...... 31 Çizelge 4.7. Benziladenin (BA)’in aydınlık ortamda Maxma 14 kiraz anacının yaprak rejenerasyonuna etkisi ...... 32 Çizelge 4.8. Benziladenin (BA)’in karanlık ortamda (10 günlük karanlık inkübasyon uygulaması) Maxma 14 kiraz anacının yaprak rejenerasyonuna etkisi ...... 33 Çizelge 4.9. Thidiazuron (TDZ) ‘ in aydınlık ortamda Mazzard F 12-1 kiraz anacının yaprak rejenerasyonuna etkisi...... 34 Çizelge 4.10.Thidiazuron (TDZ) ‘ in karanlık Ortamda (10 günlük karanlık inkübasyon uygulaması) F 12-1 kiraz anacının yaprak rejenerasyonuna etkisi ...... 35 Çizelge 4.11.Thidiazuron (TDZ) ‘ in aydınlık ortamda Maxma 14 kiraz anacının yaprak rejenerasyonuna etkisi ...... 36 Çizelge 4.12.Thidiazuron (TDZ) karanlık ortamda (10 günlük karanlık inkübasyon uygulaması)Maxma 14 kiraz anacının yaprak rejenerasyonuna etkisi ...... 37 Çizelge 4.13.Mazzard F12-1 kiraz anacının naftelenasetikasit (NAA) ve benziladenin (BA) hormonları üzerinde yapılan çalışmaları ...... 39 Çizelge 4.14.Rejenerasyon gösteren TDZ Muamelesi etrafında optimizasyon ...... 39 Çizelge 4.15. Mazzard F12-1 kiraz anacının yaprak rejenerasyonu gösteren benziladenin (BA) üzerinde yapılan karanlık inkübasyon çalışmaları ...... 41 Çizelge 4.16. Mazzard F12-1 kiraz anacının yaprak rejenerasyonu gösteren thidiazuron (TDZ) üzerinde yapılan karanlık inkübasyon çalışmaları ...... 41 Çizelge 4.17.Mazzard F 12-1 kiraz anacının yaprak rejenerasyonu gösteren Thidiazuron (TDZ) dozu üzerinde uygulanan TDZ ön muamelesi uygulaması ...... 42 Çizelge 4.18.Mazzard F 12-1 kiraz anacının yaprak rejenerasyonu gösteren thidiazuron (TDZ) dozu üzerinde uygulanan TDZ ön muamelesi uygulaması 2 ...... 43

viii

Çizelge 4.19. Mazzard F12-1 kiraz anacının yaprak rejenerasyonu gösteren 10 mg lˉ¹ benziladenin (BA) dozu üzerinde 1 saat uygulanan BA ön muamelesi uygulaması (aydınlık) ...... 44 Çizelge 4.20. Mazzard F12-1 kiraz anacının yaprak rejenerasyonu gösteren 2,5 mg lˉ¹ benziladenin (BA) dozu üzerinde 1 saat uygulanan BA ön muamelesi uygulaması (karanlık) ...... 45 Çizelge 4.21.Indole-3-butyric acid (IBA) bitki büyüme düzenleyicisinin Maxma 14 kiraz anacının köklenmesi üzerine etkisi ...... 45 Çizelge 4.22.Indole-3-butyric acid (IBA) bitki büyüme düzenleyicisinin F 12-1 kiraz anacının köklenmesi üzerine etkisi...... 46

SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ

2,4-D: 2,4-dikloro fenoksi acetic acid 2iP: İzopentil Adenin ABA: Abscisic Acid BA: Benzyladenin BAP: Benzylaminopurin ddH2O: Çift distile saf su DKW: Driver and Kuniyuki GA3: Gibberellic acid IAA: Indole Asetic Acid IBA: Indole-3-Butyric Acid KIN: Kinetin M: Molar mg: Miligram ml: Mililitre mM: Milimolar MS: Murashige and Skoog NAA: Naphtalene Asetic Acid PG: Phloroglucinol pH: Hidrojen konsantrasyonunun eksi logaritması ppm: mgl-1 QL: Quoirin and Lepoivre rpm: Dakikada dönüş sayısı STS: Silver thiosulfate TDZ: Thidiaziroun UV: Ultraviole WPM: Loyd and McCown μl: Mikrolitre μM: Mikromolar

1. GİRİŞ

Prunus, Rosaceae (gülgiller) familyasının Prunoideae alt familyasında bulunan kiraz, karayemiş, kayısı, şeftali ve erik gibi meyve ağaçlarını içeren cinsdir. Çiçekler genellikle pembe ile beyaz renkli, beş taç yaprak ve beş çanak yapraklıdır, tekli veya iki, altı ya da daha fazla salkımdan oluşan şemsiye çiçek mevcuttur. Meyve bütün türlerde oldukça büyük bir çekirdekten oluşan drupadır. Yapraklar basit, genellikler mızraksı, lopsuz ve yaprak kenarı tamamen dişlidir ( Anonim, 2012 ).

Rosaceae familyası Dünya’da ılıman iklim bölgelerinde ekonomik önem bakımından üçüncü sıradadır. Genel olarak Rosaceae familyası, 4 alt familyaya ayrılmıştır. Bunlardan birisi olan Prunoideae alt familyası kayısı (Prunus armeniaca L.), şeftali (P. persica L.), kiraz (P. avium L.), vişne (P. cerasus L.), erik (P. domestica L.) ve badem [(P. amygdalus Batsch=P.dulcis (Miller) D.A. Webb)] gibi bazı önemli meyve türleri ile kara kiraz (P. serotina Ehrh.) gibi orman ağaçlarını da içerir (Kaçar, 2004). Bu türlerin ülkemizdeki üretim miktarları dünyadaki diğer üretici ülkelerle karşılaştırıldığında Türkiye; dünya kiraz ve kayısı üretimi bakımından 1. sırada, vişne üretimi bakımından ise 3. Sırada, şeftali ve nektarin üretimi bakımından 7. sırada, erik üretimi bakımından 8. sırada yer almaktadır ( Taner, 2001 ; Arıcı, 2008 ).

Türkiye ve dünyada ılıman iklim meyve türleri içerisinde önemli bir yere sahip olan kiraz (Prunus avium L.) tür olarak botanik sınıflandırmada Rosales takımının, Rosaceae familyasının, Prunoidae alt familyasının, Prunus cinsi ve Cerasus alt cinsi içerisinde yer almaktadır (Öz, 1988).

Ülkemizde kiraz ve vişne yetiştiriciliği sürekli önem kazanmaktadır. Kiraz-vişne için oldukça uygun ekolojiye sahip olan ülkemiz, gerek kalite gerekse miktar yönünden üretici ülkeler arasında önemli bir yere sahiptir. Son yıllarda giderek artan ihracat imkanları ve dışarıda oluşturulan ‘Türk Kirazı’ imajının pekiştirilmesi ve pazar payının genişletilmesi için modern kiraz yetiştiriciliğinin sağladığı üstün kalite ve yüksek verimin üreticilerimiz tarafından da yakalanması gerekmektedir (Gülcan vd., 1995).

Son yıllarda mevsimsel dalgalanmalar göz ardı edildiğinde Türkiye’de kiraz üretiminde (Çizelge 1.1) devamlı bir artış görülmektedir (Anonim, 2011). Bu artış dikim alanlarının artmasından çok üreticinin kültürel işlemlere önem vermesi ve dolayısı ile kalite ve

1 verim artışı şeklinde karşımıza çıkmaktadır. Ülkemizde, özellikle fidancılık ve sulama olanaklarının gelişmesi, hasat sonrası işlemleri ile derin dondurma ve şoklama endüstrilerindeki gelişmeler kiraz yetiştiriciliğinin yaygınlaşmasına katkıda bulunmuştur. Ülkemizde özellikle son 10 yıldır kiraz üretiminde görülen artış esas olarak dış pazarda yakaladığı taleple açıklanmaktadır (Temurtaş, 2011).

Çizelge 1.1. Dünyadaki önemli kiraz üretici ülkeler ve 2004-2009 yıllarına ait üretim miktarları (ton).

2004 2005 2006 2007 2008 2009 Türkiye 245 000 280 000 310 254 398 141 338 361 417 694 ABD 256 824 227 522 266 349 281 862 225 073 390 000 İran 174 576 224 892 225 000 200 000 198 768 225 000 İtalya 95 169 101 295 110 910 106 189 134 407 116 200 Ukrayna 85 300 100 200 48 900 68 200 74 700 53 000 İspanya 83 467 95 726 91 672 75 738 72 466 96400 Romanya 50 988 117 859 104 791 65 163 67 664 67 874 Rusya 100 000 93 000 50 000 100 000 63 000 69 000 Yunanistan 46 714 44 201 43 700 52 595 42 000 48 051

Kiraz fidanı, çöğür ve klon anaçları üzerine aşılama yapılarak yetiştirilmekle birlikte eskiden dünyada en yaygın olarak P. avium. ve P. mahaleb çöğür anaçları kullanılmaktaydı. Bu anaçların büyük taçlı ve geç meyveye yatan, kritik iklim koşullarında kiraz-vişne yetiştiriciliğine olanak veren ve değişik hastalık-zararlılara dayanıklı gibi özelliklere sahip anaç elde edebilmek için yoğun olarak birçok ülkede çalışmalar başlamıştır. Günümüzde, P.avium, P.mahaleb ve P.cerasus türü içinde çok sayıda çöğür ve klon anaçları ile, tür ve türler arası melezleme yoluyla elde edilen hibrit klon anaçları bulunmaktadır. P. avium çöğür anaçlarına örnek olarak, Alkavo, Hüttner 170×53, KW 101, Mazzard, OCR-1 verilebilir. Aynı türün klon anaçlarına ise, Charger, Cristimar I.A.I., F 12/1’i örnek olarak vermek mümkündür. Tür ve türler arası melezlemeler sonucunda elde edilen hibrit klon anaçları arasında ise Colt, Damil (GM 61/1), Camil (GM 79), Inmil (GM 9), Gisela klonları ve M×M (Maxma) klonları bulunmaktadır (Lezzoni vd. 1991).

Çelik ile çoğaltma klon anaçlarının çoğaltılmasında vegetatif yöntemlerden en fazla kullanılanıdır. Bazı anaçlarda daldırma yöntemi de uygulanabilir. Bu yolla kısa sürede geniş çaplı üretim ve çok sayıda anaç materyali elde etmek mümkündür. In vitro tekniklerden geniş çaplı üretim ve kısa sürede çok sayıda anaç materyali elde etmek

2 amacı ile son yıllarda yaygın olarak yararlanılmaktadır. In vitro teknikler hızlı ve geniş çaplı üretim için birçok meyve türünün çoğaltılmasında da kullanılmaktadır (Bajaj, 1986).

Organize meristemlerden, henüz olgunlaşmamış veya olgunlaşmasını tamamlamış somatik hücrelerden direk (organogenesis veya somatik embriyogenesis) veya indirek (kallus, protoplast, … vb.) yollarla bitkilerin çoğaltılması ve köklendirilmesi işlemine genel olarak mikroçoğaltım denilmektedir. ABD’de doku kültürünün ticari uygulaması 1970’de başlamış (öncelikle orkidelerde ve süs bitkilerinde) ve bu yolla elde edilen ürünlerin pazar değeri bugün yılda 15 milyar dolara ulaşmıştır. Daha az sürgün elde edilmesine rağmen uç ve yan meristemlerden kitle çoğaltım ticari olarak diğerlerinden daha fazla kullanılan bir metottur (Brown ve Thorpe, 1995; Günal, 2006).

Mikroçoğaltım uygulamasında üretime, sürgün ucuyla başlanır (Sauer, 1996; Bondok vd. 1989; Borkowska, 1990). Sürgün uçlarının sürmesi sonucu oluşan uzun sürgünlerden göz içeren boğumların, tekrar kültüre alınması yoluyla (tek boğum kültürü) ya da sürgün uçlarının, yaprak koltuklarında bulunan uyur gözlerin, sitokinin uygulamalarıyla sürdürülmesi sonucu yan dalların oluşturulması yoluyla gerçekleştirilir (Zimmerman, 1991; Gunal, 2006).

Prunus türlerinde yeni çeşit ıslahı, mevcut çeşitlerin az sayıdaki ortak atalardan gelmeleri (Scorza vd., 1985), uzun gençlik kısırlık dönemlerinin olması, karakterlerin ifadesi açısından genç ağaçlar ile olgun ağaçlar arasında farklılılar bulunması (Baird vd., 1996), poliploidi, kısırlıklar, karşılıklı ve kendine uyuşmazlıklar, geniş populasyonlardan iyi olanların seçiminin ve arazide değerlendirmelerinin uzun yıllar sürmesi gibi etkenler yüzünden güçleşmektedir (Canlı ve Tian, 2008a,b).

İstenilen karekteri kontrol eden genin hücrelere doğrudan transferini sağlayan ve transfer edilmiş hücrelerden in vitro regenerasyonu yolu ile transgenik bitkilerin elde edilmesi bitki genetik transformasyonunu oluşturur. Gen transferi teknikleri kullanılarak söz konusu çeşidin diğer özelliklerini etkilemeden bitkilerin istenilen her hangi bir özel karekteri hızla değiştirilebilir. Geleneksel yöntemlerle kendini ispatlamış çeşitlerin bir karakter bakımından geliştirilmesi, diğer özelliklerini etkilemeden pek mümkün olmamaktadır. Ticari öneme sahip meyve çeşitlerinin geriye melezleme yolu ile bir karakter yönünden geliştirilmeleri, bu generasyon süreleri yüzünden çok uzun yıllar gerektirmekte, belli oranda bozulmalar içerebilmekte ve de kısırlıklar ve

3 uyuşmazlıklar yüzünden mümkün olamayabilmektedir veya çok güçtür (Canlı ve Tian, 2008a,b). Genetik transformasyon özellikle odunsu bitkilerde klasik yöntemin beraberinde getirdiği uzun gençlik kısırlık dönemi, arazide değerlendirilmeleri ve kendine ve karşılıklı uyuşmazlık gibi olumsuz etkilerin üstesinden gelmemizde kolaylık sağlamaktadırlar (Canlı vd., 2008).

Gen mühendisliği teknikleri, kendine verimlilik virüslere ve çeşitli hastalıklara dayanım gibi bazı önemli genlerin, ticari Prunus çeşitlerinin (erik, kiraz, vişne, kayısı, şeftali) genomuna hızlı bir şekilde transferini mümkün kılarak daha ekili genetik ıslaha olanak sağlayabilir (Mante vd., 1991; Canlı ve Tian, 2008a,b).

Transformasyonla mevcut çeşitlerini geliştirmek isteyen her program için bitki rejenerasyon protokollerinin geliştirilmesi bir ön koşuldur. Rejenerasyon, genetik mühendisliği tekniklerinin bitki üretimine uygulanmasında anahtar bir uygulamadır. Meyve ağaçları adventif sürgün regenerasyonu otsu türlere göre daha zor bir uygulamadır (Bartish ve Korkhovoi 1997; Trifonova ve Atanassov 1999).

2. KAYNAK ÖZETLERİ

2.1. Multiplikasyon Çalışmaları

Ekolojik koşullardan bağımsız olarak yapılmakta olan in vitro koşullarda yapılan mikro çoğaltma, klasik yöntemlerle çoğaltmaya alternatif bir yaklaşım sağlamaktadır. Bu yaklaşım sayesinde büyük boyutlarda yapılan mikroüretim çalışmalarıyla yüksek potansiyelde hız, zaman ve yerden kazanç sağlamaktadır (Randal ve Abner, 1986). Bugün kiraz anaç ve çeşitlerinin çoağltımı mikroçoğaltım ile başarılı bir şekilde gerçekleştirilmektedir (Hammatt ve Grant, 1993; Kepenek, 1994a, Kepenek, 1994b, Kepenek, 1995).

In vitro besin ortamına ilave edilen büyümeyi düzenleyiciler (2,4-D, IBA, IAA, Kinetin, BAP, vb.) gelişmeyi büyük ölçüde etkilemektedir. Doku kültürü ile üretim çalışmalarında genellikle besin ortamlarında kullanılan büyümeyi düzenleyiciler kendi aralarında farklı sonuçlar alınmaktadır. Doku kültürü yöntemleriyle çoğaltılmış Prunus türlerinin köklendirilmesiden sonra hayatta kalmalarında dış koşullara alıştırılması oldukça önemlidir. Genotip ve oksinler, bitkinin köklenmesinde önemli faktörler arasında önem yer almaktadırlar (Günal, 2006).

Pevalek-Kozlina ve Jelaska (1989), modifiye edilmiş WPM temel besin ortamına 2.2 μM benziladenin(BA), 2.5 μM 3-indolbütrikasit (IBA) ve 0.3 μM gibberellik asit (GA3)ilavesiyle yabani kiraz anacının (P. avium) in vitro üretiminde sürgün ucu ve axillary tomurcuk kullanılarak en uygun sürgün çoğaltımın sağlandığını ve in vitro’da elde edilen sürgünlerde de en iyi köklenmenin ise 4.9 μM IBA içeren besi ortamında veya axillary sürgünlerin 2.46 μM IBA solüsyonu ile muamelesinden sonra elde edildiğini belirtmişlerdir.

Al-Sabbagh vd. (1999), çalışmalarında, yarı bodur Maxma 14 (P. avium ) kiraz anacının in vitro üretiminin sağlanmasında MS temel ortamına 4.44 μM BA ve 0.49 μM IBA ilavesiyle 4 haftalık süre içinde yaklaşık 6 katı sürgün ucu ve axillary tomurcuk (yan tomurcuk) gelişiminin görüldüğü; köklenmenin ise yine 4 haftalık sürede yine katı ve sıvı MS ortamına 0.49 μM NAA veya 0.49, 2.45 μM IBA ilavesiyle köklenmenin elde edildiğini rapor edilmiştir. Köklenmenin % 100 oranında sıvı besi ortamında elde edildiğini, yüksek oksin dozlarında köklenmenin 3-5 gün daha geciktiği belirtilmiştir. Yine köklenmeyle ilgili Al-Sabbagh vd. (2000) tarafından in vitro’ da yapılan çalışmalarında ikinci haftada köklenme ortamına aktarılan sürgünlerde köklerin oluşmaya başladığı ve üçüncü haftada dikime uygun duruma geldiği rapor edilmiştir.

Demiral ve Ülger (2008), Gisela-5 anacının doku kültürü yoluyla çoğaltılması için yıllık sürgünlerin yan ve tepe tomurcukları eksplant olarak kullanılarak, dezenfekte edildikten sonra çoğaltım aşamasında 1.0 mg lˉ¹IBA + 0.75 mg lˉ¹ BAP 1.0 mg lˉ¹IBA + 1.0 mg lˉ¹BAP, 2.0 mg lˉ¹ IBA + 0.75 mg lˉ¹BAP ve 2.0 mg lˉ¹IBA + 1.0 mg lˉ¹BAP içeren MS besi ortamında kültüre almışlardır. Köklendirme aşamasında MS ortamına 0, 1, 2, 4 ve 6 mg lˉ¹ NAA ilave edilmiştir. Çoğaltım aşamasında en iyi sürgün sayısı 2.93 adet ile 1.0 mg lˉ¹IBA + 0.75 mg lˉ¹BAP ve en iyi sürgün boyu 1.68 cm ile 2.0 mg lˉ¹IBA + 1.0 mg lˉ¹BAP uygulamalarından elde edilmiş, en iyi köklendirme ise %92.88 ile 6 mg lˉ¹NAA uygulamasında olduğu saptanmıştır

Yıldırım vd. (2007), Hacıhaliloğlu kayısı çeşidinin en iyi kültüre başlama zamanının Mayıs ayı olduğu, in vitro kültüre alınması, çoğaltılması, köklendirilmesi ve aklimatizasyonuna etki eden faktörler üzerine yapılan çalışmadan alınan sonuçlarda görülmüştür. In vitro kültürlerin başlatılması için, eksplant alım tarihleri arasında belirgin farklılıklar olduğu belirtilmiştir.. TDZ, BA ve Kinetin gibi sitokininlerin ve BA’in faklı konsantrasyonlarının in vitro kültür üzerindeki etkileri çalışılmış, sürgün

çoğaltımında BA'nın farklı konsantrasyonları arasında 1 mg lˉ¹ BA'nın en iyi sonuç verdiği tespit edilmiştir. Sürgün sayısı bakımından 2.0 mg lˉ¹BA içeren besi ortamı ise en iyi sonuç veren değer olarak saptanmıştır. Bu oran, 1 mg lˉ¹BA içeren ortamdan kontrol grubuna göre farklılık göstermiştir.

Yıldırım vd. (2007), karbon kaynaklarının proliferasyon üzerine etkisini araştırmak için glikoz, sakkaroz, fruktoz ve laktozun %3'lük konsantrasyonları çalışılmış ve proliferasyon bakımından test edilen şeker tipleri arasında sakkaroz en iyi sonucu verdiği görülmüştür. En iyi köklenme oranı ise 2.0 mg lˉ¹ IBA ilave edilmiş MS besin ortamından alınmıştır.

Goudarzi vd. (1997), F 12/1 kiraz anacının sürgün ucu ile çoğaltılması üzerinde çalışma yapmışlar ve materyalin sterilizasyonunda civa klorür kullanmışlardır. Eksplantların çoğalması aşamasında, MS besin ortamının tuzları, LS besin ortamının vitaminleri ile NAA ve BA içeren bir besin ortamı kullanılmıştır. Çoğalma aşamasında en iyi sonuç, 0.25 mg lˉ¹NAA ile 1 mg lˉ¹BA bulunan ortamda görülmüştür.

Hammerschlag vd. (1987), şeftali çeşitlerinin in vitro multipikasyonunu ve köklenmesi etkileyen faktörler üzerine çalışma yapmışlardır. Sürgün çoğaltma ortamına 8.8 μM BA eklendiklerinde multipikasyonunun çok iyi gerçekleştiğini gözlemlemişlerdir. Fouad vd., (1993), ‘Meet- Ghamt’ şeftalileri ve ‘Nemaguard’ ın sürgün uçları kültürü üstüne yapılan çalışmalarında eksplant başına sürgün sayısı ortalama en yüksek Nemaguard için kullanılan 0.2 mg lˉ¹ BA + 0.01 mg lˉ¹ IBA ve ‘Meet-Ghamre’ için 0.2 mg lˉ¹ BA + 0.01 mg lˉ¹ IBA kombinasyonu olduğunu bildirmişlerdir. Üçüncü deneme yılında, bir multipikasyonla elde edilen sürgünler BA ile desteklenmiş farklı konsantrasyonlardaki ortamlarda yetiştirilmiştir. Sürgün sayısı BA konsantrasyonunu 1 mg lˉ¹den 5 mg lˉ¹ye çıkarılmasıyla eksplant başına artmış ancak sürgün uzunluğunun azaldığı görülmüştür.

Marino vd. (1991), 'San Castrese' ve 'Portici' sorbitol kayısı çeşitlerinin 116.8 mM sükroz, 58.4 mM GA3 ve IBA farklı BA konsantrasyonları ile birlikte zenginleştirilmiş modifiye MS ortamında köklenme kapasitesi ve in vitro çoğalması test edilmiştir. Buna göre çoğalma BA konsantrasyonun artmasıyla doğru orantılıdır ve çoğu durumda sorbitol ortamı üzerine sağlanmıştır.

Günal (2006), Gisela 5 ve Maxma 14 kiraz anaçlarının doku kültürü ile çoğaltılması çalışmalarında kiraz klon anaçlarının sürgün ucu kültürü ile eksplant olarak tepe ve yan

6 sürgün uçları, temel besin ortamı olarak ise MS ortamı kullanılmıştır. Multiplantasyonla ilgili yapılan çalışmalarda, GA3 (0.25 mg lˉ¹) sabit olmak üzere, sonuç olarak yan sürgün çoğaltımında kullanılan BAP’ın tek başına düşük dozları (0.1 mg lˉ¹ve 0.5 mg lˉ¹) ve düşük dozdaki 2,4-D (0.01 mg lˉ¹) ile birlikteki kombinasyonları diğer doz ve kombinasyonlarına göre daha başarılı olduğu görülmüştür.

Ružić (2008), Lapins tatlı kiraz çeşidinin in vitro multipikasyonun sağlanması için MS ortamına eklenen sitokininlerin etkisine bakıldığında BA, isopentenyl adenine (2iP), Kinetin ve TDZ, 1, 2, 5, 10 ve 15 μM konsantrasyonlarında; IBA 0, 0.5, 2.5 ve 5 μM konsantrasyonlarında oksinle kombine etmiştir. Buna göre aksiyal ve lateral sürgünlerin boyuna ek olarak BA ortamı ile en yüksek multipikasyon sağlanmıştır.

Ružić vd. (2000), mikroçoğaltım çalışmalarını tatlı kiraz anacı Gisela 5 MS ortamı üzerinde 0.3μM GA3 ve 0.5μM NAA, 4.4 μM BA ile ¼ MS ve ½ MS, makro tuzlar 2× MS, içeren MS ortamlarında yapılmıştır. Gisela 5’in en iyi büyüme ve gelişmeyi N ve P alımı ile MS ve MS 2× ortamında gösterdiği ayrıca büyüme ve multipikasyonun da ortamdan bu elementlerin alımına bağlı olduğunu rapor etmişlerdir.

Fidancı vd. (2005), Gisela 5, Maxma 14 ve Tabel/Edabriz’in hızlı çoğaltma tekniklerini in vitro’da belirlemeye çalışmışlardır. Eksplantlar sürgün ucu ve yan tomurcuklar olarak kullanılmıştır. MS ortamına 0.1 mg lˉ¹ GA3, 0.1 mg lˉ¹ NAA veya 0.1 mg lˉ¹ IBA, 0.5-1 mg lˉ¹ BA, 20 gr/l şeker ve 7 gr lˉ¹ agar ilave edilerek kültür ortamı oluşturulmuştur. Kültür oluşturma aşamasında enfeksiyon problemi yaşanmış, kardeşlenme aşamasında alt kültürlerde zaman zaman vitrifikasyon (camsılaşma) çok önemli bir problem olarak belirtilmiştir. ½ MS makro, MS mikro elementler ve 1 ppm IBA içeren köklenme ortamında üç haftalık sürede bekletilmişler ve % 95–100 köklenme başarısı elde edilmiştir.

Güçlü vd. (2010), Gisela 5, Maxma 14, Maxma 60 ve SL 64 klonal kiraz anaçlarının doku kültürü yoluyla çoğaltmasında sürgün uçları eksplant olarak kullanılmıştır. Çalısmada, uygulanan kombinasyonlara göre sürgün sayıları; Maxma 14 anacında 3.83 ile 5.00 adet/eksplant, Gisela 5 anacında 2.16 ile 5.08 adet/eksplant, Maxma 60 anacında 2.33 ile 5.08 adet/ eksplant ve SL 64 anacında 3.58 ile 4.16 adet/eksplant oranları elde edilmiştir. Sürgün uzunlugu bakımından ise en iyi sonuçlar 1 mg lˉ¹ BAP + 0.02 mg lˉ¹ IBA + 0.5 mg lˉ¹ GA3 (1.44 -1.50 cm) ve 1 mg lˉ¹ BAP + 0.02 mg lˉ¹ IBA + 1 mg lˉ¹GA3 (1.43-1.61 cm) içeren ortamlardan elde edilmiştir.

Pevalek-Kozlina ve Jelaska (1987), kültürlerin kurulması için yabani kirazın apikal ve aksil tomurcuklarını eksplantlar olarak kullanılmışlardır. Ayrıca WPM ortamını kültürün tüm aşamalarında bazal ortam olarak kullanmışlardır. Kuruluş multipikasyon safhası ve sürgün uzamasını ise 0.3 μM GA3 ve 2.2 μM bzl-6 Ade, 2.5 μM IBA içeren ortamda uygun görmüşlerdir.

2.2. Rejenerasyon Çalışmaları

Bitki büyümeyi düzenleyiciler, eksplant tipi, standart tuz karışımları, ışık rejimleri ve ön muamelelerin regenerasyona etki ettiği bildirilmiştir (Canlı ve Tian, 2008a). Genellikle Prunus türlerininin çeşitli eksplantlarında kullanılan thidiazuron (TDZ)’ nun, BA’ den daha etkili olduğu görülmüştür (Leblay vd., 1990; Korban vd., 1992; Escalettes ve Dosba, 1993; De Bond vd., 1996; Sarwar ve Skirvin, 1997; Hammatt ve Grant, 1998). TDZ hakkında benzer sonuçlar çalışma yapılan diğer türlerde de rapor edilmiştir (Bassi ve Cossio, 1991; Ainsley vd., 2001; Yan ve Zhou, 2002; Bhagwat ve Lane, 2004; Matt ve Jehle, 2005; Blando vd., 2007; Canlı ve Tian, 2008b). Ayrıca kültürlerin ilk aşamasında karanlık inkübasyonunun (Nedelcheva ve Tsoneva, 1998; Ainsley vd., 2001; Canlı ve Tian, 2008a,b) ve TDZ inkübasyonlarının regenerasyonu artırdığı bildrilmiştir (Song ve Sink, 2005). Yaprakların yaralanmasının regenerasyonu etkilediği de belirtilmiştir (Bhagwat ve Lane, 2004; Song ve Sink, 2005).

Sürgün rejenerasyonu, Prunus türlerinde hem tohumla türetilmiş dokulardan (Lane ve Cossio, 1986; Schmidt ve Kardel-Meisner, 1992) hem de olgun dokulardan uygulanarak kanıtlanmıştır. Sürgün rejenerasyonunun olgun doku kaynaklarından elde edilmesinde çoğu raporu eksplant olarak kullanılmış (Yang ve Schmidt, 1992; Tang vd., 2002; Takashina vd., 2003; Bhagwat ve Lane, 2004; Matt ve Jehle, 2005) sürgün uçlarından direkt ve direkt olmayan sürgün rejenerasyonunu sağlanmıştır (Oh vd., 1991).

Somatik embriyogenesis, `Gerema', `ScharoÈ' ve`Schattenmorelle' (P. cerasus L.) çeşitlerinde genellikle 2,4-diklorofenoksyasetik asit (2,4-D) artı kinetin (Kin) nin birlikte birleşimi kullanıldığında gözlemlenmiştir. Bir NAA ya da BA kullanması, somatik embriyogenesis oranını düşürür. Buna karşılık, kotiledon benzeri yapılar, sürgün, yaprak ve kök oluşumu geliştirdiği görülür. Bazı durumlarda, tekrar ikinci somatik embriyolar oluşur ve içlerinde iyi gelişmiş olan somatik embriyolar çimlenir.

Ortamına 0.1 mg lˉ¹ IBA eklenmesi somatik embriyogenesis başlaması için olumlu etki yaptığı bildirilmiştir (Tang vd., 2000).

Prunus türlerinden kiraz ve vişne yapraklarında yapılan yaralama işleminin regenerasyon frekansını önemli ölçüde arttırdığı da rapor edilmiştir. Prunus türlerinde de BA rejenerasyonu teşvik konusunda TDZ den daha az etkilidir. Fakat bunun yanında BA nın daha etkin olduğu konusunda bilgilerde mevcuttur (Canli vd., 2008),

Yapraklara gibi vegetatif organlara ek olarak ayrıca rejenerasyon protokolleri geliştirirken, kotiledonlar (Mante vd., 1989), embriyolar (Schneider vd., 1992), ve protoplastlarda (Ochatt ve Power, 1988) kullanılmıştır.

Prunus türlerin hepsinde transformasyon frekansı çok düşüktür ve bir çok Prunus türü için geliştirilen transformasyon sonuçları tek vaka bildirimleri olması ve az sayıda transgenik bitki elde edilebildiğinden dolayı regenerasyon ve gen transformasyon protokollerinin geliştirilerek frekanslarının artırılması gerekmektedir. Fakat P. domestica için transformasyon protokolü, depolanmış tohum dokularının kullanıldığında tekrarlı olarak kullanılabilmiştir. Diğer Prunus türlerinde gen transferi başarılı bir şekilde gerçekleştirilmiş ve gen transfer protokolleri geliştirilmiştir ve bununla birlikte ne yazık ki Prunus türlerinden sadece Avrupa eriklerinde gen transferi hipokotil dokular kullanılarak rutin uygulanabilmektedir (Canli vd., 2008).

Kiraz ve kiraza akraba Prunus türlerin de farklı dokular kullanılarak in vitro rejenerasyonları hakkında bir takım çalışmalar yapılmıştır. Kayısı, şeftali ve kirazın olgunlaşmamış tohum kotiledonları ve şeftalinin olgun tohum kotiledonları kullanılarak (Lane ve Cossio, 1986; Mante vd., 1989; Pooler ve Scorza, 1995) ve zamanda erik, şeftali ve kayısının olgunlaşmamış embriyoları ile somatik hücre hatları kullanılarak regenerasyon gerçekleştirilmiştir (Hammerschlag vd., 1985; Mante vd., 1989; Pieterse, 1989). Regenerasyon yaprak dokusu kullanılarak erik, badem (P. dulcis Mill.), kara kiraz (P. serotina Ehrh.), yabani kiraz (P. avium ) ve kuş kirazında (P. padus L.) (Mehra ve Mehra, 1974; Bassi ve Cossio, 1991; Hammat, 1993; Miguel vd., 1996; Hammat ve Grant, 1998) başarıyla gerçekleştirilmiştir.

Kiraz için çalışılan in vitro regenerasyon tekniklerinin çoğu generatif organlar kullanılarak geliştirilmiş oldukları için ticari kiraz çeşitlerinin direk olarak bir karekter

9 yönünden iyileştirilmesi çalışmalarında kullanılmaya uygun değildir (Lane ve Cossio, 1986; Canlı ve Tian, 2008a). Aynı zamanda az sayıda çeşit için bildirildiği için bu protokollerin regenerasyon yüzdeleri düşüktür (Tang vd., 2002; Bhagwat ve Lane, 2004; Matt ve Jehle, 2005; Blando vd., 2007).

Ayrıca, badem ve erikte yaprak dokusu ve hipokotil dilimleri kullanılarak regenerasyon ve transformasyon konusunda başarıya ulaşılmıştır (Mante vd., 1991; Miguel ve Oliveira, 1999). Kiraz çeşitleri olan ‘Lapins’ ve ‘Sweetheart’ yaprakları kullanılarak sırasıyla % 71,4 ve % 54 oranlarında regenerasyon sağlanmıştır (Bhagwat ve Lane, 2004).

Espinosa vd., 2006 Amerika’nın merkezinde tomruk ve kereste üretimi için önemli olan Prunus serotina Ehrh. (Kara Kiraz) için rejenerasyon protokolü oluşturmuştur. Nodal parçalar 4.44 μM BA, 0.49 μM IBA ve 0.29 μM GA3 içeren MS ortamında kültüre alınmışlar ve 3 genotipin yaprak eksplantları WPM ortamına konulmuştur. Ortama 0, 2.27, 4.54 ve 6.81 μM TDZ; 0, 0.54, 1.07 ve 5.37 μM NAA, 0, 4.44, 8.88 ve 13.32 μM BA; 0, 0.54, 1.07 ve 5.37 μM NA büyümeyi düzenleyicileri ilave edildikten sonra kültürler 3 veya 5 hafta karanlık ortamda tutulmuş ve sonra 16 saat fotoperiyod koşullarına altında bekletilmişleridir. Sürgün rejenerasyonunda en fazla eksplant sayısı, 3 hafta karanlık uygulamasından sonra 16 saatlik fotoperiyod koşullarında bekletilen 5.05 ± 1,14 ile 2.27 μM TDZ + 0.54 μM NAA dozundan elde edilmiştir. En yüksek sürgün rejenerasyon oranı (38.3) ve sürgün sayısı (4.13 ± 0.97), 6.81 μM TDZ ve 1.07 μM NAA içeren ortamdan alınmıştır. Adventif sürgünlerde en yüksek köklenme (% 27) ve kök sayısı (2.3 ± 0.2), 2.5 μM IBA içeren ortam ve 7 gün karanlık uygulamasından sonra 16 saat fotoperyod uygulamasından elde edilmiştir. Nodal eksplantları çıkarılmış stok kültürlerin en yüksek köklenme oranı % 70 olmuştur. 4 gün karanlık ardından 16 saat fotoperyod uygulamasıyla, 2.5 μM IBA içeren ortamdan sürgün başına 2.7 ± 0.9 kök elde edilmiştir. Yaşama oranı kışın soğuk muhafazasından sonra % 100 ve serada iklimlendirme ile % 86 olarak bulunmuştur.

Prunus’un olgun eksplantlarından elde edilmiş adventif sürgün rejenerasyon çalışmaları çok azdır. Adventif sürgünler P. domestica (Bassi ve Cossio, 1991), P.canescens (Antonelli ve Druart, 1990) P. persica (Declerck ve Kobran, 1996) ve P. avium ve P. serotina (Hammatt ve Grant, 1998), P. dulcis (Miguel vd., 1996) yapraklarından elde edilmiştir. Kayısıda (P.armeniaca L.) sürgün rejenerasyonu adventif indüksiyon aracılığıyla sık sık jüvenil eksplant ve endospermlerden

10 sağlanmıştır (Lane ve Cossio, 1986; Goffreda vd., 1995). Şimdiye kadar kayısıda olgun vejetatif dokulardan rejenerasyon elde edilmesi konusunda sadece bir rapor yayınlandığı için olgun kayısı eksplantlarından sürgün rejenerasyonunun indüksiyonu için etkili protokoller geliştirilmesi önemlidir (Escalettes ve Dosba, 1993). Bu raporun yazarları sonuçların yeniden üretilebilirliği ihtimalinin zayıf olduğunu belirtmişlerdir.

Şeftalinin, eriğin (P. domestica) ve kayısının somatik hücre hatlarından ve olgunlaşmamış embriyolarından da rejenerasyon başarılmıştır (Hammerschlag vd., 1985; Mante vd., 1989; Pieterse, 1989).

Liu ve Pijut (2008) genç(F) ve iki olgun (#3 ve #4 genotip olarak adlandırılan) yapraktan prunus için bir rejenerasyon sistemi geliştirmişlerdir. Prunus seronita black cherry’nin yapraklarından TDZ ve NAA içeren WPM ortamında adventif sürgün elde etmeyi başarmışlardır. Genç yapraklar(F) için en iyi rejenerasyon 9.08 µM TDZ 1.07 µM NAA ortamında %91 oranında, en yüksek sürgün sayısı 9,08 µM TDZ ve 0,54 µM NAA içeren ortamda elde edilmiştir ve genotip #4 en yüksek sürgün sayısını 4.54 µM TDZ ve 1.07 µM NAA içeren ortamda vermiştir. GümüşThisülfat kullanımı #3genotipinde %75 ve #4 genotipinde %58 oranlarında rejenerasyon oranları arttırdığını rapor etmişlerdir. Adventif sürgünler köklendirilmiş (% 70-76) ve dış koşullara alıştırılarak yetiştirilmiştir.

Bhagwat ve Lane (2004), NAA, TDZ ve BA içeren woody plant besi ortamında (Prunus avium) Lapins ve Sweetheart kiraz çeşitlerinin in vitro kültür yapraklarından sürgün rejenerasyonunu gerçekleştirmişlerdir. Optimum rejenerasyonu yaprağın orta damarı boyunca enine kesilerek yaralanan yaprak eksplantı üzerinde 2.27 ya da 4.54 µM TDZ ve 0.27 µM NAA oranlarında gözlediklerini belirtmişledir. Lapinsde %71.4, Sweetheartta %54 oranlarında rejenerasyon elde etmişlerdir.

Hammatt ve Grant (1998) tarafından Prunus türlerinden F 12-1 kiraz anacı WPM besi ortamında TDZ ve BA konsantrasyonlarında rejenerasyon çalışması yapılmış %31 oranında rejenerasyon elde edilmiştir.

Zhou vd. (2010) yaptıkları çalışmalarında şeftali yapraklarından adventif sürgün rejenerasyonu için tam bir protokol geliştirmişlerdir. Eksplantlar MS ortamında 3.55 µM ve 7.38 µM IBA ilavesiyle kültüre etmişlerdir. 3 haftalık kültür süresinden sonra genişlememiş olan yapraklar eksplant olarak kullanılmıştır. Orta damarından enine

11 yaralanan yaprakları 3 hafta karanlık ortamda bekletilmişler daha sonra ışıklı ortama almışlardır. 1/2 MS ortamı, WPM, Schenk ve Hildbrandt ortamlarında 9.08 µM TDZ ve 0.54 µM IBA içeren ortamlarda kültüre alınan eksplantlar, ½ MS ortamında 5.74 +_ 3.24 %71 oranında en yüksek rejenerasyon yüzdesini vermişlerdir. Sürgünler % 100-98.3 oranlarında köklendirilmişler ve seraya aktarılmışlardır.

Daha önce Prunus türlerinde yapılan rejenerasyon çalışmaları Çizelge 2.1.’ de özetlenmiştir.

Çizelge 2.1. Prunus türlerinin çeşitli eksplantları kullanılarak geliştirilen rejenerasyon protokolleri

Tür Çeşit Eksplant Regenerasyon Besin Ortamı Kaynak (%) Prunus Zard NJA82 Embriyo %92-100 MS Goffreda vd., armeniaca Royal Kallus ve MS+4.4 µM 1995, embriyo BA 1.0 µM Pieterse, 1989 2-4 D P.Persica Nemaquard Yaprak %3.3-%60 1/2MS, Zhou vd., x Suncrest Bailey Olgunlaşmamış MS, WPM, SH 2010, P.davidiana Loring Belle tohumlardan Mante vd., kotiledonlar 1989 Prunus P16CL5 yaprak %5.4- %73.5 LP, MS Gentile vd., persica (L.) Babygold 6 olgun kotiledon MS+ %2.5 2002 , 842 Standard embriyo sucrose +I Pooler, 1995, San BA(1.25 or Hammerschlag Flordaguard 2.5 µM)+ vd., 1985, Nemared TDZ(6.25 or Yan and Zhou, Medaguard 12.5 µM) 2002, Jingyan M2,4-D Nagaty, 2012 Lühua 9' ve0.44 u0. Wanmi and µM BA , NAA Dajiubao' ve Taif pecah 2.2 µM BA Prunus Heidelfingen olgun kotiledon %70-3 TDZ, WPM Canlı ve L. Tian avium Vogue Yaprak ve bogum WPM+5 mgl- 2008a, Matt ve Tehranivee kısmı 1 TDZ Jehle, 2005, Sunburst yaprak Blando vd., Schneiders 2007, ‘Giorgia Takashina vd., Benisyuho 2003 Benitemari Benisayaka Satonishik Prunus Lind1 Olgun kotiledon 6.7-66.7 QL Canlı ve Tian, salicina Bruce 2009 Shiro Redheart GladstoneEarly Golden Prunus Beutal yaprak 57-0.04 MS, QL Tang vd.,. cerasus Spacher Olgunlaşmamış MS+ 2002, Song ve Rexelle embriyo 0.10 mg lˉ¹ Sink 2005, Morellenfeuer kotiledonları TDZ, WMP Dolgov ve Gerema Firsov, 1999 ScharoÈ Schattenmorell

e Montmorency Black Eagle Prunus Italian Hipokotil 60-10 MS domestica Damson yaprak 11-19 IBA Bassi vd., V70033 46.25 72 BA 1991, Blue MS+%2 Petri and Vanette sukrose+ Scorza, 2010 Bluefre 0.5 ul IBA+ Yancheva, Bluebell 7.5 ul TDZ 1993, V72481 90dk sıvı 2,4- MArin ve Veeblue D (1.7)ul+ Pascual, 2005, President MS + Nowak ve Angelino 0.5 TDZ+ Mıczynski, Larry Anne 1.65 mg lˉ¹ 2002 Susina di Dro 2-4 D and Bluefre Improvet French Stanley- Marianna 2624 Wegierke Zwykla Prunus UFO-3, Alice kallus 29 Bitki oluşması BA IBA NAA Perez-Jimenez persica L. bilgi, Garnem, sağlandı. vd., 2012 Batsch GF677, Maruja, P. persica Flariba x P.dulcis Prunus Lapins yaprak 71.4- 54 WPM Bhagwat ve avium Sweetheart Lane, 2004 Prunus Black cherry yaprak 8-91 WPM Liu ve Pijut, serotina Seedling A 2008 Prunus PBS Hammatt and serotina 2322 Grant, 1998, Ehrh. (Kara 2339 Espinosa ve Kiraz) Pavia E ark., 2006 Prunuspersic Nemaguard yaprak 71.7 WPM, MS Zhou vd,. 2010 ax p. SHM davidiana Prunus Helena yaprak 200 artış Ethylene Burgos and armeniaca inhibitors Alburquerque, L. silver 2003 thiosulphate or aminoethoxy vnylyglycine Prunus dulcis Nonpareil, Ne yaprak 44.4-5.5 TDZ Aınsley vd., Mill. Plus Ultra BA 2000, 2-4 D Miguel vd., 1996 Prunus yaprak 0-77 TDZ Nas vd., 2010 microcarpa BA subs. Tortusa P. marianna, Adventif 10-43 Ms Escalettes ve P.domestica tomurcuk TDZ Dosba., 1993 ve NAA P. insititia AgNO3 Prunus ssp. kallus GA3+BAP Druart. P., P.dawyckensi 1980 s, P.canescens P.incisa x serrula Prunus 'Canino', Hipokotil ve Wang, vd.,

13 armeniaca L. 'Dorada' tohum 2011 'Moniqui' Prunus CAB 4D, CAB kallus MS Ochatt ve cerasus 5H and CAB Zeatin Power, 1988 11E P.amygdalus GF 677 kallus 63.4 MS+ 1 mg lˉ¹ Özden, 2007 x BA P. persica Prunus Apricot embriyo 100-70 2,4-D+BA Lane ve Cossio, armeniaca Sweet cherry 1986 P.campanula Kotiledon ve Kotiledon ve 5-50 2,4D+BA+ Hokanson ve ta hipokotil hipokotil TDZ+IBA+ Pooler, 2000 Maxim., NAA P. maackii Rupr., P. sargentii Rehd., P. serrula Franch., P. serrulata Lindl., P.subhirtella Miq., P. virginiana L., P. yedoensis Matsum

Literatürlerde de olduğu gibi Prunus türlerinde rejenerasyon protokolleri daha çok tohum kaynaklı dokulardan elde edilmiş olması ve vegetatif dokuların rejenerasyonunun zorluğunun rapor edilmesi, genetik transformasyonla çeşitlerin belli karakterler bakımından geliştirilebilmeleri için Prunus türlerinde vegetatif dokulardan yüksek frekanslı rejenerasyon protokollerinin geliştirilmesine ihtiyaç olduğunu göstermektedir.

Bu çalışmada Mazzard F 12-1 ve Maxma 14 kiraz anaçlarından in vitro rejenerasyon ve multiplikasyon protokolü geliştirilmesi amaçlanmıştır.

3. MATERYAL ve YÖNTEM

3.1. Materyal

3.1.1. Bitki materyali

Çalışmada kullanılan bitki materyalleri Maxma14 ve F12-1 anaçları, Eğirdir Bahçe Kültürleri Araştırma Enstitüsü parselinden 4 yaşındaki ağaçlardan 2012 ilkbaharında alınmıştır. İstasyon arazileri Eğirdir-Kovada Gölleri arasında Boğazova olarak adlandırılan vadi üzerindedir. Deniz seviyesinden yüksekliği 835 m' dir. Ağaçların büyüyen sürgünlerinin uç kısımları toplanarak plastik torbalar içerisine konarak laboratuvara getirilmiştir. 2011–2013 yılları arasında yürütülen bu çalışma SDÜ Gül ve Gül Ürünleri Araştırma ve Uygulama Doku Kültürü Laboratuarı ve SDÜ Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü Doku Kültürü Laboratuarında yürütülmüştür. Bu çalışmada bitkisel materyal olarak istasyon arazisinde bulunan ‘Mazzard F12-1’ ve ‘Maxma14’ anaçlarına ait ağaçlardan alınan sürgün örnekleri kullanılmıştır.

3.1.1.1. ‘Mazzard F12-1’

Kuşkirazı’ndan seleksiyon yoluyla elde edilmiştir. Çoğu durumda kuşkirazı çöğürlerinden daha kuvvetlidir ve hem kiraz hem de vişne çeşitleriyle uyuşması oldukça iyidir. Genellikle hendek daldırmayla çoğaltılır. Fakat mist veya sisleme altında yeşil çeliklerle de çoğaltılabilir. Bakteriyel kansere dayanıklı ancak kök boğazı kanserine hassastır (Demirtaş ve Sarısu,2011).

3.1.1.2. ‘Maxma 14’

Kuşkirazı ve idris melezidir. Yarı bodur bir anaçtır ve Fransa’da büyük popülarite kazanmıştır. F12/1 üzerine aşılı ağaçların % 40–60, SL–64 üzerine aşılı ağaçların ise % 60-80’i büyüklüğünde taç oluşturur. Kireçten kaynaklanan kloroza karşı dayanıklıdır (Demirtaş ve Sarısu, 2011).

M×M 14 (Brokforest veya Maxma delbart 14) , yarı bodurdur. Popülerliği Fransa ve Amerika’ da pek çok orijin anacına yaklaşmıştır.. Maxma 14, Michigan denemelerinde üzerindeki ağaçların yapraklarında yaz ortasında stres gözlemlenmiştir. İleri dönem uyuşmazlığı bu stresin nedeni olduğu düşünülmüştür. Fransa’daki Burlat çeşidinin ağaç

15 büyüklüğü Maxma 14 ve Colt anaçlarında aynı olmuştur. Maxma 14 anacının üzerindeki montmorency çeşidi, Colt anacının üzerindekinden daha bodur gözlemlenmiştir.. Maxma 14 Phytophtora ve bakteriyel kansere karşı daha dayanıklı yapı gösterir (Lezzoni vd., 1991).

3.1.2. Besin ortamı

Bu çalışmada bitki yapraklarından sürgün rejenerasyonu çalışmaları için WPM besin ortamı, multiplikasyon çalışmaları için MS ortamı kullanılmıştır. WPM ortamı odunsu bitkiler için geliştirilmiştir ve makro besin elementi içeriği, MS (Murashige and Skoog, 1962) besin ortamından ve QL (Quoirin ve Lepoivre, 1977) den düşük kalmıştır (Temurtaş, 2011). Bhagwat ve Lane (2004) ile Tang vd., (2002) kiraz yapraklarının rejenerasyonunda, optimal besin ortamı olarak WPM ortamını bildirmişlerdir.

Anaçların kardeşlemesi için 3 µM BA, 0.54 µM NAA, 4,4 g lˉ¹ MS, 30 g lˉ¹ sukroz ve 7 g lˉ¹ agar içeren MS (Murashige and Skoog, 1962) besin ortamı kullanılmıştır. Ortamın pH’ı HCl veya KOH ile 5,4-5,8’ ya ayarlanan besin ortamı 25 x 150 mm’lik kültür tüplerine (her tüpe 10 ml) dökülerek, 121 °C ve 106 kPa de 25 dakika otoklav edilmiştir.

3.1.3. Sterilizasyon, in vitro doku kültürlerin oluşturulması

Sürgünler boğum kültürüne uygun olarak kesilerek yaprakları temizlenmiştir (Şekil 3.1.) Örnekler 10 dakika boyunca çalkalayıcı üzerinde deterjanlı su içinde bekletilmiştir (100 rpm). Bunlar daha sonra sırasıyla deterjandan arındırmak için musluk suyuyla çalkalanmıştır. Eksplantlar fungusit ve tween-20 ile 5 dakika çalkalayıcı üzerinde kaldıktan sonra musluk suyuyla tekrar arındırılmıştır. Sonra eksplantlar 15 dakika boyunca % 15’ lik çamaşır suyu (% 0.787 sodyum hipoklorit) ile sterilize edilmiştir. Çamaşır suyundan arındırmak için steril kabin içerisinde 3’ er kere 5 dakika otoklav edilmiş steril su ile çalkalanmıştır.

Şekil 3.1. Sterilizasyonu yapılmış, dikime hazır sürgünler

Sterilize işlemi bittikten sonra boğum kültürüne uygun kestiğimiz sürgünler 25 x 150 mm’lik kültür tüplerindeki streil besin ortamına dikilmişlerdir (Şekil 3.2.).

Şekil 3.2. Sürgünlerin dikimi için kullanılan kültür tüpleri

3.2. Yöntem

Çalışmada inokulasyon işlemleri için hava akışlı steril kabinler kullanılmıştır. Çalışmaya başlamadan önce UV lambaları açılmış ve çalışmadan 15 dk. önce % 70 lik etil alkolle kabinin içi silinerek steril hale getirilmiştir.

3.2.1 Kültür odası şartları

Kültür tüpleri 24±1 C sıcaklık ve beyaz floresan lamba ile sağlanan 16/8 (aydınlık/karanlık) saatlik fotoperiyottaki (131 µMm–2 s -1, Li-cor, Inc. integrating quantum/radiometer/photometer model LI-188B ile ölçülen) kültür odasında raflara yerleştirilmiştir (Şekil 3.3.).

Şekil 3.3. Kültür odası rafları

3.2.2. Alt kültürler

4 ile 6 aylık bir zaman dilimi içerisinde her 4 hafta (1ay) lık süre sonunda bitkiler steril kabin içerisinde alt kültüre alınmış ve denemeler için yeterli bitki yetişmesi sağlanmıştır.

3.2.3 Multiplikasyon denemeleri

Çalışmanın tekrarlanabilirliği açısından rejenerasyon çalışmalarının yanında anaçların multiplikasyonu önemlidir. Bu nedenle çalışmada Maxma 14 ve F 12-1 anaçlarında multiplikasyon çalışmasına da yer verilmiştir.

3.2.3.1. Benziladenin (BA) ‘nin Mazzard F 12-1 ve Maxma 14 kiraz anacının çoğalması üzerine etkileri

F 12-1 ve Maxma 14 anaçlarının alt kültür denemelerinde literatür ışığında uygulanması belirlenen BA’nın 0, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 mg lˉ¹ (+0,54 μM NAA) dozları MS ortamında anaçların multiplikasyona teşviğinde kullanılmıştır.

3.2.3.2. Thidiazuron (TDZ)’nun Mazzard F 12-1 ve Maxma 14 kiraz kiraz anacının çoğalması üzerine etkileri

F 12-1 ve Maxma 14 anaçlarının alt kültür denemelerinde literatür ışığında uygulanması belirlenen TDZ 0, 0.125, 0.250, 0.50, 1, 1.5, 2 (+0,54 μM NAA) mg lˉ¹ dozları MS ortamında anaçların multiplikasyona teşviğinde kullanılmıştır.

3.2.4. Yapraktan regenerasyon denemeleri

Maxma 14 ve F 12-1 anaçlarında rejenerasyon protokolü geliştirmek amacıyla literatür bilgileri ışığında rejenerasyon denemeleri kurulmuştur.

In vitro ortamında büyüyen Maxma 14 ve F 12-1 kiraz anaçlarında alt kültürler denemeleri yeterli populasyon büyüklüğüne ulaştığında, bitkiciklerden alınan yaprak parçacıkları in vitro ortamında regenerasyona teşvik edilmiştir.

Rejenerasyon denemesi için hazırlanan WPM ortamı pH’ı otoklavdan önce HCl veya NaOH ile 5,78- 5.80’e ayarlanmış ve 121 °C ve 106 kPa de 15 dakika otoklav edilmiştir. Sonra ortam her kaba 15 ml olacak şekilde 100 x 20 mm’lik steril petri kaplarına dağıtılmıştır. Rejenerasyon deneyleri kullanılan farklı BA ve TDZ dozlarının aydınlık uygulama için 4’er petri, karanlık uygulama için 4’er petri içerecek şekilde kurulmuştur. Yaprak örneklerinin orta damarına dik olacak şekilde 3 adet yaralama yapılmıştır (Şekil 3.4.) ve yaprak alt yüzeyi ortama temas edecek şekilde ekim işlemi yapılmıştır.

Şekil 3.4. Yaprakların orta damarına yapılan yaralama işlemi

Her tekerrürde (petri kabında) 10 yaprak veya yaprak parçacığı kullanılmıştır. Petri kaplarının ağız kısımları parafilm ile sarılmıştır (Şekil 3.5.). Bu işlemlerden sonra iklim odasında 1 ay beklemeye alınmıştır.

Şekil 3.5. İklim odasında 1 ay beklemeye alınmış rejenerasyon denemeleri

3.2.4.1. Benziladenin (BA) ‘nin Mazzard F12-1 ve Maxma 14 kiraz anacının yaprak rejenerasyonuna etkileri

Denemede, BA’nın 0, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 mg lˉ¹ dozlarından, farklı ışık rejimleri (devamlı ışık ve 10 günlük karanlık inkübasyonları) ve ön muamelelerin (TDZ ve BA inkübasyonları) regenerasyona etkileri belirlenerek ve ardından optimum regenerasyon şartları belirlenmeye çalışılmıştır. Karanlık inkübasyonuna tabi tutulacak petri kapları alüminyum folyo ile sarılıp ışık alması engellenecek ve belirlenen en uygun ortamda, ilk on gün bekletilmiştir. Daha sonra karanlık inkübasyonuna tabi tutulmamış yapraklarla aralarındaki farklar belirlenmiştir.

3.2.4.2. Thiziron (TDZ)’nun Mazzard F12-1 ve Maxma 14 kiraz kiraz anacının yaprak rejenerasyonuna etkileri

Denemede, TDZ 0, 0.125, 0.250, 0.50, 1, 1.5, 2 mg lˉ¹ (+0,54 μM NAA) farklı konsantrasyonları uygulanarak, farklı ışık rejimleri ve ön muameleler ile optimum rejenerasyon şartları oluşturulmaya çalışılmıştır. Karanlık inkübasyonuna tabi tutulacak petri kapları alüminyum folyo ile sarılıp ışık alması engellenerek belirlenen en uygun ortamda, ilk on gün bekletilmiştir. Daha sonra karanlık inkübasyonuna tabi tutulmamış yapraklarla aralarındaki farklar belirlenmiştir.

3.2.5. Optimizasyon Denemeleri

3.2.5.1.Mazzard F 12-1 kiraz anacının aydınlık ortamda NAA (Naftelenasetikasit) ve BA (Benziladenin)‘ in kombinasyonları üzerinde yapılan çalışmalar

Mazzard F12-1 kiraz anacında rejenerasyon oranını arttırmak amacıyla BA (Benziladenin) ve NAA (Naftelenasetikasit)‘ in (BA +NAA) 0.5+0.1, 1+0.25 ve 2+1 mg lˉ¹ dozlarının optimizasyon üzerine etkileri çalışılmıştır.

3.2.5.2. Rejenerasyon gösteren TDZ muamelesi etrafında optimizasyon

TDZ ile yapılan yapraktan rejenerasyon çalışmasında, rejenerasyon elde edilen TDZ dozuna yakın dozların optimizasyona etkileri belirlenmeye çalışılmıştır.

3.2.5.3. Karanlıkta inkübasyonunun regenerasyona etkilerinin belirlenmesi

Karanlık uygulamasının rejenerasyonu artırdığı bildirildiğinden (Canlı ve Tian, 2008a) petrilere aktarılan 16:8 saat fotoperiyot uygulanan yapraklarda rejenerasyon gösteren bitki büyüme düzenleyicinin oranları tekrar 5 gün, 10 gün, 15 gün ve 20 gün karanlıkta tutularak fotoperiyot uygulanan yapraklarda rejenerasyon oranı incelenmiştir. Karanlık uygulamasına tabi tutulan petri kapları, alüminyum folyo ile sarılarak ışıkla teması kesilmiş, süre bitiminde alüminyum folyo kaldırılmıştır (Şekil 3.6).

Şekil 3.6. Karanlık uygulaması için ışıkla teması kesilen petriler

3.2.5.4. TDZ ile ön muamelenin yaprak regenerasyona etkilerinin belirlenmesi

Ön muamele amacıyla yapraklar katı besi ortamına yerleştirilmeden önce, TDZ nin 0, 0.05, 0.1, 0.25, 0,5 mg lˉ¹ (+MS) ve 0, 4, 4.4, 4.8, 6.2, 6.8, 7.2, 8.6, 9, 9,4 μM TDZ (+MS) konsantrasyonlarını içeren steril su içinde konularak 1 ve 24 saat süre ile karanlıkta inkübasyona tabi tutulmuşlardır (Şekil 3.7.) Daha sonra yapraklar orta damarına dik olacak şekilde 3 adet yaralanarak rejenerasyon gösteren hormon dozunu içeren petri kaplarına ekilmiştir. Petrilerin kenar kısımları parafilm ile sarılmıştır.

Şekil 3.7. Mazzard F 12-1 kiraz anacında TDZ ön muamelesinin uygulanması

3.2.5.5. BA ile ön muamelenin yaprak regenerasyona etkilerinin belirlenmesi

Ba ön muamelenin yaprak rejenerasyonuna etkisini belirlemek amacıyla yapraklar katı besi ortamına yerleştirilmeden önce BA’nın 0, 0.1, 0.25, 0.5, 1 mg lˉ¹ (+MS) konsantrasyonlarını içeren steril su içinde konularak 1 saat süre ile karanlıkta de inkübasyona tabi tutulmuşlardır. Daha sonra yapraklar yaralanarak rejenerasyon gösteren hormon dozunu içeren petri kaplarına ekilmiştir.

3.2.6. Köklendirme ve Alıştırma

Regenerasyon denemelerinden sonra köklenmeleri için 0, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2 mg lˉ¹ IBA içeren besin ortamlarına koyulan bitkilerden köklenme denemesi kurulmuştur. Daha sonra en iyi köklenme oranın sağlandığı konsantrasyonda rejenerasyon gösteren bitkiler köklendirilerek içinde torf bulunan 8x8 cm saksılara alınmışlardır. Burada bitkilerin dış koşullara alıştırılması sağlanmıştır.

3.2.7. Veri toplanması ve istatistikî analizlerin yapılması

Kardeşleme ve rejenerasyon denemeleri sonunda sonuçların değerlendirilmesi için 1 ay sonra dataları alınmıştır.

Kardeşleme denemesi için data verileri her konsantrasyon için: kardeşleyen explant yüzdesi, explant başına kardeş sayısı, en uzun kardeşin uzunluğu, köklenen explant yüzdesi, explant başına kök sayısı, en uzun kökün uzunluğu, kallus oluşturan explant yüzdesi, kallus çapı şeklinde kaydedilmiştir.

Rejenerasyon denemesi için data verileri her konsantrasyon için: rejenerasyon oluşturan explant yüzdesi, explant başına sürgün sayısı, en uzun sürgünün uzunluğu, köklenen explant yüzdesi, en uzun kökün uzunluğu, explant başına kök sayısı, kallus oluşturan explant yüzdesi, explant başına kallus sayısı, en geniş kallus çapı şeklinde kaydedilmiştir.

Bütün deneysel verilere SAS istatistik programında varyans analizi (ANOVA) uygulanmış ve LSD testi ile karşılaştırılmıştır (P< 0,05).

4. ARAŞTIRMA BULGULARI

4.1. Multiplikasyon denemeleri

4.1.1. Benziladenin (BA) ‘in Mazzard F12-1 ve Maxma 14 kiraz anacının multiplikasyonu üzerine etkileri

4.1.1.1. Benziladenin (BA) ‘in Mazzard F 12-1 kiraz anacı multiplikasyonu üzerine etkileri

MS içeren besin ortamlarında farklı BA dozları Mazzard F/12-1 kiraz anaçlarında eksplant başına düşen sürgün sayısı bakımından etkileri istatistiksel olarak önemli bulunmuştur (Şekil 4.1.).

Şekil 4.1. F 12-1 anacında BA multiplikasyon denemesinden bir görüntü

En yüksek kardeşleme yüzdeleri 20, 10, 5 ve 2,5 mg lˉ¹ BA içeren ortamdan elde edilmiş ve bu ortama konan explantlar sırasıyla %90, %84, %80, %76 oranlarında kardeş oluşturmuştur. Explant başına kardeş sayısı 20 mg lˉ¹ BA dozunda 1,40 sürgün/eksplant şeklindedir. Bu ortamı 5 mg lˉ¹ BA (1.36 sürgün/eksplant) ve 10 mg lˉ¹ BA (1.20 sürgün/eksplant) içeren ortamlar izlemiştir. En düşük değerler (0.24 sürgün/eksplant) BA içermeyen ortamdan alınmıştır (Çizelge 4.1.). Sürgün uzunluğu BA 5 mg lˉ¹ dozunda 7,1mm ve BA 2,5 mg lˉ¹ dozunda 6,2 mm oranıyla en yüksek değer gözlemlenmiştir.

BA içermeyen ortam dışında diğer BA dozlarında köklenme gerçekleşmemiştir. Explant başına kök sayısı BA 0 mg lˉ¹ dozunda 0,5 oranındadır. BA içermeyen ortamdaki kökün uzunluğu 12 mm uzunluğundadır. Kallus oluşumu BA dozlarında yüksek oranlarda gözlemlenmiştir. 1.25, 2.5 ve 5 mg lˉ¹ dozlarında %100 kallus oluşumu vardır. Explant başına en düşük kallus sayısı 0,37 oranıyla BA 20 BA mg lˉ¹ dozunda görülmüştür. BA içermeyen ortamda kallus gözlemlenmemiştir.

Çizelge 4.1. Benziladenin (BA) ‘in Mazzard F 12-1 kiraz anacı multiplikasyonu üzerine etkileriʷ

Muamele Kardeşleyen Sürgün/ʸ Kardeşin Köklenen Explant En Kallus Explantᶻ BA Eksplant % explant uzunluğu explant basına uzun veren başına (mg lˉ¹) (mm) % kök kök explant kallus sayısı (mm) % kolonisi sayısı

0 16,6cˣ 0,24c 1,4c 26,6a 0,5a 12a 0,00c 0,00d 1,25 66,6b 0,94 b 3,8b 0,0b 0,0b 0b 100a 0,86a 2,5 76,0ab 1,08ab 6,2a 0,0b 0,0b 0b 100a 0,80a 5 80,0ab 1,36ab 7,1a 0,0b 0,0b 0b 100a 0,82a 10 84,0ab 1,20ab 3,4b 0,0b 0,0b 0b 96,6a 0,60b 20 90,0a 1,40a 3,5b 0,0b 0,0b 0b 76,6b 0,37c

ʷ%5 seviyesinde LSD testine tabi tutulmuşlardır. ˣAynı harfle gösterilen ortalamalar arasındaki farklar önemsiz, farklı harfle gösterilen ortalamalar arasındaki farklar önemlidir (p<0,05) ʸ Sürgün başına kardeş sayısında ana explant sayılmamıştır. z 0,3 cm’ den küçük kalluslar değerlendirilmeye alınmamıştır

4.1.1.2. Benziladenin (BA)’in Maxma 14 kiraz anacı multiplikasyonu üzerine etkileri

Maxma 14 kiraz anacında BA bitki büyüme düzenleyici ile yapılan in vitro çoğaltma denemesinde (Şekil 4.2.) kardeşleme, muamele dozu arttıkça çoğalmıştır (Çizelge 4.2.). En yüksek kardeşleme %93,3 oranıyla 20 mg lˉ¹BA, %90 oranıyla 10 mg lˉ¹BA, %86,6 oranıyla 5 mg lˉ¹BA, %73,3 oranıyla 2,5 mg lˉ¹BA içeren ortamlarda gözlemlenmiştir. BA içermeyen ortamlarda kardeşleme gözlemlenmiştir. Explant başına en yüksek kardeş sayısı 20 mg lˉ¹ BA içeren ortamda (1.26) ve 10 mg lˉ¹ BA içeren ortamda (1.10) elde edilmiştir. En uzun sürgünler 1.25, 2.5, 5 ve 10 mg lˉ¹ içeren BA dozlarından elde edilmiş ve en kısa sürgün 20 mg lˉ¹ dozunda gözlemlenmiştir. BA 0 mg lˉ¹ dozunda ise sürgün hiç kardeş vermemiştir. BA içermeyen ortamda köklenme gerçekleşirken, BA içeren ortamlarda köklenme gözlemlenmemiştir. Explant başına kök sayısı 0,36 ve kök uzunluğu 0,23 oranlarıyla 0 mg lˉ¹ BA ortamından elde edilmiştir. Kallus oluşumu en

25 yüksek %90 oranla BA 20 mg lˉ¹,%83,3 oranla BA 10 mg lˉ¹, %80 oranla BA 1,25 mg lˉ¹ ve %73,3 oranla BA 5 mg lˉ¹ dozlarında gözlemlenmiştir. Explant başına kallus sayısı 0,31 oranıyla BA 20 mg lˉ¹ dozunda, 0,24 oranıyla BA 0 mg lˉ¹ dozunda gözlemlenmiştir. Deneme süresince yapılan kontrollerde Maxma14 anacının F/12-1 anacına göre, BA denemelerinde camlaşma problemleri gözlemlenmiştir.

Şekil 4.2. Benziladenin (BA)’ in Maxma 14 anacında multiplikasyon üzerine etkileri

Çizelge 4.2.Benziladenin (BA)’in Maxma14 kiraz anacı multiplikasyonu üzerine etkileriʷ

Muamele Kardeşleyen Sürgün/ʸ Kardeşin Köklenen Explant En Kallus Explantᶻ BA Eksplant % explant uzunluğu explant basına uzun veren başına (mg lˉ¹) (mm) % kök sayısı kök explant kallus (mm) % kolonisi sayısı

0 0,0c 0,00d 0,0c 36,6a 0,36a 2,3a 66,6b 0,24a

1,25 53,3bˣ 0,60c 4,1a 0,00b 0,00 b 0,0b 80ab 0,28a

2,5 73,3ab 0,86bc 4,1a 0,00b 0,00 b 0,0b 70,0b 0,26a

5 86,6a 0,90b 3,3a 0,00b 0,00 b 0,0b 73,3ab 0,27a 10 90,0a 1,10ab 4,2a 0,00b 0,00 b 0,0b 83,3ab 0,25a

20 93,3a 1,26a 2,8b 0,00 b 0,00 b 0,0b 90,0a 0,31a

4.1.2. Thidiazuron (TDZ)’un Mazzard F12-1 ve Maxma 14 kiraz anacının multiplikasyonu üzerine etkileri

4.1.2.1. Thidiazuron (TDZ)’ un Mazzard F 12-1 kiraz anacı multiplikasyonu üzerine etkileri

MS içeren besin ortamlarında değişik TDZ dozları Mazzard F 12-1 ve Maxma14 kiraz anaçlarında eksplant başına düşen sürgün sayısı bakımından etkileri istatistiksel olarak önemli bulunmuştur.

Mazzard F 12-1 kiraz anacında TDZ ‘in farklı dozlarında yapılan in vitro çoğaltma denemesinin (Şekil 4.3.) sonuçları Çizelge 4.3.’de verilmiştir. En yüksek kardeşlenme yüzdeleri %86,6 oranıyla 0,5 mg lˉ¹ TDZ, %83,3 oranıyla 1 mg lˉ¹ TDZ, 68 oranıyla 0,25 mg lˉ¹ TDZ, %64 oranıyla 2 mg lˉ¹ TDZ ve %63,3 oranıyla 0,125 mg lˉ¹ TDZ dozundan elde dilmiştir. En iyi kardeşlenme sayısı (sürgün/eksplant) 0,25 mg lˉ¹ TDZ (1,52) içeren ortamdan elde edilmiştir. 0,5 mg lˉ¹ TDZ (1.16 sürgün/eksplant) ve 1,5 mg lˉ¹ TDZ (1.06 sürgün/eksplant) içeren ortamlar da diğer en iyi sonuçları vermişlerdir. En düşük değerler (0.36 sürgün/eksplant) TDZ içermeyen ortamdan alınmıştır. En uzun kardeş uzunluğu ise 7,2 mm oranıyla 0,25 mg lˉ¹ TDZ ve 5,6 mm oranıyla 0,5 mg lˉ¹ dozundan elde edilmiştir. TDZ denemesinde köklenme gözlemlenmezken kallus oluşumları yüksek oranlarda görülmüştür. Kallus veren explant yüzdesi 1,5 mg lˉ¹ TDZ dozunda %100, 1 mg lˉ¹ TDZ dozunda %83,3 oranıyla elde edilmiştir. Explant başına kallus sayısı ise 1,5 mg lˉ¹ dozunda 0,85, 1 mg lˉ¹ dozunda 0,84, 0,5 mg lˉ¹ dozunda 0,84 ve 2 mg lˉ¹ dozunda 0,82 oranıyla en yüksek değeri vermiştir.

Şekil 4.3. Thidiazuron (TDZ)’ un Mazzard F12-1 anacında multiplikasyonu üzerine etkileri

4.3. Thidiazuron (TDZ)’ un Mazzard F 12-1 kiraz anacı multiplikasyonu üzerine etkileriʷ

Muamele Kardeşleyen Sürgün/ʸ Kardeşin Köklenen Kallus veren Explantᶻ TDZ Eksplant % explant uzunluğu (mm) explant explant başına (mg lˉ¹) % % kallus kolonisi sayısı 0 36,6cˣ 0,36d 2,9c 0 93,3ab 0,42c

0,125 63,3abc 1,03abc 3,6bc 0 96,6a 0,62b 0,25 68,0ab 1,52a 7,2a 0 88,0ab 0,64b 0,5 86,6a 1,16ab 5,6ab 0 96,6a 0,84a 1 83,3a 1,03bc 3,4bc 0 100,0a 0,84a 1,5 56,6bc 0,90bc 3,8bc 0 83,3b 0,85a 2 64,0abc 0,64cd 2,6c 0 88,0ab 0,82a

4.1.2.2. Thidiazuron (TDZ)’ un Maxma 14 kiraz anacı multiplikasyonu üzerine etkileri

Maxma14 kiraz anacının TDZ invitro çoğaltma denemesi (Şekil 4.4.) sonuçları Çizelge 4.4. ‘de verilmiştir. En iyi kardeşleme %93,3 (1,2 Sürgün/ explant) oranıyla 2 mg lˉ¹ TDZ, %90 (1,03 Sürgün/ explant) oranıyla 1,5 mg lˉ¹ TDZ dozunda ve %83,3 (0,96 Sürgün/ explant) oranıyla 1 mg lˉ¹ TDZ görülmüştür. En düşük kardeşleme oranı TDZ içermeyen ortamda görülmüştür, hiç kardeş gözlemlenmemiştir (0 Sürgün/ explant). Sürgün uzunluğu 3 mm oranıyla 0,125 mg lˉ¹ TDZ dozunda en düşük, 6,7 mm oranıyla 2 mg lˉ¹ TDZ dozunda en yüksek elde edilmiştir. Köklenme sadece TDZ içermeyen ortamda %3,3 oranıyla elde edilmiştir. Kök uzunluğu 2,3 mm olarak gözlemlenmiştir. Denemede genel olarak kallus oranları yüksektir. 1, 1.5 ve 2 mg lˉ¹ TDZ dozların %100 oranında kallus elde edilmiştir. Explant başına kallus sayısı en yüksek 0,60 oranıyla 2 mg lˉ¹ TDZ dozundan elde edilmiştir. Bu oran TDZ içermeyen ortamda 0,27 olarak elde edilmiştir.

Şekil 4.4. Maxma14 anacında TDZ multiplikasyon denemesinden bir görüntü

Çizelge 4.4. Thidiazuron (TDZ)’ un Maxma14 kiraz anacı multiplikasyonu üzerine etkileriʷ

Muamele Kardeşleyen Sürgün/ʸ Kardeşin Köklenen Explant En Kallus Explantᶻ TDZ Eksplant % explant uzunluğu explant basına uzun veren başına (mg lˉ¹) (mm) % kök kök explant kallus sayısı (mm) % kolonisi sayısı

0 0,0 d 0,00c 0,0d 3,30a 0,03a 2,3a 83,3b 0,27d

0,125 64,0 cˣ 0,73b 3,0c 0,00 b 0,00 b 0,0b 90,0ab 0,38c 0,25 70,0 bc 0,76b 3,8bc 0,00 b 0,00 b 0,0b 90,0ab 0,38c 0,5 73,3bc 0,76b 3,2bc 0,00 b 0,00 b 0,0b 93,3ab 0,39c 1 83,3 ab 0,96ab 4,3b 0,00 b 0,00 b 0,0b 100a 0,47b 1,5 90,0 a 1,03a 4,3b 0,00 b 0,00 b 0,0b 100a 0,48b 2 93,3 a 1,20a 6,7a 0,00 b 0,00 b 0,0b 100a 0,60a ʷ%5 seviyesinde LSD testine tabi tutulmuşlardır. ˣAynı harfle gösterilen ortalamalar arasındaki farklar önemsiz, farklı harfle gösterilen ortalamalar arasındaki farklar önemlidir (p<0,05) ʸ Sürgün başına kardeş sayısında ana explant sayılmamıştır. z 0,3 cm’ den küçük kalluslar değerlendirilmeye alınmamıştır.

4.2. Yaprak Eksplantından Rejenerasyon Denemeleri

4.2.1. Benziladenin (BA) ‘in Mazzard F12-1 ve Maxma 14 kiraz anacının yaprak rejenerasyonu üzerine etkileri

4.2.1.1 Benziladenin (BA)’ın Aydınlık Ortamda Mazzard F 12-1 kiraz anacının yaprak rejenerasyonuna etkisi

Mazzard F 12-1 anacında, BA’nın farklı dozlarında kurulan aydınlık rejenerasyon denemesinde BA dozları arasındaki fark istatiksel açıdan önemli bulunmuştur (Çizelge 4.5.). BA 10mg /lt dozunda %5 oranında rejenerasyon elde edilmiştir (Şekil 4.5.).

Explant başına sürgün oranı 0.05, sürgün uzunluğu 0.005 cm’dir. Diğer dozlarda rejenerasyon gözlemlenmemiştir.

BA bitki büyüme düzenleyicinin doz miktarı azaldıkça kallus oluşumunun arttığı görülmüştür. En yüksek kallus oluşumu %57,5 oranla BA 1,25 mg lˉ¹ ve %50 oranıyla 1,25 mg lˉ¹ BA dozunda görülmüştür. BA bulunmayan ortamında kallus oluşumu olmamıştır.

Explant başına kallus sayısı 1.00 oranıyla 1,25 mg lˉ¹ BA dozundan elde edilmiştir. BA dozu arttıkça kallus sayısı azalmıştır.

Şekil 4.5. BA 10 mg lˉ¹ (Aydınlık) dozunda yapraktan elde edilen rejenerasyon

Çizelge 4.5. Benzilade nin (BA)’ın aydınlık ortamda Mazzard F 12-1 kiraz anacının yaprak rejenerasyonuna etkisiʷ

Muamele Rejenere Eksplant % Eksplant Kallus veren explant Eksplantbaşınaʸ BA başına % kallus (mg lˉ¹) sürgün sayısı kolonisi sayısı Aydınlık

0 0 b 0,00b 0,00c 0,00c

1,25 0 b 0,00b 50,0a 1,00a 2,5 0 b 0,00b 57,5a 0,97a 5 0 b 0,00b 15,0b 0,22b 10 5 aˣ 0,05a 12,5b 0,12b 20 0 b 0,00b 10,0b 0,10b ʷ%5 seviyesinde LSD testine tabi tutulmuşlardır. ˣAynı harfle gösterilen ortalamalar arasındaki farklar önemsiz, farklı harfle gösterilen ortalamalar arasındaki farklar önemlidir (p<0,05) ʸ 0,3 cm’ den küçük kalluslar değerlendirilmeye alınmamıştır.

4.2.1.2. Benziladenin (BA)’in karanlık ortamda (10 günlük karanlık inkübasyon uygulaması) Mazzard F12-1 kiraz anacının yaprak rejenerasyonuna etkisi

Çizelge 4.6.’da sonuçları gösterilen F12-1 kiraz anacının BA ile kurulan 10 gün karanlık uygulamalı rejenerasyon denemesinde BA 2,5 mg lˉ¹ dozunda %5 oranında rejenerasyon elde edilmiştir (Şekil4.6.). Explant başına sürgün sayısı 0,05 oranındadır. Çizelge incelendiğinde aydınlık denemesinden farklı olarak BA içermeyen dozda kök oluşumu gerçekleşmiştir ve BA içermeyen ortamda kallus oluşumu görülmüştür. En düşük kallus oluşumu BA içermeyen 0 mg lˉ¹ dozunda görülmüştür.

Şekil 4.6. BA 2,5 mg lˉ¹ (Karanlık) dozunda yapraktan elde edilen rejenerasyon

Çizelge 4.6. Benziladenin (BA)’in karanlık ortamda (10 günlük karanlık inkübasyon uygulaması) Mazzard F 12-1 kiraz anacının yaprak rejenerasyonuna etkisiʷ

Muamele Rejenere Eksplant Köklenen Explant En Kallus Explantʸ BA Eksplant % başına explant basına kök uzun veren basına (mg lˉ¹) sürgün % sayısı kök explant kallus sayısı (mm) % kolonisi sayısı

0 0b 0,00b 5a 0,05a 0,8a 12,5c 0,22b

1,25 0 b 0,00b 0 b 0,00 b 0,0b 42,5ab 0,92a 2,5 5 aˣ 0,05a 0 b 0,00 b 0,0b 55,0a 1,22a 5 0 b 0,00b 0 b 0,00 b 0,0b 52,5ab 0,95a 10 0 b 0,00b 0 b 0,00 b 0,0b 40,0ab 0,40b 20 0 b 0,00b 0 b 0,00 b 0,0b 35,0b 0,35b ʷ%5 seviyesinde LSD testine tabi tutulmuşlardır. ˣAynı harfle gösterilen ortalamalar arasındaki farklar önemsiz, farklı harfle gösterilen ortalamalar arasındaki farklar önemlidir (p<0,05) ʸ 0,3 cm’ den küçük kalluslar değerlendirilmeye alınmamıştır.

4.2.1.3. Benziladenin (BA)’in aydınlık ortamda Maxma14 kiraz anacının yaprak rejenerasyonuna etkisi

Maxma14 kiraz anacında yapılan BA yapraktan rejenerasyon denemelerinin sonuçları Çizelge 4.7.’de özetlenmiştir. Bu denemede hiçbir dozda rejenerasyon gözlemlenmemiştir. BA’ nın dozları arasında % kallus oluşumu, kallus sayısı bakımından istatistiki bir fark gözlemlenmemiştir. BA denemesi kallus yüzdesi açısından değerlendirildiğinde sonuçlar oldukça düşüktür. Denemede 5, 10 ve 20 mg lˉ¹ BA dozların kallus oluşumu gözlemlenmemiş, 2,5 mg lˉ¹ BA dozunda ise %7,5 kallus oluşumu elde edilmiştir. BA bitki büyüme düzenleyicisi Maxma14 anacında kallus oluşumunu teşviğinde etkisi az bulunmuştur (Şekil 4.7.).

Çizelge 4.7. Benziladenin (BA)’in aydınlık ortamda maxma14 kiraz anacının yaprak rejenerasyonuna etkisiʷ

Muamele Rejenere Eksplant Kallus veren explant Eksplantbaşınaʸ BA (mg lˉ¹) % % kallus kolonisi sayısı Aydınlık 0 0 2,5bˣ 0,02ab

1,25 0 5,0ab 0,05ab 2,5 0 7,5a 0,10a 5 0 0,0b 0,00 b 10 0 0,0b 0,00 b 20 0 0,0b 0,00 b ʷ%5 seviyesinde LSD testine tabi tutulmuşlardır. ˣAynı harfle gösterilen ortamalar arasındaki farklar önemsiz, farklı harfle gösterilen ortalamalar arasındaki farklar önemlidir (p<0,05) ʸ 0,3 cm’ den küçük kalluslar değerlendirilmeye alınmamıştır.

Şekil 4.7. Maxma14 anacında rejenerasyon denemesinden bir görüntü

4.2.1.4. Benziladenin (BA)’in karanlık ortamda (10 günlük karanlık inkübasyon uygulaması) Maxma14 kiraz anacının yaprak rejenerasyonuna etkisi

Maxma 14 kiraz anacının 10 günlük karanlık inkübasyon uygulaması çalışılan yapraktan rejenerasyon denemesinin sonuçları Çizelge 4.8’ de özetlenmiştir. Denemede çalışılan dozlarda rejenerasyon gözlemlenmemiştir.

BA içermeyen dozda kallus oluşumu gözlemlenmezken 1,25 ve 2,5 mg lˉ¹ BA dozunda % 10 oranında, 5, 10 ve 20 mg lˉ¹ BA dozlarında % 2,5 oranında kallus elde edilmiştir. Explant başına kallus sayısı 1,25 mg lˉ¹ BA dozunda 0,10 oranında, 20 mg lˉ¹ BA dozunda 0,02 oranında elde edilmiştir.

Çizelge 4.8. Benziladenin (BA)’in karanlık ortamda (10 günlük karanlık inkübasyon uygulaması) maxma14 kiraz anacının yaprak rejenerasyonuna etkisiʷ

Muamele Rejenere Eksplant % Kallus veren explant % Eksplantbaşınaʸ BA (mg lˉ¹) kallus kolonisi sayısı Karanlık

0 0 0,0b 0,0 b

1,25 0 10,0aˣ 0,10a 2,5 0 10,0a 0,10a 5 0 2,5ab 0,02ab 10 0 2,5ab 0,02ab 20 0 2,5ab 0,02ab

ʷ%5 seviyesinde LSD testine tabi tutulmuşlardır. ˣAynı harfle gösterilen ortalamalar arasındaki farklar önemsiz, farklı harfle gösterilen ortalamalar arasındaki farklar önemlidir (p<0,05) ʸ 0,3 cm’ den küçük kalluslar değerlendirilmeye alınmamıştır.

4.2.2. Thidiazuron (TDZ)’un Mazzard F12-1 ve Maxma 14 kiraz anacının yaprak rejenerasyonu üzerine etkileri

4.2.2.1. Thidiazuron (TDZ)’ un aydınlık ortamda Mazzard F 12-1 kiraz anacının yaprak rejenerasyonuna etkisi

Mazzard F12-1 kiraz anacında TDZ’in farklı dozlarından yapılan rejenerasyon denemesinde (Çizelge 4.9.), aydınlık uygulamada TDZ 2 mg lˉ¹ dozunda %5 oranında elde edilmiştir (Şekil 4.8.). Explant başına sürgün 0,05 oranındadır. En yüksek kallus oluşumu % 87,5 oranıyla TDZ 2 mg lˉ¹ ve % 60 oranıyla TDZ 1 mg lˉ¹dozuna aittir. Bu

33 oran TDZ içermeyen ortamda % 2,5 oranında kalmıştır. TDZ dozu arttıkça kallus yüzdesi ve sayısının arttığı gözlemlenmiştir. TDZ 2 mg lˉ¹ dozunda explant başına kallus sayısı 1,92 oranındadır.

Şekil 4.8. TDZ 2 mg lˉ¹ (Aydınlık) dozunda yapraktan elde edilen rejenerasyonlar

Çizelge 4.9. Thidiazuron (TDZ)’ un aydınlık ortamda Mazzard F 12-1 kiraz anacının yaprak rejenerasyonuna etkisiʷ

Muamele Rejenere Eksplant başına Kallus veren Eksplantbaşınaʸ TDZ Eksplant % sürgün sayısı explant kallus mg lˉ¹ % kolonisi sayısı Aydınlık

0 0 b 0,00 b 2,50d 0,05d

0,125 0 b 0,00 b 22,5d 0,32cd 0,25 0 b 0,00 b 22,5d 0,27cd 0,5 0 b 0,00 b 30,0cd 0,60c 1,5 0 b 0,00 b 52,5bc 1,12b 1 0 b 0,00 b 60,0ab 1,12b 2 5 aˣ 0,05 a 87,5a 1,92a ʷ%5 seviyesinde LSD testine tabi tutulmuşlardır. ˣAynı harfle gösterilen ortalamalar arasındaki farklar önemsiz, farklı harfle gösterilen ortalamalar arasındaki farklar önemlidir (p<0,05) ʸ 0,3 cm’ den küçük kalluslar değerlendirilmeye alınmamıştır.

4.2.2.2. Thidiazuron (TDZ)’ un karanlık ortamda (10 günlük karanlık inkübasyon uygulaması) Mazzard F12-1 kiraz anacının yaprak rejenerasyonuna etkisi

10 günlük karanlık inkübasyon uygulaması yapılan TDZ rejenerasyon denemesinde TDZ‘ in hiçbir dozunda rejenerasyon elde edilememiştir (Çizelge 4.10.). Aydınlık uygulamasından farklı olarak TDZ içermeyen dozda %5 oranında köklenme gözlemlenmiştir. Explant başına kök sayısı 0,07 oranında ve kök uzunluğu 3,1 mm’ dir. TDZ içermeyen dozda % 7,5 oranıyla en düşük kallus oluşumu görülmüştür. Explant

34 başına kallus sayısı TDZ dozu arttıkça yükselmiştir. TDZ 0,125 mg lˉ¹ dozunda 0,60 oranında, 2 mg lˉ¹ dozunda ise 1,07 oranında elde edilmiştir.

Çizelge 4.10. Thidiazuron (TDZ)’ un karanlık ortamda (10 günlük karanlık inkübasyon uygulaması) Mazzard F12-1 kiraz anacının yaprak rejenerasyonuna etkisiʷ

Muamele Rejenere Köklenen Explant En uzun Kallus Eksplantbaşınaʸ TDZ Eksplant explant basına kök kök veren kallus (mg lˉ¹) % % sayısı (mm) explant kolonisi sayısı Karanlık %

0 0 5,0aˣ 0,07ab 3,1a 7,5d 0,07d

0,125 0 2,5b 0,15a 1,4ab 37,5cd 0,60c 0,25 0 0,0 c 0,00 b 0,0 b 45,0bc 0,47c 0,5 0 0,0 c 0,00 b 0,0 b 72,5ab 1,50a 1,5 0 0,0 c 0,00 b 0,0 b 76,6ab 1,30ab 1 0 0,0 c 0,00 b 0,0 b 80,0a 1,2ab 2 0 0,0 c 0,00 b 0,0 b 67,5ab 1,07b ʷ%5 seviyesinde LSD testine tabi tutulmuşlardır. ˣAynı harfle gösterilen ortamalar arasındaki farklar önemsiz, farklı harfle gösterilen ortalamalar arasındaki farklar önemlidir (p<0,05) ʸ 0,3 cm’ den küçük kalluslar değerlendirilmeye alınmamıştır.

Deneme süresince yapılan gözlemlerde kallusların iri ve pembe-yeşil renkte olduğu görülmüştür (Şekil 4.9.).

Şekil 4.9. Mazzard F12-1 anacının TDZ rejenerasyon denemesinde oluşan pembe-yeşil renkteki kalluslardan bir görüntü

4.2.2.3. Thidiazuron (TDZ)’ un aydınlık ortamda Maxma 14 kiraz anacının yaprak rejenerasyonuna etkisi

Maxma14 kiraz anacında TDZ bitki büyüme düzenleyicinin farklı dozlarında yapılan aydınlık çalışmasının sonuçları Çizelge 4.11.’ de gösterilmiştir. Çalışılan TDZ dozlarından rejenerasyon elde edilememiştir. TDZ içermeyen ortamda % 5 oranında

35 köklenme elde edilmiştir. Explant başına kallus sayısı 0,07 oranındadır. En uzun kök uzunluğu 2,3 mm’ dir.

Çizelge 4.11. Thidiazuron (TDZ)’ un aydınlık ortamda maxma14 kiraz anacının yaprak rejenerasyonuna etkisiʷ

Muamele Rejenere Köklenen Explant basına En uzun Kallus veren Eksplant başınaʸ TDZ Eksplant explant kök sayısı kök explant kallus kolonisi sayısı (mg lˉ¹) % % (mm) %

Aydınlık 0 0 5aˣ 0,07a 2,3a 15,0c 0,17d

0,125 0 0 b 0,00 b 0,0b 62,5b 1,42c 0,25 0 0 b 0,00 b 0,0b 80,0ab 2,45a 0,5 0 0 b 0,00 b 0,0b 63,3b 1,75bc 1 0 0 b 0,00 b 0,0b 95,0a 2,15ab 1,5 0 0 b 0,00 b 0,0b 80,0ab 1,87bc 2 0 0 b 0,00 b 0,0b 80,0ab 1,77bc ʷ%5 seviyesinde LSD testine tabi tutulmuşlardır. ˣAynı harfle gösterilen ortalamalar arasındaki farklar önemsiz, farklı harfle gösterilen ortalamalar arasındaki farklar önemlidir (p<0,05) ʸ 0,3 cm’ den küçük kalluslar değerlendirilmeye alınmamıştır.

Kallus oluşumları istatiksel açıdan önemli bulunmuştur (Şekil 4.10). Aydınlık uygulamasında en düşük oran TDZ içermeyen ortamda (%15,5) gözlemlenmiştir. Explant başına kallus sayısı en yüksek 0,25 mg lˉ¹ (2,45) ve 1 mg lˉ¹ TDZ (2,15) içeren ortamlarda elde edilmiştir.

Şekil 4.10. Maxma14 anacında TDZ 1.5 mg lˉ¹dozundaki rejenerasyon denemesinde oluşan kalluslar

4.2.2.4. Thidiazuron (TDZ)’ un karanlık ortamda (10 günlük karanlık inkübasyon uygulaması) Maxma 14 kiraz anacının yaprak rejenerasyonuna etkisi

TDZ‘ in farklı dozlarından kurulan 10 günlük karanlık inkübasyon denemesinin sonuçları Çizelge 4.12’ de özetlenmiştir. TDZ’ in karanlık uygulamasından rejenerasyon elde edilememiştir.

Çizelge 4.12. Thidiazuron (TDZ)’ un karanlık ortamda( 10 günlük karanlık inkübasyon uygulaması) Maxma14 kiraz anacının yaprak rejenerasyonuna etkisiʷ

Muamele Rejenere Köklenen Explant basına Kallus veren Eksplantbaşına kallus ʸ TDZ Eksplant % explant kök sayısı explant kolonisi sayısı (mg lˉ¹) % % Karanlık 0 0 5,0abˣ 0,07ab 0,0c 0,00c

0,125 0 0,0b 0,00c 57,5bc 1,35b 0,25 0 13,3a 0,06ab 80ab 2,13a 0,5 0 12,5a 0,17a 97,5a 1,87ab 1,5 0 0,0b 0,00c 66,6b 1,52b 1 0 0,0b 0,00c 87,5a 2,10a 2 0 0,0b 0,00c 95,0a 1,67ab ʷ%5 seviyesinde LSD testine tabi tutulmuşlardır. ˣAynı harfle gösterilen ortalamalar arasındaki farklar önemsiz, farklı harfle gösterilen ortalamalar arasındaki farklar önemlidir (p<0,05) ʸ 0,3 cm’ den küçük kalluslar değerlendirilmeye alınmamıştır..

Karanlık ortamdaki TDZ rejenerasyon çalışmasında 0, 0.25 ve 0,5 mg lˉ¹dozlarında kök oluşumu görülmüştür (Şekil 4.11.). Explant başına kök sayısı TDZ 0 mg lˉ¹ dozunda 0.07, TDZ 0,25 mg lˉ¹ dozunda 0.06, TDZ 0.5 mg lˉ¹ dozunda 0.17 oranlarındadır.

Şekil 4.11. Maxma14 anacında TDZ rejenerasyon denemesinde kök oluşumu

En yüksek kallus yüzdeleri %97,5 oranıyla 0,5 mg lˉ¹ TDZ , %95 oranıyla 2 mg lˉ¹ TDZ, %87,5 oranıyla 1 mg lˉ¹ TDZ dozunda ve %80 oranıyla 0,25 mg lˉ¹ TDZ dozunda elde edilmiştir. TDZ içermeyen ortamda kallus oluşumu gerçekleşmemiştir.

4.3. Optimizasyon Denemeleri

4.3.1. Mazzard F12-1 kiraz anacının aydınlık ortamda NAA (naftelenasetikasit) ve BA (benziladenin)‘ in kombinasyonları üzerinde yapılan çalışmalar

Mazzard F12-1 kiraz anacında rejenerasyon oranını arttırmak amacıyla BA+NAA kombinasyonları çalışılmıştır (Şekil 4.12.). Sonuçlar Çizelge 4.13’ de özetlenmiştir. Karanlık ve aydınlık çalışılan kombinasyonların aydınlık ve karanlık uygulamalarından rejenerasyon elde edilememiştir.

Aydınlık uygulamada en yüksek kallus yüzdesi BA 2 + NAA 1 mg lˉ¹dozunda %100 oranında, karanlık uygulamada BA 0,5 + NAA 0,1 ve BA 2+NAA 1 mg lˉ¹ dozunda %70 oranlarında elde edilmiştir. En düşük kallus yüzdesi BA 1 + NAA 0,25 mg lˉ¹ dozunda %17,5 oranında gözlemlenmiştir. Aydınlık uygulama karanlık uygulamaya göre kallus oluşumunu daha fazla teşvik etmiştir. Explant başına kallus sayısı BA 2 + NAA 1 mg lˉ¹ dozunda hem aydınlık hem karanlık uygulamada en yüksek değeri göstermiştir.

Şekil 4.12. BA (Benziladenin) + NAA (Naftelenasetikasit) kombinasyonlarından kurulan rejenerasyon denemeleri

Çizelge 4.13. Mazzard F12-1 kiraz anacının aydınlık ve karanlık ortamda naftelenasetikasit (NAA) ve benziladenin (BA) ‘in kombinasyonları üzerinde yapılan çalışmalarʷ

Muamele Rejenere Kallus veren Eksplantbaşına kallus ʸ (mg lˉ¹) Eksplant explant kolonisi sayısı % %

BA 0,5 + 0 65bˣ 1,3b NAA 0,1

Aydınlık BA 1 + 0 30bc 0,60bc NAA 0,25

BA 2 + 0 100a 2,37a NAA 1

BA 0,5 + 0 70,0ab 1,12b NAA 0,1 Karanlık BA 1 + 0 17,5c 0,22c (10 günlük NAA 0,25 inkübasyon) BA 2 + 0 70,0ab 1,85ab NAA 1

ʷ%5 seviyesinde LSD testine tabi tutulmuşlardır. ˣAynı harfle gösterilen ortalamalar arasındaki farklar önemsiz, farklı harfle gösterilen ortalamalar arasındaki farklar önemlidir (p<0,05) ʸ 0,3 cm’ den küçük kalluslar değerlendirilmeye alınmamıştır.

4.3.2. Rejenerasyon gösteren TDZ muamelesi etrafında optimizasyon

Rejenerasyon gösteren 2 mg lˉ¹ TDZ dozununa yakın 1.8, 1.9, 2.1, 2.2 mg lˉ¹ dozlarında %5 rejenerasyon oranını arttırmak amacıyla çalışma yapılmıştır. Kullanılan TDZ dozlarından rejenerasyon elde edilememiştir (Çizelge 4.14.). Çizelge incelendiğinde TDZ dozu arttıkça kallus oranının arttığı görülebilir. En yüksek kallus yüzdesi %87,5 oranıyla 2,2 mg lˉ¹ TDZ, %72,5 oranıyla 1,9 mg lˉ¹ TDZ ve %60 oranıyla 2,1 mg lˉ¹ TDZ muamelesinde görülmüştür. Explant başına kallus sayısı en düşük 1,8 mg lˉ¹ TDZ dozunda 0,85 dozunda gözlemlenmiştir.

Çizelge 4.14. Rejenerasyon gösteren TDZ muamelesi etrafında optimizasyonʷ

Muamele Rejenere Eksplant % Kallus veren explant Eksplantbaşına kallus ʸ (mg lˉ¹) % kolonisi sayısı TDZ Aydınlık 1,8 0 45,0bˣ 0,85b

1,9 0 72,5ab 1,52a 2,1 0 60,0ab 1,25ab 2,2 0 87,5a 1,70a

ʷ%5 seviyesinde LSD testine tabi tutulmuşlardır. ˣAynı harfle gösterilen ortalamalar arasındaki farklar önemsiz, farklı harfle gösterilen ortalamalar arasındaki farklar önemlidir (p<0,05) ʸ 0,3 cm’ den küçük kalluslar değerlendirilmeye alınmamıştır.

4.3.3. Karanlık optimizasyonu uygulaması (5-10-15-20)

4.3.3.1. Mazzard F12-1 kiraz anacının yaprak rejenerasyonu gösteren benziladenin (BA) üzerinde yapılan karanlık inkübasyon çalışmaları

Mazzard F/12-1 kiraz anacında elde edilen rejenerasyon dozlarında karanlık optimizasyonu uygulmasının sonuçları Çizelge 4.15.’ de verilmiştir.

İlk karanlık rejenerasyon çalışmasında 10 günlük inküsbasyonda BA 2,5 mg lˉ¹dozunda %5’lik rejenerasyon eldesinin oranının arttırılması amacıyla karanlık inkübasyonu uygulaması yapılmıştır. BA 10 mg lˉ¹ (Çizelge 4.15) dozunda rejenerasyon elde edilemezken, BA 2,5 mg lˉ¹ dozunda 5 ve 15 günlük karanlık muamelesinde % 2,5 oranında rejenerasyon elde edilmiştir (Şekil 4.13.).

Kallus yüzdesi BA 2,5 mg lˉ¹ dozunda, BA 10 mg lˉ¹ dozuna oranla daha yüksektir. En yüksek explant başına kallus sayısı 5 gün karanlık uygulamasında 0,40 oranıyla, 10gün karanlık uygulamasında 0,30 ve 15 gün karanlık uygulamasında 0,2 oranlarında BA 2,5 mg lˉ¹ dozunda gözlemlenmiştir. En düşük oran 0,025 ile BA 10 mg lˉ¹ dozunda 15 ve 20 gün karanlık uygulamasına aittir.

a b

Şekil 4.13. (a) BA 2,5 mg lˉ¹ 5günlük karanlık uygulamasıyla yapraktan elde edilen rejenerasyon (b) BA 2,5 mg lˉ¹ 15 gün karanlık uygulamasıyla elde edilen rejenerasyon

Çizelge 4.15. Mazzard F 12-1 kiraz anacının yaprak rejenerasyonu gösteren benziladenin (BA) üzerinde yapılan karanlık inkübasyon çalışmalarıʷ

Karanlık Muamele Rejenere Eksplant Kallus veren Eksplantbaşına kallus ʸ (mg lˉ¹) Eksplant % başına sürgün explant % kolonisi sayısı sayısı 5 gün BA 2,5 2,5aˣ 0,02a 37,5a 0,40a

BA 10 0,0b 0,00b 10,0bc 0,125bc

10 gün BA 2,5 0,0b 0,00b 25,0ab 0,300a

BA 10 0,0b 0,00b 7,5bc 0,075c 15 gün BA 2,5 2,5a 0,02a 20,0ab 0,200ab

BA 10 0,0b 0,00b 2,5c 0,025cd 20gün BA 2,5 0,0b 0,00b 15,0b 0,150bc

BA 10 0,0b 0,00b 2,5c 0,025cd ʷ%5 seviyesinde LSD testine tabi tutulmuşlardır. ˣAynı harfle gösterilen ortalamalar arasındaki farklar önemsiz, farklı harfle gösterilen ortalamalar arasındaki farklar önemlidir (p<0,05) ʸ 0,3 cm’ den küçük kalluslar değerlendirilmeye alınmamıştır.

4.3.3.2. Mazzard F12-1 kiraz anacının yaprak rejenerasyonu gösteren thidiazuron (TDZ) üzerinde yapılan karanlık inkübasyon çalışmaları

Önceki çalışmalarda rejenerasyon elde edilen TDZ 2 mg lˉ¹ dozunda uygulanan karanlık optimizasyon çalışmasının sonuçları Çizelge 4.16.’ da özetlenmiştir. 5, 10, 15 ve 20 günlük karanlık optimizasyonunda TDZ 2 mg lˉ¹ dozunda rejenerasyon elde edilememiştir.

Çizelge 4.16. Mazzard F12-1 kiraz anacının yaprak rejenerasyonu gösteren thidiazuron (TDZ) üzerinde yapılan karanlık inkübasyon çalışmalarıʷ

Muamele Rejenere Eksplant % Kallus veren explant Eksplantbaşına kallus ʸ (mg lˉ¹) % kolonisi sayısı TDZ 2 Aydınlık 5 gün 0 65,0abˣ 1,72a

10 gün 0 67,5ab 1,07a 15 gün 0 85,0a 2,12a 20gün 0 82,5a 2,12a ʷ%5 seviyesinde LSD testine tabi tutulmuşlardır. ˣAynı harfle gösterilen ortalamalar arasındaki farklar önemsiz, farklı harfle gösterilen ortalamalar arasındaki farklar önemlidir (p<0,05) ʸ 0,3 cm’ den küçük kalluslar değerlendirilmeye alınmamıştır.

TDZ karanlık çalışmasında karanlık gün sayısı arttıkça kallus yüzdesi artış göstermiştir. Kallus yüzdeleri 5 gün % 65, 10 gün %67, 15 gün %85 ve 20 gün karanlıkta %82,5 oranlarında gözlemlenmiştir. BA, TDZ ile karşılaştırıldığında tam tersi bir etki göstermiştir. BA içeren ortamda karanlık uygulaması süresi uzadıkça kallus oluşumu azalmıştır. BA 2,5 mg lˉ¹ dozunda en yüksek 5, 10 ve 15 gün karanlık uygulamasında

41 kallus yuzdesi sırasıyla 37,5, 25 ve 20 oranlarındadır. Araştırmada BA ve TDZ’ in farklı düzeylerinin kallus oluşumu oranları üzerine etkileri istatistiksel olarak önemli bulunmuştur.

4.3.4. TDZ ile ön muamelenin rejenerasyona etkisi

Mazzard F 12-1 kiraz anacında rejenerasyon oranının arttırılması için TDZ ile ön muamele uygulamasının sonuçları Çizelge 4.17.’de verilmiştir. Ekim yapılan petri besin ortamının 2 mg lˉ¹ TDZ, ön muamele yapılan sıvı ortamların da 0, 0.05, 0.1, 0.25, 0,5 mg lˉ¹TDZ içerdiği ile ön muamele uygulaması Mazzard F12-1 anaçlarında rejenerasyon oranına etkisi istatiksel olarak önemsiz bulunmuştur, rejenerasyon gözlemlenmemiştir. Ön muamelede kullanılan dozların miktarı arttıkça kallus veren explant yüzdesi ve explant başına kallus sayısında artış görülmektedir. Explant başına kallus sayısı 0,5 mg lˉ¹ ve 0,25 mg lˉ¹ TDZ dozunda sırasıyla 82,5 ve 72,5 en yüksek oranlardadır.

Çizelge 4.17. Mazzard F12-1 kiraz anacının yaprak rejenerasyonu gösteren thidiazuron (TDZ)’ un dozu üzerinde 1 saat uygulanan TDZ ön muamelesi uygulamasıʷ

Muamele Rejenere Eksplant Kallus veren explant Eksplantbaşına kallus ʸ (mg lˉ¹) % % kolonisi sayısı TDZ 0 0 35,0dˣ 0,67c 0,05 0 47,5cd 0,92bc 0,1 0 62,5bc 1,32b 0,25 0 72,5ab 1,27b 0,5 0 82,5a 2,17a ʷ%5 seviyesinde LSD testine tabi tutulmuşlardır. ˣAynı harfle gösterilen ortalamalar arasındaki farklar önemsiz, farklı harfle gösterilen ortalamalar arasındaki farklar önemlidir (p<0,05) ʸ 0,3 cm’ den küçük kalluslar değerlendirilmeye alınmamıştır.

Karanlık ortamda 24 saat 0, 0.05, 0.1, 0.25, 0,5 mg lˉ¹ TDZ içeren sıvı ortamlarda ön muamele yapılan rejenerasyon uygulaması sonucu yapraklar canlılığını yitirmiştir. Bu uygulamadan sonuç elde edilememiştir (Şekil 4.14.).

Şekil 4.14. 24 saat TDZ ön muamele uygulanan Mazzard F12-1 anacının yaprakları

Mazzard F12-1 anacında rejenerasyon elde edilen TDZ 2 mg lˉ¹ muamelesinin oranını arttırmak amacıyla yapılan diğer TDZ ön muamelesi uygulamasında 0, 4, 4.4, 4.8, 6.2, 6.8, 7.2, 8.6, 9, 9.4 µM TDZ dozları (Çizelge 4.18.) içeren sıvı ortamlar çalışılmıştır. Bu denemede hiçbir dozda rejenerasyon oluşmamıştır (Şekil 4.15.).

Şekil 4.15. Mazzard F12-1 anacında TDZ ön muamele denemesinden bir görüntü

Çizelge 4.18. Mazzard F12-1 kiraz anacının yaprak rejenerasyonu gösteren thidiazuron (TDZ)’ un dozu üzerinde uygulanan TDZ ön muamelesi uygulaması 2ʷ

Muamele Rejenere Eksplant Köklenen explant Kallus veren Eksplantbaşına kallus ʸ (µM) % % explant kolonisi sayısı TDZ % 1saat 0 0 0 57,5cˣ 0,70cd 4 0 0 36,6d 0,60cd 4,4 0 0 40,0d 0,52cd 4.8 0 0 37,5d 0,50d 6.2 0 0 67,5abc 1,22ab 6.8 0 0 75,0ab 1,02abc 7.2 0 0 70,0abc 1,32a 8.6 0 0 80,0a 1,20ab

9 0 0 60,0c 0,90bcd 9,4 0 0 62,5bc 0,90bcd

ʷ%5 seviyesinde LSD testine tabi tutulmuşlardır. ˣAynı harfle gösterilen ortalamalar arasındaki farklar önemsiz, farklı harfle gösterilen ortalamalar arasındaki farklar önemlidir (p<0,05) ʸ 0,3 cm’ den küçük kalluslar değerlendirilmeye alınmamıştır.

Uygulanma değerlendirildiğinde kallus oranı ön muameledeki TDZ konsantrasyonu arttıkça çoğaldığını göstermektedir. 0.5, 0.25 mg lˉ¹ ve 8.6, 7.2, 6.8, 6.2 µM TDZ oranlarında en iyi kallus oluşumunun gerçekleştiği görülmektedir.

4.3.5. BA ile ön muamelenin rejenerasyona etkisi

4.3.5.1. Mazzard F12-1 kiraz anacının yaprak rejenerasyonu gösteren 10 mg lˉ¹ benziladenin (BA) dozu üzerinde 1 saat uygulanan BA ön muamelesi uygulaması (aydınlık)

Mazzard F12-1 kiraz anacında 10 mg lˉ¹ (aydınlık) oranında görülen rejenerasyon oranının arttırılması amacıyla 1 saat 0, 0.5, 1, 1.5, 2 mg lˉ¹ BA ön muamelesi uygulanan çalışmanın sonuçları Çizelge 4.19.’ de verilmiştir. BA’nin hiçbir dozunda rejenerasyon elde edilememiştir. Kallus veren explant yüzdesinde en yüksek oranlar BA 1, 1,5 ve 2 mg lˉ¹ dozlarından elde edilmiştir. Explant başına kallus sayısı oranı 0,5 mg lˉ¹ dozunda 0,06 oranında görülmüştür.

Çizelge 4.19. Mazzard F12-1 kiraz anacının yaprak rejenerasyonu gösteren 10 mg lˉ¹ benziladenin (BA) dozu üzerinde 1 saat uygulanan ba ön muamelesi uygulaması (aydınlık)ʷ

BA 10 mg lˉ¹ Rejenere Eksplant Kallus veren explant Eksplantbaşına kallus ʸ % % kolonisi sayısı

0 0 12,5abˣ 0,12a 0,5 0 10,0b 0,06a 1 0 6,6ab 0,16a 1,5 0 16,6a 0,20a 2 0 12,5ab 0,12a ʷ%5 seviyesinde LSD testine tabi tutulmuşlardır. ˣAynı harfle gösterilen ortalamalar arasındaki farklar önemsiz, farklı harfle gösterilen ortalamalar arasındaki farklar önemlidir (p<0,05) ʸ 0,3 cm’ den küçük kalluslar değerlendirilmeye alınmamıştır.

4.3.5.2. Mazzard F12-1 kiraz anacının yaprak rejenerasyonu gösteren 2,5 mg lˉ¹ benziladenin (BA) dozu üzerinde 1 saat uygulanan BA ön muamelesi uygulaması (karanlık)

Mazzard F12-1 kiraz anacında BA 2,5 mg lˉ¹ (karanlık) oranlarında görülen rejenerasyon oranının arttırılması amacıyla 1 saat 0, 0.5, 1, 1.5, 2 mg lˉ¹ BA ön muamelesi uygulanan çalışmanın sonuçları Çizelge 4.20.’ de verilmiştir. Çalışılan dozlarından rejenerasyon elde edilememiştir. BA 10 mg lˉ¹ (aydınlık) dozunun ön muamele çalışmasından farklı olarak 0 mg lˉ¹ dozunda yapılan ön muamele sonucunda %2,5 oranında köklenme elde edilmiştir. Explant başına kök sayısı 0,025 oranında ve en uzun kök uzunluğu 0,5 mm’ dir. En yüksek kallus veren explant yüzdesi 0, 0.1, 0,25 ve 0,5 mg lˉ¹ BA dozunda görülmüştür. Explant başına kallus sayısı 0,05 mg lˉ¹ dozunda 0,10 oranında ve 0,25 mg lˉ¹ dozunda 0,25 oranında elde edilmiştir.

Çizelge 4.20. Mazzard F12-1 kiraz anacının yaprak rejenerasyonu gösteren 2,5 mg lˉ¹ benziladenin (BA) dozu üzerinde 1 saat uygulanan BA ön muamelesi uygulaması (karanlık) ʷ

BA Rejenere Köklenen Explant basına kök En uzun Kallus Eksplantʸ 2,5mg lˉ¹ Eksplant explant sayısı kök veren başına kallus % % (mm) explant % kolonisi sayısı

0 0 2,5aˣ 0,025a 0,5a 20,0ab 0,22a 0,05 0 0b 0b 0b 10,0b 0,10a 0,1 0 0b 0b 0b 20,0ab 0,16a 0,25 0 0b 0b 0b 22,5a 0,25a 0,5 0 0b 0b 0b 17,5ab 0,17a ʷ%5 seviyesinde LSD testine tabi tutulmuşlardır. ˣAynı harfle gösterilen ortalamalar arasındaki farklar önemsiz, farklı harfle gösterilen ortalamalar arasındaki farklar önemlidir (p<0,05) ʸ 0,3 cm’ den küçük kalluslar değerlendirilmeye alınmamıştır.

4.4. Köklenme Denemeleri ve Alıştırma

4.4.1. Indole-3-butyric acid (IBA)’in Maxma 14 kiraz anacının köklenmesi üzerine etkisi

Maxma14 kiraz anacının IBA 0, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2 mg lˉ¹ oranlarından kurulan köklenme denemesi sonuçları Çizelge 4.21.‘ de görülmektedir. Maxma 14 kiraz anacında en iyi köklenme yüzdesi 2 mg lˉ¹ IBA (%60) ve 1 mg lˉ¹ (%56,6) dozunda görülmektedir. Explant başına kök sayısında 0,5, 1 ve 2 mg lˉ¹ IBA dozlarında 0,53 ve 0,9 oranıyla en yüksek değeri vermişlerdir. En uzun kök uzunluğu 39,9 mm oranıyla 0,5 mg lˉ¹ IBA, 34,2 mm oranıyla 1 mg lˉ¹ IBA ve 33,1 mm oranıyla 2 mg lˉ¹ dozundan elde edilmiştir. IBA denemesinde kullanılan dozlarda miktarı arttıkça köklenmenin arttığı gözlemlenmiştir. (Şekil 4.16.). Maxma 14 kiraz anacında IBA ‘nın bütün dozlarında %100 kallus oluşumu görülmüştür. En yüksek explant başına kallus sayısı ve en geniş kallus çapı 2 mg lˉ¹ IBA dozunda (0,84) elde edilmiştir (Şekil 4.16.).

Çizelge 4.21. Indole-3-butyric acid (IBA)’in Maxma 14 kiraz anacının köklenmesi üzerine etkisiʷ

Muamele Köklenme Eksplant En uzun kök Kallus veren Eksplantʸ En geniş IBA % Basına kök (mm) explant başına kallus çapı(mm) (mg lˉ¹) sayısı % kolonisi sayısı 0 20,0cˣ 0,20b 15,6cd 100a 0,34 d 3,4d 0,05 26,6bc 0,26b 11,6d 100a 0,38d 3,7d 0,1 30 bc 0,43b 19,8bcd 100a 0,39 d 4,7c 0,5 36,6b 0,53ab 39,9a 100a 0,47c 3,8d 1 56,6a 0,9a 34,2ab 100a 0,76 b 7,6b 2 60,0a 0,9a 33,1abc 100a 0,84 a 8,4a ʷ%5 seviyesinde LSD testine tabi tutulmuşlardır. ˣAynı harfle gösterilen ortalamalar arasındaki farklar önemsiz, farklı harfle gösterilen ortalamalar arasındaki farklar önemlidir (p<0,05) ʸ 0,3 cm’ den küçük kalluslar değerlendirilmeye alınmamıştır.

Şekil 4.16. IBA’nın Maxma 14 anacının köklenmesi üzerine etkileri

4.4.2. Indole-3-butyric acid (IBA)’in Mazzard F 12-1 kiraz anacının köklenmesi üzerine etkisi

Mazzard F/12-1 anaçlarının IBA 0, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2 mg lˉ¹ oranlarından kurulan köklenme denemesi sonuçları Çizelge 4.22. ‘de görülmektedir. En yüksek köklenme yüzdesi 0.5, 1 ve 2 mg lˉ¹ IBA dozunda elde edilmiştir. Explant başına en iyi kök sayıları 2,34 oranıyla 2 mg lˉ¹, 2,06 oranıyla 1 mg lˉ¹ ve 2,00 oranıyla 0,5 mg lˉ¹ dozunda, en uzun kök uzunluğu ise 33,0 mm oranıyla 0,5 mg lˉ¹ dozunda ve 26,9 mm oranıyla 1 mg lˉ¹ dozunda gözlemlenmiştir. En düşük kallus yüzdesi 2 mg lˉ¹ dozunda 56,6 oranında, en yüksek 0,5 mg lˉ¹ IBA (%90) ve 1 mg lˉ¹ IBA (%83,3) dozunda elde edilmiştir. En yüksek explant başına kallus sayısı 0,61 oranıyla 2 mg lˉ¹ IBA dozundan elde edilmiştir. En geniş kallus çapı 0,84 oranıyla yine 2 mg lˉ¹ IBA dozuna aittir.

Çizelge 4.22.Indole-3-butyric acid (IBA)’ in bitki büyüme düzenleyicisinin Mazzard F 12-1 kiraz anacının köklenmesi üzerine etkisiʷ

Muamele Köklenme Eksplant En uzun kök Kallus veren Eksplantʸ En geniş IBA % Basına (mm) explant başına kallus çapı(mm) (mg lˉ¹) kök sayısı % kolonisi sayısı 0 33,3dˣ 0,70c 11,3c 76,6ab 0,29b 2,9b 0,05 40cd 0,86c 16,2bc 70bc 0,29b 2,9b 0,1 46,6 bcd 1,13bc 14,8bc 66,6bc 0,24b 2,4b 0,5 56,6abc 2,00ab 33,0a 90a 0,23b 2,3b 1 63,3ab 2,06ab 26,9ab 83,3ab 0,28b 2,8b 2 70a 2,34a 14,0bc 56,6c 0,61a 6,1a ʷ%5 seviyesinde LSD testine tabi tutulmuşlardır. ˣAynı harfle gösterilen ortalamalar arasındaki farklar önemsiz, farklı harfle gösterilen ortalamalar arasındaki farklar önemlidir (p<0,05) ʸ 0,3 cm’ den küçük kalluslar değerlendirilmeye alınmamıştır.

Şekil 4.17. IBA’nın Mazzard F12-1 anacının köklenmesi üzerine etkileri

Çizelge incelendiğinde IBA ‘nın anaçlarda kallus oluşumunu önemli derecede arttırdığı görülmektedir. Araştırmada IBA’nın farklı düzeylerinin in vitro sürgünlerin köklenme oranları üzerine etkileri istatistiksel olarak önemli bulunmuştur.

4.4.3. Rejenerasyonla elde edilen bitkileri dış koşullara alıştırma

Başarılı bir rejenerasyon protokolünden söz edebilmek için F12-1 anacından elde edilen sürgünlerin köklendirilmesi ve başarılı bir şekilde dış koşullara alıştırılması gereklidir. Dolayısıyla bu çalışmada in vitro sürgünlerinden oluşan kök sayısı, kök uzunluğu ve köklenen sürgün sayıları birlikte değerlendirildiği zaman rejenerasyondan elde edilen bitkiler 2 mg lˉ¹ IBA bitki büyüme düzenleyicisi dozunda köklenmeye alınmıştır.

Köklenen bitkiler otoklavlanmış topraklı kavanozların içine besin ortamıyla beraber alıştırmaya alınmıştır. 2-3 ay steril topraklı kavanozlarda besin ortamı değiştirilerek gelişmesi sağlanmıştır. Daha sonra içinde torf bulunan 8x8 cm saksılara alınmışlardır. Burada bitkilerin dış koşullara alıştırılması sağlanmıştır ( Şekil 4.18.).

A B

C D

Şekil 4.18. (A) Maxma14 anacını toprağa aktarım. (B) Rejenerasyon (Mazzard F 12-1) bitkisinin otoklavlanmış toprak ve besin ortamıyla toprağa alıştırılması. (C) Torflu toprağa aktarım. (D) F12-1 anacının dış koşullara alıştırılması.

5. TARTIŞMA VE ÖNERİLER

Bu çalışmada ‘Mazzard F12-1 ve ‘Maxma14’ kiraz anaçlarının in vitro multiplikasyonu ve yapraktan rejenerasyonu çalışılmıştır.

5.1. Multiplikasyon Çalışmaları

Yeterli bitki sayısının oluşturulabilmesi için 4-6 ay boyunca alt kültüre alınan anaçlarda bitkinin muhafasında kullanılan kaplarda camlaşma problemi yaşanmıştır. Jar, magenta, kavanoz farklılıklarına bakılmış, 2 anacında kavanoz ortamında camlaşma gösterdiği ve sağlıklı gelişimi için en iyi kabın ‘jar’ olduğu gözlemlenmiştir.

1. ve 2. alt kültür zamanlarında ortama eklenen Fe-EDDA ‘nın Mazzard F 12-1 anacının yapraklarında sarartma meydana getirdiği görülmüş ve ortamdan çıkarılmıştır.

Multiplikasyon denemelerinde Ms (+0,54 uM NAA) besin ortamı kullanılmış ve F12-1 bitkisinde en iyi kardeşleme 20 mg lˉ¹ BA (1.40 sürgün/eksplant), 10 mg lˉ¹ BA (1,20 sürgün/eksplant), 5 mg lˉ¹ BA (1,36 sürgün/eksplant) ve 2,5 mg lˉ¹ BA (1,08 sürgün/eksplant) ve 0,125 mg lˉ¹ TDZ (1,03 sürgün/eksplant), 0,25 mg lˉ¹ TDZ (1,52 sürgün/eksplant), 0,5 mg lˉ¹ TDZ (1,16 sürgün/eksplant) dozlarından elde edilmiştir. F 12-1 Anacında BA miktarı arttıkça kardeşlemenin arttığı, sürgün boyunun azaldığı gözlemlenmiştir. Goudarzi vd. (1997), F 12/1 kiraz anacının sürgün ucu ile çoğaltılması üzerinde çalışmışlar, çoğalma aşamasında en iyi sonuç, 0.25 mg lˉ¹ NAA ile 1 mg lˉ¹ BA bulunan ortamda elde edildiğini rapor etmişlerdir.

Hammatt ve Grant (1993), F 12/1 (P. avium), Colt (P.avium ×P.pseudocerasus) kiraz anaçlarını sürgün ucu ile üretmeye çalışmışlar; besin ortamının pH’sının 5.0’a düşürülmesi, BA konsantrasyonunun 2.2 μM, agar konsantrasyonunun 5.5 veya 6.5 gr/l olması ve besin ortamına 1.0 μM phloroglucinol ilave edilmesi durumunda sürgün çoğaltımının arttığı tespit etmişlerdir. Çalışmamızda 5.6-5.8 pH aralığında 7 gr/l agar kullanılmıştır.

Maxma14 anacında BA ‘nın önemli ölçüde camlaşma problemine yol açtığı görülmüştür. Çoğaltma aşamasında zorlanılmış ve BA miktarı düşürülüp camlaşma azaltılmıştır.

Fidancı vd. (2005), Gisela 5 ve MaxMa 14 Eksplant olarak sürgün ucu ve yan tomurcuklar kullandıkları çalışmada kültür oluşturmada MS ortamına 0.1 mg lˉ¹ GA3, 0.1 mg lˉ¹ NAA veya 0.1 mg lˉ¹ IBA, 0.5-1 mg lˉ¹ BA, 20 gr./l şeker ve 7 gr./l agar ilave edilmiştir. Kültür oluşturma aşamasında kardeşlenme aşamasında alt kültürlerde zaman zaman vitrifikasyon (camlaşma) çok önemli bir problem olarak rapor etmişlerdir.

BA çalışmasında karşılaştığımız camlaşma bulgumuza benzer olarak Alderson vd. (1987) yaptıkları çalışmada, P. tenolia’nın Firehill çeşidinin in vitro koşullardaki üretiminde MS temel ortamına 1 mg lˉ¹ BA ilave ederek axillary tomurcuk gelişiminin sağlandığını, ancak sürgünlerde vitrifikasyonun meydana geldiğini; özellikle de vitrifikasyonun explantların sterilizasyonu sırasında stres koşullarından ve ortamdaki yüksek BAP konsantrasyonundan kaynaklandığını; vitrifikasyonun BAP’ ın 1 mg lˉ¹’ den düşük olduğu dozlardaki ortamlarda azaldığını kaydetmişlerdir.

Maxma14 anacında en iyi kardeşleme oranları 2 mg lˉ¹ TDZ (1,2 sürgün/eksplant), 1,5 mg lˉ¹ TDZ (1,03 sürgün/eksplant), 1 mg lˉ¹ TDZ (0,96 sürgün/eksplant) ve 20 mg lˉ¹ BA (1,26 sürgün/eksplant), 10 mg lˉ¹ BA (1,10 sürgün/eksplant) dozlarındadır. TDZ içermeyen ortamda kardeşleme olmamıştır. Büyükdemirci (2005), Maxma 14 kiraz anacında 0.5 mg lˉ¹ BAP, 0.1 mg lˉ¹ IBA, 0.1 mg lˉ¹ GA3 ve 6 mg lˉ¹ agar içeren MS besin ortamında en iyi sürgün çoğaltımı görüldüğünü rapor etmişlerdir.

Günal (2006), Gisela 5 ve MaxMa 14 kiraz anaçlarının doku kültürü ile çoğaltılması çalışmalarında, GA3 (0.25 mg lˉ¹) sabit olmak üzere, yan sürgün çoğaltımında kullanılan BA’ın tek başına düşük dozları (0.1 ve 0.5 mg lˉ¹) ve düşük dozdaki 2,4-D (0.01 mg lˉ¹) ile birlikteki kombinasyonları diğer doz ve kombinasyonlarına göre daha başarılı olduğu görülmüştür. Çalışmaya paralel olarak çalışmamızda BA ‘nın düşük dozlarında bitki gelişimin daha iyi olduğu gözlemlenmiştir. Explant başına kardeş sayısının BA ‘nin diğer bitki büyüme düzenleyicilerle farklı kombinasyonlarda kullanılmasıyla kardeş sayısı arttırılabilir.

Al-Sabbagh vd. (1999), çalışmalarında, MaxMa 14 kiraz anacının in vitro üretiminde MS temel ortamına bizim çalışmamızdan farklı olarak IBA kullanmışlar, 4.44 μM benzyladenine ve 0.49 μM IBA ilavesiyle 4 haftalık süre sonunda 6 katı sürgün ve axillary tomurcuk gelişiminin sağlandığını rapor etmişlerdir. Çalışmamızda yalnız BA

50 kullanılarak kurulan denememizde 4 haftadan sonra bitkilerin camlaştığı, yan sürgün gelişimin olmadığı görülmüştür.

Maxma 14 kiraz anacında TZD bitki büyüme düzenleyiciyle kurulan kardeşleme denemesinde TDZ 1,5 ve 2 mg lˉ¹ dozlarında %100 oranında kallus oluşumu görülürken, explan başına sürgün sayısı 1,20 dir. TDZ bitki büyüme düzenleyicinin anaç üzerinde sürgün oluşumundan ziyade kallus teşviği daha etkilidir.

Sauer (1996) tarafından yapılan bir çalışmada 250C±1, 900 lux ışık, 16 saat fotoperyot kültür koşullarında genç sürgünlerin uç meristemleri alınarak 0.1 mg lˉ¹ NAA ve 2 mg lˉ¹ BAP içeren katı MS ortamında axillary sürgünlerin geliştiği; aynı koşullarda ancak bizim çalışmamızdan farklı olarak ışık intensitesi 500-600 lux’e düşürülerek, daha sonra buradan alınan axiller (yan) sürgünlerin 2 mg lˉ¹ IAA içeren katı veya sıvı haldeki 1/3 MS ortamına alınarak köklendirildiği belirtilmiştir.

TDZ ve BA ile yapılan multiplikasyon çalışmalarına bakılacak olursa BA ‘nın TDZ’ e oranla daha iyi kardeşlemeyi teşvik ettiği görülmüştür. Ruzic (2008), Lapins tatlı kiraz çeşidinin in vitro multipikasyonun sağlanması için MS ortamına eklenen sitokininlerin etkisine bakıldığında BA, isopentenyl adenine (2iP), Kinetin ve TDZ, 1, 2, 5, 10 ve 15 μM konsantrasyonlarında; IBA 0, 0.5, 2.5 ve 5 μM konsantrasyonlarında oksinle kombine etmiştir. Buna göre aksiyal ve lateral sürgünlerin boyuna ek olarak BA ortamı ile en yüksek multipikasyon sağlanmıştır.

Yıldırım vd. (2011), Hacıhaliloğlu kayısı çeşidinin en iyi kültüre başlama zamanının Mayıs ayı olduğu, in vitro kültüre alınması, çoğaltılması, köklendirilmesi ve aklimatizasyonuna etki eden faktörler üzerine yapılan çalışmada in vitro kültürlerin başlatılması için, eksplant alım tarihleri arasında belirgin farklılıklar olduğu görülmüştür. TDZ, BA ve Kinetin gibi sitokininlerin ve BA’in faklı konsantrasyonlarının in vitro kültür üzerindeki etkileri çalışılmış, sürgün çoğaltımında BA'nın farklı konsantrasyonları arasında 1 mg lˉ¹ BA'nın en iyi sonuç verdiği tespit edilmiştir. Sürgün sayısı bakımından ise en iyi sonuç 2.0 mg lˉ¹ BA içeren besin ortamından elde edilmiştir. Bu oran, 1 mg lˉ¹ BA içeren ortamdan kontrol grubuna göre farklılık göstermiştir.

F 12-1 bitkisinde en iyi kardeşleme 20 mg lˉ¹ BA (1.40 sürgün/eksplant), 10 mg lˉ¹ BA (1,20 sürgün/eksplant), 5 mg lˉ¹ BA (1,36 sürgün/eksplant) ve 2,5 mg lˉ¹ BA (1,08

51 sürgün/eksplant) ve 0,125 mg lˉ¹ TDZ (1,03 sürgün/eksplant), 0,25 mg lˉ¹ TDZ (1,52 sürgün/eksplant), 0,5 mg lˉ¹ TDZ (1,16 sürgün/eksplant) oranlarından elde edilmiştir. Maxma14 anacında ise 2 mg lˉ¹ TDZ (1,2 sürgün/eksplant), 1,5 mg lˉ¹ TDZ (1,03 sürgün/eksplant), 1 mg lˉ¹ TDZ (0,96 sürgün/eksplant) ve 20 mg lˉ¹ BA (1,26 sürgün/eksplant), 10 mg lˉ¹ BA (1,10 sürgün/eksplant) dozlarındadır. Sonuç olarak, F 12-1 ve Maxma 14 kiraz anaçları in vitro çoğaltıma uygun olup, diğer (GA₃, IBA vb.) bitki büyüme düzenleyicilerle birlikte kombinasyon şeklindeki dozlarla kullanılıp daha fazla kardeşleme miktarı daha da arttırılabilir. BA bitki büyüme düzenleyicisi Maxma14 sürgün çoğaltımı için camlaşma problemi yarattğı ve sürgün gelişimi, kardeşlenme ve sürgün boyu gelişimini olumsuz yönde etkilediği görülmüştür.

5.2. Rejenerasyon Çalışmaları

Bitki doku kültürü çalışmalarında başarı elde edebilmek için, eksplant seçimi, bitki büyüme düzenleyicilerin konsantrasyon ve kombinasyonlarının belirlenmesi, besin ortamlarının seçimi, ışık, sıcaklık, bitkinin ortamla uyumu önemlidir. Yapılan çalışmalar incelendiğinde, her tür ve çeşidin doku kültürü tekniklerine gösterdiği tepkilerin farklı olduğu görülmüştür. Eksplantın yaşı, tipi, eksplant kaynağı, bitkinin fizyolojik durumu gibi faktörler rejenerasyon oranını ekilemektedir. Kültür besin ortamının türü, bileşenleri, optimum kültür şartları her bir genotip için farklılık göstermektedir (Özden, 2007).

Genellikle yaprak ve gövde parçaları, tohum kaynaklı dokulara göre daha güç rejenere olmaktadır. Günümüze kadar yapılan çalışmalar, odunsu bitkilerin yapraklarından rejenerasyon çalışmalarında bitki büyüme düzenleyicilerin çok önemli olduğunu göstermektedir. Hammatt ve Grant (1998) ayrıca Sarwar ve Sirvin(1997) ,TDZ kullanımının BAP’dan daha etkili sürgün rejenerasyonu sağladığını belirtmişleridir. Fakat Tang ve ark. (2002), BAP’ın TDZ’den daha etkili olduğunu kaydetmişlerdir.

Çalışmamızda, Maxma14 anacında rejenerasyon elde edilememiş, F 12-1 kiraz anacı yapraklarında %5 oranında BA 2,5 mg lˉ¹ (karanlık), %5 oranında BA 10 mg lˉ¹ (aydınlık) ve TDZ 2 mg lˉ¹ (aydınlık) %5 oranında rejenerasyon elde edilmiştir. Karanlık uygulamasının (5, 10, 15 gün) rejenerasyona etkisi araştırılmıştır. F 12-1 anacında 5 ve 15 gün karanlık uygulaması %2,5 rejenerasyon oranı elde edilmiştir.

Rejenerasyonda karanlık ve aydınlık uygulamalar karşılaştırıldığında karanlığın rejenerasyonu etkilediği görülmüştür. F12-1 kiraz anacında BA’ da yapılan karanlık çalışmaları daha etkili olmuştur. Canlı ve Tian (2008a), karanlık uygulamasının rejenerasyonu artırdığı bildirmişlerdir. Bu çalışmada TDZ’ın farklı dozlarında karanlık uygulamasının bir farklılık yaratmadığı görülmüştür. Fakat TDZ ‘in 10 günlük karanlık uygulamasında kallus oluşumunun aydınlığa oranla daha yüksek olduğu görülmüştür.

Tang vd., (2002), Bhagwat ve Lane (2004) kiraz yapraklarının rejenerasyonunda, Hammatt ve Grant (1998), siyah kirazın rejenerasyonunda optimal besin ortamı olarak WPM kullanmışlardır. Bhagwat ve Lane (2004), ‘Lapins’ ve ‘Sweetheart’ çeşitlerinin yaprakları ile yürüttükleri rejenerasyon çalışmasında, NAA konsantrasyonunun arttırılmasının rejenerasyonu etkilediğini bildirmişlerdir. Peer ve ark. (2012) sweet cherry ile yaptıkları çalışmasında kallus kültürüyle BAP 2.0 + NAA 1.0 mg lˉ¹ dozunda rejenerasyon elde etmişlerdir. Mazzard F12-1 kiraz anacının aydınlık ve karanlık ortamda naftelenasetikasit (NAA) ve benziladenin (BA) ‘in kombinasyonları üzerinde yaptığımız çalışmada rejenerasyon elde edilememiştir. Rejenerasyon denemelerinde ortama eklenen BA+NAA kombinasyonun farklı kombinasyonları ve tek başına 0,1 mg lˉ¹ NAA dozuyla oynanması sürgün rejenerasyonu teşvik edebilir.

Zhou vd. (2010), yaptıkları çalışmalarında şeftali yapraklarından adventif sürgün rejenerasyonu için tam bir protokol geliştirmişlerdir. Eksplantlar MS ortamında 3.55 µM ve 7.38 µM IBA ilavesiyle kültüre etmişlerdir. 3 haftalık kültür süresinden sonra genişlememiş olan yapraklar eksplant olarak kullanılmıştır. Orta damarından enine yaralanan yaprakları 3 hafta karanlık ortamda bekletilmişler daha sonra ışıklı ortama almışlardır. 1/2 MS ortamı, WPM ve Schenk ve Hildbrandt ortamlarında 9.08 µM TDZ ve 0.54 µM IBA içeren ortamlarda kültüre alınan eksplantlar, ½ MS ortamında 5.74 +_ 3.24 %71 oranında en yüksek rejenerasyon yüzdesini vermişlerdir. Sürgünler % 100- 98.3 oranlarında köklendirilmişler ve seraya aktarılmışlardır.

Jimenez vd.. (2012) tarafından şeftali x badem anaçları Garnem ve GF677, UFO-3, Maruja, Flaria ve Alice Bigi çeşitlerinin, BA ve IBA içeren besin ortamından organagenetik kalluslar üretmek için bitki rejerenasyonu protokolü geliştirmişlerdir. En yüksek rejenerasyon oranı şeftali x badem anaçlarından elde edilmiştir.

Nagaty, (2012) tarafından taif şeftalisi (P. persica ) üzerinde organagenesis yoluyla rejenerasyon çalışılmıştır. Rejenerasyon ortamı IBA 2,5 µM +TDZ 3,6 µM olan dozda % 62,5 oranında başarı elde etmiştir.

Song ve Sink (2005), P. cerasus kirazında TDZ ön muamelenin rejenerasyona etkisi çalışmış, 24 saat karanlık ortamda 0.05, 0.10 ve 0.25 mg lˉ¹ TDZ+MS dozlarında ön muamaleye tabii tutulan kirazlarda, 0.10 mg lˉ¹ TDZ (sürgün /explant 4,5) dozunun rejenerasyon oranına etkileği görülmüştür. Bizim çalışmamızda, F12-1 kiraz anacında literatürler ışığında TDZ ve BA ile yapılan ön muamele çalışmaları sonuç vermemiştir. Ön muamele süresinin uzatılması ya da TDZ konsantrasyonunun artırılması ile rejenerasyon gerçekleşme ihtimali olabilir.

Günümüze kadar Prunus türlerinde birçok araştırma yapılmıştır. Maxma14 kiraz anacında yapraktan rejenerasyon çalışması bulunmazken, Mazzard F12-1 anacında Hammat ve Grant (1998), yapraktan TDZ 4,4 µM TDZ + 0,54 µM NAA dozunda %31 oranında rejenerasyon elde edilmiştir. Bizim yaptığımız çalışmada Hammat ve Grant (1998)’ ın çalışmasından farklı olarak BA bitki büyüme düzenleyicisinin 2,5 mg lˉ¹ ve 10 mg lˉ¹ (+0,54 µM NAA), dozlarından rejenerasyon elde edilmiştir. Fakat TDZ 2 mg lˉ¹ (+0,54 µM NAA), dozunda elde edilen rejenerasyon oranı %5’de kalmıştır, daha önce elde edilen %31 oranı geçilememiştir.

Yaprak eksplantlarından daha yüksek oranlarda rejenerasyon elde edilebilmesi için yaprak eksplantları ile yapılan ön muamelerde kullanılan farklı bitki büyüme düzenleyiciler (GA3,IBA vb.), farklı ortamlar (QL,MS, vb.), farklı ışık yoğunlukları, yaprakların boyutları, vb. faktörler denenerek, rejenerasyona etkisi gözlemlenebilir.

KAYNAKLAR

Anonim, 2011. Erişim Tarihi: 21.06.2011. http://www.fao.org. Erişim

Anonim, 2012. Erişim Tarihi: 15.05.2012. http://tr.wikipedia.org/wiki/Prunus

Ainsley, PJ., Hammerschlag, FA., Bertozzi, T., Collins, GG., Sedgley, M., 2000. Regeneration of Almond from İmmature Seed Cotyledons. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 67, 221-226.

AL-Sabbagh, M., Abdul-Kader, A., Khoder M., Kalhout A.R., 1999. In vitro Propagation of Semi-D Warfing Cherry Rootstock. An International Journal on Biotechnology of Higher Plants. Kluwer Academic Publishers. Plant Cell Tissue and Organ Culture, 78,173-181.

AL-Sabbagh Muna, Abdul-Kader Ahmad, Khoder Mahmoud, Kalhout Abdul- Rahman, 2000. Factors Affecting Rhizogenesis In Vitro and Acclimatization of Three Cherry Rootstock. Internatiol Journal of Horticulture Science, 6, 40-46

Alderson, P.G., Harbour, M.A., Patience, P.A., 1987. Micropropagation of Prunus tenella cv. Firehill. Symposium on In Vitro Problems Related to Mass Propagation of Horticultural Plants. ISHS Acta Horticulture. 212, 463-468.

Antonelli, M., Druart, P.,1990. The Use of a Brief 2,4-D Treatment to Induce Leaf Regeneration on Prunus canescens Bois. Acta Horticultuare, 280, 45–50.

Arıcı, E.Ş., 2008. Bazı Sert Çekirdekli Meyve Anaçlarının Doku Kültürü ile Çoğaltılması. SDÜ Ziraat Fakültesi Dergisi, 3, 19-23.

Baird, WV., Ballard, RE., Rajapakse, S., Abbott, AG., 1996. Progress in Prunus Mapping and Application of Molecular Markers to Germplasm Improvement. Horticulture Science, 31, 1099-1106.

Bajaj, Y.P.S., 1986. Biotechnology in Agriculture and Forestry, Trees. Agriculturel Sisytems, 23, 155-156.

Bartish, IV., Korkhovoi, VI., 1997. The Composition of Nutrient Medium and the Efficiency of Shoot Induction In Vitro from Apple Leaf Explants. Russian Journal of Plant Physiology, 44, 381–385.

Bassi, G., Cossio, F., 1991. In vitro Shoot Regeneration on “Bluefre” and “Susina Di Dro” Prune Cultivars (Prunus domestica L.). Acta Horticulture, 289, 81–82.

Bhagwat, B., Lane, WD., 2004. In vitro Regeneration from Leaves of Sweet Cherry (Prunus avium) ‘Lapins’ and ‘Sweetheart’. Plant Cell Tissue Organ Culture, 78, 173–181.

Blando, F., Chiriacò, L., Gerardi, C., Lucchesini, M., Rampino, P., 2007. Sweet Cherry (Prunus avium L.) ´Giorgia`, Adventitious Regeneration from Leaves of Microplants. European Journal Horticulture Science, 72,130-137.

Bondok, A.Z., El-Agomy and Gomae, A.H., 1989. In Vitro Propagation of Marianna 2624 Plum Rootstock. Egyptian Journal of Horticulture, 16, 9-16.

Borkowska, B., 1990. Rate of Proliferation and Efficiency of Rhizogenesis of Sour Cherry Cultures Recultured In Vitro For Several Years. Fruit Science Reports, 17, 165- 170.

Brown DCW., Thorpe TA., 1995. Crop Improvement Through Tissue Culture. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 11, 409-415.

Burgos, L., Alburquerque, N., 2003. Ethylene Inhibitors and Low Kanamycin Concentrations Improve Adventitious Regeneration from Apricot Leaves. Plant Cell Reports, 21,1167–1174.

Büyükdemirci, H. 2005. The Effects of Medium Ingredients on Shoot Propagation and rooting of Cherry Rootstocks In Vitro. Determination of In Vitro Propagation Techniques of Some Clonal Sweet and Sour Cherry Rootstocks. 5th International Cherry Synposium. June 06-10, 2005. Bursa-Turkey.

Canli, FA., Tian, L., 2008a. In vitro Shoot Regeneration from Stored Mature Cotyledons of Sweet Cherry (Prunus avium L.) Cultivars. Scientia Horticulturae, 116, 34-40.

Canli, FA., Tian, L., 2008b. Regeneration of Adventitious Shoots from Mature Stored Cotyledons of Japanese Plum (Prunus salicina Lind1). Scientia Horticulturae, 120, 64-69.

Canli, FA., Tian, L., 2009. Assessment of Regeneration and Transient Expression Factors for Agrobacterium Mediated Transformation of Prunus salicina Lind1. European Journal of Horticultural Sciences, 74, 66-72.

Canli, FA., Yasar, K., Yılmaz, O., 2008. Advances and Future Perspectives in Genetic Transformation of Prunus Species. Journal of Molecular Biology and Biotechnology, 1, 30-38.

De Bond, A., Eggermont, K., Pennickx, I., Goderis, I., Broekaert, W.F., 1996. Agrobacterium-Mediated Transformation of apple (Malus x Domestica borkh.): an Assessment of Factors Affecting Regeneration of Transgenic Plants. Plant Cell Reports, 15, 549-554.

Declerck, V., Korban, SS., 1996. Influence of growth Regulators and Carbon Sources on Callus Induction, Growth and Morphogenesis from Leaf Tissues of Peach (Prunus persica L. Batsch), Journal of Horticultural Science Biotechnolog., 71, 49–55.

Demiral, S., Ülger, S., 2008. Gisela 5 Kiraz Anacının Doku Kültürü ile Çoğaltılması Üzerine Bir Araştırma. Akdeniz Üniversitesi Ziraat Fakültesi Dergisi, 21, 117– 121.

Demirtaş, İ., Sarısu, C.H., 2011. Kiraz Yetiştiriciliği. Meyvecilik Araştırma İstasyonu Müdürlüğü Yayınları, 12, Isparta.

Dolgov, S.V., Firsov, A.P., 1999. Regeneration and Agrobacterium Transformation of Sour Cherry Leaf Discs. Acta Horticultural, 484, 577-580.

Druart, P., 1980. Plantlet Regeneration from Root Callus of Different Prunus Species. Scientia Horticultural, 12, 339-342.

Escalettes, V., Dosba, F., 1993. In Vitro Adventitious Shoot Regeneration from Leaves of Prunus spp. Plant Science, 90, 201–209.

Espinosa, A.C., Pijut, M.P., Michler, H.C., 2006. Adventitious Shoot Regeneration and Rooting of Prunus serotina In Vitro Cultures. . Horticulture Science, 41, 193-201.

Fidancı, A., Burak, M., Erenoğlu, B., 2005. Determination of In Vitro Propagation Techniques of Some Clonal Sweet and Sour Cherry Rootstocks. 5th International Cherry Synposium. June 06-10, 2005. Bursa-Turkey.

Fouad, MM., Gomaa, AH., Abd El Zaher, MH., 1993. Factors Influencing In Vitro Establishment and Multiplication Stages of Peach. ISHS Acta Horticulturae, 409, 191–196.

Gentile, A., Monticelli, S., Damiano, C., 2002. Adventitious Shoot Regeneration in Peach [Prunus persica L. Batsch]. Plant Cell Reports, 20, 1011–1016.

Goffreda, JC., Scopel, AL., Fiola, JA., 1995. Indole Butyric Acid Induces Regeneration of Phenotypically Normal Aprico (Prunus armeniaca) Plants from Immature Embryos. Plant Growth Regulation, 17, 41–46.

Goudarzi, R., A. Majedi, A.R. Talai and M. Mostofavi, 1997. Micropropagation of Cherry Rootstock (Prumis avium F 12/1) By Shoot Tip Culture. Iranian Journal Agricultural 28, 133-143.

Güçlü, F., Koyuncu, F., Şan, B., 2010. Bazı Klon Kiraz Anaçlarının Doku Kültürü Yöntemiyle Çoğaltılması. Süleyman Demirel Üniversitesi Fenbilimleri Enstitüsü Dergisi, 14, 144-147.

Gülcan, R., Güleryüz, M., Polat, İ., Ünal, A., Pırlak, L., Eşitken, A., Aslantaş, R., Karaduva, L., Demirsoy, H., 1995. Yumuşak ve Sert Çekirdekli Meyveler Tüketim Projeksiyonları ve Üretim Hedefleri. Türkiye Ziraat Mühendisliği 4. Teknik Kongresi, 9-13 Ocak, Ankara, 629-653

Günal, F., 2006. Gisela 5 (P.cerasus x P. canescens) ve Maxma 14 (P. mahalep) Anaçlarından In Vitro Da Sürgün Elde Edilmesi Üzerine Değişik BAP ve 2,4- d Düzeylerinin Etkilerinin Belirlenmesi. Süleyman Demirel Üniversitesi Fenbilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi, 78s, Isparta.

Hammatt, N., 1993. Micropropagation of Fastigate Bird Cherry (Prunus padus L.) and Adventitious Shoot Formation from Leaves. Journal Hortical Science, 68, 975– 982.

Hammatt, N., N.J. Grant, 1997. Micropropagation of Mature British Wild Cherry. Plant Celuler Tissue 0rgan, 47, 103-110.

Hammatt, N., Grant, NJ., 1998. Shoot Regeneration from Leaves of Prunus serotina Ehrh. (black cherry) and P. avium L. (wild cherry). Plant Cell Reports, 17, 526–530.

Hammerschlag, FA., Bauchan, G., Scorza, R., 1985. Regeneration of Peach Plants Callus Derived from Immature Embryos. Theoretical and Applied Genetics, 70, 248- 251.

Hammerschlag, FA., Bauchan GR., Scorza R., 1987. Factors Influencing Multiplication and Rooting of Peach Cultivars. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 3, 235-242.

Hokanson, K.E., Pooler, M.R., 2000. Regeneration of Ornamental Cherry (Prunus) Taxa from Mature Stored Seed. Hortical Science, 35, 745-748.

Jimenez., M. P., Navarro., A. C., Terrer., J. C., 2012. Regeneration of Peach (Prunus persica L. Batsch) Cultivars and Prunus persica x Prunus dulcis Rootstocks Via Organogenesis. Plant Cell Tissue Organ Culture, 108, 55–62.

Kaçar, Y., 2004. Moleküler Markörlerin Prunus Türlerinde Kullanımı. Alatarım. 3, 15-2.

Kepenek, K.1994a. Effect of Different BAP and NAA Concentrations on Hoot and Root Development In Vitro and Influence of Propagation Methods On Rooting and Vegetative Growth of “Red Meillandina” Rose. XXIV International Horticultural Congress. Kyoto, Japan, 13-1.

Kepenek, K.1994b. Microklonal Multiplication of Local Walnuts. (Juglans regia L.) Through Tissue Culture In Vitro. XXIV th International Horticultural Congress. Kyoto 1994, Japan, 7-1.

Kepenek, K.1995. Effect of IBA and Time of Cutting on the Rooting Capacity of Avocado Leaf-Twig Cutting of Wurtz and Duke Cultivars. World Avocado Condress III., 94.

Korban, SS., O’Connor, PA., Elobeiday, A., 1992. Effects of Thidiazuron, Naphthaleneacetic Acid Dark Incubation and Genotype on Shoot Organogenesis from Malus leaves. Journal of Horticultural Science and Biotechnology, 67, 341- 349.

Lane, WD., Cossio, F., 1986. Adventitious Shoots from Cotyledons of Immature Cherry and Apricot Embryos. Can Journal of Plant Sciences, 66, 953–959.

Leblay, C., Chevreau, E., Raboin, L.M., 1990. Adventitious Shoot Regeneration from In Vitro Leaves of Several Pear Cultivars (Pyrus communis L.). Plant Cell Tissue Organ Culture, 25, 99-105.

Lezzoni, A., Schmidt, H. And Albertini, A., 1991. Cherries (Prunus L.). Acta Horticultural., 290, 111-173.

Liu, X., Pijut, P., M., 2008. Plant Regeneration from In Vitro Leaves of Mature Black Cherry (Prunus serotina). Plant Cell Tiss Organ Culture, 94, 113–123.

Mante, S., Scorza, R., Cordts, JM., 1989. Plant Regeneration from Cotyledons of Prunus persica, Prunus domestica, and Prunus cerasus. Plant Cell Tissue Organ Culture, 19, 1–11.

Mante, S., Morgens, PH., Scorza, R., Cordts, JM., Callahan, AM., 1991. Agrobacterium- Mediated Transformation of Plum (Prunus domestica L.) Hypocotyl Slices and Regeneration of Transgenic Plants. Bıotechnology Technology, 9, 853–857.

Marino, G., Magnanini, E., Battistini, S., Righetti, B. 1991. Effect Hormones and Main Carbon Energy Sources on In Vitro Propagation of Apricot (P. armeniaca L.) cvs. ‘San Castrese’ and ‘Portici’. Acta Horticulture. (ISHS), 293, 355-362.

Matt, A., Jehle, J.A., 2005. In vitro Plant Regeneration from Leaves and Internode Sections of Sweet Cherry Cultivar (Prunus avium L.). Plant Cell Reports, 24, 468- 476.

Mehra, A., Mehra, PN., 1974. Organogenesis and Plantlet Formation In Vitro in Almond. Botanical Gazette, 135, 61–73.

Miguel, CM., Druart, P., Oliveira, MM., 1996. Shoot Regeneration from Adventitious Buds Induced on Juvenile and Adult Almond (Prunus dulcis Mill.) Explants. In vitro Cellular and Developmental Biology Plant, 32, 148–153.

Miguel, CM., Oliveira, MM., 1999. Transgenic Almond (Prunus dulcis Mill.) Plants Obtained by Agrobacterium Mediated Transformation of Leaf Explants. Plant Cell Reports, 18, 387–393.

Murashige, T., Skoog, F., 1962. A Revised Medium for Rapid Growth and Bioassay with Tobacco Tissue F. Cultures. Physiol Plant, 15, 473-497.

Nagaty, M. A., 2012. Establishment of Regeneration System for Taif Peach (Prunus persica L. Batsch) Cultivar (Balady Cultivar) in taif. Journal of American Science, 8, 1-8.

Nas, MN., Bolek, Y., Sevgin, N., 2010. The Effects of Explant and Cytokinin Type on Regeneration of Prunus Microcarpa. Scientia Horticulturae, 126, 88–94.

Nedelcheva, S., Tsoneva, E., 1998. Callus formation and the Possibility of Regenerating Complete Apricot Plants. I. Induced Primary and Organogenic Callus from Isolated Cotyledons. Rasteniev” Dni Nauki, 35, 296-300.

Nowak, B., Miczynski, K., Hudy, L., 2004. Sugar Uptake and Utilisation During Adventitious Bud Differentiation on In Vitro Leaf Explants of ‘Wegierka Zwykła’ Plum (Prunus domestica). Plant Cell Tissue and Organ Culture 76,255–260.

Ochatt, SJ., Power, JB., 1988. An Alternative Approach to Plant Regeneration from Protoplasts of Sour Cherry (Prunus cerasus L.). Plant Science, 56, 75–79.

Oh, SD., Song, WS., Yoo, SO., 1991. In vitro Propagation of Sweet Cherry (Prunus avium L.) I. Direct and Callus-Induced Plantlet Regeneration from Shoot Tip. The Korean Society for Horticultural Science (KSHS), 32, 355–367.

Öz, F., 1988. Kiraz ve Vişne. Tarımsal Araştırmaları Destekleme ve Geliştirme Vakfı Yayınları, 27s, Yalova.

Özden, A. N., 2007. GF-677 hibrit (Prunus amygdalus x P. persica) Anacının In Vitro Rejenerasyonu ve Mikro Çoğaltımı. Harran Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi, 50s, Şanlıurfa.

Pascual L., Marin J. A. 2005. A liquid 2,4-D Pulse Increased Shoot and Root Regeneration from Leaf Explants of Adult Prunus rootstocks. Scientia Horticulturae, 106, 582- 592.

Petri, C., Scorza, R., 2010. Factors Affecting Adventitious Regeneration from In vitro Leaf Explants of ‘Improved French’ Plum, the Most İmportant Dried Plum Cultivar in the USA. Annals of Applied Biology, 156, 79–89.

Pevalek-Kozlina B., S. Jelaska, 1987. Microclonal Propagation of Prunus avium L. Symposium on In vitro Problems Related to Mass Propagation of Horticultural Plants. ISHS Acta Horticulture, 212, 599-602.

Pevalek-Kozlina, B., Kelaska, S., 1989. Adventitious Root Formation Cloned Microcuttings of Prunus avium. Bioloski-Vestnik, 37, 57-66.

Pieterse, RE., 1989. Regeneration of Plants from Callus and Embryos of ‘Royal’ Apricot. Plant Cell Tissue Organ Culture, 19, 175–179.

Peer, F.A., Rather, Z.A., Mır, M.A., Bhat, K.M., Dar, K.R., Hussain, G., 2012. Callus Induction and Adventitious Shoot Regeneration in Two Genotypes of Sweet Cherry (Prunus avium). Indian Journal of Agricultural Sciences, 82, 737-41.

Pe´rez-Jime´nez, M., Navarro, A.C., Cos-Terrer, J., Regeneration of Peach (Prunus persica L. Batsch) Cultivars and Prunus persica x Prunus dulcis Rootstocks Via Organogenesis. Plant Cell Tissue Organ Culture, 108, 55–62.

Pooler, MR., Scorza, R., 1995. Regeneration of Peach [Prunus persica L. Batsch] Rootstock Cultivars from Cotyledons of Mature Stored Seed. Horticulture Science, 30, 355–356.

Quoirin, M., Lepoivre, P., 1977. Improved Media for In Vitro Culture of Prunus sp. Acta Horticultural 78, 437–442.

Randal, A.S., Abner, G., 1986. Large Scale Tissue Culture Production for Horticultural Crops. Current Plant Science and Biotechnology in Agriculture, 2, 367-371.

Ružić, D., Sarić, M., Cerović R., Ćulafić L., 2000. Relationship Between the Concentration of Macroelements, Their Uptake and Multiplication of Cherry Rootstock Gisela 5 in vitro. Plant Cell, Tissue and Organ Culture , 63, 9-14,

Ružić, Dj., 2008. The Effects of Cytokinin Types and Their Concentration on In Vitro Multiplication Of Sweet Cherry cv. Lapins. Horticultural Science (ISSN), 35, 12- 21.

Sarwar, M., Skirvin, RM., 1997. Effect of Thidiazuron and 6-benzylaminopurine on Adventitious Shoot Regeneration from Leaves of Three Strains of ‘McIntosh’ Apple (Malus X domestica Borkh.) In vitro. Science Horticulture, 68, 95-100.

Sauer, A. 1996. In vitro Propagation of Prunus Avium L. and Storage of In Vitro Derived Plantles. International Workshop on Improvement of Sweet and Sour Cherry Varieties and Rootstocks. Acta Horticulture (ISHS), 169, 168-173.

Schmidt, H., Kardel, Meisner, U., 1992. Adventivsproß Regeneration In vitro Ei Kirschen III. Adventivsproßbildung an Kotyledonen von Sußkirschensorten. Gartenbauwissenschaft, 57, 267–270.

Schneider, KE., Speranzini, D., Biggs, AR., 1992. Ontogeny of Shoot Regenerants on Excised İmmature Peach Embryos. Can Journal Plant Science, 72, 497–506.

Scorza, R., Mehlenbacher, SA., Lightner, GW., 1985. Inbreeding and Coancestry of Freestone Peach Cultivars of the Eastern United States and Implications for Peach Germplasm Improvement. Journal of the American Society for Horticultural Science, 110, 547-552.

Song, GQ., Sink, KC., 2005. Optimizing Shoot Regeneration and Transient Expression Factors for Agrobacterium Tumefaciens Transformation of Sour Cherry (Prunus cerasus L.) Cultivar Montmorency. Science Horticulture, 106, 60-69.

Takashina, T., Nakano, H., Kato, R., 2003. Efficient Plant Regeneration Culture from Leaf Explants of In Vitro Grown Sweet Cherry. Acta Horticulture, 622, 123–127.

Tang, H., Ren, Z., Krczal, G., 2000. Somatic Embryogenesis and Organogenesis from Immature Embryo Cotyledons of Three Sour Cherry Cultivars (Prunus cerasus L.). Scientia Horticulture, 83, 109-126.

Tang, HR., Ren, ZL., Reustle, G., Krczal, G., 2002. Plant Regeneration from Leaves of Sweet and Sour Cherry Cultivars. Scientia Horticulture, 93, 235–244.

Temurtaş, N., 2011. Kirazın (Prunus avium L.) In vitro Rejenerasyonu ve Çimlendirilmesi. Süleyman Demirel Üniversitesi Fenbilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi, 50s, Isparta.

Taner, Y., 2001. Sert Çekirdekli Meyve ve Özellikle Kiraz İhracatında Pazarlama Politikaları ve Stratejilerinin Belirlenmesi. 1. Sert Çekirdekli Meyveler Sempozyumu, 29-38, 25-28 Eylül,Yalova.

Trifonova, AS., Atanassov, AI., 1999. Studies on Genetic Transformation of Apple. Acta Horticulture, 484, 591–594.

Wang, H., Alburquerque, N., Burgos, L., Petri C., 2011., Adventitious Shoot Regeneration from Hypocotyl Slices of Mature Apricot (Prunus armeniaca L.) Seeds, a Feasible Alternative for Apricot Genetic Engineering. Scientia Horticulturae, 128, 457-464.

Yan, GH., Zhou, Y., 2002. Plant Regeneration from Excised Immature Embryos of Peach (Prunus persica L). Acta Horticulture Sinica., 29, 480–482.

Yancheva, S., 1993. Preliminary Studies on Regeneration Capacity of Plum (Prunus domestica L.) Somatic Tissues In Vitro. Institute of Agricultural Economics, 7, 49-52.

Yang, HY., Schmidt, H., 1992. Untersuchungen zur Adventivsproßregeneration In vitro bei Kirschen II. Adventivsproßbildung an In vitro -Bla¨ttern Verschiedener Prunus avium-Idiotypen. Gartenbauwissenschaft, 57, 7–10.

Yıldırım, H., Tilkat, E., Onay, A., Özen, H.Ç., 2007. In vitro Embry Culture of Apricot (Prunus armeniaca L. cv. Hacıhaliloğlu). International Journal of Science & Technology, 2, 99-104.

Zhou, H., Ming, L., Zhao, X., Fan, X., Guo, A., 2010. Plant Regeneration from In Vitro Leaves of the Peach Rootstock ‘Nemaguard’ (Prunus persica x P. davidiana). Plant Cell Tissue Organ Culture 101, 79–87

Zimmerman, R. J. Griesbach, F.A., 1991. Hammerschlag and RH. Lawson (eds.), Tissue Culture as Production System for Horticultural Crops Martinus Nijhoff Publishers, 367-371.

ÖZGEÇMİŞ

Adı Soyadı : Fulya DEMİR

Doğum Yeri ve Yılı : Tokat, 1989

Medeni Hali : Bekar

Yabancı Dili : İngilizce

E-posta : [email protected]

Eğitim Durumu

Lise : Ortaca Lisesi, 2007

Lisans : Süleyman Demirel Üniversitesi, Fen-Edebiyat Fakültesi, Biyoloji

Yüksek Lisans : SDÜ, Fen Bilimleri Enstitüsü, Ziraat Fakültesi, Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü

Mesleki Deneyim

GÜLAR : 2011-2012 Gül ve Gül Ürünleri Araştırma ve Uygulama Merkezi Doku Kültürü Laboratuvarı-ISPARTA

Biyoteknoloji Eğitim Kursu Sertifikası