Pasiflora Vitifolia Kunth)

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POTENCIAL ANTIOXIDANTE Y ANTIHIPERGLUCEMIANTE DE EXTRACTOS BIOACTIVOS OBTENIDOS DE GRANADILLA DE MONTE (Pasiflora vitifolia Kunth).

JENNY ALEJANDRA AVILA OSPINA

Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al título de Biólogo

Director JONH JAIRO MÉNDEZ ARTEAGA Doctor en Ciencias Químicas

Codirectora ELIZABETH MURILLO PEREA Magister en Química

Codirector ÁNGEL JIMÉNEZ RODRÍGUEZ Biólogo

UNIVERSIDAD DEL TOLIMA FACULTAD DE CIENCIAS PROGRAMA DE BIOLOGÍA IBAGUÉ- TOLIMA 2017

A Dios que siempre guía mi camino, a la memoria de mi padre que me motiva a superarme cada día y a mi madre, mi más grande apoyo.

AGRADECIMIENTOS

La autora expresa sus agradecimientos:

A los integrantes del grupo de investigación en productos naturales GIPRONUT por la orientación investigativa durante todo este aprendizaje.

Al laboratorio de extensión de la Universidad del Tolima LASEREX cuya colaboración y orientación, aprecia en gran medida.

Al grupo de investigación CEDAGRITOL de la Facultad de Agronomía (Universidad del Tolima), a la Universidad Nacional de Colombia (Sede Medellin) y a la Universidad de Lleida por su colaboración y apoyo logístico.

A la Oficina de Investigaciones por su apoyo económico, que hizo posible la materialización de este proyecto.

RESUMEN

Colombia posee 48 especies endémicas de Passifloraceae, de las cuales el 81% se encuentra en la región andina. Algunos trabajos mencionan a Passiflora vitifolia Kunth, pero pocos tratan los atributos físicas, químicas y biológicas de los subproductos del fruto. Este estudio evaluó las características físicas y químicas de semillas y cáscara del fruto de Passiflora vitifolia colectada en Ibagué, valoró el potencial antioxidante y antihiperglucemiante de extractos provenientes de estos subproductos y determinó el rendimiento y particularidades físicas y químicas del aceite proveniente de semilla y cáscara. Passiflora vitifolia se caracteriza por poseer flores de color escarlata, frutos ovoides de coloración verde con manchas blancas diseminadas longitudinalmente, con gran cantidad de semillas que conservan algunas características morfo-anatómicas del fruto, además de ser el mayor reservorio de nutrientes extraíbles con etanol; los fitofenoles son los constituyentes más abundantes, acompañados de baja cantidad de alcaloides. El ácido p-cumárico y la rutina son quimiomarcadores de la especie. Las semillas del fruto pueden utilizarse como material crudo en la industria de alimentos, cosmetológica, farmacológica, biodiesel o implementarse como suplemento alimenticio en personas con diabetes tipo 2. El rendimiento y calidad del aceite extraído de las semillas da valor agregado al fruto. El conjunto de los resultados no sólo permite conocer peculiaridades físicas, químicas y biológidas de una Passiflora procedente de la región andina del Tolima, también deja ver usos promisorios del fruto, abre posibilidades de trabajos de mayor especificidad y grado de profundidad para una especie no convencional y de limitado conocimiento científico.

Palabras clave: Passiflora vitifolia, Granadilla de monte, Actividad antioxidante, Potencial antihiperglucemiante, Extractos.

ABSTRACT

Colombia has 48 endemic species of Passifloraceae, 81% are in the Andean region. Some papers mention Passiflora vitifolia Kunth, but few assess the physical, chemical and biological characteristics of the fruit byproducts. This study determined the physical and chemical characteristics of seeds and peel of the P. vitifolia fruit collected in Ibagué, the antioxidant and antihyperglycemic potential of extracts from these byproducts were assessed and the physical and chemical characteristics and performance of seed and peel oils were determined. Passiflora vitifolia is characterized by scarlet flowers, ovoid greenish-brown fruits with longitudinally scattered white spots, with a large number of seeds that retain some morpho-anatomical characteristics of the fruit, furthermore being the largest reservoir of nutrients that can be extracted with ethanol; phytophenols are the most abundant constituents, accompanied by low amounts of alkaloids. p- coumaric acid and rutin are chemo markers of the species. The fruit seeds can be used as raw material in the food industry, cosmetology, pharmacology, biodiesel or implemented as a dietary supplement in people with type 2 diabetes. The yield and quality of the oil extracted from the seeds adds value to the fruit. The results not only allows to know the physical, chemical and biological characteristics of a Passiflora from the Andean region of Tolima, also permit to see promising uses of the fruit, opens up possibilities to get greater specific studies and depth degree for an unconventional species of limited scientific knowledge.

Keywords: Passiflora vitifolia, Granadilla de monte, Antioxidant activity, Antihyperglycemic potential, Extracts.

CONTENIDO

INTRODUCCIÓN ...... 12

1. OBJETIVOS ...... 14 1.1. OBJETIVO GENERAL ...... 14 1.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...... 14

2. MARCO REFERENCIAL ...... 15 2.1 ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL PROBLEMA ...... 15 2.2 MARCO TEORICO ...... 19 2.2.1. La familia Passifloraceae ...... 19 2.2.2. Diabetes mellitus (DM) ...... 24 2.2.3 Actividad antiradicalaria y antioxidante (In vitro) ...... 28

3. MATERIALES Y METODOS ...... 33 3.1. PREPARACIÓN DEL MATERIAL Y OBTENCIÓN DE EXTRACTOS……..33 3.2 ENSAYOS DE IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN ...... 33 3.2.1. Análisis morfométrico del fruto completo, cáscara y semillas ...... 33 3.2.2. Color instrumental ...... 34 3.2.3. Evaluación de la dureza/firmeza del fruto completo ...... 34 3.2.4. Análisis Bromatológico ...... 34 3.2.5. Preparación de extractos ...... 35 3.2.6. Pruebas físicas ...... 35 3.2.7. Análisis Fitoquímico Preliminar ...... 35 3.2.8. Perfil químico de extractos etanólicos de cáscara y semilla ...... 36 3.2.9. Parámetros HPLC-UV ...... 36 3.3. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE ...... 37 3.4. ACTIVIDAD ANTIHIPERGLUCEMIANTE IN VITRO ...... 39 3.4.1 Inhibición de α-amilasa ...... 39

3.4.2. Inhibición de difusión de glucosa ...... 40 3.5 EXTRACCIÓN Y COMPOSICIÓN FÍSICO-QUÍMICA DEL ACEITE DE P. vitifolia ...... 41 3.5.1. Extracción de aceite ...... 41 3.5.2. Metilación de ácidos grasos del aceite de semilla ...... 41 3.5.3. Parámetros de cromatografía de gases ...... 41 3.5.4. Análisis físico-químico del aceite de cáscara y semilla de P. vitifolia ...... 42 3.6 REACTIVOS ...... 43 3.7 ANÁLISIS ESTADÍSTICO ...... 43

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ...... 44 4.1 CARACTERIZACIÓN FÍSICA DE FRUTO COMPLETO, CÁSCARA Y SEMILLA DE P. vitifolia ...... 44 4.2 ANÁLISIS BROMATOLÓGICO ...... 50 4.2.1. Análisis de minerales de la cáscara y semilla de P. vitifolia ...... 52 4.3 CARACTERIZACIÓN FÍSICA Y QUÍMICA DEL ZUMO Y LOS EXTRACTOS ...... 54 4.2.1 Composición química de los extractos etanólicos ...... 61 4.4 TAMIZAJE FITOQUÍMICO ...... 65 4.5 CARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA DE ACEITES DE P. vitifolia ...... 68 4.5.1 Perfil de ácidos grasos ...... 72 4.6 ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE ...... 74 4.6.1. Evaluación del potencial fenólico total y antioxidante ...... 74 4.6.2. Actividad antihemolítica ...... 78 4.7 ACTIVIDAD ANTIHIPERGLUCEMIANTE IN VITRO ...... 81 4.7.1. Inhibición de la difusión de glucosa a través de membrana de diálisis ... 82 4.7.2. Inhibición de la enzima alfa amilasa ...... 86 4.8 ANÁLISIS DE CORRELACIÓN ...... 91

5. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS ...... 94

REFERENCIAS ...... 97

ANEXOS ...... 120

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Descripción botánica de Passiflora vitifolia ...... 23 Tabla 2. Caracterización física del fruto completo, cáscara y semilla de P. vitifolia ...... 44 Tabla 3. Evaluación bromatológica de cáscaras y semillas de P. vitifolia (%) .. 51 Tabla 4. Contenido en elementos minerales de cáscaras, semillas y zumo de P. vitifolia (mg/g de materia seca) ...... 53 Tabla 5. Caracterización física comparativa del zumo (parte comestible) y extractos etanólicos y de acetato de etilo de cáscara y semilla de frutos P. vitifolia ...... 55 Tabla 6. Composición química Extracto Etanólico (HPLC- EM) ...... 61 Tabla 7. Análisis fitoquímico realizado a extractos de cáscara y semilla de P. vitifolia ...... 66 Tabla 8. Caracterización fisicoquímica de aceites ...... 68 Tabla 9. Composición de ácidos grasos de aceite de semilla de P. vitifolia y P. edulis ...... 73 Tabla 10. Contenido fenólico total y capacidad antioxidante de la cáscara y semillas de P. vitifolia ...... 75 Tabla 11. Comparación de los efectos protectores de extractos de P. vitifolia y BHT ...... 79 Tabla 12. Porcentaje de Inhibición de difusión de glucosa a través de la membrana de diálisis ...... 82 Tabla 13. Porcentaje de inhibición de alfa amilasa de los extractos de P. vitifolia ...... 87 Tabla 14. Correlaciones - Análisis Multivariado (Statgraphics Centurion XVI.I.) ...... 92 Tabla 15. Pares de variables con valores- P por debajo de 0,05 ...... 93

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Clasificación de la diabetes mellitus...... 26 Figura 2. Color y aspecto de los frutos de P. vitifolia en estado verde (a) y con el progreso de la madurez (b) ...... 46 Figura 3. Semillas del fruto de Passiflora vitifolia ...... 49 Figura 4. Analisis bromatológico de cáscara y semilla de P. vitifolia...... 52 Figura 5. % inhibición de la difusión de glucosa vs tiempo (h) ...... 83 Figura 6. Inhibición de la alfa amilasa ...... 88

INTRODUCCIÓN

En el tema de las Passifloraceae debe reconocerse a Colombia como país privilegiado, pues de las casi 700 especies reportadas, en el territorio colombiano se registran 170 distribuídas en 3 géneros: Ancistrothyrsus, Dilkea y Passiflora (Escobar 1988; Ocampo, Coppens & Jarvis, 2010). Es llamativo en estas entidades botánicas su distribución pantropical; algunas son lianas o enredaderas, aunque existen organismos arbóreos o arbustivos; algunas son de importancia económica reconocida (Passiflora edulis f flavicarpa Sims, maracuyá amarillo, Passiflora ligularis Juss, granadilla y Passiflora mollissima Kunth, curuba); otras por el contrario tienen limitado conocimiento (Passiflora vitifolia, Passiflora capsularis, Passiflora magdalenae, entre otras). En general se les encuentra silvestres o cultivadas por el atractivo de sus frutos, vistosidad de sus flores o la curiosa forma de sus hojas (Ocampo, Coppens & Jarvis, 2010).

A las pasifloráceas se les halla en las cinco regiones biogeográficas de Colombia, distribuidas en los géneros Passiflora (97%), Dilkea y Ancistrothyrsus (con el 3% restante). La región Andina, de la que hace parte el departamento del Tolima, alberga 137 especies (81% del total), sobre todo en alturas mayores a los 1500 m.s.n.m. (Hernández & Bernal, 2000). Sus frutos comestibles y lo anteriormente expuesto justifica, al menos en parte, el que las comunidades las utilicen en la preparación de zumos, jaleas, helados, golosinas y en la medicina tradicional como sedativo, vermífugo, antiespasmódico, acción hipotensora, cardiotónica, emenagoga, diurética, antihelmíntica, agente antimicrobiano, entre otras (Oga, de Freitas, da Silva & Hanada, 1984; Anesini & Perez, 1993; Dhawan, Dhawan & Sharm, 2004). La variabilidad de aplicaciones alimenticias y etnomédicas, al igual que la reconocida presencia en ellas de alcaloides, compuestos fenólicos y compuestos cianogénicos les ha valido ser objeto de múltiples estudios científicos, por ejemplo en: biogeografía, taxonomía y/o morfología (Alvarado- Cárdenas, 2007; Ibáñez, Idrogo, Llatas-Quiroz & Paredes, 2014; Mezzonato-

Pires, 2017), en ecología e importancia económica (Lindberg & Olesen, 2001; Mezzonato-Pires, Salimena, & Bernacci, 2013), en biología reproductiva y polinización (Faria & Stehmann, 2010; Ocampo, Arias & Urrea, 2016); también sus características nutricionales y antioxidantes han sido revisadas (Rivas, Muñoz & Balcázar, 2015; Sabogal, Chávez, Oliveros, Murillo, Méndez, 2016), para sólo mencionar unos pocos.

De reciente interés científico son los estudios relacionados con su contenido de compuestos fenólicos, entre ellos flavonoides, y el estrés oxidativo. Esta anomalía fisiológica es considerada por muchos como el origen de múltiples alteraciones orgánicas, entre ellas las asociadas a la diabetes. A su vez, la diabetes es considerada como un conjunto de patologías agrupadas bajo la misma denominación y catalogadas como crónicas; su origen más frecuente se da cuando los islotes de Langerhans o islotes pancreáticos, particularmente las células beta, no producen insulina suficiente o cuando el organismo no utiliza eficazmente esta hormona (WHO, 1999).

Aunque unos cuantos trabajos hacen referencia a P. vitifolia, los que tienen que ver directamente con el conocimiento científico de esta especie de pasiflorácea son de limitada disponibilidad. Este estudio determinó algunas de las características físicas del fruto; evaluó el contenido nutricional y fitoquímico de semillas y cáscaras y valoró el potencial antioxidante y antihiperglucemiante de extractos orgánicos provenientes de cáscaras y semillas. El trabajo se complementó determinando el rendimiento y características físicas y químicas del aceite proveniente de la semilla y cáscara. La información obtenida en esta investigación aportará conocimiento científico, tecnológico y/o farmacológico de una de las pasifloráceas de baja divulgación en el mundo científico y podrá constituirse en fundamento para el desarrollo de nuevas alternativas nutracéuticas y fitofarmacológicas para la prevención y/o control de diabetes.

1. OBJETIVOS

1.1. OBJETIVO GENERAL

 Caracterizar física, química y biológicamente la cáscara y semillas provenientes del fruto de Passiflora vitifolia, una de las pasifloráceas no-convencionales y de limitados estudios científicos.

1.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Determinar comparativamente algunas de las características físicas y químicas del fruto completo, semilla y cáscara de P. vitifolia.  Caracterizar física y químicamente el “zumo” del fruto y los extractos provenientes de semilla y cáscara.  Evaluar el potencial antioxidante, antihiperglucemiante y protección de eritrocitos de P. vitifolia, bajo condiciones in-vitro, a través de extractos orgánicos obtenidos de los subproductos del fruto.  Estudiar comparativamente el rendimiento de aceite proveniente de la cáscara y semilla, y realizar la caracterización física y química del producto oleífero.  Contribuir al conocimiento de una Passiflora de escaso conocimiento en Colombia y en la región del Tolima.

2. MARCO REFERENCIAL

2.1 ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL PROBLEMA

El género Passiflora es uno de los de mayor importancia económica en el trópico, lo que se deriva de la presencia de casi 700 especímenes en estas regiones, en su mayoría en el continente americano (Ulmer & MacDougal, 2004). Asociado a esta amplia distribución, está la diversidad de usos y aplicaciones dadas por las etnias de las diferentes regiones donde se les conoce, así como también la multiplicidad de investigaciones realizadas con estas entidades botánicas. Se incluyen estudios de tipo molecular, botánico y/o agronómico, alimenticio y nutricional, usos etnomédicos y verificaciones de algunas de las funcionalidades biológicas de muchas especies de pasifloráceas. En este orden de ideas, y para sólo mencionar unos pocos:

Muschner, Lorenz, Cervi, Bonatto, Souza-Chies, Salzano, & Freitas (2003), realizaron el primer análisis filogenético molecular de la familia Passifloraceae; los resultados evidenciaron la necesidad de reevaluar la monofilia del género Passiflora y su clasificación infraespecífica. Con propósitos similares, pero a nivel del género, se destacan los trabajos de Yockteng & Nadot, en el 2004, logrando abarcar casi todas las secciones de este gran género vegetal. Para el estudio se utilizó el gen de la glutamina sintetasa expresada en cloroplasto a fin de examinar las relaciones entre especies, evidenciando una sorprendente correlación global entre la posición filogenética de las diferentes especies y su número cromosómico. De otra parte, Lorenz-Lemke, Muschner, Bonatto, Cervi, Salzano & Freitas (2005) se interesaron en las inferencias filogeográficas relacionadas con la evolución de Passiflora actinia y Passiflora elegans sobre la base de la variación del ADN nuclear ribosomal (nrDNA). Hansen, Escobar, Gilbert & Jansen (2007) se ocuparon de establecer la herencia parental, maternal y biparental del genoma del cloroplasto en el género y las implicaciones para

15 estudios filogenéticos. Ortiz, Bohórquez, Duque, Tohme, Cuéllar & Vásquez (2012) analizaron la variabilidad genética entre individuos de Passiflora edulis de plantaciones comerciales en Colombia, en total se compararon 419 fragmentos de ADN pero ninguno mostró polimorfismos.

De interés taxonómico son dignos de mencionar los trabajos de Escobar (1989) con la clasificación taxonómica de un nuevo subgénero y cinco nuevas especies en passifloras de América del Sur. En el 2002, Pérez- cortés, Tillett & Escala, realizaron un estudio morfológico de la semilla de 51 especies del género Passiflora, encontraron que estas diferencias permiten la clasificación taxonómica de las especies del género. También Plotze, Falvo, Pádua, Bernacci, Vieira, Oliveira & Bruno (2005), mediante la aplicación del método morfométrico conocido como dimensión fractal multiescalar de Minkowski, no utilizado antes en pasifloráceas. Los autores lograron realizar un análisis de la forma de la hoja que permitió establecer un patrón característico para cada una de las especies. En el 2009 Krosnick y Freudenstein, reportaron una nueva especie de Passiflora (Passiflora kuranda), mediante una revisión taxonómica de los subgéneros Tetrapathea Incluyendo los Genomas Monotípicos Hollrungia y Tetrapathea (Passifloraceae).

A nivel etnomédico, las pasifloráceas encuentran diversas aplicaciones en muchos países como sedante, vermífugo, antiespasmódico, contra el insomnio, diurético, emético, agente antimicrobial para tratar la neumonía, antihelmíntico, antidiarréico, estimulante, tónico, antihipertensivo, y para tratar los síntomas menopáusicos (Chopra, Nayar & Chopra, 1956; Dhawan, Dhawan & Sharm, 2004).

En el tema de la diabetes, el uso de diferentes sistemas vegetales ha despertado el interés por la búsqueda de nuevas moléculas con actividad frente a la patología y que, además, evidencien un mínimo de efectos colaterales. Con este propósito son muchas las especies vegetales pertenecientes a la familia Passifloraceae

16 que han sido probadas; podrían mencionarse los trabajos realizados con extractos de Passiflora incarnata (Gupta, Kumar, Chaudhary, Maithani & Singh, 2012), Passiflora nítida (Montefusco, de Carvalho, de Araújo, Teixeira, Matos & Lima, 2013) y Passiflora alata (Colomeu, Figueiredo, Cazarin, Schumacher, Maróstica, Meletti & Zollner, 2014), evaluados en modelos in vivo mediante diabetes inducida por sustancias químicas como aloxano o estreptozotocina. Estudios realizados con extractos de Passiflora nítida (Gupta et al., 2012), Passiflora ligularis (Saravanan & Parimelazhagan, 2014), y Passiflora foetida (Paulraj, Subharamanian, Suriyamoorthy & Kanakasabapathi, 2014) también utilizaron modelos in vitro como inhibidores de las enzimas alfa y beta glucosidasa, y alfa y beta amilasa.

Importa mencionar que Colombia cuenta con 170 especies que lo convierten en el país con mayor diversidad de Passiflora, tanto en formas silvestres como cultivadas (Ocampo, 2007; Ocampo, Coppens & Jarvis, 2010), no es por tanto extraño que los investigadores enfoquen sus objetivos en estudiar las especies colombianas pertenecientes a este género. Con estos propósitos se han realizado trabajos de clasificación de nuevas especies pertenecientes al subgénero Tacsonia (Passifloraceae): Passiflora formosa (Ulmer, 1999), Passiflora tarminiana (D'Eeckenbrugge, Barney, Jørgensen & MacDougal, 2001), Passiflora creuci-caetanoae (Aguirre, Aguirre & Cardenas, 2016). En el 2016, Aguirre, Bonilla & Caetano, encontraron una nueva especie clasificada como Passiflora franciscoi perteneciente al subgénero Astrophea (Passifloraceae). En el 2007, Ocampo, publicó una nueva lista de Passifloraceaes colombianas que incluye detalles sobre la distribución de estas especies y presenta 26 nuevas en Colombia, integrando aspectos importantes para su conservación. También se han realizado trabajos que han aportado valioso conocimiento vinculado a la familia en Colombia, a través de los cuales se evalúa el desempeño fotosintético y potencial hídrico foliar de gulupa (P. edulis f. edulis Sims) en estado reproductivo en tres localidades de los Andes colombianos (Pérez & Melgarejo, 2015).

Pese a lo dicho anteriormente, de Passiflora vitifolia Kunth (1817) se conocen limitados trabajos en comparación con otras especies colombianas del mismo género. Este vacío estaría en parte justificado dado que se trata de una especie silvestre, sólo cultivada a nivel de huertas de pan-coger y porque no se identifican, hasta el momento, grandes extensiones de interés económico de ella. Adicionalmente no se conocen protocolos de cultivo y fisiología de la especie lo que se convierte en una limitante para su producción a gran escala y, por ende, su interés comercial. No obstante, esta especie ha sido objeto de algunas investigaciones, por ejemplo, en los campos de la taxonomía y la ecología. Ramaiya, Bujang & Zakaria (2014a), estudiaron la caracterización morfológica y el análisis filogenético de la región espaciadora transcrita interna (ITS) del ADN ribosómico nuclear, para establecer la filogenia de especies de Passiflora. Sousa, Souza, Melo & Sodré, en el 2015, analizaron los marcadores ISSR (inter-simple sequence repeat) en especies silvestres de Passiflora como herramienta para la selección de taxones en reproducción ornamental. A nivel ecológico podría mencionarse un mayor interés en la especie, como es el caso de evaluación realizada por Snow (1982), para medir la Intensidad de la polinización y el potencial reproductivo de la semilla de P. vitifolia, encontrando que el sistema de semillas limitado al polen puede ser una desventaja de la auto-incompatibilidad. Por su parte, Lanza (1988) y Smiley (1986) relacionaron la preferencia de algunas especies de hormigas por el néctar de P. vitifolia y su influencia en la supervivencia de larvas.

Estudios más recientes vinculan los factores ecológicos y genéticos que influyen en las estrategias para elección del huésped en las mariposas Heliconius, encontrando a P. vitifolia como una de las plantas de preferencia (Merrill, Naisbit, Mallet & Jiggins 2013). Por otra parte, Ramírez en el 2006, evaluó la hibridación interespecífica en Passiflora, mediante polinización manual y características florales; en este caso, P. vitifolia produjo semillas viables después de sufrir polinización manual con polen de P. ambigua, P. edulis, P. platyloba, P. cuadrangularis y P. miniata. Se concluyó que, debido a polinizadores específicos,

18 algunas especies de pasifloras han desarrollado mecanismos genéticos para el aislamiento reproductivo y que las nuevas especies podrían haber evolucionado simétricamente a través de la poliploidía. De igual forma, en el 2016, Ocampo et al., evalúa la hibridación interespecífica entre diferentes especies cultivadas y silvestres del género Passiflora encontrando el mayor porcentaje de germinación (100%.) en el cruce P. edulis f Flavicarpa × P. vitifolia.

La revisión de literatura permite afirmar que son muy pocos los trabajos enfocados hacia actividades biológicas de la especie. Puede citarse la investigación realizada por Gomes en el 2014, donde se evalúa un método de extracción de flavonoides y un método cromatográfico (HPLC-UV) para cuantificar flavonoides: C-glicósidos, orientina, isoorientina, vitexina, isovitexina y rutina en diferentes especies de Passiflora, dentro de las que se encuentra P. vitifolia; el trabajo también evaluó la capacidad antioxidante utilizando la metodología de estabilización del radical 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), evidenciándose que los extractos de las Passifloras utilizadas presentan capacidad antioxidante comparable a la del ácido gálico, aunque P. vitifolia no mostró potencial inhibitorio de la enzima acetilcolinesterasa ni presentó actividad citotóxica relevante para inhibir el crecimiento tumoral contra la línea celular de ovario, carcinoma de colon humano y glioblastoma.

A este nivel, es importante hacer mención que en ninguno de los estudios antes relacionados P. vitifolia es el objeto central de la investigación, sólo es tenida en cuenta como una especie más en el trabajo.

2.2 MARCO TEORICO

2.2.1. La familia Passifloraceae: contiene 17 géneros y más de 700 especies (Escobar y Ruiz, 1988). Algunos autores reconocen sólo 5 géneros, dos de los cuales se encuentran en Colombia: Passiflora y Dilkea; este último, propio de bosques húmedos tropicales, posee cinco especies, de las cuales dos se

19 encuentran en la Amazonia colombiana y en el Chocó. Por su parte, el género Tetrastylis, fue creado con una sola especie brasilera (Killip, 1926); el género Ancistrothyrsus, con dos especies descritas hasta ahora (Ancistrothyrsus hirtellus, A. tessmannii), se encuentra en los bosques amazónicos del Perú y Brasil, y el género Mitostemma, con tres especies, está restringido a los bosques de la Amazonia en Brasil, Venezuela y Perú (Escobar & Ruiz, 1988).

El nombre de la familia y del género principal, Passiflora, tiene su origen en “flor de la pasión”, refiriendose a la pasión de Jesucristo; para los antiguos exploradores, los zarcillos representaban los látigos con los cuales azotaron el cuerpo de Cristo, la corona floral, representaba la corona de espinas salpicada de sangre, y el androginóforo con sus tres estilos y estigmas capitados y cinco anteras, representan la cruz, los clavos y las cinco personas que acompañaron al Señor en su muerte (Escobar & Ruiz, 1988).

La distribución de la familia es esencialmente pantropical, con pocas especies en zonas templadas en América del norte y del sur, el sur de China y Nueva Zelanda (Feuillet & MacDougal, 2007). Su morfología vegetativa es de plantas leñosas erectas, con un brote accesorio (en serie) en la parte superior de la yema axilar, con estipulas pequeñas, persistentes o caducas, en algunos casos ausentes (Androsiphonia, Barteria), pero en algunas Passifloras son grandes, a menudo asimétricas o pinnadas; a veces la parte apical imita en forma y color un huevo o una larva de una mariposa heliconia, este fenómeno se considera un elemento importante en el argumento para la existencia de la co-evolución entre Passiflora y las mariposas heliconias (Gilbert 1971; Gilbert, 1975; Feuillet & MacDougal, 2007). Gilbert (1982), atribuye la gran diversidad de formas foliares a la presión selectiva ejercida por las mariposas de la familia Heliconiidae, pues éstas en estado larval son pestes específicas de las pasifloráceas, ya que las hembras de las mariposas identifican los lugares de oviposición no sólo por el sentido del olfato, también por la vista.

Las estructuras que identifican una planta perteneciente a la familia Passifloraceae son: ovario súpero, estipitado; placentación parietal y la presencia de una corona floral (Escobar & Ruiz, 1988). Puede encontrárseles como lianas, enredaderas herbáceas con zarcillos axilares, o árboles; hojas alternas, peciolados con estípulas (ausentes en Dilkea), con nectarios extraflorales (ausentes en algunas especies de Passiflora), pedúnculos axilares; flores hermafroditas; sépalos 4 ó 5, pétalos 4 ó 5 (ausentes en algunas especies de Passiflora); opérculos membranáceo, erecto o péndulo (ausente en especies de Dilkea y algunas especies de Passiflora), 5 estambres unidos por los filamentos, formando un androginóforo u 8 y libres; ovario súpero, estipitado o subsésil, con 3 o 4 placentas parietales; semillas con testa lisa o reticulada, con arilo (Escobar & Ruiz, 1988).

La característica más llamativa de las flores es la corola, que en su forma más simple está representada por una membrana finamente lacerada, como se encuentra en algunas del género Adenia (Feuillet & MacDougal, 2007). En otros géneros, se desarrollan varias series de hilos, membranas plegadas y montículos carnosos; la mayor complejidad se encuentra en el género Passiflora (Lindman, 1906; Puri, 1947; Puri, 1948; Tillett, 1988; Endress, 1994).

En cuanto a la biología reproductiva, la polinización en Passifloraceae se ha estudiado principalmente a varias especies del género Passiflora, donde es efectuada por abejas, avispas y colibríes, y más raramente por murciélagos; un rasgo destacado es la ritmicidad en la floración, ya que un pequeño número de flores se produce cada día durante un período que en algunas especies puede durar hasta 9 meses, logrando que la antesis de una flor dure menos de un día (Feuillet y MacDougal, 2007).

Los frutos de Passifloraceae son bayas carnosas, en su mayoria presentan semillas con arilo, cuyo desarrollo se inicia durante la gametogénesis. En la madurez de la semilla, el arilo es generalmente zumoso e incoloro, a veces

21 anaranjado (Feuillet y MacDougal, 2007). El endosperma es aceitoso y proteináceo y persiste o es absorbido; el embrión es relativamente grande (Dathan & Singh 1973; Corner 1976).

La dispersión de las semillas se da gracias a una gran variedad de animales, incluyendo pájaros, murciélagos, monos e insectos. Muy pocas frutas son descascaradas de manera que se necesitan roedores o mucho tiempo de desintegración para exponer las semillas de los frutos caídos (Feuillet & MacDougal, 2007).

Las Passifloraceae ocupan una gran variedad de hábitats desde el desierto hasta las llanuras de inundación, pero son más abundantes en las selvas tropicales, la mayoría de las especies crecen en las elevaciones bajas y medias, pero algunas son pioneras en la playa y otras crecen por encima de la línea de árboles en las pendientes andinas (Feuillet & MacDougal, 2007).

Desde el punto de vista fitoquímico, la familia posee un grupo de compuestos fenólicos tales como C-glicosil-flavonas, derivados del ácido cinámico, procianidina, ácido elágico y ácido gálico. Es también común en los miembros de esta familia encontrar compuestos nitrogenados, tales como los alcaloides de tipo harman (actúan como Inhibidores de la monoaminooxidasa , encontrados en las semillas de Peganum harmala, por ejemplo la harmina, harmalina, y harmalol), los cuales son relativamente solubles en agua. Los ciclopentenoides y glucósidos cianogénicos son también de reconocida presencia en la familia (Spencer, 1988). Los cianógenos están presentes en todos los tejidos, incluidas las raíces, aunque desaparecen de los frutos durante el proceso de maduración (Feuillet & MacDougal, 2007).

Los investigadores han encontrado relacion entre la fitoquímica y la herbivoria de la familia Passifloracea. Las especies de Passiflora, y de otros géneros, son las únicas plantas anfitrión para las mariposas heliconias; la especie o combinación

22 de especies de Heliconius que las prefieren para la oviposición estaría asociado a la composición química intraespecífica de la hoja, resultando así una relación única planta:insecto. Además, se ha evidenciado que las larvas de Heliconius que se alimentan de las hojas de pasifloráceas, secuestran sus toxinas que las hacen desagradables para las aves. De otra parte, la presencia de cianógenos y alcaloides actúan como repelentes para la gran mayoría de herbívoros, exceptuando a las Heliconiinae, estrechamente coevolucionados por alimentarse de ellas. (Feuillet & MacDougal, 2007). Las glándulas de néctar extraflorales en los pecíolos, hojas, estípulas o brácteas sirven como imitadores de huevo que protegen las hojas de la depredación, y al secretar néctar, generan una fuerza defensiva a hormigas predadoras, avispas y parasitoides (Gilbert 1971; Gilbert, 1975).

Referenciando específicamente a Passiflora vitifolia, su epíteto latino significa "con las hojas de Vitis" (“Dictionary of Botanical Epithets”, 2017), especie descrita por Carl Sigismund Kunth (Bonpland, von Humboldt, & Kunth, 1817). La tabla 1 agrupa las principales características morfoanatómicas de esta especie de pasifloracea.

Tabla 1. Descripción botánica de Passiflora vitifolia Parte vegetal Descripción

Es una enredadera que alcanza hasta 8 m de longitud. Las plantas maduras tienen un tronco leñoso, de 2-3 cm de diámetro, teniendo numerosas ramas vegetativas y reproductivas. La mayor parte de los tres lóbulos de las hojas nacen en el dosel del bosque, mientras que las flores escarlatas vistosas se muestran cerca del suelo.

Parte vegetal Descripción Hojas alternas, divididas parcialmente en tres lóbulos, con el lóbulo central más largo, de 7– 15 cm de largo y 8–18 cm de ancho, lobos agudos a acuminados, base truncada a subcordada, márgenes irregularmente serrados, densamente puberulentas en el envés; pecíolos 2–5 cm de largo, con un par de

glándulas grandes en la base; estípulas diminutas, caducas. Flores rojas, solitarias, normalmente caulifloras, brácteas lanceoladas, serradas, 1–2 cm de largo; flores hasta 13 cm de ancho; tubo del cáliz 1–2 cm de largo, sépalos libres 6–8 cm de largo; pétalos 4–6 cm de largo; corona 3-

seriada.

Frutos elipsoides, tipo baya, 5–6 cm de largo y 3 cm de ancho, verde-cafés con manchas blancas, puberulentos; semillas reticuladas.

Fuente: (“Tropicos.org”, 2017; El autor)

2.2.2. Diabetes mellitus (DM): la ciencia médica utiliza el término general “diabetes mellitus” para referirse a los trastornos heterogéneos del metabolismo cuya principal característica es la hiperglucemia crónica; es causada por una baja secreción de insulina, el deterioro en la actividad de esta o como resultado de ambos factores (Kerner & Brückel, 2014; Van Belle, Coppieters & Von Herrath, 2011). Las complicaciones más comunes en pacientes con DM son la nefropatía diabética y la enfermedad cardiovascular, las cuales son responsables del 50-80

% del total de muertes por esta patología (Marenco & Lengua, 2016). En general, las complicaciones diabéticas se clasifican en microvasculares o microangiopatía (retinopatía, nefropatía y neuropatía), macrovasculares o macroangiopatía (arterosclerosis, infarto agudo al miocardio, accidente cerebro-vascular y vascular periférico) y mixtas como es el caso del pie diabético (Mantilla, 2012).

Algunos autores describen a la DM como una enfermedad multifactorial (Colomeu, Figueiredo, Cazarin, Schumacher, Maróstica, Meletti & Zollner, 2014) o como un grupo de enfermedades metabólicas (Marenco & Lengua, 2016). El perfil fisiopatológico metabólico completo de la enfermedad va más allá de la hiperglucemia (Asrafuzzaman, Afroz, Kamato, Gray & Little, 2017), debido a que involucra un conjunto de factores de riesgo cardiovascular, incluyendo varias combinaciones de obesidad abdominal, intolerancia a la glucosa, hipertensión, dislipidemia aterogénica, además de enfermedades microvasculares y macrovasculares (Cooper, Gilbert, & Epstein, 1998; Cooper, Bonnet, Oldfield & Jandeleit-Dahm, 2001; Montefusco et al., 2013).

La capacidad orgánica para generar o no insulina ha hecho que la DM se clasifique como tipo 1 y tipo 2 (DT1 y DT2, respectivamente). En común tienen los altos niveles de glucosa en la sangre (hiperglucemia); sin embargo, la DT1 por lo general comienza en personas menores de 30 años, por lo que también se denomina diabetes juvenil; a pesar de que puede ocurrir a cualquier edad, este trastorno autoinmune crónico afecta, por factores ambientales, a individuos genéticamente susceptibles (Atkinson & Eisenbarth, 2001). En personas con DT1 el propio sistema inmunológico del cuerpo ataca las células beta de los islotes de Langerhans del páncreas, destruyéndolas o dañándolas lo suficiente para reducir y eventualmente eliminar la producción de insulina (Van Belle, Coppieters & Von Herrath, 2011). Por su parte, la DT2 suele estar asociada con la obesidad o la edad, este es principalmente el resultado de la resistencia a la insulina cuando el músculo o las células adiposas no responden adecuadamente a los niveles

25 normales de insulina producida por células beta (Van Belle, Coppieters & Von Herrath, 2011).

Existen otros tipos de diabetes mellitus cuya clasificación y causa se exponen en la Figura 1.

Figura 1. Clasificación de la diabetes mellitus.

•Destrucción de las células β que conduce a una deficiencia absoluta de insulina. Diabetes tipo 1 Usualmente mediada por mecanismos inmunológicos.

•Puede ir desde una resistencia predominante a la insulina con relativa deficiencia de insulina hasta una secreción defectuosa Diabetes tipo 2 prevalente con resistencia a la insulina. Se asocia frecuentemente con otros problemas del denominado síndrome metabólico.

•Disminución de la actividad de la insulina, Diabetes Gestacional diagnosticada por primera vez durante el embarazo.

•Enfermedades del páncreas (por ejemplo, pancreatitis, fibrosis quística, hemocromatosis) •Endocrinopatías (por ejemplo, síndrome de Cushing, acromegalia, feocromocitoma) •Medicamentos inductores (por ejemplo, Otros tipos específicos de glucocorticoides, neurolépticos, alfa- diabetes interferones, pentamidina) •Defectos genéticos de la función de las células β (por ejemplo, formas MODY) •Defectos genéticos de la acción de la insulina •Otros síndromes genéticos que pueden asociarse con la diabetes

Fuente: Modificado de: Kerner & Brückel, 2014.

La Federación Internacional de Diabetes estima que 366 millones de personas alrededor del mundo tienen DM y se espera que para el 2030 estas cifras aumenten a 552 millones de personas, lo cual equivale aproximadamente a 14

26 millones de casos nuevos cada año (Calderón, Muñoz & Quintanar, 2013). Según proyecciones de la OMS, la diabetes será la séptima patología causante de mortalidad en el 2030; resulta interesante, que cerca del 80 % de las muertes por diabetes se registran en países de medianos y bajos ingresos económicos (Mathers & Loncar, 2006). En el caso de Colombia, la prevalencia de DT2 oscila entre el 4 y el 8 % en zonas urbanas; mientras que en las zonas rurales es menor del 2 %. El mestizaje, el envejecimiento y los factores asociados a la urbanización (el sobrepeso y/o el síndrome metabólico) son los principales determinantes de la epidemia de diabetes que se observa en el país (Marenco & Lengua, 2016). La diabetes se encuentra entre las primeras cinco causas de muerte en Colombia y su morbilidad también es considerablemente alta (Aschner, 2010).

La medicina alopática atribuye como causa fundamental de la Diabetes mellitus a la hiperglucemia crónica, ya sea por una baja secreción de insulina, por el deterioro en la actividad de esta hormona o bien, como resultado de ambos factores. No obstante, el perfil fisiopatológico metabólico completo de esta enfermedad va más allá de la hiperglucemia. De esta forma, la ciencia médica sostiene que el control y la regulación de la glucosa en el organismo dependen sustancialmente de la interacción entre las hormonas pancreáticas glucagón e insulina secretadas por las células α y β, respectivamente, pero con acción antagónica, mientras que el glucagón aumenta los niveles de glucosa sanguínea la insulina los disminuye al ayudar a ingresar esta molécula al interior de las células (Reyes & Plancarte, 2008).

Consecuentes con sus principios básicos, la medicina alópata justifica el tratamiento fundamental del padecimiento con el suministro a los pacientes de sustancias químicas que se oponen a su manifestación, es decir, utilizando productos que suplan las deficiencias absolutas de insulina (diabetes tipo 1), que disminuyan la resistencia a la insulina (diabetes tipo 2) o que incrementen su actividad (diabetes gestacional), entre otros (Kerner & Brückel, 2014). En cualquier caso, el control de la concentración plasmática de glucosa es vital para

27 disminuir la incidencia y la gravedad de las complicaciones diabéticas a largo plazo. Sin embargo, debe reconocerse que las terapias con fármacos, solos o en combinación, no logran restaurar totalmente la homeóstasis normal de la glucosa en sangre, y existen muchas limitaciones en su uso (Gray & Flatt, 1997).

Una alternativa a estos tratamientos podría ofrecerse a través del uso de productos naturales vegetales capaces de regular algunos de los mecanismos fisiológicos del metabolito, buscando con ello atacar el origen del trastorno. En este propósito, varios métodos in vivo son aplicados para analizar la actividad antidiabética de plantas, pero los estudios in vitro son escasos. En este sentido, un importante trabajo fue realizado por Gallagher, Flatt, Duffy, & Abdel-Wahad (2003). Estos investigadores cimentaron su criterio en que las plantas representan una vasta fuente de suplementos dietéticos potencialmente útiles para mejorar el control de la glucosa en sangre y prevenir complicaciones a largo plazo en la diabetes mellitus tipo 2.

2.2.3 Actividad antiradicalaria y antioxidante (In vitro): En lo referente a los procedimientos aplicados para evaluar la funcionalidad antiradical y/o antioxidante debe advertirse que los métodos de determinación in vitro han recibido fuertes críticos por su limitado acercamiento a la fisiología de los organismos vivos. Lo ideal sería medir la actividad antioxidante de cada componente de la muestra por separado; sin embargo, y sobre todo en el caso de muestras naturales, es muy difícil determinar el número y concentración de los compuestos antioxidantes presentes en ella. Así, en los métodos in vitro, lo que se evalúa realmente es el efecto antioxidante ya que, dependiendo del tipo de constituyentes, de su cantidad en la muestra y del método aplicado se evidenciará la capacidad antioxidante de ésta. La complejidad de los procesos de oxidación hace necesario utilizar un conjunto de métodos que refleje de forma completa el perfil antioxidante. Lo que a su vez facilita la comparación e interpretación de resultados.

En lo que tiene que ver con las medidas de la actividad antiradicalaria y/antioxidante se pueden realizar mediante dos estrategias distintas:

 El radical se forma en ausencia de la muestra y así, cuando se añade la sustancia antioxidante se produce un descenso de la señal debido a la disminución de la concentración del radical. Es el caso del 2,2-diphenyl-1- picrylhydrazyl (DPPH•+) y del 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6- sulphonic acid) (ABTS•+).  La presencia de radicales libres produce la pérdida o aparición de un reactivo, en consecuencia, en presencia de un antioxidante se provoca el aumento o disminución de la señal, por ejemplo, en ORAC (Oxigen Radical Absorbance Capacity) y FRAP (Ferric ion Reducing Antioxidant Power).

De esta forma, es justificable únicamente comparar resultados entre métodos con fundamentación similar.

 DPPH•* es un radical estable, centrado en nitrógeno, que dista mucho de parecerse a las especies reactivas de importancia biológica. En consecuencia, muchos antioxidantes que reaccionan rápidamente con radicales peroxilo no lo hacen así con DPPH•, debido al impedimento estérico que representa la estructura química que rodea al radical, lo cual hace que sustancias pequeñas generalmente muestren una mayor actividad (Chang, Yang, Wen & Chern, 2002). Lo que, a su vez, dificulta la correlación directa de los resultados obtenidos en esta metodología con el contenido de compuestos fenólicos.

 ABTS también es un radical artificial que no mimetiza bien la situación in vivo; presenta la ventaja de que el sitio radical es plano, que presenta estructuras resonantes (deslocalización del electrón desapareado en el sitio radical y mayor estabilidad radicalaria) y que este ensayo puede realizarse tanto en muestras hidrosolubles como liposolubles, eligiendo el disolvente apropiado en cada caso.

 El ABTS puede ser reducido por compuestos que tengan un potencial redox menor que el suyo (0.68V), pudiendo reaccionar con el radical muchos compuestos fenólicos con un potencial más bajo (Kuskoski, Asuero, Troncoso, Mancini-Filho & Fett, 2005).

 En el método FRAP se determina la capacidad antioxidante que tiene una sustancia para reducir el Fe+3 a Fe+2 que es menos antioxidante. El complejo férrico-2,4,6-tripiridil- s-triazina (TPTZ) incoloro es reducido al complejo ferroso coloreado. Así, cuanto más antioxidante es la sustancia bajo estudio, entonces mayor es la reducción, mayor la cantidad de Fe+3 reducido, y más alto el valor de la respuesta obtenida.

 El complejo Fe+3-TPTZ puede ser reducido por productos con potenciales redox menores a su potencial redox 0.7 V (García, De la Rosa, Herrera, González, López, González & Álvarez, 2011).  Debido a que el potencial redox del complejo Fe+3-TPTZ es comparable con el del ABTS (0.68 V) se pueden analizar compuestos similares con ambos métodos, aunque las condiciones de la reacción sean distintas.

 Sin embargo, Floegel, Kim, Chung, Koo & Chun (2011) compararon los métodos DPPH y ABTS para evaluar la actividad antioxidante en alimentos; observaron una elevada correlación de actividad antioxidante entre ambos.

 En el método ORAC el radical artificial AAPH (2,2’ azobis-(2- aminopropano-2-dihidrocloruro, generador de radicales libres) oxida a la fluoresceína de forma que esta pierde su fluorescencia. De esta forma, las sustancias antioxidantes presentes en el extracto obtenido a partir de la muestra disminuirían dicha pérdida de fluorescencia (Medina, 2010). La capacidad antioxidante de una muestra es la diferencia entre el área bajo la curva (AUC) de la muestra y el blanco.

2,2'-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) Fluoresceina La fluorescencia es asociada con la presencia de un puente de oxígeno (lactona)

 A través de análisis electroquímico por voltametría cíclica (electrodo referencia Ag/AgCl), se encontró que los polifenoles sintéticos presentan un potencial de oxidación entre 0,156 y 0,638 V, donde la quercetina tiene el menor valor.

 Los compuestos polifenólicos con muy bajo potencial de oxidación (entre 0,14 y 0,15 V), revelan una buena actividad antioxidante.

 Los antioxidantes fenólicos poseen una característica privilegiada, pues son excelentes donadores de electrones o de hidrógeno y, además, sus radicales intermediarios son relativamente estables (Muedas, La Rosa & Robles, 2008).

 Fukushima, Ohie, Yonekawa, Yonemoto, Aizawa, Mori, Watanabe, Takeuchi, Hasegawa, Taguchi & Kondo (2009) estudiaron las posibles correlaciones entre parámetros de capacidad antioxidante (DPPH y potencial redox) y el contenido de polifenoles de muestras de café y observaron una elevada y significativa corre lación entre ambos parámetros y los compuestos del café tostado, sugiriendo la importante contribución del contenido de polifenoles a la capacidad antioxidante en esta matriz.

 La determinación del contenido total de compuestos fenólicos, utilizando el método originalmente propuesto por Folin & Ciocalteu en 1927, modificado por Singleton & Rossi (1965), no es considerada en sí misma una metodología para medir actividad antioxidante, a pesar de que su principio se basa en la capacidad redox de los polifenoles. Sin embargo, la alta correlación de los resultados con otros métodos ha hecho que esta determinación se popularice como una herramienta simple y rápida para predecir actividad antioxidante, principalmente en matrices complejas, donde la cantidad de compuestos fenólicos, más que la composición específica de estas sustancias, determina la actividad antioxidante (García-Cruz, Salinas-Moreno & Valle-Guadarrama, 2012).

3. MATERIALES Y METODOS

3.1. PREPARACIÓN DEL MATERIAL Y OBTENCIÓN DE EXTRACTOS

Se trabajó con cáscara y semilla de frutos de P. vitifolia provenientes de plantas colectadas en el jardín botánico Alejandro von Humboldt, Universidad del Tolima, Ibagué (N 4° 15' a N 4° 40', y W 75° 00' a 75° 30; 1285 m.s.n.m.; temperatura media 27 °C; 1620 mm de precipitación promedio/año). Separadamente se colectó un ejemplar completo (flores, hojas y frutos) para la determinación taxonómica en el Herbario Nacional de Colombia, así como frutos enteros maduros para la realización de las pruebas físicas, químicas y biológicas.

3.2 ENSAYOS DE IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN

3.2.1. Análisis morfométrico del fruto completo, cáscara y semillas: se seleccionaron frutos sanos, maduros y de plantas espaciadas a una distancia mayor de 10 m para evitar el efecto de coancestría (probabilidad de que dos alelos tomados al azar en dos individuos sean idénticos por descendencia) (Castro, 2002). De cada planta se colectaron 3 frutos al azar. A los frutos completos (n=30) se les determinó el peso, % de parte comestible, el diámetro longitudinal y diámetro transversal. Se calculó el peso promedio de las semillas, tomando 10 de cada fruto, el largo y el ancho de las semillas, número de semillas/fruto, % de semillas, color visual y espectroscópico. En la cáscara se estableció el peso, espesor, % de cáscara, color visual y espectroscópico. En el zumo del fruto se evaluó el color espectroscópico, características físicas y físico- químicas (densidad, índice de refracción, viscosidad, pH, acidez titulable, contenido de ácido ascórbico, fenoles totales, mineralógico y tamizaje fitoquímico preliminar). Se determinó la media y la variación estándar en cada caso.

3.2.2. Color instrumental: los parámetros de color se evaluaron usando un espectrofotómetro de reflectancia (CM-5 Konica Minolta, Estados Unidos). La calibración se realizó utilizando las placas de calibración en blanco y negro, suministradas con el instrumento. Los resultados se expresaron de acuerdo con el sistema de color CIELab (los valores de L* indican brillo/oscuridad (negro, L=0 y blanco, L=100), los valores de a* indican rojo-verdor (rojo, a*=100 y verde, a*=- 100), y los valores de b* indican amarillamiento/color azul (amarillo, b*=100 y azul, b*=- 100). Las mediciones se tomaron a partir de frutas frescas seleccionadas aleatoriamente en cuatro partes diferentes de una fruta y se promediaron. La misma metodología se aplicó a semillas y zumos, con algunas modificaciones. Los índices de color (CI) y blancura (WI) se calcularon de acuerdo con las ecuaciones 1 y 2, respectivamente, propuestas por López, Gómez, & Cacace (1995). 푎∗1000 CI= (1) 퐿∗푏∗ WI= 100-[(100-L)2+a2+b2]0.5 (2)

3.2.3. Evaluación de la dureza/firmeza del fruto completo: se utilizó una sonda cilíndrica con punzón de acero de 3 cm de longitud y 3 mm de diámetro para perforar los frutos, utilizando un texturómetro LS1 Lloyd (AMETEK Inc, USA), velocidad de 2,0 mm/s y compresión de 20 mm según el método de Duprat, Grotte, Loonis & Pietri, (2000).

3.2.4. Análisis Bromatológico: Sobre el material fresco se evaluaron los porcentajes de humedad, proteína bruta (método de Kjeldahl), grasa (método de Soxhlet) y ceniza (600ºC), siguiendo en todos los casos las recomendaciones de la AOAC (2012). Para la determinación de la fibra ácido detergente neutra (FDN) y ácida (FDA) se aplicó la metodología de Van Soest, Robertson & Lewis (1991). El contenido de minerales, mayores y menores, se cuantificó por espectrofotometría de absorción atómica (Thermo Scientific iCE 3000 Series AA,

USA). La cuantificación de fósforo, boro y azufre se determinó por espectrofotometría UV-Visible (Thermo Scientific Evolution 600, USA).

3.2.5. Preparación de extractos: a partir de las cáscaras y semillas secas (Estufa a 42 °C, 3 días) y trituradas se prepararon por separado extractos hexánicos en un equipo soxhlet (6 h). Una parte del marco hexánico (50%), totalmente retirado de residuos del solvente fue tratado por percolación con etanol al 96% y la restante con acetato de etilo. Las determinaciones analíticas se efectuaron sobre el extracto hexánico (baja polaridad), el de acetato de etilo (mediana polaridad) y el etanólico (alta polaridad). Los extractos se secaron a presión reducida en un rotavapor (BÛCHI R114, Suiza) y se almacenaron (4 °C) en frascos ámbar protegidos de la luz hasta su análisis.

3.2.6. Pruebas físicas: a los extractos etanólicos y de acetato de etilo obtenidos se les evaluó el rendimiento y algunos parámetros físicos como densidad, índice de refracción, acidez titulable y pHmétrica (AOAC, 2012). El conocimiento de los extractos se complementó mediante una caracterización fitoquímica, en la búsqueda de los principales núcleos de metabólicos secundarios presentes en ellos (Pharmacognosie & Phytochimie,1993).

3.2.7. Análisis Fitoquímico Preliminar: en los extractos crudos y el zumo extraído de la fruta se evaluó la presencia o ausencia de fitoconstituyentes tales como esteroles (prueba Lieberman-Burchard), triterpenos (prueba Salkouwski), taninos (pruebas de gelatina y cloruro férrico), saponinas (Rosenthaler y espuma), fenoles (reactivo de Folin-Ciocalteu), flavonoides (ensayo de Shinoda y reacción con hidróxido sódico), alcaloides (pruebas Dragendorff, Mayer, Tanred y Valser), antocianinas (reactivo hidróxido sódico 2N), antraquinonas (reactivo de Borntrager), carbohidratos totales, (reactivo de Molisch) y carbohidratos reductores (reactivo de Benedict), con referencia a la técnica descrita por Pharmacognosie & Phytochimie (1993).

3.2.8. Perfil químico de extractos etanólicos de cáscara y semilla: las muestras de zumo liofilizado y los extractos etanólicos (0,25 g), se extrajeron primero con 5 ml de metanol/agua (50:50) (acidificado al 0,1% v/v con ácido acético) y luego dos veces con 5 ml de acetona: Agua (70:30) en un baño de ultrasonidos durante 30 min. Se reunieron las soluciones extraídas, se diluyeron relación 1:4 con agua Milli-Q acidificada (0,1%, v/v con ácido acético) y se filtraron a través de filtros de politetrafluoretileno (PTFE). Las soluciones se mantuvieron a 6 °C hasta análisis HPLC-UV. Todos los disolventes contenían ácido ascórbico (0,2% p/v).

3.2.9. Parámetros HPLC-UV: el análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento se realizó en un sistema de módulos de separación Waters Alliance 2695, acoplado a un detector de absorbancia  de doble canal (320 y 280 nm). Los compuestos se separaron con una columna Waters Atlantis dC18 (5 μm, 2,1 mm 150 mm) y utilizando un sistema de gradiente con la fase móvil consistente en disolvente A, H2O (0,1% v/v ácido fórmico) y disolvente B, Metanol 100 % 0,1 % v/v de ácido acético). El flujo fue de 0,500 ml/min. El gradiente lineal fue el siguiente: 0-0,5 min, 10 % de B (isocrático); 1,89-17,84 min, 30 % de B, (gradiente lineal); 0,5-15 min, 30 % de B, (gradiente lineal); 15-25 min, 60 % de B, (gradiente lineal); 25-35 min, 80 % de B, (gradiente lineal); 35-40 min, 10 % de B, (gradiente lineal); y 40-45 min, 10 % de B, (isocrático). La inyección fue de 10 μL y la columna se mantuvo a 30 °C, mientras que la temperatura se mantuvo a 10 °C. La presión máxima promedio en el sistema cromatográfico fue 16,55x106 Pa.

La identificación de los compuestos fenólicos en las muestras se basó en estándares disponibles y en revisión de literatura para identificar el número máximo de picos (Delpino-Rius, Eras, Vilaró, Cubero, Balcells & Canela- Garayoa, 2015).

Para cuantificar, las curvas de calibración se construyeron representando gráficamente las áreas de los picos cromatográficos medidas a las longitudes de onda específicas de las siguientes normas químicas: 284 nm para 5-

36 hydroxymethyl-furfural (HMF); 320 nm para ácidos hidroxicinámicos; 283 nm para flavanonas; 285 nm para dihidrocalcona; y 340 nm – 350 nm para flavonoles (apigenina, isorhamnetina, kaempferol y quercetina glicosidos). Los valores de fluorescencia para flavan-3-ols se midieron a 310 nm (ex=280). Para los compuestos para los que no se disponía de patrones, se realizó la cuantificación con una curva lineal (mmol/L) de un patrón con la misma aglicona (parte cromófora) a través de la correspondiente corrección al peso molecular. Las áreas cromatográficas de los compuestos fenólicos presentes en las muestras, medidas a su longitud de onda específica, se utilizaron para cuantificar por interpolación (Delpino-Rius, Eras, Vilaró, Cubero, Balcells & Canela-Garayoa, 2015)

3.3. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE

Se valoró la capacidad estabilizante de los radicales ABTS (González, Marquina, Rondón, Rodríguez-Malaver & Reyes, 2008) y DPPH (Braca, Sortino, Politi, Morelli & Mendez, 2002) de los extractos de acetato de etilo y etanol (0,97-500 mg/L) efectuando en ambos casos modificaciones en los volúmenes para su adaptación a microplacas. Para la preparación de la curva de calibración se utilizó ácido ascórbico a digetentes concentraciones (0,3125 - 5 mg/L) el cual se sometió a las mismas condiciones de ensayo. El porcentaje de estabilización se calculó según la ecuación 3: (Abs C− Abs M) % Inhibición = x 100 (3) Abs C Donde: Abs C = absorbancia del radical sin agente inhibidor de su actividad. Abs M= absorbancia de las muestras + el radical Capacidad reductora: la potencialidad antioxidante de los extractos se complementó mediante la determinación del poder reductor férrico, FRAP (Berker, Güçlü, Tor & Apak, 2007), y la capacidad estabilizadora de radicales oxígenos, ORAC, por su nombre en inglés (Ou, Hampsch-Woodill & Prior, 2001). Cabe advertir que ambas determinaciones fueron aplicadas sólo a los extractos

37 etanólicos (10000 mg/L). Varias consideraciones justifican, al menos en parte, la exclusión del extracto de acetato de etilo en estas dos evaluaciones: 1) la baja solubilidad del extracto en los reactivos de los ensayos en cuestión. 2) dificultades para encontrar un antiemulsionante adecuado que disminuyera la tensión superficial entre las fases. La prospección antioxidante de la cáscara y las semillas de P. vitifolia se enriqueció evaluando el contenido de fenoles totales (Makkar, 2003) en los extractos etanólicos y de acetato de etilo.

Actividad Antihemolítica: Previo a la determinación analítica se preparó la suspensión de eritrocitos a partir de un donante voluntario sano, no fumador, no consumidor habitual de bebidas alcohólicas, con previa lectura y firma del consentimiento informado.

Siguiendo la metodología de Durán, Montero & Marrugo (2013), se obtuvo por venopunción 4 mL de sangre periférica citrada, la cual se centrifugó a 3000 rpm durante 10 minutos para separar el plasma y los leucocitos de los eritrocitos. El pellet de eritrocitos obtenido fue resuspendido en igual volumen de buffer fosfato salino (PBS) pH 7.4, se hicieron tres lavados, centrifugando a 3000 rpm durante 10 minutos a 4 °C. Finalmente, los eritrocitos se resuspendieron al 5 % en (PBS) pH 7.4.

La actividad antihemolítica se evaluó de acuerdo cpn lo descrito por Aguillón, Maldonado, Loango, Arango & Landázuri (2013). Se tomaron 250 μl de suspensión de eritrocitos, a los que se agregaron 300 μl de H2O2 (concentración final de 0,5 M) y se adicionaron a 950 μl de las muestras (extractos etanólicos y de acetato de etilo), para una concentración final de 50, 100 y 200 μg/ml en PBS. Como control se utilizó Butil hidroxitolueno (BHT) diluido en etanol y posteriormente en PBS para preparar soluciones a 50, 100 y 200 μg/ml. Las muestras se mantuvieron en incubadora a 37 °C durante 1 hora, posteriormente se centrifugaron a 3000 rpm (10 min), se tomaron los sobrenadantes y se leyeron en el lector de microplacas Thermo Scientific Multiskan GO a una longitud de

38 onda de 560 nm. Todos los tratamientos se realizaron por triplicado. El porcentaje de inhibición de hemólisis se calculó usando la ecuación 4. (Abs C− Abs M) % Inhibición hemólisis = x 100 (4) Abs C Donde:

Abs C: es la absorbancia del control negativo (eritrocitos y H2O2) Abs M: es la absorbancia de la muestra (extractos o BHT)

3.4. ACTIVIDAD ANTIHIPERGLUCEMIANTE IN VITRO

La hiperglicemia ha sido asociada al estrés oxidativo; con esta idea en mente en este trabajo se implementaron dos metodologías in vitro: inhibición de la α- amilasa e inhibición de difusión de glucosa, para evaluar la actividad antihiperglucemiante de P. vitifolia. Estas evaluaciones se aplicaron a los extractos etanólicos y de acetato de etilo provenientes de semillas y cáscara.

3.4.1 Inhibición de α-amilasa: el método aplicado para medir la actividad inhibitoria de α-amilasa fue el propuesto por Bernfeld (1951). La acarbosa (obtenida de Sigma) se utilizó como control positivo de la inhibición enzimática (50-200 mg/L). Para la reacción se mezcló 500 μL de almidón al 1% con 100 μL de los extractos de acetato de etilo y etanol a diferentes concentraciones (100- 800 mg/L), posteriormente se agregó 100 μL de la enzima α-amilasa Sigma- A6255 factor de dilución 1/10 en buffer Tris-HCl (0.05M, pH 6.9) que contiene CaCl2 0.01M. La reacción se incubó a 40 °C por 10 min y finalmente se adicionó 500 μL de DNS y se llevó a 100 °C en el baño de maría durante 5 min. Inmediatamente se pusó a baño de hielo para detener la reacción, finalmente se agregó 5 mL de agua destilada y se leyó a 540 nm en un espectrofotómetro Thermo Scientific Multiskan GO. (Miller, 1959).

Los resultados de la inhibición de α-amilasa se expresaron en términos de porcentaje de inhibición. Siguiendo la ecuación 5 Abs Control−(Abs muestra−Abs blanco muestra) % Inhibición = × 100 Abs Control (5) Donde: Abs control: corresponde a la actividad total de la enzima durante 10 minutos sin inhibidor (el volumen del inhibidor se reemplaza por buffer Tris- HCl). Abs muestra: corresponde a la absorbancia obtenida como resultado de la actividad enzimática sobre los extractos o bien sobre el control positivo (acarbosa) Abs blanco muestra: corresponde a la absorbancia del extracto crudo obtenida en la cuantificación de sus azúcares reductores sin adicionar la enzima. Se realizó una curva de calibración con glucosa soluble (0,1-4,0 mg/L).

3.4.2. Inhibición de difusión de glucosa: Gallagher, Flatt, Duffy, & Abdel-Wahad, (2003) propusieron un modelo simple para medir la difusión de la glucosa a través de una membrana dialítica. Consiste en medir los efectos causados por los extractos de origen vegetal sobre el transporte activo de los constituyentes celulares, por ejemplo, la glucosa, a través de una membrana de diálisis. Esto modelo simula la absorción de glucosa en el intestino delgado. La metodología aplicada fue propuesta por Gallagher et al. (2003), con algunas modificaciones en cuanto a la cuantificación de azúcares reductores, la cual se realizó según la metodología de DNS propuesta por Miller (1959). Se evaluaron los extractos de acetato de etilo y etanol a (10000 mg/L). La absorbancia se midió a 540-nm. Los resultados de inhibición se expresaron aplicando la ecuación 6.

% Inhibición= Abs control− Abs muestra*100 (6) abs control Donde: Control: corresponde a la concentración de glucosa adicionada en el interior de la membrana, más la concentración de azucares reductores determinado para

40 cada extracto. Se realizó una recta de calibrado con glucosa soluble (125-2000 mg/L).

3.5 EXTRACCIÓN Y COMPOSICIÓN FÍSICO-QUÍMICA DEL ACEITE DE P. vitifolia.

3.5.1. Extracción de aceite: las cáscaras y semillas se separaron manualmente, se lavaron ligeramente con agua destilada, se secaron a temperatura ambiente durante aproximadamente dos semanas y se pulverizaron usando un molino doméstico. Las cáscaras y semillas pulverizadas (200 g) se extrajeron separadamente con n-hexano en un extractor soxhlet (6 h). Después de la extracción, el disolvente se evaporó a presión reducida en un rotavapor a 60 °C (BÛCHI R114, Suiza). Los aceites obtenidos se protegieron con nitrógeno gaseoso, se sellaron y se almacenaron en frascos de vidrio ámbar (-80 °C, Freezer Kaltis prime 390).

3.5.2. Metilación de ácidos grasos del aceite de semilla: La metilación de ácidos grasos a partir de semillas secas se realizó siguiendo la metodología propuesta por Tomás et al. (2009). Se añadió la muestra (0,5 g), 20 μl de solución de patrón interno (heptadecanoato de metilo), 0,5 ml de metanol saturado con nitrógeno, 0,5 ml de clorotrimetilsilano y 1 mg de 2,6-di-t-butil-4-metilfenol, se sometieron a vortex y se colocaron en el reactor de microondas monomodo a 90 ° C. Después de enfriar, se añadieron 2 ml de una solución de hexano: éter dietílico 1: 1, posteriormente se sometió a vortex. La mezcla se neutralizó con bicarbonato sódico sólido y solución acuosa saturada de bicarbonato de sodio. La fase superior se recuperó y se secó sobre sulfato de magnesio anhidro.

3.5.3. Parámetros de cromatografía de gases: los ésteres metílicos se determinaron utilizando un cromatógrafo de gases Agilent 6890 con un detector de ionización de llama (Agilent Technologies España, S.L., Las Rozas, España). La columna capilar de sílice fundida (30 m x 0,25 mm) se recubrió con una

41 película de 0,25 μm de (50% de cianopropil) metilpolisiloxano DB-23 (J & W Agilent, Madrid España). La temperatura del horno se programó a 150 ° C durante 1 min, aumentó a 180 ° C a 25 ° C / min, a 220 ° C a 5 ° C / min y se mantuvo a 230 ° C durante 2 min. Se utilizó una proporción de inyección dividida 1:20. Se utilizó hidrógeno como el gas portador a un caudal constante de 2 ml / min. El volumen de inyección fue de 1 μl. El sistema de inyección y las temperaturas del detector de ionización de llama fueron de 250 ° C. La cantidad absoluta de cada ácido graso en la muestra se calculó mediante la siguiente ecuación: Ai mis (mg) 푓stoich mi (mg)/mmuestra (g) = 푥 푥 Ais 푅푓 푚muestra (g) Donde Ai es el área cromatográfica del éster metílico de ácido graso, Ais es el

área cromatográfica del patrón interno, mis es la masa del patrón interno, Rf es el factor de respuesta de cada éster metílico de ácido graso al patrón interno, fstoich es la corrección estequiométrica para transformar cada concentración de éster metílico de ácidos grasos en concentración de ácidos grasos, y la masa de muestra. Los factores de respuesta de ésteres metílicos de ácidos grasos comercialmente disponibles se calcularon utilizando las mismas condiciones cromatográficas y en concentración conocida mediante la siguiente ecuación: Ai mis Rf = 푥 Ais mi Los compuestos individuales se identificaron comparando sus tiempos de retención con los de muestras auténticas y los datos disponibles en la biblioteca y literatura NIST05 (Adams, 1989; Adams, 2001).

3.5.4. Análisis físico-químico del aceite de cáscara y semilla de P. vitifolia: Los

índices de refracción (27 ºC), saponificación (mg KOH/g), yodo (g I2/100 g), acidez (mg KOH/g) peróxido (meq peróxido/Kg), se determinaron siguiendo las metodología planteadas en AOAC (2012).

3.6 REACTIVOS

Todos los reactivos químicos implementados en este estudio fueron de alta pureza. Alfa amilasa, DPPH, ABTS y persulfato de potasio y los utilizados en el análisis de HPLC y CG fueron adquiridos de Sigma–Aldrich Corp. (St. Louis, MO, USA).

3.7. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Se aplicaron las herramientas estadísticas adecuadas para cada prueba. Los resultados mostrados son la media de tres (n=3) determinaciones realizadas en cada ensayo aplicado ± La desviación estándar (DE). La comparación entre medias de los diferentes grupos en todas las pruebas experimentales se realizó mediante un análisis de varianza y el Test de Tukey para detectar las diferencias entre las medias, con un 95% de confianza. Todo el procesamiento se realizó con los paquetes estadísticos GraphPad Prims versión 6.01 y Statgraphics Centurion XVI.I.

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1 CARACTERIZACIÓN FÍSICA DE FRUTO COMPLETO, CÁSCARA Y SEMILLA DE P. vitifolia

La planta de interés en este trabajo fue identificada en el Herbario Nacional de Colombia con el nombre de Passiflora vitifolia Kunth (Nº COL 592024). El nombre P. vitifolia del latín passio + flora; vitifolia significa "con hojas similares al género Vitis". Comúnmente se le conoce en diferentes regiones como “pasiflora perfumada”, “granadilla de monte”, “granadilla de quijo” y “güillita. La Tabla 2 presenta algunas características físicas del fruto completo en comparación a la cáscara y la semilla.

Tabla 2. Caracterización física del fruto completo, cáscara y semilla de P. vitifolia Constituyente Parámetro Fruto Cáscara Semilla Completo Elíptica Margen: estriado Forma Ovoide Ovoide Ápice: sin cuerno Base: obtusa Ornamentación: retículo alveolada (Pérez-Cortéz et al., 2002). Color El color varía En estado inmaduro el Café oscuro (visual) de verde a café epicarpio es liso, verde con oscuro con manchas blancas; con el manchas avance de la madurez la blancas. coloración del epicarpio varía desde ligeramente amarilla hasta café oscuro.

Constituyente Parámetro Fruto Cáscara Semilla Completo Color L* 55,5 ± 2,48 55,5 ± 2,48 28,8±0,01 Instrumental a* –3,80 ± 1,51 –3,80 ± 1,52 0,99±0,03 b* 28.5 ± 1,82 28,5 ± 1,82 7,354±0,01 Índice de Color -2,63±0,17 -2,63±0,17 4,67±0,16 Índice de Blancura 42,12±2,93 42,12±2,93 28,41±0,01 Longitud: Grosor: longitud: Tamaño 6-7 cm 58 mm ± 0,09 0,70 cm ±0,05 diámetro: diámetro: 4-5 cm 0,45 cm ±0,04 Relación longitud/ 1:2 NA 1:2 diámetro Peso promedio (g) 74,46 ±15,03 34,96±9,75 0,0247 ± 0,02 (n=30) Porcentaje de parte Pulpa comestible (pulpa), 32,90±7,57 48,81±8,02 18,30±6,03 cáscara y semilla (%) Relación 1:2 N.A. N.A. pulpa/semilla (%) Dureza(N) 17,79 ± 0,87 N.A. N.A. Número de semillas 240- 330 N.A. N.A. por fruto (n=10) embebidas en pulpa N.A.: no aplica. P. vitifolia es una Passiflora con hermosas flores escarlatas o rojo bermellón. La fruta es muy amarga cuando cae de la planta y puede tomar un mes para madurar completamente, en donde adquiere un sabor de fresas amargas. Debido a la belleza de sus flores y fragancia de sus frutos se le encuentra cultivada a pequeña escala en el Caribe (Young, 1980). En general, el color se deriva de los pigmentos naturales en frutas y verduras, muchos de los cuales cambian a medida que la planta avanza a través de la maduración, pero esto no es evidente en esta especie lo que dificulta observar el proceso de maduración. Visualmente se aprecia un fruto verde con manchas blancas cuando está inmaduro (figura

2a), con un contenido de semilla de 240-330/fruto embebidas en la pulpa, la parte comestible se encuentra cubierta por un pericarpio duro y coriáceo. Con el avance de la madurez la coloración del epicarpo varía de amarillo ligeramente a marrón oscuro que se va arrugando lentamente (figura 2b), lo que se explica por las reacciones de pardeamiento enzimático y no enzimático que pueden dar lugar a la formación de pigmentos de color marrón, gris y negro, acompañado con la pérdida de agua. Las enzimas implicadas en las reacciones de maduración incluyen la polifenol oxidasa, que cataliza la oxidación de compuestos polifenólicos, que prevalecen en el fruto (Artés, Castañer & Gil, 1998).

El tamaño y la forma de un fruto pueden estar influenciados por el cultivar, la madurez, los insumos de producción y el ambiente en crecimiento. Por su parte, la apariencia de un fruto está determinada por factores físicos incluyendo el color, el tamaño, la forma, la tonalidad, la presencia de defectos (manchas, moretones, hendiduras, etc.) y la consistencia, muchos de los cuales cambian a medida que la planta avanza a través de la maduración.

Figura 2. Color y aspecto de los frutos de P. vitifolia en estado verde (a) y con el progreso de la madurez (b).

Fuente: autor

Muchas especies de Passiflora han sido clasificadas taxonómicamente con base en rasgos vegetativos y de morfología floral; además, se podrían utilizar las

46 características superficiales (apariencia) de la semilla, ya que son poco afectadas por las condiciones ambientales, por lo que reflejarían el genoma de las plantas y, por tanto, las relaciones filogenéticas entre ellas (Tillett, 1988; Pérez-Cortéz, Escala & Tillett, 2002). El perfil morfológico permite apreciar en la fruta de P. vitifolia que la semilla conserva la forma del fruto, tiene una superficie de reticulo- alveolado sin surcos cruzados, ápice sin cuernos y margen estriado, relación longitud-espesor (1:2).

Para la fruta fresca, se obtuvieron los valores y desviaciones estándar para los parámetros de color que muestra la Tabla 2. Puesto que el parámetro L* mostró la mayor variación de la fruta fresca, mientras que el parámetro a* reveló el menor, el valor a* es mucho más representativo del color que el valor L*. En la semilla, a diferencia de la cáscara, el valor L* indica una tendencia hacia los colores marrón, gris y negro, que coincide con la apariencia visual de la semilla (Tabla 2).

La determinación visual y espectroscópica del color de cáscara y semilla se confirmó a través de los índices de color y blancura. Sin olvidar que los consumidores evalúan primero la apariencia visual y el color, resultando así que el color determina en muchos casos si el producto es aceptado o rechazado. Así las cosas, el índice de color es utilizado para determinar fechas de cosecha o decidir si el fruto podría sufrir deterioro por tratamientos tecnológicos. El índice de blancura es una medida estrechamente relacionada con las preferencias de los consumidores por el color del producto; matemáticamente combina en un solo término luminosidad y tendencia hacia la tonalidad amarillo-azul. Los datos obtenidos para el índice de color y blancura fueron: -2,63 y 42,12; 4,67 y 28,41 de la cáscara y la semilla, respectivamente. Como se ve, los valores confirman lo mostrado en la figura 2a y 2b, así como la coloración visual descrita y los valores del color espectroscópico consignados en la Tabla 2.

En general, el color de frutos y vegetales es derivado de los pigmentos naturales. Estos pigmentos primarios son las clorofilas solubles en grasa (verde), los carotenoides (amarillo, naranja y rojo) y las antocianinas solubles en agua (rojo, azul), flavonoides (amarillo) y betalainas (rojo). Además, las reacciones de pardeamiento enzimático y no enzimático pueden dar lugar a la formación de pigmentos de color marrón, gris y negro (Barrett, Beaulieu & Shewfelt, 2010).

La dureza del fruto (17,79 N) estaría asociada con el espesor de la cáscara (58 mm), este valor es superior al de otras Passifloras; por ejemplo, los frutos de P. edulis f. flavicarpa, maracuyá amarillo, (12,8 N y 10,29 mm) y P. ligularis, granadilla, (14,3 N y 15 mm) para dureza y espesor, respectivamente (Espinoza, Arreaza, Mendez, Cañizares & Buonafina, 2008; Linares, Castillo & Londoño, 2013).

La tabla 2 muestra que el peso y el tamaño de la semilla son considerablemente menores a los correspondientes del fruto completo, lo que a su vez permite alojar en la masa comestible un número elevado de ellas (240-330 unidades/fruto); la abundante cantidad podría asociarse con el ofrecimiento que la planta hace a la diversidad y tipos de organismos encargados de su dispersión (pájaros, murciélagos, monos e insectos), garantizando así las probabilidades reproductivas (Lanza, 1988; Smiley, 1986; Feuillet y MacDougal, 2007), característica que se complementa con el atractivo color de las flores de la especie de interés. Las plantas zoófilas deben llamar la atención de sus vectores con colores y olores atrayentes. La belleza visual característicamente asociada a las flores es el efecto de su coevolución con insectos u otros animales polinizadores (Feuillet & MacDougal, 2007).

La figura 3 deja ver las características morfológicas de la semilla y las zonas consideradas en la descripcion morfológica: el ápice y la base.

Figura 3. Semillas del fruto de Passiflora vitifolia

Fuente: autor

En general, la semilla es descrita como el óvulo fecundado, transformado y maduro. Ella constituye el órgano de dispersión y perpetuación de las angiospermas y representa la culminación de la evolución reproductiva de las plantas; tres estructuras la conforman: el embrión, la cubierta seminal (que deriva de los tegumentos del óvulo) y una reserva alimenticia constituída por una gran diversidad de proteínas, carbohidratos (llevados como sacarosa vía floema) y lípidos; lo cual hace que la composición genética sea compleja (Courtis, 2013).

Uno de los atributos comunes de las pasifloras es que las especies del género poseen abundante cantidad de semillas, las cuales se adhieren al funículo sobre la pared del ovario y están rodeadas por el arilo que recubre la semilla, el cual constituye la parte comestible del fruto (Werker, 1997). Además, presentan una cubierta con células generalmente lignificadas, la cual no solo afecta la absorción de agua, sino que ofrece una resistencia al crecimiento del embrión (Cardozo, 1988). Las capas de las semillas de pasifloras son desarrolladas de óvulos bitégmicos en las cuales se observa elongación celular radial desigual (Werker, 1997). El arilo se inicia de un borde meristemático continuo alrededor de la parte

49 distal del rafe, e incluye la región exoestomal. Los pigmentos del arilo se encuentran en los cromoplastos (Werker, 1997).

MacDougal (1994) realizó una revisión taxonómica de la sección Pseudodysosmia del subgénero Decaloba del género Passiflora, y entre los caracteres utilizados en sus descripciones incluye la ornamentación de la superficie del cuerpo seminal. Esto ha permitido considerar las especies del género Passiflora como un excelente tema de estudio para caracterizar la morfología de la semilla con la finalidad de evidenciar el potencial taxonómico presente en dicha estructura para este género (Pérez-Cortéz, Escala, M., & Tillett, 2005).

La caracterización e identificación de las semillas de una especie no sólo es válida para estudios taxonómicos, sistemáticos, arqueológicos y de paleobotánica, sino que además reviste singular utilidad para la evaluación de dietas en animales silvestres; sobre esta base, agricultores y horticultores pueden disponer de tal información para mejorar y facilitar sus actividades de cultivo al permitirles la identificación de las especies tan sólo con la semilla (Johri & Rao, 1984; Pérez-Cortéz, Escala, M., & Tillett, 2002). Esto es de especial importancia cuando se trabaja con taxa como las pasifloras que agrupan gran cantidad de especies utilizadas comercialmente en la industria ornamental, medicinal y alimentaria (Escobar 1981; Delascio-Chitty 1985; Vanderplank 1990).

4.2 ANÁLISIS BROMATOLÓGICO

El análisis bromatológico de frutas y verduras comestibles desempeña un papel crucial en la evaluación de su importancia nutricional. El resumen de la composición próximal (en peso seco) de cáscara y semilla de P. vitifolia se muestra en la Tabla 3 y se ilustra a través de la figura 4. Se observa que el contenido de humedad de los subproductos de los frutos es ligeramente diferente en ambos componentes de la planta y menor del 50%, lo que les permitiría ser

50 reservados durante un período de tiempo más largo. A su vez, este bajo nivel de agua dá a entender alto grado de materia seca, la cual es depositaria de los nutrientes “mayores” (proteínas, grasas, fibra, etc) y “menores” (vitaminas y minerales) del material vegetal.

El contenido de cenizas, que es un índice de minerales, también es ligeramente diferente en la cáscara y las semillas (5,6; 4,0, respectivamente). Sin embargo, se observa que los frutos de P. vitifolia tienen un contenido de proteína bruta dos veces mayor en las semillas (15,5) que en la cáscara (6,6); también, el nivel de grasa cruda en las semillas (25,6 ± 1,30) excede cinco veces a la cáscara (5,7), mientras que la fibra cruda en las semillas (2,8) fue considerablemene menor que en la cáscara (11,4). Este valor elevado de fibra en la cáscara explicaría la dureza y consistencia del fruto de P. vitifolia (Tabla 2). Esta fibra insoluble está compuesta de celulosa y lignina (insolubles en agua y en solventes comunes), las que provienen principalmente de las paredes celulares primarias y secundarias de la cáscara.

Las fibras obtenidas a partir de frutas resultan de mayor calidad debido a que presentan una composición más equilibrada, menor contenido catiónico y de ácido fítico, mayor capacidad de retención de agua y aceite, así como una mayor fermentabilidad colónica, necesaria para la digestión y para la eliminación de desechos (Larrauri, José, Saura & Fulgencio, 1999).

Tabla 3. Evaluación bromatológica de cáscaras y semillas de P. vitifolia (%) Proteína Grasa Fibra Constituyente Humedad Ceniza Carbohidratos cruda bruta bruta 36,7 Cáscara 5,6±0,22 6,6±0,90 5,7±1,70 11,4±1,34 34.0±1,1 ±0,10 Semilla 33,8±0,35 4,0±0,12 15,5±0,60 25,6±1,30 2,8±0,34 18,4±0.7

*Diferencias significativas (p<0.05)

Figura 4. Analisis bromatológico de cáscara y semilla de P. vitifolia

Fuente: autor

La composición proximal de algunas especies de pasifloras es ampliamente conocidas. Por ejemplo, se ha reportado que las semillas de P. incarnata (Liu, Yang, Li, Zhang, Ji y Hong, 2008), tienen una cantidad de proteína (10,80%), son ricas en aceites (23,40%) y fibra cruda (17,48%). En tanto que en Passiflora edulis f. flavicarpa (maracuyá amarillo), el porcentaje de proteínas fue encontrado en 12,23%, el contenido de lípidos del 30,39%, y el porcentaje de carbohidratos y fibra del 48,73% (Malacrida & Jorge, 2012). En un trabajo realizado en Colombia, se encontró que el fruto de la curuba larga, P. mollisima, del municipio de Sonsón (Antioquia) mostraba: un contenido de humedad 77,93%, cenizas 0,55%, proteína total 0,36% (Chaparro-Rojas, Maldonado, Franco-Londoño & Urango-Marchena, 2014). Estos últimos resultados dan a entender que el mayor contenido de nutrientes en estas pasifloráceas se haya en la semilla.

4.2.1. Análisis de minerales de la cáscara y semilla de P. vitifolia: el cuerpo humano requiere de minerales para mantener una buena salud. Una serie de minerales esenciales para la nutrición humana se acumulan en diferentes partes de las plantas (Liu, Yang, Li, Zhang, Ji y Hong, 2008). Los resultados de la

52 composición de los elementos minerales de las semillas de P. vitifolia se presentan en la Tabla 4.

Tabla 4. Contenido en elementos minerales de cáscaras, semillas y zumo de P. vitifolia (mg/g de materia seca). Elementos minerales Semilla Cáscara Zumo Potasio 0,500 6,200 1,830 Sodio 1,100 0,500 0,110 Calcio 1,300 1,700 0,300 Magnesio 0,800 0,500 0,350 Cobre 0,020 0,010 4,2x10-4 Zinc 0,010 0,008 8,8 x10-3 Hierro 0,002 0,001 7,4 x10-3 Manganeso 0,001 0,001 1,25 x10-3 Boro 0,008 0,007 N.D. Fósforo 0,210 0,110 N.D. Azufre 0,090 0,260 N.D. N.D.: No determinado

Las semillas presentaron un alto nivel de calcio (1,3 mg/g), seguido de sodio (1,1 mg/g), magnesio (0,8 mg/g), potasio (0,5 mg/g) y fósforo (0,21 mg/g), pero la cáscara mostró mayores contenidos de potasio (6,2 mg/g) y calcio (1,7 mg/g).

Tal como muestra la Tabla 4, el contenido mineralógico del zumo no superó a los correspondientes de la semilla y la cáscara, excepto en el potasio (0,5; 6,2 y 1,83 mg/g para semilla, cáscara y zumo, respectivamente). Los niveles bajos de estos nutrientes en el zumo podrían estar asociados también a los polifenoles, dado que son reconocidos como inhibidores de la absorción de diferentes minerales por su capacidad quelante de metales divalentes, principalmente Fe, Cu y Zn, lo cual afecta su biodisponibilidad (Martínez, Periago & Ros, 2000). Se adiciona que la polifenoloxidasa, que tiene como cofactor al cobre, actúa sobre los polifenoles vegetales en presencia de oxígeno generando agua y quinona; la cual es responsable de los pigmentos amarillos y marrones (Porras & López, 2009). El

53 resultado de la actividad de esta enzima es no sólo contribuir al cambio de coloración del fruto de P. vitifolia sino también disminuir la disponibilidad de cobre en él, lo que justificaría el bajo nivel encontrado (4,2x10-4 mg/g).

En algunos estudios se ha indicado que la acumulación de calcio en la pared celular facilita la reticulación de los polímeros pécticos que conducen a una red de pared celular que aumenta la resistencia de la misma y la cohesión celular, lo que se asociaría con la firmeza de la piel de las frutas de P. vitifolia. También se puede usar como indicador de calidad el calcio unido en la fracción de pectina insoluble en agua (Manganaris, Vasilakakis, Diamantidis & Mignani, 2007).

El potasio es un elemento mineral esencial que ayuda a regular la presión arterial, mientras que el calcio es necesario para el crecimiento óseo y la contracción muscular y en la coagulación de la sangre. El magnesio trabaja con el calcio para mantener los huesos sanos. El calcio es también muy importante en el mantenimiento de un corazón sano y el fósforo trabaja con el calcio para construir el hueso. El fósforo es un constituyente importante del trifosfato de adenosina (ATP) y ácido nucléico y también es esencial para el equilibrio ácido-base, la formación de huesos y dientes. Los otros elementos encontrados (cobre, zinc, hierro, magnesio, manganeso) son cofactores importantes que se encuentran en la estructura de ciertas enzimas y son indispensables en numerosas vías bioquímicas (Soetan, Olaiya & Oyewole, 2010).

4.3 CARACTERIZACIÓN FÍSICA Y QUÍMICA DEL ZUMO Y LOS EXTRACTOS

Las frutas no convencionales son consumidas tradicionalmente como fruta fresca, aunque los lugareños de las regiones donde estas se dan espontáneamente las aprovechan también como zumo, ya que se consideran fuente de nutrientes, por lo que recientemente se ha observado una fuerte y amplia tendencia hacia su consumo como zumos naturales (Freitas, 2007). Los

54 valores obtenidos para las principales características físico-químicas del zumo del fruto de P. vitifolia se presentan en la tabla 5.

Tabla 5. Caracterización física comparativa del zumo (parte comestible) y extractos etanólicos y de acetato de etilo de cáscara y semilla de frutos P. vitifolia. Constituyente Parámetro Extracto Acetato de etilo Extracto Etanólico Zumo Cáscara Semilla Cáscara Semilla Rendimiento 24,26±4,68 2,52±2,1 6,23±4,1 16,62±1,2 18, 94±2,3 (%) Color L 51,38±0,02 5,71±0,07 13,30±0,11 4,67±0,4 8,47±1,7 Instrument * 6,11±0,02 -0,38±0,02 -0,22±0,30 -0,08±0,1 -1,24±0,2 al a 40,03±0,06 1,35±0,05 8,80±0,07 2,48±0,4 3,22±2,2 * b * Índice de color 0,3±0,002 -48,8±2,35 -1,88±2,54 -94,29±13,05 -4,21±2,47 Índice de 36,73±0,03 5,70±0,07 12,86±0,11 8,38±1,61 4,64±0,35 blancura Densidad 1,04±0,03 0.98±0,07 0,88±0,01 1,06±0,09 1,01±0,04 relativa (27°C) ° Brix 16,10±0,1 20,50±0,1 21,27±0,06 20,30±0,1 20,37± 0,06 Índice 1,3500±0,0 1,3200±0,01 1,2900±0,01 1,3800±0,01 1,3300±0,0 Refracción 1 (27°C) Viscosidad 6,24±1,01 N.A. N.A. N.A. N.A. (mPa, 24 °C) UV (365 nm) N.A. Fluorescenci Fluorescenci Fluorescenci Fluorescenci a azul a azul a azul a azul pH (27°C) 2,80±0,12 6,30±0,11 5,30±0,11 4,90±0,10 3,50±0,10 Acidez titulable 6,36±0,3 0,36±0,2 0,94±0,4 2,52±0,2 2,90±0,1 (% ácido cítrico) Vitamina C 231±0,1 N.A. N.A. N.A. N.A. (mg/100g zumo)

Constituyente Parámetro Extracto Acetato de etilo Extracto Etanólico Zumo Cáscara Semilla Cáscara Semilla Contenido 236,8±2,48 N.A. N.A. N.A. N.A. fenólico total mgEAG/L N.A.: no aplica; mPa: milipascal; mgEAG: miligramo equivalente de ácido gálico; nm: nanómetros.

Los parámetros L* y b* mostraron los mayores valores entre ellos (51,38; 6,11 y 40,03), lo que indica una tendencia hacia el blanco con ligera tonalidad de amarillo y la capacidad de reflejar la luz. Nuevamente, los índices de color y blancura obtenidos confirman lo antes dicho (Tabla 5).

Los valores del contenido de sólidos solubles totales y de acidez titulable del zumo (16,1 °Brix, 6,36% de ácido cítrico, relación 2,53) son muy diferentes a los reportados para el zumo de maracuyá amarillo, P. edulis f. flavicarpa (10,00 °Brix, 0,462%, relación 21,64; Rocha & Bolini, 2015), pero son similares con los datos reportados para Passiflora edulis f edulis Sims, gulupa (Franco, Cartagena, Correa, Rojano, Piedrahíta & Lobo, 2014). La información obtenida a partir de los sólidos solubles (ºBrix) y la acidez titulable es importante para determinar la etapa de maduración de una fruta. Anthon, LeStrange & Barrett (2011) advirtieron que los azúcares solubles, tales como la glucosa y la fructosa, son el mayor contribuyente a los sólidos solubles totales.

El valor de vitamina C obtenido para el zumo de P. vitifolia (231 mg/100 g de zumo) es comparativamente superior al de algunas passifloras. Por ejemplo, el jugo de P. edulis f edulis (maracuyá morado) mostró 0.32 g Kg-1 (Devi Ramaiya, Bujang, Zakaria, King, Sahrir & Arif, 2013). En la pulpa de P. edulis f. flavicarpa (maracuyá amarillo) se encontró 15,11±0,16 mg/100 g (Avila, 2004); esta especie de Passiflora es la de mayor importancia comercial a nivel mundial (Malacrida & Jorge, 2012), y su acidez resulta atractiva para los consumidores principalmente para la preparación de zumos (Deliza, MacFie & Hedderley, 2005). Según Orjuela, Campos, Sáncehz, Melgarejo & Hernández (2011), la pulpa de P. edulis.

56 f. edulis. Sims (gulupa), que hace parte de las llamadas "especies de frutas del alto-andino", reveló 20 mg vitamina C/100 g. El contenido de esta vitamina en el mesocarpio de Passiflora quadrangularis (badea) osciló entre 0.62-0.72 g Kg-1 (Devi Ramaiya et al., 2013). De acuerdo a The Natural Food Hub, cualquier alimento que tenga entre 15-30 mg de ácido ascórbico puede considerársele como una buena fuente de vitamina C; si el nivel es mayor a 30 mg, se le califica como una excelente fuente de esta vitamina (Devi Ramaiya et al., 2013).

Los ácidos orgánicos son una fuente de energía respiratoria directa tanto en células animales como en células vegetales. El producto final de la ß-oxidación

(Acetil-CoA) se convierte en CO2 y H2O, preferiblemente a través del ciclo de Krebs, por lo que las células de las frutas son capaces de utilizarlos como sustrato respiratorio y convertirlos en azúcares (Fennema, 2000). Debe recordarse que el fruto de P. vitifolia es climatérico lo que le exige disponer de fuentes de energía en abundancia durante la alta frecuencia respiratoria requerida con el avance de maduración; entonces, la alta acidez del fruto, revelada a través del pH, acidez titulable y contenido de vitamina C que muestra la Tabla 3, es tal vez aprovechada como fuente de energía respiratoria, o bien, contribuye en las características organolépticos, por ejemplo, el sabor de la parte comestible del fruto.

La determinación de compuestos fenólicos totales se realizó aplicando una reacción de oxido-reducción mediante el reactivo de Folin-Ciocalteu, el valor obtenido fue 236,8±2,48 mgEAG/L de zumo liofilizado. Datos reportados para otras especies de Passiflora permiten afirmar que esta concentración es similar a la encontrada en Passiflora maliformis (277,00±1,00 mgEAG/L material fresco), P. quadrangularis (272,96±0,67 mgEAG/L material fresco), aunque inferiores a los de P. edulis púrpura (362.00±4.68 mgEAG/L material fresco) y P. edulis amarillo (310,93±3,56 – 361,73 ± 3,99 mgEAG/L material fresco) (Devi Ramaiya et al., 2013). Luximon-Ramma, Bahorun & Crozier (2003), obtuvieron en el fruto de la pasión valores de 574±107 mgEAG/L, mientras que Janzantti, Macoris,

Garruti & Monteiro (2012) registraron para la misma especie 5289,3 mgEAG/L, y Macoris, De Marchi, Janzantti & Monteiro (2012) reportaron valores mayores a 281,8 mgEAG/L para P. edulis f. flavicarpa.

Vasco, Ruales & Kamal-Eldin (2008), determinaron el contenido de ácido ascórbico y de constituyentes fenólicos, entre otros, en P. ligularis (granadilla), considerada la segunda Passiflora de importancia comercial en Colombia, después de P. edulis (maracuyá amarillo), encontrando valores para el ácido ascórbico y los fenoles totales: 16-25 mg/100 g de peso fresco y 91 ± 43 mgEAG/g peso fresco, en tanto que para P. edulis reportaron 30–40 mg/100 g de peso fresco y 61±32 mgEAG/g peso fresco.

El conjunto de resultados mostrados confirma que el nivel de constituyentes en un fruto está fuertemente influenciado por factores genéticos, climáticos, estado de desarrollo vegetativo y sistema de cultivo (Devi Ramaiya et al., 2013), así como también del método aplicado y la unidad de equivalencia al reportar el resultado.

La información científica que caracteriza a las frutas exóticas no convencionales en relación con sus características físicas y físico-químicas constituye una referencia importante en estudios sobre la calidad de estos frutos, con el fin de determinar los requisitos de aceptación del consumidor. La calidad se define como la ausencia de defectos o grado de excelencia e incluye apariencia, color, forma, lesiones, sabor, aroma, valor nutricional y seguridad para el consumidor. Por otra parte, la Tabla 5 también deja ver características físicas determinadas a los extractos orgánicos derivados de cáscara y semilla. Un “extracto vegetal” puede ser considerado como una mezcla compleja, generalmente líquida, de constituyentes provenientes de una parte específica del vegetal, o de la planta completa, pero que, en cualquier caso, posee menor número de compuestos que la totalidad del material que le dio origen. La simplificación de entidades químicas en los extractos, lejos de convertirse en una desventaja, más bien posibilita su

58 manejo en los ensayos experimentales, lo transforma en un sistema de concentración de principios activos y en una fuente muy diversificada de oportunidades de trabajo y de rentas. Todo lo anterior hace de los extractos vegetales (medicinales, aromáticos, condimentarios), en todas sus facetas, en una poderosa herramienta de trabajo en los laboratorios de cualquier nivel (de investigación o industriales) y en los establecimientos comerciales más especializados.

También, la determinación exitosa de compuestos biológicamente activos a partir de material vegetal depende en gran medida del tipo de disolvente utilizado en el procedimiento de extracción. La Tabla 3 muestra que el etanol penetra con mayor facilidad la membrana celular para extraer los ingredientes intracelulares del material vegetal (16,62 y 18,94% para cáscara y semilla) que el acetato de etilo (2,52 y 6,23% para cáscara y semilla), aunque mayor cantidad de extractivos se obtienen a partir de la semilla.

En este trabajo se desestimó la posibilidad de utilizar el agua (índice de polaridad 9.0) y el metanol (índice de polaridad 6.6) como solventes de extracción pese a la polaridad alta de ambos y a sus posibilidades de hacer puentes de hidrógeno con el material fenólico, característicos de la familia Passifloraceae. El agua no fue tenida en cuenta por cuanto permite la ocurrencia de microoganismos, comparado con el etanol; así mismo, no se consideró el metanol por su toxicidad que lo hace inadecuado en pruebas de interés biológico. De esta forma, se consideró pertinente trabajar con el etanol (índice de polaridad 5.2), también considerado un solvente polar, aunque más bajo que los dos anteriores. La gama de posibilidades se complementó utilizando un solvente aprótico: el acetato de etilo ( ), cuyo índice de polaridad es 4.3. Así las cosas, se pudo obtener de las matrices vegetales utilizadas no sólo metabolitos desde los muy polares (p.ej., carbohidratos y fenoles) sino también los de mediana (p.ej., alcaloides) y hasta los de baja polaridad (p.ej., terpenoides y esteroides) que no pueden hacer puentes de hidrógeno.

La extracción, como es el término utilizado farmacéuticamente, es la separación de las porciones que contienen los principios activos del tejido utilizado como muestra. En ese orden de ideas, la tabla 5 deja ver que la semilla se mostró como el mayor reservorio de compuestos en el fruto, puesto que en ella se obtuvieron los mayores porcentajes de extracción, lo cual está en concordancia con la fisiología vegetal. No obstante, los valores arrojados en la determinación de densidad e índice de refracción insinúan que se trata de entidades químicas que tienen una masa molecular baja en relación con el espacio que ocupan; esta observación es más notoria cuando se utiliza acetato de etilo como solvente extractor.

Si se tiene en cuenta que la separación con etanol y acetato de etilo fue posterior a un desengrasado con n-hexano, debe entenderse que no se trata de compuestos de naturaleza lipídica que pudieran disminuir la densidad. Pudiera entonces pensarse que los dos extractos objetos del interés en este trabajo estarían constituidos más bien por compuestos voluminosos, tales como los flavonoides, junto con los ácidos fenólicos y sus ésteres, genéricamente denominados “compuestos fenólicos”.

Los valores de los parámetros de color (L*, a* y b*), al igual que el índice de color y de blancura de los extractos consignados en la Tabla 3 indican una tendencia hacia el color marrón, gris y negro, que coincide con la apariencia visual del material vegetal que les dio origen. En este caso, el valor de a* es el parámetro representativo del color del extracto proveniente de la cáscara; L* y b son distintivos para el de semilla, independientemente del solvente utilizado.

Aunque no se evidencian diferencias importantes en las otras características determinadas (densidad relativa, °Brix, índice de refracción), si se nota variabilidad de resultados en el pH y la acidez titulable del zumo y los extractos de cáscara y la semilla. Estas diferencias estarían asociadas no sólo con la presencia de ácidos orgánicos sino también con los contenidos diferenciales de

60 compuestos fenólicos, que pueden formar enlaces de hidrógeno con el etanol, tales como compuestos fenólicos glicosidados (p.e., flavonoides).

Es importante recordar que los fenoles son compuestos de carácter ligeramente ácido, propiedad que los distingue de los alcoholes. Esta discrepancia se debe a la estabilidad del ión fenóxido por deslocalización de la carga en el anillo aromático que les permite el desprendimiento del protón (H+) de los grupos fenólicos disminuyendo así el pH de sus soluciones. La mayoría de los fenoles son menos ácidos que el agua. El ión fenóxido les confiere también la capacidad de absorber la radiación ultravioleta. Ver tabla 3. Los estudios sobre flavonoides mediante espectroscopia han revelado que la mayoría de las flavonas y flavonoles exhiben dos bandas de absorción principales: la banda I (320-385nm) representa la absorción del anillo B, mientras que la banda II (250-285nm) corresponde a la absorción del anillo A. Los grupos funcionales unidos al esqueleto de flavonoides pueden causar un cambio en la absorción como es el caso de 360nm en rutina (Wollenweber & Dietz, 1981).

4.2.1 Composición química de los extractos etanólicos: en este estudio se realizó el control de calidad de los extractos etanólicos de cáscara y semilla de la especie de interés aplicando un análisis de HPLC- Espectrometría de masas (HPLC-EM). La tabla 6 agrupa los resultados obtenidos en este análisis. La determinación química fue solo efectuada en el extracto etanólico dado que este es el de mayor aplicación comercial.

Tabla 6. Composición química Extracto Etanólico (HPLC- EM). Composición química Extracto Etanólico (HPLC- EM) Compuesto Cáscara Semilla (µg/g de muestra) (µg/g de muestra) Ácido clorogénico 24 N.D. Ácido p-cumárico 73,80 78,40 Hiperóxido 20 N.D.

Composición química Extracto Etanólico (HPLC- EM) Compuesto Cáscara Semilla (µg/g de muestra) (µg/g de muestra) Quercetina 6,20 N.D. Rutina 399,40 48,80 Ácido sinápico 35,40 N.D. N.D.: No detectado bajo las condiciones del ensayo

En la tabla se observa que el ácido p-cumárico (ácido hidroxicinámico) y la rutina (flavonoide glicosidado) podrían considerarse marcadores químicos para los frutos de esta especie. No obstante, debe tenerse en cuenta que el nivel de rutina en la cáscara es aproximadamente 8 veces superior (399,4 µg/g de muestra) al de la semilla (48,8 µg/g de muestra), y el acido p-cumárico aparece en proporciones casi iguales en ambos subproductos (73,8 y 78,4 µg/g de muestra cáscara y semilla).

Otras especies de Passiflora presentan contenidos variables de los compuestos reportados en este trabajo y consignados en la Tabla 4. Por ejemplo, la pulpa de P. edulis f. flavicarpa fue analizada por su contenido de compuestos bioactivos mediante cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC-PDA-MS/MS); se encontró un contenido de ácido p-cumarico de 1,35 mg/100 g (Konta, Almeida, Amaral, Darin, Rosso, Mercadante & Bianchi, 2014). Talcott, Percival, Pittet, & Celoria (2003) usaron HPLC-DAD al jugo de P. edulis, reportando una concentración de acido p-cumárico de 519 µg/L y de ácido sinápico 626 µg/L. En tanto que, la rutina y el ácido clorogénico (164 µg/ mL y 284 µg/ mL, respectivamente) fueron reportados en el el extracto etanólico de hoja de P. incarnata aplicando HPLC-DAD (Masteikova, Bernatoniene, Bernatoniene & Velziene, 2008).

La Agencia Europea de Medicamentos define los marcadores químicos como constituyentes o grupos de constituyentes definidos químicamente de un

62 producto herbario que son de interés para fines de control de calidad independientemente de si poseen alguna actividad terapéutica (Agencia Europea de Medicamentos, 2015). Es importante tener en mente que no sólo interesa conocer la presencia/ausencia del marcador químico, sino que, además, su cantidad puede constituirse en un indicador de la calidad de una medicina herbaria. También interesa mencionar que la mayor parte de los fármacos contienen constituyentes químicos definidos de los que deriva su actividad farmacológica y biológica, pero la identificación de los constituyentes químicos activos depende de los métodos químicos de determinación (Kushwaha, Neelottama, Neeleshwar & Rai, 2010).

Aunando la información de la Tabla 6 con los planteamientos anteriores, se encuentran razones suficientes no sólo para justificar la escogencia de la rutina y el ácido p-cumárico como quimiomarcadores del fruto de P. vitifolia sino también para explicar muchas de las características organolépticas del fruto; por ejemplo, la coloración adquirida lenta, pero paulatinamente, con el avance de la maduración (figura 2) así como el sabor característico (fresas amargas) percibido al zumo, a lo que contribuiría el contenido, relativamente alto, en relación a otras pasifloráceas, del ácido ascórbico (231 mg/100g zumo) detectado en él.

Es importante destacar que todo el perfil químico de los extractos etanólicos del fruto de P. vitifolia hacen pensar en sus perspectivas tecnológicas (farmacológicas y/o cosmetológicas) y nutricionales; afirmación que encuentra respaldo en los compuestos fenólicos identificados en la tabla 6. Así:

Según ACOFARMA, la rutina se usa en el tratamiento de estados patológicos caracterizados por hemorragias capilares asociadas a un incremento de la fragilidad capilar, como accidentes vasculares de la hipertensión, nefritis hematúrica y vasculopatías diabéticas. También se utiliza en casos de insuficiencias venosas tales como várices, hemorroides, piernas cansadas,

63 flebitis, tromboflebitis y calambres nocturnos. En serums y cremas se usa como revitalizante para atenuar las ojeras (Castaño, Ruíz & Vidal, 1998).

Rutina Ácido p-cumarico Ácido sinapico Ácido clorogénico

El ácido p-cumárico fue encontrado con capacidad de activar funciones microbianas potencialmente beneficiosas para la función intestinal, entre las que se incluyen una fuerte respuesta antioxidante y la destoxificación por parte del compuesto frente a Lactobacillus plantarum, un microrganismo probiótico y comensal humano; también se ha evidenciado que la presencia de este ácido hidroxicinámico puede activar genes que facilitan la adaptación del microrganismo probiótico al intestino (Tapia & Schmeda, 2005).

El ácido sinápico detectado en la cáscara de P. vitifolia (35,4 µg/g de muestra); es un derivado hidroxicinámico que encuentra aplicación como componente de cosméticos no terapéuticos, especialmente para el blanqueamiento de la piel y como agentes cosméticos contra signos de envejecimiento de la piel (Markert, Moussou, Danoux & Rathjens, 2012).

En general, los ácidos hidroxicinámicos (ácido ferúlico, ácido caféico, ácido p- cumárico y ácido sinápico) presentan propiedades anti-cancerígenas, antiinflamatorias y anti-oxidantes (Martínez, Periago & Ros, 2000). Esta última propiedad es de gran interés para la industria de los alimentos, cosmetológica y farmacéutica.

La tabla muestra también un contenido no despreciable de ácido clorogénico (24 µg/g de muestra), aunque su aparición se dio solo en cáscara. Algunas de las propiedades farmacológicas reconocidas para este compuesto son: mejorar el metabolismo lipídico y promover la pérdida de peso mediante la reducción de la síntesis de la grasa visceral, colesterol y ácidos grasos. Además, regula la distribución de las grasas corporales, incrementa la utilización de los ácidos grasos para obtener energía y regula el metabolismo de la glucosa. (McCarty, 2005; Van Dijk, Olthof, Meeuse, Seebus, Heine & Van Dam, 2009; Ong, Hsu & Tan, 2013).

4.4 TAMIZAJE FITOQUÍMICO

En el presente trabajo se realizó la búsqueda de algunos de los principales núcleos de metabolitos secundarios en los extractos de acetato de etilo y etanol de de cáscaras y semillas a fin de garantizar una mejor detección de aquellos de mayor interés farmacológico y/o industrial. En tal propósito se investigaron 11 compuestos bioactivos principales; seis componentes fueron positivos para ambos extractos, los cuales incluyen: compuestos fenólicos, como taninos y flavonoides, presentes en grandes cantidades junto con los azúcares reductores, esteroles y esteroides; mientras que los alcaloides se encontraron en bajas cantidades. Las saponinas, las cumarinas, los glucósidos cardiacos y las antraquinonas están ausentes en ambas partes de la fruta. En la tabla 7 se consignan los resultados obtenidos en este análisis.

La tabla 7 deja ver abundante presencia de carbohidratos reductores en semilla y cáscara (por ejemplo, glucosa o fructosa) y/o no reductores (sacarosa) que normalmente aparecen ligados a muchos metabolitos secundarios, tales como los fenólicos, entre ellos los flavonoides.

Tabla 7. Análisis fitoquímico realizado a extractos de cáscara y semilla de P. vitifolia Extracto Acetato Extracto

Etilo etanólico Zumo Metabolito Prueba Cáscara Semilla Cáscara Semilla Carbohidratos totales Molish + + +++ +++ +++ y reductores Benedict ++ ++ +++ +++ +++ Fenoles Folin-Ciocalteu + + + +++ ++ Shinoda N.D. N.D. ++ +++ ++ Flavonoides CCD + + ++ +++ + Taninos Cloruro Férrico ++ ++ +++ +++ N.D. Rosenthaler N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. Saponinas Espuma N.D. N.D. N.D. N.D. N.D. Antraquinonas Borntrager N.D. N.D. + +++ + Lieberman- ++ ++ +++ +++ +++ Triterpenos y Burchard esteroides Salkouwski + ++ +++ +++ +++ CCD N.D. N.D. ++ +++ + Tanred N.D. N.D. N.D. + + Dragendorff + + + + + Alcaloides Mayer N.D. N.D. + + + Valser N.D. N.D. N.D. + + Hidróxido Antocianinas N.D. N.D. N.D. +++ + sódico 2N +++: Contenido relativo alto. ++: Contenido relativo medio. +Contenido relativo bajo. N.D.: No detectado bajo las condiciones del ensayo.

Los compuestos fenólicos, ya sea como ésteres, glucósidos o polímeros, son ubicuos en las plantas, son una parte esencial de la dieta humana, y son de considerable interés debido a sus propiedades antioxidantes, mientras que los flavonoides son los principales fitoconstituyentes en el género. La presencia de taninos, que constituyen el tercer grupo importante de fenólicos, también fueron encontrados en forma abundante. Su detección sugiere la capacidad de P. vitifolia para desempeñar un papel como agente antidiarréico y antihemorrágico (Awoyinka, Balogun & Ogunnowo, 2007). Una de las funciones asociadas a estos

66 fitoconstituyentes es servir como mecanismo de defensa de los nutrientes acumulados en los frutos vegetales, lo cual parece estar en concordancia con su hallazgo tanto en cáscara como en semilla.

Puesto que los terpenos, o terpenoides, constituyen el grupo más numeroso de metabolitos secundarios, no resulta extraña su presencia en los subproductos de los frutos de P. vitifolia, ya sea participando en los procesos de crecimiento o en funciones de defensa; en este caso localizados principalmente en las semillas. La presencia de alcaloides parece una característica común de la cáscara de otras pasifloráceas (Carvajal, Ceballos, Álvarez, Rodríguez, Àlvarez, Bonilla & Rodríguez et al., 2014), aunque también se les reconoce en otras partes de la planta (Fuentes, Méndez, Lemes, Rodríguez, Soler, González & López, 2001). Además, se han encontrado muchas especies de pasifloras que contienen pequeñas cantidades de alcaloides harmala (es decir, harmane y posiblemente harmina, harmalina, harmol y harmalol) (Dhawan, Kumar y Sharma, 2003).

Agrupando información se llega al conocimiento que los residuos frutícolas de P. vitifolia contienen metabolitos secundarios de diversa naturaleza química, tales como compuestos glicosidados (altamente polares), entre ellos flavonoides; entidades medianamente polares, por ejemplo, alcaloides, además de los constituyentes terpénicos y la materia grasa (de baja polaridad), cuya cantidad resulta ser no despreciable.

La determinación de la composición química de metabolitos secundarios con frecuencia es base de una taxonomía vegetal más alta, ya que cada especie y cada unidad taxonómica, posee una composición específica de estos compuestos. Si además se tiene en cuenta que los resultados del tamizaje fitoquímico en la cáscara y las semillas de la planta bajo estudio pueden ser adecuados para el cribado de moléculas bioactivas, la información fitoquímica y la observación de la interacción de la planta con su entorno sugieren como criterios de selección de fuentes potenciales de moléculas naturales de

67 relevancia farmacológica o de industria cosmetológica; entonces no resulta osado reconocer que el discernimiento de los constituyentes químicos de las plantas es fundamental porque dicha información será de valor para la síntesis de sustancias químicas complejas, además de coadyuvar en su determinación taxonómica.

Algunos autores sostienen que los compuestos fenólicos son el grupo más extenso de sustancias no energéticas presentes en los alimentos de origen vegetal y que, además, los subproductos de los alimentos vegetales son ricas fuentes de compuestos bioactivos, incluyendo compuestos fenólicos (Quiñones, Miguel & Aleixandre, 2012; Balasundram, Sundram, & Samman, 2006); sin embargo, su contenido cualitativo y cuantitativo es diferente en cada especie vegetal.

4.5 CARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA DE ACEITES DE P. vitifolia

Se realizaron las determinaciones para identificar adulteraciones en los aceites o caracterizar nuevos materiales; estos análisis de rutina son utilizadas para confirmar la identidad y usos potenciales de la mayoría de las grasas y aceites (Tabla 8) (Fennema, 2000).

Tabla 8. Caracterización fisicoquímica de aceites

Semilla P. edulis f. Semilla Semilla Passiflora vitifolia flavicarpa soya Maiz Parámetro físico- Comisión Codex químico (Malacrida & Silva et al., Cáscara Semilla Alimentario Jorge, 2012) 2015 (2008) Rendimiento 5,61 25,60 - - - - (%) Densidad 0,84± 0,02 0,90± 0,06 - - - - (g/mL, 27°C) Índice de 1,466- 1,465- Refracción, 1,473±0,08 1,482±0,09 1,4682±0,0001 - 1,470 1,468 27°C

Semilla P. edulis f. Semilla Semilla Passiflora vitifolia flavicarpa soya Maiz Parámetro físico- Comisión Codex químico (Malacrida & Silva et al., Cáscara Semilla Alimentario Jorge, 2012) 2015 (2008) Índice de Saponificación 189- 187- 263,92±0,8 108,93±0,1 190,7±2,76 173,95±1,48 (mg KOH/g 195 195 aceite) Índice de Iodo 109,48 124- (g I/100 g 128,10±0,7 135,81±0,7 128,0±0.75 103- ±5,02 139 aceite) 135 Índice de

acidez 3,22±0,18 2,31±0,04 2.35±0,06 1,63 ± 0,08 (% ácido - -

oléico) Indice de ésteres 260,7±0,2 106,62±0,3 - - - - (mg KOH/ g aceite) Índice de peróxidos 1,68±0,3 1,24±0,22 1,46 ± 0,03 1,54 ± 0,12 - - (meq O2 /Kg aceite)

En la tabla 8 se observa que el material lipídico (extracto hexánico) de la semilla (25.6%) es mayor al contenido en la cáscara (5,6%); no obstante, los valores obtenidos son similares al de otras semillas de passifloras como la granadilla (P. liquiaris, 26,69%; Uehara, 1985) y el maracuyá (P. edulis, 29,3%; Cerón, Osorio, & Hurtado, 2012; Chamorrro, Benavides, & Correa, 2017), o superiores como en curuba (P. mollisima, 11.16%; Uehara, 1985). El rendimiento también resulta similar al de semillas oleaginosas de importancia comercial como la soya (20%; Ortiz, Pasos, Rivas, Valdés & Cabrera, 2009); girasol (36%; Agüero, Pereyra, Aguirrezábal & Lúquez, 1999) y maíz (20.7 - 55.3%; Roy, 2000).

La densidad relativa de la mayor parte de los aceites, minerales y vegetales refinados, se encuentra entre 0.840 y 0.960 g/cm3. Debe tenerse en cuenta que en la tabla se reportan datos de aceites crudos; aun así, los valores de densidad se encuentran dentro del rango esperado.

El índice de refracción en grasas y aceites mide la pureza e identifica sustancias. El valor obtenido para P. vitifolia tanto en cáscara (1,473) como en semilla (1,482) es comparable con otros aceites vegetales que presentan valores entre 1.4557– 1.4770, incluyendo P. edulis (maracuyá; 1,46) (Cruz & Meléndez, 2004). Este resultado sugiere que el aceite se encuentra dentro de un rango de pureza aceptable. Esta información estaría asociada al peso molecular de los ácidos grasos combinados y al porcentaje de ácidos saturados e insaturados contenidos en el aceite, lo cual influye en el valor de esta propiedad física (Fennema, 2000). El índice de saponificación indica el peso molecular medio de ácidos grasos esterificados en glicerol en la molécula de triacilglicerol; entonces, un alto índice de saponificación indica el ácido graso de pesos moleculares más bajos, y viceversa (Jorge & Luzia, 2012). El valor encontrado para el índice de saponificación del aceite de cáscara fue considerablemente mayor (263,92 mg KOH/g aceite) que el de la semilla de P. vitifolia (108,93 mg KOH/g). Los datos indican que los ácidos grasos del aceite de la semilla de P. vitifolia son de mayor peso molecular que los correspondientes de la cáscara, y éste último a su vez, resulta ser de menor peso molecular en relación a otros aceites de semilla de passifloras como el de Passiflora edulis, Maracuyá, reportado por Cruz & Melendez, 2004 (217,39 mg KOH /g) y otros autores (Tabla 8).

El índice de acidez proporciona datos importantes sobre el estado de conservación del aceite. La Comisión del Codex Alimentarius (2008) determina el valor máximo del índice de acidez de 4,0 mg KOH/g como parámetro de calidad. Los valores encontrados en este trabajo (3,22 y 2,31 mg KOH/g para cáscara y semilla, respectivamente) indican que el aceite estudiado puede

70 utilizarse con fines alimenticios, ya que se encuentra dentro de los valores de calidad estipulados.

El índice de ésteres indica la cantidad de ácidos esterificados (tri, di y monoglicéridos) los cuales son superiores en la cáscara 260,7 que los contenidos en la semilla (106,6). Por su parte, el índice de peróxidos del aceite proveniente de la cáscara indica mayor disposición a la oxidación que el de semilla, lo cual estaría asociado al menor peso molecular de los ácidos grasos (mayor índice de saponificación) que lo conforman, aunque de más bajo nivel de insaturación que en el aceite proveniente de la semilla (Tabla 8). La Comisión del Codex Alimentarius (2008) ha definido un valor máximo de peróxido de 10 y 15 meq/kg para los aceites crudos y refinados, respectivamente, como parámetros de calidad. Los valores 1,68 y 1,24 meq O2/Kg aceite dan razón de la buena calidad del aceite de cáscara y semilla de P. vitifolia, lo cual se puede verificar por los bajos valores de ácido y peróxido, a su vez relacionados con el desarrollo de reacciones hidrolíticas y oxidativas, respectivamente.

El índice de yodo está directamente relacionado con el grado de insaturación presente en el aceite. Se entiende que, el aceite de semilla de P. vitifolia se compone principalmente de ácidos grasos insaturados con un valor de yodo de

135,81g I2/100 g aceite, mayor al de cáscara (128,10). Industrialmente, este parámetro se utiliza como una forma de controlar la hidrogenación de aceites.

Con un índice de yodo por encima de 100 g I2/100 g muestra, el aceite puede considerarse como semisecante (Bello, Akindele, Adeoye & Oladimeji, 2011).

Los valores del índice de refracción, yodo y saponificación en el aceite de semilla de P. vitifolia (Tabla 8) fueron consistentes con los encontrados para aceites convencionales como soja y maíz (Comisión del Codex Alimentarius, 2008), indicando su posible uso en el procesamiento de alimentos y productos químicos. Los aceites y las grasas de origen vegetal o animal, se encuentran en estado líquido o sólido, algunas veces coloreados, untuosos o inflamables; menos

71 densos que el agua, son insolubles en solventes polares debido a su naturaleza apolar que le confiere su constitución principalmente de carbono, hidrógeno y oxígeno. En el caso de aceites y grasas de origen vegetal, se encuentran en mayor proporción en las semillas que en otras partes de la planta, ya que es allí donde está el principal reservorio de energía para la germinación. La composición química confiere diferentes características físicas al material lipídico, que pueden variar según sea el tipo de extracción implementado (con solventes, prensado al frio, entre otros).

4.5.1 Perfil de ácidos grasos: sobre la base de los rendimientos de material graso obtenidos en cada uno de los subproductos que muestra la tabla 8, se determinó realizar el estudio de carcaterización química solo a la grasa proveniente de la semilla. Los resultados de este análisis se muestran en la tabla 9.

En la tabla 9 se observa que los constituyentes mayoritarios del aceite son: ácido linoléico (52,51%) y ácido oleico (11,41%), junto con una menor proporción de ácido palmitíco (7,15%) y esteárico (1,58%). Como se nota este perfil está compuesto por un alto porcentaje de ácidos grasos insaturados, UFA, (64,64%) y un bajo porcentaje de ácidos grasos saturados, SFA, (9,05%), lo cual es considerado ideal en aceites comestibles e indica las posibilidades del aceite de semilla de P. vitifolia de ser utilizado en culinaria como aceite para ensaladas o en la formulación de margarinas. La calidad y digestibilidad de aceites vegetales comestibles está determinada por la cantidad y composición de ácidos grasos insaturados (Malacrida & Jorge, 2012).

Es importante recalcar que el aceite en estudio contiene 2 ácidos grasos esenciales linoléico (18:2-6) y linolénico (18:3ω-3), pero el contenido de ácido linoléico (52,51%) es superior al del α-linolénico (0,39%). La prevalencia de ácido linoléico resulta de particular importancia dado que éste ayuda en la prevención de desórdenes cardiovasculares tales como enfermedades coronarias, ateroesclerosis y presión sanguínea (Rana & Blazquez, 2008, Malacrida & Jorge,

2012). Se ha reportado que el aceite de semilla de P. edulis f. flavicarpa Sims (maracuyá amarillo) contiene ácido oléico (6,67- 14,7%) y ácido linoléico (53,23- 73,14%), en conjunto con con ácido palmítico (6,13- 13,83%) y ácido esteárico (1,33-3,0%) (Autores: Tabla 7; Rana & Blazquez, 2008, Malacrida & Jorge, 2012). Comparando los resultados obtenidos en este trabajo con aceites comestibles de importancia comercial, puede decirse que P. vitifolia podría ser un producto oleifero con grandes perspectivas similares al aceite de girasol, soya, maíz y uva, los cuales son ricos en acido linoléico (60,0; 49,8-57,0; 39,4-65,6 y 58,0-78,0%, respectivamente) y ácido oleico (45,3; 17,7-26,1; 20,0-42,2; 12,0- 28,0%).

Cotejando la relación de ácidos grasos saturados totales y ácidos grasos insaturados SFA/UFA obtenidos en este estudio (1/7,14) con aquellos reportados por Malacrida & Jorge (2012) para el aceite de semilla de P. edulis f. flavicarpa (1/7,06), se encuentra que P. vitifolia presentó un perfil similar.

Tabla 9. Composición de ácidos grasos de aceite de semilla de P. vitifolia y P. edulis. Componentes COMPOSICIÓN % Methyl esters Passiflora vitifolia Pasiflora edulis* Cáprico (C10) 0,03 0,02 Tridecílico (C13) 0,02 0,02 Mirístico (C14:0) 0,06 0,03 Pentadecílico (C15) 0,02 0,01 Palmítico (C16:0) 7,15 6,13 Palmitoléico (C16:1) 0,15 0,12 Margárico (C17) 0,04 0,05 Esteárico (C18:0) 1,58 1,33 Oléico (C18:1) 11,41 6,91 Linoléico (C18:2) 52,51 56,23 Linolénico (C18:3) 0,39 0,34 Araquidíco (C20) 0,39 0,35 Eicosenoíco (C20:1) 0,10 0,06 Eicosadienoico (C20:2) 0,07 0,08

Componentes COMPOSICIÓN % Methyl esters Passiflora vitifolia Pasiflora edulis* Behénico (C22:0) 0,06 0,05 UFA 64,64 63,74 MUFA 11,67 7,09 PUFA 52,97 56,66 PUFA/MUFA 4.54 7.99 SFA 9,05 7,71 SFA/UFA 1/7,14 1/8,26 UFA: ácidos grasos insaturados; MUFA: ácidos grasos monoinsaturados; PUFA: ácidos grasos poliinsaturados; SFA: ácidos grasos saturados. * Fuente: Autores

Dubois, Breton, Linder, Fanni & Parmentier (2007) categorizaron a los aceites vegetales de acuerdo con su composición de ácidos grasos. Sobre la base de esta clasificación el aceite de semilla de P. vitifolia pertenece a los aceites insaturados, que contienen ácidos oléico y linoléico en altas cantidades. En este grupo están incluidos varios aceites vegetales como maíz, girasol, germen de avena y sésamo. Adicionalmente, cuando la relación de los ácidos grasos esenciales nominalmente llamados omega-6 (linoléico) y omega-3 (α-linolénico) está en relación entre 5-10 se considera óptima; si esta relación es superior a 50 el aceite es calificado como peligroso para la salud (Rana & Blazquez, 2008).

4.6 ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE

4.6.1. Evaluación del potencial fenólico total y antioxidante: los resultados del contenido fenólico total y capacidad antiradical y antioxidante de la cáscara y semillas de P. vitifolia se presentan en la Tabla 10.

El contenido de constituyentes fenólicos total varió entre las diferentes partes de la planta de Passiflora vitifolia entre 10671,52 mg EAG/100g en semillas, y 2817,18 mg EAG/100g, en la cáscara. Estos valores se diferencian a los reportados para algunas especies de Passiflora altamente comercializadas. Por

74 ejemplo, Ramaiya, Bujang, & Zakaria (2014b), encontraron un contenido de compuestos fenólicos en extractos metanólicos de hoja de 3,32; 2,37 y 2,17 g EAG/100 g para P. maliformis, P. edulis y P. quadrangularis, respectivamente.

Tabla 10. Contenido fenólico total y capacidad antioxidante de la cáscara y semillas de P. vitifolia. DPPH Fenoles (CI50, mg ABTS ORAC totales equivalente (IC50, mg (µmol TEAC Extractos (mg s de ácido TEAC/10 FRAP / 100g EAG/100g ascórbico 0 g (AEAC) muestra) muestra) /100 g muestra) muestra) Etanólic Cáscar 2817,1±19,9 1.95±0,9 c 2,33±1,1 78,2±496, 43518,2±20 o a c b 4 b 9 b Semilla 10671,5±13 0,94±0,4 a 0,46±0,2 2577,1±65 56999,3±17 7 a a a 0 a Acetato Cáscar 1554,8± 154,3±0,7 e 36,5±08 e N.D. N.D. Etilo a 29,9 d Semilla 3142,1± 97,1±0,9 d 12,0±0,5 N.D. N.D. 15,9 b d Acido ascorbico N.D. 1,4±0,1 b 2,96±0,1 N.D. N.D. c Letras diferentes indican diferencias significativas por cada columna (p<0.05). N.D.: No Determinado; EAG: equivalentes de ácido gálico; AEAC: ascorbic acid equivalent antioxidant capacity; TEAC: Trolox equivalent antioxidant capacity.

De igual manera, otras especies de Passiflora no convencionales han sido reportadas con valores diferentes; así, en el extracto metanólico de semilla P. subpeltata, Saravanan & Parimelazhagan (2014) encontraron 115.7±3.60 mg EAG/g. Por su parte, Sasikala, Saravana & Parimelazhagan (2011) hallaron que los extractos etanólicos de P. foetida contenían en cáscara 10,09±0,0 y 4,5±0,1 en semillas, expresados como porcentaje equivalente de ácido tánico.

Se evidencia claramente que los datos reportados son dependientes de la parte de la planta estudiada, así como del solvente de extracción y de la unidad equivalente en que se expresen los resultados.

Los valores numéricos consignados en la tabla 10 permiten categorizar que la actividad antioxidante de las muestras frente al DPPH se incrementó en el siguiente orden, de acuerdo a las CI50: extracto etanólico de semilla 0.46±0.2 (ABTS) < 0.94±0.4 (DPPH), seguido del extracto etanólico de cáscara 1.95±0.9 (DPPH) < 2.33±1,1 (ABTS), extracto de acetato de etilo de semilla 12.0±0.5 (ABTS) < 97.1±0.9 (DPPH) y del extracto acetato de etilo de cáscara 36,5±08 (ABTS) <154.3±0.7 (DPPH). Los datos evidencian a los constituyentes de la semilla con mayor funcionalidad antiradical, mejores resultados obtenidos con etanol que con acetato de etilo, y CI50s menores frente al ABTS que con el DPPH. No obstante, el contenido fenólico total, mgEAG/100 g muestra, decreció en el siguiente orden: 10671,5±137 extracto etanólico de semilla> 3142,15± 15,9 extracto de acetato de etilo de semilla >2817,18±19,9> extracto etanólico de cáscara>1554± 29,9 extracto acetato de etilo de cáscara; no encontrando entonces correlación directa entre la funcionalidad y la presencia de estos metabolitos.

De igual forma, el método de FRAP suministra información complementaria a la antiradicalaria y resulta útil en la determinación de la capacidad antioxidante de productos que tengan distintos tipos de antioxidantes (Medina, 2010). En este caso, los valores de la AEAC de las semillas (56999,3±170) son considerablemente más altos que los correspondientes de la cáscara (78,2±496,4). Se deduce que los fitocomponentes contenidos en la semilla dejan ver la mayor actividad reductora.

Por otra parte, los valores de la tabla 10, evidencian que al igual que para los casos anteriores, en el método de ORAC el extracto etanolico de semilla es más activo en comparación con el de cáscara. Importa recalcar que la semilla contiene

76 casi cuatro veces más compuestos fenólicos (10671,52mgGAE/100g muestra) que la cáscara (2817,18mg GAE/100 g muestra).

En un trabajo realizado por Zapata, Piedrahita & Rojano (2014), se estimó el contenido de fenoles totales de 24 matrices alimenticias y su capacidad atrapadora de radicales de oxígeno. Se encontró para la curuba (Passiflora mollissima (Kunth) L.H. Bailey) un contenido de fenoles de 10584,7 ± 260,6 mgEAG/100 g muestra, un alto valor ORAC (207.850,4 ± 2.906,5 µmol Trolox/100 g); entre tanto, el maracuyá (Passiflora edulis var. Flavicarpa) dejó ver en fenoles 39,1 ± 1,9 mgEAG/100 g muestra, calificado entre los más bajos, y ORAC 2154,5 ± 74,3, designado como moderado frente a la mayoría de granos, legumbres y frutas estudiadas. Los autores concluyeron que, en general, las frutas y hortalizas con una baja capacidad antioxidante presentaron un bajo contenido de compuestos fenólicos. También, Santos, Carvalho, Pereira, Aranha, Malik, Mendonça & de Sousa (2016), investigaron la actividad antioxidante de hojas de P. edulis aplicando in vitro DPPH y FRAP. El más alto contenido de fenólicos (16.30%), flavonoides (3.88%) y actividad antioxidante (DPPH IC50 84.23 µg ml- 1; FRAP 1.89 mmol Fe2+ g-1) se obtuvo por maceración de la droga en una relación con solución hidroalcohólica como solvente 1:8.

En resumen, el comportamiento revelado por los fitocomponentes de la semilla frente a los métodos DPPH, ABTS, FRAP y ORAC mostraron la mayor actividad, particularmente cuando fueron extraídos con etanol.

En la literatura, la actividad antioxidante puede, entre otros factores, depender del tipo (posición y número de hidroxilos en la molécula y concentración de compuestos fenólicos, y de la presencia de metales de transición (Monreal, Manzanera & Tomé, 2012). De allí la necesidad de ensayar diferentes metodologías para evaluar el efecto antioxidante, y no existe un método que refleje de forma completa el perfil antioxidante de una muestra (Medina, 2010).

Son numerosos los estudios que han mostrado que los fenoles poseen propiedades antioxidantes, inhibiendo la peroxidación lipídica y captando radicales libres como hidroxilo, supéroxido y alcoxi (Sichel, Corsaro, Scalia, Di Bilio & Bonomo, 1991; Maydata, 2002). Además, protegen de la oxidación a las lipoproteínas de baja densidad (LDL) desempeñando un papel clave en la prevención de la aterosclerosis. También pueden prevenir la trombosis, inhibiendo la agregación plaquetaria, la permeabilidad y fragilidad capilar (Mazza, 2000). Son considerados reguladores del sistema inmune y como antiinflamatorios, probablemente debido a la modulación del metabolismo del ácido araquidónico, reduciendo los niveles de tromboxano. Modulan la actividad enzimática de la ciclooxigenasa, lipoxigenasa, fosfolipasa A2, hialuronidasa, e inhiben la acción de la angiotensina convertasa, mieloperoxidasa (que produce el hipoclorito y otros prooxidantes) y xantinooxidasa (que produce los radicales superóxido) (Quiñones, Miguel, & Aleixandre, 2012; Medina, 2010).

4.6.2. Actividad antihemolítica: los glóbulos rojos se ven ampliamente afectados por los radicales libres del organismo que los conducen a la lisis celular. Los efectos antioxidantes de muchos compuestos de origen natural pueden aliviar eficazmente el daño de las células sanguíneas (Saravanan & Parimelazhagan, 2014). En este ensayo, la hemólisis de los eritrocitos fue inducida por el radical hidroxilo mediante la adición de H2O2. Esto provoca la ruptura de los eritrocitos; el contenido se filtra dando el característico color rojo de la hemoglobina al medio. Las reacciones se llevaron a cabo a pH y temperatura fisiológicos. Los resultados de la inhibición de hemólisis de eritrocitos de los extractos de P. vitifolia y BHT, fueron consignados en la tabla 11.

Tabla 11. Comparación de los efectos protectores de extractos de P. vitifolia y BHT. Concentración Porcentaje de inhibición de los extractos (mg/L) Acetato de etilo Etanólico BHT Cáscara Semilla Cáscara Semilla 50 24,81±0,6 38,23±0,9 24,02±0,7 40,12±0,5 31,3±0, c c c c 1 c 100 27,14±0,5 39,66±0,4 42,14±0,4 43,95±0,1 40,5±0, b b b b 3 b 200 29,10±02 44,44±0,6 44,85±0,5 47,70±0,4 58,2±0, a a a a 8 a

Letras diferentes indican diferencias significativas por cada columna (p<0.05).

La tabla 11 evidencia que los extractos de P. vitifolia reducen en gran medida las alteraciones inducidas por peróxido de hidrógeno en eritrocitos. Sin embargo, ninguno de los extractos a las concentraciones evaluadas (50, 100, 200 mg/L) supera el 50% de inhibición de la lisis celular. Se debe resaltar que la actividad del extracto etanólico de semilla (50 y 100 mg/L) es comparable y superior con la actividad del control positivo de la actividad (BHT) a las mismas concentraciones. Como era de esperarse, por los ensayos anteriormente discutidos, el extracto etanólico de semilla de P. vitifolia, evidencia la mayor actividad antioxidante, esto se puede relacionar con su alto contenido de fenoles totales (tabla 10), además de la presencia de diferentes fitoquímicos que actúan en sinergia, para reaccionar con el radical hidroxilo.

Los resultados obtenidos dejan ver que la propiedad antioxidante del extracto etanólico de semilla de P. vitifolia resulta comparable a la acción del BHT a la misma concentración (200 mg/L). Este comportamiento es promisorio para la especie de interés ya que podría aplicarse en la generación de productos farmacéuticos y nutracéuticos que coadyuven al control de enfermedades degenerativas como las asociadas al estrés oxidativo.

El peróxido de hidrógeno es una de las especies reactivas de oxígeno (ROS) más importantes formadas a partir de superóxido. Mediante la reacción de Fenton, los iones de metales de transición (como Fe2+) reducen el peróxido de hidrógeno al radical hidroxilo, por lo que la quelación de los iones Fe2+ y/o la reducción de los iones Fe3+ resulta importante en la prevención o reducción del estrés oxidativo (Okoko & Ere, 2012). Este oxidante celular deteriora los componentes de la membrana que están encargados de su estabilidad, como los fosfolípidos, el colesterol, las proteínas transmembranales, ADN, y posteriormente la muerte celular necrótica a través de la apoptosis impulsada por la mitocondria (Tavazzi, Di Pierro, Amorini, Fazzina, Tuttobene, Giardina & Lazzarino, 2000; Sebastia, Pertusa, Vilchez, Planas, Verbeek, Rodriguez-Farre & Sanfeliu, 2006; Sheline & Wei, 2006).

La metodología aplicada aquí demuestra que la oxidación de eritrocitos es un buen modelo para la oxidación de biomembranas en general, complementando los ensayos de actividad antioxidante in vitro expuestos anteriormente.

La presencia de altas concentraciones de ácidos grasos poliinsaturados en las membranas eritrocitarias, el transporte activo de oxígeno por la hemoglobina también contribuye a la susceptibilidad de los eritrocitos al estrés oxidativo (Sadrzadeh, Graf, Panter, Hallaway & Eaton, 1984). El peróxido de hidrógeno provoca la degradación del grupo hemo cuando está en contacto con la hemoglobina, liberando iones Fe, lo que podría iniciar la producción de radicales libres a través de la reacción de Fenton y consecuentemente la peroxidación de lípidos, que es un mecanismo de deterioro y posteriormente muerte celular (Bagchi, Bagchi, Stohs, Das, Ray, Kuszynski & Pruess, 2000; Nagababu, Chrest & Rifkind, 2003; Hossain, Shah, Gnanaraj & Iqbal, 2011).

Ademas, la alteración de la estructura del eritrocito derivada de la pérdida de la integridad de la membrana, puede originar diversos desórdenes no solo a nivel celular también a nivel del organismo, favoreciendo la aparición de numerosas

80 enfermedades resultantes de procesos degenerativos como el envejecimiento, el cáncer, las enfermedades cardiovasculares, la diabetes, entre otras (Çimen, 2008). El daño oxidativo a los eritrocitos, también puede estar implicado en la hemólisis que se asocia con algunas hemoglobinopatías y deficiencias en una serie de sistemas antioxidantes eritrocitarios (Ko, Hsiao & Kuo, 1997). Por lo tanto, la eliminación de peróxido de hidrógeno podría reducir estos efectos celulares y contribuir significativamente a la mejora de la salud y el bienestar.

4.7 ACTIVIDAD ANTIHIPERGLUCEMIANTE IN VITRO

Teniendo en cuenta que los polifenoles se les ha encontrado una acción importante en la inhibición de la alfa amilasa (Sosa, Tibisay & Araujo, 2002) y a los elevados contenidos de estos metabolitos en los extractos etanólicos de cáscara y semilla del fruto de P. vitifolia, en este estudio se consideró de importancia particular evaluar la inhibición de glucosa a través de una membrana de diálisis y determinar la capacidad inhibitoria de la enzima alfa amilasa, en un intento por ampliar las posibilidades de aplicación a nivel industrial o farmacológico de esta especie de Passiflora no convencional y de escaso conocimiento científico.

Un mayor acercamiento a lo propuesto en nuestro trabajo lo constituyó la investigación realizada por Büyükbalci & El (2008), quienes determinaron el efecto antidiabético, la actividad antioxidante y el contenido fenólico de algunos tés herbales. Bajo esta óptica, se tomó la determinación de aplicar dos metodologías que no sólo podrían dejar ver la funcionalidad antihiperglucemiante de los fitocomponentes de los extractos orgánicos de semilla y cáscara de P. vitifolia, sino que además permitirían ampliar las perspectivas farmacológicas de esta especie vegetal, así como también materializar los objetivos de esta investigación.

4.7.1. Inhibición de la difusión de glucosa a través de membrana de diálisis: se aplicó la técnica de tubos de diálisis como un modelo simple que mimetice el potencial de las fibras dietéticas solubles para retardar la difusión y el movimiento de la glucosa en el tracto intestinal (Adiotomre, Eastwood, Edwards & Brydon, 1990). El porcentaje de inhibición de los extractos sobre la difusión de glucosa a través de la membrana dialítica se registra en la tabla 12 y se ilustra a través de la figura 5.

Tabla 12. Porcentaje de Inhibición de difusión de glucosa a través de la membrana de diálisis. Tiempo de Porcentaje de inhibición de los extractos prueba Acetato de etilo Etanólico (h) Cáscara Semilla Cáscara Semilla 2 27,4±0,8 b 23,9±1,2 c 18,1±0,7 b 69,9±0,5 a 6 35,5±0,4 a 35,2±0,5 a 10,4±1,6 c 61,8±1,6 b 24 17,6±0,9 c 34,6±0,2 b 20,1±1,9 a 45,6±2,1 c

Letras diferentes indican diferencias significativas por cada columna (p<0.05).

Los datos consignados en la tabla evidencian que la actividad de los constituyentes de los extractos de acetato de etilo, obtenidos de cáscara o semilla, es inferior al 30% a las 2 h de experimentación, 4 h después están en su máxima capacidad (35%) y posteriormente ésta decae, aunque el extracto de semilla logra mantener su funcionalidad a las 24 de trabajo continuo (34.6%).

Por su parte, los metabolitos contenidos en el extracto etanólico de la cáscara dejan ver la acción más baja en todo el tiempo de prueba; pero, contrariamente, los componentes de la semilla en el mismo solvente se revelan como los más activos entre las muestras en el mismo período de ensayo. Cabe destacar que, independientemente del solvente extractor, los extractos de semilla mostraron mayor capacidad para impedir el paso de la glucosa a través de la membrana,

82 con resultados significativamente diferentes a los compuestos extraídos con acetato de etilo, como se muestra en la tabla 12 y lo ilustra la figura 5.

Figura 5. % inhibición de la difusión de glucosa vs tiempo (h)

Fuente: Autor

Gallagher et al. (2003), asociaron la capacidad de las plantas para inhibir la absorción de glucosa con la viscosidad de los polisacáridos solubles, sugiriendo que la acción antihiperglicémica puede deberse en parte al decrecimiento de la funcionalidad de absorción del metabolito in vivo. Estos investigadores sostienen que el modelo empleado, pese a la constante agitación aplicada, que imita el movimiento gastrointestinal, tiene limitantes asociadas al tiempo de prueba (22- 26 h) por cuanto éste momento no es directamente comparable con el espacio temporal de los mecanismos celulares de absorción de glucosa en el intestino, debido a que la glucosa es un carbohidrato que se absorbe rápidamente en el intestino delgado y tarda no más de 3 h en llegar al torrente sanguíneo (Noriega, 2004).

Los resultados encontrados con el extracto etanólico de semilla de P. vitifolia resultan promisorios, por cuanto la funcionalidad más alta (70%) se logra a las 2 h de trabajo, 24 horas después ha descendido hasta el 50%. Entonces, puede proponerse que el efecto retardante de los constituyentes de la semilla es digno de tener en cuenta, también se podría pensar que el predominio de fenoles en

83 esta parte del vegetal podría estar fuertemente comprometida con la inhibición de la difusión de glucosa a través de la membrana de diálisis en las primeras 2 h de evaluación. Consecuentemente, el consumo de productos derivados de la semilla de la planta ayudaría a disminuir la absorción de azúcares provenientes de la ingesta, lo que repercutiría en la calidad de vida del paciente hiperglucémico. Parece haber varios mecanismos posiblemente implicados asociados a las características físico-químicas de los extractos.

Para Gallagher et al. (2003), la validez del modelo se apoya, al menos en parte, en el uso de la membrana dialítica a base de goma guar. Experimentos in vitro e in vivo sugieren que, si bien la viscosidad del polisacárido se puede reducir parcialmente por su paso a través del estómago, se conserva mejor que otros tipos de gomas puesto que no es digerible en el intestino delgado; más bien, forma soluciones viscosas con el agua ingerida y las secreciones digestivas (Narayan, 2012).

También, algunos investigadores mencionan que la concentración y la masa molecular de las fibras solubles son los principales determinantes de la actividad antihiperglucemiante de la planta (Wood, Beer & Butler, 2000; Gallagher et al., 2003). Cabe mencionar que, en este trabajo, aunque los extractos se probaron a la misma concentración (10000 mg/L), no se estudió la dependencia entre esta variable y el efecto sobre la difusión de la glucosa.

En las últimas décadas, varios estudios han indicado el valor de la fibra vegetal o carbohidratos complejos, incluyendo fibras solubles altamente viscosas para el control de concentraciones de glucosa en sangre (Jenkins, Wolever, Leeds, Gassull, Haisman, Dilawari & Alberti, 1978; Edwards, Johnson & Read, 1988; Groop, Stenman, & Groop, 1993; Wood, Beer & Butler, 2000). Aunque los efectos de los diversos tipos de fibras sobre estos procesos fisiológicos no se conocen, es evidente que las acciones in vivo de ellas pueden diferir de las in vitro. Al unir agua, cationes y ácidos biliares o mediante la formación de geles que secuestran

84 mono o di-sacáridos, los alimentos que contienen fibra modifican los procesos digestivos y absortivos. Aunque los efectos de los diversos tipos de fibras sobre estos procesos fisiológicos no se conocen, la osmolaridad, el pH, la mezcla de fibras y nutrientes, la retención de agua y la presencia de bacterias influyen en la acción fisiológica de fibras específicas (Anderson & Chen, 1979; Gallagher et al., 2003).

Se ha reportado que la disminución de la difusión de glucosa hacia la solución externa puede deberse a la capacidad de atrapamiento de glucosa de los extractos (Palanuvej, Hokputsa, Tunsaringkarn & Ruangrungsi, 2009). El retraso del flujo de nutrientes en el medio externo es una indicación del efecto modulador de la fibra de los extractos sobre la absorción de glucosa en el yeyuno (Adiotomre et al., 1990). También ha sido revisada la influencia de los metabolitos secundarios en el alivio de la diabetes tipo 2 (Kelble, 2005).

En este trabajo se encontró un mayor contenido de fibra en la cáscara (11,4%) que en la semilla (2,8%). Ver Tabla 3. Sin embargo, las semillas dejaron ver casi 6 veces más constituyentes fenólicos que la cáscara (Tabla 10). Si se correlacionan estos valores con lo mostrado en la figura 5, se podría asociar la mayor actividad del extracto etanólico más a su disponibilidad fenólica que al de fibra.

Algunos autores sostienen que existe poca correspondencia entre la multiplicidad de compuestos encontrados en plantas del género Passiflora y los estudios realizados para probar la bioactividad de estas especies. No obstante, la revisión literaria permitió encontrar varios trabajos que agrupan en un todo una amplia gama de funcionalidades probadas científicamente en estos organismos vegetales, muchas de las cuales han sido sustentadas por la composición de compuestos bioactivos determinados. Estos trabajos tienen en común que las actividades han sido correlacionadas con los constituyentes fenólicos (Dhawan,

Dhawan & Sharma, 2004; Gadioli, da Cunha, de Carvalho, Costa & Pineli, 2016; Miroddi, Calapai, Navarra, Minciullo & Gangemi, 2013).

De otra parte, Büyükbalci & El (2008), afirman que algunas plantas antidiabéticas pueden ejercer su acción estimulando la función o número de células β y aumentando así la liberación de insulina. En algunas otras plantas, el efecto se debería a la disminución de la síntesis de glucosa en sangre debido a la disminución de la actividad de enzimas como la glucosa-6-fosfatasa, la fructosa 1,6-bisfosfatasa, etc. En otras, la actividad deriva de la lenta absorción de carbohidratos e inhibición del transporte de glucosa. Se adiciona que a los polifenoles se les ha encontrado acción importante en la inhibición de la alfa amilasa (Sosa, Tibisay & Araujo, 2002). Con estos antecedentes, en este estudio se consideró de importancia particular evaluar la capacidad inhibitoria de la enzima alfa amilasa.

4.7.2. Inhibición de la enzima alfa amilasa: la enzima digestiva α-amilasa constituye una familia de endo-amilasas que catalizan la hidrólisis inicial de almidón en oligosacáridos más cortos a través de la escisión de α-D-(1-4) enlaces glucosídicos. Ni los residuos terminales de glucosa ni los enlaces α-1,6 pueden escindirse por α-amilasa. Los productos finales de la acción son oligosacáridos de longitud variable con una configuración α y dextrinas α-limitadas los cuales incluyen una mezcla de maltosa, maltotriosa y oligosacáridos ramificados de 6-8 unidades de glucosa unidas mediante enlaces α-1,4 y α-1,6 (Michelle, Monteiro, Simeoni, Oliveira, Silveira D, 2012).

La ruptura enzimática de los enlaces alfa (1-4) de la maltosa libera unidades de glucosa que pueden ser absorbidas, dando como resultado incrementos en los niveles de glucosa sanguínea. El ensayo utiliza como modelo un inhibidor de la absorción de almidón puesto que éstos son capaces de bloquear la acción de la enzima, previniendo la liberación de disacáridos y su posterior absorción como glucosa (Mendoza & Loza, 2014). Bajo esta consideración, la inhibición de la α-

86 amilasa puede entonces constituirse en otra posibilidad de reducción de la hiperglicemia postprandial en condiciones diabéticas (Saravanan & Parimelazhagan, 2014). Los resultados de esta prueba se consignan en la tabla 13 y se ilustran en la figura 6.

Los extractos secos fueron resuspendidos en buffer Tris-HCl (0.05M, pH 6.9), para evitar cualquier interferencia de los solventes. La tabla evidencia que, bajo las condiciones en que se realizó este ensayo, sólo fue posible observar un porcentaje inhibitorio de la enzima alfa amilasa ligeramente superior al 50% con el extracto etanólico de semilla. Esta actividad fue comparable a la de la acarbosa utilizada como control positivo, pero sólo incrementando la concentración del extracto 8 veces (800mg/L) en relación a la del fármaco (100mg/L).

No obstante, este resultado puede considerarse bajo si se compara con los obtenidos en otras passifloras como P. nítida cuyo extracto hidroetanólico de hoja, a 130 μg/ml, inhibió 60% a la enzima (Montefusco-Pereira et al., 2013); P. ligularis hizo lo propio a través del extracto acetónico de pulpa a 125μg/ml, con una inhibición del 82.56% (Saravanan & Parimelazhagan, 2014).

Tabla 13. Porcentaje de inhibición de alfa amilasa de los extractos de P. vitifolia. Inhibición Extractos (%) Concentración Semilla Cáscara (mg/L) Acetato Etilo Etanol Acetato Etilo Etanol 100 -0,11±0,1 2,27±0,2 -8,23±0,1 -5,34±0,2 200 0,50±0,2 13,00±0,1 -9,42±0,1 -11,58±0,4 400 5,11±0,2 35,67±0,4 -17,41±0,3 -13,14±0,6 800 10,35±0,1 55,05±0,1 -21,64±0,1 -32,97±0,3 Concentración (mg/L) % inhibición Acarbosa (control positivo) 50 40,73±0,7 100 47,24±0,1 150 59,15±0,1 200 63,15±0,3

Figura 6. Inhibición de la alfa amilasa

Fuente: Autor

La acarbosa, un inhibidor de la α-glucosidasa, ha sido estudiado clínicamente en la diabetes mellitus tipo 2. Un informe reciente ha demostrado que este tratamiento se coliga con una reducción del 25% en la incidencia de este tipo de diabetes. El tratamiento reduce el pico de glicemia postprandial en un 20%. Sin embargo, las dosis formuladas van desde 150 mg/día a 300 mg/día que, de hecho, satura los sitios activos de las enzimas; dando a entender que las dosis altas no incrementan el efecto inhibidor del fármaco. Además, este producto presenta efectos adversos relacionados directamente con la dosis, los más comunes son los trastornos gastrointestinales como flatulencia, meteorismo y distensión abdominal (Akkarachiyasit, Charoenlertkul, Yibchok-anun & Adisakwattana, 2010), atribuíbles a la digestión alterada de almidón por la fuerte inhibición de la α-amilasa intestinal (Kim, Jo, Kwon & Hwang, 2011).

El papel potencial de las plantas medicinales como inhibidores de la α-amilasa ha sido revisado por varios autores (Mendoza & Loza, 2014). Se ha reportado que una variedad de plantas actividad inhibidora de la α-amilasa y por lo tanto pueden ser relevantes para el tratamiento de la diabetes tipo 2 (Padilla, Acuña, Velásquez & Rubio, 2006). En realidad, la ciencia médica utiliza diversas

88 estrategias terapéuticas para el tratamiento de la diabetes tipo 2, incluyendo la reducción de la demanda de insulina, la estimulación de la secreción de insulina endógena, el aumento de la acción de la insulina en los tejidos diana y la inhibición de la degradación de oligo y disacáridos (Funke & Melzing, 2006).

Una amplia gama de principios derivados de plantas que pertenecen a compuestos, principalmente alcaloides, glicósidos, goma de galactomanano, polisacáridos, hipoglucanos, peptidoglicanos, guanidina, esteroides, glicopéptidos y terpenoides, han demostrado bioactividad frente a la hiperglucemia (Lo Piparo, Scheib, Frei, Williamson, Grigorov & Chou, 2008) estudiaron las interacciones entre flavonoides y la α-amilasa en humanos. Estos investigadores encontraron que la capacidad inhibitoria está correlacionada con el número de grupos hidroxilo en el anillo B del esqueleto de flavonoides. La interacción se produce por la formación de enlaces de hidrógeno entre los grupos hidroxilo en la posición R6 o R7 del anillo A y la posición R4' o R5' del anillo B de los ligandos de polifenoles y los residuos catalíticos del sitio de unión, con la formación de un sistema conjugado  que estabiliza la interacción con el sitio activo (Lo Piparo et al., 2008). Este mecanismo está en concordancia con la acción propuesta para la acarbosa (Brownlee, 2005).

Parece importante recordar que la actividad de una enzima está determinada, entre otros factores, por la adaptación de su estructura terciaria (estructura nativa), que permite en forma extremadamente selectiva la unión al sustrato. Cabe aclarar que la mayoría de los polifenoles en los vegetales están presentes como ésteres, glucósidos o polímeros. Entonces, la estructura química de los polifenoles, más que su concentración, es determinante en la funcionalidad que estos evidencien (Sosa, Tibisay & Araujo, 2002).

Taninos, alcaloides y triterpenos son igualmente considerados como inhibidores de la enzima α-amilasa (Michelle, Monteiro, Simeoni, Oliveira, Silveira, 2012). Importa recordar que flavonoides, taninos, alcaloides y triterpenos hacen parte del perfil fitoquímicos de semilla y cáscara de P. vitifolia, por lo que no parece sorprendente la actividad moderada revelada de los extractos, pese a disponer de una amplia gama de compuestos con capacidad para inhibir la endo-amilasa. También se sabe que la hiperglucemia continua promueve la generación de especies reactivas del oxígeno (ROS) y estimula el estrés oxidativo. Además, el estrés oxidativo se asocia como causa remota de las complicaciones diabéticas, como nefropatías y retinopatías (Iwai, 2008). El contenido fenólico total de especies vegetales ha sido correlacionado con la actividad antioxidante (Büyükbalci & El, 2008). Los altos niveles de estos metabolitos en P. vitifolia, podrían sustentar no sólo el potencial antioxidante del extracto etanólico de semilla sino también ser la razón de la actividad de inhibición de la α-amilasa y de la difusión de glucosa a través de una membrana dialítica observada en este estudio.

Las ROS también pueden causar reticulación o fragmentación de proteínas, rupturas de ADN, peroxidación de lípidos y daño a la membrana y podrían ser responsables de algunas secuelas de la hiperglucemia. Existe una creciente evidencia que sugiere que la lesión diabética inducida por hiperglucemia modula el comportamiento biológico de las células y que esto se refleja en cambios de la proteína quinasa C relacionados con el estrés oxidativo (Montefusco-Pereira et al., 2013).

Passiflora vitifolia no mostró una composición diferente a la de sus congéneres, dejando ver amplia variabilidad de compuestos entre los que priman los fitofenoles, principalmente flavonoides (Tabla 7), ratificado a través de los contenidos fenolicos que muestran la tabla 10, del perfil de compuestos bioactivos consignado en la tabla 6 y de las bioactividades antioxidante (Tabla

10), inhibición de hemólisis (tabla 11), inhibición de la difusión de glucosa a través de la membrana de diálisis ( tabla 12) y la inhibición de la alfa amilasa (tabla 13).

4.8 ANÁLISIS DE CORRELACIÓN

Los resultados obtenidos en esta investigación se sometieron a un análisis multivariado de correlación en el paquete estadístico Statgraphics Centurion XVI.I. La Tabla 14 muestra las correlaciones producto de Pearson, entre cada par de variables. El rango de estos coeficientes de correlación va de -1 a +1, y miden la fuerza de la relación lineal entre las variables. También se indica, entre paréntesis, el número de pares de datos utilizados para calcular cada coeficiente. El tercer número en cada bloque de la tabla es un valor-P que prueba la significancia estadística de las correlaciones estimadas. Valores-P abajo de 0,05 indican correlaciones significativamente diferentes de cero, con un nivel de confianza del 95,0%. La tabla 15 resume los pares de variables con valores-P por debajo de 0,05.

De acuerdo a la Tabla 15, en los subproductos del fruto de Passiflora vitifolia (granadilla de monte) existe correlación directa, con un 95,5% de probabilidad, entre las determinaciones de la actividad antioxidante y a las correspondientes a las funcionalidad antihiperglucemiante las que, a su vez, estarían influenciadas por el contenido fenólico total o por la naturaleza química de estos fitoconstituyentes; lo cual dá soporte a las afirmaciones planteadas a lo largo de la discusión en este trabajo. En particular, ORAC y FRAP influyen en la inhibición de la difusión de glucosa e inhibición de la alfa amilasa, confirmando así las potencialidades de esta passifloracea en el tratamiento de la hiperglucemia.

Tabla 14. Correlaciones - Análisis Multivariado (Statgraphics Centurion XVI.I.) Correlaciones

ABTS DPPH Fenoles FRAP Inhibición alfa amilasa ABTS 0,8634 -0,9368 -1,0000 -0,8739

(Tamaño de muestra) (4) (4) (2) (4)

P- valor 0,1366 0,0632 0,0000 0,1261 DPPH 0,8634 -0,7760 -1,0000 -0,6787

(Tamaño de muestra) (4) (4) (2) (4)

P- valor 0,1366 0,2240 0,0000 0,3213 Fenoles -0,9368 -0,7760 1,0000 0,9874

(Tamaño de muestra) (4) (4) (2) (4)

P- valor 0,0632 0,2240 0,0000 0,0126 FRAP -1,0000 -1,0000 1,0000 1,0000

(Tamaño de muestra) (2) (2) (2) (2)

P- valor 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 Inhibición alfa amilasa -0,8739 -0,6787 0,9874 1,0000

(Tamaño de muestra) (4) (4) (4) (2)

P- valor 0,1261 0,3213 0,0126 0,0000 Inhibición difusión glucosa -0,8561 -0,5579 0,9531 1,0000 0,9739

(Tamaño de muestra) (4) (4) (4) (2) (4)

P- valor 0,1439 0,4421 0,0469 0,0000 0,0261 Inhibición hemolisis -0,6251 -0,9098 0,6294 1,0000 0,5591

(Tamaño de muestra) (4) (4) (4) (2) (4)

P- valor 0,3749 0,0902 0,3706 0,0000 0,4409 ORAC 1,0000 1,0000 -1,0000 -1,0000 -1,0000

(Tamaño de muestra) (2) (2) (2) (2) (2)

P- valor 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 Inhibición difusión glucosa -0,8561 -0,5579 0,9531 1,0000 0,9739

(Tamaño de muestra) (4) (4) (4) (2) (4)

P- valor 0,1439 0,4421 0,0469 0,0000 0,0261

Tabla 15. Pares de variables con valores- P < 0,05 Variables ABTS FRAP ABTS ORAC DPPH FRAP DPPH ORAC Fenoles FRAP Fenoles Inhibición alfa amilasa Fenoles Inhibición difusión glucosa Fenoles ORAC Fenoles Inhibición difusión glucosa FRAP Inhibición alfa amilasa FRAP Inhibición difusión glucosa FRAP Inhibición hemolisis FRAP ORAC FRAP Inhibición difusión glucosa Inhibición alfa amilasa Inhibición difusión glucosa Inhibición alfa amilasa ORAC Inhibición alfa amilasa Inhibición difusión glucosa Inhibición difusión glucosa ORAC Inhibición hemolisis ORAC ORAC Inhibición difusión glucosa

5. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS

De los resultados obtenidos se puede concluir que Passiflora vitifolia es una especie vegetal caracterizada, entre otras, por poseer flores llamativas de tonalidad escarlata, frutos ovoides de coloración verde con manchas blancas diseminadas longitudinalmente, que contienen gran cantidad de semillas las cuales conservan algunas de las características morfo-anatómicas del fruto tales como la forma y la dureza. Los fenoles son los más abundantes fitocompuestos de los subproductos del fruto, acompañados de baja cantidad de alcaloides; el mejor solvente para extraer estos constituyentes es el etanol (96%).

La actividad antiradicalaria fue mayor frente al ABTS en relación al DPPH, en tanto que la actividad antioxidante por el método ORAC fue superior que en FRAP, pero siempre mostrando a los constituyentes provenientes de la semilla como los más activos.

La bioprospección de esta especie no-convencional de Passiflora se evidenciaría por su aplicación como:

 Nutracéutico para incrementar la estabilidad y calidad de productos alimenticios, lo cual estaría respaldado por la abundante presencia de compuestos fenólicos ampliamente reconocidos por su actividad antioxidante.  Tratamiento de enfermedades del sistema circulatorio y vasculopatías diabéticas, sustentado por el contenido de rutina, tanto en cáscara como en semilla; compuesto que a su vez puede ser utilizado como quimiomarcador de la especie.  La presencia de ácido p-cumárico justificaría su uso en productos probióticos para mejorar la función intestinal. Este constituyente, al igual

que el anterior, podría ejercer la función de quimiomarcador a la hora de identificar la especie o de verificar la autenticidad de la especie.  Una opción más es el uso de P. vitifolia como aditivo en la elaboración de cosméticos no terapéuticos, respaldado por la presencia de ácido sinápico, un derivado hidroxicinámico presente en la cáscara. También esta parte del fruto contiente ácido clorogénico, lo que permite la aplicación del fruto para mejorar el metabolismo lipídico y promover la pérdida de peso mediante la reducción de la síntesis de la grasa visceral, colesterol y ácidos grasos.  Las cantidades significativas de proteína y grasa cruda en las semillas asi como la alta concentración de fibra y carbohidratos en la cáscara, hacen de esta especie un producto promisorio en la alimentación animal.  Adicionalmente, el rendimiento y elevado nivel de ácidos grasos insaturados del aceite extraído de las semillas dá valor agregado a los subproductos de este fruto por su aplicación en la industria alimentaria.  En particular, las semillas pueden aprovecharse como material crudo en varias industrias que incluyen la de alimentos, cosmetológica, farmacológica y biodiesel.  El extracto etanólico de semilla de P. vitifolia podría implementarse como suplemento dietético en la planificación alimenticia de personas con diabetes tipo 2.

Sin embargo, se necesitan más estudios que corroboren los efectos in vitro observados en este trabajo lo que representa un potencial terapéutico que podría limitar la absorcion de glucosa posprandial y mejorar así el control glucémico en pacientes con diabetes de tipo 2.

El conjunto de los resultados deja ver usos promisorios del fruto, abre posibilidades de trabajos de mayor especificidad y grado de profundidad para una especie no convencional y de limitado conocimiento científico de una Passiflora procedente de la región andina del Tolima. Este parece ser el primer

95 trabajo realizado para estudiar las características físicas, químicas y biológicas de Passiflora vitofolia en Colombia. En nuestro grupo de investigación, GIPRONUT, se continúa trabajando en este sentido.

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ANEXOS

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Anexo A. Consentimiento informado.

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Anexo B. Identificación taxonómica P. vitifolia

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