Libro De Resúmenes 37Congreso SEBBM Granada 2014

LIBRO DE RESÚMENES

Pósters XXXVII Congreso SEBBM

2 Granada 2014 Pósters

Primera edición: Septiembre 2014

Producción editorial: Rubes Editorial, S.L. Sicilia, 253 – 6º 4ª. 08025 Barcelona

3 Pósters XXXVII Congreso SEBBM Índice

Agradecimientos ...... 5

Comité organizador ...... 6

Junta Directiva de la SEBBM ...... 7

Socios protectores de la SEBBM ...... 7

Conferencias plenarias ...... 8

Simposios ...... 11

S1 Biomedicina molecular ...... 11 S2 Biotecnología de plantas y productos de valor añadido ...... 15 S3 Estructura y función de proteínas ...... 19

Pósters ...... 23

P00 II Workshop sobre la Innovación Docente en la Enseñanza de la Bioquímica y Biología Molecular ...... 24 P01 Apoptosis ...... 27 P02 Bases moleculares de la patología ...... 33 P03 Biología del desarrollo ...... 50 P04 Biología molecular computacional ...... 53 P05 Biomembranas y bioenergética ...... 55 P06 Bioquímica de la nutrición ...... 62 P07 Bioquímica perinatal ...... 66 P08 Bioquímica y biología molecular de plantas ...... 68 P09 Biotecnología molecular ...... 76 P10 Estructura y función de proteínas ...... 86 P11 Genómica y proteómica ...... 103 P12 Metabolismo del nitrógeno ...... 112 P13 Neurobiología molecular ...... 117 P14 Parasitología molecular ...... 125 P15 Radicales libres y estrés oxidativo ...... 133 P16 Regulación de la expresión génica y dinámica del genoma ...... 141 P17 Regulación metabólica ...... 149 P18 Señalización celular ...... 159 P19 Transgénesis en mamíferos ...... 173 P20 Transportadores de membrana ...... 175

4 Granada 2014 Pósters Agradecimientos

Nuestro agradecimiento a las entidades públicas y privadas que han colaborado económicamente en la realización del XXXVII Congreso de la SEBBM.

Ministerio de Economía y Competitividad Consejo Superior de Investigaciones Cientíﬁ cas (CSIC) Junta de Andalucía Universidad de Granada Parque de las Ciencias Turismo Ciudad de Granada

Fundación BBVA Fundación Lilly Fundación Ramón Areces L’Oréal – For Women in Science FEBS PABMB

Bio-Rad Canvax

BIOTOOLS Condalab Cultek Ecogen Eppendorf Gilson Izasa-Werfen Neuron Panreac Applichem Sarstedt StabVida Vitro Fisher Scientiﬁ c Sigma

5 Pósters XXXVII Congreso SEBBM Comité organizador

Presidente Carme Caelles Franch (responsable de Jóvenes de la Juan Luis Ramos (Estación Experimental del Zaidín, CSIC, SEBBM, IRB-Barcelona, Universidad de Barcelona) Granada - Abengoa Research, Sevilla) Marta Cascante Serratosa (responsable de Cónsules de la Comité ejecutivo SEBBM, Facultad de Biología, Universidad de Barcelona) Federico Mayor Menéndez (presidente de la SEBBM, Centro Crisanto Gutiérrez Armenta (tesorero de la Biología Molecular «Severo Ochoa», Universidad Autónoma SEBBM, Centro Biología Molecular «Severo Ochoa», CSIC- de Madrid) UAB, Madrid) Miguel Alaminos Mingorance (Facultad de Medicina, Almudena Porras Gallo (secretaria Cientíﬁ ca Electa de la Universidad de Granada) SEBBM, Facultad Farmacia, Universidad Complutense de Madrid) María Dolores Girón González (tesorera, Facultad de Farmacia, Universidad de Granada) Isabel Varela Nieto (secretaria Cientíﬁ ca de la SEBBM, Instituto de Investigaciones Biomédicas, CSIC-Universidad Tino Krell (Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Autónoma de Madrid) Granada) Otros miembros del Comité organizador - Comité local: Irene Díaz Moreno (responsable de Congresos y Cursos de Mª José Alejandre Pérez (Facultad de Ciencias, Universidad la SEBBM, Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, de Granada) cicCartuja, CSIC-Universidad de Sevilla) Matilde Barón Ayala (Estación Experimental del Zaidín, Miguel Ángel Navarro Carretero (Instituto de Parasitología y CSIC, Granada) Biomedicina «López-Neyra»-CSIC, Granada) Andrés Belver Cano (Estación Experimental del Zaidín, Enrique de la Rosa Cano (responsable de Grupos de la CSIC, Granada) SEBBM, Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid) Francisco Gamarro Conde (Instituto de Parasitología y Biomedicina «López-Neyra», CSIC, Granada) Joaquín Ros i Salvador (coordinador de la Comisión Asesora Juan José Lázaro Paniagua de Congresos SEBBM, Facultad de Medicina, Universidad (Estación Experimental del de Lérida) Zaidín, CSIC, Granada) Ana Linares Gil Rafael Salto González (secretario, Facultad de Farmacia, (Facultad de Ciencias, Universidad de Universidad de Granada) Granada) Eduardo López-Huertas León María Dolores Suárez Ortega (vicepresidenta, Facultad de (Estación Experimental del Farmacia, Universidad de Granada) Zaidín, CSIC, Granada)

Otros miembros del Comité organizador - Junta Directiva de Esperanza Ortega Sánchez (Facultad de Medicina, la SEBBM Universidad de Granada) Alicia Alonso Izquierdo (vicepresidenta y Responsable de Mariam Sahrawy Barragán (Estación Experimental del Relaciones Internacionales de la SEBBM, Departamento Zaidín, CSIC, Granada) de Bioquímica, Facultad de Ciencias, Universidad del País Vasco) Luisa María Sandalio González (Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Granada) Juan P. Bolaños Hernández (responsable del Portal Electrónico de la SEBBM, Instituto de Biología Funcional y Alberto M. Vargas Morales (Facultad de Farmacia, Genómica, IBFG, Universidad de Salamanca) Universidad de Granada)

6 Granada 2014 Pósters Junta directiva de la SEBBM

Presidente Enrique de la Rosa Cano (2010-2014) Federico Mayor Menéndez (2012-2016) [Grupos Cientíﬁ cos]

Vicepresidenta Juan Luis Ramos Martín (2010-2014) Alicia Alonso Izquierdo (2010-2014) [Empresa y Patrocinadores] [Relaciones exteriores y COSCE] Juan Pedro Bolaños Hernández (2012-2016) Secretaria [Página web] Isabel Varela Nieto (2010-2014) Carmen Caelles Franch [Divulgación] (2012-2016) [Jóvenes Investigadores] Tesorero Irene Díaz Moreno Crisanto Gutiérrez Armenta (2012-2016) (2012-2016) [Congresos y Cursos] Vocales Marta Cascante Serratosa Secretaria Electa (2010-2014) Almudena Porras Gallo [Cónsules] (2012-2014)

Socios protectores de la SEBBM

Los Socios protectores de la Sociedad Española de Bioquímica y Biología Molecular (SEBBM) contribuyen al progreso de la ciencia.

7 Pósters XXXVII Congreso SEBBM

Conferencias Plenarias

8 Granada 2014 Conferencias Plenarias

Conferencia inaugural Alberto Sols – sites to achieve specifi city. Two classes of sigma factors exist in bacteria. The σ70 −class includes most sigma factors and the RNAP σ70 -promoter Fundación BBVA complex can often spontaneously converts to the open complex, which is competent for transcription. In contrast, the complex between RNAP and its major variant sigma factor σ54 remains as a closed complex CP01-1 (R01-1) Selfish genes vs selfish metabolism: how which is incompetent for transcription until ATP hydrolysis-dependent remodelling by activator proteins occurs. The activator proteins, which environmental bacteria conquer the chemical space belong to the AAA+ protein family, bind remotely to the DNA sequences Víctor de Lorenzo upstream of the transcriptional starting site and contact RNAP-σ54 Centro Nacional de Biotecnología, CSIC, Madrid-Cantoblanco, ES through DNA looping. Most AAA+ activators contain three domains: a N-terminal regulatory domain, a central AAA+ domain and a C-terminal Bacteria that colonize sites polluted by industrial waste are capable of metabolizing synthetic and recalcitrant chemicals that have been in the DNA binding domain. The regulatory domain senses environmental biosphere for only a few years. This capability is orchestrated by the changes and controls the activities of the AAA+ domain while the AAA+ integration of environmental and physiological signals into regulatory domain contacts RNAP-σ54 and uses ATP binding and hydrolysis to systems that tightly control the expression of genes that are in charge of remodel the closed complex. In addition, bacteria gene transcription can degrading such molecules. The emergence of these capabilities is due not be inhibited though simple blockage of promoter sites. only to the adaptation of catabolic enzymes acting on new substrates, but Over the last few years we have used a combination of X-ray crystallography, also to the emergence of new regulators that fi rmly control the expression cryo-electron microscopy single particle analysis and functional analysis to of the genes involved in the production of catabolic enzymes. understand why RNAP-σ54 remains as a closed complex, how the AAA+ This scenario provides a good case to examine how transcriptional factors activator interacts with and induces changes in RNAP-σ54 that ultimately that respond to small molecules can adjust their specifi city to novel signals, lead to transcriptional activation and how binding and hydrolyzing ATP are the signifi cance of the effects of individual changes on overall behaviour of coupled to the activation process. I will present our results and explain why the evolving regulators and the role of other environmental and physiological RNAP-σ54 is unable to proceed to transcription, how a hexameric AAA+ circumstances in the process. Biological bottlenecks for biodegradation of protein interacts with and remodels the asymmetric RNAP-σ54-DNA using recalcitrant compounds include [i]unfavourable thermodynamics of (bio) ATP binding and hydrolysis, how these activators are organised at the chemical reactions at stake, [ii] lack of specifi city of existing pathways and enzymes for novel substrates, and [iii] physicochemical stress encountered enhancer-binding site and how their ATPase activity is controlled by both in polluted sites. Besides these limitations, bacterial cells also experience the regulatory and DNA-binding domains. In addition, I will discuss how increased endogenous oxidative stress during metabolism of aromatic oligomeric proteins interact with their DNA operators in order to achieve compounds, which is exacerbated when enzymes meet suboptimal substrates. repressive functions. Two experimental systems were employed to examine this issue. First, we studied the regulation of the TOL plasmid-encoded upper and lower operons of the soil bacterium Pseudomonas putida mt-2, a toluene and m-xylene degrader, on the background of endogenous production of reactive oxygen species (ROS) during the process. ROS-responsive dyes and fl ow cytometry helped to quantify stress Conferencia plenaria Leloir associated to each metabolic block and its relationship with redox metabolism. We also examined oxidative stress brought about by the still-evolving 2,4-dinitrotoluene biodegradative pathway in Burkholderia sp. DNT. The dnt CP03-1 (R03-1) pathway of this bacterium apparently evolved from a precursor naphthalene The brain speaks back to the ear: molecules, degradation route and the fi rst enzyme (2,4-dinitrotoluene dioxygenase) physiology and pathology of the efferent maintains some activity towards its earlier substrate [1]. Examination of both in vivo reactions and the associated regulatory system suggests that ROS olivocochlear-hair cell synapse production is the fi rst bottleneck that evolving pathways have to overcome for Ana Belén Elgoyhen dealing with novel compounds [2]. Evolutionary consequences [3] -and some hints for engineering new biocatalysts [4] will be discussed. Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular, Dr. Héctor N. Torres, CONICET, Buenos Aires, AR References In bringing information about the world to an individual, sensory [1] de las Heras, A., Chavarría, M. and de Lorenzo V. Mol Microbiol 2011; systems perform a series of common functions. Each system responds [2] Pérez-Pantoja, D., Nikel P.I., Chavarría M. and de Lorenzo, V. with some specifi city to a stimulus and each one employs some [3] de Lorenzo, V. BioEssays 2014; 36: 226-35.Phil Trans B Roy Soc specialized receptor cells at the periphery to translate specifi c stimuli 2013; 368: 20120377. into electrical signals that all neurons can use. That initial electrical event begins the process by which the central nervous system constructs an orderly representation of for example, sounds, odors, tastes and objects. Thus, basic sound detection begins when sound waves strike the eardrum, which transmits that physical stimulus to the organ of Corti Conferencia plenaria L’Oréal-UNESCO within the cochlea, the sensory epithelium of the mammalian inner ear. For Women in Science Here the primary receptor cells known as inner hair cells transform the information into electrical signals that are sent to the central nervous system by the auditory nerve. However, unlike vision, touch and the CP02-1 (R02-1) chemical senses, sound processing is modulated by efferent signals that Structures and mechanisms of bacterial travel in reverse, from the brain back to the inner ear. One fundamental transcriptional regulation via oligomeric proteins question in auditory neuroscience is what role(s) this feedback plays in our ability to hear. The presentation will overview our work over the Xiadong Zhang years which has contributed to elucidate the molecules which operate at Centre for Structural Biology, Imperial College London, Londres, UK this efferent olivocochlear-hair cell synapse, how the synapse operates Bacterial gene transcription depends on the binding of RNA polymerase to fi ne tune amplifi cation in the inner ear and the role of the efferent to a wide range of sigma factors that recognize specifi c promoter DNA system in protection from acoustic trauma.

9 Conferencias Plenarias XXXVII Congreso SEBBM

Conferencia plenaria Niemeyer - PABMB posttranscriptional regulation of gene expression. Examples will be presented that highlight the role of structural changes and conformational dynamics in the recognition of the 3’ splice site RNA during eukaryotic CP04-1 (R04-1) pre-mRNA splicing, translational regulation and RNA stability. Caveolin-1, a pleiotropic molecular switch in cancer development and progression Andrew F.Q. Quest Laboratorio de Comunicaciones Celulares, Centro de Estudios Conferencia plenaria de clausura Moleculares de la Célula (CEMC), Centro de Estudios Avanzados en Enfermedades Crónicas (ACCDiS), Programa de Biología Celular Fundación Ramón Areces y Molecular, ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de Chile, Santiago de Chile, CL CP06-1 (R06-1) Cancer is a leading cause of human suffering and death worldwide, Understanding the role of proteolysis in disease whereby most patient deaths are caused by metastatic dissemination rather than primary tumor growth. Understanding the mechanisms that favor Charles S. Craik such development is currently an area of great interest given the potential it University of California San Francisco, San Francisco, US holds for designing successful therapeutic intervention strategies. A central Virtually any biological process can be linked to a proteolytic event. With dogma in cancer research over the last decades has been that changes at the approximately 2% of the human genome encoding a protease a plethora molecular level, referred to as “gain-of-function” in oncogenes or “loss- of these enzymes exist, several of which have already been shown to play of-function” in tumor suppressor genes, contribute to the genesis of this roles in diverse physiological processes including development, innate and disease. Because it is generally thought that any given protein will belong to adaptive immunity, cell cycle regulation and apoptosis. In situations where one or the other category, but not to both, treatment strategies will in general a unidirectional signal is required, the hydrolysis of a peptide bond can terms seek to enhance tumor suppressor and block oncogene function. provide an irreversible, one-way event in a complex signaling pathway. Paradoxically, Caveolin-1 (CAV1), a member of the caveolin family of Similarly, the genomes of most other organisms ranging from viruses and scaffolding proteins, is implicated in cancer development and progression microorganisms to metazoans have 2 to 4% of their genomes dedicated to both as a tumor suppressor and promoter of metastasis. In recent years, proteases. In cases where there is a direct link between the proteolytic event research from this laboratory has sought to shed light on this enigma. Tumor and disease, signifi cant opportunities exist for therapeutic intervention. For suppression by CAV1 was linked to E-cadherin-dependent suppression of these reasons, there has been a great deal of interest in protease biology and genes, including survivin and cyclooxygenase-2, and augmented apoptosis. in dissecting the complex regulation, localization and activation of protease However, in the absence of E-cadherin, CAV1 promotes metastasis. More function. recent studies implicate CAV1 tyrosine phosphorylation and activation Identifying the actual proteases involved in physiological events, of a novel Rab5-Rac1 signaling axis in enhanced tumor cell migration, locating the natural substrates of the enzymes and selectively regulating invasion and metastasis. In the presence of E-cadherin, signaling via this their activity is of prime importance to the fi eld. This talk will focus on pathway and metastasis are suppressed. Thus, CAV1 switches roles in an a highly important subset of the large area of proteolysis to provide a E-cadherin-dependent manner. Understanding such context-dependent window into this rich area of research. Methodologies will be presented variations in protein function has important ramifi cations for our basic that allow the global activity of proteolysis to be determined in complex understanding of signal transduction processes and cancer, as well as for biological systems and permit the non invasive imaging of protease activity the development of successful strategies to treat the disease. in various disease states. These efforts to understand the mechanism of proteolysis in a biological context and in several cases, the relationship Acknowledgements: FONDECYT-FONDAP 15130011, FONDECYT between proteolysis and disease are providing insights regarding how best 1130250, ACT1111 (AFGQ). to regulate proteolysis in infectious diseease and cancer.

Conferencia plenaria FEBS National Lecture

CP05-1 (R05-1) Dynamics of protein-RNA interactions in posttranscriptional regulation of gene expression Michael Sattler Institute of Structural Biology, Helmholtz Zentrum München, Neuherberg, and Center for Integrated Protein Science Munich and Biomolecular NMR, Technische Universität München, Garching, München, DE Eukaryotic multi-domain proteins play crucial roles in the regulation of gene expression and cellular signaling. The structure of these proteins often depends on dynamic domain arrangements that are modulated by binding to RNA and/or other proteins. We employ integrated structural biology combining solution techniques such as NMR-spectroscopy and small angle scattering experiments with crystallography to study the structure and dynamics of multi-domain proteins involved in various aspects of

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Simposio 1: Biomedicina molecular

11 Simposios XXXVII Congreso SEBBM

S1.1 Enfermedades moleculares demonstration that such idea is true for most high-incidence diseases. Tackling this issue has been in fact rather diffi cult so far, since the human genome contains more than 70 GEFs that, in many cases, are coexpressed S1.1-1 (R1.1-1) in the same cell types and tissues. Due to this, it is of paramount importance Pancreatic cancer: From molecular to utilize “disease-mimetic” animal models to characterize unequivocally understanding to personalized treatment the spectrum of GEF-dependent diseases, identify the best therapeutic targets of the GEF family for specifi c high-incidence diseases or disease Manuel Hidalgo subtypes and, in addition, unveil the GEF-dependent Achilles’ heels Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas, Madrid, ES present in those diseases that can be used to devise new ways to attack Pancreatic cancer remains one of the most deadly cancers. Over the last them pharmacologically. In our lab, we are addressing the above issues few years, the genomic landscape of pancreatic cancer as well as precursor using as working model the Vav GEF subfamily. The three members of pancreatic cancer lesions have been deciphered in great depth. These studies this subfamily present in mammalian species (Vav1, Vav2, Vav3) are show that PDA develops as the consequence of accumulation of mutations in characterized by being directly regulated by phosphorylation on specifi c key oncogenes and tumour suppressor genes. The disease, once established, tyrosine residues. Due to this, these GEFs are specialized in connecting is characterized by high complexity, heterogeneity and genomic instability. stimulated upstream protein tyrosine kinases with the activation of Despite this facts, some patients harbour actionable mutations which targeting downstream Rho/Rac GTPases during both normal and pathophysiological has resulted in signifi cant clinical benefi t. Indeed, one of the most active signaling responses. To this end, we are using both standard and “second- areas of research in PDA is the development of strategies and approaches generation” genetically modifi ed mice to assess the pros and cons of the to personalize the treatment of patients. This is a complex fi eld that can be inactivation of these proteins in a number of high-incidence diseases. Using tackle from many complementary angles. Our group has been interested in this approach, we have discovered that two Vav subfamily members (Vav2 using patient derive xenogaft (PDX) models, aka Avatar mouse models, to and Vav3) play critical roles in breast and skin primary tumorigenesis, guide cancer treatment. A piece of freshly collected tumour is implanted in the metastasis of cancer cells to the lung, obesity, and obesity-linked immunodefi cient mouse models, expanded, treated with different anticancer comorbodities (i.e., metabolic syndrome, liver esteatosis, type II agents alone and in combination to select the most effective drug/regimen to diabetes). We have also discovered that the inactivation of any of those treat the patient cancer. Our data show that the approach is highly predicted two proteins also leads to negative effects in the cardiovascular system. but, because of complexity and cost issues, not widely applicable to clinical However, such collateral defects can be easily bypassed by treatments practice at the present stage. To solve some of these limitations we are working with currently available anti-hypertension therapies. Finally, the dissection on different aspects. One area is technological development to increase the take of the role of Vav proteins in these diseases has allowed us to discover rate of tumours and to speed time to engraftment and expansion time. biological programs and gene signatures that have favored the molecular Currently, these fi gures are approximately 60-80 % and 5-7 months. Studies understanding of those diseases, the identifi cation of new targets, and the are in progress to optimize this aspect. Another key question is the selection diagnosis of some of those diseases. In this talk, we will provide an overall of agents, both alone and in combination, to be tested in the model. In this view of the progress made in these areas. regard, it is important to integrate biomarker assessment in the tumour to pre-select a series of treatment candidates that can then be tested in the PDX models. To this end, we have now integrated next generation sequencing S1.1-3 (R1.1-3) and assessment of copy number variation in patient’s tumour. These studies Muerte celular, senescencia y autofagia provide us with an unbiased overview of the tumour genomic landscape. en la pérdida de audición relacionada From this data, using different bioinformatics and biological methods we con la edad: regulación por IGF-1 extract the most relevant drug targets that are then bench tested against the patient Avatar mouse model to select the most effective treatment. Isabel Varela-Nieto1, Adelaida Celaya2, Alejandro Gibaja2, Sara Another area of great interest in PDA therapeutics is the cancer Pulido2, Rocio de Iriarte2, Marta Magariños3 microenvironment. PDA is known for a fl ourish cancer stroma composed of 1Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols (CSIC-UAM), extracellular matrix and cells including infl ammatory, immune and cancer IdiPAZ y CIBERER, Madrid, ES, 2Instituto de Investigaciones associate fi broblast. Strategies aiming to eliminate the cancer stroma with Biomédicas Alberto Sols (CSIC-UAM) y CIBERER, Madrid, ES, agents such as hyaluronidase and Hh inhibitors among others have received 3Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols (CSIC-UAM), substantial attention. nabPTX, an agent proposed to target SPARC, one of Facultad de Ciencias (UAM) y CIBERER, Madrid, ES the key elements in the PDA stroma, has shown improvement in overall La defi ciencia congénita en el factor de crecimiento similar a la insulina survival and has received regulatory approval for this disease. Agents in tipo 1 (IGF-1) es una enfermedad rara humana que produce alteraciones this category will also be reviewed. severas del crecimiento y sordera neurosensorial. Este factor neurotrófi co Finally, strategies to target the cancer stem cell will be presented. es fundamental en la diferenciación postnatal tardía de la cóclea, su Laboratory studies have shown the presence of a small percentage of cells ausencia causa muerte por apoptosis de las neuronas auditivas tipo I, y in PDA tumours with stem properties. These cells can be identifi ed by otras alteraciones celulares en el receptor periférico y en las vías auditivas membrane markers and are considered to be resistant to chemotherapy and centrales. Entre los mecanismos implicados se ha descrito la activación radiotherapy. It is possible, that CSC is responsible for cancer failure after de quinasas de estrés (MAPK8/9 y 14-FoxP3) y la inhibición de rutas de defi nitive chemotherapy and radiotherapy and there is signifi cant interest supervivencia (AKT), de proliferación (MAPK1/3-FoxM1/p27Kip) y de in developing agents to selectively eliminate these cells. diferenciación celular (MEF2). El IGF-1 en la edad adulta es un protector ótico, mantiene la fi siología coclear y promueve la supervivencia de las neuronas auditivas. Durante S1.1-2 (R1.1-2) el envejecimiento, se produce senescencia neuronal, un aumento en la Assessing the therapeutic role of Vav expresión de genes de la maquinaria autofágica (Becn1, Atg4b yAtg5) y oncoproteins in high-incidence diseases en los niveles de marcadores proteicos de autofagosomas (LC3-II y p62), Xosé R. Bustelo neuroinfl amación y una disminución en los niveles de IGF-1 que progresa , Salvatore Fabbiano, Javier Robles, Luis Francisco pari pasu con la pérdida auditiva relacionada con la edad (ARHL). Lorenzo, María Barreira, Mauricio Menacho-Márquez El componente neurodegenerativo de la ARHL empeora en situaciones Centro de Investigación del Cáncer, Salamanca, ES patológicas de défi cit de IGF-1, agudizándose el fenotipo molecular, Although there is a wide consensus regarding the potential therapeutic celular y funcional, e incluso predispone al receptor auditivo a sufrir un role of Rho/Rac GDP/GTP exchange factors (GEFs), we have no formal mayor daño cuando se somete a estrés.

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En conclusión, el IGF-1 es un neuroprotector ótico que favorece la adenine-dinucleotide (NAD+) to a number of target protein substrates, supervivencia celular, mientras que su défi cit promueve procesos de leading to the alteration of chromatin associated proteins. PARP-1, the infl amación que producen un aumento del daño en la cóclea. founder member, is an active player in tumor adaptation to metastasis and PARP inhibitors, recognized as promising therapeutic agents against Este trabajo ha sido fi nanciado por los proyectos FP7-innova2 AFHELO homologous recombination defi cient tumors, have novel properties y la MCA TARGEAR. responsible for the anti-metastatic actions in different tumor settings. Poly(ADP-ribosyl)ation modulates pro-metastasic activities such as hypoxic response, angiogenesis and epythelial to mesenchymal transition (EMT). Furthermore, key transcription factors are fi ne-tuned through this action, S1.2 Señalización celular «cascadas helping to the adaptation of tumor to a hostile microenvironment, the recruitment of new vessels, and stimulate the cellular changes promoting y dianas» EMT. In this presentation we summarized some of the fi ndings that focalize on PARP-1’s action on tumor aggressiveness, suggesting new therapeutic S1.2-1 (R1.2-1) opportunities against an assembly of tumors not necessarily bearing DNA The loss of memory in Alzheimer disease repair defects. Jesús Ávila de Grado Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CSIC-UAM), Madrid, ES Memory impairment in Alzheimer disease (AD) could be related to a defect in the function of hippocampal region of an AD patient. In this region, dentate gyrus plays an important role in the formation of new memories. S1.3 Ingeniería tisular y medicina The study of neurogenesis in dentate gyrus, in mouse models for AD, has regenerativa indicated some important features that could also take place in Alzheimer disease patients. S1.3-1 (R1.3-4) BIOLAMINATION for customised, rapid tissue S1.2-2 (R1.2-2) fabrication: printer optional The role of the JNK pathway in insulin resistance Robert Brown Carme Caelles University College London. Institute of Orthopaedics & Universidad de Barcelona, Barcelona, ES Musculoskeletal Sciences, RNOH, Stanmore Campus, Londres, UK During the last decade, the c-Jun N-terminal kinase (JNK) has emerged as A quiet revolution is happening under the umbrella of tissue engineering as a major regulator of the insulin signalling and, hence, glucose homeostasis. we begin to understand that there are two distinct approaches available for By directly targeting the insulin receptor substrate (IRS)-1 and -2 for producing tissues. Not surprisingly, the approach we select has a profound serine phosphorylation, JNK inhibits insulin signalling at very early steps. effect on the technology we use. Firstly, and most familiar, is the idea of Actually, JNK is activated by insulin and acts as a negative feedback growing tissues by cultivation of cells in/on a substrate (often in bioreactors). mechanism to turn off insulin signal under physiological conditions. Secondly we can directly fabricate simple living tissues, in the same way However, abnormal JNK activation due to stress, such as oxidative or we ‘make’ cell-phones. In this case there is little or no contribution from endoplasmic reticulum stress, or pro-infl ammatory signals induces, by this the cells, though they are incorporated as one of the basic building blocks. IRS-phosphorylation dependent mechanism, insulin resistance. In fact, the Fabricating tissues directly is a concept which has entered largely from public insulin-sensitizing drugs and peroxisome-proliferator activated receptor excitement around the extension of ideas in 3D bio-printing to incorporate (PPAR) γ ligands thiazolidinediones (TZDs) restore glucose homeostasis living cells and proteins into the system. In fact 3D cell-printing is only one through inhibition of JNK, further supporting the role of this kinase as a of a family of approaches which is better termed BIO-LAMINATION, in major mediator of obesity-induced insulin resistance. In addition to the which thin layers (micron scale) of ‘proto-tissue’ are laid down in series to role of JNK in peripheral insulin-target tissues, JNK activity also regulates build up a stack and produce the gross-scale tissue. insulin action in pancreatic β-cells. In this regard, in vivo ectopic activation In fact although bio-printing provides the popular image, it is presently of JNK this cell type renders a glucose-intolerance phenotype in mice due far from the most effective example of fabrication by bio-lamination, as to the impairment of glucose- and insulin-induced insulin secretion and technical problems of cell survival and natural matrix polymerisation are gene transcription. Moreover, results form these mice demonstrate a direct complex. action of TZDs on pancreatic β-cells as TZD treatment inhibits this ectopic Other bio-lamination approaches include electro-spinning and cell and JNK activation and, thereby, restores insulin signalling and glucose- and matrix layering. Although attractive, the need for bio-printing and spinning insulin-induced secretion in pancreatic islets, and glucose tolerance in the approaches to assemble the X-, Y-, AND Z-planes simultaneously creates mice. a technical hurdle. Matrix and cell layering techniques avoid this by fi rstly mass-fabricating the X-Y plane layers, then stacking them to give the Z-plane in a separate stage. Cell-rich constructs are fabricated by expansion S1.2r-3 (R1.2-3) of cell sheets on specialised surfaces, matrix-rich X-Y layers by rapid co- Deciphering the insights of poly(ADP-ribosylation) compression of cells and matrix proteins (eg collagen). Bio-lamination in metastasis fabrication has the capacity to mass produce real tissues (cells embedded in a native extracellular matrix) in minutes. They can be mass- produced Francisco Javier Oliver Pozo reproducibly, economically, with simple or complex stacks of tissue Instituto de Parasitología y Biomedicina “López - Neyra”, CSIC, layers. They are already available for 3D tissue drug or disease screening, Granada, ES customised grafts and advanced drug delivery. But however we produce the Poly(ADP-ribose) polymerases (PARPs) are a group of DNA-dependent component laminae, they require a number of special processing features. nuclear enzymes (also named ARTD) which catalyze the synthesis and These include the need (i) to incorporate living cells INTO the fabric of transfer of negatively charged ADP-ribose moieties from nicotinamide- the matrix at time zero (so no cell-seeding stage but conditions must be

13 Simposios XXXVII Congreso SEBBM non-lethal): (ii) to fabricate the matrix primarily from a natural (eg protein) S1.3-3 (R1.3-6) fi bre network; (iii) to provide tight, monitored controls such that the layers Cardiac reverse remodelling by epigenetic ways are defi nable and reproducible when mass produced: (iv) to produce simple Susana González constructs in minutes (rather than days/weeks). Where these criteria can be met, new opportunities for high impact applications become possible. CNIC, Instituto de la Salud Carlos III, Madrid, ES The most important determinant of cardiovascular health is a person’s age. Cardiovascular disease (CVD) is a scourge of the developed world, S1.3-2 (R1.3-5) where it is the leading cause of morbidity and mortality. Despite the Tejidos artificiales. Del laboratorio a la clínica signifi cant progress on many fronts in the cardiovascular fi eld, heart failure is a particularly debilitating form of cardiovascular disease, with a 50% Antonio Campos death rate in 5 years after diagnosis [Harvey and Leinwand, 2011]. Thus, Facultad de Medicina, Universidad de Granada, Granada, ES numerous gaps in our current knowledge of cardiac aging remain to be La ingeniería tisular constituye un ámbito de investigación multidisciplinaria fi lled. The role of epigenetic circuits has been extensively studied in cardiac que, sustentada en la histología, tiene por objeto la construcción de tejidos development and inherited cardiac disease [Chang and Bruneau, 2012]. artifi ciales. Para la elaboración de los mismos, son necesarias células madre In contrast, critical non-inherited epigenetic modifi cations controlling con capacidad de proliferación y diferenciación selectiva, así como de age-associated homeostatic cardiac function in cardiovascular biomateriales de distinta naturaleza capaces de reproducir las propiedades pathophysiology remain poorly understood. Most studies of biomecánicas de los tejidos nativos. En la necesidad de articular las atherosclerosis or cardiomyopathies have been performed in young mice, propiedades biológicas de las células y las propiedades derivadas de while studies of genetic and pharmacological interventions that extend la naturaleza físico-química de los biomateriales radica el éxito de la lifespan rarely assessed whether CVD or heart function was improved ingeniería tisular y, por tanto, la construcción de un tejido artifi cial idóneo [North and Sinclair, 2012]. Given that the epigenetic Polycomb-member para la terapéutica. Un ejemplo de articulación específi ca es la construcción Bmi1 is central transcriptional instructor in adult stem cell maintenance de una córnea artifi cial en la que son necesarios biomateriales de calidad [Luis et al., 2012], but unknown cardiac implication, and regulates óptica y células diferenciadas para el revestimiento y la regulación del lifespan in mammals by targeting components of key longevity pathways transporte iónico a partir del humor acuoso. El desarrollo de la ingeniería such as p16INK4a, we have explored the possible implication of Bmi1 tisular está llamado a generar una importante actividad industrial de base in the maintenance of adult cardiac function. Using a combination nanotecnológica, al confi gurarse, además de como herramienta terapéutica, of conditional knockout models and biochemical analysis, we have como sustituto de los animales de experimentación en el contexto de la demonstrated that Bmi1 protects against dilated cardiomyopathy (DCM) legislación europea. by repressing cardiac senescence.

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Simposio 2: Biotecnología de plantas y productos de valor añadido

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S2.1 Ingeniería genética de plantas we have shown that TOC1 does not function as an activator but rather as a general repressor of oscillator gene expression. Repression occurs through TOC1 rhythmic association to the promoters of the oscillator S2.1-1 (R2.1-1) genes, demonstrating that the morning and evening oscillator loops are The creation and utility of synthetic genotypes connected through the repressing activity of TOC1. Chromatin remodeling in plants: boundaries between metabolic has also emerged as a crucial regulatory mechanism in a number of cellular processes including the circadian clock. Indeed, the circadian oscillation engineering and synthetic biology of core clock genes correlates with the sequential accumulation of Histone C. Zhu1, T. Capell1, Paul Christou2 acetylation and trimethylation. Inhibition of these marks abolishes 1Department of Plant Production and Forestry Science, ETSEA, oscillator gene expression, indicating that they are critical for gene University of Lleida-Agrotecnio Center, Lleida, ES, 2Department of activation. Increased clock-repressor binding was observed when Histone Plant Production and Forestry Science, ETSEA, University of Lleida- trimethylation was blocked, suggesting that this mark might regulate the Agrotecnio Center, Lleida, ES. Institució Catalana de Recerca i progression from activation to repression. The histone methyltransferase Estudis Avançats, Barcelona, ES SET DOMAIN GROUP 2/ARABIDOPSIS TRITHORAX RELATED 3 (SDG2/ATXR3) contributes to this regulation because oscillator gene An engineered extended ketocarotenoid pathway in rice and maize will be expression, Histone trimethylation and repressor binding are altered in used as an example to illustrate how synthetic biology principles and multi- plants mis-expressing SDG2/ATXR3. Our future research goal is to fi ll gene transfer can result in the formation of new molecular entities with the existing gap in the plant circadian fi eld by identifying other molecular useful biological properties. The creation of specialized novel sequestering determinants responsible for particular histone marks at the core of the structures facilitates the accumulation of metabolic precursors which can clock and their relevance controlling plant responses to the environment. subsequently be decorated be different ketolases and hydroxylases to produce diverse combinations of ketocarotenoids in an organ- or tissue-specifi c manner. The quantitative and qualitative carotenoid and ketocarotenoid profi les of particular transgenic lines depend on the expression of the integrated transgene complement. Thus the generation and characterization of a combinatorial transgenic population is a pre-requisite to select specifi c S2.2 Biología de sistemas y biología lines with particular chemodiversity. We will discuss the fundamental sintética mechanisms that underpin these experiments and we will highlight animal feeding trials to demonstrate the effects of diets fortifi ed with particular combinations of target metabolites on products derived from such animals. S2.2-1 (R2.2-1) Directed enzyme evolution: rational thoughts for non-rational experiments S2.1-2 (R2.1-2) Hydrogen peroxide signal transduction in plants. Miguel Alcalde Gathering the pieces Institute of Catalysis, ICP-CSIC, Cantoblanco, Madrid, ES Frank van Breusegem Over the past 20 years, directed evolution has been seen to be the most reliable approach to protein engineering. This tool that has revolutionized Ghent University, Ghent, BE the manner in which proteins are manipulated in the laboratory in order Different biotic and abiotic stresses adversely affect plant growth and to improve their application in distinct industrial settings and to engineer development leading to worldwide yield losses. A common theme complex metabolic pathways opening a research ground in synthetic biology. within these environmental factors is the perturbation of reactive oxygen By mimicking the mutation, recombination and selection processes that species (ROS) homeostasis. Despite the great economic importance, occur naturally in evolution, in vitro evolution provides a means of directing the signal transduction mechanisms of the oxidative stress response in the evolution of genes toward specifi c goals in a manner that may not occur plants are poorly understood. We conducted several genetic and chemical in a natural environment. Here, we summarize some successful examples screens, together with proteomic approaches in order to obtain a more from our laboratory to tailor ligninolytic genes (laccases, peroxidases, comprehensive overview on the different components of the network that peroxygenases) in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. This lecture govern the oxidative stress response. Theses efforts identifi ed several genes will pay special attention to the use of the DNA recombination machinery of as new members of the oxidative stress gene network in plants, together S. cerevisiae to accelerate artifi cial evolution, complementing the traditional with small molecules that are able to interfere with specifi c events during in vitro methods to generate tailor-made enzymes. the oxidative stress response in plants. The potential of these genes and molecules for providing abiotic stress References tolerance in commercially relevant plants will be assessed in the future. [1] P. Molina-Espeja, E. Garcia-Ruiz, D. Gonzalez-Perez, R. Ullrich, M. Hofrichter and M. Alcalde. Appl Environ Microb 2014, 80: 3496-507. [2] D. Gonzalez-Perez, P. Molina-Espeja, E. Garcia-Ruiz and M. Alcalde. S2.1-3 (R2.1-3) PloS ONE 2014; 9 (3): e90919. Transcriptional networks and epigenetic [3] P. Torres-Salas, D. Mate, I. Ghazi., F.J. Plou, A.O. Ballesteros and M. regulation at the core of the plant circadian clock Alcalde M. Chem Bio Chem 2013; 14: 903-8. [4] D. Mate, D. Gonzalez-Perez, M. Falk, R. Kittl, M. Pita, A.L. De Lacey, Paloma Mas R. Ludwig, S. Shleev and M. Alcalde. Chem Biol 2013; 20: 223-31. Centro de Regulación en AgriGenómica (CRAG). Consorcio CSIC- [5] D. Gonzalez-Perez, E. Garcia-Ruiz and M. Alcalde M. Bioengineered IRTA-UAB-UB, Bellaterra, Barcelona, ES 2012; 3: 1-6. The circadian clock is a biological time keeper mechanism able to regulate [6] E. Garcia-Ruiz, D. Gonzalez-Perez, F.J. Ruiz-Dueñas, A.T. Martinez biological rhythms with a period of approximately 24-hours. In many and M. Alcalde. Biochem J 2012; 441: 487-98. organisms, transcriptional and translational feedback loops underlie the [7] D. Mate, C. Garcia-Burgos, E. Garcia-Ruiz, A.O. Ballesteros, S. circadian function at the core of the clock. In Arabidopsis, the evening Camarero, and M. Alcalde. Chem Biol 2010; 17: 1030-41. oscillator component TIMING OF CAB EXPRESSION 1 (TOC1) was [8] M. Zumárraga, T. Bulter, S. Shleev, J. Polaina, A. Martinez-Arias, F.J. proposed to activate morning-expressed oscillator genes. In our studies, Plou, A. Ballesteros, and M. Alcalde. Chem Biol 2007; 14: 1052-64.

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S2.2-2 (R2.2-2) metabolic machinery. Aside from the carbon and energy stockpiling Microbial life-styles and adaptive changes function ascribed to the polymers themselves, GAPs play a critical of macromolecular synthesis physiological role in PHA metabolism and granule formation. Phasins form part of the mediation element network responsible for granule Soren Molin localization and segregation. PHA synthase and depolymerase are also Department of Systems Biology and Novo Nordisk Foundation attached to the granules, and operate a continuous metabolic cycle that Center for Biosustainability, Denmark Technical University of ensures the turnover of the accumulated polymer and plays a key role in Denmark, Lyngby, DK the maintenance of metabolism homeostasis. Bacteria belonging to the genus Pseudomonas posses a broad metabolic PHAs, traditionally considered bacterial reservoirs of carbon and energy, repertoire, which allows them to grow in a wide variety of environments. are now recognized as having many physiological roles. In P. putida, PHA This versatile potential for growth and persistence is refl ected in the large production ensures a more robust metabolism and improves bacterial genome sizes in Pseudomonas bacteria and in a parallel large number of fi tness. Acting as a futile cycle, PHA metabolism balances the storage vs. regulatory genes. Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen spillage equilibrium of both carbon and energy, thus determining cell size living in the environment, and under some conditions it has the capacity and morphology. PHA metabolism is controlled by the network of local to colonize humans, where it may develop life long persistent infections. and global regulators controlling the pathways involved in carbon and Moving from the outer environment to a human environment constitutes nitrogen assimilation. a signifi cant change of living conditions challenging the regulatory and PHAs are valuable nutrients for producer strains, but since they can be metabolic repertoire of the bacteria. extracellularly degraded they are also useful to the wider microbial In patients suffering from the genetic disorder cystic fi brosis (CF) P. community.The predation of PHA- producers by bacterial predators aeruginosa frequently develops persistent infections of the airways, and such as B.dellovibrio bacteriovorus has an important effect on microbial over periods of thousands of bacterial generations mutations accumulate in population dynamics since PHA granules and free HA oligomers are the bacterial populations, which gradually increase the persistence fi tness released into the environment. These can be then incorporated into the resulting in severe chronic lung infections. In a large study of more than 40 microbial metabolism of not-necessarily accumulating/degrading strains, young CF patients we have investigated the evolutionary dynamics of more enhancing their biological fi tness. than 50 different strains of P. aeruginosa, from which we have sequenced The system-wide nature of PHA metabolism makes it a real challenge to more than 600 genomes covering airway residence times from 1-10 years. design PHA-producing bacteria using synthetic biology strategies. One of the striking observations made from this investigation is that adaptive mutations in genes encoding global regulatory proteins, including RNA polymerase associated sigma factors, are very frequent in CF isolates obtained from patients with early stage P. aeruginosa airway infections. We are currently studying the relationship between the phenotypes associated S2.3 Hispano-Mexicano with some of these regulatory mutations and the microbial life-style in CF airways, and examples of such relationships will be presented. It will be S2.3-1 (R2.3-0) documented how specifi c mutations in regulatory genes may switch the Biotecnología de anticuerpos: mejora y desarrollo phenotype from one typical life-style to another more compatible with the novel environment. It is hypothesized that this pattern of mutational de nuevos antivenenos changes observed in infecting bacterial populations may represent bacterial Alejandro Alagón Cano adaptive evolution in many other scenarios, where bacteria move from one Instituto de Biotecnología, Universidad Nacional Autonóma de environment to another. México, México DF, MX

S2.2-3 (R2.2-3) The polyhydroxyalkanoate systems metabolism; S2.3-2 (R2.3-1) Structure and function of bacterial much more than a bioplastic production fructosyltransferases: fructans in traditional María A. Prieto mexican fermentation products Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid, ES Agustín López-Munguía Polyhydroxyalkanoate (PHA) are one of the current alternatives to petroleum-based plastics. From an industrial standpoint, PHAs are Instituto de Biotecnología, UNAM, Cuernavaca, MX attracting extensive interest as technical-grade polymers due to their Fructansucrases (GH68) are enzymes that catalyze the transfer of the singular set of properties: (i) substitution potential for industrial fructosyl unit of sucrose to a growing fructan polymer. Depending on the thermoplastics such as polypropylene, polyethylene, polyvinylchloride chemical nature of the resulting fructosidic bond, these enzymes may be and polyethylene terephthalate, (ii) biodegradability both in aerobic and classifi ed as levansucrases (LS) when the resulting polymer (levan) is anaerobic conditions, including aquatic environments, (iii) biobased, linked through β (2→6) bonds or inulosucrases (IS) when β (2→1) linked renewable origin, (iv) biocompatibility with cells and tissues and (vi) fructosyl units are formed in the main chain (inulin). We fi rst reported the structural diversity. unusual mosaic structure of inulosucrase (IslA) in Leuconostoc citreum The physiology of PHA production has aroused much interest since the CW28, a strain isolated from Pozol, a corn traditional lactic fermentation ability to accumulate these compounds is widespread among bacteria product traditionally consumed in the south of México. IslA, which is and PHA metabolism infl uences many cell activities. This is of particular highly specifi c for inulin synthesis, has a b-propeller catalytic domain interest with respect to model bacterial strains such as Pseudomonas putida with high identity to SacB, the levansucrase from Bacillus subtilis. KT2440, an outstanding candidate for the development of microbial chassis However, IslA also bears additional domains in both, the amino and with specialized phenotypes. The use of cutting-edge technologies such carboxyl terminal regions, domains already described in glucansucrases as transcriptomics, proteomics and metabolic fl ux analyses has improved from lactic acid bacteria. Glucansucrases are enzymes that carry out the our understanding of the interplay between PHA metabolism, which is synthesis of glucans from sucrose, in an analogous mechanism. The same extremely context-dependent, and other cell functions. structural features found in IslA were later identifi ed and characterized in PHA granules represent supramolecular complexes that carry granule several bacterial strains, including the industrial dextran producing strain associated proteins (GAPs), essential protein components of the PHA (Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F) as well as in the sequenced

17 Simposios XXXVII Congreso SEBBM genome of Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ATCC 8293. resulted in a variety of genetic disorders providing a constant source of Both glucans and fructans are present in pulque, a traditional fermentation human genetic diversity. L1 might ensure its evolutionary transmission to product that dates back to the Mesoamerican culture. Pulque is obtained new generations through the accumulation of new insertions during early from aguamiel, a sap extracted from various agave species. embryonic development or in germ cells. Thus, L1 insertions can act as In this conference several aspects related with the structural properties mutagens in the embryonic phase. In fact, endogenous L1s are expressed of these glycosyltransferases, are described, as well as their role in the in Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and human induced pluripotent traditional Mexican fermented products and their potential applications in stem cells (hiPSCs). Additionally, others and we have shown that engineered fructan synthesis. human L1s can retrotranspose in hESCs and iPSCs at a low level. In sum, these data reveal that both hESCs and hiPSCs are an excellent model to study S2.3-3 (R2.3-2) LINE-1 accumulation and its genomic impact in humans. LINE-1 retrotransposition in Fanconi anemia On the other hand, it is well established that L1 retrotransposition occurs patients by a mechanism known as target site-primed reverse transcription (TPRT), which requires both the L1-encoded endonuclease and reverse transcriptase José Luis García Pérez activities. However, it has been reported that L1 can mobilize through an GENYO-University of Granada, Granada, ES endonuclease-independent pathway (ENi), in which the element inserts at It is becoming increasingly evident that Long Interspersed Element-1 sites of DNA disrepair. Notably, recent data from our lab has demonstrated (LINE-1 or L1) retrotransposons have played an important role in shaping that the mobilization of L1 is de-regulated in Fanconi Anemia (FA) the structure and function of mammalian genomes. L1s are members of patients, including the ENi pathway. FA is a rare disease characterized the non-long-terminal-repeat (non-LTR) retrotransposon family, which are by infant mortality and genomic instability, suggesting that de-regulated widely spread in the human genome. New L1 mobilization events have LINE-1 retrotransposition may affect genomic ﬂ uidity in FA patients.

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Simposio 3: Estructura y función de proteínas

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S3.1 Receptores y proteínas de las membranas. Los sustratos conocidos son estructuralmente diversos, encontrando entre ellos lípidos y fármacos. En el parásito Leishmania, de membrana responsable de la segunda enfermedad parasitaria en importancia conocida como leishmaniasis, existen 42 genes de la familia ABC. Hemos caracterizado un nuevo transportador ABC de Leishmania, denominado S3.1-1 (R3.1-1) ABCG2 implicado en el proceso de infección. Los análisis realizados con Transportadores heteroméricos de aminoácidos: parásitos que expresan una versión inactiva del transportador (DN) o con hacia su estructura atómica parásitos mutantes nulos para ABCG2 mostraron que este transportador es necesario para la exposición de fosfatidilserina (PS) en la cara externa de 1 1 1 1 Albert Rosell , Lukasz Kowalczyk , Joana Fort , Ekaitz Errasti , la membrana plasmática del parásito. Este fenotipo se correlacionó con una 1 1 2 Paola Bartoccioni , Elena Alvarez-Marimon , Meritxell Costa , defi ciente capacidad de infectar macrófagos peritoneales. Se ha descrito 3 1 4 Marcel Meury , Guillem Portella , Laura Pérez , Arturo Rodríguez- que la exposición transitoria de PS en la superfi cie del parásito es necesaria 1 1 5 6 Banqueri , Ana Obando , Antonio Zorzano , Modesto Orozco , para el proceso de infección celular. Además, los estudios de infección 7 8 4 Xavier Carpena , José Luis Vázquez-Ibar , Juan Fernández-Recio , en un modelo experimental de leishmaniasis cutánea mostraron que los 4 7 Manuel Palacín9 Dimitrios Fotiadis , Ignacio Fita , animales infectados con parásitos DN no desarrollaban ninguna lesión, 1 2 IRB Barcelona, Barcelona, ES, IRB Barcelona y Swiss National mostrando una infl amación y carga parasitaria más baja que los animales Centre of Competence in Research TransCure, University of infectados con los parásitos control. Todos estos resultados evidencian 3 Bern, Bern, CH, Swiss National Centre of Competence in la implicación del transportador ABCG2 en la exposición de PS en la 4 Research TransCure, University of Bern, Bern, CH, Barcelona membrana del parásito, en la infección y virulencia de Leishmania. Supercomputing Center, Barcelona, ES, 5IRB Barcelona y Universidad de Barcelona, Barcelona, ES, 6IRB Barcelona, Barcelona Supercomputing Center y Universidad de Barcelona, S3.1-3 (R3.1-3) Barcelona, ES, 7Department of Structural Biology, Instituto de Transferencia de electrones entre proteínas: Biología Molecular de Barcelona (IBMB-CSIC), Barcelona, ES, 8IRB Barcelona y Institute of Biology and Technology Saclay (iBiTec-S), de la cinética a la molécula única 9 Gif-sur-Yvette Cedex, FR, IRB Barcelona, Universidad de Barcelona Carlos Gómez-Moreno1, Carlos Marcuello2, Rocio de Miguel3, Marta y CIBERER, Barcelona, ES Martínez Júlvez4, Anabel G Lostao5 Los transportadores heteroméricos de aminoácidos (HAT) son el único 1Universidad de Zaragoza, Zaragoza, ES, 2Instituto de Nanociencia ejemplo conocido de transportadores de solutos constituidos por dos de Aragón Universidad de Zaragoza, Zaragoza, ES, 3CEA, Paris, subunidades unidas por un puente disulfuro. En metazoos, la subunidad FR, 4BIFI. Universidad de Zaragoza, Zaragoza, ES,5Instituto pesada es responsable del tráfi co del heterodímero a la membrana de Nanociencia de Aragón/ Fundación ARAID, Universidad de plasmática mientras que la subunidad ligera es el transportador. Los Zaragoza, Zaragoza, ES HAT están involucrados en patologías como aminoacidurias, cáncer, El proceso de transferencia de electrones entre proteínas constituye la infección viral y adicción a cocaína. En los últimos siete años se ha base de muchas reacciones que son fundamentales para los seres vivos. La incrementado el conocimiento estructural de estos transportadores de fotosíntesis, la respiración, la fi jación de nitrógeno, la desaturación de los forma notable. El ectodominio de la subunidad pesada humana 4F2hc ácidos grasos, etc., son ejemplos representativos. En ellos, las proteínas que (4F2hc-ED) se ha resuelto a 2.1Å revelando homología estructural con intercambian electrones deben interaccionar durante un muy breve espacio amilasas bacterianas. 4F2hc-ED adolece de los residuos catalíticos clave de tiempo para que el electrón/es pase(n) de una proteína a la otra. Durante pero mantiene la hendidura catalítica para la que no se conocen ligandos. más de 25 años nuestro grupo ha investigado el mecanismo mediante el cual Homólogos bacterianos con baja identidad de secuencia (<20% con las se produce el reconocimiento entre las proteínas que deben interaccionar. subunidades ligeras como el intercambiador arginina/agmatina AdiC El trabajo se ha centrado en el estudio de la enzima Ferredoxina NADP+ de E. coli) han sido resueltos a 3.0 Å y revelan un plegamiento de tipo reductasa, que interviene en la producción de NADPH en la fotosíntesis LeuT, característico de varias familias de transportadores de solutos. La y sus proteínas complementarias, la Ferredoxina (Fd) y la Flavodoxina expresión del heterodímero 4F2hc/LAT2 humano en Pichia ha permitido (Fld), todas ellas de la cianobacteria Anabaena PCC 7119. Técnicas obtener el primer modelo a baja resolución de un HAT (21 Å) por tinción cinéticas, tanto en estado estacionario como preestacionario (inducida por negativa, análisis por docking y confi rmación por entrecruzamiento de láser y de fl ujo interrumpido) junto con el empleo de muestras mutadas residuos de cisteina. Este modelo ha revelado por primera vez la posición en posiciones concretas han permitido concluir que la interacción seinicia relativa de 4F2hc-ED sobre la subunidad ligera, ofreciendo una explicación mediante la orientación de las superfi cies de reconocimiento por atracción estructural de la estabilización del complejo. Se presentarán las estrategias electrostática seguida por una reorganización de ambas moléculas mediante que estamos siguiendo para resolver la estructura atómica de homólogos interacciones hidrofóbicas. bacterianos más robustos y de HAT eucariotas. Estas estructuras facilitarán La cristalización y resolución de la estructura del complejo entre la FNR la comprensión del papel de 4F2hc en la actividad del transportador y la Fd de Anabaena han ratifi cado nuestra propuesta al determinar que asociado y la conexión funcional con integrinas. los grupos propuestos para la interacción están próximos en el complejo y que los centros redox se encuentran a distancias que son compatibles con la reacción. S3.1-2 (R3.1-2) Recientemente hemos iniciado una línea de trabajo que se apoya en el uso Implicación del transportador ABCG2 en la de la Microscopía de Fuerzas Atómicas (AFM) para estudiar el proceso infección por el parásito Leishmania de interacción desde el punto de vista de la molécula individual. La razón Francisco Gamarro de esta decisión está en la esperanza de que la observación directa de las , David León-Guerrero, Jenny Campos-Salinas, moléculas que interaccionan permita mostrar detalles del proceso que no José Ignacio Manzano, Elena González-Rey, Mario Delgado, José son asequibles mediante el estudio del conjunto de los componentes de la María Pérez-Victoria, Santiago Castanys reacción. Instituto de Parasitología y Biomedicina “López - Neyra”, CSIC, Se ha desarrollado una estrategia que permite inmovilizar las proteínas Granada, ES con la orientación adecuada para que se produzca la interacción con Las proteínas ABC (ATP-binding cassette) constituyen una de las mayores su pareja y medir la efi ciencia del proceso de acercamiento así como familias a lo largo de toda la escala biológica, desempeñando una gran la magnitud de la fuerza ejercida. Los resultados de la medida de las diversidad de funciones, entre otras el transporte activo de moléculas a través fuerzas intermoleculares de los complejos transitorios entre las proteínas

20 Granada 2014 Simposios implicadas en la transferencia de electrones se interpretan de acuerdo S3.2-3 (R3.2-3) con el modelo propuesto anteriormente que indicaba que la interacción NETs – from infection to autoimmunity FNR:Fd es más fuerte y específi ca que la que se presenta en la FNR:Fld. Arturo Zychlinski Las mayores fuerzas de ruptura medidas entre la FNR y la Fd frente a las Max Planck Institute for Infection Biology, Berlín, DE obtenidas entre la FNR y la Fld indican la mayor mecanoestabilidad del complejo entre la FNR y su pareja natural la Fd. Neutrophils are one of the fi rst lines of defence of the immune system agains tmicrobes. These cells kill microorganisms effectively by phagocytosis and by the formation of extracellular structures, called Neutrophil Extracellular Traps (NETs). NETs are made of chromatin and specifi c neutrophil proteins and are released after a unique cell death program that requires the production ofradical oxygen species (ROS) and the relocation of neutrophil S3.2 Macromoléculas en la enfermedad elastase to the nucleus. NETs help limit and control infection and also can y vacunas activate the acquired immune system. Thus, formation of NETs appears to be necessary for an effi cient clearing of microbes but can also initiate and exacerbate autoimmune responses. S3.2-1 (R3.2-1) Vacunas contra enfermedades prevalentes Mariano Esteban Centro Nacional de Biotecnología, CSIC, Madrid, ES S3.3 Interacción proteína/proteína La vacunación es la estrategia más efectiva y menos cara para controlar y erradicar las enfermedades humanas. Muchas enfermedades han sido y complejos multiproteicos controladas mediante vacunación, pero hay otras para las que no hay vacunas disponibles. Anualmente cerca de 2 millones (M) de personas mueren a S3.3-1 (R3.3-1) causa del virus de la inmunodefi ciencia humana (VIH), cerca de 3M de Structural characterisation of the chaperone tuberculosis, 700.000 de malaria, más de 7M por cáncer, 12M están infectadas de leishmania y 170M con hepatitis C (HCV). Además, enfermedades en Hsp70 folding network personas de avanzada edad, como Alzheimer y Parkinson, sin tratamientos José María Valpuesta efectivos disponibles, están siendo abordadas mediante vacunación. Las Centro Nacional de Biotecnología, CSIC, Colmenar Viejo, Madrid, ES difi cultades en el desarrollo de vacunas se deben al desconocimiento de la patología del microorganismo, diseño del inmunógeno, protocolos de The 70 kDa heat shock proteins (Hsp70s) form a family of highly inmunización, y a la defi nición de la correlación inmune de protección. Con conserved molecular chaperones present in all domains of life and in most los nuevos avances tecnológicos derivados de la biología de sistemas y las subcellular compartments of eukaryotic cells. Hsp70s, acting in concert aproximaciones inmunológicas, el enfoque de las vacunas ha cambiado. with J Hsp40s and nucleotide exchange factors (NEFs) assist a multitude of Nuestro grupo se embarcó hace varios años en el desarrollo de vacunas para different cellular protein-folding processes during protein maturation and enfermedades para las que no hay vacunas, utilizando vectores poxvirales. quality surveillance [1,2]. Besides, Hsp70s can interact with other major chaperones like Hsp90s, Hsp110s and CCT [3-6], in some cases via other De las lecciones aprendidas de la biología del vector poxviral virus vaccinia co-chaperones, which act as physical linkers. modifi cado de Ankara (MVA) y de los estudios en el desarrollo de vacunas, We have been working over the last years in characterizing, using mostly hemos generado y patentado varios candidatos vacunales contra VIH/SIDA, electron microscopy and image processing, the interaction of Hsp70s with hepatitis C (HCV), chikungunya, malaria, leishmania, cáncer de próstata, some of these chaperones and co-chaperones in an effort to understand the y algunos han entrado en ensayos clínicos, como con VIH. De hecho, interactions that take place between these proteins, that act in coordination, hemos producido un candidato vacunal para VIH-1 (MVA-B) que ha sido forming part of an assembly line, to make the protein folding process a utilizado en dos ensayos clínicos de fase I en España, con buenos resultados more effi cient one. inmunológicos. En la conferencia, presentaremos la descripción de vectores atenuados de poxvirus, interacción con el hospedador, preclínica y clínica References frente a modelo de patógenos y estado de vacunas. [1] Kampinga, H.H., and Craig, E.A. The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specifi city. Nat Rev Mol Cell Biol 2010; 11: 579-92. S3.2-2 (R3.2-2) dUTPases, the unexplored family of signalling [2] Hartl, F.U., Bracher, A., and Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature 2011; 475: 324-32. molecules [3] Schuermann, J.P., Jiang, J., Cuéllar, J., Llorca, O. Wang, L., Taylor, A.B., Demeler, B.,Morano, K., Hart, P.J., Valpuesta, J.M., Lafer, E.M. and José R. Penadés1, Alberto Marina2 Sousa, R. Structure of the Hsp110:Hsc70 Nucleotide Exchange Complex. 1Institute of Infection Immunity and Infl ammation, Universidad de Mol Cell 2008; 31: 232-43. Glasgow, Glasgow, UK, 2Instituto de Biomedicina de Valencia (IBV- [4] Cuéllar, J., Martín-Benito, J, Scheres, S.H.W., Sousa, R., Moro, F. CSIC), Valencia, ES López-Viñas, E., Gómez-Puertas, P., Muga, A, Carrascosa, J.L. and Deciphering the molecular mechanisms that control relevant cellular Valpuesta, J.M. The structure of a CCT:Hsc70NBD complex suggests a processes is of utmost importance to understand how viruses, prokaryotic mechanism for Hsp70 delivery of substrates to the chaperonin. Nat Struct and eukaryotic cells work. The diversity of living organisms suggests that Mol Biol 2008; 15: 858-64. there are novel regulators still to be discovered, which may uncover new [5] Cuéllar, J., Perales-Calvo, J.,Muga, A., Valpuesta, J.M. and Moro, F. regulatory paradigms. dUTPases (Duts) are assumed to be ubiquitous Structural insights into the chaperone activity of the 40 kDa heat shock enzymes regulating cellular dUTP levels to prevent misincorporation of protein DnaJ. Binding and remodeling of a native substrate. J Biol Chem uracil into DNA. Recently however, Duts have been involved in the control 2013; 288: 15065-74. of several relevant cellular processes, including transfer of mobile genetic [6] Lorenz, O.R., Freiburger, LRutz, , D.A., Krause, M., Zierer, B.K. elements, regulation of the immune system, autoimmunity or apoptosis, Alvira, S. Cuéllar, J., Valpuesta, J.M, Madl, T., Sattler, M, and Buchner, J. suggesting that they perform regulatory functions. This talk aims at Modulation of the Hsp90 chaperone cycle by a stringent client protein. Mol investigating the unexplored impact of Duts as novel signalling molecules. Cell 2014; 53: 941-53.

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S3.3-2 (R3.3-2) [5] Otero A, Rodriguez de la Vega M, Tanco S, Lorenzo J, Aviles FX, Descubriendo interacciones entre enzimas Reverter D: FASEB J 2012; 26: 3754-64. proteolíticas, sus inhibidores y ligandos proteicos [6] Yanes O, Villanueva J, Querol E, Aviles FX: Nature Protoc 2007; 2: por MS-proteómica funcional 119-130. // Sanglas L et al.: PNAS 2009; 106: 1743-47. [7] Morell M, Czihal P, Otvos L, Aviles FX, Ventura S: Proteomics 2008; Francesc Xavier Avilés1, G. Covaleda1, S. Tanco1, O. Tort1, A. Otero1, 8: 3433-42. J. Vendrell1, J. Lorenzo1, M. Alonso del Ribero2, M.A. Chávez2 [8] Van Damme P, et al., Aviles FX, Gevaert K: Nature Meth 2010; 7: 512- 1Instituto de Biotecnología y de Biomedicina y Dpto. de Bioquímica, 5. Universitat Autònoma de Barcelona, Bellaterra, Barcelona, ES, 2Centro de [9] Tanco S, Lorenzo J, Garcia-Pardo J, Degroeve S, Martens L, Aviles FX, Estudios de Proteínas, Facultad de Biología, Universidad de La Habana, Gevaert K, Van Damme P: Mol Cell Proteom 2013; 12: 2096-110. La Habana, CU [10] Alonso del Rivero M, Reytor ML, Trejo SA, Chávez MA, Avilés FX, Actualmente se tiende hacia una visión integrada de las enzimas proteolíticas Reverter D: Structure 2013; 21: 1118-26. (proteasas) y acompañantes moleculares in vivo, especialmente en el contexto genómico-proteómico-interactómico. Ello también se da en unas de sus variantes más frecuentes como son las metaloproteasas y, dentro de S3.3-3 (R3.3-3) ellas, en las metalocarboxipeptidasas (MCP). El fuerte incremento en el Force generation by FtsZ bacterial cytoskeletal número de MCP detectadas en la última década pone en evidencia de que protein: what we have learned from single aún no se comprende su acción simultánea o específi ca sobre sustratos, extensible a sus restricciones por ligandos e inhibidores naturales. El hecho filament analysis de que tales sustratos, y sus efectores, sean frecuentemente de naturaleza Marisela Vélez proteica, añade grados adicionales de sofi sticación a estas interacciones ICP, CSIC, Madrid, ES (p.e. a niveles químico-físicos, de capacidad de discriminación y cinéticos), FtsZ is a bacterial cytoskeletal protein that polymerizes on the inner surface así como en la modulación de actividades y especifi cidades que promueven [1-3]. of the bacterial membrane and contributes to generate the force needed Hoy en día podemos evaluar en cerca de 30, el número de variantes for cell division. In the presence of GTP the individual protein monomers de dichas enzimas MCP, clasifi cadas entre formas M14A, B y C, y las interact longitudinally to form fi laments that can then aggregate to form recientemente emergentes formas citosólicas (tipo CCP) para la subfamilia higher order structures on the membrane surface. These fi lament aggregates M14D [4,5]. Dado que todas ellas parecen conservar el dominio “canónico” are dynamic and exchange monomers from the solution. The fi nal outcome de metalocarboxipeptidasa y los sitios de reconocimiento equivalentes, of this dynamic rearrangement on the surface is the generation of force that es un desafío real la comprensión de la relación compleja entre ellas, su bends the cell membrane inward. interacción discriminativa con sustratos naturales (peptídicos o proteicos, The rich self-assembling behavior of the protein is reproduced in vitro dado que son proteasas), y con los inhibidores proteicos ambientales. on supported lipid membranes using isolated proteins. Reversible GTP- También lo es para diseñadores de fármacos la generación de ligandos que induced polymerization observed with Atomic Force Microscopy (AFM) específi camente las controlen [2]. showed that the type of attachment to the surface and the type of lipid Las MCP, como otras proteasas, tienen otra propiedad característica present on the membrane determine the shape of the fi lament aggregates interactómica: actúan de forma transiente sobre sustratos proteicos, observed. promoviendo cortes sobre ellos que afectan fuertemente su conformación The detailed structural and dynamic information obtained with the AFM y funcionalidad. Cómo detectar dichas interacciones transientes no suele has allowed comparing the experimental results with theoretical models ser una tarea fácil, aunque factible [6-8]. También se suele desconocer el that describe the polymerization in terms of a simple set of monomer- papel que juegan en la naturaleza numerosos inhibidores proteicos de ellas, monomer interactions. Experimental results controlling the orientation que se encuentran en sistemas biológicos muy diversos. Se discutirá casos of the monomers on the surface, together with molecular dynamics recientes de descubrimiento de dichos inhibidores y/o ligandos-sustratos, y simulations and theoretical models have revealed that fi lament curvature, de estrategias proteómicas e interactómicas, basadas en espectrometría de twist, orientation and the strength of the surface attachment are all masas, así como de biología estructural seguidas para su identifi cación y important for determining the amount of force that the fi laments can exert caracterización [3,6,8-10]. También, si cabe, se presentarán datos de Maldi- on the surface. MS-Imagen (MS-imagen de tejidos) para alguna de dichas biomoléculas. References Bibliografía Mateos-Gil , P.; Paez ,A.; Hörger, I, Rivas, G.; Vicente, M.; Tarazona, P. [1] Arolas, JL, Vendrell, J, Avilés, FX, Fricker LD: Curr Pharm Des 2007; and Vélez, M. “Depolymerization dynamics of individual fi laments of 13: 349-66. bacterial cytoskeletal protein FtsZ”. PNAS 2012; 109 (21): 8133 8. [2] Fernandez D, Pallares I, Vendrell J, Aviles FX: Biochimie 2010; 92: González de Prado Salas, P., Encinar, M., Vélez, M. and Tarazona, P. 1484-500. // Fernandez D, Pallares I, Covaleda G, Vendrell J, Aviles FX: “FtsZ protein on bilayer membranes: effects of specifi c lateral bonds“. Soft Curr Med Chem 2013; 20: 1595-608. Matter 2013; 9: 6072. [3] Covaleda G, Alonso-del-Rivero MA, Chávez MA, Avilés FX, Reverter Encinar, M.; Kralicek, A.; Martos, A.; Krupka, M.; Alonso, A.; Cid, Sa.; D: J Biol Chem 2012; 287: 9250-8. Rico, A.; Jiménez, M.; Vélez, M. “Polymorphism of FtsZ fi laments on lipid [4] Rodriguez de la Vega M, Sevilla RG, Hermoso A, Lorenzo J, Tanco S, surfaces: role of monomer orientation”. Langmuir 2013; 29: 9436-46. Diez A, Fricker Ll D, Bautista JM, Aviles FX: FASEB J 2007; 20: 851-65. González de Prado Salas, P., Hörger, I., Martín-García, F., Jesús Mendieta, // Rodriguez de la Vega M, Lorenzo J, Aviles FX, Bautista JM: FASEB J Alvaro, A., Encinar, M., Gómez-Puertas, P., Vélez, M., and Tarazona, P. 2013; 27: 424-31. “Torsion and curvature of FtsZ”. Soft Matter 2014; 10: 1977-86.

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P00. II Workshop sobre la Innovación de numerosas iniciativas estudiantiles para la enseñanza-aprendizaje del metabolismo perfectamente exportables a otros ámbitos de la docencia Docente en la Enseñanza de la universitaria. En este marco de referencia se encuadra La bicicleta de Bioquímica y la Biología Molecular Krebs, una iniciativa alentada por los cinco alumnos que fi rman esta comunicación y que consiguió la activa participación de más de la mitad de los alumnos inscritos en el curso 2012-13 (que fue el que contó con mayor P00-1 (R00-2) número de matriculados en la asignatura). En palabras de los promotores Ciencia para Todos. Una experiencia para de esta iniciativa: “¿Quién no ha pensado alguna vez: “¡Qué aburrimiento aprender divulgando de clase!”? ¿No habrá algún modo de aprender esto de una forma más amena y divertida? Aunque a veces nos hagan creer que no, sí que la hay”. Pilar Roca, J. Oliver, A. Valle La bicicleta de Krebs es un buen ejemplo de que hay respuestas positivas Grupo Multidisciplinar de Oncología Traslacional. IUNICS. a esta última pregunta. Una respuesta, además, que en este caso ha sido Universitat de les Illes Balears, Palma de Mallorca, ES encontrada, creada, desarrollada y llevada a cabo por los propios alumnos. Entre las competencias genéricas que debemos evaluar los profesores de grados de Ciencias está la trasmisión de información, ideas, problemas y soluciones a público especializado y no especializado. Un grupo de P00-3 (R00-5) profesores de la UIB nos planteamos trabajar esta competencia en nuestras Hacia un enfoque evolutivo en la enseñanza asignaturas, por lo que pensamos en desarrollar un encuentro entre jóvenes de la Bioquímica universitarios y estudiantes de primaria, secundaria y bachillerato, de esta Juan Antonio Aguilera Mochón manera nació CIENCIA PARA TODOS. La experiencia tenía un doble objetivo: fomentar las vocaciones científi cas y la difusión de la Ciencia, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I. Universidad de y utilizar el encuentro para que los estudiantes de grado aprendieran Granada, Granada, ES divulgando. La célebre sentencia de Dobzhansky, “nada tiene sentido en Biología Entre las actividades del encuentro podemos señalar experiencias si no es a la luz de la Evolución”, apenas se aplica, sorprendente y científi cas, exposiciones (mujeres y ciencia, alimentación equilibrada, lamentablemente, en la enseñanza de la Bioquímica. animales exóticos, minerales, plantas carnivoras), talleres de visualización Para empezar, hay que hacer ver a los alumnos que lo que existe no es de moléculas, juegos científi cos. Además se presentó el blog que recoge los una Bioquímica, sino una enorme diversidad de bioquímicas (que se experimentos propuestos. Los alumnos en el desarrollo de la actividad se desarrollan, es cierto, en torno a una unidad muy notable). implicaron de manera activa tanto en el planteamiento de las experiencias Nuestros alumnos estudian el ciclo del citrato, el código genético, los de laboratorio (usando materiales caseros o que puedan encontrar en los mecanismos de control… sin plantearse nunca por qué son como son, esto colegios e institutos), como en el montaje y presentación a las personas que es ¿cómo y por qué surgieron en la evolución? Por ejemplo, ¿por qué el acudieron al encuentro. código genético tiene precisamente esos aminoácidos, y no otros, y no más, En el evento participaron 250 estudiantes de la UIB, y recibimos más de y sólo de la serie L...? 3.500 visitantes. La evaluación del grado de satisfacción por parte de los Sin embargo, hay razones para sospechar que el ciclo del citrato pudo visitantes fue muy alta, al igual que de los alumnos de la UIB. Mientras que empezar funcionando al revés, que el código genético coevolucionó con los profesores que participaron con sus asignaturas estamos ya trabajando las rutas de biosíntesis de aminoácidos y se congeló, que no es indiferente en el encuentro de 2015. desde el punto de vista evolutivo que la inducción o la represión génicas se realicen a través de mecanismos de control positivo o negativo, etc. Agradecimientos: alumnos de Facultad de Ciencias y Escuela Politécnica Un alumno de Bioquímica que no tenga idea de cómo pudo y puede la de la UIB, profesores y personal de administración que nos ayudaron en evolución “inventar” nuevas actividades enzimáticas y nuevas rutas tiene el montaje y desarrollo de la misma. FECYT (FCT-13-7535), ICE-UIB. un entendimiento de corto alcance de la “lógica molecular de lo viviente”. Para que esa visión sea sufi cientemente comprensiva, es necesaria, además, una refl exión sobre el problema del origen de la vida. P00-2 (R00-1) La visión evolutiva (hasta donde nos es posible en la actualidad) de la La bicicleta de Krebs, una iniciativa estudiantil Bioquímica mejora de manera decisiva la comprensión de la vida. para el aprendizaje del metabolismo (y más) Este enfoque evolutivo se ha aplicado con éxito durante años en la asignatura “Bioquímica evolutiva”, impartida por el Dpto. de Bioquímica Hugo Pineda1, Lola Nevado1, Sara Bernárdez1, Mª Jesús Pacheco1, y Biología Molecular I de la Universidad de Granada. Juan J. Criado1, Florencio Palomas1, Miguel Ángel Medina Torres2 1Alumnos de la asignatura optativa Bioquímica Metabólica de la Licenciatura en Biología de la Universidad de Málaga en el curso 2 P00m-4 2012-13, Málaga, ES, Universidad de Málaga, Andalucía Tech, Servicio de Texto Orientado iBiotecSTO: Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de Ciencias, e IBIMA (Instituto de Biomedicina de Málaga). Unidad multiplataforma interactiva para la docencia 741, CIBER de Enfermedades Raras (CIBERER), Málaga, ES de Biotecnología Bioquímica Metabólica es una asignatura que se ha ofertado como optativa Maximino Manzanera Ruiz1, Alberto Vargas2, Rafael Salto2, Antonio de segundo ciclo en la Licenciatura de Biología y como asignatura de libre Suarez2, Margarita Aguilera1, Juan Ignacio Vilchez1, Cristina García- confi guración en las Licenciaturas de Química e Ingeniería Química de la Fontana1 Universidad de Málaga durante todos los años de vigencia del último plan 1 2 de estudios de licenciaturas, actualmente en vías de extinción. Confi gurada Dept. Microbiología. Universidad de Granada, Granada, ES, Depto alrededor de tres bloques o unidades temáticas (Regulación integrada Bioquímica y Biología Molecular II. Universidad de Granada, del metabolismo, Regulación de los ejes centrales del metabolismo y Granada, ES Metabolismo en acción), la asignatura siempre se ha caracterizado por Proponemos el uso de un libro digital interactivo en formato de su sistema de auténtica evaluación continuada, por su fl exibilidad y multiplataforma para la materia de Biotecnología Farmacéutica que libertad en el desarrollo de sus contenidos y por ofrecer a los alumnos un sea accesible a través de tabletas, ordenadores y móviles inteligentes espacio propio para convertirse en protagonistas corresponsables de la (smartphones). A través de esta propuesta estamos generando un material confi guración de la asignatura. Ello ha brindado ocasión para el desarrollo bibliográfi co de actualidad, mediante un sistema que permite una puesta

24 Granada 2014 Pósters al día constante de contenidos, gracias a la incorporación rápida y autónoma de información. Pero además se quieren conseguir otros dos especializada de contenidos de forma constante por parte del profesor. objetivos relacionados íntimamente con el anterior: Igualmente consideramos que es especialmente útil para la docencia de esta 1. Desarrollar la capacidad de comunicación del conocimiento adquirido materia el suministro de información en formato vídeo. Este formato permite a otros alumnos. una mejor comprensión y asimilación de conceptos por parte del alumnado 2. Utilización de nuevas tecnologías (códigos QR, vídeos, uso de internet) que en caso contrario pueden ser confusos y llevar a interpretaciones erróneas. para comunicar lo aprendido. Estas interpretaciones erróneas son difíciles de detectar hasta la evaluación Se pretende con estos objetivos conseguir que el alumno elabore un de los estudiantes, lo que implica un cierto grado de insatisfacción por parte pensamiento estructurado y sintético ya que debe ser capaz de explicar del alumnado, así como por parte del profesorado en cuanto a la adquisición a sus compañeros el tema propuesto usando un lenguaje científi co pero de conocimientos y competencias del estudiante de esta materia. sufi cientemente claro. A través de esta solicitud pretendemos lograr el suministro de herramientas Descripción: Los alumnos se dividen para formar grupos de trabajo. A didácticas con los siguientes objetivos: cada grupo de trabajo se le asignará una glándula del sistema endocrino. (i) Generar un material bibliográfi co en español actualizable en sus Se les facilitan guiones o apuntes que pueden utilizar para guiarse durante contenidos. la elaboración del tema asignado. Asimismo se les facilita bibliografía que (ii) Suministrar contenidos digitales tales como vídeos y esquemas animados. deben consultar para realizar el trabajo. (iii) Desarrollar un sistema de autoevaluación continuo por parte del Una vez elaborado el tema deben grabar un vídeo en el que presentan alumnado con actividades para el desarrollo de las competencias propuestas el tema elaborado. La grabación se realiza con un teléfono móvil y las en la Guía Docente de la materia. explicaciones pueden realizarse de manera oral ayudándose con diapositivas del tipo power point o con la aplicación o medios que consideren oportunos (dibujos, etc.) P00-5 El vídeo se cuelga en una web (youtube, moodle, etc.) a la que el resto Diseño de clases prácticas de Bioquímica de grupos puede acceder con una clave, de manera que no esté abierta de modo general. Metabólica: estudio metabólico comparativo Cada grupo de trabajo se identifi ca con un código QR. La lectura de este de las situaciones de ayuno y alimentación código muestra cuál es el tema que desarrolla este grupo. El tema, a su vez, se identifi ca con otro código QR. La lectura de este segundo código lleva María del Mar Sola Zapata, José Luis Periago Mínguez, Paloma a una dirección URL (normalmente de youtube) en la que se encuentra el Hortelano de la Lastra vídeo con la presentación del tema. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular II, Facultad La exposición de los códigos QR (mediante una impresión de los mismos) de Farmacia, Universidad de Granada, Granada, ES se realiza en el aula habitual el día que se determine. En los Grados de Farmacia y NHyD de la UGR, los contenidos docentes La evaluación de los conocimientos adquiridos por los alumnos se realiza de metabolismo se imparten en la asignatura Bioquímica Metabólica con mediante una prueba objetiva de tipo test. Además, se pretende que los 4,5 ECTS teóricos y 1,5 ECTS prácticos. Hemos diseñado unas clases alumnos dentro de un grupo evalúen el trabajo del resto de componentes prácticas que pretendemos sean formativas y amenas al mismo tiempo. del grupo siguiendo una rúbrica. El planteamiento general consiste en desarrollar un estudio comparativo de algunos parámetros bioquímicos en dos situaciones metabólicas P00-7 claramente diferenciadas, ayuno y alimentación. Se han elegido algunos Bioquímica Estructural y Metabólica: Un libro compuestos y actividades enzimáticas que principalmente se afectan por adaptado para la docencia de la Bioquímica en la el ayuno y que ilustran claramente la regulación adaptativa de las rutas metabólicas. Durante cuatro clases presenciales de laboratorio, explicadas Facultad de Farmacia de la Universidad por un profesor, se realizan: a) Las determinaciones de las concentraciones de Granada (supuestamente séricas) de glucosa, 3-hidroxi-butirato y glicerol mediante Alberto M. Vargas Morales, Fermín Sánchez de Medina Contreras espectrofotometría; b) La determinación cualitativa de la concentración Departamento de Bioquímica y Biología Molecular II, Facultad de sérica de ácidos grasos libres mediante cromatografía en capa fi na y c) Farmacia, Universidad de Granada, Granada, ES La determinación espectrofotométrica de la actividad enzimática de la glucosa 6-fosfatasa hepática. Una quinta clase se dedica a la integración Hemos escrito y editado, en octubre de 2013, un libro de texto de metabólica de los resultados obtenidos. El material utilizado como muestra Bioquímica (Bioquímica Estructural y Metabólica, Ed. Técnica AVICAM, biológica es diferente en cada caso. Tuvimos en consideración que la Granada, 2013) con el principal objetivo de que sea utilizado como metodología estuviera adaptada a los aún escasos conocimientos técnicos manual de apoyo al estudio por los alumnos de las asignaturas básicas con que los alumnos poseen en ese momento, tratando de impedir así que la contenidos bioquímicos, Bioquímica Estructural y Bioquímica Metabólica, complicación metodológica desviara la atención del alumno de los aspectos de los Grados de Farmacia, Nutrición Humana y Dietética (NHyD) y metabólicos de las prácticas que, creemos, constituyen el principal objetivo Ciencia y Tecnología de los Alimentos (CyTA) de la Universidad de de esta asignatura. Estas clases se han impartido durante los últimos tres Granada. El libro está dividido en dos partes diferenciadas para ajustarlo a cursos académicos con un considerable grado de satisfacción de los la distribución docente que la Bioquímica tiene en los Planes de Estudios alumnos y de los profesores del departamento responsables de ellas. de estos Grados. Nos propusimos la elaboración de este libro como iniciativa de acercamiento docente al alumno que comienza los estudios universitarios, dado que la mayoría de los magnífi cos textos de Bioquímica con los que contamos no son consultados por los alumnos porque exceden P00-6 (R00-4) Utilización de códigos QR en el aprendizaje del sus requerimientos en contenidos y grado de difi cultad. Por esta razón, nuestro planteamiento se basaba en cubrir principalmente los siguientes sistema endocrino mediante trabajo en grupo y objetivos: presentación en vídeo - Abarcar de forma resumida todos los objetivos docentes de Bioquímica de Gracia Morales Kucharski las asignaturas básicas en los Grados de Farmacia, NHyD y CyTA. , Ana María Sánchez Moral - Concretar la información imprescindible. Universidad Europea de Madrid, Villaviciosa de Odón, ES - Utilizar un lenguaje asequible adaptado al alumno de los primeros cursos Objetivos: Como objetivo principal se busca que los alumnos sean capaces universitarios. de adquirir conocimiento sobre el tema propuesto mediante la búsqueda - Amenizar el texto con gran número de esquemas e ilustraciones.

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- Destacar ejemplos y aplicaciones en Farmacia y Nutrición, para lo que se bachiller. El taller debía consistir en un conjunto de experimentos para han incorporado Recuadros adicionales al texto. determinar la identidad de un asesino a partir de las pruebas halladas La utilización de este libro durante varios cursos académicos nos permitirá en una escena del crimen. Las actividades debían de ser sencillas, de valorar el grado de consecución de nuestros propósitos docentes. bajo coste y que fuesen comprensibles para el público en general. Los alumnos en grupos de 6 bajo supervisión del profesor prepararon el material y las actividades, que se fi lmaron e implementaron en un blog P00-8 (R00-3) para poder ser consultadas y utilizadas por profesores de secundaria. Proyecto Netbooks Uno a Uno: entrenamiento Los alumnos plantearon el taller de criminología como un escenario de docentes de escuelas secundarias de distribuido en tres espacios: la escena del crimen donde se recogían Argentina para el desarrollo y uso efectivo las pruebas (pelo, huellas dactilares, detección de sangre con luminol); de recursos informáticos en el aula el laboratorio de criminología, donde se analizaban las pruebas (grupo sanguíneo, DNA, pelo, etc.) y la pizarra de los sospechosos donde Ayelen Toro1 2 3 4 , Virginia Revora , Pablo Calzadilla , Lucía Chemes , por descarte debían de identifi car el asesino. Mediante encuesta se Silvina Ponce Dawson5, Cristina Caputo5, Roberto Gabriel Pozner1 evaluó la opinión de los alumnos que visitaron el taller, así como la 1Departamento de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas de los alumnos de grado que participaron en la actividad. El taller 2 y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires, AR, IIB- de criminología fue una de las actividades mejor valoradas por los 3 INTECh (CONICET), San Martín, AR, Unidad de Biotecnología visitantes, y nuestros alumnos reconocieron haber trabajado aspectos 1, IIB-INTECh (CONICET), Chascomús, AR, 4Fundación Instituto relacionados con competencias del grado como el trabajo en equipo, la Leloir, Buenos Aires, AR, 5Departamento de Física, Facultad de capacidad organizativa y expositiva. Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires, AR Agradecimientos: alumnos del grado de Bioquímica (BQ3) de la UIB. El Programa Conectar-Igualdad fue creado en Argentina en 2010 para FECYT, ICE-UIB. reducir las brechas digitales, educativas y sociales en el país y consiste en la adjudicación de netbooks a alumnos y docentes de escuelas secundarias de gestión estatal. El Programa pretende el uso de las netbooks en la escuela y los hogares y se propone lograr una sociedad alfabetizada en las P00-10 nuevas TIC. Análisis del modelo de reparto de tareas Para impulsar un uso efectivo de estas nuevas herramientas digitales se en un trabajo en grupo reglado (TEG-R) para diseñó un curso de capacitación destinado a docentes de escuela media de alumnos de Genética de primer curso de Grado asignaturas relacionadas con ciencias. El curso consistió en 4 encuentros de 4 horas de duración cada uno, se de Biología realizaron tutoriales que incluían diferentes secuencias didácticas diseñadas Oscar de Luis para usar programas específi cos. En el caso de los docentes de Química Área de Bioquímica y Biología Molecular, Dpto. de Ciencias Básicas Biológica, se trabajó con los programas Excel, Image J, Chemsketch y de la Salud, Universidad Rey Juan Carlos, Alcorcón (Madrid), ES Avogadro. El primer encuentro se enfocó en el uso general de la netbook y se En 2010 se presentó una adaptación del Aprendizaje Basado en detectó una gran disparidad de saberes en el uso de las PC, difi cultando la Problemas para la evaluación continua de la asignatura de Genética del capacidad de atención de los docentes que tenían habilidades previas. Sin Grado de Biología de la U. Rey Juan Carlos. La actividad consiste en la embargo, a lo largo del curso la heterogeneidad del grupo se redujo debido elaboración, por parte de un grupo de trabajo, de una memoria escrita a la complejidad creciente de las aplicaciones. consistente en un resumen analítico y un análisis crítico de un artículo A modo de cierre, los docentes realizaron un trabajo fi nal que consistió científi co publicado en inglés, en revista con índice JCR. La defensa en en una presentación en modalidad póster de alguna actividad, que cada público de la memoria por parte de todos los componentes del grupo es docente debía desarrollar con sus estudiantes utilizando la netbook. obligatoria. Esta herramienta ha sido perfeccionada para profundizar en la Los trabajos presentados muestran que los objetivos del curso se cumplieron evaluación, califi cación y adquisición por el alumnado de las competencias satisfactoriamente, ya que pudieron plasmar sus aprendizajes en el aula y generales de la asignatura. Con los datos del período 2009-2013 se valoró cuáles consideraban que eran las ventajas y desventajas de su uso. En las en un reciente estudio la adecuación de esta actividad. Sin embargo, no conclusiones de dichos trabajos la mayoría coincidió en el aspecto positivo se contempló determinar si el modelo de organización interna libremente de la incorporación de las netbooks en el aula ya que genera entusiasmo en elegido por cada grupo de trabajo puede ser o no determinante a la hora los estudiantes. de alcanzar las competencias propuestas y una califi cación adecuada. Con los datos del período 2011-2014 se han detectado tres tipos principales de P00-9 organización interna: una dinámica grupal cohesionada donde todos los Trabajando competencias docentes mediante el componentes del equipo trabajan globalmente, una dinámica de reparto diseño, realización y presentación de un taller de de tareas por partes temáticas reconocibles de corte más individualista, y una dinámica de reparto de tareas por fragmentos no temáticos de la carga criminología para secundaria y bachillerato de trabajo. Cabría esperar que a mayor cohesión interna en el grupo de Adamo Valle, Pilar Roca, Jordi Oliver trabajo los resultados fueran mejores por que se alcanzan mejor todas las Grupo Multidisciplinar de Oncología Traslacional. IUNICS. Universitat competencias por parte de cada miembro del equipo, pero si establecemos de les Illes Balears. Ciber Fisiopatología Obesidad y Nutrición como criterio de efi ciencia obtener una califi cación superior a la media (CB06/03) Instituto Salud Carlos III, Palma de Mallorca, ES del curso se observa que el modelo de reparto temático de tareas permite Entre las competencias genéricas de los planes de estudio del grado la máxima efi ciencia en la califi cación. Estos datos preliminares permiten de Bioquímica están la de fomentar el trabajo en equipo, la capacidad proponer una relación entre el esfuerzo y el rendimiento en cada tipo de organizativa y la expositiva. Dentro del marco del proyecto FECYT organización. Se propone también modifi car el protocolo de seguimiento “Ciencia para todos” nos planteamos que los alumnos de la asignatura del profesor y el cuestionario de autovaloración obligatorio de los alumnos Métodos y Técnicas en Biología Molecular de tercer curso, diseñasen para obtener datos más precisos con los que contrastar la hipótesis esfuerzo- un “Taller de criminología” y lo presentasen a alumnos de secundaria y rendimiento.

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P00-11 Bioquímica Metabólica y Química Orgánica I y II. Todas están situadas en Oportunidades de formación en biomedicina y el primer y segundo curso de los Grados que se imparten en la Facultad de biotecnología a nivel europeo: el Curso “Towards Farmacia de la Universidad de Granada. Pensamos que las competencias a Scientific Career: an Introductory Course for adquiridas por los alumnos en su etapa preuniversitaria no siempre son las más apropiadas o no son sufi cientes para obtener el rendimiento Research in Biomedicine and Biotechnology - adecuado en estas asignaturas. Nuestra misión como profesores es que el BIOMED-TECH” alumno adquiera las competencias específi cas de nuestras asignaturas de la manera más asequible y dinámica utilizando todos los recursos que estén a Inmacualda Llamas Company1, María Dolores González Girón2, nuestra disposición. Las técnicas y herramientas empleadas para despertar Fernando Hernández-Mateo3, Rafael Salto González2 1Departamento de Microbiología, Facultad de Farmacia, Universidad el interés y motivar a los estudiantes son numerosas. Cuando durante la de Granada, Granada, ES, 2Departamento de Bioquímica y Biología docencia de una asignatura, le indicamos al estudiante direcciones de Molecular II, Facultad de Farmacia, Universidad de Granada, internet donde pueden consultar modelos tridimensionales o vídeos de Granada, ES, 3Departamento de Química Orgánica, Facultad de técnicas de biología molecular entre otros, comprobamos que despiertan Ciencias, Universidad de Granada, Granada, ES más interés que un libro de consulta o divulgativo como La doble hélice de James D. Watson donde se narran de forma dinámica los experimentos que Los programas intensivos Erasmus han ofrecido hasta ahora la oportunidad de desarrollar actividades de formación en campos concretos. Nosotros llevaron a la dilucidación de la estructura del DNA. Una forma amena y hemos aprovechado este marco para realizar dos ediciones de un curso que divertida para introducir el conocimiento en las aulas es referirnos al cine, tiene el objetivo principal de dirigir alumnos hacia una carrera profesional a la televisión o a los periódicos para ilustrar con ejemplos ciertos aspectos en el ámbito de la investigación en Biomedicina y Biotecnología. Para ello, de la asignatura. Las películas y series de gran audiencia ofrecen contextos en las diferentes ediciones del programa hemos seleccionado alumnos de donde situados los conceptos químicos y bioquímicos nos permiten mostrar las Universidades de Granada (España), Universidad de Nottingham (Reino a los estudiantes la realidad o la fi cción de ejemplos más o menos cotidianos Unido), Universidad de Bayreuth (Alemania) y Universidad de Nova Lisboa que están acostumbrados a ver pero que no han terminado de asimilar. Los (Portugal), que han convivido durante 2 semanas y que han recibido un profesores que presentan esta propuesta saben por experiencia, que ciertos programa intensivo de orientación y formación en el área de Biomedicina procesos químicos y bioquímicos siempre son recordados por los alumnos y Biotecnología. El programa se ha estructurado mediante una serie de cuando recurrimos a casos de la vida cotidiana o del cine y televisión. mesas redondas con charlas impartidas por profesores procedentes de las 4 Durante el primer año de implantación se ha aumentado en un 20% el universidades implicadas y fi guras relevantes en el área de conocimiento. rendimiento académico de los alumnos. Además se han realizado visitas a empresas del área y así, como empresas agregadas al proyecto, han participado Abbott Laboratories S.A., Bio- Proyecto 2013-80. Vicerrectorado de Ordenación Académica y Iliberis R&D, Neuron Bio y la Fundación MEDINA. La formación de Profesorado. Secretariado de Innovación Docente. Universidad de los alumnos se ha completado con la realización de talleres prácticos Granada. sobre quorum sensing, síntesis de neoglicoproteínas, bioinformática y mutagénesis sitio específi ca de proteínas. Los profesores del curso han tutorado a los alumnos y los han asesorado en cómo orientar su actividad profesional hacia la investigación en Biomedicina y/o Biotecnología, conocer aspectos prácticos de la carrera científi ca académica y en la industria, analizar los perfi les científi cos profesionales y establecer una red P01. Apoptosis inicial de contactos en instituciones públicas así como en la industria. El hecho de que se hayan seleccionado alumnos de último curso de grado, de master y alumnos de doctorado ha posibilitado establecer un proceso de P01-1 mentorización entre ellos. Otros resultados alcanzados, en este caso para Investigating the membrane topology of BAX/BAK el profesorado ha sido el facilitar la cooperación entre universidades y con and the role of mitochondrial membrane lipids in la industria y establecer procedimientos docentes para la motivación del BAX/BAK activation alumnado hacia la investigación como salida profesional. Héctor Flores Romero, Juan García-Valero, Ane Landajuela, Olatz Actividad fi nanciada por el Organismo Autónomo de Programas Landeta, Itsasne Bustillo, Miguel García-Porras, Oihana Terrrones, Educativos Europeos (OAPEE) 2012-1-ES1-ERA10-0083 y 2013-1-ES1- Gorka Basañez ERA10-74542, El Vicerrectorado de Relaciones Internacionales y el Biophysics Unit (CSIC-UPV/EHU), Leioa, ES Campus de Excelencia CEI-BIOTIC de la Universidad de Granada. Mitochondrial outer membrane (MOM) permeabilization is the point of no return in many forms of apoptotic cell death. The lethal effect of MOM permeabilization is twofold, as it allows activation of pro-apoptotic caspase P00-12 La Bio(Química) en la vida cotidiana: método enzymes and also damages normal mitochondrial function. The BCL-2 family members BAX/BAK are crucial effectors of MOM permeabilization para estimular el interés de los estudiantes that adopt inactive conformations in healthy cells. It is well established Rafael Salto González1, Luisa Carlota López Cara2, María del Mar that functional BAX/BAK activation is a complicated process, involving Sola Zapata1, Alberto Manuel Vargas Morales1, María Dolores Girón profound conformational changes in these proteins, and culminating with González1 assembly of a protein-permeable pore in the MOM. However, our current 1Departamento de Bioquímica y Biología Molecular II, Facultad de structural knowledge of BAX/BAK primarily originates from studies with Farmacia, Universidad de Granada, Granada, ES, 2Departamento the protein in solution, although the active locus of these proteins is at de Química Farmacéutica y Orgánica, Facultad de Farmacia, the MOM. In addition, increasing evidence indicates that selected MOM- Universidad de Granada, Granada, ES localized lipids modulate the BAX/BAK-driven MOM permeabilization Divulgar de forma atractiva la ciencia y hacerla asequible a todos los pathway during apoptosis.Given the inherent complexity of the cellular públicos no siempre es fácil, especialmente si el área de conocimiento tiene apoptotic network, we use in vitro reconstituted systems bearing una cierta complejidad, lo que hace que sea difícil de comprender para physiological relevance to try elucidating the membrane topology of BAX/ el estudiante. Tal es el caso de asignaturas como Bioquímica Estructural, BAK, and their functional modulation by apoptosis-related lipid effectors.

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P01-2 (R01-3) Ocupacional. Universidad de Extremadura. Cáceres, ES. IMSERM, Cathepsin D promotes the cleavage of PARP-1 U848, Institut Gustave Roussy, Université Paris Sud, Villejuif, mediated by inactivation of BRCA1 in MCF-7 Paris, FR, 3Department of Cell Biology, Center for Molecular cells Medicine, University Medical Center Utrecht, Utrecht, NL Several studies have demonstrated the ability of Nrf2 transcription factor Juan M. Esteve1, Ghita Ghislat2, Erwin Knecht2 to control the cytoprotective adaptive response in the brain using PD 1Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad CEU Cardenal models. In this sense, brain samples from animals with neurodegeneration Herrera, Castellón de la Plana, ES, 2Centro de Investigación by oxidative stress have shown that increased nuclear Nrf2 may have a Príncipe Felipe, Valencia, ES protective effect on dopaminergic neurons in the SNpc, and on the other The breast cancer type 1 susceptibility protein (BRCA1) is a tumor hand, in MEFs it is has been observed the induction of antioxidant defenses suppressor involved in the maintenance of genetic stability in response to from this pathway after exposure to inducing agents. The chemical DNA damage, due to the control of cell cycle progression and activation characteristics of the agents which have the ability to interact with the Nrf2/ of DNA repair pathways. Cells with BRCA1 mutations manifest DNA Keap1 pathway show differences from each other in the chemical structure synthetic lethality and apoptosis after pharmacological inhibition of poly or how to interact (directly or indirectly) with the pathway. Sulforaphane (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1), a nuclear enzyme that contributes (SFN) is a naturally isothiocyanate presents in cruciferous plants. This to the resolution of DNA breaks. Hence, PARP-1 inhibitors represent a substance shows in its structure a highly electrophilic central carbon (-N = potential novel strategy for the treatment of BRCA1-mutated malignancies. C = S) which can easily react with the sulfhydryl groups of Keap1 to form Our study demonstrates that the silencing of BRCA1 activates the cleavage dithiocarbamates, so in this fact lies its ability to promote the translocation of PARP-1, and slows the cell cycle since it increases the percentage of of the transcription factor Nrf2 to the nucleus. However, it has been found that this substance can play a dual role, as a chemotherapeutic agent or as a cells in G1 phase and reduces that in the S + G2/M phase of the cell cycle. In relation to the mechanism of PARP-1 fragmentation, it has been shown promoter of antioxidant defenses. that caspases-3 and -7 cleave and, consequently, inactivate PARP-1 and Based on this powerful cellular defense of Nrf2 factor against oxidative DNA repair, thereby contributing to apoptotic cell death. However, in stress and based on the chemical features offered by SFN, the aim of MCF-7 cells silenced for BRCA1, we show that the PARP-1 cleavage was this work was to determine whether the activation of this axis exerted a + not accomplished by caspases-3 and -7. What type of proteases could then protective effect or not against MEFs induced PQ and MPP cytotoxicity be responsible for cleavage of PARP-1? The fact that lysosomal proteases, and on the other way, if that substance could modulate another celular cathepsins, can be released from lysosome and function in the cytosol processes such as autophagy, apoptosis or acetylation, thinking that this to regulate apoptosis, and that BRCA1 decreases the 52 kDa form of model could be used to elucidate the Nrf2 potential role as a molecular cathepsin D (CD), suggest a potential role of CD on PARP-1 cleavage. In therapeutic target value. this sense, we found that levels of three forms of CD (procathepsin D, the This work was supported by Gobierno de Extremadura (GR10054); 52 kDa form which leaves the Golgi apparatus and is targeted to lysosomes Instituto de Salud Carlos III (PI11/00040, PI12/02280 and CB06/05/0041). (and also to secretion in cancer cells); a lysosomal enzymatically-active M.R-A. was supported by a predoctoral fellowship from Universidad de intermediate of 48 kDa; and a lysosomal active mature form of 34 kDa) Extremadura. R.G-S. was supported by a FPU predoctoral fellowship were increased in BRCA1-silenced MCF-7 cells, but mainly precursor and (Ministerio de Educación, Spain), E.P-E. was supported by a predoctoral intermediate forms. Furthermore, we also observed that BRCA1 silencing fellowship (CIBERNED, Instituto de Salud Carlos III, Spain), RA.G-P. enhances CD mRNA levels, and our preliminary results suggest no changes was supported by a “Miguel Servet” research contract (Instituto de Salud in relation to the rate of the intracellular degradation of CD protein, leading Carlos III, Spain). to the conclusion that BRCA1 inactivation increases CD levels mainly by the control of its synthesis and not of its degradation. Finally, we demonstrate that the cleavage of PARP-1 and cell cycle slowing mediated P01-4 by silencing of BRCA1 are dependent on CD in MCF-7 cells, and this IfDotMeter®: a new tool for immunofluorescence PARP-1 fragmentation is accomplished by the catalytic activity of CD. In summary then, tumor suppressor protein BRCA1 inhibits PARP-1 cleavage analysis and negatively regulates CD synthesis in MCF-7 cells, and this PARP-1 Mario Rodríguez Arribas1, Elisa Pizarro Estrella1, Rubén Gómez cleavage is positively regulated by CD. Our results provide new data for Sánchez2, Sokhna Maryama Seidina Yakhine Diop1, Alejandro understanding the molecular and cellular mechanisms by which BRCA1 Cristo3, Antonio Grajera Hidalgo4, José Manuel Bravo San Pedro5, is involved in DNA repair, as well as to explain how PARP-1 inhibitors José Manuel Fuentes Rodríguez1, Rosa Ana González Polo1 trigger apoptosis in BRCA1-mutated cells. 1Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Neurodegenerativas (CIBERNED). Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Genética. Facultad de Enfermería y P01r-3 Terapia Ocupacional. Universidad de Extremadura, Cáceres, ES, Does sulforaphane protect against MPP+/PQ 2Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades oxidative stress effect in mouse embryonic Neurodegenerativas (CIBERNED). Department of Cell Biology, fibroblasts through the activation of Nrf2/Keap1 Center for Molecular Medicine, University Medical Center, Utrecht, 3 pathway? NL, IEEE Aerospace and Electronic Systems. Universidad de Extremadura, Cáceres, ES, 4Departamento de Bioquímica Elisa Pizarro Estrella1, J.M. Bravo San Pedro2, R. Gómez Sánchez3, y Biología Molecular y Genética. Facultad de Enfermería y S.M.S. Yakhine-Diop1, M. Rodriguez-Arribas1, R.A. González-Polo1, Terapia Ocupacional. Universidad de Extremadura, Cáceres, ES, J.M. Fuentes1 5Centro de Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades 1Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Neurodegenerativas (CIBERNED). INSERM, U848, Institut Gustave Neurodegenerativas (CIBERNED). Departamento de Bioquímica Roussy, Université Paris Sud, Villejuif, Paris, FR y Biología Molecular y Genética. Facultad de Enfermería y Most of laboratories interested in autophagy use different imaging Terapia Ocupacional. Universidad de Extremadura, Cáceres, ES, software for managing and analyzing heterogeneous parameters from 2Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades immunoﬂ uorescence experiments (LC3-puncta quantiﬁ cation and Neurodegenerativas (CIBERNED). Departamento de Bioquímica y determination of number and size of lysosomes, among others). In this BIología Molecular y Genética. Facultad de Enfermería y Terapia sense, one helpful solution would be some software working in user’s

28 Granada 2014 Pósters laptop or workstation able to access to all image settings and provide a P01-6 quick and easy-to-use analysis of these data. Apoptotic efficacy of etomoxir in HL60 human For this reason, we have designed an application called IFDOTMETER® acute myeloid leukemia cells. Cooperation with which runs on the major operating systems because it has been arsenic trioxide and glycolytic inhibitors, and programmed using Java (Sun Microsystems) as the computer platform. regulation by oxidative stress and protein kinase Briefl y, IFDOTMETER® software has been created to quantify a variety of biological hallmarks, including mitochondrial morphology, nuclear activities condensation, cell area, quantifi cation of number or size of different María Cristina Estañ Omaña1, Eva Calviño Vanegas1, Susana Calvo puncta staining and so on. Once specifi c parameters have been defi ned, Alonso1, María del Carmen Boyano-Adánez2, Elena de Blas1, IFDOTMETER® allows you to analyze a large number of images in an Eduardo Rial1, Patricio Aller1 objective and automatic way, without the supervision of researcher. 1Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid, ES, Results obtained are stored in a spreadsheet. Thus, researchers can perform 2Universidad de Alcalá de Henares, Alcalá de Henares, ES a comprehensive and precise analysis of a high number of images in an Fatty acid synthesis and metabolism are frequently exacerbated in automated manner, making easier than before this routine chore. Here leukemia cells, and may therefore represent a target for therapeutic we will show results obtained with IFDOTMETER® applying different intervention. Therefore, we analyzed the pro-apoptotic and chemo- treatments and staining in different cell lines to demonstrate that this new sensitizing action of the fatty acid oxidation inhibitor etomoxir (Eto) in tool would be useful to the scientifi c community because of both being HL60 human acute myeloid leukemia cells. Etomoxir caused negligible more objective and saving time. lethality at concentrations up to 100 μM, but greatly potentiated apoptosis induction by the anti-leukemic agent arsenic trioxide (ATO) and, with This work was supported by Gobierno de Extremadura (GR10054); lower effi cacy, by other anti-tumour drugs (etoposide, cisplatin). Etomoxir Instituto de Salud Carlos III (PI11/00040, PI12/02280 and CB06/05/0041). dose-dependently inhibited mitochondrial respiration while stimulating M.R-A. was supported by a predoctoral fellowship from Universidad glycolysis, but caused minimal alterations in intracellular nucleotide pools (ATP, ADP, AMP). In addition, etomoxir caused moderate oxidative stress de Extremadura. E.P-E. was supported by a predoctoral fellowship and stimulated the LKB-1/AMPK pathway, all of which might in part (CIBERNED, Instituto de Salud Carlos III, Spain), RA.G-P. was supported explain the chemo-sensitizing capacity of the drug with ATO. Etomoxir by a “Miguel Servet” research contract (Instituto de Salud Carlos III, also cooperated with the glycolytic inhibitor 2-deoxy-D-glucose (2-DG) to Spain). Authors thank FUNDESALUD for providing helpful assistance. induce apoptosis, and the combined etomoxir/2-DG treatment stimulated Akt and ERK phosphorylation/activation. Apoptosis generation by etomoxir plus 2-deoxy-D-glucose was further increased by co-treatment P01-5 with ATO, a response apparently explained by the capacity of ATO to Nuevas funciones génicas en apoptosis prevent defensive Akt and ERK activation. In summary, co-treatment y autofagia celular identificadas mediante with etomoxir may represent an interesting strategy to increase the cyto- reductive effi cacy of ATO and 2-deoxy-D-glucose, as well as of etomoxir genómica funcional itself which, although clinically important anti-tumour agents, exhibit Felipe Xosé Pimentel Muiños limited effi cacy in monotherapy. Instituto de Biología Molecular y Celular del Cáncer (IBMCC). CSIC-Universidad de Salamanca, Salamanca, ES P01-7 Previamente en el laboratorio hemos diseñado un sistema de alto Mecanismos involucrados en el efecto rendimiento para identifi car funcionalmente moléculas capaces de inducir antiapoptótico de leptina en placenta humana diferentes modalidades de muerte celular al ser sobreexpresadas. Este a término abordaje se basa en el uso de sistemas robóticos que facilitan el manejo sistemático de genotecas de cDNA clonadas en vectores de expresión, y en Ayelen Rayen Toro1, Antonio Pérez Pérez2, Victor Sanchez la transfección de los clones en células susceptibles y en combinación con Margalet2, Bernardo Maskin3, Cecilia Varone1 GFP. Tras el escrutinio de 135.000 clones de una genoteca humana, hemos 1IQUIBICEN - Universidad de Buenos Aires, Ciudad Autonoma de identifi cado un total de 90 elementos genéticos cuya expresión induce Buenos Aires, AR, 2Departamento de Bioquímica Médica y Biología muerte celular. De forma interesante, aunque la mayoría son capaces de Molecular, Universidad de Sevilla, Sevilla, ES, 3Hospital Nacional provocar muerte celular apoptótica, otros inducen formas de muerte celular “Profesor A. Posadas”, Buenos Aires, AR morfológicamente atípica, diferentes de la apoptosis. Durante la implantación embrionaria se genera un diálogo materno fetal Dentro de los clones apoptóticos hemos identifi cado el transportador que involucra la acción de múltiples reguladores, siendo uno de ellos la mitocondrial de fosfato, y trabajo adicional demostró que esta molécula leptina. Esta proteína de 16 kDa fue descubierta en tejido adiposo con la forma parte del poro de transición de permeabilidad que media la liberación función de regular el balance energético del organismo. También se expresa de citocromo c y la activación de las caspasas en algunos paradigmas de en placenta humana donde podría tener efectos sobre el crecimiento, apoptosis. Por otro lado, dentro de los clones atípicos hemos descubierto la supervivencia, la angiogénesis y la inmunomodulación placentaria. una nueva proteína transmembrana denominada TMEM59. Estudios Resultados previos de nuestro grupo demostraron que la leptina aumenta la proliferación celular y supervivencia en células placentarias. adicionales indicaron que esta molécula induce un fenómeno atípico de El objetivo de este trabajo es evaluar el efecto de la leptina sobre la apoptosis autofagia celular implicado en defensa contra agentes infecciosos, y no de células placentarias.Se utilizaron como modelos de trabajo explantos parece tener un papel fi siológico en muerte celular. Por tanto, a través de placentarios a término, los cuales se obtuvieron del tejido trofoblástico de un sistema no sesgado de identifi cación funcional hemos podido adscribir placentas humanas derivadas de partos vaginales normales. Los explantos funciones celulares nuevas, bien a genes conocidos que previamente no se fueron incubados en DMEM-F12 sin SFB durante 24h para inducir la habían implicado en una determinada función (transportador de fosfato), muerte celular, como control se incubaron los explantos en DMEM-F12 o a genes nuevos cuya función fi siológica se desconocía por completo con SFB al 10%. Por Western Blot y qRT-PCR se analizó la expresión de (TMEM59), demostrando el potencial de este tipo de aproximaciones para distintas proteinas involucradas en el proceso de apoptosis, y se evaluó la anotar funcionalmente el genoma. fragmentación del DNA.

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Encontramos que en presencia de leptina disminuye la proteina p53 P01r-9 y su isoforma fosforilada en Ser46, indicadora de activación de la vía Mitochondrial pathway mediators as apoptótica. También evaluamos el efecto de leptina sobre mediadores pro y pharmacological targets to improve cisplatin antiapoptóticos. Hallamos que leptina disminuye la expresión de Bax y Bid, therapeutic utility y genera un aumento en la expresión de Bcl-2. Asimismo, el tratamiento Laura Prieto García1 1 con leptina disminuye la activación de Caspasa-3. Comprobamos dicho , Sandra Sancho Martínez , José Miguel López efecto analizando el fragmento clivado de PARP-1, el cual disminuye en Novoa1, Francisco López Hernández2 1 presencia de leptina. Confi rmamos el efecto antiapoptótico de leptina, Instituto de Investigación Biomédica de Salamanca (IBSAL) y estudiando la fragmentación del DNA, la cual disminuye con el tratamiento Unidad de Fisiopatología Renal y Cardiovascular, Instituto “Reina Sofía” de Investigación Nefrológica, Departamento de Fisiología con leptina. y Farmacología, Universidad de Salamanca, Salamanca, ES, Todos estos resultados refuerzan la noción de la leptina como una importante 2Instituto de Investigación Biomédica de Salamanca (IBSAL), citoquina placentaria, con la función de promover la supervivencia de las Unidad de Fisiopatología Renal y Cardiovascular, Instituto “Reina células trofoblásticas. Sofía” de Investigación Nefrológica, Departamento de Fisiología y Farmacología, Universidad de Salamanca e Instituto de Estudios de Ciencias de la Salud de Castilla y León (IECSCYL), Unidad de P01-8 (R01-4) Investigación, Hospital Universitario de Salamanca, Salamanca, ES Lack of oligonucleosomal DNA degradation Cisplatin is a chemotherapeutic drug widely used against a variety of during caspase-dependent cell death is a cancers. Its clinical utility is limited by its side effects, result of cisplatin common trait of human glioblastoma multiforme- action in normal cells. Cisplatin toxicity is determined by target tissue and cell accumulation, subcellular handling and traffi cking through diverse derived cells due to improper activation of subcellular structures. This drug causes cell death both by apoptosis and DFF40/CAD necrosis linked to cisplatin concentration. For a better control of cisplatin’s side effects, pathways leading to activation of both types of cell death need María Sánchez Osuna1, Fina Martinez-Soler2, Sònia Pascual-Guiral1, to be clarifi ed in order to identify suitable pharmacological targets and Mercè Garcia-Belinchón1, Victoria Iglesias-Guimarais1, Elisenda implement appropriate treatments with a theranostic approach. The aim of Casanelles1, Gerard Plans3, Jordi Bruna3, Avelina Tortosa3, Victor J. this work is to establish a hierarchy in cisplatin cytotoxic mechanisms and Yuste1 to clarify the role of the mitochondrial pathway in this process. 1Cell Death, Senescence and Survival Group, Dept. Bioquímica We used cultured human lymphoma (Jurkat T cells) to investigate the i Biologia Molecular and Institut de Neurociències, Facultat de biochemical and phenotypic characteristics of the death mode induced by increasing concentrations of cisplatin. For this purpose the cells were Medicina, UAB - Centro de Investigación Biomédica en Red sobre treated for 4, 8, 12 and 18 hours with different concentrations of cisplatin Enfermedades Neurodegenerativas (CIBERNED), Barcelona, ES, (0-1000 microM). In order to put in perspective the main pathways of cell 2 Department of Basic Nursing, Institut d’Investigació Biomèdica death induced by cisplatin we used different stable trasfectants of Jurkat 3 de Bellvitge-Universitat de Barcelona, Barcelona, AF, Unit of cells in which main mitochondrial pathway proteins were modifi ed, such Neuro-Oncology, Services of Neurology and Neurosurgery, Hospital as Jurkat Bcl-2 (which presents overexpression of an antiapoptotic protein Universitari de Bellvitge, Barcelona, ES Bcl-2), Jurkat C9DN (which presents overexpression of a catalytically Apoptosis is a tightly regulated process characterized by oligonucleosomal inactive form of caspase 9) and their control carrying the empty vector DNA degradation and nuclear fragmentation. These apoptotic hallmarks (pcDNA3.0). Our results indicate that concentrations of cisplatin inducing appear when the Caspase-activated DNase (DFF40/CAD) becomes a necrotic-like cell death mode are capable of activating the apoptotic machinery. We demonstrate that caspase 9 activity and antiapoptotic Bcl- activated. Here, we show different human glioblastoma multiforme- 2 protein play a critical role in the cytotoxicity mechanism induced by derived (hGBM) cells in which caspase-dependent cell death occurs in the cisplatin, accordingly with the increase in the viability and reduction in the absence of oligonucleosomal DNA degradation. After apoptotic stimuli, apoptotic proteins expression. This knowledge may allow us to develop hGBM-derived cells activate the executioner caspases, thus processing drugs that block cisplatin-induced apoptosis and minimize cisplatin- and inhibiting ICAD, the inhibitor of DFF40/CAD. However, injured induced necrosis. cells do not hydrolyze their DNA into oligonucleosome-sized pieces. Moreover, most injured hGBM cells display heterogeneous nuclear alterations characterized by highly compacted chromatin, in the absence P01-10 (R01-7) of the classical apoptotic nuclear fragmentation. Both in vivo and in vitro Familial Parkinsonism with G2019S LRRK2 approaches demonstrate that higher levels of DFF40/CAD endonuclease mutation displays a susceptibility to the MPP+ make hGBM cells competent to undergo oligonucleosomal DNA neurotoxin by an mTOR-dependent autophagy degradation after apoptotic stimuli. Intriguingly, the overexpression of DFF40/CAD does not alter the nuclear morphology observed in apoptotic Sokhna M.S. Yakhine Diop1, José Manuel Bravo-San Pedro2, Rubén wild type hGBM cells. Altogether, these data highlight a new apoptotic Gómez-Sánchez3, Elisa Pizarro-Estrella1, Mario Rodríguez-Arribas1, 4 5 5 paradigm where nuclear alterations are DFF40/CAD-independent despite Ana Gómez-Martin , Ana Aiastui , Ana Gorostidi , Adolfo López de 6 1 1 proper caspase activation. This is the fi rst time reporting a common trait Munain , José Manuel Fuentes-Rodríguez , Rosa Ana González-Polo 1Centro de Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades in hGBM cells which may be taken into consideration to design effective Neurodegenerativas (CIBERNED). Departamento de Bioquímica chemotherapy to target these extremely aggressive tumors. y Biología Molecular y Genética, Facultad de Enfermería y Terapia Ocupacional, Universidad de Extremadura, Caceres, ES, Work supported by Ministerio de Economía y Competitividad, European 2Centro de Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades Regional Development Fund (ERDF) Grant SAF2012-31485 and Neurodegenerativas (CIBERNED). Departamento de Bioquímica Generalitat de Catalunya Grant 2009SGR-346. y Biología Molecular y Genética, Facultad de Enfermería y Terapia Ocupacional, Universidad de Extremadura, Cáceres, S-O, M. holds an FPU fellowship from Ministerio de Ciencia e Innovación ES. INSERM, U848. Institut Gustave Roussy. Université Paris (MICINN). Sud, Villejuif, Paris, FR, 3Centro de Investigación Biomédica

30 Granada 2014 Pósters en Red sobre Enfermedades Neurodegenerativas (CIBERNED). 2-phenylethynesulfonamide (PES) or pifi thrin-μ is a promising anticancer Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Genética, agent with preferential toxicity for cancer cells. The type of cell death and F. Enfermería y T.O., Universidad de Extremadura, Cáceres, the molecular cascades activated by this compound are controversial. Here, ES. Department of Cell Biology, Center for Molecular Medicine, we demonstrate PES elicits a caspase- and BAX/BAK-independent non- University Medical Center Utrecht, Utrecht, NL, 4Centro necroptotic necrotic cell death, since it is not inhibited by Necrostatin-1. de Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades This process is characterized by an early generation of reactive oxygen Neurodegenerativas (CIBERNED). Departemento de Enfermería, species (ROS) resulting in p53 up-regulation. Accordingly, thiolic Centro Universitario Plasencia, Universidad de Extremadura, antioxidants protect cells from PES-induced death. Furthermore, inhibiting Plasencia, ES, 5Centro de Investigación Biomédica en Red sobre the natural sources of glutathione with L-buthionine-sulfoximine (BSO) Enfermedades Neurodegenerativas (CIBERNED). Cell Culture strongly synergizes with PES in triggering cytotoxicity. Genetically Plataform/Neuroscience Area of Health Reseach Biodonostia modifi ed p53-null or p53 knocked-down cells show resistance to PES- Institute, Donostia Universitary Hospital , San Sebastián, ES, driven necrosis. The predominant localization of p53 in chromatin- 6Centro de Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades enriched fractions added to the up-regulation of the p53-responsive gene Neurodegenerativas (CIBERNED). Cell Culture Plataform/ p21, strongly suggest the involvement of a transcription-dependent p53 Neuroscience Area of Health Reseach Biodonostia Institute, program. On the other hand, we report an augmented production of ROS Donostia Universitary Hospital. Department of Neurology, Hospital in p53-positive cells that, added to the increased p53 content in response Donostia. Ilundain Fundazioa, Department of Neurosciences, to PES-elicited ROS, suggests that p53 and ROS are mutually regulated University of the Basque Country UPV-EHU, San Sebastián, ES in response to PES. In sum, p53 up-regulation by ROS triggers a positive Parkinson’s disease (PD) is a neurodegenerative disorder characterized feedback loop responsible of further increasing ROS production and by mitochondrial dysfunction, oxidative stress and later neuronal death. reinforcing PES-driven non-necroptotic necrosis. Several genetics and environmental factors have been implicated in the pathogenesis of PD. MPP+ is a neurotoxin widely used to induce parkinsonian cellular model, P01-12 (R01-2) it is responsible for cellular damage at different levels, apoptotic death, Influencia de FBWX7 en la adquisición depletion of mitochondrial potential membrane and deregulation of cellular de resistencia a paclitaxel en cáncer de mama recycling machinery. Jessica Gasca Bellido1 2 In this study, we characterized the MPP+-induced toxicity in fi broblasts , Rainiero Ávila Polo , Mª Luz Flores de from PD patients with G2019S LRRK2 and control individuals without this Mera1, Servando Giráldez3, María Tortolero3, Francisco Romero3, mutation. Obtained results show that MPP+ induces a mTOR-dependent Miguel A. Japón Rodríguez4, Carmen Sáez Torres4 autophagy in both fi broblasts cells. Further, cell death to MPP+ was higher 11Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS), Hospital Universitario in mutant fi broblasts which exhibited a basal level of mTOR-independent Virgen del Rocío/CSIC/Universidad de Sevilla, Sevilla, Rota, ES, autophagy due to the G2019S LRRK2 mutation. 2Departamento de Anatomía Patológica, Hospital Universitario Inhibition of autophagosome-lysosome fusion by Bafi lomycin A1 Virgen del Rocío, Sevilla, Sevilla, ES, 3Departamento de exacerbated the response to MPP+ exposure in both cell lines, but inhibition Microbiología, Facultad de Biología, Universidad de Sevilla, Sevilla, of early state autophagy by 3-methyladenine lessened this difference Sevilla, ES, 4Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS), Hospital between both cell types. Universitario Virgen del Rocío/CSIC/Universidad de Sevilla, Sevilla y This fi nding confi rms the important implication of the interaction of Departamento de Anatomía Patológica, Hospital Universitario Virgen genetics and environmental factors in the PD etiology and may help to get del Rocío, Sevilla, Sevilla, ES a better understanding in the pathogenic mechanism of this disease. Paclitaxel es un fármaco antimitótico que pertenece al grupo de los taxanos que se emplea en el tratamiento del cáncer metastásico de mama, aunque This work was supported by Gobierno de Extremadura (GR10054); Instituto su utilidad es limitada debido a la aparición de resistencia a esta sustancia. de Salud Carlos III (PI11/00040, PI12/02280 and CB06/05/0041). RA.G-P. La relación entre la parada de mitosis inducida por paclitaxel y la posterior was supported by a “Miguel Servet” research contract (Instituto de Salud supervivencia (o muerte) de la célula no se conoce completamente, aunque Carlos III, Spain). A.A. was supported by ISCIII (CA00/01506; Ministerio diversos estudios indican que podría estar implicado el sistema ubicuitina/ de Economia y Competitividad) and Instituto Biodonostia and A.G was proteasoma (UPS) que controla el ciclo celular mediante degradación de supported by the Ilundain Fundazioa. A.L.M. received research support by diversos reguladores del ciclo. FBXW7 forma parte del complejo de la the Association Francaise contre les Myopathies (Ref. 12642), the Spanish ubicuitín ligasa SCFFBXW7 y es responsable de la unión a los sustratos. Esta Ministry of Health (FIS PS09-00660), the Ilundain Foundation, Isabel Gemio ligasa ubicuitina para su posterior degradación a oncoproteínas como c-Myc, Foundation, Diputacion Foral de Gipuzkoa (DFG09/001), and SAIOTEK Ciclina E, Notch1, c-Jun y Mcl1, entre otras. Se han encontrado mutaciones (SAIO12-PE12BN008). RAG-P received research support from Ministerio o pérdida de función de FBXW7 en numerosos cánceres, por lo que se de Ciencia e Innovación, Spain (PI11/00040). JM. F received research considera generalmente que FBXW7 es un supresor tumoral. En este trabajo support from the Ministerio de Ciencia e Innovación, Spain, CIBERNED hemos evaluado el posible papel de FBXW7 en la adquisición de resistencia (CB06/05/004), Consejería, Economía, Comercio e Innovación Junta de a taxanos en el cáncer de mama. Estudiamos los niveles de expresión de Extremadura (GRU10054), Ministerio de Ciencia e Innovación, Spain FBXW7 y de los sustratos Aurora A, Ciclina E y Mcl1 mediante análisis (PI12/02280). The authors also thank FUNDESALUD for helpful assistance. inmunohistoquímico en algunas líneas celulares y en 380 cánceres de mama observando que la disminución de expresión de FBXW7 se correlaciona estadísticamente con un aumento en la expresión de los sustratos estudiados, P01r-11 (R01-6) así como con el grado tumoral más agresivo. También estudiamos el 2-phenylethynesulfonamide (PES) uncovers a efecto del silenciamiento y la sobreexpresión en algunas líneas celulares non-necroptotic necrotic cell death regulated by confi rmando la infl uencia de FBXW7 sobre los sustratos mencionados y su oxidative stress and p53 efecto en la muerte por apoptosis tras tratamiento con paclitaxel. Además, la sobreexpresión de FBXW7 en una línea celular resistente a paclitaxel Paolo Mattiolo1, Ares Barbero-Farran1, Víctor José Yuste2, Jacint derivada de células MDA-MB-468 provocó un aumento de la muerte Boix1, Judit Ribas Fortuny1 celular y una clara disminución de la proteína anti-apoptótica Mcl1 tras 1Departament de Medicina Experimental, Universitat de Lleida, el tratamiento con paclitaxel. Por lo tanto, nuestros datos parecen indicar Lleida, ES, 2Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, que FBXW7 podría infl uir en la adquisición de la resistencia a taxanos UAB, Campus de Bellaterra, ES principalmente a través de su papel en la regulación de Mcl1.

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P01-13 (R01-5) functionalization of gold nanoprisms (NPRs) with glucose selectively La 2-deoxiglucosa y la privación de glucosa enhances their cellular uptake in transformed cells.[3] Here we reveal for inducen diferentes formas de muerte celular the fi rst time the molecular mechanism of apoptosis during photothermal therapy in transformed cells following irradiation with NIR laser light.[4] Clara Lucía León-Annicchiarico, Silvia Ramírez-Peinado, Raffaella To this aim we have established conditions to readily induce apoptosis Iurlaro, Cristina Muñoz-Pinedo on mouse embryonic fi broblast (MEF) cells transformed with the SV40 Instituto de Investigación Biomédica de Bellvitge IDIBELL, virus and analyzed the mechanism of apoptosis using MEFs from different Barcelona, ES knock out mice, which are defi cient in proteins involved in the different La 2-deoxiglucosa (2DG) es un medicamento ampliamente utilizado en la routes of apoptosis (Bak and Bax, Bid, caspase-3 or caspase-9). Our results investigación básica y actualmente en ensayos clínicos como un inhibidor show that “hot” NPRs activate the intrinsic mitochondrial pathway of de la glicólisis, efi caz como agente antitumoral frente a tumores sólidos. apoptosis mediated by Bak and Bax through the activation of the BH3- Debido al efecto de la 2DG en ruta de la glicólisis, el principal efecto que only protein Bid and that apoptosis and cell death is dependent on the se le atribuye es privar a las células de ATP. No obstante, hemos visto que el presence of both caspase-9 and caspase-3. Our fi ndings demonstrate how efecto tóxico está mediado por el estrés del Retículo Endoplasmático más the functionalization and dose of NPRs, as well as laser power density que por el estrés bioenergético. and irradiation time exposure, must be regulated to specifi cally induce Estudiamos los efectos de la inhibición de la glicólisis inducida por la 2DG apoptotic cell death. Moreover the molecular mechanism presented here y por la privación de glucosa en diferentes líneas celulares de sarcomas may help to predict the effi cacy of NP-based photothermal therapy to treat y observamos que ambos tratamientos promueven diferentes formas cancer patients. de muerte celular. En la línea celular de rabdomiosarcoma Rh4, ambos estímulos inducen estrés del retículo endoplasmático y en ambos casos el References siRNA de ATF4, una proteína involucrada en el estrés reticular, protege [1] B. Pelaz, V. Grazu, A. Ibarra, C. Magen, P. del Pino, J.M. de la Fuente. de la muerte celular. Además, ambos estímulos regulan de forma similar Langmuir 2012; 28: 8965. la expresión de Noxa y de las proteínas antiapoptóticas de la familia [2] C. Bao, N. Beziere, P. del Pino, B. Pelaz, G. Estrada, F. Tian, V. Bcl-2; especialmente con bajada de Mcl-1. Sin embargo, la 2DG y la Ntziachristos, J. M. de la Fuente and D. Cui. Small 2012; 9: 68. privación de glucosa promueven formas de muerte celular diferentes; la [3] M. Pérez-Hernández, P. del Pino, B. Pelaz, E. M. Galvez, J. M. de la muerte celular por 2DG pudo ser prevenida por inhibidores de caspasas, Fuente, J. Pardo (under review). mientras que la privación de glucosa indujo muerte celular independiente [4] M. Pérez-Hernández, P. del Pino, S. G. Mitchell, B. Pelaz, E. M Gálvez, de caspasas. Éste tipo de necrosis no fue consecuencia de una caída en J. M. de la Fuente, Julián Pardo (under review). el ATP, sugiriendo un papel para una necrosis programada o necroptosis. Sin embargo, la necrostatina-1 o los antioxidantes no redujeron la muerte celular. Por el contrario, la Ciclosporina A, inhibidor del poro de transición P01-15 de permeabilidad mitocondrial, protegió de la muerte inducida por la New oleanolic acid derivatives, with different privación de glucosa. polarity, increase apoptotic effects in B16-F10, Por otro lado, encontramos que sólo las líneas celulares derivadas de los murine melanoma cells rabdomiosarcomas, fueron sensibles a la 2DG y a la privación de glucosa, mientras que líneas celulares de liposarcomas o leiomiosarcomas son Fernando Jesús Reyes Zurita1, Marta Medina ODonnell2, Rosa Ferrer sensibles a la falta de glucosa pero no a la 2DG. Nuestros resultados indican Martín1, Eva Rufi no Palomares1, Amalia Pérez Jiménez1, Leticia que el tratamiento con la 2DG no es análogo a la privación de glucosa y que García Salguero1, Pedro P. Medina1, Samuel Martín Fonseca2, la 2DG podría ser efi caz en el tratamiento de rabdomiosarcomas. Francisco Rivas2, Andrés Parra2, Juan Peragón3, José Antonio Lupíañez1 1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of P01r-14 (R01-8) Science, University of Granada, Granada, ES, 2Department of Dissecting the molecular mechanism of cell Organic Chemistry, Faculty of Science, University of Granada, death in transformed cells during photothermal Granada, ES, 3Depatment of Experimental Biology, Biochemistry therapy using gold nanoprisms Section, University of Jaen, Jaén, ES Oleanolic acid (3β-hydroxyolean-12-e-28-oic acid), a natural hydroxylated Marta Pérez Hernández1 2 3 , Pablo del Pino , Scott G. Mitchell , pentacyclic triterpene acid isolated from olive-pressing residues, has been Beatriz Pelaz4, Eva M. Gálvez5, Jesús M. de la Fuente6, Julián investigated together with some its derivatives regarding the induction of 7 Pardo apoptosis in B16-F10 melanoma cells. This study examines the response 1 Instituto Universitario de Nanociencia de Aragón (INA), of B16-F10 murine melanoma cells to oleanolic acid and three derivatives Universidad de Zaragoza. Aragon Health Research Institute (IIS with an increasing polarity (28-Benzyloleanolic acid, 3-Pthaloyl, Aragón), Edifi cio CIBA, Biomedical Research Centre of Aragon 28-Benzylolanolic acid and 3-(3,3-Dimethylglutaryl), 28-Benzyloleanolic 2 (CIBA), Zaragoza, ES, Instituto Universitario de Nanociencia de acid). The compounds tested induce citotoxicity with IC50 concentrations Aragón (INA), Universidad de Zaragoza. Fundación Araid , Zaragoza, between 9.8 to 48.5 μg/mL in a increasing form, depending on the 3 ES, Instituto Universitario de Nanociencia de Aragon (INA), polarity of the compounds. These results shown that the three derivatives 4 Universidad de Zaragoza, Zaragoza, ES, Instituto de Nanociencia were more citotoxic that its precursor oleanolic acid. At these drugs 5 de Aragón, Universidad de Zaragoza, Zaragoza, ES, Instituto de concentrations, all the products tested, induced over 95% of apoptosis, 6 Carboquímica, CSIC, Zaragoza, ES, Instituto de Nanociencia de measure by FACS analysis with annexine V FICT staining. Most of these Aragón, Universidad de Zaragoza Fundación Araid, Zaragoza, ES, compounds, which also exhibited anti-proliferative effects, generated 7 Instituto de Nanociencia de Aragón, Universidad de Zaragoza. mitochondrial disturbs, probably involving the activation of an intrinsic Fundación Araid. Aragon Health Research Institute (IIS Aragon), apoptotic route. These mitochondrial disturbs was confi rmed by FACS Edifi cio CIBA, Biomedical Research Centre of Aragon (CIBA), analysis using rhodamine 123. Morphological changes including cell Zaragoza, ES shrinkage, chromatin condensation, and loss of nuclear architecture were Gold nanoparticles (NPs) are promising vehicles to specifi cally deliver observed by Hoechst stained. These fi nding support a role of oleanolic acid drugs to cancer cells and in addition to their use in drug targeting, gold NPs derivatives as tumor suppressant and as possible new therapeutic tools for can be used as “heaters” during photothermal therapy of solid carcinomas aberrant cell proliferation in skin and may be used as chemopreventives or using near-infrared (NIR) laser light.[1,2] We have previously shown that chemotherapeutics in melanoma process development.

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This study has been supported by the grants from Ministerio de Ciencia P02. Bases moleculares de la patología e Innovación (Feder-Interconecta Program and CTQ2009-13898) and the Consejería de Innovación, Ciencia y Empresa (Junta de Andalucía) research groups CVI-157 and FQM-7372. P02r-1 La quinasa humana VRK1 regula la estabilidad de los Cuerpos de Cajal protegiendo a Coilina P01-16 The activation of DFF40/CAD and the de su degradación en el proteasoma cytoplasmic release of nuclear histones during Lara Cantarero Abad, Marta Sanz García, Pedro A. Lazo caspase-dependent apoptotic cell death Instituto de Biología Molecular y Celular del Cáncer, Consejo Superior de Investigaciones Científi cas (CSIC), Universidad de Raquel Larramona-Arcas, Laura Martínez-Escardó, María Salamanca; e Instituto de Investigación Biomédica de Salamanca Sánchez-Osuna, Víctor José Yuste Mateos (IBSAL), Hospital Universitario de Salamanca, Salamanca, ES Departamento de Bioquímica y Biología Molecular - Instituto de Los Cuerpos de Cajal (CB) son suborgánulos nucleares implicados Neurociencias, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de en el procesamiento del RNA, importante en el proceso de splicing. El Barcelona, Barcelona, ES ensamblaje de los CB, junto con su proteína scaffold Coilina, se regula a The activation of Caspase-Activated DNase (CAD) prompts to the través del ciclo celular. La quinasa humana VRK1, la actividad de la cual cytoplasmic release of nucleosomes (DNA and histones). The inhibition también es regulada dependiendo del ciclo celular, interacciona y fosforila of CAD blocks double-strand oligonucleosomal DNA fragmentation a Coilina en el residuo serina 184, regulando la estabilidad de los CB. Así, and histone release. Previous results obtained in our laboratory pointed el silenciamiento de esta quinasa, o la falta de suero en el medio, inactivan to an unexpected apoptotic behavior in glioblastoma-derived cells, a VRK1 causando una pérdida en la fosforilación de Coilina y provocando where histones release occurs in the absence of double-strand DNA el desensamblaje de estos suborgánulos nucleares; efecto rescatado por una fragmentation. Then, we took advantage of different human glioblastoma- VRK1 activa pero no por la quinasa inactiva. La pérdida de fosforilación and neuroblastoma-derived cells, over-expressing or not human CAD. de Coilina y posterior desensamblaje de los CB, son recuperados por los Only CAD over-expressing cells treated with an apoptotic insult, such inhibidores del proteasoma. La falta de VRK1 provoca la ubiquitinación, as staurosporine, displayed oligonucleosomal DNA fragmentation during a través de la lisina 48, de Coilina en el núcleo. Este proceso es mediado apoptosis. Then, we compared both, CAD over-expressing and empty en parte por Mdm2, y el exporte al citosol para su degradación en el vector-transfected cells, through Western blot. First, we determined the best proteasoma; de tal forma que este proceso se interrumpe al inhibir el condition to perform the subcellular fractionation with different detergents. exporte nuclear con LeptomicinaB. De este modo, VRK1 protege a Coilina The results obtained revealed a correlation between a high expression de su degradación y es una quinasa esencial para el mantenimiento de la of CAD and the release of the histone core variant H2B in several cell estructura de los Cuerpos de Cajal y su regulación en el ciclo celular. lines, including glioblastoma-derived U87MG and neuroblastoma-derived IMR-5 cells. Moreover CAD infl uenced the internucleosomal histone H1.2 variant release in glioblastoma-derived LN18 and IMR-5 but not in P02-2 U87MG cells. Interestingly, CAD-overexpressing U87MG cells were the Phosphorylation of mineralocorticoid receptor only CAD-transfected cells that remained unable to hydrolyze their DNA at residue S839 impairs aldosterone-dependent into oligonucleosome-sized pieces during apoptosis. Furthermore, a time course of staurosporine treatment in IMR-5 cells revealed that H1.2 variant gene transactivation coupling in a dominant release occurred already at three hours after apoptotic insult. negative manner Ruben Jimenez-Canino Supported by MINECO/FEDER Grant SAF2012-31485 and Generalitat de , Miguel X. Fernandes, Teresa Giraldez, Catalunya (2009SGR-346). This study corresponds to the work performed Diego Alvarez de la Rosa by R.L.-A. under the “Master of Neurosciences” program from UAB. Department of Physiology and Centre for Biomedical Research of the Canary Islands (CIBICAN), University of La Laguna, La Laguna, ES The mineralocorticoid receptor (MR) is a member of the nuclear receptor P01-17 (R01-1) family of transcription factors that transduces the biological effects of the Cellular senescence in tissue remodelling: from steroid hormone aldosterone, including the regulation of transepithelial physiology to pathology sodium reabsorption and blood pressure. Aldosterone interaction with MR ligand binding domain (LBD) is responsible for nuclear translocation, Daniel Muñoz Espín , Manuel Serrano Marugán dimerization and gene transactivation. It has recently been demonstrated Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), Madrid, ES that phosphorylation of S843, a residue near the aldosterone binding Recent discoveries are re-defi ning our view of cellular senescence as a pocket, inactivates human MR, presumably by reducing affi nity for the trigger of tissue remodeling that acts during normal embryonic development hormone. In this work we examined the mechanisms involved in MR and upon tissue damage. In the case of developmental processes, abrogation modulation by S843p. To that end we used mouse MR phosphomimetic of senescence is partially compensated by apoptosis but still results in mutant S839D (equivalent to S843 in human) cotransfected with wild detectable developmental abnormalities. To achieve tissue renewal, type MR in different proportions in COS-7 cells. MR-S839D is inactive senescent cells arrest their own proliferation, recruit phagocytic immune and signifi cantly decreases wild type MR activity when both forms are cells, and promote the mobilization of nearby progenitor cells that repopulate coexpressed. Assuming that MR/MR-S839D dimer formation follows a the tissue. This sequence of events (senescence, followed by clearance and binomial distribution, our results are consistent with a dominant negative then regeneration) may not be effi ciently completed in aged or pathological role of MR-S839D in the dimer. Surprisingly, aldosterone is able to induce contexts, thereby resulting in the accumulation of senescent cells. Increasing nuclear translocation of MR-S839D, although at a slower rate than wild evidence indicates that both pro-senescent therapies and anti-senescent type receptors. Therefore aldosterone is still able to bind to MR-S839D but therapies can be benefi cial. In cancer and during active tissue repair, it is ineffi cient for gene transactivation. Structure modeling of MR LBD pro-senescent therapies contribute to minimize the damage by limiting and docking experiments show that S839D mutation or S839p produce proliferation and fi brosis, respectively. Conversely, anti-senescent therapies the same effect, namely a small decrease in agonist docking energy. may help to eliminate post-repair senescent areas and recover tissue function. Taken together, these results suggest that the effect of S839p cannot be

33 Pósters XXXVII Congreso SEBBM fully explained by decreased aldosterone binding affi nity and may imply a Hospital Universitario La PAZ, IDIPAZ, Madrid, ES, 8Instituto de defect in transactivation coupling. Investigaciones Biomédicas Alberto Sols, CSIC-UAM; Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Hepáticas y Digestivas (CIBERehd), Madrid, ES, 9Instituto de Biomedicina de P02m-3 Valencia (IBV-CSIC); Centro de Investigación Biomédica en Red de Initial age-associated metabolic alterations in Enfermedades Hepáticas y Digestivas (CIBERehd), Valencia, ES different adipose tissue depots: effect of caloric La resistencia a la insulina (RI) participa en la fi siopatología de enfermedades restriction relacionadas con la obesidad como la diabetes mellitus tipo 2 y la enfermedad de hígado graso no alcohólica. Además, la RI está asociada con un estado de Patricia Corrales-Cordón1, Yurena Vivas-García1, Cristina Martínez- infl amación crónica leve que contribuye signifi cativamente a su desarrollo. García1, Adriana Izquierdo Lahuerta1, Carmen Martínez Martínez1, Las ciclooxigenasas 1 y 2 (COX-1 y COX-2) catalizan el primer paso en Maria Jesús Obregón Perea2, Manuel Ros Pérez1, Gema Medina- la biosíntesis de los prostanoides. COX-1 se expresa constitutivamente Gómez1 en diversos tejidos, mientras que la expresión de COX-2 es inducida por 1Universidad Rey Juan Carlos, Alcorcón, ES, 2Instituto de diferentes estímulos. Los hepatocitos adultos son incapaces de inducir la Investigaciones Biomédicas Alberto Sols, CSIC-UAM, Madrid, ES expresión de COX-2 independientemente de los factores proinfl amatorios Changes in the body composition such as high adiposity and sarcopeny presentes. Se ha analizado el papel de la expresión hepática de COX-2 en occur during ageing. These changes are usually associated to metabolic ratones transgénicos (hCOX-2-Tg) en un modelo de RI y de alteración de alterations like insulin resistance, type 2 diabetes and metabolic syndrome. la homeostasis energética inducido por una dieta rica en grasa. Nuestros The fat tissue is not homogeneous and the distribution and function of the resultados muestran que la expresión de COX-2 en el hepatocito protege different deposits of white adipose tissue (WAT) and brown adipose tissue frente a la RI, esteatosis hepática y obesidad, en parte debido a una mayor (BAT) change throughout life. In this study, we have studied different sensibilidad a la insulina, un aumento en la tolerancia a la glucosa, y de la WAT and BAT depots during the fi rst stage of ageing with the objective relación adiponectina/leptina. Asimismo, se observó una disminución de la to detect the initial signals of alteration. Moreover, we have studied the esteatosis hepática, adiposidad y en el área de los adipocitos, de los niveles effect of the long-term caloric restriction (CR) and its benefi ts. 3 and 12- de triglicéridos y ácidos grasos libres tanto hepáticos como plasmáticos, y de month-old mice fed ad lib and 12-month-old mice fed ad lib with a 20% las citoquinas proinfl amatorias. Los ratones hCOX-2-Tg exhibieron también CR have been used. The older animals showed insulin resistance and lower un incremento en el gasto energético, inducción de la termogénesis y de los adiponectin levels in plasma compared with the younger mice. We have niveles de expresión de genes implicados en la oxidación de ácidos grasos, studied expression of different lipid metabolism genes and their regulation así como un aumento en la señalización de insulina hepática (fosforilación in epididimal WAT (eWAT), subcutaneous WAT (scWAT) and BAT. In del receptor de insulina y AKT). Resultados similares se obtuvieron en líneas celulares hepáticas murinas y humanas que sobreexpresan COX-2. Nuestros these initial stages of ageing, expression of Glut4, IRSs and lipogenesis and datos demuestran que la expresión constitutiva de COX-2 en hepatocitos lipolysis genes were decreased in scWAT of 12-month-old animals, but not protege frente a la RI hepática, la adiposidad e infl amación en ratones hCOX- in eWAT. Although visceral WAT has been described as the most dangerous 2-Tg sometidos a una dieta rica en grasa. tissue from the metabolic point of view, our data could suggest an earlier metabolic alteration in scWAT than in eWAT, which were retrieved by long- term CR. In addition, functional markers of BAT (DIO2, LPL, PGC1α) also showed changes in these fi rst stages of ageing, Furthermore, UCP- P02r-5 1 expression was signifi cantly lower in scWAT of aged mice compared Ethanol by activating the innate immune with younger mice, suggesting an age-related loss of sWAT browning. receptors TLR4, promotes neuroinflammation, Our fi ndings suggest that initial age-related metabolic alterations occur in myelin dysfunctions, synaptic alterations and scWAT, where CR could attenuate them. epigenetic modifications in adolescent mice with Acknowledgements: MINECO (BFU2012-33594), CAM (S2010/BMD- binge ethanol drinking 2423). Jorge Montesinos Selfa, Antoni Pla Rodríguez, María Pascual Mora, Ana Isabel Gil Tebar, Clara Mar Guarch Pérez, Consuelo Guerri Sirera P02-4 (R02-3) La expresión hepática de la ciclooxigenasa-2 Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia, ES Adolescence is a brain maturation period from childhood to adulthood. (COX-2) protege de la esteatosis, adiposidad Plastic and dynamic processes occur in specifi c brain regions, such as the y resistencia a la insulina inducida por dieta rica prefrontal cortex (PFC) in which overproduction of axons and synapses, en grasa followed by rapid pruning along with ongoing myelination of axons, enhances neuronal conduction and communication. We demonstrated Daniel E. Francés1, Omar Motiño2, Águeda Fernández-González3, that ethanol by activating the innate immune receptors toll-like receptor 4 Ana Fernández-Álvarez4, Carme Cucarella5, Rafael Mayoral6, (TLR4) induces neuroinfl ammation and brain damage. Considering that the María Fernández-Velasco7, Luis Castro- Sánchez2, Lisardo Boscá8, developmental brain is vulnerable to the effects of ethanol, we investigate Cristina E. Carnovale1, Marta Casado9, Ángela M. Valverde3, whether intermittent ethanol intoxication promotes TLR4-dependent pro- Paloma Martín-Sanz8 infl ammatory processes, leading to myelin and synaptic dysfunctions and 1Instituto de Fisiología Experimental (IFISE-CONICET), Rosario, AR, epigenetic alterations. For this aim, we used wild-type (WT) and TLR4 2Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols, CSIC-UAM, defi cient (TLR4-/-) adolescent mice exposed intermittently to ethanol (3.0 Madrid, ES, 3Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols, g/kg) during 2 weeks. The levels of pro-infl ammatory mediators as well as CSIC-UAM; Centro de Investigación Biomédica en Red de Diabetes different myelin and synaptic proteins were assessed in the PFC 24h after y Enfermedades Metabólicas Asociadas (CIBERdem), Madrid, the last ethanol administration. Our results demonstrate that binge ethanol ES, 4Fundación Instituto Leloir, IIBBA-CONICET, Buenos Aires, treatment activated TLR4 pathway (MAPKs, p-p65) triggering the up- AR, 5Instituto de Biomedicina de Valencia (IBV-CSIC), Valencia, regulation of several pro-infl ammatory mediators (iNOS, COX-2), cytokines ES, 6Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades (IL-1β, TNF-α) and chemokines (MCP1, MIP1α). Ethanol treatment also Hepáticas y Digestivas (CIBERehd); Department of Medicine, decreased myelin protein levels (PLP, CNPase, MAG, MBP, NG-2) and University of California, Madrid, ES, 7Instituto de Investigación synaptic-related proteins levels (synapsin, syntaxin, SNAP-25) in PFC of

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WT mice, while no differences were observed in TLR4-/- PFC. Electron estudiado las células madre derivadas del tejido adiposo, su conversión microscopy studies showed that ethanol treatment damages myelin a adipocito y sus propiedades como célula diferenciada, prestando una sheath and alters synaptic structure in WT PFC. Ethanol treatment also especial atención a los cambios en parámetros mitocondriales. La difi cultad increased HAT activity, the levels of acetylated H3 and H4 and upregulated en la preparación de estos modelos consiste en la generación del estado the expression of immediate-early-genes related to plasticity and drug rho0, carente de mtDNA, previo a la construcción del cíbrido. Mientras addiction (bdnf, c-fos, egr1, fosb) in a TLR4-dependent manner. These trabajamos en la resolución de este problema, podemos simular diferentes fi ndings suggest that activation of TLR4 signaling by intermittent ethanol mutaciones en el mtDNA, preferentemente en los genes para los RNA de intoxication during adolescence alters synaptic plasticity, causes myelin transferencia, mediante el uso de distintos xenobióticos. Concretamente, and synaptic derangements and induces epigenetic modifi cations, that hemos elegido el linezolid, un antibiótico de amplio espectro que se une could be associated to addictive behaviour. a la subunidad grande ribosomal y ha demostrado ser un potente inhibidor de la transcripción mitocondrial. De esta manera, es posible analizar el Supported by SAF-2012-33747 and ERAB (EA-13-08). efecto de una disfunción en la expresión de genes mitocondriales sobre la diferenciación celular y su función como célula madura.

P02r-6 Financiación: Instituto de Salud Carlos III (FIS-PI10/00662 y PI11/01301). The innate immune receptors TLR4 participate in ethanol-induced proteolytic dysfunctions in glial P02m-8 (R02-7) cells Potenciació n de la capacidad de quemar grasas Antoni Pla Rodríguez, María Pascual Mora, Consuelo Guerri Sirera del tejido adiposo marrón como terapia contra Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia, ES la obesidad y la diabetes de tipo 2 Ethanol is a neurotoxic compound and its abuse induces brain damage María Calderón-Domínguez and can lead to neurodegeneration. Ethanol triggers infl ammatory , Raquel Fucho, Joan Francesc Mir, processes in glial cells, upregulating cytokines and other infl ammatory Minéia Weber, Anna Orozco, Dolors Serra, Laura Herrero mediators through the activation of Toll-like receptor 4 (TLR4) signaling. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Institut de Recent evidence indicates the role of protein degradation pathways in Biomedicina de la Universitat de Barcelona-IBUB, Universitat de neurodegeneration and in alcoholic liver disease, but how these processes Barcelona - CIBER Fisiopatología de la Obesidad y la Nutrición- affect the brain remains elusive. We have recently demonstrated that CIBEROBN, Instituto de Salud Carlos III, Barcelona, ES chronic ethanol consumption alters the two major protein degradation En el 2009, cinco grupos de investigación independientes identifi caron que pathways, the ubiquitin-proteasome system (UPS) and the autophagy- el tejido adiposo marrón (TAM), que se pensaba exclusivo de roedores y lysosome pathway (ALP), in mouse brain, and that TLR4 participates in neonatos, no sólo estaba presente sino también activo en humanos adultos. these proteolytic dysfunctions. With this study, we aim to evaluate the Curiosamente observaron que su actividad disminuía en pacientes obesos y effect of an acute dose of ethanol (50 mM) on WT and TLR4-/- mice glial diabéticos, lo que indica que este tejido participa en la termogénesis inducida, cells at different time points, through the use of techniques such as western ya sea por el frío o por la dieta. Esto situó al TAM en el punto de mira, ya blot, fl ow cytometry or confocal and electron microscopy. Our results que cualquier estrategia capaz de eliminar el exceso de lípidos de la obesidad show that a single dose of ethanol induces an overexpression of several podría ser benefi cioso para la salud. Por esta razón nos centramos en la autophagy markers (ATG12, LC3-II and CTSB). Ethanol also produces an oxidación de los ácidos grasos (FAO, fatty acid oxidation), y su enzima clave, increase in the number of autophagic vacuoles and lysosomes, which is la carnitina palmitoiltransferasa 1 (CPT1). En el presente trabajo proponemos accompanied by a basifi cation of the lysosomal pH. These changes in the que un aumento de la FAO en el TAM reduciría los niveles de los lípidos y ALP could be in part due to a reduction of the phosphorylation levels of mejoraría el fenotipo obeso y diabético. Para ello sobrexpresamos en una the autophagy inhibitor mTOR. Ethanol also alters the UPS and induces línea celular de adipocitos marrones la forma mutante permanentemente the formation of the immunoproteasome, by promoting the expression of activa de la CPTIA, la CPTIAM, la cual es insensible a su inhibidor several of its inducible subunits (β1i, β5i and PSME1). Interestingly, only fi siológico, el malonil-CoA. Observamos que los adipocitos marrones que minor changes in the proteolytic pathways were found between control and sobreexpresan la CPT1AM muestran un aumento en la FAO, en la expresión ethanol-treated TLR4-/- mice glial cells. Together, these results indicate de la proteína UCP1,y reduce el incremento del contenido de triglicéridos that a single dose of ethanol is capable of affecting proteolytic pathways in inducido por el palmitato. Además de recuperar los niveles de marcadores the brain in a TLR4-dependent manner. These fi ndings could provide new proinfl amatorios y marcadores relacionados con el síndrome metabólico, en insight into the mechanisms underlying ethanol-induced brain damage. comparación con las células GFP control. En conclusión, hemos conseguido mejorar el fenotipo obeso y diabético a través del aumento de la FAO en Supported by SAF2012-33747, PNSD, RTA-Network, RD12-0028-007. nuestro modelo celular, con el propósito de dar un nuevo enfoque terapéutico para el tratamiento de la diabetes inducida por la obesidad.

P02r-7 Disfunción OXPHOS y diferenciación celular P02-9 Laura Llobet1, Eldris Iglesias1, Alba Pesini1, Virginia Borobia1, Sonia Increased serum- and glucocorticoid- Emperador1, Ester López-Gallardo1, Julio Montoya1, Eduardo Ruiz- inducible kinase 1 (SGK1) activity potentiates Pesini2 mineralocorticoid/NaCl-induced renal but not 1 2 Universidad de Zaragoza - CIBERER, Zaragoza, ES, Universidad cardiac fibrosis de Zaragoza - CIBERER - ARAID, Zaragoza, ES Las líneas celulares transmitocondriales han sido un excelente modelo Catalina Sierra Ramos1, Guadalberto Hernández Hernández1, para el estudio de las mutaciones patológicas en el mtDNA, ya que Eduardo Salido2, Diego Álvarez de la Rosa1 reproducen exactamente el ambiente genómico humano. Sin embargo 1Department of Physiology, Centre for Biomedical Research of the presentan algunos inconvenientes como son la aneuploidía (por derivarse Canary Islands-CIBICAN, University of La Laguna, La Laguna, ES, generalmente de líneas celulares tumorales) y la falta de capacidad de 2Centre for Biomedical Research of the Canary Islands-CIBICAN diferenciación. Estos problemas pueden ser soslayados utilizando células - Centre for Biomedical Research on Rare Diseases-CIBERER, madre adultas, euploides y fácilmente diferenciables. Nosotros hemos University of La Laguna, La Laguna, ES

35 Pósters XXXVII Congreso SEBBM

The mineralocorticoids aldosterone and deoxycorticosterone acetate P02r-11 (DOCA) stimulate renal tubular salt reabsorption, increase salt appetite, Identification of bone morphogenetic protein 9 induce extracellular volume expansion, and elevate blood pressure. (BMP9) as a novel fibrogenic factor Mineralocorticoid excess induces deleterious effects on cardio- José Manuel Muñoz Félix1 1 1 renal function, including the development of fi brosis. The effects of , Nuria Perretta-Tejedor , Cristina Cuesta , 1 2 3 mineralocorticoids on renal tubular Na+ reabsorption and salt appetite José Miguel López-Novoa , Sabine Bailly , Carlos Martínez-Salgado 1 involve the serum- and glucocorticoid-inducible kinase 1 (SGK1). The Unidad de Fisiopatología Renal y Cardiovascular, Instituto present experiments explored the involvement of excess SGK1 activity “Reina Sofía” de Investigación Nefrológica, Departamento de in the development of mineralocorticoid/NaCl-induced cardiac and renal Fisiología y Farmacología, Universidad de Salamanca - Instituto fi brosis. To this end, transgenic mice (Tg.SGK1), made with a bacterial de Investigación Biomédica de Salamanca-IBSAL, Salamanca, ES, 2Inserm, U1036 - Commissariat a` l’Energie Atomique et artifi cial chromosome containing the SGK1 gene with a point mutation aux Energies Alternatives, Université de Grenoble, Grenoble, rendering the kinase constitutively active, and their wild-type littermates FR,3Unidad de Fisiopatología Renal y Cardiovascular, Instituto were uninephrectomized, treated with DOCA and given 1% NaCl in the “Reina Sofía” de Investigación Nefrológica, Departamento de drinking water for 6 weeks. The treatment led to a signifi cant increase in Fisiología y Farmacología, Universidad de Salamanca - Instituto blood pressure in both genotypes, slightly more pronounced in Tg.SGK1 de Estudios de Ciencias de la Salud de Castilla y León-IECSCYL, mice. Histology after 6 weeks treatment revealed marked glomerular, Unidad de Investigación, Hospital Universitario de Salamanca, perivascular and tubulointerstitial fi brosis in the kidney cortex, which Salamanca, ES was signifi cantly greater in Tg.SGK1 mice. In contrast, treated animals Tubulointerstitial fi brosis, a common endpoint of chronic kidney disease, developed cardiac fi brosis without signifi cant differences between is characterized by the presence of myofi broblasts and an excessive genotypes. Enhanced SGK1 activity without DOCA/NaCl treatment did accumulation of extracellular matrix (ECM) proteins in the tubular not produce fi brosis. Our results demonstrate that increased SGK1, while interstitium. Transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) is a cytokine not suffi cient to induce fi brosis without added stimuli, plays a decisive role with a relevant contribution to fi brotic development. We have previously in tissue-specifi c mineralocorticoid/NaCl-induced fi brosis. observed an increased expression of the TGF-β type I receptor ALK1 in fi brotic kidneys after unilateral ureteral obstruction (UUO), and the bone morphogenetic protein-9 (BMP9) is a strong ligand for ALK1 in endothelial P02-10 (R02-1) cells. Thus, we aim to identify the effect of BMP9 on ECM protein Una dieta rica en cacao atenúa la resistencia expression and its possible involvement in renal fi brosis development. a la insulina en las ratas ZDF We used mouse embryo fi broblasts (MEFs) stimulated with BMP9. We analyzed collagen I, fi bronectin and connective tissue growth factor Isabel Cordero-Herrera1, María Angeles Martín Arribas1, Fernando (CTGF) expressions; we evaluated expression of phosphorylated Smads 2 2 1 Sonia Escrivá Pons , Carmen Alvarez Escolá , Luis Goya Suárez , (BMPs induced-Smad1/5/8) and TGF-β1-induced Smad2/3. UUO was Ramos Rivero1 performed in BMP9 defi cient mice and their respective controls, and renal 1Departamento de Metabolismo y Nutrición. Instituto de Ciencia tissue fi brosis was analyzed by Red Sirius and Masson´s trichrome staining. y Tecnología de Alimentos y Nutrición (ICTAN-CSIC), Madrid, ES, BMP9 (20 ng/ml) induced an increase in collagen I, fi bronectin and CTGF 2Departamento de Bioquímica y Biología Molecular II. Facultad de expression in MEFs, as well as an increase in Smad1/5/8 phosphorylation Farmacia, Universidad Complutense de Madrid (UCM). CIBER de –normally induced through ALK1/2/3/6 receptors- and in Smad2/3 Diabetes y Enfermedades Metabólicas (CIBERDEM), Madrid, ES phosphorylation –induced by ALK4/5/7 receptors. Inhibition of both groups La resistencia a la insulina es una de las principales características de la of receptors with SB431542 (ALK4/5/7 inhibitor) and dorsomorphin-1 diabetes tipo 2 (1). El cacao presenta ciertos efectos antidiabéticos (2,3), (ALK1/2/3/6 inhibitor) reduced BMP-9-induced ECM protein expression. Obstructed kidneys from Bmp9-/- mice developed less renal fi brosis than pero aún no se conoce con exactitud el mecanismo molecular de acción por their respective controls. el cual ejerce dichas actividades benefi ciosas sobre la señalización de la Our data suggest that BMP9 regulates renal fi brosis stimulating ECM insulina en el hígado. protein expression by MEFS, due to an activation of receptors that El objetivo de este trabajo fue investigar el potencial preventivo de una phosphorylate Smad1/5/8 and Smad2/3 proteins. dieta rica en cacao sobre la señalización de la insulina en una situación prediabética en el hígado de las ratas ZDF (14 semanas de vida). La dieta rica en cacao (10%) mejoró la hiperglucemia y la respuesta al test de P02r-12 tolerancia a la glucosa, a la vez que disminuyó el peso corporal. Además, Depleción del DNA mitocondrial (mtDNA) debida el cacao previno el aumento de la fosforilación en Ser307 y Ser636/639 de IRS-1 respecto a los animales ZDF que recibían la dieta control, mostrando a una mutación en el gen MT-TW valores similares a los de las ratas control (ZLean). De manera similar, los Sonia Emperador1, Ester López-Gallardo1, Cristina Ruiz-Ruiz2, Alba animales alimentados con la dieta rica en cacao mostraron unos niveles de Pesini2, Maria Dolores Fuentes2, Laura Llobet2, Eldris Iglesias2, p-GSK3, p-GS y glucógeno comparables a los de las ratas ZLean. Eduardo Ruiz-Pesini3, Julio Montoya1 Por su parte, los valores de PEPCK, aumentados en las ratas ZDF, 1Universidad de Zaragoza- CIBERER, Zaragoza, ES, 2Universidad de regresaron a niveles control en aquellos animales que recibían la dieta rica Zaragoza, Zaragoza, ES, 3ARAID-Universidad de Zaragoza, Zaragoza, ES en cacao, mientras que GK y GLUT-2 no parecieron modifi carse en ningún Mutaciones en genes que codifi can para tRNAs mitocondriales son caso. Estos datos sugieren que una dieta rica en cacao podría mejorar la responsables de causar un número importante de patologías en humanos. resistencia a la insulina al prevenir la atenuación de la señalización de la En este trabajo presentamos el caso de un niño con síndrome de Leigh en hormona que se produce en el hígado en la diabetes tipo 2. el que, mediante secuenciación del mtDNA completo, encontramos una inserción de una timina en la posición 5537, que corresponde al gen MT- Bibliografía TW. Esta mutación había sido previamente descrita en otro paciente con Klover & Mooney: Int J Biochem Cell Biol 2004, 36: 753-8. enfermedad mitocondrial. Cordero-Herrera et al.: Mol Nutr Food Res 2013, 57: 974-85. Para confi rmar el efecto funcional de esta mutación, construimos cíbridos Cordero-Herrera et al.: Food Chem Toxicol 2014, 64: 10-19. transmitocondriales usando la línea rho0 de carcinoma de pulmón humano A549. En estos cíbridos observamos una caída en la actividad y cantidad del Agradecimientos: AGL2010-17579, CSD2007-00063. complejo respiratorio IV, disminución de la cantidad de ATP mitocondrial

36 Granada 2014 Pósters y ausencia de síntesis mitocondrial de proteínas. De forma más llamativa, de la leptina sobre la expresión de la sialofosfoproteina dentinaria (DSPP) detectamos una pérdida completa del mtDNA. Un hallazgo similar se había por las células pulpares humanas. ya descrito en cíbridos NT2 portadores de la m.3243A>G en MT-TL1. Metodología: Veinticinco muestras de pulpa dental humana se obtuvieron Nuestros resultados sugieren que mutaciones patológicas de genes que de terceros molares recién extraídos libres de caries y sin restauración. Las codifi can tRNA mitocondriales, en fondos genéticos nucleares particulares, muestras de pulpa fueron procesadas y la mineralización producido por podrían llevar a depleción del mtDNA. Por lo que quizás se deba secuenciar odontoblastos en respuesta a la leptina se determinó mediante el análisis estos genes en los síndromes de depleción. de la expresión de DSPP por inmunoblot y por PCR a tiempo real (qRT- PCR). La localización de LEPR en la pulpa dental fue examinada por Financiación: ISCIII; FIS (PI10-00662; PI 11-01301); CIBERER. inmunohistoquímica usando anticuerpo monoclonal anti-LEPR humano. Resultados: La immunoreactividad para los anticuerpos anti-LEPR se localizó especialmente en el estrato odontoblástico y a nivel de la P02-13 predentina. La leptina estimuló de forma dosis-dependiente la expresión de Sistema OXPHOS, nucleótidos de pirimidina, DSPP en la pulpa humana. El análisis del Western blot de las muestras de y la enfermedad de Alzheimer pulpa estimuladas con leptina reveló la presencia de una proteína de peso molecular aparente ~ 100 kDa, correspondiente al peso molecular estimado Alba Pesini1, Eldris Iglesias1, Nuria Garrido2, M. Pilar Bayona- de la DSPP. La expresión del ARNm de la DSPP se confi rmó por análisis Bafaluy2, Laura Llobet1, Sonia Emperador1, Ester López-Gallardo1, de qRT-PCR , y el tamaño de los fragmentos amplifi cados (280 pares de 2 1 Eduardo Ruiz Pesini2 Antonio Galarreta , Julio Montoya , bases) fue confi rmado por electroforesis en gel de agarosa. 1Universidad de Zaragoza- CIBERER, Zaragoza, ES, 2Universidad de Conclusión: Por primera vez se ha demostrado que los odontoblastos Zaragoza, Zaragoza, ES humanos expresan el receptor de leptina (LEPR) y que la interacción de La enfermedad de Alzheimer (AD) es una enfermedad neurodegenerativa la leptina con este receptor estimula la producción por el odontoblasto crónica y progresiva, clínicamente caracterizada por la pérdida de memoria de sialofosfoproteína dentinaria (DSPP). Estos hallazgos sugieren y el declinar cognitivo. Los sellos histopatológicos de la enfermedad que la leptina juega un papel en la respuesta defensiva pulpar y en la son el acúmulo de placas extracelulares de péptido beta-amiloide, los dentinogénesis. ovillos neurofi brilares intracelulares compuestos por la proteína tau hiperfosforilada, la pérdida de sinapsis y la degeneración neuronal. Una disfunción del sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS) ha sido P02-15 (R02-5) implicada en la patogénesis de AD. De hecho, la cadena transportadora Obesity-related glycogen mishandling in human de electrones podría tener un papel relevante en la formación de las adipose tissue: a key feature of metabolic stress membranas celulares y de las sinapsis entre las neuronas, ya que la cadena respiratoria participa en la síntesis de novo de nucleótidos de pirimidina, Sonia Fernández-Veledo1, Victoria Ceperuelo-Mallafre1, Xavier que son claves en la producción de fosfolípidos, principal compuesto de Duran1, Kelly Roche1, Catalina Núñez-Roa1, Marta Montori-Grau2, todas las membranas. Lourdes Garrido-Sánchez3, Francisco J. Tinahones3, Anna Mª Para estudiar cómo afectaría la disfunción en el sistema OXPHOS a la Gomez-Foix2, Joan Vendrell1 producción de neuritas y diferenciación neuronal, utilizamos la línea 1Hospital Universitari de Tarragona Joan XXIII - IISPV - URV celular de neuroblastoma SK-N-BE(2)C. Cultivamos y diferenciamos esta - CIBERDEM, Tarragona, ES, 2Departamento de Bioquímica y línea celular en ausencia o presencia de azida sódica (NaN3) o carbonyl Biología Molecular, Institut de Biomedicina de la Universitat de cyanide-4-(trifl uoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP), que disminuirían Barcelona-IBUB, Universitat de Barcelona - CIBERDEM, Barcelona, o aumentarían, respectivamente, el fl ujo de electrones a través de la cadena ES, 3Hospital Universitario Virgen de la Victoria - CIBERObn, respiratoria y por lo tanto quizás podrían alterar negativa o positivamente Malaga, ES la síntesis de nucleótidos de pirimidina. Background: Obesity leads to excess lipid storage in adipocytes resulting En un primer paso hemos puesto a punto las concentraciones de las drogas in the derangement of carbohydrate metabolism. It is well-known that que afectan el consumo de oxígeno, pero no la viabilidad celular. hepatic glycogen is increased under pathologic circumstances associated with obesity such as insulin resistance. Though at low levels, studies in Financiación: Instituto de Salud Carlos III [FIS-PI 10/00662 y PI murine models revealed that adipose tissue (AT) might contain glycogen 11/01301], Instituto de Investigación Sanitaria de Aragón (IIS), Asociación stores. However, to date the physio(patho)logical role of glycogen de Enfermos de Patología Mitocondrial (AEPMI) y Universidad de metabolism in human adipose tissue remains unexplored. Zaragoza-Banco de Santander (UZ2012-BIO-01). Methodology: Glycogen accumulation was studied in human adipocytes and adipose tissue from lean and obese patients by different methodological approaches (PAS, immunofl uorescence and TEM). PTG, the only glycogen- P02r-14 Efecto estimulador de la leptina sobre associated regulatory subunit (PP1-GTS) reported in murine adipocytes, was overexpressed by adenoviral transfection in human adipocytes to la producción de sialofosfoproteína dentinaria explore the metabolic effects of enforced glycogen deposition. Glycogen (DSSP) en la pulpa dental humana metabolism gene expression was analyzed in subcutaneous (SAT) and visceral (VAT) AT from lean and obese subjects in two independent cohorts. Jenifer Martin Gonzalez1 2 , Antonio Pérez-Pérez , Flora Sánchez Results: Hypoxia, which has been related to obesity-related AT dysfunction, Jiménez2, Juan José Segura Egea1, Víctor Sánchez Margalet2 promotes glycogen accumulation in human adipocytes. Enforced glycogen 1Departamento de Estomatología, Facultad de Odontología, deposition by PTG adenoviral overexpression, modifi ed adipokine secretion 2 Universidad de Sevilla, sevilla, ES, Departamento de Bioquímica, and caused insulin resistance in human adipocytes. Human myocytes Biología molecular e Inmunología, Facultad de Medicina, cultured with Ad-PTG adipocyte conditioned media also shown a decrease Universidad de Sevilla, sevilla, ES in insulin responsiveness. Clinical studies in two human independent Objetivo: La leptina, un mediador de la respuesta infl amatoria, y su receptor cohorts revealed that obesity is associated with changes in AT glycogen (LEPR) se expresan en la pulpa dental humana. La sialofosfoproteina metabolism gene expression being PPP1R3E the most predominant PP1- dentinaria (DSPP) es una proteína implicada en la odontogénesis y en la GTS isoform in human fat depots. An increased level of glycogen synthase respuesta reparativa dentino-pulpar. Esta investigación tiene como objetivo protein expression that correlates with enhanced glycogen deposition was describir la localización inmunohistoquímica de LEPR y estudiar el efecto detected in SAT from obese patients.

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Conclusions: Increased glycogen deposition in AT in obesity modifi es the apoptosis in endothelial cells through chromatin condensation, DNA endocrine function of human adipocytes and might contribute to obesity- fragmentation, increases in the subG1 peak and caspase activation. The related comorbidities. data shown here altogether indicate for the fi rst time that AD0157 displays antiangiogenic effects, both in vitro and in vivo, that are exerted partly by targeting the Akt signaling pathway in activated endothelial cells. The fact P02-16 that these effects are carried out at lower concentrations than those required Influencia de xenobióticos ambientales for other inhibitors of angiogenesis makes AD0157 a new promising en la neuropatía óptica hereditaria de Leber drug candidate for further evaluation in the treatment of cancer and other angiogenesis-related pathologies. Ester Lopez Gallardo1, Luis Diez2, Sonia Emperador1, Iñigo Martinez-Romero2, Laura Llobet2, Eldris Iglesias2, Alba Pesini2, Our experimental work is supported by grant P12-CTS-1507 (Andalusian Eduardo Ruiz-Pesini2, Julio Montoya2 Government and FEDER) and funds from group BIO-267 (Andalusian 1Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Raras Government). The “CIBER de Enfermedades Raras” is an initiative from (CIBERER), Zaragoza, ES, 2Dto. Bioquímica y Biología Molecular- the ISCIII (Spain). This communication has the support of a travel grant Facultad de Veterinaria-Universidad de Zaragoza, Zaragoza, ES “Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía El genoma mitocondrial contiene 37 genes, todos ellos esenciales para el Tech”. buen funcionamiento del sistema de fosforilación oxidativa. Mutaciones en estos genes pueden causan un défi cit de energía y causar enfermedades mitocondriales. Los efectos y la severidad de las enfermedades P02r-18 mitocondriales pueden variar enormemente. Las mutaciones patológicas Regulación de la expresión génica por Wnt3A son usualmente heteroplásmicas mientras que los polimorfi smos neutros en fibroblastos de colon humano son homoplásmicos. Sin embargo, hay algunas excepciones, por ejemplo, Núria Niell, Luis del Peso, José Manuel González-Sancho las mutaciones que causan LHON (Neuropatía Óptica Hereditaria de Bioquímica, Universidad Autónoma de Madrid, Madrid, ES Leber) son homoplásmicas en la mayoría de los casos. Esta enfermedad muestra una penetrancia incompleta, por ello, es importante investigar qué Las vías de señalización por factores Wnt son esenciales en muchos factores genéticos y/o ambientales modulan la expresión del fenotipo. En procesos del desarrollo humano, y también para mantener la homeostasis el presente trabajo hemos usado el modelo de cíbridos transmitocondriales del tejido adulto. La vía Wnt/β-catenina o canónica es la mejor conocida, portadores de una mutación causante de LHON (3460/ND1) para estudiar aunque también existen vías no canónicas, independientes de β-catenina. la combinación de dicha mutación con varias xenobióticos (factores En el colon, la vía canónica tiene una importancia fundamental y aparece ambientales) y qué importancia puede tener en el desencadenamiento desregulada en la práctica totalidad de cánceres colorrectales. Los factores de la patología del paciente. Los resultados obtenidos muestran que Wnt son secretados por los fi broblastos pericriptales y actúan sobre las dicha mutación en presencia de los xenobióticos analizados (rotenona, células epiteliales de la mucosa colónica. Sin embargo, no se sabe si estos capsaicina, anonacina) muestra diferencias en la función mitocondrial. factores actúan también de forma autocrina sobre los propios fi broblastos que los secretan, alterando su patrón de expresión génica. Para intentar Financiación: Instituto de Salud Carlos III-FIS (PI10-00662; PI 11- resolver esta incógnita, nuestro grupo se propuso estudiar el efecto de 02301), Fundación ARAID-Programa de Apoyo a la I+D+I para jóvenes Wnt3A, que activa la vía canónica, sobre la línea de fi broblastos primarios investigadores 2010, y Centro de Investigación en Red en Enfermedades de colon CCD18-Co. Para ello utilizamos una técnica de secuenciación raras (CIBERER). CIBERER es una iniciativa de ISCIII. masiva de alta resolución (RNAseq), seguida de un análisis bioinformático. El análisis estadístico nos proporcionó una lista de genes regulados diferencialmente, de los que una muestra ha sido validada mediante qPCR P02-17 y western blot. Dos de los genes validados se regulan a tiempos cortos, AD0157, a pyrrolidinedione fungal metabolite, lo que sugiere un posible mecanismo transcripcional directo. También inhibits angiogenesis by targeting the Akt aparecen genes que codifi can proteínas de la propia vía Wnt/β-catenina, o muy relacionadas con ella. De esta lista se han seleccionado varios genes signaling pathway que serán sometidos a un estudio más profundo con el fi n de analizar el mecanismo de su regulación por factores Wnt y el efecto de sus cambios Melissa García-Caballero1, Librada Cañedo2, Antonio Fernández- de expresión sobre el fenotipo, proliferación o capacidad tumorogénica de Medarde2, Miguel Ángel Medina Torres3, Ana R. Quesada3 los fi broblastos de colon. 1Universidad de Málaga, Andalucía Tech, Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de Ciencias, and IBIMA (Biomedical Research Institute of Málaga), Málaga, ES, 2Biomar P02-19 Microbial Technologies, Parque Tecnológico de León, Armunia Cocoa enriched-diet attenuates loss of beta (León), ES, 3Universidad de Málaga, Andalucía Tech, Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de Ciencias, and cell mass and function in Zucker diabetic rats IBIMA (Biomedical Research Institute of Málaga). Unidad 741, by preventing beta cell oxidative stress and CIBER de Enfermedades Raras (CIBERER), Málaga, ES apoptosis In the course of a screening program for the inhibitors of angiogenesis 1 2 2 from marine sources, AD0157, a pyrrolidinedione fungal metabolite, Elisa Fernández-Millán , Isabel Cordero-Herrera , Sonia Ramos , 3 3 Luis Goya2 was selected for its angiosupressive properties. AD0157 inhibited the Fernando Escrivá , Carmen Alvarez , , María Angeles 3 growth of endothelial and tumor cells in culture in the micromolar range. Martín 1 Our results show that subtoxic doses of this compound inhibit certain CIBER de Diabetes y Enfermedades Metabólicas (CIBERDEM), 2 functions of endothelial cells, namely, differentiation, migration and Madrid, ES, Dpto. de Metab. y Nutr., ICTAN (CSIC), Madrid, 3 proteolytic capability. Inhibition of the mentioned essential steps of in vitro ES, Dpto. Bioq. y Biol. Mol. II, Fac. Farmacia, UCM - CIBER de angiogenesis is in agreement with the observed antiangiogenic activity, Diabetes y Enfermedades Metabólicas (CIBERDEM), Madrid, ES substantiated by using two in vivo angiogenesis models, the chorioallantoic Oxidative stress has been largely implicated in the pathogenesis of membrane and the zebrafi sh embryo neovascularization assays, and by the pancreatic beta cell failure observed in type 2 diabetes (T2D). Consequently, ex vivo mouse aortic ring assay. Our data indicate that AD0157 induces identifi cation of natural antioxidant compounds that enhance or preserve

38 Granada 2014 Pósters islet beta cell mass and function is considered an emerging strategy to P02-21 prevent or treat T2D [1]. We have recently showed that fl avanol epicatechin Las células madre neurales (hNSC) un modelo and microbial-derived fl avonoid metabolites from cocoa may have anti- para el estudio del papel de los polimorfismos diabetic potential by promoting survival and function of pancreatic beta cells in vitro [2]. However, it is unknown whether this effect can be mitocondriales en la enfermedad de Parkinson achieved in vivo. Therefore, in this work we investigated the effect of a Eldris Iglesias, Laura Llobet, Alba Pesini, Sonia Emperador, Ester cocoa-rich diet preventing β-cell deterioration in an animal model of T2D López-Gallardo, Julio Montoya, Eduardo Ruiz-Pesini and the mechanisms involved. Universidad de Zaragoza-CIBERER, Zaragoza, ES Male Zucker diabetic (ZDF) rats were fed control or 10% cocoa enriched diets in the pre-diabetic state (from 6 to 14 weeks of life) and Zucker lean La enfermedad de Parkinson (PD) es una enfermedad neurodegenerativa (ZL) rats were used as control. Glucose tolerance test (GTT), beta cell causada por la destrucción de las neuronas dopaminérgicas. Muchos mass, beta cell apoptosis and pancreatic markers of apoptosis and oxidative factores se han relacionado con esta enfermedad, tales como mutaciones stress were evaluated. Animals fed with cocoa rich diet improved fasting en genes nucleares (nDNA), algunos de los cuales están implicados en hyperglycemia, hyperinsulinemia and GTT. Besides, histopathological la replicación y expresión del DNA mitocondrial (mtDNA), mutaciones study of the pancreas of these animals indicated that cocoa feeding directamente en el mtDNA y, fi nalmente, la acción de diversos xenobióticos preserved beta cell mass and prevented beta cell apoptosis. Finally, we que causan la disfunción del sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS) showed that cocoa diet enlarged the pancreatic concentration of enzymatic muchos de cuyos componentes están codifi cados en el mtDNA. Por lo and non-enzymatic endogenous antioxidant defences preventing thus tanto, el mtDNA parece jugar un papel importante en la PD. oxidative stress in ZDF rats. El desarrollo de un modelo de células neuronales dopaminérgicas estable These fi ndings provide the fi rst in vivo evidence that a cocoa-rich diet may y fi able es especialmente necesario para el estudio de la patogénesis de delay the development of T2D in the ZDF rat by preventing pancreatic esta enfermedad y el desarrollo de estrategias terapéuticas. Las células oxidative stress and beta cell apoptosis. Therefore, cocoa fl avonoids madre neurales (hNSC) constituyen células euploides con potencial para could be considered as candidates to ameliorate hyperglycemia and delay diferenciarse en neuronas dopaminérgicas. En este trabajo presentamos la deterioration of beta cell mass and function in T2D. caracterización genética de genes nucleares y mitocondriales asociados a PD y los cambios genéticos moleculares y bioquímicos que se producen References tras la diferenciación a neuronas, en particular en relación al sistema [1] Robertson, RP. Theraphy Discov Med 9:132-137 (2010) OXPHOS. [2] Fernández-Millán et al. Food Chem Toxicol 66:245-253 (2014) Financiación: ISCIII; FIS 10-00662, 11-01301; CIBERER. Acknowledgments: Grants AGL2010–17579, CSD2007-00063, BFU2011- 25420 from Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) and CIBER de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas (CIBERDEM, P02r-22 ISCIII) Spain. Role of mitochondria ROS generation in ethanol- induced TLR4/NLRP3 inflammasome activation

P02r-20 and cell death in astroglial cells DICKKOPF-1 (DKK-1) reduce el potencial Silvia Alfonso-Loeches, Juan Uneña, M Jose Morillo, Jorge Oliver-de tumorogénico de células de sarcoma de Ewing la Cruz, Consuelo Guerri Sirera Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia, ES Lorena Paule, Núria Niell, Luis del Peso, José Manuel González- Sancho Toll-like receptors (TLRs) and Nod-like receptors (NLRs) are innate Bioquímica, Universidad Autónoma de Madrid, Madrid, ES immunity sensors that provide an early/effective response to pathogenic or injury conditions. We have reported that ethanol-induced TLR4 El sarcoma de Ewing es la segunda causa de cáncer de hueso en niños activation triggers signaling infl ammatory responses in glial cells, causing y adultos jóvenes. Se caracteriza por la presencia de translocaciones neuroinfl ammation and brain damage. However, it is uncertain if ethanol cromosómicas, que en aproximadamente el 90% de los casos ocurren entre is able to activate NLRs /infl ammasome in astroglial cells, which is the los cromosomas 11 y 22 y generan la proteína de fusión EWS/FLI1, que es un factor de transcripción aberrante con propiedades oncogénicas. Los mechanism of activation, and whether there is crosstalk between both factores Wnt activan, entre otras, la vía de señalización Wnt/β-catenina que immune sensors in glial cells. Here we show that chronic ethanol treatment se encuentra desregulada en numerosos cánceres humanos. Nuestro grupo increases the co-localization of caspase-1 with GFAP+ cells, and up- ha demostrado previamente que esta vía está constitutivamente inhibida en regulates IL-1β and IL-18 in the frontal medial cortex in WT, but not in sarcoma de Ewing debido a la acción de EWS/FLI1. Asimismo, la expresión TLR4 knock-out mice. We further show that cultured cortical astrocytes de DICKKOPF-1 (DKK-1), un inhibidor extracelular de la vía Wnt/β- expressed several infl ammasomes (NLRP3, AIM2, NLRP1 and IPAF), catenina y a la vez gen diana de la misma, es inhibida transcripcionalmente although NLRP3 mRNA is the predominant form. Ethanol, as ATP and por EWS/FLI1. En este trabajo hemos reexpresado DKK-1 en cuatro LPS treatments, up-regulates NLRP3 expression, and causes caspase-1 líneas celulares de sarcoma de Ewing con el fi n de determinar la cleavage and the release of IL-1β and IL-18 in astrocytes supernatant. relevancia funcional de su silenciamiento en esta neoplasia. Experimentos Ethanol-induced NLRP3/caspase-1 activation is mediated by mitochondrial de proliferación y supervivencia usando MTS no han mostrado un (m) ROS generation because when using a specifi c mitochondria ROS efecto signifi cativo de DKK-1 sobre el crecimiento y la sensibilidad a scavenger, the mito-TEMPO (500 mM) or NLRP3 blocking peptide (4mg/ quimioterápicos (vincristina y doxorubicina, habituales en el tratamiento ml) or a specifi c caspase-1 inhibitor, Z-YVAD-FMK (10 mM), abrogates de este tumor) de las líneas A673, TC-71, A4573 y TTC-466 de sarcoma mROS release and reduces the up-regulation of IL-1β and IL-18 induced de Ewing. Por el contrario, experimentos en ratones inmunodeprimidos by ethanol or LPS or ATP. Confocal microscopy studies further confi rm demostraron que la presencia de DKK-1 ralentiza el crecimiento de that ethanol, ATP or LPS promotes NLRP3/caspase-1 complex recruitment tumores generados por células A673 y TC-71. En consecuencia, para within the mitochondria to promote cell death by caspase-1-mediated intentar determinar los genes responsables de este efecto antitumoral de pyroptosis, which accounts for ≈ 73 % of total cell death (≈22%) and the DKK-1 hemos realizado un estudio transcriptómico, mediante RNAseq, remaining (≈25%) die by caspase-3-dependent apoptosis. Suppression of que estamos analizando en la actualidad y que esperamos contribuya a the TLR4 function abrogates most ethanol effects on NLRP3 activation esclarecer el mecanismo de acción de este supresor tumoral. and reduces cell death. These fi ndings suggest that NLRP3 participates,

39 Pósters XXXVII Congreso SEBBM in ethanol-induced neuroinfl ammation and highlight the NLRP3/TLR4 The aim of this study was to analyze the effects of GR and MR agonists in crosstalk in the neuropathological processes associated with alcohol abuse. keratinocytes by using in vitro and in vivo approaches. Cultured keratinocytes were treated with the synthetic GC analog Supported by SAF2012-33747; RED-RTA, ERAB, EA 13 08. dexamethasone (Dex) and the natural mineralocorticoid aldosterone (Aldo), individually or combined, to evaluate their effects on gene expression. The anti-infl ammatory gene Tsc22d3/Gilz, a known GR- and P02r-23 Role of the mineralocorticoid receptor in mouse MR-target in other cell types, was up-regulated to a similar extent by each ligand but the combined treatment showed no additive effects. skin development We also analyzed the effects of Dex, Aldo or Dex plus Aldo after topical Julia Boix Tarín, Elena Carceller Zazo, Lisa Sevilla, Paloma Pérez application to adult mouse dorsal skin for one week. Skin samples Sánchez were analyzed by histopathology by hematoxilin/eosin staining and Instituto de Biomedicina de Valencia (CSIC), Valencia, ES immunohistochemistry using specifi c epidermal markers. Whereas Dex The mineralocorticoid receptor (MR) is a transcription factor that plays a treatment in mice resulted in epidermal thinning, as previously described, key role in ion and water homeostasis. Structurally and functionally it has Aldo elicited no major effects. However, combined Dex plus Aldo treatment a high similarity with the glucocorticoid (GC) receptor (GR). Both MR and partially counteracted the Dex-induced epidermal hypoplasia. Since these GR are steroid ligand-dependent intracellular receptors that belong to the approaches do not clarify which receptor is mediating Dex or Aldo effects, nuclear hormone receptor superfamily. and to unequivocally elucidate the role of each of these transcription factors MR can bind the natural ligand aldosterone and GCs with similar affi nities. on keratinocyte function, we have performed experiments using GR- and Given that endogenous GC plasma levels exceed those of aldosterone by MR- keratinocyte-specifi c knock-out mice and cell lines. 100-fold, one mechanism preventing continuous MR occupation by GCs is the enzyme 11 β-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 (11βHSD2). 11βHSD2 converts active GCs into inactive metabolites, unable to bind P02-25 MR, thus favoring the Aldosterone-MR signaling pathway. Generación de knock-outs de FKTN y FKRP It is known that GCs exert a critical role in skin function through GR. However, no much is known regarding MR in skin biology. Previous work en la línea muscular C2C12 de ratón mediante demonstrated that the skin phenotype of mice overexpressing either MR or la tecnología “TALEN” para el estudio de GR in epidermal keratinocytes was highly similar. Both transgenic mouse models featured atrophic skin, a reduced number of hair follicles, and distroglicanopatías impaired epidermal maturation, suggesting that MR may play a role in skin Marcos Rubio Fernández1, Madalina Raducu1, Miriam Aza development, analogously to GR. Carmona1, Cristina Susín Lara1, Lourdes Yuste Pérez1, Laura We have analyzed MR expression during mouse skin development at Rodríguez Alonso1, José Martín Nieto2, Jesús Cruces Pinto1 the mRNA and protein level. Our data showed a transient peak of MR 1Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, Universidad expression around embryonic (E) day 16.5 (E16.5), which decreased thereafter. Since epidermal barrier formation starts at E16.5, the observed Autónoma de Madrid, Instituto de Investigaciones Biomédicas 2 peak suggested a role for MR in this process. UAM-CSIC, IdiPAZ, Madrid, ES, Departamento de Fisiología, To evaluate the consequences of MR inactivation in developing skin, we Genética y Microbiología, Facultad de Ciencias, Universidad de generated MR knock-out mice using a strategy based upon generalized Alicante, Alicante, ES Cre-mediated recombination of MRloxP/loxP mice. We examined MR+/+, Mutaciones en los genes FKTN (fukutin) y FKRP (fukutin-related protein), MR+/- and MR-/- mouse skin at different embryonic and early postnatal que codifi can dos proteínas muy relacionadas, son causantes de un stages. Histopathological analysis of skin samples revealed no major conjunto de enfermedades congénitas de carácter recesivo denominadas defects of MR-/- mice but rather subtle differences in the expression of actualmente como distrofi as musculares-distroglicanopatías (MDDG, de keratinocyte-specifi c markers. Collectively, our fi ndings indicate that i) sus siglas en inglés). La falta de función de estas proteínas conduce a la MR is expressed at relatively low levels during normal skin development, ii) its constitutive ablation does not have a major impact for skin function hipoglicosilación del alfa-distroglicano (α-DG). Esta proteína sirve de at the perinatal age, and iii) GR may functionally compensate for MR loss anclaje de la célula a la matriz extracelular (MEC) en diferentes órganos y during mouse skin development. tejidos, sobre todo músculo, cerebro y retina. El α-DG sufre una importante y masiva O-glicosilación postraduccional en residuos de serina/treonina de su conocido “dominio mucina”, generando diferentes tipos de cadenas P02r-24 tanto de O-manosilglicanos como de O-N-acetil-galactosaminilglicanos. A Effects of corticosteroids in keratinocytes in vivo través de estos residuos se realiza la interacción con proteínas de la MEC and in vitro como laminina, agrina y perlecano, así como con las proteínas sinápticas neurexina y pikachurina. Sin embargo, hasta la fecha, la función de estas Elena Carceller Zazo , Julia Boix Tarín, Lisa Sevilla, Paloma Pérez proteínas FKTN y FKRP en la O-glicosilación del α-DG sigue siendo Sánchez desconocida. En un intento de elucidar sus funciones, hemos generado Instituto de Biomedicina de Valencia (CSIC), Valencia, ES una serie de mutantes knock-out (KO), tanto para FKTN como para FKRP Synthetic glucocorticoids (GCs) are effectively and largely used in therapy en la línea celular C2C12 de mioblastos de ratón, utilizando la tecnología for skin infl ammatory diseases, however, chronic treatments or high doses “TALEN” (transcription activator-like effector endonuclease). Un número produce common undesirable side effects, such as skin atrophy. signifi cativo de estos mutantes KO son defectivos en la O-glicosilación del The biological and therapeutical effects of endogenous and synthetic α-DG, tras ser analizados mediante western blotting y citometría de fl ujo, GCs are mediated by binding to the glucocorticoid receptor (GR), a ligand-dependent transcription factor of the nuclear hormone receptor utilizando anticuerpos contra las cadenas glicosílicas del α-DG. El objetivo superfamily. The mineralocorticoid receptor (MR) also belongs to this fi nal de este estudio es analizar mediante glicómica comparada los residuos superfamily and can bind both mineralocorticoids and GCs with similar glicosílicos afectados en el α-DG por la falta de función de ambas proteínas affi nities. GR and MR regulate the gene expression through binding to frente a la línea celular C2C12 silvestre. identical DNA sequences located at regulatory regions of their target genes, making diffi cult to discriminate the specifi c actions of each receptor. Financiación: Instituto de Salud Carlos III, proyecto PI12/0157.

40 Granada 2014 Pósters

P02-26 cardiovascular (p=0.011, odds ratio (OR)=0.495, intervalo 0.313-0.784), Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin: y el genotipo TT de este polimorfi smo está asociado con un incremento de pore formation and resealing of injured plasma la glucemia basal en pacientes no diabéticos y no fumadores (p=0.043, membrane by endocytosis of the pore OR=3.700, intervalo 1.266-10.815). El polimorfi smo de VAV2 Val584Met está asociado con un aumento de la presión de pulso en pacientes fumadores David González Bullón, Asier Etxaniz Iriondo, Kepa Belloso Uribe, Aitor portadores del alelo TT (p=0.016, OR=5.538, intervalo 1.022-30.019) y con un Etxebarria Gallego, César Martín Plágaro, Helena Ostolaza Etxabe riesgo reducido de desarrollar síndrome metabólico en pacientes no fumadores Departamento Bioquímica y Biología Molecular, Unidad de Biofísica portadores del alelo TT (p=0.05, OR=0,408, intervalo 0.180-0.927). (Centro Mixto, CSIC-UPV/EHU), Leioa, ES Nuestros resultados sugieren que el genotipo CT del polimorfi smo de VAV3 Sher298Thr está relacionado con un riesgo reducido de desarrollar The adenylate cyclase toxin (ACT), the causative agent of whooping hipertensión, diabetes, obesidad y daño cardiovascular. Por otra parte, cough in humans, is an essential virulence factor secreted by the Gram variantes polimórfi cas de los genes VAV2 y VAV3 parecen estar asociados negative bacteria Bordetella pertussis. The toxin suppresses the bactericidal con la presencia o ausencia de factores de riesgo cardiovascular inducidos activities of phagocytic cells due to its capacity to rapidly convert cellular por hipertensión o diabetes. ATP into cAMP. This conversion is achieved by the translocation into the target cell cytosol of the toxin N-terminal catalytic domain (AC domain, ≈ aminoacids 1-400). Meanwhile, the toxin C-terminal domain (RTX domain, P02-29 approximately the last 1300 residues), which mediates toxin binding to the Estudio de expresión de marcadores proteicos de target cell membrane, remains in the cell membrane forming cation-selective pores, which permeabilize cell membranes perturbing ion homeostasis la EMT en líneas celulares de cáncer colorrectal and inducing both haemolysis and cytolysis of nucleated cells. Here we Sara Fernández Mojón1, Rubén López-Cortés1, Laura Muinelo provide evidence that ACT pores formed by the toxin C-terminal portion are Romay2, Emilio Gil Martín1, Almudena Fernández Briera1 internalized from the cell membrane. In sum, our fi ndings uncover a linkage 1Grupo BB1, Departamento de Bioquímica, Genética e Inmunología, between cell permeabilisation by ACT and how cells protect themselves Universidad de Vigo, Vigo, ES, 2Grupo de Oncología Médica from a microbial toxin insult and may survive, and provide new valuable Traslacional, Complejo Hospitalario Universitario de Santiago de insights to the current understanding of ACT action on target cells. Compostela, Santiago de Compostela, ES La pérdida del fenotipo epitelial y la adquisición del mesenquimal, proceso conocido como Transición Epitelio-Mesénquima (EMT), es un evento P02r-28 Asociación de polimorfismos de VAV2 y VAV3 con que lidera la progresión de los tumores epiteliales, otorgando a las células tumorales un aumento de movilidad y potencial invasivo. Son muchos factores de riesgo cardiovascular inducidos por los marcadores moleculares involucrados en este proceso, de entre los hipertensión y diabetes cuales, nuestro interés radica en los productos de la acción de la enzima α(1,6)fucosiltransferasa [α(1,6)FT], por su presumible implicación en la Nuria Perretta Tejedor1 2 2 , Cristina Cuesta , José Manuel Muñoz Félix , malignización del cáncer colorrectal (CCR). 3 3 Luis García-Ortiz , Manuel A Gómez Marcos , José Ignacio Recio En este trabajo nos hemos propuesto monitorizar la expresión de varios 3 4 Rodríguez , Rogelio González-Sarmiento , José Miguel López- marcadores proteicos de la EMT en un panel de líneas celulares de CCR; 2 5 Novoa , Carlos Martínez-Salgado asimismo, hemos estudiado el efecto del silenciamiento del gen de la α(1,6) 1 Unidad de Fisiopatología Renal y Cardiovascular, Instituto Reina FT (FUT8) en las líneas isogénicas Sw480 y Sw620. Una vez testado el éxito Sofía de Investigación Nefrológica, Universidad de Salamanca, del silenciamiento por RT-qPCR, se ha procedido a valorar la expresión 2 Salamanca, ES, Unidad de Fisiopatología Renal y Cardiovascular, mediante western blot de los marcadores de la EMT seleccionados. Instituto Reina Sofía de Investigación Nefrológica, Universidad Nuestra hipótesis reside en que la enzima α(1,6)FT modula la expresión de Salamanca - IBSAL, Hospital Universitario de Salamanca, y grado de funcionalidad de ciertas proteínas de membrana vinculadas 3 Salamanca, ES, IBSAL, Hospital Universitario de Salamanca a la EMT y, por ende, la progresión maligna de los tumores. Las líneas - Unidad de Investigación, Centro de Salud La Alamedilla , Sw480 y Sw620 son un buen sistema modelo para testar esta hipótesis por 4 Salamanca, ES, Centro de Investigación del Cáncer, Universidad su origen respectivo en un tumor primario y una lesión metastásica del de Salamanca - IBSAL, Hospital Universitario de Salamanca , mismo paciente. 5 Salamanca, ES, Unidad de Fisiopatología Renal y Cardiovascular, Los resultados preliminares apuntan a que no parece haber una correlación Instituto Reina Sofía de Investigación Nefrológica, Universidad entre estos clásicos biomarcadores de la EMT y el grado de malignidad de Salamanca - IBSAL, Hospital Universitario de Salamanca - celular, lo que podría corresponderse con la posible heterogeneidad IECSCYL, Unidad de Investigación, Hospital Universitario de genotípica y mecanística de la carcinogénesis colorrectal. Salamanca, Salamanca, ES Hipertensión, diabetes y obesidad son factores de riesgo para el desarrollo Estudio fi nanciado mediante el Contrato-Programa CN 2011/024, Xunta de enfermedades cardiovasculares, una de las principales causas de muerte de Galicia. en el mundo. Hay pocos datos sobre la infl uencia de polimorfi smos genéticos en estas enfermedades. Los factores intercambiadores de guanina VAV2 y VAV3 juegan un papel importante en la homeostasis vascular in P02-30 vivo. Por ello, hemos evaluado la asociación de los polimorfi smos de VAV2 Análisis de posibles proteínas que interaccionan (rs 602990) y VAV3 (rs7528153) con la predisposición al riesgo y daño con la fukutina cardiovascular inducido por hipertensión y diabetes. Hemos extraído DNA de sangre periférica de 384 pacientes (152 hipertensos, Marcos Rubio Fernández1, Sandra Gutiérrez Vindel1, Cristina Susín 66 diabéticos y 166 no diabéticos no hipertensos). Los polimorfi smos Lara1, Lourdes Yuste Pérez1, José Martín Nieto2, Jesús Cruces fueron detectados mediante qPCR con sondas TaqMan. Hemos analizado Pinto1 en esos mismos pacientes la presión sistólica y diastólica, presión de pulso, 1Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, Universidad glucemia basal, disfunción endotelial, retinopatía, hipertrofi a ventricular Autónoma de Madrid, Instituto de Investigaciones Biomédicas izquierda y riesgo cardiovascular. UAM-CSIC, IdiPAZ, Madrid, ES, 2Departamento de Fisiología, El genotipo CT del polimorfi smo de VAV3 Sher298Thr está asociado con Genética y Microbiología, Facultad de Ciencias, Universidad de un riesgo reducido de desarrollar hipertensión, diabetes, obesidad y daño Alicante, Alicante, ES

41 Pósters XXXVII Congreso SEBBM

La fukutina, una proteína codifi cada por el gen FKTN, se ha relacionado P02-32 con un conjunto de enfermedades congénitas de carácter recesivo Desmosomal-plaque related genes and non- denominadas actualmente como distrofi as musculares-distroglicanopatías small-cell lung cancer: desciphering other (MDDG, de sus siglas en inglés). La falta de función de la fukutina conduce cellular functions a la hipoglicosilación del alfa-distroglicano (α-DG). Esta proteína actúa como anclaje de la célula a la matriz extracelular (MEC) en diferentes Joel Martín Padrón1, Laura Boyero Corral2, Miriam Yagüe Capilla2, tejidos y órganos, sobre todo músculo, cerebro y retina. El α-DG sufre Pedro Medina Vico2, Mª Esther Fárez Vidal3 importantes y masivas O-glicosilaciones postraduccionales en residuos de 1University of Granada, Departement of Biochemistry and Molecular serinas/treoninas de su conocido “dominio mucina”, generando diferentes Biology III - Centre for Genomics and Oncological Research-GENYO, tipos de cadenas tanto de O-manosilglicanos como de O-N-acetil- Granada, ES, 2University of Granada, Departement of Biochemistry galactosaminilglicanos. A través de estos residuos se realiza la interacción and Molecular Biology I - Centre for Genomics and Oncological con proteínas de la MEC como laminina, agrina y perlecano, así como Research-GENYO, Granada, ES, 3University of Granada, Departement con las proteínas sinápticas neurexina y pikachurina. Sin embargo, hasta of Biochemistry and Molecular Biology III, Granada, ES la fecha, la función de la fukutina en la O-glicosilación del α-DG es Despite advances in early detection and standard treatment, Non-Small- desconocida. Cell Lung Cancer (NSCLC) is often diagnosed at an advanced stage and En un intento de elucidar su función, en este trabajo hemos procedido carries a poor prognosis. Greater knowledge of the molecular origins and a sobreexpresar esta proteína en la línea celular humana HEK293T, progression of lung cancer may lead to improvements in the treatment and purifi carla y analizar mediante espectrometría de masas las proteínas prevention of the disease. que coeluyen con ella. Hemos seleccionado una serie de proteínas There is considerable evidence for the importance of desmosomes and their potencialmente interesantes, centrándonos preferentemente el estudio de la constituents in cancer. A role has been proposed for these adhesion genes proteína CMAS (citidina monofosfo-N-ácido acetilneuramínico sintetasa). in susceptibility to cancer and metastasis, and there is increasing evidence Esta enzima cataliza la síntesis de CMP-Neu5Ac, un sustrato utilizado por that the modulation of desmosomes is an important step in the initiation diferentes si aliltransferasas para la adición de ácido siálico, el cual está and invasiveness of human malignancies. presente en muchas de las cadenas de O-glicanos del α-DG. In addition to the well-known structural role of desmosome genes, evidences such as their dual subcellular localization, the interaction with Financiación: Instituto de Salud Carlos III, proyecto PI12/0157. single-stranded DNA and translation initiation factors, etc. suggest there is a poorly understood role of these proteins in signaling pathways. PKP1 is up-regulated in primary Squamous-cell lung cancer (SCC) tissues suggesting a putative contribution in tumorigenesis. In order to gain P02-31 (R02-4) Calpain-cathepsin crosstalk leads to greater insight into the multifuntional role of some desmosomal proteins in NSCLC tumours, we have investigated transient inhibition of the PKP1 photoreceptor cell death in an animal model of desmosomal plaque protein in several SCC lines of lung cancer in order retinitis pigmentosa to unveil role of desmosomal-plaque proteins in NSCLC carcinogenesis. PKP1 knockdown suppressed proliferation, produced cell cycle arrest and Alberto M. Hernández-Pinto1, Natalia Rodríguez-Muela2, Lucía an increment in apoptosis. Evidence suggests potential pro-oncogenic García Ledo1, Patricia Boya1, Enrique J. de la Rosa1 functions of PKP1 desmosomal-plaque protein, probably due to an 1Centro de Investigaciones Biológicas - CSIC, Madrid, ES, 2Harvard unknown regulatory role in the nucleus, where it has also been found. Department of Stem Cell & Regenerative Biology, Boston, US Retinitis pigmentosa (RP) comprises a large group of inherited retinal dystrophies that are clinically similar but genetically heterogeneous. At the P02-33 cellular level, loss of photoreceptor cells is frequently found in association Perfil de MicroRNA en respuesta al tratamiento with the disease progression, and causes visual decline and blindness. The con doxorubicina en cáncer de mama cellular changes leading to photoreceptor cell death in the retina of animal Eduardo Tormo1, Begoña Pineda1, Eva Serna2, Sandra Ballester1, models, as well as of RP patients, are not well characterized. In this work, Octavio Burgués3, Ana Lluch4, Pilar Eroles1 we have analyzed the order of events leading to photoreceptor death in the 1Instituto de investigación INCLIVA, Valencia, ES, 2Unidad Central rd10 mouse, that carries a spontaneous mutation in the Pde6b gene coding de Investigación, Universidad de Valencia-INCLIVA, Valencia, ES, a misfunctional rod-specifi c cGMP phosphodiesterase. As a consequence, 3Departamento de Patología, Hospital Clínico Universitario de intracellular cGMP levels are increased, inducing a sustained calcium Valencia, Valencia, ES, 4Departamento de Hematología y Oncología, infl ux through the cGMP-gated channels. Hospital Clínico Universitario de Valencia, Valencia, ES In this study, we have measured the role of calcium infl ux in the activation Antecedentes: El tratamiento con quimioterapia es la norma en los of caspases, calpains, and cathepsin throughout the neurodegenerative cánceres de mama triple negativo (CMTN), un subgrupo de cáncer que process by fl ow cytometry, confocal microscopy and enzymatic assays. To carece de una diana específi ca. Se han observado claramente dos tipos de determine the role of calcium and cGMP in the photoreceptor death, we respuesta: respuesta patológica completa o recaída en los tres primeros have used a calcium ionophore (A23187) and a PDE6 inhibitor (zaprinast) años tras el tratamiento. Sin embargo, los mecanismos que conducen a to simulate the rd10 phenotype in C57bl/6 mice (WT) retinal explants. estas respuestas, así como los marcadores que permitan la identifi cación y Rd10 retinas showed an early increase in the calcium levels followed by la diferenciación de estos grupos antes del tratamiento son desconocidos. an over-activation of type 2-calpains without changes in the levels of its Por otra parte, existen evidencias de una expresión aberrante de microRNA endogenous inhibitor calpastatin. Subsequently, exogenous activation of en diferentes tipos de cáncer, incluyendo cáncer de mama. Los microRNA, cathepsin B and Lysosomal DNAse was detected in the retinas, suggesting modulan la expresión de oncogenes y supresores de tumor y también están an impairment of the lysosomal system prior to cell death, measured implicados en la promoción de resistencia a los medicamentos contra el by TUNEL staining. Retinas treated with Zaprinast or A23187 partially cáncer. or totally mimicked this calcium-calpain-cathepsin pattern. Inhibition Objetivo: Estudiar los microRNA que se expresan diferencialmente en of calpains or cathepsins in specifi c stages of the degenerative process respuesta al tratamiento con doxorubicina en líneas de células de cáncer clearly rescued photoreceptors both in vitro andin vivo. Throughout all de mama. this process, caspases remained inactive, suggesting an alternative non- Métodos: Las líneas celulares de cáncer de mama MDA-MB-231 y MDA- apoptotic pathway to cell death in this model of RP. MB-468 (CMTN) y MCF7 (luminal-A) fueron expuestas a tratamiento con

42 Granada 2014 Pósters doxorubicina. Se realizó un análisis de microarrays (GeneChip miRNA 2.0 P02r-35 array) para identifi car el conjunto de microRNAs comúnmente modifi cados Interacción funcional entre las vías de TGF-β y aquellos regulados de forma diferencial. Los genes y las vías reguladas y HGF durante la transición epitelio-mesénquima por estos microRNA fueron analizados in silico. en células progenitoras hepáticas Resultados: Los análisis de PCA y Heat Maps mostraron 13 microRNAs modifi cados en las tres líneas, 25 en CMTN y 69 en la línea luminal-A. María García-Álvaro1, Laura Almalé1, Annalisa Addante1, Daniel Este patrón está relacionado con el subgrupo de cáncer de mama con más Caballero1, Celia Sequera1, Héctor Romero1, Jessica Segales2, fuerza que con el tratamiento específi co. Curiosamente, las hebras “star” Carlos Sánchez2, César Roncero1, Margarita Fernández1, Eduardo de microRNA fueron modifi cadas en un porcentaje muy alto en todos los Rial2, Isabel Fabregat3, Blanca Herrera1, Aránzazu Sánchez1 1 grupos, y el análisis teórico de los genes diana reveló que los procesos y Instituto de Investigación Sanitaria del Hospital Clínico San Carlos vías relacionadas con el cáncer fueron los más afectados. Entre las vías (IdISSC) - Dep Bioquímica y Biología Molecular II, Facultad de 2 destacan: uniones adherentes, adhesión focal, ERBB, MAPK, PI3K y la Farmacia, Universidad Complutense de Madrid, Madrid, ES, Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid, ES, 3Laboratori vía WNT, y entre los procesos celulares: proliferación, supervivencia, dÓncologia Molecular, Universitat de Barcelona, Institut angiogénesis, invasión y metástasis. dÍnvestigació Biomèdica de Bellvitge, Barcelona, ES Conclusión: El perfi l de microRNA en líneas celulares de cáncer de mama se modifi ca ampliamente por el tratamiento con doxorrubicina y las hebras Las células ovales son progenitores bipotenciales de hígado adulto que “star” de los microRNA juegan un papel fundamental. Los genes y las vías se expanden en situaciones de daño crónico y son responsables de la reparación del daño hepático. Sin embargo, se ha postulado que son el sobre las que actúan están relacionados con procesos de cáncer, por lo que origen de un subgrupo de carcinomas hepatocelulares. estos microRNA podrían ser relevantes en la respuesta al tratamiento y en Para comprender los mecanismos subyacentes a su conversión maligna, el desarrollo de resistencias. analizamos la potencial interacción entre las vías de TGF-β y HGF en el contexto de un proceso de EMT. Para ello, hemos utilizado un modelo in vitro de célula oval con un receptor Met inactivo (células Met-/-) y su P02-34 control (células Metfl x/fl x). El fenotipo mesenquimal estable (post-EMT) se Differential localization of desmosomal plaque- obtuvo mediante tratamiento crónico con TGF-β. related proteins in non-small-cell-lung cancer Las células ovales post-EMT muestran una cinética de crecimiento similar a la de sus parentales, un fenotipo más inmaduro y una mayor Laura Boyero Corral1, Mercedes Gómez-Morales2, Joel Martín- capacidad migratoria/invasiva. Además, presentan alteraciones en la Padrón1, Pedro P. Medina1, Esther Fárez-Vidal3 señalización disparada por TGF- β resistencia a la apoptosis y al estrés 1Centre for Genomics and Oncological Research-GENYO, and oxidativo inducidos por esta citoquina. Este fenotipo resistente está Department of Biochemistry and Molecular Biology 1 - School asociado a cambios signifi cativos en el perfi l de expresión de genes pro- y of Sciences - Granada University, Granada, ES, 2Department of anti-oxidantes. Además, el perfi l bioenergético muestra una disminución Pathology, School of Medicine, Granada University, Granada, en el índice OCR/ECAR, sugiriendo la adquisición de un fenotipo más ES, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology 3 and glicolítico. Immunology, School of Medicine, Granada University, Granada, ES Curiosamente, la ausencia de Met resulta en un proceso de senescencia tras la inducción de EMT, lo que sugiere que Met es necesario para la expansión Squamous cell carcinomas and adenocarcinomas are the most frequent de estas células. Por otra parte, las células ovales post-EMT presentan una forms of lung carcinoma, and have different prognoses and therapeutic señalización y respuesta al HGF alteradas. approaches. En conclusión, nuestros resultados muestran una profunda alteración en During recent years, accumulating evidence has supported an important el fenotipo de la célula oval y sus propiedades funcionales después de la role for several junctional proteins in carcinogenesis, tumour invasion EMT inducida por TGF-β. Además, apuntan a una interacción funcional and metastasis. Contact between epithelial cells is mediated by several relevante entre las vías de HGF y TGF-β en este contexto. types of cell–cell junction, which are composed of complex arrays of transmembrane and plaque proteins and are connected typically to cytoskeletal components. Desmosomes are cell–cell complexes found P02-36 primarily in epithelial tissues. El déficit de IGF-I predispone a la pérdida Previously, our group showed differentially expressed gene sequences auditiva inducida por ruido corresponding to severl desmosomal plaque-related proteins as a function Adelaida Celaya1 1 2 of tumour type, stage and differentiation grade in non-small-cell-lung , Lourdes Rodríguez-de la Rosa , Julio Contreras , 1 cancer (NSCLC). Isabel Varela-Nieto 1Instituto de Investigaciones Biomédicas “Alberto Sols” CSIC- The staining pattern of some desmosomal proteins differed between UAM - Centro de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades squamous-cell carcinomas and adenocarcinomas. Expression of these Raras-CIBERER, Madrid, ES, 2Instituto de Investigaciones proteins marked intercellular junctions that are characteristic of the Biomédicas “Alberto Sols” CSIC-UAM - Centro de Investigación squamous stratum of stratifi ed fl attened epithelium and of neoplasias with Biomédica en Red de Enfermedades Raras-CIBERER - Facultad De this type of differentiation. We observed more intense staining of these Veterinaria, UCM, Madrid, ES proteins in better differentiated areas. La defi ciencia del factor de crecimiento similar a insulina tipo I (IGF-I) In order to gain greater insight into the specifi c function of some causa sordera neurosensorial sindrómica en el hombre (ORPHA73272, desmosomal proteins in NSCLC tumours, we have investigated the OMIM608747), situación que se reproduce en ratones modifi cados subcellular localization of one of these proteins in lung squamous-cell genéticamente que no expresan este gen. El IGF-I es un agente neurotrófi co carcinomas by immunocytochemistry. durante el desarrollo y neuroprotector en el adulto. Los niveles de IGF-I PKP1 was localized on membrane and desmosomal plaque, and mainly on circulante descienden de forma fi siológica con el envejecimiento lo que se the nucleus of the cells. PKP1 knock-down caused specifi c inhibition of ha asociado con deterioro cognitivo en el hombre. PKP1 on immunostained cells in comparison with scramble cells. Nuestro objetivo ha sido estudiar si el défi cit parcial en este factor These results may suggest other functions of PKP1 in cellular regulation predispone a la pérdida auditiva y los mecanismos moleculares and cancer. Our evidence indicates that PKP1 is a potential target for responsables de la potencial respuesta agravada al daño. Para ello se ha diagnosis and treatment of NSCLC. estudiado la susceptibilidad de ratones Igf1+/– y Igf1+/+ al daño causado

43 Pósters XXXVII Congreso SEBBM por exposición excesiva al ruido a diferentes edades, utilizando técnicas P02-38 (R02-2) neurofi siológicas (potenciales auditivos del tronco cerebral), morfológicas Adipose tissue as a regulator of metabolic (histología coclear, cuantifi cación estereológica de células ciliadas) y flexibility moleculares (RT-qPCR, Western blotting). Sam Virtue Los ratones de 1-3 meses de edad de ambos genotipos resultaron Institute of Metabolic Science (IMS), Addenbrooke’s Hospital, igualmente sensibles al daño, por el contrario los ratones Igf1+/– de 6 University of Cambridge, Cambridge, UK meses de edad presentaron una mayor susceptibilidad al daño inducido por ruido que los ratones Igf1+/+. Con respecto a los animales control, los The focus of this talk is on how disruptions in the ability of organisms ratones Igf1+/– presentaron un incremento de umbrales auditivos acusado e to appropriately store and release lipid can impact on whole organism metabolic health. Both healthy mice and humans preferentially use irreversible, una mayor pérdida de células ciliadas, así como alteraciones carbohydrate in the fed state and switch to utilising a greater degree of en las principales vías de señalización del IGF-I y en la expresión génica lipid in fasted state. The ability to perform the switch between utilising de marcadores celulares y moleculares de neuroinfl amación. En su carbohydrate and lipid can be defi ned as ‘metabolic fl exibility’. While conjunto los resultados sugieren una mayor activación de la respuesta metabolic fl exibility has been extensively studied in humans, data from infl amatoria tras el trauma acústico en la situación de défi cit parcial en rodent models with alterations in metabolic fl exibility are relatively rare. IGF-I. The transcription factor Peroxisome Proliferator-Activated Receptor γ Estos resultados apoyan la idea de que bajos niveles de IGF-I predisponen (PPARγ) is essential for adipogenesis. PPARγ has been implicated in the a una mayor susceptibilidad al daño inducido por ruido y contribuyen a regulation of both carbohydrate and lipid metabolism and is therefore an identifi car las dianas moleculares que participan en este proceso. Así, las excellent candidate for controlling metabolic fl exibility. PPARγ2 is the terapias basadas en IGF-I podrían contribuir a prevenir o mejorar la pérdida adipose tissue-specifi c isoform of PPARγ and has greater transcriptional auditiva inducida por ruido. activity than PPARγ1. Despite the known role of PPARγ as a target for the thiazolidinedione class of anti-diabetic drugs, young mice (4 months Agradecimientos: Este trabajo ha recibido el apoyo del SAF2011-24391, of age) lacking PPARγ2 had surprisingly normal carbohydrate metabolism based on glucose and insulin tolerance tests. de la Fundación de Investigación Médica Mutua Madrileña 2012 y del In this talk, data from mice lacking PPARγ2 will be used to demonstrate proyecto AFHELO (FP7, European Union). LRR disfruta de contrato del how reductions in metabolic fl exibility can be detected in mice using CIBERER y AC de AFHELO. indirect calorimetry. The lower metabolic fl exibility of the PPARγ2 KO mouse indicated that these animals may have impaired lipid handling, a phenotype which was subsequently confi rmed; with PPARγ2 KO mice P02-37 (R02-8) having reduced rates of lipolysis, and dramatically reduced capacity for Increased oxidative stress and impaired whole-organism lipid clearance. Finally, the relationship between reduced antioxidant response in Lafora disease adipose tissue capacity for both lipid uptake and release and human metabolic health will be discussed. Carlos Romá Mateo1, Carmen Aguado2, Jose Luis Garcia Gimenez3, José Santiago Ibañez Cabellos4, Marta Seco Cervera3, Federico Pallardó3, Erwin Knecht2, Pascual Sanz5 P02r-39 1Instituto de Biomedicina de Valencia (CSIC) y CIBERER, Valencia, Generación de células madre pluripotentes ES, 2Centro de Investigación Principe Felipe y CIBERER, Valencia, inducidas (iPSC) para el estudio de ES, 3FIHCUV-INCLIVA y CIBERER, Valencia, ES,4FIHCUV-INCLIVA enfermedades mitocondriales y Sistemas Genómicos S.A, Valencia, ES, 5Instituto de Biomedicina Teresa Galera Monge de Valencia, CSIC y CIBERER, Valencia, ES , Francisco Zurita Díaz, Cristina González Páramos, Rafael Garesse Alarcón, M. Esther Gallardo Pérez Lafora Disease (LD, OMIM 254780, ORPHA501) is a fatal Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, Universidad neurodegenerative disorder characterized by the presence of glycogen- Autónoma de Madrid, Instituto de Investigaciones Biomédicas like intracellular inclusions called Lafora bodies and caused, in the vast UAM-CSIC - CIBERER, Madrid, ES majority of cases, by mutations in either EPM2A or EPM2B genes, Las enfermedades mitocondriales (EM) constituyen un amplio grupo encoding respectively laforin and malin. In the last years, several reports de enfermedades genéticas multisistémicas cuyo nexo de unión es una have revealed molecular details of these two proteins and have identifi ed disfunción en el sistema de fosforilación oxidativa. La falta de modelos several processes affected in LD, but the pathophysiology of the disease experimentales adecuados para el estudio de dichas enfermedades, ha still remains largely unknown. Since autophagy impairment has been difi cultado el avance en el desarrollo de nuevas terapias. En este sentido, la reported as a characteristic treat in both Lafora disease cell and animal reprogramación de células somáticas a células madre pluripotentes inducidas models, and since there is a link between autophagy and mitochondrial (iPSC) mediante la expresión ectópica de cuatro factores de transcripción, performance, we sought to determine if mitochondrial function could OCT4, SOX2, KLF4 y c-MYC, ha abierto enormes posibilidades. Por be also altered in those models. Using fi broblasts from LD patients, ello, el objetivo general de este trabajo ha consistido en la generación defi cient in laforin or malin, we found mitochondrial alterations, de iPSC a partir de fi broblastos de pacientes con EM para el estudio y oxidative stress and a defi ciency in antioxidant enzymes involved in the tratamiento potencial de las mismas. Para este fi n, hemos establecido una detoxifi cation of reactive oxygen species (ROS). Similar results were colección de fi broblastos procedentes de biopsias de piel de pacientes con EM e individuos sanos. A continuación, se han generado líneas de iPSC obtained in brain tissue samples from transgenic mice defi cient in either a partir de dichos fi broblastos mediante el uso de vectores retrovirales o the EPM2A or EPM2B genes. Furthermore, in a proteomic analysis of métodos no integrativos tipo virus Sendai. Así, hemos generado 16 líneas brain tissue obtained from Epm2b-/- mice, we observed an increase in a de IPSC portadoras de distintas mutaciones en genes mitocondriales modifi ed form of peroxirredoxin-6, an antioxidant enzyme involved in codifi cados en el DNA mitocondrial o nuclear asociadas a distintas EM: other neurological pathologies, thus corroborating an alteration of the Síndrome de Leigh, atrofi a óptica sindrómica y EM producidas por redox condition. These data support that oxidative stress produced by defectos de comunicación intergenómica. Actualmente, estamos realizando an increase in ROS production and an impairment of the antioxidant la confi rmación, molecular y funcional, de la pluripotencia de las líneas enzyme response to this stress play an important role in the development generadas, para posteriormente, diferenciarlas y caracterizarlas en los tipos of LD. celulares diana. La disponibilidad de iPSC como modelo experimental

44 Granada 2014 Pósters de las EM nos permitirá mejorar el conocimiento de los mecanismos pacientes con cáncer de próstata (CaP), son prospectos a ser herramienta fi siopatológicos de estas enfermedades y podrá suponer la apertura de útil para la detección de la enfermedad. Actualmente en México no se nuevas vías para la identificación de tratamientos farmacológicos y había realizado una investigación profunda de las mutaciones en el de terapia celular. mtDNA asociadas al CaP. Analizamos tres muestras de tejido prostático obtenidos mediante una biopsia transrectal. Se amplifi có todo el genoma mitocondrial mediante la técnica de PCR punto fi nal, de una muestra; las P02-40 demás muestras solo se amplifi caron la región MT-ND5. Posteriormente La leptina revierte parcialmente el efecto se recurrió a la técnica de secuenciación bidireccional y fi nalmente se Warburg en la línea de cáncer de mama MCF-7 examinó la presencia de variantes de la secuencia entre el tejido sano y enfermo del mtDNA. Sólo una muestra mostró dos mutaciones asociadas María del Mar Blanquer-Rosselló, Raquel García-Belmonte, Jordi al CaP, en el locus MT-CO1, alelo G6261A produciendo un cambio Oliver, Pilar Roca, Adamo Valle de aminoácido de manera non-syn:A-T y en el locus MT-ND5, alelo Grupo Multidisciplinar de Oncología Traslacional - IUNICS - Universitat C12705T cuyo cambio de aminoácido es syn:I-I. Esta misma muestra de les Illes Balears - Ciber Fisiopatología Obesidad y Nutrición (CB06/03) Instituto Salud Carlos III, Palma de Mallorca, ES mostró mutaciones en el locus MT-ATP 6, alelo A9300G con un cambio de aminoácido non-syn:A-T asociada a la miopatìa y en el locus MT- El efecto Warburg consiste en la preferencia de las células tumorales por RNR1, alelo A663G con cambio de aminoácido 12S rRNA relacionada al el uso de la vía glucolítica en detrimento de la fosforilación oxidativa riesgo de arterioesclerosis coronaria. Dichas variaciones son las primera mitocondrial. Al tratarse de una característica metabólica diferencial y reportadas en México. Dicha investigación es apenas un preámbulo dada su importancia para sostener el elevado anabolismo del tumor en para entender el cáncer de próstata, su inicio, progreso y desarrollo de crecimiento, la reprogramación metabólica se plantea como una diana interesante en la lucha contra el cáncer. La leptina es una hormona metástasis en pacientes mexicanos. producida por el tejido adiposo blanco con una importante función en la homeostasia energética. Se ha observado que la leptina aumenta la proliferación y supervivencia de las células de cáncer de mama tanto in P02-42 vitro como in vivo. No obstante, se desconoce la infl uencia que la leptina Metabolomic analysis of serum samples from puede tener sobre el metabolismo de estas células. En este estudio nos diabetic patients with and without cardiovascular planteamos evaluar la infl uencia de la leptina sobre el efecto Warburg en disease and control subjects la línea de cáncer de mama MCF-7. Se analizó el consumo de oxígeno mediante un electrodo tipo Clark, la producción de lactato mediante un Beatriz García-Fontana1, Caridad Díaz Navarro3, Pedro método enzimático y los niveles de ATP mediante luminometría en células Rozas-Moreno4, Olga Genilloud3, Francisca Vicente Pérez3, tratadas con leptina en respuesta a distintas dosis de 2-deoxiglucosa José Pérez del Palacio3, Sonia Morales-Santana1,2, y oligomicina. Se analizó también mediante western blot los niveles Manuel Muñoz-Torres1 y el grado de fosforilación de la AMPK, proteína sensora del estado 1Unidad de Metabolismo Óseo-RETICEF, Servicio de Endocrinología, energético; y la actividad de la PDH mediante un ensayo enzimático Instituto de Investigaciones Biomédicas de Granada, Hospital con inmunocaptura. Los resultados indicaron que la leptina revierte Universitario San Cecilio, Granada, ES, 2Servicio de Proteómica, parcialmente el efecto Warburg en las células MCF-7, induciendo un Fundación para la Inverstigación Biosanitaria de Andalucía metabolismo más aeróbico y una mayor dependencia de la mitocondria 3 para la síntesis de ATP. No obstante, las células con leptina mostraron Oriental –Alejandro Otero– FIBAO, Granada, ES, Fundación una mayor capacidad para activar la glucólisis al inhibir la fosforilación MEDINA, Centro de Excelencia en Investigación de Medicamentos oxidativa. Innovadores en Andalucía - Parque Tecnológico de Ciencias de la Salud, Granada, ES, 4Servicio de Endocrinología, Hospital General Financiado por CAIB-FSE, ISCIII (PI12/01827) y FEDER-Unión Europea de Ciudad Real, Ciudad Real, ES “Una manera de hacer Europa”. Metabolomics is an emerging and powerful discipline that provides an accurate and dynamic image of the phenotype of mammalian systems through the study of endogenous and exogenous metabolites in cells, tissues P02r-41 and biofl uids. The aim of this project is to analyze the metabolomic profi les Mutaciones y polimorfismos mitocondriales obtained by mass spectrometry of serum samples from type 2 diabetes en pacientes mexicanos con cáncer de próstata mellitus (T2DM) patients with and without cardiovascular disease (CVD) and control subjects, in order to fi nd new molecular pathophysiological Victoria Edwina Campos García1, Sandra Viridiana Salgado processes related to the onset of disease as well as new biomarkers for Hernández1, Jorge Ramírez Salcedo2, Patricia Ramírez Noguera2, CVD and diabetes. Sandra Díaz Barriga Arceo2, Rosalba Bonilla Sánchez3, Sergio Ureta Sánchez4, José Francisco Montiel Sosa2 In this study we analyzed 9 serum samples from T2DM patients with 1B.Q.D. Bioquímica Diagnóstica, Departamento de Bioquímica y CVD, 10 serum samples from T2DM patients without CVD and 10 Farmacología Humana, Universidad Nacional Autónoma de México, serum samples from healthy subjects. These samples were analyzed by Cuautitlan Izcalli, MX, 2PhD. en Ciencias Biomédicas, Instituto liquid chromatography coupled with high resolution mass spectrometry de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México, (LC-HRMS). The raw LC-HRMS data were converted into mass peak Distrito Federal, MX, 3Q.F.B. Departamento de Bioquímica y lists which were compared across cromatographic runs and subjected Farmacología Humana, Universidad Nacional Autónoma de México, to statistical analysis (t-test, fold change analysis, principal component Cuautitlán Izcalli, MX, 4MD. Médico Urólogo, Hospital Español, analysis and partial least square-discriminant analysis). Thus, the peaks Distrito Federal, MX whose intensity levels vary signifi cantly between different groups are En México, el cáncer de próstata es un importante problema de salud detected. pública con altos costes sociales, este tipo de neoplasia tiene una tasa The principal component analysis (PCA) successfully clustered the samples de mortalidad anual de 121.57 por cada 100 mil hombres. Los factores according to the aforementioned groups. PCA loading plot revealed that predisponentes de dicha patología son la edad y antecedentes familiares phospholipids were the main discriminatory metabolites. The role of these positivos pero poco se sabe acerca de la etiología de la enfermedad. Se molecules as biomarkers and their involvement in glucose and insulin ha estudiado que las mutaciones a nivel ADN mitocondrial (ADNmt) en pathways will also be discussed in this study.

45 Pósters XXXVII Congreso SEBBM

P02r-43 (R02-6) in primary culture. Our results showed that the three peptides signifi cantly Dissecting the role of the epidermal growth factor decreased neuronal viability, but only Aβ 25-35 and Aβ 1-42 produced receptor (EGFR) in diethylnitrosamine-induced a signifi cant increase on ROS production. In addition, we performed hepatocarcinogenesis in mice immunohistochemistry against Aβ in order to observe its localization within the neuron, showing that the distribution pattern differed depending on the Daniel Caballero Díaz1, Judit López-Luque1, Alba Marín-Martínez1, Aβ peptide, Aβ 25-35 being internalized into neurons but Aβ 1-40 and Aβ Adoración Martinez-Palacián2, María García-Álvaro2, Annalisa 1-42 remaining mostly outside the cells. In order to get inside the mechanism Addante2, María García-Bravo3, Esther Grueso4, Jose-Carlos involved in the cell damage induced by Aβ peptides, we analized changes in Segovia3, César Roncero2, Margarita Fernández2, Aránzazu the expression of synaptic proteins, such as synaptophysin, synaptotagmin Sanchez2, Isabel Fabregat5 and PSD-95, by western-blot. Our results showed the occurrence of a 1Bellvitge Biomedical Research Institute-IDIBELL, Barcelona, disregulation on the expression of these proteins. Since the changes in ROS ES, 2Dep. of Biochemistry and Molecular Biology II, School production cannot fully explain the decrease on cell viability observed in our of Pharmacy, Complutense University of Madrid and Instituto experiments, we propose that the disruption of synaptic structure must be de Investigación Sanitaria del Hospital Clínico San Carlos, involved in neuronal death induced by amyloid-beta. IdISSC, Madrid, ES, 3Cell Differentiation and Cytometry Unit - Hematopoietic Innovative Therapies Division, Centro de Investigaciones Energéticas, Medioambientales y Tecnológicas- P02r-45 CIEMAT and Centro de Investigación Biomédica en Red de Bisphenol A exposure during adulthood alters the Enfermedades Raras-CIBERER - Advanced Therapies Mixed expression of tryptophan hydroxylase type II but 4 Unit. CIEMAT/IIS Fundación Jiménez Díaz, Madrid, ES, Division not type I in the prefrontal cortex of rat: Possible of Medical Biotechnology - Paul Ehrlich Institute, Langen, DE, 5Bellvitge Biomedical Research Institute-IDIBELL - Department alterations in local serotonin synthesis of Physiological Sciences II, School of Medicine, University of Beatriz Castro Bohórquez, Pilar Sánchez Medina, Jesús Manuel Barcelona, LHospitalet de Llobregat, ES Torres De Pinedo, Esperanza Ortega Sánchez Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common cancers and Departamento de Bioquímica y Biología Molecular III e its incidence is increasing. Hepatocarcinogenesis is a multistep process Inmunología, Universidad de Granada, Granada, ES that involves genetic and environmental factors. It is necessary to elucidate Background: Bisphenol A (BPA) is able to produce neurological and the interaction and cross-regulation of these factors that synergistically behavioral dysfunctions by mechanisms that remains unknown. Serotonin contributes to HCC development. In HCC there is a disruption of the (5-HT) system is essential for prefrontal cortex (PFC) function, an important balance between cell death and survival signaling pathways. Different physiological pro-apoptotic molecules are down-regulated, or inactivated, area for cognitive control and complex behaviors. Alterations in precortical due to an over-activation of anti-apoptotic signals that impairs their serotonergic signalling have been implicated in the pathogenesis of a wide functions. At the same time, some pro-survival pathways are over-activated. range of neuropsychiatric disorders. Tryptophan hydroxylase (Tph), which One of these de-regulated survival signals is the epidermal growth factor is expressed as two isozymes (Tph1 and Tph2), catalyzes the rate-limiting receptor (EGFR) pathway. On the one hand, different EGF-like ligands step in 5-HT synthesis and is considered one of the leading target genes for are over-expressed in HCC, contributing to EGFR activation during HCC psychiatric and behavioral disorders. Tph2 is specifi cally expressed in the progression. On the other hand, it has been shown that human HCC tissues brain, whereas Tph1 is responsible for 5-HT synthesis in peripheral tissues. over-express EGF family receptors. Objective: Our objective was to evaluate the effects of adult exposure to To investigate the role of the EGFR in the process of hepatocarcinogenesis our BPA on precortical Tph isozymes expression. group generated a transgenic mice that expressed specifi cally in hepatocytes Methods: Adult male and female Wistar rats were inyected subcutaneously a truncated form of the EGFR (Alb1-ΔEGFR). These mice were treated with during 4 days with 50 μg/kg/day of BPA, the current Environmental diethylnitrosamine (DEN) to induce liver tumorigenesis. By histological Protection Agency (EPA) reference dose. At 30 min after the fi nal techniques the livers of the mice were analyzed at different times after administration, rats were euthanized and the brains were stored at -80°C treatment with DEN. Transgenic mice showed a delay in the appearance and until analysis. Quantitative RT-PCR was used to quantify mRNA levels of in the growth of tumors, as well as less infl ammation and less extracellular Tph1 and Tph2 in the PFC. Protein levels were quantifi ed by Western blot. matrix deposition in liver parenchyma. The results suggest that the EGFR Results: BPA increased mRNA and protein levels of Tph2 in the PFC of pathway plays an important role in the process of hepatocarcinogenesis. both male and female rats. No signifi cant differences in Tph1 expression Further work is required to elucidate the molecular mechanisms by which were observed after BPA treatment. EGF contributes to liver tumor cell growth and survival. Conclusion: We demonstrated for the fi rst time that BPA, at a dose considered safe by the EPA, modifi es Tph2 expression in the PFC of adult rats. Consequently, local synthesis of 5-HT might be altered. Given the role P02r-44 of 5-HT in several psychopathologies, further studies will be required to Associating the decrease on neuronal viability determine the impact of this fi nding. induced by amyloid-beta 1-40 and 1-42 with reactive oxygen species production and the P02-46 disregulation of the expression of synaptic Dissecting the role of the epidermal growth factor proteins receptor (EGFR) in the molecular mechanisms that control liver regeneration in mice Marta Domínguez-Prieto, Ana Velasco, José M. Medina Universidad de Salamanca, INCYL (Instituto de Neurociencias de Judit López-Luque1, Adoración Martínez-Palacián2, Eva Crosas- Castilla y León), Salamanca, ES Molist1, Joaquim Moreno-Càceres1, Daniel Caballero-Díaz1, Amyloid-beta (Aβ) accumulation together with tau protein María García-Bravo3, Esther Grueso4, Jose-Carlos Segovia3, César hyperphosphorylation are the main molecular events presumably responsible Roncero2, Margarita Fernández2, Aránzazu Sánchez2, Isabel for neurodegeneration observed in Alzheimer’’’’s disease. In this work, we Fabregat5 studied the effect of three Aβ peptides: Aβ 25-35, Aβ 1-40, Aβ 1-42, on 1Bellvitge Biomedical Research Institute-IDIBELL, Hospitalet cell viability and reactive oxygen species (ROS) production in rat neurons de Llobregat, ES, 2Dep. of Biochemistry and Molecular Biology

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II, School of Pharmacy, Complutense University of Madrid and diferenciarlas de aquellas con menor probabilidad de desarrollar metástasis. Instituto de Investigación Sanitaria del Hospital Clínico San Con este propósito, hemos analizado tumores procedentes de 71 pacientes Carlos-IdISSC, Madrid, ES, 3Cell Differentiation and Cytometry operadas de cáncer de mama atendiendo a los patrones de expresión de Unit. Hematopoietic Innovative Therapies Division, Centro de 1106 microRNA (miRNA), pequeñas moléculas de RNA implicadas en Investigaciones Energéticas, Medioambientales y Tecnológicas- el control de la expresión génica y que suelen encontrarse desreguladas CIEMAT and Centro de Investigación Biomédica en Red de en varias enfermedades, incluyendo cáncer. Se ha identifi cado y validado Enfermedades Raras-CIBERER - Advanced Therapies Mixed un grupo de cinco miRNA cuya expresión está disminuida en tumores Unit - CIEMAT/IIS Fundación Jiménez Díaz, Madrid, ES, 4Division de pacientes con recurrencia temprana y menor supervivencia libre de of Medical Biotechnology - Paul Ehrlich Institute, Langen, DE, progresión. Notablemente, esta fi rma de miRNA permite discriminar 5Bellvitge Biomedical Research Institute-IDIBELL - Department efi cientemente entre pacientes con bajo y alto riesgo de recaída temprana. of Physiological Sciences II, School of Medicine, University of El análisis de posibles mRNA dianas empleando la información existente Barcelona, Barcelona, ES en varias bases de datos públicas sugiere una relación entre estos cinco Liver regeneration (LR) is a very complex and well-orchestrated miRNA y la capacidad proliferativa y pro-angiogénica del tumor. phenomenon. The proliferation of hepatocytes is the main mechanism during LR, in response to mitogenic signals. Among them, epidermal growth factor (EGF) and hepatocyte growth factor (HGF) play essential P02-48 roles. However, additional studies are necessary to understand if EGF and Maslinic acid is able to inhibit the HGF pathways compensate one to each other in some aspects or if, on osteoblastogenesis and adipogenesis in two the contrary, they play unique roles during LR. Moreover, Ttansforming different cell lines growth factor-beta (TGF-β) is important at the end of LR as it inhibits proliferation and maintains the liver in its correct size. Eva E. Rufino Palomares1, Amalia Pérez-Jiménez2, Fernando J. To elucidate the specifi c role of the EGFR pathway during LR after Reyes-Zurita1, Leticia E. García-Salguero1, Juan Peragón3, Pedro P. partial hepatectomy (PH) in mice, we have generated a transgenic mouse Medina1, José A Lupiáñez1 expressing a truncated form of the EGFR (Alb1-ΔEGFR) specifi cally in 1Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I, Universidad hepatocytes. The regenerative process after 2/3 hepatectomy in transgenic de Granada, Granada, ES, 2Biomaslinic, Enterprise, S.L, Granada, mice (ΔEGFR) was compared with that of wt mice (WT). Lack of EGFR ES, 3Departamento de Biología Experimental, Universidad de Jaén, kinase activity correlated with a delay in proliferation in regenerating Jaén, ES hepatocytes, coincident with a higher activation of the TGF-β pathway. Maslinic acid (MA) is a pentacyclic triterpene acid widely present in ΔEGFR mice also showed higher basal infl ammation and differences in lipid dietary plants and especially abundant in olive fruit skins. Thecompound metabolic changes during LR, being not able to induce the transient lipid has attracted much interest owing to its provenpharmacologic safety and accumulation in hepatocytes which precedes the peak of the proliferative its many biologic activities, such asanti-infl ammatory, antiviral, antioxidant phase. In spite of this delay in proliferation, ΔEGFR mice fully regenerated and antidiabetogenic activities as well as anticancer and antiastrocytoma the liver, which means that other signaling pathways can be compensating properties. Moreover, some studies showed that this compound increase the lack of EGFR signaling. In this line of evidence, HGF levels and Met growth performance in animals. In this study, the MA effects on adipogenesis (HGF receptor) phosphorylation were higher in ΔEGFR animals after PH. and osteoblastogenesis was determined in order to analyze some of the In summary, EGF plays diverse roles in liver after PH, but attenuation of its most important parameters related to obesity and metabolic syndrome. signaling is not crucial for the fi nal regeneration of the liver. Results obtained indicated that the MA had a signifi cant inhibitory effect on adipogenesis in the model pre-3T3-L1 adipocytes. This result coincided with the antagonistic effect of the compound on PPARγ and increased Ca2+ P02-47 Identificación de una firma de miRNA asociada cytoplasmic levels in presence of MA.Taken together, these results suggest that this compound inhibits the formation of adipose tissue.Furthermore, a la recurrencia temprana en cáncer de mama it was also observed that the MA slightly increased glucose uptake in pre- adipocytes 3T3-L1. This suggests that this compound might exert a benefi cial Luís G. Pérez-Rivas1, José M. Jerez2, Rosario Carmona3, Vanessa effect in states of insulin resistance or hyperglycemia. The results alsoshowed de Luque1, Luís Vicioso4, M Gonzalo Claros3, Enrique Viguera5, that MA, in human mesenchymal cells (hMSCs) derived from bone marrow, Bella Pajares1, Alfonso Sánchez1, Nuria Ribelles1, Emilio Alba1, José Lozano6 inhibited the adipogenesis, confi rming its potential as anti-obesity and remodeling of body fat composition agent. Parallel, osteoblastogenesis in 1Laboratorio de Oncología Molecular, Instituto de Biomedicina hMSC cells was analyzed, fi nding a weak induction of molecular markers de Málaga-IBIMA, Málaga, ES, 2Dpto. Lenguajes y Ciencias de la that may be indicative of that MA positively affect bone regeneration. Computación, Universidad de Málaga-UMA, Málaga, ES,3Plataforma Andaluza de Bioinformática, Universidad de Málaga-UMA, Málaga, This study has been supported by the Feder-Interconecta Program by means ES, 4Servicio de Anatomía Patológica, Instituto de Biomedicina de of an investigation contract between University of Granada Foundation, Málaga-IBIMA, Málaga, ES, 5Dpto de Biología Celular, Genética Bio-157 research group and Biomaslinic S.L. company. y Fisiología Animal, Universidad de Málaga, Málaga, ES, 6Dpto. Biología Molecular y Bioquímica, Universidad de Málaga-UMA, Laboratorio de Oncología Molecular, Instituto de Biomedicina de P02-49 Málaga-IBIMA, Málaga, ES Cambios en el reclutamiento de la subunidad La aparición de metástasis es un evento frecuente en pacientes operadas de cáncer de mama y suele estar asociado a una mayor mortalidad. El ribosomal 40S por poblaciones de herogeneidad análisis de largas series de pacientes con amplio seguimiento ha puesto genética creciente del ARN del virus de manifi esto que la probabilidad de recaída no es constante en el tiempo, de la hepatitis C sino que sigue un patrón bimodal con un primer pico de incidencia a los 18-24 meses tras la cirugía (recurrencia temprana), seguido de un segundo Samuel Prieto Vega1, Celia Perales2, Sunnie R Thompson3, Raquel pico de menor magnitud a los 60 meses aprox. (recurrencia tardía); pasado Romero García4, J.I. Esteban5, Esteban Domingo2, Jordi Gómez este periodo, el riesgo de recaída disminuye drásticamente. Por tanto, son Castilla6 necesarios marcadores moleculares que permitan detectar con precisión 1Instituto de Biomedicina López Neyra (CSIC), Armilla, ES, aquellas pacientes que presentan mayor riesgo de recurrencia temprana y 2CBMSO Madrid, Madrid, ES, 3Dpt. Microbiology UAB Alabama,

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Birmingham Alabama, US, 4Hospital Universitario Puerta del Mar, P02-51 Cádiz, ES, 5Institut de Recerca Hospital Universitari Vall Hebron, Utilización de iPSC como modelo de estudio Barcelona, ES, 6Instituto de Biomedicina López Neyra (CSIC), de una nueva enfermedad rara CIBERehd, Armilla, ES Pilar Mollinedo Sedano1, José Antonio López-Escamez2, Silvia La región genómica 5’ del virus de la hepatitis C contiene una zona de Torices del Val1, Verónica Ramos-Mejía2, Pedro J. Real-Luna2, José unión al ribosoma. Este dominio y sus fl ancos son ricos en elementos Luis Fernández-Luna1, Domingo Gonzalez-Lamuño3 estructurales (estructuras 1ª, 2ª y 3ª) identifi cados in vitro por factores 1FUNDACION IDIVAL, Santander, ES, 2Centre for Genomics and bioquímicos y biofísicos: interacción con micro ARN hepático miR-122, Oncological Research-GENYO, Granada, ES, 3Universidad de sensibilidad a RNAsas dependientes de estructura (RNAsa III y P), luz Cantabria, Santander, ES UV-c. Se obtuvieron poblaciones heterogéneas de ARNin vitro por PCR Las nuevas tecnologías de análisis genómico y los nuevos modelos mutagénica y transcripción in vitro y en un cultivo, creciendo el virus de enfermedad mediante reprogramación celular están siendo de gran en presencia de ribavirina. Evaluamos el efecto de la variabilidad en importancia en el estudio de las enfermedades raras. Si bien estas poblaciones de ARN (HCV1-540) y de heterogeneidad genética creciente, enfermedades son de baja prevalencia (menos de 5 casos por cada 10.000 en los motivos simples a los distintos niveles estructurales y evaluamos personas), en su conjunto (más de 7000 patologías distintas) tienen los cambios en la unión al ribosoma. El efecto de la heterogeneidad una notable incidencia en la población (afectan al 7% de la población poblacional en el reconocimiento de los distintos factores varió a los mundial). Nuestro grupo está estudiando el caso de una niña de 7 años distintos niveles estructurales, siendo especialmente perjudicial para la con sospecha clínica de un síndrome de poliendocrinopatía autoinmune unión a la secuencia de miR-122 (estructura 1ª) y en el procesamiento por (síndrome APECED), asociado a mutaciones en el gen AIRE. Sin embargo, la RNasa P en la estructura tipo tRNA (estructura 3ª). El efecto sobre la la ausencia de mutaciones en este gen y la identifi cación de un cuadro RNasa III que reconoce ARN de doble cadena (estructura 2ª), fue menor, clínico más complejo con miopatía, infecciones intestinales recurrentes y pero permitió identifi car un cambio conformacional inducido por el alteraciones conductuales, indica una entidad patológica nueva. Mediante incremento mutacional, validado en geles nativos y con RNasas de simple CGH array de alta resolución (400K) se ha identifi cado una duplicación y doble cadena T1 y V1. Se evaluó la kd para la union de 40S a cada bialélica de 4.1 Kb en el cromosoma 21 que incluye el gen LINC00315 (long intergenic nonprotein coding RNA, Gene ID: 246704), un potencial población de heterogeneidad creciente in vitro obteniendo una pérdida de regulador transcripcional. Con el fi n de profundizar en el estudio genético la afi nidad por la subunidad 40S de hasta 3 veces con el incremento de de esta patología analizamos el exoma completo de la paciente y de sus las mutaciones. En cultivo celular, con y sin ribavirina, la acción de la padres. Se aportarán datos sobre ambos estudios. Simultáneamente selección natural sobre este dominio esencial para el virus, fue la de un estamos desarrollando un modelo de enfermedad transduciendo células incremento de la afi nidad a la subunidad ribosomal 40S. Concluimos que mononucleares de la paciente con vectores virales reprogramadores el reconocimiento molecular, in vitro, de las estructuras 2ª es más estable (iPSC,induced pluripotent stem cells). Estas iPSC se diferenciarán a que en las estructuras 1ª y 3ª y el dominio complejo RBS es el más sensible distintos linajes celulares (músculo, linfocitos, epitelio, neuronas) con al incremento en la tasa de mutación. En cultivo, el virus puede aprovechar relevancia en la patología estudiada, con el fi n de identifi car alteraciones el incremento en la tasa de mutación durante su replicación para facilitar la en el patrón de diferenciación o maduración celular que permitan explicar selección de mutantes más activos en dominios esenciales como el RBS. al menos parte del cuadro clínico de la paciente. Este modelo podría ser utilizado para el desarrollo de estrategias terapéuticas, tanto genéticas como farmacológicas. Presentaremos datos preliminares de este modelo P02r-50 celular. Epigenetic regulation in dilated cardiomyopathy Alicia González , Ileana B. González, Arturo Bujarrabal, Susana P02-52 González Identificación de variantes génicas relevantes Faculty of Medicine, University of Castilla-La Mancha, Ciudad de la vía de NFκB y sus consecuencias Real, ES. Fundación Centro Nacional de Investigaciones funcionales en pacientes con artritis reumatoide Cardiovasculares, CNIC, Madrid, ES Silvia Torices del Val1 2 Dilated cardiomyopathy (DCM) is one of the most common forms , Ignacio Varela Egocheaga , Thaidy Moreno of cardiomyopathy with an estimated prevalence of 1/2500. DCM Rodríguez2, Pilar Mollinedo Sedano1, Alejandro Balsa Criado3, Dora 3 1 1 is characterized by left ventricular enlargement (LVE) and systolic Pascual Salcedo , Lorena Álvarez Rodríguez , Marcos López Hoyos , 1 1 dysfunction with an ejection fraction <50%. This disease commonly results José Luis Fernández Luna , Víctor Martínez Taboada 1FUNDACION IDIVAL, Santander, ES, 2IBBTEC, Universidad de in congestive heart failure with signs and symptoms such as shortness of Cantabria, Santander, ES, 3Hospital La Paz, Madrid, ES breath, edema and increased heart rate, leading to death. DCM is a common reason for heart transplantation in adults and children. NFκB es uno de los principales moduladores de las respuestas inmune The mortality remains high without effective treatments. Further analysis e infl amatoria. Diversos estudios en pacientes con artritis reumatoide focusing on the development of cardiomyopathy are required in order to (AR) sugieren que NFκB es esencial para la expresión de citocinas improve treatment approaches and prognosis. proinfl amatorias y de enzimas que promueven la destrucción articular. Nuestra hipótesis de trabajo es que pueden existir mutaciones en los Recent studies in our group show that BMI1 protein, which belongs principales genes involucrados en la regulación de NFκB que pueden tener to the epigenetic regulator Polycomb group, seems to be involved in consecuencias funcionales relevantes y por tanto asociarse bien con la cardiomyopathy development. In order to study what happens at very early susceptibilidad a padecer AR, o bien con el pronóstico de la enfermedad. stages of the disease, we have generated mice with conditional deletion Para comprobar esta hipótesis, hemos analizado por medio de técnicas de of BMI1 (cKO Bmi1) in heart. This cKO Bmi1 mice has been obtained secuenciación de nueva generación 158 genes reguladores de la vía NFκB by crossing a cKO Bmi1 fl /fl mouse with mice bearing different cardiac en 66 pacientes con AR y en 30 controles sanos, obteniendo un total de specifi c CRE, such as αMYH6-CREERT, inducible in adult myocardium by 942 variantes génicas. Seleccionamos trece de estas variantes, afectando tamoxifen administration. a 10 genes (TLR10, TLR1, TLR7, TLR8, NLRP7, NFκBIZ, NOD2, TNIP1, The present work focuses on the caracterization of early stages of BMI1- TRIP6 y BCL10) de acuerdo a la presencia de diferencias estadísticamente mediated dilated cardiomyopathy and the elucidation of the most important signifi cativas en la frecuencia del polimorfi smo entre la población control genes and proteins involved in cardiac dysfunction and heart failure. y los pacientes con AR, la frecuencia alélica de la mutación en la población

48 Granada 2014 Pósters general, el impacto del polimorfi smo a nivel de la proteína y la función organismo infectado durante un período prolongado de tiempo. Es el reguladora que estos genes tienen en la ruta NFκB. Estas variantes fueron agente causal de enfermedades humanas de diversa severidad, desde confi rmadas en una cohorte de 400 pacientes con AR y 200 controles gastroenteritis hasta infección sistémica crónica. Como la mayoría de las sanos mediante secuenciación masiva. A fi n de determinar las posibles bacterias, esta especie contiene en su genoma sistemas toxina-antitoxina consecuencias funcionales de las variantes, se han comenzado estudios (TA). Los sistemas TA son módulos formados, generalmente, por dos para determinar el nivel de actividad de NFκB mediante ensayos con genes adyacentes, que están agrupados formando un operón. Uno de los luciferasa como gen reportero y expresión de citocinas pro-infl amatorias genes codifi ca una antitoxina, que puede ser un RNA o una proteína, y por PCR cuantitativa. Presentaremos datos preliminares sobre la posible el otro una toxina que es siempre una proteína estable capaz de interferir participación de algunas de estas variantes génicas en el desarrollo o con la proliferación o viabilidad de la bacteria. La activación de estos evolución de la artritis reumatoide. sistemas está asociado a la respuesta a estrés, y más recientemente se ha visto que pueden favorecer la supervivencia del patógeno durante la infección. P02-53 Data mining en Drosophila para la identificación Nosotros hemos realizado una búsqueda sistemática y un análisis funcional y caracterización de nuevos genes implicados de los sistemas TA de S. typhimurium, determinando que la mayoría de los sistemas TA identifi cados son funcionales. Además, hemos analizado, en la biogénesis de la función OXPHOS utilizando un modelo de infección de fi broblastos, el papel de estos Sara Palacios Zambrano, Ramiro Vicente, Paula Clemente Pérez, sistemas en la persistencia intracelular. El análisis ha permitido identifi car Susana Peralta, Lucía Echevarría, Rafael Garesse, Miguel Angel un subgrupo de sistemas TA que se expresan en la célula huésped y cuya Fernández-Moreno presencia favorece la supervivencia y/o proliferación limitada de S. Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, Universidad typhimurium en el interior de la célula infectada. Los datos demuestran un Autónoma de Madrid, Alcobendas, ES papel activo de un grupo de sistemas TA en la persistencia de Salmonella La mitocondria es un orgánulo celular de origen endosimbionte que juega en fi broblastos infectados. un papel central en el metabolismo de la célula hospedadora destacando su implicación en: (i) la síntesis de la mayor parte de la energía (ATP) celular (ii) la regulación de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), P02-55 (iii) el control de la homeostasis del Ca2+ intracelular y (iv) el control del Expresión, caracterización enzimática e interés proceso de muerte programada o apoptosis. biomédico de la pirrolin 5-carboxilato sintetasa Entre estas funciones, se considera la síntesis de ATP mediante el sistema cadena respiratoria (CR)/OXPHOS como la más relevante y humana, una enzima clave en la biosíntesis cuya disfunción genera las denominadas enfermedades mitocondriales. de prolina y ornitina El CR/OXPHOS está formado por numerosas subunidades estructurales, de las que 13 están codifi cadas en el propio genoma mitocondrial Juan Manuel Escamilla Honrubia1, Clara Marco Marín1, Nadine (mtDNA) y más de 80 en el DNA nuclear. Para la biogénesis de este Gougeard2, Vicente Rubio3 sistema se requieren, además, los elementos que las ensamblan y los 1Instituto de Biomedicina de Valencia (IBV-CSIC), Valencia, ES, numerosos componentes de la maquinaria de replicación y decodifi cación 2Centro para Investigación Biomédica en Red sobre Enfermedades del genoma mitocondrial. Mutaciones en cualquiera de ellos pueden Raras CIBERER-ISCIII, Valencia, ES, 3Instituto de Biomedicina de provocar defectos responsables de numerosas patologías denominadas Valencia (IBV-CSIC) y CIBERER-ISCIII, Valencia, ES enfermedades mitocondriales. 1 En más de la mitad de las patologías mitocondriales de base genética se La ∆ -pirrolin-5-carboxilato sintetasa (P5CS) es un enzima bifuncional desconoce el gen o genes causantes. La identifi cación de genes no descritos que cataliza los dos pasos iniciales de la biosíntesis de novo de prolina y implicados en defectos OXPHOS es uno de los retos actuales en este área. ornitina (y a través de ornitina, arginina) en animales y plantas, siendo su En este sentido, la utilización de Drosophila como modelo puede suponer défi cit un error congénito transmitido con herencia recesiva en unos casos una herramienta adicional para ello. Drosophila posee una molécula de y dominante en otros. Con la fi nalidad de establecer las características mtDNA similar a la de mamíferos y conserva los mismos elementos bioquímicas y funcionales de esta enzima e intentar determinar su responsables de su replicación, transcripción, mantenimiento, etc. El estructura, así como para explorar los efectos de las mutaciones clínicas, rastreo de diferentes bases de datos nos han permitido identifi car la tratando de entender su dominancia o recesividad, hemos expresado la presencia de genes esenciales para la función OXPHOS situados sobre P5CS recombinante humana como proteína de fusión con MBP, de la que bicistrones, es decir, codifi cados en un mismo mRNA, recordando eliminamos luego la MBP por procedimientos estándar. Nuestro sistema de una organización procariota. Los ortólogos en mamíferos de algunos expresión usa baculovirus/células de insecto Sf9, no habiendo tenido éxito de esos genes han sido recientemente caracterizados en el laboratorio. con sistemas de expresión bacteriana y escaso rendimiento con la expresión Para caracterizar otros nuevos candidatos procederemos a utilizar usando células HEK293. Hemos generado, estables y activas, las dos formas aproximaciones de interferencia de RNA y de generación de knock-outs de “splicing” alternativo de la enzima, determinando las características mediante el sistema CRISPR/Cas. cinéticas de sus dos reacciones parciales (glutamato 5-quinasa, G5K; y glutamil 5-fosfato reductasa, G5PR) y de la global, estudiando su grado de acoplamiento, y corroborando que sólo la isoforma más corta experimenta P02-54 Los sistemas toxina-antitoxina controlan retroinhibición por ornitina. Probamos que la estructura cuaternaria de la la infección por Salmonella typhimurium enzima es hexamérica, de acuerdo con la dominancia negativa propuesta para explicar los casos de herencia dominante. Los ensayos con mutantes Damián Lobato Márquez1, Inmaculada Moreno Córdoba1, Viginia dominantes han demostrado tendencia a la rápida desagregación. Los Figueroa2, Francisco García del Portillo2, Ramón Díaz Orejas1 experimentos cristalográfi cos no han generado por el momento resultados 1Centro de Investigaciones Biológicas (CIB-CSIC), Madrid, ES, positivos. 2Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC), Madrid, ES Salmonella enterica serovar typhimurium (S. typhimurium) es una Ayudas Prometeo 2009/051 (Generalitat Valenciana) y BFU2011- bacteria patógena intracelular Gram-negativa que puede persistir en el 30407(MINECO). N. Gougeard es contratada CIBERER.

49 Pósters XXXVII Congreso SEBBM

P02-56 defi cientes en Zmpste24 en relación al tiempo de desarrollo de los procesos A novel liquid chromatography coupled with a tumorales ha difi cultado el abordaje de esta cuestión. tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method El presente trabajo, surgido de la colaboración entre los laboratorios de to assess LpxC inhibition López-Otín y Juan Cadiñanos, del Instituto de Medicina Oncológica y Molecular de Asturias, y enmarcado dentro del proyecto de tesis doctoral de Caridad Díaz Navarro1, Victoria Knight-Connoni2, Kevin Barry2, Olga Jorge de la Rosa, ha permitido estudiar la implicación de este enzima y su Genilloud1, Francisca Vicente Pérez1, José Pérez del Palacio1 sustrato en el cáncer. Para ello se generaron ratones mosaico de Zmpste24, 1Fundación MEDINA, Parque Tecnológico de Ciencias de la Salud, en los que aproximadamente la mitad de las células del organismo carecen Granada, ES, 2Cubist, Lexington, MA, Lexington, US de esta proteasa y, por tanto, acumulan prelamina A. Sorprendentemente, estos ratones son fértiles y no experimentan síntomas de envejecimiento LpxC, an essential enzyme for lipid A biosynthesis in gram-negative acelerado, pese a que las células con prelamina A persisten en proporciones bacteria, represents an attractive target for therapeutics. However, similares a las células normales. En consecuencia, resultan prometedores antibacterial drug discovery efforts focused on inhibitors of LpxC have tanto el desarrollo de terapias génicas y celulares como el suplemento de found that the enzyme assay is not suitable for high-throughput screening factores sistémicos para el tratamiento de estas enfermedades. Asimismo, using conventional technologies such as assays with radiolabeled substrates la esperanza de vida normal de estos ratones permitió estudiar la relevancia involving charcoal or TLC separation and fl uorescence-based methods that del sistema Zmpste24/prelamina A en el cáncer. La aplicación de distintos detect the free amine in the reaction product by coupling to fl uorescamine. protocolos de carcinogénesis en ratones mosaico y ratones control permitió These methods are cumbersome and vulnerable to false-positive hits due to observar que los primeros presentaban un menor número de tumores fl uorescence quenching. infi ltrantes. Igualmente, el silenciamiento de ZMPSTE24 en distintas células In this work we present a novel liquid chromatography coupled with a tumorales humanas redujo signifi cativamente su capacidad invasiva. Estos tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method which offers a fast, resultados sugieren por primera vez que la proteasa ZMPSTE24 podría ser sensitive, and reliable alternative to the typical LpxC inhibition assay. It una diana antitumoral. employs mass spectrometry to directly detect product with high sensitivity. Using this system, the data collected illustrate enzyme concentration linearity and standard kinetics for conditions used in screening for LpxC inhibitors. Additional validation experiments, such as DMSO tolerance and reference inhibitor (Chir90) testing, were also carried out successfully. P03. Biología del desarrollo This method represents the fi rst communication of a methodology for the separation of the enzymatic reaction product by mean of conventional high pressure liquid chromatography (HPLC) which makes feasible the P03-1 implementation of a screening for antibacterial inhibitors of the LpxC Single-enhancer KO to study the formation using a high-throughput mass spectrometry assay in many drug discovery of the epaxial musculature during mouse setups. embryonic development

Macarena López Mayorga1, Natalia Moncaut2, Maria Rosa Giráldez P02-57 Perez1, Lydia Teboul3, Cristina Bernal Lozano1, Ana Castro Cañal1, El sistema Zmpste24/prelamina A en el cáncer Jaime Carvajal García-Valdecasas1 y el envejecimiento 1Centro Andaluz de Biología del Desarrollo, Sevilla, ES, 2The Institute of Cancer Research , London, UK, 3MRC-Harwell, Jorge de la Rosa1 2 3 , Carlos López-Otín , Juan Cadiñanos Oxfordshire, UK 1Instituto de Medicina Oncológica y Molecular de Asturias (IMOMA) The determination and specifi cation of skeletal muscle in vertebrates is - Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Instituto orchestrated by the myogenic regulatory factors Myf5, Mrf4, MyoD and Universitario de Oncología (IUOPA), Universidad de Oviedo , Myogenin. Myf5 is the fi rst to be expressed in the embryo, initiating and Oviedo, ES, 2Instituto de Medicina Oncológica y Molecular de co-ordinating the myogenic cascade. In absence of Myf5, progenitors Asturias (IMOMA), Oviedo, ES, 3Departamento de Bioquímica y fail to be specifi ed at the correct time but activation of MyoD rescues the Biología Molecular, Instituto Universitario de Oncología (IUOPA), phenotype and myogenesis progresses. Myf5/MyoD KO animals lack all Universidad de Oviedo, Oviedo, ES skeletal muscles. Los avances producidos en los últimos años en torno al envejecimiento han Myf5 transcription is controlled by over 25 regulatory elements which sido favorecidos por el estudio de los denominados síndromes progeroides drive expression in a specifi c spatiotemporal manner. Although their humanos, cuyos pacientes desarrollan de manera prematura y exacerbada contribution to the expression pattern is well defi ned we still lack an múltiples alteraciones características de la edad avanzada. Las conocidas understanding on the role of the different subpopulations of muscle como laminopatías progeroides se engloban dentro de este grupo de progenitor cells. Furthermore, there is still no connection between the patologías y, mayoritariamente, se deben a defectos en el procesamiento de spatiotemporal activation of Myf5 and its function within a particular set la proteína de la envuelta nuclear, denominada lamina A. Esta proteína es of myogenic precursors. The Early Epaxial Enhancer (EEE) operates in the sintetizada como un precursor, la prelamina A, que debe sufrir una serie de dermomyotomal dorsomedial lip and is the fi rst enhancer to activate Myf5. modifi caciones post-traduccionales hasta dar lugar a la proteína madura. En In order to address these questions we have generated a new enhancer- la última etapa de su procesamiento interviene la proteasa Zmpste24, cuya specifi c KO strain in which the EEE has been targeted. By RNA-seq, we participación se conoce desde hace más de una década gracias al trabajo del have identifi ed three gene-networks that show clear differences between the laboratorio de Carlos López-Otín, de la Universidad de Oviedo. Entonces, WT and KO embryos; two of these networks are involved in myogenesis. la generación de ratones defi cientes en esta proteasa puso de manifi esto qPCR has been used to validate the data and preliminary analyses of the la incompatibilidad de los defectos en el sistema Zmpste24/prelamina expression patterns of some of the genes in these networks also confi rms A con el desarrollo normal del organismo. Más recientemente, estudios these fi ndings. Crucially, we have crossed this new allele into the MyoD KO realizados por el mismo grupo con este modelo murino han permitido el strain and show that in the absence of MyoD rescue, specifi c back muscles desarrollo de nuevas terapias para combatir estas enfermedades. Dado are lost or severely reduced, resulting in severe scoliosis of the spine. que el envejecimiento y el cáncer son procesos íntimamente relacionados, We are now in the process of identifying all the muscle groups that may el sistema Zmpste24/prelamina A podría estar también implicado en el be affected in this double KO as this will allow us to generate a map of the desarrollo tumoral. Sin embargo, la corta esperanza de vida de los ratones musculature that originates from the dorsomedial lip of the dermomyotome.

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P03-2 P03-4 Adhesion to the Fibronectin synergy site could be Dose dependent pitx2 loss of function impairs critical for platelet function zfhx3, wnt8a and calcium handling; novel links to atrial arrhythmogenesis María Benito Jardón, Joaquín Lilao Garzón, Mercedes Costell Rosselló Estefanía Lozano-Velasco1, Francisco Hernández-Torres1, Jorge Departamento de Bioquímica y Biología Molecular Universitat de Domínguez Macías1, Leif Hove-Madsen2, Juan Cinca3, Amelia Valencia, Burjassot, ES Aránega Jiménez1, Diego Franco Jaime1 Fibronectin (FN) is a core component of many extracellular matrices 1Departamento Biología Experimental, Universidad de Jaén, Jaén, (ECM) where it regulates a variety of cell activities through direct ES, 2CSIC-ICCC, Barcelona, ES, 3Hospital Sant Pau, Barcelona, ES interactions with integrins. The fi brillar organization of FN precedes Atrial fi brillation (AF) is the most common cause of arrhythmogenesis in the assembly of other ECM proteins. FN fi brillogenesis is a cell driven humans yet the genetic cause of AF remains elusive. Recent genome-wide process that requires integrins, which bind the RGD motif in the 10th association studies (GWAS) have reported risk variants in four distinct type III module (FNIII10). The RGD motif can bind αvβ3 and α5β1 on genetic loci (4q25, 1q21, 16q22 and 16q13) which have been associated mesenchymal cells and αIIbβ3 integrins on platelets. While the RGD site with AF. Among them, the most signifi cant are 4q25 risk variants, which is suffi cient for αvβ3 to bind and assemble FN, it has been claimed that are located in the vicinity of the PITX2 gene. Given the key developmental α5β1 also requires residues in the fl anking module (FNIII9), called synergy role of Pitx2 during cardiogenesis and particularly its role in pulmonary site, for FN binding and fi brillogenesis. Aimed at studying the role of the vein deployment, it has been postulated that Pitx2 dysfunction might be the synergy site in vivo, we generated a mouse strain in which key residues of molecular link to AF. the synergy site were mutated (FNSyn mice). Surprisingly, FNSyn mice Experimental evidences in distinct laboratories, including ours, are born without apparent phenotype indicating that this site is not essential have demonstrated that Pitx2 loss of function predisposes to atrial for α5β1 binding during embryogenesis. However, a slight increase in the arrhythmogenesis. However, the molecular mechanisms driven by Pitx2 tail bleeding time and a pronounced delay in skin wound closure suggest in this context remain somehow elusive, proposing either embryonic a critical role of the synergy site for platelet and skin cell adhesion to FN. or mature gene expression defects. In order to get further insights into To eliminate a potential compensatory effect of αvβ3 integrins, we crossed the molecular mechanisms driven by Pitx2 and their putative relation the FNSyn mice with a mouse strain lacking the expression of β3 integrins. with novel AF GWAS associated genes, we have generated a new Pitx2 The β3 integrin-null mice suffer from a Glanzmann-like thrombasthenia, conditional mouse line, by intercrossing Sox2Cre and Pitx2fl oxed mice. a bleeding disorder that was exacerbated in the double mutants. About Epiblast deletion of Pitx2 leads to the generation of heterozygous and 87% of β3 integrin-null mice are born and of those around 20% will die systemic null Pitx2 null mutants, respectively. As expected, embryonic in the following weeks. However, when mice lack β3 integrins as well as mortality and cardiac defects were similarly observed in Sox2CrePitx2 null the FN-synergy site the 96,2% succumb before E17.5 (151 mice analyzed mice as those previously reported for Pitx2 knock-out mice. at E17.5-P21) of severe hemorrhages and a failure to separate blood and Molecular analyses of the left atrial appendage in heterozygous lymphatic vessels. These fi ndings demonstrate that β3 integrins only Sox2CrePitx2 mice (20-30% reduction in Pitx2 expression) and atrial- partially compensate the lack of a functional FN-synergy site. We are specifi c NppaCrePitx2 null mice (60-70% reduction in Pitx2 expression) currently testing how the synergy site promotes adhesion and will discuss demonstrate that AF GWAS associated genes such as Zfhx3, Kcnn3 and Wnt8a are severely impaired while other such as Cav1, Synpo2l or these results and the implications for human hemostasis at the meeting. Prrx1 are not. Surprisingly, beta-adrenergic signaling is not altered in these models whereas multiple calcium handling genes such as Serca2a, calsequestrin, phospholamban are severely impaired in atrial-specifi c P03-3 (R03-19-1) Developmental origin of the coronary NppaCrePitx2 null mice but not in heterozygous Sox2CrePitx2 mice. Functional assessment of calcium handling further underscores these endothelium. Of elephants and blind men fi ndings. Importantly, neither Zfhx3 nor Wnt8a gain-of-function or loss- Ramón Muñoz-Chápuli of-function experiments impairs Pitx2 expression, suggesting that Pitx2 is upstream of these genes. Furthermore, these data suggest a dose–dependent Universidad de Málaga, Málaga, ES relation between Pitx2 expression and the susceptibility to display basal The developmental origin of the coronary endothelium has been the matter or only inducible electrophysiological defects. We are currently studying of a debate in recent years. The classical view of a sprouting of the coronary the hierarchical between Pitx2, AF GWAS associated genes and calcium arteries from the aortic root was abolished 30 years ago by the evidence of handling, as well as to putative involvement of post-transcriptional a “coronary ingrowth”, i.e. a primary coronary capillary plexus appears in modulators such as microRNAs. the subepicardium, surrounds the truncus arteriosus and fi nally connects with the aortic lumen. The question then was the origin of the subepicardial capillary plexus. Different hypothesis have been postulated to explain this P03-5 (R03-19-6) origin, basically angioblasts migrating from the developing liver, outgrowth Filopodia mediate Hedgehog transport of the sinus venosus endocardium, angiogenesis from the ventricular and signalling endocardium or cells delaminating from the epicardium. This latter option has been particularly controversial, since experimental evidence has been Isabel Guerrero Vega provided either supporting or ruling out an epicardial contribution to the CSIC - UAM, Madrid, ES coronary endothelium. We have studied coronary development in a number The Hedgehog (Hh) signalling pathway is a highly conserved regulator of murine transgenic lines, and we have concluded that the embryonic and of patterning during development and homeostatic events in adult organs. the neonatal coronary endothelium is a mosaic of endocardial-derived and Hh also directs tissue-patterning acting as a morphogen. To signal in a epicardial-derived cells, in a ratio of about 3:1, receiving later a postnatal concentration dependent manner requires a graded distribution of Hh contribution from circulating endothelial progenitors. As in the Indian from producer to receptive cells. During production, Hh undergoes two story of the elephant and the blind men, different reports had detected only lipid modifi cations resulting in a highly hydrophobic molecule with a a part of the whole picture, attributing to the coronary endothelium a single cholesterol tag at the C-terminal and a Palmitoylation at the N-terminal. origin. The endothelial developmental heterogeneity could be relevant in Hh lipid modifi cations are needed to achieve a graded distribution, but order to explain the existence of atherosclerotic lesion–prone sites in the constrains its extracellular movement, leading to debate about how Hh is coronary arteries. transported to target cells. We show that Hh and most of the extracellular

51 Pósters XXXVII Congreso SEBBM components of the Hh signaling localize in fi lopodia-like structures P03-7 (R03-19-3) or cytonemes arising at the basolateral side of Drosophila wing disc Spiracle formation and tissue remodeling and abdomen epithelia. In vivo imaging, using actin reporters, and during Drosophila development: a vertex model membrane markers, such as the CD4 or the Hh co-receptor Ihog fused to approach fl uorescent tags, shows that these cytonemes are very dynamic and their extension correlates spatially and temporally with the formation of the Javier Argüello, Kai Dierkes, Arturo D’Angelo, Jerome Solon Hh gradient. Mutant conditions for proteins required for actin dynamics Cell and Developmental Biology Group, Biomechanics of affect both cytoneme formation and Hh gradient extension. In addition, Morphogenesis, Centre for Genomic Regulation (CRG), Barcelona, in vivo vesicle-like structures are visualized moving along cytonemes ES in anterograde direction. Immunoelectron microscopy also shows Hh, Strong efforts are being made to understand how large-scale tissue the Hh co-receptor Ihog, and other Hh pathway components located in movements emerge during morphogenesis. In this study, we analyze how extracellular vesicles of heterogeneous size (ranging from 50 to 250 nm) the development of spiracles in embryos of the fruit fl y Drosophilacould at the Drosophila wing imaginal disc. These vesicles present Hh in the generate forces inducing tissue remodeling. High-resolution time-lapse outer side of the double membrane. Biochemical characterization of the movies of tomato-E-cadherin and histone-RFP expressing embryos show exosomal fraction of Drosophila cultured cells indicates the presence a simultaneous migration of spiracles and posterior epidermal cell layers of active Hh and co-receptor Ihog together with exosome markers. toward the posterior part of the embryo. To explain the mechanics of Furthermore, RNA interference for genes necessary for production/ this process, we discuss two different interplays of forces: (A) during its release of exovesicles has a direct effect over Hh secretion and signaling development, spiracles push the tissue; (B) the tissue is originally moving in vivo and in vitro, indicating that Hh is transported in bonafi de and pulls the spiracles. exosomes. We propose that a Hh intracellular traffi cking in the producing The dynamics of the system is computationally simulated under both cells allows Hh to be released in exosomes and cytonemes. In our view conditions using a 2D vertex model that takes into account the surface this membrane anchored Hh dispersion could represent an advantage for elasticity of cells, contractility of the acto-myosin cortex and adhesion a lipid-modifi ed molecules to be spatially regulated to form a gradient. between neighbor cells, as well as the boundary conditions of pushing (A) Furthermore, we show that this signaling mechanism based on cell-cell or pulling (B). Tissue movements within the simulations of the two different contact is similar to the synaptic process in neuronal cells. cases (A and B) are then compared with the in vivo situation using Particle Image Velocimetry (PIV). We show meaningful differences between the simulations and the experimental evidences when the tissue is pulled, while P03r-6 the pushing boundary condition generates a general movement close to in Caracterización del tejido linfoide asociado al vivo. Our work suggests that tissue fl ow is the consequence of pushing intestino en ratones SAMP8 propensos forces generated during the formation of spiracles in Drosophila. al envejecimiento

Alba Garcia-Just1 2 1 P03r-8 , Lluïsa Miró , Anna Pérez-Bosque , Concepció miRNAs 212 and 132 are involved in morphine Amat1, Miquel Moretó1 1Departament de Fisiologia, Facultat de Farmàcia, Institut de effects on cell proliferation through BDNF Nutrició i Seguretat Alimentària, Universitat de Barcelona, regulation Barcelona, ES, 2APC Europe, Granollers, Barcelona, ES Ada Jiménez González, Adrián García Concejo, Raquel E. Rodríguez El envejecimiento es un proceso caracterizado por un incremento de Universidad de Salamanca, INCYL (Instituto de Neurociencias de la susceptibilidad a determinadas enfermedades y patologías. En este Castilla y León) IBSAL, Salamanca, ES sentido, el tejido linfoide asociado al intestino (GALT) tiene un papel Morphine effects on cell proliferation in Central Nervous System fundamental en las funciones de barrera y de defensa frente a patógenos (CNS) have been studied over the last years. It is known that this drug externos. El presente estudio tiene como objetivo caracterizar el alters the proliferative cell expression patterns. In the present work, we GALT en distintas etapas del desarrollo, en un modelo de ratones have analyzed whether morphine is triggering these changes in zebrafi sh senescentes, para su utilización futura en estudios de los efectos de la development through epigenetic factors such as miRNAs 212 and 132 dieta sobre indicadores mucosales (intestinales) de envejecimiento. Se and their involvement on BDNF expression. These miRNAs appear in the han utilizado ratones propensos al envejecimiento de la cepa SAMP8 same genetic cluster and have important roles through different pathways y resistentes al envejecimiento acelerado (SAMR1). Se han obtenido on CNS development. To studied miRNA 132 levels during zebrafi sh los ganglios linfáticos mesentéricos (GLM) y las placas de Peyer development, we performed qPCR in several developmental stages, (PP) del intestino delgado, a las 3 semanas, a los 4 y 9 meses. Se ha fi nding an increase and decrease of its levels along the development. We realizado el recuento linfocitario de los dos tejidos y la cuantificación also checked the effects of morphine and the involvement of miRNA 132 in de la actividad SA-β-galactosidasa (indicador de senescencia) por the opioid pathway by knocking down the mu opioid receptor, fi nding that citometría de flujo. Los ratones SAMP8 presentan una disminución del the levels of miRNA 132 changed between the control group and morphine peso de los GLM a los 4 y 9 meses, con una reducción significativa treated embryos. These results indicate that morphine is triggering its del número de leucocitos respecto a los SAMR1 (69% y 57%, proliferation effects through a different pathway than the one triggered respectivamente; p<0,05). En las PP, se observa una reducción del 35% by the mu receptor. Futhermore, when we studied miRNA 132 in miRNA (p<0,05) pero sólo a los 9 meses de edad. En ambos grupos, la actividad 212 morphants we found an increase in these levels, which suggests that SA-β-galactosidasa de los linfocitos ganglionares aumenta con la edad, miRNA 132 is trying to balance the absence of miRNA 212. Besides, we siendo mayor en los ratones SAMP8 que en los SAMR1 (p<0,05). have found changes in BDNF protein expression levels in morphine treated Estos resultados demuestran que el envejecimiento se caracteriza embryos and when the mu opioid receptor and miRNA 212 were knocked por una inmunosupresión en el GALT, que podría explicar la mayor down at 48 hpf. These results suggest that BDNF, an essential neurotrophin susceptibilidad a infecciones y patologías asociadas al envejecimiento. for the correct development of the CNS, has an important role in the Asimismo estos resultados sugieren que los ratones SAMP8 son un mechanisms triggered by morphine, leading to a better understanding of the buen modelo para el estudio de la senescencia. infl uence of morphine in the mechanisms of pain and addiction processes.

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P03r-9 putative structures and functions of the C-terminal domains of the FADS- Changes in dopaminergic development in type II from Listeria monocytonegens (LmFADS-typeII) and plant-like zebrafish embryos after morphine exposure FADS from Glycine max. have been investigated. Previous results pointed mediated by miRNA-212 and miRNA-29a out that the C-terminus domain of plant-like FADS proteins could contain a catalytic activity (i.e. hydrolase or phophatase), but different to that of their Adrián García Concejo, Ada Jiménez González, Raquel E. Rodríguez prokaryotic counterparts [1]. On the contrary, our recent investigations Universidad de Salamanca, INCYL (Instituto de Neurociencias de suggest that the C-terminus domain of LmFADS-type II might be related Castilla y León) IBSAL, Salamanca, ES with the pathogenic activity of gram-positive bacteria, in particular with the defence of bacteria against the lytic action of host lysozimes [2]. This Several studies have shown that the levels of expression of miRNA-212 work is a contribution to our understanding of the evolutionary history of are modifi ed after drug exposure, which may indicate a relation between FADS enzymes. this molecule and the appearance of tolerance. In addition, miR- 29a has been related to Notch signaling, which is known to mediate References dopaminergic differentiation at the early stages of Central Nervous [1] I. Yruela, S. Arilla-Luna, M. Medina, B. Contreras-Moreira. System development. We have performed a study of the expression levels Evolutionary divergence of chloroplast FAD synthetase proteins (2010) of miR-212 during the normal development of zebrafi sh embryos, to BMC Evol. Biol. 10:311. determine the stages in which this miRNA is more expressed. Our results [2] S. Leysen, L. Vanderkelen, S.D. Weeks, C.W. Michiels and S.V. have shown that after morphine exposure the levels of microRNAs 29a Strelkov. Structural basis of bacterial defense against g-type lysozyme- and 212 are altered, pointing to a relation between these two molecules. based innate immunity (2013). Cell. Mol. Life Sci. 70:1113-1122. To analyze a possible cross-talk between Notch and opioid signaling we used DAPT, an inhibitor of the metalloproteases needed to activate this pathway, and mindbomb mutants, where Notch pathway is disrupted, in addition to oprm1 morphants (lacking opioid signaling). Our results show P04-2 (R04-5) that these two cascades are antagonic when infl uencing dopaminergic Late-replicating heterochromatin fuels genome differentiation. Using a luciferase assay, we have also demonstrated, evolution that miR-212 effectively represses oprm1 expression by interacting Daniel Rico with the 3’UTR of the mRNA. We hence proposed a mechanism by Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas - CNIO, Madrid, ES which morphine is regulating the expression of mu opioid receptor and inducing the appearance of tolerance. Finally, the expression patterns of Asynchronous DNA replication of the genome has been associated some dopaminergic markers, such asth, pitx3 and nurr1, were modifi ed, with different mutation rates and copy number variation (CNV) in leading to a totally new pattern of expression, with all these genes being human populations. The late replication is generally associated to expressed in the midline. The understanding of these mechanisms that heterochromatic regions that tend to suffer high replicative stress. CNVs involve both signaling pathways could lead to unravel the initial stages typically involve intermediate to large regions, providing a potential of the addictive process. substrate for the generation of new genes through gene duplication. We have elucidated the possible relevance of the association of CNV regions with later DNA replication times on gene birth and evolution. Our analyses show that most human genes duplicated in the Primate lineage are located in late replicating CNV regions. We have traced P04. Biología molecular computacional the relationship between replication timing and the evolutionary age of duplicated genes. Strikingly, we have found that the more recently a gene has been duplicated the later it is replicated in human and mouse cells. P04-1 (R04-3) These results suggests that the currently active accumulation of CNVs Predicted structure and function of divergent in late replicating regions has being also persistently and extensively members of prokaryotic flavin adenine infl uencing genome evolution throughout animal history. We propose dinucleotide synthetase (FADS) proteins a new evolutionary model [1] based on these observations in which chromatin structure and replication dynamics conditions gene birth and Inmaculada Yruela1, Patricia Ferreira2, Bruno Contreras-Moreira3, the rising of new protein functions. Milagros Medina2 1Estación Experimental de Aula Dei, Consejo Superior References de Investigaciones Científi cas (EEAD-CSIC), Instituto de [1] Juan,D. Rico, D, et al. (2013) Late-replicating CNVs as a source of new Biocomputación y Física de Sistemas Complejos (BIFI), Zaragoza, genes. Biol Open, 2, 1402–1411. ES, 2Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular, Universidad de Zaragoza, Instituto de Biocomputación y Física de Sistemas Complejos (BIFI), Zaragoza, ES, 3Estación Experimental P04-3 de Aula Dei, Consejo Superior de Investigaciones Científi cas The human DNA damage response network (EEAD-CSIC), Instituto de Biocomputación y Física de Sistemas database of proteins Complejos (BIFI), Fundación ARAID, Zaragoza, ES Eduardo Andrés León1 2 1 Flavin adenine dinucleotide synthetases (FADSs) are well-known as a , Ildefonso Cases , Ana M. Rojas Mendoza 1 group of prokaryotic bifunctional enzymes that carry out the dual functions Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS), Hospital Universitario of ribofl avin phosphorylation to produce fl avin mononucleotide (FMN) Virgen del Rocio/CSIC/Universidad de Sevilla - Computational 2 and its subsequent adenylylation to generate FAD (hereafter FADS-type I). Biology and Bioinformatics, Sevilla, ES, Genomics and An extensive bioinformatics survey using the available genomes in public Bioinformatics Platform of Andalusia, Cartuja Scientifi c and databases revealed that certain gram-positive pathogenic bacteria (i.e. Technology Park INSUR Building, Sevilla, ES Listeria monocytonegens, Listeria welshimeri, Lactobacillus plantarum, The DNA damage response (DDR) is an essential signaling network that Bacillus cytotoxicus) and plant chloroplasts contain also variants of protects the integrity of the genome. This network is built upon a repertoire FADS sequences, named FADS-type II and plant-like FADS, respectively. of distinct but often overlapping sub-networks, where sometimes the same Both variants of FADS proteins constitute distinct evolutionary classes components have different roles in precise spatial and temporal scenarios. characterized by shorter and non-conserved C-terminal domains. The Perturbations of this network produce genomic instability, which is

53 Pósters XXXVII Congreso SEBBM inherently related to aging (Fernandez-Capetillo 2010), disease (Ciccia and opportunities to match therapies with the characteristics of the individual Elledge 2010), and cancer, reviewed in (Lukas, Lukas et al. 2011). patient’s tumor. Despite its importance, evolutionary studies addressing the emergence of In our laboratory, we have focused on developing an integrative this network were restricted to few protein families (On, Xiong et al. 2010). bioinformatics approach to demonstrate the value in integrating genomic In this line, we have recently provided the largest systematic analyses of and clinical data with available drugs, to refi ne and to improve therapeutic the human DDR network and have analysed its evolutionary properties strategies for cancer patients. (Arcas, Fernandez-Capetillo et al. 2014). We present a multi-disciplinary integrative effort that will convert the To complement this study, we have built a resource to explore these data, information contained in multidimensional genomic data into useful in an evolutionary context. biomarkers that can classify patient tumors by prognosis and to identify the From this database, it is possible to select genes according with its function drivers of tumor behavior that are optimal targets for therapy. in a particular pathway or network, according with post translational modifi cations (PTMs) where the gene acts as a target or a modifi er and also by sequence similarity. When searching for PTMs, affected residues and P04-5 (R04-4) links to Pubmed articles are provided. Full-LengtherNext: Una herramienta para In this tool, it is easy to fi nd DDR proteins that emerged at the same age, caracterizar transcriptomas de organismos or involved in same networks/pathways, and also affected by similar no modelo PTM modifi ers. When a DDR protein is selected, a detailed view displays information regarding its emergence and conservation across 47 species, Pedro Seoane Zonjic1, Noé Fernandez-Pozo1, Darío Guerrero- the overall agreement with the taxonomic tree, and the position of a post- Fernandez2, Rocío Bautista2, M. Gonzalo Claros1 translationaly modifi ed residue in a structure when available. 1Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de This resource is available at: http://ddr.cbbio.es. Ciencias, Universidad de Málaga, Málaga, ES, 2Plataforma Andaluza de Bioinformática, Centro de Supercomputación y Bioinfomática, References Edifi cio de Bioinnovación, Universidad de Málaga, Málaga, ES Arcas, A., O. Fernandez-Capetillo, I. Cases and A. M. Rojas (2014). Los estudios de transcriptomas ensamblados de novo en especies no “Emergence and evolutionary analysis of the human DDR network: modelo carecen de secuencias genómicas que sirvan de referencia para implications in comparative genomics and downstream analyses.” Mol evaluar su calidad. Esta carencia impide, por ejemplo, distinguir con Biol Evol 31(4): 940-961. claridad entre un transcrito correcto y uno artefactual, y tampoco permite Ciccia, A. and S. J. Elledge (2010). “The DNA damage response: making it distinguir fácilmente entre polimorfi smos y errores de ensamblaje. Por safe to play with knives.” Mol Cell 40(2): 179-204. otro lado, sin una referencia, también resulta difícil determinar el mejor Fernandez-Capetillo, O. (2010). “Intrauterine programming of ageing.” ensamblaje posible dentro de un conjunto dado, ni tampoco se puede saber EMBO Rep 11(1): 32-36. con precisión el porcentaje de transcritos encontrados respecto al total de Lukas, J., C. Lukas and J. Bartek (2011). “More than just a focus: The genes. Por otra parte, saber si se ha ensamblado un transcrito que puede chromatin response to DNA damage and its role in genome integrity codifi car una proteína completa es muy útil para los trabajos de laboratorio maintenance.” Nat Cell Biol 13(10): 1161-1169. posteriores. Por todo esto se ha desarrollado Full-LengtherNext con una On, T., X. Xiong, S. Pu, A. Turinsky, Y. Gong, A. Emili, Z. Zhang, J. arquitectura capaz de hacer frente con efi cacia y de forma escalable los Greenblatt, S. J. Wodak and J. Parkinson (2010). “The evolutionary requisitos de análisis de posensamblaje de la NGS. Con este programa (1) landscape of the chromatin modifi cation machinery reveals lineage specifi c se clasifi can los transcritos entre secuencias completas, N- o C-terminales, gains, expansions, and losses.” Proteins 78(9): 2075-2089. e internas), (2) se reconstruye el marco abierto de lectura del transcrito y se corrigen los posibles cambios de fase debidos al ensamblaje, (3) se identifi ca el subconjunto de transcritos sin anotar que podrían codifi car P04-4 (R04-6) proteínas nuevas propias de la especie en estudio, (4) se extraen algunos Bioinformatics approaches for personalized posibles RNA no codifi cantes, (5) se comparan distintos ensamblajes cancer therapy: from Pan-Cancer projects de novo de un transcriptoma para seleccionar el mejor, (6) se obtiene el to Patient Derived Xenograft (PDX) models transcriptoma representativo más cercano al transcriptoma completo teórico del organismo de estudio. Este programa ya ha sido usado con éxito Fátima Elena Piñeiro-Yañez, Héctor Tejero, Javier Perales-Patón, en los análisis de los transcriptomas de, por ejemplo, pino marítimo, olivo, Al-Shahrour lenguado común y lenguado senegalés. Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas - CNIO, Madrid, ES The dawn of the age of personalized cancer treatment provides the promise to identify the right drug for the individual that will greatly improve the P04-6 (R04-2) patient’s outcome. It is well known that cancer drugs work only in small Supercomputing methods for macromolecular subset of patients. For many of these agents, there are putative markers of crystallographic Ab Initio Phasing response in the literature but very few are been used in clinical practice. Isabel Usón Finkenzeller More importantly, new anticancer agents are targeted to specifi c cancer genes and are expected to be effective only in tumors in which these genes ICREA ; IBMB-CSIC, Barcelona, ES are mutated or otherwise abnormal. Crystallographic analysis does not produce a direct image as in microscopy, The success of personalized treatment of cancer patients depends on as only the diffracted intensities and not the phases of the scattered X-rays matching the most effective therapeutic regimen with the characteristics of are physically measurable. So far, in spite of its being computationally very the individual patient, balancing benefi t against risk of adverse events. The demanding, crystallography has largely turned its back on supercomputing. primary challenge in achieving this goal is the heterogeneity of the disease, Our group develops and implements crystallographic phasing methods recognizing that the majority of cancers are not single diseases but rather exploiting massive computing. an array of disorders with distinct molecular mechanisms. ARCIMBOLDO: from atomic resolution phasing[1] to a general ab initio High-throughput technologies such as next-generation sequencing have structure solution overcoming previous size and resolution barriers. Our the capacity to dissect this heterogeneity and now doing an unbiased method enforces secondary structure rather than atomicity through a interrogation of the human genome, which allows strategies to search for combination of location of model fragments (alpha-helices) with PHASER novel, previously unsuspected, biomarkers of drug response and afford [2] and density modifi cation with SHELXE [3]. The method has been

54 Granada 2014 Pósters called after the Italian painter Arcimboldo [4], who composed portraits P05. Biomembranas y bioenergética out of fruits and vegetables. While most collections of fragments remain a “still-life”, but some are correct enough for density modifi cation to reveal the protein’s portrait. P05-1 BORGES takes the principle ones step further, by enforcing unspecifi c Cross-talk between R513 methylation and S516 tertiary -rather tan secondary- structure. Like in Borges’ “Library of Babel”, phosphorylation of the cardiac voltage-gated the information we need is bound to be contained already in the PDB but sodium channel how to exploiting this information while the structure is still unknown? Our characteristic vector (CV) formalism, developed to extract folds from the Pedro Beltran Álvarez1, Ferran Feixas2, Sílvia Osuna2, Ramon PDB allows detailed analysis of local folds. Brugada1, Sara Pagans1 SUBIX: from a geometric solution of nucleic acids to the analysis 1Institut Investigació Biomèdica de Girona Dr. Josep Trueta, and prediction of packing and the information derived from packing Department of Medical Sciences School of Medicine, University of interactions. Girona , Girona, ES, 2Institut de Química Computacional i Catàlisi (IQCC) and Departament de Química, Universitat de Girona, References Campus Montilivi, Girona, ES [1] Sheldrick, Hauptman, Weeks, Miller & Usón. International Tables for Introduction: we have previously provided the fi rst evidence of arginine Macromolecular Crystallography vol. F, (eds., M.G. Rossmann and E. methylation within the voltage-gated ion channel superfamily. R513, Arnold) 333–345 (Boston, 2001). R526 and R680 in the alpha subunit of the cardiac voltage-gated sodium [2] McCoy, et al. J. Appl. Crystallogr. 40, 658–674 (2007). channel (Nav1.5) were found mono- or dimethylated [1]. The functional [3] Sheldrick. Z. Kristallogr. 217, 644–650 (2002). relevance of Nav1.5 arginine methylation is underscored by the fact that [4] Rodríguez, Grosse, Himmel, González, M de Ilarduya. Becker, R513H, R526H and R680H are known Nav1.5 mutations causing sudden Sheldrick & Usón Nature Meth. 6, 651–654 (2009). cardiac death syndromes. Objectives of the current work: 1) to describe the [5] Sammito, Millán, Rodríguez, M de Ilarduya, Meindl, De Marino, cross-talk between Nav1.5 arginine methylation and phosphorylation; and Petrillo, Buey, de Pereda, Zeth, Sheldrick & Usón. Nature Meth. 10, 1099- 2) to describe regulation of arginine methylation by mutations in residues 1101 (2013). adjacent to R513 leading to cardiac disease. Results: methylation and phosphorylation reactions were done in vitro using PRMT3 and PKA, and synthetic peptides. Reactions were P04-7 (R04-7) monitored by MALDI-TOF. Phosphorylation of S516 completely inhibited The exocyst 3D architecture by live cell imaging R513 methylation by PRMT3. Methylation of R513 reduced S516 in yeast cells phosphorylation rate by 4 orders of magnitude. Overall, our results suggest an interdependence of Nav1.5 arginine methylation and phosphorylation [2]. Devos Damien The mutation G514C, which has been described in a patient with cardiac CABD, Sevilla, ES conduction disease, blocked R513 methylation by PRMT3, but did not The structural characterization of macromolecular complexes is central to change S516 phosphorylation rate in vitro. We speculate that G514C leads understand the mechanism of action of these assemblies and to pursue in the to S516 hyperphosphorylation due to blockade of R513 methylation in vivo. Conclusions: our work provides the fi rst insights into how arginine search of new treatments for human diseases. Macromolecular complexes methylation of voltage-gated ion channels is regulated, the fi rst evidence can be composed of proteins, DNA, lipid, or any other molecules and of PKA inhibition by arginine methylation, and opens the door to their combination. We use integrative structure modeling to solve the pharmaceutical intervention to balance methylation-phosphorylation structure of macromolecular complexes with important function in a cell. equilibria in Nav1.5 cardiopathological states. In this talk, I will introduce a new method to solve the structure of multiprotein complexes. We used fl uorescent microscopy in live cell to solve References the structure of the exocyst. The structure reveals important structural, [1] Beltran-Alvarez P, et al. J Proteome Res 2011. functional and evolutionary features of this important complex in the [2] Beltran-Alvarez P, et al. In preparation. eukaryotic cell. This macromolecular modeling protocol has the potential to reveal important aspects of multi-component complexes. P05r-2 How redox proteins form transient complexes in P04-8 (R04-1) DNA: When computational chemistry meets photosynthesis and respiration computational biology Blas Moreno-Beltrán1, Antonio Díaz-Quintana1, Katiuska González- Arzola1, Alejandra Guerra-Castellano1, Adrián Velázquez-Campoy2, Modesto Orozco Pedro M. Nieto3, Marcellus Ubbink4, Miguel A De la Rosa1, Irene Institut for Research in Biomedicine, Barcelona, ES Díaz-Moreno1 DNA is the key molecule of life: an exquisite combination of chemical 1Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, cicCartuja, simplicity and biological richness that has fascinated generations of Universidad de Sevilla - CSIC, Sevilla, ES, 2Instituto de scientists. DNA is also the meeting point of chemistry and biology, and Biocomputación y Física de Sistemas Complejos (BIFI), Universidad the discovery of the structure of the DNA fi ber more than 50 years ago de Zaragoza, Zaragoza, ES, 3Instituto de Investigaciones Químicas, by Watson and Crick can be considered as the foundation of molecular cicCartuja, Universidad de Sevilla - CSIC, Sevilla, ES, 4Institute of biology. For a theoretician, DNA is one of the greatest challenges, and Chemistry, Leiden University, Leiden, NL a textbook example of a multi-resolution and multi-physics problem. I Protein complex formation is at least a two-step process in which the will summarize in my talk how we can use theoretical methods based formation of a fi nal, well-defi ned complex entails the initial formation on solid physical principles to gain information on the biology of of a dynamic encounter complex. The lifetime of the protein complex DNA, how computational chemistry meets computational biology, and is determined by the dissociation rate. Highly transient complexes, with how fi rst principles can explain not only chromatin structure, but also lifetimes on the order of milliseconds, exhibit moderate or low binding functionality. affi nities, with dissociation constants in the mM–mM range. Electron

55 Pósters XXXVII Congreso SEBBM transfer (ET) reactions mediated by soluble redox proteins exchanging lysosome. Approximately 20 Atg (autophagy-related) proteins have electrons between large membrane complexes in photosynthesis and been identifi ed in mammals that are essential in the initial stages of the respiration are excellent examples of transient interactions. preautophagosomal structure (PAS) formation and autophagosome Here, experimental approaches based on dia and paramagnetic NMR elongation. Among them, the yeast ubiquitin-like system (Atg7, Atg3 spectroscopy are combined with NMR restraint- or charge-driven docking and Atg8) is relatively well characterized. Several Atg8 homologues are simulations to study the molecular recognition processes in ET complexes, known in mammals, divided into the LC3 and GABARAP/GATE-16 subfamilies. It has been shown that LC3 membrane association is mediated using the cyanobacterial Cf-Cc6 interaction in photosynthesis and the plant by the covalent attachment of LC3 to phosphatidylethanolamine (PE). The Cc1-Cc adduct in respiration, as physiological model systems. Both ET ensembles exhibit optimal coupling between the redox centers although resulting lipidated protein then drives autophagosome maturation steps they might differ in their dynamic behavior. Needless to say that such an including cargo capture, growth and closure of the organelle, and lysosome integrative methodology opens new perspectives in our understanding of targeting or recognition. This protein-lipid covalent binding is essential the dynamic, transient adducts formed between proteins beyond the model for autophagosome elongation, but its mechanism remains unknown. systems herein analyzed. In the present study, we have focused on the molecular mechanisms by which LC3/GABARAP and GATE-16 conjugate with membranes References leading to autophagosome elongation. With this purpose, we have Díaz-Moreno et al. (2014) BBA – Bioenergetics doi: 10.1016/j. performed experiments of protein-protein and protein-lipid interaction bbabio.2014.03.009. using model membranes such as SUV (small unilamellar vesicles), LUV Moreno-Beltrán et al. Under review. (large unilamellar vesicles) and GUV (giant unilamellar vesicles). Both mammalian ubiquitin-like system and PE-maleimide conjugated human Atg8 homologs have been used. In order to obtain this information, circular P05-3 dichroism spectroscopy, sucrose gradient fl oatation, protein-lipid overlay Dos estrategias en la evolución de la (lipid dot-blot), lipid monolayer experiments and vesicle aggregation measurements have been carried out. The various proteins interact in transferencia de electrones al fotosistema I: specifi c ways with membranes of different lipid compositions. diatomeas versus sistemas verdes *Both authors have contributed equally in this work. Manuel Hervás, Pilar Bernal-Bayard, Fernando P. Molina-Heredia, Alejandro Torrado, José María Ortega, Leonor Puerto-Galán, Mercedes Roncel, José A. Navarro P05-5 Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, Universidad de Sphingosine induces the aggregation Sevilla y CSIC, cicCartuja, Sevilla, ES of imine-containing peroxidized vesicles En algas verdes unicelulares y cianobacterias, la plastocianina (Pc) y el Felix M. Goñi citocromo c6 (Cc6) actúan como transportadores alternativos de electrones Noemi Jimenez-Rojo, Ana R. Viguera, Alicia Alonso, entre los complejos de membrana b6f y fotosistema I (PSI) en fotosíntesis. Unidad de Biofi sica (CSIC, UPV/EHU), Leioa, ES Sin embargo, en algas rojas y diatomeas el Cc actúa en general como único 6 Lipid peroxidation plays a central role in the pathogenesis of many transportador entre estos complejos. La reducción del PSI en eucariotas implica diseases like atherosclerosis and multiple sclerosis. We have analyzed the la formación de un complejo transitorio inicial, que tiene que reorganizarse interaction of sphingosine with peroxidized bilayers in model membranes. hacia una confi guración optimizada antes de la propia transferencia electrónica. Cu2+ induced peroxidation was checked following UV absorbance at Sin embargo, comparada con los sistemas verdes (algas y plantas), la diatomea 245 nm, and also using the novel Avanti snoopers®. Mass spectrometry Phaeodactylum presenta una menor efi ciencia, tanto en la formación del confi rms the oxidation of phospholipid unsaturated chains. Our results complejo como en la transferencia en sí, debido a que la intensidad de la show that sphingosine causes aggregation of Cu2+- peroxidized vesicles. interacción electrostática entre el Cc6 y el PSI está atenuada respecto a las We observed that aggregation is facilitated by the presence of negatively- fuertes propiedades electrostáticas de donadores y PSI en los sistemas verdes. charged phospholipids in the membrane, and inhibited by anti-oxidants e.g. El paso de reajuste implica un conjunto preciso y específi co de interacciones, BHT. Interestingly, long-chain alkylamines (C18, C16) but not their short- que se ven afectadas negativamente en reacciones cruzadas entre donadores chain analogues (C10, C6, C1) can substitute sphingosine as promoters y PSI de diatomeas, algas verdes y plantas. Nuestros análisis cinéticos y of vesicle aggregation. Furthermore, sphinganine but not sphingosine-1- estructurales indican que la evolución en los dos grandes linajes fotosintéticos phosphate can mimic this effect. Formation of imines in the membrane eucariotas implicó cambios paralelos y complementarios en los donadores y upon peroxidation was detected by 1H-NMR and it appeared to be el PSI. En la línea evolutiva que conduce a las plantas superiores, una fuerte necessary for the aggregation effect. 31P-NMR spectroscopy reveals that interacción electrostática determina un intercambio lento del donador, lo sphingosine facilitates formation of non-lamellar phase in parallel with que limita la transferencia de electrones al fotosistema. En diatomeas, una vesicle aggregation. The data might suggest a role for sphingosine in the interacción electrostática más débil facilita, sin embargo, un intercambio más pathogenesis of atherosclerosis. rápido del Cc6, para dejar así paso a la unión de una nueva molécula donadora.

P05r-6 P05r-4 Efecto dual de la secreción de cardiolipinas Membrane Association of Autophagy Proteins en el alveolo LC3, GABARAP and GATE-16 Alba de Lorenzo1, Olga Cañadas2, Belén García-Fojeda2, Cristina Zuriñe Antón*1, Javier H. Hervás*1, Ane Landajuela1, L. Ruth Casals2 Montes1, José F. Rodríguez2, Félix M. Goñi1, Alicia Alonso1 1Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I, Universidad 1Unidad de Biofísica (CSIC, UPV/EHU) and Departamento de Complutense de Madrid, Madrid, ES, 2Departamento de Bioquímica Bioquímica y Biología Molecular, Universidad del País Vasco, Leioa, y Biología Molecular I, Universidad Complutense de Madrid - CIBER ES, 2Centro Nacional de Biotecnología - CSIC, Madrid, ES de Enfermedades Respiratorias, Madrid, ES Macroautophagy mediates the degradation of long-lived proteins La cardiolipina (CL) es un fosfolípido aniónico de las membranas de and organelles through the de novo formation of double-membrane bacterias Gram negativas que también se encuentra en la membrana autophagosomes that sequester cytoplasm and deliver it to the vacuole/ mitocondrial interna de células eucariotas y desempeña un papel clave para

56 Granada 2014 Pósters la función e integridad estructural mitocondrial. Sin embargo, se ha descrito phenylalanine, pCMF) that emulates phosphotyrosine, with the help of a que en pacientes con neumonía se produce la liberación de cardiolipina tRNA specifi c for the AMBER stop codon. These mutations induce drastic mitocondrial al fl uido alveolar, que puede alterar la función pulmonar [1]. changes not only on the redox potential, dynamics and stability of Cc, so Sin embargo, estudios recientes han indicado que fosfolípidos aniónicos affecting its biological function. podrían presentar una acción inmunomoduladora benefi ciosa en el pulmón [2]. Nuestra hipótesis es que las CL liberadas al fl uido alveolar en procesos References infecciosos e infl amatorios podrían tener un efecto perjudicial o benefi cioso [1] Hüttemann M et al. Adv. Exp. Med. Biol. (2012) 748, 237-264. en función de su concentración. [2] Yu, H et al. Biochim. Biophys. Acta (2008) 1777, 1066-1071. Los objetivos de este estudio han sido: 1) Estudiar el efecto de la CL humana [3] García-Heredia, JM et al. J. Biol. Inorg. Chem. (2011) 16, 1155-1168. [4] Zhao et al. Mol. Cell. Proteomics. (2011) 10, 1-14. 1`,3`-Bis-(1,2-dilinolenil-sn-glicero-3-fosfo)-sn-glicerol [(18:2)4-CL] en la función tensoactiva del surfactante pulmonar; y 2) Determinar el umbral de concentración a partir del cual este lípido presenta un posible efecto en la Work supported by JAE Programme (JaePre_2011_01248), ESF 2007- respuesta infl amatoria de macrófagos al lipopolisacárido bacteriano (LPS). 2013, Andalusian Government (CVI-BIO198), Ministry of Economy and Competitiveness (BFU2009-07190 and BFU2012-31670), European Los resultados indican que concentraciones de (18:2)4-CL superiores al 6% molar relativo a los fosfolípidos del surfactante (~1 μmol/ml) alteran Bio-NMR Project (2012-2013) BIO-NMR-00130 and the Centro de signifi cativamente la actividad de adsorción interfacial del surfactante Investigación Tecnología e Innovación (CITIUS). pulmonar. El mecanismo de inactivación reside en que (18:2)4-CL incrementa la fl uidez de las membranas de surfactante como se demuestra por calorimetría diferencial de barrido y anisotropía de fl uorescencia. En P05-8 contraste, nuestros resultados indican que concentraciones muy bajas de Amyloid-membrane interactions revealed cardiolipina (0.67 nmol/ml) bloquean la secreción de TNF-α, expresión de by model lipid vesicles iNOS y la fosforilación de Akt, MAPKs e ikBα en macrófagos alveolares Cristina Fernández estimulados con LPS. Este efecto inmunomodulador de la cardiolipina , Mercedes Jiménez, Germán Rivas, Rafael sucede tanto a nivel extracelular como intracelular. Giraldo En conjunto, los resultados indican que las cardiolipinas secretadas por el Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid, ES huésped en procesos infecciosos podrían tener una acción dual, benefi ciosa We have recently reported that engineering RepA-WH1, a bacterial o dañina para el huésped, en función de la concentración de este lípido en DNA-toggled protein conformational switch (dWH1→WH1) sharing el fl uido alveolar. some analogies with nucleic acid-promoted PrPc→PrPSc replication [1], constitutes a suitable synthetic model system to study protein amyloidosis Bibliografía in bacteria [2, 3]. Although amyloidogenesis has been the focus of intense [1] Ray, N.B., L. Durairaj, B.B. Chen,…., and R.K. Mallampalli. Dynamic research, the origin of the amyloid toxicity remains unclear. One proposed regulation of cardiolipin by the lipid pump Atp8b1 determines the severity mechanism of cytotoxicity is lipid membrane permeabilization. of lung injury in experimental pneumonia. Nat Med, 16(10): 1120-7, 2010. In this work we have studied the aggregation of the bacterial RepA-WH1 [2] Kuronuma K, Mitsuzawa H, Takeda K, Nishitani C, Chan ED, Kuroki Y, prionoid in the presence of cytomimetic model systems (large and giant Nakamura M, Voelker DR. “Anionic pulmonary surfactant phospholipids unilamellar lipid vesicles, LUVs, and GUVs respectively) [4]. Confocal inhibit infl ammatory responses from alveolar macrophages and U937 cells microscopy images of protein encapsulated into GUVs show association by binding the lipopolysaccharide-interacting proteins CD14 and MD-2.” and aggregation of the protein preferentially to lipid vesicles containing J Biol Chem. 284(38):25488-24500,2009. acidic phospholipids. We have also observed that RepA-WH1 elicits membrane disruption using a dye release assay on LUVs [5]. The extent of leakage was dependent on protein concentration.We have been able P05r-7 to directly measure the process of membrane permeation and leakage by How phosphorylation affects Cytochrome c time-elapsed imaging of dye fi lled GUVs upon the addition of protein. This structure and function process is fast and over the course of the experiment most of the vesicles remain intact, suggesting the assembly of defi ned pores by RepA-WH1. Alejandra Guerra-Castellano1 1 , Blas Moreno-Beltrán , Javier López- This model system has allowed us to test several compounds that have been Prados2, Francisco Rivero-Rodríguez1, Pedro M. Nieto2, Adrián described to modulate amyloid formation. Knowledge of the effect of the Velázquez-Campoy3, Antonio Díaz-Quintana1, Miguel Ángel De la RepA-WH1 prionoid on membrane integrity, will provide insight into the Rosa1, Irene Díaz-Moreno1 basis for cell death caused by amyloid proteins. 1Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, cicCartuja, Universidad de Sevilla - CSIC, Sevilla, ES, 2Instituto de References Investigaciones Químicas, cicCartuja, Universidad de Sevilla - CSIC, [1] Silva et al. Trends Biochem. Sci. 2008; 33(3):132-140. Sevilla, ES, 3Instituto de Biocomputación y Física de Sistemas [2] Giraldo, et al. Prion 2011; 5:60-64. complejos, BIFI, Universidad de Zaragoza, Zaragoza, ES [3] Fernández-Tresguerres, et al. Mol Microbiol. 2010; 77:1456-1469. Post-translational modifi cations of proteins stand out as regulatory [4] Butterfi eld and Lashuel. Angew Chem Int Ed. 2010; 49:5628-5654. mechanisms for the majority cell metabolic processes. One of the most [5] van Rooijen, et al. Biochim. Biophys. Acta 2009;1788:1271-1278. usual modifi cations is phosphorylation, which alters the physical features of proteins and affects their interactions with other proteins. Cytochrome c (Cc) phosphorylation relates to some pathological situations, P05-9 such as ischemia or cancer [1]. Cc acts as an electron carrier in the Permeabilización de membranas fosfolipídicas mitochondria. Under oxidative stress conditions, it promotes Programmed por el lipopéptido liquenisina Cell Death (PCD). Both functions are regulated by phosphorylation of the Antonio Ortiz residues Thr, Ser and Tyr at positions 28, 47 and 48, respectively [2-4]. , Jonathan R. Coronel, José A. Teruel, Francisco J. Since the specifi c Cc-phosphorylating kinases are still unknown, we have Aranda made three phosphomimetic mutations. Two of them replace Thr28 and Ser47 Departamento de Bioquímica y Biología Molecular-A, Facultad de by Asp. To mimic Tyr48 phosphorylation, we resorted to the evolved tRNA Veterinaria, Universidad de Murcia, Murcia, ES technique by replacing the Tyr48-encoding triplet for an AMBER codon. Se ha aislado una liquenisina de los medios de cultivo de Bacillus Then, we incorporated a non-canonical amino acid (p-carboxymethyl-L- licheniformis. Nuestra liquenisina consiste en un lipopéptido formado

57 Pósters XXXVII Congreso SEBBM fundamentalmente por una porción hidrofílica con un anillo peptídico P05-11 de siete aminoácidos (Gln-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Ile), y una porción Short-chain sphingolipids preferentially insert hidrofóbica constituida por un β-hidroxiácido graso de 14-16 átomos de C. into tumor cell membranes and promote Esta estructura le confi ere un marcado carácter anfi pático. Se ha observado chemotherapeutic drug uptake que liquenisina permeabiliza membranas modelo de POPC induciendo la liberación de la sonda fl uorescente carboxifl uoresceína. Esta acción Dalila Ciceri1, Lilia R. Pedrosa2, Félix M. Goñi1, Gerben A. Koning2, está modulada por la composición de la membrana, tanto de fosfolípidos F.-Xabier Contreras1 (como fosfatidiletanolamina), o esteroles como el colesterol. Estos efectos 1Unidad de Biofísica (CSIC, UPV/EHU) and Departamento de son evidentes a concentraciones bastante inferiores a la cmc, y sugieren Bioquímica y Biología Molecular, Universidad del País Vasco, la formación de estructuras agregadas del lipopéptido en la bicapa que Leioa, ES, 2Laboratory Experimental Surgical Oncology Section podrían comportarse como poros de permeabilización selectiva. Por otra Surgical Oncology, Department of Surgery, Erasmus Medical Center, parte, en estudios con eritrocitos humanos se ha visto que liquenisina es Rotterdam, NL capaz de causar la hemólisis, también a concentraciones por debajo de su Insuffi cient drug delivery into tumor cells severely limits the therapeutic cmc. A partir de estudios cinéticos comparativos, se ha observado que la effi cacy of chemotherapy. Co-delivery of liposome-encapsulated drug salida de iones K+ de los eritrocitos precede a la salida de la hemoglobina and synthetic short-chain sphingolipids (SCS) greatly improves drug y, además, la hemólisis se puede evitar de modo efi caz mediante la adición bioavailability by enhancing intracellular drug uptake. However, whether a la solución externa de protectores osmóticos de tamaño igual o superior SCS insert preferentially into tumor cells and the molecular mechanisms a 32 Å. Las evidencias indican que la hemólisis inducida por liquenisina used by those lipids to improve drug uptake is still mysterious. Here, we sigue un mecanismo de tipo coloide-osmótico, que implica la formación de show that SCS have high affi nity for tumor cells and that upon insertion poros de membrana, en el sentido más amplio del término. Estos resultados those lipids have specifi c membrane remodeling activities that favor ayudan a establecer una base molecular para la función biológica de drug binding and uptake. We found in a set of in vivo experiments that liquenisina. external addition of new clickable SCS analogues either in free form or in a liposomal formulation show more affi nity for tumor cells than for healthy ones. Furthermore, biophysical experiments show that SCS have P05r-10 (R05-4) membrane-remodeling properties. Transbilayer lipid distribution of lipids Targeting myeloid cells with liposomal by SCS at one side of the membrane has been monitored using a pyr- nanocarriers for therapeutic purposes SM analogue. External addition of SCS in organic solution to preformed plasma membrane like liposomes induces transbilayer lipid motion of pyr- Jon Ander Nieto-Garai1 2 2 , Susana Benet , Maria Pino , Eneritz SM within the membrane. Our results demonstrate how SCS are likely to 1 2 2 3 Bilbao , Itziar Erkizia , Julia G. Prado , Javier Martinez-Picado , function on drug delivery, preferentially inserting into tumor cells, and 2 1 Nuria Izquierdo-Useros* , Maier Lorizate* subsequently altering the biophysical features of cell membranes leading to 1 Unidad de Biofísica (CSIC, UPV/EHU) and Departamento de transitory membrane packaging imperfections that trigger amphiphilic drug Bioquímica y Biología Molecular, Universidad del País Vasco, uptake. Our assays validate the usage of SCS in liposomal chemotherapy 2 3 Leioa, ES, AIDS Research Institute IrsiCaixa, Badalona, ES, AIDS to promote cell-specifi c targeting, tumor cell membrane remodeling and Research Institute IrsiCaixa and ICREA, Badalona, ES fi nally drug release. We have recently discovered the mechanism followed by HIV-1 to enter mature dendritic cells (mDCs) and infect bystander CD4+T cells in lymphoid tissues, which relies on Siglec-1 (CD169) cell receptor P05-12 recognition of sialyllactose exposed on HIV-1 membrane gangliosides. Gene knockout of the coupling proteins in Here, we aimed to engineer stable nanoliposomes mimicking HIV-1 to pIP501 and CloDF13 plasmids target Siglec-1 expressed on mDCs and other myeloid cells for therapeutic Itziar Alkorta1 1 1 compound delivery to key anatomical sanctuaries. , Marina Garcia-Moreno , Itxaso Álvarez-Rodríguez , Fluorescent POPC nanoliposomes were prepared with increasing Ines Probst2, Christina Steck2, Elisabeth Grohmann2 concentrations of sialyllactose-containing gangliosides GM1 and GM3. 1University of the Basque Country, Department of Biochemistry and Nanoliposomes stability assays and further characterization were performed Molecular Biology (UPV/EHU) and Biophysics Unit (CSIC, UPV/ using fl uorimetric determination and quasi-elastic light scattering based EHU), University of the Basque Country, Leioa, ES, 2Albert-Ludwigs size determination. Siglec-1+ mDCs and activated monocytes were University Freiburg, Institute of Biology II, Microbiology, Freiburg, exposed to the same concentration of nanoliposomes and capture was DE analyzed with FACS or confocal microscopy. Statistical differences were Type IV secretion systems (T4SSs) are bacterial multiprotein complexes determined using a paired t-test. specialised in the transfer of proteins or DNA-protein complexes across Fluorescent nanoliposomes containing GM1 or GM3 specifi cally targeted cell membranes. They are essential for conjugation, bacterial-induced mDCs and activated monocytes with equal effi ciency as fl uorescent HIV-1 tumour formation in plant cells, toxin secretion, cell-to-cell translocation viral like particles. Ganglioside nanoliposomes were retained within the same of virulence factors, and intracellular activity of mammalian pathogens. By intracellular sac-like compartment where HIV-1 accumulates. Conversely, enabling conjugative DNA delivery, these systems contribute to the spread nanoliposomes devoid of gangliosides where not stored. An increase of of antibiotic resistance genes among bacteria. The secretion substrates range the ganglioside content in the liposome formulation leads to an improved from single-stranded DNA/ protein complexes to multicomponent toxins. capture effi ciency in a dose dependent manner. Nanoliposome specifi city They are assisted by integral membrane coupling factors, the multimeric for Siglec-1 was demonstrated by blocking capture with two specifi c mAbs type IV coupling proteins (T4CPs), which connect the macromolecular against Siglec-1 (P≤.0007) or with soluble sialyllactose (P≤.004). complexes to be transferred with the secretory conduit. We have developed a stable nanoliposome formulation with a potent Enterococcus faecalis and the other from CloDF13, a multi-resistance and specifi c capacity to target Siglec-1 expressing myeloid cells. This plasmid from Enterobacter cloacae. Knock-out of the T4CP gene of pIP501 technology could be crucial for delivering small therapeutic molecules to will be performed by a novel gene disruption method for E. faecalis. For lymphoid tissues. pIP501, the knock-out will be tested in conjugation assays with different E. faecalis strains, for CloDF13 between different E. coli strains. To exclude Funding: amfAR Mathilde Krim Fellowship 108676-55-RKRL. polar effects of the knock-out on downstream genes in the T4SS operon complementation will be performed by cloning the respective wild type gene *Dual Seniorship in trans on a vector compatible with pIP501 and CloDF13, respectively.

58 Granada 2014 Pósters

P05-13 P05-15 (R05-8) Modulation of the plasma membrane localization Perifosine modulates autophagy in human tumor and activation of PKCalpha by fatty acids cells treatment José M Jiménez-López1, Pablo Ríos-Marco1, Marisol Fernández- 1 2 1 1 Senena Corbalan Garcia Ortiz , Miguel García-González , Josefa L Segovia , Carmen Marco , , Teresa Coronado-Parra, Dolores Perez- María Paz Carrasco Jiménez1 Sanchez, Ruben Lopez-Nicolas, Juan C Gomez-Fernandez 1Department of Biochemistry and Molecular Biology I. Faculty of Departamento de Bioquímica y Biología Molecular-A, Facultad de Sciences. University of Granada, Granada, ES, 2Universitary School Veterinaria, Universidad de Murcia, Murcia, ES “La Inmaculada Concepción”.University of Granada, Granada, ES Protein Kinase C (PKC) is a family of serine/threonine phosphotransferases Alkylphospholipids (APLs) have been shown to inhibit the growth of that participate in a wide variety of cellular processes that are crucial various cancer cells including human hepatoma and glioblastoma cell lines. in tumor progression. Among them, proliferation, migration, invasion APLs have been evaluated in vitro as powerful cancer chemotherapeutic, and survival of cancer cells. Many studies have demonstrated these however their exact mechanisms of action on cell death and other isoenzymes are involved in cancer due to changes in their expression inhibitory pathways are unknown. In this work, we show that perifosine, as and phosphorylation levels. Unfortunately, no specifi c PKC modulators representative APLs, produces an increase of the autophagy marker LC3- to address the clinical needs have been found to date. In this work we II in HepG2 and U-87 MG cell lines, when compared with controls. An increase in autophagosomes and LC3-II levels might be consistent with studied the effect of several fatty acids (OA, DHA and EPA) on cell both autophagy stimulation and block in the late stages of autophagy. To localization, migration and catalytic activation of PKCa. Both OA and discriminate whether the increase in LC3-II in perifosine-treated cells DHA increased the catalytic activity of the enzyme. The use of several resulted from induction of autophagy or decreased autophagic fl ux, we mutants that abolished the C2 or C1 domains function revealed that the performed assays in the presence of chloroquine to block autophagy by C2 domain was essential for activation, while the C1 domain played inhibiting lysosomal proteases and preventing autophagosome-lysosome a less relevant role. In cell experiments were performed in two breast fusion. We observed that perifosine treatment produces an alteration in cancer cell lines: one from adenocarcinoma non-invasive (MCF-7) and autophagic fl ux in both cell lines. We detected moreover that blockade of the other from a highly bone metastatic (MDA-MB-231). The three fatty autophagy at the level of the autophagosome-lysosome fusion does not acids induced the translocation of PKCa from the cytosol to the plasma modify apoptotic cell death induced by perifosine in both cell lines. We membrane and increased its co-localization with actin fi laments. In conclude that modulation of autophagy process is emerging as new target addition, we demonstrated that OA and DHA reduced the cell migration for cancer therapy. capacity and induced apoptosis in both cell lines, effects that increased when PKCa was down-regulated by specifi c siRNA, suggesting that the This research was aided by the Junta de Andalucía (P11-CVI-7859). enzyme plays critical roles in the migration and survival processes in breast cancer cells. P05-16 (R05-7) Pancreatic cancer cell glycosylation regulates cell adhesion and invasion through the modulation of P05-14 Two photon fluorescence microscopy of α2β1 integrin and E-cadherin function GUV discloses unprecedented liquid domain Rosa Peracaula Miró1, Sònia Bassagañas1, Sandra Carvalho2, Ana segregation behavior in cholesterol-enriched lipid M. Dias2, Joan Figueras3, Marta Pérez-Garay1, M. Rosa Ortiz3, Celso A. Reis2, Salomé S. Pinho2 bilayers 1Universidad de Girona, Girona, ES, 2Institute of Molecular Pablo Carravilla, Félix M. Goñi, José Luis Nieva, Jose Requejo- Pathology and Immunology of the University of Porto (IPATIMUP), Porto, PT, 3Hospital Universitario Dr. Josep Trueta, Girona, ES Isidro, Nerea Huarte Unidad de Biofísica (CSIC, UPV/EHU), Leioa, ES In our previous studies we have described that ST3Gal III transfected pancreatic adenocarcinoma Capan-1 and MDAPanc-28 cells show Fluorescence microscopy imaging of Giant Unilamellar Vesicles (GUVs) increased membrane expression levels of sialyl-Lewis x (SLex) along with has been extensively used to investigate lateral segregation of liquid a concomitant decrease in α2,6-sialic acid compared to control cells. Here microdomains. However, the general application of this approach is we have addressed the role of this glycosylation pattern in the functional hampered by artifactual light-induced domain formation. Here, we properties of two glycoproteins involved in the processes of cancer cell show that this problem can be circumvented by performing two photon invasion and migration, α2β1 integrin, the main receptor for type 1 collagen, fl uorescence measurements of Laurdan-labeled GUVs, which also and E-cadherin, responsible for cell-cell contacts and whose deregulation provide quantitative information on the level of molecular order in determines cell invasive capabilities. Our results demonstrate that ST3Gal each domain by means of the Generalized Polarization function (GP). III transfectants showed reduced cell-cell aggregation and increased invasive To explore domain segregation in the absence of photooxidation, we capacities. ST3Gal III transfected Capan-1 cells exhibited higher SLex and have determined Laurdan fl uorescence and order degree in raft-standard lower α2,6-sialic acid content on the glycans of their α2β1 integrin molecules. ternary mixtures of egg sphingomyelin (eSM)/ dioleoyl-sn-glycero- As a consequence, higher phosphorylation of focal adhesion kinase tyrosine 397, which is recognized as one of the fi rst steps of integrin-derived signaling 3-phosphocholine (DOPC)/cholesterol (Chol). Our most relevant pathways, was observed in these cells upon adhesion to type 1 collagen. This observation is that lateral segregation into microscopic Lo-Ld domains molecular mechanism underlies the increased migration through collagen is never observed with eSM:Chol mole ratios lower than 1. Below this of these cells. In addition, the pancreatic adenocarcinoma cell lines as ratio the membrane average order level depends mainly on the eSM well as human pancreatic tumor tissues showed colocalization of SLex and content and no co-existence is observed. In addition, by determining the E-cadherin, which was higher in the ST3Gal III transfectants. In conclusion, order levels under coexistence conditions we infer that the maximum changes in the sialylation pattern of α2β1 integrin and E-cadherin appear to cholesterol content in Lo domains is attained with eSM:Chol ratios of infl uence the functional role of these two glycoproteins supporting the role of ca. 2:1. These observations point to eSM as the main determinant of these glycans as an underlying mechanism regulating pancreatic cancer cell macroscopic lipid platform formation in these mixtures. adhesion and invasion.

59 Pósters XXXVII Congreso SEBBM

P05-17 (R05-3) We show that a four lysine module located within the B insert of Drp1 Translation of molecular geometry into membrane interacts preferentially with CL over other anionic lipids. This interaction fission dramatically enhances Drp1 oligomerization and assembly-stimulated GTP hydrolysis. Our results add signifi cantly to a growing body of Anna Shnyrova1 1 2 , Eva Rodríguez Hortelano , Juha-Peka Mattila , evidence indicating that CL is an important regulator of many essential Sandra L. Schmid2, Sergey A. Akimov3, Vadim A. Frolov4 mitochondrial functions. 1Unidad de Biofísica (CSIC, UPV/EHU) and Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad del País Vasco, Leioa, *Dual senior autorship. ES, 2Department of Cell Biology, UT Southwestern Medical Center, Dallas, TX, US, 3A.N. Frumkin Institute of Physical Chemistry and Electrochemistry, Russian Academy of Sciences, Moscow, P05-19 RU, 4Unidad de Biofísica (CSIC, UPV/EHU) and Departamento Structure and lipid specificity support de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad del País Vasco; IKERBASQUE, Basque Foundation for Science, Leioa, ES adaptation of pestivirus p7 C-terminal helix to Membrane fi ssion constitutes an essential part of the dynamic life of permeabilizing secretory compartments cellular membranes. Proteins implicated in this process are designed Eneko Largo1, Antonio Alcaraz2, Nerea Huarte1, Vicente M. to promote high membrane curvature and localized rupture of the Aguilella2, Manuel V. Borca3, José L. Nieva1 membrane monolayers, both hallmarks to membrane fi ssion. The 1Biophysics Unit (CSIC-UPV/EHU) and Biochemistry and Molecular localized action of the fi ssion proteins is almost without exceptions Biology Department, University of the Basque Country (UPV/EHU), based upon the shallow membrane insertion (membrane wedging) Bilbao, ES, 2Laboratory of Molecular Biophysics, Department of resulting in disruption of the lipid monolayer continuity at protein Physics, Universitat Jaume I, Castelló, ES, 3Plum Island Animal length scale. Such deformation produced by an individual protein, Disease Center, Greenport, US however, is limited and do not spread far from the protein itself. Thus, larger-scale coordination of many deformations is needed in order to Classical swine fever virus (CSFV) protein p7 possesses two hydrophobic effectively remodel the lipid bilayer and induce its fi ssion. We show domains intervened by a short polar loop, predicted to span the membrane here how protein complexes implement seemingly universal and as a helix-turn- helix hairpin. Here, we use a combined lipid monolayer, topology independent strategy to coordinate their membrane-disrupting planar bilayer and vesicle analysis to characterize the insertion and action during the fi ssion process. Briefl y, creation of a protein ring-like permeabilization of membranes by constituent CSFV p7 helices. Structural complex with membrane insertions leads to a local constriction of the data and the dependence on lipid composition of these processes support membrane and to a coordinated membrane wedging, that “decouple” that the C-terminal helix is a poreforming protein adapted to permeabilizing the membrane deformations on both sides of the ring. Consequently, membranes of the secretory compartments or mitochondria. Together with ring-like rupture of one monolayer of the constricted membrane creates the observed pH-dependence and inhibition pattern, our data suggest that additional degree of freedom that critically helps the lipid bilayer to adapt CSFV p7 relies on genus-specifi c structures-mechanisms to perform its to the geometry imposed by the constricting ring. As a result, critical viroporin function. membrane curvature stress can be translated into local destabilization of lipid monolayer (far from the ring, not at the ring) leading to non- leaky physiological fi ssion. This “boundary” action might constitute a P05-20 (R05-6) general principle of translation of molecular geometry of proteins into La proteína L-plastina está implicada en el bulk membrane remodeling. Thus, the proposed mechanism can be reclutamiento de NKG2D a balsas lipídicas y en crucially important for membrane biogenesis in cells. la migración de células NK mediada por NKG2D

Esther Serrano Pertierra1, Eva Cernuda-Morollón1, Tomas Brdicka2, P05-18 2 3 Specific interaction with cardiolipin triggers Václav Horejsi , Carlos López-Larrea 1Servicio Neurología, Hospital Universitario Central de Asturias, functional activation of dynamin-related protein 1 Oviedo, ES, 2Institute of Molecular Genetics, Academy of Sciences of the Czech Republic, Praga, CZ, 3Servicio de Inmunología, Itsasne Bustillo-Zabalbeitia1, Sylvie Montessuit2, Etienne Raemy2, Hospital Universitario Central de Asturias, Oviedo, ES Gorka Basañez1, Jean-Claude Martinou*2, Oihana Terrones Urio*1 1Unidad de Biofísica (CSIC, UPV/EHU), and Departamento de Las balsas de membrana son microdominios de la membrana plasmática Bioquímica, Universidad del País Vasco, Leioa, ES, 2Department of que desempeñan múltiples funciones biológicas. La implicación de estas Cell Biology, University of Geneva, Sciences III, Ginebra, CH estructuras en la biología de células T, principalmente en la transducción Dynamin-Related Protein 1 (Drp1), a large GTPase of the dynamin de señales mediada por TCR, ha sido ampliamente estudiada. Sin superfamily, is required for mitochondrial fi ssion in healthy and apoptotic embargo, se conoce menos sobre el papel de las balsas de membrana cells. Drp1 activation is a complex process that involves translocation en la señalización por receptores de células NK. Hemos estudiado from the cytosol to the mitochondrial outer membrane (MOM) la distribución del receptor activador NKG2D en las balsas lipídicas and assembly into rings/spirals at the MOM, leading to membrane mediante el aislamiento de DRM por gradiente de densidad de sacarosa o constriction/division. Similar to dynamins, Drp1 contains GTPase (G), mediante fraccionamiento por solubilidad selectiva a beta-octilglucósido bundle signaling element (BSE) and stalk domains. However, instead en la línea celular NKL. Hemos encontrado que el complejo NKG2D- of the lipid–interacting Pleckstrin Homology (PH) domain present in DAP10 y pVav se reclutan a estas balsas tras la activación del receptor. El the dynamins, Drp1 contains the so-called B insert or variable domain análisis proteómico cualitativo mostró que el citoesqueleto de actina está that has been suggested to play an important role in Drp1 regulation. implicado en este proceso. En particular, hemos visto que la L-plastina, Different proteins have been implicated in Drp1 recruitment to the proteína que une fi lamentos de actina, juega un papel importante en el MOM, although how MOM-localized Drp1 acquires its fully functional reclutamiento de NKG2D a las balsas lipídicas. Además, la activación del status remains poorly understood. We previously found that Drp1 can receptor inhibidor NKG2A afecta parcialmente el reclutamiento a estos interact with pure lipid bilayers enriched in the mitochondrion-specifi c dominios. Por otra parte, también hemos demostrado que la L-plastina phospholipid cardiolipin (CL). Building on our previous study, we now participa en la inhibición mediada por NKG2D de la quimiotaxis de explore the specifi city and functional consequences of this interaction. células NK.

60 Granada 2014 Pósters

P05-21 (R05-5) showed an excess of cholesterol, resulting in a cholesterol to phospholipid Dimerization of the transmembrane domain ratio 6 times higher than in NS. regulates the function of p75 neurotrophin Functional analysis using the Captive Bubble Surfactometer (CBS) showed receptor the incapacity of PAP surfactant fi lms to reduce to low enough values the surface tension at the air-liquid interface. NS and P were subjected to a Irmina García-Carpio1, Kirill Nadezhdin2, Sergey Goncharuk2, Konstantin LH20 chromatography to obtain the protein, phospholipid and cholesterol Mineev2, Eva Fernandez1, Alexander Areseniev2, Marçal Vilar1 fractions separately. Thus, different combinations of these fractions with 1Neurodegeneration Unit. UFIEC-ISCIII, Majadahonda, Madrid, ES, the corresponding fractions of NS were analyzed in the CBS. The P Protein 2Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry of the fraction reconstituted into NS lipids showed an ineffi cient adsorption and Russian Academy of Sciences, Moscú, RU dynamic behavior, meaning that PAP-associated SP-B and SP-C were p75 neurotrophin receptor (p75 NTR), is best known for its role in mediating dysfunctional. On the other hand, the excess of cholesterol also showed neuronal cell death during development or after injury but it also regulates a contribution to this impaired behavior, as seen in samples containing the cell proliferation, axon guidance or survival. p75 forms disulphide-linked fully active protein and phospholipid complements of NS but the altered dimers through the Cys257 in the transmembrane domain and that it is neutral lipid fraction of P. The exacerbated amount of cholesterol in P essential for NGF mediated signaling. Here we demonstrate that p75 use two surfactant likely alters the structure and mechanical properties of surfactant different interfaces of dimerization; one promoted by Cys257 and the other layers rendering them dysfunctional. by a motif of the form AxxxG. Our functional and structural data reveals the key role that plays the Cys257 in p75 dimer assembly, redistribution and activation of the receptor. We propose the transmembrane domain of P05-24 p75 as a new target domain to inhibit receptor function. Molecular function of isolated Ca2+-dependent gating rings Teresa Giráldez Fernández P05-22 (R05-2) Roger Gimeno-Llobet, The multiple faces of caveolin in the Departamento de Ciencias Biomedicas, Facultad de Medicina, endoplasmic reticulum: from fat storage y Centro de Investigaciones Biomedicas de Canarias (CIBICAN), Universidad de La Laguna, Tenerife, La Laguna, ES to the integrity of mitochondria In some Ca2+- regulated ion channels and transporters, ion binding is sensed by Albert Pol Sorolla a large C-terminal intracellular region, where eight Regulator of Conductance IDIBAPS (CELLEX), Barcelona, ES for K+(RCK) domains form a “gating ring”. In the large conductance Ca2+ 2+ La caveolina (CAV) es un componente esencial de las caveolas, and voltage regulated channel (BK), it has been proposed that Ca binding invaginaciones ricas en colesterol de la membrana plasmática de la mayoría expands the gating ring, and the large movement of the gating ring would de nuestras células. Sin embargo, la función de las CAV no está restringida physically pull and open the gate located at the pore domain. Calcium binding a la superfi cie celular, las CAV se asocian dinámicamente con orgánulos to this region reduces the energy required to open the channel, but the exact intracelulares como el retículo endoplasmático (RE), el aparato de Golgi, mechanism underlying this process is still uncertain. Using patch-clamp o los endosomas. Este transporte intracelular de CAV regula la distribución recordings and simultaneous measurements of fl uorescence energy transfer intracelular de lípidos, ya que las CAV unen colesterol y ácidos grasos con between CFP and YFP variants of the green fl uorescent protein, our group gran afi nidad. En este contexto hemos demostrado dos funciones de CAV1 has shown that Ca2+ binding produces large structural changes that are not en el RE: i) regula los niveles de colesterol en las membranas mitocondriales, obligatorily coupled to the opening of the pore of the BK channel (Miranda et su fl uidez y la efi ciencia de la cadena respiratoria y ii) regula la acumulación al PNAS 2013 110:5217). These results are in contrast with structural studies de lípidos neutros en la bicapa del RE para generar los cuerpos lipídicos of isolated gating rings, where large rearrangements are not observed after y proporcionar energía durante la regeneración del hígado. La ausencia de Ca2+ binding. It is possible that the apparent discrepancy is due to involvement CAV1 provoca un desajuste en la distribución intracelular de lípidos con of other regions of the channel in the gating ring movement. We have now importantes consecuencias metabólicas y patológicas para células y animales. characterized the molecular function of isolated gating rings, using fl uorescent fusion proteins expressed in mammalian cells.

P05-23 Alteration of protein and lipid moieties P05-25 (R05-1) in a dysfunctional lung surfactant from alveolar TRPA1 channels are membrane sensors of proteinosis bacterial endotoxins

1 2 3 1 Mercedes Echaide Torreguitar, Carolina Ballester Lopez, Jesus Victor Meseguer , Yerandy Alpizar , Sendoa Tajada , Enoch Luis , 1 4 4 Perez-Gil Carlos Fernández-Peña , Tatiana Kichko , Peter Reeh , María Teresa Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I, Universidad Pérez-García3, José Ramón López López5, Thomas Voets2, Carlos 1 2 Félix Viana1 Complutense de Madrid, Madrid, ES Belmonte , Karel Talavera , 1Instituto de Neurociencias de Alicante UMH-CSIC, San Juan Pulmonary Alveolar Proteinosis (PAP) is a rare disease characterized by an de Alicante, ES, 2KULeuven, Leuven, BE, 3Instituto de Biología accumulation of pulmonary surfactant at the alveoli and terminal airways. y Genética Molecular (IBGM), Universidad de Valladolid-CSIC, Several studies have shown that THIS pathology is associated with an excess Valladolid, ES, 4Friedrich-Alexander-Universität, Erlangen-Nürnberg, of surfactant lipids and altered proteins. However, it is not clear how each of DE, 5Instituto de Biología y Genética Molecular (IBGM), Universidad the surfactant components contribute the most to the dysfunctional behavior of de Valladolid- CSIC, Valladolid, ES this surfactant. In the current work, surfactant from a patient with Pulmonary Alveolar Proteinosis (P) has been analyzed and compared with respect to TRPA1 is a member of the transient receptor potential (TRP) family of composition and functional behavior of porcine native surfactant (NS). cationic channels, expressed in nociceptive sensory terminals of primary Compositional analysis by Western Blot revealed the presence of surfactant sensory neurons. TRPA1 shows polymodal activation by physical (e.g. protein aggregated forms. Moreover, the protein to phospholipid ratio was temperature and mechanical stretch) and chemical stimuli. Recently, 26 times higher in P than in functional NS. An abnormal lipid composition TRPA1 has emerged as a key chemosensor for many natural and industrial was also detected by Thin Layer Chromatography and further analysis chemical irritants. In addition, TRPA1 responds to reactive oxygen species

61 Pósters XXXVII Congreso SEBBM and reactive aldehydes. Activation of TRPA1 produces pain, release of La alergia a alimentos es un problema de salud en los países desarrollados neuropeptides and infl ammation. que afecta a un 5% de la población. Provoca síntomas graves e inesperados Gram(-) bacterial infections are generally accompanied by infl ammation and y es causa frecuente de anafi laxia. En adultos los alimentos vegetales pain. These symptoms are generally attributed to sensitization of nociceptors inducen el mayor número de reacciones de hipersensibilidad, y la mayoría by infl ammatory mediators released by immune cells (e.g. monocytes and de sus alérgenos pertenecen a unas pocas familias de proteínas, entre las macrophages) through activation of the Toll-like-receptor 4 (TLR4) signaling que destacan las cupinas y las prolaminas. pathway by lipopolysaccharide (LPS), a toxic byproduct of bacterial lyses. Algunos de los problemas diagnósticos de estas alergias radican en la Unexpectedly, we found that LPS exerts fast, membrane delimited, excitatory presencia de alérgenos específi cos en ciertas partes del fruto, como las actions on TRPA1. Activation of TRPA1 by different forms of LPS correlates semillas. El poder diagnóstico de estas moléculas se ve diluido cuando se with the structure of lipid A, the lipid component of the LPS moiety. utiliza el extracto completo, el cual es una mezcla compleja del fruto. Este Moreover, we found that pain and acute pathophysiological vascular es el caso de las semillas de tomate, que son una fuente rica en proteínas de reactions, including neurogenic infl ammation (CGRP release) caused by reserva suponiendo un 80% del total. LPS are primarily dependent on TRPA1 channel activation in nociceptor Los objetivos del presente trabajo son detectar los alérgenos reconocidos terminals. The identifi cation of TRPA1 as molecular determinant of LPS por las IgE de pacientes alérgicos a las semillas de tomate, con síntomas effects opens novel avenues for the treatment of symptoms caused by graves como anafi laxia o angioedema, o leves como urticaria o síndrome de Gram(-) bacterial infections and offers new insights into the pathogenesis alergia oral, e identifi carlos mediante inmunodetecciones con anticuerpos of pain and neurovascular responses during bacterial infections. policlonales y con sueros de pacientes. Los extractos se han cromatografi ado en HPLC y los picos obtenidos se han analizado en PAGE-SDS mediante tinción con Azul de Coomassie y P05-26 tras transferencia a membranas con sueros. La unión de IgE a una banda Perifosine modulates autophagy in human tumor de 10 kDa es mayoritaria en pacientes con síntomas graves de anafi laxia y cells angioedema, mientras que bandas de mayor masa molecular (35-60 kDa) son asociadas a síntomas leves. J.M. Jiménez-López1, P. Ríos-Marco1, M. Fernández-Ortiz1, M. El uso de extractos bien defi nidos de cada tejido y la identifi cación de los García-González2, J.L. Segovia1, C. Marco1, M.P. Carrasco1 alérgenos implicados permitirá determinar el patrón de sensibilización 1Department of Biochemistry and Molecular Biology I, Faculty of de cada paciente con mayor precisión y evitar los falsos negativos que se Sciences, University of Granada, Granada, ES, 2Universitary School obtienen en las pruebas cutáneas. “La Inmaculada Concepción”, University of Granada, Granada, ES Alkylphospholipids (APLs) have been shown to inhibit the growth of various cancer cells including human hepatoma and glioblastoma cell lines. APLs P06r-2 (R06-4) have been evaluated in vitro as powerful cancer chemotherapeutic, however Cardiotrophin-1 up-regulates apelin secretion their exact mechanisms of action on cell death and other inhibitory pathways and gene expression in 3T3-L1 adipocytes are unknown. In this work, we show that perifosine, as representative Miguel López Yoldi1, Matilde Bustos2, María Asunción Romero APLs, produces an increase of the autophagy marker LC3-II in HepG2 Lozano2, J Alfredo Martínez1, Jesús Prieto2, María Jesús Moreno and U-87 MG cell lines, when compared with controls. An increase in Aliaga1 autophagosomes and LC3-II levels might be consistent with both autophagy 1Department of Nutrition, Food Science and Physiology, Centre stimulation and block in the late stages of autophagy. To discriminate for Nutrition Research, Faculty of Pharmacy, University of Navarra whether the increase in LC3-II in perifosine-treated cells resulted from - CIBER Fisiopatología de la Obesidad y Nutrición (CIBERobn), induction of autophagy or decreased autophagic fl ux, we performed assays Instituto de Salud Carlos III, Pamplona, ES, 2Area of Hepatology in the presence of chloroquine to block autophagy by inhibiting lysosomal and Gene Therapy, Center for Applied Medical Research (CIMA), proteases and preventing autophagosome-lysosome fusion. We observed University of Navarra, Pamplona, ES that perifosine treatment produces an alteration in autophagic fl ux in both cell lines. We detected moreover that blockade of autophagy at the level of Introduction: Cardiotrophin-1 (CT-1) is a member of the IL-6 family the autophagosome-lysosome fusion does not modify apoptotic cell death of cytokines. A recent study of our group has revealed that CT-1 is a key induced by perifosine in both cell lines. We conclude that modulation of regulator of glucose and lipid metabolism. Apelin is an adipokine that autophagy process is emerging as new target for cancer therapy. stimulates glucose utilization and insulin sensitivity in obese and insulin- resistant mice. The aim of the present study was to analyze the potential This research was aided by the Junta de Andalucía (P11-CVI-7859). effect of CT-1 on apelin production in adipocytes. Methods: Fully differentiated 3T3-L1 adipocytes were incubated with different concentrations (1-40 ng/mL) of recombinant protein CT-1 (rCT- 1) or IL-6 (20 ng/mL) for 18 hours. Apelin mRNA expression levels were determined by quantitative real-time PCR. The measurement of apelin P06. Bioquímica de la nutrición secretion to the medium was quantifi ed by ELISA. The phosphorylation levels of p-Akt (Ser-473) and p-ERK 1/2 (Thr 202/Tyr 204) as well as total AKT and ERK protein levels were analyzed by Western blot. Specifi c P06r-1 inhibitors were used to characterize if these pathways were involved in the Las semillas de tomate: una fuente oculta actions of CT-1 on apelin production. de alérgenos Results: rCT-1 treatment (18 h) signifi cantly increased apelin gene expression and secretion in 3T3-L1 adipocytes in a concentration dependent Laura Martín-Pedraza1, Miguel González2, Juan Carlos López- manner. In parallel, rCT-1 (20 ng/mL) induced the phosphorylation of Rodríguez1, Eva Batanero1, Rodrigo Barderas1, Miguel Blanca3, ERK and AKT in adipocytes. Pre-treatment with the PI3K inhibitor, Rosalía Rodríguez1, Mayte Villalba1 LY294002, completely blocked the stimulatory action of CT-1 on apelin 1Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad gene expression. Complutense de Madrid, Madrid, ES, 2Laboratorio de Investigación, Conclusion: The present data demonstrate the ability of rCT-1 to stimulate IBIMA, Hospital Regional Universitario de Málaga, UMA, Málaga, ES, apelin synthesis and/or secretion in adipocytes and suggest that these 3UGC Alergia, IBIMA, Hospital Universitario de Málaga, UMA, Málaga, ES effects are probably mediated by PI3K/AKT pathway.

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P06-3 (R06-1) hepática mediante suplementación con aceite de rosa mosqueta (RM) Acción moduladora de marcadores rico en ácido alfa linolénico, que se biotransforma en EPA y DHA. Para cardiovasculares y de obesidad de café verde ello, ratones macho C57BL/6J (n=5-9 por grupo experimental) fueron y yerba mate alimentados con una dieta: a) control (10% lípidos, 20% proteínas y 70% de carbohidratos) y b) alta en grasa (60% lípidos, 10% proteínas y 30% Laura Bravo Clemente, Sara Martínez López, Raquel Mateos, carbohidratos) con o sin suplementación dietaria diaria con aceite de Beatriz Sarria RM (Coesam, Chile). La dieta y la suplementación con aceite de RM ICTAN-CSIC, Madrid, ES se mantuvieron por 12 semanas. Se determinó la esteatosis hepática El café es ampliamente consumido en todo el mundo, mientras que (histología) y los niveles de PPAR-α (RT-PCR) y de ACOX (RT-PCR). la yerba mate es muy popular en países Sudamericanos, aunque su Los resultados mostraron que los animales que fueron alimentados con consumo se está extendiendo. Ambas bebidas tienen un rico contenido en dieta alta en grasa y suplementados con aceite de RM: i) presentaron una compuestos fenólicos derivados de los ácidos hidroxicinámicos, así como histología hepática normal y una disminución signifi cativa en los niveles metilxantinas, siendo la cafeína la más abundante. El café verde presenta de esteatosis hepática evaluada por el porcentaje de células con gotas una mayor concentración de estos compuestos bioactivos en comparación lipídicas, respecto al grupo que sólo recibió la dieta alta en grasa (ANOVA con el clásico café tostado. En este estudio se quiso conocer los efectos unifactorial, seguida del Test de Newman Keuls); y ii) disminuyeron en en marcadores cardiovasculares y de obesidad del consumo regular de un forma signifi cativa el contenido de grasa abdominal, respecto a aquellos producto de café mezcla de verde y tostado (35:65) y de yerba mate en una que sólo recibieron la dieta alta en grasa. La prevención de la esteatosis población normocolesterolémica (n=25) y otra hipercolesterolémica (HC, hepática se acompañó de un aumento en los niveles hepáticos del mRNA n=27). Se llevó a cabo un estudio cruzado, aleatorizado y controlado en de PPAR-α y ACOX. Se concluye que la administración dietaria de un hombres y mujeres de entre 18-45 años, no fumadores, no vegetarianos, aceite rico en ácido alfa linolénico previene la esteatosis hepática lo con un IMC=18-25 kg/m2, que tomaron el café, mate o agua (control) tres cual podría estar relacionado al aumento en los niveles de PPAR-α y de veces al día, durante 8 semanas, restringiéndose el consumo de ciertos ACOX. alimentos ricos en polifenoles. Al principio y fi nal de cada intervención se tomaron muestras de sangre y se controló la presión arterial (PA) FONDECYT 1140547. y frecuencia cardiaca (FC), se hizo un estudio antropométrico y los participantes rellenaron un registro dietético de 72 horas y cuestionario de actividad física. Se analizó el perfi l lipídico y la proteína C reactiva (PCR) P06-6 mediante autoanalizadores, así como citoquinas pro- y anti-infl amatorias, Efecto de la suplementación dietética con quimioquinas, moléculas de adhesión, adipoquinas y hormonas mediante proteínas de plasma bovino en la prevención ensayos Multiplex. Los resultados se analizaron mediante un modelo general de medidas repetidas y test de Bonferroni dentro de cada grupo de alteraciones de la mucosa intestinal (SPSS, v. 19.0). en un modelo de colitis Ambas bebidas, redujeron FC y PA, especialmente en los sujetos HC, en Lluïsa Miró1 2 2 1 los que también se observó una disminución en los niveles de colesterol , Anna Pérez-Bosque , Mònica Maijó , Javier Polo , total, VLDL-C y triglicéridos. Tras la intervención con café los voluntarios Miquel Moretó2 disminuyeron su peso corporal, así como el porcentaje de grasa corporal 1APC Europe, Granollers, Barcelona, ES, 2Departament de (por bioimpedancia); con el mate se observaron las mismas tendencias Fisiologia, Facultat de Farmàcia; Institut de Nutrició i Seguretat aunque las diferencias no fueron signifi cativas. Con ambas bebidas se Alimentària, Universitat de Barcelona, Barcelona, ES observó una ligera menor ingesta de proteína y, en el caso del mate, también En estudios previos se ha demostrado que la suplementación dietética de grasas y energía. El consumo de café dio lugar a un descenso en los con proteínas plasmáticas reduce la respuesta infl amatoria intestinal en niveles de grelina, leptina, inhibidor de la activación de plasminógeno-1 modelos de infl amación aguda. La mucosa intestinal contiene mucinas (PAI-1), resistina y PCR en ambos grupos de estudio. y TFF3, con funciones de protección y reparación tisular. El objetivo de este trabajo es analizar dichas variables en ratones KO que carecen del gen mdr-1 y desarrollan colitis de forma espontánea, y evaluar el efecto P06-5 (R06-7) de la suplementación dietética con inmunoglobulinas de plasma bovino Suplementación dietaria con aceite de rosa (IPB). Los ratones KO y los correspondientes controles recibieron una mosqueta (Rosa rubiginosa) y prevención de la dieta control o bien una dieta suplementada con 2% IPB desde el día 21 esteatosis hepática inducida por una dieta alta (destete) hasta el día 56. Se realizó un estudio histológico para establecer en grasa: participación de PPAR-alfa y ACOX el índice histopatológico así como el recuento de las células caliciformes de la mucosa del colon. También se determinó por RT-PCR la expresión Gladys Tapia Opazo1, Sergio Rodriguez1, Gladys Tapia1, Pamela de mucinas MUC1 y MUC4 (transmembrana), MUC2 (secretora) y del Romanque Ulloa1, Amanda Despessailles Tapia1, Alejandra Espinosa TFF3. Los ratones KO presentaron un mayor índice histopatológico que Escalona2, Camila Dossi Muñoz1 los controles y la suplementación con IPB redujo en parte estos efectos. 1Facultad de Medicina, Universidad de Chile, Santiago, CL, En los animales KO se observó un aumento de la expresión de MUC4 (4 2Escuela de Tecnología Médica, Facultad de Medicina, Universidad veces) y de MUC1 (6 veces, ambas P<0,05), menor expresión de MUC2 de Chile, Santiago, CL y TFF3, que se redujo en un 80% y un 50%, respectivamente (P<0,05) El elevado aporte dietario de ácidos grasos ω-6 en relación a los ácidos y un menor número de células caliciformes. La suplementación con grasos ω-3, genera alteraciones en la salud cardiovascular y hepática, IPB atenuó los cambios en la expresión de las mucinas transmembrana dentro de las patologías crónicas no transmisibles. Por otro lado, el y del TFF3 sin modifi car la MUC2 y restauró la población de células pescado, rico en ácidos grasos ω-3, es de bajo consumo en Chile, siendo secretoras de moco. Los resultados indican que la suplementación con necesario buscar otras fuentes alternativas de estos ácidos grasos, como IPB restablece la función protectora de la mucosa intestinal, modulando lo son aceites con un alto contenido del ácido alfa linolénico, precursor la expresión de mucinas y reduciendo las alteraciones histológicas de la de los ácidos grasos ω-3, eicosapentaenoico (EPA) y docosahexaenoico colitis. (DHA). Tanto EPA como DHA son activadores del factor de transcripción PPAR-α, el cual regula la expresión del gen que codifi ca para la proteína Financiado por el proyecto TRACE 2009 0317 (Ministerio de Economía y prolipolítica, ACOX. Este trabajo evaluó la prevención de la esteatosis Competitividad, España).

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P06r-7 in a dose response manner. CAF treated rats had decreased body weight and Efecto del ácido maslínico, un triterpeno waist perimeter at the 7th and 8th week of experiment at doses of 100 and 200 pentacíclico natural, sobre lesiones mg/Kg/day. Differences in food and liquid intake were found for diet, but not due to treatment. Plasma triglycerides and total cholesterol were elevated in preneoplásicas inducidas en colon de rata CAF rats compared to ST rats. A decrease in total cholesterol was found for th th Glòria Lozano-Mena, Marta Sánchez-González, M. Emília Juan, the highest doses of LM-GSPE in 7 and 10 weeks and a decrease in plasma th Joana M. Planas triglycerides with the lower doses at 12 week was observed. Departament de Fisiologia e Institut de Recerca en Nutrició i Grape seed proanthocyanidins have a clear antihypertensive effect, Seguretat Alimentària-UB, Universitat de Barcelona, Barcelona, ES preventing the rise of blood pressure due to the CAF diet. Body weight and waist perimeter were slightly modifi ed by the treatments. In addition, El ácido maslínico es un triterpeno pentacíclico presente en distintos a clear effect on plasma cholesterol was described. Therefore, LM-GSPE vegetales habituales en la dieta mediterránea. Estudios previos han could be a promising candidate for functional foods due to the improvement demostrado su actividad antiproliferativa y proapoptótica en la línea observed in most of MS components. celular de cáncer de colon HT-29. Con el fi n de confi rmar su actividad quimiopreventiva in vivo, se ha usado un modelo de cáncer de colon en rata inducido por 1,2-dimetilhidrazina (DMH). El agente carcinógeno se P06-9 inyectó semanalmente por vía intraperitoneal (20 mg/kg), mientras que el Efectos de la suplementación prolongada con ácido maslínico se administró por vía oral a las dosis 5, 10 y 25 mg/kg durante 49 días. El colon se dividió en los segmentos proximal, medial ácidos grasos omega-3 en un modelo de sordera y distal, que se fi jaron con formalina antes de la observación de lesiones progresiva preneoplásicas al microscopio óptico. La tinción de azul de metileno 1 2 3 permitió el recuento de focos de criptas aberrantes (FCA), mientras que Raquel Martínez Vega , Teresa Partearroyo , Néstor Vallecillo , 2 1 María A. Pajares1 la tinción de diaminas y hierro/azul alciano se usó para el recuento de Gregorio Varela-Moreiras , Isabel Varela-Nieto , 1 focos con depleción de mucinas (FDM), indicativas de un mayor grado Instituto de Investigaciones Biomédicas “Alberto Sols” de displasia. Además, se determinó la concentración de ácido maslínico en (CSIC-UAM) e IdiPAZ, Unidad 761, CIBERER , Madrid, ES, 2 contenido de colon para establecer una correlación con el efecto observado. Departamento de Ciencias Farmacéuticas y de la Salud, Facultad El ácido maslínico no redujo el número de FCA en colon total, que fue de Farmacia, Universidad CEU San Pablo, Boadilla del Monte, Madrid, ES, 3Instituto de Investigaciones Biomédicas “Alberto Sols” de 158±20, 189±15, 184±17 y 160±18 en los grupos DMH i DMH-ácido (CSIC-UAM) e IdiPAZ, Unidad 761, CIBERER , Madrid, ES maslínico a las tres dosis, respectivamente. En todos los grupos se observó la misma distribución de FCA, siendo mayor en los segmentos medial y Los ácidos grasos poli-insaturados omega-3 (PUFAs) son nutrientes distal. Tampoco se observaron diferencias estadísticamente signifi cativas muy conocidos por sus efectos benefi ciosos en el desarrollo cognitivo en el recuento de FDM, que fue de 28±5, 33±6, 34±10 y 35±12 en colon y su mantenimiento, regulando la infl amación, el estrés oxidativo y la total. En conclusión, el ácido maslínico a la tres dosis ensayadas no evita la sensibilidad a insulina, entre otros parámetros asociados al envejecimiento aparición de lesiones preneoplásicas inducidas por DMH en ratas. (1). Los niveles insufi cientes de ácido docosahexaenóico (omega-3) se han asociado con trastornos neurológicos, vasculares, y con la pérdida Financiado por AGL2009-12866 del MEC y 2009-SGR-00471 de la auditiva asociada a la edad (ARHL) en el hombre (2). Se ha demostrado Generalitat de Catalunya. la existencia de una relación directa entre ARHL y niveles plasmáticos elevados de homocisteína (pHcy)(3). Por el contrario, la relación entre ARHL y altos niveles plasmáticos de PUFAs resulta ser inversa (4). En el P06-8 presente estudio hemos utilizado ratones C57BL/6J y una suplementación Preventive effect of low molecular-weight prolongada con omega-3 para evaluar su impacto en la capacidad auditiva, proanthocyanidins on metabolic syndrome los niveles de Hcy, el estrés oxidativo y la infl amación. Ratones de dos meses de edad fueron alimentados con dieta control o parameters suplementada con omega-3 durante 10 meses. La capacidad auditiva de los animales fue evaluada mensualmente mediante ABR y DPOAE, analizando Zara Pons, Susana Suárez-García, Aleix Ribas-Latre, Francisca sus umbrales auditivos. Se tomaron muestras de sangre para determinar Isabel Bravo, Aïda Pascual-Serrano, Manuel Suarez, Cinta Bladé, concentraciones de pHcy y ácido fólico por HPLC. La morfología coclear Gerard Aragonès, Lluis Arola, Anna Arola-Arnal, Begoña Muguerza se evaluó mediante inmunohistoquímica y tinción con violeta de cresylo. Nutrigenomic Research Group, Universitat Rovira i Virgili, Se analizaron marcadores de infl amación y estrés oxidativo mediante Tarragona, ES Western blotting y RT-qPCR. The importance of metabolic syndrome (MS) is rising due to its increasing El grupo control mostró umbrales auditivos signifi cativamente elevados prevalence worldwide. For that reason, a great effort is being directed en ABR (~25 dB SPL) y menores amplitudes DPOAE a frecuencias to prevent the development of MS. In this regard, the use of functional medias-altas, cuando se comparó con el grupo que recibió omega-3. No se foods is highly recommended. A good animal model to study MS is the observaron diferencias histológicas entre los grupos, pero sí se detectaron cafeteria (CAF) fed rat, no only because it reproduces the MS but also niveles elevados de pHcy (p=0.13) y disminuidos de ácido fólico sérico because it shares the pathogenesis of the human disease. On the other hand, (p<0.05) en el grupo control comparado con el suplementado con omega-3. proanthocyanidins have been previously described to cause benefi cial Los resultados obtenidos sugieren que la suplementación prolongada con health effects in most of the components of MS and in cardiovascular risk omega-3 podría tener un efecto protector a largo plazo en el desarrollo de factors. ARHL. In this study, male wistar rats were fed CAF or standard (ST) diet for 12 weeks. Additionally, CAF fed rats were treated with different doses of low Referencias molecular weight grape seed proanthocyanidins extract (LM-GSPE) (25, [1] Da Young Oh et al., Cell, 142(5):687-98, 2010. 100 and 200 mg/Kg/day; n=10) or vehicle, and the ST rats were given [2] Bamini Gopinath et al., Am J Clin Nutr, 92(2):416-21, 2010. vehicle (n=10). Body weight, waist perimeter, blood pressure and food [3] Bamini Gopinath et al., J Nutr, 140(8):1469-74, 2010. intake were measured weekly. Plasmatic parameters were checked at 7th, [4] Carla Dullemeijer et al., J Nutr Health Aging, 14(5):347-51, 2010. 10th and 12th week of experiment. The animals fed with CAF diet presented raised body weight, waist perimeter Agradecimientos: Beca JAE, BFU2009-08977, SAF2011-24391, FP7- and blood pressure compared to ST rats. LM-GSPE decreased blood pressure AFHELO, FP7-AFHELO, FP7-TARGEAR y Lactalis-Puleva.

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P06-10 (R06-5) implicados como la disminución de endothelina-1 o el aumento de Estudio farmacocinético del ácido maslínico, prostaciclina. Además, se conoce que estos compuestos también pueden un componente bioactivo de Olea europea L. inhibir un gran número de enzimas, incluyendo la ECA, de promover la expresión de múltiples genes reguladores de la presión arterial y de Marta Sánchez-González1, Glòria Lozano-Mena1, Tatiana afectar en diferentes niveles a las cascadas de señalización implicadas en 1 2 1 Joana M. Planas1 Trebolento , Helena Colom , M. Emília Juan , el control de la presión arterial. 1Departament de Fisiologia e Institut de Recerca en Nutrició i Seguretat Alimentària-UB, Universitat de Barcelona, Barcelona, ES, 2 Departament de Farmàcia i Tecnologia Farmacèutica, Barcelona, ES P06-12 (R06-6) El ácido maslínico es un componente minoritario aislado de diferentes Apigenin K has intestinal anti-inflammatory plantas y principalmente de las hojas y los frutos del olivo. Se han effect in two experimental models of rat colitis descrito sus efectos benefi ciosos en modelos animales de cáncer, diabetes y cardiopatía pero se desconoce su biodisponibilidad oral. Por Raquel González Pérez1, Cristina Mascaraque Molina1, María lo tanto, el objetivo del presente estudio es determinar los parámetros Dolores Suárez Ortega2, Antonio Zarzuelo Zurita1, Olga Martínez farmacocinéticos del ácido maslínico en rata tras su administración oral. Augustin2, Femín Sánchez de Medina López-Huertas1 Una dosis única de 50 mg/kg del compuesto fue administrada mediante 1Departamento de Farmacología, Facultad de Farmacia, CIBERehd, sonda intragástrica a ratas Sprague-Dawley. Se obtuvieron muestras de UGR, Granada, ES, 2Departamento de Bioquímica y Biología sangre procedentes de la vena safena a 18 tiempos distintos durante 24 Molecular II, Facultad de Farmacia, CIBERehd, UGR, Granada, ES horas. El plasma se procesó siguiendo una doble extracción líquido- Background and objectives: Flavonoids are polyphenolic compounds líquido con acetato de etilo antes de ser analizado por HPLC-MS. which are widespread in nature and are consumed as part of the human Mediante el software Winnonlin se realizó el análisis no compartimental diet in signifi cant amounts. Many fl avonoids have been studied for their y compartimental de las concentraciones plasmáticas de ácido maslínico intestinal antiinfl ammatory activity. The aim of this study was to test the vs tiempo, siendo el modelo bicompartimental el que mejor describió intestinal anti-infl ammatory activity of apigenin K, a soluble form of la farmacocinética oral del compuesto. La C del ácido maslínico max apigenin, in two models of rat colitis, the trinitrobenzene sulfonic acid (4,82 μM) se alcanzó 49,90 min después de su administración. El AUC (TNBS) model and the dextran sulfate (DSS) model. fue de 913,58 min·μmol/L y el CL/F de 0,116 L/min/kg. Los V /F y c Methods: Apigenin K (3 mg/kg, p.o.) was administered as a pretreatment V /F fueron de 13,02 y 30,56 L/kg, respectivamente. Por otro lado, la p to rats with TNBS and DSS colitis and colonic status was checked 7 and 9 K presentó un valor de 0,034 1/min y la K de 0,0088 1/min. Los 01 10 days after colitis induction, respectively, by macroscopic and biochemical resultados obtenidos sugieren una absorción relativamente rápida con una buena distribución al compartimento periférico y una eliminación examination. sostenida. En conclusión, las concentraciones plasmáticas de ácido Results: Apigenin K pretreatment resulted in amelioration of the maslínico tras su administración oral siguen una caída biexponencial morphological signs and biochemical markers in the TNBS model. The con una constante de retorno limitada y una eliminación lenta del results demonstrate a reduction in infl amed area of 2.4 cm compared organismo. with TNBS group, lower values of macroscopic damage (5.8±1.1 vs 8.6±1.4, p<0.05) and a slight decrease in the colonic weight/length Estudio fi nanciado por los proyectos AGL2009-12866 del MCT y 2009- ratio. Myeloperoxidase and alkaline phosphatase colonic activities were SGR-00471 de la Generalitat de Catalunya. reduced by 34% (p<0,05) and 18%, respectively. Moreover, apigenin K also ameliorated morphological signs and biochemical markers in the DSS model, the comparable results. Thus macroscopic damage was signifi cantly P06-11 (R06-2) reduced (0.5±0.5 vs 2.1±0.6, p<0.05) and the colonic weight/length ratio Efectos beneficiosos de ingredientes bioactivos was lowered by approximately 10%. Colonic myeloperoxidase and alkaline sobre la hipertensión arterial phosphatase activities decreased 30% and 20%, respectively (p<0,05). Apigenin K treatment additionally reduced the colonic expression of IL1β, Begoña Muguerza, Cinta Bladé, Gerard Aragones, Manuel Suarez, IL6, Foxp3, TLR2 and TGFβ compared with the TNBS group (p>0.05 for Lluís Arola, Anna Arola-Arnal the latter two). Nutrigenomic Research Group, Universitat Rovira i Virgili, Conclusions: Apigenin K has anti-infl ammatory effects in two preclinical Tarragona, ES models of infl ammatory bowel disease. La enfermedad cardiovascular es la principal causa de muerte en el mundo y la hipertensión arterial es uno de sus principales factores de riesgo. Varios This study was supported by grants of the Centre for Technological estudios han demostrado que el consumo de alimentos o ingredientes Industrial Development (CDTI) (CENIT SENIFOOD). ricos en fl avanoles, como el cacao o extracto de pepita de uva, mejoran la función endotelial y disminuyen la presión arterial. Diferentes mecanismos podrían justifi car las propiedades antihipertensivas P06-13 (R06-3) de los fl avanoles. La vasodilatación ocasionada por estos compuestos se Pectinas, regulación del peso corporal y salud ha relacionado con la reducción del estrés oxidativo, con la producción Ana María Rodríguez Guerrero, Francisco Javier García Carrizo, de óxido nítrico (NO) y la inhibición de la enzima convertidora de la Catalina Picó Segura, Andreu Palou Oliver angiotensina (ECA), clave para el control de la presión arterial. Laboratorio de Biología Molecular, Nutrición y Biotecnología El cacao y el extracto de pepita de uva son productos ricos en fl avanoles (Universitat de les Illes Balears) y CIBER Fisiopatología de la del tipo fl avan-3-ol y proantocianidinas que han demostrado gran Obesidad y Nutrición, Palma de Mallorca, ES actividad antioxidante. Sin embargo, la concentración real de fl avonoides que alcanzan los vasos sanguineos es tan baja que es poco probable Recientemente, la composición de la microbiota intestinal ha emergido que estos compuestos actúen por un mecanismo antioxidante directo como factor crucial en la prevención de la obesidad (y sus complicaciones), y posiblemente otros mecanismos relacionados con interacciones a su vez fuertemente infl uenciada por la dieta. Numerosas investigaciones específi cas con proteínas o lípidos, serán responsables de sus efectos sobre destacan el efecto de los prebióticos como moduladores de la microbiota, la presión arterial. De hecho, el efecto antihipertensivo de los fl avanoles en un mejor funcionamiento metabólico y en la protección frente a la se atribuye fundamentalmente, a un aumento en la disponibilidad de NO. obesidad. Un tipo particular de prebióticos, utilizados de forma tradicional Sin embargo, es posible que otros mecanismos de acción estén también en alimentación, son las pectinas.

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Las pectinas son fi bras hidrosolubles del tipo polisacáridos no-almidón P06m-15 sobre las que se ha probado su papel en la mejora del control de la glucemia Marcadores diagnósticos y pronósticos y de los niveles de colesterol, aunque su posible papel en la protección en la obesidad mórbida frente a la obesidad y en otros aspectos relacionados con la salud metabólica JR Muñoz-Rodríguez1 1 1 1 1 está menos demostrado. , E Salas , E Segura , M Sánchez , G López , 1 1 1 1 2 En nuestro laboratorio, hemos desarrollado un modelo de propensión M Palma , P Rozas , L Sáenz , A Agarrado , C González-Martín , 1 1 1 2 a la obesidad: descendencia de ratas sometidas a restricción calórica G Casas , A León , J Martín , LF Alguacil 1 moderada durante el embarazo, modelo más similar a la posible Hospital General Universitario de Ciudad Real, Ciudad Real, ES, 2Hospital General Universitario de Ciudad Real, Universidad CEU situación en humanos respecto de otros modelos más restrictivos. San Pablo, Boadilla del Monte, Madrid, ES Hemos analizado el efecto protector de una suplementación moderada con pectinas altamente esterifi cadas de manzana desde el destete hasta El objetivo de este estudio es evaluar la posible utilidad diagnóstica de la edad adulta bajo una dieta control o incluyendo un factor obesogénico diversos marcadores genéticos y bioquímicos en la obesidad mórbida, así más (dieta alta en sacarosa). Hemos comprobado que la suplementación como su valor pronóstico y predictivo de la respuesta personalizada a la con pectinas a largo plazo supone una protección signifi cativa frente cirugía bariátrica. al desarrollo de adiposidad corporal, acompañada de un mejor perfi l Para el estudio bioquímico se seleccionaron 31 pacientes con obesidad mórbida (IMC>40 kg/m2) que fueron sometidos a cirugía bariátrica en el metabólico de parámetros circulantes y parámetros de expresión génica HGUCR y a los que se realizó un seguimiento de 12 meses. Se reclutó en tejidos clave. el mismo número de controles normopesos (IMC entre 18,5 y 24,9 kg/ En defi nitiva, la suplementación de la dieta con pectinas se perfi la como m2) entre el personal del hospital procurando que las proporciones de edad una posible herramienta efi caz en la prevención de la obesidad y en el y sexo resultaran homogéneas. Para los estudios genéticos se aumentó el mantenimiento de un perfi l metabólico saludable. número de pacientes a 74 y el de controles a 57. Como marcadores genéticos se midieron polimorfi smos de genes relacionados con obesidad y trastornos de la conducta alimentaria (Bdnf, P06-14 Cart, Ucp2, Fto, Adra2B y Pparg). Como marcadores bioquímicos se Dietary squalene increases high density midieron neuropéptidos (BDNF y CART), hormonas (grelina, leptina, lipoprotein-cholesterol and paraoxonase 1 adiponectina, insulina) y citoquinas proinfl amatorias (IL-6 y TNFα). and decreases oxidative stress in mice El estudio genético mostró diferencias signifi cativas entre controles y pacientes en las frecuencias de los polimorfi smos rs9939609 y rs9939973 Clara Gabás-Rivera1, Cristina Barranquero2, Roberto Martínez- del gen Fto y rs71824147 del gen Ucp2. Los niveles de IL-6 fueron Beamonte1, María Angeles Navarro-Ferrando1, Joaquín Carlos Surra- superiores en pacientes respecto a los controles. Se detectó un descenso en Muñoz3, Jesús de la Osada García4 BDNF un año después de la cirugía bariátrica en los pacientes intervenidos. 1Departamento Bioquímica y Biología Molecular y Celular, El perfi l hormonal, claramente distinto entre ambos grupos de inicio, se Universidad de Zaragoza, Zaragoza, ES, 2CIBER de Fisiopatología revirtió en los pacientes obesos intervenidos en lo que respecta a niveles de de la Obesidad y Nutrición, Instituto de Salud Carlos III, Zaragoza, adiponectina, leptina e insulina. Los datos obtenidos, junto con otros estudios preclínicos y clínicos, ES, 3Departamento de Producción Animal, Escuela Politécnica sugieren que el análisis de los polimorfi smos de Ucp2 y Fto, la citoquina Superior de Huesca, Huesca, ES, 4Departamento de Bioquímica y IL-6, el perfi l hormonal y el neuropéptido BDNF, pueden ser herramientas Biología molecular y Celular, Facultad de Veterinaria, Universidad valiosas bien para defi nir diferentes endofenotipos de obesidad, bien para de Zaragoza, Zaragoza, ES evaluar o predecir el resultado de los tratamientos contra la obesidad. Background and Purpose: squalene, the main hydrocarbon in the unsaponifi able fraction of virgin olive oil, is involved in cholesterol Financiado por el Instituto de Salud Carlos III (FIS PI10/00440). Los synthesis and it has been reported to own antiatherosclerotic and autores agradecen a Dña Amelia González López su excelente asistencia antiesteatosic effects. However, the squalene’’’’s role on lipid plasma técnica. parameters and the infl uence of genotype on this effect need to be addressed. Experimental Approaches: three male mouse models (wild-type, Apoa1- and Apoe- defi cient) were fed chow semisynthetic diets enriched in squalene to provide a dose of 1 g/kg during 11 weeks. After this period, P07. Bioquímica perinatal their plasma parameters and lipoprotein profi les were analyzed. Key Results: squalene administration at a dose of 1 g/kg showed P07-1 (R07-3) decreased reactive oxygen species in lipoprotein fractions independently Obesidad pregestacional. Consecuencias para of the animal background and caused an specifi c increase in high density lipoprotein (HDL)-cholesterol levels, accompanied by an increase in la descendencia y papel del estrés oxidativo phosphatidylcholine and paraoxonase 1 and no changes in apolipoproteins Martín Alcalá Díaz.Mor1, Sonia Clapés2, Victoria E: Bolado García1, A1 and A4 in wild-type mice. In these mice, the cholesterol increase Isabel Sánchez-Vera Gómez-Trelles1, Franciasco Dasí3, Guillermo was due to its esterifi ed form and associated with an increased hepatic Saez Tormo4, María del Pilar Ramos Álvarez1, Marta Viana Arribas1 expression of Lcat. These effects were not observed in absence of 1Facultad de Farmacia, Universidad CEU San Pablo, Madrid, ES, apolipoprotein A1. The increases in HDL- paraoxonase 1 were translated 2ICBP Victoria de Girón, La Habana, CU, 3Fundación Investigación into decreased plasma malondialdehyde levels depending on the presence Clínico de Valencia, Instituto de Investigación Sanitaria-INCLIVA, of Apolipoprotein A1. Valencia, ES, 4Dpto. de Bioquímica y Biol. Molecular-CIBEROBN, Conclusions and Implications: dietary squalene promotes changes in Facultad de Medicina - Servicio de Análisis Clínicos-CDB HGUV, HDL- cholesterol and paraoxonase 1 and decreases reactive oxygen species Universidad de Valencia, Valencia, ES in lipoproteins and plasma malondialdehyde levels, providing new benefi ts Llevamos a cabo un estudio en un modelo de rata gestante con obesidad of its intake that might contribute to explain the properties of virgin olive inducida por dieta, donde existen claras alteraciones metabólicas, entre oil, although the phenotype related to apolipoproteins A1 and E may be ellas una elevada resistencia a la insulina. Se observó un incremento en particularly relevant. el porcentaje de malformaciones congénitas en el grupo de ratas obesas,

66 Granada 2014 Pósters reducido tras la administración de vitamina E. Se observó un incremento incluyendo acciones en la grasa, el hígado o el páncreas. En este sentido en el estrés oxidativo materno (mayores niveles de daño oxidativo, tanto p53 parece estar involucrado en la programación metabólica de los islotes a proteínas (PAOP) como al ADN, no siendo así en lípidos). Las mayores pancreáticos durante la maternidad. La función endógena de p53 parece estar concentraciones de PAOP y de 8-oxo-7,8-dihidro-2 ́-desoxiguanosina, se afectada por los diferentes estadíos nutricionales y los animales modifi cados correlacionaron positivamente con el incremento en las malformaciones genéticamente en los que se altera la expresión de p53 presentan importantes congénitas. Además, los sistemas antioxidantes, tanto lipofílicos (vitamina cambios metabólicos. Además también se ha observado que la expresión de E en tejido adiposo visceral), como enzimáticos (CuZnSOD, MnSOD y p53 en el sistema nervioso central regula la acción metabólica de algunas GPx hepáticos) se encontraron disminuidos, confi rmando así la situación hormonas que afectan a la ingesta. Futuros estudios serán necesarios para de incrementado estrés oxidativo asociado a la obesidad. Además, la corroborar si p53 podría ser utilizada como diana terapéutica. subunidad catalítica de la glutamato cisteína ligasa, enzima responsable de la síntesis del glutation, está incrementada en obesidad como consecuencia de la demanda de dicho antioxidante. P07-4 (R07-5) La obesidad previa a la gestación induce alteraciones metabólicas en la placenta P07-2 (R07-4) Early nutrition reprograms the hepatic circadian Mónica Diez-Hochleitner Ruiz1, Julio Sevillano Fernández1, Jimena clock: Permanent deregulation of metabolism Pita Santibáñez1, María Haro García1, Marta Viana Arribas1, Gema Medina Gómez2, M. Pilar Ramos Álvarez1 Cristina Garcia-Beltran1, Sílvia Ribó1, Susana Kalko2, Antonio 1Bioquímica y Biología Molecular, Universidad CEU San Pablo, Fernández3, Laura Martínez-Guinó1, Judith Cebrià1, Thais Pentinat1, Madrid, ES, 2Universidad Rey Juan Carlos, Madrid, ES Débora Martínez1, Carles Lerín1, Mario Vallejo3, Rubén Díaz1, Josep Jiménez Chillarón1 La prevalencia de la obesidad ha aumentado en los últimos años, por lo que la probabilidad de que una mujer presente obesidad o sobrepeso al inicio de 1Hospital Sant Joan de Déu, Esplugues de Llobregat, ES, 2Hospital la gestación es cada vez mayor. Por estudios epidemiológicos sabemos que Clínic de Barcelona-IDIBAPS, Barcelona, ES, 3Instituto de la obesidad durante la gestación favorece un mayor riesgo de complicaciones Investigaciones Biomédicas ‘Alberto Sols’ CSIC-UAM; Centro de del recién nacido en edad adulta, aunque no se conocen en detalle los Investigación Biomédica en Red de Diabetes y Enfermedades mecanismos implicados. Por esta razón, quisimos estudiar si la obesidad Metabólicas Asociadas (CIBERDEM), ISCIII, Madrid, ES previa a la gestación altera la homeostasis glucídica y lipídica de la madre. Excessive caloric intake during early stages of development increases the Un grupo de ratas wistar recibió una dieta moderada en grasa previamente a risk of childhood obesity and predisposes individuals to develop late onset la gestación (Moderate Fat Diet, MFD), y en paralelo otro grupo recibió la of obesity, insulin resistance and type 2 diabetes. dieta control (C). Tras 35 días con las dietas, la hembras MFD ya presentaban We have developed a mouse model of neonatal overfeeding (ON) by culling sobrepeso, hiperlipemia, hiperinsulinemia y resistencia a la insulina. En este the offspring to 4 pups per dam during lactation. Control females nursed momento se cruzaron los animales y se estudiaron a día 20 de gestación. Las 8 pups during lactation (C). ON mice developed obesity, hyperglycaemia, madres con la dieta MFD tuvieron fetos más pequeños que las controles, insulin resistance and glucose intolerance with ageing. The liver was the aunque no hubo diferencias en el peso de las placentas ni en su contenido tissue that contributed most prominently to the development of insulin de lípidos. Asimismo, en las placentas del grupo MFD la expresión de Glut- resistance. In order to underpin molecular mechanisms of insulin resistance 1 y Lipina-2 estaba aumentada mientras que la de la LPL se encontraba we analysed global gene expression profi ling (Affymetrix) in livers from disminuida frente a las C. El estudio metabolómico de las placentas reveló un ON and C male mice. The Ontology with highest signifi cance was the mayor contenido de metabolitos como carnitina, acetilcarnitina, cistationina Circadian Rhythm. We next validated (qPCR) the candidate genes (Npas2, y serina (todos ellos relacionados con el metabolismo de los lípidos y la Per1, Per3, Cry1) in adult mice. Strikingly, changes in expression (Per1, glucosa) en las placentas del grupo de MFD respecto al C. Estos resultados Cry2) were already present in livers from 15-day-old ON mice. This data permiten concluir que la obesidad presente antes de la gestación, promueve suggests that altered expression of hepatic clock genes is established early un mecanismo adaptativo que protege a la placenta frente a una posible in life and do not occur as a secondary event associated to the progressive lipotoxicidad, pero a pesar de ello existen alteraciones relacionadas con un development of obesity and/or insulin resistance. aumento en la captación de glucosa y en el metabolismo de la cistationina Circadian rhythms play a major role in orchestrating daily physiological que podrían tener consecuencias en el desarrollo del feto. functions, and disrupting the expression of clock genes evokes metabolic diseases. Thus, we tested whole-body metabolism by indirect calorimetry. Financiado con SAF2010-19603 y CAM-BMD2010-2423. We found that VO2, VCO2, energy expenditure or activity absolute values were similar between groups during both the light and dark cycles. In contrast, in agreement with alterations in the circadian rhythmicity, the diurnal decrease in respiratory exchange ratio (RER) cycling started P07-5 (R07-1) signifi cantly earlier in ON mice. Likewise, upon fasting, V02, VCO2, and Programación metabólica en el periodo pre- energy expenditure remained higher in ON mice during the night cycle. y post-natal de la predisposición a la obesidad Overall, we show that early malnutrition permanently reprograms the en el adulto hepatic circadian clock. Such reprogramming induces a sustained feed- Andreu Palou back loop that may in turn infl uence the physiologic behaviour of mice Catalina Picó, leading, secondarily, to overall metabolic deregulation. CIBER Fisiología de la Obesidad y Nutrición y Laboratorio de Biología Molecular, Nutrición y Biotecnología (Universidad de las Islas Baleares), Palma de mallorca, ES P07-3 (R07-2) Alrededor del 25% de los casos de obesidad en la edad adulta tienen su Papel de p53 en la obesidad y su posible origen en las primeras etapas del desarrollo pre- y post-natal. Son períodos implicación en la programación del metabolismo críticos en los que la restricción materna de alimentos y la presencia o no de determinados componentes de los mismos puede conducir a adaptaciones Ruben Nogueiras Pozo permanentes de procesos metabólicos responsables de estos problemas y, Universidad Santiago de Compostela, Santiago de Compostela, ES según los estudios en modelos animales, los efectos pueden ser diferentes p53 es un gen supresor tumoral que desempeña múltiples funciones biológicas, dependiendo del sexo, del periodo de exposición y su severidad. Y pueden incluyendo la capacidad para modular el metabolismo a diferentes niveles, ser de signo opuesto dependiendo de si la restricción materna tienen lugar

67 Pósters XXXVII Congreso SEBBM en la gestación (propensión a la obesidad) o en la lactancia (resistencia P08-2 (R08-1) a la obesidad). Entre los nutrientes que más infl uyen en la programación Reevaluating the involvement of plastidic metabólica del control del peso corporal, en 2005 identifi camos a la leptina, phosphoglucose isomerase in starch biosynthesis un componente normal de la leche materna y ausente en las fórmulas o preparados para lactantes, que debiera ser considerado un nutriente esencial in mesophyll cells durante el desarrollo perinatal, pues en esta etapa contribuye a la organización Ángela Sánchez López, Abdellatif Bahaji, Francisco José Muñoz, de los sistemas de control metabólico-alimentario que operarán el resto de la Edurne Baroja-Fernández, Jun Li, Adriana Ricarte-Bermejo, vida. Aquí resumiremos datos recientes obtenidos en nuestro laboratorio que Goizeder Almagro, Manuel Montero, Javier Pozueta-Romero revelan la capacidad de la leptina para corregir desajustes de la programación Instituto de Agrobiotecnología (CSIC/UPNA/Gobierno de Navarra), metabólica del recién nacido debidos a la alimentación materna durante la Nafarroa, ES gestación y que, de no corregirse conducen a alteraciones metabólicas en la base del síndrome metabólico y la obesidad. It is widely assumed that the whole starch biosynthetic process occurring in leaf mesophyll cells resides exclusively in the chloroplast. According to this view, transitory starch is considered the end-product of a metabolic pathway involving plastidic phosphoglucomutase (pPGM), ADP-glucose pyrophosphorylase (AGP) and starch synthase (SS) that is linked to the P08. Bioquímica y biología molecular Calvin-Benson cycle by means of the plastidic phosphoglucose isomerase (pPGI). In this work we isolated pgi1-3, a mutant totally lacking pPGI de plantas activity as a consequence of aberrant splicing of intron 6 of the pPGI encoding gene, PGI1. Starch content in pgi1-3 leaves was ca. 10-15% of that of wild type (WT) leaves, which is similar to that of leaves of P08-1 Análisis de la expresión de la oxidasa alternativa pgi1-2, a T-DNA insertion pPGI null mutant. Unexpectedly, microscopy analyses revealed the presence of few starch granules per chloroplast in the de girasol (Helianthus annuus L.) en relación mesophyll cells of pgi1-2 and pgi1-3 leaves. Both pgi1-2 and pgi1-3 leaves con el estrés biótico causado por Plasmopara accumulated WT levels of the starch precursor molecule, ADP-glucose, halstedii and displayed reduced SS and high β-amylase activities. Moreover, the two pgi1 mutants displayed a slow growth phenotype and possessed Theo Guerra Dug1, Ana María Fernández Ocaña1, José Rafael reduced photosynthetic capacities when cultured under continuous light Pedrajas Cabrera2, Raquel Valderrama Rodríguez2, Juan Bautista photoperiod. Importantly, pgi1-2 and pgi1-3 leaves accumulated high Barroso Albarracín2, María Victoria Gómez Rodríguez1 starch content when plants were cultured in the presence of elevated CO2 1Departamento de Biología Animal, Biología Vegetal y Ecología. concentration. Furthermore, introduction into pgi1-2 and pgi1-3 of a sex1 Universidad de Jaén, Jaén, ES, 2Departamento de Biología null mutation impeding β-amylase-mediated starch breakdown reverted Experimental. Universidad de Jaén, Jaén, ES the starch-defi cient phenotype of pgi1 mesophyll cells. The overall data La oxidasa alternativa (AOX) es una proteína presente en plantas y otros (a) show that mesophyll cells of pPGI null mutants accumulate starch, (b) organismos que forma parte de la cadena mitocondrial de transporte de provide strong evidence that the reduced starch content in pgi1 mesophyll electrones. AOX puede sustituir a la Citocromo c oxidasa como aceptor cells is largely the consequence of combined factors including reduced fi nal de electrones, con la ventaja de ser insensible al cianuro si bien su photosynthetic capacity and pleiotropic changes in activities of enzymes actuación da lugar a un menor rendimiento en términos de ATP. directly linked to starch metabolism, (c) support the occurrence of Puesto que se ha descrito que AOX desempeña un importante papel frente important starch biosynthetic pathway(s) alternative to the classic Calvin- al estrés oxidativo y nitrosativo derivado de condiciones adversas de tipo Benson cycle-pPGI-pPGM-AGP-SS pathway, and (d) show that pPGI is an biótico y abiótico, se ha realizado un estudio preliminar acerca del papel important determinant of both photosynthetic capacity and growth. que esta proteína pudiera tener en la interacción entre H. annuus y uno de sus más importantes patógenos (P. halstedii), así como de la posibilidad de que AOX pudiera formar parte de los mecanismos de defensa que el BTH, P08-3 un inductor de resistencia sistémica adquirida (SAR), pudiera activar. Análisis proteómico en plantas de Arabidopsis Se han empleado dos líneas de girasol, una susceptible HA89 y otra thaliana deficientes en las tiorredoxinas f y m resistente RHA274 y tanto a nivel de expresión como de cantidad de plastidiales proteína. Los resultados obtenidos han mostrado la existencia de diferencias en Juan Fernández Trijeque, José Antonio Rojas González, Antonio la expresión de la AOX entre ambas líneas de girasol. Las plantas de la Jesús Serrato Recio, Mariam Sahrawy Barragan línea susceptible tienen distinto nivel de expresión de AOX que las de Departamento de Bioquímica, Biología Celular y Molecular de la línea resistente pero esa diferencia no parece estar relacionada con su Plantas, Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Granada, ES resistencia o susceptibilidad a P. halstedii. La infección da lugar en las La regulación redox es probablemente el mecanismo más utilizado por las plantas susceptibles a un aumento de la cantidad de AOX, no debida a plantas para controlar la activación de enzimas o la reducción de puentes una mayor transcripción de los genes que codifi can las dos isoformas, disulfuro de proteínas implicadas en diversos procesos metabólicos o de sino a una distinta regulación de la traducción y/o equilibrio en la síntesis/ degradación de la proteína. desarrollo. Aunque existen distintas proteínas capaces de llevar a cabo De nuestros resultados se deduce que si bien el BTH actúa como protector intercambios tiol/disulfuro, las tiorredoxinas (Trx) son las responsables de de la infección por P. halstedii, este efecto no está ligado a una activación muchos de las funciones que ocurren en plantas. Las Trx plastidiales de de la expresión de los genes que codifi can para las dos isoformas de la Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) son el grupo más numeroso de la familia AOX ni tampoco al aumento de la cantidad de proteína. multigénica a la que pertenecen, en el cloroplasto se han descrito las Trx f, m, x, y. Hasta hace unos años se conocía la activación específi ca de la fructosa- Las semillas de girasol fueron amablemente cedidas por el equipo del 1,6-bisfosfatasa cloroplastídica por la Trx f y de la malato deshidrogenasa profesor Said Mouzeyar, Université Blaise Pascal, Clermont-Ferrand, por la Trx m. Sin embargo el número de isoformas existentes para cada tipo, Francia. sugiere una gran diversidad funcional lo que conlleva la difi cultad de asignar un papel fi siológico concreto a cada una de las Trxs. Financiado por fondos FEDER y por el MINECO (proyecto BIO2012- Para contribuir a la identifi cación de funciones específi cas a las Trx f y 33904) y Junta de Andalucía (AGR-6374, grupo BIO286). m de Arabidopsis en este estudio hemos caracterizado las proteínas

68 Granada 2014 Pósters diferencialmente expresados en mutantes de Arabidopsis defi cientes hormonas y como moléculas señal en la rizosfera. Como fi tohormonas, (“knockout”) en las Trx f1, f2, m1, m2, m3 y m4, respectivamente. se ha propuesto que podrían jugar un papel como moduladores del Extractos de proteínas fueron preparados para comparar las proteínas en desarrollo coordinado de raíces y parte aérea en respuesta a condiciones plantas mutantes y silvestres usando la técnica de 2D-PAGE. Las proteínas de estrés nutricional. De acuerdo con esta hipótesis, se ha demostrado diferencialmente expresadas fueron identifi cadas mediante MS-MS/MS que las SL están involucradas en la regulación de la arquitectura vegetal, (MALDITOF-TOF) en el Servicio de Proteómica (SCAI) de la Universidad formación de raíces adventicias, crecimiento secundario y desarrollo de Córdoba. Los análisis muestran un total de 37 y 71 proteínas inhibidas y reproductivo. Además, nuevas funciones se están descubriendo sobreexpresadas, respectivamente, en todos los mutantes. La clasifi cación continuamente. Como moléculas señal en la rizosfera, las SL favorecen de las proteínas por categorías funcionales indica que varios procesos de el establecimiento de la simbiosis con ciertos hongos benefi ciosos del la planta están afectados, entre los cuales podemos destacar el transporte suelo (simbiosis micorrícica arbuscular). Mediante el establecimiento electrónico, la fotosíntesis y el Ciclo de Calvin, el ensamblaje de proteínas, de este tipo de simbiosis, las plantas son capaces de sobrevivir bajo y la síntesis de amino ácidos. Este estudio puede favorecer la asignación de diferentes condiciones de estrés. En la rizosfera, las SL también actúan acciones a algunas de Trx f y m analizadas. como estimulantes de la germinación de plantas parásitas de la familia Orobancheaceae (malas hierbas), las cuales ocasionan grandes pérdidas Agradecimientos: Este trabajo ha sido fi nanciado por el MICINN a nivel agronómico. Debido a este papel dual de las SL en la rizosfera, (BIO2009-7297), MINECO (BIO2012-33292) y por la Junta de Andalucía se ha propuesto que las micorrizas también podrían ser utilizadas para el (P07-CVI-02795, BIO154). desarrollo de nuevas estrategias de biocontrol frente a este tipo de malas hierbas. En nuestro grupo de investigación, estamos interesados en estudiar cómo P08-4 (R08-7) diferentes condiciones de estrés, tanto de tipo abiótico como biótico, afectan Reconocimiento molecular en la interacción a la producción y regulación de SL, así como analizar cómo esto afecta a de la NADPH-tiorredoxina-reductasa cloroplástica la formación de micorrizas y a la infección por plantas parásitas. Por otro lado, también estamos interesados en descubrir nuevas funciones de las SL, (NTRC) con 2-Cys peroxirredoxina como por ejemplo su posible implicación en respuestas de defensa. José A. Navarro1, Pilar Bernal-Bayard1, Francisco J. Cejudo1, Adrián Velázquez-Campoy2, Manuel Hervás1 1Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, cicCartuja, Sevilla, P08-6 ES, 2Instituto de Biocomputación y Física de Sistemas Complejos HPLC-MS/MS analyses show that leaves of (BIFI), Zaragoza, ES the near-starchless aps1 and pgm mutants Las NADPH-tiorredoxina-reductasas (NTR) utilizan NADPH como fuente accumulate wild type levels of ADPglucose: de electrones para la reducción de tiorredoxinas (Trx), en lo que conforma further evidence for the occurrence of various un sistema de regulación por oxidación-reducción de grupos disulfuro important ADPglucose biosynthetic pathway(s) que controla múltiples procesos celulares. Las NTR contienen una fl avina y un grupo disulfuro como cofactores, que operan como una cadena de Miren Edurne Baroja Fernández1, Abdellatif Bahaji1, Ángela transferencia intramolecular de electrones desde el NADPH al grupo María Sánchez López1, Francisco José Muñoz1, Jun Li1, Goizeder disulfuro en el sitio activo. Además de las NTR estándar, las plantas poseen Almagro1, Manuel Montero1, Adriana Ricarte Bermejo1, Pablo una NTR plastídica, llamada NTRC, con un dominio Trx fusionado a su Pujol2, Regina Galarza2, Kentaro Kaneko3, Kazusato Oikawa3, Kaede extremo C-terminal. NTRC, entre otras funciones, actúa como un reductor Wada3, Toshiaki Mitsui3, Javier Pozueta Romero1 de las 2-Cys peroxirredoxinas (2-Cys Prx), que controlan los niveles 1Instituto de Agrobiotecnología (CSIC/UPNA/Gobierno de Navarra), intracelulares de peróxido de hidrógeno, sin embargo, las características Mutilva, Navarra, ES, 2Servicio de Apoyo a la Investigación, de la interacción entre ambas proteínas no se conoce. Hemos estudiado Universidad Pública de Navarra, Pamplona, ES, 3Department of los procesos de reconocimiento molecular del sistema NTRC/2-Cys Prx Applied Biological Chemistry, Niigata University, Niigata, JP mediante calorimetría de titulación isoterma, utilizando tanto proteínas In leaves, it is widely assumed that starch is the end-product of a nativas como los módulos NTR (NTR ) y Trx (Trx ) de NTRC, expresados M M metabolic pathway exclusively taking place in the chloroplast that (a) separadamente. Las interacciones de NTRC, Trx y NTR con la 2-Cys M M involves plastidic phosphoglucomutase (pPGM), ADPglucose (ADPG) Prx son similares en cuanto a afi nidad, aunque diferentes en cuanto a la pyrophosphorylase (AGP) and starch synthase (SS), and (b) is linked to the contribución entalpía/entropía. Nuestros datos sugieren que ambos módulos, Calvin-Benson cycle by means of the plastidic phosphoglucose isomerase NTR y Trx , contribuyen signifi cativamente a la interacción de NTRC M M (pPGI). This view also implies that AGP is the sole enzyme producing the con la 2-Cys Prx, en concordancia con el modelo de interacción que hemos starch precursor molecule, ADPG. However, mounting evidence has been propuesto recientemente. Por el contrario, NTRC no interacciona con compiled pointing to the occurrence of important sources, other than the una Trx cloroplastídica de tipo x, debido a que la presencia del módulo pPGI-pPGM-AGP pathway, of ADPG. To further explore this possibility, Trx impide dicha interacción. Nuestros resultados ponen de manifi esto el in this work two independent laboratories have carried out HPLC-MS/ conjunto preciso y defi nido de interacciones que determinan la especifi cidad MS analyses of ADPG content in leaves of the near-starchless pgm and del reconocimiento molecular en el sistema NTRC/2-Cys Prx de plantas. aps1 mutants impaired in pPGM and AGP, respectively, grown under two different culture conditions. We also measured the ADPG content in WT and aps1 leaves expressing in the plastid two different ADPG P08-5 (R08-2) cleaving enzymes, and in aps1leaves expressing in the plastid GlgC, Función y regulación de las estrigolactonas como a bacterial AGP. Furthermore, we measured the ADPG content in ss3/ fitohormonas y moléculas señal en la rizosfera ss4/aps1 mutants impaired in starch granule initiation and chloroplastic Juan Antonio López Ráez ADPG synthesis. We found that, irrespective of their starch contents, , Rocío Torres Vera, Juan Manuel García pgm and aps1 leaves, WT and aps1 leaves expressing in the plastid Ramírez, Javier Rivero Bravo, Estefanía Berrio Pozo, María José ADPG cleaving enzymes, and aps1 leaves expressing in the plastid GlgC Pozo Jiménez accumulate WT ADPG content (0.13-0.19 nmol ADPG/g fresh weight). Estación Experimental del Zaidín, CSIC (EEZ-CSIC), Granada, ES In clear contrast, ss3/ss4/aps1 leaves accumulated ca. 300 fold-more Las estrigolactonas (SL) son unas moléculas multifuncionales que ADPG than WT leaves. The overall data further provide strong evidence están involucradas en diferentes procesos en las plantas, donde actúan that, in Arabidopsis leaves, (a) there are important ADPG biosynthetic

69 Pósters XXXVII Congreso SEBBM pathways, other than the pPGI-pPGM-AGP pathway, (b) pPGM and AGP microalga, desarrollando ﬁ toplancton con alto contenido en péptidos are major determinants of starch accumulation, but not of intracellular antimicrobianos (AMP). La expresión del gen MitC se ha comprobado ADPG content, and (c) most of ADPG has an extraplastidial localization a nivel de mensajero y a nivel de síntesis de proteínas. El carácter in WT leaves. antimicrobiano del ﬁ toplancton obtenido está en estudio.

P08-7 (R08-3) P08-9 Interplay between SWR1 and NuA4 chromatin Induction of bioflocculation in microalgae remodelling complexes in the control of flowering Encarnación Díaz Santos, Marta Vila Spínola, Marta De la Vega time Naranjo, Rocío Rengel, Alicia Azogil, Rosa León Bañares, Javier Vigara Fernández Pedro Crevillén Lomas, Angeles Gómez-Zambrano, Alfonso Mouriz, Laboratorio de Bioquímica y Biología Molecular, Dpto. Química y Manuel Piñeiro, José A. Jarillo Ciencia de los Materiales, Facultad de Experimentales, Universidad Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas (UPM-INIA), de Huelva, CEIMAR, Huelva, ES Pozuelo de Alarcón, ES Harvesting of microalgae biomass is a critical step, which accounts for Histone acetylation by the NuA4/Tip60 complex and histone H2A.Z more than 30% of the total price of microalgal production. Reducing deposition by the SWR1/SRCAP complex are functionally linked its cost is essential to make economically feasible the production of bulk chromatin modifi cations observed across eukaryotes, regulating multiple products from microalgae, such as biodiesel which despite the enthusiasm biological processes such as gene expression, heterochromatin boundary generated, is far from being competitive. Autoaggregation of fl occulent maintenance, and DNA repair. In our lab, we previously characterized a microalgae in response to stressing conditions is poorly understood, but it series of Arabidopsis thaliana early fl owering mutants defi ning a major is a promising approach to induce the aggregation of microalgae into fl ocks role for SWR1-C in the regulation of fl owering time, a key developmental and make microalgal harvesting a straightforward and cheap procedure. process in the lifecycle of plants. We are currently focused on the YEATS The effect of the fl occulent yeast strainSaccharomyces bayanus var. uvarum domain protein YAF9/GAS41, a shared subunit between SWR1 and NuA4 and the fl occulent microalgae Tetraselmis suecica on two chlorophytes: complexes. There are only two Arabidopsis YEATS domain proteins: the model freshwater microalga Chlamydomonas reinhardtii and the novel AtYAF9a and AtYAF9b. Atyaf9a KO allele displays an early fl owering marine microalgaPicochlorum sp HM1, was investigated. Both fl occulent phenotype, as previously characterized SWR1-C mutants. AtYAF9A binds microorganisms had a positive effect on microalgal cell aggregation and to regulatory regions of master fl owering genes altering their histone improved fl occulation effi ciencies, which were considerably increased with acetylation levels and H2A.Z dynamics. In addition to fl owering time addition of yeasts grown in anaerobic conditions. In order to gain more insights alterations, Atyaf9ayaf9b double mutant shows strong developmental in the origin of microorganism-induced microalgal fl occulation, proteins phenotypic defects as well as misregulation of many genes. We have released into the culture medium by the fl occulent yeastSaccharomyces also isolated different mutant alleles for other NuA4 subunits and have bayanus var. uvarum were isolated and its ability to induce fl occulation generated double mutant combinations to uncover the possible existence of was tested. The most abundant of these proteins was identifi ed as a protein functional redundancy between homologues. We will present our current like-glucanase and its addition in microalgal cultures caused an important data and speculate about their role in regulating plant development. improvement of the fl occulation effectiveness. The study was completed evaluating the effect of some plant lectins on the chosen chlorophytes. P08-8 Nuevas cepas de fitoplancton transgénico con P08-10 componentes antimicrobianos para reforzar el Promotion of Arabidopsis growth and flowering sistema inmune innato de especies acuículas by Alternaria alternata volatile emissions is Marta Vila Spinola, Encarnación Díaz-Santos, Marta de la Vega a photocontrolled process involving dramatic Naranjo, Javier Vigara, Rosa León Bañares changes in the plant hormonome Laboratorio de Bioquímica, Dpto. Química y Ciencia de Materiales, 1 Nuria De Diego2 1 Campus del Carmen, Facultad de Ciencias Experimentales, Jun Li , , Ángela María Sánchez-López , Abdellatif Universidad de Huelva, Campus de Excelencia Internacional del Bahaji1, Francisco José Muñoz1, Edurne Baroja-Fernández1, Karel Mar-CEIMAR, Huelva, ES Dolezal2, Lukas Spichal2, Javier Pozueta-Romero1 1 El uso de antibióticos para prevenir enfermedades en muchas especies Instituto de Agrobiotecnología (CSIC/UPNA/Gobierno de Navarra), 2 acuícolas es una práctica de riesgo que puede provocar la aparición de Mutilva, ES, Centre of the Region Haná for Biotechnological patógenos resistentes, además los antibióticos nos son efectivos frente and Agricultural Research, Department of Chemical Biology and a virus. La vacunación frente a enfermedades usuales puede hacerse en Genetics, Faculty of Science, Palacký University, Olomouc, CZ ejemplares de peces adultos, pero es imposible de aplicar a alevines o a Plants perceive biotic stimuli by recognizing different signaling substances otras especies acuícolas que carecen de un sistema inmune adaptativo, originating from the interacting microorganisms. Some of them are volatile como los bivalvos. En estos casos es necesario desarrollar alternativas de compounds. Volatile emissions from some rhizobacterial isolates promote compuestos antimicrobianos que refuercen el sistema inmunitario de los growth in Arabidopsis by facilitating nutrient uptake, photosynthesis and ejemplares cultivados y mejoren sus tasas de supervivencia. Los AMP son defense responses, and by decreasing glucose sensing and ABA levels. pequeños péptidos catiónicos que pueden inactivar a un amplio espectro Analyses of Arabidopsis mutants affected in hormone signaling have de bacterias, hongos y parásitos patógenos, además de virus y que se indicated possible involvement in the reaction to rhizobacterial volatiles. We encuentran muy conservados a lo largo de la evolución, lo que hace pensar found that the production of volatilespromoting plant growth is not restricted que su papel dentro del sistema inmune innato debe de ser fundamental. to some rhizobacteria, and that volatiles emitted by different microbial En este trabajo hemos aislado el gen que codifi ca un pequeño péptido species ranging from Gram-negative and Gram-positive bacteria to different con características antimicrobianas (AMP) a partir de tejido de Mytilus fungi (including plant pathogens and microbes normally not interacting with galloprovincialis (mejillón), lo hemos clonado en el vector de expresión plants) promote both growth and accumulation of exceptionally high levels of “Phycogen high-expression vector” para microalgas suministrado por starch in leaves of both mono- and di-cotyledonous plants. This phenomenon, la empresa Phycogenetics SL y lo hemos insertado en el genoma de una initially designated as MIVOISAP (for MIcrobial VOlatiles Induced Starch

70 Granada 2014 Pósters

Accumulation Process), involves changes in the leaf transcriptome and Craven-Bartle y col. 2013. A Myb transcription factor regulates genes of metabolome. To better understand MIVOISAP, we analyzed the effect of the phenylalanine pathway in maritime pine. The Plant Journal 74: 755- volatiles emitted by Alternaria alternata on Arabidopsis development. We 766. found that itsvolatiles induce rapid growth, development of secondary roots Shen y col. 2009. A Bioinformatic analysis of NAC genes for plant cell and initiation of the ﬂ owering. Using different mutants we also observed wall development in relation to lignocellulosic bioenergy production. that MIVOISAP down-regulated genes involved in light signaling and in the Bioenergy Res 2: 217-232. main hormone synthesis and signaling. We also carried out high throughput analyses of hormone content in root and leaves of plants exposed to A. altertata volatile emissions. The overall data showed that MIVOISAP is a P08-12 photocontrolled process involving dramatic changes in the hormonome of El herbicida auxínico ácido the both plant organs. 2,4-diclorofenoxiacético induce alteraciones

This research was partially supported by the grants [BIO2010-18239] del citoesqueleto de actina por carbonilación from the Comisión Interministerial de Ciencia y Tecnología and Fondo y S-nitrosilación y afecta la dinámica de Europeo de Desarrollo Regional (Spain) and by Iden Biotechnology. A-M. peroxisomas y mitocondrias S-L. acknowledges a predoctoral fellowship from the Spanish Ministry of Science and Innovation as well as the Ministry of Education, Youth and Maria Rodríguez-Serrano1, Diana M Pazmiño1, Imogen Sparkes2, Sports, Czech Republic (Grant L01204 from the National Program of Chris Hawes2, Maria C Romero-Puertas1, Luisa M Sandalio1 Sustainability and Agricultural Research and project POST-UP, reg. No. 1Departamento de Bioquímica, Biología Celular y Molecular CZ.1.07/2.3.00/30.0004). de Plantas, Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Granada, ES, 2School of Biological & Medical Sciences, Oxford Brookes University, oxford, UK P08-11 (R08-5) El ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) es una auxina sintética utilizada PpNAC1, posible candidato para articular la red como herbicida. Altas concentraciones de 2,4-D inducen malformaciones transcripcional implicada en la síntesis de pared en hojas (epinastia) y tallosy muerte celular. En este trabajo se han celular secundaria en pino estudiado losmecanismos moleculares implicados en la toxicidad del 2,4- D mediante el análisis de la producción de especies de oxígeno reactivo M. Belén Pascual, Blanca Craven-Bartle, Francisco M Cánovas, (ROS), óxido nítrico (NO) en plantas de Arabidopsis y su efecto sobre la Concepción Ávila estructura del citoesqueleto y la dinámica de peroxisomas y mitocondrias. Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de La aplicación foliar de 2,4-D (23 mM) producía epinastia en hojas y este Ciencias, Universidad de Málaga, Campus de teatinos, Málaga, ES fenotipo podía prevenirse por pre-tratamiento con EDTA. El análisis de la El conocimiento de las redes de regulación transcripcional que controlan acumulación de ROS mediante microscopía confocal mostró un incremento dependiente de 2,4-D del H O y O .- asociado a pequeños orgánulos, procesos importantes en coníferas es muy limitado. Por ello, la identifi cación 2 2 2 y caracterización funcional de factores de transcripción (TF) es esencial para posiblemente peroxisomas y mitocondrias, mientras que la acumulación comprender la regulación de genes implicados en procesos estrechamente total de NO no se afectaba por el tratamiento. El análisis del citoesqueleto ligados a la productividad forestal. El transcriptoma de P. pinaster contiene de actina mediante el uso de una línea de Arabidopsis FABD2-GFP mostró 877 TF distribuidos en 30 familias. Este número es similar al descrito en alteraciones el mismo dependientes del 2,4-D. El análisis de modifi caciones abeto blanco y menor al descrito en angiospermas (Canales y col. 2014). postraduccionales de proteínas por carbonilación y S-nitrosilación Los factores de transcripción NAC constituyen una gran familia génica demostró que la actina experimenta ambas modifi caciones lo que afecta específi ca de las plantas. Usando la información disponible en la base de a su polimerización, tal como sugiere la relación de F-actin/G-actin. Estos datos Sustainpine, hemos identifi cado 37 posibles genes NAC en pino. efectos se reducían por el tratamiento con EDTA, que a su vez reducía Los análisis fi logenéticos y la identifi cación de motivos conservados la oxidación de proteínas y en particular de la actina. El 2,4-D también con el programa MEME realizados en otras especies sugieren que genes reducía la velocidad y desplazamiento de peroxisomas y mitocondrias, relacionados estructuralmente podrían ejercer funciones similares (Shen y como consecuencia de las alteraciones observadas en el citoesqueleto. col. 2009). Según esto, hemos visto que PpNAC1 se agrupa en el mismo Para determinar la fuente de ROS implicada en este proceso, se analizó clado que NST1, NST2 y SND1 de Arabidopsis, genes implicados en la el fenotipo de distintos mutantes de Arabidospsis, entre ellos, las líneas formación de pared celular secundaria. Por tanto, PpNAC1 es un candidato defi cientes en xantina deshidrogenasa y enacilCoA oxidasa que mostraron interesante para estudiar la formación de madera en una especie forestal una reducción considerable de la epinastia.Se ha analizado además la como el pino donde dicho proceso es de gran importancia económica. regulación de la epinastia por ABA, jasmónico y etileno. Los resultados Ensayos de retraso en gel y estudios de expresión transitoria en protoplastos obtenidos sugieren que la epinastia es el resultado de alteraciones del de pino se han utilizado con el objetivo de elucidar el papel de PpNAC1 en la citoesqueleto de actina dependientes de ROS y NO. red de regulación transcripcional que controla la formación de pared celular secundaria, así como el control sobre los factores R2R3-Myb, esenciales en Trabajo fi nanciado por ERDF-BIO2008-04067 y BIO2012-36742 del el metabolismo de la fenilalanina y posterior síntesis de fenilpropanoides MICINN y la Junta de Andalucía (BIO-337). (Craven-Bartle y col. 2013). Resultados preliminares apuntan a que PpNAC1 regula su propia expresión así como la expresión de factores Myb implicados en el proceso. Todo esto nos permite especular sobre su posible función como P08r-13 regulador río arriba de la biosíntesis de fenilalanina, el aminoácido precursor Modulación de la capacidad antioxidante del de la lignina. La obtención de líneas embriogénicas de pino sobreexpresoras ciclo ascorbato-glutatión por modificaciones de PpNAC1 y RNAi en curso, junto con su posterior caracterización, nos post-traduccionales mediadas por óxido nítrico proporcionará la información necesaria para demostrar la implicación de este factor de transcripción en la síntesis de pared celular secundaria. Juan Carlos Begara-Morales1, Beatriz Sánchez-Calvo1, Mounira Chaki1, Raquel Valderrama1, Capilla Mata-Pérez1, Javier López- Bibliografía Jaramillo2, María N. Padilla1, Alfonso Carreras1, Francisco Javier Canales y col. 2014. De novo assembly of maritime pine transcriptome: Corpas3, Juan Bautista Barroso1 implications for forest breeding and biotechnology. Plant Biotechnology 1Grupo de Bioquímica y Señalización Celular en Óxido Nítrico, Journal 12: 286-299. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad

71 Pósters XXXVII Congreso SEBBM de Jaén, Jaén, ES, 2Instituto de Biotecnología, Departamento de la ultraestructura de la hoja en respuesta al tratamiento con Cd. Para Química Orgánica, Universidad de Granada, Granada, ES, 3Grupo establecer posibles dianas de la CPK1 se ha analizado la actividad de de Antioxidantes, Radicales Libres y Óxido Nítrico en Biotecnología proteínas peroxisomales que previamente se ha demostrado que pueden y Agroalimentación, Departamento de Bioquímica, Biología fosforilarse, la glicolato oxidasa, catalasa y superóxido dismutasa. Molecular y Celular de Plantas - Estación Esperimental del Zaidín, También se ha analizado el papel de esta quinasa en la regulación de la

CSIC, Granada, ES acumulación de H2O2 en respuesta al tratamiento con Cd. Los resultados obtenidos sugieren que la CPK1 podría regular la producción de H O Las modifi caciones post-traduccionales mediadas por óxido nítrico 2 2 procedente de la fotorrespiración en situaciones de estrés por Cd. En (MPT-NO), tales como nitración y S-nitrosilación, pueden modular la estas condiciones, las hojas de plantas cpk1 experimentan cambios función de dianas proteicas [1]. Sin embargo, la información disponible importantes en la ultraestructura de la célula que afectan especialmente sobre su efecto en la actividad y estructura de proteínas involucradas en a los peroxisomas. Por el contrario, la deficiencia de CPK1 no afecta sistemas antioxidantes es limitada. Por esta razón, se analizó el efecto a la respuesta frente al As ni a la respuesta hipersensible frente a Pst de estas MPT-NO sobre las principales enzimas del ciclo ascorbato- avrB. glutatión, clave en la detoxifi cación y regulación de los niveles de peróxido de hidrógeno en plantas [2]. En este estudio, se utilizaron Trabajo fi nanciado por ERDF-BIO2008-04067y BIO2012-36742del diferentes proteínas recombinantes de guisante: Ascorbato peroxidasa MICINN y la Junta de Andalucía (BIO-337). citosólica (APX), monodeshidroascorbato reductasa peroxisomal (MDAR) y glutatión reductasa (GR) citosólica y cloroplastídica. Los resultados pusieron de manifi esto una regulación diferente de las enzimas P08-15 del ciclo. En el caso de la APX disminuyó su actividad por nitración y PpMyb23, un nuevo factor de transcripción Myb aumentó por S-nitrosilación [3], mientras que las GR no se modifi caron y la MDAR fue inhibida por ambas modifi caciones. Además, en la APX R2R3 de coníferas relacionado con el desarrollo se identifi caron las dianas de estas MPT-NO y su implicación funcional. de las acículas y el metabolismo Finalmente, utilizando plantas de guisante sometidas a estrés salino se de los flavonoides observó que la S-nitrosilación de APX ocurre in vivo y que aumenta durante esta situación de estrés [3]. Jose M Granados, Marina Rueda-López, Mª Belén Pascual, En conclusión, se evidenció que el ciclo ascorbato-glutatión presenta Concepción Ávila, Francisco M Cánovas, Rafael A. Cañas regulación por NO, sugiriendo además una estrecha relación entre el Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de metabolismo de NO y ROS en plantas. Ciencias, Universidad de Málaga, Campus Universitario de Teatinos, Málaga, ES Referencias En un trabajo previo de nuestro laboratorio hemos caracterizado el [1] Corpas FJ et al. Plant Sci (2011), 181:604-611. metabolismo anual de las acículas de árboles adultos de Pinus pinaster [2] Noctor and Foyer. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol (1998), (Aiton) en condiciones naturales mediante el análisis de redes de co- 49:249-279. expresión de genes (WGCNA). Gracias a este análisis se pudo identifi car [3] Begara-Morales JC et al. J Exp Bot (2014), 65:527-538. un nuevo factor de transcripción Myb R2R3 de coníferas, que ha sido nombrado como PpMyb23, asociado al desarrollo de las acículas y al Financiado por Ministerio de Economía y Competitividad (proyectos metabolismo de los fl avonoides. El análisis de su secuencia muestra que BIO2012-33904 y 20134R0569) y Junta de Andalucía (grupos BIO286 y no pertenece al Subgrupo 4 de factores Myb R2R3 que han sido propuestos BIO192). como los principales responsables de la regulación del metabolismo de los fl avonoides en coníferas (Bedon et al. 2010). La caracterización de su P08-14 expresión génica a lo largo del desarrollo plantular confi rma que la acción Caracterización funcional de la quinasa CPK1 de PpMyb23 se encuentra ligada a las acículas, probablemente en respuesta peroxisomal en respuesta a estrés biótico y a las condiciones lumínicas. Como otros factores Myb R2R3 relacionados abiótico en plantas de Arabidopsis con el metabolismo de los fl avonoides su expresión se modifi ca por metil- jasmonato (MeJA). Katiuska Cárdenas, María Rodríguez-Serrano, Adela Olmedilla Arnal, María C. Romero-Puertas, Luisa M. Sandalio Bibliografía Departamento de Bioquímica, Biología Celular y Molecular de Bedon F, Bomal C, Caron S, Levasseur C, Boyle B, Mansfi eld SD, Schmidt Plantas, Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Profesor Albareda A, Gershenzon J, Grima-Pettenati J, Séguin A, MacKay J. (2010) Subgroup 1, Granada, ES 4 R2R3-MYBs in conifer trees: gene family expansion and contribution to the isoprenoid- and fl avonoid-oriented responses. J Exp Bot. 61(14): 3847- La modificación postraduccional de proteínas por fosforilación es 3864. uno de los mecanismos más comunes en la regulación de la actividad, localización subcelular y degradación de proteínas. Estos procesos están implicados en el reconocimiento de cambios en el entorno celular y en la P08-16 regulación de la respuesta celular frente a factores bióticos y abióticos. Respuesta antioxidante y fotosintética Los peroxisomas son fuentes importantes de señales celulares como especies de oxígeno y nitrógeno reactivo (ROS, RNS) y hormonas, de la fanerógama marina Posidonia oceanica al y tienen un papel central en la regulación de procesos metabólicos estrés por deficiencia lumínica esenciales para la célula y en la respuesta celular al estrés. La presencia Anna Maria Ortolà Garcia de quinasas y fosfatasas en estos orgánulos ha sido recientemente demostrada, si bien sus proteínas diana y su función no han sido Dpto. Producció Vegetal, Universitat Politècnica de València, establecidas. En este trabajo se ha llevado a cabo la caracterización València, ES de la quinasa de Arabidopsis thalina CPK1 en respuesta a estrés por La Posidonia oceanica (L.) Delile es una fanerógama marina endémica metales (Cd y As), e infección por Pseudomonas syringae (Pst avrB). del mar Mediteráneo, en donde forma extensas praderas cuya distribución Para ello, se ha utilizado un mutante de Arabidopsis deficiente en está estrechamente unida a la capacidad de penetración de la luz en el agua. esta proteína, cpk1. En este mutante se ha analizado el fenotipo de la Su ecosistema está reconocido por el European Habitats Directive (92/43/ planta en respuesta a los estreses anteriormente mencionados, así como CEE) como hábitat de interés prioritario. Actualmente las praderas litorales

72 Granada 2014 Pósters están en regresión como consecuencia, entre otros factores, del incremento P08r-18 de la sedimentación y turbidez del agua por vertidos urbanos e industriales, Microbacterium sp. 3J1 reduces the expression que modifi can las condiciones de iluminación de la columna de agua bajo of enzymes involved in ethylene pathway in roots la cual se asienta la pradera, generando una situación de estrés en la planta of pepper plants under drought conditions por la atenuación de la luz solar. En este trabajo se estudia la infl uencia de la defi ciencia de luz en plantas Cristina García-Fontana, Juan Ignacio Vílchez, Jesús González- de posidonia de praderas naturales situadas en la costa alicantina de Denia. López, Maximino Manzanera Se analiza la respuesta antioxidante y fotosintética de plantas localizadas Instituto del Agua, Universidad de Granada, Granada, ES en praderas a 3 y a 9 metros de profundidad, de dos zonas con distinta Plant water defi cit is one stress which has been extensively associated calidad de agua, una en las inmediaciones del emisario submarino de aguas with elevated release of ethylene. The impact of water stress on ethylene residuales de Denia y otra en un área alejada de su infl uencia. synthesis is of interest because ethylene is responsible for senescence and Se cuantifi ca el contenido en pigmentos fotosintéticos, carbohidratos abscission induced by water defi cits. Some microorganisms present in solubles, sacarosa, almidón y la actividad del enzima sacarosa sintetasa the rhyzosphere protect plants from drought by interaction with the plant (SS) para analizar la respuesta fotosintética. Se determina la actividad de host. The interaction of these microorganisms, that we term Drought Plant los enzimas catalasa, superóxido dismutasa y ascorbato peróxidasa, y se Protecting Bacteria (DPPB), with the plant is translated in a reduction of miden los niveles de malondialdehido (MDA), como indicadores del estrés the ethylene produced by the plant. We have isolated a Microbacterium oxidativo. sp. 3J1 strain that is desiccation tolerant soil bacterium and can interact Los resultados obtenidos apuntan a una disminución de los carbohidratos y with plants as DPPB. The inoculation of pepper plants with this strain pigmentos fotosintéticos en la planta con el incremento de la profundidad reduced the ethylene produced by the plant and this in turn induced a y turbidez, y un aumento de la actividad de los enzimas antioxidantes, marked delay in senescence. Here we used proteomic to compare plants en respuesta al deterioro del funcionamiento fotosintético debido a la inoculated with Microbacterium sp. 3J1 subjected to drying conditions limitación de la luz solar. with non-inoculated plants. Presence of the microorganism is translated in a reduction of S-adenosylhomocysteine hydrolase (SAHH). A dramatic reduction of SAHH could be translated in accumulation of SAH P08-17 (S-Adenosylhomocysteine) and SAM (S-adnosylmethionine), a methyl Genes encoding beta-mannanases in donor for choline production, which is used for glycinebetaine production, Brachypodium distachyon seeds have a role not a potent xeroprotectant produced in the chloroplast. SAHH also controls biological methylation reactions by mediating the intracellular SAH/ only in cell wall softening upon germination SAM ratio. DNA and protein methylation and demethylation play sensu stricto but also during post-germinative an important role in signal transduction. We do not discard additional reserve mobilization signal transduction effects on other pathways to increase desiccation tolerance on the plant by the reduction in SAHH caused in presence of Virginia Gonzáles-Calle, Raquel Iglesias Fernández, Victoria Llanos- Microbacterium sp. 3J1. Casado, Pilar Carbonero Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas (CBGP) - Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria – P08-19 (R08-4) Universidad Politécnica de Madrid, Pozuelo de Alarcón (Madrid), ES Differential analysis of root proteome obtained Brachypodium distachyon seeds are characterized by presenting low in microbe-plant interaction as a tool for levels of starch and high levels of (1,3; 1,4) β-glucans in its endosperm identification of proteins involved in resistance cells besides having thick mannan-rich cell walls. Upon germination to drought events in pepper plants and subsequent reserve mobilization β-mannanase encoding genes are selectively induced. Juan Ignacio Vílchez1, Cristina García Fontana2, Jesús González Endo-β-mannanases (EC 3.2.1.78) are hydrolytic enzymes that catalyze López1, Maximino Manzanera Ruiz1 the cleavage of β(1-4) bonds in the mannan polymer. In the genome of 1Universidad de Granada, Ogíjares, Granada, ES, 2Instituto del Brachypodium, the endo-β-mannanase (MAN) family is represented by Agua, Universidad de Granada, Granada, ES six members. We have systematically explored the expression of the six A collection of bacterial strains isolated in our laboratory, have been MAN genes in different organs (leaves, roots, spikes, developing seeds) shown to reduce dehydration stress1. These strains have also been shown and we have found that in dry seeds BdMAN3 is the most highly expressed to protect plants against abiotic stresses by colonizing the rhizosphere of gene, but its expression decreases upon germination in aleurone while various plant species, and promoting plant growth by reducing ethylene the other fi ve are induced at 36 hours of imbibition. In the germinating production via ACC-deaminase activity and by reducing the reduction embryo the most important genes are BdMAN2 and BdMAN6. In situ of S-adenosylhomocysteine hydrolase (SAHH) of the plant2. Apart from hybridization analysis shows that BdMAN2 and BdMAN6 transcripts ethynele accumulation, drought also causes damages by accumulation accumulate in the coleorhiza while BdMAN3 is mainly expressed in the of reactive oxygen species (ROS)3. Preliminary investigation on the radicle tip. molecular basis of bacterial mediated drought stress alleviation was Difference in sequence and expression of the MAN gene family in performed by examining the mRNA levels of three important drought stress Brachypodium distachyon and in other cereals, and their different putative responsive genes, DREB2A, CAT1, and DHN in inoculated plants by real- functions in comparison to those reported in Arabidopsis thaliana [1,2] that time quantitative polymerase chain reaction (qPCR)4. Here we describe are mainly involved in germination sensu stricto, are discussed. the effect of Microbacterium sp. 3J1 over the plant under water stress at the proteomic level using two-dimensional electrophoresis assisted by References PDQuest Basic 2D Gel Analysis software. Differentially expressed proteins [1] Iglesias-Fernández R, Rodríguez-Gacio MC, Carbonero P, Matilla AJ were identifi ed by mass spectrometry Mass (MALDI TOF-TOF) let us (2012) Softening-up mannan-rich cell walls. J. Exp. Botany 63: 3975-3988. identify a reduction in proteins such as disulfoxide isomerase, nucleoside [2] Iglesias-Fernández R, Rodríguez-Gacio MC, Barrero-Sicilia C, diphosphate kinase, Glutathione S Transferase and Annexin, involved in Carbonero P, Matilla AJ (2011) Three endo-β-mannanase genes expressed response to oxidative stress. Likewise, a decrease in proteins involved in in the micropylar endosperm and in the radicle infl uence germination of systemic resistance as chitinases and dehydrogenases was observed as well Arabidopsis thaliana seeds. Planta 233: 25-36 as in several proteins involved in the pathway of ethylene on plants such as

73 Pósters XXXVII Congreso SEBBM

S adenosyl homocysteine hydrolase, response factor binding ethylene, beta resultados identifi can por primera vez NO2–FA en plantas y sugieren que el subunit of succinyl CoA and Caffeoil CoA. consumo en la dieta y la generación fi siológica de estos lípidos electrófi los anti-infl amatorios contribuye a los benefi cios fi siológicos de las dietas ricas en ácidos grasos insaturados. P08-20 Identificación de genes de referencia para Bibliografía estudios de RT-qPCR en Pinus pinaster (Aiton) [1] Freeman BA et al., J Biol Chem. (2008), 283(23):15515-9. [2] Trostchansky A et al., Free Radic Biol Med. (2008), 44(11):1887-96. José M. Granados, Concepción Ávila, Francisco M. Cánovas, Rafael A. Cañas Financiado por fondos FEDER y por el MINECO (proyecto BIO2012- Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Facultad de 33904) y Junta de Andalucía (AGR-6374, grupo BIO286). Ciencias, Universidad de Málaga, Campus Universitario de Teatinos, Málaga, ES La técnica de RT-qPCR es uno de los procedimientos experimentales más P08r-22 utilizados para el análisis de la expresión génica. El desarrollo experimental Bio-hydrogen production in the green algae requiere la normalización de los resultados obtenidos mediante comparación Chlamydomonas: effect of H partial pressure, 2 con otros genes de referencia cuyos niveles de expresión sean uniformes en acetate and oxygen las condiciones estudiadas. En los primeros estudios realizados mediante esta técnica se usaron para la normalización genes implicados en el Jose Luis Jurado Oller, David González Ballester, Aurora Galván mantenimiento de funciones celulares básicas (“housekeeping genes”). Cejudo, Emilio Fernández Reyes Sin embargo, los niveles de expresión de dichos genes no son invariables Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad y se requiere una verifi cación experimental preliminar para determinar de Córdoba, Córdoba, ES qué genes resultan adecuados en cada organismo o tejido a estudiar. La Under anaerobic conditions, some unicellular algae and bacteria produce a falta de metodologías de trabajo estandarizadas ha provocado errores hydrogenase enzyme able to produce hydrogen (H2) in a reversible reaction. metodológicos y experimentales en la identifi cación de genes de referencia H production in algae is a clean source of H that can be potentially y en la aplicación de esta técnica que cuestionan los resultados obtenidos. 2 2 cheaper than any other way to produce H2 and would also contribute to the Se han presentado diferentes propuestas para establecer una metodología capturing of atmospheric CO . experimental adecuada, siendo en estos momentos la más aceptada MIQE 2 Unfortunately, bio-H2 production is a low effi ciency process and two of the (“Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR main limitations are: 1) the high O sensitivity (hydrogenases are inhibited Experiments”). 2 by O2 at transcriptional and post-translational level). 2) H2 production is a El pino marítimo (Pinus pinaster Aiton) es una planta modelo de interés transient process that do not last more than a few days. forestal en la que se están realizando avances en biología molecular. En We have investigated different approaches to optimize the H2 production el presente trabajo, hemos realizado la búsqueda de genes de referencia in the unicellular green alga Chlamydomonas reinhardtii. This alga is able adecuados para la normalización de los datos de RT-qPCR tanto en acícula to perform three different pathways to produce H2. Two of them are linked adulta de P. pinaster como en los primeros estadios de desarrollo plantular to photosynthesis (PSII-dependent and PSII-independent pathways) and siguiendo las recomendaciones del MIQE. Nuestro objetivo es la obtención the main difference between these two pathways is the original source de resultados fi ables y reproducibles en estudios de expresión génica en P. of electrons. In the PSII-dependent pathway, the electrons come from pinaster. the photolysis of water at PSII level. Whereas in the PSII-independent pathway, the electrons come from starch degradation. A third pathway

for H2 production is also possible through fermentative pathways that use P08r-21 starch as electron donor. Detección y formación endógena de ácidos grasos As starting point of our project we screened 22,000 insertional mutants nitrados en el aceite de oliva for two different phenotypes: starch and photosynthetic mutants. Both phenotypes can have theoretically an impact in the H production process. Raquel Valderrama Rodríguez, Beatriz Sánchez-Calvo, Capilla Mata- 2 One photosynthetic defi cient strain showed an improved H2 production Pérez, María N. Padilla, Juan C. Begara-Morales, Juan B. Barroso (PSII-linked) under low light conditions. Grupo de Bioquímica y Señalización Celular en Óxido Nítrico, The effect of the H2 accumulation in the cultures headspace was also Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de investigated. We found that H partial pressure is an important factor that Jaén, Jaén, ES 2 can inhibit the production. By aerating the cultures we have improved H2 El óxido nítrico (NO) y especies de nitrógeno reactivo derivadas (RNS) production by 10 times. reaccionan con ácidos grasos insaturados originando ácidos grasos Finally, we studied the effect of acetate in the culture media. Cultures nitrados (NO2–FA). Estas moléculas se consideran novedosos mediadores that were supplemented with acetate can improve H2 production by 2 de señalización celular que abarcan un amplio conjunto de respuestas times. Moreover, continuous supplementation with acetate can result in a celulares en sistemas animales, entre los que destacan una probada función sustained H2 production. anti-infl amatoria y benefi cios a nivel de salud cardiovascular [1]. El aceite Altogether, our results show an optimization of the H2 production process de oliva virgen extra (EVOO) es la fuente principal de los lípidos en la in Chlamydomonas by more than 60 times. dieta mediterránea, y promueve respuestas anti-infl amatorias y benefi cios clínicos a través de mecanismos pobremente defi nidos. El presente estudio evaluó mediante LC-MS/MS, el contenido endógeno de NO2–FA, tanto en P08-23 aceituna como en EVOO procedentes de tres variedades de la provincia Autentificación de aceite de oliva mediante qPCR de Jaén. Se observó la presencia de ácido nitro-linoleico conjugado (NO - 2 Natividad Ortega Santamaría CLA) en los tres aceites ensayados. El carácter electrofílico de estos Sonia Ramos-Gómez, , María D. Busto, NO –FA fue confi rmado por la detección HPLC-MS/MS [2] de niveles David Palacios, Manuel Pérez-Mateos 2 Área de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias, signifi cativos de aductos de cisteína-proteína de ácido nitro-oleico (NO2- OA-cisteína) en el fruto. Además, la nitración de EVOO por nitritos en Universidad de Burgos, Burgos, ES condiciones digestivas de acidez gástrica, reveló que el consumo humano El elevado valor nutricional del aceite de oliva puede verse reducido de los EVOO origina un incremento de NO2-CLA y NO2-OA. Estos mediante adulteración con otros aceites vegetales. Este tipo de práctica 74 Granada 2014 Pósters supone, además, importantes pérdidas económicas por lo que es necesario Agradecimientos: Este trabajo ha sido fi nanciado por el Ministerio de certifi car la autenticidad del aceite de oliva. La elevada sensibilidad y Ciencia e Innovación (BIO2009-7297) y por la Junta de Andalucía (P07- fi abilidad de las técnicas basadas en ADN les han convertido en una CVI-02795). herramienta básica en el control de calidad y seguridad alimentaria. En este contexto, el objetivo de este trabajo fue determinar la aplicabilidad de métodos basados en ADN y PCR cuantitativa (qPCR) para la autentifi cación P08-25 de aceite de oliva. Respuesta antioxidante al estrés hídrico en Se analizaron mediante qPCR nueve sistemas de amplifi cación específi cos plantas de sorgo para olivo: tres previamente publicados (PIP5, G219/172H y C4-80), y seis diseñados en este trabajo (ycf1, clpP, Pre, PetN, 1post y 2post). La Magaly Pérez Lara, Víctor Olalde Portugal, Silvia Edith Valdés aplicabilidad de dichos sistemas se determinó mediante cuantifi cación de Rodríguez ADN de olivo, amplifi cación específi ca de olivo frente a otras especies CINVESTAV Irapuato, Irapuato, MX oleaginosas, cuantifi cación de olivo en mezclas de ADN y amplifi cación de El sorgo es una planta gramínea que es capaz de tolerar el estrés por ADN de aceites de oliva. defi ciencia de agua, por lo que diversos estudios se han enfocado en la De los resultados obtenidos destacar que el sistema 2post no permitió respuesta bioquímica el estrés hídrico. Nuestro grupo de trabajo realizó cuantifi car ADN de olivo, los sistemas ycf1, clpP y PIP5 mostraron rangos de un estudio de proteómica en hojas de sorgo, en respuesta al estrés hídrico, cuantifi cación limitados, y C4-80 no presentó especifi cidad. Por el contrario, haciendo uso de electroforesis en geles de 2D y la Espetrometría de masas. el intervalo de cuantifi cación de G219/172H y PetN osciló entre 2,5 μg y Los resultados obtenidos indicaron que las proteínas que aumentan, en su 25 pg y entre 2,5 μg y 2,5 pg para Pre y 1post, mostrando especifi cidad mayoría están relacionadas con la respuesta antioxidante. Con el fi n de validar para olivo frente a colza, girasol, soja y maíz. La especifi cidad relativa de los cambios observados en el estudio de proteómica, se planteó cuantifi car G219/172H y 1post fue del 0,2% de ADN de olivo en ADN de sésamo, y del la actividad antioxidante en hojas de plantas de sorgo (Sorghum vulgare 0,1% para Pre y PetN. Además, estos sistemas permitieron la detección de var. BJ 83 Caloro) de 58 días después de la siembra, sometidas a estrés por ADN extraído de aceites de oliva. No obstante, es necesario comprobar su defi ciencia de agua, el cual consistió en someter a las plantas a un estrés especifi cidad en otros aceites vegetales y en alimentos elaborados. gradual durante 7 días, llegando a suprimir el riego durante un día, mientras que el control estuvo bajo riego adecuado. En extractos de hoja de plantas control y sometidas a estrés hídrico, se evaluó la capacidad antioxidante y P08-24 la relación glutatión oxidado/reducido, además se cuantifi có la actividad Efecto sobre la fotosíntesis y la acumulación de de enzimas antioxidantes como superóxido dismutasa, catalasa y ascorbato azúcares en frutos de fresa (Fragaria x ananassa) peroxidasa. Los resultados obtenidos indican que hubo un aumento de estas de la reducción de los niveles de las isoformas actividades en las plantas que fueron sometidas a estrés hídrico, lo cual sugiere que esta actividad podría estar contribuyendo a la tolerancia al estrés. cFBP1 y cyFBP de FBPasa En este estudio se destaca la importancia de estas enzimas en la tolerancia al estrés hídrico estableciendo parámetros para cuantifi car el nivel de estrés en Antonio Jesús Serrato Recio1, José Antonio Rojas González1, Juan plantas de sorgo, que podrían ser utilizados como referencia en otras especies Antonio García Gago2, Fernando Pliego Alfaro2, José Ángel Mercado de plantas con importancia económica y social. Carmona2, Mariam Sahrawy Barragán1 1Departamento de Bioquímica, Biología Celular y Molecular de Plantas, Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Granada, ES, 2 P08-26 (R08-6) Departamento de Biología Vegetal, IHSM-UMA-CSIC, Universidad La interrupción de la función de las fructosa- de Málaga, Málaga, ES 1,6-bisfosfatasas cloroplastídica y citosólica La fructosa-1,6-bifosfatasa (FBPasa) juega un papel clave en la fi jación induce cambios metabólicos que afecta todos los del CO2 atmosférico durante la fotosíntesis y en procesos gluconeogénicos, conociéndose tres isoformas, localizadas en el cloroplasto (cFBP1 y procesos en plantas de Arabidopsis thaliana cFBP2) y el citosol (cyFBP). cFBP1 forma parte de las enzimas del ciclo José Antonio Rojas González1 1 de Calvin y contiene un lazo regulador que la hace dependiente del estado , Antonio Jesús Serrato Recio , Ina redox del cloroplasto, siendo regulada por tiorredoxina f. Sin embargo, Thormählen2, Peter Geigenberger2, Mariam Sahrawy Barragán1 al contrario que con cFBP1, no se ha descrito ninguna regulación redox 1Consejo Superior de Investigaciones Científi cas, Estación para cyFBP, la cual forma parte de la ruta de biosíntesis de sacarosa. A Experimental del Zaidín, Granada, ES, 2Ludwig-Maximilians- la isoforma cFBP2 todavía no se le ha asignado una función fi siológica Universität München, Martinsried, DE defi nida, pudiendo participar en procesos relacionados con las otras dos Se han caracterizado tres mutantes de Arabidopsis thaliana con pérdida isoformas, las cuales muestran un mayor nivel de expresión que cFBP2. de función en las enzimas fructosa-1,6-bisfosfatasa (FBPasas) citosólica La fresa (Fragaria x ananassa) es un cultivo estratégico para la agricultura (cyfbp) y cloroplastídica 1 (cfbp1) y de ambas (cyfbp cfbp1). Debido al española, siendo una de sus cualidades organolépticas más valoradas, papel clave que ejerce la enzima plastidial en el Ciclo de Calvin, las plantas por su contenido en sacarosa, el sabor dulce del fruto. Aunque en los mutante cfbp1 presentan un tamaño más reducido en relación con el silvestre estadíos iniciales tiene cierta capacidad fotosintética, la mayor parte de los afectando especialmente la tasa fotosintética, estructura de la hoja, raíz y azúcares acumulados en los frutos son transportados por el fl oema desde el desarrollo de la planta. Cuando se interrumpe la función de la isoforma las hojas. Para determinar el papel de las FBPasas en el contenido fi nal citosólica en la síntesis de la sacarosa provoca un acumulo de almidón en de sacarosa en fruto se realizaron construcciones antisentido para cFBP1 los cloroplastos y contenido de sacarosa similar al silvestre. Interesante fue y sobre-expresoras para cyFBP con las que se transformaron plantas de comprobar que el doble mutante cyfbp cfbp1 puede heredar las características fresa, obteniéndose una serie de líneas que contenían el marcador de de uno u otro parental, sin embargo el fenotipo es similar al del mutante cfbp1. selección. Estas líneas fueron analizadas mediante la técnica de western- Los cambios fi siológicos inducidos por la pérdida de función de las FBPasas blot para determinar el nivel de expresión de las dos isoformas estudiadas. en cada uno de los mutantes podrían indicar modifi caciones en varios Asimismo, se ha relacionado la capacidad fotosintética de estas líneas procesos metabólicos importantes. Para estudiar el papel de ambas enzimas con el contenido en FBPasas de las hojas. Para la caracterización de los en la síntesis y distribución de azúcares en plantas se ha suministrado, a frutos de fresa se han analizado parámetros como el peso, la dureza o los cada mutante, un aporte exógeno de azúcares (sacarosa, glucosa, fructosa, grados Brix (directamente relacionados con el contenido en azúcares, manitol, glucosa 1P, glucosa 6P, fructosa 6P y fructosa-1,6-bisfosfato) principalmente la sacarosa). observando en algunos casos la recuperación del fenotipo silvestre. Se han

75 Pósters XXXVII Congreso SEBBM determinado los contenidos en hexosas, sustrato, triosas fosfato y analizado Campus de Teatinos, Málaga, ES, 3Instituto de Hortofruticultura los metabolitos en los tres mutantes mediante GS MS. Los resultados Subtropical y Mediterránea La Mayora, Universidad de Málaga, muestran que como respuesta a la falta de una o ambas FBPasas se produce Consejo Superior de Investigaciones Científi cas - Área de Genética, un acumulo de sustrato y de triosas P. La pérdida de la enzima cloroplastídica Facultad de Ciencias, Campus de Teatinos, Málaga, ES cFBPasa1 provoca un signifi cativo cambio en los niveles de los metabolitos One of the most important soilborne diseases affecting avocado (Persea pertenecientes a distintas categorías, azúcares, azúcares alcohol, aminos americana Mill.) crops is white root rot, caused by the fungus Rosellinia ácidos, ácidos orgánicos, antioxidantes, etc. Estos resultados sugieren que necatrix. Moreover, this fungus is considered to be an emergent threat to en el mutante cyfbp la planta reorganiza su metabolismo carbonado, mientras crop plants worldwide. Imaging techniques applied to remote sensing are que en los mutantes cfbp1 y doble mutante, existe una respuesta general de la emerging as powerful tools to be used in crop protection. In this study planta para evitar la situación extrema a la cual está sometida por la falta de we investigated the potential applications of imaging techniques, including aporte carbonado. BIO 2012-33292. Junta de Andalucía BIO 154. chlorophyll fl uorescence, blue-green fl uorescence and thermography, in early detection of white root rot on leaves of infected avocado plants. The results show that changes in certain chlorophyll fl uorescence parameters P08-27 Arabidopsis mutants in the bHLH transcription provide early indications of fungal infection prior to the development of visual symptoms in the aerial part of the plant. factors SPEECHLESS and MUTE reveal transcriptional and functional features of stomataless plants in photosynthesis and secondary metabolites P09. Biotecnología molecular Marisa Pérez Bueno1, Magdalena Triviño2, Alberto de Marcos2, Carmen Fenoll2, Montaña Mena2, Matilde Barón1 P09-1 1Departamento de Bioquímica, Biología Celular y Molecular de Plantas Isolation and Identification of a new archaea - Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Granada, ES, 2Departamento de Ciencias Ambientales, Facultad de Ciencias Ambientales y strain in hypersaline waters Bioquímica, Universidad de Castilla la Mancha, Toledo, ES Marta de la Vega Naranjo1, Agustín García Barneto2, José Ariza Stomata are microscopic valves formed by guard cell pairs in the epidermis of Carmona2, Rosa León Bañares1 terrestrial plants. As they regulate gas exchange with the atmosphere, stomata 1Laboratorio de Bioquímica, Dpto. Química y Ciencia de Materiales, are essential for CO2 uptake and H2O loss, thus controlling photosynthesis, Campus del Carmen, Facultad de Ciencias Experimentales, transpiration and leaf temperature. Plants dynamically regulate stomatal Universidad de Huelva, Campus de Excelencia Internacional del opening in response to environmental conditions; work in Arabidopsis during Mar-CEIMAR, Huelva, ES, 2Dpto. Ingeniería Química, Física- the last years has also established that stomata abundance is also regulated Química y Química Orgánica, Campus del Carmen, Facultad de during leaf development through genetic networks whose molecular Ciencias Experiementales, Universidad de Huelva, Huelva, ES components have been partially unveiled. For instance, loss of function of the An extremely halophilic archea was isolated from marine salt ponds at the bHLH transcription factors SPCH and MUTE produces stomataless plants with very limited growth even in sucrose-supplemented medium. Southwest of Spain. Analysis of its 16S rRNA encoding gene showed that the Using ATH1 Affymetrix microarrays we made hybridizations with RNA isolated microorganism was phylogenetically related to species of the genus from wild-type Arabidopsis, spch-3 and mute-3 mutants and identifi ed Halorubrum within the Halobacteriaceae family. Halorubrum cells were ca.1.800 differentially expressed transcripts (p-value with false discovery harvested by centrifugation and carotenoids were extracted with methanol. rate correction <0.05; ± 2 fold change) in three pairwise comparisons. Carotenoids identifi cation was performed by HPLC and confi rmed by UPLC- Their functional classifi cation identifi ed major expression changes in MS. Results revealed that this Halorubrum strain produces as predominant key genes. The mutant transcriptomes predict a limited photosynthesis, carotenoid, bacterioruberin. This carotenoid is a dipolar C50 carotenoid with but also important changes in secondary metabolism, cuticle and cell 4 hydroxyl substitutes. It shows the typical 3-fi nger UV-Vis spectra with wall composition that might modify the permeability to gases of the absorption around 467, 497 and 531 nm and a molecular weight of 713. Its mutant epidermes. The impact of the observed transcriptional changes in biosynthesis is described as the addition of an isoprenoid-C5 unit to each of photosynthesis-related genes was examined in-situ by quenching analysis of the extremes of lycopene-C40, followed by the introduction of the 4 hydroxil chlorophyll fl uorescence. Kinetic analyses of the red fl uorescence emitted groups. Bacterioruberin contains 13 pairs of conjugated double bonds, so it can by chlorophyll estimate photosynthetic effi ciency as well as mechanisms be an effective hydroxyl free-radical scavenger; it can protect the halobacteria of energy dissipation indicative of stress. Blue and green fl uorescence was from fatal injury of oxidative damage under strong light, and resist oxidative used to estimate the accumulation of pigments and secondary metabolites DNA damage resulting from UV irradiation. This carotenoid could be very suggested by the transcriptomic analysis. useful for practical applications and the extremely halophilic archeon could be considered as a prokaryotic candidate for the production of carotenoids.

P08-28 Fluorescence and thermal imaging techniques P09-2 (R09-7) allow detection of white root rot on leaves of Herramientas para el control de la expresión avocado plants infected with Rosellinia necatrix durante procesos de infección en patógenos y prior to the development of symptoms simbiontes Carlos Medina Morillas1 1 Espen Granum1, María Luisa Pérez Bueno1, Claudia Calderón2, Cayo , Beatriz Mesa Pereira , Eva María Camacho 1 1 2 Ramos3, Antonio de Vicente2, Francisco M. Cazorla2, Matilde Barón1 Fernandez , Amando Flores Díaz , Irene Jiménez Guerrero , 2 1 1Estación Experimental del Zaidín, Consejo Superior de Francisco Javier López Baena , Eduardo Santero Santurino 1 2 Investigaciones Cientíﬁ cas, Granada, ES, 2Instituto de Universidad Pablo de Olavide, Sevilla, ES, Universidad de Sevilla, Hortofruticultura Subtropical y Mediterránea La Mayora, Sevilla, ES Universidad de Málaga, Consejo Superior de Investigaciones El estudio de las interacciones entre microorganismos y sus hospedadores Cientíﬁ cas - Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias, presenta ciertas limitaciones que dificultan el seguimiento del proceso

76 Granada 2014 Pósters de infección en el interior de los organismos superiores. La naturaleza P09-4 (R09-3) del hospedador puede impedir la monitorización del microorganismo Un insecticida natural interfiere con durante la infección, por lo que se hace necesario el uso de sistemas de comportamientos bacterianos clave en procesos microscopía adaptados a condiciones “in vivo”. Así mismo, el limitado infectivos número de herramientas que permiten el control de la expresión de genes involucrados en las interacciones bacteria-hospedador, restringe Isabel Mª López-Lara1, Joaquina Nogales2, Ángel Pech-Canul1, Lydia la posibilidad de activar o desactivar dichos genes en el momento o Mª Bernabéu-Roda2, Nieves Calatrava-Morales2, José Olivares2, 3 1 Mª José Soto Misffut2 lugar deseados en el transcurso de la infección. En nuestro laboratorio Laura Álvarez , Otto Geiger , 1 hemos contribuido al desarrollo de un sistema de expresión de Centro de Ciencias Genómicas, Universidad Nacional Autónoma de 2 proteínas que responde a concentraciones permisivas de diferentes México-UNAM, Cuernavaca, MX, Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Granada, ES, 3Centro de Investigaciones Químicas, Universidad inductores como el salicilato, ácido acetil salicílico o 3-metil benzoato. Autónoma del Estado de Morelos-UAEM, Cuernavaca, MX Dicho sistema acopla dos reguladores transcripcionales que funcionan en cascada, el primero de los cuales controla la expresión del segundo En Sinorhizobium meliloti, la pérdida de función del gen fadD que codifi ca que finalmente regula la expresión de genes heterólogos clonados una acil-CoA ligasa específi ca de ácidos grasos de cadena larga, promueve bajo el control de un promotor inducible. Estos elementos proceden movilidad swarming e interfi ere con la capacidad de establecer simbiosis con alfalfa [1]. El análisis de extractos lipídicos de sobrenadantes de cultivo de distintas especies bacterianas, y han demostrado su eficiencia en del mutante fadD y su cepa parental desveló la presencia en el mutante de la producción de proteínas heterólogas en diferentes microorganismos dos compuestos que fueron identifi cados como 2-tridecanona (2-TDC) y tanto patógenos de animales (Salmonella) como simbiontes de plantas dodecanal, ausentes en los sobrenadantes de la cepa silvestre. La aplicación (Sinorhizobium). Una de las características interesantes del sistema es de 2-TDC comercial en concentraciones micromolar induce movilidad en que los inductores son capaces de difundir libremente entre los distintos superfi cie de cepas de S. meliloti, favoreciendo tanto swarming como un tejidos del hospedador sin presentar toxicidad a las concentraciones desplazamiento independiente de fl agelos. La 2-TDC se ha descrito como ensayadas. Esta propiedad junto a una correcta monitorización del un insecticida natural producido por variedades silvestres de tomate [2] proceso infectivo, permite disparar la expresión de genes de interés pero hasta ahora no se habían descrito sus efectos en bacterias. La 2-TDC en el momento deseado lo cual puede ser muy útil para comprender afecta comportamientos en superfi cie de diversas bacterias: promueve cuando y donde actúan los genes implicados en las interacciones swarming en los patovares tomato y syringae de Pseudomonas syringae, tanto de bacterias patógenas como simbiontes con sus hospedadores inhibe formación de biofi lm en S. meliloti y P. syringae y es capaz de respectivos. anular el swarming de Salmonella. Interesantemente, la aplicación de esta metilcetona interfi ere con el establecimiento de 2 interacciones planta- bacteria: la formación de nódulos en la simbiosis S. meliloti–alfalfa, y el desarrollo de peca bacteriana en tomate, resultados con potencial P09-3 (R09-1) Herramientas biotecnológicas derivadas de virus biotecnológico. de plantas Bibliografía José Antonio Darós Arnau [1] Soto et al. 2002. Mol. Microbiol. 43:371-382. [2] Williams et al. 1980. Science 207:888-889. Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas (CSIC- Universidad Politécnica de Valencia), Valencia, ES Los virus que infectan plantas superiores son muy sencillos P09r-5 (R09-4) genéticamente. Sin embargo, sus pequeños genomas contienen Physical and functional standardization of información sufi ciente para completar complejos ciclos infecciosos glycolytic modules for knocking-in novel que, además de la replicación, movimiento y transmisión del virus, metabolic capacities in Gram-negative bacteria incluyen la desactivación de las defensas de la planta. Estos pequeños genomas codifi can un número limitado de proteínas que suelen ser Alberto Sánchez-Pascuala, Víctor de Lorenzo, Pablo I. Nikel multifuncionales y tener la capacidad de interaccionar, reclutar y Systems Biology Program, Centro Nacional de Biotecnología, CSIC, subvertir la actividad de multitud de factores del huésped para que Campus de Cantoblanco, Madrid, ES desarrollen diversos cometidos durante la infección. Los viroides One key tenet of Synthetic Biology is the physical and functional son un caso extremo dentro de los agentes infecciosos de las plantas, modularization of the components of live systems for enabling their puesto que son RNA capaces de replicarse y moverse por el huésped a reuse in a different biological context. Because of their extant metabolic pesar de no codifi car ninguna proteína propia. La sencillez estructural network, bacteria which are appealing for biotechnological processes (e.g., y riqueza funcional de los virus y viroides de las plantas facilita el Pseudomonas putida KT2440) often show a non-optimal energetic yield desarrollo de herramientas biotecnológicas basadas en elementos de that limit their effi ciency under operation conditions. In order to overcome su biología. En nuestras investigaciones recientes hemos desarrollado this state of affairs, we took the Escherichia coli’s Embden-Meyerhof- un vector viral desarmado, basado en el potyvirus del grabado del Parnas pathway (one of the most effi cient glycolytic pathways in terms of tabaco, de interés en ingeniería metabólica de plantas. El vector energy balance) as the starting point for improving sugar utilization in P. putida and other Gram-negative bacteria. To this end we engineered various permite coexpresar simultáneamente varias proteínas heterólogas en genetic/biochemical modules that are composable and interchangeable cantidades equimolares y en la misma localización subcelular. Así, la by means of the format brought about by the Standard European Vector coexpresión de dos factores de transcripción de la ruta de biosíntesis Architecture (SEVA; Silva-Rocha et al., 2013, Nucleic Acids Res. 41: de las antocianinas conlleva a la acumulación de niveles notables de D666-D675). These designs considered [i] the distribution of a minimal estos compuestos antioxidantes en los tejidos de la planta invadidos por set of relevant glycolytic genes from E. coli into two different catalytic el vector. También hemos desarrollado un sistema para la producción blocks, [ii] the elimination of restriction enzyme targets in the genes, while de RNA recombinantes en Escherichia coli basado en la coexpresión maintaining the amino acid sequence of the polypeptides encoded, and de un RNA derivado del viroide latente de la berenjena junto con una [iii] the creation of independent enzymatic modules with corresponding proteína con la que éste interacciona durante la infección, la isoforma DNA sequences fl anked by appropriate restriction sites for easing their cloroplástica de la tRNA ligasa de berenjena. subsequent formatting with the SEVA rules. These genetic/biochemical

77 Pósters XXXVII Congreso SEBBM devices allow for the re-factoring of central pathways for C consumption Herein we present our last advances in the development of nanotechnology- in a variety of Gram-negative microorganisms, thereby increasing their based strategy for delivery of therapeutic proteins into cells. For this energy balance and thus developing new-to-Nature metabolic capabilities. purpose, several chemical strategies, based on solid phase chemistry, and basic molecular biology techniques has been optimized for the conjugation of proteins to nanoparticles. P09r-6 (R09-5) Aptámeros de RNA para el estudio de la función del dominio CRE del genoma del virus de la P09r-8 A SMART chemistry for liver injury diagnosis hepatitis C Antonio Delgado González1, Mavys Tabraue Chávez2, Rosario María Alba Fernández Sanlés, Beatriz Berzal Herranz, Pablo Ríos Marco, Sánchez Martín2, Salvatore Pernagallo2, Juan José Díaz-Mochón2 Alfredo Berzal Herranz, Cristina Romero López 1DestiNA Genomics Ltd y GENYO - Centre for Genomics and Instituto de Parasitología y Biomedicina “López - Neyra”, CSIC, Oncological Research: Pfi zer / University of Granada / Andalusian Granada, ES Regional Government - PTS- Granada; and Dep. Medicinal and La consecución del ciclo infectivo del virus de la hepatitis C (HCV) Organic Chemistry, School of Pharmacy, University of Granada, depende de varios dominios genómicos altamente conservados en Granada, ES, 2DestiNA Genomics Ltd, Granada, ES estructura y secuencia, entre los que se encuentra la región CRE (cis- Molecular diagnostics is the process of identifying genetic variants acting replicating element). Este elemento, esencial para la replicación in biological samples. Testing for human diseases and illnesses, drug viral e implicado en la regulación de la traducción, se encuentra en el performance and toxicities, pathogenic bacteria and viruses has created an extremo 3’ de la región codifi cante del genoma. Su estructura presenta important, multi-billion and rapidly expanding global market. Molecular tres dominios con estructura tallo lazo, denominados 5BSL3.1, 5BSL3.2 y diagnostics is increasingly being used in the cost challenged medical health 5BSL3.3, de los cuales los dos primeros son esenciales para la replicación systems, animal health, food safety and pharmaceutical industries. The y además el 5BSL3.2 es importante en la regulación de la traducción. limitation to its use in clinical diagnosis has been cost, testing errors, and Este dominio ejerce su función reguladora mediante la interacción con la clinician conservatism. proteína RNA polimerasa NS5B y con regiones distantes en el genoma DestiNA Tecnology is unique and distinguishable from ALL existing como la región 3’UTR o el elemento IRES (internal ribosome entry enzymatic methods of nucleic acid analysis. It can be used to identify site) localizado en la región 5’UTR. Dada su importancia funcional, se any known target nucleic acid sequences, including insertion and deletion presenta como una potencial diana terapéutica. Los mejores candidatos mutations, as well as non-mutated nucleic acid sequences. DestiNA reagents para interferir con un elemento funcional estructural de RNA como el can successfully be used on the major diagnostic platforms - fl uorescence CRE son los aptámeros de RNA. Los aptámeros son oligonucleótidos and colourimetric. This gives the technology a unique, powerful position que se unen específi camente a su diana dependiendo de su secuencia y versus current detection methods. estructura, de manera similar a los anticuerpos. Se obtienen mediante un In this study, DestiNA reagents are combined with two of the major proceso de selección in vitro conocido como SELEX. Hemos aislado una diagnostic platforms - fl uorescence and colourimetric - for developing batería de aptámeros tras nueve rondas de selección y el análisis de sus novel tools for early detection and quantifi cation of miRNA-122 involved secuencias ha permitido clasifi carlos en cinco grupos defi nidos por un in human liver injury. motivo común. Observamos que los motivos de secuencia cuya diana es The integration of these platforms with DestiNA reagents promises to 5BSL3.2 están presentes en los aptámeros que inhiben en mayor medida transform and expand routine clinical diagnostic for liver injury with los niveles de RNA total (>80%) de un sistema replicativo subgenómino benefi ts in terms of result consistency, time, cost, and ease of use. de HCV. Además, dichas secuencias consenso se encuentran en los lazos apicales de los aptámeros. Asimismo, los ensayos de unión de NS5B al genoma viral en presencia de los aptámeros muestran que aquellos que se unen al motivo 5BSL3.2 compiten por la unión de la polimerasa NS5B P09r-9 al extremo 3’ del genoma. Los resultados obtenidos apoyan el potencial Tumor-associated circulating microRNAs del elemento CRE como diana terapéutica, así como el potencial de los detection by Chem-NAT aptámeros de RNA como agentes antivirales. M.A. Luque-González1, M. Tabraue-Chávez2, R.M. Sánchez-Martín1, S. Pernagallo2, J.J. Díaz-Mochón1 1GENYO - Centre for Genomics and Oncological Research: P09-7 Nanoparticles as protein carriers Pfi zer / University of Granada / Andalusian Regional Government - PTS- Granada; and Dep. Medicinal and Organic Chemistry, Juan Diego Unciti Broceta, Victoria Cano Cortés, María Paz Ruiz School of Pharmacy, University of Granada, Granada, ES, 2DestiNA Blas, Juan Jose Díaz-Mochón, Rosario M. Sanchez-Martin Genomica S.L, Granada, ES Dpto. Química Orgánica y Farmacéutica, Universidad de Granada - Among the advanced emerging nucleic acid detection (NAT) technologies, Centro de Genómica e Investigación Oncológica-GENyO, Granada, ES DestiNA Genomics has developed a unique chemistry approach for nucleic The development of an effi cient carrier system for delivery of functional acid testing (Chem-NAT). DestiNA core technology takes advantage of proteins into cells, although a challenging area of research, is a key dynamic chemistry for nucleic acid sequence specifi c recognition, using technology for the progress of research in the biological sciences and aldehyde-modifi ed natural nucleobases (so called SMART nucleobases), medicine. Recent examples include conjugation of proteins to cell and probes based on peptide nucleic acid (PNA) containing an “abasic” penetrating peptides (CPP) such as those derived from HIV-1 TAT, position (DestiNA probes), which can be made complementary to any “profection” by cationic lipids and the use of several “nanodevices” such as target nucleic acid sequence [Bowler et al. in Angew. Chem. Int. Ed. 2010]. nanotubes or silica nanoparticles. Previously we have reported that amino- In this study the unique DestiNA reagents are combined with Matrix- functionalized, cross-linked polystyrene microspheres of highly defi ned Assisted Laser Desorption Ionization – Time-of-Flight Mass Spectrometry sizes (200 nm– 2 μm) are effi cient cellular delivery devices that can enter a (MALDI-TOF MS) to rapidly identify tumor-associated circulating broad range of cell types including adherent, suspension and primary cells. microRNAs as biomarkers of cancer. This biological model represents These microspheres are inherently attractive as a carrier/delivery system the fi rst step in developing novel suite assays for medical diagnostic fi eld. due to their lack of toxicity and highly controllable cellular loading. Integration of DestiNA technology with MALDI-TOF MS brings a truly

78 Granada 2014 Pósters innovative step forward for rapidly detects circulating microRNAs with Uno de los usos más extendidos y novedosos de las beta-galactosidasas benefi ts in terms of result consistency, time, cost, and ease of use. es su utilización en la síntesis de galactooligosacaridos (GOS), derivados With its potential PCR free approach, this tool promises to transform and lácteos con propiedades prebióticas que son usados en la elaboración expand routine clinical diagnostic testing and screening for tumor-associated de ciertos alimentos funcionales. La enzima produce GOS mediante circulating microRNAs in the emerging companion diagnostics market. transgalactosilación, la cual se ve favorecida por altas concentraciones de lactosa. Teniendo en cuenta que la lactosa es bastante insoluble en agua, es necesario llevar a cabo la reacción a temperaturas elevadas, por lo que el P09-10 uso de la Kl-β-gal se ve limitado. Optimization of the E. coli biosynthesis of En este trabajo se compara la capacidad de síntesis de GOS entre la lycopene through mathematical modelling variante silvestre de la Kl-β-gal y una variante mutante de la misma obtenida mediante mutagénesis dirigida, la cual posee una estabilidad Nakens Núñez Martín1, Julia Gallego2, Manuel Cánovas2, Néstor térmica mayor. Torres1 1Departamento de Bioquímica, Microbiología, Biología Celular y Genética. Facultad Biología, Universidad de La Laguna, San P09-12 Cristobal de La Laguna, ES, 2Departamento de Bioquímica y Novel conjugation approaches for delivery Biología Molecular e Inmunología, Facultad de Química, Campus of nucleic acids mediated by nanoparticles de Excelencia Internacional Regional “Campus Mare Nostrum”, Universidad de Murcia,, Murcia, ES Victoria Cano-Cortés, Juan Diego Unciti-Broceta, María Paz Ruiz- Isoprenoids is an ubiquitous family of lipid compounds of industrial and Blas, Juan José Díaz-Mochón commercial interest due to its key roles in cell signaling, pigmentation and GENYO - Centre for Genomics and Oncological Research: Pfi zer / defense among others. Currently the processes used to produce isoprenoids University of Granada / Andalusian Regional Government - PTS- are based in their extraction from natural sources (mainly plants), but these Granada; and Dep. Medicinal and Organic Chemistry, School of processes show poor effi ciency and sustainability. Thus their biosynthesis Pharmacy, University of Granada, Granada, ES by microorganisms has since, long time ago be proposed as a more effi cient, The effi cient introduction and delivery of bioactive materials into cells cheaper and sustainable alternative. (such as a drug, protein, nucleic acid, etc) to elicit, induce or control However the bioengineering of this process have been halted by several specifi c biological functions is of fundamental importance throughout factors. The fi rst one is the complexity of the metabolic pathways involved many areas of biology and medicine. The ability to add a specifi c in the biosynthesis of this family of secondary metabolites. All isoprenoids plasmidic DNA into cells to modify cellular function or to deliver are built from a basic block, the Dimethylallyl pyrophosphate (DMAPP) RNA sequences into cells to silence a cellular function has signifi cant or its isomer, the Isopentenyl pyrophosphate (IPP). This fi ve carbon applications in Biomedicine. However, their celular access can often structure is synthetized via two independent pathways, the mevalonate be severely limited by properties such as solubility, charge or size. and non-mevalonate pathway. The latter one is of major interest from Several techniques for the delivery of these therapeutic molecules are a biotechnological perspective since, in addition to its occurrence in in development such as cationic lipids, polymers and nanoparticles. chloroplasts and protozoa, it is also present in prokaryotic microorganisms. However, due to certain issues (such as poor uptake effi ciencies, major The goal of this project is to address the metabolic engineering of an E. coli perturbations of cellular function or high cellular mortality) there is strain in order to optimize the production of one member of the isoprenoid still a need to improve transfection effi ciency for specifi c cell lines family, the lycopene. For this purpose we will built up a mathematical model that are diffi cult to transfect. Herein we present our last advances in of the non-mevalonate. The model will integrate the available information the development of nanotechnology-based transfection agents. For this of the pathway network and regulatory features. Once it will be evaluate purpose, several chemical strategies, based on solid phase chemistry, in terms of stability, robustness and reliably will be used to determine the and basic molecular biology techniques has been optimized for the changes, either in individual or group of enzymes or transport processes conjugation of DNA to nanoparticles. that should be modifi ed in order to increase lycopene productivity while cell viability is guaranteed. P09-13 Work funded by research grants from ACIISI, Ref No. ACIISI Project ProID Biodiesel conversion of non-edible vegetable 2010/39 and Project BIO2011-29233-C02-02 MINECO. IMBRAIN REF. oils catalyzed by magnetic cross-linked enzyme FP7-REGPOT-2012-CT2012-31637-IMBRAIN. aggregates of Candida antarctica lipase B

Iraide Bejarano1, Jone I. Otsoa-Txintxetru1, Enrique A. Picó1, P09-11 Carmen López2, María J. Llama1, Juan L. Serra1 Evaluación de la producción 1Enzyme and Cell Technology Group, Department of de galactooligosacáridos en variantes de beta Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Science and galactosidasa de Kluyveromyces lactis Technology, University of the Basque Country (UPV/EHU), Leioa, ES,2Ikerbasque, Basque foundation for science; Biochemistry and Agustín Rico Díaz, María Esperanza Cerdán Villanueva, Manuel Molecular Biology Department, University of the Basque Country Becerra Fernández (UPV/EHU), Leioa, ES Universidade da Coruña, A Coruña, ES In the past years, ﬁ rst generation biodiesel was obtained by La beta galactosidasa de Kluyveromyces lactis (Kl-β-gal) es una de las transesteriﬁ cation reaction with methanol of edible vegetable oil and enzimas más usadas en la industria de alimentación, especialmente en la animal fats. Second-generation biodiesel can be also produced from láctea. Aunque la enzima tiene muchas características interesantes como non-food crops such as non-edible vegetable oils. In this work magnetic son su alta capacidad hidrolítica o su seguridad (es producida por un cross-linked enzyme aggregates (mCLEAs) of the lipase B from Candida organismo generalmente reconocido como seguro), tiene la desventaja antarctica (CALB) were obtained by cross-linking covalently the de ser bastante lábil a temperaturas altas. Esta característica limita su uso insolubilized lipase to magnetic nanoparticles (MNPs) functionalized en aplicaciones industriales que necesitan llevarse a cabo a temperaturas with amine groups, using glutaraldehyde as cross-linking reagent. The moderadamente elevadas. resulting novel robust biocatalyst, denoted as mCLEA-CALB, has been

79 Pósters XXXVII Congreso SEBBM used to catalyze the conversion to biodiesel of different non-edible P09r-15 vegetable oils. Stability and reutilization of magnetic biocatalyst For this purpose the trans/esterifi cation reaction catalyzed by mCLEA- (mCLEAs) for biodiesel production from CALB was assessed using different non-edible oils (waste-frying, unrefi ned microalgae oil soya, Jatropha and Cameline oils) in the presence o methanol, ethanol, 2-propanol and 2-butanol as alkyl-donors. Different alcohol:triglyceride Enrique Angulo Picó1, Carmen López2, Álvaro Cruz-Izquierdo1, molar ratios (1:1, 3:1, 6:1, 9:1 and 12:1) were assayed at 30ºC in 1 ml Teresa García-Bárcena1, Noelia Villarroel1, María J. Llama1, Juan L. reaction mixture stirred by a rotatory mixer. Serra1 Olive oil was used as control oil in all assays.Finally, the reaction mixture 1Enzyme and Cell Technology Group, Department of was scaled up to 50 ml using control olive oil and methanol as substrates Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of Science and in a magnetic reactor (Carousel 12 Plus, Radleys, UK). The biodiesel Technology, University of the Basque Country (UPV/EHU), Leioa, conversion of oil to fatty acids methyl esters (FAMEs) was optimized using ES,2Ikerbasque, Basque foundation for science; Biochemistry and different amounts of mCLEA-CALB and an alcohol:triglyceride molar ratio Molecular Biology Department, University of the Basque Country of 6:1. The obtained FAMEs were analyzed by thin-layer chromatography (UPV/EHU), Leioa, ES (TLC) in Silica Gel G-60 plates after staining with Coomassie Blue. Combinatorial approaches in enzyme immobilization are increasing in Then, digital images of plates were taken and analyzed using the “TLC the design of novel robust immobilized biocatalysts. Catalytic functions Analyzer” software (available at: http://www.sciencebuddies.org/science- may improve using cross-linked enzyme aggregates (CLEAs) to obtain research-papers/tlc_analyzer.shtml). Results were exported and integrated more stable catalysts. Moreover, magnetic nanoparticles (MNPs) are an numerically in a spreadsheet to calculate the amount of FAMEs and attractive support for enzyme immobilization offering fast and simple triglycerides. recovery of the immobilized catalyst with a magnet. The lipase B from Results obtained indicate that mCLEA-CALB appears as a promising novel Candida antarctica (CALB) is one of the most used enzymes in organic biocatalyst of interest to catalyze the production of second-generation chemistry, based on its broad specifi city and high selectivity. Its capability biodiesel from waste-frying oil and other non-edible vegetable oils. to catalyze trans/esterifi cation reactions makes it a very good alternative for biodiesel production. Work supported by the MINECO (CTQ2011-25052), the Basque The aim of this work is to produce biodiesel by reactions of esterifi cation Government (SAIOTEK S-PE12UN041) and UPV/EHU (GIU11/25). catalyzed by magnetic CLEAs of CALB (mCLEA-CALB), using either free fatty acids (FFA) or oils from the microalga Scenedesmus sp, as well as analyze the stability and possible reutilization of the biocatalyst for the synthetic purposes. The progress of reactions was assessed by high P09-14 Inmovilización de la enzima -galactosidasa de performance liquid chromatography (HPLC). Different experimental β conditions such as type of alcohol, alcohol:FFA molar ratio, type of Aspergillus oryzae en membranas de quitosano agitation, as well as different solvents were tested to fi nd the best conditions Maria del Carmen Romero Cruz1, Paulina Urrutia2, Gonzalo Ruiz- for obtaining biodiesel in terms of reaction rates and conversion values. In addition, the stability of hydrolytic and biosynthetic activity of mCLEAs Philippi2, Carlos Vílchez Lobato1, Javier Vigara Fernández1, Lorena was tested after incubating the immobilized enzyme for 48 h in different Wilson Soto2 organic solvents. 1Dpto. Química y Ciencia de los Materiales, Facultad de Ciencias Using mild conditions of temperature (30˚C) and magnetic stirring, Experimentales, Universidad de Huelva, CEIMAR, Huelva, ES, biodiesel conversion of oils up to 90% was obtained with methanol as 2Escuela de Ingeniería Bioquímica, Pontifi cia Universidad Católica, alkyl-donor and t-butanol as solvent. The reutilization of mCLEAs was Valparaiso, CL tested using two different types of stirring methods. After 50 consecutive La inmovilización de biocatalizadores persigue la mejora de las prestaciones cycles, the complete initial activity was maintained using mechanical biotecnológicas de los mismos con idea de aumentar sus posibilidades de stirring. aplicación en los distintos campos de la industria productiva. El presente trabajo muestra un estudio de inmovilización de la β-galactosidasa (EC Work supported by the MINECO (CTQ2011-25052), Basque Government 3.2.1.23) del hongo Aspergillus oryzae utilizando membranas de quitosano (SAIOTEK S-PE12UN041), UPV/EHU (GIU11/25) and EU (Energreen activadas con glutaraldehído, que permite la inmovilización covalente de la Project EFA217/11, POCTEFA). enzima al soporte. En los estudios de optimización de la inmovilización, la actividad enzimática se cuantifi có utilizando orto-nitrofenil-β-galactosido (ONPG) como sustrato. La activación de los grupos aminos del quitosano P09r-16 (xNH2) con glutaraldehído (GT) se optimizó a una relación de 10GT:1NH2, Magnetic cross-linked enzyme aggregates obteniéndose un rendimiento de la inmovilización próximo al 55 %, frente of Candida antarctica lipase B. Kinetic al 20% obtenido con la relación 1GT:1NH2. Para la carga enzimática characterization and its use to obtain bioproducts utilizada se estableció un valor óptimo de 10 mg prot./g soporte, basada en un compromiso entre la actividad expresada y el rendimiento de la Teresa García-Bárcena1, Ane Quesada1, Julen Díaz1, Enrique A. inmovilización. La membrana de quitosano activada se preparó a diferentes Picó1, Carmen López2, María J. Llama1, Juan L. Serra1 grosores (2; 2,5 y 4 mm) incrementándose 3,5 veces el rendimiento de la 1Enzyme and Cell Technology Group, Department of Biochemistry inmovilización para un grosor del 2 mm; el aumento del grosor provocó and Molecular Biology, Faculty of Science and Technology, un aumento aparente de la constante de Michaelis para el ONPG, como University of the Basque Country (UPV/EHU), Leioa, ES,2Enzyme consecuencia de restricciones difusionales. Independientemente del grosor and Cell Technology Group, Department of Biochemistry and utilizado, la inmovilización mejoró la estabilidad térmica de la enzima Molecular Biology, Faculty of Science and Technology, University of respecto al sistema libre. Como interés biotecnológico, la β-galactosidasa the Basque Country (UPV/EHU) - Ikerbasque, Basque foundation inmovilizada en membranas de quitosano puede utilizarse para diseñar un for science; Biochemistry and Molecular Biology Department, biosensor de lactosa, acoplando la membrana a un detector que permita University of the Basque Country (UPV/EHU), Leioa, ES cuantifi car la glucosa resultante de la hidrólisis enzimática. The use of robust magnetic biocatalysts is nowadays a rapidly emerging area because the enzyme can be easily recovered from the reaction Proyecto: ALGANAET (PIRSES-GA-2011-295165). mixture and reused in several catalytic cycles. In this work cross-linked

80 Granada 2014 Pósters enzyme aggregates (CLEAs) of the lipase B from Candida antarctica substrates is possible to bind oligonucleotide molecules at the surfaces of (CALB) have been covalently bound to magnetic nanoparticles (MNPs) the holes without the participation of intermediate molecules as binding of magnetite to obtain a novel robust biocatalyst denoted as mCLEA- functional groups. CALB. Here we describe the direct adsorption of DNA oligonucleotides after

In order to compare the behavior of this novel magnetically-separable surface activation by UV irradiation. Effective DNA-TiO2 surface binding biocatalyst to that of the soluble enzyme, the main structural and was demonstrated after several astringent washes. We demonstrate also that catalytic properties of mCLEA-CALB have been studied. For this fi xed oligonucleotides are able to hybridize specifi cally to its corresponding purpose the hydrolytic activity was assessed using the chromogenic antisense non-fi xed oligonucleotide. These preliminary results allow us to substrate p-nitrophenyl acetate (pNPA) whereas the synthetic activity propose TiO2 as an adequate substrate for nanobiosensor applications based was evaluated by following the trans/esterifi cation reaction to obtain on nucleic acids sequence recognition. either biodiesel (from free fatty acids or triglycerides with methanol) or biosurfactant (sucrose monopalmitate, SMP, from sucrose and vinyl palmitate). P09-18 The effects of substrate concentration and temperature were studied in Producción y caracterización de la enzima the case of the hydrolytic activity. In the other hand, the kinetics of -galactosidasa de Saccharomyces cerevisiae mCLEA-CALB to obtain fatty acid methyl esters (FAMEs) was studied α using oleic, linoleic and linolenic acids at 30°C, and the values of María E. Álvarez Cao, María Esperanza Cerdán Villanueva, Manuel kinetic parameters Km and Vm were determined. Also the kinetics of Becerra Fernández, María Isabel González Siso the transesterifi cation reaction was followed using non-edible vegetable Universidade da Coruña, A Coruña, ES oils (unrefi ned soybean and jatropha oils) as well as olive oil as a La α-galactosidasa de la levadura Saccharomyces cerevisiae (ScAGAL) control substrate. The effect of stirring on the hydrolytic and synthetic es una glucósido hidrolasa que cataliza la hidrólisis enzimática de activity was followed using both mechanical (gyratory) and ultrasound residuos galactosa unidos por enlaces α-(1,6) de galacto-oligosacáridos (sonoreactor) agitation. y galacto-mananos poliméricos. La ScAGAL presenta bajo coste de Finally, the synthetic activity of mCLEA-CALB to catalyze the synthesis producción, gran estabilidad a temperatura ambiente y amplio rango of SMP was studied. The reaction was carried out at 60ºC with magnetic de Tª y pH de trabajo que la identifi can como una enzima robusta y de stirring using different amount of mCLEAs and substrates, in the presence especial importancia en numerosas aplicaciones biotecnológicas que of different organic solvents (DMSO, t-butanol and 2-methyl-2-butanol). van desde la industria azucarera y la alimentación animal, pasando por These results indicate that mCLEAs of CALB can be envisaged as a la farmacéutica, hasta la producción de etanol o biodiesel acoplado a la promising novel biocatalyst of interest to catalyze both hydrolytic and degradación de diferentes materiales (melazas, derivados de legumbres). transesterifi cation reactions to obtain bioproducts. En este trabajo, el gen MEL1 que codifi ca para la ScAGAL fue clonado y expresado en la cepa S. cerevisiaeBJ3505 generando diferentes Work supported by the MINECO (CTQ2011-25052), the Basque construcciones con el fi n de favorecer la purifi cación y producción de la Government (SAIOTEK S-PE12UN041) and UPV/EHU (GIU11/25). enzima. Además, la optimización de las condiciones de cultivo permitió mejorar la productividad obteniendo un incremento de hasta 10 veces más de enzima al aumentar la concentración de la fuente de carbono y la P09-17 DNA binding and hybridyzation on functionarized aireación del medio de cultivo, y hasta 30 veces más si se alarga el tiempo de cultivo hasta las 250 h. Por otro lado, la caracterización enzimática TiO surfaces 2 de la ScAGAL utilizando diferentes sustratos y su estudio comparativo con otras α-galactosidasas disponibles en el mercado, demuestra que la José Antonio Mas Gutiérrez1, José Vicente Pérez-Girón2, enzima hidroliza efi cientemente los sustratos naturales melibiosa, rafi nosa Ruy Sanz González3, Miriam Jaafar Ruiz-Castellanos4, Jens Jensen5, Oscar de Luis Jiménez6 y estaquiosa pero no puede actuar directamente sobre galactomananos complejos, como el galactomanano de algarrobo, pudiendo hidrolizar 1Laboratorio de Genómica del Centro de Apoyo Tecnológico, los galactomano-oligosacáridos sintéticos, Gal1Man y Gal3,4Man en Universidad Rey Juan Carlos, Campus de Alcorcón, Alcorcón, ES, 3 5, combinación con la enzima ß-manosidasa. Estas ventajas permiten que la 2Emerging Viruses Department, Heinrich Pette Institute, Hamburg, ScAGAL sea un buen candidato para su aplicación en la eliminación de DE, 3CNR-IMM-MATIS, Catania, IT, 4Departamento de Física de la oligosacáridos de la familia de la rafi nosa (RFO). Materia Condensada, Facultad de Ciencias, Universidad Autónoma de Madrid, Campus de Cantoblanco, Madrid, ES, 5Thin Film Physics Division, Department of Physics, Chemistry and Biology, Linköping University, Linköping, SE, 6Departamento de Ciencias P09-19 Básicas de la Salud, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Identification of an inhibitory antibody for Rey Juan Carlos, Campus de Alcorcón, Alcorcón, ES imaging active urokinase plasminogen activator

Titanium dioxide (TiO2) is a versatile material with a wide range of (uPA) technological applications. The physical and chemical properties of TiO 2 Natalia Sevillano1 2 3 surfaces are infl uenced by morphology and crystallinity, among others. , Aaron M. LeBeau , Daniel R. Hostetter , Henry F. 2 1 Preparing well-ordered functional structures of TiO , having highly active VanBrocklin , Charles S. Craik 2 1 surface areas, is of great interest due to their potential application for Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California 2 biomaterials and biosensors. San Francisco, San Francisco, US, Center for Molecular and One way of fabricating regular micro- and nano-patterns is by ion-beam Functional Imaging, Department of Radiology and Biomedical lithography (IBL), where a mask is used to harness an ion beam and defi ne Imaging, University of California San Francisco, San Francisco, US, 3 the structures. Energetic ion-beams induce localized material modifi cations CytomX Therapeutics Inc, South San Francisco, US in TiO2, which is susceptible to chemical etching. In this way a well-defi ned Increased proteolytic activity is a common characteristic of highly pattern with interesting surface properties can be induced. proliferative and invasive cancers. Proteases are involved in all stages The applied lithography method generates a permanent and well defi ned of cancer and represent functional biomarkers that can be targeted to periodic structure of micrometre sized square holes having nanostructured distinguish aggressive disease.

TiO2 surfaces, presenting different physical and chemical properties Over-expression of the plasminogen activation system (PAS) – which compared to the surrounding rutile single crystal surface. On the patterned consists of the serine protease urokinase plasminogen activator (uPA), the

81 Pósters XXXVII Congreso SEBBM uPA receptor, uPAR, and uPA inhibitor, PAI-1, – has been documented in P09-21 a number of primary and metastatic cancers. The expression of the PAS Identifying recombinant antibodies to directly correlates with cancers that are phenotypically aggressive, result conformational states of challenging protein in poor clinical prognosis, and quickly acquire drug resistance to fi rst line targets therapies. Active uPA is a functional biomarker of aggressive cancer that can be selectively targeted for preclinical imaging using an antagonistic Natalia Sevillano1, JungMin Kim1, Hai Ta1, Kiment Verba2, David molecular approach. Agard2, John Gross1, Yifan Cheng2, Charles S. Craik1 Using a fully human naïve Fab phage-display library we have identifi ed 1Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California a human antibody (Fab U33) that selectively inhibits the active form San Francisco, San Francisco, US, 2Department of Biochemistry of uPA. This antibody targets and internalizes the active form of uPA and Biophysics, University of California San Francisco, San via a receptor mediated mechanism by mimicking the action of the Francisco, US endogenous inhibitor of uPA, PAI-1. We have used U33 labeled with Monoclonal antibodies (mAbs) are ubiquitous in biomedical research fl uorophores or radionuclides to non-invasively detect active uPA and medicine. Synthetic antibodies (recombinant antibodies, rAbs) can in vivo in prostate cancer xenografts and in experimental metastasis be created in the laboratory, completely eliminating animals from the models. antibody-production process. rAbs can be used in the same applications as traditional mAbs such as western blotting, immunohistochemistry, FACs and immuno-precipitation experiments. They have several P09-20 (R09-6) Evolución dirigida de una peroxigenasa advantages over the traditional hybridoma-based antibodies, including control over the state of the antigen that allows identifi cation of inespecífica, un biocatalizador altamente antibodies to conformational states of the antigen, rapid identifi cation promiscuo y selectivo of antibody binders allowing automation for high throughput production and ability to develop antibodies to highly toxic or non-immunogenic Patricia Molina-Espeja1, Eva Garcia-Ruiz2, David Gonzalez-Perez1, proteins.A fully human naïve Fab phage-display library with a diversity Miguel Alcalde1 of 4.1 x 1010 was constructed by the Craik laboratory using methods 1Departamento de Biocatálisis, Instituto de Catálisis y previously described. We have optimized the protocols for phage display Petroleoquímica, CSIC, Madrid, ES, 2Departamento de Ingeniería panning for fast verifi cation of binders and initial characterization of Química y Biomolecular, Universidad de Illinois en Urbana- the epitope by semi-quantitative and competitive ELISAs without the Champaign, Urbana, Illinois, US purifi cation of the Fabs. Using these optimized protocols, we have Hace diez años, se descubrió en el hongo basidiomiceto Agrocybe successfully generated Fabs that are useful for structural analysis against aegerita una enzima capaz de catalizar actividades que engloban aquellas a wide range of protein targets including proteases, membrane proteins de la cloroperoxidasa de Caldaryomices fumago (CPO) y las de las and protein complexes. monooxigenasas del citocromo P450 [1,2]. Con el nombre de peroxigenasa inespecífi ca (unspecifi c peroxygenase, UPO, EC 1.11.2.1), esta versátil enzima [3] ha demostrado suplir las carencias de las anteriores, con una P09-22 elevada efi ciencia y selectividad. La UPO es una enzima extracelular e Solid lipid nanoparticle composition is a key independiente de cofactores como el NAD(P)H y otras enzimas auxiliares factor for the development of a suitable drug (sólo necesita H2O2 para trabajar), al contrario que las P450, lo que reduce el coste de su aplicación. delivery system Hemos sometido a esta peroxigenasa hemo-tiolada (cisteína como Lide Arana Urbieta, Félix María Goñi, Itziar Alkorta ligando axial) a evolución dirigida hacia expresión funcional en Unidad de Biofísica (CSIC, UPV/EHU), and Departamento de Saccharomyces cerevisiae [4]. Tras cinco ciclos, se obtuvo la variante Bioquímica, Universidad del País Vasco, Leioa, ES PaDa-I, con unos niveles de secreción de ~8 mg/L. También ha sido sobre-expresada en Pichia pastoris, obteniendo ~230 mg/L (material Development of novel drug delivery systems for the treatment of sin publicar). En ambos casos, las propiedades y comportamiento son complex diseases has become a big challenge for the last two decades. equivalentes a los de la enzima homóloga. Así, disponemos de una Many drugs present low water solubility, poor absortion or rapid plataforma de fácil uso para continuar su mejora hacia aplicaciones de elimination and suitable drug carriers are essential for the improvement interés biotecnológico. En nuestro caso, estamos sometiendo a PaDa-I a of drug bioavailability. Nanotechnology has abruptly broadened the fi eld evolución hacia mejora de su actividad hidroxilativa sobre naftaleno, en of drug delivery systems and particularly, Solid Lipid Nanoparticles detrimento de su actividad oxidativa (material sin publicar). Esta última (SLN) have emerged as some of the most promising nanocarriers for transforma el compuesto de interés, 1-naftol, en productos no deseados. controlled drug delivery. SLN have many advantages: they are able to La actividad oxidativa en la UPO parece estar muy relacionada con incorporate hydrophilic and lipophilic drugs, they present no biotoxicity su estabilidad, pero los resultados obtenidos son esperanzadores, con and their production can be easily scaled up. Due to their solid core, una nueva variante que reduce cinco veces la actividad oxidativa drug release is controlled and their size facilitates drug diffusion through (peroxidasa) manteniendo su capacidad de transferencia de oxígeno some biological barriers. SLN composition must be carefully selected (actividad peroxigenasa). depending on targeted tissue and incorporated drug. In this work we have tested solid lipid nanoparticles (SLN) composed of long-chain fatty acids, Bibliografía Epikuron 200 (largely soy bean lecithin), and bile salts. A total of fi ve [1] Ullrich R, Nüske J, Scheibner K, Spantzel J, Hofrichter M. Novel different systems were prepared, and characterized by photon correlation haloperoxidase from the agaric basidiomycete Agrocybe aegerita oxidizes spectroscopy, transmission electron microscopy, differential scanning aryl alcohols and aldehydes. Appl Environ Microb 2004; 70: 4575-81. calorimetry, and capacity to incorporate non-polar drugs. Our results [3] Hofrichter M and Ullrich R. Oxidations catalyzed by fungal suggest that SLN composition is essential for particle size, polidispersity peroxygenases. Curr Opin Chem Biol 2014; 19: 116-25. and stability but not for drug incorporation effi ciency.

82 Granada 2014 Pósters

P09-23 architecture that includes three catalytic sites and several oxidation Hydrolysis of mcl-polyhydroxyalkanoates pathways. In this work, an evolved version of VP was subjected to a by immobilized depolymerase from range of hybrid and evolutionary strategies in Saccharomyces cerevisiae to study the resistance to H O . After 5 generations of random-, Streptosporangium roseum 2 2 saturation- and domain- mutagenesis together with in vivo DNA Noelia Villarroel1, Alba Álvarez1, Teresa García-Bárcena1, Enrique A. recombination approaches, several structural determinants behind the Picó1, Carmen López2, María J. Llama1, Juan L. Serra1 oxidative destabilization of the enzyme were unmasked. To keep balance 1Enzyme and Cell Technology Group, Department of Biochemistry between activity and stability,selected benefi cial mutations were further and Molecular Biology, Faculty of Science and Technology, relocated in novel mutational environments by in vivo sequence blocks University of the Basque Country (UPV/EHU), Leioa, ES,2Enzyme exchange promoting epistatic interactions. The best variant of this and Cell Technology Group, Department of Biochemistry and process accumulated 8 mutations that increased the half-life up to 30 min Molecular Biology, Faculty of Science and Technology, University in the presence of 3,000 equivalents of H2O2 and shifted 6ºC upwards of the Basque Country (UPV/EHU) - IKERBASQUE, Basque the kinetic thermostability. Whilst the main heme domain was not Foundation for Science , Leioa, ES signifi cantly modifi ed, mutations in the surroundings of the Mn2+ binding Over the past years, the use of plastics in packaging and other products pocket and the catalytic tryptophan decreased substrates affi nities for has exacerbated the problem of disposal of solid waste. In response to both catalytic sites exerting a benefi cial effect to the protein stabilization. the problem and harmful effects of the plastic waste on the environment, Multiple structural alignment with other H2O2 tolerant peroxidases there is a considerable interest in the production of biodegradable plastics. addressed possible roles played by the new mutations in the overall Polyhydroxyalkanoates (PHAs) provide a good fully degradable alternative oxidative damage process of the heme-peroxidase superfamily. to petrochemical plastics. Among PHAs, the medium-chain length ones (mcl-PHAs) are considered to be promising candidates for special bioplastic applications due to properties such as elasticity, hydrophobicity, P09r-25 low oxygen permeability, among others. Screening a glycosynthase library with an At the same time, PHAs have an added interest as source of R-3- hydroxyalkanoic acids (R-HAs), the monomers that form the polymer, enzyme-independent assay based on a which are scaffolds as chiral starting materials in fi ne chemical, fluorescent sensor pharmaceutical and medical industries. Extracellular PHA depolymerases Hugo Aragunde Pazos are enzymes capable of degrading PHAs available in the environment after , Estela Castilla, Eduardo Andrés, Xevi the death or lysis of PHA-accumulating bacteria. Biarnés, Antoni Planas In our laboratory a hypothetical protein with a putative extracellular mcl- Laboratory of Biochemistry, Bioengineering Department, Institut PHA depolymerase activity from Streptosporangium roseum DSM43021 Quimic de Sarria, Universitat Ramon Llull, Barcelona, ES was cloned and expressed as a hexahistidine recombinant protein in cells Glycosynthases have become effi cient tools for the enzymatic synthesis of E. coli BL21 (DE3) and then purifi ed by IMAC. of oligosaccharides, glycoconjugates and polysaccharides. They are Taking into account the advantages that the immobilization can offer with engineered retaining glycosidases in which the hydrolase activity is respect to the soluble enzyme in aspects such as stability or reutilization abolished by mutation of the catalytic nucleophile but effi ciently catalyze of biocatalyst, the aim of this work was to immobilize the recombinant transglycosylation when using activated glycosyl fl uoride donors with protein testing different supports in order to obtain an effi cient and the opposite anomeric confi guration to the substrate in the wild-type robust biocatalyst to hydrolyze mcl-PHAs. For this purpose, hydrophobic enzyme. Enzyme-directed evolution approaches are applied to improve the adsorption to porous polypropylene (Accurel MP-1000) and covalent performance of current glycosynthases and engineer specifi city for new linkage to magnetic nanoparticles (MNPs) were used. The biochemical substrates. However, simple and general screening methods are required properties of the resulting biocatalysts as well as their ability to catalyze the production of monomers or dimers of R-HAs in the hydrolytic reaction since most of the reported assays are specifi c for each particular enzyme of PHAs were compared. Also, the biocatalysts were used for several [1]. Only one “universal” screening method has been proposed, a pH-based consecutive hydrolytic cycles to demonstrate their possible reutilization in assay that measures the hydrofl uoric acid released as by-product of the the hydrolytic reaction of mcl-PHA which could allow a cost reduction in glycosynthase reaction, being detected by color change of a pH-indicator future bioprocesses. [2]. However, it is not very reproducible and diffi cult to implement due to sample matrix variations. Work supported by the MINECO (CTQ2011-25052), Basque Government We have developed a new general screening assay independent of (SAIOTEK S-PE12UN041) and UPV/EHU (GIU11/25). NV was the enzyme specifi city for the screening of glycosynthase libraries [3]. recipient of a predoctoral scholarship from the Basque Government. This assay is based on the use of a chemical sensor to transduce fl uoride concentration (by-product of all glycosynthase reactions using fl uoride activated donors) into a fl uorescence signal. We report here P09-24 the application to a nucleophile saturation mutant library of Bacillus Screening mutant libraries of versatiles licheniformis 1,3-1,4-β-glucanase. Beyond the expected mutations at peroxidase from Pleurotus eryngii to enhance the nucleophile, other variants have acquired glycosynthase activity. oxidative stability Surprisingly, an aspartic acid for glutamic acid replacement renders a highly active glycosynthase, but retaining low hydrolase activity. David Gonzalez-Perez1, Eva Garcia-Ruiz2, Bernardo J. Gómez It appears to be an intermediate state between glycosyl hydrolase and Fernández1, Francisco Javier Ruiz-Dueñas3, Ángel T.Martinez3, glycosynthase [4]. Miguel Alcalde1 1Instituto de Catálisis y Petroleoquímica, CSIC, Madrid, ES, References 2Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University [1] Roman K., Withers S.G. (2010) Carbohydr. Res. 345, 1272-1279. of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana, US, 3Centro de [2] Ben-Davis A., Shoham G., Shoham Y. (2008) Chem. Biol. 15, 546-551. Investigaciones Biológicas - CSIC, Madrid, ES [3] Andrés E., Aragunde H., Planas A. (2014) Biochem. J. 458, 355–363. Versatile peroxidases (VP) are promiscuous biocatalyst with the [4] Aragunde H., Castilla E., Biarnés X., Faijes M., Planas A. (2014) highest fragility to peroxides reported yet due to sophisticate molecular Carbohydr. Res. 389, 85-92.

83 Pósters XXXVII Congreso SEBBM

P09-26 compiten de forma muy efectiva con la proteína por la superfi cie hidrofílica, Identification of reciprocal adhesion genes in no habiéndose observado una dependencia signifi cativa en su capacidad de pathogenic and nonpathogenic Pseudomonas inhibición con el peso molecular. Incluso en condiciones de fuerza iónica elevada, donde las interacciones electrostáticas se ven minimizadas, 1 mg Jesús de la Torre Zúñiga1 1 , Maria Antonia Molina Henares , Estrella de PE es capaz de provocar la desorción de 0.5 mg de lisozima previamente Duque Martin de Oliva2, Miguel Alaminos Mingorance3, Manuel adsorbida sobre 10 mg de sílice contenidos en 1 mL. 1 4 1 Espinosa Urgel , Amalia Roca , Patricia Bernal Guzman , Matilde Finalmente, la capacidad de prevenir la adsorción de proteínas a superfi cies 1 5 2 Fernandez , Sophie de Bentzmann , Juan Luis Ramos Martin de sílice mediante el recubrimiento previo de estas superfi cies con una 1 Consejo Superior de Investigaciones Científi cas-EEZ, Department monocapa de polielectrolito ha sido testada encontrándose que lavados 2 of Environmental Protection, Granada, ES, Abengoa Research, sucesivos de la superfi cie tienen un efecto prácticamente despreciable sobre Department of Biotechnology, Campus Palmas Altas, Sevilla, ES, el nivel de recubrimiento de la superfi cie y, por tanto, sobre su protección 3Universidad de Granada, Facultad de Medicina, Department of frente a la adsorción proteica. Histology, Granada, ES, 4Bio-Iliberis R&D, Granada, ES, 5UPR CNRS 9027, Marseille, FR

We used a combination of in silico and large-scale mutagenesis P09-28 approaches to expand our current knowledge of the genetic determinants El receptor de productos avanzados de glicación used by Pseudomonas putida KT2440 to attach to surfaces. We fi rst identifi ed in silico orthologs that have been annotated in Pseudomonas (RAGE) como una diana para la generación de aeruginosa as potentially involved in attachment. In this search 67 paired- reactivos específicos de transfección de células related genes of P. putida KT2440 and P. aeruginosa were identifi ed as eucariotas associated to adhesion. To test the potential role of the corresponding gene products in adhesion, 37 knock-out mutants of KT2440, available María Dolores Girón González1, Fernando Hernández Mateo2, in the Pseudomonas Reference Culture Collection, were analyzed with Francisco Javier López-Jaramillo2, Arturo Morales Portillo2, Alfonso regard to their ability to form biofi lms in polystyrene microtiter plates; Salinas Castillo3, Francisco Santoyo González2, Rafael Salto of these, 7 mutants were defi cient in adhesion. Since mutants in all González1 potential adhesion genes were not available, we generated a genome- 1Departamento de Bioquímica y Biología Molecular II, Facultad de wide collection of mutants made of 15 360 independent mini-Tn5 Farmacia, Universidad de Granada, Granada, ES, 2Departamento de insertions and tested them for the formation of biofi lm on polystyrene Química Orgánica, Facultad de Ciencias, Universidad de Granada, microtiter plates. Eighteen clones that exhibited a reduction of at least Granada, ES, 3Departamento de Química Analítica, Facultad de 3-fold in biofi lm biomass formation were considered candidate mutants Ciencias, Universidad de Granada, Granada, ES in adhesion determinants. DNA sequencing of the insertion site identifi ed En las alteraciones a largo plazo de la diabetes y en la angiogénesis 5 other new genes involved in adhesion. Phenotypic characterization of asociada con la metástasis tumoral, el receptor de productos avanzados de the mutants showed that 11 of the inactivated proteins were required for attachment to biotic surfaces too. This combined approach allowed glicación (RAGE) tiene un papel esencial. Este receptor se sobre-expresa us to identify new proteins with a role in P. putida adhesion, including en los tejidos diana asociados a estas patologías y tras unirse a sus ligandos the global regulator RpoN and GacS, the lectin-like protein LecA, PstS, se internaliza. Esto hace que este receptor constituya una diana para el and a protein of unknown function (PP1633). The remaining mutants desarrollo de reactivos específi cos de transfección. corresponded to functions known or predicted to participate in adhesion Así, derivados de polietilenimina (PEI 25 kDa) y PAMAM-G2 se based on previous evidence, such as the large adhesion proteins LapA, modifi caron mediante la reacción de glicación no enzimática de Maillard LapF, and fl agellar proteins. In silico analysis showed this set of genes para generar nuevos agentes de transfección irreversiblemente glicados to be well conserved in all sequenced P. putida strains, and that at least capaces de unirse al RAGE. Estos reactivos así sintetizados mantienen la 9 reciprocal genes involved in attachment are shared by P. putida and capacidad de unir DNA y protegerlo de la degradación por endonucleasas. P. aeruginosa. Además, mientras que los reactivos glicados mostraron una baja capacidad de transfección en células CHO-k1 que no expresan RAGE, los compuestos glicados actuaron como efi cientes reactivos de transfección P09r-27 en una línea celular CHO-k1 que expresa de manera recombinante el Inhibición de la adsorción de proteínas a RAGE. La especifi cidad de estos reactivos quedo demostrada por el superficies de sílice mediante el uso de hecho de que la pre-incubación con albúmina glicada, el ligando natural polielectrolitos de alta densidad de carga del RAGE, o dansyl cadaverina, un inhibidor de la internalización del RAGE, bloquean la transfección mediada por los reactivos glicados. Los Felipe Hornos Adán, Rocío Esquembre Tomé, Javier Gómez Pérez resultados obtenidos se han confi rmado en las líneas celulares NRK y Instituto de Biología Molecular y Celular (Universidad Miguel RAW264.7 que expresan de manera natural el receptor. Asimismo, los Hernández), Elche, ES compuestos glicados retienen su efi ciencia de transfección en presencia La adsorción es un proceso complejo que puede afectar a la estabilidad de suero y son capaces de promover la transfección in vivo en un modelo estructural de las proteínas dependiendo de factores tales como temperatura, experimental en ratón. Por tanto, nuestros resultados muestran que pH o fuerza iónica. Aunque la adsorción de proteínas ha encontrado la reacción de Maillard es un procedimiento simple y directo para la multitud de aplicaciones biotecnológicas, resulta necesario el desarrollo preparación de reactivos glicados de transfección específi cos y que esta de metodologías que permitan su modulación para facilitar el manejo in técnica es aplicable a otros reactivos de transfección que presenten grupos vitro de proteínas en condiciones de alta dilución y el almacenamiento y amino libres. En conclusión, las propiedades de estos compuestos son manipulación de fármacos proteicos que evite su inactivación inducida por muy interesantes para su uso in vivo: la glicación confi ere selectividad con la adsorción - desorción a superfi cies de vidrio o plástico y su potencial un muy pequeño efecto sobre la toxicidad de los reactivos, mantienen su inmunogenicidad. actividad en presencia de suero y utiliza una vía única de internalización Proponemos la utilización de polielectrolitos (PE) catiónicos de alta mediada por receptores, con una alta efi ciencia de transfección in vivoen densidad de carga como medio efi caz para inhibir la adsorción de proteínas ratón. a superfi cies de sílice. En particular hemos estudiado la capacidad de inhibición de polielectrolitos basados en grupos amonio y en grupos amina Investigación subvencionada por el Proyecto CTQ2011-29299-C02 de distinto peso molecular. Nuestros resultados indican que estos PE (MEC).

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P09-29 P09-31 Adsorción de proteínas a superficies Engineering biological approaches for antibiotic hidrofóbicas: caracterización termodinámica y detection. A new microbial biosensor based on estrategias de inhibición the Pseudomonas putida TtgR repressor

Rocío Esquembre Tomé, Felipe Hornos Adán, Javier Gómez Pérez Manuel Espinosa-Urgel1, Luis Serrano2, Juan Luis Ramos1, Instituto de Biología Molecular y Celular (Universidad Miguel Ana María Fernández-Escamilla1 Hernández), Elche, ES 1Department of Environmental Protection, Estación Experimental 2 La adsorción de proteínas a superfi cies hidrofóbicas es un proceso del Zaidín, CSIC, Granada, ES, European Molecular Biology complejo que puede afectar la estabilidad estructural de las proteínas y Laboratory and Centre for Genomic Regulation Systems Biology su actividad biológica dependiendo de factores tales como temperatura, Research Unit, Barcelona, ES pH o fuerza iónica. Aunque la adsorción de proteínas ha encontrado Environmental contamination by toxic organic compounds and multitud de aplicaciones biotecnológicas, resulta necesario el desarrollo antimicrobials is one of the causes for the recent surge of multidrug-resistant de metodologías que permitan su modulación para facilitar el manejo in pathogenic bacteria. Monitoring contamination is therefore the fi rst step in vitro de proteínas en condiciones de alta dilución y el almacenamiento y containment of antimicrobial resistance, and requires the development of manipulación de fármacos proteicos que evite su inactivación inducida simple, sensitive and quantitative tools that detect a broad spectrum of toxic por la adsorción - desorción a superfi cies de plástico y su potencial compounds. The emerging approach for detecting toxic compounds is the inmunogenicidad. rational design of microbial biosensors. In this study, we have engineered Hemos caracterizado termodinámicamente la adsorción de la proteína a new specifi c microbial biosensor based on the ttgR-regulated promoter modelo lisozima a partículas coloidales de látex (de diámetro menor de which controls expression of the TtgABC extrusion effl ux pump, coupled 1 μm) e identifi cado sustancias que permiten la inhibición efectiva de to a gfp reporter. The system was introduced in Pseudomonas putida DOT- dicho proceso. Dada su naturaleza apolar y la presencia de cargas en su T1E, a strain characterized by its ability to survive in the presence of high superfi cie para asegurar su estabilidad coloidal (evitar su aglomeración), concentrations of diverse organic compounds. This whole-cell biosensor is la energía libre de adsorción contiene tanto un componente electrostático capable to detect a wide range of antibiotics, as well as organic compounds como otro hidrofóbico. Nuestros resultados indican que la adsorción such as toluene or fl avonoids. Our tool opens the possibility to screen a proteica presenta cooperatividad negativa debido a la repulsión wide range of toxic compounds by altering the TtgR binding site to obtain electrostática entre moléculas individuales de proteína adsorbidas sobre specifi c versions of this biosensor oriented to sense specifi c compounds. la superfi cie hidrofóbica. Como consecuencia, el nivel de recubrimiento (y la afi nidad aparente de la proteína por la superfi cie) es máximo a un pH cercano a su punto isoeléctrico disminuyendo a medida que aumenta P09-32 la carga de la proteína. Mediante calorimetría isoterma de titulación Análisis funcional de tres acil-CoA sintetasas hemos podido caracterizar termodinámicamente las contribuciones implicadas en la degradación de ácidos biliares electrostáticas e hidrofóbicas del proceso de adsorción así como en Pseudomonas putida DOC21 cuantifi car su inhibición mediante surfactantes y polímeros hidrofílicos como el polivinilalcohol. Álvaro Barrientos Castañeda, Estefanía Merino García, Joaquín Rodríguez Fernández, Esther Coto Alcaraz, Raquel Benavides Serrano, José María Luengo Rodríguez, Elías Rodríguez Olivera P09-30 (R09-2) Dpto Biología Molecular, Universidad de León, León, ES Visualizando ATP intracelular en células vivas Pseudomonas putida DOC21 es una g-proteobacteria aislada del medio ambiente por su capacidad para utilizar ácidos biliares y otros esteroides Vicente González Charro, Iván López Montero como única fuente de carbono. En el genoma de esta bacteria se han Universidad Complutense de Madrid, Madrid, ES identifi cado cinco clusters de genes que codifi can funciones implicadas con La molécula de ATP (adenosín trifosfato) es la principal fuente de el catabolismo de estos compuestos (genes std). Tres de estos genes codifi can energía necesaria para realizar trabajo biológico. La mayor parte de ATP posibles acil-CoA sintetasas implicadas en la degradación de ácidos biliares se genera mediante el proceso de respiración mitocondrial. Se sabe que (stdA1, stdA2 y stdA3). Se ha procedido a la mutación específi ca mediante el ATP generado es transportado al citosol en contra de un gradiente de deleción de cada uno de estos genes obteniéndose las cepas ΔstdA1, concentración, mediante el potencial de membrana actuando como fuerza ΔstdA2 y ΔstdA3. Dos de las cepas mutantes obtenidas, ΔstdA1 y ΔstdA2, motriz. Al mismo tiempo, el ADP se transporta activamente al interior resultaron incapaces de asimilar colato y otros ácidos biliares, no viéndose de las mitocondrias, manteniendo su concentración citosólica muy baja. afectado el metabolismo de testosterona y 4-androsten-3,17-diona. Por La relación de concentraciones de ATP:ADP en el citosol es del orden de el contrario, el tercer mutante, ΔstdA3, crecía con difi cultad en cualquier 200:1. Sin embargo no se conoce la distribución de ATP en los diferentes medio en el que la fuente de carbono fuera un compuesto esteroideo. compartimentos intracelulares debido a que los métodos convencionales Cuando se cultivaron dichos mutantes en medios conteniendo colato para la detección y cuantifi cación de ATP, basados en análisis de extractos como fuente de intermediarios metabólicos y con succinato como fuente celulares, sólo proporcionan niveles promediados de ATP. Por ello, la de carbono para soportar el crecimiento bacteriano, el mutante ΔstdA1 detección selectiva de ATP intracelular en células únicas vivas se ha acumulaba en los caldos de cultivo Δ1/4-3-cetocolato y Δ1,4-3-cetocolato, convertido recientemente en un tema de investigación muy activo. El el mutante ΔstdA2 acumulaba 7α,12α-dihidroxi-3-oxopregna-1,4-dien- diseño de sensores específi cos de ATP permitirá entender cómo se regula 20-carboxilato (DHOPDC), y el mutante ΔstdA3 mostraba un bloqueo la concentración de ATP intracelular a nivel de célula única. En esta metabólico a nivel del 3aα-H-4α(3’’’’propanoato)-7aβ-metilhexahidro- contribución se expondrán las diferentes aproximaciones, tanto químicas 1,5-indanodiona (HIP). Análisis bioquímicos posteriores demostraron que como biológicas, que se han realizado recientemente para monitorizar StdA1 cataliza la tioesterifi cación de colato, 3-cetocolato, Δ1/4-3-cetocolato y visualizar los niveles de ATP en células individuales y en tiempo real. y Δ1,4-3-cetocolato a sus respectivos derivados de CoA, la proteína StdA2 Además, se mostrarán resultados preliminares del uso de un sensor basado cataliza la transformación de DHOPDC a DHOPDC-CoA, mientras que la en rodamina tanto en células NIH3T3 como en sistemas de membrana enzima StdA3 lleva a cabo la tioesterifi cación del HIP y/o sus derivados artifi ciales. hidroxilados a sus tioésteres de coenzima A.

85 Pósters XXXVII Congreso SEBBM

P09-33 [3]. There is little known about the sequence of events that leads to SG Comparative evaluation of the antitumor formation but, in this work, we propose that the SG assembly by TIA- activity of new platinum based drugs on human 1 involves the nucleating trigger of dimerisation via RRM2. In addition, adenocarcioma cell lines post-translational modifi cations of TIA-1 (such as phosphorylation that occurs in cells under stress) can also lead to the SG formation. Enric Milà1, Roldán Cortés1, Margarita Crespo2, Laia Davin2, Raquel Fas-Activated Serine/Threonine Kinase (FAST K) is known to interact with Martín2, Josefi na Quirante3, Daniel Ruiz3, Ramon Messeguer4, and phosphorylate TIA-1 [4,5]. The substitution of three serines at TIA-1 Carme Calvis4, Laura Baldomà5, Josefa Badia5, Marta Cascante1 RRMs by either aspartic acid — serving as a phosphoserine mimic — or 1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Faculty of alanine — that can no longer be phosphorylated — helps to understand the Biology - IBUB, Universitat de Barcelona (UB), IDIBAPS, Unit structural effects of TIA-1 phosphorylation, as well as the TIA-1 capability Associated with CSIC, Barcelona, ES, 2Departament de Química of being phosphorylated by FAST K. In fact, we have explored how such Inorgànica and IBUB, Facultat de Química, UB, Barcelona, ES, Ser-by-Asp phosphomimetic mutants of TIA-1 trigger the conformational 3Laboratori de Química Orgànica, Facultat de Farmàcia, UB, changes required for RRM dimerisation and TIA-1 protein self-association Barcelona, ES, 4Biomed Division LEITAT Technological Center, Parc by combining Light Scattering and AU measurements with Molecular Científi c de Barcelona, Barcelona, ES, 5Departament de Bioquímica i Dynamics simulations. Biologia Molecular, Facultat de Farmàcia, IBUB, UB, Barcelona, ES Our hypothesis presents a novel paradigm for the fi eld of neurodegenerative research suggesting that the SG nucleation can be initiated by TIA-1 RRM It is estimated that 50-70% of cancer patients are treated with platinum (II) domains, rather than by the PRD module as is widely accepted. drugs. Despite the therapeutic benefi t of the approved platinum based drugs (cisplatin, carboplatinand Oxaliplatin), their effi cacy is still limited due to References side effects and resistances. Hence, great efforts have been undertaken to [1] Anderson P, Kedersha N. (2002) Visibly stressed: the role of eIF2, TIA- develop novel metal-based drugs. Over the last three decades thousands 1, and stress granules in protein translation Cell Stress Chaperones 7: 213- of Pt-containing compounds have been designed and tested, but just a few 221. of them have entered clinical use (carboplatin, oxaliplatin and nedaplatin) [2] Wolozin, B. (2012) Regulated protein aggregation: stress granules and or are in clinical trials. Despite the therapeutic benefi t of the approved neurodegeneration Mol Neurodegener.7: 56. platinum drug, the effi cacy of the treatments is still limited due to side [3] Wang I, Hennig J, Jagtap PK, Sonntag M, Valcárcel J, Sattler M. (2014) effects and intrinsic and acquired resistances. It is believed that DNA isthe Structure, dynamics and RNA binding of the multi-domain splicing factor main target of platinum drug and that cisplatin and its analogues form TIA-1 Nucleic Acids Res. 42: 5949-5966. an intrastrand d(GpG) adduct with platinum cross-linking N7 atoms of [4] Tian Q, Taupin J, Elledge S, Robertson M, Anderson P. (1995) Fas- neighbour guanine residues of DNA. It has been also shown that carrier activated serine/threonine kinase (FAST) phosphorylates TIA-1 during amine ligands of cisplatin analogues appear to modulate the antitumor Fas-mediated apoptosis J. Exp. Med. 182: 865-874. properties of this class of drugs. Cyclometalating N-donor ligands may [5] Izquierdo, JM, Valcarcel J. (2007) Fas-activated serine/threonine kinase offer an alternative approach to give structures quite different from that (FAST K) synergizes with TIA-1/TIAR proteins to regulate Fas alternative of cisplatin and analogs, with the possibility that those could interact in splicing. J. Biol. Chem. 282: 1539-1543. a different way with DNA and consequently show a different spectrum of activity and toxicity profi le. We have been recently involved in the synthesis of a novel class of seven-membered platinacycles, and the lack of information on the biological activity of these compounds prompted us to P10-2 undertake the present study. Nucleophosmin stabilization as a strategy to prevent its mislocalization in leukemia

Sonia Bañuelos1, Igor Arregi1, María Sendino1, Marián Alonso- Mariño1, José Antonio Rodríguez2, Jarl Underhaug3, Aurora P10. Estructura y función de proteínas Martínez3, Maria Ángeles Urbaneja1 1Unidad de Biofísica (CSIC/UPV-EHU) and Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of the Basque P10-1 Country, Leioa, ES, 2Department of Genetics, Physical Anthropology Effect of TIA-1 phosphorylation in dimerisation and Animal Physiology, University of the Basque Country, Leioa, ES, and stress granule formation 3Department of Biomedicine, University of Bergen, Bergen, NO Nucleophosmin (NPM) is a protein involved in ribosome biogenesis and Sofía Muñoz García-Mauriño1 1 , Isabel Cruz-Gallardo , Antonio other functions affecting cell proliferation. NPM is oligomeric and built 1 2 3 Díaz-Quintana , Myriam Gorospe , Jacqueline A. Wilce , Irene Díaz- of several domains: a compact, pentameric core, is connected through 1 Moreno long and fl exible linkers to small, helical C-terminal domains. Albeit 1 Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, cicCartuja, continuously shuttling between nucleolus, nucleoplasm and cytoplasm, 2 Universidad de Sevilla – CSIC, Sevilla, ES, Laboratory of Genetics, NPM is mostly enriched in nucleoli, which probably depends on its binding National Institute on Aging-Intramural Research Program, NIH, to G-rich sequences of nucleic acids. NPM deregulation has been related 3 Baltimore, US, Department of Biochemistry and Molecular Biology, to different types of cancer; in particular, NPM1 is the most frequently Monash University, Victoria, AU mutated gene in acute myeloid leukemia (AML), and these mutations TIA-1 (T-cell restricted Intracellular Antigen-1) is an RNA-Binding Protein cause the aberrant localization of the protein to the cytoplasm. It has (RBP) that functions as a translational repressor, sequestering target mRNA been shown that AML-related mutations confer NPM an additional NES into stress granules (SG) upon cellular stress [1]. It has been shown that the (nuclear export sequence), and impair folding of the C-terminal domain deregulation of this system results in neurodegenerative diseases such as (e.g., abolishing ability to bind nucleic acids and hence to the nucleolus), Alzheimer [2]. all in all displacing the protein to the cytoplasm. Therefore, AML can be TIA-1 is constituted by three RNA Recognition Motifs (RRMs) and regarded as a “misfolding disease”. The “pharmacological chaperones” a Prion-Related Domain (PRD). Preliminary work using EMSA and approach is an interesting strategy to restore the conformational stability Analytical Ultracentrifugation (AU) revealed that TIA-1 RRM2 has a high of misfolded proteins. Probing for changes in the thermal stability of propensity to form dimers, while TIA-1 RRM23 or RRM3 alone behave as NPM C-terminal domain, we have performed a high throughput screening a stable monomer, in agreement with recent NMR relaxation measurements of a natural compound library. 25 hits were found to increase the Tm of 86 Granada 2014 Pósters the domain by 6-21ºC. We have then tested the effect of some of these prognosis because of its remarkable capacity for invasion and metastasis. compounds on the subcellular localization of AML-like mutants in HeLa PDAC exhibits an extremely low survival rate (<3-4% at 5 years), due to its cells expressing fl uorescent NPM constructs. One compound is able to diffi cult diagnosis in early stages, and its high resistance to chemotherapy partially restore nucleolar localization whereas another one alleviates and radiotherapy. Hence, there is an urgent need to develop new and the protein aggregation of misfolded mutants. We conclude that these effective therapies against this disease.Protein NUPR1 (Nuclear Protein compounds might help to promote native localization and functionality of 1), also known as p8, is a nuclear protein overexpressed in several types mutant, oncogenic NPM. of human cancers (breast, thyroid, skin...), especially in PDAC, where NUPR1 is essential for the development and progression of the tumor. Several studies have shown that blocking NUPR1 expression in pancreatic P10-3 Recognition of nucleophosmin by the export cancer cells prevents the formation of tumors, thus, confi rming its key role in PDAC. receptor Crm1: deciphering the basis of aberrant NUPR1 protein is a small (82 aminoacid residues), basic and multifunctional traffic in leukemia protein without stable secondary and tertiary structure, belonging to the groupof intrinsically disorderedproteins (IDP’s). Its interaction with its Igor Arregi Vado1, Marián Alonso-Mariño1, José Antonio Rodríguez2, different partners promotes the mutual stabilization of their structures María Ángeles Urbaneja1, Sonia Bañuelos1 in a particular conformation and the formation of fuzzy, but biologically 1Unidad de Biofísica (CSIC/UPV-EHU) and Department of active complex. NUPR1 fuzzy complexes are involved in the regulation of Biochemistry and Molecular Biology, University of the Basque important cellular processes, such as transcription of genes, cellular cycle, Country, Leioa, ES, 2Departamento de Genética, Antropología Física y Fisiología Animal. Facultad de Ciencias, EHU/UPV, Leioa, ES or apoptosis. In our group, we have developed a new strategy for identifying compounds Nucleophosmin (NPM) is a nucleolar protein involved in several functions capable of blocking NUPR1 intracellular interactions. The in vitro selected impacting cell growth, such as the assembly and export of ribosomes from compounds inhibited NUPR1 interactions with one of its cellular partners the nucleolus to the cytoplasm. NPM is an oligomeric, multidomain protein, and effi ciently blocked NUPR1 function in cell-based studies. built of a compact core, connected to C-terminal, globular domains through long, fl exible linkers. Although NPM is normally enriched in nucleoli, its activities require continuous shuttling between nucleolus, nucleoplasm Keywords: NUPR1, PDAC, IDPs, Thermal stability, Structural characterization and cytoplasm. This traffi c relies on different localization signals in the of proteins, HTS. protein: NLS for import, Crm1-dependent NES for export, and C-terminal domains for binding to nucleolar components. NPM deregulation has been related to different types of cancer; in particular, NPM1 gene is P10-5 (R10-1) frequently mutated in acute myeloid leukemia (AML), correlating with an Dissecting I-DmoI endonuclease catalysis “live” aberrant, cytoplasmic localization of the protein. It has been shown that Rafael Molina Monterrubio1 2 1 AML-related mutations of NPM impair folding of the C-terminal domain, , Stefano Stella , Pilar Redondo , Hansel 3 4 3 1 hampering attachment to the nucleolus, and confer an additional NES, Gomez , Maria Jose Marcaida , Modesto Orozco , Jesus Prieto , 2 both factors contributing to displacement of the protein to the cytoplasm. Guillermo Montoya The molecular determinants of wild type NPM recognition by the export 1Structural Biology and Biocomputing Programme, Spanish National receptor Crm1 are not yet understood; on the other hand, the subcellular Cancer Research Centre (CNIO), Macromolecular Crystallography localization of mutant NPM in AML remains to be explained in terms of Group, Madrid, ES, 2Structural Biology Group, Novo Nordisk Crm1 binding properties. To better understand the determinants of NPM Foundation Center for Protein Research, Faculty of Health and cellular traffi c, both in physiological and pathological conditions, we are Medical Sciences, University of Copenhagen, Copenhagen, DK, characterizing NPM recognition by Crm1, and the effect of AML mutations 3Institute for Research in Biomedicine (IRB Barcelona,Joint on the interaction. We have observed that AML-related NPM mutants BSC-CRG-IRB Program in Computational Biology and Department bind indeed with stronger avidity to Crm1, explaining their unbalanced of Biochemistry and Molecular Biology, University of Barcelona, transport in leukemia. Barcelona, ES, 4Department of Chemistry and Biochemistry, University of Bern, Bern, CH The enzymatic hydrolysis of a DNA phoshpodiester bond has been widely P10-4 Identifying protein-protein interaction inhibitors studied; however, the chemical reaction has not been directly observed. for NUPR1, a key therapeutic target in Here we watch the course of a double strand break generation by I-DmoI, a homing endonuclease. The catalysis of this enzyme family is similar to pancreatic cancer type II restriction enzymes, which are general tools in molecular biology and boosted the recombinant DNA technology. By using a “dynamic” María Arruebo1, Ángel Lanas2, José L. Neira3, Juan L. Iovanna4, Adrián Velázquez-Campoy5, Olga Abián6 crystallography approach we provide the fi rst time-resolved view of a 1IIS Aragón / Instituto Aragonés de Ciencias de la Salud-IACS, two-metal ion cleavage mechanism, a central reaction to modify and edit Zaragoza, ES, 2IIS Aragón, Universidad de Zaragoza, Servicio DNA. We developed a procedure to capture intermediates of the different de Digestivo - Hospital Clínico Universitario Lozano Blesa de catalytic steps allowing us to analyse and watch the reaction by “freezing” Zaragoza, Zaragoza, ES, 3Instituto de Biología Molecular y Celular, multiple stages. We observe the successive entrance of two metals involved Universidad Miguel Hernández - Instituto de Biocomputación y in the reaction, and fi nally the arrival of a third metal in a central position Física de Sistemas Complejos (BIFI), Universidad de Zaragoza, of the active site. This metal plays a pivotal role triggering the consecutive Elche, ES, 4Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille digestion of the targeted phosphodiester bonds in the non-coding and coding (CRCM), INSERM U1068, Marsella, FR, 5BIFI - Universidad de strands. Finally, the central metal abandons its position after double strand Zaragoza - Fundación ARAID, Diputación General de Aragón, break generating a 4bp DNA overhang. We solved more than 150 crystal Zaragoza, ES, 6IIS Aragón/Instituto Aragonés de Ciencias de la structures to obtain key snapshots of different catalytic stages, showing the Salud (IACS) - BIFI - Universidad de Zaragoza, Zaragoza, ES orchestrated conformational changes in the amino acids, nucleotides and Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), the most common type of metals during catalysis. Our work provides a “live” and visual proof of this pancreatic cancer, is one of the most aggressive human cancers and worse key biological mechanism.

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P10-6 P10-8 (R10-3) The Proliferating Cell Nuclear Antigen-associated Instruct: infraestructura europea para biología factor p15PAF is an intrinsically disordered estructural protein with non-random structural preferences Carlos Oscar Sorzano Sánchez1, José María Carazo2 at sites of interaction with other proteins 1Centro Nacional de Biotecnología, Madrid, ES, 2Centro Nacional de Biotecnología, CSIC, Madrid, ES Alfredo De Biasio1, Alain Ibáñez de Opakua1, Tiago N. Cordeiro2, La biología estructural proporciona información muy valiosa sobre los Maider Villate1, Nekane Merino1, Nathalie Sibille2, Moreno Lelli3, mecanismos biológicos implicados en el funcionamiento fi siológico y Tammo Diercks1, Pau Bernadó2, Francisco J Blanco4 patológico de las células. La obtención de información experimental 1 2 CIC bioGUNE, Derio, ES, Centre de Biochimie Structurale, de alta calidad depende en gran medida del acceso a infraestructuras 3 Montpellier, FR, Institut de Sciences Analytiques, Villeurbanne, de última generación para el análisis de estructuras biológicas desde 4 FR, IKERBASQUE, Bilbao, ES resolución celular a resolución atómica utilizando cristalografía de rayos We present the fi rst structural characterization of the p15PAF protein X, resonancia magnética nuclear, tomografía electrónica, así como otras showing that it is monomeric and intrinsically disordered in solution técnicas biofísicas y bioquímicas. Instruct es una infraestructura europea but with non-random conformational preferences at sites of protein- cuyo objetivo es proporcionar acceso mediante un proceso de revisión protein interactions. The Proliferating Cell Nuclear Antigen-associated por pares a un amplio abanico de técnicas para el estudio estructural. factor p15PAF is a 12 kDa nuclear protein that acts as a regulator of Instruct tiene un modelo de nodos con un nodo central. El nodo central DNA repair during DNA replication. The p15PAF gene is overexpressed coordina actividades como decisiones estratégicas, acceso al portal web, in several types of human cancer. The nearly complete NMR backbone cursos, colaboraciones con la industria mientras que los nodos nacionales assignment of p15PAF allowed us to measure 86 N-HN residual dipolar coordinan el acceso de los usuarios de ese país. En esta charla se expondrán couplings (RDCs). Our RDC analysis reveals non-random conformational los recursos disponibles a través de Instruct así como el proceso para preferences in distinct regions, including the PCNA-interacting protein solicitarlos. motif (PIP-box) and the KEN-box (recognized by the ubiquitin ligase that targets p15PAF for degradation). In accordance with these fi ndings, the P10r-9 analysis of the 15N R2 relaxation rates shows a relatively reduced mobility The interaction of TIA-1 with C-rich RNA for the residues in these regions. The agreement between the experimental small angle X-ray scattering curve of p15PAF and that computed from sequences is driven by its pH-dependent RRM3 a statistical coil ensemble corrected for the presence of local secondary domain structural elements further validates our structural model for p15PAF. The Isabel Cruz-Gallardo1, Jesús Angulo2, Myriam Gorospe3, B. Göran coincidence of these transiently structured regions with protein-protein Karlsson4, Jacqueline A. Wilce5, Miguel A. De la Rosa1, Irene Díaz- interaction and post-translational modifi cation sites suggests a possible role Moreno1 for these structures as molecular recognition elements for p15PAF. 1Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, cicCartuja, Universidad de Sevilla - CSIC, Sevilla, ES, 2School of Pharmacy, University of East Anglia - Norwich Research Park, Norwich, P10-7 (R10-2) UK,3Laboratory of Genetics, National Institute on Aging-Intramural Structural basis of regulation and oligomerization Research Program, NIH, Baltimore, US, 4Swedish NMR Centre, of human cystathionine β-synthase, the central University of Gothenburg, Gothenburg, SE, 5Department of enzyme of transsulfuration Biochemistry and Molecular Biology, Monash University, Victoria, AU June Ereño Orbea T-cell intracellular antigen-1 (TIA-1) is a key RNA binding protein that CICBiogune, Derio, ES regulates critical events in cell physiology by the regulation of pre-mRNA Cystathionine β-synthase (CBS) controls the fl ux of sulfur from splicing and mRNA translation [1, 2]. It possesses three RNA recognition motifs (RRM) along with a glutamine-rich domain, with the central methionine to cysteine, a precursor of glutathione, taurine, and H2S. CBS condenses serine and homocysteine to cystathionine with the help of three domains (RRM2 and RRM3) acting as RNA binding platforms. While cofactors, heme, pyridoxal-5′-phosphate, and S-adenosyl-L-methionine. RRM2 domain is primarily responsible for the RNA interaction, the RRM3 Inherited defi ciency of CBS activity causes homocystinuria, the most contribution to the RNA binding, as well as its targets sequences, are still frequent disorder of sulfur metabolism. We present the structure of the unknown. Here we combine Nuclear Magnetic Resonance (NMR), Surface Plasmon Resonance (SPR) and pull-down assays to elucidate the sequence human enzyme, discuss the unique arrangement of the CBS domains in specifi city of TIA-1 RRM3 [3]. We demonstrate that RRM3 signifi cantly the C-terminal region, and propose how they interact with the catalytic binds to those oligonucleotides enriched with cytosines. Notably, in core of the complementary subunit to regulate access to the catalytic site. combination with RRM2 or in the context of the full length protein, the This arrangement clearly contrasts with other proteins containing the CBS RRM3 domain enhances the binding to C-rich sequences. In addition, the domain including the recent Drosophila melanogaster CBS structure. The binding of RRM3 to RNA is modifi ed by pH conditions, having a signifi cant absence of large conformational changes and the crystal structure of the effect on the overall interaction of TIA-1 protein [4]. Our fi ndings provide partially activated pathogenic D444N mutant suggest that the rotation of a new insight into the role of RRM3 in regulating TIA-1 binding to C-rich CBS motifs and relaxation of loops delineating the entrance to the catalytic stretches, abundant at the 5’ TOPs (5’ Terminal Oligopyrimidine Tracts) of site represent the most likely molecular mechanism of CBS activation translationally-repressed mRNAs under stress situations [5]. by S-adenosyl-L-methionine. Moreover, our data suggest how tetramers, the native quaternary structure of the mammalian CBS enzymes, are References formed. Because of its central role in transsulfuration, redox status, and [1] Förch et al. (2000). Mol Cell, 6: 1089-1098.

H2S biogenesis, CBS represents a very attractive therapeutic target. The [2] Mazan-Mamczarz et al. (2006). Mol Cell Biol, 26: 2716-2727. availability of the structure will help us understand the pathogenicity of the [3] Cruz-Gallardo, I. et al. (2014) RNA Biol, 11. numerous missense mutations causing inherited homocystinuria and will [4] Cruz-Gallardo, I. et al. (2013). J Biol Chem, 288: 20896-20907. allow the rational design of compounds modulating CBS activity. [5] Damgaard and Lykke-Andersen. (2011) Genes Dev, 25: 2057-2068.

88 Granada 2014 Pósters

Acknowledgements: Andalusian Government (P07-CVI-02896, P08- of the c-Src-SH3 distal loop, also resulting in conformational changes of CVI-3876, P11-CVI-7216 and BIO198); Bio-NMR Research Infrastructure Leu100 that might be related to the binding of proline rich motifs. Our ﬁ ndings co-funded by EC (FP7/2007-2013, grant agreement 26186 and BIO- show that electrostatic interactions and solvation of the residues close to the NMR-00190); NMR services at the Centro de Investigación Tecnología e folding nucleation site of the c-Src-SH3 domain might play an important role Innovación de la Universidad de Sevilla (CITIUS). during folding reaction and amyloid ﬁ bril formation.

Acknowledgements: This research was funded by the Spanish Ministry of P10-10 (R10-6) Science and Innovation and Ministry of Economy and Competitiveness and Structural basis for the recruitment and FEDER (EU) [BIO2009-13261-C02-01/02 BIO2012-39922-C02-01/02, activation of the Legionella phospholipase VipD CTQ2013-4493 and CSD2008-00005], Andalusian and Valentian Regional Government (Spain) and FEDER (EU) [P09-CVI-5063 and by the host GTPase Rab5 P10-CVI-5915; Prometeo 2013/018]. Data collection was supported Maria Lucas1, Andrew H. Gaspar2, Chiara Pallara3, Ander by European Synchrotron Radiation Facility (ESRF, Grenoble, France) Vidaurrazaga1, Adriana L. Rojas1, Matthias P. Machner2, Aitor [BAG proposals MX-1406 and MX-1541] and ALBA (Barcelona, Spain) Hierro1 [proposals 2012010072 and 2012100378]. This work has been performed 1CIC bioGUNE, Derio, ES, 2Cell Biology and Metabolism by members of the research groups BIO-328 Protein Structures of the Program, National Institute of Health, Bethesda, US, 3Barcelona Andalusian Regional Government (Spain). We thank the staff at the ID14-4 Supercomputing Center, Barcelona, ES beamline of the ESRF (Grenoble, France) and specially we would also like to thank the beam line XALOC from the Spanish Synchrotron Radiation A challenge for microbial pathogens is to assure that their translocated effector Facility ALBA and Jordi Juanhuix, Jordi Benach and Fernando Gil for proteins modulate only the correct host cell compartment during infection. The their assistance in the measurement of the crystals. Legionella pneumophila effector protein VipD localizes to early endosomal membranes and alters their lipid and protein composition, thereby protecting the pathogen from endosomal fusion. This process requires the phospholipase A1 P10r-12 (PLA1) activity of VipD that is triggered specifi cally upon binding to the host Structural approaches on YIH1: a protein cell GTPase Rab5, a key regulator of endosomes. Here, we present the crystal structure of VipD in complex with constitutively active Rab5 and reveal the involved in protein synthesis control under molecular mechanism underlying PLA1 activation. An active site-obstructing stravation conditions loop that originates from the C-terminal domain of VipD is repositioned upon Sara Zamora Caballero1 1 Rab5 binding, thereby exposing the catalytic pocket within the N-terminal , Jerónimo Bravo Sicilia , Bertrand 2 PLA1 domain. Substitution of amino acid residues located within the VipD- Séraphin 1 Rab5 interface prevented PLA1 activation and caused a failure of VipD Instituto de Biomedicina de Valencia (CSIC), Valencia, ES, 2 mutant proteins to target to Rab5-enriched endosomal structures within cells. IGBMC, Illkirch, FR Experimental and computational analyses confi rmed an extended VipD- Protein synthesis is an essential and complex process that is susceptible to binding interface on Rab5 that explains why this L. pneumophila effector can different environmental situations. One of them might be the accumulation compete with cellular ligands for Rab5 binding. Together, our data explain how of uncharged tRNAs due to starvation, leading to the activation of a cell the catalytic activity within microbial effectors can be precisely linked to their response that affects general protein synthesis. The proposed mechanism subcellular localization. requires GCN2 binding to GCN1, being this interaction mediated by the GCN2 RWD domain. Once these two proteins have interacted, the complex binds to the ribosome, what is essential for the detection of empty tRNAs; P10r-11 since GCN1 is thought to facilitate the transfer of uncharged tRNAs from the Electrostatic effects in the folding of the ribosome to the histidyl tRNA synthetase like domain of Gcn2. This signal SH3 domain of the c-Src tyrosine kinase: pH- activates the kinase domain of GCN2, leading EIF2α phosphorylation, which promotes the translation of some determinant transcription activators of dependence in 3D-domain swapping and amyloid amino acid biosynthetic genes and also represses general protein synthesis. formation YIH1 (yeast IMPACT homolog 1) also contains a RWD domain that interacts with GCN1 through the same region as GCN2, thus competing Julio Luis Bacarizo Roa1 1 , Ana Cámara Artigas , Sergio Martínez with GCN2 for GCN1 binding and down-regulating GCN2 activation. 2 3 1 Rodríguez , José Luis Neira Faleiro , José Manuel Martín García , Our aim is to elucidate the crystal structure of the YIH1-GCN1 complex. 1 1 Montserrat Andújar Sánchez , Emilia Ortíz Salmerón Here we present the crystallization trials of this complex and also, the 1 2 Universidad de Almería, Aguadulce, ES, Universidad de Granada, C-terminal structure of a fungi YIH1 homolog. This C-terminal belongs 3 Almería, ES, Universidad Miguel Hernández, Elche, ES to the UPF 0029 group in Pfam with unknown functions described. It is The SH3 domain of the c-Src tyrosine kinase (c-Src-SH3) aggregates to form conserved in both procariotes and eucariotes. This domain is organized as intertwined dimers and amyloid fi brils at mild acidic pHs. In this work, we show beta-alpha-beta-beta-alpha-beta, similar to a ferredoxin like domain. that a single mutation of residue Gln128 of this SH3 domain has a signifi cant effect on: (i) its thermal stability; and (ii) its propensity to form amyloid fi brils; the Gln128Glu mutant forms amyloid fi brils at neutral pH but not at mild acidic P10r-13 pH, while Gln128Lys and Gln128Arg mutants do not form these aggregates Melanocortin receptor 1 (MC1R) variants under any of the conditions assayed. We have also solved the crystallographic and human pigmentation phenotypes. structures of the wild-type (WT) and Gln128Glu, Gln128Lys and Gln128Arg mutants from crystals obtained at different pHs. At pH 5.0, crystals belong to Characterization of a MC1R mutant from a family the hexagonal space group P6522 and the asymmetric unit is formed by a chain with hypopigmentation of skin and hair of the protomer of the c-Src-SH3 domain in an open conformation. At pH 7.0, Julia Sirés-Campos crystals belong to the orthorhombic space group P212121, with two molecules , Marta Abrisqueta González, Celia Jiménez- at the asymmetric unit showing the characteristic fold of the SH3 domain. Cervantes, José Carlos García-Borrón Martínez, Conchi Olivares Sánchez Analysis of these crystallographic structures shows that the residue at position Universidad de Murcia, Murcia, ES 128 is connected to Glu106 at the diverging β-turn through a cluster of water Melanocortin 1 receptor (MC1R) is a Gs protein-coupled receptor molecules. Changes in this hydrogen-bond network leads to the displacement (GPCR) expressed on the surface of melanocytes and crucial for the

89 Pósters XXXVII Congreso SEBBM regulation of its proliferation and function. Upon binding melanocortins, P10-15 MC1R activates the cAMP pathway, ultimately leading to synthesis Estudio estructural de dUTPasas diméricas of photoprotective eumelanins. Conversely, defective signaling is virales associated with pheomelanogenesis. MC1R gene is highly polymorphic Elisa Maiques1 1 1 and differences in signaling by MC1R variants result in diverse human , Jordi Donderis , Ilty Mehmedov , María Angeles 2 2 3 1 skin pigmentation and skin cancer susceptibility. The MC1R is seven- Tormo-Más , María García , José R. Penadés , Alberto Marina 1 pass integral transmembrane protein with the canonical GPCRs Instituto de Biomedicina de Valencia (IBV-CSIC), Valencia, ES, 2 structure. The C-terminal domain may play an important role in receptor Centro de Investigación y Tecnología Animal (CITA-IVIA), Segorbe, 3 traffi cking, functional coupling and regulation of signaling. We have ES, Institute of Infection, Immunity, and Infl ammation, College of Medical, Veterinary, and Life Sciences, University of Glasgow, analyzed for function a new natural nonsense mutation resulting in the Glasgow, UK premature truncation of the C-terminal tail. This p.Y298* mutation was found in human family with hypopigmentation. Deletion of the complete Las dUTPasas (Dut) son enzimas presentes en todos los organismos, cytoplasmic C-terminus in the mutant protein reduced functional responsables de mantener los niveles celulares de dUTP bajos, al hidrolizar coupling to the cAMP pathway to almost undetectable levels. The este nucleótido a dUMP y pirofosfato. Según su estado de oligomerización, residual activity was lower for p.Y298* than for most hypomorphic red las Dut se clasifi can en tres grupos, monoméricas, diméricas y triméricas. hair color-associated alleles. The electrophoretic pattern was similar Tanto las Dut monoméricas como las triméricas, a pesar de no tener una for the p.Y298* and wildtype proteins, indicative of comparable post- elevada homología a nivel de secuencia, presentan un plegamiento similar formado por hojas betas que generan un centro activo común. En cambio, translational processing and oligomerization. Signifi cant expression of las Dut diméricas son proteínas cuya estructura secundaria está formada the p.Y298* variant on the cell surface was detected by ELISA in non- por α-hélices, por tanto, con un plegamiento diferente al de las otras Dut. permeabilized heterologous cells and confi rmed by confocal microscopy, Además, las propiedades bioquímicas de las enzimas pertenecientes a este thus challenging the current view of the role of the MC1R C-terminus in grupo también difi eren de otras Dut, siendo capaces de hidrolizar tanto forward traffi cking through the biosynthetic-secretory pathway. However, dUTP como dUDP. the intracellular half-life of the p.Y298* mutant in transiently transfected Aunque las Dut diméricas son un grupo menor dentro de la familia, son cells was shorter, compared with wildtype, suggesting sensitivity to las que presentan patógenos como Leishmania major, Trypanosoma cruzi proteolytic digestion and a faster turnover. y Campylobacter jejuni. Diferentes bacteriófagos de Staphylococcus aureus presentan este tipo de Dut diméricas, mientras que otros presentan las más predominantes Dut triméricas. Las Dut triméricas han sido P10r-14 ampliamente caracterizadas a nivel estructural, habiendo estructuras de Structural characterization of the β-propeller todos los reinos, desde virus hasta el hombre, incluyendo Dut de fagos domain of Erb1, an essential protein in de S. aureus, donde nuestro grupo ha contribuido de forma importante. eukaryotic ribosome biogenesis Por el contrario, la caracterización estructural de Dut diméricas se reduce a pocos ejemplos. En esta comunicación presentaremos trabajo reciente Marcin Wegrecki, Jerónimo Bravo del laboratorio que nos ha permitido resolver la estructura tridimensional Instituto de Biomedicina de Valencia - CSIC, Valencia, ES de 3 Dut diméricas de diferentes fagos S. aureus, ϕDI, ϕO11 y ϕ55, en sus formas Apo y unidas a dUMPnPP. La comparación de estas Erb1 (Bop1 in mammals) is a eukaryotic protein essential in ribosome estructuras entre sí, y con los pocos ejemplos depositados en el PDB, nos biogenesis. Altogether with Nop7 and Ytm1 it forms a stable complex han permitido delimitar un módulo mínimo compuesto por 4 α-hélices that participates in early steps of rRNA processing and is necessary for implicadas en el reconocimiento e hidrólisis del nucleótido. A este núcleo the proper maturation of the 60S ribosomal subunit although its exact básico se suman múltiples inserciones variables en secuencia y tamaño implication in the process remains unknown. The amino terminal part of cuya implicación en la catálisis y/o otras funciones será discutida en la Erb1 harbors a poorly characterized domain (BopNt) which is directly presentación. responsible for its function and binding to Nop7, whereas the carboxy- terminus of the protein contains a big β-propeller domain that is formed by seven WD repeats. It has been postulated that this C-terminal region P10-16 is not directly involved in the main function of the protein during 60S Structural and dynamic study of the response synthesis; nevertheless it is well conserved within the Erb1/Bop1 family regulator CheY3 from the R. sphaeroides and provides an extensive surface for possible protein-protein and protein- RNA interactions. In total, 22 pre-ribosomal factors contain a β-propeller chemotaxis network domain in their structure indicating that it is one of the most common folds Lorena Varela, Christian Bell, Judith Armitage, Christina Redfi eld that maintain the complex network of interactions required for the 60S Universidad de Oxford, Oxford, UK assembly. The process by which bacteria bias their motility, enabling them to move Here we present the crystal structure of the β-propeller domain of Erb1 towards favourable chemical stimuli and away from unfavourable ones, is from Saccharomyces cerevisiae at 1.6Å (residues 417-807) that was known as chemotaxis. obtained as a result of random proteolysis event during crystallization The chemotaxis signalling network of E. coli. depends on trials of Erb1/Nop7 dimer. The structural information allowed us to autophosphorylation of a histidine protein kinase (HPK) in response to a exactly defi ne the boundaries of the domain and to describe its particular signal from a sensor domain, with subsequent transfer of the phosphoryl features, being the presence of a long insertion within the second WD group to an aspartate on response regulator (RR) proteins that bind to the repeat the most distinctive characteristic. This additional segment forms a fl agellar motor and alter its rotation. CheY is a simple 14kDa single domain protrusion on the surface of the propeller and may play an important role RR that is conserved across motile species. It is formed by 5 alpha-helices in peptide binding. We conclude that the proper folding of the insertion is and 5 beta-strands surrounding a conserved phosphoryl accepting aspartate determined by the neighboring blades of the propeller. The analysis of the residue, and once phosphorylated diffuses to the fl agellar motor, binding to electrostatic surface and conserved hot-spot residues allows us to predict its FliM component to cause switching of rotational direction and, hence, a the patches that might be involved in protein-protein interactions. At last, change from smooth-swimming to tumbling. we show that the propeller binds to RNA through a defi ned surface that The photosynthetic bacterium Rhodobacter sphaeroides has multiple can be saturated. chemosensory pathways formed by homologues of the E. coli chemosensory

90 Granada 2014 Pósters proteins. It has six homologues of the response regulator CheY and they all P10-18 have different effects on chemotaxis. Characterization of canine adipose derived In this work we have used solution-state NMR methods to answer mesenchymal stem cell population: expression important questions about the structure, dynamics and function of the of metalloproteinases MMP-2 and MMP-9 6 highly homologous CheYs from R. sphaeroides. We have performed +2 1 2 3 a detailed study on how conditions (Mg and BeF3 concentrations, Guillermo Mejías Martínez , Leticia G. León , Maria Luisa Fermín , pH) affect the structure and function of the CheY3 protein. Under Elena Merino1, Cristina Fragío3, Elisabeth Kremmer4, Concepción Tejero Ortego1 conditions where CheY3 is inactive (no BeF3 bound) and at low pH we have detected one minor and one major protein conformation and upon 1Department of Biochemistry and Molecular Biology IV, Veterinary pH increase these populations are inverted and fi nally only one species Faculty (UCM), Madrid, ES, 2Center of Biomedical Investigations is present. We have observed that only at high pH is Mg+2required for from Canarias (CIBICAN) - Institute of Biomedical Technologies 3 the protein to bind BeF , a phosphorylation mimic, and the affi nity for (ITB) (ULL), La Laguna, ES, Department of Animal Medicine 3 4 Mg+2 is considerably higher than at low pH. We have evidence for the and Surgery, Veterinary Faculty (UCM), Madrid, ES, Institut für Immunologie, GSF-Forschungszentrum Umwelt und Gesundheit, presence of two binding sites for Mg+2, one with very high affi nity and München, DE one with lower affi nity locatedclose to the BeF3 binding site. We have also investigated backbone dynamics of the inactive and active forms Adult mesenchymal stem cells (MSC) are multipotent cells able to of CheY3 using heteronuclear NOE experiments and no signifi cant differentiate into adipogenic, condrogenic and osteogenic lineages. differences have been observed suggesting that the fl exibility of both Initially MSC source has been bone marrow, however currently adipose conformations is similar. Finally, we have assigned the backbone tissue-derived stem cells (ADSCs) has been shown as an interesting alternative source, making these cells particularly attractive for therapeutic resonances of CheY3 in their inactive and active states using triple- exploitation.The aim of this work was to develop an easy-to-use protocol resonance NMR methods and information about secondary structure to isolate and characterize canine MSCs from adipose tissue. In addition, has been obtained from the analysis of 1H, 13C and 15N chemical shifts considering the role of MMP-2 and MMP-9 in migration and facilitating using TALOS as well as CD experiments. homing to the injured tissue, a study of its expression has been done. Peritoneal fat was obtained from clinically healthy bitches at the time of elective ovariohysterectomy, digested with collagenase I and then isolated P10-17 by centrifugation and fi ltration. cMSCs were cultured in IMDM medium at Biophysical characterization of the L-isoaspartyl 2 7000 cell/cm with 10% dog serum at 38ºC, 5% CO2 and 90% air humidity. O-methyltransferase from Escherichia coli In vitro growth is exponential until 25-30 days, and doubling time of all samples studied remains constant throughout 1-4th passages. Dot plot of Emilio José González Ramirez1 2 , Sergio Martínez-Rodriguez , Emilia stained cMSC after incubation with primary antibodies reveal that these Ortiz-Salmerón1, Montserrat Andújar-Sánchez1, Ana Cámara-Artigas1 cells had positive results for CD90 and negative for CD34, CD45 and 1Departamento de Química y Física, Escuela Politécnica y Facultad MHC-II. Gelatin zymografy reveal the expression of MMP-2 and MMP-9. de Ciencias Experimentales, Universidad de Almería, Almería, In conclusion, we have isolated and characterized a canine adipose ES, 2Departamento de Química y Física, Universidad de Granada, tissue-derived mesenchymal stem cells population. As far as we know, Granada, ES we provided the fi rst evidence that canine mesenchymal derived adipose cells constitutively express MMP-2 and MMP-9. Further investigations on The protein L-isoaspartyl O-methyltransferase (PIMT) is a highly cMSC differentiation into specifi c tissues may lead to the development of conserved enzyme found in a wide diversity of organisms, including novel therapeutic strategies to target specifi c diseases. plants, insects, bacteria, and mammals. Its function is to recognize L-Isoaspartyl residues in proteins and revert to L-aspartyl residues. This action takes places by the transfer of a methyl group from S-adenosyl-L- P10r-19 methionine (AdoMet) to the α-carboxyl of the L-isoaspartyl group, which Inhibition of Type IV secretion ATPase TrwD forms a succinimide, and subsequent hydrolysis converts a fraction of by unsaturated fatty acids as a potential tool these residues to aspartyls [1].There are several studies on E.coli PIMT (EC-PIMT) functional features, but the knowledge about its biophysical to prevent wide spread dissemination of behavior is scarce. We have performed a biophysical characterization antibiotic resistance genes of this enzyme by using spectroscopic techniques. Our results shows Yolanda García Cazorla1, Jorge Ripoll Rozada2, Cristina Machón3, that E.Coli PIMT is monomeric in all the range of pH assayed (2-12) María Getino1, Fernando de la Cruz1, Elena Cabezón1, Ignacio and protein concentration (1-10 mg·mL-1) at temperatures below 45oC. Arechaga1 We have also characterized the stability of the protein by means of 1Departamento de Biología Molecular, Universidad de Cantabria, e fl uorescence emission. Our results show that the protein denaturizes at Instituto de Biomedicina y Biotecnología de Cantabria (IBBTEC), urea concentrations higher than 2.5 M. CSIC-UC-IDICAN, Santander, ES, 2Instituto de Biología Molecular e Celular (IBMC), Porto, PT, 3Instituto de Investigación Biomédica- Acknowledgment: This research was funded by the Spanish Ministry of IRB, Barcelona, ES Science and Innovation and Ministry of Economy and Competitiveness Antibiotic resistance has become a major health issue [1]. Unfortunately, and FEDER (EU) [BIO2012-39922-C02-01/02], Andalusian Regional the development of new antibiotics is being very slow and expensive Government (Spain) and FEDER (EU) [P09-CVI-5063 and P10- and we are running out of weapons to fi ght against the appearance CVI-5915]. This work has been performed by members of the research of multi-resistant bugs. Bacterial conjugation is the main mechanism groups BIO-328 Protein Structures of the Andalusian Regional for the wide spread dissemination of antibiotic resistance genes and, Government (Spain). therefore, the search of specifi c inhibitors of conjugation (COINs) could become a brand new strategy in this warfare. In the search of References potential COINs, previous studies have reported that unsaturated fatty [1] Fang, P., Li, X., Wang, J., Xing, L., Gao, Y., Niu, L., Teng, M., (2010) acids (uFAs) were able to inhibit conjugation [2]. Based on these “Crystal Structure of the Protein L-Isoaspartyl Methyltransferase from studies we have looked for the molecular targets of these compounds Escherichia coli”. Cell Biochem Biophys 58, 163–167. and we have found that the Type IV secretion ATPase TrwD is inhibited

91 Pósters XXXVII Congreso SEBBM by linoleic acid and 2-alkynoic fatty acids, such as the 2-hexadecynoic P10-21 acid. These two uFAs compounds were the most effective inhibitors in Tyrosinase-catalyzed hydroxylation R388 plasmid conjugation [3]. The inhibitory effect is specifi c for the of hydroquinone, a depigmenting agent, traffi c ATPase TrwD, as the remaining ATPases of the Type IV secretion to hydroxyhydroquinone: a kinetic study system are unaffected by both uFAs and 2-AFAs. We have characterized the inhibition mechanism and we have found that in both cases it is María del Mar García Molina1, Jose Luis Munoz-Munoz2, Miguel a non-competitive inhibition, as the affi nities for the substrate (ATP) Angel Maria Solano2, Jose Berna1, Francisco Garcia-Canovas2 and product (ADP) are not altered in the presence of the fatty acids. 1Universidad de Murcia, Albatera, ES, 2Universidad de Murcia - Altogether, these results could open new avenues in the development Grupo GENZ, Murcia, ES of new strategies to prevent the dissemination of antibiotic resistance Hydroquinone (HQ) is used as a depigmenting agent. In this work we genes. demonstrate that tyrosinase hydroxylates HQ to 2-hydroxyhydroquinone (HHQ). Oxy-tyrosinase hydroxylates HQ to HHQ forming the complex References met-tyrosinase-HHQ, which can evolve in two different ways, forming [1] Sommer M.O. (2014). Microbiology: Barriers to the spread of deoxy-tyrosinase and p-hydroxy-o-quinone, which rapidly isomerizes resistance. Nature. Doi: 10.1038. to 2-hydroxy-p-benzoquinone or on the other way generating met- [2] Fernandez-Lopez R. et al. (2005) Unsaturated fatty acids are inhibitors tyrosinase and HHQ. In the latter case, HHQ is rapidly oxidized by of bacterialconjugation. Microbiology. 151, 3517–3526. oxygen to generate 2-hydroxy-p-benzoquinone, and therefore, it cannot [3] Getino M. et al. (2014) 2-alkynoic fatty acids as chemically stable close the enzyme catalytic cycle for the lack of reductant (HHQ). conjugation inhibitors. (Submitted) However, in the presence of hydrogen peroxide, met-tyrosinase (inactive on hydroquinone) is transformed into oxy-tyrosinase, which is active on HQ. Similarly, in the presence of ascorbic acid, HQ is transformed into 2-hydroxy-p-benzoquinone by the action of tyrosinase; however, in this P10-20 A triple mutant of human, Mn(II)-dependent case, ascorbic acid reduces met-tyrosinase to deoxy-tyrosinase, which after binding to oxygen, originates oxy-tyrosinase. This enzymatic form ADP-ribose/CDP-alcohol diphosphatase is now capable of reacting with HQ to generate p-hydroxy-o-quinone, (ADPRibase-Mn) displays cyclic ADP-ribose which rapidly isomerizes to 2-hydroxy-p-benzoquinone. The formation of HHQ during the action of tyrosinase on HQ is demonstrated by means (cADPR) phosphohydrolase as its major activity of high performance liquid chromatography mass spectrometry (HPLC- Iralis López-Villamizar1, Alicia Cabezas1, José Canales1, Ascensión MS) by using hydrogen peroxide and high ascorbic acid concentrations. Fernández1, Rosa María Pinto1, João Meireles Ribeiro1, Joaquim Rui We propose a kinetic mechanism for the tyrosinase oxidation of HQ which allows us the kinetic characterization of the process. A possible explanation Rodrigues2, María Jesús Costas1, José Carlos Cameselle1 of the cytotoxic effect of HQ is discussed. 1Grupo de Enzimología, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Genética, Facultad de Medicina, Universidad de Extremadura, Badajoz, ES, 2Escola Superior de Tecnologia e Gestão, P10-22 Instituto Politécnico de Leiria, Leiria, PT Crystallographic structure of the first WW domain ADPRibase-Mn (EC 3.6.1.53) belongs to the metallo-dependent of Human YAP2 isoform phosphatases superfamily, where it forms a family of its own (SCOP2 ID 4002589). Rat and human ADPRibase-Mn hydrolyze ADP-ribose Ana Camara-Artigas1, Julio Bacarizo1, Sergio Martínez-Rodríguez2 (A), CDP-choline (B) and 2´,3´-cAMP (C) with decreasing effi ciencies 1Department of Chemistry and Physics, University of Almería, (kcat/KM). They also display a unique cADPR phosphohydrolase Agrifood Campus of International Excellence (ceiA3), Almería, ES, activity much less effi cient than the activities on the other substrates [1- 2Department of Physical Chemistry, Faculty of Sciences, University 3]. Zebrafi sh ADPRibase-Mn has similar specifi city but is inactive on of Granada, Granada, ES cADPR [3]. Mutagenesis of human ADPRibase-Mn showed that Phe37 is The WW domain is a small modular domain (approximately 35-40 residues) a determinant of the preference for A, due to a hydrophobic interaction that takes its name from the presence of two highly conserved tryptophan with the nitrogenous base, not evident with B, C or cADPR in docking residues. These domains were fi rst identifi ed in the Yes tyrosine kinase simulations. The F37A mutant exhibited, versus the wild type, a 50- Associated Protein (YAP), and since their discovery they became focus of fold decrease of effi ciency on A, much less marked (only 3-5 fold) on attention as they have been related to several important human diseases such B, C and cADPR. The double mutant F37A+L196F showed stronger as Cancer, the Liddle’s syndrome, Alzhehimer’s, Huntington’s and viral decreases of effi ciency on A, B and C, but not on cADPR. In contrast, diseases. Two major isoforms of YAP have been described in human tissues, the C253A mutation had a weak stimulatory effect with A, Band C, much namely YAP1 and YAP2, containing one and two WW domains, respectively. stronger with cADPR. Finally, the triple mutant F37A+L196F+C253A Up to date, most of the available WW domain structures have been was preferentially active on cADPR. While the wild-type is 150-, 40- or obtained in solution by NMR techniques, and very few structures of WW domains have been solved by X-ray diffraction. These domains show an 6-fold more effi cient on A, B or C than on cADPR, the triple mutant intrinsic conformational fl exibility which diffi cult the formation of crystal was 2.9-, 1.3- or 7.2-fold more effi cient on cADPR than on A, B or C. contacts and, therefore, their crystallization. We have solved the fi rst The change of specifi city included, in absolute terms, a 7-fold increase crystallographic structure of the fi rst WW domain of the h-YAP2 at 1.6 Å of the cADPR phosphohydrolase effi ciency over the wild type. Further resolution in its apo form. The high quality of the data allowed us to model mutagenesis could perhaps generate an even more specifi c cADPR residues 165-208. The Ramachandran plot shows 100% of the residues in phosphohydrolase. the preferred regions. The interactions that stabilize this minimal modular domain have been References analyzed, showing that besides Trp177, which together with Pro202 [1] Canales et al., 2008, Biochem. J. 413, 103. and Phe189 form an aromatic cluster in the hydrophobic core of the [2] Canales et al., 2009, FEBS Lett. 583, 1593. protein, some salt-bridges might play a key role in their folding reaction. [3] Rodrigues et al., 2012, PloS ONE 7, e42249. Furthermore, this structure allows us to explore for the fi rst time the conformational changes that take place in this domain upon binding of Support: Gobierno de Extremadura and FEDER (GR10133). Proline Rich Motifs.

92 Granada 2014 Pósters

P10r-23 (R10-5) for the design of resurrected Precambrian β-lactamases [3], we wanted A common signalosome for programmed cell to further confi rm the performance of this evolutionary phylogeny death in humans and plants method analyzing the properties of additional resurrected ancestral β-lactamases standing in the evolutionary path among Firmicutes and Katiuska González-Arzola1 1 , Jonathan Martínez-Fábregas , Antonio Actinobacteria phyla, encoding proteins dating back between ~1.4 and 1 2 2 Díaz-Quintana , Simon Janocha , Rita Bernhardt , Adrián ~2.9 billion years (Gyr). This alternative evolutionary reconstruction also 3 1 1 Velázquez-Campoy , Irene Díaz-Moreno , Miguel Ángel De la Rosa produced β-lactamases with higher in vitro denaturation temperatures 1Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, cicCartuja, (~25 °C) and higher substrate promiscuity than modern β-lactamases. Universidad de Sevilla - CSIC, Sevilla, ES, 2Institut für Biochemie, In vivo studies showed that the resurrected enzymes provided actual Universität des Saarlandes, Campus B2.2, Saarbrücken, Escherichia coli cells with higher resistance to different third-generation DE,3Institute of Biocomputation and Physics of Complex Systems antibiotics, providing us with plausible evolutionary scenarios for actual (BIFI), Joint-Unit IQFR-CSIC-BIFI, Department of Biochemistry and microorganisms’ antibiotic resistance. Our results reinforce the virtues of Molecular and Cell Biology, University of Zaragoza, Zaragoza, ES ancestral protein reconstruction as a biotechnological cornerstone for the Programmed cell death (PCD) is a fundamental event for the development molecular design of engineered enzymes. Furthermore, our denaturation of multicellular organisms. In mammalian cells, early events in PCD experiments suggest a different evolutionary environment for ancestral involve the release of cytochrome c (Cc) from mitochondria to the Gram-positive bacteria, in full agreement with the inferred colonization cytoplasm to act at the fi rst stages of the apoptotic process, playing a key of land environments by Actinobacteria/Firmicutes at some point at the role in assembling the apoptosome. In plants, PCD is part of a general end of the Archean period [4]. process named hypersensitive response, where Cc is also released into the cytosol but its role in PCD remains veiled. Such highly conserved cytoplasmic location of Cc upon apoptotic stimuli lead to think of a References common link for PCD in evolutionarily distant species, like humans and [1] Cole MF, Gaucher EA. Utilizing natural diversity to evolve protein plants. function: applications towards thermostability. Curr Opin Chem Biol. To better understand the role of Cc in the onset of PCD in both humans (2011) 15(3):399-406. and plants, a proteomic approach based on affi nity chromatography with [2] Gaucher EA, Thomson JM, Burgan MF, Benner SA. Inferring the Cc as bait was used. Upon combining this approach and Bimolecular palaeoenvironment of ancient bacteria on the basis of resurrected proteins. Fluorescence Complementation (BIFC), a total of 8 human and 9 plant Nature (2003) 425(6955):285-288. new proteins interacting with Cc under PCD were found [1,2]. These new [3] Risso VA, Gavira JA, Mejia-Carmona DF, Gaucher EA, Sanchez-Ruiz PCD Cc-partners are involved in protein folding, translational regulation, JM. Hyperstability and substrate promiscuity in laboratory resurrections oxidative stress, DNA damage, energetic and mRNA metabolism. of Precambrian β-lactamases. J Am Chem Soc. (2013) 135(8):2899-902. Strikingly, some of the novel human Cc-targets are closely related to those [4] Battistuzzi FU, Hedges SB. A major clade of prokaryotes with ancient for plant Cc, indicating that the evolutionarily well-conserved cytosolic adaptations to life on land. Mol Biol Evol (2009) 26(2):335-343. Cc – appearing in organism from plant to mammals- interact with a wide range of targets on PCD. Modeling of the complexes between human and plant Cc with its P10r-25 counterparts shows how the heme crevice of Cc takes part of the complex Caracterización físico-química y funcional interface in agreement with the vast majority of known redox adducts of del citocromo c de la cianobacteria Nostoc sp. Cc. However, in contrast to the high turnover rate of the mitochondrial 6-3 Cc redox adducts, those occurring under PCD lead to the formation of PCC 7119 rather stable nucleo-cytoplasmic ensembles, as inferred from Surface Alejandro Torrado Maya Plasmon Resonance (SPR) and Nuclear Magnetic Resonance (NMR) , Leonor Puerto-Galán, Manuel Hervás, Jose measurements. On the basis of these fi ndings, we suggest that human and A. Navarro, Fernando Publio Molina-Heredia plant Cc interacts with pro-survival, anti-apoptotic proteins after its release Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, Universidad de into the cytoplasm. Then, Cc may interfere with cell survival pathways and Sevilla y CSIC, cicCartuja, Sevilla, ES unlock PCD in order to prevent the spatial and temporal co-existence of En cianobacterias, las cadenas de transporte de electrones fotosintética antagonist signals. y respiratoria están localizadas en el mismo compartimento celular y comparten algunos componentes, como son la plastocianina (Pc) References o el citocromo (Cit) c y el complejo b -f. Se ha propuesto que en [1] Martínez-Fábregas, J. et al. (2013). Mol. Cell. Proteomics, 12: 3666- 6 6 estos organismos el Cit c y la Pc podrían transportar los electrones 3676. 6 alternativamente desde el complejo b -f al Fotosistema I (PSI) o a la Cit [2] Martínez-Fábregas, J. et al. (2014). Mol. Cell. Proteomics, doi:10.1074/ 6 c oxidasa. Además de Cit c y Pc, en cianobacterias se han encontrado mcp.M113.034322. 6 otros posibles transportadores solubles de electrones, localizados en el lumen tilacoidal, cuya función aún no ha sido bien establecida, como son el Cit c y el Cit c . A partir de un análisis de secuencias génicas P10-24 6-2 M Assessing the performance of ancestral protein en cianobacterias fi lamentosas formadoras de heterocistos, hemos reconstruction encontrado otra proteína que podría intervenir en estos procesos: el Cit c6-3. En estos organismos, la fi jación de nitrógeno atmosférico Sergio Martínez-Rodríguez, Valeria Alejandra Risso, José Manuel se produce en unas células especializadas denominadas heterocistos.

Sánchez-Ruiz En estas células, debido a que la nitrogenasa se inhibe por O2, la tasa Departamento de Quimica Fisica, Facultad de Ciencias, Universidad respiratoria es muy alta, con el ﬁ n de crear un ambiente anoxigénico. de Granada, Granada, ES En este trabajo hemos abordado la caracterización físico-química y el

Ancestral sequence reconstruction is a protein engineering methodology análisis funcional del Cit c6-3. Esta proteína no es capaz de interaccionar exploiting natural sequence diversity to obtain protein variants with eﬁ cientemente con el PSI, por lo que no parece actuar en fotosíntesis. En enhanced characteristics [1], and has also been suggested to allow cambio, sí reduce especíﬁ camente a determinadas oxidasas terminales inferring features of the physical environment in which ancient en los heterocistos, por lo que proponemos que podría tener un papel organisms evolved [2]. After successful evaluation of this approach relevante en respiración.

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P10-26 P10-28 Structural and thermodynamic characterization Estudio estructural y funcional de la fosfatasa of the interaction between viral late domains and MG207 de Mycoplasma genitalium their cellular targets Patricia Casino Ferrando1, Ana M. Martínez Martínez Mariscal2, 3 2 1 Pedro Buzón1, Manuel Iglesias-Bexiga1, Francisco Castillo1, Andrés Alberto Marina , Jaume Piñol , Ignacio Fita 1 Palencia1, Maria J. Macias2, Francisco Blanco3, Ana Camara- Department of Structural Biology, Instituto de Biología Molecular 2 Artigas4, Irene Luque1 de Barcelona (IBMB-CSIC), Barcelona, ES, Departamento de 1Department of Physical Chemistry, University of Granada, Granada, Bioquímica i Biología Molecular, Institut de Biotecnología i ES, 2Structural and Computational Biology Programme, Institute Biomedicina, Universitat Autònoma de Barcelona, Bellaterra- 3 for Research in Biomedicine, Barcelona, ES, 3Structural Biology Barcelona, ES, Departmento de genómica y proteómica, Instituto Unit, CIC bioGUNE, Parque tecnológico de Bizkaia, Deiro, ES, de Biomedicina de Valencia (IBV-CSIC), Valencia, ES 4Department of Physical Chemistry, Biochemistry and Inorganic Mycoplasma genitalium es una bacteria parasitaria con genoma mínimo Chemistry, University of Almería, Almería, ES (~580Kb) implicada en infecciones urogenitales, del endometrio y Many viruses encode a late budding domain (L-domain) in their sequence. síndrome pélvico infl amatorio; carece de pared celular y por tanto no es These L-domains usually contain highly conserved motifs known to sensible a antibióticos que bloquean la síntesis de ésta como la penicilina mediate cellular protein-protein interactions, such as PPXY and PTAP. y los betalactámicos [1]. La movilidad de estas bacterias se realiza por These motifs are essential for the recruitment of the cellular machinery deslizamiento gracias a una membrana que sobresale del polo de la bacteria sequestered by the virus for replication inside the infected cell. The budding llamada organela terminal y que está implicada en adherencia celular. process, which is mediated by the ubiquitin-proteasome system, has been En Mycoplasma pneumoniae, se ha correlacionado la función quinasa/ proposed as a potential target to inhibit viral replication. We present here a fosfatasa con la movilidad, de forma que mutaciones en la serín/treonina structural and thermodynamic characterization of the interactions between prkC (MPN248) y su fosfatasa prpC (MPN247) producen cambios en la a set of peptide ligands corresponding to L-domains sequences from movilidad así como cambios en el patrón de fosforilación de proteínas different viruses (including Ebola, HTLV-1, Rabies, Marburg and HIV- de la organela terminal, HMW1 y HMW2 [2]. Acorde al tamaño de su 1) and their cellular targets (the UEV domain of hTsg101 and the WW genoma, M. genitalium contiene muy pocas proteínas señalizadoras y tan domains of hNedd4) aimed at understanding the molecular determinants sólo cuatro ORFs han sido anotadas como fosfatasas, la proteína fosfatasa of binding affi nity and specifi city in these systems. Our work reveals that 2C (MG_108), dos serine/treonín fostatasas (MG_207 y MG_246) y the establishment of networks of water-mediated hydrogen bonds at the la pirofosfatasa inorgánica (MG_351). Recientemente, se demostró in binding interface and the reorganization of the conformational distribution vivo que la fosfatasa MG_207 estaba implicada en virulencia, ya que la in both protein and ligand upon complex formation are important features cepa knockout en MG_207 era menos virulenta, su adherencia a células determining the thermodynamic signature of these interactions, that need to eucarióticas era menor y presentaba un patrón de proteínas fosforiladas be taken into account for a full understanding of these systems. The work diferente a la silvestre [3]. Con el fi n de caracterizar la fosfatasa MG207 presented suggests that combining a detailed structural and thermodynamic hemos obtenido, por cristalografía, su estructura tridimensional que analysis with screening and molecular biology techniques can provide very muestra un plegamiento a/β característico de fosfodiesterasas, además el valuable information for the design of specifi c and high affi nitty inhibitors estudio funcional demuestra que MG207 presenta tanto actividad fosfatasa as potential broad spectrum antivirals. como fosfodiesterasa. En el centro activo se observó la presencia de dos metales y un sulfato y hemos confi rmado que las actividades fosfatasa y fosfodiesterasa son modulables dependiendo de la presencia de cationes divalentes, siendo los metales de transición Mn2+, Ni2+ y Fe2+ quienes P10-27 Structural insights into the Ca+2 and PI(4,5)P2 especialmente activan esta enzima. binding modes of the C2 domains of rabphilin 3A Bibliografía and synaptotagmin 1 [1] Anagrius C, Loré B, Jensen JS. Treatment of Mycoplasma genitalium. Observations from a Swedish STD clinic. PLoS One. 2013;8(4):e61481. María Dolores Pérez Sánchez1 2 , Teresa Coronado-Parra , Jaime [2] Page CA, Krause DC. Protein kinase/phosphatase function correlates 2 2 3 Guillén , Juan C. Gómez-Fernández , Nuria Verdaguer , Senena with gliding motility in Mycoplasma pneumonia. J Bacteriol. 2013:1750-7. 1 Corbalán-García [3] Martinez MA, Das K, Saikolappan S, Materon LA, Dhandayuthapani 1 Dpto. Bioquímica y Biología Molecular A, Universidad de S. A serine/threonine phosphatase encoded by MG_207 of Mycoplasma 2 Murcia, Jumilla, ES, Dpto de Bioquímica y Biología Molecular genitalium is critical for its virulence. BMC Microbiol. 2013;13:44. A, Universidad de Murcia, Murca, ES, 3Department of Structural Biology, Instituto de Biología Molecular de Barcelona (IBMB-CSIC), Barcelona, ES P10-29 Proteins containing C2 domains are the sensors for Ca+2 in myriad of Biogénesis de ribosomas, “the Backstage” secretory pathways. Here, we have determined the structure of this domain in complex with PI(4,5)P and IP at resolutions of 1.75 and 1.9 Gisela Pöll, Shuang Li, Uli Ohmayer, Thomas Hierlmeier, Philipp 2 3 Jorge Pérez-Fernández Å, respectively, unveiling that the polybasic cluster formed by strands β3- Milkereit, β4 is involved in the interation with the phosphoinositides. A comparative Universität Regensburg, Biochemie-Zentrum Regensburg (BZR), Lehrstuhl Biochemie III, Regensburg, DE study demonstrates that the C2A domain is highly specifi c for PI(4,5)P2/

PI(3,4,5)P3, whereas the C2B domain cannot discrimiate among sny of the La biogénesis de ribosomas es un proceso celular que implica el diphosphorylated forms. Structural comparisons between C2A domains procesamiento y plegamiento de los RNA ribosómicos y la incorporación of rabphilin 3A and synaptotagmin 1 indicated the presence of a key de las proteínas ribosómicas. Dicho proceso es facilitado, en organismos glutamic residue in the polybasic cluster of synaptotagmin 1 that abolishes eucariotas, por la acción de más de 150 proteínas conocidas como factores the interaction with PI(4,5)P2. Together, these results provide a structural de ensamblaje. Algunos de estos factores, denominados Utp, son capaces explanation for the ability of different C2 domains to pull plasma and de formar subcomplejos proteicos (UTP), que participan como entidades vesicle membranes close together in a Ca+2-dependent manner and reveal independientes en la biogénesis de la subunidad menor del ribosoma how this family of proteins can use subtle structural changes to modulate (40S). Dos de estos subcomplejos, tUTP/UTP A y UTP B participan en their sensivity and speciﬁ city to various cellular signals. las primeras etapas del ensamblaje y procesamiento del RNA ribosómico.

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Actualmente, se conoce la composición proteica de tUTP/UTP A y UTP B P10-32 y su arquitectura ha sido analizada hasta ahora en base a las interacciones Structural insights into the human Sigma-1 binarias proteína-proteína. En este trabajo presentamos una caracterización Receptor Chaperone structure and interactions bioquímica detallada de la arquitectura de los subcomplejos tUTP/UTP Jose Luis Ortega Roldan A y UTP B. Los resultados obtenidos indican la completa reconstitución , Felipe Ossa, Nader Amin, Jason Schnell in vitro de tUTP y UTP B. Además, proporcionan evidencias bioquímicas Department of Biochemistry, University of Oxford, Oxford, UK sobre la existencia de complejos binarios, ternarios o de grado superior, The Sigma-1 Receptor (S1R) is a ligand-regulated membrane en consonancia con las interacciones binarias previamente descritas. protein chaperone involved in the ER stress response. S1R activity is Por último, los resultados sugieren que los diferentes complejos implicated in diseases of the central nervous system including amnesia, proteicos obtenidos constituyen diferentes módulos de tUTP y UTP B y schizophrenia, depression, Alzheimer’s disease, and addiction. S1R has proporcionan un nuevo punto de vista sobre intermediarios de ensamblaje been shown previously to regulate the Hsp70 BiP and the IP3R calcium o desensamblaje de los subcomplejos UTP. channel through a C-terminal domain. It also binds and is regulated by a large number of small molecules such us psychostimulants (cocaine, methamphetamine and DMT), antidepressants, antipsychotics and P10-30 steroids. N-terminal protein tails act as aggregation We have developed methods for bacterial expression and reconstitution of the chaperone domain and a truncation construct lacking the fi rst protective entropic bristles: the SUMO case transmembrane domain (TM) of human S1R into DPC:DPPC mixed Patrizia Marinelli, Ricardo Graña-Montes, David Reverter, Salvador micelles that enable its study by solution NMR spectroscopy. S1R is found to contain a fi rst TM, two helices in the cytosolic loop, Ventura followed by the second TM and a juxtaposed helix, a largely dynamic Universitat Autónoma de Barcelona, Barcelona, ES region and a structured, helical C-terminal region that encompasses a The formation of β-sheet enriched amyloid fi brils constitutes the hallmark membrane associated domain containing four helices. The helical region of many diseases but is also an intrinsic property of polypeptide chains in at residues ~198-206 is strongly amphipathic and proposed to anchor the general, because the formation of compact globular proteins comes at the chaperone domain to micelles and membranes. Three of the helices in the expense of an inherent sequential aggregation propensity. In this context, C- terminal region closely correspond to previously identifi ed cholesterol identifi cation of strategies that enable proteins to remain functional and and drug recognition sites. soluble in the cell has become a central issue in chemical biology. We show Moreover, we show experimentally using chemical shifts, spin relaxation here, using human SUMO proteins as a model system, that the recurrent and H/D exchange that the second TM, whose position hasn’t been presence of disordered tails fl anking globular domains might constitute yet predicted accurately, spans the residues 89 to 111 and includes the entire another of these protective strategies. These short, disordered, and highly Sterol Binding Domain Like 1 (SBD1), partially responsible for drug soluble protein segments would act as intramolecular entropic bristles, binding. reducing the overall protein intrinsic aggregation propensity and favoring In addition, we show that the chaperone domain interacts with full- length thus the attainment and maintenance of functional conformations. BiP or the isolated nucleotide binding domain (NBD) of BiP, but not the substrate binding domain, suggesting that the NBD is suffi cient for S1R interactions. These results, that constitute the fi rst structural information obtained for P10-31 Directed evolution of acyltransferases this protein and its interactions, advance our understanding of S1R and are likely to be useful in refi ning models of the S1R drug binding sites. for triglyceride production in E. coli

Omar Santín, Gabriel Moncalián P10-33 IBBTEC, Universidad de Cantabria, Santander, ES Conformational distribution of the SH3-SH2 Wax ester synthase/diacylglicerol acyltransferase (WS/DGAT) is a family Tandem of the Abl kinase and its modulation of enzymes able to perform the esterifi cation of diacylglycerol or fatty alcohols and acyl-CoA to produce triglycerides (TAGs) or wax esters, by intramolecular interactions respectively. Both products can be easily transformed onto biodiesel. Carles Corbi-Verge1, Fabrizio Marinelli2, Ana Zafra Ruano1, Javier Although the specifi city determinants of substrate recognition are still Ruiz-Sanz1, Irene Luque-Fernández1, José D. Faraldo-Gómez2 unknown and there is no crystal structure solved from any bacterial WS/ 1Departamento de Quimica Fisica, Facultad de Ciencias, DGATs , we recently published a study where we used limited proteolysis Universidad de Granada, Granada, ES, 2Max Planck Institute of and directed mutagenesis approaches to identify key folding domains Biophysics, Theoretical Molecular Biophysics Group , Frankfurt, DE and motifs critical for the catalysis. We have also recently patented Tyrosine kinases are involved in a wide variety of key signaling processes a diacylglycerol acyltransferase (tDGAT) (ES201200967) from the and are therefore tightly regulated by the cell. Indeed, numerous thermophilic organism Thermomonospora curvata that is able to produce pathologies, ranging from cancer to neurodegeneration, result from or TAGs and waxes in E. coli. We have used this system for TAG production are associated with defi ciencies in kinase regulation. Consequently, these in E.coli, but we believe it can be signifi cantly improved through directed enzymes are a prominent target for novel pharmacological strategies evolution of tDGAT. Thus, the main goal of our work is to enhance TAG against human disease. production in E. coli by directed evolution. Moreover, this work will This study focuses on Abl, which is one of the most ubiquitously conserved provide us some information about the amino acids residues involved tyrosine kinases. Abl is present in all metazoa, where it plays an essential in substrate recognition. For this purpose we have developed a direct role in processes as diverse as cytoskeleton reorganization, DNA repair, evolution protocol where we constructed mutant libraries by mutagenic and regulation of apoptosis. Accordingly, when constitutively active forms PCR in order to obtain variants of the protein. Using Nile Red, a fl uorescent of Abl are present in normal cells, these are transformed into cancer cells. dye that binds to neutral lipids we can select different variants of tDGAT For example, in human white-blood cells, a chromosomal abnormality through a high throughput selection system based on fl uorimetry and fl ow leads to the fusion of the bcr and abl genes, which together encode for a cytometry. Mutants carrying interesting phenotypes are further selected cytoplasm-targeted, deregulated form of Abl; Bcr-Abl interferes with the and sequenced. This way we were able to detect mutations that lead to a cell cycle, resulting in uncontrolled cell proliferation, and is the principal 2-fold increase in the TAG production. cause of chronic myeloid leukemia (CML).

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Regulation of Abl can be thought as a reversible equilibrium whereby the most types of cancer. The apoptotic machinery depends on a family SH3, SH2 and catalytic domains are either dissociated or self-assembled of proteases called caspases, whose activation irreversibly triggers cell in one or more confi gurations. External factors, such as competing death. interactions involving one or both regulatory domains, will bias this Caspase-9 is an initiator caspase that generates the active forms of equilibrium in one or other direction. For Abl in particular, the signifi cance Caspase-3 and Caspase-7 by limited proteolysis, and thereby transmits of this mechanism is underscored by the fact that mutations that impair the apoptotic signal to the execution phase. PP2A is a serine/threonine the correct assembly of the autoinhibited complex, either in the SH3-SH2 phosphatase critical to physiological processes, including apoptosis, tandem or in the domain-domain linkers, confer CML cells with resistance inducing cell death either by dephosphorylating proteins or by its own against inhibitory drugs designed to target the catalytic domain of the Bcr-Abl oncogene. This outcome has prompted considerable interest in inhibition. the mechanisms of allosteric regulation of Abl and other tyrosine kinases, Cell penetrating peptides are molecules that can translocate into cells and in the development of compounds designed to interfere with these without causing membrane damage. Based on the characterization of mechanisms. the region responsible for the interaction, we developed cell penetrating In this study, we use molecular simulations, free-energy calculations and fusion peptides specifi cally designed to disrupt the Caspase-9/PP2ACα differential scanning calorimetry to study the determining factors of a binding. Using these peptides, we performed the biophysical and necessary step in the assembly of the autoinhibited form of Abl, namely the biochemical characterization of the interaction, showing a direct organization of the SH3 and SH2 domains into a conformation conducive association between Caspase-9 and PP2ACα. We are also evaluating the to its association with the SH2-kinase linker. Our results show that the therapeutical potential of these peptides to induce Caspase-9 dependent conformational dynamics of the Abl SH3-SH2 tandem are clearly distinct apoptosis. from those of Src and related kinases. This fi nding enables us to reconcile seemingly contradictory structural and biophysical data on the mechanism of Abl regulation. Finally, we also examine the impact of activating mutations within the SH3-SH2 unit, particularly in the short connector P10-36 between the domains. Mutational studies on ancestral proteins Fadia Manssour1, Valeria A Risso1, Alvaro Inglés-Prieto1, Raquel Godoy-Ruiz2, Jose A Gavira3, Beatriz Ibarra-Molero1, Jose M P10r-34 ER targeting of COPI vesicles involves cargo Sanchez-Ruiz1 1 recognition by tethering factors Departamento de Quimica Fisica, Facultad de Ciencias, Universidad de Granada, Granada, ES, 2Department of Biochemistry Ana María Pérez-Linero, Javier Manzano-López, Marcos Cámara- and Molecular Biology, University of Maryland School of Medicine, Donoso, Manuel Muñiz Maryland, US, 3Laboratorio de Estudios Cristalográfi cos, Departamento de Biología Celular, Universidad de Sevilla, Sevilla, ES Instituto Andaluz de Ciencias de la Tierra (Consejo Superior de Vesicular transport through the eukaryotic secretory pathway is essential Investigaciones Científi cas- Universidad de Granada), Armilla, for cellular function. This process depends on cytosolic coat proteins that Granada, ES form vesicles from a donor compartment and ensure their correct docking We have carried out an extensive mutational analysis of two thioredoxins: and fusion with the acceptor compartment trough interaction with a laboratory resurrection of a protein of the last common bacterial ancestor tethering factors. Specifi cally, the Dsl1 tethering complex tethers Golgi- (LBCA thioredoxin), an organism estimated to have lived about 4 billion derived COPI retrograde transport vesicles to the endoplasmic reticulum years ago, and one of its modern descendant (E. coli thioredoxin). Both (ER) membrane. In this study, we found that the Dsl1 complex interacts physically with the p24 proteins, which are type I transmembrane proteins share the same overall 3D-structure but show only 55% sequence proteins assembled into heteromeric complexes. The p24 complex is an identity[1-2]. abundant cargo passenger of COPI vesicles that facilitates COPI vesicle A total of 25 variants involving exchanges between highly similar amino budding by stabilizing the COPI coat onto the Golgi membrane. By using acids (E/D, I/V)[3-4] were purifi ed and their thermal stabilities were genetic analysis we also show that the Dsl1 and p24 complexes interact investigated by Differential Scanning Calorimetry. functionally. Indeed, the phenotypic characterization of double mutants Surprisingly, our results indicate a signifi cant correlation between the indicates that the Dsl1-p24 physical interaction is required for an effi cient mutation effects on the ancestral and modern backgrounds suggesting a COPI vesicle tethering to the ER. Therefore, our results strongly suggest conservation of protein mutational energetics over billions of years. that a specialized cargo like the p24 complex could promote the Golgi- to-ER retrograde transport by coupling both budding and tethering events References of COPI vesicles. [1] Ingles-Prieto A, Ibarra-Molero B, Delgado-Delgado A, Perez- Jimenez R, Fernandez JM, Gaucher EA, Sanchez-Ruiz JM, Gavira A (2013) Conservation of protein structure over four billion years. P10r-35 Structure21:1690-1697. Study of the Caspase-9/PP2ACα interaction in the apoptotic pathway as a potential target for cancer [2] Perez-Jimenez R, Ingles-Prieto A, Zhao AM, Sanchez-Romero I, Alegre-Cebollada J, Kosuri P, Garcia.Manyes S, Kappock TJ, therapy Tanokura M, Holmgren A, Sanchez-Ruiz JM (2011) Single-molecule Leticia Domínguez Berrocal1, Angelita Rebollo2, Jerónimo Bravo paleoenzymology probes the chemistry of resurrected enzymes. Nat Sicilia1 Struct Mol Biol 18:592-596. 1Instituto de Biomedicina de Valencia (IBV-CSIC), Valencia, ES, [3] Godoy-Ruiz R, Perez-Jimenez R, Ibarra-Molero B and Sanchez-Ruiz 2INSERM UMRS 945, Hôpital Pitié Salpêtrière, Université Pierre et JM. Relation between protein stability, evolution and structure, as probed Marie Curie, París, FR by carboxylic acid mutations. J Mol Biol 336:313-318. Apoptosis is the process of programmed cell death induced in damaged, [4] Godoy-Ruiz R, Perez-Jimenez R, Ibarra-Molero B and Sanchez-Ruiz unnecessary or dangerous cells to signal macrophages to engulf and JM. A stability pattern of protein hydrophobic mutations that refl ects degrade their corpses. This key mechanism is found to be altered in evolutionary structural optimitzation. Biophys J 89:3320-3331.

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P10r-37 state and the misfolding kinetics, by organizing the supramacromolecular Structure and function study of the complex that structures at the expense of the two b-sheets present in the PDZ3 fold. synthesizes S-adenosylmethionine However, those mutations affecting the b2–b3 loop, included into the prone- to-aggregation region composed by a single b-sheet comprising b2 to b4 Ben Murray1 2 3 , Svetlana Antonyuk , Alberto Marina , Sebastiaan Van chains, stabilize the trimeric intermediate previously shown in the wild-type Liempd4, Shelly Lu5, Jose Mato4, Samar Hasnain2, Adriana Rojas3 PDZ3 and slow-down aggregation. These results strongly suggest that the a3 1Molecular Biophysics group, Institute of Integrative biology, Faculty helix protects to some extent the PDZ3 domain core from misfolding. This of Health and life sciences, University of Liverpool & Structural might well constitute the fi rst example where an extra-element, intended to biology unit, CIC bioGUNE, Parque Tecnoloico de Bizkaia , Derio, link the PDZ3 domain to the following SH3 in PSD95 and in other members ES, 2Molecular Biophysics group, Institute of Integrative biology, of the MAGUK family, not only regulates the binding abilities of this domain Faculty of Health and life sciences, University of Liverpool, but it also protects PDZ3 from misfolding and aggregation. Liverpool, UK, 3Structural Biology Unit, CIC bioGUNE, Parque tecnológico de Bizkaia, Derio, ES, 4Metabolomics Unit, CIC 5 bioGUNE, Parque Tecnológico de Bizkaia, Derio, ES, Division of P10-39 Gastroenterology and Liver Diseases, USC Research center for Liver A functional amyloid assembly controls plasmid Disease, USC-UCLA Research center for ALPD and Cirrhosis, Keck Scool of medicine, Los Angeles, US DNA replication in bacteria S-Adenosylmethionine (SAMe) is the principal methyl donor of the cell and María Moreno del Álamo1, Fátima Gasset-Rosa1, Susana Moreno- is synthesized via an ATP-driven process by methionine adenosyltransferase Díaz de la Espina1, Elena Fernández-Tresguerres1, Rudi Lurz2, (MAT) enzymes. It is tightly linked with cell proliferation in liver and Rafael Giraldo1 colon cancer. In humans, there are three genes, mat1A, mat2A and mat2B, 1Centro de Investigaciones Biológicas-CSIC, Madrid, ES, 2Max Plant which encode MAT enzymes. mat2A and mat2B transcribe MATα2 and Institute for Molecular Genetics, Berlin, DE MATβ enzyme subunits, respectively, with catalytic and regulatory roles. DNA replication is tightly regulated to constrain the genetic material within The MATα2β complex is expressed in nearly all tissues and is thought to strict spatiotemporal boundaries and copy numbers. In some plasmids be essential in providing the necessary SAMe fl ux for methylation of DNA from Gram-negative bacteria, two circular DNA molecules associate and various proteins including histones. In human hepatocellular carcinoma (‘handcuff’) their replication origins (ori) through a nucleoprotein assembly mat2A and mat2B genes are upregulated, highlighting the importance of with an oligomer of a plasmid-encoded replication protein (Rep) at its the MATα2β complex in liver disease. The individual subunits have been core. Handcuffi ng thus hampers new replication rounds and determines structurally characterized but the nature of the complex has remained elusive plasmid incompatibility [1]. The WH1 domain in the RepA protein of the despite its existence having been postulated for more than 20 years and the Pseudomonas pPS10 plasmid, besides its contributions to transcriptional observation that MATβ is often colocalized with MATα2. Though SAMe can repression of repA gene and to plasmid DNA replication initiation by the be produced by MAT(α2) alone, our work shows that the V of the MATα2β 4 max full length protein [2], assembles into amyloid fi bers upon binding to DNA complex is three- to fourfold higher depending on the variants of MATβ that in vitro [3] and causes an amyloid proteinopathy when overexpressed in participate in complex formation. Using X-ray crystallography and solution Escherichia coli [4,5]. We have developed a monoclonal antibody (B3h7) X-ray scattering, the fi rst structures are provided of this 258 kDa functional specifi c for an amyloid oligomeric conformation of RepA-WH1 which has complex both in crystals and solution with an unexpected stoichiometry of revealed here that the handcuffed RepA assemblies are amyloid by nature. 4α2 and 2βV2 subunits. It is demonstrated that the N-terminal regulates the RepA amyloids are found both in handcuffed complexes reconstructed activity of the complex and it is shown that complex formation takes place surprisingly via the C-terminal of MATβV2 that buries itself in a tunnel in vitro and inside the nucleoid of bacterial cells, where plasmids with low copy numbers are known to cluster for partition and DNA-promoted created at the interface of the MAT(α2)2. The structural data suggest a unique mechanism of regulation and provide a gateway for structure-based drug RepA-WH1 amyloidogenesis actually occurs. A stable amyloid core would design in anticancer therapies. thus provide the basis for the previously reported requirement of molecular chaperones in dismantling handcuffs to allow for further replication rounds. RepA is a versatile DNA binding manifold, whose abilities, beyond transcriptional auto-repression and plasmid replication initiation, now also P10-38 The misfolding behaviour of PSD95-PDZ3 is include the assembly of a replication inhibitory functional amyloid. modified by extra-domain structures and post- References translational modifications [1] Giraldo R and Fernández-Tresguerres ME (2004). Plasmid 52(2): 69-83. [2] Gasset-Rosa F, et al. (2008). Mol Microbiol 68(3): 560-572. Javier Murciano Calles1, Marta Marin-Argany2, Eva S. Cobos1, [3] Giraldo R (2007). Proc Natl Acad Sci USA 104: 17388-93. Sandra Villegas2, Jose C. Martinez1 [4] Fernández-Tresguerres ME, et al. (2010). Mol Microbiol 77: 1456-69. 1Departamento de Quimica Fisica, Facultad de Ciencias, [5] Gasset-Rosa F, et al. (2014). Mol Microbiol 91(6):1070-1087 Universidad de Granada, Granada, ES, 2Departament de Bioquimica i Biologia Molecular, Facultat de Biociencies, Universitat Autonoma de Barcelona, Barcelona, ES P10-40 Post-translational modifi cations located out from the binding pocket of the Characterization of specific amino acid changes third PDZ domain of PSD95 (PDZ3) regulate binding affi nity and specifi city through an intra-domain electrostatic network. Such residues involve some in rhodopsin as putative positively selected sites charged residues in the b2–b3 loop (were a succinimide modifi cation occurs) in visual pigment evolution and the a3 helix (an extra-structural element that links the PDZ3 domain with Miguel Antonio Fernández Sampedro the following SH3 domain in PSD95, and contains the phosphorylation target , Sundaramoorthy Srinivasan, Tyr397). We have shown that these structural elements and their related post- Eva Ramon Portés, Pere Garriga Solé translational modifi cations also infl uence the folding/misfolding pathway of Grup de Biotecnologia Molecular i Industrial, Centre de PDZ3, by using site-directed mutagenesis combined with calorimetry and Biotecnologia Molecular, Universitat Politècnica de Catalunya, spectroscopy. We have found that, although all the assayed mutations generate Terrassa (Barcelona), ES proteins more prone to aggregation than the wild-type PDZ3, those directly Rhodopsin has highly conserved motifs throughout vertebrate species, affecting the a3 helix increase the population of the DSC-detected intermediate but there are differences at variable sites in residues shared among

97 Pósters XXXVII Congreso SEBBM lower mammals (monotreme) and the therian mammals. The shared P10-42 residues among monotreme and, reptile and amphibian rhodopsins, Binding of activators to the kinase unit of AMPK: include amino acids at positions 7, 8, 13, 225, 346 and 348, which theoretical study of the activation mechanism are not shared with therian. Moreover, a Bayes empirical approach Gleiciane Leal Moraes1 1 2 predicts several positively selected sites in the therian branch: Phe37, , Carolina Estarellas , Ana Castro , Axel 1 1 Gln225 and Ile290 at the transmembrane helices of the receptor; Phe- Bidon-Chanal , F. Javier Luque 1 13 at the N terminus; and Ser343, Ser344 and Ala346 at the C terminus Departamento de Fisicoquímica, Facultad de Farmacia, Universidad de Barcelona, Santa Coloma de Gramanet, ES, of the protein. Here, we have expressed, purifi ed and functionally 2Instituto de Química Médica, CSIC, Madrid, ES characterized three of these rhodopsin changes: F13M, Q225R and A346S. We fi nd that Q225R and A346S mutants have a wild type-like Mammalian AMP-activated protein kinase (AMPK) is a serine/threonine behaviour upon photobleaching/acidifi cation and Western blot analysis protein kinase that acts as a key sensor of cellular energy status. Its primary and metarhodopsin II decay rates but show different hydroxylamine function it to “sense” changes in the intracellular level of ATP and to couple reactivity. Both Q225R and A346S mutants show increased reactivity the changes in ATP to phosphorylation of downstream substrates, leading to hydroxylamine, refl ecting lower conformational stability as observed to an increase in the rate of pathways producing ATP and/or a decrease in the rate of ATP-consuming processes. Its function in the homeostasis for echidna (most basal mammals) rhodopsins. We observe a lower Gt of cellular energy confers AMPK a major role in numerous metabolic activation rate for Q225R which can be explained because the mutation disorders, such as type 2 diabetes, obesity and cancer. This explains the is located close to the third intracellular loop important for Gt binding. progressive interest in AMPK as a therapeutic target. A346S shows increased Gt activation rate that could be related to the AMPK is a heterotrimer composed of three different subunits: alpha, beta evolutionary loss of an extra phosphorylation place at the C terminal and gamma. The alpha subunit carries the catalytic function and contains a tail of rhodopsin. In contrast, the extracellular F13M mutant could not kinase domain at the N-terminus of the protein followed by an autoinhibitory bind retinal and showed a clearly different electrophoretic pattern. We domain and a C-terminal domain required for interaction with the beta could restore chromophore binding, for F13M, by adding a cysteine subunit. The AMPK activity is regulated by several mechanisms, including pair (N2C/D282C) that forms a stabilizing disulfi de bond. This result a number of indirect activators of AMPK (such as metformin, rosiglitazone reveals the importance of the N-terminal domain of rhodopsin in visual and resveratrol), an direct activators, such as compound A-769662 . Some pigment evolution. of these activators show a clear specifi city for a particular AMPK subunit, which opens they way to design and discover new compounds that could activate AMPK in some tissues but not in others, minimizing in this way the P10-41 putative negative effects of the activation of AMPK at whole body level. Different retinal binding modes to visual Up to now, the mechanism exerted by direct activators remained unknown. pigments suggest mechanism for Fine- Tuning Very recently, two X-ray structures showing the binding of direct AMPK activators have been reported. This study reports the results of molecular GPCR-ligand interactions dynamics simulates carried out to gain insight into the mechanism of AMPK activation by A-769662. Sundaramoorthy Srinivasan, Miguel Fernandez, Eva Ramon, Pere Garriga Grup de Biotecnologia Molecular i Industrial, Centre de P10r-43 Biotecnologia Molecular, Universitat Politècnica de Catalunya, Macromolecular crowding modulates the Terrassa, ES interaction of DnaK with its functional partners Cone opsins are G-protein coupled receptors localized in cone Garbiñe Celaya photoreceptor cells of the retina. These receptors are activated by light , Ianire Martin, Alejandra Aguado, Yovana Cabrera, and mediate the complex process of color vision. These visual pigments Fernando Moro, Arturo Muga are heptahelical transmembrane proteins, bound to a light sensitive Unidad de Biofísica (CSIC, UPV/EHU) and Departamento de chromophore, 11 - cis -retinal (11CR) through a protonated Schiff Bioquímica y Biología Molecular, Universidad del País Vasco, base (SB) linkage at K312. Red and green opsin pigments show 95% Leioa, ES sequence identity and they share a similarly biophysical and biochemical Hsp70 proteins are central components of the cellular network of properties, yet the possible structural differences between each other molecular chaperones and they assist a broad range of physiological are unclear. In order that to study human red and green cone pigments processes, such as folding and assembly of newly synthesized proteins or were expressed in COS-1 cells, regenerated with 11CR and purifi ed refolding of misfolded and aggregated proteins. DnaK (Hsp70) of E. coli is using immunochromatography. Were analyzed the purifi ed pigments an allosteric chaperone that has a nucleotide binding domain (NBD), that using UV-vis and fl uorescence spectroscopies in the dark state and after binds and hydrolyzes ATP, a substrate binding domain (SBD) and a linker photoactivation. Ligand binding was measured by using the analog that connects both domains. DnaK, together with the cochaperone DnaJ 9-cis-retinal (9CR) in addition to 11CR. The results of the regeneration (Hsp40) and the nucleotide exchange factor GrpE, forms the chaperone system that is able to avoid aggregation of partially unfolded protein experiments with the photoactivated receptors show that green cone conformations and to remodel and reactivate some protein aggregates by opsin can not form a pigment in the visible region of the spectrum itself or cooperating with other chaperone systems, such as ClpB (Hsp100). when regenerated with 11CR but it can band with a visible form 9CR. DnaJ and GrpE regulate the functional cycle of DnaK, which is based The acidifi cation of the sample regenerated 11CR showed increased on a complex allosterical interdomain communication that promotes absorption at 440nm suggesting the formation of unprotonated SB linkage transition between two main DnaK conformations that differ in substrate activated between 11CR and green opsin. In contrast, activated red cone affi nity; when DnaK binds ATP, the linker promotes the tethering of both opsin exhibits the formation with protonated SB both retinals. These domains and it acquires an open conformation with lower affi nity. Binding that results suggest the difference in aminoacid sequence between green of substrates and DnaJ induces ATP hydrolysis and DnaK acquires a and red opsins not only contributes to their spectral sensitivity but also conformation recognizable by GrpE, where the two domains separate and modulates ligand binding after photoactivation. Identifi ed the molecular behave independently. In this ADP-bound state, the SBD adopts a closed interactions these details contributing differences in ligand binding can conformation that tightly binds substrates. be a model for fi ne-tuning of ligand- receptor of other members of the The sequential association reactions that occur during the functional cycle GPCR superfamily. of the chaperone system have been characterized under dilute experimental

98 Granada 2014 Pósters conditions, despite the fact that in the intracellular medium the equilibrium the ER and Golgi apparatus. They function individually to mediate selective and transition rates between different protein conformations are most likely incorporation of specifi c cargo proteins into ER-derived vesicles by linking affected by volume exclusion arising from macromolecular crowding. We the cargo with the COPII coat. Here, we show that cargo receptors also have studied the effect of crowding on the conformational properties, interact with each other to form a High-Molecular-Weight complex at the ATPase and chaperone activities of the DnaK system. level of the ER exit sites. We also found that this complex is required for de Our data show that crowding regulates in a temperature dependent manner novo assembly of the cis-Golgi compartment by promoting COPII vesicle the affi nity of DnaK for DnaJ, but not for GrpE. The most relevant DnaJ tethering. Our results suggest that, in addition to their individual function domain regulating this interaction is the disordered G/F rich region that can in selective ER export, cargo receptors cooperate to maintain the structural be recognized by DnaK as a pseudosubstrate at low temperatures. Excluded and functional homeostasis of the early secretory pathway by forming a volume conditions also allow ClpB to compete with GrpE for binding to multi-protein platform that stabilizes the COPII coat onto the vesicle the same DnaK region. This competition directs DnaK to reactivate stable membrane and thereby ensures correct functioning of tethering factors. protein aggregates, interacting with ClpB, or to remodel substrate proteins, interacting with GrpE. Therefore, crowding modulates the interaction of DnaK with specifi c protein partners. P10-46 Unraveling GPCR-Zinc interactions and its role in depression P10-44 Aminooxi análogos de histidina: una Mercè Tena Campos, Xiaoyun Dong, Diana Rivera Rodríguez, Eva posible estrategia para modular la histidina Ramon Portes, Pere Garriga Solé Grup de Biotecnologia Molecular i Industrial, Centre de descarboxilasa humana Biotecnologia Molecular, Universitat Politècnica de Catalunya, Francisca María Sánchez Jiménez1, Rosario Castro Oropeza1, Terrassa, ES Almudena Pino Ángeles1, Maximilian A. Khomutov2, José Luis Zinc supplementation has been widely reported to improve treatment against Urdiales Ruiz1, Alexander Khomutov2 major depressive disorder. It is also well known that G-protein-coupled 1 Dept. Biología Molecular y Bioquímica. Universidad de Málaga- receptor (GPCRs) are involved in this disorder, among these 5-HT1A, GalR1 Unidad 741 CIBERER, Campus Andalucía Tech, Málaga, ES, and GPR39, all three potentially connected to zinc modulation. Our work 2Instituto de Biología Molecular Engelhardt, Moscú, RU has been focused on the study and characterization of these receptors and its relationships with zinc both in vitro and in cell culture. To this aim, we La histamina (Hia) es una amina biógena implicada en procesos have designed a strategy to purify the receptors in a conformationally active fi siológicos esenciales (respuesta inmune, neurotransmisión, entre otros). state. We have used receptors tagged with the monoclonal 1D4 antibody El desequilibrio de su metabolismo juega un destacado papel en muchas epitope, and employed ligand assisted purifi cation. We have purifi ed all patologías. El control de los efectos adversos de Hia se ejerce únicamente three receptors properly folded, active and in a monomeric state as shown modulando sus receptores (H R-H R). En células humanas, Hia se 1 4 by native gel electrophoresis. sintetiza por descarboxilación de la L-His, en la reacción dependiente de In the case of GPR39, it is still under debate whether zinc is the orthosteric piridoxal 5-fosfato (PLP) que cataliza la histidina descarboxilasa (HDC, ligand or not, but it is clear that there is an interaction between the receptor EC 4.1.1.22). La baja tasa de expresión y la inestabilidad de HDC han and the metal ion. According to our results, the receptor appears to be difi cultado su caracterización estructural y funcional, y por tanto el purifi ed bound to zinc, even when cell culture and purifi cation media desarrollo de estrategias basadas en su inhibición. Nuestra experiencia are not supplemented with the cation, meaning that there is a specifi c derivada de estudios in silico (modelado y dinámica molecular) y interaction between zinc and GPR39 under physiological conditions. This experimentales con HDC, nos permitió abordar la búsqueda de nuevas interaction is confi rmed by Trp fl uorescence increase upon EDTA addition posibilidades. Mediante tecnología de “barrido virtual” dedujimos que to a GPR39 purifi ed sample. un inhibidor competitivo efectivo debería ser aquel capaz de enlazarse 5-HT , GalR have been described to heterodimerize triggering a non- efi cientemente con el PLP formando una estructura similar al intermediario 1A 1 physiological state that would underly depression. Using FRET we have PLP-substrato. Debería también conservar el grupo imidazol para reforzar demonstrated that zinc is able to disrupt this interaction. Both purifi ed la afi nidad por el sitio catalítico. Ambas características podían conseguirse receptors are analyzed by surface plasmon resonance in order to determine utilizando el compuesto 4(5)-aminooximetilimidazol (O-IMHA). Esta the kinetics of this interaction. Further investigations should be carried out hipótesis se ha contrastado experimentalmente sobre extractos de HDC to fully uncover the relationships between these receptors, zinc and major humana purifi cada. Hemos comprobado que O-IMHA es capaz de formar depressive disorder. una PLP-oxima en el centro catalítico de la enzima humana. Los resultados indican que O-IMHA puede constituir una cabeza de síntesis prometedora de inhibidores de HDC. Aprovechando el conocimiento actual sobre la P10-47 estructura de la enzima proponemos las confi guraciones más probables del Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, aducto en el sitio catalítico y podremos desarrollar nuevos derivados con potencial traslacional. endonucleasa IV y uracil DNA glicosilasa forman parte de un complejo proteico implicado en SAF2011-26518 y CVI-06585. CIBERER (ISCIII). mantener la integridad del genoma en E. coli

Maria Alexandra Cañas Pacheco, Laura Aguilera Gil, Elaine Ferreira P10r-45 Melo, Carina S. Alvarez, Rosa Giménez Claudio, Josefa Badía Golgi assembly depends on vesicle tethering Palacin, Laura Baldomà Llavinés mediated by cooperation of ER cargo receptors Departamento de Bioquimica i Bilogia Molecular, Facultat de Farmàcia, Universitat de Barcelona. Institut de Biomedicina de la Javier Manzano-López, Ana María Pérez-Linero, Laura Ojeda- UB (IBUB), Barcelona, ES Márquez, Marcos Cámara-Donoso, Manuel Muñiz Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) es una proteína Departamento de Biología Celular, Universidad de Sevilla, Sevilla, ES multifuncional. A parte de su función en la glicolisis presenta otras Endoplasmic reticulum (ER) cargo receptors are major transmembrane actividades. Estudios previos realizados por nuestro grupo con mutantes constituents of the early secretory pathway that continuously cycle between gapA y células silenciadas con RNA antisentido sugerían la implicación

99 Pósters XXXVII Congreso SEBBM funcional de GAPDH en procesos de reparación del DNA en E. coli. 3Estación Experimental del Zaidin, CSIC (EEZ-CSIC), Granada, Las células defi cientes en GAPDH presentan menor supervivencia que ES, 4Departamento de Quimica Fisica, Facultad de Ciencias, las células control frente al tratamiento con agentes genotóxicos, así Universidad de Granada, Granada, ES como un mayor número de centros apurínicos/apirimidínicos (centros Parkinson’s disease is a neurodegenerative disorder with a high AP) espontáneos en su genoma. En este estudio se han realizado ensayos impact in our society. This is one of several diseases related to the pull down seguidos de Western blot con varias proteínas de los sistemas oligomerization and aggregation of α-Synuclein (αSyn). The interaction de reparación del DNA. Los resultados muestran interacción de GAPDH of αSyn with surfactants, lipids and membranes appears to play a key con: (i) SSB (single strand DNA binding protein), proteína esencial en los role in its physiological function. The αSyn found in cells presents a post- procesos de reparación por recombinación homóloga y respuesta SOS (ii) transcriptional modifi cation consisting of the acetylation of its N-terminus, endonucleasa Endo IV, implicada en la reparación de centros AP y (iii) which appears to affect its behavior and therefore also its function. uracil DNA glicosilasa (UDG) que genera un centro AP al eliminar el Sodium dodecyl sulfate (SDS) has been widely used as a simple model uracilo presente en el DNA. El estudio de estas interacciones en mutantes for membrane environment and has been reported to accelerate amyloid defi cientes en estas proteínas indica que GAPDH, EndoIV y UDG forman fi brillation of αSyn in vitro. In this study, we compared N-acetylated and parte de un complejo de reparación de DNA en E. coli. La morfología unacetylated αSyn in their mode of interaction with SDS and related their fi lamentosa observada en cepas silenciadas o defi cientes en GAPDH a las 3 different properties with their amyloidogenic propensity. We found that horas de recuperación después de un tratamiento con bleomicina o agentes in the presence of sub-CMC concentrations of SDS αSyn forms SDS- alquilantes es compatible con la inhibición de la división celular por associated partially folded oligomers. These oligomers appear to constitute acúmulo de lesiones no reparadas en el genoma y confi rma la implicación optimal species for spontaneous and effi cient formation of amyloid nuclei, de GAPDH en procesos de reparación del DNA en E. coli. which further drive rapid, lag-free amyloid fi brillation. N-acetylation reduces the extent of αSyn oligomerization favoring its interaction with micelles, thereby reducing the rate of formation of amyloid nuclei. P10-48 Docosahexaenoic acid effect on the conformational stability of the rhodopsin mutants G90V and N55K P10-51 associated with retinitis pigmentosa El dominio β-hairpin, implicación en el proceso señalizador de dUTPasas triméricas Xiaoyun Dong, Eva Ramon Portes, Pere Garriga Sole Jorge Donderis Martínez1 1 1 Grup de Biotecnologia Molecular i Industrial, Centre de , Elisa Maiques , Ilty Mehemedov , María 2 2 3 Biotecnologia Molecular, Universitat Politècnica de Catalunya, Ángeles Tormo Más , María García Caballer , José Penadés , Alberto 1 Terrassa, ES Marina 1Instituto de Biomedicina de Valencia, CSIC, Valencia, ES, Rhodopsin is a prototypical seven-transmembrane helix receptor belonging 2Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias, CITA-IVIA, to the G-protein coupled receptor (GPCR) superfamily. It functions as a Segorbe, ES, 3Institute of Infection, Immunity, and Infl ammation, visual photoreceptor and serves as the photosensitive pigment for scotopic College of Medical, Veterinary, and Life Sciences, University of vision under dim light conditions. As a GPCR, its structural and functional Glasgow, Glasgow, UK features are modulated by lipids. Docosahexaenoic acid (DHA) provides a physiologically relevant milieu for stabilizing rhodopsin but the Infl uence Las dUTPasas (DUT) son enzimas presentes en todos los organismos que of DHA on rhodopsin mutants conformational properties have not been hidrolizan el dUTP a dUMP y pirofosfato inorgánico. Diversos trabajos previously explored. We have studied the structural features of two han descrito la actividad señalizadora de las DUT independientemente thermosensitive mutants, G90V and N55K, which are associated with the de su actividad catalítica, como es el caso de la DUT monomérica del retinal degenerative disease retinitis pigmentosa and show thermal unstability Epstein-Barr virus, capaz de inducir la expresión de citoquinas pro- when solubilized in the classical neutral detergent dodecyl maltoside (DM). infl amatorias, o la DUT trimérica de la rata que une a PPARα y regula la expresión génica mediada por el complejo PPARα-RXR; o, recientemente We have used 1,2-didocosa-hexaenoyl--sn-glycero-3-phosphocholine nuestro grupo demostró que en Staphylococcus aureus las DUT triméricas (DDHA-PC) liposomes for reconstituting the purifi ed rhodopsin mutants. de bacteriófagos podían inducir la transferencia horizontal de islas de G90V mutant reconstituted in DDHA-PC liposomes showed a 4-fold thermal patogenicidad (SaPI) en estas bacterias [1,2]. stability increase than in DM. In turn, N55K mutant showed a slight increase La movilidad de las SaPI depende de la unión de la DUT a la proteína on its thermal stability under the same conditions. The active conformation Stl que reprime la isla. Dicha unión está vinculada a una conformación metarhodopsin II decayed faster, as measured by retinal release fl uorescence catalíticamente activa de la DUT además de la presencia de un dominio spectroscopic measurements, for both mutants in DDHA-PC liposomes extra de entre 20-30 residuos muy variable en secuencia y longitud entre compared with DM. DDHA-PC liposomes also preserved G90V and N55K las diferentes DUT fágicas. opsin conformations allowing more effi cient binding of exogenously added Para comprender mejor la capacidad señalizadora de estas proteínas, en 11-cis-retinal ligand. DDHA-PC liposomes provide an environment can este trabajo hemos resuelto la estructura tridimensional de 3 DUT con preserve the conformation of the pathogenic mutations by providing higher capacidad inductora de las SaPI de diferentes fagos. Sorprendentemente, thermal stability when compared with the DM-purifi ed receptors. These comparando estas estructuras, junto con la DUT del fago 80α, previamente effects highlight the potential stabilizing role of DHA on the structural resuelta por nuestro grupo, observamos que dentro de este dominio extra features of rhodopsin mutants associated with retinal disease. no conservado a nivel de secuencia, existe una región central de 9 residuos que ocupa una disposición espacial idéntica en todas ellas así como la misma conformación, un β-hairpin, pese a la diversidad de la secuencia. P10-49 Nuestros estudios mutacionales muestran que este motivo estructural juega N-terminal acetylation of α-Synuclein decreaces un papel clave en el reconocimiento de la proteína Stl y por lo tanto en la the population of partially folded oligomers and actividad señalizadora de estas DUT. reduces amyloid aggregation Bibliografía David Ruzafa Ruiz1, Yuriko Hernández G.2, Giovanni Bisello2, [1] Penadés et al., 2013. dUTPases, the unexplored family of signalling Bertrand Morel3, Francisco Conejero-Lara4 molecules. Curr. Opin. Microbiol. 16, 163–170. 1Universidad de Granada, Granada, ES, 2Dipartimento di Science [2] Tormo-Más et al., 2013. Phage dUTPases Control Transfer of Virulence del Farmaco, Università degli Studi di Padova, Padova, IT, Genes by a Proto-Oncogenic G Protein-like Mechanism. Mol. Cell 49, 947-958.

100 Granada 2014 Pósters

P10-52 by CPS1D mutations. Using a baculovirus/insect cell system we have fi nally Investigando la función de CutA en bacterias: succeeded in producing recombinant human CPS1 in large amount and pure estudios estructurales y funcionales form, allowing us to experimentally examine the effects of reported mutations and ascertain its disease-causing potential (Díez-Fernández et al. Human Mut Lorena Tremino-Agulló1, Javier Espinosa2, Carles Palanca1, Asunción 2013; 34:1149). In addition we have determined the structure of CPS1, in Contreras2, Vicente Rubio1 both apo and ligand-bound (NAG and ADP/Pi) forms. The liganded structure 1Instituto de Biomedicina de Valencia (IBV-CSIC) y CIBERER- revealed how NAG binds in a pocket of the C-terminal domain and has ISCIII, Valencia, ES, 2División de Genética, Universidad de identifi ed elements stabilized by ADP binding and conformational changes that Alicante, Alicante, ES lead to defi ne the carbamate tunnel, which in the apo form is heavily branched Nuestro laboratorio ha aclarado sobre base estructural la función de la and open to the environment. Our structures decipher the CPS1 inability to use proteína PII, señalizador homotrimérico de 112 residuos, muy conservado glutamine and reveal a potential channel for ammonia intake. Furthermore, y ampliamente distribuido, que interacciona con enzimas, canales y they help rationalize the disease-causing role of most clinical CPS1 mutations. reguladores de expresión génica. Ahora intentamos lo mismo con la proteína CutA, de secuencia aparentemente no homóloga a PII, también Supported by Fundación Alicia Koplowitz and Valencian (Prometeo homotrimérica, de 112 residuos, muy conservada y ampliamente distribuida. 2009/051) and Spanish (BFU2011-30407; FPU to CD-F) governments. Su nombre se debe a que su gen se identifi có en una región de dos genes de E.coli cuya deleción sensibilizaba a cobre, sin evidencia sólida de su implicación en protección a metales. Suponiéndole una función señalizadora P10-54 análoga a la de PII, realizamos un estudio de doble híbrido en levadura con Unveiling the mechanism of transcriptional una librería del genoma y de candidatos prometedores de la cianobacteria auto-regulation of parD system Synechococcus elongatus, el mismo organismo y estrategia que llevaron a Srdja Drakulic identifi car las dianas de PII. Los resultados con CutA, presentados aquí, han , Ana María Hernández-Arriaga, Carlos Fernández- sido poco informativos. También presentaremos la estructura cristalina de Tornero, Ramón Díaz Orejas CutA de S. elongatus a 2 Å de resolución, esencialmente idéntica a la de PII Centro de Investigaciones Biológicas (CIB/CSIC), Madrid, ES excepto por faltar los largos lazos fl exibles T, sin que hayamos tenido éxito Survival of extrachromosomal genetic material in bacterial population en generar estructura de complejos con metales de esta proteína. Finalmente, involves the activity of toxin-antitoxin systems (TA). In particular, the presentaremos experimentos en que reconsideramos desde el inicio la maintenance of R1 plasmid requires the employment of three stability funcionalidad de CutA, utilizando un mutante nulo de E. coli, exclusivo de systems: parA, parB and parD. The focus of our work is on the parD system, CutA, en el que investigamos la sensibilidad a metales y otras características a type II toxin-antitoxin system, consisting of stable protein toxin Kid, a fenotípicas. Confi amos en que estos experimentos proporcionen información ribonuclease which activity leads to cell growth arrest, and of proteolyses funcional sólida sobre el papel de CutA y sobre las razones de su amplia prone Kis antitoxin, which through protein-protein interactions abolishes distribución y alta conservación. the toxic effect of Kid. Interestingly, parD operon exhibits a transcriptional auto-regulation. Depending on their relative molar ratio and the presence Financiado por ayudas Prometeo 2009/051 (Generalitat Valenciana) y of promoter DNA, Kis and Kid form differentially sized complexes, with BFU2011-30407 (MINECO). L. Tremino becaria FPI del MINECO. variable capacity of parD operon transcriptional regulation.Our preliminary results indicate that KisKid complexes coexist with RNAP at the promoter, raising questions of how KisKid system and RNAP interact, and how P10-53 (R10-4) would this lead to parD operon´s transcription decrease. In order to provide Crystal structures of human carbamoyl phosphate the answers to previously raised questions, we have combined structural, synthetase 1 (CPS1) shed light on domains in a fi rst place negative-staining EM, with biochemical/functional analysis of the RNAP core-enzyme (subunits composition: α, β, β´, γ, ω), RNAP functions, substrate tunnels and allosteric core in complex with the sigma70 factor (RNAP holoenzyme), KisKid activation, and allow rationalization of inborn repressor with its promoter DNA (PO), and RNAP holoenzyme:KisKid:PO CPS1 deficiency complex. The 3DEM structure of the repressor-DNA complex indicates that two KisKid-heterooctamers, bound respectively at the operator sites Sergio de Cima Martín1, Luis Mariano Polo1, Carmen Díez- I and II, establish protein-protein interactions to form a supercomplex in Fernandez1, Javier Cervera1, Ignacio Fita2, Vicente Rubio1 which the RNAP binding site seems to be exposed through the extensive 1Instituto de Biomedicina de Valencia of the CSIC, and Group DNA bending. Our current work is dedicated to the determination of the 739 of the Centro de Investigación Biomédica en Red sobre structural and biochemical properties of the RNAP holoenzyme-KisKid- Enfermedades Raras-CIBERER del Instituto de Salud Carlos III, DNA complex, with the goal of deciphering the transcriptional regulation Valencia, ES, 2Institut de Biologia Molecular de Barcelona (CSIC), mechanism of the KisKid repressor complex on the parD system. Barcelona, ES CPS1 is a large six-domain protein that constitutes the fi rst step of the urea cycle: the synthesis of carbamoyl phosphate from bicarbonate, ammonia P10-55 and two ATP molecules. A paramount feature of this enzyme is its absolute The why of linkers in structural biology: the case requirement for N-acetyl-L-glutamate (NAG), an allosteric activator without of Galectin-4 which it is inactive. The report of CPS1 regulation by lysine deacylation Mónica Álvarez Pérez1 1 2 by NAD-dependent sirtuin 5 connected the urea cycle with the age-control , Eliza Buzamet , Rubén M. Buey , Sabine 3 2 3 3 machinery (Nakagawa et al. Cell 2009; 137:560). CPS1 defi ciency (CPS1D) Vértesy , J. Fernando Díaz , Sabine André , Hans-Joachim Gabius , 1 1 is an inborn disorder that cause severe neonatal hyperammonemia leading Margarita Menéndez , Dolores Solís 1 to mental retardation or even to death. More than 300 mutations have been Instituto de Química Física Rocasolano, CSIC and Centro de reported in CPS1D patients, of which the majority are missense mutations Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Respiratorias- 2 showing little recurrence and having unproven disease-causing potential. The CIBERES, Madrid, ES, Centro de Investigaciones Biológicas, 3 structure of the E. coli homologous CPS has been known for >15 years, but CSIC, Madrid, ES, Institut für Physiologische Chemie,Tierärztliche differences with CPS1 (40% identity; use of glutamine instead of ammonia; Fakultät, LMU München, Munich, DE insensitivity to NAG) rendered essential to obtain the structure of CPS1 for Cell surface glycans are versatile biochemical signals decoded and translated proper understanding of its functioning, and for evaluating disease causation into responses by endogenous lectins [1]. Among them, the members of the

101 Pósters XXXVII Congreso SEBBM galectin family with ability to crosslink glycans of cellular glycoconjugates Nacional de La Plata, La Plata, AR, 3Department of Macromolecular fulfi l special tasks, e.g. in growth control and glycoprotein routing as Structure, Centro Nacional de Biotecnología, Consejo Superior de galectin-4 (Gal-4) does [2, 3]. To address the issue on the functional Investigaciones Cienfícas-CSIC, Madrid, ES signifi cance of the 42-amino-acid linker connecting the two lectin domains, Carboxypeptidase D (CPD) is a 180 kDa membrane-bound we engineered variants and performed structural analysis in solution. metallocarboxypeptidase that contains three carboxypeptidase (CP) Analytical ultracentrifugation and gel fi ltration revealed an impact of linker domains. The biological function of this enzyme is not well known truncation on quaternary structure, further studied by additional variants. but it is thought to participate in the maturation of hormones and other This type of structural analysis was fl anked by precipitation analysis with a bioactive peptides in the trans-Golgi network and functions as a docking pan-galectin counterreceptor, i.e. the glycoprotein asialofetuin. The obtained receptor for duck hepatitis B virus. Only the fi rst and second domains results disclose new information on linker presence and encourage respective have detectable carboxypeptidase activity whereas the third domain seems analysis using this strategy on homodimeric Gal-1, engineered to have the to be implicated in the virus recognition. Previous reports described the Gal-4 linker, and the chimera-type Gal-3. three-dimensional structures of the fi rst and second CP domains solved by X-ray crystallography. Nonetheless, nothing is known about the three References dimensional structure of the full-length enzyme and the implications for [1] Gabius et al. (2011) From lectin structure to functional glycomics: its biological function. principles of the sugar code. TIBS 36, 298-316. To study the structure of full-length human CPD we cloned, recombinantly [2] Ledeen et al. (2012) Beyond glycoproteins as galectin counterreceptors: expressed and purifi ed a soluble form of this enzyme, lacking the tumor-effector T cell growth control via ganglioside GM1. Ann N Y Acad transmembrane domain. For this purpose we used a mammalian cell-based Sci 1253, 206-221. expression system that allows us to purify milligrams of soluble and active [3] Velasco et al. (2013) Neuronal galectin-4 is required for axon growth human CPD. and for the organization of axonal membrane L1 delivery and clustering. J The oligomeric state of the enzyme was determined by molecular exclusion Neurochem 125, 49-62. chromatography and dynamic light scattering (DLS), showing that the protein self-associates to a homotrimeric complex with a molecular weight of approximately 450 kDa. The CPD trimeric complex was stable up to 1 P10-56 Tubulin dimer dissociation by chaperones TBCE M salt concentrations, suggesting that complex association is driven by hydrophobic interactions. and TBCB is a mechanically driven process By single particle EM reconstructions we confi rmed the trimeric native Gerardo Carranza1, Marina Serna2, Jaime Martín-Benito3, Jose María state of this soluble human CPD enzyme. In the trimer each CPD monomer Valpuesta3, Juan Carlos Zabala1 has almost triangular appearance with dimensions of approximately 80 x 1Universidad de Cantabria, Santander, ES, 2Imperial College, 80 Å. The oligomeric structure has a 3-fold rotational symmetry with a London, UK, 3Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC), high structural fl exibility. Madrid, ES Finally, using the interactions observed in the tridimensional structure of duck CPD dII previously solved, we propose a three-dimensional structure A group of molecular chaperones termed tubulin cofactors (TBCs) model of human CPD to explain the obtained single particle EM 2D participate in tubulin proteostasis inside the cell playing an important role reconstructions. in the spatial and temporal regulation of the microtubule cytoskeleton. While tubulin heterodimer formation is well characterized, its dissociation pathway is not well understood. P10-58 In the study reported here we showed the structural determination by electron La asociación de las GTPasas pequeñas RagA microscopy and image processing of the complex between human TBCE, TBCB and α-tubulin (αEB), which is formed upon dissociation of the αβ- y Rab3 al motor de dineína tiene lugar a través tubulin heterodimer by both chaperones, as well as its interpretation through de su unión a DYNLT the molecular fi tting of the atomic structures of the protein domains. Javier Merino Gracia1 2 3 Docking of the atomic structures of the different domains of the three , Ruth A. Valero , Mª Flor García-Mayoral , proteins, including the UBL domain of TBCE, solved in this study by X-ray Marta Bruix3, Ignacio Rodríguez-Crespo2 crystallography, has allowed us to construct an atomic model of the αEB 1Universidad Complutense de Madrid, Madrid, ES, 2Departamento complex with important functional consequences regarding the molecular de Bioquímica y Biología Molecular I, Universidad Complutense de mechanism of the tubulin dimer dissociation by both tubulin cofactors. This Madrid, Madrid, ES, 3Instituto de Química-Física Rocasolano, CSIC, process, which is not energy-dependent, takes place through the distortion of Madrid, ES the α/β-tubulin interface caused by a steric clash between the TBCE CAP- Las cadenas ligeras de dineína, DYNLT, DYNLL y DYNLRB, son pequeñas Gly and LRR domains and β-tubulin. Finally, the protruding arrangement of proteínas diméricas que forman parte del motor de dineína, una estructura both UBL domains in the αEB complex suggests a direct interaction of this macromolecular de ~1.2 MDa encargada del transporte retrógrado por complex with the proteasome, mediating α-tubulin degradation. los microtúbulos. Estas tres cadenas se asocian al extremo N-terminal de la cadena intermedia de dineína, DYNC1I. Aunque DYNLT y DYNLL no son homólogas entre sí, adoptan un plegamiento casi idéntico, con láminas P10-57 beta antiparalelas como superfi cies de unión del dímero, fl anqueada por dos Insights into the human carboxypeptidase D alfa hélices en cada monómero. Para DYNLL se ha descrito su asociación structure deduced from single-particle electron a numerosas proteínas celulares y virales que poseen una de las dos microscopy secuencias consenso de unión: KSTQT y –KDTGIQVDR, las cuales adoptan una disposición de cadena beta que se inserta de forma antiparalela en el Javier Garcia Pardo1, Sebastian Tanco1, Pablo Gallego1, Daniela homodímero previamente formado. Sin embargo, DYNLL posee un único Lufrano2, David Reverter1, José L. Carrascosa3, Julia Lorenzo1, sitio de unión para polipéptidos, implicando que si se asocia a la cadena Francesc X. Avilès1 intermedia de dineína no puede unirse simultáneamente a una proteína diana. 1Institut de Biotecnologia i Biomedicina and Departament de Nuestro trabajo muestra que DYNLT, al contrario que DYNLL, funciona Bioquimica i Biologia Molecular, Universitat Autònoma de como una proteína de acoplamiento de proteínas diana al motor de dineína, Barcelona, Bellaterra, ES, 2Laboratorio de Investigación de presentando dos sitios de unión. RagA y Rab3D son dos pequeñas GTPasas Proteínas Vegetales, Facultad de Ciencias Exactas, Universidad que se asocian con DYNLT. Por medio de dobles híbridos de levaduras y

102 Granada 2014 Pósters mutagénesis dirigida de las GTPasas, hemos identifi cado el sitio de unión fungal laccases are capable to promote complex hetero-polymerizations of de DYNLT, y los requerimientos de la secuencia para la interacción. Con great signifi cance for the synthesis of dyes [1]. técnicas de NMR hemos localizado los aminoácidos de DYNLT implicados The present work describes a laboratory evolution protocol to engineer en la unión a la cadena intermedia de dineína y los implicados en su unión effi cient fungal laccases for the synthesis of polymeric dyes. The departure a las GTPasas pequeñas. En experimentos de inmunoprecipitación hemos point for this study was the laccase IG-88 mutant from of Myceliophthora confi rmado que DYNLT funciona como proteína puente capaz de asociar thermophila, which was previously evolved through 21 rounds of RagA y Rab3D a microtúbulos. Así, establecemos un modelo que describe directed evolution for secretion in yeast, organic co-solvent tolerance and un nuevo mecanismo de asociación de proteínas al motor de dineína, para su alkalophilicity [2-4]. With the help of a HTS-assay based on the oxidative transporte por los microtúbulos. cross-coupling (heterocoupling N-C) of 2,5-diaminobenzenesulfonic acid (2,5-DABSA) and policatechol, laccase mutant libraries were screened and new variants with improved turnover rates under operational conditions P10-59 (alkaline pH, high temperature) were identifi ed. La pérdida funcional de VAMP2 en células plasmáticas humanas provoca una disminución de la secreción de inmunoglobulinas

Laura Gómez Jaramillo, Raquel Romero García, Ana B. Ramos P11. Genómica y proteómica Amaya, Gema Jiménez Gómez, José A. Brieva, Antonio Campos Caro Hospital Universitario Puerta del Mar, Cádiz, ES P11-1 (R11-1) Objetivo: Las células plasmáticas (CP) son células secretoras por Where proteomics is the approach in basic and excelencia que presentan una maquinaria exocítica muy desarrollada, translational plant research, but how? donde se engloban las proteínas SNARE. Estas participan en todo proceso de fusión de membrana que tenga lugar en la célula, gracias a la formación Jesus V. Jorrin Novo de un complejo constituido por tres miembros, uno de cada una de las Agroforestry and Plant Biochemistry and Proteomics; Dpt. of tres familias descritas de estas proteínas; SNAP25, Syntaxinas y VAMP. Biochemistry and Molecular Biology, Córdoba, ES Resultados previos implican a SNAP-23 y STX4 en la secreción de Igs. El Biological investigation and knowledge at the molecular level, whether objeto de este estudio es defi nir qué miembro de la familia VAMP completa the experimental systems are plants or other living organisms, models or el complejo que lleva a cabo la secreción de Ig en CPs humanas. orphans, is based and the result of data generated by the use of different and Metodología: Usamos la línea celular U266. Caracterizamos la complementary methodological approaches. Historically we moved from the expresión y distribución de VAMP2 mediante ensayos de western blot classical and in vitrotechniques (e.g. protein chemistry/biochemistry) to the e inmunofl uorescencia, respectivamente. Como estudios de pérdida de in vivo and the most recent holistic, –omics, ones (e.g. proteomics), that with función realizamos tres estrategias; 1) Silenciamos su expresión con ARNi, mathematical and bioinformatics tools build the so-called Systems biology. 2) Sobreexpresamos la cadena ligera de la toxina tetánica, neurotoxina Nowadays, biological research should not be just the result of data que degrada VAMP2 y VAMP3 pero no afecta a la integridad de los accumulation and blind acceptance of the huge amount of data generated demás miembros de la familia y 3) Expresamos varias construcciones by the potent –omics equipment’s and algorithms, as the result of that could de VAMP2 que consisten en distintas deleciones del fragmento be, in the best of the cases, merely descriptive and speculative. transmembrana de la proteína con el fi n de que compitan con la forma As indicated in the title of this presentation, and based on my own research normal endógena provocando la formación de complejos no funcionales. experience and the current literature, it is pretended to discuss how is or En los sobrenadantes resultantes de todos estos ensayos hemos medido la could be the contribution of proteomics to the knowledge in these living secreción de IgE mediante ELISA. organisms. Why, when, and how to use proteomics should be the questions Resultados: La disminución de los niveles de VAMP2 o su pérdida de to be answered. Finally, the challenges, power and limitations of the función en las células provoca una disminución en la secreción de Igs. El approach will be evaluated. mismo efecto observamos cuando introducimos en la célula la proteína VAMP2 delecionada en el fragmento trasmembrana que se distribuye deslocalizada por todo el citoplasma. Además observamos que las vesículas P11-2 (R11-2) que transportan la IgE en células U266 colocalizan parcialmente con VAMP2. La proteína quinasa DYRK1A regula transcripción Conclusión: VAMP2 es un claro candidato a ser el tercer SNARE que, vía su reclutamiento a promotores junto con SNAP23 y STX4, forman el complejo que lleva a cabo la secreción de Igs en CP. Si bien, la disminución es parcial, indicando que Susana de la Luna existen otras proteínas SNARE o reguladoras implicadas en dicho proceso. ICREA y Centro de Regulación Genómica-CRG, Barcelona, ES DYRK1A es una proteína quinasa que participa en procesos celulares relacionados con proliferación, diferenciación y supervivencia. La actividad P10-60 biológica de esta quinasa es extremadamente dependiente de la dosis génica Synthesis of polymeric dyes through oxidative ya que su sobreexpresión se ha asociado a alteraciones del neurodesarrollo cross-coupling by directed laccase evolution asociadas al síndrome de Down, mientras que mutaciones en uno de los alelos del gen codifi cante son responsables de un nuevo síndrome asociado Ana Isabel Vicente Martín1 2 , Susana Camarero Fernández , Miguel al locus MRD7 (Mental Retardation Autosomal Dominant 7). 1 Alcalde Galeote DYRK1A está presente tanto en el núcleo como en el citoplasma de células de 1 2 Instituto de Catálisis y Petroleoquímica, CSIC, Madrid, ES, Centro mamífero, si bien la mayoría de sus actividades nucleares pueden ser explicadas de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid, ES por fosforilaciones que ocurren en el citosol. Estas observaciones han planteado Fungal laccases (EC1.10.3.2) are blue-multicopper containing enzymes dudas sobre si esta quinasa posee funciones específi camente nucleares. capable of oxidizing phenols, polyphenols, aromatic amines and many Mediante una aproximación proteómica no sesgada, hemos identifi cado other compounds with the concomitant reduction of molecular oxygen que la fracción nuclear de DYRK1A interacciona con componentes de la to water. The versatility of these enzymes can be expanded by the use of maquinaria basal de transcripción. El análisis a nivel genómico de la presencia redox mediators (from natural or synthetic origin) thereby fi nding plenty of de DYRK1A en cromatina, mediante experimentos de ChIP-Seq, ha revelado applications ranging from bioremediation to novel green processes. Besides, que la quinasa es reclutada a regiones proximales de promotores dependientes

103 Pósters XXXVII Congreso SEBBM de la RNA polimerasa II caracterizados por la presencia de una secuencia través de la activación de la integrina αIIbβ3. Además, se sabe que C3G palindrómica muy conservada, y enriquecidos en categorías funcionales juega un papel fundamental en la agregación plaquetaria, tanto in vitro como relacionadas con traducción y procesamiento de RNA. La presencia de in vivo, a través de la activación de Rap1b. En base a todo esto, nuestra DYRK1A en genes dependientes de la RNA polimerasa III también ha sido hipótesis es que C3G puede infl uir en la secreción durante la activación detectada. Nuestros datos indican que la expresión de un grupo de genes diana, plaquetaria. Para estudiar esta cuestión, hemos utilizado líneas de ratones dentro de estas categorías, depende de la actividad quinasa de DYRK1A. transgénicos para C3G (tgC3G) y C3GΔCat (un mutante con deleción del Además, la reducción en los niveles de DYRK1A provoca una reducción en el dominio catalítico) donde ambos transgenes se expresan bajo el promotor tamaño de las células. Los resultados permiten proponer un modelo por el que del gen PF4, exclusivo de megacariocitos y plaquetas. La evaluación de la DYRK1A podría regular directamente la expresión de genes diana mediante la cantidad de proteínas secretadas, tras la activación por trombina, mostró que fosforilación, en regiones reguladoras promotoras, de diferentes componentes las plaquetas tgC3G secretaron mayor cantidad que los controles, mientras de la maquinaria basal de la transcripción, contribuyendo a la coregulación de que las plaquetas transgénicas para C3GΔCat secretaron una menor cantidad. programas de expresión implicados en la homeostasis celular. El perfi l de secreción proteica de las plaquetas tgC3G también fue diferente al encontrado en los demás grupos hallándose una mayor variedad de proteínas. Un estudio proteómico preliminar reveló que entre las proteínas P11-3 diferencialmente secretadas por las plaquetas tgC3G se encontraban Caracterización de la expresión de haptoglobina apolipoproteínas, inhibidores de proteasas, fi brinógeno, αhemoglobina y en cáncer colorrectal trombospondina-1, las cuales son de gran interés por estar involucradas en el desarrollo de diversas patologías cardiovasculares. Estos resultados permirán Óscar Mariño Crespo1, Elisa Cuevas Álvarez2, Emilio Gil Martín1, profundizar en el papel de C3G como regulador de la función plaquetaria Almudena Fernández Briera1 y abren nuevas perspectivas sobre sus posibles efectos fi sio-patológicos, 1Departamento de Bioquímica, Genética e Inmunología, Universidad especialmente en el contexto de patologías trombóticas. de Vigo, Vigo, ES, 2Servicio de Anatomía Patológica, Complejo Hospitalario Universitario de Ourense, Ourense, ES La haptoglobina (Hp) es una proteína de fase aguda conocida por unir P11-5 hemoglobina durante la hemólisis, evitando así la pérdida de hierro y el daño Efecto del clima en las comunidades bacterianas renal. En un estudio reciente detectamos esta proteína en especímenes de asociadas al suelo rizosférico en el Parque pacientes con cáncer colorrectal (CCR) como potencial portadora de CDw75, Nacional de Sierra Nevada un epitopo glucídico relacionado con la progresión de esta neoplasia. Para proseguir con este trabajo nos hemos propuesto certifi car la expresión Javier Pascual1, Silvia Blanco1, Juan Luis Ramos2, Pieter van de la Hp en CCR mediante un estudio inmunohistoquímico utilizando Dillewijn1 especímenes de tejido sano y tumoral (12 y 55, respectivamente). Además, 1Departamento de Protección Ambiental, Estación Experimental del hemos pretendido caracterizar su expresión y relación con el CDw75 Zaidín, CSIC, Granada, ES, 2ABENGOA RESEARCH, Sevilla, ES mediante western blot de fracciones enriquecidas en proteínas citosólicas Teniendo en cuenta que los microorganismos presentes en el suelo, y o de membrana procedentes de especímenes de tejido sano y tumoral de especialmente en el suelo asociado a las raíces de las plantas, la rizosfera, algunos de los pacientes empleados en el estudio histológico. ejercen un papel clave en la dinámica y el funcionamiento de los Ninguno de los especímenes de tejido sano analizados por inmunohistoquímica ecosistemas, es necesario conocer cómo las comunidades bacterianas se presentó expresión de Hp, mientras que en el tejido tumoral únicamente ven infl uenciadas por los cambios climáticos que se producen en el medio se detectó en 9 de los 55 ensayados (16 %). Cuando estaba presente, la ambiente. Uno de los lugares que puede ser utilizado como modelo para Hp apareció de forma tenue, focal y restringida a las células del epitelio evaluar el efecto del clima es el Parque Nacional de Sierra Nevada, debido glandular. Además, hemos comprobado que la expresión de esta proteína se a la clara estratifi cación termoclimática que existe en el macizo montañoso. asocia signifi cativamente con la edad del paciente, el estadio de Dukes y la El objetivo del presente trabajo ha consistido en el análisis de la diversidad presencia de metástasis. taxonómica y funcional de las comunidades bacterianas asociadas a la Mediante western blot hemos acreditado la presencia preferencial de la Hp rizosfera del tomillo salsero (Thymus zygis L.) y al suelo suelto, presente en la fracción citosólica y comprobado que su patrón de bandas coincide en en diferentes pisos termoclimáticos de dos regiones de Sierra Nevada, masa con el del epitopo CDw75. Por otro lado, no parece haber diferencias Capileira y Puerto de la Ragua. de expresión de la Hp entre el tejido sano y el tumoral. Para llevar a cabo el estudio se ha analizado el ADN metagenómico de las comunidades bacterianas presentes en las diferentes muestras de suelo: (i) Estudio fi nanciado mediante el Contrato-Programa CN 2011/024, Xunta la diversidad taxonómica se ha analizado mediante pirosecuenciación de de Galicia. amplicones del gen ARNr 16S, mientras que (ii) la diversidad funcional se ha estudiado utilizando GeoChips. Los resultados obtenidos hasta la fecha muestran que el clima ejerce un papel P11-4 clave en la estructura y funcionalidad de las comunidades bacterianas del Nueva función del GEF C3G como regulador suelo. Este trabajo forma parte de un estudio más amplio donde se analizará del secretoma plaquetario: implicación en la a su vez la dinámica de las comunidades bacterianas a escala temporal. patología trombótica

Víctor Martín Granado1, Sara Gutiérrez Herrero1, Sara Alonso P11r-6 Alvarez2, Sara Ortiz Rivero1, José Ramón González Porras2, Neibla Análisis transcriptómico mediante RNA-seq de Priego Bendeck3, Almudena Porras Gallo3, Carmen Guerrero Arroyo1 genes de respuesta a ácido linolénico implicados 1Centro de Investigación del Cáncer, IBMCC (USAL-CSIC), IBSAL, Salamanca, ES, 2Hospital Universitario de Salamanca, IBSAL, en situaciones de estrés abiótico en Arabidopsis 3 Salamanca, ES, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular Capilla Mata Pérez1, Beatriz Sánchez-Calvo1, Juan Carlos Begara- II, Facultad de Farmacia, UCM, IdISSC, Madrid, ES Morales1, María N Padilla-Serrano1, Raquel Valderrama1, Francisco C3G es un factor intercambiador de nucléotidos de guanina (GEF) de Rap1, Luque2, Ana Fernández-Ocaña1, Francisco J Corpas3, Juan B Barroso1 una proteína de la familia Ras muy abundante en plaquetas. Especíﬁ camente, 1Grupo de Bioquímica y Señalización Celular en Óxido Nítrico, la isoforma Rap1b participa en aspecto críticos de la función plaquetaria a Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad

104 Granada 2014 Pósters de Jaén, Jaén, ES, 2Departamento de Biología Experimental, P11-8 Universidad de Jaén, Jaén, ES, 3Grupo de Antioxidantes, Radicales Búsqueda de termoenzimas hidrolíticas en una Libres y Óxido Nítrico en Biotecnología y Agroalimentación, metagenoteca de aguas termales Departamento de Bioquímica, Biología Molecular y Celular de Juan José Escuder Rodríguez, Kamila Knapik, María Isabel Plantas, Estación Esperimental del Zaidín, CSIC, Granada, ES González Siso, Manuel Becerra Fernández El ácido linolénico (LnA) es un ácido graso poliinsaturado esencial de Universidad de A Coruña, A Coruña, ES la serie omega-3, precursor de la fi tohormona Ácido Jasmónico (JA), La metagenómica funcional, es decir, el estudio del genoma colectivo de una implicada en diversas situaciones de estrés abiótico que cursan con comunidad microbiana presente en una muestra ambiental, es una poderosa la sobreproducción de especies de oxígeno reactivo (ROS) [1,2]. Con herramienta para explotar la gran diversidad de microorganismos no el objetivo de tener un conocimiento más amplio acerca de los genes cultivables en la búsqueda de nuevas enzimas con aplicación industrial. La implicados en la respuesta a LnA, se realizó un análisis transcriptómico en técnica se basa en la extracción del material genético presente en la muestra cultivos celulares de A. thaliana, mediante la tecnología de secuenciación ambiental y su clonación en un hospedador heterólogo para la obtención a gran escala Illumina-mRNA-Seq. Se analizó el comportamiento de una biblioteca metagenómica (metagenoteca) en la que identifi car de genes que responden a la señalización por LnA implicados en la actividades enzimáticas de interés añadiendo los sustratos adecuados al generación de un fenómeno de estrés oxidativo durante situaciones de medio de cultivo. Esta metodología, en comparación con la metagenómica estrés abiótico, identifi cándose un total de 3275 genes que respondían basada en secuencia, permite encontrar nuevos productos génicos que no presentan homología signifi cativa con las secuencias conocidas y a LnA. La mayoría estaban relacionados con la ruta biosintética del depositadas en las bases de datos. Determinados procesos industriales se JA, como la Lipoxigenasa (LOX) o Aleno Óxido Ciclasa (AOC) [3]. llevan a cabo en condiciones adversas para la mayoría de microorganismos, Sin embargo, una parte importante de ellos estaba relacionada con el tales como elevadas temperaturas, pH extremo, alta salinidad o alta mecanismo de respuesta frente a diversas situaciones de estrés abiótico, concentración de solventes. En este sentido, es común la búsqueda de como la galactinol sintasa 1 (GOLS1), diferentes enzimas detoxifi cadoras enzimas procedentes de comunidades microbianas de ambientes extremos, de grupos carbonilo y diferentes deshidrogenasas. En defi nitiva, el en los que se dan condiciones similares. En este trabajo se ha construido análisis funcional mediante tecnología RNA-seq permite ampliar nuestro una metagenoteca a partir de una muestra de aguas termales para la conocimiento sobre la conexión de ROS y la ruta de señalización del JA, búsqueda de enzimas hidrolíticas estables a elevadas temperaturas. Debido evidenciando que una parte signifi cativa de estos genes codifi ca proteínas a que los fenómenos de transcripción, traducción, plegamiento y secreción relacionadas con la respuesta de la planta a diferentes situaciones de del producto génico pueden ser incorrectos al emplear como hospedador la estrés y estímulos abióticos. bacteria mesófi la Escherichia coli, se ha empleado un vector lanzadera que permite la transferencia de la metagenoteca a la bacteria termófi la Thermus Bibliografía thermophilus para incrementar los productos génicos detectables. [1] Suza WP et al. (2010) Plant Physiol Biochem 48:337-50. [2] Hu X et al. (2009) Plant Signal Behav 4:696-7. P11m-9 [3] Wasternack C, Hause B (2013) Ann Bot. Identificación de biomarcadores y nuevas

Financiado por Ministerio de Economía y Competitividad (proyectos proteínas relacionadas con la enfermedad BIO2012-33904, AGR-6374, AGR-6038, 20134R0569) y Junta de aterosclerótica en pacientes con diabetes Andalucía (grupos BIO286 y BIO192). mellitus tipo 2

Beatriz García-Fontana1, Sonia Morales-Santana2, Victoria Longobardo3, Antonia García-Martín1, Rebeca Reyes-García1, Pedro P11-7 (R11-4) Rozas-Moreno4, José Antonio García-Salcedo5, Manuel Muñoz- MicroRNAs in tumor development Torres1 Pedro Medina Vico 1Unidad de Metabolismo Óseo (RETICEF), Servicio de Endocrinología, Instituto de Investigaciones Biomédicas de Universidad de Granada, Granada, ES Granada, Hospital Universitario San Cecilio, Granada, ES, 2Unidad MiRNAs are a class of small RNA molecules that regulate gene expression de Metabolismo Óseo (RETICEF), Servicio de Endocrinología, at the posttranscriptional level. Initially discovered in Caenorhabditis Instituto de Investigaciones Biomédicas de Granada, Hospital elegans, they were considered an oddity of nematodes until it was Universitario San Cecilio - Servicio de Proteómica, Fundación realized that some of them were phylogenetically conserved in a wide para la Investigación Biosanitaria de Andalucía Oriental -Alejandro variety of animals including humans. Today, miRNAs are increasingly Otero- (FIBAO) , Granada, ES, 3Servicio de Proteómica, Instituto seen as important regulators of gene expression, ushering in a renewed de Parasitología y Biomedicina “López Neyra” (CSIC), Granada, 4 appreciation of the regulative capabilities of ncRNA. At the cellular level, ES, Servicio de Endocrinología, Hospital General de Ciudad Real, Ciudad Real, ES, 5Unidad de Enfermedades Infecciosas, Instituto miRNAs are signifi cant in the establishment and maintenance of cell de Investigaciones Biomédicas de Granada, Hospital Universitario identity. Aberrant levels of miRNAs often result in loss of differentiation, San Cecilio, Granada, ES a hallmark of cancer. Not surprisingly, therefore, dysfunctions of the miRNA pathway affect many cellular processes that are routinely altered La prevalencia de diabetes mellitus está aumentando rápidamente alcanzando proporciones epidémicas. Esta enfermedad se asocia a in cancer, such as differentiation, proliferation, apoptosis, metastasis, and numerosas complicaciones, siendo la enfermedad aterosclerótica (EA) una senescence. de las más relevantes debido a su morbimortalidad. Por ello, la identifi cación Although the miRNA era started only a few years ago, it has brought precoz de pacientes diabéticos con alto riesgo de padecer EA es relevante great promise for diagnosis, prognosis, and therapy of cancer. The quick para reducir el impacto de esta enfermedad y sus complicaciones. El development of powerful techniques such as miRNA microarrays, short- objetivo de este estudio fue comparar el proteoma sérico de pacientes con RNA deep sequencing, specifi c quantitative polymerase chain reaction diabetes mellitus tipo 2 (DM2) con o sin EA con el de sujetos sanos para (PCR) of miRNAs, and antisense technologies is expected to have a identifi car biomarcadores o proteínas esenciales que intervengan en la signifi cant impact on clinical oncology in the next decade. patogénesis de la DM2 y la EA.

105 Pósters XXXVII Congreso SEBBM

Se realizó un estudio proteómico incluyendo 18 hombres divididos en tres P11-11 grupos: i) 6 pacientes con DM2 y EA, ii) 6 pacientes con DM2 sin EA; iii) Identificación de proteínas celulares de unión 6 controles sanos. Se realizó una depleción proteica de las 14 proteínas al elemento CRE del genoma del virus de la mayoritarias para mejorar la sensibilidad de detección en suero. Los perfi les hepatitis C proteicos fueron separados mediante 2D-DIGE y las imágenes obtenidas fueron analizadas mediante el software específi co DeCyder 7.0. Las Pablo Ríos Marco, Cristina Romero López, Alba Fernández Sanlés, proteínas expresadas diferencialmente se identifi caron por espectrometría Alfredo Berzal-Herranz de masas-masas (MALDI TOF-TOF) o cromatografía líquida acoplada a Instituto de Parasitología y Biomedicina “López - Neyra”, CSIC, espectrometría de masas (LC-MS/MS). Armilla, ES Nuestros resultados muestran una sobreexpresión de la proteína de unión El genoma del virus de la hepatitis C (HCV) es un RNA monocatenario a retinol plasmático (RBP) y de la glutation peroxidasa 3 (GPx -3) y una de polaridad positiva con una longitud aproximada de 9,6 Kb. Existen disminución de los niveles séricos de Transtirretina (TTR) en pacientes con diversos dominios estructurales en su genoma que destacan por su DM2 y EA en comparación con pacientes diabéticos sin EA y controles capacidad para regular procesos esenciales para el virus tales como su sanos. traducción y replicación. Dos de estos dominios son el lugar de entrada El análisis proteómico revela cambios en proteínas relacionadas con interna del ribosoma (IRES) o la región 3´X-tail, situados en las regiones procesos infl amatorios en pacientes con DM2 y EA sugiriendo que el no traducibles 5ÚTR y 3ÚTR respectivamente. Otro dominio de gran proceso infl amatorio juega un papel muy importante en el desarrollo de interés en el genoma del virus es el denominado cis-replicating element complicaciones vasculares en la DM2. Estas proteínas podrían actuar como (CRE), presente en el extremo 3´ de la región codifi cante del virus. CRE biomarcadores o dianas terapéuticas de la enfermedad aterosclerótica en tiene capacidad de interactuar con IRES o 3´X-tail y así regular cambios pacientes con DM2 mejorando la supervivencia de estos pacientes. necesarios entre las etapas de traducción y replicación del ciclo infectivo del virus. En este trabajo hemos tratado de identifi car proteínas celulares que muestren asociación con el elemento CRE y puedan afectar a su interacción P11r-10 (R11-5) Fucosylation increase in -1 acid glycoprotein con otros dominios del genoma viral. Así, experimentos de incubación del α fragmento CRE con lisados celulares en condiciones de competición con (AGP) in pancreatic cancer IRES, con el propio CRE o con un RNA no relacionado, fueron utilizados para demostrar la especifi cidad de unión de CRE a proteínas celulares. Las Meritxell Balmaña1, Estela Giménez2, Ángel Puerta3, Esther Llop1, proteínas obtenidas tras los ensayos de pull-down se analizaron mediante Carme de Bolós4, Sílvia Barrabés1, Mercedes de Frutos3, Rosa electroforesis desnaturalizante (SDS-PAGE) 1D y cromatografía líquida Peracaula1 acoplada a espectrometría de masas (LC-MS/MS). Estas técnicas nos han 1Biochemistry and Molecular Biology Unit, Department of Biology, permitido identifi car un conjunto de proteínas que interactúan con la región University of Girona, Girona, ES, 2Department of Analytical CRE del HCV entre las que destacan miembros de la familia hnRNP, Chemistry, University of Barcelona, Barcelona, ES, 3Institute of tubulinas, helicasas y factores relacionados con la traducción. Asimismo, Organic Chemistry (CSIC), Madrid, ES, 4Institute Hospital del Mar ensayos de unión de CRE a subunidades ribosomales demuestran que CRE of Medical Investigations (IMIM), Barcelona, ES se une específi camente a la subunidad 40S. Todos estos resultados son de Pancreatic cancer (PDAC) is the fourth leading cause of cancer death gran importancia para investigar la relación de CRE con diferentes factores [1]. Its low survival rate (around 5% in 5 years) is due to the intrinsic celulares y otros dominios del virus y así poder comprender cómo dichas aggressiveness of this tumour and also to a late diagnosis. The only interacciones afectan a procesos biológicos del virus. biomarker available for PDAC is CA19-9, but it is currently only used to monitor the pathology because of its false positive results. Previously, our group performed N-glycan analysis of major serum acute P11-12 phase proteins, including α-1 acid glycoprotein (AGP), in pancreatic Efecto del probiótico Shewanella putrefaciens cancer, chronic pancreatitis and healthy control sera and concluded that Pdp11 en el proteoma hepático del lenguado increase in core fucosylation in AGP could be cancer associated [2]. In this study, AGP from serum samples from a larger cohort (N=31) was senegalés (Solea senegalensis) cultivado a purifi ed using an anti-AGP immunoaffi nity column. Different ELISAs diferentes densidades de biomasa using specifi c fucose recognizing lectins and antibodies against fucosylated Juan Jurado1 1 2 epitopes were performed to determine differences in AGP glycoepitopes , Tránsito García-García , Miguel Ángel Moríñigo , 1 between the groups. In addition, relative quantitation of AGP glycosylation María José Prieto-Álamo 1 variants by stable isotope labelling of AGP released N-glycans was Dpto. Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba, 2 carried out using [12C]/[13C] aniline and ZIC-HILIC-ESI-TOF-MS [3]. Córdoba, ES, Dpto. Microbiología, Universidad de Málaga, Málaga, ES Furthermore, AGP isoforms were analysed by capillary electrophoresis La introducción de nuevas especies es uno de los desafíos pendientes para (CE-UV) [4]. An increase in fucosylation levels using Aleuria aurantia desarrollar una acuicultura productiva, viable y sostenible. En este sentido, lectin was found in PDAC patients compared to chronic pancreatitis and el lenguado senegalés (Solea senegalensis) es una especie con alto potencial healthy controls and this increase was more marked in the advanced en la acuicultura marina española. Sin embargo, la escasez de herramientas PDACs. The sialofucosylated antigen (sialyl-Lewis x) also tended to be veterinarias constituye una seria limitación para la implantación del cultivo increased in the AGP of the PDAC group. Complementarily, MS results intensivo del lenguado, muy susceptible a patologías infecciosas por showed an increase in the levels of certain fucosylated glycan structures Photobacterium, Vibrio y Tenacibaculum, sobre todo cuando se cultiva a between chronic pancreatitis and PDAC. Moreover, signifi cantly different densidades elevadas de biomasa. Los probióticos (PB) constituyen una opción profi les by CE-UV, which separates AGP isoforms, were obtained between interesante ya que en los peces aumentan tanto la efi ciencia de la alimentación AGP from controls and PDACs. Altogether these results suggest that AGP como la resistencia a las enfermedades y a otras situaciones de estrés. fucosylation levels could be useful as a PDAC marker. Con el objeto de investigar las bases moleculares de este efecto benefi cioso a nivel de expresión de proteínas, en este trabajo hemos estudiado el References: efecto del PB Shewanella putrefaciens Pdp11 en el proteoma hepático [1] Siegel R, et al. CA Cancer J Clin 2014. del lenguado senegalés cultivado a dos densidades diferentes: (i) [2] Sarrats A, et al. Proteomics Clin Appl 2010. densidad normal (DN: 7 Kg/m2), y (ii) densidad alta (DA: 30 Kg/m2). [3] Gimenez E, et al. Anal Bioanal Chem 2013. Este estudio se llevó a cabo mediante la separación de proteínas por [4] Puerta A, et al. Methods Mol Biol 2013. electroforesis bidimensional en geles desnaturalizantes de poliacrilamida

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(2-DE) utilizando tiras de amplio rango de pH (3-11NL). Las proteínas susceptibilidad a diversas patologías y situaciones de estrés, sobre todo diferencialmente expresadas se identifi caron mediante el uso combinado cuando se cultiva a altas densidades de biomasa, condiciones necesarias de huella peptídica y espectrometría de masas en tandem (PMF + MS/MS). para la rentabilidad de las explotaciones. Actualmente, la acuicultura El tratamiento de los peces con el PB provocó cambios en la expresión de europea carece de herramientas veterinarias sufi cientes lo que supone una 6 proteínas a DN y de 2 a DA de cultivo. Por otra parte, el estrés generado limitación para el desarrollo de este sector. Los probióticos son una opción por el cultivo de los peces a DA en ausencia de PB, afectó a la expresión de interesante ya que parecen aumentar la efi ciencia de la alimentación, la 11 proteínas, produciendo mayoritariamente incrementos de expresión. Por el tolerancia a situaciones de estrés, y la resistencia a enfermedades. El contrario, en presencia de PB, la DA provocó principalmente disminuciones análisis de los patrones de expresión transcripcional aporta una valiosa de expresión. Entre las proteínas afectadas, hay proteínas implicadas en el información sobre el funcionamiento coordinado de los genes en respuesta metabolismo de glúcidos (PGAM1, GAPDH y F16P1), en el metabolismo de a distintas variables. Hemos analizado, mediante qRT-PCR en tiempo real, aminoácidos y proteínas (LAP, PHGDH, FAAA, y SPYA), en la detoxifi cación los perfi les hepáticos de expresión transcripcional de S. senegalensis, en de xenobióticos (GSTR y GSTT) o en el transporte de hierro (TF). respuesta a estrés por sobrepoblación y a una infección por bacterias del genero Vibrio. En ambos casos se ha investigado el efecto del probiótico Financiación: AGL2011-30381-CO3-03. Shewanella putrefaciens Pdp11. Se han cuantifi cado 28 transcritos que codifi can proteínas implicadas en la respuesta inmune, respuesta a estrés, metabolismo central y crecimiento, y proteasas relacionadas con varios P11-13 procesos biológicos. Los resultados muestran que los lenguados cultivados Nueva función del GEF C3G como regulador a alta densidad presentan niveles disminuidos de varios transcritos de del secretoma plaquetario: implicación en la la respuesta inmune, lo que explicaría su mayor susceptibilidad a sufrir infecciones. Por el contrario la infección indujo la expresión de la mayoría patología trombótica de los genes relacionados con la respuesta inmune. En las condiciones Victor Martin Granado1, Sara Gutiérrez Herrero1, Sara Alonso analizadas, el probiótico no tuvo un efecto apreciable sobre los cambios de Alvarez2, Sara Ortiz Rivero1, José Ramón González Porras2, Neibla expresión debidos a la sobrepoblación, pero produjo una mayor resistencia Priego Bendeck3, Almudena Porras Gallo3, Carmen Guerrero Arroyo1 a la infección en estos lenguados, lo que se relaciona con la recuperación de 1Centro de Investigación del Cáncer, IBMCC (USAL-CSIC), IBSAL, niveles normales de los transcritos de la respuesta inmune. Los resultados Salamanca, ES, 2Hospital Universitario de Salamanca, IBSAL, respaldan el efecto benefi cioso de S. putrefaciens Pdp11 como tratamiento Salamanca, ES, 3Departamento de Bioquímica y Biología Molecular profi láctico en situaciones de susceptibilidad a patógenos durante el cultivo II, Facultad de Farmacia, UCM, IdISSC, Madrid, ES del lenguado.

C3G es un factor intercambiador de nucléotidos de guanina (GEF) de Rap1, Financiación: AGL2011-30381-CO3-03. una proteína de la familia Ras muy abundante en plaquetas. Específi camente, la isoforma Rap1b participa en aspectos críticos de la función plaquetaria a través de la activación de la integrina αIIbβ3. Además, se sabe que C3G P11-15 juega un papel fundamental en la agregación plaquetaria, tanto in vitro como iTRAQ analysis of hepatic proteins in free-living in vivo, a través de la activación de Rap1b. En base a todo esto, nuestra hipótesis es que C3G puede infl uir en la secreción durante la activación Mus spretus mice to assess the contamination plaquetaria. Para estudiar esta cuestión, hemos utilizado líneas de ratones status of areas surrounding Doñana National Park transgénicos para C3G (tgC3G) y C3GΔCat (un mutante con deleción del Nieves Abril Díaz dominio catalítico) donde ambos transgenes se expresan bajo el promotor , Eduardo Chicano-Galvez, Carmen Michán Doña, del gen PF4, exclusivo de megacariocitos y plaquetas. La evaluación de la Carmen Pueyo de la Cuesta, Juan López-Barea cantidad de proteínas secretadas, tras la activación por trombina, mostró que Dpto. Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba, las plaquetas tgC3G secretaron mayor cantidad que los controles, mientras Córdoba, ES que las plaquetas transgénicas para C3GΔCat secretaron una menor cantidad. Doñana National Park (DNP), a Biosphere Reserve located at SW El perfi l de secreción proteica de las plaquetas tgC3G también fue diferente Spain, includes some of the most environmentally valuable ecosystems al encontrado en los demás grupos hallándose una mayor variedad de in Europe. Nevertheless, DNP is threatened by pesticides, metals and proteínas. Un estudio proteómico preliminar reveló que entre las proteínas contaminants carried out by local streams and Guadalquivir River. A diferencialmente secretadas por las plaquetas tgC3G se encontraban follow-up study started by combining conventional biomarkers and 2-DE apolipoproteínas, inhibidores de proteasas, fi brinógeno, αhemoglobina y proteomic approaches that resolved near 3,000 protein spots. Based on trombospondina-1, las cuales son de gran interés por estar involucradas en el these pioneering studies, we have combined several “omics” approaches desarrollo de diversas patologías cardiovasculares. Estos resultados permirán for the identifi cation of molecular biomarkers of pollution exposure, profundizar en el papel de C3G como regulador de la función plaquetaria using the aboriginal species Mus spretus as bioindicator. This mouse is y abren nuevas perspectivas sobre sus posibles efectos fi sio-patológicos, phyllogenetically related to Mus musculus, thus facilitating the use of its especialmente en el contexto de patologías trombóticas. gene/protein sequence databases for massive identifi cation of proteins and transcripts with altered expression. Here we report the results of a second generation proteomic study in free-living M. spretus from neighboring P11-14 areas of Doñana National Park (DNP) with different pollution levels. Efecto del probiótico Shewanella putrefaciens Liver proteins from mice captured at the “Matochal” rice fi elds (MAT), Pdp11 sobre la expresión transcripcional del the “Rocina” stream (ROC), two sites of the “Partido” streams (PAR, AJO) and the reference site “Lucio del Palacio” (LP), were labeled lenguado senegalés (Solea senegalensis) en with iTRAQ-8plex tags to quantify differentially expressed proteins. A respuesta a factores de estrés fisiopatológico previous isoelectric focusing step was included to improve separation of the highly complex peptide mixture. Mass spectrometry was carried out in María-José Prieto-Álamo1 1 , Laura Maldonado-Escudero , Silvana T a LTQ Orbitrap system for protein dentifi cation and iTRAQ reporter ion 2 2 1 Tapia-Paniagua , Miguel Ángel Moríñigo , Juan Jurado quantitation using the Mus musculus database as reference. Of the near 1 Dpto. Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba, 100,000 peptides sequenced, 1032 proteins were identifi ed and quantifi ed 2 Cordoba, ES, Dpto. Microbiología, Universidad de Málaga, Málaga, ES by iTRAQ reporter ions, leading to the identifi cation of 118 proteins that El cultivo del lenguado senegalés (Solea senegalensis), un organismo no were signifi cantly altered (> 2.5 fold variation) in at least two problem areas modelo de interés para la acuicultura española, se ve difi cultado por su (PAR, AJO, ROC or MAT) compared to the reference (LP). The results

107 Pósters XXXVII Congreso SEBBM of iTRAQ analysis were confi rmed by Western blotting. The identifi ed a condiciones de normoxia e hipoxia. Así, se ha visto que reprime la proteins provide insight about the different defense strategies in free-living expresión aerobia de genes como COX5B [2], TIR1 [3] y HEM13 [4] mice affected by pollutants in DNP and its surrounding areas (CTM2012- así mismo también se ha observado que en el caso de HEM13 activa su 38720-C03-02, CVI-3829, CTM2009-12858-CO2-02, BIO1675). expresión en condiciones de anaerobiosis. Por otra parte Ixr1 participa en la respuesta a estrés oxidativo, ya que se ha determinado que su ausencia incrementa la sensibilidad a la presencia de peróxidos [5]. Estructuralmente P11r-16 Ixr1 se caracteriza por la presencia de dos dominios HMG dispuestos en Análisis de la expresión de la proteína tándem, y varias regiones de poliglutaminas. Diversos estudios han puesto CD26/DPPIV en diferentes líneas celulares de manifi esto que Ixr1 interacciona con DNA platinado a través de sus dominios HMG [1]. de cáncer colorrectal Para poder profundizar en el conocimiento de las diferentes funciones en las Marta Rodríguez Quiroga1, Lorena Vázquez-Iglesias1, Leticia Barcia que está implicado Ixr1 es necesaria la búsqueda de nuevas interacciones Castro1, Andrea Díaz Díaz1, Oscar J Cordero2, Fco.Javier Rodriguez de esta proteína. El sistema TAP (Tandem Affi nity Purifi cation) y el sistema Berrocal1, María Páez de la Cadena1 de doble híbrido son dos técnicas de gran utilidad a la hora de identifi car 1Dpto.Bioquímica, Genética e Inmunología, Universidad de Vigo, nuevas interacciones entre proteínas. En este trabajo se han empleado Vigo, ES, 2Dpto.Bioquimica y Biología Molecular, Ed. CIBUS, estos dos métodos para encontrar posibles interacciones de Ixr1 con otras proteínas en Saccharomyces cerevisiae. Para ello se ha optimizado Universidad de Santiago de Compostela, Santiago de Compostela, el método TAP empleando diferentes etiquetas/epítopos y mejorando las ES condiciones de purifi cación. La proteína CD26 (dipeptidil peptidasa IV, DPPIV; EC 3.4.14.5) es una glicoproteína transmebrana exopeptidasa, localizada en la superfi cie Bibliografía celular de linfocitos, células endoteliales y epiteliales. Sus funciones, [1] M.M . McA’Nulty et al., Mutat. Res. (1996), 75-86. dependientes e independientes de la actividad enzimática parecen estar [2] J.R Lambert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994), 91:7345-9. relacionadas con la regulación de respuestas infl amatorias e inmunológicas, [3] J.P. Bourdineaud et al., Mol. Microbiol. (2000), 38:879-890. la transducción de señales y la apoptosis, sugiriendo su implicación en [4] R. Castro-Prego et al., FEMS Yeast Res. (2010), 10:309-321. la progresión tumoral. También se encuentra en forma soluble en varios [5] R. Castro-Prego et al., Biochem. J. (2010), 425(1):235-43. fl uidos biológicos y hemos propuesto su utilidad como biomarcador en cáncer colorrectal (CCR). Se ha descrito como supresor tumoral tanto en cáncer de páncreas como en melanoma y hay indicios de que cumple esta P11r-18 función en CCR. Niveles de proteína y actividad enzimática Numerosos estudios muestran que las células tumorales reactivan lo que de MMP-9 en cáncer de pulmón no microcítico se conoce como Transición Epitelio-Mesénquima (EMT). En su intento por liberarse de su confi namiento habitual, las células sufren una serie de Leticia Barcia Castro1, Sonia Blanco Prieto1, Lorena Vázquez cambios que conllevan a una mayor capacidad migratoria, invasividad y Iglesias1, F.J. Rodriguez-Berrocal1, M. Isabel Botana Rial2, M. Paez una elevada resistencia a apoptosis. Las células que están sufriendo esta de la Cadena1 transición se pueden identifi car generalmente por la presencia o ausencia 1Dpto. Bioquímica, Genética e Inmunología, Universidad de de determinadas moléculas que las dotan de una estructura más fl exible, Vigo, Vigo, ES, 2Servicio de Neumología, Complexo Hospitalario capacidad de viajar, y por una forma diferente a la de la célula epitelial. Universitario de Vigo, Vigo, ES En este trabajo nos propusimos analizar la expresión de la proteína CD26 Las enzimas Metaloproteasas de Matriz Extracelular (MMP) juegan un y de dos proteínas implicadas en la EMT: E-cadherina y vimentina en 8 papel esencial en la progresión del tumor en distintos tipos de cáncer. En líneas celulares derivadas de cáncer colorrectal de diferentes estadios: particular la MMP9 o gelatinasa B degrada componentes de la matriz como SW1116, SW480, SW620, DLD-1, COLO205, T84, HT-29 y Caco-2 el colágeno tipo IV por lo que se la relaciona con procesos de invasión mediante técnicas de western blot y citometría de fl ujo. y metástasis. Aunque la función reside en su actividad enzimática, la Los resultados muestran que las líneas SW480 y SW620 presentan mayoría de los estudios sobre su valor como marcador tumoral se realizan un fenotipo mesenquimal ya que tienen niveles elevados de la proteína cuantifi cando los niveles de proteína. vimentina mientras que los niveles de E-cadherina son signifi cativamente El objetivo de nuestro estudio es determinar en el suero de pacientes con menores a los de las otras líneas celulares analizadas que muestran un cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), los niveles de proteína y de fenotipo de tipo epitelial. Los resultados obtenidos tanto por citometría actividad enzimática de MMP-9 mediante técnicas de ELISA y ensayos como por western blot indican que la proteína CD26 se expresa casi de zimografía. En las zimografías se cuantifi có la actividad atendiendo a exclusivamente en células de fenotipo epitelial. sus diferentes isoformas: proMMP9 (92 kDa), el conjunto de la proMMP9 (92 kDa) y la pro-MMP9-NGAL (130 kDa) y fi nalmente, la MMP9 total Financiación: AECC (GCB13131592CAST), INBIOMED (CN2012/273), (proMMP9, proMMP9-NGAL y Homodímero proMMP9). REGICC (CN2012/217). Los resultados muestran que los niveles de MMP-9 (tanto de proteína como de actividad) se incrementan en las muestras de pacientes con CPNM en comparación con el grupo control. La media de los niveles de proteína en el P11m-17 grupo control es de 209,04±148,6 (ng/mL) frente a 392,29±241,61 (ng/mL) Estudio del interactoma de Ixr1 en Saccharomyces en CPNM. En el caso de la actividad, considerando el conjunto constituido cerevisiae por la proMMP9 y proMMP9-NGAL, los valores para el grupo control Aida Inés Barreiro Alonso son de 16,57±11,38 (u.a.) frente a 25,39±13,9 (u.a.) de las muestras con , Ángel Vizoso Vázquez, Mónica Lamas CPNM. El estudio de correlación entre los niveles de MMP-9 obtenidos Maceiras, María Esperanza Cerdán Villanueva mediante zimografía y los obtenidos por ELISA muestran correlaciones Universidad de A Coruña, A Coruña, ES diferentes dependiendo de la banda de actividad considerada siendo el Ixr1 es una proteína HMG de la levadura Saccharomyces cerevisiae. Dicha conjunto proMMP9 y proMMP9-NGAL el que presenta mejor correlación proteína se identifi có por su unión a DNA platinado. El cisplatino es una con los niveles séricos. droga antitumoral empleada principalmente para el tratamiento de tumores sólidos como los presentes en el cáncer de ovario, testículo o cuello [1]. Financiación: Agrupamento Inbiomed 2012/73, Proyecto PS09-00405, Ixr1 es, además, un factor transcripcional implicado en la adaptación Instituto de Salud Carlos III y fondos FEDER.

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P11-19 P11-21 Análisis mediante pirosecuenciación del grado Análisis proteómico de vesículas de membrana de metilación del gen SEPT9 en suero para el externa aisladas de cultivos de la cepa probiótica diagnóstico de cáncer colorrectal Escherichia coli 1917 en medio DMEM

Loretta De Chiara, Olalla Otero-Estévez, María Páez de la Cadena, Lorena Toloza Maturana, Laura Aguilera Gil, María José Fábrega Francisco Javier Rodríguez Berrocal, Vicenta Soledad Martínez Zorzano Fernández, Rosa Giménez Claudio, Laura Baldomà Llavinés, Josefa Departamento de Bioquímica, Genética e Inmunología, Facultad de Badía Biología, Universidad de Vigo, Vigo, ES Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Facultat de Recientemente, tras analizar cualitativamente el estado de hipermetilación Farmàcia, Universitat de Barcelona, Institut de Biomedicina de la UB (IBUB), Barcelona, ES del gen SEPT9, éste ha sido propuesto como marcador diagnóstico para cáncer colorrectal (CCR). El objetivo de este trabajo es cuantifi car Escherichia coli Nissle 1917 (EcN) es un probiótico utilizado en el mediante pirosecuenciación el porcentaje de metilación de SEPT9 en tratamiento de patologías intestinales. EcN favorece el equilibrio de suero de individuos sometidos a colonoscopia. Adicionalmente se evaluó la microbiota y mejora la homeostasis intestinal. Sin embargo, existe su valor diagnóstico para detectar casos de CCR y de neoplasia avanzada poca información sobre cómo las moléculas efectoras liberadas por este (adenomas avanzados o CCR). probiótico acceden a las células del huésped. Las bacterias gram-negativas Por pirosecuenciación se estudiaron 7 sitios CpG incluidos en la región producen vesículas de membrana externa (OMV). Estas estructuras promotora del gen, en muestras de suero de: 21 individuos sin hallazgos, 15 desempeñan un rol importante en la interacción bacteria-huésped. Por con patologías benignas, 19 con adenomas no avanzados, 7 con adenomas ello, las OMV generadas por microbiota comensal y probióticos gram- avanzados y 22 casos de CCR. Para evaluar la capacidad diagnóstica se negativos se vislumbran como agentes importantes en la señalización construyeron curvas ROC y se calcularon las áreas bajo la curva (AUC) a nivel intestinal. Los estudios proteómicos pueden aportar información para cada sitio CpG y sus combinaciones realizadas mediante regresión relevante en este contexto. logística binaria. Fijando la especifi cidad al 90%, se estimó la sensibilidad Aquí se presenta el proteoma de las OMV aisladas de cultivos de la cepa EcN del marcador en cada supuesto. en DMEM, medio habitual para el cultivo de líneas de epitelio intestinal. Para el diagnóstico de CCR, los valores de AUC obtenidos para cada uno Las proteínas de las OMV fueron separadas en geles de poliacrilamida-SDS, de los sitios CpG estudiados estuvieron comprendidos entre 0,51-0,60, extraídas del gel y analizadas por espectrometría de masas. Las proteínas con valores de sensibilidad de 4,5-18,2%. La mayor sensibilidad (36,4%) identifi cadas fueron clasifi cadas en grupos funcionales según las bases se alcanzó combinando las posiciones 1 a 6 (AUC: 0,74). En cuanto a la UniProt y GenProtecEc y los resultados comparados con los obtenidos detección de neoplasia avanzada, el AUC resultó entre 0,50-0,59 para los del proteoma de las OMV aisladas de cultivos en LB, recientemente 7 sitios analizados, con sensibilidades de 10,3-24,1%. La combinación publicado por nuestro grupo de investigación. Se identifi caron un total óptima (posiciones 1 a 4 y 7) mostró un AUC de 0,70 (sensibilidad 41,4%). de 148 proteínas, 114 eran comunes al proteoma de las OMV en LB. La En resumen, a pesar de la baja sensibilidad que presenta la metilación de distribución en grupos funcionales fue similar en ambos proteomas. En SEPT9 para la detección tanto de CCR como de neoplasia avanzada, el cuanto a su localización subcelular las OMV en DMEM presentan una análisis por pirosecuenciación permitió identifi car los sitios CpG que más mayor proporción de proteínas de membrana interna y de citoplasma. Así, contribuyen, lo que permitirá optimizar su capacidad diagnóstica. el medio de cultivo determina la composición de las OMV. En conjunto los resultados demuestran que las OMV de probióticos contienen proteínas Financiación: Fundación Científi ca de la Asociación Española contra capaces de interaccionar con células del huésped y modular su función. el Cáncer (GCB13131592CAST) y Fondo de Investigación Sanitaria del * Estos autores han contribuido por igual. Instituto de Salud Carlos III - FEDER (PI12/00117).

P11-22 P11-20 Análisis proteómico para el estudio de los c-Myc como predictor de respuesta a la mecanismos de ensamblaje y desensamblaje de radioquimioterapia en el cáncer de recto las RNA polimerasas eucarióticas Marta Cuadros Celorrio1, Raquel Conde Muiño2, Pablo Palma2, Victoria Sánchez3, Sofía Boyero4 Ana Isabel Garrido-Godino, Verónica Martínez-Fernández, Abel 1Departamento de Bioquímica y Biología Molecular III e Francisco Navarro Gómez Cuevas-Bermúdez, Inmunología, Universidad de Granada - Centro Pfi zer-Universidad Departamento de Biología Experimental, Universidad de Jaén, Jaén, ES de Granada-Junta de Andalucía de Genómica e Investigación Las RNA polimerasas son complejos multiproteicos encargados de la Oncológica (GENYO), Granada, ES, 2Sección de Cirugía Colorrectal, transcripción. A pesar de que existe una amplia información de cómo Servicio de Cirugía General, HUVN Granada, Granada, ES, 3Centro estos complejos funcionan e interactúan en el núcleo celular de eucariotas, Pfi zer - Universidad de Granada - Junta de Andalucía de Genómica poco se sabe sobre los mecanismos de su ensamblaje citoplasmático y e Investigación Oncológica (GENYO), Granada, ES, 4Universidad de su posterior entrada al núcleo, así como de los procesos de reciclado y Granada, Granada, ES desensamblaje nucleares. Nuestra investigación ha permitido ahondar en Introducción: El tratamiento actual del cancer de recto localmente estos procesos y describir nuevos mecanismos y proteínas implicados avanzado (CRLA) incluye regímenes de radioquimoterapia (RQPT) en los mismos. Mediante técnicas de análisis proteómicos, combinadas antes de la exéresis quirúrgica. Hasta la fecha, no existe ningún marcador contécnicas genéticas, bioquímicas y de biología molecular hemos que pueda predecir la respuesta a esa RQPT, sin poderse detectar el alto determinado la existencia de dos nuevas proteínas, Bud27 y Rtr1 que índice de pacientes que no se benefi cian de esta actuación, no exenta de median estos procesos y que tienen un efecto directo en el ensamblaje de las morbilidad y de un alto coste económico.El objetivo de este estudio es RNA polimerasas eucarióticas y en el proceso transcripcional. Continuar evaluar la expresión de c-Myc como posible marcador de respuesta a la con este tipo de abordaje, ayudará a clarifi car y profundizar en estos RQTP en pacientes afectos con CRLA. mecanismos que tienen un interés crucial para entender la transcripción, Material y métodos: Para determinar si la sobreexpresión del ARNm no solo desde el punto de vista funcional en el núcleo, sino desde un punto de c-Myc se correlacionaba con una amplifi cación del ADN se realizó de vista dinámico que implica, además, los procesos de ensamblaje y hibridación in situ con fl uorescencia (FISH). Además, se realizó la desensamblaje de la maquinaria de transcripción. inmunohistoquímica de c-Myc. Se analizaron mediante curvas ROC la

109 Pósters XXXVII Congreso SEBBM sensibilidad y especifi cidad de la sobreexpresión de c-Myc para predecir particular, la nefropatía diabética (ND) es la principal causa (44,3%) de ERC la respuesta al tratamiento. terminal en el mundo. Estos pacientes presentan un riesgo cardiovascular Resultados: Identifi camos mediante microarrays 257 genes cuya expresión (CV) añadido y se estima que el 40% de la población española con era distinta y signifi cativa entre respondedores y no respondedores a la enfermedad renal oculta (no diagnosticada) fallecerá principalmente RQTP. En la red de interconexión más importante destacaban 24 genes de problemas cardiovasculares. Si bien es conocida la existencia de un relacionados directa o indirectamente con c-Myc. Ninguno de los tumores síndrome cardio-renal, o desorden por el cual la disfunción del corazón amplifi có c-Myc. El 100% de las muestras presentaron un elevado número o riñón afecta al otro órgano, no se comprenden del todo los procesos que de células tumorales positivas (>90%), independientemente de su respuesta operan específi camente en este contexto. al tratamiento.El análisis de curvas ROC indica que la sobreexpresión de En este trabajo, perseguimos un doble objetivo: a) la identifi cación de c-Myc tiene una especifi cidad del 93.8% y una sensibilidad del 70% para nuevos marcadores de ERC, ND y riesgo CV, y b) la aplicación de nuevas determinar la respuesta al tratamiento. tecnologías como la Espectrometría de Masas de Imagen (MSI) al estudio Conclusiones: La sobreexpresión de c-Myc a nivel de ARNm muestra de la aterosclerosis como patología de base en el síndrome cardio-renal. una buena correlación con la respuesta a la QRTP en pacientes afectos de En un abordaje multidisciplinar empleando RMN, DIGE y SRM-LC-MS/ CRLA. MS en modelos animales tempranos de ND y aterosclerosis y en muestras humanas, hemos analizado el proteoma y el metaboloma de tejido renal, tejido arterial, orina y exosomas aislados de orina. En paralelo, hemos P11-23 (R11-6) desarrollado y aplicado con éxito un protocolo MSI de análisis de arterias Differentiation of mouse embryonic stem cells que permite identifi car, in situ, mapas moleculares específi camente towards pancreatic beta-cell surrogates through asociados a regiones arteriales concretas (zona de placa, capa íntima o capa regulation of Pdx1 by nitric oxide media) y su implicación en el desarrollo de la lesión aterosclerótica.

Carmen Salguero Aranda1, Rafael Tapia Limonchi1, Gladys Cahuana Macedo2, Ana Belén Hitos Prados1, Irene Díaz Contreras1, Karim P11-25 Hmadcha1, Mario Fernández Fraga3, Franz Martín Bermudo1, Bernat Aislamiento de una nueva hidrolasa a partir de Soria Escoms1, Juan R. Tejedo Huamán1, Francisco Bedoya Bergua1 un manantial geotermal mediante metagenómica 1Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa- funcional CABIMER, Sevilla, ES, 2Universidad Pablo de Olavide, Sevilla, ES, 3Hospital Universitario Central de Asturias, Asturias, ES Mª Eugenia de Castro1, Esther Rodriguez-Belmonte2, Maria Isabel 2 Pdx1 (Pancreatic and duodenal homeobox 1) is a transcription factor González-Siso 1 2 that regulates the pancreatic development and the differentiation and Universidad de A Coruña, A Coruña, ES, Área de Bioquímica y functionality of beta cells. Our group has shown that exposure of mouse Biología Molecular, Facultad de Ciencias, Universidad de A Coruña, embryonic stem (mES) cells to high concentrations of NO donors such A Coruña, ES as diethylenetriamine nitric oxide adduct (DETA-NO) increases the Las beta-galactosidasas (EC 3.2.1.23) constituyen una gran familia expression of Pdx1. In that study we report that the increase of Pdx1 de proteínas con capacidad para catalizar la hidrólisis de enlaces β-D expression after NO treatment is associated with the release of Polycomb (1,4)-galactosídicos y participar en reacciones de transgalactosilación. Repressive Complex 2 (PRC2) and the histone acetyltransferase P300 Por ello, son ampliamente utilizadas en la industria alimentaria como from its promoter. Moreover, it is observed some changes in bivalent intermediarias para la producción de leche sin lactosa, la revalorización marks of histone H3k27me3 and H3K4me3, site specifi c changes of DNA de los sueros o la obtención de galacto-oligosacáridos, constituyentes methylation, and no changes in H3 acetylation of Pdx1 promoter. The fundamentales de los prebióticos, entre otros. En los últimos años, la knowledge of the regulation of the gene Pdx1 has allowed us develop a posibilidad de obtener beta-galactosidasas termoestables y el creciente protocol to differentiate mES cells towards insulin producing cells. The mercado de alimentos funcionales han incrementado su interés industrial. protocol consists of adding to the culture medium 0.5 mM DETA-NO La metagenómica funcional permite analizar el genoma colectivo de una for 19 hours, 100 μM valproic acid for 6 days, 50 μM P300 inhibitor for comunidad microbiana expresándolo de manera heteróloga y constituye un 20 hours and a fi nal step of suspension culture to form aggregates for 3 campo emergente de la biotecnología que ha permitido la caracterización days. This simple and cost effective differentiation protocol allows the de enzimas procedentes de microorganismos de ambientes difíciles de generation of cells stably expressing markers of beta-cells such as Pdx1, aislar por sus condiciones extremófi las. Nkx6.1, GcK, Kir6.2, Glut-2 and insulin. En el presente estudio se recoge la purifi cación y caracterización enzimática de una hidrolasa obtenida mediante búsqueda funcional en una Subvencionado por Ministerio de Economía y Competitividad-Secretaría metagenoteca de aguas termales procedentes del manantial del Riocaldo de Estado de Investigación Desarrollo e Innovación (IPT-2011-1615- (Lobios, Ourense), no descrita hasta el momento y que presenta actividad 900000) y Junta de Andalucía (CTS- 7127/2011). hidrolasa estable a 65ºC.

P11-24 (R11-3) P11-26 Estrategias ómicas aplicadas al estudio de la Recombinant glycoproteins gp125 and gp350 for patología renal y vascular immunodiagnostic of EBV

Irene Zubiri, Marta Martín-Lorenzo, Laura González-Calero, María Iván Iglesias Baena, Encarnación Campos Gutierrez, Fernando Posada-Ayala, Aroa S. Maroto, Fernando Vivanco, Gloria Álvarez- Morcillo de Amuedo, Julian López-Viota, José Rojas, Ainel Alemán Llamas Vircell SL, Granada, ES Departamento de Inmunología, IIS-Fundación Jiménez Díaz, UAM, Serodiagnosis of Epstein-Barr virus (EBV) gain relevance for Madrid, ES its relationship with nasopharyngeal carcinoma and other EBV- La enfermedad renal crónica (ERC) es un problema emergente en todo associated diseases. Viral capsid glycoproteins gp125 and gp350 has el mundo. En España, en pacientes seguidos en atención primaria con been described as good antigens for early infections, which proteins enfermedades tan frecuentes como hipertensión arterial (HTA) o diabetes combined with EBNA and p18 could improve the sensitivity. The yeast mellitus (DM), la prevalencia de ERC puede alcanzar el 35-40%. En and mammalian overexpression of recombinant proteins is an important

110 Granada 2014 Pósters tool to obtain post-translational modifi cations, which can be essential primarios como en células endoteliales inmortalizadas. Estudios in its antigenicity, and higher yield than the native form obtained from posteriores que hemos realizado con la aeroplisinina-1, han dilucidado que virus culture. este compuesto también presenta capacidad antiinfl amatoria al disminuir We have purifi ed the tagged gp125 from Baculovirus and Pichia los niveles de proteínas a las que se les atribuyen importantes actividades pastoris system, and the N-terminal gp350 and C-terminal gp350 from infl amatorias por mediar algunos estadios como puede ser la atracción de Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris system. The improvement of células infl amatorias, proteasas para facilitar la trasvasación de las células the expression conditions in a bioreactor were carried out with the control desde el torrente sanguíneo hasta el foco infl amatorio, además de disminuir of parameters in order to reduce degradation and to obtain higher biomass. los niveles de COX-2 responsable de sintetizar moléculas de carácter After yeast cell disruption and clarifi cation, the purifi cation strategy were infl amatorio. carried out by affi nity chromatography in FPLC system and analyzed using Tanto el proceso angiogénico como el proceso infl amatorio, no sólo the specifi c monoclonal antibodies. se encuentran regulados por las proteínas a las que se les asocian Both enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and magnetic directamente, sino que está descrito que en ambos procesos ejerce nanoparticules (MNP) have been used to get an antigen characterization of un importante papel las proteínas responsables del metabolismo the different fussion proteins, developing a new method of diagnostic with redox. Mediante aproximación proteómica hemos comprobado que high sensitivity and specifi city. The gp125 obtained from Pichia pastoris el tratamiento con aeroplisinina-1 modifi ca los niveles de proteínas showed similar activity than the commercial native antigen, and contribute relacionadas con el metabolismo redox, sugiriendo que el efecto to distinguish between possitive and negative serum samples for IgM. We antiinfl amatorio y antiangiogénico de la aeroplisinina-1 demostrado have observed the crucial role of the expression in eukaryotic system of en estudios anteriores, se debe al efecto multidiana sobre diversos early antigens from the capsid of EBV in order to conserve the relevance “módulos del metabolismo” permitiendo engrosar las evidencias de glycosilations into the conformational epitopes. este compuesto como un potente agente modulador de los procesos asociados a los tumores.

P11-27 Supported by grant P12-CTS-1507 (Andalusian Government and FEDER) P1 recombinant antigen for the Mycoplasma and funds from group BIO-267 (Andalusian Government). The “CIBER de pneumoniae diagnosis Enfermedades Raras” is an initiative from the ISCIII.

Anabel López Ramos1, Ana Leticia Jiménez Escobar2, Ivan Iglesias Baena1, Encarnación Campos Gutierrez1, Fernando Morcillo1, Julian P11-29 López Viota1, Jose Rojas1 Actividad proteosomal en pacientes mexicanos 1Vircell SL, Granada, ES, 2Universidad de Granada, Granada, ES con cáncer de próstata Mycoplasma pneumoniae is a human pathogen that causes atypical José Francisco Montiel-Sosa1, Victoria Edwina Campos Garcia2, bacterial pneumonia with high prevalence in children and young adults. Sandra Díaz-Barriga Arceo1, Jorge Ramirez Salcedo3, Sergio Ureta4, Other pathogens produce pneumonia with a nonspecifi c clinical, so to Patricia Ramírez Noguera1 develop an immunological method with high sensitivity and specifi city. A 1PhD. en Bioquímica, Departamento de Bioquímica y Farmacología kit for the diagnostic of M. pneumoniae by ELISA has been developed by Humana, Universidad Nacional Autónoma de México, Cuautitlán Vircell S.L. for detection of the infection in the early state (IgM). Izcalli, MX, 2B.Q.D. Bioquímica Diagnóstica, Departamento The adhesin P1 has been described as a good antigen for serological test de Bioquímica y Farmacología Humana, Universidad Nacional for its immunogenicity. This membrane protein has been obtained from Autónoma de México, Cuautitlan Izcalli, MX, 3PhD. en Ciencias the bacterial extract, but in order to improve the relation yield-cost, we Biomedicas. Instituto de Fisiologia Celular, Universidad Nacional have designed the cloning and overexpression of P1 in eukaryotic and Autónoma de México, México, MX, 4M.D.Médico Urólogo, Hospital prokaryotic system. Español, Distrito Federal, MX The C-terminal fragment of P1 has been cloned into expression vector for Baculovirus and Escherichia coli, obtaining a tagged proteins that were Dentro de las señales celulares involucradas en proceso de cáncer de purifi ed by affi nity chromatography in FPLC system and analyzed using próstata CaP, el sistema ubiquitina proteosoma y proteínas similares specifi c monoclonal antibodies. We have developed the expression and a ubiquitina (SUMO) juegan un papel muy importante. Con objeto de purifi cation process to obtain the purifi ed protein. conocer el estado de ubiquitinación proteíca y sumoilación in vitro en The obtained recombinant P1, conserve the crucial epitopes for the biopsias de pacientes con cáncer de próstata se estimó, la capacidad de discrimination between positive and negative serum samples. Indeed, formación in vitro de aductos-Ub y aductos-SENP específi cos utilizando we have develop a new platform for mycoplasma diagnosis, using las proteínas de fusión recombinantes HA-Ub-Vinilsulfona y HA-SUMO nanoparticles labelled to the antigen. -1 y HA-SUMO 2/3-vinilsulfona (VS). Las sondas HA-Ub-VS y HA- SUMO-1-VS y -2/3-VS producto de la generación de unaproteína de fusión Tag-HA, reaccionaron covalentemente con los sitios nucleofílicos activos de las enzimas DUB y SENP respectivamente. Estas enzimas están P11-28 Efecto de la aeroplisinina-1 sobre proteínas presentes en el tejido prostático y dependiendo de su estado y actividad, se pudieron unir covalentemente con el grupo VS de cada sonda. Los involucradas en el proceso angiogénico e resultados al momento muestran que la actividad similar a quimotripsina inflamatorio estimada por medio de ensayos fl uorogénicos y utilizando sustratos Javier A. García-Vilas específi cos acoplados a coumarina está aumentada signifi cativamente , Ana R. Quesada, Miguel Ángel Medina Torres un 10 % respecto al control negativo analizado. Estas deducciones son Universidad de Málaga, Andalucía Tech, Departamento de Biología importantes desde el punto de vista funcional del sistema ubiquitina Molecular y Bioquímica, Facultad de Ciencias, and IBIMA- proteosoma en la células. Este sistema multienzimático, es capaz de Biomedical Research Institute of Málaga - Unidad 741, CIBER de reconocer sustratos proteícos intracelulares necesarios en la modulación Enfermedades Raras-CIBERER, Málaga, ES de señales enfocadas en el control de la función y degradación de La aeroplisinina-1 metabolito secundario sintetizado por esponjas como proteínas señalizadoras en diversos procesos de transformación celular mecanismo de defensa, ha sido caracterizada por nuestro grupo como y cáncer. El aumento en la actividad proteolítica similar a quimotripsina un potente agente antiangiogénico por modular proteínas involucradas sugiere una activación signifi cativa en los pacientes de cáncer analizados estrechamente en este proceso, tanto en células endoteliales de cultivos quizá con este fi n.

111 Pósters XXXVII Congreso SEBBM

P11-30 Hemos abordado un exhaustivo estudio mutacional de la región de 56 Distinct serum proteome profiles associated aminoácidos C-terminal de la GS de Synechocystis tanto in vitro (mediante with collagen-induced arthritis, and complete ensayos de retardo en gel e inactivación con proteínas purifi cadas) como Freund’s adjuvant-induced inflammation in in vivo (expresando en Synechocystis las versiones mutantes de la GS). Hemos identifi cado tres residuos (glutamato 419, asparragina 456 y CD38–/– mice arginina 459 de la GS de Synechocystis) fundamentales para la interacción GS/IFs y la inactivación de la enzima. Analizando los resultados a la luz Antonio Rosal-Vela1, Sonia García-Rodríguez1, Jorge Postigo2, de la estructura de la GS de Synechocystis (PDB ID 3NG0), obtenida Marcos Iglesias2, Jesús Merino2, Ramón Merino3, Mercedes recientemente, observamos que estos tres residuos se localizan próximos y Zubiaur1, Jaime Sancho1 expuestos al solvente, constituyendo un núcleo para la interacción GS/IFs 1Instituto de Parasitología y Biomedicina “López-Neyra”, CSIC, responsable de la inactivación de la enzima. (IPBLN-CSIC), Armilla (Granada), ES, 2Departmento de Biología Molecular, Instituto de Formación e Investigación Marqués de Bibliografía Valdecilla, Universidad de Cantabria, Santander, ES, 3Instituto de [1] García-Domínguez M, Reyes JC, Florencio FJ (1999) Prot Natl Acad Biomedicina y Biotecnología de Cantabria/CSIC-Universidad de Sci USA 96, 7161-7166. Cantabria-SODERCAN, Santander, ES [2] Saelices L, Galmozzi CV, Florencio FJ, Muro-Pastor MI. Mol Microbiol. Collagen-type-II-induced arthritis (CIA) is milder in CD38-/- than in WT 2011 Nov; 82 (4):964-75. mice. Their serum samples were treated with ProteoMiner-beads to equalize protein concentrations resulting in a signifi cant enrichment in proteins from extracellular vesicles (blood microparticles, exosomes). ProteoMiner- P12-2 (R12-1) equalized samples were subjected to 2D-DiGE and MS-MALDI-TOF/TOF Análisis global de la degradación de residuos analyses to identify proteins that were differentially expressed in CD38-/- versus WT mice either with arthritis (Col.II+/CIA+), with no arthritis (Col. cianurados industriales por Pseudomonas II+/CIA-), or with infl ammation (CFA-treated). Altered proteins included pseudoalcaligenes CECT5344 those involved in acute phase response (SAA1), infl ammation (B2MG, Conrado Moreno Vivián1, Víctor M. Luque-Almagro1, Isabel Manso1, HABP2, Hemoglobin), complement activation (Ficolins, C4-B fragments, Isabel Ibáñez1, Lara P. Sáez1, M. Paz Escribano1, Purifi cación C1qb, C3-b-chain), polyclonal B-cell activation (Ig-kappa-light-chain) and Cabello2, Francisco Castillo1, M. Dolores Roldán1 lipid metabolism (APOE, APOAI, APOAII, APOAIV, APOJ/Clusterin). Of 1Dpto. Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba, the proteins that changed in abundance, Hemoglobin and APOE could be Córdoba, ES, 2Dpto. Botánica, Ecología y Fisiología Vegetal, indicative of the milder pathological process found in CIA+CD38-/- mice, Universidad de Córdoba, Córdoba, ES whereas another set of proteins such as HABP2, Ig-kappa-light-chain, SAA1, Ficolin-1, and Ficolin-2 were clearly associated to the stronger Diversas actividades industriales, como la minería y el electropulido del response of WT mice to either collagen immunization or CFA-treatment. oro y otros metales preciosos en la joyería, generan residuos que contienen Multivariate analyses revealed that the differential protein abundance una elevada concentración de cianuro, un compuesto muy tóxico para la of 28 distinct protein spots was able to discriminate between CIA+ and mayoría de los seres vivos. Así, la industria joyera de Córdoba genera CIA- mice, independently of their genetic background. This approach is anualmente varias toneladas de un residuo alcalino que contiene hasta 1,5 suitable for the identifi cation of arthritis, or infl ammation serum proteome M de cianuro y diversos metales, como cobre, hierro y zinc, el cual debe signatures in mice with distinct genetic backgrounds. ser tratado mediante procedimientos físico-químicos. La bacteria alcalófi la Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT5344 puede utilizar cianuro, cianato, diferentes nitrilos y complejos cianuro-metálicos como única fuente de nitrógeno, por lo que es un buen candidato para la biodegradación de los residuos cianurados industriales. Para optimizar la degradación del P12. Metabolismo del nitrógeno residuo de la joyería en biorreactores, se ha estudiado el efecto del pH, la aireación, la fuente de carbono y la cantidad de inóculo inicial, entre otros parámetros, y se ha comprobado que esta estirpe puede consumir hasta 12 P12-1 (R12-3) mM de cianuro total cuando crece a pH 9, lo que evita la volatilización Análisis mutacional de la interacción GS-IFs en del cianuro como HCN. La secuenciación completa del genoma de esta cianobacterias estirpe (1,2) ha permitido realizar estudios proteómicos y genómicos que revelan que el cianuro provoca en esta bacteria una respuesta global de Rocío Robles Rengel , Lorena Saelices Gómez, Francisco Javier adaptación a esta fuente de nitrógeno tóxica. La inducción de una oxidasa Florencio Bellido, María Isabel Muro Pastor alternativa asociada a una malato:quinona oxidorreductasa permite, no Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis, cicCartuja, sólo la respiración insensible al cianuro, sino también la formación de Universidad de Sevilla-CSIC, Sevilla, ES oxalacetato, que reacciona con el cianuro formando una cianhidrina. La La glutamina sintetasa de tipo I (GS) de Synechocystis sp. PCC 6803se nitrilasa NitC inducible por cianuro utiliza esta cianhidrina para formar regula a nivel transcripcional y postraduccional en función del balance amonio, que es asimilado por la ruta GS/GOGAT (3,4). El cianuro también carbono/nitrógeno celular. La regulación postraduccional se lleva a cabo induce sistemas de captación de hierro, ya que la biodisponibilidad del mediante la interacción reversible proteína-proteína con dos factores hierro disminuye por la formación de complejos estables con el cianuro. inactivantes, IF7 e IF17 [1]. En el caso de Anabaena sp. PCC 7120, Además, el residuo cianurado induce una respuesta de estrés oxidativo existe un único factor inactivante denominado IF7A, homólogo a IF7 y de defensa frente a metales. Finalmente, se han obtenido mutantes en de Synechocystis. La GS de Synechocystis es inactivada por IF7, IF17 e los genes implicados en la biosíntesis de polihidroxialcanoatos de cadena IF7A, mientras que la GS de Anabaena sólo es inactivada por su propio corta y media identifi cados en el genoma, lo que ha permitido comprobar factor, IF7A. Basándonos en esta observación, hemos construído cuatro que, según la estirpe empleada (silvestre o mutantes), es posible producir proteínas quiméricas entre la GS de Synechocystis y la de Anabaena. material bioplástico de diferente naturaleza durante el crecimiento con El estudiocomparado de estas proteínas nos ha permitido localizar una el residuo cianurado, lo que confi ere un valor añadido al proceso de región carboxilo terminal de 56 residuos de aminoácidos responsable de biorremediación de este residuo industrial tóxico. la interacción GS/IFs. Por otra parte conocemos la naturaleza electrostática de dicha interacción y se han identifi cado tres residuos de arginina de los Bibliografía factores inactivantes, claves para la funcionalidad de estas proteínas [2]. [1] Luque-Almagro et al. Environ. Microbiol. 15: 253-270 (2013).

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[2] Wibberg et al. J. Biotechnol. 175: 67-68 (2014). jóvenes. Durante el desarrollo y crecimiento del tronco de los árboles, éstos [3] Luque-Almagro et al. Microbiology 157:739-746 (2011). afrontan un consumo masivo de carbono y nitrógeno para proveer la síntesis [4] Estepa et al. Environ. Microbiol. Rep. 4: 326-334 (2012). de celulosa y lignina. Estudios previos han demostrado que la expresión del gen de asparraginasa en el pino está asociada al intensivo desarrollo del Financiado por MICINN (BIO2011-30026-C02-01) y Junta de Andalucía sistema vascular que se produce en el tallo de las plántulas una vez que ésta (Proyecto Excelencia CVI-7560). ha agotado las reservas de la semilla, y que su expresión está confi nada a las células de la región del cambium [1]. La observación de que este gen se expresa también en células de xilema secundario en diferenciación de P12-3 árbol adulto sugiere que la ASPG podría jugar un papel importante en el Proteolytic control of the Bradyrhizobium desarrollo vascular y ser de gran relevancia en la producción de biomasa. japonicum transcription factor FixK Aunque conocemos, en líneas generales, la implicación de la asparraginasa 2 en el transporte y movilización de nitrógeno, desconocemos los mecanismos Juan J. Cabrera1 1 2 , Noemí Fernández , Mariette Bonnet , Monika moleculares que controlan espacial y temporalmente su actividad. En Stegmann2, Zeljka Maglica3, Eilika Weber-Ban3, Hauke Hennecke2, nuestro grupo seguimos diferentes aproximaciones para dilucidar el control Eulogio J. Bedmar1, Socorro Mesa1 transcripcional y post-transcripcional de esta enzima y su implicación en el 1Department of Soil Microbiology and Symbiotic Systems, desarrollo del sistema vascular. Nuestros objetivos específi cos son determinar Estación Experimental del Zaidín, CSIC, Granada, ES, 2Institute las características del procesado y activación de la asparraginasa de pino y of Microbiology, ETH Zurich, Zürich, CH, 3Institute of Molecular los factores que regulan la expresión génica asociada al desarrollo vascular. Biology and Biophysics, ETH Zurich, Zürich, CH FixK is a key regulator that controls a large number of genes required for 2 Bibliografía the anoxic and microoxic, endosymbiotic and nitrogen-fi xing life styles of [1] Rafael A. Cañas, Fernando de la Torre, Francisco M. Cánovas, the α-proteobacterium Bradyrhizobium japonicum [1]. FixK is an unusual 2 Francisco R. Cantón. (2007). Planta, 225:1205-1219. member of the CRP/FNR family of bacterial transcription factors, because it is active in vitro without an additional effector molecule and is regulated Este trabajo ha sido fi nanciado con ayudas del Ministerio de Economía y posttranslationally by the oxidation of its singular cysteine residue [2]. Competitividad (BIO2012-33797, AGL9-12139C0202) y una ayuda F.P.U. In addition to its oxidation-mediated control, FixK is also regulated by 2 del Ministerio de Educación a SVK (AP2010-5434). proteolysis. Despite the induction of fi xK2 gene expression at low-oxygen concentrations, the steady-state levels of the FixK2 protein remains constant regardless of the growth conditions [2]. Further, the B. japonicum ClpAP1 proteolytic system degrades FixK in vitro [3]. Remarkably, the recently P12-5 (R12-9) 2 Control de RegR sobre la expresión de los genes solved FixK2structure in complex with DNA revealed that the C-terminus of FixK2 is surface-exposed, and therefore a target for proteolysis [4]. nor de Bradyrhizobium japonicum: micro-oxia We also observed that a truncated variant is always co-purifi ed together versus anoxia with N-terminally His6-tagged FixK2 proteins. Mass spectrometric analysis revealed that this form a C-terminally cleaved derivative (between V220 Ana Salas Huertas, María Jesús Torres Porras, María Jesús Delgado and L221), which lacks the last twelve amino acids. Likewise, this shorter Igeño, Eulogio J. Bedmar Gómez

FixK2 species is also present in cells of B. japonicum. In this work, we Departamento de Microbiología del Suelo y Sistemas Simbióticos - have constructed a series of protein variants with modifi cations within Estación Experimental del Zaidín, CSIC, AP 419, Granada, ES the C-terminus of FixK . Our results showed that the C-terminal stretch 2 Bradyrhizobium japonicum es una bacteria del suelo que establece una of twelve amino acids, and particularly L221, play a crucial role in FixK 2 asociación simbiótica con plantas de soja y es capaz de desnitrifi car tanto proteolysis, protein folding, DNA binding and in vitro activity. In order to en vida libre como en simbiosis. Los genes napEDABC, nirK,norCBQD y fi nd out the function of the carboxy-terminal part of FixK in vivo, we are 2 nosRZDYFLX, que codifi can las enzimas nitrato-, nitrito-, óxido nítrico- currently testing different proteins derivatives with regard to their ability to y óxido nitroso-reductasa, respectivamente, son necesarios para llevar complement a fi xK mutant strain. 2 a cabo dicho proceso. En B. japonicum, se han descrito dos cascadas reguladoras, FixLJ-FixK y RegSR-NifA, de respuesta a oxígeno. Estudios Bibliografía 2 [1] Mesa et al. (2008) J. Bacteriol. 190:6568-79. recientes de nuestro grupo de investigación han demostrado que la proteína [2] Mesa et al. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106:21860-5. reguladora RegR es necesaria para la máxima inducción de los genes nor [3] Bonnet et al. (2013) FEBS Lett. 587:88-93 en condiciones de cultivo anaeróbicas con nitrato y que este control es [4] Bonnet et al. (2013) J. Biol. Chem. 288:14238-46. independiente de RegS [1]. En este trabajo, se ha investigado si el control que ejerce RegR sobre los genes nor ocurre también en micro-oxia o si This work was supported by the ERDF-co-fi nanced grant AGL2011-23383 es exclusivo de condiciones anóxicas. Para ello, se han cultivado la cepa from MINECO. parental USDA110spc4 y las mutantes en los genes regS y regR, en medio mínimo con succinato como fuente de carbono, con nitrato como aceptor fi nal de electrones y en condiciones micro-óxicas (2% de oxígeno en la P12-4 atmósfera gaseosa). Tras el cultivo de las células, se han realizado estudios Caracterización de la asparraginasa de pino: de expresión de los genes nor mediante la determinación de la actividad implicaciones en el desarrollo del sistema vascular β-galactosidasa de una fusión transcripcional norC-lacZ y estudios de detección de la proteína NorC mediante tinción del grupo hemo c.Los Sonia H. E. Van Kerckhoven, Rafael A. Cañas, Fernando de la Torre, resultados obtenidos han confi rmado que la proteína reguladora RegR Concepción Avila, Francisco M. Cánovas, Francisco R. Cantón está implicada en la inducción de los genes nor en respuesta a anoxia y Universidad de Málaga, Dpto Biol. Molecular y Bioquímica, Málaga, ES nitrato. Sin embargo, en condiciones de micro-oxia los niveles de actividad La asparragina es un metabolito clave en plantas para el transporte y reserva β-galactosidasa de la fusión norC-lacZ, así como la expresión de la proteína temporal de nitrógeno. La principal vía de movilización del nitrógeno NorC en la cepa mutante regR, fueron superiores a los detectados en la contenido en el grupo amido de la asparragina implica a la enzima cepa parental. Esto sugiere que, a diferencia de lo observado en anoxia, asparraginasa (ASPG, EC 3.5.1.1), especialmente en tejidos que demandan la proteína RegR podría tener un papel represor sobre la expresión de los altas cantidades de este elemento, tales como semillas en desarrollo y hojas genes nor en condiciones micro-óxicas.

113 Pósters XXXVII Congreso SEBBM

Bibliografía durante la germinación y desarrollo postgerminativo temprano de judía. El [1] Torres et al., 2014. PLOS one, en prensa. gen PVN1, que corresponde con la proteína puriﬁ cada, fue el que mostró mayor valor de expresión en ejes en desarrollo. La inclusión de nitrato en Este trabajo se ha subvencionado con fondos coﬁ nanciados por FEDER del el medio de imbibición redujo la expresión del gen, lo que sugiere una proyecto AGL2010-18607 del Ministerio de Economía y Competitividad. relación con el estado nutricional de plántulas de judía.

Bibliografía P12-6 (R12-8) Cabello-Díaz JM, Quiles FA, Lambert R, Pineda M y Piedras P (2012). El gen nosZ como marcador molecular de la Plant Physiol. Biochem., 53, 54-60. desnitrificación en ecosistemas naturales Quiles FA, Raso MJ, Pineda M y Piedras P (2009). Physiol. Plant., 135, 19-28. David Correa-Galeote, German Tortosa, Eulogio J. Bedmar Departamento de Microbiología del Suelo y Sistemas Simbióticos - Financiación: Ministerio de Economía y Competitividad (AGL2012- Estación Experimental del Zaidín - Agencia CSIC, Granada, ES 34230) y el Plan Andaluz de Investigación (BIO-115).

La relación entre el contenido en nitratos, la emisión de N2O y las distintas comunidades desnitrifi cantes en diferentes muestras medioambientales aún no ha sido establecida. En este estudio se determinó la abundancia relativa genes P12-8 (R12-10) de la desnitrifi cación narG, napA, nirK, nirS y nosZ con el fi n de correlacionar NRT1 y el transporte de compuestos los distintos genes tanto entre sí, como con el substrato inicial y el producto nitrogenados en Chlamydomonas fi nal de la reacción de la desnitrifi cación y a su vez, tratar de establecer un gen Victoria Calatrava de la desnitrifi cación como marcador molecular de dicho proceso. , José Higuera, Zaira González, Emilio Fernández Para ello se seleccionaron dos sitios de muestreo dentro del Parque Nacional Reyes, Aurora Galván Cejudo de Doñana uno con escaso contenido en nitratos (Laguna del Acebrón, S1) Dpto. Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Córdoba, y otro con elevado contenido en nitratos (Arroyo de la Cañada, S2). La Córdoba, ES recogida de sedimentos se realizó en los meses de abril y octubre de los El nitrato es una señal positiva que activa la ruta de asimilación de nitrato/ años 2008, 2009 y 2010. El aislamiento, purifi cación y amplifi cación de los nitrito. Para la activación de la ruta son necesarios dos factores, 1) la genes 16S rRNA así como de los genes de la desnitrifi cación se realizó de entrada de nitrato al interior de la célula, y 2) la presencia de un NIT2 la manera habitualmente realizada en el laboratorio. funcional. NIT2 es un factor de transcripción del tipo RWP-RK y es el De acuerdo con el test de Spearman, la abundancia relativa de los genes de principal gen regulador de la ruta que necesita además de una proteína la desnitrifi cación no presentó correlación ni con el contenido en nitratos dedo de zinc (NZF1) para la óptima funcionalidad de NIT2, en respuesta ni con la emisión de N2O en S1. Por el contrario, para S2 existe correlación a nitrato. Los mutantes nit2 ni sienten el nitrato ni crecen en medios con signifi cativamente positiva entre el contenido en nitratos y cada uno de los nitrato [1, 2]. genes de la desnitrifi cación, si bien el gen nosZ fue el gen que presentó NRT2 y NRT1 son transportadores de nitrato que pertenecen a familias de una mayor correlación. La emisión de N2O y la abundancia relativa proteínas no relacionadas. A la familia NRT2 pertenecen transportadores de los genes de la desnitrifi cación en S2 fue negativa, encontrándose la de nitrato/nitrito de alta afi nidad y algunos de ellos esenciales para el mayor correlación negativa para el gen nosZ. Por otra parte, tanto en S1 crecimiento con nitrato como única fuente de nitrógeno. A la familia como en S2, todos los genes de la desnitrifi cación se correlacionaron NRT1 pertenecen transportadores de nitrato, aminoácidos, oligopéptidos. estadísticamente entre sí, observándose la mayor correlación entre el gen Recientemente esta familia se ha denominado NPF (NRT1/PTR Family). nosZ y el resto de genes analizados. En el presente trabajo se ha estudiado el papel de NRT1 de Chlamydomonas Por tanto, se propone el gen nosZ como un posible marcador molecular (NPF7) en la señalización por nitrato y el efecto sobre la utilización de de las comunidades desnitrifi cantes en muestras medioambientales fuentes de nitrógeno orgánica, urea, aminoácidos, péptidos. contaminadas con nitratos. Bibliografía [1] Camargo A, Llamas A, Schnell RA, Higuera JJ, González-Ballester P12-7 (R12-7) D, Lefebvre PA, Fernández E, Galván A (2007) Nitrate signaling by the Identificación de una nucleasa en ejes regulatory gene NIT2 in Chlamydomonas. Plant Cell 19: 3491-3503. embrionarios de judía regulada por nitrato [2] Higuera JJ, Fernandez E, Galvan A (2014) Chlamydomonas NZF1, a tandem-repeated zinc fi nger factor involved in nitrate signalling by Rocío Lambert Rodríguez, Juan Miguel Cabello Díaz, Cristina controlling the regulatory gene NIT2. Plant Cell Environ. doi: 10.1111/ Caballo Linares, Francisco Antonio Quiles Luque, Pedro Piedras pce.12305. Montilla Universidad de Córdoba, Córdoba, ES Financiado por JA-P08-CVI-042157 y MINECO-BFU2011-29338 (EU Las actividades nucleasas de plantas están implicadas en la degradación FEDER Programa). de ácidos nucleicos asociada a procesos de muerte celular programada y a los de restricción, reparación y recombinación del ADN. Sin embargo, el conocimiento sobre la función de las nucleasas de plantas es muy limitado. P12-9 (R12-2) En ejes en desarrollo de judía se ha detectado una actividad nucleasa 25 años de estudios sobre metabolismo mayoritaria que utiliza ARN y ADNmc como sustratos, cuyos valores de de nitrógeno y carbono en haloarqueas actividad incrementaron tras la emergencia radicular coincidiendo con María José Bonete el incremento de actividad nucleotidasa (Cabello-Díaz et al, 2012) y la , Mónica Camacho, Carmen Pire, Rosa María acumulación de ureidos (Quiles et al, 2009), lo que podría sugerir una Martínez-Espinosa, Julia Esclapez, Vanesa Bautista, Anna Vegara, implicación en la movilización de reservas. Esta enzima se ha purifi cado Susana Díaz, Francisco Pérez-Pomares, Basilio Zafrilla, Laia Pedro- y el gen que la codifi ca (PVN1) se ha identifi cado mediante MALDI TOF/ Roig, Gloria Bravo-Barrales, Francisco I. Llorca TOF. Las características de la enzima purifi cada así como la secuencia División de Bioquímica y Biología Molecular Universidad de del gen indican que pertenece a la familia S1/P1 de nucleasas. Utilizando Alicante, Alicante, ES la base de datos del genoma de judía (www.phytozome.com), se han Los estudios sobre microorganismos extremófi los han aumentado identifi cado 5 miembros de esta familia, cuya expresión se ha analizado exponencialmente en los últimos años. Estos organismos se han adaptado

114 Granada 2014 Pósters a vivir en medios inhóspitos caracterizados por temperaturas, presiones, P12-11 valores de pH y fuerza iónica extremos. Investigaciones recientes Transcriptómica de la deficiencia en glutamina muestran que sus maquinarias celulares son únicas, ofreciendo una fuente sintetasa plastídica en la leguminosa modelo valiosa de nuevos biocatalizadores y compuestos de alto valor añadido Lotus japonicus en el mercado. Nuestro grupo de investigación ha centrado sus esfuerzos en el Marco Betti, Carmen M. Pérez-Delgado, Margarita García-Calderón, estudio y caracterización del metabolismo del carbono y del nitrógeno Antonio J. Márquez de haloarqueas. Como es bien sabido, el N es uno de los elementos Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular, Facultad básicos de los seres vivos, y la disponibilidad de una fuente adecuada de Química, Universidad de Sevilla, Sevilla, ES del mismo a menudo limita la productividad primaria en algunos En las plantas existen diferentes isoformas de glutamina sintetasa ambientes naturales y en la agricultura. En relación a ello, cabe resaltar (GS) cuya función fi siológica precisa está aún por esclarecer. En este que las publicaciones sobre la regulación a nivel transcripcional y trabajo se muestra un resumen de todos los estudios de transcriptómica post-transcripcional de la asimilación del nitrato/amonio son escasas llevados a cabo hasta la fecha con los mutantes Ljgln2-2 defi cientes en en el Dominio Archaea. Este hecho ha motivado que recientemente GS plastídica (GS2) de L. japonicus, que fueron previamente aislados nuestro objetivo se centre en comprender los mecanismos que subyacen en nuestro laboratorio, y que constituyen los primeros mutantes de su en la regulación de este metabolismo y sus diferencias con los otros clase que han sido identifi cados y caracterizados en plantas leguminosas. Dominios. Dichos estudios han puesto de manifi esto la importancia de la GS2 en Hasta el momento se ha aislado, caracterizado y expresado enzimas como distintos procesos tales como la respuesta a sequía [1] y la reasimilación de glutamato, isocitrato y glucosa deshidrogenasas, glutamina sintetasa, amonio fotorrespiratorio [2], estableciendo las múltiples interconexiones ciclodextrin glucanotransferasa, nitrato y nitrito reductasas y proteínas tanto de la GS2, como de la sequía y la fotorrespiración, con distintos reguladoras como GlnK (PII). Estos estudios se han complementado procesos metabólicos de la célula. El hecho de que muchos de los cambios con otros de carácter fi siológico para conocer con detalle cómo estas observados sean comunes para los distintos procesos examinados sugiere haloarqueas se adaptan a condiciones cambiantes del medio o a medios que la GS2 media en la respuesta a diferentes situaciones de estrés como el producido por la sequía ó por la existencia de un ciclo fotorrespiratorio extremos en los que además existen compuestos tóxicos. En este sentido, incompleto en las plantas. Otros estudios más recientes utilizando redes de la vía de desnitrifi cación se presenta como una de las más destacadas para coexpresión han identifi cado posibles factores de transcripción que pueden explorar posibles usos de las haloarqueas en biorremediación de aguas tener papeles clave en la respuesta de las plantas [3]. y suelos salinos. Para comprender mejor esta ruta metabólica se han purifi cado y caracterizado enzimas implicadas en ella y se han realizado Bibliografía análisis informáticos para identifi car los genes involucrados en esta ruta en [1] Díaz P, Betti M, Sánchez DH, Udvardi MK, Monza J, Márquez AJ haloarqueas desnitrifi cantes. (2010) New Phytol. 188, 1001-1013. [2] Pérez-Delgado CM, García-Calderón M, Sánchez DH, Udvardi M, Kopka J, Márquez AJ, Betti M (2013) Plant Physiol. 162, 1834-1848. P12r-10 [3] Pérez-Delgado CM (2014) Tesis Doctoral, Universidad de Sevilla. Estudio funcional de promotores de genes de la asimilación de nitrógeno en Haloferax Agradecemos la fi nanciación del proyecto P10-CVI-6368 y BIO-163 de mediterranei la Consejería de Economía, Innovación y Ciencia, Junta de Andalucía, y Plan Propio Universidad Sevilla. Rebeca González Guerrero, Anna Vegara Luque, Gabriel Felipe Rodríguez Lozano, Julia María Esclapez Espliego, Carmen Lucía Pire Galiana, María José Bonete Pérez P12-12 (R12-11) Grupo Biotecnología de Extremófi los, Universidad de Alicante, San THB1, una hemoglobina truncada regulada por Vicente del Raspeig, ES nitrógeno, modula los niveles de óxido nítrico Haloferax mediterranei es una arquea halófi la extrema capaz de adaptar (NO) y la actividad NR en Chlamydomonas su metabolismo en función de la fuente de nitrógeno disponible. Puede Francisco Javier Ocaña Calahorro, Emanuel Sanz Luque, Aurora crecer en presencia de amonio, nitrato, nitrito o aminoácidos como única Galván Cejudo, Emilio Fernández Reyes fuente de nitrógeno. Se han llevado a cabo análisis mediante microarrays Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad y por qPCR que indican cuáles son los genes cuya transcripción se ve de Córdoba, Córdoba, ES afectada en función de la disponibilidad y de la fuente de nitrógeno. Entre estos genes se encuentran los que codifi can la glutamina sintetasa La gran familia de hemoglobinas está presente en todos los organismos vivos. Durante mucho tiempo, se ha relacionado a estas proteínas con el (glnA), glutamato sintasa (gltS) y NAD-glutamato deshidrogenasa transporte y almacenamiento de oxígeno. Sin embargo, su participación (gdh-1). Se han clonado los promotores de estos genes fusionados con en diferentes procesos fi siológicos y una emergente variedad de funciones, el gen de la β-galactosidasa de Haloferax lucentensis (bgaH) como gen le confi eren una gran importancia, aunque la mayoría de ellas son todavía reportero en el vector pVA-513 con el que se ha transformado Haloferax poco conocidas. En los últimos años, se ha relacionado a las hemoglobinas mediterranei, midiéndose la actividad β-galactosidasa de las células con la degradación del NO, que está implicado en multitud de procesos de transformadas en medios con diferentes fuentes de nitrógeno. Además señalización celular, de esta manera se evitarían posibles efectos tóxicos se han realizado mutantes en el promotor del gen gltS que permiten la del NO debido a su acumulación. En el alga verde Chlamydomonas identifi cación de sitios clave en la regulación de la actividad de este reinhardtii, encontramos la mayor familia de hemoglobinas truncadas promotor. descritas hasta la fecha (THB1 -12). En este trabajo, se describe cómo Por último con el objetivo de identifi car los posibles reguladores dos de ellas (THB1 y THB2) están reguladas por la fuente de nitrógeno transcripcionales que se unan al promotor del gen gltS, se han realizado y el factor de transcripción NIT2, que controla gran parte de los genes ensayos de cromatografía de afi nidad DNA-proteína, mediante la unión implicados en la asimilación de nitrato en el alga (transportadores y del promotor biotinilado a una matriz magnética con estreptavidina, e reductasas específi cas). También se muestra cómo THB1 se sobreexpresa incubando con extractos de Haloferax mediterranei obtenidos en diferentes en presencia de NO y cómo es capaz de convertir in vitro el NO en nitrato. condiciones de cultivo. Además, se caracteriza cómo la nitrato reductasa está implicada de manera

115 Pósters XXXVII Congreso SEBBM muy efi ciente en la reducción de la THB1 necesaria para su actividad, y alternativa de biosíntesis de Phe, que no dependería de arogenato (Yoo et cómo su represión produce un aumento de la actividad NR. Por lo tanto, al., 2013; de la Torre et al., 2014). En esta ruta alternativa el prefenato sería sugerimos en este trabajo, que esta hemoglobina controla los niveles de NO transformado en fenilpiruvato a través de la enzima prefenato dehidratasa e inhibe la actividad NR simultáneamente. (PDT). El fenilpiruvato producido en esta reacción sería posteriormente convertido en Phe a través de una transaminasa de aminoácidos aromáticos. Una particularidad de especial interés es el hecho de que las actividades ADT P12-13 (R12-6) y PDT se encuentran en las mismas proteínas en Arabidopsis thaliana (Cho Estudio mediante técnicas “ómicas” del papel et al., 2007). señalizador de la glutamina sintetasa plastídica En los últimos años, nuestro grupo de investigación ha estado trabajando en la ruta del prefenato, centrados principalmente en la enzima PAT de en el metabolismo de la leguminosa modelo Pinus pinaster, y más recientemente en la caracterización de familia de Lotus japonicus las ADT en esta misma especie. La presente comunicación desarrolla el Margarita García-Calderón trabajo de caracterización que estamos realizando en la familia de genes , Jesús Giráldez, Carmen M. Pérez- ADT/PDT de P. pinaster, integrada por al menos 9 genes candidatos Delgado, Marco Betti, Antonio J. Márquez presentes en el transcriptoma de esta especie (Canales et al., 2013). Departamento de Bioquímica Vegetal y Biología Molecular, Facultad Estos genes candidatos presentan patrones de expresión característicos de Química, Universidad de Sevilla, Sevilla, ES y dependientes del órgano y el estadio de desarrollo de la planta. De El mutante fotorrespiratorio Ljgln2-2 de la leguminosa modelo Lotus estos 9 genes, 3 de ellos forman un grupo fi logenético característico japonicus es defi ciente en la enzima glutamina sintetasa plastídica de gimnospermas. Los objetivos de nuestro trabajo se encuentran (GS2), siendo incapaz de reasimilar el amonio fotorrespiratorio cuando actualmente enfocados en la caracterización funcional de este grupo de 3 se cultiva en condiciones de aire (fotorrespiración activa) [1]. Cuando genes ADT/PDT característicos de coníferas. el mutante se cultiva bajo una atmósfera de alto CO2, la planta no realiza la fotorrespiración, suprimiendo el efecto de la defi ciencia en GS2 en Bibliografía este proceso. Para analizar si la GS2 pudiera estar implicada en otros Canales J, et al. (2013). Plant Biotechnol J. 12(3):286-99. aspectos del metabolismo de la planta además de en la fotorrespiración, Cho MH, et al. (2007)J Biol Chem. 282(42):30827-35. se utilizaron técnicas “ómicas” en el estudio de plantas silvestres y De la Torre F, El-Azaz J, Ávila C and Cánovas FM. (2014). Plant Physiol. mutantes bajo condiciones de alto CO2. En plantas en simbiosis con 164(1):92-104. Mesorhizobium loti, genes correspondientes al metabolismo del Yoo H, et al. (2013). Nat Commun. 4:2833. almidón y sacarosa y metabolismo de aminoácidos mostraron menor expresión en plantas mutantes respecto a WT. Los resultados sugieren que en plantas noduladas, la defi ciencia en GS2 conlleva alteraciones P12-15 (R12-5) en la expresión de genes del metabolismo del C y N, sugiriendo un Efectos de elevados niveles de CO y nitrato 2 papel de la GS2 en la señalización del balance C/N en plantas de L. durante el desarrollo de las hojas primarias japonicus. Estudios de co-expresión han permitido establecer la relación de la GS2 con el metabolismo del C, compatible con otros de girasol resultados anteriormente obtenidos sobre la defi ciencia en nodulación Francisco José Canales Castilla, Purifi cación De la Haba, Elisabeth de mutantes Ljgln2-2 [2]. Barrientos, Lourdes de la Mata, Eloísa Agüera Departamento de Botánica, Ecología y Fisiología Vegetal, Facultad Bibliografía de Ciencias, Universidad de Córdoba, Córdoba, ES [1] Pérez-Delgado CM, García-Calderón M, Sánchez DH, Udvardi MK, Se ha estudiado el efecto de elevados niveles de CO y nitrato sobre el Kopka J, Márquez AJ, Betti M. 2013. Plant Physiol. 162, 1834-48. 2 [2] García-Calderón M, Chiurazzi M, Espuny MR, Márquez AJ. 2012. desarrollo de las hojas primarias de girasol. Las plantas se cultivaron 42 días con CO ambiental (400 mL L-1) y 10 mM de nitrato (C10), CO MPMI 25, 211-9. 2 2 -1 ambiental y 25 mM de nitrato (C25) y elevado CO2 (800 mL L ) y 25 mM Agradecemos la fi nanciación de la Consejería de Economía, Innovación y de nitrato (T), en condiciones controladas de luz, temperatura y humedad Ciencia de la Junta de Andalucía (proyecto P10-CVI-6368 y BIO-163) y relativa, recolectándose el primer par de hojas a los 16, 22, 32 y 42 días. Plan Propio Universidad de Sevilla. Los resultados indican que algunos procesos metabólicos son sensibles a la alta concentración de CO2 y nitrato durante la ontogenia de las hojas primarias de girasol. Así, las plantas cultivadas con elevada concentración de CO mostraron un mayor crecimiento que las plantas cultivadas con CO P12-14 (R12-4) 2 2 Biosíntesis de fenilalanina en coníferas: ambiental, como refl eja la determinación del peso seco (PS) de la planta completa, PS y área foliar así como la determinación de la masa foliar caracterización de la familia arogenato específi ca (SLM). La elevada concentración de CO2 y nitrato (T) aumentó dehidratasa de Pinus pinaster signifi cativamente la fi jación fotosintética de CO2 en las hojas en relación con la concentración de CO ambiental (C10 y C25), principalmente en Jorge El-Azaz Ciudad 2 , Fernando de la Torre, Concepción Ávila, hojas de jóvenes. El contenido en pigmentos fotosintéticos disminuyó Francisco M. Cánovas con el desarrollo de la hoja en todos los tratamientos, especialmente con Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Universidad de elevados CO y nitrato (T), produciéndose la mayor disminución entre Málaga, Málaga, ES 2 los 28 y 42 días. Estos resultados sugieren que el elevado CO2 acelera En las plantas, la biosíntesis de los aminoácidos aromáticos tirosina (Tyr) la degradación de pigmentos fotosintéticos y posiblemente también la y fenilalanina (Phe) tiene lugar en los cloroplastos a través de la ruta del senescencia de la hoja. En los tres tratamientos, se genera un importante prefenato, que tiene su origen en la ruta del siquimato. En la ruta del prefenato, estrés oxidativo durante la senescencia de hojas primarias de girasol, la biosíntesis de Phe tiene lugar mediante dos reacciones consecutivas: como se revela por la acumulación de H2O2, siendo esta acumulación más la primera de ellas consiste en la conversión de prefenato en arogenato a elevada en plantas crecidas con elevado CO2, y elevado nitrato. En hojas través de una reacción de transaminación (actividad prefenato-arogenato senescentes el incremento en los niveles de H2O2 ocurrió en paralelo con aminotransferasa, PAT) y posteriormente la transformación del arogenato en una disminución en la actividad de las enzimas antioxidantes (catalasa Phe (actividad arogenato dehidratasa, ADT). Muy recientemente, dos nuevas y ascorbato peroxidasa). Nuestro resultados indican que una elevada publicaciones han aportado evidencias respecto a la existencia de una vía exposición a CO2 puede provocar estrés oxidativo debido a la disminución 116 Granada 2014 Pósters en la actividad de enzimas antioxidantes posiblemente como consecuencia sea mínimo o rico. Entre ellos destacan algunas de las oxidasas terminales y de un incremento de la carbonilación de proteínas (Qui et al. 2008. otros genes que podrían proporcionar pistas acerca de la ruta de asimilación Photosynth Res 97: 155-66). del cianuro.

Agradecimientos: Investigación fi nanciada por la Junta de Andalucía Los autores agradecen la fi nanciación de este trabajo por parte del Grupo de Investigación BIO-0159). Ministerio de Ciencia e Innovación (BIO2011-30026-C02-01), del Gobierno de Extremadura (GR10165) y FEDER 2007-2013. D. Macías agradece la beca concedida por el Programa de captación y formación de P12-16 recursos humanos de excelencia en investigación, desarrollo e innovación Regulación de enzimas esenciales en el 2010 de la UEX cofi nanciado a su vez por la Junta de Extremadura. Los metabolismo de H. mediterranei en función autores agradecen la ayuda técnica de G. Gutiérrez. de la fuente de nitrógeno

Anna Vegara, Catalina Ruíz, Mónica Camacho, Julia Esclapez, P12-18 Vanesa Bautista, María José Bonete Papel de Trk1 y de la fuente de nitrógeno en División de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de la regulación del transportador de K+ Hak1 en Alicante, Alicante, ES levaduras Haloferax mediterranei es una arquea halófi la extrema que puede utilizar Norberto Escudero*1, María C. Álvarez2, José Ramos2, José M. diferentes fuentes de nitrógeno inorgánicas u orgánicas para su crecimiento. Siverio*1 Este microorganismo posee dos genes (glnK y glnK ) que codifi can 1 2 1Departamento de Bioquímica, Universidad de La Laguna, proteínas de transducción de señales altamente conservadas, ambas La Laguna, ES, 2Departamento de Microbiología, Universidad de pertenecientes a la superfamilia de las PII. Estas proteínas reguladoras Córdoba, Córdoba, ES actúan en la célula para que pueda adaptarse a las diferentes condiciones + del medio; perciben señales del balance entre carbono y nitrógeno, La levadura Hansenula polymorpha presenta dos transportadores de K ; + modifi cando la actividad de las principales enzimas implicadas en los Hak1, de alta afi nidad y regulado por los niveles de K ; y Trk1, de baja + ciclos de dichos elementos. Con la generación de mutantes knockout en afi nidad y constitutivo. HAK1 es inducido a bajas concentraciones de K . H. mediterranei defi cientes en los genes glnK y glnK , mediante estudios La fuente de nitrógeno también afecta los niveles de Hak1. La presencia de 1 2 + fi siológicos y ensayos enzimáticos, se ha estudiado cómo afecta la ausencia concentraciones elevadas de K desencadena la endocitosis y degradación de estas proteínas reguladoras a la actividad de enzimas clave como son vacuolar de la permeasa. La deleción del gen TRK1 desregula HAK1. En glutamina sintetasa, isocitrato deshidrogenasa y glutamato deshidrogenasa. una cepa Δtrk1, los niveles tanto del gen (HAK1) como de la permeasa Los resultados sugieren que la actividad isocitrato deshidrogenasa regula la (Hak1) son más altos que en la cepa silvestre. Los mutantes Δtrk1 son + + ruta de asimilación de amonio, ya que un aumento de su actividad produce hipersensibles a Li y Na ; y los elevados niveles de Hak1 son regulados + una disminución de la de glutamato deshidrogenasa. Además, las dos a la baja sólo en concentraciones superiores a 50 mM K . Nuestros + proteínas PII ejercen la misma función de activación sobre la actividad de resultados sugieren que Trk1 podría actuar como un sensor de K en la glutamina sintetasa. levadura por mecanismos que desconocemos. La sobreexpresión de TRK1 podría aportar pistas a este respecto. Para ello hemos creado una cepa en la que TRK1 se expresa bajo el promotor del gen de la nitrato reductasa YNR1. Resultados muy preliminares indican que los niveles de Hak1 son bajos en P12-17 Efecto del cianuro sobre la expresión génica medios con bajo K+. de Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT 5344

Gracia Becerra, María Isabel Igeño, María Isabel Carmona, María Isabel Guijo, Faustino Merchán, Rafael Blasco Plá Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Genética, P13. Neurobiología molecular Facultad de Veterinaria, Universidad de Extremadura, Cáceres, ES Pseudomonas pseudoalcaligenes CECT 5344 es una bacteria que se P13-1 (R13-3) aisló por su capacidad de utilizar cianuro como fuente de nitrógeno. El APC/C-Cdh1 coordinates neurogenesis análisis trascriptómico (RNA-seq) de la respuesta global a cianuro de la and cortical size during development cepa CECT 5344 en medio mínimo ha puesto de maniﬁ esto que la mayoría María Delgado Esteban1 2 2 de los genes regulados positivamente por cianuro están relacionados con , Irene García-Higuera , Sergio Moreno , procesos que ya han sido previamente descritos en el mismo contexto, Ángeles Almeida1 pero utilizando otras aproximaciones experimentales. Así, la presencia de 1Instituto de Investigación Biomédica de Salamanca-IBSAL, cianuro induce la expresión de operones implicados en el metabolismo Hospital Universitario de Salamanca, Fundación IECSCYL - del nitrógeno (cianato, aminoácidos y nitrilos), en la respuesta al estrés Instituto de Biología Funcional y Genómica-IBFG, CSIC/Universidad oxidativo y en la respiración insensible a cianuro (oxidasas terminales). de Salamanca, IBSAL , Salamanca, ES, 2Instituto de Biología El cianuro induce también la expresión de un nuevo grupo de genes Funcional y Genómica-IBFG, CSIC/Universidad de Salamanca, probablemente involucrados en la degradación de compuestos aromáticos. IBSAL, Salamanca, ES Los genes regulados negativamente codiﬁ can proteínas pertenecientes a The morphology of the adult brain is the result of a delicate balance tres categorías: proteínas ribosómicas, transportadores (fosfato y sulfato) between neural progenitor proliferation and the initiation of neurogenesis y proteínas implicadas en el metabolismo energético (ciclo de Krebs y in the embryonic period. Here we assessed whether the anaphase- fosforilación oxidativa). Estos resultados se han validado por q-PCR. El promoting complex/cyclosome (APC/C) cofactor, Cdh1— which regulates papel de los nuevos genes implicados en el metabolismo del cianuro, y no mitosis exit and G1-phase length in dividing cells—regulates neurogenesis descritos hasta la fecha, se analizará mediante mutagénesis dirigida. in vivo. We use an embryo-restricted Cdh1 knockout mouse model and La mayoría de los genes cuya expresión varía en respuesta a cianuro en show that functional APC/C-Cdh1 ubiquitin ligase activity is required for medio mínimo también lo hace, y en el mismo sentido, en medio LB. Sin both terminal differentiation of cortical neurons in vitro and neurogenesis embargo, existen genes cuya expresión varía dependiendo de que el medio in vivo. Further, genetic ablation of Cdh1 impairs the ability of APC/C to

117 Pósters XXXVII Congreso SEBBM promote neurogenesis by delaying the exit of the progenitor cells from the experimental conditions. We also detect ApoD in the extracellular medium, cell cycle. This causes replicative stress and p53-mediated apoptotic death indicating secretion to the extracellular space. resulting in decreased number of cortical neurons and cortex size. These Culture growth and metabolic or oxidative stress alters caveolae and results demonstrate that APC/C-Cdh1 coordinates cortical neurogenesis endosome distribution. The intracellular localization of ApoD indicates and size, thus posing Cdh1 in the molecular pathogenesis of congenital that secretion is followed by interaction with the plasma membrane, neurodevelopmental disorders, such as microcephaly. caveolin-dependent endocytosis, and location in endosomes. No ApoD is immunodetected in mitochondria. Interestingly, an important fraction of This work was funded by FEDER (European regional development fund) ApoD is located in lysosomes. Large LAMP2-ApoD-positive organelles and Instituto de Salud Carlos III (PI12/00685; RD06/0026/1008 and indicate ApoD presence in autophagolysosomes which is confi rmed RD12/0014/0007). by co-localization with LC-3. ApoD presence inside lysosomes and autophagolysosomes is stable over time, suggesting an active role in autophagy. P13r-2 Previous hypotheses on ApoD neuroprotective roles in glial cells must be Mitochondrial supercomplexes assembly explains refi ned: control of plasma membrane and of the lysosome/autophagosome differences in reactive oxygen species production function must be key elements in the function of this lipid-binding protein. between neurons and astrocytes Support: MICINN (BFU2011-23978), JCyL (VA180A11-2). Irene López Fabuel, Juan Pedro Bolaños Instituto de Biología Funcional y Genómica, Salamanca, ES P13-4 (R13-1) Understanding the physiological roles of reactive oxygen species (ROS) in Molecular mechanisms underlying Parkinson´s the brain requires dissecting out the contribution of each of the four different disease: LRRK2 takes centerstage neural cell types to ROS formation. Here, the abilities of mitochondria isolated from rodent neurons and astrocytes, the most abundant brain cell Sabine Hilfiker types, to spontaneously form ROS were characterized. We found that ROS CSIC, Granada, ES production is about one order of magnitude higher in astrocytes than in Mutations in the Leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) gene are the neurons. This observation is intriguing in view of the widely held notion most common cause of familial Parkinson´s disease (PD), and risk that astrocytes, which express high levels of antioxidants, are effi cient ROS factor variants increase the risk for sporadic PD. However, despite the detoxifi ers. We also found that the main source of ROS in both cell types importance of LRRK2 for the pathogenesis of both familial and sporadic is the mitochondrial electron transport chain, but the difference is ROS versions of the disease, its biological function, and the mechanism(s) production cannot be accounted by the relative abundance of total complex by which pathogenic mutations cause neurodegeneration in PD remain I, a major superoxide anion source within mitochondria. Furthermore, the largely unknown. LRRK2 is a large multi-domain containing protein high ROS production by astrocytes is conserved amongst several rodents, with various protein-interaction domains, a GTPase and a protein kinase including Wistar rat and C57BL6 mice. In view that the mitochondrial domain. Altered catalytic activity correlates with neurotoxicity, indicating supercomplex assembly factor, SCAFI, is not functional in C57BL6 mice, that targeting those activities may provide clues as to novel therapeutic we conclude that the high ROS production in astrocytes is not due to a strategies for LRRK2-linked PD. However, the cellular readout(s) of such putative differential expression of this assembly protein. Interestingly, we altered catalytic activities remain largely unclear. Recent cell biological found that in astrocytes a large proportion of complex I protein occurs free, studies have started to highlight possible early cellular events which whereas in neurons most complex I is part of supercomplexes. We conclude are altered in the presence of pathogenic LRRK2. These events include that this differential complex I assembly into supercomplexes explains the alterations in endocytosis, autophagy, retromer-mediated traffi cking high mitochondrial ROS production by astrocytes. These results suggest from late endosomes to the Golgi, and Golgi integrity. How mutant cell-specifi c physiological roles for mitochondrial ROS in the brain. LRRK2 may induce such divergent effects on intracellular membrane traffi cking pathways remains unclear, and may involve a large variety of distinct molecular mechanisms. Alternatively, since membrane traffi cking P13r-3 pathways are highly interconnected and interdependent, a small number of Understanding ApoD neuroprotective function: LRRK2-mediated cellular alterations may give rise to the wide spectrum modulation of glial ApoD subcellular traffic upon of vesicular traffi cking alterations. I will present our data on the role of metabolic and oxidative stress pathogenic LRRK2 in regulating Rab protein activities which can account for the majority of the observed cellular alterations. Raquel Pascua-Maestro1, María Dolores Ganfornina2, Diego Sánchez2 1Estudiante de doctorado, Dpto. Bioquímica y Biología Molecular y P13r-5 Fisiología / IBGM – Universidad de Valladolid / CSIC, Valladolid, ES, The human Tp53 Arg72Pro polymorphism 2Profesor titular, Valladolid, ES modulates neuronal vulnerability to amyloid-beta Apolipoprotein D (ApoD) is expressed in the nervous system, increases neurotoxicity with aging and neurodegeneration, and is induced in response to Rebeca Lapresa Ruiz de Gauna serum deprivation or oxidative stress. To understand how ApoD traffi c , María Delgado Esteban, Ángeles through different subcellular compartments affects glial cells protecting Almeida Parra mechanisms, we analyze the time course of ApoD subcellular traffi c upon Instituto de Investigación Biomédica de Salamanca-IBSAL, Hospital exposure to low-serum and paraquat stimuli in a human astroglioma cell Universitario de Salamanca, Fundación IECSCYL - Instituto line. de Biología Funcional y Genómica-IBFG, CSIC/Universidad de During treatment, the spatial pattern of ApoD reorganizes from large Salamanca, IBSAL, Salamanca, ES intracellular perinuclear organelles to a dotted surface pattern, indicative of Alzheimer´s disease (AD) is the most common form of dementia in the engagement in intracellular vesicles followed by a second phase of action elderly. AD is a neurodegenerative disorder of the Central Nervous System on the membrane. A small fraction of ApoD locates in the endoplasmic characterized by an altered amyloid-beta (Ab) metabolism, leading to reticulum and Golgi apparatus. Both signals are independent of the deposition of Ab peptides into neuritic plaques, tau hyperphosphorylation,

118 Granada 2014 Pósters which forms neurofi brillary tangles, neuroinfl ammation and the assessed whether Cdh1 regulates neuronal survival in vivo by generating degeneration of synapses and neurons in the hippocampus and cortex, mice lacking Cdh1 from excitatory neurons of the adult forebrain. regions implicated in learning and memory. These animals were viable but exhibited a severe impairment in neurite It has been described that p53 plays an essential role in this neurodegeneration outgrowth and arborisation, leading to synapse loss and neurodegeneration process [1]. The p53 protein naturally occurs in humans in two variants in the adult cerebral cortex and hippocampal CA1 region. Moreover, with single nucleotide polymorphism (SNP) resulting in Arg or Pro at Cdh1 loss induced basal anxiety and spatial learning and memory defi cits. residue 72. This SNP occurs in the proline-rich domain of this protein, Our results demonstrate that Cdh1 is essential for neurite outgrowth and which regulates its apoptotic activity [2]. Recently, we have demonstrated synaptic plasticity in the adult brain and supports the role of APC/C-Cdh1 that the Arg72-p53 genotype increases neuronal susceptibility to ischemia- in neuronal integrity and survival. induced apoptosis [3]. The objective of this study was to determine the role of p53 Arg72Pro Funded: Instituto de Salud Carlos III (PI12/0685 and RD12/0014/0007), polymorphism on the susceptibility of neurons to Ab-induced Junta de Castilla y León (GRS244/A/08 and GREX206), Ministerio de neurodegeneration and its potential role as a genetic biomarker for AD risk. Ciencia e Innovación (SAF2010-20008) and Fundación Miguel Casado We used cortical neurons in primary culture from wild-type (wt) mice and San José. both knockout p53 mice (KOp53) and Knock-in human p53, expressing either p53Pro or p53Arg. Neurons were then incubated in culture medium containing either 10 μM Ab(25-35), the active fragment of Ab, or 10 μM Ab(35-25), the inactive form, for 24 hours. We analysed protein expression P13r-7 levels by Western Blot and mitochondrial function and apoptosis by fl ow Papel regulador de Wrap53 en la isquemia cytometry. cerebral We fi rst found that Ab promoted p53 stabilisation in cortical neurons. Irene Sánchez Morán Moreover, genetic depletion of p53 prevented Ab-induced mitochondrial , Cristina Rodríguez, Ángeles Almeida depolarization and neurodegeneration, suggesting that p53 might play an Instituto de Investigación Biomédica de Salamanca-IBSAL, Hospital important role in AD. Furthermore, we observed that the polymorphic Universitario de Salamanca, Fundación IECSCYL, Salmanca - variant p53Arg increased the susceptibility of neurons to mitochondrial Instituto de Biología Funcional y Genómica-IBFG, CSIC/Universidad depolarization and the subsequent apoptosis caused by Ab, in comparison de Salamanca, IBSAL, Salamanca, ES to the p53Pro one. Thus, p53 Arg72Pro polymorphism modulates the Durante la isquemia cerebral se interrumpe el aporte de glucosa y oxígeno susceptibility of neurons to Ab neurotoxicity and could determine the a la región cerebral afectada, lo que desencadena una compleja cascada de extent of brain damage in AD. These results pose Tp53 Arg72Pro SNP as a señalización celular, denominada “cascada isquémica”, que culmina en la good biomarker candidate for AD risk. muerte neuronal. Se ha descrito que la proteína supresora de tumores p53 está implicada en la muerte neuronal isquémica [1]. En los últimos años se This work was funded by FEDER, ISCIII (PI12/0685, RD12/0014/0007) han identifi cado RNAs and Junta de Castilla y León. R. Lapresa was funded by MECD (Ministerio reguladores que desempeñan un importante papel en el control de la de Educación, Cultura y Deporte, becas FPU). expresión de genes eucariotas [2]. Wrap53 es un cis-NAT (Natural Antisense Transcript) que se localiza en el cromosoma 17p13 y solapa Bibliografía con la región 5’UTR de p53. Se ha descrito que los transcritos de Wrap53 [1] Lanni C, Racchi M, Memo M, Govoni S and Uberti D (2012) Free controlan la expresión de p53 al interferir con la región solapante [3]. Es Radic Biol Med 52:1727-1733. más, se han identifi cado varios SNP (single nucleotide polymorphisms) en [2] Pietsch EC, Humbey O, and Murphy ME (2006) Oncogene 25:1602- Wrap53, específi cos de humanos, que afectan a la capacidad de regulación 1611. de los niveles de p53. [3] Gomez-Sanchez JC, Delgado-Esteban M, Rodriguez-Hernandez I, En el presente trabajo nos propusimos estudiar la posible función de Sobrino T, Perez de la OssaN, Reverte S, Bolaños JP, Gonzalez-Sarmiento Wrap53 en la regulación de la expresión de p53 en neuronas, tras el insulto R, Castillo J and Almeida A (2011) J Exp Med 208:429-437. isquémico. Además, hemos analizado la asociación entre SNP de Wrap53 (rs2287498 y rs2287497) y el estado funcional de pacientes de ictus isquémico. La expresión de Wrap53 y p53 se analizó mediante RT q-PCR P13-6 Cdh1 is essential for neurite outgrowth and en neuronas corticales y células de neuroblastoma humano (SH-SY5Y) diferenciadas sometidas a 90 minutos isquemia experimental (deprivación synaptic plasticity in the adult brain in vivo de oxígeno y glucosa). Los estudios clínicos se realizaron en una cohorte Verónica Bobo Jiménez, María Delgado Esteban, Juan Pedro de pacientes de ictus isquémico procedente del Hospital Universitario de Bolaños Hernández, Ángeles Almeida Parra Salamanca. El estado funcional de los pacientes se evaluó a los 3 meses del Instituto de Investigación Biomédica de Salamanca-IBSAL - ictus, mediante la escala de Rankin modifi cada. Instituto de Biología Funcional y Genómica-IBFG, Centro Superior Nuestros resultados mostraron que los niveles de Wrap53 y p53 no de Investigaciones Científi cas-CSIC/Universidad de Salamanca- variaron signifi cativamente durante la isquemia. Sin embargo, observamos USAL, Salamanca, ES un incremento signifi cativo en los niveles de Wrap53 a las 24 horas tras The E3 ubiquitin ligase APC/C (Anaphase Promoting Complex/Ciclosome) el insulto isquémico. El análisis genómico reveló que el SNP rs2287498 is a multi subunit complex that regulates progression from metaphase to modula el estado funcional de pacientes de ictus, de manera que pacientes anaphase, exit from mitosis and G1 maintenance in proliferating cells. que portan el alelo T presentan peor pronóstico funcional a los 3 meses del To be active, APC/C requires the binding of either one of two activators: infarto cerebral. Cdc20 or Cdh1. Neurons are postmitotic cells that undergo an active En conclusión, nuestros resultados sugieren que Wrap53, NAT de p53, downregulation of cell cycle-related proteins to survive. However, podría estar modulando la susceptibilidad de las neuronas a la isquemia. Es neurons retain the ability to activate the cell cycle machinery in response más, el estado funcional de pacientes de ictus isquémico está condicionado to pathological circumstances, including both acute injury and chronic por el SNP rs2287498 de Wrap53, de manera que hemos identifi cado un neurodegenerative disorders. Recently, we described that Cdh1 is the main nuevo biomarcador genético de pronóstico en ictus. activator of APC/C in cultured cortical neurons. Moreover, APC/C-Cdh1 is essential for neuronal survival in vitro, as it prevents the activation of El trabajo ha sido fi nanciado por el Instituto de Salud Carlos III the cell cycle machinery and the subsequent neuronal apoptosis. Here we (PI12/0685;RD12/0014/0007), la Junta de Castilla y León y el FSE (ISM).

119 Pósters XXXVII Congreso SEBBM

Bibliografía region remain unclear. It has been hypothesized that point mutations and/ [1] Hong LZ, et al. (2010) Neurosci Bull 26:232-240. or post-translational modifi cations on a-syn alter the stability of the protein [2] Watanabe T, et al. (2008) Nature 453:539-543. leading to an increase of its steady-state levels and eventually to neuronal [3] Mahmoudi et al. (2009) Molcel 33, 462-471. death. We have set up a microscope-based methodology to longitudinally track individual neurons and determine the risk of neuronal death induced by wild-type (wt) and mutant versions of a-syn. Furthermore, to determine P13-8 the stability of wt and mutant versions of a-syn in living neurons we La expresión génica de receptores de adenosina have applied a novel optical pulse-chase methodology based on the y metabotrópicos de glutamato en cultivos photoswitchable protein Dendra2 and longitudinal analysis to measure its half-life on neurons in situ. Among the pathological a-syn mutations, primarios de neuronas se modula por glutamato y the E46K mutation increases signifi cantly the risk of neuronal death on un derivado hidrosoluble de C fulereno primary cortical neurons. Post-translational modifi cations modulate a-syn 60 dependent neuronal death risk. We are currently analyzing whether these Davide Giust1, Tatiana Da Ros2, Mairena Martín3, José Luis effects are associated with a change on the stability of the protein. Albasanz3 1Institute of Infl ammation and Repair, University of Manchester, Supported by: FP7-Marie Curie IRG (Project ID:224849), MINECO Manchester, UK, 2Dipartimento di Scienze Chimiche e (BFU2012-39737), Ramón y Cajal Program MICINN (RYC2008-0325) Farmaceutiche, Università degli Studi di Trieste, Trieste, and UTE project CIMA. IT,3Departamento de Química Inorgánica, Orgánica y Bioquímica, Facultad de Ciencias y Tecnologías Químicas / Facultad de Medicina de Ciudad Real, Centro Regional de Investigaciones P13-10 Biomédicas, Universidad de Castilla-La Mancha, Ciudad Real, ES Análisis de la expresión de SERCA2 en cerebros A concentraciones fi siológicas el glutamato, como principal neurotransmisor humanos afectados por la enfermedad de excitador, participa en procesos de aprendizaje y memoria a través de receptores ionotrópicos y metabotrópicos. Sin embargo, a elevadas concentraciones actúa Alzheimer como una neurotoxina, principalmente a través de receptores ionotrópicos, M. Rosario Sepúlveda1, Julio Navascués1, Ana M. Mata2 produciendo degeneración y muerte celular propia de muchas enfermedades 1Depto. Biología Celular, Facultad de Ciencias, Universidad de neurodegenerativas. Los niveles de glutamato se regulan, entre otros, por la Granada, Granada, ES, 2Depto. Bioquímica y Biología Molecular acción del nucleósido adenosina sobre sus receptores, inhibiendo su liberación, y Genética, Facultad de Ciencias, Universidad de Extremadura, a través de receptores A1, o estimulando la misma, a través de receptores Badajoz, ES A2A. En el presente trabajo se estudió el efecto del L-Glutamato (L-Glu) en la arquitectura celular y en la expresión de los receptores de adenosina y La enfermedad de Alzheimer es una enfermedad neurodegenerativa que metabotrópicos de glutamato; así como el posible papel neuroprotector del se caracteriza por una pérdida progresiva de memoria y una decadencia cognitiva. Esta neurodegeneración está asociada a la presencia de placas t3ss, un derivado hidrosoluble del C60 fulereno. El estudio se llevó a cabo usando cultivos primarios de neuronas que fueron tratadas con L-Glu y t3ss. Se seniles de péptido β-amiloide y ovillos neurofi brilares de tau, así como a determinó la viabilidad celular por el método de MTT, se valoró la expresión una alteración en la homeostasis del Ca2+ intracelular. Entre los mecanismos de las proteínas MAP-2 y NEFH por inmunohistoquímica y se cuantifi caron reguladores del Ca2+ neuronal se encuentra la Ca2+-ATPasa de retículo los genes que codifi can los mGluR y AdoR por PCR cuantitativa en tiempo sarco(endo)plásmico (SERCA), que transporta Ca2+ del citoplasma al interior real. Los resultados mostraron que el L-Glu causaba muerte neuronal que del retículo a expensas de la hidrólisis de ATP. En este trabajo se ha analizado revertía en presencia de t3ss. Este derivado hidrosoluble de fulereno modulaba la expresión de SERCA2 mediante inmunohistoquímica en secciones de los receptores mGlu y Ado en las mismas condiciones en las que revertía el cerebros humanos sanos y afectados por la enfermedad de Alzheimer. Los efecto tóxico del L-Glu. Por tanto, los resultados sugieren que el fulereno resultados mostraron localización de esta proteína en el soma de neuronas protege las neuronas de la excitotoxicidad en un proceso que parece estar en ambas muestras, y una elevada expresión en otro tipo celular no neural asociado a la modulación de la expresión génica de los receptores de adenosina principalmente en los cerebros afectados. Se realizaron ensayos con y metabotrópicos de glutamato. marcadores específi cos de astrocitos y microglía, células que cada vez son consideradas más relevantes en la patogénesis de la enfermedad. Nuestros resultados sugieren una relación entre la sobreexpresión de SERCA y la P13-9 (R13-4) participación de la glía en la enfermedad de Alzheimer. Effect of alpha-synuclein pathological mutations and post-translational modifications on stability Financiación: Ministerio de Economía y Competitividad (BFU2011- 23313), Junta de Extremadura y FEDER (A.M.M); BFU2010-19981 and survival on neurons in situ (J.N.); CEI BioTic Granada mP_BS_35 (M.R.S.). Ignacio Iñigo1, Iker Zuriguel2, Laura Larrea3, María Esther Luquin3, Rafael Aldabe3, Montserrat Arrasate3 1Center for Applied Medical Research-CIMA, Graduate Program P13-11 on Neuroscience and Cognition, School of Medicine, University of CSP-alpha is essential to maintain Navarra, Pamplona, ES, 2School of Sciences, University of Navarra, the quiescence of radial-glia like stem cells Pamplona, ES, 3Center for Applied Medical Research-CIMA, in postnatal neurogenesis University of Navarra, Pamplona, ES Alpha-synuclein (a-syn) is a presynaptic protein with a key role on Jose Luis Nieto-Gonzalez, Leonardo Gómez-Sánchez, Fabiola Mavillard, Pedro Linares-Clemente, Jose Antonio Martinez-Lopez, neurodegenerative disorders like Parkinson´s disease (PD) and dementia Rafael Fernandez Chacon with Lewy Bodies (DLB). Although 90% of PD cases are sporadic, Ricardo Pardal, mutations on the gene encoding a-syn (SNCA) cause autosomal Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS) HUVR/CSIC/Universidad dominant PD. Indeed, duplications and triplications of SNCA gene cause de Sevilla, Dpto. de Fisiología Médica y Biofísica and CIBERNED, parkinsonism with prominent dementia linking a-syn levels with neuronal Sevilla, ES death. Yet, the mechanisms that regulate a-syn steady-state levels on Cysteine String Protein-α (CSP-α) is a synaptic co-chaperone that prevents sporadic and familial PD cases with point mutations on the SNCA coding activity-dependent degeneration of nerve terminals. Mutations in the

120 Granada 2014 Pósters human CSP-α gene cause neuronal ceroid lipofuscinosis characterized by P13-13 progressive dementia and seizures. Synapses formed onto granule cells Alterations in age-dependent spatial segregation by parvalbumin (PV)-expressing basket cells progressively degenerate in of secretory vesicles upon treatments associated CSP-α KO mice. Using electrophysiology in acute hippocampal slices, with Parkinson´s disease we have found that the properties of GABA release from basket cells are dysfunctional in CSP-α KO mice. In addition, at the dentate gyrus of CSP-α Mar Martínez Salvador, Elena Fernández, Sabine Hilfi ker KO mice, the number of calretinin-expressing neurons is signifi cantly Instituto de biomedicina López Neyra, CSIC, Armilla, ES increased. We have systematically used BrdU injections and specifi c Neurons and neuroendocrine cells are packed with secretory vesicles, markers to uncover a severe deregulation of adult neurogenesis. We have only a few of which seem to be releasable upon appropriate stimuli. observed that the pool of radial-glia like stem cells becomes progressively Previous studies have shown that vesicles display functional and spatial depleted due to hyper-proliferation, likely caused by a loss of stem cell segregation according to age, whereby newly synthesized vesicles seem quiescence. Surprisingly, part of these alterations occurs before basket cell to be preferentially released. Here, using various fl uorescent cargo synaptic dysfunction is established, suggesting that proliferation increase proteins which change colour with time fused to either neuropeptides is partly due to a cell autonomous mechanism. Indeed, in the absence or select neurotransmitter transporters, we evaluated effects of toxins of CSP-α, although the number of neurospheres formed is much higher associated with Parkinson´s disease on secretory vesicle age and during the fi rst passages, this number progressively becomes much lower distribution in dopaminergic cells in culture. We found alterations in the than in controls. Our data are compatible with two types of alterations percentage of old versus newly synthesized vesicles largely consistent in adult neurogenesis: circuit-independent and circuit (PV neurons)- with previously observed toxin-induced effects on secretion and/or axonal dependent mechanisms. Remarkably, our study uncovers an unanticipated transport. Various reagents which modulate either proteasome function requirement of CSP-α to maintain the quiescence of radial-glia like cells in or macroautophagy indicate that preferentially older secretory vesicles postnatal neurogenesis. are subject to degradation by autophagy (crinophagy). Similarly, older vesicles seem to be preferentially excluded from neurites, indicating the existence of a cellular mechanism able to distinguish vesicles according to their age for their intracellular transport as well as degradation. Additional P13-12 POMGnT1, a protein involved in muscle-eye- studies underway are attempting to address whether proteins associated with familial Parkinson´s disease also cause alterations in vesicle age with brain disease, is located in the Golgi complex implications for dopaminergic transmission. in the mouse retina and 661W photoreceptors

1 1 1 Mary Luz Uribe , Carmen Haro , María Paz Ventero , Laura P13-14 Campello1, Jesús Cruces2, José Martín Nieto1 Increased intracellular iron load is associated 1Departamento de Fisiología, Genética y Microbiología, Facultad with lysosomal alterations and modulated by TPC de Ciencias, Universidad de Alicante, Alicante, ES, 2Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma and TRPML2 channel regulation de Madrid, Instituto de Investigaciones Biomédicas UAM-CSIC, Belén Fernández, Sabine Hilfi ker IdiPAZ, Madrid, ES Instituto de Parasitología y Biomedicina “López-Neyra”, CSIC, The POMGNT1 gene, encoding protein O-linked mannose β1,2-N- (IPBLN-CSIC), Parque Tecnológico de Ciencias de la Salud, acetylglucosaminyltransferase 1, is associated with muscle-eye-brain Granada, ES disease (MEB) and other dystroglycanopathies. Its lack of function or Iron dyshomeostasis has been shown associated with various expression causes hypoglycosylation of alpha-dystroglycan (α-DG) in neurodegenerative diseases including Parkinson´s disease (PD), but the muscle and CNS (including brain and retina), where it catalyzes the underlying cellular mechanisms leading to eventual cellular demise remain transfer of N-acetyl-glucosamine to O-mannosylated α-DG. MEB patients unclear. Here, we show increased iron content in postmortem samples from ocular symptoms include retinal dysplasia and detachment, glaucoma PD patients as compared to age-matched controls. Artifi cially increasing and abnormal electroretinogram. In this context, α-DG O-glycosylation iron content in cultured dopaminergic neuronal as well as non-neuronal cells is known to be relevant for the establishment of functional synapses causes increased apoptosis in a time- and dose-dependent manner, which between photoreceptors and their postsynaptic, bipolar cells in the retina. is most pronounced in dopaminergic cells. Under non-toxic conditions, Nonetheless, the POMGnT1 expression pattern in the normal mammalian increasing iron content is associated with a pronounced proliferation of late retina remains to be addressed. endosomal/lysosomal compartments, where iron seems to be preferentially In this work we have demonstrated by means of RT-PCR and stored. Furthermore, increased intracellular iron load is associated immunoblotting analyses that the POMGNT1 gene is expressed at the with increased oxidative stress and autophagy induction. Interestingly, application of NAADP, an agonist of lysosomal TPC and TRPML mRNA and protein levels in all mammalian species studied, from rodents channels, potentiates cell death associated with increased cellular iron to humans. Immunohistochemical studies have shown that it concentrates content, whilst its antagonist Ned-19 inhibits the effects. Overexpression in the myoid portion of mouse photoreceptor inner segments, where it of TPC1 and TPC2 potentiates cell death induced upon intracellular iron colocalizes with GM130, a Golgi complex protein marker. Its presence increase, whilst the dominant-negative channel mutants are without effect. in the Golgi has also been revealed in 661W cells, a mouse cone NAADP triggers a large increase in cytosolic iron in TPC2-expressing photoreceptor immortalized cell line. However, and in contrast to retinal cells, indicating that iron is released from lysosomal stores in an NAADP- tissue, POMGnT1 additionally accumulates in the nucleus in 661W mediated manner. Similar effects are observed with TRPML2, indicating photoreceptors, where it colocalizes with POMT1 and POMT2, two that both channels regulate iron release from lysosomal compartments. proteins known to form a heterodimer active in the O-linked addition Together, our data indicate that increased cellular iron load is associated of mannose to (unglycosylated) α-DG. These results are suggestive that with an increase in lysosomal proliferation which may be a consequence POMGnT1 not only participates in the O-glycosylation of α-DG in the of enhanced iron storage in this organelle, and that iron release from acidic Golgi complex, but also of other yet-to-be-identifi ed proteins in the stores involves TPC2 and TRPML2 channels in a manner regulatable by nucleus of mouse photoreceptors. NAADP and Ned-19. These data indicate that modulating lysosomal iron storage and release capacities may be a benefi cial therapeutic strategy for a Funding: Instituto de Salud Carlos III grant PI12/0157. variety of disorders associated with iron dyshomeostasis.

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P13-15 Migration was studied using wound-healing assays, Time-Lapse live-cell El déficit en C-RAF incrementa la Imaging and Immunocytochemistry. neuroinflamación y la apoptosis en el receptor Results: Our results show that CPPs are internalized and reduced the rate auditivo tras exposición a estrés por ruido of cell growth. Interestingly, the effects of CPPs are stronger in GSCs compared to other type of cells. TAT sequence did not signifi cantly change Rocío de Iriarte Rodríguez1, Marta Magariños Sánchez2, Isabel the rate of growth. Varela-Nieto1, Ulf R. Rapp3 Although several studies show that Cx43 increases cell migration, our 1Instituto de Investigaciones Biomédicas “Alberto Sols”, CSIC- results indicate that the region of Cx43 that interacts with c-Src does not UAM - CIBERER, Unit 761, Instituto de Salud Carlos III , Madrid, exert this effect. In fact, the CPPs used in this study reduced the rate of ES, 2Instituto de Investigaciones Biomédicas “Alberto Sols”, GSC migration and locomotion. CSIC-UAM - CIBERER, Unit 761, Instituto de Salud Carlos III Conclusions: Our results indicate that c-Src plays an essential role in the - Departamento de Biología, Universidad Autónoma de Madrid , effects of Cx43 in GSCs proliferation and migration and suggest these Madrid, ES, 3Department of Molecular Biology, Max-Planck-Institute CPPs as promising therapies . of Biochemistry, Madrid, ES Las proteínas RAF son serina treonina quinasas pertenecientes a la ruta RAS-RAF-MERK-ERK. Son esenciales para la proliferación, P13-17 supervivencia y diferenciación celular durante el desarrollo, y en la Effect of Parkinson´s disease-associated LRRK2 homeostasis de los tejidos adultos. El défi cit a homocigosis de CRAF es mutations and kinase inhibition on microtubule una enfermedad rara sindrómica que cursa sordera neurosensorial en el interactions hombre (ORPHA648), observándose el mismo fenotipo en el ratón nulo C-Raf-/-. En contraste, los animales heterocigotos C-Raf+/- no muestran Marian Blanca Ramírez1, Elena Fdez2, Sabine Hilfi ker2 alteraciones funcionales ni anatómicas. 1Instituto de Parasitología y Biomedicina “López - Neyra”, CSIC, Nuestro objetivo ha sido estudiar sí el défi cit parcial de C-Raf predispone Granada, ES, 2Instituto de Parasitología y Biomedicina “López- al daño auditivo. Para ello se ha utilizado como agente estresor el ruido y Neyra”, CSIC, (IPBLN-CSIC), Parque Tecnológico de Ciencias de la ratones C-Raf +/+ y C-Raf +/- y se ha realizado el estudio comparado de Salud, Granada, ES la neurofi siología (potenciales auditivos del tronco cerebral), la morfología Mutations in LRRK2 (leucine-rich repeat kinase 2) are associated y citoarquitectura (histología, inmunofl uorescencia, TUNEL) y niveles de with both sporadic and familial Parkinson´s disease (PD). LRRK2 is marcadores de tipo celular, proliferación, supervivencia e infl amación (RT- a large protein containing both GTPase and kinase activities. Various qPCR y Western blotting). studies indicate that LRRK2 interacts with microtubules and modulates Los ratones de ambos genotipos presentaron un incremento de 50 dB SPL en cytoskeletal functions by regulating microtubule dynamics. We fi nd that el umbral auditivo inmediatamente tras la exposición al ruido. Los ratones PD-related mutations in the GTPase domain, but not the kinase domain, C-Raf +/+ recuperaron parcialmente la función auditiva 35 días después, cause templating of LRRK2 onto stable, acetylated microtubules. A por el contrario, los ratones C-Raf+/- presentaron una pérdida auditiva similar templating is observed when inhibiting the kinase activity of irreversible. Así mismo, mostraron un mayor daño celular y un aumento del LRRK2 by various distinct, specifi c kinase inhibitors. Such interaction 90% en el número de células apoptóticas. Las cócleas de los ratones C-Raf can be partially disrupted by nocodazole, and fully disrupted upon cold- +/- presentaron mayores niveles basales de activación de JNK que las de induced microtubule depolymerization. Microtubule regrowth assays C-Raf +/+. Ambos genotipos expuestos a ruido incrementaron la actividad indicate that LRRK2 fi laments form with a delay after microtubules de ERK y de proteínas implicadas en la respuesta infl amatoria (p-JNK) en are reformed. Modulating the acetylation status of microtubules causes la cóclea, así como en marcadores de apoptosis (PARP-1 fragmentado). alterations in fi lament formation consistent with the idea that pathogenic En resumen, nuestros resultados indican que el receptor auditivo mantiene LRRK2 interacts preferentially with stable microtubules. An artifi cial su función aun cuando los niveles de C-RAF estén disminuidos, pero que mutation in LRRK2 which enhances GTP hydrolysis decreases fi lament se reduce su capacidad de recuperación tras la exposición a estrés. formation, whilst a mutation which abolishes an autophosphorylation site in LRRK2 is without effect. Together, the data indicate that LRRK2 Agradecimientos: RdI tiene un contrato asociado al proyecto SAF2011- fi lament formation is dependent on its GTPase activity, modulated by 24391. El trabajo ha sido fi nanciado con la ayuda de este proyecto y con kinase inhibition, and occurs by preferential association with stable el FP7-AFHELO. microtubules. Further studies are under way to determine the impact of such interactions on modulating posttranslational microtubule modifi cations. P13r-16 Specificity of cell-penetrating peptides based on connexin43 and c-Src in glioma stem cells P13r-18 Myriam Jaraíz Rodríguez, Marta Domínguez-Prieto, José M. Medina, Targeted modulation of the glial inflammatory Arantxa Tabernero response in Retinitis Pigmentosa attenuates Instituto de Neurociencias de Castilla y León-INCYL, Salamanca, ES photoreceptor cell death Glioma stem cells (GSCs) are thought to be responsible for tumor María Platón Corchado1, Catalina Hernández-Sánchez1, Alberto M. initiation, relapse, and therapeutic resistance in gliomas, the most common 1 1 1 brain tumors. Connexin43 (Cx43), the main gap junction channel- Hernández-Pinto , Miguel Marchena , Noemí Álvarez-Lindo , Ana 1 2 2 2 forming protein in astrocytes, is down-regulated in GSCs. Interestingly, I. Arroba , Sean Jmaeff , Pablo F. Barcelona , H. Uri Saragovi , 1 restoring Cx43 reverses GSC phenotype and consequently reduces their Enrique J. de la Rosa 1 tumorigenicity. Our previous work shows that the interaction of Cx43 with Centro de Investigaciones Biológicas-CIB-CSIC, Madrid, ES, 2 c-Src is responsible for this antitumorigenic effect. McGill University, Lady Davis Institute-Jewish General Hospital, Aims: On this basis, we have designed several cell-penetrating peptides Montreal, CA (CPPs) containing different regions of Cx43 involved in c-Src interaction Purpose: Retinitis Pigmentosa (RP) is a heterogeneous group of genetic and we have investigated their role on GSC proliferation and migration. retinal dystrophies. In most forms of RP, photoreceptor cell death is Methods: Human G166 GSCs, C6 rat glioma cells, neurons and astrocytes associated with disease progression. Reactive Müller cell gliosis and cultures were treated with CPPs. Cell growth was analyzed by MTT. microglial activation are also found, often prior to photoreceptor death.

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Here, we studied infl ammatory pathways, arising from Müller cell and P13-20 microglia that regulate neuronal cell death. Pathogenic mutations in LRRK2 cause Methods: We analyzed the expression of pro-infl ammatory cytokines and alterations in cell cycle progression of markers of reactive Müller cell gliosis and microglial activation by qRT- and premature centrosome splitting PCR and immunohistochemistry in retinas from wild type and RP mouse models. Growth factors and pharmacological agents were tested in retinal Jesús Madero Pérez1, Elena Fdez1, Patricia Gómez-Suaga1, Angus explants ex vivo and by intravitreal injection in vivo. C. Nairn2, Ana Aiastui3, Adolfo López de Munaín3, Sabine Hilfi ker1 The agents were selected to modulate the glial infl ammatory response. 1Instituto de Parasitología y Biomedicina “López-Neyra”-CSIC, The treatments included clodronate-liposomes (to cause depletion of Armilla, ES, 2Dept. of Psychiatry, Yale University School of microglia), IGF-I (to polarize microglia response), and antagonists of the Medicine, New Haven, US, 3Neuroscience Area, Biodonostia p75NTR receptor (a receptor present in Müller and glial cells and whose Institute, San Sebastián, ES activity stimulates TNFα production). Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) are the most common Results: A marked increase in GFAP and TNFα transcription preceded cause of familial and sporadic Parkinson´s disease (PD). The effects photoreceptor cell death in RP retinas. Reduced photoreceptor cell death, of pathogenic mutations in LRRK2 have generally been studied in better preservation of the outer nuclear layer, and decreased gliosis were differentiated, non-dividing neuronal cells. However, recent studies indicate observed upon treatment. that pathogenic LRRK2 may play a role in dividing cells as well, as indicated Conclusions: Our results suggest the possible existence in the RP retinas by alterations in adult neurogenesis or the increased cancer risk in LRRK2 of a pro-infl ammatory loop mediated by the activation of p75NTR in PD patients. Here, we report that three pathogenic LRRK2 mutants cause Müller glial cells, which causes TNFα production. Modulation of the alterations in cell cycle progression, nuclear shape alterations and premature p75NTR infl ammatory response is a possible target to attenuate RP centrosome splitting. Premature centrosome splitting is associated with progression. partial displacement of the intercentrosomal linker protein rootletin, and can be partially or fully rescued when expressing rootletin, dominant-negative Nek2a or active PP1a, indicating a LRRK2-mediated deregulation of the P13-19 balance of the Nek2a/PP1 pathway controlling centrosome cohesion via LRRK2 delays degradative receptor trafficking intercentrosomal linkers. Alterations in centrosome cohesion and nuclear by impeding late endosomal budding through shape changes are reverted upon pharmacological LRRK2 kinase inhibition. Centrosomal and nuclear shape alterations are also observed in human decreasing Rab7 activity dermal fi broblasts from G2019S LRRK2 mutant PD patients compared to Pilar Rivero-Ríos1, Patricia Gómez-Suaga1, Elena Fdez1, Marian healthy controls. Together, our data indicate a mechanism for pathogenic Blanca Ramírez1, Isidro Ferrer2, Ana Aiastui3, Adolfo López de LRRK2 function in dividing cells. Munain3, Sabine Hilfi ker1 1Institute of Parasitology and Biomedicine “López-Neyra”, Consejo Superior de Investigaciones Científi cas-CSIC, Granada, ES, P13-21 (R13-5) 2Institute of Neuropathology, IDIBELL-University Hospital Bellvitge, Chronic hypoxia aggravates Alzheimer’s disease University of Barcelona, Hospitalet de Llobregat, ES, 3Neuroscience pathology by causing microglial dysfunction Area, Biodonostia Institute, San Sebastián, ES Rosana March-Diaz1, Antonio Heras-Garvín1, Adrian Viehweger1, Mutations in the leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) gene cause late- Sebastian Jimenez1, Alberto Serrano-Pozo1, Victoria Navarro1, onset autosomal dominant Parkinson´s disease (PD), and sequence Almudena Gerpe2, Marisa Vizuete1, Antonia Gutierrez3, José López- variations at the LRRK2 locus are associated with increased risk Barneo1, Edurne Berra2, Javier Vitorica1, Alberto Pascual Bravo1 for sporadic PD. LRRK2 contains both GTPase and kinase domains 1Instituto de Biomedicina de Sevilla-IBiS, Hospital Universitario fl anked by protein interaction motifs, and mutations associated with Virgen del Rocío/CSIC/Universidad de Sevilla, Sevilla, ES, 2Centro familial PD have been described for both catalytic domains. LRRK2 de Investigación Cooperativa en Biociencias, CIC bioGUNE - Parque has been implicated in diverse cellular processes, and recent evidence Tecnológico de Bizkaia, Derio, ES, 3Dept. Biología Celular, Genética pinpoints to an important role for LRRK2 in modulating a variety of y Fisiología - Facultad de Ciencias. Instituto de Investigación intracellular membrane traffi cking pathways. However, the underlying Biomédica de Málaga-IBIMA - Universidad de Málaga, Sevilla, ES mechanisms are poorly understood. Here, by studying the classical, Alzheimer’s disease (AD) is the most prevalent neurodegenerative disorder well-understood, degradative traffi cking pathway of the epidermal and the most common form of dementia. In many cases AD patients present growth factor receptor (EGFR), we show that LRRK2 regulates concomitant vascular pathology. Low oxygen levels are also frequently endocytic membrane traffi cking in a Rab7-dependent manner. Mutant found in the brain of AD patients. The most accepted hypothesis to explain LRRK2 expression causes a slight delay in early-to-late endosomal the correlation between hypoxia and AD is the deposition of amyloid ß traffi cking, and a pronounced delay in traffi cking out of late endosomes, (Aß) occurring in the microvasculature (amyloid angiopathy) and the which become aberrantly elongated into tubules. This is accompanied affectation by the disease of the locus coeruleus, a brain region involved by a delay in EGFR degradation. The LRRK2-mediated defi cits in in the control of brain blood fl ow. However, few data has been collected to EGFR traffi cking and degradation can be reverted upon coexpression of understand the relation between hypoxia and AD progression. active Rab7 and of a series of proteins involved in bridging the EGFR We show here the accumulation of the hypoxic marker HIF1α (Hypoxia- to Rab7 on late endosomes. Moreover, expression of TBC1D15, the inducible-factor 1α), the major transcription factor for the adaptation to Rab7 GAP, mimicks the effects of mutant LRRK2 on EGFR traffi cking. hypoxic conditions, in the brain of AD patients by western blot. We have Effector pull-down assays indicate that pathogenic LRRK2 decreases also characterized the consequences of chronic exposition to hypoxia in the Rab7 activity both in cells overexpressing LRRK2, as well as in progression of the disease using a widely accepted AD mice model. fi broblasts from pathogenic mutant LRRK2 PD patients as compared AD mice were exposed to physiologic hypoxia (8.5% oxygen, 21 days) at to healthy controls. Together, these fi ndings provide novel insights into initial and advances stages of the pathology. Brains from hypoxic animals a previously unknown regulation of Rab7 activity by mutant LRRK2 showed no differences in the Aß content and number of plaques, but they which impairs membrane traffi cking at very late stages of the endocytic showed a clear reduction in the total number of microglial cells that was pathway. Current studies are underway to determine whether LRRK2- even more evident around the Aß plaques. In vitro analyses suggest that mediated changes in intraluminal endolysosomal calcium may account hypoxia slows down proliferation and chemotaxis towards polymeric Aß for altered Rab7 activity. in both cell line and primary microglial cultures.

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Interestingly, the brain cortex from the hypoxic animals showed a high potential and cellular excitability. Our group has previously shown that increase in the number of dystrophic neurites surrounding the microglia- the neuronal isoform of the serum and glucocorticoid-regulated kinase free Aß plaques. We observed also a decrease in the mRNA levels of (SGK1.1), with distinct subcellular localization and modulation, up- two markers of interneurons, Somatostatin and Neuropeptide-Y, in the regulates the Kv7.2/3 current in neurons. Moreover, transgenic mice hippocampus of hypoxic mice. These data suggest that hypoxia accelerates (Tg.sgk) expressing a constitutively active form of SGK1.1 (S515D) the progression of AD pathology. were resistent to seizures induced by kainic acid, unveiling a novel role The pathway underlying microglial affectation by hypoxia has an enormous for SGK1.1 as a physiological regulator of the M-current and neuronal potential in neurodegenerative disorders where microglia function is excitability (Miranda et al, J Neurosci 2013 33:2684). The ubiquous correlated with the progression of the disease. isoform of this kinase, SGK1, has been involved in protection from apoptosis (Mikosz et al JBC 2001 276:20) and neurogenesis (Anacker et al PNAS 2013 110:8708). Both mechanisms have been associated to P13-22 seizure-induced neuronal death. Therefore, to explore whether SGK1.1 GPCR homo- and heteroreceptor complexes also protects against seizure cell death, we compared the levels of neuronal in the brain death in Tg.sgk vs wild-type mice, using the Fluoro-Jade staining approach in different brain regions in mice with comparable seizure development. Dasiel Oscar Borroto Escuela1 2 , Manuel Narváez , Michael Di Our results show a signifi cant decrease in neuronal death in transgenic 1 1 3 4 Palma , Wilber Romero-Fernández , Ismel Brito , Michael Bader , mice after kainate treatment, even under status epilepticus. Experiments are 5 1 6 Malgorzata Filip , Luigi F. Agnati , Pierre Trifi lieff , Jonathan underway in our laboratory to test signalling pathways involved in SGK1.1 7 1 Javitch , Kjell Fuxe protective role. This result is clinically relevant, since both seizure-induced 1 Department of Neuroscience, Karolinska Institutet, Stockholm, cognitive impairments and epileptic seizure severity are infl uenced by the 2 SE, Department of Physiology, School of Medicine, University of extent of damage caused by seizures. Malaga, Málaga, ES, 3IIIA-CSIC, Artifi cial Intelligence Research Institute, Spanish National Research Council, Barcelona, ES, 4Max- Delbrück-Center for Molecular Medicine, Berlín, DE, 5Laboratory P13-24 of Drug Addiction Pharmacology and Department of Pharmacology, Dopamine D1 and D2 receptor immunoreactivities Institute of Pharmacology, Polish Academy of Sciences, Kraków, PL, 6University Bordeaux 2 INRA, Bordeaux, FR, 7Department of in the arcuate median eminence complex Neuroscience, Columbia University, New York, US Wilber Romero Fernández1, Dasiel Borroto-Escuela2, Víctor Vargas- G protein–coupled receptors (GPCRs) play critical roles in cellular processes Barroso3, Manuel Narváez Narváez4, Michael Di Palma5, Luigi F and signaling and have been shown to form homo and heteroreceptor Agnati6, Jorge Larriva Sahd3, Kjell Fuxe2 complexes with diverge biochemical and/or pharmacological activities. 1Faculty of Health Sciences, Technical University of Ambato, However, despite extensive experimental results supporting the formation Ambato, EC, 2Department of Neuroscience, Karolinska Institute, of GPCR homo and heteroreceptor complexes in heterologous systems, the Stockholm, SE, 3Institute of Neurobiology, National Autonomous existence of such receptor-receptor complexes in their native environment University of Mexico, Campus Juriquilla, Querétaro, MX, remains largely unknown, mostly because of the lack of appropriate 4Department of Physiology, School of Medicine, University of methodology. For instance, until recently years the methods that have Málaga, Málaga, ES, 5Department of Earth, Life and Environmental been developed to study receptor-receptor interactions require that genetic Sciences, Section of Physiology, Carlo Bo University of Urbino, constructs be expressed in the cells to enable detection of the receptor Urbino, IT, 6IRCCS Lido Venice, Venice, IT interactions, thus excluding the use of tissue samples. In order to demonstrate Dopamine D1 and D2 receptor (D1DR and D2DR) immunohistochemistry in native tissue the existence of GPCR homo and heteroreceptor complexes, was used to determine the distribution of the D1DR and D2DR especially in a manner that can be generally applicable to different receptor immunoreactivities (IR) in the rat arcuate-median eminence complex. pairs, a well-characterized in situ proximity ligation assay (in situ PLA) has Punctate D1DR and D2DR immunoreactivities were enriched in the been adapted to confi rm the existence of GPCR homo- and heteroreceptor lateral palisade zone, while the densities were low to modest in the medial complexes in brain slices ex vivo. We also describe the in situ PLA procedure palisade zone. D1DR but not D2DR IR nerve cell bodies were found as a high selectivity and sensitivity assay to image GPCR homo- and in the ventromedial part of the arcuate nucleus and in the lateral part of heteroreceptor complexes in brain sections by confocal microscopy and how the internal layer of the median eminence. A large number of tyrosine the assay is performed. We point out as well the method advantages and hydrolase (TH) IR nerve cell bodies in dorsomedial part showed punctate disadvantages and compare it to other available techniques. D1DR IR but only a few presented D2DR IR which were mainly found in a substantial number of TH cell bodies of the ventral periventricular hypothalamic nucleus. This immunohistochemical work could explain the P13-23 (R13-6) The neuronal-specific serum and glucocorticoid- role of D1DR and D2DR in this region. regulated kinase 1.1 protects against seizure- induced neuronal death P13-25 (R13-2) Super-resolution imaging of cargo transport Natalia Armas-Capote1, Adoración Martínez-Palacián2, Diego Álvarez de la Rosa1, Teresa Giráldez3 Melike Lakadamyali 1Departamento de Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina y Centro ICFO, Instituto de Ciencias Fotónicas, Castelldefels, Barcelona, ES de Investigaciones Biomédicas de Canarias-CIBICAN, Universidad Intracellular transport is essential for maintaining cell function and 2 de La Laguna, La Laguna, ES, Dep. of Biochemistry and Molecular morphology. Transport is carried out by molecular motors that convert the Biology II, School of Pharmacy, Complutense University of Madrid and energy of ATP hydrolysis to mechanical motion. Several single molecule Instituto de Investigación Sanitaria del Hospital Clínico San Carlos- in vitro studies produced a wealth of information on the biophysical 3 IdISSC, Madrid, ES, Departamento de Ciencias Biomédicas, Facultad properties and function of these motors. However, the cellular environment de Medicina y Centro de Investigaciones Biomedicas de Canarias- imposes further challenges on motors. Multiple, opposing polarity motors CIBICAN, Universidad de La Laguna, La Laguna, ES must coordinate or compete to overcome road-blocks in the crowded The M-current formed by tetramerization of Kv7.2 and Kv7.3 subunits is cellular environment to effectively deliver their cargo in the right place at a neuronal voltage gated K+ conductance that controls resting membrane the right time. We are combining super-resolution microscopy with single

124 Granada 2014 Pósters particle tracking to understand how motors tackle these challenges. Our on-a-chip incorporates for the fi rst time two compartments with different fl ow studies have shown that, even the dense microtubule network can present velocities (according to the physiological fl ow division) and two physical obstacles to motor-mediated cargo transport, but motors are well-adapted barriers representing the reticular mesh and the interendothelial slits (IES) to circumvent these obstacles. where cells fi rst slow down increasing the hematocrit and then traverse the IES in a unidirectional matter. To validate the use of this platform, several experiments were carried out with different types of red blood cells (RBCs). As P13-26 a proof of concept, we described that old RBCs showed less deformability than Ultrastructural localization of the core-machinery freshly drawn RBCs when traversing the microconstrictions. Posterior analysis for vesicle secretion allowed studying the passage and deformability of infected RBCs through the IES using peripheral blood of BALB/c mice experimentally infected with Israel Salcedo González, Heidi de Wit, Jan van Weering the P. yoelii 17X-GFP strain. Results showed that infected reticulocytes are Department of Functional Genomics, Center for Neurogenomics and signifi cantly more deformable than non-infected reticulocytes, in agreement Cognitive Research, Neuroscience Campus Amsterdam, Amsterdam, NL with the higher deformability of reticulocytes parasitized by P. vivax, a human Neurons communicate with each other through synapses. The secretion malarial parasite with reticulocyte tropism. These results suggest that the device of neurotransmitters is highly regulated by voltage-sensitive channels that is able to reproduce physiological conditions and to distinguish different types allow Ca2+ infl ux in the cell triggering the fusion of the vesicles, where the of RBCs by means of deformation/mechanical properties. Presently, we are neurotransmitters are stored, with the active zone in the cell membrane. All determining if there is hemolysis during the pass of blood through the device, this process is controlled by a set of proteins, including SNARE proteins. if there is pitting in the absence of macrophages and the rheological properties The SNARE proteins are a large family of proteins connected to the cell’s of malarial infected RBCs. membrane system, some, to the vesicles (v-SNAREs) and some others to the cell membrane (t-SNAREs), while other proteins help this core to operate correctly. Four proteins are essential for neurotransmitter release: P14-2 Syntaxin, Munc18, SNAP25 and Synaptotagmin. This process starts with Cambios inducidos por choque térmico en el the assembly of Syntaxin and SNAP25 in the membrane, helped by Munc18. transcriptoma de Leishmania major After, Synaptotagmin and Synaptobrevin bind to them and form the SNARE Alberto Rastrojo, Begoña Aguado, José M. Requena complex, docking the vesicles close to the membrane. When the SNARE Centro de Biología Molecular Severo Ochoa-CSIC-UAM, Madrid, ES complex is zippered, Complexin inhibits fusion until Synaptotagmin detects Ca2+ infl ux, promoting membranes fusion and neurotransmitter release. Los parásitos del género Leishmania, causantes de un grupo de patologías It is known that, after fusion, the SNARE complex is dissolved by the conocidas como leishmaniasis, son transmitidos a humanos y otros mamíferos enzyme NSF, but somehow the proteins should be prevented to bind again. a través de insectos hematófagos. Durante la transmisión, entre otros cambios, Also, the axon button constitutes a very independent system as it is far el parásito debe enfrentarse a un aumento signifi cativo en la temperatura away from the cell soma, making necessary to recycle the vesicles to gain ambiente, siendo considerado un factor disparador del proceso de diferenciación. functionality again. Para comprender mejor la relación entre el aumento de temperatura y la The aim of this research is to clarify the redistribution and recycling of the diferenciación en Leishmania, en este estudio, hemos analizado mediante proteins involved in neurotransmitter release after vesicle fusion. To address RNASeq los cambios en el transcriptoma de la forma promastigote (propia this question, in our lab we use primary cultures of mouse chromaffi n cells del insecto vector) asociados a la temperatura de crecimiento propia de sus as a suitable model for neuron vesicle cycle. The cells are stimulated with a huéspedes (26 o 37ºC). La cuantifi cación de los niveles de expresión relativa highly concentrated K+ solution to trigger vesicle secretion. They are fi xed at de los 11.523 transcritos anotados para L. major y su análisis con diferentes several times after stimulation. To visualize the proteins, immunofl uorescent programas (Cuffdiff, DESeq y DESeq2), han puesto de manifi esto importantes stainings are used for confocal microscopy, analyzing the redistribution of cambios en el transcriptoma inducidos por choque térmico. Considerando los the proteins through the cell with the program Image J. To follow the exact resultados comunes a los 3 programas, observamos la expresión diferencial de organelle where the proteins are while recycling, electron-microscopy is 111 transcritos, de los que 92 mostraron una acumulación y 19 disminuyeron used, labeling the proteins with immunogold particles. The data obtained sus niveles. Los transcritos codifi cantes de amastinas y otras proteínas from these techniques will allow insight for the fi rst time into the cycle of the específi cas del estadio amastigote (forma del parásito en el huésped mamífero) proteins responsible of vesicle fusion. aumentaron su expresión, así como transcritos codifi cantes de quinasas, ciclinas y proteínas de unión a RNA. También observamos la acumulación durante el choque térmico de 12 transcritos correspondientes a RNA estructurales (snoRNA y rRNA). Además, hemos observado que el choque térmico tiene efectos importantes sobre mecanismos clave de la regulación de la expresión P14. Parasitología molecular génica en Leishmania como son el trans-splicing, la poliadenilación y la terminación transcripcional.

P14-1 (R14-2) Functional microengineered model of the human P14-3 splenon-on-a-chip Adenylate cyclase toxin promotes bacterial internalization into non phagocytic cells Aleix Elizalde-Torent1, Luís Rigat-Brugarolas2, María Bernabéu1, Mariana De Niz1, Lorena Martín-Jaular1, Carmen Fernández- Asier Etxaniz Iriondo1, César Martín1, Kepa B. Uribe1, Aitor Becerra1, Antoni Homs-Corbera2, Josep Samitier2, Hernando A. Del Etxebarria1, David González Bullón1, Jon Arluzea2, Felix M. Goñi1, Portillo1 Juan Aréchaga2, Helena Ostolaza1 1CRESIB-Barcelona Center for International Health Research, 1Unidad de Biofísica (CSIC, UPV/EHU) and Departamento de Barcelona, ES, 2Nanobioengineering group, Institute for Bioquímica y Biología Molecular, Universidad del País Vasco, Bioengineering of Catalonia-IBEC, Barcelona, ES Bilbao, ES, 2Departamento de Biología Celular, Facultad de We have developed a newfangled microfl uidic device that mimics the Medicina, Universidad del País Vasco, Bilbao, ES hydrodynamic behavior and fi ltering functions of the splenon, the minimal Bordetella pertussis causes whooping cough, a respiratory infectious disease functional unit of the red pulp of the spleen able to maintain its fi ltering that is the fi fth largest cause of vaccine-preventable death in infants. Though functions. Unlike any other previous microfl uidic devices, the human splenon- historically considered an extracellular pathogen, this bacterium has been

125 Pósters XXXVII Congreso SEBBM detected both in vitro and in vivo inside phagocytic and non-phagocytic cells. facilitar la clasifi cación de muestras, caracterización genética de las However the precise mechanism used by B. pertussis for cell entry, or the poblaciones naturales y cepas de laboratorio, y para dilucidar la sistemática putative bacterial factors involved remain largely unknown. Here we fi nd that y taxonomía de la família Lymnaeidae. Los marcadores de ADN ribosomal adenylate cyclase toxin (ACT), one of the important toxins of B. pertussis, is (ADNr) y de ADN mitocondrial (ADNmt) han demostrado ser útiles en esta suffi cient to promote bacterial internalization into nonphagocytic cells. After tarea en los invertebrados en general. Su aplicación también ha demostrado exhaustive characterization of the entry route we show that uptake of “toxin- ser útil en caracoles lymnaeidos a niveles específi cos, genéricos y de coated bacteria” proceeds via a clathrin-independent, caveolaedependent taxones supragenéricos. Los espaciadores transcritos internos del ADNr, entry pathway, allowing the internalized bacteria to survive within the cells. ITS-2 e ITS-1, son las secuencias más útiles para clasifi car especies de Intracellular bacteria were found inside non-acidic phagosomes enriched lymnaeidos. Un fragmento del gen de la subunidad I de la citocromo c in sphingomyelin and cholesterol, or “free” in the cytosol of the invaded oxidasa (cox1) del ADNmt también resultó útil, aunque los marcadores cells, suggesting that the ACT-induced bacterial uptake does not follow the del ADNmt deben ser empleados con precaución. Cada uno de los tres classical phagolysosomal pathway. Activation of Tyr kinases and toxin- marcadores de ADN se amplifi caron mediante PCR independientemente induced Ca2+-infl ux are essential for the entry process. We hypothesize that para cada especímen de lymnaeido, y cada producto de PCR se secuenció B. pertussismight use ACT to activate the endocytic machinery of non- para una caracterización de haplotipos. Los datos de las secuencias de phagocytic cells and gain entry into these cells, which represents a possible nucleótidos de los ITS-2 e ITS-1 del ADNr nuclear y de cox1 del ADNmt mechanism by which it might evade the host immune system. de depositaron en el GenBank. Los resultados obtenidos cambian el escenario de los lymnaeidos conocido hasta ahora en Chile. Se demostró la presencia de Galba truncatula en Chile, especie que ha sido siempre P14r-4 confundida con Lymnaea viator. Esta última podría ser la principal Molecular epidemiology and analysis of the responsable de la infección animal, mientras que G. truncatula lo sería risk of infection by Anisakis spp. (Nematoda: de la mayoría de casos humanos. Especímenes de Pectinidens diaphana Anisakidae) in sardines (Sardina pilchardus) from mostraron una gran variabilidad intraespecífi ca en su ADN, con un nuevo haplotipo en ITS-1 y tres nuevos en cox1. Lymnaea patagonica demostró Iberian waters ser un sinónimo de P. diaphana. Las escasas diferencias nucleotídicas a nivel de ITS-2 e ITS-1 mantienen a L. patagonica como una subespecie Dolores Molina Fernández, David Malagón, Gema Merino Espinosa, de P. diaphana. Tampoco Lymnaea lebruni presentó diferencias sufi cientes Rocío Benítez, F. Javier Adroher, Joaquina Martín Sánchez para considerarlo un taxón distinto respecto a P. diaphana y L. patagonica. Departamento de Parasitología, Facultad de Farmacia, Universidad Todo ello proporciona una nueva línea de base para llevar a cabo futuros de Granada, Granada, ES estudios apropiados sobre la transmisión, epidemiología y control de la Sardine (Sardina pilchardus) is a fi sh commonly consumed and appreciated Fascioliasis humana y animal en Chile. in Mediterranean countries. A molecular epidemiological survey with 190 sardines from 5 fi shing areas of Mediterranean (Málaga, southern Spain) Financiación: SAF2010-20805, Ministerio de Economía y Competitividad; and Atlantic Spanish coasts (southern: Cádiz and Isla Cristina; northern: A RD06/0021/0017, Red de Investigación Cooperativa en Enfermedades Coruña and Ondarroa) were carried out to analyse the presence of Anisakis Tropicales-RICET, RETICS-FEDER, Ministerio de Sanidad, Madrid; y spp. larvae. All found larvae in fi sh were in third larval stage. The higher PROMETEO 2012/042, Programa I+D de Grupos de Investigación de prevalence of these larvae was observed in fi sh from A Coruña (28.3%), Excelencia, Generalitat Valenciana, Valencia. followed from Ondarroa (5%) and Cádiz (2.5%). No Anisakis larvae were found in fi sh from Málaga and Isla Cristina. Three Anisakis genotypes were identifi ed by polymerase chain reaction followed by restriction fragment P14-6 (R14-1) length polymorphism of the ribosomal fragment ITS1-5.8S-ITS2: A. simplex Carbohydrate-binding agents act as potent sensu stricto, A. pegreffi i and a hybrid genotype between these two species. A. trypanocidals that elicit modifications in VSG pegreffi i was the more prevalent species in A Coruña (71.0 % of larvae). Only three Anisakis larvae (9.1% collected larvae) were located in the musculature glycosylation of sardines: two of them were identifi ed as A. pegreffi i, and the remaining Víctor M. Castillo-Acosta1, Antonio E. Vidal1, Luis Miguel Ruiz- one was a hybrid genotype. Sardine infection was associated with fi shing Pérez1, Els J.M. Van Damme2, Yasuhiro Igarashi3, Jan Balzarini4, area and fi sh length/weight. Risk factor multivariate analysis shows that the Dolores González-Pacanowska1 risk of infection increases 1.6 times per cm in the length of the sardines in the 1Instituto de Parasitología y Biomedicina “López - Neyra”, same fi shing area. Also, in equal length, sardines from A Coruña have a risk CSIC, Armilla (Granada), ES, 2Laboratory of Biochemistry and of parasitization 11.5 times higher than those from other fi shing areas. In any Glycobiology, Department of Molecular Biotechnology, Ghent case, the low number of larvae found in the muscle supposes a low human University, Ghent, BE, 3Biotechnology Research Center, Toyama anisakiasis risk. This risk is less, however, if people eat smaller sardines and/ Prefectural University, Toyama, JP, 4Rega Institute for Medical or sardines from fi shing areas with low prevalence of Anisakis infection, Research, Leuven, BE which reduces signifi cantly the presence of Anisakis in this fi sh. The protozoan parasite Trypanosoma brucei is the etiologic agent of African trypanosomiasis. The chemotherapy relies on a few drugs P14-5 which have adverse side-effects. The cell surface of bloodstream forms Caracterización multigénica de los vectores dwelling in the mammalian host is covered by a densely packed coat transmisores de fascioliasis humana y animal en of glycosylphosphatidylinositol-anchored glycoproteins. The major component is the variant surface glycoprotein (VSG) which is glycosylated Chile, basada en la utilidad de marcadores del by both paucimannose and oligomannose N-glycans for building up the ADN ribosomal y mitocondrial protective barrier against the immune system. Surface glycans are poorly accessible and killing mediated by peptide lectin-VSG complexes is Verónica H Agramunt , Maria Dolores Bargues, Santiago Mas-Coma hindered by active endocytosis. In contrast to previous belief, here we Departamento de Parasitología, Facultad de Farmacia, Universidad show that high affi nity carbohydrate binding agents (CBAs) bind to de Valencia, Burjassot, Valencia / Departamento de Ciencias surface glycoproteins and abrogate growth of T. brucei bloodstream Biomédicas, Universidad CEU-Cardenal Herrera, Castellón, ES forms. Specifi cally, binding of the mannose-specifi c Hippeastrum hybrid Las implicaciones de los lymnaeidos en la transmisión de la fascioliasis, agglutinin (HHA) triggered intense perturbations in endocytosis and su epidemiología y control, insta a desarrollar nuevas herramientas para further parasite lysis. Prolonged exposure to HHA induced parasites

126 Granada 2014 Pósters resistance based on their diminished capacity to bind the lectin. These tres subespecies de Trypanosoma brucei, dos son infectivas para el humano, parasites exhibited a loss of triantennary oligomannose at the expense of T. b. rhodesiense y T. b. gambiense, mientras T. b. brucei es sensible al acción paucimannose structures in surface glycoproteins as a result of genetic del suero humano (SH). Se ha descrito la Apolipoproteina L1 (ApoL1) como rearrangements that abolished expression of the oligosaccharyltransferase el componente del suero humano responsable de la lisis de los tripanosomas, TbSTT3B gene together with the appearance of novel chimeric enzymes. formando poros al nivel del lisosoma del parasito. En T. b. rhodesiense, la In addition, we have evaluated the trypanocidal activity of a series of expresión de un único gen, el SRA (Serum Resistante Associated gene) es prokaryote non-peptidic CBAs that rendered parasitological cure in acute sufi ciente para conferir resistencia al SH, impidiendo la acción de ApoL1. En models of African trypanosomiasis. Thus specifi c glycosylation patterns T. b. gambiense, el parasito responsable de 95% de los casos de enfermedad de are important for CBA cytotoxicity and parasite fi tness in vivo and agents sueño, el mecanismo de resistencia no está todavía bien entendido. binding effi ciently to surface glycoproteins emerge as a new strategy for El objetivo de nuestro trabajo era descubrir genes implicados en el therapy for African trypanosomiasis. mecanismo desarrollado por T. b. gambiense para resistir al SH. Nuestra estrategia consistió en complementar la cepa sensible al SH de T. b. brucei por una librería de expresión construida a partir del ADN genómico de T. P14-7 b. gambiense. La selección de los clones se hizo por adición de 1% de SH. Función, estructura y regulación de la expresión Dos genes han sido identifi cados: HRF-1 y HRF-2 (Human Resistant de la tirosina aminotransferasa de Leishmania Factor), cuya sobreexpresión permite a T. b. brucei proliferar en presencia de 10% de SH. HRF-1 se expresa en el nucléolo de la célula, y su papel infantum regulador esta estudiado vía secuenciación masiva de ARN. HRF-2 es una Miguel Ángel Moreno Izquierdo1, Ana Alonso Ayala1, Pedro José proteína glicosilada perteneciendo a la familia de la lectinas. El análisis Alcolea Alcolea1, Peter John Myler2, Antonio Jiménez3, Vicente de su localización subcelular por inmunofl uorescencia nos permitió Larraga Rodríguez1 colocalizar HRF-2 con proteínas implicadas en exocytosis. El KO de 1Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid, ES, ambos genes HRF-1 y 2 en T. b. gambiense está en proceso y nos permitirá 2Seattle Biomedical Research Institute, Seattle, Washington, US, evaluar si su falta de expresión impide al parasito de resistir el SH. 3Universidad de Alcalá de Henares, Alcalá de Henares, ES A pesar de la ausencia de la proteína TgsGP publicada recientemente como implicada en el mecanismo de resistencia al SH de T. b. gambiense, hemos Leishmania infantum es el agente responsable de la leishmaniasis visceral caracterizados dos genes HRF-1 y HRF-2 cuya sobreexpresión confi ere en la cuenca mediterránea. En su ciclo biológico se alternan dos estadíos: resistencia parcial. promastigote (extracelular en el insecto vector, donde desarrolla un proceso por el que adquiere mayor infectividad conocido como metaciclogénesis) y amastigote (intracelular en el macrófago del hospedador mamífero). La P14-9 falta de nutrientes esenciales hace que el parásito utilice rutas alternativas ABCI3, un nuevo transportador mitocondrial de para obtener energía, como la degradación de aminoácidos aromáticos mediante transaminación, relacionada con la patogenia y la infectividad por Leishmania major implicado en la susceptibilidad la toxicidad para el hospedador de los productos fi nales de degradación. En a antimoniales L. infantum esta transaminación la lleva a cabo la tirosina aminotransferasa Talia Arcari (LiTAT). LiTAT es una proteína citoplásmática, que se expresa en , José Ignacio Manzano, Santiago Castanys, Francisco amastigotes y en promastigotes logarítmicos y metacíclicos en cultivo Gamarro axénico. Por otro lado se sobreexpresa en cepas resistentes a óxido nítrico Instituto de Parasitología y Biomedicina “López-Neyra”, CSIC, de L. chagasi. Dicha sobreexpresión podría explicarse por su interacción (IPBLN-CSIC), Parque Tecnológico de Ciencias de la Salud, con la malato descarboxilasa, responsable de la síntesis de piruvato a partir Granada, ES de malato produciendo NADPH, requerido en la protección frente a estrés Los parásitos del genero Leishmania son responsables de un grupo oxidativo. LiTAT, en ausencia de hierro, sufre una degradación mediada por de enfermedades devastadoras con diversas manifestaciones clínicas. proteasoma, la cual puede ser eludida por la deleción del dominio N-terminal. La ausencia de vacunas y la frecuente resistencia a los fármacos, hace Por ello, LiTAT es un buen candidato para un diseño racional de inhibidores necesario identifi car nuevas dianas terapéuticas. Los transportadores y su estructura unida al cofactor fue resuelta por cristalografía de rayos X ABC (ATP-binding cassette) son una familia de proteínas implicadas en a una resolución de 2.3 Å (PDB: 4ix8). Mediante acoplamiento molecular la resistencia a fármacos en diversos organismos. En el presente trabajo in silico, los residuos responsables de la diferente especifi cidad de sustrato describimos la caracterización funcional del transportador ABCI3 de entre LiTAT y el ortólogo en mamíferos fueron identifi cados, permitiendo Leishmania major, que pertenece a un grupo de transportadores únicos generar un grupo farmacóforo para la identifi cación de nuevos inhibidores de tripanosomátidos. Utilizando parásitos que sobreexpresan ABCI3 frente a la leishmaniasis. fusionada a GFP (GFP-ABCI3) y ensayos de permeabilización con digitonina, hemos determinado que ABCI3 se localiza en la membrana externa de la mitocondria del parásito. Hemos obtenido parásitos con un P14r-8 alelo delecionado para ABCI3 (LmABCI3+/-), y hemos realizado ensayos Identificación por cribado de una librería de de viabilidad celular en presencia de fármacos leishmanicidas. Los sobreexpresión de genes implicados en el promastigotes LmABCI3+/- son cinco veces más resistentes a Sb(III) y As(III); al exponer los parásitos a concentraciones subletales de Sb(III), mecanismo de resistencia al suero humano de estos acumulan menos Sb(III), presentan unos niveles de ATP mayores, una Trypanosoma brucei gambiense menor despolarización de la membrana mitocondrial, y menores niveles de ROS que los parásitos control. Además, los parásitos que sobreexpresan Jean-Mathieu Bart1 2 3 , Carlos Cordon-Obras , Fabian Lorenzo , Basilio una versión mutada inactiva del transportador (LmABCI3K1088M) son 3 1 2 Valladares , Agustin Benito , Miguel Navarro también más resistentes a Sb(III). Actualmente estamos realizando ensayos 1 Centro Nacional de Medicina Tropical Instituto de Salud Carlos de complementación de LmABCI3+/- con una copia episomal del gen y 2 III, Armilla, ES, Instituto de Parasitología y Biomedicina “López - posteriormente trataremos de obtener parásitos mutantes nulos. Neyra”, CSIC, Armilla, ES, 3Instituto Universitario de Enfermedades Tropicales y Salud Pública de Canarias, Santa Cruz de Tenerife, ES Financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad, Plan Trypanosoma es un protozoo que vive en el torrente sanguino de los Nacional de I+D+i Proyectos SAF2012-34267 (F.G.), SAF2011-28102 mamíferos. Desarrolló a lo largo de la evolución una serie de mecanismos para (S.C.) y por el Plan Andaluz de Investigación (Proyecto de Excelencia eludir las respuestas inmunes específi cas e innatas de sus huéspedes. De las CTS-7282).

127 Pósters XXXVII Congreso SEBBM

P14r-10 several bioinformatic tools in T. cruzi and L. major. We also demonstrated Identificación y caracterización de nuevos fármacos that Jean3 is differentially expressed during the stages of growth and de reposición activos frente a Trypanosoma brucei proliferation. In addition, the infective forms of these parasites exhibit high gene expression levels of this protein kinase. Marta Martínez-García1 1 2 , Luis Carvalho , Rubén Cebrián Castillo , We are now performing several experiments in order to study the Jenny Campos-Salinas1, Ignacio Pérez-Victoria3, J. Ignacio Manzano localization of Jean3 and its implication in different processes such as González1, Santiago Castanys1, Francisco Gamarro1, Vanessa Yardley4, treatment resistance, cell cycle and viability, cell death and apoptosis, and Elena González1, Mercedes Maqueda Abreu2, José Mª Pérez-Victoria1 parasites virulence phenomena. 1IPBLN-CSIC, Granada, ES, 2Universidad de Granada, Granada, ES, 3Fundación MEDINA, Granada, ES, 4LSHTM, Londres, UK El protozoo parásito Trypanosoma brucei es responsable de la enfermedad del P14r-12 sueño, una de las enfermedades consideradas como “olvidadas” por la OMS Identificación funcional de posibles secuencias que cuenta con un peor control farmacológico. Los pocos medicamentos promotoras de la polimerasa de ARN tipo II en disponibles son muy tóxicos y difíciles de administrar, por lo que se tripanosomas africanos necesitan nuevos fármacos capaces de cruzar la barrera hematoencefálica sin producir neurotoxicidad, a ser posible de administración oral y de un Carlos Cordon-Obras1, Andreu Saura1, Diana López Farfán1, Fabián precio asumible por los pacientes. La reposición de fármacos (utilización Lorenzo2, Nick Dickens3, Basilio Valladares2, Miguel Navarro1 de medicamentos en uso para tratar otras enfermedades) es una estrategia 1Instituto de Parasitología y Biomedicina “López - Neyra”, CSIC, interesante para identifi car este tipo de compuestos, ya que permite reducir el Granada, ES, 2Instituto Universitario de Enfermedades Tropicales tiempo transcurrido desde la identifi cación del compuesto hasta su entrada en y Salud Pública de Canarias, Santa Cruz de Tenerife, ES,3The fase clínica de estudio. En este trabajo describiremos la actividad tripanocida Wellcome Trust Centre for Molecular Parasitology, Glasgow, UK y el mecanismo de acción de varios de estos prometedores compuestos frente Los tripanosomátidos son protozoos fl agelados pertenecientes al orden a T. brucei. Un ejemplo lo constituye la tafenoquina (TFQ), un fármaco oral Kinetoplastida, organismos ancestrales que se separaron muy pronto del en fase clínica avanzada (IIb/III) para tratar y prevenir la malaria y que resto de la rama eucariota. Su particular evolución hace que presenten una ha demostrado ser efi caz in vivo frente a Leishmania, aunque no frente a Trypanosoma cruzi. Mostramos que la TFQ es activa a concentraciones combinación de rasgos procariotas y eucariotas única, fundamentalmente a submicromolares frente a distintas subespecies de T. brucei, incluyendo nivel de transcripción y organización genómica. Con la salvedad del Spliced T. b. rhodesiense. La TFQ provoca una despolarización mitocondrial en el Leader (SL), un ARN que se añade al 5’ de todos los ARN mensajeros, no parásito, aumento de Ca2+ intracelular y producción de especies reactivas del se ha identifi cado ningún otro promotor de ARN polimerasa de tipo II (pol oxígeno, que acaban produciendo alteraciones celulares a nivel del bolsillo II), e incluso éste, es bastante particular, puesto que inhibidores específi cos fl agelar, el núcleo y la mitocondria. También mostraremos el efecto de otros de pol II y pol III no reducen su actividad en la medida esperada. La transcripción, mediada en la mayoría de los marcos abiertos de lectura fármacos de reposición muy activos frente a T. brucei (IC50%= 3 nM) cuyo mecanismo de acción estamos caracterizando. por la pol II, está organizada en policistrones, y se ha sugerido que los sitios donde cambia el sentido de la transcripción (SSR), son secuencias de Financiación: Ministerio de Economía y Competitividad SAF2011-28215 iniciación de la transcripción. Sin embargo, no se ha identifi cado ninguna (JMPV),SAF2012-34267 (FG), Junta de Andalucía BIO1786(JMPV) y secuencia específi ca que pueda ser considerada como promotor. Fondos FEDER de la UE (SC, FG y JMPV). Para realizar este trabajo primero se generó un antisuero purifi cado por afi nidad frente a la subunidad mayor de la pol II, lo que nos permitió analizar su expresión por Western blot, y su localización en el núcleo del Kinetoplastida P14r-11 modelo (Trypanosoma brucei) mediante inmunofl uorescencia. Empleando este Analysis of the Trypanosomatid serine/threonine antisuero para inmunoprecipitación de cromatina y posterior secuenciación protein kinase “Jean3”, a novel potential masiva identifi camos posibles promotores de la pol II. Esta técnica reveló más de 200 picos signifi cativos de acumulación de la pol II, la mayoría de ellos therapeutic target asociados con los SSR divergentes del genoma de T. brucei. La alta resolución de esta técnica nos permitió acotar con gran precisión regiones candidatas para Andrés Vacas-Oleas1, Celia Fernández-Rubio1, Carmen Sanmartin2, actuar como promotores. El potencial de estas regiones como promotores se Socorro Espuelas3, Paul Nguewa1 está evaluando mediante el análisis de actividad de un gen reportero insertado 1Instituto de Salud Tropical, University of Navarra/Departamento de forma estable en el genoma. Resultados preliminares muestran que algunas de Microbiología y Parasitología, University of Navarra, Pamplona, de estas regiones permiten la transcripción del gen reportero, al contrario de lo ES, 2Instituto de Salud Tropical/Departamento de Química Orgánica que ocurre con la misma construcción en ausencia de promotor. Estos datos, de y Farmacéutica, University of Navarra, Pamplona, ES, 3Instituto confi rmarse, supondrían la modifi cación del paradigma que dicta la ausencia de Salud Tropical/Department of Pharmacy and Pharmaceutical de promotores de ARN pol II en los Kinetoplastida. Technology, School of Pharmacy, University of Navarra, Pamplona, ES Leishmaniasis, Sleeping sickness and Chagas disease are neglected diseases caused by intra-cellular parasites that belong to the Trypanosomatidae P14-13 family. These pathologies affect several million people around the world. Caracterización de un nuevo transportador The transmission of the parasites between invertebrate vectors and mammalian hosts, involves morphological and physiological changes ABC esencial en Trypanosoma brucei, agente needed to acquire virulence and to adapt to the environment. This etiológico de la enfermedad del sueño mechanism of differentiation is called metacyclogenesis. We identifi ed Lina Orrego a number of genes apparently involved during this process. One of our , Viviana Sánchez-Martíns, Marta Martínez-García, María objectives is the validation of these genes as therapeutic targets. Cabello-Donaire, Sophie Malagerie-Cazenave, Jenny Campos- After screening the Leishmania and Trypanosoma genomes, we found Salinas, Antonio Estevez, Santiago Castanys, Francisco Gamarro, plausible candidates involved in the parasites differentiation and adaptation José M. Pérez-Victoria phenomena. We mainly focus on protein kinases as promising druggable Instituto de Parasitología y Biomedicina “López-Neyra”-CSIC, Granada, ES molecules described against different pathologies. After identifying La enfermedad del sueño es una enfermedad tropical causada por el “Jean3” as a therapeutic target candidate in several trypanosomatids, the protozoo parásito Trypanosoma brucei. La transmite la mosca TseTse, analysis of its structure and the prediction of its function were assessed by que inyecta las formas procíclicas del parásito al hospedador mamífero,

128 Granada 2014 Pósters donde se transforman en formas sanguíneas que causan la enfermedad, P14m-15 mortal en ausencia de tratamiento. Como los medicamentos tripanocidas Desarrollo y validación de un sistema HTS no son adecuados debido a su toxicidad y a la aparición de resistencias, en un modelo experimental de LV para es prioritario encontrar nuevas dianas terapéuticas para el desarrollo de el descubrimiento de nuevos fármacos fármacos. En este trabajo presentamos la caracterización de TbABCG6, un nuevo transportador ABC de T. brucei. La proteína ortóloga en el leishmanicidas parásito Leishmania, se encuentra localizada en membrana plasmática Estefanía Calvo Álvarez, José Miguel Escudero Martínez, Rosa y confi ere resistencia a medicamentos leishmanicidas. En primer Reguera Torres, Rafael Balaña Fouce, Estefanía Calvo Álvarez lugar, ensayos de northern y western blot indicaron que TbABCG6 se Dpto. Ciencias Biomédicas, Facultad de Veterinaria, Universidad de expresa mayoritariamente en las formas sanguíneas del parásito, estadío León, León, ES sobre el que se realizó el resto de la caracterización. Los ensayos de inmunofl uorescencia usando anticuerpos generados frente a esta proteína El descubrimiento de nuevos fármacos para tratar la leishmaniosis visceral mostraron que se localiza en vesículas cercanas al bolsillo fl agelar del (LV), la forma más severa de los distintos tipos de leishmaniosis, es cada vez más urgente y necesario, debido a la inefi cacia de los tratamientos actuales, parásito, donde se encuentra concentrada la maquinaria endocítica y su toxicidad y a la aparición de resistencias. El desarrollo de sistemas de exocítica. La sobreexpresión de TbABCG6 no confi rió resistencia a alto rendimiento o HTS (High-Throughput Screening), permitiría testar fármacos tripanocidas. Por el contrario, incrementó la sensibilidad a miles de compuestos de manera rápida, efectiva y reproducible. Debido a suramina, un fármaco que entra por endocitosis mediada por receptor, la infl uencia crítica de la respuesta inmune del hospedador en el tratamiento aunque esta mayor sensibilidad no se debe a diferencias en la acumulación de la infección, el sistema empleado incluye la totalidad de las poblaciones de suramina. Por otra parte, la interferencia parcial de la expresión celulares involucradas en la interacción parásito-hospedador y la forma de TbABCG6 mediante RNAi causó una dramática disminución del intracelular del parásito. Nuestro grupo ha validado un sistema HTS en crecimiento del parásito asociada con una anormal morfología celular placas de 384 pocillos, mediante el empleo de un modelo ex vivo de bazos (ensanchamiento del bolsillo fl agelar y presencia de múltiples fl agelos). infectados con una cepa de L. infantum que sobreexpresa de forma estable la La importancia de dicha proteína en la viabilidad del parásito sugiere proteína infrarroja iRFP. La regulación de la expresión génica en Leishmania un papel esencial de TbABCG6 en T. brucei que estamos tratando de involucra las zonas 3’ no traducidas (3’UTR), las cuales contienen señales elucidar. necesarias para el procesamiento adecuado de los ARNm. La máxima expresión de la proteína iRFP en la fase de amastigote fue analizada mediante Financiación: Ministerio de Economía y Competitividad SAF2011-28215 el clonaje de distintas regiones 3’UTR de genes regulados diferencialmente (JMPV), SAF2012-34267 (FG), Junta de Andalucía BIO1786 (JMPV) y en la fase intracelular del ciclo (A2, AMASTIN), y del gen HSP70II de L. Fondos FEDER de la UE (SC, FG y JMPV). infantum expresado de forma constitutiva, corriente abajo del reportero infrarrojo. La caracterización de la fl uorescencia emitida fue realizada en promastigotes, amastigotes aislados de infecciones in vitro en la línea humana P14r-14 THP-1, y amastigotes purifi cados de bazos de ratones BALB/c infectados. El transportador ABCG2 de Leishmania está Las infecciones experimentales en ratones BALB/c para la obtención de los implicado en la resistencia a antimoniales cultivos ex vivo se llevaron a cabo con la cepa iRFP-3’HSP70+ L. infantum. La validación del sistema se realizó mediante el testado de una colección Ana Perea , José Ignacio Manzano, Kirsten Verachtert, Santiago de 320 compuestos en placas de 384 pocillos, obteniendo valores Z>0.5. Castanys, Francisco Gamarro La capacidad para identifi car compuestos mediante sistemas HTS es vital Instituto de Parasitología y Biomedicina “López-Neyra”, CSIC, para el descubrimiento de nuevos fármacos que puedan ser empleados en un (IPBLN-CSIC), Parque Tecnológico de Ciencias de la Salud, futuro en la terapia contra la leishmaniosis. Granada, ES La quimioterapia es actualmente la única herramienta de lucha disponible Agradecimientos: trabajo fi nanciado por los proyectos AGL2010 16078/ frente a la leishmaniasis, aunque el reducido arsenal de fármacos GAN y CYTED 214RT0482, del Ministerio de Economía y Competitividad disponibles y el incremento del fallo terapéutico limitan el control de esta (MINECO). enfermedad parasitaria. La familia de transportadores ABC (ATP-binding cassette) en Leishmania incluye 42 genes distribuidos en 8 subfamilias (A- H), llevando a cabo funciones biológicas relevantes. Se han caracterizado P14-16 varios miembros de la subfamilia ABCG, los cuales son half-transporters, Fosforilación de la histona H2AX en Leishmania implicados en la resistencia a fármacos, translocación de fosfolípidos a la major como respuesta al daño producido en el membrana plasmática e infectividad. Nuestro grupo ha descrito que líneas ADN por los derivados camptotecínicos dominantes negativas para el transportador ABCG2, presentan una menor infectividad en modelo murino. Hemos comprobado que la sobreexpresión Raquel Álvarez-Velilla, Rafael Balaña-Fouce, Rosa M Reguera- de ABCG2 confi ere una resistencia signifi cativa a Sb(III) así como al ión Torres, Yolanda Pérez-Pertejo metálico As(III), debido a una reducción en su acumulación por incremento Dpto. Ciencias Biomédicas, Facultad de Veterinaria, Universidad de de su efl ujo. Igualmente, hemos observado que formas amastigotas León, León, ES de Leishmania que sobreexpresan el transportador ABCG2, son más La camptotecina y sus derivados estabilizan el complejo de escisión que se resistentes a antimonio que la línea salvaje. Asimismo, comprobamos que genera entre la Topoisomerasa IB (TopIB) y la molécula de ADN durante el la resistencia a metales revierte tras la reducción de los niveles de tioles proceso de replicación. Esta estabilización a menudo implica la formación mediante el pretratamiento con butionina-sulfoximida. Los estudios de de roturas de la doble cadena debido a la colisión entre este complejo y localización subcelular en parásitos que sobreexpresan ABCG2-GFP, la horquilla de replicación, lo que puede desencadenar tanto en un arresto sugieren que el transportador se localiza en vesículas intracelulares del del ciclo celular como en la muerte de la célula. Como consecuencia del parásito. daño producido se activan los procesos de reparación del ADN a través de modifi caciones o variantes de las histonas. Uno de los marcadores mas Financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad, Plan tempranos del daño en el material genético en eucarioras es la ϒH2AX, una Nacional de I+D+i Proyectos SAF2012-34267 (F.G.), SAF2011-28102 variante de la histona H2A con un serina fosforilada. En tripanosomatidos, (S.C.) y por el Plan Andaluz de Investigación (Proyecto de Excelencia esta fosforilación se produce en la treonina 130 situada en el extremo CTS-7282). C terminal de la histona. Por lo tanto, este marcador nos es útil para una

129 Pósters XXXVII Congreso SEBBM correcta evaluación del daño sufrido en el ADN provocado por la acción The quest for new leads against the human infections caused by the de los inhibidores camptotecínicos. Diseñamos un péptido para la posterior protozoans of the genus Leishmania, known collectively as leishmaniasis, inmunización de un conejo y así obtener anticuerpos específi cos frente a is urgently demanding, as chemotherapy, based on a paucity of drugs, la histona fosforilada. Estudiamos el daño producido por la camptotecina is threatened by rising resistance. Aminoalcohols are a versatile y tres de sus derivados: gimatecan, topotecan y el metabolito activo del pharmacological scaffold successfully assayed for anti-infl ammatory, irinotecan, denominado SN38, en promastigotes de Leishmania major. antitumoral, antibiotic and antiparasitic activities. Estos compuestos fueron evaluados a una concentración fi ja y distintos In this work, a set of 15 alkyl-substituted aminoalcohols were assayed tiempos, observándose en todos los casos una señal positiva para la histona for leishmanicidal activity. All were active at micromolar range, being fosoforilada que va aumentando hasta un máximo de 2 horas. Además se compound 5 the best candidate on intracellular L. donovani parasites (IC = observa un arresto de ciclo celular en distintas fases como consecuencia de la 50 0.7μM, and selectivity index = 71.4). rotura de doble cadena durante las primeras horas de exposición a la droga. The most active compounds induced depletion of intracellular levels of ATP; however, they displayed a non-homogenous mechanism lethal Financiación: PI12/00104 del Instituto de Salud Carlos III y CYTED 214RT0482 del Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO). pattern, depending on subtle structural differences, as assessed by biochemical and microscopical techniques. Two polarized modes of action were unveiled; whereas for compound 5 is based on mitochondrial P14-17 dysfunction, with inhibition of complex II of the respiratory chain, Respuesta inmune de dendrímeros carbosilanos en compound 8 behaved as a membrane-active agent inducing an irreversible ganglio de ratón infectado con Leishmania major loss of internal homeostasis with entrance of vital dyes. Aside from these two extreme prototypes, others, as compound 9, fell in an intermediate, Ana Tejería-Bengoechea, José Miguel Escudero-Martínez, Yolanda gray area, between them with alteration of membrane traffi c with Pérez-Pertejo, Rafael Balaña Fouce, Rosa Mª Reguera intracellular vesiculation and accumulation of material at the fl agellar Dpto. Ciencias Biomédicas, Facultad de Veterinaria, Universidad de pocket. León, León, ES Altogether aminoalcohols resulted as appealing new candidates for Se ha estudiado la respuesta inmune ex vivo de 10 nanopartículas Leishmania chemotherapy. dendriméricas derivadas de carbosilano con diferente carga, sobre gangliocitos murinos infectados con Leishmania major, el agente responsable Supported by grants VI PN de I+D+I 2008-2011 ISCIII -Subdirección de la leishmaniosis cutánea en el Viejo Mundo. Ratones BALB/c infectados General de Redes y Centros de Investigación Cooperativa RICET en la almohadilla plantar con promastigotes metacíclicos de L. major (RD12/0018/0007, RD12/0018/0017, RD12/0018/0002), PI12-02706 (LR), modifi cados genéticamente con el gen que codifi ca la proteína fl uorescente SAF2012-34267 (F.G.), Proyecto de Excelencia CTS-7282 (F.G.) and JCyL mCherry, se sacrifi caron la 16º semana postinfección y se reseccionó el 221U13. ganglio poplíteo que drenaba la lesión infectada. Los explantes de ganglio infectados se cultivaron en presencia de una concentración de cada dendrímero toxicológicamente no comprometida. Tras 72h de cultivo, se P14-19 recogieron los sobrenadantes para valorar las citoquinas: IL-4, IL-12, TNFα Clonaje y expresión de la enzima E1, activadora e INFγ. El dendrímero BDEF 031 y los cinco derivados de éste, mostraron una disminución signifi cativa de la IL-4 y un aumento tanto en la señal de de ubiquitina, en Leishmania infantum TNFα como en la del INFγ, ambas correspondientes a una respuesta Th1, Jaime Larraga, Pedro José Alcolea, Ana Alonso, Vicente Larraga cabe destacar, que ninguno de los dendrímeros mostró cambios en IL-12 con respecto al control. Los otros 4 dendrímeros, de generaciones superiores a los Centro de Investigaciones Biológicas - CSIC, Madrid, ES anteriores, fueron capaces de disminuir la respuesta Th2 mediada por la IL- La leishmaniosis es una enfermedad producida por protozoos del género 4, pero no fue signifi cativa, mientras que en el caso de la respuesta Th1, no Leishmania que afecta a dos millones de personas en el mundo. Es se encontraron señales de un aumento del TNFα y del INFγ. Para completar una zoonosis transmitida a través de la picadura de dípteros del género estos resultados de la respuesta inmune se realizó la cuantifi cación de las Phlebotomus. Las principales formas clínicas son cutánea, visceral y actividades iNOS y arginasa de las células hospedadoras, obteniendo unos mucocutánea. En Europa el agente causante de la enfermedad visceral es niveles altos de NO en el sobrenadante de los cultivo y una baja actividad L. infantum. arginasa atribuible a un ratio Th1/Th2 elevado. La enzima activadora de ubiquitina (E1) cataliza el primer paso en la reacción de ubiquitinación que marca las proteínas para su degradación Trabajo fi nanciado por los proyectos PI12/00104 del Instituto de vía proteasoma. Al inicio de la cascada de la ubiquitinación, la enzima Salud Carlos III y CYTED 214RT0482, del Ministerio de Economía y E1 une ATP-Mg2+ y la ubiquitina. En el siguiente paso, una cisteína Competitividad (MINECO). catalítica del enzima E1, ataca el complejo ubiquitina-AMP formado a través de una sustitución acílica, creando simultáneamente una unión tioéster, liberándose AMP. Finalmente el complejo E1-ubiquitina P14-18 (R14-4) Amino alcohols as an appealing and versatile transfi ere la ubiquitina a la enzima catalítica E2 a través de una reacción scaffold for Leishmania chemotherapy. de transesterifi cación. Se ha realizado el clonaje del gen activador de la ubiquitina E1 Unraveling their mechanism of action (LinJ.07.0010) en el vector pQE-30 y se llevó a cabo la expresión en la cepa M15 de E. coli. Las condiciones óptimas de expresión resultaron ser M. Ángeles Abengozar Infantes1, Raquel García-Hernández2, Pilar Fernández de Palencia1, Luis Antonio Bustos3, Ricardo Escarcena3, 2h a 30 ºC, siendo parcialmente soluble. Se purifi có usando cromatografía Santiago Castanys2, Esther Del Olmo3, Francisco Gamarro2, Arturo de afi nidad y se está procediendo a su caracterización. San Feliciano3, Luis Rivas1 Mediante el uso de los programas ClustalW y BlastP se ha realizado el 1Centro de Investigaciones Biológicas (CSIC), Unidad alineamiento, siendo el grado de homología obtenido aproximadamente Metabolómica, Interacciones y Bioanálisis (UMIB), Madrid, ES, del 90% con L. major y L. braziliensis, reduciéndose este valor al 41% 2Instituto de Parasitología y Biomedicina ‘López-Neyra’, CSIC, en el caso de Trypanosoma cruzi, siendo todavía menor en el caso de Armilla, ES, 3Facultad de Farmacia, Departamento de Química los mamíferos. Se ha llevado a cabo el modelado de la proteína con el Farmacéutica (USAL), Salamanca, ES programa PyMol.

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P14-20 implications for the development of an in vitro culture. As a proof of Efecto de la sobreexpresión de las proteínas concept, we attempted in vitro culture of P.yoelli adding RBCs from fosfatasas 1 (PP1) en Leishmania infantum mice with a pyruvate kinase defi ciency (PKD). PKD mice presented high percentages of CD71hi cells in blood comparing with normal Ana Alonso María Degayón, , Pedro J. Alcolea, Miguel Angel Moreno, animals. In these conditions, we were able to see merozoite reinvasion Vicente Larraga and viable parasites after 120 h of culture. Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid, ES La leishmaniasis visceral es una enfermedad zoonótica causada por el protozoo Leishmania infantum en la Cuenca Mediterránea, donde P14r-22 los perros son el reservorio principal. La transmisión se produce Tráfico de hemo en Leishmania, un protozoo por la picadura del vector Phlebotomus perniciosus. A lo largo del parásito auxótrofo para este metabolito esencial ciclo biológico digenético, el parásito se desarrolla desde su forma María Cabello Donaire1 2 3 extracelular y móvil en el hospedador invertebrado, promastigote; , Alfonso Calvo , Francisco J. Gálvez , Noemí a su estado intracelular y no móvil, en el hospedador mamífero, Vergara-Segura1, Alba Rodríguez-Martínez1, Lina Orrego1, Marta amastigote. Las PP1 desempeñan un papel esencial en la regulación Martínez-García1, Sophie Malagarie-Cazenave1, M. Carmen Ruiz- de una gran variedad de procesos en los organismos eucariotas. Sin Cantero1, Antonio M. Estévez1, José Mª Pérez-Victoria1 embargo, las rutas de señalización celular que desencadenan estos 1Institute of Parasitology and Biomedicine “López-Neyra”, Consejo cambios morfogénicos en L. infantum apenas han sido caracterizadas, Superior de Investigaciones Científi cas-CSIC, Armilla, ES, 2Centro lo que promueve este estudio. El alineamiento comparativo de las de Investigación Médica Aplicada-CIMA/Departamento de Histología PP1 codifi cadas por el cromosoma 34 en L. infantum revela un y Patología, Universidad de Navarra, Pamplona, ES, 3Estación núcleo catalítico altamente conservado que difi ere únicamente en el Experimental del Zaidin, CSIC (EEZ-CSIC), Granada, ES extremo N-terminal. Los perfi les de expresión génica analizados por La leishmaniasis es una devastadora enfermedad tropical causada por el qRT-PCR a lo largo del ciclo biológico muestran que diversas PP1 se protozoo parásito Leishmania. Su control se basa en la quimioterapia, encuentran sobreexpresadas en promastigotes infectivos diferenciados pero los fármacos leishmanicidas en uso clínico no son adecuados, en el fl ebótomo respecto a promastigotes de cultivo axénico. La por lo que es prioritario encontrar nuevos tratamientos. Una estrategia sobreexpresión de las PP1 LinJ.15.0240 y LinJ.34.0840 en trasfectantes atractiva para la identifi cación de nuevas dianas farmacológicas consiste estables de L. infantum mediante la integración del plásmido pIR-mcs, en aprovechar diferencias bioquímicas entre el parásito y el hospedador altera la cinética de crecimiento en promastigotes de cultivo axénico. humano. El metabolismo del grupo hemo, un metabolito esencial en Asimismo, los estudios por Western blot refl ejan un drástico descenso todos los organismos aeróbicos, constituye una de estas diferencias, en la sobreexpresión de las mencionadas PP1 tras 48 h de incubación. ya que como el resto de tripanosomátidos patógenos, Leishmania es Estas observaciones sugieren que las PP1 podrían desempeñar una auxótrofo para esta porfi rina y debe rescatarlo de la persona infectada. función esencial en los procesos de diferenciación celular. En este trabajo caracterizamos el tráfi co de porfi rinas a través de la membrana plasmática de L. major. Mostramos que la entrada de porfi rinas es dependiente de proteína y que se afecta por variaciones P14-21 de pH y temperatura así como por la presencia iones y de inhibidores Reticulocyte-prone malaria parasites de la producción de energía. A su vez, existe un efl ujo de porfi rinas que predominantly invade CD71hi immature cells: también caracterizamos. Por otra parte mostramos la caracterización implications for the development of an in vitro de una nueva familia de transportadores de membrana pertenecientes a la superfamilia MFS. Algunos miembros están implicados en tráfi co culture for Plasmodium vivax de porfi rinas en el parásito y otros confi eren resistencia a fármacos Lorena Martín Jaular1, Aleix Elizalde-Torrent1, Richard Thomson- leishmanicidas. Finalmente, estamos analizando la implicación de Luque1, Mireia Ferrer1, Jose Carlos Segovia2, Esperanza Herreros- transportadores ABCB en el tráfi co de porfi rinas en la mitocondria, el Aviles3, Carmen Fernandez-Becerra1, Hernando A del Portillo4 destino principal del hemo. 1CRESIB (Barcelona Center for International Health Research), Barcelona, ES, 2CIEMAT, madrid, ES, 3Tres Cantos Medicines Financiación: Ministerio de Economía y Competitividad SAF2011-28215 Development Campus, GlaxoSmithKline, madrid, ES, 4ICREA - (JMPV), Junta de Andalucía BIO1786 (JMPV) y Fondos FEDER de la UE CRESIB (Barcelona Center for International Health Research), (JMPV). barcelona, ES The lack of an in vitro culture for malaria parasites with a unique P14-23 tropism for reticulocytes, such as Plasmodium vivax or the P. yoelii Identification of a novel chromatin factor (CPF) 17X strain hinders research in these organisms. In order to advance in the characterization of infected cells during P.yoelii 17X-Balb/c associated with VSG expression in African experimental infections we have assessed CD71 expression in erythroid Trypanosomes + cells (TER119 ) as a correlate of maturation. Parasites were found Andreu Saura mainly in immature cells from blood after day 5 post infection (p.i.). , Diana López Farfán, Isabel Vidal-Cobo, Miguel Immature reticulocytes (CD71hi) were present in low levels at the Navarro beginning of the infeccion but its number increases as the infection Instituto de Parasitología y Biomedicina “López-Neyra”, CSIC, progresses. The increase of CD71hi cells in blood concurred with (IPBLN-CSIC), Parque Tecnológico de Ciencias de la Salud, changes in erythropoietic organs. CD71hi cells appeared in spleen at Granada, ES day 10p.i and increased in bone marrow from day 15 p.i. being the Antigenic variation in Trypanosoma brucei involves a sophisticated cells mainly infected. Interestingly, mean fl uorescence intensity (MFI) mechanism to elude the host immune response by changes in the of CD71 in infected cells was higher in both, bone marrow and spleen expression of different Variant Surface Glycoprotein (VSG). The VSG than in the blood at day 15 p.i. This fact strongly suggests that the is expressed in a mono-allelic manner out of 1000 VSG genes, from one parasite would begin the infection in erythropoietic organs; thereafter, telomeric site known as VSG-expression site (VSG-ES). The mono- immature cells would be released to blood. The parasite preference allelic expressed VSG gene is recruited in a single extra-nucleolar for immature cells that are rare in normal blood could have important nuclear body (ESB) that seems to be controlled at several levels. In

131 Pósters XXXVII Congreso SEBBM this study, we have identifi ed a novel chromatin factor that function P14-25 by enabling and disabling the accessibility of transcriptional factors. Identificación de polimorfismo F200Y del We fi rst developed a monoclonal antibody (11C10E4 mAb) against the gen de β-tubulina en una población de recombinant protein and designed a trypanosome cell line that express Haemonchus contortus aislada en la Facultad an HA-tagged version of CPF. Western blot analysis using the mAb de Estudios Superiores Cuautitlán, UNAM, 11C10E4 showed a single band corresponding to the endogenous CPF (105 KDa), also detected by epitope-tagging. Subcellular localization Estado de México of CPF by Immunofl uorescence microscopy using the mAb localized Rosa Isabel Higuera Piedrahita1, Jorge Alfredo Cuéllar Ordaz1, Maria the protein in the nucleus, as expected. Functional analysis by RNA Eugenia López Arellano2, F. Alba Hurtado1, Gabriel Ramírez Vargas2, interference confi rmed fi rst the depletion of CPF by Western blot César Cuenca Verde1 analysis. To deepen the phenotype we carried out a reverse transcriptase 1Maestría en Ciencias de la Producción y Salud Animal. Facultad de quantitative PCR (RT-qPCR), after CPF depletion which showed a Estudios Superiores Cuautitlán. UNAM, Cuautitlán, MX, 2Instituto decreased expression of VSG221 mRNA, as well as a slightly increase Nacional de Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias. of Procyclin mRNA, the surface protein expressed in the Procyclic Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Parasitología insect stage. However, no changes in the ribosomal RNA level were Veterinaria, Jiutepec, MX detected although is also transcribed by the same RNA polymerase. Haemonchus contortus es uno de los parásitos gastrointestinales Next, we investigate the occupancy of CPF along the VSG-ES locus con mayor impacto en los sistemas productivos mexicanos. La by Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) experiments using the mAb genotipifi cación del polimorfi smo F200Y del gen de β-tubulina permite anti-CPF. ChIP-qPCR data analysis demonstrated that CPF is present monitorear la resistencia en fi ncas y puede ayudar a correlacionar con in VSG221 coding region and the pseudo-VSG, genes located within factores de riesgo y prácticas de manejo en campo. El aislamiento the active VSG-ES. Future aims are directed to delineate the specifi c de la cepa de Haemonchus contortus en la FES Cuautitlán muestra function of CPF in VSG-ES expression. susceptibilidad del 80- 90% a bencimidazoles en ensayos in vitro (Moreno y col., 2013), sin embargo se requiere confi rmar como cepa susceptible por métodos moleculares. El objetivo de éste estudio fue determinar el polimorfi smo F200Y del gen de β-tubulina de esta cepa P14-24 (R14-5) provenientes de ovinos. El estudio se realizó en la Unidad de Helmintos Caracterización funcional de las condensinas del CENID-PAVET, INIFAP, Jiutepec, Morelos. Se realizó la extracción en la variación antigénica de Trypanosoma brucei y digestión de DNA de larvas infectantes (L3) a 56 ºC por 12 horas, se realizó la cuantifi cacion DNA en un nanodrop, obteniéndose 2,8 ug/ Domingo I. Rojas-Barros1 2 1 , Jean-Mathieu Bart , Diana López-Farfán , uL, con una correlación de 260/280 de 2,04. Paso seguido, se realizó la Miguel Navarro1 técnica de Alelo Específi co - PCR (AS-PCR) para la identifi cación del 1Instituto de Parasitología y Biomedicina “López - Neyra”, CSIC, polimorfi smos, se utilizaron 10uL de Gotaq® que contiene 1X de buffer, Granada, ES, 2Instituto de Salud “Carlos III”, Madrid, ES 0.25uM de primer, 0,2 mM de dNTP, 1.5 mM de MgCl2 y 1 U de Taq Los tripanosomas africanos eluden la respuesta inmunológica del polimerasa en 22uL y 40 ciclos de amplifi cación. En la primera reacción hospedador expresando consecutivamente distintos tipos de la se utilizó 1uL de PN1: (5’-GGCAAATATGTCCCACGTGC-3’) y 1uL de PN2 (5’-GAAGCGCGATACGCTTGAGC- 3’) y 8uL de DNA de Glicoproteína Variable de Superfi cie (VSG) lo que permite al parásito larvas tres. El segundo PCR se realizó utilizando 8uL de DNA del primer una infección persistente. Trypanosoma brucei dispone de un complejo PCR, se utilizó 1uL de PH1 (5’-GGAACGATGGACTCCTTTCG-3’); sistema genético dedicado a proporcionar todo un repertorio de miles de 1uL de PH2 (5’- GATCAGCATTCAGCTGTCCA-3’) y 1ul de PH3 genes que codifi can diferentes VSG. Sin embargo, para una variación (5’- CTGGTAGAGAACACCGATGAAACATA-3’) para resistencia antigénica efi caz, el parásito debe expresar en la membrana un solo tipo y 1ul de PH4 (5’-ATACAGAGCTTCGTTGTCAATACGA-3’) para de VSG en un momento dado, lo que requiere la expresión monoalélica susceptibilidad (Méo y col., 2012). Los resultados muestran que la cepa de la familia multigénica de VSG. Recientemente hemos descrito que de Haemonchus contortus de la FES Cuautitlán presentó un patrón de el complejo Cohesina es importante para la regulación de la VSG, ya bandas de 250 (fragmento resistente) y 550 (fragmento susceptible), lo que la interferencia de RNA de las cohesinas conduce a la separación cual indica que es una cepa heterocigota, resultados que contrastan con prematura de las cromátidas hermanas del VSG-ES y a un incremento lo notifi cado por Moreno y col. (2013) e Higuera y col. (2014) donde en la frecuencia de aparición de nuevas variantes antigénicas (Landeira había sido susceptible en estudios in vitro e in vivo. Éstos resultados et al., JCB. 2009). nos indican que la presión que se realiza el aislamiento para mantenerla Las condensinas, junto con las cohesinas, son complejos cuya función debe ser mínima manteniendo individuos susceptibles en su mayoría, es esencial para mantener la topología de los cromosomas a lo largo del además de que las pruebas moleculares son mucho más sensibles para ciclo celular. Recientemente se ha sido descrito que las condensinas están realizar el diagnóstico de resistencia a bencimidazoles. involucradas en la regulación de la expresión génica (Hirano et al. G&D, 2012). Para estudiar la función de las condensinas en T. brucei hemos P14-26 caracterizado funcionalmente las subunidades TbSMC4 y TbCND2 del Estudio de nuevos compuestos con actividad complejo. Para ello, hemos generado un anticuerpo monoclonal y un antisuero de conejo frente a TbSMC4. Análisis por imunofl orescencia nos leishmanicida, inhibidores de la expresión de ha permitido determinar la localización nuclear de TbSMC4. Experimentos genes implicados en la resistencia y virulencia de interferencia de RNA (RNAi) de TbSMC4 muestran un incremento Celia Fernández-Rubio1, Daphne Campbell1, Elena Ibañez2, Esther signifi cativo del porcentaje de células en fase G2, demostrando la función Moreno3, Andrés Vacas-Oleas1, Juana Schwartz3, Juan Antonio esencial de las condensinas en el control del ciclo celular en este protozoo Palop4, Alfonso Calvo5, Socorro Espuelas3, Carmen Sanmartin4, parásito. Además, RNAi de TbSMC4 y TbCND2 provocó un incremento Paul Nguewa1 en la frecuencia de variación antigénica, detectándose la expresión de 1Instituto de Salud Tropical, University of Navarra/Departamento otras VSG. Estos resultados sugieren que el complejo Condensina juega de Microbiología y Parasitología, University of Navarra, Pamplona, un papel importante en el establecimiento y/o mantenimiento del estado ES, 2Centro de Investigación Médica Aplicada-CIMA, Universidad transcripcional del VSG-ES. de Navarra, Pamplona, ES, 3Instituto de Salud Tropical/Department

132 Granada 2014 Pósters of Pharmacy and Pharmaceutical Technology, School of Pharmacy, P15. Radicales libres y estrés oxidativo University of Navarra, Pamplona, ES,4Instituto de Salud Tropical/ Departamento de Química Orgánica y Farmacéutica, University of Navarra, Pamplona, ES, 5Centro de Investigación Médica Aplicada- P15-1 CIMA/Departamento de Histología y Patología, Universidad de Cambios en la homeostasis del hierro (Fe) y Navarra, Pamplona, ES expresión de óxido nítrico sintasa inducible La OMS clasifi ca a la leishmaniasis como una de las enfermedades (iNOS) en el preacondicionamiento (P) hepático tropicales desatendidas y de interés mundial. Entre las prioridades con hierro frente a isquemia reperfusión (IR) actuales en el abordaje de estas patologías, está la búsqueda de nuevos Virginia Fernandez, Angela Novoa Arce, Arlette Román Salinas, tratamientos. A partir de un banco de compuestos, cuatro fueron Romina Vargas Villagrán, Luis A. Videla Cabrera, Pamela Cornejo seleccionados según los criterios empíricos de un buen fármaco. Dos Zamorano de ellos (2b y 4b) presentaron en ensayos de dosis-respuesta frente a Universidad de Chile, Facultad de Medicina, ICBM, Programa de promastigotes de L. major bajas IC50s (< 3 μM) y altos índices de Farmacología, Santiago, CL selectividad debido a su escasa toxicidad en macrófagos. Se midió el La isquemia-reperfusión (IR) asociada a cirugías hepáticas bajo oclusión potencial terapéutico de los dos posibles antiparasitarios, observándose vascular, desencadena infl amación en el hígado, asociado a la activación una reducción de la carga parasitaria cercana al 80% en macrófagos temprana de las células de Küpffer que liberan especies reactivas del murinos infectados a concentraciones subletales de ambos. El oxígeno, gatillando un estrés oxidativo drástico. El uso del protocolo de fármaco leishmanicida de referencia, la paromomicina, presentó una protección contra la IR consistente en 6 dosis de 50 mg/kg de Fe en días disminución menor, cercana al 60%. Además, 2b y 4b inducen por sí alternos (P con Fe; PFe), genera una ventana de estrés oxidativo transiente mismos la liberación en los macrófagos de óxido nítrico cuya actividad que recupera la actividad del NF-κB, factor de transcripción redox sensible. leishmanicida ha sido ampliamente descrita. El estudio de la actividad Considerando que NF-κB regula la expresión de la iNOS, y los efectos hepatoprotectores de esta enzima, en este estudio se evaluó la expresión de estos compuestos demostró alteración del ciclo celular con arresto (RT-PCR) y actividad (niveles de nitritos y nitratos séricos) de iNOS en la fase G1, siendo muy signifi cativo en el caso del compuesto 2b. en ratas sometidas al protocolo de PFe o dosis equivalentes de salino Se analizó la expresión de genes relacionados con la proliferación (controles), seguido de 1 h de isquemia y 20 h de reperfusión o cirugía (PCNA), resistencia a fármacos (ABC-transporter y α-tubulina) y sham (laparatomía sin isquemia). Además, se evaluó la expresión de virulencia (QDPR). Se observa una disminución de los niveles de proteínas que regulan la homeostasis del Fe, hepcidina (qPCR) que PCNA, α-tubulina y QDPR tras el tratamiento con ambos compuestos. degrada a la ferroportina (exportador celular de Fe), ferroportina y ferritina Sin embargo, no varía la expresión de ABC-transporter, que se ha (almacenador celular de Fe) (RT-PCR) en hígado de rata. descrito como una de las principales familias de proteínas implicadas En relación a controles-sham, la IR per se incrementó la expresión de iNOS, en la multiresistencia a fármacos. Por los resultados mencionados, efecto exacerbado 5,2 veces por el PFe, el cual aumentó 1,3 veces (p<0,05) consideramos estos compuestos con actividad leishmanicida como los niveles de nitritos/nitratos séricos. En estas condiciones, el PFe frente a buenos candidatos para futuros estudios en un modelo animal de la IR indujo la expresión de hepcidina (7 veces) y la de ferritina (2 veces), sin cambios en la expresión de ferroportina. leishmaniasis cutánea. Se concluye que el PFe se asocia a la inducción de iNOS, enzima de acción antioxidante ya que •NO neutraliza radicales superóxido. La inducción de hepcidina limita los niveles de ferroportina, favoreciendo el P14-27 (R14-3) almacenamiento del Fe en la ferritina, evitando sus efectos deletéreos. Papel de la proteína de unión a RNA RBP33 en el silenciamiento de la expresión génica en Financiado por FONDECYT 1110006 Trypanosoma brucei

Sandra Fernández Moya1 2 3 P15-2 , Mark Carrington , Antonio M. Estévez Protein kinase CK2 as a potential therapeutic 1LMU-München, Departamento de Anatomía III-Biología Celular, Múnich, DE, 2University of Cambridge Department of Biochemistry , target in glioblastoma: preliminary preclinical Cambridge, UK, 3Instituto de Parasitología y Biomedicina “López- studies with apigenin based inhibition Neyra”, IPBLN-CSIC, Armilla, ES Laura Ferrer-Font1, Estefania Alcaraz1, Maria Plana1, Ana Paula En esta comunicación presentamos la caracterización inicial de la Candiota2, Emilio Itarte1, Carles Arús1 proteína de unión RNA RBP33 de Trypanosoma brucei. RBP33 es 1Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Universitat una proteína nuclear y esencial para la viabilidad del parásito. Hemos Autònoma de Barcelona, Cerdanyola del Vallès, ES, 2Centro de identifi cado el conjunto de los RNA asociados a RBP33 mediante Investigación Biomédica en Red en Bioingeniería, Biomateriales y inmunoprecipitación de los complejos RNA-proteína y posterior Nanomedicina (CIBER-BBN), Cerdanyola del Vallès, ES secuenciación masiva (RNAseq). La mayoría de los transcritos unidos Glioblastoma (GBM) is the most aggressive human glial tumour, with a RBP33 están descritos como no codifi cantes, siendo un tercio de éstos a median survival of 14-15 months. Temozolamide (TMZ) is a standard producidos por genes localizados al fi nal de las unidades de transcripción chemotherapeutic for GBM treatment. Cancer stem cells (CSC) mediate policistrónicas o localizados en orientación antisentido dentro de una chemoresistence, indicating their persistence in these tumours after treatment. Protein kinase CK2 contributes to tumour development, unidad transcripcional. La depleción mediante RNAi de RBP33 conduce proliferation, and suppression of apoptosis in cancer, and it is overexpressed a un aumento en los niveles de RNA provenientes de regiones que in human GBM. Targeting CK2 in GBM treatment could benefi t patients. están normalmente silenciadas, tales como zonas de cambio de hebra, We have studied the CK2 expression level, using Western Blot analysis, retrotransposones o secuencias repetidas, siendo este fenómeno más normalized to constitutive tubuline content in preclinical GBM. Orthotopic acusado en la forma sanguínea del parásito. Este trabajo supone el primer GBM growing in C57Bl/6 mice (n=3) were generated by injecting 105 ejemplo de una proteína de unión a RNA implicada en la regulación del GL621 cells. Tumour volumes were assessed by T2W MRI during 15 silenciamiento génico en tripanosomas. days and mice sacrifi ced (fi nal volume 77.3+10.9mm3). Both contralateral

133 Pósters XXXVII Congreso SEBBM non-affected brain parenchyma and wild type mice brains (n=3) were Cortical neurons in primary culture were stimulated with glutamate (100 μM) investigated. We also evaluated the effect of TMZ and apigenin (API), and mitochondrial function and generation of radical oxygen species were a CK2 inhibitor, in cultured GL261 cells. For this, incubation of GL261 measured by ﬂ ow cytometry. Here we described that glutamate promoted cells in 6-well plates with 20, 40 and 100μM drug was performed and cell oxidative stress and mitochondrial membrane potential depolarization by viability was assessed by the Trypan Blue method. The expression level a mechanism involving cyclin B1 accumulation. Moreover, expression of CK2 catalytic subunit (CK2α) was found higher in tumour (4-fold) of either cyclin B1 or hEmi1, a well-known APC/C inhibitor, induced and in contralateral brain parenchyma (2-fold) than in wild type tissue oxidative stress, mitochondrial dysfunction and neurodegeneration. (p <0.05). In contrast, no signiﬁ cant changes were detected in CK2 Our results suggest that NMDAR stimulation increased Cdk5 kinase regulatory subunit (CK2β) expression, suggesting a predominance of free activity leading to Cdh1 phosphorylation, APC/C inactivation and cyclin CK2α in tumours. In in vitro experiments, API decreased cell viability B1 stabilization. As a consecuence, cyclin B1 promoted oxidative stress, with respect to control as compared to TMZ (28.8+5% and 64.3+1,5%, mitochondrial dysfunction and neuronal apoptotic death. These results respectively) at equal drug concentration (100μM). Our data suggest reveal Cdh1 as a novel Cdk5 substrate that mediates cyclin B1 neuronal that CK2 targeted inhibitors could offer an alternative treatment for accumulation in excitotoxicity. chemoresistance to TMZ in preclinical GBM studies. Funded by ISCIII (PS09/0366, RD06/0026/1008) MICINN (SAF2010- Supported by: SAF 2011-23870, SGR191-2014. 20008), and Junta de Castilla y León.

P15-3 (R15-4) P15r-5 Activación por hipoxia del nicho neurogénico NMDA receptor activity in astrocytes sustains del cuerpo carotídeo neuronal survival through a p35/Cdk5-Nrf2 Aida Platero-Luengo1, Susana González-Granero2, Blanca Díaz- pathway Castro1, José Ignacio Piruat1, José Manuel García-Verdugo2, Ricardo Daniel Jimenez Blasco1, Patricia Santofi mia-Castaño2, Antonio Pardal1, José López-Barneo1 Gonzalez2, Angeles Almeida1, Juan P. Bolaños1 1Instituto de Biomedicina de Sevilla, Universidad de Sevilla, 1Institute of Functional Biology and Genomics (IBFG), University Sevilla, ES, 2Instituto Cavanilles de Biodiversidad y Biología of Salamanca-CSIC, Salamanca, ES, 2Department of Physiology, Evolutiva, Universidad de Valencia, Valencia, ES Faculty of Veterinary, University of Extremadura, Caceres, ES El mecanismo por el cual los estímulos ambientales y la demanda Glutamatergic neurotransmission unavoidably enhances reactive oxygen fi siológica son capaces de modular los nichos neurogénicos en los organismos adultos es una cuestión clave para entender la función de los species (ROS) that in excess can trigger oxidative damage eventually leading procesos de formación de nuevas neuronas en la etapa postembrionaria. to neurodegeneration. Neurons are equipped with discrete antioxidant Nuestros estudios con células madre neurales del cuerpo carotideo, un defense that is insuffi cient to fully provide self-protection under certain órgano quimiosensor responsable de la respuesta ventilatoria arterial, han stressing conditions. Their neighbor astrocytes complement the antioxidant revelado cómo el estímulo hipóxico es capaz de activar la proliferación del defense and survival of neurons by releasing glutathione precursors, nicho neurogénico del cuerpo carotídeo a través del establecimiento de una which neurons take up for de novo glutathione biosynthesis. However, the estructura tipo sinapsis entre la célula glómica neuronal madura y la célula molecular mechanism by which neurons communicate astrocytes the need progenitora de donde proviene. De este modo, se establecen mecanismos for glutathione precursors to support survival during neurotransmission de control donde los elementos maduros pueden infl uir sobre los elementos is unknown. Here, we show that N-methyl-D-aspartate (NMDA), a indiferenciados para conseguir un equilibrio en el desarrollo de la función glutamate-receptor subtype agonist, at a dose sustaining neurotransmission del órgano. El modelo establecido para el cuerpo carotídeo demuestra activates NMDA receptors in astrocytes triggering a signaling cascade cómo los distintos elementos de un nicho neurogénico se coordinan para involving protein kinase Cd-dependent p35/cyclin-dependent kinase-5 permitir al tejido adaptarse a situaciones fi siológicas cambiantes. (Cdk5) activation. Active p35/Cdk5 poly-phosphorylates nuclear factor- erythroid 2-related factor 2 (Nrf2), which translocate to the nucleus to promote the expression of antioxidant genes. Furthermore, by releasing P15-4 (R15-3) glutathione precursors, NMDA receptor-mediated Nrf2 activation in Cyclin B1: mediator of mitochondrial dysfunction astrocytes sustains the antioxidant defense and survival of closely spaced in excitotoxicity neurons. Thus, during neurotransmission, glutamate-receptor activation in astrocytes decisively contributes to boost the antioxidant defense and Carolina Maestre1, Miguel Veas-Pérez de Tudela2, Juan P. Bolaños2, survival of neurons. Ángeles Almeida2 1Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas, Madrid, ES, 2Instituto de Investigación Biomédica de Salamanca, Hospital P15-6 (R15-2) Universitario de Salamanca - Instituto de Biología Funcional y Micro RNAs involved in redox responses: Genómica, Universidad de Salamanca-CSIC, Salamanca, ES some examples related to organ fibrosis Anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C), an E3 ubiquitin ligase Santiago Lamas Peláez that destabilizes cell cycle proteins, is activated by Cdh1 in post-mitotic Consejo Superior de Investigaciones Cientifi cas - Centro de Biologia neurons, where it regulates axonal growth, synaptic plasticity and survival. The APC/C-Cdh1 substrate, cyclin B1, has been found to accumulate in Molecular Severo Ochoa, Madrid, ES degenerating brain areas in Alzheimer´s disease and stroke. Recently, we Recent evidences point to the existence of a set of microRNAs that have reported that stimulation of N-methyl-D-aspartate receptors (NMDAR) participate actively in redox homeostasis and hormesis, and the term that occurs in neurodegenerative diseases promoted the phosphorylation of “redoximirs” has been coined to defi ne them. Reciprocally, proteins Cdh1 by the Cdk5/p25 complex, a condition necessary and suffi cient for its involved in the basic machinery of microRNA processing can be translocation to the cytosol and APC/C-Cdh1 inactivation. This led to the infl uenced by the cellular redox state. MicroRNAs may regulate central stabilization of cyclin B1 in cortical neurons and cell death. These results pathways of the antioxidant response such as that of Nrf2 or directly highlight the importance of elucidating the role of cyclin B1 in neurons regulate the generation of reactive oxygen species by targeting mRNAs under excitotoxic conditions relevant to neurological disease. that code for proteins directly involved in this process such as NOXs

134 Granada 2014 Pósters or components of mitochondrial complexes. We have focused on two P15r-8 different potential targets: a) miRNAs regulating the levels of the Análisis de las micorredoxinas de most relevant endogenous antioxidant, glutathione (GSH) b) miRNAs Corynebacterium glutamicum y su papel targeting ROS generating proteins involved in fi brogenesis. We en el control del estrés oxidativo identifi ed mir-433 as a redoximir capable of targeting both the catalytic and modulatory subunits of Glutathione-cysteine ligase (GCL) and of Almudena F. Villadangos, Jose A. Gil, Luis M. Mateos reducing GSH levels. In addition we could demonstrate the participation Área de microbiología, departamento de biología molecular, of mir-433 in fi brotic processes by using models of fi brosis in the liver facultad de ciencias biológicas y ambientales, Universidad de León, (bile duct ligation) and kidney (unilateral ureteral obstruction). We have León, ES also identifi ed a novel microRNA that participates in the regulation of Las células sufren oxidaciones moleculares indeseables derivadas del propio fi brogenesis by targeting both NOX-4 and the TGF-b pathway in cellular metabolismo aerobio y de agentes exógenos tóxicos. Los mecanismos de and animal models of fi brosis as well as in patients with idiopathic respuesta celular combaten esas oxidaciones manteniendo un ambiente pulmonary fi brosis. We believe redoximirs constitute an important reductor en el citoplasma mediante el uso de sistemas de “buffer” Redox. potential pathway to understand the involvement of redox responses in Un sistema Redox exclusivo de actinomicetos, el cual depende de redoxinas pathophysiological processes leading to organ fi brosis. específi cas (micorredoxinas; Mrx) y de compuestos de bajo peso molecular (micotiol; MSH), conforma el par Redox Mrx/MSH. Representantes del grupo de actinomicetos están ampliamente distribuidos en la naturaleza y presentan gran interés desde el punto de vista industrial P15-7 Influencia del estrés oxidativo en la vía (p.e. Streptomyces es el principal productor de antibióticos) y médico. Con respecto a este último aspecto, el par Mrx/MSH podría ejercer de activación de la proteína quinasa activada un papel relevante en los procesos de supervivencia de los miembros por AMP (AMPK) hepática en ratas tratadas de actinomicetos patógenos más representativos (Mycobacterium con hormona tiroidea (T ) tuberculosis, Rhodococcus equi o Corynebacterium diphtheriae) frente al 3 desafío con agentes oxidantes del hospedador. Pamela Cornejo Zamorano1, Romina Vargas Villagran2, Virginia El conocimiento detallado de las micorredoxinas a nivel molecular Fernández Arancibia2, Luis A. Videla Cabrera2 y funcional en representantes de actinomicetos facilitaría la tarea 1Universidad Diego Portales, Facultad de Salud y Odontología, indicada. Nuestro grupo de trabajo ha identifi cado varias micorredoxinas en Corynebacterium glutamicum, M. tuberculosis y R. equi, siendo Escuela de Tecnología Médica, Ñuñoa, CL, 2Universidad de denominadas Mrx1 y Mrx3. Las micorredoxinas son proteinas pequeñas Chile, Facultad de Medicina, ICBM, Programa de Farmacología, con un centro activo conservado “CxxC” y próximo al extremo N-terminal; Independencia, Santiago, CL estas Mrx son específi cas de MSH y no se acoplan con otros compuestos

La administración de T3 conduce a estrés oxidativo (EOx) hepático, de bajo peso molecular (glutation o bacilitiol) de otros sistemas Redox. En mediado por el efecto calorigénico de la hormona. AMPK es un C. glutamicum se han obtenido mutantes “knockout” simples y dobles para sensor del estado energético celular, regulada por alosterismo (AMP) los genes mrx1 y mrx3, siendo estos mutantes sometidos a análisis de estrés y por fosforilación reversible de la subunidad catalítica α por distintas oxidativoin vivo por presencia de metales pesados (cadmio, manganeso proteínas quinasas tales como TAK1, CaMKKβ y LKB1. El objetivo de o arsenico) o agentes qúimicos como peróxido de hidrógeno y diamida. este estudio es determinar el efecto del EOx en la expresión de AMPK Los resultados indican que Mrx1 y Mrx3 tienen un papel importante en el restablecimiento de la viabilidad celular después de ser somentidos a en hígado de rata por la administración de T3 y determinar su correlación con la expresión de TAK1 y CaMKKβ. Para esto los animales fueron estrés oxidativo. La proteina Mrx1 de C. glutamicum [1] y M. tuberculosis [1,2] ha sido recientemente caracterizada in vitro. Los ensayos in vitro pretratados 0,5 horas antes de la administración con T3 (0,1 mg/Kg de peso) con el antioxidante N-acetilcisteina (NAC) 0,5 g/Kg. Se midieron realizados con Mrx1 para determinar la cascada multienzimática mostraron que la enzima es reducida mediante MSH [1,2]. La proteína Mrx3 de C. los niveles de mRNA con qPCR, niveles proteicos mediante Western glutamicum presenta igualmente el motivo típico “CxxC” del centro activo, Blot y 8-isoprostanos hepáticos y plasmáticos como parámetro de EOx así como una cisteína adicional “atípica” (C ), aunque hasta el momento se con un kit comercial. La administración de T produjo un incremento 65 3 desconoce su cascada enzimática in vitro. estadísticamente signiﬁ cativo en los niveles de mRNA de AMPK en comparación con los controles (p<0,05), efecto suprimido parcialmente Bibliografía con el pretratamiento con NAC. Por otra parte, se observó aumento de [1] E. Ordóñez, K. Van Belle, G. Roos, S. De Galan, M. et al. J Biol Chem 6,4 veces y 291 veces en los niveles de mRNA de CaMKKβ y TAK1 2009; 284:15107-15116. respectivamente luego del tratamiento con la hormona en comparación [2] K. Van Laer, L. Buts, N. Foloppe, D. Vertommen, et al. Mol Microbiol. con los controles, efecto abolido por la administración de NAC. Se determinó el efecto sobre la relación TAK1 fosforilada/TAK1 no fosforilada, observándose un incremento estadísticamente signiﬁ cativo P15-9 después de tratamiento con T3 comparado con los valores controles DHA diet supplementation modulates the (190%), efecto parcialmente suprimido en los animales que fueron activation of neutrophils in post-exercise pretratados con NAC (p<0,05). Los niveles de CaMKKβ aumentaron conditions 65% en relación a los controles, efecto anulado con el pretratamiento con NAC. Los niveles de 8-isoprostanos plasmáticos y hepáticos de Miquel Martorell, Xavier Capó, Antoni Sureda, Joan Miquel Batle, Antoni Pons ratas tratadas con T3 aumentaron en relación a controles, efecto abolido Isabel Llompart, Josep A Tur, en los animales pretratados con NAC. Se concluye que el incremento Research Group on Community Nutrition and Oxidative Stress, IUNICS, University of the Balearic Islands - CIBER: CB12/03/30038 en la expresión de AMPK hepática inducida por T3 está mediado por un mecanismo redox al cual podría contribuir el aumento en la expresión y/o Fisiopatología de la Obesidad y la Nutrición, CIBERobn, Instituto de activación de TAK1 y CaMKKβ. Salud Carlos III-ISCIII, Palma de Mallorca, ES Background and objectives: Docosahexaenoic acid (DHA, C22:6n3) Financiado por FONDECYT 1120034. increases phagocytic and fungical activity of neutrophils. We aimed to

135 Pósters XXXVII Congreso SEBBM study the effects of training and DHA diet supplementation on the reactive compared to their Wt counterparts. This could be driven by the presence oxygen and nitrogen species production by neutrophil in football players. of dysfunctional mitochondria in NQO1KO cells, which causes outer Methods: Subjects were randomly included into two groups: placebo and mitochondrial membrane permeabilization and the release of apoptotic factors experimental groups. The placebo group took one liter fi ve times a week that trigger the apoptosis process. Deregulation of mitogenic pathways could of a placebo drink and the experimental group consumed the experimental surpass this increase of apoptotic signaling resulting in the overall stimulation drink enriched with DHA. Blood samples, used to purify neutrophils and of growth rate and extended long-term survival of MEFs lacking NQO1. serum, were collected at the beginning in basal conditions and after 8 weeks of training and diet intervention in basal and in post-exercise conditions. ROS production by neutrophils after the activation with zymosan and with P15-11 phorbol myristate acetate (PMA) were determined by chemiluminescence Hyperbaric oxygen therapy in the management techniques. Nitrate levels were determined both in serum and in neutrophil of chronic wound induces an antioxidant response using a nitric oxide analyzer (NOA) 280i (Sievers). Results: Neutrophils counts were not infl uenced by the training season or and modulates plasma VEGF and endothelin-1 the DHA diet supplementation, but the acute exercise realized at 8 weeks Antoni Sureda1, Juan M. Batle1, Xavier Capó1, Miquel Martorell1, signifi cantly increased neutrophil counts. No effects were observed in the Silvia Tejada2, Josep A. Tur1, Antoni Pons1 chemiluminescence produced by neutrophils after their activation with 1Research Group on Community Nutrition and Oxidative Stress, zymosan or PMA in the basal condition, however, the exercise signifi cantly IUNICS, University of the Balearic Islands, Palma de Mallorca, increased neutrophil ROS production in response to immune stimulus Spain and CIBER: CB12/03/30038 Fisiopatología de la Obesidad without effects of DHA diet supplementation. Moreover, the exercise y la Nutrición, Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), Palma de signifi cantly decreased the time at which the maximal ROS production was Mallorca, ES, 2Experimental Laboratory, Research Unit, Son Llàtzer attained, and this decrease was higher in the experimental group. Exercise Hospital, IUNICS and University of the Balearic Islands , Palma de signifi cantly decreased nitrate levels in neutrophil but their increased in Mallorca, ES serum, in both placebo and experimental groups, but this effect was higher in the experimental group. Hyperbaric oxygen (HBO) treatment is the medical use of oxygen at higher Conclusion: The consumption of an enriched DHA beverage for eight than 1 atmosphere of pressure. The aim of the study was to evaluate the weeks accelerates the postexercise neutrophil production of ROS after effects of HBO clinical treatment on the antioxidant response and the levels stimulation with zymosan and increases the neutrophil secretion of nitrate of vascular endothelial growth factor (VEGF) and endothelin-1 in patients in post-exercise conditions. with chronic wounds. Ten patients with a chronic wounded situation (diabetic Keywords: Docosahexaenoic acid; DHA; neutrophil; exercise; zymosan; wounds, osteomyelitis, enteritis radica and osteoarthritis) were volunteered PMA; nitrate. to participate in the study. The average time wounds without healing before starting the HBO treatment were 20.5 ± 10.1 months. The patients performed Acknowledgments: Programme of Promotion of Biomedical Research 20 HBO sessions and blood samples were taken before and 2 hours after and Health Sciences, Projects 11/01791, Red Predimed-RETIC the sessions 1, 5 and 20. No signifi cant differences were reported in the RD06/0045/1004, and CIBERobn CB12/03/30038. hematological parameters. Serum CK activity was progressively decreasing with the sessions performed. No signifi cant differences were reported in any enzymatic activity of erythrocytes after HBO treatments. Plasma catalase P15r-10 (R15-5) activity responded to the HBO therapy with a signifi cant increase after the The effects of NQO1 deletion in Nrf2/Akt fi rst and fi fth sessions. Plasma MPO activity was signifi cantly reduced after pathways and growth deregulation of mouse all analysed sessions. VEGF levels signifi cantly increased after the sessions respect to the pre-session values. Endothelin-1 levels were progressively embryonic fibroblasts decreasing during the HBO therapy, with signifi cant differences at the Julia Ariza Gómez1, Laura Jódar Montilla1, Evi Mercken2, Michel session 20. No signifi cant differences were evidenced in plasma nitrite Bernier2, Rafael de Cabo Moreno2, José Manuel Villalba Montoro1 levels. The levels of MDA adducts in plasma were signifi cantly lower 1Department of Cell Biology, Physiology and Immunology, University at the last analysed session. In conclusion, HBO therapy increases the of Córdoba, Campus de Excelencia Internacional Agroalimentario, plasma antioxidant defenses and regulates angiogenesis and vascular tone CeiA3, Córdoba, ES, 2Experimental Gerontology Section, by increasing VEGF and decreasing endothelin-1, which may be important Translational Gerontology Branch, National Institute on Aging, factors in promoting enhanced wound healing. National Institutes of Health, Baltimore, US Keywords: Antioxidants, Chronic wound, Hyperbaric chamber, Oxidative damage, VEGF. NAD(P)H-quinone oxidoreductase 1 (NQO1) is a 31kDa ubiquitously expressed fl avoenzyme that plays an important role in antioxidant defense, Acknowledgments: Programme of Promotion of Biomedical Research and being one of the best characterized detoxifying enzymes whose expression is Health Sciences, Projects 11/01791, Red Predimed-RETIC RD06/0045/1004, regulated by Nrf2. NQO1 catalyzes the reduction of several quinone substrates and CIBERobn CB12/03/30038. using both NADH and NADPH. Besides its role as antioxidant, NQO1 has been involved in the regulation of cell growth and development. Although cells from many solid tumors contain increased levels of NQO1, low levels of NQO1 are also associated with tumor development and carcinogenesis. Our P15-12 results show that the lack of NQO1 results in higher proliferation rates and Assessment of environmental pollution applying extended lifespan of immortalized MEFs, which is consistent with a role for oxidative stress biomarkers in the mussel Mytilus decreased NQO1 expression in tumor development. We have also observed galloprovincialis increased nuclear translocation of Nrf2 in NQO1KO MEFs, as well as in liver of NQO1KO mice when compared to their Wt counterparts. An enhancement Silvia Tejada1, Antoni Sureda2, Ainhoa Zuazu3, Miguela Méndez2, of Nrf2-mediated antioxidant response might constitute a hormetic response Antonino Natalotto4, Salvatore Fasulo4, Salud Deudero3 to the lack of NQO1 which, together with the activation of the Akt pathway 1University of the Balearic Islands / Experimental Laboratory, Research and higher levels of the glucose transporter GLUT1, could result in increased Unit, Son Llàtzer Hospital, IUNICS, Palma de Mallorca, ES, 2Research growth and lifespan of NQO1KO cells. In fact, teratomas are generated when Group on Community Nutrition and Oxidative Stress, IUNICS, NQO1KO cells are subcutaneously injected into immunodefi cient mice. University of the Balearic Islands, Palma de Mallorca, Spain and However, NQO1KO MEFs also exhibited higher levels of apoptosis when CIBER: CB12/03/30038 Fisiopatología de la Obesidad y la Nutrición,

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Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), Palma de Mallorca, ES, 3Spanish have used a Drosophila line carrying loss of function mutations in DJ-1ß Institute of Oceanography, Palma de Mallorca, BI, ES, 4Dep. of Animal (ortholog of DJ-1). Biology and Marine Ecology, University of Messina, IT The individuals of both disease models show a decrease of their motor In polluted environments, and especially in coastal waters, living organisms performance. Using this phenotype, we started a screening of molecules are most often exposed to complex mixtures of chemical contaminants. that could recover the motor ability of these fl ies. So far, we have Mussels are desirable as bioindicators since they are likely to refl ect identifi ed some possible candidates that belong to different functional changes in the environment pollution status. Transplanting mussels from a categories. Among these compounds, there are antioxidants, chelators reference site to different locations allows biomonitoring the alterations due of different metals and metabolism modulators. Interestingly, some of to environmental pollutants. The aim of the present study was to analyse the the compounds are able to improve motor performance in fl ies of both biochemical response of the mussels (Mytilus galloprovincialis) exposed to disease models, while others seem to have a specifi c effect over either petrol refi nery. Mussels purchased from a mussel farm in Messina (Italy) FRDA fl ies or PD fl ies. were transplanted for two months in a control clean site (Brucoli) and a polluted site (Priolo refi nery). A third group was maintained in the same conditions in the farm for two months. Gills from each specimen (n=8 for P15-14 each station) were dissected and used for biochemical analysis. Mussels La genisteína afecta a la eficacia de los from the three studied areas presented the same length and width. Mussels tratamientos contra el cáncer de mama from the polluted site presented higher levels of malondialdehyde respect modulando la producción de especies radicales to the clean site. The activities of catalase and glutathione-S transferase (GST) were signifi cantly higher in the polluted site, whereas the activity de oxígeno of acetylcholinesterase was signifi cantly lower respect non-polluted sites. Daniel Gabriel Pons Miro, Daniel Palou Gramón, Adamo Valle A signifi cant increase in the gene expression of metallothionein (MT)-10, Gómez, Jordi Oliver Oliver, Pilar Roca MT-20 and cytochrome P450 were reported in the polluted site respect Grupo Multidisciplinar de Oncología Traslacional. IUNICS. Universitat to the other areas, whereas the increase in catalase and GST was not de les Illes Balears - Ciber Fisiopatología Obesidad y Nutrición statistically signifi cant. In conclusion, pollutants induce oxidative stress (CB06/03) Instituto Salud Carlos III, Palma de Mallorca, ES and increase the antioxidant and detoxifying system in mussels. The use of biomarkers in gills of the mussel M. galloprovincialis is a good tool to Algunos tratamientos del cáncer de mama tienen como efecto la generación categorize differences between polluted and non-polluted areas. de especies radicales de oxígeno (ROS), lo que favorece la muerte celular. Keywords: Antioxidants, Biomarkers, Oxidative damage, Pollution. La genisteína (GEN), un fi toestrógeno presente en la soja, podría modular la producción de ROS gracias a su interacción con los dos tipos de receptores Acknowledgments: National Parks Program 024/2010 and CIBERobn estrogénicos (ER), ERα y ERβ, siendo más afín por ERβ. CB12/03/30038. Nuestro objetivo fue determinar los efectos de la GEN sobre la efi cacia del cisplatino (CDDP), el paclitaxel (PTX) y el tamoxifeno (TAM) en líneas celulares de cáncer de mama con diferente ratio ER α/ERβ. Se estudiaron las líneas MCF-7 (elevada ratio ERα/ERβ) y T47D (baja ratio ERα/ERβ) tratadas con 1μM GEN, 10μM CDDP, 10nM PTX y 10μM TAM, así como P15-13 Drug screening in Drosophila models of FRDA la combinación de los citotóxicos con la GEN, durante 48h. Se determinó la viabilidad celular (Cristal Violeta), la producción de ROS (Amplex Red) and PD y la autofagia (monodansilcadaverina, indicador de apoptosis). Pablo Calap Quintana1, Francisco José Sanz López1, Lucía Benito En MCF-7 la GEN promovió una mayor viabilidad celular y una Jardón1, Verónica Muñoz Soriano2, Sandra López Domènech2, María disminución de la autofagia provocada por los tratamientos excepto con Dolores Moltó Ruiz3, Nuria Paricio Ortiz2, María José Martínez CDDP, sin cambios signifi cativos en la producción de ROS. En T47D la Sebastián1 GEN provocó una disminución en la producción de ROS en los tratamientos 1Departamento de Genética, Universidad de Valencia, Burjassot, de CDDP y TAM con la GEN respecto a los tratamientos solos, sin cambios ES, 2Departamento de Genética, Universidad de Valencia - ERI signifi cativos en la viabilidad celular ni en la autofagia. de Biotecnología y Biomedicina, Burjassot, ES,3Departamento Los resultados parecen indicar que el tratamiento con GEN en células con de Genética, Universidad de Valencia - Red de Salud Mental, una ratio ERα/ERβ alta podría favorecer la proliferación celular e inhibir CIBERSAM - Fundación Investigación Clínico de Valencia, INCLIVA, la apoptosis debido a su actividad estrogénica. En cambio, en células con Burjassot, ES una ratio ERα/ERβ baja la presencia de GEN favorecería una reducción de la producción de ROS, pudiendo disminuir la efi cacia de los tratamientos Friedreich ataxia (FRDA) is the most common inherited ataxia in anticancerígenos. the western population and is caused by a reduction in the level of the mitochondrial protein frataxin. Parkinson’s disease (PD) is the second Financiación: CAIB-FSE, ISCIII (PI12/01827) y FEDER-Unión Europea most common neurodegenerative disease in the world and is caused “Una manera de hacer Europa”. by the selective loss of dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta and the decrease of the striatal dopamine levels. In both neurodegenerative diseases oxidative stress and mitochondrial alterations P15-15 seem to have an important role in the pathogenesis of both diseases. Efecto del silenciamiento o inhibición de la Many groups are trying to identify possible therapeutic molecules that may alleviate the symptoms of both disorders. For FRDA, the drug candidates UCP2 sobre el estrés oxidativo en la línea de under more intense study are antioxidants, iron chelators and compounds cáncer de mama MCF-7 that increase the synthesis of frataxin. Current therapy for PD, based on a Mercedes Nadal-Serrano, Daniel G. Pons, Adamo Valle, Pilar Roca, dopamine replacement strategy, provides effective control in the fi rst stages Jordi Oliver Oliver of the disease, but fails in retard, stop or reverse the neurodegeneration. We have developed a model of FRDA in D. melanogaster that employs an Grupo Multidisciplinar de Oncología Traslacional. IUNICS. Universitat iRNA expressed in the whole organism by means of the GAL4-UAS system de les Illes Balears - Ciber Fisiopatología Obesidad y Nutrición with the purpose of reducing the expression of the Drosophila fh gene (CB06/03) Instituto Salud Carlos III, Palma de Mallorca, ES (which codifi es Drosophila frataxin). Mutations in DJ-1 are associated to El estrés oxidativo juega un papel dual en el desarrollo del cáncer; por autosomal recessive forms of PD. As a D. melanogaster model of PD, we una parte una elevada producción de radicales libres de oxígeno (ROS)

137 Pósters XXXVII Congreso SEBBM promueve la muerte celular, pero a niveles menores los ROS pueden P15r-17 actuar como segundos mensajeros promoviendo la proliferación celular. Effects of exogenous lipid source on mitochondrial La mitocondria es la principal fuente de producción de ROS en la célula, physiology and mTOR pathway in an in vitro model por lo que la UCP2 juega un papel importante en el control del estrés Elena Gutiérrez Casado1 1 oxidativo, desacoplando la cadena respiratoria y evitando de esta manera , Lucía Fernandez del Río , José Antonio González Reyes1, María Isabel Burón Romero1, Chary López la producción de ROS. Pedrera2, José Manuel Villalba Montoro1 El objetivo que nos propusimos fue determinar el efecto del silenciamiento 1Departamento de Biología Celular, Fisiología e Inmunología, con siRNA o la inhibición con genipin de la UCP2 sobre la proliferación y Universidad de Córdoba, Campus de Excelencia Internacional el estrés oxidativo en la línea de cáncer de mama MCF-7. Concretamente Agroalimentario, ceiA3, Córdoba, ES, 2Instituto Maimónides de se ha determinado la proliferación (cristal violeta), la producción de ROS Investigación Biomédica de Córdoba (IMIBIC), Universidad de (Amplex Red) y el daño oxidativo en lípidos y proteínas (4-HNE y grupos Córdoba, Córdoba, ES carbonilo, respectivamente). Over the last few decades many scientifi c research groups have focused Mediante siRNA se consiguió una importante disminución de los their interest on the knowledge of those processes that are involved niveles de ARN mensajero de la UCP2, que se acompañó de una caída in aging, as well as on their possible manipulation in order to stop or de los niveles de proteína. El silenciamiento y la inhibición de la UCP2 retard it. Nowadays, the unsaturation degree of membrane phospholipids provocaron una disminución de la viabilidad de las células cancerosas, en (Membrane Theory of Aging) (Hulbert, 2003) and the endogenous el caso del genipin dependiente de la dosis. Además se observó un aumento generation of reactive oxygen species (ROS) (Mitochondrial/Free Radicals importante en la producción de ROS, que se acompañó de un aumento de Theory of Aging) (Harman, 1956) are two of the most widely accepted los daños oxidativos, tanto en lípidos como proteínas. factors that affect aging. De los resultados obtenidos se puede desprender que la inhibición de Unsaturation degree of cellular membranes is inversely proportional to la UCP2 podría utilizarse como una nueva estrategia en el tratamiento longevity, although unsaturated fatty acids are also crucial to maintain the coadyuvante del cáncer. fl uidity of the lipid membranes. Fatty acid content of the diet can modify the composition of membrane phospholipids (Ochoa-Herrera et al., 2001), and can also affect the function of the electron transport chain (ETC) located Financiación: CAIB-FSE, ISCIII (PI12/01827) y FEDER-Unión Europea in the inner mitochondrial membrane (Aoun et al., 2012). The ETC is not “Una manera de hacer Europa”. only the most important cellular energetic machinery for ATP generation, but also one of the main sources of ROS in cells. ROS can interact with lipids and proteins altering the permeability of cellular membranes and the P15r-16 (R15-6) functional conformation of proteins. Calorie restriction abolishes age-related changes The Ser/Thr-kinase mTOR is a crucial kinase in sensing the availability of of coenzyme Q levels in liver and skeletal muscle nutrients and growth factors in cells, and promoting the activation/inhibition of different molecules involved in processes such as autophagy. Optimal from mice fed a polyunsaturated fatty acids- nutrient sensing through the mTOR pathway is impaired with aging. On enriched diet the other hand, inhibition of mTOR pathway by dietary manipulations as calorie restriction increases lifespan (López-Otín et al., 2013). Lucía Fernández del Río1 2 2 , Guillermo López-Lluch , Plácido Navas , The aim of our work was to determine how the mitochondrial physiology, Jon J. Ramsey3, María Isabel Burón1, José Manuel Villalba1 cellular oxidative damage, and the mTOR signaling pathway could be 1Departamento de Biología Celular, Fisiología e Inmunología, modifi ed by the supplementation with exogenous lipids using an in Universidad de Córdoba, Campus de Excelencia Internacional vitro model. A mouse hepatocarcinoma cell line (Hepa 1.6) was grown Agroalimentario, ceiA3, Córdoba, ES, 2Centro Andaluz de Biologia in culture medium containing either low (1g/l) or high glucose (4,5g/l), del Desarrollo, Universidad Pablo de Olavide-CSIC, CIBERER, and supplemented or not with two different lipid emulsions (at 7μg/ml): Instituto de Salud Carlos III, Sevilla, ES, 3VM Molecular Lipofundin, based on ω-6 fatty acids (thus mimicking a diet enriched Biosciences. UCDavis, Davis (California), US in soybean oil) or Lipoplus which also contains ω-3 fatty acids (thus mimicking a diet containing fi sh oil). After 48 hours of treatment with the Coenzyme Q (Q) is a lipid-soluble electron carrier and a powerful corresponding emulsion, different parameters related with mitochondrial antioxidant. Dietary n-6 polyunsaturated fatty acids (n-6 PUFA) increase function (including mitochondrial potential and activities of ETC hepatic Q levels with aging. To investigate if these effects were altered complexes) and oxidative stress (including superoxide and peroxide levels by calorie restriction (CR) we established two groups of mice fed lifelong and oxidative damage), as well as the activation state of components of diets containing soybean oil (high in n-6 PUFA) as the main fat source, the mTOR pathway were assessed. Our results indicate that exogenous fat, either ad libitum or under CR. We also studied two additional CR groups targets mitochondrial physiology, oxidative stress and mTOR pathway in a fed diets containing lard (high in saturated and n-9 monounsaturated manner that is dependent on fatty acid composition. fatty acids) or fi sh oil (high in n-3 PUFA). Liver and skeletal muscle samples were taken after 6 or 18 months of dietary intervention starting P15-18 (R15-1) at an age of 3 months. Hepatic Q9 and Q10 levels increased and Q9/Q10 Papel de p38alfa y del estrés oxidativo en el ratio decreased with age in the control but not in the CR group. When comparing the three CR diets it was found that Q9 and Q10 levels were control de la citoquinesis maximal in CR-fi sh, and Q9/Q10 ratio was the lowest in CR-soy and CR- Ana M. Tormos1, Raquel Taléns-Visconti2, María Jorques1, Salvador fi sh. In skeletal muscle, levels of coenzyme Q9 did not change either by Pérez-Garrido1, Ana Bonora-Centellés1, Ángel R Nebreda3, Juan Sastre1 CR or age but Q10 levels increased signifi cantly with age in the control 1Departamento de Fisiología, Facultad de Farmacia, Universidad although not in CR group. Q9 levels were higher in CR-soy compared de Valencia, Burjasot, ES, 2Departamento de Farmacia y Tecnología with CR-lard, whereas CR-fi sh displayed the lowest Q9/Q10 ratio. We Farmacéutica, Facultad de Farmacia, Universidad de Valencia, demonstrate that: i) CR abolishes age-induced changes of Q levels in Burjasot, ES, 3Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats liver and skeletal muscle from mice fed PUFA-enriched diets, and ii) (ICREA), Barcelona, ES liver and skeletal muscle tissues adapt to a PUFA-enriched CR diet by La citoquinesis es la última etapa de la mitosis e implica una reorganización increasing Q levels and decreasing Q9/Q10 ratio. del citoesqueleto de actina. Un fallo de la citoquinesis es uno de los

138 Granada 2014 Pósters principales mecanismos de formación de células poliploides en mamíferos, References que pueden resultar genéticamente inestables. Nuestros resultados indican [1] Cairns RA et al. Nat Rev Cancer 2011. que la citoquinesis está regulada por la MAP quinasa p38alfa sensible al [2] Luo J et al. Cell 2009. estado redox y puede verse afectada por el estrés oxidativo. La activación [3] Montero AJ et al. Drugs 2011. de MNK-1 es dependiente de p38alfa y MK2 y se requiere para la escisión [4] Dixon S et al. Natu Chem Bio 2014. del puente intercelular. Los ratones viejos con defi ciencia específi ca de p38alfa en hígado tienen disminuida la fosforilación de MNK-1. La vía de la pequeña GTPasa Rho – a través de fosfo-PRK-2, fosfocofi lina, P15-20 y p27- también está deteriorada en los ratones knock-out cuando son Presence of antioxidant enzymes and viejos. Asimismo, la ausencia de p38alfa condujo a una disminución de la peroxisomes in olive fruits (Olea europaea L.) fosforilación de HSP27, que se requiere para la polimerización de la actina. Por ello, se observa un grave deterioro de los fi lamentos de F-actina en el Eduardo López-Huertas, Luis A del Río hígado de ratones viejos con defi ciencia de p38alfa. No obstante, no se Group of Antioxidants, Free Radicals and Nitric Oxide in produce estrés oxidativo en estos animales. En consecuencia, la defi ciencia Biotechnology, Food and Agriculture - Estación Experimental del de p38alfa a largo plazo afecta el ensamblaje de la actina, sin producir Zaidín, Consejo Superior de Investigaciones Científi cas (CSIC), estrés oxidativo, dando lugar a un fallo de la citoquinesis y binucleación Granada, ES de los hepatocitos con el envejecimiento. Por otro lado, el aislamiento de The occurrence in olive (Olea europaea L.) fruit tissue of peroxisomes and hepatocitos produce marcada depleción de glutatión, incremento en la different antioxidant enzymes is reported for the fi rst time. Ultrastructural generación de especies reactivas del oxígeno y activación de la entrada analysis showed that olive cells were characterized by the presence of large en ciclo celular con bloqueo de la citoquinesis y binucleación. La adición vacuoles and lipid drops. Plastids, mitochondria and peroxisomes were de N-acetil cisteína previno la depleción de glutatión y frenó la entrada placed near the cell wall, showing some type of association with it. Olive en el ciclo celular, evitando el fallo de la citoquinesis y la formación de fruit peroxisomes were purifi ed by sucrose density-gradient centrifugation, hepatocitos binucleados durante el aislamiento. En consecuencia, nuestros and catalase, glutathione reductase and ascorbate peroxidase were found in resultados muestran que los hepatocitos entran en fase S pero no completan peroxisomes. In olive fruit tissue the presence of a battery of antioxidant la division celular cuando existe defi ciencia de p38alfa o durante su enzymes was demonstrated, including catalase, four superoxide dismutase aislamiento, dando lugar en ambos casos a un fallo de la citoquinesis y (SOD) isozymes (mainly an Fe-SOD plus 2 Cu,Zn-SOD, and a Mn-SOD), binucleación. all the enzymes of the ascorbate-glutathione cycle, reduced and oxidized glutathione, ascorbate, and four NADPH-recycling dehydrogenases. The knowledge of the full composition of antioxidants (enzymatic and non- P15r-19 enzymatic) in olive fruits is crucial to be able to understand the processes N-based ligands with intracellular oxidative regulating the antioxidant composition of olive oil. activity as potential anti-tumor agents Supported by the ERDF-cofi nanced grant AGL2011-24428 from the Marta González-Bártulos1 1 1 1 , Olaf Cussó , Miquel Costas , Xavi Ribas , Ministry of Economy and Competitiveness, Spain. Anna Massaguer2 1Bioinorganic and Supramolecular Chemistry group (QBIS), Department of Chemistry, University of Girona, Girona, ES, P15-21 2Biochemistry and Molecular Biology Unit, Department of Biology, NADPH oxidasas como dianas terapéuticas University of Girona, Girona, ES en la leucemia mieloide crónica Tumor cells have persistently higher levels of Reactive Oxygen Species (ROS) than normal cells which is a consequence of their abnormal Beatriz Sánchez-Sánchez1, Sara Gutiérrez-Herrero2, Guillermo metabolism together with genetic alterations [1,2]. The constitutive López Ruano1, Rodrigo Prieto Bermejo1, Marta Romo-González1, oxidative stress of cancer cells provides a specifi c target for the design Marcial Llanillo1, Atanasio Pandiella2, Carmen Guerrero2, Jesús F. 3 3 3 Angel of novel redox-based anticancer therapies, as cancer cells are very San Miguel , Fermín Sánchez-Guijo , Consuelo del Cañizo , Hernandez Hernandez1 vulnerable to pro-oxidant agents such as transition metal based-complexes [3]. When accumulated inside the cells, metals such as iron, manganese 1Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de or copper, undergo cycling redox reactions that generate high levels of Salamanca - Instituto de Investigación Biomédica de Salamanca- ROS, generating additional ROS, which likely increase the oxidative stress IBSAL, Salamanca, ES, 2CIC-Centro de Investigación del Cáncer, above the cytotoxic threshold, leading to a cell death [4]. Therefore, we CSIC, Salamanca, ES, 3Instituto de Investigación Biomédica evaluated the antitumoral properties of fi ve polyamine Fe-Complexes de Salamanca-IBSAL, Hospital Universitario de Salamanca, and their corresponding uncomplexed ligands. Only the ligands displayed Salamanca, ES antiproliferative activity against breast adenocarcinoma MCF-7 and Las células cancerosas muestran una excesiva producción de especies pancreas adenocarcinoma CAPAN-1 cancer cell lines. The most active reactivas del oxígeno (ROS), lo que parece estar relacionado con el inicio y compounds were selected to further analyze their cytotoxicity against la progresión del cáncer. Las NADPH oxidasas son uno de los principales a broad panel of tumor and non-malignant cell lines and their ability to sistemas productores de ROS en la célula. La leucemia mieloide crónica inhibit the clonogenicity of cancer cells. In addition, the ability of the (LMC) está provocada por la expresión de la quinasa BCR-ABL, cuya compounds to generate ROS inside the cells and the infl uence of the actividad conduce a un aumento de la producción de ROS, en parte a través intracellular iron in their cytotoxicity was evaluated. Our results reveal that de NADPH oxidasas. La terapia de la LMC basada en el uso de inhibidores three ligands display an interesting anticancer activity, with higher IC50 de BCR-ABL es muy efectiva, sin embargo la existencia o aparición de values in non-malignant cells than in tumor cells and exhibit inhibitory resistencias a este tratamiento es aún un serio problema. effect on the clonogenicity of tumor cells. Moreover, the ligands are not En este estudio se evalúa la familia de las NADPH oxidasas como dianas hemolytic against human red blood cells. We determine that the ligands are terapéuticas en la LMC. Se ha analizado el efecto de diferentes inhibidores inducers of oxidative stress and that ROS induction is associated to their de NADPH oxidasas, ya sea solos o en combinación con inhibidores de strong capactity to bind intracellular iron and generate the highly oxidant BCR-ABL, en células de LMC y en dos modelos animales diferentes. Una iron coordination complexes inside the cells, inducing the cell death. These de las conclusiones a las que llega el estudio es que la inhibición de las results indicate that these ligands may be a potential pro-oxidant anticancer NADPH oxidasas deteriora drásticamente la proliferación y viabilidad de agents. las células de LMC e inhibe el crecimiento de tumores in vivo. Además, la

139 Pósters XXXVII Congreso SEBBM combinación de inhibidores de las NADPH oxidasas con inhibidores de apoptosis through the caspase-dependent pathway. In this work, in order BCR-ABL era altamente sinérgica. Los investigadores sugieren que esta to continue studying the potential antitumor activity of amitriptyline, we estrategia podría utilizarse no solo en LMC sino también en otros tipos de have analyzed the effects of amitriptyline on the expression of several tumores. antioxidants in human breast cancer cell lines, and in combination with the Por tanto, este estudio demuestra que las NADPH oxidasas son una chemotherapeutic camptothecin (CPT). interesante diana terapéutica para la LMC, que podría usarse como Materials and Method: MCF-10A (non-tumoral line cell) and MCF-7 alternativa al uso de inhibidores de BCR-ABL, o para potenciar el efecto and MDA-MB-231 cells (breast cancer cell lines with different hormonal de dichos inhibidores. Será interesante en el futuro profundizar en la characteristics) were treated 24h with Amit (20μM), 10μM CPT and a posibilidad de trasladar estos resultados a la práctica clínica. combination of both. Expression of several antioxidants (MnSOD, catalase, GSR, HO-1) was analyzed by RT-qPCR. Results: MCF-10A: Antioxidant expression was decreased in the different P15-22 treatment conditions, except for HO-1 that was signifi cantly increased. Role of the NADPH oxidase NOX4 in liver MCF-7: With Amit, an increase of GSR and a decrease of HO-1 were tumorigenesis observed. With the combination therapy, expression of the four antioxidants was decreased. Eva Crosas-Molist1, Esther Bertran1, Joan Fernando1, Isabel MDA-MB-231: With Amit, all antioxidants showed a decreased expression Fabregat2 except for HO-1, which was higher than in control. With the combination 1Bellvitge Biomedical Research Institute-IDIBELL, LHospitalet de therapy, similar results to MCF-7 were obtained, with the exception of the Llobregat, ES, 2Bellvitge Biomedical Research Institute-IDIBELL - expression of HO-1, which showed a signifi cant increase. Departament de Ciències Fisiològiques II, University of Barcelona, Conclusions: In general, Amit induces a reduction in the antioxidant Barcelona, ES system, especially dramatic for catalase in the combination therapy. However, HO-1 showed a signifi cant increase in the non-tumoral cells and NOX4 has been implicated in a variety of physiological processes, including in the combination therapy of MDA-MB-231 tumor cells. HO-1 could be cellular senescence, apoptosis, survival, migration, endoplasmatic reticulum an important antioxidant against oxidative stress in breast cells since two of stress and differentiation. We have previously described that in liver cells, the cell lines tested reacted increasing notably its expression after oxidative NOX4 upregulation is necessary for TGF-beta-induced suppressor effects, treatment. After inducing oxidative stress, cells increase the expression of in particular, for cell death (Carmona-Cuenca et al., J Hepatol. 49:965, some antioxidants, different ones depending on cell type. 2008). NOX4 is also required for TGF-beta-induced stellate cell activation during liver fi brosis (Sancho et al. PLoS One, 7(9):e45285, 2012) and pre-clinical assays have suggested NOX4 inhibitors as useful tools to P15-24 ameliorate this process (Jiang et al., Free Radic Biol Med., 53:289, 2012). Caracterización de la enzima ascorbato However, the potential consequences of sustained treatment of liver cells with NOX4 inhibitors are unknown yet. peroxidasa en extractos crudos de Dunaliella Here we show that stable knockdown of NOX4 expression in liver tumour salina cells increase their proliferative capacity. In vivo analysis in mice revealed Antonio León Vaz, Rocio Rengel Domínguez, Maria del Carmen that NOX4 expression is down regulated during diethyl-nitrosamine (DEN)- Javier Vigara Fernández induced hepatocarcinogenesis. Furthermore, xenograft experiments in athymic Romero Cruz, mice indicated that NOX4 silencing confers advantage to human hepatocellular Dpto. Química y Ciencia de los Materiales, Facultad de Ciencias carcinoma (HCC) cells to form earlier and bigger tumours in vivo. Furthermore, Experimentales, Universidad de Huelva, CEIMAR, Huelva, ES silencing NOX4 in HCC cells induces a decrease in cell-to-cell and cell-to- Las especies reactivas de oxígeno (ROS), tales como el peróxido de matrix adhesion and an increase in cell migration. NOX4 knockdown resulted hidrógeno, el radical superóxido, el radical hidroxilo y el oxígeno singlete, in decreased expression of E-cadherin and ZO-1, components of adherent and son continuamente producidas en plantas y microalgas en distintas rutas tight junctions respectively, lower adhesion capacity and a decrease in focal metabólicas y con distinta localización subcelular. La producción de estas adhesions. Moreover, a change in the integrin pattern in the plasma membrane especies se incrementa en situaciones de estrés ambiental, excediendo was observed when NOX4 was silenced. All together, these results point to la capacidad detoxifi cadora del organismo y causando daños oxidativos a role for NOX4 in maintaining epithelial structures, increasing cell-to-cell a proteínas, ADN, lípidos y otras macromoléculas. Para evitar estos and cell-to-matrix adhesions, and preventing cell migration. In summary, daños oxidativos los distintos organismos han desarrollado efi cientes NOX4 may play a relevant tumor suppressor role during early stages of liver sistemas enzimáticos. La ascorbato peroxidasa (APX; EC 1.1.1.11) es una tumorigenesis. In support of this idea, immunochemical analyses of NOX4 hemoproteína que juega un importante papel en la eliminación de H2O2 expression in human liver tumor cell lines and tissues revealed decreased (la forma más estable entre las distintas ROS) utilizando ascorbato como NOX4 protein levels in liver tumorigenesis. donador de electrones. En este trabajo se presenta la caracterización del ensayo de actividad de la enzima de la APX en extractos crudos de la microalga eucariótica halófi la Dunaliella salina. La actividad se muestra P15-23 dependiente de sus sustratos (ascorbato y agua oxigenada) y se estabiliza Amitriptyline, used alone or in combination con la presencia de EDTA en el medio de reacción, el ensayo también requiere un medio tamponado, siendo su pH óptimo 6,0, en tampón therapy, modifies expression of several MES 100 mM. Se ha determinado una temperatura óptima de 34 ºC y antioxidants in breast cancer cell lines una energía de activación de 13,31 kJ/mol para el ensayo de actividad. La APX de Dunaliella salina muestra una cinética de Michaelis-Menten Eduardo Díaz-Parrado, Jéssica Núñez-Vasco, Matilde Illanes, para el peróxido de hidrógeno, mostrando un valor de K de 47,52 μM Manuel m Ana Fernández-Rodríguez, Ana María Moreno-Fernández, y una V de 449,33 U/ml; presentando una cinética sigmoidal para el De Miguel máx ascorbato, con valores de S0,5 de 3,05 μM y un factor de Hill de n=1,06. Dpto. Citología e Histología Normal y Patológica, Facultad de La actividad APX de Dunaliella salina se inhibe drásticamente por azida Medicina, Universidad de Sevilla, Sevilla, ES y cinuro, inhibidores característicos de hemoproteínas, mostrándose una Introduction: Oxidative therapy is a promising anticancer strategy based inhibición parcial por Mn+2 y por DTT. Por otro lado, la carencia de fuente on the production of high levels of ROS and/or the depletion of antioxidants nitrogenada o la presencia de metales pesados (Cd+2) en el medio de cultivo of tumor cells. We have already demonstrated that Amitriptyline (Amit), a de Dunaliella salina, generó estrés oxidativo en la microalga, provocando tricyclic antidepressant, induces an increase of ROS production, leading to el aumento de los niveles de actividad de la ascorbato peroxidasa.

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P16. Regulación de la expresión génica the genome is not well understood. Here we report that in breast cancer cells the unliganded progesterone receptor binds genomic sites y dinámica del genoma and targets a repressive complex containing HP1g, LSD1, HDAC1/2, CoREST, JARID1B and the RNA SRA (Steroid Receptor Activator) to 20% of hormone-inducible genes, keeping these genes silenced prior to P16-1 (R16-4) hormone treatment. The complex is anchored via binding of HP1g to Temporal and spatial regulation of the Yen1 H3K9me3. SRA interacts with PR, HP1g and LSD1, and its depletion Holliday junction resolvase prevents genome compromises the loading of the repressive complex to target chromatin instability promoting aberrant gene de-repression. Upon hormonal treatment the HP1g-LSD1 complex is displaced from these constitutively poorly Miguel González Blanco1, Joao Matos2, Stephen C. West1 expressed genes as a result of rapid phosphorylation of histone H3 at 1Clare Hall Laboratories, London Research Institute, Cancer serine 10 mediated by MSK1, which is recruited to the target sites by Research UK, Potters Bar, UK, 2Institute of Biochemistry, the activated PR. On the other hand, the HP1g-LSD1 complex is also Department of Biology, ETH Zürich, Otto-Stern-Weg 3, Zürich, CH recruited to the hormone-repressed genes BCAS1 and KRT23 promoting The careful orchestration of cellular events such as DNA replication, a close chromatin conformation. These results highlight the importance repair, and segregation is essential for equal distribution of the duplicated of the HP1g-LSD1 complex as a key factor involved in hormonal gene genome into two daughter cells. To ensure that persistent recombination regulation of breast cancer cells. intermediates are resolved prior to cell division, the Yen1 Holliday junction resolvase is activated at anaphase. Here, we show that the master cell-cycle regulators, cyclin-dependent kinase (Cdk) and Cdc14 phosphatase, control P16-4 the actions of Yen1. During S phase, Cdk-mediated phosphorylation of La cromatina-quinasa VRK1 regula la histona Yen1 promotes its nuclear exclusion and inhibits catalytic activity by H2AX y la formación de los focos de reparación reducing the effi ciency of DNA binding. Later in the cell cycle, at anaphase, de ADN inducidos por radiación ionizante Cdc14 drives Yen1 dephosphorylation, leading to its nuclear relocalization and enzymatic activation. Using a constitutively activated form of Yen1, Marcella Salzano, Marta Sanz-García, Diana M. Monsalve, David S. we show that uncontrolled Yen1 activity is detrimental to the cell: spatial Moura, Pedro A. Lazo and temporal restriction of Yen1 protects against genotoxic stress and, by Instituto de Biología Molecular y Celular del Cáncer de Salamanca, avoiding competition with the noncrossover-promoting repair pathways, (CSIC). Instituto de Investigación Biomédica de Salamanca-IBSAL, prevents loss of heterozygosity. Hospital Universitario de Salamanca, Salamanca, ES El daño local al ADN altera la estructura de la cromatina y el detectar y el responder a esta alteración es probablemente el inicio de la Respuesta P16-2 (R16-3) al Daño del ADN (RDA). En este contexto, las cromatina quinasas son Protein neddylation controls the timing of DNA unos buenos candidatos por participar en la detección de la alteración end resection and DNA double strand break local de la cromatina por daño al ADN y en sus respuestas celulares. break repair VRK1 es una Ser-Thr quinasa nucleosomal identifi cada en el nuestro laboratorio como un nuevo sensor de la RDA. Está descrito que VRK1 Pablo Huertas1 1 2 , Sonia Jimeno , María Jesús Fernández Ávila , regula muchos procesos celulares como por ejemplo el ciclo celular, Cristina Cepeda García2, Daniel Gómez Cabello2, Andrés Cruz García1 condensación de la cromatina y protección de las células al daño génico 1CABIMER/Universidad de Sevilla, Sevilla, ES, 2CABIMER, Sevilla, ES por regulación positiva de p53. Nuestros resultados demuestran que su DNA double strand breaks are the most cytotoxic lesions that can occur depleción por “knock-down” causa una pérdida global de la acetilación on the DNA. They can be repaired by different mechanisms and optimal de las histonas independientemente de ATM. También hemos demostrado survival requires a tight control between them. Here we show that que VRK1 interacciona directamente con H2AX fosforilándola en protein deneddylation as a major controller of repair pathway choice. Ser139 inmediatamente tras el daño al ADN inducido por radiación Neddylation inhibition changes the normal repair profi le towards an ionizante. El efecto sobre la fosforilación de H2AX y la formación de los increase on homologous recombination. Indeed, after DNA damage fast focos es prevenido por el knock-out de VRK1 y rescatado por la quinasa and local RNF111-mediated neddylation acts as an inhibitor of BRCA1 activa, pero no con la inactiva, demostrando que es necesaria la actividad and CtIP-mediated DNA end resection, a key process in repair pathway de VRK1 para la respuesta al daño del ADN. Además, el pretratamiento choice. A secondary wave of deneddylation by the COP9-signalosome con los inhibidores de ATM demostró una cooperación de ATM y VRK1 allows resection to take place at later times. By controlling DNA resection, sobre la formación de los focos de reparación. Concluimos que VRK1 es protein neddylation not only affect the choice between NHEJ and un nuevo componente de la cromatina, que reacciona a sus alteraciones homologous recombination, but also controls the balance between different y que participa a la respuesta muy temprana al daño génico, funcionando recombination subpathways. Thus, protein neddylation act as a molecular ella sola o en colaboración de ATM. clock, controlling the timing of DNA end resection and repair events.

P16r-5 P16-3 (R16-2) Papel de SF3B en la reparación de los cortes Role of chromatin dynamics on hormone- de doble cadena en el DNA dependent gene regulation in breast cancer cells Mª Rosario Prados Carvajal1, Cristina Cepeda García1, Pablo Guillermo Pablo Vicent Martínez Huertas2 Centre de Regulació Genòmica (CRG), Barcelona, ES 1CABIMER, Sevilla, ES, 2CABIMER/Universidad de Sevilla, Sevilla, ES A close chromatin conformation prevents gene expression in eukaryotic De los muchos tipos de daños que puede sufrir el DNA, los cortes de cells. Genes activated by external cues have to overcome this repressive doble cadena (DSB) son de los más citotóxicos, ya que causan mutaciones, state by locally changing chromatin structure to a more open state. reordenamientos cromosómicos e inestabilidad genómica. Así, las células Although much is known about hormonal gene activation, how basal han desarrollado diferentes mecanismos para la detección, señalización y repression of regulated genes is targeted to the correct sites throughout reparación de estas roturas. La reparación de dicho daño puede realizarse

141 Pósters XXXVII Congreso SEBBM por recombinación homóloga (Homologous Recombination; HR) o P16m-7 por unión de extremos no homólogos (Non-Homologous End Joining; Identification of novel SND1 target genes NHEJ). La decisión entre ambos mecanismos de reparación depende de involved in glycerolipid metabolism in human la activación o no del proceso denominado resección de los extremos de hepatoma cells under inflammatory conditions DNA. Dicho mecanismo es, por tanto, un proceso muy regulado y crítico Enara Arretxe en la supervivencia de las células. , Sandra Armengol, Sarai Mula, Leire Enzunza, Una de las proteínas más importantes implicada en la resección del DNA es Yolanda Chico, Begoña Ochoa, María José Martínez la proteína CtIP, que controla si el proceso de resección ha de activarse o no. Universidad del País Vasco, Leioa, ES Esta decisión depende de la integración de múltiples señales celulares por SND1 (Staphylococcal nuclease and Tudor domain-containing 1) is a parte de CtIP, garantizando así que las DSB sean señalizadas y reparadas transcriptional corregulator involved in adipogenesis, stress response and de la mejor manera posible. Para ello, CtIP sufre múltiples modifi caciones cancer progression. Current evidence indicates that SND1 upregulation postraduccionales e interacciona con diversas proteínas. is a hallmark of several types of cancers. In particular in human Como parte de un estudio para entender como se regula la resección hepatocarcinoma, SND1 overexpression is correlated with malignancy and a crosstalk between SND1, miRNA221, NF-κB and infl ammation a nivel celular, hemos aislado nuevas proteínas que interaccionan signaling pathways may be envisaged. Work in our lab demonstrated físicamente con CtIP. Entre ellas, hemos encontrado diversas subunidades that SND1 gene activity in human hepatoblastoma cells is upregulated del complejo SF3B. Como la depleción de varios componentes de dicho by a transcriptional network involving NF-κB, Sp1 and NF-Y binding complejo disminuyen la efi ciencia de la recombinación homóloga, estamos in response to the infl ammatory cytokine TNFa. Very recently, we have estudiando su papel en resección con más detalles. Aquí, presentamos performed the fi rst genome-wide search for endogenous SND1 binding evidencias de que la depleción de distintas subunidades de SF3B reduce sites by Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)-chip assays on HepG2 la resección de cortes de doble cadena inducidos en el DNA de manera human hepatoma cells under basal and TNFα-induced infl ammatory artifi cial. Como se ha descrito que la subunidad SF3B2 del complejo es un conditions. Here we validated by ChIP-qPCR the binding of SND1 to the sustrato de ATM, la quinasa principal del checkpoint de daño en el DNA, promoter of four target genes, CHPT1, LPGAT1, LPIN1 and PTDSS1, estamos analizando el papel de esas fosoforilaciones en la función del involved in regulation of glycerophospholipid metabolism. When SND1 complejo SF3B en resección. protein was augmented in the nucleus by TNFα treatment, the transcript expression of CHPT1, LPGAT1 and LPIN1 was increased whereas that of PTDSS1 was decreased. These results were compatible with the increment in the cellular phosphatidylcholine content detected in the TNFα treated P16r-6 Regulación del método de reparación de roturas cells. SiRNA-mediated SND1 silencing abolished the TNFα-induced changes on the mRNA level of the target genes as well as the increment in de doble cadena en el DNA por HDAC1, HDAC2 cellular PC content. However, under non-infl ammatory conditions, SND1 y PARP3 silencing did not affect the expression of LPIN1 and PTDSS1 but reduced the expression of CHPT1 and LPGAT1. Our fi ndings indicate that SND1 Cintia Checa Rodríguez, Pablo Huertas Sánchez, Daniel Gómez binding is essential for the TNFα action on the expression of these SND1 Cabello target genes involved in regulating cellular phosphatidylcholine content. Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER), Sevilla, ES Supported by Gobierno Vasco (IT336/19, AE-2011-1-34, Saiotek calls) and UPV/EHU (UFI11/20). Los cortes de doble cadena (DSB) son el tipo de daño más citotóxico que puede sufrir el DNA, pudiendo causar mutaciones e inestabilidad genómica. Existen dos mecanismos para reparar estos cortes, la unión P16r-8 (R16-5) de extremos no homólogos (Non-Homologous End Joining; NHEJ) y la VRK1 y AurKB interaccionan en mitosis recombinación homóloga (Homologous Recombination; HR). No se conoce regulando la fosforilación específica de la histona bien el mecanismo por el que los DSB son reparados por una u otra vía. 3 y la correcta progresión del ciclo celular Sin embargo, se considera que el procesamiento de los extremos del corte, o resección, es un paso clave en esta decisión conduciendo a la reparación David da Silva Moura, Marta Vázquez-Cedeira, Pedro A. Lazo por HR e impidiendo la vía de NHEJ. La detección y señalización del daño Instituto de Biología Molecular y Celular del Cáncer, CSIC, (checkpoint) infl uye también en el método de reparación. Universidad de Salamanca; e Instituto de Investigación Biomédica El daño en el DNA conduce a una cascada de eventos coordinada, conocida de Salamanca (IBSAL), Hospital Universitario de Salamanca, como respuesta al daño en el DNA (DNA Damage Response, DDR) Salamanca, ES donde el reclutamiento de proteínas a la lesión está regulado en parte por El ciclo celular es un proceso altamente regulado en el que participan modifi caciones postraduccionales incluyendo la fosforilación y la poli diversas proteínas quinasa, como la Aurora B y la VRK1. Estas dos (ADP-ribosilación). Recientemente, se ha demostrado que la poli (ADP- quinasas controlan varios procesos para una correcta progresión del ciclo ribosa) polimerasa PARP3 es activada específi camente por los DSB in vitro celular, entre los cuales se destaca la condensación de la cromatina. Durante y se ha propuesto que pueda tener un papel en HR. la mitosis, las dos serina-treonina quinasas contribuyen signifi cativamente Por otra parte, la estructura de la cromatina infl uye en el reconocimiento, en la condensación de la cromatina en varios mecanismos, entre los que se destaca la fosforilación de las histonas, más precisamente de la histona señalización y reparación de daños en el DNA. Las modifi caciones de 3. VRK1 fosforila específi camente la treonina 3 (T3) de la histona 3 y la histonas pueden alterar sus propiedades e infl uir en la respuesta al daño. Aurora B fosforila específi camente la histona 3 en la serina 10 (S10). Se ha visto que las deacetilasas de histonas humanas HDAC1 e HDAC2 En este trabajo, hemos demostrado que VRK1 interacciona con Aurora B responden al daño del DNA y promueven la señalización y reparación de y que esta interacción se produce durante la mitosis, concretamente en las los DSB. Ambas proteínas parecen implicadas tanto en NHEJ como en HR. fases más tardías. Además, analizamos el efecto de la interacción VRK1- En este trabajo hemos analizado el efecto de la depleción de HDAC1, Aurora B en la capacidad de fosforilar a la histona 3. Así, confi rmamos HDAC2 y PARP3 sobre el balance entre NHEJ y HR. Para entender su que cantidades crecientes de Aurora B, afectaban a la fosforilación de la función, hemos estudiado su posible papel en el proceso de resección y histona 3, en el residuo T3, por VRK1 y que este efecto era independiente checkpoint. de la actividad quinasa de la Aurora B. De la misma manera, cantidades

142 Granada 2014 Pósters crecientes de VRK1, activa o inactiva, afectaban a la fosforilación de la se desconoce el papel que este tipo de modifi caciones pueda tener en la histona 3, en el residuo S10, por la Aurora B. El mismo efecto sobre la evolución de la enfermedad hepática producida por el virus de la hepatitis histona 3 fue verifi cado en ensayos quinasa con (32P[ATP]). Posteriormente, C (VHC). hemos analizado durante el ciclo celular los niveles de fosforilación de Objetivos: Estudiar las modifi caciones covalentes de histonas inducidas la histona 3, en los dos residuos T3 y S10, y hemos demostrado que la por la infección por VHC y determinar los mecanismos moleculares disminución de la fosforilación de la histona 3 en los dos residuos coincide implicados. con la interacción VRK1-Aurora B. Métodos: Para determinar el papel del VHC en la inducción de cambios Con estos resultados concluimos que la interacción VRK1-Aurora B afecta epigenéticos se utilizó un sistema de infección in vitro de VHC (VHCcc) negativamente la fosforilación de la histona 3 por las dos quinasas, y que sobre la línea celular Huh7.5. Alternativamente la región codifi cante de este puede ser un mecanismo regulatorio para una correcta salida de la la proteína del core viral (genotipos 1a, 1b y 2a) se clonó en un vector mitosis. de expresión eucariota con el que se realizaron ensayos de transfección transitoria sobre la línea celular Huh7.5 y en cultivos primarios de hepatocitos humanos. Las modifi caciones de histonas se analizaron por P16-9 Western Blot, utilizando anticuerpos específi cos. Para determinar las GtrS and GltR form a two-component system: actividades enzimáticas implicadas se ensayó el efecto de inhibidores The central role of 2-ketogluconate in the específi cos como el ZM443979 y ensayos de siRNA. La expresión de expression of exotoxin A and glucose catabolic genes implicados en el control de la actividad infl amatoria, como NF-κB y COX-2, se determinó por RT-PCR cuantitativa. enzymes in Pseudomonas aeruginosa Resultados: Hemos demostrado que el HCV a través de la proteína core inhibe la fosforilación del residuode Serina 10 de la histona H3 Abdelali Daddaoua1, Carlos Molina-Santiago2, Jesús de la Torre2, (H3Ser10ph), un marcador epigenético asociado a la regulación de la Tino Krell2, Juan-Luis Ramos3 actividad transcripcional y la mitosis celular. Los ensayos con inhibidores 1Estación Experimental de Zaidín, CSIC, Otura, Granada, ES, 2EEZ - de actividades enzimáticas implicadas en la fosforilación de histonas CSIC, Granada, ES, 3ABENGOA RESEARCH, Sevilla, ES demostraron que el efecto sobre la H3Ser10 inducida por la proteína del In the human pathogen Pseudomonas aeruginosa the GltR regulator is core viral se inhibía en presencia de ZM443979, un inhibidor de la actividad required for glucose transport whereas GtrS is a sensor kinase that plays a Aurora quinasa B (AKB). Mediante ensayos de coinmunoprecipitación key role in mediating bacteria-host interaction and pathogen dissemination observamos una interacción directa entre la proteína del core viral y la in the host. We show that GtrS and GltR form a two-component system and AKB. La interacción con la proteína del core indujo una inhibición de this novel TCS was found to regulate the expression from the promoters la actividad quinasa de la AKB. Asociado a la inhibición de la actividad P , P and P , which control the expression of genes involved in edd/gap-1 oprB glk AKB se observó una inhibición de transcripción de NF-κB y COX-2, genes glucose metabolism and transport. In addition, the GtrS/GltR pair regulates implicados en el control de la respuesta infl amatoria. La sobreexpresión de the expression of toxA that encodes exotoxin A, the primary virulence factor. AKB revirtió este efecto y disminuyó la infectividad extracelular del virus, Microcalorimetry-based ligand screening of the recombinant GtrS ligand de manera opuesta la inhibición de la actividad de Aurora B aumentó la binding domain revealed specifi c binding of 2-ketogluconate (2-KG) (K = D infectividad viral. 5 μM) and 6-phosphogluconate (K = 98 μM). These effectors accelerate D Conclusiones: La proteína del core del VHC interacciona con AKB GtrS autophosphorylation, with concomitant transphosphorylation of inhibiendo su actividad quinasa y disminuyendo los niveles de fosforilación GltR leading to a 3-fold increase in transcription. Surprisingly, in vivo a de la H3Ser10ph así como la expresión de NF-κB y COX-2, dos genes similar increase in expression from the above promoters was observed implicados en la regulación de la respuesta infl amatoria. Este mecanismo for the mutant defi cient in GltR regardless of the presence of effectors. podría ser una nueva estrategia del VHC para asegurar su infectividad y Using footprinting assays, the GltR operator site was found to contain the persistencia en la célula huésped. consensus sequence 5´-tgGTTTTTc-3´. We propose that 2-ketogluconate is a key metabolite in the stringent transcriptional control of genes involved in virulence and glucose metabolism. Surprisingly, we found that the GltR P16-11 response regulator is a repressor that is released from its target operators of Vitamin D has wide regulatory effects on histone the toxA and glucose metabolism genes upon phosphorylation. This system corresponds to another mode that guarantees a concerted regulation of modifying enzymes in human colon cancer cells carbohydrate metabolism and exotoxin A expression. Antonio Barbáchano Becerril, Fábio Pereira, Asunción Fernández- Barral, Gemma Ferrer-Mayorga, Alberto Muñoz, María Jesús Larriba Instituto de Investigaciones Biomédicas Alberto Sols, CSIC-UAM, P16-10 La inhibición de la actividad Aurora quinasa Madrid, ES Vitamin D is obtained from the diet or mainly synthesized in the skin and B mediada por VHC regula la respuesta 3 is converted into the active metabolite 1alpha, 25-dihydroxyvitamin D antiinflamatoria en las fases iniciales 3 (1,25(OH)2D3). Epidemiological data suggest a protective role of vitamin D de la infección against several neoplasias, particularly colorectal cancer. 1,25(OH)2D3 is a major regulator of gene expression. Histones are subject to posttranslational Irene Francisco Recuero1 2 3 , Antonio Madejón , Julie Sheldon , Celia modifi cations including methylation, acetylation and others. Misregulation Perales3, Ana Isabel Gil2, Jordi Muntané4, Esteban Domingo3, Javier of histone modifi cations alters gene expression and cell phenotype, which García-Samaniego Rey2, Aurora Sánchez Pacheco1 may contribute to cancer initiation, progression and/or metastasis. We 1Bioquímica, Universidad Autónoma de Madrid, Madrid, ES, found that 1,25(OH)2D3has a wide regulatory action on the expression 2 Departamento de Digestivo, Ciberhed. Hospital Carlos III, Madrid, of genes coding for histone demethylases of the Jumonji C domain and 3 ES, Consejo Superior de Investigaciones Científi cas (CSIC), lysine-specifi c demethylase families (Pereira et al., 2011; 2012). Notably, Madrid, ES, 4Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBIS) - Hospital 1,25(OH)2D3induces the expression of the histone demethylase JMJD3/ UniversitarioVirgen Del Rocio de Sevilla, Sevilla, ES KDM6B that specifi cally demethylates the lysine 27 of histone H3 Introducción: Los cambios epigenéticos, entre los que se encuentran las (H3K27) and has tumour suppressor activity. We found that the induction modifi caciones covalentes de histonas, son cruciales en la inducción de of JMJD3 is necessary for the adequate gene regulatory, antiproliferative, inestabilidad genética asociada a enfermedades en humanos, incluyendo and prodifferentiation actions of 1,25(OH)2D3 in human colon cancer cells. el desarrollo de fi brosis hepática y carcinoma hepatocelular. Sin embargo, Conversely, 1,25(OH)2D3 inhibits the expression of several Polycomb 143 Pósters XXXVII Congreso SEBBM group proteins that participate in the Polycomb repressive complexes directly regulates the expression of virulence functions in response (PRC) 1 and 2, which are responsible for H3K27 methylation and promote to a host signal. In this work we aimed at understanding the molecular tumorigenesis. The inhibition of PRC2 activity by DZNep potentiates the mechanism that leads to the activation of P. aeruginosa ECF sigma factors. gene regulatory action of 1,25(OH)2D3 and also its effects on colon cancer We have identifi ed two proteases, Prc and RseP, involved in the processing cell proliferation and differentiation. Thus, 1,25(OH)2D3 exerts an ample of several anti-sigma factors in response to their cognate inducing signal. regulatory effect on the expression of histone modifying enzymes involved Moreover, we have also observed that some anti-sigma factors are already in epigenetic regulation that, in turn, mediate 1,25(OH)2D3 actions on gene processed in an N- and a C-domain prior to the perception of the signal. expression and cell phenotype in colon cancer. The biological signifi cance of this observation is discussed.

P16-12 P16-14 New strategies in relationship between lncRNAs Genetic analysis of the role of the Mlp1 export and the SWI/SNF complex factor in genetic stability

Antonio Herrera Merchán, Carmen Callejas Lechuga, Purifi cación Francisco García Benítez, Hélène Gaillard, Andrés Aguilera López Fernández Espinosa, Pedro Pablo Medina Vico CABIMER/Universidad de Sevilla, Sevilla, ES Universidad de Granada, Granada, ES Transcription of a DNA sequence increases its recombination frequency, a Long non-coding RNAs (lncRNAs) are a new class of non-coding gene phenomenon referred to as transcription-associated recombination (TAR). regulators. But unlike their smaller counterparts, microRNAs, relatively During transcription, negative supercoils are accumulated behind the less is known about the roles and functions of lncRNAs. Current evidence advancing RNA polymerase, facilitating the unwinding of the DNA helix. suggests that lncRNAs may play important roles in a wide range of This transient DNA opening favours the annealing of the nascent mRNA to biological processes in human cancers. the transcribed strand (TS) forming a DNA:RNA hybrid (R-loop). R-loops Many of the LncRNAs have been functionally associated with chromatin- can be formed naturally as intermediates in specifi c cellular processes, such remodeling complexes. as mitochondrial DNA replication or immunoglobulin class switching and SWI/SNF is chromatin-remodeling complex, which alters the interactions have been suggested to play a role in transcription termination. A number of between DNA and histones and modifi es the availability of the DNA for observations in E. coli, yeast and humans indicate that the non-transcribed transcription. The latest deep-sequencing of tumor genomes has reinforced strand (NTS) is more susceptible to damage than the TS. The formation of the important and ubiquitous tumor suppressor role of the SWI/SNF R-loops, in which the NTS remains single stranded, renders the NTS more complex in cancer. However, although SWI/SNF complex play a key role in vulnerable to DNA damage and contributes to TAR. gene expression, the regulation of this complex itself is poorly understood. We are interested in understanding the different mechanisms associated with We hypothesize that LncRNAs could be also functionally related SWI/SNF the optimal biogenesis of mRNA and the control of R-loops formation. We playing a role in its function in carcinogenesis. Supporting this hypothesis, have found mlpD in a screening for deletions of non essential nuclear genes recently, an LncRNA was found functionally associated with the SWI/SNF that show hyper recombination when we overexpress a human deaminase complex, in prostate cancer. that preferentially targets ssDNA in Saccharomyces cerevisiae. The MLP1 We are gathering preliminary results using new technologies of sequencing gene encodes a nuclear pore basket protein that has an important role in and immunoprecipitation of RNA (RNA-IP) to identify new LncRNAs unspliced mRNA retention, SUMO regulation and telomere organization. associated with SWI/SNF in different tumor cell lines for subsequently We investigate the role of Mlp1, its paralog Mlp2 and their human homolog develop functional assays to infer its biological role in tumor development. TPR in preventing genomic instability. Current results of Mlp1 will be presented and discussed.

P16r-13 Unravelling the molecular mechanism activating P16-15 ECF sigma factor in Pseudomonas aeruginosa Novel roles for the protein kinase DYRK1A as a chromatin-associated transcriptional regulator Joaquín R. Otero-Asman1, Cristina Civantos1, Karlijn Bastiaansen2, Marian Llamas1 Chiara Di Vona1, Daniela Bezdan1, Abul B.M.M.K. Islam2, Nuria 1Dept. of Environmental Protection, Estación Experimental del Lopez-Bigas2, Stephan Ossowski1, Susana de la Luna1 Zaidín-CSIC, Granada, ES, 2Department of Molecular Microbiology 1Centro de Regulación Genómica-CRG, Barcelona, ES, Vrije Universiteit Amsterdam Faculty of Earth and Life Sciences, 2Departament de Ciències Experimentals i de la Salut, Universitat Amsterdam, NL Pompeu Fabra, Barcelona, ES Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen that lives in a Our perception of how kinases regulate gene expression has recently wide range of environments. There are many interactions between the been expanded to consider not only their infl uence on transcription environment and the bacterium that permit this niche variability. Many of factors and co-regulators but also that on histones, chromatin remodelers these interactions are possible because of the action of a regulatory system or components of the basal transcription machinery, all of which may be known as cell surface signaling (CSS). CSS systems recognize signals directly modifi ed by kinases at specifi c genomic loci. DYRK1A (dual- from the environment and transmit them into the cytosol, affecting gene specifi city tyrosine-regulated kinase) belongs to a highly conserved family expression.The system is constituted by an outer membrane receptor, a of kinases represented in all eukaryotes and it is known to fulfi l key roles cytoplasmic membrane located anti-sigma factor and an extracytoplasmic during brain development. While DYRK1A is present both in the nucleus function (ECF) sigma factor in the cytosol. In absence of the inducing and cytoplasm of mammalian cells, very little is known about the nuclear signal, the anti-sigma factor binds to and keeps inactive the sigma factor. activities of DYRK1A. We show here that nuclear DYRK1A is an active The regulatory cascade starts with the recognition of the signal by the kinase that participates in high molecular weight complexes, interacting receptor, which promotes the proteolytic degradation of the anti-sigma with several components of the basal transcriptional machinery, including factor and the activation of the ECF sigma factor. The ECF sigma factor RNA polymerase II. We mapped the genome-wide profi le of DYRK1A can then interact with the RNA polymerase and induce expression of target interactions with chromatin and found that the kinase is recruited to RNA genes. Most P. aeruginosa CSS systems have a role in the regulation of iron polymerase II-dependent promoters, where it activates transcription in a uptake, which is an important process for the pathogen during infection. kinase dependent manner. DYRK1A binds chromatin regions displaying a However, this bacterium has a CSS system, called PUMA3 or Vre, that highly conserved palindromic sequence that lies close to the transcription

144 Granada 2014 Pósters start site of target genes, a sequence that is apparently necessary for P16-18 DYRK1A-mediated transcriptional activation. Growth-dependent Roturas de ADN y topoisomerasas: el peligro de expression of a subset of DYRK1A target genes depends on DYRK1A jugar con cuchillos protein levels and/or activity, and indeed, downregulation of DYRK1A Felipe Cortes Ledesma diminishes cell growth. Thus, we propose a novel role for DYRK1A as a chromatin-associated transcriptional regulator and as part of the machinery CABIMER, Sevilla, ES controlling cell growth. Las topoisomerasas de ADN son enzimas nucleares muy conservadas en la evolución que pueden considerarse un arma de doble fi lo. Por un lado, su acción es necesaria para regular los cambios topológicos inherentes a todos P16-16 los procesos fundamentales que implican a la molécula de ADN, incluyendo SMARCA4 expression regulation by miRNAs tanto la transcripción, replicación y reparación como la condensación y in lung carcinogenesis segregación cromosómica. Sin embargo, su ciclo catalítico emplea un mecanismo de rotura transitoria y religación que, si se ve interrumpido, puede IF Coira1, EE. Rufi no-Palomares1, P. Peinado1, C. Metheetrairut2, L. dar lugar a roturas de ADN persistentes, con las evidentes consecuencias Boyero1, OA Romero3, J Carretero4, E. Farez-Vidal5, M. Cuadros5, FJ que éstas pueden tener para la supervivencia celular y la integridad del Reyes-Zurita5, JA Lupiáñez5, M Sánchez-Cespedes3, FJ Slack2, PP genoma. Además, esta peculiaridad del mecanismo de acción de las Medina1 topoisomerasas es la base de la efi cacia antitumoral de los llamados “venenos 1University of Granada, Department of Biochemistry and Molecular de topoisomerasas”, un grupo químicamente heterogéneo de compuestos Biology. Centre for Genomics and Oncological Research (GENYO), que inhiben específi camente el paso de religación catalizado por la enzima, Granada, ES, 2Yale University, New Haven, US,3IDIBELL, induciendo así la formación de roturas de ADN que, por su alto índice de Barcelona, ES, 4University of Valencia, Department of Physiology, proliferación, afectan preferentemente a las células tumorales. Además de Valencia, ES, 5University of Granada. Department of Biochemistry esta interesante relación con la terapia del cáncer, se ha demostrado que una and Molecular Biology, Granada, ES defi ciente reparación de roturas generadas por topoisomerasas puede ser la base de diversas patologías neurológicas humanas. Por lo tanto, comprender SWI/SNF complex is chromatin-remodeling complex able to alter the en su totalidad los mecanismos y la regulación que rigen la reparación de interactions between DNA and histones and modify the availability las roturas de ADN inducidas por topoisomerasas adquiere una importancia of the DNA information to the cell machinery, using the energy of the fundamental para la salud, con posibles implicaciones en el desarrollo de ATP hydrolysis. Last deep-sequencing efforts on tumoral genomes have futuras herramientas, tanto de diagnóstico y pronóstico como terapéuticas. underlined the important and ubiquitous role of the SWI/SNF complex and cancer. It has been known that the expression of SMARCA4, the helicase/ATPase catalytic subunit of the SWI/SNF complex, is frequently P16-19 lost in NSCLC cell lines, mainly by mutations. In primary tumours, the Pitx2 differently controls the expression of host loss of expression of SMARCA4 is also frequent, however it lost cannot be explained by mutations nor other gene silencing mechanisms such us genes and gene-embedded microRNAs in cardiac promoter hyper-methylation. So, the regulation of SMARCA4 is partially and skeletal muscle cells unknown. In this assay, we study if the microRNAs contributes to the Francisco Hernandez-Torres, Amelia E Aranega, Diego Franco Jaime loss of expression of SMARCA4 in lung tumors. For this purpose we Departamento de Biología Experimental, Universidad de Jaén, have determined experimentally the 3’UTR, and analysed functionally Jaén, ES the microRNA binding sites previously predicted by bioinformatics tools. Results obtained indicated that the loss of expression of SMARCA4 The Pitx2 gene is a member of the Bicoid-like homeobox family that observed in primary lung tumors can be due to microRNA activity. plays an importantrole in embryonic left-right signalling and subsequently during cardiac and skeletal muscle organogenesis. Pitx2 misregulation has been as well associated with skeletal and cardiac muscle diseases. P16-17 (R16-1) Although three Pitx2 isoforms are expressed in mice, Pitx2a, Pitx2b RNAPII dephosphorylation is facilitated and Pitx2c, only Pitx2c plays a determinant role in left–right signalling and organogenesis. Over the last years we have gained insights into the by the Rpb4/7 heterodimer transcriptional regulatory mechanisms driven by Pitx2 in both cardiac Olga Calvo and skeletal muscle. Interestingly, besides playing a role in regulating a Instituto de Biología Funcional y Genómica. CSIC/Universidad de large number of protein-coding genes, microRNAs are also regulated by Salamanca, Salamanca, ES Pitx2. Whereas the functional role of distinct microRNAs in cardiac and skeletal muscle development and homeostasis is progressively emerging, The eukaryotic RNAPII enzyme, whose activity is essential for their transcriptional control and the genetic networks in which they are transcription of protein-coding genes, is a complex of 12 subunits, Rpb1 involved remains largely unexplored. Among 34 differentially regulated to Rpb12. The Rpb4 and Rpb7 subunits bind to each other forming a microRNAs by Pitx2 in either skeletal or cardiac muscle cells, 10 (~30%) complex in archaebacteria and in eukaryotic cells, and display some unique display putative Pitx2 binding sites in the -3000 bp proximal promoter features that distinguish them from the remaining subunits. In the case of sequence, among with other muscle-enriched transcription factor binding S. cerevisiae, the Rpb4/7 heterodimer can dissociate from the rest of the sites. Curiously, only two of these microRNAs were intergenic, supporting holoenzyme, and has been shown to be involved in several gene expression thus their own transcriptional regulatory mechanisms, while the majority processes. Thus, they are important for transcription initiation, elongation of them were embedded into distinct host genes. Since transcriptional and, in particular, Rpb4 contributes to contranscriptional recruitment regulation of gene-embedded microRNAs seemed to be modulated in of 3’-end processing factors. Moreover, recent evidences suggest that accordance with transcriptional regulation of the host gene,we evaluated they are also involved in DNA repair, mRNA export and decay, as well the host gene/microRNA expression levels in Pitx2 gain-of-function as in translation. Here, I present additional data showing that the Rpb4/7 experiments using Sol8 skeletal muscle and HL-1 atrial cardiomyocytes, heterodimer is important to maintain proper RNAPII phosphorylation levels respectively. Surprisingly, our data demonstrate that most of these in S. cerevisiae, regulating several kinases and phosphatases. In fact, in the microRNAs are independently regulated from its host gene, and moreover absence of a functional Rpb4/7 heterodimer, RNAPII phosphorylation is such transcriptional regulation is cell-type specifi c. We our now working dramatically enhanced all along the transcription cycle due to altered CTD to establish the mechanisms by with Pitx2 can exert this microRNAs phosphatases recruitment. transcriptional regulation.

145 Pósters XXXVII Congreso SEBBM

P16-20 datos obtenidos resultaron ser más claros al analizarlos por esta técnica que Adult exposure to Bisphenol A decrease por western. En la cepa salvaje, se obtienen niveles altos de GFP expresado the expression of 5alpha-reductase type I con la 3´-UTR de CYC1 y bajos con la de KlCYC1. Hemos comprobado in the prefrontal cortex of female rat. A novel por tanto, que se puede modular la expresión de GFP con estas UTR, y que el efecto del mutante nup84 varía en función de la 3´-UTR contigua a la mechanism underlying Bisphenol A-associated región codifi cadora. psychopathologies? Bibliografía Esperanza Ortega Sánchez1 2 , Beatriz Castro Bohorquez , Pilar [1] T. Alvarez-Felgar, B.M Varela-Rodríguez y MA Freire-Picos. 2 2 Sánchez Medina , Jesús M. Torres de Pinedo Variaciones en la expresión de genes con procesamiento alternativo en 1 2 Universidad de Granada, Granada, ES, Dpto. de Bioquímica, mutantes del poro nuclear. XXXVI Congreso de la SEBBM 2013. Biología Molecular 3 e Inmunología. Facultad de Medicina. [2] B.M. Varela-Rodríguez. Expresión de formas recombinantes de GFP Universidad de Granada, Granada, ES en levaduras: efecto de la cepa y componentes del poro nuclear. Tesis de Most people in developed countries are exposed almost continuously to licenciatura. Facultad de ciencias, UDC 2013. Bisphenol A (BPA), an endocrine-disrupting chemical presents in food packaging and dental sealants. BPA is able to interfere with cognitive functions and behavior, but the mechanisms underlying these effects remain P16-22 unknown. Allopregnanolone (AlloP) is a neuroactive steroid involved in DbdR, nuevo miembro de la familia de modulating behavioral functions, stress, and neuroendocrine axes and its LysR, regulador transcripcional de la ruta de deregulation is implicated in the development of several psychopathologies. In these processes a key role is held by 5α-reductase (5α-R), the rate-limiting degradación anaerobia de 3,5-dihidroxibenzoato enzyme of AlloP synthesis. Given 5α-R type 1 is the isozyme mainly en Thauera aromatica AR-1 implicated in the biosynthesis of AlloP, we examined the effects of BPA on Pacheco, D. 5α-R1 expression in the prefrontal cortex (PFC) of female rats. We focused Molina-Fuentes, A., , Marín, P., Díaz-Romero, A., on PFC since it is an important area for cognitive control and complex Marqués, S. behaviors. Adult female Wistar rats were subcutaneously injected during Departamento de Protección Ambiental, Estación Experimental del 4 days with 50 μg/kg/day of BPA, the current Environmental Protection Zaidín, CSIC, Granada, ES Agency (EPA) reference dose. Rats were euthanized at 30 min after the T. aromatica AR-1 es una bacteria desnitrifi cante capaz de crecer en 3,5 fi nal administration. Quantitative RT-PCR and Western blot analysis were dihidroxibenzoato (3,5-DHB) como única fuente de carbono y energía performed to quantify mRNA and protein levels of 5α-R1 respectively. Under mediante una ruta oxidativa independiente de oxígeno utilizando nitrato the conditions assayed, BPA decreased the expression of 5α-R1. This fi nding como aceptor fi nal de electrones [1]. La agrupación génica que codifi ca para is very interesting because reduced brain levels of 5α-R1 and, consequently las enzimas de la ruta y proteínas transportadoras consta de 20 genes en una AlloP, may contribute to increased the vulnerability for mental and emotional región cromosómica de 29 Kb [2]. Un análisis de RT-PCR ha permitido defi nir pathology in females. Thus, mood changes during the menstrual cycle, una organización transcripcional en cinco operones, cuatro de los cuales son postpartum, major depression and epilepsy are pathologies associated with inducibles por sustrato. A ambos extremos de la agrupación se encuentran low AlloP levels. We present here a possible novel mechanism underlying sendos reguladores de la familia de LysR. Mediante mutagénesis dirigida BPA-associated psychopathologies but also raises questions about the safety hemos determinado que el único gen regulador esencial de la ruta es dbdR. of adult exposure to BPA. Un análisis de expresión en un fondo mutante dbdR revela que los operones principales de la ruta son dependiente de este regulador. Mediante extensión a partir de cebador hemos defi nido los promotores de estos operones, que P16r-21 muestran una notable conservación en estructura, y en los que se predicen los Análisis de la expresión de GFP con diferentes posibles sitios de unión para reguladores de la familia de LysR. Estos sitios 3´-UTR en un mutante nup84 del NPC de unión se están confi rmando mediante ensayos de retardo en gel (EMSA) y de footprinting con DNAsa utilizando proteína DbdR sopreexpresada y Bárbara María Varela-Rodríguez, Tania Alvarez-Felgar, Ana María purifi cada. El gen regulador forma un operón con qorA, una de las enzimas Maria Angeles Freire Picos Rodríguez-Torres, responsable del segundo paso de la ruta. Este operón presenta niveles basales Área de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias, de expresión, inducibles en presencia de sustrato. Su actividad está regulada Universidad de la Coruña, A Coruña, ES negativamente por la presencia de DbdR en ausencia del sustrato. Se han

Uno de los aspectos clave de regulación de la expresión génica es construido fusiones de cuatro promotores de la ruta (Porf18, Porf20, Pdctp y Pdbdr) el procesamiento del extremo 3´de los RNA transcritos por la RNA al gen reportero lacZ para analizar su actividad en un huésped heterólogo polimerasa II. En las regiones 3´-UTR (3´-Untranslated) de los mensajeros en presencia y ausencia del regulador. Los resultados conﬁ rman el papel del se encuentran señales que determinan, entre otras, su estabilidad y en regulador en la expresión de estos promotores, aunque la actividad basal y la general todos los procesos post-transcripcionales. fuerza de los distintos promotores varían. Esto siguiere distintos mecanismos Menos conocido es el proceso que determina el emplazamiento de un de activación para los distintos promotores. Estas construcciones se han mRNA en el citosol por su paso a través del Complejo del Poro Nuclear utilizado para analizar la expresión en T. aromatica AR-1. Los resultados

(NPC). Datos de nuestro grupo [1] indican que la mutación del factor confi rman que DbdR regula la expresión desde al menos Porf18, Porf20 y Pdctp. Nup84 (que forma parte del “complejo Y” del NPC) de la levadura Por otra parte se confi rma la represión catabólica inicialmente descrita como Saccharomyces cerevisiae afecta a la abundancia de transcritos detectables la represión de la utilización de 3,5-DHB en presencia de benzoato(3): en los genes con poliadenilación alternativa. Esto nos llevó a buscar un observamos que la presencia simultánea de succinato y 3,5-DHB produce sistema para identifi car el producto fi nal de la expresión, la proteína. una cinética típica de crecimiento diáuxico, donde el 3,5-DHB sólo se Para ello expresamos GFP con variantes de regiones 3´-UTR de genes de utiliza una vez consumido el succinato. Esta represión se ejerce a nivel de levaduras: por un lado la 3´-UTR del gen CYC1 y por otro las variantes de la expresión desde al menos los promotores Porf18 y Porf20. Finalmente, el la UTR de un gen con poliadenilación alternativa, KlCYC1, expresado en S. análisis de la expresión de los promotores regulados en fondos mutantes para cerevisiae [2]. El análisis de la expresión de GFP se llevó a cabo tanto por los distintos pasos de la ruta nos ha permitido determinar que la molécula microscopía de fl uorescencia como por fl uorimetría y por western blot. Los efectora es el sustrato 3,5-DHB y no un producto de su metabolismo. Este resultados de fl uorimetría permitieron apreciar diferencias importantesen la extremo se analizará bioquímicamente mediante microcalorimetría isoterma expresión de GFP en el mutante nup84 expresando la UTR de KlCYC1. Los de titulación (ITC) con la proteína reguladora purifi cada.

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Bibliografía del gen. Tras la activación del gen existe un desplazamiento de N-2 y [1] Gallus, C., and Schink, B. (1998) Arch Microbiol. 169, 333-338. una desestructuración parcial o total en los nucleosomas N-1 y N+1, [2] Molina-Fuentes, A. (2012) Tesis doctoral. dejando accesible los elementos en cis del gen. También se estudia el [3] Philipp B & Schink B. (2000) Arch Microbiol. 173, 91. posicionamiento de Egr1 en condiciones de silenciamiento para investigar la implicación de la proteína EGR1 en el desplazamiento del nucleosoma Proyecto ﬁ nanciado por fondos FEDER, proyecto del MICINN BIO2011- N-2. Los resultados reiteran la importancia del estudio de los mecanismos 23615. de regulación de la cromatina a nivel mononucleosomal.

P16r-23 P16-25 Electrophoretic mobility of catenated, knotted BCL7A’s role in haematological malignancies and supercoiled DNA molecules Carlos Baliñas Gavira1, Pedro P. Medina2 1 Jorge Cebrián1, Alicia Castán1, Maridian J. Kadomatsu-Hermosa2, Centre for Genomics and Oncological Research (GENYO), Granada, 2 Víctor Martínez2, Cristina Parra2, María José Fernández-Nestosa2, ES, University of Granada, Departement of Biochemistry and Christian Schaerer2, Pablo Hernández1, Jorge B. Schvartzman1, Molecular Biology I. Centre for Genomics and Oncological Research Dora B. Krimer1 (GENYO), Granada, ES 1Department of Cellular and Molecular Biology. Centro de Gene expression regulation increases the functional versatility and Investigaciones Biológicas (CSIC), Madrid, ES, 2Scientifi c and Applied adaptability of the cell by allowing it to express certain proteins when Computing Laboratory. Polytechnic School. National University needed. It is, therefore, one of the most important and complex processes of Asunción. P.O. Box 2111 SL. San Lorenzo, Asunción, PY of biology. Changes in the gene expression patterns are key in cancer cell Two-Dimensional (2D) agarose gel electrophoresis is the method of transformation, through an increase in expression of genes that promote choice to separate the stereoisomers for any given circular DNA molecule. carcinogenesis (oncogenes) and/or a decrease in expression of genes that Supercoiled, catenated and knotted families are clearly identifi ed as they prevent it (tumour suppressor genes). exhibit different electrophoretic mobility. Here we used classical genetics, SWI/SNF chromatin-remodeling complex alters the interactions between treatments with Norfl oxacine and 2D agarose gel electrophoresis run at DNA and histones and modifi es the availability of the DNA for transcription. different conditions (voltage and agarose concentration) to analyze the The latest deep-sequencing of tumor genomes has reinforced the important mobility of four families of stereoisomers of the same mass: monomeric and ubiquitous tumor suppressor role of the SWI/SNF complex in cancer. CatAs (where both duplexes are nicked), monomeric CatBs (where However, although SWI/SNF complex play a key role in gene expression, one duplex is nicked and the other is covalently closed), covalently the regulation of this complex itself is poorly understood. closed dimers and knotted dimers. The results obtained indicate that the BCL7A was recently identifi ed as a new member of the human SWI/SNF contribution of catenane, knot and supercoil nodes to electrophoretic complex. Recently, some reports found BCL7A expression inactivated mobility varies signifi cantly depending on the electrophoretic conditions in hematological malignancies. After screening for BCL7A genetic employed. Whereas increasing voltage has little effect on the catenanes´ alterations over a battery of hematological cell lines, we found two cell mobility, it changes signifi cantly the mobility of supercoiled and knotted lines homozygously mutated for BCL7A. We are currently using these dimers. This observation was confi rmed for CatBs. Moreover, for partially cell lines to analyze tumor phenotype changes after BCL7A expression replicated molecules displaying two regions: one already replicated and restoration. Upon the completion of this task, we will go through functional the other not, the electrophoretic mobility is determined by the size of the analysis to determine BCL7A role in tumorigenesis. region and the distribution of supercoiled and pre-catenane nodes.

P16-26 P16-24 El tirosol regula el patrón global de expresión de Mecanismos de regulación de la cromatina: ARN mensajeros implicados en la reproducción, posicionamiento mononucleosomal en el gen Egr1 desarrollo y crecimiento de Caenorhabditis elegans

Angela L. Riffo-Campos, Josefa Castillo, M. Isabel Rodrigo, Gerardo Ana Cañuelo Navarro1, Francisco J. Esteban Ruiz2, Juan Peragón López-Rodas, Luis Franco Sánchez1 Laboratorio de Epigenética y cromatina. Departamento de 1Área de Bioquímica y Biología Molecular, Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Valencia e Biología Experimental, Universidad de Jaén, Jaén, ES, 2Área INCLIVA, Valencia, ES de Biología Celular, Departamento de Biología Experimental, La cromatina es una estructura compleja formada por DNA, RNA y Universidad de Jaén, Jaén, ES proteínas, que permite el empaquetamiento ordenado del genoma en las El tirosol (Tir, 2-(-4-hidroxifenil)etanol) es uno de los compuestos células eucarióticas. Representa un nivel adicional de regulación de todos fenólicos presentes en el fruto y hoja de olivo benefi ciosos para la salud. La los procesos metabólicos del DNA, como la replicación, reparación, incorporación de 250 μM de Tir en el medio de cultivo de Caenorhabditis recombinación y transcripción. El gen Egr1 (Early growth response 1) elegans incrementa la longevidad, la termotolerancia y la resistencia pertenece al tipo denominados genes inmediato tempranos (IEGs), dado al estrés oxidativo. En estudios previos hemos identifi cado, mediante que se activa rápidamente en respuesta a señales mitogenicas que activan el análisis de los cambios inducidos en el proteoma de esta especie, las la proliferación celular fundamentalmente mediante la vía de señalización proteínas dianas celulares sobre las que termina infl uyendo. En este trabajo de las MAP Quinasas. hemos determinado los cambios que se producen en el patrón global de En la presente investigación se estudia el posicionamiento nucleosomal expresión de ARN mensajeros mediante un análisis de microarrays de del gen Egr1 en los modelos biológicos in vivo (hepatectomía parcial en ARN utilizando la metodología Affymetrix. ratón) e in vitro (línea celular MLP29 de precursoras de hepatocitos de Utilizando C.elegans GeneChipR Genome Array se han medido los ratón). El posicionamiento se determina mediante ensayos de digestión con cambios que se producen en la expresión génica de 22625 transcritos. En la enzima MNasa y posterior análisis por PCR en tiempo real utilizando respuesta a 250 μM de Tir se producen cambios en los niveles de ARNm de amplicones solapantes que cubren la región del promotor y el inicio de 208 genes; en 206 el nivel de expresión estaba aumentado y en 2 de ellos la transcripción del gen. Los resultados demuestran que la posición de disminuido. Un posterior análisis de enriquecimiento funcional puso de los nucleosomas se mantiene en ambos modelos antes de la activación manifi esto que estos genes están implicados en procesos biológicos tales

147 Pósters XXXVII Congreso SEBBM como la reproducción, el metabolismo lipídico, el desarrollo embrionario cell enucleation. After validation of the pleck results by real-time PCR and y larvario, la morfogénesis y la regulación de la velocidad de crecimiento, Western, we generated shRNAs encoded by mammalian vectors that were transcripción, transporte, así como en otras funciones. Destaca la inducción used to transfect MEL cells and down-regulate plek in transient or stable de 19 genes que codiﬁ can para la Proteína Mayor del Esperma (msp). transfectants. We analyzed also the effect of plek in early and late stages Estos resultados permiten relacionar el incremento en la longevidad con la of cell differentiation. reproducción, desarrollo y crecimiento en C. elegans mediado por tirosol.

Este trabajo ha sido fi nanciado por el Plan de Apoyo a la Investigación, P16-29 Desarrollo Tecnológico e Innovación de la Universidad de Jaén Accurate chromatin structure is required for (R1/13/2010/02). proper Top2 and condensin activities during chromosome decatenation and centromere P16-27 (R16-6) biorientation Mip6p, a putative mRNA binding protein Marina Murillo-Pineda1, Marta Clemente-Ruiz1, Fernando Monje Manuel Martín Expósito, Susana Rodríguez Navarro Casas2, Félix Prado Velasco1 Centro de Investigación Príncipe Felipe, Valencia, ES 1CABIMER-CSIC, Sevilla, ES, 2CABIMER-USE, Sevilla, ES Las proteínas de unión a ARN (RBP) juegan un papel clave en el control The structural organization of chromosomes is essential for their correct post-transcripcional de diferentes ARN, que, junto a la regulación function and dynamics during the cell cycle. The assembly of DNA into transcripcional, es una de las vías para regular los niveles de expresión chromatin provides the substrate for topoisomerases and condensin, which de genes durante el desarrollo. El control postranscripcional puede ocurrir introduce the different levels of superhelical torsion required for DNA a diferentes niveles en el metabolismo de ARN, incluyendo splicing, metabolism. In particular, Top2 and condensin are directly involved in poliadenilación, estabilidad, localización y transporte del ARN mensajero both the resolution of precatenanes that form during replication and the del núcleo al citoplasma. formation of the intramolecular loop that detect tension at the centromeric La proteína Mip6 (MEX67-interacting protein 6) es una proteína con chromatin during chromosome biorientation. Here we show that histone dominios de unión a ARN, que interacciona físicamente con las proteínas depletion activates the spindle assembly checkpoint (SAC) and impairs Mex67 y Sus 1. Mip6p posee tres dominios de unión a ARN en su extremo sister chromatid decatenation, leading to chromosome missegregation and N-terminal. lethality in the absence of the SAC. We demonstrate that histone depletion A través de distintas aproximaciones se ha tratado de identifi car las dianas impairs chromosome biorientation and activates the Aurora-dependent (RNA unidos) a estos RBP o identifi car RBP que se unen a secuencias pathway, which detects tension problems at the kinetochore. Interestingly, regulatorias conocidas. En general, los análisis genéticos indican que los SAC activation is suppressed by the absence of Top2 and Smc2, an RBP deben regular numerosos RNA ya que la pérdida de un RBP presenta essential component of condensin. Indeed, smc2-8 suppresses catenanes mayores efectos que cepas desreguladas de ARNm conocidos. accumulation, mitotic arrest and growth defects induced by histone En nuestro laboratorio estamos realizando la caracterización funcional depletion at semi-permissive temperature. Therefore, our results reveal the de Mip6. Hemos identifi cado que la localización de Mip6 varía en base a importance of chromatin structure for the function of Top2 and condensin cambios de temperatura. Por otro lado, el dominio C-terminal es necesario during precatenanes resolution and centromere biorientation, two essential para la interacción con Mex67 además de ser imprescindible para el paso processes for chromosome segregation. de Mip6 entre el núcleo y el citoplasma. Además, el mutante mip6 presenta resistencia a estrés severo por temperatura. Por último, estamos estudiando cuáles son los ARN diana de Mip6 bajo P16-30 condiciones de estrés como choque térmico. Se presentarán los últimos Cambio de accesibilidad de la subunidad resultados más relevantes obtenidos en la caracterización de Mip6. ribosomal 40S al IRES del virus de la hepatitis C tras la unión del miR-122 P16r-28 RNAi-mediated silencing of plekstrin in murine Ascensión Ariza-Mateos, Jordi Gómez Instituto de Parasitología y Biomedicina “López - Neyra”, CSIC erytrholeukemia cell differentiation - CIBER de enfermedades hepáticas y digestivas (CIBERehd), Vanessa Fernández Calleja1, Pablo Hernández2, Jorge B. Armilla, Granada, ES Schvartzman2, Dora B. Krimer2 El virus de la hepatitis C (HCV) es un virus de RNA de cadena sencilla 1Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, Madrid, ES, y polaridad positiva perteneciente a la familia Flaviviridae. El genoma 2Department of Cellular and Molecular Biology, Centro de comprende una región 5’ no traducible que funciona como un sitio de Investigaciones Biológicas-CSIC, Madrid, ES entrada interna del ribosoma (IRES), incluyendo el codón de inicio de la Murine erythroleukemias are experimental models that have been traducción AUG, esencial para la síntesis de proteínas independiente de la successful to comprehend tumour leukemogenesis mechanisms and estructura 5’-cap. normal erythropoiesis development. Friend murine erythroleukemia Se ha demostrado que la enzima RNasa P, que procesa los precursores de cells (MEL) derived from transformed erythroblasts immortalized by the los tRNA del hospedador, puede cortar in vitro el genoma del RNA de Friend complex virus were used in our lab to study the cell differentiation HCV en el IRES cerca del triplete iniciador AUG, indicando la presencia blockade that characterize these cell lines. We established resistant cell de una estructura tipo-tRNA en el IRES. Otros grupos y nosotros hemos lines (MEL-R) that unlike their parental line, are refractive to inducers demostrado previamente que el IRES de HCV reside en la región genómica of differentiation (Fernández et al., Leukemia Research (2008) 32, 1-570 en una conformación cerrada que es capaz de cambiar a una 121; SpringerPlus (2013) 2, 392). Recent results using next generation conformación abierta por la unión de moléculas del microRNA-122 en su sequencing recognized 487 genes that increased their expression fl anco 5’. greater than two fold between MEL undifferentiated and MEL-R cells. En este estudio hemos probado cuantitativamente la capacidad del miR- Among these genes we identifi ed pleckstrin (plek), a protein implicated 122 para interaccionar con el RNA-HCV tanto en la forma cerrada como in signaling and cytoskeletal function. Cytoskeletal proteins undergo en la abierta, determinando dos nuevos sitios de unión en tandem para el reorganization during terminal erythropoiesis and are involved in erythroid miR-122 en el fl anco 3’ del IRES.

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Los efectos de unión del miR-122 en el fl anco 3’ del IRES fueron no la expresan (Daudi, Raji) así como poblaciones celulares de linfocitos determinados mediante RNasa específi cas de simple y doble cadena (RNasa B y de CP normales y patológicas derivadas de pacientes con mieloma. A, T1 y V1) y agentes químicos (DMS). Sin embargo, la accesibilidad a Se modifi có el DNA genómico con bisulfi to y se analizó el grado de la estructura tipo-tRNA por las RNasa que reconocen específi camente metilación de las diferentes CpG por secuenciación. También se trataron este regiones tipo-tRNA (RNasas P y Z) fue afectada, al igual que la las células con 5-Aza-2-deoxycytidine, un inhibidor de la metilación del accesibilidad por la RNasa H, indicando que la unión del miR-122 en el DNA, para analizar, mediante PCR a tiempo real, si había cambios en los fl anco 3’ del IRES provoca un cambio conformacional local en torno al niveles de transcripción de PRDM1β. codón de inicio de traducción, que podría afectar directamente a la unión Resultados: Hemos analizado hasta 12 posiciones CpG presentes en el de las subunidades ribosomales. Mediante ensayo de unión de la subunidad promotor de PRDM1β. Lo más destacado es que la línea celular U266 ribosomal 40S en presencia de miR-122, se pudo concluir que el miR-122 prácticamente no presenta metilación en ninguna de las CpG, solo en las se une al RNA-HCV en ambos fl ancos del IRES-HCV y que esto podría posiciones CpG 7 y 8 en menos del 25% de los clones analizados. Sin ser un proceso sincrónico que induce un cambio conformacional global de embargo en líneas celulares como Daudi y Raji, así como en linfocitos B y la estructura del IRES afectando directamente a la unión de la subunidad CP normales, se observa un patrón diferente donde las posiciones 4, 5, 6, 9 y ribosomal 40S. 12 están preferentemente metiladas. Para evaluar si la expresión de PRDM1β tiene relación directa con el estado de metilación del promotor, el tratamiento con 5-Aza-2-deoxycytidine mostró un aumento en los niveles de transcritos P16-31 de PRDM1β en cultivos de células Namalwa pero no con U266. The inhibitory state of the T-cell receptor alpha Conclusión: Estos datos indican que la metilación de las CpG en el enhancer in T lymphocytes is not reverted upon promotor es, al menos, uno de los mecanismos por el cual se regula la expresión de PRDM1β. T cell helper differentiation of CD4+ lymphocytes

Úrsula Angulo Urrecho, Beatriz del Blanco, Jennifer López Ros, Cristina Hernández-Munain Instituto de Parasitología y Biomedicina “López-Neyra”, CSIC, (IPBLN-CSIC), Parque Tecnológico de Ciencias de la Salud, P17. Regulación metabólica Armilla, ES The T-cell receptor α (Tcra) enhancer (Eα) is essential for Tcra locus P17-1 germline transcription and primary Vα-to-Jα recombination during Profiling of promoter occupancy by SND1 thymocyte development. We found that Eα is inhibited late during coactivator in human hepatoma cells via thymocyte differentiation and in peripheral T cells, indicating that it is not ChIP-chip analysis required to drive transcription of rearranged Tcra genes. Eα inactivation in peripheral T lymphocytes resulted in the lost of the enhancer-dependent Enara Arretxe, Begoña Ochoa, Sandra Armengol, Sarai Mula, chromatin modifi cations and in the disruption of functional long-range Yolanda Chico, María José Martínez enhancer-promoter interactions as a consequence of the downregulation of Department of Physiology, University of the Basque Country Medical E2A and GATA-3 in mature T cells. Since GATA-3 is essential for T helper School, UPV/EHU, Leioa, ES (Th) 2 differentiation and has a role in regulatory T cell (Treg) maintenance Staphylococcal nuclease domain-containing protein 1 (SND1), also and function, we hypothesized that Eα function might be re-activated known as p100 coactivator or Tudor-SN, is an evolutionarily conserved during CD4+ cell differentiation. We have differentiated T cells in vitro to multifunctional protein implicated in a variety of cellular processes, different Th subsets: Th1, Th2, Th17 and Treg to evaluate whether there is a including adipogenesis, stress response, gene transcription, RNA direct correlation between Eα activity and Gata3 and Tcfe2a transcription. metabolism and cancer progression. Originally identifi ed as a transcriptional Our results indicate that the high induction of GATA-3 transcription coactivator of EBNA-2, we now know that SND1 can modify the observed during Th2 differentiation is not suffi cient to activate Eα activity expression of several genes by interacting with transcription factors in peripheral CD4+ T cells and that other factors are clearly required for STAT5, STAT6, c-Myb and PPARγ. However, the relevance of SND1 as enhancer function in these cells. Further experiments are currently being a transcriptional coactivator remains unresolved and no comprehensive performed to extend these analyses during CD8+ T lymphocyte activation. picture of potential SND1 target genes has yet been reported. Interestingly, we found overexpression of SND1 in human hepatoma cells exposed to TNFα through NF-κB binding to gene promoter, supporting a role for P16-32 SND1 in infl ammation signalling pathways. To gain insight into the role of Regulación epigenética del promotor PRDM1β en SND1 in gene transcription regulation, we performed genome-wide search mieloma múltiple for endogenous SND1 binding sites by Chromatin Immunoprecipitation Raquel Romero García (ChIP)-chip analysis on HepG2 human hepatoma cells left untreated and , Laura Gómez Jaramillo, Francisco Mora upon TNFα stimulation. We found a set of 645 target genes in basal cells López, Antonio Campos Caro and 822 in cytokine-treated cells, of which 281 genes were exclusively Hospital Universitario Puerta del Mar, Cádiz, ES bound in the treated group. Transcription factor binding site analysis of Objetivo: El gen PRDM1 codifi ca para un factor de transcripción clave target genes at CEAS server revealed enrichment of motifs for established en el proceso de diferenciación de linfocitos B a células plasmáticas (CP). partners and novel transcription factors involved in stress response (i.e. Existen dos isoformas de PRDM1, denominadas PRDM1α y PRDM1β, HSF and ATF), viral infection (i.e. STAT1 and STAT3), cell proliferation que se originan a partir de dos promotores diferentes. La proteína PRDM1α (i.e. MEIS1/AHOXA9, E2F, E2F1 and PAX) and metabolic regulation actúa como represor de la transcripción mientras que se desconoce la (i.e. p300 and CREB). Gene Ontology classifi cation of SND1 target genes función de la isoforma truncada PRDM1β aunque se ha observado que, en by DAVID showed enriched ontologies such as regulation of information las líneas celulares de mieloma estudiadas, su expresión está aumentada molecules, metabolism, organ morphogenesis and central nervous system con respecto a la de la proteína normal. Por ello, hemos estudiado si el development. Major differences of TNFα-treated vs untreated human estado de metilación de su promotor está relacionado con la expresión en hepatoma cells were a few ontologies involving phospholipid metabolism, mielomas. heat shock protein binding and the TGF-β signaling pathway. Metodología: Se han utilizado líneas celulares de mieloma que expresan la isoforma PRDM1β (U266, NCI-H929) y otras líneas de linfocitos que Supported by Basque Government grants IT-336/10 and S-PE13UN139.

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P17r-2 P17m-4 La sensibilidad del metabolismo de poliaminas a ¿Es la resistencia a la insulina dependiente la privación de glucosa es mayor en células de la remodelación del tejido adiposo? de neuroblastoma con amplificación de n-myc Martín Alcalá Díaz-Mor1, Julio Sevillano Fernández1, Jimena Pita 1 2 Mª Victoria Ruiz Pérez, José Luis Urdiales, Francisca Sánchez Santibañez , Isabel Sánchez-Vera Gómez-Trelles , María del Pilar 1 1 Jiménez, Miguel Ángel Medina Ramos Álvarez , Marta Viana Arribas 1 Departamento de Biología Molecular y Bioquímica, Universidad de Departamento de Química y Bioquímica, Facultad de Farmacia, 2 Málaga, Málaga, ES Universidad San Pablo CEU, Madrid, ES, Departamento de Ciencias Médicas Básicas, Facultad de Medicina, Universidad San El oncogén n-myc es capaz de potenciar la síntesis de poliaminas, moléculas Pablo CEU, Madrid, ES esenciales para la proliferación celular cuyos niveles están elevados en muchos tumores. El neuroblastoma, el tumor sólido extracraneal más frecuente Introducción: La capacidad de expansión del tejido adiposo ante la en niños, muestra amplifi cación de n-myc en el 25% de los casos, y dicha acumulación de grasa en la obesidad es clave en el desarrollo de patologías amplifi cación está asociada a mala prognosis y escaso éxito del tratamiento. asociadas. Sin embargo, se desconoce la cronología en la aparición de los En este trabajo, hemos evaluado la relevancia de la amplifi cación de n-myc cambios estructurales del tejido adiposo, así como la implicación de cada sobre varias características metabólicas de células de neuroblastoma humano, uno en la pérdida de funcionalidad. y hemos analizado los efectos de la inhibición de la glucólisis sobre el Objetivos: Determinar el papel de la remodelación de la matriz extracelular metabolismo de poliaminas en dichas células. Los resultados de este trabajo y la infi ltración de macrófagos en el estroma vascular sobre la resistencia muestran una relación previamente desconocida entre la glucólisis y los a la insulina (RI) en el tejido adiposo visceral (TAV) de ratones obesos. niveles de poliaminas: la inhibición de la glucólisis desencadena eventos de Métodos: Ratones CBL57/6J de 3 semanas de edad fueron divididos señalización que llevan a una disminución de los niveles proteicos de N-Myc en 2 grupos: un control (C), alimentado con dieta estándar y un grupo y a un descenso de la expresión de la enzima ornitina descarboxilasa y de los alimentado con dieta rica en grasa (O), durante 14 y 28 semanas. Se niveles de poliaminas, todo ello acompañado por un bloqueo del ciclo celular. analizaron parámetros metabólicos, proteínas de la cascada de señalización Esta relación entre la privación de glucosa y la defi ciencia de la síntesis de de la insulina en TAV y se analizó su estructura por inmunohistoquímica. poliaminas, y su aparente relación con la amplifi cación de n-myc, podría ser Resultados: Se observó RI en el grupo O desde la semana 14. A pesar de explotada para el desarrollo de nuevas terapias antitumorales contra tumores que ya existía una infi ltración de macrófagos inducida por HIF-1α, todavía que presenten amplifi cado este oncogén. no se vieron cambios ni en el acúmulo de colágeno ni en la señalización de la insulina en el TAV. Sin embargo, en la semana 28, la RI en los animales O se caracterizó por la disminución en el receptor de insulina y el aumento en la fosforilación de p38 en el TAV. A nivel estructural, además de la infi ltración de P17m-3 (R17-5) Modulación del metabolismo de los cuerpos macrófagos, se observó un marcado acúmulo de colágeno total, tipo I y tipo III. Conclusiones: Durante el desarrollo de obesidad, la llegada de macrófagos lipídicos hepáticos de ratón en la endotoxemia parece ser uno de los primeros cambios en el TAV, aunque no es Lino Arisqueta Herranz, Hiart Navarro-Imaz, Yuri Rueda Estévez, sufi ciente para bloquear allí la señalización de la insulina. Esta pérdida Olatz Fresnedo Aranguren de funcionalidad del tejido se ve aumentada por los cambios estructurales Departamento de Fisiología, UPV/EHU, Leioa, ES posteriores, principalmente mediados por el acúmulo de colágeno. Durante la respuesta de fase aguda frente a patógenos se producen cambios específi cos en el metabolismo de los lípidos que conducen a la P17-5 denominada lipemia de la sepsis. Esta adaptación se considera parte de The lack of GlnB and YejB compensates la respuesta inmune innata ya que favorece la eliminación del torrente sanguíneo de endotoxinas como el lipopolisacárido (LPS). La lipemia se the detrimental effect of spoT deletion in E. coli origina, entre otros, como consecuencia de adaptaciones hepáticas que cells expressing wild type relA afectan al ensamblaje de VLDL, un proceso complejo en el que intervienen 1 1 1 2 los cuerpos lipídicos (CL). Este estudio se propuso con el fi n de analizar Manuel Montero , Goizeder Almagro , Alejandro Viale , Angel Sevilla , 2 2 2 en qué medida el metabolismo de los CL hepáticos está implicado en la Manuel Cánovas , Cristina Bernal , Ana Belén Lozano , Francisco 1 1 Javier Pozueta-Romero1 respuesta inmune innata. Para ello se administró LPS a ratones salvajes y José Muñoz , Edurne Baroja-Fernández , 1 ratones defi cientes en leptina (ob/ob), cepa que presenta esteatosis hepática Instituto de Agrobiotecnología (CSIC/UPNA/Gobierno de Navarra), 2 (acumulación de CL) y mayor sensibilidad a la endotoxemia. Uno de los Mutilva, Navarra, ES, Departamento de Bioquímica y Biología efectos más destacables del tratamiento con LPS es una menor acumulación Molecular e Inmunología, Facultad de Química, Campus de de CL hepáticos. El segundo es la reducción en el contenido de colesterol Excelencia Internacional Regional “Campus Mare Nostrum”, esterifi cado (CE) de estos CL. La cuantifi cación de la actividad de Universidad de Murcia, Murcia, ES enzimas implicados en el metabolismo de lípidos neutros así como de la In Escherichia coli, intracellular ppGpp content in response to nutritional expresión de proteínas relacionadas condujo a proponer dos mecanismos defi ciency is controlled by the balanced action of RelA (synthetase I) and para explicar estas adaptaciones: uno dependiente de la modulación de the dual-function (synthetase/hydrolase) SpoT. Generally ascribed to the actividades enzimáticas y otro dependiente de la movilización de lípidos. detrimental effects of high (p)ppGpp levels, the co-existence of spoT null Estudios con cultivos primarios de hepatocitos confi rman que las citoquinas (DspoT) with relA profi cient alleles has been considered synthetically lethal. sobresecretadas tras el tratamiento con LPS participan en la regulación However, in a recent work we have reported the construction of DspoT mutants diferencial de las actividades triglicérido hidrolasa y diglicérido hidrolasa in a relA+background accumulating nearly wild type (WT) ppGpp levels when hepáticas, lo que probablemente conduce a una canalización de sustratos cells were cultured on a rich complex medium. Sequencing of the genomes hacia la biogénesis de VLDL. Este mecanismo conduciría a la menor from various selected DspoT clones identifi ed in all of them suppressor acumulación de CL en el hígado. Por otro lado, el menor contenido de CE mutations located in relA. In two of them, additional inactivating mutations de los CL se debe probablemente a una mayor secreción de colesterol al were found in glnB and yejB, two genes that have not been characterized as sinusoide mediada por sobreactivación del receptor nuclear LXR. En los genetically linked to relA. To know whether mutations resulting in the total ratones ob/ob estos mecanismos se encuentran atenuados, lo que podría abolishment of the glnB and yejB genes could compensate the detrimental condicionar una respuesta innata defi ciente. effects of spoT deletions in E. coli in this work we obtained multiple independent DspoTDglnB and DspoTDyejB clones. Importantly, these clones expressed Subvencionado por Gobierno Vasco (IT-336-10) y UPV/EHU (UFI11/20). WT RelA, displayed a nearly WT growth phenotype, and accumulated nearly

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WT ppGpp and glycogen contents when cultured in a rich complex medium. ES, 3Department of Cancer Biology, Dana-Farber Cancer Institute, None of these mutants, however, could grow on glucose minimal medium. The Harvard Medical School, Boston, MA, US, 4Surgery, Memorial overall data (a) show that different mutations other than in relA can be selected Sloan-Kettering Cancer Center, New York, US, 5Department of in E. coli cells compensating the detrimental effects of spoT deletion, and (b) Morphology, Surgery and Experimental Medicine Section of General point to the occurrence in E. coli of mechanism(s), other than SpoT-mediated Pathology, University of Ferrara, Ferrara, IT, 6CIC bioGUNE, Centro ppGpp hydrolytic breakdown, that prevent ppGpp over-accumulation. To our de Investigación Biomédica en Red de Enfermedades Hepáticas knowledge this is the fi rst report describing the production of spoT null mutants y Digestivas (Ciberehd), Derio, ES, 7CIC bioGUNE, Ikerbasque, of E. coli expressing WT RelA. Basque foundation for science; Biochemistry and Molecular Biology Department, University of the Basque Country (UPV/EHU), Derio, ES Prostate cancer (PCa) is the third most common tumor found and the P17-6 (R17-6) third leading cause of cancer death in men in Europe. The main driver of The development of insulin resistance can be PCa is the PI3K pathway, which regulates cell proliferation, survival and regulated by the levels of G-protein coupled importantly, metabolism. The availability of a mouse model that is faithful Receptor kinase 2 in myeloid cells to the human disease is an invaluable tool for the study of this type of cancer. While much is known about the signaling requirements of PCa, the Rocío Vila-Bedmar1, Elisa Lucas1, Marta Cruces-Sande1, Hanneke metabolic needs of this tumor remain vastly obscure. Willemen2, Annemieke Kavelaars3, Cobi Heijnen3, Cristina Murga1, We have previously demonstrated that in order to meet their energetic Federico Mayor Jr.1 demands, cancer cells reprogram their metabolism through alterations in 1Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (UAM-CSIC), the transcriptional landscape. Universidad Autónoma de Madrid - Instituto de investigación We have approached the study of cancer metabolism starting from a Sanitaria La princesa, Madrid, ES, 2Laboratory of Neuroimmunology systematic analysis of transcriptional regulators that potentially contribute and Developmental Origins of Disease (NIDOD), University Medical to the metabolic switch. To defi ne these factors, we have applied meta- Center Utrecht, Utrecht, NL, 3Department of Symptom Research, analysis constrains that ensure the selection of relevant candidates, Division of Internal Medicine, The University of Texas MD Anderson approach that has been shown to be valid to identify novel metabolic cues. Cancer Center, Houston, Texas, US We have focused on metabolic transcriptional regulators that i) are altered Introduction: G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) is a kinase in a signifi cant proportion of publicly available databases, and ii) that show classically involved in the modulation of the signalling mediated by association with disease-free survival and metastatic disease. many G protein-coupled receptors (GPCR), but it has also been recently This approach allowed us to unveil the tumor suppressive potential of described to contribute to the development of insulin resistance (IR) and the transcriptional co-activator PGC1A. Comparative analysis of PGC1A fat mass accretion in vivo. Accordingly, our previously published studies expression in melanoma, where it has been shown to be up-regulated, has have described that lowering GRK2 levels can confer protection against led us to defi ne the appropriate expression level for gene re-expression in the development of IR in different mice models of this condition, and also prostate cancer. PGC1A re-expression leads to a tumor-suppressive reverse that this kinase plays an important role in the regulation of obesity and Warburg effect in vitro and in vivo, refl ected as an increase in mitochondrial energy expenditure. In this regard, obesity, which is currently considered oxidative metabolism and decrease in lactate production as a consequence as a chronic low-level infl ammatory disease, is a risk factor for the of the transcriptional regulation. Our data suggest that PGC1A is at the development of IR. Particularly, macrophages that infi ltrate adipose tissue top of prostate cancer metabolic reprogramming and that this event is of during obesity have been recognized to have a key contribution to this importance for the development of metabolic therapeutic strategies. metabolic disorder. In this work, we evaluate the potential effect of changes in the levels of GRK2 specifi cally in macrophages to the insulin resistant and obese phenotype observed after a high fat diet (HFD) in mice. P17-8 Materials and Methods: The specifi c contribution of GRK2 in La osteopontina provoca cambios en el macrophages/myeloid cells in the context of IR and obesity has been metabolismo lipídico y biliar en hígado de ratón assessed in a mice model with a specifi c partial deletion of GRK2 in Maitane Núñez myeloid cells, including microglia/macrophages/granulocytes (LysM- , Beatriz Gómez-Santos, Olatz Fresnedo, Patricia GRK2+/-). These mice were fed a HFD and insulin and glucose tolerance Aspichueta as well as insulin signalling in different tissues were explored. University of the Basque Country (UPV/EHU), Leioa, ES Results: Our study showed that LysM-GRK2+/- mice are partially protected La osteopontina (OPN) participa en numerosos procesos fi siológicos y against diet induced obesity (DIO), with no differences in food intake, and patológicos. Diferentes estudios han relacionado el aumento de OPN con display lower fasting plasma glucose levels after high fat feeding. Moreover, la aparición de hepatocarcinoma pero se desconoce si este aumento juega HFD-fed LysM-GRK2+/- mice show improved glucose tolerance and a more algún papel importante en el metabolismo hepático y en la reprogramación potent activation of insulin signals in different insulin target tissues, and are metabólica, característica de este tipo de enfermedades. El objetivo protected against the development of non alcoholic fatty liver disease (NAFLD). principal de este trabajo fue estudiar si el aumento de OPN provoca cambios Conclusion: Our data establish that changes in GRK2 levels specifi cally in en el metabolismo lipídico y biliar en ratón. Para ello, se administró OPN myeloid cells can regulate the development of diet-induced IR. recombinante (rOPN) vía intravenosa en dos días alternos. Se determinaron parámetros corporales, niveles de lípidos y expresión de genes relevantes. Los resultados muestran que la administración de rOPN provoca un P17r-7 (R17-8) aumento de la masa hepática sin cambios de la corporal. Estos cambios están Hacking the master transcriptional program of asociados a una remodelación lipídica, con un aumento en el contenido en prostate cancer metabolism colesterol libre (CL) y sin modifi caciones en el colesterol esterifi cado (CE), diglicérido (DG) y triglicérido (TG). Paralelamente ocurre un descenso Lorea Valcárcel1, Veronica Torrano1, Ana Rosa Cortazar1, Sonia en la expresión de genes implicados en la síntesis de CE, el transporte Fernández Ruiz1, Patricia Zuñiga García1, Mar Lorente2, Alfredo Caro de CL y en el metabolismo de lipoproteínas. La administración de rOPN Maldonado1, Natalia Martín Martín1, Amaia Zabala1, Pere Puigserver3, induce cambios en el metabolismo de glicerofosfolípidos, aumentando el Brett Carver4, Paolo Pinton5, Guillermo Velasco2, Ana Maria Aransay6, contenido hepático de fosfatidilcolina (PC) y fosfatidiletanolamina (PE) y Arkaitz Carracedo7 disminuyendo la expresión de genes relacionados con las vías de síntesis 1CIC bioGUNE, Derio, ES, 2Biochemistry and Molecular Biology de PC. Estas modifi caciónes del metabolismo de CL y PC pueden estar Department, School of Biology, Complutense University, Madrid, directamente relacionadas con un descenso en la expresión de genes

151 Pósters XXXVII Congreso SEBBM implicados en el transporte de sales biliares y en la regulación de la 307 of the IRS-1. Also, a lack of response to Akt phosphorylation via síntesis de ácidos biliares. En conclusión, la exposición a OPN produce mTOR in the presence of insulin was observed. Furthermore, this fatty una remodelación del metabolismo lipídico y biliar en el hígado de ratón. acid produced oxidative stress and endoplasmic reticulum stress as well as rearrangements of the actin cytoskeleton. These effects were not observed Subvencionado por GV (IT-336-10) y UPV/EHU (UFI11/20). with treatment OA. It suggests that saturated fatty acids promote insulin resistance and disturb the podocyte metabolism, playing an important role in the renal dysfunction in the context of lipotoxicity. P17-9 Adaptation of T lymphocyte effector function to Acknowledgements: Fundación de la SEEN, MINECO (BFU2012- 33594), metabolic stress CAM (S2010/BMD-2423) y Ayudas a la Movilidad 2012 URJC.

Sonia Tejedor Vaquero, Cristina López-Rodríguez, José Aramburu Beltrán P17r-11 Departament de Ciències Experimentals i de la Salut, Universitat Mitochondrial ATP governs neuronal response to Pompeu Fabra, Barcelona, ES NMDA, and is maintained by calcium activation In the last years it has been reported that nutrients and metabolism play of ATP-Mg/Pi carrier, SCaMC-3 essential roles in T lymphocyte activation and differentiation. T lymphocytes exhibit specifi c metabolic features depending on their activation and Carlos Rueda, Javier Traba, Ignacio Amigo, Irene Llorente-Folch, polarization stage, being this crucial for their role in adaptive immune Beatriz Pardo, Araceli del Arco, Jorgina Satrustegui responses. Glucose is necessary for T lymphocyte expansion and polarization Departamento de Biología Molecular, Centro de Biología Molecular towards effector Th cells upon antigen stimulation, since it is both a main Severo Ochoa, Consejo Superior de Investigaciones Científi cas-CSIC- fuel for ATP production and a source of building blocks for macromolecule UAM, Universidad Autónoma de Madrid - Centro de Investigación biosynthesis. T lymphocytes can encounter substantial variations in glucose Biomédica en Red de Enfermedades Raras–CIBERER - Instituto de concentration at infl ammation sites and tumors, which raises the question of Investigación Sanitaria Fundación Jiménez Díaz-IIS-FJD, Madrid, ES how glucose fl uctuations affect their capacity to maintain ATP and appropriate Glutamate excitotoxicity is caused by sustained activation of neuronal responses to cytokines. We have explored the response of T lymphocytes to NMDA receptors causing elevations in cytosolic Ca2+ and Na+, activation glucose deprivation during cytokine-driven polarization. Our results show of PARP-1, fall in cytosolic NAD+ and ATP, and delayed Ca2+deregulation that T lymphocytes can resist substantial glucose restriction and maintain (DCD) followed by neuronal death. Mitochondria undergo early changes in ATP levels by arresting their proliferation. Results indicate that expression membrane potential during excitotoxicity but their relation with these events of different cytokines is differentially sensitive to glucose deprivation, and is still controversial. SCaMC-3/Slc25a23 is a mitochondrial ATP-Mg/Pi we are currently analyzing the contribution of various energy-regulatory carrier which transports ATP or ADP in a strictly Ca2+-dependent way and pathways to cytokine expression. Our results suggest that local nutrient is a candidate to play a role in the initial mitochondrial response to NMDA. conditions during T lymphocyte activation can have a signifi cant impact in We have studied the early responses to NMDA in cortical neurons including their function over polarizing pressure from cytokines. a rapid increase in oxygen consumption rate (OCR) which was found to be due to Ca2+-dependent upregulation of respiration. NMDA exposure resulted Funded by the Spanish Government (SAF2009-08066, SAF2012-36535 in a rapid fall in mitochondrial ATP ([ATP]mit) in SCaMC-3 KO neurons, but to CL-R; SAF2011-24268 to JA), Fundació la Marató TV3 (080730, not in control neurons, in which Ca2+-dependent adenine nucleotide uptake 122530, CL-R and JA) and Generalitat de Catalunya (2009 SGR601, through the carrier maintained [ATP]mit. The fall in [ATP]mit in the KO neurons 2014 SGR1153). STV is supported by a predoctoral fellowship BES-2013- was associated with a blunted increase in respiration and a further decrease 062670. in cytosolic ATP levels, indicating that maintenance of [ATP]mit was required to upregulate OXPHOS upon NMDA exposure. The rapid fall in [ATP]

mit and blunted respiratory response were prevented by PARP-1 inhibitors, P17m-10 indicating a rapid NMDA-induced PARP-1 activation as cause. A second Alterations of cellular metabolism of podocytes in consequence of the lack of SCaMC-3 was an early appearance of DCD. This a lipotoxic context was associated with reduced Ca2+ retention capacity (CRC) and increased Ca2+- dependent swelling in mitochondria from SCaMC-3 KO mice incubated with Adriana Izquierdo Lahuerta1 1 2 , Cristina Martínez-García , T-K Yeo , Yurena physiological millimolar concentrations of ADP or Mg-ATP, suggesting that 1 1 2 1 Vivas , Patricia Corrales , Sheldon Chen , Gema Medina-Gómez failure to maintain matrix AdN is responsible for both the impaired CRC in 1 2 Universidad Rey Juan Carlos, Madrid, ES, Division of Nephrology/ mitochondria and earlier neuronal DCD. SCaMC-3 KO neurons were more Hypertension, Northwestern University, Chicago, US vulnerable to glutamate excitotoxicity in vitro and SCaMC-3 KO mice were In last decades there has been a rapid change in life style that has more susceptible to kainate-induced seizures, showing that SCaMC-3 is an led to an alarming increase in the prevalence of obesity and obesity- early player in excitotoxic cascade both in vitro and in vivo. associated complications. Obese patients are at increased risk of developing hypertension, heart disease, insulin resistance, dyslipidemia, type 2 diabetes and renal disease. The excess of calories are stored as P17r-12 triglycerides in adipose tissue, and also accumulate ectopically in other G protein-coupled receptor kinase 2 regulates: organs, including kidney, which contributes to the damage through a toxic The development of non-alcoholic fatty liver disease process named lipotoxicity. Recently, evidences suggest that renal lipidic accumulation leads to glomerular damage and more specifi cally, whether M Cruces Sande1, R Vila Bedmar1, E Lucas1, HL Willemen2, this accumulation produces podocyte dysfunction. The aim of this study CJ Heijnen3, A Kavelaars3, Á González-Rodríguez4, ÁM Valverde4, was to analyze the mechanisms underlying the process of lipotoxicity in F Mayor Jr1, C Murga1 podocytes, key cells in glomerular fi ltration barrier maintenance. We have 1Centro de Biología Molecular Severo Ochoa UAM-CSIC, used conditional immortalized cultured mouse podocytes treated with Universidad Autónoma de Madrid - Instituto de Investigación different doses (100, 500 and 750 μM) of palmitic acid (PA) and oleic acid Sanitaria La Princesa, Madrid, ES, 2Laboratory of Neuroimmunology (OA), for 24h. PA treatment produced an intracellular accumulation of lipid and Developmental Origins of Disease (NIDOD), University Medical droplets and abnormal glucose and lipid metabolism. Such accumulation Center Utrecht, Utrecht, NL, 3Department of Symptom Research, led to an infl ammation associated to an increased phosphorylation at Ser Division of Internal Medicine, The University of Texas MD Anderson

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Cancer Center, Houston, Texas, US, 4Centro de Investigación order to study whether GRK2 could be a good target to ameliorate the Biomédica en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas detrimental consequences of HFD in the heart. Given the lack of selective Asociadas (CIBERDEM), ISCIII, Barcelona - Instituto de GRK2 pharmacological inhibitors, we have used GRK2 hemizygous Investigaciones Biomédicas Àlberto Sols´ CSIC-UAM, Madrid, ES mice (GRK2+/-) as a model to assess the effects of a sustained systemic Background: Insulin resistance (IR) and obesity are major health problems inhibition of GRK2 on cardiac tissue. We fi nd that, after 12 weeks of and important risk factors for the development of non-alcoholic fatty liver HFD, insulin-dependent cardiac responses are impaired in young disease (NAFLD), a disease spectrum that includes hepatic steatosis, wild type (WT) while preserved in GRK2+/- mice. Besides, adult 10 non-alcoholic steatohepatitis (NASH), fi brosis, and cirrhosis. G protein- month-old WT mice fed a HFD for 32 weeks presented cardiomyocyte coupled receptor kinase 2 (GRK2), fi rst identifi ed as a G protein-coupled hypertrophy and pathological cardiomegaly, while in HFD-fed GRK2+/- receptor regulator, has been recently described to play a relevant role in animals heart size was indistinguishable from that of chow-fed mice. IR and obesity in vivo. GRK2 hemizygous (GRK2+/-) mice are protected In addition, we detected that cardiac tissue of GRK2+/- adult mice fed against high fat diet (HFD)-induced systemic and hepatic insulin resistance with standard diet shows enhanced cardiac insulin sensitivity compared and obesity. However, the effect of GRK2 in the development of HFD- with aged-matched WT hearts, and displays features of non-pathological induced NAFLD has not been studied. mild cardiac hypertrophy. These results highlight the importance of Materials and methods: Given the lack of a potent and specifi c GRK2 maintaining GRK2 levels under a certain physiological level to preserve inhibitor, we used a global tamoxifen (Tx)-inducible murine model insulin-mediated cardioprotection. in which GRK2 levels are decreased once HFD-induced IR has been established. Also, a long term chronic state of IR and obesity was triggered by feeding wild type (WT) and GRK2+/- mice a 32 week-long HFD. To P17-14 discriminate the effects of the differential body weight gain, we fed mice Increased expression of carnitine with a methionine-choline defi cient diet (MCD), which induces NAFLD palmitoyltransferase 1A in rat ventromedial independently of fat mass accretion. hypothalamus produces hyperphagia, overweight Results: Systemic insulin sensitivity was preserved after decreasing GRK2 levels in the middle of a high fat feeding using tamoxifen, and accordingly and alters the hyphothalamic lipidomic profile enhanced insulin signaling was observed in the liver of HFD-fed Tx-induced Joan Francesc Mir1, Paula Mera1, Gemma Fabrias2, Fina Casas2, Sofi a GRK2-/- mice. Moreover, hepatic steatosis, a hallmark of NAFLD, was Costa2, Minéia Weber1, Raquel Fucho1, María Calderón-Domínguez1, decreased in these mice. Also, different signs of infl ammation present in WT Harald Petri3, Núria Casals4, Laura Herrero1, Dolors Serra1 mice were absent in Tx-induced GRK2-/- animals. Nevertheless, after a long 1Department of Biochemistry, Facultat de Farmàcia, Universitat de term HFD we found no differences in steatosis between WT and GRK2+/- Barcelona, Institut de Biomedicina de la Universitat de Barcelona mice, despite the decrease in body weight gain and liver weight. Finally, we (IBUB) and CIBER Fisiopatología de la Obesidad y la Nutrición found an increase in GRK2 protein levels in the liver of mice fed a MCD, (CIBEROBN), Instituto Carlos III, Barcelona, ES, 2Department a well established model of NASH, similar to what is detected during HFD of Biomedicinal Chemistry, Institute of Advanced Chemistry of feeding in WT animals, and we are further characterizing this model. Catalonia (IQAC)/CSIC, Barcelona, ES, 3UniQure, Amsterdam, NL, Conclusion: Taken together, these results suggest a role for GRK2 in the 4Universitat Internacional de Catalunya, Sant Cugat del Vallés, ES establishment and development of NAFLD. Lipid metabolism in hypothalamic neurons is a key pathway in food intake modulation and glucose homeostasis. Carnitine palmitoyltransferase (CPT) 1A is the rate-limiting enzyme in mitochondrial fatty acid oxidation P17r-13 Obesity related cardiac hypertrophy is modulated and it has recently been proposed as a crucial mediator of fasting and ghrelin orexigenic signaling. However, the relationship between changes in by G protein-coupled receptor kinase 2 CPT1A activity and the intracellular downstream effectors that contribute Elisa Lucas1, María Jurado_Pueyo1, Rocío Vila-Bedmar1, Juan J. to appetite modulation in hypothalamus is not fully understood. Lazcano2, Javier Gómez-Ambrosi3, Gema Frühbeck3, Javier Díez4, The aim of our study is to analyze the peripheral and central effect of Cristina Murga1, Federico Mayor Jr.1 an increased CPT1A expression in the ventromedial nucleus of the 1Departamento de Biología Molecular y Centro de Biología Molecular hypothalamus (VMH). Severo Ochoa (UAM-CSIC) - Instituto de Investigación Sanitaria We used adeno-associated virus (AAV) to express a permanently active La Princesa, Madrid, ES, 2Centro Nacional de Investigaciones form of CPT1A (malonyl-CoA-insensitive CPT1A, here CPT1AM) in rat Cardiovasculares (CNIC), Madrid, ES, 3Metabolic Research VMH. We have observed that permanent activation of CPT1A in VMH led Laboratory, Universidad de Navarra, CIBERobn, Pamplona, ES, to hyperphagia, overweight, hyperglycemia and the development of insulin 4Division of Cardiovascular Sciences, Centre for Applied Medical resistance. These effects seem to be triggered by changes in the expression Research (CIMA) and Department of Cardiology and Cardiovascular of neurotransmitter transporters and hypothalamic changes in structural Surgery, University Clinic, University of Navarra, Pamplona, ES and bioactive complex lipids such as ceramides and phospholipids.These data highlight the role of ventromedial CPT1A in the modulation of food The heart is a constitutive energy-demanding organ. Although intake and consequently glucose homeostasis. mitochondrial lipid oxidation is the principal energy source in the healthy heart, the maintenance of glucose utilization is necessary for normal cardiac function. Nevertheless, alterations in cardiac energy metabolism P17-15 downstream neurohormonal stimulation play a crucial role in the Modulación de la composición lipídica pathogenesis of heart failure (HF). One biomarker molecule upregulated in human and several animal models of HF is G protein-coupled receptor de cuerpos lipídicos en hígado de ratón. Efecto kinase 2 (GRK2), a kinase originally discovered to regulate G protein- de una dieta rica en grasa coupled receptor desensitization. Previous studies have described the Hiart Navarro Imaz potential role of GRK2 as a direct modulator of insulin signaling in , Ibone Labiano Ciriza, Yuri Rueda Estévez, Lino several tissues in addition to its classical role in cardiac βAR signaling Arisqueta Herranz, Olatz Fresnedo Aranguren regulation which can also have an indirect effect on insulin signaling. Departamento de Fisiología Universidad del pais vasco/ Euskal Since we have observed that GRK2 levels are increased in the hearts Herriko Unibersitatea (UPV/EHU), Leioa, ES of high fat diet (HFD)-fed animals and also in ob/ob mice, we aimed Los cuerpos lipídicos (CL) citoplasmáticos son estructuras especializadas to explore the effect of lowering GRK2 levels during HFD feeding in en el almacenaje y movilización de lípidos que se acumulan en una

153 Pósters XXXVII Congreso SEBBM amplia diversidad de situaciones fi siológicas y patológicas. La dieta y los P17-17 condicionantes metabólicos afectan a los niveles hepáticos de CL. Se han Activación de blancos metabólicos río abajo realizado diversos estudios proteómicos con la fi nalidad de establecer en de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK) qué modo se regula la composición de este orgánulo pero se desconocen hepática por la hormona tiroídea (T ) las adaptaciones cuantitativas en el lipidoma. En este estudio describimos 3 cómo afecta una dieta rica en grasa a la composición de los CL hepáticos Luis Videla Cabrera1, Romina Vargas Villagrán1, Pamela Cornejo en ratones salvajes y defi cientes en leptina (ob/ob), que presentan esteatosis Zamorano2, Virginia Fernández Arancibia1 hepática por hiperfagia. Es destacable la similitud en la composición lipídica 1Facultad de Medicina Universidad de Chile, Santiago, CL, 2Faculad (triglicéridos, diglicéridos, colesterol libre y esterifi cado, fosfatidilcolina de Medicina Universidad Diego Portales, Santiago, CL y fosfatidiletanolamina) entre las dos cepas analizadas alimentadas con La administración de T3 activa a la AMPK hepática como respuesta una dieta control. La característica más remarcable de los CL aislados adaptativa frente a condiciones de alta demanda energética. El hígado de hígado de animales tratados con dieta rica en grasa es la disminución de ratas macho Sprague-Dawley tratadas con 0,1 mg T3/kg presentó un en el contenido de colesterol esterifi cado (CE). Esta disminución es aumento (P<0,05) en los niveles de pAMPK (ELISA) y de sus blancos muy marcada en los ratones ob/ob y va acompañada de modifi caciones acetil-CoA carboxilasa (pACC) y proteína de unión al elemento de relevantes en los parámetros bioquímicos plasmáticos e índice hepático. El respuesta a AMP-cíclico (pCREB) (Western blot), con mayor expresión conjunto de resultados indica que la mejora de la función hepática de los de los ARNm de ACC, CREB y del receptor activado por proliferadores ratones obesos alimentados con la dieta rica en grasa podría estar vinculada peroxisomales-γ coactivador-1α (PGC-1α)(qPCR). Conjuntamente, a una mejora en la gestión del colesterol acumulado en los CL hepáticos. T3 aumentó (P<0,05) la expresión proteica y de ARNm de la carnitina El incremento en el transporte reverso de colesterol podría jugar un papel palmitoil transferasa-1α (CPT-1α), acil-CoA oxidasa 1 (ACOX1) y acil- central en esta adaptación. CoA tioesterasa 2 (ACOT2) hepáticas, con mayores niveles séricos de β-hidroxibutirato. Se concluye que la fosforilación de AMPK hepática por

Subvencionado por Gobierno Vasco (IT-336-10) y UPV/EHU (UFI11/20). T3 se asocia a la mayor activación de sus blancos directos ACC, CREB y PGC-1α conduciendo a un incremento en la capacidad de oxidación de ácidos grasos, asociado al aumento en las enzimas relacionadas CPT-1α, P17m-16 (R17-7) ACOX1 y ACOT2, y evidenciado por la respuesta cetogénica consecuente. Alteraciones en la vía tumoral Wnt/β-catenina La activación de la AMPK constituiría un mecanismo de señalización en linfocitos circulantes inducidas por clave para la regulación de la dinámica energética hepática en apoyo de los mecanismos de preacondicionamiento, protección y/o reparación metabolitos relacionados con la diabetes otorgados por T3. Valle Montalvo-Romeral1, María Gutiérrez-Salmerón1, Ana Chocarro- Financiado por FONDECYT 1120034. Calvo2, José Manuel García-Martínez1, Antonio De La Vieja3, Custodia García-Jiménez1 1Universidad Rey Juan Carlos, Alcorcón, ES, 2Ludwig Institute for P17r-18 Cancer Research - University of Oxford, Oxford, UK, 3Instituto de Mathematical modelling of the amyloidogenic Salud Carlos III, Majadahonda (Madrid), ES pathway during Alzheimer’s disease in the Introducción: La población diabética presenta un riesgo incrementado de desarrollar ciertos cánceres tejido-específi cos. Los cánceres asociados a context of the lipid membrane diabetes suelen presentar alteraciones en la vía Wnt/β-catenina. Nuestro Guido Rosales Santos1, Mario Díaz2, Néstor V. Torres1 grupo ha demostrado que la acumulación nuclear de β-catenina, efector de la 1Grupo de Biología de Sistemas y Modelización Matemática. señalización tumoral por Wnt, sólo se produce en presencia de alta glucosa Departamento de Bioquímica, Microbiología, Biología Celular y (hiperglucemia). Hipotetizamos que otros metabolitos característicos Genética. Universidad de La Laguna, La Laguna, ES, 2Laboratorio de la diabetes pueden inducir alteraciones en proteínas relacionadas con de Fisiología y Biofísica de Membranas, Departamento de Biología la vía Wnt/β-catenina cooperando con la alta glucosa para favorecer la Animal y Edafología y Geología, La Laguna, ES aparición del fenotipo tumoral. Los linfocitos circulantes expresan los Alzheimer’s disease (AD) is the most common cause of dementia. There is componentes de la vía Wnt y en pacientes diabéticos están expuestos a over 30 million people affected worldwide, and this number is increasing dichos metabolitos, por tanto planteamos la posibilidad de encontrar en every year. There is not therapy for AD. It is caused by the neuronal death ellos, marcadores tempranos de riesgo de cáncer asociado a diabetes. produced mainly by the toxic effect of amyloid-β peptides accumulation, Objetivo: Identifi car alteraciones moleculares en la vía Wnt/β-catenina en after the precursor protein (APP) is cleaved by a specifi c beta secretase linfocitos circulantes humanos producidas por el ambiente metabólico de (BACE). APP and BACE proteins are located in the cellular membrane la diabetes. of neurons. Specifi cally, both APP and BACE reside within detergent Metodología: Se usan linfocitos humanos procedentes de voluntarios resistant domains called lipid rafts. It is known that alterations in the lipid sanos y la línea tumoral inmortalizada de linfocitos Jurkat. Se compara la composition of lipid rafts play an important role in the disease, being this respuesta de los linfocitos sanos y los tumorales a estímulos metabólicos issue a very important aspect for fi nding a cure to AD. característicos de la diabetes. Los resultados se analizan por western-blot, Systemic approach to the study of AD let us to quantify the importance qPCR y citometría. of each component of the causal pathway to produce amyloid-β and its Resultados: Se observan cambios en los componentes de la señalización relationship with the lipid composition of the membrane. The objective tumoral Wnt/ β-catenina a nivel de expresión génica (p300), niveles of this work is to use mathematical modeling to understand the role of the proteícos (β-catenina) y funcionalidad (exhibición de receptor LRP6) membrane composition on AD and try to fi nd an effective therapy for this en linfocitos humanos sanos que difi eren de la respuesta observada en disease. linfocitos tumorales (Jurkat). Conclusiones: Es posible detectar cambios a distintos niveles de la vía This work was funded by research Grants from Spanish MINECO Wnt/β-catenina en linfocitos humanos expuestos al ambiente metabólico (BIO2011-29233-C02-02 and SAF2010-22114-C02-0) and from Agencia de la diabetes. Nuestros resultados sugieren la posibilidad de usar linfocitos Canaria de Investigación, Innovación y Sociedad de la Información (Ref. circulantes de pacientes diabéticos para la detección precoz de marcadores Project PIL2070901 and PIL2071001). GS is recipient of a fellowship from predictivos de tumores asociados a diabetes. Fundación Cajacanarias para posgraduados.

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P17r-19 (R17-1) P17-21 Adaptation of T lymphocyte effector function Regulation of hypoxia response by NO to metabolic stress in pluripotent stem cells

Sonia Tejedor Vaquero, Cristina López Rodríguez, José Aramburu Estefanía Caballano Infantes1, Ana B. Hitos2, Irene Díaz2, Gladys M. Beltrán Cahuana2, Abdelkrim Hmadcha3, Fran Martín4, Bernat Soria5, Juan Departamento de Ciencias Experimentales y de la Salud, R. Tejedo4, Francisco J. Bedoya4 Universidad Pompeu Fabra, Barcelona, ES 1Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa (CABIMER) y Universidad Pablo de Olavide, Sevilla, ES, 2CABIMER, In the last years it has been reported that nutrients and metabolism Universidad Pablo de Olavide, y Centro de Investigación Biomédica play essential roles in T lymphocyte activation and differentiation. T en Red de Diabetes y Enfermedades Metabólicas Asociadas lymphocytes exhibit specifi c metabolic features depending on their (CIBERDEM), Sevilla, ES, 3CABIMER, Fundación Progreso y activation and polarization stage, being this crucial for their role in adaptive Salud, y Red de Terapia Celular (Tercel), Sevilla, ES,4CABIMER, immune responses. Glucose is necessary for T lymphocyte expansion and Universidad Pablo de Olavide; Red de Terapia Celular (Tercel), y polarization towards effector Th cells upon antigen stimulation, since it CIBERDEM, Sevilla, ES, 5CABIMER, Fundación Progreso y Salud; is both a main fuel for ATP production and a source of building blocks Red de Terapia Celular (Tercel), y CIBERDEM, Sevilla, ES for macromolecule biosynthesis. T lymphocytes can encounter substantial variations in glucose concentration at infl ammation sites and tumors, which The expansion of pluripotent cells (ESCs and iPSCs) under conditions that raises the question of how glucose fl uctuations affect their capacity to maintain their pluripotency is necessary to implement a cell therapy program. maintain ATP and appropriate responses to cytokines. We have explored the Previously, we have described that low nitric oxide donor diethylenetriamine/ response of T lymphocytes to glucose deprivation during cytokine-driven nitric oxide adduct (DETA-NO) added to the culture medium, promote the polarization. Our results show that T lymphocytes can resist substantial expansion of these cell types. The mechanisms involved in this response glucose restriction and maintain ATP levels by arresting their proliferation. are not yet known. We present evidences that when ESC and iPSCs are Results indicate that expression of different cytokines is differentially grown under normoxia in presence of Nitric Oxide (NO) triggers a similar sensitive to glucose deprivation, and we are currently analyzing the response to hypoxia, thus maintaining the pluripotency. We have studied contribution of various energy-regulatory pathways to cytokine expression. the stability of protein HIF-1α (Hypoxia Inducible Factor) in presence of Our results suggest that local nutrient conditions during T lymphocyte low NO. Because of the close relationship between hypoxia, metabolism, activation can have a signifi cant impact in their function over polarizing mitochondrial function and pluripotency we have analyzed by qRT-PCR the expression of genes involved in glucose metabolism and the glycolytic pressure from cytokines. pathway such as: HK2, LDHA and PDK1; besides other gene targets of HIF. We further analyzed the expression of genes involved in mitochondrial Funded by the Spanish Government (SAF2009-08066, SAF2012-36535 biogenesis such as PGC1α, TFAM and NRF1 and we have observed that to CL-R; SAF2011-24268 to JA), Fundació la Marató TV3 (080730, low NO maintains the same expression that in hypoxia. The study of the 122530, CL-R and JA) and Generalitat de Catalunya (2009 SGR601, mitochondrial membrane potential using MitoTracker dye, showed a 2014 SGR1153). STV is supported by a predoctoral fellowship BES-2013- slight decrease in the membrane potential in cells with NO in normoxia , 062670. this indicated that NO might decrease the mitochondrial function. We will analyze other metabolic parameters, to determinate if this molecule regulates mitochondrial function and mimics Hypoxia Response. The knowledge of P17-20 the role of NO in the Response to Hypoxia and the mechanisms that help Implicación de FAT/CD36 en la modulación to maintain self renewal in pluripotent cells grown under normoxia, can del metabolismo lipídico hepático help to the design of culture media where NO could be optimal for stem cell expansion in the performance of future cell therapies. Larraitz Fernández-Ares, Daniela Mestre, Juan Luis García- Rodríguez, Igor Aurrekoetxea, Xabier Buqué, Patricia Aspichueta Subvencionado por: Universidad del País Vasco (UPV/EHU), Bilbao, ES - Ministerio de Economía y Competitividad-Secretaría de Estado de CD36 es una glicoproteína que en la enfermedad del hígado graso no Investigación Desarrollo e Innovación (IPT-2011-1615-900000) alcohólica se sobreexpresa en la membrana plasmática del hepatocito - Junta de Andalucía (CTS- 7127/2011) donde juega un papel clave en la entrada de AG, siendo su destino metabólico desconocido. El objetivo fue investigar la implicación de CD36 en la modulación del metabolismo lipídico hepático e investigar P17-22 el mecanismo. Papel de los factores de transcripción E2F1 Se infectaron hepatocitos de ratón C57/6J con adenovirus sentido para y E2F2 en la esteatosis hepática CD36 y LacZ. Se analizó la incorporación de sustratos radiactivos en los principales lípidos hepáticos, y en los metabolitos solubles ácidos Daniela Mestre Congregado1, Igor Aurrekoetxea1, Larraitz secretados. Se investigó la expresión de proteínas implicadas en estrés Fernández-Ares1, Xabier Buqué1, Ainhoa Iglesias2, Ana Zubiaga2, de retículo endoplásmico, actividad mTORC1 y se analizó su relación Patricia Aspichueta1 con el proceso de autofagia en presencia de inhibidores de la función 1Departamento de Fisiología, Facultad de Medicina y Odontología, lisosomal. Universidad del País Vasco UPV/EHU, Leioa, ES, 2Departamento de La sobreexpresión de CD36 aumentó la incorporación de oleato en Genética, Antropología Física y Fisiología Animal, Facultad de Ciencia triglicéridos y en los metabolitos solubles ácidos secretados y de acetato y Tecnología, Universidad del País Vasco UPV/EHU, Leioa, ES en fosfolípidos. Además, provocó el incremento en p-S6 y la inhibición del La enfermedad del hígado graso no alcohólica (EHGNA) se desarrolla en fl ujo de autofagia, compatible con el incremento en la actividad mTORC1. un 80% de pacientes obesos, lo que se considera un factor de riesgo para el La inhibición de la función lisosomal disminuyó los niveles de p-S6 y desarrollo de carcinoma hepatocelular (CHC). En el desarrollo de EHGNA revirtió la secreción de solubles ácidos y la esterifi cación lipídica. y de CHC se producen importantes adaptaciones metabólicas. E2F1, Como conclusión, la sobreexpresión de CD36 en el hepatocito induce una regulador del metabolismo oxidativo y cuya ausencia confi ere resistencia remodelación metabólica ligada a la activación de mTORC1. El incremento a obesidad, es junto con otros factores de transcripción E2F importante en la síntesis de novo de fosfolípidos y esterifi cación de triglicéridos sugiere regulador del ciclo celular. El objetivo fue defi nir el papel de los factores de una mayor actividad de fosfolipasas lo que podría inducir mTORC1. transcripción E2F1 y E2F2 en la instauración de hepatoesteatosis.

155 Pósters XXXVII Congreso SEBBM

Se utilizaron ratones macho de 3 meses E2F1-/-, E2F2-/- y sus controles. La ingesta de dietas hiperlipídicas (HL) provoca una hiperlipidemia que Se indujo esteatosis administrando una dieta rica en grasa (HFD) durante conlleva una mayor captación de ácidos grasos por parte del músculo 10 semanas. Se analizó la secreción hepática de triglicéridos (TG), el cardíaco. La situación de lipotoxicidad que se genera se acompaña de contenido hepático en TG y su modulación en condiciones pro-esteatóticas resistencia a la insulina, estrés oxidativo, disfunción mitocondrial y como la inhibición de la secreción de VLDL y el ayuno de 24 horas. disminución de la utilización de glucosa, que puede conducir a una pérdida -/- La HFD indujo esteatosis en ratones control. En ratones E2F2 el contenido de la capacidad contráctil y, por ende, a un fallo cardíaco. La rosiglitazona hepático en TG era el 40% del de los ratones control y permaneció invariable (Rsg) es una tiazolidinediona que aumenta la sensibilidad a la insulina y tras la administración de la HFD. Sin embargo, el almacén de TG inducido disminuye la lipotoxicidad periférica, a través de la mejora de la función por el ayuno de 24 horas era superior en los ratones E2F2-/- que en los E2F1- mitocondrial. En estudios previos hemos demostrado la existencia de un /- y sus controles. En animales E2F1-/-, la HFD provocó el incremento de TG, dimorfi smo sexual en la función y biogénesis mitocondriales, lo cual nos aunque no llegó a los valores de sus controles, lo que es atribuible al aumento en la secreción de TG como lo demuestra su inhibición farmacológica. lleva a plantearnos si existen diferencias entre sexos en el efecto de la Rsg En conclusión, los factores de transcripción E2F1 y E2F2 están implicados sobre la lipotoxicidad cardíaca asociada a la administración de una dieta en la instauración de la hepatoesteatosis por HFD. E2F1 ejerce un efecto HL durante 15 semanas en ratas. La Rsg (100mg/kg dieta) se administró a sobre la secreción hepática de TG y E2F2 podría estar implicado en los la mitad de los animales durante las dos últimas semanas del tratamiento. procesos de síntesis de novo de lípidos. En respuesta a la Rsg, las hembras responden de manera más acusada a la disminución de triglicéridos en el miocardio provocada por la HL, Gobierno Vasco IT-336-10. lo que se acompaña de una mayor activación de la vía de señalización a la insulina y el consiguiente incremento en la utilización de la glucosa. Paralelamente, las ratas hembra tratadas con Rsg muestran un mayor P17-23 metabolismo mitocondrial y un menor estrés oxidativo en el miocardio. Papel de la osteopontina en la modulación del En conclusión, la Rsg promueve una mayor movilización lipídica en el metabolismo hepático durante el envejecimiento músculo cardíaco de las hembras, mejorando del fenotipo lipotóxico típico que es característico de la cardiomiopatía diabética. Beatriz Gómez-Santos, Maitane Núñez-García, Olatz Fresnedo, Patricia Aspichueta Financiado por MECD (SAF2010-21792, una beca FPU), CAIB Departamento de Fisiología Universidad del pais vasco/ Euskal Herriko Unibersitatea (UPV/EHU), Leioa, ES (PCTIB-31/2011, una beca FPI), FSE y FEDER-Unión Europea “Una manera de hacer Europa”. El envejecimiento está caracterizado por una pérdida progresiva de la integridad fi siológica. La osteopontina (OPN) es una glicoproteína multifuncional que muestra expresión incrementada en patologías derivadas del síndrome metabólico y en varios tipos de cáncer, siendo la prevalencia de P17r-25 (R17-3) estas patologías mayor con la edad. Nuestro objetivo fue determinar si OPN Protein Kinase A-dependent phosphorylation modula el metabolismo lipídico hepático durante el envejecimiento y defi nir el of the ATPase Inhibitory Factor 1 (IF1) mecanismo implicado. Se emplearon ratones defi cientes en OPN (OPN-KO) y determines the metabolic status of the cell sus controles, de 3 y 10 meses de edad. Se estudió el contenido lipídico hepático y actividades enzimáticas involucradas en el metabolismo de triglicéridos y Javier García-Bermúdez1, María Sánchez-Aragó2, José M. Cuezva2 colesterol. Se analizaron parámetros séricos y rutas de señalización ligadas 1Centro de Biología Molecular, Madrid, ES, 2Centro de Biología a procesos de síntesis y oxidación de lípidos. Los resultados mostraron que Molecular Severo Ochoa (CSIC-UAM), Madrid, ES en animales control los niveles séricos de OPN aumentaban con la edad. La defi ciencia en OPN durante el envejecimiento resultó en un aumento del Mitochondria play key roles in cellular metabolism and bioenergetics índice hepático, del contenido hepático en colesterol esterifi cado y triglicérido and are the master regulators in the execution of cell-death mediating así como en glicerofosfolípidos. Los cambios en las actividades enzimáticas intracellular signaling by calcium and reactive oxygen species (ROS). analizadas no parecían ser causantes del incremento lipídico observado en During the last years, the interest in mitochondria has experienced los ratones OPN-KO de mayor edad, en los que la actividad mTORC1 estaba a boost because of its involvement in a growing number of human disminuida. Se observó mayor expresión proteica de la acetil-CoA carboxilasa diseases displaying very different phenotypes. In mitochondria, the H+- y menor porcentaje de su forma fosforilada compatible con su mayor actividad. ATP synthase is the rotatory engine of the inner membrane that utilizes Como conclusión, OPN modula el metabolismo lipídico hepático durante el the proton gradient generated by respiration for the synthesis of most envejecimiento. Su falta resulta en el incremento del almacén lipídico, debido, cellular ATP in normal aerobic differentiated cells. The expression level al menos en parte, al incremento de la síntesis de novo. of the nuclear encoded inhibitor peptide called ATPase Inhibitory Factor 1 (IF1) regulates the synthase activity of the H+-ATP synthase, being a Subvencionado por GV (IT-336-10) y UPV/EHU (UFI11/20). central player in controlling the fl ux of ATP being produced by oxidative phosphorylation (OXPHOS). IF1 is a very short half-life protein that is highly overexpressed in most prevalent human carcinomas. The P17-24 Dimorfismo sexual en el efecto de la rosiglitazona overexpression of IF1 in cancer promotes an increase in the fl ux of aerobic glycolysis and a ROS-mediated signal that results in retrograde signaling to sobre la lipotoxicidad del músculo cardíaco the nucleus to activate programs of cell survival. However, the mechanisms asociada a una dieta hiperlipídica that regulate the expression and activity of IF1 remain elusive. Herein, we demonstrate in human cancer cell lines that IF1 is regulated by post- Miquel Sbert-Roig, Marco Bauzá-Thorbrügge, Bel M. Galmés- Pascual, Francisco J. García-Palmer, Isabel Lladó, Ana M. Proenza, translational mechanisms. We show that the phosphorylation of IF1 on a Magdalena Gianotti serine residue by cyclic AMP-dependent protein kinase A (PKA) prevents + Grup de Metabolisme Energètic i Nutrició, Dept. Biologia Fonamental its binding to the H -ATPsynthase complex. Moreover, de-phosphorylated i Ciències de la Salut y IUNICS, Universitat de les Illes Balears. IF1 is strongly bound to the complex and exerts an enhanced inhibition on IdISPa, Palma de Mallorca. Centro de Investigación Biomédica its enzymatic activity. en Red Fisiopatología de la Obesidad y la Nutrición (CIBERobn, CB06/03/0043), Instituto de Salud Carlos III, Palma de Mallorca, ES Supported by SAF2013-41945-R.

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P17-26 Se utilizaron ratas Wistar de ambos sexos alimentadas durante 16 semanas Dimorfismo sexual en la respuesta de la con dieta HL que, a dos semanas del sacrifi cio y para la mitad de los paraoxonasa a la suplementación de una dieta animales, se suplementó con Rsg (100mg/kg dieta). En muestras de TABr hiperlipídica con rosiglitazona se determinaron parámetros marcadores de función, biogénesis, dinámica y capacidad oxidativa mitocondriales, así como mecanismos antioxidantes. Bel M. Galmés-Pascual, Marco Bauzá-Thorbrügge, Miquel Sbert- La suplementación con Rsg provocó un aumento de la masa y la dinámica Roig, Magdalena Gianotti, Ana M. Proenza, Francisco J. García- mitocondriales en ambos sexos, aunque mucho más acentuado en los Palmer, Isabel Lladó machos. Sin embargo, la capacidad oxidativa únicamente se incrementó Grup de Metabolisme Energètic i Nutrició, Dept. Biologia Fonamental en las hembras. La respuesta antioxidante, en cambio, se estimuló en igual i Ciències de la Salut y IUNICS, Universitat de les Illes Balears. medida en ambos sexos. IdISPa, Palma de Mallorca. Centro de Investigación Biomédica En conclusión, el TABr parece responder de manera diferencial según en Red Fisiopatología de la Obesidad y la Nutrición (CIBERobn, el sexo a los efectos inductores de la biogénesis de la Rsg, aumentando CB06/03/0043), Instituto de Salud Carlos III, Palma de Mallorca, ES la proliferación mitocondrial en las ratas macho y la diferenciación La ingesta de dietas hipercalóricas induce infl amación y estrés oxidativo mitocondrial en las hembras. Esta respuesta heterogénea podría deberse y aumenta el riesgo cardiovascular. Estudios previos han puesto de a la acción de las hormonas sexuales, de acuerdo con resultados previos manifi esto que las ratas hembra presentan un menor daño oxidativo tisular obtenidos in vitro que muestran un efecto opuesto del estradiol y de la como resultado de una mayor capacidad antioxidante y funcionalidad testosterona sobre la biogénesis mitocondrial. mitocondrial. El enzima paraoxonasa 1 (PON1) es el principal responsable de la función antiaterogénica de las HDL, viéndose alterada su actividad Estudio fi nanciado por MECD (SAF2010-21792, una beca FPU), CAIB por la dieta. La rosiglitazona (Rsg), un fármaco que mejora el perfi l de (PCTIB-31/2011, una beca FPI), FSE y FEDER-Unión Europea “Una sensibilidad insulínica, estimula la función mitocondrial y reduce el estado manera de hacer Europa”. de infl amación. El objetivo fue determinar las diferencias entre sexos en la respuesta a la Rsg de marcadores de estrés oxidativo y, en particular, de la actividad P17-28 y los niveles séricos de la PON1. Para ello se utilizaron ratas macho y La suplementación de una dieta hipercalórica hembra Wistar de 22 semanas, alimentadas durante 16 semanas con una con rosiglitazona mejora la sensibilidad hepática dieta hiperlipídica (22,5% de materia grasa). Durante las últimas dos semanas de tratamiento, la mitad de los animales recibieron la misma dieta a la insulina en las ratas macho pero no en las suplementada con Rsg (100mg/kg dieta). hembras La Rsg mejoró el perfi l de sensibilidad a la insulina, aumentó la capacidad antioxidante total y disminuyó la peroxidación lipídica sérica de manera Bel M. Galmés-Pascual, Miquel Sbert-Roig, Marco Bauzá- más acusada en las ratas macho que en las hembras. La suplementación Thorbrügge, Ana M. Proenza, Magdalena Gianotti, Isabel Lladó, Francisco J. García-Palmer de la dieta hiperlipídica con Rsg aumentó la expresión hepática de PON1 en las ratas macho, mientras que en las hembras produjo un aumento de la Grup de Metabolisme Energètic i Nutrició, Dept. Biologia Fonamental actividad del enzima. Estos resultados ponen de manifi esto un dimorfi smo i Ciències de la Salut y IUNICS, Universitat de les Illes Balears, sexual en los efectos de la Rsg a nivel de protección antioxidante que IdISPa - Centro de Investigación Biomédica en Red Fisiopatología de podrían condicionar el riesgo cardiovascular en función del sexo. la Obesidad y la Nutrición (CIBERobn, CB06/03/0043), Instituto de Salud Carlos III, Palma de Mallorca, ES Estudio fi nanciado por MECD (SAF2010-21792, una beca FPU), CAIB La ingesta de dietas hipercalóricas conduce a resistencia a la insulina y a (PCTIB-31/2011, una beca FPI), FSE y FEDER-Unión Europea “Una acumulación de grasa en el hígado. La rosiglitazona (Rsg) es un agonista de manera de hacer Europa”. PPARγ que mejora la sensibilidad a la insulina de forma directa en el tejido adiposo blanco y, gracias a la secreción de adiponectina por los adipocitos, en el músculo y en el hígado. P17-27 (R17-4) El objetivo fue determinar el efecto de la suplementación con Rsg Dimorfismo sexual en la función y biogénesis de una dieta hipercalórica sobre la sensibilidad hepática a la insulina y mitocondrial del tejido adiposo retroperitoneal en a la adiponectina en ratas macho y hembra. Se utilizaron ratas Wistar respuesta a la suplementación con rosiglitazona alimentadas durante 16 semanas con una dieta hiperlipídica rica en en ratas alimentadas con dieta hiperlipídica sacarosa (HLS, 22,5% materia grasa). Durante las dos últimas semanas de tratamiento, la mitad de los animales se alimentaron con la misma Marco Bauzá-Thorbrügge, Miquel Sbert-Roig, Bel M. dieta HLS suplementada con Rsg (100mg/kg). Se recogieron el suero, los Galmés-Pascual, Magdalena Gianotti, Francisco J. García-Palmer, depósitos grasos y el hígado. En el hígado se determinó la actividad de la Isabel Lladó, Ana M. Proenza fosfoenolpiruvato carboxiquinasa y se analizó la vía de señalización de la Grup de Metabolisme Energètic i Nutrició, Dept. Biologia insulina mediante la activación de Akt, y la de la adiponectina a través de Fonamental i Ciències de la Salut, IUNICS, Universitat de les AdipoR2 y la activación de AMPk. En el suero se determinaron los niveles Illes Balears. IdISPa, Palma de Mallorca. Centro de Investigación de adiponectina. Biomédica en Red Fisiopatología de la Obesidad y la Nutrición En comparación con las ratas hembra, la adiposidad y los niveles de (CIBERobn, CB06/03/0043), Instituto de Salud Carlos III, Palma triacilglicéridos hepáticos fueron más elevados en los machos HLS y de Mallorca, ES disminuyeron de forma más acusada por efecto de la Rsg. Además, en La población mitocondrial del tejido adiposo blanco retroperitoneal (TABr) las ratas macho, la Rsg mejoró la tolerancia a la glucosa aumentando de ratas hembra es menos diferenciada y más abundante que la de los los niveles séricos de adiponectina y los hepáticos de AdipoR2 e machos. Este dimorfi smo sexual se atenúa en respuesta a la alimentación incrementando la activación de Akt. La disminución de la actividad con una dieta hiperlipídica (HL). fosfoenolpiruvato carboxiquinasa indica una menor producción hepática El objetivo de este estudio fue determinar si la rosiglitazona (Rsg), un de glucosa. Por el contrario, en las ratas hembra los efectos de la dieta HLS fármaco agonista del PPARγ que mejora la capacidad oxidativa y aumenta y de la suplementación con Rsg fueron más moderados. el contenido mitocondrial en los adipocitos, ejerce efectos dependientes En conclusión, la mayor acumulación ectópica de grasa en el hígado de del sexo en el TABr. los machos por la alimentación con la dieta HLS altera su sensibilidad a

157 Pósters XXXVII Congreso SEBBM la insulina de forma más acusada que en las hembras, alteraciones que se que parte de los efectos pleiotrópicos de las estatinas en esta patología revierten, al menos en parte, por la Rsg. se relacionan con sus benefi cios sobre el estrés oxidativo. Entre los marcadores más recientemente introducidos de peroxidación lipídica Estudio fi nanciado por MECD (SAF2010-21792, una beca FPU), CAIB se encuentran los 8-isoprostanos, compuestos estables resultantes de (PCTIB-31/2011, una beca FPI), FSE y FEDER-Unión Europea “Una la oxidación del ácido araquidónico por radicales libres. Evaluando manera de hacer Europa”. los niveles de 8-isoprostanos (ELISA) en plasma y orina de individuos control, hipercolesterolémicos e hipercolesterolémicos tratados con estatinas en este trabajo demostramos, tanto que los niveles de P17-29 (R17-2) 8-isoprostanos pueden ser un marcador temprano de oxidación en Mitochondrial glutamate transporter (Aralar): humanos hipercolesterolémicos, como que el tratamiento con estatinas influence over myelin formation and dopamine se asocia a prevención del daño oxidativo. Los niveles de 8-isoprostanos metabolism se elevan signifi cativamente en plasma del grupo hipercolesterolémico (52,08±4,01 vs 39,06±3,17 pg/mL; p=0,016), normalizándose Beatriz Pardo1 1 1 , Irene Llorente-Folch , Sara Laine-Menéndez , prácticamente por el tratamiento con estatinas (52,08±4,01 vs 1 1 1 Carlos B. Rueda , Paloma González-Sánchez , Inés Juaristi , Paula 41,34±2,5 pg/mL; p=0,04). Los resultados en orina corroboran estas Martínez-Valero1, Araceli del Arco2, Jorgina Satrústegui1 observaciones, sin alcanzar las diferencias signifi cación estadística. 1Dept. de Biología Molecular, Centro de Biología Molecular Severo De las estatinas evaluadas, la atorvastatina es la que muestra un mejor Ochoa UAM-CSIC, CIBER de Enfermedades Raras, Universidad perfi l en la normalización de los niveles de 8-isoprostanos, así como en Autónoma de Madrid, Madrid, ES, 2Área de Bioquímica, Centro la reducción del colesterol total. De la comparación de estos resultados Regional de Investigación Biomédica (CRIB), Facultad de Ciencias con los de otros indicadores de daño oxidativo a lípidos y proteínas, Ambientales y Bioquímica, Universidad de Castilla - La Mancha, Toledo, ES proponemos considerar a los 8-isoprostanos como el indicador más temprano de daño oxidativo en la detección y posterior evaluación del The mitochondrial transporter of aspartate-glutamate Aralar/AGC1 is a tratamiento con estatinas. regulatory component of the malate-aspartate shuttle, mainly expressed in neurons. Aralar-defi ciency in mouse and human causes a shutdown Financiado con la ayuda CONSOLIDER-INGENIO CSD2007-00063. of brain shuttle activity and global cerebral hypomyelination (OMIM ID # 612949) associated with a drastic drop in brain aspartate and N-acetylaspartate (NAA) levels. Aralar-knockout (Aralar-KO) mice show defi cits in motor coordination, ataxia, hyperactivity, anxiety-like P17-31 behaviour and hyperreactivity (a phenotype very similar to what is Integrando el papel de la resistina en un modelo observed in the human patients). In Aralar-KO mice, the striatum is the de riesgo cardiovascular: estudio en ratones ob/ob brain region most affected in terms of size, amino acid and monoamine content. We fi nd a fall in DA and in vesicular monoamine transporter-2 Ana Martín Vega1, Sandra Tavárez Alonso1, Lidia López López1, Pilar 2 Eulalia Alonso Iglesias1 (VMAT2) levels which causes an increase both in non-vesicular dopamine Codoñer Franch , and dopamine turnover (DOPAC/dopamine ratio) through MAO activity. 1Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Our results suggest that Aralar-defi ciency results in a failure to produce Medicina, Universidad de Valencia, Valencia, ES, 2Departamento de mitochondrial NADH and to an increase of ROS in the cytosol causing Pediatría , Facultad de Medicina, Universidad de Valencia; Servicio a fall in VMAT2 and GSH/GSSH ratio in striatum. Aralar-hemizygous de Pediatría, HU Dr Peset, Valencia, ES (Aralar-HT) mice, with half-a-dose of Aralar and decreased NAA, have La obesidad es uno de los factores principales de RCV. De origen also a heightened DOPAC/DA ratio with oxidative stress via MAO and multifactorial, la acumulación excesiva de grasa en el tejido adiposo increased sensitivity to amphetamine; as well as a delayed postnatal promueve la liberación por este órgano endocrino de moléculas myelination. infl amatorias y adipoquinas implicadas, por diferentes vías, en las NAA is one of the most concentrated metabolites in human and mice brain, alteraciones metabólicas de la obesidad y en su asociación con el RCV. but the physiological functions served by NAA remain controversial. NAA is proposed to be involved in providing acetyl CoA needed for Para evaluar el papel de la adipoquina resistina en este contexto, hemos oligodendrocyte maturation and postnatal myelin synthesis, neuronal cuantifi cado sus niveles circulantes (Multiplex) y su relación con el estado osmoregulation and energy metabolism. These data make further the point metabólico (perfi l lipídico y resistencia insulínica), el daño oxidativo about the putative relevance of NAA in higher brain functions and control (8-isoprostanos), la infl amación (IL-6) y el metabolismo de la arginina of behavior.The correlation between reduced NAA, hypomyelination (óxido nítrico (NO) y poliaminas) en ratones ob/ob, un modelo genético and DA dysfuntion is relevant because its involvement in neurological de RCV. Los resultados sobre los niveles de resistina en este modelo de and psychiatric human diseases and needs to be further investigated and obesidad son contradictorios. Según nuestros resultados, los niveles de discussed. resistina en ratones ob/ob son signifi cativamente más altos que en los controles lean (3269±297 vs 1352±74 pg/mL; p<0,0001), y se correlacionan positivamente con aumentos signifi cativos del índice HOMA (p=0,002), P17-30 colesterol (p=0,018), TGs (p=0,015), IL-6 (p<0,0001), 8-isoprostanos Detección temprana del daño oxidativo (p=0,003), espermina (p=0,005) y peso de los paquetes grasos (p<0,0001). en pacientes hipercolesterolémicos: efectos Los niveles de resistina también se correlacionan, aunque de forma del tratamiento con estatinas inversa, con el descenso en la producción de NO (p=0,003) y el cociente espermidina/espermina (p<0,0001). Estos resultados apoyan el papel de la Lidia López López, Sandra Tavárez Alonso, Ana Martín Vega, Eulalia resistina en la RI en este modelo de obesidad, así como los mecanismos Alonso Iglesias propuestos para su actuación que incluirían activación de la respuesta Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de infl amatoria, del estrés oxidativo y descenso en la producción de NO. Los Medicina, Universidad de Valencia, Valencia, ES posibles efectos de la resistina sobre el metabolismo de las poliaminas Numerosas evidencias clínicas y experimentales indican que las merecen ser analizados. alteraciones en el balance oxidativo están implicadas en la instauración y progresión de las patologías de RCV como la hipercolesterolemia, y Financiado con la ayuda CONSOLIDER-INGENIO CSD2007-00063.

158 Granada 2014 Pósters

P18-3 P18. Señalización celular Critical role of p38MAPK in the alternative activation of macrophages P18-1 (R18-3) Glutaminolisis y mTOR: interacción entre el Sonsoles Hortelano Blanco, Lidia Jimenez, Sandra Herranz, Alfonso metabolismo y la señalización celular en cáncer Luque Unidad de Terapias Farmacológicas. Instituto de Investigación Raúl V. Durán de Enfermedades Raras (IIER), Instituto de Salud Carlos III, Group of Metabolism and Cell Signaling, Institut Européen de Majadahonda, ES Chimie et Biologie VINCO Unit, U916 INSERM, Bordeaux, FR Alternative activation of macrophages plays an important role in a range Tradicionalmente se ha contemplado la transformación metabólica de of physiological and pathological processes, including infl ammation, las células cancerígenas como un fenómeno secundario encaminado a wound repair and tissue remodeling as well as parasite clearance and tumor abastecer a la célula de la energía necesaria para permitir una rápida progression. This alternative phenotype, also known as M2 macrophages, is proliferación. Sin embargo, en los últimos años esta visión ha cambiado induced by type 2 cytokines such as IL-4. The binding of IL-4 to its receptor con el descubrimiento de que los genes que codifi can para determinados leads to activation of two major signaling pathways: STAT-6 and PI3K. enzimas metabólicos pueden ser considerados como oncogenes o genes However, recent studies have described that p38MAPK might play a role in supresores de tumor. De esta manera, la transformación metabólica puede IL-4-dependent signaling in some types of cells. Since IL-4 is one of the most localizarse en el origen del cáncer. Esta conclusión lleva a la pregunta relevant cytokines involved in the alternative activation of macrophages, de cómo consiguen los cambios metabólicos celulares alterar las rutas we investigated whether p38MAPK plays a role in the polarization of de señalización para permitir el crecimiento descontrolado de la célula macrophages. Our results reveal that IL-4 induces phosphorylation of tumoral. En este sentido, nuestra investigación se centra en el estudio de p38MAPK in peritoneal macrophages, in addition to STAT-6 and PI3K los mecanismos por los que los nutrientes, en especial los aminoácidos, activation. Furthermore, p38MAPK inactivation, by gene silencing or activan la vía de señalización mTOR (mammalian target of rapamycin), un pharmacological inhibition, suppressed IL-4-induced typical M2 markers, regulador principal del crecimiento celular. Nuestros resultados muestran indicating the involvement of p38MAPK in the signaling of IL-4 leading que la glutamina, un aminoácido crucial para la bioenergética de las células to M2-macrophage polarization. Moreover, p38MAPK inhibition blocked cancerígenas, activa la ruta mTORC1 (mTOR complex 1) por medio de phosphorylation of STAT-6 and Akt, suggesting that p38MAPK is upstream su propia degradación a través de la glutaminolisis. La glutaminolisis es of these signaling pathways. Taken together, our results establish a new role la doble desaminación de la glutamina para producir α-cetoglutarato. El for p38MAPK during IL-4-induced alternative activation of macrophages. α-cetoglutarato intracelular activa a la familia de proteínas PHD (prolyl hydroxylases), necesarias para la activación de mTORC1. Por lo tanto, la ruta glutamina/PHD/mTORC1 constituye una cascada de señalización P18r-4 principal en la respuesta celular a la disponibilidad de nutrientes. Tanto Insights into novel DDR functions of GRK2 and la glutaminolisis como la ruta mTORC1 aparecen activados en una gran repercussions on cell cycle arrest variedad de tumores. De esta manera, nuestros resultados suponen un claro ejemplo de cómo el metabolismo alterado de la célula tumoral afecta a Adolfo Javier Molejón García, Verónica Rivas Guerrero, Federico procesos de señalización celular, fundamentales para el crecimiento rápido Mayor Menéndez, Petronila Penela Márquez del tumor. La existencia de una relación mecanística entre glutaminolisis Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CSIC-UAM), y mTORC1 abre las puertas a futuras investigaciones para determinar si Universidad Autónoma de Madrid - Instituto de investigación ambos procesos tienen un efecto sinergístico como dianas terapéuticas Sanitaria La princesa, Madrid, ES contra el cáncer. DNA Damage Response (DDR) is a complicated and conserved signalling mechanism utilised by cells to repair errors in DNA in order to avoid genomic lesions that may arise from non-pathological origins (DNA replication, P18r-2 oxidative metabolism) or genotoxic insults (radiation, genotoxins). As such, Non-invasive spatio-temporal activation of DDR mechanisms exist as an anti-tumourigenic generated from a variety engineered receptor tyrosine kinases with light of genomic lesions from point mutations to chromosomal aberrations. Furthermore, defects in DDR signalling are associated to a variety of Álvaro Inglés Prieto1 1 2 , Eva Reichhart , Karin Schelch , Robert tumourigenic predispositions such as loss of p53, BRCA or ATM. In order to 1 2 1 Riedler , Michael Grusch , Harald Janovjak effi ciently orchestrate a DDR response, cells require sensors (MRN, 53BP1), 1 2 Institute of Science and Technology Austria, Viena, AT, Institute of signal transducers (ATM/ATR, Chk1/Chk2, p53) and ultimately effectors Cancer Research, Department of Medicine I, Comprehensive Cancer (p21, Puma, Noxa). Depending on the type of signal in a genomically intact Center Vienna, Medical University of Vienna, Viena, AT cell, the outcome will be either DNA repair and re-entry into cell cycle, or cell Receptor tyrosine kinases (RTKs) are a large family of cell surface cycle arrest via senescence or apoptosis. GRK2, a GPCR Receptor Kinase, has receptors that sense growth factors and hormones and regulate a variety emerging functions outside of its traditional role of phosphorylating GPCR of cell behaviours in health and disease. Contactless activation of RTKs receptors for desensitisation and subsequent internalisation for degradation with spatial and temporal precision is currently not feasible. Here, we or receptor recycling. We have recently uncovered that GRK2 is degraded generated RTKs that are insensitive to endogenous ligands but can be by default during G2/M transition, which allows cell cycle progression. selectively activated by low intensity blue light. We screened light- However, upon G2-checkpoint activation GRK2 is stabilized and cell cycle oxygen-voltage (LOV)-sensing domains for their ability to activate is arrested. In this cellular context, GRK2 helps cells to cope with damage RTKs by light-activated dimerization. Incorporation of LOV domains by attenuating the p53 response and the expression of pro-apoptotic factors. found in aureochrome photoreceptors of stramenopiles resulted in robust We have unveiled evidence of GRK2 further modulating the DDR cascade activation of the fi broblast growth factor receptor 1 (FGFR1), epidermal upstream of p53 in response to acute and chronic genotoxic insults. As such, growth factor receptor (EGFR) and RET receptor. In human cancer and we suggest a complex intertwinement of GRK2 with ATM wherein GRK2 endothelial cells, light induced cellular signalling with spatial and temporal could be a target of ATM based on structural features and in vitro and in situ precision. Furthermore, light faithfully mimicked complex mitogenic phosphorylation assays, while downstream functionality of ATM would be and morphogenic cell behaviour induced by growth factors. RTKs under attenuated by GRK2 in a kinase dependent manner. Furthermore, we note an optical control (Opto-RTKs) provide a powerful optogenetic approach to inverse correlation between GRK2 protein levels and degree of senescence actuate cellular signals and manipulate cell behaviour. in cellular models and physiological settings. In this light, we propose GRK2

159 Pósters XXXVII Congreso SEBBM as a potential therapeutic target owing to novel modulatory functions as well with each other. Conversely, specifi c activation of ERK5 by the upstream as putative substrate in DDR response. kinase MEK5 also induces the nuclear translocation of both ERK5 and AR. We also provide evidences showing a functional link between these proteins. Over-expression of active ERK5 enhances the ligand-dependent P18-5 trancriptional activity of AR (PSA promoter activity, a specifi c clinical Función de β2-quimerina como supresor de biomarker for prostate cancer), whereas silencing ERK5 inhibits the AR tumores en cáncer de mama Her2+ transcriptional activation in response to androgens. Finally, we tested in prostate cancer cells the compound XMD8-92, a newly sinthetized ERK5 Victoria Casado Medrano1, María José Caloca Roldán2 spefi cic inhibitor. XMD8-92 inhibits cell proliferation and induces cell 1Instituto de Biología y Genética Molecular, Valladolid, ES, 2CSIC death in both LnCaP (functional AR) and C4-2 (castrate resistant) cells, (IBGM), Valladolid, ES whereas inhibition of the ERK1/2 pathway using MEK1 inhibitors had not Las quimerinas son una familia de proteínas GAP (GTPase activating signifi cative effect. In conclusion, we propose ERK5 inhibiton as a new proteins) que esta formada por cuatro miembros: α1-, α2-, β1-, y β2- treatment fort androgen-dependent and castrate-resistant prostate cancers. quimerinas. Estas proteínas tienen una estructura característica con un dominio C1 que une DAG y ésteres de forbol, un dominio GAP que inactiva selectivamente a la GTPasa Rac, y un dominio SH2 N-terminal, solo P18r-7 presente en las isoformas α2- y β2 de las quimerinas. Estas características ABTL0812, a novel dual mTORC1/2 hacen únicas a las quimerinas dentro de las Rho-GAP y las situa como and dihydrofolate reductase (DHFR) inhibitor reguladores clave que conectan la señalización por DAG con la activación with a novel mechanism of action de Rac. La hiperactivación de GTPasas de la familia Rho, incluida Rac, es común en cáncer, por lo que a las proteínas inactivadoras de estas Ingrid Tatiana Erazo Andrade1, José Alfon2, Mariana Gomez- GTPasas se las atribuye un posible papel como supresores de tumores. Para Ferreria2, María Salazar3, Mar Lorente3, Marc Cortal2, Guillermo comprobar este papel de β2-quimerina en cáncer de mama, hemos generado Velasco3, Carles Domenech2, José Miguel Lízcano1 un modelo de ratón en el que hemos eliminado la expresión de esta proteína 1Protein Kinases and Signal Transduction Lab, Departament de en ratones MMTV-ErbB2/Neu, que desarrollan cáncer de mama por la Bioquimica, Institut de Neurociències, Facultat de Medicina, sobreexpresión del protooncogén ErB2/Her2/Neu en el epitelio mamario. Universitat Autònoma de Barcelona , Bellaterra, ES, 2Ability Hemos evaluado el efecto de la defi ciencia de β2-quimerina sobre el tiempo Pharmaceuticals SL, Edifi ci Eureka, Campus de la UAB Universitat de latencia, la multiplicidad tumoral, la velocidad de crecimiento de los Autònoma de Barcelona , Bellaterra, ES, 3Departamento de tumores, el número de lesiones preneoplásicas y la metástasis pulmonar. Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Biología, Universidad Nuestros resultados demuestran que la eliminación de β2-quimerina Complutense de Madrid , Madrid, ES reduce signifi cativamente la latencia en la aparición de tumores de mama ABTL0812 is a novel multitarget drug with high effi cacy by oral route in y aumenta el número de lesiones preneoplásicas. Sin embargo, no hemos mice models of cancer. In vivo ABTL0812 induces the regression of tumor observado diferencias estadísticamente signifi cativas en la multiplicidad o volume in xenograft models derived from human lung (A549) and human el crecimiento de los tumores en ausencia de β2-quimerina. Para estudiar pancreatic cancer cells (MiaPaca-2), and very recently started a Phase los mecanismos moleculares regulados por β2-quimerina implicados en I First in Human Clinical Trial in patients with advanced solid tumors. la transformación maligna hemos estudiado los niveles de Rac activado We have shown that ABTL0812 induces the inhibition of two clinically y las principales vías de señalización reguladas por el receptor ErbB/Neu validated targets: mTORC1 (mTOR complex-1) and dihydrofolate (activación de Akt y ERK). En conjunto nuestros resultados indican que β2- reductase (DHFR). Despite of this, ABTL0812 does not bind any of these quimerina regula los pasos iniciales del desarrollo de los tumores de mama proteins, thus its precise mechanism of action remains to be described. mediados por activación del receptor ErbB2 a través de un mecanismo que Here we show that ABTL0812 blocks the proliferation of lung and pancreatic implica la activación de la GTPasa Rac. cancer cell lines. ABTL0812 induces autophagic cell death, but no apoptosis, and inhibition of fusion of autophagosomes with lysosomes prevents its citotoxicity. We also show that ABTL0812 induces the expression of TRB3 P18-6 (R18-4) (tribbles homologue 3), a known Akt protein inhibitor in both A549 and ERK5 binds and regulates the androgen receptor MiaPaca-2 human cancer cells. Overexpressed TRB3 interacts with Akt and in prostate cancer cells: molecular and functional prevents Akt phosphorylation (Ser473) by mTORC2. This, in turn, results in characterization low levels of phosphorylated TSC2 and inhibition of mTORC1 (ribosomal S6 phosphorylation). Finally, ABTL0812-induced mTORC1 inhibition Tatiana Erazo Andrade, Pau Muñoz Guardiola, José Ramón would render the loss of expression of the Cyclin D1, of E2F1 transcription Bayascas, Néstor Gómez, José Miguel Lizcano factor (controlled by Cyclin D1) and DHFR (controlled by E2F1). Protein Kinases and Signal Transduction Lab, Departament de Since TRB3 is down-regulated in some tumor types, the induction of TRB3 Bioquimica, Institut de Neurociències, Facultat de Medicina, expression by ABTL0812 might account for the anti-tumoral action of Universitat Autònoma de Barcelona, Bellaterra (Barcelona), ES this compound. We proposed TRB3 expression levels as a biomarker to Prostate cancer is the second commonest cause of cancer related death in monitor the antitumor effi cacy of ABTL0812 in humans. men in the western world. Usually, prostate cancer is initially androgen- dependent so patients are usually treated with androgen deprivation therapy. However, after remission the tumor frequently progresses into P18r-8 a state of castration resistance, and available treatment options are only Role of the APC/C complex mediated degradation palliative in most cases. of GRK2 in mitosis The MAP kinase ERK5 is activated in response to a wide range of growth Clara Reglero factors and cellular stresses and controls cell proliferation and progression , Verónica Rivas, Federico Mayor Jr., Petronila Penela through the cell cycle, and the ERK5 pathway is associated with poor Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CSIC-UAM), prognosis of prostate cancer. Universidad Autónoma de Madrid - Instituto de Investigación Here we show that ERK5 interacts with the AR protein in the cytosol Sanitaria La Princesa, Cantoblanco, ES of resting cells, and that activation of AR with androgens induces the Proteasome-dependent degradation of key kinases represents a major translocation of both proteins to the nucleus, where they continue to interact regulatory mechanism in the control of cell cycle. We have recently

160 Granada 2014 Pósters reported that timely degradation of GRK2, a serine/threonine G protein- P18-10 coupled receptor kinase, is part of an intrinsic pathway that ensures cell The neurosteroid-regulated σ1 receptor engages cycle progression. Besides being a key player in the desensitization of NMDA receptor negative control for opioid manifold GPCR receptors, GRK2 emerge as a signaling node due to its analgesia ability to regulate a variety of signaling proteins and cellular functions. We have previously found that GRK2 protein levels progressively decay Pilar Sanchez Blazquez1, Maria Rodriguez-Muñoz1, Manuel Merlos2, during G2/M as a result of the sequential cooperation of the E3 ligases Jose Miguel Vela2, Javier Garzón1 Mdm2 and APC/C. Thus, during G2 the functional interaction of Pin1 with 1Instituto Cajal, CSIC, Madrid, ES, 2Drug Discovery & Preclinical the CDK2/cyclinA-dependent phosphorylated GRK2 triggers its Mdm2- Development, Esteve. Scientifi c Park of Barcelona, Barcelona, ES mediated ubiquitination. At mitosis onset, GRK2 decay is promoted by the The antagonists of the sigma 1 receptor (σ1R) are of therapeutic interest APC/C-Cdc20 complex that recognizes a D-Box in GRK2, in a spindle because these drugs reduce neuropathic pain and enhance mu-opioid checkpoint-independent manner. receptor (MOR)-mediated analgesia. However, the precise molecular events It is expected that this tightly regulated degradation of GRK2 will have implicated in the positive effects of these antagonists remain unknown. signifi cant physiological consequences in mitosis. In this regard, recent The present study has identifi ed the σ1R within the protein assembly, data of our group have unveiled the functional interaction of GRK2 with supporting MOR-glutamate N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor regulatory factors involved in cytokinesis. Thus, we have demonstrated cross-regulation, in which this receptor couples the negative infl uence of that GRK2 is a key modulator of microtubule dynamics through the NMDARs to restrain opioid signalling in response to MOR activation. The phosphorylation of the tubulin deacetylase HDAC6. In addition, we have σ1R is a neurosteroid-regulated receptor that associates with NMDAR NR1 found that GRK2 infl uences the extent of PI3K activation by a direct subunits to maintain NMDAR signalling within physiological limits. The exogenous σ1R ligands likely mimic this physiological regulation through interaction with the regulatory subunit p85, which also acts as a scaffold to the use of agonists and antagonists to respectively enhance and reduce the regulate the Rho-family GTPase Cdc42 and Septins at the cleavage furrow. ability of morphine-activated MORs to recruit NMDAR activity. Thus, the Our data reveal the presence of GRK2 in the midbody, a structure wherein absence of σ1Rs or σ1R antagonists disconnects both systems, enhancing HDAC6 and p85 are also found. Dynamic changes in the levels and morphine analgesia and diminishing the development of tolerance. At functionality of GRK2 might help to timely activate HDAC6 or/and PI3K the molecular level, σ1R antagonists through the removal of σ1Rs from in order to orchestrate microtubule dynamics and to recruit/activate factors their binding to NR1 subunits promote the entrance of negative regulators involved in organizing the contractile ring and setting the symmetry of the of NMDARs, likely Ca2+-CaM, which impair the negative feedback on division plane. Our results suggest that defective or sustained degradation opioid analgesia and reduce the impact of glutamate in neuropathic pain. of GRK2 during mitosis could impair cytokinesis and contribute to Therefore, the negative effects of σ1R antagonists on NMDAR function polyploidy and chromosomal instability. alleviate neuropathic pain and also reduce the requirements of opioid receptor occupancy as a suitable adjuvant of opioid analgesia. (Supported by MSC, Plan Nacional Drogas 11-014 and MINECO, SAF 2012-034991). P18-9 PAR-3 participates in Thy-1-induced astrocyte migration without affecting polarization P18-11 Cytoneme-mediated delivery of Hedgehog Areli Cárdenas, Milene Kong, Alvaro Alvarez, Alejandra Valdivia, regulates the expression of bone morphogenetic Lisette Leyton Andrew F.G. Quest, proteins to maintain germline stem cells Facultad de Medicina, Universidad de Chile, Independencia, CL in Drosophila PAR-3 is an important adaptor protein that participates in polarization of many cell types by forming a complex with PAR-6/aPKC; however, Patricia Rojas Ríos1, Isabel Guerrero2, Acaimo González Reyes3 PAR-3 is not part of this complex during astrocyte polarization. We have 1Institute of Human Genetics (IGH) mRNA Regulation and shown that the neuronal protein Thy-1 induces astrocyte polarization and Development , Montpellier, FR, 2Centro de Biologia Molecular migration; however, the signaling mechanisms involved and the role of Severo Ochoa, CSIC/Universidad Autonoma de Madrid, Madrid, 3 PAR-3 in these processes have not been completely elucidated. Here, ES, Centro Andaluz de Biología del Desarrollo, CSIC/Universidad we evaluated whether PAR-3 participates in adhesion, polarization and Pablo de Olavide, Sevilla, ES Stem cells are characterised by their undifferentiated state, their potential migration of astrocytes induced by Thy-1. To this end, DITNC1 astrocytes were transfected with PAR-3-specifi c siRNA or siRNA control. Then, cells for self-renewal and their capacity to produce one or multiple types of were seeded and treated with Thy-1-Fc or control TRAIL-R2-Fc. Cell differentiated cells. These properties sustain homeostasis and repair of adult polarity and focal adhesions were assessed by immunofl uorescence staining tissues and open a high expectative about the use of these cells in regenerative of cells with anti-giantin and anti-vinculin, respectively, and analyzed by medicine. Adult stem cells are found in specialised microenvironments confocal microscopy. Cell migration was assessed in wound-healing assays or niches that control their proliferation, self-renewal and differentiation and the cell-free area was calculated after 24h of Thy-1 stimulation. of the progeny. The niches are composed of different support cells and signals like morphogens. The Drosophila ovary is an excellent system to The polarization of DITNC cells upon Thy-1 stimulation was not affected 1 study the molecular mechanisms that operate in stem cell niches because by silencing of PAR-3, whereas these cells exhibited longer focal adhesions this organ contains a well-defi ned niche, the Germline Stem Cell (GSC) than control cells either non-stimulated or stimulated with the negative niche. Our data demonstrate that Hedgehog (Hh) signalling pathway is control protein (TRAIL-R2-Fc). Accordingly, astrocytes lacking PAR-3 essential in the niche of the GSCs for their maintenance. The expression of migrated less than the control cells in the presence of Thy-1. Hh is regulated by Engrailed in a type of support cells of the GSC niche, Our results implicate PAR-3 in Thy-1-induced astrocyte migration, but not the Cap Cells (CpCs). Hh is secreted from the CpCs and received by the polarization. Together, these observations suggest a novel role for PAR-3 in Escort Cells, another type of niche cell, where the Hh pathway induces cell signaling pathways activated by Thy-1 in astrocyte migration. the expression of two essential GSC factors, Dpp and Gbb. Interestingly, Hh protein decorates short projections emanating from CpCs that remind Acknowledgements: FONDECYT 3140471 (AC), FONDECYT 1110149 to the fi lopodia described in different tissues of Drosophila larvae called (LL), 1130250 (AFGQ); Iniciativas Científi cas Milenio BNI P09-015-F cytonemes. When the Hh signalling is impaired within the niche, wildtype (LL); Anillo ACT1111 (AFGQ). CpCs project longer Hh-coated cytonemes suggesting that the niche senses

161 Pósters XXXVII Congreso SEBBM and responds to changes in Hh signalling. In addition, we have found that due to the induction of the indole-dependent effl ux pump demonstrating that the perturbation of the formation and/or dynamic of cytonemes in the niche indole acts as an interspecies signalling molecule in antibiotic resistance. compromised the GSC self-renewal demonstrating that cytonemes are essential for the maintenance of stem cells. P18r-14 Crosstalk between HGF and BMP9 signaling P18r-12 pathways in hepatic progenitor oval cells Papel de TCFL5 en el desarrollo tumoral Annalisa Addante1 1 1 Javier Galán Martínez , María García-Álvaro , Nerea Deleyto , Margarita , Inés Sánchez Gómez, Konstantinos Fernández1, César Roncero1, Isabel Fabregat2, Blanca Herrera1, Stamatakis, Núria Gironès Pujol, Manuel Fresno Escudero Aránzazu Sánchez1 Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CSIC-UAM), Madrid, 1Instituto de Investigación Sanitaria, Hospital Clínico San Carlos ES (IdISSC). Dep Bioquímica y Biología Molecular II, Facultad Las células madre tumorales, también denominadas Cancer Stem Cells de Farmacia, Universidad Complutense de Madrid, Madrid, (CSC) son parte de la población heterogénea del tumor siendo las ES,2Laboratori d’Oncologia Molecular, Universitat de Barcelona, responsables del mantenimiento de este, de la recurrencia y de la metástasis. Institut d’Investigació Biomèdica de Bellvitge, L’Hospitalet de Comprender el papel que desempeñan este tipo de células durante el Llobregat, Madrid, ES desarrollo tumoral se ha convertido recientemente en un importante campo Oval cells constitute a bi-potential progenitor cell population from adult de estudio para el desarrollo de nuevas terapias contra el cáncer. Una vía liver. Under chronic liver disease (CLD), they become activated and start para la obtención de estas CSC es la formación de esferoides multicelulares to proliferate and differentiate into cholangiocytes and/or hepatocytes to tumorales (MCTS), un modelo de cáncer in vitro generado a partir de la compensate for the cellular loss and maintain liver homeostasis. It is well agregación de células en suspensión. Estudios recientes muestran niveles recognized the critical role of the TGF-b in CLD, but the role of other elevados del factor de transcripción TCFL5 después de la formación members of the TGF-b superfamily, the BMPs, is only partly understood. de MCTS por la línea celular de cáncer de colon HT-29. El gen TCFL5 We focused our attention in BMP9, since previous results from our group codifi ca para al menos cuatro isoformas de las cuales, de solo dos, se tienen and others indicated that BMP9 has a pro-tumorigenic action in HCC cells. referencias a nivel experimental, denominadas TCFL5 y CHA. TCFL5 To study BMP9 role in hepatic progenitor cells, we used an in vitro model presenta la secuencia canónica compuesta por 6 exones mientras que CHA of oval cell lines harbouring a genetically inactivated met tyrosine kinase carece del primer exón. Para determinar el papel de estas isoformas en la (Met-/- cells) and its control (Metfl x/fl x cells) that also allow us to explore a formación de MCTS y de CSC in vitro se sobreexpresaron las isoformas possible signaling interaction between HGF and BMP9. TCFL5 y CHA en diferentes líneas de cáncer de colon y se estudió el Our data show that BMP9 induces canonical and non-canonical signaling fenotipo tumoral de estas células así como la expresión de marcadores pathways in both Metfl x/fl x and Met-/- oval cells, although Met appears to típicos de CSC. Además, se generaron tumores xenoinjertados a partir de increase BMP9-induced Smad1/5/8 activation. Interestingly, BMP9 estas células para determinar el crecimiento tumoral in vivo. Los resultados decreases oval cell number, effect that is amplifi ed in absence of Met. To obtenidos muestran que, in vitro, las líneas celulares que sobreexpresan elucidate the underlying mechanisms; we investigated a potential effect of CHA presentan un fenotipo más tumoral y mayor expresión de marcadores BMP9 on apoptotic oval cell death. Our results show that BMP9 elicits a de CSC que las líneas sobreexpresantes de TCFL5 que presentan el fenotipo moderate but signifi cant increase in apoptosis, which is more pronounced opuesto. In vivo, sin embargo, las líneas que sobreexpresan CHA crecieron in Met-/- cells. Furthermore, HGF is able to prevent BMP9 effects in oval más lentamente que las TCFL5. cells. All these data suggest that BMP9 is a suppressor (pro-apoptotic) factor in oval cells and they also evidence a novel functional crosstalk between P18r-13 Regulation of TtgGHI efflux pump by indole Met/HGF and BMP9 signaling pathways in oval cell survival, with a mechanism that will be discussed. increases antibiotic resistance of Pseudomonas putida DOT-T1E P18r-15 Carlos Molina Santiago1, Abdelali Daddaoua1, Juan Luis Ramos2 The Calcineurin splicing isoform CnA 1 1Consejo Superior de Investigaciones Científi cas. Estación β Experimental del Zaidín, Granada, ES, 2ABENGOA RESEARCH, is implicated in early embryonic stem cell Sevilla, ES differentiation and reduces pathological cardiac In Gram-negative bacteria, multidrug effl ux pumps are responsible for hypertrophy the extrusion of chemicals. Some of these effl ux pumps are induced by Jesús María Gómez-Salinero endogenously produced effectors, while abiotic or biotic signals induce the , María Villalba-Orero, Marina expression of other effl ux pumps. In Pseudomonas putida, the TtgABC Mercedes-Olañeta, Paula Ortiz-Sanchez, Enrique Lara-Pezzi effl ux pump is the main antibiotic extrusion system and it is modulated Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), by TtgR regulator. The plasmid-encoded TtgGHI effl ux pump in P. putida Madrid, ES DOT-T1E, regulated by TtgV regulator, plays a secondary role in antibiotic Embryonic stem cells (ESCs) have the ability to proliferate indefi nitely resistance in the parental strain; however, its role is critical in isogenic in culture, and to differentiate into all embryonic lineages. Although backgrounds defi cient in TtgABC. TtgV recognizes indole as effector the transcriptional program that coordinates pluripotency has been which is not produced by Pseudomonas species, therefore, the indole- progressively unveiled during the past few years, the signalling pathways dependent antibiotic resistance seems to be part of an antibiotic resistance that regulate early differentiation events are not completely understood. programme at the community level. We have recently described that CnAβ1, an alternative splicing variant of Transcriptomic analyses revealed that the indole specifi c response involves the phosphatase calcineurin, enhances muscle regeneration and improves the expression of the TtgGHI pump but also a set of genes involved in cardiac function after myocardial infarction. CnAβ1 lacks the autoinhibitory iron homeostasis, as well as genes for amino acid catabolism. In a domain typical of calcineurin, and instead has a unique C-terminal domain ttgABC-defi cient P. putida, background ampicillin and other bactericidal with no similarity to any known protein. Unlike other calcineurin isoforms, compounds lead to cell death. Co-culture assays of E. coli and P. putida CnAβ1 has no impact on NFAT-regulated genes and instead activates the ΔttgABC allowed growth of P. putida mutant in the presence of ampicillin Akt pathway. Interestingly, we have currently determined that CnAβ1 is

162 Granada 2014 Pósters specifi cally located at the Golgy contrary to other calcineurin isoforms, and largely unknown. Recent studies reported that, in skeletal muscle of old that this localization is mediated by its unique C-terminal domain. CnAβ1 mice, the muscle fi ber expresses grow factors, driving satellite cells to is strongly expressed in stem and progenitor cells, although its role in these break quiescence by undergoing proliferation, and this would explain the cells is unknown. We found that CnAβ1 downregulation had no effect on previously accepted skeletal muscle regenerative decline with aging. A ESC pluripotency. However, CnAβ1 depletion in mESCs during the fi rst deep analysis of muscle stem cell aging has provided us with a novel vision 48 hours of differentiation specifi cally affected differentiation towards on why aged muscle stem cells lose their homeostatic quiescent state. the cardiac mesoderm lineage promoting hematopoietic differentiation. In very old, geriatric mice, satellite cells do not undergo a proliferative In contrast, CnAβ1 overexpression promoted differentiation towards pathway; instead, they switch to a pre-senescence stage. This switch the cardiac mesoderm lineage. Our results suggest that CnAβ1 regulates has dramatic consequences, since it converts the satellite cell reversible mESC differentiation through the control of the Akt/GSK3 signalling G0 arrest into an irreversible G0 arrest that abrogates cell activation pathway. Interestingly, CnAβ1 knockout mice show increased cardiac upon muscle injury, thus precluding effi cient regeneration and stem cell hypertrophy in response to trans-aortic banding, whereas transgenic self-renewal in aged mice. We have established that satellite cells from mice overexpressing CnAβ1 have decreased hypertrophy and improved sarcopenic geriatric, unlike those from non-sarcopenic old mice, enter cardiac function. Together, these results suggest that CnAβ1 is implicated into a “point of no-return”, and lose their reversible quiescence state in in early mESCs differentiation, and that it reduces pathological cardiac homeostatic conditions. We have also found this loss of quiescence in hypertrophy. satellite cells of progeric mice with accelerated aging and in samples from aged humans. Mechanistically, we have found that geriatric and progeric satellite cells P18-16 express senescence markers like p16INK4a. Indeed, p16INK4a, which is A proteomics strategy reveals novel roles for never expressed in adult or old muscle stem cells in homeostatic conditions, the protein kinase DYRK1A within the nucleus becomes de-repressed in geriatric and progeric satellite cells, correlating with loss of reversible quiescence. Genetic silencing of p16INK4a in Julia Roewenstrunk1, Chiara Di Vona1, Eva Borras2, Eduard Sabido2, geriatric and progeric satellite cells reverses G0 irreversible senescence into Susana de la Luna1 a G0 reversible quiescence, thus allowing stem cell activation and muscle 1Centro de Regulación Genómica-CRG, Barcelona, ES, 2Proteomics regeneration in aged mice. Our results further show that in conditions of Unit, Centro de Regulación Genómica-CRG y Universitat Pompeu muscle injury, in which satellite cells need to proliferate extensively to form Fabra-UPF, Barcelona, ES new myofi bers, geriatric satellite cells are unable to proliferate and undergo The protein kinase DYRK1A (dual-specifi city tyrosine-regulated kinase) instead an accelerated entry into a deep senescence state (geroconversion). is an evolutionary conserved kinase highly sensitive to gene dosage We propose that satellite cell geroconversion arises from two opposed alterations. Reduced levels of DYRK1A in individuals due to gene forces: the proliferative pressure of the damaged muscle local environment truncation or microdeletions cause microcephaly, intrauterine growth and the persistent cell cycle arrest induced by a p16INK4a -regulated Rb/ retardation and developmental delay. On the other hand, DYRK1A EF2 anti-proliferative axis on aged satellite cells. overexpression is associated to some neuropathological traits in Down syndrome. Evidence obtained in different model systems indicates that DYRK1A regulates brain growth across evolution, by playing a role in P18r-18 neuron survival and differentiation. These activities have been associated to Function of C3G as a regulator of cell migration/ DYRK1A-mediated phosphorylation of mostly cytosolic targets. However, invasion and tumour growth DYRK1A is also localized in the nucleus, but information on functional Celia Sequera1 1 1 1 roles for nuclear DYRK1A is still pretty scarce. To search for the identity , Neibla Priego , María Arrechederra , Ana Vázquez , 2 1 2 of physiological targets of nuclear DYRK1A, we have implemented a Sara Ortiz-Rivero , Aránzazu Sánchez , Carmen Guerrero , 1 quantitative interaction proteomic approach based on DYRK1A affi nity Almudena Porras 1 purifi cation from nuclear extracts followed by label-free quantifi cation Departamento de Bioquímica y Biología Molecular II, Facultad de 2 mass spectrometry. By using statistical values, we have generated a ranked- Farmacia, UCM, IdISSC, Madrid, ES, Centro de Investigación del list of putative interactors that includes already known DYRK1A partners Cáncer IBMCC (USAL-CSIC), IBSAL, Salamanca, ES as the scaffold DCAF7 or members of the 14-3-3 family of proteins. To C3G is a guanine nucleotide exchange factor (GEF) for Rap1 and R-Ras, gain insight into the biological role of nuclear DYRK1A, we have looked but it also acts through mechanisms not dependent on its GEF activity. It for the enrichment of gene ontology (GO) terms for the proteins found is essential for embryonic development due to its role in integrin-mediated in the screen. A signifi cant enrichment in GO terms associated with RNA adhesion and migration. In addition, C3G inhibits migration of highly splicing, transcription and DNA repair was found. We have validated invasive breast carcinoma cells, although the mechanisms involved remain the interaction of DYRK1A with several of its putative targets by direct unknown. The function of C3G in human cancer is controversial acting as and reverse co-immunoprecipitation experiments. Moreover, we have either a tumour suppressor or mediator. generated experimental evidence indicating that some of the DYRK1A p38 MAPKs regulate different cellular functions, including migration. putative interactors are novel DYRK1A substrates. In summary, we have p38a MAPK is the most abundant isoform and essential for embryonic defi ned a nuclear DYRK1A interactome that will be a powerful tool for development. p38a plays also a dual role in cancer depending on the tumour the characterization of the functional participation of DYRK1A in specifi c type and stage and it can promote migration and invasion of tumour cells. nuclear processes. We have previously described that C3G through inhibition of p38a MAPK regulates cell death. We have now analyzed if C3G also regulates migration and invasion through mechanisms dependent on p38a in non-tumour and P18-17 (R18-2) tumour cells. By knocking-down/out C3G and/or p38a, we have found that Regulation of satellite cell functions in aging C3G inhibits migration and invasion through a mechanism that involves down-regulation of p38a activity. This was confi rmed by using a selective Eusebio Perdiguero Santamaría p38a/b inhibitor. In addition, we have demonstrated that Rap-1 activation is Universidad Pompeu Fabra (UPF), Barcelona, ES not required for these C3G actions. MMPs might be important mediators of Among the principal properties that distinguish adult mammalian stem C3G/p38 effects on invasion. We are further characterizing the mechanisms cells from their more differentiated progeny is the capacity of stem cells used by C3G and/or p38a to regulate these processes. to remain in a quiescent state for prolonged periods of time. However, the We have also found that both C3G and p38a promote tumour growth of molecular pathways for the maintenance of stem-cell quiescence remain HCT116 cells, as determined by in vitro and in vivo assays.

163 Pósters XXXVII Congreso SEBBM

P18-19 P18r-21 (R18-6) DUSP10 is a cyclooxygenase 2 activity induced P2X7 receptor stimulation in neurons mediates gene and it regulates colon cancer cell stress different pathway activation in the presence or responses absence of calcium

Bakarne Urzelai1 1 2 Marta Jiménez Martínez, Konstantinos Stamatakis, Alba Jiménez- , Francisco Llavero , José Luis Zugaza Segovia, Beatriz Barrocal, Manuel Fresno 1Universidad del País Vasco (UPV/EHU)/Centro Vasco de Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (UAM-CSIC), Madrid, ES Neurociencias Achucarro, Leioa, ES, 2Ikerbasque/Centro Vasco de Neurociencias Achucarro/Universidad del País Vasco (UPV/EHU), Colorectal cancer is one of the deadliest types of cancer, due to its high Leioa, ES metastatic capacity and chemoresistance acquisition. Cyclooxygenase 2 (COX-2) elevated expression has been shown to play an important role in P2X7 belongs to the family of ionotropic ATP-gated receptors, which colorectal tumour development and its inhibition can help prevent cancer function as ion channels mediating calcium infl ux. P2X7 is one of the death. predominant purinergic P2X receptor subtype expressed in neural cells. We performed gene expression microarray analysis to identify genes It is involved in a variety of processes such as ATP-mediated cell death, regulation of receptor traffi cking, and infl ammation. It is largely known up- or down-regulated by COX-2 overexpression. We identifi ed genes that P2X7 receptor stimulation leads to regulation of the mitogen-activated with altered expression in these conditions, one of them being the Dual protein kinases (MAPK) extracellular regulated kinases (ERK1/ERK2), Specifi city Phosphatase 10 (DUSP10), specifi c for JNK and p38 MAPKs. c-Jun N-terminal kinase (JNK) and p38. The canonical pathway for the DUSP10 resulted to be up-regulated by COX-2 activity as well as by PGE2 activation of these MAPKs is mediated by Ras. treatment in a concentration depended manner. Here, we show that P2X7 receptor stimulation triggers not only the MAPK We generated cell lines stably expressing DUSP10 or silencing DUSP10 activation but also the Ras GTPase activation. Besides, we demonstrate that by infecting with lentivirus the colorectal adenocarcinoma HT29-LucD6 in the presence of calcium this Ras/MAPK pathway regulation is mediated cells. We found that DUSP10 are implicated in cell proliferation and stress by the Ras guanine exchange factor (GEF) RasGRF1. For its activation, resistance to serum deprivation, osmotic and genotoxic agents and to this GEF requires a calcium input from the extracellular medium, which confl uence arrest. DUSP10 could be regulating the HT29 cell response at will intracellularly bind to calmodulin. In this confi guration, Ca+2-loaded these conditions through the p38 pathway. calmodulin binds to the RasGRF1 IQ motif and activates it. Surprisingly, These results suggest that DUSP10 expression can confer a growth and P2X7 also activates Ras in a Ca+2-independent manner. In addition, this survival advantage in tumor environment to colorectal cancer cells. alternative Ras activation leads to the activation of the small GTPase Rap1 and more importantly, triggers neural cell death. Our fi ndings demonstrate that P2X7 stimulation in neurons activates two different signaling pathways P18-20 depending on the presence or absence of extracellular Ca+2, leading to cell Identification of PMEPA1 as a cyclooxygenase survival versus cell death. 2 induced gene and its potential implication in cancer progression P18-22 (R18-1) Alba Jiménez Segovia, Konstantinos Stamatakis, Marta Jiménez, Tetraspanin-enriched microdomains. Translating Beatriz Barrocal, Manuel Fresno signals from the plasma membrane to Rac Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (UAM-CSIC), Madrid, ES GTPase and exosomes Cyclooxygenase 2 (COX-2) elevated expression has been associated María Yáñez-Mó with tumour development especially in colorectal cancer, and it is known Universidad Autónoma de Madrid, Madrid, ES that its inhibition can prevent cancer. In order to study the mechanisms that mediate the pro-tumorigenic effects of COX-2 we generated cell Tetraspanin-enriched microdomains (TEM) have unique biophysical lines stably overexpressing this gene and performed gene expression properties suited for the regulation of cell motility and intercellular adhesion. microarray analysis to identify genes regulated by this overexpression. In this study we demonstrate that TEM play a role in the compartmentalization One of the up-regulated genes in the COX-2 overexpressing cells is of Rac GTPase at the plasma membrane and into exosomes, providing a PMEPA1, identifi ed as an androgen-induced gene, highly expressed in molecular mechanism for the regulation of cell motility by tetraspanins. We characterized the intracellular TEM interactome by high-throughput several cancers. The encoded product is a transforming growth factor-β mass-spectrometry, and found a specifi c interaction of tetraspanin CD81 (TGF-β)-induced transmembrane protein overexpressed in breast, with the GTPase Rac. This interaction was confi rmed biochemically and prostate and colorectal cancer. In order to study PMEPA1 effects, we both microscopy cross-correlation analysisthat demonstrated in situ integration of overexpressed and silenced, PMEPA1 in human colon adenocarcinoma both molecules into the same molecular complex. Pull-down experiments (HT29) and human ovarian carcinoma (Skov3) cells, generating stable revealed that CD81-Rac interaction was direct and independent of Rac cell lines. We studied in vivo and in vitro cell characteristics, noting activation status. Knockdown of CD81 resulted in enhanced protrusion rate, signifi cant differences between empty vector (EV) and PMEPA1 altered focal adhesion formation and decreased cell migration, correlating overexpressing cells. We observed differences in cell morphology, caused with increased active Rac. Re-expression of wild typeCD81, but not by a different distribution of the actin cytoskeleton. Those morphological its truncated form lacking the C-terminal cytoplasmic domain, rescued differences are related to a PMEPA1- induced process of Epithelial these effects. The phenotype of CD81 knockdown cells was mimicked Mesenchymal Transition. by treatment with a soluble peptide with the C-terminal sequence of the Mouse xenograft experiments, with subcutaneous and intraperitoneal tetraspanin. TEM-driven compartmentalization was also relevant for protein injection of the mentioned cells in nude mice, showed a differential effect sorting into exosomes. Quantitative proteomics showed that TEM ligands of PMEPA1 overexpression in the two cell types, HT29 and Skov3, account for a great proportion of the exosome proteome and that a selective leading to a fi nal growth delay of HT-29 xenografts, while PMEPA1 repertoire of CD81-associated molecules, including Rac, is not correctly overexpressing Skov3 cells had a high initial survival and proliferative routed to exosomes in cells from CD81-defi cient animals. Therefore TEM- advantage compared with EV cells. dependent compartmentalization is revealed as a new regulatory mechanism These fi ndings suggest that PMEPA1 may have an important role in cancer of Rac activity. Moreover, our data provide fi rm evidence that insertion into progression. TEMs is critical for protein inclusion into the exosome structure.

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P18r-23 Para ello hemos generado una línea de fi broblastos embrionarios knock-out GRK2 modulates cell proliferation and invasive de K-Ras (KO). La expresión proteica se ha analizado por western blot. migration of the highly metastatic MDA-MB-231 Las expresiones basales de fosfo-Smad2 y fosfo-Smad3 son similares en breast cancer cells fi broblastos KO de K-Ras y WT; sin embargo la expresión de fosfo-Erk1/2 es menor en fi broblastos K-Ras-/-, mientras que la expresión de fosfo-Akt Laura Nogués1, Philippe Chavrier2, Federico Mayor Jr.1, Petronila es mayor en estas células. TGF-β1 aumenta la expresión de Ras-GTP y la Penela3 fosforilación de Erk1/2 sólo en fi broblastos WT, e induce una fosforilación -/- 1Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CSIC-UAM), Madrid, similar de Smad2 y Smad3 en fi broblastos WT y K-Ras . Además, TGF-β1 ES, 2Membrane and cytoskeleton dynamics department, Institut estimula la expresión de fi bronectina, colágeno tipo I y colágeno total sólo Curie, Paris, FR, 3Instituto de Investigación Sanitaria La Princesa, en fi broblastos WT. En ausencia de K-Ras la inhibición de la vía de Erk1/2 Madrid, ES no reduce la expresión de fi bronectina y colágeno tipo I. Sin embargo, la inhibición de la vía PI3K/Akt disminuye la síntesis de colágeno tipo I y de Breast cancer progression and outcome are conditioned by the acquisition fi bronectina en fi broblastos WT y KO. of two key abilities by tumour cells: the growth and survival capability that Estos datos sugieren que la isoforma K-Ras regula negativamente la trigger resistance to therapy and the invasion into host tissues resulting expresión basal de proteínas de MEC (a través de la vía de PI3K/Akt), in metastatic dissemination. Although both processes are usually studied regula positivamente la activación de la vía de Erk1/2, y es necesaria para separately, the underlying mechanisms seem to be governed by the same la activación de Erk1/2 en respuesta a TGF-β1, pero no para la activación signalling nodes, including growth factor and chemokine receptors, p53 de la Smad2 y 3. Además, K-Ras es necesaria para el incremento en la mutations and components of the Ras/ MAPKs/ PI3K axis. In addition, other expresión de proteínas de la MEC inducido por TGF-β1, fundamentalmente cancer-associated factors can cooperate with these oncogenic-signalling a través de la vía de Erk1/2. routes to strength tumoural properties. In this sense, the serine/threonine kinase GRK2 is emerging as a key signalling node tightly connected to these cascades, given its participation in relevant biological processes such P18-25 as cell cycle, proliferation or migration. Moreover, our recent fi ndings Chemotaxis of Pseudomonas to gamma- show a novel interaction of GRK2 with the histone deacetylase HDAC6, which has also been associated with malignant transformation and invasive aminobutyrate (GABA) motility in breast cancer. All these evidences strongly suggest a relevant Jose Antonio Reyes Darias*1, Vanina García*1, Miriam Rico contribution of GRK2 in breast cancer tumorigenesis. We report herein that Jiménez1, Andrés Corral Lugo1, Olivier Lesouhaitier2, Dalia Juárez GRK2 subcellular distribution is altered in transformed breast cancer cells. Hernández3, Yiling Yang4, Shuangyu Bi4, Marc Feuilloley2, Jesús Moreover, GRK2 modulates in vitro and in vivo proliferation of the triple Muñoz Rojas3, Victor Sourjik4, Tino Krell1 negative MDA-MB-231 cells, in a HDAC6- phosphorylation dependent 1Department of Environmental Protection, Estación Experimental del manner, and protects from SAHA (an HDAC6 inhibitor)-induced cell Zaidín, Consejo Superior de Investigaciones Científi cas, Granada, death. Furthermore, GRK2 also potentiates MDA-MB-231 cell migration ES, 2Laboratory of Microbiology Signals and Microenvironnement towards different oncogenic stimuli, whereas GRK2 down-regulation LMSM, EA 4312, Normandie Université, Université Rouen, Evreux, results in suppression of both cell migration and invasion in 2D and 3D FR, 3Laboratorio de Ecología Molecular Microbiana, Centro de models. Finally, GRK2 is required for two-dimensional matrix proteolysis, Investigaciones en Ciencias Microbiológicas-Instituto de Ciencias, suggesting a relevant role of GRK2 in the formation of protrusive structures Benemérita Universidad Autónoma de Puebla, Puebla, MX, 4Max termed invadopodia. Overall, these results point GRK2 as a possible Planck Institute for Terrestrial Microbiology & LOEWE Research contributor towards cell malignancy and as a potential drug target. Center for Synthetic Microbiology (SYNMIKRO), Marburg, DE Bacteria are able to migrate toward a more suitable environment by detecting chemical and physical stimuli, in a process called chemotaxis. P18r-24 K-Ras modula la respuesta fibrótica inducida Environmental stimuli are sensed by chemoreceptors, so called methyl– accepting chemotaxis proteins (Mcp), which is typically composed of por TGF-β1 mediante mecanismos independientes a periplasmic ligand-binding domain (LBD) and a cytosolic signalling de la vía de Smad domain. Chemotaxis occurs primarily to growth substrates but was also reported for neurotransmitters, plant signals or quorum sensing signals and Cristina Cuesta Apausa1 1 , José Manuel Muñoz Féliz , Nuria Perretta the physiological relevance of taxis to these compounds is poorly understood. 1 2 1 Tejedor , Carlos Martínez Salgado , Isabel Fuentes Calvo Gamma-aminobutyrate (GABA) is ubiquitously present in nature and 1 Unidad de Fisiopatología Renal y Cardiovascular, Instituto has many functions like being a neurotransmitter, plant signal or growth “Reina Sofía” de Investigación Nefrológica, Departamento de substrate. We show by microcalorimetric analysis that the recombinant LBDs Fisiología y Farmacología, Universidad de Salamanca - Instituto of the chemoreceptors PctC in the pathogenic Pseudomonas aeruginosa and de Investigación Biomédica de Salamanca-IBSAL, Salamanca, ES, McpG in the saprophytic P. putida KT2440 bind GABA. Receptor chimeras 2 Unidad de Fisiopatología Renal y Cardiovascular, Instituto “Reina comprising the LBD of either PctC or McpG with the Tar signaling domain Sofía” de Investigación Nefrológica, Departamento de Fisiología y were constructed and the signal output determined using fl uorescence Farmacología, Universidad de Salamanca - Instituto de Estudios resonance energy transfer (FRET). The resulting EC50 values for GABA de Ciencias de la Salud de Castilla y León-IECSCYL, Unidad de were with 3.6 ± 0.3 nM (PctC-Tar) and 5.7 ± 2 nM (McpG-Tar) extremely Investigación, Hospital Universitario de Salamanca, Salamanca, ES low, indicating that both receptors are highly sensitive for GABA. The EC50 La fi brosis es uno de los estadios fi nales de muchas enfermedades crónicas. of PctC-Tar for GABA was 3100-fold inferior to the value for L-Pro, the Se caracteriza por la presencia de miofi broblastos y por una deposición strongest responding protein amino acid. Experiments with Caenorhabditis excesiva de proteínas de matriz extracelular (MEC). El factor de elegans showed that pctC mutation did not alter bacterial virulence. However, crecimiento transformante-β1 (TGF-β1) es una citoquina muy importante mcpG mutation caused a reduction in tomato root colonization following en la regulación de los procesos fi bróticos. Señaliza a través de las proteínas chemotaxis. The C. elegans data and the presence of a GABA receptor in a Smad2 y Smad3 gracias a la activación de su receptor tipo I. Además puede saprophytic indicate that GABA taxis may not be related to virulence. The activar otras vías de señalización, como la vía de Ras. Hay 3 isoformas de environmental omnipresence of GABA and its multi-functionality suggests las proteínas Ras: H-, N- y K-Ras. that other bacteria may also show GABA taxis. Nuestro objetivo es determinar si K-Ras regula la expresión de proteínas de MEC inducida por TGF-β1 y a través de que ruta de señalización intracelular. * Authors contributed equally to this work.

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P18-26 grupo ha demostrado que mientras la señalización tumoral por Wnt Characterization of a new human oncogene conduce al acúmulo citosólico del efector de la vía: la β-catenina, su retención nuclear y activación transcripcional (responsable del aumento Bárbara de la Peña, Cristian Suárez, Angustias Page, Josefa P. de proliferación y otras características tumorales) requiere la existencia Alameda, Llanos Casanova, Ángel Ramírez, Manuel Navarro de niveles elevados de glucosa. Esta acumulación nuclear dependiente de CIEMAT, Madrid, ES hiperglucemia está mediada parcialmente por inhibición de la actividad Most human tumors have mutations in genes of the Ras small GTPase desacetilasa de las sirtuinas y, aunque hay evidencia de la implicación de protein family. Ras proteins work as binary molecular switches that SIRT1, se desconoce si hay otras sirtuinas implicadas y cuáles son los control intracellular signaling networks. Inappropriate activation of mecanismos subyacentes. ras causes aberrant signal transduction, proliferation and malignant Recientemente se ha demostrado que el silenciamiento de SIRT6 transformation. Oncogenic mutations in Ras prevent GTP hydrolysis, altera el metabolismo de la glucosa y conduce a una disminución de la locking Ras in a permanently active state. The main Ras isoforms are H-Ras, N-Ras and K-Ras, mutations of which are found in several types glucemia y, por consiguiente, de la insulinemia. A diferencia de otras of human tumors. In spite of this, the human Ras family consists on sirtuinas los niveles de SIRT6 fl uctúan de unos tipos celulares a otros y some 36 different genes, many of which have been scarcely studied. esta sirtuina además de la actividad desacetilasa posee actividad ADP- One of these relatively unkonwn genes is ERas (Embryonic Ras), which ribosilasa. is a constitutively active Ras protein. ERas is located in chr X, and is Los importantes efectos de SIRT6 sobre el metabolismo de la glucosa nos expressed only in embryonic stem cells, being undetectable in adult han conducido a plantear el Objetivo: identifi car estímulos que alteran los tissues. niveles y actividad de SIRT6 y su relación con el fenotipo tumoral. In the course of a high-throughput genetic screening to identify novel genes Metodología: células tumorales intestinales humanas y murinas mutated in human cancer, we detected insertional mutations leading to the estimuladas con: glucosa, Wnt-3A o LiCl. Se evalúan cambios en niveles activation of ERas in a number of tumors. In this work, we describe the o modifi caciones por Western Blot e inmunofl uorescencia; en expresión cloning and introduction of ERas in several non-malignant human cell génica por qPCR y en actividad desacetilasa por luminiscencia. Mediante lines. Forced expression of a HA-tagged ERas results in drastic changes in citometría determinamos su infl uencia en proliferación celular. Análisis cell shape, mobility and invasivity, as well as in the activation of specifi c estadístico por ANOVA y post-test Bonferroni. downstream pathways. Our results suggest that inappropriate expression of Resultados: Las proteínas Wnt-3A y LiCl reducen signifi cativamente los ERas could have a role in human cancer. niveles de SIRT6 afectando a la actividad desacetilasa. Las alteraciones de los niveles de SIRT6 correlacionan con alteraciones de la proliferación celular. P18-27 (R18-5) Identificación de Hit1 como un nuevo regulador Conclusiones: Algunos estímulos como Wnt o LiCl pueden facilitar la aparición o progresión tumoral a través de la depleción ejercida sobre SIRT de la salida de mitosis en Saccharomyces 6. cerevisiae

Ana Isabel de los Santos Velázquez, Fernando Monje Casas Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa P18r-29 Lck (CABIMER), Utrera, ES Interleukin 2 requieres p56 /PLCy/nPKCs En la levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae, la salida de (PKCθ)/αPIX pathway to induce Rac 1-PYGM mitosis se produce gracias a la liberación de Cdc14 desde el nucleolo hasta activation in T cells el citoplasma, donde esta fosfatasa revierte los eventos de fosforilación Francisco Llavero Bernal1 1 determinados por las ciclinas mitóticas, lo cual conduce fi nalmente a la , Bakarne Urzelai López de Aberásturi , 2 inactivación de las mismas. La liberación de Cdc14 se produce gracias José Luis Zugaza Gurruchaga a dos cascadas de señalización: la ruta FEAR (Cdc-Fourteen Early 1Universidad del País Vasco (UPV/EHU), Leioa, ES, 2Ikerbasque/ Anaphase Release) y la ruta MEN (Mitotic Exit Network). Aunque no Centro Vasco de Neurociencias Achucarro/Universidad del País es esencial, FEAR juega un papel importante en la correcta segregación Vasco (UPV/EHU), Leioa, ES del ADNr y los telómeros, la dinámica del huso mitótico, y la activación Small GTPases of the Rho family have been implicated in important de MEN. Así, la identifi cación de nuevos componentes de esta ruta es cellular processes such as cell migration and adhesion, protein secretion, importante para entender mejor el proceso de salida de mitosis. En nuestro and/or gene transcription. However, little is known about the role that grupo de investigación, hemos identifi cado la proteína Hit1, de función Rho GTPases play in IL-2-mediated responses in Kit 225 T cells. Our desconocida hasta el momento, como un posible nuevo componente de group has shown that IL-2 induces Rac 1 activation, which interacts la ruta FEAR, y estamos analizando el papel específi co que esta proteína with PYGM and modifi es its activity to trigger T cell proliferation. juega en la correcta regulación de la liberación de Cdc14 y la salida de We have investigated the mechanisms by which PYGM is activated mitosis. through Rac 1 in T cells. Our results suggest that IL-2 stimulates α-PIX/Rac 1/PYGM pathway activation through the novel Protein 225A P18r-28 kinase C theta type (PKCθ). Furthermore, by constructing αPIXS y Regulación de la desacetilasa de histonas SIRT6 αPIXS488A mutants we show that these residues are essential for PYGM en relación con el fenotipo tumoral activation. Moreover, it has been published that β subunit of the IL-2- receptor activates p56Lck which in turns activates the phosphoinositide María Gutiérrez-Salmerón1, Valle Montalvo-Romeral1, Ana Chocarro- phospholipase C-gamma (PLCγ). Here, we have observed that p56Lck Calvo2, José Manuel García-Martínez1, Antonio De la Vieja3, and PLCγ are implicated in the IL-2 signaling cascade that leads to Custodia García-Jiménez1 Rac1/PYGM pathway activation. 1Facultad Ciencias de la Salud. Universidad Rey Juan Carlos, These data reveal a novel signaling pathway in which IL-2 transduces Alcorcón, ES, 2Ludwig Institute for Cancer Research, University of signals through the Lymphocyte cell-specifi c protein-tyrosine kinase Oxford, Oxford, UK, 3Instituto de Salud Carlos III, Majadahonda, ES (p56Lck)/Phosphoinositide phospholipase C-gamma (PLC)/novel Protein Introducción: La hiperglucemia favorece el desarrollo tumoral con kinase C theta type (PKCθ)/Rho guanine nucleotide exchange factor αPIX efectos directos sobre las células tumorales y efectos sistémicos. Nuestro /Rac 1 axis to activate PYGM.

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P18r-30 such as GNRH1 and PENK. It shows both target dependent transcriptional Novel functional complexes between Galphaq activator and repressor activities and it has been described to form a and PB1 domain-containing proteins complex together with IRF2BP1 and IRF2BP2. However, the mechanisms that underlie the regulation and functional activity of IRF2BPL are largely Sofía Cabezudo Violero1, Guzmán Sánchez Fernández2, Catalina unknown. The aim of this study is to characterize the regulation and Ribas Núñez2, Federico Mayor Menéndez2 function of this protein. 1Centro de Biología Molecular Severo Ochoa (CBMSO), Instituto We present evidence that IRF2BPL is predominantly nuclear and shows a de Investigación Sanitaria La Princesa, Madrid, ES, 2Max-Planck- strong transcriptional repressor activity in serum-starved cells. Activation Institute for Heart and Lung Research, Centro de Biologia Molecular of signaling pathways by the addition of serum leads to translocation of the “Severo Ochoa” (CSIC-UAM) and Instituto de Investigación protein to the cytoplasm. IRF2BPL contains a nuclear localization sequence Sanitaria La Princesa, Madrid, ES (NLS) that is highly conserved in the interferon regulatory factor family. Introduction: G proteins play an essential role in the initiation of G-protein Within the NLS of IRF2BPL2 lies a Serine residue (Ser526) that has been coupled receptor (GPCR) signalling. Particularly, the Gαq/11 family has found phosphorylated in proteomic studies, raising the possibility that this been classically shown to associate and activate PLCβ. However, additional phosphorylation may be critical for its localization and functional activity. effectors are responsible for other Gαq functions. We have reported that Substitutions of Serine at position 526 to Alanine (non-phosphorylable) GPCR activation promotes a direct interaction between Gαq and PKCƷ. and Aspartic acid (phospho-mimetic) have been generated by site-directed This association involves the basic PB1-type II domain of PKCƷ and a mutagenesis. Preliminary results suggest that Ser526 phosphorylation is novel acidic region in Gαq different from the classical effector-binding important for IRF2BPL localization and function. Moreover, we have region. This interaction leads to the stimulation of the ERK5 pathway found that IRF2BPL overexpression leads to a decreased colony formation and to the development of cardiac hypertrophy, independently of the in both non-transformed and HRasV12-transformed NIH3T3 cells, which canonical effector PLCβ. In this work, we have described that another PB1 is associated with an early accumulation of cleaved caspase-3, suggesting containing protein, such as p62, belong to this Gαq/PKCƷ complex and increased apoptotic cell death. Taken together, our results point to an explored additional downstream pathways for this new Gαq interactome. important function of IRF2BPL in the negative regulation of transcriptional Methods: Biochemical characterization of the Gαq/p62 complex activity and cellular proliferation. was performed by mutagenesis and co-immunoprecipitation analysis. Functionality of the Gαq/PKCƷ complex was determined performing XCELLigence, propidium iodide incorporation and annexinV assays. P18r-32 Results: We demonstrate that Gαq and p62 can be found in the same Regulation of c-Src tyrosine kinase activity functional protein complex. This association is enhanced upon Gαq by calmodulin activation by GPCR. Furthermore, GRK2, a negative regulator of Gαq Silviya R. Stateva1 1 2 signalling, abrogates this complex. This association involves the PB1 , Estefanía Anguita , Valentina Salas , Gustavo 3 1 domain of p62 and the acidic region of Gαq, described to be essential for Benaim , Antonio Villalobo 1 PKCƷ binding. Interestingly, this association is preserved in PKCƷ defi cient Instituto de Investigaciones Biomédicas, Consejo Superior de cells, suggesting a direct interaction. Additionally, we show that the Gαq/ Investigaciones Científi cas – Universidad Autónoma de Madrid, 2 PKCƷ/ERK5 complex links Gαq to an apoptotic cell death pathway which Madrid, ES, Universidad Central de Venezuela, Facultad de is autophagy-dependent. Ciencias, Instituto de Biología Experimental, Caracas, VE, 3 Conclusion: Overall, our study provides concluding evidence showing Universidad Central de Venezuela, Facultad de Ciencias, Instituto that PKCƷ acts as a functional effector of Gαq through the engagement of de Biología Experimental & Instituto de Estudios Avanzados (IDEA), a novel binding region in the alpha subunit leading to ERK5 activation and Caracas, VE apoptotic cell death in a mechanism dependent on autophagy where p62 Calmodulin (CaM) is a Ca2+-receptor protein that regulates more than could play an interesting role as part of this complex. These results could one hundred target proteins with and without enzymatic activity in Ca2+- help to uncover the identifi cation of new potential pharmacological targets dependent and independent manners and modulates a myriad of cellular for the treatment of cardiovascular diseases. processes, some of which are vital for tumorigenesis (i.e. cell proliferation, apoptosis and autophagy) [1]. c-Src is a non-receptor tyrosine kinase that participates in signaling pathways that transduces events initiated P18-31 by different types of cellular receptors and adhesion molecules, and IRF2-Binding Protein Like: implication of controls many cellular functions including: cell migration, proliferation, the Ser526 phosphorylation on its cellular differentiation, apoptosis and stress-response, among others [2]. It has been previously demonstrated that CaM directly interacts with c-Src in a partial localization, transcriptional activity and its novel Ca2+-dependent manner and that trifl uoperazine, a CaM antagonist, inhibits role as growth suppressor the phosphorylation of c-Src, suggesting that CaM plays an important role in survival signals in pancreatic tumor cells [3]. We demonstrate in Jon Vallejo1 2 3 1 , Aintzane Apraiz , Dorkaitz Basarte , Asier Fullaondo , this work that recombinant c-Src directly binds CaM in Ca2+-dependent 1 Ana M. Zubiaga and independent manners, suggesting that this kinase likely has more 1 Departamento de Genética, Antropología Física y Fisiología Animal, than one CaM-binding domain. A couple of IQ-like motifs identifi ed Facultad de Ciencia y Tecnología, Universidad del País Vasco UPV/ in silico in c-Src could be responsible for the binding of CaM to this 2 EHU, Leioa, ES, Departamento de Biología Celular e Histología, kinase in the absence of Ca2+. We also show that CaM enhances the auto- Facultad de Medicina y Odontología, Universidad del País Vasco phosphorylation and tyrosine kinase activity of c-Src in the absence and 3 UPV/EHU, Leioa, ES, Dpt Genética, Antropología Física y Fisiología presence of Ca2+, most strongly in the former condition. We are testing Animal, Fac. de Ciencia y Tecnología, Universidad del País Vasco whether the CaM antagonist W-7 inhibits or not the hydrogen peroxide- UPV/EHU, Leioa, ES induced phosphorylation of c-Src in human breast adenocarcinoma SK- Ras proteins are important molecular switches that control intracellular BR-3 cells, and whether or not CaM-dependent protein kinase II and/or the signaling networks, and their deregulation is one of the key events leading CaM-regulated protein phosphatase calcineurin, play a role in this process. to cellular transformation. On-going work in the laboratory has identifi ed IRF2BPL, an interferon regulatory factor family member, as a new Bibliografía downstream effector of H-Ras. IRF2BPL encodes a transcription factor [1] Berchtold MW, Villalobo A (2014) Biochim. Biophys. Acta – Mol. Cell that is thought to play a role in transcriptional regulation of hormones Res. 1843: 398-435.

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[2] Thomas SM, Brugge JS (1997) Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 13: 513-609. and protein aggregation. Interestingly, latexin expression appears down- [3] Yuan K, Jing G, Chen J, Liu H, Zhang K, Li Y, Wu H, McDonald JM, regulated in several cancer cells because of hypermethylation of its Chen Y (2011) J. Biol. Chem. 286: 24776-]24784. promoter. Thus, the over-expression of latexin in these cells prevents tumour growth, suggesting a possible involvement of latexin in tumour Funded by SAF2011-23494, S2011/BMD-2349 and PITN-GA-2011-289033 suppression. Retinoic acid (RA) is a natural metabolite of vitamin A that to AV. plays an essential role in neural development. RA induces differentiation through the regulation of genes involved in cell proliferation, cell cycle and cell death. Among these genes, RA has been found to activate the P18m-33 expression of a number of tumor suppressors such as retinoic acid receptor- Papel de la AMPK (proteína quinasa activada β(RARB), tazarotene-induced gene 1 (TIG1) or thioredoxin reductase. In por AMP) en la amplificación de la señalización our study, we demonstrate that RA induces the expression of latexin in SH- tumoral por glucosa SY5Y neuroblastoma cells. Moreover, SH-SY5Y cells that constitutively and stably express latexin, present enhanced RA-mediated differentiation, Ana Chocarro-Calvo1 2 , José Manuel García-Martínez , María as shown by both increased levels of the neuron specifi c enolase (NSE) 2 2 3 Gutiérrez-Salmerón , Valle Montalvo-Romeral , Antonio De la Vieja , differentiation marker, and decreased levels of the DNA-binding protein 2 Custodia García-Jiménez inhibitor (ID1) dedifferentiation marker. These fi rst results encourage us 1 Ludwig Institute for Cancer Research, University of Oxford, to further characterize the molecular pathways behind latexin-mediated Headington, Oxford, UK, 2Facultad Ciencias de la Salud. tumor suppression activity, likely involving cellular differentiation, which Universidad Rey Juan Carlos, Alcrocón, ES, 3Instituto de Salud seem of great interest to unveil the initial stages leading to the development Carlos III, Majadahonda, ES of certain types of cancer. Estudios epidemiológicos asocian un aumento en la incidencia de cánceres sitio-específi cos con la diabetes. Las células tumorales sufren alteraciones del metabolismo de la glucosa, de lípidos y de proteínas por lo que la P18-35 (R18-7) reprogramación del metabolismo energético celular ha despertado un fuerte Development of a luminescence-based interés clínico como estrategia para combatir la enfermedad. La proteína AMPK permite a la célula adaptarse al estrés metabólico por lo que mitocondrial calcium assay optimized representa una diana molecular importante en cáncer y diabetes. Nuestro for high-throughput screening grupo ha demostrado que la hiperglucemia amplifi ca la señalización Paloma Navas Navarro1 2 3 tumoral por Wnt/b-catenina en cánceres asociados a diabetes a través de , Javier García-Sancho , Britta Jehle , Joe aumentos en niveles y actividad de la acetil transferasa p300. Lewis3, Fabiana Perocchi4, María Teresa Alonso Alonso2 Objetivos: Caracterizar el papel de la AMPK en la amplifi cación de la 1Instituto de Biología y Genética Molecular, Valladolid, ES, 2Instituto señalización tumoral por glucosa. de Biología y Genética Molecular (IBGM) - Universidad de Valladolid Metodología: Usamos células tumorales intestinales murinas (STC- - Consejo Superior de Investigaciones Científi cas, Valladolid, ES, 1) y humanas (HT-29) en normo o hiper-glucemia. Los tratamientos 3Chemical Biology Core Facility - EMBL Heidelberg, Heidelberg, DE, incluyen inhibidores/activadores de AMPK, sobreexpresión y depleción 4Maximilians-Universität (LMU) Munich, Munich, DE de AMPK. Las alteraciones en las proteínas se miden por western Blot, Mitochondria are capable of uptaking large amounts of Ca2+ via a inmunofl uorescencia e inmunoprecipitaciones. membrane- potential, ruthenium-red-sensitive mechanism recently Resultados: La hiperglucemia aumenta la fosforilación de AMPK (T172) identifi ed as the mitocondria calcium uniporter. Mitochondria Ca2+ uptake correlacionando con un incremento en los niveles, acetilación y actividad controls intracellular Ca2+ signalling, cell metabolism, cell survival and acetiltrasferasa de p300. Estos efectos son reproducidos por la activación other celular functions by buffering cytosolic Ca2+ levels and regulating de AMPK mediante Metformina/AICAR o la sobreexpresión de una forma mitochondrial effectors. Mitochondrial Ca2+ signaling pathways are silvestre y son bloqueados por un inhibidor de AMPK (Compuesto C) o su depleción mendiante siRNA específi co. considered drug targets, as their regulation can determine cell fate in Conclusiones: La AMPK media la amplifi cación de la señalización disease models such as ischemia-reperfusion injury, neurodegeneration, tumoral por hiperglucemia en cánceres asociados a diabetes y sugiere un cardiomyopathies or metabolic disorders. However, till present, no nuevo mecanismo de adaptación de la célula tumoral a estas condiciones selective and specifi c compounds with therapeutic potential are available de estrés metabólico. to modulate mitochondrial Ca2+ homeostasis. Aequorin is a calcium-binding photoprotein that emits bioluminescence when it is reconstituted with its cofactor coelenterazine. We have developed P18-34 an aequorin-based assay to monitor mitocondrial Ca2+kinetics and we Latexin enhances retinoic acid-mediated have optimized it for high-throughput screening using a 96-well-plate- differentiation in human neuroblastoma-derived reader platform. A bioluminescence-based assay has several advantages SH-SY5Y cells over a fl uorescence-based one: 1) targeting of the aequorin probe to mitochondria matrix is extremely precise, thus permitting the selective Carla Granados1, María Sánchez-Osuna2, Josep Vendrell1, Irantzu measurement inside the organelle;2) aequorin can be reconstituted with Pallarès1, Víctor J. Yuste2 different prosthetic groups allowing to cover a large dynamic range of Ca2+ 1Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Facultat de concentration, from 10-7 to 10-3 M; 3) aequorin has a low Ca2+ buffering Ciències i Institut de Biotecnologia i de Biomedicina, Universitat effect and it is nearly insensitive to changes in Mg2+ or pH that may occur Autònoma de Barcelona , Barcelona, ES, 2Cell Death, Senescence inside mitochondria; 4) it has a high signal-to-noise ratio, making it an and Survival Group, Departament de Bioquímica i Biologia ideal Ca2+ sensor for high-throughput screening; 5) the raw luminescent Molecular and Institut de Neurociències, Facultat de Medicina, signal can be calibrated in Ca2+ concentration by discharging all the Universitat Autònoma de Barcelona, Barcelona, ES remaining aequorin. We have engineered a HeLa monoclonal cell line that Latexin, the only known endogenous carboxypeptidase inhibitor, was stably expresses a mitochondrial matrix-targeted GFP-Aequorin fusion initially identifi ed in the lateral neocortex of rat brain and has been used protein. Aequorin was reconstituted with coelenterazine n, which reduces as a marker of neurons in the developing brain. Latexin also plays a its affi nity for Ca2+, it has a slower consumption rate and allows to monitor role in regulating hematopoietic stem cells homeostasis, infl ammation, Ca2+ kinetics for long periods of time.

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P18-36 en células de cáncer de mama. Además, Sam68 puede ser reclutado en Regulation of Zic1 gene expression by nitric las vías de señalización de leptina e insulina como substrato del receptor, oxide and its role in the regulation of sonic habiéndose mostrado su participación en la proliferación, crecimiento Hedgehog pathway in mouse embryonic stem celular y efectos antiapoptóticos mediados por estas hormonas en diferentes tipos celulares. cells Objetivos: Estudiar la expresión de Sam68 y su nivel de fosforilación Amparo Beltrán Povea, Carmen Salguero Aranda, Rafael Tapia medidos por leptina e insulina en diferentes líneas celulares de cáncer de Limonchi, Ana Belén Hitos Prados, Irene Díaz Contreras, Gladys mama (MCF7, MDA-MB-231 y BT-474), estudiando asimismo el efecto Cahuana Macedo, Bernat Soria Escoms, Francisco Bedoya Bergua, de la inhibición de la expresión de Sam68 mediante siRNA. Juan R. Tejedo Huaman Resultados: En nuestro trabajo se ha demostrado un incremento en Centro Andaluz de Biología Molecular y Medicina Regenerativa la cantidad de proteína y expresión génica de Sam68 en respuesta al (CABIMER), Sevilla, ES estímulo con leptina o insulina en todas las líneas celulares de cáncer de Our laboratory has developed a protocol for endoderm differentiation mama estudiadas. Además, tanto la estimulación con leptina como con of mouse embryonic stem cells which consists in exposing cells to insulina, promovieron un incremento en la fosforilación en tirosina de high concentrations of a nitric oxide donor for 19 hours. This treatment Sam68, regulando negativamente su capacidad de unión a RNA en estas suppresses the expression of pluripotency genes such as Oct4 and Nanog, líneas celulares. La inhibición de la expresión de Sam68 resultó en una and induces differentiation events of early acquisition of epithelial menor activación de las vías MAPK y PI3K en la estimulación con ambas morphology and expression of markers of defi nitive endoderm such as hormonas. Pdx1. We observed in previous studies in mouse embryonic stem cells Conclusión: Estos resultados sugieren la participación de Sam68 en la (mESC) that nitric Oxide causes an increase of the expression of Zic- señalización de los receptores de leptina e insulina en células de cáncer de 1, a marker of differentiation toward ectoderm, so we decided to study mama, mediando los efectos trófi cos de estas hormonas en proliferación y this gene in endodermic differentiation process. It has been proved that crecimiento celular. Zic1 and Gli proteins physically and functionally interact through their zinc fi nger domains, and that Zic1 is essential to the regulation of Sonic Hedgehog (Ssh) pathway in neural development. The aim objective of P18r-38 this study is to determine if Zic1 is regulated by NO, and if this gene Leptin prevents apoptosis triggered by increased has a role in the regulation of Ssh pathway in mESC related with endoderm development. In our early studies in mouse embryonic stem temperature in placental explants cells (mESCs) we have analysed Zic1 gene and protein expression of Antonio Pérez-Pérez1, Ayelen Toro2, Flora Sánchez-Jiménez1, Jenifer cells treated with high concentration of nitric oxide, as well as the DNA Martín-González3, Teresa Vilariño-García1, Cecilia Varone2, Víctor methylation on its promoter region, showing that the expression of Zic1 Sánchez-Margalet1 in presence of Nitric Oxide was increased, without signifi cant changes 1Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular, on DNA methylation. Furthermore, we found that the transcription Hospital Universitario Virgen Macarena, 13 Facultad de Medicina, factor Egr1 could active to Zic1 expression after NO treatment. Then 2 we proved that Zic1 coexpressed with Pdx1 in cells treated with NO, in Sevilla, ES, Departamento de Química Biológica, IQUIBICEN, adult pancreatic cells and in pancreas tissue, which are enough evidence Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos 3 to suspect that Zic1 may be involved in the process of differentiation Aires, Buenos Aires, AR, Department of Stomatology (Endodontics to endoderm. Finally, we determined that NO treatment suppresses Ssh section), School of Dentistry, University of Sevilla, Sevilla, ES signaling pathway, decreasing the expression of it targets genes. To test Maternal fever is common during pregnancy and and has for many whether this modifi cation is promoted by Zic1, we developed gain and years been suspected to harm the developing fetus. Whether increased loss of function assays of Zic1, reveling thus the possible role of Zic1 maternal temperature produces exaggerated apoptosis in trophoblast in Ssh signaling pathway inhibition and differentiation process toward cells remains unclear. Since p53 is a critical regulator of apoptosis we endoderm in mESC. hypothesized that increased temperature in placenta produce abnormal expression of proteins participating in the p53 pathway and fi nally Subvencionado por: caspase 3 activacion. Moreover, leptin, produced by placenta, has - Ministerio de Economía y Competitividad-Secretaría de Estado de demonstrated to promote the proliferation and survival of trophoblastic Investigación Desarrollo e Innovación (IPT-2011-1615-900000) cells. That is why, we aimed to study the possible role of leptin - Junta de Andalucía (CTS- 7127/2011) preventing apoptosis triggered by high temperature, as well as the molecular mechanisms underlying this effect. Fresh placental tissue was collected from normal pregnancies. Placental P18m-37 Sam68 participa en las vías de señalización de explants were exposed to increased temperature (40ºC and 42ºC) for different time points. We employed 10 nM leptin which is the optimal leptina e insulina en células de cáncer de mama leptin concentration. Western blotting and real-time PCR were performed Flora Sánchez-Jiménez1, Antonio Pérez-Pérez1, Jenifer Martin- on tissue lysate for protein and mRNA expression of p53 and downstream González2, Antonio M. Carmona-Fernández1, Victor Sánchez- effector proteins, p21, Bax, Mdm2 and caspase 3. Margalet1 Maximal apoptotic effect of high temperature was obserbed after 3 h 1Hospital Universitario Virgen Macarena, Montemayor, ES, incubation of trophoblasts. Protein and mRNA expression of p53, p21, 2Departamento de Estomatología, Facultad de Odontología, Bax, Mdm2 and caspase 3 were signifi cantly increased in explants at Universidad de Sevilla, Sevilla, ES 40ºC and 42ºC in compared with explants to 37ºC. Conversely, this Introducción: La obesidad y la resistencia a la insulina son factores de increased expression was signifi cantly attenuated by leptin 10 nM at both riesgo bien conocidos para el desarrollo del cáncer de mama en mujeres 40ºC and 42ºC. postmenopáusicas. La elevación de los niveles de leptina e insulina modulan These data illustrate the potential role of leptin for inhibiting the excessive positivamente el crecimiento de estas células tumorales. La proteína Sam68 apoptosis in villous trophoblast triggered by high temperature. However, es una proteína de unión a ARN que también interacciona con proteínas de the upstream regulation of p53 with regard to exaggerated apoptosis in señalización. Se ha demostrado previamente la sobreexpresión de Sam68 response to elevated temperature merits further investigation.

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P18r-39 P18r-41 PTEN mediates the inhibition of c-Src oncogenic Transporte núcleo-citoplasmático del complejo activity promoted by connexin43 in glioma cells SNF1 de Saccharomyces cerevisiae and astrocytes Montserrat Vega1, Alejandra Fernández-Cid2, Alberto Riera2, Pilar 1 1 Ana González Sánchez, Marta Domínguez-Prieto, Sandra Herrero- Herrero , Fernando Moreno 1 González, Jose M Medina, Arantxa Tabernero Departamento de bioquímica y biología molecular, Universidad 2 Universidad de Salamanca, INCYL (Instituto de Neurociencias de de Oviedo, Oviedo, ES, MRC Clinical Sciences Centre - Imperial College Faculty of Medicine, London, UK Castilla y León), Salamanca, ES La familia de proteín quinasas AMPK/SNF1 es esencial para establecer Gliomas are the most common brain tumors and they present a very bad en todas las células eucariotas, incluidas las levaduras, la regulación prognosis. One of their characteristics is a high activity of the oncogen, metabólica adecuada en respuesta a diferentes tipos de estrés. El complejo c-Src, and a low expression of connexin43 (Cx43), the main protein SNF1 de S.cerevisiae está constituido por tres subunidades, una subunidad forming gap junction channels in astrocytes. In previous works we showed catalítica Snf1 y dos subunidades reguladoras, Snf4 y una de las tres that restoring Cx43 to glioma cells inhibits c-Src activity. Since c-Src subunidades implicadas en la localización subcelular del complejo (Sip1, activity is inhibited by c-terminal Src kinase (Csk) phosphorylation and Sip2 o Gal83). En S. cerevisiae, este complejo se requiere no solo para la PTEN dephosphorylation, we investigated wether Cx43 could regulate adaptación de la levadura a diferentes condiciones ambientales, entre las c-Src activity by recruiting or regulating said enzymes. que se incluye el estrés nutricional generado por condiciones de limitación In this work we show that silencing PTEN expression in C6 glioma cells de glucosa, sino que también está implicado en procesos de desarrollo. stably transfected with Cx43 (C6Cx43) reverted the effect of Cx43 on En esta comunicación presentamos datos de la infl uencia de los niveles c-Src activity and on cell proliferation. These results indicate that PTEN de glucosa en la distribución subcelular y mecanismo de transporte al participates in the inhibition of c-Src activity promoted by Cx43. Using núcleo del complejo SNF1. Experimentos de coinmunoprecipitación de confocal microscopy and co-inmunoprecipitation studies, we confi rmed cromatina (ChIP) demuestran que las tres proteínas que forman parte del the interaction between Cx43, PTEN and c-Src in C6 glioma cells complejo SNF1 (Snf1, Gal83 y Snf4), están presentes en el núcleo tanto transfected with Cx43 and astrocytes in primary culture. In addition, we en condiciones de alta como de baja glucosa. Hasta ahora el sistema de found Csk in this inmunocomplexes, suggesting that Cx43 can recruit the importación y exportación utilizado por estas proteínas era desconocido. machinery required to inactivate c-Src. Finally, we found that restoring Aquí mostramos la interacción de estas tres proteínas con las importinas Cx43 expression in C6 glioma cells, in addition to reduce c-Src activity del sistema clásico de importación, Kap95 y Kap60, así como su and proliferation, upregulates PTEN and Csk. interacción con la exportina Xpo1, en condiciones de alta y baja glucosa. According with the results, it could be concluded that PTEN and Csk Experimentos in vitro muestran que la interacción de Snf4, Snf1 y Gal83 participate in the inhibition of the activity of c-Src promoted by Cx43 in con las importinas Kap60 y Kap95, está regulada por la presencia de glioma cells and astrocytes. Gsp1GDP y Gsp1GTP. Demostrando que la direccionalidad del transporte núcleo-citoplásmico viene dada por la GTPasa Gsp1 en función de si está cargada con GDP (citoplasma) o GTP (núcleo). P18-40 Regulación de los niveles de PLK1 por la E3 ligasa SKP1-CUL1-F-box P18r-42 Mechanism for the specific targeting of Ana Cristina Rivas1 1 1 , Servando Giráldez , Joaquín Herrero-Ruiz , Mar methyltransferases to chemoreceptors in Mora-Santos1, María Cristina Limón-Mortés1, Carmen Sáez2, Miguel Ángel Japón2, Maria Tortolero1, Francisco Romero1 Pseudmonas aeruginosa PAO1 1 Departamento de Microbiología, Facultad de Biología, Universidad Andrés Corral Lugo, Cristina García Fontana, Manuel Espinosa 2 de Sevilla, Sevilla, ES, Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS), Urgel, Tino Krell Hospital Universitario Virgen del Rocío/CSIC/Universidad de Sevilla Estación Experimental del Zaidin, CSIC (EEZ-CSIC), Granada, ES y Departamento de Anatomía Patológica, Hospital Universitario Virgen del Rocío, Sevilla, ES Chemosensory pathways are major signal transduction mechanisms in bacteria. Methyltransferases of the CheR family and methylesterases of PLK1 (Polo-Like Kinase1) es una quinasa de serina/treonina que interviene the CheB family control chemoreceptor methylation, and this dynamic en muchos de los eventos que tienen lugar durante la mitosis, como la posttranslational modifi cation is necessary for proper chemotaxis of bacteria. entrada en mitosis, la maduración de los centrosomas, el ensamblaje del Studies with enterobacteria that contain a single CheR or CheB show that, huso mitótico, la separación de las cromátidas hermanas, la activación del in addition to binding at the methylation site, some chemoreceptors bind complejo APC/C y la salida de mitosis y el inicio de la citocinesis. Además, CheR or CheB through additional high-affi nity sites at distinct pentapeptide PLK1 está implicada en la replicación del ADN y en el restablecimiento sequences in the chemoreceptors. We investigated the recognition of del ciclo celular tras el punto de control de G2 producido por los daños chemoreceptors by CheR proteins in the human pathogen Pseudomonas en el ADN. Durante el ciclo, PLK1 se degrada vía APC/C-proteasoma aeruginosa PAO1. Of the four methyltransferases in PAO1, we detected comenzando su degradación al fi nal de la mitosis y continuando a lo largo an interaction only between CheR2 and the chemoreceptor methyl- de la fase G1. PLK1 también se degrada por el APC/C en G2 en respuesta accepting chemotaxis protein B (McpB), which contains the pentapeptide al daño en el ADN. Por otra parte, recientemente hemos descrito que en GWEEF at its carboxyl terminus. Furthermore, CheR2 was also the only la fase S los niveles de PLK1 están controlados por la ligasa de ubicuitina paralog that methylated McpB in vitro, and deletion of the pentapeptide SCFFBXW7α. En este caso, PLK1 es ubicuitilada y degradada vía proteasoma sequence abolished both the CheR2-McpB interaction and the methylation en condiciones no estresantes e incrementándose este efecto tras radiación of McpB. When clustered according to protein sequence, bacterial CheR ultravioleta. Esta degradación contribuye a la parada del ciclo celular en proteins form two distinct families-those that bind pentapeptide-containing la fase S al impedir la formación de los complejos de pre-replicación (pre- chemoreceptors and those that do not. These two families are distinguished RC), lo que reduce la proliferación celular. Dado que se ha descrito que las by an insertion of three amino acids in the β-subdomain of CheR. Deletion ligasas de ubicuitina SCFFBXW7α y SCFβTrCP pueden regular la estabilidad de of this insertion in CheR2 prevented its interaction with and methylation un mismo sustrato, tanto cooperando como interfi riendo en la degradación of McpB. Pentapeptide-containing chemoreceptors are common to many del mismo, hemos estudiado el efecto de SCFβTrCP sobre PLK1 y sus bacteria species; thus, these short, distinct motifs may enable the specifi c posibles implicaciones en las funciones de la quinasa. assembly of signaling complexes that mediate different responses.

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P18-43 lipidada de LC3, la degradación de p62 y reduce los niveles de mRNA de Singularidad de SUMO en la regulación de las PHD Bnip3 en células tratadas con dexametasona. Estos resultados obtenidos en cultivos celulares apoyan la idea de que la activación de ERK 1/2 disminuye Almudena Gerpe-Pita, Amelie Schöber, Onintza Carlevaris, Edurne Berra la degradación proteica a través de los dos sistemas celulares, proteasoma y CIC bioGUNE, Derio, ES lisosomal, por lo que el tungstato sódico podría ser un agente útil situaciones Utilizando el oxígeno como sustrato, las PHD (Prolyl Hydroxylase Domain fi siopatológicas en las que se presentase una atrofi a muscular. containing proteins) son enzimas que catalizan la hidroxilación de sus proteínas dianas sobre un residuo prolina. Estas dioxigenasas, conservadas Proyecto Financiado por la Fundación Botín. a lo largo de la evolución y de las que se han descrito tres isoformas en mamíferos (PHD1-3), se identifi caron inicialmente como los sensores de oxígeno responsables de regular la estabilidad de la subunidad α del factor P18-45 de transcripción HIF (Hypoxia Inducible Factor), el “jefe de orquesta” de Paralogous chemoreceptors mediate chemotaxis la cascada de señalización de hipoxia y el mantenimiento de la homeostasis towards protein amino acids and the non-protein de oxígeno. No obstante, las PHD no son enzimas redundantes y si bien PHD1, 2 y 3 comparten ciertos substratos y tareas, es evidente que también amino acid gamma-aminobutyrate (GABA) muestran ciertas especifi cidades en cuanto a su función y regulación. Miriam Rico Jiménez1, Francisco Muñoz Martínez1, Cristina Gracía La SUMOilación es una modifi cación postraduccional que conlleva la Fontana1, Matilde Fernandez2, Bertrand Morel3, Álvaro Ortega4, conjugación covalente de SUMO (Small Ubiquitin-like Modifi er). El Juan Luís Ramos1, Tino Krell1 proceso de SUMOilación implica una cascada de reacciones enzimáticas 1Estacion experimental del Zaidín, CSIC, Granada, ES, 2Bioilíberis en la que intervienen un complejo único de activación, Uba2/Aos1 o SAE1/ SL, Granada, ES, 3Departamento de Química Física, Facultad de SAE2, una enzima de conjugación (Ubc9), una E3 específi ca para ciertos Ciencias, Universidad de Granada, Granada, ES,4Universidad de sustratos (PIAS, RanBP2 o Pc2 son algunos ejemplos) y deSUMOilasas, Murcia, Murcia, ES responsables de la deconjugación de SUMO. La interacción dinámica entre SUMOilación y deSUMOilación modula importantes vías de señalización The paralogous receptors PctA, PctB and PctC of Pseudomonas aeruginosa molecular y entre ellas, la cascada de señalización de hipoxia. Por ello, nos were reported to mediate chemotaxis to amino acids, intermediates of amino planteamos estudiar el papel de SUMO en la regulación de las PHD. En esta acid metabolism and chlorinated hydrocarbons. We show that the recombinant presentación discutiremos nuestros resultados más recientes sobre el papel ligand binding regions (LBRs) of PctA, PctB and PctC bind 17, 5 and 2 singular de SUMO en la regulación de PHD1, 2 y 3, su implicación en las L-amino acids, respectively. In addition, PctC-LBR recognized GABA but rutas dependientes e independientes de HIF y su relevancia fi siopatologica. not any other structurally related compound. L-Gln, one of the three amino acids that is not recognized by PctA-LBR, was the most tightly binding ligand to PctB suggesting that PctB has evolved to mediate chemotaxis primarily P18-44 towards L-Gln. Bacteria were effi ciently attracted to L-Gln and GABA, but La activación de ERK 1/2 es suficiente para mutation of pctB and pctC, respectively, abolished chemoattraction. restaurar la degradación proteica mediada por The physiological relevance of taxis towards GABA is proposed to reside in an interaction with plants. LBRs were predicted to adopt double PDC (PhoQ/ dexametasona en células de músculo esquelético DcuS/CitA) like structures and site directed mutagenesis studies showed that José Dámaso Vílchez Rienda1, Rafael Salto González1, María Elena ligands bind to the membrane-distal module. Analytical ultracentrifugation Cabrera Cazorla1, Joan J Guinovart i Cirera2, María Dolores Girón studies have shown that PctA-LBR and PctB-LBR are monomeric in the González1 absence and presence of ligands, which is in contrast to the enterobacterial 1Departamento de Bioquímica y Biología Molecular II, Facultad receptors that require sensor domain dimers for ligand recognition. de Farmacia, Universidad de Granada, Granada, ES, 2Instituto de Investigación Biomédica, Universidad de Barcelona y CIBER de Diabetes y Enfermedades Metabólicas (CIBERDEM), Barcelona, ES P18-46 Protein kinase CK2 affects the stability of the La atrofi a muscular se desarrolla en situaciones de ayuno prolongado, enfermedades como cáncer, diabetes, SIDA o sepsis y en condiciones como HB-EGF receptor ErbB4 in 786-O cells el envejecimiento, denervación o tratamiento con glucocorticoides. En E. Alcaraz1, J. Vilardell1, E. Sarró2, M. Plana1, A. Meseguer2, E. Itarte1 estas situaciones, se produce una disminución en la síntesis de proteínas 1Departament de Bioquímica i Biologia Molecular, Universitat conjuntamente con un aumento en su degradación. La degradación de Autònoma de Barcelona, Cerdanyola del Vallès, ES, 2Fisiopatologia proteínas en músculo esquelético está mediada por la actividad de dos Renal, CIBBIM, Institut de Recerca Hospital Universitari Vall rutas conservadas: ubiquitina-proteasoma y un aumento de la autofagia Hebron, Barcelona, ES lisosomal. La primera ruta, responsable del recambio de la mayoría de proteínas musculares solubles y miofi brilares, se activa como resultado Heparin-binding EGF-like growth factor (HB-EGF), a member of the EGF de una expresión aumentada de ubiquitina y ligasas de ubiquitina, como family, binds and activates ErbB1 and ErbB4. ErbB4 is expressed as different ATROGEN1 y MuRF1. La autofagia juega un papel muy importante en la alternatively spliced isoforms that are characterized by variant extracellular degradación proteica en el músculo esquelético e implica un incremento en juxtamembrane (JM) and intracellular cytoplasmic (CYT) domains. The JM la transcripción de una serie de genes como LC3, p62 y Bnip3. Ambas rutas domain of type a (JM-a) can be cleaved by ADAM 17 in response to binding están moduladas por el factor de transcripción Forkhead box O3 (FoxO3). of ligands to the receptor, or the activation of PKC. The proteolytic fragment FoxO3 normalmente está fosforilado por Akt y en estado inactivo en el can be further cleaved by γ-secretase, which releases the intracellular domain citosol, pero en ausencia de una represión de Akt, se transloca al núcleo donde as a soluble fragment of 80kDa (CYT2-ICD) which can translocate into the induce la expresión de una serie de genes relacionados con los dos sistemas nucleus where it functions as a co-activator or co-repressor for a number of de degradación. En cultivos de células musculares de rata L6, el tungstato transcription factors. In previous studies we had observed that protein kinase sódico, activador de ERK 1/2, es capaz de inhibir la degradación inducida CK2 was involved in the response to HB-EGF in the renal cell carcinoma 786- por dexametasona. El tungstato promueve la fosforilación de FoXO3a, lo O cell line. To study the potential role of CK2 in ErbB4 receptor processing, que conduce a su inactivación e inhibición de su translocación al núcleo we generated a stable transfected 786-O cell line that expresses JMa-Cyt2 y por tanto, a una disminución en la actividad del promotor de ubiquitina ErbB4 isoform, characteristic of renal cells. Treatment of these cells with así como una menor expresión de las ligasas de ubiquitina. Asimismo, el the CK2 inhibitor CX-4945 resulted in a marked reduction of ErbB4 levels. tungstato reduce la formación de autofagosomas, la expresión de la forma Under the same conditions, CX-4945 did not affect the levels of the membrane

171 Pósters XXXVII Congreso SEBBM protein transferrin receptor or of the CK2 substrate Iκ. Destabilization of poliquístico, resistencia a la insulina y subfertilidad en la mujer en edad ErbB4 promoted by CX-4945 did not cause to the accumulation of CYT2- reproductiva. ICD, as occured in response to HB-EGF or PMA, but to the complete loss La proteína de unión a ARN Sam68 se expresa en células de la granulosa of bands detected with the anti-ErbB4 antibody. Treatment with lysosomal y las hembras de los ratones knockout son subfértiles, con problemas proteinases inhibitors (leupeptin and pepstatin) attenuated the effect of CX- de ovulación. Ya que hemos encontrado que Sam68 puede reclutarse 4945 on CYT2-ICD leading to its accumulation. Moreover, interaction a la señal de los receptores de insulina y leptina, planeamos estudiar between CK2 (CK2α and, in particular, CK2β subunit) and ErbB4 receptor la participación de Sam68 en la señal y la acción de los receptores de has been detected by pull down analysis, and downregulation of CK2β using insulina y leptina en células de la granulosa. Además, estudiamos la siRNAs decreased the expression of ErbB4. To sum up, CK2 seems necessary expresión de Sam68 en células de la granulosa en respuesta a la leptina to maintain ErbB4 levels within the cell. Supported by grants BFU2009- y la insulina in vitro. 10189 (MCINN) and SAF-2011-29506 (MINECO). Las células de la granulosa se obtuvieron a partir de la obtención de ovocitos para la fertilización invitro. La señalización se studio por inmunoprecipitación e inmunoblot de las proteínas fosforiladas. La P18-47 expression de Sam68 se inhibe por estrategia antisentido. El nivel de MDN-0066 a novel inhibitor of VHL/HIF pathway expression de Sam68, los receptors de leptina e insulina se cuantifi caron produced by a new Pseudomonas species por RT-PCR e inmunoblot. Hemos encontrado que Sam68 se tirosín-fosforila por estimulación Bastien Cautain, Nuria De Pedro, Javier Pascual, Jesus Martin, con insulin o leptina en células de la granulosa, reclutando Sam68 Fernando Reyes, Olga Genilloud, Francisca Vicente a los complejos de señalización y disminuyendo la capacidad de Fundacion MEDINA, Armilla, ES unión al ARN. Además, tanto la leptina como la insulina aumentan Throughout recent history, metabolites of microbial origin have had an la expresión de Sam68 en las células de la granulosa. Finalmente, la extraordinary impact on the welfare of humanity. In fact, natural products have expresion de Sam68 es necesaria para la activación completa de las largely been –and still are– considered an exceedingly valuable platform for vías de señalización PI3K y MAPK, por insulin y leptina en células de the discovery of new drugs against diverse pathologies. Such value is partly la granulosa. due to their higher complexity and chemical diversity as compared to those of En conclusion, Sam68 es reclutado a la señal del receptor de leptina e synthetic and combinatorial compounds. Mutations in the Von Hippel-Lindau insulin, su expression se induce por ambas hormonas, y la expression de (vhl) gene are responsible for VHL disease, congenital polycythemia, and are Sam68 es necesaria para la completa activación de la transducción de la found in many sporadic tumor types. The primary cause of morbidity and señal de los receptores de insulina y leptina. Sam68 puede ser un nuevo mortality for these patients arises from progression of Renal Cell Carcinoma elemento en la resistencia a la insulina ovárica y la fertilidad disminuida (RCC) or end-stage renal disease. Inactivation of the Von Hippel-Lindau (vhl) en mujeres obesas tumor suppressor gene arises in the majority of Renal Cell Carcinoma (RCC) as well as in other types of cancer and is associated with a high degree of vascularization and poor prognosis. Loss of pVHL function thus represents P18r-49 a pathognomonic molecular defect for therapeutic exploitation. In this study, β3 Integrin is essential for invadopodia renal carcinoma cell lines with naturally occurring vhl mutations (RCC4 formation in TGF-β lung carcinoma treated VA) and their genetically matched wild-type vhl (RCC4 VHL)counterparts cells were seeded onto 96-well plates and treated with a collection of 1,040 organic extracts obtained from 130 unicellular bacteria strains belonging to Rafael Peláez Cristóbal, Xabier Morales, Elisabeth Salvo, Saray at least 25 genera of the phyla Actinobacteria, Firmicutes, Proteobacteria Garasa, Ana Rouzaut and Bacteroidetes. This strategy allowed us to identify several extracts Universidad de Navarra/CIMA, Pamplona, ES obtained from the bacterial strain F-278,770T showing biological activities Tumor cell migration and invasion are crucial events during cell metastasis, not associated with previously known active metabolites. The fractionation which is the main cause of death in patients with cancer. Depending on the and structural elucidation of one of these extracts led to the discovery of a new mechanical properties of the tumor stroma, cancer cells develop invasive lipodepsipeptide (MDN-0066) with specifi c toxicity in pVHL defi cient cells actin-rich structures capable of degrading the surrounding extracellular that is not detectable in cells with pVHL expression rescue. This discovery matrix (ECM) known as invadopodia. demonstrated the feasibility of selectively targeting the loss of the vhl tumor Integrins are transmembrane proteins implicated in cell adhesion and suppressor gene for potential clinical benefi t and may have great impact migration. Integrin activation induces signaling cascades conducive on the development of new targeted therapies from natural product for the to the reorganization of cell cytoskeleton. Recent reports have treatment of cancer and other genetic diseases. demonstrated the presence of different integrins surrounding the invadopodia core in breast and melanoma cancer cells. β3 integrin and αvβ3 heterodimer have been associated with poor prognosis and P18m-48 Papel de la proteína de unión a ARN Sam68 en increased metastasis in several carcinoma types. We aimed to determine whether β3 integrin participates in invadopodia formation in lung la señal de la leptina y la insulina en células de carcinoma cells. We based our hypothesis on our previous fi ndings of la granulosa specifi c TGF-β induction of β3 integrin dependent metastasis in lung carcinoma cells. 1 2 Teresa Vilariño García , Antonio Pérez-Pérez , Victor Blasco In this study, we demonstrated that β3 integrin is temporarily allocated on 3 3 3 Rodriguez , Nicolás Prados Nodd , Manuel Fernández Sánchez , the invadopodia of H157 NSCLC cells. β3 integrin silencing or functional Víctor Sánchez Margalet2 blockade completely abrogates invadopodia formation, even after treatment 1 Departamento Bioquimica Médica y Biología Molecular, Facultad with TGF-β (a cytokine that signifi cantly induces invadopodia formation) 2 de Medicina de Sevilla, Sevilla, ES, Departamento de Bioquímica while β3 integrin re-expression restores the capacity of invadopodia Médica y Biología Molecular, Hospital Universitario Virgen formation in integrin defi cient cells. Moreover, integrin activation induces 3 Macarena, Facultad de Medicina, Sevilla, ES, Instituto Valenciano different signal pathways (FAK, SRC, ERK and Small GTPases family) de infertilidad de Sevilla, Sevilla, ES allowing invadopodia formation. La obesidad es un problema medico no solo porque se asocia a la diabetes In conclusion, we demonstrated a dual role of the β3 integrin in invadopodia tipo 2 y al riesgo cardiovascular, sino también por porque se asocia a ovario formation during cancer cell metastasis: it contributes to the initial cell

172 Granada 2014 Pósters adhesion and then it activates signal pathways implicated in invadopodia P18-52 formation. TGFβ2 dictates disseminated tumor cell fate in target organs through TGFβ-RIII and p38α/β signaling P18r-50 Mecanismos de regulación de la expresión Paloma Bragado Domingo de ENA1 en respuesta a pH alcalino: un estudio IDIBAPS, Barcelona, ES cuantitativo Metastases are thought to arise from disseminated tumor cells (DTCs) that can either initiate growth immediately or reprogram into dormancy. In this Maria López Malo, Silvia Petrezselyova, David Canadell, Joaquín state they can remain undetected for long periods before resuming growth Ariño and forming overt metastases. The mechanisms driving dormancy of DTCs UAB-Instituto Biotecnología y Biomedicina, Barcelona, ES remain largely unknown. We hypothesize that via a “seed and soil” mechanism the target organ microenvironment where DTCs lodge controls the timing of La alcalinización del medio supone una situación de estrés para DTCs dormancy and thus their fate. Using head and neck and breast cancer la levadura Saccharomyces cerevisiae, que conlleva una respuesta models we have studied the nature of the organ-derived signals that control the adaptativa que da lugar a un remodelado de la expresión génica. Uno interconversion of DTCs between dormancy and proliferation states. We found de los genes relevantes para la adaptación a pH alcalino es ENA1, que that the bone marrow (BM) represents a growth restrictive micro-environment codifi ca una Na+ ATPasa implicada en la detoxifi cación de sodio. En la in which DTCs persist for long periods of time in a quiescent/dormant state. regulación del gen ENA1 por pH alcalino están implicadas diversas rutas In this tissue, host-derived TGFβ2, but not TGFb1, signaling, activates p38α/β, de señalización. Una de ellas está mediada por la proteína calcineurina inducing a [ERK/p38] low signaling ratio. This results in induction of DEC2/ que desfosforila el factor transcripcional Crz1, permitiéndole la entrada SHARP1 and p27, downregulation of CDK4 and dormancy of malignant en el núcleo y por tanto la unión a las secuencias específi cas activando DTCs. TGFβ2-induced dormancy required TGFβ -receptor-I, TGFβ -receptor- el gen. La respuesta independiente de calcineurina está bajo el control de III and SMAD1/5 activation to induce p27. In contrast, in lungs, which is a dos rutas diferentes, Rim101 y Snf1, en las que está implicado el represor site commonly permissive for metastasis, TGFb2 signals are weaker and Nrg1. Si bien este proceso ha sido caracterizado desde un punto de vista only a short-term dormancy ensues before DTCs start proliferating and fuel cualitativo, no ha sido investigado desde un punto de vista cuantitativo, metastases. Importantly, systemic inhibition of TGFβ-receptor-I or p38α/β que permita eventualmente el modelado del mismo. Para ello hemos activities awakened dormant DTCs fueling multi-organ metastasis. Our work analizado a lo largo del tiempo en células expuestas a estrés alcalino reveals a “seed and soil” mechanism where TGFβ2 and TGFβRIII signaling diversos parámetros como la tasa de transcripción y la cantidad de mARN through p38α/β regulate DTC dormancy and defi nes restrictive (BM) and de ENA1, la cantidad de Crz1, su transición citosol-núcleo y su cinética -permissive (lung) microenvironments for HNSCC metastasis. By identifying de unión al promotor de ENA1, así como la cantidad de Ena1 producida. key pathways controlling dormancy we open opportunities for eradication of Un análisis similar para el represor Nrg1 está en curso. De esta manera the residual disease. confi amos defi nir los parámetros que gobiernan la expresión de Ena1 en respuesta a estrés alcalino.

P18r-51 P19. Transgénesis en mamíferos Búsqueda de nuevos mecanismos de actuación de la proteína fosfatasa Ptc1 P19r-1 IGF1R (insulin-like growth factor type 1 receptor) Laura Tatjer Recorda, Asier González Seviné, Joaquín Ariño Carmona regula la regeneración del epitelio bronquiolar UAB-Instituto Biotecnología y Biomedicina, Sabadell, ES induciendo la diferenciación de las células de Clara

Las proteínas fosfatasas de tipo 2C (PP2C) conforman una familia Sergio Piñeiro-Hermida, Icíar P. López, Raquel Torrens, José G. Pichel de enzimas monoméricas, conservadas a lo largo de la evolución, Centro de Investigación Biomédica de la Rioja (CIBIR), Fundación que en S. cerevisiae están codifi cadas por 7 genes estructuralmente Rioja Salud, Logroño, La Rioja, ES relacionados (PTC1-7). La isoforma más estudiada en levaduras es Los IGF (insulin-like growth factors) son factores pleiotrópicos que regulan Ptc1, ya que ésta puede desempeñar múltiples funciones específi cas la proliferación, diferenciación y supervivencia celular activando el IGF1R, no compartidas con las otras PP2C. Como consecuencia, un mutante su receptor específi co. Controlan el desarrollo y la homeostasis del pulmón, ptc1 presenta defectos de crecimiento ante diversas formas de estrés, su regeneración tras daño y participan en enfermedades pulmonares como el como los que activan la vía de señalización de la integridad de la pared síndrome de distrés respiratorio, la fi brosis y el cáncer. Aunque la expresión celular (p. ej., pH alcalino y el blanco de calcofl úor) o en presencia pulmonar de IGF1R es ubicua y sus niveles son elevados en el epitelio, la de rapamicina, un inhibidor de la vía TOR, la cual señaliza la falta de acción de IGF1R depende de la disponibilidad de los ligandos, del momento nutrientes. Con el objeto de identifi car posibles dianas de la acción de del desarrollo y del tipo celular. Como los ratones defi cientes en IGF1R mueren Ptc1, hemos rastreado bibliotecas genómicas para encontrar genes que, al nacer por insufi ciencia respiratoria debido a la hipoplasia e inmadurez en sobreexpresión, alivien el fenotipo de sensibilidad a pH alcalino, pulmonar, para determinar la función de IGF1R en el epitelio del pulmón murino blanco de calcofl úor y rapamicina del mutante. Como resultado adulto se generaron mutantes condicionales Nkx2.1-Cre; Igf1r fl /fl , que expresan de la búsqueda se han aislado un total de 25 genes que suprimen o la recombinasa Cre en el epitelio respiratorio. Estos ratones mutantes expresan alivian uno o varios fenotipos característicos del mutante ptc1. Nos niveles reducidos de mRNA de Igf1r en el pulmón, presentan alteraciones en el hemos centrado en el estudio de PPH21 y PPH22, que codifi can dos epitelio bronquiolar terminal (adelgazamiento, reducción de la densidad celular subunidades catalíticas redundantes de la proteína fosfatasa de tipo 2A. y aumento de la proliferación), pero sin impacto morfológico aparente en el Los resultados obtenidos nos indican que la carencia de Ptc1 estaría parénquima alveolar. Durante la recuperación del daño bronquiolar inducido alterando los diferentes complejos fosfatasa-Tap42, que actúan como por la ablación selectiva de las células epiteliales de Clara con naftaleno, la efectores de la vía TOR cuando ésta es inhibida. defi ciencia de Igf1r mantiene los defectos histológicos, dispara la proliferación y retrasa su diferenciación. In vitro, los IGF inducen la expresión de CCSP Financiado por BFU2011-30197-C3-01. (Clara Cell Secreted Protein) en células epiteliales bronquiolares humanas.

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Los resultados demuestran que la señalización mediada por IGF1R en el células ES. Con la aparición de las nuevas nucleasas de edición genómica, en epitelio respiratorio regula la regeneración del epitelio bronquiolar dañado, particular con las CRISPR-Cas9 ha sido posible diseñar una estrategia para induciendo la diferenciación de las células de Clara. eliminar estas secuencias reguladoras, intergénicas, directamente del locus endógeno. Los primeros resultados obtenidos han sido extraordinariamente positivos, con alteraciones fenotípicas evidentes similares a las obtenidas P19-2 (R03_19-2) anteriormente durante el análisis de ratones transgénicos. En este trabajo Retos y nuevas oportunidades en transgénesis presentaremos los resultados obtenidos aplicando la tecnología CRISPR- animal mediante las nucleasas de edición Cas9 para la inactivación especíﬁ ca de secuencias intergénicas in vivo, en genómica CRISPR-Cas9 el genoma de ratón.

Lluís Montoliu, Davide Seruggia Centro Nacional de Biotecnología (CNB-CSIC), Madrid, ES P19r-4 (R03_19-4) Las primeras células troncales pluripotentes embrionarias (ES) de ratón se Antizyme Inhibitor 2 expression in the adrenal describieron en 1981 por Martin Evans. En 1986, Mario Capecchi integró gland: study with knock-out mice el uso de dichas células y la experiencia en recombinación homóloga Ana Lambertos Escudero1 2 desarrollada por Oliver Smithies para diseñar el protocolo de inactivación , Bruno Ramos Molina , Carlos López 2 2 2 dirigida de genes en el genoma de ratón, proceso por el cual los tres García , Cristina Peñafi el Verdú , Andrés Joaquín López Contreras , 2 2 investigadores recibieron el premio Nobel en 2007. Durante años esta Asunción Cremades Campos , Rafael Peñafi el García 1 2 poderosa tecnología ha permanecido relativamente invariable y ha permitido University of Murcia, Los Alcázares, Murcia, ES, Department of la generación de miles de mutaciones en el genoma de ratón. El panorama Biochemistry and Molecular Biology B and Immunology, Faculty of cambió a partir de 2009, cuando se publicaron las primeras ratas con genes Medicine, University of Murcia, Murcia, ES inactivados mediante el uso de ZFN. Las nucleasas dirigidas de dedos de Polyamines are small organic cations essential for cell proliferation, zinc (ZFN) están constituidas por unas proteínas quiméricas con un dominio differentiation and survival. Ornithine decarboxylase (ODC), the key de unión a DNA, variable, en función de la secuencia a inactivar, y un enzyme controlling polyamine biosynthesis, is negatively regulated by dominio de corte (endonucleasa) de DNA en doble cadena, derivado del proteins termed antizymes (AZs). We recently described a novel antizyme enzima de restricción FokI. Un par de años más tarde, en 2011, apareció la inhibitor (AZIN2) that stimulates ODC activity and polyamine uptake. To segunda generación de nucleasas de edición genómica, las TALEN, en los gain insight on the tissue expression profi le of AZIN2 and to explore its que de nuevo un dominio de unión a DNA se combinaba con un dominio possible physiological role, we generated Azin2 knock-out mice expressing endonucleasa. Pero la verdadera revolución no llegaría hasta 2013, cuando bacterial β-D-galactosidase as a reporter gene, under the control of the se publicaron los primeros trabajos demostrando el uso de las nucleasas Azin2 endogenous promoter, what allows a very sensitive and specifi c CRISPR-Cas9, derivadas de bacterias, en las que el reconocimiento no detection of the expression of the gene in the tissues of transgenic mice. estaba mediado por una proteína sino por una pequeña secuencia de RNA Whole mount analysis and histochemical detection of lacZ using X-gal que posteriormente interaccionaba con el dominio endonucleasa (Cas9). staining revealed that Azin2 is expressed in the medulla but not in the Esta tercera (por el momento) versión de las nucleasas de edición genómica cortex of adrenal glands. The majority of chromaffi n cells displayed a ha supuesto una verdadera revolución en la manera como diseñar y generar granular-like reactivity, with clusters of cells with both cytosolic and a alteraciones genéticas de diverso tipo en prácticamente cualquier organismo. more intense superimposed granular staining. No sexual dimorphism En el laboratorio hemos realizado la transición desde las TALEN a las was observed. Azin2 mRNA levels were halved in heterozygous and CRISPR-Cas9 con éxito, y por ello comentaré las ventajas y las limitaciones dramatically reduced in homozygous mice. Adrenal polyamine and de estas fabulosas nuevas herramientas de modifi cación genómica que catecholamine content and mRNA levels of genes related with polyamine están llamadas a substituir, prácticamente por completo, nuestro trabajo de metabolism were not affected by Azin2 defi ciency. Microarray analysis mutaciones, tradicionalmente abordado a través de células ES. comparing gene expression in wild type and knock-out mice identifi ed 28 genes that were down-regulated more than 2-fold in the adrenal gland of transgenic mice and 67 genes up-regulated. Bioinformatics tools suggest P19r-3 that both catecholamine secretion and the amount of secretory vesicles may Inactivación de regiones intergénicas mediante be reduced in the adrenal gland of knock-out mice. These results support CRISPR-Cas9 en el genoma de ratón the previous view that AZIN2 may participate in vesicular traffi cking and secretion. (Supported by SAF2011-29051). Davide Seruggia, Marta Cantero, Lluis Montoliu Centro Nacional de Biotecnologia (CNB-CSIC), Madrid, ES

Apenas un 2% del genoma de mamíferos está ocupado por regiones génicas P19-5 (R03_19-5) que codiﬁ can para proteínas. El resto del genoma está plagado de secuencias de Generación de translocaciones cromosómicas ADN repetidas y de elementos reguladores de la expresión génica, esenciales en células humanas asociadas a cáncer mediante para el control en tiempo y espacio de la transcripción. Nuestro laboratorio está interesado en el estudio estructural y funcional de las secuencias el empleo de CRISPR-Cas9 aisladoras genómicas, capaces de delimitar dominios de expresión e impedir Juan Carlos Ramírez1, Raúl Torres1, Sandra Rodríguez-Perales2 la interacción entre loci vecinos. Uno de nuestros modelos experimentales es 1Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares, el locus de la tirosinasa de ratón, cuya mutación está asociada con albinismo. CNIC, Madrid, ES, 2Centro Nacional Investigaciones Oncológicas En experimentos anteriores demostramos la existencia de regiones aisladoras (CNIO), Madrid, ES genómicas en posición 5’ y 3’ del locus de la tirosinasa de ratón. En particular, la región 5’ contiene elementos fundamentales para la expresión correcta de Las translocaciones son un tipo de reordenamiento cromosómico este gen que cuando se eliminan en construcciones transgénicas condicionan frecuentemente descrito en el inicio y/o evolución de muchos tipos de una expresión variegada. Desde hace muchos años nuestra intención era cáncer. Algunas de ellas producen oncogenes que son responsables de la reproducir los experimentos realizados sobre transgenes en el propio locus transformación maligna. El mecanismo especíﬁ co que genera este tipo de endógeno. Sin embargo, la presencia de múltiples secuencias repetitivas reordenamiento es complejo y aún no se conoce en detalle, pero siempre es alrededor de estas secuencias intergénicas reguladoras impedía la aplicación desencadenado por la dos roturas de doble hebra (DSB) en el ADN de dos de aproximaciones tradicionales, basadas en recombinación homóloga en cromosomas no homólogos. La reparación errónea de esas roturas al reunir

174 Granada 2014 Pósters de manera ilegítima los dos fragmentos de los cromosomas rotos resulta en tumor-like phenotype that contributes to explain the presence of these la generación de translocaciones . proteins in much different type of tumors. A potential therapeutic effect of Para poder tener un conocimiento más completo sobre como afectan las Auphen in tumors where cell proliferation can be associated with AQP3 translocaciones cromosómicas al inicio del cáncer es necesario reproducir seems promising, but more studies are necessary to clarify this issue. de manera precisa estos reordenamientos. Hemos desarrollado una nueva estrategia para inducir translocaciones cromosómicas específi cas basada en la capacidad del sistema CRISPR-Cas9 de inducir DSBs en localizaciones P20-2 (R20-6) específi cas. Occurrence of carbon catabolite repression- Como modelos de estudio hemos elegido las translocaciones t(8;21)/ regulated mechanism involved in the transport RUNX1-ETO y t(11;22)/EWSR-FLI1, características de algunos tipos de leucemia mieloide aguda y del sarcoma de Ewing. Usando el sistema of extracellular ADP-glucose in Escherichia coli CRISPR-Cas9 hemos sido capaces de inducir con una elevada frecuencia Goizeder Almagro1, Manuel Montero1, Alejandro M. Viale2, Mehdi estas translocaciones tanto en líneas celulares establecidas, como en Rahimpour1, Abdelhatif Bahaji1, Francisco José Muñoz1, Edurne células progenitoras humanas (células hematopoyéticas y mesenquimales). Baroja-Fernández1, Javier Pozueta-Romero1 El análisis por FISH y la secuenciación a nivel de ADN, ARN y proteína 1Instituto de Agrobiotecnología (CSIC/UPNA/Gobierno de Navarra), de los genes de fusión generados revelan una alta fi abilidad y precisión Mutilva, ES, 2Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario del sistema CRISPR-Cas9, proporcionando una nueva herramienta muy (IBR, CONICET), Departamento de Microbiología, Facultad de poderosa para el estudio del cáncer lo que podría llevar al desarrollo de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, Universidad Nacional de nuevas terapias basadas en los productos de estas translocaciones. Rosario, Rosario, AR ADP-glucose is the precursor molecule for glycogen and starch biosynthesis in bacteria and plants, respectively. Due to the high abundance of this nucleotide-sugar in tubers and endosperms present in the normal diet of P20. Transportadores de membrana many animals, we explored the possible occurrence of an ADP-glucose transport system in the enterobacterial species Escherichia coli. To avoid artifacts resulting from the possible conversion of periplasmic ADP-glucose P20-1 (R20-1) breakdown products into glycogen, in this work we used glglC and pgm Role of Aquaporins in cell proliferation: Functional null mutants unable to catalyze the reversible conversion of ADP-glucose inhibition of AQP3 with a gold-based compound into glucose-1-P, and glucose-1-P into glucose-6-phosphate, respectively. Noteworthy, these cells converted the exogenoulsy added ADP-glucose into Miriam Echevarría Irusta, Ana Galán-Cobo, Ana Serna, Reposo glycogen. Uptake of ADP-glucose was confi rmed by the disappearance of Ramírez Lorca, Ismael Sánchez Gomar, Juan José Toledo-Aral this nucleotide-sugar from the culture medium. ΔpgmΔptsG, ΔpgmΔptsH, Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS), Hospital Universitario ΔpgmΔptsI and ΔpgmΔcrr cells impaired in the PTS components produced Virgen del Rocío/CSIC/Universidad de Sevilla (Departamento glycogen from exogenously added ADP-glucose, indicating that the de Fisiología Médica y Biofísica) - Centro de Investigación transport of this nucleotide-sugar is not mediated by PTS. Furthermore, Biomédica en Red sobre Enfermedades Respiratorias (CIBERES) y ΔpgmΔcyaA and ΔpgmΔcrp cells, both impaired in the CRP-cAMP carbon Neurodegenerativas (CIBERNED), Sevilla, ES catabolite repression mechanism, neither incorporated ADP-glucose nor Objective: Numerous studies indicated an abnormal AQPs expression in produced glycogen from ADP-glucose, demonstrating that the uptake of tumor of different origins and a role for these proteins in angiogenesis, this nucleotide-sugar is CRP-cAMP regulated in E. coli. Finally, using a cell migration and proliferation had been shown. Recently we verifi ed that systematic and comprehensive gene-disrupted mutant collection of E. coli the gold (III) complex Auphen signifi cantly inhibits the cell proliferation we identifi ed some genes belonging to the CRP-cAMP regulon encoding of AQP3 expressing cells. Then to better understand the role AQPs may membrane proteins whose absence impair ADP-glucose transport. play in the cell proliferation process we explore the effects that stable overexpression of these proteins (o-AQPs) produce over the proliferation and cell cycle of wt-PC12 cells as a cellular model. P20-3 (R20-2) Methods: Cell cycle by fl ow cytometry with propidium iodide and cell Insights into the functional mechanism of secondary proliferation through cell counting and BrdU staining were used. Using transporters revealed by X-ray crystallography Nocodazole we evaluated the cell response to arrest its cell cycle and the José Luis Vázquez Ibar resistance to apoptosis by Annexin V staining; and proteomic and transcriptomic techniques were performed to highlight key molecules implicated in cell Universitat Autònoma de Barcelona, Barcelona, ES proliferation which expression may be altered by overexpression of AQPs. Atomic structures of membrane transport proteins have revealed important Finally, in cells with large expression of AQP3 we explore the effect of Auphen insights regarding the functional mechanism of membrane transport over cyclins expression and cell cycle progression. proteins. In particular, these structures have confi rmed the validity of the Results: Cells with o-AQPs showed higher cell proliferation rate and alternate-access model, predicted forty years ago, as the general mechanism larger percentage of cells in phases S and G2/M. After 24h in the presence used by these proteins to translocate substrates from one side to another side of Nocodazole, o-AQPs cells exhibited less modifi cation of the cell cycle of the membrane. In addition, questions like how substrate is recognized by pattern and lower Annexin V specifi c staining consistent with a higher the transporter and how substrate triggers protein conformational changes resistance to apoptosis. Additionally, in AQP3-expressing cells treated with are being answered combining these high-resolution crystal structures with Auphen, strong arrest of the cell cycle in the S-G2/M phases, in concordance biochemical and functional assays. In this regard, here I am presenting with the analysis of cyclins (A, B1, D1, E) levels was observed. The RT- two examples of substrate induced-fi t mechanism in secondary transport qPCR analysis comparing o-AQPs cells to wt cells validated interesting proteins, the initial step for substrate translocation. First, the latest crystal changes in the expression of molecules related with cell proliferation, tumor structure of the lactose permease of E. coli in occluded state with bound and cell cycle progression, such as, Zeb2, Jun, JunB, NF-kβ, Cxcl9, Cxcl10, substrate reveals how substrate is able to sculpt the binding site; revealing TNF, and TNF receptors. some hints about substrate and proton-motive force coupling. Second, the Conclusions: The signifi cant role of AQPs in the cell proliferation process structure of the onward-facing conformation of the L-arginine/agmatine seems to be connected to increments in the cell cycle turnover. Our results exchanger of E. coli with bound substrate reveals the molecular mechanism support the view that larger expression of AQPs confers to the cell a more of substrate-induced conformational changes in this transporter.

175 Pósters XXXVII Congreso SEBBM

P20r-4 (R20-4) dependencia de alcohol, dolor, epilepsia, desórdenes respiratorios e Bases moleculares del efecto dominante negativo hiperplexia o enfermedad del sobresalto, un desorden neurológico humano de una mutación de GlyT2 asociada caracterizado por sobresaltos enérgicos y generalizados en respuesta con hiperplexia a estímulos triviales acústicos o táctiles asociado con una defi ciente neurotransmisión glicinérgica inhibidora cuya segunda causa principal son Esther Arribas González1, Jaime de Juan Sanz2, Carmen Aragón mutaciones en el gen humano de GlyT2. Rueda3, Beatriz López Corcuera3 Un aspecto de gran interés es el estudio del papel de los transportadores de 1Centro de Biología Molecular Severo Ochoa-CSIC-UAM - IdiPAZ- glicina GlyT1 y GlyT2 en vías nociceptivas, ya que la red de interneuronas Hospital Universitario La Paz, Universidad Autónoma de Madrid, glicinérgicas localizadas en las astas dorsales de la médula espinal regulan Madrid, ES, 2Department of Biochemistry, Weill Cornell Medical la transmisión de la señal dolorosa desde la periferia a regiones superiores College , New York, US, 3Centro de Biología Molecular Severo del cerebro. Trabajos de eliminación génica han revelado que la actividad Ochoa-CSIC-UAM - Centro de Investigación Biomédica en Red de de los GlyTs, puede modular la neurotransmisión glicinérgica, por lo Enfermedades Raras, Instituto de Salud Carlos III - IdiPAZ-Hospital que conocer la regulación de los GlyTs en vías nociceptivas puede tener Universitario La Paz, Universidad Autónoma de Madrid, Madrid, ES consecuencias terapeúticas. La hiperplexia o “enfermedad de sobresalto” es un síndrome clínico De hecho, la inyección intratecal de inhibidores de GlyTs produce raro caracterizado por una respuesta exagerada a estímulos triviales analgesia en modelos animales de dolor. Estudios previos, han demostrado auditivos o táctiles. Este trastorno neurológico puede producir daño que la neurotransmisión glicinergica puede regularse por la actividad de cerebral y/o muerte súbita en neonatos debido a episodios de apnea y receptores purinérgicos. fallos cardiorrespiratorios. La enfermedad es causada por un défi cit en En este trabajo, hemos descrito cómo el receptor P2X3 es capaz de regular la neurotransmisión glicinérgica inhibidora. La forma presináptica de la actividad de transporte de GlyT2 y proponemos las rutas de señalización la hiperplexia puede originarse por mutaciones en el gen humano del que median esta comunicación intercelular entre neuronas sensoriales e transportador neuronal de glicina GlyT2 (SLC6A5). GlyT2 media el interneuronas glicinérgicas. reciclado de la glicina desde la hendidura hasta el terminal presináptico constituyendo la principal fuente de neurotransmisor liberado en las sinapsis glicinérgicas. Aunque la mayoría de las mutaciones detectadas P20-6 (R20-3) son recesivas, produciendo pérdida de función bialélica por inactividad del Modulación del tráfico de los transportadores de transportador o por su ausencia de la membrana, hay un mutante dominante negativo sobre el tráfi co de GlyT2. Hemos explorado las propiedades y nucleósidos concentrativos (CNT) a la membrana alteraciones estructurales de este mutante y analizado el efecto dominante plasmática y sus implicaciones en la acción de negativo que retiene a GlyT2 en el retículo endoplasmático impidiendo su fármacos derivados de nucleósidos expresión en superfi cie. La introducción de una arginina en lugar de Ser- 512 altera el plegamiento del transportador y promueve mejor asociación Paula Fernández-Calotti con la chaperona calnexina, menor unión a Sec24D y, por tanto, retención Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de en retículo. Hemos demostrado la formación de oligómeros comunes Barcelona, Instituto de Biomedicina (IBUB). CIBERehd, Barcelona, ES GlyT2-S512R. La sobreexpresión de calnexina rescata el efecto dominante Los análogos de nucleósidos (AN) constituyen una clase importante de negativo incrementando la cantidad de GlyT2 que alcanza la membrana antimetabolitos proapoptóticos utilizados en el tratamiento de neoplasias y reduciendo la interacción entre GlyT2 y su mutante. El rescate por hematológicas, tumores sólidos y enfermedades infecciosas. El ingreso de chaperonas químicas ha sido investigado en un sistema heterólogo y en estas moléculas a las células se produce a través de los transportadores de cultivos primarios de neuronas. nucleósidos de membrana (TN) concentrativos (hCNT) y equilibrativos (hENT) contribuyendo a la biodisponibilidad del fármaco y a la citotoxicidad o capacidad antiviral del mismo. La resistencia a los AN se ha relacionado a P20r-5 (R20-5) Regulación del transportador neuronal de glicina la biodisponibilidad y la entrada a las células entre otras causas. La regulación de la actividad de los TN de forma específi ca es un enfoque GlyT2 por el receptor purinérgico P2X3 adecuado para modular la biodisponibilidad de un determinado AN. Lucía Villarejo López1, Esperanza Jimenez2, Carmen Aragon3, Demostramos que el ácido transretinoico (ATRA) induce el tráfi co de Beatriz López-Corcuera3 hCNT3 a la membrana plasmática causando un aumento en su actividad 1Centro de Biología Molecular, Madrid, ES, 2Departamento de y en la consecuente entrada del AN fl udarabina en células de leucemia Biología Molecular, Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa,” linfocítica crónica (LLC) causando una reversión de la resistencia al CSIC, UAM - Centro de Investigación Biomédica en Red de fármaco. Recientemente hemos observado que el tráfi co de hCNT3 en Enfermedades Raras, Instituto de Salud Carlos III - IdiPAZ-Hospital células de colon depende de la interacción directa de la porción amino Universitario La Paz, UAM, Madrid, ES, 3Centro de Investigación terminal del hCNT3 con Galectina 4. Biomédica en Red de Enfermedades Raras, Instituto de Salud Por otro lado, la terapia combinada para el tratamiento de la infección por Carlos III - IdiPAZ-Hospital Universitario La Paz, Universidad el virus de la hepatitis C implica interferón α (IFNα) y el AN ribavirina. Autónoma de Madrid, Madrid, ES Aunque en condiciones basales hENT1 es el principal transportador de La glicina es el neurotransmisor inhibidor más abundante en áreas ribavirina, ningún estudio ha evaluado el papel de hCNT2, un excelente caudales del sistema nervioso central, desempeña un importante papel potencial transportador de ribavirina, en presencia de IFNα. Demostramos en la generación de ritmos motores y permite el procesamiento de que IFNα induce un rápido y transitorio aumento de la actividad hCNT2 en señales nociceptivas, sensoriales y respuestas refl ejas espinales. Es, células HHL5 derivadas de hepatocitos y un consecuente incremento en la además, un activador del receptor N-metil-D-aspartato (NMDA) en vías entrada de ribavirina a estas células. glutamatérgicas excitadoras donde funciona como agonista obligado del Es evidente que la expresión de los TN posee un papel fundamental en la glutamato. La neurotransmisión mediada por glicina fi naliza cuando es biodisponibilidad y en la respuesta a fármacos AN. El análisis del patrón retirada de la hendidura sináptica por los neurotransportadores (GlyT) de expresión de TN podría ser útil como biomarcador del metabolismo presentes en las membranas plasmáticas de la glía adyacente (GlyT1) y en y acción de fármacos asi como también para predecir la respuesta a una los botones presinápticos de neuronas glicinérgicas (GlyT2). determinada terapia. Por lo tanto, el estudio de las propiedades regulatorias Las dos isoformas han sido asociadas a la patogénesis de ciertos desórdenes de cada TN es fundamental para la mejora de los tratamientos antitumorales del sistema nervioso como la esquizofrenia, alteraciones cognitivas, y antivirales.

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