Herpetologia no Brasil II
Princípios bioativos da pele de anfíbios: panorama atual e perspectivas
Carlos Alberto Schwartz, Mariana de Souza Castro, Osmindo Rodrigues Pires Júnior, Natan Medeiros Maciel, Elisabeth Nogueira Ferroni Schwartz e Antonio Sebben
Resumo A secreção cutânea dos anfíbios contém uma infinidade de substâncias biologicamente ativas empregadas em três funções principais: proteção contra o desenvolvimento de microrganismos patogênicos, como defesa passiva contra o ataque de predadores carnívoros, e, ainda, como feromônios. Considerando as espécies conhecidas na atualidade, o número de espécies que tiveram secreções cutâneas estudadas até o presente é estimado em menos de 20% do total. Mesmo nessas, o conhecimento a respeito da composição química e das propriedades farmacológicas das secreções cutâneas é apenas parcial, o que indica que mesmo as espécies já estudadas devem ser pesquisadas à luz das novas metodologias disponíveis. No presente artigo, apresentamos o panorama atual dessa área, considerações a respeito de problemas metodológicos enfrentados e suas perspectivas. Palavras-chave: Toxinas, Venenos, Amphibia, Antibióticos, Secreção Cutânea.
Abstract The amphibian skin secretions contain a great variety of biologically active compounds used in three main functions: protection against the development of microorganisms, passive defense against predators and, even as pheromones. Considering the species currently known, the number of species that had the skin secretion studied till now answer less than 20% of the total. Even in these species, the knowledge about the chemical composition and the pharmacological properties are just partial. Therefore the species already studied must be evaluated in the light of recent methodologies. Herein we present the currently outlook in these multidisciplinary area, considerations concerning the methodological problems, and perspectives. Keywords: Toxins, Poison, Amphibia, Antibiotic, Cutaneous Secretion.
Histórico usados como drogas cardiotônicas. Talvez este Há cerca de 5 mil anos, a medicina oriental tenha sido o primeiro uso de um produto de origem já fazia uso de secreção de pele de sapos na animal como fármaco. Introduzidas na Europa no elaboração de preparados denominados Ch'an-Su século 17, foram usadas por mais de 200 anos, até
Aceito em novembro de 2005. Laboratório de Toxinologia, Departamento de Ciências Fisiológicas Universidade de Brasília, 70910-970, Brasília, DF, Brasil. [email protected]
200 Herpetologia no Brasil II Princípios bioativos da pele de anfíbios: panorama atual e perspectivas
serem substituídas pelos glicosídeos digitálicos, “exercício, banho, pôr o doente num forno com o mesmo propósito (TOLEDO & JARED, aquecido, ou sobre o animal retalhado”. Por 1995). fim, afirma Piso: “Nós envenenamos até os rios Enquanto isso, na América do Sul, e os elementos da natureza. Convertemos em povos nativos há muito fazem uso de secreção instrumento de destruição o próprio ar de que de pele de anfíbios anuros no preparo de flechas se vive, e nenhum ser, salvo o homem, faz e dardos usados na caça e na guerra, ou guerra com o veneno alheio”, referindo-se ao utilizados em rituais de purificação e de uso de venenos nas flechas e na forma de preparação para a caça. Índios colombianos beberagens. ainda fazem uso da secreção de Phyllobates Em excelente registro histórico, terribilis para envenenar setas, lançadas com o ROSENFELD & KELEN (1969) compilaram auxílio de zarabatanas, para caçar aves e as publicações acerca de animais peçonhentos e primatas (MYERS et al., 1978) Na Amazônia sua relação com o homem, no período de 1500 a brasileira, índios Katukina utilizam secreção de 1968. Este artigo mostra que aproximadamente pele de espécies de Phyllomedusa em rituais 8.000 autores publicaram, durante esse conhecidos como “kâmpo” ou “kâmbo”. período,cerca de 10.600 artigos nas diferentes Guilherme Piso (1611-1678), médico áreas da toxinologia de organismos vertebrados holandês contemporâneo de Maurício de e invertebrados. Destes, apenas 164 autores Nassau, em sua passagem pelo Brasil, registrou pesquisaram venenos de anfíbios ou temas no livro História Natural e Médica da Índia correlatos. Nesse período, em que a maioria dos Ocidental (PISO, 1658, p.618-619), algumas autores contribuiu com apenas um ou alguns observações a respeito dos venenos dos sapos trabalhos, vale destacar a expressiva brasileiros. Seguem alguns trechos, no mínimo participação dos chineses K.K Chen,. e A.L curiosos, do relato de Piso: “Cururu ou sapo Chen que entre as décadas de 1930 e 1950 envenena de qualquer maneira, quer publicaram cerca de 50 artigos sobre a química externamente, pela urina e saliva, quer do veneno de Bufo spp. e Chan'su. internamente, e muito pior, com o sangue, a PHISALIX & BERTRAND (1902) gordura e sobretudo o fel ingeridos. Os demonstraram que, além de esteróides, a perversíssimos íncolas preparam deles, secreção cutânea de Bufo bufo continha uma torrados e reduzidos a pó, beberagens letais e amina biogênica, a qual denominaram as propinam em quantidades mínimas, às bufotenina. Esse foi o primeiro registro de escusas. Surgem logo inflamações das fauces e aminas em secreção cutânea de anfíbios. A da garganta, securas, infecções, soluços, partir de 1920, pesquisadores como vômitos e disenterias, desmaios, névoas nos Handowsky, Jensen & Chen e Wieland olhos, convulsões, delírios e amarelidões. dedicaram-se a pesquisar bufotenina e outras Como antídotos são recomendados: aminas biogênicas encontradas em pele de
200 Herpetologia no Brasil II Princípios bioativos da pele de anfíbios: panorama atual e perspectivas diversas espécies de Bufo. No entanto, os secreção cutânea observou uma interessante princípios bioativos de pele de anfíbios viriam a propriedade cardiotóxica. Esse estudo viria a ganhar destaque a partir do início da década de ser retomado por volta de 1996 por Elisabeth N. 1950, com os primeiros trabalhos do F. Schwartz e colaboradores, que pesquisador italiano Vittorio Erspamer Dentre demonstraram ser a siphonopsina uma proteína inúmeros feitos de Erspamer, vale registrar a com potente atividade hemolítica. A atividade descoberta da serotonina (ERSPAMER & cardiotóxica, observada por SAWAYA (1940), ASERO, 1952), a partir de glândula salivar de é, na verdade, devida à hemólise e conseqüente moluscos cefalópodes, então batizada como aumento dos níveis de potássio circulante. enteramina. Em 1959, isolou e caracterizou a A partir de 1960, aumenta o número de leptodactilina, uma amina biogênica com pesquisadores dedicados a estudar secreções atividade nicotínica, a partir de extratos de pele cutâneas de anfíbios: Kaiser e Michel (Áustria), da rã sul-americana Leptodactylus ocellatus Venancio Deulofeu e Edmundo Ruveda (CEI & ERSPAMER, 1966). Isolou e (Argentina), John Daly e Bernard Witkop caracterizou diversos peptídeos, especialmente (EUA), Kuno Meyer e Host Linde (Suíça), a partir de pele de exemplares de Gerhard Habermehl (Alemanha). Phyllomedusinae do Brasil e da Argentina. Ao No Brasil, o químico, Raymond Zelnik todo, foram mais de 600 espécies de anfíbios, dedica-se ao estudo dos esteróides de venenos de diversas regiões do mundo, estudados por de Bufo spp., enquanto Paulo Pasquarelli ele e sua equipe. defende sua tese de Doutorado sobre o bloqueio No Brasil talvez o trabalho pioneiro da ação vagal pelo veneno bruto de Bufo tenha sido “Algumas experiências com o ictericus, em coração in situ do próprio animal. veneno de Bufo ictericus” de LACERDA Esse trabalho é retomado em 1979 por Carlos FILHO (1878). Com a mesma abordagem A. Schwartz, que demonstra ser a exploratória, VITAL BRAZIL & VELLARD dehidrobufotenina o constituinte do veneno (1926) publicam dois artigos sobre ações de responsável pelo bloqueio vagal. secreção de pele dos anuros brasileiros Bufo No mesmo período, Antonio Sebben marinus, Leptodactylus labyrinthicus e inicia seu mestrado com um pequeno sapinho Pyxicephalus (=Odontophrynus) cultripes, amarelo trazido ao Instituto de Biociências por demonstrando sua toxicidade quando Elio Gouveia (pesquisador do Parque Nacional administradas em diversos animais do Itatiaia, RJ), que afirmava: “Trata-se de um experimentais. animal muito venenoso”. Deu-se início ao Na década de 1940, nos primórdios da trabalho pioneiro no país de estudo de Universidade de São Paulo, Paulo Sawaya neurotoxinas em secreção cutânea de anfíbios, inicia uma série de estudos com a espécie no caso o Brachycephalus ephippium. Siphonops annulatus (Gymnophiona), em cuja Em 1985, Sebben e Schwartz fundam o
200 Herpetologia no Brasil II Princípios bioativos da pele de anfíbios: panorama atual e perspectivas grupo de pesquisa em venenos animais na antibióticas, atuando na defesa contra a Universidade de Brasília. A partir desse núcleo proliferação de microrganismos (bactérias, básico, foi criado o atual Laboratório de fungos e protozoários), principalmente na pele. Toxinologia, que também conta com os Tais compostos são representados pesquisadores Elisabeth Schwartz, Mariana de principalmente por peptídeos com Souza Castro e Osmindo Rodrigues Pires propriedades citotóxicas e citolíticas. Júnior. Outro grupo de compostos contidos Hoje, novos grupos passam a se dedicar nas secreções dessas glândulas tem um papel de de maneira sistemática à pesquisa de compostos defesa passiva contra predadores. Seus efeitos bioativos de anfíbios brasileiros, dentre os farmacológicos incluem ações cardiotóxicas, quais cabe destacar os liderados por Carlos miotóxicas e neurotóxicas, alguns são agentes Bloch Júnior (CENARGEN/EMBRAPA-DF, hipotensivos, vasoconstrictores e outros, ainda, Centro Nacional de Pesquisas de Recursos possuem efeitos alucinogênicos. Tais Genéticos e Biotecnologia), Wagner Fontes propriedades podem claramente afetar um (UnB) e Krishnamurti de Morais Carvalho predador em potencial (CLARKE, 1997). (UECE). Quimicamente, tais compostos podem ser agrupados em quatro classes (Quadro 1), a As classes de compostos saber: alcalóides, aminas biogênicas, Todos os anfíbios apresentam em sua esteróides e peptídeos - incluindo polipeptídeos pele dois tipos de glândulas: glândulas mucosas e proteínas (DALY et al., 1987; ERSPAMER, e glândulas de veneno. Glândulas mucosas são 1994; CLARKE, 1997). menores e distribuídas por todo o corpo, As secreções da pele de anfíbios têm mantendo a pele úmida, propiciando condições sido objeto de estudo sob os mais variados para a respiração cutânea. As glândulas de prismas: na bioprospecção, na procura de novas veneno, de origem epitelial e de arquitetura drogas farmacológicas; na sistemática e, alveolar, são compostas por células ou sincícios também, por representarem ótimo material para granulares organizados ao redor de um ducto experimentos em biofísica. Até o presente, único, associados a células mioepiteliais embora centenas de substâncias tenham sido diretamente inervadas, sugerindo a liberação de descritas, muitas delas aguardam melhor seus produtos em situações de estresse ou caracterização farmacológica. Esta enorme compressão mecânica criadas por predadores significância dos compostos encontrados em (TOLEDO & JARED, 1995; CLARKE, 1997). anfíbios deve servir como mais uma motivação As glândulas de veneno, como o nome para a conservação mundial destes pequenos e indica, são responsáveis pela síntese e maravilhosos animais (BARTHALMUS, armazenamento de uma grande diversidade de 1994). compostos químicos com propriedades
200 Herpetologia no Brasil II Princípios bioativos da pele de anfíbios: panorama atual e perspectivas
Quadro 1: Ocorrência de compostos bioativos encontrados entre os representantes da anfibiofauna brasileira: (+) presença; (-) ausência; (Æ ) ocorrência não avaliada.
Famílias/Gêneros Aminas Esteróides Alcalóides TTX e Peptídeos Proteínas Biogênicas Lipofí licos Derivados
Anura Bufonidae Bufo + + - - - + Atelopus Æ + - + Æ Æ
Melanophryniscus + - + - Æ Æ Brachycephalidae - - - + Æ Æ Leptodactylidae + - - - + + Hylidae + Æ - - + + Microhylidae + - - - Æ Æ Pipidae + Æ Æ - + + Ranidae + Æ Æ - + + Dendrobatidae - Æ + Æ Æ Æ Centrolenidae Æ Æ Æ Æ Æ Æ Allophrynidae Æ Æ Æ Æ Æ Æ Gymnophiona Caecilidae + - - - + + Rhinatrematidae Æ Æ Æ Æ Æ Æ Urodela Plethodontidae Æ Æ Æ Æ Æ Æ
1. Alcalóides A concentração desses alcalóides na Alcalóides são compostos que secreção cutânea pode variar qualitativa e possuem um anel heterocíclico que contêm quantitativamente, inclusive entre diferentes nitrogênio e apresentam uma limitada populações de uma mesma espécie. A presença distribuição na natureza (DALY et al., 1987). destes alcalóides provavelmente está Apesar da sua ampla distribuição, alcalóides relacionada com a dieta (DALY et al., 1994a). têm sido detectados em poucas espécies, Esta hipótese é reforçada por estudos onde se particularmente na família Dendrobatidae. observou que os animais perderam sua Entretanto, a ocorrência desses compostos foi toxicidade com a manutenção de adultos em registrada em salamandras, tritões (gêneros cativeiro. Além disso, indivíduos gerados por Triturus e Taricha) (MOSHER, 1964) e em reprodução em cativeiro (F1) também não se representantes de anuros das famílias apresentaram tóxicos (DALY et al., 1997). Mantellidae (gênero Mantella), MORTARI et al. (2004) demonstraram Myobatrachidae (gênero Pseudophryne), a presença de duas decahidroquilinas, da Bufonidae (gêneros Melanophryniscus e Pumiliotoxina 251D e a Histrinicotoxina 285A Atelopus) e Brachycephalidae (DALY, 2004; em pele de Epipedobates flavopictus PIRES Jr. et al, 2002). (Dendrobatidae) coletados na região do 1.1. Alcalóides lipossolúveis Distrito Federal.
200 Herpetologia no Brasil II Princípios bioativos da pele de anfíbios: panorama atual e perspectivas
1.1.1. Batracotoxinas (BTX) e/ou condutância de cálcio para sítios A batracotoxina (Fig.1) é encontrada intracelulares, bloqueio do retorno de cálcio somente no gênero Phyllobates para sítios extracelulares através da ATPase (Dendrobatidae) e é considerada a mais potente dependente de cálcio e facilitação de liberação toxina não-protéica já descrita.(DALY et al., de cálcio dos retículos sarcoplasmáticos. No 1987) A batracotoxina apresenta uma alta entanto, DALY et al. (1992a), contrariando os afinidade ao sítio 2, causando a abertura de estudos anteriores, reinterpretaram o efeito canais de sódio voltagem-dependentes de nervo primário da PTX-B, discutindo sua ação em e músculo. A conseqüência é um grande influxo canais de sódio voltagem-dependentes de nervo de sódio, causando despolarização irreversível e músculo, com um possível efeito adicional na das membranas de nervo e músculo e danos mobilização de cálcio, atuando também nas ultraestruturais na célula (ALBUQUERQUE et sinapses com liberação dos al., 1981). neurotransmissores. A partir deste trabalho nenhum outro foi realizado para esclarecer o mecanismo de ação da PTX-B. 1.1.3. Decahidroquinolinas Originalmente denominada Pumiliotoxina C (Fig.2), esta classe de alcalóides tem sido isolada de diversos dendrobatídeos, freqüentemente ocorrendo em conjunto com histrionicotoxinas. As decahidroquinolinas raramente são Figura 1: Estrutura química de alcalóides batracotoxinas. encontradas em Epipedobates, estando ausentes em Aromobates (Dendrobatidae). 1.1.2. Pumiliotoxinas (PTXs) Representadas por pumiliotoxina A (PTX-A) e pumiliotoxina B (PTX-B) (Fig.2), aparecem na natureza unicamente em dendrobatídeos e foram isoladas originalmente do anuro Dendrobates pumilio. A PTX-B inicialmente potencializa e prolonga as contrações de músculo esquelético de anfíbios, de aves e de mamíferos, tendo efeito reversível e dose-dependente. ALBURQUERQUE et al. (1981) relacionaram sua toxicidade com alterações em eventos dependentes de cálcio Figura 2: Estrutura química de alcalóides em nervo e músculo, tais como: mobilização histrionicotoxinas, pumiliotoxinas e decahidroquiloninas.
200 Herpetologia no Brasil II Princípios bioativos da pele de anfíbios: panorama atual e perspectivas
Além dos dendrobatídeos, este alcalóide foi chegando a ser 200 vezes mais potente que a encontrado também em mantelídeos e em morfina (BRADLEY, 1993). extratos de pele de Melanophryniscus. A 1.2. Tetrodotoxina (TTX) e derivados atividade farmacológica e o sítio de ação dos A tetrodotoxina (Fig.3) é considerada decahidroquinolinas não estão totalmente uma das mais potentes neurotoxinas animais já esclarecidos, no entanto parece estar isoladas (GOTO, 1965). A TTX promove um relacionada com um bloqueio não competitivo bloqueio altamente seletivo dos canais de sódio de receptores nicotínicos e de canais de sódio e voltagem-dependentes presentes em nervos e potássio voltagem-dependentes.(DALY et al., músculos, levando então, à paralisia de tecidos 1984, 1992a; DALY & SPANDE, 1986; DALY com membranas excitáveis como músculos e et al., 1990). nervos. Seus principais efeitos sistêmicos são 1.1.4. Histrionicotoxinas (HTX) caracterizados por um bloqueio As histrionicotoxinas (Fig.2), neuromuscular, hipotensão e depressão alcalóides isolados inicialmente de respiratória (RITCHIE, 1980). Esta molécula é Dendrobates histrionicus (Dendrobatidae) um alcalóide aminoperhidroquinazolínico apresentam baixa toxicidade em mamíferos. A (C111H 738N O ) cuja molécula consiste de um HTX atua em canais de sódio e potássio grupo guanidínico carregado positivamente voltagem-dependentes de nervo e músculo, (GOTO, 1965). reduzindo a condutância e bloqueando o receptor nicotínico da junção neuromuscular (MALEQUE, 1984). 1.1.5. Indolizidinas Os estudos realizados até o momento mostraram que as indolizidinas agem como Figura 3: Estrutura química da tetrodotoxina. bloqueadores não competitivos de receptores nicotínicos na junção neuromuscular. As Os primeiros indícios de ocorrência de indolizidinas são encontradas em Dendrobates TTX entre os anfíbios foram apontados por e Phyllobates, sendo ausente em Epipedobates TWITTI & JOHNSON (1934), que além de serem encontradas em Mantella e em descreveram, nos tecidos e ovos da salamandra Melanophryniscus (DALY & SPANDE, 1986). Taricha torosa (Salamandridae), uma toxina 1.1.6. Epibatidina com ação paralisante denominada de Epibatidina é um alcalóide tarichatoxina. Três décadas depois, MOSHER azabicicloheptano, isolado do dendrobatídeo et al. (1964) demonstraram a identidade entre equatoriano Epipedobates tricolor (DALY et tarichatoxina e tetrodotoxina, sendo esta a al., 1980). Este alcalóide é considerado um primeira detecção deste composto em potente analgésico (SPANDE et al., 1992) vertebrados terrestres. A ocorrência de TTX e
200 Herpetologia no Brasil II Princípios bioativos da pele de anfíbios: panorama atual e perspectivas outros derivados foi posteriormente registrada A ocorrência de TTX em diversos em órgãos e tecidos de outras espécies de anfíbios sugere que sua origem seja exógena, urodelos das famílias Salamandridae (Cyonops, contudo nenhum estudo conclusivo foi Notophthalmus, Paramesotriton, Taricha e realizado. Atualmente nosso grupo está Triturus) e Ambystomatidae (Ambystoma). estudando a hipótese de que a produção desta KIM et al. (1975) identificaram toxina por bactérias simbióticas, presentes no tetrodotoxina em Atelopus (Bufonidae) da trato gastrointestinal de Brachycephalus spp.. América Central. Da pele e ovos de A. 1.3. Samandarinas chiriquiensis, foi isolada a chiriquitoxina, um Entre as salamandras, além da novo derivado da TTX que possui um grupo - presença de tetrodotoxina e derivados CH(OH)CH(NH2)COOH na posição C11, destaca-se a ocorrência de alcalóides do sendo química e farmacologicamente diferente grupo da samandarina (Fig.4) e de proteínas da TTX. citotóxicas, em representantes das famílias DALY et al. (1994b) registrou a Salamandridae e Plethodontidae. Os ocorrência de pequenas concentrações de TTX alcalóides do grupo da samandarina em Colostethus inguinalis (Dendrobatidae). apresentam potente atividade convulsivante TANU et al. (2001) descreveram a ocorrência em mamíferos. O envenenamento por estes de TTX e derivados em Polypedates sp. compostos causa disfunção respiratória, (Rhacophoridae). arritmias cardíacas e paralisia parcial, Recentemente PIRES Jr. et al. (2002; podendo causar morte (HABERMEHL, 2005) demonstraram a presença de 1981). As duas espécies do gênero tetrodotoxina e derivados em Brachycephalus Bolitoglossa (Plethodontidae), as únicas ephippium, B. nodoterga e B. pernix salamandras brasileiras, ainda não foram (Brachycephalidae). Em B. ephippium, foi investigadas sob o ponto de vista também identificada a 11-oxotetrodotoxina toxinológico. (PIRES Jr. et al., 2004) (Fig.3), um derivado raro que chega a ser de quatro a cinco vezes mais tóxico que TTX. PIRES Jr. et al. (2005) também isolaram quatro novos derivados de tetrodotoxina em B. ephippium, cujas estruturas estão sendo elucidadas. Em termos de Figura 4: Estrutura química da samandarina e samandarona. toxicidade, esses mesmos autores verificaram a existência de uma variação entre populações de 2. Esteróides B. ephippium. Brachycephalus nodoterga é a Bufadienolídeos são esteróides espécie menos tóxica das três e B. pernix é a que produzidos pelo metabolismo do colesterol ou apresentou a maior toxicidade. do hidroxicolato, sendo encontrados nos
200 Herpetologia no Brasil II Princípios bioativos da pele de anfíbios: panorama atual e perspectivas venenos e tecidos dos anuros da família Envenenamentos de cães por ingestão Bufonidae, mas especificamente em Bufo e de anfíbios ocorrem principalmente com sapos Atelopus (FLIER et al., 1980). (Bufo spp.). Nos cães, essas secreções cutâneas Os bufadienolídeos são representados causam arritmia cardíaca, edema pulmonar, por dois grandes grupos: as bufogeninas hipertensão, convulsões e morte. (bufaginas) e bufotoxinas. As bufogeninas são constituídas por um anel esteroídico anexado a um grupo lactona. As bufotoxinas são compostos formados basicamente pela conjugação de bufogeninas e suberil-argininas (TOLEDO & JARED, 1995). Bufogeninas e bufotoxinas atuam de Figura 5: Estrutura química dos esteróides marinobufagenina e telocinobufagina. maneira similar aos extratos de digitalis (VITAL BRAZIL, 1982). Em concentrações 3. Aminas biogênicas que naturalmente ocorrem no veneno são As aminas biogênicas destacam-se dos cardiotóxicas para muitos mamíferos, demais compostos bioativos encontrados na apresentando propriedades pele de anfíbios pela sua ampla distribuição cardioaceleradoras, aumentando a força do entre representantes das diversas famílias. batimento cardíaco. Bufogeninas são Diversas aminas já foram identificadas e inibidores da enzima Na++-K -ATPase (FLIER tiveram sua estrutura química e ação et al., 1980) e provavelmente estão envolvidas farmacológica elucidadas. Várias são na homeostase de eletrólitos e água mediadores químicos bastante comuns entre os (LICHTSTEIN et al., 1992), aumentando a animais e algumas, como a serotonina, são pressão arterial. também encontradas em vegetais. Entretanto, Esteróides não cardiotônicos como ao contrário dos vegetais e da maioria dos ergosterol, colesterol e o -sitosterol também tecidos de outros animais, na pele dos anfíbios são encontrados em venenos de sapos esses compostos são produzidos e estocados em (ZELNIK et al., 1964). Alguns grande quantidade (SEBBEN et al., 1993; bufadienolídeos possuem atividade ERSPAMER, 1994). antitumoral, a exemplo da bufalina, bufotalina, As aminas encontradas na pele de gamabufotalina, cinobufotalina, cinobufagina anfíbios são classificadas em quatro grupos, e outras (NOGAWA et al., 2001; KAMANO et caracterizados principalmente pela al., 2002). Recentemente CUNHA FILHO et descarboxilação de aminoácidos: al. (2005) descreveram a ação antimicrobiana indolalquilaminas, imidazolalquilaminas, dos esteróides marinobufagenina e monohidroxi-fenilalquilaminas e telocinobufagina (Fig.5), ambos isolados de catecolaminas. Bufo rubescens.
200 Herpetologia no Brasil II Princípios bioativos da pele de anfíbios: panorama atual e perspectivas
3.1. Indolalquilaminas empregadas na detecção destas aminas, como Indolalquilaminas ou aminas indólicas cromatografia líquida de alta performance são moléculas derivadas da descarboxilação do (HPLC) e espectrometria de massa triptofano, como serotonina (5-HT) e derivados (McCLEAN et al., 2002). n-metilados, como a bufotenina (BTN) e O- A atividade farmacológica mais metilbufotenina, cíclicos, como característica das aminas indólicas é a ação deidrobufotenina (DHB), e sulfoconjugados, estimulante em musculatura lisa. Com raras como a bufotionina (DHB-S) (Fig.6). Aminas exceções, os músculos lisos extravasculares indólicas representam os compostos bioativos são contraídos pela ação dessas substâncias. mais comuns em pele de anfíbios, com altas Muitas delas apresentam ainda ação irritante concentrações presentes particularmente em em mucosas (ERSPAMER, 1971). A Bufo. serotonina, além de vasoconstritora, altera a O grupo de pesquisa de ERSPAMER função motora do trato gastrointestinal, (1994) avaliou a presença de aminas indólicas termoregulação e induz a secreção de em extratos de pele de mais de 400 espécies de catecolaminas pelas glândulas supra-renais. anfíbios, com resultados positivos para as 65 Bufotenina causa contração muscular em certos espécies de bufonídeos e para 172 espécies de órgãos de mamíferos, possuindo uma provável anfíbios de outras famílias analisadas. Nos ação alucinogênica (FORSSTRÖM et al., últimos anos novas metodologias têm sido 2001). Essa amina também já foi detectada na
Figura 6: Estrutura química de aminas encontradas na pele de anfíbios.
200 Herpetologia no Brasil II Princípios bioativos da pele de anfíbios: panorama atual e perspectivas urina de pacientes esquizofrênicos. Já a O- secreção cutânea de anfíbios, como aminas metilbufotenina, até hoje encontrada apenas em biogênicas e polipeptídeos (CEI et al., 1967), Bufo alvarius, possui poderosa ação alcalóides em dendrobatídeos (MYERS & alucinogênica (HABERMEHL, 1981). DALY, 1976) e peptídeos triptofilinos Entre os urodelos, indolalquilaminas (STEINBORNER et al., 1996). Outros estudos foram encontradas em Plethodontidae e ainda foram feitos com o uso de esteróides Salamandridae. Já entre os anuros foram (LOW, 1972), indolalquilaminas da secreção encontrados em Discoglossidae, da pele (CEI et al., 1972) e glândula parotóide Bombinatoridae, Hylidae, Heleophrynidae, (CERIOTTI et al., 1989), ou com uma Hyperoliidae, Ascaphidae, Leptodactylidae, combinação de pele e glândula parotóide de Microhylidae, Limnodynastidae, bufonídeos (MACIEL et al., 2003). MACIEL Myobatrachidae, Pelobatidae, Pipidae e (2003) utiliza caracteres da secreção cutânea Ranidae. SCHWARTZ et al. (1992) descrevem das espécies do grupo Bufo crucifer para a ocorrência de serotonina e bufotenina em indicar relações de parentesco. Estes dados Siphonops annulatus. Este seria o primeiro demonstram que estes caracteres possuem sinal registro de ocorrência de indolalquilaminas em filogenético e indicam, pelo menos de forma gimnofionos. Recentemente a ocorrência de preliminar, as relações filogenéticas deste indolalquilaminas foi registrada em grupo. Leptodactylus syphax (Leptdodactylidae), Parece existir uma diferença na Melanophryniscus cambaraensis atividade de sistemas enzimáticos específicos (DOURADO et al. 2004) e em espécies de envolvidos na síntese das aminas biogênicas Osteocephalus (Hylidae) (COSTA et al., provenientes das secreções de pele e das 2005). glândulas parotóides, sugerindo que estas Segundo CEI et al. (1972), a presença últimas não são simplesmente, um de um dado derivado indólico implica na agrupamento de glândulas cutâneas (MACIEL ocorrência de um sistema enzimático que et al., 2003). catalisa sua biossíntese, de forma altamente 3.2. Imidazolalquilaminas específica. Enzimas são proteínas Imidazolalquilaminas ou aminas manufaturadas na célula por um complexo imidazólicas são moléculas formadas pela processo de codificação. Desta forma, cada descarboxilação da histidina e são amina e seu precursor ou metabólito poderiam representadas pela histamina (Fig.6), seus ser considerados caracteres para inferir derivados n-metilados, n-acetilados e por relações de parentesco entre espécies formas ciclizadas de n-metilhistaminas. Sua intimamente relacionadas. Alguns trabalhos de distribuição entre os anfíbios é bem mais sistemática e taxonomia bioquímica já foram restrita do que as indolalquilaminas, sendo realizados utilizando princípios ativos da encontradas em anuros das famílias Hylidae,
200 Herpetologia no Brasil II Princípios bioativos da pele de anfíbios: panorama atual e perspectivas
Leptodactylidae, Microhylidae, 4. Peptídeos Myobatrachidae e Ranidae. O manuseio de Os trabalhos pioneiros realizados por animais como Leptodactylus labyrinthicus Vittorio Erspamer, no início da década de 60, podem provocar reações alérgicas como constituem um marco no estudo sistemático urticária, irritação nas mucosas nasais e dessas moléculas (RENDA, 2000). Na sua oculares, lacrimejamento e espirros (SEBBEN quase totalidade, esses trabalhos foram et al., 1993). realizados a partir da pele seca de animais 3.3. Monohidroxi-fenilalquilaminas coletados ao redor de todo o mundo, que eram As monohidroxi-fenilalquilaminas são enviados pelo correio para a Itália e compostos formados pela descarboxilação da processados por meio de extrações alcoólicas. L-tirosina, como a tiramina, candicina e Mesmo usando uma metodologia bastante leptodactilina. Parecem estar presentes em sua simples, Erspamer e seus colegas foram grande maioria em leptodactilídeos. A tiramina capazes de isolar e caracterizar, além das já é encontrada normalmente, em quantidades mencionadas aminas biogênicas, 50 novos variáveis, em tecidos de plantas e animais e peptídeos bioativos pertencentes, pelo menos, também pode estar presente em alguns gêneros a 10 famílias diferentes (ERSPAMER, 1994). alimentícios (KIRSCHBAUM et al., 2000). A Hoje, graças a inúmeros avanços tecnológicos, leptodactilina causa bloqueio da transmissão como o advento de equipamentos de HPLC neuromuscular com efeitos similares aos do acoplados a espectrômetros de massa, o curare (CEI & ERSPAMER, 1966). Esta isolamento e a caracterização de peptídeos a substância foi encontrada em 56 espécies de partir da secreção cutânea de anuros têm anuros estudados (ERSPAMER, 1994). Já a apresentado um notável crescimento. Uma candicina parece ser encontrada apenas na pele simples busca no PubMed de Leptodactylus pentadactylus. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) usando como 3.4. Catecolaminas palavras-chave frog peptides resultou em 3.897 As catecolaminas encontradas na pele referências bibliográficas, demonstrando o de anfíbios são a epinefrina, norepinefina, acentuado interesse da comunidade científica dopamina e epinina (Fig.6). Estas moléculas por esse campo de pesquisa. são amplamente distribuídas no gênero Bufo, Os peptídeos biologicamente ativos não sendo encontradas em outros bufonídeos. encontrados na pele de anuros são classificados Entre outras ações a epinefrina tem uma em diferentes grupos dependendo dos efeitos potente ação vasopressora e causa um aumento fisiológicos observados em preparações das taxas cardíaca e respiratória. Em altas farmacológicas, podendo ser agrupados em doses, pode causar espasmos, estupor, vômito, oito classes principais (LAZARUS & ATTILA, convulsões. 1993; ERSPAMER, 1994):
200 Herpetologia no Brasil II Princípios bioativos da pele de anfíbios: panorama atual e perspectivas
4.1. Bradicininas 4.3. Ceruleínas Além da própria bradicinina (isolada São peptídeos quimicamente inicialmente da pele de Rana temporaria), relacionados com o pentapeptídeo C- nesse grupo estão incluídos peptídeos terminal dos peptídeos gastrointestinais encontrados, em sua maioria, em Ranidae. colecistocinina e gastrina. Produzem Acredita-se que esses peptídeos desempenhem diversos efeitos comportamentais em um papel na defesa do animal contra predação, mamíferos, tais como inibição da ingestão de uma vez que a liberação de bradicininas no alimento e de água, antinocicepção e lúmen gástrico do predador, promove um sedação. A ceruleína foi isolada inicialmente aumento na motilidade gástrica, capaz de da pele da perereca australiana Litoria induzir o vômito, com a conseqüente ejeção da caerulea (Hylidae) (ANASTASI et al., 1968; presa (CONLON & ARONSSON, 1997). DIMALINE, 1983). 4.2. Taquicininas 4.4. Bombesinas Grupo definido pela presença Em 1971, Erspamer e colaboradores característica do pentapeptídeo C-terminal isolaram um peptídeo de 14 resíduos de
54 Phe -Xaa -Gly-Leu-Met-NH2. As taquicininas aminoácidos, denominado bombesina, a partir formam uma das famílias mais numerosas e de extratos da pele da rã européia Bombina largamente distribuídas, com bombina (Bombinatoridae). Somente no final aproximadamente 50 taquicininas já da década de 70, peptídeos análogos foram identificadas e seqüenciadas. Ocorrem em isolados de tecido cerebral e do trato invertebrados e em todas as classes de gastrintestinal de mamíferos. As bombesinas vertebrados, sendo bastante abundantes na pele têm um vasto espectro de ação, merecendo de anfíbios. As taquicininas de anfíbios são destaque o fato de promoverem uma resposta peptídeos relacionados com a substância P, um gástrica integrada (aumento na liberação de polipeptídeo presente no trato gastrointestinal e bicarbonato e muco, inibição da secreção ácida no sistema nervoso de mamíferos. Estes e de pepsina e aumento na atividade motora) peptídeos agem intensamente sobre a (AYALON et al., 1981). musculatura lisa, vascular e extravascular, além 4.5. Sauvagina de apresentarem efeito estimulante sobre as Com 40 resíduos de aminoácidos, este glândulas lacrimais e salivares. Destaca-se a peptídeo foi obtido da pele de Phyllomedusa ocorrência de fisalemina, um dos mais potentes sauvagei e parece estar presente apenas em agentes hipotensivos encontrados na natureza, Phyllomedusinae. Tem ação hipotensora isolado da pele de diversas espécies de moderada e age de forma complexa sobre a Physalaemus (Leptodactylidae) (SEVERINI et hipófise anterior, estimulando a liberação do al., 2002). hormônio adrenocorticotrópico (HACI) e de beta-endorfinas (ERSPAMER et al., 1980;
200 Herpetologia no Brasil II Princípios bioativos da pele de anfíbios: panorama atual e perspectivas
MONTECUCCHI et al., 1980; Quanto à ocorrência, tudo indica que os MONTECUCCHI et al., 1981). peptídeos estão presentes em todas as espécies, 4.6. Dermorfinas e Deltorfinas já tendo sido detectados em representantes de São polipeptídeos opióides isolados da praticamente todas as famílias. pele de algumas espécies de Phyllomedusinae A constatação de que na pele de (Phyllomedusa, Agalychnis e Pachymedusa), anfíbios encontram-se peptídeos com potente apresentando espectro de ação semelhante ao atividade antimicrobiana é atribuída a uma das endorfinas, com potente efeito analgésico. descoberta ao acaso feita por Michael Zasloff Esses opióides são encontrados em (ZASLOFF, 1987). Ele observou que fêmeas de Phyllomedusa bicolor e, aparentemente, são Xenopus laevis (Pipidae) não apresentavam responsáveis por alguns dos efeitos infecções bacterianas, mesmo após terem sido promovidos pela administração sistêmica de submetidas a cirurgias em condições não- secreção cutânea em humanos, conhecida estéreis. Decidiu, assim, investigar os fatores como “vacina de sapo”. Este procedimento, envolvidos na proteção natural desses animais, conhecido como “kambô” ou “kampô”, foi vindo a isolar as magaininas 1 e 2, peptídeos de desenvolvido e é praticado por indígenas sul- 23 resíduos de aminoácidos, ativos contra americanos em rituais preparatórios para a caça bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, (DALY et al.,1992b; ERSPAMER et al., 1993). bem como fungos e protozoários. Sua alta Atualmente vem sendo aplicado seletividade por membranas de indiscriminadamente e de forma irresponsável microrganismos abriu um novo campo de (sem base científica) em diversas regiões do investigação e, durante os últimos anos, vários país, alardeando propriedades de depuração e peptídeos antimicrobianos foram isolados das desintoxicação do organismo. secreções de anfíbios ao redor do mundo 4.7. Peptídeos antimicrobianos (BARRA & SIMMACO, 1995; SIMMACO et Diversos compostos isolados da al., 1999; RINALDI, 2002; .NASCIMENTO et secreção cutânea de anfíbios apresentam al., 2003). atividade antimicrobiana. Esteróides e aminas Tais pesquisas têm sido impulsionadas biogênicas são capazes de inibir o crescimento pela emergência crescente de linhagens de determinadas cepas de patógenos. No bacterianas multi-resistentes. Atualmente, entanto, o grande avanço nessa área ocorreu existe um interesse considerável das grandes com a descoberta dos peptídeos indústrias farmacêuticas em produzir novos antimicrobianos (NASCIMENTO et al., 2003). antibióticos, uma vez que os antimicrobianos, Tanto pela abundância quanto pela diversidade atualmente disponíveis, têm-se mostrado de moléculas, esses compostos parecem ineficazes no tratamento de inúmeras infecções constituir o mais importante sistema de defesa bacterianas. Diante desse quadro, os peptídeos contra microrganismos presentes nos anfíbios. antimicrobianos de anuros representam uma
200 Herpetologia no Brasil II Princípios bioativos da pele de anfíbios: panorama atual e perspectivas nova classe de moléculas antibióticas com 1992; SIMMACO et al., 1993; PARK et al., considerável emprego terapêutico (BARRA & 1994); SIMMACO, 1995; SIMMACO et al., 1999; - As temporinas, isoladas inicialmente NASCIMENTO et al., 2003). da espécie Rana temporaria, são os menores Os peptídeos antimicrobianos de peptídeos antimicrobianos conhecidos, com 10 anfíbios apresentam cadeia polipeptídica a 13 resíduos de aminoácidos (SIMMACO et pequena (10-46 resíduos de aminoácidos), com al., 1996). um grande número de aminoácidos básicos e O emprego de tais peptídeos como hidrofóbicos, distribuídos ao longo da cadeia, agentes antimicrobianos reside no fato de que levando à formação de alfa-hélices anfipáticas são altamente seletivos e induzem a lise celular quando em ambientes hidrofóbicos. Acredita- por meio de interações basicamente de natureza se que o mecanismo de ação dos peptídeos eletrostática. Conseqüentemente, é remota a catiônicos de anfíbios envolva a interação com possibilidade de o emprego sistemático de tais a membrana da célula-alvo por meio de peptídeos vir a selecionar linhagens resistentes, interações eletrostáticas/hidrofóbicas, seguida pois a interação do peptídeo com a célula-alvo é da inserção dos peptídeos na membrana, o que largamente influenciada pela presença leva à perda da integridade funcional e acentuada de fosfolipídios ácidos nas conseqüente morte celular (DATHE & membranas biológicas bacterianas (BIGGIN & WIEPRECHT, 1999; LOHNER & PRENNER, SANSOM, 1999; MATSUZAKI, 1999). A face 1999; OREN & SHAI, 1999). externa das membranas celulares de Os peptídeos antimicrobianos de vertebrados é constituída basicamente por anfíbios costumam ser relacionados a três fosfolipídios neutros (“zwiteriônicos”), pelos famílias predominantes, com base em suas quais os peptídeos catiônicos de anfíbios seqüências e estruturas tridimensionais: apresentam baixa afinidade (ZASLOFF, 2002). - Peptídeos lineares e anfipáticos que Dois principais mecanismos de ação formam hélices, como as magaininas, de citolítica já foram propostos: o mecanismo Xenopus e as dermaseptinas de Phyllomedusa, “carpete” e o mecanismo de formação de os quais têm ação comprovada contra bactérias, canais. No mecanismo “carpete”, o peptídeo se fungos e protozoários e pouco efeito sobre agrega paralelamente à superfície da células humanas (ZASLOFF, 1987; MOR et membrana, via interações eletrostáticas. Isto al., 1991; FLEURY et al., 1998; BATISTA et causa um afilamento na membrana, podendo al., 1999); rompê-la, levando a bactéria à morte. No - Peptídeos provenientes da família segundo, o peptídeo se insere Ranidae, que são as brevininas, as gaegurinas e perpendicularmente à membrana plasmática da as esculentinas. Contém uma ponte dissulfeto bactéria, induzindo um rearranjo estrutural que na porção C-terminal (MORIKAWA et al., possibilita a formação de um poro
200 Herpetologia no Brasil II Princípios bioativos da pele de anfíbios: panorama atual e perspectivas transmembrânico. Esse poro interfere no antimicrobianos de anuros, principalmente de mecanismo de osmoregulação, causando um anfíbios encontrados no Cerrado, como descontrole no fluxo de íons e solutos que leptodactilídeos dos gêneros Leptodactylus, entram e saem da célula, causando a morte Odontophrynus, Physalaemus e diversos celular (OREN & SHAI, 1999). gêneros da subfamília Hylinae (sensu Muitos peptídeos apresentam um FAIVOVICH et al., 2005). Já isolamos e espectro de atividade apreciavelmente amplo. caracterizamos 15 novos peptídeos As dermaseptinas constituem um bom antimicrobianos das espécies Hypsiboas lundii, exemplo, pois em concentrações micromolares H. albopunctatus, Leptodactylus ocellatus, L. causam lise de bactérias, protozoários e labyrinthicus e Phyllomedusa distincta leveduras, além de apresentarem notável (BATISTA et al., 1999; NASCIMENTO et al., efetividade contra fungos filamentosos 2004; CASTRO et al., 2005) (Quadro 2). Tais responsáveis por infecções oportunistas letais, estudos permitiram constatar a grande ocasionadas pela síndrome da diversidade de peptídeos bioativos produzidos imunodeficiência ou pelo uso de agentes pelos anuros, evidenciando o papel da secreção imunosupressivos (MOR et al., 1994). cutânea de anuros como uma fonte riquíssima Já existem exemplos de drogas de substâncias antimicrobianas. produzidas a partir de tais peptídeos, como o 5. Feromônios sexuais pexiganan (MSI-78), um derivado da Em Urodela, o fator de reconhecimento magainina, empregado no tratamento de sexual e corte mais significativo é a úlceras polimicróbicas de pé em pacientes comunicação química feita por meio de diabéticos (GE et al., 1999a, b). feromônios. Estas substâncias são produzidas Misturas de peptídeos antimicrobianos pelas glândulas cutâneas que, durante o período e suas combinações com antibióticos reprodutivo, possuem notável convencionais costumam apresentar notável desenvolvimento. Apesar de várias espécies de sinergia, indicando uma potencial aplicação no vertebrados utilizarem sinais químicos, são tratamento de infecções por patógenos multi- poucos os feromônios que já foram resistentes (KOBAYASHI et al., 2001). identificados quimicamente. O primeiro Por fim, merece destaque o fato do feromônio identificado quimicamente em repertório peptídico produzido por diferentes anfíbios, e também em um vertebrado, é a espécies de anuros revelar peculiaridades que sodefrina, peptídeo produzido pelo macho do podem significar novas bioatividades e tritão Cynops pyrrhogaster (Salamandridae) especificidades a serem estudadas e (KIKUYAMA et al., 1995). ROLLMANN et exploradas. al. (1999) descreveram um feromônio Nosso grupo tem se dedicado ao proteináceo que aumenta a receptividade da isolamento e a caracterização de peptídeos fêmea em Plethodon jordani (Plethodontidae).
200 Herpetologia no Brasil II Princípios bioativos da pele de anfíbios: panorama atual e perspectivas
Quadro 2: Exemplos de peptídeos antimicrobianos isolados da secreção cutânea de anuros da fauna brasileira.
Peptídeo Espécie Estrutura Primaria
Ocelatina 1 Leptodactylus ocellatus GVVDILKGAGKDLLAHLVGKISEKV-CONH2
Ocelatina 2 Leptodactylus ocellatus GVLDIFKDAAKQILAHAAEQI-CONH2
Ocelatina 3 Leptodactylus ocellatus GVLDILKNAAKNILAHAAEQI-CONH2
Hilina b1 Hypsiboas lundii FIGAILPAIAGLVHGLINR-CONH2
Hilina b2 Hypsiboas lundii FIGAILPAIAGLVGGLINR-CONH2 *DD M Phyllomedusa distincta ALWKTMLKKLGTMALHAGKAAFGAAADTISQ DD L Phyllomedusa distincta ALWKTLLKNVGKAAGKAALNAVTDMVNQ DD K Phyllomedusa distincta GLWSKIKAAGKEAAKAAAKAAGKAALNAVSEAV DD Q1 Phyllomedusa distincta ALWKNMLKGIGKLAGQAALGAVKTLVGAES DD Q2 Phyllomedusa distincta GLWSKIKEAAKTAGLMAMGFVNDMV
*DD, dermadistinctina
Este feromônio foi isolado da glândula contendo água na concentração final de 10 pM, submandibular (mental) do macho. sem efeitos sobre machos ou sobre fêmeas de Posteriormente, um feromônio parecido com a outras espécies, como a Litoria caerulea. Mais sodefrina foi purificado do tritão Cynops recentemente, foi isolado um peptídeo, em ensicauda (YAMAMOTO et al., 2000). Leptodactylus fallax, capaz de induzir Já em anuros, a comunicação acústica comportamento agressivo nos machos da desempenha papel fundamental no espécie. Este peptídeo não é produzido pelas reconhecimento sexual e na corte (HOLLIDAY fêmeas (KING et al., 2005). & TEJEDO, 1995; SULLIVAN et al., 1995). No entanto, já foram isolados dois peptídeos de Conclusões e Perspectivas anuros com potente efeito sobre o O lento e gradual processo de aquisição comportamento sexual de machos e de fêmeas. do conhecimento a respeito dos princípios WABNITZ et al. (1999) monitoraram o bioativos presentes na pele dos anfíbios trouxe conteúdo peptídico das secreções das glândulas uma série de avanços, mas também, outros parotóides e rostrais de machos e fêmeas de tantos problemas a serem resolvidos. Litoria splendida durante um período de três Entendemos que reconhecer esses problemas é anos e isolaram um componente existente condição necessária para não repeti-los, apenas nas secreções dos machos. Este buscando assim soluções para promover peptídeo, denominado esplendiferina, avanços da ciência sob paradigmas e conceitos apresenta 25 resíduos de aminoácidos e é capaz atuais. Alguns procedimentos rotineiros há 40 de atrair fêmeas mantidas em um tanque anos são desnecessários ou até condenáveis nos
200 Herpetologia no Brasil II Princípios bioativos da pele de anfíbios: panorama atual e perspectivas dias atuais. Vejamos alguns exemplos: hoje e metodológico da época, SEBBEN e sabemos que não se deve adotar uma única colaboradores coletaram cerca de mil metodologia para isolar e a caracterizar exemplares de Brachycephalus ephippium para quimicamente e farmacologicamente os poder caracterizar, parcialmente, uma das compostos presentes em uma dada espécie de neurotoxinas do grupo da TTX (SEBBEN et al., anfíbio. Isso porque o tratamento necessário 1986). Para caracterização de TTX, autores para trabalhar com proteínas é diferente japoneses utilizaram como material de partida daquele utilizado para esteróides ou alcalóides. 100 quilos de ovário do baiacu Takifugu Desta forma, cada animal é investigado por rubripes , para obter, ao final do processo nove múltiplas metodologias, com o intuito de traçar gramas de toxina cristalizada. um perfil completo dos compostos presentes Com a construção de um analisador de em sua secreção cutânea. Além disso, atenta-se TTX, único no Brasil, por Schwartz e Pires Jr., para as possíveis variações qualitativas e/ou nosso grupo é capaz, hoje, de analisar a quantitativas, que possam estar relacionadas a composição dessa família de toxinas de um parâmetros sazonais, populacionais ou sexuais. único exemplar de Brachycephalus. Outro aspecto, desprezado por muitos No entanto, se a caracterização química pesquisadores, diz respeito à falta de material tem sido o foco principal da maioria dos testemunho das espécies estudadas. As trabalhos atuais, pouco tem sido feito em espécies pesquisadas devem ter exemplares relação à determinação da atividade depositados em coleções científicas e com os farmacológica de muitos dos compostos respectivos números de tombo citados nos isolados de secreção cutânea de anfíbios. São trabalhos. A falta desse procedimento exceção alguns peptídios que possuem comprometeu e compromete muitos trabalhos. atividade antimicrobiana. Em relação aos avanços das Nesse sentido, entendemos que os metodologias de pesquisa, aspectos merecem grupos de pesquisa devem investir mais nessa destaque: novos métodos e tecnologias abordagem, de modo que se complete a permitem uma significativa diminuição da compreensão a respeito do papel dessas quantidade de materiais utilizados na moléculas para os anfíbios. caracterização química e farmacológica. Como vimos, a composição de ERSPAMER (1959) utilizou 9 quilos de pele moléculas bioativas na secreção cutânea de seca de Leptodactylus ocellatus para purificar e cada espécie de anfíbio é complexa, podendo caracterizar a leptodactilina. Para estudos de em alguns casos, ultrapassar 50 compostos. alcalóides, Daly e colaboradores dizimaram Assim, é difícil a compreensão da função de tal populações de Dendrobates spp. e Phyllobates quantidade e diversidade de compostos na spp. na América Central e na região Norte da biologia dessas espécies. A toxicidade de América do Sul. Seguindo o referencial técnico determinada espécie pode ser devida a
200 Herpetologia no Brasil II Princípios bioativos da pele de anfíbios: panorama atual e perspectivas microconcentrações de potentes neurotoxinas, ANASTASI, A.; ERSPAMER, V. & ENDEAN, R. Isolation and amino acid sequence of caerulein, the como em Brachycephalus pernix ou em active peptide in the skin of Hyla caerulea. Archives Epipedobates flavopictus, ou a grandes of Biochemistry and Biophysics, v.125: 5768. 1968. acúmulos de moléculas, como serotonina, um AYALON, A.; YAZIGI, R.; THOMPSON, J.C.; neurotransmissor presente em quase DEVITT, P.G.; RAYFORD, P.L. & THOMPSON, praticamente os animais, mas que em grande J.C. Direct effect of bombesin on isolated gastric concentração na glândula de veneno, atua como mucosa. Biochemical and Biophysical Research Communications, v.99, n.4: 1390-1397. 1981. uma potente arma química contra diversos predadores. BARRA, D. & SIMMACO, M. Amphibian skin: a promising resource for antimicrobial peptides. Entretanto quando falamos em arma Trends in Biotechnology, v.13: 205-209. 1995. química, devemos considerar que nem sempre BARTHALMUS, G.T. Biological roles of uma secreção é capaz de causar a morte de um amphibian skin secretions. In: HEATWOLE, H. eventual predador. Nem por isso, ela é menos (org). Amphibian Biology. Surrey Beatty and Sons, importante para a defesa de uma determinada 1994. espécie. Nesse contexto, algumas perguntas BATISTA, C.V.; DA SILVA, L.R.; SEBBEN, A.; adicionais devem ser levantadas. Quantos SCALONI, A.; FERRARA, L.; PAIVA, G.R.; exemplares de um determinado anfíbio devem OLAMENDI-PORTUGAL, T.; POSSANI, L.D. & BLOCH, C. Jr. Antimicrobial peptides from the ser consumidos, por um único predador, para Brazilian frog Phyllomedusa distincta. Peptides, que alguma alteração sistêmica seja v.20: 679-686. 1999. observável? Qual é o mecanismo de resistência BIGGIN, P. & SANSOM, M. Interactions of alpha- do predador em relação às toxinas de sua presa? helices with lipid bilayers: a review of simulation Por que os anfíbios apresentam, em suas studies. Biophysical Chemistry, v.76: 161-183. 1999. secreções, uma diversidade de compostos com atividades farmacológicas tão distintas? BRADLEY, D. Frog venom cocktail yields a one- handed painkiller. Science, v.261: 1117. 1993. Esses são apenas alguns pontos a serem considerados com vistas a ampliar esse mundo CASTRO, M.S.; MATSUSHITA, R.H.; SEBBEN, A.; SOUSA, M.V. & FONTES, W. Hylins: à parte que é a exploração de moléculas bombinins H structurally related peptides from the presentes na pele dos anfíbios. skin secretion of the Brazilian tree-frog Hyla biobeba. Protein and Peptide Letters, v.12: 89-93. 2005. Referências Bibliográficas CEI, J.M. & ERSPAMER, V. Biochemical taxonomy of South American amphibians by means ALBURQUERQUE, E.X.; WARNICH, J.E.; of skin amines and polypeptides. Copeia, v.1966: MALEQUE, M.A.; KAUFFMAN, F.C.; 74-78. 1966. TAMBURINI, R.; NIMIT, Y. & DALY, J. W. The pharmacology of pumiliotoxin-B. Interaction with CEI, J.M.; ERSPAMER, V. & ROSEGHINI, M. calcium sites in the sarcoplasmicreticulum of Biogenic amines. In: BLAIR, W.F. (org). Evolution skeletal muscle. Molecular Pharmacology, v.19: in the genus Bufo. Austin and London: University of 411-424. 1981.
200 Herpetologia no Brasil II Princípios bioativos da pele de anfíbios: panorama atual e perspectivas
Texas Press, p.233-243, 1972. DALY, J.W.; HIGUET, R.J. & MYERS, C.W. Occurence of skin alkaloids in non-dendrobatidae CEI, J.M.; ERSPAMER, V. & ROSEGHINI, M. frogs from Brazil (Bufonidae), Australia Taxonomic and evolutionary significance of (Myobatrachidae), and Madagascar (Mantellinae). biogenic amines and polypeptides occurring in Toxicon, v.22, n.96: 905-919. 1984. amphibian skin. I. Neotropical leptodactylid frogs. Systematic Zoology, v.16: 328-342. 1967. DALY, J.W.; MYERS, C.W. & WHITTAKER, N. Further classification of skin alkaloids from CERIOTTI, G.; CARDELLINI, P.; MARIAN, P. & neotropical poison frogs, Dendrobatidae, with a SALA, M. Chromatographic study of toad venoms general survey of toxic noxious substances in the for taxonomic purposes. Bulletino di Zoologia, Amphibia. Toxicon, v.25, n.10: 1023-1095. 1987. v.56: 357-360. 1989. DALY, J.W.; GARRAFFO, H.M.; HALL, G.S.E. & CLARKE, B.T. The natural history of the COVER Jr., J.F. Absence of skin alkaloids in amphibian skin secretions, their normal functioning captive-raised madagascan mantelline frogs and and potential medical applications. Biological sequestration of dietary alkaloids. Toxicon, v.35, Reviews, v.72: 365-379. 1997. n.7: 1131-1135. 1997.
CONLON, J.M. & ARONSSON, U. Multiple DALY, J.W.; MYERS, C.W.; WARNICK, J.E. & bradykinin-related peptides from the skin of the ALBUEQUERQUE, E.X. Levels of Batrachotoxin frog, Rana temporaria. Peptides, v.18, n.3: 361- and lack of sensitivity to its action in poison-dart 365. 1997. frogs Phyllobates. Science, v.208: 1383-1385. 1980.
COSTA, T.O.G.; MORALES, R.A.V.; BRITO, T.P.; DALY, J.W.; SECUNDA, S.I.; GARRAFFO, H.M. PINTO, A.C. & BLOCH Jr., C. Occurrence of & SPANDE, T.F. Variability in alkaloid profiles in bufotenin in the Osteocephalus genus, Anura: neotropical poison frogs (Dendrobatidae) Genetic Hylidae. Toxicon (no prelo), 2005. versus envoronmental determinants. Toxicon, v.30 n.8: 887-898. 1992a. CUNHA FILHO, G.A.; SCHWARTZ, C.A.; RESCK, I.S.; MURTA, M.M.; LEMOS, S.; DALY, J.W.; GARRAFFO, H.M.; SPANDE, T.F.; CASTRO, M.S.; KYAW, C.; PIRES Jr., O.R.; JARAMILLO, C. & RAND, A.S. Dietary source for BLOCH Jr., C.; LEITE, J.R.S. & SCHWARTZ, E.F. skin alkaloids of poison frogs, Dendrobatidae. Antimicrobial activity of the bufadienolides Journal of Chemical Ecology, v.20, n.4: 943-955. marinobufagenin and telocinobufagin isolated as 1994a. major components from skin secretion of the Bufo rubescens. Toxicon, v.45, n.6: 777-782. 2005. DALY, J.W.; GUSOVSKY, F.; MYERS, C.W.; YOTSU-YAMASHITA, M. & YASUMOTO, T. DALY, J. W. Marine Toxins and Non marine Toxins: First occurrence of tetrodotoxin in a dendrobatid Convergence or Symbiotic Organisms? Journal of frog, Colostethus inguinalis, with further reports for Natural Products, v.67: 1211-1215. 2004. the bufonid genus Atelopus. Toxicon, v.32, n.3: 279- 285. 1994b. DALY, J.W. & SPANDE, T.F. Amphibian alkaloids: chemistry, pharmacology and biology. In: DALY, J.W.; CACERES, J.; MONI, R.W.; PELLETIER, S.W. (org.) Alkaloids: chemical and GUSOVSKY, F.; MOOS, M.Jr.; SEAMON, K.B.; biological. New York: Springer-Verlag, 1986. MILTON, K. & MYERS, C.W. Frog secretions and hunting magic in the upper Amazon: identification DALY, J.W.; GARRAFFO, H.M. & PANNELL, of a peptide that interacts with an adenosine L.K. Alkaloids from australian frogs receptor. Proceedings of the National Academy of (Myobatrachidae): pseudophrynamines and Sciences of the United States of America, v.89, pumiliotoxins. Journal of Natural Products, v.53 n.22:10960-10963. 1992b. n.2: 407-421. 1990.
200 Herpetologia no Brasil II Princípios bioativos da pele de anfíbios: panorama atual e perspectivas
DATHE, M. & WIEPRECHT, T. Structural features G. & BIANCHI, A. Pharmacological studies of of helical antimicrobial peptides: their potential to 'sapo' from the frog Phyllomedusa bicolor skin: a modulate activity on model membranes and drug used by the Peruvian Matses Indians in biological cells. Biochimica et biophysica act,. shamanic hunting practices. Toxicon, v.31, n.9: v.1462: 71-87. 1999. 1099-1111. 1993.
DIMALINE, R. Is caerulein amphibian CCK? FAIVOVICH, J.; HADDAD, C.F.B.; GARCIA, Peptides, v.4, n.4: 457-62. 1983. P.C.A.; FROST, D.R.; CAMPBELL, J.A. & WHEELER, W.C. Systematic review of the frog DOURADO, F.S.; MACIEL, N.M.; TOLLENDAL, family Hylidae, with special reference to Hylinae: F.; SCHWARTZ, C.A.; SCHWARTZ, E.N.F. phylogenetic analysis and taxonomic revision. Occurrence of indolealkylamines in the skin Bulletin of the American Museum of Natural secretions of two frogs: Melanophryniscus History, n.294: 1-240. 2005. cambaraensis (Bufonidae) and Leptodactylus syphax (Leptodactylidae). In: VIII CONGRESSO FLEURY, Y.; VOUILLE, V.; BEVEN, L.; DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE AMICHE, M.; WROBLEWSKI, H.; DELFOUR, TOXINOLOGIA AND VIII SYMPOSIUM OF A. & NICOLAS P. Synthesis, antimicrobial activity THE PAN AMERICAN SECTION OF THE and gene structure of a novel member of the INTERNATIONAL SOCIETY ON dermaseptin B family. Biochimica et Biophysica TOXINOLOGY, 2004, Angra dos Reis, 2004. Acta, v.1396: 228-236. 1998.
ERSPAMER, V. Isolation of leptodactyline from FLIER, J.; EDWARDS, M.W.; DALY, J.W. & extracts of Leptodactylus skin. Archives MYERS, C.W. Widespread occurrence in frogs and Biochemistry Biophysics, v.82: 431-438. 1959. toads of skin compounds interacting with the ouabain site of Na+, K+-ATPase. Science, v.208: ERSPAMER, V. Biogenic amines and active 503-505. 1980. polyptides of the amphibian skin. Annual Review of Pharmacology, v.11: 327-350, 1971. FORSSTRÖM, T.; TUOMINE, J. & KÄRKKAINEN, J. 2001. Determination of ERSPAMER, V. Bioactive Secretions of the potentially hallucinogenic N-dimethylted Amphibian Integument. In: HEATWOLE, H.; indoleamines in human urine by HPLC/ESI-MS- BARTHALMUS, G.T. & HEATWOLE, A.Y. (org) MS. Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Amphibian Biology. Surrey Beatty and Sons, 1994. Investigation, v.61: 547-556. 2001.
ERSPAMER, V. & ASERO, B. Identification of GE, Y.; MacDONALD, D.; HENRY, M.M.; HAIT, enteramine, specific hormone of enterochromaffin H.I.; NELSON, K.A.; LIPSKY, B.A.; ZASLOFF, cells, as 5-hydroxytryptamine. Nature, v.169, 800- M.A. & HOLROYD, K.J. In vitro susceptibility to 801. 1952. pexiganan of bacteria isolated from infected diabetic foot ulcers. Diagnostic Microbiology and ERSPAMER, V.; ERSPAMER, G.F.; IMPROTA, Infectious Disease, v.35: 45-53. 1999a. G.; NEGRI, L. & DE CASTIGLIONE, R. Sauvagine, a new polypeptide from Phyllomedusa GE, Y.; MacDONALD, D.L.; HOLROYD, K.J.; sauvagei skin. Occurrence in various Phyllomedusa THORNSBERRY, C.; WEXLER, H. & ZASLOFF, species and pharmacological actions on rat blood M. In vitro antibacterial properties of pexiganan, an pressure and diuresis. Naunyn-Schmiedeberg's analog of magainin. Antimicrobial Agents and Archives of Pharmacology, v.312, n.3: 265-270. Chemotherapy, v.43: 782-788. 1999b. 1980. GOTO, T.; KISHI, Y.; TAKAHASHI, S. & ERSPAMER, V.; ERSPAMER, G.F.; SEVERINI, HIRATA, T. Tetrodotoxin. Tetrahedron, v.21: 2059- C.; POTENZA, R.L.; BARRA, D., MIGNOGNA, 2088. 1965.
200 Herpetologia no Brasil II Princípios bioativos da pele de anfíbios: panorama atual e perspectivas
HABERMEHL, G. Venomous animals and their LACERDA FILHO, J.B. Algumas experiências toxins. New York: Springer Verlag, 1981. com o veneno do Bufo ictericus Spix (Crapaud du Brésil). Arquivos do Museu Nacional, v.3: 33-39. HOLLIDAY, T. & TEJEDO, M. Intrasexual 1878. selection and alternative mating behavior. In: HEATWOLE, H. & SULLIVAN, B.K. (org) LAZARUS, L.H. & ATTILA, M. The toad, ugly and Amphibian Biology. Surrey Beattyn and Sons, 1995. venomous, wears yet a precious jewel in his skin. Progress in Neurobiology, v.41: 473-507. 1993. KAMANO, Y.; YAMASHITA, A.; NOGAWA, T.; MORITA, H.; TAKEYA, K.; ITOKAWA, H.; LICHTSTEIN, D.; SAMUELOV, S. & WECHTER, SEGAWA, T.; YUKITA, A.; SAITO, K.; W.J. Digitalis-like compounds in animal tissues. KATSUYAMA, M. & PETTIT, G.R. QSAR Journal of Basic and Clinical Physiology and evaluation of the Ch'an Su and related Pharmacology, v.3: 269-292. 1992. bufadienolides against the colchicineresistant primary liver carcinoma cell line PLC/PRF/5. LOHNER, K. & PRENNER, E. Differential Journal of Medicinal Chemistry, v.45: 5440-5447. scanning calorimetry and X-ray diffraction studies 2002. of the specificity of the interaction of antimicrobial peptides with membrane-mimetic systems. KIKUYAMA, S.; TOYODA, F.; OHMIYA, Y.; Biochimica et Biophysica Acta., v.1462: 141-156. MATSUDA, K.; TANAKA, S. & HAYASHI, H. 1999. Sodefrin: a female-attracting peptide pheromone in newt cloacal glands. Science, v.267: 1643-1645. LOW, B.S. Evidence from parotoid-gland 1995. secretions. In: BLAIR, W.F. (org). Evolution in the genus Bufo. Austin and London: University of KIM, Y.H.; BROWN, G.B.; MOSHER, H.S. & Texas Press, p.244-264, 1972. FUHRMAN, F.A. Occurrence of tetrodotoxin in atelopid frogs of Costa Rica. Science, v.189: 151. MACIEL, N.M. Indolalquilaminas e proteínas do 1975. veneno das glândulas granulares na filogenia do grupo Bufo crucifer Wied-Neuwied, 1821, Anura: KING, J.D.; ROLLINS-SMITH, L.A.; NIELSEN, Bufonidae. Brasília, 2003. 69p. Dissertação P.F.; JOHN, A. & CONLON, J.M. Characterization (Mestrado, Biologia Animal) Instituto de Ciências of a peptide from skin secretions of male specimens Biológicas, Universidade de Brasília. of the frog Leptodactylus fallax that stimulates aggression in male frogs. Peptides, v.26: 597-601. MACIEL, N.M.; SCHWARTZ, C.A.; PIRES Jr., 2005. O.R.; SEBBEN, A.; CASTRO, M.S.; SOUSA, M.V.; FONTES, W. & SCHWARTZ, E.N.F. KIRSCHBAUM, J.; REBSCHER, K. & Composition of indolealkylamines of Bufo BRÜCKNER, H Liquid chromatographic rubescens cutaneous secretions compared to six determination of biogenic amines in fermented other Brazilian bufonids with phylogenetic foods after derivatization with 3,5-dinitrobenzoyl implications. Comparative Biochemistry and chloride. Journal of Chromatography A, v.881: 517- Physiology B, v.134, n.4: 641-649. 2003. 530. 2000. MALEQUE, M.A.; BROSSI, A.; WITKOP, B.; KOBAYASHI, S.; HIRAKURA, Y. & GODLESKI, S.A. & ALBUQUERQUE, E.X. MATSUZAKI, K. Bacteria-selective synergism Interaction of analogs of histrionicotoxin with the between the antimicrobial peptides alpha- helical acetilcholine receptor ionic channel complex and magainin 2 and cyclic beta-sheet tachyplesin I: membrane excitability. Journal of Pharmacology toward cocktail therapy. Biochemistry, v.40: 14330- and Experimental Therapeutics., v.229: 72-79. 14335. 2001. 1984.
200 Herpetologia no Brasil II Princípios bioativos da pele de anfíbios: panorama atual e perspectivas
MATSUZAKI, K. Why and how are peptide-lipid flavopictus: pumiliotoxin 251D, histrionicotoxin interactions utilized for self-defense? Magainins and decahydroquinolines. Toxicon, v.43, n.3: 303- and tachyplesins as archetypes, Biochimica et 310. 2004. Biophysica Acta, v.1462: 1-10. 1999. MOSHER, H.S.; FUHRMAN, F.A.; BUCHWALD, McCLEAN, S.; ROBINSON, R.; SHAW, C. & H.D. & FISCHER, H.G. Tarichatoxin-tetrodoxin: a SMYTH, F. Characterization and determination of potent neurotoxin. Science, v.144: 1100. 1964. indole alkaloids by electrospray ionization ion trap. Rapid Communication in Mass Spectrometry, v.16: MYERS, C.W. & DALY, J.W. Preliminary 346-354. 2002. evaluation of skin toxins and vocalizations in taxonomic and evolutionary studies of poison-dart MONTECUCCHI, P.C.; ANASTASI, A.; DE frogs, Dendrobatidae. Bulletin of American. CASTIGLIONE, R. & ERSPAMER, V. Isolation Museun. Natural. History, v.157: 173-261. 1976. and amino acid composition of sauvagine. An active polypeptide from methanol extracts of the skin of MYERS, C.W.; DALY, J.W. & MALKIN, B. A the South American frog Phyllomedusa sauvagei. dangerously toxic new frog (Phyllobates) used by International Journal of Peptide and Protein Emberá Indians of western Colombia, with Research. v.16, n.3: 191-199. 1980. discussion of blowgun fabrication and dart poisoning. Buletim of Aerican. Mueum.of Naural. MONTECUCCHI, P.C. & HENSCHEN, A. Amino History, v.161: 307366. 1978. acid composition and sequence analysis of sauvagine, a new active peptide from the skin of NASCIMENTO, A.C.; FONTES, W.; SEBBEN, A. Phyllomedusa sauvagei. International Journal of & CASTRO, M.S. Antimicrobial peptides from Peptide and Protein Research, v.18, n.2: 113-120. anurans skin secretions. Protein and Peptide 1981. Letters, v.10: 227-238. 2003.
MOR, A.; HANI, K. & NICOLAS, P. The vertebrate NASCIMENTO, A.C.; ZANOTTA, L.C.; KYAW, peptide antibiotics dermaseptins have overlapping C.M.; SCHWARTZ, E.N.; SCHWARTZ, C.A.; structural features but target specific SEBBEN, A.; SOUSA, M.V.; FONTES, W. & microorganisms. Journal of Biological Chemistry, CASTRO, M.S. Ocellatins: new antimicrobial v.269: 31635-31641. 1994. peptides from the skin secretion of the South American frog Leptodactylus ocellatus (Anura: MOR, A.; NGUYEN, V.H.; DELFOUR, A.; Leptodactylidae). The Protein Journal, v.23: 501- MIGLIORE-SAMOUR, D. & NICOLAS, P. 508. 2004. Isolation, amino acid sequence, and synthesis of dermaseptin, a novel antimicrobial peptide of NOGAWA, T.; KAMANO, Y.; YAMASHITA, A. & amphibian skin. Biochemistry, v.30: 8824-8830. PETTIT, G.R. Isolation and structure of five mew 1991. cancer cell growth inhibitory bufadienolides from the chinese tradicional drug Ch'an su. Journal of MORIKAWA, N.; HAGIWARA, K. & Natural Products, v.64: 1148-1152. 2001. NAKAJIMA, T. Brevinin-1 and -2, unique antimicrobial peptides from the skin of the frog, OREN, Z. & SHAI, Y. Mode of action of linear Rana brevipoda porsa. Biochemical and amphipathic alpha-helical antimicrobial peptides. Biophysical Research Communications, v.189: 184- Biopolymers, v.47: 451-463. 1999. 190. 1992. PARK, J.M., JUNG, J.E. & LEE, B.J. Antimicrobial MORTARI, M.R.; SCHWARTZ, E.N.F.; peptides from the skin of a Korean frog, Rana SCHWARTZ, C.A.; PIRES Jr., O.R.; BLOCH Jr., rugosa. Biochemical and Biophysical Research C.; SEBBEN, A. & SANTOS, M.M. Main alkaloids Communications, v.205: 948-954. 1994. from the Brazilian dendrobatidae frog Epipedobates
200 Herpetologia no Brasil II Princípios bioativos da pele de anfíbios: panorama atual e perspectivas
PHISALIX, C. & BERTRAND, G. Sur les principes Saraiva, 1969. actifs du venin de crapaud commum. Comptes Rendus. Academie of Sciences, v.135. 1902. SAWAYA, P. Sobre o veneno das glândulas cutâneas, a secreção e o coração de Siphonops PIRES Jr., O.R.; SEBBEN, A.; SCHWARTZ, annulatus. Boletim da Faculdade de Philosophia E.N.F; LARGURA, S.W.R.; BLOCH Jr., C.; Ciências e Letras da Universidade de São Paulo, v. MORALES, R.A.V. & SCHWARTZ, C.A. 4: 207-270. 1940. Occurrence of tetrodotoxin and its analogues in the Brazilian frog Brachycephalus ephippium, Anura: SCHWARTZ, E.N.F.; SCHWARTZ, C.A.; Brachycephalidae. Toxicon, v.40: 761-766. 2002. SEBBEN, A. & MENDES, E.G. Ocorrência de serotonina, 5-hidroxitriptamina. e bufotenina, NN- PIRES Jr, O.R.; MORALES, R.A.V.; SEBBEN, A.; dimetil-5-hidroxitriptamina em extrato de pele de SCHWARTZ, E.N.F.; BLOCH Jr., C. & Siphonops annulatus, Caecilidae-Gymnophiona. SCHWARTZ, C.A. Occurrence of 11-oxoTTX, a In: XIX CONGRESSO BRASILEIRO DE rare tetrodotoxin analog, in Brachycephalidae frog ZOOLOGIA. 1992, Belém, Pará, UFPA, 1992. Brachycephalus ephippium. Toxicon, v.42: 563- 566. 2004. SEBBEN, A.; SCHWARTZ, C. A. & CRUZ, J. S. A defesa química dos anfíbios. Ciência Hoje, v.15, PIRES Jr., O.R.; MORALES, R.A.V.; SEBBEN, A.; n.87: 25-33. 1993. SCHWARTZ, E.N.F.; BLOCH Jr., C. & SCHWARTZ, C.A. Further report of the occurrence SEBBEN, A.; SCHWARTZ, C.A.; VALENTE, D. of tetrodotoxin and new analogues in the anuran & MENDES, E.G. A tetrodotoxin-like substance family Brachycephalidae. Toxicon, v.45, n.1: 73-79. found in the brazilian frog Brachycephalus 2005. ephippium. Toxicon, v.24: 799-806. 1986.
PISO, G. História Natural e Médica da Índia SEVERINI, C.; IMPROTA, G.; FALCONIERI- Ocidental (em Cinco Livros) (1658). Rio de Janeiro, ERSPAMER, G.; SALVADORI, S. & ERSPAMER, Coleção de Obras Raras, Instituto Nacional do V. The tachykinin peptide family. Pharmacological Livro, 685p. 1957. Reviews, v.54, n.2: 285-322. 2002.
RENDA, T.G. Vittorio Erspamer: A true pioneer in SIMMACO, M.; MIGNOGNA, G. & BARRA, D. the field of bioactive peptides. Peptides, v.21: 1585- Antimicrobial peptides from amphibian skin: what 1586. 2000. do they tell us? Biopolymers, v.47: 435-450. 1999.
RINALDI, A.C. Antimicrobial peptides from SIMMACO, M.; MIGNOGNA, G.; BARRA, D. & amphibian skin: an expanding scenario. Current BOSSA, F. Novel antimicrobial peptides from skin Opinion in Chemical Biology, v.6: 799-804. 2002. secretion of the European frog Rana esculenta. FEBS Letters, v.324: 159-161. 1993. RITCHIE, J.M. Tetrodoxin and saxitoxina and the sodium channels of exitable tissues. Trends in SIMMACO, M.; MIGNOGNA, G.; CANOFENI, Pharmacological Sciences, v.1, n.2: 275-279. 1980. S.; MIELE, R.; MANGONI, M.L. & BARRA, D. Temporins, antimicrobial peptides from the ROLLMANN, S.M.; HOUCK, L.D. & European red frog Rana temporaria. European. FELDHOFF, R.C. Proteinaceous pheromone Journal of Biochemistry, v.242: 788-792. 1996. affecting female receptivity in a terrestrial salamander. Science, v.285: 1907-1909. 1999. SPANDE, T.F.; GARRAFFO, H.M.; EDWARDS, M.W.; YEH, H.J.C.; PANNELL, L. & DALY, J.W. ROSENFELD, G. & KELEN, E.M.A. Bibliography Epibatidine: a novel (chloropyridyl0 of animal venoms, envenomation and treatment azabicycloheptane with potent analgesic activity (Period 1500-1968). São Paulo, Indústria Gráfica from an Ecuadoran Poison Frog. Journal of
200 Herpetologia no Brasil II Princípios bioativos da pele de anfíbios: panorama atual e perspectivas
American Chemistr. Society, v.114: 3475-3478. peptides from Xenopus skin: isolation, 1992. characterization of two active forms, and partial cDNA sequence of a precursor. Proceedings of the STEINBORNER, S.T.; WABNITZ, P.A.; BOWIE, National Academy of Sciences of the United States of J.H. & TYLER, M.J. The application of mass America, v.84: 54495454. 1987. spectrometry to the study of evolutionary trends in amphibians. Rapid Communication in Mass ZASLOFF, M. Antimicrobial peptides of Spectrometry, v.10: 92-95. 1996. multicellular organisms. Nature, v.415: 389-395. 2002. SULLIVAN, B.K.; RYAN, M.J. & VERRELL, P.A. Female choice and mating system structure. In: ZELNIK, R.; ZITI, L.M. & GUIMARÃES, C.V. A HEATWOLE, H. & SULLIVAN, B.K. (org) chromatographic study of the bufadienolides Amphibian Biology. Surrey Beatty and Sons, 1995. isolated from the venom of the parotoid glands of Bufo paracnemis Lutz, 1925. Journal of TANU, M.B.; MAHMUD, Y.; TSURUDA, K.; Chromatography, v.15: 9-14. 1964. ARAKAWA, O. & NOGUCHI, T. Occurrence of tetrodotoxin in the skin of a rhacophoridid frog Polypedates sp. from Bangladesh. Toxicon, v.39: 937-941. 2001.
TOLEDO, R.C. & JARED, C. Cutaneous granular glands and amphibiam venoms. Comparative Biochemistry and Physiological A., v.111, n.1: 1- 29.1995.
TWITTI, V.C. & JOHNSON, H.H. Motor inhibition in Ambystoma produced by Triturus transplants. Science, v.80: 78-79. 1934.
VITAL BRAZIL, O. & VELLARD, J. Contribuição ao estudo dos batrachios. Memórias do Instituto de Butantan, v.3: 7-70. 1926.
VITAL BRAZIL, O. Peçonhas. In: CORBETT, C.E. (org) Farmacodinâmica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1982.
WABNITZ, P.A.; BOWIE, J.H.; TYLER, M.J.; WALLACE, J.C. & SMITH, B.P. Aquatic sex pheromone from a male tree frog. Nature, v.401: 444445. 1999.
YAMAMOTO, K.; KAWAI, Y.; HAYASHI, T.; OHE, Y.; HAYASHI, H.; TOYODA, F.; KAWAHARA, G.; IWATA, T. & KIKUYAMA, S. Silefrin, a sodefrin-like pheromone in the abdominal gland of the sword-tailed newt, Cynops ensicauda. FEBS Letters, v.472: 267-270. 2000.
ZASLOFF, M. Magainins, a class of antimicrobial
200