PARTE I Herramientas Básicas
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PARTE I Herramientas Básicas Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 15 16 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II I - CAPÍTULO 1 1. Objetivo del cultivo: si bien es difícil tratar de clasificar las aplicaciones que se persiguen con el cultivo de tejidos, se podría esquemati- Establecimiento de cultivos de zarlas en aplicaciones para: tejidos vegetales • Estudios básicos. En este caso, los explan- tes cultivados pueden ser diversos. Si lo único Luis Mroginski, Pedro Sansberro y que se quiere lograr es un sistema de callos Eduardo Flaschland para estudiar algún proceso fisiológico, se puede cultivar cualquier órgano, tejido o célula 1 Introducción viva. En este caso –en que lo único que se bus- ca es la inducción de callos– lo ideal es cultivar El cultivo de tejidos –en su acepción amplia– explantes jóvenes, derivados de semillas en puede ser definido como un conjunto muy hete- germinación, donde se obtienen respuestas rá- rogéneo de técnicas que presentan en común pidas y, en general, hay menores problemas de el hecho de que un explante (una parte sepa- contaminación con microorganismos. A veces rada del vegetal que pueden ser protoplastos – se hace uso del cultivo de tejidos porque repre- células desprovistas de pared celular– células, senta un sistema experimental que simplifica tejidos u órganos) se cultiva asépticamente en la complejidad generada por los fenómenos un medio artificial de composición química de- de correlación entre las distintas partes que finida y se incuba en condiciones ambientales normalmente están presentes en una planta controladas. La imprecisión de esta definición entera. El explante que se usará estará condi- puede generar muchas polémicas, pero es ac- cionado por lo que se quiere estudiar. Un buen tualmente aceptada. Generalmente es común ejemplo lo constituye el cultivo de ovarios fe- dividir las técnicas del cultivo de tejidos en dos cundados del tomate para estudiar los reque- grandes grupos: a) cultivos en medios semisó- rimientos nutricionales durante el crecimiento lidos y b) cultivos en medios líquidos, los que de los frutos. Asimismo, el cultivo de óvulos ha a su vez pueden ser agitados (mediante el em- sido muy útil para estudiar aspectos relaciona- pleo de agitadores de uso continuo) o estacio- dos con la formación de las fibras en algodón. narios. También es frecuente dividir al cultivo El cultivo de discos de tallos brindó una valiosa de tejidos atendiendo a los niveles de comple- ayuda para estudiar la rizogénesis in vitro. jidad en cultivo de órganos, cultivos celulares y • Obtención de plantas con sanidad contro- cultivo de protoplastos. Para el establecimien- lada. Es muy común la utilización del cultivo de to de los cultivos utilizando cualquiera de los tejidos para la obtención de plantas libres de sistemas es necesario tener en cuenta algunos virus (ver VIII.-9). El explante ideal para ello es aspectos generales comunes relacionados con el meristema (dependiendo de la especie, de el explante, la asepsia, el medio de cultivo y 0,2-0,5mm de longitud) consistente del domo y las condiciones de incubación. La discusión de de un par de primordios foliares. estos aspectos constituye el objetivo de este • Micropropagación. En este caso depende- capítulo. Adicionalmente se incluye el tema de rá del sistema que se quiere utilizar. Si lo que la aclimatación de las plantas regeneradas in se quiere explotar es la brotación de meris- vitro, que es de gran importancia en la mayoría temas, los ápices terminales y los segmentos de las aplicaciones del cultivo de tejidos en la uninodales de ramas jóvenes constituyen ex- agricultura. celentes explantes. En este caso el cultiva- dor de tejidos debe conocer perfectamente la biología de la reproducción de la planta para 2 Explante aprovechar aquellos explantes que en forma Varios factores deben ser tenidos en cuenta natural son propágulos. En cambio, si se pre- en la elección del explante apropiado para el tende micropropagar mediante el empleo de establecimiento de los cultivos in vitro, entre semillas sintéticas (ver Parte IV, capítulo 2) el ellos: explante original deberá posibilitar la inducción Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II 17 de la embriogénesis somática. En este caso, la • Establecimiento de suspensiones celula- utilización de embriones zigóticos inmaduros u res. En este caso se recomienda iniciar los cul- hojas, suelen ser frecuentes como explantes. tivos a partir de explantes extraídos de semillas • Obtención de híbridos interespecíficos. en germinación (hipocótilo, epicótilo, cotiledo- Una de las primeras aplicaciones del cultivo de nes, raíces). tejidos en la agricultura lo constituyó su empleo como ayuda para la obtención de híbridos deri- 2. Posibilidad de contaminación con mi- croorganismos. De ser posible, se deben cul- vados de cruzamientos interespecíficos, donde tivar explantes de plantas donantes que crecen se produce el aborto temprano de embriones. en condiciones de invernadero, con ello se En estos casos, el explante cultivado es el reduce sustancialmente las tasas de contami- embrión cigótico en estadios tempranos de su nación. Por otra parte, es recomendable evitar desarrollo. Con la misma finalidad también se el uso de «explantes sucios» (raíces, rizomas) utilizan ovarios u óvulos fecundados. que provienen de plantas crecidas en macetas • Obtención de plantas de semillas con em- o en el campo, dado que en la mayoría de los briones rudimentarios. Para esta finalidad los casos no es posible conseguir una buena des- explantes pueden ser semillas (por ej. orquí- infección de los mismos. deas) o bien, se aíslan los embriones en un es- tado temprano de desarrollo («corazón») como 3. Edad fisiológica. Este es un aspecto de en el caso de yerba mate o de algunas varieda- gran influencia en la morfogénesis. Como regla des de duraznero. general se puede decir que cuando más joven • Obtención de plantas haploides (consi- e indiferenciado se encuentre el explante a cul- tivar, mejor será su respuesta in vitro. Es por derando como haploide a un esporofito que ello que los meristemas apicales y axilares son contiene el complemento gamético de cromo- ampliamente usados en numerosas especies. somas). En este caso, los explantes más uti- En el caso de la micropropagación de plan- lizados son las anteras, aunque también pue- tas leñosas, la edad del explante es un factor den emplearse microsporas aisladas, óvulos y crítico. Si los tejidos son jóvenes, la micropro- ovarios no fertilizados. pagación tiene mayores posibilidades de ser • Inducción de variación somaclonal. En este exitosa que con tejidos maduros. Este hecho caso se pueden utilizar varios explantes, pero genera la necesidad de realizar tratamientos si la finalidad de su utilización es la aplicación de rejuvenecimiento de las plantas donantes en planes de mejoramiento genético de plan- de explantes. tas, los explantes utilizados deben posibilitar la regeneración de plantas enteras. 4. Tamaño. En general, cuanto más grande • Producción y/o conversión de sustancias sea el explante mayores serán las posibilida- útiles. Se puede utilizar una gran variedad des de inducir la proliferación de callos o la re- de explantes. Los de raíces suelen ser muy generación directa de órganos. Sin embargo, a mayor tamaño de explante también son ma- utilizados. yores las probabilidades de que los cultivos se • Obtención de híbridos somáticos. Para esta contaminen con microorganismos. También es finalidad se recurre a la fusión de protoplastos. necesario tener en cuenta que existe un ta- En la mayoría de los casos se aíslan los proto- maño mínimo del explante, que depende de la plastos de mesófilos de hojas y de suspensio- especie y del material vegetal, por debajo del nes celulares. cual no es fácil lograr el establecimiento de los • Conservación e intercambio de germo- cultivos. Los explantes muy pequeños suelen plasma. Los meristemas son los explantes requerir del empleo de medios más complejos preferidos para el desarrollo de sistemas de o de los denominados medios acondicionados. conservación a mediano y largo plazo (crío- 5. Epoca del año. Es un factor que suelen conservación con nitrógeno líquido) y para el tener mucha importancia en la micropropa intercambio de material genético. gación y que generalmente está asociado al 18 Biotecnología y Mejoramiento Vegetal II grado de dormición que presentan ciertos ex- te –con la ayuda de un microscopio estereos- plantes (yemas, por ejemplo) y también con la cópico– los cultivos en forma periódica (por lo posibilidad de mayor o menor proliferación de menos semanalmente). También se pueden microorganismos. realizar pruebas con medios de cultivo dife- renciales y «test» bioquímicos específicos. 3 Asepsia Para evitar y/o minimizar las contaminacio- nes de los cultivos con microorganismos es Uno de los principales problemas que se necesario: presentan cuando se tratan de establecer los cultivos es el de la contaminación de los mis- 1) Conocer el material vegetal con que se tra- mos con diversos tipos de microorganismos baja y los posibles contaminantes específicos. (hongos, levaduras, bacterias, fitoplasmas, vi- rus). El ambiente generado por explante-medio 2) Realizar una adecuada preparación de la de cultivo-condiciones físicas de incubación planta dadora de explantes, cultivándola pre- es altamente propicio para la proliferación de ferentemente en invernaderos tratadas con muchos de estos microorganismos que pue- productos químicos que eliminen patógenos y den provocar la destrucción de los cultivos. Es eventuales microorganismos endófitos.