Die Rolle Plasmazytoider Dendritischer Zellen in der Koordination der Immunreaktion gegen Herpes simplex Virus Typ1

The role of plasmacytoid dendritic cells in the coordination of the immune response against herpes simplex virus type1

Der Naturwissenschaftlichen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

zur

Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat.

vorgelegt von

Philipp Schuster

aus Nürnberg

Als Dissertation genehmigt

von der Naturwissenschaftlichen Fakultät

der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Tag der mündlichen Prüfung: 08.01.2014

Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Johannes Barth

Gutachter/in: Prof. Dr. Falk Nimmerjahn

Prof. Dr. Barbara Schmidt

Inhaltsverzeichnis

1 Zusammenfassung ...... 1 2 Summary ...... 3 3 Einleitung ...... 5 3.1 Das Herpes simplex Virus Typ1 ...... 5 3.1.1 Klassifikation und Aufbau ...... 5 3.1.2 Virale Infektion ...... 5 3.1.3 Epidemiologie und Transmission ...... 6 3.1.4 Klinik ...... 7 3.2 Kontrolle der HSV-1-Infektion durch das Immunsystem ...... 8 3.2.1 Begrenzung der Primärinfektion durch das native Immunsystem ...... 8 3.2.2 Kontrolle der latenten Infektion durch das adaptive Immunsystem ...... 10 3.3 Plasmazytoide Dendritische Zellen in der HSV-1-Infektion ...... 12 3.3.1 Charakterisierung Plasmazytoider Dendritischer Zellen ...... 12 3.3.2 Regulatorische Effekte von PDC auf die Immunreaktion ...... 14 4 Ziele der Arbeit ...... 17 5 Material und Methoden ...... 18 5.1 Materialien und Geräte ...... 18 5.1.1 Glas- und Plastikwaren ...... 18 5.1.2 Reagenzien ...... 18 5.1.3 Kommerzielle Kits ...... 20 5.1.4 Antikörper ...... 20 5.1.5 Geräte ...... 22 5.1.6 Sonstige Geräte und Materialien ...... 23 5.2 Methoden ...... 24 5.2.1 Isolation der verwendeten Zellpopulationen ...... 24 5.2.2 Herstellung von Virusstocks ...... 25 5.2.3 Kultivierung und Stimulation der Zellen ...... 27 5.2.4 Nukleinsäureextraktion ...... 27 5.2.5 Nukleinsäureanalysen ...... 28 5.2.6 ELISA ...... 31 5.2.7 CD257-Westernblot ...... 32 5.2.8 Fluoreszenz-Mikroskopie ...... 33 5.2.9 Durchflusszytometrie ...... 34 5.2.10 Statistik ...... 38 6 Ergebnisse ...... 40 6.1 Phänotypisierung von PDC in der HSV-1-Infektion ...... 40 6.1.1 Identifikation von PDC-Oberflächenrezeptoren mittels Chipanalyse ...... 40 6.1.2 Identifikation neuer Oberflächenrezeptoren mittels Durchflusszytometrie ...... 42

6.1.3 Einfluss von IL-3 auf die Regulation von PDC-Oberflächenrezeptoren ...... 44

6.1.4 Einfluss von HSVUV auf die Regulation von PDC-Oberflächenrezeptoren ...... 46

6.1.5 Einfluss von HSVUV und IL-3 auf die Regulation von PDC- Oberflächenrezeptoren ...... 47 6.1.6 Die Ergebnisse aus Transkriptionsanalyse und Durchflusszytometrie korrelieren bezüglich des Ausmaßes der Regulation der Rezeptoren ...... 48 6.1.7 Die Regulation von Oberflächenrezeptoren setzt überwiegend früh nach der Stimulation von PDC ein ...... 49 6.1.8 Rezeptoren mit deutlicher Transkription aber fehlender Oberflächenexpression liegen intrazellulär oder in löslicher Form vor ...... 50 6.1.9 Die Effekte von HSV-1 auf PDC sind unabhängig von der Infektiosität ...... 51 6.1.10 HSV-1 zeigt keine produktive Infektion von PDC ...... 52 6.1.11 Die Aufnahme von HSV-1 in PDC erfolgt zum Teil durch Endozytose ...... 54 6.2 Die Immunreaktion gegen HSV-1 in Abhängigkeit vom Serostatus der Spender ....56 6.2.1 Die Sekretion von Interferon-gamma in PBMC nach Stimulation mit HSV-1 ist abhängig vom Serostatus der Spender ...... 56 6.2.2 Die Quelle der IFNγ-Sekretion in PBMC nach Infektion mit HSV-1 unterscheidet sich bei seropositiven und seronegativen Spendern ...... 58 6.2.3 Das Ausmaß der zellulären Aktivierung in PBMC nach Infektion mit HSV-1 ist vom Serostatus weitgehend unabhängig ...... 61 6.2.4 Infektiöses HSV-1 induziert bei seropositiven und seronegativen Spendern eine unterschiedliche Polarisierung der Immunreaktion ...... 64 6.2.5 Die Sekretion von IFNγ nach Stimulation mit UV-inaktiviertem HSV-1 aus T- Zellen ist auf CD4-positive Zellen seropositiver Donoren beschränkt ...... 66 6.2.6 Plasmazytoide Dendritische Zellen verstärken die HSV-1-induzierte IFNγ- Sekretion ...... 69 6.2.7 PDC erhöhen die Zahl aktivierter und IFNγ-sezernierender Zellen ...... 72 6.2.8 Die Mechanismen der verstärkenden Signale von PDC auf die Sekretion von IFNγ unterscheiden sich Serostatus-abhängig ...... 76 7 Diskussion ...... 80 8 Verzeichnis der verwendeten Literatur ...... 104 9 Verzeichnis der Vorveröffentlichungen ...... 128 10 Abkürzungsverzeichnis ...... 129 11 Anhang ...... 132 11.1 Analyse der Reinheit isolierter PDC ...... 132 12 Danksagung ...... 133

Zusammenfassung

1 Zusammenfassung

An der Kontrolle von Infektionen mit dem Herpes simplex Virus Typ1 (HSV-1) ist eine Vielzahl verschiedener Immunzellen des nativen und adaptiven Immunsystems beteiligt. Zu diesen Zellen zählen insbesondere auch Plasmazytoide Dendritische Zellen (PDC), die in der frühen Phase viraler Infektionen eine zentrale Rolle einnehmen. Durch die schnelle Freisetzung großer Mengen Typ1 Interferone (IFN) wirken sie direkt auf infizierte Zellen und inhibieren so die virale Replikation. Darüber hinaus wird immer deutlicher, dass PDC mit anderen Immunzellen interagieren und so regulierend auf die entstehende Immunantwort wirken. Die Mechanismen dieser Wechselwirkungen, besonders derjenigen, die auf direktem Zell-Zell-Kontakt beruhen, sind jedoch nur in wenigen Fällen identifiziert.

Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit sollten Rezeptoren humaner PDC identifiziert werden, die an diesen zellulären Interaktionen beteiligt sein könnten. Basierend auf einer genomweiten Transkriptionsanalyse konnten auf der Ebene der Protein- Expression 51 Rezeptoren auf der Oberfläche von PDC detektiert werden, darunter CD48, CD156b, CD229, CD305 und CD319 die erstmals auf PDC nachgewiesen wurden. Die Rezeptoren CD48, CD229 und CD319 sind Mitglieder der SLAM- Familie, die an der Koregulation zytotoxischer Zellen beteiligt ist, was eine Wechselwirkung zwischen PDC und Effektorzellen der Immunreaktion gegen HSV-1 am Ort der akuten Infektion ermöglichen könnte. Die Stimulation mit Interleukin (IL)-3 oder HSV-1 induzierte eine Regulation der Expression von Oberflächenrezeptoren, die unabhängig von der Infektiosität des Virus auftrat. Aus der zeitlich koordinierten, einheitlichen Regulation von Rezeptoren einer Funktionsgruppe konnte ein Modell des Lebenszyklus von PDC etabliert werden. Dieses legt nahe, dass PDC zum Ort der Infektion migrieren, virale Antigene aufnehmen und anschließend über das Blut in sekundäre lymphatische Gewebe wandern.

Im zweiten Teil der Studie sollte die Immunreaktion gegen HSV-1 untersucht und generelle regulatorische Effekte von PDC auf die Aktivierung und IFNγ-Sekretion verschiedener Immunzellen in Abhängigkeit vom Serostatus der Spender analysiert werden. In mononukleären Zellen des peripheren Blutes HSV-seropositiver Spender konnten nach Stimulation mit infektiösem HSV-1 insbesondere reaktive CD3- negative Zellen und CD4-positive T-Zellen, sowie die Freisetzung von IL-2 und IL-10 identifiziert werden. Die Immunreaktion seronegativer Spender war dagegen durch

1 Zusammenfassung reaktive CD3-negative Zellen, CD8-positive T-Zellen und γδT-Zellen, und die Produktion von IL-8 und IL-12 gekennzeichnet. In der vorliegenden Arbeit konnte somit erstmalig eine auf seronegative Spender beschränkte HSV-induzierte Sekretion von IFNγ aus humanen γδT-Zellen beobachtet werden. In Experimenten, die nach Depletion von PDC durchgeführt wurden, zeigte sich ein verstärkender Effekt von PDC auf die Aktivierung und insbesondere auf die Sekretion von IFNγ aller beteiligten Immunzellen, der unabhängig vom Serostatus der Spender auftrat. Die Beobachtung, dass die reduzierte Freisetzung von IFNγ aus Zellen seropositiver Donoren durch eine erneute Zugabe von PDC, aus Zellen seronegativer Donoren dagegen besonders durch lösliche Stoffe stimulierter PDC revertiert wurde, legt nahe, dass sich die beteiligten Mechanismen unterscheiden und vom Serostatus abhängen.

Die in der vorliegenden Studie erworbenen Erkenntnisse über die Expression und Regulation von PDC-Oberflächenrezeptoren, sowie über die Wechselwirkung zwischen PDC und Effektorzellen der Immunantwort, erweitern somit das grundlegende Verständnis der Rolle von PDC in der Koordination der Immunreaktion gegen HSV-1 und können als Ausgangspunkt für weitere Studien zur Funktionalität einzelner Rezeptor-Liganden-Interaktionen dienen.

2 Summary

2 Summary

The control of herpes simplex virus type1 (HSV-1) infections is mediated by many different cells of the innate and adaptive immunity. In particular during the early phase of infection, plasmacytoid dendritic cells (PDC) play a crucial role in limiting viral spread. Via their rapid secretion of large amounts of type1 interferons (IFN), they directly act on infected cells leading to an inhibition of viral replication. Moreover, evidence is accumulating that PDC interact with other immune cells shaping the nascent immune response. However, in most cases the mechanisms of these cross- talks, especially those depending on direct cell-to-cell contact, still remain elusive.

The aim of the first part of this study was to identify human PDC receptors that are potentially involved in cellular interactions. Based on a genome-wide transcription analysis, a total of 51 receptors were detected on the surface of PDC at the level of protein expression. These receptors included CD48, CD156b, CD229, CD305 and CD319, which were identified on human PDC for the first time. The expression of CD48, CD229 and CD319, all members of the SLAM family of receptors, involved in the co-regulation of cytotoxic cells, may enable the cross-talk between PDC and effector cells at the site of an acute HSV-1 infection. Stimulation with interleukin (IL)-3 or HSV-1 induced changes in the receptor expression on PDC independent of viral infectivity and revealed a timely coordinated and consistent regulation pattern of functionally related receptors. These results fitted into a model of the PDC life cycle during herpes viral infection, including the migration of these cells to the site of infection, the sampling of antigen and the homing to secondary lymphatic tissue via the blood stream.

The second part of this thesis focused on the immune responses against HSV-1 and general regulatory effects of PDC on the activation and IFNγ secretion of various immune cells, analyzed with respect to the HSV serostatus. Following stimulation with infectious HSV-1, the response of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from seropositive donors was dominated by CD3-negative cells and CD4-positive T cells and the secretion of IL-2 and IL-10. In contrast, reactive CD3-negative cells, CD8-positive T cells and γδT cells, along with production of IL-8 and IL-12 were identified in the cultures of cells from seronegative individuals. This is the first report on the HSV-1 induced secretion of IFNγ from human γδT cells restricted to seronegative donors. Experiments involving the stimulation of PBMC after depletion

3 Summary of the PDC population revealed an enhancing effect of PDC on the activation, and, more pronounced, on the secretion of IFNγ of all reactive cells involved in the immune response, which was not dependent on the serostatus. The reduced secretion of IFNγ in the absence of PDC in cells of seropositive donors was enhanced after re-addition of PDC, whereas cells of seronegative donors responded predominantly to soluble factors derived from stimulated PDC. These data indicated that the involved mechanisms differed according to the serostatus.

The findings of this thesis concerning the expression and regulation of PDC surface receptors and the interactions between PDC and effector cells enhance the fundamental understanding of the role of PDC in the coordination of the immune response against HSV-1 and will serve as basis for future studies on the functionality of single receptor-ligand-interactions.

4 Einleitung

3 Einleitung

3.1 Das Herpes simplex Virus Typ1

3.1.1 Klassifikation und Aufbau

Das Herpes simplex Virus Typ1 (HSV-1) ist ein Vertreter der Gruppe humanpathogener Herpesviren. Zusammen mit dem sehr nahe verwandten Herpes simplex Virus Typ2 (HSV-2) und dem Varicella Zoster Virus (VZV) wird es zur Unterfamilie der alpha-Herpesviren gezählt. Ein charakteristisches Merkmal dieser Unterfamilie ist der ausgeprägte Neurotropismus, also die Infektion von Nervenzellen, die von einer lebenslangen Persistenz gefolgt ist. Des Weiteren zeichnen sich diese Viren durch ihre Fähigkeit aus, ein breites Spektrum an Zellen zu infizieren. Der Replikationszyklus von alpha-Herpesviren ist kurz, was zu einer schnellen Ausbreitung in Zellkultur führt, die in der Regel mit hoher Zytopathogenität einhergeht (Pellett und Roizman 2006; Roizman, Knipe, und Whitley 2006; Modrow et al. 2010).

Das Genom von HSV-1 setzt sich aus einem einzelnen doppelsträngigen DNA- Molekül von etwa 152000 Basenpaaren zusammen, das innerhalb der viralen Partikel linear vorliegt und einen Kern aus Proteinen umschließt. Im Verlauf der Infektion von Zellen wird das Genom zirkularisiert und in den Zellkern transportiert. Innerhalb der Virionen ist das Genom von einem ikosaedrischen Kapsid umgeben, welches wiederum von einer Hüllmembran eingeschlossen ist. In diese Membran sind virale Glykoproteine eingelagert, die den Eintritt in Wirtszellen ermöglichen. Zwischen Hülle und Kapsid sind weitere virale Proteine eingelagert, die als Tegument bezeichnet werden. Diese Tegumentproteine spielen eine wichtige regulatorische Rolle in der frühen Phase der Infektion, indem sie die virale Transkription regulieren und in den Haushalt der Wirtszelle eingreifen. Die so aufgebauten sphärischen Partikel haben einen Durchmesser von 225nm (Roizman, Knipe, und Whitley 2006; Modrow et al. 2010).

3.1.2 Virale Infektion

Der initiale Eintritt von HSV-1 in den Körper erfolgt in der Regel durch die Infektion von Epithelzellen der oro-labialen Schleimhaut (Roizman, Knipe, und Whitley 2006). In diesem Prozess wird der erste Kontakt (Adsorption) zwischen der Zelle und dem Viruspartikel durch eine verhältnismäßig schwache Interaktion der viralen Glykoproteine gB und gC mit Heparansulfaten der Zelloberfläche vermittelt (Herold et

5 Einleitung al. 1994). Anschließend leitet die Bindung an spezifische zelluläre Rezeptoren die Fusion der Virushülle mit der Plasmamembran der Zelle ein. In diesem Zusammenhang wurden mehrere Rezeptor-Liganden-Interaktionen beschrieben. So konnte die Bindung des viralen Glykoproteins gD an HVEM (engl.: herpesvirus entry mediator, HveA, CD270) (Montgomery et al. 1996), Nectin-1 (HveC, CD111) (Geraghty et al. 1998), sowie durch die 3-O-Sulfotransferase modifiziertes Heparansulfat (3-OS HS) (Tiwari et al. 2004) gezeigt werden. Eine Nectin-2-vermittelte (HveB, CD112) Infektion durch HSV-1 konnte bisher nur für einige Laborstämme beschrieben werden (Warner et al. 1998). Kürzlich konnte PIRLα (engl.: paired immunoglobulin-like type 2 receptor) als ein Ko-Rezeptor der HSV-1-Infektion identifiziert werden, an den das virale Glykoprotein gB bindet (Satoh et al. 2008). Neben der Fusion an der Zelloberfläche kann eine Infektion auch durch Endozytose von HSV-1 etabliert werden. Die Rolle dieses Eintrittsmechanismus ist jedoch noch weitgehend ungeklärt (Roizman, Knipe, und Whitley 2006). Im Verlauf der akuten Infektion breitet sich HSV-1 am Ort der primären Infektion aus und gelangt in die Endigungen peripherer sensorischer Nerven. Durch einen retrograden Transport entlang der Axone erreichen virale Kapside schließlich Ganglien und etablieren dort eine latente Infektion. Im Falle einer oro-labialen Infektion ist das Trigeminalganglion betroffen. In Phasen von lokaler oder systemischer Immunsuppression, sowie bei physikalischem oder emotionalem Stress kann es zu einer Reaktivierung von HSV-1 aus diesem Stadium der Latenz kommen. Die Folgen dieser Reaktivierung sind der anterograde axonale Transport und die Freisetzung viraler Partikel im Bereich der primären Infektion (Roizman, Knipe, und Whitley 2006; Modrow et al. 2010).

3.1.3 Epidemiologie und Transmission

HSV-1 wird hauptsächlich über Speichel oder den Kontakt mit HSV-Läsionen in der Kindheit oder Jugend übertragen (Modrow et al. 2010; Hellenbrand et al. 2005). Weltweit sind etwa 40% der Jugendlichen unter 15 Jahren infiziert, dieser Anteil steigt auf 60- 90% bei Erwachsenen (Smith und Robinson 2002). Die Durchseuchung mit HSV-1 unterliegt jedoch starken regionalen Schwankungen; so wurden innerhalb Europas Werte zwischen 52% in Finnland und 84% in Bulgarien veröffentlicht (Pebody et al. 2004). Nach Wutzler et al. liegt die Prävalenz in Deutschland bei 72,5% und steigt auf mehr als 88% in über 40-Jährigen, ähnliche Werte wurden auch von Hellenbrand et al. publiziert (Hellenbrand et al. 2005; Wutzler et al. 2000).

6 Einleitung

Die Seroprävalenz von HSV-1 in Deutschland zeigte zwischen 1977 und 2002 keine signifikante Veränderung (Buxbaum et al. 2003), in den USA konnte jedoch ein Rückgang um nahezu 7% im Zeitraum von 1988 bis 2004 beobachtet werden (Xu et al. 2006). In einer weiteren Studie aus England und Wales wurde insbesondere unter Jugendlichen eine Abnahme von HSV-1-Infektionen deutlich (Vyse et al. 2000). Diese Veränderungen in der Epidemiologie der Infektionen mit HSV-1 spiegelten sich auch in der Art der Transmission wieder. Neben der klassischen oro-labialen Infektion stieg während der letzten Jahre der Anteil von HSV-1 an genitalen Infektionen deutlich (Nilsen und Myrmel 2000; Xu et al. 2006; Slomka et al. 1998; Lafferty et al. 2000). Eine Studie in den USA zeigte, dass unter den sexuell aktiven Erwachsenen HSV-1 mittlerweile die Ursache für die Hälfte der genitalen Primärinfektionen durch Herpesviren ist (Langenberg et al. 1999). Bei jungen Frauen in Schweden und Norwegen konnte bei erstmalig auftretenden Symptomen in 53% bzw. 50-90% der Fälle HSV-1 nachgewiesen werden (Löwhagen et al. 2000; Nilsen und Myrmel 2000). Diese Verlagerung der Infektion, insbesondere bei jungen, sexuell aktiven Menschen, wurde einerseits mit der steigenden Zahl suszeptibler Jugendlicher (Vyse et al. 2000; Löwhagen et al. 2000; Lafferty et al. 2000; Xu et al. 2002) und andererseits mit einer Zunahme an oro-genitalem Verkehr (Remez 2000; Löwhagen et al. 2000; Lafferty et al. 2000; Vyse et al. 2000; Nilsen und Myrmel 2000; Xu et al. 2002; Wolff et al. 2002) in dieser Altersgruppe in Verbindung gebracht.

3.1.4 Klinik

In der Regel verlaufen Primärinfektionen mit HSV-1 asymptomatisch, im Falle einer oro-fazialen Infektion können jedoch auch Läsionen im Bereich der Lippen (Herpes labialis), der Mundschleimhaut oder des Zahnfleisches (Gingivostomatitis aphthosa) auftreten (Roizman, Knipe, und Whitley 2006; Modrow et al. 2010). In etwa 30-40% der HSV- 1-Infizierten treten symptomatisch verlaufende Reaktivierungen des Virus aus der Latenz auf (Roizman, Knipe, und Whitley 2006). Im Gegensatz zur oro-fazialen Infektion verlaufen genitale Primärinfektionen mit HSV-1 häufiger symptomatisch (Wolff et al. 2002; Löwhagen et al. 2000), symptomatische Reaktivierungen sind dagegen selten (Reeves et al. 1981; Nilsen und Myrmel 2000; Wald et al. 1995). In seltenen Fällen können sowohl primäre Infektionen wie auch Reaktivierungen zu schweren Erkrankungen führen. Neonatale Infektionen erfolgen am häufigsten durch den Kontakt des Neugeborenen mit HSV-1 oder HSV-2 im Geburtskanal. Dies kann als Folge der

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Reaktivierung, insbesondere aber bedingt durch eine genitale Primärinfektion kurz vor der Geburt eintreten, wenn die Serokonversion der Mutter noch nicht abgeschlossen ist (Z. A. Brown et al. 1997). Unter diesen Bedingungen kann es zur Etablierung einer generalisierten Infektion des Kindes kommen, die mit einer Sterblichkeit von bis zu 75% verbunden ist (Buxbaum et al. 2003). Primärinfektionen und Reaktivierungen der HSV-1-Infektion können zur Infektion der Cornea führen. Diese Erkrankung führt häufig zu einer Hornhautperforation, die mit einer Hornhauttransplantation behandelt werden muss (Liesegang 2001). Die Akute Retinale Nekrose (ARN) kann neben HSV-2 und VZV auch durch HSV-1 verursacht werden. Bedingt durch die Reaktivierung von HSV-1 tritt die ARN besonders in 36-47 Jahre alten Patienten auf und ist häufig mit einer herpesviralen Enzephalitis assoziiert (Gandorfer und Thurau 2009; Ganatra et al. 2000). Diese nekrotisierende Infektion der Retina kann zu einer drastischen Einschränkung der Sehfähigkeit bis hin zur Erblindung führen (Gandorfer und Thurau 2009). Eine weitere schwerwiegende Komplikation ist auch die alleinige HSV-Meningitis/-Enzephalitis, die bei verzögerter Therapie zu neurologischen Ausfallserscheinungen, Koma und Tod führen kann.

3.2 Kontrolle der HSV-1-Infektion durch das Immunsystem

3.2.1 Begrenzung der Primärinfektion durch das native Immunsystem

Eine zentrale Familie von Zytokinen der nativen und intrinsischen Immunreaktion sind Typ1 Interferone (IFN) (Isaacs und Lindenmann 1957). Bevor HSV-1 in Nervenenden eintritt und in Ganglien eine latente Infektion etabliert, kommt es zu einer Replikation in der Cornea oder der Mundschleimhaut. Diese erste Replikation kann durch Typ1 IFN inhibiert werden (Mossman 2002). Der antivirale Effekt wird dabei indirekt vermittelt, indem die Bindung von Typ1 IFN an den Rezeptor (IFNAR) die Expression Interferon-stimulierter Gene (ISG) induziert. Die Wirkungsmechanismen dieser großen Gruppe von Proteinen beeinflussen eine Vielzahl zellulärer wie viraler Prozesse, die beispielsweise die Inhibition der Proteinsynthese durch die Proteinkinase R (PKR), den Abbau zellulärer und viraler RNA durch die RNaseL, die Unterdrückung der viralen Transkription durch PML (engl.: promyelocytic leukemia protein) und Sp100, oder die Induktion der Apoptose beinhalten (Mossman 2002; Sadler und Williams 2008; García-Sastre und Biron 2006). Die zusätzliche Freisetzung von Interferon-gamma (IFNγ) und des Tumornekrosefaktors (TNF) aus Zellen des angeborenen Immunsystems verstärkt die Inhibition der viralen Replikation um ein

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Vielfaches (Sainz und Halford 2002; Pierce et al. 2005; Feduchi, Alonso, und Carrasco 1989). In der akuten Infektion mit HSV-1 werden IFNγ und TNFα unter Anderem von Makrophagen, gamma/delta T-Zellen (γδT-Zellen), Natürlichen Killerzellen (NK- Zellen) oder Natürlichen Killer-T-Zellen (NKT-Zellen) sezerniert, und folglich konnte für alle diese Zelltypen eine limitierende Funktion in der frühen Ausbreitung der HSV- 1-Infektion gezeigt werden.

Nach der Inokulation von HSV-1 in die Cornea von Mäusen konnte die Infiltration von Makrophagen und γδT-Zellen in das Trigeminalganglion beobachtet werden. Die Depletion dieser beiden Zellpopulationen führte jeweils zu einem schwereren Verlauf und einer stärkeren Verbreitung der Infektion in neuronalen Zellen, was sowohl im Modell der okularen Infektion wie auch nach der Inokulation von HSV-1 in die Pfoten von Mäusen deutlich wurde (Kodukula et al. 1999; Sciammas et al. 1997). Die Inhibition der induzierbaren Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS) von Makrophagen oder die Neutralisation des von Makrophagen sezernierten TNFα führte, ebenso wie die Neutralisation des von γδT-Zellen freigesetzten IFNγ, zu ähnlichen Resultaten (Kodukula et al. 1999). Eine protektive Funktion von Makrophagen konnte neben der reduzierten Ausbreitung in neuronale Gewebe auch am Ort der Inokulation von HSV- 1 beobachtet werden. Nach der Injektion des Virus in die anteriore Augenkammer inhibierte die frühe Infiltration von Makrophagen die posteriore Ausbreitung und verhinderte so die Infektion der ipsilateralen Retina (Cathcart et al. 2009). Die Depletion von Makrophagen in immunisierten Mäusen führte insbesondere in der frühen Phase nach einer okularen Infektion zu einer verstärkten viralen Replikation im Auge (Mott et al. 2007). Eine Rekrutierung IFNγ-sezernierender γδT-Zellen konnte auch nach der intravaginalen Infektion von Mäusen mit HSV-2 beobachtet werden, deren Depletion die Suszeptibilität der Mäuse für die Infektion erhöhte (Nishimura et al. 2004).

Eine zentrale Funktion in der Limitierung der akuten Infektion mit HSV-1 konnte auch für NK und NKT-Zellen gezeigt werden. So induzierte die Injektion von HSV-1 in die anteriore Augenkammer nur nach Depletion von NK-Zellen, nicht aber in unbehandelten Mäusen die Infektion der ipsilateralen Retina (Tanigawa et al. 2000). Die intranasale Infektion von T-Zell-defizienten Mäusen führte erst bei zusätzlicher NK- Zell-Defizienz zu erhöhten Viruslasten in der Lunge und dem Auftreten einer schweren nekrotisierenden Enzephalitis (Adler et al. 1999). In diesem Zusammenhang konnte Interleukin-18 (IL-18) als ein Zytokin identifiziert werden, das an der

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Aktivierung von NK-Zellen beteiligt ist, da nach intranasaler Infektion IL-18-defizienter Mäuse neben einer höheren Viruslast auch eine reduzierte IFNγ-Sekretion und Zytotoxizität von NK-Zellen in der Lunge zu beobachten war (Reading et al. 2007). Des Weiteren konnte ein durch IL-15 vermittelter aktivierender Effekt auf NK-Zellen nachgewiesen werden (Ahmad et al. 2000). Zusätzlich zu den antiviralen Effekten von NK-Zellen konnte auch eine bisher unbekannte Helferfunktion dieser Zellen auf die Aktivierung von CD8-positiven Zytotoxischen T-Zellen (CTL) beschrieben werden (Nandakumar et al. 2008). Neben NK-Zellen tragen auch NKT-Zellen zur Immunreaktion gegen Herpes simplex Viren bei, was sowohl in der vaginalen Infektion mit HSV-2 als auch nach kutaner Infektion mit HSV-1 gezeigt werden konnte (Ashkar und Rosenthal 2003; Grubor-Bauk et al. 2003) und insbesondere in der Kontrolle stark virulenter Stämme von HSV-1 wichtig zu sein scheint (Cornish et al. 2006).

3.2.2 Kontrolle der latenten Infektion durch das adaptive Immunsystem

Im Anschluss an die native Immunreaktion in der frühen Phase der akuten Infektion mit Herpes simplex Viren wird die Beseitigung infektiöser Viruspartikel und die Etablierung einer latenten nicht-lytischen Infektion durch zelluläre Komponenten des adaptiven Immunsystems vermittelt. Hier wurden Effekte von CD4-positiven T-Zellen und CD8-positiven T-Zellen beschrieben. Nach Injektion von HSV-1 in die anteriore Augenkammer von Mäusen erfolgte eine Infektion der ipsilateralen Retina nur nach gemeinsamer Depletion beider T-Zellpopulationen (Azumi und Atherton 1994). Eine anhaltende chronische Infektion von murinen Trigeminalganglien konnte, nach okularer Infektion, ebenfalls nur in der Abwesenheit von CD4-positiven und CD8- positiven T-Zellen beobachtet werden (Ghiasi et al. 1999). In humanen genitalen Läsionen einer Infektion mit HSV-2 wurden spezifische T-Zellen identifiziert, die überwiegend CD4 exprimierten (Koelle, Abbo, et al. 1994), die Beseitigung viraler Partikel war jedoch mit zytotoxischen Effektorfunktionen sowohl CD4-positiver wie auch CD8- positiver Zellen assoziiert (Koelle, Posavad, et al. 1998).

Einige Studien zeigten eine dominante Rolle von CD4-positiven T-Zellen. So war der Schutz gegen eine vaginale Infektion bei Mäusen nach Vakzinierung von CD4- positiven T-Zellen abhängig (Kuklin et al. 1998), der Transfer HSV-1-spezifischer CD4- positiver T-Zellen trug zur Etablierung einer latenten Infektion in Trigeminalganglien von SCID-Mäusen (engl.: severe combined immunodeficiency) bei (Minagawa und Yanagi 2000), und HSV-spezifische CD4-positive murine T-Zellen verhinderten den

10 Einleitung letalen Verlauf einer okularen Infektion mit HSV-1 (BenMohamed et al. 2003). Die Beseitigung viraler Partikel in neuronalem Gewebe durch CD4-positive T-Zellen war unabhängig von Perforin oder FAS (A. J. Johnson, Chu, und Milligan 2008). Darüber hinaus konnte auch bei einer vaginalen Infektion mit HSV-2 ein protektiver, nicht- zytotoxischer Mechanismus bestätigt werden, der durch IFNγ vermittelt wurde (Iijima et al. 2008; Milligan et al. 2004). In weiteren Studien wurde ein stärkerer Beitrag CD8- positiver T-Zellen dokumentiert. So beschrieben Simmons et al. CD8-positive T- Zellen als den Zelltyp, der die Beseitigung von Viruspartikeln in den Ganglien HSV-1- infizierter Mäuse vermittelt (Simmons und Tscharke 1992). In ex vivo Kulturen muriner Trigeminalganglien konnte durch die Depletion CD8-positiver Zellen die Reaktivierung einer latenten HSV-1-Infektion induziert werden (T. Liu et al. 2000), und die Infektion des vaginalen Epithels mit HSV-2 in Mäusen war nach Depletion CD8- positiver T-Zellen verstärkt (M. B. Parr und Parr 1998). Diese Unterdrückung der genitalen Infektion durch CD8-positive T-Zellen wurde im Wesentlichen durch IFNγ und nicht durch zytotoxische Mechanismen vermittelt (Dobbs et al. 2005). Das Ausmaß der latenten Infektion konnte mit der Expression von PD-1 (engl.: programmed cell death 1, CD279) in murinen Trigeminalganglien korreliert werden, was auf eine Ermüdung der CD8-positiven T-Zellen hindeuten könnte (Mott et al. 2009). Auch im peripheren Blut HSV-1- und HSV-2-seropositiver Menschen konnten HSV- spezifische CD8-positive T-Zellen detektiert werden (Posavad, Koelle, und Corey 1996). In latent mit HSV-1 infizierten humanen Trigeminalganglien konnte sowohl ein Infiltrat von CD8-positiven Zellen wie auch die Produktion von IFNγ nachgewiesen werden, was auf einen chronisch-inflammatorischen Prozess hinweist (Theil et al. 2003). In explantierten humanen Trigeminalganglien verhinderten HSV-1-spezifische CD8- positive T-Zellen die Reaktivierung einer latenten Infektion dieses Virus (Khanna et al. 2003). Neben der latenten Infektion mit HSV-1 in Trigeminalganglien ist auch die latente Infektion mit HSV-2 in humanen genitalen Ganglien mit persistierenden Effektorfunktionen CD8-positiver T-Zellen assoziiert (Verjans et al. 2007; J. Zhu et al. 2007). Zur Generierung einer robusten primären Antwort CD8-positiver T-Zellen gegen HSV-1 in der Maus ist die Anwesenheit CD4-positiver T-Zellen nötig (Rajasagi et al. 2009). Sowohl CD4- wie auch CD8-positive T-Zellen spielen also eine wichtige Rolle im Erhalt der latenten Infektion durch die Unterdrückung der lytischen Replikation von Herpes simplex Viren. In neuronalen Geweben erfolgt diese Kontrolle jedoch durch nicht-zytotoxische Mechanismen.

11 Einleitung

Beland et al. konnten zeigen, dass B-Zell-defiziente Mäuse nach intraperitonealer Injektion von HSV-1 im Gegensatz zu Kontrollmäusen Enzephalitiden entwickelten (Beland et al. 1999). Ein Defekt in der µ-Immunglobulinkette erhöhte die Suszeptibilität für eine kutane HSV-Infektion bis zu 1000-fach (Deshpande, Kumaraguru, und Rouse 2000). Infektionen mit HSV-1 verliefen in Abwesenheit von B-Zellen häufiger letal, was jedoch durch den Transfer von Immunserum verhindert werden konnte (Beland et al. 1999). Der Transfer von Immunserum verhinderte in SCID-Mäusen den letalen Verlauf einer kornealen Infektion mit HSV-1 (Minagawa und Yanagi 2000) und begrenzte die Ausbreitung einer genitalen HSV-2-Infektion in B-Zell-defizienten Mäusen (Dudley, Bourne, und Milligan 2000). Schließlich konnten nach intravaginaler Infektion mit HSV-2 virusspezifische Plasmazellen in murinen Ganglien nachgewiesen werden, die zum Erhalt der viralen Latenz beitragen könnten (Milligan et al. 2005).

3.3 Plasmazytoide Dendritische Zellen in der HSV-1-Infektion

3.3.1 Charakterisierung Plasmazytoider Dendritischer Zellen

Plasmazytoide Dendritische Zellen (PDC) wurden 1999 von zwei unabhängigen Arbeitsgruppen als die Hauptproduzenten von Typ1 Interferonen identifiziert (Cella et al. 1999; Siegal et al. 1999). Trotz ihrer geringen Frequenz von unter 0,5% der mononukleären Zellen im peripheren Blut (PBMC) wird ihre zentrale Rolle in der nativen wie auch adaptiven Immunreaktion gegen bakterielle und virale Infektionen seitdem immer deutlicher (Y. Liu 2005; Kadowaki et al. 2000; Kadowaki und Liu 2002; Soumelis und Liu 2006; Marco Colonna, Trinchieri, und Liu 2004; Barchet, Cella, und Colonna 2005; Fitzgerald- Bocarsly 2002; Fitzgerald-Bocarsly und Feng 2007; Fitzgerald-Bocarsly, Dai, und Singh 2008).

In Abwesenheit entzündlicher Prozesse sind PDC in der Haut nicht nachzuweisen (Donaghy et al. 2009; Kohrgruber et al. 2004), können aber an den Ort einer Inflammation rekrutiert werden. So konnte ihre Infiltration in Läsionen von VZV- (Gerlini et al. 2006; Huch et al. 2010; Kohrgruber et al. 2004) oder HSV-2-Infektionen (Lund et al. 2006; Donaghy et al. 2009; Kohrgruber et al. 2004) detektiert werden. Als Teil des angeborenen Immunsystems erkennen PDC Krankheitserreger anhand Pathogen-assoziierter molekularer Muster (PAMP, engl.: pathogen-associated molecular patterns), zusätzlich werden auch Gefahrensignale von geschädigten Zellen (DAMP, engl.: damage-associated molecular patterns) erkannt (Matzinger 2002). In diesem Zusammenhang wurde insbesondere der endosomal lokalisierte Toll-ähnliche

12 Einleitung

Rezeptor 9 (TLR9, engl.: Toll-like receptor) beschrieben, der nach Erkennung unmethylierter CpG-Motive in doppelsträngiger DNA die Sekretion von Typ1 Interferonen und anderen proinflammatorischen Zytokinen induziert (Krieg 2001; Krieg 2002; Simon Rothenfusser et al. 2002; Y. Liu 2005; Fuchsberger, Hochrein, und O'Keeffe 2005; Ishii und Akira 2006; Uematsu und Akira 2006; Blasius und Beutler 2010; Krug et al. 2001; Krug et al. 2004; Lund et al. 2003; Lund et al. 2006; Peng et al. 2007; Vollmer et al. 2004; Donhauser et al. 2010; Ries et al. 2013; Hochrein et al. 2004). Diese löslichen Faktoren können einerseits die Ausbreitung von Pathogenen begrenzen, andererseits aber auch regulatorisch auf die entstehende Immunreaktion wirken (Fitzgerald-Bocarsly 2002; Fitzgerald-Bocarsly und Feng 2007; Fitzgerald-Bocarsly, Dai, und Singh 2008). Im Anschluss an die Aktivierung maturieren PDC zu Antigen-präsentierenden Zellen (Grouard et al. 1997; Kadowaki et al. 2000; Fonteneau et al. 2003; Ochando et al. 2006; Hoeffel et al. 2007; Di Pucchio et al. 2008; Jaehn et al. 2008; Mouriès et al. 2008; Björck et al. 2008; Haeryfar 2005; Villadangos und Young 2008; Y. Liu 2005; Kadowaki und Liu 2002; Soumelis und Liu 2006; Marco Colonna, Trinchieri, und Liu 2004; Barchet, Cella, und Colonna 2005). Die Multifunktionalität von PDC reicht von der Erkennung und Limitierung der Ausbreitung eines Pathogens über die Regulation anderer Immunzellen bis hin zur direkten Präsentation von Antigenen an Zellen des adaptiven Immunsystems.

Eine Reihe verschiedener Rezeptoren wurde bisher auf humanen PDC beschrieben. Nachdem PDC ursprünglich als Linienmarker-negative Zellen nachgewiesen wurden, können sie heute durch die Expression der PDC-spezifischen Marker BDCA2 (CD303) und BDCA4 (CD304) detektiert werden (Dzionek et al. 2000). Zusätzlich wurde die Expression von CD2 (LFA-2), CD4, CD7 (LEU-9), CD11a (ITGAL), CD18 (ITGB2), CD36, CD38, CD43 (SPN), CD44, CD45RA, CD54 (ICAM-1), CD58 (LFA- 3), CD62L (SELL), CD86 (B7-2), CD98 (SLC3A2), CD116 (CSF2RA), CD123 (IL3RA), CD164 (Sialomucin), HLA-DR, HLA-DQ und HLA-A/B/C beschrieben (Dzionek et al. 2000). Im Verlauf der Maturation von PDC konnte eine verstärkte Expression von CD40 (TNFRSF5), CD80 (B7-1), CD83, CD86 (B7-2), HLA-DR und MHC-I, sowie eine reduzierte Expression von CD62L (SELL) und CD183 (CXCR3) gezeigt werden (Cella et al. 2000). Die Rezeptoren CD31 (PECAM1), CD68 (LAMP4) und CD336 (NCR2) (Fuchs et al. 2005) konnten ebenso wie CD32 (FCGR2A), CD184 (CXCR4), CD191 (CCR1), CD192 (CCR2), CD195 (CCR5), CD197 (CCR7) und CD252 (TNFSF4, OX-40L) (Marco Colonna, Trinchieri, und Liu 2004) auf der Oberfläche von PDC nachgewiesen werden. Schließlich wurden die Rezeptoren CD97 (Matmati

13 Einleitung et al. 2007), CD170 (SIGLEC5) (Lock et al. 2004), CD253 (TNFSF10, TRAIL) (Chaperot et al. 2006), sowie CD111 (PVRL1, Nectin-1, HveC), CD112 (PVRL2, Nectin-2, HveB) und CD270 (TNFRSF14, HVEM, HveA) (Donaghy et al. 2009) auf PDC identifiziert.

3.3.2 Regulatorische Effekte von PDC auf die Immunreaktion

Zusätzlich zu den antiviralen Effekten der von PDC sezernierten Typ1 Interferone und anderer Zytokine auf infizierte Zellen, regulieren PDC auch die Migration, Aktivierung und Effektorfunktionen anderer Immunzellen. Wie in Abbildung 1 zusammengefasst, wurden verschiedene zelluläre Interaktionen in der Infektion mit humanen alpha-Herpesviren beschrieben (Abb. 1). Humane PDC induzierten nach Stimulation mit HSV-1 oder Interleukin-3 (IL-3) die Proliferation von allogenen naiven CD4-positiven T-Zellen (Kadowaki et al. 2000). In Anwesenheit von IL-3 sezernierten diese T-Zellen nach Restimulation die Th2-Zytokine IL-4, IL-5 und IL-10, die Kokultur mit CpG- oder HSV-stimulierten PDC führte dagegen zur Expression von IFNγ und IL-10 (Kadowaki et al. 2000; Moseman et al. 2004). Die Sekretion von IFNγ wurde durch Typ1 IFN deutlich verstärkt (Kadowaki et al. 2000). Später konnten für die unter Zugabe von HSV-1 differenzierten T-Zellen sowohl inhibitorische Effekte auf die Proliferation naiver CD4-positiver T-Zellen als auch zytotoxische Funktionen durch die Expression von Perforin und Granzym B beschrieben werden, was zur Bezeichnung als „CD4- positive zytotoxische regulatorische T-Zellen“ führte (Kawamura et al. 2006). Die endozytotische Aufnahme von HSV-1 in humane PDC induzierte die Freisetzung der Chemokine CCL4 und CXCL10, die die Migration von aktivierten CD4-positiven T- Zellen und NK-Zellen vermittelten (Megjugorac et al. 2004). So konnte ein enger Kontakt zwischen humanen PDC und aktivierten NK-Zellen, CD4-positiven und CD8- positiven T-Zellen in den Läsionen einer HSV-2-Infektion beobachtet werden (Donaghy et al. 2009; Kohrgruber et al. 2004). In Patienten mit einer Herpesvirus-assoziierten ARN konnte neben der reduzierten Zahl und Funktionalität der PDC auch eine reduzierte Freisetzung von IFNγ aus CD8-positiven Zellen beschrieben werden (Kittan et al. 2007). Ein wichtiger Beitrag von PDC zur Kontrolle herpesviraler Infektionen konnte auch im Mausmodell identifiziert werden. So verliefen intravaginale Infektionen mit HSV-2 in TLR9-defizienten Mäusen oder nach Depletion der PDC-Population schwerer und waren im Vergleich zur Infektion von Wildtyp-Mäusen mit einer erhöhten Sterblichkeit verbunden (Lund et al. 2006). Die Infektion mit HSV-1 induzierte in Mäusen eine starke Sekretion von IFNγ aus NK-Zellen, die jedoch nicht durch den Kontakt dieser Zellen

14 Einleitung mit viralen Partikeln, sondern durch das von PDC freigesetzte IL-18 vermittelt wurde (Barr et al. 2007). Nach der Depletion von PDC wurde, in der kutanen Infektion mit HSV-1, eine reduzierte Sekretion von IFNγ auch bezüglich der CD8-positiven CTL, in Verbindung mit einer reduzierten Zytotoxizität dieser Zellen und einer erhöhten Viruslast, beobachtet. An der Generierung HSV-spezifischer CTL waren PDC jedoch nur indirekt, durch die Interaktion mit dendritischen Zellen im Lymphknoten, beteiligt. Neben den aktivierenden Effekten von IFNα konnte hier auch eine Wechselwirkung durch CD2 und CD40L gezeigt werden (Yoneyama et al. 2005). Im Anschluss an diese erste Beschreibung einer direkten zellulären Interaktion und der daran beteiligten Rezeptoren in der murinen Infektion mit HSV-1 konnten indirekt auch im humanen System Rezeptor-vermittelte regulatorische Mechanismen identifiziert werden. So induzierte die Stimulation von PDC mit HSV-1 oder CpG die Expression von GITRL, dem Liganden für GITR (engl.: glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor), der auf aktivierten NK- und T-Zellen exprimiert wird. Neben den verstärkenden Effekten von Typ1 IFN erhöhte die Bindung von GITRL auf CpG- stimulierten PDC an GITR auf NK-Zellen deren Produktion von IFNγ und die Zytotoxizität gegen NK-Zell-sensitive Zielzellen (Hanabuchi et al. 2006). Zusätzlich zu GITRL induzierte die Stimulation mit HSV-1 oder CpG auch eine anhaltende Expression von ICOS-L (engl.: inducible co-stimulator ligand, B7-H2) auf humanen PDC (Ito et al. 2007). In Kokulturen CpG-stimulierter PDC mit allogenen naiven CD4- positiven T-Zellen verstärkte die Interaktion von CD80 und CD86 der PDC mit CD28 der T-Zellen deren Expansion. Die Restimulation der T-Zellen induzierte die Sekretion von IL-10 und IFNγ, wobei die Blockade der Interaktion zwischen ICOS und ICOS-L selektiv die Produktion von IL-10 inhibierte, die Blockade von CD80 und CD86 dagegen die Freisetzung von IL-10 erhöhte (Ito et al. 2007).

15 Einleitung

Abbildung 1: Kontrolle der Infektion mit alpha-Herpesviren durch das Immunsystem. Zusammenfassende Darstellung der an der Kontrolle von humanen alpha-Herpesviren beteiligten Immunzellen. Abgebildet sind Quellenangaben zu direkten Effekten verschiedener Zellpopulationen auf die herpesvirale Infektion und interzellulären Wechselwirkungen. Abbildung modifiziert nach Schuster et al. 2011.

16 Ziele der Arbeit

4 Ziele der Arbeit

Plasmazytoide Dendritische Zellen nehmen in der immunologischen Kontrolle viraler Infektionen eine zentrale Rolle ein. Durch ihre klassischen nativen Effektorfunktionen wie der schnellen Sekretion großer Mengen an Typ1 Interferonen limitieren sie die initiale Replikation von Viren in der akuten Infektion und begrenzen somit deren Ausbreitung im Körper. Innerhalb der letzten Jahre wurde jedoch eine weitere Funktion von PDC immer deutlicher. Auf Grund ihrer Fähigkeit mit einer Vielzahl anderer Immunzellen zu interagieren, werden PDC heute als eine wichtige Zellpopulation an der Schnittstelle zwischen der nativen und adaptiven Immunität angesehen. Aus dieser Position können sie sowohl die Aktivierung von Zellen des angeborenen Immunsystems wie Makrophagen, Natürlichen Killerzellen, Natürlichen Killer-T-Zellen oder γδT-Zellen beeinflussen als auch modulierende Effekte auf Zellen des adaptiven Immunsystems wie B-Zellen, CD4-positive, CD8-positive oder regulatorische T-Zellen vermitteln. Im Zusammenhang mit der Kontrolle von Infektionen humaner Herpes simplex Viren wurden bereits mehrere dieser regulatorischen Interaktionen beobachtet, deren zu Grunde liegende Mechanismen, insbesondere diejenigen die durch direkten Zell-Zell-Kontakt vermittelt werden, bisher jedoch nur in wenigen Fällen identifiziert wurden.

Ein Ziel dieser Arbeit stellte somit die Identifizierung von Oberflächenrezeptoren humaner PDC dar, die an zellulären Interaktionen beteiligt sein könnten. Basierend auf einer genomweiten Transkriptionsanalyse wurden hierzu die Expression, sowie die durch Stimulation mit HSV-1 induzierte Regulation, auf Proteinebene analysiert. Des Weiteren sollten generelle inhibitorische oder aktivatorische Effekte von PDC auf die an der Kontrolle der HSV-1-Infektion beteiligten Immunzellen HSV-seropositiver und seronegativer Spender identifiziert werden.

17 Material und Methoden

5 Material und Methoden

5.1 Materialien und Geräte

5.1.1 Glas- und Plastikwaren

Produkt Bezugsquelle EDTA-Röhrchen S-Monovette 9ml K3E Sarstedt, Nümbrecht ELISA-Platten Maxisorp Nunc, Wiesbaden Eppendorf-Reaktionsgefäße 1,5 und 2ml Sarstedt, Nümbrecht FACS-Röhrchen 5ml Sarstedt, Nümbrecht Objektträger für Immunfluoreszenz Medco, Dülmen PCR-Gefäße Thermo-Tube 0,2ml PEQlab, Erlangen Photometer-Küvetten Eppendorf, Hamburg Platte für Real-time PCR 96 Well Applied Biosystems, Darmstadt QIAshredder-Säulen Qiagen, Hilden SafeGuard Pipettenspitzen PEQlab, Erlangen Schraubdeckelgefäße 1,5/15/50ml Sarstedt, Nümbrecht Separations-Säulen MS und LS Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach Sterilfilter 0,22 und 0,45µm Millipore, Schwalbach Ultrazentrifugen-Röhrchen 38,5ml Beckman Coulter, Krefeld Polyallomer und Ultra-Clear Zellkultur-Platten 24/48/96 Well Greiner Bio-One, Frickenhausen Zellkultur-Flaschen 25/75/175cm2 Greiner Bio-One, Frickenhausen

5.1.2 Reagenzien

Produkt Bezugsquelle Agarose Invitrogen, Karlsruhe Ammoniumacetat Merck, Darmstadt Ammoniumpersulfat (APS) Merck, Darmstadt β-Mercaptoethanol (β-ME) Sigma-Aldrich, Taufkirchen Bromphenolblau (BPB) Sigma-Aldrich, Taufkirchen Biocoll Separating Solution (Ficoll) Biochrome AG, Berlin Bio-Magermilchpulver Heirler Cenovis GmbH, Radolfzell Bovines Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich, Taufkirchen 4´,6-Diamidin-2-phenylindol Sigma-Aldrich, Taufkirchen Dihydrochlorid (DAPI) Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4) Merck, Darmstadt Dimethylsulfoxid getrocknet (DMSO) Merck, Darmstadt DNAse und RNAse freies Wasser Sigma-Aldrich, Taufkirchen dNTP-Mix Roche, Mannheim Dulbecco`s Modified Eagle Medium Gibco BRL, Eggenstein (DMEM) Ethanol 99,8% Merck, Darmstadt Ethylendiamintetraessigsäure 0,5M Sigma-Aldrich, Taufkirchen (EDTA) Essigsäure Merck, Darmstadt FcR-Blocking Reagent Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach

18 Material und Methoden

Fluoprep zum Eindecken von Biomérieux, Nürtingen Objektträgern Fötales Kälberserum (FKS) Lonza, Basel, Schweiz Pan Biotech, Aidenbach Sigma-Aldrich, Taufkirchen Glucose Merck, Darmstadt Glutamin Gibco BRL, Eggenstein Glycerin Merck, Darmstadt Glycin Roth, Karlsruhe Humanes AB-Serum Lonza, Basel, Schweiz Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) Merck, Darmstadt Kaliumchlorid (KCl) Merck, Darmstadt Luminol Biosynth, Staad, Schweiz Methanol 99,8 % Merck, Darmstadt N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin Roth, Karlsruhe (TEMED) Natriumchlorid (NaCl) Merck, Darmstadt Natriumdodecylsulfat (SDS) Merck, Darmstadt Natronlauge (NaOH) Merck, Darmstadt Normalserum Ziege Dianova, Hamburg Nonidet P-40 (NP-40) Sigma-Aldrich, Taufkirchen Pacific Blue Succinimidyl Ester (PB) Invitrogen, Karlsruhe Paraformaldehyd (PFA) Sigma-Aldrich, Taufkirchen Para-Hydroxycumarsäure Sigma-Aldrich, Taufkirchen Penicillin Sigma-Aldrich, Taufkirchen Phenolrotlösung Merck, Darmstadt Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) Roche, Mannheim Phytohämagglutinin (PHA) Oxoid, Wesel Proteinstandard Fermentas, St. Leon-Rot Random Primer Invitrogen, Darmstadt Rekombinantes humanes IL-3 R&D Systems, Wiesbaden-Nordenstadt Roswell Park Memorial Institute 1640 Gibco BRL, Eggenstein Medium (RPMI 1640) Rotiphorese Gel A (30%) Roth, Karlsruhe Rotiphorese Gel B (2%) Roth, Karlsruhe Salzsäure (HCl) Merck, Darmstadt Saponin Sigma-Aldrich, Taufkirchen Schwefelsäure (H2SO4) Merck, Darmstadt Streptomycin Sigma-Aldrich, Taufkirchen Sucrose Sigma-Aldrich, Taufkirchen SybrGreen I Nucleic Acid Gel Stain Invitrogen, Darmstadt Tetramethylbenzidin (TMB) eBioscience, Frankfurt Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris) Roth, Karlsruhe Trypanblau Lösung 0,4% Sigma-Aldrich, Taufkirchen Tween20 Roth, Karlsruhe Wasserstoffperoxid (H2O2) Merck, Darmstadt eBioscience, Frankfurt

19 Material und Methoden

5.1.3 Kommerzielle Kits

Produkt Bezugsquelle Artus HSV-1/2 TM PCR Kit Qiagen, Hilden CD304 (BDCA-4/Neuropilin-1) Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach MicroBead Kit CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit Invitrogen, Darmstadt Cytofix/Cytoperm BD Biosciences, Heidelberg Fixation/Permeabilization Kit ETI-HSVK-G 1/2 (HSV-1/2 IgG) Diasorin, Dietzenbach FlowCytomix Human Th1/Th2 11plex Kit eBioscience, Frankfurt RTU Human IFN gamma ELISA Ready-SET- eBioscience, Frankfurt Go! Human IL-4 ELISA Ready-SET-Go! eBioscience, Frankfurt Human IL-17A (homodimer) ELISA eBioscience, Frankfurt Ready-SET-Go! IFN-alpha ELISA-Modulset Bender Medsystems, Wien IFN-γ Secretion Assay Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach MagNA Pure LC DNA Isolation Kit – Roche, Mannheim Large Volume QIAamp DNA Blood Mini Kit Qiagen, Hilden QIAquick PCR Purification Kit Qiagen, Hilden RNase-free DNase Roche, Mannheim RNase-free DNase Set Qiagen, Hilden RNeasy Mini Kit Qiagen, Hilden SuperScript II Reverse Transcriptase mit Invitrogen, Darmstadt First-Strand Buffer und DTT Taq DNA Polymerase mit Puffer Invitrogen, Darmstadt TaqMan Universal PCR Master Mix Applied Biosystems, Darmstadt

5.1.4 Antikörper

Antigen Konjugation Klon Bezugsquelle CD1c PE AD5-8E7 Miltenyi Biotec CD2 FITC 6G4 ImmunoTools CD3 FITC, PE HIT3a BD Biosciences CD3 PE/Cy5 UCHT1 AbD Serotec CD3 AlexaFluor 700 UCHT1 BioLegend CD4 FITC, PE, PE/Cy7 SK3 BD Biosciences CD8 FITC HIT8a BD Pharmingen CD8 PE RPA-T8 BD Pharmingen CD8 APC MEM-31 ImmunoTools CD8 APC/H7 SK1 BD Pharmingen CD9 FITC MEM-61 ImmunoTools CD11a FITC MEM-25 ImmunoTools CD11c PE/Cy5 B-ly6 BD Pharmingen CD14 FITC MEM-18 ImmunoTools CD14 PE/Cy5 61D3 AbD Serotec

20 Material und Methoden

CD14 PE/Cy5 TüK 4 ImmunoTools CD16 FITC 3G8 BD Pharmingen CD18 FITC LFA-1/1, 54 ImmunoTools CD19 FITC 4G7 BD Biosciences CD19 PE HIB19 BD Pharmingen CD20 FITC L27 BD Biosciences CD26 -- 22C3 ImmunoTools CD29 FITC MEM-101A ImmunoTools CD31 FITC MEM-05 ImmunoTools CD33 FITC HIM3-4 ImmunoTools CD36 FITC IVC7 ImmunoTools CD37 FITC NMN 46 ImmunoTools CD38 FITC HIT2 ImmunoTools CD40 FITC 5C3 eBiosciences CD43 FITC MEM-59 ImmunoTools CD44 FITC MEM-85 ImmunoTools CD45 FITC HI30 BD Biosciences CD46 FITC MEM-258 ImmunoTools CD47 -- B6H12.2 Dianova CD47 -- 2D3 Dianova CD48 FITC MEM-102 ImmunoTools CD49d FITC BU49 ImmunoTools CD50 FITC MEM-171 ImmunoTools CD53 -- MEM-53 ImmunoTools CD54 FITC 1H4 ImmunoTools CD55 FITC BRIC 110 ImmunoTools CD58 FITC MEM-63 ImmunoTools CD59 FITC MEM-43 ImmunoTools CD62L FITC LT-TD180 ImmunoTools CD63 FITC MEM-259 ImmunoTools CD66acde FITC IH4Fc ImmunoTools CD69 FITC FN50 Miltenyi Biotec CD69 PE TP1.55.3 ImmunoTools CD69 PE FN40 BD Pharmingen CD74 FITC BU45 ImmunoTools CD80 FITC MEM-233 ImmunoTools CD82 FITC 53H5 eBiosciences CD83 FITC HB15e BD Pharmingen CD95 FITC FAS 19 ImmunoTools CD97 FITC MEM-180 ImmunoTools CD99R FITC MEM-131 ImmunoTools CD103 FITC 2G5 ImmunoTools CD123 PE AC145 Miltenyi Biotec CD134 FITC ACT35 eBiosciences CD150 FITC A12 (7D4) eBiosciences CD156b FITC 111633 R&D Systems CD161 PE DX12 BD Pharmingen CD162 -- TB5 ImmunoTools CD170 -- 1A5 Paul Crocker*

21 Material und Methoden

CD180 PE MHR73-11 eBiosciences CD183 FITC 49801 R&D Systems CD184 PE 12G5 BD Pharmingen CD195 FITC 2D7/CCR5 BD Biosciences CD197 FITC 150503 R&D Systems CD229 PE 249936 R&D Systems CD253 PE RIK-2 eBiosciences CD257 --, FITC 1D6 eBiosciences CD262 PE DJR2-4 eBiosciences CD274 PE MIH1 eBiosciences CD277 PE eBioBT3.1 eBiosciences CD303 FITC AC144 Miltenyi Biotec CD304 PE, APC AD5-17F6 Miltenyi Biotec CD305 PE DX26 BD Pharmingen CD319 PE 235614 R&D Systems CD336 PE p44-8.1 BD Pharmingen EEA1 -- polyklonal New England Biolabs HLA-DR FITC HL-39 ImmunoTools MHC-I PE DX17 BD Biosciences TCRγ/δ FITC 11F2 Miltenyi Biotec * Wellcome Trust Biocentre, College of Life Sciences, University of Dundee, Dundee, UK

Sekundär-Antikörper Konjugation Klon Bezugsquelle Goat anti-mouse IgG (H+L) Fab FITC polyklonal Dianova Goat anti-rabbit IgG (H+L) AlexaFluor 633 polyklonal Invitrogen F(ab)2 Rabbit anti-mouse HRP polyklonal Dako

Isotypkontrollen Konjugation Klon Bezugsquelle mouse IgG1 -- polyklonal Invitrogen mouse IgG1 FITC, PE MOPC-21 BD Biosciences mouse IgG1 PE/Cy5 polyklonal AbD Serotec mouse IgG2a FITC 20102.1 R&D Systems mouse IgG2a PE/Cy5 UPC-10 ImmunoTools mouse IgG2a APC PPV-04 ImmunoTools

5.1.5 Geräte

Gerät Hersteller Durchflusszytometer FACScalibur Becton Dickinson, Heidelberg Durchflusszytometer LSR II Becton Dickinson, Heidelberg ETI-Max 3000 Diasorin, Dietzenbach Extraktionsgerät MagNA Pure Roche, Mannheim Fluoreszenzmikroskop Leica DMI6000B Leica Microsystems, Wetzlar Fujifilm LAS-1000 plus gel Fujifilm, Düsseldorf documentation system Inkubator Steri-Cult 200 Labotect, Göttingen

22 Material und Methoden

Inverses Lichtmikroskop Nikon Eclipse Nikon, Dűsseldorf TCS100 Leica SP5 konfokales Laser Scanning Leica Microsystems, Wetzlar Mikroskop Photometer BioTec ELx800 Virion/Serion, Würzburg Photometer Emax precision microplate Molecular Devices, Biberach an der Riss reader Real-time PCR-System 7500 Applied Biosystems, Darmstadt Thermocycler TPersonal Biometra biomedizinische Analytik GmbH, Göttingen Ultrazentrifuge L7-55 mit SW 32 Ti Rotor Beckman Coulter, Krefeld UV-Crosslinker BLX-E254 BIO-LINK Vilber Lourmat, Eberhardzell Zentrifuge Labofuge M Heraeus, Hanau Zentrifuge Mikro 200R Hettich, Tuttlingen Zentrifuge Rotina 38R und 48R Hettich, Tuttlingen

5.1.6 Sonstige Geräte und Materialien

Produkt Bezugsquelle Hand-Homogenisator Sartorius, Göttingen Magneten MiniMACS, MidiMACS Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach Neubauer Zählkammer Marienfeld-Superior, Lauda-Königshofen Primer Biomers.net, Ulm

23 Material und Methoden

5.2 Methoden

5.2.1 Isolation der verwendeten Zellpopulationen

Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMC) wurden aus dem EDTA-Blut gesunder Spender über Ficoll-Gradienten isoliert. Dazu wurde das Blut für 10 Minuten bei 400xg zentrifugiert. Nach Abnahme des Plasmas wurden jeweils 15ml der zellulären Bestandteile mit 20ml RPMI 1640-Medium versetzt und damit 15ml Biocoll-Medium überschichtet. Nach 25 Minuten Zentrifugation bei 440xg ohne Bremse wurde der Lymphozytenring oberhalb der Biocoll-Schicht entnommen und mit 30ml RPMI 1640-Medium bei 440xg für 10 Minuten zentrifugiert. Anschließend wurden die Zellen ein weiteres Mal in 20ml RPMI 1640-Medium bei 440xg für 10 Minuten pelletiert.

Die Aufreinigung von PDC erfolgte durch eine positive Selektion mittels des CD304 MicroBead Kits. Hierzu wurden PBMC mit 20ml MACS-Puffer (PBSo (138mM NaCl;

2,7mM KCl; 6,5mM Na2HPO4; 1,5mM KH2PO4; pH7,3; steril filtriert) versetzt mit 1% FKS und 2mM EDTA) bei 440xg für 10 Minuten zentrifugiert und anschließend in 1,5µl MACS-Puffer, 0,5µl FcR-Blockierungsreagenz und 0,5µl an magnetische Beads gekoppelte anti-CD304 Antikörper pro 1x 106 PBMC aufgenommen. Nach Inkubation für 15 Minuten bei 4°C wurde der Ansatz erneut mit 20ml MACS-Puffer gewaschen und bei 440xg für 10 Minuten zentrifugiert. Nach Resuspension in 1ml MACS-Puffer wurden die Zellen auf eine LS-Separations-Säule aufgetragen. Nach dreimaligem Waschen mit je 3ml MACS-Puffer wurden die Zellen, nach Entfernen des Magneten, zweimal mit je 5ml MACS-Puffer eluiert. Um die Reinheit der PDC-Population zu erhöhen, wurde der Vorgang mit einer MS-Separations-Säule wiederholt. Dazu wurden die Zellen der ersten Separation bei 440xg für 10 Minuten zentrifugiert, in 500µl MACS-Puffer aufgenommen und auf die MS-Säule aufgetragen. Nach dreimaligem Waschen mit je 500µl MACS-Puffer wurden die PDC zweimal mit 2ml MACS-Puffer eluiert, bei 440xg für 10 Minuten zentrifugiert und in 1ml RPMI 1640- Medium resuspendiert. Die Depletion von PDC aus der PBMC-Fraktion erfolgte ebenfalls nach diesem Protokoll, jedoch ohne die Zugabe des FcR- Blockierungsreagenzes.

Zur Bestimmung der Viabilität und der Zellzahl wurden 15µl der Zellsuspension mit Trypanblau versetzt und in eine Neubauer Zählkammer geladen. Um die Zahl der

24 Material und Methoden

PBMC zu quantifizieren, wurden diese zuvor mit Turks-Lösung (3% Essigsäure mit Gentianaviolett) versetzt, um eventuell enthaltene Erythrozyten zu lysieren.

5.2.2 Herstellung von Virusstocks

Zur Stimulation der Zellen wurde ein klinisches HSV-1-Isolat eingesetzt (Kittan et al. 2007). Zur Analyse der Virus-Aufnahme und Replikation in PDC wurde zusätzlich das Isolat 166v verwendet, das freundlicherweise von Gillian Elliott (Department of Virology, Faculty of Medicine, Imperial College London, London, UK) und Peter O’Hare (Marie Curie Research Institute, The Chart, Oxted, Surrey RH8 0TL, UK) zur Verfügung gestellt wurde. Dieses Virus exprimiert ein Fusionsprotein aus VP22 und GFP (engl.: green fluorescent protein). Durch dessen Einlagerung in das virale Tegument werden fluoreszierende Virionen gebildet, die in ihrer Replikationsfähigkeit jedoch nicht beeinträchtigt sind (Elliott und O'Hare 1999).

Die Anzucht der Virusstocks erfolgte durch Infektion von Vero-Zellen, die auf Grund einer homozygoten Deletion der Gene für Interferon (IFN) α und β1 keine Typ1 IFN exprimieren (Diaz et al. 1988), in 175cm2 Zellkultur-Flaschen mit je 20ml DMEM- Medium. Nach 2 Stunden Inkubation mit dem infektiösen Virus bei 37°C wurden die Zellen mit 50ml PBSo gewaschen und mit 50ml frischem DMEM-Medium je Zellkultur-Flasche für 3-4 Tage kultiviert. Das Zellkultur-Material wurde zweimal bei -80°C eingefroren, um alle Zellen aufzuschließen, und durch Zentrifugation bei 1000xg für 15 Minuten von zellulären Bestandteilen getrennt. Zur Analyse der Rezeptorregulation auf PDC wurde dieser Virusüberstand steril filtriert und direkt zur Zellkultur gegeben. Für die Versuche zur Aktivierung von T-Zellen wurde der Virusüberstand weiter aufgereinigt. Hierzu wurden 450ml Zellkulturüberstand zunächst durch Ultrazentrifugation bei 50000xg für 90 Minuten pelletiert, in 5ml frischem RPMI 1640-Medium resuspendiert und homogenisiert. Nach dem Auftragen auf einen Gradierten aus 15-30-prozentiger Sucrose-Lösung (VSB-Puffer; 15% bzw. 30% Sucrose; 0,1% BSA; steril filtriert) und Ultrazentrifugation bei 50000xg für 30 Minuten wurde der sichtbare Virusring entnommen. Anschließend wurde der Virusstock mit VSB-Puffer (50mM Tris; 12mM KCl; 5mM EDTA; pH7,8; steril filtriert) verdünnt und erneut durch Ultrazentrifugation bei 80000xg für 90 Minuten pelletiert. Die isolierten Viruspartikel wurden in RPMI 1640-Medium aufgenommen, steril filtriert und bei -80°C gelagert.

25 Material und Methoden

Die Infektiosität, also die Konzentration der infektiösen viralen Partikel der Stocks, wurde durch Bestimmung der TCID50 ermittelt. Dabei wurde die Verdünnung bestimmt, welche eine Vero-Zellkultur mit einer Wahrscheinlichkeit von 50 Prozent infiziert. In 96 Well Zellkultur-Platten wurden Vero-Zellen mit 75µl DMEM-Medium pro Well ausgesät und die 8 Ansätze der ersten Reihe (Reihe 0) mit 25µl des vorverdünnten HSV-Stocks infiziert. Durch das Überführen von jeweils 25µl in die anschließende Reihe wurde die Viruskonzentration schrittweise 1:4 weiter verdünnt. Nach 4 Tagen Inkubation bei 37°C wurden die Wells mit dem HSV-typischen zytopathischen Effekt (CPE) identifiziert. Zur Berechnung der TCID50 wurde in jedem Experiment die Grenze bestimmt, bei der 50% der Wells infiziert waren, und der Prozentsatz der infizierten Ansätze von der kleinsten Verdünnung bis oberhalb bzw. unterhalb dieser Grenze errechnet. Hierzu wurden von der höchsten HSV- Konzentration (Reihe 0) ausgehend alle Wells ohne CPE als 2 gezählt und addiert. Analog wurden alle Ansätze mit CPE ausgehend von der kleinsten HSV- Konzentration (Reihe 11) ebenfalls mit 2 gewertet.

(A / (A + B)) x 100 = C

(D / (D + E)) x 100 = F

A: Summe aller infizierten Wells bis einschließlich der Reihe oberhalb der 50%-Grenze B: Summe aller nicht infizierten Wells bis einschließlich der Reihe oberhalb der 50%-Grenze C: Prozentsatz aller infizierten Wells über der 50%-Grenze D: Summe aller infizierten Wells bis einschließlich der Reihe unterhalb der 50%-Grenze E: Summe aller nicht-infizierten Wells bis einschließlich der Reihe unterhalb der 50%-Grenze F: Prozentsatz aller infizierten Wells unter der 50%-Grenze

(C – 50%) / (C – F) = P

P: Proportionale Distanz

VR+P = G

V: Verwendete Verdünnungsstufen R: Die Reihe nach der 50%-Grenze (Reihe 0 nicht mitgerechnet) G: TCID50 der verwendeten Ausgangskonzentration bei dem eingesetzten Volumen (25µl)

G x H x 40 = TCID50 / ml

H: Faktor für die Vorverdünnung des Virusstocks

Die Infektiosität des Virusstocks ergab sich aus dem Mittelwert von 9 Einzelbestimmungen, wobei ausgehend von drei verschiedenen Vorverdünnungen

26 Material und Methoden des HSV-Stocks (1:100, 1:1000 und 1:10000) jeweils drei unabhängige Bestimmungen durchgeführt wurden.

Die Viruspräparationen wurden in ihrer infektiösen Form (HSVINF), oder nach Bestrahlung mit UV-Licht der Wellenlänge 254nm als inaktivierte Stocks eingesetzt

(HSVUV). Dabei wurden für die Analyse der Expression von PDC- Oberflächenrezeptoren 0,12J/cm2 und für Versuche zur Aktivierung von T-Zellen 0,6J/cm2 appliziert.

5.2.3 Kultivierung und Stimulation der Zellen

Vero-Zellen wurden in DMEM-Medium mit 10% FKS, 50mg/ml Glutamin, 200U/ml Penicillin und 90U/ml Streptomycin kultiviert. Humane Blutzellen wurden in RPMI 1640-Medium mit 10% FKS, 50mg/ml Glutamin, 200U/ml Penicillin und 90U/ml Streptomycin kultiviert. Bei der Kultivierung von PDC wurde dem Medium, soweit nicht anders beschrieben, Interleukin-3 (IL-3) in einer Konzentration von 20ng/ml zugesetzt. In den Experimenten zur Proliferation von T-Zellen wurde das FKS durch humanes AB-Serum (5%) ersetzt. Zur Stimulation von Zellen mit HSV-1 wurde, 6 soweit nicht anders angegeben, eine Konzentration von 1x 10 TCID50/ml oder ein äquivalentes Volumen des UV-inaktivierten HSV-1-Stocks eingesetzt.

5.2.4 Nukleinsäureextraktion

Zur Isolation von DNA aus PBMC wurde der QIAamp DNA Blood Mini Kit verwendet und die Puffer AW1 und AW2 mit Ethanol 99,8% verdünnt. 1x 107 PBMC in 200µl PBSo wurden mit 20µl Protease versetzt und durch Zugabe von 200µl AL-Puffer durch Vortexen und Inkubation für 10 Minuten bei 56°C lysiert. Die Proben wurden mit 200µl 99,8% Ethanol gemischt, auf QIAamp-Säulen aufgetragen und bei 8000xg für 1 Minute zentrifugiert. Anschließend wurde nach Zugabe von 500µl AW1-Puffer bei 8000xg für 1 Minute und nach Zugabe von 500µl AW2-Puffer bei 18500xg für 3 Minuten zentrifugiert. Zum Eluieren der gewaschenen DNA wurden die Säulen 1 Minute mit 50µl AE-Puffer inkubiert und bei 8000xg für 1 Minute zentrifugiert. Die Konzentration der isolierten DNA wurde photometrisch bei 260nm bestimmt.

Für den Nachweis von HSV-DNA in PDC oder Vero-Zellen wurde die DNA unter Verwendung des MagNA Pure LC DNA Isolation Kit – Large Volume automatisiert isoliert. Um die Extraktion und die anschließende Real-time PCR zu überprüfen, wurde jeweils eine HSV-positive Kontrolle mitgeführt. Die Elution erfolgte in 100µl

27 Material und Methoden

Elutionspuffer. Die Analyse wurde von der Sektion für Diagnostik des Virologischen Instituts, Klinische und Molekulare Virologie in Erlangen durchgeführt.

Die Extraktion von RNA erfolgte mittels des RNeasy Mini Kits. Hierzu wurde der RLT- Puffer mit dem vierfachen Volumen an Ethanol 99,8% verdünnt und mit 10µl/ml β- Mercaptoethanol versetzt. Die Zellen wurden in 350µl RLT-Puffer lysiert, auf QIAshredder-Säulen aufgetragen und für 2 Minuten bei 18500xg zentrifugiert. Nach Zugabe von 350μl 70% Ethanol wurde das Lysat auf RNeasy-Säulen überführt, für 15 Sekunden bei 18500xg zentrifugiert und einmal mit 350µl RW1-Puffer durch Zentrifugation bei 18500xg für 15 Sekunden gewaschen. Für den DNAse-Verdau wurde die Probe mit 10μl RNase-freier DNase I und 70μl RDD-Puffer (Qiagen) für 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die zelluläre RNA wurde mit 350µl RW1- Puffer für 15 Sekunden, mit 500µl RPE-Puffer für 15 Sekunden und mit 500µl RPE- Puffer für 2 Minuten bei jeweils 18500xg gewaschen und in 50µl DNase-freiem Wasser durch Zentrifugation bei 18500xg für 1 Minute eluiert. Ein zweiter DNase- Verdau mit 6µl RNase-freier DNase I (Roche) wurde bei 37°C für 20 Minuten durchgeführt und das Enzym anschließend bei 75°C für 8 Minuten inaktiviert.

5.2.5 Nukleinsäureanalysen

Zur Chipanalyse wurde jeweils die Hälfte der isolierten PDC eines Spenders für 6

Stunden mit IL-3 oder IL-3 und HSVUV kultiviert. Nach dem Ernten der Zellen und Zentrifugation bei 380xg für 10 Minuten wurden die Zellkulturüberstände asserviert. Stimulierte bzw. unstimulierte Zellen von 6 verschiedenen Spendern wurden vereinigt und die RNA isoliert. Die RNA-Proben wurden an das Kompetenzzentrum für fluoreszente Bioanalytik (KfB) in Regensburg weitergeleitet. Dort wurde die Qualität und Quantität der isolierten RNA chromatographisch mit dem 2100 Bio-Analyzer (Agilent Technologies, Waldbronn) überprüft und anschließend mit oligo-dT-Primern in cDNA umgeschrieben. Nach der Fluoreszenzmarkierung wurden die Proben auf einem Human Genome U133 Plus 2.0 Array (Affymetrix, Santa Clara, USA) hybridisiert. Das Auslesen der Daten und eine erste Auswertung erfolgte ebenfalls durch das KfB. Die Durchführung und Analyse dieses Experimentes wurde bereits in der Diplomarbeit mit dem Titel „Charakterisierung von Oberflächenrezeptoren Plasmazytoider Dendritischer Zellen in der nativen Immunabwehr gegen Viren“ von Philipp Schuster beschrieben (Schuster 2007).

28 Material und Methoden

Die Transkripte der Rezeptoren CD63, CD74, CD180 und CD257 wurden in PDC nach Kultivierung mit IL-3 oder IL-3 und HSVUV für 6 Stunden zusätzlich durch Real- time PCR quantifiziert. Hierzu wurde die vereinigte RNA aus PDC von 4 Spendern eingesetzt. Zur reversen Transkription wurde die isolierte RNA durch Zugabe von Ammoniumacetat (1/3 des Volumens der gelösten RNA) und Ethanol 99,8% (das 2,5-fache des Gesamtvolumens) bei -80°C über Nacht gefällt. Anschließend wurde die RNA bei 18500xg und 4°C für 30 Minuten zentrifugiert, mit 100µl Ethanol 70% überschichtet und erneut für 10 Minuten bei 18500xg zentrifugiert. Die pelletierte RNA wurde für 10 Minuten getrocknet und in 40µl 1x First-Strand Puffer mit 1mM DTT, 0,5mM dNTP-Mix und 2µg Random Primer bei 65°C für 5 Minuten inkubiert. 19µl dieser Lösung wurden mit 1µl SuperScript II Reverse Transkriptase versetzt und für 10 Minuten bei 25°C, 50 Minuten bei 42°C und 15 Minuten bei 70°C revers transkribiert. Weitere 19µl wurden ohne Reverse Transkriptase parallel als Negativkontrolle mitgeführt. Die Menge einzelner Kopien in der cDNA wurde durch Real-time PCR quantifiziert. Alle Proben wurden 30-fach verdünnt und mit 10µl Probenvolumen je Ansatz eingesetzt. Jeder Reaktionsansatz enthielt in 50µl 0,5x TaqMan Universal PCR Master Mix, 0,1x SybrGreen I Nucleic Acid Gel Stain und je 100nM der entsprechenden Primer. Die Initiation der Reaktion erfolgte bei 50°C für 2 Minuten und bei 95°C für 10 Minuten. Zur Amplifikation wurden 45 Zyklen mit 95°C für 15 Sekunden und 60°C für 1 Minute durchgeführt. Am Ende der Analyse wurde eine Dissoziationskurve für einen Temperaturbereich von 60°C bis 95°C ermittelt. Alle Proben wurden im Triplikat gemessen. Die verwendeten Primer sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die Regulation der Transkription wurde nach Normalisieren der Proben auf das stabil exprimierte Haushaltsgen β-Glucuronidase (GUS) bestimmt.

Um cDNA-Kopien absolut zu quantifizieren, wurden die entsprechenden DNA- Abschnitte, inklusive der flankierenden Sequenzen, aller untersuchten Genprodukte durch eine konventionelle PCR amplifiziert und als Standard-Verdünnungsreihen in den Real-time PCR Experimenten mitgeführt. Zur Herstellung der Standards wurde jeweils DNA von 1x 105 PBMC in 50µl 1x Taq-Puffer, 0,2mM dNTP-Mix, 0,2µl Taq- Polymerase und jeweils 50ng der entsprechenden Primer eingesetzt. Die Amplifikation erfolgte nach 2 Minuten Denaturierung bei 95°C in 40 Zyklen bei 95°C für 30 Sekunden, 55°C für 30 Sekunden und 72°C für 1 Minute. Durch Extension bei 72°C für 5 Minuten wurde die PCR abgeschlossen. Die verwendeten Primer sind in Tabelle 1 aufgeführt. Die Amplifikate wurden durch Gelelektrophorese überprüft und

29 Material und Methoden mittels des QIAquick PCR Purification Kits aufgereinigt. Dabei wurden die Proben mit dem fünffachen Volumen des PB-Puffers gemischt auf QIAquick-Säulen aufgetragen und für 1 Minute bei 16000xg zentrifugiert. Nach einmaliger Zugabe von 750µl PE- Puffer wurde zweimal bei 16000xg für jeweils 1 Minute zentrifugiert, das Amplifikat mit 50µl EB-Puffer für 1 Minute inkubiert und durch Zentrifugation bei 16000xg für 30 Sekunden eluiert. Die Konzentration der isolierten DNA wurde photometrisch bei 260nm bestimmt und daraus die Zahl der enthaltenen Kopien/µl errechnet.

1mol = 6x 1023 Moleküle = L x 660g

L: Länge des Amplifikates in bp

Durch Verdünnung wurde eine Standardreihe von 109 bis 100 Molekülen/Reaktion hergestellt.

Tabelle 1: Eingesetzte PCR-Primer. Aufgelistet sind die Primer zur Generierung der Standard-Verdünnungsreihen und für die Real-time PCR zur Quantifizierung der Transkripte von CD63, CD74, CD180, CD257 und β-Glucuronidase (GUS). Zusätzlich angegeben sind die linearen Messbereiche in Kopien/Reaktionsansatz und die Referenz-Sequenzen der Gene mittels derer die Primer ausgewählt wurden.

Primer zur Standard- Linearer Referenz- Gen Primer für Real-time PCR Herstellung Bereich Sequenz 5‘-gcagtgggactgattgccg-3‘ 5‘-gggctacccctggctctct-3‘ CD63 101 – 108 AK311893 5‘-gatcataagacaatagttctcc-3‘ 5‘-ccacaaaagccaccaggaa-3‘ 5‘-ggagccctgtacacaggc-3‘ 5‘-aggccaccaccgcctact-3‘ CD74 102 – 108 BC018726 5‘-cgttgggaagcttcatgcg-3‘ 5‘-gttctgggaggtgactgtcagtt-3‘ 5‘-gccagattaactggatacatg-3‘ 5‘-ggcagaaacatcgcttaatgg-3‘ CD180 102 – 108 NM_005582 5‘-agtactttcagattccgtgc-3‘ 5‘-gattggatattcccgtttggatt-3‘ 5‘-ccagcaaacctactgtacag-3‘ 5‘-gccaagccctgccatgta-3‘ CD257 101 – 108 NM_006573 5‘-tccctttctgtggagtcatc-3‘ 5‘-accacagggaatggatcatttc-3‘ 5’-ggctggtgaattaccagatc-3’ 5’-ctgtcaagggcagtaacctgttc-3’ GUS 101 – 107 M15182 5’-caatgaatacagataggcagg-3’ 5’-cgccacgactttgttttctg-3’

Die Replikationskapazität von HSV in PDC und Vero-Zellen wurde im Zeitverlauf in jeweils zwei unabhängigen Experimenten durch Real-time PCR analysiert. Die Zellen 6 wurden bei einer Dichte von 0,2x 10 Zellen/ml mit HSVUV oder HSVINF (MOI 1; engl.: multiplicity of infection) für 2 Stunden infiziert, anschließend mit PBSo gewaschen und für 10 Minuten mit Trypsin (140mM NaCl; 5mM KCl; 0,65mM Na2HPO4; 5mM Glucose; 25mM Tris; 0,01% EDTA; 0,25% Trypsin; 0,1% Phenolrotlösung; pH7,5; steril filtriert) behandelt. Nach zweimaligem Zentrifugieren mit jeweils 10ml Medium

30 Material und Methoden bei 400xg für 10 Minuten wurden die Zellen mit einer Dichte von 0,2x 106 Zellen/ml ausgesät und bei 37°C kultiviert. Nach 1 Stunde, sowie nach 1, 2, 3, 4 und 5 Tagen in Kultur wurde jeweils ein Ansatz geerntet. Hierfür wurden die Zellkulturüberstände bei 850xg für 10 Minuten zentrifugiert und von zellulären Bestandteilen getrennt. Adhärente Zellen und die zellulären Bestandteile aus den Überständen wurden mit PBSo gewaschen, für 10 Minuten mit Trypsin behandelt, jeweils in 1ml Medium bei 850xg für 10 Minuten zentrifugiert und in 250µl Medium vereinigt. Nach der Isolation der DNA erfolgte die Detektion von HSV-Genomen unter Verwendung des Artus HSV-1/2 TM PCR Kits durch die Sektion für Diagnostik des Virologischen Instituts, Klinische und Molekulare Virologie in Erlangen. Hierzu wurden pro Ansatz 20µl des Master Mixes mit 10µl Mg-Lösung und 2µl der internen Kontrolle versetzt und davon jeweils 30µl zusammen mit 20µl Proben DNA eingesetzt. Die Amplifikation erfolgte nach einer Denaturierung bei 95°C für 10 Minuten in 45 Zyklen bei 95°C für 15 Sekunden und 55°C für 1 Minute.

5.2.6 ELISA

Die Konzentration von IFNα2a/-α2b in den Zellkulturüberständen wurde mit einem IFN-alpha ELISA-Modulset bestimmt. Hierfür wurden die Wells einer ELISA-Platte mit je 100µl einer mit ELISA PBS (138mM NaCl; 2,7mM KCl; 7,9mM Na2HPO4; 1,5mM

KH2PO4) hergestellten 1:10 Verdünnung des Fangantikörpers pro Well befüllt und bei 4°C inkubiert. Am nächsten Tag wurde mit 250μl Wasch-Puffer (PBSo; 0,05% Tween20) gewaschen und mit 250μl Proben-Puffer (ELISA PBS; 0,5% BSA; 0,05% Tween20) über Nacht blockiert, um unspezifische Proteinbindungen zu reduzieren. Anschließend wurde die Platte zweimal mit je 250µl Wasch-Puffer pro Well gewaschen und zu einem Volumen von 180μl Proben-Puffer jeweils 20µl der zu testenden Probe und 50μl des 1:1000 in Proben-Puffer verdünnten HRP-Konjugates pipettiert. Nach Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur und dreimaligem Waschen mit 250µl Wasch-Puffer je Well wurden jeweils 100μl der frisch angesetzten Substrat-Lösung aus Tetramethylbenzidin und H2O2 (1:1) zugegeben. Der Farbumschlag wurde nach Inkubation für ca. 15 Minuten bei Raumtemperatur durch 100μl 4N Schwefelsäure pro Well gestoppt und die Extinktion photometrisch bestimmt. Der IFNα-Gehalt der Proben wurde anhand einer Standard- Verdünnungsreihe aus der Differenz der optischen Dichte bei 450nm und 630nm bestimmt. Die Standard-Verdünnungsreihe (500 bis 8pg/ml) und Negativkontrollen

31 Material und Methoden wurden im Duplikat mitgeführt. Bei Werten außerhalb des linearen Messbereichs wurden die Proben entsprechend konzentrierter oder stärker verdünnt eingesetzt.

Zur Analyse der Konzentration von IFNγ, IL-4 und IL-17A in Zellkulturüberständen wurden ELISA-Sets der Firma eBioscience verwendet. Das Beschichten der ELISA- Platten erfolgte durch Zugabe von 100µl des mit Beschichtungs-Puffer verdünnten Fangantikörpers (1:260) pro Well und Inkubation bei 4°C über Nacht. Nach fünfmaligem Waschen mit je 250µl Wasch-Puffer (PBSo; 0,05% Tween20) wurde mit 200µl Proben-Puffer für 1 Stunde bei Raumtemperatur blockiert und anschließend erneut fünfmal gewaschen. Jeweils 100µl der zu untersuchenden Proben, der Standard-Verdünnungsreihe, sowie der Negativkontrollen wurden eingesetzt und bei 4°C über Nacht inkubiert. Die Detektion gebundener Zytokine erfolgte bei Raumtemperatur in drei Schritten. Zunächst wurden die Ansätze mit 100µl des 1:260 in Proben-Puffer verdünnten Detektionsantikörpers für 1 Stunde und danach mit 100µl des 1:260 in Proben-Puffer verdünntem Avidin-HRP für weitere 30 Minuten inkubiert. Schließlich wurden 100µl der Substratlösung je Well eingesetzt, dessen Umsetzung innerhalb von 15 Minuten erfolgte. Vor jedem dieser Schritte wurde fünf- bis siebenmal mit 250µl Wasch-Puffer je Well gewaschen. Nach dem Abstoppen der Reaktion durch 50µl 4N Schwefelsäure wurde die Differenz der optischen Dichte bei 450 und 570nm photometrisch ermittelt. Die Standard-Verdünnungsreihen der ELISAs deckten Konzentrationen von 500 bis 8pg/ml für IFNγ und IL-17, sowie von 200 bis 3pg/ml für IL-4 ab. Alle Proben wurden vor der Messung entsprechend verdünnt, um innerhalb dieses Bereiches zu liegen.

Bei 34 Spendern wurde der HSV-Serostatus bestimmt. Der Nachweis von anti-HSV Antikörpern erfolgte in Blutplasma durch ELISA mittels des ETI-HSVK-G 1/2 (HSV- 1/2 IgG). Die Analyse wurde in der Sektion für Diagnostik des Virologischen Instituts, Klinische und Molekulare Virologie in Erlangen automatisiert am ETI-Max 3000 durchgeführt.

5.2.7 CD257-Westernblot

Die Sekretion von CD275 (BLyS, BAFF) aus PDC wurde mittels Westernblotanalyse untersucht. Hierzu wurden isolierte PDC für 6 oder 40 Stunden mit IL-3 oder IL-3 und

HSVUV kultiviert. Jeweils 40µl der Zellkulturüberstände wurden mit 4µl des 10x Proben-Puffers (312,5mM Tris pH6,8; 50% Glycerin; 25% β-ME; 10% SDS; 25mM EDTA; 0,03% BPB) versetzt und bei 95°C für 10 Minuten denaturiert. 40µl aller

32 Material und Methoden

Proben, sowie 5µl des Proteinstandards wurden auf ein Polyacrylamidgel aufgetragen (Sammelgel 5%: 16% Rotiphorese Gel A Lösung; 6,4% Rotiphorese Gel B Lösung; 116,5mM Tris pH6,8; 0,1% SDS; 0,1% APS; 0,1% TEMED. Trenngel 10%: 36,3% Rotiphorese Gel A Lösung; 13% Rotiphorese Gel B Lösung; 375 mM Tris pH8,8; 0,1% SDS; 0,1% APS; 0,04% TEMED). Die Auftrennung der Proteine erfolgte bei 140V und 30mA für 60 Minuten unter Verwendung von Lauf-Puffer (25mM Tris; 250mM Glycin; 0,1% SDS). Das Gel wurde auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF)- Membran transferiert, die zuvor mit Methanol 99,8% befeuchtet und dann für 10 Minuten in Transfer-Puffer (50mM Tris; 40mM Glycin; 20% Methanol) inkubiert wurde. Das Übertragen der Proteine auf die Membran erfolgte unter Verwendung von Whatmann Papier, das mit Transfer-Puffer getränkt wurde, in einer Semi-dry Kammer bei 15V und 80mA für 90 Minuten. Nach dreimaligem Waschen mit Wasch- Puffer (PBSo; 0,05% Tween20) für jeweils 10 Minuten wurde die Membran für 60 Minuten bei Raumtemperatur in Blockierungs-Puffer (PBSo; 5% Milchpulver; 0,4% Tween20) inkubiert. Die Färbung erfolgte in 5ml Blockierungs-Puffer mit anti-CD257 Antikörper (1µg/ml) über Nacht bei 4°C. Im Anschluss wurde die Membran einmal mit Blockierungs-Puffer und zweimal mit Wasch-Puffer für jeweils 10 Minuten gewaschen und mit 13µg des HRP-konjugierten Kaninchen anti-Maus Sekundär-Antikörpers in 10ml Färbe-Puffer (PBSo; 1,5% BSA; 0,4% Tween20) für 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dreimaligem Waschen der Membran mit Wasch- Puffer für jeweils 10 Minuten wurde der Blot durch Zugabe von 5ml ECL-Lösung A

(0,1M Tris pH8,6; 1,25mM Luminol; 0,01% H2O2) und 50µl ECL-Lösung B (6,7mM Para-Hydroxycumarsäure in DMSO) entwickelt und mit dem Fujifilm LAS-1000 plus gel documentation system analysiert.

5.2.8 Fluoreszenz-Mikroskopie

Die Aufnahme von HSV in PDC wurde mit Hilfe der konfokalen Fluoreszenz- Mikroskopie untersucht. Hierzu wurden PDC mit dem autofluoreszierenden HSV- Stamm 166v (MOI 1) für 60 Minuten auf Eis gehalten, um eine Anlagerung der Viren an die Zelloberfläche zu ermöglichen und anschließend bei 37°C inkubiert. Nach Kultivierung für 0, 15, 30 oder 90 Minuten wurden die Zellen geerntet, mit kaltem PBSo gewaschen und bei 380xg für 10 Minuten zentrifugiert. Die Zellen wurden in 20µl PBSo aufgenommen, auf Objektträger transferiert und 1 Stunde mit PFA 4% fixiert. Nach dreimaligem Waschen in Wasch-Puffer (PBSo; 0,05% Tween20) für jeweils 10 Minuten wurden die Zellen durch Zugabe von 50µl Permeabilisierungs- 33 Material und Methoden

Puffer (PBSo; 0,3% Saponin; 1% BSA) je Ansatz für 30 Minuten permeabilisiert und blockiert. Die Färbung der Zellen erfolgte jeweils in 50µl Permeabilisierungs-Puffer. Im ersten Schritt wurde mit einem 1:100 verdünnten Kaninchen anti-EEA1 Antikörper über Nacht bei 4°C inkubiert, zur Detektion wurde ein 1:1000 verdünntes AlexaFluor 633-konjugiertes Ziege anti-Kaninchen F(ab‘)2 Fragment zugegeben. Die Bindung an den Erstantikörper erfolgte bei Raumtemperatur für 60 Minuten. Anschließend wurden die Zellkerne mit DAPI (300nM) für 5 Minuten gefärbt. Nach jedem Schritt wurden die Objektträger dreimal für jeweils 10 Minuten in Wasch-Puffer gewaschen. Die Objektträger wurden mit Fluoprep eingedeckt und am konfokalen Laser Scanning Mikroskop analysiert.

Zur Analyse der Replikationskapazität von HSV wurden PDC und Vero-Zellen mit einer Dichte von 0,2x 106 Zellen/ml in 48 Well Zellkultur-Platten über Nacht kultiviert und am nächsten Tag mit HSV 166v (MOI 7) infiziert. Nach 2 Stunden Inkubation bei 37°C wurden die Zellen mit PBSo gewaschen und für 10 Minuten mit Trypsin behandelt, um anhaftende Viren zu entfernen. Anschließend wurden die Zellen in 10ml Medium bei 440xg zentrifugiert und jeweils 1x 105 Zellen ausgesät. Die Replikation von HSV wurde durch die Expression des an GFP fusionierten VP22 nach Kultivierung für 1 und 6 Stunden, sowie nach 1, 2, 3 und 6 Tagen am Fluoreszenzmikroskop DMI6000B bestimmt.

5.2.9 Durchflusszytometrie

Für die Analyse der Expression von Oberflächenrezeptoren auf PDC vor der Kultivierung wurden frisch isolierte PBMC in 1ml FACS-Puffer (PBSo; 1% FKS; 1mM EDTA) für 10 Minuten bei 380xg zentrifugiert und in 100µl FACS-Puffer mit 0,5µl FcR-Blockierungsreagenz pro 1x 106 Zellen aufgenommen. Nach Inkubation bei 4°C für 10 Minuten wurde die Zellzahl auf 20x 106 PBMC/ml eingestellt. Die Färbung erfolgte mit jeweils 4µl der entsprechenden Antikörper in 50µl FACS-Puffer mit 1x 106 Zellen bei 4°C für 20 Minuten. Anti-CD170, Anti-CD184 und Anti-CD195 wurden mit 10µl eingesetzt. Die Proben wurden mit jeweils 3ml FACS-Puffer bei 550xg für 10 Minuten zentrifugiert und mit 200µl PFA 4% fixiert. PDC wurden als CD14-, CD11c- negative Zellen und je nach Konjugation des zu untersuchenden Antikörpers als CD303-FITC- oder CD304-PE-positive Zellen identifiziert. Jeweils eine Einzelmessung zur Expression der Rezeptoren auf frisch isolierten PDC erfolgte im Rahmen der Diplomarbeit von Philipp Schuster (Schuster 2007).

34 Material und Methoden

Um die Regulation von Oberflächenrezeptoren auf PDC zu untersuchen, wurden aufgereinigte PDC für 40 Stunden in Anwesenheit von IL-3, IL-3 und HSVUV, IL-3 und

HSVINF, oder HSVUV alleine kultiviert. Zur Analyse der Regulationskinetik wurden

PDC für 1, 2 oder 3 Tage mit IL-3 und HSVUV stimuliert. Nach dem Ernten wurden die Zellen bei 850xg für 10 Minuten zentrifugiert und die Überstände bei -20°C asserviert. Die Zellen wurden in 1ml FACS-Puffer resuspendiert, erneut bei 850xg für 10 Minuten zentrifugiert und in 100µl FACS-Puffer mit 20µl FcR-Blockierungsreagenz aufgenommen. Nach Inkubation für 10 Minuten bei 4°C wurden die Zellen auf 0,3x 106 PDC/ml eingestellt und jeweils 50µl zur Färbung für 20 Minuten bei 4°C inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit 3ml FACS-Puffer bei 550xg zentrifugiert und mit 200µl PFA 4% fixiert. Der Nachweis von PDC erfolgte nach dem Ausschluss von CD14- und CD11c-positiven Zellen je nach Konjugation des zu untersuchenden Antikörpers als CD304-PE- oder HLA-DR-FITC-positive Zellen. Anti-CD274 wurde mit 3µl, anti-CD184 und anti-CD195 mit 5µl, alle anderen Antikörper mit 1,5µl eingesetzt. Einzelne Messungen der Rezeptorexpression nach Stimulation von PDC für 40 Stunden mit IL-3 oder IL-3 und HSVUV wurden im Rahmen der Diplomarbeit von Philipp Schuster durchgeführt (Schuster 2007).

Die Expression und Regulation von CD26, CD47, CD53, CD162 und CD170 wurde unter Verwendung unkonjugierter Antikörper untersucht. In diesen Fällen erfolgte die Färbung in drei Schritten: Zunächst wurden die Zellen nach der Blockierung der Fc- Rezeptoren mit den unkonjugierten Antikörpern bei 4°C für 20 Minuten inkubiert und anschließend mit 3ml FACS-Puffer für Sekundär-Antikörper (PBSo; 1% Ziegenserum; 1mM EDTA) bei 1000xg für 10 Minuten zentrifugiert. Zur Färbung von PBMC wurden die Antikörper mit 16µg/ml, zur Färbung von PDC mit 6µg/ml in 50µl FACS-Puffer eingesetzt. Anti-CD170 wurde als Zellkulturüberstand mit 10µl bzw. 5µl verwendet. Im zweiten Schritt wurden die Zellen in 50µl FACS-Puffer für Sekundär- Antikörper mit einem FITC-konjugierten Ziege anti-Maus IgG Fab versetzt (32µg/ml) und für 20 Minuten bei 4°C inkubiert. Im dritten Schritt wurden die Zellen nach erneutem Waschen mit 3ml FACS-Puffer für Sekundär-Antikörper bei 440xg für 10 Minuten mit den direkt-konjugierten Antikörpern CD304, CD14 und CD11c zur Identifizierung von PDC gefärbt.

Die intrazelluläre Expression und Regulation von CD63, CD74, CD180 und CD257 wurde in drei unabhängigen Experimenten unter Verwendung des Cytofix/Cytoperm

35 Material und Methoden

Fixation/Permeabilization Kits analysiert. Hierzu wurden frisch isolierte PBMC und

PDC nach Kultivierung für 40 Stunden mit IL-3 oder IL-3 und HSVUV eingesetzt. Im Anschluss an die extrazelluläre Färbung von jeweils 1x 106 PBMC oder 4,5x 104 PDC wurden die Zellen zweimal mit 1ml FACS-Puffer bei 590xg für 10 Minuten zentrifugiert und mit 250µl Fixation/Permeabilization solution für 20 Minuten bei 4°C permeabilisiert. Nach zweimaligem Waschen mit je 1ml BD Perm/Wash buffer bei 590xg und 4°C für 10 Minuten wurden die Zellen in 50µl BD Perm/Wash buffer aufgenommen und intrazelluläre, unspezifische Bindestellen durch die Zugabe eines unkonjugierten Maus IgG Isotyp-Antikörpers für 15 Minuten bei 4°C blockiert. Hierbei wurden 0,5µg in Ansätzen mit PBMC und 0,3µg in Ansätzen mit PDC eingesetzt. Die intrazelluläre Färbung erfolgte bei 4°C für 30 Minuten. PBMC wurden mit 4µl, PDC mit 2µl aller Antikörper inkubiert. Im letzten Schritt wurden die Zellen zweimal mit 1ml BD Perm/Wash buffer bei 590xg und 4°C für 10 Minuten zentrifugiert und in 200µl PFA 4% aufgenommen.

Zur Identifikation IFNγ-sezernierender Zellen wurde der IFN-γ Secretion Assay eingesetzt. Bei dieser Methode wurden 1x 106 Zellen nach 20 Stunden Kultivierung, Stimulation mit infektiösem HSV-1 (MOI 0,5) oder einem äquivalenten Volumen des UV-inaktivierten Stocks auf Eis gestellt, geerntet und bei 400xg und 4°C für 10 Minuten zentrifugiert. Im Anschluss an einen Waschschritt mit 1ml Wasch-Puffer (PBSo; 0,5% BSA; 2mM EDTA; steril filtriert) und erneuter Zentrifugation wurden die Zellen in 90µl RPMI 1640-Medium mit 10µl des Fangreagenzes für 7 Minuten auf Eis inkubiert. Das Fangreagenz enthält Konjugate aus Antikörpern gegen CD45 und Antikörpern gegen IFNγ. Diese Konjugate binden also an die Oberfläche aller Zellen der eingesetzten Suspension und können zusätzlich IFNγ binden. Im nächsten Schritt wurden die Proben nach Zugabe von 900µl warmem RPMI 1640-Medium für 45 Minuten bei 37°C inkubiert. Das während dieser Phase von einer Zelle produzierte IFNγ bindet direkt an das Fangreagenz auf der Zelloberfläche. Um falsch-positive Färbungen zu vermeiden, wurden die Zellen durch regelmäßiges Invertieren der Reaktionsgefäße in Suspension gehalten. Im Anschluss wurde die IFNγ-Freisetzung der Proben auf Eis gestoppt und die Zellen nach Zugabe von 900µl Wasch-Puffer bei 440xg und 4°C für 10 Minuten zentrifugiert. Die so vorbehandelten Proben wurden jeweils in 100µl FACS-Puffer mit 5µl FcR-Blockierungsreagenz für 10 Minuten auf 4°C gestellt. Zur Identifikation IFNγ-sezernierender Zellen wurde eine Färbung mit 10µl des Fluoreszenz-konjugierten IFNγ-Detektionsantikörpers und Anti-

36 Material und Methoden

CD3-AlexaFluor700 (1µl), Anti-CD4-PE/Cy7 (2µl), Anti-CD8-APC/H7 (2µl) sowie Anti- γδTCR-FITC (5µl) wie beschrieben durchgeführt. Zusätzlich wurde zum Ausschluss von Monozyten und toten Zellen Anti-CD14-PE/Cy5 (2µl) respektive aktiviertes PacificBlue (0,5µg in DMSO) verwendet, und die Expression des Aktivierungsmarkers CD69 (5µl) bestimmt.

Der Anteil HSV-infizierter Monozyten innerhalb der PBMC wurde nach 20 Stunden Inkubation mit HSV 166v (MOI 0,5) ermittelt. Hierbei wurden Monozyten als CD14- positive, CD3-negative Zellen identifiziert und das Ausmaß der Infektion durch die Expression von GFP bestimmt.

Das Zytokinprofil in Zellkulturüberständen wurde mittels des Human Th1/Th2 11plex RTU FlowCytomix Kits analysiert. Hierzu wurden jeweils 1x 106 PBMC von 7 seropositiven und 6 seronegativen Spendern für 20 Stunden mit oder ohne HSV kultiviert. Nach dem Abnehmen der Überstände wurden diese bei 850xg für 10 Minuten zentrifugiert, um zelluläre Bestandteile zu entfernen, und bis zur weiteren Analyse bei -20°C gelagert. Jeweils 25µl der Überstände wurde mit 25µl einer Mischung aus fluoreszierenden Beads, die mit Antikörpern gegen IFNγ, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12 p70, TNFα oder TNFβ konjugiert sind, versetzt. Jede Bead-Population bindet dabei ein spezifisches Zytokin und kann anhand ihrer Größe von 4 oder 5µm, sowie der Fluoreszenzintensität bei 700nm identifiziert werden. Nach Zugabe von 50µl einer Mischung aus Zytokin-spezifischen, Biotin- konjugierten Antikörpern wurden die Ansätze bei Raumtemperatur für 2 Stunden inkubiert. Durch Zentrifugation bei 200xg für 5 Minuten mit 1ml Proben-Puffer wurden die Proben zweimal gewaschen und anschließend mit 50µl PE-konjugiertem Streptavidin für 1 Stunde bei Raumtemperatur gefärbt. Nach erneutem Waschen wurden die Ansätze in 500µl Proben-Puffer aufgenommen und am Durchflusszytometer analysiert. Die Quantifizierung der Zytokin-Konzentrationen anhand einer mitgeführten Standard-Verdünnungsreihe erfolgte unter Verwendung der FlowCytomix Pro Software.

In den Versuchen zur Expansion von T-Zellen durch die Stimulation mit HSV-1 wurden PBMC nach der Isolation mit dem CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit gefärbt. Hierzu wurden die Zellen zunächst mit 20ml kaltem CFSE-Puffer (PBSo; 0,1% BSA; steril filtriert) gewaschen und bei 440xg für 10 Minuten zentrifugiert. Die Färbung erfolgte durch Inkubation von 1x 106 Zellen pro Milliliter CFSE-Puffer mit

37 Material und Methoden

2µM CFSE (CFSE: Carboxyfluorescein-Diacetate-Succinimidyl-Ester; Stock-Lösung 5mM in DMSO) für 10 Minuten bei 37°C. Im Anschluss wurden die Zellen mit dem vierfachen Volumen eiskaltem CFSE-Medium (RPMI 1640-Medium; 0,5% BSA; 50mg/ml Glutamin; 200U/ml Penicillin; 90U/ml Streptomycin; steril filtriert) versetzt, 5 Minuten auf Eis gestellt und zweimal mit frischem CFSE-Medium bei 440xg für 10 Minuten gewaschen. Jeweils 1x 106 Zellen wurden in 500 µl RPMI 1640-Medium mit 5% humanem AB-Serum ausgesät und mit infektiösem HSV-1 (MOI 0,5), einem äquivalenten Volumen des UV-inaktivierten HSV-Stocks oder ohne Stimulation kultiviert. Nach 6 Tagen wurden die Zellen geerntet, zur Unterscheidung verschiedener Zelltypen mit Fluoreszenz-konjugierten Antikörpern wie oben beschrieben gefärbt und die Proliferation als Abnahme der CFSE-Fluoreszenz analysiert. CD4-positive T-Zellen wurden als CD3+ CD4+ CD8- CD14- Zellen, CD8 positive-T-Zellen als CD3+ CD4- CD8+ CD14- Zellen und doppelt negative T-Zellen als CD3+ CD4- CD8- CD14- Zellen identifiziert.

Die durchflusszytometrischen Messungen erfolgten am FACScalibur oder dem LSR II. Zur Analyse der Daten wurde FACS-Express verwendet.

5.2.10 Statistik

Die Ergebnisse der Zytokinbestimmung mittels ELISA und dem FlowCytomix-Kit sind als Mittelwerte und Standardabweichung angegeben. Zur statistischen Analyse wurde der gepaarte t-Test verwendet. Der Vergleich der Zytokinsekretion in Abhängigkeit zum HSV-1 Serostatus der Spender wurde unter Verwendung des ungepaarten t-Tests analysiert.

Durchflusszytometrisch ermittelte Werte der Analyse von Zellen sind als Median und Interquartilenabstand dargestellt. Hierzu wurde für die Messung der Expression und Regulation von Oberflächenrezeptoren auf PDC die Mittlere Fluoreszenzintensität (MFI), für die Analyse CD69-exprimierender Zellen, IFNγ-sezernierender Zellen sowie infizierter Monozyten der Prozentsatz positiver Zellen und zur Bestimmung der Proliferation der Prozentsatz negativer Zellen eingesetzt. Vor der statistischen Auswertung der Expression von Oberflächenrezeptoren auf PDC wurden die MFI-

Werte logarithmiert (log10), um eine Normalverteilung zu erreichen. Im Anschluss wurde der gepaarte t-Test, für den Vergleich der Expressionswerte die innerhalb eines Versuchs ermittelt wurden (zwischen der Kultivierung mit IL-3 und der

Stimulation mit IL-3/HSVUV, sowie zwischen der Stimulation mit IL-3/HSVUV und 38 Material und Methoden

HSVUV in Abwesenheit von IL-3), oder der ungepaarte t-Test, für Werte aus verschiedenen Experimenten, verwendet. Somit wurde der ungepaarte Test für die Vergleiche zwischen frisch isolierten PDC innerhalb der PBMC-Population mit PDC nach der Kultivierung mit IL-3, IL-3/HSVUV oder HSVUV alleine, sowie zwischen PDC nach Kultivierung mit IL-3 und nach Stimulation HSVUV in Abwesenheit von IL-3 durchgeführt. Unterschiede in der Expression von Rezeptoren zwischen PDC nach

Stimulation mit IL-3/HSVUV und PDC nach Infektion mit IL-3/HSVINF wurden ebenfalls mittels des ungepaarten t-Tests analysiert. Zusätzlich wurde die Bonferroni-Korrektur für multiple Vergleiche angewendet, also die ermittelten p-Werte mit der Zahl der nachgewiesenen Rezeptoren auf der Oberfläche von PDC multipliziert (n=51). Zur statistischen Analyse der Sekretion von IFNγ, der Expression von CD69, sowie der Infektion von Monozyten wurden Tests für nicht-normalverteilte Datensätze verwendet. Der Vergleich der Ergebnisse zwischen der HSV-seropositiven und der HSV-seronegativen Spendergruppe erfolgte mittels des Mann-Whitney Tests für ungepaarte Werte, der Vergleich innerhalb einer Gruppe unter Verwendung des Wilcoxon Signed-Ranks Tests für gepaarte Werte.

Die Korrelation der Expression und Regulation von PDC-Oberflächenrezeptoren aus Chip- und Durchflusszytometrie erfolgte ebenfalls nach Logarithmieren der Werte aller 51 nachgewiesenen Rezeptoren. Hierzu wurden die mediane MFI der durchflusszytometrischen Messungen, sowie die Signalwerte der Chipanalyse nach Kultivierung von PDC mit IL-3 eingesetzt, um die absolute Expression der

Rezeptoren zu vergleichen (log10). Zur Korrelation der Regulation von Rezeptoren, wurde die x-fache Änderung der Expressionswerte zwischen Kultivierung mit IL-3 und IL-3/HSVUV verwendet (log2).

Alle Wahrscheinlichkeiten wurden mit dem Statistikprogramm „VassarStats: Website for Statistical Computation“ (http://vassarstats.net) errechnet und zweiseitige p-Werte unter 0,05 als signifikant erachtet.

39 Ergebnisse

6 Ergebnisse

6.1 Phänotypisierung von PDC in der HSV-1-Infektion

6.1.1 Identifikation von PDC-Oberflächenrezeptoren mittels Chipanalyse

Um einen Überblick über das Oberflächenrezeptor-Repertoire von PDC zu gewinnen, wurde eine Chipanalyse auf Transkriptionsebene durchgeführt. Zur Gewinnung einer ausreichenden Menge an RNA wurden isolierte PDC von 6 verschiedenen Donoren jeweils zur Hälfte mit Interleukin-3 (IL-3) oder IL-3 und UV-inaktiviertem HSV-1

(HSVUV) für 6 Stunden kultiviert. Die Stimulation mit HSVUV induzierte in allen Ansätzen eine signifikante Produktion von IFNα, während nach der Inkubation mit IL- 3 alleine nur in zwei der sechs Kulturen eine geringe Sekretion nachzuweisen war (3924,8 ± 2199,8pg/ml versus 6,9 ± 9,9pg/ml; p=0,01) (Tabelle 2). Nach dem Vereinigen der mit IL-3 kultivierten PDC aller Spender konnten 4,52µg, aus mit

HSVUV stimulierten PDC 4,18µg RNA isoliert und zur Untersuchung der Transkription eingesetzt werden. Diese RNA-Proben wurden am Kompetenzzentrum für fluoreszente Bioanalytik (KfB) in Regensburg auf dem Human Genome U133 Plus 2.0 Array hybridisiert. Eine vorläufige Auswertung der Rohdaten der Chipanalyse erfolgte ebenfalls am KfB.

Tabelle 2: Charakterisierung der zur Chipanalyse eingesetzten Zellen. Aufgelistet ist die Zahl der isolierten mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC) und der aufgereinigten Plasmazytoiden Dendritischen Zellen (PDC) aller 6 Spender, der Anteil der PDC an der PBMC-Population, sowie die Interferon-alpha (IFNα)-Produktion nach Kultivierung von PDC mit Interleukin-3 (IL-3) oder IL-3 und UV-inaktiviertem Herpes simplex Virus Typ1 (HSVUV) für 6 Stunden.

Donor PBMC-Zahl PDC-Zahl PDC-Frequenz IFNα-Konzentration (pg/ml) 6 6 (x10 ) (x10 ) (%) IL-3 HSVUV 1 192 1,62 0,84 0 4702,3 2 373 1,22 0,33 0 2392,8 3 262 0,60 0,23 0 7559,5 4 228 0,52 0,23 0 5560,1 5 200 1,08 0,54 23,9 1693,4 6 240 0,72 0,30 17,3 1640,6

Die weitere Analyse der Chip-Daten, basierend auf der Reinheit der isolierten PDC, wurde bereits in der Diplomarbeit mit dem Titel „Charakterisierung von Oberflächenrezeptoren Plasmazytoider Dendritischer Zellen in der nativen Immunabwehr gegen Viren“ von Philipp Schuster beschrieben (Schuster 2007). Zusammenfassend konnte durch die Isolation von PDC als CD304-positive Zellen, ausgehend von einer mittleren Frequenz von 0,35% innerhalb der PBMC-Population,

40 Ergebnisse eine durchschnittliche Reinheit von 93,2% (n=6) erreicht werden (Abb. 17 Anhang). Um dem Einfluss der in geringem Maße enthaltenen, kontaminierenden Zellpopulationen (im Mittel aus 5 unabhängigen Versuchen wurden 1,91% Monozyten, 1,20% MDC, 0,92% B-Zellen und 0,17% NK-Zellen detektiert) zu berücksichtigen, wurde ein Schwellenwert für die Signalstärke der Chipanalyse definiert. Demzufolge wurden Transkripte nur dann als nachgewiesen erachtet, wenn deren Signalstärke den Wert für TLR9 (Signalstärke 95 in der Chipanalyse nach Kultivierung von PDC mit IL-3) überschritt. TLR9 wird auf niedrigem Niveau und nahezu ausschließlich in PDC und B-Zellen exprimiert (Hornung et al. 2002; Wagner 2004). Die Untersuchung der Expression von Oberflächenrezeptoren wurde auf Rezeptoren der CD-Klassifikation fokussiert. Die Chipanalyse beinhaltete Messwerte zu 323 Rezeptoren dieser Klassifikation, von denen 134 Rezeptoren den definierten

Grenzwert der Signalstärke vor oder nach Stimulation mit HSVUV überschritten. Zur weiteren Phänotypisierung wurden 64 Rezeptoren ausgewählt, die an zentralen Funktionen der PDC oder der Interaktion mit anderen Immunzellen beteiligt sein könnten. Die bekanntermaßen nicht auf PDC exprimierten Rezeptoren CD1c, CD3, CD14, CD16, CD19 und CD161, mit Signalwerten unterhalb von TLR9 dienten als Negativkontrollen (Abb. 2).

41 Ergebnisse

Abbildung 2: Chipanalyse der Transkription von Oberflächenrezeptoren in PDC. Dargestellt sind die Ergebnisse des Human Genome U133 Plus 2.0 Array (Affymetrix) für die ausgewählten Oberflächenrezeptoren nach Kultivierung von Plasmazytoiden Dendritischen Zellen mit Interleukin-3 (IL-3) oder Stimulation mit IL-3 und UV-inaktiviertem HSV-1 (HSVUV) für 6 Stunden. Die Signale der Hybribisierung sind als Zahlenwert und farbkodiert angegeben. Die Expressionsstärke von TLR9 diente als Referenz zur Festlegung des Grenzwertes für den positiven Nachweis von Transkripten.

6.1.2 Identifikation neuer Oberflächenrezeptoren mittels Durchflusszytometrie

Um die Ergebnisse der Chipanalyse zu verifizieren, wurde die Expression von PDC- Oberflächenrezeptoren auf Proteinebene durchflusszytometrisch untersucht. Insgesamt wurden mit Genehmigung der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg (Antragsnummer 3299) PDC von 35 verschiedenen gesunden Spendern analysiert. Im ersten Schritt wurde das Expressionsniveau der ausgewählten Rezeptoren auf der Oberfläche von PDC innerhalb frisch isolierter PBMC ermittelt. Hierzu erfolgte der Nachweis von PDC als CD304 (BDCA4)- oder CD303 (BDCA2)-positive Zellen. Da die Analyse der Zellpopulation nach der Isolation CD304-positiver Zellen aus PBMC einen PDC- Anteil von 93,2%, sowie 1,91% Monozyten und 1,2% MDC ergab (Abb. 17 Anhang), wurden Monozyten und MDC durch die zusätzliche Färbung von CD14 und CD11c

42 Ergebnisse ausgeschlossen. Die durch die Kombination dieser Marker charakterisierte Zellpopulation sollte also im Mittel einen Anteil von 96,33% PDC enthalten. Somit konnten 3,67% der Zellen in dieser Population nicht eindeutig als PDC identifiziert werden. Folglich wurden nur die Rezeptoren als auf PDC exprimiert erachtet, die auf mehr als 3,67% der Zellen nachgewiesen wurden. Unter dieser Bedingung konnte eine deutliche Expression der Rezeptoren CD2 (im Median auf 19,20% der PDC; n=3), CD4 (97,55%; n=5), CD11a (99,88%; n=6), CD26 (68,16%; n=4), CD29 (99,66%; n=6), CD31 (98,10%; n=6), CD36 (99,72%; n=3), CD38 (89,99%; n=3), CD43 (99,99%, n=4), CD44 (99,94%, n=3), CD45 (100%, n=4), CD46 (98,53%, n=4), CD47 (100%; n=4), CD48 (50,32%, n=5), CD49d (99,81%, n=5), CD50 (91,54%, n=5), CD53 (100%, n=4), CD54 (87,43%, n=7), CD59 (97,62%, n=3), CD62L (98,63%, n=3), CD99 (99,91%, n=3), CD123 (99,63%, n=4), CD156b (81,56%, n=3), CD162 (99,91%, n=4), CD183 (90,37%, n=3), CD184 (94,55%, n=4), CD195 (93,02%, n=3), CD197 (36,34%, n=4), CD229 (87,20%, n=6), CD303 (99,90%, n=5), CD304 (99,28%, n=5), CD305 (99,97%, n=4), CD319 (31,69%, n=5), HLA-DR (99,97%, n=4) und HLA-ABC (99,82%, n=4) auf der Oberfläche humaner PDC detektiert werden. Die Rezeptoren CD8 (4,22%; n=5), CD40 (6,68%; n=4), CD55 (4,41%, n=4), CD97 (5,50%, n=5), CD170 (9,99%, n=4) und CD336 (7,93%, n=4) waren auf frisch isolierten PDC nur marginal exprimiert, der Anteil positiver PDC überstieg jedoch den definierten Grenzwert. Neben diesen Rezeptoren war die Expression von CD18 (6,53%, n=7), CD58 (32,71%, n=6), CD66acde (4,72%, n=5), CD80 (17,73%, n=10), CD82 (5,79%, n=7) und CD83 (13,64%, n=9) auf isolierten PDC nach der Kultivierung für 40 Stunden mit IL-3, und von CD69 (87,60%, n=6), CD95 (64,94%, n=6), CD253 (28,22%, n=8) und CD274 (37,20%, n=9) nach

Kultivierung mit IL-3 und HSVUV zu beobachten. Unter diesen Rezeptoren befanden sich neben Molekülen, die bereits auf der Oberfläche von PDC beschrieben wurden auch Rezeptoren, die wir erstmalig auf humanen PDC detektieren konnten wie CD48 (BLAST, SLAMF2), CD156b (ADAM17, TACE), CD305 (LAIR-1), CD229 (Ly9, SLAMF3) und CD319 (CRACC, SLAMF7). Alle 6 Rezeptoren, die als Negativkontrollen mitgeführt wurden (CD1c, CD3, CD14, CD16, CD19 und CD161), lagen in ihrer Expression unterhalb des Grenzwertes. Die Expression von 13 der 64 ausgewählten Rezeptoren konnte auf der Oberfläche von PDC nicht nachgewiesen werden. Dazu zählten Rezeptoren mit Chipsignalen unter 250 (CD9, CD20, CD33, CD37, CD134, CD150 und CD277); Rezeptoren, die auf leukämischen, aber nicht

43 Ergebnisse frisch isolierten PDC beschrieben wurden (CD262) (Blum et al. 2006); Rezeptoren auf TLR4 positiven Zellen (CD180) (Divanovic et al. 2005); Rezeptoren deren Ektodomäne abgespalten wird (CD257) (Huard et al. 2004); Rezeptoren mit intrazellulärer Lokalisation (CD63, CD74) (Mantegazza et al. 2004; Iannello et al. 2006); sowie das Integrin CD103 (ITGAE), das auf dendritischen Zellen besonders im Darm-assoziierten Lymphgewebe exprimiert wird (Annacker et al. 2005).

6.1.3 Einfluss von IL-3 auf die Regulation von PDC-Oberflächenrezeptoren

Die Regulation von Rezeptoren auf der Oberfläche humaner PDC wurde durch den Vergleich der Expression dieser Rezeptoren auf frisch isolierten PDC innerhalb der PBMC-Population mit dem Expressionsniveau nach Kultivierung isolierter PDC mit

IL-3, HSVUV oder IL-3 und HSVUV für 40 Stunden ermittelt (Abb. 3). Eine Regulation durch IL-3 wurde definiert als eine signifikante Änderung der medianen Fluoreszenzintensität (MFI) in den durchflusszytometrischen Analysen, die, ausgehend von der Expression auf frisch isolierten PDC innerhalb der PBMC- Population, durch die Kultivierung isolierter PDC mit IL-3, aber nicht durch die

Stimulation mit HSVUV in Abwesenheit von IL-3 zu beobachten war. So konnte eine signifikant erhöhte Expression des Adhäsionsmoleküls CD54 (ICAM-1) (p=0,014), das die Bindung von Antigen-präsentierenden Zellen an T-Zellen ermöglicht (Montoya et al. 2002; Campanero et al. 1993), des Komplement-assoziierten CD55 (DAF) (p=0,005) (Fujita et al. 1987; Longhi et al. 2006) mit kostimulatorischer Funktion auf T-Zellen (Capasso et al. 2006) und dem NK-Zellrezeptor CD336 (NCR2, LY95, NK-p44) (p=0,018), der nach Aktivierung die IFNα-Sekretion von PDC inhibiert (Fuchs et al. 2005) auf die Kultivierung mit IL-3 zurückgeführt werden. Die Expression von CD229 (Ly9, SLAMF3) (p=0,015), das als koinhibitorischer Rezeptor für die Zytotoxizität von T- Zellen beschrieben ist (Romero et al. 2005; Martín et al. 2005; Sintes et al. 2007), wurde dagegen signifikant reduziert. Darüber hinaus wurde ein inhibitorischer Effekt der

Stimulation mit HSVUV auf die IL-3-induzierte Expression von CD336 deutlich (Fuchs et al. 2005), da nach kombinierter Stimulation mit IL-3 und HSVUV keine Hochregulation dieses Rezeptors zu detektieren war (p=0,007 aus IL-3 versus IL-3/HSVUV).

44 Ergebnisse

Abbildung 3: Durchflusszytometrische Analyse der Expression und Regulation von Oberflächenrezeptoren auf PDC.

45 Ergebnisse

Die Ergebnisse einer repräsentativen Messung zu CD319 nach Kultivierung mit Interleukin-3 (IL-3) (schwarz) sowie nach Stimulation mit IL-3 und dem UV-inaktivierten HSV-1 (HSVUV) für 40 Stunden (rot) sind in Form eines dot plots und als Histogramm dargestellt. Abgebildet ist die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) der Analyse der Expression von Oberflächenrezeptoren auf Plasmazytoiden Dendritischen Zellen (PDC) von 35 unabhängigen Spendern auf frisch isolierten PDC innerhalb der PBMC-Population (ungefüllte Rauten) und nach Kultivierung für 40 Stunden mit IL-3 (schwarze Rauten), IL-3 und HSVUV (rote Rauten) und HSVUV alleine (blaue Rauten). Die horizontalen Balken zeigen signifikante Unterschiede in der Expression an (t-Test p<0,05 nach Bonferroni- Korrektur mit n=51), die Signalstärken der Isotyp-Kontrollen sind als graue Linien dargestellt. Nicht enthalten sind Daten zu Rezeptoren, die auf der Oberfläche von PDC nicht nachgewiesen werden konnten, sowie zu Rezeptoren, die nach Stimulation keine signifikante Änderung in der Expression aufwiesen (CD2, CD8, CD18, CD44, CD46, CD48, CD50, CD58, CD59, CD66a, CD80, CD82, CD83, CD97, CD162, CD170, HLA-DR, HLA-ABC). Die Abbildung beinhaltet einzelne Messungen, die im Rahmen der Diplomarbeit von Philipp Schuster durchgeführt wurden (Schuster 2007).

6.1.4 Einfluss von HSVUV auf die Regulation von PDC-Oberflächenrezeptoren

Analog zur Regulation der Rezeptorexpression durch IL-3 wurde eine Regulation durch HSVUV als eine signifikant unterschiedliche Expression zwischen frisch isolierten PDC innerhalb der PBMC-Population und isolierten PDC nach Stimulation mit HSVUV in Abwesenheit von IL-3 definiert, wenn dies durch die Kultivierung mit IL-

3 nicht auftrat. Nach diesen Kriterien induzierte die Stimulation mit HSVUV eine signifikant reduzierte Expression von CD4 (p=0,043); der Adhäsionsmoleküle CD11a (ITGAL, LFA-1A) (p=0,026), CD29 (ITGB1, VLAB) (p=0,034) und CD31 (PECAM1) (p=0,035); der Dipeptidyl-Peptidase CD26 (DPP4) (p=0,005), die Eigenschaften von Chemokinen modifizieren kann (Ohtsuki, Tsuda, und Morimoto 2000); des Endozytose- induzierenden CD36 (p=0,021) (Taylor et al. 2005; Blasius und Colonna 2006); CD304 (BDCA4, NRP1) (p=0,008), dessen Beteiligung an der immunologischen Synapse kontrovers diskutiert wird (Tordjman et al. 2002; Dzionek et al. 2002); und dem Marker für hämatopoetische Zellen CD45 (PTPRC) (p=0,029) mit regulatorischer Funktion in Immunzellen (Hermiston, Zikherman, und Zhu 2009). Eine signifikant verstärkte Expression der Marker für Aktivierung und Maturation CD38 (p=0,014) (Frasca et al. 2006) und CD69 (CLEC2C) (p=0,005) (Sancho, Gómez, und Sánchez-Madrid 2005), sowie des koregulatorischen CD274 (B7H1, PD-L1) (p=0,034) (Greenwald, Freeman, und Sharpe 2005; J. A. Brown et al. 2003; H. K. Kim et al. 2006; Channappanavar, Twardy, und Suvas 2012; Jaehn et al. 2008) konnte ebenfalls direkt auf die Stimulation mit HSVUV zurückgeführt werden. Die kombinierte Stimulation mit HSVUV und IL-3 verstärkte die HSVUV- induzierte Regulation der Rezeptoren CD4 und CD69 (p=0,006 bzw. p=0,035 aus

HSVUV versus IL-3/HSVUV). Die durch HSVUV reduzierte Expression von CD36 und

46 Ergebnisse

CD304 trat besonders in Abwesenheit von IL-3 auf (p=0,008 bzw. p=0,010 aus

HSVUV versus IL-3/HSVUV) (Abb. 3).

6.1.5 Einfluss von HSVUV und IL-3 auf die Regulation von PDC- Oberflächenrezeptoren

Die Expression einer Reihe von Rezeptoren wurde, ausgehend von frisch isolierten PDC innerhalb der PBMC-Population, sowohl durch Kultivierung mit IL-3 als auch durch Stimulation mit HSVUV signifikant verändert (Abb. 3). So war eine reduzierte Expression folgender Rezeptoren zu beobachten: CD49d (ITGA4) (p=0,005 durch IL-

3 und p=0,018 durch HSVUV), CD53 (TSPAN25) (p=0,005 und p=0,005) und CD99 (MIC2) (p=0,005 und p=0,012), beteiligt an Adhäsion und Migration (Engelhardt und Wolburg 2004); CD62L (SELL) (p=0,005 und p=0,005), dem Liganden für CD162, das unter inflammatorischen Bedingungen auf Endothelzellen präsentiert wird (Sperandio 2006; Gallatin, Weissman, und Butcher 1983); CD123 (IL3RA) (p=0,005 und p=0,005), das durch Bindung von IL-3 Überlebenssignale vermittelt (Marco Colonna, Trinchieri, und Liu 2004); des Chemokinrezeptors CD183 (CXCR3) (p=0,010 und p=0,009), durch den PDC zum Ort der Inflammation rekrutiert werden (Kohrgruber et al. 2004); des endozytotischen CD303 (CLEC4C, BDCA2) (p=0,009 und p=0,005) (Dzionek et al. 2001); sowie des inhibitorischen CD305 (LAIR-1) (p=0,005 und p=0,011) (Meyaard et al. 1997; Lebbink et al. 2006; Lebbink und Meyaard 2007; Meyaard 2008; Meyaard 2010). Die Expression des kostimulatorischen CD40 (TNFRSF5) (p=0,013 und p=0,005) (Grewal und Flavell 1996) und des Apoptose induzierenden CD95 (TNFRSF6, FAS) (p=0,005 und p=0,023) (Krammer 2000) wurde sowohl durch IL-3 als auch durch Stimulation mit

HSVUV verstärkt. Der Vergleich der Rezeptorregulation induziert durch IL-3 oder

HSVUV in Abwesenheit von IL-3 ergab einen signifikant stärkeren Effekt von HSVUV auf die Herunterregulierung von CD53 (p=0,005), CD99 (p=0,05) und CD183 (p=0,005). Die Oberfächenexpression von CD123 (p=0,036) wurde besonders durch die Zugabe von IL-3 reduziert. Ein dominanter Effekt von IL-3 ergab sich auch bezüglich der erhöhten Expression von CD40 und CD95, da beide Rezeptoren durch die kombinierte Stimulation mit IL-3 und HSVUV signifikant stärker induziert wurden, als nach Stimulation mit HSVUV in Abwesenheit von IL-3 (p=0,006 für CD40 und p=0,008 für CD95). Für die reduzierte Expression von CD62L konnte durch die kombinierte Stimulation mit IL-3 und HSVUV ein additiver Einfluss von IL-3 und HSVUV beobachtet werden (p=0,030 für IL-3 versus IL-3 und HSVUV; p=0,031 für HSVUV

47 Ergebnisse

versus HSVUV und IL-3). Die kombinierte Stimulation mit HSVUV und IL-3 induzierte verglichen zur Kultivierung isolierter PDC mit IL-3 alleine auch eine signifikant stärkere Reduktion der Expression von CD49d (p=0,015), CD303 (p=0,048) und CD305 (p=0,015). Die Expression der Rezeptoren CD47 (IAP), CD156b (ADAM17, TACE), CD184 (CXCR4) und CD195 (CCR5) wurde dagegen unter allen Kultivierungsbedingungen im gleichen Ausmaß reduziert, was somit auch eine Folge der PDC-Isolation oder des Alterns der Zellen darstellen könnte. Eine signifikant veränderte Expression einiger Rezeptoren war nur nach kombinierter Stimulation mit

IL-3 und HSVUV zu beobachten. Dies betraf die erhöhte Expression des Chemokinrezeptors CD197 (CCR7) (p=0,011 verglichen mit IL-3) (Kohrgruber et al. 2004); des Apoptose induzierenden CD253 (TRAIL, TNFSF10) (p=0,007 verglichen mit IL-3 und p=0,011 verglichen mit frisch isolierten PDC) (Chaperot et al. 2006); und des Koaktivators zytotoxischer Zellen CD319 (CRACC, SLAMF7) (p=0,005 verglichen mit IL-3 und p=0,031 verglichen mit HSVUV) (Bouchon et al. 2001; Kumaresan et al. 2002; Stark und Watzl 2006), sowie die reduzierte Expression des Adhäsionsmoleküls CD43 (SPN) (p=0,017 verglichen mit IL-3) (Sperandio 2006).

6.1.6 Die Ergebnisse aus Transkriptionsanalyse und Durchflusszytometrie korrelieren bezüglich des Ausmaßes der Regulation der Rezeptoren

Die Ergebnisse aus den durchflusszytometrischen Messungen wurden mit den Werten der Signalstärke der Transkriptionsanalyse verglichen, um das Ausmaß der Korrelation dieser Methoden zu bestimmen (Abb. 4). Hierzu wurden die absoluten Expressionswerte der 51 auf der Oberfläche von PDC nachgewiesenen Rezeptoren nach Kultivierung mit IL-3 logarithmiert (log10). Die lineare Regressionsanalyse zeigte keine signifikante Korrelation (r2=0,07; p=0,07). Um den Grad der Regulation der Expression zu vergleichen, wurde die x-fache Änderung der Expression durch die

Stimulation mit IL-3 und HSVUV berechnet, und diese ebenfalls logarithmiert (log2). Im Gegensatz zur absoluten Expression ergab sich für die Regulation der Rezeptoren eine signifikante Korrelation zwischen den Ergebnissen der Chipanalyse und den Messungen am Durchflusszytometer (r2=0,34; p<0,0001).

48 Ergebnisse

Abbildung 4: Korrelation der Ergebnisse zwischen Transkriptionsanalyse und Durchflusszytometrie. Die Werte aus der Transkriptionsanalyse und den durchflusszytometrischen Messungen der 51 nachgewiesenen Rezeptoren wurden logarithmiert und mittels der linearen Regressionsanalyse verglichen. Für die Expression (a) nach Kultivierung mit Interleukin-3 (log10) ergab sich keine signifikante Korrelation, die Regulation der Rezeptoren (b) durch Stimulation mit Interleukin-3 und UV- inaktiviertem HSV-1 (log2 der x-fachen Änderung) korrelierte dagegen signifikant.

6.1.7 Die Regulation von Oberflächenrezeptoren setzt überwiegend früh nach der Stimulation von PDC ein

Um ein genaueres Bild der Kinetik der Rezeptorregulation zu erhalten, wurde die Expression der Rezeptoren am Durchflusszytometer im Zeitverlauf nach Stimulation mit IL-3 und HSVUV für einen, zwei und drei Tage analysiert. Jede Messung wurde mit aufgereinigten PDC von zwei unabhängigen Donoren durchgeführt und mit den Expressionswerten frisch isolierter PDC innerhalb der PBMC-Population verglichen (Tabelle 3). Eine Änderung der Expressionsstärke um 50% wurde als Regulation erachtet, was gut mit den statistischen Analysen der Regulation nach 40 Stunden Stimulation korrespondierte (Abb. 3). Zehn der elf Rezeptoren mit verstärkter Expression wurden bereits nach einem Tag hochreguliert. Dazu zählten CD38, CD40, CD54 und CD95, deren Expression anhaltend erhöht blieb, sowie die transient hochregulierten Rezeptoren CD36, CD69, CD253, CD274, CD319 und CD336. Eine verstärkte Expression von CD197 war erst an Tag 2 nach Stimulation zu beobachten. Bei 20 Rezeptoren zeigte sich eine reduzierte Expression, die größtenteils bereits nach einem Tag einsetzte (CD4, CD45, CD47, CD48, CD53, CD62L, CD99, CD123, CD162, CD183, CD184, CD195, CD303 und CD305). Die Herunterregulierung von CD31, CD156b und CD304 erfolgte erst an Tag zwei, die von CD2, CD49d und CD229 erst an Tag 3 nach Stimulation. Veränderungen in der Expression von Oberflächenrezeptoren setzten also früh nach Stimulation ein und konnten größtenteils bereits nach 24 Stunden erfasst werden.

49 Ergebnisse

Tabelle 3: Kinetik der Regulation von Oberflächenrezeptoren auf PDC. Aufgereinigte Plasmazytoide Dendritische Zellen (PDC) wurden mit Interleukin-3 und UV-inaktiviertem HSV-1 stimuliert und die Regulation der Rezeptoren bezüglich der Expression auf frisch isolierten PDC innerhalb der Population mononukleärer Zellen des peripheren Blutes (PBMC) analysiert. Eine Änderung der Expressionsstärke um 50% wurde als Regulation erachtet. Auf Grund der starken Donor-spezifischen Schwankung der Regulation von HLA-DR und HLA-ABC sind diese Rezeptoren nicht dargestellt. Die Analyse jedes Rezeptors erfolgte an PDC zweier unabhängiger Spender. Für CD8, CD11a, CD18, CD26, CD43, CD44, CD46, CD50, CD55, CD58, CD59, CD66acde, CD80, CD82, CD83, CD97 und CD170 konnte keine Regulation beobachtet werden.

Art der Regulation Tag 1 nach Stimulation Tag 2 nach Tag 3 nach Stimulation Stimulation Transiente CD36, CD69, CD253, CD274, CD319, Hochregulation CD336 Hochregulation CD38, CD40, CD54, CD95 CD197 Herunterregulation CD4, CD45, CD47, CD48, CD53, CD62L, CD31, CD2, CD49d, CD99, CD123, CD162, CD183, CD184, CD156b, CD229 CD195, CD303, CD305 CD304

6.1.8 Rezeptoren mit deutlicher Transkription aber fehlender Oberflächenexpression liegen intrazellulär oder in löslicher Form vor

Einige Rezeptoren konnten trotz starker Signale in der Chipanalyse auf der Oberfläche von PDC nicht nachgewiesen werden. Zu diesen Rezeptoren zählten CD63 (Chipanalysesignal 1810 nach Kultivierung mit IL-3 bzw. 1889 nach

Stimulation mit IL-3 und HSVUV), CD74 (8052 bzw. 6928), CD180 (1178 bzw. 949) und CD257 (2682 bzw. 5815) (Abb. 2). Die Transkription dieser Rezeptoren konnte jedoch mittels Real-time PCR in PDC nach Kultivierung für 6 Stunden mit IL-3 und IL-

3/HSVUV bestätigt werden (Abb. 5a). In durchflusszytometrischen Analysen konnte die intrazelluläre Expression von CD63, CD74 und CD180 mittels Permeabilisierung der Zellen beobachtet werden. CD74 und CD180 konnten in frisch isolierten PDC, CD63 dagegen erst nach Kultivierung mit IL-3 für 40 Stunden detektiert werden. Alle drei Rezeptoren zeigten eine leicht reduzierte Expression bedingt durch die

Stimulation mit IL-3 und HSVUV. Die intrazelluläre Expression von CD257 konnte erst nach Stimulation von PDC mit IL-3 oder IL-3 und HSVUV detektiert werden, war jedoch auch unter diesen Bedingungen sehr gering (Abb. 5b). Da CD257 in löslichen Formen von dendritischen Zellen sezerniert wird (Huard et al. 2004), wurde eine Westernblotanalyse der Zellkulturüberstände von PDC nach Stimulation mit IL-3 oder

IL-3 und HSVUV durchgeführt. Unter beiden Bedingungen konnten lösliche Formen von CD257 sowohl nach 6 als auch nach 40 Stunden Kultivierung nachgewiesen werden (Abb. 5c). Da das Signal nach Kultivierung für 6 Stunden verstärkt in den Ansätzen HSV-stimulierter PDC zu detektieren war, nach 40 Stunden jedoch kein deutlicher Unterschied zwischen der Kultivierung mit IL-3 oder IL-3 und HSVUV zu

50 Ergebnisse

erkennen war, könnte die Stimulation mit HSVUV die Freisetzung löslichen CD257 aus PDC beschleunigen.

Abbildung 5: Analyse der Expression von CD63, CD74, CD180 und CD257 in PDC. (a) Real-time PCR der Transkription der Rezeptoren. Die Standard-Verdünnungsreihen wurden in drei unabhängigen Experimenten überprüft. Abgebildet sind der Mittelwert und das 95% Konfidenzintervall. Zur Quantifizierung der Transkripte nach Kultivierung mit Interleukin-3 (IL-3) oder Stimulation mit IL-3 und UV-inaktiviertem HSV-1 (HSVUV) wurde RNA aus Plasmazytoiden Dendritischen Zellen (PDC) von vier Spendern vereinigt. Die Ergebnisse wurden auf die Zahl der Transkripte des Haushaltsgens GUS normalisiert. (b) Durchflusszytometrische Analyse der intrazellulären Expression der Rezeptoren in frisch isolierten PDC (schwarze Linie links) und PDC kultiviert für 40 Stunden mit IL-3 (schwarze Linie rechts) oder IL-3 und HSVUV (rote Linie rechts). Die Isotyp-Kontrolle ist als graue Fläche abgebildet. Dargestellt ist ein repräsentatives Ergebnis aus den Messungen von drei unabhängigen Spendern. (c) Westernblotanalyse von löslichem CD257 in den Zellkulturüberständen von PDC nach Kultivierung mit IL-3 oder IL-3 und HSVUV für sechs und 40 Stunden.

6.1.9 Die Effekte von HSV-1 auf PDC sind unabhängig von der Infektiosität

Die Regulation der untersuchten Oberflächenrezeptoren auf PDC nach Stimulation mit IL-3 und infektiösem HSV-1 (HSVINF) für 40 Stunden wies keine signifikanten

Unterschiede zu dem Phänotyp auf, der durch Stimulation mit IL-3 und HSVUV induziert wurde (Daten nicht gezeigt). Die sezernierte Menge an IFNα war nach 5 Kultivierung mit HSVINF (6,0 ± 4,5ng pro 10 PDC) im Vergleich zur Kultivierung mit

51 Ergebnisse

5 HSVUV (7,8 ± 7,0ng pro 10 PDC) leicht, jedoch ebenfalls nicht signifikant reduziert (p=0,06; n=14). Eine genauere Analyse der für diese Experimente eingesetzten 6 Virusüberstände ergab eine Restinfektiosität von 0,115x 10 TCID50/ml nach der Bestrahlung mit 0,12J/cm2. Ausgehend von der Infektiosität vor der Bestrahlung mit 6 6,17x 10 TCID50/ml entsprach dies einer 54-fachen Reduktion. Um auszuschließen, dass die stimulatorischen Effekte des UV-inaktivierten Virusüberstandes durch diese 6 4 Restinfektiosität bedingt waren, wurden PDC mit 1x 10 TCID50/ml oder 2x 10

TCID50/ml des infektiösen Virusstock stimuliert. In zwei Experimenten induzierte der 50-fach verdünnte Virusstock 45- bzw. 200-mal weniger IFNα. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die beobachteten stimulatorischen Effekte von HSV-1 auf PDC, bezüglich der Freisetzung von IFNα und der Regulation von Rezeptoren, unabhängig von der Infektiosität des Virus sind.

6.1.10 HSV-1 zeigt keine produktive Infektion von PDC

Die Fähigkeit von HSV-1, PDC produktiv zu infizieren, wurde zunächst durch die Quantifizierung der genomischen HSV-DNA mittels Real-time PCR analysiert. Hierzu wurden in parallelen Ansätzen PDC und Vero-Zellen mit HSVUV oder HSVINF infiziert. Nach 2 Stunden Inkubation wurden die Zellen mit Trypsin behandelt und gewaschen, um an der Zelloberfläche anhaftende Virionen zu entfernen. Die virale Replikation wurde anschließend über einen Zeitraum von 5 Tagen verfolgt (Abb. 6a). Die erste Analyse erfolgte nach der Kultivierung der infizierten Zellen für 1 Stunde (Tag 0). Die zu diesem Zeitpunkt beobachtete mittlere Reduktion viraler Genom-Kopien in den Zellkulturüberständen um den Faktor 373 verglichen zur eingesetzten Zahl infektiöser viraler Partikel (Stock) bestätigte die effiziente Entfernung von extrazellulären Virionen. Da die Zellen nach dem Ernten erneut mit Trypsin behandelt und gewaschen wurden, wurde in diesen Experimenten nur die Zahl der intrazellulären HSV-Kopien erfasst. Die Quantifizierung viraler DNA-Kopien in der zellulären Fraktion der Vero-Zellen ergab verglichen zu PDC im Mittel eine 110-fach erhöhte Internalisierungsrate, die weitgehend unabhängig von der Infektiosität der Viren war.

Sowohl HSVUV als auch HSVINF replizierten sehr effizient in Vero-Zellen, was durch den raschen Anstieg viraler DNA-Kopien in den Zellkulturüberständen und innerhalb der Zellen verdeutlicht wurde. In den Ansätzen mit UV-inaktiviertem HSV-1 war jedoch eine leicht verzögerte Replikationskinetik in Vero-Zellen zu beobachten, da die Zahl der viralen Genom-Kopien im Überstand an Tag 1 nach Infektion verglichen zu HSVINF 13,4-fach reduziert war. Im Gegensatz zu Vero-Zellen war weder in den 52 Ergebnisse

PDC noch in den Überständen der PDC-Kulturen ein Anstieg der viralen Genom- Kopien zu verzeichnen, wobei über die gesamte Dauer der Versuche HSV-DNA auf niedrigem Niveau detektierbar blieb. Diese Beobachtungen konnten durch Fluoreszenz-mikroskopische Experimente mit dem GFP-exprimierenden HSV-1- Isolat 166v untermauert werden. Hier konnte die Expression des Fluoreszenz- markierten VP22 in Vero-Zellen bereits nach 24 Stunden nachgewiesen werden, während in PDC erst nach 144 Stunden ein sehr schwaches Signal zu erahnen war (Abb. 6b). Nach der Aufnahme von HSV-1 in PDC kommt es also zu keiner produktiven Infektion dieser Zellen.

Abbildung 6: Analyse der Infektion und Replikation von HSV-1 in Vero-Zellen und PDC. (a) Quantifizierung von HSV-1-Genomen im Virusstock, den Zellkulturüberständen (links) und innerhalb der Zellen (rechts) zu verschiedenen Zeitpunkten. Vero-Zellen und Plasmazytoide Dendritische Zellen (PDC) wurden parallel mit infektiösem HSV (HSVINF) (MOI 1) oder einem äquivalenten Volumen des UV-inaktivierten Stocks (HSVUV) infiziert. Angegeben ist der Mittelwert aus zwei unabhängigen Versuchen. (b) Die virale Replikation in Vero-Zellen (oben) und PDC (unten) wurde zusätzlich durch die Infektion mit dem autofluoreszierenden HSV-1-Isolat 166v (MOI 7) untersucht. Durch die Expression des GFP-markierten VP22 sind produktiv infizierte Zellen anhand ihrer grünen Fluoreszenz identifizierbar. Der Versuch wurde im Duplikat durchgeführt.

53 Ergebnisse

6.1.11 Die Aufnahme von HSV-1 in PDC erfolgt zum Teil durch Endozytose

Die Aufnahme von HSV-1 im Zeitverlauf wurde durch konfokale Mikroskopie näher analysiert (Abb. 7). Schon nach 10- bis 15-minütiger Inkubation von PDC mit dem autofluoreszierenden HSV-1-Isolat 166v konnten virale Partikel innerhalb der Zellen nachgewiesen werden. Nach Kultivierung für 45 Minuten war die Zahl der detektierbaren, intrazellulären Virionen bereits rückläufig. Durch die parallele Färbung von EEA1 (engl.: early endosomal antigen 1) konnte der Anteil endozytotisch aufgenommener HSV-1-Partikel abgeschätzt werden. Die Kolokalisation von HSV mit diesem endosomalen Protein war in seltenen Fällen detektierbar, während der Großteil der viralen Partikel keine Kolokalisation zeigte. Diese Ergebnisse legen nahe, dass HSV-1 durch Endozytose in PDC aufgenommen werden kann, dies aber nicht den bevorzugten Mechanismus darstellt. Die von einer anderen Arbeitsgruppe nachgewiesene Expression der zur Infektion nötigen Rezeptoren CD111 (herpes virus entry mediator C, HVE-C), CD112 (HVE-B) und CD270 (HVE-A, HVEM) auf humanen PDC (Donaghy et al. 2009) legt die zusätzliche Aufnahme von HSV-1 durch Fusion der Virushülle mit der Plasmamembran der PDC nahe.

54 Ergebnisse

Abbildung 7: Analyse der Aufnahme von HSV-1 in PDC. Die Aufnahme des autofluoreszierenden HSV-Isolats 166v (grün) in Plasmazytoide Dendritische Zellen wurde im Zeitverlauf untersucht. 0, 5, 10, 15, 45, 90 und 180 Minuten nach der Infektion (MOI 1) wurden die Zellen auf einem Objektträger fixiert, Endosomen (rot) durch das frühe endosomale Antigen 1 (EEA1) und Zellkerne (blau) mit DAPI gefärbt. Ausgewählt wurden repräsentative Aufnahmen der konfokalen Immunfluoreszenz aus zwei unabhängigen Experimenten.

55 Ergebnisse

6.2 Die Immunreaktion gegen HSV-1 in Abhängigkeit vom Serostatus der Spender

6.2.1 Die Sekretion von Interferon-gamma in PBMC nach Stimulation mit HSV- 1 ist abhängig vom Serostatus der Spender

Im Anschluss an die Phänotypisierung von PDC sollte deren Funktion in der Immunreaktion gegen HSV-1 näher charakterisiert werden. Dazu wurde zunächst die Konzentration von Typ1 und Typ2 Interferonen (IFNα und IFNγ) in Zellkulturüberständen stimulierter und unstimulierter PBMC mittels ELISA untersucht. Die Analyse der Zytokinsekretion erfolgte dabei nach Kultivierung für 20 Stunden unter Zugabe von infektiösem HSV-1 (HSVINF) (MOI 0,5; engl.: multiplicity of infection), einer äquivalenten Menge UV-inaktiviertem HSV-1 (HSVUV) oder ohne virale Stimulation. Das in diesen Experimenten eingesetzte HSVUV wurde durch die Bestrahlung mit 0,6J/cm2 inaktiviert. Durch diese 5-fach erhöhte Dosis der Bestrahlung wurde die Infektiosität des Virusstocks vollständig inhibiert (Daten nicht gezeigt). Um dem Einfluss des adaptiven Immunsystems Rechnung zu tragen, wurden sowohl Zellen HSV-1-seronegativer als auch seropositiver Spender untersucht. Aus der Bestimmung des Serostatus von 34 Donoren ergab sich ein Anteil von 26,5% HSV-Seronegativer. Die Immunreaktion dieser Spender sollte also die Situation einer primären Infektion mit HSV-1 reflektieren. 73,5% der Spender besaßen bereits IgG-Antikörper gegen HSV-1. Durch vorhandene adaptive Immunzellen sollte die Reaktion dieser Spender mit einer Reaktivierung der latenten HSV-1-Infektion vergleichbar sein. Ausgehend von einer IFNα-Konzentration von 0,0 ± 0,0pg/ml in den Überständen unstimulierter PBMC, induzierte die Stimulation mit

HSVINF eine signifikante Sekretion von IFNα in den Kulturen seropositiver (3648,4 ± 2606,7pg/ml; p=0,014) und seronegativer Spender (3474,4 ± 1334,7pg/ml; p=0,002).

Die Stimulation mit HSVUV führte verglichen zu unstimulierten PBMC ebenfalls zur Produktion signifikanter Mengen von IFNα bei seropositiven (1967,8 ± 921,3pg/ml; p=0,034) wie seronegativen Donoren (2495,8 ± 204,7pg/ml; p=0,003) (Abb. 8a). Weder bezüglich des Serostatus, noch bezüglich der Infektiosität von HSV-1 konnten signifikante Unterschiede in der Freisetzung von IFNα detektiert werden.

Die Kultivierung mit infektiösem HSV-1 führte bei beiden Spendergruppen zu einer deutlichen Freisetzung von IFNγ. Bei seropositiven Spendern war hier ein Anstieg der Konzentration von 5,4 ± 11,3pg/ml in unstimulierten Kulturen auf 1334,3 ± 701,7pg/ml (p=0,004) zu verzeichnen. Die Sekretion von IFNγ in den Versuchen mit

56 Ergebnisse

Zellen seronegativer Donoren stieg, bedingt durch die Stimulation, von 58,2 ± 96,3pg/ml in unstimulierten PBMC auf 2344,8 ± 786,8pg/ml (p=0,002) und fiel somit signifikant stärker aus als in den Kulturen seropositiver Spender (p=0,046). Ein weiterer Unterschied in der Reaktivität der Spendergruppen bezüglich der Produktion von IFNγ wurde durch die Stimulation mit UV-inaktiviertem HSV-1 deutlich. Hier konnte, verglichen zu unstimulierten PBMC, nur in den Kulturen seropositiver Spender mit 321,6 ± 90,3pg/ml (p=0,009) eine signifikante Sekretion von IFNγ beobachtet werden, währen die Produktion von IFNγ bei seronegativen Donoren mit 143,5 ± 96,3pg/ml gering war (Abb. 8b).

Um zu analysieren, ob die Unterschiede in der IFNγ-Sekretion im Zusammenhang mit einer unterschiedlich verlaufenden Infektion in den Kulturen seropositiver und seronegativer Spender stehen, wurde das Ausmaß infizierter Zellen in den PBMC- Kulturen unter Verwendung des autofluoreszierenden HSV-1-Isolats 166v (MOI 0,5) bestimmt. An Hand der Expression des GFP-markierten viralen Proteins VP22 wurde hier der Anteil infizierter Monozyten (Median 1,50%; Interquartilenabstand (IQR) 0,41-3,07%; n=13), T-Zellen (0,03%; 0,03-0,04%; n=13), CD4-positiver T-Zellen (0,03%; 0,01-0,03%; n=9), CD8-positiver T-Zellen (0,07%; 0,04-0,08%; n=9), NK- Zellen (0,27%; 0,23-0,33%, n=9) und B-Zellen (0,23%; 0,12-0,33%; n=4) quantifiziert. Die höchsten Werte wurden für Monozyten ermittelt, wobei mit 1,72% (0,50-3,25%) ein leicht, aber nicht signifikant erhöhter Anteil infizierter Monozyten in den PBMC seronegativer Spender, verglichen zu 0,25% (0,23-1,60%) bei seropositiven Donoren, beobachtet wurde (p=0,165) (Abb. 8c).

57 Ergebnisse

Abbildung 8: Interferon-Sekretion und Infektion in PBMC nach Stimulation mit HSV-1. Die Freisetzung von Typ1 und Typ2 Interferonen (IFN), sowie der Anteil infizierter Monozyten innerhalb der PBMC-Population wurden nach Stimulation der Zellen für 20 Stunden analysiert, wobei HSV-1 mit einer MOI von 0,5 des infektiösen Virus (HSVINF) oder einem äquivalenten Volumen des UV-inaktivierten Stocks (HSVUV) eingesetzt wurde. Die Werte seropositiver Spender sind als blaue Rauten, die seronegativer Donoren als rote Rauten abgebildet. Signifikante Unterschiede (p<0,05) innerhalb einer Spendergruppe sind als horizontale Linien, Unterschiede zwischen den Gruppen als horizontale Klammern dargestellt. In den ELISA-Messungen zur Konzentration von IFNα (a) und IFNγ (b) in den Überständen der Zellkulturen nach Stimulation mit HSVINF wurden 7 seropositive und 6 seronegative Spender, nach Stimulation mit HSVUV 4 seropositive und 3 seronegative Donoren analysiert. Zusätzlich ist der Mittelwert angegeben. Die statistische Auswertung erfolgte mittels des t- Tests. (c) In den durchflusszytometrischen Analysen der Infektion wurden PBMC von 5 seropositiven und 8 seronegativen Donoren mit dem HSV-Isolat 166v kultiviert. Produktiv infizierte Monozyten wurden anhand der Expression von GFP identifiziert. Abgebildet ist der Anteil infizierter Monozyten und der Median der Messungen. Die statistische Analyse erfolgte durch den Mann-Whitney Test.

6.2.2 Die Quelle der IFNγ-Sekretion in PBMC nach Infektion mit HSV-1 unterscheidet sich bei seropositiven und seronegativen Spendern

Zur genaueren Charakterisierung der durch HSV-1 induzierten Immunreaktion wurde die Quelle der IFNγ-Produktion identifiziert. In früheren Studien von Asanuma und Kollegen und unserer Arbeitsgruppe konnten bei seropositiven Spendern, nach Stimulation mit HSV, IFNγ-sezernierende CD4-positive T-Zellen mit einer Frequenz von etwa 0,2% detektiert werden (Kittan et al. 2007; Asanuma et al. 2000). Im Folgenden sollte untersucht werden, ob die unterschiedlichen Konzentrationen von IFNγ in den Zellkulturüberständen seropositiver und seronegativer Spender auf einer veränderten Zahl reaktiver Zellen oder einer unterschiedlichen Menge freigesetzter Zytokine je Zelle beruhten. Nach Stimulation von PBMC mit infektiösem HSV-1 für 20 Stunden wurden IFNγ-sezernierende Zellen durchflusszytometrisch erfasst und die Expression zelltypspezifischer Marker analysiert. Die Auftrennung der Lymphozyten des peripheren Blutes (PBL) nach ihrer Expression von CD3 ergab nach Stimulation

58 Ergebnisse

mit HSVINF in den PBMC-Kulturen von seropositiven und seronegativen Spendern einen signifikanten Anstieg an IFNγ-sezernierenden T-Zellen. Bei seropositiven Spendern erhöhte sich der mediane Anteil von 0,01% (IQR 0,01-0,02%) in unstimulierten Kulturen auf 0,09% (0,06-0,10%) nach Stimulation (p=0,01), bei seronegativen Donoren von 0,01% (0,01-0,01%) auf 0,40% (0,26-1,36%) (p<0,01). Ein signifikanter Anstieg der IFNγ-Sekretion konnte auch bezüglich CD3-negativer Zellen beobachtet werden. Hier erhöhten sich die Anteile IFNγ-freisetzender Zellen bedingt durch die Kultivierung mit HSVINF von 0,01% (0,00-0,01%) auf 0,17% (0,14- 0,42%) (p=0,01) bei seropositiven Donoren und von 0,01% (0,00-0,01%) auf 0,48% (0,31-0,83%) (p<0,01) bei seronegativen Spendern. Im Vergleich der beiden Spendergruppen wurde ein signifikant größerer Anteil IFNγ-produzierender T-Zellen innerhalb der Kulturen seronegativer Spender deutlich (p<0,001), was bezüglich der CD3-negativen Zellen nicht zu beobachten war (p=0,101) (Abb. 9a). Durch eine genauere Charakterisierung der reaktiven T-Zellen nach Stimulation mit HSVINF konnte gezeigt werden, dass in beiden Spendergruppen CD8-positive T-Zellen, CD4- positive T-Zellen und eine T-Zellsubpopulation negativ für CD4 und CD8 (DN, doppelt negativ), wenn auch zum Teil nur in geringem Ausmaß, signifikant an der IFNγ-Sekretion beteiligt waren (Abb. 9b). Bedingt durch die Stimulation stiegen die Anteile IFNγ-produzierender CD8-positiver T-Zellen bezüglich aller T-Zellen bei seropositiven von 0,01% (0,00-0,01%) in unstimulierten PBMC auf 0,03% (0,03- 0,05%) (p=0,01) und bei seronegativen Spendern von 0,00% (0,00-0,01%) auf 0,28% (0,25-0,75%) (p<0,01). Die Zahl der IFNγ-sezernierenden CD4-positiven T-Zellen erhöhte sich von 0,00% (0,00-0,01%) auf 0,05% (0,03-0,06%) (p=0,02) bei seropositiven und von 0,00% (0,00-0,01%) auf 0,02% (0,02-0,06%) (p<0,01) bei seronegativen Donoren. Für DN T-Zellen seronegativer Spender konnte, ausgehend von 0,00% (0,00-0,00%) in unstimulierten PBMC, die Sekretion von IFNγ in 0,21% (0,05-0,41%) (p<0,01) aller CD3-positiven Zellen beobachtet werden, während der Anstieg bei seropositiven Spendern von 0,00% (0,00-0,00%) auf 0,01% (0,01-0,01%) sehr gering, aber trotzdem signifikant ausfiel (p=0,02). In den Kulturen seropositiver Spender waren somit CD8-positive T-Zellen und insbesondere CD4-positive T- Zellen, in seronegativen Donoren dagegen CD8-positive T-Zellen und DN T-Zellen für den Hauptteil der Produktion von IFNγ verantwortlich. Die verstärkte Produktion von IFNγ innerhalb der T-Zellpopulation seronegativer Spender, verglichen zu seropositiven Spendern, konnte auf einen signifikant höheren Anteil reaktiver CD8-

59 Ergebnisse positiver T-Zellen (p<0,001), sowie DN T-Zellen (p<0,001) zurückgeführt werden (Abb. 9b). Da fast alle humanen αβT-Zellen im peripheren Blut CD4 oder CD8 exprimieren, γδT-Zellen jedoch überwiegend durch die fehlende Expression von CD4 und CD8 gekennzeichnet sind (Parker et al. 1990), wurde zur Identifikation IFNγ- sezernierender T-Zellen zusätzlich der Nachweis des γδT-Zellrezeptors integriert, wodurch ein Anteil von 74,4% (51,0-75,8%) γδT-Zellen an der DN T-Zellpopulation deutlich wurde. Somit konnte gezeigt werden, dass die HSV-induzierte IFNγ- Sekretion aus γδT-Zellen von 0,01% (0,00-0,01%) aller CD3-positiven Zellen bei seropositiven und 0,32% (0,23-0,41%) bei seronegativen Spendern, verglichen zu 0,00% (0,00-0,00%) in unstimulierten Kulturen beider Spendergruppen, nahezu ausschließlich auf Zellen seronegativer Spender beschränkt war (Abb. 9c). Die verstärkte Freisetzung von IFNγ in den PBMC-Kulturen seronegativer Donoren konnte also insbesondere auf einen höheren Anteil reaktiver CD8-positiver T-Zellen und γδT-Zellen zurückgeführt werden.

60 Ergebnisse

Abbildung 9: IFNγ-sezernierende Zellen in PBMC nach Infektion mit HSV-1. Zur Identifikation IFNγ-sezernierender Zellen wurden PBMC von seropositven (blau, n=8) und seronegativen Spendern (rot, n=9) für 20 Stunden mit infektiösem HSV-1 (HSVINF) (MOI 0,5) stimuliert. Im Anschluss wurde in durchflusszytometrischen Messungen neben dem freigesetzten IFNγ die Expression verschiedener zelltypspezifischer Marker analysiert. Dargestellt sind der Median und der Interquartilenabstand (oben) der Anteile IFNγ-sezernierender Zellen (a) nach Auftrennung bezüglich der Expression von CD3 innerhalb der Lymphozyten des peripheren Blutes (PBL). (b) Innerhalb der T-Zellen wurden zusätzlich die Anteile von CD8+, CD4+ und CD8- CD4- (DN, doppelt negativ) Subpopulationen an der Freisetzung von IFNγ ermittelt. (c) Die Analyse der γδT-Zellen erfolgte in PBMC von 3 seropositiven und 4 seronegativen Donoren. Signifikante Unterschiede (p<0,05) innerhalb einer Spendergruppe (Wilcoxon Signed-Ranks Test) sind als horizontale Linien, Unterschiede zwischen den Gruppen (Mann-Whitney Test) als horizontale Klammern dargestellt. Repräsentative Messungen der Anteile IFNγ-produzierender Zellen an den jeweiligen Populationen in PBMC von seropositiven und seronegativen Spendern sind in der unteren Hälfte dargestellt.

6.2.3 Das Ausmaß der zellulären Aktivierung in PBMC nach Infektion mit HSV- 1 ist vom Serostatus weitgehend unabhängig

Da sich die Immunreaktion in PBMC seropositiver und seronegativer Donoren neben der Produktion von IFNγ auch bezüglich anderer Effektorfunktionen der oben beschriebenen Zelltypen unterscheiden könnte, wurde die Expression des frühen Aktivierungsmarkers CD69 nach Stimulation mit infektiösem HSV-1 für 20 Stunden untersucht. Unter Berücksichtigung der Anteile CD69-exprimierender Zellen in den

61 Ergebnisse beiden Spendergruppen sollte geklärt werden, ob die Grundlage der geringeren Produktion von IFNγ in seropositiven Spendern eine reduzierte Aktivierung von Immunzellen bildete. Die Analyse der Expression von CD69 innerhalb der PBL ergab, ausgehen von unstimulierten Zellen, in beiden Spendergruppen einen signifikanten Anstieg aktivierter CD3-positiver wie CD3-negativer Zellen in Reaktion auf die Stimulation mit infektiösem HSV-1. Die medianen Anteile aktivierter T-Zellen erhöhten sich bei seropositiven Spendern von 0,24% (IQR 0,10-0,33%) auf 7,19% (4,92-10,42%) (p=0,01) und bei seronegativen Donoren von 0,51% (0,34-0,86%) auf 9,43% (9,13-10,97%) (p=0,05). Unter den CD3-negativen Zellen konnte bei seropositiven Donoren ein Anstieg der CD69-Expression von 0,54% (0,25-1,05) auf 9,17% (5,43-13,51%) (p=0,01) und bei seronegativen Donoren von 1,09% (0,32- 3,26%) auf 11,70% (7,58-14,99%) (p=0,05) beobachtet werden. Ein Serostatus- abhängiger Unterschied war jedoch nicht zu detektieren (Abb. 10a). Durch die Aufgliederung der T-Zellpopulation seropositiver Spender nach der Expression von CD4 und CD8 konnte gezeigt werden, dass die erhöhte Expression von CD69 überwiegend auf CD8-positiven (Median 3,22%; IQR 1,85-4,89%) und CD4-positiven (4,68%; 2,86-6,86%) T-Zellen zu detektieren war, DN T-Zellen waren verglichen zu diesen beiden Zellpopulationen in signifikant geringerem Ausmaß unter den aktivierten T-Zellen vertreten (0,76%; 0,41-0,85%; p=0,02 verglichen zu CD8; p=0,05 verglichen zu CD4). Im Gegensatz dazu konnten innerhalb der T-Zellpopulation seronegativer Spender nach der Stimulation mit HSVINF vergleichbare Anteile CD69- positiver T-Zellsubtypen nachgewiesen werden. Bezüglich aller CD3-positiven Zellen exprimierten 5,84% (2,88-7,19%) der CD8-positiven, 3,08% (1,69-8,70%) der CD4- positiven und 2,55% (2,05-2,82%) der DN T-Zellen CD69 (Abb. 10b). Die erkennbaren, aber nicht signifikanten Unterschiede in der Expression von CD69 auf DN T-Zellen, in Abhängigkeit zum Serostatus der Spender (p=0,062), wurden auch im Nachweis CD69-positiver γδT-Zellen deutlich. Nach Stimulation mit HSVINF konnten CD69-exprimierende γδT-Zellen mit einem Anteil von 0,32% (0,20-0,50%) aller CD3-positiven Zellen in den Kulturen seropositiver Spender und 1,88% (1,58- 1,95%) bei seronegativen Spendern detektiert werden (Abb. 10c).

62 Ergebnisse

Abbildung 10: Ausmaß der zellulären Aktivierung in PBMC nach Infektion mit HSV-1. Zur Analyse der zellulären Aktivierung wurden PBMC von seropositiven (blau, n=8) und seronegativen Spendern (rot, n=6) für 20 Stunden mit infektiösem HSV-1 (HSVINF) (MOI 0,5) stimuliert. Im Anschluss wurde in durchflusszytometrischen Messungen neben der Expression des frühen Aktivierungsmarkers CD69 die Expression verschiedener zelltypspezifischer Marker analysiert. Dargestellt sind der Median und der Interquartilenabstand (oben) der Anteile CD69-exprimierender Zellen (a) nach Auftrennung bezüglich der Expression von CD3 innerhalb der Lymphozyten des peripheren Blutes (PBL). (b) Innerhalb der T-Zellen wurden zusätzlich die Anteile der CD69-Expression auf den CD8+, CD4+ und CD8- CD4- (DN, doppelt negativ) Subpopulationen ermittelt. (c) Die Analyse der γδT-Zellen erfolgte in PBMC von jeweils 3 seropositiven und seronegativen Donoren. Signifikante Unterschiede (p<0,05) innerhalb einer Spendergruppe (Wilcoxon Signed-Ranks Test) sind als horizontale Linien dargestellt. Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen (Mann-Whitney Test) ergaben sich nicht. Repräsentative Messungen der Anteile CD69-exprimierender Zellen an den jeweiligen Populationen in PBMC von seropositiven und seronegativen Spendern sind in der unteren Hälfte dargestellt.

Im Vergleich zur Sekretion von IFNγ konnten deutlich mehr CD69-positive Zellen nachgewiesen werden, wobei insbesondere der überproportional erhöhte Anteil aktivierter CD4-positiver T-Zellen beider Spendergruppen, sowie aktivierter CD8- positiver T-Zellen seropositiver Spender auffiel. Somit war ein Großteil der Serostatus-abhängigen Unterschiede, die bezüglich der Freisetzung von IFNγ detektiert werden konnten, für die Expression von CD69 nur angedeutet zu

63 Ergebnisse beobachten. Eine Ausnahme bildeten nur γδT-Zellen seropositiver Spender, deren Grad der Aktivierung deutlich geringer ausfiel als dies bei seronegativen Spendern zu beobachten war. Die Stimulation mit infektiösem HSV-1 führte also zu Serostatus- abhängigen, signifikanten Unterschieden bezüglich der Sekretion von IFNγ, die aber bezüglich der Expression des frühen Aktivierungsmarkers CD69 in dieser Ausprägung nicht zu beobachten waren.

6.2.4 Infektiöses HSV-1 induziert bei seropositiven und seronegativen Spendern eine unterschiedliche Polarisierung der Immunreaktion

Die reduzierte Freisetzung von IFNγ aus Zellen seropositiver Spender, verglichen zu seronegativen Spendern, trotz ähnlicher Aktivierung vieler beteiligter Zellpopulationen, könnte auf eine unterschiedliche Polarisierung der Immunantwort hinweisen. Um dies zu verifizieren, wurde das Sekretionsprofil von 11 Zytokinen anhand ihrer Konzentration im Zellkulturüberstand durchflusszytometrisch analysiert.

Nach der Stimulation von PBMC mit infektiösem HSV-1 konnten im Zellkulturüberstand IFNγ, IL-1β, IL-2, IL-8, IL-6, IL-10 und IL-12 nachgewiesen werden, dagegen war keine signifikante Freisetzung von IL-4, IL-5, TNFα oder TNFβ zu detektieren (Abb. 11). Wie auch in den ELISA-Messungen zur Sekretion von IFNγ konnte nach Stimulation eine signifikante Produktion von IFNγ in den Zellkulturen beider Spendergruppen beobachtet werden. Die Konzentration stieg dabei in den Kulturüberständen seropositiver Spender von 23,1 ± 19,7pg/ml bei unstimulierten Zellen auf 413,4 ± 222,7pg/ml (p=0,007) und bei seronegativen Donoren von 31,7 ± 39,5pg/ml auf 702,6 ± 222,5pg/ml (p=0,002). Dabei fiel die Produktion in den Kulturen seronegativer Spender erneut höher aus. Dieser Serostatus-abhängige Unterschied erreichte, im Gegensatz zum Nachweis mittels ELISA, keine Signifikanz (p=0,055), war jedoch als deutlicher Trend zu identifizieren. Eine signifikante Sekretion von IL-12 und IL-8, in Reaktion auf die Stimulation mit infektiösem HSV, war auf die Kulturen seronegativer Donoren beschränkt. Hier konnten in unstimulierten Kulturen 14,3 ± 13,8pg/ml IL-12 und 3518,4 ± 234,1pg/ml IL-8 detektiert werden. Durch die Stimulation mit HSVINF war ein Anstieg auf 25,2 ± 11,3pg/ml IL-12 (p=0,002) und 4315,5 ± 484,6pg/ml IL-8 (p=0,022) zu verzeichnen. Eine HSV-induzierte Freisetzung signifikanter Mengen an IL-2 und IL-10 konnte dagegen nur bei seropositiven Spendern detektiert werden. Bedingt durch die

Stimulation mit HSVINF erhöhte sich die Konzentration von IL-2 von 26,9 ± 36,2pg/ml

64 Ergebnisse in unstimulierten Kulturen auf 101,2 ± 41,2pg/ml (p=0,001), die Konzentration von IL- 10 von 96,2 ± 94,5pg/ml auf 194,1 ± 129,9pg/ml (p=0,003). Aus dem Vergleich der beiden Spendergruppen ergab sich ein signifikanter Unterschied in der HSV- induzierten Sekretion von IL-2 (p=0,044) und IL-12 (p=0,032). Sowohl die Zellen seropositiver als auch seronegativer Spender reagierten auf die Stimulation mit infektiösem HSV mit einer verstärkten Freisetzung von IL-1β und IL-6. In den Kulturen seropositiver Donoren war ein Anstieg von 427,2 ± 469,5pg/ml IL-1β in unstimulierten Kulturen auf 2627,8 ± 1702,9pg/ml (p=0,006) und von 3293,0 ± 3459,3pg/ml IL-6 auf 5263,8 ± 3672,4pg/ml (p=0,004) zu verzeichnen. Die Stimulation von PBMC seronegativer Spender induzierte ausgehend von unstimulierten Zellen eine Erhöhung der IL-1β-Konzentration von 383,0 ± 240,4pg/ml auf 3679,4 ± 1068,3pg/ml (p=0,001) und der IL-6-Konzentration von 3223,9 ± 2610,0pg/ml auf 4824,7 ± 2134,7pg/ml (p=0,048). Die Konzentration des Th2- Zytokins IL-4 und des Th17-Zytokins IL-17a wurde zusätzlich mittels ELISA analysiert (Daten nicht gezeigt). Hierbei konnte in keiner der Spendergruppen eine erhöhte Produktion dieser Zytokine, in Reaktion auf die Stimulation mit infektiösem HSV, nachgewiesen werden.

Die bisher beschriebenen Serostatus-abhängigen Unterschiede in der Sekretion von IFNγ konnten also auch bezüglich der Produktion von IL-2, IL-8, IL-10 und IL-12 beobachtet werden, wobei die Immunreaktion seropositiver Spender durch die Freisetzung von IL-2 und IL-10, die seronegativer Spender dagegen durch IL-12 und höhere Konzentrationen von IL-8 charakterisiert waren.

65 Ergebnisse

Abbildung 11: Polarisierung der Immunreaktion gegen HSV-1 in PBMC. Um die Polarisierung der Immunreaktion nach Stimulation von PBMC seropositiver (blau, n=7) und seronegativer Spender (rot, n=6) mit infektiösem HSV-1 (HSVINF) (MOI 0,5) für 20 Stunden zu analysieren, wurde die Konzentration von 11 Zytokinen im Kulturüberstand durchflusszytometrisch bestimmt. Abgebildet sind Zytokine, die durch die Stimulation mit HSV-1 signifikant verstärkt freigesetzt wurden (t-Test, p<0,05), sowie der Mittelwert der jeweiligen Konzentrationen. Signifikante Unterschiede innerhalb einer Spendergruppe sind als horizontale Linien, Unterschiede zwischen den Gruppen als horizontale Klammern dargestellt. Eine HSV-induzierte Sekretion von IL-4, IL-5, TNFα oder TNFβ konnte nicht beobachtet werden.

6.2.5 Die Sekretion von IFNγ nach Stimulation mit UV-inaktiviertem HSV-1 aus T-Zellen ist auf CD4-positive Zellen seropositiver Donoren beschränkt

Die Stimulation von PBMC seropositiver Donoren mit infektiösem HSV-1 induzierte eine verstärkte Produktion von IL-2 und IL-10, aber weniger IL-8, IL-12 und IFNγ verglichen zur Reaktion in seronegativen Spendern. Insbesondere konnte in seropositiven Spendern eine signifikant reduzierte Zahl IFNγ-sezernierender CD8- positiver T-Zellen und γδT-Zellen detektiert werden. Im Gegensatz dazu konnte aber bei der Bestimmung der Konzentration an freigesetzten Interferonen in den Zellkulturüberständen nach Stimulation von PBMC mit UV-inaktiviertem HSV-1 eine geringe, aber signifikante Freisetzung von IFNγ beobachtet werden, die auf Zellen seropositiver Spender beschränkt war. Im Folgenden sollte die Reaktion von T-Zellen auf UV-inaktiviertes HSV-1 in Abhängigkeit zum Serostatus der Donoren näher charakterisiert und die beteiligten Zelltypen identifiziert werden.

66 Ergebnisse

Die Stimulation von PBMC seropositiver Spender mit UV-inaktiviertem HSV-1 für 20 Stunden induzierte die Sekretion von IFNγ aus 0,04% (IQR 0,02-0,04%) der CD4- positiven T-Zellen bezüglich aller CD3-positiven Zellen (Abb. 12a). Die Reaktivität dieser Zellpopulation entsprach somit der IFNγ-Sekretion, die auch nach der Stimulation mit infektiösem HSV-1 induziert wurde (Median 0,03%; IQR 0,03-0,06%). Im Gegensatz dazu konnten IFNγ-freisetzende CD8-positive T-Zellen in den Kulturen seropositiver Spender mit einem Anteil von 0,04% (0,03-0,06%) bezüglich aller CD3- positiven Zellen ausschließlich nach Stimulation mit infektiösem HSV-1, nicht aber nach Kultivierung mit UV-inaktiviertem Virus detektiert werden (0,01%; 0,00-0,01%). Bezüglich der Aktivierung der verschiedenen T-Zellsubpopulationen ergab sich für CD4-positive T-Zellen ein ähnliches Bild wie es auch für die Freisetzung von IFNγ beobachtet werden konnte. Die Kultivierung mit HSVINF induzierte einen Anteil CD69- exprimierender CD4-positiver T-Zellen von 6,15% (4,96-8,97%) aller CD3-positiven

Zellen, die Stimulation mit HSVUV führte mit 5,88% (3,34-6,81%) zu einer vergleichbaren Expression dieses Aktivierungsmarkers. Im Gegensatz zur selektiven Sekretion von IFNγ aus CD8-positiven T-Zellen nach der Stimulation mit infektiösem HSV-1, konnte für die Aktivierung dieser Zellen kein Zusammenhang mit der Infektiosität des Virus detektiert werden. Da die Expression von CD69 auf 4,63% (2,24-5,67%) der CD8-positiven T-Zellen bezüglich aller CD3-positiven Zellen nach

Stimulation mit HSVINF und auf 3,89% (2,24-4,53%) nach Stimulation mit HSVUV induziert wurde, führten beide Arten der viralen Stimulation zu einer vergleichbaren Aktivierung dieser Zellen (Abb. 12a). In seropositiven Donoren war die Produktion von IFNγ in Reaktion auf UV-inaktiviertes HSV-1 also auf CD4-positive T-Zellen beschränkt und fiel ebenso stark aus wie nach der Stimulation mit infektiösem HSV- 1. Auch wenn die Infektiosität von HSV keinen Einfluss auf die Aktivierung von CD8- positiven T-Zellen seropositiver Spender zeigte, setzten diese nur nach Stimulation mit infektiösem HSV-1 IFNγ frei.

Die Analyse der Reaktivität von CD4-positiven T-Zellen seronegativer Spender ergab einen Effekt der Stimulation mit HSV-1 auf die Expression von CD69, der mit seropositiven Donoren vergleichbar war. Mit einem Anteil CD69-exprimierender CD4- positiver T-Zellen von 10,24% (7,16-11,26%) bezüglich aller CD3-positiven Zellen nach Stimulation mit HSVINF und 6,82% (4,81-8,24%) nach Stimulation mit HSVUV wurden diese Zellen ebenfalls weitgehend unabhängig von der Infektiosität des Virus aktiviert (Abb. 12b). Trotz der ähnlichen Aktivierung von CD4-positiven T-Zellen in

67 Ergebnisse seronegativen Spendern konnte durch die Stimulation mit UV-inaktiviertem HSV-1, anders als in den Kulturen seropositiver Spender, keine Sekretion von IFNγ aus diesen Zellen beobachtet werden (0,00%; 0,00-0,01%). Die Fähigkeit von CD4- positiven T-Zellen nach Stimulation mit UV-inaktiviertem HSV-1 IFNγ zu produzieren war also auf seropositive Spender beschränkt (Abb. 12b).

Die zentrale Funktion von CD4-positiven T-Zellen seropositiver Spender wurde auch in Experimenten zur Expansion der verschiedenen T-Zellsubpopulationen deutlich. Nach Stimulation CFSE-gefärbter PBMC seropositiver Spender mit UV-inaktiviertem oder infektiösem HSV-1 für 6 Tage wurde die Proliferation dieser Zellen analysiert. Wie auch bezüglich der Sekretion von IFNγ zu beobachten war, konnte für die Population CD4-positiver T-Zellen seropositiver Spender sowohl nach Stimulation mit UV-inaktiviertem als auch nach Stimulation mit infektiösem HSV-1 eine deutliche Expansion detektiert werden (Abb. 12c). Die Anteile expandierter CD4-positiver T-

Zellen bezüglich aller CD3-positiven Zellen lagen nach Stimulation mit HSVUV bei

10,24% (7,61-11,87%) und nach Stimulation mit HSVINF bei 8,39% (7,66-8,88%). Trotz einer vergleichbar starken Aktivierung der CD8-positiven T-Zellsubpopulation, sowie der IFNγ-Sekretion nach Stimulation mit infektiösem Virus, konnte keine Proliferation dieser Zellen in den Kulturen seropositiver Spender beobachtet werden (Abb. 12c). Innerhalb der Population doppelt negativer T-Zellen seropositiver Donoren konnte weder durch die Stimulation mit infektiösem, noch durch UV- inaktiviertes HSV-1, größere Anteile aktivierter, IFNγ-sezernierender oder expandierender Zellen detektiert werden (Abb. 12a und c).

Die Stimulation mit infektiösem HSV-1 induzierte in seropositiven Spendern also die Freisetzung von IFNγ aus CD4-positiven und CD8-positiven T-Zellen, während die Kultivierung mit UV-inaktiviertem HSV-1 die Produktion von IFNγ nur in CD4- positiven T-Zellen auslöste (Abb. 12a). Die Reaktion von CD4-positiven T-Zellen seropositiver Spender war somit weitgehend unabhängig von der Infektiosität des Virus (Abb. 12a). Dies konnte neben der Sekretion von IFNγ auch bezüglich der Aktivierung und der selektiven Expansion dieser Zellpopulation nach Stimulation mit UV-inaktiviertem HSV-1 gezeigt werden (Abb. 12b und c).

68 Ergebnisse

Abbildung 12: Identifikation reaktiver Zellen nach Stimulation von PBMC mit UV-inaktiviertem HSV-1. Durchflusszytometrische Analyse IFNγ-sezernierender, aktivierter und expandierender T- Zellpopulationen in PBMC von seropositiven (n=5, blau) und seronegativen Spendern (n=3, rot). (a) Quantifizierung IFNγ-produzierender und CD69-exprimierender Zellen in den CD8-positiven, CD4- positiven und doppelt negativen (DN) T-Zellsubpopulationen von seropositiven Donoren. (b) Vergleich der Sekretion von IFNγ und der Expression von CD69 innerhalb der CD4-positiven T-Zellpopulation seronegativer und seropositiver Spender. (c) Analyse der T-Zellproliferation von seropositiven Donoren. Nach Kultivierung CFSE-gefärbter Zellen wurde die Expansion anhand der reduzierten CFSE-Fluoreszenz (CFSE-) bestimmt. Median und Interquartilenabstand aus der Stimulation mit Mock (gefüllt), UV-inaktiviertem HSV-1 (HSVUV, diagonal gestreift) und infektiösem HSV-1 (HSVINF, kariert) für 20 Stunden (a und b) oder 6 Tagen (c). Zur Stimulation wurde HSV mit einer MOI von 0,5, oder ein äquivalentes Volumen des inaktivierten Stocks eingesetzt.

6.2.6 Plasmazytoide Dendritische Zellen verstärken die HSV-1-induzierte IFNγ- Sekretion

Um die Rolle Plasmazytoider Dendritischer Zellen in der Immunreaktion gegen HSV- 1 näher zu charakterisieren, wurde zunächst die Sekretion von IFNα und IFNγ in der PBMC-Population in An- und Abwesenheit dieses Zelltyps analysiert. Zu diesem Zweck wurden Zellpopulationen mit unterschiedlicher Zusammensetzung jeweils für 20 Stunden mit infektiösem HSV-1 (MOI 0,5) stimuliert. Neben der vollständigen PBMC-Population wurden dazu auch PBMC nach Depletion der PDC-Population eingesetzt. Um sicherzustellen, dass die beobachteten Unterschiede auf das Fehlen der PDC zurück zu führen waren, wurde zusätzlich eine rekonstituierte PBMC- Population mitgeführt, die durch Zugabe von PDC zur PDC-freien PBMC-Population generiert wurde. In diesen Zellkulturen wurden PDC mit 10% im Überschuss

69 Ergebnisse eingesetzt, um deren Effekt zu verstärken und dem Stress der Aufreinigung dieser Zellen Rechnung zu tragen. Des Weiteren erfolgte die Stimulation einer für PDC depletierten PBMC-Population unter Beimischung von Überständen HSV-stimulierter PDC, wodurch die Art der von PDC vermittelten Signale eingegrenzt werden sollte. Einflüsse, die durch lösliche Stoffe vermittelt werden, sollten sowohl in Anwesenheit von PDC als auch nach der Zugabe von Zellkulturüberständen stimulierter PDC zu beobachten sein. Effekte, deren Vermittlung von direkten Zell-zu-Zell-Kontakten abhängen, wären dagegen nur in der Anwesenheit von PDC, nicht aber nach der Zugabe von Zellkulturüberständen nachweisbar.

Die Analyse der Konzentration von IFNα in den Zellkulturüberständen zeigte nach Stimulation mit infektiösem HSV-1, einen signifikanten Anstieg der IFNα-Sekretion unter allen vier Kultivierungsbedingungen (Abb. 13a). Im Vergleich zur Stimulation der vollständigen PBMC-Population, in der eine Konzentration von 4225,5 ± 2428,6pg/ml zu detektieren war, war nach Depletion von PDC mit 1071,0 ± 624,5pg/ml eine signifikant geringe Menge IFNα nachweisbar (p=0,002), was die Rolle der PDC als Hauptproduzenten der Typ1 Interferone unterstreicht (Cella et al. 1999; Siegal et al. 1999). Eine starke Freisetzung von IFNα aus PDC wurde insbesondere nach Stimulation der mit einem Überschuss an PDC rekonstituierten PBMC-Population deutlich. Hier konnte, nach Kultivierung mit infektiösem HSV-1, mit 20128,5 ± 9666,5pg/ml die höchste Konzentration detektiert werden, die nicht nur die Menge an IFNα nach Depletion von PDC (p<0,001), sondern auch innerhalb der vollständigen PBMC-Population (p<0,001) signifikant überschritt. In den Experimenten, die zur Abschätzung des Mechanismus der zellulären Interaktionen dienten, wurden PBMC nach Depletion von PDC mit Zellkulturüberstand von HSV- stimulierten PDC versetzt. Im Kulturmedium wurde hierbei, direkt im Anschluss an die Stimulation der PDC-freien PBMC-Population mit HSV-1, eine IFNα- Konzentration von 500pg/ml erreicht. Unter dieser Bedingung konnte nur eine bemerkenswert geringe Konzentration von IFNα detektiert werden, die mit 659,2 ± 143,5pg/ml im Bereich der zugesetzten Menge an IFNα lag und sogar die von PDC- depletierten PBMC produzierte Menge signifikant unterschritt (p=0,036). Durch die frühzeitige Zugabe von IFNα wurde dessen Neusynthese also inhibiert.

Ähnlich wie im Falle der Sekretion von IFNα, konnte auch in den Messungen zur Konzentration von IFNγ unter allen vier Kultivierungsbedingungen ein signifikanter

70 Ergebnisse

Anstieg der Freisetzung in Reaktion auf die Stimulation mit infektiösem HSV-1 verzeichnet werden (Abb. 13b). Eine weitere Parallele stellte die, im Vergleich zur vollständigen PBMC-Population mit 2003,8 ± 893,3pg/ml, signifikant reduzierte Sekretion von IFNγ in Abwesenheit der PDC dar (498,1 ± 288,6pg/ml; p<0,001). Da eine Expression von IFNγ in PDC nicht beschrieben ist, konnte dies, im Gegensatz zu IFNα, nicht auf die Entnahme der produzierenden Zellen zurückgeführt werden. Unter der erneuten Zugabe von PDC konnte diese reduzierte Sekretion revertiert werden (p=0,001), wobei die so erzielte Konzentration von 789,7 ± 512,3pg/ml weiterhin unter der in der vollständigen PBMC-Population lag (p=0,002). In der Anwesenheit von löslichen Stoffen, produziert von stimulierten PDC, konnten vergleichbare Konzentrationen von IFNγ detektiert werden wie nach Rekonstitution mit PDC. Auch hier wurden mit 826,8 ± 366,2pg/ml jedoch signifikant niedrigere Werte, verglichen zur vollständigen PBMC-Population gemessen (p=0,003). Der Anstieg der Freisetzung bezüglich der für PDC depletierten PBMC-Population war jedoch nicht signifikant. Unter keiner der vier Kultivierungsbedingungen konnte die Sekretion von IL-4 oder IL-17a nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt).

Die Analyse der Anteile infizierter Monozyten in An- und Abwesenheit von PDC ergab ein komplementäres Bild. Nach Depletion von PDC und anschließender Infektion der PDC-freien PBMC-Population wurde mit 3,44% (IQR 3,31-5,19%), verglichen mit 1,94% (0,01-3,56%) in der vollständigen PBMC-Population, ein signifikant erhöhter Anteil an infizierten Monozyten nachgewiesen (p<0,05) (Abb. 13c). Dieser Anstieg in der Infektionsrate konnte durch die Rekonstitution der PBMC- Population mit einem Überschuss an PDC revertiert werden. Hier wurden 0,57% (0,33-1,33%) der Monozyten infiziert, was sowohl bezüglich der PDC-freien PBMC- Population (p=0,02) als auch bezüglich der vollständigen PBMC-Population (p=0,02) zu einer signifikant reduzierten Infektion führte. Die frühe Zugabe von Zellkulturüberstand stimulierter PDC zu PBMC nach Depletion der PDC-Population führte mit einem Anteil infizierter Monozyten von 0,12% (0,07-0,18%) zu einer nahezu vollständigen Unterdrückung der Infektion von Monozyten (Abb. 13c).

Die Depletion von PDC aus der PBMC-Population führte also zu einer reduzierten Sekretion von IFNα und IFNγ, sowie zu einer verstärkten Infektion von Monozyten. Diese Effekte konnten durch einen Überschuss an PDC revertiert werden. Die so erzielten sehr hohen IFNα-Konzentrationen wie auch die sehr frühe Zugabe von

71 Ergebnisse

IFNα-haltigen Überständen stimulierter PDC, induzierten eine deutliche Reduktion in der Zahl der infizierten Monozyten, was die Grundlage für die geringere Freisetzung von IFNγ, verglichen zu vollständigen PBMC, bilden könnte.

Abbildung 13: Effekt von PDC auf die Interferon-Sekretion und Infektion nach Kultivierung mit HSV-1. Um den Effekt von Plasmazytoiden Dendritischen Zellen (PDC) auf die Sekretion von Interferonen (IFN) und die Infektion von Monozyten zu bestimmen, wurden neben der vollständigen PBMC- Population (blau), auch PBMC nach Depletion der PDC-Population (rot), nach Rekonstitution der depletierten PBMC mit einem Überschuss an PDC (grün), sowie nach Zugabe von Zellkulturüberstand (SN) stimulierter PDC zur PDC-freien PBMC-Population (lila) für 20 Stunden mit infektiösem HSV-1 (HSVINF) (MOI 0,5) kultiviert. In den ELISA-Messungen zur Konzentration von IFNα (a) und IFNγ (b) in den Überständen der Zellkulturen sind Daten zu 9 unabhängigen Experimenten (n=6 für die Zugabe von PDC-Überständen zu PDC-freien PBMC), sowie der Mittelwert dargestellt. Die statistische Auswertung erfolgte mittels des t-Tests. (c) Der Anteil infizierter Monozyten nach Stimulation mit dem HSV-1-Isolat 166v wurde durchflusszytometrisch bei 7 unterschiedlichen Donoren (n=4 für die Zugabe von PDC-Überständen zu PDC-freien PBMC) bestimmt. Abgebildet ist der Anteil infizierter Monozyten, sowie der Median aller Messungen. Signifikante Unterschiede (p<0,05 Wilcoxon Signed-Ranks Test) sind als horizontale Linien dargestellt.

6.2.7 PDC erhöhen die Zahl aktivierter und IFNγ-sezernierender Zellen

Im Anschluss wurde der Effekt von PDC auf IFNγ-sezernierende Zellen näher charakterisiert (Abb. 14a). Durch die zusätzliche Analyse der Expression von CD69 wurde der Anteil IFNγ-produzierender Zellen nach Stimulation mit infektiösem HSV-1 in Relation zur Aktivierung der jeweiligen Zellpopulationen gesetzt (Abb. 14b). Auf Grund der Spender-abhängigen Variabilität der IFNγ-Sekretion wurden die Ergebnisse der Stimulation von PDC-freien PBMC, der rekonstituierten PBMC- Population und PDC-freier PBMC nach Zugabe von PDC-Kulturüberstand auf die HSV-induzierte Reaktion im PBMC normalisiert. Zur Beschreibung der durch PDC vermittelten Effekte wurden die Ergebnisse zunächst unabhängig vom Serostatus der Donoren analysiert.

72 Ergebnisse

Die Stimulation mit infektiösem HSV-1 in der Abwesenheit von PDC induzierte die Sekretion von IFNγ in einem Anteil der CD3-positiven Zellen, der 25,6% (IQR 23,5- 33,4%) der Reaktion dieser Zellen in der vollständigen PBMC-Population repräsentierte. Die Zahl IFNγ-produzierender CD3-negativer Zellen nach Depletion von PDC war mit 26,6% (18,1-31,5%) der reaktiven CD3-negativen Zellen in der vollständigen PBMC-Population ebenfalls drastisch reduziert. Die Sekretion von IFNγ aus beiden Zellpopulationen fiel also in PDC-depletierten PBMC signifikant geringer aus als in der vollständigen PBMC-Population (jeweils p=0,05). Durch die Rekonstitution der PBMC-Population mit einem Überschuss an PDC konnte die verminderte Zahl der IFNγ-produzierenden T-Zellen auf 56,4% (37,2-75,6%) (p=0,05) und die Zahl der IFNγ-sezernierenden CD3-negativen Zellen auf 48,6% (35,6-60,2%) (p=0,05) der Reaktion in der vollständigen PBMC-Population, verglichen zu PDC- freien PBMC, signifikant erhöht werden. Die Zugabe von Zellkulturüberständen stimulierter PDC führte, verglichen zu PDC-freien PBMC, ebenfalls zu einer signifikanten Reversion der reduzierten Zahl IFNγ-freisetzender Zellen in Abwesenheit von PDC, da somit 59,8% (55,3-89,2%) (p=0,05) der Reaktivität von T- Zellen und 68,9% (40,1-102,4%) (p=0,05) der Reaktivität von CD3-negativen Zellen in der vollständigen PBMC-Population erreicht wurde (Abb. 14a). Ein ähnliches Bild ergab sich für die Regulation des frühen Aktivierungsmarkers CD69 auf diesen Zellpopulationen, auch wenn die Expression nach Depletion von PDC, verglichen zur Reaktion in der vollständigen PBMC-Population, mit 74,4% (69,5-82,5%) (p=0,05) bezüglich der CD3-positiven Zellen und 70,2% (60,3-80,6%) bezüglich der CD3- negativen Zellen weniger stark reduziert war und der Effekt auf CD3-negative Zellen keine Signifikanz erreichte. In beiden Zellpopulationen konnten die Anteile CD69- positiver Zellen durch Zugabe von PDC (jeweils p=0,05) oder deren Kulturüberständen (jeweils p=0,05), verglichen zur Stimulation in Abwesenheit von PDC, signifikant erhöht werden. Die Aktivierung CD3-positiver Zellen stieg nach Zugabe von PDC auf 91,2% (85,7-96,7%) und nach Zugabe von Überständen stimulierter PDC auf 98,4% (82,6-108,6%) der Reaktion dieser Zellen in der vollständigen PBMC-Population. Innerhalb der Population CD3-negativer Zellen erreichte die Expression von CD69 nach Zugabe von PDC ein Niveau von 100,3% (83,8-107,3%) und nach Zugabe von PDC-Überständen ein Niveau von 117,6% (113,0-130,9%) verglichen zur Stimulation der vollständigen PBMC-Population. Somit überstieg die Expression von CD69 auf CD3-negativen Zellen in Anwesenheit

73 Ergebnisse löslicher Stoffe aus stimulierten PDC sogar das Niveau der Expression nach Stimulation unbehandelter PBMC (p=0,05) (Abb. 14b).

Innerhalb der T-Zellsubpopulationen induzierte die Stimulation der PDC-depletierten

PBMC-Population mit HSVINF Anteile IFNγ-produzierender Zellen, die 25,8% (19,8- 32,2%) der Reaktion von CD8-positiven, 43,8% (31,1-47,0%) der Reaktion von CD4- positiven und 21,0% (19,9-30,9%) der Reaktion von DN T-Zellen in vollständigen PBMC entsprach (Abb. 14a). Durch die Rekonstitution mit PDC konnte die Zahl der IFNγ-sezernierenden CD8-positiven T-Zellen auf 35,8% (31,2-64,5%), die Zahl von CD4-positiven T-Zellen auf 79,7% (60,9-91,8%) und die Zahl von DN T-Zellen auf 40,0% (32,6-65,2%) der Reaktivität der jeweiligen Subpopulation in der vollständigen PBMC-Population gesteigert werden. Die Stimulation der PDC-freien PBMC nach Zugabe von Überständen stimulierter PDC induzierte in diesen Zellen eine Freisetzung von IFNγ, die 51,1% (47,3-76,8%) der Reaktion von CD8-positiven, 74,1% (69,0-82,4%) der Reaktion von CD4-positiven und 66,3% (44,2-86,3%) der Reaktion von DN T-Zellen in der vollständigen PBMC-Population darstellte.

Bezüglich des Aktivierungsmarkers CD69 konnte nach Stimulation mit HSVINF in Abwesenheit von PDC eine Expression detektiert werden, die auf CD8-positiven T- Zellen 79,9% (74,6-87,3%), auf CD4-positiven T-Zellen 61,1% (56,0-76,9%) und auf DN T-Zellen 69,0% (63,9-74,3%) der Induktion in der vollständigen PBMC-Population entsprach. Wie auch für die Sekretion von IFNγ deutlich wurde, führte die erneute Zugabe von PDC zur depletierten PBMC-Population zu einer verstärkten Aktivierung der T-Zellsubpopulationen, so wurde ein Expressionsniveau von CD69 erreicht, das 93,2% (86,3-95,5%) der Aktivierung von CD8-positiven, 81,6% (69,5-91,6%) der Aktivierung von CD4-positiven und 89,6% (84,5-96,3%) der Aktivierung von DN T- Zellen repräsentierte. In Anwesenheit löslicher Stoffe aus stimulierten PDC in der PDC-freien PBMC-Population fiel die Expression von CD69 mit 98,9% (85,1-103,8%) der Reaktion von CD8-positiven, 75,6% (65,1-99,2%) der Reaktion von CD4- positiven und 107,3% (95,3-128,7%) der Reaktion von DN T-Zellen in der vollständigen PBMC-Population ebenfalls höher aus als in Abwesenheit von PDC.

Somit wurde ein Effekt von PDC auf CD8-positive T-Zellen deutlich, der ähnlich auch für die gesamte CD3-positive T-Zellpopulation zu beobachten war. Verglichen zur vollständigen PBMC-Population wurden in Abwesenheit von PDC signifikant weniger IFNγ-sezernierende (p=0,05) und CD69-exprimierende (p=0,05) CD8-positive T-

74 Ergebnisse

Zellen detektiert. Diese reduzierte Reaktivität in der PDC-depletierten PBMC- Population konnte sowohl durch die Zugabe von PDC (p=0,05 für IFNγ und CD69), also auch durch Überstände stimulierter PDC (p=0,05 für IFNγ und CD69) signifikant revertiert werden. Bezüglich der CD4-positiven, sowie der DN T-Zellpopulation wurden, im Gegensatz dazu, in der statistischen Analyse abweichende Effekte der PDC auf die Freisetzung von IFNγ und die Expression von CD69 ersichtlich. Zwar konnte innerhalb der CD4-positiven T-Zellpopulation, verglichen zur Reaktion in der vollständigen PBMC-Population, in Abwesenheit von PDC ein signifikant geringerer Anteil IFNγ-produzierender (p=0,05), sowie CD69-exprimierender Zellen (p=0,05) nachgewiesen werden, dies war jedoch nur durch die Rekonstitution der PBMC- Population mit PDC signifikant zu revertieren (p=0,05 für IFNγ und CD69), wohingegen der Anstieg reaktiver Zellen durch Zellkulturüberstand keine Signifikanz erreichte. Auch innerhalb der Population doppelt negativer T-Zellen war nach Depletion der PDC ein Abfall der Zahlen IFNγ-produzierender und CD69- exprimierender (p=0,05) Zellen, verglichen zur Reaktion in der vollständigen PBMC- Population, zu verzeichnen, der im Falle von IFNγ zwar deutlich ausfiel, jedoch keine Signifikanz erreichte. Die geringere Expression von IFNγ und CD69 in Abwesenheit von PDC konnte durch erneute Zugabe von PDC (p=0,05 für IFNγ und CD69), jedoch insbesondere durch lösliche Stoffe stimulierter PDC (p=0,05 für IFNγ und CD69) signifikant gesteigert werden. Der starke Einfluss von Zellkulturüberständen stimulierter PDC auf DN T-Zellen wurde zudem im signifikant erhöhten Level der CD69-Expression, verglichen zur PBMC-Population die mit PDC rekonstituiert wurde, deutlich (p=0,05) (Abb. 14a und b).

Bezüglich aller untersuchten Zellpopulationen wurde somit ein verstärkender Effekt von PDC auf die Sekretion von IFNγ deutlich. Dies konnte auch für die Anteile aktivierter Zellen in diesen Populationen beobachtet werden, wobei der Einfluss von PDC hier geringer ausfiel. Die beteiligten Signale scheinen jedoch in verschiedenen Zellpopulationen durch unterschiedliche Mechanismen vermittelt zu werden. Während lösliche Stoffe stimulierter PDC insbesondere auf DN T-Zellen wirken, konnte die Reaktivität CD4-positiver T-Zellen verstärkt durch Zell-Zell-Kontakte mit PDC erhöht werden.

75 Ergebnisse

Abbildung 14: Einfluss von PDC auf IFNγ-sezernierende Zellen und die zelluläre Aktivierung. Um den Effekt von Plasmazytoiden Dendritischen Zellen (PDC) auf Interferon-γ-sezernierende Zellen und die zelluläre Aktivierung zu untersuchen, wurden neben der vollständigen PBMC-Population (blau), auch PBMC nach Depletion der PDC-Population (rot), nach Rekonstitution der depletierten PBMC mit einem Überschuss an PDC (grün), sowie nach Zugabe von Zellkulturüberstand (SN) stimulierter PDC zur PDC-freien PBMC-Population (lila) für 20 Stunden mit infektiösem HSV-1 (MOI 0,5) kultiviert. In durchflusszytometrischen Messungen wurde die Sekretion von IFNγ (a) und die Expression von CD69 (b) innerhalb der CD3-positiven, sowie der CD3-negativen Population der Lymphozyten des peripheren Blutes bestimmt. Zusätzlich wurden CD8+, CD4+ und CD4- CD8- (DN, doppelt negativ) T-Zellen analysiert. Dargestellt sind die Ergebnisse als Median und Interquartilenabstand, nach Normalisierung auf die Reaktion innerhalb der nicht-depletierten PBMC- Population, aus 6 unabhängigen Experimenten. Signifikante Unterschiede (p<0,05 Wilcoxon Signed- Ranks Test) sind als horizontale Linien dargestellt.

6.2.8 Die Mechanismen der verstärkenden Signale von PDC auf die Sekretion von IFNγ unterscheiden sich Serostatus-abhängig

Auf Grund der unterschiedlichen Wirkung von PDC oder Zellkulturüberständen stimulierter PDC auf die Freisetzung von IFNγ in den untersuchten T- Zellpopulationen, wurden die Daten zu deren Reaktivität näher analysiert. So sollte untersucht werden, ob der starke Effekt von PDC auf CD4-positive T-Zellen, die innerhalb der Reaktion seropositiver Spender eine zentrale Rolle spielten,

76 Ergebnisse beziehungsweise der dominante Einfluss löslicher Stoffe aus stimulierten PDC auf doppelt negative T-Zellen, die insbesondere zu der Reaktion seronegativer Donoren beitragen, charakteristisch für die jeweiligen Zelltypen waren, oder im Zusammenhang mit dem Serostatus standen (Abb. 15). Auf Grund der sehr geringen Freisetzung von IFNγ aus γδT-Zellen seropositiver Donoren, nach Stimulation der vollständigen PBMC-Population, wurden die Daten zur PDC-vermittelten Regulation dieser Zellen hier nicht mit einbezogen.

Wie bereits im Abschnitt 6.2.7 beschrieben, konnte nach der Depletion von PDC ein deutlicher Rückgang IFNγ-sezernierender Zellen, verglichen zur Reaktion innerhalb der vollständigen PBMC-Population, verzeichnet werden. Mit einem Anteil IFNγ- freisetzender CD8-positiver T-Zellen von 34,0% (IQR 18,3-52,4%) der Reaktion dieser Zellen in der vollständigen PBMC-Population bei seropositiven und von 24,7% (21,4-25-8%) bei seronegativen Donoren, war die Reaktivität dieser T-Zellpopulation in beiden Spendergruppen in Abwesenheit von PDC reduziert. Mit einem Rückgang IFNγ-produzierender CD4-positiver T-Zellen auf 42,5% (33,1-61,7%) der Reaktion in PBMC bei seropositiven Spendern, sowie auf 45,2% (36,2-46,4%) bei seronegativen Donoren konnte für CD4-positive T-Zellen ebenfalls ein verstärkender Effekt von PDC auf die Sekretion von IFNγ beobachtet werden, der unabhängig vom Serostatus auftrat. Auch bezüglich der γδT-Zellen seronegativer Spender konnte, bedingt durch die Abwesenheit von PDC, eine reduzierte Zahl IFNγ-produzierender Zellen beobachtet werden, da unter dieser Bedingung die Reaktivität dieser Zellen auf 22,9% (19,8-23,0%) der Reaktion in PBMC sank. Im Gegensatz zu diesem einheitlichen Effekt der Depletion von PDC auf die Freisetzung von IFNγ, wurde eine Serostatus-abhängige Tendenz der beteiligten Interaktionsmechanismen deutlich. Die Zugabe eines Überschusses an PDC zur PDC-depletierten PBMC-Population zeigte einen dominanten Effekt auf die Rekonstitution der IFNγ-Sekretion in seropositiven Spendern, indem die Reaktivität CD8-positiver T-Zellen auf 73,2% (44,3-91,8%) der Reaktion in PBMC und CD4-positiver T-Zellen auf 94,3% (89,2- 109,3%) erhöht wurde. Ein verstärkender Effekt auf die Sekretion von IFNγ in seronegativen Donoren wurde dagegen insbesondere durch die frühe Zugabe von Zellkulturüberständen stimulierter PDC beobachtet. Unter dieser Bedingung konnten die Anteile IFNγ-produzierender Zellen in CD8-positiven T-Zellen auf 51,2% (51,1- 74,8%) der Reaktion in PBMC, in CD4-positiven T-Zellen auf 75,4% (74,1-80,1%) und in γδT-Zellen auf 81,9% (81,2-84,5%) gesteigert werden (Abb. 15).

77 Ergebnisse

Abbildung 15: Einfluss von PDC auf die IFNγ-Sekretion in seropositiven und seronegativen Donoren. Die Sekretion von IFNγ aus CD8-positiven, CD4-positiven und γδT-Zellen nach Stimulation der vollständigen PBMC-Population (blau), PBMC nach Depletion der PDC-Population (rot), nach Rekonstitution der depletierten PBMC mit einem Überschuss an PDC (grün), sowie nach Zugabe von Zellkulturüberstand (SN) stimulierter PDC zur PDC-freien PBMC-Population (lila) für 20 Stunden mit infektiösem HSV-1 (MOI 0,5) wurde in durchflusszytometrischen Messungen analysiert. Dargestellt sind die Ergebnisse aus den Experimenten mit Zellen von jeweils 3 seropositiven und 3 seronegativen Donoren nach Normalisierung auf die Reaktion innerhalb der nicht-depletierten PBMC-Population (n=2 für γδT-Zellen). Auf Grund der sehr geringen Anteile IFNγ-produzierender γδT-Zellen nach Stimulation der Zellen seropositiver Spender sind bezüglich dieser Zellpopulation nur Daten zu den Messungen seronegativer Spender enthalten.

Diese Daten legen nahe, dass sich die PDC-vermittelten Signale zur verstärkten Freisetzung von IFNγ in der Art ihrer Übertragung unterscheiden. Da CD8-positive und CD4-positive T-Zellen, sowie γδT-Zellen jedes Spenders einheitlich, bevorzugt auf die Zugabe von PDC oder von Zellkulturüberständen reagieren, scheinen diese Unterschiede vom Serostatus abzuhängen. Folglich sollten zellvermittelte Signale in seropositiven und lösliche Stoffe in seronegativen Spendern an der Regulation der IFNγ-Sekretion beteiligt sein. Die Ergebnisse der Analyse der Immunreaktion in seropositiven und seronegativen Donoren sind in der Tabelle 4 zusammengefasst.

78 Ergebnisse

Tabelle 4: Übersicht der Immunreaktion gegen HSV-1 in seropositiven und seronegativen Spendern. Die Tabelle fasst die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zur Immunreaktion gegen HSV-1 in mononukleären Zellen des peripheren Blutes seropositiver und seronegativer Donoren zusammen. Die Induktion der Sekretion von Typ1 und Typ2 Interferonen (IFN) ist als +, eine starke Sekretion als ++ dargestellt. Zusätzlich sind die Zelltypen aufgelistet, die nach Stimulation den Hauptteil der IFNγ- sezernierenden oder CD69-exprimierenden Zellen repräsentierten, sowie die Art der freigesetzten Interleukine (IL). Analog zur Sekretion von Typ1 und Typ2 Interferonen wurde ein identifizierter Effekt von Plasmazytoiden Dendritischen Zellen (PDC) auf die Sekretion von IFNγ und die Induktion von CD69 als + und ein starker Effekt als ++ abgebildet. Schließlich ist der postulierte Mechanismus der Interaktion zwischen PDC und IFNγ-sezernierenden Zellen angegeben.

Seropositive Donoren Seronegative Donoren IFNα-Sekretion ++ ++ IFNγ-Sekretion + ++ Infektion von Monozyten + ++ IFNγ-sezernierende Zellen CD3-, CD4+T, (CD8+T) CD3-, CD8+T, γδT CD69-exprimierende Zellen CD3-, CD4+T, CD8+T CD3-, CD4+T, CD8+T, γδT Sezernierte Interleukine IL-2, IL-10, IL-1β, IL-6 IL-12, IL-8, IL-1β, IL-6 Effekt von PDC auf IFNγ ++ ++ Effekt von PDC auf CD69 + + Interaktionsmechanismus Zell-vermittelt Lösliche Faktoren

79 Diskussion

7 Diskussion

An der immunologischen Kontrolle von HSV-1-Infektionen ist ein breites Spektrum verschiedener Zelltypen beteiligt. Die Begrenzung der initialen Infektion erfolgt dabei durch Zellen der nativen Immunität, während an der Kontrolle der latenten Infektion zusätzlich adaptive Immunzellen beteiligt sind. Plasmazytoide Dendritische Zellen (PDC) scheinen in beiden Phasen der Infektion mit HSV-1 eine zentrale Rolle einzunehmen, indem sie unter anderem durch die Sekretion von Typ1 Interferonen direkte antivirale Funktionen ausüben, darüber hinaus aber auch regulatorische Effekte auf die entstehende Immunantwort vermitteln (Schuster et al. 2011). Nicht zuletzt die Kolokalisation von PDC mit aktivierten T- und NK-Zellen in den Läsionen herpesviraler Infektionen legt nahe, dass auch direkte zelluläre Interaktionen in der Regulation der Immunreaktion involviert sind (Kohrgruber et al. 2004; Donaghy et al. 2009). Über die tatsächlich beteiligten Rezeptor-Liganden-Interaktionen ist jedoch nur wenig bekannt. Aus diesem Grund sollten im ersten Teil der vorliegenden Studie Rezeptoren identifiziert werden, die an interzellulären Wechselwirkungen beteiligt sein könnten. Hierzu wurde die Expression von Oberflächenrezeptoren humaner PDC basierend auf einer genomweiten Transkriptionsanalyse durchflusszytometrisch untersucht.

Zur Analyse der Transkription wurden isolierte PDC eingesetzt, die durch direkte Markierung mit magnetischen Beads über zwei Säulen aufgereinigt wurden. Durch diese Prozedur konnte eine Reinheit von etwa 94% erreicht werden (Abb. 17 Anhang). Dieser Prozentsatz hätte durch die Verwendung alternativer Isolationskits, die eine zusätzliche Depletion Linienmarker-positiver Zellen vorsehen, weiter erhöht werden können. Die erhöhte Reinheit der PDC-Population ist aber in der Regel mit einer deutlich reduzierten Zellausbeute, bedingt durch den zusätzlichen Negativisolationsschritt, verbunden (Daten nicht gezeigt). Da in diesem Projekt ausschließlich frisches EDTA-Blut verwendet wurde, stellte die geringe Zahl isolierter PDC einen bedeutenden limitierenden Faktor dar. Um dem Anteil der in den PDC- Kulturen enthaltenen kontaminierenden Zellpopulationen Rechnung zu tragen, wurde daher ein Grenzwert von 95 für die Signalstärke in der Chipanalyse definiert, der sich an dem Ausmaß der TLR9-Expression orientierte. TLR9 wird außer in PDC nur noch in B-Zellen auf niedrigem Niveau exprimiert (Hornung et al. 2002; Wagner 2004) und sollte somit als geeignete Referenz für eine weitgehend PDC-spezifische Expression

80 Diskussion dienen. Die Signalwerte der meisten Linienmarker wie CD3, CD14, CD16 und CD19, lagen unterhalb dieses Grenzwertes, der nur von dem B-Zell-Marker CD20 knapp überschritten wurde (Abb. 2). In den durchflusszytometrischen Analysen der Rezeptorexpression wurden ebenfalls isolierte PDC verwendet und ein Grenzwert für den positiven Nachweis von Rezeptoren festgelegt. Durch den Ausschluss von Monozyten und MDC mittels Färbung mit Antikörpern gegen CD14 und CD11c konnten im Mittel 3,67% der Zellen in den PDC-Kulturen nicht eindeutig identifiziert werden. Folglich wurden nur diejenigen Rezeptoren als exprimiert erachtet, die auf mehr als 3,67% der frisch isolierten oder kultivierten PDC zu detektieren waren. Weder die mitgeführten Negativkontrollen noch die Expression von CD20 überschritten diesen Grenzwert.

Unter diesen Bedingungen konnte die Expression von 51 Rezeptoren auf Ebene der RNA- (Abb. 2) und der Protein-Expression (Abb. 3) nachgewiesen werden. Darunter befanden sich Rezeptoren, die auf PDC bereits beschrieben waren und deren Expression bestätigt werden konnte wie CD2 (LFA-2), CD4, CD11a (ITGAL), CD18 (ITGB2), CD36, CD38, CD43 (SPN), CD44, CD45RA, CD54 (ICAM-1), CD58 (LFA- 3), CD303 (BDCA2), CD304 (BDCA4), HLA-DR, HLA-A/B/C (Dzionek et al. 2000), CD62L (SELL) (Cella et al. 1999; Dzionek et al. 2000), CD123 (IL3RA) (Grouard et al. 1997; Dzionek et al. 2000), CD184 (CXCR4), CD195 (CCR5) (Penna, Sozzani, und Adorini 2001; Fong et al. 2002; Marco Colonna, Trinchieri, und Liu 2004), CD197 (CCR7) (Marco Colonna, Trinchieri, und Liu 2004; Penna, Sozzani, und Adorini 2001; Seth et al. 2011), CD183 (CXCR3), CD40 (TNFRSF5), CD80 (B7-1), CD83 (Cella et al. 2000), CD253 (TNFSF10, TRAIL) (Chaperot et al. 2006), CD274 (Jaehn et al. 2008), CD31 (PECAM1) und CD336 (NCR2) (Fuchs et al. 2005), CD97 (Matmati et al. 2007) und CD170 (SIGLEC5) (Lock et al. 2004). Darüber hinaus konnte die intrazelluläre Lokalisation der Rezeptoren CD63 (LAMP3), CD74 (engl.: MHC-II invariant chain) und CD180 (LY64), sowie eine lösliche Variante von CD257 (TNFSF13B, BAFF) im Überstand kultivierter PDC detektiert werden (Abb. 5). Neben diesen Rezeptoren konnte in dieser Studie erstmalig die Expression von CD48 (SLAMF2, BLAST), CD156b (ADAM17, TACE), CD229 (SLAMF3, Ly9), CD305 (LAIR-1) und CD319 (SLAMF7, CRACC) auf der Oberfläche von humanen PDC beschrieben werden (Abb. 3) (Schuster et al. 2010).

CD156b, ein Mitglied der ADAM (engl.: a disintegrin and metalloprotease domain)- Familie, ist an der Abspaltung von TNFα (Moss et al. 1997; Black et al. 1997; Doedens und

81 Diskussion

Black 2000) und CD62L (Peschon et al. 1998; Bueno et al. 2002; Bennett et al. 1996) von der Zelloberfläche beteiligt. CD305, ein Kollagen-bindender Rezeptor mit einem zytoplasmatischen ITIM (engl.: immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif), könnte die Aktivierung von Immunzellen nach der Extravasation regulieren (Meyaard et al. 1997; Lebbink et al. 2006; Lebbink und Meyaard 2007; Meyaard 2008; Meyaard 2010). Mit den drei Mitgliedern CD48, CD229 und CD319 stellte die SLAM (engl.: signaling lymphocytic activation molecule)-Familie den Großteil der hier erstmalig beschriebenen Rezeptoren dar. Für die Rezeptoren dieser Familie wurden eine Reihe regulatorischer Effekte, insbesondere auf zytotoxische Zellen, beschrieben. CD48 ist der natürliche Ligand für CD244 (2B4, SLAMF4) (M. H. Brown et al. 1998; Latchman, McKay, und Reiser 1998), einem weiteren Vertreter der SLAM-Familie, der auf humanen CD8-positiven T-Zellen, NK-Zellen (Nakajima et al. 1999; Romero et al. 2004; Valiante und Trinchieri 1993), γδT-Zellen (Nakajima et al. 1999; Valiante und Trinchieri 1993) und schwächer auch auf CD4-positiven T-Zellen (Romero et al. 2004) exprimiert wird. Die Bindung von CD48 an CD244 oder die Ligation von CD244 mit Antikörpern induzierte mittels koregulatorischer Signale eine verstärkte Zytotoxizität von NK-Zellen gegen suszeptible Zellen (Valiante und Trinchieri 1993; Nakajima et al. 1999; Sivori et al. 2000; Chuang, Kumaresan, und Mathew 2001; Stark und Watzl 2006). Dieser aktivierende Effekt von CD244 auf die Zytotoxizität konnte auch bezüglich der Lyse EBV-infizierter B-Zellen durch humane zytotoxische T-Zellen (CTL) beobachtet werden (Dupré et al. 2005). Die Rezeptoren CD229 und CD319 sind Selbstliganden, binden also an CD229 beziehungsweise CD319 anderer Zellen (Romero et al. 2005; Kumaresan et al. 2002). Beide Rezeptoren konnten auf B-Zellen, T-Zellen und NK-Zellen nachgewiesen werden (Sintes et al. 2007; Romero et al. 2004; La Fuente et al. 2001; Bouchon et al. 2001). Die Ligation von CD229 auf murinen oder humanen T-Zellen inhibierte deren Aktivierung sowie die Sekretion von Zytokinen wie IFNγ oder IL-2 nach Stimulation mit Antikörpern gegen CD3 (Sintes et al. 2007; Martín et al. 2005). Ein inhibitorischer Effekt von CD229 konnte auch für murine invariante NKT-Zellen beschrieben werden (Sintes et al. 2013). Im Gegensatz zu CD229 vermittelte CD319 kostimulatorische Signale, die die Zytotoxizität von humanen NK-Zellen erhöhten (Bouchon et al. 2001; Kumaresan et al. 2002; Stark und Watzl 2006). Nach der Ligation von CD319 auf humanen B-Zellen konnte eine verstärkte Proliferation dieser Zellen beobachtet werden (Lee et al. 2007).

82 Diskussion

Nach dem Abschluss der Expressionsanalysen des vorliegenden Projektes wurde eine ähnliche Studie veröffentlicht (Cabezón et al. 2011), in der ebenfalls ein breites Spektrum von Oberflächenrezeptoren auf humanen PDC untersucht wurde. Die Auswahl der Rezeptoren in der Studie von Cabezón et al. überschnitt sich mit den Analysen der vorliegenden Arbeit nur in wenigen Fällen, die Autoren konnten jedoch die Expression von CD48, CD229, CD305 und CD319 bestätigen. Zusätzlich waren CD63, CD80, CD83, CD150, CD262 und CD274, wie in der vorliegenden Arbeit beschrieben, bei Cabezón und Kollegen auf der Oberfläche von frisch isolierten PDC nicht nachweisbar. Darüber hinaus konnten CD148 (PTPRJ), CD272 (BTLA), CD352 (NTB-A, SLAMF6), CD357 (GITR, TNFRSF18) und CD361 (EVI2B) auf PDC identifiziert werden (Cabezón et al. 2011), deren Expression in der vorliegenden Studie nicht untersucht wurde.

Zur Analyse der Regulation von Oberflächenrezeptoren wurden isolierte PDC mit

Interleukin-3 (IL-3), IL-3 und UV-inaktiviertem HSV (HSVUV) oder HSVUV in Abwesenheit von IL-3 stimuliert. Aus den Vergleichen der Expression von Rezeptoren frisch isolierter und stimulierter PDC, sowie zwischen den unterschiedlich stimulierten PDC-Kulturen, konnte der Effekt der verschiedenen Stimulationen auf die Regulation der untersuchten Rezeptoren identifiziert werden (Abb. 3). Nach Kultivierung von PDC mit IL-3 war im Vergleich zu frisch isolierten PDC eine selektiv erhöhte Expression von CD54, CD55 und CD336, sowie eine verringerte Expression von CD229 zu beobachten. Die Kultivierung mit HSVUV alleine induzierte verglichen zu frisch isolierten PDC die spezifische Hochregulation von CD38, CD69 und CD274, dagegen wurde die Expression von CD4, CD11a, CD26, CD29, CD31, CD36, CD45 und CD304 reduziert. Eine Reihe verschiedener Oberflächenrezeptoren wurde, ausgehend von der Expression auf frisch isolierten PDC, sowohl durch Stimulation mit IL-3 als auch durch HSVUV in Abwesenheit von IL-3 reguliert, wobei die Expression der einzelnen Rezeptoren unter beiden Kultivierungsbedingungen einheitlich entweder reduziert oder erhöht wurde. So war eine reduzierte Expression von CD47, CD49d, CD53, CD62L, CD99, CD123, CD156b, CD183, CD184, CD195, CD303 und CD305 zu verzeichnen, während CD40 und CD95 verstärkt exprimiert wurden. Eine erhöhte Expression von CD197, CD253 und CD319, sowie ein Rückgang der Expression von CD43 waren ausschließlich nach kombinierter

Stimulation mit IL-3 und HSVUV zu beobachten.

83 Diskussion

Interleukin-3 stellt einen wichtigen Faktor für das Überleben unstimulierter PDC dar (Grouard et al. 1997; Dzionek et al. 2000). In der vorliegenden Studie wurden durch IL-3 aber auch eine Reihe verschiedener Rezeptoren reguliert, wobei die deutliche Hochregulation von CD40 eine einsetzende Maturation nahelegte (Abb. 3). Insbesondere die Expression von CD336 (NKp44, NCR2) wurde durch die

Kultivierung mit IL-3 induziert. Die zusätzliche Stimulation mit HSVUV verhinderte jedoch die Hochregulation von CD336 (Abb. 3). Diese Art der Regulation von CD336 wurde auch von Fuchs et al. im Zusammenhang mit der Stimulation von PDC durch CpG beschrieben (Fuchs et al. 2005). In dieser Arbeit konnten aktivierte CD8-positive Gedächtnis-T-Zellen, die in Tonsillen eng mit PDC assoziiert waren, als eine natürliche Quelle der Sekretion von IL-3 identifiziert werden. Des Weiteren reduzierte die Ligation von CD336 auf PDC deren Freisetzung von IFNα nach Stimulation mit CpG (Fuchs et al. 2005). Zwölf Rezeptoren wurden sowohl durch die Kultivierung mit IL-

3 als auch durch die Stimulation mit HSVUV reguliert, wobei das Ausmaß der veränderten Expression unter den verschiedenen Kultivierungsbedingungen teilweise variierte (Abb. 3). So wurden dominante Effekte von IL-3 auf die Regulation von

CD123, sowie von HSVUV auf die Expression von CD49d, CD53, CD99, CD183 und CD303 deutlich. Ein additiver Einfluss der beiden Stimuli konnte bezüglich der Regulation von CD62L und CD305 beobachtet werden. Die Expression der Rezeptoren CD47, CD156b, CD184 und CD195 wurde jedoch unter allen Kultivierungsbedingungen gleichmäßig reduziert. Somit könnte die Regulation dieser Rezeptoren generell und unabhängig von der Art des Stimulus, bedingt durch das Altern dieser Zellen oder als Folge der Isolation der PDC induziert werden.

Die Analyse der Regulationskinetik erfolgte durch die Stimulation isolierter PDC mit

IL-3 und HSVUV für einen, zwei und drei Tage (Tabelle 3). Dabei zeigte sich für die Rezeptoren, die unter dieser Kultivierungsbedingung verstärkt exprimiert wurden, eine sehr früh einsetzende Regulation. So stieg die Expression der Rezeptoren CD38, CD40, CD54 und CD95 bereits nach einem Tag. Dies galt auch für CD36, CD69, CD253, CD274, CD319 und CD336, deren Expression nach zwei oder drei Tagen jedoch wieder rückläufig war. Nur für den Zellmigrationsmarker CD197 war eine verstärkte Expression erst nach zwei Tagen zu beobachten, ein Anstieg der Expression des kostimulatorischen Moleküls CD80 fand noch später statt. Da die Expression von CD80 auf eine Subpopulation von PDC begrenzt war, fiel die Änderung der Mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) bezüglich der gesamten PDC-

84 Diskussion

Population nur gering aus und überschritt den definierten Grenzwert für den Nachweis der Rezeptorregulation (Änderung der Expressionsstärke um 50% verglichen zu frisch isolierten PDC) nicht. Eine reduzierte Expression war für die Rezeptoren CD4, CD45, CD47, CD48, CD53, CD62L, CD99, CD123, CD162, CD183, CD184, CD195, CD303 und CD305 bereits am ersten Tag, für CD31, CD156b und CD304 am zweiten Tag, und für CD2, CD49d und CD229 am dritten Tag nach Stimulation zu detektieren.

In der Analyse der Rezeptorexpression wurde deutlich, dass funktional verwandte Rezeptoren, induziert durch die Stimulation, einheitlich reguliert wurden. Zu diesen Regulationsgruppen zählten Chemokinrezeptoren, die PDC zum Ort der Inflammation rekrutieren, Adhäsionsmoleküle der Migration, Rezeptoren der Endozytose und Antigenaufnahme, sowie Rezeptoren mit inhibitorischen Effekten, deren Expression reduziert wurde. Die Expression zellulärer Marker der Aktivierung und Maturation, sowie von Rezeptoren, die an der Interaktion mit Effektorzellen des Immunsystems beteiligt sind, wurde dagegen erhöht. Basierend auf der Expression und der funktional und zeitlich koordinierten Regulation von Oberflächenrezeptoren ergab sich ein Modell des Lebenszyklus von PDC in der Infektion mit HSV-1 (Abb. 16), wonach PDC an den Ort der Infektion rekrutiert werden, Antigene aufnehmen und über den Blutkreislauf in sekundäre lymphatische Gewebe wandern. Im Blut exprimieren unreife PDC die Chemokinrezeptoren CD183, CD184 und CD195, die der Erkennung inflammatorischer Prozesse dienen und die Migration von PDC steuern (Yoneyama et al. 2004; La Rosa et al. 2003; Kohrgruber et al. 2004; Cella et al. 1999; Vanbervliet et al. 2003). Eine erste Anhaftung sowie das Rollen von PDC am vaskulären Endothel könnte durch die Adhäsionsmoleküle CD31 (Hordijk 2006), CD43 (Sperandio 2006), CD44 (Sperandio 2006), CD47 (Feigelson et al. 2003; Lebbink und Meyaard 2007; Ticchioni et al. 2001; E. J. Brown und Frazier 2001), CD54 (La Rosa et al. 2003), CD62L (Sperandio 2006; Gallatin, Weissman, und Butcher 1983), CD99 (Engelhardt und Wolburg 2004) und CD162 (Sperandio 2006; Ma, Plow, und Geng 2004) vermittelt werden, während die Integrine CD11a (Ostermann et al. 2002), CD18 (May et al. 2000), CD29 (May et al. 2000) und CD49d (May et al. 2000; Berlin et al. 1995) eine feste Adhäsion induzieren und die Transmigration ins Gewebe einleiten könnten. Von de la Rosa und Kollegen konnte bezüglich der Migration von PDC insbesondere die Funktionalität von CD18, CD29, CD31 und CD54 bestätigt werden (La Rosa et al. 2003). Die Rekrutierung von PDC an den Ort der Inflammation konnte bereits in verschiedenen Studien belegt werden, darunter auch

85 Diskussion in Läsionen verursacht durch die Infektion mit HSV-2 (Donaghy et al. 2009; Kohrgruber et al. 2004; Lund et al. 2006) oder VZV (Gerlini et al. 2006; Huch et al. 2010; Kohrgruber et al. 2004). Die Aufnahme von HSV-1 könnte durch die Rezeptoren CD111, CD112 und CD270 vermittelt werden, die auf der Oberfläche humaner PDC präsentiert werden (Donaghy et al. 2009), wobei auch endozytotische Mechanismen an der Aktivierung von PDC beteiligt sind (Megjugorac et al. 2004). Für andere Viren (HIV und CMV) oder die Kultivierung mit Antikörpern wurde die Endozytose in PDC mittels der Rezeptoren CD4 (Beignon et al. 2005; Pritschet et al. 2012), CD303 (Dzionek et al. 2001; Jaehn et al. 2008) oder CD170 (Lock et al. 2004) beschrieben und bezüglich CD36 postuliert (Blasius und Colonna 2006). Die Daten der vorliegenden Arbeit zeigen, dass die Expression von CD4, CD36 und CD303 nach der Aufnahme von HSV-1 herunterreguliert wird. Durch den Kontakt mit HSV-1 wurde außerdem die Expression von CD305 reduziert, das in Anwesenheit von Kollagen die Aktivierung von Immunzellen im Gewebe inhibieren könnte (Meyaard et al. 1997; Lebbink et al. 2006; Lebbink und Meyaard 2007; Meyaard 2008; Meyaard 2010), und schließlich die Aktivierung und Reifung der PDC, erkennbar an der verstärkten Expression von CD38 (Frasca et al. 2006), CD69 (Sancho, Gómez, und Sánchez- Madrid 2005) und CD83 (Cella et al. 2000), eingeleitet. Im Verlauf der Reifung wurde die Expression der Adhäsionsmoleküle CD11a, CD29, CD31, CD43, CD47, CD49d, CD62L, CD99 und CD162, sowie der Chemokinrezeptoren CD183, CD184 und CD195 herunterreguliert (Abb. 3), was die Emigration der PDC aus dem Gewebe und den erneuten Eintritt in den Blutkreislauf ermöglichen könnte. Die verzögerte Expression des Chemokinrezeptors CD197 könnte durch die Bindung der C-C-Motiv Chemokin-Liganden 19 und 21 (CCL19, CCL21) die Migration der PDC in lymphatisches Gewebe einleiten (Marco Colonna, Trinchieri, und Liu 2004; Kohrgruber et al. 2004; La Rosa et al. 2003; Penna, Sozzani, und Adorini 2001; Yoneyama et al. 2004; Seth et al. 2011). Diese Chemokine werden an den venösen Endothelien der Gefäße im Lymphknoten (HEV, engl.: high endothelial venules) präsentiert. Neben CD197 ist auch CD62L an dieser Migration beteiligt, vermutlich indem es durch die Bindung verschiedener Rezeptoren der HEV wie CD162 (engl.: selectin-P ligand, PSGL-1), MADCAM-1 (engl.: mucosal vascular addressin cell adhesion molecule 1), GlyCAM-1 (engl.: glycosylation dependent cell adhesion molecule 1) oder CD34 die initiale Bindung von PDC induziert (Cella et al. 1999; Cella et al. 2000; Venturi et al. 2003; Sperandio 2006; Girard und Springer 1995; Marco Colonna, Trinchieri, und Liu 2004). Durch die Stimulation mit HSV-1 wurde die Expression von CD62L auf der Zelloberfläche von PDC jedoch reduziert.

86 Diskussion

Die hohen Signalwerte in der Transkriptionsanalyse, zusammen mit der ebenfalls herunterregulierten Expression von CD156b, das die Abspaltung von CD62L von der Zelloberfläche vermittelt, könnte jedoch die erneute Expression von CD62L ermöglichen. Auch wenn dieser Weg des homing bereits für PDC beschrieben wurde (Facchetti et al. 1988; Cella et al. 1999; Cella et al. 2000; Yoneyama et al. 2004; Seth et al. 2011; Marco Colonna, Trinchieri, und Liu 2004), ist noch unklar, ob PDC aus dem entzündeten Gewebe tatsächlich in Lymphknoten einwandern, oder direkt in lymphatisches Gewebe gelangen.

Abbildung 16: Modell des Lebenszyklus von PDC in der Infektion mit HSV-1. Basierend auf der Expression und der HSV-induzierten funktional und zeitlich koordinierten Regulation von Oberflächenrezeptoren auf Plasmazytoiden Dendritischen Zellen (PDC) ergab sich ein Modell des Lebenszyklus von PDC in der Infektion mit HSV-1. Neben den in der vorliegenden Arbeit analysierten Rezeptoren sind auch Rezeptoren enthalten, deren Expression auf PDC bereits von anderen Arbeitsgruppen identifiziert wurde. Im oberen Teil der Abbildung ist die Rekrutierung von PDC in entzündetes Gewebe dargestellt. Hier nehmen PDC Antigene auf, interagieren mit lokalen Effektorzellen und können direkte zytotoxische Effekte vermitteln. Anschließend wandern PDC über das Blut in sekundäres lymphatisches Gewebe, wo sie durch Wechselwirkungen mit naiven T-Zellen die entstehende adaptive Immunantwort regulieren (untere Hälfte der Abbildung). Abbildung modifiziert nach Schuster et al. 2011.

87 Diskussion

Dieses Modell des Lebenszyklus von PDC in der Infektion mit HSV-1 legt nahe, dass PDC an zwei unterschiedlichen Orten mit anderen Zellen des Immunsystems interagieren können. So könnten einerseits Effektorfunktionen am Ort der Infektion reguliert werden, andererseits aber, durch die Wechselwirkung mit naiven T-Zellen oder Antigen-präsentierenden Zellen (APC) in lymphatischen Geweben, auch die entstehende adaptive Immunreaktion beeinflusst werden. An diesen Prozessen könnten die Rezeptoren CD2, CD40, CD48, CD50, CD54, CD55, CD58, CD80, CD97, CD229, CD274, CD319, HLA-A/B/C und HLA-DR, die in der vorliegenden Studie auf der Oberfläche humaner PDC nachgewiesen wurden, beteiligt sein. Mögliche Funktionen und Interaktionen dieser Rezeptoren sollen, zusammen mit anderen auf PDC beschriebenen regulatorischen Molekülen, im weiteren Verlauf dieser Arbeit diskutiert werden (siehe unten). Am Ort der Infektion könnten PDC neben der Sekretion von Typ1 Interferonen auch durch Zell-Zell-Kontakt-abhängige Mechanismen auf infizierte Zellen einwirken. Die erhöhte Expression von CD253 (TRAIL) auf PDC könnte, möglicherweise zusammen mit der Sekretion von Granzym B, zytotoxische Funktionen vermitteln (Chaperot et al. 2006; Drobits et al. 2012; Kalb et al. 2012; Bratke et al. 2010) und somit die Ausbreitung der Infektion limitieren. Die Funktion von PDC-Oberflächenrezeptoren in der Immunreaktion gegen HSV-1 soll in zukünftigen Studien im Detail untersucht werden.

Die Stimulation humaner PDC mit infektiösem HSV-1 (HSVINF) induzierte die Regulation von Oberflächenrezeptoren in einem vergleichbaren Ausmaß wie dies auch nach der Stimulation mit HSVUV zu beobachten war. Auch wenn die Bestrahlung mit UV-Licht das in diesen Versuchen eingesetzte Virus nicht vollständig inaktivierte, war diese einheitliche Regulation nicht auf die residuale Infektiosität von HSV-1 zurückzuführen. Darüber hinaus konnte durch die Quantifizierung von HSV- Genomen und unter Verwendung des autofluoreszierenden HSV-1-Klons 166v gezeigt werden, dass die Inkubation von PDC mit HSV-1 weder zu einer produktiven Infektion noch zur Replikation der viralen DNA führte (Abb. 6). Die Aufnahme viraler Partikel erfolgte sehr schnell und wurde teilweise durch Endozytose vermittelt (Abb. 7). Die Aktivierung humaner PDC unabhängig von der Infektiosität von HSV-1 konnte zusätzlich durch die Sekretion vergleichbarer Mengen an IFNα nach Stimulation mit infektiösem oder UV-inaktiviertem HSV-1 gezeigt werden. Eine frühe Blockade im Infektionszyklus wurde auch von Donaghy et al. beschrieben, die keine Transkription der immediate early Gene von HSV-2 in humanen PDC detektieren konnten (Donaghy

88 Diskussion et al. 2009). Des Weiteren induzierten sowohl HSV-1 (Krug et al. 2004) als auch HSV-2 (Lund et al. 2003) die Freisetzung von IFNα in murinen PDC unabhängig von der Infektiosität der Viren. In diesen Studien konnte gezeigt werden, dass die Induktion der IFN-Sekretion durch TLR9 vermittelt wurde, da PDC TLR9-defizienter Mäuse, sowie PDC aus Wildtyp-Mäusen nach Blockade des TLR9 mittels inhibitorischer Oligodesoxyribonukleotide (ODN) kaum IFNα freisetzten (Lund et al. 2003; Krug et al. 2004). Darüber hinaus war auch die verstärkte Expression von CD86 (B7-2) von der TLR9-vermittelten Signaltransduktion abhängig (Krug et al. 2004). In humanen PDC konnte die HSV-1-induzierte Sekretion von Typ1 IFN ebenfalls durch inhibitorische ODN reduziert werden (Peng et al. 2007). Die Kultivierung mit Chloroquin, das die Endozytose inhibiert, blockierte ebenfalls die Produktion von IFNα nach Stimulation humaner PDC mit HSV-1 (Schmidt et al. 2005; Megjugorac et al. 2004) oder muriner PDC mit HSV-2 (Lund et al. 2003). Auch im Falle der Stimulation humaner PDC mit dem Humanen Cytomegalovirus (HCMV) konnte in der Abwesenheit einer permissiven Infektion eine TLR9-vermittelte Aktivierung und Sekretion von IFNα beobachtet werden (Varani et al. 2007). In einer Studie von Hochrein und Kollegen konnte zusätzlich eine TLR9-unabhängige Sekretion von IFNα aus murinen PDC nach Stimulation mit HSV beschrieben werden (Hochrein et al. 2004), diese war jedoch abhängig von der Infektiosität des Virus und konnte durch inaktiviertes HSV nicht induziert werden (Hochrein et al. 2004; Lund et al. 2003).

Die in der vorliegenden Arbeit erhobenen Daten legen eine zentrale Rolle der PDC in der Erkennung, Kontrolle und Abwehr herpesviraler Infektionen nahe. Neben den direkten antiviralen Effektorfunktionen von PDC scheinen insbesondere regulatorische Interaktionen mit anderen Zelltypen der nativen und adaptiven Immunität involviert zu sein. Durch die Analyse der Expression und Regulation von PDC-Oberflächenrezeptoren konnte eine Vielzahl von Molekülen identifiziert werden, die an diesen interzellulären Wechselwirkungen beteiligt sein könnten. Im zweiten Teil der Arbeit sollte daher der Einfluss von PDC auf andere Zellen des Immunsystems näher charakterisiert werden.

Die Immunreaktion gegen HSV-1 in humanen PBMC wurde in der vorliegenden Arbeit insbesondere anhand der Sekretion von Interferon-gamma (IFNγ) analysiert. Im Zusammenhang mit HSV-Infektionen wurde die Expression dieses Zytokins in verschiedenen Zelltypen wie NK-Zellen (Barr et al. 2007; Reading et al. 2007), γδT-Zellen

89 Diskussion

(Kodukula et al. 1999; Nishimura et al. 2004), CD4-positiven T-Zellen (Yu, Manickan, und Rouse 1996; Cunningham et al. 2006; Iijima et al. 2008; Milligan et al. 2004) und CD8-positiven T- Zellen (Dobbs et al. 2005; Theil et al. 2003; Cunningham et al. 2006; Pollara, Katz, und Chain 2004; Khanna et al. 2004; Decman et al. 2005; T. Liu et al. 2001) beschrieben, was die Analyse der Reaktivität von Zellen des nativen und adaptiven Immunsystems ermöglichte. Durch die Inhibition der viralen Replikation (Feduchi, Alonso, und Carrasco 1989; Sainz und Halford 2002; Pierce et al. 2005) scheint IFNγ eine zentrale Rolle in der Limitierung der Ausbreitung von HSV-Infektionen am Ort der lytischen Infektion (Nishimura et al. 2004; Reading et al. 2007; Iijima et al. 2008; Dobbs et al. 2005; Milligan et al. 2004; Cunningham et al. 2006; Yu, Manickan, und Rouse 1996), aber auch in der Inhibition der Reaktivierung in neuronalen Zellen (Kodukula et al. 1999; Theil et al. 2003; Cunningham et al. 2006; Pollara, Katz, und Chain 2004; Khanna et al. 2004; Decman et al. 2005; T. Liu et al. 2001; Cantin, Tanamachi, und Openshaw 1999) zu vermitteln. Da IFNγ zusätzlich die Expression von MHC-I auf HSV- infizierten Zellen erhöht, verstärkt es auch die Lyse durch zytotoxische CD8-positive T-Zellen (Cunningham et al. 2006). Um den Verlauf der Immunreaktion sowohl im Kontext der primären Infektion als auch der Reaktivierung einer bereits etablierten latenten Infektion mit HSV-1 zu verfolgen, wurden HSV-seronegative und – seropositive Spender in die Studie aufgenommen. Somit konnten Serostatus- abhängige Unterschiede in der Reaktivität einzelner Zelltypen des Immunsystems identifiziert werden. Die Rolle Plasmazytoider Dendritischer Zellen in der Immunreaktion gegen HSV-1 wurde durch die Depletion dieser Zellpopulation vor der Stimulation analysiert. Darüber hinaus wurde die Reaktivität verschiedener Zelltypen nach der Rekonstitution der PDC-depletierten PBMC durch die erneute Zugabe von PDC oder Zellkulturüberständen HSV-stimulierter PDC bestimmt, um zwischen Zellkontakt-abhängigen Interaktionen und Effekten von löslichen Stoffen zu diskriminieren.

Im ersten Schritt wurde die Sekretion von Typ1 und Typ2 Interferonen in den Zellkulturüberständen von PBMC HSV-seronegativer und –seropositiver Spender untersucht. Dabei ergab sich bezüglich der Stimulation mit infektiösem HSV-1

(HSVINF) eine signifikante Freisetzung von IFNα, die nicht vom Serostatus der Donoren beeinflusst wurde (Abb. 8a). In beiden Spendergruppen konnte nach

Stimulation mit HSVINF auch die Produktion von IFNγ detektiert werden (Abb.8b). Die Konzentration von IFNγ in den Kulturüberständen seronegativer Spender war jedoch signifikant höher als nach Stimulation von PBMC seropositiver Spender, was mit

90 Diskussion einem leicht erhöhten Anteil infizierter Monozyten in den Kulturen assoziiert war (p=0,165) (Abb. 8c). Die geringere Sekretion von IFNγ bei seropositiven Spendern könnte also durch eine bessere Kontrolle der Infektion und der damit verbundenen reduzierten Ausbreitung des Virus in den Kulturen, bedingt durch Effektorfunktionen der adaptiven Immunität erklärt werden.

Die Identifizierung der IFNγ-sezernierenden Zellen in der primären Antwort gegen

HSVINF, also in den Kulturen von PBMC seronegativer Spender, zeigte eine Beteiligung von CD3-negativen Zellen, CD8-positiven T-Zellen sowie von T-Zellen, die weder CD4 noch CD8 exprimierten (doppelt negativ, DN) (Abb. 9a und b). Durch die Analyse des T-Zellrezeptors (TCR) konnte in der T-Zellpopulation ein mittlerer Anteil von 4,4% γδT-Zellen nachgewiesen werden. 86% der γδT-Zellen exprimierten weder CD4 noch CD8 und repräsentierten so mit 74,4% den Großteil der DN T- Zellpopulation. Die Sekretion von IFNγ in den Kulturen seronegativer Spender, unter direkter Identifikation von γδT-Zellen, wurde in vier Experimenten untersucht, wobei die Produktion von IFNγ im Mittel für 5,7% der γδT-Zellen beobachtet werden konnte. Der wesentliche Beitrag von γδT-Zellen an der Freisetzung von IFNγ wurde in der vorliegenden Arbeit deutlich, da sie trotz ihrer geringen Frequenz etwa die Hälfte der IFNγ-sezernierenden T-Zellen repräsentierten (Abb. 9b und c). Nach Parker und Kollegen sind humane γδT-Zellen im adulten peripheren Blut mit einem Anteil von etwa 5% der T-Zellen vertreten und exprimieren dort zu über 70% einen TCR aus den Ketten Vγ2 (entspricht Vγ9) und Vδ2. Der Großteil dieser Population ist negativ für CD4 und CD8 (Parker et al. 1990). Es wurde bereits eine Reihe verschiedener Antigene beschrieben, die die Aktivierung von γδT-Zellen vermitteln, ein einheitliches Modell zu Reaktivität dieser Zellen konnte bisher jedoch nicht identifiziert werden. Zu den bekannten Antigenen zählen insbesondere körpereigene Stoffe, die bedingt durch eine Infektion oder zellulären Stress verstärkt oder verändert präsentiert werden wie MICA, MICB und ULBP, oder Phosphoantigene wie IPP und DMAPP. Einige dieser Phosphoantigene sind Stoffwechselprodukte eukaryotischer Zellen, treten jedoch auch in prokaryotischen Pathogenen auf. Zur Aktivierung von γδT- Zellen müssen diese Stoffe nicht prozessiert oder an klassischen MHC-Molekülen präsentiert werden, eine Erkennung durch den TCR scheint jedoch essentiell zu sein (Champagne 2011; Hayday 2000; Sciammas und Bluestone 1999; Münz, Steinman, und Fujii 2005; Eberl und Moser 2009). Neben Signalen über den TCR wird die Reaktivität von γδT- Zellen durch eine Vielzahl koregulatorischer Mechanismen, vermittelt durch

91 Diskussion

Rezeptoren wie TLR, CD16, CD28, CD226, NKG2D und CD94/NKG2A (Champagne 2011; Halary et al. 1997) oder Zytokine wie IL-1, IL-7, IL12, IL-15 und Typ1 IFN kontrolliert (Hayday 2000; Vermijlen et al. 2007; S Rothenfusser et al. 2001; Devilder et al. 2009; Fowler et al. 2012). Im Mausmodell konnte ein γδT-Zellklon identifiziert werden, der spezifisch auf das Glykoprotein I (gI) von HSV-1 reagiert, wobei dies im humanen System nicht beobachtet werden konnte (R. M. Johnson et al. 1992; Sciammas et al. 1994; Champagne 2011; Hayday 2000). In der Immunreaktion von Mäusen gegen eine primäre Infektion mit HSV-2 konnte die Migration von γδT-Zellen in genitale Läsionen beobachtet werden (Nishimura et al. 2004; Rakasz et al. 1999). Eine wichtige Funktion von γδT-Zellen scheint in der frühzeitigen Produktion von IFNγ zu liegen, wodurch die Ausbreitung viraler Partikel in neuronales Gewebe limitiert wird (T. Liu, Tang, und Hendricks 1996; Sciammas et al. 1997; Kodukula et al. 1999; Hayday 2000) und die Polarisierung der entstehenden adaptiven Immunantwort in Richtung Th1 verstärkt wird (Nishimura et al. 2004). Die Rolle von humanen γδT-Zellen in der primären Infektion mit HSV wurde bisher kaum untersucht. In einer Studie von Verjans und Kollegen konnten IFNγ-produzierende γδT-Zellen in erstmalig auftretenden Läsionen einer HSV-1- Infektion detektiert weden, die jedoch in vitro auf infizierte Zellen weder mit Zytotoxizität noch mit Proliferation reagierten (Verjans et al. 2004). Durch die Stimulation von PBMC HSV-1-seropositiver Donoren mit HSV-infizierten Zellen konnte eine Expansion von γδT-Zellen beobachtet werden, was bei seronegativen Spendern nicht der Fall war (Maccario et al. 1993; Maccario et al. 1995; Bukowski, Morita, und Brenner 1994). Da γδT-Zellen in ihrer Proliferation von IL-2 abhängig sind, dieses Zytokin selbst aber kaum produzieren (Casetti et al. 2005), könnte die fehlende Expansion indirekt auf die Abwesenheit reaktivierter CD4-positiver Gedächtnis-Zellen zurückgeführt werden. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals die Sekretion von IFNγ aus γδT-Zellen seronegativer Spender bedingt durch die in vitro Stimulation mit HSV-1 beschrieben werden. Bezüglich der Analyse der Sekretion von IFNγ lag der Fokus der vorliegenden Studie auf T-Zellen. In der Infektion mit HSV wurden jedoch neben unterschiedlichen T-Zellpopulationen insbesondere NK-Zellen als wichtige IFNγ-Produzenten beschrieben (Barr et al. 2007; Reading et al. 2007). Diese Zellpopulation wird derzeit in einem anderen Projekt der Arbeitsgruppe in ihrer Wertigkeit für die native Immunabwehr gegen HSV-1 untersucht. Die Freisetzung von IFNγ aus CD8- positiven T-Zellen seronegativer Spender legt nahe, dass auch diese Zellpopulation

92 Diskussion durch native Mechanismen unabhängig von der Präsentation viraler Antigene an MHC-I aktiviert wurde (siehe unten).

Nach der Stimulation der Zellen seropositiver Spender mit HSVINF sezernierten CD3- negative Zellen ebenfalls IFNγ (Abb. 9a), die Freisetzung aus CD8-positiven und DN T-Zellen fiel, verglichen zu seronegativen Spendern, jedoch signifikant geringer aus (jeweils p<0,001). Diese Unterschiede wurden auch bezüglich des direkten Nachweises von γδT-Zellen deutlich. Die Produktion von IFNγ aus CD4-positiven T- Zellen konnte dagegen selektiv nur in den Kulturen seropositiver Donoren beobachtet werden (Abb. 9b). Die Arbeitsgruppe um Asanuma konnte im humanen Blut seropositiver Donoren CD4-positive HSV-spezifische Gedächtnis-T-Zellen mit einer Frequenz von 0,22% nachweisen (Asanuma et al. 2000). Der Anteil IFNγ- sezernierender CD4-positiver T-Zellen lag in der vorliegenden Arbeit mit 0,05% deutlich unterhalb dieses Wertes (Abb. 9b). Auch wenn der Nachweis dieser Zellpopulation bei Asanuma et al. ebenfalls anhand der Sekretion von IFNγ ermittelt wurde, könnte die verstärkte Produktion auf den unterschiedlichen Stimulationsbedingungen wie der Verwendung infizierter Zelllysate oder der zusätzlichen Kostimulation durch Antikörper gegen CD28 beruhen (Asanuma et al. 2000). In früheren Experimenten unserer Arbeitsgruppe konnte, nach der Stimulation von PBMC seropositiver Spender mit einem infizierten Verozell-Lysat, ebenfalls ein Anteil IFNγ-freisetzender CD4-positiver T-Zellen von über 0,20% detektiert werden (Kittan et al. 2007). Ein weiterer Hinweis auf die Reaktivierung von CD4-positiven Gedächtnis-T-Zellen seropositiver Donoren wurde durch die Stimulation mit UV- inaktiviertem HSV-1 (HSVUV) deutlich. In der Veröffentlichung von Green et al. konnte bereits gezeigt werden, dass die Sekretion von IFNγ nach Stimulation mit HSVUV auf Zellen seropositiver Spender begrenzt war (Green, Yeh, und Overall 1981). Dies konnte in der vorliegenden Arbeit durch die Analyse der IFNγ-Konzentration in den Zellkulturüberständen bestätigt werden, da hier, im Gegensatz zu einer Serostatus- unabhängigen Freisetzung von IFNα, nur in den Kulturen von PBMC seropositiver Donoren signifikante Mengen an IFNγ detektiert wurden (Abb. 8a und b). Die Identifizierung der an der Sekretion beteiligten Zellpopulationen zeigte, dass in Folge der Kultivierung mit HSVUV nahezu ausschließlich CD4-positive T-Zellen IFNγ produzierten (Abb. 12a). Auch wenn der Anteil dieser Zytokin-sezernierenden Zellen gering ausfiel, konnten ähnliche Werte ermittelt werden wie sie auch nach der

Stimulation mit HSVINF zu detektieren waren. Im Gegensatz dazu konnten in den

93 Diskussion

Kulturen der Zellen seronegativer Spender nach Stimulation mit HSVUV keine IFNγ- freisetzenden CD4-positiven T-Zellen nachgewiesen werden (Abb. 12b). Zur Induktion der Proliferation von CD4-positiven Gedächtnis-T-Zellen sind verglichen zu naiven T-Zellen geringere Mengen an Antigenen und weniger kostimulatorische Signale nötig (London, Lodge, und Abbas 2000; Berard und Tough 2002; MacLeod, Kappler, und Marrack 2010). In den Proliferationsanalysen der vorliegenden Arbeit konnte innerhalb der T-Zellpopulation seropositiver Spender die Expansion von CD4-positiven T- Zellen dementsprechend sowohl nach Stimulation mit infektiösem wie auch UV- inaktiviertem HSV-1 beobachtet werden (Abb. 12c). Um die Spezifität dieser Zellen gegenüber HSV-1 zu untersuchen, sollen in weiteren Experimenten zur Proliferation auch PBMC seronegativer Spender analysiert werden. Neben CD4-positiven Gedächtnis-T-Zellen (Cunningham et al. 1985; Cunningham et al. 2006; Koelle, Abbo, et al. 1994; Koelle, Corey, et al. 1994; Koelle, Posavad, et al. 1998; Koelle, Frank, et al. 1998; Schmid 1988; M. Kim et al. 2008; Chentoufi et al. 2008; Mikloska und Cunningham 1998) werden im Verlauf der Infektion mit HSV auch durch adaptive HSV-spezifische CD8-positive T-Zellen wichtige Effekte vermittelt. (Azumi und Atherton 1994; Ghiasi et al. 1999; Koelle, Posavad, et al. 1998; Simmons und Tscharke 1992; T. Liu et al. 2000; M. B. Parr und Parr 1998; Dobbs et al. 2005; Theil et al. 2003; Khanna et al. 2003; Verjans et al. 2007; J. Zhu et al. 2007). Die Reaktivität dieser

CD8-positiven T-Zellen nach Stimulation mit HSVINF fiel in den Kulturen seropositiver Spender jedoch sowohl bezüglich der Sekretion von IFNγ (Abb. 9b) als auch bezüglich der Expansion (Abb. 12c) sehr gering aus. Die Beobachtung einer fehlenden Reaktivierung von CD8-positiven Gedächtnis-T-Zellen unter diesen

Kultivierungsbedingungen wurde zusätzlich durch die Stimulation mit HSVUV deutlich, da so weder die Freisetzung von IFNγ (Abb. 12a) noch die Proliferation (Abb. 12c) von CD8-positiven T-Zellen induziert werden konnte. Diese Ergebnisse wurden auch durch die Experimente der Arbeitsgruppe um Asanuma unterstützt, die im humanen peripheren Blut keine Reaktivierung von CD8-positiven Gedächtnis-T-Zellen identifizieren konnten (Asanuma et al. 2000). Im Gegensatz dazu konnte jedoch die Migration von zytotoxischen CD8-positiven T-Zellen zum Ort der HSV-Infektion detektiert und diese Zellen auch aus herpesviralen Läsionen isoliert werden (Cunningham et al. 2006; Cunningham et al. 1985; Koelle, Abbo, et al. 1994; Koelle et al. 2001; Koelle, Posavad, et al. 1998; Posavad et al. 2000). Diese widersprüchlichen Beobachtungen könnten einerseits durch eine niedrige Frequenz dieser Zellpopulation in Blut, andererseits aber auch durch eine zeitlich verzögerte Aktivierung erklärt werden, da

94 Diskussion die Infiltration von CD8-positiven T-Zellen erst erfolgte, nachdem CD4-positive T- Zellen bereits an den Ort der Infektion gewandert waren (Cunningham et al. 1985; Cunningham et al. 2006; Koelle, Abbo, et al. 1994; Koelle, Posavad, et al. 1998). Des Weiteren konnte eine Subpopulation CD8-positiver Gedächtnis-T-Zellen identifiziert werden, die dauerhaft am Ort der Infektion verbleibt. So wurden aktivierte CD8-positive Gedächtnis-T-Zellen in latent Infizierten Trigeminalganglien identifiziert (Knickelbein et al. 2008; Himmelein et al. 2011; Wakim et al. 2008; Gebhardt et al. 2009), die durch die Produktion von IFNγ und Granzym B die Reaktivierung einer latenten HSV-1- Infektion verhinderten (Knickelbein et al. 2008). Zusätzlich konnte diese Zellpopulation auch in der Haut, insbesondere in den Arealen einer abgelaufenen HSV-Infektion, identifiziert, und ein protektiver Effekt auf eine erneute Infektion beschrieben werden (Gebhardt et al. 2009; Mackay et al. 2012).

In der vorliegenden Arbeit war die Sekretion von IFNγ aus γδT-Zellen seropositiver Spender sehr gering. Sowohl Maccario und Kollegen wie auch Bukowski und Kollegen konnten zeigen, dass die Proliferation humaner γδT-Zellen in PBMC auf seropositive Spender begrenzt war (siehe oben) und die expandierte Zellpopulation HSV-infizierte Zellen lysierte (Bukowski, Morita, und Brenner 1994; Maccario et al. 1993; Maccario et al. 1995). In diesen Studien erfolgte die Stimulation humaner PBMC jedoch mit PHA-stimulierten PBMC, die mit HSV-1 infiziert und anschließend fixiert wurden (Maccario et al. 1992) und nicht wie in der vorliegenden Arbeit durch die direkte Zugabe viraler Partikel. Des Weiteren wurde die Sekretion von IFNγ nicht analysiert. Da durch diese von Maccario et al. beschriebene Methode neben γδT-Zellen auch CD8- positive T-Zellen seropositiver Spender aktiviert wurden, soll in weiteren Experimenten unserer Arbeitsgruppe die Sekretion von IFNγ und zytotoxische Funktionen dieser Zelltypen in Kokulturen mit HSV-infizierten Zellen analysiert werden. Durch Versuche mit isolierten γδT-Zellen und CD8-positiven T-Zellen sollen zusätzlich direkte aktivierende Signale identifiziert werden.

Da die Sekretion von IFNγ aus γδT-Zellen, CD8-positiven T-Zellen und, weniger deutlich, auch aus CD3-negativen Zellen, in den Kulturen der PBMC seronegativer Spender erhöht ausfiel, stellte sich die Frage, ob diese Zellpopulationen bei seropositiven Donoren weniger stark aktiviert wurden. Insbesondere bezüglich der der NK- und γδT-Zellen erfolgt die Aktivierung durch Mechanismen, die auf der Erkennung gestresster Zellen anhand der Abwesenheit oder der verstärkten

95 Diskussion

Präsentation körpereigener Liganden beruhen (Champagne 2011; Eberl und Moser 2009; Hayday 2000; Münz, Steinman, und Fujii 2005; Sciammas und Bluestone 1999; Vivier et al. 2008; Vivier 2006). Durch die Effektorfunktionen adaptiver CD4-positiver T-Zellen in den Kulturen seropositiver Spender könnten diese Veränderungen auf der Oberfläche infizierter Zellen unterdrückt werden, wodurch die Reaktivität der beiden nativen Zellpopulationen geringer ausfiele. Um die Aktivierung der analysierten Zellpopulationen in den PBMC seropositiver und seronegativer Spender zu quantifizieren, wurde die Induktion des frühen Aktivierungsmarkers CD69 untersucht. Analog zur Sekretion von IFNγ konnte nach der Stimulation der Zellen seronegativer

Spender mit HSVINF verglichen mit seropositiven Donoren eine leicht erhöhte Expression von CD69 auf CD3-positiven, CD3-negativen, CD8-positiven T-Zellen und DN T-Zellen, sowie eine leicht reduzierte Induktion auf CD4-positiven T-Zellen beobachtet werden (Abb.: 10a und b). Diese Serostatus-abhängigen Differenzen fielen im Gegensatz zur Sekretion von IFNγ geringer aus, so dass keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Spendergruppen identifiziert werden konnten. Mit einem Anteil CD69-exprimierender γδT-Zellen von 0,32% bei seropositiven und 1,88% bei seronegativen Spendern, war die Aktivierung dieser Zellpopulation mit dem Serostatus assoziiert (Abb. 10c). Die reduzierte Freisetzung von IFNγ in den Kulturen der Zellen seropositiver Spender konnte also, mit Ausnahme von γδT- Zellen, nicht auf eine geringere Aktivierung der jeweiligen Zellpopulationen zurückgeführt werden.

Einen weiteren Mechanismus, der bei vergleichbarer Aktivierung von Zellpopulationen zu einer abweichenden Sekretion von IFNγ führen könnte, stellt die Polarisation der Immunreaktion dar. Die am besten untersuchten Polarisationsmuster stellen Th1, das an der Reaktion gegen intrazelluläre Pathogene und Viren beteiligt ist, und Th2 dar, das die humorale Immunreaktion gegen extrazelluläre Parasiten fördert. Die Polarisation in Richtung Th17 ist mit der Reaktion gegen Bakterien und Pilze, aber auch mit Autoimmunerkrankungen assoziiert (Liao, Lin, und Leonard 2011). Diese Polarisationen werden durch die Freisetzung unterschiedlicher Zytokine etabliert. In den Überständen der Kulturen von Zellen seronegativer Spender konnte nach Stimulation mit HSVINF eine verstärkte Sekretion von Interleukin-12 (IL-12) und IL-8 detektiert werden, dagegen erfolgte eine HSV-1-induzierte Freisetzung von IL-2 und IL-10 nur nach Stimulation der Zellen seropositiver Donoren. Neben IFNγ konnte in beiden Spendergruppen die Produktion der proinflammatorischen Zytokine IL-1β

96 Diskussion und IL-6 nachgewiesen werden (Abb. 11). Das Zytokinmilieu unterschied sich also in Abhängigkeit vom Serostatus der Spender, wobei IL-4 als typisches Th2-Zytokin, sowie IL-17 als Schlüsselzytokin einer Th17-Antwort, nicht detektiert werden konnten. Das proinflammatorische Zytokin IL-8 (CXCL8) hat die Funktion eines Chemokins, das neben neutrophilen Granulozyten auch T-Zellen rekrutiert (Larsen et al. 1989). Die Produktion von IL-8 konnte in der humanen monozytenartigen Zellline THP-1 durch die Bindung von HSV-1 gB an TLR2 induziert werden (Cai et al. 2013). Ein wichtiger Beitrag von IL-8 an der Etablierung einer Immunreaktion konnte in den Experimenten zur DNA-basierten Vakzinierung von Mäusen gezeigt werden (Sin et al. 2000). Hier konnte durch die intramuskuläre Injektion eines Plasmides kodierend für gD von HSV-2 die Bildung HSV-spezifischer CD4-positiver T-Zellen induziert werden. Bei gleichzeitiger Gabe von IL-8-kodierenden Plasmiden konnten nach Restimulation eine erhöhte Proliferation, sowie eine verstärkte Sekretion von IL-2 und IFNγ innerhalb dieser Zellpopulation beobachtet werden (Sin et al. 2000). Die Sekretion von IL-12 konnte in den Läsionen einer HSV-Infektion detektiert werden (Mikloska et al. 1998; Cunningham et al. 1985). Es ist ein zentrales Zytokin, das die Differenzierung naiver CD4-positiver T-Zellen zu Th1-Zellen induziert (G Trinchieri und Gerosa 1996; Liao, Lin, und Leonard 2011) und somit deren Sekretion von IFNγ, IL-2, aber auch IL-10 verstärkt (G Trinchieri und Gerosa 1996; Cyktor und Turner 2011). Neben diesen längerfristigen Effekten auf die Polarisierung von Helfer-Zellen, wurden jedoch weitere Funktionen von IL-12 in der Immunreaktion beschrieben. So konnte die Sekretion von IFNγ aus ruhenden oder aktivierten NK-Zellen und T-Zellen alleine durch die Inkubation mit IL-12 induziert werden (G Trinchieri 1994; B. E. Freeman et al. 2012). Diese Reaktion erfolgte ohne weitere Signale, konnte jedoch durch IL-2, TNFα, IL-1β (G Trinchieri 1994) oder IL-18 (Balasubramani et al. 2010; Berg, Cordes, und Forman 2002) verstärkt werden. Dieser Mechanismus der Zytokin-vermittelten Sekretion von IFNγ könnte auch der in der vorliegenden Arbeit beobachteten Reaktion CD8-positiver T-Zellen seronegativer Spender zu Grunde liegen. Da diese Freisetzung von IFNγ zwar durch Signale des T-Zellrezeptors oder durch kostimulatorische Signale über CD28 verstärkt werden kann, diese jedoch nicht essentiell sind (G Trinchieri 1994; Berg, Cordes, und Forman 2002), ist die Reaktion nicht auf die spezifische Erkennung eines Pathogens begrenzt und könnte somit auch beim ersten Kontakt mit HSV-1 Antigen-unabhängig induziert werden. IL-10 wird insbesondere von CD4-positiven T-Zellen nach Restimulation sezerniert (Kadowaki et al. 2000; Mosser und Zhang 2008; Cyktor und Turner 2011), was die

97 Diskussion selektive Produktion dieses Zytokins in den Kulturen der Zellen seropositiver Spender erklären könnte. Dieses anti-inflammatorische Zytokin dämpft die Immunreaktion, indem es die Aktivierung von T-Zellen inhibiert. Dieser Effekt wird einerseits durch eine reduzierte Expression von MHC-II, CD80 und CD86 auf Antigen-präsentierenden Zellen, zusammen mit einer reduzierten Reifung von dendritischen Zellen vermittelt, was die Präsentation von Antigenen limitiert, andererseits wird auch die Sekretion proinflammatorischer Zytokine inhibiert (Cyktor und Turner 2011; Mosser und Zhang 2008; Aurelian 2004; G Trinchieri 1994; G Trinchieri und Gerosa 1996; de Malefyt et al. 1991). Zu den Zytokinen, deren Sekretion durch IL-10 inhibiert werden, zählt auch IL-12 (Mosser und Zhang 2008; G Trinchieri 1994; G Trinchieri und Gerosa 1996), das in der vorliegenden Arbeit in den Kulturen seropositiver Spender nicht zu detektieren war. Die reduzierte Freisetzung von IFNγ aus CD8-positiven T-Zellen seropositiver Spender könnte also indirekt durch IL-10 vermittelt werden. Trotz der Produktion von IL-10 und der fehlenden Sekretion von IL-12 konnte die Sekretion von IFNγ aus CD4-positiven T-Zellen seropositiver Spender detektiert werden (Abb. 9b). Dies könnte dadurch erklärt werden, dass IL-12 zwar an der Induktion, nicht aber der Aufrechterhaltung einer Th1-Antwort beteiligt ist (Gazzinelli et al. 1994), des Weiteren ist die direkte Wirkung von IL-10 hauptsächlich auf die Inhibition der Signaltransduktion von CD28 in naiven CD4-positiven T-Zellen begrenzt, da sowohl aktivierte T-Zellen wie auch Gedächtnis-T-Zellen nur geringe Mengen des Rezeptors für IL-10 exprimieren (Mosser und Zhang 2008). IL-2 wird vorwiegend von CD4-positiven T-Zellen nach deren Antigen-spezifischer Aktivierung sezerniert (Liao, Lin, und Leonard 2011; Liao, Lin, und Leonard 2013; Katzman et al. 2011). Dementsprechend konnte dieses Zytokin in der vorliegenden Arbeit nur nach Stimulation von Zellen seropositiver Spender detektiert werden (Abb. 11). Die am besten untersuche Funktion von IL-2 stellt der verstärkende Effekt auf die Proliferation von T-Zellen dar (Liao, Lin, und Leonard 2011; Liao, Lin, und Leonard 2013; Katzman et al. 2011), die in der vorliegenden Arbeit nahezu ausschließlich auf CD4-positive T-Zellen seropositiver Spender begrenzt war (Abb. 12c).

Um den Einfluss von PDC auf die Immunantwort gegen infektiöses HSV-1 zu untersuchen, wurden PBMC nach der Depletion von PDC stimuliert. In der Abwesenheit von PDC war die Konzentration von IFNα in den Zellkulturüberständen stark reduziert (Abb. 13a), was die zentrale Rolle dieser Zellpopulation in der Sekretion von Typ1 Interferonen verdeutlichte. Zusätzlich konnten deutlich geringere

98 Diskussion

Mengen an IFNγ und ein erhöhter Anteil infizierter Monozyten detektiert werden (Abb. 13b und c). Durch die erneute Zugabe von PDC zur PDC-depletierten PBMC- Population konnten diese Effekte revertiert werden. Somit konnte für humane PDC, neben ihrer Rolle in der Produktion von IFNα, ein verstärkender Einfluss auf die Sekretion von IFNγ, sowie ein limitierender Effekt auf die Etablierung der Infektion von Monozyten nachgewiesen werden (Abb. 13). Da in diesen Versuchen PDC mit einem Anteil von 10% im Überschuss zugegeben wurden, konnten höhere Konzentrationen an IFNα, sowie geringere Anteile infizierter Monozyten als nach der Stimulation der vollständigen, unbehandelten PBMC detektiert werden. Im Gegensatz dazu konnte durch die Rekonstitution der PBMC-Population zwar eine signifikant erhöhte Sekretion von IFNγ verglichen zu PDC-depletierten PBMC induziert werden, die Konzentration im Zellkulturüberstand erreichte jedoch nicht die Werte, die in der vollständigen PBMC-Population ermittelt wurden. Einen Grund hierfür könnte der reduzierte Anteil infizierter Monozyten bedingt durch die erhöhte Konzentration von IFNα unter diesen Kultivierungsbedingungen darstellen, wodurch weniger IFNγ-sezernierende Zellen aktiviert werden könnten. Eine weitere Ursache könnte in der Methodik der PDC-Depletion mittels magnetischer Separation und dem damit verbundenen Stress liegen. Um die Effekte Zell-vermittelter und löslicher Faktoren von PDC auf den Verlauf der Immunreaktion gegen HSV-1 zu diskriminieren, wurden PDC-depletierte PBMC neben der beschriebenen Rekonstitution mit PDC auch mit Kulturüberständen HSV-stimulierter PDC versetzt. In diesen Ansätzen erfolgte die Zugabe der PDC-Überstände direkt im Anschluss an die Stimulation der PDC-depletierten PBMC, wodurch in den Kulturen eine IFNα- Konzentration von 500pg/ml erreicht wurde. Unter dieser Bedingung war die Sekretion von IFNα stark reduziert und es konnten nach der Inkubationsphase von 20 Stunden Konzentrationen ermittelt werden, die im Bereich der eingesetzten Menge lagen (Abb. 13a). Der Grund für diese geringe Sekretion von IFNα nach der frühzeitigen Zugabe von PDC-Überständen stellte sehr wahrscheinlich die effektive Blockade der Infektion dar, was auch an der geringen Zahl infizierter Monozyten deutlich wurde (Abb. 13c). Der Anteil infizierter Monozyten nach Zugabe von PDC- Überständen wurde in vier Experimenten ermittelt, wodurch keine statistische Analyse der Ergebnisse möglich war. Trotz der Reduktion der Produktion von IFNα und der Infektion von Monozyten konnten jedoch IFNγ-Konzentrationen detektiert werden, die im Bereich der rekonstituierten PBMC-Population lagen (Abb. 13b).

99 Diskussion

Neben der absoluten Konzentration löslicher antiviraler Stoffe von PDC scheint also insbesondere die Kinetik ihrer Produktion einen verstärkenden Einfluss auf die Sekretion von IFNγ und einen limitierenden Effekt auf die Replikation von HSV-1 zu vermitteln.

Um die Effekte von PDC auf die Sekretion von IFNγ auf zellulärer Ebene zu analysieren, wurden die Anteile IFNγ-produzierender Zellen nach der Depletion von PDC und der Rekonstitution der PBMC-Population quantifiziert. In der Abwesenheit von PDC war die Sekretion von IFNγ aus CD3-positiven und CD3-negativen Zellen, sowie aus CD8-positiven, CD4-positiven und doppelt negativen T-Zellen deutlich reduziert (Abb. 14a). Durch die erneute Zugabe von PDC zur PDC-depletierten PBMC-Population konnte die Zahl der IFNγ-produzierenden Zellen in allen untersuchten Zellpopulationen gesteigert werden. Auch in diesen Versuchen wurden die Anteile IFNγ-positiver Zellen zwar erhöht, erreichten jedoch nicht die Werte, die nach Stimulation der vollständigen, unbehandelten PBMC ermittelt werden konnten. Neben der Rekonstitution der PBMC-Population konnten die Anteile IFNγ- produzierender Zellen auch durch die Zugabe von Überständen stimulierter PDC zur PDC-depletierten PBMC-Population erhöht werden (Abb. 14a). Die verstärkenden Effekte von PDC auf die Sekretion von IFNγ waren ebenfalls bezüglich der Expression des Aktivierungsmarkers CD69 zu beobachten. Während die IFNγ- Freisetzung aus den einzelnen Zellpopulationen in der Abwesenheit von PDC um etwa 75% reduziert war, konnte unter diesen Bedingungen ein Rückgang der Induktion von CD69 detektiert werden, der bei etwa 25% lag (Abb. 14b). Diese Experimente legten nahe, dass PDC wichtige Signale vermitteln, die insbesondere die Sekretion von IFNγ in verschiedenen Zellpopulationen, jedoch weniger die Aktivierung dieser Zellen regulieren. In der weiteren Analyse dieser Ergebnisse, unter Differenzierung bezüglich des Serostatus der Spender, wurde zudem deutlich, dass diese Signale durch unterschiedliche Mechanismen an die verschiedenen T- Zellpopulationen vermittelt wurden. Wie in der vorliegenden Arbeit bereits beschrieben wurde, waren an der Freisetzung von IFNγ aus T-Zellen seronegativer Spender insbesondere CD8-positive T-Zellen und γδT-Zellen beteiligt (Abb. 9b). Die reduzierte Sekretion von IFNγ aus diesen Zelltypen in der Abwesenheit von PDC konnte durch die erneute Zugabe von PDC nur wenig beeinflusst werden. Im Gegensatz dazu zeigte die frühzeitige Zugabe von Überständen stimulierter PDC deutliche Effekte, die die Sekretion von IFNγ erhöhten (Abb. 15). Diese Ergebnisse

100 Diskussion unterstützen die Theorie, dass die Sekretion von IFNγ aus CD8-positiven T-Zellen seronegativer Spender durch Zytokine und nicht primär durch die spezifische Erkennung von HSV-1 induziert wurde, da die Anteile infizierter Monozyten unter dieser Kultivierungsbedingung stark reduziert war (Abb. 13c). In diesem Zusammenhang könnten die beteiligten löslichen Stoffe direkt von PDC sezerniert werden, oder in anderen Zellen, indirekt durch die Zugabe von PDC-Überständen, induziert werden. Nach der Stimulation von PBMC seropositiver Donoren mit HSVINF konnte die Sekretion von IFNγ aus CD4-positiven T-Zellen detektiert werden (Abb. 9b und 12a). Die reduzierte Produktion von IFNγ nach der Depletion von PDC konnte durch die direkte Zugabe von PDC zu den Kulturen revertiert werden, lösliche Stoffe aus stimulierten PDC waren hier dagegen weniger wirksam (Abb. 15). Somit scheinen Zellkontakt-abhängige Signale von PDC die Sekretion von IFNγ aus CD4- positiven T-Zellen seropositiver Spender zu verstärken. Bezüglich der Freisetzung von IFNγ aus CD4-positiven T-Zellen seronegativer Donoren konnte dieser Mechanismus nicht beobachtet werden.

Die Expression einer Reihe verschiedener Oberflächenrezeptoren auf humanen PDC, die an der Koregulation anderer Immunzellen beteiligt sein könnten, wurde in der vorliegenden Arbeit analysiert. Unter Berücksichtigung weiterer, bereits beschriebener PDC-Rezeptoren, konnten insbesondere Mitglieder von drei Rezeptor- Familien identifiziert werden, durch die PDC regulatorische Interaktionen in der Immunreaktion gegen HSV-1 vermitteln könnten (Abb. 16). Diese Wechselwirkungen könnten die Immunantwort sowohl am Ort der Infektion als auch in lymphatischen Geweben beeinflussen. Für die Rezeptoren CD48 (BLAST), CD229 (Ly9), CD319 (CRACC) und CD352 (NTBA) der SLAM-Familie wurden regulatorische Effekte auf die die Zytotoxizität und die Sekretion von IFNγ aus NK-Zellen und T-Zellen beschrieben (Cabezón et al. 2011; Schuster et al. 2010; Falco et al. 2004; Flaig, Stark, und Watzl 2004; Valdez et al. 2004; Nakajima et al. 1999; Sivori et al. 2000; Stark und Watzl 2006; Valiante und Trinchieri 1993; Chuang, Kumaresan, und Mathew 2001; Dupré et al. 2005; Sintes et al. 2007; Martín et al. 2005; Bouchon et al. 2001; Kumaresan et al. 2002), durch CD319 kann jedoch auch die Proliferation von B-Zellen verstärkt werden (Lee et al. 2007). Nach der Stimulation von PDC konnte die Expression von GITRL (Hanabuchi et al. 2006), CD252 (OX40L) (Marschner et al. 2005; Diana et al. 2009) und CD70 (Shaw et al. 2010), Liganden der TNF- Rezeptor-Familie, detektiert werden (Duttagupta, Boesteanu, und Katsikis 2009). Die Interaktion von GITRL der PDC mit CD357 (GITR) auf NK-Zellen verstärkte deren

101 Diskussion zytotoxische Funktion, sowie die Sekretion von IFNγ. Da CD357 auch auf CD4- positiven und CD8-positiven T-Zellen exprimiert wird, könnten PDC auch kostimulatorische Effekte an diese Zelltypen vermitteln (Hanabuchi et al. 2006). Bezüglich der Aktivierung von NKT-Zellen konnte ein Beitrag von PDC durch die Interaktion von CD252 mit CD134 (Ox40) der NKT-Zelle beschrieben werden (Marschner et al. 2005; Diana et al. 2009), die Differenzierung und Antikörperproduktion von B-Zellen wurde, vermittelt durch die Bindung von CD70 an CD27, ebenfalls durch PDC verstärkt (Shaw et al. 2010). Die dritte Gruppe regulatorischer Rezeptoren wird durch die Mitglieder der B7-Familie repräsentiert, von denen CD80 (B7-1), CD86 (B7- 2), CD274 (B7-H1, PD-L1) und CD275 (B7-H2, ICOS-L) auf PDC beschrieben wurden (Cella et al. 2000; Dzionek et al. 2000; Jaehn et al. 2008; Ito et al. 2007). Wie in einem Übersichtsartikel von Duttagupta et al. beschrieben, binden diese Moleküle wie auch das ebenfalls auf PDC exprimierte CD270 (HVEM, HveA) (Donaghy et al. 2009) an die Rezeptoren der CD28-Familie und vermitteln so regulatorische Signale an naive und Gedächtnis-T-Zellen (Duttagupta, Boesteanu, und Katsikis 2009). In Folge der Stimulation von PDC mit CpG verstärkten CD80 und CD86 die Expansion naiver CD4-positiver T-Zellen und deren Sekretion von IFNγ nach Restimulation, dagegen induzierte CD275 die Differenzierung regulatorischer CD4-positiver T-Zellen, die IL-10 sezernierten (Ito et al. 2007). Durch CD274 werden inhibitorische Signale vermittelt, die die Aktivierung von T-Zellen reduzieren (Duttagupta, Boesteanu, und Katsikis 2009; Greenwald, Freeman, und Sharpe 2005; J. A. Brown et al. 2003; Channappanavar, Twardy, und Suvas 2012). Die Adhäsionsmoleküle CD50 (ICAM-3) und CD54 (ICAM-1) sind an der Ausbildung der immunologischen Synapse zwischen T-Zellen und APC beteiligt, stabilisieren den Kontakt dieser Zelltypen und erleichtern so die Präsentation von Antigenen (Campanero et al. 1993; Montoya et al. 2002). Schließlich konnte auch für die Interaktionen zwischen CD2 und CD58 (LFA-3) (Crawford et al. 2003), sowie zwischen CD55 und CD97 (Capasso et al. 2006) ein verstärkender Effekt auf die Aktivierung von T- Zellen gezeigt werden.

Die Komplexität von Interaktionen vieler verschiedener Zelltypen, auch über die Grenze zwischen nativer und adaptiver Immunität, wird immer deutlicher. Insbesondere regulatorische Effekte von Zelltypen des angeborenen Immunsystems auf eine entstehende Immunreaktion gegen Pathogene rücken zunehmend in den Fokus der aktuellen Forschung. Im Zusammenhang mit viralen Infektionen vermitteln Plasmazytoide Dendritische Zellen zentrale Funktionen, die über die frühzeitige

102 Diskussion

Sekretion löslicher antiviraler Substanzen wie Typ1 Interferone hinaus zu gehen scheinen. Bisher sind jedoch nur wenige Mechanismen der Rezeptor-vermittelten Interaktion zwischen PDC und anderen Immunzellen näher charakterisiert. Die in der vorliegenden Studie erhobenen Daten zur Expression und Regulation von Oberflächenrezeptoren auf humanen PDC (Abb. 3) stellen somit eine wichtige Grundlage zur weiteren Analyse dieser interzellulären Wechselwirkungen dar. Insbesondere an der Kontrolle einer persistierenden viralen Infektion mit Herpes simplex Viren scheinen eine Vielzahl verschiedener Zelltypen involviert zu sein, wodurch diese ein gutes Modell zur Identifikation PDC-vermittelter Effekte darstellen sollten. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde die Immunreaktion gegen HSV-1 in Abhängigkeit zum Serostatus der Blutspender charakterisiert und eine verstärkende Wirkung von PDC auf die Sekretion von IFNγ identifiziert (Tabelle 4). Darüber hinaus legen die Daten nahe, dass an dieser regulatorischen Funktion von PDC sowohl lösliche Stoffe wie auch Zellkontakt-abhängige Mechanismen beteiligt sind. In weiteren Experimenten unserer Arbeitsgruppe sollen diese Wechselwirkungen näher untersucht werden. Auf längere Sicht sollten sich somit Möglichkeiten zeigen, die Immunreaktion gegen HSV, andere Infektionen, aber auch im Zusammenhang mit der Therapie von Tumorerkrankungen oder Autoimmunreaktionen, durch die gezielte Manipulation von PDC zu modifizieren. Ein Mittel könnten Agonisten der Toll-ähnlichen Rezeptoren (TLR) 9 und 7 darstellen, durch die schon heute verschiedene Reaktionen von PDC induziert werden können.

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125 Verzeichnis der verwendeten Literatur

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126 Verzeichnis der verwendeten Literatur

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127 Verzeichnis der Vorveröffentlichungen

9 Verzeichnis der Vorveröffentlichungen

Originalartikel:

Kittan, N. A., Bergua, A., Haupt, S., Donhauser, N., Schuster, P., Korn, K., Harrer, T., & Schmidt, B. (2007). Impaired plasmacytoid dendritic cell innate immune responses in patients with herpes virus-associated acute retinal necrosis. J. Immunol. 179(6): 4219-4230.

Haupt, S., Donhauser, N., Chaipan, C., Schuster, P., Puffer, B., Daniels, R. S., Greenough, T. C., Kirchhoff, F., & Schmidt, B. (2008). CD4 binding affinity determines HIV-1 induced plasmacytoid dendritic cell interferon alpha production. J. Virol. 82(17): 8900-8905.

Schuster, P., Donhauser, N., Pritschet, K., Ries, M., Haupt, S., Kittan, N.A., Korn, K., & Schmidt, B. (2010). Coordinated regulation of plasmacytoid dendritic cell surface receptors upon stimulation with herpes simplex virus type 1. Immunology 129(2): 234-247.

Donhauser, N., Helm, M., Pritschet, K., Schuster, P., Ries, M., Korn, K., Vollmer, J. & Schmidt, B. (2010). Differential effects of P-class versus other CpG oligodeoxynucleotide classes on the impaired innate immunity of plasmacytoid dendritic cells in HIV-1 infection. AIDS Res. Hum. Retrovir. 26(2): 161-171.

Pritschet, K., Donhauser, N., Schuster, P., Ries, M., Haupt, S., Kittan N. A., Korn, K., Pöhlmann, S., Holland, G., Bannert, N., Bogner, E. & Schmidt, B. (2012). CD4- and dynamin-dependent endocytosis of HIV-1 into plasmacytoid dendritic cells. Virology 423(2): 152-164.

Donhauser, N., Pritschet, K., Helm, M., Harrer, T., Schuster, P., Ries, M., Bischof, G., Vollmer, J., Smola, S. & Schmidt, B. for the German Competence Network HIV/AIDS (2012). Chronic immune activation in HIV-1 infection contributes to reduced interferon alpha production via enhanced CD40:CD40 ligand Interaction. PLoS ONE 7(3):e33925.

Ries, M., Schuster, P., Thomann, S., Donhauser, N., Vollmer, J. & Schmidt, B. (2013). Identification of novel oligonucleotides from mitochondrial DNA which spontaneously induce plasmacytoid dendritic cell activation. Journal of Leucocyte Biology. 94(1): 123-35.

Übersichtsartikel:

Schuster, P., Boscheinen, J. B., Tennert, K. & Schmidt, B. The role of plasmacytoid dendritic cells (PDC) in innate and adaptive immune responses against alpha herpes virus infections (2011). Advances in Virology. 2011:679271.

128 Abkürzungsverzeichnis

10 Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung

ADAM Disintegrin und Metalloprotease (engl.: a disintegrin and metalloprotease)

APC Antigen-präsentierende Zellen (engl.: antigen-presenting cells)

ARN Akute Retinale Nekrose

BDCA Antigen dendritischer Zellen im Blut (engl.: blood dendritic cell antigen)

BSA Bovines Serum Albumin

CCL C-C-Motiv Chemokin-Ligand

CD Oberflächen-Differenzierungsmarker (engl.: cluster of differentiation)

CFSE Fluoreszenzfarbstoff, Carboxyfluorescein-Diacetate-Succinimidyl-Ester

CMV Cytomegalovirus

CPE Zytopathischer Effekt (engl.: cytopathic effect)

CTL Zytotoxische T-Zellen (engl.: cytotoxic T lymphocytes)

CXCL C-X-C-Motiv Chemokin-Ligand d Tage

DAMP Gefahrensignale von geschädigten Zellen (engl.: damage-associated molecular patterns)

DAPI Fluoreszenzfarbstoff, 4´,6-Diamidin-2-phenylindol Dihydrochlorid

DMAPP Dimethylallylpyrophosphat

DN CD4- und CD8-negativ (doppelt negativ)

DNA Desoxyribonukleinsäure (engl.: deoxyribonucleic acid)

EBV Epstein-Barr-Virus

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EEA1 frühes endosomales Antigen 1 (engl.: early endosomal antigen 1)

ELISA Enzymimmunoassay (engl.: enzyme linked immunosorbent assay)

FACS Durchflußzytometrie (engl.: fluorescence-aided cell sorting)

FcR Rezeptor für den konstanten Teil von Antikörpern

129 Abkürzungsverzeichnis

FITC Fluoreszenzfarbstoff, Fluoresceinisothiocyanat

FKS Fötales Kälberserum gB virales Glykoprotein B

GFP Grün Fluoreszierendes Protein (engl.: green fluorescent protein)

GITRL Glucocorticoid-induzierter Tumor-Nekrosefaktor-Rezeptor (engl.: glucocorticoid-induced tumor necrosis factor receptor ligand)

GUS β-Glucuronidase h Stunden

HEV Venöse Gefäße im Lymphknoten (engl.: high endothelial venules)

HIV Humanes Immundefizienz Virus

HLA Humanes Leukozyten-Antigen

HRP Meerrettichperoxidase (engl.: horseradish peroxidase)

HSV Herpes simplex Virus

HSVINF infektiöses Herpes simplex Virus

HSVUV UV-inaktiviertes Herpes simplex Virus

HVEM Rezeptor zur Aufnahme von HSV (engl.: herpesvirus entry mediator)

ICOS Induzierbarer Ko-Stimulator für T-Zellen (engl.: inducible T cell co- stimulator)

IFN Interferon

Ig Immunglobulin

IL Interleukin

IPP Isopentenylpyrophosphat

IQR Interquartilenabstand

ITIM inhibierende zytoplasmatische Domäne von Rezeptoren (engl.: immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif) kD Kilodalton

KfB Kompetenzzentrum für fluoreszente Bioanalytik

MDC Myeloide Dendritische Zellen (engl.: myeloid dendritic cells)

MFI Mittlere Fluoreszenzintensität

130 Abkürzungsverzeichnis

MHC Haupt-Histokompatibilitäts-Komplex (engl.: major histocompatibility complex)

MIC MHC-I-verwandtes Protein (engl.: MHC class I chain-related protein) min Minuten

MOI Verhältnis zwischen der Zahl infektiöser Viren und der Zellzahl (engl.: multiplicity of infection)

NK-Zelle Natürliche Killerzellen

NKT-Zelle Natürliche Killer-T-Zellen

ODN Oligodesoxyribonukleotide

PAMP Pathogen-assoziierte molekulare Muster (engl.: pathogen-associated molecular patterns)

PBL Lymphozyten des peripheren Blutes (engl.: peripheral blood lymphocytes)

PBMC mononukleären Zellen im peripheren Blut (engl.: peripheral blood mononuclear cells)

PCR Polymerase-Kettenreaktion (engl.: polymerase chain reaction)

PDC Plasmazytoide Dendritische Zellen (engl.: plasmacytoid dendritic cells)

PE Fluoreszenzfarbstoff, Phycoerythrin

PFA Paraformaldehyd

RNA Ribonukleinsäure (engl.: ribonucleic acid)

SCID schwerer kombinierter Immundefekt (engl.: severe combined immunodeficiency)

SN Zellkulturüberstand (engl.: supernatant)

TCID50 Volumen des Virusstocks, das Zellkulturen mit 50% Wahrscheinlichkeit infiziert (engl.: tissue culture infectious dose 50)

TCR T-Zellrezeptor

TLR Toll-ähnlicher Rezeptor (engl.: Toll-like receptor)

TNF Tumor-Nekrosefaktor

VP22 Tegumentprotein von HSV-1

VZV Varicella Zoster Virus

131 Anhang

11 Anhang

11.1 Analyse der Reinheit isolierter PDC

Abbildung 17: Analyse der Reinheit isolierter PDC. (a) Der Anteil von Plasmazytoiden Dendritischen Zellen (PDC) innerhalb der PBMC-Population (oben) und nach Aufreinigung CD304-positiver Zellen (unten) wurde in 6 unabhängigen Experimenten bestimmt. Hierzu wurden PDC als CD303-positive, CD304-positive Zellen innerhalb der PBMC oder als CD4-positive, CD303-positive Zellen in der isolierten Population identifiziert. In einem zweiten Ansatz wurden PDC als CD4-positive, Linienmarker (lin)-negative, CD11c-negative Zellen nachgewiesen. (b) Die Anteile kontaminierender Myeloider Dendritischer Zellen (MDC), Monozyten, B- Zellen und NK-Zellen innerhalb der isolierten PDC-Population wurden in 5 Experimenten quantifiziert. MDC wurden als CD4-positive, lin-negative, CD11c-positive Zellen, Monozyten als CD4-positive, CD14-positive Zellen, B-Zellen als CD19-positive, CD20-positive Zellen und NK-Zellen als CD3- negative, CD16-positive Zellen identifiziert. Angegeben sind die Anteile der verschiedenen Populationen als Median und Interquartilenabstand. Der Linienmarker beinhaltete Antikörper gegen CD3, CD14, CD16 und CD20. (Daten entnommen aus: Schuster 2007)

132 Danksagung

12 Danksagung

Vielen Dank an Herrn Professor Fleckenstein für die Möglichkeit meine Doktorarbeit am Virologischen Institut in Erlangen durchführen zu können.

Dankeschön an Prof. Dr. Falk Nimmerjahn für die Übernahme des Erstgutachtens zu dieser Arbeit.

Besonders möchte ich mich bei Barbara bedanken. Herzlichen Dank für deine tatkräftige Unterstützung, viel Geduld und die Möglichkeit eigenverantwortlich an diesem Projekt zu arbeiten.

Dankeschön auch an Dr. Gillian Elliott und Prof. Peter O’Hare für die Bereitstellung des autofluoreszierenden HSV-Isolates 166v, und an Prof. Paul Crocker für den Antikörper gegen CD170.

Vielen Dank an meine Mentoren Prof. Dr. Thomas Harrer und Prof. Dr. Michael Mach.

Bei Brigitte möchte ich mich für die hervorragende Betreuung im Graduiertenkolleg 1071 bedanken.

Vielen Dank an alle Mitarbeiter/innen des Virologischen Instituts für die zahlreichen Blutspenden und die hilfreichen Antworten auf alle Fragen.

Ein besonderer Dank gilt allen Mitarbeiterinnen der Diagnostik und Klaus für die freundliche Unterstützung und eure Hilfsbereitschaft.

Herzlichen Dank an alle früheren und aktuellen Mitglieder unserer Arbeitsgruppe, besonders an Kathrin, Sabrina, Katja, Moritz und Norbert für die ausgezeichnete und fröhliche Arbeitsatmosphäre, eure Hilfe bei Versuchen und eure Freundschaft.

Dankeschön auch an meine Familie und Freunde für ihre Unterstützung.

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