Paraíba (Steindachneridion Parahybae, Siluriformes, Pimelodidae) Na Bacia Do Paraíba Do Sul Por Meio De Marcadores Microssatélites E DNA Mitocondrial

UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES JACKELINE ALVES VILAR

Avaliação genética populacional do Surubim-do- paraíba (Steindachneridion parahybae, Siluriformes, Pimelodidae) na bacia do Paraíba do Sul por meio de marcadores microssatélites e DNA mitocondrial.

MOGI DAS CRUZES, SP 2012 UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES JACKELINE ALVES VILAR

Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado em Biotecnologia da Universidade de Mogi das Cruzes como parte dos requisitos para obtenção do Titulo de Mestre em Biotecnologia. Área de concentração: Biotecnologia Aplicada a recursos Naturais e Agronegócios

Orientador: Prof. Dr. Alexandre Wagner Silva Hilsdorf Co-orientadora: Prof. Dra. Laura Helena Orfão

MOGI DAS CRUZES, SP 2012

FICHA CATALOGRÁFICA Universidade de Mogi das Cruzes - Biblioteca Central

Vilar, Jackeline Alves Avaliação genética populacional do Surubim-do-paraíba (Steindachneridion parahybae, Siluriformes, Pimelodidae ) na bacia do Paraíba do Sul por meio de marcadores microssatélites e DNA mitocondrial / Jackeline Alves Vilar. – 2012. 111 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Universidade de Mogi das Cruzes, 2012 Área de concentração: Biotecnologia Aplicada a recursos Naturais e Agronegócios Orientador: Prof. Dr. Alexandre Wagner Silva Hilsdorf 1. Surubim-do-Paraíba 2. Steindachneridion parahybae 3. Microssatélites 4. D-loop 5. Conservação genética I. Hilsdorf, Alexandre Wagner Silva

CDD 597

DEDICATÓRIA

Dedico esta vitória a Deus por me guiar nas horas difíceis e por me presentear com tantas pessoas maravilhosas no decorrer do trabalho.

Aos meus pais, irmãos e namorado pelo exemplo, incentivo, amor e carinho.

AGRADECIMENTOS

A todos aqueles que contribuíram de forma direta ou indireta para realização desse trabalho: Ao professor Dr. Alexandre Wagner Silva Hilsdorf pela orientação, dedicação e apoio. A minha Co-orientadora Profa. Dra. Laura Helena por sua dedicação, paciência e por estar sempre à disposição quando precisei. Ao Danilo Caneppele pelos trabalhos de coletas, juntamente com os pescadores do Projeto CESP/ANEEL. A professora Dra. Maria Rita do ICMbio, pelas amostras cedidas do Rio Muriaé e aos bons conselhos no desenvolvimento do trabalho. Aos Professores da pós-graduação em Biotecnologia, pelo conhecimento transmitido. Aos Professores Dr. Wellington, Dra Maria Santina e Dra. Katia, pelas correções no meu trabalho e disponibilidade para participar da minha banca de qualificação. A Juliana Viana, pelo companheirismo, amizade e pela paciência em todas as etapas da construção da biblioteca genômica enriquecida de microssatélites. A Dra. Márcia que gentilmente me orientou nos trabalhos com os géis de poliacrilamida e nas análises estatísticas dos microssatélites. As amigas de laboratório Pamela Rezende, Juliana de Biasi e Suhaila conhecidas também como “ajudantes do dia”, por sempre ajudar no desenvolvimento do meu trabalho e nas minhas análises e por proporcionarem ótimos momentos de convivência. A amiga Aline Lago pelos bons conselhos e carinho. Aos companheiros de laboratório Gabriel, Caio e Rodrigo por tornar esse espaço um ambiente mais agradável e alegre. A todo Núcleo de Biotecnologia e pós-graduandos que me ajudaram na parte de laboratório e proporcionaram muitos momentos de descontração em especial Profa. Dra Leia, Almir, Emy, Felipe, Dra. Débora, e as técnicas Thais e Mary. Aos professores, diretores e coordenadores que trabalham comigo pelo apoio e torcida. A todos meus irmãos pela paciência, amor e força quando precisei. Aos meus pais, por compreender minha ausência, apoiar minhas decisões, pela torcida e pelo amor que me deram incondicionalmente. Ao Ricardo, meu namorado cujo apoio e amor foram fundamentais ao longo do curso.

RESUMO

Um dos pontos centrais para o planejamento de medidas de conservação da biodiversidade aquática é o entendimento da estrutura populacional da espécie para que se determinem tanto as respostas fisiológicas às variações ambientais como as estratégias de manejo das populações naturais. O trabalho em questão objetivou avaliar a diversidade genética intra e interpopulacional da espécie Steindachneridion parahybae na Bacia do rio Paraíba do Sul, outrora de significativa importância econômica, e atualmente em perigo de extinção. Foram capturados 46 indivíduos em quatro diferentes localidades na Bacia do Paraíba do Sul. Amostras de tecidos da nadadeira foram retiradas e posteriormente usadas na extração total do DNA. Todas as amostras foram analisadas, no entanto, apenas nos Rio Paraíba do Sul e do Rio Muriaé capturou-se um número suficiente de animais para as análises populacionais. A região D-loop do DNAmt foi amplificada com primers específicos de todos os indivíduos amostrados e então sequenciada. O alinhamento final das sequências da região controle do DNAmt, com 657 pares de bases de comprimento, obtidas das 46 amostras de Steindachneridion parahybae analisadas gerou uma matriz de dados que definiu um total de 27 haplótipos. A maior diversidade haplotípica (Hd) (0,980) é encontrada no Rio Paraíba do Sul, com 20 haplótipos. A amostragem no Rio Muriaé forneceu uma diversidade haplotípica menor (0,652), apresentando apenas quatro haplótipos. Marcadores moleculares do tipo microssatélites foram desenvolvidos para espécie e utilizados para avaliar a diversidade e a estrutura genética de populações de S. paraybae. O DNA foi amplificado utilizando quatro primers microssatélites desenvolvidos para a espécie. Os produtos de amplificação foram submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida 9%, corado com nitrato de prata e fotodocumentado. Os alelos foram genotipados com o uso do programa ImageQuantTM 300 Imager (GE Healthcare) e as análises estatísticas conduzidas por meio dos programas Arlequin 3.01 e FSTAT. A estrutura genética das populações foi analisada por meio da AMOVA, baseada nas estimativas de FST e RST. Os quatro loci estudados foram polimórficos para a espécie, apresentando heterozigosidade observada de 0,440 a 1,000 para as duas populações analisadas. O número de alelos encontrados foi de 6 a 10 alelos por loci e a média da riqueza alélica variou de 12 a 16. A análise de AMOVA mostrou que a maior parte da variabilidade genética (98,88%) encontra-se dentro de cada população e apenas 5,88% entre elas.

Palavras – chave: Surubim, Steindachneridion parahybae, microssatélites, D- loop, conservação genética.

ABSTRACT

The establishment of conservation strategies for aquatic biodiversity depends on previous studies of population structure. Such information may explain many physiological responses caused by modifications in natural environments. The present work aimed to evaluate intra and inter-populational genetic diversity of the endangered Steindacheridionparahybae, from Paraiba do Sul river basin. From four sampling sites, fin samples were obtained from 46 fish and processed for DNA extraction. All samples were analyzed, although only the samples from Paraiba do Sul and Muriaé rivers gave an adequate number for population analysis. The D-loop sequence from mtDNA was obtained using specific primers. The final alignment of mtDNA control regions contained 657 base pairs and gave rise to 27 haplotypes. The highest haplotype diversity (HD=0.980) was found in Paraiba do Sul river, with 20 haplotypes. Samples from Muriaé river resulted in decreased haplotype diversity (HD=0.652) with only four haplotypes. Microsatellite markers were also developed in our study in order to evaluate the diversity and genetic structure. The DNA was amplified using four primers developed in this study. AgNO3-stained polyacrylamide gels (9%) were obtained after electrophoresis of PCR products. The alleles were genotyped using ImageQuanttm 300 Imager (GE HealthCare) and statistical analysis were performed using the software Arlequin 3.01 and FSTAT. The genetic structure of each population was analyzed using AMOVA based on the values of FST and RST. The four loci were polymorphic for S. parahybae, with a heterozigosity ranging from 0.440 to 1.000 for both populations analyzed here. Regarding the alleles number, 6 to 10 alleles per loci were found and allele richness ranged from 12 to 16. AMOVA analysis indicated that most of genetic variability (98.88%) was observed with each population and only 5.88% within populations.

Keywords: surubim, Steindachneridion parahybae, microsatellite, D-loop, genetic conservation.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 Mapa da localização da Bacia do rio Paraíba do Sul. 18

Figura 2 Mapa da segmentação da bacia do rio Paraíba do Sul por 21 barragens e usinas hidrelétricas

Figura 3 Vista dorso lateral de Steindachneridion parahybae 25

Figura 4 Mapa com a localização dos pontos de amostragens do 36 Steindachneridion parahybae

Figura 5 Vista geral de umas das áreas de captura no município de 38 Lavrinhas, SP

Figura 6 Espécime de Steindachneridion paraybae capturado 38 Lavrinhas-SP

Figura 7 Vista geral de umas das áreas de captura no município de 39 Andrade Pinto – Rio Paraíba e Fazenda dos Casais – Rio das Flores

Figura 8 Espécimes mortas de Dourada e Surubim-do-paraíba 40 encontradas após acidente com Endosulfan

Figura 9 Mortalidade de várias espécies de peixes após acidente 40 com Endosulfan no rio Pirapitinga um dos afluentes do Rio Paraíba do Sul

Figura 10 Detalhe das ilhas e corredeiras presentes na região de 41 captura

Figura 11 Exemplar capturado na localidade de Andrade Pinto – RJ 41

Figura 12 Vista da área amostrada da localidade de Andrade Pinto – 42 RJ

Figura 13 Pescadores locais no apoio às campanhas de coleta de 42 exemplares de Surubim-do-paraíba

Figura 14 Mapa da localidade de Afonso Arinos – Rio Preto – RJ 43

Figura 15 Vista geral de uma das áreas de captura no município de 44 Afonso Arinos – Rio Preto

Figura 16 Mapa com a localização do Distrito de Itaperuna – RJ 45

Figura 17 Vista geral de umas das áreas de captura no município de 46 Itaperuna –RJ - Rio Muriaé

Figura 18 Vista geral de umas das áreas de captura no rio Muriaé – 46 RJ

Figura 19 Gel de agarose a 0,8% com DNA genômico extraído da 58 nadadeira do Steindachneridion parahybae, marcado com brometo de etídeo

Figura 20 Gel de agarose a 1% com produto de PCR corado com 59 brometo de etídeo. Nota: M= Marcador λ-Hind

Figura 21 Gel de agarose a 1% com produtos de PCR após 59 purificação com kit corado com brometo de etídeo. Nota: M= Marcador λ-Hind

Figura 22 Gel de agarose contendo produto de extração plasmidial 66

Figura 23 Eletroferograma do clone 3 enfocando o microssatélite CA 66

Figura 24 Gel de poliacrilamida para o lócus Sur11 e Sur13, utilizando 70 marcadores 100pb e 10pb

Figura 25 Loco Sur4 (160pb) com diferentes amostras de DNA 70 evidenciando regiões monomórficas

Figura 26 Continuação da corrida do Loco Sur4 evidenciando regiões 70 monomórficas

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Localização dos locais de captura do Surubim-do-paraíba 47

Tabela 2 Condições de amplificação para os primers de D-loop 48

Tabela 3 Condições de amplificação para os microssatélites 54

Tabela 4 Distribuição das amostras de Steindachneridion parahybae de 60 acordo com os locais de coletas e haplótipos encontrados

Tabela 5 Sítios polimórficos entre os haplótipos de S. parahybae 62

Tabela 6 Características moleculares das sequências da região 63 controle do DNA mitocondrial de S. parahybae e índices de diversidade nucleotídica e haplotípica por região de amostragem e total

Tabela 7 Análise molecular de variância baseado em sequências de 64 DNA mitocondrial com a estrutura comparando as amostras coletadas no Rio Paraíba do Sul (localidade de Andrade Pinto) as amostras coletadas no Rio Muriaé

Tabela 8 Análise molecular de variância baseado em sequências de 65 DNA mitocondrial

Tabela 9 Total de primers desenhados para a espécie 67 Steindachneridion parahybae

Tabela 10 Primers específicos para a espécie Steindachneridion par 69

Tabela 11 Resumo estatístico da diversidade genética 71

Tabela 12 Análise molecular de variância baseado em microssatélites 72

Tabela 13 Análise molecular de variância baseado em microssatelites 73

Tabela 14 Relação e descrição dos indivíduos de cada haplótipos que 82 formam o banco de germoplasma in vivo

Tabela 15 Cruzamentos direcionados buscando aumentar ou manter a 84 diversidade haplotípica da espécie Surubim-do-paraíba

LISTA DE ABREVIAÇÕES

AgNO3 Nitrato de prata D-loop Displacement loop dNTP Desoxiribonucleotídeo (A, G, C, ou T) EDTA Ácido Etilenoaminotetracético EHW Equilíbrio de Hardy-Weinberg Fis Coeficiente de Endogamia

FST Índice de diferenciação entre grupos HCl Ácido clorídrico IPTG Isopropil tiogalactosídeo

MgCl2 Cloreto de magnésio mM Milimolar NaCl Cloreto de sódio NaOH Hidróxido de sódio ng Nanogramas pb Pares de bases PA Persulfato de amônio PCR Reação em cadeia da polimerase, do inglês Polymerase Chain Reaction RNAse Enzima que degrada o ácido ribonucléico rpm Rotações por minuto SDS Dodecil Sulfato de Sódio, do inglês: Sodium Dodecyl Sulfate SMM Modelo de Mutação passo-a-passo, do inglês Stepwise Mutation Model SSC Solução Padrão de Citrato Salino, do inglês Standard Saline Citrate SSR Repetições de Sequências Simples, inglês Simple Sequences Repetition Taq Enzima termoestável derivada da bactéria Thermus aquaticus TBE Solução tampão constituída de Tris, ácido bórico e EDTA TEMED Tetrametiletiletilenodiamino UV Luz ultravioleta SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ...... 15 1.1Diversidade da ictiofauna de água doce ...... 15 1.2 A Bacia do Rio Paraíba do Sul ...... 16 1.3 Ictiofauna do Rio Paraíba do Sul ...... 22 1.4 Gênero Steindachneridion ...... 23 1.5 Surubim-do-paraíba - Steindachneridion parahybae (Steindachner, 1877) (Siluriformes, Pimelodidae) ...... 24 1.6 Marcadores moleculares ...... 26 1.7 A variabilidade genética em peixes neotropicais ...... 29 1.8 PAN – Plano de Ação Nacional ...... 31 2 OBJETIVOS ...... 33 2.1 Geral...... 33 2.2 Específicos...... 33 3 MÉTODOS ...... 34 3.1 Ocorrência de populações de Surubim-do-paraíba...... 35 3.2 Localidades de Captura de Surubim-do-paraíba (Steindachneridion parahybae) ..... 37 3.2.1 Rio Paraíba do Sul - Município de Lavrinhas – SP...... 37 3.2.2 Rio Paraíba do Sul – Entre os municípios de Rio das Flores – RJ (margem esquerda) e Andrade Pinto – RJ (margem direita) ...... 39 3.2.3 Rio Preto - Afonso Arinos (05 exemplares) ...... 43 3.2.4 Rio Muriaé (RMIT) – Itaperuna – RJ (12 Exemplares) ...... 44 3.3 Coleta de tecido e extração de DNA ...... 47 3.4 Amplificações das regiões do D-loop do DNA mitocondrial...... 48 3.5 Construção da biblioteca genômica enriquecida em microssatélites ...... 49 3.5.1 Digestão do DNA genômico ...... 49 3.5.2 Seleção dos fragmentos ...... 49 3.5.3 Pré-amplificação ...... 49 3.5.4 Seleção dos fragmentos contendo microssatélites ...... 50 3.5.5 Amplificação dos fragmentos selecionados ...... 51 3.5.6 Clonagem ...... 51 3.5.7 Transformação de bactérias ...... 51 14

3.5.8 Plaqueamento das bactérias transformadas ...... 51 3.5.9 Amplificação dos insertos clonados ...... 52 3.5.10 Miniprep...... 52 3.5.11 Sequênciamento e análise das sequências ...... 53 3.5.12 Desenho dos primers ...... 53 3.5.13 Testes de amplificação dos microssatélites ...... 53 3.5.14 Eletroforese em gel de poliacrilamida e genotipagem ...... 54 3.6 Análises estatísticas ...... 56 4.RESULTADOS ...... 58 4.1 Extração de DNA ...... 58 4.2 Amplificações e sequênciamento das regiões do D-loop do DNA mitocondrial...... 58 4.3 Análises estatísticas das sequências ...... 60 4.4 Diversidade nucleotídica e haplotípica ...... 63 4.5 Análise molecular de variância ...... 64 4.6 Construção da biblioteca genômica enriquecida em microssatélite ...... 65 4.6.1 Amplificação dos insertos clonados ...... 65 4.6.2 Sequênciamento e análise das sequências ...... 66 4.6.3 Testes de amplificação dos microssatélites ...... 69 5 ANÁLISE DOS DADOS ...... 71 5.1 Diversidade alélica ...... 71 5.2 Análise molecular de variância ...... 72 6 DISCUSSÃO ...... 74 6.1 Análises populacionais baseadas no DNA mitocondrial ...... 74 6.1.1Distribuição dos haplótipos ...... 74 6.1.2Diversidade nucleotídica e haplotípica ...... 74 6.2 Construção da biblioteca genômica enriquecida com microssatélites ...... 75 6.2.1 Amplificação dos microssatélites ...... 77 6.2.2 Diversidade genética intrapopulacional ...... 77 6.3Estruturação genética das populações ...... 79 6.4Cruzamento direcionados ...... 80 7. CONCLUSÕES ...... 86 REFERÊNCIAS ...... 87 APÊNDICES...... 111

1 INTRODUÇÃO

1.1 Diversidade da ictiofauna de água doce

Atualmente, o número de espécies de peixes já alcançou a marca de 32.200 espécies (FROESE E PAULY, 2012). A zona neotropical, que se estende da América do Sul até a América Central, incluindo a zona tropical do México, é considerada a de maior diversidade de peixes de água doce do mundo com aproximadamente 4.475 espécies em Reis et al. (2003) seguida pela Ásia e África com respectivamente 3.000 espécies (CRESCÊNCIO, 2005). Nesta região estão inclusos majoritariamente peixes do grupo Otophysi representados pelas ordens Characiformes (aproximadamente 1.200 espécies), Siluriformes (aproximadamente 1.300) e Gymnotiformes (80 espécies). Também são encontrados representantes das ordens Perciformes da família dos ciclídeos (100 a 150 espécies), e da ordem Ciprinodontiformes (100 espécies), das famílias osteoglossídeos (dois gêneros) e Lepidosirenídeos (uma espécie). No Brasil a ictiofauna de água doce compreende 2.300 espécies enquanto a ictiofauna marinha 1.298 espécies (REIS et al., 2003). A proporção das espécies é influenciada pelas diferenças entre as bacias hidrográficas, porém, é notada uma grande diversidade no continente Sul americano. Isso se deve provavelmente ao isolamento geográfico apresentado e a variedade de habitat (lagos, rios, poças, riachos, corredeiras e planícies inundadas) e bacias de drenagem (AGOSTINHO et al., 2007). Essa multiplicidade de habitat e a disponibilidade de alimentos decorrentes das variações são fatores que alteram a estrutura da ictiofauna (AGOSTINHO et al., 1999; SMITH et al., 2003). De acordo com Vari (1988) e Menezes (1996) existem no Brasil sete grandes divisões baseadas no sistema hidrográfico: a bacia do Amazonas, Guianas, Nordeste, bacia do rio São Francisco, bacia Leste (onde está incluso o rio Paraíba do Sul) e a bacia Platina. Em uma avaliação feita pela International Union for Conservation of Nature (IUCN), das 30.700 espécies de peixes (atualmente em 32.200) descritas, 3.481 foram avaliadas e 1.275 foram listadas com algum grau de ameaça, o que equivale a 3% do total de espécies de peixes taxonomicamente identificadas (IUCN, 2006). No Brasil, o Livro Vermelho da Fauna Brasileira Ameaçada de Extinção de acordo com Machado et al. (2008) listou o conjunto de espécies da fauna nacional com graus

diferentes de ameaça. Em peixes, há 159 espécies ameaçadas, sendo 135 peixes de água doce e 24 marinhos. Os peixes de água doce da categoria de ameaçados de extinção representam cerca de 5,9% das espécies de peixes conhecidas em nossa fauna, porém, ainda existem dúvidas sobre a extensão deste número. A família Rivulidae apresenta o maior número de espécies de peixes ameaçadas de extinção (52 espécies), enquanto que em outras famílias a quantidade de espécies em extinção é menor: Characidae (32 espécies), Trichomycteridae (10 espécies), Loricariide (nove espécies), Heptapteridae (seis espécies), Pimelodidae (cinco espécies), Cichlidae (cinco espécies), Crenuchidae (três espécies), Poeciliidae (três espécies), Callichthyidae (duas espécies), Anostomidae (duas espécies), Doradidae, Batrachoididae, Apteronotidae, Sternopygidae e outra família incerta (cada uma com uma espécie) (ROSA & LIMA, 2008). As bacias do Leste brasileiro compreendidas entre a foz do rio São Francisco e o norte do Estado de Santa Catarina, formam a região de endemismo com maior número de espécies ameaçadas, totalizando 59 espécies. Isto ocorre devido à grande extensão territorial desta área, e, sobretudo, ao alto grau de deterioração ambiental (desmatamento, assoreamento, poluição e construção de usinas hidrelétricas) encontrado na região, juntamente com o nível de endemismo marcante de sua ictiofauna. Peixes de médio a grande porte como, o piau (Leporinus thayeri), as piabanhas (Brycon insignis e Brycon devillei), a vermelha (Brycon vermelha), o andirá (Henochilus wheatlandii), os cascudos (Pogonopoma parahybae e Delturus parahybae), e peracuca (Kalyptodoras bahiensis) e o Surubim (Steindachneridion) habitam os maiores rios do Leste brasileiro, incluindo os rios Paraíba do Sul, Doce, Mucuri, Jequitinhonha e Paraguaçu (ROSA & LIMA, 2008).

1.2 A Bacia do Rio Paraíba do Sul

Com uma área de aproximadamente 55.300 km2 o rio Paraíba do Sul é considerado em superfície uma das três maiores bacias hidrográficas secundárias do Brasil (Figura 1). Tem início na Serra da Bocaina, no Estado de São Paulo e deságua no oceano Atlântico, na praia de Atafona, em São João da Barra (RJ). Formado pela confluência dos rios Paraitinga e Paraibuna, a bacia do rio Paraíba do Sul abrange

três estados: São Paulo (13.900 km2), Minas Gerais (20.700 km2) e Rio de Janeiro (20.900 km2) e 180 municípios: 88 em Minas Gerais, 53 no Rio de Janeiro e 89 em São Paulo (CEIVAP, 2010). A bacia do rio Paraíba do Sul localiza-se no extremo norte da zona da Floresta Ombrófila Densa do Estado de São Paulo e de acordo com Buckup (1998) esta região possui elevada porcentagem de espécies endêmicas de peixes. Esta bacia fornece água para cidades, indústrias, usinas hidrelétricas e propriedades rurais. O rio Paraíba do Sul abastece diretamente uma população de cerca de 14 milhões de pessoas localizadas nas duas grandes megalópoles do país, São Paulo e Rio de Janeiro. Diariamente são consumidos cerca de 7,5 bilhões de litros de água destinada ao consumo humano e industrial, porém são despejados, estimadamente, um bilhão de litros de esgotos por dia (CEIVAP, 2010). Entre as décadas de 1950 e 1960, o rio Paraíba do Sul teve trechos corrigidos, entre os municípios de Cachoeira Paulista a Caçapava, e de Aparecida a Pindamonhangaba. Esta iniciativa do Departamento Nacional de Obras de Saneamento – DNOS - visou aumentar a declividade de escoamento, aumentando a capacidade de vazão, com diminuição do risco de transbordamento e de inundação das margens. Atualmente, os reservatórios de Paraibuna, Santa Branca e do Jaguari também têm o objetivo de diminuir os riscos de inundação (FUNDAÇÃO CHRISTIANO ROSA, 2009). O ciclo de degradação na bacia do rio Paraíba do Sul iniciou-se ainda no século XVII com o processo de degradação ambiental e a destruição da vegetação nativa para o cultivo da cana de açúcar no Vale do Paraíba paulista e região dos Campos dos Goitacazes, no Estado do Rio de Janeiro. Em meio aos século XVIII e XIX houve o ciclo do café nas regiões do Alto e Médio Paraíba, acentuando ainda mais o processo de degradação e desgaste do solo. Ainda, no final do século XIX, ocorreu a crise da cultura cafeeira movido pela abolição da escravatura, desencadeando uma severa redução da cobertura vegetal original do vale do Paraíba do Sul. Como consequência, houve erosão e perda da fertilidade do solo, e o assoreamento do rio, transformando assim plantações em pastagens, restringindo a atividade econômica do início do século XX às atividades agropecuárias. A industrialização e o desenvolvimento urbano iniciaram exclusivamente na década de 1940 (FUNDAÇÃO CHRISTIANO ROSA, 2009).

Figura 1. Mapa da localização da Bacia do rio Paraíba do Sul. Fonte: Vívian Uhlig (2012).

A expansão demográfica e o intenso desenvolvimento industrial ocorridos nas últimas décadas na Região Sudeste, refletem-se na qualidade das águas do rio Paraíba do Sul, destacando-se como fontes poluidoras as de origem industrial, doméstica e da agropecuária, sobretudo as decorrentes de vários acidentes ambientais em sua bacia. Uma das principais ameaças do rio Paraíba do Sul, segundo a Agência Nacional das Águas – ANA são os efluentes domésticos e os resíduos sólidos oriundos das cidades. Do total de esgoto coletado são destinados a tratamento apenas 10,4% em São Paulo, 2,0% no Rio de Janeiro e 1,2% em Minas Gerais. Os efluentes de resíduos industriais lançados no rio Paraíba do Sul são monitorados de forma ineficiente e ineficazes (ARAÚJO, et al 2010). Além das fontes poluidoras existem quatro usinas hidrelétricas operando na calha do rio Paraíba do Sul (Figura 2). A usina hidrelétrica Ilha dos Pombos, que entrou em operação em 1924, entre Rio de Janeiro e Minas Gerais, provocou grande mortandade de peixes na época da piracema. São previstos ainda sete empreendimentos hidrelétricos nas regiões do Médio e Baixo Paraíba, quatro deles já em construção (ARAUJO et.al. 2010). A formação de reservatórios para implantação de hidrelétricas gera modificações no fluxo de água e nos nutrientes ocasionando impactos sobre a reprodução, alimentação e o desaparecimento de lagoas marginais, utilizadas para a eclosão de ovos e desenvolvimento da fase juvenil de diversas espécies de peixes (HILSDORF, 2002). A construção de barragens de grandes (UHEs) e pequenas (PCHs) usinas na calha principal do rio, assim como em seus afluentes podem determinar o desaparecimento de espécies nativas, aumentando o risco de espécies ameaçadas, como o Surubim-do-paraíba e a piabanha (MACHADO et al., 2008). A ocorrência de desmatamento das margens da bacia do rio Paraíba do Sul, devido a diversas formas de ocupação irregular e desordenada e uso inadequado do solo na agricultura é responsável pelo assoreamento, modificação da vegetação e desgastes do solo (ARAÚJO et al., 2010). Além disso, o histórico de acidentes ambientais é muito extenso e antigo. Dentre os acidentes de extrema gravidade destacam-se os ocorridos em 1977 (contaminação por metais pesados), em 1982 (contaminação por substâncias tóxicas e metais pesados), em 1984 (acidente rodoviário com o despejo de 30 mil litros de acido sulfúrico no Rio Piabanha), em 1988 (vazamento de óleo ascarel), em 1989 (despejo de metanol após acidente com caminhão tanque), em 2003

(vazamento de aproximadamente 20 milhões de litros de soda caustica no Rio Pomba), em 2007 (contaminação por bauxita) e em 2008 (vazamento de cerca de oito mil litros do produto químico Endosulfan no rio Pirapitinga, afluente do rio Paraíba do Sul, causando grande mortalidade ao longo de 400 quilômetros na bacia) (FIPERJ et al., 2008) A introdução de espécies exóticas representa outra grande ameaça à biodiversidade do rio Paraíba do Sul, sejam estas espécies introduzidas de forma acidental ou não. Dessa forma, devido a seus hábitos predatórios, competição, migração e reprodução, estas espécies causam desequilíbrio na fauna nativa do rio. Atualmente, dezesseis espécies de peixes alóctones, procedentes da América do Norte, América Central Europa, África, Ásia e de outros rios sul americanos podem ser registradas no Paraíba do Sul. A maior responsabilidade quanto à introdução de espécies exóticas na bacia do rio Paraíba do Sul, cabe as atividades de piscicultura e empreendimentos do tipo pesque-e-pague, embora alguns grupos de peixes foram introduzidos na bacia por iniciativas oficiais, como é o caso de Tilapia rendalli e Cichla ocellaris (BARROSO, 1989; BIZERRIL, 1999). Foram introduzidas também, a espécie carnívora Salminus brasiliensis (dourado), provocando um sensível desequilíbrio na fauna devido a seus hábitos predatórios e migratórios. As espécies Synbranchus marmoratus (muçum) e Hoplerythrinus unitaeniatus (marobá) não eram registradas no trecho de Santa Cecília, porém seu aparecimento nessa região gerou especulações se foram também introduzidas ou reapareceram (ARAUJO et al., 2010). Espécies introduzidas como o Cichla kelberi (tucunaré), Metynnis maculatus (pacu- peva), Piaractus mesopotamicus (pacu) e Pseudoplatystoma corruscans (pintado) têm limitada possibilidade de se estabelecerem como populações viáveis na calha principal e afluentes do rio Paraíba do Sul. O tucunaré e o pacu-peva preferem ambientes lênticos, portanto não estão estabelecidos no rio, consequentemente não oferecem grande risco de invasão. Já o pacu, o tambaqui e o pintado são espécies migratórias de longas distâncias necessitando de condições ambientais não mais existentes nos trechos entre às barragens Funil e Santa Cecília, não havendo desta forma adaptação às mudanças ambientais ocorridas nessas regiões, portanto, esses animais não se estabeleceram (ARAUJO et al., 2010).

Figura 2. Mapa da segmentação da bacia do rio Paraíba do Sul por barragens e Usina hidrelétricas.Fonte: Vívian Uhlig (2012)

Entre as espécies introduzidas, o Pimelodus maculatus (mandi-amarelo) é a única espécie que demonstrou adaptação no Paraíba do Sul e, portanto compete com espécies nativas do fundo, provocando um desequilíbrio nas populações dessas espécies (ARAUJO et al., 2010). A similaridade entre o bioma de espécies nativas e introduzidas é um aspecto que pode conduzir a um processo de exclusão de grupos que possuem menor potencial biótico (LOWE MCCONNELL, 1987)

1.3 Ictiofauna do Rio Paraíba do Sul

Na década de 50, o rio Paraíba do Sul e seus afluentes foram considerados um dos mais piscosos do Estado de São Paulo. Apesar da grande diversidade de peixes, poucos são capturados em maior volume e que apresentam elevado valor comercial, entre eles podemos relatar principalmente a Piabanha (Brycon insignis), piavas (Leporinus sp.), Surubim-do-paraíba (Steindachneridion parahybae erroneamente designado por Pseudoplatystoma sp.), Piapara (Leporinus sp.) e o Robalo (Centropomus sp.) (MACHADO & ABREU, 1952). Contudo, a pesca comercial no Vale do Paraíba deixou de representar o papel econômico apresentado nos anos 50. Atualmente, 115 espécies consideradas como nativas são ainda encontradas na calha do Paraíba do Sul e tributários, como os Lambaris (Astyanax sp.), Piabanha (B. insignis), Curimbatá (Prochilodus sp.), Bagre (Rhamdia parahybae) e a Pirapitinga-do-Sul (Brycon opalinus) (ARAUJO & NUNAN, 2005). A ictiofauna na bacia do rio Paraíba do Sul podem ser classificada em espécies dulcícolas nativas (68,5% do total amostrado), espécies marinhas (22%) e espécies dulcícolas introduzidas (9,5%). Os grupos marinhos são comuns à sistemas lagunares e à desembocadura de rios (BIZERRIL et al., 1995). A fauna de água doce nativa é formada essencialmente por peixes Otophysi, um arranjo comum às demais bacias da região Neotropical (Lowe McConnell, 1987). Dentre as ordens catalogadas, os Siluriformes são os que apresentam maior riqueza de espécies, o que concorda com o padrão descrito por Bizerril (1994) para rios do leste brasileiro. A ordem Characiformes reúne 35 espécies, agrupadas em 6 famílias, das quais a família Characidae engloba a maior riqueza de taxa. A

distribuição dos Characiformes abrange todos os domínios, o que reflete a grande diversificação morfológica e ecológica do grupo. A ordem Siluriformes está representada na bacia por 70 espécies. Em comparação com os Characiformes, verifica-se maior riqueza relativa de espécies no alto curso dos rios. Estes locais mostram-se ideais aos Trichomycteridae, além de Neoplecostomus spp. Paraeiorhina spp., Upsilodus victori, Schizolecis guntheri, Corydoras barbatus e Rhamdioglanis transfasciatus, refletindo a própria morfologia dos grupos e o hábito bentônico dos mesmos, que em conjunto reduzem a capacidade de carregamento pelos rios.

1.4 Gênero Steindachneridion

A família Pimelodidae é considerada a mais diversificada dos Siluriformes neotropicais, com cerca de 300 espécies e 50 a 60 gêneros (MEES, 1974). Segundo Lundberg & Littmann (2003) os representantes desta família são exclusivos de água doce e tem distribuição na América do Sul e Panamá. Pertencente à ordem dos Siluriformes, o gênero Steindachneridion é caracterizado por peixes que apresentam grande porte, até 1000 cm ou mais de comprimento padrão e compartilham alguns caracteres anatômicos. Além das características gerais de Pimelodidae, S. amblyurum (Eigenmann & Eigenmann, 1888), S. parahybae (Steindachner, 1877), S. doceanum (Eigenmann & Eigenmann, 1889), S. scriptum (Miranda Ribeiro, 1918), S. punctatum (Miranda Ribeiro, 1918) e S. melanodermatum, uma espécie recentemente descoberta, têm em comum a forma das placas dentígeras do premaxilar e do vômer, a presença de seis a oito raios divididos na nadadeira dorsal e o número reduzido de rastros branquiais. Todas as espécies, com exceção das fósseis são descritas. Peixes do gênero Steindachneridion têm olhos relativamente pequenos, longos barbilhões maxilares que se estendem até a base da nadadeira dorsal ou a nadadeira adiposa. A nadadeira adiposa é relativamente longa e reta, e sua base é maior do que a base da nadadeira anal. Apresentam espinhos curtos na nadadeira peitoral e dorsal. A maioria das espécies deste gênero tem padrão de cor clara acinzentada ou acastanhada combinada com marrom escuro, listras vermiculares

escuras ou manchas. No entanto, S. doceanum tem reticulações em seu corpo em vez de pontos, e S. melanodermatum é o único no gênero que apresenta cor de fundo marrom escuro. S. amblyurum difere de outros membros por ter uma barbatana caudal arredondada em vez de uma nadadeira caudal sendo esta dentada (GARAVELLO, 2005).

1.5 Surubim-do-paraíba - Steindachneridion parahybae (Steindachner, 1877) (Siluriformes, Pimelodidae)

A espécie Steindachneridion parahybae, conhecida como Surubim-do-paraíba, possui grande porte, atingindo no mínimo 60cm de comprimento padrão. Tem corpo achatado, com dorso escuro marcado por muitas manchas pequenas e alongadas, hábitos predominantemente noturnos, seus olhos são pequenos e pouco eficientes, e a percepção do ambiente é auxiliada pelos barbilhões (GARAVELLO, 2005) (Figura 3). Sua ocorrência está associada a poções de pouca profundidade localizados nas regiões centrais dos rios e próximos as corredeiras. Pode ser encontrado também em áreas intermediárias como remansos do domínio das ilhas e nos encontros de rios (BIZERRIL, 1999, HONJI et al., 2009). Sua alimentação é composta por peixes (Rineloricaria sp. e Pimelodella sp.) e crustáceos (Trichodactylus sp.) (MORAES JÚNIOR & CARAMASCHI, 1993). Nesta espécie é observado canibalismo e fotofobia das larvas, características comuns entre os bagres. Presumi-se ainda que possua hábito migratório (HONJI et al., 2009). Assim como Pseudoplatystoma corruscans também conhecido como pintado, e outros siluriformes, existem poucas informações sobre o Surubim-do-paraíba, sua migração e desova. A fim de se entender melhor sobre o processo de migração, foram rastreadas as migrações de 24 fêmeas adultas de Surubim (pintado, Pseudoplatystoma coruscans (peso entre 9,5 a 29,0 kg), no rio São Francisco, a jusante da represa de Três Marias, com o uso de biotelemetria. O estudo revelou que na época da desova, que ocorre de novembro a março, fêmeas de Surubim encontram-se nas proximidades (até cerca de 11 km de distância) da cachoeira de Pirapora. Em dias de cheia, elas migram ao local e permanecem por um ou dois dias, provavelmente

para desovar. Uma mesma fêmea pode repetir este comportamento migratório várias vezes durante uma mesma estação reprodutiva. Alem disso, após a migração, algumas fêmeas regressam para o mesmo lugar que ocupavam anteriormente. Outras migram distâncias maiores, de quase 200 km, e espalham-se pelo rio São Francisco, indo da barragem de Três Marias até a cidade de São Romão. Outras entram pelo rio das Velhas, um dos maiores tributários do Rio São Francisco. Algumas poucas fêmeas ficam no sítio de desova até a próxima estação reprodutiva. A velocidade de natação durante a migração atinge até 31 km por dia (GODINHO, 2011)

Figura 3. Vista dorso lateral de Steindachneridion parahybae. Foto: Alexandre W.S. Hilsdorf.

O Surubim-do-paraíba, provavelmente, antes de todos os processos de degradação do Paraíba do sul, era encontrado em toda bacia do rio Paraíba do Sul. Segundo Machado & Abreu (1952), no início dos anos 50, foi observada a pesca desta espécie em 10 municípios do vale do Paraíba do Sul, sendo que em alguns destes municípios foi observado características dos rios, como corredeiras e poções que são mais propícias a presença dessa espécie. Atualmente sua ocorrência se dá exclusivamente nos estados de Minas Gerais e Rio de Janeiro, no entanto em 2009 foi capturado apenas um espécime desse peixe no trecho paulista da bacia do Paraíba do Sul, sendo considerada comercialmente extinta na região (Hilsdorf et al., 2006). De acordo com o Livro Vermelho da Fauna Brasileira Ameaçada de Extinção o Surubim-do-paraíba encontra-se criticamente em perigo na Lista Nacional das Espécies de Invertebrados Aquáticos e Peixes Ameaçados de Extinção (ROSA E LIMA, 2008).

1.6 Marcadores moleculares

Marcadores genéticos são características qualitativas com a herança Mendeliana, facilmente reconhecida e cuja expressão não sofrem influência ambiental de acordo com Robinson (1998) podendo ser morfológicos, bioquímicos ou moleculares. Diversas metodologias têm sido utilizadas para avaliar a estrutura populacional em espécies de peixes. Algumas destas incluem: diferenciações morfométricas e merísticas, estruturas calcificadas, características fisio-comportamentais e marcadores genético-bioquímicos (KUMPF et al., 1987). Porém, foi com uso de fenótipos eletroforéticos de proteínas, Stocks (1981), e a intensa variabilidade encontrada nos ácidos nucléicos, Hallerman et al. (1988) e Ferris & Berg (1987) que avanços significativos no estudo da estrutura populacional de vários grupos de animais e vegetais foram realizados. Com o desenvolvimento da técnica da PCR (Polymerase Chain Reaction), Saiki et al. (1985), tornaram-se possíveis estudos genético-moleculares envolvendo grande número de indivíduos. Esta técnica se baseia na síntese in vitro de milhões de cópias de um segmento especifico de DNA que permite a quantificação e análise da variabilidade genética intra e inter populacionais de qualquer organismo. A variabilidade genética é uma importante ferramenta de investigação para conferir afinidades e limites entre as espécies e estimar níveis de migração e dispersão das populações (MATIOLI et al., 2001). Estudos genéticos em populações de peixes neotropicais têm sido realizados utilizando-se marcadores bioquímicos e moleculares tais como: aloenzimas/isoenzimas, RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA), RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism), AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism), VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) e STR (Short Tandem Repeats) (OLIVEIRA et al., 2009). Marcadores moleculares podem ser utilizados em estudos de populações de peixes e em aquicultura com diversos objetivos, como, por exemplo, para identificação de híbridos e espécies, estabelecimento de relações filogenéticas, estimativa do tamanho efetivo populacional, identificação de populações-chave para conservação de recursos genéticos, determinação genética do impacto da introdução de espécies em uma determinada área. Informações moleculares podem

ser úteis, ainda, na definição de estratégias de melhoramento e construção de mapas genéticos, Ferguson et al. (1998), e para a certificação de produtos processados, além de estimar inúmeros parâmetros de interesse ecológico como o efeito gargalo, relações de parentesco e outros (SALKOE & TOONEN, 2006).

1.6.1 DNA mitocondrial

O DNA mitocondrial (DNAmt) é uma molécula que possui características favoráveis para estudos genético-evolutivos. Possui grandes quantidades por célula, seu genoma é pequeno, apresenta herança materna de acordo com Cummins et al. (1997), tem uma taxa mutacional maior do que o DNA nuclear e tal polimorfismo surge mais por mutação do que por recombinação (EYRE-WALKER & AWADALLA, 2001). Por estas razões, o DNAmt tem sido extensivamente utilizado para questões que envolvem estrutura populacional, Santos et al. (2007) e Hrbek et al. (2005), filogeografia, Sivasundar et al. (2001) e Bermingham & Martin (1998) e filogenia (SHIMABUKURO – DIAS et al., 2004 E HILSDORF et al., 2008). As informações contidas no DNA mitocondrial são comumente utilizadas como metodologias para estudos sobre a estrutura genética populacional e para o conhecimento das relações filogenéticas inter e intraespecíficas em diversos táxons (AVISE, 1994). O tamanho médio do DNAmt em peixes apresenta cerca de 16.500 (500) pares de base (pb). O genoma mitocondrial codifica 13 proteínas, 2 RNA ribossômicos, 22 RNA transportadores (MEYER, 1993). Há também uma região distinta conhecida como D-Loop (Displacement Loop) que controla a replicação e transcrição do DNAmt (CLAYTON, 1991). Essa região possui a maior taxa de substituição de nucleotídeos, apresentando desta forma uma taxa evolutiva de 2 a 5 vezes maior do que as outras regiões codificadoras do DNAmt (GREENBERG, 1983).

1.6.2 Marcadores Microssatélites

Uma das técnicas mais utilizadas para estudo do polimorfismo entre sequências de DNA é a SSR (repetições curtas em tandem “Short Tandem Repeats”), ou microssatélites (LITT E LUTY, 1989). Trata-se de elementos repetitivos, formados por arranjos de repetições em tandem, de dois a seis nucleotídeos de comprimento (FERGUSON et al., 1998; MILACH, 1998; MATIOLI, 2001). Os microssatélites predominantes em peixes compreendem, até agora, repetições de duas bases, usualmente (GT/CA)n ou (CT/CA)n. O polimorfismo desses marcadores baseia-se na variação do número dos elementos repetidos, provavelmente devido aos erros da DNA polimerase durante o processo de replicação e reparo da molécula de DNA. A repetição dinucleotídica [CA]n é uma das mais abundantes famílias de microssatélites. (LEE E KOCHER, 1996) Os loci microssatélites vem sendo a classe mais polimórfica de marcadores disponível (Queller et al.,1993), isso porque possuem potencial para fornecer estimativas de migrações contemporâneas, distinguem elevadas taxas de migração de panmixia e estima o parentesco dos indivíduos (SELKON & TOONEM, 2006). Comparando os microssatélites com outros marcadores moleculares, verifica- se que estes apresentam uma série de vantagens sobre os demais, pois são abundantes, cobrem extensivamente o genoma, possuem natureza multialélica, necessitam de pequenas quantidades de DNA para análise, são de fácil detecção por PCR, têm herança do tipo mendeliana e são expressos como alelos codominantes (LIMA, 1998; MOREIRA, 1999). Têm sido aplicados em diversos estudos na área animal, entre eles: estimativas de distâncias genéticas; monitoramento de linhagens endocruzadas; testes de paternidade em diversas espécies animais; comparações de composição genética de amostras recentes e antigas e análise da diversidade genética. Podem indicar aos criadores a ocorrência da redução da diversidade genética devido ao emprego de um pequeno número de parentais, por meio da comparação dos níveis de variabilidade entre a origem e o material derivado. Também auxiliam na identificação dos estoques mais divergentes geneticamente, de forma a maximizar a

recuperação da variabilidade genética via cruzamento, bem como para monitorar os níveis de endocruzamentos nos plantéis (MELO, et al., 2008)

1.7 A variabilidade genética em peixes neotropicais

Estudos sobre a variabilidade genética apresentam considerável importância quando se refere à elaboração de projetos que objetivam a conservação de recursos naturais (LEUZZI et al. 2004). A capacidade de uma população se adaptar a um ambiente em modificação depende da variabilidade genética. Indivíduos com determinados alelos ou combinações de alelos podem apresentar as características necessárias para sua sobrevivência e reprodução sob novas ou adversas condições. O estudo da variação em nível molecular pode fornecer respostas a tais adaptações observadas nos organismos. Os primeiros trabalhos com o emprego de marcadores de DNA em peixes neotropicais de água doce foram publicados na década de 90 (OLIVEIRA, 2009). A partir de então, inúmeros trabalhos utilizando diferentes marcadores moleculares visando o entendimento dos padrões genéticos das populações, resolução de problemas taxonômicos, de filogenia, conservação e introdução de espécies de cativeiro em populações selvagens, tem sido realizados (DERGAM et al., 1998; CHIARI & SORE, 1999; MOYSES & ALMEIDA, 2002). O uso de ferramentas genéticas para a caracterização de espécies híbridas tem sido o objeto de diversos estudos, Teixeira e Oliveira (2005) tal qual observado no trabalho de Gomes et al. (2011) o qual avaliou a diversidade genética de um estoque de Dourado (Salminus brasiliensis) utilizado em programas de repovoamento do rio Paranapanema, por meio do marcador RAPD. Pode se observar também no trabalho de Frederico et al. (2012) que, com o objetivo de observar a filogeografia da população de Paratrygon aiereba realizou análises genéticas com amostras de DNA do gene mitocondrial citocromo oxidase I (COI) e ATPase 6, para assim obter informações sobre a distribuição da diversidade genética e para determinar se existe estruturação genética possibilitando a conservação dos organismos estudados. Marcadores moleculares microssatélite são extensivamente utilizados em estudos genéticos de peixes (WASKO E GALETTI, 2002). Sua aplicação é ampla

como observado no trabalho de Lopez (2006) com uso de seis loci microssatélites de pacu P. mesopotamicus para o estudo da variabilidade genética de populações de Brycon sinuensis. Outros trabalhos são descritos utilizando o emprego de marcadores do tipo microssatélites entre esses podemos destacar o trabalho de Rueda (2011) no qual descreve o isolamento e caracterização dos loci de microssatélites polimórficos altamente variáveis, para uso da análise genética de peixes Characiformes migradores Salminus brasiliensis. Também descrito no trabalho de Olivatti (2011) o qual empregou o uso de loci microssatélites, utilizando os primers heterólogos, em 31 indivíduos de Leporinus friderici de populações naturais do rio Araguaia, na região central do Brasil, para avaliar a diversidade genética da espécie e apoiar os programas de manejo e conservação. Pode-se destacar também o emprego de marcadores microssatélites no trabalho de Barrero (2010), o qual objetivou estimar a diversidade genética de grupos de pacu (Piaractus mesopotamicus) A utilização de DNA mitocondrial é observado no trabalho de Sivasundar et al. (2001) para o qual utilizaram sequências do genoma mitocondrial (ATPase subunidades 6 e 8) com o intuito de inferir as relações filogenéticas de espécies do gênero Prochilodus oriundos das bacias dos rios Paraná, Amazonas, Orinoco e Magdalena. Ainda em relação à utilização de sequências gênicas, Prioli et al. (2002) usaram a região controladora do mtDNA de Astyanax altiparanae do rio Iguaçu para separar populações dessa espécie de populações de A. bimaculatus e verificar o nível de endemismo, isolamento geográfico e similaridade entre as populações. Oliveira et al. (2009) utilizaram análises do DNA mitocondrial para mostrar que as populações de tucunaré introduzidas na bacia do rio Paraná (UHE Itaipu, Capivari, Promissão e rio Paranapanema) eram originárias principalmente do rio Tocantins. Recentemente Matoso et al. (2011) verificou a variabilidade genética em Astyanax fasciatus presente na cabeceira do rio Tibagi e Vila Velha no Paraná, a partir da digestão enzimática de restrição (RFLP) da região DLoop do DNA mitocondrial. Pode ser observado também no trabalho de Carvajall (2010) o uso do DNA mitocondrial para investigar e avaliar a estrutura da população do tucunaré (Cichla pleiozona) na Amazônia boliviana.

1.8 PAN – Plano de Ação Nacional

O projeto “Monitoramento biológico de espécies aquáticas ameaçadas de extinção na bacia do rio Paraíba do Sul: desenvolvimento de sistema piloto e implementação de plano de ação”, estruturado a partir de um conjunto de ações previstas no Plano de Ação Nacional (PAN) Paraíba do Sul, coordenado pelo Centro de Pesquisa e Gestão de Recursos Pesqueiros Continentais (CEPTA) e Centro Nacional de Pesquisa e Conservação de Répteis e Anfíbios (RAN), foi contemplado com recursos do Comitê de Integração da Bacia Hidrográfica do Rio Paraíba do Sul (CEIVAP, 2010). Trata-se de um projeto de parceria entre o Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade (ICMBio) e a Associação de Pescadores e Amigos do Rio Paraíba do Sul – Projeto Piabanha. O objetivo geral do projeto é estruturar um sistema piloto de monitoramento biológico da fauna aquática ameaçada de extinção em trechos do médio e baixo rio Paraíba do Sul. Dentre as atividades programadas no projeto estão: mapeamento e monitoramento de populações remanescentes das espécies aquáticas ameaçadas de extinção; consolidar uma rede de parceiros para o desenvolvimento de atividades de conservação dos recursos hídricos do rio Paraíba do Sul; o desenvolvimento de um banco de dados geograficamente referenciado com informações, imagens e mapas para subsidiar demais atividades e uma série de outras ações. O PAN Paraíba do Sul tem como objetivo recuperar e manter as espécies aquáticas ameaçadas de extinção da Bacia do Rio Paraíba do Sul. Abrange nove espécies aquáticas ameaçadas de extinção, constituindo cinco espécies de peixes, um quelônio e três espécies de crustáceos. Estas espécies são alvos de programas de conservação: o Surubim-do-paraíba (Steindachneridion parahybae); piabanha (Brycon insignis); pirapitinga-do-sul (Brycon opalinus); cascudo-leiteiro (Pogonopoma parahybae); curimbatá (Prochilodus vimboides); cágado-de-hogei (Mesoclemmys hogei); camarão-gigante-africano ou camarão-negro (Atya gabonensis); camarão-pedra ou camarão-babu (Atya scabra); pitu-verdadeiro (Macrobrachium carcinus).

Assim, o presente trabalho representa parte desse projeto que objetiva estabelecer estratégias de conservação e manejo, baseado nos resultados das analises genéticas.

2. Objetivos

2.1 Geral

O presente trabalho objetiva avaliar a diversidade genética da espécie Steindachneridion parahybae por meio do sequenciamento da região D-loop do DNA mitocondrial e de marcadores do tipo microssatélites (SSR) com a finalidade de propor estratégias de conservação, manejo e recuperação das populações remanescentes.

2.2 Específicos

 Construção de uma biblioteca enriquecida em microssatélites para a espécie.  Avaliar a variabilidade intra e interpopulacional por meio de marcadores microssatélites.  Avaliar a variabilidade genética de Steindachneridion parahybae por comparação de sequências da região hiper variável D-loop mitocondrial.  Propor um manejo reprodutivo baseado nos resultados gerados para otimizar os programas de repovoamento

O fluxograma abaixo descreve as etapas seguidas para obter os resultados desejados.

3. MÉTODO

3.1 Ocorrência de populações de Surubim-do-paraíba.

O presente trabalho foi conduzido com recursos do projeto “Formação de um banco de germoplasma da ictiofauna ameaçada do rio Paraíba do Sul” financiado pela CESP/ANEEL/FAEP no Laboratório de Genética de Organismos Aquáticos e Aquicultura (LAGOAA) do Núcleo Integrado de Biotecnologia (NIB), da Universidade de Mogi das Cruzes. Este projeto visa mapear e capturar exemplares de três espécies de peixes nativas da bacia do Paraíba do Sul, listadas no Livro vermelho da fauna brasileira ameaçada de extinção (MACHADO et al., 2008). Entre estas, encontram-se o Surubim-do-paraíba. A captura dos indivíduos na região do Rio Paraíba do Sul foi conduzida com auxílio de pescadores locais, equipe da Estação de Hidrobiologia e Aquicultura de Paraibuna da CESP e do Projeto Piabanha localizado em Itaocara, no Estado do Rio de Janeiro. A captura no Rio Muriaé, afluente da Bacia do Paraíba do Sul, foi conduzido pela equipe do Centro Nacional de Pesquisa e Conservação de Peixes Continentais, órgão vinculado ao Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade. Durante o período de dois anos de mapeamento de localidades de ocorrência de populações de Surubim-do-paraíba foram identificadas quatro locais cuja presença desta espécie já havia sido constatada com a captura de exemplares (Figura 4 e 5). Contudo, apesar das populações terem sido localizadas, os dois anos de coleta com intenso esforço de pesca não foram suficientes para capturar um número representativo de indivíduos, o que sugere a frágil situação destas populações.

Figura 4. Mapa com a localização dos pontos de amostragens do Steindachneridion parahybae. Fonte: Vívian Uhlig (2012).

3.2 Localidades de Captura de Surubim-do-paraíba (Steindachneridion parahybae)

3.2.1 Rio Paraíba do Sul - Município de Lavrinhas – SP.

No intuito de se verificar informações sobre a ocorrência do Surubim-do- paraíba na região de Lavrinhas – SP e de se ampliar o número de áreas de captura da espécie para o projeto de Pesquisa e Desenvolvimento CESP/ANEEL (0061- 017/2006) “Formação de um banco de germoplasma da Ictiofauna ameaçada da bacia do rio Paraíba do sul”, foi enviada para a região uma equipe da Estação de Hidrobiologia e Aquicultura de Paraibuna da CESP. Com o Apoio da Secretaria de Meio Ambiente do município foram feitos contatos com pescadores locais, que indicaram os principais pontos de ocorrência da espécie (Figura 5), tendo sido realizados esforços de captura nos dias 09, 10 e 11 de novembro de 2010. Sob a orientação do pescador amador, Francisco de Paula Cordeiro (Chiquinho), a equipe se dividiu em 03 pontos da região de influência da PCH Lavrinhas, em implantação na região, sendo que na quinta feira (11/11/2010), por volta das 20h30, o técnico de Meio Ambiente da CESP – Benedito da Piedade Pereira Barros, fisgou um exemplar de Surubim-do-paraíba. O indivíduo capturado pesou 1440 g e foi transportado para a Estação em Paraibuna onde foi marcado eletronicamente e amostrado para futuras avaliações genéticas (Figura 6). A presença desse único animal não indica que há uma população estabelecida nessa região, principalmente porque nessa região estão sendo implementadas duas Pequenas Centrais Hidrelétricas (PCHs) (CEIVAP, 2010). A captura em questão realimenta a esperança na recuperação da espécie no Estado, já que a mesma atualmente é considerada regionalmente extinta, conforme o Livro da Fauna Ameaçada de Extinção no Estado de São Paulo.

Figura 5. Vista geral de umas das áreas de captura no município Lavrinhas – SP, Rio Paraíba do Sul, cruzamento com a Rodovia Presidente Dutra, Lavrinhas- SP. Fonte: Google (2012)

Figura 6. Espécime de Steindachneridion parahybae capturado Lavrinhas-SP. Fonte: Danilo Caneppele.

3.2.2 Rio Paraíba do Sul – Entre os municípios de Rio das Flores – RJ (margem esquerda) e Andrade Pinto – RJ (margem direita)

Conforme a figura 7 e 10 o trecho amostrado nesta localidade se apresenta bastante meandrado, com a presença de diversas ilhas fluviais rodeadas por corredeiras e remansos. A cobertura vegetal natural nas margens do Rio Paraíba do Sul é praticamente inexistente em toda a sua extensão, restando aqui apenas poucos fragmentos quase sempre localizados nas Ilhas.

Figura 7. Locais de captura entre as localidades de Andrade Pinto – Rio Paraíba e Fazenda dos Casais – Rio das Flores. Fonte: Google (2012)

A maioria dos exemplares provenientes desta localidade foi capturada ao longo do tempo pelo dono da Fazenda dos Casais (Sr. Elder) e mantidos em um tanque da própria fazenda até terem sido disponibilizados à CESP em dezembro de 2003. As figuras 12 e 13 mostram regiões investigadas à procura de novos espécimes. A figura 11 apresenta um dos animais capturados durante o período em que foi encontrado o maior numero de animais. Durante o andamento do Projeto de P&D (2007 a 2010) foram realizadas diversas campanhas de captura pela equipe da

CESP, porém, após o acidente ocorrido em nov/2008 (vazamento de Endosulfan – SERVATS) todas as tentativas de captura foram frustradas. Este acidente acarretou a mortalidade de peixes em uma escala realmente significativa (Figura 8 e 9)

Figura 8. Espécimes mortas de Dourado e Surubim-do-paraíba encontradas após acidente com Endosulfan. Fonte: Danilo Caneppele.

Figura 9. Mortalidade de várias espécies de peixes após acidente com Endosulfan no rio Pirapitinga um dos afluentes do Rio Paraíba do Sul. Fonte: Ricardo Terra

Figura 10. Detalhe das ilhas e corredeiras presentes na região de captura. . Fonte: Google (2012)

Figura 11. Exemplar capturado na localidade de Andrade Pinto – RJ. Fonte: Danilo Caneppele

Figura 12. Vista geral de umas das áreas de captura no município Andrade Pinto – RJ. Fonte: Danilo Caneppele.

Figura 13. Pescadores locais no apoio às campanhas de coleta de exemplares de Surubim-do- paraíba. Fonte: Danilo Caneppele

3.2.3 Rio Preto - Afonso Arinos

Os exemplares capturados nesta localidade são fruto de esforços anteriores ao início do projeto. Em janeiro de 1998 foram obtidos os primeiros exemplares através de uma campanha realizada pela equipe da CESP com o apoio de pescadores locais, confirmando a presença da espécie na localidade, sendo que em dezembro de 2006, outros exemplares foram capturados. Observam-se nessa localidade grandes áreas com pouca cobertura vegetal, e grande proximidade com a cidade, o que pode permitir a interferência humana nessa população (Figura 14 e 15). Durante a realização do projeto foram realizadas campanhas na localidade, ampliando os esforços para áreas à montante e à jusante do ponto original das primeiras capturas, porém sem o sucesso esperado. Vale destacar que na última década foram implantadas três Pequenas Centrais Hidrelétricas (PCHs) na região de confluência entre os rios Preto e Paraibuna, provavelmente alterando processos migratórios de dispersão da espécie.

Figura 14. Mapa da localidade de Afonso Arinos – Rio Preto - RJ. Fonte: Google (2012)

Figura 15. Vista geral de uma das áreas de captura no município de Afonso Arinos – Rio Preto. Fonte: Danilo Caneppele.

3.2.4 Rio Muriaé (RMIT) – Itaperuna – RJ

Os exemplares de Surubim foram capturados no Rio Muriaé a aproximadamente 8 km a montante da cidade de Itaperuna (Figura 16). O rio Muriaé nasce em Minas Gerais, desaguando no rio Paraíba do Sul no Rio de Janeiro. A região de coleta está localizada em uma região de agricultura, desprovida de proteção por mata ciliar, processo este iniciado com o cultivo de café no século XIX (Figura 17 e 18). É importante salientar que o rio Muriaé foi atingindo em 2006 e 2007 por vazamentos de lama resultante do tratamento de bauxita. O rio Muriaé apresenta instaladas duas PCHs, uma em funcionamento próxima a cidade de Miraí e outra desativada no distrito de Venâncio, em Itaperuna. A coleta foi realizada no período de 27 de junho a 30 de junho de 2011. A localização da população foi feita por um pescador local Sr. Ivan Nunes Nogueira da colônia de pescadores Z21 em colaboração com a equipe do ICMBio do CEPTA- Pirassununga. Inicialmente, não houve êxito em capturas nas localidades apontadas pelo Sr. Ivan pela equipe do CEPTA. Os 12 exemplares foram capturados em um único ponto com rede de espera. De acordo como relato do Sr. Ivan, o Surubim era

relativamente fácil de capturar, contudo atualmente somente alguns poucos pescadores que sabem sua localização conseguem ainda com certa dificuldade pescá-lo. Os animais selvagens capturados no Paraíba do Sul, no Rio Pomba e no Rio Preto estão sendo mantidos na Estação de Hidrobiologia e Aquicultura de Paraibuna da Companhia Energética de São Paulo (CESP) em Paraibuna, no Estado de São Paulo, devidamente marcados com micro – transpondes na região dorsal para identificação para constituírem o banco de germoplasma ex-situ da espécie (Tabela 1). Os outros animais selvagens capturados no rio Muriaé estão sendo mantidos no Centro Nacional de Pesquisa e Conservação de Peixes Continentais, órgão vinculado ao Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade (ICMBio) em Pirassununga (SP).

Figura 16: Mapa com a localização do Distrito de Itaperuna - RJ Fonte: Google (2012)

Figura 17: Vista geral de umas das áreas de captura no município de Itaperuna – RJ. Rio Muriaé – RJ. Fonte: Dr. Sandoval dos Santos Júnior

Figura 18: Vista geral de umas das áreas de captura no rio Muriaé - RJ. Fonte: Dr. Sandoval dos Santos Júnior

Tabela 1- Localização dos locais de captura do Surubim-do-paraíba.

Localidade Posição geográfica N

1-Rio Paraíba do Sul (RPLA) –Lavrinhas – SP 22º34’38.95’’S; 44º53’28.87’’O 1

2- Rio Paraíba do Sul (RPAP) – Andrade Pinto – RJ 22º28’12.79’’S; 44º16’07.42’’O 25 3- Rio Preto (RPAA) – Afonso Arinos – RJ 22º00’33.78’’S; 43º20’25.79’’O 5 4- Rio Pomba (RPSP) –Santo Antônio de Pádua – 22º34’38.95’’S; 44º53’28.87’’O 3 RJ 5- Rio Muriaé (RMIT) – Itaperuna – RJ 21º11’36.69’’S; 41º59’18.33’’O 12

Apesar dos intensos esforços de captura, devido às condições ambientais e aos acidentes ocorridos nos rios amostrados, um número baixo amostral foi capturado para as análises populacionais. Contudo, todos os animais foram investigados quanto à presença de haplótipos.

3.3 Coleta de tecido e extração de DNA

Amostras de tecido da nadadeira caudal foram retiradas de cada indivíduo Hilsdorf et al. (1999) mantidos na CESP e no ICMBio e armazenada em etanol 95%. Posteriormente, as amostras foram levadas para Laboratório de Genética de Organismos Aquáticos e Aquicultura (LAGOAA) do Núcleo Integrado de Biotecnologia (NIB), da Universidade de Mogi das Cruzes. A extração do DNA total foi realizada de acordo com protocolo descrito por Taggart et al. (1992) com uma modificação: o uso do tampão STE (0,1 M NaCl, 0,05M Tris-HCl e 0,01M EDTA, pH 8,0) com menores quantidades de EDTA, visto que este pode quelar o MgCl2, reduzindo a eficiência de amplificação pelo PCR. A qualidade e integridade do DNA foram testadas em eletroforese 0,8% e a quantidade foi medida por espectrofotometria no NanoDrop® ND-1000 (Thermo Fisher Scientific). As amostras de DNA foram devidamente catalogadas e armazenadas em freezer a – 2° C.

3.4 Amplificações e sequênciamento das regiões do D-loop do DNA mitocondrial.

Os primers utilizados nesta etapa foram previamente desenvolvidos por Cruz (2009). As amplificações pela reação em cadeia de polimerase (PCR) foram realizadas para um volume final de 25,0 μL, contendo 2,5 μL de tampão de reação 10x (KCl buffer), 2,5 μl de cada primer (direto e reverso), 2,5 μL de deoxinucleotideo trifosfato 2,5 mM (dATP, dCTP, dTTP, dGTP, Amershan Pharmacia Biotech), 2,5 mM de MgCl2, 0.5 de Taq DNA Polimerase (Invitrogen) e 2.5 μL de DNA, água ultrapura para completar o volume. As condições de amplificação no termociclador estão descritas na Tabela 2.

Tabela 2 - Condições de amplificação para os primers de D-loop. Etapas Temperatura Tempo 1. Desnaturação inicial 94 4 minutos 2. Desnaturação 94 1 minuto 3. Anelamento 58 1 minuto 4. Extensão 72 2 minutos 5. Repetir a etapa 2 _ 35 vezes 6. Extensão final 72 7 minutos

Todas as PCR foram verificados após corrida em gel de agarose 1,0%, marcadas com brometo de etídio e fotografados no fotodocumentador em luz UV, comparando-se os tamanhos de fragmentos com o marcador 100 pb (Invitrogen). Após a amplificação do fragmento alvo do D-loop do DNAmt foi feita a purificação com kit (GE Helathcare Life Science), e então as amostras foram enviadas ao Centro de Estudos do Genoma Humano (USP), para sequênciamento pelo sistema ABI 3730 DNA Analyser (reação BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit). Cada amostra foi sequenciada duas vezes.

3.5 Construção da biblioteca genômica enriquecida em microssatélites

3.5.1 Digestão do DNA genômico

O DNA genômico (180 ng) extraído do tecido da nadadeira do Surubim-do- paraíba, foi digerido por meio da enzima de restrição de corte frequente, Rsa I (10 U/μg), formando fragmentos entre 300 e 600 pb. A reação de digestão foi realizada, de acordo com a instrução do fabricante, modificada apenas pelo acréscimo de espermidina (40 mM para uma reação de 25 μL). Posteriormente incubada a 37º C por 12h. Os produtos gerados pela digestão do DNA foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1% por 2 horas a 60V.

3.5.2 Seleção dos fragmentos

Adaptadores com sequências conhecidas de 21 e 25 pb Rsa21 (5´CTCTTGCTTACGCGTGGACTA3´) e Rsa25 (5’TAGTCCACGCGTAAG CAAGAGCACA3’) foram ligadas, com o auxílio da enzima T4 ligase (Amershan Pharmacia Biotech), aos fragmentos com extremidades abruptas, gerados pela digestão do DNA. A reação de ligação foi realizada com: 6 μL de DNA digerido, 10 μL de tampão

5X (Amershan Pharmacia Biotech – (150 mM Tris-HCl (pH 7,8), 50 mM de MgCl2, 50 mM de DTT e 5 mM de ATP)), 2 μL de adaptador (10 μM), 4 unidades de T4 DNA ligase e água para completar 50 μL. Essa reação foi incubada a 20º C por 2h.

3.5.3 Pré-amplificação

Para enriquecer o produto da ligação e evitar a seleção e exclusão casual de alguns fragmentos, o produto da reação de ligação foi amplificado utilizando apenas um primer Blunt, neste caso o oligonucleotídeo Rsa21. A reação de amplificação constituiu em: 5 μL do produto da ligação; 2,0 μL do primer Rsa21 (10 μM); 5,0 μL

de tampão 10 X (50 mM KCl; 10 mM de Tris-HCl, pH 8,9); 2,0 μL de MgCl2 (50 mM); 4μL de dNTP (2,5 mM), 1,0 μL de Taq polimerase (5 U) e água deionizada autoclavada para completar o volume final de 50 μL. O produto da amplificação da ligação foi então purificado com o kit (Quiaquick PCR Purification Kit, Quiagen) .

3.5.4 Seleção dos fragmentos contendo microssatélites

O material purificado da pré-amplificação foi então, submetido ao passo de enriquecimento da biblioteca de regiões contendo as repetições desejadas. Os fragmentos contendo sequências ricas em GA a CA foram selecionados por meio da hibridização com oligonucleotídeos biotinilados biotina IIIII (CT) 8 e biotina IIIIII (GT) 8 que se ligam a estreptavidina contida nas partículas magnéticas (Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles, Promega). Como as contas magnéticas marcadas com estreptavidina precisam de uma preparação prévia, estas partículas foram lavadas. Para isso 600μL da solução contendo estas partículas, foram homogeneizados e colocados em um microtubo. Com o auxílio de uma rack (Magna Separator Magnetic Particle, Promega) as partículas foram então aderidas à parede do tubo e após cerca de 30 s removeu-se o sobrenatante. O tubo foi então removido da rack e 300 μL de SSC 0,5 x foram adicionados e misturados às partículas. Este passo foi repetido por três vezes. Após o sobrenadante ser removido pela última vez, as partículas foram ressuspendidas em 100 μL de SSC 0,5x. Para o preparo do DNA, foram utilizadas 400 μL de água adicionados a 100 μL de DNA purificado. Essa solução foi incubada a 95º C por 15 minutos. Em seguida, adicionaram-se 13 μL de SSC 20x e 3 μL de cada sonda de microssatélite biotinilado – biotina IIIII (CT)8 e biotina IIIIII (GT)8, sendo hibridizados à temperatura de 60º C por 20 minutos, com agitação suave a cada 2 minutos. Em seguida, misturaram-se as esferas magnéticas pré-lavadas à mistura de hibridização. Após incubar em temperatura ambiente, magnetizar e ressuspender, obtêm-se o sobrenadante contendo os fragmentos selecionados.

3.5.5 Amplificação dos fragmentos selecionados

Os fragmentos selecionados foram reamplificados usando o oligonucleotídeo Rsa21. A reação de amplificação continha: 20 μL de fragmentos selecionados pelas contas magnéticas, 4 μL de Rsa21 (10 μM), 10μL de tampão 10x (Fermentas), 6 μL de MgCl2 (25mM), 8μL de dNTP (2,5mM), 1 unidade de Taq DNA polimerase (Fermentas) e água deionizada para completar o volume de 100 μL. A amplificação apresentou as seguintes condições: 96°C por 5 min; 40 ciclos de 96°C por 45 s, 62°C por 1 min e 72°C por 2 min; alongamento final a 72°C por 2 min. O produto foi aplicado em gel de agarose 1% a 120 V por 1h e 40 min. aproximadamente.

3.5.6 Clonagem

Após a etapa de amplificação pela Reação em Cadeia da Polimerase, os fragmentos selecionados foram ligados ao plasmídeo (pGEM-T Vector System, Promega). Este plasmídeo possui o gene AMPr, que confere resistência ao antibiótico ampicilina, as bactérias que possuem este plasmídeo são capazes de sobreviver em um meio de cultura contendo ampicilina.

3.5.7 Transformação de bactérias

Para a transformação, foram utilizadas bactérias Escherichia coli linhagem XL- Blue, modificadas pelo método de Hanahan et al. (1991), no qual se utiliza o choque térmico, processo pelo qual a parede celular das bactérias competentes é desestabilizada temporariamente, permitindo a entrada de DNAs exógenos.

3.5.8 Plaqueamento das bactérias transformadas

Uma vez transformadas, as bactérias competentes foram plaqueadas em meio LB-ágar com ampicilina e X-Gal e incubadas em estufa a 37º C por 20 h. A seleção

das colônias foi realizada, de forma a escolher, aquelas que apresentavam coloração branca, as chamadas colônias positivas. Após a seleção das colônias positivas, estas foram replicadas em meio 2YT-HMFM contendo ampicilina e incubadas a 37ºC por 20 h. Logo após, foram deixadas em freezer a -20ºC por 30 min, e armazenadas com glicerol em freezer à -80ºC.

3.5.9 Amplificação dos insertos clonados

Com o objetivo de identificar os clones contendo microssatélites e verificar a eficiência do procedimento de enriquecimento e clonagem, uma reação de amplificação dos insertos diretamente das colônias obtidas na etapa anterior foi realizada, utilizando-se o primer Rsa21. Colônias individuais foram transferidas com o auxílio de um palito estéril para o tubo de PCR contendo 30,5 μL de água deionizada (milliQ estéril). Esta suspensão de células foi utilizada em uma reação com volume final de 45,0 μL contendo as seguintes concentrações dos reagentes:

5,0 μL de tampão 10X (50 mM KCl; 10mM de Tris-HCl, pH 8,9), 4,0 μL de MgCl2 (2,5 mM), 4,0 μL de dNTP (2,5 mM), 2,5 μL de Rsa21 (10 mM), 1,0 μL de Taq DNA polimerase (5 U/μL). Esta reação foi submetida a um passo inicial de desnaturação a 95ºC por 4 minutos, seguido de 30 ciclos (94ºC por 30 s, 52ºC por 45 s, 72ºC por 1 min e 30 s) e um passo final de extensão a 72ºC por 8 min. Para controle, 10 μL do volume da reação foram utilizados na eletroforese em gel de agarose 1,5%.

3.5.10 Miniprep

Após o crescimento das bactérias foi realizado o processo de Miniprep, que é a extração de DNA plasmidial de 25 clones, extraídos com o kit para mini-prep da GE Healthcare (Illustra tissue & cells genomicPrep Mini Spin Kit) no Laboratório de Genética de Organismos Aquáticos e Aquicultura (LAGOAA).

3.5.11 Sequênciamento e análise das sequências

Após a construção do banco com fragmentos enriquecidos em microssatélites foi realizada a etapa de sequênciamento dos clones positivos com o primer T7 (primer direto). A reação consiste em: 1 μL de água ultrapura, 2 L de tampão Save Money, 1 μL de primer (5 pmol), 4 μL de DNA do plasmídeo e 2 μL de Big Dye (vs.3.1), com um volume final de 10 μL e amplificada em termociclador nas seguintes condições: 96°C, seguido de 35 ciclos (96° C por 45 s, 50° C por 30 s e 60° C por 4 min). As 25 amostras foram sequênciadas utilizando o sistema automático ABI 3730 DNA Analyser no Centro de Estudos do Genoma Humano USP. As sequências foram visualizadas no software CodonCode Alingner versão 3.7.1 .(2010). Nesse mesmo programa, a sequência do adaptador foi identificada e removida.

3.5.12 Desenho dos primers

Os primers direto e reverso de cada SSR foram desenhados com o auxílio do software Primer 3 ( Rozen et al.; 2000), de acordo com os seguintes critérios: não conter bases redundantes; estar a uma distância adequada dos SSRs (entre 20 a 60 pb); ser constituídos por 17 a 23 nucleotídeos sem sequências repetitivas; conter uma porcentagem de bases G e C entre 50 a 55 %; começar em 5’ e terminar em 3’ com duas bases G, ou C, ou G e C, se possível; e ter temperatura de anelamento entre 45 e 60 °C, com diferença máxima de 2 ºC entre as temperaturas dos primers direto e reverso, de modo que possam ser usados na mesma reação e não sofram auto-hibridização.

3.5.13 Testes de amplificação dos microssatélites

Testes preliminares foram realizados para determinar as condições ótimas de temperatura de anelamento, concentrações de MgCl2 e de DNA para amplificação de cada loco. Testaram-se gradientes de temperatura que variaram de 45 a 65°C

(Tabela 3), concentrações de MgCl2 de 1,5 a 3,0 mM e concentrações de DNA de 50 a 150 ng/μL. Os primers, sintetizados, foram diluídos em água ultra-pura autoclavada para uma concentração final de 10 μM. As amplificações pela reação em cadeia de polimerase (PCR) foram realizadas para um volume final de 10,0 μL, contendo 1,0 μL de tampão de reação 10x (KCl buffer), 0,5 μM de cada primer (direto e reverso), 1,0 μL de deoxinucleotideo trifosfato 2,5 mM (dATP, dCTP, dTTP, dGTP, Amershan

Pharmacia Biotech), 1,5 – 3,0 mM de MgCl2, 1,25 U de Taq DNA Polimerase (Fermentas), 1 μL de DNA e água ultra pura para completar o volume. A reação de amplificação do DNA foi realizada em termociclador PTC-200 (MJ Research) com um ciclo inicial de desnaturação a 94°C por 3 min, seguido de 30 - 35 ciclos (94°C por 30 s para desnaturação, temperatura de anelamento por 30 s, 72°C por 1 min para extensão) e extensão final de 72°C por 5 min.

Tabela 3. Condições de amplificação Etapas Temperatura Tempo 7. Desnaturação inicial 95º C 3 minutos 8. Desnaturação 95º C 40 segundos 9. Anelamento Variável 30 segundos 10. Extensão 72º C 2 minutos 11. Repetir a etapa 2 - 30 vezes 12. Extensão final 72º C 8 Minutos

3.5.14 Eletroforese em gel de poliacrilamida e genotipagem

O produto de amplificação foi submetido a eletroforese em gel de poliacrilamida a 9%, contendo: 21 mL de água ultra pura; 9 mL de poliacrilamida 30% (Acrilamida e Metilenobisacrilamida 29:1); 1,5 mL de TBE 10x (pH 8,3); 300 μL de persulfato de amônio (APS) e 30 μL de TEMED. As amostras foram preparadas numa proporção de 1:1 (produto de PCR: azul de bromofenol), foram aplicadas 5 μL de cada amostras em cada poço e 3 μL dos marcadores de 10 e 100 pb (DNA Ladder - Fermentas). O tampão de corrida

consistiu de TBE 10x. A fonte de energia foi ajustada para 400 v. O tempo de corrida variou de acordo com o tamanho de cada lócus, cerca de 2 horas para 150pb e 3 a 4 horas para 200 a 220pb. Os géis foram marcados com Nitrato de Prata (AgNO3) a 2g/L e revelado com solução de hidróxido de sódio (NaOH) a 12g/L com 800 µl de formaldeído em 1 L de água ultra pura). Posteriormente, o gel foi fotografado em fotodocumentador ImageQuantTM 300 Imager (GE Healthcare). As bandas foram medidas com o programa ImageQuantTM TL analysis (GE Healthcare).

3.6 ANÁLISES ESTATÍSTICAS

3.7 DNA mitocondrial

O resultado do sequênciamento foi analisado pelo programa CodonCode Aligner versão 3.7.1 (2010) para avaliar a qualidade das sequências e, gerar as sequências consensos. Os consensos (contigs) foram gerados a partir da comparação de duas ou mais sequências da mesma amostra. Os contigs servem para confirmar cada nucleotídeo sequenciado, descartando erros no processo de sequênciamento. O CodonCode é um programa que realiza a identificação de bases a partir do eletroforetograma (base-calling) e determina a confiabilidade de cada base, levando em conta anomalias na migração eletroforética decorrente da inserção dos terminadores e do espectro de emissão dos fluoróforos. As sequências consensos foram automaticamente alinhadas pelo ClustalW implementado no programa MEGA versão 5 (2011). O alinhamento foi feito após a remoção de ambiguidades no começo e no fim de cada sequência. Para avaliar a neutralidade do processo de seleção natural foram usados os testes de Fs de Fu e D de Tajima executados no programa DnaSP. Se o resultado destes testes forem não significativos podemos dizer que as populações estão em equilíbrio genético. A variabilidade genética foi estimada usando os seguintes parâmetros: diversidades nucleotídicas (π) (Nei, 1987), diversidades haplotípicas (Hd), Nei e Tajima (1981) e número de sítios polimórficos (S) pelo programa DnaSP (ROZAS et al., 2008). A análise da estrutura genética das populações foi realizada pela Análise da Variância Molecular (AMOVA – Analysis of Molecular Variance). Esta estimativa leva em consideração a frequência de distribuição dos haplótipos, e o número de diferenças de sítios de restrição entre eles. Os valores de divergências são incorporados a uma análise de variância para estimar o grau de subdivisão genética intraespecífica (EXCOFFIER et al., 1992). Desta forma são produzidas estimativas dos componentes de variância e valores análogos ao Fst, Wright (1951), modificados para genomas haplóides (WEIR E COCKERHAM, 1984). A AMOVA foi processada com o programa Arlequin, versão 3.5.1.2. (EXCOFFIER e LISCHER, 2010). Das amostras coletadas nas três localidades do Rio Paraíba do Sul apenas

as do Rio das Flores foram utilizadas para comparação com as amostras do Rio Muriaé, devido ao número de animais capturados.

3.8 Microssatélites

As sequências foram visualizadas no programa CodonCode Aligner versão 3.7.1 (2010) para localização de microssatélites e análise da qualidade das sequências. Nesse mesmo programa, a sequência do adaptador foi identificada e removida. Após a seleção das sequências que contém microssatélites, estas foram alinhadas pelo método Clustal W, por meio do programa BioEdit (HALL et al.; 1999), que também foi utilizado para avaliar o nível de redundância entre as sequências. A diversidade genética intrapopulacional foi caracterizada pelo número de alelos (A), riqueza alélica (AR); heterozigosidade observada (HO) heterozigosidade esperada (HE); equilíbrio de Hardy Weinberg (PHW); coeficiente de endogamia (FIS). Estes parâmetros foram obtidos nos programas ARLEQUIM v. 3.01 (EXCOFFIER et al.,2006), FSTAT v. 2.9.3.2 (GOUDET, 2002).

4. Resultados

4.1 Extração de DNA

As extrações de DNA total foram realizadas com sucesso. O DNA extraído apresentou pouca degradação quando observada em gel de agarose 0,8% (Figura 19), e forneceram material suficiente para o desenvolvimento deste trabalho. As concentrações de DNA obtidas variaram de 150 ng/µl a 2500 ng/µl, todas com bons níveis de pureza, mostrando razões entre os comprimentos de onda e 260/280 próximos a 2.0.

Figura 19 - Gel de agarose a 0,8% com DNA genômico extraído da nadadeira do Steindachneridion parahybae, marcado com brometo de etídeo.

4.2 Amplificações e sequênciamento das regiões do D-loop do DNA mitocondrial.

Todas as amostras foram amplificadas com sucesso. As amplificações produziram um fragmento de 1000 pares de base, e as bandas apresentavam resíduos da amplificação (Figura 21). Após a purificação com o kit, os resíduos da amplificação foram retirados (Figura 22) e as amostras foram enviadas para sequênciamento.

Figura 20 - Gel de agarose a 1% com produto de PCR marcado com brometo de etídeo. Nota: Marcador 1Kb Fermentas. Amostras H (RPAP) Andrade Pinto.

Figura 21 – Gel de agarose a 1% com produtos de PCR após purificação com kit e corado com brometo de etídeo. Nota: Marcador λ-Hind Invitrogen. M

4.3 Análises estatísticas das sequências

O alinhamento final das sequências da região controle do DNAmt, com 657 pares de bases de comprimento, obtidas das 46 amostras de Steindachneridion parahybae analisadas gerou uma matriz de dados que definiu um total de 27 haplótipos (Tabela 4). A média de bases nucleotídicas calculadas foi de 32,6% de adenina, 36,7% de timina, 15% de guanina e 15,7% de citosina, evidenciando a prevalência de AT na composição genética dessa região. Dezesseis sítios polimórficos foram encontrados (Tabela 5).

Tabela 4 - Distribuição das amostras de Steindachneridion parahybae de acordo com os locais de coletas e haplótipos encontrados. (-) haplótipos não encontrados. Haplótipos Localidade RPLA RPAP RPAA RPSP RMIT Hap 1 1 3 2 - - Hap 2 - 1 - - - Hap 3 - 2 - - - Hap 4 - 1 - - - Hap 5 - 1 - - - Hap 6 - 1 - - - Hap 7 - 1 - - - Hap 8 - 2 - - - Hap 9 - 1 - - - Hap 10 - 1 - - - Hap 11 - 1 - - - Hap 12 - 1 - - - Hap 13 - 1 - - - Hap 14 - 2 - - - Hap 15 - 1 - - - Hap 16 - 1 - - - Hap 17 - 1 - - - Hap 18 - 1 - - -

Hap 19 - - 1 - - Hap 20 - - 1 - - Hap 21 - - 1 1 7 Hap 22 - - - 1 - Hap 23 - 1 - 1 - Hap 24 - 1 - - - Hap 25 - - - - 2 Hap 26 - - - - 1 Hap 27 - - - - 2 Total 1 25 5 3 12

Do total de haplótipos obtidos (27), três são compartilhados entre os locais de coletas e os outros 24 são exclusivos.

Tabela 5 - Sítios polimórficos entre os haplótipos de S. parahybae. Os números dos haplótipos estão listados na coluna à esquerda e as posições polimórficas no alto da tabela. Os nucleotídeos do haplótipo 1 (Hap 1) representam os demais nucleotídeos na mesma posição. Nos sítios polimórficos os nucleotídeos diferentes são indicados na tabela. Nucleotídeos idênticos são representados por (.).

27 139 143 144 212 273 282 306 401 521 523 534 563 573 614 623 Hap 1 A T A A C A A G A T G C A G G T Hap 2 ...... A C . . T . . A C Hap 3 . . . . T ...... A . Hap 4 ...... C ...... Hap 5 ...... A ...... Hap 6 . . . . T . . . C . . . . . A . Hap 7 G . . . T ...... T . A . . Hap 8 . . . . T G . A C C A T . A A . Hap 9 ...... A . C ...... Hap 10 ...... A C . . T . . A . Hap 11 . . . . T . . A . C . . . . A . Hap 12 ...... A C . . T . . . . Hap 13 . . . . T . . A C . . . . . A . Hap 14 G . . . T G . . C C A T G A A . Hap 15 G . . . T . . A C C . . G . A . Hap 16 . . . . T . . . C C . . . . A . Hap 17 ...... A C C ...... Hap 18 . . . . T . . . . C . . . . A . Hap 19 . . . . T ...... T G . A . Hap 20 . . . . T G . . . . . T G A A . Hap 21 G . G G T G . A C C A T G A A . Hap 22 G . G . T G . . C C A T G A A . Hap 23 . . G . T . . A C C A T . A A . Hap 24 . . . . T . A C C . . . . A . Hap 25 . . G . T . G . C C . . G . A . Hap 26 . C G . T . G A C C A T . A A . Hap 27 . C G . T G G A C C A T . A A .

4.4 Diversidade nucleotídica e haplotípica

As características moleculares das populações de S. parahybae dos rios Paraíba do Sul (RPAA) e do Rio Muriaé (RMIT) estão apresentadas na Tabela 6. As análises foram feitas somente nessas amostras devido ao número pequeno de animais amostrados nas outras localidades. A maior diversidade haplotípica (Hd) (0,980) é encontrada no Rio Paraíba do Sul, onde 20 haplótipos foram encontrados. A amostragem no Rio Muriaé forneceu uma diversidade haplotípica menor (0,652), apresentando apenas 4 haplótipos. A diversidade nucleotídica foi maior no Rio Paraíba do Sul (0,72%) enquanto que no Rio Muriaé foi de apenas 0,62%.

Tabela 6 - Características moleculares das sequências da região controle do DNA mitocondrial de S. parahybae e índices de diversidade nucleotídica e haplotípica por região de amostragem e total. Local de amostragem Característica Rio Paraíba do sul Rio Muriaé Total Número de sequências 25 12 37 Número total de sítios 657 657 657 Número de sítios polimórficos 13 10 16 (S) Número total de mutações 14 10 16 (Eta) Diversidade nucleotídica 0,00723 0,00626 0,00968 (π ± S.D) ± 0,00061 ± 0,00133 Número de haplótipos (k) 20 4 24 Diversidade haplotípica 0,980 ± 0,017 0,652 ± 0,133 0,956 (h ± S.D) D de Tajima 1,20834 NS 0,89317 NS 2,04389 * Fs de Fu -13,418 NS 2,890 NS -10,609 NS * P < 0.05

4.5 Análise molecular de variância

A análise molecular de variância foi feita baseada nas sequências de DNA mitodocondrial e nos resultados de microssatélites. As tabelas 7, e 8 apresentam os resultados de DNA mitocondrial enquanto que as tabelas 12 e 13 apresentam os resultados de microssatelites. Devido ao número amostral baixo, não foi possível estabelecer estruturas para análises moleculares envolvendo todas as localidades separadamente. Assim, para a análise molecular de variância, duas estruturas foram usadas:

1° RPAP (n= 25 ) x RMIT (n=12)

2° RPAA, RPLA e RPAP (n=31) x RMIT e RPSP (n=15)

Tabela 7 – Análise molecular de variância baseado em sequências de DNA mitocondrial com a estrutura comparando as amostras coletadas no Rio Paraíba do Sul (localidade de Andrade Pinto) e as amostras coletadas no Rio Muriaé.

Causas da variação Graus de Soma dos Componentes Porcentagem Liberdade Quadrados de Variância de Variância Entre populações 1 34.210 1.97215 46.95 Dentro das populações 35 78.007 2.22876 53.05

Total 36 112.216 4.20091 Φst= 0,46946* *significa p<0,0001. Baseado em 1023 permutações

Quando as amostras foram divididas em duas populações, Rio Paraíba do Sul e Rio Muriaé, a análise hierárquica da AMOVA revelou que há variação genética entre as populações (Tabela 6), embora grande parte da diferenciação (53%) esteja dentro das populações. Com o Φst de 0,46946 podemos definir cada população com uma unidade de conservação diferente. Na segunda estrutura, foi usado todas as amostras do Paraíba do Sul (Lavrinhas, e Andrade Pinto) com o Rio Preto (localidade de Afonso Arinos) contras

as amostras de Muriaé (localidade Itaperuna) com o Rio Pomba (localidade Santo Antônio de Pádua)

Tabela 8 – Análise molecular de variância baseado em sequências de DNA mitocondrial com a estrutura comparando as amostras coletadas no Rio Paraíba do Sul (Andrade Pinto e Lavrinhas) juntamente com as amostras do Rio Preto (Afonso Arinos) com as amostras coletadas no Rio Muriaé (Itaperuna) juntamente com as amostras de Rio Pomba (Santo Antonio de Pádua).

Causas da variação Graus de Soma dos Componentes Porcentagem Liberdade Quadrados de Variância de Variância Entre populações 1 29,767 1,36202 35,03

Dentro das populações 43 108,633 2,52636 64,97

Total 44 138,400 3,88837 Φst= 0,35028* *significa p<0,0001. Baseado em 1023 permutações

Nesta estrutura (Tabela 8), a análise hierárquica da AMOVA revelou que também há variação genética entre as populações, embora grande parte da diferenciação (65%) esteja dento das populações. Com o Φst de 0,35028 significativo podemos definir cada população com uma unidade de conservação diferente.

4.6 Construção da biblioteca genômica enriquecida em microssatélite

4.6.1 Amplificação dos insertos clonados

A digestão com a enzima Rsa I resultou em um arraste do DNA genômico, indicando que o DNA extraído da amostra H05 estava com excelente qualidade. O DNA não gerou nenhuma banda de tamanho preferencial de fragmentos, produzindo assim, o perfil adequado para a construção da biblioteca. A enzima corta o sitio GT AC de forma abrupta, a ligação dos adaptadores garantiu que cada fragmento tivesse uma terminação comum e conhecida.

4.6.2 Sequênciamento e análise das sequências

Dos 96 clones gerados (Figura 23), foram sequênciados 25, destes, 16 apresentaram repetições do tipo microssatélites, o que corresponde a uma eficiência de 64% possibilitando assim o desenho dos primers. As sondas biotiniladas utilizadas na construção da biblioteca carregavam motivos CT e GT. Isto explical a frequência de repetições dinucleotídicas. (Figura 24)

Figura 22. Gel de agarose contendo produto de extração plasmidial.

Figura 23. Eletroferograma do clone 3 enfocando o microssatélite C A.

Tabela 9: Total de primers desenhados para a espécie Steindachneridion parahybae

Loci Seqüência do Primer Motivo Tamanho Tipo total

Sur3a F- 5’CAT TCA ACA CAC AAA CAA TAC AGG 3’ (CT)5 220pb Imperfeito

R- 5’CAG ATC TCA CCG ATA TAC TGC AC 3’ (CA)17

Sur3b F- 5’ CTC TTT GTC TCA CCT GGT TGT C 3’ (CA)20 150pb Perfeito R- 5’ CAC ACA CCT ACA CAT TCA CTT CAA 3’

Sur4b F- 5’ GCT GAG GTG TAG CAG GAA GT 3’ (CA)17 166pb Perfeito R- 5’ CAA ATG GGC CAA AGA CAT TTG 3’

Sur6 F- 5’ GCT CAA ACT GAT TCA ACT GCT 3’ (GT)50 212pb Perfeito R- 5’ CGT TTA ATC TAC AAG CAT GCA C 3’

Sur7 F- 5’ CTA AAC AGC CAG GCT TGG AC 3’ (TG)5 139pb Perfeito R- 5’ CGC AAC CAC AAA CAG CTC AGG 3’

Sur8 F- 5’ CAG ACA ACA ACC TTT TTC CTC C 3’ (CT)11 229pb Imperfeito

R- 5’ CAG AGC TCA AGG ACT CTG TGG 3’ (GT)36

Sur11 F- 5’ CAG TTA AAT TAG TCC TGG GAA TCC 3’ (GT)14 172pb Perfeito R- 5’ GGA ACG GTG ATG ATG ATG C 3’

Sur13 F- 5’ CTA AAG CGT CAC GTC GGG AT 3’ (CA)13 152pb Perfeito R- 5’ CCT GTC AAA GGT GCA GAC TGT 3’

Sur14 F- 5’ CCT ATG TCT CTT CGA TCC CC 3’ (GT)21 167pb Imperfeito

R- 5’ CCA CTT CCT CTT CTG GTT CTG 3’ (GA)16

Sur15 F- 5’ GTG ATT GAT TGT TTG GGG AC 3’ (CA)32 187pb Perfeito R- 5’ CTA CAG CTG TGC CTT CAT AA 3’

Sur17 F- 5’ CTC ACC GCT AAT GAG CTA CG 3’ (CA)10 155pb Perfeito R- 5’ CAG TGT CAT TTT ACG TTT AAG 3’

Sur19 F- 5’ GTT GGG AAA GCT GAT GAT GTC 3’ (CA)7 173pb Perfeito R- 5’ CAT TGA TGC GTC CCC AGT A 3’

Sur20 F- 5’ CCT GAG CTG TTT GTG GTT GC 3’ (CA)5 116pb Perfeito R- 5’ GTA AGC GCG AGC TGT TTA GG 3’

Sur21 F- 5’ CCT TTA CAG AAC AGC GTC GA 3’ (GA)31 161pb Perfeito R- 5’ AGC TGC AGA TGA ATG GTG TG 3’

Sur23 F- 5’ GAG GTC ATC CAT CGC TTT GT 3’ (CA)30 166pb Perfeito R- 5’ GGT TAG CCG CTG TTC TCA C 3’

Sur24 F- 5’ CAG TGA GAT ATG CAG GTG TGC 3’ (CA)34 154pb Perfeito R- 5’ GCA CAA GGA TCA CAA CAA TAG C 3’

4.6.3 Testes de amplificação dos microssatélites

Dos 16 primers confeccionados, apenas sete amplificaram, sendo eles Sur04, Sur11, Sur13, Sur14, Sur21, Sur23 e Sur24. Destes sete, apenas quatro foram identificados como polimórficos, sendo eles o Sur11, Sur13, Sur14 e Sur23 (Tabela 10).

Tabela 10: Primers específicos para a espécie Steindachneridion parahybae. Loci Sequência dos Primers Motivo Tamanho Tipo total (pb)

Sur 11 F – 5’ CAG TTA AAT TAG TCC TGG GAA TCC-3’ (GT)14 172pb Perfeito R – 5’ GGA ACG GTG ATG ATG ATG C-3’

Sur 13 F – 5’ CTA AAG CGT CAC GTC GGG AT- 3’ (CA)13 152pb Perfeito R – 5’ CCT GTC AAA GGT GCA GAC TGT-3’

Sur 14 F – 5’ CCT ATG TCT CTT CGA TCC CC -3’ (GT)21 167pb Imperfeito

R – 5’ CCA CTT CCT CTT CTG GTT CTG-3’ (GA)16

Sur 23 F – 5’ CAG TGA GAT ATG CAG GTG TGC-3’ (CA)31 166pb Perfeito R – 5’ GCA CAA GGA TCA CAA CAA TAG C-3’

O tamanho dos alelos, em pares de bases foi determinado pelo uso do programa I Quant Capture 300 – GE, que estimou o peso molecular das bandas no gel de poliacrilamida por comparação com o marcador 10 pb (Invitrogen) e o marcador 100 pb (Fermentas). (Figura 25)

100pb

10pb Sur11 172pb Sur13 150pb

Figura 24. Gel de poliacrilamida para o lócus Sur11 e Sur13, utilizando marcadores 100pb e 10pb.

Figura 25. Loco Sur4 (160pb) com diferentes amostras de DNA evidenciando regiões monomórficas.

Figura 26. Continuação Loco Sur4 evidenciando regiões monomórficas.

5. ANÁLISE DOS DADOS

5.1 Diversidade alélica

Os locos apresentaram-se polimórficos, com variação de 6 a 10 alelos e riqueza alélica de 12 a 16 (Tabela 11).

Tabela 11 - Resumo estatístico da diversidade genética de 4 loci microssatélites em 2 locais amostrados: número de alelos (A), riqueza alélica (AR); heterozigosidade observada (HO) heterozigosidade esperada (HE); equilíbrio de Hardy Weinberg (PHW); coeficiente de endogamia (FIS).

Local Lócus A Ar Ho He PHW FIS Paraíba do Sul Sur 11 6 12 0.440 0.844 0.000 0.465 Andrade Pinto Sur 13 7 12 1.000 0.807 0.000 - 0.251 Sur 14 7 13 1.000 0.785 0.000 - 0.304 Sur 23 10 16 0.800 0.872 0.000 0.094 Média 7.5 13.25 0.810 0.827 0.000 - 0.078 DP 1.070 2.061 0.264 0.038 0.00 0.356

Muriaé (RJ) Sur 11 5 8 1.000 0.724 0.000 - 0.404 Sur 13 4 6 0.916 0.681 0.270 - 0.367 Sur 14 7 198 0.833 0.851 0.139 0.022 Sur 23 7 170 0.916 0.840 0.057 - 0.095 Média 5.75 95.5 0.916 0.774 0.116 -0.231 DP 1,5 102.83 0.068 0.084 0.117 0.180

5.2 Análise molecular de variância

Assim como ocorreu para o DNA mitocondrial, não foi possível estabelecer estruturas para análises moleculares envolvendo todas as localidades separadamente para os microssatélites. Assim, para a análise molecular de variância, duas estruturas foram usadas:

1° RPAP (n= 25 ) x RMIT (n=12) 2° RPAA, RPLA e RPAP (n=31) x RMIT e RPSP (n=15)

A análise molecular de variância mostrou que a maior variação apresenta-se dentro das populações como apresentado na tabela 12

Tabela 12- Análise molecular de variância baseado em microssatelites, com a estrutura comparando as amostras coletadas no Rio Paraíba do Sul (Andrade Pinto) e as amostras coletadas no Rio Muriaé.

Causas da variação Graus de Soma dos Componentes Porcentagem Liberdade Quadrados de Variância de Variância Entre populações 1 4.757 0.1008 5.88 Dentro das populações 36 61.000 1.6944 98.88

Total 37 65.757 1.7136 Φst= 0.05882 *significa p<0,0001. Baseado em 1023 permutações

Tabela 13 - Análise molecular de variância baseado em microssatelites com a estrutura comparando as amostras coletadas no Rio Paraíba do Sul (localidade de Andrade Pinto e Lavrinhas) juntamente com as amostras do Rio Preto (localidade Afonso Arinos) com as amostras coletadas no Rio Muriaé (localidade de Itaperuna) juntamente com as amostras de Rio Pomba (localidade de Santo Antonio de Pádua).

Causas da variação Graus de Soma dos Componentes Porcentagem Liberdade Quadrados de Variância de Variância Entre populações 1 49.617 0.04713 2.83 Dentro das populações 44 48.500 1.61667 97.17 Total 45 98.117 1.66380 Φst= 0.02832 *significa p<0,0001. Baseado em 1023 permutações

De acordo com os resultados de AMOVA, verificou-se que na primeira Estrutura (RPAP x RMIT) 5,88% da variabilidade genética estão representados entre as populações, de modo que 98,88% concentram-se dentro das mesmas. Na segunda estruturação (RPAA, RPLA e RPAP x RMIT e RPSP) 2,83% da variabilidade genética estão representadas entre as populações, e dentro das mesmas corresponde a 97.17%. Embora o valor de FST seja significativo (Φst= 0.05882) e (Φst = 0.02832), ele demonstrou baixa estruturação genética nas duas estruturas analisadas.

6 DISCUSSÃO

6.1 Análises populacionais baseadas no DNA mitocondrial

6.1.1 Distribuição dos haplótipos

Entre os 27 haplótipos identificados nas 46 sequências nucleotídicas de Steindachneridion parahybae, englobando os indivíduos de todas as localidades, verificou-se que 24 são exclusivos, ou seja, são encontrados em uma única população e 3 (haplótipo1, haplótipo 21 e haplótipo 23) são compartilhados por mais de uma população. O haplótipo 1 foi encontrado em 1 indivíduo de Lavrinhas, 3 no município de Andrade Pinto e 2 em Afonso Arinos, haplótipo 21 esteve representado 1 vez em Santo Antônio de Pádua e 1 vez Andrade Pinto e 7 vezes em Itaperuna. Finalmente, o haplótipo 23 foi compartilhado entre Andrade Pinto e Santo Antônio de Pádua. Uma hipótese para a ocorrência do número alto de haplótipos exclusivos (89%) é que esses haplótipos possuem a frequência baixa na população e sua observação foi prejudicada pelo número amostral pequeno. Desta forma é possível que o número amostral possa não ter sido suficientemente grande para encontrar haplótipos raros nas populações. Com a extinção que o Surubim-do-paraíba vem sofrendo nesses últimos anos, esses haplótipos estão se tornado ainda mais raros.

6.1.2 Diversidade nucleotídica e haplotípica

A comparação dos índices genéticos entre todas as localidades de coleta é impossibilitada pelo baixo número de indivíduos capturados. Portanto para a discussão dos resultados de diversidade usaremos os animais das localidades de Andrade Pinto (Rio Paraíba do Sul) e Itaperuna (Rio Muriaé). A diversidade haplotípica é um índice que reflete a probabilidade de dois haplótipos escolhidos ao acaso em uma população serem diferentes, enquanto que a diversidade nucleotídica reflete a probabilidade de dois nucleotídeos homólogos escolhidos ao acaso serem diferentes em uma população (NEI & LI, 1979).

Pode-se notar, em confirmação com os resultados da frequência e distribuição de haplótipos, que em Andrade Pinto - RJ as diversidades nucleotídicas e haplotípicas são maiores, comparadas com a população de Itaperuna. O valor máximo de diversidade nucleotídica detectado em espécies de água doce em Leporinus microlophus 10%, Bermingham & Avise (1986) é maior do que os encontrados em espécies anádromas (5%), catádromas (2%) e marinhas (4,4%) (BILLINGTON & HEBERT, 1991). Na espécie de peixe de água doce neotropical, Colossoma macropomum, a diversidade nucleotídica varia de 1,1% a 1,2% (SANTOS et al., 2007). A diversidade nucleotídica encontrada para Surubim-do- paraíba variou de 0,6 a 0,7%, mostrando que a variação dos nucleotídeos dessa espécie é bem menor do que em outras espécies. Embora peixes marinhos e dulcícolas apresentem suas diferenças, utilizaremos definições de Grant e Bowen (1998) feitas para peixes marinhos para interpretar as diversidades nucleotídicas e haplotípicas. As populações do Rio Paraíba do Sul e do Rio Muriaé apresentaram diversidades nucleotídicas baixas (π <1,0%) e diversidades haplotípicas altas (h>0,5). Estas condições são atribuídas à expansão depois de um período de baixo tamanho populacional efetivo, o rápido crescimento populacional aumenta a retenção de novas mutações. Essa caracterização não reflete a realidade da espécie que permanece desaparecida dos locais onde anteriormente era sempre visualizada. Os haplótipos encontrados nas populações analisadas são seletivamente equivalentes e sugerem que as populações se encontram em equilíbrio em relação a esses haplótipos do DNAmt, segundo mostram os resultados estatísticos não significantes (P>0,05) de D de Tajima e Fs de Fu.

6.2 Construção da biblioteca genômica enriquecida com microssatélites

A construção da biblioteca enriquecida em microssatélites para o Surubim-do- paraíba correspondeu a 64% de eficiência na identificação de clones positivos: 16 clones contendo microssatélites dos 25 clones sequênciados. Embora essa

eficiência seja aparentemente baixa, esta dentro dos limites observados no protocolo de Billote et al. (1999), entre cerca de 20 e 70%. Esta porcentagem pode refletir vários fatores, tais como a presença de poucas regiões repetitivas no genoma e a composição de bases do mesmo, que interfere sobre a enzima de restrição utilizada durante a digestão. A posição do sítio de clivagem da enzima de restrição do DNA pode influenciar o tamanho do fragmento obtido e a representatividade das regiões repetitivas amostradas, indicando que o uso combinado de enzimas com sítio de clivagem distintos pode produzir fragmentos entre 200 a 1000 pb, ideais para os demais passos da construção da biblioteca. Outro fator são as terminações dos fragmentos digeridos, que podem dificultar a ligação dos adaptadores, o que requer condições experimentais ótimas para a ligação e adaptadores que por sua vez, possuam elementos de terminações coesivas. Na etapa de hibridização com sondas biotiniladas, os tipos de sonda utilizadas e as condições de lavagem das microesferas também podem influenciar sobre a obtenção de sequências repetidas (ZANE et al., 2002) A metodologia que utiliza hibridização seletiva com partículas magnéticas para o isolamento de marcadores microssatélites, tem como resultado uma eficiência que pode variar de 20% a 90% na identificação de clones positivos, enquanto o método tradicional de isolamento de microssatélites resulta uma taxa média de clones positivos para peixes de 3,1%, sendo o mínimo de 0,066 e o máximo de 8,92%.(ZANE et al., 2002). Dos microssatélites encontrados, 34% não puderam ser desenhados, devido à proximidade da região repetitiva das extremidades, sendo a região flanqueadora insuficiente em número de bases para o desenho de um primer. A baixa eficiência no desenho dos microssatelites também se deve à qualidade de sequênciamento ruim, que pode ter sido ocasionada por contaminação cruzada de amostras ou por problemas no momento do sequênciamento. Neste último aspecto, Penha (2007) comentou que a polimerização do sequênciamento pode gerar um decréscimo da qualidade da sequência, tornando-a imprópria para o desenho de primers. Essa polimerização também pode ocorrer após o sequênciamento de uma região repetitiva, sendo lida apenas uma das regiões flanqueadoras. É importante obter regiões flanqueadoras de boa qualidade, uma vez que o polimorfismo nestas regiões

pode afetar os sítios de anelamento dos primers, promovendo o aparecimento de alelos nulos (RALLO, et al., 2000). Contudo, foram desenhados primers com microssatélites que apresentavam motivos dinucleotídeos perfeitos e imperfeitos, devido a grande dificuldade em obter apenas sequências perfeitas.

6.2.1 Amplificação dos microssatélites

Dos dezesseis marcadores microssatélites desenvolvidos, apenas quatro foram considerados ideais para o estudo das análises populacionais por apresentarem alto grau de polimorfismo e menor quantidade de amplificações inespecíficas (bandas sttuters). Os demais locos que amplificaram apresentaram grande quantidade de bandas sttuters, sendo estes excluídos das análises. O aparecimento de tais bandas ocorre, principalmente, em repetições de dinucleotídeos (GREGAN et al., 1994). Contudo, segundo Ashworth et al. (2004), loci que revelam muitas bandas residem em regiões duplicadas no genoma ou resultam de desenho inadequado do primer. Outro fator refere-se ao tamanho do motivo. De acordo com Edward et al., (1991), as bandas inespecíficas tendem a diminuir com o aumento do tamanho do motivo, e no caso dos primers excluídos das análises os motivos apresentavam entre 5 e 10 pb. A presença de lócus monomórficos correspondeu a 18,75%, indicando baixa variabilidade genética intra e interpopulacional.

6.2.2 Diversidade genética intrapopulacional

A diversidade genética encontrada dentro das populações de Steindachneridion parahybae analisadas no presente estudo foi elevada. Segundo Frankhan et al., (2008), a diversidade genética pode ser descrita utilizando o número de alelos, a frequência de alelos e a heterozigosidade média. A avaliação dos quatro loci microssatélites permitiu a identificação de 53 alelos diferentes, apresentando de 06 (Sur11) a 10 (Sur23) alelos por lócus, sendo de 6,62% a média do número de alelos encontrados em todas as populações. Esse

valor encontra-se abaixo do observado para peixes de água doce (Dewoody & Avise, 2000). Valores superiores a média de alelos observados em peixes de água doce também foram encontrados por Benites (2008) e Pereira et al., (2008), respectivamente, 17 alelos e 15,3, ambos para Pseudoplatystoma corruscans. A heterozigosidade observada variou de 0,44 a 1, enquanto as esperadas variaram de 0,80 a 0,87. Em geral, as heterozigosidades esperadas são empregadas para a obtenção da heterozigosidade média, pois são menos sensíveis ao tamanho amostral do que a heterozigosidade observada (FRANKHAM et al., 2008). Os resultados obtidos relativos à variabilidade genética nas populações de S. parahybae corroboram com dados obtidos na literatura para outras espécies. Pereira et al. (2008) analisando seis populações de pintado (Pseudoplatystoma corruscans) de diferentes localidades da Bacia Paraná-Paraguai, usando sete primers, encontraram valores das heterozigosidades observadas e esperadas variando de 0,0732 a 0,9250 e de 0,3107 a 0,9424, respectivamente. As populações analisadas por Pereira et al. (2008) também apresentaram significativo (p<0,05) desvio de equilíbrio de Hardy-Weinberg) para a maioria dos locos. Considerando todas as populações em um mesmo grupo, a maior variabilidade foi encontrada dentro das populações com valores de 91,75% (FST). Ollivati et al. (2011) analisando populações de Leporinus friderici, nativa da Bacia Amazônica avaliou amplificações de loci microssatélites, utilizando os primers heterólogos, em 31 indivíduos de L. friderici. Estas amostras foram coletadas de populações naturais do rio Araguaia, na região central do Brasil. Oito loci foram analisados com sucesso. Seis deles foram polimórficos, e o número de alelos variou de três a 10. Os valores de heterozigosidade esperados para estes locos polimórficos variou de 0,488 a 0,795. Vrijenhoek (1996) analisando populações naturais de duas espécies de truta Oncorhynchus clarki lewisi e Oncorhynchus mykiss, encontrou Ho de 0,676 e He 0,850. Ferreira & Casatti (2006) detectaram He e Ho de 0,952 e 1,0 para loci microssatélites em populações de curimbata coletadas nas escadas de transposição das usinas hidrelétricas de canoas I e II, situadas no rio Paranapanema. Todos os lócus da população do rio Paraíba do Sul apresentaram desequilíbrio de Hardy-Weinberg. Na população do rio Muriaé apenas o loci Sur11 não

apresentou equilíbrio de Hardy-Weinberg, considerando que esse local era o que possuía número pequeno de espécimes amostrados, o número amostral pode não ter mostrado toda a variabilidade alélica presente na população natural (FERGUSON & DANZMANN, 1998; HILSDORF et al., 2006) Considerando que os microssatélites são uma classe de marcadores moleculares com alta taxa de mutação, Balloux & Lugon-Moulin (2002) amostragens maiores possivelmente revelariam a variação de alelos que realmente correspondem aquela presente nas populações.

6.3 Estruturação genética das populações

Para o estudo da estruturação genética das populações, foram utilizadas duas situações. Na primeira comparou-se os animais do Paraíba do Sul (Andrade Pinto) com os animais do rio Muriaé (Itaperuma). E na segunda situação, utilizando a proximidade geográfica como critério comparou-se as amostras do Paraíba do Sul (Lavrinhas, e Andrade Pinto) com o Rio Preto (Afonso Arinos) contra as amostras de Muriaé (Itaperuna) com o Rio Pomba (Santo Antônio de Pádua). As análises moleculares de variância foram feitas com os resultados do sequênciamento da região do DNA mitocondrial e também com os resultados da genotipagem dos microssatélites. A diversidade genética e diferenciação entre populações são influenciadas por fatores como deriva genética e endocruzamento, Wright (1951) e dessa maneira, a estimativa da diversidade genética, bem como de sua distribuição intra e interpopulacional, é fundamental para traçar medidas de conservação de espécies. Ainda que os resultados anteriores apontem para uma situação de alto fluxo gênico, devido a alta diversidade haplotipica, nesse estudo, procurou-se verificar se existe variabilidade genética nos poucos animais que foram capturados na natureza, principalmente porque esses animais serão usados para cruzamentos visando repovoamento. Os resultados da AMOVA, para a análise do DNA mitocondrial, mostraram que 53,05% da variação estavam dentro das populações, enquanto que 46,95% da variação se encontram entre populações (Tabela 7). Entretanto, quando os

microssatelites foram usados na análise, a porcentagem de variação foi menor (5,88%) dentro das populações e também menor entre as populações (98,88%). Quando as sequências mitocondriais foram utilizadas na AMOVA para a primeira estrutura foi observado um Φst significativo de 0,46946 indicando uma forte estruturação genética. Nas análises utilizando o marcador nuclear microssatelites o índice Fst foi de Φst= 0.05882, adverso aos resultados do DNA mitocondrial indicando baixa estruturação genética.

6.4 Cruzamento direcionados

O repovoamento de peixes nos rios brasileiros é uma prática aplicada que visa manter a espécie no seu ambiente natural. É uma medida mitigadora comumente imposta a empresas de energia elétrica como consequência do represamento de rios, que impedem a reprodução de peixes migradores. Também aplica-se o repovoamento em determinados sistemas aquáticos que tenham sofrido algum acidente ecológico como derramamento de produtos tóxicos e que tenham a ictiofauna prejudicada. O repovoamento também é utilizado após alterações que levam ao desequilíbrio do número de indivíduos, como degradação de áreas ou ainda episódios de sobrepesca. Devido à alta prolificidade das espécies de peixes migradores, na maioria das vezes, utiliza-se poucos reprodutores nas estações de reprodução para se obter os alevinos que serão liberados na natureza. A alta prolificidade torna a reprodução artificial mais fácil e prática, porém pode levar ao efeito fundador nessas espécies, que reduz drasticamente a variabilidade genética dessas populações (POVH et al., 2008). No caso do Surubim-do-paraíba, assim como em outras espécies ameaçadas, o pequeno número de indivíduos que são capturados na natureza também faz com que na maioria das vezes, este efeito fundador ocorra. Mesmo que o número de peixes aumente momentaneamente no ambiente natural, a diminuição da variabilidade genética pode causar redução a resistência a doenças, e principalmente perda da capacidade de se adaptar as alterações ambientais (TANIGUCHI, 2003). Os níveis de endogamia tendem a aumentar em populações que apresentam parentesco, levando ao número maior de indivíduos homozigotos e

consequêntemente a progênies com maior número de defeitos e aumento de problemas relacionados à reprodução. Em longo prazo, espécies que são repovoadas sem avaliação da diversidade genética dos reprodutores e manejo reprodutivo sem delineamentos visando aumentar a diversidade, não atingirão o equilíbrio natural e possivelmente serão extintas. Considerando-se a importância do conhecimento da estruturação genética de uma população para o sucesso do seu repovoamento, em teoria, o início de qualquer programa de repovoamento deveria partir de uma análise genética dos reprodutores. Dessa forma, o cruzamento de indivíduos geneticamente distantes produziria uma progênie com maior variabilidade possível. Como a aplicação de programas de repovoamento geralmente é feito em espécies que já estão em risco de extinção, muitas vezes não é possível obter um número suficiente de reprodutores que permita o direcionamento dos cruzamentos de indivíduos de determinada região. Desta forma não se pode avaliar se é válido introduzir material genético de outras regiões em locais que apresentam baixo número de indivíduos daquela espécie. Esta é a situação encontrada para o Surubim-do-paraíba. Como pode ser observado na Tabela 14, no Rio Preto (RPAA) foram capturados apenas cinco indivíduos e todos eram fêmeas, impossibilitando cruzamentos. Dessa forma, para repovoar o Rio Preto seria necessário utilizar reprodutores machos de outras regiões. Para que fosse possível sugerir uma proposta de manejo reprodutiva eficiente do ponto de vista de diversidade genética, utilizou-se o DNA mitocondrial para estabelecer os haplótipos diferentes, considerando que estes representariam essa diversidade. Embora os microssatelites também sejam os marcadores mais eficientes para este tipo de abordagem, os poucos lócus encontrados até o momento não permitem definir uma correlação de parentesco que diferencie os animais. Futuros estudos serão feitos visando aumentar o número de lócus para que se possa aplicar os microssatélites no direcionamento dos cruzamentos. Baseados na prospecção dos haplótipos dessa espécie e na identificação dos sexo dos animais feita no momento da implantação dos transponders (Tabela 13) sugerimos os cruzamentos entre indivíduos que pertençam a grupos haplotípicos diferentes (Tabela 14), levando em consideração que haplótipos diferentes possuem divergência ancestral materna.

Após a identificação do sexo e marcação dos indivíduos do Rio Muriaé, uma nova prospecção dos haplótipos dessa população será feita para que esses animais também possam ser cruzados visando aumentar a diversidade haplotípica. O uso de reprodutores que apresentem diversidade genética e o monitoramento dessa diversidade ao longo dos anos aumentará a variabilidade genética das populações, prevenindo a adaptação ao cativeiro e evitando a endogamia. Espera-se que assim a espécie Surubim-do-paraíba, consiga se restabelecer na natureza.

Tabela 14 - Relação e descrição dos indivíduos de cada haplotipos que formam o banco de germoplasma in vivo. Caracterização

Haplótipos Transponder Captura Sexo RPAP_6 0005FFE2A0 Dez-2006 F RPAP_21 000600E378 Dez-2003 M Hap_01 RPAP_22 000600AA45 Dez-2003 F RPAA_4 0006000D6F4 Jan-1998 F RPAA_5 000600F68D Dez-2006 F

Hap_02 RPAP_9 0005FFDBC4 Dez-2003 F

RPAP_7 0005FFF2FB Dez-2003 M Hap_03 RPAP_8 6000100 Dez-2003 M Hap_04 RPAP _5 000600EB2E Dez-2006 F Hap_05 RPAP_4 0005FFFF20 Dez-2006 F

Hap_06 RPAP_6 0005FFE E7C Dez-2003 F Hap_07 RPAP_23 0005FFFE4A Dez-2006 F RPAP_20 00060103BE Dez-2006 M Hap_08 RPAP_11 0005FE45F1 Dez-2003 M

Hap_09 RPAP_2 963000000311259 Jun-2008 I

Hap_10 RPAP_19 000600D833 Dez-2006 M Hap_11 RPAP_17 0005FFD893 Dez-2003 M Hap_12 RPAP_16 6000121 Dez-2006 M Hap_13 RPAP_15 0006000F43 Jan-2003 F

RPAP_14 000600D395 Dez-2003 F Hap_14 RPAP_1 963000000335269/5FFE89E Jun-2008 F Hap_15 RPAP_13 0005FFFA9A Dez-2006 M Hap_16 RPAP_12 000600D384 Dez-2006 F

Hap_17 RPAP_10 000600FF7A Dez-2006 F Hap_18 RPAP_18 000600F0BF Dez-2003 F

Hap_19 RPAA_3 0006000CDC6 Jun-2005 F

Hap_20 RPAA_2 000600CB54 Jun-2005 F

RPAA_1 6000260 Jun-2005 F Hap_21 RPSP_1 0006000ED9 Jan-1998 F mais 7 animais do Muriaé

Hap_22 RPSP_3 6000312 Dez-2006 M RPAP_24 0006000F7E7 Dez-2006 M Hap_23 RPSP_2 0005FFE60E Dez-2006 M Hap_24 RPAP_25 0006000D76 Dez-2003 F Hap_25 2 indivíduos do Muriaé Hap_26 1 indivíduo do Muriaé Hap_27 2 indivíduos do Muriaé

Tabela 15 - Cruzamentos direcionados buscando aumentar ou manter a diversidade haplotípica das espécies Surubim-do-paraíba.

Machos

RPAP_21 RPAP_7 RPAP_8 RPAP_20 RPAP_11 RPAP_19 RPAP_17 RPAP_16 RPAP_13 RPSP_3 RPAP_24 RPSP_2 Fêmeas

RPAP_6 X X X X X X X X X X X

RPAP_22 X X X X X X X X X X X

RPAA_4 X X X X X X X X X X X

RPAA_5 X X X X X X X X X X X

RPAP_9 X X X X X X X X X X X X

RPAP _5 X X X X X X X X X X X X

RPAP_4 X X X X X X X X X X X X

RPAP_6 X X X X X X X X X X X X

RPAP_23 X X X X X X X X X X X X

RPAP_15 X X X X X X X X X X X X

RPAP_14 X X X X X X X X X X X X

RPAP_1 X X X X X X X X X X X X

RPAP_12 X X X X X X X X X X X X

RPAP_10 X X X X X X X X X X X X

RPAP_18 X X X X X X X X X X X X

RPAA_3 X X X X X X X X X X X X

RPAA_2 X X X X X X X X X X X X

RPAA_1 X X X X X X X X X X X X

RPSP_1 X X X X X X X X X X X X

RPAP_25 X X X X X X X X X X X X

7 Conclusões

Mediante os resultados obtidos das análises genéticas de S. paraybae pode-se concluir que:

Neste estudo o uso do D-loop do DNA mitocondrial indicou ser uma ferramenta eficiente para as análises de diversidade genética em populações naturais de S. paraybae. No entanto, os marcadores microssatélites não mostraram a mesma eficiência, mesmo apresentando grande diversidade de alelos. Os haplótipos do DNA mitocondrial detectados nas populações de S. Paraybae indicam uma forte estruturação genética que se deve principalmente à uma riqueza alélica alta observada em alguns locos analisados, o que colaboraria para uma boa ocorrência de diferentes genótipos. Dos dezesseis loci de microssatélites desenvolvidos para a espécie S. paraybae foram polimórficos apenas quatro, o que indica a necessidade de buscar na biblioteca genômica outros loci que indicariam um resultado mais consistente. Os dados genéticos com o uso dos microssatélites indicaram uma moderada estruturação genética, resultado que sugere, que os mecanismos de isolamento ainda não refletem de forma acentuada maior diferenciação entre estas populações o que se opõe aos resultados do DNA mitocondrial. Esses dados adversos sugerem que o número baixo de locos analisados aliados ao baixo número de espécimes coletados tenham influenciado nas análises.

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Apêndice A - Alelos encontrados nos locos Sur11, Sur13, Sur14 e Sur24 com seus respectivos tamanhos (pb) e unidades de repetição

Loco Alelo Tamanho em pb Número de repetições 4 157 (GA/TC)32 5 159 (GA/TC) Sur 11 1 164 (TG/CA)10 33 6 161 (GA/TC) 2 166 (TG/CA)11 34 7 163 (GA/TC) 3 168 (TG/CA)12 35 8 165 (GA/TC) 4 170 (TG/CA)13 36 9 166 (GA/TC) 5 172 (TG/CA)14 37 10 167 (GA/TC) 6 176 (TG/CA)16 38

11 169 (GA/TC)39 Sur 13 1 150 (CA/TG)12 Sur 23 1 158 (TG/CA) 2 152 (CA/TG)13 27 2 160 (TG/CA) 3 154 (CA/TG)14 28 3 162 (TG/CA) 4 156 (CA/TG)15 29 4 164 (TG/CA) 5 158 (CA/TG)16 30 5 166 (TG/CA) 6 160 (CA/TG)17 31 6 168 (TG/CA) 7 162 (CA/TG)18 32

7 170 (TG/CA)33 Sur 14 1 151 (GT/AC)29

8 172 (TG/CA)34 2 153 (GA/TC)30

9 174 (TG/CA)35 3 155 (GA/TC)31

Apêndice B - Tabela com as características dos quatro loci microssatélites isolados para Steindachneridion parahybae, em que, n= número de amostras; Ta= temperatura de anelamento para cada locus; Ho= heterozigosidade observada; He= heterozigosidade esperada.

100

Loci Sequência dos Primers Motivo Tamanho total (pb) Tipo Ta (ºC) Nº de Ho He alelos

Sur 11 F – 5’ CAG TTA AAT TAG TCC TGG GAA TCC-3’ (GT)14 172pb Perfeito R – 5’ GGA ACG GTG ATG ATG ATG C-3’ 52 6 0.440 0.844

Sur 13 F – 5’ CTA AAG CGT CAC GTC GGG AT- 3’ (CA)13 152pb Perfeito R – 5’ CCT GTC AAA GGT GCA GAC TGT-3’ 54 7 1.000 0.807

Sur 14 F – 5’ CCT ATG TCT CTT CGA TCC CC -3’ (GT)21 167pb Imperfeito

R – 5’ CCA CTT CCT CTT CTG GTT CTG-3’ (GA) 16 54 11 1.000 0.872

Sur 23 F – 5’ CAG TGA GAT ATG CAG GTG TGC-3’ (CA)31 166pb Perfeito R – 5’ GCA CAA GGA TCA CAA CAA TAG C-3’ 58 9 0.800 0.827

101

Apêndice C – Genótipos de todos os indivíduos analisados das populações, sendo A: RPAP – Andrade Pinto RJ; B: RPAA – Afonso Arinos RJ; C: RPLA – Lavrinhas SP; D: RPSP – Santo Antonio de Pádua RJ; E: RMIT – Itaperuna RJ.

102

Sur 11 Sur 13 Sur 14 Sur 23 Sur 11 Sur 13 Sur 14 Sur 23 Sur 11 Sur 13 Sur 14 Sur 23

A 176 158 167 166 A 176 158 167 174 A 170 156 163 168 172 152 163 164 170 152 165 164 170 152 161 164 A 172 154 167 166 A 166 160 169 174 A 168 156 163 170 172 150 163 162 166 152 163 162 168 152 161 164 A 168 154 165 166 A 166 158 172 166 A 176 156 163 168 168 150 163 158 166 152 169 164 170 152 159 164 A 166 156 167 166 A 172 158 165 172 A 176 158 163 166 166 150 163 158 166 152 163 172 170 154 159 160 A 172 156 167 166 A 172 156 165 167 172 150 163 158 168 152 163 167 A 164 156 167 168 A 176 156 165 174 B 168 158 161 170 164 150 163 160 172 152 163 164 168 154 157 164 A 176 156 167 168 A 176 158 165 166 B 176 158 153 168 170 152 163 168 170 152 163 162 170 154 151 154 A 176 158 167 172 A 170 162 161 166 B 170 156 153 168 170 152 165 172 166 154 159 164 170 152 151 164 A 164 160 167 172 A 168 158 163 168 B 172 156 153 166 164 152 165 172 168 154 161 164 172 152 151 166

103

A 164 158 167 172 A 168 156 163 168 B 168 156 156 166 164 152 163 164 168 152 161 164 168 152 152 164

Sur 11 Sur 13 Sur 14 Sur 23 Sur 11 Sur 13 Sur 14 Sur 23

C 170 158 155 166 E 176 152 000 168 166 152 153 164 172 152 164 160 D 176 158 159 000 E 176 154 161 166 170 154 155 000 172 152 163 162 D 168 158 161 168 E 176 156 169 166 168 154 163 168 172 152 163 162 D 170 158 155 000 E 176 156 169 168 170 154 151 000 172 152 163 166 E 176 158 164 170 E 176 158 169 166 172 154 161 164 172 152 000 160 E 176 156 164 168 E 176 158 000 166 172 152 161 162 172 152 000 160 E 176 156 198 168 E 178 158 000 166 172 152 000 162 170 152 000 160

104

Sur 11 Sur 13 Sur 14 Sur23 E 174 158 165 166 170 152 161 162 E 174 158 165 000 170 152 161 000

105

Apêndice D – Sequências consensos alinhadas do DNA mitocondrial

106

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TATACTAGGT TAAGAGTGAT 07 Muriae TACATTATGT ACTAGTACAT AATATGTATA TGTTACATTA TGGTGTAGTA CMTAAGTGTA AGTATTACAT GATGGGTTAA TACATTCAAT GCAATGCACA GTGTCATTTA ATATACTAGG 08 Muriae ATACATTATG TACTAGTACA TAATATGTAT ATGTTACATT ATGGTGTAGT ACMTAAGTGT AAGTATTACA TGATGGGTTA ATACATTCAA TGCAATGCAC AGTGTCATTT AATATACTAG 09 Muriae TTATACATTA TGTACTAGTA CATAATATGT ATATGTTACA TTATGGTGTA GTACMTAAGT GTAAGTATTA CATGATGGGT TAATACATTC AATGCAATGC ACAGTGTCAT TTAATATACT 10 Muriae TACATTATGT ACTAGTACAT AATATGTATA TGTTACATTA TGGTGTAGTA CMTAAGTGTA AGTATTACAT GATGGGTTAA TACATTCAAT GCAATGCACA GTGTCATTTA ATATACTAGG 11 Muriae CATTATGTAC TAGTACATAA TATGTATATG TTACATTATG GTGTAGTACA TAAGTGTAAG TATTACATGA TGGGTTAATA CATTCAATGC AATGCACAGT GTCATTTAAT ATACTAGGTT 12 Muriae TATTATGTAC TAGTACATAA TATGTATATA TTACATTATG GTGTAGTACA TAAGTGTAAC TATTACATGA TGGGTTAATA CATTCAATGC AATGCACAGT GTCATTTAAT ATACTAGGTT H01 Rio da TATTATGTAC TAGTACATAA TATGTATATG TTACATTATG GTGTAGTACA TAAGTGTAAG TATTACATGA TGGGTTAATA CATTCAATGC AATGCACAGT GTCATTTAAT ATACTAGGTT H02 Rio da ATATTATGTA CTAGTACATA ATATGTATAT ATTACATTAT GGTGTAGTAC ATAAGTGTAA GTATTACATG ATGGGTTAAT ACATTCAATG CAATGCACAG TGTCATTTAA TATACTAGGT H03 Rio da TATTATGTAC TAGTACATAA TATGTATATA TTACATTATG GTGTAGTACA TAAGTGTAAG TATTACATGA TGGGTTAATA CATTTAATGC AATGCACAGT GTCATTTAAT ATACTAGGTT H04 Rio da ATATATTATG TACTAGTACA TAATATGTAT ATATTACATT ATGGTGTAGT ACATAAGTGT AAGTATTACA TGATGGGTTA ATACATTTAA TGCAATGCAC AGTGTCATTT AATATACTAG H05 Rio da TATTATGTAC TAGTACATAA TATGTATATA TTACATTATG GTGTGGTACA TAAGTGTAAA TATTACATGA TGGGTTAATA CATTCAATGC AATGCACAGT GTCATTTAAT ATACTAGGTT H06 Rio da ATATTATGTA CTAGTACATA ATATGTATAT ATTACATTAT GGTGTAGTAC ATAAGTGTAA GTATTACATG ATGGGTTAAT ACATTCAATG CAATGCACAG TGTCATTTAA TATACTAGGT H07 Rio da TATATTATGT ACTAGTACAT AATATGTATA TATTACATTG TGGTGTAGTA CATAAGTGTA AGTATTACAT GATGGGTTAA TACATTCAAT GCAATGCACA GTGTCATTTA ATATACTAGG H08 Rio da TATTATGTAC TAGTACATAA TATGTATATA TTACATTGTG GTGTAGTACA TAAGTGTAAG TATTACATGA TGGGTTAATA CATTCAATGC AATGCACAGT GTCATTTAAT ATACTAGGTT H09 Rio da ATATTATGTA CTAGTACATA ATATGTATAT ATTACATTAT GGTGTGGTAC ATAAGTGTAA ATATTACATG ATGGGTTAAT ACATTCAATG CAATGCACAG TGTCATTTAA TATACTAGGT H10 Rio da TTATGTACTA GTACATAATA TGTATATATT ACATTATGGT GTAGTACATA AGTGTAAATA TTACATGATG GGTTAATACA TTCAATGCAA TGCACAGTGT CATTTAATAT ACTAGGTTAA H11 Rio da TATATTATCT ACTAGTACAT AATATGTATA TATTACATTA TGGTGTAGTA CATAAGTGTA AGTATTACAT GATGGGTTAA TACATTCAAT GCAATGCACA GTGTCATTTA ATATACTAGG H12 Rio da ATATTATGTA CTAGTACATA ATATGTATAT ATTACATTAT GGTGTAGTAC ATAAGTGTAA GTATTACATG ATGGGTTAAT ACATTCAATG CAATGCACAG TGTCATTTAA TATACTAGGT H13 Rio da ATATATTATG TACTAGTACA TAATATGTAT ATGTTACATT ATGGTGTAGT ACATAAGTGT AGATATTACA TGATGGGTTA ATACATTCAA TGCAATGCAC AGTGTCATTT AATATACTAG H14 Rio da TATTATGTAC TAGTACATAA TATGTATATG TTACATTATG GTGTAGTACA TAAGTGTAAG TATTACATGA TGGGTTAATA CATTCAATGC AATGCACAGT GTCATTTAAT ATACTAGGTT H15 Rio da TATATATTAT GTACTAGTAC ATAATATGTA TATATTACAT TATGGTGTAG TACATAAGTG TAGATATTAC ATGATGGGTT AATACATTCA ATGCAATGCA CAGTGTCATT TAATATACTA H16 Rio da TATTATGTAC TAGTACATAA TATGTATATA TTACATTATG GTGTRGTACA TAAGTGTAAG TATTACATGA TGGGTTAATA CATTCAATGC AATGCACAGT GTCATTTAAT ATACTAGGTT H17 Rio da TATATTATGT ACTAGTACAT AATATGTATA TATTACATTA TGGTGTAGTA CATAAGTGTA GGTATTACAT GATGGGTTAA TACATTCAAT GCAATGCACA GTGTCATTTA ATATACTAGG H18 Rio da TATTATGTAC TAGTACATAA TATGTATATA TTACATTATG GTGTAGTACA TAAGTGTAGA TATTACATGA TGGGTTAATA CATTCAATGC AATGCACAGT GTCATTTAAT ATACTAGGTT H19 Rio da TATATTATGC TACTAGTACA TAATATGTAT ATATTACATT ATGGTGTAGT ACATAAGTGT AAGTATTACA TGATGGGTTA ATACATTCAA TGCAATGCAC AGTGTCATTT AATATACTAG H20 Rio da TATATTATGT ACTAGTACAT AATATGTATA TATTACATTA TGGTGTAGTA CATAAGTGTA AGTATTACAT GATGGGTTAA TACATTCAAT GCAATGCACA GTGTCATTTA ATATACTAGG H21 Rio da ATATTATGTA CTAGTACATA ATATGTATAT ATTACATTAT GGTGTAGTAC ATAAGTGTAA GTATTACATG ATGGGTTAAT ACATTCAATG CAATGCACAG TGTCATTTAA TATACTAGGT H22 Rio da TATATATTAT GTACTAGTAC ATAATATGTA TATATTACAT TATGGTGTAG TACATAAGTG TAAGTATTAC ATGATGGGTT AATACATTCA ATGCAATGCA CAGTGTCATT TAATATACTA H23 Rio da TATTATGTAC TAGTACATAA TATGTATATG TTACATTATG GTGTAGTACA TAAKTGTAAG TATTACATGA TGGGTTAATA CATTCAATGC AATGCACAGT GTCATTTAAT ATACTAGGTT H24 Rio da TATTATGTAC TAGTACATAA TATGTATATA TTACATTATG GTGTAGTACA TWAKTGTAAG TATTACATGA TGGGTTAATA CATTCAATGC AATGCACAGT GTCATTTAAT ATACTAGGTT H25 Rio da TATTATGTAC TAGTACATAA TATGTATATG TTACATTATG GTGTAGTACA TAAGTGTAAG TATTACATGA TGGGTTAATA CATTCAATGC AATGCACAGT GTCATTTAAT ATACTAGGTT I01 Rio Po ATATTATGTA CTAGTACATA ATATGTATAT GTTACATTAT GGTGTAGTAC ATAAGTGTAA GTATTACATG ATGGGTTAAT ACATTCAATG CAATGCACAG TGTCATTTAA TATACTAGGT I02 Rio Po ATATTATGTA CTAGTACATA ATATGTATAT GTTACATTAT GGTGTAGTAC ATAAGTGTAA GTATTACATG ATGGGTTAAT ACATTCAATG CAATGCACAG TGTCATTTAA TATACTAGGT I03 Rio Po TATACATTAT GTACTAGTAC ATAATATGTA TATGTTACAT TATGGTGTAG TACATAAGTG TAAGTATTAC ATGATGGGTT AATACATTCA ATGCAATGCA CAGTGTCATT TAATATACTA J01 Rio Pr TATATATTAT GTACTAGTAC ATAATATGTA TATGTTACAT TATGGTGTAG TACATAAGTG TAAGTATTAC ATGATGGGTT AATACATTCA ATGCAATGCA CAGTGTCATT TAATATACTA J02 Rio Pr TATATATTAT GTACTAGTAC ATAATATGTA TATATTACAT TATGGTGTAG TACATAAGTG TAAGTATTAC ATGATGGGTT AATACATTCA ATGCAATGCA CAGTGTCATT TAATATACTA J03 Rio Pr TTATGTACTA GTACATAATA TGTATATATT ACATTATGGT GTAGTACATA AGTGTAAGTA TTACATGATG GGTTAATACA TTCAATGCAA TGCACAGTGT CATTTAATAT ACTAGGTTAA J04 Rio Pr ATTATGTACT AGTACATAAT ATGTATATAT TACATTATGG TGTAGTACAT AAGTGTAAGT ATTACATGAT GGGTTAATAC ATTCAATGCA ATGCACAGTG TCATTTAATA TACTAGGTTA J05 Rio Pr TATTATGTAC TAGTACATAA TATGTATATA TTACATTATG GTGTAGTACA TAAGTGTAAG TATTACATGA TGGGTTAATA CATTCAATGC AATGCACAGT GTCATTTAAT ATACTAGGTT São Paulo TATTATGTAC TAGTACATAA TATGTATATA TTACATTATG GTGTAGTACA TAAGTGTAGA TATTACATGA TGGGTTAATA CATTCAATGC AATGCACAGT GTCATTTAAT ATACTAGGT

107

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TGTTATTTAA CATAACAATA AATCATACAT 07 Muriae TTAAGAGTGA TATCTACATT AAATTTAGGT CCTCATGAAC TCATTTTAAC GAGAAGACCG TCTGTTTAAT TGTATTGATT TCTTTAGTAC ATTTTCTCTT GTGTTATTTA ACATAACAAT 08 Muriae GTTAAGAGTG ATATCTACAT TAAATTTAGG TCCTCATGAA CTCATTTTAA CGAGAAGACC GTCTGTTTAA TTGTATTGAT TTCTTTAGTA CATTTTCTCT TGTGTTATTT AACATAACAA 09 Muriae AGGTTAAGAG TGATATCTAC ATTAAATTTA GGTCCTCATG AACTCATTTT AACGAGAAGA CCGTCTGTTT AATTGTATTG ATTTCTTTAG TACATTTTCT CTTGTGTTAT TTAACATAAC 10 Muriae TTAAGAGTGA TATCTACATT AAATTTAGGT CCTCATGAAC TCATTTTAAC GAGAAGACCG TCTGTTTAAT TGTATTGATT TCTTTAGTAC ATTTTCTCTT GTGTTATTTA ACATAACAAT 11 Muriae AAGAGTGATA TCTACATTAA ATTTAGGTCC TCATGAACTC ATTTTAACGA GAAGACCGTC TGTTTAATTG TATTGATTTC TTTAGTACAT TTTCTCTTGT GTTATTTAAC ATAACAATAA 12 Muriae AAGAGTGATA TCTACATTAA ACTTAGATCC TCATGAACTC ATTTTAACGA GAAGACCGTC TGTTTAATTG TATTGATTTC TTTAGTACAT TTTCTCTTGT GTTATTTAAC ATAACAATAA H01 Rio daAAGAGTGATA TCTACATTAA ATTTAGATCC TCATGAACTC ATTTTAACGA GAAGACCGTC TGTTTAATTG TATTGATTTC TTTAGTACAT 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ACATTTTCTC TTGTGTTATT TAACATAACA H16 Rio daAAGAGTGATA TCTACATTAA ATTTAAATCC TCATGAACTC ATTTTAACGA GAAGACCGTC TGTTTAATTG TATTGATTTC TTTAGTACAT TTTCCCTTGT GTTATTTAAC ATAACAATAA H17 Rio daTTAAGAGTGA TATCTACATT AAATTTAAAT CCTCATGAAC TCATTTTAAC GAGAAGACCG TCTGTTTAAT TGTATTGATT TCTTTAGTAC ATTTTCCCTT GTGTTATTTA ACATAACAAT H18 Rio daAAGAGTGATA TCTACATTAA ATTTAAATCC TCATGAACTC ATTTTAACGA GAAGACCGTC TGTTTAATTG TATTGATTTC TTTAGTACAT TTTCTCTTGT GTTATTTAAC ATAACAATAA H19 Rio daGTTAAGAGTG ATATCTACAT TAAATTTAAA TCCTCATGAA CTCATTTTAA CGAGAAGACC GTCTGTTTAA TTGTATTGAT TTCTTTAGTA CATTTTCCCT TGTGTTATTT AACATAACAA H20 Rio daTTAAGAGTGA TATCTACATT AAATTTAAAT CCTCATGAAC TCATTTTAAC GAGAAGACCG TCTGTTTAAT TGTATTGATT TCTTTAGTAC ATTTTCTCTT GTGTTATTTA ACATAACAAT H21 Rio daTAAGAGTGAT ATCTACATTA AATTTAAATC CTCATGAACT CATTTTAACG AGAAGACCGT CTGTTTAATT GTATTGATTT CTTTAGTACA TTTTCCCTTG TGTTATTTAA CATAACAATA H22 Rio daGGTTAAGAGT GATATCTACA TTAAATTTAA ATCCTCATGA ACTCATTTTA ACGAGAAGAC CGTCTGTTTA ATTGTATTGA TTTCTTTAGT ACATTTTCCC TTGTGTTATT TAACATAACA H23 Rio daAAGAGTGATA TCTACATTAA ATTTAAATCC TCATGAACTC ATTTTAACGA GAAGACCGTC TGTTTAATTG TATTGATTTC TTTAGTACAT TTTCYCTTGT GTTATTTAAC ATAACAATAA H24 Rio daAAGAGTGATA TCTACATTAA ATTTAAATCC TCATGAACTC ATTTTAACGA GAAGACCGTC TGTTTAATTG TATTGATTTC TTTAGTACAT TTTCCCTTGT GTTATTTAAC ATAACAATAA H25 Rio daAAGAGTGATA TCTACATTAA ATTTAGGTCC TCATGAACTC ATTTTAACGA GAAGACCGTC TGTTTAATTG TATTGATTTC TTTAGTACAT TTTCTCTTGT GTTATTTAAC ATAACAATAA I01 Rio PoTAAGAGTGAT ATCTACATTA AACTTAGATC CTCATGAACT CATTTTAACG AGAAGACCGT CTGTTTAATT GTATTGATTT CTTTAGTACA TTTTCTCTTG TGTTATTTAA CATAACAATA I02 Rio PoTAAGAGTGAT ATCTACATTA AATTTAGATC CTCATGAACT CATTTTAACG AGAAGACCGT CTGTTTAATT GTATTGATTT CTTTAGTACA TTTTCTCTTG TGTTATTTAA CATAACAATA I03 Rio PoGGTTAAGAGT GATATCTACA TTAAATTTAG GTCCTCATGA ACTCATTTTA ACGAGAAGAC CGTCTGTTTA ATTGTATTGA TTTCTTTAGT ACATTTTCTC TTGTGTTATT TAACATAACA J01 Rio PrGGTTAAGAGT GATATCTACA TTAAATTTAG ATCCTCATGA ACTCATTTTA ACGAGAAGAC CGTCTGTTTA ATTGTATTGA TTTCTTTAGT ACATTTTCTC TTGTGTTATT TAACATAACA J02 Rio PrGGTTAAGAGT GATATCTACA TTAAATTTAA ATCCTCATGA ACTCATTTTA ACGAGAAGAC CGTCTGTTTA ATTGTATTGA TTTCTTTAGT ACATTTTCTC TTGTGTTATT TAACATAACA J03 Rio PrGAGTGATATC TACATTAAAT TTAAATCCTC ATGAACTCAT TTTAACGAGA AGACCGTCTG TTTAATTGTA TTGATTTCTT TAGTACATTT TCTCTTGTGT TATTTAACAT AACAATAAAT J04 Rio PrAGAGTGATAT CTACATTAAA TTTAAATCCT CATGAACTCA TTTTAACGAG AAGACCGTCT GTTTAATTGT ATTGATTTCT TTAGTACATT TTCCCTTGTG TTATTTAACA TAACAATAAA J05 Rio PrAAGAGTGATA TCTACATTAA ATTTAAATCC TCATGAACTC ATTTTAACGA GAAGACCGTC TGTTTAATTG TATTGATTTC TTTAGTACAT TTTCCCTTGT GTTATTTAAC ATAACAATAA São Paulo AAGAGTGATA TCTACATTAA ATTTAAATCC TCATGAACTC ATTTTAACGA GAAGACCGTC TGTTTAATTG TATCGATTTC TTTAGTACAT TTTCTCTTGT GTTATTTAAC ATAACAATAA

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H22 Rio daTATAAGTTAT TTTTTTTCGG GTCGCTTCCA TTTGGCATCC TTTGTAATGA TTTAATGACA TATACTTAAT AATTACATAC CGTTATTTAG TACATACACT CCATTTACTT TCTCCATACA H23 Rio daTTATTTTTTT TCGGGTCGCT TCCATTTGGC ATCCTTCCTG CAGTTGTTTC CAATGAGTAA TGTAGGTGGT CCATAATAAT TTGGCGTAGC ACATTAATGT AATGATTTAA TGACATATAC H24 Rio daTTATTTTTTT TCGGGTCGCT TCCATTTGGC ATCCTTCCTG CAGTTGTTTC CAATGAGCAA TGTAGGTGGT CCATAATAAT TTGGCATAGC ACATTGATGT AATGATTTAA TGACATATAC H25 Rio daTTATTTTTTT TCGGGTCGCT TCCATTTGGC ATCCTTCCTG CAGCTGTTTC CAATGAGTAA TGTAGGTGGT CCATAATAAT TTGGCGTAGC ACATTGATGT AATGATTTAA TGACATATAC I01 Rio PoGTTATTTTTT TTCGGGTCGC TTCCATTTGG CATCCTTCCT GCAGCTATTT CCAATGAGTA ATGTAGGTGG TCCATAATAA TTTGGCGTAG CACATTAATG TAATGATTTA ATGACATATA I02 Rio PoGTTATTTTTT TTCGGGTCGC TTCCATTTGG CATCCTTCCT GCAGCTATTT CCAATGAGTA ATGTAGGTGG TCCATAATAA TTTGGCGTAG CACATTAATG TAATGATTTA ATGACATATA I03 Rio PoTATAAGTTAT TTTTTTTCGG GTCGCTTCCA TTTGGCATCC TTTGTAATGA TTTAATGACA TATACTTAAT AATTACATAC CATTATTTAG TACATACACT CCATTTACTT TCTCCATACA J01 Rio PrTATAAGTTAT TTTTTTTCGG GTCGCTTCCA TTTGGCATCC TTTGTAATGA TTTAATGACA TATACTTAAT AATTACATAC CATTATTTAG TACATACACT CCATTTACTT TCTCCATACA J02 Rio PrTATAAGTTAT TTTTTTTCGG GTCGCTTCCA TTTGGCATCC TTTGTAATGA TTTAATGACA TATACTTAAT AATTACATAC CATTATTTAG TACATACACT CCATTTACTT TCTCCATACA J03 Rio PrATTTTTTTTC GGGTCGCTTC CATTTGGCAT CCTTCCTGCA GTTGTTTCCA ATGAGTAATG TAGGTGGTCC ATAATAATTT GGCGTRGCAC ATTGATGTAA TGATTTAATG ACATATACTT J04 Rio PrTATTTTTTTT CGGGTCGCTT CCATTTGGCA TCCTTCCTGC AGTTGTTTCC AATGAGCAAT GTAGGTGGTC CATAATAATT TGGCATAGCA CATTGATGTA ATGATTTAAT GACATATACT J05 Rio PrTTATTTTTTT TCGGGTCGCT TCCATTTGGC ATCCTTCCTG CAGTTGTTTC CAATGAGCAA TGTAGGTGGT CCATAATAAT TTGGCATAGC ACA?TTGATG TAATGATTTA ATGACATATA São Paulo TTATTTTTTT TCGGGTCGCT TCCATTTGGC ATCCTTCCTG CAGCTGTTTC CAATGAACGA TGTAGGTGGT CCATAATAAT TTGGCATAGC ACA?TTGATG TAATGATTTA ATGACATATA

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