UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES JACKELINE ALVES VILAR Avaliação genética populacional do Surubim-do- paraíba (Steindachneridion parahybae, Siluriformes, Pimelodidae) na bacia do Paraíba do Sul por meio de marcadores microssatélites e DNA mitocondrial. MOGI DAS CRUZES, SP 2012 UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES JACKELINE ALVES VILAR Avaliação genética populacional do Surubim-do- paraíba (Steindachneridion parahybae, Siluriformes, Pimelodidae) na bacia do Paraíba do Sul por meio de marcadores microssatélites e DNA mitocondrial. Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado em Biotecnologia da Universidade de Mogi das Cruzes como parte dos requisitos para obtenção do Titulo de Mestre em Biotecnologia. Área de concentração: Biotecnologia Aplicada a recursos Naturais e Agronegócios Orientador: Prof. Dr. Alexandre Wagner Silva Hilsdorf Co-orientadora: Prof. Dra. Laura Helena Orfão MOGI DAS CRUZES, SP 2012 FICHA CATALOGRÁFICA Universidade de Mogi das Cruzes - Biblioteca Central Vilar, Jackeline Alves Avaliação genética populacional do Surubim-do-paraíba (Steindachneridion parahybae, Siluriformes, Pimelodidae ) na bacia do Paraíba do Sul por meio de marcadores microssatélites e DNA mitocondrial / Jackeline Alves Vilar. – 2012. 111 f. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) - Universidade de Mogi das Cruzes, 2012 Área de concentração: Biotecnologia Aplicada a recursos Naturais e Agronegócios Orientador: Prof. Dr. Alexandre Wagner Silva Hilsdorf 1. Surubim-do-Paraíba 2. Steindachneridion parahybae 3. Microssatélites 4. D-loop 5. Conservação genética I. Hilsdorf, Alexandre Wagner Silva CDD 597 DEDICATÓRIA Dedico esta vitória a Deus por me guiar nas horas difíceis e por me presentear com tantas pessoas maravilhosas no decorrer do trabalho. Aos meus pais, irmãos e namorado pelo exemplo, incentivo, amor e carinho. AGRADECIMENTOS A todos aqueles que contribuíram de forma direta ou indireta para realização desse trabalho: Ao professor Dr. Alexandre Wagner Silva Hilsdorf pela orientação, dedicação e apoio. A minha Co-orientadora Profa. Dra. Laura Helena por sua dedicação, paciência e por estar sempre à disposição quando precisei. Ao Danilo Caneppele pelos trabalhos de coletas, juntamente com os pescadores do Projeto CESP/ANEEL. A professora Dra. Maria Rita do ICMbio, pelas amostras cedidas do Rio Muriaé e aos bons conselhos no desenvolvimento do trabalho. Aos Professores da pós-graduação em Biotecnologia, pelo conhecimento transmitido. Aos Professores Dr. Wellington, Dra Maria Santina e Dra. Katia, pelas correções no meu trabalho e disponibilidade para participar da minha banca de qualificação. A Juliana Viana, pelo companheirismo, amizade e pela paciência em todas as etapas da construção da biblioteca genômica enriquecida de microssatélites. A Dra. Márcia que gentilmente me orientou nos trabalhos com os géis de poliacrilamida e nas análises estatísticas dos microssatélites. As amigas de laboratório Pamela Rezende, Juliana de Biasi e Suhaila conhecidas também como “ajudantes do dia”, por sempre ajudar no desenvolvimento do meu trabalho e nas minhas análises e por proporcionarem ótimos momentos de convivência. A amiga Aline Lago pelos bons conselhos e carinho. Aos companheiros de laboratório Gabriel, Caio e Rodrigo por tornar esse espaço um ambiente mais agradável e alegre. A todo Núcleo de Biotecnologia e pós-graduandos que me ajudaram na parte de laboratório e proporcionaram muitos momentos de descontração em especial Profa. Dra Leia, Almir, Emy, Felipe, Dra. Débora, e as técnicas Thais e Mary. Aos professores, diretores e coordenadores que trabalham comigo pelo apoio e torcida. A todos meus irmãos pela paciência, amor e força quando precisei. Aos meus pais, por compreender minha ausência, apoiar minhas decisões, pela torcida e pelo amor que me deram incondicionalmente. Ao Ricardo, meu namorado cujo apoio e amor foram fundamentais ao longo do curso. RESUMO Um dos pontos centrais para o planejamento de medidas de conservação da biodiversidade aquática é o entendimento da estrutura populacional da espécie para que se determinem tanto as respostas fisiológicas às variações ambientais como as estratégias de manejo das populações naturais. O trabalho em questão objetivou avaliar a diversidade genética intra e interpopulacional da espécie Steindachneridion parahybae na Bacia do rio Paraíba do Sul, outrora de significativa importância econômica, e atualmente em perigo de extinção. Foram capturados 46 indivíduos em quatro diferentes localidades na Bacia do Paraíba do Sul. Amostras de tecidos da nadadeira foram retiradas e posteriormente usadas na extração total do DNA. Todas as amostras foram analisadas, no entanto, apenas nos Rio Paraíba do Sul e do Rio Muriaé capturou-se um número suficiente de animais para as análises populacionais. A região D-loop do DNAmt foi amplificada com primers específicos de todos os indivíduos amostrados e então sequenciada. O alinhamento final das sequências da região controle do DNAmt, com 657 pares de bases de comprimento, obtidas das 46 amostras de Steindachneridion parahybae analisadas gerou uma matriz de dados que definiu um total de 27 haplótipos. A maior diversidade haplotípica (Hd) (0,980) é encontrada no Rio Paraíba do Sul, com 20 haplótipos. A amostragem no Rio Muriaé forneceu uma diversidade haplotípica menor (0,652), apresentando apenas quatro haplótipos. Marcadores moleculares do tipo microssatélites foram desenvolvidos para espécie e utilizados para avaliar a diversidade e a estrutura genética de populações de S. paraybae. O DNA foi amplificado utilizando quatro primers microssatélites desenvolvidos para a espécie. Os produtos de amplificação foram submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida 9%, corado com nitrato de prata e fotodocumentado. Os alelos foram genotipados com o uso do programa ImageQuantTM 300 Imager (GE Healthcare) e as análises estatísticas conduzidas por meio dos programas Arlequin 3.01 e FSTAT. A estrutura genética das populações foi analisada por meio da AMOVA, baseada nas estimativas de FST e RST. Os quatro loci estudados foram polimórficos para a espécie, apresentando heterozigosidade observada de 0,440 a 1,000 para as duas populações analisadas. O número de alelos encontrados foi de 6 a 10 alelos por loci e a média da riqueza alélica variou de 12 a 16. A análise de AMOVA mostrou que a maior parte da variabilidade genética (98,88%) encontra-se dentro de cada população e apenas 5,88% entre elas. Palavras – chave: Surubim, Steindachneridion parahybae, microssatélites, D- loop, conservação genética. ABSTRACT The establishment of conservation strategies for aquatic biodiversity depends on previous studies of population structure. Such information may explain many physiological responses caused by modifications in natural environments. The present work aimed to evaluate intra and inter-populational genetic diversity of the endangered Steindacheridionparahybae, from Paraiba do Sul river basin. From four sampling sites, fin samples were obtained from 46 fish and processed for DNA extraction. All samples were analyzed, although only the samples from Paraiba do Sul and Muriaé rivers gave an adequate number for population analysis. The D-loop sequence from mtDNA was obtained using specific primers. The final alignment of mtDNA control regions contained 657 base pairs and gave rise to 27 haplotypes. The highest haplotype diversity (HD=0.980) was found in Paraiba do Sul river, with 20 haplotypes. Samples from Muriaé river resulted in decreased haplotype diversity (HD=0.652) with only four haplotypes. Microsatellite markers were also developed in our study in order to evaluate the diversity and genetic structure. The DNA was amplified using four primers developed in this study. AgNO3-stained polyacrylamide gels (9%) were obtained after electrophoresis of PCR products. The alleles were genotyped using ImageQuanttm 300 Imager (GE HealthCare) and statistical analysis were performed using the software Arlequin 3.01 and FSTAT. The genetic structure of each population was analyzed using AMOVA based on the values of FST and RST. The four loci were polymorphic for S. parahybae, with a heterozigosity ranging from 0.440 to 1.000 for both populations analyzed here. Regarding the alleles number, 6 to 10 alleles per loci were found and allele richness ranged from 12 to 16. AMOVA analysis indicated that most of genetic variability (98.88%) was observed with each population and only 5.88% within populations. Keywords: surubim, Steindachneridion parahybae, microsatellite, D-loop, genetic conservation. LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 Mapa da localização da Bacia do rio Paraíba do Sul. 18 Figura 2 Mapa da segmentação da bacia do rio Paraíba do Sul por 21 barragens e usinas hidrelétricas Figura 3 Vista dorso lateral de Steindachneridion parahybae 25 Figura 4 Mapa com a localização dos pontos de amostragens do 36 Steindachneridion parahybae Figura 5 Vista geral de umas das áreas de captura no município de 38 Lavrinhas, SP Figura 6 Espécime de Steindachneridion paraybae capturado 38 Lavrinhas-SP Figura 7 Vista geral de umas das áreas de captura no município de 39 Andrade Pinto – Rio Paraíba e Fazenda dos Casais – Rio das Flores Figura 8 Espécimes mortas de Dourada e Surubim-do-paraíba 40 encontradas após acidente com Endosulfan Figura 9 Mortalidade de várias espécies de peixes após acidente 40 com Endosulfan no rio Pirapitinga um dos afluentes do Rio Paraíba do Sul Figura 10 Detalhe das ilhas e corredeiras presentes na região de 41 captura Figura 11 Exemplar capturado na localidade de Andrade Pinto – RJ 41